JP2022549133A

JP2022549133A - 細菌を保存するための方法および組成物

Info

Publication number: JP2022549133A
Application number: JP2022517288A
Authority: JP
Inventors: ミチョンスキー，スコット
Original assignee: Vedanta Biosciences Inc
Current assignee: Vedanta Biosciences Inc
Priority date: 2019-09-16
Filing date: 2020-09-15
Publication date: 2022-11-24
Also published as: EP4031154A4; AU2020350573A1; EP4031154A1; US20220389369A1; CA3151326A1; CN114980910A; WO2021055352A1

Abstract

本開示は、細菌の保存のための方法および組成物を提供する。本開示の側面は、保存された細菌性組成物を調製する方法であって、細菌性組成物を急速冷凍すること、および急速冷凍された細菌性組成物を凍結乾燥して、保存された細菌性組成物を生成することを含む、前記方法を提供する。いくつかの態様において、１以上の細菌株は、１以上の嫌気性細菌株を含む。いくつかの態様において、嫌気性細菌株は、偏性嫌気性細菌である。

Description

関連出願
本出願は、２０１９年９月１６日に出願の米国仮出願番号第６２／９０１，２０５号の米国特許法§１１９（ｅ）の下での利益を、主張する。参照された出願の全内容は、参照によって本明細書中に組み込まれる。
発明の分野
本開示は、細菌を保存するための方法および組成物を提供する。

背景
ヒト腸マイクロバイオームは多数の微生物を含む。これらの微生物の多くは嫌気性細菌である。ヒト腸マイクロバイオームに由来する嫌気性細菌を含む組成物は、ヒト疾患の処置において可能性を示している（例えば、Ａｔａｒａｓｈｉｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ５００，２３２，２０１３；Ａｔａｒａｓｈｉｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ１６３，１，２０１５；Ｍａｔｈｅｗｓｏｎｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１７，５０５，２０１６を参照）。嫌気性細菌は、それらの酸素に対する感受性のため、保存が困難である。したがって、嫌気性細菌を保存するための改良された組成物および方法が必要とされている。

概要
本開示の側面は、細菌性組成物を急速冷凍すること、および急速冷凍された細菌性組成物を凍結乾燥して、保存された細菌性組成物を生成することを含む、保存された細菌性組成物を調製する方法を提供する。いくつかの態様において、細菌性組成物は、１以上の細菌株を含む。いくつかの態様において、１以上の細菌株は、１以上の嫌気性細菌株を含む。いくつかの態様において、嫌気性細菌株は、偏性嫌気性細菌である。

いくつかの態様において、細菌性組成物は、クロストリジウム網に属する、１以上の細菌株を含む。いくつかの態様において、１以上の細菌株は、クロストリジウム科に属する。いくつかの態様において、細菌は、クロストリジウム属に属する、１以上の細菌株を含む。いくつかの態様において、細菌性組成物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｂｏｌｔｅａｅ、Ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓｃｏｌｉｈｏｍｉｎｉｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉａｕｍｆｉｓｓｉｃａｔｅｎａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｓｙｍｂｉｏｓｕｍ、Ｂｌａｕｔｉａｐｒｏｄｕｃｔａ、Ｄｏｒｅａｌｏｎｇｉｃａｔｅｎａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｉｎｎｏｃｕｕｍ、およびＦｌａｖｉｎｏｆｒａｃｔｏｒｐｌａｕｔｔｉからなる群から選択される、１以上の細菌株を含む。いくつかの態様において、細菌性組成物は、配列番号１～８からなる群から選択される核酸配列と少なくとも９７％の配列同一性を有する１６ＳｒＤＮＡ配列を含む１以上の細菌株を含む。

いくつかの態様において、方法は、さらに細菌性組成物を培養することを、含む。いくつかの態様において、細菌性組成物は、製剤緩衝液中で洗浄され、再懸濁される。いくつかの態様において、急速冷凍は、細菌性組成物を超冷却された表面と接触させることによって、遂行される。いくつかの態様において、急速冷凍は、細菌性組成物を液体窒素と接触させることによって、遂行される。

いくつかの態様において、細菌性組成物は、対称性の形状を有する。いくつかの態様において、対称性の形状は、対称性の冷凍した滴である。いくつかの態様において、保存された細菌性組成物は、－８０℃の温度に供される。

いくつかの態様において、凍結乾燥は、第１の乾燥ステップ、および第２の乾燥ステップを含む。いくつかの態様において、第１の乾燥ステップは、急速冷凍された細菌性組成物を、－１０℃の温度に、そして、７０ｍＴｏｒｒの圧力の下に供することを含む。いくつかの態様において、第２の乾燥ステップは、急速冷凍された細菌性組成物を、＋２０℃の温度に、そして、７０ｍＴｏｒｒの圧力の下に供することを含む。

いくつかの態様において、方法は、凍結乾燥した後に、保存された細菌性組成物のバイアビリティのレベルを決定することをさらに含む。いくつかの態様において、保存された細菌性組成物のバイアビリティのレベルは、一定期間にわたって、細菌のコロニー形成単位の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、または少なくとも４０％である。いくつかの態様において、一定期間は、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも４週間、少なくとも２ヶ月間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、または少なくとも１年間以上である。
本発明のこれらおよび他の側面、ならびにその様々な態様は、本発明の図面および詳細な説明を参照することで、より明らかになるであろう。

本発明の各限定は、本発明の様々な態様を包含し得る。したがって、任意の１つの要素または要素の組み合わせを含む本発明の各限定は、本発明の各側面に含まれ得ることが想定される。本発明は、その適用において、以下の説明に記載されているかまたは図面に示されている構成の詳細および構成要素の配置に限定されない。本発明は他の態様が可能であり、様々な方法で実施または実行することができる。

図面の簡単な説明
添付の図面は、一定の縮尺で描かれることを意図されていない。図面は例示的なものにすぎず、本開示を可能にするために必要なものではない。明確にする目的で、すべての構成要素が、図面において標識されてもよいというわけではない。図面において：
図１は、指示された細菌株の凍結乾燥後バイアビリティを示す。パーセント凍結乾燥後バイアビリティ（ｙ軸上の％バイアビリティ）は、細菌培養の収穫に続いて数え上げられたコロニー形成単位に対する、凍結乾燥に続いて数え上げられたコロニー形成単位に基づいて、算出される。それぞれの指示された細菌株に関して、左カラムは、凍結乾燥に先立つ標準冷凍プロセス（すなわち、凍結乾燥トレイ）に続くバイアビリティに対応し、右カラムは、本明細書中に記載の急速冷凍滴、および凍結乾燥方法に続くバイアビリティに対応する。

詳細な説明
嫌気性細菌を含む細菌組成物の保存は困難である。細菌は冷凍してプレート上または溶液中で再増殖することができるが、この方法の標準化は困難であった。治療目的に使用できる細菌を保存する必要性がある。冷凍保存および凍結乾燥などの保存方法は、好気性細菌に関して十分に確立されており、保存方法での好気性細菌の生存および回収に影響する多くの要因が理解されている（Ｐｒａｋａｓｈｅｔａｌ．ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌＬｅｔｔ（２０１３）３３９：１－９）。生存細菌に依存する細菌生成物に関して、保存プロセスに続く細菌のバイアビリティのレベルを増強することは、かかる生成物の生成と関連するコストを、削減する可能性を有する。ヒト腸マイクロバイオームから得られた嫌気性細菌株などの細菌が、ヒト疾患の処置において可能性を示していることを考えると、高レベルの細菌回収を可能にする、細菌を保存するための改善された方法が必要とされる。

細菌性組成物を保存する方法であって、細菌性組成物を急速冷凍すること、および急速冷凍された細菌性組成物を凍結乾燥して、保存された細菌性組成物を生成することを含む、前記方法が、本明細書中に記載されている。冷凍させ、急速冷凍された細菌性組成物を保管する能力は、保存プロセスにより大きな柔軟性を可能にする。いくつかの態様において、本明細書中に記載の方法は、嫌気性細菌の保存のために使用される。

本発明は、その適用において、以下の説明に記載されているかまたは図面に示されている構成の詳細および構成要素の配置に限定されない。本発明は他の態様が可能であり、様々な方法で実施または実行することができる。また、本明細書で使用されている表現および用語は説明を目的としており、限定と見なされるべきではない。本明細書における「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、または「有する」、「含有する」、「含む（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、およびそれらの変形の使用は、その後に列挙される項目およびその等価物、ならびに追加の項目を包含することを意味する。

本明細書で提供されるのは、細菌を保存するための組成物および方法である。
一側面において、本明細書で提供される方法は、細菌性組成物の保存を可能にする。いくつかの態様において、本明細書中に記載の方法は、嫌気性細菌の保存のために使用される。組成物は、バイアビリティの損失を最小限に抑えながら、細菌が凍結乾燥サイクルを通過することを可能にする。いくつかの態様において、細菌性組成物は、細菌を含む。いくつかの態様において、細菌性組成物は１以上の細菌株を含む。いくつかの態様において、細菌性組成物は、単一の細菌株を含む。いくつかの態様において、細菌性組成物は、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、または少なくとも８つ以上の細菌株（例として、精製された細菌株）を含む。
いくつかの態様において、細菌性組成物は、１以上の嫌気性細菌株（例として、偏性嫌気性細菌）を含む。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、嫌気性細菌は偏性嫌気性細菌である。

