CN114980910A - 用于保存细菌的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了用于保存细菌的方法和组合物。本公开的各个方面提供了制备保存的细菌组合物的方法，所述方法包括将细菌组合物速冻，并将速冻的细菌组合物冻干从而产生保存的细菌组合物。在一些实施方案中，所述细菌组合物包含一种或多种细菌菌株。在一些实施方案中，所述一种或多种细菌菌株包括一种或多种厌氧细菌菌株。在一些实施方案中，所述厌氧细菌菌株是严格厌氧细菌。

Description

用于保存细菌的方法和组合物
相关申请
根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求于2019年9月16日提交的美国临时申请号62/901,205的优先权。该申请的全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本公开提供了用于保存细菌的方法和组合物。
背景技术
人肠道微生物组包括大量数目的微生物。这些微生物中大量是厌氧细菌。包括源自人肠道微生物组的厌氧细菌的组合物已经显示出治疗人类疾病的潜力(参见，例如，Atarashi等人,Nature 500,232,2013；Atarashi等人,Cell 163,1,2015；Mathewson等人,Nature Immunology 17,505,2016)。厌氧细菌因为它们对氧的敏感性使得它们的保存是有挑战性的。因此需要改良的用于保存厌氧细菌的组合物和方法。
发明内容
本公开的各个方面提供了制备保存的细菌组合物的方法，所述方法包括：将细菌组合物速冻，以及将速冻的细菌组合物冻干以产生保存的细菌组合物。在一些实施方案中，所述细菌组合物包含一种或多种细菌菌株。在一些实施方案中，所述一种或多种细菌菌株包括一种或多种厌氧细菌菌株。在一些实施方案中，所述厌氧细菌菌株是严格厌氧细菌。
在一些实施方案中，所述细菌组合物包含属于梭菌(Clostridia)纲的一种或多种细菌菌株。在一些实施方案中，所述一种或多种细菌菌株属于梭菌科(Clostridiaceae)。在一些实施方案中，所述细菌包括属于梭菌属(Clostridium)的一种或多种细菌菌株。在一些实施方案中，所述细菌组合物包含选自由下列各项组成的组中的一种或多种细菌菌株：鲍氏梭菌(Clostridium bolteae)，Anaerotruncus colihominis，断链真杆菌(Eubacteriaumfissicatena)，共生梭菌(Clostridium symbiosum)，生产布劳特氏菌(Blautiaproducta)，Dorea longicatena，无害梭菌(Clostridium innocuum)和Flavinofractorplautii。在一些实施方案中，所述细菌组合物包含具有与选自由SEQ ID NO:1-8组成的组的核酸序列有至少97％序列同一性的16S rDNA序列的一种或多种细菌菌株。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括培养所述细菌组合物。在一些实施方案中，将所述细菌组合物洗涤并重悬于配制缓冲液中。在一些实施方案中，所述速冻通过使所述细菌组合物与超冷表面接触来进行。在一些实施方案中，所述速冻通过使所述细菌组合物与液氮接触来进行。
在一些实施方案中，所述细菌组合物具有对称形状。在一些实施方案中，所述对称形状是对称的冷冻液滴。在一些实施方案中，使所述保存的细菌组合物经受-80℃的温度。
在一些实施方案中，所述冻干包括初级干燥步骤和二级干燥步骤。在一些实施方案中，所述初级干燥步骤包括使所述速冻的细菌组合物经受-10℃的温度并处于70mTorr的压力下。在一些实施方案中，所述二级干燥步骤包括使所述速冻的细菌组合物经受+20℃的温度并处于70mTorr的压力下。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括确定冻干后所述保存的细菌组合物中的存活率水平。在一些实施方案中，所述保存的细菌组合物在一段时间后的存活率水平是所述细菌的菌落形成单位的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。在一些实施方案中，所述一段时间为至少1周、至少2周、至少4周、至少2个月、至少3个月、至少6个月或至少1年或更长时间。
参照附图和本发明的详述，本发明的这些和其他方面，以及它们的各种实施方案将变得更明显。
对本发明的每个限制可以涵盖本发明的各个实施方案。因此，预期涉及任一个要素或要素组合的对本发明的每一个限制可以包括在本发明的每个方面中。本发明在其应用中不限于下面描述中所给出的或在附图中图示的组分的构造或配置方式的细节。本发明能够存在其他实施方案并且能够以各种方式实施或执行。
附图说明
附图不意在按比例绘制。附图仅是说明性的，并且不是实现本公开所必需的。为了清楚的目的，可以不将每个组分都标记在附图中。在附图中：
图1显示了所指示的细菌菌株的冻干后存活率。基于冻干后所得的菌落形成单位相对于收获细菌培养物后所得的菌落形成单位计算冻干后的存活率百分比(y-轴上的％存活率)。对于每个所指示的细菌菌株，左列对应于冻干前标准冷冻过程(即，冷冻-干燥托盘)后的存活率，右列对应于本文所述的速冻液滴和冻干方法后的存活率。
具体实施方式
包括厌氧细菌的细菌组合物的保存具有挑战性。尽管细菌可以被冻结并在平板上或在溶液中重新生长，但难以使此过程标准化。存在着对保存可以用于治疗目的的细菌的需要。对于厌氧细菌已经充分地建立了保存方法，诸如低温保存和冻干，并且认识到了在保存方法中影响厌氧细菌的存活和复苏的许多因素(Prakash等人，FEMS Microbiol Lett(2013)339:1-9)。对于依赖有活力细菌的细菌产品，提高保存方法后细菌的存活率水平具有减少与制备此类产品相关的成本的潜力。鉴于获自人肠微道生物组的细菌(诸如厌氧细菌菌株)已经显示出在治疗人类疾病中的潜力，因此需要允许高水平细菌复苏的改良的用于保存细菌的方法。
本文描述了保存细菌组合物的方法，所述方法包括速冻细菌组合物并将速冻的细菌组合物冻干以制备保存的细菌组合物。冷冻和保存速冻的细菌组合物的能力允许保存方法具有更大的灵活性。在一些实施方案中，本文所述的方法用于保存厌氧细菌。
本发明在其应用中不限于下面描述中所给出的或在附图中图示的组分的构造或配置方式的细节。本发明能够存在其他实施方案并且能够以各种方式实施或执行。此外，本文所用的用语和术语用于描述的目的，并且不应当被认为是限制。“包括”、“包含”或“具有”、“含有”、“涉及”以及在本文中它们的变化形式的使用意在涵盖后面列举的条目及其等效形式以及额外的条目。
本文提供了用于保存细菌的组合物和方法。在一个方面，本文提供的方法允许保存细菌组合物。在一些实施方案中，本文所述的方法用于保存厌氧细菌。所述组合物允许细菌以最小的存活率损失经过冻干循环。在一些实施方案中，所述细菌组合物包括细菌。在一些实施方案中，所述细菌组合物包括一种或多种细菌菌株。在一些实施方案中，所述细菌组合物包括单一细菌菌株。在一些实施方案中，所述细菌组合物包括至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种或至少8种或更多种细菌菌株(例如，纯化的细菌菌株)。
在一些实施方案中，所述细菌组合物包括一种或多种厌氧细菌菌株(例如，严格厌氧细菌)。在本文提供的组合物的一些实施方案中，所述厌氧细菌是严格厌氧细菌。
在一些实施方案中，所述细菌组合物包括一种或多种属于梭菌纲的细菌菌株。在一些实施方案中，一种或多种细菌菌株来自梭菌科。在一些实施方案中，所述细菌来自梭菌属。在一些实施方案中，所述细菌属于梭菌簇IV、XIVa、XVI、XVII或XVIII。在一些实施方案中，所述细菌属于梭菌簇IV、XIVa或XVII。在一些实施方案中，所述细菌属于梭菌簇IV或XIVa。
在一些实施方案中，所述细菌组合物包括下列细菌菌株中的一种或多种：鲍氏梭菌(Clostridium bolteae),Anaerotruncus colihominis，肠道塞利单胞菌(Sellimonasintestinalis)，共生梭菌(Clostridium symbiosum)，生产布劳特氏菌(Blautiaproducta)，Dorea longicatena，丹毒丝菌科细菌(Erysipelotrichaceae bacterium)和Flavinofractor plautii。例如，细菌菌株鲍氏梭菌、Anaerotruncus colihominis、肠道塞利单胞菌、共生梭菌、生产布劳特氏菌、Dorea longicatena、丹毒丝菌科细菌和Flavinofractor plautii记载在PCT公开号WO 2017/218680中，该申请的全部内容通过引用并入本文。所述菌株也列在表1中。应当认识到也可以使用备选的菌株名称，例如，如表1中所列的那样。
在一些实施方案中，所述细菌组合物包括下列细菌菌株中的一种或多种：鲍氏梭菌90A9，Anaerotruncus colihominis DSM17241，肠道塞利单胞菌，鲍氏梭菌，Anaerotruncus colihominis，肠道塞利单胞菌，共生梭菌，生产布劳特氏菌，Dorealongicatena，丹毒丝菌科细菌和Flavinofractor plautii。在一些实施方案中，所述细菌组合物包括下列细菌菌株中的两种或更多种(例如，2、3、4、5、6、7或8种)：鲍氏梭菌，Anaerotruncus colihominis，肠道塞利单胞菌，共生梭菌，生产布劳特氏菌，Dorealongicatena，丹毒丝菌科细菌和Flavinofractor plautii。在一些实施方案中，所述细菌组合物包括鲍氏梭菌。在一些实施方案中，所述细菌组合物包括Anaerotruncuscolihominis。在一些实施方案中，所述细菌组合物包括肠道塞利单胞菌。在一些实施方案中，所述细菌组合物包括共生梭菌。在一些实施方案中，所述细菌组合物包括生产布劳特氏菌。在一些实施方案中，所述细菌组合物包括Dorea longicatena。在一些实施方案中，所述细菌组合物包括丹毒丝菌科细菌。在一些实施方案中，所述细菌组合物包括Flavinofractor plautii。
