JP2022553330A

JP2022553330A - 自己免疫疾患を処置するためのｍｂｖの使用

Info

Publication number: JP2022553330A
Application number: JP2022523596A
Authority: JP
Inventors: スティーブンバディラク，; ジョージエス．ハッシー，; ラファエルクラム，
Original assignee: University of Pittsburgh
Current assignee: University of Pittsburgh
Priority date: 2019-10-23
Filing date: 2020-10-22
Publication date: 2022-12-22
Also published as: KR20220087483A; AU2020370289A9; EP4054606A4; WO2021081231A1; US20240131075A1; CN114615987A; CA3157369A1; EP4054606A1; AU2020370289A1

Abstract

必要な対象における自己免疫障害を処置するための方法が開示される。これらの方法は、対象に、細胞外マトリックス由来の単離されたマトリックス結合型小胞（ＭＢＶ）を含む医薬調製物を投与するステップを含む。投与は、全身的であり得る。一部の実施形態では、対象は、関節リウマチまたは乾癬を有する。本発明は、例えば、必要な対象における自己免疫障害を処置する方法であって、前記対象に、細胞外マトリックス由来の単離されたマトリックス結合型小胞（ＭＢＶ）の治療有効量を含む医薬調製物を全身投与によって投与するステップを含み、それにより、前記自己免疫障害が処置される、方法を提供する。

Description

関連出願への相互参照
本願は、参照により組み込まれる、２０１９年１０月２３日出願の米国出願第６２／９２５，１２９号に基づく利益を主張している。

分野
本発明は、自己免疫障害を処置するためのマトリックス結合型小胞（ＭＢＶ）の投与に関する。

背景
自己免疫状態、例えば、とりわけ、関節リウマチ、乾癬、ループス、多発性硬化症などの処置における大きな課題は、感染性病原体に対する宿主防御免疫応答を保持しつつ、自己免疫の原因となる免疫応答を選択的にモジュレートすることである。これまでのところ、現在使用されている免疫抑制治療の発生頻度が最も高い副作用は、感染症および悪性腫瘍のリスク増加である。したがって、これらの状態を処置するための他の治療剤が依然として必要とされている。

要旨
必要な対象における自己免疫障害を処置するための方法であって、対象に、細胞外マトリックス由来の単離されたマトリックス結合型ナノ小胞（ＭＢＶ）の治療有効量を含む医薬調製物を投与するステップを含み、それにより、自己免疫障害が処置される、方法が、開示される。一部の非限定的な例では、投与は、全身的である。他の非限定的な例では、障害は、関節リウマチである。さらなる非限定的な例では、障害は、乾癬、ループス、天疱瘡、類天疱瘡、または多発性硬化症である。方法は、これらの処置対象を選択するステップを含み得る。

本発明の上述のおよび他の目的、特色および利点は、添付の図面を参照して進む後続の詳細な説明からより明らかになる。

図１Ａ～１Ｇは、液相細胞外小胞（ＥＶ）およびマトリックス結合型ナノ小胞（ＭＢＶ）の形態的特徴付けを示す。図１Ａは、直径およそ１００ｎｍの個別の球体がマトリックス全体にわたって分散されている、膀胱マトリックス（ＵＢＭ）由来のＥＣＭ足場の走査型電子顕微鏡画像を示す。スケールバー＝１μｍ。図１Ｂは、液相（ＥＶ）または固相細胞外区画（ＭＢＶ）から小胞を選択的に回収するために使用された３Ｔ３線維芽細胞培養モデルの説明図を示す。図１Ｃは、脱細胞化後の細胞の非存在およびインタクトな細胞核の非存在を実証する、位相差顕微鏡検査、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色、および４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）染色を示す。図１Ｄは、３Ｔ３線維芽細胞培養モデルから単離された液相ＥＶおよびＭＢＶの透過型電子顕微鏡画像を示す。スケールバー＝１００ｎｍ。図１Ｅは、３Ｔ３線維芽細胞培養物から単離された液相ＥＶおよびＭＢＶのナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）からのサイズ分布プロットを示す。図１Ｆは、液相ＥＶおよびＭＢＶにおけるＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１およびＨｓｐ７０発現レベルを比較する免疫ブロット分析を示す。図１Ｇは、液相ＥＶおよびＭＢＶにおける電気泳動分離タンパク質の銀染色分析を示す。同上。同上。図２Ａ～２Ｅは、ＥＶとＭＢＶ間のｍｉＲＮＡカーゴの差異を示す。図２Ａは、３Ｔ３親細胞から単離された全ＲＮＡ、それらの分泌された液相ＥＶ、およびそれらのＭＢＶの、バイオアナライザー分析を示す。図２Ｂは、液相ＥＶ（緑色）、ＭＢＶ（青色）および細胞（赤色）ＲＮＡ－ｓｅｑデータセットを比較する主成分分析（ＰＣＡ）を示す。図２Ｃは、液相ＥＶ、ＭＢＶおよび親細胞におけるｍｉＲＮＡの差次的発現を実証するボルケーノプロットを示す。組み入れ基準は、Ｐ値＜０．０５で、両方向でのｌｏｇ_２の２倍の差（変化倍数）であった。各ドットは、特異的ｍｉＲＮＡ転写物を表し、縦破線の右側（かつ横破線の上）の緑色のドットは、発現レベルの相対的上昇に対応し、左側（かつ横破線の上）の赤色のドットは、発現レベルの相対的低下に対応する。青色のドット（横破線の下に出現する）は、発現レベルに有意な変化がないｍｉＲＮＡを示す。図２Ｄは、ｍｉＲＮＡシークエンシングの結果のＲＴ－ｑＰＣＲによる検証を示す、^＊ｐ＜０．０５、ｎ＝４。図２Ｅは、ＩｎｇｅｎｕｉｔｙＰａｔｈｗａｙＡｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ機能分析）を示す。ＩＰＡ機能分析により同定された有意に高められた分子機能は、ＭＢＶ（赤色－下のバー）および液相ＥＶ（青色－上のバー）において差次的に発現されたｍｉＲＮＡを考慮して決定された。細胞成長および増殖、細胞形態、細胞間シグナル伝達、および組織発達については赤色バーがなく、消化器系発達および機能、肝臓系発達および機能ならびに臓器発達および機能については青色バーがない。同上。同上。同上。図３Ａ～３Ｈは、ＭＢＶの細胞起源に基づくＭＢＶのｍｉＲＮＡカーゴの差異を示す。図３Ａは、細胞の非存在を示す、脱細胞化ＢＭＳＣ細胞培養プレートの位相差顕微鏡画像を示す。図３Ｂは、脱細胞化ＢＭＳＣ培養プレートから単離されたＭＢＶの透過型電子顕微鏡画像を示す。スケールバー＝１００ｎｍ。図３Ｃ～図３Ｅは、ＢＭＳＣ（図３Ｃ）、ＡＳＣ（図３Ｄ）およびＵＣＳＣ（図３Ｅ）脱細胞化培養プレートから単離されたＭＢＶのナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）からのサイズ分布プロットを示す。図３Ｆは、ＢＭＳＣ、ＡＳＣおよびＵＣＳＣ由来ＭＢＶから単離された全ＲＮＡのバイオアナライザー分析を示す。図３Ｇは、ＢＭＳＣＭＢＶ（緑色；中央左側）、ＵＣＳＣＭＢＶ（青色；右上）およびＡＳＣＭＢＶ（赤色；右下）ＲＮＡ－ｓｅｑデータセットを比較する主成分分析（ＰＣＡ）を示す。図３Ｈは、ＢＭＳＣ、ＡＳＣおよびＵＣＳＣ由来ＭＢＶにおけるｍｉＲＮＡの差次的発現を実証するボルケーノプロットを示す。組み入れ基準は、Ｐ値＜０．０５で、両方向でのｌｏｇ_２の２倍の差（変化倍数）であった。各ドットは、特異的ｍｉＲＮＡ転写物を表し、縦破線の右側（かつ横破線の上）の緑色のドットは、発現レベルの相対的上昇に対応し、左側（かつ横破線の上）の赤色のドットは、発現レベルの相対的低下に対応する。青色のドット（横破線の下）は、発現レベルに有意な変化がないｍｉＲＮＡを示す。同上。同上。同上。図４Ａ～４Ｅは、ＭＢＶと液相ＥＶと親細胞の間のリン脂質のＬＣ／ＭＳによる特徴付けを示す。図４Ａは、ＭＢＶから得られたリン脂質の典型的な全イオンクロマトグラムを示す。図４Ｂは、ＭＢＶにおける主要なリン脂質クラスの質量スペクトルを示す。評価は、リン脂質の飽和（二重結合数＝０）、一価不飽和（二重結合数＝１）および多価不飽和（二重結合数＝２～１０）種の定量を含んだ。図４Ｃは、主要なリン脂質の全含有量を示す円グラフを示す。データは、全リン脂質の％として提示されている。図４Ｄおよび図４Ｅは、異なるリン脂質分子種の含有量を示す。データは、Ｚスコアに自動スケーリングされ、青色（低い値）から赤色（高い値）をコードした、ヒートマップとして提示されている。略語は、ＥＶ、エキソソーム小胞；ＭＢＶ、マトリックス結合型小胞；ＰＣ、ホスファチジルコリン；ＰＣｄ、ＰＣジアシル種；ＰＣｐ、ＰＣプラズマローゲン；ＰＥ、ホスファチジルエタノールアミン；ＰＥｄ、ＰＥジアシル種；ＰＥｐ、ＰＥプラズマローゲン；ＰＩ、ホスファチジルイノシトール；ＰＳ、ホスファチジルセリン；ＢＭＰ、ビス－モノアシルグリセロホスフェート；ＰＡ、ホスファチジン酸；ＰＧ、ホスファチジルグリセロール；およびＳＭ、スフィンゴミエリンである。同上。同上。同上。図５Ａ～５Ｄは、ＭＢＶと液相ＥＶと親細胞の間のＬＰＥ、ＬＰＡおよびＬＰＧの差異を調査するＬＣ／ＭＳ特徴付けおよび追跡調査分析を示す。図５Ａは、ＭＢＶから得られた主要なリゾリン脂質の典型的な質量スペクトルを示す。図５Ｂは、主要なリゾリン脂質の全含有量を示す円グラフを示す。データは、全リゾリン脂質の％として提示されている。図５Ｃおよび図５Ｄは、リゾリン脂質分子種の含有量を示す。データは、Ｚスコアに自動スケーリングされ、青色（低い値）から赤色（高い値）をコードした、ヒートマップとして提示されており、ｎ＝３である。略語は、ＥＶ、エキソソーム小胞；ＭＢＶ、マトリックス結合型小胞；ＬＰＣ、リゾホスファチジルコリン；ＬＰＥ、リゾホスファチジルエタノールアミン；ＬＰＩ、リゾホスファチジルイノシトール；ＬＰＳ、リゾホスファチジルセリン；ＬＰＡ、リゾホスファチジン酸；ＬＰＧ、リゾホスファチジルグリセロール；およびｍＣＬ、モノリゾカルジオリピンである。同上。図６Ａ～６Ｃは、ＰＵＦＡ含有リン脂質およびそれらの酸化的に修飾された分子種のレベルが液相ＥＶにおけるレベルと比較してＭＢＶにおけるほうが高いことを実証する。親細胞、液相ＥＶおよびＭＢＶにおける遊離ＰＵＦＡ（図６Ａ）およびそれらの酸素化代謝物（図６Ｂ）の含有量を評価した。データは、平均±ｓ．ｄ．、^＊ｐ＜０．０５として、および細胞またはＭＢＶと比較して、提示されており、ｎ＝３である。図６Ｃは、親細胞、液相ＥＶおよびＭＢＶにおける単一、二重および三重酸素化リン脂質種の含有量を示す。データは、Ｚスコアに自動スケーリングされ、青色（低い値）から赤色（高い値）をコードした、ヒートマップとして提示されている。略語は、ＥＶ、エキソソーム小胞；ＭＢＶ、マトリックス結合型小胞；ＰＬ、リン脂質；ＰＣ、ホスファチジルコリン；ＰＥ、ホスファチジルエタノールアミン；ＰＩ、ホスファチジルイノシトール；ＰＳ、ホスファチジルセリン；ＢＭＰ、ビス－モノアシルグリセロホスフェート；ＰＡ、ホスファチジン酸；ＰＧ、ホスファチジルグリセロール；およびＣＬ、カルジオリピンである。同上。図７は、ラット動物モデルにおける関節リウマチの処置のためのＭＢＶの投与経路を示す。図８Ａ～８Ｅは、プリスタンのみ、腹腔内（ＩＰ）メトトレキサート（ＭＴＸ）、関節周囲（ＰＡ）ＭＢＶ、または静脈内（ＩＶ）ＭＢＶで処置された対照および関節炎ラットモデルの個々の関節炎スコアを示す。図８Ａは、７日目の処置群にわたっての関節炎スコアを示し、図８Ｂは、１０日目の処置群にわたっての関節炎スコアを示し、図８Ｃは、１３日目の処置群にわたっての関節炎スコアを示し、図８Ｄは、１７日目の処置群にわたっての関節炎スコアを示し、図８Ｅは、２１日目の処置群にわたっての関節炎スコアを示す。同上。図９Ａは、プリスタンによって臨床的関節炎をフェノコピーするように誘導され、プリスタンのみ、ＩＰメトトレキサート、ＰＡＭＢＶ、またはＩＶＭＢＶで処置されたＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットの、複数の視点から撮影された写真を示す。図９Ｂは、疾患対照および関節周囲ＭＢＶ処置ラットの足のさらに接写した画像を示す。図１０は、プリスタンのみ、ＩＰメトトレキサート、ＰＡＭＢＶ、またはＩＶＭＢＶで処置された対照および関節炎ラットモデルにおける処置の最初の２１日間の平均関節炎スコアを示す。図１１Ａは、ＩＰメトトレキサート、ＰＡＭＢＶ、およびＩＶＭＢＶで処置された対照および関節炎ラットモデルの足が撮影されたデジタル画像を示す。図１１Ｂは、ＩＰメトトレキサート、ＰＡＭＢＶ、およびＩＶＭＢＶで処置された関節炎ラットモデルにおける処置の最初の７７日間の平均関節炎スコアを示す。図１２Ａ～１２Ｅは、ＭＢＶの局所および全身投与が、急性および慢性両方のプリスタン誘発関節炎の疾患重症度を有意に低下させることを示す。Ａ）実験計画および処置レジメン。Ｂ）０日目および１００日目の各群の前および後足の代表的な画像。前および後足の相当な浮腫、紅斑および歪みがプリスタン＋ＰＢＳ群では明らかであるが、残りの処置群には表在性の変化が見られない。Ｃ）腹腔内メトトレキサートは、プリスタン＋ＰＢＳと比較して、１０～２１日目の間および８４～１００日目の間の疾患スコアリングを有意に低下させる（ｐ＜．０５）。Ｄ）関節周囲ＭＢＶは、プリスタン＋ＰＢＳと比較して、１０～２１日目の間および７０～１００日目の間の疾患スコアリングを有意に低下させる（ｐ＜．０５）。Ｅ）静脈内ＭＢＶは、プリスタン＋ＰＢＳと比較して、１０～２１日目の間および７０～１００日目の間の疾患スコアリングを有意に低下させる（ｐ＜．０５）。パネルＣ～Ｅに表されている全ての値は、平均±ＳＥＭであり、７～２８日目についてはｎ＝８、および２８～１００日目についてはｎ＝４である。同上。図１３Ａ～１３Ｅは、マトリックス結合型ナノ小胞が慢性プリスタン誘発関節炎において滑膜炎、軟骨分解、およびプロテオグリカン喪失を低減することの証拠を提供する。Ａ）脛距（脛骨＝Ｔｉ、距骨＝Ｔａ）関節の代表的な１０×Ｈ＆Ｅおよび１０×トルイジンブルー画像、ならびに隣接滑膜（ｓｙｎ）の４０×Ｈ＆Ｅ画像。Ｂ）滑膜の４０×Ｈ＆Ｅ画像の調査の結果、ｉ．ｐ．ＭＴＸ、ｐ．ａ．ＭＢＶ、およびｉ．ｖ．ＭＢＶは全て、滑膜炎を有意に低減し、浸潤性免疫細胞の相対比率を有意に低下させた（ｐ＜．０５）。Ｃ）１０×トルイジンブルー画像の調査の結果、ｉ．ｐ．ＭＴＸ、ｐ．ａ．ＭＢＶ、およびｉ．ｖ．ＭＢＶは、プリスタン＋ＰＢＳと比較して軟骨損傷の重症度を低下させた。Ｄ）１０×Ｈ＆Ｅ画像の調査の結果、ｉ．ｐ．ＭＴＸ、ｐ．ａ．ＭＢＶ、およびｉ．ｖ．ＭＢＶは、プリスタン＋ＰＢＳと比較してプロテオグリカン喪失の重症度を低下させた。Ｅ）プリスタン＋Ｉ．ｐ．ＭＴＸ、＋ｐ．ａ．ＭＢＶ、および＋ｉ．ｖ．ＭＢＶは全て、プリスタン＋ＰＢＳと比較して累積病理組織学的スコアを有意に低下させた（ｐ＜．０５）。パネル１３Ｂ～１３Ｅにおける全ての値は、平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）を表す。同上。図１４Ａ～１４Ｃは、マトリックス結合型ナノ小胞が関節マクロファージ表現型をプリスタン誘発関節炎に見られるＭ１優位の表現型からＭ２優位の表現型へとモジュレートすることを立証する。Ａ）脛距関節に隣接する滑膜組織の代表的な２０×ＩＨＣ画像。４つのチャネルの複合画像が図示されており、個々のカラーチャネルも標的（核、ＣＤ６８、ＴＮＦアルファ、およびＣＤ２０６）ごとに図示されている。Ｂ）対照＋ＰＢＳと比較して、プリスタン＋ＰＢＳは、Ｍ２マクロファージ（ＣＤ２０６＋／ＣＤ６８＋）と比較したＭ１マクロファージ（ＴＮＦアルファ＋／ＣＤ６８＋）の比を有意に上昇させる（ｐ＜．０５）。３つ全ての処置群（ｉ．ｐ．ＭＴＸ、ｐ．ａ．ＭＢＶおよび、ｉ．ｖ．ＭＢＶ）が、滑膜組織におけるＭ１：Ｍ２マクロファージの比を有意に低下させる（ｐ＜．０５）。Ｃ）３つ全ての処置群において対照＋ＰＢＳおよびプリスタン＋ＰＢＳと比較してＭ２：Ｍ１マクロファージの比の上昇がある（ｐ＞．０５）。パネルＢおよびＣにおける全ての値は、平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）を表す。同上。図１５Ａ～１５Ｂは、マトリックス結合型ナノ小胞の全身および局所投与が慢性プリスタン誘発関節炎における有害な骨リモデリングを防止することをマイクロＣＴイメージングにより示すデジタル画像である。Ａ）１００日目の前足の代表的なマイクロＣＴ画像。相当な骨リモデリングおよび損傷が、プリスタン＋ＰＢＳ群では前足の近位骨全体にわたって見られる一方で、３つ全ての処置群は、骨の形態のわずかな変化または変化非存在を示す。Ｂ）１００日目の後足の代表的なマイクロＣＴ画像。相当な骨リモデリングおよび損傷が、プリスタン＋ＰＢＳ群では脛距関節に局在して見られる一方で、３つ全ての処置群は、骨の形態のわずかな変化または変化非存在を、特に脛距関節領域において示す。同上。図１６は、マトリックス結合型ナノ小胞でのイミキモド誘発マウス乾癬の処置を示すデジタル画像である。画像は、毛を剃られ、除毛され、ＩＭＱ（対照１）または石油ゼリー（対照２）のどちらかで処置されている背側の皮膚の画像である。ＭＢＶの全身投与は、イミキモド誘発乾癬において紅斑および落屑を低減する。加えて、ＭＢＶの全身投与は、イミキモド誘発乾癬において皮膚の厚さを低減する。図１７は、累積乾癬スコアリングの折れ線グラフである。乾癬面積重症度指数（ＰＡＳＩ）から導出した累積乾癬スコアリングを使用して疾患重症度をスコアリングした。ＭＢＶの（腹腔内投与による）全身投与は、皮膚炎症のＩＭＱ誘発乾癬モデルにおける累積乾癬スコアリングを実質的に低下させた。累積スコアリングは、改良臨床的乾癬面積重症度指数（ＰＡＳＩ）（最大スコア＝１２）に基づいた。紅斑および落屑を０～４の尺度で独立してスコアリングした：０、なし；１、軽度；２、中等度；３、顕著；および４、非常に顕著。両耳の厚さを、ノギスを使用して測定し、ベースラインからの変化パーセンテージを皮膚の厚さの指標として算出した。ＭＢＶの全身投与は、イミキモド誘発乾癬と比較して総合疾患スコアを低下させる。図１８は、ＭＢＶ後のキーホールリンペットヘモシアニンＩｇＭアッセイからの結果の棒グラフである。ＫＬＨでの免疫化前のＭＢＶの全身投与は、ＫＬＨ抗原に対する正常なＩｇＭ抗体の応答を開始する宿主動物の能力に影響を及ぼさない。公知の免疫抑制剤である、シクロホスファミドは、ビヒクル＋ＫＬＨ対照と比較して７、１４および２１日目の抗ＫＬＨＩｇＭレベルを有意に低下させる。ビヒクル＋ＫＬＨ対照動物とＭＢＶ処置動物の間に産生されるＩｇＭのレベルの有意な差はない。これらの結果は、ＭＢＶの全身投与が生理的な抗体免疫応答を抑制しないことを実証する。図１９は、ＭＢＶ後のキーホールリンペットヘモシアニンＩｇＧアッセイからの結果である図８の棒グラフである。ＫＬＨでの免疫化前のＭＢＶの全身投与は、ＫＬＨ抗原に対する正常なＩｇＧ抗体の応答を開始する宿主動物の能力に影響を及ぼさない。公知の免疫抑制剤である、シクロホスファミドは、ビヒクル＋ＫＬＨ対照と比較して７、１４および２１日目の抗ＫＬＨＩｇＧレベルを有意に低下させる。ビヒクル＋ＫＬＨ対照動物とＭＢＶ処置動物の間に産生されるＩｇＧのレベルの有意な差はない。これらの結果は、ＭＢＶの全身投与が生理的な抗体免疫応答を抑制しないことを実証する。

配列表
添付の配列表に収載されている核酸配列およびアミノ酸配列は、アメリカ合衆国特許規則連邦規則法典第３７巻§１．８２２に定義のヌクレオチド塩基についての標準文字略号およびアミノ酸についての３文字コードを使用して示されている。各核酸配列の一方の鎖のみが示されているが、示されている鎖へのいずれの言及にも相補鎖が含まれると理解されたい。配列表は、ＡＳＣＩＩテキストファイル［Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ、２０２０年１０月２２日、１．０９７バイト］として提出されており、参照により本明細書に組み込まれる。

詳細な説明
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）で構成されている生物学的足場が外科用メッシュ材料として開発されており、それらは、とりわけ腹壁ヘルニアの修復（Alicuban et al., Hernia. 2014;18(5):705-712）、骨格筋の再構成（Mase et al., Orthopedics. 2010;33(7):511）、食道再建（Badylak et al., Tissue Eng Part A. 2011; 17(11-12):1643-50）、硬膜置換（Bejjani et al., J Neurosurg. 2007;106(6):1028-1033）、腱修復（Longo et al., Stem Cells Int. 2012;2012:517165）、乳房再建（Salzber, Ann Plast Surg. 2006;57(1):1-5）を含めた臨床的適用に使用される（Badylak et al., Acta Biomater. 2009;5(1):1-13）。

マトリックス結合型ナノ小胞（ＭＢＶ）は、ＥＣＭの線維状ネットワークに埋め込まれている。これらのナノ粒子は、それらのカーゴをＥＣＭ足場製造プロセス中の分解および変性から遮蔽する。

エキソソームは、以前に体液および細胞培養上清中でほぼ排他的に同定された小胞である。ＭＢＶとエキソソームは別個であることが実証されている。ＭＢＶは、例えば、界面活性剤および／または酵素による消化に対して抵抗性であり、特有の脂質プロファイルを有し、異なるマイクロＲＮＡのクラスターを含有するので、他の小胞とは異なる。ＭＢＶは、エキソソームなどの他の小胞に見られるのと同じ特徴的な表面タンパク質を有さない。

本明細書に開示される通り、ＭＢＶは、全身性の治癒応答を（例えば、全身投与により）モジュレートして、例えば、生体機能を保存するまたは回復させる。例えば、ＭＢＶの投与は、免疫応答を保存するまたは回復させるためのもの、例えば、自己免疫障害（例えば、関節リウマチ、強皮症、潰瘍性大腸炎、天疱瘡、類天疱瘡、クローン病、乾癬、乾癬性関節炎、硬化症、または全身性エリテマトーデスなど）を処置するためのものなどであり得る。

用語
以下の用語および方法の説明は、本開示をよりよく記載するため、および本開示の実施に関して当業者をガイドするために提示する。「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」という単数形は、文脈により明確に別段の規定がなされない限り、１つまたは１つより多くを指す。例えば、「１つの（ａ）細胞を含む」という用語は、単一の対象または複数の対象を含み、「少なくとも１つの対象を含む」という句と等価であるとみなされる。「または（ｏｒ）」という用語は、文脈によりそうでないことが明白に示されない限り、示されている要素の選択肢のうちの単一の要素、または２つもしくはそれよりも多くの要素の組合せを指す。本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」を意味する。したがって、「ＡまたはＢを含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇＡｏｒＢ）」は、追加的な要素を排除することなく、「Ａ、Ｂ、またはＡとＢを含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇＡ，Ｂ，ｏｒＡａｎｄＢ）」を意味する。本明細書で言及されるＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受託番号の日付は、少なくとも早ければ２０１５年９月１６日に入手可能な配列である。本明細書において引用されている参考文献、特許出願および刊行物、ならびにＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受託番号は全て参照により組み込まれる。そうでないことが示されない限り、「約」は、５パーセント以内を示す。本開示の種々の実施形態の精査を容易にするために、以下の特定の用語の説明を提示する。

投与：組成物（例えば、ＭＢＶ、またはＭＢＶを含む医薬調製物など）の対象への選択された経路による導入。経路は、局所的であることもあり、または全身であることもある。例えば、選択された経路が静脈内である場合、組成物は、組成物を対象の静脈に導入することにより投与される。選択された経路が局所的である場合、組成物は、組成物を対象の組織に直接導入することにより投与され得る。

動物：例えば、哺乳動物および鳥類を含むカテゴリーである、生きている多細胞脊椎動物生物体。哺乳動物という用語は、ヒトおよび非ヒト哺乳動物のどちらも含む。同様に、「対象」という用語は、ヒトおよび動物対象のどちらも含む。

関節炎：関節炎は、体内の１つまたは複数の関節の滑膜を冒す疾患である。関節炎は、最も一般的な種類の関節疾患であり、関節の炎症を特徴とする。この疾患は、通常は少数関節型である（少数の関節を冒す）が、全身型であることもある。一般に罹患する関節としては、股関節、膝、下部腰椎および頸椎、指の近位および遠位指節間関節、第１手根中手関節、ならびに第１足根中足関節が挙げられる。症状としては、罹患関節の、関節痛および硬直、発赤、温感、腫脹、ならびに可動域減少が挙げられる。一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法を使用して、関節炎を処置することができる。

１つの種類の関節炎は、関節リウマチである。関節リウマチは、体内の複数の関節の滑膜を冒す慢性全身性自己免疫疾患である。この疾患は全身性であるため、この疾患には多くの関節外症状がある。例えば、ニューロパチー、強膜炎、リンパ節腫大、心膜炎、脾腫、関節炎、およびリウマトイド結節は、この疾患の頻出要素である。関節リウマチの大部分の症例では、対象は、症状の寛解および増悪（「フレアまたは再燃」とも称される）を有する。関節リウマチは、後天性である自己免疫疾患とみなされ、この自己免疫疾患には遺伝的要因が関与するようである。一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法を使用して、関節リウマチを処置することができる。

別の種類の関節炎は、血清反応陰性脊椎関節症である乾癬性関節炎であり、これは、乾癬に冒されている人々に起こる長期型の自己免疫関節炎である。乾癬性関節炎は、ソーセージのような外観を有する手指および足指全体の腫脹として現れ、爪に対する変化（例えば、爪の小さな陥没、爪の肥厚、および爪床からの爪の剥離）、乾癬と一致する皮膚の変化（例えば、乾癬性関節炎の開始前に高い頻度で生じる赤い、うろこ状の、かゆい局面など）を伴うことがある。乾癬性関節炎は、乾癬を有する人々の最大３０％を冒し、小児にも成人にも起こる。種々の種類の乾癬性関節炎、例えば、少数関節型、多関節型、破壊性関節炎、破壊性関節炎、脊椎関節炎、および遠位指節間関節炎などが、含まれる。処置は、ＮＳＡＩＤ（例えば、イブプロフェン、ナプロキセン、ジクロフェナク、インドメタシン、およびエトドラクなど）、疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ、例えば、メトトレキサート、レフルノミド、シクロスポリン、アザチオプリン、およびスルファサラジンなど）、生物反応修飾物質（例えば、インフリキシマブ、エタネルセプト、ゴリムマブ、セルトリズマブペゴルおよびアダリムマブを含めたＴＮＦ－α阻害剤；ＩＬ－１２／ＩＬ－２３阻害剤ウステキヌマブ；ならびにＪａｋ阻害剤トファシチニブ（tocifitinib）、またはＸＥＬＪＡＮＺ（登録商標）など）、ホスホジエステラーゼ－４阻害剤（例えば、アプレミラスト）、低レベルレーザー治療、レチノイドエトレチナート、メトキシソラレンおよび長波長紫外線光線（ＰＵＶＡ）での光化学治療、コルチコステロイドの関節注射、ならびに整形外科手術（例えば、関節置換術など）を含み得る。一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法を使用して、乾癬性関節炎を処置することができる。

自己免疫障害：自己免疫障害は、人の免疫系が、内在性抗原に対する不適切な応答（例えば、Ｂ細胞またはＴ細胞応答）を引き起こし、結果としてそれ自体の細胞、組織および／または臓器を傷つけ、炎症および損傷に至る、広範な関連疾患を含む。８０を超える異なる自己免疫疾患がある。傷害は、シェーグレン病のような、ある特定の臓器または組織に限局されることもあり、または乾癬のような、全身性であることもある。症状は、自己免疫疾患の種類によって異なり得るが、よく見られる症状としては、疲労、筋肉痛、腫脹および発赤、軽度の発熱、集中困難、手足のしびれおよび刺痛、毛髪脱落、ならびに発疹が挙げられる。自己免疫障害の検査は、同様に種類によって異なるが、典型的な検査としては、抗核抗体検査（ＡＮＡ）、およびある特定の障害の種類の場合に産生される特異的自己抗体についての検査、ならびに身体の炎症についての検査が挙げられる。

一部の例では、自己免疫疾患は、アジソン病、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性肝炎、自己免疫性脳炎、セリアック病、クローン病、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、免疫性血小板減少症、ＩｇＡ腎症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、多発性硬化症、重症筋無力症、類天疱瘡、天疱瘡、多腺性自己免疫性症候群２型、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、強皮症、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、高安動脈炎（Takayasu's arteriosis）、１型糖尿病、潰瘍性大腸炎、または未分化結合組織病（ＵＣＴＤ）を含む。

