JP2022549393A - Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ ｉｍｍｉｔｉｓおよびＤｉｒｏｆｉｌａｒｉａ ｒｅｐｅｎｓを標的とするためのシステムおよび方法 - Google Patents

Abstract

寄生生物特異的ＤＮＡ標的捕捉技法を使用する動物宿主におけるＤｉｒｏｆｉｌａｒｉａ ｉｍｍｉｔｉｓおよびＤｉｒｏｆｉｌａｒｉａ．ｒｅｐｅｎｓの鑑別検出、ならびにかかる標的のポリメラーゼ連鎖反応検出のためのデバイス、システム、キットならびに方法を含むプラットフォームが、提供される。本発明の一実施形態によれば、動物宿主における寄生生物感染の診断のためのデバイスであって、サーモサイクラーを含むＰＣＲ測定装置を含む、デバイスが提供される。

Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０１９年４月２６日出願の米国仮特許出願第６２／８３９，１３６号および２０１９年７月８日出願の米国仮特許出願第６２／８７１，４６３号の利益を主張し、その各々は、これによって、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

技術分野
本発明は、動物宿主における寄生生物による感染、特に、Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ ｉｍｍｉｔｉｓおよびＤｉｒｏｆｉｌａｒｉａ ｒｅｐｅｎｓによる感染を同定するためのシステムおよび方法に関する。

犬糸状虫症、およびより低い程度ではあるが猫糸状虫症は、寄生性回虫Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ ｉｍｍｉｔｉｓによる感染に起因する［Haddock, K. C. Soc. Sci. Med. (1987)；Knight, D. H. Veterinary Clinics of North America - Small Animal Practice (1987)；Shearer, P. Banf. Appl. Res. Knowl. Team 1-16 (2011)］。糸状虫症は、米国および世界中でコンパニオンアニマルの最も重要な健康問題の１つである［Wang, D. et al. Parasites and Vectors 7, 1-18 (2014)；Dantas-Torres, F. and Otranto D. Parasites and Vectors 6, 1 (2013)］。この寄生生物は、オオカミ、コヨーテ、クマ、キツネ、アシカ、アザラシおよび絶滅危惧ＩＡ類の北米クロアシイタチを含む他の哺乳動物にも感染することが公知である。Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓは、時折ヒトにも感染するが、重大な臨床像を引き起こすことはまれである［Ro, J. Y. et al. Human Pathology (1989)］。Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓは、南北アメリカ、欧州、日本およびオーストラリアにおいて最も蔓延している。

Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ ｒｅｐｅｎｓは、犬、猫、オオカミ、コヨーテ、キツネ、アシカおよびヒトにおいても疾患を引き起こす、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓと近縁の寄生性回虫である［Genchi, C. and Kramer, L. Parasites and Vectors 10, 1-6 (2017)］。Ｄ．ｒｅｐｅｎｓは、犬において、種々の型の重大な皮膚炎、皮膚結節、および重症の症例では臓器損傷を含む様々な臨床像を引き起こす［Capelli, G. et al. Parasites and Vectors 11, 1-21 (2018)］。Ｄ．ｒｅｐｅｎｓは、主に欧州、アフリカおよび南アジアにおいて見出される旧世界の疾患である［Genchi, C. and Kramer, L. H. Vet. Parasitol. 280, 108995 (2019)］。Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓと同様、Ｄ．ｒｅｐｅｎｓも蚊によって伝染する。また、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓと同様、Ｄ．ｒｅｐｅｎｓは時折、ヒトにおいて感染症を引き起こす［Capelli, G. et al. Parasites and Vectors 11, 1-21 (2018)；Harizanov, R. N. et al. Parasitol. Res. 113, 1571-1579 (2014)］。

理想的には、ペットおよび野良の両方の全ての犬および猫を、好ましくは周期的に、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓの存在についてテストすべきである。かかるテストは、宿主哺乳動物が予防的薬物レジメンを受ける場合、特に重要である。テストには現在、血液中のミクロフィラリアの直接的観察、抗原テストおよびポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）が含まれる［Trancoso, T.A.L. et al. Rev Bras Parasitol Vet. 29, 1, (2020)］。顕微鏡を使用した血液中のミクロフィラリアの直接的観察は、最も古いテストであるが、低レベルのミクロフィラリアが見逃される場合が多いため、または宿主哺乳動物の身体中に成虫（adult worm）が存在するにもかかわらず血液中にミクロフィラリアが存在しない（一方の性別だけの感染、性的にまだ成熟していない虫（worm）、繁殖するには老いすぎた虫、またはミクロフィラリアを死滅させることには成功するが成虫は死滅させることができない宿主哺乳動物の免疫系に起因する）ため、感度の欠如に悩まされている。さらに、宿主哺乳動物の大きい集団のマススクリーニングのための血液の直接的顕微鏡評価は、要求される時間およびスキルレベルに起因して、実用的ではない。

現在、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓについて犬をスクリーニングするために最も一般的に使用されるテストは、性的に成熟した雌性成虫から血流中に流れた循環Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓ抗原の検出に基づく抗原テストである［Little, S. et al. Parasites and Vectors 11, 1-10 (2018)；Ciuca, L. et al. Vet. Parasitol. 225, 81-85 (2016)］。抗原ベースのテストには、いくつかの重大な問題がある。第１に、このテストは、雌性寄生生物が性的に成熟するまで（感染後６～７カ月）、哺乳動物宿主においてＤ．ｉｍｍｉｔｉｓ寄生生物を有効に検出しない。これは重要な期間である。検出における遅延は寄生生物に有利なスタートを許してしまうが、処置が早期に開始できれば、寄生生物が宿主動物に対して害を引き起こす時間が短くなり、処置有効性はかなり改善されるからである。さらに、抗原ベースのテストは、一方の性別だけの雄性感染を有効に検出しない。さらに、テスト結果が抗原陰性である宿主哺乳動物のうち約１％は、ミクロフィラリア陽性であることが示されている（偽陰性結果）。最後に、抗原ベースのアッセイは、他の寄生生物種と交差反応でき、偽陽性結果を引き起こし得るというかなりの証拠がある［Schnyder, M. and Deplazes, P. Parasit Vectors. 5, 258 (2012)；Aroch, I. et al. Vet Parasitol. 211, 303-305 92015)］。

顕微鏡ベースのテストおよび抗原ベースのテストに関する問題に対処するために、いくつかのＤＮＡベースのＰＣＲテストが開発されている［Gioia, G. et al. Vet. Parasitol. 172, 160-163 (2010)；Norgen Biotek. Dirofilaria immitis PCR Detection Kit (2011)；Latrofa, M. S. et al. Vet. Parasitol. 185, 181-185 (2012)；Albonico, F. et al. Vet. Parasitol. 200, 128-132 (2014)；Tahir, D. et al. Vet. Parasitol. 235, 1-7 (2017)］。しかし、これらのＰＣＲテストは全て、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓおよび／またはＤ．ｒｅｐｅｎｓのゲノム中に見出される低コピー数のＤＮＡ標的を検出するように設計されており、したがって、高度に高感度なわけではない。これらのテストが、非常に低レベルのまたはプレパテントの感染、即ち、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓまたはＤ．ｒｅｐｅｎｓ感染が血清学的抗原テストを使用して検出できる期間の前の感染、例えば、雌性成虫が性的に成熟しミクロフィラリアを産生する前の感染を検出できないことに起因して、これらのテストは、控えめに使用されてきたか、または獣医環境では全く使用されてこなかった。

Ｄ．ｒｅｐｅｎｓに対する高度に高感度な種特異的テストの論拠は、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓに対するテストと類似である。Ｄ．ｒｅｐｅｎｓでは、顕微鏡ベースのテストが、ミクロフィラリアの存在を探すために主に使用される［Capelli, G. et al. Parasites and Vectors 11, 1-21 (2018)］。宿主哺乳動物をスクリーニングするために利用可能な、Ｄ．ｒｅｐｅｎｓに特異的な標準化された抗原ベースのテストは存在しない［Ciuca, L. et al. Vet. Parasitol. 225, 81-85 (2016)］。したがって、全ての生活環ステージにおいて、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓおよび／またはＤ．ｒｅｐｅｎｓの存在について宿主哺乳動物の血液または血清中の少量のＤＮＡを検出することができる高度に高感度な種特異的アッセイが、大いに必要とされている。
蚊宿主においてＤ．ｉｍｍｉｔｉｓまたはＤ．ｒｅｐｅｎｓを検出するための高度に高感度な種特異的ＰＣＲテストは、開発されていない。それにもかかわらず、蚊集団におけるＤ．ｉｍｍｉｔｉｓおよびＤ．ｒｅｐｅｎｓの地理的分布および密度の知見は、寄生生物制御プログラムを計画する際の重要な因子である。局地的な犬および猫集団に対するリスクの程度を理解するために、感染した蚊の地理的分布を正確に評価することができなければならない。したがって、野外で収集された蚊のプールにおいて、いずれの生活環ステージでもＤ．ｉｍｍｉｔｉｓおよびＤ．ｒｅｐｅｎｓを検出するための高度に高感度な種特異的テストが、必要とされている。

Haddock, K. C. Soc. Sci. Med. (1987) Knight, D. H. Veterinary Clinics of North America -Small Animal Practice (1987) Shearer, P. Banf. Appl. Res. Knowl. Team 1-16 (2011) Wang, D. et al. Parasites and Vectors 7, 1-18 (2014) Dantas-Torres, F. and Otranto D. Parasites and Vectors 6, 1 (2013) Ro, J. Y. et al. Human Pathology (1989) Genchi, C. and Kramer, L. Parasites and Vectors 10, 1-6 (2017) Capelli, G. et al. Parasites and Vectors 11, 1-21 (2018) Genchi, C. and Kramer, L. H. Vet. Parasitol. 280, 108995 (2019) Harizanov, R. N. et al. Parasitol. Res. 113, 1571-1579 (2014) Trancoso, T.A.L. et al. Rev Bras Parasitol Vet. 29, 1, (2020) Little, S. et al. Parasites and Vectors 11, 1-10 (2018) Ciuca, L. et al. Vet. Parasitol. 225, 81-85 (2016) Schnyder, M. and Deplazes, P. Parasit Vectors. 5, 258 (2012) Aroch, I. et al. Vet Parasitol. 211, 303-305 92015) Gioia, G. et al. Vet. Parasitol. 172, 160-163 (2010) Norgen Biotek. Dirofilaria immitis PCR Detection Kit (2011) Latrofa, M. S. et al. Vet. Parasitol. 185, 181-185 (2012) Albonico, F. et al. Vet. Parasitol. 200, 128-132 (2014) Tahir, D. et al. Vet. Parasitol. 235, 1-7 (2017)

本発明の一実施形態によれば、動物宿主における寄生生物感染の診断のためのデバイスであって、サーモサイクラーを含むＰＣＲ測定装置を含む、デバイス。ＰＣＲ測定装置は、感染した前記動物宿主から得られた組織試料中の前記寄生生物のＤＮＡ中の反復性配列を標的とするように構成されている。

寄生生物は、Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ ｉｍｍｉｔｉｓまたはＤｉｒｏｆｉｌａｒｉａ ｒｅｐｅｎｓであり得、反復性配列は、寄生生物に対する感度および選択性を提供するように選択され得る。一部の実施形態では、ＰＣＲ測定装置は、光学読み出し機構を含み、この光学読み出し機構は、目に見えるバンドを有するテストストリップを必要に応じて含む。

組織試料は、感染した動物宿主から得られた血漿、血清または全血であり得る。さらに、組織試料は、感染した蚊由来であり得る。

本発明の実施形態によれば、寄生生物に感染した疑いがある哺乳動物宿主を処置する方法が提供される。本方法は、（ａ）寄生生物に感染した疑いがある哺乳動物宿主由来の試料を提供するステップ；ならびに（ｂ）試料中の寄生生物の存在の検出を引き起こすステップを含む。この検出は、（ｉ）試料からＤＮＡを利用可能にするステップ；（ｉｉ）試料を、標的ＤＮＡに対して相補的な標識されたＤＮＡと混合するステップ；および（ｉｉｉ）ＰＣＲを使用して標的ＤＮＡを検出するステップを含み、寄生生物の存在が、検出を引き起こすステップの結果として検出された場合、哺乳動物宿主に、寄生生物感染を低減または排除するのに有効な処置を施行する。

標識されたＤＮＡは、（ａ）標的ＤＮＡを同定するステップであって、標的ＤＮＡが、寄生生物によって独自に保有される反復性ＤＮＡであるステップを含むプロセスを使用して作製されている。同定するステップは、（ｉ）ゲノムＤＮＡ配列リードを寄生生物から得るステップ、（ｉｉ）各配列リードをトリミングして、等しい長さのトリミングされた配列リードのリードセットを生成するステップ、（ｉｉｉ）リード対を形成するために、リードセットの各配列を、リードセット中の全ての他の配列リードと比較するステップであって、所与の対の各リードが、その長さの少なくとも５５％にわたって、その対の他のリードと、少なくとも９０％の類似性を共有する、ステップ、（ｉｖ）リード対を評価して、寄生生物のゲノム中の、ゲノム中に高いコピー数を推定上有する配列の候補セットを同定するステップ、および（ｖ）配列の候補セットから、寄生生物によって独自に保有される最終配列を選択するステップ；ならびに（ｂ）寄生生物によって独自に保有される最終配列を使用して、標識されたＤＮＡの合成を引き起こすステップを含み、標識されたＤＮＡは、寄生生物によって独自に保有される同定された反復性ＤＮＡに対して相補的である。

寄生生物は、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓまたはＤ．ｒｅｐｅｎｓであり得る。一部の実施形態では、寄生生物感染は、パテントである。他の実施形態では、寄生生物感染は、プレパテントである。組織試料は、イヌであり得る感染した哺乳動物宿主から得られた血漿、血清または全血であり得る。

一部の実施形態では、標識されたＤＮＡは、コンジュゲーション部分を含む。コンジュゲーション部分は、ビオチンであり得る。一部の実施形態では、標的ＤＮＡは、捕捉ＤＮＡに結合する捕捉媒体を使用して混合物から単離される。捕捉媒体は、磁気ビーズまたはテストストリップであり得、捕捉媒体は、ストレプトアビジンでコーティングされ得る。

一部の実施形態では、ＰＣＲは、プライマーおよびプローブセットを使用するリアルタイムＰＣＲである。一部の実施形態では、寄生生物はＤ．ｉｍｍｉｔｉｓであり、プライマーおよびプローブセットは、ｐ１Ｄｉｍ１、ｐ２Ｄｉｍ１およびｐ３Ｄｉｍ１からなる群から選択される。他の実施形態では、寄生生物はＤ．ｒｅｐｅｎｓであり、プライマーおよびプローブセットは、ｐ１Ｄｒｅ１、ｐ２Ｄｒｅ１およびｐ３Ｄｒｅ１からなる群から選択される。

一部の実施形態では、寄生生物はＤ．ｉｍｍｉｔｉｓであり、標的ＤＮＡはＤｉｍ１である。標識されたＤＮＡは、配列番号３および配列番号４からなる捕捉オリゴヌクレオチドのセットであり得る。

一部の実施形態では、寄生生物はＤ．ｒｅｐｅｎｓであり、標的ＤＮＡはＤｒｅ１である。標識されたＤＮＡは、配列番号７および配列番号８からなる捕捉オリゴヌクレオチドのセットであり得る。

一部の実施形態では、処置は、メラルソミン、イベルメクチン、ドキシサイクリン、モキシデクチン、およびそれらの組合せからなる群から選択される。

本発明の実施形態によれば、動物宿主における寄生生物感染を検出するためのキットが提供される。キットは、（ａ）反復性種特異的寄生生物標的ＤＮＡに対して相補的な標識されたＤＮＡ、（ｂ）捕捉ＤＮＡに結合する捕捉媒体、および（ｃ）寄生生物感染を検出するための書面による指示のセットを含む。

寄生生物は、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓまたはＤ．ｒｅｐｅｎｓであり得、標識されたＤＮＡは、コンジュゲーション部分を含む。一部の実施形態では、コンジュゲーション部分はビオチンであり、捕捉媒体は、磁気ビーズ、テストストリップ、およびそれらの組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、捕捉媒体は、ストレプトアビジンでコーティングされている。キットは、プライマーおよびプローブセットを含み得る。

一部の実施形態では、寄生生物はＤ．ｉｍｍｉｔｉｓであり、標識されたＤＮＡは、配列番号３および配列番号４からなる捕捉オリゴヌクレオチドのセットである。一部の実施形態では、寄生生物はＤ．ｉｍｍｉｔｉｓであり、標的ＤＮＡはＤｉｍ１である。一部の実施形態では、寄生生物はＤ．ｉｍｍｉｔｉｓであり、プライマーおよびプローブセットは、ｐ１Ｄｉｍ１、ｐ２Ｄｉｍ１、ｐ３Ｄｉｍ１およびｐ４Ｄｉｍ１からなる群から選択される。

他の実施形態では、寄生生物はＤ．ｒｅｐｅｎｓであり、標識されたＤＮＡは、配列番号７および配列番号８からなる捕捉オリゴヌクレオチドのセットである。一部の実施形態では、寄生生物はＤ．ｉｍｍｉｔｉｓであり、標的ＤＮＡはＤｒｅ１である。一部の実施形態では、寄生生物はＤ．ｒｅｐｅｎｓであり、標的ＤＮＡはＤｒｅ１である。一部の実施形態では、寄生生物はＤ．ｒｅｐｅｎｓであり、プライマーおよびプローブセットは、ｐ１Ｄｒｅ１、ｐ２Ｄｒｅ１およびｐ３Ｄｒｅ１からなる群から選択される。

実施形態の上述の特色は、添付の図面を参照して、以下の詳細な説明を参照してより容易に理解される。

図１Ａおよび１Ｂは、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓおよびＤ．ｒｅｐｅｎｓの反復性標的ＤＮＡならびに本発明の実施形態に従う例示的なビオチン化された捕捉オリゴヌクレオチドを示す。図１Ａは、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓ Ｄｉｍ１反復性標的ＤＮＡ、および標的ＤＮＡにハイブリダイズした例示的なＤｉｍ１捕捉オリゴヌクレオチドを示す。図１Ｂは、Ｄ．ｒｅｐｅｎｓ Ｄｒｅ１反復性標的ＤＮＡ、および標的ＤＮＡにハイブリダイズした例示的なＤｒｅ１捕捉オリゴヌクレオチドを示す。全てのフォワード捕捉オリゴヌクレオチドは、５’から３’である。全てのリバース捕捉オリゴヌクレオチドは、３’から５’である。 図１Ａおよび１Ｂは、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓおよびＤ．ｒｅｐｅｎｓの反復性標的ＤＮＡならびに本発明の実施形態に従う例示的なビオチン化された捕捉オリゴヌクレオチドを示す。図１Ａは、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓ Ｄｉｍ１反復性標的ＤＮＡ、および標的ＤＮＡにハイブリダイズした例示的なＤｉｍ１捕捉オリゴヌクレオチドを示す。図１Ｂは、Ｄ．ｒｅｐｅｎｓ Ｄｒｅ１反復性標的ＤＮＡ、および標的ＤＮＡにハイブリダイズした例示的なＤｒｅ１捕捉オリゴヌクレオチドを示す。全てのフォワード捕捉オリゴヌクレオチドは、５’から３’である。全てのリバース捕捉オリゴヌクレオチドは、３’から５’である。

図２は、本発明の実施形態に従うビオチン化された捕捉オリゴヌクレオチドおよびストレプトアビジンコーティングされた磁気ビーズを使用する標的ＤＮＡ捕捉手順の例示的な図を示す。

