JP2023036560A - タンパク質用又は細胞用の添加剤 - Google Patents
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Abstract
Description
例えば、特許文献1には、グリシルグリシンを培地に添加することで、動物細胞に高濃度に有用物質を生産させることができることが開示されている。また、特許文献2には、リン脂質類似構造を有するポリマーを含有する培地で細胞培養した場合に、生理活性物質を効率的に生産できることが開示されている。また、特許文献3には、疎水性D-アミノ酸を含有する培地が、細胞増殖を促進させ、有用物質の生産量を増大させることが開示されている。
しかし、このような血清代替物を含む培地の多くは、抗体産生細胞の増殖性、生存性および抗体生産性の面で血清含有培地に比べて十分なものとは言えない。さらに血清代替物も天然物由来のものが多く、供給制限があり、一般的に高価である。
以上のことから、ウシ胎児血清(FBS)に代わる血清代替物の開発が期待されている。
多くの動物細胞を長期間良好な状態で保存するには、―130℃以下で(水のガラス化温度以下)の凍結保存が必要とされており、温度上昇した場合は細胞の機能低下を招く。そのため、凍結細胞を輸送する際は冷却手段として液体窒素を利用した極低温輸送の形態が採用されているがコストが高い問題がある。そこで、細胞を機能低下せずに低コストで長時間輸送が可能な細胞保存液の開発が望まれている。例えば、特許文献4には、間葉系幹細胞を、ヒドロキシエチルデンプン(HES)及びジメチルスルホキシド(DMSO)を含む凍結保存液を用いて凍結し、この凍結細胞を―80℃で保存しても、解凍後の生存及び増殖能が維持できることが記載されている。この方法を用いることで、間葉系幹細胞を機能低下させずにドライアイス輸送が可能である。しかし、この凍害保護液には、血清アルブミンまたは血清が含まれることが多かった。血清の構成成分は、未だ完全に解明されておらず、その上、凍結保存中に動物細胞に何らかの変異を促す病原体ウイルス等が存在するリスクもある。また、平成25年6月に、欧州医薬品庁の医薬品安全監視リスク評価委員会より、製剤の安全性に関する問題が示された海外臨床試験の結果を根拠としてHES製剤の販売承認停止勧告が発表されている。よって、血清を使用することなく長時間の輸送が可能な凍結保存液が求められていた。
しかし、これらの方法はタンパク質の種類によっては、保持率や安定期間が満足できるものではない場合があり、更なる改良が求められている。
また、ブロッキング剤としては、TWEEN(登録商標)20と称される界面活性剤、ヒドロキシアルキルセルロース、ポリビニルアルコール、(メタ)アクリロイルモルホリンとその他のモノマーとの共重合体なども知られている(特許文献14、15、16)。
また、ホスホリルコリン基を側鎖に有する共重合体を用いたブロッキング剤も検討されている(特許文献17、非特許文献6)。
〔2〕アミノ酸系重合体(A)の質量平均分子量が2,000以上である、請求項1記載の添加剤。
〔3〕アミノ酸系重合体(A)の濃度が20.0w/v%である水溶液において測定した不凍水の量が、前記重合体1gあたり200mg以上である、〔1〕または〔2〕に記載の添加剤。
〔4〕アミノ酸系重合体(A)が、下記一般式(1)~(3)で示される少なくともいずれかの構造単位を有する、〔1〕または〔2〕に記載の添加剤。
(一般式(1)~(3)中の、Aはアミノ酸残基、XおよびYは、それぞれ独立してOまたはNH、R1はアルキレン基、R2はアルキレン基、1つ以上の水素原子がヒドロキシル基で置換されたアルキレン基、フェニレン基、エステル基、エーテル基、ウレタン結合、アミド結合、またはこれらの組み合わせから構成される非イオン性の2価の基を示す。)
〔5〕アミノ酸系重合体(A)が、アミノ酸系重合体(A)を構成する構造単位の合計100質量%に対して、一般式(1)~(3)で示される少なくともいずれかの構造単位を30~100質量%含む、〔1〕または〔2〕に記載の添加剤。
〔6〕タンパク質安定化剤またはブロッキング剤である、〔1〕または〔2〕に記載の添加剤。
〔7〕アミノ酸系重合体(A)の濃度が、0.01~30.0w/v%である、〔6〕に記載の添加剤。
〔8〕〔6〕に記載のタンパク質安定化剤と、タンパク質とを共存させる、タンパク質の安定化方法。
〔9〕抗原または抗体を含む担体に〔6〕に記載のブロッキング剤を処理する工程を含む、免疫測定方法。
〔10〕担体がラテックス粒子である、〔9〕に記載の免疫測定方法。
〔11〕〔6〕に記載のブロッキング剤で一部または全部が被覆された、標的物質に対する抗原または抗体を含む担体。
〔12〕〔7〕に記載の担体を備えた、免疫測定のためのキット。
〔13〕〔1〕または〔2〕に記載の添加剤を含む、細胞用培地。
〔14〕アミノ酸系重合体(A)の培地中の濃度が0.001~1質量%である、〔13〕に記載の細胞用培地。
〔15〕〔13〕に記載の細胞用培地中で細胞を培養する、スフェロイドまたは生理活性物質の製造方法。
〔16〕細胞凍結保護剤である、〔1〕または〔2〕に記載の添加剤。
〔17〕〔16〕に記載の細胞凍結保護剤を含む、細胞凍結保存液。
〔18〕さらに低分子溶剤を含み、浸透圧は500~2500mOsm/kgである、〔17〕に記載の細胞凍結保存液。
〔19〕アミノ酸系重合体(A)の濃度は、0.1~30.0w/v%である、〔17〕に記載の細胞凍結保存液。
〔20〕低分子溶剤がジメチルスルホキシド、プロピレングリコール、エチレングリコールおよびグリセリンからなる群より選択された少なくとも一種であり、低分子溶剤の含有量が5.0w/v%以下である、〔17〕に記載の細胞凍結保存液。
〔21〕〔17〕に記載の細胞凍結保存液と細胞とを混合する工程と、細胞凍結保存液と細胞との混合物を凍結する工程と、を含む、細胞の凍結方法。
〔22〕〔17〕に記載の細胞凍結保存液を用いて凍結された、スフェロイド。
〔23〕〔17〕に記載の細胞凍結保存液を用いて凍結された、オルガノイド。
アミノ酸誘導体としては、アミノ酸のアミノ基、カルボシキル基、またはその他の官能基のどれか1つの水素原子が別の官能基に置換されたものであり、これらの置換基を介してエチレン性不飽和基を導入することもできる。置換基としては特に限定されないが、アミノ基、カルボキシル基、水酸基等を有するアルキル基が好ましい。
アミノ酸およびアミノ酸誘導体は保護されたものでもよいが、最終的には脱保護されていることが好ましい。
アミノ酸系重合体(A)の質量平均分子量は、2,000以上であることが好ましく、5,000~100,000であることがより好ましい。質量平均分子量が2,000以上であることにより、タンパク質安定化剤及びブロッキング剤として用いた際に、タンパク質の標的以外への非特異吸着を抑制できる。また、細胞用添加剤として用いた際に、細胞内への取り込みを抑制できる。質量平均分子量が100,000以下であることにより、水溶液とすることができ、培地等への溶解性が向上する。さらに、増粘作用を低下させ、ゲル化等の不具合を防ぐことができ、ピペット操作などの取り扱いが容易になる。
アミノ酸系重合体(A)の質量平均分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(GPC)によって標準ポリエチレングリコール換算で計測した値を採用する。
R2のアルキレン基としては、R1と同様のものが挙げられ、それに加え、1つ以上の水素原子がヒドロキシル基で置換されたアルキレン基も挙げられる。
R2のフェニレン基としては、オルト-フェニレン基、メタ-フェニレン基、パラ-フェニレン基が挙げられる。
R2のエステル基としては、エステル基、チオエステル基、リン酸エステル基、硫酸エステル基、硝酸エステル基、炭酸エステル等が挙げられる。
R2のエーテル基としては、エーテル結合のほか、ポリエーテル基であってもよく、エチレングリコール基、プロピレングリコール基、テトラメチレングリコール基が挙げられ、これらが2つ以上連続した構造でも構わない。
上記以外にも、R2はウレタン結合やアミド結合でもよく、これらの置換基から2種類以上の組み合わせから構成されてもよい。
単量体(a1)
単量体(a2)
単量体(a3)
このようなアミノ酸系単量体(a2)の好ましい製造方法としては、例えば、保護アミノ酸と、必要に応じて塩基性化合物とをあらかじめプロトン性溶媒に溶解させた後、1分子中にスチレン骨格とハロゲン化アルキル基を有するエチレン性不飽和単量体を添加して反応させて保護アミノ酸系単量体を前駆体として合成する。保護アミノ酸系単量体は脱保護させて、アミノ酸系単量体にすることが好ましい。また、保護アミノ酸に代えてプロリンを使用してアミノ酸系単量体(a2)を得ることもできる。