自己免疫疾患のための様々な処置を投与することができる。一部の例では、抗炎症薬および／または免疫抑制薬を投与することができる。

生体適合性：哺乳動物対象に埋め込まれた場合に対象において有害な応答を惹起しない任意の材料。生体適合性材料は、個体に導入されるとその意図された機能を果たすことができ、その個体に対して毒性でも傷害性でもなく、対象において材料に対する免疫学的拒絶を誘導することもない。

自己免疫性脳炎：自己免疫疾患に起因する、様々な重症度がある脳の炎症。症状としては、頭痛、発熱、錯乱、肩こりおよび嘔吐を挙げることができ、併発症としては、てんかん発作、幻覚、発話困難、記憶障害および聴覚障害を挙げることができる。抗体媒介性抗Ｎ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸受容体脳炎（抗ＮＭＤＡ受容体脳炎、これは、卵巣奇形腫を伴うことがあり、主に１８～４５歳の女性を冒す）およびラスムッセン脳炎などの、様々な種類の自己免疫性脳炎が、含まれる。全身性エリテマトーデス、橋本脳症、自己免疫性辺縁系脳炎およびシデナム舞踏病などの、他の自己免疫疾患が、自己免疫性脳炎の原因となることもある。一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法を使用して、自己免疫性脳炎を処置することができる。

富化：混合物中に存在するナノ小胞などの目的の成分の量のその混合物中の他の望ましくない成分の量に対する比率が富化プロセス後に富化プロセス前と比較して高くなるプロセス。

細胞外マトリックス（ＥＣＭ）：これだけに限定されないが、組織内の細胞を囲み、支持し、また、別段の指定のない限り無細胞性である、構造タンパク質、特殊タンパク質、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、および成長因子を含めた、構造的かつ機能的な生体分子および／または生体高分子の複雑な混合物。ＥＣＭ調製物は「脱細胞化された」または「無細胞性」であるとみなすことができ、細胞が、本明細書に記載されており、当技術分野で公知のプロセスによって供給源組織から取り出されたものであることを意味する。「ＥＣＭ由来ナノ小胞」、「マトリックス結合型ナノ小胞」、「ＭＢＶ」または「ＥＣＭに由来するナノ小胞」などの「ＥＣＭ由来材料」とは、天然のＥＣＭから調製されたか、またはＥＣＭが培養細胞によって産生されるｉｎｖｉｔｒｏ供給源から調製されたナノ小胞である。ＥＣＭ由来ナノ小胞は下で定義されている。

再燃またはフレア：自己免疫障害などの、疾患または障害の増悪。再燃は、しばらくの間存在した疾患または障害の症状が突然悪化したときに起こる。例えば、再燃の場合、疾患または疾患症状の重症度が一時的に悪化するが、最終的には弱まるかまたは軽減する。例えば、自己免疫障害の場合、自己免疫障害の炎症または他の徴候もしくは症状は、再燃中に悪化し得る。

炎症性腸疾患（ＩＢＤ）：原因不明の慢性、再発性腸炎を特徴とする自己免疫疾患。ＩＢＤを有する患者では、腸の内壁の潰瘍および炎症が腹痛、下痢および直腸出血の症状を引き起こす。クローン病（ＣＤ）および潰瘍性大腸炎（ＵＣ）という２つの主な種類のＩＢＤがあり、これらの両方の疾患は、腸上皮細胞に対する自己抗体により媒介される腸内の炎症反応の無制限の活性化に起因するようである。

ＣＤとＵＣの間の主な差異は、炎症性変化の位置および性質である。ＣＤは、口から肛門までの消化管の任意の部分を冒すこと（飛び石病変）があるが、症例の大多数は、回腸終端部で始まる。対照的に、潰瘍性大腸炎は、結腸および直腸に限定される。最もよく見られるＩＢＤの症状は、発熱、嘔吐、下痢、血便（ｂｌｏｏｄｙｓｔｏｏｌ）（血便（ｈｅｍａｔｏｃｈｅｚｉａ））、腹痛および体重減少を含むが、多数の他の問題も含み得る。症状の重症度は、ＩＢＤに罹患している患者の生活の質を損なわせ得る。ほとんどの患者にとって、ＩＢＤは、症状が数カ月から数年にわたって続く慢性状態である。それは、若年成人に最も多く見られるが、あらゆる年齢で起こり得る。ＩＢＤは、ユダヤ系の人々に特によく見られ、発生率にも民族による差がある。

ＩＢＤの診断は、臨床症状またはバリウム注腸の使用に基づき得るが、直接可視化（Ｓ状結腸鏡検査または結腸内視鏡検査）が最も正確な検査である。長引くＩＢＤは、結腸がんのリスク因子であり、ＩＢＤの処置は、医薬および外科手術を含み得る。

ＵＣを有する一部の患者は、直腸の疾患（直腸炎）しか有さない。ＵＣを有する他の者は、直腸および隣接する左側結腸に限局された疾患（直腸Ｓ状結腸炎）を有する。さらに他の者は、結腸全体のＵＣ（遍在するＩＢＤ）を有する。ＵＣの症状は、一般に、疾患が広範囲に及ぶほど（疾患に罹患する結腸の部分が大きいほど）重症度が高い。直腸に限局された疾患（直腸炎）または左側結腸の末端に限局されたＵＣ（直腸Ｓ状結腸炎）を有する患者の予後は、全結腸ＵＣのものより良好である。疾患がより広範囲に及んでいる患者では、炎症している腸からの失血は、貧血を引き起こすことがあり、鉄分補充保健薬またはさらには輸血での処置を必要とすることがある。

めったにないことだが、結腸は、炎症が非常に重度になると急性的に拡張してサイズが大きくなることがある。この状態は、中毒性巨大結腸と称される。中毒性巨大結腸を有する患者は、発熱、腹痛および腹部膨張、脱水症ならびに栄養障害のため病状が極めて重い。患者が医薬によって急速に軽快しない限り、通常は、結腸破裂を防止するために外科手術が必要である。

ＣＤは、消化管の全ての領域で起こり得る。この疾患に伴って、炎症および線維症に起因する腸閉塞が、多数の患者で起こる。肉芽腫および瘻孔形成は、ＣＤについての発生頻度の高い併発症である。疾患進行の結果は、静脈内栄養補給、外科手術、および結腸人工肛門造設術を含む。

ＩＢＤの寛解を、多くの方法で測定することができる。臨床的寛解は、疾患の症状の欠如を指す。組織学的および内視鏡的寛解は、内視鏡手順中に除去された生検腸組織の炎症の非存在を指す。

単離された：「単離された」生物学的成分（例えば、核酸、タンパク質、細胞、またはナノ小胞など）は、生物体の細胞内またはＥＣＭ内の、天然に存在する成分である他の生物学的成分から実質的に分離または精製されている。「単離された」核酸およびタンパク質は、標準的な精製方法により精製された核酸およびタンパク質を含む。単離されたＭＢＶは、ＥＣＭの線維状物質から取り出されている。この用語は、宿主細胞において組換え発現により調製された核酸およびタンパク質、ならびに化学合成された核酸も包含する。

リシルオキシダーゼ（Ｌｏｘ）：コラーゲンおよびエラスチン前駆体のリシン残基からのアルデヒドの形成を触媒する銅依存性酵素。これらのアルデヒドは、高度に反応性であり、他のリシルオキシダーゼ由来アルデヒド残基と、または修飾されていないリシン残基との自発的な化学反応を受ける。ｉｎｖｉｖｏでは、これにより、コラーゲンおよびエラスチンの架橋結合がもたらされ、これは、コラーゲン原線維の安定化において、ならびに成熟エラスチンの完全性および弾性に関して役割を果たす。構造が異なる複雑な架橋結合がコラーゲンにおいて（３つのリシン残基に由来するピリジノリン）およびエラスチンにおいて（４つのリシン残基に由来するデスモシン）形成される。Ｌｏｘ酵素をコードする遺伝子が種々の生物体からクローニングされている（Ｈａｍａｌａｉｎｅｎｅｔａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ１１：５０８，１９９１；Ｔｒａｃｋｍａｎｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２９：４８６３，１９９０；参照により本明細書に組み込まれる）。ヒトリシルオキシダーゼの配列の残基１５３～４１７および残基２０１～４１７は、触媒機能のために重要であることが示されている。ＬｏｘＬ１、ＬｏｘＬ２、ＬｏｘＬ３およびＬｏｘＬ４と称される４つのＬｏｘ様アイソフォームがある。

マクロファージ：細胞デブリ、外来物質、微生物、およびがん細胞を貪食し、分解する、白血球の一種。これらの細胞は、ファゴサイトーシスにおけるそれらの役割に加えて、発達、組織の維持および修復において、ならびに、リンパ球などの免疫細胞を含めた他の細胞を動員し、それらに影響を及ぼすという点で、自然免疫および適応免疫の両方において重要な役割を果たす。マクロファージは、Ｍ１およびＭ２と称されている表現型を含めた多くの表現型で存在し得る。主に炎症促進性機能を果たすマクロファージは、Ｍ１マクロファージ（ＣＤ８６^＋／ＣＤ６８^＋）と称され、一方、炎症を低減し、また、組織修復を刺激し、調節するマクロファージは、Ｍ２マクロファージ（ＣＤ２０６^＋／ＣＤ６８^＋）と称される。マクロファージの種々の表現型を同定するマーカーは、種間で様々である。マクロファージ表現型は、Ｍ１およびＭ２の両極端の間にわたる一連のものによって表されることに留意するべきである。Ｆ４／８０（接着Ｇタンパク質共役型受容体Ｅ１（ＡＤＧＲＥ１）遺伝子によってコードされる）は、マクロファージマーカーである。どちらも参照により本明細書に組み込まれるＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受託番号ＮＰ＿００１２４３１８１．１、２０１８年４月６日およびＮＰ＿００１９６５、２０１８年３月５日を参照されたい。ＭＢＶは、マクロファージの表現型をモジュレートする能力があり、したがって、Ｍ２様、調節性またはリモデリング促進性マクロファージの増加をもたらすと考えられる。したがって、ＭＢＶを使用して、対象においてマクロファージのＭ２表現型を誘導することおよびＭ１マクロファージを阻害することができる。

マイクロＲＮＡ：一般には標的ｍＲＮＡの翻訳を抑止することによって遺伝子発現を転写後調節する約１７～約２５ヌクレオチド塩基長の小さな非コードＲＮＡ。ｍｉＲＮＡは、負の調節因子として機能し得、したがって、特定のｍｉＲＮＡの量が多いことは標的遺伝子発現のレベルが低いことと相関する。ｍｉＲＮＡには、一次ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）、未熟ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）、および成熟ｍｉＲＮＡという３つの形態が存在する。一次ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）は、約数百塩基から１ｋｂを超えるまでのステムループ構造化された転写物として発現される。ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ転写物は、核において、ステムループの基部付近のステムの両鎖を切断するドローシャと称されるＲＮａｓｅＩＩエンドヌクレアーゼによって切断される。ドローシャは、ＲＮＡ２重鎖を互い違いに切断し、５’リン酸および３’末端の２ヌクレオチド突出を残す。切断産物である未熟ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）は、約６０～約１１０ヌクレオチド長であり、フォールドバック様式で形成されたヘアピン構造を有する。ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡはＲａｎ－ＧＴＰおよびエクスポーチン－５によって核から細胞質に輸送される。ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは細胞質においてダイサーと称される別のＲＮａｓｅＩＩエンドヌクレアーゼによってさらにプロセシングされる。ダイサーは、５’リン酸および３’突出を認識し、ステムループ接合部でループを切断してｍｉＲＮＡ２重鎖を形成する。ｍｉＲＮＡ２重鎖がＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に結合し、そこでアンチセンス鎖が優先的に分解され、センス鎖成熟ｍｉＲＮＡはＲＩＳＣをその標的部位に向ける。成熟ｍｉＲＮＡはｍｉＲＮＡの生物学的に活性な形態であり、約１７～約２５ヌクレオチド長である。

多発性硬化症（ＭＳ）：患者の８０～８５％に再発寛解型の病気として現れる、時間的および空間的に散在する中枢神経系白質障害として古典的に説明されている、自己免疫疾患。ＭＳは、脳および脊髄の神経細胞の鞘の損傷に関連する慢性の通常は進行性の疾患である。脳および脊髄磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、体性感覚誘発電位の分析、ならびに免疫グロブリンまたはオリゴクローナルバンドの増加量を検出するための脳脊髄液の分析により、診断を行うことができる。ＭＲＩは、特に感度の高い診断ツールである。ＭＳの存在または進行を示すＭＲＩ異常は、Ｔ２荷重および流体減衰反転回復画像における高強度白質シグナル、活動性病変のガドリニウム増強、低信号「ブラックホール」（グリオーシスおよび軸索病態を表す）、ならびにＴ１荷重研究での脳萎縮を含む。連続ＭＲＩ研究を使用して疾患進行を示すことができる。ＭＳ患者の状態は、ＭＳ患者の脳における磁気共鳴（ＭＲＩ）活性の長期的な毎月の追跡調査により評価することができる。ＭＲＩは、小さい患者コホートにおける第Ｉ／ＩＩ相臨床試験のための独自の一連の評価基準を提供し、したがって、新規治療戦略の原理証明のためのデータを確立するためによく適している（例えば、Harris et al., Ann. Neurol. 29:548-555, 1991；MacFarland et al., Ann. Neurol. 32:758-766, 1992；Stone et al., Ann. Neurol. 37:611-619, 1995を参照されたい）。

再発寛解型多発性硬化症は、完全または部分的回復を伴い発作間に疾患進行がない明確に定義された急性の発作を特徴とするＭＳの臨床経過である。寛解中に、全ての症状が消失することもあり、または一部の症状が継続して永続的になることもある。しかし、寛解期の間に疾患の明らかな進行はない。

二次進行型多発性硬化症は、最初は再発寛解型であり、そしてその後、たまの再発およびちょっとした寛解をことによると伴って可変的な速度で進行型になる、ＭＳの臨床経過である。一次進行型多発性硬化症は、最初に進行型を呈する。

ＭＳの症状としては、しびれ、言語および筋肉協調障害、かすみ目、ならびに重度の疲労が挙げられる。

ＭＳの処置は、インターフェロンベータ－１ａ、インターフェロンベータ－１ｂ、酢酸グラチラマー、ミトキサントロン、ナタリズマブ、フィンゴリモド、テリフルノミド、フマル酸ジメチル、アレムツズマブ、オクレリズマブ、シポニモド、クラドリビン、オクレリズマブ、リツキシマブ、および代替／補完薬を含む。一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法を使用して、ＭＳを処置することができる。

ナノ小胞：直径約１０～約１，０００ｎｍのナノ粒子である細胞外小胞。ナノ小胞は、他の分子の中でも生物学的に活性なシグナル伝達分子（例えば、マイクロＲＮＡ、タンパク質）を運搬する脂質膜結合型粒子である。一般に、ナノ小胞は、脂質二重層により限定され、生体分子を二重層に封入する、および／または二重層に包埋することができる。したがって、ナノ小胞は、原形質膜で囲まれた内腔を含む。異なる型の小胞は、直径、細胞内起源、密度、形状、沈降速度、脂質組成、タンパク質マーカー、核酸含有量および細胞外マトリックス由来であるかまたは分泌されたものであるかなどの起源に基づいて区別することができる。ナノ小胞は、例えば、ＥＣＭ由来のマトリックス結合型ナノ小胞（上記を参照されたい）など、その起源、タンパク質含有量および／またはｍｉＲ含有量によって同定することができる。

「エキソソーム」または「液相細胞外小胞（ＥＶ）」は、細胞により分泌され、直径が１０から１５０ｎｍまでにわたる、膜様小胞である。一般に、後期エンドソームまたは多胞体は、限定されたエンドソーム膜からこれらの封入された小胞中への小胞の内向きの出芽および切断によって形成された内腔内小胞を含有する。次いで、原形質膜と融合すると、エキソサイトーシスの間にこれらの内腔内小胞が多胞体内腔から細胞外の環境、一般には血液、脳脊髄液または唾液などの体液中に放出される。膜のセグメントが陥入し、エンドサイトーシスによって取り込まれると、エキソソームが細胞内に生じる。より小さな小胞に分解され、最終的に細胞から吐き出される内部移行したセグメントは、タンパク質、ならびにｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡなどのＲＮＡ分子を含有する。血漿由来エキソソームは、リボソームＲＮＡをほとんど欠く。細胞外マトリックス由来エキソソームは、特定のｍｉＲＮＡおよびタンパク質成分を含み、事実上、血液、尿、唾液、精液、および脳脊髄液などのあらゆる体液中に存在することが示されている。エキソソームは、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ６３、ＣＤ８１、および／またはＣＤ９を発現し得、したがって、ＣＤ１１ｃ^＋および／またはＣＤ６３^＋および／またはＣ８１^＋および／またはＣＤ９^＋であり得る。エキソソームは、表面に高レベルのリシルオキシダーゼを有さない。

「ＥＣＭ由来のナノ小胞」、「マトリックス結合型ナノ小胞」、「ＭＢＶ」または「ＥＣＭ由来ナノ小胞」は全て、同じ膜結合型粒子を指し、当該粒子は、サイズが１０ｎｍ～１０００ｎｍにわたり、細胞外マトリックスに存在し、細胞挙動に影響を及ぼすタンパク質、脂質、核酸、成長因子およびサイトカインなどの生物学的に活性なシグナル伝達分子を含有する。これらの用語は、互換的であり、同じ小胞を指す。これらのナノ小胞は、ＥＣＭに埋め込まれ、それに結合しており、単に表面に付着しているのでも、体液中を自由に循環しているのでもない。これらのナノ小胞は、凍結融解、ならびにペプシン、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ、プロテイナーゼＫ、およびコラゲナーゼなどのプロテアーゼによる消化、ならびに界面活性剤による消化などの、厳しい単離条件に対して抵抗性である。ＭＢＶは、エキソソームを含めた他の細胞外小胞とは別個のものであり、エキソソームとは別個のリン脂質組成物を有する。ある特定の状況では、ＭＢＶはまた、エキソソームに一般に起因するある特定のマーカーの非存在に基づいて、エキソソームと区別され得る。一部の実施形態では、ＭＢＶは、タンパク質発現または脂質含有量についての以下の特色の１つまたは複数を特徴とする：
（ｉ）ＭＢＶは、ＣＤ６３および／もしくはＣＤ８１および／もしくはＣＤ９の１つもしくは複数を発現しないこともあり、またはエキソソームなどの他の小胞と比較して低レベルもしくはわずかに検出可能なレベルのＣＤ６３および／もしくはＣＤ８１および／もしくはＣＤ９（ＣＤ６３^ｌｏおよび／もしくはＣＤ８１^ｌｏおよび／もしくはＣＤ９^ｌｏ）を有することもある（例えば、実施例１を参照されたい）。様々な方法、例えば、抗体に基づく方法、例えばウエスタンブロッティングまたはフローサイトメトリーなどを使用して、ＭＢＶにおけるＣＤ６３および／またはＣＤ８１および／またはＣＤ９の少ない発現、わずかに検出可能な発現、または発現の非存在を区別することができる（例えば、Bashashati and Brinkman, Adv Bioinformatics, 2009: 584603を参照されたい）。一部の実施形態では、ＣＤ６３および／またはＣＤ８１および／またはＣＤ９のＭＢＶ発現は、ＭＢＶにおけるＣＤ６３および／またはＣＤ８１および／またはＣＤ９の発現が、エキソソームなどの他の小胞の平均発現を少なくとも１標準偏差または少なくとも２標準偏差を下回る場合、他の小胞と比較して少ないまたはわずかに検出可能とみなされる；
（ｉｉ）ＭＢＶは、全リン脂質の少なくとも５５％がホスファチジルコリン（ＰＣ）およびホスファチジルイノシトール（ＰＩ）の組合せで構成される、リン脂質含有量を有する；
（ｉｉｉ）ＭＢＶは、全リン脂質の１０％またはそれ未満がスフィンゴミエリン（ＳＭ）で構成される、リン脂質含有量を有する；
（ｉｖ）ＭＢＶは、全リン脂質の２０％またはそれ未満がホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）で構成される、リン脂質含有量を有する；
（ｖ）ＭＢＶは、全リン脂質含有量の１５％またはそれより多くがホスファチジルイノシトール（ＰＩ）で構成される、リン脂質含有量を有し、このパーセントは、脂質濃度のパーセントを表す。

一部の実施形態では、ＭＢＶは、以下の特色の全てを特徴とする：
（ｉ）ＣＤ６３および／もしくはＣＤ８１および／もしくはＣＤ９の１つもしくは複数を発現しないか、または低レベルもしくはわずかに検出可能なレベルのＣＤ６３および／もしくはＣＤ８１および／もしくはＣＤ９（ＣＤ６３^ｌｏおよび／もしくはＣＤ８１^ｌｏおよび／もしくはＣＤ９^ｌｏ）を有する（上でさらに説明した通り）；
（ｉｉ）全リン脂質の少なくとも５５％がホスファチジルコリン（ＰＣ）およびホスファチジルイノシトール（ＰＩ）の組合せで構成される、リン脂質含有量；
（ｉｉｉ）全リン脂質の１０％またはそれ未満がスフィンゴミエリン（ＳＭ）で構成される、リン脂質含有量；
（ｉｖ）全リン脂質の２０％またはそれ未満がホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）で構成される、リン脂質含有量；ならびに
（ｖ）全リン脂質含有量の１５％またはそれより多くがホスファチジルイノシトール（ＰＩ）である、リン脂質含有量。

一部の実施形態では、ＭＢＶは、以下の特色の全てを特徴とする：
（ｉ）全リン脂質の少なくとも５５％がホスファチジルコリン（ＰＣ）およびホスファチジルイノシトール（ＰＩ）の組合せで構成される、リン脂質含有量；
（ｉｉ）全リン脂質の１０％またはそれ未満がスフィンゴミエリン（ＳＭ）で構成される、リン脂質含有量；
（ｉｉｉ）全リン脂質の２０％またはそれ未満がホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）で構成される、リン脂質含有量；ならびに
（ｉｖ）全リン脂質含有量の１５％またはそれより多くがホスファチジルイノシトール（ＰＩ）である、リン脂質含有量。

一部の実施形態では、ＭＢＶは、以下の特色の１つまたは複数を特徴とする：
（ｉ）全リン脂質の少なくとも５５％がホスファチジルコリン（ＰＣ）およびホスファチジルイノシトール（ＰＩ）の組合せで構成される、リン脂質含有量；
（ｉｉ）全リン脂質の１０％またはそれ未満がスフィンゴミエリン（ＳＭ）で構成される、リン脂質含有量；
（ｉｉｉ）全リン脂質の２０％またはそれ未満がホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）で構成される、リン脂質含有量；ならびに
（ｉｖ）全リン脂質含有量の１５％またはそれより多くがホスファチジルイノシトール（ＰＩ）である、リン脂質含有量。

ＭＢＶが単離されるＥＣＭは、組織からのＥＣＭであることもあり、培養下で細胞から産生されることもあり、または商業的な供給源から購入されることもある。

天疱瘡：皮膚および粘膜を冒す自己免疫疾患。デスモソームによって隣接上皮細胞間の付着を形成するデスモグレインに対して自己抗体が形成する。自己抗体がデスモグレインを攻撃し、これによって細胞と表皮が分離され（「棘細胞離開」）、水疱が形成され、それらの水疱が剥がれ落ちてびらんになる。水疱は、皮膚のかなりの領域に広がり得る。様々な天疱瘡の種類、例えば、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、表皮内好中球性ＩｇＡ皮膚症、腫瘍随伴性天疱瘡、および風土病性落葉状天疱瘡などが、含まれる。天疱瘡の処置は、局所ステロイド（例えば、クロベタゾールなど）、ステロイドの病巣内注射（例えば、デキサメタゾンなど）、免疫抑制薬（例えば、ＣＥＬＬＣＥＰＴ（登録商標）またはミコフェノール酸など）、血清または血漿プール製品（例えば、特に重症天疱瘡、例えば腫瘍随伴性天疱瘡のための、静脈内ガンマグロブリン（ＩＶＩＧ）など）、および生物製剤（例えば、特に難治性尋常性天疱瘡の重症例のための、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）、またはリツキシマブなど）を含む。一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法を使用して、天疱瘡を処置することができる。

類天疱瘡：皮膚の水疱形成として現れる稀な自己免疫疾患。類天疱瘡は、天疱瘡に似ているように見えるが、棘細胞離開を含まない。類天疱瘡は、女性および６０歳を超える人々に、より多く見られる。多様な種類の類天疱瘡、例えば、ＩｇＧ媒介類天疱瘡、例えば、妊娠性、水疱性および瘢痕性類天疱瘡、ならびにＩｇＡ媒介類天疱瘡、例えば、ＩｇＡ媒介免疫水疱性疾患などが、含まれる。処置は、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）またはリツキシマブ、コルチコステロイド（例えば、外用コルチコステロイドおよび全身性コルチコステロイドなど）、グルココルチコイド温存薬、免疫抑制薬、抗炎症薬、生物学的療法、および静注用免疫グロブリンを含み得る。一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法を使用して、類天疱瘡を処置することができる。

薬学的に許容される担体：請求項記載の医薬調製物において有用な薬学的に許容される担体は、従来のものである。Remington's Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition (1975)には、本明細書において開示される融合タンパク質の薬学的送達に適した組成物および製剤が記載されている。

一般に、担体の性質は、使用される特定の投与形式に依存する。例えば、非経口製剤は、通常、水、生理的食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストロース、グリセロールなどの薬学的かつ生理的に許容される流体をビヒクルとして含む注射液を含む。固体組成物（例えば、散剤、丸剤、錠剤、またはカプセル剤の形態）に関しては、従来の無毒性固体担体は、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプンまたはステアリン酸マグネシウムを含み得る。投与される医薬調製物は、生物学的に中性の担体に加えて、微量の無毒性補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、保存剤、およびｐＨ緩衝剤など、例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートなどを含有し得る。

医薬品：対象または細胞に適正に投与された場合に所望の治療効果または予防効果をもたらすことができる化学化合物または組成物。

リン脂質：２つの疎水性脂肪酸テールと、リン酸基からなる親水性ヘッドとからなる構造を有する、脂質のクラス。リン脂質の主要クラスとしては、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、スフィンゴミエリン（ＳＭ）、カルジオリピン（ＣＬ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、およびビス－モノアシルグリセロホスフェート（ＢＭＰ）が挙げられる。リン脂質は、様々な方法で測定することができる。例えば、ＬＣ－ＭＳに基づく網羅的リピドミクスおよびレドックスリピドミクスを使用することができる。一部の実施形態では、特定のリン脂質含有量は、全リン脂質（例えば、ＭＢＶ中の全リン脂質など）のパーセント濃度として示され、このパーセント濃度は、重量／重量である。

ポリヌクレオチド：任意の長さの核酸配列（例えば、直鎖状配列など）。したがって、ポリヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドを含み、染色体内に見いだされる遺伝子配列も含む。「オリゴヌクレオチド」は、ネイティブなリン酸ジエステル結合によって結合した、複数の結合したヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドは、６ヌクレオチド長から３００ヌクレオチド長の間のポリヌクレオチドである。オリゴヌクレオチド類似体は、オリゴヌクレオチドと同様に機能するが、天然には存在しない部分を有する部分を指す。例えば、オリゴヌクレオチド類似体は、例えば、ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドなど、変更された糖部分または糖間連結などの天然に存在しない部分を含有し得る。天然に存在するポリヌクレオチドの機能的な類似体は、ＲＮＡまたはＤＮＡに結合し得、ペプチド核酸（ＰＮＡ）分子を含む。

乾癬：異常な皮膚の斑、例えば、赤いまたは紫色の、乾燥した、かゆい、およびうろこ状の斑など、ならびに皮膚の表皮層の異常に過剰および急速な成長を特徴とする、自己免疫疾患。乾癬の症状は、小さい、限局性の斑から全身範囲に及び得る。多様な種類の乾癬、例えば、尋常性乾癬、滴状乾癬、逆乾癬、膿疱性乾癬、および乾癬性紅皮症などが、含まれる。発症機序は、皮膚細胞に対する免疫系の反応を伴い、処置は、ステロイドクリーム、ビタミンＤ３クリーム、紫外線、および免疫系抑制医薬、例えばメトトレキサートなどを含み得る。乾癬は、乾癬性関節炎、リンパ腫、心血管疾患、クローン病、およびうつ病のリスク増加と関連付けられる。一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法を使用して、乾癬を処置することができる。乾癬の再燃は、乾燥したまたは寒い天候、ストレス、または皮膚の外傷によって誘発され得、結果として、この障害に特徴的な乾燥した、かゆい斑が形成され得る。

精製された：「精製された」という用語は、絶対的な純度を求めるものではなく、相対語として意図されている。したがって、例えば、精製された核酸分子調製物とは、その調製物中の言及された核酸が、細胞内のその天然の環境下にある核酸よりも純度が高いものである。例えば、核酸の調製物は、核酸がその調製物の総タンパク質含有量の少なくとも５０％になるように精製される。同様に、精製されたＭＢＶ調製物とは、その調製物中のエキソソームが、微小胞およびエキソソームが存在する細胞を含む環境下にあるエキソソームよりも純度が高いものである。核酸またはＭＢＶの精製された集団は、それぞれ純度が約９０％よりも高い、約９１％よりも高い、約９２％よりも高い、約９３％よりも高い、約９４％よりも高い、約９５％よりも高い、約９６％よりも高い、約９７％よりも高い、約９８％よりも高い、約９９％よりも高いもしくは１００％である、または他の核酸もしくは細胞成分を含まない。

疾患の防止または処置：疾患の「防止」は、例えば、疾患の素因を有することが分かっている人における疾患の発生を阻害することを指す。素因を有することが分かっている人の例は、家族内に病歴がある人、または対象に状態の素因を与える因子に曝露されてきた人である。「処置」は、疾患または病的状態が発生し始めた後にその徴候または症状を好転させる治療介入を指す。

寛解：疾患の臨床的に検出可能な症状もしくは徴候の非存在をおよび／または疾患進行の欠如を特徴とする病状。何が寛解を構成するかは、問題の自己免疫障害によって変わり得る。

再発：寛解期間後の疾患の徴候もしくは症状の逆戻りまたは疾患進行、あるいは症状改善期間後の疾患の徴候または症状の増悪。

再発寛解型疾患：症状改善および疾患進行欠如期間（寛解期）、続いての、罹患組織における炎症増加を含めた、障害の症状の悪化および疾患進行の徴候を特徴とする、自己免疫障害。多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患（結腸クローン病および潰瘍性大腸炎を含む）、乾癬、および関節リウマチが、再発寛解型自己免疫疾患の例である。