いくつかの態様において、細菌性組成物は、クロストリジウム網に属する、１以上の細菌株を含む。いくつかの態様において、１以上の細菌株は、クロストリジウム科からである。いくつかの態様において、細菌は、クロストリジウム属からである。いくつかの態様において、細菌は、クロストリジウム属クラスターＩＶ、ＸＩＶａ、ＸＶＩ、ＸＶＩＩ、またはＸＶＩＩに属する。いくつかの態様において、細菌は、クロストリジウム属クラスターＩＶ、ＸＩＶａ、またはＸＶＩＩに属する。いくつかの態様において、細菌は、クロストリジウム属クラスターＩＶ、またはＸＩＶａに属する。
いくつかの態様において、細菌性組成物は、以下の細菌株の１以上を含む：Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｂｏｌｔｅａｅ、Ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓｃｏｌｉｈｏｍｉｎｉｓ、Ｓｅｌｌｉｍｏｎａｓｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｓｙｍｂｉｏｓｕｍ、Ｂｌａｕｔｉａｐｒｏｄｕｃｔａ、Ｄｏｒｅａｌｏｎｇｉｃａｔｅｎａ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、およびＦｌａｖｉｎｏｆｒａｃｔｏｒｐｌａｕｔｉｉ。細菌株であるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｂｏｌｔｅａｅ、Ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓｃｏｌｉｈｏｍｉｎｉｓ、Ｓｅｌｌｉｍｏｎａｓｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｓｙｍｂｉｏｓｕｍ、Ｂｌａｕｔｉａｐｒｏｄｕｃｔａ、Ｄｏｒｅａｌｏｎｇｉｃａｔｅｎａ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、およびＦｌａｖｉｎｏｆｒａｃｔｏｒｐｌａｕｔｉｉは、実例として、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１７／２１８６８０に記載され、それは、その全体において、参照によって組み込まれる。株は、表１でも描かれる。例として、表１に描かれるとおり、代用の株名が、同様に使用されてもよいことが、理解されるべきである。

いくつかの態様において、細菌性組成物は、以下の細菌株の１以上を含む：Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｂｏｌｔｅａｅ９０Ａ９、ＡｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓｃｏｌｉｈｏｍｉｎｉｓＤＳＭ１７２４１、Ｓｅｌｌｉｍｏｎａｓｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｂｏｌｔｅａｅ、Ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓｃｏｌｉｈｏｍｉｎｉｓ、Ｓｅｌｌｉｍｏｎａｓｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｓｙｍｂｉｏｓｕｍ、Ｂｌａｕｔｉａｐｒｏｄｕｃｔａ、Ｄｏｒｅａｌｏｎｇｉｃａｔｅｎａ、ＥｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍおよびＦｌａｖｉｎｏｆｒａｃｔｏｒｐｌａｕｔｉｉ。

いくつかの態様において、細菌性組成物は、以下の細菌株の２以上（例として、２、３、４、５、６、７、または８）を含む：Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｂｏｌｔｅａｅ、Ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓｃｏｌｉｈｏｍｉｎｉｓ、Ｓｅｌｌｉｍｏｎａｓｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｓｙｍｂｉｏｓｕｍ、Ｂｌａｕｔｉａｐｒｏｄｕｃｔａ、Ｄｏｒｅａｌｏｎｇｉｃａｔｅｎａ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、およびＦｌａｖｉｎｏｆｒａｃｔｏｒｐｌａｕｔｉｉ。いくつかの態様において、細菌性組成物はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｂｏｌｔｅａｅを含む。

いくつかの態様において、細菌性組成物はＡｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓｃｏｌｉｈｏｍｉｎｉｓを含む。いくつかの態様において、細菌性組成物はＳｅｌｌｉｍｏｎａｓｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓを含む。いくつかの態様において、細菌性組成物はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｓｙｍｂｉｏｓｕｍを含む。いくつかの態様において、細菌性組成物はＢｌａｕｔｉａｐｒｏｄｕｃｔａを含む。

いくつかの態様において、細菌性組成物はＤｏｒｅａｌｏｎｇｉｃａｔｅｎａを含む。いくつかの態様において、細菌性組成物はＥｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍを含む。いくつかの態様において、細菌性組成物はＦｌａｖｉｎｏｆｒａｃｔｏｒｐｌａｕｔｉｉを含む。

一側面において、本明細書に（例として、例に）示されるように、本明細書に提供される方法は、嫌気性細菌株の保存を可能にする。本発明の方法において使用することができる嫌気性株は、実例としてＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１３／０８０５６１、ＷＯ２０１５／１５６４１９、ＷＯ２０１８／１１７２６３、ＷＯ２０１７／２１８６８０、ＷＯ２０１９／０９４８３７、およびＷＯ２０１９／１１８５１５中に記載されるなどの、治療コンソーシアムにおいて使用される細菌株を含む。一側面において、本明細書に（例として、例に）示されるように、本明細書中に提供される方法は、クロストリジウム属クラスターＩＶ、ＸＩＶａ、またはＸＶＩＩに属する嫌気性細菌株の保存を可能にする。一側面において、本明細書に（例として、例に）に示されるように、本明細書に提供される方法は、嫌気性細菌株であるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｂｏｌｔｅａｅ、Ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓｃｏｌｉｈｏｍｉｎｉｓ、Ｓｅｌｌｉｍｏｎａｓｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｓｙｍｂｉｏｓｕｍ、Ｂｌａｕｔｉａｐｒｏｄｕｃｔａ、Ｄｏｒｅａｌｏｎｇｉｃａｔｅｎａ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、およびＦｌａｖｉｎｏｆｒａｃｔｏｒｐｌａｕｔｉｉの保存を可能にする。例示的な細菌株はまた、それらの１６ｓｒＲＮＡ配列（配列番号１～８）によって同定され得る。それらの配列による細菌の同定はさらに、例示された細菌と同一または非常に類似しているさらなる細菌株の同定を可能にする。例えば、細菌株の１６ｓｒＲＮＡ配列を用いて、全ゲノム配列決定を通して、これらの配列を１６Ｓデータベースと比較することにより、（パーセント同一性に基づいて）最も近い類縁（ｒｅｌａｔｉｖｅ）を同定した（表１）。

加えて、全部のゲノム配列決定および全部のゲノムを全部のゲノムデータベースと比較することに基づいて、配列番号１～８のより提供される１６ＳのｒＲＮＡ配列を有する細菌株は、以下の細菌種にもっとも密接に関連する：Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｂｏｌｔｅａｅ９０Ａ９、ＡｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓｃｏｌｉｈｏｍｉｎｉｓＤＳＭ１７２４１、ＤｒａｃｏｕｒｔｅｌｌａｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓＧＤ１、ＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｓｙｍｂｉｏｓｕｍＷＡＬ－１４１６３、ＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｂａｃｔｅｒｉｕｍＵＣ５．１－１Ｄ４、ＤｏｒｅａｌｏｎｇｉｃａｔｅｎａＣＡＧ：４２、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ２１＿３、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｏｒｂｉｓｃｉｎｄｅｎｓ１＿３＿５０ＡＦＡＡ（例として、表１を参照）。したがって、一側面において、表１の各列において、細菌株は非常に類似しているか、および／または同一であることを理解されたい。いくつかの態様において、本開示の文脈において、表１の列内の細菌株の名称は、互換的に使用され得る。

本開示の側面は、本明細書に記載の細菌株または種の配列のいずれか１つの核酸配列に対して配列同一性を有する１６ＳｒＤＮＡ配列を有する、細菌株に関する。２つ以上の核酸またはアミノ酸配列の文脈における用語「同一の」、およびパーセント「同一性」は、同一である２つ以上の配列または部分配列を指す。２つの配列が「実質的に同一」であるとは、比較ウィンドウ上または指定領域で最大の一致が得られるように比較および整列され、以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用して測定されるか、もしくは手動アラインメントおよび目視検査によって測定された場合に、核酸またはアミノ酸配列の特定の領域または配列全体にわたって同じであるアミノ酸残基またはヌクレオチドの特定のパーセンテージを有する（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、または９９．９％の配列同一性）場合を指す。

任意に、同一性は、少なくとも約５０ヌクレオチド長の領域にわたって、より好ましくは１００～５００または１０００以上のヌクレオチド長の領域にわたって存在する。いくつかの態様において、同一性は、１６ＳｒＲＮＡまたは１６ＳｒＤＮＡ配列の長さにわたって存在する。

いくつかの態様において、細菌性組成物は、特定された領域にわたって、または、全配列にわたって本明細書中に記載の株または細菌種のいずれか１つに対して、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％または最高１００％の配列同一性を有する１以上の細菌性株を含む。当業者には、２つ以上の核酸配列またはアミノ酸配列の文脈における用語「配列同一性」または「パーセント同一性」とは、２つ以上の配列またはその一部の間の類似性の尺度を指すことが、理解されるであろう。