1分子中にスチレン骨格とハロゲン化アルキル基を有するエチレン性不飽和単量体としては、クロロメチルスチレン、クロロエチルスチレン、クロロプロピルスチレン、クロロブチルスチレン、ブロモメチルスチレン、ブロモエチルスチレン、ブロモプロピルスチレン、ブロモブチルスチレン等が挙げられる。これらは、オルト体、メタ体、パラ体等の構造異性体を含んでいても構わない。
1分子中に2つのアクリロイル基を有する2官能のエチレン性不飽和単量体としては、例えば、エチレングリコールジアクリレート、ネオペンチルグリコールジアクリレート、1,6-ヘキサンジオールジアクリレート、1,9-ノナンジオールジアクリレート、トリエチレングリコールジアクリレート、ポリエチレングリコールジアクリレート(共栄社製、ライトアクリレート4EG-A、9EG-A、14EG-A)、3-メチル―1,5-ペンタンジオールジアクリレート、ポリテトラメチレングリコールジアクリレート、ジメチロールトリシクロデカンジアクリレート、2-ブチル―2-エチル―1,3-プロパンジオールジアクリレート等が挙げられる。
これらの2官能のエチレン性不飽和単量体は、上記の1官能のエチレン性不飽和単量体の組み合わせで、反応させて合成しても構わないし、市販品を使用しても構わない。
ヒドロキシル基含有アクリレート(c-1)としては、例えば、2-ヒドロキシエチルアクリレート、2-ヒドロキシプロピルアクリレート、4-ヒドロキシブチルアクリレート、2-アクリロイロキシエチル2-ヒドロキシエチルフタル酸、ポリエチレングリコールモノアクリレート(日油製、ブレンマーAE-90U、AE-200、AE-400)ポリプロピレングリコールモノアクリレート(日油製、ブレンマーAP-200、AP-400、AP-550、AP-800)、ポリエチレングリコール―ポリプロピレングリコールモノアクリレート(日油製、ブレンマーAEP)、ヒドロキシルエチルアクリルアミドなどが挙げられる。
ヒドロキシル基含有メタクリレート(c-2)としては、例えば、2-ヒドロキシエチルメタクリレート、2-ヒドロキシプロピルアクリレート、2-メタクリロイロキシエチル2-ヒドロキシエチルフタル酸、ポリエチレングリコールモノメタクリレート(日油製、PE-90、PE-200、PE-350)ポリエチレングリコールモノメタクリレート(ブレンマーPP-1000、PP-500、PP-800)ポリエチレングリコール-ポリプロピレングリコールものメタクリレート(日油製、ブレンマー50PEP-300、70PEP-350B)、ヒドロキシルエチルメタクリルアミドなどが挙げられる。
カルボキシル基含有アクリレート(d-1)としては、例えば、アクリル酸、2-アクリロイロキシエチルコハク酸、2-アクリロイロキシエチルフタル酸、2-アクリロイロキシエチルヘキサヒドロフタル酸等が挙げられる。
カルボキシル基含有メタクリレート(d-2)としては、例えば、メタクリル酸、2-メタクリロイロキシエチルコハク酸、2-メタクリロイロキシエチルヘキサヒドロフタル酸等が挙げられる。
グリシジル基含有メタクリレート(e-1)としては、例えば、グリシジルメタクリレート等が挙げられる。グリシジル基含有アクリレート(e-2)としては、例えば、グリシジルアクリレート、4-ヒドロキシブチルアクリレートグリシジルエーテル等が挙げられる。
イソシアネート基含有アクリレート(f-1)としては、例えば、2-イソシアナトエチルアクリレート等が挙げられる。イソシアネート基含有メタクリレート(f-2)としては、例えば、2-イソシアナトエチルメタクリレート、昭和電工社製、カレンズMOI-EG等が挙げられる。
アミノ酸系重合体を得る際に、アミノ酸系単量体(a1)~(a3)の他に、1分子中に1つのエチレン性不飽和基を有するその他の単量体(b)を共重合させることができる。
例えば、
メチル(メタ)アクリレート、エチル(メタ)アクリレート、プロピル(メタ)アクリレート、ブチル(メタ)アクリレート、ペンチル(メタ)アクリレート、ヘプチル(メタ)アクリレート、2-エチルヘキシル(メタ)アクリレート、シクロヘキシル(メタ)アクリレート、オクチル(メタ)アクリレート、ノニル(メタ)アクリレート、デシル(メタ)アクリレート、ウンデシル(メタ)アクリレート、ラウリル(メタ)アクリレート、トリデシル(メタ)アクリレート、テトラデシル(メタ)アクリレート、ペンタデシル(メタ)アクリレート、ヘキサデシル(メタ)アクリレート、ヘプタデシル(メタ)アクリレート、ステアリル(メタ)アクリレート、イソステアリル(メタ)アクリレート、ベヘニル(メタ)アクリレート、イソボルニル(メタ)アクリレート等の直鎖または分岐、脂環式アルキル基含有エチレン性不飽和モノマー;
1-プロピレン、1-ブテン、1-ペンテン、1-ヘキセン、1-オクテン、1-ノネン、1-デセンなどのα-オレフィン系エチレン性不飽和モノマー;
スチレン、α-メチルスチレン、o-メチルスチレン、p-メチルスチレン、m-メチルスチレン、ビニルナフタレン、ベンジルアクリレート、ベンジルメタクリレート、フェノキシエチルアクリレート、フェノキシエチルメタクリレート、フェノキシジエチレングリコールアクリレート、フェノキシジエチレングリコールメタクリレート、フェノキシテトラエチレングリコールアクリレート、フェノキシテトラエチレングリコールメタクリレート、フェノキシヘキサエチレングリコールアクリレート、フェノキシヘキサエチレングリコールメタクリレート、フェニルアクリレート、フェニルメタクリレート等の芳香族エチレン性不飽和単量体;
(メタ)アクリルアミド、N-メトキシメチル-(メタ)アクリルアミド、N-エトキシメチル-(メタ)アクリルアミド、N-プロポキシメチル-(メタ)アクリルアミド、N-ブトキシメチル-(メタ)アクリルアミド、N-ペントキシメチル-(メタ)アクリルアミド、N,N-ジ(メトキシメチル)アクリルアミド、N-エトキシメチル-N-メトキシメチルメタアクリルアミド、N,N-ジ(エトキシメチル)アクリルアミド、N-エトキシメチル-N-プロポキシメチルメタアクリルアミド、N,N-ジ(プロポキシメチル)アクリルアミド、N-ブトキシメチル-N-(プロポキシメチル)メタアクリルアミド、N,N-ジ(ブトキシメチル)アクリルアミド、N-ブトキシメチル-N-(メトキシメチル)メタアクリルアミド、N,N-ジ(ペントキシメチル)アクリルアミド、N-メトキシメチル-N-(ペントキシメチル)メタアクリルアミド、N,N-ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、N,N-ジエチルアミノプロピルアクリルアミド、N,N-ジメチルアクリルアミド、N,N-ジエチルアクリルアミド等のアミド基含有エチレン性不飽和単量体;
トリフルオロエチル(メタ)アクリレート、ヘプタデカフルオロデシル(メタ)アクリレート等のフッ素化アルキル基含有エチレン性不飽和単量体;
2-ヒドロキシエチル(メタ)アクリレート、2-ヒドロキシプロピル(メタ)アクリレート、4-ヒドロキシブチル(メタ)アクリレート、グリセロールモノ(メタ)アクリレート、4-ヒドロキシビニルベンゼン、1-エチニル-1-シクロヘキサノール、アリルアルコール等のヒドロキシル基含有エチレン性不飽和単量体;
ポリエチレングリコール(メタ)アクリレート、ポリプロピレンレングリコール(メタ)アクリレート、ポリエチレングリコールポリプロピレングリコール(メタ)アクリレート、ポリエチレングリコールポリテトラメチレングリコール(メタ)アクリレート、ポリプロピレングリコールポリテトラメチレングリコール(メタ)アクリレート、メトキシポリエチレングリコール(メタ)アクリレート、エトキシポリエチレングリコール(メタ)アクリレート等のポリオキシアルキレン親水性骨格含有の不飽和モノマーが挙げられる。
その他の単量体(b)は、本発明の目的を損なわない範囲で必要に応じて適宜使用でき、2種類以上を組み合わせて使用してもよい。
アミノ酸系重合体(A)は、例えば、アミノ酸系単量体(a1)~(a3)と、必要に応じて1分子中に1つのエチレン性不飽和基を有するその他の単量体(b)を使用して、通常の溶液重合により得られる。製造方法としては、下記の例が挙げられる。
