JP2023025120A - スフェロイドを用いた細胞システムならびにそれらの製造方法及び使用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、NIH STTRの補助金第R42-TR001270号に基づく政府の支援を受けてなされた。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
本出願は米国を指定国とする国際出願であり、米国特許法第120条に基づき出願され、2017年12月4日出願の米国仮出願第62/594,525号の優先権を主張し、該仮出願は参照によりその全体が本明細書に援用される。
(i)ヒドロゲルを備える細胞培養容器と、
(ii)1種以上の神経細胞及び/または単離された組織外植片を含む1個以上のスフェロイドと、
(iii)電流発生器を備える増幅器と、
(iv)電圧計及び/または電流計と、
(v)少なくとも第1の刺激用電極及び少なくとも第1の記録用電極と
を備えるシステムであって、
上記増幅器と、電圧計及び/または電流計と、電極とが、電流が上記増幅器から上記少なくとも1つの刺激用電極に供給され、電流が上記記録用電極で受け取られ、上記電圧計及び/または電流計に供給される回路を介して、互いに電気的に接続されており、
上記細胞培養容器全体にわたって電場が確立されるように、上記刺激用電極が、上記神経細胞及び/または単離された組織外植片の1個以上の細胞体にあるいはそれに近接して配置され、上記記録用電極が、上記細胞体に対して遠位の所定の距離に配置される上記システムにも関する。いくつかの実施形態において、上記スフェロイドは本明細書に記載のいずれかのスフェロイドである。
上記固体基材の上記中空の内部は、上記固体基材の外部の点から少なくとも1つの開口部を通してアクセス可能であり、
上記中空の内部部分は、上記開口部に近接する第1の部分と、上記開口部の遠位の少なくとも第2の部分とを備え、
上記1種以上の神経細胞及び/または上記1種以上の組織外植片は、上記中空の内部の上記第1の部分にまたはそれに近接して配置され、上記ヒドロゲルマトリクスと物理的に接触しており、
上記少なくとも1つの中空の内部の上記第2の部分は、軸索が、上記1種以上の神経細胞及び/または上記1種以上の組織外植片から上記中空の内部の上記第2の内部部分中へと成長できるように、上記第1の部分と流体連通している。
上記第2の領域は、上記第1の領域に隣接し、且つ第1の領域と流体連通する、その側部に開口部を有する、第2の領域の内壁の形状に形成された空間を備える。いくつかの実施形態において、上記組成物は少なくとも1%のポリエチレングリコール(PEG)を含む。
(i)1種以上の神経細胞、及び/または
(ii)1種以上のシュワン細胞または乏突起膠細胞
を含む第1のスフェロイドと、
(i)1種以上の末梢ニューロン
を含む第2のスフェロイドと
を備え、各スフェロイドは上記空洞中に配置されている。いくつかの実施形態において、上記システムは、第1、第2、及び第3の空洞であって、それぞれがスフェロイド及び少なくとも50マイクロリットルの細胞培養培地を保持するように構成された上記空洞を備え、上記第1の空洞が上記第2の空洞の近位に且つ上記第3の空洞の遠位に配置されるように、上記空洞が整列している。いくつかの実施形態において、上記システムは、少なくとも第4の空洞を備え、各空洞が正方形の角を画定するようなパターンで空洞が配置される。いくつかの実施形態において、上記空洞は、上記第1の空洞中の上記第1のスフェロイドから生じた軸索が上記第2の空洞まで伸長し、上記第2の空洞中の上記スフェロイドからの軸索が上記第3の空洞中の軸索まで伸長するように一列に整列している。
(a)1種以上の神経細胞を、上記固体基材であって、少なくとも1つの外表面、少なくとも1つの内表面、及び上記少なくとも1つの内表面によって画成され、且つ少なくとも1つの開口部を通して上記固体基材の外部の点からアクセス可能な少なくとも1つの内部チャンバを備える上記固体基材に接触させることと、
(b)神経細胞を含む1個以上のスフェロイドを、上記少なくとも1つの内部チャンバに配置することと、
(c)細胞培地を、上記少なくとも1個のスフェロイドを覆うのに十分な量の細胞培地によって上記培養容器中に印加することと
を含み、
上記内表面の少なくとも一部は、第1の細胞が貫入不能なポリマー及び第1の細胞が貫入可能なポリマーを備える。いくつかの実施形態において、ステップ(b)は、単離された後根神経節、脊髄外植片、網膜外植片、及び皮質外植片の1種または組み合わせから選択される組織外植片を含むスフェロイドを配置することを含む。
少なくとも1つの刺激用電極を上記1種以上の神経細胞または組織外植片の細胞体にまたはそれに近接して配置することと、
少なくとも1つの記録用電極を、軸索にまたはそれに近接して、上記細胞体から最も遠位の点で配置することと
を更に含み、
上記1種以上の電気生理学的メトリクスは、電気伝導速度、活動電位、1種以上の神経細胞の膜に沿った電気インパルスの通過に伴う波の振幅、1種以上の神経細胞の膜に沿った電気インパルスの幅、1種以上の神経細胞の膜に沿った上記電気インパルスの潜時、及び1種以上の神経細胞の膜に沿った上記電気インパルスのエンベロープの1種または組み合わせである。
(a)本明細書に開示のいずれかの組成物中の1個以上のスフェロイドを培養することと、
(b)少なくとも1種の薬剤を上記1個以上のスフェロイドに曝露することと、
(c)上記1個以上のスフェロイドの1種以上の形態計測上の変化及び/もしくは1種以上の電気生理学的メトリクスを測定及び/または観測することと、
(d)上記1個以上のスフェロイドの1種以上の1種以上の形態計測上の変化及び/または1種以上の電気生理学的メトリクスを上記薬剤の毒性と相関させ、その結果、上記形態計測上の変化及び/または電気生理学的メトリクスが、細胞生存率が低下することを示す場合には、上記薬剤は有毒であると特徴付けられ、上記形態計測上の変化及び/または電気生理学的メトリクスが、細胞生存率が変化しないまたは増加することを示す場合には、上記薬剤は無毒及び/または神経保護作用があると特徴付けられることと
を含む、薬剤の毒性ならびに/あるいは神経保護作用の評価方法にも関する。
(a)少なくとも1個の軸索を成長させるのに十分な時間及び条件下、薬剤の存在下または非存在下で、本明細書に開示のいずれかの組成物中の1個以上のスフェロイドを培養することと、
(b)上記1個以上のスフェロイド由来の1個以上の軸索におけるミエリン形成の量を検出することと
を含み、
検出することが任意選択で、
(i)薬剤の存在下または非存在下において、上記1個以上のスフェロイドの1種以上の形態計測上の変化及び/もしくは1種以上の電気生理学的メトリクスを測定及び/または観測するステップと、
(ii)薬剤の存在下または非存在下における、上記1個以上のスフェロイドの1種以上の形態計測上の変化及び/もしくは1種以上の電気生理学的メトリクスを、上記スフェロイドのミエリン形成の定量的または定性的変化と相関させるステップと
を含む上記方法にも関する。
(a)1個以上のスフェロイド及び/もしくはスフェロイドから成長した軸索の数または密度を定量化することと、
(b)本明細書に開示のいずれかの組成物中の1個以上のスフェロイドを培養することと、
(c)上記スフェロイドを、上記スフェロイド中で上記1個以上の軸索を成長させるまたは細胞を成長させるのに十分な期間培養した後で、上記スフェロイド内の細胞の数及び/または上記組成物中のスフェロイドから成長した軸索の数もしくは密度を計算することと
を含む、神経細胞成長及び/または軸索変性の検出ならびに/あるいは定量化方法のも関する。いくつかの実施形態において、ステップ(b)は任意選択で、上記1個以上のスフェロイドを1種以上の薬剤と接触させることを含む。いくつかの実施形態において、ステップ(c)は任意選択で、1個以上のスフェロイドを培養した後で、かかる1個以上のスフェロイドの内部及び/もしくは外部の記録を検出することと、上記記録を既知のもしくは対照の数の細胞に対応する同様の記録の測定値と相関させることとを含む。いくつかの実施形態において、ステップ(c)は任意選択で、
(i)上記1個以上のスフェロイドを1種以上の薬剤と接触させる上記ステップの前後における細胞内及び/もしくは細胞外の記録ならびに/または形態計測上の変化を測定する更なるステップと、
(ii)上記1個以上のスフェロイドを上記1種以上の薬剤と接触させた後の、上記記録及び/もしく形態計測上の変化に対する上記1個以上のスフェロイドを上記1種以上の薬剤と接触させる前の、上記記録及び/もしく形態計測上の変化の差異を、細胞数及び/または軸索の数または密度の変化と相関させるステップと
を含む。
(a)上記薬剤の存在下及び非存在下で、本明細書に開示のいずれかの組成物中の1個以上のスフェロイドを培養することと、
(b)上記薬剤の存在下及び非存在下で、上記1個以上のスフェロイド全体にわたって電位を印加することと、
(c)上記薬剤の存在下及び非存在下で、上記1個以上のスフェロイドからの1種以上の電気生理学的メトリクスを測定することと、
