JP2022548746A - B型肝炎表面抗原阻害剤の結晶形及びその使用 - Google Patents

B型肝炎表面抗原阻害剤の結晶形及びその使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、B型肝炎表面抗原阻害剤の結晶及びその製造方法、及びB型肝炎表面抗原阻害剤の製造における前記結晶形の使用である。【化1】JPEG2022548746000024.jpg34169

Description

発明の詳細な説明
本出願は出願日が2019年9月19である中国特許出願201910887908.1の優先権を主張する。本出願は上記の中国特許出願の全文を引用する。
〔技術分野〕
本発明はB型肝炎表面抗原阻害剤の結晶形及びその製造方法に関し、更にB型肝炎表面抗原阻害剤の製造における前記結晶形の使用を含む。
〔背景技術〕
B型肝炎と呼ばれるB型ウイルス性肝炎は、B型肝炎ウイルス(Hepatitis B Virus、略してHBV)による体の感染によって引き起こされる病気である。B型肝炎ウイルスは、主に肝細胞に存在し、肝細胞に損傷を与え、肝細胞の炎症、壊死、線維化を引き起こす肝指向性ウイルスである。B型ウイルス性肝炎には、急性と慢性の2種類がある。成人の急性B型肝炎のほとんどは、自体の免疫機構により治癒される。しかし、慢性B型肝炎(CHB)は世界的な健康保険の大きな課題となっており、慢性肝疾患、肝硬変(cirrhosis)及び肝細胞癌(HCC)を引き起こす主な原因でもある。世界中で20億人がB型慢性肝炎ウイルスに感染し、3億5千万人以上がB型肝炎を発症し、毎年60万人近くがB型慢性肝炎の合併症で死亡していると推定されている。中国はB型肝炎の発生率の高い地域であり、B型肝炎の患者が多く蓄積されており、深刻な被害をもたらしている。データによると、中国では現在約9,300万人がB型肝炎ウイルスに感染し、約2,000万人が慢性B型肝炎と診断され、そのうち10%~20%が肝硬変に発展する可能性があり、1%~5%が肝臓癌に発展する可能性がある。
B型肝炎の機能的治癒のキーポイントは、HBsAg(B型肝炎ウイルス表面抗原)を除去し、表面抗体を産生することである。HBsAgの定量化は、非常に重要な生物学的指標である。慢性的に感染した患者では、HBsAgの減少及びセロコンバージョンはめったに観察されなく、これは現在の治療法の終点である。
B型肝炎ウイルス(HBV)の表面抗原タンパク質は、HBVが肝細胞に侵入する過程で非常に重要な役割を果たしており、HBV感染の予防と治療に非常に重要な意義を持っている。表面抗原タンパク質には、共通のC末端S領域を共有する大(L)、中(M)、及び小(S)の表面抗原タンパク質を含む。それらは、異なる長さがリーディングフレームの3つのAUG開始コドンによって決定されるオープンリーディングフレームから発現される。前記3つの表面抗原タンパク質には、前S1/前S2/S、前S2/S、及びSドメインが含まれる。HBV表面抗原タンパク質は小胞体(ER)膜に組み込まれ、N末端のシグナル伝達配列によって開始される。これらはビリオンの基本構造を形成するだけではなく、球状や糸状のサブウイルス粒子(SVPs、HBsAg)を形成して、ER、宿主ER及びプレゴルジ装置で凝集し、SVPは多くのS表面抗原性タンパク質を含んでいる。Lタンパク質は、ウイルスの形態形成やヌクレオカプシドの相互作用に不可欠であるが、SVP形成には必要ない。前記のSVPはヌクレオカプシドが不足しているため、非感染性である。SVPsは、病気の進行、特にHBVに対する免疫応答に大きく関与しており、感染者の血液中には、SVPsの量はウイルスの少なくとも10,000倍であり、免疫系を捕捉し、B型肝炎ウイルスに対する体の免疫応答を弱めている。HBsAgもヒトの自然免疫を阻害し、多糖(LPS)及びIL-2によって誘導されるサイトカイン産生を阻害し、単球における樹状細胞のDC機能及びERK-1/2とc-JunN末端干渉キナーゼ-1/2に対するLPSの誘導活性を阻害する。特に、肝硬変及び肝細胞癌における疾患の進行は、持続的に分泌されるHBsAgにも大きく関連している。これらの研究成果はHBsAgが慢性肝炎の発症に重要な役割を果たしていることを明らかにした。
現在承認されている抗HBV薬は、主に免疫調節薬(インターフェロン-α及びペグインターフェロン-α-2α)及び抗ウイルス薬(ラミブジン、アデホビルジピボキシル、エンテカビル、ビブジン、テノホビル、クラブジンなど)である。ここで、抗ウイルス薬はヌクレオチド薬に属し、作用機序はHBV DNAの合成を阻害することであるが、HBsAgのレベルを直接低下させることはできない。長期治療と同様に、ヌクレオチドベースの薬物は、自然界で観察されたものと同様のHBsAgクリアランス率を示した。