強皮症：皮膚、血管、筋肉および内臓器官を変化させ得る自己免疫疾患。疾患は、限局される（例えば、皮膚に）こともあり、他の臓器を冒すこともある。症状としては、肥厚した皮膚の領域、硬直、疲労、および寒冷曝露時の手指または足指への血流不良を挙げることができる。多様な種類の強皮症、例えば、限局性強皮症、例えば限局性モルフェア、モルフェア－硬化性萎縮性苔癬オーバーラップ（ＬＳＡ）、汎発性モルフェア、Ｐａｓｉｎｉ－Ｐｉｅｒｉｎｉ皮膚萎縮症、汎硬化性モルフェア、深在性モルフェア、線状モルフェア、ならびに全身性強皮症、例えばＣＲＥＳＴ症候群および進行性全身性硬化症などが、含まれる。発症機序は、健康な組織を攻撃する身体の免疫系に起因する可能性が高い結合組織の異常成長を含む。この状態は、最も多くの場合、中年期に始まり、女性のほうが男性より罹患頻度が高い。

処置は、コルチコステロイド、メトトレキサート、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、血管拡張薬（例えば、カルシウムチャネル遮断薬、アルファ遮断薬、セロトニン受容体アンタゴニスト、アンジオテンシンＩＩ受容体阻害剤、スタチン、局所硝酸塩、またはイロプロストなど）、ホスホジエステラーゼ５阻害剤（例えば、シルデナフィルなど）、ボセンタン、テトラサイクリン、シクロホスファミド、アザチオプリン、エンドセリン受容体アンタゴニスト、プロスタノイド、制酸薬、消化管機能改善薬、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、アンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト、免疫抑制剤（例えば、アザチオプリン、メトトレキサート、シクロホスファミド、ミコフェノレート、静注用免疫グロブリン、リツキシマブ、シロリムス、アレファセプト、ならびにチロシンキナーゼ阻害剤イマチニブ、ニロチニブおよびダサチニブなど）、エンドセリン受容体アンタゴニスト、ベータ－グリカンペプチド、ハロフジノン、バシリキシマブ、アレムツズマブ、アバタセプト、および造血幹細胞移植を含み得る。一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法を使用して、強皮症を処置することができる。

対象：非ヒト霊長類、マウス、ウサギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、およびは虫類などの哺乳動物および非哺乳動物などの全ての脊椎動物を含めたヒトおよび非ヒト動物。当該記載の方法の多くの実施形態では、対象は、ヒトである。「対象」は、「患者」という用語と同義で使用される。

全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）：ループスとしても公知のＳＬＥは、身体の免疫系（例えば、抗核抗体など）が健康な組織を誤って攻撃する、自己免疫疾患である。症状は、軽度から重度に及び、対象によっておよび時間と共に異なり得、この時間は、例えば、病気または再燃の期間、および症状がほとんどない寛解の期間を含む。よく見られる症状としては、関節痛および関節腫脹、発熱、胸痛、毛髪脱落、口腔内潰瘍、リンパ節腫脹、疲労感、および赤い発疹（例えば、顔の）が挙げられる。関節、皮膚、腎臓、脳、心臓または肺の炎症が起こることもある。それは、最も一般的には、１５～４５歳の間で始まるが、広範な年齢が冒され得る。妊娠可能年齢の女性ならびにアフリカ系、カリブ系および中国系の女性は、より高リスクである。

処置は、タクロリムス、疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ、例えば、コルチコステロイドなど；抗マラリア薬、例えば、ヒドロキシクロロキン、ならびに免疫抑制剤、例えばメトトレキサートおよびアザチオプリンなど；ヒドロキシクロロキン；シクロホスファミド；ならびにミコフェノール酸）、免疫抑制薬、鎮痛薬（例えば、非ステロイド性抗炎症薬、またはＮＳＡＩＤ、例えば、インドメタシンおよびジクロフェナクなど）、オピオイド、静注用免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）、生活様式の変化（例えば、日光の、および疲労を誘導する活動の回避など）、腎臓移植（例えば、ループス腎炎を処置するための）、および抗凝固薬（例えば、抗リン脂質症候群用の）を含み得る。一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法を使用して、ＳＬＥを処置することができる。

治療有効量：処置される対象において所望の効果を実現するのに十分な、ＭＢＶなどの特定の物質の量。対象に投与する場合、所望のｉｎｖｉｔｒｏ効果が実現されることが示されている標的組織中濃度（例えば、骨または関節中）が実現される投与量が一般に使用される。

「全リン脂質」または「全リン脂質含有量」：ＭＢＶに関して、単離されたＭＢＶ、すなわち、ＥＣＭから単離されたＭＢＶ、の所与の量の中に存在する全てのリン脂質の合計を指す。ＭＢＶは、例えば、脱細胞化ＥＣＭの酵素による消化および分画遠心分離によって、単離することができる。全リン脂質含有量は、ＬＣ－ＭＳに基づく網羅的リピドミクスおよびレドックスリピドミクスなどの方法によって決定することができる。全リン脂質含有量は、重量で測定される。全リン脂質含有量のパーセンテージは、重量／重量ベースでのパーセント濃度を指す。

移植：ＭＢＶなどの生体適合性基材を、それを必要とする対象内に配置すること。

処置すること、処置、および治療：症状の軽減、寛解、減少、または状態が患者により許容されるものになること、変性もしくは衰退の速度が遅くなること、変性の最終点がより消耗性が低いものになること、または対象の身体的もしくは精神的ウェルビーイングが改善されることなどの任意の客観的または主観的パラメーターを含めた、傷害、病状または状態の減弱または好転に関する任意の成功または成功の兆候。処置は、身体検査、神経学的検査、または精神医学的評価の結果を含めた客観的または主観的パラメーターによって評価することができる。

別段の断り書きがない限り、専門用語は、従来の用法に従って使用される。分子生物学における一般用語の定義は、Benjamin Lewin, Genes V、出版社Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology、出版社Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9)；およびRobert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference、出版社VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)において見つけることができる。

大要
ＭＢＶには、自己免疫障害に罹患している対象に投与されたときに自己免疫障害を処置する能力があることが、本明細書に開示される。特に、全身送達されたＭＢＶには、自己免疫障害の症状の処置において、罹患組織へのＭＢＶの局所投与から得られる治療効果と同じである治療効果があることを発見した。したがって、本発明は、ＭＢＶを、自己免疫障害のための独特な全身療法として位置付ける。

一部の状態、例えば、これだけに限定されないが、乾癬などには、ＭＢＶの局所投与が特に有効であることも、本明細書に開示される。例えば、乾癬の処置において、ＭＢＶの局部的皮膚投与は、特に有効である。

下の実施例２で説明されるように、関節リウマチのラットモデルにおいて、尾静脈への静脈内注射により全身的にまたは関節周囲注射により局所的にＭＢＶが投与されたラットの関節炎スコアは、関節リウマチの処置のゴールドスタンダートである関節周囲メトトレキサートを受けたラットの関節炎スコアと同程度に改善した。なおかつ、関節炎スコアの改善が、全身注射を受けようと、局所注射を受けようと、ラット間で同等であったことは、驚くべき発見であった。学説では、ＭＢＶの全身注射は、希釈効果をもたらすことになり、それ故、いかなる有意なレベルの局所的治療効果ももたらさないとされていたが、相反することが見られた。したがって、ＭＢＶの全身投与には、身体の一部に限局されないまたは局所処置に適していない多くの自己免疫障害を処置する治療可能性がある。多くの自己免疫障害は、全身性炎症を引き起こすものであり、または多くの組織を冒す全身性障害である。したがって、局所処置は、有効な処置方法でも、効率的な処置方法でもない。皮膚を冒す障害、例えば、天疱瘡などでは、局部的投与などの局所投与は、皮膚のかなりの領域が障害により冒されている場合には実用的でない可能性があり、多くの場合、罹患対象による皮膚への局所塗布は、それらが処置を局所投与するために患部に到達することができない場合、実現不可能であり得、それ故、全身処置の選択肢のほうが効率的かつ実用的であり得る。さらに、関節リウマチのような疾患では、罹患関節への治療剤の局所注射は極度に痛く、身体の多様な部分の複数の関節が冒されることがある。それ故、全身療法の選択肢は、より快適な処置選択肢のみならず、自己免疫障害によって引き起こされる全身性炎症を処置するためのより効率的な機序も提供する。

局所投与は、本明細書に開示される自己免疫障害を処置するために企図されるが、これらの障害を有する対象は、ＭＢＶが全身療法として投与されたとき、特に、障害が、局所投与が利用できないもしくは他の理由で局所投与による処置に適していない感受性組織を冒すものであるとき、または障害が、全身の位置および組織を冒すもの（例えば、全身性障害）である場合、特有の治療利益を経験する。症状が身体の１カ所より多くの位置に見られる自己免疫障害の処置において、ＭＢＶでの全身治療は、そのような障害の効率的かつ有効な処置を提供する。静脈内全身投与を使用して上述の治療効果を達成することができるが、全身投与の他の方法も企図される。

必要な対象における自己免疫障害（例えば、慢性自己免疫障害など）を処置する方法であって、対象に、細胞外マトリックス由来の単離されたマトリックス結合型小胞（ＭＢＶ）（例えば、膀胱、小腸、心臓、真皮、肝臓、腎臓、子宮、脳、血管、肺、骨、筋肉、膵臓、胃、脾臓、結腸、脂肪組織または食道の細胞外マトリックス由来のＭＢＶなど；例えば、ＭＢＶは、ヒト、サル、ブタ、ウシまたはヒツジから選択される哺乳類脊椎動物からのものなどの、膀胱マトリックス（ＵＢＭ）、小腸粘膜下組織（ＳＩＳ）、または膀胱粘膜下組織（ＵＢＳ）に由来する）の治療有効量を含む医薬調製物を投与するステップを含み、それにより、自己免疫障害が処置される、方法が、本明細書に開示される。一部の実施形態では、投与は、全身的である。

一部の実施形態では、自己免疫障害は、眼以外の自己免疫障害である。一部の実施形態では、自己免疫障害は、関節リウマチでも、強皮症でも、潰瘍性大腸炎でもない。一部の実施形態では、自己免疫障害は、アジソン病、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性脳炎、自己免疫性肝炎、セリアック病、クローン病、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、免疫性血小板減少症、ＩｇＡ腎症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、多発性硬化症、重症筋無力症、類天疱瘡、天疱瘡、多腺性自己免疫性症候群２型、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、強皮症、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、高安動脈炎、１型糖尿病、潰瘍性大腸炎、または未分化結合組織病（ＵＣＴＤ）である。他の実施形態では、自己免疫障害は、アジソン病、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性脳炎、自己免疫性肝炎、セリアック病、クローン病、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、免疫性血小板減少症、ＩｇＡ腎症、多発性硬化症、重症筋無力症、類天疱瘡、天疱瘡、多腺性自己免疫性症候群２型、乾癬、乾癬性関節炎、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、高安動脈炎、１型糖尿病、または未分化結合組織病（ＵＣＴＤ）である。

一部の実施形態では、自己免疫障害は、関節リウマチである。特定の非限定的な例では、投与は、全身的である。他の実施形態では、自己免疫障害は、強皮症である。さらなる実施形態では、自己免疫障害は、潰瘍性大腸炎である。さらなる実施形態では、自己免疫障害は、天疱瘡である。一部の実施形態では、自己免疫障害は、類天疱瘡である。他の実施形態では、自己免疫障害は、クローン病である。さらなる実施形態では、自己免疫障害は、乾癬である。さらなる実施形態では、自己免疫障害は、乾癬性関節炎である。さらに他の実施形態では、自己免疫障害は、多発性硬化症である。一部の実施形態では、自己免疫障害は、全身性エリテマトーデスである。一部の実施形態では、自己免疫障害は、自己免疫性脳炎である。

これらの実施形態のいずれにおいても、方法は、処置の対象を選択するステップを含み得る。投与は、全身的であることもあり、または局所的であることもある。

本明細書に開示される自己免疫障害を処置する方法では、対象は、ＭＢＶの投与後に長期間にわたって治療利益を経験することができる。一部の例では、対象は、ＭＢＶの投与からの少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも１カ月、少なくとも２カ月、または少なくとも３カ月の期間続く治療利益を経験する。特定の非限定的な例では、投与からの治療利益は、少なくとも１週間続く。特定の例では、投与からの治療利益は、少なくとも２週間続く。特定の非限定的な例では、投与からの治療利益は、少なくとも１カ月続く。特定の非限定的な例では、投与からの治療利益は、少なくとも２カ月続く。特定の例では、投与からの治療利益は、少なくとも３カ月またはそれより長く続く。一部の非限定的な例では、治療利益は、投与時に存在する疾患または障害の症状の低減である。一部の非限定的な例では、治療利益は、対象において自己免疫障害により引き起こされる炎症のレベルの、ＭＢＶの投与の前に自己免疫障害により引き起こされた炎症のレベルの低下である。一部の非限定的な例では、治療利益は、疾患または障害の寛解である。一部の非限定的な例では、治療利益は、その期間中の疾患もしくは障害の症状の再燃の低減または疾患もしくは障害の症状の再燃の消失である。一部の実施形態では、開示される方法は、疾患、例えば、これだけに限定されないが、関節リウマチ、多発性硬化症または全身性エリテマトーデスなど、の再燃を低減する。

一部の実施形態では、投与は、全身的であり得る。全身投与は、静脈内投与、経口投与、経腸投与、非経口投与、鼻腔内投与、直腸投与、舌下投与、口腔投与、唇下投与、腹腔内投与、皮下または筋肉内投与であり得る。特定の非限定的な例では、全身投与は、静脈内投与である。特定の非限定的な例では、全身投与は、経口投与である。特定の非限定的な例では、全身投与は、経腸投与である。特定の非限定的な例では、全身投与は、非経口内投与である。特定の非限定的な例では、全身投与は、鼻腔内投与である。特定の非限定的な例では、全身投与は、直腸投与である。特定の非限定的な例では、全身投与は、舌下投与である。特定の非限定的な例では、全身投与は、口腔投与である。特定の非限定的な例では、全身投与は、唇下投与である。特定の非限定的な例では、全身投与は、腹腔内投与である。特定の非限定的な例では、全身投与は、皮下投与である。特定の非限定的な例では、全身投与は、筋肉内投与である。

細胞外マトリックス（ＥＣＭ）由来のナノ小胞
ＥＣＭ由来のナノ小胞（マトリックス結合型ナノ小胞、ＭＢＶとも称される）は、参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開第ＷＯ２０１７／１５１８６２号および同第ＷＯ２０１８／２０４８４８号に一般に記載されている。ナノ小胞が細胞外マトリックスに包埋されていることが開示されている。これらのＭＢＶは、単離することができ、また、生物学的に活性である。したがって、これらのＭＢＶを治療目的で単独でまたは別のＥＣＭと共に使用することができる。細胞外マトリックスは、これだけに限定されないが、哺乳動物組織内の細胞を囲んで支持し、また、別段の指定のない限り無細胞性である、構造タンパク質、特殊タンパク質、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、および成長因子を含めた、構造的かつ機能的な生体分子および／または生体高分子の複雑な混合物である。一般に、開示されるＭＢＶは、任意の型の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に包埋されたものであり、その場所から単離することができる。したがって、ＭＢＶは、分離可能にＥＣＭの表面に存在しているのではなく、また、エキソソームではない。

細胞外マトリックスは、例えば、これだけに限定することなく、米国特許第４，９０２，５０８号；同第４，９５６，１７８号；同第５，２８１，４２２号；同第５，３５２，４６３号；同第５，３７２，８２１号；同第５，５５４，３８９号；同第５，５７３，７８４号；同第５，６４５，８６０号；同第５，７７１，９６９号；同第５，７５３，２６７号；同第５，７６２，９６６号；同第５，８６６，４１４号；同第６，０９９，５６７号；同第６，４８５，７２３号；同第６，５７６，２６５号；同第６，５７９，５３８号；同第６，６９６，２７０号；同第６，７８３，７７６号；同第６，７９３，９３９号；同第６，８４９，２７３号；同第６，８５２，３３９号；同第６，８６１，０７４号；同第６，８８７，４９５号；同第６，８９０，５６２号；同第６，８９０，５６３号；同第６，８９０，５６４号；および同第６，８９３，６６６号；これらのそれぞれはその全体が参照によって組み込まれる）に開示されている。しかし、ＥＣＭは、任意の組織から作製することもでき、任意のｉｎｖｉｔｒｏ供給源から作製することもでき、この場合、ＥＣＭは培養細胞によって産生され、ネイティブなＥＣＭの１つまたは複数のポリマー成分（構成物）を含む。ＥＣＭ調製物は、「脱細胞化された」または「無細胞性」であるとみなすことができ、これは、細胞が供給源組織または培養物から取り出されていることを意味する。

一部の実施形態では、ＥＣＭは、脊椎動物、例えば、これだけに限定されないが、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジなどを含めた哺乳類脊椎動物から単離される。ＥＣＭは、これだけに限定することなく、膀胱、腸（例えば、小腸もしくは大腸など）、心臓、真皮、肝臓、腎臓、子宮、脳、血管、肺、骨、筋肉、膵臓、胃、脾臓、結腸、脂肪組織または食道を含めた任意の臓器または組織に由来するものであってよい。特定の非限定的な例では、細胞外マトリックスは、食道組織、膀胱（例えば、膀胱マトリックスもしくは膀胱粘膜下組織など）、小腸粘膜下組織、真皮、臍帯、心膜、心臓組織、または骨格筋から単離される。ＥＣＭは、例えば、これだけに限定することなく、粘膜下組織、上皮基底膜、固有層などを含めた器官から得た任意の部分または組織を含み得る。非限定的な一実施形態では、ＥＣＭは膀胱から単離される。

ＥＣＭは、基底膜を含んでもよく、含まなくてもよい。別の非限定的な実施形態では、ＥＣＭは、基底膜の少なくとも一部分を含む。ＥＣＭ材料は、毛細血管内皮細胞または線維細胞などの元の組織を構成する細胞要素の一部を保持していてもよく、保持していなくてもよい。一部の実施形態では、ＥＣＭは、基底膜表面と非基底膜表面の両方を含有する。

非限定的な一実施形態では、ＥＣＭはブタ膀胱から回収される（膀胱マトリックスまたはＵＢＭとしても公知）。簡単に述べると、ＥＣＭは、ブタなどの哺乳動物から膀胱組織を取り出し、残留している脂肪組織を含めた外側の結合組織を切り落とすことによって調製される。水道水で繰り返し洗浄することによって残留している全ての尿を除去する。まず、組織を、脱上皮溶液、例えば、これだけに限定することなく、高張性食塩水（例えば、１．０Ｎの食塩水）中に１０分間から４時間までにわたる期間にわたって浸漬することによって組織を層剥離させる。高張性食塩溶液への曝露により、基礎をなす基底膜から上皮細胞を除去する。必要に応じて、カルシウムキレート剤を食塩溶液に添加することができる。最初の層剥離手順後の残りの組織は上皮基底膜および上皮基底膜に対して反内腔側の組織層を含む。比較的脆弱な上皮基底膜は一定して損傷を受け、これを内腔表面に対する任意の機械的剥離によって除去する。次に、この組織をさらなる処理に供して反内腔側組織の大部分を除去するが上皮基底膜および固有層は維持する。外側漿膜、外膜、筋層粘膜、粘膜下層および粘膜筋板の大部分を残りの上皮除去組織から機械的剥離によってまたは酵素処理（例えば、トリプシンまたはコラゲナーゼを使用する）、その後の水分付加、および剥離の組合せによって除去する。これらの組織の機械的除去は、例えば、これだけに限定することなく、Ａｄｓｏｎ－ＢｒｏｗｎピンセットおよびＭｅｔｚｅｎｂａｕｍはさみを用いて腸間膜組織を除去し、筋層および粘膜下層を、スカルペルハンドルまたは湿らせたガーゼに包んだ他の剛体を用いて縦方向に拭う動作を使用して拭いとることによって実現される。切刃、レーザーを伴う自動化ロボット手順および他の組織分離方法も意図されている。これらの組織を除去した後、得られたＥＣＭは、主に上皮基底膜および下にある固有層からなる。

別の実施形態では、ＥＣＭを、ブタ膀胱組織をスカルペルハンドルおよび湿らせたガーゼで縦方向に拭う動作を使用して剥離させて、漿膜および筋層の両方を含む外層を除去することによって調製する。組織セグメントを裏返した後、粘膜の内腔部分を、同じ拭う動作を使用して基礎をなす組織から層剥離させる。粘膜下組織に穴をあけないように注意する。これらの組織を除去した後に得られたＥＣＭは主に粘膜下層からなる（参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，２７７，９９９号の図２を参照されたい）。

ＥＣＭを粉末として調製することもできる。そのような粉末は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＧｉｌｂｅｒｔｅｔａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ２６（２００５）１４３１－１４３５の方法に従って作製することができる。例えば、ＵＢＭシートを凍結乾燥させ、次いで、液体窒素中に浸漬させるために切って小さなシートにすることができる。次いで、スナップ凍結材料を、粒子が回転式ナイフミルに入るように十分小さくなるように細かく砕くことができ、それにより、ＥＣＭを粉末化する。同様に、ＥＣＭ組織内でＮａＣｌを沈殿させることにより、材料を均一サイズの粒子に砕き、それをスナップ凍結させ、凍結乾燥させ、粉末化することができる。

非限定的な一実施形態では、ＥＣＭは小腸粘膜下組織またはＳＩＳに由来する。市販の調製物としては、これだけに限定されないが、ＳＵＲＧＩＳＩＳ（商標）、ＳＵＲＧＩＳＩＳ－ＥＳ（商標）、ＳＴＲＡＴＡＳＩＳ（商標）、およびＳＴＲＡＴＡＳＩＳ－ＥＳ（商標）（ＣｏｏｋＵｒｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｃ．；Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄ．）ならびにＧＲＡＦＴＰＡＴＣＨ（商標）（ＯｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓＩｎｃ．；ＣａｎｔｏｎＭａｓｓ．）が挙げられる。別の非限定的な実施形態では、ＥＣＭは、真皮に由来する。市販の調製物としては、これだけに限定されないが、ＰＥＬＶＩＣＯＬ（商標）（ヨーロッパではＰＥＲＭＡＣＯＬ（商標）として販売されている；Ｂａｒｄ、Ｃｏｖｉｎｇｔｏｎ，Ｇａ．）、ＲＥＰＬＩＦＯＲＭ（商標）（Ｍｉｃｒｏｖａｓｉｖｅ；Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓ．）およびＡＬＬＯＤＥＲＭ（商標）（ＬｉｆｅＣｅｌｌ；Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ、Ｎ．Ｊ．）が挙げられる。別の実施形態では、ＥＣＭは、膀胱に由来する。市販の調製物としては、これだけに限定されないが、ＵＢＭ（ＡＣｅｌｌＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｊｅｓｓｕｐ、Ｍｄ．）が挙げられる。

ＭＢＶは、以下に開示されている方法を使用して細胞外マトリックスから引き出す（それから放出させる）ことができる。方法は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるQuijano et al., Tissue Engineering, part C, doi.org/10.1089/ten.TEC.2020.0243, October 3, 2020に開示されている。

一部の実施形態では、ＥＣＭは、ペプシン、コラゲナーゼ、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ、リベラ－ゼ、またはプロテイナーゼＫなどの酵素を用いて消化され、ＭＢＶが単離される。他の実施形態では、ＭＢＶは、グリシンＨＣＬ、クエン酸、水酸化アンモニウムなどの溶液を用いてｐＨを変化させることによって、キレート剤、例えば、これだけに限定されないが、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡなどの使用、塩、例えば、これだけに限定されないが、塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、ヨウ化ナトリウム、チオシアン酸ナトリウムなどを使用してイオン強度および／もしくはカオトロピック効果によって、またはＥＣＭをグアニジンＨＣｌもしくは尿素のような変性条件に曝露することによって、ＥＣＭから放出され、分離される。

特定の例では、ＭＢＶは、ペプシン、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ、プロテイナーゼＫ、塩類溶液またはコラゲナーゼなどの酵素でのＥＣＭの消化した後に調製される。ＥＣＭは、凍結融解されることもあり、または機械的な分解に供されることもある。

一部の実施形態では、ＣＤ６３、ＣＤ８１、および／またはＣＤ９の発現をＭＢＶで検出することができない。したがって、一部の実施形態では、ＭＢＶは、ＣＤ６３および／またはＣＤ８１および／またはＣＤ９を発現しない。１つの特定の例では、ＣＤ６３、ＣＤ８１、およびＣＤ９をナノ小胞で検出することはできない。他の実施形態では、ＭＢＶは、例えばウエスタンブロットによって検出可能なものなど、わずかに検出可能なレベルのＣＤ６３、ＣＤ８１、およびＣＤ９を有する。これらのＭＢＶは、ＣＤ６３^ｌｏＣＤ８１^ｌｏＣＤ９^ｌｏである。他の実施形態では、ＭＢＶは、検出可能なレベルのＣＤ６３、ＣＤ８１またはＣＤ９の１つまたは複数を発現しない。他の実施形態では、ＭＢＶは、わずかに検出可能なレベルのＣＤ６３、ＣＤ８１またはＣＤ９の１つまたは複数を発現する。当業者は、例えば、ＣＤ６３、ＣＤ８１、およびＣＤ９に特異的に結合する抗体を使用して、ＣＤ６３^ｌｏおよび／またはＣＤ８１^ｌｏおよび／またはＣＤ９^ｌｏであるＭＢＶを容易に同定することができる。これらのマーカーの低いレベルは、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）などの手順および蛍光標識された抗体を使用して確立して、ＣＤ６３、ＣＤ８１およびＣＤ９の少量および多量についての閾値を決定することができる。開示されるＭＢＶは、ＥＣＭの表面に一過性に付着し得るエキソソームなどのナノ小胞とは、これらは生体液中に存在しているため異なる。ＭＢＶは、ｉｎｖｉｖｏでＥＣＭに結合しており、生体液中には見られないからである。

ＭＢＶは、例えばエキソソームと比較して、特徴的なリン脂質含有量を有する。一部の実施形態では、ＭＢＶの全リン脂質含有量は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）およびホスファチジルイノシトール（ＰＩ）併せて少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８５％、もしくは９０％、または約５０％～９０％、５０％～６５％、５０％～６０％、５０％～７０％、６０％～７０％、６０％～９０％、もしくは７０％～９０％である。特定の実施形態では、ＭＢＶの全リン脂質含有量は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）およびホスファチジルイノシトール（ＰＩ）併せて少なくとも５５％である。特定の実施形態では、ＭＢＶの全リン脂質含有量は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）およびホスファチジルイノシトール（ＰＩ）併せて少なくとも６０％である。一部の実施形態では、ＭＢＶのリン脂質含有量は、８：１未満（例えば、７：１未満、６：１未満、５：１未満、４：１未満、３：１未満、または２：１未満）のホスファチジルコリン（ＰＣ）のホスファチジルイノシトール（ＰＩ）に対する比を含む。一部の実施形態では、ＭＢＶのリン脂質含有量は、０．５～１：１の範囲、または１：０．５～１の範囲、または０．５～１：２の範囲、または２：０．５～１の範囲、または０．８～１：１の範囲、または１：０．８～１の範囲のホスファチジルコリン（ＰＣ）のホスファチジルイノシトール（ＰＩ）に対する比を含む。一実施形態では、ＭＢＶのリン脂質含有量は、約１：１のホスファチジルコリン（ＰＣ）のホスファチジルイノシトール（ＰＩ）に対する比を含む。特定の実施形態では、ＭＢＶのリン脂質含有量は、約０．９：１のホスファチジルコリン（ＰＣ）のホスファチジルイノシトール（ＰＩ）に対する比を含む。

一部の実施形態では、ＭＢＶの全リン脂質含有量は、スフィンゴミエリン（ＳＭ）１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％もしくはそれ未満、または約５％～１０％、５％～１５％、１０％～１５％、もしくは８％～１２％である。特定の実施形態では、ＭＢＶの全リン脂質含有量は、スフィンゴミエリン（ＳＭ）１０％またはそれ未満である。一部の実施形態では、全リン脂質含有量は、スフィンゴミエリン（ＳＭ）１５％もしくはそれ未満、スフィンゴミエリン１４％もしくはそれ未満、スフィンゴミエリン１３％もしくはそれ未満、スフィンゴミエリン１２％もしくはそれ未満、スフィンゴミエリン１１％もしくはそれ未満、スフィンゴミエリン１０％もしくはそれ未満、スフィンゴミエリン９％もしくはそれ未満、スフィンゴミエリン８％もしくはそれ未満、スフィンゴミエリン７％もしくはそれ未満、スフィンゴミエリン６％もしくはそれ未満、スフィンゴミエリン５％もしくはそれ未満、またはスフィンゴミエリン４％もしくはそれ未満である。

一部の実施形態では、ＭＢＶの全リン脂質含有量は、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％または１０％もしくはそれ未満、あるいは約１０％～２０％、１５％～２０％、１４％～１８％、または１２％～１６％である。特定の実施形態では、ＭＢＶの全リン脂質含有量は、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）２０％またはそれ未満である。

一部の実施形態では、ＭＢＶの全リン脂質含有量は、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）５％、１０％、１２％、１５％、１８％、２０％、２５％、または３０％もしくはそれより多く、あるいは約５％～３０％、１０％～２０％、１０～２５％、１５％～２５％、または１２％～１８％である。特定の実施形態では、ＭＢＶは、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）が１５％またはそれより多い、リン脂質含有量を含む。

特定の実施形態では、ＭＢＶの全リン脂質含有量は、１５％またはそれより多くホスファチジルイノシトール、２０％またはそれ未満ホスファチジルエタノールアミン、および１０％またはそれ未満スフィンゴミエリンで構成される。特定の実施形態では、ＭＢＶの全リン脂質含有量は、１５％またはそれより多くがホスファチジルイノシトール、および２０％またはそれ未満がホスファチジルエタノールアミンである。特定の実施形態では、ＭＢＶの全リン脂質含有量は、１５％またはそれより多くがホスファチジルイノシトール、および１０％またはそれ未満がスフィンゴミエリンである。特定の実施形態では、ＭＢＶの全リン脂質含有量は、２０％またはそれ未満ホスファチジルエタノールアミンおよび１０％またはそれ未満スフィンゴミエリンで構成される。特定の実施形態では、ＭＢＶの全リン脂質含有量は、１５％より多くがホスファチジルイノシトールであり、２０％またはそれ未満がホスファチジルエタノールアミンであり、１０％またはそれ未満がスフィンゴミエリンであり、併せて少なくとも５５％がホスファチジルイノシトールおよびホスファチジルコリンである。一実施形態では、ＭＢＶの全リン脂質含有量は、併せて少なくとも５５％がホスファチジルコリン（ＰＣ）およびホスファチジルイノシトール（ＰＩ）であり、１０％またはそれ未満がスフィンゴミエリン（ＳＭ）である。特定の実施形態では、ＭＢＶの全リン脂質含有量は、併せて少なくとも５５％がホスファチジルイノシトールおよびホスファチジルコリンであり、１５％より多くがホスファチジルイノシトールである。特定の実施形態では、ＭＢＶの全リン脂質含有量は、併せて５５％がホスファチジルイノシトールおよびホスファチジルコリンであり、２０％またはそれ未満がホスファチジルエタノールアミンである。

ＭＢＶは、リシルオキシダーゼ（Ｌｏｘ）も含み得る。一般に、ＥＣＭに由来するナノ小胞は、エキソソームよりも多いＬｏｘ含有量を有する。Ｌｏｘは、ＭＢＶの表面に発現される。ナノＬＣＭＳ／ＭＳプロテオミクス解析を使用して、Ｌｏｘタンパク質を検出することができる。Ｌｏｘの定量を行うことができる（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるHill RC, et al., Mol Cell Proteomics. 2015;14(4):961-73を参照されたい）。

