JP2022546589A - 超解像画像化のための高速スキャニングシステム - Google Patents

超解像画像化のための高速スキャニングシステム Download PDF

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Abstract

本明細書において、超解像画像を生成するための高スループット光学スキャニングシステム、およびその使用方法が開示される。本明細書において提供される光学スキャニング装置およびその使用方法は、連続的に移動している物体を、ステージ速度における変動があったとしても、高い分解能で高スループットスキャニングすることを可能にする。これは、基材、たとえば、フルオロフォアを含む生物学用のチップなどの、高スループットスキャニングを支援することができる。本明細書においてはまた、改善された光学リレーシステム、およびスキャニング光学素子も提供される。TIFF2022546589000003.tif121170

Description

相互参照
本出願は、2019年9月5日に提出された米国特許仮出願第62/896,541号の恩典を主張するものであり、該仮出願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
背景
現代社会において商品原価とは、企業の起業を可能にするものであり、一方で企業の倒産を引き起こし得るものでもある。多くの場合、この商品およびサービスの原価（COGS）は、特定の処理についてのスループットを増大させることによって、減少させることが可能である。そのため、商品を可能な限り迅速かつ効率良く処理することを可能にすることは、多くの場合、企業にとって「必須」である。商品の自動検査は、ビジョンシステムまたは画像化システムを用いて規定どおりになされる。これらのシステムは、物体の静止画または動画を取得し、そして該動画または静止画の解析に基づいて該物体の状態を決定するために、使用される。そのため、該物体に次に何が起きるのかを決定するために、動画または静止画から定量化可能なデータを抽出することが必要である。定量化可能なデータの抽出は、画像の品質（画像の特徴物がどのくらい明確に定まっているか（ぼけ）、適切なコントラストがどのくらい好ましく定まっているか、等）に、常に依存する。単純かつ費用効果の高い様式で、この必要性を、高スループット画像化（試料が連続的に移動している最中の、試料の画像化）に関する必要性と組み合わせることは、難題である。オンザフライ方式での画像化または高スループット画像化の重要な局面の1つは、試料ステージの速度をほぼ一定に維持することである。試料ステージの速度が変化している場合、画像はぼやけ、そして抽出される定量化可能なデータは、不十分なものになり得る。いくつかの高スループット処理に関しては、スキャニング中の超解像画像化（回折限界未満の画像化）、および<0.5ピクセルのぼけが要求される。この定量化の改善は、2つのミラー（速度追尾ミラーおよび加速追尾ミラー）を用いて、または1つのミラーを用いて、フィードフォワードアプローチ（現在のフィールドの平均速度を使用して、次のフィールドのための速度補正項を計算し、かつ提供する）を利用して達成され得る。画像の安定化の正確性が<40 nmであり、かつスピードが20 FPS（フレーム毎秒）よりも速いという、リアルタイム位置データのみを使用する超解像システムにおいて、画像の安定化のために1つまたは2つのミラーが使用される、既知の適用例は、現時点では存在しない。
典型的な、単一分子、単一フルオロフォアに感受性の、生物学用の蛍光による光学スキャニングシステムには、長い露光時間を有する低ノイズカメラが必要とされる。これらのシステムは、多くの場合、花こう岩または同等のものの上に据え付けられた、高精度でかつ安定な画像化プラットフォームを必要とする。加えて、これらのシステムは「ステップアンドリピート方式」の足場を採用しており、該方式は、複数のフィールドの高スループットで安定な画像化を達成するために、高加速および高減速、ならびに高質量を必要とする。短時間（約5分）で、高倍率で、面積の大きいチップ（2000 mm2）をスキャンすることは、ステップアンドリピートシステムで可能であるよりも短い、画像化のフレーム時間を必要とする。
ステップアンドリピートシステムが元々有しているステージ加速時間およびセトリング時間に起因するスループットの喪失を防止するためには、「イメージオンザフライ（image on the fly）」方式のアプローチが必要である。従来型のイメージオンザフライ方式の適用は、ほぼ一定（約+/-0.05%）である速度を提供することが可能な試料ステージと、試料が移動している間に該試料を画像化するスキャニング光学素子とを、必要とする。ステージが進む間にステージ速度が一定でない場合、スキャニング光学素子は、ステージの移動中に、試料の正確に同じ領域を画像化することはできない。これは結果的に、ぼやけた画像（たとえば、約+/-3ピクセルのピクセルスミアを有する画像）をもたらし得る。4この問題は、典型的には、重量のあるステージと強力なステージ駆動力とを用いることによって、ほぼ一定である速度を提供する、高価なステージを利用することによって解消される。残念なことに、これは、製品のコストを押し上げ、かつ製品を、ベンチトップシステムとして使用するには非現実的なものにしてしまう。
低コスト、小型、および／または軽量である、典型的なステージは、さまざまな表面の不規則性を有する構成要素で作られており、該不規則性は、たとえば、孔、バリ、機械加工による溝、くぼみ、およびゆがんだキャビティなどである。これらの不規則性は、通常、一定でない速度をもたらす。たとえば、ステージの経路におけるバリまたはくぼみは、ステージの瞬間的な遅れを引き起こし、そしてその後、ステージが該不規則性に遭遇する前に有していた速度に戻る前に、ステージを速める可能性がある。ステージの速度変動は、許容できないレベルで画像のぼけを発生させるために、これらの低コストでより小さな構成要素の使用は、現行のイメージオンザフライ方式でのスループットスキャニングアプローチに対しては不適合なものとなっている。
したがって、必要とされるものは、速度変動への許容性が増加している、改善されたスキャニング光学素子であり、これは、より小さく、軽量で、かつ低コストである光学スキャニングシステムにおいて、単一フルオロフォア感受性を用いたイメージオンザフライ方式でのスキャニングを使用して、安定性が増加している（たとえば、ピクセルスミアが減少している）画像を取得することを可能にする。
概要
本発明は、少なくとも部分的には、移動しているステージ上の物体を画像化する際のピクセルスミアを減少させる、新規な方法および装置の発見に基づく。