既存の臨床治療法はHBsAgの低減効果が低いため、現在の臨床医学ではHBsAgを効果的に低減できる低分子経口投与阻害剤の開発が急務となっている。
Roche社は、B型肝炎の治療のためにRG7834という表面抗原阻害剤を開発し、グラウンドホッグ抗B型肝炎モデルにおける当該化合物の有効性:RG7834を単剤で使用した場合、2.57個logの表面抗原、1.7個logのHBV-DNAを低下させることを報道した。現在、特に慢性B型肝炎を予防又は治療するための薬剤とする、HBsAgを効果的に低減できる新しい化合物は依然として必要とされている。
〔発明の概要〕
本発明は、粉末X線回折スペクトルが下記の2θ角:6.30±0.20°、9.30±0.20°及び20.16±0.20°において特徴的な回折ピークを有する式(I)で表される化合物の結晶形Aを提供する。
Figure 2022548746000002
本発明の幾つかの実施の態様において、前記結晶形Aの粉末X線回折スペクトルは下記の2θ角:6.30±0.20°、9.30±0.20°、9.84±0.20°、18.68±0.20°、20.16±0.20°、23.06±0.20°、24.00±0.20°及び25.38±0.20°において特徴的な回折ピークを有する。
本発明の幾つかの実施の態様において、前記結晶形Aの粉末X線回折スペクトルは下記の2θ角:6.30±0.20°、9.30±0.20°、9.84±0.20°、12.84±0.20°、18.68±0.20°、20.16±0.20°、21.26±0.20°、23.06±0.20°、24.00±0.20°、25.38±0.20°において特徴的な回折ピークを有する。
本発明の幾つかの実施の態様において、前記結晶形Aの粉末X線回折スペクトルは以下の2θ角:6.302°、7.883°、9.301°、9.842°、12.838°、15.436°、16.580°、18.124°、18.680°、19.459°、20.161°、20.800°、21.262°、21.704°、23.057°、24.000°、24.837°、25.382°、26.244°、26.558°、27.740°、28.119°、28.827°、29.502°、29.880°、30.261°、30.762°、31.678°、32.595°、33.061°、34.347°、35.253°、35.738°、36.642°、38.619°及び39.558°において特徴的な回折ピークを有する。
本発明の幾つかの実施の態様において、前記結晶形AのXRPDスペクトルは図1に示された通りである。
本発明の幾つかの実施の態様において、前記結晶形AのXRPDスペクトル解析データは表1に示された通りである。
Figure 2022548746000003
本発明の幾つかの実施の態様において、前記結晶形Aの示差走査熱量曲線は224.58±3℃において吸熱ピークのピーク値を有する。
本発明の幾つかの実施の態様において、前記結晶形AのDSCスペクトルは図2に示された通りである。
本発明の幾つかの実施の態様において、前記結晶形Aの熱重量分析曲線は200.00±3℃の際に重量が0.127%減少し、250±3℃の際に重量が0.224%減少する。
本発明の幾つかの実施の態様において、前記結晶形AのTGAスペクトルは図3に示された通りである。
本発明は、式(I)で表される化合物の結晶形Aの製造方法を提供し、任意の形態の式(I)で表される化合物を、アルコール系溶媒、アセトン、酢酸エチル、アセトニトリル又はアルコール系溶媒、アセトン、アセトニトリル及び水に加え、所定の温度で所定の時間撹拌した後、濾過し、ケーキを乾燥させて結晶形Aを得る工程を含む。
本発明の幾つかの実施の態様において、前記アルコール系溶媒、アセトン、アセトニトリルと水の体積比は、1:5~3から選択される。
本発明の幾つかの実施の態様において、前記アルコール系溶媒、アセトン、アセトニトリルと水の体積比は、1:1~3から選択される。
本発明の幾つかの実施の態様において、前記アルコール系溶媒は、メタノール、エタノール、又はイソプロパノールから選択される。
本発明の幾つかの実施の態様において、前記攪拌温度は25℃~65℃から選択される。
本発明の幾つかの実施の態様において、前記攪拌時間は1時間~72時間から選択される。
本発明の幾つかの実施の態様において、前記式(I)で表される化合物と溶媒の重量比は、1:1~30から選択される。