在一个方面，如本文所示(例如，在实施例中)，本文提供的方法允许保存厌氧细菌菌株。可以在本发明中的方法中使用的厌氧菌包括在联合治疗中使用的细菌菌株，诸如例如在PCT公开号WO2013/080561、WO2015/156419、WO2018/117263、WO2017/218680、WO2019/094837和WO2019/118515中所述。在一个方面，如本文所示(例如，在实施例中)，本文提供的方法允许保存属于梭菌簇IV、XIVa或XVII的厌氧细菌菌株。在一个方面，如本文所示(例如，在实施例中)，本文提供的方法允许保存厌氧细菌菌株鲍氏梭菌、Anaerotruncuscolihominis、肠道塞利单胞菌、共生梭菌、生产布劳特氏菌、Dorea longicatena、丹毒丝菌科细菌和Flavinofractor plautii。示例性的细菌菌株还可以通过它们的16s rRNA序列(SEQ ID NO:1-8)鉴定。此外通过其序列鉴定细菌还允许鉴定与举例说明的细菌相同或高度相似的其他细菌菌株。例如，细菌菌株的16s rRNA序列用来通过全基因组测序以及通过将这些序列与16S数据库比较来鉴定最近的亲属(基于百分比同一性)(表1)。另外，基于全基因组测序以及所述全基因组与全基因组数据库的比较，具有SEQ ID NO:1-8提供的16SrRNA序列的细菌菌株与下列的菌种最密切相关：鲍氏梭菌90A9，Anaerotruncuscolihominis DSM 17241，Dracourtella massiliensis GD1，共生梭菌WAL-14163，梭菌UC5.1-1D4，Dorea longicatena CAG:42，丹毒丝菌科细菌21_3，和园环梭菌(Clostridiumorbiscindens)1_3_50AFAA(参见，例如，表1)。因此，在一个方面，应当认识到表1的每一行，细菌菌株是高度相似的和/或相同的。在一些实施方案中，在本公开的上下文中，表1的一行内的细菌菌株的名称可互换使用。
Figure BDA0003615795060000071
本公开的各个方面涉及具有与本文所述的细菌菌株或菌种的任一个序列的核酸序列有序列同一性的16S rDNA序列的细菌菌株。在两个或更多个核酸或氨基酸序列的情形中术语“相同的”、“同一性”百分比是指两个或更多个序列或子序列是相同的。当在比较窗或指定的区域内比较和比对最大对应性(如使用下列序列比较算法中之一或通过手工比对和目测测量)时，如果两个序列在特定区域的核酸或氨基酸序列内或在整个序列内具有特定百分比的氨基酸残基或核苷酸是相同的(例如，至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性)，则所述两个序列是“基本上相同的”。任选地，同一性在长度为至少约50个核苷酸的区域内，或更优选地在长度为100-500个或1000个或更多个核苷酸的区域内存在。在一些实施方案中，同一性在16S rRNA或16S rDNA序列的长度内存在。
在一些实施方案中，所述细菌组合物包括在特定区域内或在整个序列内与本文所述的菌株或细菌菌种中的任一个有至少60％、至少70％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％或至多达100％的序列同一性的一种或多种细菌菌株。本领域技术人员要理解在两个或更多个核酸序列或氨基酸序列的情形下术语“序列同一性”或“序列同一性百分比”是指两个或更多个序列或其部分之间的相似性的量度。
在一些实施方案中，所述细菌组合物包括一种或多种细菌菌株，其中所述一种或多种细菌菌株包括与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的核酸序列具有至少97％序列同一性的一个或多个16S rDNA序列。在一些实施方案中，所述细菌组合物包括一种细菌菌株，其中所述细菌菌株包括与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的核酸序列具有至少97％序列同一性的一个或多个16S rDNA序列。在一些实施方案中，所述细菌组合物包括一种细菌菌株，其中所述细菌菌株包括与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的核酸序列具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或至多达100％序列同一性的一个或多个16S rDNA序列。
在一些实施方案中，所述细菌组合物包括一种细菌菌株，其中所述细菌菌株包括与SEQ ID NO:1的核酸序列具有至少97％序列同一性的一个或多个16s rDNA序列。在一些实施方案中，所述细菌组合物包括一种细菌菌株，其中所述细菌菌株包括与SEQ ID NO:2的核酸序列具有至少97％序列同一性的一个或多个16s rDNA序列。在一些实施方案中，所述细菌组合物包括一种细菌菌株，其中所述细菌菌株包括与SEQ ID NO:3的核酸序列具有至少97％序列同一性的一个或多个16s rDNA序列。在一些实施方案中，所述细菌组合物包括一种细菌菌株，其中所述细菌菌株包括与SEQ ID NO:4的核酸序列具有至少97％序列同一性的一个或多个16s rDNA序列。在一些实施方案中，所述细菌组合物包括一种细菌菌株，其中所述细菌菌株包括与SEQ ID NO:5的核酸序列具有至少97％序列同一性的一个或多个16s rDNA序列。在一些实施方案中，所述细菌组合物包括一种细菌菌株，其中所述细菌菌株包括与SEQ ID NO:6的核酸序列具有至少97％序列同一性的一个或多个16s rDNA序列。在一些实施方案中，所述细菌组合物包括一种细菌菌株，其中所述细菌菌株包括与SEQ IDNO:7的核酸序列具有至少97％序列同一性的一个或多个16s rDNA序列。在一些实施方案中，所述细菌组合物包括一种细菌菌株，其中所述细菌菌株包括与SEQ ID NO:8的核酸序列具有至少97％序列同一性的一个或多个16s rDNA序列。
另外地，或备选地，两个或更多个序列可以被评估进行序列之间的比对。在两个或更多个核酸或氨基酸序列的情形下术语“比对”或“比对”百分比是指两个或更多个序列或子序列是相同的。当在比较窗或指定的区域内比较和比对最大对应性(如使用下列序列比较算法中之一或通过手工比对和目测测量)时，如果两个序列在特定区域的核酸或氨基酸序列内或在整个序列内具有特定百分比的氨基酸残基或核苷酸是相同的(例如，至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％相同)，则所述两个序列是“基本上比对得上的”。任选地，比对在长度为至少约50个核苷酸的区域内，或更优选地在长度为100-500个或1000个或更多个核苷酸的区域内存在。在一些实施方案中，同一性在16S rRNA或16S rDNA序列的长度内存在。
对于序列比较，典型地一个序列充当参考序列，测试序列与参考序列比较。用于比较的序列比对方法在本领域中是众所周知的。参见，例如，Smith和Waterman(1970)Adv.Appl.Math.2:482c的局部同源性算法，Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.(1970)48:443的同源性比对算法，Pearson和Lipman.Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1998)85:2444的相似性搜索方法，这些算法的计算机化实施形式(Wisconsin Genetics软件包(GeneticsComputer Group.Madison,WI)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)，或手动对比和目测(参见，例如，Brent等人、Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.(Ringbou编辑,2003))。适合用于确定序列同一性百分比和序列相似性的算法的两个实例是BLAST和BLAST 2.0算法，它们分别记载于Altschul等人,Nuc.Acids Res.(1977)25:3389-3402，和Altschul等人,J.Mol.Biol.(1990)215:403-410。
应当认识到，术语“细菌”和“细菌菌株”当在本文中使用时是可互换的。
如本文所用，术语“分离的”是指已经与一个或多个不期望的组分分离的细菌或细菌菌株，所述不期望的组分诸如另一细菌或细菌菌株，生长培养基的一个或多个组分，和/或样品(诸如粪便样品)的一个或多个组分。在一些实施方案中，所述细菌从来源基本上分离使得所述来源的其他组分检测不到。
在一些实施方案中，所述细菌菌株从单个菌落生长起来。在一些实施方案中，所述细菌菌株是纯化的细菌菌株。如本文所用，术语“纯化的”是指已经与一个或多个组分(诸如污染物)分离的细菌菌株或包含所述细菌菌株的组合物。在一些实施方案中，所述细菌菌株基本上不含污染物。在一些实施方案中，组合物的一种或多种细菌菌株可以单独地从在含有所述细菌菌株的培养物或样品中制备的和/或在含有所述细菌菌株的培养物或样品中存在的一种或多种其他细菌中纯化。在一些实施方案中，细菌菌株分离自或纯化自样品，然后在细菌繁殖的适宜条件下培养，例如，在厌氧培养条件下。在细菌繁殖的适宜条件下生长的细菌可以从其生长的培养物中基本上分离/纯化。
所述组合物的细菌菌株可以使用本领域中众所周知的发酵技术制备。在一些实施方案中，活性成分使用厌氧发酵罐制备，厌氧发酵罐可以支持厌氧细菌菌株的快速生长。厌氧发酵罐可以是，例如，搅拌釜式反应器或一次性波浪生物反应器。培养基诸如BL培养基和EG培养基，或这些培养基的去除动物组分的类似形式，可以用来支持细菌菌种的生长。在一些实施方案中，在速冻前所述细菌组合物生长至期望的生长期。在一些实施方案中，在速冻前所述细菌组合物生长至期望的细胞密度。在一些实施方案中，所述细胞密度是细菌菌株的期望光密度(例如，OD600)。
可以通过传统技术(诸如离心和过滤)从发酵肉汤中纯化和浓缩细菌产物。一般来说，在使细菌组合物进行速冻前将细菌离心成沉淀物。在一些实施方案中，所述细菌组合物在速冻前进行洗涤。如本文所用，术语“洗涤”或“进行洗涤”是指用来分离细菌细胞和去除残留的不期望组分(例如，细胞碎片、生长培养基的组分)的一系列步骤。在一些实施方案中，所述方法涉及从培养物(例如，生长培养基)中分离细菌细胞，将分离的细菌细胞重悬在洗涤缓冲液中，并通过传统技术(诸如离心和过滤)从所述洗涤缓冲液中分离所述细菌细胞。在一些实施方案中，分离的细菌细胞重悬在配制缓冲液中。在一些实施方案中，所述方法涉及洗涤细菌组合物并将所述细菌组合物重悬在配制缓冲液中。
在一些实施方案中，配制缓冲液包含冻干保护剂、营养素、缓冲液和抗氧化剂。示例的配制缓冲液记载在PCT公开号WO 2018/081550中，该申请的全部内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，本公开提供了包含冻干保护剂、营养素、抗氧化剂和缓冲液的组合物。在一些实施方案中，配制缓冲液包含蔗糖、酵母提取物、L-半胱氨酸、组氨酸和氯化镁。在一些实施方案中，配制缓冲液包含7％蔗糖、0.1％酵母提取物、0.05％L-半胱氨酸、20mM组氨酸和0.01％氯化镁。在一些实施方案中，配制缓冲液包含焦亚硫酸钠。在一些实施方案中，配制缓冲液包含0.05％焦亚硫酸钠。
在一些实施方案中，本文公开的细菌组合物包含约10、约102、约103、约104、约105、约106、约107、约108、约109、约1010、约1011、约1012、约1013或更多个细菌。在一些实施方案中，本文公开的细菌组合物包含每毫升约10、约102、约103、约104、约105、约106、约107、约108、约109、约1010、约1011、约1012、约1013或更多个细菌。应当认识到一些细菌可以是无活力的。在一些实施方案中，本文公开的细菌组合物包含约10、约102、约103、约104、约105、约106、约107、约108、约109、约1010、约1011、约1012、约1013或更多个菌落形成单位(cfu)的细菌。在一些实施方案中，本文公开的细菌组合物包含每毫升约10、约102、约103、约104、约105、约106、约107、约108、约109、约1010、约1011、约1012、约1013或更多个菌落形成单位(cfu)的细菌。