本明細書において記載される本開示の1つの局面は、以下を含む画像化システムを提供する：光源；複数のフィールドをキャプチャーするための、対物レンズと機能的に連結されている1つまたは複数のカメラ；基材を支持するように構成されているステージであって、該光源に近接する規定された経路に沿って移動するように構成されている、ステージ；該ステージに機械的かつ機能的に連結されているエンコーダー；該エンコーダーから位置情報を受け取るように、および該ステージについての複数の位置の複数の計算を実施するように構成されている、位置処理モジュール；該ステージについての該複数の位置の該複数の計算を受け取る、該位置処理モジュールに機能的に連結されている該規定された経路に近接する軸に連結されているスキャニングミラー；およびシステムの構成要素を同期的に作動させるように構成されている、制御モジュール。いくつかの態様において、システムは、画像処理モジュールをさらに含み、該画像処理モジュールは：(i) 該基材上に配置された複数の分析物のうちのある分析物の位置、または、該基材上に配置されたある分析物の、該基材上に配置された別の分析物に対する相対位置を同定するために複数の画像を処理するための画像化アルゴリズムを使用するように；および(ii) 該位置または該相対位置において該分析物が同定されたら該分析物を分析するように、構成されており、ここで、該複数の分析物が、該複数の分析物のうちのある分析物と該複数の分析物のうちの別の分析物との間の最小有効ピッチがλ/(2*NA)未満であるような密度で該基材上に配置されており、式中、λは、光路において使用される光の波長であり、かつ「NA」は、該1つまたは複数のカメラの開口数である。いくつかの態様において、該光源はレーザーを含む。いくつかの態様において、該光源は複数のレーザーを含む。いくつかの態様において、該画像化処理モジュールは、複数の超解像画像を生成するように構成されている。いくつかの態様において、該スキャニングミラーの複数の動作は、該位置処理モジュールの該複数の計算から生じる。いくつかの態様において、該複数の計算は、該ステージの速度測定値または位置測定値の関数である。いくつかの態様において、該位置処理モジュールは、該複数の計算を波形で出力するように構成されている。いくつかの態様において、該基材は複数のフィールドを含む。いくつかの態様において、該エンコーダーは：該基材上に配置された該複数の分析物のうちの該分析物の該位置、または、該基材上に配置された該分析物の、該基材上に配置された別の分析物に対する該相対位置についての1つまたは複数の補正値を生成するように；および該1つまたは複数の補正値を該波形に適用するように、構成されている。いくつかの態様において、該スキャニングミラーは、該複数のフィールドのうちの1つのフィールドのスキャンが完了したら元の位置へと移動するように、および該複数のフィールドのうちの次のフィールドのスキャンを開始するように構成されている。いくつかの態様において、該光源は、約400～800ナノメートルの波長を含む。いくつかの態様において、該エンコーダーは、該ステージの該複数の移動に基づいて複数のエンコーダーカウントを実施するように構成されている。いくつかの態様において、該エンコーダーは、該複数のエンコーダーカウントからシグナル周期を生成するように構成されている。いくつかの態様において、該エンコーダーカウントは、約0.05マイクロメートル～約30マイクロメートルの距離に位置付けられる。いくつかの態様において、該エンコーダーは、512ナノメートルにおいて、該複数のエンコーダーカウントからシグナル周期を生成する。いくつかの態様において、該基材は、規定された複数のレーンを含む。いくつかの態様において、該規定された複数のレーンのうちの1つのレーンは、複数の列を含む。いくつかの態様において、該複数の超解像画像は、約10～約40ナノメートル未満のぼけを含む。いくつかの態様において、該ぼけは、約20～約150フレーム毎秒のフレームレートにおいて生じる。いくつかの態様において、該複数の分析物は、該画像化システムの回折限界未満またはλ/(2*NA)未満の中心間の間隔で、該基材上に配置される。いくつかの態様において、該複数の計算は、瞬間的な計算を含む。
本明細書において開示される別の局面は、前述の態様のいずれか1つのシステムを利用して、移動している基材上の複数のフィールドを画像化する方法を提供する。
本明細書において開示される別の局面は、複数のフィールドを含む移動している基材を画像化する方法を提供し、該方法は以下の工程を含む：該基材をステージ上に配置する工程であって、光源に近接する規定された経路に沿って移動するように該ステージが構成されている、工程；該ステージに機械的かつ機能的に連結されているエンコーダーから位置情報を受け取るように位置処理モジュールを構成する工程であって、該位置処理モジュールが、該ステージについての複数の位置の複数の計算を実施するようにさらに構成されている、工程；該位置処理モジュールに機能的に連結されている該規定された経路に近接する軸に連結されているスキャニングミラーを、該ステージについての該位置の該複数の計算を受け取るように構成する工程；および1つまたは複数のカメラを用いて、該複数のフィールドのうちの少なくとも1つのフィールドを画像化する工程。いくつかの態様において、方法の一部は同期的に実施される。いくつかの態様において、方法は、以下をさらに含む：該基材上に配置された複数の分析物のうちのある分析物の位置、または、該基材上に配置されたある分析物の、該基材上に配置された別の分析物に対する相対位置を同定するために複数の画像を処理するための画像化アルゴリズムを使用する工程。いくつかの態様において、該複数の分析物が、該複数の分析物のうちのある分析物と該複数の分析物のうちの別の分析物との間の最小有効ピッチがλ/(2*NA)未満であるような密度で該基材上に配置されており、式中、λは、光路において使用される光の波長であり、かつ「NA」は、該光学画像化モジュールの開口数である。いくつかの態様において、該スキャニングミラーの複数の動作は、該位置処理モジュールの該複数の計算から生じる。いくつかの態様において、該複数の計算は、該ステージの速度測定値または位置測定値の関数である。いくつかの態様において、方法は、該複数の計算を波形で出力するように該位置処理モジュールをさらに構成することを、さらに含む。いくつかの態様において、方法は：該基材上に配置された該複数の分析物のうちの該分析物の該位置、または、該基材上に配置された該分析物の、該基材上に配置された別の分析物に対する該相対位置についての1つまたは複数の補正値を生成するように；および該1つまたは複数の補正値を該波形に適用するように、該位置処理モジュールを構成することを、さらに含む。いくつかの態様において、方法は、該複数のフィールドのうちの1つのフィールドのスキャンが完了したら元の位置へと移動するように、および該複数のフィールドのうちの次のフィールドのスキャンを開始するように該スキャニングミラーをさらに構成することを、さらに含む。いくつかの態様において、方法は、複数のエンコーダーカウントからシグナル周期を生成するように該エンコーダーを構成することを、さらに含む。いくつかの態様において、該エンコーダーカウントは、約0.05マイクロメートル～約30マイクロメートルの距離に位置付けられる。いくつかの態様において、該エンコーダーは、512ナノメートルにおいて、該複数のエンコーダーカウントからシグナル周期を生成する。いくつかの態様において、該複数の画像のうちのある画像は、約10～約40ナノメートル未満のぼけを含む。いくつかの態様において、該ぼけは、約20～約150フレーム毎秒のフレームレートにおいて生じる。
参照による組み入れ
本明細書において言及されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願がそれぞれ、参照により組み入れられるように具体的にかつ個々に示された場合と同程度に、参照により本明細書に組み入れられる。本明細書に含まれる本開示と相反する、参照により組み入れられる刊行物および特許または特許出願の範囲については、本明細書が、そのような相反する事柄のどれよりも優先され、および／または上位に立つことが、意図される。
前述のならびに他の目的、特徴、および利点は、類似の参照記号がさまざまな観点の全体にわたって同じ部分を指す添付の図面に示される、以下の本発明の特定の態様の説明から明らかであろう。本発明のさまざまな態様の原理を説明するに際し、図面は必ずしも一定の縮尺ではなく、代わりに強調がなされている。