本発明の幾つかの実施の態様において、前記式(I)で表される化合物と溶媒の重量比は、1:5~30から選択される。
本発明はまた、慢性B型肝炎を治療するための医薬の製造における前記式(I)で表される化合物、又は前記式(I)で表される化合物の結晶形Aの使用を提供する。
〔技術効果〕
本発明の化合物は、有意な抗B型肝炎ウイルス活性を有する。本発明の化合物は、シトクロムP450アイソザイムを阻害せず、薬物間相互作用のリスクが低いことを示し;ラット、ヒト及びマウスの3種における肝ミクロソームの安定性が優れており、化合物が容易に代謝されないことを示し;良好な曝露性と生物学的利用能を有し;単回投与による神経毒性試験において忍容性が良い。
本発明の化合物の結晶形Aは、入手が容易であり、良好な物理的安定性及び化学的安定性を有し、高い工業的利用価値及び経済的価値を有する。
〔定義及び説明〕
別途に説明しない限り、本明細書で用いられる以下の用語及び連語は以下の意味を含む。一つの特定の連語又は用語は、特別に定義されない場合、不確定又は不明瞭ではなく、普通の定義として理解されるべきである。本明細書で商品名が出た場合、相応の商品又はその活性成分を指す。
本発明の中間体化合物は当業者に熟知の様々な合成方法によって製造することができ、以下に挙げられた具体的な実施形態、他の化学合成方法と合わせた実施形態及び当業者に熟知の同等の代替方法を含み、好適な実施形態は本発明の実施例を含むが、これらに限定されない。
本発明の具体的な実施形態の化学反応は適切な溶媒で完成され、前記の溶媒は本発明の化学変化及びそれに必要な試薬と材料に適するべきである。本発明の化合物を得るため、当業者が既存の実施形態に基づいて合成工程又は反応スキームを変更又は選択することが必要であることもある。
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の何らの制限にもならない。
本発明に使用されたすべての溶媒は市販品で、さらに精製せずにそのままで使用してもよい。
化合物は手動又はChemDraw(登録商標)ソフトによって名付けられ、市販化合物はメーカーのカタログの名称を使用した。
本発明の粉末X線回折(X-ray powder diffractometer、XRPD)方法
計器モデル:Dandong Haoyuan DX-2700BH Xー線回折計
測定方法:約10~20mgの試料をXRPDの検出に用いる。
詳細なXRPDパラメータは下記の通りである:
X線管:Cu、kα、(λ=1.54184Å)。
管電圧:40kV、管電流:30mA
発散スリット:1mm
センサスリット:0.3mm
散乱防止スリット:1mm
走査範囲:3~40deg
ステップ角:0.02deg
ステップ幅:0.5秒
本発明の示差熱分析(Differential Scanning Calorimeter、DSC)方法
計器モデル:METTLER TOLEDO DSC1示差走査熱量計
測定方法:試料(2~6mg)を30ULのDSC金メッキ高圧坩堝に取って測定を行い、10℃/minの昇温速度で、試料を40℃から350℃まで加熱する。
本発明の熱重量分析(Thermal Gravimetric Analyzer、TGA)方法
計器モデル:TA TGA550熱重量分析計
測定方法:試料(2~10mg)を、アルミニウム製坩堝に取り、白金バスケットに置いて測定を行い、窒素ガス(N)の条件で、40ml/minのガス流量で、10℃/minの昇温速度で、試料を40℃から500℃まで加熱する。
〔図面の簡単な説明〕
〔図1〕式(I)で表される化合物の結晶形AのCu-Kα放射のXRPDスペクトルである。
〔図2〕式(I)で表される化合物の結晶形AのDSCスペクトルである。
〔図3〕式(I)で表される化合物の結晶形AのTGAスペクトルである。
〔図4〕式(II)で表される化合物の単結晶X線回折の立体化学構造の楕円体図である。
〔発明を実施するための形態〕
本発明の内容がよりよく分かるように、以下に具体的な実施の形態を参照しながらさらに説明するが、具体的な実施の態様は本発明の内容を制限するものではない。
実施例1:式(I)で表される化合物の製造
Figure 2022548746000004