窒素ガス導入管、コンデンサー、および撹拌機を備えた反応容器に、アミノ酸系ビニルモノマー、必要に応じてその他の単量体(b)と溶剤を仕込み、窒素置換しながら70~80℃に昇温する。モノマー成分の濃度は、反応時間の短縮と重合時の発熱を考慮して20~50重量%の範囲で行なう事が好ましい。窒素置換後、開始剤を添加し、還流条件下で反応させた。反応時間は、反応率(転化率)や残留モノマー成分の低減を考慮して5~24時間の範囲である事が好ましい。反応率(転化率)は98%以上とすることが好ましい。反応の終了や残留モノマーの確認は、ガスクロマトグラフィーなどの一般的な分析方法で確認する事ができる。反応終了後、冷却して目的のアミノ酸系重合体を得ることができる。
水溶性重合開始剤としては特に限定されず、例えば、過硫酸アンモニウム、過硫酸カリウム、過酸化水素、2,2’-アゾビス(2-メチルプロピオンアミジン)ジハイドロクロライドなど、従来既知のものを好適に使用することができる。
本発明の添加剤は、タンパク質安定化剤またはブロッキング剤としても有用である。以下に、タンパク質安定化剤及びブロッキング剤としての用途について述べる。
<タンパク質安定化方法>
本発明のタンパク質安定化剤と、タンパク質とを共存させることにより、タンパク質を安定に保管することができる。安定化剤とタンパク質とは、共通の溶媒に溶解又は分散させることで共存させることができる。
本発明のブロッキング剤を使用することで、免疫測定法において非特異的な反応を抑制することができる。本発明において、ブロッキングとは、免疫測定法において、検体中の標的物質(抗原または抗体)と該標的物質に対する抗原または抗体との抗原抗体反応以外に起因する非特異的な吸着を防止すること、また上記非特異的な吸着による担体の凝集の発生を防ぐことをいう。なお、検体中の標的物質が標的物質に対する抗原または抗体を介さずに担体に吸着すると測定値の異常が発生することがあり、それを防ぐことも含む。上記免疫測定法としては、ラテックス凝集法、ELISA法、化学発光法、免疫比濁法(TIA)法、放射免疫測定(RIA)、イムノクロマトグラフィー等による診断が挙げられる。
また、本発明において、ブロッキングとは、検体が病理組織であって病理組織中に含まれる抗原と前記抗原に対する抗体との抗原抗体反応以外に起因する非特異的な吸着を防止することを含む。このような免疫測定法としては、免疫染色法等が挙げられる。
ラテックス粒子としては、(メタ)アクリルアミド化合物、(メタ)アクリレート化合物、不飽和アルデヒド化合物、不飽和カルボン酸化合物または不飽和無水カルボン酸化合物、不飽和スルホン酸化合物、スチレン化合物等のモノマーから誘導されるポリマー粒子が挙げられる。ポリマー粒子の中でも、スチレン化合物と不飽和カルボン酸化合物との共重合体であるものが好ましい。
本発明の免疫測定のためのキットは、ブロッキング剤で一部または全部が被覆された、標的物質に対する抗原または抗体を含む担体を少なくとも備えるものである。本発明のキットは、通常の免疫測定による検体中の標的物質の検出に用いるためのキットと同様にして、本発明の免疫測定方法に使用できる。
本発明の添加剤は、細胞培養用培地添加剤としても有用である。以下に、細胞培養用培地添加剤としての用途について述べる。
本発明の細胞培養用培地添加剤を添加する細胞用培地としては、従来公知の細胞用培地を使用することができる、例えば、市販されている各種培地(αMEM、MEM、DMEM、IMDEM、RPMI1640、DMEM/F12など)や、これらの組み合わせが挙げられる。
細胞用培地には、必要に応じて、各種増殖因子(上皮成長因子やインスリン様成長因子、神経成長因子、肝細胞増殖因子、血管内皮増殖因子、塩基性繊維芽細胞増殖因子、トランスフェリン、ステロイドホルモン、2-メルカプトエタノールなど)や各種動物血清(ウシ胎児血清(FBS)やウシ血清など)、血清代替物などを添加するのが好ましい。
本発明の細胞用培地中で細胞を培養することで、生理活性物質を高効率で生産することができる。本実施形態に係る生理活性物質の製造方法では、前述のアミノ酸系重合体(A)を含む細胞用培地添加剤を含む細胞用培地を用いて、細胞を培養することを含む。
上記細胞用培地で培養される細胞は特に限定されず、生理活性物質の生産に使用可能な細胞であればよい。特に抗体生産可能な細胞であれば、例えば、CHO細胞、BHK細胞、HepG2細胞、rodentmyeloma細胞、(SP2/O細胞、NSO細胞などのマウス骨髄腫細胞など)、ハイブリドーマ、および、それらの細胞に外来遺伝子を導入した形質転換細胞が挙げられる。
本発明の添加剤は、細胞凍結保護剤としても有用である。以下に、細胞凍結保護剤としての用途について述べる。
本発明の細胞凍結保護剤を、例えば低分子溶剤と混合することにより、細胞凍結保存液とすることができる。細胞凍結保存液は、アミノ酸系重合体(A)を含むものであり、低分子溶剤を含むことが好ましく、天然の動物由来成分を含まないことが好ましい。
また、本細胞凍結保存液は、凍結過程において、細胞が細胞膜内に脱水するのを促進させること等によって、氷晶形成を防ぐことで、細胞の生存率を向上させることができるものと考えられる。このため、該細胞保存液の浸透圧は500~2,500mOsm/kgが好ましく、より好ましくは1,000~2,500mOsm/kg、さらに好ましくは1,500~2,300mOsm/kgである。細胞凍結保存液の浸透圧は、該細胞凍結保存液に含有されるイオンを含む全物質の濃度により定まる。細胞培養用培地の浸透圧は含まれるアミノ酸系重合体で310~360mOsm/kgに調整することができるが、本細胞凍結保存液の浸透圧は、それ以外に糖類、アミノ酸、ビタミンなどの細胞培養用培地に含有する低分子化合物や低分子溶剤を後から添加することで適宜調整することができる。
本発明の細胞凍結保存液を用いることで、ES細胞やiPS細胞等のコロニーや3次元培養した(幹)細胞スフェロイド等の細胞凝集物をより簡易で効率よく凍結、輸送できる。
本明細書で用いる細胞は、凍結保存に付されることがある細胞であれば特に限定されず、微生物、細菌、動物細胞、植物細胞のいずれであってもよい。ここでいう動物には、ヒトを含む哺乳類、魚類、鳥類、昆虫類等が包含される。
本発明における「動物細胞」としては、培養細胞として株化された細胞、生物組織から得られる株化されていない正常細胞、遺伝子工学的手法により得られた形質転換細胞など、いずれの形式のものであってもよい。細胞は、組織または臓器中のすべての種類の細胞などの体細胞;全能性幹細胞、多能性幹細胞(例えば、iPS細胞、ES細胞)、及び前駆細胞などのすべての型の幹細胞;卵母細胞;精子;および生殖細胞などの任意の型の細胞を含む。
細胞は、単離された形態または細胞含有体液、細胞コロニーや3次元培養した(幹)細胞スフェロイド、組織、臓器の形態などの単離されない細胞凝集体であってもよい。
本発明による細胞凍結保存液は、低分子溶剤を含むことが好ましい。低分子溶剤とは、例えば、ジメチルスルホキシド(DMSO)、エチレングリコール(EG)、プロピレングリコール(PG)、グリセリンが挙げられる。これらは2種以上を組み合わせて使用してもよい。低分子溶剤を有することは、充分な凍結保護効果を得る上で有利である。
本発明による細胞凍結保存液中における低分子溶剤の含有量は、使用する成分の種類により適宜変更することが可能であるが、好ましくは、最終濃度が5.0w/v%以下となるような量である。5.0w/v%以下であると、細胞に対する毒性が低くなり好ましい。また、DMSOは分化に影響を与える可能性があるため、含まないことが好ましい。
本発明の細胞凍結保存液は、天然の動物由来成分を含まないことが好ましい。天然の動物由来成分としては、例えば、アルブミン、血清、血漿及び基礎培地等が挙げられる。血清としては成牛血清、仔牛血清、新生仔牛血清、および牛胎児血清等が挙げられる。
本発明の細胞凍結保存用溶液は、天然の動物由来成分を含まないため、天然の動物由来成分のロット間での品質の違いといった問題を生じることがない上、血清に含まれる各種サイトカイン、増殖因子およびホルモン等の本来細胞保存に不必要な成分による細胞の性質の変化を回避でき、更に、由来不明な基礎培地中の成分による影響も回避できる。そのため、本発明の細胞凍結保存用溶液は、特に臨床使用において生体に安全に適用することができるという観点で、非常に有用である。しかも、後述の実施例で示されるとおり、天然の動物由来成分が含まれていなくとも細胞を良好な生存率で凍結保存することができる。
本発明による細胞凍結保存液は、細胞培養用培地を含むことが好ましい。細胞培養用培地の種類は特に限定はされず、本技術的分野における当業者によって、その細胞の培養が可能である培地を適宜選択することができるが、細胞培養用培地成分は、天然の動物由来成分を含有しない動物組織培養用の基本培地の成分を用いることが好ましい。培地としては、αMEM、MEM、DMEM、IMDEM、RPMI1640、DMEM/F12等が挙げられる。また、本発明による細胞凍結保存液は、培地の含有量が高い程、低い細胞毒性を示すため、低分子溶剤、化合物以外の成分が全て培地であってもかまわない。