本発明の一態様にしたがった、基材から、加速追尾ミラーおよび速度追尾ミラー（すなわち、ミラーが2つの態様）を含む検出器へと向かう光路に沿った、光学スキャニング装置の構成要素の概略図である。 一態様にしたがった、移動しているステージを追尾するミラーの動作、たとえば、速度追尾ミラーなどの動作を制御する鋸歯状波形と、該鋸歯状波形の、可動ステージの軸に沿った位置における経時的な変化についての相関との、説明である。 速度追尾ミラーおよび加速追尾ミラー（ミラーが2つの態様）のための駆動シグナルを生成して、移動している基材の画像を、測定されたかまたは予想されたステージ速度誤差と、予想されたステージ速度とに基づいて安定化するために使用され得る、波形の一例を提供する。 本発明の一態様にしたがった、基材から、1つの移動追尾ミラー（すなわち、ミラーが1つの態様）を含む検出器へと向かう光路に沿った、光学スキャニング装置の構成要素の概略図である。 移動追尾ミラー（ミラーが1つの態様）のための駆動シグナルを生成して、移動している基材の画像を、測定されたかまたは予想されたステージ速度誤差と、予想されたステージ速度とに基づいて安定化するために使用され得る、波形の一例を提供する。 フィールドレベルのフィードフォワード機構の、1つの可能な具体化の概略図を提供するものであり、該機構は、補正項を提供して、装置のうちの、基材または可動ステージの速度変動に応答して動作することが可能であるミラーに、提供される駆動シグナルを調節する。 図7Aおよび7Bは、位置処理モジュールの構成要素、および該位置処理モジュールの構成要素から装置のいくつかの構成要素への接続の、概略図であり、装置の構成要素には、調節可能な追尾ミラー、および基材または可動ステージの位置検知装置が含まれる。接続は、矢印で示される。実線の矢印は、位置処理モジュールからそれぞれの構成要素へと送られる、シグナルを示す。点線の矢印は、ステージまたは基材の速度変動の測定と、加速追尾ミラーまたは移動追尾ミラーに機能的に接続されているモーターを制御する駆動シグナルへの転換とについての、経路を示す。破線の矢印は、光学スキャニングシステムの構成要素内での、光路に沿った光の動きを示す。図7Aは、ミラーが2つの態様に関するものであり、一方で図7Bは、ミラーが1つの態様に関するものである。 図7Aの説明を参照されたい。 移動している基材のフィールドの安定化された画像をキャプチャーする装置の、追尾ミラーが2つの態様を作動させる方法のフローチャートを提供する。 移動している基材のフィールドの安定化された画像をキャプチャーする装置の、追尾ミラーが1つの態様を作動させる方法のフローチャートを提供する。 図9Aおよび9Bは、画像のピクセルスミアがそれぞれ+1および+2である一例を図示する。四角形はそれぞれ、1つのピクセルを表す。 システムからのデータを制御する構成要素および該データを保管する構成要素を含む、光学スキャニングシステムの一態様を例示する。 シーケンサーのスループット 対 アレイのピッチを示し、そして10ドルゲノムのために必要とされる基準を満たすシステム設計を概説する。 低コストの配列決定のための、240 nmのピッチで80 nmの直径の結合領域（スポット）という高密度領域の提案される態様を示す。 1,000ドルゲノムのために使用される試料の有効密度と比較した、提案される基材密度の比較である。 600 nmのピッチで2xフィルターで処理された、シミュレートされた単一分子のためのクロストーク計算を示す。 600 nm、400 nm、および300 nmの中心間距離の基材上の単一分子分析物の検出の画像の、2xオーバーサンプリングされたシミュレーション（左） 対 4xオーバーサンプリングされ、そしてデコンボリューションされたシミュレーション（右）を示す。 2xオーバーサンプリングされたシミュレーション 対 4xオーバーサンプリングされそしてデコンボリューションされたシミュレーションを用いて処理された、単一分析物間の異なる中心間距離（アレイのピッチ（nm））で近接するスポット間の、クロストークのプロットを示す。 本発明の1つの態様にしたがった、基材上の分析物の相対位置を高い正確性で決定する方法のためのフローチャートを示す。 本発明の1つの態様にしたがった、基材から検出された、デコンボリューションされた光学シグナルから、個々の分析物を同定する方法のための、フローチャートを示す。 本発明の1つの態様にしたがった、基材上に固定化されたポリヌクレオチドを配列決定する方法のためのフローチャートを示す。 本発明の1つの態様にしたがった、反復検出からの光学シグナル検出プロセスにおける工程の概要を示す。 本発明の1つの態様にしたがった、最初の生画像解析のための工程のフローチャートを示す。 本発明の1つの態様にしたがった、複数のサイクルからの光学シグナルピーク情報からの位置決定のための工程のフローチャートを示す。 本発明の1つの態様にしたがった、正確な相対位置情報および画像デコンボリューションアルゴリズムを用いる、画像からの、オーバーラップする光学シグナルの同定のための工程のフローチャートを示す。 本発明の1つの態様にしたがった、高密度に詰め込まれた基材の反復検出からの画像についての光学シグナル検出およびデコンボリューションプロセスのための工程の、詳細なフローチャートを示す。 図22Aは、生画像から検出された光学シグナルからの、4つのフルオロフォア間のフルオロフォア強度のクロストークプロットを示す。図22Bは、4xオーバーサンプリングされた画像からの、4つのフルオロフォア間のフルオロフォア強度のクロストークプロットを示す。 図23Aは、4xオーバーサンプリングされた画像からの、4つのフルオロフォア間のフルオロフォア強度のクロストークプロットを示す。図23Bは、同じ画像化領域であるが、図11に示されるように、かつ本明細書において記載されるように実施されるデコンボリューションおよび最近傍回帰を用いたクロストークプロットを示す。 図24Aは、分析物の間が約315 nmの中心間の間隔での、フィールドの生画像のシミュレートされた4色合成画を示す。図24Bは、分析物の間が約315 nmの中心間の間隔での、デコンボリューションされた画像のシミュレートされた4色合成画を示す。 変異体標的および野生型（WT）標的の等量を含む、EGFR遺伝子におけるコドン790付近の領域に対応する合成オリゴヌクレオチド鋳型の1:1の混合物の、配列決定の結果を示す。 塩基の組み込みおよび切断の交互のサイクルからの画像を示す。 本明細書において記載されるシステムおよび方法によって生成された、基材上に固定化され、そしてフルオロフォアを含むプローブによって結合された、単一分子の画像である。 図27の右パネルは、基材上のいくらかの分析物からのオーバーレイされた各サイクルからのフィールドのオーバーサンプリングされた画像からのピーク（ピークのクラスター）を示す。左パネルは、右パネルの平滑化されたバージョンであり、相対位置情報を示す高度に正確なピークを有する複数のサイクルにわたる分析物からのピークのガウス分布を概括する。 フィールドにおいて見いだされる複数の分子のそれぞれについてのローカライゼーションの変動を示す。ローカライゼーションの分散の中央値は5 nmであり、かつ、3シグマのローカライゼーションの分散は10 nmより小さい。 実施例1の実験から得られた例示的データを示し、該データは、高速スキャニング方式での画像が、ステップアンドシュート方式でのマッピング密度と同様のマッピング密度をもたらすことを証明する。 実施例1の実験から得られた例示的データを示し、該データは、高速スキャニング方式での画像が、ステップアンドシュート方式でのマッピング密度と同様のマッピング密度をもたらすことを証明する。データは、高速スキャニング方式のフィールドが、ステップアンドシュート方式でマッピングされたフィールドの、最小で95%を含むことを示す。 本明細書において記載されるシステム（「HSS」）および従来のシステム（「SnS」）の両方について、流体キャビティにおけるすべてのフィールドにわたって測定された平均分析物密度（分析物/μm2）を示す。箱の中にある直線は、分布の中央値である。箱はデータ点の半分を包含しており、かつ箱の中央には中央値（直線）が記載される。ひげは、データ点の10%の印および90%の印を示す。 本明細書において記載されるシステム（「HSS」）および従来のシステム（「SnS」）の両方について、流体キャビティにおけるすべてのフィールドにわたって測定された平均分析物密度（分析物/μm2）を示す。箱の中にある直線は、分布の中央値である。箱はデータ点の半分を包含しており、かつ箱の中央には中央値（直線）が記載される。ひげは、データ点の10%の印および90%の印を示す。 本明細書において記載されるシステム（「HSS」）および従来のシステム（「SnS」）の両方について、画像化されたフィールドの数の関数としての、平均分析物密度を示す。