図３Ａ～３Ｆは、本発明の実施形態に従うＤ．ｉｍｍｉｔｉｓ反復性標的ＤＮＡ Ｄｉｍ１およびＤ．ｒｅｐｅｎｓ反復性標的ＤＮＡ Ｄｒｅ１のリアルタイムＰＣＲのための例示的なプライマーおよびプローブセットを示す。図３Ａ～３Ｃは、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓ反復性標的ＤＮＡ Ｄｉｍ１にハイブリダイズした、それぞれ、例示的なリアルタイムＰＣＲプライマーおよびプローブセットｐ１Ｄｉｍ１、ｐ２Ｄｉｍ１およびｐ３Ｄｉｍ１を示す。図３Ｄ～３Ｆは、Ｄ．ｒｅｐｅｎｓ反復性標的ＤＮＡ Ｄｅｒ１にハイブリダイズした、それぞれ、例示的なリアルタイムＰＣＲプライマーおよびプローブセットｐ１Ｄｒｅ１、ｐ２Ｄｒｅ１およびｐ３Ｄｒｅ１を示す。全てのフォワードプライマーおよびプローブは、５’から３’である。全てのリバースプライマーは、３’から５’である。例示的なプライマーおよびプローブセットｐ１Ｄｉｍ１、ｐ２Ｄｉｍ１、ｐ３Ｄｉｍ１、ｐ１Ｄｒｅ１、ｐ２Ｄｒｅ１およびｐ３Ｄｒｅ１の全てのプローブは、その５’末端に結合した蛍光色素６－カルボキシフルオレセイン（「６－ＦＡＭ」）、その３’末端に結合したクエンチャーＩｏｗａ Ｂｌａｃｋ（登録商標）ＦＱ（「ＩＡＢｋＦＱ」）、および５’末端から９塩基の内部ＺＥＮ（商標）クエンチャーを有する。 図３Ａ～３Ｆは、本発明の実施形態に従うＤ．ｉｍｍｉｔｉｓ反復性標的ＤＮＡ Ｄｉｍ１およびＤ．ｒｅｐｅｎｓ反復性標的ＤＮＡ Ｄｒｅ１のリアルタイムＰＣＲのための例示的なプライマーおよびプローブセットを示す。図３Ａ～３Ｃは、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓ反復性標的ＤＮＡ Ｄｉｍ１にハイブリダイズした、それぞれ、例示的なリアルタイムＰＣＲプライマーおよびプローブセットｐ１Ｄｉｍ１、ｐ２Ｄｉｍ１およびｐ３Ｄｉｍ１を示す。図３Ｄ～３Ｆは、Ｄ．ｒｅｐｅｎｓ反復性標的ＤＮＡ Ｄｅｒ１にハイブリダイズした、それぞれ、例示的なリアルタイムＰＣＲプライマーおよびプローブセットｐ１Ｄｒｅ１、ｐ２Ｄｒｅ１およびｐ３Ｄｒｅ１を示す。全てのフォワードプライマーおよびプローブは、５’から３’である。全てのリバースプライマーは、３’から５’である。例示的なプライマーおよびプローブセットｐ１Ｄｉｍ１、ｐ２Ｄｉｍ１、ｐ３Ｄｉｍ１、ｐ１Ｄｒｅ１、ｐ２Ｄｒｅ１およびｐ３Ｄｒｅ１の全てのプローブは、その５’末端に結合した蛍光色素６－カルボキシフルオレセイン（「６－ＦＡＭ」）、その３’末端に結合したクエンチャーＩｏｗａ Ｂｌａｃｋ（登録商標）ＦＱ（「ＩＡＢｋＦＱ」）、および５’末端から９塩基の内部ＺＥＮ（商標）クエンチャーを有する。 図３Ａ～３Ｆは、本発明の実施形態に従うＤ．ｉｍｍｉｔｉｓ反復性標的ＤＮＡ Ｄｉｍ１およびＤ．ｒｅｐｅｎｓ反復性標的ＤＮＡ Ｄｒｅ１のリアルタイムＰＣＲのための例示的なプライマーおよびプローブセットを示す。図３Ａ～３Ｃは、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓ反復性標的ＤＮＡ Ｄｉｍ１にハイブリダイズした、それぞれ、例示的なリアルタイムＰＣＲプライマーおよびプローブセットｐ１Ｄｉｍ１、ｐ２Ｄｉｍ１およびｐ３Ｄｉｍ１を示す。図３Ｄ～３Ｆは、Ｄ．ｒｅｐｅｎｓ反復性標的ＤＮＡ Ｄｅｒ１にハイブリダイズした、それぞれ、例示的なリアルタイムＰＣＲプライマーおよびプローブセットｐ１Ｄｒｅ１、ｐ２Ｄｒｅ１およびｐ３Ｄｒｅ１を示す。全てのフォワードプライマーおよびプローブは、５’から３’である。全てのリバースプライマーは、３’から５’である。例示的なプライマーおよびプローブセットｐ１Ｄｉｍ１、ｐ２Ｄｉｍ１、ｐ３Ｄｉｍ１、ｐ１Ｄｒｅ１、ｐ２Ｄｒｅ１およびｐ３Ｄｒｅ１の全てのプローブは、その５’末端に結合した蛍光色素６－カルボキシフルオレセイン（「６－ＦＡＭ」）、その３’末端に結合したクエンチャーＩｏｗａ Ｂｌａｃｋ（登録商標）ＦＱ（「ＩＡＢｋＦＱ」）、および５’末端から９塩基の内部ＺＥＮ（商標）クエンチャーを有する。 図３Ａ～３Ｆは、本発明の実施形態に従うＤ．ｉｍｍｉｔｉｓ反復性標的ＤＮＡ Ｄｉｍ１およびＤ．ｒｅｐｅｎｓ反復性標的ＤＮＡ Ｄｒｅ１のリアルタイムＰＣＲのための例示的なプライマーおよびプローブセットを示す。図３Ａ～３Ｃは、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓ反復性標的ＤＮＡ Ｄｉｍ１にハイブリダイズした、それぞれ、例示的なリアルタイムＰＣＲプライマーおよびプローブセットｐ１Ｄｉｍ１、ｐ２Ｄｉｍ１およびｐ３Ｄｉｍ１を示す。図３Ｄ～３Ｆは、Ｄ．ｒｅｐｅｎｓ反復性標的ＤＮＡ Ｄｅｒ１にハイブリダイズした、それぞれ、例示的なリアルタイムＰＣＲプライマーおよびプローブセットｐ１Ｄｒｅ１、ｐ２Ｄｒｅ１およびｐ３Ｄｒｅ１を示す。全てのフォワードプライマーおよびプローブは、５’から３’である。全てのリバースプライマーは、３’から５’である。例示的なプライマーおよびプローブセットｐ１Ｄｉｍ１、ｐ２Ｄｉｍ１、ｐ３Ｄｉｍ１、ｐ１Ｄｒｅ１、ｐ２Ｄｒｅ１およびｐ３Ｄｒｅ１の全てのプローブは、その５’末端に結合した蛍光色素６－カルボキシフルオレセイン（「６－ＦＡＭ」）、その３’末端に結合したクエンチャーＩｏｗａ Ｂｌａｃｋ（登録商標）ＦＱ（「ＩＡＢｋＦＱ」）、および５’末端から９塩基の内部ＺＥＮ（商標）クエンチャーを有する。 図３Ａ～３Ｆは、本発明の実施形態に従うＤ．ｉｍｍｉｔｉｓ反復性標的ＤＮＡ Ｄｉｍ１およびＤ．ｒｅｐｅｎｓ反復性標的ＤＮＡ Ｄｒｅ１のリアルタイムＰＣＲのための例示的なプライマーおよびプローブセットを示す。図３Ａ～３Ｃは、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓ反復性標的ＤＮＡ Ｄｉｍ１にハイブリダイズした、それぞれ、例示的なリアルタイムＰＣＲプライマーおよびプローブセットｐ１Ｄｉｍ１、ｐ２Ｄｉｍ１およびｐ３Ｄｉｍ１を示す。図３Ｄ～３Ｆは、Ｄ．ｒｅｐｅｎｓ反復性標的ＤＮＡ Ｄｅｒ１にハイブリダイズした、それぞれ、例示的なリアルタイムＰＣＲプライマーおよびプローブセットｐ１Ｄｒｅ１、ｐ２Ｄｒｅ１およびｐ３Ｄｒｅ１を示す。全てのフォワードプライマーおよびプローブは、５’から３’である。全てのリバースプライマーは、３’から５’である。例示的なプライマーおよびプローブセットｐ１Ｄｉｍ１、ｐ２Ｄｉｍ１、ｐ３Ｄｉｍ１、ｐ１Ｄｒｅ１、ｐ２Ｄｒｅ１およびｐ３Ｄｒｅ１の全てのプローブは、その５’末端に結合した蛍光色素６－カルボキシフルオレセイン（「６－ＦＡＭ」）、その３’末端に結合したクエンチャーＩｏｗａ Ｂｌａｃｋ（登録商標）ＦＱ（「ＩＡＢｋＦＱ」）、および５’末端から９塩基の内部ＺＥＮ（商標）クエンチャーを有する。 図３Ａ～３Ｆは、本発明の実施形態に従うＤ．ｉｍｍｉｔｉｓ反復性標的ＤＮＡ Ｄｉｍ１およびＤ．ｒｅｐｅｎｓ反復性標的ＤＮＡ Ｄｒｅ１のリアルタイムＰＣＲのための例示的なプライマーおよびプローブセットを示す。図３Ａ～３Ｃは、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓ反復性標的ＤＮＡ Ｄｉｍ１にハイブリダイズした、それぞれ、例示的なリアルタイムＰＣＲプライマーおよびプローブセットｐ１Ｄｉｍ１、ｐ２Ｄｉｍ１およびｐ３Ｄｉｍ１を示す。図３Ｄ～３Ｆは、Ｄ．ｒｅｐｅｎｓ反復性標的ＤＮＡ Ｄｅｒ１にハイブリダイズした、それぞれ、例示的なリアルタイムＰＣＲプライマーおよびプローブセットｐ１Ｄｒｅ１、ｐ２Ｄｒｅ１およびｐ３Ｄｒｅ１を示す。全てのフォワードプライマーおよびプローブは、５’から３’である。全てのリバースプライマーは、３’から５’である。例示的なプライマーおよびプローブセットｐ１Ｄｉｍ１、ｐ２Ｄｉｍ１、ｐ３Ｄｉｍ１、ｐ１Ｄｒｅ１、ｐ２Ｄｒｅ１およびｐ３Ｄｒｅ１の全てのプローブは、その５’末端に結合した蛍光色素６－カルボキシフルオレセイン（「６－ＦＡＭ」）、その３’末端に結合したクエンチャーＩｏｗａ Ｂｌａｃｋ（登録商標）ＦＱ（「ＩＡＢｋＦＱ」）、および５’末端から９塩基の内部ＺＥＮ（商標）クエンチャーを有する。

図４は、本発明の実施形態に従うプライマーおよびプローブセットｐ１Ｄｉｍ１を使用して生成されたＤ．ｉｍｍｉｔｉｓ ｇＤＮＡについてのリアルタイムＰＣＲ標準曲線を示す。

図５は、本発明の実施形態に従うＤ．ｉｍｍｉｔｉｓ反復性標的ＤＮＡ Ｄｉｍ１にハイブリダイズした例示的なテストストリッププライマーおよびプローブセットｐ４Ｄｉｍ１を示す。全てのフォワードプライマーおよびプローブは、５’から３’である。全てのリバースプライマーは、３’から５’である。

図６Ａ～６Ｃは、本発明の実施形態に従うテストストリップＰＣＲ結果を示す。図６Ａは、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓゲノムＤＮＡの対照希釈系列のテストストリップＰＣＲ結果を示す。図６Ｂおよび６Ｃは、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓ感染したおよび未感染のイヌについてのテストストリップＰＣＲ結果を示す。 図６Ａ～６Ｃは、本発明の実施形態に従うテストストリップＰＣＲ結果を示す。図６Ａは、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓゲノムＤＮＡの対照希釈系列のテストストリップＰＣＲ結果を示す。図６Ｂおよび６Ｃは、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓ感染したおよび未感染のイヌについてのテストストリップＰＣＲ結果を示す。

具体的な実施形態の詳細な説明
定義。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、以下の用語は、文脈が明らかに他を要求しない限り、示された意味を有するものとする：

「セット」は、少なくとも１つのメンバーを含む。

本明細書で使用される場合、「リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応」、「リアルタイムＰＣＲ」、「定量的ポリメラーゼ連鎖反応」および「ｑＰＣＲ」は、同義である。

「サーモサイクラー」は、ＤＮＡの複製を引き起こす温度変化の一連のサイクルを実行することによってポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を介してＤＮＡのセグメントを増幅するように構成された装置である。例えば、Mullis KB (April 1990) Scientific American. 262 (4): 56-61, 64-5を参照のこと。Saiki R et al. (December 1985) Science. 230 (4732): 1350-4もまた参照のこと。

「付随する光学読み出し機構」は、付随するサーモサイクラーが定量サイクルＣｑに到達したときに閾値の存在について光学的に報告するための機構と組み合わせた、ＤＮＡ結合性の標識された配列特異的プライマーおよびプローブのセットを含むシステムである。光学読み出し機構は、蛍光標識された配列特異的プライマーおよびプローブ、ならびに例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）から入手可能な標準的なｑＰＣＲシステム中と同様の写真光学検出器を使用することによって、達成され得る。あるいは、光学読み出し機構は、Zaky WI et al. (2018) PLoS Negl Trop Dis 12(11): e0006962に記載されるように、テストストリップ上の目に見えるバンドの出現を誘発するために、適切に標識されたＤＮＡを使用することによって実行され得る。

「構成されたＰＣＲ測定装置」は、特異的ＤＮＡ標的に対するプライマーを備えたＰＣＲ測定装置である。

本明細書で使用される場合、「感染した」、例えば、感染した動物宿主、感染した哺乳動物宿主または感染した蚊宿主は、生物が、その身体中に寄生生物Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓまたはＤ．ｒｅｐｅｎｓを保有することを意味するものとする。

「プレパテント感染」などは、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓまたはＤ．ｒｅｐｅｎｓ感染が血清学的抗原テストを使用して検出できる期間の前に存在しているＤ．ｉｍｍｉｔｉｓまたはＤ．ｒｅｐｅｎｓ感染を意味するものとする。

「パテント感染」などは、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓまたはＤ．ｒｅｐｅｎｓ感染が血清学的抗原テストを使用して検出できる期間の後に存在しているＤ．ｉｍｍｉｔｉｓまたはＤ．ｒｅｐｅｎｓ感染を意味するものとする。

「コンジュゲーション部分」は、捕捉媒体、例えば、磁気ビーズ、非磁気ビーズ、メンブレン、テストストリップ（ストリップテストの間に利用される）、またはカラムの内容物への核酸分子の結合を促進する、核酸分子に結合された化学的部分を意味するものとする。

「捕捉ＤＮＡ」は、（ａ）コンジュゲーション部分を有する捕捉オリゴヌクレオチド、（ｂ）コンジュゲーション部分を有するＰＣＲプライマーから合成されたＤＮＡ、および（ｃ）それらの組合せからなる群のメンバーを意味するものとする。

「捕捉媒体」は、特定のコンジュゲーション部分に特異的に結合する任意の媒体を意味するものとする。例えば、磁気ビーズ、非磁気ビーズ、メンブレン、テストストリップ（ストリップテストの間に利用される）、およびカラムの内容物は、特定のコンジュゲーション部分と相互作用しそれと結合する分子、タンパク質または他の反応性基でコーティングされ得る。コンジュゲーション部分を有する捕捉オリゴヌクレオチド、またはコンジュゲーション部分を有するＰＣＲプライマーから合成されたＤＮＡは、捕捉媒体に結合することができる。

「標識されたＤＮＡ」は、（ａ）コンジュゲーション部分を有する捕捉オリゴヌクレオチド、（ｂ）コンジュゲーション部分を有するＰＣＲプライマー；（ｃ）その検出を促進するための１つまたは複数の部分を含むリアルタイムＰＣＲプローブ、（ｄ）その検出を促進するための１つまたは複数の部分を含むテストストリッププローブ、および（ｅ）および、それらの組合せからなる群から選択されるメンバーを意味するものとする。

「哺乳動物宿主」は、寄生生物に感染した哺乳動物を意味するものとする。

「蚊宿主」および「蚊媒介生物（mosquito vector）」は、寄生生物に感染した蚊を意味するものとする。

哺乳動物宿主としても蚊宿主としても適格でない「動物宿主」または「宿主」には、哺乳動物宿主および蚊宿主の両方が含まれる。

「相補的な」は、オリゴヌクレオチド、プライマーまたはプローブの塩基の少なくとも８０％が、標的配列と塩基対合することが可能であることを意味するものとする。

Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓおよびＤ．ｒｅｐｅｎｓの両方について、感染は、感染性幼虫（第３ステージＬ３）が、蚊によって哺乳動物宿主の皮膚に植え付けられるときに開始する。感染性幼虫は、蚊によって引き起こされた咬傷を介して侵入し、皮下組織に潜り込む。次の６～７カ月の間に、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓ幼虫は２回脱皮し、肺動脈および心臓に移動し、成長して完全に成体の寄生生物になる。Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓとは異なり、Ｄ．ｒｅｐｅｎｓ成虫は、皮下組織にとどまり、心臓にも肺動脈にも移動しない。

雄性および雌性の成虫は交尾し、雌性は、数千のミクロフィラリア（第１のステージＬ１幼虫）を血流中に毎日放出する。これらのミクロフィラリアは、蚊が血液食を摂取している蚊に吸い上げられるまで、血液中を循環する。蚊に入ると、Ｌ１幼虫は脱皮してＬ２になり、次いで、感染性Ｌ３幼虫になる。Ｌ３は、蚊の口部分に移動し、ここで、蚊が再び摂食したときに、別の哺乳動物宿主に感染できる。したがって、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓおよびＤ．ｒｅｐｅｎｓの両方の完全な生活環は、哺乳動物宿主および蚊宿主の両方を要求する［Kotani, T. and Powers, K. G. Am. J. Vet. Res. 43, 2199-2206 (1982)；Silaghi, C., Beck, R. et al. Parasites and Vectors 10, 1-13 (2017)］。感染した哺乳動物宿主では、成虫は、１０～１２インチの長さになり、５～１０年間生存することができる。ミクロフィラリアは、血液食の間に蚊に吸い上げられる前に、血流中で２～３年間生存することができる。

Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓに感染した哺乳動物宿主では、目に見える症状には、努力性呼吸、咳嗽および消耗が含まれる。心臓、肺および腎臓への損傷が、症状が観察される前にしばしば生じる［Monchy, D., Levenes, H., Guegan, H., Poey, C. & Dubourdieu, D. Pulmonary dirofilariasis. Medecine tropicale: revue du Corps de sante colonial (1993)］。しばしば、哺乳動物宿主は、うっ血性心不全に起因して最終的に死亡する。

成虫を死滅させることができるメラルソミンを含む種々の薬物が、糸状虫症を処置するために使用され得る。しかし、入院が推奨され、多くの症例では、強制的な安静が数カ月間要求されるので、かかる処置は高額である。メラルソミン処置の前および後に、他の薬物が使用され、一部の症例では、メラルソミン処置を反復する必要があり得る。殺された成体糸状虫およびミクロフィラリアは、肺および循環に詰まり得る血餅を生じ得るので、この処置にはリスクがないわけではない。多くの症例、特に、慢性症状が診断の時点で既に明らかになっている進行した症例では、この疾患は、血餅および他の合併症の増加したリスクに起因して、処置を行ってもなお致死的である。かかる進行した症例では、または動物がメラルソミン処置に耐えられない場合には、手術が、肺動脈および心臓から成体糸状虫を物理的に除去するために要求され得る。したがって、初期感染の予防は、より安全でありかつかなり安価であるので、かなり好ましい代替法である。感染のリスクは、ペットを屋内に置くことによって劇的に低減され得るが、これは、実用的なアプローチでも望ましいアプローチでもない場合が多い。リスクのある動物へのイベルメクチンなどの毎月の予防的薬物の投与は、糸状虫予防のための最も一般的なアプローチである。かかる予防的処置は、糸状虫の存在についての診断テストの後にのみ開始すべきである。毎月の予防的予防薬を使用する場合であっても、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓについての定期的検査が、処置が適切に機能していることを確実にするため、および処置が開始される前に存在していた可能性があるが検出されなかった任意の感染を検出するために、なおも推奨される。

Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓ感染のための他の処置には、糸状虫によって引き起こされる肺への害を低減させるための、メラルソミンの使用前（prior the use of）のイベルメクチンおよびドキシサイクリンによる前処置が含まれる。Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓ感染は、ドキシサイクリンと併せた、大環状ラクトン、例えば、イベルメクチンおよびモキシデクチンによっても直接処置され得る。

Ｄ．ｒｅｐｅｎｓの臨床像は、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓとは異なるが、薬物処置レジメンは、それほど標準化されてはいないものの、類似である。

本発明の実施形態に従う寄生生物特異的ＤＮＡ標的捕捉技法およびかかる標的のポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）検出のカップリングを介した、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓおよびＤ．ｒｅｐｅｎｓの鑑別検出のためのデバイス、システム、キットおよび方法を含むプラットフォームが、本明細書に記載される。一部の実施形態では、ＰＣＲは、リアルタイムＰＣＲである。それらの高い感度および種特異性に起因して、これらのプラットフォームは、感染の早くも１０週間後に、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓまたはＤ．ｒｅｐｅｎｓのいずれかの感染を検出するために、哺乳動物宿主血液／血漿試料をスクリーニングするために使用され得る。本発明の実施形態によれば、パテント感染およびプレパテント感染は、ゲノム標的ＤＮＡまたは無細胞標的ＤＮＡ（「ｃｆＤＮＡ」）の選択的捕捉を可能にすることによって検出され得る。

一部の実施形態では、本明細書に記載されるプラットフォームは、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓまたはＤ．ｒｅｐｅｎｓのプレパテント感染を検出することが可能である。これらのプレパテント感染を検出するためのプラットフォームは、現在利用可能ではない。しかし、感染した動物は、低用量の薬物療法で早期に処置され得、より少ない処置副作用を経験し得、感染に起因する生理的損傷を被ることがあまりなくなり得るので、プレパテント感染を検出する能力は、臨床的に有用であり、新たな処置戦略への門戸を開く。

一部の実施形態では、本明細書に記載されるプラットフォームは、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓまたはＤ．ｒｅｐｅｎｓ感染の早期検出を可能にするための、獣医および臨床検査室による使用のために意図される。一部の実施形態では、これらのプラットフォームは、疫学者によっても使用され得、これらの寄生生物の昆虫媒介生物である蚊のスクリーニングおよび分析を促進する。蚊のスクリーニングは、マッピング、処置戦略の評価、介入プログラムの評価、ならびにＤ．ｉｍｍｉｔｉｓおよびＤ．ｒｅｐｅｎｓ感染の市中拡散のリスクの評価を可能にする。

本明細書に記載される寄生生物検出プラットフォームは、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓおよびＤ．ｒｅｐｅｎｓの両方のゲノムの洗練されたバイオインフォマティクスベースのスクリーニングを介して開発された。各生物について、バイオインフォマティクススクリーニングは、その生物に独自でありかつその寄生生物のゲノム内に最大のコピー数で存在すると予測されるゲノムＤＮＡ配列を同定した。これらのＤＮＡエレメントは、そのそれぞれの寄生生物の検出のための最適な標的を提示するが、それは、これらのＤＮＡエレメントが、起源の種に独自でありかつ起源のゲノム内で高度に反復性であり、それにより、種特異的かつ最適に高感度な検出アッセイ標的になっているからである。標的の数が大きくなるほど、アッセイはより高感度になるので、これらの反復性ＤＮＡエレメントは、ＤＮＡ検出アッセイのための高感度な標的である。これらのアッセイ標的に対する配列相補性を有するオリゴヌクレオチド構築物を設計することによって、その特異的ゲノム標的配列に結合することが可能なオリゴヌクレオチドが、同定された標的配列を含むＤＮＡ分子を捕捉するために使用され得る。

一部の実施形態では、各捕捉分子へのビオチン標識（コンジュゲーション部分）の付加は、ビオチン－ストレプトアビジン連結を介した、ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズへのこれらの人工構築物の結合を可能にする。この連結は、哺乳動物宿主のまたは蚊からの血液／血清内のＤ．ｉｍｍｉｔｉｓまたはＤ．ｒｅｐｅｎｓ標的ＤＮＡに特異的に結合（ハイブリダイズ）することが可能な捕捉ビーズの生成を生じる。標的ＤＮＡの特異的結合および捕捉の後に、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓおよび／またはＤ．ｒｅｐｅｎｓ標的ＤＮＡは、磁気ビーズ単離および捕捉オリゴヌクレオチドからの溶出を介して、富化され得る。

一部の実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチドは、標的ＤＮＡに最初にハイブリダイズされ得、次いで、適切に処理された捕捉媒体、例えば、ストレプトアビジンコーティングされたビーズに結合され得る。他の実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチドは、適切に処理された捕捉媒体に最初に結合され、その後、標的ＤＮＡにハイブリダイズされる。

ビオチン／ストレプトアビジン相互作用以外に、種々の化学が、捕捉ＤＮＡを適切な捕捉媒体に結合させるために使用され得る。一部の実施形態では、捕捉ＤＮＡは、捕捉ビーズ、例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）Ｍ－２７０ Ａｍｉｎｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）、または他の同様にコーティングされた捕捉媒体への捕捉ＤＮＡの直接的結合を促進する５’スルフヒドリルコンジュゲーション部分で改変され得る。他の実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチドは、５’もしくは３’アミノコンジュゲーション部分を用いて改変され得、またはＰＣＲプライマーは、捕捉ビーズ、例えば、カルボン酸でコーティングされたＤｙｎａｂｅａｄｓ（商標）Ｍ－２７０ Ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ Ａｃｉｄ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）、または他の同様にコーティングされた捕捉媒体への、アミド結合を介した捕捉ＤＮＡの直接的結合を促進する５’アミノコンジュゲーション部分で標識され得る。

一部の実施形態では、Ｉ－Ｌｉｎｋｅｒ（商標）コンジュゲーション部分が、捕捉オリゴヌクレオチド（複数可）またはＰＣＲプライマーの５’末端に結合され得る。Ｉ－Ｌｉｎｋｅｒ（商標）コンジュゲーション部分は、多くの適用において、アミノコンジュゲーション部分改変を置換し得る。さらに、Ｉ－Ｌｉｎｋｅｒ（商標）コンジュゲーション部分は、捕捉媒体への捕捉ＤＮＡの結合のために使用され得る捕捉媒体反応性基の範囲を拡大させる。例えば、アルデヒド改変された捕捉媒体およびケトン改変された捕捉媒体が、Ｉ－Ｌｉｎｋｅｒ（商標）コンジュゲーション部分を有する捕捉ＤＮＡに結合するために使用され得る。

一部の実施形態では、アミン改変された捕捉ＤＮＡが、捕捉媒体上の曝露されたカルボキシレート基またはスクシンイミジルエステルを介して捕捉媒体に結合され得る。他の実施形態では、チオール改変された捕捉ＤＮＡが、試薬架橋剤、例えば、４－（マレイミドフェニル）酪酸スクシンイミジル（ＳＭＰＢ）を使用して、アミノシラン捕捉媒体に結合され得る。一部の実施形態では、Ａｃｒｙｄｉｔｅ（商標）が、アクリル連結を介して捕捉媒体に捕捉ＤＮＡを共有結合させるためのコンジュゲーション部分として使用され得る。他の実施形態では、５’ジゴキシゲニンＮＨＳエステルが、抗ジゴキシゲニンでコーティングされた捕捉媒体に捕捉ＤＮＡを結合させるためのコンジュゲーション部分として使用され得る。他の実施形態では、５’スルフヒドリル改変された捕捉ＤＮＡが、アミンコーティングされた捕捉媒体に結合するために使用され得る。

カルボキシルコンジュゲーション部分およびアミノコンジュゲーション部分は、捕捉ＤＮＡを捕捉媒体に結合させるための一般的な反応性基である。例えば、以下の反応性基を含む捕捉媒体が利用され得る：－ＣＯＯＨ（カルボン酸）、－ＲＮＨ_２（一級脂肪族アミン）、－ＡｒＮＨ_２（芳香族アミン）、－ＡｒＣＨ_２Ｃｌクロロメチル（塩化ビニルベンジル）、－ＣＯＮＨ_２（アミド）、－ＣＯＮＨＮＨ_２（ヒドラジド）、－ＣＨＯ（アルデヒド）、－ＯＨ（ヒドロキシル）、－ＳＨ（チオール）および－ＣＯＣ（エポキシ）。

捕捉オリゴヌクレオチドに結合することが可能な他の捕捉媒体、例えば、非磁気ビーズ、例えば、シリカビーズ、ポリスチレンビーズ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ビーズおよびＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）ビーズもまた使用され得る。これらのビーズは、遠心分離を使用して単離され得、その後、標的ＤＮＡが溶出され得る。さらに、標的ＤＮＡのカラムベースの捕捉は、捕捉オリゴヌクレオチドでコーティングされた上述の非磁気ビーズが充填されたカラムを使用することによって実施され得る。カラムには、捕捉オリゴヌクレオチドでコーティングされた磁気ビーズが充填されてもよい。試料は、かかるカラムを通り抜け得、標的ＤＮＡが存在する場合、これは、捕捉オリゴヌクレオチドコーティングされたビーズに結合する。標的ＤＮＡは、これらのビーズから引き続いて溶出され得る。

以下にさらに記載されるように、テストストリップもまた、コンジュゲーション部分を有するＰＣＲプライマーから合成されたＤＮＡに結合するための捕捉媒体として使用され得る。

他の標的ＤＮＡ捕捉方法には、表面（メンブレン）に結合した捕捉オリゴヌクレオチドを使用するマイクロ流体ラテラルフロー技法が含まれ得る。捕捉オリゴヌクレオチドでコーティングされたマイクロアレイ様スライドまたはポリスチレンマイクロウェルもまた、標的ＤＮＡを捕捉するために使用され得る。

一部の実施形態では、標的ＤＮＡの溶出は、捕捉ビーズまたは他の捕捉媒体を単に加熱し、それにより、捕捉オリゴヌクレオチドと、捕捉オリゴヌクレオチドに対して相補的な配列を保有する捕捉された標的分子との間の相互作用（水素結合）を壊すことによって行われる。次いで、これらの熱的に放出された標的分子を含む上清は、ＰＣＲによる下流のテストを可能にするために回収される。

溶液中への標的ＤＮＡの溶出は、標的ＤＮＡを増幅するために、ビーズ結合した標的ＤＮＡに対して３～５サイクルのＰＣＲを行うことによっても実行され得る。次いで、増幅された標的ＤＮＡは、ＰＣＲによる下流のテストを介した検出に供され得る。さらに、変性試薬、例えば、ＤＮＡ含有溶液において１１よりも高いｐＨを生じるアルキル化試薬もまた、捕捉オリゴヌクレオチドと、捕捉オリゴヌクレオチドに対して相補的な配列を保有する捕捉された標的分子との間の水素結合を破壊するために使用され得る。

例示的な捕捉オリゴヌクレオチドは、図１Ａおよび図１Ｂに例示される。これらの捕捉オリゴヌクレオチドを設計するために使用される反復性種特異的ＤＮＡ配列もまた、図１Ａおよび図１Ｂに例示される。標的ＤＮＡ捕捉手順の例示的な図は、図２に示される。

一部の実施形態では、相補的配列捕捉、磁気プルダウンおよび熱的放出を介した試料からの標的ＤＮＡの単離の後、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓおよび／またはＤ．ｒｅｐｅｎｓの高度に高感度な種特異的検出が、単離されたＤＮＡ試料に対するＰＣＲベースのアッセイを使用することによって達成され得る。ＰＣＲベースのアッセイは、捕捉のために標的化される同じ高感度かつ種特異的な反復性ＤＮＡエレメントを活用することによって開発された。一部の実施形態では、各寄生生物について、ＰＣＲプライマーを、これらの標的ＤＮＡ配列を増幅するように設計し、改変されたリアルタイムＰＣＲプローブ構築物を、増幅後の蛍光検出を可能にするように設計した。

好ましくは、各ＰＣＲプライマーおよびプローブは、長さが１２塩基対（ｂｐ）～４０ｂｐである。プライマーおよびプローブは、それらの標的配列に対して完全に相補的である必要はないが、オリゴヌクレオチド、プライマーまたはプローブの塩基の少なくとも８０％が、標的配列と塩基対合することが可能である。

一部の実施形態では、プローブ設計は、構築物の５’末端に連結された６－ＦＡＭフルオロフォア、即ち蛍光色素、構築物の３’末端に連結された非蛍光クエンチャー、および内部非蛍光クエンチャーの組み込みを含む。例示的なプライマーおよびプローブ構築物は、図３Ａおよび図３Ｄに例示される。

フルオロフォア、即ち蛍光色素、および１つまたは２つのクエンチャーを含む種々のリアルタイムＰＣＲプローブが利用され得る。

適切なプローブフルオロフォアには、５’６－ＦＡＭ、５’ＴＥＴ、５’Ｙａｋｉｍａ Ｙｅｌｌｏｗ（登録商標）、５’ＨＥＸ、５’ＪＯＥ、５’Ｃｙ３、５’Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ－Ｘ（登録商標）、５’Ｃｙ５、５’ＭＡＸ、５’ＴＹＥ ５６３、５’ＴＡＭＲＡ、５’ＲＯＸ．５’ＴＥＸ ６１５および５’ＴＹＥ ６６５が含まれるがこれらに限定されない。

本発明の種々の実施形態では、当業者に容易に明らかな適切なクエンチャーもまた、前述のプローブフルオロフォアと組み合わされる。これらのクエンチャーには、ＺＥＮ（商標）（内部クエンチャー）プラス３’Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＦＱ（登録商標）、３’Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＲＱ－Ｓｐ（登録商標）、ＴＡＯ（商標）（内部クエンチャー）プラスＩｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＲＱ－Ｓｐ（登録商標）、およびＢｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ１が含まれるがこれらに限定されない。例えば、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、Ｉｏｗａ、ＵＳＡ）およびSilaghi C. et al. Parasit Vectors. 10, 1, (2017)を参照のこと。ＴＡＭＲＡクエンチャーまたはＭＧＢ－ＮＦＱクエンチング化学もまた使用され得る（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ））。

種々の型のリアルタイムＰＣＲプローブが利用され得る。例えば、５’ヌクレアーゼプローブ、例えば、ＰｒｉｍｅＴｉｍｅ ｑＰＣＲ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、Ｉｏｗａ、ＵＳＡ））が使用され得る。プローブフルオロフォアは１つまたは２つのクエンチャーによってクエンチされるので、５’エキソヌクレアーゼプローブは、最初は蛍光ではない。しかし、ＰＣＲ増幅の間に、ＤＮＡポリメラーゼの５’エキソヌクレアーゼ活性が、クエンチャー（複数可）をプローブフルオロフォアの近接近から放出して、プローブフルオロフォア蛍光の検出を可能にする。より高いシグナル対ノイズ比が、３’クエンチャーと共に内部クエンチャー、例えば、ＺＥＮ（商標）およびＴＡＯ（商標）クエンチャーを使用することによって達成され得る。内部クエンチャーは、プローブ内の任意の内部位置に位置し得るが、好ましくは、内部クエンチャーは、５’末端のプローブフルオロフォアから９塩基にある。

改変されたヌクレオチドを利用するプローブもまた使用され得る。例えば、Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｌｕｓ ｑＰＣＲ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、Ｉｏｗａ、ＵＳＡ））は、プローブに、より高い特異性をもたらし得る、より高い構造的安定性および増加したＴ_ｍを与えるために、いくつかのロックト核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドをプローブ中に組み込む。さらに、１つまたは複数のＬＮＡを利用するＰｒｉｍｅＴｉｍｅ ＬＮＡ ｑＰＣＲ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、Ｉｏｗａ、ＵＳＡ））が、プローブに、より高い特異性をもたらし得る、短いプローブについてのより高い構造的安定性、および増加したＴ_ｍを与えるために、使用され得る。

分子ビーコンリアルタイムＰＣＲプローブもまた使用され得る。５’ヌクレアーゼプローブとは異なり、分子ビーコンプローブは、それらの標的配列に結合していない場合にクエンチされたヘアピン構造を形成する自己相補的な末端を有する。分子ビーコンプローブは、一方の末端にフルオロフォアを含み、他方の末端にクエンチャーを含む。蛍光シグナルは、リアルタイムＰＣＲサイクリングの間のその標的配列へのハイブリダイゼーションの際のプローブの線状化によって生成される。

その最も典型的な形態では、ＤＮＡは、第１鎖および第２鎖からなる二本鎖分子として存在する。これらの鎖の各々の配列は、他方の逆相補体であり、各鎖は、他方の鎖と塩基対合する。一部の実施形態では、反復性種特異的標的ＤＮＡの両方の鎖は、各鎖上に存在する配列（単数または複数）に対して相補的なオリゴヌクレオチドによって捕捉され、一部の実施形態では、ＰＣＲを使用して増幅および検出される。好ましくは、捕捉オリゴヌクレオチドの配列は、偽陽性増幅またはリアルタイムＰＣＲ効率の低下を防止するために、ＰＣＲプライマーの配列と同じである。他の実施形態では、反復性種特異的標的ＤＮＡの単一の鎖が、鎖上に存在する配列に対して相補的なオリゴヌクレオチドによって捕捉され、ＰＣＲを使用して増幅および検出される。好ましくは、捕捉オリゴヌクレオチドの配列は、ＰＣＲプライマーのうち１つの配列と同じである。

一部の実施形態では、犬および猫由来の潜在的に感染した血液／血清試料、または寄生生物を潜在的に保有している蚊試料が含まれるテスト試料は、存在する場合に病原体由来標的ＤＮＡの放出を促進するために処理される。次いで、標的ＤＮＡが捕捉され、単離され、ＰＣＲを使用して検出される。例えば、磁気ビーズを使用する標的ＤＮＡの捕捉は、試料がＤ．ｉｍｍｉｔｉｓまたはＤ．ｒｅｐｅｎｓ ＤＮＡを含む場合にのみ生じ、陽性リアルタイムＰＣＲシグナルは、標的ＤＮＡの捕捉後にのみ生じる。一部の実施形態では、５コピー未満の捕捉された標的ＤＮＡが検出され得る。単一のＤ．ｉｍｍｉｔｉｓミクロフィラリアは、図１Ａに示される例示的な標的ＤＮＡエレメントを１千万コピー含むと推定される。単一のＤ．ｒｅｐｅｎｓミクロフィラリアは、図１Ｂに示される例示的な標的ＤＮＡを３千万コピー含むと推定される。さらに、捕捉され、単離され、検出されるゲノム標的ＤＮＡは、全てのライフステージにおいて存在し、プレパテントおよびパテントの両方の感染、ならびに雄性のみの感染、雌性のみの感染ならびに雄性と雌性の混合感染の検出を可能にする。

