JP2023015311A - 多量体、四量体および八量体 - Google Patents

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Abstract

【課題】エフェクタードメインの多量体を提供する。【解決手段】本発明は、ポリペプチドの四量体ならびにエフェクタードメイン（抗原結合部位（例えば、抗原またはｐＭＨＣに特異的に結合する抗体またはＴＣＲ結合部位、またはその可変ドメイン）など）またはインクレチン、インスリンもしくはホルモンペプチドなどのペプチドの四量体および八量体などの多量体に関する。【選択図】図１

Description

本発明は、ポリペプチドの四量体ならびにエフェクタードメイン（抗原結合部位（例えば、抗原またはｐＭＨＣに特異的に結合する抗体またはＴＣＲ結合部位、またはその可変ドメイン）など）またはインクレチン、インスリンもしくはホルモンペプチドなどのペプチドの四量体および八量体などの多量体に関する。
エフェクタードメインの多量体は、エフェクタードメインの活性および存在を組み合わせ、それを倍化するために医療および非医療の応用において有用性が認識されており、これは例えば、（例えば、抗体またはＴＣＲ結合ドメインであるエフェクタードメインについて）抗原結合のより高いアビディティを提供するため、または、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで標的リガンドとの二または多特異的標的化または相互作用を提供するためなど、生物活性または結合活性を増進させるためのものである。
タンパク質単量体の多量体への自己集合を引き起こす多量体化ドメインが当該技術分野において公知である。例としては、ｐ５３、ｐ６３およびｐ７３などの転写因子に見られるドメインの他に、ＴＲＰカチオンチャネルなどのイオンチャネルに見られるドメインが挙げられる。転写因子ｐ５３は、異なる機能ドメインに分けることができる：Ｎ末端トランス活性化ドメイン、プロリンリッチドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、四量体化ドメインおよびＣ末端調節領域。ヒトｐ５３の四量体化ドメインは、残基３２５～３５６から伸長しており、４－ヘリカルバンドルフォールドを有する（Jeffrey et al., Science (New York, N.Y.) 1995, 267(5203):1498-1502）。ＴＲＰＭ四量体化ドメインは、一過性受容体電位カチオンチャネルサブファミリーＭのメンバータンパク質１～８の短い逆平行コイルドコイル四量体化ドメインである。それは、大規模なコアパッキングおよび鎖間極性相互作用によって一緒に保持される（Fujiwara et al., Journal of Molecular Biology 2008, 383(4):854-870）。一過性受容体電位（ＴＲＰ）チャネルは、多様な形態の感覚入力に応答する四量体の陽イオン選択的イオンチャネルの大きいファミリーを構成する。別の例は、カリウムチャネルのＢＴＢドメインである。このドメインは、電位依存性カリウムチャネルタンパク質のＮ末端に見出すことができ、アルファサブユニットの機能的四量体チャネルへの集合に関与する細胞質四量体化ドメイン（Ｔ１）を表す（Bixby et al., Nature Structural Biology 1999, 6(1):38-43）。このドメインはまた、ＫＣＴＤ１（カリウムチャネル四量体化ドメイン含有タンパク質１；Ding et al., DNA and Cell Biology 2008, 27(5):257-265）のような、カリウムチャネルではないタンパク質にも見出すことができる。
多量体抗体断片は、ビオチン、ｄＨＬＸ、ＺＩＰおよびＢＡＤドメインの他にｐ５３などの様々な多量体化技術を使用して製造されてきた（Thie et al., Nature Boitech., 2009:26, 314-321）。製造が効率的であるビオチンは、ヒトにおいて免疫反応を誘導する細菌タンパク質である。
ヒトｐ５３（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０４６３７（Ｐ５３＿ＨＵＭＡＮ））は、多くの腫瘍種において腫瘍抑制因子として作用し、生理的環境および細胞種に応じて増殖停止またはアポトーシスを誘導する。それは、トランス活性化因子として細胞周期の調節に関与し、このプロセスのために必要とされる一連の遺伝子を制御することによって細胞分裂を負に調節するように作用する。ヒトｐ５３は、多様な形質転換細胞において増加した量で見出される。それは、約６０％のがんで頻繁に変異または不活性化されている。ヒトｐ５３の欠損はバレット化生において見られ、これは、下部食道の通常は層状の扁平上皮が化生性円柱上皮によって置換された状態である。この状態は、約１０％の患者において慢性胃食道逆流症を伴う合併症として発症し、食道腺癌の発症の素因となる。
ｐ５３の９つのアイソフォームが天然に存在し、広範な正常組織において組織依存的に発現される。アイソフォーム２は、ほとんどの正常組織において発現されるが、脳、肺、前立腺、筋肉、胎児脳、脊髄および胎児肝臓においては検出されない。アイソフォーム３は、ほとんどの正常組織において発現されるが、肺、脾臓、精巣、胎児脳、脊髄および胎児肝臓においては検出されない。アイソフォーム７は、ほとんどの正常組織において発現されるが、前立腺、子宮、骨格筋および乳房においては検出されない。アイソフォーム８は、結腸、骨髄、精巣、胎児脳および腸においてのみ検出される。アイソフォーム９は、ほとんどの正常組織において発現されるが、脳、心臓、肺、胎児肝臓、唾液腺、乳房または腸においては検出されない。
本発明は、以下を提供する：
第１の構成において
エフェクタードメイン（例えば、タンパク質ドメインまたはペプチド）の少なくとも第１、第２、第３および第４のコピーのタンパク質多量体であって、多量体が、会合して一緒になる第１、第２、第３および第４の自己会合性四量体化ドメイン（ＴＤ）によって多量体化されており、各四量体化ドメインが、前記タンパク質ドメインまたはペプチドの１つまたは複数のコピーを含む各々の操作されたポリペプチドによって構成されている、多量体。
第２の構成において
ＴＣＲ結合部位、インスリンペプチド、インクレチンペプチドまたはペプチドホルモンの単離された四量体または八量体、あるいは複数の前記四量体または八量体。
抗体結合部位または抗体可変ドメイン（例えば、単一可変ドメイン）の単離された四量体または八量体、あるいは複数の前記四量体または八量体。
一例では、四量体または八量体は、水溶液（例えば、水性真核細胞培養培地）中で可溶性である。一例では、四量体または八量体は、真核細胞中で発現可能である。例示は以下に提供される。
第３の構成において
（ａ）水溶液（例えば、水性真核細胞増殖培地または緩衝液）中で可溶性である、ＴＣＲ ＶドメインまたはＴＣＲ結合部位の四量体または八量体、
（ｂ）水溶液（例えば、水性真核細胞増殖培地または緩衝液）中で可溶性である、抗体単一可変ドメインの四量体または八量体、
（ｃ）ＨＥＫ２９３細胞によって細胞内および／または細胞外に発現可能である、ＴＣＲ ＶドメインまたはＴＣＲ結合部位の四量体または八量体、または
（ｄ）ＨＥＫ２９３細胞によって細胞内および／または細胞外に発現可能である、抗体可変ドメイン（例えば、抗体単一可変ドメイン）の四量体または八量体。
第４の構成において
本発明の多量体、四量体または八量体の操作されたポリペプチドまたは単量体。
第５の構成において
（Ｎ末端からＣ末端の方向に）
（ａ）ＴＣＲ Ｖ１－ＴＣＲ Ｃ１－抗体ＣＨ１（例えば、ＩｇＧ ＣＨ１）－場合により存在するリンカー－ＴＤを含み、
（ｉ）Ｖ１がＶαであり、かつＣ１がＣαであり、
（ｉｉ）Ｖ１がＶβであり、かつＣ１がＣβであり、
（ｉｉｉ）Ｖ１がＶγであり、かつＣ１がＣγであり、または
（ｉｖ）Ｖ１がＶδであり、かつＣ１がＣδであり、
または
（ｂ）ＴＣＲ Ｖ１－抗体ＣＨ１（例えば、ＩｇＧ ＣＨ１）－場合により存在するリンカー－ＴＤを含み、
（ｉ）Ｖ１がＶαであり、
（ｉｉ）Ｖ１がＶβであり、
（ｉｉｉ）Ｖ１がＶγであり、または
（ｉｖ）Ｖ１がＶδであり、
または
（ｃ）抗体Ｖ１－抗体ＣＨ１（例えば、ＩｇＧ ＣＨ１）－場合により存在するリンカー－ＴＤを含み、
（ｉ）Ｖ１がＶＨであり、または
（ｉｉ）Ｖ１がＶＬ（例えば、ＶλまたはＶκ）であり、
または
（ｄ）抗体Ｖ１－場合により存在する抗体ＣＨ１（例えば、ＩｇＧ ＣＨ１）－抗体Ｆｃ（例えば、ＩｇＧ Ｆｃ）－場合により存在するリンカー－ＴＤを含み、
（ｉ）Ｖ１がＶＨであり、または
（ｉｉ）Ｖ１がＶＬ（例えば、ＶλまたはＶκ）であり、
または
（ｅ）抗体Ｖ１－抗体ＣＬ（例えば、ＣλまたはＣκ）－場合により存在するリンカー－ＴＤを含み、
（ｉ）Ｖ１がＶＨであり、または
（ｉｉ）Ｖ１がＶＬ（例えば、ＶλまたはＶκ）であり、
または
（ｆ）ＴＣＲ Ｖ１－ＴＣＲ Ｃ１－場合により存在するリンカー－ＴＤを含み、
（ｉ）Ｖ１がＶαであり、かつＣ１がＣαであり、
（ｉｉ）Ｖ１がＶβであり、かつＣ１がＣβであり、
（ｉｉｉ）Ｖ１がＶγであり、かつＣ１がＣγであり、または
（ｉｖ）Ｖ１がＶδであり、かつＣ１がＣδである、
操作された（かつ場合により単離された）操作されたポリペプチド（Ｐ１）。
第６の構成において
本発明の操作されたポリペプチドまたは単量体をコードする核酸であって、場合により、該ポリペプチドを発現するための発現ベクターによって構成される、核酸。
第７の構成において
細胞内に発現および／または分泌された多量体を製造するためのタンパク質多量体の製造方法における本発明の核酸またはベクターの使用であって、該方法が、該核酸またはベクターを含む真核細胞中で該多量体を発現させることおよび／または該真核細胞から該多量体を分泌させることを含む、使用。
第８の構成において
（ａ）真核細胞中で発現されるＴＣＲ Ｖ－ＴＤ（例えば、ＮＨＲ２ ＴＤまたはＴＣＲ Ｖ－ｐ５３ ＴＤ）融合タンパク質の可溶性および／または細胞内発現を含み、場合により、複数の前記多量体を単離することを含む、ＴＣＲ Ｖドメイン多量体を製造する方法、
（ｂ）真核細胞中で発現される抗体Ｖ（例えば、単一可変ドメイン）－ＴＤ（例えば、Ｖ－ＮＨＲ２ ＴＤまたはＶ－ｐ５３ ＴＤ）融合タンパク質の可溶性および／または細胞内発現を含み、場合により、複数の前記多量体を単離することを含む、抗体Ｖドメイン多量体を製造する方法、
（ｃ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞などの真核細胞中で発現されるインクレチンペプチド－ＴＤ（例えば、インクレチンペプチド－ＮＨＲ２ ＴＤまたはインクレチンペプチド－ｐ５３ ＴＤ）融合タンパク質の可溶性および／または細胞内発現を含み、場合により、複数の前記多量体を単離することを含む、インクレチンペプチド（例えば、ＧＬＰ－１、ＧＩＰまたはインスリン）多量体を製造する方法、または
（ｄ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞などの真核細胞中で発現されるペプチドホルモン－ＴＤ（例えば、ペプチドホルモン－ＮＨＲ２ ＴＤまたはペプチドホルモン－ｐ５３ ＴＤ）融合タンパク質の可溶性および／または細胞内発現を含み、場合により、複数の前記多量体を単離することを含む、ペプチドホルモン多量体を製造する方法。
第９の構成において
本発明の核酸またはベクターを含む真核細胞中でグリコシル化された多量体を製造するためのタンパク質多量体の製造方法における、該核酸またはベクターの使用。
第１０の構成において
単量体および／または二量体ポリペプチドより高い収率で四量体を製造するための、ポリペプチドの四量体を製造する方法における自己会合性四量体化ドメイン（ＴＤ）（例えば、ＮＨＲ２ ＴＤ、ｐ５３ ＴＤ、ｐ６３ ＴＤもしくはｐ７３ ＴＤまたはそのホモログもしくはオルソログ）の使用。
第１１の構成において
単量体および／または二量体ポリペプチドより高い収率で四量体を製造するための、タンパク質ドメインまたはペプチドの複数のコピーを含むポリペプチドの四量体の製造方法における操作されたポリペプチドの使用であって、操作されたポリペプチドが、前記タンパク質ドメインまたはペプチドの１つまたは複数のコピーを含み、かつ自己会合性四量体化ドメイン（ＴＤ）（例えば、ＮＨＲ２ ＴＤ、ｐ５３ ＴＤ、ｐ６３ ＴＤもしくはｐ７３ ＴＤまたはホモログもしくはオルソログ）をさらに含む、使用。
第１２の構成において
単量体、二量体または三量体との混合状態ではない複数の四量体を製造するための、ポリペプチドの四量体の製造方法における自己会合性四量体化ドメイン（ＴＤ）（例えば、ＮＨＲ２ ＴＤ、ｐ５３ ＴＤ、ｐ６３ ＴＤもしくはｐ７３ ＴＤまたはそのホモログもしくはオルソログ）の使用。
第１３の構成において
本発明の多量体、四量体、八量体、操作されたポリペプチドまたは単量体の細胞内および／または分泌発現のための核酸またはベクターを含む真核宿主細胞。
第１４の構成において
単量体、二量体または三量体との混合状態ではない複数の四量体を製造するための、タンパク質ドメインまたはペプチドの複数のコピーを含むポリペプチドの四量体の製造方法における操作されたポリペプチドの使用であって、操作されたポリペプチドが、前記タンパク質ドメインまたはペプチドの１つまたは複数のコピーを含み、かつ自己会合性四量体化ドメイン（ＴＤ）（例えば、ＮＨＲ２ ＴＤ、ｐ５３ ＴＤ、ｐ６３ ＴＤもしくはｐ７３ ＴＤまたはホモログもしくはオルソログ）をさらに含む、使用。
第１５の構成において
（ｉ）ＴＣＲ細胞外ドメイン、
（ｉｉ）免疫グロブリン定常ドメイン、および
（ｉｉｉ）ＥＴＯのＮＨＲ２多量体化ドメイン
を含む、ｐＭＨＣ複合体に結合できる多価ヘテロ二量体可溶性Ｔ細胞受容体。
第１６の構成において
（ｉ）免疫グロブリン可変ドメイン、および
（ｉｉ）ＥＴＯのＮＨＲ２多量体化ドメイン
を含む、多量体免疫グロブリン。
第１７の構成において
可溶性の多量体ポリペプチドに集合させる方法であって、
（ａ）ＥＴＯのＮＨＲ２ドメインに融合した、前記多量体ポリペプチドの単量体を提供すること、
（ｂ）前記単量体の複数のコピーを会合させ、それによって多量体の可溶性ポリペプチドを得ること
を含む、方法。
第１８の構成において
（ｉ）本発明のポリペプチドをコードする細胞株（例えば、真核性の哺乳動物細胞株、例えば、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯまたはＣｏｓ細胞株）、および（ｉｉ）本発明の四量体を含む、混合物。
第１９の構成において
タンパク質エフェクタードメイン（例えば、抗体可変ドメインまたは結合部位）の四量体の収率を増進させる方法であって、該方法が、ポリペプチドの四量体を細胞株（例えば、哺乳動物細胞、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３またはＣｏｓ細胞株）から発現させることを含み、該ポリペプチドが、本発明のポリペプチドであり、かつ１つまたは複数のエフェクタードメインを含み、かつ、該方法が、場合により、前記発現された四量体を単離することを含む、方法。
本発明はまた、本発明の多量体、四量体または八量体を含む、医薬組成物、化粧品、食料品、飲料、洗浄用製品、洗浄剤も提供する。
ＮＨＲ２四量体化ドメインによって補助された、単量体およびホモ二量体を介した四価のヘテロ二量体可溶性ＴＣＲタンパク質複合体の段階的な自己集合を表す構成図である。 ＮＨＲ２四量体化ドメインおよび免疫グロブリンヒンジドメインによって補助された、単量体２およびホモ二量体２を介した八価のヘテロ二量体可溶性ＴＣＲタンパク質複合体の段階的な自己集合を表す構成図である。 ｔｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲを発現しかつ集合させるために使用されるａ鎖およびβ鎖のドメイン配置の構成図である。 ｏｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲを発現しかつ集合させるために使用されるａ鎖およびβ鎖のドメイン配置の構成図である。 ｔｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲタンパク質複合体のａ鎖およびβ鎖のアミノ酸配列である。交互となるドメインのアミノ酸配列に下線を引いている。 ｏｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲタンパク質複合体のａ鎖およびβ鎖のアミノ酸配列である。交互となるドメインのアミノ酸配列に下線を引いている。 ｔｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ－ＩＬ２融合タンパク質複合体を発現しかつ集合させるために使用されるａ鎖およびβ鎖のドメイン配置の構成図である。 ｏｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ－ＩＬ２融合タンパク質複合体を発現しかつ集合させるために使用されるａ鎖およびβ鎖のドメイン配置の構成図である。 ｔｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ－ＩＬ２融合タンパク質複合体のａ鎖およびβ鎖のアミノ酸配列である。交互となるドメインのアミノ酸配列に下線を引いている。 ｏｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ－ＩＬ２融合タンパク質複合体のａ鎖およびβ鎖のアミノ酸配列である。交互となるドメインのアミノ酸配列に下線を引いている。 ＮＨＲ２四量体化ドメインによって補助された、単量体およびホモ二量体を介した四価の単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）複合体の段階的な自己集合を表す構成図である。 リンカーおよびＮＨＲ２ドメインを含む、四価のｄＡｂの集合のためのドメイン配置の構成図である。 ＮＨＲ２四量体化ドメインによって補助された、単量体およびホモ二量体を介した四価のＦａｂ複合体の段階的な自己集合を表す構成図である。 重鎖中のリンカーおよびＮＨＲ２ドメイン、ならびに軽鎖可変および定常ドメインを含む、四価のＦａｂの集合のためのドメイン配置の構成図である。 ＮＨＲ２四量体化ドメインおよびＣＨ１ドメインに連結された抗体ヒンジ領域に補助された、単量体およびホモ二量体を介した八価のＦａｂ複合体の段階的な自己集合を表す構成図である。 重鎖中のヒンジ、リンカーおよびＮＨＲ２ドメイン、ならびに軽鎖可変および定常ドメインを含む、八価のＦａｂの集合のためのドメイン配置の構成図である。 Ｑｕａｄ １６およびＱｕａｄ １７の構成図である。 （Ａ）Ｑｕａｄ １６および（Ｂ）Ｑｕａｄ １７の単量体の配列および構成を示す。 同上 同上 同上 抗Ｉｇウエスタンブロットを使用した分泌タンパク質の解析を示す：（Ａ）ＳＤＳ変性条件下でのＰＡＧＥゲル－１６＝Ｑｕａｄ１６；１７＝Ｑｕａｄ１７；および（Ｂ）ネイティブ（すなわち、非変性）条件下でのＰＡＧＥゲル－１６＝Ｑｕａｄ１６；１７＝Ｑｕａｄ１７。 抗ヒトＩｇＧ ＨＲＰ検出抗体をプローブとした変性ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルから調製されたウエスタンブロットである。（Ａ）Ｑｕａｄ ３およびＱｕａｄ ４からのタンパク質試料を全細胞抽出物から調製し、それぞれレーン１およびレーン２に流した。Ｑｕａｄ ３およびＱｕａｄ ４について予測されるＭｗはそれぞれ４６．１および４６．４ｋＤａである。（Ｂ）Ｑｕａｄ １２およびＱｕａｄ １３からのタンパク質試料を全細胞抽出物から調製し、それぞれレーン１およびレーン２に流した。Ｑｕａｄ １２およびＱｕａｄ １３について予測されるＭｗはそれぞれ４７．８および４８．１ｋＤａである。 抗ヒトＩｇＧ ＨＲＰ検出抗体をプローブとした変性ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルから調製されたウエスタンブロットである。（Ａ）Ｑｕａｄ ３およびＱｕａｄ ４からのタンパク質試料を細胞上清を濃縮することによって調製し、それぞれレーン１およびレーン２に流した。Ｑｕａｄ ３およびＱｕａｄ ４について予測されるＭｗはそれぞれ４６．１および４６．４ｋＤａである。（Ｂ）Ｑｕａｄ １２およびＱｕａｄ １３からのタンパク質試料を細胞上清を濃縮することによって調製し、それぞれレーン１およびレーン２に流した。Ｑｕａｄ １２およびＱｕａｄ １３について予測されるＭｗはそれぞれ４７．８および４８．１ｋＤａである。 抗ＨＩＳ ＨＲＰ検出抗体をプローブとした変性ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルから調製されたウエスタンブロットである。（Ａ）Ｑｕａｄ １４、Ｑｕａｄ １５、Ｑｕａｄ １８およびＱｕａｄ １９からのタンパク質試料を全細胞抽出物から調製し、それぞれレーン１～４に流した。Ｑｕａｄ １４、Ｑｕａｄ １５、Ｑｕａｄ １８およびＱｕａｄ １９について予測されるＭｗはそれぞれ２２．０、２２．３、３７．４および３７．７ｋＤａである。（Ｂ）Ｑｕａｄ ２３、Ｑｕａｄ ２４、Ｑｕａｄ ２６およびＱｕａｄ ２７からのタンパク質試料を全細胞抽出物から調製し、それぞれレーン１～４に流した。Ｑｕａｄ ２３、Ｑｕａｄ ２４、Ｑｕａｄ ２６およびＱｕａｄ ２７について予測されるＭｗはそれぞれ３２．１、３２．４、３３．７および３４．０ｋＤａである。（Ｃ）Ｑｕａｄ ３４、およびＱｕａｄ ３８からのタンパク質試料を全細胞抽出物から調製し、それぞれレーン１～２に流した。Ｑｕａｄ ３４、およびＱｕａｄ ３８について予測されるＭｗはそれぞれ２５．５および２５．４ｋＤａである。（Ｄ）Ｑｕａｄ ４０、Ｑｕａｄ ４２、Ｑｕａｄ ４４およびＱｕａｄ ４６からのタンパク質試料を全細胞抽出物から調製し、それぞれレーン１～４に流した。Ｑｕａｄ ４０、Ｑｕａｄ ４２、Ｑｕａｄ ４４およびＱｕａｄ ４６について予測されるＭｗはそれぞれ２５．４、３７．６、２５．５および３８．０ｋＤａである。レーンＵは、トランスフェクトされていないＨＥＫ２９３Ｔ細胞（陰性対照）から調製された濃縮血清を含有し、Ｃは、抗Ｈｉｓ ＨＲＰ検出抗体について陽性対照として使用されたＨｉｓタグ化タンパク質である。血清抗Ｈｉｓバックグラウンドバンドを黒矢印で強調しており、これは全てのブロットにおいて一貫して検出することができる。 同上 （Ａ）変性ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルから調製され、抗ヒトＩｇＧ ＨＲＰ検出抗体をプローブとしたウエスタンブロットである。Ｑｕａｄ １４およびＱｕａｄ １５からのタンパク質試料を全細胞抽出物から調製し、それぞれレーン１およびレーン２に流した。Ｑｕａｄ １４およびＱｕａｄ １５について予測されるＭｗはそれぞれ２２．０および２２．３ｋＤａである。（Ｂ）抗ヒトＩｇＧ ＨＲＰ検出抗体をプローブとしたネイティブＰＡＧＥゲルから調製されたウエスタンブロットである。レーン１およびレーン２は、全細胞抽出物から調製されたＱｕａｄ １４およびＱｕａｄ １５からのタンパク質試料を含有する。 リーダーおよびタグ配列に融合したＱｕａｄポリペプチド（Quad polyeptides）である。リンカーが存在する場合、リンカーはＧ４Ｓ（１つのＧ４Ｓのみ）である。＊は、ＴＣＲのアルファ鎖とベータ鎖の間のＳ－Ｓ結合の形成を可能とするシステイン残基を導入されたＴＣＲ定常ドメインを示す。ヒトＩｇＧ１ヒンジを使用した。全てのＣ領域はヒトのものである。ＴＣＲ ＶドメインはＮＹ－ＥＳＯ－１に特異的である。ＧＦＰ＝緑色蛍光タンパク質。 同上 同上 本明細書中の全てのポリペプチドの図式およびアミノ酸配列はＮ末端からＣ末端に向けて書かれている。本明細書中の全てのヌクレオチド配列は５’から３’に向けて書かれている。
詳細な説明
本発明は、ポリペプチドの四量体およびエフェクタードメイン（抗原結合部位（例えば、抗原またはｐＭＨＣに特異的に結合する抗体またはＴＣＲ結合部位、またはその可変ドメイン）など）またはインクレチン、インスリンもしくはホルモンペプチドなどのペプチドの四量体および八量体などの多量体に関する。実施形態では、本発明の多量体は、真核系（eurkaryotic systems）での製造に有用であり、かつ、医薬品の製造、診断、イメージング剤、洗浄剤としてなど、様々な産業用途に有用な可溶性形態で真核細胞から分泌させることができる。エフェクタードメインまたはペプチドの四量体または八量体などのより高次の多量体は、抗原またはｐＭＨＣ結合アビディティを増進させるために有用である。これは、有効な薬剤の製造のため、または、多量体、四量体または八量体を含む診断試薬の感度の増進のために有用であり得る。追加的または代替的な利点は、例えば、対象における疾患または状態を治療または予防するために、本発明の多量体がヒトまたは動物対象に投与される時にｉｎ ｖｉｖｏでの半減期が増進されることである。有用なことに、本発明はまた、多特異的（例えば、二または三特異的）な多価結合タンパク質も提供することができる。特異性は、抗原またはｐＭＨＣ結合の特異性に関するものであり得る。結合ドメインまたはペプチドを含む単一の操作されたポリペプチドを使用することによって、本発明は、ある特定の例では、有用なことに高純度で多価の（例えば、二特異的な）タンパク質を製造するための手段を提供する。単一種の操作されたポリペプチド単量体の使用は、多（例えば、二）特異的または多価のタンパク質を製造するために２つまたはそれより多くの異なるポリペプチド種が使用される場合に見られる混合製造物の問題を回避する。
本発明は、以下の条項、態様および概念を提供する。本明細書中の任意の条項は、本明細書中の任意の態様または概念と組み合わせることができる。本明細書中の任意の態様は、本明細書中の任意の概念と組み合わせることができる。
態様：
１．エフェクタードメイン（例えば、タンパク質ドメイン）またはペプチドの少なくとも第１、第２、第３および第４のコピーのタンパク質多量体であって、前記多量体が、会合して一緒になる第１、第２、第３および第４の自己会合性四量体化ドメイン（ＴＤ）によって多量体化しており、各四量体化ドメインが、前記タンパク質ドメインまたはペプチドの１つまたは複数のコピーを含む各々の操作されたポリペプチドによって構成されている、多量体。
一例では、各ＴＤは、表２に列挙されたタンパク質１～１１９のいずれか１つのＴＤである。一例では、各ＴＤは、ｐ５３ ＴＤまたはそのホモログもしくはオルソログである。一例では、各ＴＤは、ＮＨＲ２ ＴＤまたはそのホモログもしくはオルソログである。一例では、各ＴＤは、ｐ６３ ＴＤまたはそのホモログもしくはオルソログである。一例では、各ＴＤは、ｐ７３ ＴＤまたはそのホモログもしくはオルソログである。一例では、各ＴＤは、ＮＨＲ２ ＴＤではない。一例では、各ＴＤは、ｐ５３ ＴＤではない。一例では、各ＴＤは、ｐ６３ ＴＤではない。一例では、各ＴＤは、ｐ７３ ＴＤではない。一例では、各ＴＤは、ｐ５３、６３または７３のＴＤではない。一例では、各ＴＤは、ＮＨＲ２、ｐ５３、６３または７３のＴＤではない。
「会合して一緒になる」とは、態様１のＴＤが、操作されたポリペプチドの第１、第２、第３および第４のコピーを多量体化して、多量体タンパク質、例えば、真核細胞または哺乳動物細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）の細胞内で（intracellulary）発現できるかつ／または真核細胞または哺乳動物細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）から細胞外に分泌できるかつ／または水性媒体（例えば、真核細胞または哺乳動物細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）培養培地）中で可溶性である多量体を提供することである。その例は、ＮＨＲ ＴＤ、ｐ５３ ＴＤ、ｐ６３ ＴＤおよびｐ７３ ＴＤ（例えば、ヒトのＮＨＲ ＴＤ、ｐ５３ ＴＤ、ｐ６３ ＴＤおよびｐ７３ ＴＤ）またはこれらのオルソログもしくはホモログである。
一例では、ＴＤは、ｐ５３ ＴＤ（またはそのホモログもしくはオルソログ）ではなく、例えば、ヒトｐ５３ ＴＤ（またはそのホモログもしくはオルソログ）ではない。一例では、ＴＤは、ＮＨＲ２ ＴＤまたはそのホモログもしくはオルソログであるが、ｐ５３ ＴＤまたはそのホモログもしくはオルソログではない。一例では、ＴＤは、ヒトＮＨＲ２ ＴＤまたはそのホモログもしくはオルソログであるが、ヒトｐ５３ ＴＤまたはそのホモログもしくはオルソログではない。一例では、ＴＤは、ヒトＮＨＲ２である。一例では、ＴＤのアミノ酸配列は、ヒトＮＨＲ２の配列に少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８または９９％同一である。一例では、ドメインまたはペプチドは、ＮＨＲ２ ＴＤも含むポリペプチドによって天然に構成されるものではない。
一例では、ポリペプチドのドメインの全ては、ヒトのものである。
操作されたポリペプチドは、前記ＴＤのコピーのＮ末端に前記ドメインまたはペプチドの１つまたは複数のコピーを含んでもよい。追加的または代替的に、操作されたポリペプチドは、前記ＴＤのコピーのＣ末端に前記ドメインまたはペプチドの１つまたは複数のコピーを含んでもよい。一例では、操作されたポリペプチドは、第１の第１の前記ドメインまたはペプチドおよびＴＤを含み、第１のドメインまたはペプチドは、ＴＤから少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００個の連続するアミノ酸だけ離れており、第１のドメインまたはペプチドとＴＤとの間にさらなる前記ドメインまたはペプチドは存在しない。
一例では、多量体（例えば、前記操作されたポリペプチドの四量体）は、４つの（但し、４つより多くない）ＴＤ（例えば、同一のＴＤ）および４、８、１２または１６の（但し、それぞれ前記の４、８、１２または１６より多くない）コピーの前記ドメインまたはペプチドを含む。一例では、各ＴＤおよび各前記ドメインまたはペプチドは、ヒトのものである。