詳細な説明
本発明のさまざまな態様が本明細書において示されかつ記載されているが、そのような態様が単なる例として提供されていることは、当業者には明らかである。無数の変形、改変、および置き換えが、本発明から逸脱することなく、当業者に想起され得る。本明細書において記載される本発明の態様のさまざまな代替物が採用され得ることが、理解されるべきである。
本発明のさまざまな態様の詳細が、以下の説明において記載される。本発明の他の特徴、目的、および利点は、説明および図面から、ならびに特許請求の範囲から、明らかである。
本明細書において使用される場合、「対物レンズ」との語は、光学スキャニングシステムにおける、1つの素子かまたは素子の1群であって、1つまたは複数のレンズを含み、かつ、電磁シグナル（たとえば、光学シグナルなど）を拡大するように構成されており、かつそのように作動する、素子を指す。いくつかの態様において、対物レンズは、大きい開口数（NA）を、たとえば0.6～1.5の範囲内などのNAを有し、かつ、空気中で、または液浸（たとえば、水、油、もしくは他の浸液など）を介して、画像化を行う。さまざまな態様において、対物レンズは、2 mm～25 mmの範囲内の焦点距離を有し得る。
本明細書において使用される場合、「基材」との語は、画像化のための標的である、多数の異なった特徴物を有する物体を指す。これらの特徴物は、空間的に均一なパターンとして配置されてよく、またはそうでなくてもよい。たとえば、いくつかの態様において、基材は、標的生体分子が標的特徴物として結合している表面を有する、非平面の構造物を含み、これはたとえば、ビーズまたはウェルなどである。別の例では、いくつかの態様において、基材はアレイチップを含む。アレイチップ（すなわち、アレイ、マイクロアレイ、またはチップ）とは、表面を有する固相の支持体であって、該表面に、標的生体分子（たとえば、タンパク質または核酸）が標的特徴物として結合している結合部位が載っている、固相の支持体を指し、該表面は、好ましくは平面の表面または実質的に平面の表面であるが、これらに限定されない。
本明細書において使用される場合、「レーン」との語は、検出可能なイベントを含む、基材の一部分を指し、該イベントは、分析物プローブの結合を含むが、これに限定されない。
本明細書において使用される場合、「フィールド」との語は、カメラにより、1枚の画像内にキャプチャー可能な、基材のある領域を指す。基材上のフィールドは、カメラの視野に関連付けられる。基材上の複数のフィールドの画像を取得することによって、基材の全体がスキャンされ得る。
本明細書において使用される場合、「光路（optical path）」または「光路（light path）」との語は、光または他の電磁放射線の、供給源からカメラのセンサーへの経路を指す。光路に沿ったミラーによる、光路の操作は、ランダムなまたは規則正しい速度変動を有して連続的に移動している基材から、静止画をキャプチャーすることを可能にする。
本明細書において使用される場合、「スキャニング」との語は、基材の状態を観察および記録するための操作を指す。
本明細書において使用される場合、「超解像」とは、画像化システムの回折限界未満で配置されている特徴物を指す。
本明細書において使用される場合、「速度追尾ミラー」との語は、ある速度での基材の移動を追尾するように構成されている、ミラーを指す。この速度は、固定であってよく、または可変であってもよい。速度は、あらかじめ定められていてよく、または速度における規則正しいかまたはランダムな誤差を含んでもよい。
本明細書において使用される場合、「速度追尾誤差」との語は、速度追尾ミラーによる基材またはステージの速度の追尾における、誤差を指す。いくつかの態様において、これは、速度追尾ミラーによって追尾されている速度から、基材の速度が逸脱したことの結果である。
本明細書において使用される場合、「加速追尾ミラー」との語は、光学スキャニングシステムに機能的に接続されているミラーであって、非直線性に応答して回転するミラーを指し、該非直線性は、たとえば、ステージ速度における規則正しいかもしくはランダムな誤差、または予想されたステージ速度もしくは一定のステージ速度からの、任意の他の逸脱などである。いくつかの態様において、ピクセルスミアが減少している、移動している基材の静止画を提供するために、加速追尾ミラーは、速度追尾ミラーと組み合わされる。
本明細書において使用される場合、「電気モーター」との語は、電気シグナルを物理的な運動へと変換する装置を指し、これはたとえば、電気エネルギーに応答して回転するモーターなどである。いくつかの態様において、電気モーターは、速度追尾ミラーまたは加速追尾ミラーを回転させるための、回転機構を提供する。電気モーターは、位置処理モジュールに機能的に連結され得るものであり、該位置処理モジュールは、電気モーターの制御された運動を引き起こすための、電気シグナルまたは駆動シグナルを送る。電気モーターは、ガルバノメーターまたは圧電アクチュエーターであり得る。本明細書において使用される場合、「ガルバノメーター」とは、電気シグナルに応答して動く、磁界中のコイルを指す。これは、追尾ミラーの回転運動を作動させるための電気モーターとしての役割を果たすことができる。本明細書において使用される場合、「圧電アクチュエーター」との語は、電場が印加された際の圧電材料の形状変化に基づく、電気モーターの一種を指す。本明細書においては、電気モーターが好ましい態様として称されるが、本明細書において記載される本発明の一部の構成要素の作動を引き起こす他の装置、たとえば、油圧の、空気圧の、または磁気の原理に基づくものなどもまた、使用され得る。
本明細書において使用される場合、「位置処理モジュール」との語は、装置における1つまたは複数の構成要素であって、光学スキャニングシステムの構成要素全体の制御をもたらす構成要素を指す。特に、位置処理モジュールは、1つまたは複数の追尾ミラーに機能的に接続されている電気モーターの動作を制御する装置を、含む。したがって、位置処理モジュールは駆動シグナルを生成し、そして該シグナルをこれらの電気モーターに伝達する。駆動シグナルは、ステージまたは基材の、あらかじめプログラムされた動きから、または観察された動きから、生成され得る。駆動シグナルは、位置センサーまたは速度センサーによって、たとえばエンコーダーなどによって収集された情報から生成され得、そして、速度測定値を生成するために使用され得、該速度測定値はその後、1つまたは複数の追尾ミラーの動作を制御する応答性の駆動シグナルへと、転換される。
本明細書において使用される場合、「電気シグナル」または「駆動シグナル」との語は、電気モーターへと送られる、制御された量のエネルギーであって、該モーターによって物理的な運動へと変換される、制御された量のエネルギーを指す。たとえば、ガルバノメーターは、鋸歯状波に似た駆動シグナルを送ることによって、可動ステージを追尾するように、および画像化の完了後にその元の位置へと戻るように、ミラーの回転を引き起こし得る。