ある特定の実施形態では、ＭＢＶは、１つまたは複数のｍｉＲＮＡを含む。特定の非限定的な例では、ＭＢＶは、ｍｉＲ－１４３、ｍｉＲ－１４５およびｍｉＲ－１８１のうちの１つ、２つ、または３つ全てを含む。ｍｉＲ－１４３、ｍｉＲ－１４５およびｍｉＲ－１８１は、当技術分野で公知である。

ｍｉＲ－１４５核酸配列は、参照により本明細書に組み込まれるＭｉＲｂａｓｅ受託番号ＭＩ００００４６１で提供される。ｍｉＲ－１４５核酸配列は、ＣＡＣＣＵＵＧＵＣＣＵＣＡＣＧＧＵＣＣＡＧＵＵＵＵＣＣＣＡＧＧＡＡＵＣＣＣＵＵＡＧＡＵＧＣＵＡＡＧＡＵＧＧＧＧＡＵＵＣＣＵＧＧＡＡＡＵＡＣＵＧＵＵＣＵＵＧＡＧＧＵＣＡＵＧＧＵＵ（配列番号１）である。ｍｉＲ－１８１核酸配列は、参照により本明細書に組み込まれるｍｉＲｂａｓｅ受託番号ＭＩ００００２６９で提供される。ｍｉＲ－１８１核酸配列は、ＡＧＡＡＧＧＧＣＵＡＵＣＡＧＧＣＣＡＧＣＣＵＵＣＡＧＡＧＧＡＣＵＣＣＡＡＧＧＡＡＣＡＵＵＣＡＡＣＧＣＵＧＵＣＧＧＵＧＡＧＵＵＵＧＧＧＡＵＵＵＧＡＡＡＡＡＡＣＣＡＣＵＧＡＣＣＧＵＵＧＡＣＵＧＵＡＣＣＵＵＧＧＧＧＵＣＣＵＵＡ（配列番号２）である。ｍｉＲ－１４３核酸配列は、参照により本明細書に組み込まれるＮＣＢＩ受託番号ＮＲ＿０２９６８４．１、２０１８年３月３０日で提供される。ｍｉＲ－１４３核酸配列をコードするＤＮＡは、ＧＣＧＣＡＧＣＧＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＴＧＣＡＧＴＧＣＴＧＣＡＴＣＴＣＴＧＧＴＣＡＧＴＴＧＧＧＡＧＴＣＴＧＡＧＡＴＧＡＡＧＣＡＣＴＧＴＡＧＣＴＣＡＧＧＡＡＧＡＧＡＧＡＡＧＴＴＧＴＴＣＴＧＣＡＧＣ（配列番号３）である。

投与後、ＭＢＶは、対象におけるマクロファージにおいてＦ４／８０（マクロファージマーカー）およびＣＤ－１１ｂの発現を維持する。ナノ小胞で処理されたマクロファージは、主に、Ｍ２表現型を示すＦ４／８０＋Ｆｉｚｚ１＋である。

本明細書に開示されるＭＢＶは、薬学的送達のための組成物に製剤化し、生体足場およびデバイスに使用することができる。ＭＢＶは、参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開第ＷＯ２０１７／１５１８６２号に開示されている。

ＭＢＶのＥＣＭからの単離
ＭＢＶを作製するために、目的の任意の細胞にＥＣＭを産生させることができ、または商業的供給源からのＥＣＭを利用することができる。上記を参照されたい。ＭＢＶは、処置される対象と同じ種から作製することができ、または異なる種から作製することができる。一部の実施形態では、これらの方法は、ＥＣＭを酵素で消化して消化されたＥＣＭを作製するステップを含む。特定の実施形態では、ＥＣＭを、ペプシン、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ、コラゲナーゼ、メタロプロテイナーゼ、および／またはプロテイナーゼＫのうちの１つまたは複数で消化する。特定の非限定的な例では、ＥＣＭを、エラスターゼおよび／またはメタロプロテイナーゼのみで消化する。別の非限定的な例では、ＥＣＭを、コラゲナーゼおよび／またはトリプシンおよび／またはプロテイナーゼＫでは消化しない。他の実施形態では、ＥＣＭを界面活性剤で処理する。さらなる実施形態では、方法は、酵素の使用を含まない。特定の非限定的な例では、方法は、ＭＢＶを単離するために、塩化カリウムなどの塩などのカオトロピック剤またはイオン強度を利用する。追加的な実施形態では、ＥＣＭを、ＭＢＶの単離前にＭＢＶ含有量が増加するように操作することができる。ＭＢＶの単離のための方法は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるQuijano et al., Tissue Engineering, part C, doi.org/10.1089/ten.TEC.2020.0243, October 3, 2020に開示されている。

一部の実施形態では、ＥＣＭを酵素で消化する。ＥＣＭを酵素で約１２～約４８時間、例えば、約１２～約３６時間などにわたって消化することができる。ＥＣＭを酵素で約１２、約２４、約３６または約４８時間にわたって消化することができる。特定の非限定的な一例では、ＥＣＭを酵素を用いて室温で消化する。しかし、消化は、約４℃、または約４℃から２５℃の間の任意の温度で行うことができる。一般に、ＥＣＭを、酵素を用い、コラーゲン原線維を除去するのに十分な任意の時間の長さにわたって、任意の温度で消化する。消化プロセスは、組織供給源に応じて変動し得る。必要に応じて、ＥＣＭを、酵素での消化前またはその後のいずれかに凍結および融解によって処理する。ＥＣＭをイオン性および／または非イオン性界面活性剤を含めた界面活性剤で処理することができる。

次いで、消化されたＥＣＭを、例えば遠心分離によって処理して、原線維を含まない上清を単離する。一部の実施形態では、消化されたＥＣＭを、例えば、第１のステップとして約３００～約１０００ｇで遠心分離する。したがって、消化されたＥＣＭを、約４００ｇ～約７５０ｇで、例えば、約４００ｇ、約４５０ｇ、約５００ｇまたは約６００ｇで遠心分離することができる。この遠心分離は、約１０～約１５分にわたって、例えば、約１０～約１２分にわたって、例えば、約１０、約１１、約１２、約１４、約１４、または約１５分にわたって行うことができる。消化されたＥＣＭを含む上清を収集する。

ＭＢＶはＬｏｘを含む。一部の実施形態では、そのようなＭＢＶを単離するための方法は、細胞外マトリックスをエラスターゼおよび／またはメタロプロテイナーゼで消化して消化された細胞外マトリックスを作製するステップと、消化された細胞外マトリックスを遠心分離してコラーゲン原線維レムナントを除去し、したがって原線維を含まない上清を作製するステップと、原線維を含まない上清を遠心分離して固形物を単離するステップと、固形物を担体中に懸濁させるステップとを含む。

一部の実施形態では、消化されたＥＣＭを、第２のステップとして約２０００ｇ～約３０００ｇで遠心分離することもできる。したがって、消化されたＥＣＭを、約２，５００ｇ～約３，０００ｇで、例えば、約２，０００ｇ、２，５００ｇ、２，７５０ｇまたは３，０００ｇで遠心分離することができる。この遠心分離は、約２０～約３０分にわたって、例えば、約２０～約２５分にわたって、例えば、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９または約３０分にわたって行うことができる。消化されたＥＣＭを含む上清を収集する。

追加的な実施形態では、消化されたＥＣＭを、第３のステップとして約１０，０００～約１５，０００ｇで遠心分離することができる。したがって、消化されたＥＣＭを、約１０，０００ｇ～約１２，５００ｇで、例えば、約１０，０００ｇ、１１，０００ｇまたは１２，０００ｇで遠心分離することができる。この遠心分離は、約２５～約４０分にわたって、例えば、約２５～約３０分にわたって、例えば、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９または約４０分にわたって行うことができる。消化されたＥＣＭを含む上清を収集する。

これらの遠心分離ステップのうちの１つ、２つ、または３つ全てを独立に利用することができる。一部の実施形態では、３つ全ての遠心分離ステップを利用する。遠心分離ステップを例えば２回、３回、４回、または５回、繰り返すことができる。一実施形態では、３つ全ての遠心分離ステップを３回繰り返す。

一部の実施形態では、消化されたＥＣＭを約５００ｇで約１０分にわたって遠心分離する、約２，５００ｇで約２０分にわたって遠心分離する、および／または約１０，０００ｇで約３０分にわたって遠心分離する。これらのステップ（複数可）、例えば、３つ全てのステップを、２回、３回、４回、または５回、例えば３回、繰り返すことができる。したがって、非限定的な一例では、消化されたＥＣＭを約５００ｇで約１０分にわたって遠心分離し、約２，５００ｇで約２０分にわたって遠心分離し、約１０，０００ｇで約３０分にわたって遠心分離する。これらの３つのステップを３回繰り返す。このようにして、原線維を含まない上清を作製する。

次いで、原線維を含まない上清を遠心分離してＭＢＶを単離する。一部の実施形態では、原線維を含まない上清を約１００，０００ｇ～約１５０，０００ｇで遠心分離する。したがって、原線維を含まない上清を約１００，０００ｇ～約１２５，０００ｇで、例えば、約１００，０００ｇ、約１０５，０００ｇ、約１１０，０００ｇ、約１１５，０００ｇまたは約１２０，０００ｇで遠心分離する。この遠心分離は、約６０～約９０分にわたって、例えば、約７０～約８０分、例えば、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５または約９０分にわたって行うことができる。非限定的な一例では、線維を含まない上清を約１００，０００ｇで約７０分にわたって遠心分離する。ＭＢＶである固形物を収集する。次いで、これらのＭＢＶを、これだけに限定されないが、緩衝剤などの任意の目的の担体中に再懸濁させることができる。

さらなる実施形態では、ＥＣＭを酵素で消化しない。これらの方法では、ＥＣＭをリン酸緩衝食塩水などの等張食塩溶液中に懸濁させる。次いで、塩を懸濁液に、塩の最終濃度が約０．１Ｍよりも高くなるように添加する。濃度は、例えば、最大約３Ｍ、例えば、約０．１Ｍの塩～約３Ｍ、または約０．１Ｍ～約２Ｍであり得る。塩は、例えば、約０．１Ｍ、０．１５Ｍ、０．２Ｍ、０．３Ｍ、０．４Ｍ、０．７Ｍ、０．６Ｍ、０．７Ｍ、０．８Ｍ、０．９Ｍ、１．０Ｍ、１．１Ｍ、１．２Ｍ、１．３Ｍ、１．４Ｍ、１．５Ｍ、１．６Ｍ、１．７Ｍ、１．８Ｍ、１．９Ｍ、または２Ｍであり得る。一部の非限定的な例では、塩は、塩化カリウム、塩化ナトリウムまたは塩化マグネシウムである。他の実施形態では、塩は、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、ヨウ化ナトリウム、チオシアン酸ナトリウム、ナトリウム塩、リチウム塩、セシウム塩またはカルシウム塩である。

一部の実施形態では、ＥＣＭを塩類溶液中に約１０分～約２時間、例えば、約１５分～約１時間、約３０分～約１時間、または約４５分～約１時間にわたって懸濁させる。ＥＣＭを塩類溶液中に約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５または１２０分にわたって懸濁させることができる。ＥＣＭを塩類溶液中に４℃から約５０℃まで、例えば、これだけに限定されないが、約４℃～約２５℃または約４℃～約３７℃の温度で懸濁させることができる。特定の非限定的な例では、ＥＣＭを塩類溶液中に約４℃で懸濁させる。他の特定の非限定的な例では、ＥＣＭを塩類溶液中に約２２℃または約２５℃（室温）で懸濁させる。別の非限定的な例では、ＥＣＭを塩類溶液中に約３７℃で懸濁させる。

一部の実施形態では、方法は、細胞外マトリックスを約０．４Ｍよりも高い塩濃度でインキュベートするステップと、消化された細胞外マトリックスを遠心分離してコラーゲン原線維レムナントを除去するステップと、上清を単離するステップと、上清を遠心分離して固形物を単離するステップと、固形物を担体中に懸濁させ、それにより、ＭＢＶを細胞外マトリックスから単離するステップとを含む。

塩類溶液中でインキュベートした後、ＥＣＭを遠心分離してコラーゲン原線維を除去する。一部の実施形態では、消化されたＥＣＭを約２０００ｇ～約５０００ｇで遠心分離することもできる。したがって、消化されたＥＣＭを約２，５００ｇ～約４，５００ｇで、例えば、約２，５００ｇ、約３，０００ｇ、３，５００、約４，０００ｇ、または約４，５００ｇで遠心分離することができる。特定の非限定的な一例では、遠心分離を約３，５００ｇで行う。この遠心分離は、約２０～約４０分にわたって、例えば、約２５～約３５分にわたって、例えば、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０分、約３１、約３２、約３３、約３４または約３５分にわたって行うことができる。次いで、上清を収集する。

追加的な実施形態では、次いで、上清を、第３のステップとして、約１００，０００～約１５０，０００ｇで遠心分離することができる。したがって、消化されたＥＣＭを、約１００，０００ｇ～約１２５，０００ｇで、例えば、約１００，０００ｇ、１１０，０００ｇまたは１２０，０００ｇで遠心分離することができる。この遠心分離は、約３０分～約２．５時間にわたって、例えば、約１時間～約３時間にわたって、例えば、約３０分、約４５分、約６０分、約９０分、または約１２０分（２時間）にわたって行うことができる。固形物を収集し、緩衝生理食塩水などの溶液中に懸濁させ、それにより、ＭＢＶを単離する。

さらに他の実施形態では、ＥＣＭを、これだけに限定されないが、リン酸緩衝食塩水などの等張緩衝塩類溶液中に懸濁させる。遠心分離または他の方法を使用して大きな粒子を除去することができる（以下を参照されたい）。次いで、限外濾過を利用して、ＭＢＶをＥＣＭから単離し、粒子は、約１０ｎｍから約１０，０００ｎｍの間、例えば、約１０から約１，０００ｎｍの間、例えば、約１０ｎｍから約３００ｎｍの間である。

特定の非限定的な例では、等張緩衝食塩溶液は約０．１６４ｍＭの総塩濃度および約７．２～約７．４のｐＨを有する。一部の実施形態では、等張緩衝食塩溶液は、０．００２ＭのＫＣｌ～約０．１６４ＭのＫＣＬ、例えば、約０．００２７ＭのＫＣｌを含む（リン酸緩衝食塩水中のＫＣＬの濃度）。次いで、この懸濁液を超遠心分離によって処理する。

等張緩衝塩類溶液中でインキュベートした後、ＥＣＭを遠心分離してコラーゲン原線維を除去する。一部の実施形態では、消化されたＥＣＭを約２０００ｇ～約５０００ｇで遠心分離することもできる。したがって、消化されたＥＣＭを約２，５００ｇ～約４，５００ｇで、例えば、約２，５００ｇ、約３，０００ｇ、３，５００、約４，０００ｇ、または約４，５００ｇで遠心分離することができる。特定の非限定的な一例では、遠心分離を約３，５００ｇで行う。この遠心分離は、約２０～約４０分にわたって、例えば、約２５～約３５分にわたって、例えば、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０分、約３１、約３２、約３３、約３４または約３５分にわたって行うことができる。

高分子量材料を懸濁液から除去するために精密濾過と遠心分離とを使用し、組み合わせることができる。一実施形態では、精密濾過を使用して２００ｎｍを超えるものなどのサイズが大きな分子材料を除去する。別の実施形態では、遠心分離を使用することによってサイズが大きな材料を除去する。第３の実施形態では、精密濾過および超遠心分離の両方を使用して、高分子量材料を除去する。約１０，０００ｎｍよりも大きい、約１，０００ｎｍよりも大きい、約５００ｎｍよりも大きい、または約３００ｎｍよりも大きい材料などの高分子量材料を懸濁ＥＣＭから除去する。

次いで、精密濾過の流出液、または上清を限外濾過に供する。したがって、約１０，０００ｎｍ未満、約１，０００ｎｍ未満、約５００ｎｍ未満、または約３００ｎｍ未満の粒子を含む流出液を収集し、利用する。次いで、この流出液を、分画分子量（ＭＷＣＯ）が３，０００～１００，０００である膜を用いた限外濾過に供する。実施例では１００，０００ＭＷＣＯを使用した。

自己免疫障害を処置するための方法
必要な対象における自己免疫障害（例えば、とりわけ、関節リウマチ、強皮症、潰瘍性大腸炎、天疱瘡、類天疱瘡、クローン病、乾癬、乾癬性関節炎、多発性硬化症、および／または全身性エリテマトーデスなど）を処置するための方法も、本明細書に開示される。これらの方法は、処置を必要とする対象を（例えば、自己免疫障害、例えば、関節リウマチ、強皮症、潰瘍性大腸炎、天疱瘡、類天疱瘡、クローン病、乾癬、乾癬性関節炎、多発性硬化症、および／または全身性エリテマトーデスなどを有する対象に関して）選択するステップ、および対象に、ＭＢＶの治療有効量を投与して（例えば、ＭＢＶの治療有効量を含む医薬調製物を投与することによって）自己免疫応答を減少させるステップを含み、それにより、自己免疫応答障害が処置される。一部の例では、ＭＢＶを全身投与することができる。特定の例では、ＭＢＶは、ＩＶ投与により投与される。他の例では、自己免疫疾患は、関節リウマチである。他の実施形態では、ＭＢＶは、局所投与される。特定の非限定的な例では、自己免疫疾患は、乾癬である。

対象は、脊椎動物対象またはヒトであり得る。非限定的な例では、対象は、ヒトである。対象は、哺乳動物であり得る。対象は、鳥類または家庭用ペット、例えばネコ、イヌもしくはウサギなどであり得る。対象は、非ヒト霊長類（例えば、類人猿）、またはブタ、反芻動物、ウマおよび家禽を含めた家畜であり得る。方法は、自己免疫応答を減少させるための処置を必要とする対象を選択するステップ、および対象にＭＢＶの治療有効量を投与する（例えば、ＭＢＶの治療有効量を含む医薬調製物を投与することによる）ステップを含む。一部の実施形態では、ＭＢＶを全身投与することができる。他の実施形態では、ＭＢＶを局所投与することができる。ＭＢＶは、自己免疫活性の減少を必要とする対象と同じ種に由来することもあり、またはそのような対象とは異なる種に由来することもある。ＭＢＶは、自己のものであることもある。

本明細書に開示される方法は、対象における自己免疫活性の減少をもたらすことができる。一部の例では、自己免疫障害の徴候または症状が低減または排除される。例えば、本明細書における方法は、対象における自己免疫障害の完全寛解または部分寛解をもたらすことができる。一部の例では、本明細書における方法を使用して、対象における自己免疫障害の再燃または再発を低減するまたは消失させることができる。一部の例では、本明細書における方法を使用して、対象における自己免疫障害の再燃の頻度または強度を低減するまたは消失させることができる。一部の実施形態では、本明細書における方法を使用して、対象における自己免疫障害の進行を防止することができる。

ＭＢＶ（またはＭＢＶを含む医薬調製物）の投与は、対象における自己免疫障害の徴候または症状を長期間にわたって低減または排除することができる。一部の実施形態では、対象は、長期間にわたって続くＭＢＶの処置コースの治療効果を経験する。好ましくは、ＭＢＶは、全身投与される。例えば、この長期間は、処置コースを始めた時点で開始してその１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月または６カ月後に終了する期間であり得る。例えば、この長期間は、処置コースが終了した時点で開始してその１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月または６カ月後に終了する期間であり得る。対象が経験する治療効果は、（ｉ）処置コースの前の症状の重症度と比較して自己免疫障害の症状の重症度の前記期間にわたる低下、（ｉｉ）自己免疫障害もしくはその症状の前記期間にわたる寛解、（ｉｉｉ）前記期間の間の自己免疫疾患の再燃もしくは再発の防止、（ｉｖ）処置コースの前に経験した症状の重症度と比較して前記期間の間の再燃もしくは再発中に経験する症状の重症度の低下、（ｖ）処置コースの前の再発または再燃の頻度と比較して前記期間の間の再発もしくは再燃の頻度の低下、または（ｖｉ）処置コースの完了後の前記期間の間の疾患進行の徴候の非存在であり得る。いずれの所与の自己免疫障害についても、症状の重症度の低下もしくは改善または障害の寛解を、特定の障害の関連する臨床兆候に従って、および関連する客観的臨床基準、例えば、特定の疾患または障害用のスコアリングシステムに従って、測定することができる。例えば、患者は、前記期間の間に、ＭＢＶの処置コースの結果として、処置コースの前のスコアと比較して障害の改善を示唆する疾患または障害の臨床スコアの低下を経験することができる。患者は、処置の前のスコアと比較して自己免疫障害スコアの低下を前記期間中に経験することができ、スコアは、前記期間の間、処置の前のスコアより低いままである。

対象に、処置コースを構成するＭＢＶの１回または複数回の投与を施すことができる。処置コースは、好ましくは全身投与される。処置コースは、ＭＢＶの週に１回４週間、週に１回３週間、週に１回２週間、週に１回１週間（すなわち、１回だけの投与）、週に２回４週間、週に２回３週間、週に２回２週間、週に２回１週間、週に３回４週間、週に３回３週間、週に３回２週間、週に３回１週間、週に４回１週間、週に４回２週間、週に４回３週間、または週に４回４週間の投与であり得る。

一実施形態では、対象は、週に１回４週間、週に１回３週間、週に１回２週間、週に１回１週間（すなわち、１回だけの投与）、週に２回４週間、週に２回３週間、週に２回２週間、週に２回１週間、週に３回４週間、週に３回３週間、週に３回２週間、週に３回１週間、週に４回１週間、週に４回２週間、週に４回３週間、または週に４回４週間の初期処置コース、続いて、初期処置コースの完了から１カ月後、２カ月後、３カ月後、４カ月後、５カ月後、６カ月後、７カ月後、８カ月後、９カ月後、１０カ月後、１１カ月後、または１２カ月後に維持コースを受ける。一実施形態では、患者は、処置コースの６カ月後に維持コースを受ける。維持コースは、処置コースと同じであることもあり、または異なることもある。維持コースは、ＭＢＶの週に１回４週間、週に１回３週間、週に１回２週間、週に１回１週間（すなわち、１回だけの投与）、週に２回４週間、週に２回３週間、週に２回２週間、週に２回１週間、週に３回４週間、週に３回３週間、週に３回２週間、週に３回１週間、週に４回１週間、週に４回２週間、週に４回３週間、または週に４回４週間の投与であり得る。維持コースを、３カ月ごとに、６カ月ごとに、９カ月ごとに、または毎年、投与することができる。一実施形態では、維持コースは、６カ月ごとに投与される。

一部の実施形態によれば、対象に１投与当たり体重１ｋｇにつきＭＢＶ１×１０^６～１×１０^１２個が投与される。別の実施形態では、対象に１投与当たり体重１ｋｇにつきＭＢＶ１×１０^７～１×１０^１１個が投与される。別の実施形態では、対象に１投与当たり体重１ｋｇにつきＭＢＶ１×１０^７～１×１０^８個が投与される。別の実施形態では、対象に１投与当たり体重１ｋｇにつきＭＢＶ１×１０^８～１×１０^１０個が投与される。別の実施形態では、対象に１投与当たり体重１ｋｇにつきＭＢＶ１×１０^９～１×１０^１０個が投与される。別の実施形態では、対象に１投与当たり体重１ｋｇにつきＭＢＶ１×１０^６～１×１０^８個が投与される。別の実施形態では、対象に１投与当たり体重１ｋｇにつきＭＢＶ１×１０^７～１×１０^９個が投与される。別の実施形態では、対象に１投与当たり体重１ｋｇにつきＭＢＶ１×１０^８～１×１０^１１個が投与される。別の実施形態では、対象に１投与当たり体重１ｋｇにつきＭＢＶ１×１０^９～１×１０^１１個が投与される。別の実施形態では、対象に１投与当たり体重１ｋｇにつきＭＢＶ１×１０^６～１×１０^１４個が投与される。別の実施形態では、対象に１投与当たり体重１ｋｇにつきＭＢＶ１×１０^１２～１×１０^１４個が投与される。一実施形態では、上述の量のいずれかによるＭＢＶの投与は、全身投与によるものである。

一実施形態によれば、対象が自己免疫障害に関連する症状の再燃を経験したとき、対象にＭＢＶの処置コースが投与される。一実施形態によれば、対象が寛解後に自己免疫疾患または障害の進行を経験したとき、対象に処置コースが投与される。一実施形態によれば、対象に、自己免疫疾患または障害の再燃または再発を防止するためにＭＢＶの処置コースが投与される。例えば、再燃または再発を防止するために、対象に、３カ月ごとに、４カ月ごとに、５カ月ごとに、６カ月ごとに、７カ月ごとに、８カ月ごとに、９カ月ごとに、１０カ月ごとに、１１カ月ごとに、または１年に１回、処置コースが投与される。

様々な自己免疫障害（例えば、慢性自己免疫障害など）が含まれる。一部の実施形態では、自己免疫障害は、皮膚、呼吸器系、生殖器系、心血管系または神経系を冒す、または主として冒す。一部の実施形態では、対象は、アジソン病、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性肝炎、セリアック病、クローン病、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、免疫性血小板減少症、ＩｇＡ腎症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、多発性硬化症、重症筋無力症、類天疱瘡、天疱瘡、多腺性自己免疫性症候群２型、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、強皮症、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、高安動脈炎（Takayasu's arteriosu）、１型糖尿病、潰瘍性大腸炎、または未分化結合組織病（ＵＣＴＤ）を有し得る。

一部の例では、自己免疫障害は、眼以外の自己免疫障害である。一部の実施形態では、自己免疫障害は、皮膚、呼吸器系、生殖器系、心血管系または神経系を冒す、または主として冒す。一部の実施形態では、対象は、アジソン病、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性肝炎、セリアック病、クローン病、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、免疫性血小板減少症、ＩｇＡ腎症、多発性硬化症、重症筋無力症、類天疱瘡、天疱瘡、多腺性自己免疫性症候群２型、乾癬、乾癬性関節炎、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、高安動脈炎、１型糖尿病、または未分化結合組織病（ＵＣＴＤ）を有し得る。一部の例では、自己免疫障害は、関節リウマチでも、強皮症でも、潰瘍性大腸炎でもない。

一部の実施形態では、対象は、関節リウマチ（ＲＡ）を有する。一部の例では、方法は、ＲＡを有する対象にＭＢＶの治療有効量を投与する（例えば、ＭＢＶの治療有効量を含む医薬調製物を投与することによる）ステップを含み、それにより、ＲＡが処置される。好ましくは、ＭＢＶは、例えば静脈内投与により、全身投与される。ＭＢＶを、例えば、腹腔内、筋肉内、経口、経腸、非経口、鼻腔内、直腸、舌下、口腔、皮下または唇下投与により、全身投与することもできる。方法は、ＲＡを有する対象を選択するステップを含み得る。様々な技法を使用して対象のＲＡを同定することができる。例えば、ＲＡは、イメージング（例えば、関節からの滑液、骨浸食、関節付近の骨量減少、軟部組織腫脹、および異常に小さい関節腔、亜脱臼を、例えばＸ線、ＭＲＩまたは超音波を使用して、同定するために）、血液検査（例えば、リウマチ因子（ＲＦ）、抗シトルリン化タンパク質抗体（ＡＣＰＡ、例えば、ＥＬＩＳＡなどを使用して抗ＣＣＰ抗体により測定されるような）、赤血球沈降速度（ＥＳＲ）、Ｃ反応性タンパク質、全血球数、腎機能、肝臓酵素レベル、または抗核抗体／ＡＮＡを同定するために）、および２０１０ＡＣＲ／ＥＵＬＡＲＲｈｅｕｍａｔｏｉｄＡｒｔｈｒｉｔｉｓＣｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎＣｒｉｔｅｒｉａ（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Aletaha et al., 2010 rheumatoid arthritis classification criteria: an American College of Rheumatology/European League Against Rheumatism collaborative initiative, Annals of the Rheumatic Diseases, 69 (9): 1580-8 (2010)）を使用して、同定することができる。一部の実施形態では、ＭＢＶは、ＲＡを処置するために全身投与される。特定の例では、ＭＢＶは、ＩＶ投与により投与される。他の例では、ＭＢＶは、経口投与により投与される。他の実施形態では、ＭＢＶは、筋肉内、皮下または腹腔内投与により投与される。一部の実施形態では、方法は、ＲＡの再燃の重症度または頻度を減少させることができる。例えば、一部の実施形態では、対象は、ＲＡの処置においてＭＢＶの処置コースからの長期間にわたって続く治療効果を経験する。好ましくは、ＭＢＶは、全身投与される。例えば、この長期間は、処置コースの開始から１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、または６カ月の期間であり得る。例えば、この長期間は、処置コースの終了から１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、または６カ月の期間であり得る。対象が経験する治療効果は、（ｉ）処置コースの前の症状の重症度と比較してＲＡの症状の重症度の前記期間にわたる低下、（ｉｉ）ＲＡもしくはその症状の前記期間にわたる寛解、（ｉｉｉ）前記期間の間のＲＡ再燃もしくは再発の防止、（ｉｖ）処置コースの前に経験した症状の重症度と比較して前記期間の間のＲＡ再燃もしくは再発中に経験する症状の重症度の低下、（ｖ）処置コースの前の再発もしくは再燃の頻度と比較して前記期間の間のＲＡ再発もしくは再燃の頻度の低下、または（ｖｉ）処置コースの完了後の前記期間の間のＲＡ疾患進行の徴候の非存在であり得る。ＲＡについて、症状の重症度の低下もしくは改善または障害の寛解を、関連する臨床兆候に従って、および関連する客観的臨床基準、例えば、ＲＡのＤＡＳ２８などのスコアリングシステムに従って、測定することができる。例えば、一実施形態では、対象は、処置コースの前の対象の関節炎スコアと比較して、処置コースの始まりから１カ月、２カ月または３カ月の期間にわたって関節炎スコア減少を経験し、このスコア減少は、処置コースが終了してもまだ維持される。一部の実施形態では、ＭＢＶの投与は、処置コースの開始時から１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、または６カ月以内にＲＡの寛解をもたらし、寛解は、処置コースが終了してもまだ維持される。一部の実施形態では、ＭＢＶの投与は、処置コースの開始からその１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、または６カ月後の終了までの期間の間、対象のＤＡＳ２８スコアの５．１未満への減少をもたらす。一部の実施形態では、ＭＢＶ処置コースの投与は、処置コースの開始からその１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、または６カ月後の終了までの期間の間、対象のＤＡＳ２８スコアの３．２未満への減少（低い疾患活動性）をもたらす。一部の実施形態では、ＭＢＶの投与は、処置コースの開始からその１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、または６カ月後の終了までの期間の間、対象のＤＡＳ２８スコアの２．６未満への減少をもたらし、すなわち、この投与によって寛解が得られる。一実施形態では、対象は、処置コースの開始からその１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、または６カ月後の終了まで測定される期間の間、ＤＡＳ２８スコアの減少を経験する。一部の実施形態では、ＤＡＳ２８スコアの減少は、１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月またはそれより長い期間の処置コースが終了してもまだ維持される。一実施形態では、ＤＡＳ２８スコアの減少は、ＭＢＶの全身投与によって達成される。一実施形態では、ＲＡの処置の治療効果は、処置コースの継続期間を超えて、例えば、１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月またはそれより長く、延長する。