在一些实施方案中，本文公开的细菌组合物包含总计10-1013、102-1013、103-1013、104-1013、105-1013、106-1013、107-1013、108-1013、109-1013、1010-1013、1011-1013、1012-1013、10-1012、102-1012、103-1012、104-1012、105-1012、106-1012、107-1012、108-1012、109-1012、1010-1012、1011-1012、10-1011、102-1011、103-1013、104-1013、105-1013、106-1013、107-1011、108-1011、109-1011、1010-1011、10-1010、102-1010、103-1010、104-1010、105-1010、106-1010、107-1010、108-1010、109-1010、10-109、102-109、103-109、104-109、105-109、106-109、107-109、108-109、10-108、102-108、103-108、104-108、105-108、106-108、107-108、10-107、102-107、103-107、104-107、105-107、106-107、10-106、102-106、103-106、104-106、105-106、10-105、102-105、103-105、104-105、10-104、102-104、103-104、10-103、102-103或10-102个细菌。在一些实施方案中，本文公开的组合物包含每毫升总计10-1013、102-1013、103-1013、104-1013、105-1013、106-1013、107-1013、108-1013、109-1013、1010-1013、1011-1013、1012-1013、10-1012、102-1012、103-1012、104-1012、105-1012、106-1012、107-1012、108-1012、109-1012、1010-1012、1011-1012、10-1011、102-1011、103-1013、104-1013、105-1013、106-1013、107-1011、108-1011、109-1011、1010-1011、10-1010、102-1010、103-1010、104-1010、105-1010、106-1010、107-1010、108-1010、109-1010、10-109、102-109、103-109、104-109、105-109、106-109、107-109、108-109、10-108、102-108、103-108、104-108、105-108、106-108、107-108、10-107、102-107、103-107、104-107、105-107、106-107、10-106、102-106、103-106、104-106、105-106、10-105、102-105、103-105、104-105、10-104、102-104、103-104、10-103、102-103或10-102个细菌。
在一些实施方案中，本文公开的细菌组合物包含10-1013、102-1013、103-1013、104-1013、105-1013、106-1013、107-1013、108-1013、109-1013、1010-1013、1011-1013、1012-1013、10-1012、102-1012、103-1012、104-1012、105-1012、106-1012、107-1012、108-1012、109-1012、1010-1012、1011-1012、10-1011、102-1011、103-1013、104-1013、105-1013、106-1013、107-1011、108-1011、109-1011、1010-1011、10-1010、102-1010、103-1010、104-1010、105-1010、106-1010、107-1010、108-1010、109-1010、10-109、102-109、103-109、104-109、105-109、106-109、107-109、108-109、10-108、102-108、103-108、104-108、105-108、106-108、107-108、10-107、102-107、103-107、104-107、105-107、106-107、10-106、102-106、103-106、104-106、105-106、10-105、102-105、103-105、104-105、10-104、102-104、103-104、10-103、102-103或10-102个菌落形成单位的细菌。在一些实施方案中，本文公开的组合物包含每毫升10-1013、102-1013、103-1013、104-1013、105-1013、106-1013、107-1013、108-1013、109-1013、1010-1013、1011-1013、1012-1013、10-1012、102-1012、103-1012、104-1012、105-1012、106-1012、107-1012、108-1012、109-1012、1010-1012、1011-1012、10-1011、102-1011、103-1013、104-1013、105-1013、106-1013、107-1011、108-1011、109-1011、1010-1011、10-1010、102-1010、103-1010、104-1010、105-1010、106-1010、107-1010、108-1010、109-1010、10-109、102-109、103-109、104-109、105-109、106-109、107-109、108-109、10-108、102-108、103-108、104-108、105-108、106-108、107-108、10-107、102-107、103-107、104-107、105-107、106-107、10-106、102-106、103-106、104-106、105-106、10-105、102-105、103-105、104-105、10-104、102-104、103-104、10-103、102-103或10-102个菌落形成单位的细菌。
在本文提供的细菌组合物的一些实施方案中，所述组合物包括每毫升至少1x108个菌落形成单位的细菌。
本文所述的方法涉及速冻细菌组合物。如本文所用，术语“速冻”，也称为“急冻”，是指细菌组合物的温度快速地降低到-70℃以下的温度的过程，例如，使用液氮或干冰进行。在一些实施方案中，速冻涉及使细菌组合物与超冷表面接触。在一些实施方案中，速冻涉及使细菌组合物与含有液氮或干冰的容器接触。在一些实施方案中，速冻涉及使细菌组合物与液氮接触。在一些实施方案中，将细菌组合物施加到液氮形成液滴。在一些实施方案中，从液氮收集细菌组合物的液滴。在一些实施方案中，从液氮收集细菌组合物的液滴并转移到用于冻干的容器(例如，冻干小瓶)。
包括细菌菌株的组合物可以被冻干以保存细菌菌株。在一些实施方案中，所述组合物或所述组合物的细菌菌株被冻干。冻干组合物(包括包含细菌的组合物)的方法，在本领域中是已知的。参见，例如，美国专利3,261,761；美国专利4,205,132；PCT公开号WO2014/029578、WO 2012/098358、WO2012/076665和WO2012/088261，它们的全部内容通过引用并入本文。然而，发现允许冻干某种细菌诸如厌氧细菌的条件一直有挑战性。参见，例如，Peiren等人、Appl Microbol Biotechnol(2015)99:3559。应当认识到，在一个方面，本文提供的稳定化和保存的方法允许产生允许制造细菌菌株、特别是厌氧细菌菌株的组合物的能力。本文所述的方法导致冻干的细菌组合物的存活率增加。
本公开的各个方面提供了制备保存的细菌组合物的方法，涉及将细菌组合物速冻并将速冻的细菌组合物冻干以产生保存的细菌组合物。通常，冻干是保存材料诸如细菌的干燥过程，涉及冷冻-干燥。通过冷冻材料，然后将材料置于真空下，期间冰经历升华，将水从材料中去除。在一些实施方案中，冻干循环涉及冷冻、初级干燥和二级干燥的步骤。术语“温度速变率”是指在冻干循环的步骤之间调整温度的速率。
在一些实施方案中，冻干循环包括初级干燥步骤和二级干燥步骤，每个步骤涉及使细菌组合物承受期望的温度和压力。
在一些实施方案中，初级干燥步骤包括使速冻的细菌组合物承受约-30℃至+10℃、-20℃至0℃、-15℃至-5℃、或-12℃至-7℃的温度。在一些实施方案中，初级干燥步骤包括使速冻的细菌组合物承受约-30℃、-29℃、-28℃、-27℃、-26℃、-25℃、-24℃、-23℃、-22℃、-21℃、-20℃、-19℃、-18℃、-17℃、-16℃、-15℃、-14℃、-13℃、-12℃、-11℃、-10℃、-9℃、-8℃、-7℃、-6℃、-5℃、-4℃、-3℃、-2℃、-1℃、0℃、+1℃、+2℃、+3℃、+4℃、+5℃、+6℃、+7℃、+8℃、+9℃或+10℃的温度。在一些实施方案中，初级干燥步骤包括使速冻的细菌组合物承受约-10℃的温度。
在一些实施方案中，初级干燥步骤包括使速冻的细菌组合物承受约50mTorr至90mTorr、60mTorr至80mTorr、65mTorr至75mTorr、60mTorr至70mTorr、55mTorr至75mTorr或70mTorr至85mTorr的压力。在一些实施方案中，初级干燥步骤包括使速冻的细菌组合物承受约50mTorr、51mTorr、52mTorr、53mTorr、54mTorr、55mTorr、56mTorr、57mTorr、58mTorr、59mTorr、60mTorr、61mTorr、62mTorr、63mTorr、64mTorr、65mTorr、66mTorr、67mTorr、68mTorr、69mTorr、70mTorr、71mTorr、72mTorr、73mTorr、74mTorr、75mTorr、76mTorr、77mTorr、78mTorr、79mTorr、80mTorr、81mTorr、82mTorr、83mTorr、84mTorr、85mTorr、86mTorr、87mTorr、88mTorr、89mTorr或90mTorr的压力。在一些实施方案中，初级干燥步骤包括使速冻的细菌组合物承受约70mTorr的压力。
在一些实施方案中，初级干燥步骤包括使速冻的细菌组合物承受约-10℃的温度和约70mTorr的压力。