記載された核酸構築物は、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓまたはＤ．ｒｅｐｅｎｓに特異的なオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド誘導体である。例示的な標的ＤＮＡエレメントＤｉｍ１のそれぞれ第１鎖（Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓ「標的配列」）（配列番号１）および第２鎖（配列番号２）に対して相補的なＤ．ｉｍｍｉｔｉｓについての例示的な捕捉オリゴヌクレオチド（配列番号４および配列番号３）は、図１Ａに示される。

例示的な標的ＤＮＡエレメントＤｒｅ１のそれぞれ第１鎖（配列番号５）（Ｄ．ｒｅｐｅｎｓ「標的配列」）および第２鎖（配列番号６）に対して相補的なＤ．ｒｅｐｅｎｓについての例示的な捕捉オリゴヌクレオチド（配列番号８および配列番号７）は、図１Ｂに示される。他のＤ．ｒｅｐｅｎｓ標的配列もまた提供される。例えば、配列番号２５が、本発明の実施形態に従って利用され得る。一部の実施形態では、配列番号２６が、標的配列として使用され得る。しかし、配列番号２６は、Ｂｒｕｇｉａ ｍａｌａｙｉ ＤＮＡといくらかの類似性を有する。Ｄ．ｒｅｐｅｎｓ特異的標的配列である配列番号２７および配列番号２８もまた、本発明の実施形態に従って利用され得る。

Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓについての例示的なプライマーおよびプローブセットｐ１Ｄｉｍ１（プライマー配列番号９および配列番号１０、ならびにプローブ配列番号１１）は、図３Ａに示される。Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓについての例示的なプライマーおよびプローブセットｐ２Ｄｉｍ１（プライマー配列番号９および配列番号２１、ならびにプローブ配列番号２２）は、図３Ｂに示される。Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓについての例示的なプライマーおよびプローブセットｐ３Ｄｉｍ１（プライマー配列番号９および配列番号２３、ならびにプローブ配列番号２４）は、図３Ｃに示される。

Ｄ．ｒｅｐｅｎｓについての例示的なプライマーおよびプローブセットｐ１Ｄｒｅ１（プライマー配列番号１２および配列番号１３、ならびにプローブ配列番号１４）は、図３Ｄに示される。Ｄ．ｒｅｐｅｎｓについての例示的なプライマーおよびプローブセットｐ２Ｄｒｅ１（プライマー配列番号１５および配列番号１６、ならびにプローブ配列番号１７）は、図３Ｅに示される。Ｄ．ｒｅｐｅｎｓについての例示的なプライマーおよびプローブセットｐ３Ｄｒｅ１（プライマー配列番号１８および配列番号１９、ならびにプローブ配列番号２０）は、図３Ｆに示される。

一部の実施形態では、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓ捕捉オリゴヌクレオチドならびにプライマーおよびプローブセットｐ１Ｄｉｍ１、ｐ２Ｄｉｍ１、ｐ３Ｄｉｍ１およびｐ４Ｄｉｍ１を、成体雄性および雌性Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓゲノムＤＮＡの次世代配列決定（ＮＧＳ）ベースの分析から得られた出力配列データに基づいて設計した（以下の材料および方法を参照のこと）。

一部の実施形態では、Ｄ．ｒｅｐｅｎｓ捕捉オリゴヌクレオチドならびにプライマーおよびプローブセットｐ１Ｄｒｅ１、ｐ２Ｄｒｅ１およびｐ３Ｄｒｅ１を、成体雄性および雌性Ｄ．ｒｅｐｅｎｓゲノムＤＮＡのＮＧＳベースの分析から得られた出力配列データに基づいて設計した（以下の材料および方法を参照のこと）。

一部の実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチドのセット（二本鎖標的ＤＮＡの各鎖について１つの捕捉オリゴヌクレオチド）が、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓの最も豊富で種特異的なゲノム標的ＤＮＡエレメントについて提供され、これは、哺乳動物宿主または蚊媒介生物種に起源する試料からＤ．ｉｍｍｉｔｉｓ由来標的ＤＮＡを単離し、得られた試料をこの標的ＤＮＡについて富化するのに有効である。例えば、例示的なビオチン化された捕捉オリゴヌクレオチド配列番号３および配列番号４、またはそれらの誘導体が、標的ＤＮＡ Ｄｉｍ１の両方の鎖を捕捉するために使用され得る。一部の実施形態では、標的ＤＮＡの単一の鎖を捕捉するための単一の捕捉オリゴヌクレオチドが使用され得る。例えば、配列番号３および配列番号４、またはそれらの誘導体からなる群から選択される１つの例示的なビオチン化された捕捉オリゴヌクレオチドが、標的ＤＮＡ Ｄｉｍ１の一方の鎖を捕捉するために使用され得る。

一部の実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチドのセット（二本鎖標的ＤＮＡの各鎖について１つの捕捉オリゴヌクレオチド）が、Ｄ．ｒｅｐｅｎｓの最も豊富で種特異的なゲノム標的ＤＮＡエレメントについて提供され、これは、哺乳動物宿主または蚊媒介生物種に起源する試料からＤ．ｒｅｐｅｎｓ由来標的ＤＮＡを単離し、得られた試料をこの標的ＤＮＡについて富化するのに有効である。例えば、例示的なビオチン化された捕捉オリゴヌクレオチド配列番号７および配列番号８、またはそれらの誘導体が、標的ＤＮＡ Ｄｒｅ１の両方の鎖を捕捉するために使用され得る。一部の実施形態では、標的ＤＮＡの単一の鎖を捕捉するための単一の捕捉オリゴヌクレオチドが使用され得る。例えば、配列番号７および配列番号８、またはそれらの誘導体からなる群から選択される１つの例示的なビオチン化された捕捉オリゴヌクレオチドが、標的ＤＮＡ Ｄｒｅ１の一方の鎖を捕捉するために使用され得る。

一部の実施形態では、哺乳動物宿主または蚊媒介生物種に由来する試料中のＤ．ｉｍｍｉｔｉｓ標的ＤＮＡの存在を検出するためのリアルタイムＰＣＲアッセイにおいて有効な最適なプライマーおよびプローブセットが提供される。標的ＤＮＡの検出は、哺乳動物宿主または蚊媒介生物種がＤ．ｉｍｍｉｔｉｓに感染していること（that that）を示す。例えば、一部の実施形態では、プライマー配列番号９および配列番号１０、またはそれらの誘導体、ならびにプローブ配列番号１１、またはその誘導体を構成する例示的なプライマーおよびプローブセットｐ１Ｄｉｍ１が、使用され得る。他の実施形態では、プライマー配列番号９および配列番号２１、またはそれらの誘導体、ならびにプローブ配列番号２２、またはその誘導体を構成する例示的なプライマーおよびプローブセットｐ２Ｄｉｍ１が、使用され得る。一部の実施形態では、プライマー配列番号９および配列番号２３、またはそれらの誘導体、ならびにプローブ配列番号２４、またはその誘導体を構成する例示的なプライマーおよびプローブセットｐ３Ｄｉｍ１が、使用され得る。

一部の実施形態では、哺乳動物宿主または蚊媒介生物種に由来する試料中のＤ．ｒｅｐｅｎｓ標的ＤＮＡの存在を検出するためのリアルタイムＰＣＲアッセイにおいて有効な最適なプライマーおよびプローブセットが提供される。標的ＤＮＡの検出は、哺乳動物宿主または蚊媒介生物種がＤ．ｒｅｐｅｎｓに感染していること（that that）を示す。例えば、一部の実施形態では、プライマー配列番号１２および配列番号１３、またはそれらの誘導体、ならびにプローブ配列番号１４、またはその誘導体を構成する例示的なプライマーおよびプローブセットｐ１Ｄｒｅ１が、使用され得る。他の実施形態では、プライマー配列番号１５および配列番号１６、またはそれらの誘導体、ならびにプローブ配列番号１７、またはその誘導体を構成する例示的なプライマーおよびプローブセットｐ２Ｄｒｅ１が、使用され得る。一部の実施形態では、プライマー配列番号１８および配列番号１９、またはそれらの誘導体、ならびにプローブ配列番号２０、またはその誘導体を構成する例示的なプライマーおよびプローブセットｐ３Ｄｒｅ１が、使用され得る。

一部の実施形態では、寄生生物に感染した疑いがある哺乳動物宿主を処置する方法が提供される。この方法は、（ａ）寄生生物に感染した疑いがある哺乳動物宿主由来の試料を提供するステップ；および（ｂ）試料中の寄生生物の存在の検出を引き起こすステップを含む。この検出は、（ｉ）試料からＤＮＡを利用可能にするステップ；（ｉｉ）試料を、標的ＤＮＡに対して相補的な標識されたＤＮＡと混合するステップ；および（ｉｉｉ）ＰＣＲを使用して標的ＤＮＡを検出するステップを含み；寄生生物の存在が、検出を引き起こすステップの結果として検出された場合、哺乳動物宿主に、寄生生物感染を低減または排除するのに有効な処置を施行する。

標識されたＤＮＡは、（ａ）標的ＤＮＡを同定するステップであって、標的ＤＮＡが、寄生生物によって独自に保有される反復性ＤＮＡである、ステップを含むプロセスを使用して作製されている。この同定するステップは、（ｉ）ゲノムＤＮＡ配列リードを寄生生物から得るステップ、（ｉｉ）各配列リードをトリミングして、等しい長さのトリミングされた配列リードのリードセットを生成するステップ、（ｉｉｉ）リード対を形成するために、リードセットの各配列を、リードセット中の全ての他の配列リードと比較するステップであって、所与の対の各リードが、その長さの少なくとも５５％にわたって、その対の他のリードと、少なくとも９０％の類似性を共有する、ステップ、（ｉｖ）リード対を評価して、寄生生物のゲノム中の、ゲノム中に高いコピー数を推定上有する配列の候補セットを同定するステップ、および（ｖ）配列の候補セットから、寄生生物によって独自に保有される最終配列を選択するステップ；ならびに（ｂ）寄生生物によって独自に保有される最終配列を使用して、標識されたＤＮＡの合成を引き起こすステップを含み、標識されたＤＮＡは、寄生生物によって独自に保有される同定された反復性ＤＮＡに対して相補的である。

寄生生物は、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓまたはＤ．ｒｅｐｅｎｓであり得る。一部の実施形態では、寄生生物感染は、パテントである。他の実施形態では、寄生生物感染は、プレパテントである。組織試料は、イヌであり得る感染した哺乳動物宿主から得られた血漿、血清または全血であり得る。

一部の実施形態では、標識されたＤＮＡは、コンジュゲーション部分を含む。コンジュゲーション部分は、ビオチンであり得る。一部の実施形態では、標的ＤＮＡは、捕捉ＤＮＡに結合する捕捉媒体を使用して混合物から単離される。捕捉媒体は、磁気ビーズまたはテストストリップであり得、捕捉媒体は、ストレプトアビジンでコーティングされ得る。

一部の実施形態では、ＰＣＲは、プライマーおよびプローブセットを使用するリアルタイムＰＣＲである。一部の実施形態では、寄生生物はＤ．ｉｍｍｉｔｉｓであり、プライマーおよびプローブセットは、ｐ１Ｄｉｍ１、ｐ２Ｄｉｍ１およびｐ３Ｄｉｍ１からなる群から選択される。他の実施形態では、寄生生物はＤ．ｒｅｐｅｎｓであり、プライマーおよびプローブセットは、ｐ１Ｄｒｅ１、ｐ２Ｄｒｅ１およびｐ３Ｄｒｅ１からなる群から選択される。

一部の実施形態では、寄生生物はＤ．ｉｍｍｉｔｉｓであり、標的ＤＮＡはＤｉｍ１である。標識されたＤＮＡは、配列番号３および配列番号４からなる捕捉オリゴヌクレオチドのセットであり得る。

一部の実施形態では、寄生生物はＤ．ｒｅｐｅｎｓであり、標的ＤＮＡはＤｒｅ１である。標識されたＤＮＡは、配列番号７および配列番号８からなる捕捉オリゴヌクレオチドのセットであり得る。

一部の実施形態では、処置は、メラルソミン、イベルメクチン、ドキシサイクリン、モキシデクチン、およびそれらの組合せからなる群から選択される。

一部の実施形態では、動物宿主における寄生生物感染を検出するためのキットが提供される。キットは、（ａ）反復性種特異的寄生生物標的ＤＮＡに対して相補的な標識されたＤＮＡ、（ｂ）捕捉ＤＮＡに結合する捕捉媒体、および（ｃ）寄生生物感染を検出するための書面による指示のセットを含む。

寄生生物は、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓまたはＤ．ｒｅｐｅｎｓであり得、標識されたＤＮＡは、コンジュゲーション部分を含む。一部の実施形態では、コンジュゲーション部分はビオチンであり、捕捉媒体は、磁気ビーズ、テストストリップ、およびそれらの組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、捕捉媒体は、ストレプトアビジンでコーティングされている。キットは、プライマーおよびプローブセットを含み得る。

一部の実施形態では、寄生生物はＤ．ｉｍｍｉｔｉｓであり、標識されたＤＮＡは、配列番号３および配列番号４からなる捕捉オリゴヌクレオチドのセットである。一部の実施形態では、寄生生物はＤ．ｉｍｍｉｔｉｓであり、標的ＤＮＡはＤｉｍ１である。一部の実施形態では、寄生生物はＤ．ｉｍｍｉｔｉｓであり、プライマーおよびプローブセットは、ｐ１Ｄｉｍ１、ｐ２Ｄｉｍ１、ｐ３Ｄｉｍ１およびｐ４Ｄｉｍ１からなる群から選択される。

他の実施形態では、寄生生物はＤ．ｒｅｐｅｎｓであり、標識されたＤＮＡは、配列番号７および配列番号８からなる捕捉オリゴヌクレオチドのセットである。一部の実施形態では、寄生生物はＤ．ｉｍｍｉｔｉｓであり、標的ＤＮＡはＤｒｅ１である。一部の実施形態では、寄生生物はＤ．ｒｅｐｅｎｓであり、標的ＤＮＡはＤｒｅ１である。一部の実施形態では、寄生生物はＤ．ｒｅｐｅｎｓであり、プライマーおよびプローブセットは、ｐ１Ｄｒｅ１、ｐ２Ｄｒｅ１およびｐ３Ｄｒｅ１からなる群から選択される。

一部の実施形態では、動物宿主におけるＤ．ｉｍｍｉｔｉｓまたはＤ．ｒｅｐｅｎｓ感染の診断のためのデバイスであって、サーモサイクラーを含むＰＣＲ測定装置を含み、ＰＣＲ測定装置が、感染した動物宿主から得られた組織試料中のＤ．ｉｍｍｉｔｉｓまたはＤ．ｒｅｐｅｎｓのＤＮＡ中の反復性標的配列を標的とするように構成されている、デバイスが提供される。反復性標的配列は、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓまたはＤ．ｒｅｐｅｎｓに対する感度および選択性を提供するように選択され得る。ＰＣＲ測定装置は、光学読み出し機構を含み得る。光学読み出し機構は、目に見えるバンドを有するテストストリップを必要に応じて含む。組織試料は、感染した動物宿主由来であり得る。組織試料は、感染した蚊または感染したイヌ由来であり得る。

一部の実施形態では、テストストリップを利用するＰＣＲベースのプラットフォームが、動物宿主における寄生生物感染、例えば、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓまたはＤ．ｒｅｐｅｎｓ感染の検出のために提供される。Zaky et al. PLoS Negl Trop Dis. 2018 Nov 21;12(11)を一般に参照のこと。このストリップテストプラットフォームは、捕捉媒体としてテストストリップを利用する。テストストリップは、コンジュゲーション部分を有するＰＣＲを使用するＰＣＲを介して合成されたＤＮＡへの結合のための反応性基でコーティングされたバンドを有する。

簡潔に述べると、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓまたはＤ．ｒｅｐｅｎｓに感染した疑いがある哺乳動物または蚊プール由来の組織試料は、標的ＤＮＡ、例えば、それぞれＤｉｍ１またはＤｒｅ１に対して特異的なプライマーを使用するＰＣＲに供される。ＰＣＲプライマーの一方または両方が、テストストリップ上のバンドに結合することができるコンジュゲーション部分で標識される。例えば、図５に示されるように、リバースプライマー配列番号２９は、ビオチンコンジュゲーション部分で標識される。このリバースプライマーを使用した標的ＤＮＡ Ｄｉｍ１のＰＣＲ増幅の後、ＰＣＲの間に配列番号２９から合成されたＤＮＡの鎖は、ビオチン標識され、次いで、このＤＮＡ鎖は、ストレプトアビジンでコーティングされたバンドを有するテストストリップに結合され得る。テストストリップバンドへのＰＣＲ産物の結合後、テストストリッププローブ（複数可）が、バンド結合したＤＮＡ鎖上の相補的な配列に次いでハイブリダイズされる。テストストリッププローブは、その検出を促進するための部分で標識される。例えば、図５では、テストストリッププローブ配列番号３０は、６－ＦＡＭで標識される。一部の実施形態では、このハイブリダイズしたプローブの存在は、金粒子にコンジュゲートした抗ＦＩＴＣ抗体（抗ＦＩＴＣ抗体は６－ＦＡＭに特異的に結合する）を使用して可視化され得る。したがって、標的寄生生物ＤＮＡが組織試料中に存在する場合、コンジュゲーション部分を有するＰＣＲプライマーから標的ＤＮＡのＰＣＲの間に合成されたＤＮＡ鎖は、テストストリップバンドに結合する；テストストリップバンドに結合した場合、テストストリッププローブは、バンド結合したＤＮＡ上の相補的な配列にハイブリダイズする；テストストリッププローブがバンド結合したＤＮＡにハイブリダイズする場合、その存在は、例えば、テストストリッププローブの標識に結合する抗体の使用を介して、可視化され得る。標的寄生生物ＤＮＡが組織試料中に存在しない場合、テストストリップバンドに結合するＤＮＡが存在せず、可視化は起こらない。

上で議論したように、ビオチン／ストレプトアビジン以外の種々のコンジュゲーション部分および捕捉媒体化学が使用され得る。

さらに、テストストリッププローブは、６－ＦＡＭ以外の検出可能な標識を含み得る。適切な標識には、５’ＴＥＴ、５’Ｙａｋｉｍａ Ｙｅｌｌｏｗ（登録商標）、５’ＨＥＸ、５’ＪＯＥ、５’Ｃｙ３、５’Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ－Ｘ（登録商標）、５’Ｃｙ５、５’ＭＡＸ、５’ＴＹＥ ５６３、５’ＴＡＭＲＡ、５’ＲＯＸ．５’ＴＥＸ ６１５および５’ＴＹＥ ６６５が含まれるがこれらに限定されない。

さらに、テストストリッププローブの存在は、テストストリッププローブの標識に特異的に結合する金粒子コンジュゲート抗体の使用を介する以外の方法で可視化され得る。例えば、テストストリッププローブの標識に特異的に結合するアルカリホスファターゼコンジュゲート抗体が、可視化のために比色ペルオキシダーゼ基質と共に使用され得る。

一部の実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチドは、標的ＤＮＡの存在のストリップテスト検出のための標的ＤＮＡのＰＣＲの前に、組織試料から標的ＤＮＡを捕捉するために使用され得る。他の実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチドは、標的ＤＮＡの存在のストリップテスト検出のための標的ＤＮＡのＰＣＲの前には使用されない。

一部の実施形態では、動物宿主におけるＤ．ｉｍｍｉｔｉｓ感染を検出するのに適切なキットであって、そのうち少なくとも１つがコンジュゲーション部分を有するテストストリップＰＣＲプライマーのセット、テストストリッププローブ（各プライマーおよびプローブは、反復性種特異的Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓ標的ＤＮＡに対して相補的である）、コンジュゲーション部分を有するＰＣＲプライマーから合成されたＤＮＡに結合する捕捉媒体、ならびにＤ．ｉｍｍｉｔｉｓ感染を検出するための書面による指示のセットを含むキットが提供される。セットの少なくとも１つのＰＣＲプライマーは、ビオチン化され得、捕捉媒体は、ストレプトアビジンでコーティングされ得る。捕捉媒体には、コンジュゲーション部分に結合する反応性基でコーティングされたバンドを有するテストストリップが含まれ得る。