工程A:1-1(10.00g、59.5mmol)を0℃でジクロロメタン(500ml)に溶解させた後、塩化スルホニル(10.77g、79.77mmol、7.98ml)を加え、混合溶液を35℃で38時間攪拌した。溶液を300mlの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に注ぎ、攪拌し、分層した。水相を酢酸エチルで抽出した後(150ml×3回)、合わせた有機相を飽和食塩水で洗浄し(40ml×3回)、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧蒸留して白色の残留物を得た。次に、白色の残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶離液:石油エーテル/酢酸エチル=30/1~20/1)で精製して、化合物1-2を得た。
H NMR(400MHz,MeOH-d)δ10.75(s,1H),7.74(s,1H),6.54(s,1H),5.98(s,1H),3.85(s,3H)。
工程B:1-2(8.00g、39.49mmol)、1-ブロモ-3-メトキシ-プロパン(7.25g、47.39mmol)をN,N-ジメチルホルムアミド(100.00ml)に溶解させ、0℃に冷却した後炭酸カリウム(10.92g、78.98mmol)を加え、更に混合溶液を25℃に昇温させて10時間攪拌した。次に、酢酸エチル(300ml)及び水(50ml)を溶液に添加し、25℃で10分間攪拌した。有機相を分離し、飽和食塩水で(40ml×3)洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧濃縮して黄色液体を得た。更に黄色液体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶離液:石油エーテル/酢酸エチル=30/1~20/1)で精製して、化合物1-3を得た。
H NMR(400MHz,CDCl)δ10.90(s,1H),7.82(s,1H),6.52(s,1H),4.16(t,J=6.0Hz,2H),3.94(s,3H),3.60(t,J=6.0Hz,2H),3.38(s,3H),2.13(t,J=6.0Hz,2H)。
工程C:1-3(3.64g、13.25mmol)、塩化ベンジル(2.18g、17.23mmol、1.98ml)のN,N-ジメチルホルムアミド(10.00ml)溶液に炭酸カリウム(4.76g、34.45mmol)を添加し、混合溶液を25℃で20時間攪拌した。酢酸エチル(150ml)及び水(30ml)を溶液に添加し、溶液を20℃で10分間攪拌した。次に、有機相を分離し、水(30ml×2)及び飽和食塩水(30ml×2)で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧濃縮して化合物1-4を得た。
工程D:1-4(2.00g、5.48mmol)及び水酸化リチウム一水和物(1.38g、32.89mmol)をテトラヒドロフラン(20ml)及び水(10ml)の混合溶液に添加した後、10~20℃で10時間攪拌した。次に、溶液を酢酸エチル/石油エーテル1/1(5ml×3)で洗浄した。水相をpH=1~2に調節した。更に、溶液をジクロロメタン(50ml×3)で抽出し、有機相を合わせて、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧濃縮して化合物2-ベンジルオキシ-5-クロロ-4-(3-メトキシプロパン)安息香酸を得た。2-ベンジルオキシ-5-クロロ-4-(3-メトキシプロパン)安息香酸(1.00g、2.85mmol)のジクロロメタン(10.00ml)溶液に塩化チオニル(508.60mg、4.28mmol、310.12μL)を添加し、混合溶液を25℃で1時間攪拌した。次に、溶液を減圧濃縮して残留物を得た。更に残留物をトルエンに溶解させ、減圧濃縮して残留物を得、残留物1-5を窒素ガスの雰囲気で保存した。
H NMR(400MHz,DMSO-d)δ12.87-12.22(m,1H),7.74(s,1H),7.53(br d,J=7.2Hz,2H),7.40(t,J=7.6Hz,2H),7.36-7.30(m,1H),6.94(s,1H),5.27(s,2H),4.20(s,2H),3.50(s,2H),3.26(s,3H),1.98(t,J=6.4Hz,2H)。