(d)上記1個以上のスフェロイドによる1種以上の電気生理学的メトリクスの上記差異を上記薬剤の神経調節作用と相関させ、その結果、上記薬剤の存在下での電気生理学的メトリクスが上記薬剤の非存在下で測定された上記電気生理学的メトリクスと比較して変化することが神経調節作用を示し、上記薬剤の存在下での電気生理学的メトリクスが上記薬剤の非存在下で測定された上記電気生理学的メトリクスと比較して変化しないことが、上記薬剤が神経調節作用を与えないことを示すことと
を含む上記方法にも関する。
(a)上記薬剤の存在下及び非存在下で、本明細書に開示のいずれかの組成物中の1個以上のスフェロイドを培養することと、
(b)上記薬剤の存在下及び非存在下で、上記1個以上のスフェロイドの1種以上の形態計測上の変化を測定及び/もしくは観測することと、
(c)上記1種以上の形態計測上の変化を上記薬剤の神経調節作用と相関させ、その結果、上記薬剤の存在下での形態学的メトリクスが上記薬剤の非存在下で測定及び/もしくは観測される上記形態学的メトリクスと比較して変化することが神経調節作用を示し、上記薬剤の存在下での形態学的メトリクスが上記薬剤の非存在下で測定及び/もしくは観測される上記形態学的メトリクスと比較して変化しないことが、上記薬剤が神経調節作用を与えないことを示すことと
を含む上記方法にも関する。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
(項目1)
神経細胞、神経節、幹細胞、及び免疫細胞から選択される細胞ならびに/もしくは組織の1種または組み合わせを含む細胞のスフェロイドを含む組成物。
(項目2)
前記スフェロイドが後根神経節及び三叉神経節から選択される組織を含む、項目1記載の組成物。
(項目3)
前記スフェロイドが、グリア細胞、胚細胞、間葉系幹細胞、人工多能性幹細胞由来の細胞、交感ニューロン、副交感ニューロン、脊髄運動ニューロン、中枢神経系ニューロン、末梢神経系ニューロン、腸管神経系ニューロン、運動ニューロン、感覚ニューロン、コリン作動性ニューロン、GABA作動性ニューロン、グルタミン酸作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、セロトニン作動性ニューロン、介在ニューロン、アドレナリン作動性ニューロン、三叉神経節、星状細胞、乏突起膠細胞、シュワン細胞、ミクログリア細胞、上衣細胞、放射状グリア細胞、衛星細胞、腸管グリア細胞、下垂体細胞、及びそれらの組み合わせから選択される1種以上の細胞を含む、項目1または2に記載の組成物。
(項目4)
前記スフェロイドが、T細胞、B細胞、マクロファージ、星状細胞、及びそれらの組み合わせから選択される1種以上の免疫細胞を含む、項目1~3のいずれかに記載の組成物。
(項目5)
前記スフェロイドが、胚性幹細胞、間葉系幹細胞、人工多能性幹細胞、及びそれらの組み合わせから選択される1種以上の幹細胞を含む、項目1~4のいずれかに記載の組成物。
(項目6)
前記神経細胞が、胚性幹細胞、間葉系幹細胞、及び人工多能性幹細胞から選択される幹細胞に由来する、項目1~5のいずれかに記載の組成物。
(項目7)
前記スフェロイドの径が約200ミクロン~約700ミクロンである、項目1~6のいずれかに記載の組成物。
(項目8)
前記スフェロイドが、1種以上の神経細胞及び1種以上のシュワン細胞を、1個のシュワン細胞当り約4個の神経細胞に等しい細胞型の比で含む、項目1~7のいずれかに記載の組成物。
(項目9)
前記スフェロイドが、1種以上の神経細胞及び1種以上の星状細胞を、1個の星状細胞当り約4個の神経細胞の比で含む、項目1~8のいずれかに記載の組成物。
(項目10)
前記スフェロイドが、1種以上の神経細胞及び1種以上の星状細胞を、1個の星状細胞当り約1個の神経細胞の比で含む、項目1~9のいずれかに記載の組成物。
(項目11)
前記スフェロイドが、1種以上の神経細胞及び1種以上のシュワン細胞を、1個のシュワン細胞当り約10個の神経細胞の比で含む、項目1~10のいずれかに記載の組成物。
(項目12)
前記スフェロイドが、1種以上の神経細胞及び1種以上のグリア細胞を、1個のグリア細胞当り約4個の神経細胞に等しい比で含む、項目1~11のいずれかに記載の組成物。
(項目13)
前記細胞のいずれか1種以上が人工多能性幹細胞から分化している、項目1~12のいずれかに記載の組成物。
(項目14)
前記スフェロイドが人工多能性幹細胞及び/または免疫細胞を含まない、項目1~13のいずれかに記載の組成物。
(項目15)
前記スフェロイドが未分化幹細胞を含まない、項目1~14のいずれかに記載の組成物。
(項目16)
前記スフェロイドが、約30,000、35,000、40,000、45,000、50,000、55,000、60,000、65,000、70,000、75,000、80,000、90,000、100,000、150,000、200,000、225,000、または250,000個以上の細胞を含む、項目1~15のいずれかに記載の組成物。
(項目17)
前記スフェロイドが75,000個以上の細胞を含む、項目1~16のいずれかに記載の組成物。
(項目18)
前記スフェロイドが1種以上の磁性粒子を更に含む、項目1~17のいずれかに記載の組成物。
(項目19)
(i)ヒドロゲルを備える細胞培養容器と、
(ii)1種以上の神経細胞及び/または単離された組織外植片を含む1個以上のスフェロイドと、
(iii)電流発生器を備える増幅器と、
(iv)電圧計及び/または電流計と、
(v)少なくとも第1の刺激用電極及び少なくとも第1の記録用電極と
を備えるシステムであって、
前記増幅器と、電圧計及び/または電流計と、電極とが、電流が前記増幅器から前記少なくとも1つの刺激用電極に供給され、電流が前記記録用電極で受け取られ、前記電圧計及び/または電流計に供給される回路を介して、互いに電気的に接続されており、
前記細胞培養容器全体にわたって電場が確立されるように、前記刺激用電極が、前記神経細胞及び/または単離された組織外植片の1個以上の細胞体にあるいはそれに近接して配置され、前記記録用電極が、前記細胞体に対して遠位の所定の距離に配置される
前記システム。
(項目20)
前記スフェロイドが項目1~18のいずれか1項に記載のスフェロイドである、項目19に記載のシステム。
(項目21)
前記培養容器が、96、192、384個、もしくはそれを超える内部チャンバを備える、項目19または20に記載のシステム。
(項目22)
前記96、192、384個、またはそれを超える内部チャンバが、1種以上の単離されたシュワン細胞または1種以上の乏突起膠細胞が、前記1種以上の単離された組織外植片及び/または前記1種以上の神経細胞からの軸索伸長に対してミエリンを蓄積させるように、前記組織外植片及び/もしくは神経細胞に十分近接した前記シュワン細胞ならびに/または前記乏突起膠細胞を備える、項目21に記載のシステム。
(項目23)
固体基材であって、その上に前記ヒドロゲルマトリクスが架橋されている前記固体基材を更に備え、前記固体基材が、約1ミクロン~約5ミクロンの径の細孔を有する少なくとも1つのプラスチック表面を備える、項目19~22のいずれかに記載のシステム。
(項目24)
前記固体基材が連続する外表面と内表面とを備え、かかる固体基材は、円筒形または実質的に円筒形の少なくとも1つの部分と、少なくとも1つの中空の内部であって、前記中空の内部の端部において、前記内表面の少なくとも1つの部分によって画成された前記中空の内部とを備え、前記内表面は、径が約0.1ミクロン~約1.0ミクロンの1つ以上の細孔を備え、
前記固体基材の前記中空の内部は、前記固体基材の外部の点から少なくとも1つの開口部を通してアクセス可能であり、
前記中空の内部部分は、前記開口部に近接した第1の部分と、前記開口部の遠位の少なくとも第2の部分とを備え、
前記1種以上の神経細胞及び/または前記1種以上の組織外植片は、前記中空の内部の前記第1の部分にまたはそれに近接して配置され、前記ヒドロゲルマトリクスと物理的に接触しており、
前記少なくとも1つの中空の内部の前記第2の部分は、軸索が、前記1種以上の神経細胞及び/または前記1種以上の組織外植片から前記中空の内部の前記第2の内部部分中へと成長できるように、前記第1の部分と流体連通している、
項目23に記載のシステム。
(項目25)
前記組成物がスポンジを含まない、項目19~24のいずれかに記載のシステム。
(項目26)
前記ヒドロゲルが、少なくとも、第1の細胞が貫入不能なポリマー及び第1の細胞が貫入可能なポリマーを含む、項目19~25のいずれかに記載のシステム。
(項目27)
前記少なくとも1種の、細胞が貫入不能なポリマーが含むPEGが約15%以下であり、前記少なくとも1種の、細胞が貫入可能なポリマーが、約0.05%~約1.00%の、RAD 16-I、RAD 16-II、EAK 16-I、EAK16-II、及びdEAK 16から選択される自己組織化性ペプチドの1種または組み合わせを含む、項目26に記載のシステム。
(項目28)
前記組成物がポリエチレングリコール(PEG)を含まない、項目19~24のいずれかに記載のシステム。
(項目29)