一部の実施形態では、動物宿主におけるＤ．ｒｅｐｅｎｓ感染を検出するのに適切なキットであって、そのうち少なくとも１つがコンジュゲーション部分を有するテストストリップＰＣＲプライマーのセット、テストストリッププローブ（各プライマーおよびプローブは、反復性種特異的Ｄ．ｒｅｐｅｎｓ標的ＤＮＡに対して相補的である）、コンジュゲーション部分を有するＰＣＲプライマーから合成されたＤＮＡに結合する捕捉媒体、ならびにＤ．ｒｅｐｅｎｓ感染を検出するための書面による指示のセットを含むキットが提供される。セットの少なくとも１つのＰＣＲプライマーは、ビオチン化され得、捕捉媒体は、ストレプトアビジンでコーティングされ得る。捕捉媒体には、コンジュゲーション部分に結合する反応性基でコーティングされたバンドを有するテストストリップが含まれ得る。

材料および方法
以下の例示的な材料および方法が、本発明の実施形態に従って使用され得る。当業者は、以下の材料および方法が例示に過ぎないこと、ならびにこれらのプロトコールが特定の状況を提供するために必要に応じて調整され得ることを理解する。

アッセイ設計

本明細書に記載されるアッセイ設計は、問題の寄生生物種のゲノム中に見出される最も高度に反復されたＤＮＡエレメントを同定するために、寄生生物ゲノム、例えば、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓまたはＤ．ｒｅｐｅｎｓのゲノムの次世代配列決定（ＮＧＳ）を使用することと、その後のバイオインフォマティクスパイプラインの使用とを含む。次いで、このパイプラインは、問題の寄生生物種に特異的なＤＮＡ配列を有するものを同定するために、高度に反復されたＤＮＡエレメントについてのデータをフィルタリングするために使用される。次いで、これらの高度に反復された種特異的ＤＮＡ配列を使用して、本発明者らは、反復性種特異的配列を含むゲノム寄生生物標的ＤＮＡについて最適な捕捉オリゴヌクレオチドを設計するため、ならびに捕捉された標的ＤＮＡを検出するために最適なＰＣＲプライマーおよびプローブセットを設計するために、バイオインフォマティクスパイプラインを利用する。

標的ＤＮＡ配列同定

成体寄生生物から抽出されたＤＮＡのペアードエンド次世代配列決定ベースの分析は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ（登録商標）プラットフォーム［３００サイクルカートリッジ（２×１５０）］を使用して実施される。一部の実施形態では、当業者に公知の他のＮＧＳ配列決定プラットフォームもまた使用され得る。分析後、生リードは、全てのリードが等しい長さになるように、トリミングおよびフィルタリングされる（長さが１００塩基未満のリードは除去され、１００塩基よりも大きい全てのリードは、長さが１００塩基未満になるようにトリミングされる）。次いで、ペアードエンドリードは、インターレースされ、リードのサブセット（５００，０００と１，０００，０００との間）は、Ｇａｌａｘｙベースの／ＲｅｐｅａｔＥｘｐｌｏｒｅｒおよびＴＡＲＥＡＮソフトウェアツールを使用して分析される（Novak P, et al. Bioinformatics. 29, 6, 2013；Novak P, et al. Nucleic Acids Res. 45, 12, 2017）。これらのプログラムは、全対全のＢＬＡＳＴ分析を可能にし、その間に、各リードが、データセット内の全ての他のリードと比較される。任意の２つのリードが、リード長さの５５％またはそれよりも長くにわたって、９０％またはそれよりも高い類似性を共有する場合、対が形成され、次いで、リード対は、これらの基準を満たすリードのクラスターを構築するために使用される。クラスターを構築する場合、各リードは、ノードによって示され、首尾よい対形成は、２つのノードを連結するエッジの存在によって示される。エッジの長さは、２つのリード間の類似性の特徴であり、より短いエッジは、より大きい同一性を有する２つのリードを連結し、より長いエッジは、対形成の基準をなおも満たしているがあまり類似していない２つのリードを示す。次いで、エッジの長さおよび個々のノードの関連性に基づいて、クラスターは、特徴的な形状をとる。このように、より短い反復は、より緊密なスターバースト（ｓｔａｒ－ｂｕｒｓｔ）様クラスターを形成するが（Grant JR et al. Front Genet. 10, 833, 2019）、それは、クラスター内の個々のリードが、クラスター中のより多数の他のリードとの対形成基準を満たすからである。クラスター構造の視覚的観察に加えて、連結性が、可能な対の最大数と比較したクラスター内の対の数の比である連結成分指数（ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｉｎｄｅｘ）を調べることによって、さらに評価され得る。例えば、クラスター内の全てのリードが、クラスター中の全ての他のリードとの対形成基準を満たす場合、連結成分指数は、１．００である。したがって、より大きい連結成分指数は、クラスター中のリード間でのより高い程度の配列保存を示す。次いで、この数は、クラスターへのリードマッピングの総数と組み合わせて、可能なゲノム寄生生物標的ＤＮＡとしての使用のための候補反復を選択するために使用されるが、それは、これら２つの因子が、推定上最大のコピー数のゲノム反復エレメントの選択を可能にするからである。スーパークラスターもまた、２つまたはそれよりも多くのクラスターが、２つのクラスター間で分割された相補的なペアードエンドリードメイトの存在に基づいて、高い程度の配列類似性を共有する場合に、構築され得る。

候補標的反復ＤＮＡ配列の選択後、ＮＣＢＩベースのＢＬＡＳＴ分析が、他の関連の生物（例えば、宿主種、近縁の寄生生物種、宿主において見出される共生細菌など）由来のＤＮＡに対して有意な類似性を有すると予測される潜在的な標的反復ＤＮＡ配列についてスクリーニングするためおよびそれを排除するために実施される。かかるスクリーニングを介して、アッセイの特異性を妨害し得る他の種との交差反応性を示す寄生生物標的ＤＮＡを選択する可能性は、大きく低減される。次いで、ＰｒｉｍｅｒＱｕｅｓｔソフトウェアが、標的反復ＤＮＡエレメントの最適なＰＣＲ増幅を与えるように、可能なプライマー／プローブ候補を選択するために使用される。これらの候補は、関連するオフターゲットＰＣＲ増幅を生じ得るプライマー対をさらに排除するために、ＮＣＢＩベースのプライマー－ＢＬＡＳＴ分析を使用してさらにスクリーニングされる。

捕捉オリゴヌクレオチド設計

５’ビオチン化された捕捉オリゴヌクレオチドの対（配列番号３および配列番号４）を、二本鎖Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓ標的ＤＮＡ（Ｄｉｍ１）の各鎖に対して相補的になるように設計した（図１Ａ）。これは、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓ標的ＤＮＡの両方の鎖の捕捉を可能にする。

同様に、５’ビオチン化された捕捉オリゴヌクレオチドの対（配列番号７および配列番号８）を、二本鎖Ｄ．ｒｅｐｅｎｓ標的ＤＮＡ（Ｄｒｅ１）の各鎖に対して相補的になるように設計した（図１Ｂ）。これは、Ｄ．ｒｅｐｅｎｓ標的ＤＮＡの両方の鎖の捕捉を可能にする。

収集された全血試料からのイヌ血漿単離

全血を、無細胞ＤＮＡ ＢＣＴ（登録商標）血液収集管（Ｓｔｒｅｃｋ、ＵＳＡ）中に収集し、ＤＮＡ単離が開始されるまで、室温で維持する。全血を、２，０００×ｇで２０分間遠心分離して、血漿を単離する。次いで、回収された血漿を、１６，０００×ｇで１０分間遠心分離して、残余の細胞およびデブリをペレット化する。上清を、クライオチューブに移し、処理まで－８０℃で貯蔵する。

イヌ血漿試料からの寄生生物ｃｆＤＮＡの捕捉

入力試料は、２００μｌ血漿＋１００μｌ １×結合緩衝液（５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）；０．５ｍＭ ＥＤＴＡ；１Ｍ ＮａＣｌ）からなり、１．０ピコモルの各ビオチン化された捕捉オリゴヌクレオチドを添加し、試料を、９５℃で１０分間加熱して、血漿試料中のｃｆＤＮＡを変性させる。このステップは、一本鎖ｃｆＤＮＡ分子を作り出し、相補的なハイブリダイゼーション部位を露出させる。相補的なｃｆＤＮＡ標的へのビオチン化された捕捉オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、振盪インキュベータ（７５０＋ｒｐｍ）中５５℃で生じる。ｃｆＤＮＡのビーズ捕捉を、５０μｌのストレプトアビジンコーティングされた磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）Ｍ－２７０ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を添加し、試料を振盪インキュベータ（９００＋ｒｐｍ）中で室温で３０分間インキュベートすることによって達成する。このステップは、ビオチン化された捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズしたｃｆＤＮＡを、強いストレプトアビジン－ビオチン連結によって、ストレプトアビジンコーティングされたビーズに結合させる。磁石を使用して、捕捉された寄生生物ｃｆＤＮＡを保有するビーズを単離する。ビーズを、１×結合緩衝液で２回洗浄する。捕捉された寄生生物ｃｆＤＮＡの溶出を、ビーズを１×ＳＳＣ中で洗浄し、次いで、ビーズを５０μｌ ｄｄＨ_２Ｏ中に再懸濁し、その後、９５℃で５分間インキュベートすることによって達成する。このステップは、非ビオチン化寄生生物ｃｆＤＮＡ（標的ＤＮＡ）を水中に溶出させる。磁石を使用してビーズを単離し、溶液中の溶出されたｃｆＤＮＡを回収する。５０μｌの試料を回収する（図２）。

あるいは、標的ＤＮＡは、ＰＣＲ増幅を使用してビーズから溶出され得る。この方法を使用して、ビーズは、５０μｌ ＰＣＲミックス（非ビオチン化寄生生物特異的ＰＣＲプライマー対を有するＰＣＲ反応ミックス）中に再懸濁され、直接増幅される（３～５サイクル）。ここで、上清は、増幅された非ビオチン化寄生生物標的ＤＮＡを含む。磁石を使用してビーズを単離し、増幅された標的ＤＮＡを、溶液から回収する。

蚊プール試料調製：粗抽出技法

簡潔に述べると、１．７ｍｌの微量遠心管中で、無菌のプラスチックマイクロ乳棒（ｍｉｃｒｏ－ｐｅｓｔｌｅ）（Ａｘｙｇｅｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｕｎｉｏｎ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して、各蚊プール（最大で２５匹の蚊）を１８０μｌの０．２Ｎ ＮａＯＨで３分間すりつぶす。次いで、マイクロ乳棒を、さらなる１８０μｌの０．２Ｎ ＮａＯＨで、すりつぶされた蚊を含む同じ１．７ｍｌ管中にリンスし、全ての蚊デブリが乳棒から除去されたことを確認する。新しいきれいな無菌マイクロ乳棒を、各プールに使用する。各管を、７５℃で１０分間インキュベートする。１１５．２μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ＝８．０）および３６４．８μｌのヌクレアーゼなしの水を、各試料に添加し、管を、ボルテックスミキサーを使用して、１０秒間徹底的に混合する。試料を、１０，０００×ｇで３分間遠心分離し、抽出されたＤＮＡを含む上清を収集し、きれいな１．７ｍｌ微小遠心管中に移す。Zaky et al. PLoS Negl Trop Dis. 2018 Nov 21;12(11)を参照のこと。

蚊プール試料調製：カラムベースの抽出技法

最大で２５匹の蚊のプールを、２．０ｍｌ微小遠心管中に置く。１つまたは複数の亜鉛ボールベアリング（または類似のアイテム）を各管中に置く。１８０μｌのリン酸緩衝食塩水（ｐＨ ７．２）を、各管に添加する。管を、水平振盪プラットフォーム上で３０分間ボルテックスする。各管を、短時間遠心分離して、管の底にデブリを収集する。２０μｌのプロテイナーゼＫを各試料に添加する。次いで、カオトロピック塩を含む緩衝液（例えば、Ｑｉａｇｅｎ緩衝液ＡＬ）２００μｌを、各試料に添加し、３秒間ボルテックスすることによって混合する。次いで、管を、７０℃で１０分間インキュベートする。次いで、さらなる（add）２０μｌのプロテイナーゼＫを、各試料に添加し、３秒間ボルテックスすることによって混合する。管を、５６℃で１時間インキュベートし、次いで、１６，０００×ｇまたはそれよりも大きいｇで５分間遠心分離して、デブリをペレット化する。各管からの上清を、新たな管に移し、さらなる２００μｌの９８％エタノールを各試料に添加する。次いで、各試料を、イオン交換カラムまたはビーズベースの溶液（例えば、Ｑｉａｇｅｎ ＤＮｅａｓｙスピンカラム）に適用し、８，０００×ｇで１分間遠心分離する。フロースルーを廃棄し、５００μｌのエタノール含有洗浄緩衝液（例えば、Ｑｉａｇｅｎ緩衝液ＡＷ１）を各試料に添加し、１６，０００×ｇまたはそれよりも速い速度で３分間遠心分離する。このエタノール洗浄を、さらに２回反復する。最終遠心分離の後、カラムを、新しいきれいな微小遠心管に移し、２５μｌまたはそれよりも多くの溶出溶液（例えば、ヌクレアーゼなしの水、リン酸緩衝食塩水、Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡなどの溶液）を、各カラムに添加する。溶出溶液を、最低２分間、カラム上に置く。各カラムを１０，０００×ｇで２分間遠心分離して、カラムからＤＮＡ含有試料を溶出させる。Fischer, P, et al. Ann Trop Med Parasitol. 96: 809-821 (2002)を参照のこと。

標的ＤＮＡの検出（Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓ）

３つのリアルタイムＰＣＲプライマーおよびプローブセット（ｐ１Ｄｉｍ１、ｐ２Ｄｉｍ１およびｐ３Ｄｉｍ１）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、Ｉｏｗａ、ＵＳＡ）を、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓ Ｄｉｍ１反復標的ＤＮＡに対して相補的になるように設計した。

ｐ１Ｄｉｍ１について、フォワードプライマー（配列番号９）およびプローブ（配列番号１１）は、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓ反復性Ｄｉｍ１標的ＤＮＡの一方のＤＮＡ鎖上の配列（配列番号２）に対して相補的である。リバースプライマー（配列番号１０）は、Ｄｉｍ１反復性標的ＤＮＡの反対側のＤＮＡ鎖上の配列（配列番号１）に対して相補的である（図３Ａ）。プローブは、その５’末端に結合した蛍光色素６－ＦＡＭおよびその３’末端に結合したクエンチャーＩＡＢｋＦＱを有する。さらに、プローブは、５’末端から９塩基の内部ＺＥＮ（商標）クエンチャーを有する。本明細書のリアルタイムＰＣＲ例は、プライマーおよびプローブセットｐ１Ｄｉｍ１を使用する。

ｐ２Ｄｉｍ１について、フォワードプライマー（配列番号９）およびプローブ（配列番号２２）は、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓ反復性Ｄｉｍ１標的ＤＮＡの一方のＤＮＡ鎖上の配列（配列番号２）に対して相補的である。リバースプライマー（配列番号２１）は、Ｄｉｍ１反復性標的ＤＮＡの反対側のＤＮＡ鎖上の配列（配列番号１）に対して相補的である（図３Ｂ）。プローブは、その５’末端に結合した蛍光色素６－ＦＡＭおよびその３’末端に結合したクエンチャーＩＡＢｋＦＱを有する。さらに、プローブは、５’末端から９塩基の内部ＺＥＮ（商標）クエンチャーを有する。

ｐ３Ｄｉｍ１について、フォワードプライマー（配列番号９）およびプローブ（配列番号２４）は、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓ反復性Ｄｉｍ１標的ＤＮＡの一方のＤＮＡ鎖上の配列（配列番号２）に対して相補的である。リバースプライマー（配列番号２３）は、Ｄｉｍ１反復性標的ＤＮＡの反対側のＤＮＡ鎖上の配列（配列番号１）に対して相補的である（図３Ｃ）。プローブは、その５’末端に結合した蛍光色素６－ＦＡＭおよびその３’末端に結合したクエンチャーＩＡＢｋＦＱを有する。さらに、プローブは、５’末端から９塩基の内部ＺＥＮ（商標）クエンチャーを有する。

熱サイクリングを、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して実施した。２０μｌリアルタイムＰＣＲ反応を、以下の試薬を用いてセットアップした：１０μｌの２×ＴａｑＰａｔｈ ＰｒｏＡｍｐ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）；０．８μｌの２０μＭフォワードプライマー；０．８μｌの２０μＭリバースプライマー；２．５μｌの１μＭプローブ；０．９μｌのｄｄＨ_２Ｏ；および５μｌの鋳型ＤＮＡ（例えば、溶出されたＤｉｍ１標的ＤＮＡ）。リアルタイムＰＣＲサイクリング条件は、以下の通りであった：５０℃で２分間および次いで、９５℃で１０分間、その後、９５℃で１５秒間および６２℃で１分間を４０サイクル。

標的ＤＮＡの検出（Ｄ．ｒｅｐｅｎｓ）

３つのリアルタイムＰＣＲプライマーおよびプローブセット（ｐ１Ｄｒｅ１、ｐ２Ｄｒｅ１およびｐ３Ｄｒｅ１）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、Ｉｏｗａ、ＵＳＡ）を、Ｄ．ｒｅｐｅｎｓ Ｄｒｅ１反復標的ＤＮＡに対して相補的になるように設計した。

ｐ１Ｄｒｅ１について、フォワードプライマー（配列番号１２）およびプローブ（配列番号１４）は、Ｄ．ｒｅｐｅｎｓ反復性Ｄｒｅ１標的ＤＮＡの一方のＤＮＡ鎖上の配列（配列番号６）に対して相補的である。リバースプライマー（配列番号１３）は、Ｄｒｅ１反復性標的ＤＮＡの反対側のＤＮＡ鎖上の配列（配列番号５）に対して相補的である（図３Ｄ）。プローブは、その５’末端に結合した蛍光色素６－ＦＡＭおよびその３’末端に結合したクエンチャーＩＡＢｋＦＱを有する。さらに、プローブは、５’末端から９塩基の内部ＺＥＮ（商標）クエンチャーを有する。

ｐ２Ｄｒｅ１について、フォワードプライマー（配列番号１５）およびプローブ（配列番号１７）は、Ｄ．ｒｅｐｅｎｓ反復性Ｄｒｅ１標的ＤＮＡの一方のＤＮＡ鎖上の配列（配列番号６）に対して相補的である。リバースプライマー（配列番号１６）は、Ｄｒｅ１反復性標的ＤＮＡの反対側のＤＮＡ鎖上の配列（配列番号５）に対して相補的である（図３Ｅ）。プローブは、その５’末端に結合した蛍光色素６－ＦＡＭおよびその３’末端に結合したクエンチャーＩＡＢｋＦＱを有する。さらに、プローブは、５’末端から９塩基の内部ＺＥＮ（商標）クエンチャーを有する。

ｐ３Ｄｒｅ１について、フォワードプライマー（配列番号１８）およびプローブ（配列番号２０）は、Ｄ．ｒｅｐｅｎｓ反復性Ｄｒｅ１標的ＤＮＡの一方のＤＮＡ鎖上の配列（配列番号６）に対して相補的である。リバースプライマー（配列番号１９）は、Ｄｒｅ１反復性標的ＤＮＡの反対側のＤＮＡ鎖上の配列（配列番号５）に対して相補的である（図３Ｆ）。プローブは、その５’末端に結合した蛍光色素６－ＦＡＭおよびその３’末端に結合したクエンチャーＩＡＢｋＦＱを有する。さらに、プローブは、５’末端から９塩基の内部ＺＥＮ（商標）クエンチャーを有する。

