JP2023036319A - 難消化性オリゴ糖の製造方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】消費者の心理的障害となる、熱処理や酵素処理などの人為的なグルコシド結合の形成過程を介さずに、穀物等原料そのものに由来する機能性(又は難消化性)オリゴ糖の調製方法を提供すること。【解決手段】糖質原料を糊化することにより糊化澱粉を調製する工程と、前記糊化澱粉に酵素を添加して加水分解することにより加水分解物を調製する工程と、前記加水分解物を遠心分離して上澄み液を得る工程と、を有する難消化性オリゴ糖の製造方法により解決する。【選択図】図1
Description
特許法第30条第2項適用申請有り ▲1▼ 集会の開催日 2020年9月10日 ▲2▼ 集会名、開催場所 2020年度(第69回)日本応用糖質科学会 応用糖質科学シンポジウム オンライン開催(https://confit.atlas.jp/guide/event/jsag2020/static/online)
特許法第30条第2項適用申請有り ▲1▼ 集会の開催日 2021年3月20日 ▲2▼ 集会名、開催場所 日本農芸化学会2021年度大会 オンライン開催(https://www.jsbba.or.jp/2021/)
特許法第30条第2項適用申請有り ▲1▼ ウェブサイトの掲載日 2020年9月3日 ▲2▼ ウェブサイトのアドレス https://confit.atlas.jp/guide/event/jsag2020/notifications
特許法第30条第2項適用申請有り ▲1▼ ウェブサイトの掲載日 2021年3月5日 ▲2▼ ウェブサイトのアドレス https://www.jsbba.or.jp/MeetingofJSBBA/2021/MeetingofJSBBA2021.pdf
本発明は、糖質原料から難消化性オリゴ糖を製造する難消化性オリゴ糖の製造方法に関する。
オリゴ糖とは重合度2から20程度の単糖の重合物であり、その構成糖や結合様式の違いから多様なオリゴ糖が存在する。
近年、オリゴ糖は様々な生物活性を示すことが明らかとなっており、注目されている。特に各種加水分解酵素による消化性が低いことを特徴とする難消化性のオリゴ糖は、食生活の欧米化により問題となっている食物繊維の摂取量の減少の課題を解決する方法として注目されている。また、オリゴ糖は、健康維持と疾病予防に対して有効であるとされており、プレバイオティクスと言われる腸内微生物叢の改善効果や、低う蝕性の甘味料として利用されるほか、パンの品質維持への利用など、幅広く種々の飲食物に利用されている。
これら難消化性オリゴ糖の製造は、澱粉を原料とした焙焼法や酵素法で製造されている。焙焼法は澱粉を一定の酸を含む条件で高熱処理することで、加水分解と重合を生じさせることで、複雑な分岐を形成させる方法であり、難消化性の糖が生成される。
焙焼法で得たオリゴ糖は刺激臭があり、味覚上も好ましくない。しかし、それらをα-アミラーゼ処理、グルコアミラーゼ処理、トランスグルコシダーゼ処理、水素添加処理、イオン交換趣旨による脱塩やクロマト分離を行うことで除去することによる難消化性オリゴ糖の製造法がある(特許平2-145169号公報、特開平2-154664号公報)。
一方で、酵素作用によりあらたなグルコシド結合を形成させることで、難消化性オリゴ糖をつくる方法も知られる。例えば、グルカノトランスフェラーゼを用いることで(α1→4)と(α1→6)のグルコシド結合を含むグルコオリゴ糖の混合物を製造する方法(特表2012-525840号公報)、耐熱性の糖転移酵素を用いることで(α1→2)(α1→3)結合を含むオリゴ糖を合成する方法(特開2011-177118号公報)などが知られる。
その他、キシラン分解により得られるキシロオリゴ糖や、寒天を分解して得られるアガロオリゴ糖なども難消化性オリゴ糖として製造されているが、原料の入手が限られたり、分解に、用いる酵素が特殊で高価であったりすることが課題である。
一方、穀類やイモ類から得られる澱粉は、夾雑物が少なく、異味、異臭、着色性がほとんど無く、しかも安価である。ただし、これら澱粉は消化性が良く、これらを原料とした難消化性オリゴ糖組成物を製造する方法はない。
広い分野に使用されているオリゴ糖であるが、口に入れるものである場合、特に消費者は天然物である方が心理的な障害が少なく、受け入れられやすい傾向がある。そのため、新たなグリコシド結合を形成させることで製造される難消化性オリゴ糖よりは、天然物に含まれるグリコシド結合を利用し、それを含むオリゴ糖を抽出する製造方法がより好ましい。
また、現在の製造方法の一部には、原料の入手が困難であるなどの課題のほか、分岐形成に必要な酵素が高価な場合や入手困難である場合がある。