一例では、多量体、四量体または八量体は、操作されたポリペプチドの第１、第２、第３および第４の同一のコピーを含み、該ポリペプチドは、ＴＤおよび１つ（但し、１つより多くない）、２つ（但し、２つより多くない）、またはそれより多くのコピーの前記タンパク質ドメインまたはペプチドを含む。
一部の実施形態では、本発明の多量体、四量体または八量体を形成するためにたった１種の操作されたポリペプチドを必要とすることによって、本発明は、有利なことに、純粋な（または高純度、すなわち９０、９５、９６、９７、９８または９９％より高い純度）のフォーマットで容易に単離できるフォーマットの他に、純粋な（または高純度の）形態でそのようなフォーマットを製造する方法を提供する。純度は、任意の他の多量体またはポリペプチド単量体との組成物中で混合状態でないか、または、本発明の多量体、および、操作されたポリペプチド（polyeptide）を含む他の多量体および／またはポリペプチド単量体を含む組成物中で９０、９５、９６、９７、９８または９９％より多くの種を含む、本発明の多量体によって指し示される。したがって、これらの実施形態において異なる種類のポリペプチドの混合物が回避または最小化される。したがって、これはまた、有利なことに、１（１つより多くない）種類のみの操作されたポリペプチドを含む複数の多量体（例えば、複数の四量体または八量体）であって、抗原結合について一特異的（であるが多価）である、または代替的に抗原結合について二もしくは多特異的である、多量体を提供する。したがって、本発明は、複数の多量体（例えば、複数の四量体または八量体であって、各ポリペプチドが、抗原結合について少なくとも四価であり、かつ（ｉ）二特異的（すなわち、２つの異なる抗原に特異的に結合できる）であるか、または（ｉｉ）抗原結合について一特異的かつ少なくとも四価である、多量体を提供する。本明細書において抗原結合が記載される場合、ドメインがＴＣＲ Ｖドメインである場合にはこれは代替的にｐＭＨＣ結合であり得る。有利には、該複数物は、純粋形態（すなわち、１つより多くの種類のポリペプチド単量体を含む多量体（例えば、四量体または八量体）と混合されていない）である。一例では、多量体は、少なくとも２つの異なる種類の抗原結合部位を含む。一例では、多量体は、二特異的、三特異的または四特異的である。一例では、多量体は、４、６、８、１０または１２、好ましくは４または８の、抗原結合部位またはｐＭＨＣ結合部位の価数を有する。
一例では、ペプチドＭＨＣ（ｐＭＨＣ）は、クラスＩまたはクラスＩＩのｐＭＨＣである。
例えば、ドメイン、抗体または結合部位に関して、本明細書で使用される「特異的に結合する」という用語は、ドメイン、抗体または結合部位が、ＳＰＲによって決定される１ｍＭまたはそれ未満の結合親和性で特定の抗原（またはｐＭＨＣ）を認識することを意味する。
標的結合能力、特異性および親和性（ＫＤ（Ｋｄとも称される）、Ｋｏｆｆおよび／またはＫｏｎ）は、当該技術分野における任意のルーチンな方法、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、決定することができる。本明細書で使用される「ＫＤ」という用語は、特定の結合部位／リガンド、受容体／リガンドまたは抗体／抗原の相互作用の平衡解離定数を指す意図である。一実施形態では、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）は、２５℃で実行される。別の実施形態では、ＳＰＲは、３７℃で実行される。一実施形態では、ＳＰＲは、生理的ｐＨ、例えば約ｐＨ７またはｐＨ７．６で（例えば、ｐＨ７．６のＨｅｐｅｓ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ－ＥＰとも称される）を使用して）実行される。一実施形態では、ＳＰＲは、生理的塩レベル、例えば１５０ｍＭ ＮａＣｌで実行される。一実施形態では、ＳＰＲは、０．０５体積％以下の界面活性剤レベル、例えば、０．０５％のＰ２０（ポリソルベート２０；例えば、Ｔｗｅｅｎ－２０（商標））および３ｍＭのＥＤＴＡの存在下で、実行される。一例では、ＳＰＲは、２５℃または３７℃で、ｐＨ７．６の緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％の界面活性剤（例えば、Ｐ２０）および３ｍＭ ＥＤＴＡで実行される。緩衝液は、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓを含有し得る。一例では、ＳＰＲは、２５℃または３７℃でＨＢＳ－ＥＰ中で実行される。ＨＢＳ－ＥＰは、Ｔｅｋｎｏｖａ Ｉｎｃ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ；カタログ番号Ｈ８０２２）から入手することができる。一例では、親和性（例えば、ＶＨ／ＶＬ結合部位の親和性）は、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）などの任意の標準的なＳＰＲ装置を使用するか、またはＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６（商標）（Ｂｉｏ－Ｒａｄ（登録商標））を使用することによってＳＰＲを使用して決定される。結合データは、例えば、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６（商標）解析ソフトウェアに固有のモデルを使用して、標準技術を使用して固有の１：１モデルにフィッティングすることができる。
一例では、本発明の多量体、四量体または八量体は、単離された多量体、四量体または八量体である。一例では、本発明の多量体、四量体または八量体は、前記操作されたポリペプチドのコピーからなる。場合により、本発明の多量体、四量体または八量体は、４つまたは８つであるがそれぞれ４つまたは８つより多くないコピーの操作されたポリペプチドを含む。
「操作された」は、ポリペプチドが天然に存在しないこと、例えば、タンパク質ドメインまたはペプチドが、前記ＴＤも含むポリペプチドによって天然には構成されないことを意味する。
各前記タンパク質ドメインまたはペプチドは、生物学的に活性のドメインまたはペプチド（例えば、ヒトまたは動物中で生物学的に活性）であってよく、例えば、抗原またはペプチドＭＨＣ（ｐＭＨＣ）に特異的に結合するドメインであるか、または、抗原またはｐＭＨＣ結合部位によって構成されるドメインである。代替としては、ドメインまたはペプチドは、インクレチンまたはインスリンペプチドなどの、炭水化物、グルコースまたは糖調節剤である。代替としては、ドメインまたはペプチドは、阻害剤または酵素、またはヒトもしくは動物中の生物学的機能もしくは経路の阻害剤である。代替としては、ドメインまたはペプチドは、鉄調節剤である。したがって、一例では、各タンパク質ドメインまたはペプチドは、抗原またはｐＭＨＣ結合ドメインもしくはペプチド；ホルモン；炭水化物、グルコースまたは糖調節剤；鉄調節剤；および酵素阻害剤から選択される。
２．前記ドメインまたはペプチドの四量体または八量体である、任意の先行する態様の多量体。
３．免疫グロブリンスーパーファミリー結合部位（例えば、ｓｃＦｖまたはｓｃＴＣＲなどの、抗体またはＴＣＲ結合部位）の四量体または八量体を含む、任意の態様１または２の多量体。
免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）は、細胞の認識、結合、または接着プロセスに関与する細胞表面および可溶性タンパク質の大きいタンパク質スーパーファミリーである。分子は、免疫グロブリン（抗体としても公知）と共有する構造的特色に基づいてこのスーパーファミリーのメンバーとして分類され、それらは全て、免疫グロブリンドメインまたはフォールドとして公知のドメインを持つ。ＩｇＳＦのメンバーとしては、細胞表面抗原受容体、免疫系の補助受容体および共刺激分子、リンパ球への抗原提示に関与する分子、細胞接着分子、ある特定のサイトカイン受容体および細胞内筋肉タンパク質が挙げられる。それらは、通常、免疫系での役割に関連する。
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ドメインは、Ｖα（例えば、Ｖβとペア形成）、Ｖβ（例えば、Ｖαとペア形成）、Ｖｙ（例えば、Ｖδとペア形成）またはＶδ（例えば、Ｖｙとペア形成）であり得る。
４．前記結合部位が、第２の可変ドメインとペア形成した第１の可変ドメインを含む、態様３の多量体。
第１の例では、第１および第２の可変ドメインは、操作されたポリペプチドによって構成される。別の例では、第１のドメインは、操作されたポリペプチドによって構成され、かつ、第２のドメインは、該操作されたポリペプチドとは異なる（かつ場合により、ＴＤを含むか、またはＴＤを欠いている）さらなるポリペプチドによって構成される。
代替としては、ドメインは、定常領域ドメインである。代替としては、ドメインは、ＦｃＡｂである。代替としては、ドメインは、非Ｉｇ抗原結合部位であるか、または非Ｉｇ抗原結合部位、例えばアフィボディによって構成される。
抗原結合部位およびエフェクタードメイン
一例では、該または各抗原結合部位（またはエフェクタードメイン）は、抗体可変ドメイン（例えば、ＶＬまたはＶＨ、抗体単一可変ドメイン（ドメイン抗体またはｄＡｂ）、ラクダ科動物ＶＨＨ抗体単一可変ドメイン、サメ免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＮＡ Ｖ）、Ｎａｎｏｂｏｄｙ（商標）またはラクダ化ＶＨ単一可変ドメイン）；Ｔ細胞受容体結合ドメイン；免疫グロブリンスーパーファミリードメイン；無顎類動物可変リンパ球受容体（J Immunol; 2010 Aug l;185(3):1367-74; "Alternative adaptive immunity in jawless vertebrates; Herrin BR & Cooper M D.）；フィブロネクチンドメイン（例えば、Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標））；ｓｃＦｖ；（ｓｃＦｖ）２；ｓｃ－ｄｉａｂｏｄｙ；ｓｃＦａｂ；センチリンおよびＣＴＬＡ－４から選択されるスキャフォールドに由来する抗原結合部位（Ｅｖｉｂｏｄｙ（商標））；リポカリンドメイン；プロテインＡのＺドメインなどのプロテインＡ（例えば、Ａｆｆｉｂｏｄｙ（商標）またはＳｐＡ）；Ａドメイン（例えば、Ａｖｉｍｅｒ（商標）またはＭａｘｉｂｏｄｙ（商標））；熱ショックタンパク質（ＧｒｏＥＩおよびＧｒｏＥＳに由来するエピトープ結合ドメインなど）；トランスフェリンドメイン（例えば、トランスボディ）；アンキリンリピートタンパク質（例えば、ＤＡＲＰｉｎ（商標））；ペプチドアプタマー；Ｃ型レクチンドメイン（例えば、Ｔｅｔｒａｎｅｃｔｉｎ（商標））；ヒトγ－クリスタリンまたはヒトユビキチン（アフィリン）；ＰＤＺドメイン；サソリ毒素；およびヒトプロテアーゼ阻害剤のクニッツ型ドメインからなる群から選択される。
抗原結合部位のさらなる供給源は、国際公開第２００７０２４７１５号パンフレットの第４０頁第２３行から第４３頁第２３行目に開示される抗体の可変ドメインおよびＶＨ／ＶＬペアである。この特定の開示は、本発明において使用するためおよび本出願の請求項に含めることを可能とするためのエピトープ結合部分についての基礎を提供するべく本明細書に明示的に記載されているかのように、参照することにより本明細書に組み込まれる。
「ドメイン」は、タンパク質の残りの部分から独立した三次構造を有する、フォールディングしたタンパク質構造である。一般に、ドメインは、タンパク質の個別の機能的特性に関与し、多くの場合に、タンパク質の残りの部分および／またはドメインの機能を失うことなく付加し、除去し、または他のタンパク質に移すことができる。「単一抗体可変ドメイン」は、抗体可変ドメインに特徴的な配列を含むフォールディングしたポリペプチドドメインである。したがって、単一抗体可変ドメインには、完全な抗体可変ドメインおよび改変された可変ドメイン、例えば、１つまたは複数のループが、抗体可変ドメインに特徴的ではない配列によって置換されたもの、または、切断されているか、またはＮ末端もしくはＣ末端の伸長を含む抗体可変ドメインの他に、全長ドメインの少なくとも結合活性および特異性を保持する可変ドメインのフォールディングした断片が含まれる。
「免疫グロブリン単一可変ドメイン」または「抗体単一可変ドメイン」という語句は、異なるＶ領域またはドメインから独立した抗原またはエピトープに特異的に結合する抗体可変ドメイン（ＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬ）を指す。免疫グロブリン単一可変ドメインは、他の異なる可変領域または可変ドメインを有するフォーマット（例えば、ホモまたはヘテロ多量体）で存在することができ、該他の領域またはドメインは、単一免疫グロブリン可変ドメインによる抗原結合のために必要とされない（すなわち、免疫グロブリン単一可変ドメインは、追加の可変ドメインから独立して抗原に結合する）。「ドメイン抗体」または「ｄＡｂ」は、該用語が本明細書で使用される場合、抗原に結合できる「免疫グロブリン単一可変ドメイン」と同じである。免疫グロブリン単一可変ドメインは、ヒト抗体可変ドメインであり得るが、齧歯類動物などの他の種からの単一抗体可変ドメイン（例えば、国際公開第００／２９００４号パンフレットに開示されるものなど）、テンジクザメおよびラクダ科動物ＶＨＨ免疫グロブリン単一可変ドメインも挙げられる。ラクダ科動物ＶＨＨは、ラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダ、およびグアナコなどの種に由来する免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドであり、天然に軽鎖を欠いている重鎖抗体を産生する。そのようなＶＨＨドメインは、当該技術分野において利用可能な標準技術にしたがってヒト化することができ、そのようなドメインはなおも、本発明による「ドメイン抗体」と考えられる。本明細書で使用される「ＶＨとしては、ラクダ科動物ＶＨＨドメインが挙げられる。ＮＡ Ｖは、テンジクザメなどの軟骨魚で同定された別の種類の免疫グロブリン単一可変ドメインである。これらのドメインもまた、新規抗原受容体可変領域（Novel Antigen Receptor variable region）（Ｖ（ＮＡＲ）またはＮＡＲＶと一般に略記される）として公知である。さらなる詳細については、Mol. Immunol. 44, 656-665 (2006)および米国特許出願公開第２００５００４３５１９号明細書を参照。ＣＴＬＡ－４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４）は、主にＣＤ４＋ Ｔ細胞上に発現されるＣＤ２８ファミリー受容体である。その細胞外ドメインは、可変ドメイン様のＩｇフォールドを有する。抗体のＣＤＲに対応するループを異種配列と置換して異なる結合特性を付与することができる。異なる結合特異性を有するように操作されたＣＴＬＡ－４分子は、Ｅｖｉｂｏｄｙとしても公知である。さらなる詳細については、Journal of Immunological Methods 248 (1-2), 31-45 (2001)を参照。リポカリンは、ステロイド、ビリン、レチノイドおよび脂質などの疎水性小分子を輸送する細胞外タンパク質のファミリーである。それらは、異なる標的抗原に結合するように操作できる円錐構造の解放端に数多く（numer of）のループを有する堅固なβシート二次構造を有する。アンチカリンは、１６０～１８０アミノ酸の大きさであり、リポカリンに由来する。さらなる詳細については、Biochim Biophys Acta 1482: 337-350 (2000)、米国特許第７２５０２９７号明細書および米国特許出願公開第２００７０２２４６３３号明細書を参照。アフィボディは、抗原に結合するように操作できる、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）のプロテインＡに由来するスキャフォールドである。該ドメインは、約５８アミノ酸の３ヘリカルバンドルからなる。表面残基の無作為化によってライブラリーが生成されている。さらなる詳細については、Protein Eng. Des. Sel. 17, 455-462 (2004)および欧州特許出願公開第１６４１８１８号明細書を参照。Ａｖｉｍｅｒ（商標）は、Ａドメインスキャフォールドファミリーに由来するマルチドメインタンパク質である。約３５アミノ酸の天然ドメインは、確定されたジスルフィド結合の構造をとる。Ａドメインのファミリーが呈する天然のバリエーションをシャッフルすることによって多様性が生成される。さらなる詳細については、Nature Biotechnology 23(12), 1556 - 1561 (2005)およびExpert Opinion on Investigational Drugs 16(6), 909-917 (June 2007)を参照。トランスフェリンは、単量体の血清輸送糖タンパク質である。トランスフェリンは、許容性の表面ループにペプチド配列を挿入することによって異なる標的抗原に結合するように操作することができる。操作されたトランスフェリンスキャフォールドの例としては、Ｔｒａｎｓ－ｂｏｄｙが挙げられる。さらなる詳細については、J. Biol. Chem 274, 24066-24073 (1999)を参照。Ｄｅｓｉｇｎｅｄ Ａｎｋｙｒｉｎ Ｒｅｐｅａｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＤＡＲＰｉｎ（商標））は、細胞骨格への必須膜タンパク質の接着を媒介するタンパク質のファミリーであるアンキリンに由来する。単一のアンキリンリピートは、２つのａヘリックスおよびβターンからなる３３残基のモチーフである。それらは、各リピートの第１のａヘリックスおよびβターン中の残基を無作為化することによって異なる標的抗原に結合するように操作することができる。それらの結合インターフェースは、モジュールの数を増加させることによって増加させることができる（親和性成熟の方法）。さらなる詳細については、J. Mol. Biol. 332, 489-503 (2003)、PNAS 100(4), 1700-1705 (2003)およびJ. Mol. Biol. 369, 1015-1028 (2007)、および米国特許出願公開第２００４０１３２０２８号明細書を参照。フィブロネクチンは、抗原に結合するように操作できるスキャフォールドである。Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）は、ヒトフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）の１５個の反復単位の１０番目のドメインの天然アミノ酸配列の骨格からなる。βサンドイッチの１つの末端の３つのループを操作して、Ａｄｎｅｃｔｉｎが目的の治療標的を特異的に認識することを可能とすることができる。さらなる詳細については、Protein Eng. Des. Sel. 18, 435- 444 (2005)、米国特許出願２００８０１３９７９１号明細書、国際公開第２００５０５６７６４号パンフレットおよび米国特許第６８１８４１８号明細書を参照。ペプチドアプタマーは、定常スキャフォールドタンパク質からなるコンビナトリアル認識分子であり、定常スキャフォールドタンパク質は、典型的に、活性部位に挿入された制約された可変ペプチドループを含有するチオレドキシン（ＴｒｘＡ）である。さらなる詳細については、Expert Opin. Biol. Ther. 5, 783-797 (2005)を参照。ミクロボディは、３～４個のシステインブリッジを含有する２５～５０アミノ酸長の天然に存在する小型タンパク質に由来し、小型タンパク質の例としては、ＫａｌａｔａＢＩおよびコノトキシンおよびノッティンが挙げられる。小型タンパク質は、小型タンパク質の全体的なフォールドに影響することなく２５アミノ酸までを含むように操作できるループを有する。操作されたノッティンドメインのさらなる詳細については、国際公開第２００８０９８７９６号パンフレットを参照。他のエピトープ結合部分およびドメインとしては、異なる標的抗原結合特性を操作するためのスキャフォールドとして使用されてきたタンパク質が挙げられ、ヒトγ－クリスタリンおよびヒトユビキチン（アフィリン）、ヒトプロテアーゼ阻害剤のクニッツ型ドメイン、Ｒａｓ結合タンパク質ＡＦ－６のＰＤＺドメイン、サソリ毒素（カリブドトキシン）、Ｃ型レクチンドメイン（テトラネクチン）が挙げられ、これらは、Non-Antibody Scaffolds from Handbook of Therapeutic Antibodies (2007, edited by Stefan Dubel)のChapter 7およびProtein Science 15:14-27 (2006)において総説されている。
５．各ポリペプチドが、前記タンパク質ドメインまたはペプチドの第１および第２のコピーを含み、前記ポリペプチドが、（Ｎ末端からＣ末端の方向に）（ｉ）前記第１のコピー－ＴＤ－前記第２のコピー；（ｉｉ）ＴＤ－ならびに前記第１および第２のコピー；または（ｉｉｉ）前記第１および第２のコピー－ＴＤを含む、任意の先行する態様の多量体。
６．前記ＴＤがＮＨＲ２ ＴＤであり、かつ、前記ドメインまたはペプチドがＮＨＲ２ドメインまたはペプチドではない；または、前記ＴＤがｐ５３ ＴＤであり、かつ、前記ドメインまたはペプチドがｐ５３ドメインまたはペプチドではない、任意の先行する態様の多量体。
７．前記操作されたポリペプチドが、第２の種類のタンパク質ドメインまたはペプチドの１つまたは複数のコピーを含み、前記第２の種類のタンパク質ドメインまたはペプチドが、前記第１のタンパク質ドメインまたはペプチドとは異なる、任意の先行する態様の多量体。
例えば、ポリペプチドは、Ｎ末端方向に、（ｉ）Ｐ１－ＴＤ－Ｐ２；または（ｉｉ）ＴＤ－Ｐ１－Ｐ２を含み、Ｐ１は、第１の種類（すなわち、態様１の多量体のドメインまたはペプチドの種類）のドメインまたはペプチドのコピーであり、かつ、Ｐ２は、前記第２の種類のドメインまたはペプチドのコピーである。
８．前記ドメインが、免疫グロブリンスーパーファミリードメインである、任意の先行する態様の多量体。
９．前記メインまたはペプチドが、抗体可変もしくは定常ドメイン（例えば、抗体単一可変ドメイン）、ＴＣＲ可変もしくは定常ドメイン、インクレチン、インスリンペプチド、またはホルモンペプチドである、任意の先行する態様の多量体。
１０．前記多量体が、前記操作されたポリペプチドの第１、第２、第３および第４の同一のコピーを含み、前記ポリペプチドが、ＴＤ、および、前記タンパク質ドメインまたはペプチドの１つ（但し、１つより多くない）、２つ（但し、２つより多くない）またはそれより多くのコピーを含む、任意の先行する態様の多量体。
１１．前記操作されたポリペプチドが、抗体またはＴＣＲ可変ドメイン（Ｖ１）およびＮＨＲ２ ＴＤを含む、任意の先行する態様の多量体。
１２．前記ポリペプチドが、（Ｎ末端からＣ末端の方向に）（ｉ）Ｖ１－場合により存在するリンカー－ＮＨＲ２ ＴＤ；（ｉｉ）Ｖ１－場合により存在するリンカー－ＮＨＲ２ ＴＤ－場合により存在するリンカー－Ｖ２；または（ｉｉｉ）Ｖ１－場合により存在するリンカー－Ｖ２－場合により存在するリンカー－ＮＨＲ２ ＴＤを含み、Ｖ１およびＶ２が、ＴＣＲ可変ドメインであり、かつ同一もしくは異なり、または、Ｖ１およびＶ２が、抗体可変ドメインであり、かつ同一もしくは異なる、態様１１の多量体。
１３．Ｖ１およびＶ２が、抗体単一可変ドメインである、態様１２の多量体。
１４．各操作されたポリペプチドが、（Ｎ末端からＣ末端の方向に）Ｖ１－場合により存在するリンカー－ＮＨＲ２ ＴＤを含み、Ｖ１が、抗体またはＴＣＲ可変ドメインであり、かつ、各操作されたポリペプチドが、Ｖ２を含む各々の第２の操作されたポリペプチドとペア形成しており、Ｖ２が、それぞれＶ１とペア形成して抗原またはｐＭＨＣ結合部位を形成する抗体またはＴＣＲ可変ドメインであり、かつ、場合により、１つのポリペプチドが、抗体Ｆｃを含み、または抗体ＣＨ１を含み、かつ、他のポリペプチドが、ＣＨ１とペア形成する抗体ＣＬを含む、態様１１の多量体。
１５．前記ＴＤが、（ｉ）配列番号１０もしくは１２６に同一またはそれに対して少なくとも８０％同一のアミノ酸配列；または（ｉｉ）配列番号１２０もしくは１２３に同一またはそれに対して少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む、任意の先行する態様の多量体。
１６．前記多量体が、レオプロ（ReoPro（商標））；アブシキシマブ；リツキサン（Rituxan（商標））；リツキシマブ；ゼナパックス（Zenapax（商標））；ダクリズマブ；シムレクト（Simulect（商標））；バシリキシマブ；シナジス（Synagis（商標））；パリビズマブ；レミケード（Remicade（商標））；インフリキシマブ；ハーセプチン（Herceptin（商標））；マイロターグ（Mylotarg（商標））；ゲムツズマブ；キャンパス（Campath（商標））；アレムツズマブ；ゼヴァリン（Zevalin（商標））；イブリツモマブ；ヒュミラ（Humira（商標））；アダリムマブ；ゾレア（Xolair（商標））；オマリズマブ；ベキサール（Bexxar（商標））；トシツモマブ；ラプティバ（Raptiva（商標））；エファリズマブ；アービタックス（Erbitux（商標））；セツキシマブ；アバスチン（Avastin（商標））；ベバシズマブ；タイサブリ（Tysabri（商標））；ナタリズマブ；アクテムラ（Actemra（商標））；トシリズマブ；ベクティビックス（Vectibix（商標））；パニツムマブ；ルセンティス（Lucentis（商標））；ラニビズマブ；ソリリス（Soliris（商標））；エクリズマブ；シムジア（Cimzia（商標））；セルトリズマブ；シンポニー（Simponi（商標））；ゴリムマブ、イラリス（Ilaris（商標））；カナキヌマブ；ステラーラ（Stelara（商標））；ウステキヌマブ；アーゼラ（Arzerra（商標））；オファツムマブ；プロリア（Prolia（商標））；デノスマブ；ヌマックス（Numax（商標））；モタビズマブ；アブスラックス（ABThrax（商標））；ラキシバクマブ；ベンリスタ（Benlysta（商標））；ベリムマブ；ヤーボイ（Yervoy（商標））；イピリムマブ；アドセトリス（Adcetris（商標））；ブレンツキシマブ；ベドチン（Vedotin（商標））；パージェタ（Perjeta（商標））；ペルツズマブ；カドサイラ（Kadcyla（商標））；アド・トラスツズマブ；キイトルーダ（Keytruda（商標））、オプジーボ（Opdivo（商標））、ガザイバ（Gazyva（商標））およびオビヌツズマブからなる群から選択される抗体の抗原結合部位の四量体または八量体を含む、任意の先行する態様の多量体。
例えば、操作されたポリペプチドの前記タンパク質ドメインは、前記群から選択される抗体の抗体結合部位のＶドメイン（ＶＨまたはＶＬ）であり、多量体は、操作されたポリペプチドのＶドメインとペア形成して選択された抗体の抗原結合部位を形成するさらなるＶドメイン（それぞれＶＬまたはＶＨ）を含む。したがって、有利なことに、本発明は、前記選択された抗体の結合部位の四量体または八量体を提供し、これは、有益には、その同種抗原（cognate antigen）に結合するため、または、多量体が投与されてｉｎ ｖｉｖｏで同種抗原に結合するヒトまたは動物における疾患または状態を治療または予防するための、向上した親和性、アビディティおよび／または有効性を有し得る。
例えば、多量体、四量体または八量体は、抗体の抗原結合部位の４つのコピーを含み、抗体は、アダリムマブ、サリルマブ、デュピルマブ、ベバシズマブ（例えば、アバスチン（商標））、セツキシマブ（例えば、アービタックス（商標））、トシリズマブ（例えば、アクテムラ（商標））またはトラスツズマブ（ハーセプチン（商標））である。代替としては、抗体は、抗ＣＤ３８抗体、抗ＴＮＦａ抗体、抗ＴＮＦＲ抗体、抗ＩＬ－４Ｒａ抗体、抗ＩＬ－６Ｒ抗体、抗ＩＬ－６抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＣＳＫ９抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ１３８抗体、抗ＩＬ－１抗体である。代替としては、抗体は、国際公開第２００７０２４７１５号パンフレットの第４０頁第２３行から第４３頁第２３行（その開示は、参照することにより本明細書に組み込まれる）に開示される抗体から選択される。
本発明における結合部位は、例えば、受容体（例えば、ＫＤＲまたはＦｌｔ）のリガンド（例えば、サイトカインまたは増殖因子、例えば、ＶＥＧＦまたはＥＧＦＲ）結合部位であってよい。例えば、本発明における結合部位は、例えば、ヒトまたは動物における目または腫瘍の医療用途のための、アイリーア（Eyelea）（商標））、アバスチン（商標）またはルセンティス（商標）の結合部位であってよい。リガンドまたは抗原がＶＥＧＦである場合、多量体（mutlimer）、四量体または八量体は、ヒトまたは動物対象におけるがん（caner）または目の状態（例えば、滲出型もしくは萎縮型ＡＭＤまたは糖尿病網膜症）の治療または予防のため、または血管新生の阻害剤としてのものであり得る。
１７．ＴＣＲ結合部位、インスリンペプチド、インクレチンペプチドまたはペプチドホルモンの単離された四量体または八量体、あるいは複数の前記四量体または八量体。