いくつかの態様において、細菌性組成物は１以上の細菌株を含み、ここで該１以上の細菌株は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号８の核酸配列と少なくとも９７％の配列同一性を有する１以上の１６ｓｒＤＮＡ配列を含む。いくつかの態様において、細菌性組成物は１つの細菌株を含み、ここで該細菌株は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号８の核酸配列と少なくとも９７％の配列同一性を有する１以上の１６ｓｒＤＮＡ配列を含む。いくつかの態様において、細菌性組成物は１つの細菌株を含み、ここで該細菌株は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号８の核酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、または最大１００％の配列同一性を有する１以上の１６ｓｒＤＮＡ配列を含む。

いくつかの態様において、細菌性組成物は１つの細菌株を含み、ここで該細菌株は、配列番号１の核酸配列と少なくとも９７％の配列同一性を有する１以上の１６ｓｒＤＮＡ配列を含む。いくつかの態様において、細菌性組成物は１つの細菌株を含み、ここで該細菌株は、配列番号２の核酸配列と少なくとも９７％の配列同性を有する１以上の１６ｓｒＤＮＡ配列を含む。いくつかの態様において、細菌性組成物は１つの細菌株を含み、ここで該細菌株は、配列番号３の核酸配列と少なくとも９７％の配列同性を有する１以上の１６ｓｒＤＮＡ配列を含む。いくつかの態様において、細菌性組成物は１つの細菌株を含み、ここで該細菌株は、配列番号４の核酸配列と少なくとも９７％の配列同性を有する１以上の１６ｓｒＤＮＡ配列を含む。いくつかの態様において、細菌性組成物は１つの細菌株を含み、ここで該細菌株は、配列番号５の核酸配列と少なくとも９７％の配列同性を有する１以上の１６ｓｒＤＮＡ配列を含む。いくつかの態様において、細菌性組成物は１つの細菌株を含み、ここで該細菌株は、配列番号６の核酸配列と少なくとも９７％の配列同性を有する１以上の１６ｓｒＤＮＡ配列を含む。いくつかの態様において、細菌性組成物は１つの細菌株を含み、ここで該細菌株は、配列番号７の核酸配列と少なくとも９７％の配列同性を有する１以上の１６ｓｒＤＮＡ配列を含む。

いくつかの態様において、細菌性組成物は１つの細菌株を含み、ここで該細菌株は、配列番号８の核酸配列と少なくとも９７％の配列同性を有する１以上の１６ｓｒＤＮＡ配列を含む。

追加的にまたは代替的に、２つ以上の配列が、配列間のアラインメントについて評価されてもよい。２つ以上の核酸またはアミノ酸配列の文脈における用語「アラインメント」またはパーセント「アラインメント」は、同一である２つ以上の配列または部分配列を指す。２つの配列が「実質的に整列（アラインメント）されている」とは、比較ウィンドウ上または指定領域で最大の一致が得られるように比較および整列され、以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用して測定されるか、もしくは手動アラインメントおよび目視検査によって測定された場合に、核酸またはアミノ酸配列の特定の領域または配列全体にわたって同じであるアミノ酸残基またはヌクレオチドの特定のパーセンテージを有する（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、または９９．９％同一）場合を指す。任意に、アラインメントは、少なくとも約５０ヌクレオチド長の領域にわたって、より好ましくは１００～５００または１０００以上のヌクレオチド長の領域にわたって存在する。いくつかの態様において、同一性は、１６ＳｒＲＮＡまたは１６ＳｒＤＮＡ配列の長さにわたって存在する。

配列比較については、典型的には１つの配列が参照配列として作用し、それに対して試験配列が比較される。比較のために配列をアラインメントさせる方法は、当技術分野においてよく知られている。例えば、以下による：ＳｍｉｔｈａｎｄＷａｔｅｒｍａｎ（１９７０）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２ｃの局所相同性アルゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎａｎｄＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９７０）４８：４４３の相同性アラインメントアルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎａｎｄＬｉｐｍａｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９８）８５：２４４４の類似方法の検索、これらアルゴリズムのコンピュータ化された実施（ＷｉｓｃｏｎｓｉｎＧｅｎｅｔｉｃｓＳｏｆｔｗａｒｅＰａｃｋａｇｅ，ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ．Ｍａｄｉｓｏｎ．ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）、または手動アラインメントおよび目視検査（例えば、Ｂｒｅｎｔｅｔａｌ．，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（Ｒｉｎｇｂｏｕｅｄ．，２００３）を参照）。パーセント配列同一性および配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの２つの例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらはそれぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．，Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．（１９７７）２５：３３８９－３４０２およびＡｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９０）２１５：４０３－４１０に記載されている。
本明細書で使用される「細菌」および「細菌株」という用語は、交換可能であることが理解されるべきである。

本明細書に使用されるとき、用語「単離された」は、別のバクテリアまたは細菌株、生育培地の１以上の成分、および／またはふん便試料などの試料の１以上の成分などの、１以上の望ましくない成分から分離された細菌または細菌株を指す。いくつかの態様において、細菌は、供給源の他の成分が検出されないように、実質的に供給源から単離される。

いくつかの態様において、細菌株は、単一コロニーから増殖する。いくつかの態様において、細菌株は、精製細菌株である。本明細書で使用される場合、用語「精製された」とは、汚染物質などの１以上の成分から分離されたものを含む細菌株または組成物を指す。いくつかの態様において、細菌株は、汚染物質を実質的に含まない。いくつかの態様において、組成物の１以上の細菌株は、培養物中または細菌株を含有する試料中に生成されおよび／または存在する１以上の他の細菌または細菌株から独立して、精製され得る。いくつかの態様において、細菌株は、試料から単離または精製され、次いで細菌複製に適した条件下、例えば嫌気性培養条件下で培養される。細菌の複製に適した条件下で増殖した細菌は、その後、それが増殖している培養物から単離／精製することができる。

組成物の細菌株は、当技術分野において知られている発酵技術を用いて製造することができる。いくつかの態様において、活性成分は、嫌気性細菌株の急速な増殖を支援することができる、嫌気性発酵槽を使用して製造される。

嫌気性発酵槽は、例えば、撹拌槽型反応器または使い捨てウェーブバイオリアクターであり得る。ＢＬ培地およびＥＧ培地などの培地、または動物成分を含まないこれらの培地の類似のバージョンを用いて、細菌種の増殖を支援することができる。

いくつかの態様において、細菌性組成物は、急速冷凍に先立ち、所望の成長相に成長される。いくつかの態様において、細菌性組成物は、急速冷凍に先立ち、所望の細胞密度に成長される。いくつかの態様において、細胞密度は、細菌株の所望の光学密度（例として、ＯＤ_６００）である。

細菌生成物は、遠心分離および濾過などの伝統的な技法によって、発酵ブロスから精製および濃縮することができる。一般に、細菌は、細菌性組成物を急速冷凍に供するのに先立って、ペレット化される。いくつかの態様において、細菌性組成物は、急速冷凍に先立って、洗浄される。本明細書に使用されるとき、用語「洗浄」または「洗浄すること」は、細菌性細胞を単離して、残留する望ましくない成分（例として、細胞破壊片、生育培地の成分）を取り除くための連続のステップを指す。いくつかの態様において、方法は、細菌細胞を培養物（例えば、生育培地）から単離し、洗浄緩衝液中に、単離された細菌細胞を再懸濁して、そして、細菌性細胞を、遠心分離およびろ過などの伝統的な技法によって、洗浄緩衝液から単離することに関わる。いくつかの態様において、単離された細菌細胞は、製剤緩衝液中に再懸濁される。いくつかの態様において、方法は、細菌性組成物を洗浄して、製剤緩衝液中に細菌性組成物を再懸濁することに関わる。

いくつかの態様において、製剤緩衝液は、凍結保護剤、栄養素、緩衝液、および酸化防止剤を含む。製剤緩衝液の例は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１８／０８１５５０中に記載されており、それは、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの態様において、本開示は、凍結防止剤、栄養素、抗酸化剤、および緩衝液を含む組成物を提供する。いくつかの態様において、製剤緩衝液は、スクロース、酵母抽出物、Ｌ‐システイン、ヒスチジン、および塩化マグネシウムを含む。いくつかの態様において、製剤緩衝液は、７％のスクロース、０．１％の酵母抽出物、０．０５％のＬ‐システイン、２０ｍＭのヒスチジン、および０．０１％の塩化マグネシウムを含む。いくつかの態様において、製剤緩衝液は、メタ重亜硫酸ナトリウムを含有する。いくつかの態様において、製剤緩衝液は、０．０５％のメタ重亜硫酸ナトリウムを含有する。