前記ヒドロゲルが第1の領域及び第2の領域を備え、前記第1の領域が、円柱または直方体であって、その長手方向の軸が前記細胞培養容器の上面及び底面を貫通する方向を向いた前記円柱または直方体の形状に形成され、前記円柱または直方体のそれぞれが、前記円柱または直方体の内表面によって画成される空間を備え、前記空間及び前記細胞培養容器の上面を貫く1つ以上の開口部によりアクセス可能であり;
前記第2の領域が、前記第1の領域に隣接し、且つ第1の領域と流体連通する、その側部に開口部を有する、第2の領域の内壁の形状に形成された空間を備える、
項目19~28のいずれかに記載のシステム。
(項目30)
ミリリットル当り約5~約20ピコグラムの濃度の神経成長因子(NGF)及び/または約0.001重量/体積%~約0.01重量/体積%の範囲の濃度のアスコルビン酸を含む細胞培地を更に備える、項目19~29のいずれかに記載のシステム。
(項目31)
前記1個以上のスフェロイドが、グリア細胞、胚細胞、間葉系幹細胞、人工多能性幹細胞由来の細胞、交感ニューロン、副交感ニューロン、脊髄運動ニューロン、中枢神経系ニューロン、末梢神経系ニューロン、腸管神経系ニューロン、運動ニューロン、感覚ニューロン、コリン作動性ニューロン、GABA作動性ニューロン、グルタミン酸作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、セロトニン作動性ニューロン、介在ニューロン、アドレナリン作動性ニューロン、三叉神経節ニューロン、星状細胞、乏突起膠細胞、シュワン細胞、ミクログリア細胞、上衣細胞、放射状グリア細胞、衛星細胞、腸管グリア細胞、及び下垂体細胞から選択される細胞の少なくとも1種または組み合わせ含む、項目19~30のいずれかに記載のシステム。
(項目32)
幹細胞、多能性細胞、筋芽細胞、及び骨芽細胞の1種以上を更に備える、項目19~31のいずれかに記載のシステム。
(項目33)
前記1種以上の神経細胞が、哺乳動物の末梢神経系由来の初代哺乳動物細胞を含む、項目19~32のいずれかに記載のシステム。
(項目34)
前記ヒドロゲルが少なくとも1%のポリエチレングリコール(PEG)を含む、項目19~33のいずれかに記載のシステム。
(項目35)
前記スフェロイドが約3、30、90、または365日以上培養されている、項目19~34のいずれかに記載のシステム。
(項目36)
前記固体基材の少なくとも一部が、前記固体基材の前記内表面の少なくとも一部が、前記スフェロイドが配置されている円筒形または実質的に円筒形の中空の内部チャンバを画成するように円筒形または実質的に円筒形である、項目19~35のいずれかに記載のシステム。
(項目37)
前記1個以上のスフェロイドが、幅が約100ミクロン~約500ミクロン、長さが約0.11~約10,000ミクロンの軸索成長を有する1種以上の神経細胞を含む、項目19~36のいずれかに記載のシステム。
(項目38)
前記ヒドロゲルが、一連のチャネルによって互いに流体連通する一連の2つ以上の空洞を備え、少なくとも1つの空洞がスフェロイドを備え、少なくとも第2の空洞が第2のスフェロイド、細胞の懸濁液、またはDRGを備え、前記スフェロイド及び前記第2のスフェロイド、細胞の懸濁液、またはDRGが3次元軸索によって連結されている、項目19~37のいずれかに記載のシステム。
(項目39)
前記3次元軸索の高さが、その最低点において少なくとも約10ミクロンであるか、または少なくとも細胞単層の3層である、項目38に記載のシステム。
(項目40)
前記空洞が、前記固体基材の水平なもしくは実質的に水平な面に配置されたU字形または円形のウェルを有するウェルであり、各チャネルが1個以上のスフェロイドに連結した1個以上の軸索を備える、項目38に記載のシステム。
(項目41)
(i)1種以上の神経細胞、及び/または
(ii)1種以上のシュワン細胞または乏突起膠細胞
を含む第1のスフェロイドと、
(i)1種以上の末梢ニューロン
を含む第2のスフェロイドと
を備え、
各スフェロイドが前記空洞中に配置されている、項目40に記載のシステム。
(項目42)
第1、第2、及び第3の空洞であって、それぞれがスフェロイド及び少なくとも50マイクロリットルの細胞培養培地を保持するように構成された前記空洞を備え、
前記第1の空洞が前記第2の空洞の近位に且つ前記第3の空洞の遠位に配置されるように、前記空洞が整列している、
項目40記載のシステム。
(項目43)
少なくとも第4の空洞を備え、各空洞が正方形の角を画定するようなパターンで空洞が配置された、項目42に記載のシステム。
(項目44)
前記空洞が、前記第1の空洞中の前記第1のスフェロイドから生じた軸索が前記第2の空洞まで伸長し、前記第2の空洞中の前記スフェロイドからの軸索が前記第3の空洞中の軸索まで伸長するように一列に整列している、項目42に記載のシステム。
(項目45)
固体基材を備える培養容器中における、1個以上のスフェロイドの3次元培養物の製造方法であって、
(a)1種以上の神経細胞を、前記固体基材であって、少なくとも1つの外表面、少なくとも1つの内表面、及び前記少なくとも1つの内表面によって画成され、且つ少なくとも1つの開口部を通して前記固体基材の外部の点からアクセス可能な少なくとも1つの内部チャンバを備える前記固体基材に接触させることと、
(b)神経細胞を含む1個以上のスフェロイドを、前記少なくとも1つの内部チャンバに配置することと、
(c)細胞培地を、前記少なくとも1個のスフェロイドを覆うのに十分な量の細胞培地によって前記培養容器中に印加することと
を含み、
前記内表面の少なくとも一部が、第1の細胞が貫入不能なポリマー及び第1の細胞が貫入可能なポリマーを備える前記方法。
(項目46)
ステップ(b)が、単離された後根神経節、脊髄外植片、網膜外植片、及び皮質外植片の1種または組み合わせから選択される組織外植片を含むスフェロイドを配置することを含む、項目45に記載の方法。
(項目47)
前記スフェロイドが、任意選択で幹細胞に由来する、運動ニューロン、感覚ニューロン、交感神経ニューロン、副交感神経ニューロン、皮質ニューロン、脊髄ニューロン、末梢ニューロンの1種または組み合わせから選択される神経細胞の懸濁液として形成される、項目45または項目46に記載の方法。
(項目48)
前記スフェロイドが、単離されたシュワン細胞及び/または乏突起膠細胞を更に含む、項目45~47のいずれかに記載の方法。
(項目49)
(d)前記スフェロイドに、ステップ(c)の後に約12時間~約1年間、神経突起及び/または軸索を成長させるステップを更に含む、項目45~48のいずれかに記載の方法。
(項目50)
(i)ステップ(a)の前に試料から1種以上の神経細胞を単離するステップ、及び/または
(ii)前記1個以上のスフェロイドが後根神経節(DRG)を含む場合、ステップ(b)の前に1種以上の哺乳動物からDRGを単離するステップ、及び/または
(iii)前記1個以上のスフェロイドがシュワン細胞または乏突起膠細胞を含む場合、1種以上のシュワン細胞及び/または1種以上の乏突起膠細胞を単離するステップ
を更に含む、項目45~49のいずれかに記載の方法。
(項目51)
前記刺激用電極に電流を導入した際に、前記記録用電極が、前記記録用電極において測定することができる1種以上の電気生理学的メトリクスに対応する信号を受信できるように、
少なくとも1つの刺激用電極を前記1種以上の神経細胞または組織外植片の細胞体にまたはそれに近接して配置することと、
少なくとも1つの記録用電極を、軸索にまたはそれに近接して、前記細胞体から最も遠位の点で配置することと
を更に含み、
前記1種以上の電気生理学的メトリクスが、電気伝導速度、活動電位、1種以上の神経細胞の膜に沿った電気インパルスの通過に伴う波の振幅、1種以上の神経細胞の膜に沿った電気インパルスの幅、1種以上の神経細胞の膜に沿った前記電気インパルスの潜時、及び1種以上の神経細胞の膜に沿った前記電気インパルスのエンベロープの1種または組み合わせである、
項目45~50のいずれかに記載の方法。
(項目52)
(a)項目1~18のいずれかに記載の組成物中の1個以上のスフェロイドを培養することと、
(b)少なくとも1種の薬剤を前記1個以上のスフェロイドに曝露することと、
(c)前記1個以上のスフェロイドの1種以上の形態計測上の変化及び/もしくは1種以上の電気生理学的メトリクスを測定及び/または観測することと
を含む、薬剤の毒性ならびに/あるいは神経保護作用の評価方法。
(項目53)
1個以上のスフェロイドの1個以上の軸索のミエリン形成または脱ミエリン形成の判定方法であって、
(a)少なくとも1個の軸索を成長させるのに十分な時間及び条件下、薬剤の存在下または非存在下で、項目1~18のいずれかに記載の組成物中の1個以上のスフェロイドを培養することと、
(b)前記1個以上のスフェロイド由来の1個以上の軸索におけるミエリン形成の量を検出することと
を含み、
検出することが任意選択で、
(i)薬剤の存在下または非存在下において、前記1個以上のスフェロイドの1種以上の形態計測上の変化及び/もしくは1種以上の電気生理学的メトリクスを測定及び/または観測するステップと、