いくつもの重要なペプチドホルモンが下垂体から分泌される。下垂体前葉は３つのホルモンを分泌する：乳腺に作用するプロラクチン；副腎皮質に作用してグルココルチコイドの分泌を調節する副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）；および骨、筋肉、および肝臓に作用する成長ホルモン。脳下垂体後葉は、バソプレシンとも呼ばれる抗利尿ホルモン、およびオキシトシンを分泌する。ペプチドホルモンは、多くの異なる器官および組織によって産生されるが、これには、心臓（心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）または心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＦ））および膵臓（グルカゴン、インスリンおよびソマトスタチン）、胃腸管（コレシストキニン、ガストリン）、および脂肪組織貯蔵（レプチン）が含まれる。一例では、本発明のペプチドホルモンは、プロラクチン、ＡＣＴＨ、成長ホルモン（ソマトトロピン）、バソプレシン、オキシトシン、グルカゴン、インスリン、ソマトスタチン、コレシストキニン、ガストリンおよびレプチンから選択される（例えば、ヒトのプロラクチン、ＡＣＴＨ、成長ホルモン、バソプレシン、オキシトシン、グルカゴン、インスリン、ソマトスタチン、コレシストキニン、ガストリンおよびレプチンから選択される）。
一例では、インクレチンは、ＧＬＰ－１、ＧＩＰまたはエキセンジン－４ペプチドである。
本発明は、実施形態では、以下の操作された四量体および八量体を提供する：
インクレチンの単離された四量体または八量体。
インスリンペプチドの単離された四量体または八量体。
ＧＬＰ－１（グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）ペプチドの単離された四量体または八量体。
ＧＩＰ（グルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド）ペプチドの単離された四量体または八量体。
エキセンジン（例えば、エキセンジン－４）ペプチドの単離された四量体または八量体。
ペプチドホルモンの単離された四量体または八量体。
プロラクチンまたはプロラクチンペプチドの単離された四量体または八量体。
ＡＣＴＨまたはＡＣＴＨペプチドの単離された四量体または八量体。
成長ホルモンまたは成長ホルモンペプチドの単離された四量体または八量体。
バソプレシンまたはバソプレシンペプチドの単離された四量体または八量体。
オキシトシンまたはオキシトシンペプチドの単離された四量体または八量体。
グルカゴンまたはグルカゴンペプチドの単離された四量体または八量体。
インスリンまたはインスリンペプチドの単離された四量体または八量体。
ソマトスタチンまたはソマトスタチンペプチドの単離された四量体または八量体。
コレシストキニンまたはコレシストキニンペプチドの単離された四量体または八量体。
ガストリンまたはガストリンペプチドの単離された四量体または八量体。
レプチンまたはレプチンペプチドの単離された四量体または八量体。
抗体結合部位（例えば、ｓｃＦｖまたはＦａｂ）の単離された四量体または八量体。
ＴＣＲ結合部位（例えば、ｓｃＴＣＲ）の単離された四量体または八量体。
ＴＣＲ Ｖα／Ｖβ結合部位の単離された四量体または八量体。
ＴＣＲ Ｖｙ／Ｖδ結合部位の単離された四量体または八量体。
抗体単一可変ドメイン結合部位の単離された四量体または八量体。
ＦｃＡｂ結合部位の単離された四量体または八量体。
これらの四量体または八量体のいずれかの一例では、ドメインまたはペプチドは、ヒトのものである。これらの四量体または八量体のいずれかの一例では、四量体または八量体は、ＮＨＲ２ ＴＤ（例えば、ヒトＮＨＲ２）を含む。これらの四量体または八量体のいずれかの一例では、四量体または八量体は、ｐ５３ ＴＤ（例えば、ヒトｐ５３ ＴＤ）を含む。これらの四量体または八量体のいずれかの一例では、四量体または八量体は、ｐ６３ ＴＤ（例えば、ヒトｐ６３ ＴＤ）を含む。これらの四量体または八量体のいずれかの一例では、四量体または八量体は、ｐ７３ ＴＤ（例えば、ヒトｐ７３ ＴＤ）を含む。これらの四量体または八量体のいずれかの一例では、四量体または八量体は、ＴＤ（例えば、ヒトＮＨＲ２ ＴＤ）の四量体を含み、それによって、ドメインまたはペプチドは、４つまたは８つのドメインまたはペプチドの多量体を形成する。
一例では、該複数物は、純粋であり、例えば、１つより多くの種類のポリペプチド単量体を含む前記結合部位またはペプチドの多量体と混合状態ではない。
１８．（ａ）水溶液（例えば、水性真核細胞増殖培地または緩衝液）中で可溶性であり、
（ｂ）真核細胞から分泌可能であり、かつ／または
（ｃ）真核細胞の発現産物である、
任意の先行する態様の多量体、四量体または八量体。
一例では、多量体、四量体または八量体は、ＨＥＫ２９３Ｔ（または他の真核、哺乳動物、ＣＨＯまたはＣｏｓ）細胞からの上清の試料を使用し、かつウエスタンブロットを使用して検出されるＰＡＧＥゲル上での前記多量体、四量体または八量体について予測される分子量の単一のバンドによって指し示される安定な形態で、そのような細胞から分泌可能である。
１９．（ａ）水溶液（例えば、水性真核細胞増殖培地または緩衝液）中で可溶性である、ＴＣＲ ＶドメインまたはＴＣＲ結合部位の四量体または八量体、
（ｂ）水溶液（例えば、水性真核細胞増殖培地または緩衝液）中で可溶性である、抗体単一可変ドメインの四量体または八量体、
（ｃ）ＨＥＫ２９３細胞によって細胞内および／または細胞外に発現可能である、ＴＣＲ ＶドメインまたはＴＣＲ結合部位の四量体または八量体、または
（ｄ）ＨＥＫ２９３細胞によって細胞内および／または細胞外に発現可能である、抗体可変ドメイン（例えば、抗体単一可変ドメイン）の四量体または八量体。
培地の一例は、Ｌ－グルタミンを添加したＳＦＭＩＩ増殖培地（例えば、４ｍＭ Ｌ－グルタミンを添加した完全ＳＦＭＩＩ増殖培地）である。一例では、培地は、無血清のＨＥＫ２９３細胞培養培地である。一例では、培地は、無血清のＣＨＯ細胞培養培地である。
例えば、本発明における細胞は、ヒト細胞、例えばＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞など）である。
２０．前記四量体または八量体が、抗原またはｐＭＨＣ結合について二特異的である、任意の先行する態様の多量体、四量体または八量体。
２１．前記ドメインが同一である、任意の先行する態様の多量体、四量体または八量体。
２２．真核細胞のグリコシル化を含む、任意の先行する態様の多量体、四量体または八量体。
例えば、グリコシル化は、ＣＨＯ細胞のグリコシル化である。例えば、グリコシル化は、ＨＥＫ（例えば、ＨＥＫ２９３ＴなどのＨＥＫ２９３）細胞のグリコシル化である。例えば、グリコシル化は、Ｃｏｓ細胞のグリコシル化である。例えば、グリコシル化は、ピキア（Picchia）細胞のグリコシル化である。例えば、グリコシル化は、サッカロミセス（Sacchaaromyces）細胞のグリコシル化である。
２３．前記細胞がＨＥＫ２９３細胞である、態様２２の多量体、四量体または八量体。
２４．複数の、任意の先行する態様の多量体、四量体または八量体。
２５．任意の先行する態様の多量体、四量体または八量体および薬学的に許容される担体、希釈剤または医薬品添加物を含む、医薬組成物。
２６．態様１～２４のいずれか１つの多量体、四量体または八量体を含む、化粧品、食料品、飲料、洗浄用製品、洗浄剤。
２７．任意の先行する態様の多量体、四量体または八量体の、前記操作された（かつ場合により単離された）ポリペプチドまたは（場合により単離された）単量体。
単量体は、前記タンパク質ドメインまたはペプチドを含みかつＴＤをさらに含む、本明細書に開示される操作されたポリペプチドである。
場合により、操作されたポリペプチドは、（Ｎ末端からＣ末端の方向に）可変ドメイン（Ｖ１）－定常ドメイン（Ｃ）（例えば、ＣＨ１またはＦｃ）－場合により存在するリンカー－ＴＤを含む。
２８．（Ｎ末端からＣ末端の方向に）：
（ａ）ＴＣＲ Ｖ１－ＴＣＲ Ｃ１－抗体Ｃ（例えば、ＣＨ、ＣＨ１（ＩｇＧ ＣＨ１など）またはＣＬ（ＣｋまたはＣκなど））－場合により存在するリンカー－ＴＤを含み、
（ｉ）Ｖ１がＶαであり、かつＣ１がＣαであり、
（ｉｉ）Ｖ１がＶβであり、かつＣ１がＶβであり、
（ｉｉｉ）Ｖ１がＶｙであり、かつＣ１がＣｙであり、または
（ｉｖ）Ｖ１がＶδであり、かつＣ１がＣ８であり、
または
（ｂ）ＴＣＲ Ｖ１－抗体Ｃ（例えば、ＣＨ、ＣＨ１（ＩｇＧ ＣＨ１など）またはＣＬ（ＣλまたはＣκなど））－場合により存在するリンカー－ＴＤを含み、
（ｉ）Ｖ１がＶαであり、
（ｉｉ）Ｖ１がＶβであり、
（ｉｉｉ）Ｖ１がＶｙであり、または
（ｉｖ）Ｖ１がＶδであり、
または
（ｃ）抗体Ｖ１－抗体Ｃ（例えば、ＣＨ、ＣＨ１（ＩｇＧ ＣＨ１など）またはＣＬ（ＣｋまたはＣκなど））－場合により存在するリンカー－ＴＤを含み、
（ｉ）Ｖ１がＶＨであり、または
（ｉｉ）Ｖ１がＶＬ（例えば、ＶλまたはＶκ）であり、
または
（ｄ）抗体Ｖ１－場合により存在する抗体Ｃ（例えば、ＣＨ、ＣＨ１（ＩｇＧ ＣＨ１など）またはＣＬ（ＣｋまたはＣκなど））－抗体Ｆｃ（例えば、ＩｇＧ Ｆｃ）－場合により存在するリンカー－ＴＤを含み、
（ｉ）Ｖ１がＶＨであり、または
（ｉｉ）Ｖ１がＶＬ（例えば、ＶλまたはＶκ）であり、
または
（ｅ）抗体Ｖ１－抗体ＣＬ（例えば、ＣｋまたはＣκ）－場合により存在するリンカー－ＴＤを含み、
（ｉ）Ｖ１がＶＨであり、または
（ｉｉ）Ｖ１がＶＬ（例えば、ＶλまたはＶκ）であり、
または
（ｆ）ＴＣＲ Ｖ１－ＴＣＲ Ｃ１－場合により存在するリンカー－ＴＤを含み、
（ｉ）Ｖ１がＶαであり、かつＣ１がＣαであり、
（ｉｉ）Ｖ１がＶβであり、かつＣ１がＣβであり、
（ｉｉｉ）Ｖ１がＶγであり、かつＣ１がＣγであり、または
（ｉｖ）Ｖ１がＶδであり、かつＣ１がＣδである、
操作された（かつ場合により単離された）操作されたポリペプチド（Ｐ１）。
（ａ）または（ｂ）において、一例では、ＴＣＲ Ｖは、ｐＭＨＣに特異的に結合する単一鎖ＴＣＲ結合部位（ｓｃＴＣＲ）によって構成され、該結合部位は、ＴＣＲ Ｖ－リンカー－ＴＣＲＶを含む。一例では、操作されたポリペプチドは、（Ｎ末端からＣ末端の方向に）（ｉ）Ｖ１－リンカー－Ｖ－場合により存在するＣ－場合により存在するリンカー－ＴＤ、または（ｉｉ）Ｖα－リンカー－Ｖ１－場合により存在するＣ－場合により存在するリンカー－ＴＤを含み、Ｖαは、ＴＣＲ Ｖドメインであり、かつ、Ｃは、抗体Ｃドメイン（例えば、ＣＨ１またはＣＬ）またはＴＣＲ Ｃである。
好ましくは、抗体Ｃは、ＣＨ１（例えば、ＩｇＧ ＣＨ１）である。
一例では、多量体、四量体または八量体は、１５５ｋＤａ以下の大きさを有し、例えば、前記タンパク質ドメインは、ラクダ科動物ＣＤＲ３またはウシＣＤＲ３などの、少なくとも１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２アミノ酸のＣＤＲ３を含む抗体可変ドメインである。
一例では、多量体、四量体または八量体は、ＴＣＲ結合部位および抗体結合部位を含む。例えば、各ポリペプチドは、ＴＣＲ Ｖ（例えば、ｐＭＨＣに特異的に結合するｓｃＴＣＲによって構成される）および抗体Ｖ（例えば、ｓｃＦｖによって構成され、または前記第２のポリペプチドによって構成される第２のＶドメインとペア形成して、抗原に特異的に結合するＶ／Ｖペア形成した結合部位を形成する）を含む。一例では、ｐＭＨＣは、ＲＡＳペプチドを含む。一例では、抗原は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、または本明細書に開示される任意の他の抗原からなる群から選択される。例えば、抗原はＰＤ－１であり、かつ、ｐＭＨＣはＲＡＳペプチドを含む。
２９．前記操作されたポリペプチドＰ１が、さらなるポリペプチド（Ｐ２）とペア形成しており、Ｐ２が、（Ｎ末端からＣ末端の方向に）：
（ｇ）ＴＣＲ Ｖ２－ＴＣＲ Ｃ２－抗体ＣＬ（例えば、ＣλまたはＣκ）を含み、Ｐ１が、態様２８に記載された（ａ）によるものであり、かつ
（ｉ）Ｐ１が（ａ）（ｉｉ）によるものである場合に、Ｖ２がＶαであり、かつＣ２がＣαであり、
（ｉｉ）Ｐ１が（ａ）（ｉ）によるものである場合に、Ｖ２がＶβであり、かつＣ２がＣβであり、
（ｉｉｉ）Ｐ１が（ａ）（ｉｖ）によるものである場合に、Ｖ２がＶγであり、かつＣ２がＣγであり、または
（ｉｖ）Ｐ１が（ａ）（ｉｉｉ）によるものである場合に、Ｖ２がＶδであり、かつＣ２がＣδであり、
または
（ｈ）ＴＣＲ Ｖ２－抗体ＣＬ（例えば、ＣｋまたはＣκ）を含み、Ｐ１が、態様２８に記載された（ｂ）によるものであり、かつ
（ｉ）Ｐ１が（ｂ）（ｉｉ）によるものである場合に、Ｖ２がＶαであり、
（ｉｉ）Ｐ１が（ｂ）（ｉ）によるものである場合に、Ｖ２がＶβであり、
（ｉｉｉ）Ｐ１が（ｂ）（ｉｖ）によるものである場合に、Ｖ２がＶγであり、または
（ｉｖ）Ｐ１が（ｂ）（ｉｉｉｉ）によるものである場合に、Ｖ２がＶδであり、
または
（ｉ）抗体Ｖ２－ＣＬ（例えば、ＣｋまたはＣκ）を含み、Ｐ１が、態様２８に記載された（ｃ）によるものであり、かつ
（ｉ）Ｐ１が（ｃ）（ｉｉ）によるものである場合に、Ｖ２がＶＨであり、または
（ｉｉ）Ｐ１が（ｃ）（ｉ）によるものである場合に、Ｖ２がＶＬ（例えば、ＶλまたはＶΚ）であり、
または
（ｊ）抗体Ｖ２－場合により存在するＣＬ（例えば、ＣｋまたはＣκ）を含み、Ｐ１が、態様２８に記載された（ｄ）によるものであり、かつ
（ｉ）Ｐ１が（ｄ）（ｉｉ）によるものである場合に、Ｖ２がＶＨであり、または
（ｉｉ）Ｐ１が（ｄ）（ｉ）によるものである場合に、Ｖ２がＶＬ（例えば、ＶλまたはＶκ）であり、
または
（ｋ）抗体Ｖ２－ＣＨ１（例えば、ＩｇＧ ＣＨ１）を含み、Ｐ１が、態様２８に記載された（ｅ）によるものであり、かつ
（ｉ）Ｐ１が（ｅ）（ｉｉ）によるものである場合に、Ｖ２がＶＨであり、または
（ｉｉ）Ｐ１が（ｅ）（ｉ）によるものである場合に、Ｖ２がＶＬ（例えば、ＶλまたはＶκ）であり、
または
（ｌ）ＴＣＲ Ｖ２－ＴＣＲ Ｃ２を含み、Ｐ１が、態様２８に記載された（ｆ）によるものであり、かつ
（ｉ）Ｐ１が（ｆ）（ｉｉ）によるものである場合に、Ｖ２がＶαであり、かつＣ２がＣαであり、
（ｉｉ）Ｐ１が（ｆ）（ｉ）によるものである場合に、Ｖ２がＶβであり、かつＣ２がＣβであり、
（ｉｉｉ）Ｐ１が（ｆ）（ｉｉｉ）によるものである場合に、Ｖ２がＶγであり、かつＣ２がＣγであり、または
（ｉｖ）Ｐ１が（ｆ）（ｉｖ）によるものである場合に、Ｖ２がＶδであり、かつＣ２がＣδである、
態様２８のポリペプチド。
場合により、Ｖ１およびＶ２は、抗原またはｐＭＨＣに特異的に結合できるペア形成した可変ドメイン結合部位を形成する。一例では、Ｖ１およびＶ２は、例えば、レオプロ（商標）；アブシキシマブ；リツキサン（商標）；リツキシマブ；ゼナパックス（商標）；ダクリズマブ；シムレクト（商標）；バシリキシマブ；シナジス（商標）；パリビズマブ；レミケード（商標）；インフリキシマブ；ハーセプチン（商標）；マイロターグ（商標）；ゲムツズマブ；キャンパス（商標）；アレムツズマブ；ゼヴァリン（商標）；イブリツモマブ；ヒュミラ（商標）；アダリムマブ；ゾレア（商標）；オマリズマブ；ベキサール（商標）；トシツモマブ；ラプティバ（商標）；エファリズマブ；アービタックス（商標）；セツキシマブ；アバスチン（商標）；ベバシズマブ；タイサブリ（商標）；ナタリズマブ；アクテムラ（商標）；トシリズマブ；ベクティビックス（商標）；パニツムマブ；ルセンティス（商標）；ラニビズマブ；ソリリス（商標）；エクリズマブ；シムジア（商標）；セルトリズマブ；シンポニー（商標）；ゴリムマブ、イラリス（商標）；カナキヌマブ；ステラーラ（商標）；ウステキヌマブ；アーゼラ（商標）；オファツムマブ；プロリア（商標）；デノスマブ；ヌマックス（商標）；モタビズマブ；アブスラックス（商標）；ラキシバクマブ；ベンリスタ（商標）；ベリムマブ；ヤーボイ（商標）；イピリムマブ；アドセトリス（商標）；ブレンツキシマブ；ベドチン（商標）；パージェタ（商標）；ペルツズマブ；カドサイラ（商標）；アド・トラスツズマブ；キイトルーダ（商標）、オプジーボ（商標）、ガザイバ（商標）およびオビヌツズマブからなる群から選択される抗体の可変ドメインである。
一実施形態では、抗体はアバスチンである。
一実施形態では、抗体はアクテムラである。
一実施形態では、抗体はアービタックスである。
一実施形態では、抗体はルセンティスである。
一実施形態では、抗体はサリルマブである。
一実施形態では、抗体はデュピルマブである。
一実施形態では、抗体はアリロクマブである。
一実施形態では、抗体はエボロクマブである。
一実施形態では、抗体はペムブロリズマブである。
一実施形態では、抗体はニボルマブである。
一実施形態では、抗体はイピリムマブである。
一実施形態では、抗体はレミケードである。
一実施形態では、抗体はゴリムマブである。
一実施形態では、抗体はオファツムマブである。
一実施形態では、抗体はベンリスタである。
一実施形態では、抗体はキャンパスである。
一実施形態では、抗体はリツキシマブである。
一実施形態では、抗体はハーセプチンである。
一実施形態では、抗体はデュルバルマブである。
一実施形態では、抗体はダラツムマブである。
一例では、Ｖ１は、（単一可変ドメインである場合はそれ自体で、またはＶ２とペア形成した場合に、）ＡＢＣＦ１；ＡＣＶＲ１；ＡＣＶＲ１Ｂ；ＡＣＶＲ２；ＡＣＶＲ２Ｂ；ＡＣＶＲＬ１；ＡＤＯＲＡ２Ａ；アグリカン；ＡＧＲ２；ＡＩＣＤＡ；ＡＷＩ；ＡＩＧ１；ＡＫＡＰ１；ＡＫＡＰ２；ＡＩＹＩＨ；ＡＭＨＲ２；ＡＮＧＰＴ１；ＡＮＧＰＴ２；ＡＮＧＰＴＬ３；ＡＮＧＰＴＬ４；ＡＮＰＥＰ；ＡＰＣ；ＡＰＯＣ１；ＡＲ；ＡＺＧＰ１（亜鉛－ａ－糖タンパク質）；Ｂ７．１；Ｂ７．２；ＢＡＤ；ＢＡＦＦ；ＢＡＧ１；ＢＡＩ１；ＢＣＬ２；ＢＣＬ６；ＢＤＮＦ；ＢＬＮＫ；ＢＬＲｌ（ＭＤＲ１５）；ＢｌｙＳ；ＢＭ Ｐｌ；ＢＭＰ２；ＢＭＰ３Ｂ（ＧＤＦＩＯ）；ＢＭＰ４；ＢＭＰ６；ＢＭ Ｐ８；ＢＭＰＲＩＡ；ＢＭＰＲＩＢ；ＢＭ ＰＲ２；ＢＰＡＧ１（プレクチン）；ＢＲＣＡ１；ＣＩ９ｏｒｆｌＯ（ＩＬ２７ｗ）；Ｃ３；Ｃ４Ａ；Ｃ５；Ｃ５Ｒ１；ＣＡＮＴ１；ＣＡＳＰ１；ＣＡＳＰ４；ＣＡＶ１；ＣＣＢＰ２（Ｄ６／ＪＡＢ６１）；ＣＣＬ１（１－３０９）；ＣＣＬ１１（エオタキシン）；ＣＣＬ１３（ＭＣＰ－４）；ＣＣＬ１５（ＭＩＰ－ｉｄ）；ＣＣＬ１６（ＨＣＣ－４）；ＣＣＬ１７（ＴＡＲＣ）；ＣＣＬ１８（ＰＡＲＣ）；ＣＣＬ１９（Ｍ ＩＰ－３ｂ）；ＣＣＬ２（ＭＣＰ－１）；ＭＣＡＦ；ＣＣＬ２０（ＭＩＰ－３ａ）；ＣＣＬ２１（ＭＩＰ－２）；ＳＬＣ；エクソダス－２；ＣＣＬ２２（ＭＤＣ／ＳＴＣ－１）；ＣＣＬ２３（Ｍ ＰＩＦ－１）；ＣＣＬ２４（ＭＰＩＦ－２ Ｉ エオタキシン－２）；ＣＣＬ２５（ＴＥＣＫ）；ＣＣＬ２６（エオタキシン－３）；ＣＣＬ２７（ＣＴＡＣＫ／ＩＬＣ）；ＣＣＬ２８；ＣＣＬ３（ＭＩＰ－ｌａ）；ＣＣＬ４（Ｍ ＩＰ－ｌｂ）；ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）；ＣＣＬ７（ＭＣＰ－３）；ＣＣＬ８（ｍｃｐ－２）；ＣＣＮＡ１；ＣＣＮＡ２；ＣＣＮＤ１；ＣＣＮＥ１；ＣＣＮＥ２；ＣＣＲ１（ＣＫＲ１／ＨＭ１４５）；ＣＣＲ２（ｍｃｐ－１ＲＢ／ＲＡ）；ＣＣＲ３（ＣＫＲ３／ＣＭＫＢＲ３）；ＣＣＲ４；ＣＣＲ５（ＣＭ ＫＢＲ５／ＣｈｅｍＲ１３）；ＣＣＲ６（ＣＭＫＢＲ６／ＣＫＲ－Ｌ３／ＳＴＲＬ２２／ＤＲＹ６）；ＣＣＲ７（ＣＫＲ７／ＥＢＩ１）；ＣＣＲ８（ＣＭ ＫＢＲ８／ＴＥＲ１／ＣＫＲ－Ｌ１）；ＣＣＲ９（ＧＰＲ－９－６）；ＣＣＲＬ１（ＶＳＨＫ１）；ＣＣＲＬ２（Ｌ－ＣＣＲ）；ＣＤ１６４；ＣＤ１９；ＣＤ１Ｃ；ＣＤ２０；ＣＤ２００；ＣＤ－２２；ＣＤ２４；ＣＤ２８；ＣＤ３；ＣＤ３７；ＣＤ３８；ＣＤ３Ｅ；ＣＤ３Ｇ；ＣＤ３Ｚ；ＣＤ４；ＣＤ４０；ＣＤ４０Ｌ；ＣＤ４４；ＣＤ４５ＲＢ；ＣＤ５２；ＣＤ６９；ＣＤ７２；ＣＤ７４；ＣＤ７９Ａ；ＣＤ７９Ｂ；ＣＤ８；ＣＤ８０；ＣＤ８１；ＣＤ８３；ＣＤ８６；ＣＤＨ１（Ｅ－カドヘリン）；ＣＤＨ１０；ＣＤＨ１２；ＣＤＨ１３；ＣＤＨ１８；ＣＤＨ１９；ＣＤＨ２０；ＣＤＨ５；ＣＤＨ７；ＣＤＨ８；ＣＤＨ９；ＣＤＫ２；ＣＤＫ３；ＣＤＫ４；ＣＤＫ５；ＣＤＫ６；ＣＤＫ７；ＣＤＫ９；ＣＤＫＮ１Ａ（ｐ２ＩＷａｐｌ／Ｃｉｐｌ）；ＣＤＫＮ１Ｂ（ｐ２７Ｋｉｐｌ）；ＣＤＫＮＩＣ；ＣＤＫＮ２Ａ（ｐｌ６ＩＮＫ４ａ）；ＣＤＫＮ２Ｂ；ＣＤＫＮ２Ｃ；ＣＤＫＮ３；ＣＥＢＰＢ；ＣＥＲ１；ＣＨＧＡ；ＣＨＧＢ；キチナーゼ；ＣＨＳＴ１０；ＣＫＬＦＳＦ２；ＣＫＬＦＳＦ３；ＣＫＬＦＳＦ４；ＣＫＬＦＳＦ５；ＣＫＬＦＳＦ６；ＣＫＬＦＳＦ７；ＣＫＬＦＳＦ８；ＣＬＤＮ３；ＣＬＤＮ７（クローディン－７）；ＣＬＮ３；ＣＬＵ（クラスタリン）；ＣＭＫＬＲ１；ＣＭＫＯＲ１（ＲＤＣ１）；ＣＮＲ１；ＣＯＬ１８Ａ１；ＣＯＬ１Ａ１；ＣＯＬ４Ａ３；ＣＯＬ６Ａ１；ＣＲ２；ＣＲＰ；ＣＳＦｌ（Ｍ－ＣＳＦ）；ＣＳＦ２（ＧＭ－ＣＳＦ）；ＣＳＦ３（ＧＣＳＦ）；ＣＴＬＡ４；ＣＴＮＮＢｌ（ｂ－カテニン）；ＣＴＳＢ（カテプシンＢ）；ＣＸ３ＣＬ１（ＳＣＹＤｉ）；ＣＸ３ＣＲ１（Ｖ２８）；ＣＸＣＬ１（ＧＲＯｌ）；ＣＸＣＬＩＯ（ＩＰ－１０）；ＣＸＣＬ１１（ｌ－ＴＡＣ／ＩＰ－９）；ＣＸＣＬ１２（ＳＤＦ１）；ＣＸＣＬ１３；ＣＸＣＬ１４；ＣＸＣＬ１６；ＣＸＣＬ２（ＧＲ０２）；ＣＸＣＬ３（ＧＲ０３）；ＣＸＣＬ５（ＥＮＡ－７８ Ｉ ＬＩＸ）；ＣＸＣＬ６（ＧＣＰ－２）；ＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）；ＣＸＣＲ３（ＧＰＲ９／ＣＫＲ－Ｌ２）；ＣＸＣＲ４；ＣＸＣＲ６（ＴＹＭＳＴＲ ＩＳＴＲＬ３３ Ｉ Ｂｏｎｚｏ）；ＣＹＢ５；ＣＹＣ１；ＣＹＳＬＴＲ１；ＤＡＢ２ＩＰ；ＤＥＳ；ＤＫＦＺｐ４５１Ｊ０１１８；ＤＮＣＬ１；ＤＰＰ４；Ｅ２Ｆ１；ＥＣＧＦ１；ＥＤＧ１；ＥＦＮＡＩ；ＥＦＮＡ３；ＥＦＮＢ２；ＥＧＦ；ＥＧＦＲ；ＥＬＡＣ２；ＥＮＧ；ＥＮ０１；ＥＮ０２；ＥＮ０３；ＥＰＨＢ４；ＥＰＯ；ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ－２）；ＥＲＥＧ；ＥＲＫ８；ＥＳＲ１；ＥＳＲ２；Ｆ３（ＴＦ）；ＦＡＤＤ；ＦａｓＬ；ＦＡＳＮ；ＦＣＥＲ１Ａ；ＦＣＥＲ２；ＦＣＧＲ３Ａ；ＦＧＦ；ＦＧＦ１（ａＦＧＦ）；ＦＧＦ１０；ＦＧＦ１１；ＦＧＦ１２；ＦＧＦ１２Ｂ；ＦＧＦ１３；ＦＧＦ１４；ＦＧＦ１６；ＦＧＦ１７；ＦＧＦ１８；ＦＧＦ１９；ＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）；ＦＧＦ２０；ＦＧＦ２１；ＦＧＦ２２；ＦＧＦ２３；ＦＧＦ３（ｉｎｔ－２）；ＦＧＦ４（ＨＳＴ）；ＦＧＦ５；ＦＧＦ６（ＨＳＴ－２）；ＦＧＦ７（ＫＧＦ）；ＦＧＦ８；ＦＧＦ９；ＦＧＦＲ３；ＦＩＧＦ（ＶＥＧＦＤ）；ＦＩＬｌ（イプシロン）；ＦＩＬｌ（ＺＥＴＡ）；ＦＵ１２５８４；ＦＵ２５５３０；ＦＬＲＴｌ（フィブロネクチン）；ＦＬＴｌ；ＦＯＳ；ＦＯＳＬｌ（ＦＲＡ－Ｉ）；ＦＹ（ＤＡＲＣ）；ＧＡＢＲＰ（ＧＡＢＡａ）；ＧＡＧＥＢ１；ＧＡＧＥＣ１；ＧＡＬＮＡＣ４Ｓ－６５Ｔ；ＧＡＴＡ３；ＧＤＦ５；ＧＦＩ１；ＧＧＴ１；ＧＭ－ＣＳＦ；ＧＮＡＳ１；ＧＮＲＨｌ；ＧＰＲ２（ＣＣＲＩＯ）；ＧＰＲ３１；ＧＰＲ４４；ＧＰＲ８１（ＦＫＳＧ８０）；ＧＲＣＣＩＯ（ＣＩＯ）；ＧＲＰ；ＧＳＮ（ゲルゾリン）；ＧＳＴＰｌ；ＨＡＶＣＲ２；ＨＤＡＣ４；ＥＤＡＣ５；ＨＤＡＣ７Ａ；ＨＤＡＣ９；ＨＧＦ；ＨＩＦ１Ａ；ＨＩＰ１；ヒスタミンおよびヒスタミン受容体；ＨＬＡ－Ａ；ＨＬＡ－ＤＲＡ；ＨＭ７４；ＨＭＯＸ１；ＨＵＭＣＹＴ２Ａ；ＩＣＥＢＥＲＧ；ＩＣＯＳＬ；１Ｄ２；ＩＦＮ－ａ；ＩＦＮＡ１；ＩＦＮＡ２；ＩＦＮＡ４；ＩＦＮＡ５；ＩＦＮＡ６；ＩＦＮＡ７；ＩＦＮＢ１；ＩＦＮガンマ；ＴＦＮＷ１；ＩＧＢＰ１；ＩＧＦ１；ＩＧＦ１Ｒ；ＩＧＦ２；ＩＧＦＢＰ２；ＩＧＦＢＰ３；ＩＧＦＢＰ６；ＩＬ－１；ＩＬ１０；ＩＬ１０ＲＡ；ＩＬ１０ＲＢ；ＩＬ１１；ＩＬ１１ＲＡ；ＩＬ－１２；ＩＬ１２Ａ；ＩＬ１２Ｂ；ＩＬ１２ＲＢ１；ＩＬ１２ＲＢ２；１Ｌ１３；ＩＬ１３ＲＡ１；ＩＬ１３ＲＡ２；１Ｌ１４；１Ｌ１５；ＩＬ１５ＲＡ；ＩＬ１６；１Ｌ１７；ＩＬ１７Ｂ；ＩＬ１７Ｃ；ＩＬ１７Ｒ；１Ｌ１８；ＩＬ１８ＢＰ；ＩＬ１８Ｒ１；ＩＬ１８ＲＡＰ；１Ｌ１９；ＩＬＩＡ；ＩＬ１Ｂ；ＩＬ１Ｆ１０；ＩＬ１Ｆ５；ＩＬ１Ｆ６；ＩＬ１Ｆ７；ＩＬ１Ｆ８；ＩＬ１Ｆ９；ＩＬ１ＨＹ１；ＩＬ１Ｒ１；ＩＬ１Ｒ２；ＩＬ１ＲＡＰ；ＩＬ１ＲＡＰＬ１；ＩＬ１ＲＡＰＬ２；ＩＬ１ＲＬ１；ＩＬ１ＲＬ２ ＩＬ１ＲＮ；１Ｌ２；１Ｌ２０；ＩＬ２０ＲＡ；ＩＬ２１Ｒ；１Ｌ２２；１Ｌ２２Ｒ；１Ｌ２２ＲＡ２；１Ｌ２３；１Ｌ２４；１Ｌ２５；１Ｌ２６；１Ｌ２７；１Ｌ２８Ａ；１Ｌ２８Ｂ；１Ｌ２９；ＩＬ２ＲＡ；ＩＬ２ＲＢ；ＩＬ２ＲＧ；１Ｌ３；１Ｌ３０；ＩＬ３ＲＡ；１Ｌ４；ＩＬ４Ｒ；１Ｌ５；ＩＬ５ＲＡ；１Ｌ６；ＩＬ６Ｒ；ＩＬ６ＳＴ（糖タンパク質１３０）；１Ｌ７；ＴＬ７Ｒ；１Ｌ８；ＩＬ８ＲＡ；ＩＬ８ＲＢ；ＩＬ８ＲＢ；１Ｌ９；ＩＬ９Ｒ；ＩＬＫ；ＩＮＨＡ；ＩＮＨＢＡ；ＩＮＳＬ３；ＩＮＳＬ４；ＩＲＡＫＩ；ＩＲＡＫ２；ＩＴＧＡ１；ＩＴＧＡ２；１ＴＧＡ３；ＩＴＧＡ６（ａ６インテグリン）；ＩＴＧＡＶ；ＩＴＧＢ３；ＩＴＧＢ４（ｂ４インテグリン）；ＪＡＧ１；ＪＡＫ１；ＪＡＫ３；ＪＵＮ；Ｋ６ＨＦ；ＫＡＩ１；ＫＤＲ；ＭＴＬＧ；ＫＬＦ５（ＧＣボックスＢＰ）；ＫＬＦ６；ＫＬＫ１０；ＫＬＫ１２；ＫＬＫ１３；ＫＬＫ１４；ＫＬＫ１５；ＫＬＫ３；ＫＬＫ４；ＫＬＫ５；ＫＬＫ６；ＫＬＫ９；ＫＲＴ１；ＫＲＴ１９（ケラチン１９）；ＫＲＴ２Ａ；ＫＲＴＨＢ６（毛特異的ＩＩ型ケラチン）；ＬＡＭＡ５；ＬＥＰ（レプチン）；Ｌｉｎｇｏ－ｐ７５；Ｌｉｎｇｏ－Ｔｒｏｙ；ＬＰＳ；ＬＴＡ（ＴＮＦ－ｂ）；ＬＴＢ；ＬＴＢ４Ｒ（ＧＰＲ１６）；ＬＴＢ４Ｒ２；ＬＴＢＲ；ＭＡＣＭＡＲＣＫＳ；ＭＡＧまたはＯｍｇｐ；ＭＡＰ２Ｋ７（ｃ－Ｊｕｎ）；ＭＤＫ；Ｍ ＩＢ１；ミッドカイン；Ｍ ＩＦ；Ｍ ＩＰ－２；ＭＫ１６７（Ｋｉ－６７）；ＭＭＰ２；Ｍ ＭＰ９；ＭＳ４Ａ１；ＭＳＭＢ；ＭＴ３（メタロチオネクチン－ｉｆｉ）；ＭＴＳＳ １；ＭＵＣ １（ムチン）；ＭＹＣ；ＭＹＤ８８；ＮＣＫ２；ニューロカン；ＮＦＫＢ １；ＮＦＫＢ２；ＮＧＦＢ（ＮＧＦ）；ＮＧＦＲ；ＮｇＲ－Ｌｉｎｇｏ；ＮｇＲ－Ｎｏｇｏ６６（Ｎｏｇｏ）；ＮｇＲ－ｐ７５；ＮｇＲ－Ｔｒｏｙ；ＮＭ Ｅ１（ＮＭ２３Ａ）；ＮＯＸ５；ＮＰＰＢ；ＮＲＯＢ１；ＮＲＯＢ２；ＮＲ１Ｄ１；ＮＲ１Ｄ２；ＮＲ１Ｈ２；ＮＲ１Ｈ３；ＮＲ１Ｈ４；ＮＲ１Ｉ２；ＮＲ１Ｉ３；ＮＲ２Ｃ１；ＮＲ２Ｃ２；ＮＲ２Ｅ１；ＮＲ２Ｅ３；ＮＲ２Ｆ１；ＮＲ２Ｆ２；ＮＲ２Ｆ６；ＮＲ３Ｃ１；ＮＲ３Ｃ２；ＮＲ４Ａ１；ＮＲ４Ａ２；ＮＲ４Ａ３；ＮＲ５Ａ１；ＮＲ５Ａ２；ＮＲ６Ａ１；ＮＲＰ１；ＮＲＰ２；ＮＴ５Ｅ；ＮＴＮ４；ＯＤＺ１；ＯＰＲＤ１；Ｐ２ＲＸ７；ＰＡＰ；ＰＡＲＴＩ；ＰＡＴＥ；ＰＡＷＲ；ＰＣＡ３；ＰＣＮＡ；ＰＤＧＦＡ；ＰＤＧＦＢ；ＰＥＣＡＭ１；ＰＦ４（ＣＸＣＬ４）；ＰＧＦ；ＰＧＲ；ホスファカン；ＰＩＡＳ２；ＰＩＫ３ＣＧ；ＰＬＡＵ（ｕＰＡ）；ＰＬＧ；ＰＬＸＤＣ１；ＰＰＢＰ（ＣＸＣＬ７）；ＰＰＩＤ；ＰＲ１；ＰＲＫＣＱ；ＰＲＫＤ１；ＰＲＬ；ＰＲＯＣ；ＰＲＯＫ２；ＰＳＡＰ；ＰＳＣＡ；ＰＴＡＦＲ；ＰＴＥＮ；ＰＴＧＳ２（ＣＯＸ－２）；ＰＴＮ；ＲＡＣ２（ｐ２ＩＲａｃ２）；ＲＡＲＢ；ＲＧＳ１；ＲＧＳ１３；ＲＧＳ３；ＲＮＦ１１０（ＺＮＦ１４４）；ＲＯＢ０２；Ｓ１００Ａ２；ＳＣＧＢ１Ｄ２（リポフィリンＢ）；ＳＣＧＢ２Ａ１（マンマグロビン２）；ＳＣＧＢ２Ａ２（マンマグロビン１）；ＳＣＹＥ１（内皮単球活性化サイトカイン）；ＳＤＦ２；ＳＥＲＰＩＮＡ１；ＳＥＲＰＩＮＩＡ３；ＳＥＲＰＩＮＢ５（マスピン）；ＳＥＲＰＩＮＥ１（ＰＡＴ－ｉ）；ＳＥＲＰＩＮＦ１；ＳＨＢＧ；ＳＬＡ２；ＳＬＣ２Ａ２；ＳＬＣ３３Ａ１；ＳＬＣ４３Ａ１；ＳＬＩＴ２；ＳＰＰｌ；ＳＰＲＲＩＢ（Ｓｐｒｉ）；ＳＴ６ＧＡＬ１；ＳＴＡＢｌ；ＳＴＡＴ６；ＳＴＥＡＰ；ＳＴＥＡＰ２；ＴＢ４Ｒ２；ＴＢＸ２１；ＴＣＰＩＯ；ＴＤＧＦ１；ＴＥＫ；ＴＧＦＡ；ＴＧＦＢ１；ＴＧＦＢ１Ｉ１；ＴＧＦＢ２；ＴＧＦＢ３；ＴＧＦＢＩ；ＴＧＦＢＲ１；ＴＧＦＢＲ２；ＴＧＦＢＲ３；ＴＨ１Ｌ；ＴＨＢＳ１（トロンボスポンジン－１）；ＴＨＢＳ２；ＴＨＢＳ４；ＴＨＰＯ；ＴＩＥ（Ｔｉｅ－ｉ）；Ｔ］ＭＰ３；組織因子；ＴＬＲＩＯ；ＴＬＲ２；ＴＬＲ３；ＴＬＲ４；ＴＬＲ５；ＴＬＲ６；ＴＬＲ７；ＴＬＲ８；ＴＬＲ９；ＴＮＦ；ＴＮＦ－ａ；ＴＮＦＡＩＰ２（Ｂ９４）；ＴＮＦＡＩＰ３；ＴＮＦＲＳＦ１ １Ａ；ＴＮＦＲＳＦ１Ａ；ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ；ＴＮＦＲＳＦ２１；ＴＮＦＲＳＦ５；ＴＮＦＲＳＦ６（Ｆａｓ）；ＴＮＦＲＳＦ７；ＴＮＦＲＳＦ８；ＴＮＦＲＳＦ９；ＴＮＦＳＦＩＯ（ＴＲＡＩＬ）；ＴＮＦＳＦ１ １（ＴＲＡＮＣＥ）；ＴＮＦＳＦ１２（ＡＰ０３Ｌ）；ＴＮＦＳＦ１３（Ａｐｒｉｌ）；ＴＮＦＳＦ１３Ｂ；ＴＮＦＳＦ１４（ＨＶＥＭ－Ｌ）；ＴＮＦＳＦ１ ５（ＶＥＧＩ）；ＴＮＦＳＦ１ ８；ＴＮＦＳＦ４（０Ｘ４０リガンド）；ＴＮＦＳＦ５（ＣＤ４０リガンド）；ＴＮＦＳＦ６（ＦａｓＬ）；ＴＮＦＳＦ７（ＣＤ２７リガンド）；ＴＮＦＳＦ８（ＣＤ３０リガンド）；ＴＮＦＳＦ９（４－ｌＢＢリガンド）；ＴＯＬＬＩＰ；Ｔｏｌｌ様受容体；ＴＯＰ２Ａ（トポイソメラーゼｌｉａ）；ＴＰ５３；ＴＰＭ １；ＴＰＭ２；ＴＲＡＤＤ；ＴＲＡＦ１；ＴＲＡＦ２；ＴＲＡＦ３；ＴＲＡＦ４；ＴＲＡＦ５；ＴＲＡＦ６；ＴＲＥＭ １；ＴＲＥＭ２；ＴＲＰＣ６；ＴＳＬＰ；ＴＷＥＡＫ；ＶＥＧＦ；ＶＥＧＦＢ；ＶＥＧＦＣ；バーシカン；ＶＨＬ Ｃ５；ＶＬＡ－４；ＸＣＬ１（リンホタクチン）；ＸＣＬ２（ＳＣＭ－ｌｂ）；ＸＣＲ１（ＧＰＲ５
／ＣＣＸＣＲ１）；ＹＹ１；およびＺＦＰＭ２からなる群から選択される抗原に特異的に結合することができる。