本明細書において使用される場合、「デューティサイクル」との語は、追尾ミラーがステージを追尾しており、かつカメラがフィールドを画像化している時間（追尾ミラーがその初期位置に戻るという、フライバック時間の対義語）のパーセントを指す。
本明細書において使用される場合、「画像化頻度」または「画像キャプチャー頻度」との語は、基材上においてフィールドの画像がキャプチャーされる頻度を指す。
本明細書において使用される場合、「ピクセルスミア」との語は、画像化される物体の、画像キャプチャー中の移動に起因する、軸に沿ったピクセルの広がりの測定値を指す。大量のピクセルスミアは、シャープネスが低く、かつ大量のぼけを有する画像をもたらす。いくつかの態様において、光路における、または1つもしくは複数の追尾ミラーの動作における、補正されない速度変動に起因して、ピクセルスミアは生じる。本明細書においては、いくつかの態様において、速度変動を有して可動ステージ上を連続的に移動している基材の画像をキャプチャーするための装置および方法が提供され、ここで、基材の移動の主軸に沿ったピクセルスミアの量は、光路に沿った1つまたは複数の追尾ミラーの回転によって、軽減される。
本明細書において使用される場合、「ロジック」との語は、指示のセットであって、1つまたは複数の計算装置の1つまたは複数のプロセッサ（たとえばCPU）によって実行された際に1つまたは複数の機能を実施するように作動する指示のセット、および／または、他のロジック素子によって使用される、および／または機械的な装置（たとえばサーボ等）の操作を制御する素子によって使用される、1つもしくは複数の結果の形で、または入力データの形で、データを返すように作動する指示のセットを、指す。さまざまな態様および実行において、任意の所与のロジックは、1つまたは複数のプロセッサ（たとえばCPU）によって実行可能な1つまたは複数のソフトウェア要素として実行され得、1つまたは複数のハードウェア要素として、たとえば、特定用途向け集積回路（ASIC）および／またはフィールド・プログラマブル・ゲート・アレイ（FPGA）などとして、実行され得、または1つまたは複数のソフトウェア要素、および1つまたは複数のハードウェア要素の任意の組み合わせとして実行され得る。任意の特定のロジックのソフトウェア要素は、スタンドアローン型のソフトウェアアプリケーションとして、クライアントサーバーシステムにおけるクライアントとして、クライアントサーバーシステムにおけるサーバーとして、1つまたは複数のソフトウェアモジュールとして、1つまたは複数の関数ライブラリとして、ならびに、1つまたは複数の、静的および／もしくは動的リンクライブラリとして、実行され得るが、これらに限定されない。実行中、任意の特定のロジックの指示は、1つまたは複数の、コンピュータープロセス、スレッド、ファイバー、および他の適切なランタイムエンティティとして具現化され得、それらは、1つまたは複数の計算装置のハードウェアにおいてインスタンスを作成することができ、かつ、メモリー、CPU時間、ストレージ領域、およびネットワーク帯域幅を含み得るがこれらに限定されない計算リソースを、アロケートすることができる。
本明細書において使用される場合、中心間距離との語は、基材上の各分子の平均位置の間の差によって判定される、2つの近接する分子の間の距離を指す。平均最少中心間距離との語は、基材上に置かれた各分析物の中心とその最近傍の分析物の中心との間の平均距離を特に指すが、一方で、中心間距離との語はまた、基材上の分析物の密度に関連する限定の文脈においては、最少の中心間距離をも指す。本明細書において使用される場合、「ピッチ」または「平均有効ピッチ」との語は、概して、平均最少の中心間距離を指すために使用される。分析物の規則正しいアレイの文脈においては、ピッチはまた、画定された軸に沿って、近接する分子の間の中心間距離を決定するために、使用されてよい。
本明細書において使用される場合、「オーバーレイ」との語（たとえば、画像をオーバーレイする）は、複数のサイクルにわたって各分析物から検出される光学シグナル（たとえば位置および強度、またはピークの位置）の分布を生成するために、異なるサイクルからの画像をオーバーレイすることを指す。検出される光学シグナルのこの分布は、画像をオーバーレイすることによって、処理された人工的な画像をオーバーレイすることによって、または位置情報を含むデータセットをオーバーレイすることによって、生成され得る。したがって、本明細書において使用される場合、「画像をオーバーレイする」との語は、複数のサイクルのそれぞれについて、単一の分析物に結合する単一のプローブからの光学シグナルについての位置情報の分布を生成するための、これら機構の任意のものを包含する。
「サイクル」は、1つまたは複数のパスの完了、および検出可能な標識を基材から取り除くことによって、定義される。1サイクルにつき1つまたは複数のパスという、後続のサイクルが、実施され得る。本明細書において記載される方法およびシステムに関して、複数のサイクルが、単一の基材または試料に対して実施される。DNA配列決定に関して、複数のサイクルは、可逆的ターミネーター、および組み込まれたヌクレオチドから除去可能な、検出可能な標識の使用を必要とする。タンパク質に関して、複数のサイクルは、それらの適切な立体配置で折りたたまれたタンパク質を維持するか、または使用されるプローブが、結合効率がタンパク質の折りたたみの立体配置とは無関係であるようペプチド配列に結合するように選ばれるかのいずれかの、プローブを除去する（取り除く）条件を必要とする。
検出アッセイにおける「パス」とは、検出可能な標識を含む複数のプローブが、結合した分析物に導入され、プローブと別個の標的分析物との間に選択的な結合が生じ、そして検出可能な標識から複数のシグナルが検出されるというプロセスを指す。パスは、標的分析物に特異的に結合する抗体のセットの導入を含む。パスはまた、合成による配列決定中に伸長する鎖への組み込みのための、標識されたヌクレオチドのセットの導入を含み得る。基材からすべての検出可能な標識が取り除かれる前に、または検出可能な標識もしくは可逆的ターミネーターが配列決定中に組み込まれたヌクレオチドから除去される前に、プローブの異なるセットの複数のパスが存在し得る。一般的に、4つのヌクレオチドがパス中に使用される場合、サイクルは、標準的な4つのヌクレオチドでの合成による配列決定について、単一のパスのみからなる。
本明細書において使用される場合、画像とは、サイクル中またはサイクル内のパス中に取得される、フィールドの画像を指す。いくつかの態様において、単一の画像は、単色の検出可能な標識の検出に限定される。
本明細書において使用される場合、「フィールド」との語は、画像化される基材の、単一の領域を指す。典型的なアッセイ中に、単一のフィールドは、1サイクルにつき少なくとも1回画像化される。たとえば、4色を用いる20サイクルのアッセイについて、すべて同じフィールドの、20 * 4 = 80枚の画像が存在し得る。
「標的分析物」または「分析物」とは、同定、定量化、あるいは特徴付けされようとする、単一の分子、化合物、複合体、物質、もしくは成分を指す。標的分析物は、限定するものではないが、例として、単一の分子（任意の分子サイズのもの）、単一の生体分子、ポリペプチド、タンパク質（折りたたまれている、もしくは折りたたまれていない）、ポリヌクレオチド分子（RNA、cDNA、もしくはDNA）、それらの断片、修飾核酸などのそれらの修飾分子、またはそれらの組み合わせを含み得る。1つの態様において、標的ポリヌクレオチドは、合成による配列決定を容易にするように、ハイブリダイズされるプライマーを含む。標的分析物は、本明細書において記載される光学的検出方法を用いて標的分析物を配列決定する、同定する、および定量化するために使用され得るプローブによって、認識される。