熱サイクリングを、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して実施する。３つのプライマーおよびプローブセット（ｐ１Ｄｒｅ１、ｐ２Ｄｒｅ１およびｐ３Ｄｒｅ１）の各々について、２０μｌリアルタイムＰＣＲ反応を、以下の試薬を用いてセットアップする：１０μｌの２×ＴａｑＰａｔｈ ＰｒｏＡｍｐ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ；０．８μｌの２０μＭフォワードプライマー；０．８μｌの２０μＭリバースプライマー；２．５μｌの１μＭプローブ；０．９μｌのｄｄＨ_２Ｏ；および５μｌの鋳型ＤＮＡ（例えば、溶出されたＤｒｅ１標的ＤＮＡ）。リアルタイムＰＣＲサイクリング条件は、以下の通りである：５０℃で２分間および次いで、９５℃で１０分間、その後、９５℃で１５秒間および６０℃で１分間を４０サイクル。

ストリップアッセイのためのＤＮＡ捕捉／単離

総ｃｆＤＮＡを、製造業者の指示に従って、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ＭａｇＭＡＸ（商標）Ｃｅｌｌ－Ｆｒｅｅ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して、イヌ血漿から単離する。各イヌ試料について、２ｍｌの血漿を出発材料として使用し、溶出体積は３０μｌであった。５μｌの溶出液を、プライマー配列番号９および配列番号２９を使用する各ＰＣＲ反応（３５サイクル）のための鋳型として使用した。

あるいは、寄生生物特異的ｃｆＤＮＡは、捕捉媒体、例えば、捕捉オリゴヌクレオチドに結合する適切にコーティングされた磁気ビーズ表面に結合した捕捉オリゴヌクレオチドを使用して捕捉され得る。オリゴヌクレオチドは、適切に処理された捕捉媒体に最初に結合され得、その後、標的ＤＮＡ、例えば、Ｄｉｍ１にハイブリダイズされ得る。標的ＤＮＡは、ストリップテストＰＣＲプライマー（配列番号９および配列番号２９）を使用するＰＣＲ増幅（３５サイクル）を使用して、ビーズから溶出され得る。

ストリップアッセイのためのＰＣＲ増幅

熱サイクリングを、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して実施した。各ＰＣＲ反応を以下のようにセットアップした：２５μｌの２×ＴａｑＰａｔｈ ＰｒｏＡｍｐ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ；１μｌの１０μＭフォワードプライマー（配列番号９）；１μｌの、１０μＭのビオチン化されたリバースプライマー（配列番号２９）；５μｌの溶出液（鋳型）；および１８μｌのｄｄＨ_２Ｏ。ＰＣＲサイクリング条件は、以下の通りである：９５℃で１０分間、その後、９５℃で４０秒間および６０℃で１分間を３５サイクル、ならびに６０℃で単一の１０分間の伸長。

ストリップアッセイのための検出

１０μｌのＰＣＲ産物を、１μｌの１０ｐｍｏｌ／μｌストリップテストプローブ（配列番号３０）および３９μｌのアニーリング緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ７．５～８、５０ｍＭ ＮａＣｌおよび１ｍＭ ＥＤＴＡ）と合わせる。次いで、ＰＣＲ産物を、混合物を９５℃で５分間加熱することによって変性させる。次いで、混合物を、５５℃で３０分間維持して、ストリップテストプローブをＰＣＲ産物のビオチン化されたＤＮＡ鎖にハイブリダイズさせる。

テストストリップを、混合物に次に曝露させ、ラテラルフローを介して、混合物は、テストストリップの全長にわたって移動した。６－ＦＡＭ標識されたプローブにハイブリダイズしたビオチン化された鎖がストレプトアビジンコーティングされたテストストリップ（捕捉媒体）上のバンドに結合すると、目に見える陽性結果が生じる。６－ＦＡＭ標識されたプローブに結合する金標識された抗フルオレセイン（６－ＦＡＭ）抗体は、テストストリップ上でのＤｉｍ１ ＰＣＲ産物の可視化を可能にする。Zaky et al. PLoS Negl Trop Dis. 2018 Nov 21;12(11)を参照のこと。

（実施例１）
Ｄｉｍ１ Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓリアルタイムＰＣＲアッセイの分析感度
Ｄｉｍ１ Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓリアルタイムＰＣＲアッセイの分析感度を、連続希釈された量（１００ピコグラム、１０ピコグラム、１ピコグラム、１００フェムトグラム、１０フェムトグラム、１フェムトグラム、１００アトグラム、１０アトグラムおよび１アトグラム）のＤ．ｉｍｍｉｔｉｓゲノムＤＮＡを鋳型として用いてｐ１Ｄｉｍ１プライマーおよびプローブセットを使用して、最初に評価した。全ての反応を、５回の反復で実施した。Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓ ＤＮＡのリアルタイム増幅は、サイクル定量（Ｃｑ）値によって示される、閾値においてプローブ蛍光が検出されたときのサイクル数によって示される。増幅が４０未満の平均Ｃｑ値で生じた場合、結果は陽性とみなされる。ゲノムＤＮＡの各入力量についての５回の反復の平均Ｃｑおよび標準偏差（ＳＤ）は、表１に示される。Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓリアルタイムＰＣＲアッセイは、下は１０アトグラムの入力Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓゲノムＤＮＡまで、全ての反復において、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓゲノムＤＮＡを一貫して検出した。しかし、５回の反復のうち２回のみが、１アトグラムの入力鋳型ＤＮＡにおいてＤ．ｉｍｍｉｔｉｓ ＤＮＡ検出を示した。これらのデータによれば、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓ Ｄｉｍ１リアルタイムＰＣＲアッセイの分析感度は、１０アトグラムと１アトグラムとの間のＤ．ｉｍｍｉｔｉｓゲノムＤＮＡであると決定される。

（実施例２）
Ｄｉｍ１ Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓリアルタイムＰＣＲアッセイの種特異性
Ｄｉｍ１ Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓリアルタイムＰＣＲアッセイの種特異性を、イヌおよびネコゲノムＤＮＡと共に、種々の近縁のフィラリア性寄生生物由来のゲノムＤＮＡを使用して実証した。以下の寄生生物由来の１００ｐｇの入力ゲノムＤＮＡを鋳型として使用した：Ｂｒｕｇｉａ ｍａｌａｙｉ、Ｌｏａ ｌｏａ、Ｂｒｕｇｉａ ｐａｈａｎｇｉ、Ａｃａｎｔｈｏｃｈｅｉｌｏｎｅｍａ ｖｉｔｅａｅ、Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ ｂａｎｃｒｏｆｔｉ、Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ ｖｏｌｖｕｌｕｓおよびＯｎｃｈｏｃｅｒｃａ ｏｃｈｅｎｇｉ。イヌおよびネコゲノムＤＮＡ（１０ナノグラム、１ナノグラムおよび１００ピコグラム）を、これらの哺乳動物宿主種のゲノムＤＮＡとの交差反応性について試験するための鋳型として使用した。テストした全ての試料においてシグナルは検出されず、これは、様々な入手可能な寄生生物、イヌおよびネコＤＮＡ試料とのＤｉｍ１アッセイの交差反応性が存在しないことを実証している（表２）。

（実施例３）
Ｄｉｍ１リアルタイムＰＣＲアッセイと２つの現行のＰＣＲアッセイとの間の感度の比較
本発明者らのＤ．ｉｍｍｉｔｉｓアッセイ（Ｄｉｍ１リアルタイムＰＣＲアッセイ）と２つの現行のリアルタイムＰＣＲアッセイ（一方はＤ．ｉｍｍｉｔｉｓミトコンドリアチトクロムＣオキシダーゼサブユニット１（「ミトコンドリアＣＯＩ」）遺伝子を標的化し（Tahir et. al. Veterinary Parasitology 235, 1-7 (2017)）、他方はＤ．ｉｍｍｉｔｉｓ １６ＳリボソームＲＮＡ（「１６Ｓ ｒＲＮＡ」）遺伝子を標的化する（Watts et. al. Molecular and Cellular Probes 14, 425-430 (1999)））との間の増幅効率の比較を、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓゲノムＤＮＡを鋳型として使用して実施した。各試料を三連でテストした。得られた平均Ｃｑ値は、本発明者らのＤｉｍ１リアルタイムＰＣＲアッセイが、ミトコンドリアＣＯＩアッセイと比較して、増幅の間に、５．６サイクル早く（１０ｐｇの入力ＤＮＡを使用する）および６．５サイクル早く（１ｐｇの入力ＤＮＡを使用する）Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓゲノムＤＮＡを検出したことを実証している（表３）。同様に、Ｄｉｍ１リアルタイムＰＣＲアッセイは、１６Ｓ ｒＲＮＡアッセイと比較して、全ての量の入力ＤＮＡ（１００ｐｇ、１０ｐｇおよび１ｐｇ）にわたって、約４サイクル早くＤ．ｉｍｍｉｔｉｓゲノムＤＮＡを検出した（表４）。これらのデータは、ミトコンドリアＣＯＩおよび１６Ｓ ｒＲＮＡリアルタイムＰＣＲアッセイの両方と比較した、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓ Ｄｉｍ１リアルタイムＰＣＲアッセイの感度における増加を示している。感度におけるこの増加は、ミトコンドリアＣＯＩアッセイと比較して約６５倍、１６Ｓ ｒＲＮＡアッセイと比較して約１６倍であった。

（実施例４）
Ｄｉｍ１リアルタイムＰＣＲアッセイと２つの現在使用されているアッセイとの間の検出限界の比較
本発明者らのＤｉｍ１リアルタイムＰＣＲアッセイと、現在使用されている１６Ｓ ｒＲＮＡアッセイおよび現在使用されているミトコンドリアＣＯＩアッセイとの、分析検出限界の比較を、連続希釈されたＤ．ｉｍｍｉｔｉｓゲノムＤＮＡ（１０ピコグラム、１ピコグラム、１００フェムトグラム、１０フェムトグラム、１フェムトグラム、１００アトグラム、１０アトグラム、１アトグラムおよび１００ゼプトグラム）を鋳型として使用して実施した。一貫した検出（表５中で「Ｘ」で示される）が、３回の反復反応のうち少なくとも２回において、４０を下回るＣｑ値によって決定される。表５に示されるように、本発明者らのＤｉｍ１リアルタイムＰＣＲアッセイは、１０ａｇのＤ．ｉｍｍｉｔｉｓゲノムＤＮＡまで一貫した検出を示すが、１６Ｓ ｒＲＮＡアッセイおよびミトコンドリアＣＯＩアッセイは、１ｆｇのＤ．ｉｍｍｉｔｉｓゲノムＤＮＡまで一貫した検出を示す。このデータは、Ｄｉｍ１リアルタイムＰＣＲアッセイ検出の分析感度が、現在使用されているリアルタイムＰＣＲアッセイよりもおよそ１００倍高いことを示している。したがって、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓ Ｄｉｍ１リアルタイムＰＣＲアッセイは、イヌおよびネコ患者試料におけるプレパテント感染についての増加した検出感度を提供することができる。

（実施例５）
イヌ血液試料に対するＤｉｍ１リアルタイムＰＣＲアッセイの評価
本発明者らのＤｉｍ１アッセイを、感染したおよび未感染のイヌ全血試料由来の臨床試料を用いて検証した。簡潔に述べると、ＤＮＡを、製造業者の指示に従って、Ｑｉａｇｅｎ ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ ＤＮＡカラム抽出キットを使用して、３００μｌのイヌ全血から単離した。ＤＮＡを、７５μｌ ｄｄＨ_２Ｏ中に溶出し、１μｌを各Ｄｉｍ１リアルタイムＰＣＲアッセイに使用した。データは、４頭の未感染のイヌおよび３頭のＢｒｕｇｉａ ｐａｈａｎｇｉ感染したイヌにおいてＤ．ｉｍｍｉｔｉｓ ＤＮＡの検出がないことを示す（表６）。Ｂ．ｐａｈａｎｇｉは、近縁のフィラリア性線虫寄生生物である。したがって、偽陽性もネコ／イヌ寄生生物Ｂ．ｐａｈａｎｇｉとの交差反応性も観察されなかった。さらに、血液収集の２．５カ月前に５０匹のＬ３ Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓ幼虫を感染させた２頭のイヌでは、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓの検出は見られなかった（表６）。これら２頭のイヌは、血液中に検出可能なミクロフィラリアを伴わない初期プレパテント感染を有する。Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓ寄生生物は通常、感染のおよそ７０日後に、未熟な成体へと発達し、血流へと最初に侵入する［Kotani, T. & Powers, K. G. Am. J. Vet. Res. 43, 2199-2206 (1982)］。したがって、感染後２．５カ月の時点での全血試料中のＤ．ｉｍｍｉｔｉｓ ＤＮＡの検出は、必ずしも期待されなかったが、それは、これが最初の虫が血流に到達した直後だからである。高レベルでの検出が、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓによるパテント感染を示している４頭のイヌにおいて見られた（表６）。Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓ Ｄｉｍ１リアルタイムＰＣＲアッセイは、臨床試料で予想通りに機能し、未曝露のイヌおよび初期プレパテントのイヌにおいて検出を示さず、Ｂｒｕｇｉａ ｐａｈａｎｇｉ感染したイヌにおいて交差反応性を示さず、パテント感染および血液試料中の高いミクロフィラリア数を有するイヌにおいて強い検出を示した。

（実施例６）
無細胞ＤＮＡを使用してプレパテント感染を検出する際のＤｉｍ１リアルタイムＰＣＲアッセイの感度
プレパテントＤ．ｉｍｍｉｔｉｓ感染を検出する際の本発明者らのＤｉｍ１リアルタイムＰＣＲアッセイの臨床感度を、血漿から単離した無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を使用して、２頭の感染したイヌ（イヌ＃８およびイヌ＃９）において評価した。プレパテント期間の間、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓ虫は、Ｌ３幼虫（蚊からの感染性ステージ）として開始し、その後、感染のおよそ７０日後に、未熟な成体として宿主血流に侵入する。これらの未熟な成体が血流に入ると、これらは、細胞およびＤＮＡを宿主血流中に流すことができる。パテンシーには、感染のおよそ６～７カ月後に到達し、この時点で、これらの感染は、性的に成熟した成体雌性によって流された抗原を同定する現行の標準的な血清学技法によって検出することができる。プレパテント期間の間、成体雌性抗原は、存在しないか、または現行の血清学的技法によって検出されるのに十分に高い濃度では存在しない。しかし、未熟な成虫から流されたＤＮＡは、このプレパテント期間の間、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）として血流中に存在する。本発明者らは、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓ ＤＮＡが、総ｃｆＤＮＡ画分の一部として、本発明者らのＤ．ｉｍｍｉｔｉｓ Ｄｉｍ１リアルタイムＰＣＲアッセイを使用して、臨床的プレパテント感染において検出され得ることを実証した。簡潔に述べると、全血を、５０匹のＤ．ｉｍｍｉｔｉｓ第３ステージ幼虫（Ｌ３）による感染の３カ月後に開始して、２週間毎にイヌの各々から収集した。総ｃｆＤＮＡを、製造業者の指示に従って、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ＭａｇＭＡＸ（商標）Ｃｅｌｌ－Ｆｒｅｅ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して、イヌ血漿から単離した。各時点においておよび各イヌについて、２μｌの単離されたＤＮＡを出発材料として使用し、溶出体積は３０μｌであった。本発明者らのＤｉｍ１リアルタイムＰＣＲアッセイのために、５μｌの溶出液を、各ＰＣＲ反応のための鋳型として使用し、各試料を三連でテストした。

データは、２頭の人工的に感染させたイヌの各々において、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓ ｃｆＤＮＡが、４０未満の平均Ｃｑ値によって示されるように、全ての時点からの血漿試料において本発明者らのＤｉｍ１リアルタイムＰＣＲアッセイを使用して検出されたことを示している（表７）。現行の標準的なポイントオブケアデバイス（ＤｉｒｏＣＨＥＫ（登録商標）抗原テスト（Ｚｏｅｔｉｓ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ））を使用した感染の血清学的抗原検出は、熱処理した血清（血清の熱処理は、ＤｉｒｏＣＨＥＫアッセイ感度を改善することが実証されている）において、イヌ＃８およびイヌ＃９についてそれぞれ感染の５カ月後および感染の５．５カ月後に、最初に生じることが示された。熱処理していない血清では、抗原の血清学的検出は、イヌ＃８およびイヌ＃９についてそれぞれ感染の５カ月後および感染の７．５カ月後に、最初に生じることが示された。

表７に示されるように、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓ ｃｆＤＮＡは、４０未満のＣｑ値によって示されるように、感染の３カ月後、３．５カ月後、４カ月後および４．５カ月後に、抗原の血清学的検出の前に、血漿中で明らかに検出された。これらの結果は、感染の抗原検出の２＋カ月前に、本発明者らのＤ．ｉｍｍｉｔｉｓ Ｄｉｍ１リアルタイムＰＣＲアッセイがイヌにおいてプレパテント感染を検出する能力を実証している。これは、パテンシー前の首尾よい早期薬物処置のための重要な示唆を与えている。

本発明者らのＤ．ｉｍｍｉｔｉｓ Ｄｉｍ１リアルタイムＰＣＲアッセイがイヌ血漿からｃｆＤＮＡの偽陽性検出を生じ得るかどうかを評価するために、２頭の未曝露のイヌおよび２頭のＢ．ｐａｈａｎｇｉ感染したイヌをテストした。表８に示されるように、データは、試料のいずれにおいてもシグナルが検出されなかったことを示しており、これは、偽陽性検出がなく、ネコ／イヌ寄生生物Ｂ．ｐａｈａｎｇｉとの交差反応性／検出が存在しないことを示している。

（実施例７）
緩衝液中のＤ．ｉｍｍｉｔｉｓ Ｄｉｍ１標的ＤＮＡを捕捉するための磁気ナノ粒子技術およびオリゴヌクレオチドの使用
本発明者らは、ビオチン改変されたＤ．ｉｍｍｉｔｉｓ特異的捕捉オリゴヌクレオチドと併せて磁気ナノ粒子技術（磁気ビーズ）が溶液中のＤ．ｉｍｍｉｔｉｓ ＤＮＡを効率的に捕捉する能力を評価した。陽性イヌ試料を模倣するために、１００ｐｇのＤ．ｉｍｍｉｔｉｓゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）（試料１）ならびに各々１００ｐｇのＤ．ｉｍｍｉｔｉｓゲノムｇＤＮＡおよびイヌｇＤＮＡ（試料２）を、２００μｌの１Ｍ塩結合緩衝液に添加した。５’ビオチン化された捕捉オリゴヌクレオチドのセットを、溶液中のＤ．ｉｍｍｉｔｉｓ ｇＤＮＡを特異的に標的としそれにハイブリダイズさせるために使用した。対の各捕捉オリゴヌクレオチドを、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓ Ｄｉｍ１標的ＤＮＡ反復内の対向するＤＮＡ鎖に対して相補的になるように設計して、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓ ＤＮＡの両方の鎖の捕捉を可能にする。捕捉されたＤＮＡの単離を、ストレプトアビジンコーティングされた磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）Ｍ－２７０ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）へのビオチン－ストレプトアビジン連結によってＤｉｍ１標的ＤＮＡをビーズに連結させることによって達成する（図２）。溶出させた後、単離されたＤＮＡ試料を、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓ Ｄｉｍ１標的ＤＮＡについて富化する。回収されたＤＮＡを、本発明者らのＤｉｍ１反復リアルタイムＰＣＲアッセイによって検出し、結果を、既知の量の入力Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓ ｇＤＮＡの標準曲線（図４）と比較した。