いくつかの態様において、本明細書中に開示の細菌性組成物は、約１０、約１０^２、約１０^３、約１０^４、約１０^５、約１０^６、約１０^７、約１０^８、約１０^９、約１０^１０、約１０^１１、約１０^１２、約１０^１３またはそれ以上の細菌を含む。いくつかの態様において、本明細書中に開示の細菌性組成物は、１ミリリットルあたり、約１０、約１０^２、約１０^３、約１０^４、約１０^５、約１０^６、約１０^７、約１０^８、約１０^９、約１０^１０、約１０^１１、約１０^１２、約１０^１３またはそれ以上の細菌を含む。いくつかの細菌は生存可能ではない場合があることが、理解されるべきである。いくつかの態様において、本明細書中に開示の細菌性組成物は、約１０、約１０^２、約１０^３、約１０^４、約１０^５、約１０^６、約１０^７、約１０^８、約１０^９、約１０^１０、約１０^１１、約１０^１２、約１０^１３またはそれ以上のコロニー形成単位（ｃｆｕ）の細菌を含む。いくつかの態様において、本明細書に開示の細菌性組成物は、１ミリリットルあたり、約１０、約１０^２、約１０^３、約１０^４、約１０^５、約１０^６、約１０^７、約１０^８、約１０^９、約１０^１０、約１０^１１、約１０^１２、約１０^１３またはそれ以上のコロニー形成単位（ｃｆｕ）の細菌を含む。

いくつかの態様において、本明細書に開示の細菌性組成物は、１０～１０^１３、１０^２～１０^１３、１０^３～１０^１３、１０^４～１０^１３、１０^５～１０^１３、１０^６～１０^１３、１０^７～１０^１３、１０^８～１０^１３、１０^９～１０^１３、１０^１０～１０^１３、１０^１１～１０^１３、１０^１２～１０^１３、１０～１０^１２、１０^２～１０^１２、１０^３～１０^１２、１０^４～１０^１２、１０^５～１０^１２、１０^６～１０^１２、１０^７～１０^１２、１０^８～１０^１２、１０^９～１０^１２、１０^１０～１０^１２、１０^１１～１０^１２、１０～１０^１１、１０^２～１０^１１、１０^３～１０^１３、１０^４～１０^１３、１０^５～１０^１３、１０^６～１０^１３、１０^７～１０^１１、１０^８～１０^１１、１０^９～１０^１１、１０^１０～１０^１１、１０～１０^１０、１０^２～１０^１０、１０^３～１０^１０、１０^４～１０^１０、１０^５～１０^１０、１０^６～１０^１０、１０^７～１０^１０、１０^８～１０^１０、１０^９～１０^１０、１０～１０^９、１０^２～１０^９、１０^３～１０^９、１０^４～１０^９、１０^５～１０^９、１０^６～１０^９、１０^７～１０^９、１０^８～１０^９、１０～１０^８、１０^２～１０^８、１０^３～１０^８、１０^４～１０^８、１０^５～１０^８、１０^６～１０^８、１０^７～１０^８、１０～１０^７、１０^２～１０^７、１０^３～１０^７、１０^４～１０^７、１０^５～１０^７、１０^６～１０^７、１０～１０^６、１０^２～１０^６、１０^３～１０^６、１０^４～１０^６、１０^５～１０^６、１０～１０^５、１０^２～１０^５、１０^３～１０^５、１０^４～１０^５、１０～１０^４、１０^２～１０^４、１０^３～１０^４、１０～１０^３、１０^２～１０^３、または、１０～１０^２の間となる細菌を含有する。いくつかの態様において、本明細書に開示の組成物は、１０～１０^１３、１０^２～１０^１３、１０^３～１０^１３、１０^４～１０^１３、１０^５～１０^１３、１０^６～１０^１３、１０^７～１０^１３、１０^８～１０^１３、１０^９～１０^１３、１０^１０～１０^１３、１０^１１～１０^１３、１０^１２～１０^１３、１０～１０^１２、１０^２～１０^１２、１０^３～１０^１２、１０^４～１０^１２、１０^５～１０^１２、１０^６～１０^１２、１０^７～１０^１２、１０^８～１０^１２、１０^９～１０^１２、１０^１０～１０^１２、１０^１１～１０^１２、１０～１０^１１、１０^２～１０^１１、１０^３～１０^１３、１０^４～１０^１３、１０^５～１０^１３、１０^６～１０^１３、１０^７～１０^１１、１０^８～１０^１１、１０^９～１０^１１、１０^１０～１０^１１、１０～１０^１０、１０^２～１０^１０、１０^３～１０^１０、１０^４～１０^１０、１０^５～１０^１０、１０^６～１０^１０、１０^７～１０^１０、１０^８～１０^１０、１０^９～１０^１０、１０～１０^９、１０^２～１０^９、１０^３～１０^９、１０^４～１０^９、１０^５～１０^９、１０^６～１０^９、１０^７～１０^９、１０^８～１０^９、１０～１０^８、１０^２～１０^８、１０^３～１０^８、１０^４～１０^８、１０^５～１０^８、１０^６～１０^８、１０^７～１０^８、１０～１０^７、１０^２～１０^７、１０^３～１０^７、１０^４～１０^７、１０^５～１０^７、１０^６～１０^７、１０～１０^６、１０^２～１０^６、１０^３～１０^６、１０^４～１０^６、１０^５～１０^６、１０～１０^５、１０^２～１０^５、１０^３～１０^５、１０^４～１０^５、１０～１０^４、１０^２～１０^４、１０^３～１０^４、１０～１０^３、１０^２～１０^３、または、１０～１０^２の間となる、ミリリットル当たりの細菌を含有する。

いくつかの態様において、本明細書に開示の細菌性組成物は、１０～１０^１３、１０^２～１０^１３、１０^３～１０^１３、１０^４～１０^１３、１０^５～１０^１３、１０^６～１０^１３、１０^７～１０^１３、１０^８～１０^１３、１０^９～１０^１３、１０^１０～１０^１３、１０^１１～１０^１３、１０^１２～１０^１３、１０～１０^１２、１０^２～１０^１２、１０^３～１０^１２、１０^４～１０^１２、１０^５～１０^１２、１０^６～１０^１２、１０^７～１０^１２、１０^８～１０^１２、１０^９～１０^１２、１０^１０～１０^１２、１０^１１～１０^１２、１０～１０^１１、１０^２～１０^１１、１０^３～１０^１３、１０^４～１０^１３、１０^５～１０^１３、１０^６～１０^１３、１０^７～１０^１１、１０^８～１０^１１、１０^９～１０^１１、１０^１０～１０^１１、１０～１０^１０、１０^２～１０^１０、１０^３～１０^１０、１０^４～１０^１０、１０^５～１０^１０、１０^６～１０^１０、１０^７～１０^１０、１０^８～１０^１０、１０^９～１０^１０、１０～１０^９、１０^２～１０^９、１０^３～１０^９、１０^４～１０^９、１０^５～１０^９、１０^６～１０^９、１０^７～１０^９、１０^８～１０^９、１０～１０^８、１０^２～１０^８、１０^３～１０^８、１０^４～１０^８、１０^５～１０^８、１０^６～１０^８、１０^７～１０^８、１０～１０^７、１０^２～１０^７、１０^３～１０^７、１０^４～１０^７、１０^５～１０^７、１０^６～１０^７、１０～１０^６、１０^２～１０^６、１０^３～１０^６、１０^４～１０^６、１０^５～１０^６、１０～１０^５、１０^２～１０^５、１０^３～１０^５、１０^４～１０^５、１０～１０^４、１０^２～１０^４、１０^３～１０^４、１０～１０^３、１０^２～１０^３、または、１０～１０^２の間となる、細菌のコロニー形成単位を含有する。いくつかの態様において、本明細書に開示の組成物は、１０～１０^１３、１０^２～１０^１３、１０^３～１０^１３、１０^４～１０^１３、１０^５～１０^１３、１０^６～１０^１３、１０^７～１０^１３、１０^８～１０^１３、１０^９～１０^１３、１０^１０～１０^１３、１０^１１～１０^１３、１０^１２～１０^１３、１０～１０^１２、１０^２～１０^１２、１０^３～１０^１２、１０^４～１０^１２、１０^５～１０^１２、１０^６～１０^１２、１０^７～１０^１２、１０^８～１０^１２、１０^９～１０^１２、１０^１０～１０^１２、１０^１１～１０^１２、１０～１０^１１、１０^２～１０^１１、１０^３～１０^１３、１０^４～１０^１３、１０^５～１０^１３、１０^６～１０^１３、１０^７～１０^１１、１０^８～１０^１１、１０^９～１０^１１、１０^１０～１０^１１、１０～１０^１０、１０^２～１０^１０、１０^３～１０^１０、１０^４～１０^１０、１０^５～１０^１０、１０^６～１０^１０、１０^７～１０^１０、１０^８～１０^１０、１０^９～１０^１０、１０～１０^９、１０^２～１０^９、１０^３～１０^９、１０^４～１０^９、１０^５～１０^９、１０^６～１０^９、１０^７～１０^９、１０^８～１０^９、１０～１０^８、１０^２～１０^８、１０^３～１０^８、１０^４～１０^８、１０^５～１０^８、１０^６～１０^８、１０^７～１０^８、１０～１０^７、１０^２～１０^７、１０^３～１０^７、１０^４～１０^７、１０^５～１０^７、１０^６～１０^７、１０～１０^６、１０^２～１０^６、１０^３～１０^６、１０^４～１０^６、１０^５～１０^６、１０～１０^５、１０^２～１０^５、１０^３～１０^５、１０^４～１０^５、１０～１０^４、１０^２～１０^４、１０^３～１０^４、１０～１０^３、１０^２～１０^３、または、１０～１０^２の間となる、ミリリットル当たりの細菌のコロニー形成単位を含有する。
本明細書に提供の細菌性組成物のいくつかの態様において、組成物は、１ミリリットル当たり少なくとも１×１０^８コロニー形成単位の細菌を含む。