在一些实施方案中，二级干燥步骤包括使速冻的细菌组合物承受约0℃至+40℃、+10℃至+30℃、+15℃至+25℃或+17℃至+22℃的温度。在一些实施方案中，二级干燥步骤包括使速冻的细菌组合物承受约0℃、+1℃、+2℃、+3℃、+4℃、+5℃、+6℃、+7℃、+8℃、+9℃、+10℃、+11℃、+12℃、+13℃、+14℃、+15℃、+16℃、+17℃、+18℃、+19℃、+20℃、+21℃、+22℃、+23℃、+24℃、+25℃、+26℃、+27℃、+28℃、+29℃、+30℃、+31℃、+32℃、+33℃、+34℃、+35℃、+36℃、+37℃、+38℃、+39℃或+40℃的温度。在一些实施方案中，二级干燥步骤包括使速冻的细菌组合物承受约+20℃的温度。
在一些实施方案中，二级干燥步骤包括使速冻的细菌组合物承受约50mTorr至90mTorr、60mTorr至80mTorr、65mTorr至75mTorr、60mTorr至70mTorr、55mTorr至75mTorr或70mTorr至85mTorr的压力。在一些实施方案中，二级干燥步骤包括使速冻的细菌组合物承受约50mTorr、51mTorr、52mTorr、53mTorr、54mTorr、55mTorr、56mTorr、57mTorr、58mTorr、59mTorr、60mTorr、61mTorr、62mTorr、63mTorr、64mTorr、65mTorr、66mTorr、67mTorr、68mTorr、69mTorr、70mTorr、71mTorr、72mTorr、73mTorr、74mTorr、75mTorr、76mTorr、77mTorr、78mTorr、79mTorr、80mTorr、81mTorr、82mTorr、83mTorr、84mTorr、85mTorr、86mTorr、87mTorr、88mTorr、89mTorr或90mTorr的压力。在一些实施方案中，初级干燥步骤包括使速冻的细菌组合物承受约70mTorr的压力。
在一些实施方案中，初级干燥步骤包括使速冻的细菌组合物承受约+20℃的温度和约70mTorr的压力。
在一些实施方案中，冻干循环包括具有0.5℃/min至3℃/min的温度速变率的一个或多个步骤。在一些实施方案中，温度速变率为0.5℃/min、0.6℃/min、0.7℃/min、0.8℃/min、0.9℃/min、1.0℃/min、1.1℃/min、1.2℃/min、1.3℃/min、1.4℃/min、1.5℃/min、1.6℃/min、1.7℃/min、1.8℃/min、1.9℃/min、2.0℃/min、2.1℃/min、2.2℃/min、2.3℃/min、2.4℃/min、2.5℃/min、2.6℃/min、2.7℃/min、2.8℃/min、2.9℃/min或3.0℃/min。在一些实施方案中，冻干循环包括具有1.0℃/min的温度速变率的一个或多个步骤。在一些实施方案中，冻干循环包括具有2.5℃/min的温度速变率的一个或多个步骤。
在一些实施方案中，冻干循环的每个步骤具有0.5℃/min至3℃/min的温度速变率。在一些实施方案中，温度速变率为0.5℃/min、0.6℃/min、0.7℃/min、0.8℃/min、0.9℃/min、1.0℃/min、1.1℃/min、1.2℃/min、1.3℃/min、1.4℃/min、1.5℃/min、1.6℃/min、1.7℃/min、1.8℃/min、1.9℃/min、2.0℃/min、2.1℃/min、2.2℃/min、2.3℃/min、2.4℃/min、2.5℃/min、2.6℃/min、2.7℃/min、2.8℃/min、2.9℃/min或3.0℃/min。在一些实施方案中，冻干循环的每个步骤具有1.0℃/min的温度速变率。在一些实施方案中，冻干循环的每个步骤具有2.5℃/min的温度速变率。
在一些实施方案中，保存的细菌组合物在冻干后承受储存条件持续一段时间。在一些实施方案中，保存的细菌组合物承受约-100℃至-60℃、-90℃至-70℃、-95℃至-75℃、-85℃至-75℃、-85℃至-70℃或-85℃至-65℃的温度。在一些实施方案中，保存的细菌组合物在冻干后承受约-100℃、-99℃、-98℃、-97℃、-96℃、-95℃、-94℃、-93℃、-92℃、-91℃、-90℃、-89℃、-88℃、-87℃、-86℃、-85℃、-84℃、-83℃、-82℃、-81℃、-80℃、-79℃、-78℃、-77℃、-76℃、-75℃、-74℃、-73℃、-72℃、-71℃、-70℃、-69℃、-68℃、-67℃、-66℃、-65℃、-64℃、-63℃、-62℃、-61℃或-60℃的温度。在一些实施方案中，保存的细菌组合物在冻干后承受约-80℃的温度。在一些实施方案中，保存的细菌组合物在冻干后承受约-80℃的温度持续一段时间。在一些实施方案中，所述一段时间为至少1周、至少2周、至少4周、至少2个月、至少3个月、至少6个月或至少1年或更长时间。
在一些实施方案中，包括本文提供的细菌菌株的固体组合物可以配制作为药物组合物用于施用，例如，通过对冻干产品复配进行施用。术语“药物组合物”如本文所用意指由本文提供的固体制剂和一种或多种药学上可接受的赋形剂的混合或组合形成的产物。
“可接受的”赋形剂是指必须与活性成分(例如，细菌菌株)相容并且对施用的受试者无害的赋形剂。在一些实施方案中，基于组合物的预期施用途径选择药学上可接受的赋形剂，例如，用于经口或经鼻施用的组合物可以包含与经直肠施用的组合物不同的药学上可接受的赋形剂。赋形剂的实例包括无菌水、生理盐水、溶剂、基材、乳化剂、混悬剂、表面活性剂、稳定剂、调味剂，芳族化合物、赋形剂、媒介物、防腐剂、粘合剂、稀释剂、渗透压调节剂、舒缓剂、填充剂、崩解剂、缓冲剂、包衣剂、润滑剂、着色剂、增甜剂、增稠剂和增溶剂。
在一个方面，本公开提供了允许保存细菌的组合物。在一些实施方案中，所述细菌是厌氧细菌。可用于保存细菌的组合物在本文也称为稳定化组合物。制备保存的细菌组合物的方法，如本文所用，是指在速冻和冻干后提高其中的细菌存活率并允许细菌复苏的方法。所述组合物的稳定或保存功能性可以通过将两个特定时间点(例如，在第1天和在第100天)时有活力细菌的数目(例如，菌落形成单位)进行比较来评估。在一些实施方案中，所述组合物的保存功能性通过将在第一时间点时的有活力细菌的数目(例如，菌落形成单位)与在第二时间点时的有活力细菌的数目(例如，菌落形成单位)比较来评估。
在一些实施方案中，所述组合物的保存功能性通过将速冻前的有活力细菌的数目(例如，菌落形成单位)与在速冻后的有活力细菌的数目(例如，菌落形成单位)比较来评估。在一些实施方案中，所述组合物的保存功能性通过将速冻前的有活力细菌的数目(例如，菌落形成单位)与在冻干后的有活力细菌的数目(例如，菌落形成单位)比较来评估。在一些实施方案中，所述组合物的保存功能性通过将速冻后/冻干前的有活力细菌的数目(例如，菌落形成单位)与在冻干后的有活力细菌的数目(例如，菌落形成单位)比较来评估。
在一些实施方案中，所述组合物的保存功能性通过将速冻前的有活力细菌的数目(例如，菌落形成单位)与在使所述组合物承受储存条件持续一段时间后的有活力细菌的数目(例如，菌落形成单位)比较来评估。在一些实施方案中，所述组合物的保存功能性通过将速冻后/冻干前的有活力细菌的数目(例如，菌落形成单位)与在使所述组合物承受储存条件持续一段时间后的有活力细菌的数目(例如，菌落形成单位)比较来评估。在一些实施方案中，所述组合物的保存功能性通过将冻干后的有活力细菌的数目(例如，菌落形成单位)与在使所述组合物承受储存条件持续一段时间后的有活力细菌的数目(例如，菌落形成单位)比较来评估。
如果在两个时间点时或在一段时间内菌落形成单位的数目相同或基本上相同，则所述组合物是完美的保存方法。两个时间点之间或在一段时间内菌落形成单位的数目的大幅减少指示该方法不是良好的保存组合物。
在一些实施方案中，本文提供的方法允许在一段时间内复苏至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至多达100％的菌落形成单位。在一些实施方案中，所述一段时间为至少1周、至少2周、至少4周、至少2个月、至少3个月、至少6个月或至少1年或更长时间。在一些实施方案中，通过将一段时间内在第一时间点时细菌(例如，细菌菌株或全部细菌)的菌落形成单位的数目相对于在第二时间点时细菌(例如，细菌菌株或全部细菌)的菌落形成单位的数目进行比较确定复苏的菌落形成单位的百分比或保存水平。例如，细菌的50％复苏或保存50％表示在一段时间内一半细菌保持活力；100％复苏表示在一段时间内全部(或基本上全部)细菌保持活力。
在一些实施方案中，本文提供的方法导致保存的细菌组合物在一段时间内的存活率水平为至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至多达100％的菌落形成单位。在一些实施方案中，所述一段时间为至少1周、至少2周、至少4周、至少2个月、至少3个月、至少6个月或至少1年或更长时间。在一些实施方案中，通过将一段时间内在第一时间点时细菌(例如，细菌菌株或全部细菌)的菌落形成单位的数目相对于在第二时间点时细菌(例如，细菌菌株或全部细菌)的菌落形成单位的数目进行比较确定存活率水平。例如，50％存活率表示在一段时间内一半细菌保持活力；100％存活率表示在一段时间内全部(或基本上全部)细菌保持活力。
在一些实施方案中，与涉及在冷冻-干燥托盘(例如，
Figure BDA0003615795060000191
冷冻-干燥托盘)中冷冻和冻干细菌组合物的方法相比，本文提供的方法导致保存的细菌组合物具有提高的存活率。在一些实施方案中，与涉及在冷冻-干燥托盘中冷冻和冻干细菌组合物的方法相比，本文所述的方法导致保存的细菌组合物具有提高至少1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、150倍、200倍、500倍或更多倍的存活率。
SEQ ID NO:1菌株1 16S核糖体RNA 鲍氏梭菌
Figure BDA0003615795060000201
SEQ ID NO:2菌株2 16S核糖体RNA Anaerotruncus colihominis
Figure BDA0003615795060000202
SEQ ID NO:3菌株3 16S核糖体RNA 扭链瘤胃球菌
Figure BDA0003615795060000211
SEQ ID NO:4菌株4 16S核糖体RNA 共生梭菌
Figure BDA0003615795060000212
SEQ ID NO:5菌株5 16S核糖体RNA 生产布劳特氏菌
Figure BDA0003615795060000221
SEQ ID NO:6菌株6 16S核糖体RNA Dorea Longicatena
Figure BDA0003615795060000222
SEQ ID NO:7菌株7 16S核糖体RNA 丹毒丝菌科细菌
Figure BDA0003615795060000231
SEQ ID NO:8菌株8 16S核糖体RNA Subdoligranulum spp
Figure BDA0003615795060000232