(ii)薬剤の存在下または非存在下における、前記1個以上のスフェロイドの1種以上の形態計測上の変化及び/もしくは1種以上の電気生理学的メトリクスを、前記スフェロイドのミエリン形成の定量的または定性的変化と相関させるステップと
を含む前記方法。
(項目54)
(a)1個以上のスフェロイド及び/もしくはスフェロイドから成長した軸索の数または密度を定量化することと、
(b)項目1~18のいずれかに記載の組成物中の1個以上のスフェロイドを培養することと、
(c)前記スフェロイドを、前記スフェロイド中で前記1個以上の軸索を成長させるまたは細胞を成長させるのに十分な期間培養した後で、前記スフェロイド内の細胞の数及び/または前記組成物中のスフェロイドから成長した軸索の数もしくは密度を計算することと
を含み、
ステップ(b)が任意選択で、前記1個以上のスフェロイドを1種以上の薬剤と接触させることを含み、
ステップ(c)が任意選択で、1個以上のスフェロイドを培養した後で、かかる1個以上のスフェロイドの内部及び/もしくは外部の記録を検出することと、前記記録を既知のもしくは対照の数の細胞に対応する同様の記録の測定値と相関させることとを含むか、または、
ステップ(c)が任意選択で、
(i)前記1個以上のスフェロイドを1種以上の薬剤と接触させる前記ステップの前後における細胞内及び/もしくは細胞外の記録ならびに/または形態計測上の変化を測定する更なるステップと、
(ii)前記1個以上のスフェロイドを前記1種以上の薬剤と接触させた後の、前記記録及び/もしく形態計測上の変化に対する前記1個以上のスフェロイドを前記1種以上の薬剤と接触させる前の、前記記録及び/もしく形態計測上の変化の差異を、細胞数及び/または軸索の数または密度の変化と相関させるステップと
を含む、神経細胞成長及び/または軸索変性の検出ならびに/あるいは定量化方法。
(項目55)
薬剤の神経調節作用の測定または定量方法であって、
(a)前記薬剤の存在下及び非存在下で、項目1~18のいずれかに記載の組成物中の1個以上のスフェロイドを培養することと、
(b)前記薬剤の存在下及び非存在下で、前記1個以上のスフェロイド全体にわたって電位を印加することと、
(c)前記薬剤の存在下及び非存在下で、前記1個以上のスフェロイドからの1種以上の電気生理学的メトリクスを測定することと、
(d)前記1個以上のスフェロイドによる1種以上の電気生理学的メトリクスの前記差異を前記薬剤の神経調節作用と相関させ、その結果、前記薬剤の存在下での電気生理学的メトリクスが前記薬剤の非存在下で測定された前記電気生理学的メトリクスと比較して変化することが神経調節作用を示し、前記薬剤の存在下での電気生理学的メトリクスが前記薬剤の非存在下で測定された前記電気生理学的メトリクスと比較して変化しないことが、前記薬剤が神経調節作用を与えないことを示すことと
を含むか、または、
(a)前記薬剤の存在下及び非存在下で、項目1~18のいずれかに記載の組成物中の1個以上のスフェロイドを培養することと、
(b)前記薬剤の存在下及び非存在下で、前記1個以上のスフェロイドの1種以上の形態計測上の変化を測定及び/もしくは観測することと、
(c)前記1種以上の形態計測上の変化を前記薬剤の神経調節作用と相関させ、その結果、前記薬剤の存在下での形態学的メトリクスが前記薬剤の非存在下で測定及び/もしくは観測される前記形態学的メトリクスと比較して変化することが神経調節作用を示し、前記薬剤の存在下での形態学的メトリクスが前記薬剤の非存在下で測定及び/もしくは観測される前記形態学的メトリクスと比較して変化しないことが、前記薬剤が神経調節作用を与えないことを示すことと
を含む前記方法。
(項目56)
項目19~37のいずれかに記載のシステムの製造方法であって、
(a)神経細胞を、前記細胞がスフェロイドを形成するのに十分な期間、細胞培養培地中で培養することと、
(b)前記スフェロイドを前記ヒドロゲル内に配置することと、
(c)神経突起または軸索を成長させるのに十分な期間、前記スフェロイドを細胞培養培地に曝露することと
を含む前記方法。
(項目57)
ステップ(a)が前記神経細胞を1種以上の磁性粒子と混合することを含む、項目56に記載の方法。
(項目58)
ステップ(b)が磁力を使用して、前記スフェロイドを前記ヒドロゲルの空洞内に配置することを含む、項目57に記載の方法。
(項目59)
ステップ(b)が、超音波による力、機械的力、または流体による力を使用して、前記ヒドロゲルの空洞内に配置することを含む、項目56に記載の方法。
(項目60)
前記スフェロイドが、項目1~18に記載のいずれかの組成物中に開示されているスフェロイドである、項目56に記載の方法。
(項目61)
前記1個以上のスフェロイドの1種以上の1種以上の形態計測上の変化及び/または1種以上の電気生理学的メトリクスを前記薬剤の毒性と相関させ、その結果、前記形態計測上の変化及び/または電気生理学的メトリクスが、細胞生存率が低下することを示す場合には、前記薬剤は有毒であると特徴付けられ、前記形態計測上の変化及び/または電気生理学的メトリクスが、細胞生存率が変化しないまたは増加することを示す場合には、前記薬剤は無毒及び/または神経保護作用があると特徴付けられることを更に含む、項目52に記載の方法。
Moore, 2011;Curley et al., 2011;Irons et al., 2008;及びTibbitt and Anseth, 2009(それらのそれぞれは、その全体が参照により援用される)に、様々な種類が記載されている。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスは、液化プレゲル溶液を、紫外光、可視光、または波長が約300nm、400nm、450nm、もしくは500nmを超える任意の光に曝露することにより固化させることができる。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスを、様々な形状、例えば、神経路を模倣するように設計された二股に分岐した形状に固化してもよい。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスはポリ(エチレングリコール)ジメタクリラート(PEG)を含む。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスはPuraMatrixを含む。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスはグリシジルメタクリラート-デキストラン(MeDex)を含む。いくつかの実施形態において、神経細胞が上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクス中に組み込まれる。いくつかの実施形態において、神経系由来の細胞が上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクス中に組み込まれる。いくつかの実施形態において、上記神経系由来の細胞はシュワン細胞及び/または乏突起膠細胞である。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスは、動物(哺乳動物など)の神経系由来の組織外植片、及び上記神経系に由来する細胞ではあるが、単離し培養して、培養物中の該細胞の集団を濃縮した上記細胞の補助的集団を含む。いくつかの実施形態において、上記ヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスは、網膜組織外植片、DRG、または脊髄組織外植片などの組織外植片、ならびに単離及び培養されたシュワン細胞、乏突起膠細胞、及び/またはミクログリア細胞の集団を含む。いくつかの実施形態において、2種以上のヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスが細胞培養容器中で同時に使用される。いくつかの実施形態において、2種以上のヒドロゲルまたはヒドロゲルマトリクスが同一の細胞培養容器中で同時に使用されるが、上記ヒドロゲルは、組織培養容器中に、独立して対処可能なウェルなどの微小環境を形成する壁によって分離される。多重化組織培養容器において、いくつかの実施形態が、1つのウェルもしくは場所の中のヒドロゲルマトリクスが、上記細胞培養容器の別のウェルもしくは場所の中のヒドロゲルマトリクスと異なるまたは同一となるような、上記細胞培養容器内の任意の数の上述のウェルまたは独立して対処可能な場所を備えることが可能である。
et al. (1995) Nature 374:546-549;Yamamoto et al. (1992) J. Immunol. 148:4072-76;Ballas et al. (1996) J. Immunol. 157:1840-45;Klinman et al. (1997) J. Immunol. 158:3635-39;Sato et al. (1996) Science 273:352-354;Pisetsky (1996) J. Immunol. 156:421-423;Shimada et al. (1986) Jpn. J.