工程E:-70℃でリチウムヘキサメチルジシラジド(1mol/L、23.88ml)のテトラヒドロフラン(20ml)溶液に1-5(2.94g、7.96mmol)及び化合物a(1.62g、8.76mmol、1.10eq)のテトラヒドロフラン(20ml)溶液を一滴ずつ添加した(5分間)後、冷却浴を取り外し、混合物を続いて5分間攪拌した。更に酢酸アンモニウム(3.23g、41.95mmol)及び酢酸(67.85g、1.13mmol)を混合物に添加し、テトラヒドロフランの大部分を60℃のスピン蒸発機で除去し、残留物を60~65℃で1.5時間加熱した。反応混合物を冷却した後、水(40ml)及びジクロロメタン(200ml)を添加した。混合物を10分間攪拌した後分離し、有機相を水(10ml×3)及び炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、干燥させ、次に濃縮して黄色の残留物を得た。残留物を更にシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶離液:石油エーテル/酢酸エチル=10/1)で化合物1-6を得た。
工程F:1-6(3.00g、6.36mmol)のテトラヒドロフラン(20ml)溶液に湿ったパラジウム炭素(500mg)を添加し、溶液を25℃で水素ガス(15psi)の雰囲気で2時間攪拌した。次に褐色の懸濁液を濾過し、濾液を収集し、減圧濃縮して残留物を得た。更に残留物を石油エーテル/酢酸エチル(4/1)でスラリー化させ(2回)、濾過して化合物1-7を得た。
工程G:-10℃で、1-8(20.00g、178.33mmol)のジクロロメタン溶液(150.00ml)にピリジン(2.82g、35.67mmol)を添加した後、更に五塩化リン(37.14g、178.33mmol)を添加し、得られた混合物を-10℃で0.5時間反応させた。反応終了後、反応系に炭酸水素ナトリウム(44.94g、534.99mmol)を添加した。反応を0.5時間攪拌を続けた後、珪藻土で濾過して、ジクロロメタン(20ml×3)洗浄し、濾液を濃縮して残留物1-9を得た。
H NMR(400MHz,CDCl)δ7.68(d,J=3.91Hz,1H),7.35-7.44(m,5H),7.22(d,J=3.67Hz,1H),6.91(s,1H),5.34(s,2H)。
工程H:1-7(10.00g、26.19mmol)、炭酸セシウム(38.40g、117.86mmol)及び1-9(21.88g、130.95mmol)のジメチルスルホキシド(100.00ml)溶液を100℃で16時間攪拌した。反応終了後、50mlの水で反応をクエンチングさせ、更に150mlの水で反応溶液を希釈し、ジクロロメタン(100ml×3)で抽出した後、有機相を合わせて、飽和食塩水(100ml×3)で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ後、減圧濃縮して残留物を得た。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶離液:ジクロロメタン/エタノール=100/1~8/1)で精製して、化合物1-10を得た。
工程I:1-10をキラルクロマトグラフィーカラムで分離し(分離カラム:AS(250mm×30mm、10um);移動相:[0.1%のアンモニア水からエタノール];溶出勾配:40%~40%、4.3min;120min)精製して2つの立体配座異性体を得、保持時間=2.516min及び時間=5.098minであった。更に保持時間=2.516minの異性体(55mg、116.64μmol)をメタノール(10ml)溶液に入れ、4mol/Lの水酸化ナトリウム(145.80μL)に添加した。反応溶液を25~30℃で2時間攪拌した。反応溶液を減圧濃縮し、残留物を水(20ml)に溶解させ、2mol/Lの塩酸でpHを1~2に調節し、固体を析出させた後、濾過し、乾燥させて式(I)で表される化合物(保持時間=3.842min)、ee値(鏡像体過剰率):100%を得た。ee値(鏡像体過剰率)の測定方法:OD-3S_3_40_3ML、分離カラム:Chiralcel OD-3 100×4.6mm I.D.,3μm、移動相:40%のメタノール(0.05%のジエチルアミン)をCOに、流量:3mL/min、波長:220nm。
式(I)で表される化合物:H NMR(400MHz,CDCl)δ15.40(s,1H),8.32(s,1H),7.62(s,1H),7.41(dd,J=1.28,4.83Hz,1H),6.93-6.98(m,2H),6.91(s,1H),6.88(s,1H),6.62(s,1H),4.09(t,J=6.24Hz,2H),3.51(t,J=5.87Hz,2H),3.28(s,3H),2.05(quin,J=6.08Hz,2H)。
実施例2:式(I)で表される化合物の結晶形Aの製造
温度を40℃に制御し、式(I)で表される化合物(1g)を反応フラスコに添加した後、アセトン(10mL)を添加し、混合物を40℃で24時間攪拌し、室温に冷却させて濾過し、ケーキをアセトン(10mL)で洗浄して、粗生成物を得、粗生成物を真空乾燥オーブンで乾燥させて(45℃、16時間)式(I)で表される化合物の結晶形Aを得た。