表９に示されるように、データは、それぞれ１９．９８および２０．４４のＣｑ値によって示されるように、両方のテスト試料における回収されたＤ．ｉｍｍｉｔｉｓ ｇＤＮＡの増幅および検出を示す。各試料について、平均Ｃｑ値は、１試料当たり５回の反復の平均である。

溶液から回収されたＤＮＡの量を決定するために、本発明者らは、１０ピコグラム、５ピコグラム、２．５ピコグラムおよび１ピコグラムの入力Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓ ｇＤＮＡを使用して、本発明者らのＤ．ｉｍｍｉｔｉｓ Ｄｉｍ１リアルタイムＰＣＲアッセイを実施し、平均Ｃｑ値を使用して標準曲線を生成した（図４）。ベストフィット線形式（ｌｉｎｅ ｆｏｒｍｕｌａ）を使用して、ＤＮＡ回収は、５μｌの入力鋳型体積当たり７．９ピコグラム（表９試料１）および５μｌの入力鋳型体積当たり７．１ピコグラム（表９試料２）であると決定された。各試料について５０μｌの総ＤＮＡ回収体積を考慮すると、総回収は、それぞれ、７９ピコグラムおよび７１ピコグラムであると計算される。これらのデータは、このＤＮＡ捕捉方法が、表９試料１（１００ｐｇの添加されたＤ．ｉｍｍｉｔｉｓ ＤＮＡ）からＤ．ｉｍｍｉｔｉｓ ＤＮＡの７９％を、表９試料２（１００ｐｇの添加されたＤ．ｉｍｍｉｔｉｓ ＤＮＡおよび１００ｐｇのイヌＤＮＡ）からＤ．ｉｍｍｉｔｉｓ ＤＮＡの７１％を回収したことを示している。これらの結果は、このＤＮＡ捕捉方法が溶液から特異的ＤＮＡ配列を効率的に回収する能力を立証している。

さらに、この特異的捕捉方法は、本発明者らのＤｉｍ１リアルタイムＰＣＲアッセイを用いた検出の最適な感度を生じる、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓ標的ＤＮＡの富化を促進する。

（実施例８）
イヌ血漿からＤ．ｉｍｍｉｔｉｓ Ｄｉｍ１標的ＤＮＡを捕捉するための磁気ナノ粒子技術およびオリゴヌクレオチドの使用
本発明者らは、ビオチン改変されたＤ．ｉｍｍｉｔｉｓ特異的捕捉オリゴヌクレオチドとカップリングされた磁気ナノ粒子（磁気ビーズ）技術が、血漿からＤ．ｉｍｍｉｔｉｓ ＤＮＡを効率的に捕捉する能力をさらに評価した。陽性イヌ血漿試料を模倣するために、１００ｐｇのＤ．ｉｍｍｉｔｉｓ ｇＤＮＡを、未曝露のイヌに由来する２００μｌの血漿に添加した。各々１００ｐｇのＤ．ｉｍｍｉｔｉｓおよびイヌＤＮＡを補充した１×結合緩衝液を、総ＤＮＡ回収の比較として使用した。表１０に示されるように、データは、それぞれ１９．７９（血漿試料）および２０．５２（１Ｍ塩緩衝液）のＣｑ値によって示されるように、両方のテスト試料における回収されたＤ．ｉｍｍｉｔｉｓ ＤＮＡの増幅および検出を示す。このデータは、両方の試料における入力ＤＮＡの類似の回収を示す、１未満のＣｑ差を示す。したがって、この方法は、血漿から寄生生物ＤＮＡを効率的に捕捉することが可能である。

（実施例９）
無細胞ＤＮＡを使用してパテント感染を検出する際のＤｉｍ１リアルタイムＰＣＲアッセイの感度
パテントミクロフィラリア陽性Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓ感染を検出する際の本発明者らのＤｉｍ１リアルタイムＰＣＲアッセイの実施形態の臨床感度を、イヌ血漿から単離した無細胞ＤＮＡ（「ｃｆＤＮＡ」）を使用して、３頭のＤ．ｉｍｍｉｔｉｓ感染したイヌ（イヌ＃１４、イヌ＃１５およびイヌ＃１６）において評価した。総ｃｆＤＮＡを、製造業者の指示に従って、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ＭａｇＭＡＸ（商標）Ｃｅｌｌ－Ｆｒｅｅ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）を使用して、イヌ血漿から単離した。各時点においておよび各イヌについて、２ｍｌの血漿を出発材料として使用し、溶出体積は３０μｌであった。５μｌの溶出液を、プライマーおよびプローブセットｐ１Ｄｉｍ１を使用する各リアルタイムＰＣＲ反応のための鋳型として使用し、各試料を三連でテストした。

表１１に示されるように、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓ ｃｆＤＮＡは、パテントミクロフィラリア陽性イヌにおいて、血漿中で明らかに検出された。これらの結果は、パテント感染および高いミクロフィラリア数を有するイヌの血漿試料中のＤ．ｉｍｍｉｔｉｓ ｃｆＤＮＡの存在を実証している。

（実施例１０）
Ｄｉｍ１反復性標的ＤＮＡ（配列番号２）のストリップテスト検出
Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓ反復性種特異的標的ＤＮＡのストリップテスト検出感度を、連続希釈された量（１ピコグラム、１００フェムトグラム、１０フェムトグラム、１フェムトグラム、１００アトグラム、１０アトグラム、１アトグラム、１００ゼプトグラム）のＤ．ｉｍｍｉｔｉｓゲノムＤＮＡを鋳型として用いてプライマーおよびプローブセットｐ４Ｄｉｍ１（配列番号９、配列番号２９、配列番号３０）（図５）を使用して評価した。簡潔に述べると、ＰＣＲを、フォワードおよびリバースプライマー、それぞれ配列番号９および配列番号２９を使用して、３５サイクルにわたって実施した。ＰＣＲ産物の一方のＤＮＡ鎖（ビオチン化されたＰＣＲプライマー配列番号２９から合成された鎖）が、ＰＣＲ増幅後にビオチン化される。ＰＣＲ産物を変性させ（９５℃で５分間）、６－ＦＡＭ標識されたプローブ（配列番号３０）を添加して、ビオチン化されたＤＮＡ鎖にハイブリダイズさせる。ラテラルフローを介して、試料は、テストストリップの全長にわたって移動する。６－ＦＡＭ標識されたプローブにハイブリダイズしたビオチン化された鎖がストレプトアビジンコーティングされたテストストリップ（捕捉媒体）上のバンドに結合すると、目に見える陽性結果が生じる。６－ＦＡＭ標識されたプローブに結合する金標識された抗フルオレセイン（６－ＦＡＭ）抗体は、テストストリップ上でのＤｉｍ１ ＰＣＲ産物の可視化を可能にする。

データは、ストリップ検出方法が、下は１アトグラムの入力Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓゲノムＤＮＡまで、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓゲノムＤＮＡを一貫して検出したことを示している（図６Ａ）。これらのデータによれば、ストリップ検出方法の分析感度は、１０アトグラムと１アトグラムとの間の入力Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓゲノムＤＮＡの分析感度で、Ｄｉｍ１ Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓリアルタイムＰＣＲアッセイの実施形態（表１）と匹敵する。

本発明者らのＤｉｍ１ストリップテスト検出アッセイを、感染したおよび未感染のイヌ血漿試料由来の臨床試料を用いて検証した。簡潔に述べると、総ｃｆＤＮＡを、製造業者の指示に従って、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ＭａｇＭＡＸ（商標）Ｃｅｌｌ－Ｆｒｅｅ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して、イヌ血漿から単離した。各イヌ試料について、２ｍｌの血漿を出発材料として使用し、溶出体積は３０μｌであった。５μｌの溶出液を、プライマーおよびプローブセットｐ４Ｄｉｍ１を使用する各ＰＣＲ反応（３５サイクル）のための鋳型として使用した。

あるいは、寄生生物特異的ｃｆＤＮＡは、捕捉媒体、例えば、捕捉オリゴヌクレオチドに結合する適切にコーティングされた磁気ビーズ表面に結合した捕捉オリゴヌクレオチドを使用して捕捉され得る。オリゴヌクレオチドは、適切に処理された捕捉媒体に最初に結合され得、その後、標的ＤＮＡ、例えば、Ｄｉｍ１にハイブリダイズされ得る。標的ＤＮＡは、ストリッププライマー（配列番号９および配列番号２９）を用いたＰＣＲ増幅（３５サイクル）を使用して、ビーズから溶出され得る。ここで、この上清は、一方のビオチン化された鎖を含むＰＣＲ産物を含む。上に示されるように、ビーズを除去するために磁石が使用され得、増幅された標的ＤＮＡが回収され得、ストリップを使用してテストされ得る。

いずれの場合にも、ＰＣＲ産物は変性され得（９５℃で５分間）、ストリップテストプローブ、例えば、配列番号３０が、ビオチン化されたＤＮＡ鎖にハイブリダイズさせるために添加され得る。上記のように、ラテラルフローを介して、試料は、テストストリップの全長にわたって移動する。６－ＦＡＭ標識されたプローブにハイブリダイズしたビオチン化された鎖がストレプトアビジンコーティングされたテストストリップ（捕捉媒体）上のバンドに結合すると、目に見える陽性結果が生じる。６－ＦＡＭ標識されたプローブに結合する金標識された抗フルオレセイン（６－ＦＡＭ）抗体は、テストストリップ上でのＤｉｍ１ ＰＣＲ産物の可視化を可能にする。

ストリップテスト検出アッセイは、臨床試料で予想通りに機能し、未曝露のイヌにおいて検出を示さず、Ｂｒｕｇｉａ ｐａｈａｎｇｉ感染したイヌにおいて交差反応性を示さず、パテント感染および血液試料中の高いミクロフィラリア数を有するイヌにおいて強い検出を示した（図６Ｂおよび６Ｃ）。Zaky et al. PLoS Negl Trop Dis. 2018 Nov 21;12(11)もまた参照のこと。

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本発明の種々の実施形態は、この段落の後の段落において列挙した（かつ本出願の最後に提供される実際の特許請求の範囲の前の）潜在的な特許請求の範囲によって特徴付けられ得る。これらの潜在的な特許請求の範囲は、本出願の記載の一部を構成する。したがって、以下の潜在的な特許請求の範囲の主題は、本出願または本出願に基づいて優先権を主張する任意の出願に関与する後の手続きにおいて、実際の特許請求の範囲として提示され得る。かかる潜在的な特許請求の範囲を含めることは、実際の特許請求の範囲が潜在的な特許請求の範囲の主題をカバーしないことを意味すると解釈すべきではない。したがって、後の手続きにおいてこれらの潜在的な特許請求の範囲を提示しないという決定は、公共へのその主題の寄付として解釈すべきではない。

限定なしに、特許請求され得る潜在的な主題（以下に提示される実際の特許請求の範囲との混同を回避するために、文字「Ｐ」が前置きされる）は、以下を含む：
請求項Ｐ１． 動物宿主における寄生生物感染の診断のためのデバイスであって、サーモサイクラーを含むＰＣＲ測定装置を含み、前記ＰＣＲ測定装置が、感染した前記動物宿主から得られた組織試料中の前記寄生生物のＤＮＡ中の反復性配列を標的おするように構成されている、デバイス。
請求項Ｐ２． 前記寄生生物が、Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ ｉｍｍｉｔｉｓおよびＤｉｒｏｆｉｌａｒｉａ ｒｅｐｅｎｓからなる群から選択される、請求項Ｐ１に記載のデバイス。
請求項Ｐ３． 前記反復性配列が、前記寄生生物に対する感度および選択性を提供するように選択されている、請求項Ｐ１からＰ２のいずれか一項に記載のデバイス。
請求項Ｐ４． 前記ＰＣＲ測定装置が、光学読み出し機構を含む、請求項Ｐ１からＰ３のいずれか一項に記載のデバイス。
請求項Ｐ５． 付随する前記光学読み出し機構が、目に見えるバンドを有するテストストリップを含む、請求項Ｐ４に記載のデバイス。
請求項Ｐ６． 前記組織試料が、前記感染した動物宿主から得られた血漿、血清および全血からなる群から選択される、請求項Ｐ１からＰ５のいずれか一項に記載のデバイス。
請求項Ｐ７． 前記組織試料が、感染した蚊由来である、請求項Ｐ１からＰ６のいずれか一項に記載のデバイス。
請求項Ｐ８． 寄生生物に感染した疑いがある哺乳動物宿主を処置する方法であって、
（ａ）前記寄生生物に感染した疑いがある前記哺乳動物宿主由来の試料を提供するステップ；ならびに
（ｂ）前記試料中の前記寄生生物の存在の検出を引き起こすステップであって、前記検出が、
（ｉ）前記試料からＤＮＡを利用可能にするステップ；
（ｉｉ）前記試料を、標的ＤＮＡに対して相補的な標識されたＤＮＡと混合するステップ；および
（ｉｉｉ）ＰＣＲを使用して前記標的ＤＮＡを検出するステップ
を含む、ステップ
を含み、
前記寄生生物の存在が、検出を引き起こすステップの結果として検出された場合、前記哺乳動物宿主に、前記寄生生物感染を低減または排除するのに有効な処置を施行する、方法。
請求項Ｐ９． 前記標識されたＤＮＡが、
ａ．前記標的ＤＮＡを同定するステップであって、前記標的ＤＮＡが、前記寄生生物によって独自に保有される反復性ＤＮＡであり、前記同定するステップが、
ｉ．ゲノムＤＮＡ配列リードを前記寄生生物から得るステップ、
ｉｉ．各配列リードをトリミングして、等しい長さのトリミングされた配列リードのリードセットを生成するステップ、
ｉｉｉ．リード対を形成するために、前記リードセットの各配列を、前記リードセット中の全ての他の配列リードと比較するステップであって、所与の対の各リードが、その長さの少なくとも５５％にわたって、その対の他のリードと、少なくとも９０％の類似性を共有する、ステップ、
ｉｖ．前記リード対を評価して、前記寄生生物のゲノム中の、前記ゲノム中に高いコピー数を推定上有する配列の候補セットを同定するステップ、および
ｖ．配列の前記候補セットから、前記寄生生物によって独自に保有される最終配列を選択するステップ
を含む、ステップ；ならびに
ｂ．前記寄生生物によって独自に保有される前記最終配列を使用して、前記標識されたＤＮＡの合成を引き起こすステップ
を含むプロセスを使用して作製されており、前記標識されたＤＮＡが、前記寄生生物によって独自に保有される同定された前記反復性ＤＮＡに対して相補的である、請求項Ｐ８に記載の方法。
請求項Ｐ１０． 前記寄生生物が、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓおよびＤ．ｒｅｐｅｎｓからなる群から選択される、請求項Ｐ８からＰ９のいずれか一項に記載の方法。
請求項Ｐ１１． 前記寄生生物感染がパテントである、請求項Ｐ１０に記載の方法。
請求項Ｐ１２． 前記寄生生物感染がプレパテントである、請求項Ｐ１０に記載の方法。
請求項Ｐ１３． 前記組織試料が、感染した哺乳動物宿主から得られた血漿、血清および全血からなる群から選択される、請求項Ｐ８からＰ１２のいずれか一項に記載の方法。
請求項Ｐ１４． 前記哺乳動物宿主がイヌである、請求項Ｐ８からＰ１３のいずれか一項に記載の方法。
請求項Ｐ１５． 前記標識されたＤＮＡが、コンジュゲーション部分を含む、請求項Ｐ８からＰ１４のいずれか一項に記載の方法。
請求項Ｐ１６． 前記コンジュゲーション部分がビオチンである、請求項Ｐ１５に記載の方法。
請求項Ｐ１７． 前記標的ＤＮＡが、捕捉ＤＮＡに結合する捕捉媒体を使用して前記混合物から単離される、請求項Ｐ８からＰ１６のいずれか一項に記載の方法。
請求項Ｐ１８． 前記捕捉媒体が、磁気ビーズおよびテストストリップからなる群から選択される、請求項Ｐ１７に記載の方法。
請求項Ｐ１９． 前記捕捉媒体が、ストレプトアビジンでコーティングされている、請求項Ｐ１７からＰ１８のいずれか一項に記載の方法。
請求項Ｐ２０． 前記ＰＣＲが、プライマーおよびプローブセットを使用するリアルタイムＰＣＲである、請求項Ｐ８からＰ１９のいずれか一項に記載の方法。
請求項Ｐ２１． 前記寄生生物がＤ．ｉｍｍｉｔｉｓであり、前記プライマーおよびプローブセットが、ｐ１Ｄｉｍ１、ｐ２Ｄｉｍ１およびｐ３Ｄｉｍ１からなる群から選択される、請求項Ｐ２０に記載の方法。
請求項Ｐ２２． 前記寄生生物がＤ．ｒｅｐｅｎｓであり、前記プライマーおよびプローブセットが、ｐ１Ｄｒｅ１、ｐ２Ｄｒｅ１およびｐ３Ｄｒｅ１からなる群から選択される、請求項Ｐ２０に記載の方法。
請求項Ｐ２３． 前記寄生生物がＤ．ｉｍｍｉｔｉｓであり、前記標的ＤＮＡがＤｉｍ１である、請求項Ｐ８からＰ２１のいずれか一項に記載の方法。
請求項Ｐ２４． 前記寄生生物がＤ．ｉｍｍｉｔｉｓであり、前記標識されたＤＮＡが、配列番号３および配列番号４からなる捕捉オリゴヌクレオチドのセットである、請求項Ｐ８からＰ２１およびＰ２３のいずれか一項に記載の方法。
請求項Ｐ２５． 前記寄生生物がＤ．ｒｅｐｅｎｓであり、前記標的ＤＮＡがＤｒｅ１である、請求項Ｐ８からＰ２０およびＰ２２のいずれか一項に記載の方法。
請求項Ｐ２６． 前記寄生生物がＤ．ｒｅｐｅｎｓであり、前記標識されたＤＮＡが、配列番号７および配列番号８からなる捕捉オリゴヌクレオチドのセットである、請求項Ｐ８からＰ２０、Ｐ２２およびＰ２５のいずれか一項に記載の方法。
請求項Ｐ２７． 前記処置が、メラルソミン、イベルメクチン、ドキシサイクリン、モキシデクチン、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項Ｐ８からＰ２６のいずれか一項に記載の方法。
請求項Ｐ２８． 動物宿主における寄生生物感染を検出するためのキットであって、
ａ）反復性種特異的寄生生物標的ＤＮＡに対して相補的な標識されたＤＮＡ、
ｂ）捕捉ＤＮＡに結合する捕捉媒体、および
ｃ）前記寄生生物感染を検出するための書面による指示のセット
を含む、キット。
請求項Ｐ２９． 前記寄生生物が、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓおよびＤ．ｒｅｐｅｎｓからなる群から選択される、請求項Ｐ２８に記載のキット。
請求項Ｐ３０． 前記標識されたＤＮＡが、コンジュゲーション部分を含む、請求項２８から２９のいずれか一項に記載のキット。
請求項Ｐ３１． 前記コンジュゲーション部分がビオチンである、請求項Ｐ３０に記載のキット。
請求項Ｐ３２． 前記捕捉媒体が、磁気ビーズ、テストストリップ、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項Ｐ２８からＰ３１のいずれか一項に記載のキット。
請求項Ｐ３３． 前記捕捉媒体が、ストレプトアビジンでコーティングされている、請求項Ｐ２８からＰ３２のいずれか一項に記載のキット。
請求項Ｐ３４． プライマーおよびプローブセットを含む、請求項Ｐ２８からＰ３３のいずれか一項に記載のキット。
請求項Ｐ３５． 前記寄生生物がＤ．ｉｍｍｉｔｉｓであり、前記標識されたＤＮＡが、配列番号３および配列番号４からなる捕捉オリゴヌクレオチドのセットである、請求項Ｐ２８からＰ３４のいずれか一項に記載のキット。
請求項Ｐ３６． 前記寄生生物がＤ．ｉｍｍｉｔｉｓであり、前記標的ＤＮＡがＤｉｍ１である、請求項Ｐ２８からＰ３５のいずれか一項に記載のキット。
請求項Ｐ３７． 前記寄生生物がＤ．ｉｍｍｉｔｉｓであり、前記プライマーおよびプローブセットが、ｐ１Ｄｉｍ１、ｐ２Ｄｉｍ１、ｐ３Ｄｉｍ１およびｐ４Ｄｉｍ１からなる群から選択される、請求項Ｐ３４に記載のキット。
請求項Ｐ３８． 前記寄生生物がＤ．ｒｅｐｅｎｓであり、前記標識されたＤＮＡが、配列番号７および配列番号８からなる捕捉オリゴヌクレオチドのセットである、請求項２８から３４のいずれか一項に記載のキット。
請求項Ｐ３９． 前記寄生生物がＤ．ｒｅｐｅｎｓであり、前記標的ＤＮＡがＤｒｅ１である、請求項Ｐ２８からＰ３４およびＰ３８のいずれか一項に記載のキット。
請求項Ｐ４０． 前記寄生生物がＤ．ｒｅｐｅｎｓであり、前記プライマーおよびプローブセットが、ｐ１Ｄｒｅ１、ｐ２Ｄｒｅ１およびｐ３Ｄｒｅ１からなる群から選択される、請求項Ｐ３４に記載のキット。