Cancer Res. 77:808-816;Cowdery et al. (1996) J. Immunol. 156:4570-75;Roman et al. (1997) Nat. Med. 3:849-854;Lipford et
al. (1997a) Eur. J. Immunol. 27:2340-44、WO98/55495、及びWO00/61151を参照されたい。したがって、これら及びその他の方法を用いて、免疫刺激性ヌクレオチド、免疫刺激性の単離された核酸などの免疫刺激性物質を識別する、試験する、及び/または確認することができる。
21, 2015に公表されているヒドロゲルから選択されるポリマーの1種または組み合わせを含む。
合成ポリマー
ポリエチレングリコール(ポリエチレンオキシド)、ポリビニルアルコール、ポリ(メタクリル酸2-ヒドロキシエチル)、ポリアクリルアミド、シリコーン、それらの組み合わせ、及びそれらの誘導体など。
多糖(合成または天然供給源由来のいずれでもよい)
ヒアルロン酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、デキストラン、アガロース、キトサン、アルギン酸塩、それらの組み合わせ、及びそれらの誘導体など。
天然のタンパク質または糖タンパク質
コラーゲン、ゼラチン、エラスチン、チチン、ラミニン、フィブロネクチン、フィブリン、ケラチン、絹フィブロイン、それらの組み合わせ、及びそれらの誘導体など。
ポリペプチド(合成または天然供給源)
ポリリシン、及び既に列挙している全てのRAD及びEAKペプチドなど。
本明細書では、「スフェロイド」または「細胞スフェロイド」とは、例えば、概括的には、その主軸(長軸または短軸)の1つを中心に回転する楕円もしくは円または凸円弧もしくは凹円弧に対応する3次元形状の、任意の細胞の集団であってよく、3次元の卵形、偏球形及び長球形、球形、レンズ形、または実質的に同等の形状が挙げられる。
(1999)(これらは参照によりそれらの全体が本明細書に援用される)に記載される。いくつかの実施形態において、上記細胞培養培地は、培養物における軸索のミエリン形成を促進するように段階的に変更される。ミエリン形成前培地及びミエリン形成培地は以下の成分を含む。
i.磁性材料のナノ粒子コアと、
ii.上記磁性コア上に不連続なコーティングを形成するベースコーティング材料であって、アクセス可能な場合に、上記ベースコート粒子の生体高分子に対する非特異的結合に寄与する少なくとも1箇所の不連続領域を与える上記ベースコーティング材料と、
iii.生体高分子による不連続領域へのアクセスを妨げる更なるコーティング材料とを含む被覆された磁性粒子が提供される。直上に記載された粒子の磁性コア材料は、少なくとも1種の遷移金属酸化物を含んでいてもよく、好適なベースコーティング材料はタンパク質を含む。磁性粒子をコーティングするのに好適なタンパク質としては、ウシ血清アルブミン及びカゼインが挙げられるが、これらに限定はされない。上記更なるコーティング材料は、当初のコーティングタンパク質、または上記磁性コア上のベース材料に結合する特異的結合対の一方の構成因子であってよい。例示的な特異的結合対としては、ビオチン-ストレプトアビジン、抗原-抗体、受容体-ホルモン、受容体-リガンド、アゴニスト-アンタゴニスト、レクチン-炭水化物、プロテインA-抗体Fc、及びアビジン-ビオチンが挙げられる。一実施形態において、上記特異的結合対の上記構成因子は、二官能性連結化合物を介してベースコーティング材料に結合する。例示的な二官能性連結化合物としては、スクシンイミジル-プロピオノ-ジチオピリジン(SPDP)、及びスルホスクシンイミジル-4-[マレイミドメチル]シクロヘキサン-1-カルボキシラート(SMCC)が挙げられる。但し、その他の種々のかかるヘテロ二官能性リンカー化合物がPierce(Rockford, Ill.)より入手可能である。
(i)ヒドロゲルマトリクスと、
(ii)1個以上のスフェロイドと、
(iii)発電器と、
(iv)電圧計及び/または電流計と、
(v)少なくとも第1の刺激用電極及び少なくとも第1の記録用電極と
を備えるシステムであって、
上記発電器と、電圧計及び/または電流計と、電極とが、電流が上記発電器から上記少なくとも1つの刺激用電極に供給され、電流が上記記録用電極で受け取られ、上記電圧計及び/または電流計に供給される回路を介して、互いに電気的に接続されており、
上記細胞培養容器全体にわたって電位が確立されるように、上記刺激用電極が、上記神経細胞の1個以上の細胞体にあるいはそれに近接して配置され、上記記録用電極が、上記細胞体に対して遠位の所定の距離に配置される上記システムにも関する。
人工多能性幹細胞などの幹細胞を得ることと、
上記細胞を1種以上の細胞増殖因子に曝露することと、
上記幹細胞を神経細胞に分化させることと、
上記細胞を、第1及び/もしくは第2の空洞またはウェルを備える固体基材中に播種することと
を含む上記方法に関する。いくつかの実施形態において、第1及び/または第2の空洞は、U字底ウェル、湾曲底ウェル、または平底ウェルである。いくつかの実施形態において、上記方法は、約10000個、15000個、20000個、25000個、30000個、35000個、40000個、45000個、50000個、55000個、60000個、65000個、70000個、75000個、80000個、90000個、100000個、125000個、150000個、175000個、200000個、225000個、または250000個の細胞を播種することを含む。いくつかの実施形態において、上記細胞を播種する上記ステップは、固体基材内に分離され、それぞれに細胞培養培地を収納した一連の空洞またはウェル中に、1種以上のf細胞を播種することを含む。いくつかの実施形態において、上記空洞またはウェルを播種する上記ステップは、各ウェルが細胞のスフェロイドを収納し、各スフェロイドが懸濁液またはハンギングドロップ形式で成長するように、上記固体基材内に配置されたパターンに上記細胞を播種することを含む。いくつかの実施形態において、上記細胞を培養するためのシステム、培養プレート、または装置の製造方法は、上記細胞が自発的に1個以上のスフェロイドを形成するのに十分な時間、上記細胞を乱すことなく培養することを含む。
(i)細胞を、幹細胞から、神経細胞、星状細胞、シュワン細胞、もしくは本明細書に開示される任意の他の細胞の1種または組み合わせである1種以上の細胞型へと分化させることと、次いで
(ii)上記1種以上の細胞を、スフェロイドを形成するのに十分な時間混合することと
を含む。いくつかの実施形態において、上記方法は、スフェロイドが形成された後に、いずれの細胞をも分化させるステップを含まない。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記スフェロイドまたは任意の細胞を1種以上のDRGに曝露することを含まない。
目的は、末梢神経の形態学を模倣し、臨床的に類似した生理学的測定を支援する器官型の微小生理学的モデルを開発することであった。Nerve-On-A-Chipの設計をマイクロエンジニアリングによるヒドロゲルスキャフォールドを用いて作り上げた(図1のA及びB)。
実施例2:ラット脊髄のナノシャトルスフェロイドプロトコル
1日目(図12):
1.E15ラットの子から6個の脊髄を単離し、全ての後根神経節を確実に
除去する。
2.スプリングハンドル式ハサミを用いて、6個の脊髄全てを小さな塊に切断する。
3.1000μLピペットを用いて小塊にした脊髄及び培地を1.5mLの微小遠沈管に移す。
4.700rcfで2分30秒間遠心分離することにより、脊髄塊をペレット化する。
5.ペレットを崩さないように注意しながら、上記微小遠沈管から上清を取り除く。
6.1mLの0.25%トリプシン-EDTAを上記微小遠沈管に添加し、ペレットを砕いてトリプシン中に懸濁させる。
7.37℃で15分間インキュベートする。
8.1.5mLのトリプシン阻害剤溶液が入った15mLの管にトリプシン+細胞懸濁液を添加することによってトリプシン-EDTAをクエンチする。
9.700rcfで5分間遠心分離して、脊髄塊をペレット化する。
10.ペレットを崩さないように注意しながら、15mLコニカル管から上清を取り除く。
11.ペレットが入った上記15mLコニカル管に2mLの脊髄播種培地を添加する。
12.100μLピペットを用いて15回粉砕して(ピペットを1mLの容量に設定)、塊を砕く。
13.解離させた脊髄の溶液に更に3mLの脊髄播種培地を添加する。
14.解離させた脊髄の溶液5mLを全て、40μmのセルストレーナーに通し、漉した培地をペトリ皿に収取する。
15.各l2ウェルPLLカバーグラス上に300μLの解離させた脊髄溶液を添加する。この培地はカバーグラス上で泡立ったままとし、カバーグラスの端を越えてウェルを液で満たすことにならないようにする必要がある。カバーグラスを確実に完全に覆うために、12ウェルプレートを静かに傾けて、解離させた脊髄溶液がカバーグラス全体に広がるようにする。必要に応じて、更に別な方向に傾けることを繰り返し、完全に覆うようにする。
16.上記播種した細胞を37℃で2時間インキュベートする。
17.2時間後に播種培地を静かに取り除き、700μLのN2:NG培地と交換する。当該ウェルの横にN2:NG培地を添加して、流体の流れによって播種した細胞が基材から除去されるのを防ぐ。
2日目:
1.ウェルに0.5mLの0.25%トリプシン-EDTAを添加することにより、1つのウェルの播種した細胞を犠牲にして計数を行う。
2.37℃で4分間インキュベートする。
3.基材から吸い上げたトリプシン及び細胞を0.5mLの神経基礎培地が入った1.5mLの微小遠沈管に移し、トリプシンを希釈する。
4.10回粉砕して、細胞間接着を破壊し、細胞溶液を得る。
5.トリパンブルー及び血球計算盤を用いて、上記ウェル中に存在する細胞の計数を行う。
6.残余のウェルに60,000細胞当り1μLの割合でナノシャトルを添加する。カバーグラスの全領域にナノシャトル溶液を分散させるようにする。
7.これをインキュベータに戻し、更にインキュベートする。