実施例3:高温、多湿条件下での式(I)で表される化合物の結晶形Aの固体安定性試験
式(I)で表される化合物の結晶形Aの試料をそれぞれ約100mgずつ2部秤量し、ガラス試料バイアルの底に置き、薄く広げた。試料をアルミホイルで密封し、アルミホイルにいくつかの小さい穴をあけ、試料が周囲の空気に完全に接触できるようにし、40℃/75%湿度の恒温・恒湿ボックスに入れた。前記条件に置いた試料を5日目、10日目にサンプリング検出し、検出結果と0日目の初回検出結果と比較し、試験結果は下記の表2に示された通りである:
Figure 2022548746000005
実験結論:本発明の式(I)で表される化合物の結晶形Aは良好な安定性を有し、薬になりやすい。
実施例4:異なる温度、湿度及び光照射条件下での式(I)で表される化合物の結晶形Aの固体物理的安定性試験
式(I)で表される化合物の結晶形Aをそれぞれ約100mgずつ4部秤量し、ガラス試料バイアルの底に置き、薄層に広げ、アルミホイルでバイアルの口を密封し、アルミホイルにいくつかの小さい穴をあけ、試料が周囲の空気に完全に接触できるようにした。製造した4部の試料をそれぞれ25℃/92.5%の相対湿度、60℃、40℃/75%及び光照射の条件下に置き、10日目の試料の物理的安定性を観察した。同時に、式(I)で表される化合物の結晶形Aの固体約100mgを一部秤量し、ガラス試料バイアルの底に置き、スクリューキャップで密封し、-20℃に保存し、対照品として使用した。10日目にすべての試料を取り出し、室温に恢復させ、試料の外観変化を観察し、試料の結晶形をXRPDで検出した。加速試料と対照試料を比較することにより、式(I)で表される化合物の結晶形Aの固体物理的安定性を判断した。下記の表3は、結晶形Aの固体物理的安定性の実験結果を示している。
Figure 2022548746000006
実験結論:本発明の式(I)で表される化合物の結晶形Aは、良好な安定性を有し、薬になりやすい。
実施例5:単結晶X線回折検出分析
式(I)で表される化合物は単結晶として培養しにくいため、その絶対配置を確認するために、式(I)で表される化合物をトリメチルシリルジアゾメタンでメチル化させ、式(II)で表される化合物を得、更に式(II)で表される化合物を単結晶として培養した。
製造方法は下記の通りであり:
Figure 2022548746000007
式(I)で表される化合物(5g、11.16mmol)をメタノール(15ml)及びテトラヒドロフラン(45ml)の混合溶液に添加し、室温で、トリメチルシリルジアゾメタン(2mol/L、8.37ml)を1回添加した後、室温で12時間攪拌した。反応溶液を濃縮し、更に20mlのtert-ブチルメチルエーテルを添加し、攪拌した後濾過し、乾燥させて式(II)で表される化合物を得た。式(II)で表される化合物をメタノールに溶解させ、溶媒蒸発法を用いて、室温で10日間培養して式(II)で表される化合物の単結晶を得、回折用の結晶サイズは0.06×0.08×0.16mmであった。結晶は三斜晶系に属し、空間群はP1であり、結晶セルのパラメーターは:a=13.0669(13)、b=13.4585(12)、c=14.4699(14)Å、α=90.348(4)、β=109.374(4)、γ=96.367(4)であり、結晶セルの体積はV=2383.3(4)Å3であり、結晶セル内の非対称単位の数はZ=1であった。
回折強度データはBruker D8 venture回折計によって収集し、光源はCuKα放射線であり、走査方法:φ/ω走査であり、収集された回折点の総数は40999個であり、独立した回折点の数は15341個であり、観測可能な点の数(I/sigma≧2)は5471であった。
直接法(Shelxs97)を利用して結晶構造を分析し、124個の非水素原子位置を取得し、最小二乗法を使用して構造パラメーターを補正し、原子種を特定し、幾何計算方法と差分Fourier法で、すべての水素原子の位置を取得し、精製後R=0.1357、wR=0.4252(w=1/α|F|)、S=1.817であった。最終的な化学量論式は4(C2220ClNOS)であり、計算された単一分子量は461.90であり、計算された結晶密度は1.287g/cmであった。