例えば、本発明の任意の構成では、多量体、四量体または八量体は、第１および第２のエピトープまたは抗原に特異的に結合し、該第１および第２のエピトープまたは抗原のそれぞれは、ＥｐＣＡＭおよびＣＤ３；ＣＤ１９およびＣＤ３；ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦＲ２；ＶＥＧＦおよびＥＧＦＲ；ＣＤ１３８およびＣＤ２０；ＣＤ１３８およびＣＤ４０；ＣＤ２０およびＣＤ３；ＣＤ３８およびＣＤ１３８；ＣＤ３８およびＣＤ２０；ＣＤ３８およびＣＤ４０；ＣＤ４０およびＣＤ２０；ＣＤ１９およびＣＤ２０；ＣＤ－８およびＩＬ－６；ＰＤＬ－１およびＣＴＬＡ－４；ＣＴＬＡ－４およびＢＴＮ０２；ＣＳＰＧおよびＲＧＭ Ａ；ＩＧＦ１およびＩＧＦ２；ＩＧＦ１および／または２ならびにＥｒｂ２Ｂ；ＩＬ－１２およびＩＬ－１８；ＩＬ－１２およびＴＷＥＡＫ；ＩＬ－１３およびＡＤＡＭ８；ＩＬ－１３およびＣＬ２５；ＩＬ－１３およびＩＬ－ｌベータ；ＩＬ－１３およびＩＬ－２５；ＩＬ－１３およびＩＬ－４；ＩＬ－１３およびＩＬ－５；ＩＬ－１３およびＩＬ－９；ＩＬ－１３およびＬＨＲアゴニスト；ＩＬ－１３およびＭＤＣ；ＩＬ－１３およびＭＩＦ；ＩＬ－１３およびＰＥＤ２；ＩＬ－１３およびＳＰＲＲ２ａ；ＩＬ－１３およびＳＰＲＲ２ｂ；ＩＬ－１３およびＴＡＲＣ；ＩＬ－１３およびＴＧＦ－ベータ；ＩＬ－１アルファおよびＩＬ－１ベータ；ＭＡＧおよびＲＧＭ Ａ；ＮｇＲおよびＲＧＭ Ａ；ＮｏｇｏＡおよびＲＧＭ Ａ；ＯＭＧｐおよびＲＧＭ Ａ；ＲＧＭ ＡおよびＲＧＭ Ｂ；Ｔｅ３８およびＴＮＦアルファ；ＴＮＦアルファおよびＩＬ－１２；ＴＮＦアルファおよびＩＬ－１２ｐ４０；ＴＮＦアルファおよびＩＬ－１３；ＴＮＦアルファおよびＩＬ－１５；ＴＮＦアルファおよびＩＬ－１７；ＴＮＦアルファおよびＩＬ－１８；ＴＮＦアルファおよびＩＬ－１ベータ；ＴＮＦアルファおよびＩＬ－２３；ＴＮＦアルファおよびＭ ＩＦ；ＴＮＦアルファおよびＰＥＧ２；ＴＮＦアルファおよびＰＧＥ４；ＴＮＦアルファおよびＶＥＧＦ；およびＶＥＧＦＲおよびＥＧＦＲ；ＴＮＦアルファおよびＲＡＮＫリガンド；ＴＮＦアルファおよびＢｌｙｓ；ＴＮＦアルファおよびＧＰ１３０；ＴＮＦアルファおよびＣＤ－２２；およびＴＮＦアルファおよびＣＴＬＡ－４からなる群から選択される。
例えば、第１のエピトープまたは抗原は、ＣＤ３；ＣＤ１６；ＣＤ３２；ＣＤ６４；およびＣＤ８９からなる群から選択され、かつ、第２のエピトープまたは抗原は、ＥＧＦＲ；ＶＥＧＦ；ＩＧＦ－１Ｒ；Ｈｅｒ２；ｃ－Ｍｅｔ（別名ＨＧＦ）；ＨＥＲ３；ＣＥＡ；ＣＤ３３；ＣＤ７９ａ；ＣＤ１９；ＰＳＡ；ＥｐＣＡＭ；ＣＤ６６；ＣＤ３０；ＨＡＳ；ＰＳＭＡ；ＧＤ２；ＡＮＧ２；ＩＬ－４；ＩＬ－１３；ＶＥＧＦＲ２；およびＶＥＧＦＲ３からなる群から選択される。
一例では、Ｖ１は、（単一可変ドメインである場合はそれ自体で、またはＶ２とペア形成した場合に、）ヒトＩＬ－１Ａ、ＩＬ－１β、ＩＬ－１ＲＮ、ＩＬ－６、ＢＬｙｓ、ＡＰＲＩＬ、アクチビンＡ、ＴＮＦアルファ、ＢＭＰ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ７、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＲＡＮＫＬ、ＴＲＡＩＬ、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＢまたはＰＧＦからなる群から選択される抗原に特異的に結合することができ、場合により、多量体は、ＩＬ－２またはＩＬ２－ペプチドなどの、サイトカインのアミノ酸配列（例えば、Ｃ末端からＴＤ）を含み、かつ、多量体、四量体または八量体は、ヒト対象においてがんを治療または予防するためのものである。一例では、前記エフェクターまたはタンパク質ドメインは、そのような抗原に結合することができ、場合により、多量体は、ＩＬ－２またはＩＬ２－ペプチドなどの、サイトカインのアミノ酸配列（例えば、Ｃ末端からＴＤ）を含み、かつ、多量体、四量体または八量体は、ヒト対象においてがんを治療または予防するためのものである。
３０．態様２８に定義されるＰ１、または態様２９に定義されるＰ２とペア形成したＰ１の多量体（例えば、二量体、三量体、四量体または八量体）、あるいは複数の前記多量体であって、場合により、前記多量体が、態様１～２４のいずれか１つによるものである、多量体または複数の多量体。
好ましくは、多量体は、操作されたポリペプチドおよび／またはエフェクタードメインの四量体である。一例では、複数の四量体は、該ポリペプチドの単量体、二量体または三量体と混合状態ではない。
一例では、多量体、例えば四量体は、２つの異なるｐＭＨＣに特異的に結合することができる。
３１．態様２７～２９のいずれか１つの操作されたポリペプチドまたは単量体をコードする核酸であって、場合により、前記核酸が、前記ポリペプチドを発現するための発現ベクターによって構成されている、核酸。
一例では、核酸は、ＤＮＡであり、該ＤＮＡは、場合により、ポリペプチドまたは単量体の発現用のプロモーターに作動可能に接続されており、または該プロモーターを含む。別の例では、核酸は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）である。
３２．態様１～２４のいずれか１つの多量体、四量体、八量体、操作されたポリペプチドまたは単量体の細胞内および／または分泌発現のための、態様３１の核酸またはベクターを含む真核宿主細胞。
３３．細胞内に発現および／または分泌された多量体を製造するためのタンパク質多量体の製造方法における態様３１に記載の核酸またはベクターの使用であって、前記方法が、前記核酸またはベクターを含む真核細胞中で前記多量体を発現させることおよび／または前記真核細胞から前記多量体を分泌させることを含む、使用。
３４．態様３１に記載の核酸またはベクターを含む真核細胞においてグリコシル化された多量体を製造するためのタンパク質多量体の製造方法における、前記核酸またはベクターの使用。
本発明の哺乳動物のグリコシル化は、哺乳動物、例えばヒトにおける疾患または状態の医学的治療または予防のための本発明の多量体、四量体または八量体を含むまたはそれからなる薬剤を製造するために有用である。したがって、本発明は、そのような使用方法の他に、この目的のための本発明の多量体、四量体または八量体を提供する。同様に、本発明による哺乳動物のものである１つまたは複数の宿主細胞（またはその細胞株）における細胞内および／または分泌発現は、そのような薬剤を製造するために有用である。ＨＥＫ２９３、ＣＨＯまたはＣｏｓ細胞は医薬の製造のためによく使用されるので、これらの細胞におけるそのような発現は特に有用である。
一実施形態では、本発明は、本発明の多量体、四量体または八量体を含む洗浄剤またはパーソナルヘルスケア製品を含む。一実施形態では、本発明は、本発明の多量体、四量体または八量体を含む食料品または飲料を含む。
一例では、本発明の多量体、単量体、二量体、三量体、四量体、八量体、ポリペプチド、組成物、混合物、使用または方法は、産業上または家庭内の使用のためのものであり、あるいはそのような使用のための方法において使用される。例えば、それは、農業、油もしくは石油産業、食品もしくは飲料品産業、衣料産業、包装産業、電子工学産業、コンピューター産業、環境産業、化学産業、航空宇宙（aeorspace）産業、自動車産業、バイオテクノロジー産業、医療産業、ヘルスケア産業、歯科産業、エネルギー産業、消費者製品産業、製薬産業、採鉱産業、クリーニング産業、林業、漁業、レジャー産業、リサイクル産業、化粧品産業、プラスチック産業、パルプもしくは紙産業、織物産業、衣料産業、レザーもしくはスエードもしくは獣皮産業、タバコ産業または鉄鋼産業のためのものであり、またはそれにおいて使用される。
３５．（ｉ）態様２７～２９のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチドをコードする真核細胞株、および（ｉｉ）態様１～２４のいずれか１つに定義される多量体、四量体または八量体を含む、混合物。
３６．前記細胞株が、前記細胞の分泌産物を含む培地中にあり、前記分泌産物が、前記多量体、四量体または八量体を含む、態様３５の混合物。
３７．医療用途のための、態様１～２４のいずれか１つの多量体、四量体または八量体。
３８．（ａ）真核細胞中で発現されるＴＣＲ Ｖ－ＮＨＲ２ ＴＤまたはＴＣＲ Ｖ－ｐ５３ ＴＤ融合タンパク質の可溶性および／または細胞内発現を含み、場合により、複数の前記多量体を単離することを含む、ＴＣＲ Ｖドメイン多量体を製造する方法、
（ｂ）真核細胞中で発現される抗体Ｖ（例えば、単一可変ドメイン）－ＮＨＲ２ ＴＤまたはＶ－ｐ５３ ＴＤ融合タンパク質の可溶性および／または細胞内発現を含み、場合により、複数の前記多量体を単離することを含む、抗体Ｖドメイン多量体を製造する方法、
（ｃ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞などの真核細胞中で発現されるインクレチンペプチド－ＮＨＲ２ ＴＤまたはインクレチンペプチド－ｐ５３ ＴＤ融合タンパク質の可溶性および／または細胞内発現を含み、場合により、複数の前記多量体を単離することを含む、インクレチンペプチド（例えば、ＧＬＰ－１、ＧＩＰまたはインスリン）多量体を製造する方法、または
（ｄ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞などの真核細胞中で発現されるペプチドホルモン－ＮＨＲ２ ＴＤまたはペプチドホルモン－ｐ５３ ＴＤ融合タンパク質の可溶性および／または細胞内発現を含み、場合により、複数の前記多量体を単離することを含む、ペプチドホルモン多量体を製造する方法。
３９．単量体および／または二量体ポリペプチドより高い収率で四量体を製造するための、ポリペプチドの四量体の製造方法における自己会合性四量体化ドメイン（ＴＤ）（例えば、ＮＨＲ２ ＴＤ、ｐ５３ ＴＤ、ｐ６３ ＴＤもしくはｐ７３ ＴＤまたはそのホモログもしくはオルソログ）の使用。
４０．単量体および／または二量体ポリペプチドより高い収率で四量体を製造するための、タンパク質ドメインまたはペプチドの複数のコピーを含むポリペプチドの四量体の製造方法における操作されたポリペプチドの使用であって、前記操作されたポリペプチドが、前記タンパク質ドメインまたはペプチドの１つまたは複数のコピーを含み、かつ自己会合性四量体化ドメイン（ＴＤ）（例えば、ＮＨＲ２ ＴＤ、ｐ５３ ＴＤ、ｐ６３ ＴＤもしくはｐ７３ ＴＤまたはホモログもしくはオルソログ）をさらに含む、使用。
４１．単量体、二量体または三量体との混合状態ではない複数の四量体を製造するための、ポリペプチドの四量体の製造方法における自己会合性四量体化ドメイン（ＴＤ）（例えば、ＮＨＲ２ ＴＤ、ｐ５３ ＴＤ、ｐ６３ ＴＤもしくはｐ７３ ＴＤまたはそのホモログもしくはオルソログ）の使用。
４２．単量体、二量体または三量体との混合状態ではない複数の四量体を製造するための、タンパク質ドメインまたはペプチドの複数のコピーを含むポリペプチドの四量体の製造方法における操作されたポリペプチドの使用であって、前記操作されたポリペプチドが、前記タンパク質ドメインまたはペプチドの１つまたは複数のコピーを含み、かつ自己会合性四量体化ドメイン（ＴＤ）（例えば、ＮＨＲ２ ＴＤ、ｐ５３ ＴＤ、ｐ６３ ＴＤもしくはｐ７３ ＴＤまたはホモログもしくはオルソログ）をさらに含む、使用。
４３．四量体の前記収率が、単量体および／または二量体の前記収率の少なくとも１０、２０、３０、４０または５０倍である、態様３９～４２のいずれか１つの使用。
４４．前記方法において製造される四量体：製造される単量体および／または二量体の比が、少なくとも９０：１０（例えば、少なくとも９５：５または９８：２、または９９：１）である、態様３９～４３のいずれか１つの使用。
４５．各単量体が、４０、３５、３０、２５または２０ｋＤａ以下の大きさを有する、態様３９～４４のいずれか１つの使用。
４６．各四量体が、２００、１６０、１５５または１５０ｋＤａ以下の大きさを有する、態様３９～４５のいずれか１つの使用。
４７．前記方法が、真核細胞株から前記四量体を発現させることを含む、態様３９～４６のいずれか１つの使用。
４８．（ｉ）ＴＣＲ細胞外ドメイン、
（ｉｉ）免疫グロブリン定常ドメイン、および
（ｉｉｉ）ＥＴＯのＮＨＲ２多量体化ドメイン
を含む、ｐＭＨＣ複合体に結合できる多価ヘテロ二量体可溶性Ｔ細胞受容体。
４９．（ｉ）免疫グロブリン可変ドメイン、および
（ｉｉ）ＥＴＯのＮＨＲ２多量体化ドメイン
を含む、多量体免疫グロブリン。
５０．可溶性の多量体ポリペプチドに集合させる方法であって、
（ａ）ＥＴＯのＮＨＲ２ドメインに融合した、前記多量体ポリペプチドの単量体を提供すること、
（ｂ）前記単量体の複数のコピーを会合させ、それによって多量体の可溶性ポリペプチドを得ること
を含む、方法。
本発明は、さらに以下を提供する：
（ｉ）図１に示される単量体；
（ｉｉ）図１に示されるホモ二量体；
（ｉｉｉ）図１に示されるホモ四量体；
（ｉｖ）図２に示される単量体２；
（ｖ）図２に示されるホモ二量体２；
（ｖｉ）図２に示されるホモ四量体２；
（ｖｉｉ）図１１ａに示される単量体；
（ｖｉｉｉ）図１１ａに示されるホモ二量体；
（ｉｘ）図１１ａに示されるホモ四量体；
（ｘ）図１２ａに示される単量体；
（ｘｉ）図１２ａに示されるホモ二量体；
（ｘｉｉ）図１２ａに示されるホモ四量体；
（ｘｉｉｉ）図１３ａに示される単量体２；
（ｘｉｖ）図１３ａに示されるホモ二量体２；
（ｘｖ）図１３ａに示されるホモ四量体２；または
（ｘｖｉ）（ｉ）～（ｘｖ）のいずれか１つ（例えば、Ｑｕａｄ ３、Ｑｕａｄ ４、Ｑｕａｄ １２、Ｑｕａｄ １３、Ｑｕａｄ １４、Ｑｕａｄ １５、Ｑｕａｄ １６およびＱｕａｄ １７のいずれか１つ）を含む多量体タンパク質、または図２１に示される任意のタンパク質（任意のリーダーまたはタグを除く）の多量体。
（ｘｖｉｉ）複数の（ｘｖｉ）の多量体；または
（ｘｖｉｉｉ）（ｉ）～（ｘｖｉｉ）のいずれか１つおよび薬学的に許容される担体、希釈剤または医薬品添加物を含む医薬組成物。
本発明はまた、以下を提供する：
（ｉ）四価または八価の抗体Ｖ分子；
（ｉｉ）四価または八価の抗体Ｆａｂ分子；
（ｉｉｉ）四価または八価の抗体ｄＡｂ分子；
（ｉｖ）四価または八価の抗体ｓｃＦｖ分子；
（ｖ）四価または八価の抗体ＴＣＲ Ｖ分子；または
（ｖｉ）四価または八価の抗体ｓｃＦｖ分子
であって、該分子は、
（ａ）水溶液（例えば、本明細書に開示される溶液または細胞培養培地）中で可溶性であり、かつ／または
（ｂ）ＨＥＫ２９３細胞によって細胞内および／または細胞外に発現可能である。
本発明は、そのＮ末端および／またはＣ末端においてＮＨＲ２配列ではないアミノ酸配列（例えば、ペプチド、タンパク質ドメインまたはタンパク質）に融合したＮＨＲ２またはｐ５３（または本明細書に開示される別のＴＤ）の請求項の多量体（例えば、四量体）を提供する。例えば、配列は、ＴＣＲ（例えば、ＴＣＲａ、ＴＣＲβ、ＣａまたはＯβ）、サイトカイン（例えば、インターロイキン、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１２およびＩＦＮ）、抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ、ｄＡｂまたはＦａｂ）および抗体ドメイン（例えば、ＶまたはＣドメイン、例えば、ＶＨ、ＶＬ、Ｖκ、Ｖλ、ＣＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ヒンジ（hige）、ＣκまたはＣｘドメイン）から選択される。場合により、多量体は、
（ｉ）水溶液（例えば、本明細書に開示される溶液または細胞培養培地）中で可溶性であり、かつ／または
（ｉｉ）ＨＥＫ２９３細胞によって細胞内および／または細胞外に発現可能である、
分子である。
本発明は以下を提供する（inventonprovides）：
（ｉ）細胞、例えば、真核細胞、例えば、哺乳動物、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯまたはＣｏｓ細胞からのポリペプチドの多量体の可溶性発現のためのポリペプチドの製造のためのＮＨＲ２またはｐ５３（または本明細書に開示される別のＴＤ）の使用。
（ｉｉ）細胞、例えば、真核細胞、例えば、哺乳動物、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯまたはＣｏｓ細胞中でのポリペプチドの多量体の細胞内発現のためのポリペプチドの製造のためのＮＨＲ２またはｐ５３（または本明細書に開示される別のＴＤ）の使用。
（ｉｉｉ）細胞内（intracelllular）発現産物を含む細胞であって、該産物が、そのＮ末端および／またはＣ末端においてＮＨＲ２配列ではないアミノ酸配列（例えば、ペプチド、タンパク質ドメインまたはタンパク質）に融合したＮＨＲ２またはｐ５３（または本明細書に開示される別のＴＤ）を含むポリペプチドの多量体を含む、細胞。
（ｉｖ）宿主細胞から細胞内にかつ／または可溶性に発現される多量体の製造におけるペプチド、タンパク質ドメイン、ポリペプチドまたはタンパク質を四量体化するための乱交雑（promiscuous）四量体化ドメインとしてのＮＨＲ２の使用。
場合により、アミノ酸は、ヒトのペプチド、タンパク質ドメインまたはタンパク質、例えば、ＴＣＲ（例えば、ＴＣＲａ、ＴＣＲβ、ＣａまたはＣβ）、サイトカイン（例えば、インターロイキン、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１２およびＩＦＮ）、抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ、ｄＡｂまたはＦａｂ）、または抗体ドメイン（例えば、ＶまたはＣドメイン、例えば、ＶＨ、ＶＬ、Ｖκ、Ｖλ、ＣＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ヒンジ、ＣκまたはＣλドメイン）のアミノ酸配列である。
場合により、該または各ポリペプチドは、Ｑｕａｄ １～４６からなる群から選択されるポリペプチド（すなわち、図２１に示すポリペプチドであるが、任意のリーダーまたはタグ配列を除く）を含む。場合により、本発明は、例えば、医療または診断用途、例えば、ヒトまたは動物（例えば、ヒト）において疾患または状態を治療または予防するための医療用途のための、そのようなＱｕａｄ １～４６からなる群から選択されるポリペプチドの多量体（例えば、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体または八量体、好ましくは四量体または八量体）を提供する。
場合により、該または各ポリペプチドは、配列番号１３～５０からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチド（任意のリーダーまたはタグ配列を除く）を含む。場合により、該または各ポリペプチドは、配列番号８３～１１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド（任意のリーダーまたはタグ配列を除く）を含む。場合により、本発明は、例えば、医療または診断用途、例えば、ヒトまたは動物（例えば、ヒト）において疾患または状態を治療または予防するための医療用途のための、そのようなポリペプチドの多量体（例えば、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体または八量体、好ましくは四量体または八量体）を提供する。
一例では、ＴＤは、配列番号１～９のいずれか１つによって構成されるＴＤである。一例では、ＴＤは、配列番号１０または１２６を含むＴＤである。一例では、ＴＤは、配列番号１２４または１２５によってコードされる。一例では、各ＴＤのアミノ酸配列は、配列番号１０または１２６であり、あるいは、配列番号１０または１２６に対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９６ｍ ９７、９８または９９％同一である。
一例では、ＴＤは、配列番号１２０または１２３を含むＴＤである。一例では、ＴＤは、配列番号１１６または１１９によってコードされる。一例では、各ＴＤのアミノ酸配列は、配列番号１２０または１２３であり、あるいは、配列番号１２０または１２３に対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９６ｍ ９７、９８または９９％同一である。
場合により、操作されたポリペプチドまたは単量体によって構成されるドメインまたはペプチドは、配列番号５１～８２から選択されるアミノ酸を含む。
高純度の四量体
本明細書に例示される通り、本発明は、一構成では、四量体化ドメイン（ＴＤ）、例えばｐ５３四量体化ドメイン（ｐ５３ ＴＤ）を使用して、二量体および単量体などのより低次の構造の製造に対して優先的にエフェクタードメインの四量体を製造できるという驚くべき実現に基づく。これは、四量体の分泌がＣＨＯ、ＨＥＫ２９３およびＣｏｓ細胞株などの哺乳動物発現細胞株からの望ましい収率であるために特に有用である。本発明はまた、２００、１６０、１５５または１５０ｋＤａ以下の大きさの四量体の製造のために特に有用である。
したがって、本発明は、以下の概念を提供する：
概念
１．単量体および／または二量体ポリペプチドより高い収率で四量体を製造するための、ポリペプチドの四量体の製造方法における四量体化ドメイン（ＴＤ）（例えば、ｐ５３四量体化ドメイン（ｐ５３ ＴＤ）またはＮＨＲ２ ＴＤ）またはそのホモログもしくはオルソログの使用。
単量体および二量体は、それぞれ１または２コピーのＴＤ、ホモログまたはオルソログを含む。
一例では、ＴＤ、オルソログまたはホモログは、ヒトドメインである。
一例では、四量体の収率は、単量体の収率より高く；一例では、四量体の収率は、二量体の収率より高く；一例では、四量体の収率は、三量体の収率より高く；一例では、四量体の収率は、単量体および二量体の収率より高く；一例では、四量体の収率は、単量体および三量体の収率より高く；一例では、四量体の収率は、単量体、二量体および三量体の収率より高い。
例えば、ＴＤは、ｐ５３アイソフォーム１のＴＤである。一例では、ＴＤは、ヒトｐ５３（例えば、アイソフォーム１）の３２５～３５６（または３１９～３６０；または３２１～３５９）位に対して同一のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。場合により、ＴＤ、オルソログまたはホモログは、配列番号１０、１２６、１１または１２に対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８または９９％同一のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。例えば、配列は、前記選択される配列に対して同一である。場合により、ＴＤ、オルソログまたはホモログは、配列番号１２０、１２１、１２２または１２３に対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８または９９％同一のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。例えば、配列は、前記選択される配列と同一である。
２．同一のＴＤまたはそのホモログもしくはオルソログの第１、第２、第３および第４のコピーが使用される、概念１の使用。
３．前記ＴＤが、ＮＨＲ２、ｐ５３、ｐ６３またはｐ７３の四量体化ドメインである、任意の先行する概念の使用。
例えば、ＴＤは、ｐ５３ ＴＤである。一例では、ＴＤは、ｐ５３ ＴＤ、例えばヒトｐ５３ ＴＤの、オルソログまたはホモログである。
４．前記四量体の収率が、単量体および／または二量体の前記収率の少なくとも１０倍である、任意の先行する概念の使用。
場合により、収率は、単量体および／または二量体の収率の少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍である。場合により、製造される四量体：単量体および／または二量体の比は、少なくとも９０：１０、例えば、少なくとも９５：５；または９６：４；または９７：３；または９８：２；または９９：１である。場合により、四量体のみが製造される。
一実施形態では、各単量体、二量体または四量体によって構成される各ドメインは、ヒトドメインであり；かつ、場合により、単量体、二量体または四量体は、非ヒトのアミノ酸配列またはリンカーを含まない。
５．前記方法において製造される四量体：製造される単量体および／または二量体の比が、少なくとも９０：１０（すなわち、単量体の量の９倍；二量体の量の９倍；または単量体および二量体の組合せの量の９倍）である、任意の先行する概念の使用。
６．前記収率または比が、前記四量体製造方法の製造物の試料を得ること、前記試料に対してタンパク質分離技術を使用して四量体、単量体および二量体を分離すること、および四量体の量を単量体および二量体の量と比較することによって決定可能または決定される、概念４または５の使用。
四量体、単量体、二量体および三量体の量は、例えば、本明細書に記載されるゲル、例えば、ネイティブゲル、すなわち、ＳＤＳの非存在下などの、変性条件下ではないゲルのウエスタンブロット解析を使用して決定することができる。
７．前記収率または比が、
（ａ）前記四量体製造方法の製造物の試料を得ること、
（ｂ）非還元条件下でポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を実行して、前記四量体に対応するバンドおよび前記単量体に対応するバンドおよび／または前記二量体に対応するバンドに前記試料を分離すること、および
（ｃ）例えば、相対的なバンド強度および／またはバンドサイズを比較することによって、前記四量体バンドを前記単量体および／または二量体バンドと比較して前記収率または比を決定すること
によって決定可能または決定される、概念４または５の使用。
８．前記収率または比が、
（ｄ）前記四量体製造方法の製造物の試料を得ること、
（ｅ）非還元条件下でポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を実行して、前記四量体に対応するバンドに前記試料を分離することであって、例えば、前記ゲルが、非変性条件下（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（sodium dodecylsuphate）（ＳＤＳ）の非存在下）にある、分離すること、
（ｆ）前記単量体に対応するバンドおよび／または前記二量体に対応するバンドが存在しないことを判定すること
によって決定可能または決定される、概念４または５の使用。
９．（ｇ）前記四量体製造方法の製造物の第２の試料を得ること、
（ｈ）還元条件下でポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を実行して、前記単量体に対応するバンドおよび／または前記二量体に対応するバンドに前記第２の試料を分離することであって、例えば、前記ゲルが、非変性条件下（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の非存在下）にある、分離すること、および
（ｉ）ステップ（ｈ）によって製造されたゲルをステップ（ｂ）または（ｅ）のゲルと比較して、ステップ（ｂ）のゲルにおける単量体および／または二量体バンドの位置を決定することであって、または、そのようなゲルが、ステップ（ｅ）のゲルであることが期待される、決定すること
を含む、概念７または８の使用。
１０．各単量体が、４０ｋＤａ以下の大きさを有する、任意の先行する概念の使用。
例えば、単量体は、３５、３０、２５、２４、２３、２２、２１または２０ｋＤａ以下の大きさを有する。
１１．各四量体が、１５０ｋＤａ以下の大きさを有する、任意の先行する概念の使用。
例えば、四量体は、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０または１４０ｋＤａ以下の大きさを有する。
１２．前記方法が、哺乳動物細胞株、例えば、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯまたはＣｏｓ細胞株から前記四量体を発現させることを含む、任意の先行する概念の使用。
例えば、細胞株は、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ）細胞株である。代替としては、細胞株は、酵母（例えば、サッカロミセス（Saccharomyces）またはピキア（Pichia）、例えば、Ｐパストリス（Ｐパストリス（P pastoris）））または細菌細胞株である。
１３．前記方法が、哺乳動物細胞株、例えば、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯまたはＣｏｓ細胞株から前記四量体を分泌させることを含む、任意の先行する概念の使用。
したがって、有利なことに、一例では、使用または四量体は、哺乳動物細胞株（例えば、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯまたはＣｏｓ細胞株）または真核細胞株からの発現のためのものである。これは、本発明の製造物、例えば四量体の大規模製造のために有用である。
例えば、細胞株は、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ）細胞株である。代替としては、細胞株は、酵母（例えば、サッカロミセス（Saccharomyces）またはピキア（Pichia）、例えば、Ｐパストリス（P pastoris））または細菌細胞株である。
１４．各ポリペプチドまたは単量体が、前記ＴＤ、ホモログまたはオルソログ、および、１つまたは複数のタンパク質エフェクタードメイン（１つまたは複数の抗体ドメインなど、例えば、抗原結合部位を形成する１つまたは複数の抗体ドメイン）を含む、任意の先行する概念の使用。
１５．前記ポリペプチドが、
（ｉ）抗原に特異的に結合できる抗体単一可変ドメイン（ｄＡｂまたはＶＨＨまたはＮａｎｏｂｏｄｙ（商標））、
（ｉｉ）抗原に結合できるｓｃＦｖまたはｐＭＨＣに結合できるｓｃＴＣＲ、
（ｉｉｉ）抗原に結合できるＦａｂ、または
（ｉｖ）ＴＣＲ可変ドメインまたはｐＭＨＣ結合部位
の１つまたは複数を含む、概念１４の使用。
１６．各ポリペプチドまたは単量体が、前記ＴＤ、ホモログまたはオルソログ、および、１つまたは複数のインクレチン、インスリン、ＧＬＰ－１またはエキセンジン－４のドメインを含む、任意の先行する概念の使用。
１７．各ポリペプチドまたは単量体が、前記ＴＤ、ホモログまたはオルソログ、ならびに第１および第２の抗原結合部位を含む、任意の先行する概念の使用。
１８．各結合部位が、
（ｉ）抗原に特異的に結合できる抗体単一可変ドメイン（ｄＡｂまたはＶＨＨまたはＮａｎｏｂｏｄｙ（商標））、
（ｉｉ）抗原に結合できるｓｃＦｖまたはｐＭＨＣに結合できるｓｃＴＣＲ、
（ｉｉｉ）抗原に結合できるＦａｂ、または
（ｉｖ）ＴＣＲ可変ドメインまたはｐＭＨＣ結合部位
によって提供される、概念１７の使用。
１９．各結合部位が、抗体単一可変ドメインによって提供される、概念１８の使用。