本发明在其应用中不限于下面描述中所给出的或在附图中图示的组分的构造和配置方式的细节。本发明能够存在其他实施方案并且能够以各种方式实施或执行。此外，本文所用的用语和术语用于描述的目的，并且不应当被认为是限制。“包括”、“包含”或“具有”、“含有”、“涉及”以及在本文中它们的变化形式的使用意在涵盖后面列举的条目及其等效形式以及额外的条目。
除非本文中另外定义，否则结合本公开使用的科学和技术术语应当具有本领域普通技术人员普遍理解的含义。此外，除非上下文另外需要，否则单数术语应当包括复数，且复数术语应当包括单数。本公开的方法和技术通常根据本领域中公知的常规方法执行。通常，本文所述的结合生物化学、酶学、分子和细胞生物学、微生物学、病毒学、细胞或组织培养、遗传学以及蛋白和核酸化学使用的命名和它们的技术是本领域中众所周知的和普遍使用的。本公开的方法和技术通常根据本领域中众所周知的常规方法以及如在本说明书中自始至终引用并讨论的各种一般的和更具体的参考文献中所述执行，除非另外指明。
本发明进一步通过下面的实施例说明，所述实施例不应当解释为是进一步的限制。在本申请中自始至终引用的所有参考文献(包括文献参考、授权专利、公开的专利申请和同时待审的专利申请)的全部内容明确地通过引用并入本文，尤其是上文提到的教导。然而，对任何参考文献的引用不意在承认所述参考文献是现有技术。
实施例
进行研究以测试冻干前配制的培养物的速冻液滴。测试证明了与在冷冻-干燥托盘(例如,
Figure BDA0003615795060000241
冷冻-干燥托盘)中冷冻和冻干的细菌菌株相比，在冷冻和冻干后细菌菌株的存活率提高。除了存活率提高以外，冷冻和保存冷冻的沉淀物的能力还允许以更大的灵活性制备保存的细菌产品。
细菌培养物接种在生长培养基中并在37℃厌氧地孵育。一旦光密度(OD)超过基于待测试的菌株的目标阈值，则将培养物离心并重悬在配制缓冲液中。使用的配制缓冲液含有70g/L蔗糖、1g/L酵母提取物、0.5g/L L-半胱氨酸、20mM组氨酸和0.1g/L氯化镁。用于VE303-1、VE303-2和VE303-6的配制缓冲液还含有0.5g/L焦亚硫酸钠。用于传统冷冻-干燥法的配制缓冲液是相同的，不同之处在于它不含有氯化镁。再次将培养物离心，弃去上清液，再次悬浮在配制缓冲液中。培养物液滴通过使用1mL移液器将其加入至液氮浴中被速冻。使用筛子收集冷冻的液滴并等分至置于干冰上的冻干小瓶中。将小瓶转移到搁板温度为-50℃的冻干机中。所有小瓶在-50℃保持4小时。初级干燥在-10℃和70mTorr进行。二级干燥在+20℃和70mTorr进行。然后将小瓶从冻干机移出并在-80℃保存直至它们能够进行测试。
对于每种细菌菌株，对于两种方法中的每种，将收获样品、冻干-复苏样品(数据未显示)和冻干后样品铺板以确定在方法的每个阶段时细菌菌株的存活率。通过在还原磷酸盐缓冲盐水(PBS)中制备所有样品的连续稀释液来制备平板。将样品的100μL等分试样混合在900μL 1X PBS中。通过将来自前面稀释液中的100μL混合在900μL PBS中制备连续稀释液。进行该步骤以产生10-1至10-7的稀释液。10-5、10-6、和10-7稀释液用来将100μL接种至巧克力琼脂平板上。使用无菌珠将接种的稀释液铺展开，并在37℃厌氧孵育>48小时。统计每个平板上的菌落以确定每个样品的存活率。对于冻干后样品，将0.1克材料在PBS中再水化，然后稀释和铺板以确定存活率。
每种细菌菌株的冻干后存活率与使用在冷冻-干燥托盘(例如，
Figure BDA0003615795060000251
Figure BDA0003615795060000252
冷冻-干燥托盘)中冷冻细菌培养物的传统方法的各个细菌菌株的冻干后存活率进行比较(图1)。细菌菌株VE303-06证明存活率的提高最高(从使用冷冻-干燥托盘的3.9％增加至使用本文所述的方法的20％)。
序列表
<110> 韦丹塔生物科学股份有限公司（Vedanta Biosciences, Inc.）
<120> 用于保存细菌的方法和组合物
<130> P0745.70021WO00
<140> 尚未分配
<141> 分配后同时具有
<150> US 62/901,205
<151> 2019-09-16
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1530
<212> DNA
<213> 鲍氏梭菌（Clostridium bolteae）
<400> 1
atgagagttt gatcctggct caggatgaac gctggcggcg tgcctaacac atgcaagtcg 60
aacgaagcaa ttaaaatgaa gttttcggat ggatttttga ttgactgagt ggcggacggg 120
tgagtaacgc gtggataacc tgcctcacac tgggggataa cagttagaaa tgactgctaa 180
taccgcataa gcgcacagta ccgcatggta cggtgtgaaa aactccggtg gtgtgagatg 240
gatccgcgtc tgattagcca gttggcgggg taacggccca ccaaagcgac gatcagtagc 300
cgacctgaga gggtgaccgg ccacattggg actgagacac ggcccaaact cctacgggag 360
gcagcagtgg ggaatattgc acaatgggcg aaagcctgat gcagcgacgc cgcgtgagtg 420
aagaagtatt tcggtatgta aagctctatc agcagggaag aaaatgacgg tacctgacta 480
agaagccccg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtagggggc aagcgttatc 540
cggatttact gggtgtaaag ggagcgtaga cggcgaagca agtctgaagt gaaaacccag 600
ggctcaaccc tgggactgct ttggaaactg ttttgctaga gtgtcggaga ggtaagtgga 660
attcctagtg tagcggtgaa atgcgtagat attaggagga acaccagtgg cgaaggcggc 720
ttactggacg ataactgacg ttgaggctcg aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac 780
cctggtagtc cacgccgtaa acgatgaatg ctaggtgttg gggggcaaag cccttcggtg 840
ccgtcgcaaa cgcagtaagc attccacctg gggagtacgt tcgcaagaat gaaactcaaa 900
ggaattgacg gggacccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa 960
gaaccttacc aagtcttgac atcctcttga ccggcgtgta acggcgcctt cccttcgggg 1020
caagagagac aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt 1080
cccgcaacga gcgcaaccct tatccttagt agccagcagg taaagctggg cactctaggg 1140
agactgccag ggataacctg gaggaaggtg gggatgacgt caaatcatca tgccccttat 1200
gatttgggct acacacgtgc tacaatggcg taaacaaagg gaagcaagac agtgatgtgg 1260
agcaaatccc aaaaataacg tcccagttcg gactgtagtc tgcaacccga ctacacgaag 1320
ctggaatcgc tagtaatcgc gaatcagaat gtcgcggtga atacgttccc gggtcttgta 1380
cacaccgccc gtcacaccat gggagtcagc aacgcccgaa gtcagtgacc caactcgcaa 1440
gagagggagc tgccgaaggc ggggcaggta actggggtga agtcgtaaca aggtagccgt 1500
atcggaaggt gcggctggat cacctccttt 1530
<210> 2
<211> 1522
<212> DNA
<213> Anaerotruncus colihominis
<400> 2
tcaaagagtt tgatcctggc tcaggacgaa cgctggcggc gcgcctaaca catgcaagtc 60
gaacggagct tacgttttga agttttcgga tggatgaatg taagcttagt ggcggacggg 120
tgagtaacac gtgagcaacc tgcctttcag agggggataa cagccggaaa cggctgctaa 180
taccgcatga tgttgcgggg gcacatgccc ctgcaaccaa aggagcaatc cgctgaaaga 240
tgggctcgcg tccgattagc cagttggcgg ggtaacggcc caccaaagcg acgatcggta 300
gccggactga gaggttgaac ggccacattg ggactgagac acggcccaga ctcctacggg 360
aggcagcagt gggggatatt gcacaatggg cgaaagcctg atgcagcgac gccgcgtgag 420
ggaagacggt cttcggattg taaacctctg tctttgggga agaaaatgac ggtacccaaa 480
gaggaagctc cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggga gcaagcgttg 540
tccggaatta ctgggtgtaa agggagcgta ggcgggatgg caagtagaat gttaaatcca 600
tcggctcaac cggtggctgc gttctaaact gccgttcttg agtgaagtag aggcaggcgg 660
aattcctagt gtagcggtga aatgcgtaga tattaggagg aacaccagtg gcgaaggcgg 720
cctgctgggc tttaactgac gctgaggctc gaaagcgtgg ggagcaaaca ggattagata 780
ccctggtagt ccacgccgta aacgatgatt actaggtgtg gggggactga ccccttccgt 840
gccgcagtta acacaataag taatccacct ggggagtacg gccgcaaggt tgaaactcaa 900