「プローブ」とは、本明細書において使用される場合、分子、細胞の構成要素もしくは構造、または細胞の特性を検出するまたは評価するための、他の分子（たとえば合成による配列決定中に標識される相補的ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、もしくは全長のタンパク質等）、細胞の構成要素もしくは構造（脂質、細胞壁等）、または細胞に結合することができる、分子を指す。プローブは、標的分析物に結合する構造または構成要素を含む。いくつかの態様において、複数のプローブが、同じ標的分析物の異なる部分を認識してよい。プローブの例は、限定するものではないが、標識された可逆的ターミネーターヌクレオチド、アプタマー、抗体、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド（DNA、RNA）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。プローブとしての、抗体、アプタマー、オリゴヌクレオチド配列、およびそれらの組み合わせはまた、以下に詳細に記載される。
プローブは、プローブの標的分析物への結合を検出するために使用される、検出可能な標識を含み得る。プローブは、直接的にまたは間接的に、標的分析物に結合され得るか、ハイブリダイズされ得るか、コンジュゲートされ得るか、もしくは共有結合され得る。
本明細書において使用される場合、検出可能な標識との語は、プローブが標的分析物に結合され、そして光学画像化システムを用いて画像化される際に、検出可能な光学シグナルを発生させることができる、プローブに結合される分子を指す。検出可能な標識は、直接的にまたは間接的に、プローブに結合され得るか、ハイブリダイズされ得るか、コンジュゲートされ得るか、もしくは共有結合され得る。いくつかの態様において、検出可能な標識は、蛍光分子または化学発光分子である。プローブは、検出可能な標識を介して光学的に検出され得る。
本明細書において使用される場合、光学分布モデルとの語は、点光源からの光検出に関する統計学的な確率の分布を指す。これらは、たとえばガウス分布を含む。ガウス分布は、光学分布モデルとして点像分布関数を生成するために、検出において予想される収差を含むように修正され得る。
光学スキャニングシステムおよびその使用方法
本明細書において、基材が可動ステージ上で移動している最中に、高感度で、基材の一部分または基材のフィールドの画像を高フレームレートでキャプチャーするためのシステムが提供される。該光学スキャニングシステムは、高速、単一分子、単一フルオロフォアでの画像化が可能であり、これはこれまで、ステージ移動の厳密な制御を必要とする、重くかつ高価なシステムか、またはより遅い、ステップアンドリピート方式の光学スキャニングシステムによってしか、提供されていない。本明細書において提供される光学スキャニングシステムは、1%から10%まで変動するステージ速度、および画像の少なくとも数ピクセルのぼけを補正する、1つのミラーまたは2つのミラーのスキャニング光学素子を用いることによって、（連続的に移動しているステージの画像として使用され得る。この補正は、0.1%未満の変動で追尾されたステージ速度と同等の、または+/-1ピクセル以下のピクセルスミアの画像と同等の画像をもたらし得る。したがって、本明細書において開示されるスキャニング光学素子は、速度誤差（すなわち速度変動）を、たとえば可動ステージまたは基材の局所的な加速および減速などを、補正して、連続的に移動している可動ステージの画像化中に、安定化された画像フィールドをカメラへと提供して、ピクセルスミアを減少させる、システムを提供する。
本明細書における光学スキャニングシステムは、速度を追尾するための1つのスキャニングミラーを含む、高速スキャニングのための超解像画像化システムを提供する。該超解像画像化システムは、エンコーダーを有する試料ステージ、FPGA、レーザー照射源、1つのミラーまたは高速スキャニング光学素子、およびカメラまたは画像検出手段を含み得る。ある例において、システムは2つのスキャニングミラーを含み得る。この高速スキャニングシステムは、試料ステージのリアルタイム位置情報を利用して、試料ステージの移動と同期した様式で1つのミラーを回転させるために使用される波形を、生成かつ更新するものであり、ここで、ミラーの同期した回転は、回転範囲全体にわたって、回転範囲の最終位置まで続き得る。2つのミラーシステムを含むある例において、高速スキャニングシステムは、試料ステージのリアルタイム位置情報を利用して、試料ステージの移動と同期した様式で2つのミラーを回転させるために使用される波形を、生成かつ更新するものであり、ここで、片方または両方のミラーの同期した回転は、回転範囲全体にわたって、回転範囲の最終位置まで続き得る。ある例において、エンコーダーは位置情報を含み得る。この回転範囲中に取得された画像は、フォワードスキャン画像を含む。ある例において、フォワードスキャンの完了後に、ミラーの回転は、ステージが連続的に移動している最中の、ミラーの回転範囲の開始位置に戻る回転であるバックスキャンと、次のフィールドのフォワードスキャンとを含む。
ある例において、超解像画像は約10 nm～約40 nm未満のぼけを含む。ある例において、超解像画像は、約40 nm～約35 nm未満、約40 nm～約30 nm未満、約40 nm～約25 nm未満、約40 nm～約20 nm未満、約40 nm～約15 nm未満、約40 nm～約10 nm未満、約35 nm～約30 nm未満、約35 nm～約25 nm未満、約35 nm～約20 nm未満、約35 nm～約15 nm未満、約35 nm～約10 nm未満、約30 nm～約25 nm未満、約30 nm～約20 nm未満、約30 nm～約15 nm未満、約30 nm～約10 nm未満、約25 nm～約20 nm未満、約25 nm～約15 nm未満、約25 nm～約10 nm未満、約20 nm～約15 nm未満、約20 nm～約10 nm未満、または約15 nm～約10 nm未満のぼけを含む。ある例において、超解像画像は、約40 nm未満、約35 nm未満、約30 nm未満、約25 nm未満、約20 nm未満、約15 nm未満、または約10 nm未満のぼけを含む。ある例において、超解像画像は、少なくとも、約40 nm未満、約35 nm未満、約30 nm未満、約25 nm未満、約20 nm未満、または約15 nm未満のぼけを含む。ある例において、超解像画像は、最大で、約35 nm未満、約30 nm未満、約25 nm未満、約20 nm未満、約15 nm未満、または約10 nm未満のぼけを含む。
ある例において、ぼけの低減は、約20フレーム毎秒（FPS）～約150 FPSのフレームレートにおいて達成される。ある例において、ぼけの低減は、以下のフレームレートにおいて達成される：約20 FPS～約30 FPS、約20 FPS～約40 FPS、約20 FPS～約50 FPS、約20 FPS～約75 FPS、約20 FPS～約100 FPS、約20 FPS～約125 FPS、約20 FPS～約150 FPS、約30 FPS～約40 FPS、約30 FPS～約50 FPS、約30 FPS～約75 FPS、約30 FPS～約100 FPS、約30 FPS～約125 FPS、約30 FPS～約150 FPS、約40 FPS～約50 FPS、約40 FPS～約75 FPS、約40 FPS～約100 FPS、約40 FPS～約125 FPS、約40 FPS～約150 FPS、約50 FPS～約75 FPS、約50 FPS～約100 FPS、約50 FPS～約125 FPS、約50 FPS～約150 FPS、約75 FPS～約100 FPS、約75 FPS～約125 FPS、約75 FPS～約150 FPS、約100 FPS～約125 FPS、約100 FPS～約150 FPS、または約125 FPS～約150 FPS。ある例において、ぼけの低減は、約20 FPS、約30 FPS、約40 FPS、約50 FPS、約75 FPS、約100 FPS、約125 FPS、または約150 FPSのフレームレートにおいて達成される。ある例において、ぼけの低減は、少なくとも、約20 FPS、約30 FPS、約40 FPS、約50 FPS、約75 FPS、約100 FPS、または約125 FPSのフレームレートにおいて達成される。ある例において、ぼけの低減は、最大で、約30 FPS、約40 FPS、約50 FPS、約75 FPS、約100 FPS、約125 FPS、または約150 FPSのフレームレートにおいて達成される。