前記反応は穏やかな条件で中性環境で実施され、キラル炭素は反転しなかった。従って、式(I)で表される化合物の絶対配置は、式(II)で表される化合物と一致した。式(II)で表される化合物の単結晶データから、式(I)で表される化合物の絶対配置を決定することができた。式(II)で表される化合物の単分子立体構造の楕円体図は図4を参照できる。式(II)で表される化合物の結晶の原子座標(×10)及び等価等方性変位パラメータ(Å×10)は表4を参照できる。式(II)で表される化合物の結合長(Å)及び結合角[deg]は表5を参照できる。式(II)で表される化合物のねじれ角[deg]は表6を参照できる。
Figure 2022548746000008
Figure 2022548746000009
Figure 2022548746000010
Figure 2022548746000011
Figure 2022548746000012
Figure 2022548746000013
Figure 2022548746000014
Figure 2022548746000015
Figure 2022548746000016
Figure 2022548746000017
Figure 2022548746000018
Figure 2022548746000019
Figure 2022548746000020
実施例1:式(I)で表される化合物のHBV体外活性試験
実験材料:
1.細胞株:HepG2.2.15細胞
HepG2.2.15細胞培養培地(DMEM/F12、Invitrogen-11330032;10%の血清、Invitrogen-10099141;100units/mlのペニシリン及び100μg/mlのストレプトマイシン、Hyclone-SV30010;1%の非必須アミノ酸、Invitrogen-11140050;2mmのL-GLUTAMINE、Invitrogen-25030081;300μg/mlのGeneticin、Invitrogen-10131027。
2.試薬:
パンクレリパーゼ(Invitrogen-25300062)
DPBS(Corning-21031CVR)
ジメチルスルホキシド(Sigma-D2650-100ML)
ハイスループットDNA精製キット(QIAamp 96 DNA Blood Kit、Qiagen-51162)
定量的ファストスタートユニバーサルプローブ試薬(FastStart Universal Probe Master、Roche-04914058001)
B型肝炎表面抗原定量検出キット(Antu Bio、CL 0310)。
3.消耗品及び機器:
96ウェル細胞培養プレート(Corning-3599)
COインキュベーター(HERA-CELL-240)
光シールフィルム(ABI-4311971)
定量PCR96ウェルプレート(Applied Biosystems-4306737)
蛍光定量PCR装置(Applied Biosystems-7500 real time PCR system)。
実験方法:
1.HepG2.2.15細胞(4x10細胞/ウェル)を96ウェルプレートに接種し、37℃、5%のCOで一晩培養した。
2.2日目、3倍勾配で合計8個の化合物濃度に希釈した。異なる濃度の化合物を培養ウェルに添加し、同じ条件で2つのウェルを設置した。培養溶液のジメチルスルホキシドの最終濃度は0.5%であった。10μMのETVを100%の阻害対照とした;0.5%のジメチルスルホキシドを0%の阻害対照にした。
3.5日目、化合物を含む新鮮な培養溶液に変更した。
4.8日目に培養ウェルの培養溶液を採取し、一部の試料を取って、ELISAでB型肝炎ウイルスS抗原の含有量を測定し;一部の試料を取ってハイスループットDNA精製キット(Qiagen-51162)でDNAを抽出した。
5.PCR反応溶液の製造は表7に示された通りである:
Figure 2022548746000021
プレプライマー配列:GTGTCTGCGGCGTTATCA
ポストプライマー配列:GACAAACGGGCAACATACCTT
プローブ配列:5’+FAM+CCTCTKCATCCTGCTGCTATGCCTCATC+TAMRA-3’
6.1 96ウェルPCRプレートの各ウェルに15μLの反応混合物を添加した後、各ウェルに10μlの試料DNA又はHBV DNA標準を添加した。
6.2 PCRの反応条件は:95℃で10分間加熱した後、95℃で15秒間変性させ、60℃で1分間伸長させ、合計40サイクルをした。
6.3 ELISAによるB型肝炎ウイルスS抗原含有量の測定は50Lの試料と標準液をそれぞれ反応プレートに添加し、更に50Lの酵素コンジュゲートを各ウェルに添加し、よく振とうして混合し、37℃で60分間温浴した後、洗浄液でプレートを5回洗浄し、各ウェルに50Lの発光基質を添加し、よく混合し、室温の暗所で10分間反応させ、最後にマイクロプレートリーダーで化学発光強度を検出した。