一部の実施形態では、対象は、強皮症を有する。一部の例では、方法は、ＭＢＶの治療有効量を投与する（例えば、ＭＢＶの治療有効量を含む医薬調製物を投与することによる）ステップを含み、それにより、強皮症が処置される。好ましくは、ＭＢＶは、例えば静脈内投与により、全身投与される。様々な強皮症の種類、例えば、限局性強皮症、例えば限局性モルフェア、モルフェア－硬化性萎縮性苔癬オーバーラップ（ＬＳＡ）、汎発性モルフェア、Ｐａｓｉｎｉ－Ｐｉｅｒｉｎｉ皮膚萎縮症、汎硬化性モルフェア、深在性モルフェア、線状モルフェア、ならびに全身性強皮症、例えば、ＣＲＥＳＴ症候群および進行性全身性硬化症などを、開示される方法を使用して処置することができる。一部の実施形態では、ＭＢＶは、強皮症を処置するために全身投与される。特定の例では、ＭＢＶは、ＩＶまたは経口投与により投与される。ＭＢＶを、腹腔内、皮下または筋肉内投与により投与することもできる。方法は、強皮症の再燃の重症度または頻度を減少させることができる。方法は、強皮症の寛解をもたらすこともできる。

方法は、強皮症を有する対象を選択するステップを含み得る。様々な技法を使用して、強皮症を有する対象を同定することができる。例えば、強皮症についての検査は、臨床診断（例えば、肥厚した皮膚の領域、硬直、疲労、および寒冷曝露時の手指もしくは足指への血流不良を特定するものなど）、血液検査（例えば、抗核抗体としても公知の、免疫学的因子のレベル上昇についてのものなど）、肺機能検査（例えば、Ｘ線もしくはコンピュータ断層撮影（ＣＴスキャン）を使用して、肺機能を測定するためのものなど、例えば、肺損傷を特定ためのものなど）、心電図（例えば、うっ血性心不全もしくは心臓の電気的活動不全を特定するためのものなど）、心エコー検査（例えば、肺高血圧症もしくはうっ血性心不全を特定するためのものなど）、消化管検査（例えば、内視鏡検査もしくはマノメトリーなど）、または腎臓検査（例えば、血液検査を使用して高レベルのタンパク質を同定するためのものなど）を含み得る。一部の実施形態では、ＭＢＶは、強皮症を処置するために全身投与される。特定の例では、ＭＢＶは、ＩＶ投与により投与される。他の例では、ＭＢＶは、経口投与により投与される。他の実施形態では、ＭＢＶは、局所的に、例えば皮膚に、投与される。投与方法は、強皮症の再燃の重症度の頻度を減少させることができる。方法は、強皮症の寛解をもたらすこともできる。例えば、オリジナルまたは改変Ｒｏｄｎａｎスコアを使用して、強皮症の重症度を測定することができる。Ｒｏｄｎａｎスコアは、身体の１７の解剖学的表面領域の皮膚肥厚の重症度に０～３のスコアを付け、全ての表面スコアを合計することにより決定される。３の表面スコアは、皮膚をつまんで折り目にすることができない著しく厚い皮膚を表す。成人については０の表面スコアが健康であるが、小児は、０または１の健康スコアを有し得る。一実施形態では、対象は、ＭＢＶ投与の結果として表面スコアの０または１への低下を経験し、寛解を経験する。別の実施形態では、対象は、ＭＢＶ投与の結果として表面スコアの２またはそれ未満への低下を経験する（３は、重度の疾患を示唆する）。一実施形態では、対象は、ＭＢＶ投与時からのＲｏｄｎａｎスコアの減少を経験し、投与から１カ月、２カ月または３カ月にわたって減少した状態を維持する。一実施形態では、この減少は、ＭＢＶの全身投与によって達成される。一実施形態では、強皮症の処置の治療効果は、処置コースの継続期間を超えて、例えば、１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月またはそれより長く、延長する。

一部の実施形態では、対象は、潰瘍性大腸炎を有する。一部の例では、方法は、ＭＢＶの治療有効量を投与する（例えば、ＭＢＶの治療有効量を含む医薬調製物を投与することによる）ステップを含み、それにより、潰瘍性大腸炎が処置される。好ましくは、ＭＢＶは、例えば静脈内投与により、全身投与される。方法は、潰瘍性大腸炎を有する対象を選択するステップを含み得る。様々な技法を使用して、潰瘍性大腸炎を有する対象を同定することができる。例えば、潰瘍性大腸炎についての検査は、完全血球算定（例えば、貧血もしくは血小板増加症を特定するためのものなど）、電解質もしくは腎機能検査（例えば、低カリウム血症、低マグネシウム血症もしくは腎前性腎不全を特定するためのものなど）、肝機能検査（例えば、原発性硬化性胆管炎を特定するためのものなど）、Ｘ線、尿検査、便培養（例えば、寄生虫もしくは感染性病原体を特定するためのものなど）、赤血球沈降速度もしくはＣ反応性タンパク質測定（例えば、炎症を特定するためのものなど）、またはＳ状結腸鏡検査（例えば、大腸における潰瘍を特定するためのものなど）を含み得る。一部の例では、臨床的大腸炎活動指数（clinical colitis activity index）を使用して、潰瘍性大腸炎の重症度を評価することができる。一部の実施形態では、ＭＢＶは、潰瘍性大腸炎を処置するために全身投与される。特定の例では、ＭＢＶは、ＩＶ投与により投与される。他の例では、ＭＢＶは、経口投与により投与される。一部の例では、ＭＢＶは、腹腔内、皮下または筋肉内投与により投与される。ＭＢＶを、局所的に、例えば消化管に、投与することができる。方法は、潰瘍性大腸炎の再燃の重症度または頻度を減少させることができる。方法は、潰瘍性大腸炎疾患の臨床的寛解および内視鏡的寛解をもたらすこともできる。例えば、一部の実施形態では、ＭＢＶの投与は、処置の前のスコアと比較して潰瘍性大腸炎のＭａｙｏスコアまたは潰瘍性大腸炎疾患活動性指数（ＵＣＤＡＩ）の減少をもたらす。一実施形態では、患者は、Ｍａｙｏスコアの２またはそれ未満への低下を経験し、寛解を経験する。別の実施形態では、患者は、Ｍａｙｏスコアの５またはそれ未満への低下を経験する。別の実施形態では、患者は、Ｍａｙｏスコアの１０未満への低下を経験する。一実施形態では、対象は、ＭＢＶ処置コースの開始時から測定されるＭａｙｏスコアまたはＵＣＤＡＩスコアの減少を経験し、その後、１カ月、２カ月、または３カ月にわたって減少した状態を維持する。一実施形態では、この減少は、ＭＢＶの全身投与によって達成される。一実施形態では、潰瘍性大腸炎の処置の治療効果は、処置コースの継続期間を超えて、例えば、１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月またはそれより長く、延長する。

一部の実施形態では、対象は、クローン病を有する。一部の例では、方法は、ＭＢＶの治療有効量を投与する（例えば、ＭＢＶの治療有効量を含む医薬調製物を投与することによる）ステップを含み、それにより、クローン病が処置される。好ましくは、ＭＢＶは、例えば静脈内投与により、全身投与される。一部の例では、ＭＢＶは、腹腔内、皮下または筋肉内投与により投与される。開示される方法を使用して、回結腸クローン病、結腸クローン病、胃十二指腸クローン病および空回腸炎を含めた様々な種類のクローン病を処置することができる。作用因子により引き起こされるクローン病、例えば、免疫系機能不全（例えば、自己免疫性、または自然免疫障害）、遺伝的要因、腸内細菌の変化、および環境因子により引き起こされるクローン病などを、処置することができる。方法は、クローン病を有する対象を選択するステップを含み得る。様々な技法を使用して、クローン病を有する対象を同定することができる。例えば、クローン病についての検査は、内視鏡検査（例えば、結腸内視鏡検査など）、イメージング（例えば、バリウム造影Ｘ線、ＣＴスキャン、およびＭＲＩスキャンを使用するものなど）、および血液検査（例えば、鉄、ビタミンＤまたはビタミンＢ１２欠乏、赤血球沈降速度（ＥＳＲ）、およびＣ反応性タンパク質レベルを特定するためのものなど）を含み得る。一部の実施形態では、ＭＢＶは、クローン病を処置するために全身投与される。特定の例では、ＭＢＶは、ＩＶ投与により投与される。他の例では、ＭＢＶは、経口投与により投与される。ＭＢＶを、局所的に、例えば消化管に、投与することができる。方法は、クローン病の再燃の重症度または頻度を減少させることができる。方法は、クローン病の臨床的寛解および内視鏡的寛解をもたらすこともできる。例えば、一部の実施形態では、ＭＢＶの投与は、処置の前のスコアと比較してクローン病疾患活動性指数（ＣＤＡＩ）の減少をもたらす。一実施形態では、患者は、ＣＤＡＩスコアの１５０未満への低下を経験し、寛解を経験する。別の実施形態では、患者は、ＣＤＡＩスコアの４５０未満への低下を経験する（４５０またはそれより大きいスコアは、重度の疾患を示唆する）。別の実施形態では、患者は、ＭＢＶ処置の結果として少なくとも７０ＣＤＡＩポイントの降下（治療応答を示唆する）を経験する。例えば、別の実施形態では、患者は、ＭＢＶ処置の結果としてＭＢＶ投与時からの少なくとも７０ＣＤＡＩポイントの降下（治療応答を示唆する）を経験し、投与から１カ月、２カ月、または３カ月もしくはそれより長くにわたって減少した状態を維持する。一実施形態では、対象は、ＭＢＶ投与時からのＣＤＡＩスコアの減少を経験し、投与から１カ月、２カ月または３カ月にわたって減少した状態を維持する。一実施形態では、この減少は、ＭＢＶの全身投与によって達成される。一実施形態では、クローン病の処置の治療効果は、処置コースの継続期間を超えて、例えば、１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月またはそれより長く、延長する。

一部の実施形態では、対象は、天疱瘡を有する。一部の例では、方法は、ＭＢＶの治療有効量を投与する（例えば、ＭＢＶの治療有効量を含む医薬調製物を投与することによる）ステップを含み、それにより、天疱瘡が処置される。好ましくは、ＭＢＶは、例えば静脈内投与により、全身投与される。一部の例では、ＭＢＶは、腹腔内、皮下または筋肉内投与により投与される。一部の例では、ＭＢＶは、局部的皮膚投与により局所投与される。様々な天疱瘡の種類、例えば、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、ＩｇＡ天疱瘡、または腫瘍随伴性天疱瘡などを、開示される方法を使用して処置することができる。方法は、天疱瘡を有する対象について選択するステップを含み得る。様々な技法を使用して、天疱瘡を有する対象を同定することができる。例えば、天疱瘡についての検査は、臨床診断（例えば、眼および口腔粘膜における病変によって）、皮膚または粘膜生検（例えば、棘細胞離開によって生じた皮内小胞を特定するためのものなど）、および血液試料に関するＥＬＩＳＡまたは皮膚生検に関する免疫蛍光検査（例えば、抗デスモグレイン自己抗体を同定するためのものなど）を含み得る。一部の実施形態では、ＭＢＶは、天疱瘡を処置するために全身投与される。特定の例では、ＭＢＶは、ＩＶ投与により投与される。他の例では、ＭＢＶは、経口投与により投与される。他の実施形態では、ＭＢＶは、皮膚に局所投与される。方法は、天疱瘡の再燃の重症度または頻度を減少させることができる。方法は、天疱瘡の寛解をもたらすこともできる。症状の重症度の低下は、ＭＢＶ投与時からのＰＤＡＩ（天疱瘡疾患指数）の減少または自己免疫性水疱性皮膚障害強度スコア（ＡＢＳＩＳ）の減少に基づき得る。中等度の疾患は、ＰＤＡＩ＜１５またはＡＢＳＩＳ＜１７であり、有意な疾患は、１５～４４の間のＰＤＡＩまたは１７～５３の間のＡＢＳＩＳであり、広範囲の疾患は、４５より大きいＰＤＡＩまたは５３より大きいＡＢＳＩＳである。一実施形態では、対象は、ＰＤＡＩスコアの１５未満へのまたはＡＢＳＩＳスコアの１７未満への低下を経験し、寛解を経験する。別の実施形態では、対象は、ＰＤＡＩスコアの４５未満へのまたはＡＢＳＩＳスコアの５３未満への低下を経験する（４５もしくはそれより大きいＰＤＡＩスコアまたは５３もしくはそれより大きいＡＢＳＩＳスコアは、重度の疾患を示唆する）。一実施形態では、対象は、ＭＢＶ投与時からのＰＤＡＩスコアの減少を経験し、投与から１カ月、２カ月または３カ月にわたって減少した状態を維持する。一実施形態では、この減少は、ＭＢＶの全身投与によって達成される。一実施形態では、天疱瘡の処置の治療効果は、処置コースの継続期間を超えて、例えば、１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月またはそれより長く、延長する。

他の実施形態では、対象は、類天疱瘡を有する。一部の例では、方法は、ＭＢＶの治療有効量を投与する（例えば、ＭＢＶの治療有効量を含む医薬調製物を投与することによる）ステップを含み、それにより、類天疱瘡が処置される。好ましくは、ＭＢＶは、例えば静脈内投与により、全身投与される。一部の例では、ＭＢＶは、腹腔内、皮下または筋肉内投与により投与される。一部の例では、ＭＢＶは、局部的皮膚投与により局所投与される。様々な類天疱瘡の種類、例えば、ＩｇＧ媒介類天疱瘡、例えば、妊娠性、水疱性および瘢痕性類天疱瘡、ならびにＩｇＡ媒介類天疱瘡、例えば、ＩｇＡ媒介免疫水疱性疾患などを、開示される方法を使用して処置することができる。方法は、類天疱瘡を有する対象を選択するステップを含み得る。様々な技法を使用して、類天疱瘡を有する対象を選択することができる。例えば、類天疱瘡についての検査は、臨床診断（例えば、別の特定可能な原因がない皮膚の緊満性水疱およびびらん；剥離性歯肉炎、または口腔、眼、鼻、生殖器、肛門、咽頭、喉頭および／もしくは食道の粘膜を冒す粘膜炎；あるいは原因不明のそう痒、そう痒性湿疹性発疹、または蕁麻疹様局面を特定するためのものなど）、病理組織診断（例えば、病変組織を、例えばパンチ生検とヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を使用して、特定するためのものなど）、直接免疫蛍光検査（ＤＩＦ；例えば、生検標本において組織結合抗体を同定するためのものなど）、間接免疫蛍光検査（例えば、基底膜ゾーンの抗原を標的とする循環抗体を、例えば唾液試料を使用して、同定するためのものなど）、および抗原特異的血清学的検査（例えば、ＮＣ１６Ａ、ＢＰ１８０、ＢＰ２３０、ラミニン３３２またはＶＩＩ型コラーゲンに対する自己抗体を、例えばＥＬＩＳＡを使用して、同定するためのものなど）を含み得る。一部の実施形態では、ＭＢＶは、類天疱瘡を処置するために全身投与される。特定の例では、ＭＢＶは、ＩＶ投与により投与される。他の例では、ＭＢＶは、経口投与により投与される。他の実施形態では、ＭＢＶは、皮膚に局所投与される。方法は、類天疱瘡の再燃の頻度の重症度を減少させることができる。方法は、類天疱瘡の寛解をもたらすこともできる。症状の重症度の低下は、ＭＢＶ投与時からのＰＤＡＩ（天疱瘡疾患指数）の減少または自己免疫性水疱性皮膚障害強度スコア（ＡＢＳＩＳ）の減少に基づき得る。中等度の疾患は、ＰＤＡＩ＜１５またはＡＢＳＩＳ＜１７であり、有意な疾患は、１５～４４の間のＰＤＡＩまたは１７～５３の間のＡＢＳＩＳであり、広範囲の疾患は、４５より大きいＰＤＡＩまたは５３より大きいＡＢＳＩＳである。一実施形態では、対象は、ＰＤＡＩスコアの１５未満へのまたはＡＢＳＩＳスコアの１７未満への低下を経験し、寛解を経験する。別の実施形態では、対象は、ＰＤＡＩスコアの４５未満へのまたはＡＢＳＩＳスコアの５３未満への低下を経験する（４５もしくはそれより大きいＰＤＡＩスコアまたは５３もしくはそれより大きいＡＢＳＩＳスコアは、重度の疾患を示唆する）。一実施形態では、対象は、ＭＢＶ投与時からのＰＤＡＩまたはＡＢＳＩＳスコアの減少を経験し、投与から１カ月、２カ月または３カ月にわたって減少した状態を維持する。一実施形態では、この減少は、ＭＢＶの全身投与によって達成される。一実施形態では、類天疱瘡疾患の処置の治療効果は、処置コースの継続期間を超えて、例えば、１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月またはそれより長く、延長する。

さらなる実施形態では、対象は、乾癬を有する。一部の例では、方法は、ＭＢＶの治療有効量を投与する（例えば、ＭＢＶの治療有効量を含む医薬調製物を投与することによる）ステップを含み、それにより、乾癬が処置される。一部の実施形態では、必要な対象における乾癬を処置するための方法であって、対象に、細胞外マトリックス由来の単離されたＭＢＶの治療有効量を含む医薬調製物を投与するステップを含み、それにより、対象における乾癬が処置される、方法が、開示される。医薬調製物を全身投与することができる。医薬組成物を、対象の皮膚に局部的など、局所投与することができる。一部の実施形態では、医薬組成物は、対象の皮膚の１つまたは複数の局面に投与される。多様な種類の乾癬、例えば、尋常性乾癬、滴状乾癬、逆乾癬、膿疱性乾癬、および乾癬性紅皮症などが、含まれる。方法は、乾癬を有する対象を選択するステップを含み得る。様々な技法を使用して、対象の乾癬を同定することができる。例えば、乾癬についての検査は、臨床診断（例えば、痛いこともあり、かゆいこともある、皮膚のうろこ状の紅斑性の局面、丘疹または斑を特定することによるものなど）または皮膚生検もしくは擦過（例えば、真皮とかみ合うクラブ状の表皮突起、表皮肥厚、皮膚の最表面層からの異常な皮膚細胞、または炎症性浸潤物を特定するためのものなど）を含み得る。一部の実施形態では、ＭＢＶは、乾癬を処置するために全身投与される。特定の例では、ＭＢＶは、ＩＶ投与により投与される。他の例では、ＭＢＶは、経口投与により投与される。他の実施形態では、ＭＢＶは、皮膚または病変に局所投与される。方法は、乾癬の再燃の頻度または重症度を減少させることができる。方法は、乾癬の寛解をもたらすことができる。症状の重症度の低下、または寛解は、ＰＡＳＩスコア（乾癬面積重症度指数）の減少に基づくものであり得、複数の基準に０～４の間のスコアが付けられ、それらの基準が合計される。軽度の乾癬は、０～５の間のＰＡＳＩスコアであり、中等度の乾癬は、５～１２の間のＰＡＳＩスコアであり、重度の乾癬は、１２～２０の間のＰＡＳＩスコアであり、非常に重度の乾癬は、２０より大きいＰＡＳＩスコアである。一実施形態では、対象は、治療応答を示唆する、ベースラインからＰＡＳＩスコアの７５％またはそれを超える向上である、ＰＡＳＩ７５を、ＭＢＶ処置コースの結果として経験する。一実施形態では、対象は、ＭＢＶ処置コースの結果として、ＰＡＳＩスコアの約０への低下を経験し、寛解を経験する。別の実施形態では、対象は、ＭＢＶ処置コースの結果として、ＰＡＳＩスコアの２０未満への低下を経験する（２０またはそれより大きいスコアは、重度の疾患を示唆する）。一実施形態では、対象は、ＭＢＶ処置コースの開始時からのＰＡＳＩスコアの減少を経験し、投与から１カ月、２カ月、または３カ月もしくはそれより長きにわたって減少した状態を維持する。一実施形態では、この減少は、ＭＢＶの全身投与によって達成される。一実施形態では、乾癬の処置の治療効果は、処置コースの継続期間を超えて、例えば、１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月またはそれより長く、延長する。

さらなる実施形態では、対象は、乾癬性関節炎を有する。一部の例では、方法は、ＭＢＶの治療有効量を投与する（例えば、ＭＢＶの治療有効量を含む医薬調製物を投与することによる）ステップを含み、それにより、乾癬性関節炎が処置される。好ましくは、ＭＢＶの投与は、開示される方法を使用して処置され得る、少数関節型、多関節型、破壊性関節炎、破壊性関節炎、脊椎関節炎および遠位指節間関節炎などの様々な種類の乾癬性関節炎ごとである。方法は、乾癬性関節炎を有する対象について選択するステップを含み得る。様々な技法を使用して、乾癬性関節炎を有する対象を同定することができる。例えば、乾癬性関節炎についての検査は、臨床診断（例えば、乾癬もしくは乾癬性関節炎の家族歴、爪甲離床症（onycholysi）、手の遠位指節間関節、腱付着部炎、または指炎を特定するためのものなど）、血液検査（例えば、リウマトイド因子について陰性の結果を確認するためのものなど）、およびＸ線（例えば、変形性関節変化を特定するためのものなど）を含み得る。一部の実施形態では、ＭＢＶは、乾癬性関節炎を処置するために全身投与される。特定の例では、ＭＢＶは、ＩＶ投与により投与される。他の例では、ＭＢＶは経口投与により投与される。他の実施形態では、ＭＢＶは、局所的に、例えば関節内に、投与される。方法は、乾癬性関節炎の再燃の頻度または重症度を減少させることができる。方法は、乾癬性関節炎の寛解をもたらすことができる。乾癬性関節炎の疾患活動性指数（ＤＡＰＳＡ）スコアの減少を使用して応答を判定することができる。一実施形態では、対象は、ＭＢＶ処置コースの結果として、ＤＡＰＳＡスコアの４未満への低下を経験し、寛解を経験する。一部の実施形態では、対象は、治療応答を示唆する、５０％、７５％または８５％のＤＡＰＳＡスコアの低下をＭＢＶ処置コースの結果として経験する。別の実施形態では、対象は、ＭＢＶ処置コースの結果として、ＤＡＰＳＡスコアの２８未満への低下を経験する（２８またはそれより高いスコアは、高い疾患活動性を示唆する）。一実施形態では、対象は、ＭＢＶ投与の結果としてＤＡＰＳＡスコアの減少を経験し、ＭＢＶ処置コースの開始から１カ月、２カ月または３カ月にわたって減少した状態を維持する。一実施形態では、この減少は、ＭＢＶの全身投与によって達成される。一実施形態では、乾癬性関節炎の処置の治療効果は、処置コースの継続期間を超えて、例えば、１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月またはそれより長く、延長する。

一部の実施形態では、対象は、多発性硬化症を有する。一部の例では、方法は、ＭＢＶの治療有効量を投与する（例えば、ＭＢＶの治療有効量を含む医薬調製物を投与することによる）ステップを含み、それにより、多発性硬化症が処置される。好ましくは、ＭＢＶは、全身投与、例えば静脈内投与により送達される。一部の例では、ＭＢＶは、腹腔内、皮下または筋肉内投与により投与される。様々な多発性硬化症の種類、例えば、再発寛解型、二次進行型、一次進行型、および臨床的に初発の段階の多発性硬化症などを、開示される方法を使用して処置することができる。方法は、多発性硬化症を有する対象を選択するステップを含み得る。様々な技法を使用して、多発性硬化症を有する対象を同定することができる。例えば、多発性硬化症についての検査は、臨床診断（例えば、身体的、精神的および精神科的症状、例えば、複視、片側の眼の失明、筋力低下、感覚または協調障害によるものなど）、イメージング（例えば、脱髄の領域を、例えば病変または斑により、特定するためのものなど）、腰椎穿刺（例えば、ＩｇＧのオリゴクローナルバンドを、例えば脳脊髄液において、例えば電気泳動により、同定するためのものなど）、視覚および感覚誘発電位、ならびに生検を含み得る。一部の実施形態では、ＭＢＶは、多発性硬化症を処置するために全身投与される。特定の例では、ＭＢＶは、ＩＶ投与により投与される。他の実施形態では、ＭＢＶは、経口投与により投与される。方法は、多発性硬化症の再燃の頻度または重症度を減少させることができる。方法は、多発性硬化症の寛解をもたらすことができる。方法は、疾患進行を防止することもできる。総合障害度スコア（ＥＤＳＳ）の減少を使用して応答を判定することができる。一実施形態では、患者は、身体障害の寛解を示唆する、ＥＤＳＳスコアの１．５またはそれ未満への低下をＭＢＶ処置コースの結果として経験する。別の実施形態では、対象の２５フィート歩行能力は、ＭＢＶ処置コースの結果として改善する。別の実施形態では、患者は、ＥＤＳＳスコアの８．５未満への低下を経験する（８．５またはそれより大きいスコアは、非常に重度の身体障害を示唆する）。一実施形態では、対象は、ＭＢＶ投与の結果としてＥＤＳＳスコアの減少を経験し、ＭＢＶ処置コースの開始から１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、または６カ月にわたって減少した状態を維持する。一実施形態では、この減少は、ＭＢＶの全身投与によって達成される。一実施形態では、ＭＳの処置の治療効果は、処置コースの継続期間を超えて、例えば、１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月またはそれより長く、延長する。

さらなる実施形態では、対象は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を有する。一部の例では、方法は、ＭＢＶの治療有効量を投与する（例えば、ＭＢＶの治療有効量を含む医薬調製物を投与することによる）ステップを含み、それにより、ＳＬＥが処置される。好ましくは、ＭＢＶは、全身投与により、例えば、静脈内投与により投与される。一部の例では、ＭＢＶは、腹腔内、皮下または筋肉内投与により投与される。様々な理由に起因する全身性エリテマトーデス、例えば、遺伝的要因、薬物反応または他のループス（例えば、円板状、皮膚ループス）に起因するＳＬＥなどを、開示される方法を使用して処置することができる。方法は、ＳＬＥを有する対象を選択するステップを含み得る。様々な技法を使用して、ＳＬＥを有する対象を選択することができる。例えば、ＳＬＥについての検査は、血清学的検査（例えば、抗核抗体（ＡＮＡ）、抗抽出可能核抗原（抗ＥＮＡ）、抗ｄｓＤＮＡ、抗Ｕ１ＲＮＰ（全身性硬化症および混合性結合組織病の際にも出現する）、ＳＳ－Ａ（または抗Ｒｏ）、およびＳＳ－Ｂ（または抗Ｌａ）についてのものなど）、補体系レベル、電解質レベルおよび腎機能、肝酵素レベル、完全血球算定、ならびにエリテマトーデス（ＬＥ）細胞試験を含み得る。一部の実施形態では、ＭＢＶは、ＳＬＥを処置するために全身投与される。特定の例では、ＭＢＶは、ＩＶ投与により投与される。他の実施形態では、ＭＢＶは、経口投与により投与される。方法は、ＳＬＥの再燃の重症度または頻度を減少させることができる。方法は、ＳＬＥの寛解をもたらすことができる。疾患重症度は、ＳＬＥ疾患活動性指数（ＳＬＥＤＡＩ）またはＢＩＬＡＧスコアにより測定することができる。一実施形態では、対象は、寛解を示唆する、ＳＬＥＤＡＩスコアの３もしくはそれ未満への低下またはＢＩＬＡＧスコアのＤもしくはＥへの低下をＭＢＶ処置コースの結果として経験する。一実施形態では、対象は、治療応答を示唆する、ＳＬＥＤＡＩスコアの４もしくはそれより大きい低下またはＢＩＬＡＧスコアのＣもしくはそれ未満への低下をＭＢＶ処置コースの結果として経験する。別の実施形態では、対象は、ＭＢＶ処置コースの結果として、ＳＬＥＤＡＩの７．５未満への低下またはＢＩＬＡＧスコアのＡからＢへの低下を経験する（７．５もしくはそれより大きいＳＬＥＤＡＩスコアまたはＡのＢＩＬＡＧスコアは、重度の疾患を示唆する）。一実施形態では、対象は、ＭＢＶ投与の結果としてＳＬＥＤＡＩまたはＢＩＬＡＧスコアの減少を経験し、ＭＢＶ処置コースの開始時から１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、または６カ月にわたって減少した状態を維持する。一実施形態では、この減少は、ＭＢＶの全身投与によって達成される。一実施形態では、ＭＳの処置の治療効果は、処置コースの継続期間を超えて、例えば、１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月またはそれより長く、延長する。

方法は、自己免疫性脳炎を有する対象について選択するステップを含み得る。一部の例では、方法は、ＭＢＶの治療有効量を投与する（例えば、ＭＢＶの治療有効量を含む医薬調製物を投与することによる）ステップを含み、それにより、自己免疫性脳炎が処置される。様々な技法を使用して、自己免疫性脳炎を有する対象を選択することができる。例えば、脳炎を有する対象を選択するステップは、炎症を判定するための脳スキャン（例えば、ＭＲＩを使用するものなど）；ＥＥＧ（例えば、脳炎が異常な信号を生じさせることになる、脳の活動のモニタリングなど）、腰椎穿刺（脊椎穿刺）、血液検査、尿検査、およびウイルスＤＮＡの存在を検出するための（例えば、ウイルス性脳炎を特定するための）脳脊髄液のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）検査を含み得る。一部の実施形態では、ＭＢＶは、自己免疫性脳炎を処置するために全身投与される。特定の例では、ＭＢＶは、ＩＶまたは経口投与により投与される。一部の実施形態では、ＭＢＶは、全身投与により、例えば、静脈内投与により投与される。一部の例では、ＭＢＶは、腹腔内、皮下または筋肉内投与により投与される。他の実施形態では、ＭＢＶは、脳に局所的に、例えば脳内注射により、投与される。一部の実施形態では、投与方法は、自己免疫性脳炎の再燃の頻度もしくは重症度を減少させることができ、または自己免疫脳炎に関連する炎症を減少させることができ、その結果、患者は、自己免疫脳炎をもはや有さないか、または自己免疫性脳炎が寛解期にある。一実施形態では、自己免疫性脳炎の処置の治療効果は、処置コースの継続期間を超えて、例えば、１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月またはそれより長く、延長する。

投与は、全身的であり得る。全身投与の例示的な経路としては、これだけに限定されないが、静脈内投与、経口投与、経腸投与、非経口投与、鼻腔内投与、直腸投与、舌下投与、口腔投与、唇下投与、腹腔内投与、経皮、経粘膜、皮下または筋肉内投与が挙げられる。特定の、非限定的な例では、全身投与は、静脈内投与である。

投与は、局所的であり得る。局所投与の例示的な経路としては、関節内注射、局部的皮膚投与、くも膜下腔内投与および皮内投与、または目的の組織もしくは臓器上もしくは内への直接注射もしくは適用によるものが挙げられる。