そこで、本発明は、消費者の心理的障害となる、熱処理や酵素処理などの人為的なグルコシド結合の形成過程を介さずに、穀物等原料そのものに由来する機能性(又は難消化性)オリゴ糖の製造方法を提供することを目的とする。
本発明者らは清酒中のオリゴ糖が特徴的な構造のオリゴ糖であることから清酒オリゴ糖として研究を行ってきた(Journal of Bioscience and Bioengineering 124(2)171-177)。重合度6~8のオリゴ糖の構造解析から、これらオリゴ糖の一部には、α-1,4結合の主鎖の非還元末端領域に隣接した2つのα-1,6結合の分岐が存在することを見出した。その1つであるDP6-1の立体構造式を図1に示す。DP6-1は、イソマルトオリゴ糖やマルトオリゴ糖と比較して、グルコアミラーゼによる消化性が著しく低いことを発見した(Carbohydrate Polymers Volume 251, 1 January 2021, 116993)。
このようなパターンの分岐構造を澱粉中から見出されていないことから、糖転移などの影響をしらべたものの、糖転移による生成ではなく、澱粉に含まれる隣接した分岐構造が米澱粉中に存在することを見出した。本分岐を非還元末端にもつ清酒オリゴ糖DP6-1は、難消化性であることから、焙炒や酵素による糖転移を介さずに、澱粉に本来含まれる分岐構造を抽出することで、難消化性のオリゴ糖を製造できると考えるに至った。さらに、幅広い穀物の澱粉に当該の分岐構造が含まれることを見出したことから、澱粉を含む様々な穀類から、難消化性のオリゴ糖を調製できる点にもメリットがあると考え、本発明を完成した。
本発明はかかる知見に基づきなされたものであり、糖質原料を糊化することにより糊化澱粉を調製する工程と、前記糊化澱粉に酵素を添加して加水分解することにより加水分解物を調製する工程と、前記加水分解物を遠心分離して上澄み液を得る工程と、を有する難消化性オリゴ糖の製造方法を提供するものである。
本発明によれば、食習慣のある糖質原料を用いて、安全な難消化性オリゴ糖を低コストで製造することができる。
1.米のα-アミラーゼ消化およびグルコアミラーゼ消化
山田錦(精米歩合70%)20gをミキサーでよく粉砕後、20mM酢酸緩衝液 (pH5.0)400mLに懸濁した。沸騰浴中で30分間処理した後、30分間オートクレーブ処理し、糊化状態にした。豚すい臓α-アミラーゼ(Sigma Aldrich社製)1,000Uを添加し、24時間、55℃で消化後、グルコアミラーゼ(Rhizopus由来、東洋紡株式会社)40Uを添加し、24時間、40℃で消化した。沸騰浴中に10分間保つことで酵素を失活させた後、4℃、10分間、14,000rpmで遠心処理後、孔径0.45μmのメンブレンフィルターに通し試料とした。
山田錦(精米歩合70%)20gをミキサーでよく粉砕後、20mM酢酸緩衝液 (pH5.0)400mLに懸濁した。沸騰浴中で30分間処理した後、30分間オートクレーブ処理し、糊化状態にした。豚すい臓α-アミラーゼ(Sigma Aldrich社製)1,000Uを添加し、24時間、55℃で消化後、グルコアミラーゼ(Rhizopus由来、東洋紡株式会社)40Uを添加し、24時間、40℃で消化した。沸騰浴中に10分間保つことで酵素を失活させた後、4℃、10分間、14,000rpmで遠心処理後、孔径0.45μmのメンブレンフィルターに通し試料とした。
2.米澱粉由来オリゴ糖の精製
酵素消化試料にクロマトグラフ用活性炭32gを加えてよく撹拌し、ブフナー漏斗を用いてろ紙(No.2、ADVANTEC)でろ過した後、Milli-Q水2Lを加えて再度ろ過した。次に、50%エタノール400mLを加えて溶出し、回収液をエバポレーターで2mLに濃縮後、Shodex HILICpak VN-50 10Eカラム(10.0mm×250mm、粒径5μm、昭和電工株式会社)を用い、移動相70%アセトニトリル、流速3.0mL/minのアイソクラティック溶出を40℃で行った。試料導入量は50μLとし、フラクションコレクター(ADVANTEC CHF-122SC)により分取した。
酵素消化試料にクロマトグラフ用活性炭32gを加えてよく撹拌し、ブフナー漏斗を用いてろ紙(No.2、ADVANTEC)でろ過した後、Milli-Q水2Lを加えて再度ろ過した。次に、50%エタノール400mLを加えて溶出し、回収液をエバポレーターで2mLに濃縮後、Shodex HILICpak VN-50 10Eカラム(10.0mm×250mm、粒径5μm、昭和電工株式会社)を用い、移動相70%アセトニトリル、流速3.0mL/minのアイソクラティック溶出を40℃で行った。試料導入量は50μLとし、フラクションコレクター(ADVANTEC CHF-122SC)により分取した。
3.分析
(1)LC-TOF/MS分析