3日目:
1.各ウェルに0.5mLの0.25%トリプシン-EDTAを添加する。
2.37℃で4分間インキュベートする。
3.基材から吸い上げたトリプシン及び細胞を、トリプシンを希釈する量に等しい量のN2:NG培地が入った15mLコニカル管に移す。
4.上記細胞溶液を700rcfで5分間遠心分離する。
5.上清を除去し、2mLのN2:NG培地と交換する。
6.1mLの注射器及び20ゲージの針を用いて5回粉砕することにより、細胞ペレットを砕く。
7.上記細胞懸濁液に更に5.2mLのN2:NG培地を添加する(合計7.2mL)。
8.この細胞懸濁液から10μLの試料をとり、トリパンブルー及び血球計算盤を用いて、mL当たりの細胞の数を算出する。
9.96ウェルの各ウェルへの添加に必要な細胞懸濁液の量を計算する。
例えば、ウェル当り500,000細胞、400,000細胞、または300,000細胞
10.非接着性96ウェルプレートを確実に磁気駆動装置の上に載置した状態とし(図11)、次いで上記非接着性96ウェルの各ウェルに適宜の量の細胞溶液を添加する。必要に応じて、上記96ウェルのそれぞれにおける容量が150μLとなるように、上記ウェルにN2:NG培地を追加する。
11.上記96ウェルプレートをインキュベータに戻し、2日間、スフェロイドを崩さずに形成させる。
5日目:
1.PEG構築物を作製する。手引きが必要な場合は他のプロトコルを参照のこと。
2.2% anti/anti洗浄溶液で3回洗浄する。
3.37℃で終夜、洗浄液中に保存する。
6日目:
1.磁気駆動装置の上から96ウェルプレートを取り外す。
2.1000μLピペット(100μLに設定)を用いて、96ウェルの各ウェル中の液体を静かに吸い上げ/吐き出しして、スフェロイドを懸濁させる。
3.10μLピペット(10μLに設定)を用いて、スフェロイドを96ウェルから取り出す。
4.氷上のペトリ皿中の2mLの培地に上記スフェロイドを添加する。
5.上記スフェロイドを氷上の空のペトリ皿に再度移す。4μLに設定した10μLピペットを用いる。この操作は、96ウェルから移ってきた何らかの細胞片を除去するのに役立つ。
6.細胞を封入するためのマトリゲルの1:20希釈液を、ゲル化を防止するために必ず全ての溶液を氷上(10℃未満)に保ちながら、マトリゲルをN2:NG培地と混合することによって調製する(スフェロイドの移動によって加えられた培地を考慮する必要がある)。
例:4個のスフェロイドを含む200μLの1:20マトリゲル希釈液に関しては、10μLのマトリゲル、178μLのN2:NG培地、及びスフェロイドと共に移された12μLの培地を含む。したがってこのステップでは、10μLのマトリゲルを178μLのN2:NG培地に添加する。
7.上気空のペトリ皿中のスフェロイドに、上記混合したマトリゲル及びN2:NG培地を添加する。
8.Rain-Xを塗布したスライドグラスを上記磁気位置決め装置に取り付ける(図13)。
9.上記スライドグラスの上に上記PEG構築物を含むTranswellインサートを載置する。
10.上記磁気駆動装置を操作して、スフェロイドを配置したい空隙の下に磁石の位置を調節する。
11.10μLに設定したピペットを用いて、スフェロイド及び1:20マトリゲル溶液を上記空隙に移す。磁石の上でスフェロイドを放す(図14のB)。
12.Transwellインサート中の全ての構築物について、手順10及び11を繰り返す。
13.37℃で30分間、マトリゲルをゲル化させる。
14.上記インサートの下にN2:NG培地を添加する。
15.所望するように培養する。
丸底/U字底プレート:1種の分化細胞型または分化細胞型の組み合わせのいずれかに対して、96ウェルの、透明な「U字」丸底の、未処理のスフェロイドマイクロプレート(Corning REF:4415)を用いた。血球計算盤を用いて、再懸濁した細胞を再度計数する。それに従って、マイクロピペッタを用いて、5000細胞から最大で10万細胞の各スフェロイドに必要な密度を各ウェルに添加する。次いでこのスフェロイドマイクロプレートを、懸濁液で、当該の細胞型に対応する遠心分離速度で5分間遠心分離し、24時間以上、スフェロイドが形成されるまで37℃のインキュベータ中に載置する。
3次元構築物の配置とするためにスフェロイドを移動するには、6ウェルの組織培養処理プレート(Transwell、径が24mm、孔径が0.4um、REF:3450-透明)内で、各ウェルについて、使用した計1500ulのPBSの500ulを除去することよって構築物を乾燥し、ここでメンブレンの上部はスフェロイドを配置するために部分的に乾燥している。次いで8%のマトリゲルを3次元構造の内部に添加し、その後37℃のインキュベータ中に30分間載置する。
未分化の初代ヒト筋芽細胞を非コーティング組織培養容器上に販売元指定の密度で播種し、1日目、2日目、4日目等々に血清を含む成長培地を供給し、60%の培養密度に達するまで細胞分裂をトリガーする。60%の培養密度に達したときには、細胞はトリプシンにより継代6まで継代されている。継代6(P6)及び60%の培養密度に達したところで、初代ヒト筋芽細胞をトリプシンと共に培養容器から取り出し、遠心分離し、計数のために培地中に再懸濁し、2回目の遠沈を行い、DMEM/F12中に800万細胞/mLの濃度になるように再懸濁する。
この検討において、統合神経伝導速度(NCV)及び組織病理学的評価に好適なデータを提供することができる、人工多能性幹細胞(iPSC)由来のニューロン(hN)及び初代ヒトシュワン細胞(hSC)から構成される、イン・ビトロ、マイクロエンジニアリングによる、生体模倣の、全ヒト末梢神経(Human-Nerve-on-a-Chip[HNoaC])について説明する。この全ヒトシステムは、本発明者らが以前に、胚性ラット後根神経節(DRG)ニューロン及びラットSCを用いて開発したイン・ビトロ「Nerve-on-a-Chip」(NoaC)プラットフォーム5の重要な拡張である。本発明者らの知る限り、このhNとhSCとの組み合わせは、これまでに如何なる他の幹細胞に基くイン・ビトロ神経系でも達成されていない。このモデルは、堅牢な軸索伸長(約5mm)を模倣し、ヒトiPSC由来のニューロンのヒトシュワン細胞のミエリン形成の最初の証拠及び、イン・ビトロモデルのような全ヒトイン・ビトロシステムにおける神経伝導速度の試験の最初の証拠を示した。したがって、上記革新的なヒト末梢神経のHNoaCモデルは、ヒトの疾患モデル化、創薬、及び毒性スクリーニングの分野を加速する可能性がある。
T-75培養フラスコ(353136;Corning, Corning, NY)を、滅菌ろ過した0.1%ポリ-L-オルニチン(PLO;Sigma-Aldrich, St.Louis, MO)の滅菌水(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)溶液で被覆することによって用意した。次いでこのフラスコを滅菌水で4回洗浄した。7.5mLの10μg/mLラミニン(Sigma-Aldrich,
St. Louis, MO)リン酸緩衝生理食塩水(PBS;Caisson Labs, Smithfield, UT)溶液を上記フラスコに加え、これを4℃で終夜その状態に保った。ラミニン溶液を吸引し、15mLの培養液をこのT-75培養フラスコに直接入れ、37℃のインキュベータ中で平衡化した後に細胞播種を行った。ヒトシュワン細胞(hSC)培地はScienCell(Carlsbad、CA)から購入した。ヒトシュワン細胞株(カタログ番号1700;ScienCell)は冷結保存バイアル入りで受け入れ、報告によれば5×105細胞/mL超であった。このバイアルを凍結保存から取り出し、37℃水浴中で解凍した。バイアルの内容物を上記PLO/ラミニンで被覆したT-75フラスコ上に均一に分配させた。培養物を5% CO2雰囲気中、37℃で少なくとも16時間静置して、付着及び増殖を促進させた。培地は24時間毎に交換した。80%の培養密度に達したところで、hSCを3mLのAccutase(登録商標)(Sigma-Aldrich)を用いることによって継代し、Accutase(登録商標)を37℃で3分間フラスコに添加した。細胞が完全に剥離したところで、8mLのhSC培地をフラスコに入れた。剥離したhSCの11mLの溶液を15mLのコニカル管に移し、200×g(Eppendorf 5810R遠心分離機、半径18cm、Eppendorf, Hamburg, Germany)、室温(RT、約22℃)で5分間遠心した。上清を吸引し、ペレットを1mLのhSC培養培地中に再懸濁させた。従来の血球計算盤(Hausser Scientific, Horsham,
PA)を用いて細胞を計数した。
Dynamics, Inc, Madison, WI)及び1mLのiCell(登録商標)Nervous System Supplement (FUJIFILM
Cellular Dynamics, Inc)を補充した100mLのiCell(登録商標)Neurons Base Medium (FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc)を用いて調製した。運動ニューロンの解凍を準備するために、hN培地を室温まで加温し、1mLのhN培地を滅菌した50mLコニカル管に添加した。1バイアルのiCell(登録商標)ヒト運動ニューロン(hN;FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc)を37℃の水浴中で約2分30秒間解凍した。このバイアルの内容物を、細胞溶液を完全に混合し、且つ解凍した細胞への浸透圧ショックを最小限に抑えるために、旋回させる動きで滴下することにより、1mLのhN培地が入った50mLコニカル管に移した。次いでこの細胞バイアルを1mLのhN培地ですすぎ、50mL管に移した。次に、この50mL遠沈管にhN培地を旋回させながらゆっくりと滴加する(2~3滴/秒)ことによって、この溶液の容量を10mLとした。次いで、この細胞溶液を15mLコニカル管に移し、200×g、室温で5分間遠心分離した。上清を吸引し、管を指で弾き、次いでピペットで2~3回吸い上げ/吐き出しすることにより、細胞を1mLのhN培地中に再懸濁した。次に、細胞溶液の10μL試料を採取し、血球計算盤を用いて細胞の計数を行った。