投薬処置は、最終的に１投与当たり体重１ｋｇにつきＭＢＶ１×１０^６～１×１０^１２個（すなわち、小胞の絶対数）を送達するための、単回投与スケジュールまたは複数回投与スケジュールであり得る。投与は、単回投与として、周期的ボーラスとして、または持続注入、例えば、徐放薬もしくは薬物送達デバイスからの特定の期間の連続放出による持続注入として、提供することができる。対象に適切な量にみあった用量を投与することができる。複数回投与を施す場合、投与は、間欠的であり得る。例示的な実施形態では、ＭＢＶの治療有効量の投与（例えば、全身投与、例えば静脈内投与、または任意の他の投与経路など）を１回行うことができ、または繰り返し、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０回など、行うことができる。例示的な実施形態では、投与を隔週、毎週、２週間ごとに、毎月、または２、３、４、５もしくは６カ月ごとに行うことができる。他の実施形態では、治療利益を得るために単回投与しか必要とされない。他の実施形態では、処置コースの開始から１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月または６カ月間、治療利益を得るために、１処置コースしか必要とされない。他の実施形態では、処置コースの終了から１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月または６カ月続く治療利益を得るために、１処置コースしか必要とされない。

個々の用量は、典型的には、対象に対して測定可能な効果を生じさせるために必要とされる量以上であり、対象組成物またはその副産物の吸収、分布、代謝および排泄（「ＡＤＭＥ」）の薬物動態および薬理に基づいて、したがって、対象体内の組成物の性質に基づいて、決定することができる。これは、投与経路はもちろん投薬量も考慮することを含み、投薬量は、局所および全身（例えば、静脈内）適用用に調整され得る。投与の有効量および／または投与レジメンは、経験的に、前臨床アッセイから、安全性および漸増および用量範囲試験、個々の臨床医と患者の関係、ならびにｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏアッセイから容易に決定することができる。一般に、これらのアッセイは、自己免疫障害（例えば、関節リウマチ、強皮症、潰瘍性大腸炎、天疱瘡、クローン病、乾癬、乾癬性関節炎、硬化症、または全身性エリテマトーデスなど）を評価することになる。

ＭＢＶの治療有効量を、例えば、約３．０～約８．０のｐＨ、好ましくは、約３．５～約７．４、３．５～６．０、または３．５～約５．０のｐＨの等張性緩衝液中の、薬学的に許容される担体（例えば、医薬調製物中の）に再懸濁させることができる。有用な緩衝剤としては、クエン酸ナトリウム－クエン酸、およびリン酸ナトリウム－リン酸、および酢酸ナトリウム／酢酸緩衝剤が挙げられる。他の薬剤、例えば、保存薬および抗菌剤などを、組成物に添加することができる。これらの組成物を局所的に、または全身的に、例えば静脈内に、投与することができる。

ＭＢＶの治療有効量を含む医薬調製物を、正確な投薬量の個々の投与に適した単位剤形に製剤化することができる。投与される活性化合物の量は、処置される対象、病気の重症度、および投与様式に依存することになり、処方する臨床医の判断に委ねることが最良である。これらの縛りの中で、投与される製剤は、ある量の活性成分を処置される対象において所望の効果を実現するために有効な量で含有することになる。例示的な実施形態では、ＭＢＶでの処置は、投与時に存在する自己免疫障害（例えば、関節リウマチ、強皮症、潰瘍性大腸炎、天疱瘡、クローン病、乾癬、乾癬性関節炎、硬化症、または全身性エリテマトーデスなど）の徴候または症状の減少または低減をもたらす。

ＭＢＶの投与は、対象への治療利益をもたらす。治療利益は、例えば時間および／または強度の関数として、変化し得る。例示的な実施形態では、対象は、ＭＢＶの投与後、長期間にわたって治療利益を経験する。例えば、対象は、少なくとも３日、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも１カ月、少なくとも２カ月、少なくとも３カ月、少なくとも４カ月、少なくとも５カ月、少なくとも６カ月またはそれより長い期間続く治療利益を経験することができる。

一部の実施形態では、対象は、ＭＢＶの投与からの少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも１カ月、少なくとも２カ月、または少なくとも３カ月の期間続く治療利益を経験する。さらなる実施形態では、投与からの治療利益は、処置コースが完了してもさらに少なくとも１週間続く。さらに他の実施形態では、投与からの治療利益は、処置コースが完了してもさらに少なくとも２週間続く。さらなる実施形態では、投与からの治療利益は、処置コースが完了してもさらに少なくとも１カ月続く。一部の実施形態では、投与からの治療利益は、処置コースが完了してもさらに少なくとも２カ月続く。さらなる実施形態では、投与からの治療利益は、処置コースが完了してもさらに少なくとも３カ月またはそれより長く続く。さらなる実施形態では、投与からの治療利益は、処置コースが完了してもさらに少なくとも６カ月またはそれより長く続く。さらに他の実施形態では、治療利益は、投与時に存在する障害の症状の低減である。

一部の例では、ＭＢＶでの処置は、ＭＢＶの投与前の自己免疫活性レベルと比較して対象における自己免疫活性の減少または低下をもたらすことができる。一部の例では、ＭＢＶでの処置は、自己免疫障害の寛解をもたらすことができる。一部の例では、ＭＢＶでの処置は、自己免疫障害（例えば、関節リウマチ、強皮症、潰瘍性大腸炎、天疱瘡、クローン病、乾癬、乾癬性関節炎、硬化症、または全身性エリテマトーデスなど）の徴候または症状の再燃の低減または消失をもたらすことができる。例えば、ＭＢＶでの処置は、処置コースが完了してもさらに長期間（例えば、少なくとも３日、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも１カ月、少なくとも２カ月、少なくとも３カ月、または少なくとも６カ月の期間など）、自己免疫障害の、再燃の低減もしくは消失、または徴候もしくは症状の低減もしくは排除をもたらすことができる。処置は、疾患または障害の寛解をもたらすことができる。

対象に追加的な治療剤を同じまたは異なる組成物または医薬調製物で投与することができる。例示的な実施形態では、対象は、自己免疫障害（例えば、関節リウマチ、強皮症、潰瘍性大腸炎、天疱瘡、クローン病、乾癬、乾癬性関節炎、硬化症、または全身性エリテマトーデスなど）を有し、対象に追加的な治療剤、例えば、抗炎症薬などが投与され、および／または免疫抑制薬が投与され得る。

一部の実施形態では、方法は、治療利益が達成されたことを検出するステップを含む。治療有効性の測定法は、修飾される特定の疾患に適用可能であり、当業者には治療有効性を測定するための使用に適している検出方法が分かるであろう。当技術分野で公知の任意の方法を使用して対象を応答について評価することができる。例示的な実施形態では、対象は、自己免疫障害（例えば、関節リウマチ、強皮症、潰瘍性大腸炎、天疱瘡、クローン病、乾癬、乾癬性関節炎、硬化症、または全身性エリテマトーデスなど）を有し、対象における治療応答を、抗核抗体検査（ＡＮＡ）、またはある特定の自己免疫型において産生される特異的自己抗体、身体の炎症についての検査などによって測定することができる。

例示的な方法が以下に開示される。

ここで一般的に説明している本開示は、以下の実施例を参照することによってより容易に理解されるであろう。以下の実施例は、本開示のある特定の態様および実施形態の例証を目的として含めるものに過ぎず、いかなる点においても本開示の範囲を限定することを意図したものではない。

（実施例１）
リピドミクスおよびＲＮＡシークエンシングによるマトリックス結合型小胞（ＭＢＶ）および細胞外小胞（ＥＶ）の鑑別
マトリックス結合型ナノ小胞（ＭＢＶ）は、ＥＣＭ生体足場に不可欠な成分として報告されている。液相細胞外小胞（ＥＶ）は、徹底した調査の対象となってきたが、ＭＢＶとのそれらの類似性は、サイズおよび形状に限定される。本実施例は、ＬＣ－ＭＳに基づくリピドミクスおよびレドックスリピドミクスを利用して、液相ＥＶリン脂質とＭＢＶリン脂質の詳細な比較を行った。小胞内カーゴの包括的ＲＮＡシークエンシングおよびバイオインフォマティック解析と併せて、本実施例は、ＭＢＶが、ＥＶの明確に区別できる特有の部分集団であることを示し、ＥＣＭに基づくバイオマテリアルの識別特色を示す。

本実施例は、ＥＶの液相（すなわち、エキソソーム）とマトリックス結合形態（すなわち、ＭＢＶ）との類似性および差異を特定する。しかし、生体液中に存在するＥＶ、ならびにネイティブ組織ＥＣＭおよびＥＣＭに基づくバイオマテリアル中に存在するＭＢＶが、複数の細胞源から分泌された異種集団に相当することを考えると、これらの推定的ＥＶ集団間の直接比較ｉｎｖｉｖｏ分析には問題がある。体液または組織由来小胞の使用に代わる手段として、培養細胞によりｉｎｖｉｔｒｏで産生されたＥＣＭおよび馴化培地を単離することができる（Fitzpatrick et al., Biomater Sci., 3, 12-24 (2015)。この手法には、単一細胞型源を使用することによって小胞の起源に関するあらゆる疑いを未然に取り除くこと；液相区画または固相区画のどちらかから小胞を選択的に回収することができること；ならびに細胞培養環境を制御することができ、それ故、小胞組成およびカーゴも制御することができることなどの、いくつかの利点がある。

材料および方法
ｉｎｖｉｔｒｏ細胞由来ＥＣＭの調製：ヒト骨髄幹細胞（ＢＭＳＣ）、ヒト脂肪幹細胞（ＡＳＣ）およびヒト臍帯幹細胞（ＵＣＳＣ）ＥＣＭプレートは、ＳｔｅｍＢｉｏＳｙｓ（ＳａｎＡｎｔｏｎｉｏ、Ｔｅｘａｓ）により提供されたものであり、それらを発表されているプロトコール（Lai et al., Stem cells and development 19, 1095-1107 (2010)）に従って調製した。簡単に述べると、ヒトＢＭＳＣ、ヒトＡＳＣ、またはヒトＵＣＳＣを、ヒトフィブロネクチンでコーティングされた７５ｃｍ^２の細胞培養フラスコに１ｃｍ^２当たり細胞３，５００個の細胞密度で播種し（３７℃で１時間）、２０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）と１％ペニシリン－ストレプトマイシンとを補充したα－ＭＥＭ培地で１４日間培養した。最初の播種の翌日、そしてその後、３日ごとに培地をリフレッシュした。７日目に、アスコルビン酸２－ホスフェート（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）を５０μＭの最終濃度で培地に添加した。１４日目に、２０ｍＭ水酸化アンモニウム中の０．５％Ｔｒｉｔｏｎを使用して５分間、プレートを脱細胞化し、カルシウムとマグネシウムの両方を含有するハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ＋／＋）で２回すすぎ、超純Ｈ_２Ｏで１回すすいだ。マウスＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞を、７５ｃｍ^２細胞培養フラスコに１ｃｍ^２当たり細胞３，５００個の細胞密度で播種し、エキソソーム枯渇ＦＢＳ（G. V. Shelke, et al, Journal of extracellular vesicles 3, 24783 (2014)）と１％ペニシリン－ストレプトマイシンとアスコルビン酸２－ホスフェート（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）とを５０μＭの最終濃度で補充したＤＭＥＭ培地で７日間培養した。７日目に、培養３Ｔ３線維芽細胞から上清を収集し、プレーティングした培養物をＰＢＳで３回洗浄し、２０ｍＭ水酸化アンモニウム中の０．５％Ｔｒｉｔｏｎを使用して５分間、脱細胞化し、そしてその後、超純Ｈ_２Ｏで３回すすいだ。

ＭＢＶおよび液相ＥＶの単離：ＭＢＶを単離した（L. Huleihel et al., Science advances 2, e1600502 (2016)）。簡単に述べると、脱細胞化されたＥＣＭを、緩衝剤（５０ｍＭＴｒｉｓｐＨ７．５、５ｍＭＣａＣｌ_２、１５０ｍＭＮａＣｌ）中の１００ｎｇ／ｍＬのＬｉｂｅｒａｓｅＤＬ（Ｒｏｃｈｅ）で１時間、３７℃で酵素によって消化した。液相ＥＶを含有する細胞培養上清、およびＭＢＶを含有する消化されたＥＣＭを、５００ｇ（１０分）、２５００ｇ（２０分）、および１０，０００ｇ（３０分）での分画遠心分離に供し、上清を０．２２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に通した。次いで、遊離したＭＢＶまたは液相ＥＶを含有する清澄化された上清を、４℃で７０分間、１００，０００×ｇで遠心分離（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒＯｐｔｉｍａＬ－９０ＫＵｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）して、小胞をペレット化した。次いで、小胞ペレットを洗浄し、１×ＰＢＳに再懸濁させ、さらなる使用まで－２０℃で保管した。

膀胱マトリックス（ＵＢＭ）の調製：ＵＢＭは、市場出荷体重のブタ（ＴｉｓｓｕｅＳｏｕｒｃｅ；ＬＬＣ、Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＩＮ）から調製した（L. Huleihel et al., Science advances 2, e1600502 (2016)）。簡単に述べると、漿膜、外筋層、粘膜下組織、および粘膜筋板を機械的剥離により除去し、粘膜の尿路上皮細胞を脱イオン水での洗浄により基底膜から解離させた。残存基底膜および固有層（まとめてＵＢＭと呼ぶ）を、４％エタノールを含有する０．１％過酢酸中で２時間、３００ｒｐｍで撹拌することにより脱細胞化し、続いてリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）および１型水での洗浄を行った。次いで、ＵＢＭを凍結乾燥させ、＃６０メッシュスクリーンを備えたＷｉｌｅｙＭｉｌｌを使用してミル粉砕した。

走査型電子顕微鏡検査（ＳＥＭ）：ＵＢＭを低温２．５％グルタルアルデヒドで２４時間固定し、続いて１×ＰＢＳでの３０分の洗浄を３回行った。その際、試料を洗浄ごとに３０分間、段階的アルコール系列（３０％、５０％、７０％、９０％、１００％エタノール）で脱水し、次いで、一晩、４℃の１００％エタノール中に入れておいた。試料を１００％エタノールでさらに３回、各回３０分間、洗浄し、ＬｅｉｃａＥＭＣＰＤ０３０ＣｒｉｔｉｃａｌＰｏｉｎｔＤｒｙｅｒ（ＬｅｉｃａＭｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＢｕｆｆａｌｏＧｒｏｖｅ、ＩＬ、ＵＳＡ）と転移媒体としての二酸化炭素を使用して臨界点乾燥させた。次いで、ＳｐｕｔｔｅｒＣｏａｔｅｒ１０８Ａｕｔｏ（ＣｒｅｓｓｉｎｇｔｏｎＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＵＫ）を使用して４．５ｎｍ厚の金／パラジウム合金塗膜を試料にスパッタコーティングし、それをＪＥＯＬＪＳＭ６３３０ｆ走査型電子顕微鏡（ＪＥＯＬ、Ｐｅａｂｏｄｙ、ＭＡ、ＵＳＡ）でイメージングした。

透過型電子顕微鏡検査（ＴＥＭ）：ＴＥＭイメージングは、炭素コーティンググリッドに載せて４％パラホルムアルデヒドで固定したＭＢＶまたは液相ＥＶを用いて行った（L. Huleihel et al., Science advances 2, e1600502 (2016)）。高解像度ＡｄｖａｎｃｅｄＭｉｃｒｏｓｃｏｐｙＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓデジタルカメラを搭載したＪＥＯＬ１２１０ＴＥＭを用いて８０ｋＶでグリッドをイメージングした。ＪＥＯＬＴＥＭソフトウェアを使用して代表画像からＭＢＶのサイズを決定した。

ナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）：液相ＥＶおよびＭＢＶの粒子サイズおよび濃度は、高速ビデオキャプチャおよび粒子トラッキングソフトウェアを装備したＮａｎｏｓｉｇｈｔ（ＮＳ３００）計器を使用して計算した。試料を、粒子不含水を使用して１：５００希釈して最終体積１０００μｌにした。シリンジポンプを使用して、試料をシステムに計量供給した。測定は、試料ごとに４５秒の３回のキャプチャから行った。ビデオ加工および粒子計算のために、検出閾値を４に調整した。評価した試料の各々についてのデータを、濃度対粒子サイズとして提示する。

ＲＮＡ単離：ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者の使用説明書に従って使用して、３Ｔ３細胞、液相ＥＶおよびＭＢＶから全ＲＮＡを単離した。ＲＮＡ単離の前に、液相ＥＶおよびＭＢＶ試料を３７℃で３０分間、ＲＮａｓｅＡ（１０μｇ／ｍｌ）で処理して、一切の夾雑ＲＮＡを分解した。ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計を使用してＲＮＡの量を決定し、その品質をＡｇｉｌｅｎｔＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ２１００（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により判定した。

ＲＮＡシークエンシングおよびバイオインフォマティック解析：１００ｎｇの各試料を用い、ＱＩＡｓｅｑ（商標）ｍｉＲＮＡＬｉｂｒａｒｙＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者の使用説明書に従って用いて、ｍｉＲＮＡライブラリー調製を開始した。簡単に述べると、成熟ｍｉＲＮＡの３’および５’末端にアダプターをライゲーションした。次いで、ライゲーションしたｍｉＲＮＡを、固有の分子インデックス（ＵＭＩ）を有する逆転写（ＲＴ）プライマーを使用してｃＤＮＡに逆転写した。次いで、ｃＤＮＡを清浄化してアダプタープライマーを除去し、続いて、ユニバーサルフォワードプライマーと試料インデックスを指定する４８のリバースプライマーのうちの１つとを用いてライブラリーの増幅を行った。シークエンシング前の精度管理を、ＡｇｉｌｅｎｔＲＮＡＳｃｒｅｅｎＴａｐｅＳｙｓｔｅｍを使用して行った。次世代シークエンシングを、ＮｅｘｔＳｅｑ５００計器を用いて２．５ｐＭの負荷量で行った。バイオインフォマティクス解析は、ＧｅｎｅｖｉａＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｔａｍｐｅｒｅ、Ｆｉｎｌａｎｄ）が行った。ＦａｓｔＱＣソフトウェアを使用してシークエンシングリードの品質を調査した。ＴｒｉｍＧａｌｏｒｅ！［バージョン０．４．５；］を使用して、全ての試料におけるデフォルト設定のアダプター配列を除去した。ｆａｓｔｘ＿ｔｒｉｍｍｅｒソフトウェア（ＨａｎｎｏｎＬａｂによるＦＡＳＴＸＴｏｏｌｋｉｔ；バージョン０．０．１４）を使用して、全てのリードを、マイクロＲＮＡの典型的なサイズである２１塩基に短縮した。次いで、各試料のリードを、対応する参照ゲノム（ｈｇ３８、ＧＲＣｍ３８）に対してアラインメントした。ソフトウェアｂｏｗｔｉｅ［バージョン１．２．２］およびｍｉＲＤｅｅｐ２［バージョン０．０．８］を使用して、試料全体にわたってのｍｉＲＮＡ計数値の表を作成した。このプロセスでは、この研究に関わる各種についての前駆体ｍｉＲＮＡおよび成熟ｍｉＲＮＡ配列をｍｉＲｂａｓｅから得た。成熟ｍｉＲＮＡの計数値は、それらに関連する全ての前駆体ｍｉＲＮＡの中央値を使うことにより得た。全ての試料の成熟ｍｉＲＮＡの計数値を、ＤＥＳｅｑ２を使用して正規化した。さらなる解析の前にデータの品質を保証するために、主成分分析（ＰＣＡ）を行い、結果を、ｇｇｐｌｏｔ２を使用してマウス試料およびヒト試料について別々に可視化した。成熟ｍｉＲＮＡデータの正規化および試料群間の統計的検定は、ＤＥＳｅｑ２を用いて行った。ベンジャミニ・ホッホベルク法を使用して、Ｐ値を多重検定用に補正した。調整ｐ値が＜０．０５であり、絶対ｌｏｇ２変化倍数が＞１であるｍｉＲＮＡは、有意に差次的に発現されると考えた。実験的に試験されたｍｉＲＮＡ－標的相互作用のｍｉｒＴＡＲｂａｓｅデータベースを使用して、差次的に発現されるｍｉＲＮＡの表にそれらの標的およびそれらの信頼度のアノテーションを付与した。差次的に発現されるｍｉＲＮＡには、ＲパッケージｍｉＲＮＡｔａｐを使用して予測標的のアノテーションも付与した。ｍｉＲＮＡｔａｐは、５つの異なるデータベース（ＰｉｃＴａｒ、ＤＩＡＮＡ、ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ、ｍｉＲａｎｄａ、ｍｉＲＤＢ）からのｍｉＲＮＡ標的予測を集計し、総合ｍｉＲＮＡ標的スコアを計算する。可能性のあるｍｉＲＮＡ標的相互作用をアノテーションに含めるために必要とされるデータベースソースの最少量は、３であった。

Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙｐａｔｈｗａｙａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）：ＩｎｇｅｎｕｉｔｙＰａｔｈｗａｙＡｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（バージョン０１－１４）を、差次的発現（ＤＥ）ｍｉＲＮＡの機能分析に使用した。ＩＰＡＣｏｒｅＡｎａｌｙｓｉｓを使用してｍｉＲＮＡ標的を特定した。実験的に観察された結果にフィルターを設定して、有意に富化された分子および細胞の機能、ならびにｍｉＲＮＡによる影響を受けた生理系発達機能についての情報を得た。

ｑＰＣＲ検証：逆転写（ＲＴ）および定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＡｄｖａｎｃｅｄｍｉＲＮＡＡｓｓａｙｓＰｒｏｔｏｃｏｌ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して行った。簡単に述べると、１０ｎｇの全ＲＮＡをＴａｑＭａｎ（登録商標）ＡｄｖａｎｃｅｄｍｉＲＮＡｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号Ａ２８００７）で使用して３’－ポリ（Ａ）テールを合成し、それをｍｉＲＮＡに適応させた。ポリ（Ａ）テールを認識するユニバーサルＲＴプライマーを使用してＲＴ反応でｃＤＮＡを合成し、続いて、ｍｉＲ－ＡＭＰフォワードおよびリバースユニバーサルプライマーを使用してｍｉＲ－ＡＭＰステップを行ってｃＤＮＡ分子の数を増加させた。ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＦａｓｔＡｄｖａｎｃｅｄＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４４４４５５６）と、ｍｍｕ－ｍｉＲ－１６３－５ｐ、ｍｍｕ－ｍｉＲ－２７ａ－５ｐ、ｍｍｕ－ｍｉＲ－９２ａ－１－５ｐ、ｍｍｕ－ｍｉＲ－４５１ａ、ｍｍｕ－ｍｉＲ－９３－５ｐおよびｍｍｕ－ｍｉＲ－９９ｂ－５ｐを認識する特定のＴａｑＭａｎ（登録商標）ＡｄｖａｎｃｅｄｍｉＲＮＡＡｓｓａｙｓ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号Ａ２５５７６）とを使用して、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）システムマシンでｑＰＣＲを行った。液相ＥＶを基準として使用して、ＭＢＶ試料に関する発現の変化倍数を特定の標的の各々について計算した。

免疫ブロットおよび銀染色アッセイ：３Ｔ３線維芽細胞の３つの別々の培養物から得た液相ＥＶおよびＭＢＶをそれぞれプールし、ナノトラッキング粒子解析により定量した。免疫ブロットおよび銀染色分析両方のために、液相ＥＶ試料とＭＢＶ試料の両方について同数の小胞をゲル上に負荷した。ＭＢＶまたは液相ＥＶ２１×１０^１１個を、５％βメルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する２×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝剤（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）と混合し、４～２０％勾配ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で分割し、次いで、ＰＶＤＦ膜に転写した。膜を、一晩、次の一次抗体と共にインキュベートした：１：１０００希釈のウサギ抗ＣＤ６３、ウサギ抗ＣＤ８１、ウサギ抗ＣＤ９、およびウサギ抗Ｈｓｐ７０（ＳｙｓｔｅｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。膜を、１：５，０００希釈のヤギ抗ウサギ二次抗体（ＳｙｓｔｅｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共にインキュベートする前またはした後に３回、各々１５分間、洗浄した。洗浄された膜を化学発光基質（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）に曝露し、次いで、ＣｈｅｍｉＤｏｃＴｏｕｃｈ計器（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して可視化した。ＳｉｌｖｅｒＳｔａｉｎＰｌｕｓＫｉｔ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を製造業者の使用説明書に従って使用してゲルの銀染色を行い、ＣｈｅｍｉＤｏｃＴｏｕｃｈ計器（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して可視化した。

リン脂質のＬＣ／ＭＳ分析：脂質を、３Ｔ３細胞、エキソソームおよびＭＢＶからＦｏｌｃｈ手順（J. Folch, et al, J biol Chem 226, 497-509 (1957)）により抽出した。リン脂質およびそれらの酸素化産物のＭＳ分析は、Ｏｒｂｉｔｒａｐ（商標）Ｆｕｓｉｏｎ（商標）Ｌｕｍｏｓ（商標）質量分析器（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で行った（Y. Y. Tyurina et al., ACS nano 5, 7342-7353 (2011)）。簡単に述べると、ＤｉｏｎｅｘＵｌｔｉｍａｔｅ３０００ＨＰＬＣシステムで順相カラム（Ｌｕｎａ３μｍＳｉｌｉｃａ（２）１００Å、１５０×２．０ｍｍ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ））を用いて毎分０．２ｍｌの流量でリン脂質を分離した。カラムを３５℃で維持した。１０ｍＭの酢酸アンモニウムを含有する勾配溶媒（ＡおよびＢ）を使用して分析を行った。溶媒Ａは、プロパノール：ヘキサン：水（２８５：２１５：５、ｖ／ｖ／ｖ）を含有し、溶媒Ｂは、プロパノール：ヘキサン：水（２８５：２１５：４０、ｖ／ｖ／ｖ）を含有した。全ての溶媒は、ＬＣ／ＭＳグレードであった。カラムを０～２３分にわたって１０％～３２％Ｂの線形勾配で溶出し、２３～３２分にわたって３２～６５％Ｂの線形勾配を使用して溶出し、３２～３５分にわたって６５～１００％Ｂの線形勾配で溶出し、３５～６２分にわたって１００％Ｂで保持し、６２～６４分にわたって１００％～１０％Ｂの線形勾配で溶出し、続いて６４～８０分にわたって１０％Ｂで平衡させた。スペクトルを陰イオンモードで取得した。重水素化リン脂質を内部標準として使用した（ＡｖａｎｔｉＰｏｌａｒＬｉｐｉｄｓ）。試料ごとに３回の技術的反復実験を実行して再現性を評価した。ソフトウェアパッケージＣｏｍｐｏｕｎｄＤｉｓｃｏｖｅｒｅｒ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）と、社内で生成した解析ワークフローおよび非酸化／酸化脂質データベースを使用して、ＬＣ／ＭＳデータの解析を行った。脂質を滞留時間によってさらにフィルタリングし、断片化質量スペクトルにより確認した。

遊離脂肪酸およびそれらの酸化産物のＬＣ／ＭＳ分析：遊離脂肪酸は、Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅハイブリッド四重極ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＳａｎＪｏｓｅ、ＣＡ）にオンラインで結合したＤｉｏｎｅｘＵｌｔｉｍａｔｅ（商標）３０００ＨＰＬＣシステムを使用してＬＣ／ＭＳにより分析した（Y. Y. Tyurina et al., Nature chemistry 6, 542 (2014)）。簡単に述べると、脂肪酸およびそれらの酸化的誘導体を、溶媒の勾配（Ａ：メタノール（２０％）／水（８０％）（ｖ／ｖ）およびＢ：メタノール（９０％）／水（１０％）（ｖ／ｖ）、両方とも５ｍＭの酢酸アンモニウムを含有する）を使用してＣ１８カラム（ＡｃｃｌｉａｍＰｅｐＭａｐＲＳＬＣ、３００μｍ１５ｃｍ、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により分離した。カラムを、７０分にわたっての３０％溶媒Ｂから９５％溶媒Ｂへの線形勾配を使用して毎分１２μＬの流量で溶出し、７０から８０分まで９５％Ｂで保持し、続いて、８３分までに初期条件に戻し、さらに７分間、再平衡させた。スペクトルを陰イオンモードで取得した。分析データを取得し、Ｘｃａｌｉｂｕｒソフトウェアを使用して解析した。試料ごとに最低３回の技術的反復実験を実行して再現性を増加させた。

結果
液相ＥＶおよびマトリックス結合型ナノ小胞の単離：走査型電子顕微鏡検査（ＳＥＭ）を行って、ブタ膀胱マトリックス（ＵＢＭ）由来のＥＣＭ生体足場内に包埋されているＭＢＶの高分解能、高倍率イメージングを行った。ＳＥＭ画像は、コラーゲン線維全体にわたって分散された直径およそ１００ｎｍの個別の球体を明らかにした（図１Ａ）。固体ＥＣＭ基材内に蓄積されたＭＢＶが、液相に分泌されたＥＶとは別の細胞外小胞の特有のクラスであるかどうかを調べるために、液相または固相細胞外区画からの小胞の選択的回収を可能にするｉｎｖｉｔｒｏ３Ｔ３線維芽細胞培養モデルを使用した（図１Ｂ）。位相差顕微鏡検査、ならびにＨ＆ＥおよびＤＡＰＩ染色切片からの代表画像は、細胞培養プレートの脱細胞化後に目に見える残存細胞もインタクトな核もないことを示した（図１Ｃ）。細胞培養上清から回収した液相ＥＶおよび脱細胞化ＥＣＭから単離されたＭＢＶのＴＥＭイメージング（図１Ｄ）は、小胞のこれら２集団が同様の形態を共有することを示した。さらに、ナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）分布プロットは、液相ＥＶとＭＢＶ両方について同様の小胞サイズを示し、大部分の小胞が直径＜２００ｎｍを有した（図１Ｅ）。ＭＢＶが、エキソソームに一般に起因するマーカーを含有するどうかを判定するために、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ９およびＨｓｐ７０についての免疫ブロット分析を行った（J. Lotvall et al. (Taylor & Francis, 2014)）。結果は、液相ＥＶとは対照的に、ＭＢＶがＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ９の著しい減少を示すことを示した。ＭＢＶは、免疫ブロットアッセイでわずかに検出可能であるレベルの、また、ＥＶに発現されるレベルと比べて著しく減少したレベルの、ＣＤ９およびＣＤ８１を発現した。ＭＢＶは、ＥＶで観察されたものよりも有意に低いＣＤ６３発現も示した（図１Ｆ）。言い換えると、液相ＥＶ（すなわち、エキソソーム）は、ＭＢＶと比較してＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ９の発現レベルが富化される。さらに、電気泳動で分離したタンパク質の銀染色は、ＭＢＶが、液相ＥＶとは明らかに異なるタンパク質カーゴを含有することを示した（図１Ｇ）。これは、ＭＢＶがナノ小胞の特有の部分集団であり得ることを示唆する。

ｍｉＲＮＡは、３Ｔ３線維芽細胞由来の液相ＥＶおよびＭＢＶに選択的にパッケージングされる：包括的次世代ＲＮＡシークエンシング（ＲＮＡ－ｓｅｑ）を用いて、ＭＢＶおよび液相ＥＶにおいて、これらの小胞が由来した３Ｔ３線維芽細胞親細胞と比較して差次的に発現される、ｍｉＲＮＡのカタログを作った。バイオアナライザー分析は、液相ＥＶおよびＭＢＶから単離された全ＲＮＡにおいて１８Ｓおよび２８ＳリボソームＲＮＡの非存在ならびに小ＲＮＡ分子（＜２００ｎｔ）の富化を明示した。しかし、液相ＥＶからの小ＲＮＡのサイズ分布は、ＭＢＶよりもはるかに広く、液相ＥＶでは１００～２００ｎｔの間の小ＲＮＡ分子が著しく富化された（図２Ａ）。親細胞ＲＮＡ、液相ＥＶ、およびＭＢＶ単離物（１群当たりｎ＝３）から生成したｍｉＲＮＡライブラリーの次世代シークエンシングを行うことにより、差次的ｍｉＲＮＡシグネチャーに分析の焦点を合わせた。主成分分析（ＰＣＡ）は、それぞれの群内で反復ｍｉＲＮＡプロファイルが互いに近くにクラスター化することを示した（図２Ｂ）。