エンコーダーは、位置をエンコードするスケールと組み合わされた、センサー、トランスデューサー、または読み取りヘッドであり得る。ある例において、センサーは、エンコードされた位置をアナログシグナルまたはデジタルシグナルへと変換するために、スケール（たとえばエンコーダーカウント）を読み取り、該シグナルはその後、デジタルリードアウト（DRO）または動作制御器によって、位置へとデコードされ得る。したがって、ある例において、位置センサー（位置センサー、速度センサー、および／または加速センサーを含む）は、基材または可動ステージにおけるエンコーダーカウント（または別のスケール）と連動する、リニアエンコーダーである。ある例において、基材におけるエンコーダーカウントは、約0.05μm～約30μmの距離に位置付けられる。ある例において、基材におけるエンコーダーカウントは、以下の距離に位置付けられる：約0.05μm～約0.1μm、約0.05μm～約1μm、約0.05μm～約2μm、約0.05μm～約3μm、約0.05μm～約5μm、約0.05μm～約7μm、約0.05μm～約10μm、約0.05μm～約15μm、約0.05μm～約20μm、約0.05μm～約25μm、約0.05μm～約30μm、約0.1μm～約1μm、約0.1μm～約2μm、約0.1μm～約3μm、約0.1μm～約5μm、約0.1μm～約7μm、約0.1μm～約10μm、約0.1μm～約15μm、約0.1μm～約20μm、約0.1μm～約25μm、約0.1μm～約30μm、約1μm～約2μm、約1μm～約3μm、約1μm～約5μm、約1μm～約7μm、約1μm～約10μm、約1μm～約15μm、約1μm～約20μm、約1μm～約25μm、約1μm～約30μm、約2μm～約3μm、約2μm～約5μm、約2μm～約7μm、約2μm～約10μm、約2μm～約15μm、約2μm～約20μm、約2μm～約25μm、約2μm～約30μm、約3μm～約5μm、約3μm～約7μm、約3μm～約10μm、約3μm～約15μm、約3μm～約20μm、約3μm～約25μm、約3μm～約30μm、約5μm～約7μm、約5μm～約10μm、約5μm～約15μm、約5μm～約20μm、約5μm～約25μm、約5μm～約30μm、約7μm～約10μm、約7μm～約15μm、約7μm～約20μm、約7μm～約25μm、約7μm～約30μm、約10μm～約15μm、約10μm～約20μm、約10μm～約25μm、約10μm～約30μm、約15μm～約20μm、約15μm～約25μm、約15μm～約30μm、約20μm～約25μm、約20μm～約30μm、または約25μm～約30μm。ある例において、基材におけるエンコーダーカウントは、約0.05μm、約0.1μm、約1μm、約2μm、約3μm、約5μm、約7μm、約10μm、約15μm、約20μm、約25μm、または約30μmの距離に位置付けられる。ある例において、基材におけるエンコーダーカウントは、少なくとも、約0.05μm、約0.1μm、約1μm、約2μm、約3μm、約5μm、約7μm、約10μm、約15μm、約20μm、または約25μmの距離に位置付けられる。ある例において、基材におけるエンコーダーカウントは、最大で、約0.1μm、約1μm、約2μm、約3μm、約5μm、約7μm、約10μm、約15μm、約20μm、約25μm、または約30μmの距離に位置付けられる。ある例において、エンコーダーによって検出可能な位置の分解能は、1 nm以下である。これは、たとえば、基材上のライン間への、またはエンコーダーカウント間への内挿を用いてなされ得る。エンコーダーカウント間の間隔は、ステージのスキャンスピードと、および位置測定の頻度と、相関し得る。
エンコーダーによって、たとえばリニアエンコーダーによって使用されるスケールは、光学型、磁気型、静電容量型、誘導型、渦電流に基づくものであり得る。ある例において、位置の検出は、たとえば、画像相関法に基づく光学画像センサーを用いることによって、基材または可動ステージ上のスケール無しでなされ得る。
ある例において、超解像画像化システムは、ゲノム配列決定用のデータを取得するために使用され得る。いくつかの例において、本明細書において、回折限界未満の中心間の間隔で表面上に固定化された分析物からのシグナルの画像化を容易にするための、システムおよび方法が提供される。これらのシステムおよび方法は、高い分解能の画像を生成するために、先進の画像化システムを使用し、かつ、高い正確性での基材上の分子の位置決定を容易にするために、反復検出を使用し、かつ、高密度に詰め込まれた表面上の各分子についてのシグナルのアイデンティティを高い正確性で取得するために、画像のデコンボリューションを使用する。これらの方法およびシステムは、高密度に詰め込まれた基材上での、単一分子の、合成による配列決定を可能にして、高い正確性での高効率かつ非常に高スループットのポリヌクレオチドの配列決定を提供する。
光学スキャニングシステムの、ミラーが1つの態様において提供されるスキャニング光学素子は、図4に示される。この態様において、光学スキャニングシステムは、マウントされた基材120を軸に沿って移動させるように構成されている、可動ステージ110を含む。基材120は、1つまたは複数のフィールド121を含み、該フィールドは、ステージが連続的に移動しているときに、光学スキャニングシステムによって個々に画像化される。基材は、照射機構（示されていない）によって照射され、そして基材からの光は、対物レンズ130を通って、光路に沿って進む。移動している基材の画像は、移動追尾ミラー145によって、画像センサーに対して安定化される。フィールド121の画像は、画像センサーを含むカメラ160によってキャプチャーされる。移動追尾ミラー145は、画像フィールドの平面に対して平行である軸の回りを回転するように構成されている。移動追尾ミラー145の回転は、カメラ160による画像のキャプチャー中に、光路を調節して、フィールドの画像を安定化させる。したがって、光学スキャニングシステムの、ミラーが1つの態様は、移動している基材の画像化中に、ステージの速度変動を補正しないシステムによって、シャープネスが改善されているか、またはピクセルスミアが減少している、安定化された画像を提供する。
いくつかの態様における光学スキャニングシステムは、連続的に移動している物体、たとえば、可動ステージ上にマウントされた基材などを、スキャニングの様式で画像化するように構成されている。そのような態様において基材は、典型的には可動ステージ上にマウントされており（あるいは、可動ステージ上に設置されており）、該可動ステージは、カメラが基材のフィールドの画像をキャプチャーする最中に、対物レンズの下で基材を連続的に移動させることができる1つまたは複数の機構（たとえば、モーターまたは他のアクチュエーター）に、連結されている。可動ステージは、対物レンズの光軸に対して垂直である方向に沿って基材を移動させるように構成されており、かつそうさせるように作動する。いくつかの態様において、通常、対物レンズの光軸に沿って、画像化される物体および／または対物レンズを動かす、自動焦点合わせ型の機構の動作に対して、可動ステージの移動の軸は直交する。