本明細書に記載される方法は、細菌性組成物を急速冷凍させることに関わる。本明細書に使用されるとき、「スナップフリージング」としても知られる用語「急速冷凍」は、細菌性組成物の温度が、例えば液体窒素またはドライアイスを使用して、迅速に－７０℃未満の温度まで下げられることによるプロセスを指す。いくつかの態様において、急速冷凍は、細菌性組成物を超冷却された表面と接触させることに関わる。いくつかの態様において、急速冷凍は、液体窒素またはドライアイスを含有する容器と細菌性組成物を接触させることに関わる。いくつかの態様において、急速冷凍は、液体窒素と細菌性組成物を接触させることに関わる。いくつかの態様において、細菌性組成物は、滴を形成する液体窒素に適用される。いくつかの態様において、細菌性組成物の滴は、液体窒素から収集される。いくつかの態様において、細菌性組成物の滴は、液体窒素から収集されて、凍結乾燥のための容器（例として、凍結乾燥バイアル）に移動される。

細菌株を含む組成物は、凍結乾燥して細菌株を保存することができる。いくつかの態様において、組成物または組成物の細菌株は、凍結乾燥されている。細菌を含む組成物などの組成物を凍結乾燥する方法は、当技術分野において知られている。例として、米国特許第３，２６１，７６１号；米国特許第４，２０５，１３２号；ＰＣＴ公報ＷＯ２０１４／０２９５７８、ＷＯ２０１２／０９８３５８、ＷＯ２０１２／０７６６６５およびＷＯ２０１２／０８８２６１を参照；これらはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。

しかしながら、嫌気性細菌などの特定の細菌の凍結乾燥を可能にする条件を見出すことは挑戦的である。例えば、Ｐｅｉｒｅｎｅｔａｌ．，ＡｐｐｌＭｉｃｒｏｂｏｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２０１５）９９：３５５９を参照。一側面において、本明細書に提供される安定化および保存の方法は、細菌株、特に嫌気性細菌株の製造を可能にする組成物を生成する能力を許容することが、理解されるべきである。本明細書中に記載の方法は、凍結乾燥された細菌性組成物の増大したバイアビリティをもたらす。

本開示の側面は、保存された細菌性組成物を調製する方法であって、細菌性組成物を急速冷凍すること、および急速冷凍された細菌性組成物を凍結乾燥して、保存された細菌性組成物を生成することに関わる、前記方法を提供する。一般に凍結乾燥は、細菌などの材料を保存するための乾燥（ｄｅｓｉｃｃａｔｉｏｎ）プロセスであり、フリーズドライに関わる。材料を冷凍し、次いで材料を真空下に置くことによって、材料から水を除去し、その間に氷は昇華する。いくつかの態様において、凍結乾燥サイクルは、凍結、一次乾燥、および二次乾燥のステップを含む。用語「温度勾配速度」とは、凍結乾燥サイクルのステップ間で、温度が調節される速度を指す。

いくつかの態様において、凍結乾燥サイクルは、第１の乾燥ステップおよび第２の乾燥ステップを含み、それぞれは、細菌性組成物を所望の温度および圧力に供することに関わる。

いくつかの態様において、第１の乾燥ステップは、急速冷凍された細菌性組成物を約－３０℃～＋１０℃、－２０℃～０℃、の－１５℃～－５℃、または－１２℃～－７℃の温度に供することを含む。いくつかの態様において、第１の乾燥ステップは、急速冷凍された細菌性組成物を、約－３０℃、－２９℃、－２８℃、－２７℃、－２６℃、－２５℃、－２４℃、－２３℃、－２２℃、－２１℃、－２０℃、－１９℃、－１８℃、－１６℃、－１７℃、－１４℃、－１５℃、－１３℃、－１２℃、－１１℃、－１０℃、－９℃、－８℃、－７℃、－６℃、－５℃、－４℃、－３℃、－２℃、－１℃、０℃、＋１℃、＋２℃、＋３℃、＋４℃、＋５℃、＋６℃、＋７℃、＋８℃、＋９℃、または＋１０℃の温度に供することを含む。いくつかの態様において、第１の乾燥ステップは、急速冷凍された細菌性組成物を、約－１０℃の温度に、供することを含む。

いくつかの態様において、第１の乾燥ステップは、急速冷凍された細菌性組成物を、約５０ｍＴｏｒｒ～９０のｍＴｏｒｒ、６０ｍＴｏｒｒ～８０ｍＴｏｒｒ、６５ｍＴｏｒｒ～７５ｍＴｏｒｒ、６０ｍＴｏｒｒ～７０ｍＴｏｒｒ、５５ｍＴｏｒｒ～７５ｍＴｏｒｒ、または７０ｍＴｏｒｒ～８５ｍＴｏｒｒの圧力に供することを含む。いくつかの態様において、第１の乾燥ステップは、急速冷凍された細菌性組成物を、約５０ｍＴｏｒｒ、５１ｍＴｏｒｒ、５２ｍＴｏｒｒ、５３ｍＴｏｒｒ、５４ｍＴｏｒｒ、５５ｍＴｏｒｒ、５６ｍＴｏｒｒ、５７ｍＴｏｒｒ、５８ｍＴｏｒｒ、５９ｍＴｏｒｒ、６０ｍＴｏｒｒ、６１ｍＴｏｒｒ、６２ｍＴｏｒｒ、６３ｍＴｏｒｒ、６４ｍＴｏｒｒ、６５ｍＴｏｒｒ、６６ｍＴｏｒｒ、６７ｍＴｏｒｒ、６８ｍＴｏｒｒ、６９ｍＴｏｒｒ、７０ｍＴｏｒｒ、７１ｍＴｏｒｒ、７２ｍＴｏｒｒ、７３ｍＴｏｒｒ、７４ｍＴｏｒｒ、７５ｍＴｏｒｒ、７６ｍＴｏｒｒ、７７ｍＴｏｒｒ、７８ｍＴｏｒｒ、７９ｍＴｏｒｒ、８０ｍＴｏｒｒ、８１ｍＴｏｒｒ、８２ｍＴｏｒｒ、８３ｍＴｏｒｒ、８４ｍＴｏｒｒ、８５ｍＴｏｒｒ、８６ｍＴｏｒｒ、８７ｍＴｏｒｒ、８８ｍＴｏｒｒ、８９ｍＴｏｒｒ、または９０ｍＴｏｒｒの圧力に供することを含む。いくつかの態様において、第１の乾燥ステップは、急速冷凍された細菌性組成物を、約７０ｍＴｏｒｒの圧力に、供することを含む。
いくつかの態様において、第１の乾燥ステップは、急速冷凍された細菌性組成物を、－１０℃の温度に、そして、７０ｍＴｏｒｒの圧力に供することを含む。

いくつかの態様において、第２の乾燥ステップは、急速冷凍された細菌性組成物を約０℃～＋４０℃、＋１０℃～＋３０℃、－１５℃～＋２５℃、または－１７℃～＋２２℃の温度に供することを含む。いくつかの態様において、第２の乾燥ステップは、急速冷凍された細菌性組成物を、約０℃、＋１℃、＋２℃、＋３℃、＋４℃、＋５℃、＋６℃、＋７℃、＋８℃、＋９℃、＋１０℃、＋１１℃、＋１２℃、＋１３℃、＋１４℃、＋１５℃、＋１６℃、＋１７℃、＋１８℃、＋１９℃、＋２０℃、＋２１℃、＋２２℃、＋２３℃、＋２４℃、＋２５℃、＋２６℃、＋２７℃、＋２８℃、＋２９℃、＋３０℃、＋３１℃、＋３２℃、＋３３℃、＋３４℃、＋３５℃、＋３６℃、＋３７℃、＋３８℃、＋３９℃、または＋４０℃の温度に供することを含む。いくつかの態様において、第２の乾燥ステップは、急速冷凍された細菌性組成物を、約＋２０℃の温度に、供することを含む。