本発明の細胞凍結保存液は、アミノ酸系重合体や低分子溶剤以外の成分を含んでもよく、その他の成分としては、細胞培養用培地等に含まれるものであれば好適に使用できる。例えば、糖類やアミノ酸、ビタミン類、抗酸化剤、微量元素等が挙げられる。
糖類としては、グルコース、スクロース等が好ましい。
ビタミン類としては、ビオチン、パントテン酸、コリン、ホラシン(葉酸)、myo-イノシトール、ナイアシン、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、コバラミンなどのビタミンB 群のビタミン類が挙げられる。
抗酸化剤としては、グルタチオン、アスコルビン酸等が挙げられる。
微量元素としては、Ag+、Al3+、Ba2+、Cd2+、Co2+、Cr3+、Ge+、Mn2+、Mo6+、NI2+、Rb+、Se4+、Si4+、Sn2+、V5+、Zr4+、Br-、F-、I-等が挙げられる。
上記アミノ酸、ビタミン類、抗酸化剤、微量元素などの成分は2種以上併用してもよく、また各成分はそれぞれ2種以上用いてもよい。
更に、pH調製剤等を含んでも良い。pH調整剤としては、例えば、リン酸緩衝液および炭酸緩衝液等が挙げられる。また、Basic Stock Solution (BSS)にリン酸緩衝液を添加しない場合には、生理食塩水を添加したものも用いることができる。このうちリン酸緩衝液を用いることが特に好ましい。pH調整剤は細胞凍結保存用溶液中のpHをおよそ6.5~9.0、好ましくは7.0~8.5に調整するために適宜用いることが好ましい。なお、本発明におけるリン酸緩衝液とは、塩化ナトリウム、リン酸一ナトリウム(無水)、リン酸一カリウム(無水)、リン酸二ナトリウム(無水)、リン酸三ナトリウム(無水)、塩化カリウム、及びリン酸二水素カリウム(無水)などのことをいい、特に塩化ナトリウム、リン酸一ナトリウム(無水)、塩化カリウム、またはリン酸二水素カリウム(無水)を用いることが好ましい。また、リン酸二水素カリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、およびリン酸水素二ナトリウムの組み合わせも好ましい。pH調整剤は細胞保存液中に0.01~1.0w/v%含まれることが好ましく、0.05~0.5w/v%含まれることがより好ましい。
本発明による細胞凍結保存液は、滅菌されていることが好ましい。細菌等の感染のリスクが低減されるため、より安全に生体へ適用することができる。滅菌の種類としては、細胞凍結保護液の成分が変性・分解等しない方法であればどれでもよく、その中でもフィルター滅菌が好ましい。
本発明の細胞保存液を使用する細胞の凍結方法としては、特に限定されないが、細胞凍結保存液と細胞を混合する混合工程と、細胞凍結保存液と細胞の混合物を凍結する凍結工程とを含むことが好ましい。
混合工程の前に、細胞をPBS(リン酸緩衝生理食塩水)等の洗浄液を用いて洗浄してもよい。これによって、例えば、培養培地等の成分の混入をより低減することができる。
混合工程において、細胞凍結保存液1mLあたりの細胞数は、特に限定されないが、好ましくは103~109個/mL、より好ましくは104~108個/mLになるように調製することが好ましい。
また、細胞凝集体(コロニー、スフェロイド)の混合工程においては、細胞凍結保護剤1mLあたりの細胞凝集体の数は、特に限定されないが、好ましくは1~105個/mL、より好ましくは1~103個/mLになるように調製することが好ましい。
混合物は、例えば、アンプルまたはクライオチューブ等の耐寒性容器に移して、氷上でよくピペッティングする。耐寒性容器は、内部が滅菌されていることが好ましい。
凍結工程において、冷却速度は特に限定されないが、例えば、急激に冷却した場合には、細胞内と細胞外の水分の氷結に差が生じ、細胞の微細構造を破壊するおそれがあるため、耐寒性容器を温度制御可能なフリーザーもしくは緩慢凍結容器にセットし、1分間に0.5℃ から3℃ の速度で冷却を行われていることが好ましい。
温度制御可能なフリーザーもしくは緩慢凍結容器としては、ワケンビーテック社のCoolCell(登録商標)、Nalgene社のMr.Frosty、及び日本フリーザー株式会社のバイセル等が挙げられる。最終的な凍結温度は特に限定されないが、好ましくは-80℃以下、より好ましくは-150℃以下、さらに好ましくは-196.5℃以下である。また、-80℃付近で保存した後、-180℃~-200℃(例えば、液体窒素中)に移して保存してもよい。これにより、凍結細胞が得られる。
また、細胞のコロニー、スフェロイド等の細胞凝集体は、細胞の内部を脱水置換し、一気に液体窒素温度に低下することで細胞全体をガラス化させ固定させる方法が使用されてもよい。例えば、耐寒性容器を液体窒素に直接浸漬することにより、細胞凝集体の凍結物を得ることができる。
本発明における細胞凍結保存液は、例えば、耐寒性容器、温度制御可能なフリーザーもしくは緩慢凍結容器、または使用説明書等と組み合わせて、キットとしてもよい。キットの使用説明書には、例えば、上記の凍結保存方法等が記載されている。
本発明の凍結細胞は、保存の対象となる細胞によって異なるが、例えば、保存1週間経過後またはそれ以上経過後(例えば、10日間以上、10年以上経過後)において、良好な生存率、増殖率を達成し得る。本発明の解凍後の生存率は、解凍直後において、細胞生存率=生細胞の数/(生細胞の数+死細胞の数)×100%と定義される。解凍後の生存率は、50%以上、好ましくは60%以上、より好ましくは70%以上、さらに好ましくは80%以上、特に好ましくは90%以上である。解凍直後とは、解凍後12時間以内を意味する。
また、本発明の解凍後の増殖率は、細胞増殖率=解凍3日後細胞の数/解凍初期に播種した細胞の数×100%と定義される。増殖率は、105%以上、好ましくは150%以上、より好ましくは200%以上である。
本発明に係る凍結方法または保存方法を用いて凍結保存された細胞は、上述のとおり、解凍後に良好な生存率、増殖率を示し得る(後述の実施例も参照)。解凍は、素早く行うことが好ましく、例えば、37℃±1℃のウォーターバスに浸漬して行うことが好ましい。解凍後の細胞の使用において、細胞凍結保護剤は除去されてもよいし、除去されなくてもよい。
・アミノ酸系単量体1
4つ口フラスコに、L-グリシン(10.0g,0.133mol)、水酸化ナトリウム(10.7g,0.266mol)、水25mLを入れ、溶解させた。反応溶液を氷浴中で冷却し、塩化アクリロイル(13.26g,0.147mol)を1時間かけて滴下した。滴下後、氷浴中で30分間攪拌した後に、室温でさらに2時間攪拌した。反応液に塩酸水を加えてpH1~2に調製した後に、酢酸エチルで抽出を行い、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧溜去した。得られた固体をさらにジエチルエーテルで洗浄した後、濾過し、24時間減圧乾燥させ、下記構造のアミノ酸系単量体1(12.12g、70.5%)を得た。
アミノ酸系単量体1
・アミノ酸系単量体2~5
表1に示す材料に変更した以外は、製造例1と同様の方法で下記構造のアミノ酸系単量体をそれぞれ得た。また、アミノ酸は製造例1におけるL-グリシンと同モル量を使用した。
アミノ酸系単量体2、3、5
・アミノ酸系単量体6
撹拌機および温度計、還流器、滴下ロートを備えた反応容器に、グリシンtert-ブチル塩酸塩(54.9g,0.327mol)、水酸化ナトリウム(19.6g,0.491mol)、エタノール100mLを入れた。撹拌しながら70℃まで昇温して溶解させた後、温度を40℃まで冷却した。滴下ロートから、4-クロロメチルスチレン(52.8g,0.344mol)を1時間かけて滴下した。反応温度を40℃に維持して6時間反応させた。反応後、溶液を濾過し、濾液を分取した。この濾液に酢酸エチルを少しずつ加え、冷却して再結晶させた。再度、得られた結晶をエタノールに溶解させ、酢酸エチルで再結晶下後、室温で24時間、減圧乾燥して下記構造のアミノ酸系単量体前駆体1(84.21g,80.3%)を得た。
アミノ酸系単量体前駆体1
アミノ酸系単量体6
・アミノ酸系単量体7
表2に示す材料に変更した以外は、製造例6と同様な方法で下記構造のアミノ酸系単量体前駆体2を得た。また、アミノ酸は製造例6におけるグリシンtert-ブチル塩酸塩と同モル量を使用した。
アミノ酸系単量体前駆体2
アミノ酸系単量体7