ｍｉＲＮＡ含有量の大きな差が、親細胞と液相ＥＶとＭＢＶの単離物間で観測された。全体的として、２８（５０．９１％）のｍｉＲＮＡはＭＢＶにおいて液相ＥＶと比較して少なくとも２倍差次的に発現されることが認められた（図２Ｃ）。加えて、それぞれの液相ＥＶまたはＭＢＶおよび親細胞ｍｉＲＮＡプロファイルは、明確に別個のものであった（図２Ｂ、図２Ｃ）。ｍｉＲＮＡシークエンシングの結果を検証するために、ＲＴ－ｑＰＣＲを行って、３Ｔ３線維芽細胞から単離された液相ＥＶと比較して上方調節された３つのｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ－１６３－５ｐ、ｍｉＲ－２７ａ－５ｐ、ｍｉＲ－９２ａ－１－５ｐ）および下方調節された３つのｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ－４５１ａ、ｍｉＲ－９３ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－９９ｂ－５ｐ）を検出した（図２Ｄ）。結果は、液相ＥＶと比較してＭＢＶにおいてｍｉＲ－１６３－５ｐ、ｍｉＲ－２７ａ－５ｐ、およびｍｉＲ－９２ａ－１－５ｐのレベルが上方調節され、ｍｉＲ－４５１ａ、ｍｉＲ－９３ｂ－５ｐ、およびｍｉＲ－９９ｂ－５ｐが下方調節されたことを示し、それによって、ｍｉＲＮＡシークエンシングデータからの結果が裏付けられた。液相ＥＶと比較してＭＢＶにおいて差次的に富化されたｍｉＲＮＡについてのＩｎｇｅｎｕｉｔｙＰａｔｈｗａｙＡｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）は、臓器および系の発達および機能との強い関連性を示した。対照的に、ＭＢＶと比較して液相ＥＶにおいて差次的に富化されたｍｉＲＮＡは、細胞の成長、発達、増殖および形態に関与する経路と関連付けられた（図２Ｅ）。

ＭＢＶｍｉＲＮＡ含有量は、細胞起源に特有のものである：３Ｔ３線維芽細胞モデルでの結果は、細胞培養上清に分泌された液相ＥＶと比較して、ＥＣＭ内に蓄積されたＭＢＶ内へのｍｉＲＮＡの選択的パッケージングを示した。ＭＢＶｍｉＲＮＡカーゴが、細胞起源に特有のものであるかどうかを判定するために、異なるヒトドナーから単離された骨髄由来幹細胞（ＢＭＳＣ）、脂肪幹細胞（ＡＳＣ）および臍帯幹細胞（ＵＣＳＣ）によりｉｎｖｉｔｒｏで産生されたＥＣＭから単離されたＭＢＶのｍｉＲＮＡ組成を、次世代シークエンシング法によって特徴付け、比較した。脱細胞化ＢＭＳＣ細胞培養プレートの代表的な位相差顕微鏡画像は、細胞の非存在および分岐フィブリル構造の存在を示した（図３Ａ）。脱細胞化ＢＭＳＣ細胞培養プレートからの単離されたＭＢＶのＴＥＭイメージングは、細胞外小胞に起因する特徴的な形態を示した（図３Ｂ）。さらに、ナノ粒子トラッキング解析は、ＢＭＳＣ由来ＭＢＶとＡＳＣ由来ＭＢＶとＵＣＳＣ由来ＭＢＶとの間で同様の分布プロットを示し、小胞の大部分が直径＜２００ｎｍを有した（図３Ｃ～３Ｅ）。これらの試料からの全ＲＮＡの単離後、バイオアナライザー分析は、リボソームＲＮＡの非存在および小ＲＮＡ分子（＜２００ｎｔ）の富化を示した（図３Ｆ）。ｍｉＲＮＡライブラリーを試料（ＢＭＳＣ、ｎ＝３名のヒトドナー；ＡＳＣ、ｎ＝３名のヒトドナー；ＵＣＳＣ、ｎ＝３名のヒトドナー）から生成し、ｍｉＲＮＡシークエンシングに供した。主成分分析は、試料が、主として、それらが由来した細胞型ごとにクラスター化することを示した（図３Ｇ）。ＭＢＶ試料を生成するために使用した細胞型ごとに３名の別々のヒトドナーを使用したにもかかわらず、主成分分析は、それぞれの群内のｍｉＲＮＡプロファイルにおいて高い均一性度を示した（図３Ｇ）。加えて、ボルケーノプロットは、ＢＭＳＣ由来ＭＢＶとＵＣＳＣ由来ＭＢＶ間でのほうがＢＭＳＣ－ＡＳＣとＵＣＳＣ－ＡＳＣ間よりも少ないｍｉＲＮＡの差次的発現が認められることを示した。

液相ＥＶ、ＭＢＶおよび親細胞のリン脂質プロファイル：いくつかの研究によってＥＶの脂質組成が特徴付けられている（T. Skotland, et al, Journal of lipid research 60, 9-18 (2019)）。しかし、ＭＢＶのリン脂質組成に関するデータはない。それ故、ＬＣ－ＭＳに基づく網羅的リピドミクスおよびレドックスリピドミクス解析を行って、ＭＢＶおよび液相ＥＶのリン脂質組成をそれらの３Ｔ３線維芽細胞親細胞と比較して比較評価した（図４Ａ、図４Ｄ）。９つの主要なリン脂質クラスが３つのタイプの試料にわたって検出され、総数５３６の検出された分子種は、次の主要クラス間に分布していた：ビス－モノアシルグリセロホスフェート（ＢＭＰ）－５９種、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）－３７種、カルジオリピン（ＣＬ）－１１７種、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）－３３種、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）－１０２種、ホスファチジルセリン（ＰＳ）－４５種、ホスファチジン酸（ＰＡ）－２６種、ホスファチジルコリン（ＰＣ）－１０７種、およびスフィンゴミエリン（ＳＭ）－１０種（図４Ｄ）。多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）残基のそれらの含有量の点から見て、ＰＥ、ＰＩ、ＰＣおよびＰＳは、４～７の二重結合を含有するこれらの多価不飽和ＰＬ種の主要リザーバーに相当した（図４Ｂ）。これらのＰＵＦＡは、シグナル伝達脂質メディエーターの有力な前駆体に相当する。メディエーターの形成は、５－リポキシゲナーゼまたは１５－リポキシゲナーゼによりＰＵＦＡリン脂質が触媒的酸素化されて酸素化リン脂質が生じること、その後、この酸素化リン脂質が、特殊なホスホリパーゼＡ２の１つにより加水分解されて酸素化脂肪酸（脂質メディエーター）を放出することによって生じる（Z. Zhao et al., Endocrinology 151, 3038-3048 (2010)；Y. Y. Tyurina et al., Journal of leukocyte biology, (2019)）。加えて、酸化ＰＵＦＡリン脂質は、アポトーシス、フェロトーシスおよび炎症を含めた多数の細胞内プロセスおよび細胞応答を協調させるシグナル伝達分子として働く（Y. Y. Tyurina et al., Antioxidants & redox signaling 29, 1333-1358 (2018).）。これらのリン脂質とそれらの相対含有量の分子スペシエーションにおいて液相ＥＶとＭＢＶ間に有意な差が観測された（図４Ｅ）。明らかにＳＭは例外として、全てのリン脂質においてアラキドン酸（ＡＡ）残基およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）残基が検出された（図４Ｅ）。リン脂質の多くについて、量は、液相ＥＶおよび親細胞と比べてＭＢＶにおけるほうが有意に多かった（図４Ｅ）ことから、ＭＢＶは、ＰＵＦＡ－リン脂質のリッチリザーバーとみなされる。ＰＵＦＡリン脂質は、ＰＬＡ_２により加水分解され、その結果、遊離ＰＵＦＡおよびＬＰＬが放出されることになり得る（V. D. Mouchlis, et al, Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids 1864, 766-771 (2019)）。前者が、ＣＯＸおよびＬＯＸという２つの主要オキシゲナーゼによってさらに利用されて、炎症促進能力または抗炎症能力を有する脂質メディエーターが生成され得る（Y. Y. Tyurina et al., Redox (phospho) lipidomics of signaling in inflammation and programmed cell death. Journal of leukocyte biology, (2019)；C. A. Rouzer, et al., Chemical reviews 103, 2239-2304 (2003)；H. Kuhn, et al., Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids 1851, 308-330 (2015)）。この知見は、ＭＢＶを、細胞／組織の状況に依存してこれらの脂質メディエーターの合成のための可能性のある前駆体として認定するものである（Y. Y. Tyurina et al., Journal of leukocyte biology, (2019).）。定量的には、ＭＢＶは、ＰＩ、ＰＳ、ＰＧおよびＢＭＰにおいて富化された（図４Ｃおよび表２）。図４Ｃに示すリン脂質含有量を表１にも提供する。

対照的に、ＰＥ、ＰＡおよびＳＭの含有量は、液相ＥＶでのほうが多かった。ＰＣは、細胞および液相ＥＶにおける主たるリン脂質であった。特有のミトコンドリアリン脂質であるカルジオリピン（ＣＬ）の含有量は、ＭＢＶおよび親細胞と比較して液相ＥＶにおけるほうが有意に少なかった（図４Ｆ）。ＣＬは、ミトコンドリアの内膜に主として局在する特有のミトコンドリア特異的リン脂質である（M. Schlame, et al., Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids 1862, 3-7 (2017)）ので、この知見は、ＭＢＶ生合成が細胞のミトコンドリア区画と関連する可能性を意味する。プラズマローゲンリン脂質（またはエーテルリン脂質）は、構造的にジアシル－リン脂質（またはエステル－リン脂質）と異なる（M. Schlame, et al., Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids 1862, 3-7 (2017)）。プラズマローゲンでは、ビニルエーテル結合が、ｓｎ－１飽和または一価不飽和鎖をリン脂質のグリセロール骨格に連結している（N. E. Braverman, et al., Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Basis of Disease 1822, 1442-1452 (2012)）。エーテル脂質であるＰＥおよびＰＣプラズマローゲンは、膜融合を助長することができること（P. E. Glaser, et al., Biochemistry 33, 5805-5812 (1994)）および細胞外小胞の膜厚を増加させることができること（X. Han, et al., Biochemistry 29, 4992-4996 (1990)；T. Rog, et al., Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes 1858, 97-103 (2016)）が示されており、したがって、細胞によるナノ小胞取込みに関与し得る。詳細なＭＳ／ＭＳ分析は、液相ＥＶとＭＢＶの両方において高レベルのエーテルＰＥおよびＰＣ種（プラズマローゲン）を示した。これらの種を、それぞれ、ＰＥ－１６：０ｐ／２０：４、ＰＥ－１６：１ｐ／２０：４、ＰＥ－１８：１ｐ／２０：４、ＰＥ－１８：１ｐ／２２：６およびＰＣ－１６：０ｐ／２０：４、ＰＣ－１８：０ｐ／２０：４、ＰＣ－２０：０ｐ／２０：４、ＰＣ－１８：０ｐ／２２：６として識別した（図４Ｅ）。

液相ＥＶ、ＭＢＶおよび親細胞のリゾリン脂質プロファイル：ホスホリパーゼＡによって生じるリン脂質の加水分解性代謝物であるリゾリン脂質（ＬＰＬ）は、とりわけ、マクロファージ活性化（R. Ray, et al., Blood 129, 1177-1183 (2017)）、炎症および線維化（A. M. Tager et al., Nature medicine 14, 45 (2008)）、組織修復およびリモデリング（K. Masuda, et al., The FEBS journal 280, 6600-6612 (2013)）ならびに創傷治癒（K. M. Hines et al., Analytical chemistry 85, 3651-3659 (2013)）を含めた様々な生理学的応答をモジュレートする、生物活性シグナル伝達分子である。ＬＣ－ＭＳ分析は、ＬＰＬが３つ全てのタイプの試料中に存在することを、ＭＢＶおよび液相ＥＶ中のそれらの全含有量が親細胞と比較して１．７～１．８倍多かったが、示した。より具体的には、７クラスのＬＰＬが同定された：リゾホスファチジルエタノールアミン（ＬＰＥ）、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）、リゾホスファチジルセリン（ＬＰＳ）、リゾホスホイノシトール（ＬＰＩ）、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、リゾホスファチジルグリセロール（ＬＰＧ）およびモノリゾカルジオリピン（ｍＣＬ）（図５Ａ）。ＭＢＶは、ＬＰＥ、ＬＰＡおよびＬＰＧにおいて親細胞と比較して富化された（図５Ｂ）。ＬＰＩおよびｍＣＬの含有量は、細胞に対してＭＢＶおよび液相ＥＶにおけるほうが有意に少なかった。ＬＰＡおよびＬＰＧの含有量は、ＥＶと比較してＭＢＶにおけるほうが有意に多かった。ＭＢＶ中のｍＬＣＬおよびＬＰＩのレベルは、ＥＶ中より３倍および６．３倍高かったが、細胞と比較して３．３分の１および１．９分の１であった（図５Ｃ、図５Ｄ）。ＭＢＶとＥＶ間にＬＰＥ、ＬＰＣおよびＬＰＳの含有量の有意な変化は認められなかった。１６：０、１６：１、１８：０および１８：１を含有する非酸化性分子種は、検出された全てのＬＰＬ種に見られた主要なタイプであった（図５Ｃ）。これらの知見は、マクロファージ分化、組織修復、リモデリングおよび創傷治癒にとって重要である生物活性分子であるリゾリン脂質の高いレベルが、ＭＢＶの特有の特色であることを示唆している。

ＭＢＶおよび液相ＥＶの遊離および酸素化脂肪酸の分析：マウス骨髄由来マクロファージのＭＢＶへの曝露は、構成的マクロファージ表現型に関連するＭ２様マーカーであるＦｉｚｚ１およびＡｒｇ１の発現をもたらす（L. Huleihel et al., Science advances 2, e1600502 (2016)）ので、液相ＥＶおよび親細胞に対するＭＢＶにおけるＰＵＦＡおよびそれらの酸素化産物のＬＣ／ＭＳ分析を行った。ＭＢＶは、アラキドン脂肪酸（２０：４、ＡＡ）、ドコサヘキサエン脂肪酸（２２：６、ＤＨＡ）およびドコサペンタエン脂肪酸（２２：５、ＤＰＡ）において強く富化された（図６Ａ）。言い換えると、ＭＢＶは、それぞれの酵素機構－ＣＯＸおよび－ＬＯＸによるシグナル伝達脂質メディエーターの生合成の基質のリザーバーに相当する。液相ＥＶにおいて、主要ＰＵＦＡは、リノール酸（１８：２）およびリノレイン酸（１８：３）であった（図６Ａ）。

細胞外小胞は、ＡＡ由来脂質メディエーターの生合成のための酵素機構を含有する（E. Boilard, Journal of lipid research 59, 2037-2046 (2018)）ので、酸素化脂肪酸のレドックスリピドミクス分析を行った。ＭＢＶに対して液相ＥＶでは高レベルのＡＡ代謝物、例えば、１２－ＨＥＴＥ、１５－ＨＥＴＥ、リポキシンＡ_４などが見られた（図６Ｂ）。組織修復に関連して、リポキシンＡ_４（ＬＸＡ_４）およびＤ系列リゾルビンＤ１（ＲｖＤ１）－アラキドン酸（２０：４、ＡＡ）およびドコサヘキサエン酸（２２：６、ＤＨＡ）からの１２／１５－ＬＯＸにより産生される－が、Ｍ２様表現型へのマクロファージ活性化を刺激する（C. N. Serhan, The American journal of pathology 177, 1576-1591 (2010)）。最後に、ＭＢＶおよび液相ＥＶにおける酸素化ＡＡおよびＤＨＡを含有する酸化リン脂質を特徴付けた。酸素化種のレベルは、ＰＳ、ＰＩおよびＰＣが一酸素化種により提示される液相ＥＶよりも、ＭＢＶにおける方が高かった。ＢＭＰ、ＰＧおよびＣＬは、単一および二重酸素化ＡＡおよびＤＨＡ残基を含有し、三重酸素化ＰＵＦＡは、ＰＥでのみ見られた（図６Ｃ）。全体として、リピドミクスおよび酸化的リピドミクスの結果は、遊離ＡＡ、ＤＨＡおよびＤＰＡおよびＰＵＦＡ含有リン脂質ならびにそれらの酸化的に修飾された分子種のレベルが、液相ＥＶ中のレベルと比較してＭＢＶ中でのほうが高いことを示す。液相ＥＶはそうではないが、ＭＢＶは、ＰＵＦＡ非酸素化および酸素化リン脂質が富化されたため、酸化および酸化性エステル化ＰＬ種の潜在的リザーバーに相当し、したがって、細胞外環境の炎症促進／抗炎症状況に依存して異なるホスホリパーゼにより活性化される脂質メディエーターの潜在的供給源に相当する。

上述のＬＣ－ＭＳに基づくリピドミクスおよびレドックスリピドミクス研究に取り組んで、液相ＥＶリン脂質とＭＢＶリン脂質の詳細な比較を行った。小胞内カーゴの包括的ＲＮＡシークエンシングおよびバイオインフォマティック解析と併せて、これらのデータは、ＭＢＶが、液相ＥＶ（すなわち、エキソソーム）とは別個のものである、ＥＶの明確に区別できる特有の部分集団であることを示し、ならびに類似性が小胞のサイズおよび形状に限定される、ＥＣＭに基づくバイオマテリアルの識別特色を示す。

本明細書では、小胞集団を、液相細胞培養培地または固相ＥＣＭ基材のどちらかへのそれらの区画化に基づいて分画した。組成に関しては、３Ｔ３線維芽細胞のＥＣＭから単離されたＭＢＶは、液相ＥＶとおよび親細胞と比較して差次的なｍｉＲＮＡおよび脂質シグネチャーを有した。これらのデータは、分子の選別が小胞生合成中に起こって、異なる細胞外位置に向かうことになっている小胞にｍｉＲＮＡおよび脂質を特異的に分配するというシナリオを連想させる。さらに、液界面と固体基材とを区別する細胞の能力、および別個の脂質シグネチャーを有する小胞の適合した部分集団をこれらの完全に異なる区画に選択的に蓄積する細胞の能力は、ＭＢＶの、液相に分泌されるＥＶの生合成とは異なる、無関係の膜生合成の証拠を提供する。ＭＢＶが細胞外マトリックスの稠密な線維ネットワーク内に組み込まれることが示されていることを考慮すると、ＭＢＶは、組織発達および恒常性期間中のマトリックス蓄積中に、ならびに傷害後の動的マトリックスリモデリング中に、ＥＣＭ成分と協調して細胞により分泌されるはずである。さらに、ＥＣＭは、組織特異的３Ｄ構造で配置されているタンパク質とプロテオグリカンとグリコサミノグリカンの複雑な混合物である（Hussey et al., Nature Review Materials, 3(7):159-173, 2018）ことを考えると、ＭＢＶカーゴおよび脂質含有量はまた、組織および細胞起源に特有のものであるはずである。解剖学的に別個の組織起源に由来するＥＣＭ生体足場から単離されたＭＢＶは、差次的ｍｉＲＮＡシグネチャーを有する（Huleihel et al., Science Advances, 2, e1600502, 2016）。本研究からの結果は、異なるヒトドナー由来の骨髄由来幹細胞、脂肪幹細胞および臍帯幹細胞によりｉｎｖｉｔｒｏで産生されたＥＣＭから単離されたＭＢＶが、細胞源に特異的な特有のｍｉＲＮＡシグネチャーを有したことをさらに示す。加えて、ＢＭＳＣ由来ＭＢＶとＵＣＳＣ由来ＭＢＶ間でのほうがＢＭＳＣ－ＡＳＣとＵＣＳＣ－ＡＳＣ間より少ないｍｉＲＮＡが差次的に発現されること、脂肪幹細胞の組織特異的な分化能によるものと考えることができる知見、が見出された（L. Xu et al., Stem cell research & therapy 8, 275 (2017)）。これらの知見は、ドナーの内因性の変動によって有意な影響を受けなかったＭＢＶｍｉＲＮＡプロファイルの細胞特異的特色をさらに強調する。しかし、ヒトドナー３名が全て男性であったことを考えると、幹細胞の試料からのＭＢＶのｍｉＲＮＡカーゴにおける性別関連変動を判定するためのさらなる研究が必要である。重要なこととして、主成分分析は、異なるヒトドナーから単離された特定の細胞型により蓄積されたＭＢＶからのｍｉＲＮＡカーゴのバッチ間の高い一貫度を示しており、このことは、研究ツールまたは臨床治療法としてのＭＢＶおよびＥＣＭバイオマテリアル製造を支持する。本研究は、マトリックスに組み込まれたＭＢＶがＥＶの特有の部分集団であることを確証する。加えて、ＭＢＶは、エキソソームに一般に起因するタンパク質（例えば、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ９）の著しい減少を示した。

体液に分泌され、細胞間情報伝達に容易に利用可能であるＥＶとは対照的に、組織ＥＣＭ内に包埋されているＭＢＶは、マトリックスと安定的に会合しており、ＥＣＭ材料の分解後にしかそれを単離することができない（Huleihel et al., Science advances 2, e1600502 (2016)）。ＭＢＶを放出するためにマトリックス分解が必要であることは、抗炎症性脂質メディエーターを生成するそれらの能力に関連するものを含めた、それらの作用機序を部分的に規定し得る。ＭＢＶは、脱細胞化後でさえインタクトのままであり、ＥＣＭに付着したままであるので、それらの構成要素であるリン脂質の分子スペシエーションは、そのようなＭＢＶ－ＥＣＭ相互作用を助長する可能性が高い。ＬＣ－ＭＳに基づくリピドミクスおよびレドックスリピドミクス手法を使用して、ＭＢＶリン脂質、リゾリン脂質、ならびに酸素化および非酸素化ＰＵＦＡの分子スペシエーションの詳細な特徴付けを行った。マクロファージ分化、組織修復、リモデリングおよび創傷治癒にとって重要である生物活性分子であるリゾリン脂質の高いレベルが、ＭＢＶの特有の特色である。加えて、融合性脂質として、リゾリン脂質は、細胞内標的への小胞内容物の移送を助長することができる。液相ＥＶはそうではないが、ＭＢＶは、ＰＵＦＡ非酸素化および酸素化リン脂質が富化されたため、酸化および酸化性エステル化ＰＬ種の潜在的リザーバーに相当する。注目すべきこととして、ＰＵＦＡ富化ＭＢＶは、細胞外環境の炎症促進性／抗炎症性の状況に依存して異なるホスホリパーゼにより活性化される脂質メディエーターの重要な供給源である。

（実施例２）
プリスタン誘発関節炎の処置のためのＭＢＶの使用
実施例１で説明した方法論を使用して膀胱マトリックスを調製した。

ＭＢＶは、研究室で生成したブタＵＢＭから、オービタルロッカーを用いて緩衝剤（５０ｍＭＴｒｉｓｐＨ７．５、５ｍＭＣａＣｌ_２、１５０ｍＭＮａＣｌ）中のＬｉｂｅｒａｓｅＴＬ（高純度コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩ）での２４時間の室温での酵素による消化によって単離した。次いで、消化されたＥＣＭを３０分間１０，０００×ｇでの遠心分離に供してＥＣＭデブリを除去した。次いで、遊離したＭＢＶを含有する清澄化された上清を、４℃で２時間、１００，０００×ｇで遠心分離（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒＯｐｔｉｍａＬ－９０ＫＵｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）して、ＭＢＶをペレット化した。

ラットのプリスタン誘発関節炎モデルは、関節リウマチの研究のための臨床的に意義のある動物モデルとして確立されている（Tuncel et al. PLoS One. 2016; 11(5):e0155936）。８週齢メスＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットにおいて研究０日目に基底部より１ｃｍ遠位の尾の背側への３００μＬのプリスタン（２，６，１０，１４－テトラメチルペンタデカン（tetramethypentadacane））の皮内注射によってプリスタン誘発関節炎を誘発した。陰性対照動物には０日目にプリスタンの皮内注射を施さなかった。プリスタンの２回目の用量３００μＬを４日目に尾基底背部からおよそ１ｃｍ遠位の皮内に投与した。プリスタンを施した動物は、一緒にケージで飼育した。プリスタンを施した動物を次の実験群に無作為に割り当てた：プリスタンのみ＋ＰＢＳ、プリスタン＋ｉ．ｐ．メトトレキサート（ＭＴＸ）、プリスタン＋関節周囲（ｐ．ａ．）ＭＢＶ、および静脈内（ｉ．ｖ．）ＭＢＶ。関節周囲および静脈内ＭＢＶ投与経路の描写を図７に示す。

関節炎スコアを７、１０、１４、１７、２１、２８日目に、そしてその後、１００日の終点に至るまで週に１回、動物ごとに判定した。足裏および足底の視点からそれぞれ見て前足および後足各々の写真を撮った。次の６０点関節炎スコアリング基準を使用して無関係の審査員２名が定性的関節炎感度を評価した：１点を炎症した指関節または足指各々に与え、５点以下を罹患足関節に割り当てた（足１本当たり１５点、ラットごとに６０点）。プリスタンのみ＋ＰＢＳに指定した動物には、７、１０、１４、１７および２１日目に一切処置を施さなかった。プリスタン＋ｉ．ｐ．メトトレキサート動物には、７、１０、１４、１７および２１日目に腹腔内（ｉ．ｐ．）に送達することにより１×滅菌ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の０．１ｍｇ／ｋｇのメトトレキサートを施した。プリスタン＋関節周囲ＭＢＶ動物には、後足および前足の足底および足裏表面にそれぞれ送達することにより２５μＬの５００μｇ／ｍＬのブタ由来ＵＢＭＭＢＶ（１ｍＬ当たり粒子１×１０^１１個）を施した。静脈内ＭＢＶ群には、動物の外側尾静脈に静脈内送達することにより１００μＬの５００μｇ／ｍＬのＵＢＭＭＢＶ（１ｍＬ当たり粒子１×１０^１１個）を施した。（図１２Ａ）各群内の動物４匹を２８日の短期研究に割り当て、動物４匹を１００日研究に割り当てた。アルファ０．０５およびベータ０．８０と予め決められたメトトレキサートの以前に発表されたエフェクトサイズを使用して、試料サイズを決定した。関節炎スコアを平均±平均の標準誤差として表した。７～２１日目は、各群についての８のｎを表し、次いで２８日目およびそれ以降は、各群についての４のｎを表す。二元配置分散分析とテューキーの事後補正を使用して群の差を解析した。有意性を、研究の前にｐ＜．０５と決定した。

標的化ＰＡ（関節周囲）投与によっても、全身ＩＶ投与によっても、ＭＢＶの投与は、ラットにおける関節炎の重症度を有意に低下させ、ゴールドスタンダートケアであるメトトレキサートと同様の有効性を示した。全てのラットは７日目に０の関節炎スコアを提示した（図８Ａ）が、早くも１０日目には、高い関節炎スコアがプリスタンのみラットで観測され、処置を施した全てのラットは、より低い関節炎スコアを提示した（図８Ｂ）。驚くべきことに、１３日目に開始しても、ＭＢＶ処置は、関節炎処置のゴールドスタンダートであるメトトレキサートと同様に効果的であった（図８Ｃおよび図８Ｄ）。２１日目までに、ＭＢＶ処置ラット（ＩＶ処置ラットとＰＡ処置ラットの両方）は、メトトレキサート処置ラットより低い関節炎スコアを提示した（図８Ｅ）。ラットの足について撮った写真は、プリスタンのみおよびメトトレキサートおよびＭＢＶ処置ラットにおける紅斑および浮腫の差を実証する（図９Ａ～図９Ｂ）。実験の最初の２１日間の処置群の平均関節炎スコアを図１０に示す。ＭＢＶ投与のＰＡ投与は、プリスタンのみラットと比較して関節炎スコアの同等の低下、およびメトトレキサート処置と同等の関節炎スコアの低下を示したが、意外にも、静脈内投与には関節炎スコアを低下させる点でＰＡおよびメトトレキサートと同じ有効性があることを発見した。ＩＶ投与は、ＭＢＶの効力を希釈することになり、したがって、炎症関節に対して及ぼすその効果は、あったとしても限られていると予測したが、これは観測されなかった。驚くべきことに、ＭＢＶのＰＡとＩＶの両方の投与経路が、プリスタンのみラットと比較して関節炎スコアの同等の低下を示し、両方が、メトトレキサート処置と同程度に関節炎スコアを低下させた。炎症部位に対する関節周囲注射は痛く、個体における多くの関節が炎症を起こしていることがあるので、ＭＢＶの静脈内投与がＰＡ投与と全く同じように有効であるという予期せぬ発見は、侵襲性が低い上に同様に有効な治療効果のために全身送達経路を使用することができ、したがって、投与ごとに（関節ごとに複数回注射ではなく）単回注射しか必要とせず、それ故、患者にとってより快適であることを示唆する。

意外にも、ＩＶ投与とＰＡ投与の両方によりＭＢＶを施したラットでは炎症の再発も減少された。実験の７７日目まで収集したデータは、ＭＢＶ処置を炎症の慢性および再発期の関節炎に対する効果的な治療法として支持する。図１１Ａの写真に示されているように、表現型的には、ＰＡまたはＩＶＭＢＶで処置したラットの足は、メトトレキサートで処置したものと同等の紅斑および浮腫を提示する。ＰＡおよびＩＶＭＢＶは、関節リウマチのゴールドスタンダートケアであるメトトレキサートと同一の有効性で炎症の慢性および再発期におけるプリスタン誘発関節炎臨床スコアリングを低下させる（図１１Ｂ）。関節リウマチのラットモデルからの組織の分析は、組織炎症および組織間の空間の減少という結果となった。ＭＢＶ処置試料では、メトトレキサート処置で観測されたものと同等の空間の回復および炎症の減少があった。これは、生物レベルおよび組織レベル両方でのＭＢＶの有効性を明示する。

０～４２日目に指定した疾患の急性期では、ビヒクル処置罹患動物（プリスタン＋ＰＢＳ）における目視疾患重症度は、１７日目にピークに達し、ピーク疾患スコアは１４．８±０．８であった。罹患動物の腹腔内（ｉ．ｐ．）ＭＴＸ処置（プリスタン＋ｉ．ｐ．ＭＴＸ）は、１０、１４、１７および２１日目における急性疾患重症度を低下させ、ピーク疾患スコア（９．８±０．８）は２１日目にあった（図１２Ｃ、ｐ＜．０５）。局所、関節周囲（プリスタン＋ｐ．ａ．ＭＢＶ）投与は、１０、１４、１７、２１および２８日目における疾患重症度を低下させ、６．９±０．９のピーク疾患スコアが１０日目にあった（図１２Ｄ、ｐ＜．０５）。全身、静脈内（プリスタン＋ｉ．ｖ．ＭＢＶ）投与は、１０、１４、１７、２１および２８日目における疾患重症度を低下させ、８．０±０．６のピーク疾患スコアが１０日目にあった（図１２Ｅ、ｐ＜．０５）。急性期における３つの処置群間に有意な差はなく（ｐ＞．０５）、３つ全ての処置群が、無病対照群とは異なった（ｐ＞．０５）。要するに、ｉ．ｐ．ＭＴＸ、ｐ．ａ．ＭＢＶ、およびｉ．ｖ．ＭＢＶは、疾患の急性期においてプリスタン誘発ＲＡ疾患の重症度を低下させる点で同等に有効である。