２０．前記ＴＤ、ホモログまたはオルソログが、前記さらなるドメインに直接的に融合している、概念１４～１８のいずれか１つの使用。
２１．各単量体またはポリペプチドが、前記さらなるドメインのＣ末端に直接的にまたはペプチドリンカーを介して融合した前記ＴＤ、ホモログまたはオルソログを含む、概念２０の使用。
２２．ポリペプチドの四量体であって、各ポリペプチドが、
（ｉ）四量体化ドメイン（ＴＤ）（例えば、ｐ５３ ＴＤまたはＮＨＲ２ ＴＤ）またはそのホモログもしくはオルソログ、
（ｉｉ）１つまたは複数のタンパク質エフェクタードメイン、および
（ｉｉｉ）場合により、（ｉ）を（ｉｉ）に連結する（例えば、（ｉｉ）のＣ末端を（ｉ）のＮ末端に連結する）リンカー
を含み、
場合により、各四量体が、１５０または２００ｋＤａ以下の大きさを有する、
四量体。
例えば、四量体は、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０または１４０ｋＤａ以下の大きさを有する。一例では、本発明における任意の多量体、二量体、三量体、四量体または八量体は、少なくとも６０または８０ｋＤａの大きさを有し、これは、例えば、（例えば、対象において疾患または状態を治療または予防するために）多量体、二量体、三量体、四量体または八量体を投与されたヒトまたは動物対象において半減期を増加させるために有用であり得る。これらの範囲の大きさは、腎臓濾過の大きさより大きいものであり得る。
代替としては、本発明は、四量体の代わりに単量体、二量体、四量体または八量体を提供する。
２３．各ポリペプチドが、
（ｉ）抗原に特異的に結合できる抗体単一可変ドメイン（ｄＡｂまたはＶＨＨまたはＮａｎｏｂｏｄｙ（商標））、
（ｉｉ）抗原に結合できるｓｃＦｖまたはｐＭＨＣに結合できるｓｃＴＣＲ、
（ｉｉｉ）抗原に結合できるＦａｂ、または
（ｉｖ）ＴＣＲ可変ドメインまたはｐＭＨＣ結合部位
の１つまたは複数を含む、概念２２の四量体。
２４．各ポリペプチドが、前記ＴＤ、ホモログまたはオルソログ、および、１つまたは複数のインクレチン、インスリン、ＧＬＰ－１またはエキセンジン－４のドメインを含む、概念２２または２３の四量体。
２５．各ポリペプチドが、前記ＴＤ、ホモログまたはオルソログ、ならびに第１および第２の抗原結合部位を含む、概念２２または２３の四量体。
２６．各結合部位が、
（ｉ）抗原に特異的に結合できる抗体単一可変ドメイン（ｄＡｂまたはＶＨＨまたはＮａｎｏｂｏｄｙ（商標））、
（ｉｉ）抗原に結合できるｓｃＦｖまたはｐＭＨＣに結合できるｓｃＴＣＲ、
（ｉｉｉ）抗原に結合できるＦａｂ、または
（ｉｖ）ＴＣＲ可変ドメインまたはｐＭＨＣ結合部位
によって提供される、概念２５の四量体。
２７．各結合部位が、抗体単一可変ドメインによって提供される、概念２６の四量体。
２８．前記ＴＤ、ホモログまたはオルソログが、前記エフェクタードメインに直接的に融合している、概念２２～２７のいずれか１つの四量体。
２９．各ポリペプチドが、前記エフェクタードメインのＣ末端に直接的にまたはペプチドリンカーを介して融合した前記ＴＤ、ホモログまたはオルソログを含む、概念２２～２７のいずれか１つの四量体。
一実施形態では、各ポリペプチドは、２つのみ（すなわち、第１および第２のみであり、第３は含まない）のエフェクタードメインまたは２つのみのｄＡｂ、ＶＨＨ、ｓｃＦｖ、ｓｃＴＣＲ、Ｆａｂもしくは抗原結合部位を含む。
３０．概念２２～２９のいずれか１つの四量体および薬学的に許容される担体、希釈剤または医薬品添加物を含む医薬組成物。
場合により、組成物は、滅菌された医療容器またはデバイス、例えば、注射器、バイアル、吸入器または注射デバイスに含まれる。
３１．概念２２～２９のいずれか１つの四量体を含む、化粧品、食料品、飲料、洗浄用製品、洗浄剤。
３２．任意の先行する概念に記載されるポリペプチドをコードする細胞株（例えば、哺乳動物細胞株、例えば、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯまたはＣｏｓ細胞株）、および任意の先行する概念に定義される四量体を含む、混合物。
場合により、混合物は、滅菌された容器に含まれる。
３３．前記細胞株が、前記細胞の分泌産物を含む培地中にあり、前記分泌産物が前記四量体を含む、概念３２の混合物。
３４．前記分泌産物が、概念１～３１のいずれか１つに定義される単量体および／または二量体を含まない、概念３３の混合物。
３５．前記分泌産物が、単量体および／または二量体の量の少なくとも１０倍の量の前記四量体を含む、概念３３の混合物。
３６．前記分泌産物が、少なくとも９０：１０の四量体：単量体および／または二量体の比で前記四量体を含む、概念３３の混合物。
３７．ポリペプチドの四量体を細胞株（例えば、哺乳動物細胞、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３またはＣｏｓ細胞株）から発現させることを含む、タンパク質エフェクタードメイン（例えば、抗体可変ドメインまたは結合部位）の四量体の収率を増進させる方法であって、前記ポリペプチドが、任意の先行する概念に定義されるものであり、かつ１つまたは複数のエフェクタードメインを含み、かつ、前記方法が、場合により、前記発現された四量体を単離することを含む、方法。
ホモログ、オルソログまたは同等物は、四量体化機能を有する。
ホモログ：共通の祖先ＤＮＡまたはタンパク質配列を起源とすることによって第２の遺伝子、ヌクレオチドまたはタンパク質配列に関係する遺伝子、ヌクレオチドまたはタンパク質配列。ホモログという用語は、の事象によって分離された遺伝子間の関係または遺伝子複製の事象によって分離された遺伝子間の関係に適用されることがある。
オルソログ：オルソログは、種分化によって共通の祖先遺伝子、ヌクレオチドまたはタンパク質配列から進化した異なる種における遺伝子、ヌクレオチドまたはタンパク質配列である。通常、オルソログは、進化の過程で同じ機能を保持する。
一例では、ＴＤ、オルソログまたはホモログは、表２に列挙されたタンパク質１～１１９のいずれか１つのＴＤである。一例では、オルソログまたはホモログは、表２に列挙されたタンパク質１～１１９のいずれか１つのＴＤのオルソログまたはホモログである。一実施形態では、ｐ５３四量体化ドメイン（ｐ５３－ＴＤ）またはそのホモログもしくはオルソログの使用の代わりに、本明細書中の発明の全ての態様は、表２に列挙されたタンパク質１～１１９のいずれか１つのＴＤまたはそのホモログもしくはオルソログがポリペプチド、単量体、二量体、三量体または四量体において使用されることまたはそれに包含されることに関するものとして読むことができる。ＴＤは、ＮＨＲ２（例えば、ヒトＮＨＲ２）のＴＤまたはそのオルソログもしくはホモログであり得る。ＴＤは、ｐ６３（例えば、ヒトｐ６３）のＴＤまたはそのオルソログもしくはホモログであり得る。ＴＤは、ｐ７３（例えば、ヒトｐ７３）のＴＤまたはそのオルソログもしくはホモログであり得る。これは、以下の通りの１つまたは複数の利点を有し得る：
－ 哺乳動物または他の真核細胞、例えば、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３またはＣｏｓなどの本明細書に開示される哺乳動物細胞からの四量体の分泌；
－ 単量体に対する、分泌される四量体の収率の増進；
－ 二量体に対する、分泌される四量体の収率の増進；
－ 三量体に対する、分泌される四量体の収率の増進；
－ 単量体および二量体を合わせたものに対する、分泌される四量体の収率の増進；
－ 単量体、二量体および三量体を合わせたものに対する、分泌される四量体の収率の増進；
－ 抗原結合部位を含む四量体における抗原結合の親和性またはアビディティの増進；
－ ２００または１６０または１５０ｋＤａ以下の大きさの四量体の産生および／または発現の増進。
一実施形態では、各ポリペプチドまたは単量体は、レオプロ（商標）；アブシキシマブ；リツキサン（商標）；リツキシマブ；ゼナパックス（商標）；ダクリズマブ；シムレクト（商標）；バシリキシマブ；シナジス（商標）；パリビズマブ；レミケード（商標）；インフリキシマブ；ハーセプチン（商標）；トラスツズマブ；マイロターグ（商標）；ゲムツズマブ；キャンパス（商標）；アレムツズマブ；ゼヴァリン（商標）；イブリツモマブ；ヒュミラ（商標）；アダリムマブ；ゾレア（商標）；オマリズマブ；ベキサール（商標）；トシツモマブ；ラプティバ（商標）；エファリズマブ；アービタックス（商標）；セツキシマブ；アバスチン（商標）；ベバシズマブ；タイサブリ（商標）；ナタリズマブ；アクテムラ（商標）；トシリズマブ；ベクティビックス（商標）；パニツムマブ；ルセンティス（商標）；ラニビズマブ；ソリリス（商標）；エクリズマブ；シムジア（商標）；セルトリズマブ；シンポニー（商標）；ゴリムマブ、イラリス（商標）；カナキヌマブ；ステラーラ（商標）；ウステキヌマブ；アーゼラ（商標）；オファツムマブ；プロリア（商標）；デノスマブ；ヌマックス（商標）；モタビズマブ；アブスラックス（商標）；ラキシバクマブ；ベンリスタ（商標）；ベリムマブ；ヤーボイ（商標）；イピリムマブ；アドセトリス（商標）；ブレンツキシマブ；ベドチン（商標）；パージェタ（商標）；ペルツズマブ；カドサイラ（商標）；アド・トラスツズマブ；ガザイバ（商標）およびオビヌツズマブから選択される抗体の１つまたは複数のＶＨ、ＶＬまたはＶＨ／ＶＬ結合部位を含む。代替としては、（例えば、ヒトにおいてがんを治療または予防するために）各ポリペプチドまたは単量体は、イピリムマブ（またはヤーボイ（商標））、トレメリムマブ、ニボルマブ（またはオプジーボ（商標））、ペムブロリズマブ（またはキイトルーダ（商標））、ピジリズマブ、ＢＭＳ－９３６５５９、デュルバルマブおよびアテゾリズマブから選択される抗体の１つまたは複数のＶＨ、ＶＬまたはＶＨ／ＶＬ結合部位を含む。
一例では、四量体は、イピリムマブ（またはヤーボイ（商標））、トレメリムマブ、ニボルマブ（またはオプジーボ（商標））、ペムブロリズマブ（またはキイトルーダ（商標））、ピジリズマブ、ＢＭＳ－９３６５５９、デュルバルマブおよびアテゾリズマブからなる群から選択される第１の抗体の抗原結合部位の４つのコピー、および、場合により、前記群から選択される第２の抗体の抗原結合部位の４つのコピーを含み、第１の抗体と第２の抗体は異なる。例えば、第１の抗体は、イピリムマブ（またはヤーボイ（商標））であり、かつ、場合により、第２の抗体は、ニボルマブ（またはオプジーボ（商標））またはペムブロリズマブ（またはキイトルーダ（商標））である。これは、ヒトにおいてがんを治療または予防するために有用である。
一例では、四量体は、アバスチンの抗原結合部位の４つのコピーを含む。一例では、四量体は、ヒュミラの抗原結合部位の４つのコピーを含む。一例では、四量体は、アービタックスの抗原結合部位の４つのコピーを含む。一例では、四量体は、アクテムラ（商標）の抗原結合部位の４つのコピーを含む。一例では、四量体は、サリルマブの抗原結合部位の４つのコピーを含む。一例では、四量体は、デュピルマブの抗原結合部位の４つのコピーを含む。一例では、四量体は、アリロクマブまたはエボロクマブの抗原結合部位の４つのコピーを含む。一例では、四量体は、の抗原結合部位の４つのコピーを含む。一例では、四量体は、レミケードの抗原結合部位の４つのコピーを含む。一例では、四量体は、ルセンティスの抗原結合部位の４つのコピーを含む。一例では、四量体は、アイリーア（Eylea）（商標）の抗原結合部位の４つのコピーを含む。そのような四量体は、ヒトに投与してがんを治療または予防するために有用である。そのような四量体は、ヒトに投与して眼状態（例えば、滲出型ＡＭＤまたは糖尿病網膜症、例えば、結合部位が、アバスチン、ルセンティスまたはアイリーアの部位の場合）を治療または予防するために有用である。そのような四量体は、ヒトに投与して血管新生を治療または予防するために有用である。
一例では、四量体は、インスリンの４つのコピーを含む。一例では、四量体は、ＧＬＰ－１の４つのコピーを含む。一例では、四量体は、ＧＩＰの４つのコピーを含む。一例では、四量体は、エキセンジン－４の４つのコピーを含む。一例では、四量体は、インスリンの４つのコピーおよびＧＬＰ－１の４つのコピーを含む。一例では、四量体は、インスリンの４つのコピーおよびＧＩＰの４つのコピーを含む。一例では、四量体は、インスリンの４つのコピーおよびエキセンジン－４の４つのコピーを含む。一例では、四量体は、ＧＬＰ－１の４つのコピーおよびエキセンジン－４の４つのコピーを含む。そのような四量体は、ヒトに投与して糖尿病（例えば、ＩＩ型糖尿病）または肥満症を治療または予防するために有用である。
疾患および状態
本発明の単量体または多量体（例えば、二量体、三量体、四量体または八量体）は、ヒトまたは動物対象に投与して対象において疾患または状態を治療または予防するための方法において使用することができる。
場合により、疾患または状態は、以下から選択される：
（ａ）神経変性疾患または状態；
（ｂ）脳疾患または状態；
（ｃ）ＣＮＳ疾患または状態；
（ｄ）記憶喪失または障害；
（ｅ）心臓または心臓血管の疾患または状態、例えば、心臓発作、卒中または心房細動；
（ｆ）肝臓疾患または状態；
（ｇ）腎臓疾患または状態、例えば、慢性腎臓病（ＣＫＤ）；
（ｈ）膵臓疾患または状態；
（ｉ）肺疾患または状態、例えば、嚢胞性繊維症またはＣＯＰＤ；
（ｊ）胃腸疾患または状態；
（ｋ）喉または口腔の疾患または状態；
（ｌ）眼疾患または状態；
（ｍ）生殖器疾患または状態、例えば、膣、陰唇、陰茎または陰嚢の疾患または状態；
（ｎ）性感染性疾患または状態、例えば、淋病、ＨＩＶ感染症、梅毒またはクラミジア感染症；
（ｏ）耳疾患または状態；
（ｐ）皮膚疾患または状態；
（ｑ）心臓疾患または状態；
（ｒ）鼻疾患または状態
（ｓ）血液疾患または状態、例えば、貧血、例えば、慢性疾患またはがんの貧血；
（ｔ）ウイルス感染症；
（ｕ）病原性細菌感染症；
（ｖ）がん；
（ｗ）自己免疫疾患または状態、例えば、ＳＬＥ；
（ｘ）炎症性疾患または状態、例えば、関節リウマチ、乾癬、湿疹、喘息、潰瘍性大腸炎、大腸炎、クローン病またはＩＢＤ；
（ｙ）自閉症；
（ｚ）ＡＤＨＤ；
（ａａ）双極性障害；
（ｂｂ）ＡＬＳ［筋萎縮性側索硬化症］；
（ｃｃ）変形性関節症；
（ｄｄ）先天性または発達上の欠陥または状態；
（ｅｅ）流産；
（ｆｆ）血液凝固状態；
（ｇｇ）気管支炎；
（ｈｈ）非滲出型または滲出型ＡＭＤ；
（ｉｉ）血管新生（例えば、腫瘍のまたは眼中のもの）；
（ｊｊ）感冒；
（ｋｋ）癲癇；
（ｌｌ）線維症、例えば、肝臓または肺線維症；
（ｍｍ）真菌疾患または状態、例えば、鵞口瘡；
（ｎｎ）代謝性疾患または状態、例えば、肥満症、無食欲、糖尿病、Ｉ型またはＩＩ型糖尿病。
（ｏｏ）潰瘍、例えば、胃潰瘍または皮膚潰瘍；
（ｐｐ）乾燥皮膚；
（ｑｑ）シェーグレン症候群；
（ｒｒ）サイトカインストーム；
（ｓｓ）難聴、聴覚喪失または障害；
（ｔｔ）遅いまたは早い代謝（すなわち、対象の体重、性別および年齢の平均よりも遅いまたは早い）
（ｕｕ）妊娠障害、例えば、不妊症または低い生殖能力；
（ｖｖ）黄疸；
（ｗｗ）皮膚発疹；
（ｘｘ）川崎病；
（ｙｙ）ライム病；
（ｚｚ）アレルギー、例えば、ナッツ、草、花粉、チリダニ、ネコまたはイヌの柔毛または鱗屑のアレルギー；
（ａａａ）マラリア、腸チフス、結核またはコレラ；
（ｂｂｂ）鬱病；
（ｃｃｃ）精神遅滞；
（ｄｄｄ）小頭症；
（ｅｅｅ）栄養不良；
（ｆｆｆ）結膜炎；
（ｇｇｇ）肺炎；
（ｈｈｈ）肺塞栓症；
（ｉｉｉ）肺高血圧症；
（ｊｊｊ）骨障害；
（ｋｋｋ）敗血症または敗血症性ショック；
（ｌｌｌ）静脈洞炎（Sinusitus）；
（ｍｍｍ）ストレス（例えば、産業ストレス）；
（ｎｎｎ）サラセミア、貧血、フォンウィルブランド病、または血友病；
（ｏｏｏ）帯状疱疹または口唇ヘルペス；
（ｐｐｐ）月経；
（ｑｑｑ）低精子数。
治療または予防のための神経変性またはＣＮＳ疾患または状態
一例では、神経変性またはＣＮＳ疾患または状態は、アルツハイマー病、老年期精神病、ダウン症候群、パーキンソン病、クロイツフェルト・ヤコブ病、糖尿病性ニューロパチー、パーキンソン症候群、ハンチントン病、マチャド・ジョセフ病、筋萎縮性側索硬化症、糖尿病性ニューロパチー、およびクロイツフェルト・クロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択される。例えば、疾患は、アルツハイマー病である。例えば、疾患は、パーキンソン症候群である。
一例では、本発明の方法がＣＮＳまたは神経変性疾患または状態を治療するためにヒトまたは動物対象に実施される場合、方法は、対象においてＴｒｅｇ細胞の下方調節を引き起こし、それによって、全身の単球由来マクロファージおよび／またはＴｒｅｇ細胞が脈絡叢を超えて対象の脳に入ることを促進し、それによって、疾患または状態（例えば、アルツハイマー病）が治療され、予防され、またはその進行が低減される。一実施形態では、方法は、対象のＣＮＳ系において（例えば、脳および／またはＣＳＦにおいて）ＩＦＮ－ガンマの増加を引き起こす。一例では、方法は、神経線維を回復させ、かつ／または神経線維損傷の進行を低減させる。一例では、方法は、神経ミエリンを回復させ、かつ／または神経ミエリン損傷の進行を低減させる。一例では、本発明の方法は、国際公開第２０１５１３６５４１号パンフレットに開示される疾患または状態を治療または予防し、かつ／または方法は、国際公開第２０１５１３６５４１号パンフレット（この文献の開示は、例えば、そのような方法、疾患、状態、および、ＣＮＳおよび神経変性疾患および状態の治療および／または予防をもたらすために対象に投与できる潜在的な治療剤、例えば、免疫チェックポイント阻害剤などの剤、例えば、該文献に開示される抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＴＩＭ３または他の抗体の開示を提供するために、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示される任意の方法と共に使用することができる。。
治療または予防のためのがん
治療され得るがんとしては、新生血管を形成していない、または実質的に新生血管を形成していない腫瘍の他に、新生血管を形成した腫瘍が挙げられる。がんは、非固形腫瘍（血液腫瘍、例えば、白血病およびリンパ腫など）を含むことができ、または固形腫瘍を含むことができる。本発明を用いて治療されるがんの種類としては、癌腫、芽細胞腫、および肉腫、およびある特定の白血病またはリンパ性悪性腫瘍、良性および悪性腫瘍、および悪性腫瘍、例えば、肉腫、癌腫、および黒色腫が挙げられるがこれらに限定されない。成人腫瘍／がんおよび小児腫瘍／がんも含まれる。
血液がんは、血液または骨髄のがんである。血液（または造血）がんの例としては、急性白血病（急性リンパ球性白血病、急性骨髄球性白血病、急性骨髄性白血病および骨髄芽球、前骨髄球性（promyeiocytic）、骨髄単球性、単球性および赤白血病など）、慢性白血病（慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病、慢性骨髄性白血病、および慢性リンパ球性白血病など）などの白血病、真性多血症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（無痛性および高グレード形態）、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、Ｈ鎖病、骨髄異形成（myeiodysplastic）症候群、有毛細胞白血病および脊髄形成異常が挙げられる。
固形腫瘍は、シストまたは液体区画を通常含有しない組織の異常な塊である。固形腫瘍は、良性または悪性であり得る。異なる種類の固形腫瘍は、それらを形成する細胞の種類によって命名される（肉腫、癌腫、およびリンパ腫など）。肉腫および癌腫などの固形腫瘍の例としては、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、および他の肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、リンパ性腫瘍、膵臓がん、乳がん、肺がん、卵巣がん、前立腺がん、肝細胞癌、扁平細胞癌（squamous eel! carcinoma）、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髄様癌、甲状腺乳頭癌、褐色細胞腫 皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、ヘパトーマ、胆管癌、絨毛癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、精上皮腫、膀胱癌、黒色腫、およびＣＮＳ腫瘍（神経膠腫（脳幹神経膠腫および混合神経膠腫など）、膠芽腫（多形膠芽腫としても知られる） 星状細胞腫、ＣＮＳリンパ腫、胚細胞腫、髄芽腫（medu!loblastoma）、神経鞘腫 頭蓋咽頭腫（craniopharyogioma）、上衣腫、松果体腫（pineaioma）、血管芽腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫（menangioma）、神経芽腫、網膜芽腫および脳転移など）が挙げられる。
治療または予防のための自己免疫疾患
・急性播種性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）
・急性壊死性出血性白質脳炎
・アジソン病
・無ガンマグロブリン血症
・円形脱毛症
・アミロイドーシス
・強直性脊椎炎
・抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎
・抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）
・自己免疫性血管性浮腫
・自己免疫性再生不良性貧血
・自己免疫性自律神経失調症
・自己免疫性肝炎
・自己免疫性高脂血症
・自己免疫性免疫不全
・自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）
・自己免疫性心筋炎
・自己免疫性卵巣炎
・自己免疫性膵炎
・自己免疫性網膜症
・自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）
・自己免疫性甲状腺疾患
・自己免疫性蕁麻疹
・軸索性および神経性ニューロパチー
・バロー病
・ベーチェット病
・水疱性類天疱瘡
・心筋症
・キャッスルマン病
・セリアック病
・シャガス病
・慢性疲労症候群
・慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）
・慢性再発性多発性骨髄炎（chronic recurrent multifocal ostomyelitis）（ＣＲＭＯ）
・チャーグ・ストラウス症候群
・瘢痕性類天疱瘡／良性粘膜類天疱瘡
・クローン病
・コーガン症候群（Cogans syndrome）
・寒冷凝集素病
・先天性心臓ブロック
・コクサッキー心筋炎
・クレスト病
・本態性混合寒冷グロブリン血症
・脱髄性ニューロパチー
・疱疹状皮膚炎
・皮膚筋炎
・デビック病（視神経脊髄炎）
・円板状狼瘡
・ドレスラー症候群
・子宮内膜症
・好酸性食道炎
・好酸性筋膜炎
・結節性紅斑
・実験的アレルギー性脳脊髄炎
・エバンス症候群
・線維筋痛症
・線維性肺胞炎
・巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）
・巨細胞性心筋炎
・糸球体腎炎
・グッドパスチャー症候群
・多発血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ）（旧名ウェゲナー肉芽腫症）
・グレーヴス病
・ギラン・バレー症候群
・橋本脳炎
・橋本甲状腺炎
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多価可溶性ＴＣＲ
本構成は、多価可溶性ＴＣＲタンパク質に関する。一態様では、本発明は、四価および八価の可溶性ＴＣＲアナログに関する。本発明のＴＣＲタンパク質は、単量体から自己集合することができ、かつ完全にヒト起源である。該タンパク質は、ＥＴＯ ＮＨＲ２多量体化ドメインを含む多量体である。本発明はまた、多量体可溶性ＴＣＲを構築する方法、およびそのようなタンパク質を使用する方法にも関する。
治療用分子として代替的な可溶性ＴＣＲフォーマットを活用する試みは、抗体フォーマットの過多と比べてはるかに遅れている。これは大部分、細胞外ＴＣＲ α／β鎖が膜貫通および細胞質ドメインから分離されるとＴＣＲのヘテロ二量体膜貫通タンパク質は溶解性の固有の問題を有することに起因する。第２に、標的部位でのそれらの同種リガンドに対するこれらの分子の固有の低い親和性およびアビディティは、治療用分子としてのそれらの開発を大きく妨害してきた。
これらの欠点を克服するために、本発明の本構成は、多価および可溶性の両方であるＴＣＲタンパク質を提供する。多価性は同種ｐＭＨＣに対するＴＣＲのアビディティを増加させ、かつ溶解性は、膜貫通環境の外側でのＴＣＲの使用を可能とする。したがって、第１の態様では、
（ｉ）ＴＣＲ細胞外ドメイン；
（ｉｉ）（ｉｉ）免疫グロブリン定常ドメイン、および
（ｉｉｉ）（ｉｉｉ）ＥＴＯのＮＨＲ２多量体化ドメイン
を含む、ｐＭＨＣ複合体に結合できる多価ヘテロ二量体可溶性Ｔ細胞受容体が提供される。
Ｉｇ定常ドメインの使用は、安定性および溶解性を有するＴＣＲ細胞外ドメインを提供し、ＮＨＲ２ドメインを介した多量体化は、多価性を提供しかつアビディティを増加させた。有利には、全てのドメインはヒト起源であり、または、ヒトタンパク質配列に準拠するものである。
Ｉｇ定常ドメインを使用してＴＣＲを安定化しかつ可溶性にすることによって、非天然ジスルフィド結合の使用が回避される。したがって、有利には、本発明のＴＣＲは、非天然ジスルフィド結合を含まない。
一実施形態では、前記複合体は重鎖および軽鎖を含み、かつ、各軽鎖はＴＣＲ Ｖαドメインおよび免疫グロブリンＣαドメインを含み、かつ、各重鎖はＴＣＲ Ｖβドメインおよび免疫グロブリンＣＨ１ドメインを含む。
一実施形態では、各軽鎖はＴＣＲ Ｃａドメインを追加的に含み、かつ、各重鎖はＴＣＲ Ｖβドメインを追加的に含む。
実施形態では、ＴＣＲと免疫グロブリンドメインとは、柔軟性リンカーによって分離されていてもよい。
ＮＨＲ２多量体化ドメインは、有利には、免疫グロブリンドメインのＣ末端に取り付けられる。したがって、重鎖および軽鎖の各二量体は１つの多量体化ドメインに取り付けられることになり、重鎖－軽鎖二量体は会合して多価のオリゴマーになる。
実施形態では、多量体化ドメインと免疫グロブリンドメインとは、柔軟性リンカーによって分離されている。ある特定の実施形態では、これにより多量体化ドメインは免疫グロブリンドメインからの妨害なしに多量体化することができる。
実施形態では、ＴＣＲタンパク質は、免疫グロブリンヒンジドメインをさらに含んでもよい。ヒンジドメインは、重鎖－軽鎖二量体の二量体化を可能とし、これは、ＴＣＲタンパク質のさらなる多量体化を可能とする。例えば、四量体を形成する多量体化ドメインは、免疫グロブリンヒンジドメインを使用して、八量体までの多量体を形成することができる。同様に、二量体化する多量体化ドメインは、ヒンジドメインの存在下で四量体を形成することができる。
実施形態では、本発明のＴＣＲタンパク質は四価である。
実施形態では、本発明のＴＣＲタンパク質は八価である。
本発明は、ヒトにおいてＥＴＯファミリータンパク質に見られるｎｅｒｖｙ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｒｅｇｉｏｎ ２（ＮＨＲ２）ドメインを使用して四価のヘテロ二量体フォーマットで安定的に集合する可溶性ＴＣＲを提供する（Liu et al. 2006）。ＮＨＲ２ドメインは、２つのＮＨＲ２ホモ二量体のペア形成から形成されるホモ四量体を天然に形成することが分かっている。細胞外ＴＣＲａ鎖またはＴＣＲβ鎖に作動可能に連結されたＮＨＲ２は、単量体、その後にホモ二量体から逐次的に自己集合した四価のヘテロ二量体可溶性ＴＣＲタンパク質分子を優先的に形成する（図１）。
八量体に集合するＴＣＲタンパク質は、免疫グロブリンヒンジドメインを用いることによって、ＮＨＲ２ドメインを使用して作成することができる。
さらなる態様では、本発明のＴＣＲタンパク質は、生物学的に活性のポリペプチド／エフェクター分子に連結することができる。そのようなポリペプチドの例としては、サイトカインなどの免疫学的活性部分、抗体または標的化ポリペプチドなどの結合性タンパク質などを挙げることができる。
本発明は、四価および八価のヘテロ二量体可溶性ＴＣＲを作製する方法、目的の宿主細胞をトランスフェクトするために使用されるタンパク質をコードするＤＮＡベクター、およびこれらの新規の高感度の多価可溶性ＴＣＲタンパク質分子の使用にさらに関する。使用のための応用としては、治療法、診断法および創薬が挙げられるがこれらに限定されない。
さらなる態様では、本発明は、非ヒト構築物成分を用いることなく、効率的な様式で多価の免疫グロブリン分子を構築する方法を提供する。
したがって、
（ｉ）免疫グロブリン可変ドメイン、および
（ｉｉ）ＥＴＯのＮＨＲ２多量体化ドメイン
を含む、多量体免疫グロブリンが提供される。
免疫グロブリン可変ドメインは、好ましくは抗体可変ドメインである。そのようなドメインは、ＥＴＯ ＮＨＲ２多量体化ドメインに融合されており、ＥＴＯ ＮＨＲ２多量体化ドメインは、免疫グロブリン可変ドメインの四量体を形成するための手段を提供する。
ＥＴＯ ＮＨＲ２ドメインは、免疫グロブリン多量体の製造においてｐ５３および類似の多量体化ドメインより効率的であり、構築物中に非ヒト成分を使用しない多量体免疫グロブリン分子の製造を可能にする。
ＥＴＯのＮＨＲ２ドメインとの融合状態で免疫グロブリン可変ドメインを発現すること、および該可変ドメインを集合させて多量体とすることを含む、多量体免疫グロブリンを製造する方法も提供される。
好ましくは、免疫グロブリン可変ドメインは、１つまたは複数の免疫グロブリン定常ドメインに取り付けられる。
有利には、免疫グロブリンドメインは、抗体ドメインである。例えば、可変ドメインは、ＶＨおよびＶＬ抗体ドメインであり得る。例えば、定常ドメインは、抗体ＣＨ１ドメインである。