4500 Control Software, Texas Instruments, Dallas, TX)を用いて選択し、photo-translinkable溶液の照射を、波長385nmの紫外光を用いて28~32秒間行った。処理後に、上記インサート及びフォトマスクによって生み出された空隙内から過剰なPEGDMA/LAP溶液を除去した。次いで、2%抗生物質/抗真菌剤洗浄緩衝液(Thermo Fischer Scientific, Walton, MA)を用いて、この構築物を、インサートの上部と下部でそれぞれ10分間、3回洗浄した。インサート及び内部の鍵穴形のチャンネルから洗浄緩衝液を除去した。細胞が透過可能なスキャホールドを作製するために、上記空隙に8%の成長因子低減Matrigel(登録商標)マトリクス(Corning)を慎重に充填し、37℃のインキュベータ中で重合させた。
3次元構築物におけるミエリン形成を誘導するために、hN培地(上記)を用いて2種の培地を調製した。ミエリン化前培地は、hN培地、10% HyCloneウシ胎児血清(FBS;LaCell LLC, New Orleans, LA)、及び1%抗生物質-抗真菌剤緩衝液を用いて調製した。ミエリン化培地は、hN培地、10% FBS、10ng/mLの組換えラットβ神経成長因子(NGF;R&D Systems,
Minneapolis, MN)、及び50μg/mLのL-アスコルビン酸(Sigma-Aldrich)を用いて調製。スフェロイドを形成後に、ピペットを用いてマイクロプレートから移し、hN培地の液滴として35mmの組織培養処理ディッシュ(Cell Treat, Pepperell, MA)上に載置した。次いで滅菌したDumont 5号の先端の細いピンセット(11295-10;Dumont, Montignez, Switzerland)を用いて、スフェロイドをマトリゲル内の3次元構築物「バルブ部分」に配置した。最後に1.5mLのミエリン化前培地を上記6ウェルプレートのTranswell(登録商標)メンブレンの下に入れ、搭載したヒドロゲル構築物を5% CO2雰囲気、37℃のインキュベータ中に載置し、培養を行った。隔日で培地の半量の交換を行った。上記構築物をミエリン化前培地中に1週間保持した後、ミエリン化培地に交換して3週間保持した。
上記6ウェル培養プレートの全てのウェルを、4%パラホルムアルデヒド(PFA;Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA)、pH7.4を用いて室温で30分間固定化し、次いでPBSで4回、各15分間洗浄した。次に、固定化した試料を、PBS、5%ヤギ正常血清(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)、0.2% Triton-X-100(Sigma-Aldrich)、及び0.4%ウシ血清アルブミン(Sigma-Aldrich)を含む1×ブロッキング溶液中に室温で1時間入れ、それに続いて、ブロッキング溶液中、4℃で終夜、以下の1次抗体、すなわち、ウサギ-α-sl00(ab868, 1:400;Abcam, Cambridge, MA)、またはマウス-α-βIIIチューブリン(ab78078, 1:500;Abcam)で標識する。別の試行において、ウサギ-α-ミエリン塩基性タンパク質(MBP, ab133620, 1:500;Abcam)も同一のインキュベーション条件下で使用した。翌日、ウェルをPBSで4回、室温で各8分間洗浄した。次いでこのプレートを、2次抗体、Alexa 488ヤギ抗ウサギIgG(1:300, Abam)またはAlexa 568ヤギ抗マウスIgG(1:300, Abam)、及びDAPI(1:200, Sigma-Aldrich)を用いて標識した。2次抗体及びDAPIをI×ブロッカー溶液に室温、暗所で90分間溶解した。このプレートを室温、暗所にてPBSで5回、各8分間洗浄した。次に、このプレートをパラフィルムで密封し、金属箔で覆い、4℃に維持し、その後Nikon Al共焦点顕微鏡(Nikon, Tokyo, Japan)を用いて顕微鏡観察を行った。
包埋に使用した全ての材料は、別段の記載がない限り、Electron Microscopy Sciencesから購入し、ドラフト下で取り扱い、推奨される個人用保護具を装着して使用した。ヒドロゲル構築物を培養物から取り出し、膜貫通型ウェルの両側を、室温でPBSにより3回洗浄し、その後固定化を行った。次いでこのヒドロゲル構築物を、室温で30分間、4% PFA/0.5%グルタルアルデヒドの溶液中に浸漬した。細胞脂質の2次固定化及び染色を、1%四酸化オスミウムのPBS、pH7.4溶液を用いた、室温、暗条件下での2時間の後固定により実現した。次いで上記構築物をPBSで3回、15分間洗浄した後、2%酢酸ウラニル水溶液を用い、室温、暗条件下で30分間対比染色した。50%エタノール/PBSでの10分の洗浄から始めて、70%エタノール/PBSでの10分の洗浄、及び90%エタノール/PBSでの終夜の洗浄による室温での段階的エタノール洗浄によって脱水を行った。翌日、この構築物を100%エタノールで2回、室温で30分間洗浄した。解剖顕微鏡下、メスを用いて、PEGDMAを除去せずに、膜貫通型ウェルからヒドロゲル構築物を個別に解剖した。構築物を平面包埋型(EMS 70902, Electron Microscopy Sciences)中に配置した。上記固定化ヒドロゲルから残存エタノールを蒸発させる時間を設けた後に、Spurr樹脂(低粘度包埋培地Spurrキット;Electron Microscopy Sciences)とプロピレンオキシドの1:1混合物からなる浸透培地で置換した。浸透培地を75分間静置した後、100%のSpurr樹脂で置換し、これを70℃のオーブン中で終夜、且つ室温で48時間硬化した後、ウルトラミクロトームによる薄片作製を行った。
切片作製及び透過型電子顕微鏡法(TEM)
切片作製及びTEMによる評価をルイジアナ州立大学(Baton Rouge, LA)の共有機器施設(SIF)で実施した。HNoaC標本内、すなわち、組織のバルブ内(但し、上記バルブにおいて、上記バブルは、上記チャネル及び上記近位チャネル(すなわちバルブの近く)、ならびに遠位チャネルと交わる)の4箇所で超薄切片を80~100nmの厚さに切り出した。切片をFormvarカーボン被覆銅グリッド、200メッシュ上に配置し、室温で20分間、2%酢酸ウラニルの液滴上に浮遊させることにより金属を含浸させた。次いでこれらの切片を脱イオン水の水滴で3回、1分間すすいだ。視覚化するために、JEOL 1400 TEM(Peabody, MA)を120kVの加速電圧において、種々の倍率で使用した。
HNoaC断面のTEM画像から取得したメトリクスとしては、軸索径及びG比(すなわち、軸索径と繊維全体[軸索+ミエリン鞘]の径の比)を含んでいた。軸索径及びG比は、二人の異なる独立した盲検化した研究者が、無髄軸索と3層以上の暗色のミエリンラッピング(myelin wrapping)によって囲まれた軸索の両方を測定することによって明らかになった。G比及び軸索径は、Fiji7におけるスケール、しきい値、測定機能を用いて測定した。G比メトリクスは、無作為に10の画像をサンプリングして、3つ以上のミエリン膜(myelin laminae)を有する軸索を見い出すことによって計算した一方、無髄繊維は、遠位チャネルから10の軸索の画像を無作為にサンプリングすることによって測定した。軸索径は、軸索の総面積を見い出すためのしきい値関数を用いることにより測定した。次いで、軸索が円形であると仮定して、面積から径を算出した。G比の計算は、内部の軸索の径の単純な線形予測に基づいた一方、繊維全体の外径(軸索と周囲を囲む暗色に染色されたミエリン膜(myelin lamellae)からなる)は、所与の神経線維の最小径と最大径との平均値を採用することによって計算した。ミエリン層が近接しいていることがミエリン鞘の全周にわたって一貫していないために、外径を得るためのこの平均化手法が必要であった。G比は、平均の外径に対する内部の径を採用することによって計算た。ミエリン鞘の外側の範囲を測定する際に、シュワン細胞の大きな有核体は除外した。
共培養において1ヶ月後に、再構成された神経を有するTranswell(登録商標)インサートを電気生理学的検査用のステージ上に載置した。2つのチューブ(一方は供給用、他方は吸引用)をTranswell(登録商標)インサートの縁部に沿って配置し、酸素化人工脳脊髄液(ACSF)5を組織試料に灌流させた。複合活動電位(CAP)を記録するために、ガラスキャピラリマイクロピペット電極(1~4MΩ)をクラスター化細胞体の近傍のチャネルのバルブに挿入し、チャネル中を伸長する軸索を、上記バルブから1~3mm遠位に配置した同心円双極白金-イリジウム電極を用いて刺激した。白金記録用電極をACSF充填ガラス製マイクロピペット中に配置し、100倍のゲイン及び0.1Hzのハイパスフィルタリング~3kHzのローパスフィルタリングに設定した増幅器に接続した。刺激パルスの高さ及び幅は、それぞれ10ボルト及び200μ秒に維持した。試料を1Hzの最大繰り返し速度で刺激し、試料当り少なくとも50回の刺激を印加した。アナログ/デジタルコンバータ(PowerLab;AD Instmments、Colorado Springs, CO)を用いてCAP波形を視覚化し、更にLabChartソフトウェア(AD Instruments)を用いて保存した。CAPを記録した後、実体顕微鏡及びカメラを用いて、刺激用電極及び記録用電極のスナップショットを撮影し、神経伝導速度(NCV)の計算用に上記電極間の距離を測定した。CAPピーク位置から刺激アーティファクトの位置を減じることによって潜時を決定した。有髄hMN/hSC共培養物及び無髄hMN単独培養物のNCVは、刺激用電極と記録用電極の間の距離を潜時で除すことによって評価した。