ＲＡは、慢性再発寛解型の表現型の疾患であるので、動物を急性期後に観察して、慢性疾患発症に対するＭＢＶ投与の長期効果を見定めた。２８日目の後、１００日目の研究完了まで、追加のＭＴＸ処置も追加のＭＢＶ処置も投与しなかった。慢性期の開始時（４２日目）に、疾患重症度は弱まっており、４２～６３日目に次の群の間に差はなかった（ｐ＞．０５）：プリスタン＋ＰＢＳ、プリスタン＋ｉ．ｐ．ＭＴＸ、プリスタン＋ｐ．ａ．ＭＢＶ、およびプリスタン＋ｉ．ｖ．ＭＢＶ。７０日目に、プリスタン＋ＰＢＳ群は、二次疾患再燃が生じ始め、この再燃は、１００日目まで増加し続け、１００日目の時点で、最終疾患重症度スコアは、１７．３±５．１であった。対照的に、プリスタン＋ＭＴＸ、＋ｐ．ａ．ＭＢＶ、および＋ｉ．ｖ．ＭＢＶ群は、１００日目までこの上昇傾向が生じなかった。さらに、対照的に、ＭＴＸ、ｐ．ａ．ＭＢＶ、およびｉ．ｖ．ＭＢＶの投与は、疾患重症度の有意な減少をＭＴＸについては８４日目～１００日目に（図１２Ｃ、ｐ＜．０５）、ｐ．ａ．ＭＢＶについては７０～１００日目に（図１２Ｄ、ｐ＜．０５）、およびｉ．ｖ．ＭＢＶについては７０～１００日目に（図１２Ｅ、ｐ＜．０５）もたらした。３つの処置条件全てが１００日目における疾患重症度の再発を防止し、その上、３つの処置群間に疾患スコアの差はなかった（ｐ＞．０５）。このデータは、驚くべきことに、全身投与が有効かつ非毒性であり、予測したような希釈効果を見せないことを示す。

データは、局所的および全身的に送達されたＭＢＶがプリスタン誘発関節炎の急性および慢性発症を、メトトレキサートと同等の有効性で防止することを示唆する。

驚くべきことに、ＭＢＶの初期処置コース、全身的にまたは局所的にどちらかで、ＭＢＶには、ＭＢＶの初期処置コースが終了した後、数週間～数カ月間、関節炎症状を緩和する上で治療効果があり得、それによって、関節リウマチ症状のその後のフレアの重症度もしくは頻度が低下され、またはさらにはそのようなフレアが消失し、その結果、寛解することになる。さらに、驚くべきことに、全身投与したＭＢＶは希釈効果を経験せず、関節周囲に局所投与したＭＢＶと同程度に有効であることが判明した。

（実施例３）
マトリックス結合型ナノ小胞は、プリスタン誘発関節炎における滑膜炎症性浸潤、関節軟骨破壊および関節プロテオグリカン喪失を減少させる。
滑膜炎、軟骨破壊およびプロテオグリカン喪失は、ＲＡ疾患進行の際に起こる基本的な病理組織学的変化である。これらの病理組織学的パラメーターに対するＭＢＶ処置の効果を判定するために、実施例２からの動物から病理組織学的イメージングおよび分析のためのラット後足を研究終了時（１００日目）に収集した。

各動物からの後足１本を病理組織学的分析に使用した。組織検体をＰＢＳ、ｐＨ７．４中の１０％ホルマリンで固定し、５％ギ酸を使用して脱灰し、パラフィンろうに包埋した。関節組織診断および病理診断のための光学顕微鏡検査による検査のためにヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で切片を染色した。光学顕微鏡検査による検査のためにトルイジンブルーとエオシン対比染色剤の両方で切片を染色して、関節軟骨のプロテオグリカン組成を評価した。

適応３パラメータースコアリングシステムを使用することにより脛距関節の炎症および関節損傷を調査した。滑膜組織内の炎症細胞の相対比率に依存して０～３段階（０は炎症なしを表し、３は重度に炎症した関節を表す）で炎症をスコアリングした。軟骨破壊を０～３段階でスコアリングし、結果は、死んだ軟骨細胞および空の骨小腔の出現から関節軟骨の完全喪失にわたった。軟骨におけるプロテオグリカンの喪失を０～３段階でスコアリングし、ここでの結果は、トルイジンブルー染色により完全に染色された軟骨から関節軟骨の完全喪失にわたった。群ごとに、複合スコアを全てのパラメーターについて計算した。組織診断スコアを平均±標準誤差として表す。

ビヒクル処置動物は、滑膜炎症性細胞浸潤、関節軟骨分解および関節プロテオグリカン喪失の増加を特徴とする相当な関節病態を発症した（図１３Ａ）。対照＋ＰＢＳ群と比較して、プリスタン＋ＰＢＳ群は、陰性対照動物群と比較して滑膜炎症の増加（２．７±０．３対０．０±０．０）、軟骨破壊の増加（２．０±１．０対０．０±０．０）、およびプロテオグリカン喪失の増加（２．７±０．３対０．０±０．０）を有した（図１３Ａ～１３Ｅ、ｐ＜．０５）。プリスタン＋ＰＢＳ群（２．７±０．３）と比較して、全ての処置群－プリスタン＋ＭＴＸ（０．７±０．３）、ｐ．ａ．ＭＢＶ（１．７±０．７）、およびｉ．ｖ．ＭＢＶ（０．７±０．３）－は、組織学的スコアリングにより滑膜浸潤および滑膜炎症の低減を示した（図１３Ａ～１３Ｅ、ｐ＜．０５）。軟骨破壊およびプロテオグリカン喪失に関してプリスタン＋ＰＢＳ群と３つの処置群の間に有意な差はなかったが、３つ全ての処置群は、これらのパラメーターの低減を示した（図１３Ｃおよびｄ．、ｐ＞．０５）。プリスタン＋ＰＢＳ群と比較して、全ての処置群－繰り返しになるがプリスタン＋ＭＴＸ、ｐ．ａ．ＭＢＶ、およびｉ．ｖ．ＭＢＶ－は、３つ全てのパラメーターの累積スコアの低下を示した（プリスタン＋ＰＢＳ（７．３±１．２）対プリスタン＋ＭＴＸ（２．３±０．３）、およびプリスタン＋ｉ．ｖ．ＭＢＶ（２．３±０．３））（図２．ｅ．、ｐ＜．０５）。３つ全ての組織学的パラメーターにわたって３つの処置群間に差は観測されなかった（図１２Ａ～１３Ｅ、ｐ＞．０５）。このデータは、全身投与が有効かつ非毒性であることを示す。

（実施例４）
マトリックス結合型ナノ小胞は、炎症性細胞浸潤を低減し、炎症促進性滑膜Ｍ１様マクロファージの抗炎症性Ｍ２様マクロファージへのモジュレーションを促進する。
前述の試料からの組織切片を使用して、脛距関節に隣接する滑膜組織におけるマクロファージ表現型を、免疫組織化学的検査を使用して評価した。キシレンの３回の漸進的洗浄を使用してパラフィン包埋組織切片を脱パラフィンし、続いて、１００％から７０％エタノールへ徐々に低下するエタノール交換を使用して再水和を行った。市販のＤｅＣａｌ溶液を製造業者のプロトコール（ＢｉｏＧｅｎｅｘ）に従って使用して抗原回復を行った。次いで、１×ｔｒｉｓ緩衝食塩水、ｐＨ７．４中の５％ウシ血清アルブミンを使用して１時間、室温で切片をブロックした。ブロック後、切片を約１８時間、４℃で、次の一次抗体および希釈度でインキュベートした：ヤギ抗ＣＤ６８（１：１００）、ウサギ抗ＴＮＦアルファ（１：１００）、およびマウス抗ＣＤ２０６（１：１００）。一次抗体インキュベーション後、切片を１時間、室温で、次の蛍光コンジュゲート二次抗体と共にインキュベートした：抗ウサギＡＬＥＸＡＦＬＵＯＲ（登録商標）３００、抗マウスＡＬＥＸＡＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８、および抗ヤギＡＬＥＸＡＦＬＵＯＲ（登録商標）５９４。切片をＤＲＡＱ５核染色剤で対比染色し、イメージングした。

炎症促進性Ｍ１様マクロファージとＭ２様マクロファージ間の不均衡は、ＲＡ病態の重要な構成要素である。対照＋ＰＢＳと比較して、プリスタン＋ＰＢＳは、滑膜ＴＮＦ－アルファ＋／ＣＤ６８＋、Ｍ１様マクロファージの、滑膜ＣＤ２０６＋／ＣＤ６８＋、Ｍ２マクロファージに対する比を増加させた（３．９±０．９対１．５±０．２、図１４Ａおよび１４Ｂ、ｐ＜．０５）。Ｍ１様マクロファージ：Ｍ２様マクロファージの比は、プリスタン＋ＰＢＳと比較して、プリスタン＋ＭＴＸ（０．７±０．４、図１４Ａおよび１４Ｂ、ｐ＜．０５）、プリスタン＋ｐ．ａ．ＭＢＶ（１．０±０．４、図１４Ａおよび１４Ｂ、ｐ＜．０５）、およびプリスタン＋ｉ．ｖ．ＭＢＶ（０．７±０．４、図１４Ａおよび１４Ｂ．、ｐ＜．０５）では減少した。処置条件間にＭ１様マクロファージ：Ｍ２様マクロファージの比の有意な差はなく、処置条件と対照＋ＰＢＳ群の間にも有意な差はなかった（図１４Ａおよび１４Ｂ、ｐ＞．０５）。Ｍ２様マクロファージ：Ｍ１様マクロファージの比に関して、処置群と対照＋ＰＢＳ群とプリスタン＋ＰＢＳ群の間に差はなかった（図１４Ａおよび１４Ｃ）。統計的に有意でないが、Ｍ２様マクロファージ：Ｍ１様マクロファージの比の増加が、対照＋ＰＢＳおよびプリスタン＋ＰＢＳと比較して３つ全ての実験処置群における動物の滑膜において観測された（図１４Ａおよび１４Ｃ）。

（実施例５）
マトリックス結合型ナノ小胞は、プリスタン誘発関節リウマチモデルにおいて有害な骨リモデリングおよび関節破壊を防止する
実施例２で研究した動物の１００日目の犠牲後に後足のマイクロコンピュータ断層撮影（マイクロＣＴ）画像を取得した。複合連続断面画像を使用して３Ｄ画像をレンダーリングした。それらを図１５Ａ～Ｂに示す。

プリスタン＋ＰＢＳ群と比較して、３つ全ての処置群は、関節のマイクロＣＴイメージングおよび３Ｄ再構成により観測したとき質的骨損傷および関節変性を実質的に低減した。前足では、ｉ．ｐ．ＭＴＸ、ｐ．ａ．ＭＢＶ、およびｉ．ｖ．ＭＢＶ投与は、ビヒクル対照と比較して有害な骨リモデリングを実質的に防止した。これらの予防的変化が動物の前足と後足の両方で起こった。前足では、損傷が尺骨および橈骨の関節と前足の小さい手根骨において観測され、より遠位の指節間関節および手指関節のわずかな変化があった（図１５Ａ）。後足では、主として頸骨および距骨の関節において、マイクロＣＴでのこの関節の融合（靱帯結合）および非存在によって明らかであるように、有害なリモデリングが観測された（図１５Ｂ）。かさねて、このデータは、ＭＢＶの全身投与が、ＲＡにより引き起こされる質的骨および関節損傷を有意に低減することを示す。これらの効果は、ＭＢＶの関節周囲投与と同様であった。これは、驚くべきことに、ＭＢＶの全身投与で希釈効果がなかったことを示す。

（実施例６）
コラーゲン誘発関節炎の処置のためのマトリックス結合型小胞（ＭＢＶ）の使用
ＵＢＭ、およびＵＢＭ由来のＭＢＶを、実施例２で説明した方法論を使用して調製する。

８週齢メスＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットにおいて、研究０日目に基底部より１ｃｍ遠位の尾の背側への、フロイント不完全アジュバントを含有するエマルション中の２００μｇ／ｍＬのＩＩ型ウシコラーゲン１００μＬの皮下注射によって、コラーゲン誘発関節炎を誘発する。対照動物には０日目に皮内ＩＩ型コラーゲンエマルションを施さない。２００μｇ／ｍＬのＩＩ型コラーゲンエマルションの２回目の用量１００μＬを７日目に尾基底背部からおよそ１ｃｍ遠位の皮下に投与する。ＩＩ型コラーゲンエマルションを施した動物は、一緒にケージで飼育する。ＩＩ型コラーゲンエマルションを施した動物を次の実験群に無作為に割り当てる：ＩＩ型コラーゲンエマルションのみ、メトトレキサート、関節周囲ＭＢＶ、および静脈内ＭＢＶ。関節炎スコアを７日目、１０日目、１４日目、１７日目、２１日目、２８日目に、そしてその後、１００日目に至るまで週に１回、動物ごとに判定する。足裏および足底の視点からそれぞれ見て前足および後足各々の写真を撮る。６０点関節炎スコアリング基準を使用して関節炎を評価する：１点を炎症した指関節または足指各々に与え、５点以下を罹患足関節に割り当てる（足１本当たり１５点、ラットごとに６０点）。ＩＩ型コラーゲンエマルションのみに指定した動物には、７、１０、１４、１７および２１日目に一切処置を施さない。メトトレキサート動物には、７、１０、１４、１７および２１日目に腹腔内に送達することにより１×滅菌ＰＢＳ中の０．１ｍｇ／ｋｇのメトトレキサートを施す。関節周囲ＭＢＶ動物には、後足および前足の足底および足裏表面にそれぞれ送達することにより２５μＬの５００μｇ／ｍＬのブタ由来ＵＢＭＭＢＶを施す。静脈内ＭＢＶ群には、動物の外側尾静脈に静脈内送達することにより１００μＬの５００μｇ／ｍＬのＵＢＭＭＢＶを施す。各群内の動物４匹を２８日の短期研究に割り当て、動物４匹を１００日研究に割り当てる。アルファ０．０５およびベータ０．８０と予め決められたメトトレキサートの以前に発表されたエフェクトサイズを使用して、試料サイズを決定する。関節炎スコアを平均＋／－平均の標準誤差として表す。二元配置分散分析とテューキーの事後補正を使用して群の差を解析する。有意性を、研究の前に０．０５のアルファで決定した。

結果は、ＭＢＶで処置した動物が、未処置対照動物と比較して有意に減少した関節炎スコアを明示すること、およびＭＢＶ処置動物の関節炎スコアが、メトトレキサート処置動物の関節炎スコアと同等であることを示す。さらに、静脈内ＭＢＶ処置は、関節周囲ＭＢＶ処置と同様に効果があることが見出される。これらのデータは、関節炎に対するＭＢＶ処置が、関節炎の処置のゴールドスタンダート：メトトレキサートと同様に効果があることを実証する。さらに、データは、ＭＢＶの全身投与には関節リウマチの処置において局所投与と同様の治療有効性があること、および全身的または局所的にどちらかでのＭＢＶの初回投与が、ＭＢＶの初回投与後、数週間～数カ月間、関節炎症状を緩和する上で治療効果があり得、それによって、関節リウマチ症状のその後のフレアの重症度もしくは頻度が低下され、またはさらにはそのようなフレアが消失することになることを実証する。

（実施例７）
乾癬の処置のためのマトリックス結合型小胞（ＭＢＶ）の使用
膀胱マトリックス（ＵＢＭ）の調製：ＵＢＭを以前に記載されている通り調製した（ＭａｓｅＶＪ，ｅｔａｌ．Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃｓ．２０１０；３３（７）：５１１）。市場体重動物由来のブタ膀胱をＴｉｓｓｕｅＳｏｕｒｃｅ，ＬＬＣから取得した。簡単に述べると、漿膜、外筋層、粘膜下層、および筋層粘膜を機械的に除去した。粘膜の管腔尿路上皮細胞を脱イオン水で洗浄することによって基底膜から解離させた。残りの組織は基底膜および下にある粘膜の固有層からなり、４％エタノールを含む０．１％過酢酸中、３００ｒｐｍで２時間にわたって撹拌することによって脱細胞化した。次いで、組織をＰＢＳおよび滅菌水で広範囲にわたってすすいだ。次いで、ＵＢＭを凍結乾燥させ、ＷｉｌｅｙＭｉｌｌを使用し、＃６０メッシュスクリーンを用いて破砕して微粒子にした。

マトリックス結合型ナノ小胞の単離：ＭＢＶは、研究室で生成したブタ膀胱マトリックス（ＵＢＭ）から、オービタルロッカーを用いて緩衝剤（５０ｍＭＴｒｉｓｐＨ７．５、５ｍＭＣａＣｌ_２、１５０ｍＭＮａＣｌ）中のＬｉｂｅｒａｓｅＴＬ（高純度コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩ）での２４時間の室温での酵素による消化によって単離した。次いで、消化されたＥＣＭを１０，０００×ｇ（３０分）での遠心分離に供してＥＣＭデブリを除去した。次いで、遊離したＭＢＶを含有する清澄化された上清を、４℃で２時間、１００，０００×ｇで遠心分離（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒＯｐｔｉｍａＬ－９０ＫＵｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）して、ＭＢＶをペレット化した。

乾癬の誘発および処置レジメン：８週齢メスＣ５７／ｂｌ６マウスにおいて、マウスの毛を剃った背中および右側耳介への６２．５ｍｇの５％イミキモドクリームの毎日の局部塗布により７日間、乾癬を誘発した。動物の毛を剃った背中および右側耳介の７日にわたっての画像を図１６に示す。対照動物には研究を通して局部イミキモドを施さず、その代わりに、毛を剃った背中および右側耳介への石油ゼリーの局部投与を施した。処置群および治療パラダイムを、乾癬フレアの防止および既存フレアの管理に分けた。予防的治療を施した動物には、研究の０～１６日目の間、処置を施し、管理療法を施した動物には、研究の７～１６日目の間、処置を施した。静脈内ＭＢＶを施した動物には、処置タイムラインによる指定の通りに研究の各々の日に５００μｇ／ｍＬのブタ由来ＵＢＭＭＢＶを施した。０日目に始めて７日目まで、紅斑、落屑および厚さを無関係の審査員２名が臨床的乾癬面積重症度指数（ＰＡＳＩ）を改良した客観的スコアリングシステムを使用してスコアリングした。０＝なし、１＝軽度、２＝中等度、３＝顕著、４＝非常に顕著というスコアである０～４のスコアを、紅斑および落屑に割り当てた。各々の日に、マイクロメーターを使用して右側耳介の厚さを測定し、皮膚の厚さを、厚さの増加に基づいて、所定の日と比較してスコアリングした（－１日目では２０～４０％、－２日目では４０～６０％、－３日目では６０～８０％、－４日目では＞８０％）。各指数からの全スコアを合計し、乾癬性炎症の総合尺度を１２点総合尺度（０～１２）で表した。０日目から７日目までの動物の累積乾癬スコア（ＰＡＳＩ）を図１７に示す。

統計解析：アルファ０．０５およびベータ０．８０と予め決められたアシトレチンの以前に発表されたエフェクトサイズを使用して、試料サイズを決定した。乾癬面積重症度指数（ＰＡＳＩ）スコアを平均±平均の標準誤差として表した。二元配置分散分析とテューキーの事後補正を使用して群の差を解析した。有意性を、研究の前に０．０５のアルファで決定した。

提供するＰＡＳＩスコアおよび動物の画像により実証されるように、ＭＢＶの全身投与は、イミキモド誘発乾癬における紅斑および落屑を低減する。加えて、ＭＢＶの全身投与は、イミキモド誘発乾癬において皮膚の厚さを低減する。ＭＢＶ処置動物のＰＡＳＩスコアは、未処置動物より有意に低かった。これは、全身投与によるＭＢＶが乾癬を処置するための実行可能な治療法であることを示す。

（実施例８）
ＭＢＶは免疫抑制効果を生じさせない
免疫抑制および免疫毒性のキーホールリンペットヘモシアニン（Keyhold Limpet Hemocyanin）（ＫＬＨ）ラットモデルを使用して、全身的に送達したＭＢＶの免疫毒性を評価した。８週齢Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットを４つの別々の群に分けた：ＫＬＨでの免疫化後の正常な抗ＫＬＨ応答を実証するために使用したＫＬＨ対照、処置にもＫＬＨ免疫化にも関係のないあらゆる潜在的効果を考えて調整を行うために使用したビヒクル対照、強力な免疫抑制剤としてのシクロホスファミド陽性対照、および全身性免疫に対するＭＢＶ投与の効果を評価するためのＭＢＶ処置群。０日目に、シクロホスファミド処置動物に２００ｍｇ／ｋｇのｉ．ｐ．を施し、ＭＢＶ処置動物には、０、３および６日目に静脈内に送達することにより１ｍｇ／ｍｌのＵＢＭＭＢＶを施した。７日目に、ビヒクル対照以外の全ての群を、フロイント不完全アジュバント中の１０００μｇ／ｍｌの再構成ＫＬＨ０．４ｍＬでｉ．ｐ．免疫化した。１４、２１および２８日目（免疫化後７、１４および２１日）に、全血を外側尾静脈から採取し、抗ＫＬＨＩｇＭおよびＩｇＧの分析のために血清を単離した。ＥＬＩＳＡを使用して全ての動物の血清において抗ＫＬＨＩｇＭおよびＩｇＧを評価した。結果を図１８（抗ＫＬＨＩｇＭレベル）および図１９（抗ＫＬＨＩｇＧレベル）に示す。

図１８および１９に示すように、ＫＬＨでの免疫化前のＭＢＶの全身投与は、ＫＬＨ抗原に対する正常なＩｇＧまたはＩｇＭ抗体の応答を開始する宿主動物の能力に影響を及ぼさない。公知の免疫抑制剤である、シクロホスファミドは、ビヒクル＋ＫＬＨ対照と比較して７、１４および２１日目の抗ＫＬＨＩｇＧおよびＩｇＭレベルを有意に低下させる。ビヒクル＋ＫＬＨ対照動物とＭＢＶ処置動物の間に、産生されるＩｇＧまたはＩｇＭのレベルの有意な差はない。

これらの結果は、ＭＢＶの全身投与が、生理的な抗体免疫応答を抑制しないこと、および免疫抑制剤（メトトレキサートおよびシクロホスファミドのような）である、自己免疫疾患のための他の標準的な処置とは対照的に、ＭＢＶを使用して、免疫系を抑制することなくＲＡおよび他の自己免疫疾患を処置することができることを実証する。したがって、自己免疫疾患を処置するためのＭＢＶの使用により、免疫抑制治療の副作用、例えば、感染症およびがんなどを回避することができる。

開示した主題の原理を応用することができる多くの可能な実施形態にかんがみて、説明した実施形態が本開示の例に過ぎないこと、および説明した実施形態を本開示の範囲を限定するものと解釈すべきでないことは理解されるはずである。もっと正確に言えば、本開示の範囲は、後続の特許請求の範囲により定義される。

Claims

必要な対象における自己免疫障害を処置する方法であって、前記対象に、細胞外マトリックス由来の単離されたマトリックス結合型小胞（ＭＢＶ）の治療有効量を含む医薬調製物を全身投与によって投与するステップを含み、それにより、前記自己免疫障害が処置される、方法。
前記自己免疫障害が、眼以外の自己免疫障害である、請求項１に記載の方法。
前記自己免疫障害が、関節リウマチでも、強皮症でも、潰瘍性大腸炎でもない、請求項１または２に記載の方法。
前記自己免疫障害が、アジソン病、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性肝炎、セリアック病、クローン病、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、免疫性血小板減少症、ＩｇＡ腎症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、多発性硬化症、重症筋無力症、類天疱瘡、天疱瘡、多腺性自己免疫性症候群２型、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、強皮症、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、高安動脈炎、１型糖尿病、潰瘍性大腸炎、自己免疫性脳炎、または未分化結合組織病（ＵＣＴＤ）から選択される、請求項１または２に記載の方法。
前記自己免疫障害が、アジソン病、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性肝炎、セリアック病、クローン病、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、免疫性血小板減少症、ＩｇＡ腎症、多発性硬化症、重症筋無力症、類天疱瘡、天疱瘡、多腺性自己免疫性症候群２型、乾癬、乾癬性関節炎、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、高安動脈炎、１型糖尿病、自己免疫性脳炎、または未分化結合組織病（ＵＣＴＤ）から選択される、請求項１から３に記載の方法。
前記自己免疫障害が、関節リウマチである、請求項１、２または４に記載の方法。
前記自己免疫障害が、強皮症である、請求項１、２または４に記載の方法。
前記自己免疫障害が、潰瘍性大腸炎である、請求項１、２または４に記載の方法。
前記自己免疫障害が、天疱瘡である、請求項１から５に記載の方法。
前記自己免疫障害が、類天疱瘡である、請求項１から５に記載の方法。
前記自己免疫障害が、クローン病である、請求項１から５に記載の方法。
前記自己免疫障害が、乾癬である、請求項１から５に記載の方法。
前記自己免疫障害が、乾癬性関節炎である、請求項１から５に記載の方法。
前記自己免疫障害が、多発性硬化症である、請求項１から５に記載の方法。
前記自己免疫障害が、全身性エリテマトーデスである、請求項１から５に記載の方法。
前記自己免疫障害が、自己免疫性脳炎である、請求項１から５に記載の方法。
前記対象が、前記ＭＢＶの投与開始から測定してまたは前記ＭＢＶの投与終了から測定して長期間にわたって治療利益を経験する、請求項１から１６までのいずれか一項に記載の方法。
前記対象が、ＭＢＶの投与から開始して少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも１カ月、少なくとも２カ月、または少なくとも３カ月の期間続く治療利益を経験する、請求項１から１７までのいずれかに記載の方法。
前記対象が、ＭＢＶの投与終了から測定して少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも１カ月、少なくとも２カ月、または少なくとも３カ月の期間続く治療利益を経験する、請求項１から１７までのいずれかに記載の方法。
前記投与からの前記治療利益が、少なくとも１カ月続く、請求項１８または請求項１９に記載の方法。
前記投与からの前記治療利益が、少なくとも２カ月続く、請求項１８または請求項１９に記載の方法。
前記投与からの前記治療利益が、少なくとも３カ月またはそれより長く続く、請求項１８または請求項１９に記載の方法。
前記投与からの前記治療利益が、少なくとも６カ月続く、請求項１８または請求項１９に記載の方法。
前記全身投与が、静脈内投与、経口投与、経腸投与、非経口投与、鼻腔内投与、直腸投与、舌下投与、口腔投与、唇下投与、腹腔内投与、皮下または筋肉内投与から選択される、請求項１から２３までのいずれかに記載の方法。
前記全身投与が、静脈内投与である、請求項２４に記載の方法。
前記ＭＢＶが、１投与当たり体重１ｋｇにつきＭＢＶ１×１０^６～１×１０^１２個の量で投与される、請求項１から２５までのいずれか一項に記載の方法。
前記ＭＢＶが、静脈内投与される、請求項２６に記載の方法。
前記ＭＢＶが、週に１回４週間、週に１回３週間、週に１回２週間、週に１回１週間、週に２回４週間、週に２回３週間、週に２回２週間、週に２回１週間、週に３回４週間、週に３回３週間、週に３回２週間、週に３回１週間、週に４回１週間、週に４回２週間、週に４回３週間、または週に４回４週間投与される、請求項１から１８までのいずれか一項に記載の方法。
必要な対象における乾癬を処置する方法であって、前記対象に、細胞外マトリックス由来の単離されたＭＢＶの治療有効量を含む医薬調製物を投与するステップを含み、それにより、前記対象における前記乾癬が処置される、方法。
前記医薬調製物を前記対象に全身投与するステップを含む、請求項２９に記載の方法。
前記医薬調製物を前記対象に局所投与するステップを含む、請求項２９に記載の方法。
前記対象にとっての治療利益が、前記ＭＢＶの投与の前に存在する前記障害の症状の低減である、請求項１から３１までのいずれか一項に記載の方法。
前記対象にとっての治療利益が、前記対象における炎症のレベルの、前記ＭＢＶの投与の前の炎症のレベルの低下である、請求項１から３２までのいずれかに記載の方法。
治療利益が、障害の寛解である、請求項１から３３までのいずれかに記載の方法。
治療利益が、障害の症状のフレアの低減、または上記期間中の障害の症状のフレアの消失である、請求項１から３４までのいずれかに記載の方法。
（ｉ）前記ＭＢＶが、ＣＤ６３、ＣＤ８１および／もしくはＣＤ９の１つもしくは複数を発現しないか、またはほとんど検出できないレベルのＣＤ６３、ＣＤ８１および／もしくはＣＤ９を有する；ならびに／あるいは
（ｉｉ）前記ＭＢＶが、
（ａ）併せて少なくとも５５％のホスファチジルコリン（ＰＣ）およびホスファチジルイノシトール（ＰＩ）で構成されるリン脂質含有量；
（ｂ）１０％もしくはそれ未満のスフィンゴミエリン（ＳＭ）で構成されるリン脂質含有量；
（ｃ）２０％もしくはそれ未満のホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）で構成されるリン脂質含有量；ならびに／または
（ｄ）１５％もしくはそれより多くのホスファチジルイノシトール（ＰＩ）で構成されるリン脂質含有量
を含む、請求項１から３５までのいずれかに記載の方法。
前記ＭＢＶが、膀胱、小腸、心臓、真皮、肝臓、腎臓、子宮、脳、血管、肺、骨、筋肉、膵臓、胃、脾臓、結腸、脂肪組織または食道の細胞外マトリックスに由来する、請求項１から３６までのいずれかに記載の方法。
前記ＭＢＶが、膀胱マトリックス（ＵＢＭ）、小腸粘膜下組織（ＳＩＳ）、または膀胱粘膜下組織（ＵＢＳ）に由来する、請求項１から３６までのいずれかに記載の方法。
前記ＭＢＶが、ヒト、サル、ブタ、ウシまたはヒツジから選択される哺乳類脊椎動物からの細胞外マトリックスに由来する、請求項１から３８までのいずれか一項に記載の方法。
請求項１から３９までのいずれか一項に記載の方法において使用するための、細胞外マトリックス由来の単離されたマトリックス結合型小胞（ＭＢＶ）の治療有効量を含む医薬調製物。
全身投与用に製剤化される、請求項４０に記載の医薬調製物。
前記全身投与が、静脈内投与である、請求項４１に記載の医薬調製物。
自己免疫障害が、関節リウマチである、請求項４１に記載の医薬調製物。
自己免疫障害が、乾癬である、請求項４０に記載の医薬調製物。
局所投与用に製剤化される、請求項４４に記載の医薬調製物。
前記局所投与が、局部的皮膚投与である、請求項４５に記載の医薬調製物。