6.4 データ分析:
阻害率の計算:%Inh.=(1-試料における値/ジメチルスルホキシド対照値)×100。
EC50の計算:GraphPad Prismソフトを用いて、HBVに対する化合物の50%阻害濃度(EC50)値を計算した。
実験結果は表8に示された通りである:
Figure 2022548746000022
実験結論:式(I)で表される化合物は、HBV-DNA及びB型肝炎表面抗原(HBsAg)を効果的に阻害することができる。
式(I)で表される化合物の結晶形AのCu-Kα放射のXRPDスペクトルである。 式(I)で表される化合物の結晶形AのDSCスペクトルである。 式(I)で表される化合物の結晶形AのTGAスペクトルである。 式(II)で表される化合物の単結晶X線回折の立体化学構造の楕円体図である。

Claims (16)

  1. 粉末X線回折スペクトルが下記の2θ角:6.30±0.20°、9.30±0.20°及び20.16±0.20°において特徴的な回折ピークを有する、式(I)で表される化合物の結晶形A。
    Figure 2022548746000023
  2. 粉末X線回折スペクトルが下記の2θ角:6.30±0.20°、9.30±0.20°、9.84±0.20°、18.68±0.20°、20.16±0.20°、23.06±0.20°、24.00±0.20°及び25.38±0.20°において特徴的な回折ピークを有する、請求項1に記載の結晶形A。
  3. 粉末X線回折スペクトルが下記以下の2θ角:6.30±0.20°、9.30±0.20°、9.84±0.20°、12.84±0.20°、18.68±0.20°、20.16±0.20°、21.26±0.20°、23.06±0.20°、24.00±0.20°、25.38±0.20°において特徴的な回折ピークを有する、請求項2に記載の結晶形A。
  4. 粉末X線回折スペクトルが下記の2θ角:6.302°、7.883°、9.301°、9.842°、12.838°、15.436°、16.580°、18.124°、18.680°、19.459°、20.161°、20.800°、21.262°、21.704°、23.057°、24.000°、24.837°、25.382°、26.244°、26.558°、27.740°、28.119°、28.827°、29.502°、29.880°、30.261°、30.762°、31.678°、32.595°、33.061°、34.347°、35.235°、35.738°、36.642°、38.619°及び39.558°において特徴的な回折ピークを有する、請求項3に記載の結晶形A。
  5. XRPD曲線スペクトルが図1で示される通りである、請求項4に記載の結晶形A。
  6. 示差走査熱量曲線が224.58℃±3℃において吸熱ピークのピーク値を有する、請求項1~5のいずれか1項に記載の結晶形A。
  7. DSCスペクトルが図2で示される通りである、請求項6に記載の結晶形A。
  8. 熱重量分析曲線が200.00±3℃の際に重量が0.127%減少し;250±3℃の際に重量が0.224%減少する、請求項1~5のいずれか1項に記載の結晶形A。
  9. TGAスペクトルが図3で示される通りである、請求項8に記載の結晶形A。
  10. 任意の形態の式(I)で表される化合物を、アルコール系溶媒、アセトン、酢酸エチル、アセトニトリル又はアルコール系溶媒、アセトン、アセトニトリル及び水に添加し、所定の温度で所定の時間撹拌した後、濾過し、ケーキを乾燥させて結晶形Aを得る工程を含む、式(I)で表される化合物の結晶形Aの製造方法。
  11. アルコール系溶媒、アセトン、アセトニトリルと水の体積比が、1:1~3から選択される、請求項10に記載の製造方法。
  12. アルコール系溶媒は、メタノール、エタノール、又はイソプロパノールから選択される、請求項10又は11に記載の製造方法。
  13. 攪拌温度は25℃~65℃から選択される、請求項10に記載の製造方法。
  14. 攪拌時間は1時間~72時間から選択される、請求項10に記載の製造方法。
  15. 式(I)で表される化合物と溶媒の重量比は、1:1~30から選択される、請求項10に記載の製造方法。
  16. 慢性B型肝炎を治療するための医薬の製造における請求項1~9のいずれか1項に記載の結晶形Aの使用。
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