・アミノ酸系単量体8
グリシンtert-ブチル塩酸塩をL-プロリンに変更した以外は製造例6のアミノ酸系単量体前駆体1と同様な方法で、下記構造のアミノ酸系単量体8を得た。また、L-プロリンは製造例6におけるグリシンtert-ブチル塩酸塩と同モル量を使用した。
アミノ酸系単量体8
・2官能の単量体1
還流器および撹拌機を備えた反応容器に、4-ヒドロキシブチルアクリレート(138.0g,0.957mol)、ピリジン80mLを仕込んだ。氷冷しながら、メタクリル酸クロリド(110.1g,1.05mol)を1時間かけて滴下した。4時間反応させた後、溶液を濾過し、濾液を減圧溜去し、下記構造の2官能の単量体1(130.0g,64.0%)を得た。
2官能の単量体1
・ポリエチレングリコールモノアクリレート:日油製、ブレンマーAE-90U
・ポリプロピレングリコールモノアクリレート:日油製、ブレンマーAP-200
・アミノ酸系単量体9
還流器および撹拌機を備えた反応容器に、2官能の単量体1(89.06g,0.420mol)、及びグリシンtert-ブチル塩酸塩(72.1g,0.225mol)、エタノール120mLを仕込んだ。撹拌しながら昇温した後、70℃で5時間反応させた。反応終了後、減圧乾燥によりエタノールを除去し、アセトンで再結晶をし、下記構造のアミノ酸系単量体前駆体3(96.11g,88.0%)を得た。
アミノ酸系単量体前駆体3
・アミノ酸系単量体10,11
表4に示す材料に変更した以外は、製造例12と同様の方法でアミノ酸系単量体10,11をそれぞれ得た。
・アミノ酸系単量体12
グリシンtert-ブチル塩酸塩をL-プロリンに、かつ2官能の単量体1から2官能の単量体4に変更した以外は、製造例13のアミノ酸系単量体前駆体9と同様の方法で下記構造のアミノ酸系単量体12を得た。また、L-プロリンは製造例13におけるグリシンtert-ブチル塩酸塩と同モル量を使用した。
アミノ酸系単量体12
・アミノ酸系重合体1
攪拌器、温度計、滴下ロート、還流器を備えた反応容器に、エタノール150部を仕込み、内温を75℃に昇温し十分に窒素置換した。別途用意しておいた、アゾビスイソブチルニトリル0.4部、(アミノ酸系単量体1)100部を75℃に保ちながら3時間滴下を続け、さらに8時間撹拌を続けた。反応終了後、冷却して取出した。その後、減圧乾燥でエタノールを完全に揮発させ、アミノ酸系重合体1を得た。
表5に示す配合組成で、重合体製造例1と同様の方法でアミノ酸系重合体2~16をそれぞれ得た。表中において、質量平均分子量および不凍水量以外の数字は部数を表す。
重量平均分子量は、GPC(ゲルパーミエーションクロマトグラフィー)測定によるポリエチレングリコール換算の値として表5に示す。
装置;GPCSYSTEM24H(昭和電工社製)
カラム;SB-803HQ+SB-804HQ(昭和電工社製)
溶出溶媒;20mMリン酸緩衝液
標準物質;ポリエチレングリコール(アジレント・テクノロジー社製)
流速;0.5mL/分、試料溶液使用量;10μL、カラム温度;40℃
・アミノ酸系重合体の不凍水の測定
アミノ酸系重合体1~16について、アミノ酸系重合体の濃度が20.0w/v%である水溶液を調整した。この水溶液を不凍水の測定用サンプルとした。アミノ酸系重合体に含有される不凍水量の測定方法は、特開2016-063801号公報に詳しく説明される方法を用いて測定した。本願明細書に記載の発明においては、示差走査熱量計(DSC装置;株式会社日立ハイテクサイエンスDSC6200)を用い、窒素流量50mL/分、5℃/分間の条件で各種の割合で含水させたポリマーにおける潜熱の移動について測定をした。
温度プログラムは、(i)室温から-100℃まで冷却、(ii)-100℃で5分間保持、(iii)-100℃から30℃まで加熱を行った。上記(iii)において、水の低温結晶化に起因する発熱ピーク及び水の低温融解に起因する吸熱ピークの有無によって自由水、中間水の有無が確認される。つまり、DSCチャートにおいて、-40℃付近における潜熱の放出や、-20℃以上の氷点下における潜熱の吸収は、アミノ酸系重合体に含有される中間水の規則化と再不規則化に起因するものと考えられている。
DSC装置を用いて、酸化アルミパンを室温から-100℃まで冷却し、ついで5分間ホールドした後、昇温速度5℃/分で-100℃から30℃まで加熱を行う過程での吸発熱量の測定を行った。
各試料について、DSC測定後にアルミパンにピンホールをあけて真空乾燥後、その重量を測定し、重量減少分を含水量とした。
含水率(WC)は、酸化アルミパンの質量を除外した上で、以下の式(I)で求める。
含水率(WC)=(W1-W0)/W0(I)
(W0:試料の乾燥重量(g)、W1:試料の含水重量(g))
また、サンプル毎に、0℃付近の吸熱量から、自由水の量を求め、-40℃付近における発熱量と-20℃以上の氷点下における吸熱量から中間水の量を求め、上記で求めた各サンプルの含水量(W1-W0)から自由水と中間水の量を差し引いた量を不凍水量として求めた。アミノ酸系重合体1gあたりの不凍水量は、求められた不凍水量を試料の乾燥重量(W0)で除することにより求めた。実験の結果を表5に示す。
BMA:n-ブチルメタクリレート
HEA:ヒドロキシエチルアクリレート
AA:アクリル酸
(タンパク質安定化剤水溶液1~20)
重合体製造例1~16で得られたアミノ酸系重合体1~16、ポリビニルピロリドン(以下PVP)、およびプロリンを表6に記載の濃度になるように、リン酸緩衝生理食塩水(以下PBS溶液)にて調整し、タンパク質安定化剤水溶液1~18を得た。
PVP:ポリビニルピロリドン、質量平均分子量10,000
得られたタンパク質安定化剤について以下の評価を実施した。結果を表6に示す。
HRP標識抗CRP抗体ab24462(abcam社製)を8.0ng/mLとなるように、得られたタンパク質安定化剤水溶液1mLで希釈・混合し、評価用の酵素水溶液を作成した。評価用酵素水溶液は濃度変化がないよう、よく密閉し25℃暗所で保管した。
ペルオキシダーゼ用発色キット(住友ベークライト製)を用い、発色剤(3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジン(TMBZ)溶液)を10mLと基質液(過酸化水素水)100μLを混合し発色液を得た。
この発色液100μLと、評価用酵素水溶液100μLとを96穴ウェルプレートに加え、30℃暗所で20分間静置した。これに停止液(硫酸水溶液)を100μL加え反応を停止させた。その後、450nmでの吸光度をプレートリーダーMultimodeReaderMithras2LB943(BERTHOLDTECHNOLOGIES社製)で測定し、反応により生じたTMBZ酸化物の量を定量した。TMBZの酸化反応はHRP標識CRP抗体の活性と相関するため、得られた吸光度を酵素活性の指標として使用することができる。
上記酵素活性評価を、評価用酵素水溶液の保管前と25℃30日間保管後の2回行い、吸光度を測定した。保管前の吸光度を100%としたときの、保管後の吸光度の比率を計算して相対吸光度とし、下記基準にてタンパク質の変性を評価した。結果を表6に示す。
◎:95%以上(極めて良好)
○:90%以上、95%未満(良好)
△:80%以上、90%未満(使用可能)
×:80%未満(使用不可)
(ブロッキング剤水溶液1~20)
重合体製造例1~16で製造したアミノ酸系重合体1~16、PVP、およびプロリンを表7に記載の濃度になるように、PBS溶液にて調整し、ブロッキング剤水溶液1~20を得た。
得られたブロッキング剤溶液について、下記の通り、[抗原抗体反応試験]及び[非特異吸着試験]を実施し、吸光度の差異を基準に評価した。結果を表7に示す。
(ウェルプレートの固相抗体処理)
固相用の抗CRP抗体ab8279(abcam社製)が25μg/mLの濃度になるようにPBS溶液で調整した。この固相用の抗CRP抗体溶液をPSt製96穴ウェルプレートに50μLずつ添加し、室温2時間静置した後、溶液を吸引し除去した。
前述の固相抗体処理した96穴ウェルプレートに、得られたブロッキング剤水溶液を200μLずつ添加し吸引除去し、これを3回繰り返した。最後にブロッキング剤水溶液を50μLずつ添加し、室温2時間静置した後、溶液を吸引し除去した。
CRP抗原8C72(Hytest社製)が2μg/mLになるようにPBS溶液で調整した。このCRP抗原溶液を、前述のブロッキング処理した96穴ウェルプレートに50μLずつ添加し、30℃2時間静置した後、溶液を吸引し除去した。その後、余剰の抗原を除去する目的で、得られたブロッキング剤水溶液を200μLずつ添加し吸引除去する操作を3回繰り返した。