上記本発明の実施形態は、例示に過ぎないことが意図される；多数のバリエーションおよび改変が、当業者に明らかとなる。全てのかかるバリエーションおよび改変は、任意の添付の特許請求の範囲において定義される本発明の範囲内であることが意図される。

他の実施形態では、寄生生物はＤ．ｒｅｐｅｎｓであり、標識されたＤＮＡは、配列番号７および配列番号８からなる捕捉オリゴヌクレオチドのセットである。一部の実施形態では、寄生生物はＤ．ｉｍｍｉｔｉｓであり、標的ＤＮＡはＤｒｅ１である。一部の実施形態では、寄生生物はＤ．ｒｅｐｅｎｓであり、標的ＤＮＡはＤｒｅ１である。一部の実施形態では、寄生生物はＤ．ｒｅｐｅｎｓであり、プライマーおよびプローブセットは、ｐ１Ｄｒｅ１、ｐ２Ｄｒｅ１およびｐ３Ｄｒｅ１からなる群から選択される。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
動物宿主における寄生生物感染の診断のためのデバイスであって、サーモサイクラーを含むＰＣＲ測定装置を含み、前記ＰＣＲ測定装置が、感染した前記動物宿主から得られた組織試料中の前記寄生生物のＤＮＡ中の反復性配列を標的とするように構成されている、デバイス。
（項目２）
前記寄生生物が、Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ ｉｍｍｉｔｉｓおよびＤｉｒｏｆｉｌａｒｉａ ｒｅｐｅｎｓからなる群から選択される、項目１に記載のデバイス。
（項目３）
前記反復性配列が、前記寄生生物に対する感度および選択性を提供するように選択されている、項目１から２のいずれか一項に記載のデバイス。
（項目４）
前記ＰＣＲ測定装置が、光学読み出し機構を含む、項目１から３のいずれか一項に記載のデバイス。
（項目５）
付随する前記光学読み出し機構が、目に見えるバンドを有するテストストリップを含む、項目４に記載のデバイス。
（項目６）
前記組織試料が、前記感染した動物宿主から得られた血漿、血清および全血からなる群から選択される、項目１から５のいずれか一項に記載のデバイス。
（項目７）
前記組織試料が、感染した蚊由来である、項目１から６のいずれか一項に記載のデバイス。
（項目８）
寄生生物に感染した疑いがある哺乳動物宿主を処置する方法であって、
（ａ）前記寄生生物に感染した疑いがある前記哺乳動物宿主由来の試料を提供するステップ；ならびに
（ｂ）前記試料中の前記寄生生物の存在の検出を引き起こすステップであって、前記検出が、
（ｉ）前記試料からＤＮＡを利用可能にするステップ；
（ｉｉ）前記試料を、標的ＤＮＡに対して相補的な標識されたＤＮＡと混合するステップ；および
（ｉｉｉ）ＰＣＲを使用して前記標的ＤＮＡを検出するステップ
を含む、ステップ
を含み、
前記寄生生物の存在が、検出を引き起こすステップの結果として検出された場合、前記哺乳動物宿主に、前記寄生生物感染を低減または排除するのに有効な処置を施行する、方法。
（項目９）
前記標識されたＤＮＡが、
ａ．前記標的ＤＮＡを同定するステップであって、前記標的ＤＮＡが、前記寄生生物によって独自に保有される反復性ＤＮＡであり、前記同定するステップが、
ｉ．ゲノムＤＮＡ配列リードを前記寄生生物から得るステップ、
ｉｉ．各配列リードをトリミングして、等しい長さのトリミングされた配列リードのリードセットを生成するステップ、
ｉｉｉ．リード対を形成するために、前記リードセットの各配列を、前記リードセット中の全ての他の配列リードと比較するステップであって、所与の対の各リードが、その長さの少なくとも５５％にわたって、その対の他のリードと、少なくとも９０％の類似性を共有する、ステップ、
ｉｖ．前記リード対を評価して、前記寄生生物のゲノム中の、前記ゲノム中に高いコピー数を推定上有する配列の候補セットを同定するステップ、および
ｖ．配列の前記候補セットから、前記寄生生物によって独自に保有される最終配列を選択するステップ
を含む、ステップ；ならびに
ｂ．前記寄生生物によって独自に保有される前記最終配列を使用して、前記標識されたＤＮＡの合成を引き起こすステップ
を含むプロセスを使用して作製されており、前記標識されたＤＮＡが、前記寄生生物によって独自に保有される同定された前記反復性ＤＮＡに対して相補的である、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記寄生生物が、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓおよびＤ．ｒｅｐｅｎｓからなる群から選択される、項目８から９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
前記寄生生物感染がパテントである、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記寄生生物感染がプレパテントである、項目１０に記載の方法。
（項目１３）
前記組織試料が、感染した哺乳動物宿主から得られた血漿、血清および全血からなる群から選択される、項目８から１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記哺乳動物宿主がイヌである、項目８から１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記標識されたＤＮＡが、コンジュゲーション部分を含む、項目８から１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
前記コンジュゲーション部分がビオチンである、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記標的ＤＮＡが、捕捉ＤＮＡに結合する捕捉媒体を使用して前記混合物から単離される、項目８から１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
前記捕捉媒体が、磁気ビーズおよびテストストリップからなる群から選択される、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記捕捉媒体が、ストレプトアビジンでコーティングされている、項目１７から１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
前記ＰＣＲが、プライマーおよびプローブセットを使用するリアルタイムＰＣＲである、項目８から１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
前記寄生生物がＤ．ｉｍｍｉｔｉｓであり、前記プライマーおよびプローブセットが、ｐ１Ｄｉｍ１、ｐ２Ｄｉｍ１およびｐ３Ｄｉｍ１からなる群から選択される、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記寄生生物がＤ．ｒｅｐｅｎｓであり、前記プライマーおよびプローブセットが、ｐ１Ｄｒｅ１、ｐ２Ｄｒｅ１およびｐ３Ｄｒｅ１からなる群から選択される、項目２０に記載の方法。
（項目２３）
前記寄生生物がＤ．ｉｍｍｉｔｉｓであり、前記標的ＤＮＡがＤｉｍ１である、項目８から２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
前記寄生生物がＤ．ｉｍｍｉｔｉｓであり、前記標識されたＤＮＡが、配列番号３および配列番号４からなる捕捉オリゴヌクレオチドのセットである、項目８から２１および２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記寄生生物がＤ．ｒｅｐｅｎｓであり、前記標的ＤＮＡがＤｒｅ１である、項目８から２０および２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
前記寄生生物がＤ．ｒｅｐｅｎｓであり、前記標識されたＤＮＡが、配列番号７および配列番号８からなる捕捉オリゴヌクレオチドのセットである、項目８から２０、２２および２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記処置が、メラルソミン、イベルメクチン、ドキシサイクリン、モキシデクチン、およびそれらの組合せからなる群から選択される、項目８から２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
動物宿主における寄生生物感染を検出するためのキットであって、
ｄ）反復性種特異的寄生生物標的ＤＮＡに対して相補的な標識されたＤＮＡ、
ｅ）捕捉ＤＮＡに結合する捕捉媒体、および
ｆ）前記寄生生物感染を検出するための書面による指示のセット
を含む、キット。
（項目２９）
前記寄生生物が、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓおよびＤ．ｒｅｐｅｎｓからなる群から選択される、項目２８に記載のキット。
（項目３０）
前記標識されたＤＮＡが、コンジュゲーション部分を含む、項目２８から２９のいずれか一項に記載のキット。
（項目３１）
前記コンジュゲーション部分がビオチンである、項目３０に記載のキット。
（項目３２）
前記捕捉媒体が、磁気ビーズ、テストストリップ、およびそれらの組合せからなる群から選択される、項目２８から３１のいずれか一項に記載のキット。
（項目３３）
前記捕捉媒体が、ストレプトアビジンでコーティングされている、項目２８から３２のいずれか一項に記載のキット。
（項目３４）
プライマーおよびプローブセットを含む、項目２８から３３のいずれか一項に記載のキット。
（項目３５）
前記寄生生物がＤ．ｉｍｍｉｔｉｓであり、前記標識されたＤＮＡが、配列番号３および配列番号４からなる捕捉オリゴヌクレオチドのセットである、項目２８から３４のいずれか一項に記載のキット。
（項目３６）
前記寄生生物がＤ．ｉｍｍｉｔｉｓであり、前記標的ＤＮＡがＤｉｍ１である、項目２８から３５のいずれか一項に記載のキット。
（項目３７）
前記寄生生物がＤ．ｉｍｍｉｔｉｓであり、前記プライマーおよびプローブセットが、ｐ１Ｄｉｍ１、ｐ２Ｄｉｍ１、ｐ３Ｄｉｍ１およびｐ４Ｄｉｍ１からなる群から選択される、項目３４に記載のキット。
（項目３８）
前記寄生生物がＤ．ｒｅｐｅｎｓであり、前記標識されたＤＮＡが、配列番号７および配列番号８からなる捕捉オリゴヌクレオチドのセットである、項目２８から３４のいずれか一項に記載のキット。
（項目３９）
前記寄生生物がＤ．ｒｅｐｅｎｓであり、前記標的ＤＮＡがＤｒｅ１である、項目２８から３４および３８のいずれか一項に記載のキット。
（項目４０）
前記寄生生物がＤ．ｒｅｐｅｎｓであり、前記プライマーおよびプローブセットが、ｐ１Ｄｒｅ１、ｐ２Ｄｒｅ１およびｐ３Ｄｒｅ１からなる群から選択される、項目３４に記載のキット。

Claims (40)

1. 動物宿主における寄生生物感染の診断のためのデバイスであって、サーモサイクラーを含むＰＣＲ測定装置を含み、前記ＰＣＲ測定装置が、感染した前記動物宿主から得られた組織試料中の前記寄生生物のＤＮＡ中の反復性配列を標的とするように構成されている、デバイス。
2. 前記寄生生物が、Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ ｉｍｍｉｔｉｓおよびＤｉｒｏｆｉｌａｒｉａ ｒｅｐｅｎｓからなる群から選択される、請求項１に記載のデバイス。
3. 前記反復性配列が、前記寄生生物に対する感度および選択性を提供するように選択されている、請求項１から２のいずれか一項に記載のデバイス。
4. 前記ＰＣＲ測定装置が、光学読み出し機構を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のデバイス。
5. 付随する前記光学読み出し機構が、目に見えるバンドを有するテストストリップを含む、請求項４に記載のデバイス。
6. 前記組織試料が、前記感染した動物宿主から得られた血漿、血清および全血からなる群から選択される、請求項１から５のいずれか一項に記載のデバイス。
7. 前記組織試料が、感染した蚊由来である、請求項１から６のいずれか一項に記載のデバイス。
8. 寄生生物に感染した疑いがある哺乳動物宿主を処置する方法であって、
   （ａ）前記寄生生物に感染した疑いがある前記哺乳動物宿主由来の試料を提供するステップ；ならびに
   （ｂ）前記試料中の前記寄生生物の存在の検出を引き起こすステップであって、前記検出が、
   （ｉ）前記試料からＤＮＡを利用可能にするステップ；
   （ｉｉ）前記試料を、標的ＤＮＡに対して相補的な標識されたＤＮＡと混合するステップ；および
   （ｉｉｉ）ＰＣＲを使用して前記標的ＤＮＡを検出するステップ
   を含む、ステップ
   を含み、
   前記寄生生物の存在が、検出を引き起こすステップの結果として検出された場合、前記哺乳動物宿主に、前記寄生生物感染を低減または排除するのに有効な処置を施行する、方法。
9. 前記標識されたＤＮＡが、
   ａ．前記標的ＤＮＡを同定するステップであって、前記標的ＤＮＡが、前記寄生生物によって独自に保有される反復性ＤＮＡであり、前記同定するステップが、
   ｉ．ゲノムＤＮＡ配列リードを前記寄生生物から得るステップ、
   ｉｉ．各配列リードをトリミングして、等しい長さのトリミングされた配列リードのリードセットを生成するステップ、
   ｉｉｉ．リード対を形成するために、前記リードセットの各配列を、前記リードセット中の全ての他の配列リードと比較するステップであって、所与の対の各リードが、その長さの少なくとも５５％にわたって、その対の他のリードと、少なくとも９０％の類似性を共有する、ステップ、
   ｉｖ．前記リード対を評価して、前記寄生生物のゲノム中の、前記ゲノム中に高いコピー数を推定上有する配列の候補セットを同定するステップ、および
   ｖ．配列の前記候補セットから、前記寄生生物によって独自に保有される最終配列を選択するステップ
   を含む、ステップ；ならびに
   ｂ．前記寄生生物によって独自に保有される前記最終配列を使用して、前記標識されたＤＮＡの合成を引き起こすステップ
   を含むプロセスを使用して作製されており、前記標識されたＤＮＡが、前記寄生生物によって独自に保有される同定された前記反復性ＤＮＡに対して相補的である、請求項８に記載の方法。
10. 前記寄生生物が、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓおよびＤ．ｒｅｐｅｎｓからなる群から選択される、請求項８から９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記寄生生物感染がパテントである、請求項１０に記載の方法。
12. 前記寄生生物感染がプレパテントである、請求項１０に記載の方法。
13. 前記組織試料が、感染した哺乳動物宿主から得られた血漿、血清および全血からなる群から選択される、請求項８から１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記哺乳動物宿主がイヌである、請求項８から１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記標識されたＤＮＡが、コンジュゲーション部分を含む、請求項８から１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記コンジュゲーション部分がビオチンである、請求項１５に記載の方法。
17. 前記標的ＤＮＡが、捕捉ＤＮＡに結合する捕捉媒体を使用して前記混合物から単離される、請求項８から１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 前記捕捉媒体が、磁気ビーズおよびテストストリップからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
19. 前記捕捉媒体が、ストレプトアビジンでコーティングされている、請求項１７から１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記ＰＣＲが、プライマーおよびプローブセットを使用するリアルタイムＰＣＲである、請求項８から１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 前記寄生生物がＤ．ｉｍｍｉｔｉｓであり、前記プライマーおよびプローブセットが、ｐ１Ｄｉｍ１、ｐ２Ｄｉｍ１およびｐ３Ｄｉｍ１からなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
22. 前記寄生生物がＤ．ｒｅｐｅｎｓであり、前記プライマーおよびプローブセットが、ｐ１Ｄｒｅ１、ｐ２Ｄｒｅ１およびｐ３Ｄｒｅ１からなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
23. 前記寄生生物がＤ．ｉｍｍｉｔｉｓであり、前記標的ＤＮＡがＤｉｍ１である、請求項８から２１のいずれか一項に記載の方法。
24. 前記寄生生物がＤ．ｉｍｍｉｔｉｓであり、前記標識されたＤＮＡが、配列番号３および配列番号４からなる捕捉オリゴヌクレオチドのセットである、請求項８から２１および２３のいずれか一項に記載の方法。
25. 前記寄生生物がＤ．ｒｅｐｅｎｓであり、前記標的ＤＮＡがＤｒｅ１である、請求項８から２０および２２のいずれか一項に記載の方法。
26. 前記寄生生物がＤ．ｒｅｐｅｎｓであり、前記標識されたＤＮＡが、配列番号７および配列番号８からなる捕捉オリゴヌクレオチドのセットである、請求項８から２０、２２および２５のいずれか一項に記載の方法。
27. 前記処置が、メラルソミン、イベルメクチン、ドキシサイクリン、モキシデクチン、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項８から２６のいずれか一項に記載の方法。
28. 動物宿主における寄生生物感染を検出するためのキットであって、
    ｄ）反復性種特異的寄生生物標的ＤＮＡに対して相補的な標識されたＤＮＡ、
    ｅ）捕捉ＤＮＡに結合する捕捉媒体、および
    ｆ）前記寄生生物感染を検出するための書面による指示のセット
    を含む、キット。
29. 前記寄生生物が、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓおよびＤ．ｒｅｐｅｎｓからなる群から選択される、請求項２８に記載のキット。
30. 前記標識されたＤＮＡが、コンジュゲーション部分を含む、請求項２８から２９のいずれか一項に記載のキット。
31. 前記コンジュゲーション部分がビオチンである、請求項３０に記載のキット。
32. 前記捕捉媒体が、磁気ビーズ、テストストリップ、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２８から３１のいずれか一項に記載のキット。
33. 前記捕捉媒体が、ストレプトアビジンでコーティングされている、請求項２８から３２のいずれか一項に記載のキット。
34. プライマーおよびプローブセットを含む、請求項２８から３３のいずれか一項に記載のキット。
35. 前記寄生生物がＤ．ｉｍｍｉｔｉｓであり、前記標識されたＤＮＡが、配列番号３および配列番号４からなる捕捉オリゴヌクレオチドのセットである、請求項２８から３４のいずれか一項に記載のキット。
36. 前記寄生生物がＤ．ｉｍｍｉｔｉｓであり、前記標的ＤＮＡがＤｉｍ１である、請求項２８から３５のいずれか一項に記載のキット。
37. 前記寄生生物がＤ．ｉｍｍｉｔｉｓであり、前記プライマーおよびプローブセットが、ｐ１Ｄｉｍ１、ｐ２Ｄｉｍ１、ｐ３Ｄｉｍ１およびｐ４Ｄｉｍ１からなる群から選択される、請求項３４に記載のキット。
38. 前記寄生生物がＤ．ｒｅｐｅｎｓであり、前記標識されたＤＮＡが、配列番号７および配列番号８からなる捕捉オリゴヌクレオチドのセットである、請求項２８から３４のいずれか一項に記載のキット。
39. 前記寄生生物がＤ．ｒｅｐｅｎｓであり、前記標的ＤＮＡがＤｒｅ１である、請求項２８から３４および３８のいずれか一項に記載のキット。
40. 前記寄生生物がＤ．ｒｅｐｅｎｓであり、前記プライマーおよびプローブセットが、ｐ１Ｄｒｅ１、ｐ２Ｄｒｅ１およびｐ３Ｄｒｅ１からなる群から選択される、請求項３４に記載のキット。

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