いくつかの態様において、第２の乾燥ステップは、急速冷凍された細菌性組成物を、約５０ｍＴｏｒｒ～９０のｍＴｏｒｒ、６０ｍＴｏｒｒ～８０ｍＴｏｒｒ、６５ｍＴｏｒｒ～７５ｍＴｏｒｒ、６０ｍＴｏｒｒ～７０ｍＴｏｒｒ、５５ｍＴｏｒｒ～７５ｍＴｏｒｒ、または７０ｍＴｏｒｒ～８５ｍＴｏｒｒの圧力に供することを含む。いくつかの態様において、第２の乾燥ステップは、急速冷凍された細菌性組成物を、約５０ｍＴｏｒｒ、５１ｍＴｏｒｒ、５２ｍＴｏｒｒ、５３ｍＴｏｒｒ、５４ｍＴｏｒｒ、５５ｍＴｏｒｒ、５６ｍＴｏｒｒ、５７ｍＴｏｒｒ、５８ｍＴｏｒｒ、５９ｍＴｏｒｒ、６０ｍＴｏｒｒ、６１ｍＴｏｒｒ、６２ｍＴｏｒｒ、６３ｍＴｏｒｒ、６４ｍＴｏｒｒ、６５ｍＴｏｒｒ、６６ｍＴｏｒｒ、６７ｍＴｏｒｒ、６８ｍＴｏｒｒ、６９ｍＴｏｒｒ、７０ｍＴｏｒｒ、７１ｍＴｏｒｒ、７２ｍＴｏｒｒ、７３ｍＴｏｒｒ、７４ｍＴｏｒｒ、７５ｍＴｏｒｒ、７６ｍＴｏｒｒ、７７ｍＴｏｒｒ、７８ｍＴｏｒｒ、７９ｍＴｏｒｒ、８０ｍＴｏｒｒ、８１ｍＴｏｒｒ、８２ｍＴｏｒｒ、８３ｍＴｏｒｒ、８４ｍＴｏｒｒ、８５ｍＴｏｒｒ、８６ｍＴｏｒｒ、８７ｍＴｏｒｒ、８８ｍＴｏｒｒ、８９ｍＴｏｒｒ、または９０ｍＴｏｒｒの圧力に供することを含む。いくつかの態様において、第１の乾燥ステップは、急速冷凍された細菌性組成物を、約７０ｍＴｏｒｒの圧力に、供することを含む。
いくつかの態様において、第１の乾燥ステップは、急速冷凍された細菌性組成物を、約＋２０℃の温度に、そして、約７０ｍＴｏｒｒの圧力に供することを含む。

いくつかの態様において、凍結乾燥サイクルは、０．５℃／分～３℃／分の間の温度勾配速度を有する、１以上のステップを含む。いくつかの態様において、温度勾配速度は、０．５℃／分、０．６℃／分、０．７℃／分、０．８℃／分、０．９℃／分、１．０℃／分、１．１℃／分、１．２℃／分、１．３℃／分、１．４℃／分、１．５℃／分、１．６℃／分、１．７℃／分、１．８℃／分、１．９℃／分、２．０℃／分、２．１℃／分、２．２℃／分、２．３℃／分、２．４℃／分、２．５℃／分、２．６℃／分、２．７℃／分、２．８℃／分、２．９℃／分、または３．０℃／分である。いくつかの態様において、凍結乾燥サイクルは、１．０℃／分の温度勾配速度を有する、１以上のステップを含む。いくつかの態様において、凍結乾燥サイクルは、２．５℃／分の温度勾配速度を有する、１以上のステップを含む。

いくつかの態様において、凍結乾燥サイクルの各ステップは、０．５℃／分～３℃／分の間の温度勾配速度を有する。いくつかの態様において、温度勾配速度は、０．５℃／分、０．６℃／分、０．７℃／分、０．８℃／分、０．９℃／分、１．０℃／分、１．１℃／分、１．２℃／分、１．３℃／分、１．４℃／分、１．５℃／分、１．６℃／分、１．７℃／分、１．８℃／分、１．９℃／分、２．０℃／分、２．１℃／分、２．２℃／分、２．３℃／分、２．４℃／分、２．５℃／分、２．６℃／分、２．７℃／分、２．８℃／分、２．９℃／分、または３．０℃／分である。いくつかの態様において、凍結乾燥サイクルの各ステップは、１．０℃／分の温度勾配速度を有する。いくつかの態様において、凍結乾燥サイクルの各ステップは、２．５℃／分の温度勾配速度を有する。

いくつかの態様において、保存された細菌性組成物は、凍結乾燥に続いて、貯蔵条件に一定期間供される。いくつかの態様において、保存された細菌性組成物は、約－１００℃～－６０℃、－９０℃～－７０℃、－９５℃～－７５℃、－８５℃～－７５℃、－８５℃～－７０℃、または－８５℃～－６５℃の温度に供される。いくつかの態様において、保存された細菌性組成物は、凍結乾燥に続いて、約－１００℃、－９９℃、－９８℃、－９７℃、－９６℃、－９５℃、－９４℃、－９３℃、－９２℃、－９１℃、－９０℃、－８９℃、－８８℃、－８７℃、－８６℃、－８５℃、－８４℃、－８３℃、－８２℃、－８１℃、－８０℃、－７９℃、－７８℃、－７７℃、－７６℃、－７５℃、－７４℃、－７３℃、－７２℃、－７１℃、－７０℃、－６９℃、－６８℃、－６７℃、－６６℃、－６５℃、－６４℃、－６３℃、－６２℃、－６１℃、または－６０℃の温度に供される。いくつかの態様において、保存された細菌性組成物は、凍結乾燥に続いて約－８０℃の温度に供される。いくつかの態様において、保存された細菌性組成物は、凍結乾燥に続いて一定期間約－８０℃の温度に供される。いくつかの態様において、一定期間は、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも４週間、少なくとも２ヶ月間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、または少なくとも１年間以上である。

いくつかの態様において、本明細書で提供される細菌株を含む固体組成物は、例えば凍結乾燥生成物の再構成による医薬組成物として投与用に製剤化することができる。本明細書で使用される「医薬組成物」という用語は、本明細書で提供される固体配合物と１以上の薬学的に許容し得る賦形剤との混合または組み合わせから得られる生成物を意味する。

「許容し得る」賦形剤とは、活性成分（例えば、細菌株）と適合性でなければならず、かつそれが投与される対象に有害ではない賦形剤を指す。いくつかの態様において、薬学的に許容し得る賦形剤は、組成物の意図される投与経路に基づいて選択され、例えば経口または経鼻投与用組成物は、直腸投与用組成物とは異なる薬学的に許容し得る賦形剤を含み得る。賦形剤の例には、滅菌水、生理食塩水、溶媒、基剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定化剤、香味剤、芳香剤、賦形剤、ビヒクル、保存剤、結合剤、希釈剤、等張化剤、緩和剤、増量剤、崩壊剤、緩衝剤、コーティング剤、滑沢剤、着色剤、甘味剤、増粘剤、および可溶化剤が含まれる。

一側面において、本開示は、細菌の保存を可能にする組成物を提供する。いくつかの態様において、細菌は嫌気性細菌である。細菌の保存に有用な組成物は、本明細書において安定化組成物とも呼ばれる。保存された細菌性組成物を調製するための方法は、本明細書中に使用されるとき、その中の細菌のバイアビリティを促進し、および急速冷凍および凍結乾燥に続く細菌の回収を可能にする方法を指す。

組成物の安定化または保存の機能性は、２つの特定の時点（例として、１日目および１００日目）における生存細菌の数（例として、コロニー形成単位）を比較することによって、評価することができる。いくつかの態様において、組成物の保存の機能性は、第１の時点での生存細菌（例として、コロニー形成単位）の数を、第２の時点での生存細菌の数（例として、コロニー形成単位）と比較することによって、評価される。

いくつかの態様において、組成物の保存の機能性は、急速冷凍の前の生存細菌の数（例として、コロニー形成単位）を、急速冷凍の後の生存細菌の数（例として、コロニー形成単位）と比較することによって、評価される。いくつかの態様において、組成物の保存の機能性は、急速冷凍の前の生存細菌の数（例として、コロニー形成単位）を、凍結乾燥後の生存細菌（例として、コロニー形成単位）の数と比較することによって、評価される。いくつかの態様において、組成物の保存の機能性は、急速冷凍の後／凍結乾燥の前の生存細菌の数（例として、コロニー形成単位）を、凍結乾燥後の生存細菌の数（例として、コロニー形成単位）と比較することによって、評価される。

いくつかの態様において、組成物の保存の機能性は、急速冷凍の前の生存細菌の数（例として、コロニー形成単位）を、組成物を一定期間、貯蔵条件に供した後の生存細菌の数（例として、コロニー形成単位）と比較することによって、評価される。いくつかの態様において、組成物の保存の機能性は、急速冷凍の後／凍結乾燥の前の生存細菌の数（例として、コロニー形成単位）を、組成物を一定期間、貯蔵条件に供した後の生存細菌の数（例として、コロニー形成単位）と比較することによって、評価される。いくつかの態様において、組成物の保存の機能性は、凍結乾燥の後の生存細菌の数（例として、コロニー形成単位）を、組成物を一定期間、貯蔵条件に供した後の生存細菌の数（例として、コロニー形成単位）と比較することによって、評価される。

コロニー形成単位の数が２つの時点でまたはある期間にわたって同一または実質的に同一である場合、その組成物は、完全な保存方法である。２つの時点の間またはある期間にわたるコロニー形成単位の数の大幅な減少は、該方法が良好な保存組成物ではないことを示す。