一実施形態では、ＴＣＲおよび非ＴＣＲの両方の免疫グロブリンである、本発明による多量体免疫グロブリン分子は、ファージディスプレイまたは別のディスプレイ技術によるスクリーニングのために製造される。したがって、例えば、多価の免疫グロブリンは、ファージコートタンパク質との融合物として製造される。コートタンパク質に融合して製造される各免疫グロブリンについて、他の免疫グロブリン分子はコートタンパク質なしで製造され、それによりそれらはＮＨＲ２多量体化の結果としてファージ表面に集合することができる。
上記に詳述した本発明の本構成は、新規の多価の、例えば四価および八価の、可溶性タンパク質を製造するための核酸配列および方法に関する。一態様では、特に、可溶性タンパク質は、高い感度、親和性および特異性で４つのｐＭＨＣに結合できる四価のヘテロ二量体フォーマットに集合したＴＣＲである。可溶性の四価のヘテロ二量体ＴＣＲは、細胞外ＴＣＲ α／β鎖の全体または部分のいずれかから構成された独特のタンパク質分子である。細胞外ＴＣＲ α／β鎖は、免疫グロブリンＣＨ１およびＣＬ（ＣκまたはＣＸのいずれか）ドメインに連結される。この連結は、ヘテロ二量体ＴＣＲ α／βの安定な形成を可能とする。可溶性四価ＴＣＲの文脈での独特の特徴は、ＣＨ１のＣ末端またはＣＬのＣ末端に作動可能に連結されたタンパク質ＥＴＯファミリーのＮＨＲ２ホモ四量体ドメインである。この様式でのヘテロ二量体ａ／ｐＴＣＲへのＮＨＲ２ドメインの連結は、それが細胞内で四価のフォーマットに自己集合し、その後に可溶性タンパク質として上清中に分泌されることを可能とする。
ＴＣＲ細胞外ドメイン
ＴＣＲ細胞外ドメインは、可変領域および定常領域から構成される。これらのドメインは、それらが抗体および他の免疫グロブリンドメイン中に存在するのと同様にＴ細胞受容体中に存在する。ＴＣＲのレパートリーは、抗体の重鎖および軽鎖遺伝子において使用される同じ遺伝子再構成機構によって作られる広範な多様性を有する（Tonegawa, S. (1988) Biosci. Rep. 8:3-26）。多様性のほとんどは、ａ鎖およびβ鎖の相補性決定領域３（ＣＤＲ３）をコードする可変（Ｖ）領域および連結（または多様性、Ｄ）領域の接合部において生成される（Davis and Bjorkman (1988) Nature 334:395-402）。ＩＭＧＴ ＬＩＧＭデータベースなどのＴＣＲ遺伝子のデータベースが利用可能であり、ＴＣＲをクローニングする方法が当該技術分野において公知である。例えば、Bentley and Mariuzza (1996) Ann. Rev. Immunol. 14:563-590; Moysey et al., Anal Biochem. 2004 Mar 15;326(2):284-6; Walchli, et al. (2011) A Practical Approach to T-Cell Receptor Cloning and Expression. PLoS ONE 6(11): e27930を参照。
免疫グロブリン可変ドメイン
抗体可変ドメインは当該技術分野において公知であり、多様な供給元から入手することができる。ＩＭＧＴおよびＫａｂａｔなどの抗体可変ドメインの配列のデータベースが存在し、また可変ドメインは、確立された技術にしたがって天然配列のクローニングおよび発現、または人工核酸の合成によって製造することができる。
バクテリオファージ抗体ディスプレイライブラリーおよびラムダファージ発現ライブラリーの構築方法は当該技術分野において周知である（McCafferty et al. (1990) Nature, 348: 552; Kang et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 88: 4363; Clackson et al. (1991) Nature, 352: 624; Lowman et al. (1991) Biochemistry, 30: 10832; Burton et al. (1991) Proc. Natl. Acad Sci USA., 88: 10134; Hoogenboom et al. (1991) Nucleic Acids Res., 19: 4133; Chang et al. (1991) J Immunol., 147: 3610; Breitling et al. (1991) Gene, 104: 147; Marks et al. (1991) 上掲; Barbas et al. (1992) 上掲; Hawkins and Winter (1992) J Immunol., 22: 867; Marks et al., 1992, J Bioi. Chem., 267: 16007; Lerner et al. (1992) Science, 258: 1313；参照することにより本明細書に組み込まれる）。
１つの特に有利なアプローチは、ｓｃＦｖファージライブラリーの使用である（Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 85: 5879-5883; Chaudhary et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 87: 1066-1070; McCafferty et al. (1990) 上掲; Clackson et al. (1991) Nature, 352: 624; Marks et al. (1991) J Mol. Bioi., 222: 581; Chiswell et al. (1992) Trends Biotech., 10: 80; Marks et al. (1992) J Bioi. Chem., 267）。バクテリオファージコートタンパク質上に提示されたｓｃＦｖライブラリーの様々な実施形態が記載されてきた。例えば、Ｗ０９６／０６２１３およびＷ０９２／０１０４７（Medical Research Council et al.）およびＷ０９７／０８３２０（Morphosys）（これらは、参照することにより本明細書に組み込まれる）に記載される通り、ファージディスプレイアプローチの精密化も公知である。
そのような技術は、抗体可変ドメインへのＮＨＲ２多量体化ドメインの融合によって多量体免疫グロブリンの製造のために適合させることができる。
免疫グロブリン定常ドメイン
本明細書において称される免疫グロブリン定常ドメインは、好ましくは抗体定常ドメインである。定常ドメインは、抗体サブタイプ間で配列が異なり、好ましくは、定常ドメインは、ＩｇＧ定常ドメインである。好ましくは、定常ドメインは、ＣＨ１定常ドメインである。抗体定常ドメインは、当該技術分野において周知であり、ＩＭＧＴおよびＫａｂａｔデータベースなどの多数の供給元およびデータベースから入手することができる。
免疫グロブリン可変ドメインへの抗体定常ドメインの融合もまた、例えば操作されたＦａｂ抗体断片の構築において、当該技術分野において公知である。
リンカー
柔軟性リンカーを使用してＴＣＲ可変ドメイン－Ｉｇ定常ドメインをＮＨＲ２多量体化ドメインに接続することができる。これにより、互いからまたは多量体複合体中の他の分子からの立体障害なしでＴＣＲドメインおよび多量体化ドメインが機能することが可能となる。好適なリンカーは、例えば、グリシンリピート、グリシン－アラニンリピート、Ｇｌｙ（４）Ｓｅｒリンカー、またはReddy Chichili et al., 2012 Protein Science 22:153-167に記載される柔軟性ポリペプチドリンカーを含む。
免疫グロブリンヒンジドメイン
Ｉｇヒンジドメイン、本発明では好ましくは抗体ヒンジドメインは、天然抗体中の抗体定常領域を連結するドメインである。したがって、このドメインは、抗体定常ドメインを含む分子の天然の二量体化を提供する。それは、例えば、Ｆ（ａｂ）２抗体断片の他に、ＩｇＧなどの全抗体中に存在する。この領域は、２つのＣＨ１定常ドメインを接続して一緒にする２つの天然の鎖間ジスルフィド結合を含む。
一実施形態では、多量体化ドメインは、Ｉｇ定常ドメインまたはヒンジドメインに取り付けられていてもよい。ヒンジドメインが存在する場合、多量体化ドメインは、ヒンジ領域で接合したＴＣＲ可変－Ｉｇ定常ドメインの４つの二量体を含むＴＲＣ八量体を形成する。ヒンジ領域がない場合、多量体化ドメインは、四量体の形成に繋がる。好ましくは、多量体化ドメインは、定常ドメインまたはヒンジ領域のＣ末端に取り付けられる。
生物活性分子
１つまたは複数の生物活性分子またはエフェクター分子（ＥＭ）を本発明の多量体、例えば多量体ＴＣＲタンパク質に取り付けることができる。そのような分子は、例えば、抗ＣＤ３抗体または抗体断片などの、抗体、特にＴＣＲの免疫認識および機能を補助し得る抗体であり得る。
一部の態様では、生物活性分子は、以下により詳細に記載されるように、細胞毒性薬物、毒素、またはサイトカインなどの生物活性分子であり得る。生物活性分子の例としては、ＭＩＰ－１ｂなどのケモカイン、ＩＬ－２などのサイトカイン、ＧＭ－ＣＳＦまたはＧ－ＣＳＦなどの増殖因子、リシンなどの毒素、ドキソルビシンまたはタキサンなどの細胞毒性剤、放射性および蛍光標識などの標識などが挙げられる。ＴＣＲにコンジュゲート可能な生物活性分子の例については、米国特許出願公開第２０１１００７１９１９号明細書を参照。
他の態様では、生物活性分子は、例えば、以下からなる群から選択される：ｉｎ ｖｉｖｏでポリペプチドリガンドの半減期を延長する分子に結合できる基、およびｉｎ ｖｉｖｏでポリペプチドリガンドの半減期を延長する分子。そのような分子は、例えば、ＨＳＡまたは細胞マトリックスタンパク質であってよく、ｉｎ ｖｉｖｏでＴＣＲ分子の半減期を延長する分子に結合できる基は、ＨＳＡまたは細胞マトリックスタンパク質に特異的な抗体または抗体断片である。
一実施形態では、生物活性分子は、結合性分子、例えば抗体断片である。好適なリンカーを使用して２つ、３つ、４つ、５つまたはそれより多くの抗体断片を連結して一緒にすることができる。これらの抗体断片の任意の２つまたはそれより多くの特異性は同じであってもよいし、異なっていてもよく、それらが同じである場合、一価の抗体断片と比べて標的に対して増加したアビディティを有する多価の結合性構造物が形成される。
生物活性分子はさらに、エフェクター基、例えば抗体Ｆｃ領域であってもよい。
Ｎ末端またはＣ末端への取付けは、ＴＣＲ分子または操作されたポリペプチドの多量体への集合の前に行われてもよいし、その後に行われてもよい。したがって、Ｎ末端またはＣ末端の生物活性分子が既に存在する、Ｉｇ定常ドメインを有するＴＣＲ融合物を（合成により、または核酸の発現により）製造してもよい。しかしながら、ある特定の態様では、Ｎ末端またはＣ末端への付加は、ＴＣＲ融合物が製造された後に行われる。例えば、塩化フルオレニルメチルオキシカルボニルを使用してＴＣＲ融合物のＮ末端にＦｍｏｃ保護基を導入することができる。Ｆｍｏｃは、高親和性でＨＳＡなどの血清アルブミンに結合し、またＦｍｏｃ－ＴｒｐまたはＦＭＯＣ－Ｌｙｓは、増加した親和性で結合する。Ｆｍｏｃ保護基を付けたままでペプチドを合成した後、システインを通じてスキャフォールドと連結させることができる。代替としては、これもＨＳＡに結合するパルミトイル部分であり、これは例えば、リラグルチドにおいてこのＧＬＰ－１アナログの半減期を延長するために使用されている。
あるいは、例えばアミンおよびスルフヒドリル反応性リンカーＮ－ｅ－マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）を用いて、ＴＣＲ融合物（TCR fusinon）をＮ末端で改変することができる。このリンカーを介して、ＴＣＲを他のポリペプチド、例えば抗体Ｆｃ断片に連結することができる。
ＮＨＲ２ドメイン
ＡＭＬ１／ＥＴＯは、Ｍ２サブタイプの急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）に見出されるｔ（８；２１）から生じる融合タンパク質である。ＡＭＬ１／ＥＴＯは、ＥＴＯのほとんど（５７５ ａａ）とインフレームで融合したＲＵＮＸ１のＮ末端１７７アミノ酸を含有する。ＥＴＯのｎｅｒｖｙ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｄｏｍａｉｎ ２は、オリゴマー化およびタンパク質－タンパク質相互作用などの、ＡＭＬ１／ＥＴＯに関連する生物学的活性の多くに関与する。このドメインは、Liu et al(2006)において詳細に特徴付けられている。ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＧ＿０２３２７２．２を参照。
本発明の一態様では、可溶性の多価のフォーマットに集合したタンパク質は、ＴＣＲ ａ鎖およびβ鎖の細胞外ドメインから部分的にまたは全体的に構成されたＴＣＲである。ＴＣＲ ａ鎖およびβ鎖は、免疫グロブリンＣＨ１およびＣＬドメインによって安定化され、以下の構成で編成され得る：
１．Ｖα－ＣＬおよびＶβＣＨ１
２．Ｖα－ＣＨ１およびＶβ－ＣＬ
３．ＶαＣα－ＣＬおよびＶβＣβ－ＣＨ１
４．ＶαＣαＣＨ１およびＶβＣβＣＬ
本発明の一態様では、細胞外ＴＣＲドメインは、タンパク質の柔軟性を促進しかつ最適なタンパク質フォールディングを促進する、場合により存在するペプチドリンカー（Ｌ）を介して免疫グロブリンＣＨ１およびＣＬドメインに連結される。
１．Ｖα－（Ｌ）－ＣＬおよびＶβ－（Ｌ）－ＣＨ１
２．Ｖα－（Ｌ）－ＣＨ１およびＶβ－（Ｌ）－ＣＬ
３．ＶαＣα－（Ｌ）－ＣＬおよびＶβＣβ－（Ｌ）－ＣＨ１
４．ＶαＣα－（Ｌ）－ＣＨ１およびＶβＣβ－（Ｌ）－ＣＬ
本発明の別の態様では、ＮＨＲ２ホモ四量体ドメインなどの四量体化ドメイン（ＴＤ）は、細胞外ＴＣＲ ａ鎖およびβ鎖に連結された、免疫グロブリンＣＨ１またはＣＬドメインのいずれかのＣ末端に連結される。ＮＨＲ２ドメインは、場合により、ペプチドリンカーを介してＣＨ１またはＣＬドメインに連結されてもよい。結果として生じる四価のヘテロ二量体ＴＣＲタンパク質は、以下の構成で編成され得る（（Ｌ）は場合により存在するペプチドリンカーである）：
１．Ｖα－（Ｌ）－ＣＬおよびＶβ－（Ｌ）－ＣＨ１－（Ｌ）－ＴＤ
２．Ｖα－（Ｌ）－ＣＨ１－（Ｌ）－ＴＤおよびＶβ－（Ｌ）－ＣＬ
３．ＶαＣα－（Ｌ）－ＣＬおよびＶβＣβ－（Ｌ）－ＣＨ１－（Ｌ）－ＴＤ
４．ＶαＣα－（Ｌ）－ＣＨ１－（Ｌ）－ＴＤおよびＶβＣβ－（Ｌ）－ＣＬ
５．Ｖα－（Ｌ）－ＣＬ－（Ｌ）－ＴＤおよびＶβ－（Ｌ）－ＣＨ１
６．Ｖα－（Ｌ）－ＣＨ１およびＶβ－（Ｌ）－ＣＬ－（Ｌ）－ＴＤ
７．ＶαＣα－（Ｌ）－ＣＬ－（Ｌ）－ＴＤおよびＶβＣβ－（Ｌ）－ＣＨ１
８．ＶαＣα－（Ｌ）－ＣＨ１およびＶβＣβ－（Ｌ）－ＣＬ－（Ｌ）－ＴＤ
その同種ｐＭＨＣに対する可溶性ＴＣＲの感度は、アビディティ効果を増加させることによって増進させることができる。これは、四量体化ドメインによって促進される抗原結合部位の数を増加させることによって達成される。そしてこれが、一価の可溶性ＴＣＲと比べてタンパク質分子の分子量も増加させ、したがって循環中の血清保持を延長させる。血清半減期の増加もまた、これらの分子がそれらの同種標的抗原と相互作用する可能性を増進させる。
四価のヘテロ二量体可溶性ＴＣＲタンパク質分子は、単一細胞上に提示された１つ、２つ、３つまたは４つのｐＭＨＣに同時に結合することができ、または、その同種ｐＭＨＣを提示する１つ、２つ、３つまたは４つの異なる細胞に同時に結合する。
本発明において使用されるＴＣＲ α鎖およびβ鎖の配列は、特定のｐＭＨＣに特異的な公知のＴＣＲからのものであってもよいし、または、ファージディスプレイなどの当該技術分野において公知の技術を使用してスクリーニングによってｄｅ ｎｏｖｏで同定されてもよい。さらには、ＴＣＲ配列は、本発明においてα鎖およびβ鎖に限定されず、ヒトＴ細胞から直接的にクローニングされたか、または、組換えＤＮＡ技術を使用して指向性進化によって同定されたＴＣＲ８およびγまたはε鎖およびその配列バリエーションも組み込むことができる。
本発明の別の態様では、四価のヘテロ二量体可溶性ＴＣＲタンパク質分子は、可溶性の、安定かつ正しくフォールディングしたタンパク質分子の最適な製造のために哺乳動物細胞において優先的に製造される。
本発明による多量体（例えば、四量体または八量体）、または多価のＴＣＲは、任意の好適なベクター系を使用して、哺乳動物細胞などの細胞中で発現させることができる。ｐＴＴ５発現ベクターは、多価可溶性ＴＣＲを発現するために使用される発現系の一例である。ｐＴＴ５発現系は、懸濁液に適合させたＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞中の組換えタンパク質の高レベルの一過性の製造を可能とする（Zhang et al. 2009）。それは、宿主細胞の複製因子と共にＤＮＡプラスミドのエピソーム複製を媒介して組換えタンパク質の増進された発現を可能とする、ウイルスタンパク質エプスタイン・バー核抗原１（ＥＢＮＡ－１）によって認識される複製起点（ｏｒｉＰ）を含有する。当該技術分野において公知かつ市販されている哺乳動物細胞発現用の他の好適なベクター系を本発明で使用することができる。
四価のヘテロ二量体可溶性ＴＣＲタンパク質分子または他の多量体は、発現ベクターから遺伝子を一過的に発現することによって製造することができる。
別の実施形態では、四価のヘテロ二量体可溶性ＴＣＲタンパク質分子または他の多量体は、操作された安定な細胞株から製造することができる。タンパク質分子をコードする遺伝子を宿主細胞のゲノムに単一のコピーまたは複数のコピーとして組み込む当該技術分野において公知のゲノム操作技術を使用して細胞株を操作し、タンパク質分子を製造することができる。ＤＮＡ組込みの部位は、宿主ゲノム内の定義された場所であってもよいし、または、ランダムに組み込んで所望のタンパク質分子の最大発現を得ることができる。ゲノム操作技術としては、相同組換え、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンシステムなどのトランスポゾン媒介性の遺伝子移入、リコンビナーゼ媒介性のカセット交換などの部位特異的リコンビナーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼなどのエンドヌクレアーゼ媒介性の遺伝子ターゲティング、レンチウイルスなどのウイルス媒介性の遺伝子移入を挙げることができるがこれらに限定されない。
また、本発明の別の態様では、四価のヘテロ二量体可溶性ＴＣＲタンパク質分子または他の多量体は、封入体としてＥ．ｃｏｌｉの細胞質中で過剰発現によって製造され、その同種ｐＭＨＣまたは抗原に正しく結合できる機能的タンパク質分子を製造するためにアフィニティークロマトグラフィーによる精製後にｉｎ ｖｉｔｒｏでリフォールディングされる。
本発明の別の態様では、四価のヘテロ二量体可溶性ＴＣＲタンパク質分子または他の多量体の発現は哺乳動物または細菌細胞に限定されず、昆虫細胞、植物細胞、および酵母細胞などの下等真核細胞において発現および製造することもできる。
本発明の別の態様では、ヘテロ二量体可溶性ＴＣＲ分子または他の多量体は、例えば、その同種ｐＭＨＣに対して８つまでの結合部位を有する、八価のタンパク質複合体として製造される（図２）。複数の抗原結合部位により、この分子は、１つの細胞上に提示される８つまでのｐＭＨＣに結合すること、または、８つまでの異なる細胞上に提示されるｐＭＨＣに結合することが可能となり、したがって高感度の可溶性ＴＣＲが生成される。
分子のヘテロ二量体可溶性ＴＣＲ部分は、ＴＣＲ ａ鎖またはβ鎖のいずれかにそれ自体連結されたＣＨ１またはＣＬドメインのいずれかのＣ末端に免疫グロブリンヒンジドメインを融合することによって二価の分子とされる。ヒンジドメインは、２つの重鎖の接続を可能としてＩｇＧと類似の構造を与える。ヒンジドメインのＣ末端に、場合により存在するペプチドリンカーを介してＮＨＲ２などの四量体化ドメインが連結される。Ｉｇ ＣＨ１またはＣＬドメインおよびＮＨＲ２ドメインのそれぞれＣ末端およびＮ末端に免疫グロブリンヒンジを結合することによって、単量体２と称される２つのＮＨＲ２単量体の集合が可能となる。この構成において、長い柔軟性リンカーがヒンジとＮＨＲ２ドメインとの間に提供されなければ、２つのＮＨＲ２ドメインは、構造的な制約により逆平行の会合によってホモ二量体を形成しない可能性が最も高いことが予測される。免疫グロブリンＣＨ１またはＣＬドメインを介したヘテロ二量体可溶性ＴＣＲへの四量体化およびヒンジドメインの連結は、ＮＨＲ２ホモ四量体２を通じて形成された八価の可溶性ＴＣＲの段階的な自己集合を可能とする。八価の可溶性ＴＣＲの自己集合は、ＮＨＲ２単量体２およびホモ二量体２の中間体タンパク質複合体を介して為される（図２）。結果として生じる八価のヘテロ二量体可溶性ＴＣＲタンパク質分子は、その同種ｐＭＨＣに対して優れた感度を有し、したがって、天然に見られる親和性をはるかに上回るようにそのｐＭＨＣリガンドに対してＴＣＲを親和性成熟する必要なく未知の抗原またはｐＭＨＣを同定するという特有の利点を与える。特に、それは、特徴付けられていない腫瘍特異的Ｔ細胞および自己免疫疾患などの他の疾患に関与するＴ細胞によって認識されるｐＭＨＣを同定するために有用である。八価のヘテロ二量体可溶性ＴＣＲタンパク質分子の多数の異なる構成を製造することができる。一部の例を以下に示す。
１．Ｖα－（Ｌ）－ＣＬおよびＶβ－（Ｌ）－ＣＨ１－ヒンジ－（Ｌ）－ＴＤ
２．Ｖα－（Ｌ）－ＣＨ１－ヒンジ－（Ｌ）－ＴＤおよびＶβ－（Ｌ）－ＣＬ
３．Ｖα－Ｃα－（Ｌ）－ＣＬおよびＶβ－Ｃβ－（Ｌ）－ＣＨ１－ヒンジ－（Ｌ）－ＴＤ
４．ＶαＣα（Ｌ）－ＣＨ１－ヒンジ－（Ｌ）－ＴＤおよびＶβＣβ－（Ｌ）－ＣＬ
５．Ｖα－（Ｌ）－ＣＬ－（Ｌ）－ＴＤおよびＶβ－（Ｌ）－ＣＨ１－ヒンジ
６．Ｖα－（Ｌ）－ＣＨ１－ヒンジおよびＶβ－（Ｌ）－ＣＬ－（Ｌ）－ＴＤ
７．Ｖα－Ｃα－（Ｌ）－ＣＬ－（Ｌ）－ＴＤおよびＶβ－Ｃβ（Ｌ）－ＣＨ１－ヒンジ
８．Ｖα－Ｃα－（Ｌ）－ＣＨ１－ヒンジおよびＶβ－Ｃβ－（Ｌ）－ＣＬ－（Ｌ）－ＴＤ
本発明の別の態様では、自己集合した多価のタンパク質、優先的に四価および八価のヘテロ二量体可溶性ＴＣＲは、生物活性剤／エフェクター分子に融合またはコンジュゲート化され、それによって、これらの分子ががん細胞などの所望の細胞集団にガイドされ、それらの治療効果を特異的に発揮することを可能とする。細胞毒性薬物、毒素、またはサイトカインなどのエフェクター分子をガイドするモノクローナル抗体の腫瘍標的化能力はよく確立されている（Perez et al. 2014; Young et al. 2014）。同様に、本発明において概説される多価可溶性ＴＣＲ分子もまた、エフェクタータンパク質およびポリペプチドと融合させ、または細胞毒性剤にコンジュゲート化することができる。本発明において概説される多価のタンパク質複合体との融合タンパク質として使用するために好適なエフェクタータンパク質分子の例としては、ＩＦＮａ、ＩＦＮβ、ＩＦＮｙ、ＩＬ－２、ＩＬ－１１、ＩＬ－１３、顆粒球コロニー刺激因子［Ｇ－ＣＳＦ］、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子［ＧＭ－ＣＳＦ］、および腫瘍壊死因子［ＴＮＦ］ａ、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＣＤ４０Ｌ、およびＴＲＡＩＬ、共刺激リガンドはＢ７．１またはＢ７．２、ケモカインＤＣ－ＣＫ１、ＳＤＦ－１、フラクタルカイン、リホタクチン（lyphotactin）、ＩＰ－１０、Ｍｉｇ、ＭＣＡＦ、ＭｌＰ－ｌａ、ＭＩＰ－１／３、ＩＬ－８、ＮＡＰ－２、ＰＦ－４、およびＲＡＮＴＥＳまたはこれらの活性断片が挙げられるがこれらに限定されない。融合タンパク質として使用するために好適なまたは本発明に記載される多価のタンパク質複合体にコンジュゲート化される毒性剤の例としては、ジフテリア毒素、リシン、シュードモナス・エキソトキシン（Pseudomonas exotoxin）などの毒素、アウリスタチン、メイタンシン、カリケアミシン、アントラサイクリン、デュオカルマイシン、ピロロベンゾジアゼピンなどの細胞毒性薬物が挙げられるがこれらに限定されない。細胞毒性薬物は、選択リンカーによってコンジュゲート化することができ、選択リンカーは、切断不可能もしくはプロテアーゼによって切断可能であり、または酸不安定である。
異成分を除去しかつコンジュゲートの安定性を向上させるために、細胞毒性薬物を部位特異的な様式でコンジュゲート化することができる。特定のシステイン残基を操作しまたは糖転移酵素およびトランスグルタミナーゼを通じた酵素コンジュゲート化を使用することによってこれを達成することができる(Panowski et al. 2014）。
本発明の別の態様では、多価のタンパク質複合体は、蛍光剤、放射性剤または電子移動剤などの、検出を可能とする分子に共有結合的に連結される。
本発明の別の態様では、エフェクター分子（ＥＭ）は、場合により存在するペプチドリンカーを介してＮＨＲ２などの四量体化ドメインのＣ末端を介して多価のタンパク質複合体に融合される。ＮＨＲ２ドメインを介した融合をアレンジして多数の異なる構成で多価のタンパク質複合体を製造することができる。四価のヘテロ二量体可溶性ＴＣＲを使用して製造できるタンパク質の構成の一部の例を以下に示す：
１．Ｖα－（Ｌ）－ＣＬおよびＶβ－（Ｌ）－ＣＨ１－（Ｌ）－ＴＤ－（Ｌ）－ＥＭ
２．Ｖα－（Ｌ）－ＣＨ１－（Ｌ）－ＴＤ－（Ｌ）－ＥＭおよびＶβ－（Ｌ）－ＣＬ
３．Ｖα－Ｃα－（Ｌ）－ＣＬおよびＶβ－Ｃβ－（Ｌ）－ＣＨ１－（Ｌ）－ＴＤ－（Ｌ）－ＥＭ
４．Ｖα－Ｃα－（Ｌ）－ＣＨ１－（Ｌ）－ＴＤ－（Ｌ）－ＥＭおよびＶβ－Ｃβ－（Ｌ）－ＣＬ
５．Ｖα－（Ｌ）－ＣＬ－（Ｌ）－ＴＤ－（Ｌ）－ＥＭおよびＶβ－（Ｌ）－ＣＨ１
６．Ｖα－（Ｌ）－ＣＨ１およびＶβ－（Ｌ）－ＣＬ－（Ｌ）－ＴＤ－（Ｌ）－ＥＭ
７．Ｖα－Ｃα－（Ｌ）－ＣＬ－（Ｌ）－ＴＤ－（Ｌ）－ＥＭおよびＶβ－Ｃβ－（Ｌ）－ＣＨ１
８．Ｖα－Ｃα－（Ｌ）－ＣＨ１およびＶβ－Ｃβ－（Ｌ）－ＣＬ－（Ｌ）－ＴＤ－（Ｌ）－ＥＭ
本発明の別の態様では、エフェクター分子（ＥＭ）は、場合により存在するペプチドリンカーを介して免疫グロブリンＣＨ１またはＣＬ１ドメインのいずれかのＣ末端で多価のタンパク質複合体に融合される。免疫グロブリンドメインを介したＥＭの融合をアレンジして多数の異なる構成で多価のタンパク質複合体を製造することができる。四価のヘテロ二量体可溶性ＴＣＲを使用して製造できるタンパク質の構成の一部の例を以下に示す：
９．Ｖα－（Ｌ）－ＣＬ－（Ｌ）－ＥＭおよびＶβ－（Ｌ）－ＣＨ１－（Ｌ）－ＴＤ
１０．Ｖα－（Ｌ）－ＣＨ１－（Ｌ）－ＴＤおよびＶβ－（Ｌ）－ＣＬ－（Ｌ）－ＥＭ
１１．Ｖα－Ｃα－（Ｌ）－ＣＬ－（Ｌ）－ＥＭおよびＶαβ－Ｃβ－（Ｌ）－ＣＨ１－（Ｌ）－ＴＤ
１２．Ｖα－Ｃα－（Ｌ）－ＣＨ１－（Ｌ）－ＴＤおよびＶβ－Ｃβ－（Ｌ）－ＣＬ－（Ｌ）－ＥＭ
１３．Ｖα－（Ｌ）－ＣＬ－（Ｌ）－ＴＤおよびＶβ－（Ｌ）－ＣＨ１－（Ｌ）－ＥＭ
１４．Ｖα－（Ｌ）－ＣＨ１－（Ｌ）－ＥＭおよびＶβ－（Ｌ）－ＣＬ－（Ｌ）－ＴＤ
１５．Ｖα－Ｃα－（Ｌ）－ＣＬ－（Ｌ）－ＴＤおよびＶβ－Ｃβ－（Ｌ）－ＣＨ１－（Ｌ）－ＥＭ
１６．Ｖα－Ｃα－（Ｌ）－ＣＨ１－（Ｌ）－ＥＭおよびＶβ－Ｃβ－（Ｌ）－ＣＬ－（Ｌ）－ＴＤ
本発明の別の態様では、エフェクター分子（ＥＭ）は、場合により存在するペプチドリンカーを介して免疫グロブリンＣＨ１またはＣＬ１ドメインのいずれかのＣ末端で、そしてまた四量体化ドメイン（例えば、ＮＨＲ２）のＣ末端で多価のタンパク質複合体に融合される。このアプローチは、２つのエフェクター分子の融合物がＴＣＲヘテロ二量体複合体によって融合されることを可能とする。免疫グロブリンドメインおよび四量体化ドメインを介したＥＭの融合をアレンジして多数の異なる構成で多価のタンパク質複合体を製造することができる。四価のヘテロ二量体可溶性ＴＣＲを使用して製造できるタンパク質の構成の一部の例を以下に示す：
１７．Ｖα－（Ｌ）－ＣＬ－（Ｌ）－ＥＭおよびＶβ－（Ｌ）－ＣＨ１－（Ｌ）－ＴＤ－（Ｌ）－ＥＭ
１８．Ｖα－（Ｌ）－ＣＨ１－（Ｌ）－ＴＤ－（Ｌ）－ＥＭおよびＶβ－（Ｌ）－ＣＬ－（Ｌ）－ＥＭ
１９．Ｖα－Ｃα－（Ｌ）－ＣＬ－（Ｌ）－ＥＭおよびＶβＣβ－（Ｌ）－ＣＨ１－（Ｌ）－ＴＤ－（Ｌ）－ＥＭ
２０．Ｖα－Ｃα－（Ｌ）－ＣＨ１－（Ｌ）－ＴＤ－（Ｌ）－ＥＭおよびＶβ－Ｃβ－（Ｌ）－ＣＬ－（Ｌ）－ＥＭ
２１．Ｖα－（Ｌ）－ＣＬ－（Ｌ）－ＴＤ－（Ｌ）－ＥＭおよびＶβ－（Ｌ）－ＣＨ１－（Ｌ）－ＥＭ
２２．Ｖα－（Ｌ）－ＣＨ１－（Ｌ）－ＥＭおよびＶβ－（Ｌ）－ＣＬ－（Ｌ－）ＴＤ－（Ｌ）－ＥＭ
２３．Ｖα－Ｃα－（Ｌ）－ＣＬ－（Ｌ）－ＴＤ－（Ｌ）－ＥＭおよびＶβ－Ｃβ－（Ｌ）－ＣＨ１－（Ｌ）－ＥＭ
２４．Ｖα－（Ｌ）－ＣＨ１－（Ｌ）－ＥＭおよびＶβ－Ｃβ－（Ｌ）－ＣＬ－（Ｌ）－ＴＤ－（Ｌ）－ＥＭ
本発明の別の態様では、多価のタンパク質複合体は、精製を促進するタンパク質タグに融合される。精製タグは当該技術分野において公知であり、以下のタグを挙げることができるがこれらに限定されない：Ｈｉｓ、ＧＳＴ、ＴＥＶ、ＭＢＰ、Ｓｔｒｅｐ、ＦＬＡＧ。
非ＴＣＲ多量体
本発明は、複数の相互作用性ドメインまたは抗原に結合する能力を有する可溶性の多価のフォーマットにタンパク質を集合させる独特の方法を提供する。タンパク質は、優先的には直接的または間接的に免疫系に関与する、または免疫応答を調節する能力を有する、単量体、ホモ二量体、ヘテロ二量体またはオリゴマーであり得る。例としては、ＴＣＲ、ペプチドＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ、抗体またはその抗原結合部分、および代替的な非抗体タンパク質スキャフォールドを有する結合性タンパク質が挙げられるがこれらに限定されない。
本発明の別の態様では、相互作用性ドメインまたは抗原は、任意の細胞表面発現または分泌タンパク質、ＭＨＣクラスＩもしくはＩＩに関連するペプチド、またはウイルスおよび細菌タンパク質などの病原体に関連する任意のタンパク質であり得る。