HRP標識抗CRP抗体ab24462(abcam社製)が0.08μg/mLになるようにPBS溶液で調整した。このHRP標識抗CRP抗体溶液を、前述の抗原処理した96穴ウェルプレートに50μLずつ添加し、室温2時間静置した後、溶液を吸引し除去した。その後、余剰の標識抗体を除去する目的で、得られたブロッキング剤溶液を200μLずつ添加し吸引除去する操作を3回繰り返した。
ペルオキシダーゼ用発色キット(住友ベークライト製)の発色剤10mLと基質液0.1mLを用いて発色溶液を調整した。この発色溶液を前述の標識抗体吸着処理した96穴ウェルプレートに100μLずつ添加し、30℃暗所で20分静置した。次に各ウェルに住友ベークライト社製ペルオキシダーゼ用発色キットの停止液(硫酸水溶液)100μLを添加した。
各ウェルの450nmの吸光度(吸光度Aとする)を測定した。これは、抗原抗体反応(特異吸着)によりウェルに吸着した抗体量を表す吸光度である。
(ウェルプレートの固相抗体処理)
固相用抗CRP抗体ab8279(abcam社製)が25μg/mLの濃度になるようにPBS溶液で調整した。この固相用抗CRP抗体溶液をPSt製ELISA用96穴ウェルプレートに50μLずつ添加し、室温2時間静置した後、溶液を吸引し除去した。
前述の固相抗体処理した96穴ウェルプレートに、得られたブロッキング剤水溶液を200μLずつ添加し吸引除去し、これを3回繰り返した。最後にブロッキング剤水溶液を50μLずつ添加し、室温2時間静置した後、溶液を吸引し除去した。
HRP標識抗CRP抗体ab24462(abcam社製)が0.08μg/mLになるようにPBS溶液で調整した。このHRP標識CRP抗体溶液を、前述のブロッキング処理した96穴ウェルプレートに50μLずつ添加し、室温2時間静置した後、溶液を吸引し除去した。その後、余剰の標識抗体を除去する目的で、得られたブロッキング剤水溶液を200μLずつ添加し吸引除去する操作を3回繰り返した。
ペルオキシダーゼ用発色キット(住友ベークライト製)の発色剤10mLと基質液0.1mLを用いて発色溶液を調整した。この発色溶液を前述の標識抗体吸着処理した96穴ウェルプレートに100μLずつ添加し、30℃暗所で20分静置した。次に各ウェルに住友ベークライト社製ペルオキシダーゼ用発色キットの停止液(硫酸水溶液)100μLを添加した。
各ウェルの450nmの吸光度(吸光度Bとする)を測定した。これは、抗原がないため、標識抗体の非特異吸着によるウェルに吸着した抗体量を表す吸光度である。
◎:1.0≦(吸光度A-吸光度B):良好
〇:0.8≦(吸光度A-吸光度B)<1.0:使用可能
△:0.5≦(吸光度A-吸光度B)<0.8:使用不可
×:(吸光度A-吸光度B)<0.5:不良
[実施例3-1~3-18、比較例3-1~3-2]
(細胞培養用培地1~20)
重合体製造例1~16であるアミノ酸系重合体1~16、PVP、およびメチオニンを以下に述べるそれぞれの基礎培地に表8に記載の濃度になるように添加し、ピペッティングをすることで細胞培養用培地1~20を得た。
以下の通り、細胞培養用培地添加剤の評価を行った。結果を表8に示す。
培地はDynamisMedium(Gibco製)を用い、L-Glutaminを1質量%になるように添加した。以後これを基礎培地とする。これを2セット用意し、アミノ酸系重合体を含む細胞培養用培地添加剤を表8に記載の濃度となるようにそれぞれ添加した。それぞれの基礎培地にIgG遺伝子を導入しIgG抗体を分泌産生するCHO細胞株を加え、CHO細胞株の濃度が1,000,000cells/mLとなる細胞懸濁液を作製した。得られた細胞懸濁液20mLを、125mLの三角フラスコに播種し、37℃にて培養した。なお、培養中、栄養源が枯渇する前に3~4日に一度、上澄み液15mLを回収し、新たな基礎培地15mLと交換し、これを5回繰り返した。
抗体産生細胞凝集物の発生抑制性は、培地交換を5回繰り返した後の三角フラスコの液
面付近を目視観察することによって評価した。
◎:凝集物が三角フラスコの液面付近に発生していない:良好
○:凝集物が三角フラスコの液面付近に僅かに発生している:使用可
×:凝集物が三角フラスコの液面付近に一様に発生している:使用不可
抗体産生細胞凝集物の発生抑制性評価と同様にしてCHO細胞の培養をし、培地交換を5回繰り返した後の細胞培養液を遠心分離することで、培地上清を回収した。培地中の抗体量を、BethylLaboratories,Inc製のHumanIgGELISAQuantitationSetを用いて測定した。また、沈降した細胞群のDNA量も定量し、単位DNA量あたりの抗体生産量として算出した。アミノ酸系重合体を含む細胞用培地添加剤を加えないで培養した場合の成績を1とした場合の相対値で判定した。
◎:1.5以上(非常に良好)
○:1.2以上1.5未満(良好)
△:1以上1.2未満(やや不良)
×:1未満(不良)
10%FBS-DMEM培地(以下、DMEM培地とする)にアミノ酸系重合体を含む細胞培養用培地添加剤を表8に記載の濃度となるように添加し、攪拌をすることで細胞培養用培地を調製した。ヒト肝がん細胞株HepG2細胞を、250,000細胞/mLとなるように上記のアミノ酸系重合体を含む細胞用培地添加剤を添加した細胞培養用培地に播種した後、96ウェルU底マイクロプレートのウェルに1ウェルあたり200μLになるように分注した。その後、本プレートをCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて静置状態で3日間培養した。3日間培養後のHepG2細胞を含む培養液を回収し、遠心分離にすることで培地上清を回収した。培地中のアルブミン量を、BethylLaboratories,Inc製AlbuminELISAQuantitationSetを用いて測定した。また、沈降した細胞群のDNA量も定量し、単位DNA量あたりのアルブミン生産量として算出した。アミノ酸系重合体(A)を含む細胞培養用培地添加剤を加えないで培養した場合の成績を1とした場合の相対値で判定した。
◎:1.5以上(非常に良好)
○:1.2以上1.5未満(良好)
△:1以上1.2未満(やや不良)
×:1未満(不良)
アルブミン産生性評価と同様に、HepG2細胞を3日間培養した。その後、HepG細胞をPBS溶液にて洗浄し、DMEM培地を入れ替えた。CYP3A4活性はP450-GloTMCYP3A4AssayKits(Promega製)を用い、CYP3A4の基質としてLuciferin-IPAを用いた。CYP3A4活性値はプレートリーダー(Berthold製)を用いて測定した。また、細胞群のDNA量も定量し、単位DNA量あたりのCYP3A4活性値として算出した。アミノ酸系重合体(A)を含む細胞培養用培地添加剤を加えないで培養した場合の成績を1とした場合の相対値で判定した。
◎:1.5以上(非常に良好)
○:1.2以上1.5未満(良好)
△:1以上1.2未満(やや不良)
×:1未満(不良)
アルブミン産生性評価と同様に、HepG2細胞を3日間培養した。その後、HepG2細胞を回収し、RNeasyMicroKit(QIAGEN製)を用いてトータルRNAを抽出した。抽出した各全RNAをReverTraAceqPCRRTMasterMix(TOYOBO製)を用いた逆転写反応によりcDNAを合成した。cDNAと目的遺伝子(CYP3A4とアルブミン)のTaqManprobe(LifeTechnologies製、CYP3A4:Hs00604506_m1,アルブミン:Hs00609411_m1)を用いてqRT-PCRを実施した。リファレンス遺伝子にはGAPDH(LifeTechnologies製、Hs02786624_g1)を用いた。各遺伝子の相対発現量はGAPDHを基準に比較Ct法を用いて算出した。アミノ酸系重合体(A)を含む細胞培養用培地添加剤を加えないで培養した場合の成績を1とした場合の相対値で判定した。
◎:2以上(非常に良好)
○:1.2以上2未満(良好)
△:1以上1.2未満(やや不良)
×:1未満(不良)
DMEM培地にアミノ酸系重合体(A)を含む細胞培養用培地添加剤を表8に記載の濃度になるように添加し、攪拌をすることで細胞培養用培地を調製した。ヒト肝がん細胞株HepG細胞を100,000細胞/mLとなるように、上記のアミノ酸系重合体を含む細胞用培地で調整しマイクロプレート(住友ベーラクイト社製PrimeSurfaceMS-9096U)のウェルに1ウェルあたり100μLになるように播種した。その後、本プレートをCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて静置状態で3日間培養した。スフェロイド形成性は、3日後に細胞培養状態を透過式光学顕微鏡40倍で写真撮影し、細胞の形態を観察することによって、以下の基準で判定した。評価結果を表8に示す。