いくつかの態様において、本明細書中に提供される方法は、一定期間にわたり、コロニー形成単位の少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、最高１００％の回収を可能にする。いくつかの態様において、一定期間は、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも４週間、少なくとも２ヶ月間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、または少なくとも１年間以上である。いくつかの態様において、回収されたコロニー形成単位のパーセンテージまたは保存レベルは、一定期間における第１の時点での細菌（例えば、細菌株または総細菌）のコロニー形成単位の数を、第２の時点での細菌（例えば、細菌株または総細菌）のコロニー形成単位の数と比較することにより、決定される。

例えば、細菌の５０％の回収または５０％の保存は、細菌の半分が、一定期間にわたって生存を維持したことを示し；および１００％の回収は、すべての（または実質的にすべての）細菌が、一定期間にわたって生存を維持したことを示す。

いくつかの態様において、本明細書中に提供される方法は、一定期間にわたり、コロニー形成単位の少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、最高１００％の保存された細菌性組成物のバイアビリティのレベルをもたらす。いくつかの態様において、一定期間は、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも４週間、少なくとも２ヶ月間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、または少なくとも１年間以上である。

いくつかの態様において、バイアビリティのレベルは、一定期間にわたる、第１の時点での細菌（例として、細菌株または総細菌）のコロニー形成単位の数を、第２の時点での細菌（例として、細菌株または総細菌）のコロニー形成単位の数と比較することにより、決定される。例えば、５０％のバイアビリティは、細菌の半分が、一定期間にわたって生存を維持したことを示し；および１００％のバイアビリティは、すべての（または実質的にすべての）細菌が、一定期間にわたって生存を維持したことを、示す。

いくつかの態様において、本明細書中に提供の方法は、凍結乾燥トレイ（例として、ＧＯＲＥ（登録商標）Ｌｙｏｇｕａｒｄ（登録商標）凍結乾燥トレイ）中の細菌性組成物を冷凍および凍結乾燥することに関わる方法と比較して、増強されたバイアビリティを有する保存された細菌性組成物をもたらす。

いくつかの態様において、本明細書中に記載の方法は、凍結乾燥トレイ中の細菌性組成物を冷凍および凍結乾燥することに関わる方法と比較して、少なくとも１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、５００倍、またはそれより強く増強されるバイアビリティを有する、保存された細菌性組成物をもたらす。

配列番号１株１１６ｓリボソームＲＮＡＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｂｏｌｔｅａｅ
ＡＴＧＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧＧＡＴＧＡＡＣＧＣＴＧＧＣＧＧＣＧＴＧＣＣＴＡＡＣＡＣＡＴＧＣＡＡＧＴＣＧＡＡＣＧＡＡＧＣＡＡＴＴＡＡＡＡＴＧＡＡＧＴＴＴＴＣＧＧＡＴＧＧＡＴＴＴＴＴＧＡＴＴＧＡＣＴＧＡＧＴＧＧＣＧＧＡＣＧＧＧＴＧＡＧＴＡＡＣＧＣＧＴＧＧＡＴＡＡＣＣＴＧＣＣＴＣＡＣＡＣＴＧＧＧＧＧＡＴＡＡＣＡＧＴＴＡＧＡＡＡＴＧＡＣＴＧＣＴＡＡＴＡＣＣＧＣＡＴＡＡＧＣＧＣＡＣＡＧＴＡＣＣＧＣＡＴＧＧＴＡＣＧＧＴＧＴＧＡＡＡＡＡＣＴＣＣＧＧＴＧＧＴＧＴＧＡＧＡＴＧＧＡＴＣＣＧＣＧＴＣＴＧＡＴＴＡＧＣＣＡＧＴＴＧＧＣＧＧＧＧＴＡＡＣＧＧＣＣＣＡＣＣＡＡＡＧＣＧＡＣＧＡＴＣＡＧＴＡＧＣＣＧＡＣＣＴＧＡＧＡＧＧＧＴＧＡＣＣＧＧＣＣＡＣＡＴＴＧＧＧＡＣＴＧＡＧＡＣＡＣＧＧＣＣＣＡＡＡＣＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧＴＧＧＧＧＡＡＴＡＴＴＧＣＡＣＡＡＴＧＧＧＣＧＡＡＡＧＣＣＴＧＡＴＧＣＡＧＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＴＧＡＧＴＧＡＡＧＡＡＧＴＡＴＴＴＣＧＧＴＡＴＧＴＡＡＡＧＣＴＣＴＡＴＣＡＧＣＡＧＧＧＡＡＧＡＡＡＡＴＧＡＣＧＧＴＡＣＣＴＧＡＣＴＡＡＧＡＡＧＣＣＣＣＧＧＣＴＡＡＣＴＡＣＧＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡＴＡＣＧＴＡＧＧＧＧＧＣＡＡＧＣＧＴＴＡＴＣＣＧＧＡＴＴＴＡＣＴＧＧＧＴＧＴＡＡＡＧＧＧＡＧＣＧＴＡＧＡＣＧＧＣＧＡＡＧＣＡＡＧＴＣＴＧＡＡＧＴＧＡＡＡＡＣＣＣＡＧＧＧＣＴＣＡＡＣＣＣＴＧＧＧＡＣＴＧＣＴＴＴＧＧＡＡＡＣＴＧＴＴＴＴＧＣＴＡＧＡＧＴＧＴＣＧＧＡＧＡＧＧＴＡＡＧＴＧＧＡＡＴＴＣＣＴＡＧＴＧＴＡＧＣＧＧＴＧＡＡＡＴＧＣＧＴＡＧＡＴＡＴＴＡＧＧＡＧＧＡＡＣＡＣＣＡＧＴＧＧＣＧＡＡＧＧＣＧＧＣＴＴＡＣＴＧＧＡＣＧＡＴＡＡＣＴＧＡＣＧＴＴＧＡＧＧＣＴＣＧＡＡＡＧＣＧＴＧＧＧＧＡＧＣＡＡＡＣＡＧＧＡＴＴＡＧＡＴＡＣＣＣＴＧＧＴＡＧＴＣＣＡＣＧＣＣＧＴＡＡＡＣＧＡＴＧＡＡＴＧＣＴＡＧＧＴＧＴＴＧＧＧＧＧＧＣＡＡＡＧＣＣＣＴＴＣＧＧＴＧＣＣＧＴＣＧＣＡＡＡＣＧＣＡＧＴＡＡＧＣＡＴＴＣＣＡＣＣＴＧＧＧＧＡＧＴＡＣＧＴＴＣＧＣＡＡＧＡＡＴＧＡＡＡＣＴＣＡＡＡＧＧＡＡＴＴＧＡＣＧＧＧＧＡＣＣＣＧＣＡＣＡＡＧＣＧＧＴＧＧＡＧＣＡＴＧＴＧＧＴＴＴＡＡＴＴＣＧＡＡＧＣＡＡＣＧＣＧＡＡＧＡＡＣＣＴＴＡＣＣＡＡＧＴＣＴＴＧＡＣＡＴＣＣＴＣＴＴＧＡＣＣＧＧＣＧＴＧＴＡＡＣＧＧＣＧＣＣＴＴＣＣＣＴＴＣＧＧＧＧＣＡＡＧＡＧＡＧＡＣＡＧＧＴＧＧＴＧＣＡＴＧＧＴＴＧＴＣＧＴＣＡＧＣＴＣＧＴＧＴＣＧＴＧＡＧＡＴＧＴＴＧＧＧＴＴＡＡＧＴＣＣＣＧＣＡＡＣＧＡＧＣＧＣＡＡＣＣＣＴＴＡＴＣＣＴＴＡＧＴＡＧＣＣＡＧＣＡＧＧＴＡＡＡＧＣＴＧＧＧＣＡＣＴＣＴＡＧＧＧＡＧＡＣＴＧＣＣＡＧＧＧＡＴＡＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＧＧＧＡＴＧＡＣＧＴＣＡＡＡＴＣＡＴＣＡＴＧＣＣＣＣＴＴＡＴＧＡＴＴＴＧＧＧＣＴＡＣＡＣＡＣＧＴＧＣＴＡＣＡＡＴＧＧＣＧＴＡＡＡＣＡＡＡＧＧＧＡＡＧＣＡＡＧＡＣＡＧＴＧＡＴＧＴＧＧＡＧＣＡＡＡＴＣＣＣＡＡＡＡＡＴＡＡＣＧＴＣＣＣＡＧＴＴＣＧＧＡＣＴＧＴＡＧＴＣＴＧＣＡＡＣＣＣＧＡＣＴＡＣＡＣＧＡＡＧＣＴＧＧＡＡＴＣＧＣＴＡＧＴＡＡＴＣＧＣＧＡＡＴＣＡＧＡＡＴＧＴＣＧＣＧＧＴＧＡＡＴＡＣＧＴＴＣＣＣＧＧＧＴＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＣＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＧＴＣＡＧＣＡＡＣＧＣＣＣＧＡＡＧＴＣＡＧＴＧＡＣＣＣＡＡＣＴＣＧＣＡＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＣＴＧＣＣＧＡＡＧＧＣＧＧＧＧＣＡＧＧＴＡＡＣＴＧＧＧＧＴＧＡＡＧＴＣＧＴＡＡＣＡＡＧＧＴＡＧＣＣＧＴＡＴＣＧＧＡＡＧＧＴＧＣＧＧＣＴＧＧＡＴＣＡＣＣＴＣＣＴＴＴ