aggaattgac gggggcccgc acaagcagtg gagtatgtgg tttaattcga agcaacgcga 960
agaaccttac caggtcttga catcggatgc atagcctaga gataggtgaa gcccttcggg 1020
gcatccagac aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt 1080
cccgcaacga gcgcaaccct tattattagt tgctacgcaa gagcactcta atgagactgc 1140
cgttgacaaa acggaggaag gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg 1200
gctacacacg tactacaatg gcactaaaac agagggcggc gacaccgcga ggtgaagcga 1260
atcccgaaaa agtgtctcag ttcagattgc aggctgcaac ccgcctgcat gaagtcggaa 1320
ttgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc 1380
gcccgtcaca ccatgggagt cggtaacacc cgaagccagt agcctaaccg caaggggggc 1440
gctgtcgaag gtgggattga tgactggggt gaagtcgtaa caaggtagcc gtatcggaag 1500
gtgcggctgg atcacctcct tt 1522
<210> 3
<211> 1529
<212> DNA
<213> 扭链瘤胃球菌（Ruminococcus torques）
<400> 3
tacgagagtt tgatcctggc tcaggatgaa cgctggcggc gtgcctaaca catgcaagtc 60
gagcgaagcg ctgttttcag aatcttcgga ggaagaggac agtgactgag cggcggacgg 120
gtgagtaacg cgtgggcaac ctgcctcata cagggggata acagttagaa atgactgcta 180
ataccgcata agcgcacagg accgcatggt gtagtgtgaa aaactccggt ggtatgagat 240
ggacccgcgt ctgattaggt agttggtggg gtaaaggcct accaagccga cgatcagtag 300
ccgacctgag agggtgaccg gccacattgg gactgagaca cggcccaaac tcctacggga 360
ggcagcagtg gggaatattg cacaatgggg gaaaccctga tgcagcgacg ccgcgtgaag 420
gaagaagtat ttcggtatgt aaacttctat cagcagggaa gaaaatgacg gtacctgagt 480
aagaagcacc ggctaaatac gtgccagcag ccgcggtaat acgtatggtg caagcgttat 540
ccggatttac tgggtgtaaa gggagcgtag acggataggc aagtctggag tgaaaaccca 600
gggctcaacc ctgggactgc tttggaaact gcagatctgg agtgccggag aggtaagcgg 660
aattcctagt gtagcggtga aatgcgtaga tattaggagg aacaccagtg gcgaaggcgg 720
cttactggac ggtgactgac gttgaggctc gaaagcgtgg ggagcaaaca ggattagata 780
ccctggtagt ccacgccgta aacgatgact actaggtgtc ggtgtgcaaa gcacatcggt 840
gccgcagcaa acgcaataag tagtccacct ggggagtacg ttcgcaagaa tgaaactcaa 900
aggaattgac ggggacccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcga 960
agaaccttac ctggtcttga catccggatg acgggcgagt aatgtcgccg tcccttcggg 1020
gcgtccgaga caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag 1080
tcccgcaacg agcgcaaccc ttatcttcag tagccagcat ataaggtggg cactctggag 1140
agactgccag ggagaacctg gaggaaggtg gggatgacgt caaatcatca tgccccttat 1200
ggccagggct acacacgtgc tacaatggcg taaacaaagg gaagcgagag ggtgacctgg 1260
agcgaatccc aaaaataacg tctcagttcg gattgtagtc tgcaactcga ctacatgaag 1320
ctggaatcgc tagtaatcgc ggatcagcat gccgcggtga atacgttccc gggtcttgta 1380
cacaccgccc gtcacaccat gggagtcagt aacgcccgaa gccagtgacc caaccttaga 1440
ggagggagct gtcgaaggcg ggacggataa ctggggtgaa gtcgtaacaa ggtagccgta 1500
tcggaaggtg cggctggatc acctccttt 1529
<210> 4
<211> 1527
<212> DNA
<213> 共生梭菌（Clostridium symbiosum）
<400> 4
atgagagttt gatcctggct caggatgaac gctggcggcg tgcctaacac atgcaagtcg 60
aacgaagcga tttaacggaa gttttcggat ggaagttgaa ttgactgagt ggcggacggg 120
tgagtaacgc gtgggtaacc tgccttgtac tgggggacaa cagttagaaa tgactgctaa 180
taccgcataa gcgcacagta tcgcatgata cagtgtgaaa aactccggtg gtacaagatg 240
gacccgcgtc tgattagcta gttggtaagg taacggctta ccaaggcgac gatcagtagc 300
cgacctgaga gggtgaccgg ccacattggg actgagacac ggcccaaact cctacgggag 360
gcagcagtgg ggaatattgc acaatgggcg aaagcctgat gcagcgacgc cgcgtgagtg 420
aagaagtatt tcggtatgta aagctctatc agcagggaag aaaatgacgg tacctgacta 480
agaagccccg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtagggggc aagcgttatc 540
cggatttact gggtgtaaag ggagcgtaga cggtaaagca agtctgaagt gaaagcccgc 600
ggctcaactg cgggactgct ttggaaactg tttaactgga gtgtcggaga ggtaagtgga 660
attcctagtg tagcggtgaa atgcgtagat attaggagga acaccagtgg cgaaggcgac 720
ttactggacg ataactgacg ttgaggctcg aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac 780
cctggtagtc cacgccgtaa acgatgaata ctaggtgttg gggagcaaag ctcttcggtg 840
ccgtcgcaaa cgcagtaagt attccacctg gggagtacgt tcgcaagaat gaaactcaaa 900
ggaattgacg gggacccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa 960
gaaccttacc aggtcttgac atcgatccga cgggggagta acgtcccctt cccttcgggg 1020
cggagaagac aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt 1080
cccgcaacga gcgcaaccct tattctaagt agccagcggt tcggccggga actcttggga 1140
gactgccagg gataacctgg aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcatcat gccccttatg 1200
atctgggcta cacacgtgct acaatggcgt aaacaaagag aagcaagacc gcgaggtgga 1260
gcaaatctca aaaataacgt ctcagttcgg actgcaggct gcaactcgcc tgcacgaagc 1320
tggaatcgct agtaatcgcg aatcagaatg tcgcggtgaa tacgttcccg ggtcttgtac 1380
acaccgcccg tcacaccatg ggagtcagta acgcccgaag tcagtgaccc aaccgcaagg 1440
agggagctgc cgaaggcggg accgataact ggggtgaagt cgtaacaagg tagccgtatc 1500
ggaaggtgcg gctggatcac ctccttt 1527
<210> 5
<211> 1531
<212> DNA
<213> 生产布劳特氏菌（Blautia producta）
<400> 5
atcagagagt ttgatcctgg ctcaggatga acgctggcgg cgtgcttaac acatgcaagt 60
cgagcgaagc acttaagtgg atctcttcgg attgaagctt atttgactga gcggcggacg 120