〇:1つのスフェロイドを形成(良好)
△:複数個のスフェロイドを形成(やや不良)
×:スフェロイドを形成しない(不良)
DMEM培地にアミノ酸系重合体を含む細胞用培地添加剤を表8に記載の濃度になるように添加し、攪拌をすることで細胞培養用培地を調製した。ヒト肝がん細胞株HepG2細胞を100,000細胞/mLとなるように、上記のアミノ酸系重合体を含む細胞用培地添加剤を添加した細胞培養用培地で調整し、96ウェルU底マイクロプレートのウェルに1ウェルあたり100μLになるように分注した。その後、本プレートをCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて静置状態で5日間培養した。
ATP活性は、1、5日後にATPアッセイを行うことによって評価した。具体的には、培養後のウェルに100μLのATP試薬(『塊』のATP測定試薬:東洋ビーネット社製)を添加、5回ピペッティングし、5分間室温で静置した後、100μLの試薬・細胞溶解液を別プレートに分取し1分間撹拌した。これをMithrasLB940(Berthold社製)を用いて発光量を測定した。評価結果を表8に示す。
ATP活性=(培養5日後の発光量)/(培養1日後の発光量)×100
◎:120%≦ATP活性ATP活性がかなり高い。(非常に良好)
〇:50%≦ATP活性<120%ATP活性が高い。(良好)
△:20%≦ATP活性<50%ATP活性がやや高い。(可)
×:ATP活性<20%ATP活性が低い。(不良)
・細胞凍結保存液1
重合体製造例1であるアミノ酸系重合体1を30w/v%とDMSOを5w/v%、富士フィルム和光純薬製のDMEM(製品コード:042-32255)70v/v%を配合し、十分均一になるまでピペッティングし、溶解させた後、これをフィルターで濾過して無菌的な細胞凍結保存液1を得た。
[実施例4-2~4-18、比較例4-1~4-6]
表9に示す配合組成で、実施例4-1と同様の方法で細胞凍結保存液2~24を得た。
薬局方に準拠する「氷点降下法」により、GONOTEC社製浸透圧測定装置(オズ゛モメータ)を用いて、細胞凍結保護液の浸透圧を測定した。結果を表9に示す。
15mL遠心管に9mLのMEMα培地を分注し、洗浄用培地とした。ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞(タカラバイオ社製、C-12977)(パッセージ数:2)が凍結保存され、入っているクライオチューブを37℃温水浴にて振盪し、細胞を解凍した。解凍した細胞を洗浄用MEMα培地が入った15mL遠沈管に加え、遠心(500×g3分、室温)を行った。上清をアスピレートし、ペレットをタッピングし、MEMα培地を2mL添加し、の細胞培養用φ100mmディッシュ(AGCテクノグラス製、3020-100)に、細胞を播種した。
37℃、5%CO2インキュベーターにて3日培養した。培養3日後、1mLのトリプシンEDTA溶液を加え、37℃、5%CO2インキュベーターで3分間静置し、細胞を細胞培養用ディッシュから剥離させ、細胞を回収した。2継代目の細胞(パッセージ数:4)をヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞(以下、P-hATMSC細胞とも呼ぶ)として以下の実験で使用した。
細胞凍結保存液1~22 1mLを、上記で得られたP-hATMSC細胞の総数が1×106の細胞に添加し、数回ピペッティングした後に、クライオチューブに移した。そして、適量の2-プロパノールを入れたMr.Frostyに、クライオチューブを入れ、蓋を閉め、―80℃に設定した冷凍庫で水平に12時間保管した後に、―152℃に設定した冷蔵庫で水平に3日保管した。
上記で得られたP-hATMSC細胞を培養シャーレ上で培養後、トリプシン処理により剥離、回収した。その後、96wellU底プレート(住友ベークライト(株)製、PrimeSurface(登録商標)、MS-9096U)に1000個細胞/ウェルの細胞数で播種し、浮遊培養することでスフェロイド形成を誘導した。培養3日後に直径約200μmのスフェロイドを得た。
上記のように作成したスフェロイド50個をマイクロピペッターにて培養液中から回収し、遠心分離(500×g、3分、室温)をかけた後、上清をアスピレートし、ペレットをタッピングした。ペレットに細胞凍結保存液(S―1~17)を添加し、スフェロイドを細胞凍結保存液中で数回ピペッティングした後に、クライオチューブに移し、蓋を閉め、―80℃に設定した冷凍庫で水平に12時間保管した。12時間後、―152℃に設定した冷蔵庫で水平に3日保管した。
クライオチューブを37℃温水浴にて振盪し、細胞を解凍した。
解凍した細胞懸濁液を100μL分注し、100μLの0.5%のトリパンブルー染色液をピペットで注いた。数回のピペット操作により混合した後、トリパンブルー染色細胞懸濁液を血球計算盤に乗せ、16の小さな四角を含む各1mm×1mmの4つの大きな四角内で、青色に染色された死細胞と、染色されない生細胞の数を計数した。
細胞の生存率%を下記の式にて算出した。
(生存率%)=(非染色細胞の数)/(非染色細胞と青色に染色された細胞との総数)
◎:生存率%≧90%(特に良好)
〇:90%>生存率%≧75%(良好)
△:75%>生存率%≧60%(可)
×:60%>生存率%(不良)
評価結果を表9に示す。
10%のウシ胎児血清と、1%のペニシリンーストレプトマイシンーアンホテリシンB(共にBiologicalIndustries社製)とを添加したDMEM(以下:(DMEM+10%FBS+1%PS)培地)を15mL遠心管に9mL分注し、洗浄用培地とした。解凍した細胞を洗浄用培地へ加え、遠心分離(500×g3分、室温)を行った。上清をアスピレートし、ペレットをタッピングし、(DMEM+10%FBS+1%PS)培地を2mL添加し、AGCテクノグラス製のφ35mmIWAKI接着処理ディッシュに細胞を播種した。播種する前に100μL分注し、細胞数を血球計算盤で計測した。37℃、5%CO2にて、インキュベーターで3日培養した。培養3日後、0.5mLのトリプシンEDTA溶液を加え、37℃、5%CO2インキュベーターで3分間静置し、残りの細胞を接着処理から剥離した。剥離した細胞の数は血球計算盤で計測した。細胞増殖率を、(培養3日後細胞の数)/(播種した細胞の数)×100%によって計算した。評価結果を表9に示す。
<評価基準>
◎:増殖率%≧200%(特に良好)
〇:200%>増殖率%≧150%(良好)
△:150%>増殖率%≧105%(可)
×:105%>増殖率%(不良)
増殖性評価で使用した培養の3日後の細胞に、TRIzol試薬(InvitrogenCorporation,Carlsbad,CA.USA)で培養物から全RNAを抽出し、製造業者のプロトコルに従ってPrimeScriptTMRTMasterMix(PerfectRealTime)(Takara、Cat#RR036A)でcDNAを合成した。qRT-PCRは、ThermalCyclerDiceRealTimeSystem(TakaraTP900)を用いて、TBGreenPremixExTaqII(Takara、RR820A)を用いて3回行った。
qRT-PCRの容量は25μLであり、1μL(μg)cDNA、12.5μLTBGreenPremixExTaqII(Takara、RR820A)、それぞれ1μLの特異的フォワード及びリバースプライマー、並びに9.5μL滅菌水を含有する。
データは、ΔΔCt比定量により解析した。データをGAPDHレベルに対して標準化し、対象値と比較した。
SSEA1(Fut4としても知られる)
フォワードプライマー:GCAGGGCCCAAGATTAACTGAC(配列番号1)
リバースプライマー:AAGCGCCTGGGCCTAAGAA(配列番号2)
Sox2
フォワードプライマー:GTTCTAGTGGTACGTTAGGCGCTTC(配列番号3)
リバースプライマー:TCGCCCGGAGTCTAGCTCTAAATA(配列番号4)
Nanog
フォワードプライマー:TGCCTCACACGGAGACTGTC(配列番号5)
リバースプライマー:AGTGGGTTGTTTGCCTTTGG(配列番号6)
Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase(Gapdh)(内部陽性対照として)