LC-TOF/MS分析には、アセトニトリルと等量混合したのち、0.45μm孔のシリンジフィルターで処理した試料を用いた。
(1)LC-TOF/MS分析
LC-TOF/MS分析には、アセトニトリルと等量混合したのち、0.45μm孔のシリンジフィルターで処理した試料を用いた。
HPLCにはACQUITY UPLC H-Class(Waters Corporation、MA、USA) を用いた。カラムにはShodex HILICpak VN-50 4D(4.6mm×150mm、粒径5μm、昭和電工株式会社) を用い、70%アセトニトリルのアイソクラティック溶出を流速0.3mL/minで行った。カラム温度は40℃とした。ポストカラムで15mM塩化リチウムを含む75%アセトニトリルを、流速1μL/minで混合しESIに導入した。Desolvation temperatures 280℃、desolvation gas flows 800L/h、capillary voltage 1.1kVとし、検出質量範囲をm/z=50-3,200とした。
TOF/MSにはXevoG2-XS Q-TOF(Waters Corporation)を用いた。イオン化はESIによるポジティブモードを選択し、desolvation temperatures 600℃、desolvation gas flows 1,200L/h、capillary voltageは3.0kVとした。LC/MSの操作とデータ解析にはWaters MassLynx V4.1を用い、scan timeは1secとし、検出質量範囲をm/z=50-700とした。EICの作成の際のm/zは誤差範囲を±0.05Daとした。
(2)NMR解析
試料を重水(99.8%)数mLに溶解後、エバポレーターにより乾固させた。再度、この操作を行うことで、水酸基の水素を重水素に置換した。この試料を重水650μLに溶解し、NMR管(4.22mm×180mm、株式会社シゲミ)に注入した。JEOL ECZ 600R(日本電子株式会社)を用いて1H-NMRスペクトルを測定した。内部標準物質としてアセトン(δH:2.23ppm、δc:30.5ppm)を用いた。
試料を重水(99.8%)数mLに溶解後、エバポレーターにより乾固させた。再度、この操作を行うことで、水酸基の水素を重水素に置換した。この試料を重水650μLに溶解し、NMR管(4.22mm×180mm、株式会社シゲミ)に注入した。JEOL ECZ 600R(日本電子株式会社)を用いて1H-NMRスペクトルを測定した。内部標準物質としてアセトン(δH:2.23ppm、δc:30.5ppm)を用いた。
4.結果
山田錦より精製したオリゴ糖をLC-TOF/MSで分析したところ、清酒オリゴ糖DP6-1と溶出時間が一致する明瞭なピークが検出された(図2)。このピークの化合物をカラム精製し、NMR解析したところ、清酒オリゴ糖DP6-1と一致する1H-NMRスペクトラムが検出された(図3)。このことから、本化合物が清酒オリゴ糖DP6-1と同一の構造のオリゴ糖(図1)であることが示された。
山田錦より精製したオリゴ糖をLC-TOF/MSで分析したところ、清酒オリゴ糖DP6-1と溶出時間が一致する明瞭なピークが検出された(図2)。このピークの化合物をカラム精製し、NMR解析したところ、清酒オリゴ糖DP6-1と一致する1H-NMRスペクトラムが検出された(図3)。このことから、本化合物が清酒オリゴ糖DP6-1と同一の構造のオリゴ糖(図1)であることが示された。
1.様々な穀類由来澱粉からの隣接した分岐を含むオリゴ糖の抽出
試料として、試薬として市販されている、とうもろこし由来澱粉(富士フィルム和光純薬株式会社)、小麦由来澱粉(富士フィルム和光純薬株式会社)、ばれいしょ由来澱粉(富士フィルム和光純薬株式会社)、米由来澱粉(Sigma-Aldrich)を用いた。その他、タイ米(タイ国産)、α化米(飯田商事株式会社)、インディカ米としてタイ米(タイ国産)を粉砕したもの、及び、ジャポニカ米としてうるち米を粉砕した上新粉(新潟県産)、もち米粉(佐賀県産)を用いた。
試料として、試薬として市販されている、とうもろこし由来澱粉(富士フィルム和光純薬株式会社)、小麦由来澱粉(富士フィルム和光純薬株式会社)、ばれいしょ由来澱粉(富士フィルム和光純薬株式会社)、米由来澱粉(Sigma-Aldrich)を用いた。その他、タイ米(タイ国産)、α化米(飯田商事株式会社)、インディカ米としてタイ米(タイ国産)を粉砕したもの、及び、ジャポニカ米としてうるち米を粉砕した上新粉(新潟県産)、もち米粉(佐賀県産)を用いた。
試料0.5gを20mlの20mM酢酸緩衝液(pH5.0)に懸濁し、30分間沸騰水中で処理した後、120℃30分間オートクレーブにより処理し、直ちに40℃の湯浴につけることで糊化澱粉を調製した。