配列番号２株２１６ｓリボソームＲＮＡＡｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓｃｏｌｉｈｏｍｉｎｉｓ
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配列番号３株３１６ｓリボソームＲＮＡＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓｔｏｒｑｕｅｓ
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配列番号４株４１６ｓリボソームＲＮＡＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｓｙｍｂｉｏｓｕｍ
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配列番号５株５１６ｓリボソームＲＮＡＢｌａｕｔｉａｐｒｏｄｕｃｔａ
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配列番号６株６１６ｓリボソームＲＮＡＤｏｒｅａＬｏｎｇｉｃａｔｅｎａ
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配列番号７株７１６ｓリボソームＲＮＡＥｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ
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配列番号８株８１６ｓリボソームＲＮＡＳｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍｓｐｐ
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本明細書において別に定義されない限り、本開示に関連して使用される科学的および技術的用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈上別段の要求がない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。本開示の方法および技術は、一般に当技術分野において知られている従来の方法に従って行われる。一般に、本明細書に記載の生化学、酵素学、分子および細胞生物学、微生物学、ウイルス学、細胞または組織培養、遺伝学ならびにタンパク質および核酸化学に関連して使用される命名法および技術は、当技術分野でよく知られており一般的に使用されるものである。本開示の方法および技術は一般に、別に指示されない限り、当分野で知られている従来の方法に従って、本明細書を通して引用および議論される種々の一般的およびさらに具体的な参考文献に記載されるようにして、実施される。

本発明を、以下の例によりさらに説明するが、これは決してさらなる限定として解釈されるべきではない。本明細書を通して引用される全ての参考文献（参考文献、発行された特許、公開された特許出願、および同時係属中の特許出願を含む）の全内容は、特に上記で参照された教示に関して、参照により本明細書に明確に組み込まれる。しかしながら、いかなる参考文献の引用も、その参考文献が先行技術であることの承認を意図するものではない。

例
凍結乾燥の前に、製剤化された培養物の急速冷凍滴を試験するために、検討を遂行した。凍結乾燥トレイ（例として、ＧＯＲＥ（登録商標）Ｌｙｏｇｕａｒｄ（登録商標）凍結乾燥トレイ）中で冷凍および凍結乾燥した細菌株と比較した場合の、冷凍および凍結乾燥後の細菌株の改善されたバイアビリティを立証する試験。バイアビリティの改善とともに、冷凍し、凍結したペレットを保管する能力は、保存された細菌生成物の生成に伴うより大きな柔軟性を可能にする。

細菌培養物を、生育培地中で接種し、３７℃で嫌気的にインキューベートした。一旦光学密度（ＯＤ）が、試験される株に基づいた標的閾値を超えると、培養物を、スピンダウンさせ、製剤緩衝液で再懸濁した。使用した製剤緩衝液は、７０ｇ／Ｌスクロース、１ｇ／Ｌ酵母抽出物、０．５ｇ／ＬＬ‐システイン、２０ｍｍヒスチジン、および０．１ｇ／Ｌ塩化マグネシウムを有する。ＶＥ３０３－１、ＶＥ３０３－２、およびＶＥ３０３－６に関する製剤緩衝液も、０．５ｇ／Ｌメタ重亜硫酸ナトリウムを含有した。塩化マグネシウムを含有しないことを除いて、従来の凍結乾燥法のために使用される製剤緩衝液は同一であった。培養物を二度スピンダウンさせ、上清を廃棄し、そして再び製剤緩衝液中に懸濁した。培養物の滴を、１ｍＬピペットを使用して液体窒素槽にそれらを加えることによって、急速冷凍した。冷凍した滴を、篩を用いて収集し、ドライアイス上にある凍結乾燥バイアルに等分した。バイアルを、－５０℃の棚温度を伴う凍結乾燥器へ移動した。すべてのバイアルを、－５０℃で４時間保持した。第１の乾燥を、－１０℃および７０ｍＴｏｒｒで遂行した。第２の乾燥を、＋２０℃および７０ｍＴｏｒｒで遂行した。バイアルを次いで凍結乾燥器から取り除き、それらを試験できるまで－８０℃で保管した。

各細菌株に関して、２つの方法のそれぞれのための収穫試料、冷凍解凍試料（データは示されていない）、および凍結乾燥後試料を平板培養し、プロセスの各ステージでの細菌株のバイアビリティを決定した。プレートを、減少したホスファート緩衝食塩水（ＰＢＳ）中ですべての試料に関して連続希釈液を生成することによって作成した。試料の１００μＬアリコートを、１ＸＰＢＳの９００μＬ中で混和した。前のＰＢＳの９００μＬ中の希釈物から１００μＬを混和することにより、連続希釈を遂行した。これを遂行し、希釈物を１０^－１から１０^－７まで生成した。１０^－５、１０^－６、および１０^－７の希釈物を使用し、チョコレート寒天平板上で１００μＬを平板培養した。平板培養した希釈物を、無菌ビーズを用いてばらまき、３７℃で＞４８時間、嫌気的にインキューベートした。各プレート上のコロニーを、数え上げ、各試料のバイアビリティを決定した。凍結乾燥後試料に関して、材料の０．１グラムを、希釈および平板培養の前にＰＢＳ中で再水和させ、バイアビリティを決定した。

各細菌株の凍結乾燥後のバイアビリティを、凍結乾燥トレイ（例として、ＧＯＲＥ（登録商標）Ｌｙｏｇｕａｒｄ（登録商標）凍結乾燥トレイ）中の細菌培養物を冷凍させる従来の方法を用いたそれぞれの細菌株の凍結乾燥後のバイアビリティと、比較した（図１）。細菌株ＶＥ３０３－０６は、バイアビリティにおいて最も高い改善を立証した（凍結乾燥トレイを使用した３．９％から本明細書中に記載の方法を使用した２０％まで増加した）。

Claims

保存された細菌性組成物を調製する方法であって、
細菌性組成物を急速冷凍すること、および
急速冷凍された細菌性組成物を凍結乾燥して、保存された細菌性組成物を生成すること
を含む、前記方法。
細菌性組成物が、１以上の細菌株を含む、請求項１に記載の方法。
細菌性組成物が、１以上の嫌気性細菌株を含む、請求項１または２に記載の方法。
嫌気性細菌株が、偏性嫌気性細菌である、請求項３に記載の方法。
細菌性組成物が、クロストリジウム網に属する１以上の細菌株を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
１以上の細菌株が、クロストリジウム科に属する、請求項５に記載の方法。
細菌が、クロストリジウム属に属する１種以上の細菌株を含む、請求項６に記載の方法。
細菌性組成物が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｂｏｌｔｅａｅ、Ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓｃｏｌｉｈｏｍｉｎｉｓ、Ｓｅｌｌｉｍｏｎａｓｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｓｙｍｂｉｏｓｕｍ、Ｂｌａｕｔｉａｐｒｏｄｕｃｔａ、Ｄｏｒｅａｌｏｎｇｉｃａｔｅｎａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｉｎｎｏｃｕｕｍ、およびＦｌａｖｉｎｏｆｒａｃｔｏｒｐｌａｕｔｉｉからなる群から選択される１以上の細菌株を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
細菌性組成物が、配列番号１～８からなる群から選択される核酸配列と少なくとも９７％の配列同一性を有する１６ＳｒＤＮＡ配列を含む１以上の細菌株を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
細菌性組成物を洗浄すること、および製剤緩衝液中で細菌性組成物を再懸濁することをさらに含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
急速冷凍することが、細菌性組成物を、超冷却された表面と接触させることによって遂行される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
急速冷凍することが、細菌性組成物を、液体窒素と接触させることによって遂行される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
細菌性組成物が、対称性の形状を有する、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
対称性の形状が、対称性の冷凍した滴である、請求項１３に記載の方法。
保存された細菌性組成物を、－８０℃の温度に供することをさらに含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
凍結乾燥することが、第１の乾燥ステップおよび第２の乾燥ステップを含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
第１の乾燥ステップが、急速冷凍された細菌性組成物を、－１０℃の温度に、および７０ｍＴｏｒｒの圧力の下に供することを含む、請求項１６に記載の方法。
第２の乾燥ステップが、急速冷凍された細菌性組成物を、＋２０℃の温度に、および７０ｍＴｏｒｒの圧力の下に供することを含む、請求項１６または１７に記載の方法。
細菌性組成物を培養することをさらに含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
凍結乾燥した後、保存された細菌性組成物のバイアビリティのレベルを決定することをさらに含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
保存された細菌性組成物のバイアビリティのレベルが、一定期間にわたり、細菌のコロニー形成単位の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、または少なくとも４０％である、請求項２０に記載の方法。
一定期間が、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも４週間、少なくとも２ヶ月間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、または少なくとも１年間以上である、請求項２１に記載の方法。