ggtgagtaac gcgtgggtaa cctgcctcat acagggggat aacagttaga aatggctgct 180
aataccgcat aagcgcacag gaccgcatgg tctggtgtga aaaactccgg tggtatgaga 240
tggacccgcg tctgattagc tagttggagg ggtaacggcc caccaaggcg acgatcagta 300
gccggcctga gagggtgaac ggccacattg ggactgagac acggcccaga ctcctacggg 360
aggcagcagt ggggaatatt gcacaatggg ggaaaccctg atgcagcgac gccgcgtgaa 420
ggaagaagta tctcggtatg taaacttcta tcagcaggga agaaaatgac ggtacctgac 480
taagaagccc cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtagggg gcaagcgtta 540
tccggattta ctgggtgtaa agggagcgta gacggaagag caagtctgat gtgaaaggct 600
ggggcttaac cccaggactg cattggaaac tgtttttcta gagtgccgga gaggtaagcg 660
gaattcctag tgtagcggtg aaatgcgtag atattaggag gaacaccagt ggcgaaggcg 720
gcttactgga cggtaactga cgttgaggct cgaaagcgtg gggagcaaac aggattagat 780
accctggtag tccacgccgt aaacgatgaa tactaggtgt cgggtggcaa agccattcgg 840
tgccgcagca aacgcaataa gtattccacc tggggagtac gttcgcaaga atgaaactca 900
aaggaattga cggggacccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg 960
aagaacctta ccaagtcttg acatccctct gaccggcccg taacggggcc ttcccttcgg 1020
ggcagaggag acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa 1080
gtcccgcaac gagcgcaacc cctatcctta gtagccagca ggtgaagctg ggcactctag 1140
ggagactgcc ggggataacc cggaggaagg cggggacgac gtcaaatcat catgcccctt 1200
atgatttggg ctacacacgt gctacaatgg cgtaaacaaa gggaagcgag acagcgatgt 1260
tgagcaaatc ccaaaaataa cgtcccagtt cggactgcag tctgcaactc gactgcacga 1320
agctggaatc gctagtaatc gcgaatcaga atgtcgcggt gaatacgttc ccgggtcttg 1380
tacacaccgc ccgtcacacc atgggagtca gtaacgcccg aagtcagtga cccaacctta 1440
caggagggag ctgccgaagg cgggaccgat aactggggtg aagtcgtaac aaggtagccg 1500
tatcggaagg tgcggctgga tcacctcctt t 1531
<210> 6
<211> 1529
<212> DNA
<213> Dorea longicatena
<400> 6
aacgagagtt tgatcctggc tcaggatgaa cgctggcggc gtgcttaaca catgcaagtc 60
gagcgaagca cttaagtttg attcttcgga tgaagacttt tgtgactgag cggcggacgg 120
gtgagtaacg cgtgggtaac ctgcctcata cagggggata acagttagaa atgactgcta 180
ataccgcata agaccacggt accgcatggt acagtggtaa aaactccggt ggtatgagat 240
ggacccgcgt ctgattaggt agttggtggg gtaacggcct accaagccga cgatcagtag 300
ccgacctgag agggtgaccg gccacattgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga 360
ggcagcagtg gggaatattg cacaatggag gaaactctga tgcagcgacg ccgcgtgaag 420
gatgaagtat ttcggtatgt aaacttctat cagcagggaa gaaaatgacg gtacctgact 480
aagaagcccc ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtaggggg caagcgttat 540
ccggatttac tgggtgtaaa gggagcgtag acggcacggc aagccagatg tgaaagcccg 600
gggctcaacc ccgggactgc atttggaact gctgagctag agtgtcggag aggcaagtgg 660
aattcctagt gtagcggtga aatgcgtaga tattaggagg aacaccagtg gcgaaggcgg 720
cttgctggac gatgactgac gttgaggctc gaaagcgtgg ggagcaaaca ggattagata 780
ccctggtagt ccacgccgta aacgatgact gctaggtgtc gggtggcaaa gccattcggt 840
gccgcagcta acgcaataag cagtccacct ggggagtacg ttcgcaagaa tgaaactcaa 900
aggaattgac ggggacccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcga 960
agaaccttac ctgatcttga catcccgatg accgcttcgt aatggaagct tttcttcgga 1020
acatcggtga caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag 1080
tcccgcaacg agcgcaaccc ctatcttcag tagccagcag gttaagctgg gcactctgga 1140
gagactgcca gggataacct ggaggaaggt ggggatgacg tcaaatcatc atgcccctta 1200
tgaccagggc tacacacgtg ctacaatggc gtaaacaaag agaagcgaac tcgcgagggt 1260
aagcaaatct caaaaataac gtctcagttc ggattgtagt ctgcaactcg actacatgaa 1320
gctggaatcg ctagtaatcg cagatcagaa tgctgcggtg aatacgttcc cgggtcttgt 1380
acacaccgcc cgtcacacca tgggagtcag taacgcccga agtcagtgac ccaaccgtaa 1440
ggagggagct gccgaaggtg ggaccgataa ctggggtgaa gtcgtaacaa ggtagccgta 1500
tcggaaggtg cggctggatc acctccttt 1529
<210> 7
<211> 1537
<212> DNA
<213> 丹毒丝菌科细菌（Erysipelotrichaceae bacterium）
<400> 7
atggagagtt tgatcctggc tcaggatgaa cgctggcggc atgcctaata catgcaagtc 60
gaacgaagtt tcgaggaagc ttgcttccaa agagacttag tggcgaacgg gtgagtaaca 120
cgtaggtaac ctgcccatgt gtccgggata actgctggaa acggtagcta aaaccggata 180
ggtatacaga gcgcatgctc agtatattaa agcgcccatc aaggcgtgaa catggatgga 240
cctgcggcgc attagctagt tggtgaggta acggcccacc aaggcgatga tgcgtagccg 300
gcctgagagg gtaaacggcc acattgggac tgagacacgg cccaaactcc tacgggaggc 360
agcagtaggg aattttcgtc aatgggggaa accctgaacg agcaatgccg cgtgagtgaa 420
gaaggtcttc ggatcgtaaa gctctgttgt aagtgaagaa cggctcatag aggaaatgct 480
atgggagtga cggtagctta ccagaaagcc acggctaact acgtgccagc agccgcggta 540
atacgtaggt ggcaagcgtt atccggaatc attgggcgta aagggtgcgt aggtggcgta 600
ctaagtctgt agtaaaaggc aatggctcaa ccattgtaag ctatggaaac tggtatgctg 660
gagtgcagaa gagggcgatg gaattccatg tgtagcggta aaatgcgtag atatatggag 720
gaacaccagt ggcgaaggcg gtcgcctggt ctgtaactga cactgaggca cgaaagcgtg 780
gggagcaaat aggattagat accctagtag tccacgccgt aaacgatgag aactaagtgt 840
tggaggaatt cagtgctgca gttaacgcaa taagttctcc gcctggggag tatgcacgca 900
agtgtgaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagtat gtggtttaat 960
tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggcc ttgacatgga aacaaatacc ctagagatag 1020
ggggataatt atggatcaca caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg 1080
ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc ttgtcgcatg ttaccagcat caagttgggg 1140
actcatgcga gactgccggt gacaaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcatcat 1200
gccccttatg gcctgggcta cacacgtact acaatggcgg ccacaaagag cagcgacaca 1260
gtgatgtgaa gcgaatctca taaaggtcgt ctcagttcgg attgaagtct gcaactcgac 1320
ttcatgaagt cggaatcgct agtaatcgca gatcagcatg ctgcggtgaa tacgttctcg 1380
ggccttgtac acaccgcccg tcaaaccatg ggagtcagta atacccgaag ccggtggcat 1440
aaccgtaagg agtgagccgt cgaaggtagg accgatgact ggggttaagt cgtaacaagg 1500
tatccctacg ggaacgtggg gatggatcac ctccttt 1537
<210> 8
<211> 1530
<212> DNA
<213> Subdoligranulum spp
<400> 8
tattgagagt ttgatcctgg ctcaggatga acgctggcgg cgtgcttaac acatgcaagt 60
cgaacggggt gctcatgacg gaggattcgt ccaacggatt gagttaccta gtggcggacg 120
ggtgagtaac gcgtgaggaa cctgccttgg agaggggaat aacactccga aaggagtgct 180
aataccgcat gatgcagttg ggtcgcatgg ctctgactgc caaagattta tcgctctgag 240
atggcctcgc gtctgattag ctagtaggcg gggtaacggc ccacctaggc gacgatcagt 300
agccggactg agaggttgac cggccacatt gggactgaga cacggcccag actcctacgg 360
gaggcagcag tggggaatat tgggcaatgg gcgcaagcct gacccagcaa cgccgcgtga 420
aggaagaagg ctttcgggtt gtaaacttct tttgtcgggg acgaaacaaa tgacggtacc 480
cgacgaataa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc 540
gttatccgga tttactgggt gtaaagggcg tgtaggcggg attgcaagtc agatgtgaaa 600
actgggggct caacctccag cctgcatttg aaactgtagt tcttgagtgc tggagaggca 660
atcggaattc cgtgtgtagc ggtgaaatgc gtagatatac ggaggaacac cagtggcgaa 720
ggcggattgc tggacagtaa ctgacgctga ggcgcgaaag cgtggggagc aaacaggatt 780
agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga tggatactag gtgtgggggg tctgaccccc 840
tccgtgccgc agttaacaca ataagtatcc cacctgggga gtacgatcgc aaggttgaaa 900
ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagta tgtggtttaa ttcgaagcaa 960
cgcgaagaac cttaccaggg cttgacatcc cactaacgaa gcagagatgc attaggtgcc 1020
cttcggggaa agtggagaca ggtggtgcat ggttgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt 1080
gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctt attgttagtt gctacgcaag agcactctag 1140
cgagactgcc gttgacaaaa cggaggaagg tggggacgac gtcaaatcat catgcccctt 1200
atgtcctggg ccacacacgt actacaatgg tggttaacag agggaggcaa taccgcgagg 1260
tggagcaaat ccctaaaagc catcccagtt cggattgcag gctgaaaccc gcctgtatga 1320
agttggaatc gctagtaatc gcggatcagc atgccgcggt gaatacgttc ccgggccttg 1380
tacacaccgc ccgtcacacc atgagagtcg ggaacacccg aagtccgtag cctaaccgca 1440
aggagggcgc ggccgaaggt gggttcgata attggggtga agtcgtaaca aggtagccgt 1500
atcggaaggt gcggctggat cacctccttt 1530

Claims (22)

1.一种制备保存的细菌组合物的方法，所述方法包括：
将细菌组合物速冻，以及
将速冻的细菌组合物冻干以产生保存的细菌组合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述细菌组合物包含一种或多种细菌菌株。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述细菌组合物包含一种或多种厌氧细菌菌株。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述厌氧细菌菌株是严格厌氧细菌。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述细菌组合物包含属于梭菌(Clostridia)纲的一种或多种细菌菌株。
6.根据权利要求5所述的方法，其中一种或多种细菌菌株属于梭菌科(Clostridiaceae)。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述细菌包括属于梭菌属(Clostridium)的一种或多种细菌菌株。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述细菌组合物包含选自由下列各项组成的组中的一种或多种菌株：鲍氏梭菌(Clostridium bolteae)、Anaerotruncuscolihominis、肠道塞利单胞菌(Sellimonas intestinalis)、共生梭菌(Clostridiumsymbiosum)、生产布劳特氏菌(Blautia producta)、Dorea longicatena、无害梭菌(Clostridium innocuum)和Flavinofractor plautii。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述细菌组合物包含含有与选自由SEQID NO:1-8组成的组的核酸序列具有至少97％序列同一性的16S rDNA序列的一种或多种菌株。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，所述方法进一步包括洗涤所述细菌组合物并将所述细菌组合物重悬在配制缓冲液中。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述速冻通过使所述细菌组合物与超冷表面接触来进行。
12.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述速冻通过使所述细菌组合物与液氮接触来进行。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述细菌组合物具有对称形状。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述对称形状是对称的冷冻液滴。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，所述方法进一步包括使所述保存的细菌组合物经受-80℃的温度。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述冻干包括初级干燥步骤和二级干燥步骤。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述初级干燥步骤包括使所述速冻的细菌组合物经受-10℃的温度并处于70mTorr的压力下。
18.根据权利要求16或17所述的方法，其中所述二级干燥步骤包括使所述速冻的细菌组合物经受+20℃的温度并处于70mTorr的压力下。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，所述方法进一步包括培养所述细菌组合物。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，所述方法进一步包括确定冻干后所述保存的细菌组合物中的存活率水平。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述保存的细菌组合物在一段时间后的存活率水平是所述细菌的菌落形成单位的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％或至少40％。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述一段时间为至少1周、至少2周、至少4周、至少2个月、至少3个月、至少6个月或至少1年或更长时间。
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