糊化澱粉試料を5Uの豚すい臓α-アミラーゼ(Sigma Aldrich社製)及び40Uのグルコアミラーゼ(Rhizopus由来、東洋紡株式会社)により、40℃、24時間酵素処理し、その後沸騰水中で10分間処理することで酵素反応を停止させた。その後、室温で15,000rpmで遠心処理し、上澄みを試料とした。
2.分析
(1)LC-TOF/MS分析
LC-TOF/MS分析には、アセトニトリルと等量混合したのち、0.45μm孔のシリンジフィルターで処理したものを用いた。
(1)LC-TOF/MS分析
LC-TOF/MS分析には、アセトニトリルと等量混合したのち、0.45μm孔のシリンジフィルターで処理したものを用いた。
HPLCにはACQUITY UPLC H-Class(Waters Corporation、MA、USA)を用いた。カラムにはShodex HILICpak VN-50 4D(4.6mm×150mm、粒径5μm、昭和電工株式会社)を用い、70%アセトニトリルのアイソクラティック溶出を流速0.3mL/minで行った。カラム温度は40℃とした。ポストカラムで15mM塩化リチウムを含む75%アセトニトリルを、流速1μL/minで混合しESIに導入した。Desolvation temperatures 280℃、desolvation gas flows 800L/h、capillary voltage 1.1kVとし、検出質量範囲をm/z=50-3,200とした。
TOF/MSにはXevoG2-XS Q-TOF(Waters Corporation)を用いた。イオン化はESIによるポジティブモードを選択し、desolvation temperatures 600℃、desolvation gas flows 1,200L/h、capillary voltageは3.0kVとした。LC/MSの操作とデータ解析にはWaters MassLynx V4.1を用い、scan timeは1secとし、検出質量範囲をm/z=50-700とした。EICの作成の際のm/zは誤差範囲を±0.05Daとした。
隣接した分岐を持つオリゴ糖である清酒オリゴ糖DP6-1との溶出時間の一致を確認するために、LC-TOF/MSの分析の際は、試料の前後に、DP6-1を含む清酒試料を分析した。
3.結果
マスクロマトグラムの比較(図4)より、とうもろこし由来澱粉とタイ米の試料において、清酒オリゴ糖DP6-1と溶出時間が異なるピークが検出されたことから、これら試料からは隣接した分岐を持つDP6-1を抽出できなかったが、それ以外の穀類等の試料からは、DP6-1と一致する溶出時間のピークが検出された。したがって、米のみならず、小麦、ばれいしょといった穀類中にも隣接した分岐が存在し、その酵素分解物からは、その隣接した分岐を含む、難消化性のオリゴ糖が抽出できることが示された。
マスクロマトグラムの比較(図4)より、とうもろこし由来澱粉とタイ米の試料において、清酒オリゴ糖DP6-1と溶出時間が異なるピークが検出されたことから、これら試料からは隣接した分岐を持つDP6-1を抽出できなかったが、それ以外の穀類等の試料からは、DP6-1と一致する溶出時間のピークが検出された。したがって、米のみならず、小麦、ばれいしょといった穀類中にも隣接した分岐が存在し、その酵素分解物からは、その隣接した分岐を含む、難消化性のオリゴ糖が抽出できることが示された。
Claims (7)
- 糖質原料を糊化することにより糊化澱粉を調製する工程と、
前記糊化澱粉に酵素を添加して加水分解することにより加水分解物を調製する工程と、
前記加水分解物を遠心分離して上澄み液を得る工程と、
を有する難消化性オリゴ糖の製造方法。 - 前記糖質原料が、澱粉である、請求項1記載の難消化性オリゴ糖の製造方法。
- 前記糖質原料が、穀類、芋類、それらの加工品や加工品の副産物からなる群から選択された少なくとも1種である、請求項1又は2に記載の難消化性オリゴ糖の製造方法。
- 前記酵素が、αーアミラーゼ及び/又はグルコアミラーゼである、請求項1~3のいずれか1項に記載の難消化性オリゴ糖の製造方法。
- 前記酵素が、糸状菌由来の酵素である、請求項1~4のいずれか1項に記載の難消化性オリゴ糖の製造方法。
- 前記酵素が、アスペルギルスオリゼ、アスペルギルスルーチュエンシス、リゾプスオリゼからなる群から選択された少なくとも1種を由来とする、請求項1~5のいずれか1項に記載の難消化性オリゴ糖の製造方法。
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JP2021143307A JP2023036319A (ja) | 2021-09-02 | 2021-09-02 | 難消化性オリゴ糖の製造方法 |
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