データは、一元配置分散分析(One-wayanalysisofvariance)(ANOVA)により分析した。有意なF比の場合、Tukeyの事後試験を行った.有意水準P<0.05とし、他に示さない限り平均±標準偏差として示した。すべてのデータは、特に示さない限り少なくとも3回独立した実験から得た。
[SSEA1、Sox2、Nanog]
◎:2≦遺伝子発現量;遺伝子発現量がかなり高い。
〇:1.5≦遺伝子発現量<2;遺伝子発現量が高い。
△:1≦遺伝子発現量<1.5;遺伝子発現量がやや高い。
×:遺伝子発現量<1;遺伝子発現量が低い。
解凍したスフェロイドを洗浄用培地へ加え、遠心分離(500×g3分、室温)を行った。上清をアスピレートし、PBSを2ml添加し、培地洗浄した後、上清を更にアスピレートし、Accumax(イノベーティブセルテクノロジーズ製)を2mL添加し、ペレットをタッピングした後に、20分間静置し、単一浮遊細胞を得た。洗浄用培地へ加え、遠心分離(500xg3分、室温)を行い、上清をアスピレートで除去した。PBSを2mL添加した後、100μL分注し、100μLの0.5%のトリパンブルー染色液にピペットで注いた。数回のピペット操作により混合した後、トリパンブルー染色細胞懸濁液を血球計算盤に乗せ、青色に染色された死細胞と、染色されない生細胞の数を計数した。
細胞の生存率%を下記の式にて算出した。
(生存率%)=(非染色細胞の数)/(非染色細胞と青色に染色された細胞との総数)
◎:生存率%≧50%(特に良好)
○:50%>生存率%≧40%(良好)
△:40%>生存率%≧20%(可)
×:20%>生存率%(不良)
評価結果を表9に示す。
細胞凍結保存液1~22を使用し、スフェロイド(細胞凝集体)の凍結実験の保存全ての培養物を0.25%Trysin-EDTAで37℃3分間解離させた後に、MEMα培地で2回洗浄し、300gで5分間4℃遠心分離した後、スフェロイド及び単細胞を回収した。
MEMα中に、播種初期の細胞数を、5×104細胞/ウェルになるように調整し、TPP社製培養用平底24平面ウェル(ポリスチレン製、培養表面は接着処理有)に播種した。培養後6日目にスフェロイド縁部の接着、伸展状態を観察し、細胞のコンフルエント状態を評価した。
・再播種におけるスフェロイドの細胞増殖性の評価基準
◎:視野にスフェロイドが観察されず、細胞の接着、伸展が観察され、細胞がコンフルエントとなっている。細胞の増殖性が優れている。
〇:視野にスフェロイドが観察されず、細胞の接着、伸展が観察されるが、細胞がコンフルエントとなっていない。細胞の増殖性が良好である。
△:視野に直径が200μm以下(200μmを含む)のスフェロイドが1つ以上、培養面に残留していることが観察される。細胞の増殖性がやや良好となっている。
×:視野に直径が200μm以上のスフェロイドが1つ以上、培養面に残留していることが観察される。細胞の増殖性が不良となる。
増殖性評価で使用した培養の3日後の細胞に、TRIzol試薬(InvitrogenCorporation,Carlsbad,CA.USA)で培養物から全RNAを抽出し、製造業者のプロトコルに従ってPrimeScriptTMRTMasterMix(PerfectRealTime)(Takara、Cat#RR036A)でcDNAを合成した。qRT-PCRは、ThermalCyclerDiceRealTimeSystem(TakaraTP900)を用いて、TBGreenPremixExTaqII(Takara、RR820A)を用いて3回行った。
qRT-PCRの容量は25μLであり、1μL(μg)cDNA、12.5μLTBGreenPremixExTaqII(Takara、RR820A)、それぞれ1μLの特異的フォワード及びリバースプライマー、並びに9.5μL滅菌水を含有する。
データは、ΔΔCt比定量により解析した。データをGAPDHレベルに対して標準化し、対象値と比較した。
SSEA1(Fut4としても知られる)
フォワードプライマー:GCAGGGCCCAAGATTAACTGAC(配列番号1)
リバースプライマー:AAGCGCCTGGGCCTAAGAA(配列番号2)
Sox2
フォワードプライマー:GTTCTAGTGGTACGTTAGGCGCTTC(配列番号3)
リバースプライマー:TCGCCCGGAGTCTAGCTCTAAATA(配列番号4)
Nanog
フォワードプライマー:TGCCTCACACGGAGACTGTC(配列番号5)
リバースプライマー:AGTGGGTTGTTTGCCTTTGG(配列番号6)
Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase(Gapdh)(内部陽性対照として)
データは、一元配置分散分析(One-wayanalysisofvariance)(ANOVA)により分析した。有意なF比の場合、Tukeyの事後試験を行った.有意水準P<0.05とし、他に示さない限り平均±標準偏差として示した。すべてのデータは、特に示さない限り少なくとも3回独立した実験から得た。
[SSEA1、Sox2、Nanog]
◎:2≦遺伝子発現量;遺伝子発現量がかなり高い。
〇:1.5≦遺伝子発現量<2;遺伝子発現量が高い。
△:1≦遺伝子発現量<1.5;遺伝子発現量がやや高い。
×:遺伝子発現量<1;遺伝子発現量が低い。
また、細胞凍結保護剤中の不凍水の存在により、細胞膜外での安定な水和状態を維持し、低分子溶剤による膜内へ浸透速度の制御は可能となり、スフェロイドの凍結の過程において、スフェロイド内部と周辺部で凍結に時間差を緩和することで、解凍後のスフェロイドの生存率を確保したためであると考えられる。
それに対して、比較例4-1~4-6はアミノ酸系共重合体を含まない細胞凍結保存液であり、スフェロイドの凍結保存ができなかったと考えられる。
Claims (23)
- タンパク質用又は細胞用の添加剤であって、アミノ酸残基含有構造単位を有するアミノ酸系重合体(A)を含む、添加剤。
- アミノ酸系重合体(A)の質量平均分子量が2,000以上である、請求項1記載の添加剤。
- アミノ酸系重合体(A)の濃度が20.0w/v%である水溶液において測定した不凍水の量が、前記重合体(A)1gあたり200mg以上である、請求項1または2に記載の添加剤。
- アミノ酸系重合体(A)が、アミノ酸系重合体(A)を構成する構造単位の合計100質量%に対して、一般式(1)~(3)で示される少なくともいずれかの構造単位を30~100質量%含む、請求項1または2に記載の添加剤。
- タンパク質安定化剤またはブロッキング剤である、請求項1または2に記載の添加剤。
- アミノ酸系重合体(A)の濃度が、0.01~30.0w/v%である、請求項6に記載の添加剤。
- 請求項6に記載の添加剤と、タンパク質とを共存させる、タンパク質の安定化方法。
- 抗原または抗体を含む担体に請求項6に記載の添加剤を処理する工程を含む、免疫測定方法。
- 担体がラテックス粒子である、請求項9に記載の免疫測定方法。
- 請求項6に記載の添加剤で一部または全部が被覆された、標的物質に対する抗原または抗体を含む担体。
- 請求項11に記載の担体を備えた、免疫測定のためのキット。
- 請求項1または2に記載の添加剤を含む、細胞用培地。
- アミノ酸系重合体(A)の培地中の濃度が0.001~1質量%である、請求項13に記載の細胞用培地。
- 請求項13に記載の細胞用培地中で細胞を培養する、スフェロイドまたは生理活性物質の製造方法。
- 細胞凍結保護剤である、請求項1または2に記載の添加剤。
- 請求項16に記載の添加剤を含む、細胞凍結保存液。
- さらに低分子溶剤を含み、浸透圧は500~2,500mOsm/kgである、請求項17に記載の細胞凍結保存液。
- アミノ酸系重合体(A)の濃度は、0.1~30.0w/v%である、請求項17に記載の細胞凍結保存液。
- 低分子溶剤がジメチルスルホキシド、プロピレングリコール、エチレングリコールおよびグリセリンからなる群より選択された少なくとも一種であり、低分子溶剤の含有量が5.0w/v%以下である、請求項18に記載の細胞凍結保存液。
- 請求項17に記載の細胞凍結保存液と細胞とを混合する工程と、細胞凍結保存液と細胞との混合物を凍結する工程と、を含む、細胞の凍結方法。
- 請求項17に記載の細胞凍結保存液を用いて凍結された、スフェロイド。
- 請求項17に記載の細胞凍結保存液を用いて凍結された、オルガノイド。
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