非ＴＣＲ多量体は、ＦａｂのｄＡｂなどの、抗体または抗体断片の多量体であり得る。本発明によるｄＡｂおよびＦａｂの例としては、以下が挙げられる：
多価のＤＡｂの例
２５．ＶＨ－（Ｌ）－ＮＨＲ２
２６．ＶＬ（λまたはκ）－（Ｌ）－ＮＨＲ２
２７．ＶＨ－（Ｌ）－ＮＨＲ２－（Ｌ）－ＥＭ
２８．ＶＬ（λまたはκ）－（Ｌ）－ＮＨＲ２－（Ｌ）－ＥＭ
２９．ＶＨ－ＣＨ１－（Ｌ）－ＮＨＲ２
３０．ＶＬ（λまたはκ）－ＣＬ－（Ｌ）－ＮＨＲ２
３１．ＶＨ－ＣＨ１－（Ｌ）－ＮＨＲ２－（Ｌ）－ＥＭ
３２．ＶＬ（λまたはκ）－ＣＬ－（Ｌ）－ＮＨＲ２－（Ｌ）－ＥＭ
多価のＦａｂの例
３３．ＶＨ－ＣＨ１－（Ｌ）－ＮＨＲ２およびＶＬ（λまたはκ）－ＣＬ
３４．ＶＬ（λまたはκ）－ＣＬ－（Ｌ）－ＮＨＲ２およびＶＨ－ＣＨ１
３５．ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－（Ｌ）－ＮＨＲ２およびＶＬ（λまたはκ）－ＣＬ
３６．ＶＬ（λまたはκ）－ＣＬ－ヒンジ－（Ｌ）－ＮＨＲ２およびＶＨ－ＣＨ１
３７．ＶＨ－ＣＨ１－（Ｌ）－ＮＨＲ２－（Ｌ）－ＥＭおよびＶＬ（λまたはκ）－ＣＬ
３８．ＶＬ（λまたはκ）－ＣＬ－（Ｌ）－ＮＨＲ２－（Ｌ）－ＥＭおよびＶＨ－ＣＨ１
３９．ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－（Ｌ）－ＮＨＲ２－（Ｌ）－ＥＭおよびＶＬ（λまたはκ）－ＣＬ
４０．ＶＬ（λまたはκ）－ＣＬ－ヒンジ－（Ｌ）－ＮＨＲ２－（Ｌ）－ＥＭおよびＶＨ－ＣＨ１
４１．ＶＨ－ＣＨ１－（Ｌ）－ＮＨＲ２およびＶＬ（λまたはκ）－ＣＬ－（Ｌ）－ＥＭ
４２．ＶＬ（λまたはκ）－ＣＬ－（Ｌ）－ＮＨＲ２およびＶＨ－ＣＨ１－（Ｌ）－ＥＭ
４３．ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－（Ｌ）－ＮＨＲ２およびＶＬ（λまたはκ）－ＣＬ－（Ｌ）－ＥＭ
４４．ＶＬ（λまたはκ）－ＣＬ－ヒンジ－（Ｌ）－ＮＨＲ２およびＶＨ－ＣＨ１－（Ｌ）－ＥＭ
上記の例において、（Ｌ）は場合により存在するペプチドリンカーを表し、ＥＭは、毒素、薬物またはサイトカインなどの生物活性剤またはエフェクター分子を表し、これには、抗体、ＦａｂおよびＳｃＦｖなどの結合性分子が含まれる。
可変軽鎖は、ＶλまたはＶκのいずれかであり得る。
本発明の一態様では、集合した四量体化タンパク質分子は、一例では、動物創薬プラットフォーム（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ）を使用して創薬に適用するためのヒトｐＭＨＣであり得る。そのような文脈において、四量体化ドメインは、優先的に、意図する動物種を起源とする遺伝子から発現および製造される。そのような創薬応用の一例は、例えばラットにおける免疫化のための抗原としての四量体化ヒトｐＭＨＣの使用であろう。ラットがｐＭＨＣで免疫化されると、免疫応答は、タンパク質複合体の四量体化ドメインではなくヒトｐＭＨＣを特異的に対象とする。
多価の抗体は、例えば、ＮＨＲ２多量体化ドメインに融合した単一ドメイン抗体配列を使用して製造することができる。
本発明に関連する態様では、四価のタンパク質は、腫瘍抗原の分子イメージング用のプローブとして使用されるペプチドであり得る。そのようなプローブの多価結合性は、ｉｎ ｖｉｖｏでの増進された親和性、アビディティおよび保持時間を有し、そしてこれがｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍標的化を増進させるので、一価の分子プローブに対して独特の利点を有する。
多量体化ドメインは、上記したＮＨＲ２ドメインである。好ましくは、ポリペプチドは、該ポリペプチドに融合したＩｇ定常ドメインの使用によって安定化されかつ／または可溶性とされ、融合物はポリペプチドの四量体を提供する。Ｉｇヒンジドメインを使用して八量体を提供することができる。
多量体の使用
本発明による多量体ＴＣＲタンパク質は、可溶性ＴＣＲタンパク質が適応される任意の応用において有用である。本発明のＴＣＲタンパク質の特定の利点としては、選択された標的に対する増加したアビディティ、および／または複数の標的に結合する能力が挙げられる。
したがって、一態様では、本発明の多価のヘテロ二量体可溶性ＴＣＲタンパク質分子は、免疫応答を選択的に阻害するため、例えば、自己免疫応答の抑制のために使用することができる。これらの可溶性タンパク質分子の多価の、例えば四価の、性質は、Ｔ細胞と抗原提示細胞との抗原特異的な相互作用と競合する鋭敏な感度および結合親和性を該分子に与える。この種の中和効果は、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、乾癬、炎症性腸疾患、グレーヴス病、血管炎および１型糖尿病などの自己免疫疾患において治療的に有益であり得る。
同様に、四価のヘテロ二量体可溶性ＴＣＲタンパク質分子は、標的分子に結合する特定の移植抗原および自己抗原のＴ細胞認識を選択的に抑制し、したがって細胞間相互作用を阻害することによって組織移植拒絶を予防するために使用することができる。
本発明の別の態様では、四価のヘテロ二量体可溶性ＴＣＲタンパク質分子は、毒性、感染性疾患研究、神経学的研究、挙動および認知研究、生殖、遺伝学および異種移植研究などの臨床研究において使用することができる。
同種ｐＭＨＣに対して増進された感度を有する四価のヘテロ二量体可溶性ＴＣＲタンパク質分子は、ヒト患者から直接的に得られた生体試料を使用する診断の目的のために使用することができる。四価のヘテロ二量体可溶性ＴＣＲの増進された感度は、生来的に低密度で発現されることが分かっている、ＭＨＣ上に提示される潜在的な疾患関連ペプチドの検出を可能とする。これらの分子はまた、関連する臨床試験に患者を加入させるための患者の層化のためにも使用することができる。
本発明の別の態様では、八価のヘテロ二量体可溶性ＴＣＲタンパク質分子は、様々な疾患の治療のための医薬調製物において使用することができる。
本発明に関連する別の態様では、八価のヘテロ二量体可溶性ＴＣＲタンパク質分子は、腫瘍の分子イメージング用のプローブとして使用し、または治療用タンパク質として調製することができる。
実施例１：四価および八価の可溶性ヘテロ二量体ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ分子の生成
本実施例は、それぞれｔｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲおよびｏｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲと称する四価および八価の可溶性ヘテロ二量体ＴＣＲ分子を生成する方法を実証する。これらのフォーマットは、標的部位での溶解性および同種リガンドに対するアビディティに関連する問題を克服する。
安定かつ可溶性の分子としてｔｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲおよびｏｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲを例示するために、免疫グロブリン定常ドメインおよびＮＨＲ２四量体化ドメインと共にＮＹ－ＥＳＯ－１に対して高親和性を有するＴＣＲ αβ可変配列を本実施例では使用する。
本実施例において使用されるＳＬＬＭＷＩＴＱＣ－ＨＬＡ－Ａ＊０２０１に特異的な高親和性ＮＹ－ＥＳＯ ＴＣＲ αβ鎖（それぞれＴＣＲ Ｖα－ＣａおよびＶβ－Ｃｐを構成する）は、シグナルペプチド配列（ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳ）を含めて国際公開第２００５／１１３５９５号パンフレットに報告されている。タンパク質の精製を助けるために、ヒスチジンタグをＮＨＲ２ドメインのＣ末端に組み込んだ。
ｔｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲおよびｏｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲの成分をコードするＤＮＡ構築物を２ベクター系として合成により構築して、哺乳動物細胞での可溶性発現および機能的集合を可能とする。発現ベクターへのクローニングのためのＤＮＡ配列が合成される２つの集合したＴＣＲ鎖（ａ鎖およびβ鎖）の構成図の描写を図３および図４に示し、それらのアミノ酸配列を図５および図６に示す。
ｐＴＴ５発現系は、懸濁液に適合させたＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞中の組換えタンパク質の高レベルの一過性の製造を可能とする（Zhang et al. 2009）。それは、宿主細胞の複製因子と共にＤＮＡプラスミドのエピソーム複製を媒介して組換えタンパク質の増進された発現を可能とする、ウイルスタンパク質エプスタイン・バー核抗原１（ＥＢＮＡ－１）によって認識される複製起点（ｏｒｉＰ）を含有する。したがって、ｔｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲおよびｏｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ分子のための成分をクローニングするためにｐＴＴ５発現ベクターを選択する。
ＴＣＲ αβ鎖を含有する合成されたＤＮＡ断片を、制限部位（ＲＳ）で制限酵素（ＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ、Ｆｅｒｍａｎｔａｓ）を用いて消化し、ＤＮＡを１％アガロースゲル上で分離する。正しいサイズのＤＮＡ断片を切り出し、Ｑｉａｇｅｎのゲル抽出キットを使用してＤＮＡを精製する。ｐＴＴ５ベクターも同じ制限酵素を用いて消化し、切り出したアガロースゲルから線状化プラスミドＤＮＡを精製する。消化されたＴＣＲ αβ鎖を消化されたｐＴＴ５ベクターにクローニングして、４つの発現ベクター（ｐＴＴ５－ｔｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１－ＴＣＲａ、ｐＴＴ５－ｔｓ－ＥＳＯ－１－ＴＣＲβ、ｐＴＴ５－ｏｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１－ＴＣＲａおよびｐＴＴ５－ｏｓ－ＥＳＯ－１－ＴＣＲβ）を得る。
四価および八価の可溶性ＮＹ－ＥＳＯ ＴＣＲの発現
ｔｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲおよびｏｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲの機能的発現は、懸濁液に適合させたＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞中で実行する。ＨＥＫ２９３－ＥＢＮＡ細胞を３７℃、５％のＣＯ２および９５％の湿度で無血清ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、２ｍＭ Ｌ－グルタミンと共に高グルコース（４．５ｇ／Ｌ））中で培養する。
各トランスフェクションのために、約６０％のコンフルエントな細胞からＨＥＫ２９３－ＥＢＮＡ細胞（３×１０７細胞）を２５０ｍＬのエルレンマイヤーシェーカーフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に新たに播種する。ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ＭＡＸ陽イオン性脂質塩基試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を供給元のガイドラインにしたがって使用してトランスフェクションを実行する。ｔｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲの発現のために、３７．５μｇの全プラスミドＤＮＡ（ｐＴＴ５－ｔｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１－ＴＣＲａおよびｐＴＴ５－ｔｓ－ＥＳＯ－１－ＴＣＲβのベクターのそれぞれに１８．７５μｇのプラスミドＤＮＡを使用するか、または異なる量の２つの発現プラスミド）をトランスフェクションごとに使用する。同様にｏｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲの発現のために、ｐＴＴ５－ｏｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１－ＴＣＲａおよびｐＴＴ５－ｏｓ－ＥＳＯ－１－ＴＣＲβのそれぞれに１８．７５μｇのプラスミドＤＮＡをトランスフェクションのために使用する。トランスフェクション後に細胞を新鮮な培地中に回収し、４～８日にわたって１１０ｒｐｍのオービタルシェーカー中、５％ ＣＯ２、３７℃で培養した。より小スケールのトランスフェクションを６ウェルまたは２４ウェルプレート中で同様に行う。
発現された可溶性ｅＴＣＲ２－ＢｉＴＥの解析
上清中に分泌されたｔｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲおよびｏｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲタンパク質分子をドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって直接的にまたはタンパク質精製後に解析する。タンパク質試料および標準を還元条件下および非還元条件下の両方で調製する。Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ Ｔｅｔｒａ細胞電気泳動システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）でのタンパク質電気泳動用のキャストミニゲルを使用してＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。クマシーブルー色素を使用してＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル中のタンパク質を染色した。
ｔｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲおよびｏｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲタンパク質分子の精製
細胞上清からの可溶性ｔｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲおよびｏｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲを２ステップで精製する。第１のステップでは、ニッケルを搭載したニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）アガロース樹脂（ＨｉｓＰｕｒ Ｎｉ－ＮＴＡ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ ａｇａｒｏｓｅ－Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ）と共に固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を使用する。結合および洗浄緩衝液は、低濃度のイミダゾール（１０～２５ｍＭ）を含有するｐＨ７．２のトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）からなる。ＩＭＡＣカラムからのＨｉｓタグ化ｔｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲおよびｏｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲの溶出および回収は、高濃度のイミダゾール（＞２００ｍＭ）を用いる洗浄によって達成する。溶出されたタンパク質画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析し、目的のタンパク質を含有する画分をプールする。プールされたタンパク質画分を直接的に結合アッセイに使用するか、またはサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を伴う第２のステップでさらに精製する。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ｉｎｃｒｅａｓｅプレパックカラム（Ｇｅｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して標的タンパク質の単量体、オリゴマーおよび任意の凝集形態を分離除去する。
表面プラズモン共鳴
ｔｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲおよびｏｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲのそのｐＭＨＣへの特異的結合および親和性解析をＢＩＡｃｏｒｅを使用して行う。簡潔に述べれば、精製したヒスチジンタグ化ｔｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲおよびｏｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲタンパク質をニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）のＮｉ２＋キレート化を介してセンサー表面に捕捉する。ＮＹ－ＥＳＯ ｐｅｐ（ＳＬＬＭｗｉＴＱｖ）－ＭＨＣ（ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ）を含有する異なる濃度のアナライト溶液を注入し、結合シグナルをモニターした。
実施例２：四価および八価の可溶性ＮＹ－ＥＳＯ ＴＣＲ－ＩＬ２融合分子の生成
ｔｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ－ＩＬ２およびｏｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ－ＩＬ２タンパク質複合体を発現するために必要とされるドメインをコードするＤＮＡを上記の通りに合成し、発現ベクターｐＴＴ５にクローニングする。ｔｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ－ＩＬ２およびｏｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ－ＩＬ２のためのＴＣＲ αβ鎖内のドメインの構成図の描写を図７および図８に示し、アミノ酸配列を図９および図１０に示す。
ｔｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ－ＩＬ２およびｏｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ－ＩＬ２の発現、精製および特徴付けは上記の通りに実行する。
実施例３：高収率の四量体分泌物
簡潔に述べれば、従来の遺伝子操作技術を使用して、Ｑｕａｄ １６（図１４および図１５）をコードするＨＥＫ２９３－Ｔ細胞株を作製し、Ｑｕａｄ １７（図１４および図１５）をコードする別のＨＥＫ２９３－Ｔ細胞株を作製した。
タンパク質発現が起こり、タンパク質が細胞株から分泌された。細胞をインキュベートした培地の試料を変性条件下のＰＡＧＥ（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）またはネイティブ条件下（ＳＤＳなし）のＰＡＧＥに供した。前者を（メルカプトエタノールを使用して）さらに還元条件下としたが、後者はそうしなかった。
還元されたゲルは、予測される単量体サイズにはっきりとしたバンドを示した（図１６）。驚くべきことに、非還元の、ネイティブゲルは、単量体、二量体または三量体のサイズに検出可能なバンドを示さず、代わりに四量体のサイズに強いバンドが見られ、四量体の非常に高い収率が得られたことを指し示し、これは高純度であることがＳＥＣによって確認された。
Ｑｕａｄ １６について、ＳＥＣからの四量体ピークをＳＤＳ－ＰＡＧＥに流し、得られたバンドを質量分析のために切り出した。トリプシン消化でデータを得、ｐ５３を１００％のタンパク質で検出した。これは、分泌されたＱｕａｄ １６が多量体化されたことの決定的証拠である。
実施例４：ＮＨＲ２ ＴＰに融合したＴＣＲの細胞外部分の細胞内タンパク質発現
発現ベクター
全てのＤＮＡ断片を合成し、Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）により発現ベクターｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。合成されたＤＮＡ断片およびＱｕａｄポリペプチドの構成図および配列を図２１、および本明細書中の配列表に示す。
ＤＮＡの調製
Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅによって合成された凍結乾燥されたプラスミドＤＮＡを５０ｎｇ／μｌの濃度にＭＱ水で再懸濁した。従来の熱ショック法を使用して５０ｎｇのＤＮＡを５０μｌのコンピテントＤＨ５ａ細胞に形質転換した。１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢ寒天プレート上に細胞をプレートし、３７℃で終夜生育させた。個々のコロニーを採取し、２２０ｒｐｍ、３７℃で終夜生育させた。製造者の指示書（Ｑｉａｇｅｎ）にしたがってＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔを使用してＤＮＡを細胞から精製した。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞へのトランスフェクション
簡潔に述べれば、１０％ ＦＢＳおよびＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを添加した高グルコースＤＭＥＭ中にＨＥＫ２９３Ｔ細胞を維持した。細胞を２ｍｌの培地中に６ウェルプレートのウェルあたり６×１０５細胞で播種し、３７℃、５％ ＣＯ２で終夜接着させた。７．５μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を１５０μｌのＯｐｔｉＭｅｍに希釈し、室温で５分間インキュベートした。プラスミドＤＮＡ（２．５μｇ）を１５０μｌのＯｐｔｉＭｅｍに希釈した。希釈したＤＮＡを希釈したＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００と合わせ、穏やかに混合し、室温で２０分間インキュベートした。３００μｌの複合体を６ウェルプレートのうちの１つのウェルに加えた。培地が無血清であることを解析が必要とする場合、トランスフェクションの６時間後に培地を吸引し、ＣＤ２９３培地で置き換えた。解析前に３７℃、５％ ＣＯ２で４８時間細胞をインキュベートした。
したがって、異なるフォーマットのＴＣＲ連結ＮＨＲ２四量体化ドメイン（ＴＤ）構築物（Ｑｕａｄ）をＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。ＴＣＲの四価のフォーマットに似たＱｕａｄ ３およびＱｕａｄ ４（図１および図３に図式的に表す構造）およびＴＣＲの八価のフォーマットに似たＱｕａｄ １２およびＱｕａｄ １３（図２および図４に図式的に表す構造）をタンパク質発現解析のためにトランスフェクトした。細胞内に発現されたタンパク質を確認するために、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞から以下の通りにタンパク質試料を調製した。簡潔に述べれば、細胞を２ｍｌのＰＢＳで１回洗浄し、その後に吸引した。１５０μｌのトリプシン－ＥＤＴＡ（０．０５％）を各ウェルに加え、細胞を室温で約１分間インキュベートした。プレートを軽くたたいて、あらゆる強く接着した細胞を外した。８５０μｌの培地を各ウェルに加えてトリプシンを不活化した。細胞を１．５ｍｌのエッペンドルフに移し、１，０００ｒｐｍで５分間遠心した。上清を吸引し、ペレットを氷上で貯蔵した。Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ Ｓｅｔ ＩＩＩ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を含有する４００μｌの細胞溶解緩衝液（１０ｍＭのトリス、ｐＨ ７．５、１％ ＳＤＳ）中に細胞を再懸濁し、１／２００に希釈した。試料を激しくボルテックスし、氷上で２０分間インキュベートした。Ｂｒａｎｓｏｎ Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して細胞を超音波処理した。振幅を３０％に設定し、計２４秒間（６秒オン、３秒オフを４回）細胞を超音波処理した。製造者の説明書にしたがってＰｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（商標）を使用して全タンパク質濃度を定量化した。１００μｇをＭＱ水で希釈して８０μｌの体積とした。次いで２０μｌの５ｘ ＳＤＳローディングバッファーを加えて１ｍｇ／ｍｌの試料とした。ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット解析の前に９５℃で５分間試料をインキュベートした。
変性条件下のＳＤＳ－ＰＡＧＥ上でタンパク質試料を分離した。典型的に、２５μｇの全細胞溶解液（２５μｌ）をウエスタンブロット解析のためにゲルに流した。５μｌのＰａｇｅＲｕｌｅ Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ １０－１８０ｋＤａ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｄｄｅｒをタンパク質試料の隣でゲルに流した。０．１％ ＳＤＳを含有するトリス－グリシン緩衝液中でゲル泳動を行った。１５０ボルトの定電圧を使用し、色素の先端が充分に移動するまで約７０分間ゲル泳動を行った。
以下の分離ゲルおよび濃縮ゲルを使用してＳＤＳ－ＰＡＧＥ（１５％ ビス－トリス）ゲルを調製した。
分離ゲル：
・５ｍｌ ３０％ビス－アクリルアミド
・２．６ｍｌ １．５Ｍトリス（ｐＨ８．８）
・５０μｌ ２０％ ＳＤＳ
・１００μｌ １０％ ＡＰＳ
・１０μｌ ＴＥＭＥＤ
・２．２ｍｌ ＭＱ水
濃縮ゲル：
・０．７５ｍｌ ３０％ビス－アクリルアミド
・１．２５ｍｌ １．５Ｍトリス（ｐＨ８．８）
・２５μｌ ２０％ ＳＤＳ
・５０μｌ １０％ ＡＰＳ
・５μｌ ＴＥＭＥＤ
・２．９ｍｌ ＭＱ水
Ｑｕａｄ ３、Ｑｕａｄ ４、Ｑｕａｄ １２およびＱｕａｄ １３からのＴＣＲ－ＮＨＲ２ ＴＤ融合タンパク質のタンパク質発現の特異的かつ高感度検出のためにウエスタンブロッティングを行った。ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離したタンパク質を以下の通りにＡｍｅｒｓｈａｍ Ｈｙｂｏｎｄ（商標） ０．４５μＭ ＰＶＤＦ膜に移した。簡潔に述べれば、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｈｙｂｏｎｄ ０．４５μＭ ＰＶＤＦ膜を約１分間ＭｅＯＨで活性化し、使用前にトランスファーバッファー（２５ｍＭトリス、１９０ｍＭグリシン、２０％ ＭｅＯＨ）でリンスした。スポンジ、濾紙、ゲル、膜、濾紙、スポンジの積層を用意し、移動用のカセット中に置いた。移動は、氷上で７５分間２８０ｍＡで実行した。膜をブロッキングバッファー（ＴＢＳＴ、５％ 粉乳）中で約２時間インキュベートした。膜をＴＢＳＴで簡潔に洗浄した後、ＴＢＳＴ、１％ 粉乳中に１／２５００で希釈した抗ヒトＩｇＧ ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ、３１４１０）と共に４℃で終夜インキュベートした。膜を充分に洗浄（ＴＢＳＴでの３回の洗浄、各１５分）した後、Ｐｉｅｒｃｅ ＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅを使用して発色させた。
ウエスタンブロットのプローブとするために抗ヒトＩｇＧ検出抗体を使用して、予測される分子量の特定のタンパク質バンドをＱｕａｄ ３（４６．１ｋＤａ）、Ｑｕａｄ ４（４６．４ｋＤａ）、Ｑｕａｄ １２（４７．８ｋＤａ）およびＱｕａｄ １３（４８．１ｋＤａ）から調製された試料から検出することができる（図１７Ａおよび図１７Ｂ）。これらのデータは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＴＣＲ－ＮＨＲ２ ＴＤ融合タンパク質の細胞内タンパク質発現の確認となる。
解析した全てのＱｕａｄについて、明瞭な単一のバンドを検出することができ、ＮＨＲ２ ＴＤとのＴＲＶβ－ＴＲＶβ－ＩｇＧ１－ＣＨ１（＋／－ＩｇＧヒンジドメイン）の融合物が安定であることを指し示す。これらの発現データもまた、本実施例で例示される四価（Ｑｕａｄ ３およびＱｕａｄ ４）および八価（Ｑｕａｄ １２およびＱｕａｄ １３）の分子を集合させることができることの確認となる。
Ｑｕａｄ ３とＱｕａｄ ４と違いは、ＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインとＮＨＲ２ ＴＤとの間に位置する小さいペプチドリンカー（Ｇ４Ｓ）の存在である。これはまた、Ｑｕａｄ １２およびＱｕａｄ １３についても当てはまり、Ｑ１３はＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインとＮＨＲ２ ＴＤとの間にペプチドリンカーを含有する。発現データから、ペプチドリンカーはタンパク質発現を結果としてもたらさないことが分かる。しかしながら、これらのＴＣＲ－ＮＨＲ２ ＴＤフォーマットにおいて抗原結合およびまたは多量体化複合体の安定化を助けるためにペプチドリンカーを含めることが望ましい場合がある。