GraphPad Prismソフトウェア(GraphPad Software,
Inc., La Jolla, CA, USA)を用いて、Tukeyポストホック検定による一元配置分散分析(ANOVA)を実施し、異なる種類のスフェロイド間の大きさの違いを評価した。電気生理学の解析のために、平均値及び標準偏差を計算し、独立2群のt検定を行った(GraphPad Software)。平均値間が有意差であることを指定するのにp値≦0.05を用いた。
シュワン細胞はニューロンのスフェロイドへのアセンブリを向上させた
本発明者らは、Nerve-on-a-chip(NoaC)システムの寸法内に適切に収まるスフェロイド(すなわち、径が1,000μM未満であり、且つ多数の細胞を維持する)を作製するために、種々の細胞密度をもつスフェロイドを作製した。本発明者らはまた、種々のスフェロイドの大きさを比較して、hNとhSCとの間の相互作用を理解した。低接着性丸底プレート中に所望の数の細胞を入れた後、スフェロイドの形成を毎日監視した。hSCの単独培養では、約2日以内にスフェロイドが形成され、常に鋭利な縁部を有する形状であることが判明した(図43のa~c)。対照的に、hNの単独培養では、2日間ではスフェロイドに自己組織化せず、代わりに多くのより小さな球状構造体が形成された(図43のg~i)。共培養では、hNのみから形成されたスフェロイド(約3~9日、図44)と比較した場合、hSCはスフェロイドへのhNの取り込みを促進した(約2日)。共培養スフェロイドの縁部(図43のd~f)は、おそらく共培養スフェロイドの不均一な性質に起因して、hSCのみを含有するスフェロイドと比較して、あまり明確に画定されていなかった。興味深いことに、75,000hNと75,000hSCとから構成される共培養スフェロイドの大きさ(1025±52μm)は、75,000hSCのみの大きさ(967±51μm)と非常に類似することが判明し、このことは、共培養スフェロイドの方がより密に充填されていることを示唆し、それ故に上記2種の細胞型が互いに親和性を有していることが確認される。
二重ヒドロゲルシステムの外側部分は成長抵抗性の10% PEGDMAで構成されている一方、チャネルの内側部分は、成長促進基材としての完全に濃厚な(8~12mg/mL)マトリゲルが充填されている。ゲル形成後、スフェロイドをチャネルのバルブ部分の上に静かに移し、10% FBSを含有する培地中で増殖させたが、hNからの神経突起伸長を遅延させつつhSCの増殖及び移動を促進するためのNGFを含んでいなかった。1週間後、上記インキュベーション溶液をNGF及びL-アスコルビン酸を補充した培地に交換して、伸長中の軸索と接触しているhSCによる神経突起の伸長及びミエリン形成を促進させた。
最後に、免疫染色及び共焦点顕微鏡観察と共に、プラスチック樹脂による包埋及び薄片作製を行い、TEMにより、上記システム中におけるミエリン形成のレベル及び質を評価した。上記システムにおける効果的なミエリン形成の証拠としては、コンパクトでないミエリン(図47のA)、コンパクトなミエリン(図47のB)、及びコンパクト化の過程のミエリン(図47のC)が挙げられたが、これらに限定されなかった。ミエリン形成の証拠が見られた軸索に関しては、有髄神経線維のG比は0.57±0.16であった。有髄及び無髄軸索の軸索径は、それぞれ0.55±0.33及び0.40±0.15μmであった。また、軸索なしでの層状ミエリン形成(図47のD)、細胞質内の層板小体の存在(図47のE)、及び裸(無髄)の軸索(図47のF)の証拠も見られた。比較的規則的な間隔のらせん状膜(membranen whorl)からなる細胞質内の層板小体の出現は、老化細胞小器官の再循環と一致するオートファゴソーム産生を表すと解釈された。層板小体の分布はまばらで、アポトーシス核は観察されず、これのことは、影響を受けた細胞がプログラムされた細胞死に関与していないことを示している。
ヒトシュワン細胞(hSC)が存在する場合としない場合で、iPSC由来のヒトニューロン(hN)の神経伝導速度(NCV)を測定することができるかどうかを判断するために、脳切片電気生理学と類似の技法を用いた。チャネル内の軸索を刺激し、細胞体からの複合活動電位(CAP)を記録した(図46のA)。軸索を細胞体から約1~3mm離れた箇所で刺激し、刺激用電極と記録用電極の間のインパルスの移動距離を計算した。最速のシグナルとピークシグナルとの間の差異を判定するために、2種類のNCV、すなわち開始NCVとピークNCVとを評価した(図46のB’及びB’’)。驚くべきことに、hN/hSC共培養物試料を用いた場合の開始及びピークNCVは、hN単独培養物試料と比較してより遅いことが判明した。75K hN単独培養及び75K/25K hN/hSC共培養物の開始NCVは、それぞれ0.28±0.07及び0.20±0.02m/sと測定される一方、ピークNCVは、それぞれ0.18±0.04及び0.13±0.02m/sであることが判った(図46のC)。SCの数が多い試料(75K/75K及び75K/50KでのhN/SCの共培養物)については、開始及びピークNCVの測定が困難であった。これらの試料の定性的な試験により、共培養物試料では神経突起伸長の密度がやや低くなることが明らかになっており、このことから、NCVが低下する可能性がある。
イン・ビトロ神経システムの製造における課題
初代hSCを用いたイン・ビトロミエリン形成は、成人の神経からのhSCの抽出8、9、線維芽細胞による汚染8~10、及びイン・ビトロでの増殖性/非ミエリン形成性表現型へのSCの形質転換11、12に伴う複雑な問題に一部起因して、長らく課題であった。胚性、新生児期、及び成体のげっ歯動物SCによるラット後根神経節(DRG)感覚ニューロンのミエリン形成に関しては、共培養条件は十分に確立されている13~15。しかしながら、同様の共培養条件では、ラットDRGニューロンと共に培養したヒトSCを用いてミエリン形成を再現できない11。初代ヒトSCを厳密に精製するまたはヒト幹細胞もしくはヒト線維芽細胞をSC様細胞へと分化させると、ラット感覚ニューロンのミエリン形成のレベルが制限されるという結果を招くが、混合種培養物で見られる上記制限の程度は、胚性ラットSCを用いて生じる上記制限の程度に比較して大幅に小さくなり11、16、それはおそらく、種の違い、または軸索の数と比較したSCの密度に起因すると思われる。最近、Clark及びその共同研究者ら17は、ラット幹細胞によるヒト幹細胞由来の感覚ニューロンのミエリン形成の実証に成功した。それでも、ヒトシュワン細胞によるヒトiPSC由来ニューロンのミエリン形成を示すイン・ビトロシステムは、依然としてとらえどころがない。
シュワン細胞の遊走は、発生及び損傷後の末梢神経再生の間の重要な現象である25。神経堤細胞の運命をシュワン細胞前駆体に、最終的にはシュワン細胞に向ける手がかりはほとんど知られていない。しかしながら、前駆細胞とシュワン細胞の両方が、分化、増殖、及び機能的成熟に関して、伸長する軸索に依存していることは数十年前から知られている26。本明細書において、本発明者らが初めて、hNとhSCから構成されるこのミニ神経節を作製することにより、イン・ビトロでのヒトの起源の組織へのこの遊走を観測することができた。軸索は、このプロセスで伸長する軸索に同調する、遊走するhSCと連動して外側に伸長した。hSCは、約5mmの全軸索伸長と比較して、スフェロイドの外側約1mmまでしか遊走していなかったことを観測したことは興味深いことであった。このことは、通例ではより小さい2次元領域中に100,000個を超えるシュワン細胞を添加する一般的な2次元共培養実験17、27と比較して、これらの実験中に添加した、ニューロンと比較したhSCの数が少ないことに起因する可能性がある。軸索伸長と比較して控えめなこのhSCの伸長は、ミエリン形成前の期間が僅かに1週間であることと、培養の第1週の後に培地にNGFを添加した結果である可能性もある。NGFによってニューロン-シュワン細胞間の相互作用及びミエリン形成も亢進することが明らかになっており28、そのことから、NGFはSCの遊走を低下させる因子である可能性がある。上記スフェロイド外のヒトSCの遊走に基づいて、このHNoaCモデルは、治療薬分子の存在下でのSCの遊走の潜在的能力を研究するためにも使用することができ、したがって末梢神経損傷の患者に対する治療薬の候補を創出することができる。
様々な神経障害が、様々な種類の神経生理学的特徴を示すことで知られている30。したがって、イン・ビトロでのマイクロエンジニアリングによる神経は、探索的な及び機構的な毒性学的研究を行うための手段として、電気生理学的変化を明らかにすることができるはずである。初めてヒトiPSC由来のニューロンを用いて神経伝導を検討したこの研究では、有髄及び無髄ヒト軸索間での神経伝導速度(NCV)の差異を確認でき、このことから、このシステムが神経機能を評価するのに十分に敏感であることがあきらかである。驚くべきことに、有髄hN/hSC共培養物試料では、無髄のhNのみの単独培養物試料と比較して、NCVがより遅いことが明らかになった。この培養物の定性的な調査により、当該スフェロイド中のhSCの数がHNoaCのチャネル中での伸長及び軸索密度を低下させていた可能性があり、それがNCVの低下につながりやすいことが明らかになった。また、高SC(50K及び75K)密度の共培養物では、多くの軸索が折り返しているように見えたことから、NCV計算に影響を与える可能性のある刺激を与えた点と記録した点との間の最適な長さを測定することができなかった。更に、共培養スフェロイド中に非神経細胞体が存在すると、適切に刺激された細胞体からの記録の確率が低下する。重要なことに、hNからのNCVは、ヒトの患者において得られたNCV値と比較してかなり低いことが判明した31~33。これは、室温の、イン・ビボで評価した神経の成熟した有髄軸索と比較して成熟度が低いiPSC由来のニューロンで構成されるイン・ビトロシステムを考慮すれば、特段驚くべきことではない。
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