実施例５：ＮＨＲ２ ＴＰに融合したＴＣＲの細胞外部分の可溶性タンパク質発現
実施例４において、ＴＣＲ－ＮＨＲ２ ＴＤ融合タンパク質がＨＥＫ２９３Ｔ細胞の細胞内に発現されることが示された。ここで再び、Ｑｕａｄ ３、Ｑｕａｄ ４、Ｑｕａｄ １２およびＱｕａｄ １３を使用してこれらの融合タンパク質の可溶性発現を実証した。上記の通りに、Ｑｕａｄ ３、Ｑｕａｄ ４、Ｑｕａｄ １２およびＱｕａｄ １３をＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、細胞上清からの可溶性タンパク質を濃縮した。簡潔に述べれば、トランスフェクションの４８時間後に培地を回収し、２，０００ｒｐｍで５分間遠心して任意の細胞またはデブリを除去した。典型的に、１０ｋＤａのＭＷＣＯと共にＡｍｉｃｏｎ（商標） Ｕｌｔｒａ ０．５ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｕｎｉｔを使用して５００μｌの培地を１００μｌに濃縮した。２５μｌの５× ＳＤＳローディングバッファーを試料に加えた後、ゲル／ウエスタンブロット解析の前に９５℃で５分間インキュベートした。濃縮したタンパク質試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で分離し、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｈｙｂｏｎｄ ０．４５μＭ ＰＶＤＦ膜に移した。上記の方法を使用し、抗ヒトＩｇＧ ＨＲＰを使用してウエスタンブロッティングおよびタンパク質検出を行った。
細胞上清から濃縮および調製されたタンパク質試料は、Ｑｕａｄ ３（４６．１ｋＤａ）、Ｑｕａｄ ４（４６．４ｋＤａ）、Ｑｕａｄ １２（４７．８ｋＤａ）およびＱｕａｄ １３（４８．１ｋＤａ）に対応するウエスタンブロット上の予測される分子量に特定のタンパク質バンドを示す（図１８Ａおよび図１８Ｂ）。ウエスタンブロット発現データは、ＨＥＫ２９３ＴにおけるＴＣＲ－ＮＨＲ２ ＴＤ融合タンパク質の可溶性発現を明確に示す。これらのデータは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞などの真核細胞中で発現されるＴＣＲ－ＮＨＲ２ ＴＤ融合タンパク質の可溶性発現を実証する初めての報告である。
四量体（Ｑｕａｄ ３およびＱｕａｄ ４）および八量体（Ｑｕａｄ １２およびＱｕａｄ １３）の両方のＴＣＲ－ＮＨＲ２ ＴＤフォーマットからの可溶性タンパク質発現の検出は、広範な状況でＮＨＲ２ ＴＤを応用できる可能性を強調する。ＮＨＲ２ ＴＤ融合分子の使用は、治療用分子ならびに診断およびイメージングにおいて使用するためのタンパク質分子の調製のために使用することができる。
実施例６：ＮＨＲ２ ＴＤに融合した抗体断片の細胞内タンパク質発現
ＮＨＲ２ ＴＤの汎用性をさらに例示するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における発現を試験するためにＮＨＲ２ ＴＤに融合したいくつもの異なる抗体断片フォーマットを構築した。
Ｑｕａｄ １４およびＱｕａｄ １５は、図１１および図２１に図式的に描写されるＶＨとＮＨＲ２ ＴＤとの間に位置するペプチドリンカーありまたはなしでＮＨＲ２ ＴＤに融合した抗体ＶＨドメインを含有する。Ｑｕａｄ １４およびＱｕａｄ １５中のＶＨドメインはＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）に特異的である。このフォーマットのいくつもの他のバージョンも構築し、治療的に有用な薬物標的に特異的なＶＨを用いて試験した。結合ドメインの配列を表４に列記する。これらの一部としては、Ｑｕａｄ ３４（ＴＮＦａに特異的）、Ｑｕａｄ ３８（ＶＥＧＦに特異的）、Ｑｕａｄ ４０（ＥＧＦＲに特異的）およびＱｕａｄ ４４（ＣＤ３８に特異的）が挙げられる。
それぞれＱｕａｄ ４２およびＱｕａｄ ４６をもたらすＥＧＦＲおよびＣＤ１３８に特異的な第２のＶＨドメインの含有物を有する追加の結合アームを含むＱｕａｄ ３８およびＱｕａｄ ４４をさらに開発した。Ｑｕａｄ ４２およびＱｕａｄ ４６は、二特異的な四量体を形成するＮＨＲ２ ＴＤドメインを介して多量体化する能力を有する二特異的な分子を表す。
別の例では、エフェクター分子（ヒトＩＬ２）をＱｕａｄ １４およびＱｕａｄ １５のＣ末端に連結してＱｕａｄ １８およびＱｕａｄ １９を結果としてもたらし、それによって、ＶＨ－ＮＨＲ２－ＩＬ２分子は四価かつ二機能性となる。
別の例では、抗体Ｆａｂ断片（ＶＨ－ＣＨ１）を図１２に図式的に描写されるようにＮＨＲ２ ＴＤ（Ｑｕａｄ ２３およびＱｕａｄ ２４）に連結した。Ｑｕａｄ ２３およびＱｕａｄ ２４は、免疫グロブリン軽鎖を含有する第２の鎖（例えば、Ｑｕａｄ ２５）とｉｎ ｖｉｔｒｏで共発現または混合および集合された時に四価のＦａｂ分子を表す。
さらに別の例では、ヒトＩｇＧ１ヒンジドメインをＱｕａｄ ２３およびＱｕａｄ ２４に含ませ、これはＱｕａｄ ２６およびＱｕａｄ ２７と称され、図１３に図式的に描写される。Ｑｕａｄ ２６およびＱｕａｄ ２７は、免疫グロブリン軽鎖ドメインを含有する第２の鎖（例えば、Ｑｕａｄ ２５）とｉｎ ｖｉｔｒｏで共発現または混合および集合された時に八価のＦａｂ分子を表す。
全てＨｉｓタグ化された以下のＱｕａｄベクター、Ｑｕａｄ １４、Ｑｕａｄ １５、Ｑｕａｄ １８、Ｑｕａｄ １９、Ｑｕａｄ ２３、Ｑｕａｄ ２４、Ｑｕａｄ ２６、Ｑｕａｄ ２７、Ｑｕａｄ ３４、Ｑｕａｄ ３８、Ｑｕａｄ ４０、Ｑｕａｄ ４２、Ｑｕａｄ ４４およびＱｕａｄ ４６をＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。タンパク質試料を上記の通りに全細胞抽出物から調製し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上で分離し、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｈｙｂｏｎｄ ０．４５μＭ ＰＶＤＦ膜に移した。ＴＢＳＴ、１％ 粉乳中で１／２５００に希釈した抗Ｈｉｓ ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ、Ａ７０５８）をプローブとして使用して特定のタンパク質発現を検出した。
Ｑｕａｄ １４、Ｑｕａｄ １５、Ｑｕａｄ １８、Ｑｕａｄ １９、Ｑｕａｄ ２３、Ｑｕａｄ ２４、Ｑｕａｄ ２６、Ｑｕａｄ ２７、Ｑｕａｄ ３４、Ｑｕａｄ ３８、Ｑｕａｄ ４０、Ｑｕａｄ ４２、Ｑｕａｄ ４４およびＱｕａｄ ４６を使用して試験した全ての異なる抗体－ＮＨＲ２ ＴＤ融合タンパク質について全細胞抽出物中で特定のタンパク質発現を検出することができた（図１９Ａ～Ｄ）。興味深いことに、ＮＨＲ２ ＴＤのＮ末端に融合したＶＨ結合ドメインに加えて、ＮＨＲ２ ＴＤドメインのＣ末端に融合したエフェクタードメイン（ＩＬ２）を含有するＱｕａｄ １８およびＱｕａｄ １９は、良好なタンパク質発現を示した。
Ｑｕａｄ ２３およびＱｕａｄ ２４ポリペプチドの発現は、ＮＨＲ２ ＴＤを使用して、パートナーとなる可溶性Ｑｕａｄ分子（例えば、Ｑｕａｄ ２５）とｉｎ ｖｉｔｒｏで共発現または混合された時に四価の抗体Ｆａｂ分子を形成できることを強調する。同様に、ヒトＩｇＧ１ヒンジドメインを含むＱｕａｄ ２６およびＱｕａｄ ２７の発現は、ＮＨＲ２ ＴＤを使用して、パートナーとなる可溶性の第２のパートナー鎖（例えば、Ｑｕａｄ ２５）とｉｎ ｖｉｔｒｏで共発現または混合された時に八価の抗体Ｆａｂ分子を形成できることを強調する。
ＮＨＲ２ ＴＤドメインのＣ末端に融合した追加のＶＨドメインを含有するＱｕａｄ ４２およびＱｕａｄ ４６二特異的分子もまた、良好なタンパク質発現を示した。これらのデータは、ＮＨＲ２ ＴＤドメインの汎用性、および、広範なタンパク質フォーマットを開発するために異なる結合性およびエフェクター分子に融合されるその能力を強調する。データはまた、ＮＨＲ２ ＴＤのＮ末端およびＣ末端の両方にタンパク質分子を融合できることも示唆し、これは二特異的な多価のタンパク質分子の開発を可能とする。
実施例７：ＮＨＲ２ ＴＤに融合した抗体断片の多価集合
ＮＨＲ２ ＴＤは、四量体複合体へのＥＴＯのオリゴマー化に関与する。実施例４～６に示すように、ＮＨＲ２ ＴＤドメインを使用して、発現に影響することなくＮ末端もしくはＣ末端またはＮ末端およびＣ末端の両方に結合ドメインおよびエフェクター分子を融合することができる。結合ドメインは、ＴＣＲ可変および定常ドメイン、抗体および抗体断片またはＩＬ２などのエフェクター分子であり得る。ＮＨＲ２ ＴＤは生来的に細胞内でのみ発現される細胞内発現タンパク質の一部分であるにもかかわらずＮＨＲ２ ＴＤに融合した時に可溶性フォーマットでタンパク質を発現することもできる（図１８）
ＮＨＲ２ ＴＤは結合ドメインに融合された時にオリゴマー化する能力を保持するかどうかを実証するために、Ｑｕａｄ １４およびＱｕａｄ １５をＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で発現させ、上記の通りに全細胞抽出物からタンパク質試料を調製した。タンパク質試料を変性および非変性（ネイティブ）条件下のＰＡＧＥゲル上で分離した。ネイティブゲルは、ＳＤＳを用いずに上記のプロトコールを使用して調製した。ＰＡＧＥゲルからのタンパク質をＡｍｅｒｓｈａｍ Ｈｙｂｏｎｄ ０．４５μＭ ＰＶＤＦ膜に移した。抗ヒトＩｇＧ ＨＲＰ検出抗体をプローブとして用いて特定のタンパク質発現を検出した。
予想された通り、変性条件下で、Ｑｕａｄ １４およびＱｕａｄ １５からのＶＨ－ＮＨＲ２ ＴＤの発現は単量体として見ることができ、特定のタンパク質バンドを予測される分子量（２２および２２．３ｋＤａ）で検出することができる（図２０Ａ）。非変性、したがってネイティブ条件下では、興味深いことに、Ｑｕａｄ １４およびＱｕａｄ １５からのＶＨ－ＮＨＲ２ ＴＤの単量体または二量体を検出することはできない（図２０Ｂ）。Ｑｕａｄ １４およびＱｕａｄ １５からのＶＨ－ＮＨＲ２ ＴＤの四量体であると思われる高分子量タンパク質バンドのみを検出することができる。四量体の集合は、タンパク質強度およびＱｕａｄ １４およびＱｕａｄ １５の検出可能な単量体および二量体が何ら存在しないことによる判断で、効率性が高くかつ純粋であるようである。
実施例４～７のデータをあわせると、ＮＨＲ２ ＴＤは汎用性が高く、様々なタンパク質結合ドメインおよびエフェクター分子の融合を可能とする決定的証拠がある。ＮＨＲ２ ＴＤは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞などの真核細胞からのタンパク質の可溶性発現を可能とし、かつ高度に安定かつ純粋な四量体分子を形成させる。
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Claims (50)

  1. エフェクタードメイン（例えば、タンパク質ドメイン）またはペプチドの少なくとも第１、第２、第３および第４のコピーのタンパク質多量体であって、前記多量体が、会合して一緒になる第１、第２、第３および第４の自己会合性四量体化ドメイン（ＴＤ）によって多量体化しており、各四量体化ドメインが、前記タンパク質ドメインまたはペプチドの１つまたは複数のコピーを含む各々の操作されたポリペプチドによって構成されている、多量体。
  2. 前記ドメインまたはペプチドの四量体または八量体である、請求項１に記載の多量体。
  3. 免疫グロブリンスーパーファミリー結合部位の四量体または八量体を含む、請求項１または２のいずれかに記載の多量体。
  4. 前記結合部位が、第２の可変ドメインとペア形成した第１の可変ドメインを含む、請求項３に記載の多量体。
  5. 各ポリペプチドが、前記タンパク質ドメインまたはペプチドの第１および第２のコピーを含み、前記ポリペプチドが、（Ｎ末端からＣ末端の方向に）（ｉ）前記第１のコピー－ＴＤ－前記第２のコピー；（ｉｉ）ＴＤ－ならびに前記第１および第２のコピー；または（ｉｉｉ）前記第１および第２のコピー－ＴＤを含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の多量体。
  6. 前記ＴＤがＮＨＲ２ ＴＤであり、かつ、前記ドメインまたはペプチドがＮＨＲ２ドメインまたはペプチドではない；または、前記ＴＤがｐ５３ ＴＤであり、かつ、前記ドメインまたはペプチドがｐ５３ドメインまたはペプチドではない、請求項１～５のいずれか１項に記載の多量体。
  7. 前記操作されたポリペプチドが、第２の種類のタンパク質ドメインまたはペプチドの１つまたは複数のコピーを含み、前記第２の種類のタンパク質ドメインまたはペプチドが、前記第１のタンパク質ドメインまたはペプチドとは異なる、請求項１～６のいずれか１項に記載の多量体。
  8. 前記ドメインが、免疫グロブリンスーパーファミリードメインである、請求項１～７のいずれか１項に記載の多量体。
  9. 前記メインまたはペプチドが、抗体可変もしくは定常ドメイン、ＴＣＲ可変もしくは定常ドメイン、インクレチン、インスリンペプチド、またはホルモンペプチドである、請求項１～８のいずれか１項に記載の多量体。
  10. 前記多量体が、前記操作されたポリペプチドの第１、第２、第３および第４の同一のコピーを含み、前記ポリペプチドが、ＴＤ、および、前記タンパク質ドメインまたはペプチドの１つ（但し、１つより多くない）、２つ（但し、２つより多くない）またはそれより多くのコピーを含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の多量体。
  11. 前記操作されたポリペプチドが、抗体またはＴＣＲ可変ドメイン（Ｖ１）およびＮＨＲ２ ＴＤを含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の多量体。
  12. 前記ポリペプチドが、（Ｎ末端からＣ末端の方向に）（ｉ）Ｖ１－場合により存在するリンカー－ＮＨＲ２ ＴＤ；（ｉｉ）Ｖ１－場合により存在するリンカー－ＮＨＲ２ ＴＤ－場合により存在するリンカー－Ｖ２；または（ｉｉｉ）Ｖ１－場合により存在するリンカー－Ｖ２－場合により存在するリンカー－ＮＨＲ２ ＴＤを含み、Ｖ１およびＶ２が、ＴＣＲ可変ドメインであり、かつ同一もしくは異なり、または、Ｖ１およびＶ２が、抗体可変ドメインであり、かつ同一もしくは異なる、請求項１１に記載の多量体。
  13. Ｖ１およびＶ２が、抗体単一可変ドメインである、請求項１２に記載の多量体。
  14. 各操作されたポリペプチドが、（Ｎ末端からＣ末端の方向に）Ｖ１－場合により存在するリンカー－ＴＤを含み、Ｖ１が、抗体またはＴＣＲ可変ドメインであり、かつ、各操作されたポリペプチドが、Ｖ２を含む各々の第２の操作されたポリペプチドとペア形成しており、Ｖ２が、それぞれＶ１とペア形成して抗原またはｐＭＨＣ結合部位を形成する抗体またはＴＣＲ可変ドメインであり、かつ、場合により、１つのポリペプチドが、抗体Ｆｃを含み、または抗体ＣＨ１を含み、かつ、他のポリペプチドが、ＣＨ１とペア形成する抗体ＣＬを含む、請求項１１に記載の多量体。
  15. 前記ＴＤが、（ｉ）配列番号１０もしくは１２６に同一またはそれに対して少なくとも８０％同一のアミノ酸配列；または（ｉｉ）配列番号１２０もしくは１２３に同一またはそれに対して少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載の多量体。
  16. 前記多量体が、レオプロ（商標）；アブシキシマブ；リツキサン（商標）；リツキシマブ；ゼナパックス（商標）；ダクリズマブ；シムレクト（商標）；バシリキシマブ；シナジス（商標）；パリビズマブ；レミケード（商標）；インフリキシマブ；ハーセプチン（商標）；マイロターグ（商標）；ゲムツズマブ；キャンパス（商標）；アレムツズマブ；ゼヴァリン（商標）；イブリツモマブ；ヒュミラ（商標）；アダリムマブ；ゾレア（商標）；オマリズマブ；ベキサール（商標）；トシツモマブ；ラプティバ（商標）；エファリズマブ；アービタックス（商標）；セツキシマブ；アバスチン（商標）；ベバシズマブ；タイサブリ（商標）；ナタリズマブ；アクテムラ（商標）；トシリズマブ；ベクティビックス（商標）；パニツムマブ；ルセンティス（商標）；ラニビズマブ；ソリリス（商標）；エクリズマブ；シムジア（商標）；セルトリズマブ；シンポニー（商標）；ゴリムマブ、イラリス（商標）；カナキヌマブ；ステラーラ（商標）；ウステキヌマブ；アーゼラ（商標）；オファツムマブ；プロリア（商標）；デノスマブ；ヌマックス（商標）；モタビズマブ；アブスラックス（商標）；ラキシバクマブ；ベンリスタ（商標）；ベリムマブ；ヤーボイ（商標）；イピリムマブ；アドセトリス（商標）；ブレンツキシマブ；ベドチン（商標）；パージェタ（商標）；ペルツズマブ；カドサイラ（商標）；アド・トラスツズマブ；キイトルーダ（商標）、オプジーボ（商標）、ガザイバ（商標）およびオビヌツズマブからなる群から選択される抗体の抗原結合部位の四量体または八量体を含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載の多量体。
  17. ＴＣＲ結合部位、インスリンペプチド、インクレチンペプチドまたはペプチドホルモンの単離された四量体または八量体、あるいは複数の前記四量体または八量体。
  18. （ａ）水溶液中で可溶性であり、
    （ｂ）真核細胞から分泌可能であり、かつ／または
    （ｃ）真核細胞の発現産物である、
    請求項１～１７のいずれか１項に記載の多量体、四量体または八量体。
  19. （ａ）水溶液中で可溶性である、ＴＣＲ ＶドメインまたはＴＣＲ結合部位の四量体または八量体、
    （ｂ）水溶液中で可溶性である、抗体単一可変ドメインの四量体または八量体、
    （ｃ）ＨＥＫ２９３細胞によって細胞内および／または細胞外に発現可能である、ＴＣＲ ＶドメインまたはＴＣＲ結合部位の四量体または八量体、または
    （ｄ）ＨＥＫ２９３細胞によって細胞内および／または細胞外に発現可能である、抗体可変ドメインの四量体または八量体。
  20. 前記四量体または八量体が、抗原またはｐＭＨＣ結合について二特異的である、請求項１～１９のいずれか１項に記載の多量体、四量体または八量体。。
  21. 前記ドメインが同一である、請求項１～２０のいずれか１項に記載の多量体、四量体または八量体。
  22. 真核細胞のグリコシル化を含む、請求項１～２１のいずれか１項に記載の多量体、四量体または八量体。
  23. 前記細胞がＨＥＫ２９３細胞である、請求項２２に記載の多量体、四量体または八量体。
  24. 複数の、請求項１～２３のいずれか１項に記載の多量体、四量体または八量体。
  25. 請求項１～２４のいずれか１項に記載の多量体、四量体または八量体および薬学的に許容される担体、希釈剤または医薬品添加物を含む、医薬組成物。
  26. 請求項１～２４のいずれか１項に記載の多量体、四量体または八量体を含む、化粧品、食料品、飲料、洗浄用製品、洗浄剤。
  27. 請求項１～２６のいずれか１項に記載の多量体、四量体または八量体の、前記操作された（かつ場合により単離された）ポリペプチドまたは（場合により単離された）単量体。
  28. （Ｎ末端からＣ末端の方向に）：
    （ａ）ＴＣＲ Ｖ１－ＴＣＲ Ｃ１－抗体ＣＨ１－場合により存在するリンカー－ＴＤを含み、
    （ｉ）Ｖ１がＶαであり、かつＣ１がＣαであり、
    （ｉｉ）Ｖ１がＶβであり、かつＣ１がＣβであり、
    （ｉｉｉ）Ｖ１がＶγであり、かつＣ１がＣγであり、または
    （ｉｖ）Ｖ１がＶδであり、かつＣ１がＣδであり、
    または
    （ｂ）ＴＣＲ Ｖ１－抗体ＣＨ１－場合により存在するリンカー－ＴＤを含み、
    （ｉ）Ｖ１がＶαであり、
    （ｉｉ）Ｖ１がＶβであり、
    （ｉｉｉ）Ｖ１がＶγであり、または
    （ｉｖ）Ｖ１がＶδであり、
    または
    （ｃ）抗体Ｖ１－抗体ＣＨ１－場合により存在するリンカー－ＴＤを含み、
    （ｉ）Ｖ１がＶＨであり、または
    （ｉｉ）Ｖ１がＶＬであり、
    または
    （ｄ）抗体Ｖ１－場合により存在する抗体ＣＨ１－抗体Ｆｃ－場合により存在するリンカー－ＴＤを含み、
    （ｉ）Ｖ１がＶＨであり、または
    （ｉｉ）Ｖ１がＶＬであり、
    または
    （ｅ）抗体Ｖ１－抗体ＣＬ－場合により存在するリンカー－ＴＤを含み、
    （ｉ）Ｖ１がＶＨであり、または
    （ｉｉ）Ｖ１がＶＬであり、
    または
    （ｆ）ＴＣＲ Ｖ１－ＴＣＲ Ｃ１－場合により存在するリンカー－ＴＤを含み、
    （ｉ）Ｖ１がＶαであり、かつＣ１がＣαであり、
    （ｉｉ）Ｖ１がＶβであり、かつＣ１がＣβであり、
    （ｉｉｉ）Ｖ１がＶγであり、かつＣ１がＣγであり、または
    （ｉｖ）Ｖ１がＶδであり、かつＣ１がＣδである、
    操作された（かつ場合により単離された）ポリペプチド（Ｐ１）。
  29. 前記操作されたポリペプチドＰ１が、さらなるポリペプチド（Ｐ２）とペア形成しており、Ｐ２が、（Ｎ末端からＣ末端の方向に）：
    （ｇ）ＴＣＲ Ｖ２－ＴＣＲ Ｃ２－抗体ＣＬを含み、Ｐ１が、請求項２８に記載された（ａ）によるものであり、かつ
    （ｉ）Ｐ１が（ａ）（ｉｉ）によるものである場合に、Ｖ２がＶαであり、かつＣ２がＣαであり、
    （ｉｉ）Ｐ１が（ａ）（ｉ）によるものである場合に、Ｖ２がＶβであり、かつＣ２がＣβであり、
    （ｉｉｉ）Ｐ１が（ａ）（ｉｖ）によるものである場合に、Ｖ２がＶγであり、かつＣ２がＣγであり、または
    （ｉｖ）Ｐ１が（ａ）（ｉｉｉ）によるものである場合に、Ｖ２がＶδであり、かつＣ２がＣδであり、
    または
    （ｈ）ＴＣＲ Ｖ２－抗体ＣＬを含み、Ｐ１が、請求項２８に記載された（ｂ）によるものであり、かつ
    （ｉ）Ｐ１が（ｂ）（ｉｉ）によるものである場合に、Ｖ２がＶαであり、
    （ｉｉ）Ｐ１が（ｂ）（ｉ）によるものである場合に、Ｖ２がＶβであり、
    （ｉｉｉ）Ｐ１が（ｂ）（ｉｖ）によるものである場合に、Ｖ２がＶγであり、または
    （ｉｖ）Ｐ１が（ｂ）（ｉｉｉ）によるものである場合に、Ｖ２がＶδであり、
    または
    （ｉ）抗体Ｖ２－ＣＬを含み、Ｐ１が、請求項２８に記載された（ｃ）によるものであり、かつ
    （ｉ）Ｐ１が（ｃ）（ｉｉ）によるものである場合に、Ｖ２がＶＨであり、または
    （ｉｉ）Ｐ１が（ｃ）（ｉ）によるものである場合に、Ｖ２がＶＬであり、
    または
    （ｊ）抗体Ｖ２－場合により存在するＣＬを含み、Ｐ１が、請求項２８に記載された（ｄ）によるものであり、かつ
    （ｉ）Ｐ１が（ｄ）（ｉｉ）によるものである場合に、Ｖ２がＶＨであり、または
    （ｉｉ）Ｐ１が（ｄ）（ｉ）によるものである場合に、Ｖ２がＶＬであり、
    または
    （ｋ）抗体Ｖ２－ＣＨ１を含み、Ｐ１が、請求項２８に記載された（ｅ）によるものであり、かつ
    （ｉ）Ｐ１が（ｅ）（ｉｉ）によるものである場合に、Ｖ２がＶＨであり、または
    （ｉｉ）Ｐ１が（ｅ）（ｉ）によるものである場合に、Ｖ２がＶＬであり、
    または
    （ｌ）ＴＣＲ Ｖ２－ＴＣＲ Ｃ２を含み、Ｐ１が、請求項２８に記載された（ｆ）によるものであり、かつ
    （ｉ）Ｐ１が（ｆ）（ｉｉ）によるものである場合に、Ｖ２がＶαであり、かつＣ２がＣαであり、
    （ｉｉ）Ｐ１が（ｆ）（ｉ）によるものである場合に、Ｖ２がＶβであり、かつＣ２がＣβであり、
    （ｉｉｉ）Ｐ１が（ｆ）（ｉｉｉ）によるものである場合に、Ｖ２がＶγであり、かつＣ２がＣγであり、または
    （ｉｖ）Ｐ１が（ｆ）（ｉｖ）によるものである場合に、Ｖ２がＶδであり、かつＣ２がＣδである、
    請求項２８に記載のポリペプチド。
  30. 請求項２８に定義されるＰ１、または態様２９に定義されるＰ２とペア形成したＰ１の多量体、あるいは複数の前記多量体であって、場合により、前記多量体が、請求項１～２４のいずれか１項に記載されたものである、多量体または複数の多量体。
  31. 請求項２７～２９のいずれか１項に記載の操作されたポリペプチドまたは単量体をコードする核酸であって、場合により、前記核酸が、前記ポリペプチドを発現するための発現ベクターによって構成されている、核酸。
  32. 請求項１～２４のいずれか１項に記載の多量体、四量体、八量体、操作されたポリペプチドまたは単量体の細胞内および／または分泌発現のための、請求項３１に記載の核酸またはベクターを含む真核宿主細胞。
  33. 細胞内に発現および／または分泌された多量体を製造するためのタンパク質多量体の製造方法における請求項３１に記載の核酸またはベクターの使用であって、前記方法が、前記核酸またはベクターを含む真核細胞中で前記多量体を発現させることおよび／または前記真核細胞から前記多量体を分泌させることを含む、使用。
  34. 請求項３１に記載の核酸またはベクターを含む真核細胞においてグリコシル化された多量体を製造するためのタンパク質多量体の製造方法における、前記核酸またはベクターの使用。
  35. （ｉ）請求項２７～２９のいずれか１項に記載の操作されたポリペプチドをコードする真核細胞株、および（ｉｉ）請求項１～２４のいずれか１項に定義される多量体、四量体または八量体を含む、混合物。
  36. 前記細胞株が、前記細胞の分泌産物を含む培地中にあり、前記分泌産物が、前記多量体、四量体または八量体を含む、請求項３５に記載の混合物。
  37. 医療用途のための、請求項１～２４のいずれか１項に記載の多量体、四量体または八量体。
  38. （ａ）真核細胞中で発現されるＴＣＲ Ｖ－ＮＨＲ２ ＴＤまたはＴＣＲ Ｖ－ｐ５３ ＴＤ融合タンパク質の可溶性および／または細胞内発現を含み、場合により、複数の前記多量体を単離することを含む、ＴＣＲ Ｖドメイン多量体を製造する方法、
    （ｂ）真核細胞中で発現される抗体Ｖ－ＮＨＲ２ ＴＤまたはＶ－ｐ５３ ＴＤ融合タンパク質の可溶性および／または細胞内発現を含み、場合により、複数の前記多量体を単離することを含む、抗体Ｖドメイン多量体を製造する方法、
    （ｃ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞などの真核細胞中で発現されるインクレチンペプチド－ＮＨＲ２ ＴＤまたはインクレチンペプチド－ｐ５３ ＴＤ融合タンパク質の可溶性および／または細胞内発現を含み、場合により、複数の前記多量体を単離することを含む、インクレチンペプチド多量体を製造する方法、または
    （ｄ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞などの真核細胞中で発現されるペプチドホルモン－ＮＨＲ２ ＴＤまたはペプチドホルモン－ｐ５３ ＴＤ融合タンパク質の可溶性および／または細胞内発現を含み、場合により、複数の前記多量体を単離することを含む、ペプチドホルモン多量体を製造する方法。
  39. 単量体および／または二量体ポリペプチドより高い収率で四量体を製造するための、ポリペプチドの四量体の製造方法における自己会合性四量体化ドメイン（ＴＤ）の使用。
  40. 単量体および／または二量体ポリペプチドより高い収率で四量体を製造するための、タンパク質ドメインまたはペプチドの複数のコピーを含むポリペプチドの四量体の製造方法における操作されたポリペプチドの使用であって、前記操作されたポリペプチドが、前記タンパク質ドメインまたはペプチドの１つまたは複数のコピーを含み、かつ自己会合性四量体化ドメイン（ＴＤ）をさらに含む、使用。
  41. 単量体、二量体または三量体との混合状態ではない複数の四量体を製造するための、ポリペプチドの四量体の製造方法における自己会合性四量体化ドメイン（ＴＤ）の使用。
  42. 単量体、二量体または三量体との混合状態ではない複数の四量体を製造するための、タンパク質ドメインまたはペプチドの複数のコピーを含むポリペプチドの四量体の製造方法における操作されたポリペプチドの使用であって、前記操作されたポリペプチドが、前記タンパク質ドメインまたはペプチドの１つまたは複数のコピーを含み、かつ自己会合性四量体化ドメイン（ＴＤ）をさらに含む、使用。
  43. 四量体の前記収率が、単量体および／または二量体の前記収率の少なくとも１０倍である、請求項３９～４２のいずれか１項に記載の使用。
  44. 前記方法において製造される四量体：製造される単量体および／または二量体の比が、少なくとも９０：１０である、請求項３９～４３のいずれか１項に記載の使用。
  45. 各単量体が、４０ｋＤａ以下の大きさを有する、請求項３９～４４のいずれか１項に記載の使用。
  46. 各四量体が、１５０ｋＤａ以下の大きさを有する、請求項３９～４５のいずれか１項に記載の使用。
  47. 前記方法が、真核細胞株から前記四量体を発現させることを含む、請求項３９～４６のいずれか１項に記載の使用。
  48. （ａ）ＴＣＲ細胞外ドメイン、
    （ｂ）免疫グロブリン定常ドメイン、および
    （ｃ）ＥＴＯのＮＨＲ２多量体化ドメイン
    を含む、ｐＭＨＣ複合体に結合できる多価ヘテロ二量体可溶性Ｔ細胞受容体。
  49. （ｉ）免疫グロブリン可変ドメイン、および
    （ｉｉ）ＥＴＯのＮＨＲ２多量体化ドメイン
    を含む、多量体免疫グロブリン。
  50. 可溶性の多量体ポリペプチドに集合させる方法であって、
    （ａ）ＥＴＯのＮＨＲ２ドメインに融合した、前記多量体ポリペプチドの単量体を提供すること、および
    （ｂ）前記単量体の複数のコピーを会合させ、それによって多量体の可溶性ポリペプチドを得ること
    を含む、方法。
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