さまざまな態様において、可動ステージの速度は、0.1 mm毎秒～1000 mm毎秒の範囲内（またはより速い）であり得る。いくつかの態様において、可動ステージの速度は、10 mm毎秒～100 mm毎秒の範囲内であり得る。いくつかの態様において、可動ステージ（およびしたがって、その上にマウントされた基材）は、一定の速度で移動するように構成され得るが、該ステージは依然として、本明細書において提供される光学システムによって補正される速度変動誤差の、対象である。いくつかの態様において、可動ステージは、10～50 mm毎秒の速度で移動する。いくつかの態様において、可動ステージの速度は約25 mm毎秒である。他の態様において、可動ステージは、一定でない速度で移動するように構成され得る。この一定でない速度もまた、本明細書において提供される光学システムによって補正される変動誤差の、対象になり得る。
いくつかの態様において、所与の望ましい速度で可動ステージを移動させることを容易にするための機構が使用され得る。そのような機構は、移動を引き起こす1つまたは複数の構成要素（たとえば、リニアモーター、リードスクリュー、スクリューモーター、スピードスクリュー等）、および摩擦を減少させる1つまたは複数の構成要素（たとえば、さまざまなタイプのベアリングなど）を含み得る。
たとえば、いくつかの態様において、可動ステージには、金属ベアリング（たとえば、ボールベアリング、シリンダーベアリング、クロスローラーボールベアリング等）が使用され得、該金属ベアリングは、数ミクロンの反復性を有していて、所与の望ましい速度で可動ステージを移動させることを容易にする。反復性は、根本的には、油中で金属ベアリングを転がすことの結果である － 金属ベアリングは転がる際に弾み、そしてそのような弾みは、ベアリング上で移動している物体の動きにジッターをもたらす。そのような動きの「反復性」は、ある一定の範囲よりも上でのみ、均一であり得る、なぜならば、任意の2つの金属ベアリングは、ある一定の許容性の範囲内でのみ、同じ様式で弾み得るからである。したがって、ボールベアリングを使用する態様は、典型的にはより大きい速度変動を有し、かつしたがって画像のぼけ（たとえばピクセルスミア）をもたらす。しかしながら、ボールベアリングを使用するステージは、それらが、同等なエアベアリングのステージよりも、軽く、小さく、かつ安価であるという点を含む、いくつかの利点を提供する。したがって、本明細書において、いくつかの態様にしたがって、可動ステージの速度変動に起因する画像のぼけまたはピクセルスミアを減少させるための、改善されたスキャニング光学素子が提供され、ここで可動ステージは、移動対象にいくらかの速度変動をもたらすボールベアリングまたは他の構成要素を有するステージを包含する。
いくつかの態様において、連続的な光学スキャニング中に、可動ステージの速度は、意図される速度から0.1%を超えて変動する。いくつかの態様において、連続的な光学スキャニング中に、可動ステージの速度は、意図される速度から0.5%を超えて変動する。いくつかの態様において、連続的な光学スキャニング中に、可動ステージの速度は、0.1%～1%変動する。いくつかの態様において、本明細書において提供される光学スキャニングシステムは、0.1%～1%の間から0.1%未満までの速度変動を有する可動ステージからの画像の、ぼけまたはピクセルスミアを減少させる。いくつかの態様において、安定化された画像のピクセルスミアは、
Figure 2022546589000002
未満である。いくつかの態様において、可動ステージは、2次元フルフレーム電子センサーを有するカメラが2次元画像を生成する最中に、対物レンズに対する第1の既知の横方向において、連続的な動きで基材を移動させるように構成されている。いくつかの態様において、基材上のフィールドの複数の行または列を画像化するために、可動ステージは、連続的に蛇行する様式で移動するように構成されている。
いくつかの態様において、基材は、可動ステージ上にマウントされる（あるいは、可動ステージ上に設置される）。いくつかの態様において、基材は、その上に配置された標的生体分子を有するアレイを含む。いくつかの態様において、基材は、画像化のための標的である、多数の異なった特徴物を含む。たとえば、アレイチップなど。いくつかの態様において、基材は、画像化するための標的がランダムに位置しているアレイを含む。
いくつかの態様において、基材は、画像化のための標的である、多数の異なった特徴物を含む。たとえば、いくつかの態様において、基材は、標的生体分子が標的特徴物として結合している表面を有する、非平面の構造物を含み、これはたとえば、ビーズまたはウェルなどである。いくつかの態様において、基材はアレイチップを含む。いくつかの態様において、アレイチップは、表面を有する、たとえば、平面の表面または実質的に平面の表面を有する、固相の支持体であり、該表面には、生体分子が標的特徴物として結合する結合部位が載っている。いくつかの態様において、アレイチップ上の結合部位は、規則的なパターンで、またはランダムな様式で、配置され得る。いくつかの態様において、結合部位は、標的生体分子の結合に適した寸法を有するように構成されている。したがって、結合部位は、空間的に規定されていて、かつ他の部位とオーバーラップしていない；つまり結合部位は、アレイチップ上において空間的に分離している。結合部位へと結合する際、生体分子は、アレイチップに共有結合してよく、または非共有結合してもよい。
いくつかの態様において、基材はバイオチップである。いくつかの態様において、バイオチップは、高スループットマイクロ流体を含む。いくつかの態様において、バイオチップは、試料から単一分子を検出するための生体分子を含む。いくつかの態様において、基材は、その上に配置された標的核酸を有するアレイを含む。別の態様において、基材は、画像化のための標的である、多数の異なった特徴物を含む。
いくつかの態様において、基材上の結合部位は、それぞれが別々に画像化されるフィールドへと、分割される。典型的な基材は、数百または数千のフィールドへと分割され得るものであり、該フィールドは、行および列の矩形のパターンに配置される。（たとえば、フィールドの行および列は追尾領域を含み得、該領域は、それぞれ実質的に横の寸法および縦の寸法に沿って整列している）。
そのような態様において、本明細書において記載される技術は、基材をフィールドごとにスキャニングおよび画像化する技術を提供する。一例として、対物レンズの光軸に対して実質的に垂直な平面および／または軸において、y方向に沿って可動ステージが基材を移動させている最中に、光学スキャニングシステムは、（本明細書において記載されるように）スキャニングの様式で基材を画像化する。この例においては、可動ステージが、フィールドの次の列を画像化するために基材を配置できるようにすることを目的として、画像化されているフィールドの列の最終位置に到達したときに、光学スキャニングシステムは画像化を停止する。別の例において、対物レンズの光軸に対して実質的に垂直である平面において、（たとえばy方向に沿って）前後に蛇行する様式で可動ステージが基材を移動させている最中に、光学スキャニングシステムは、（本明細書において記載されるように）スキャニングの様式で基材を画像化する。この例においては、光学スキャニングシステムは、可動ステージが一方向に基材を移動させている最中に、フィールドのうちのある列を画像化し、そしてその後、可動ステージが逆方向に基材を移動させている／戻している最中に、フィールドの次の／隣接する列を画像化するものであり、たとえば、光学スキャニングシステムは、連続的に蛇行する様式でフィールドの列を効率良く横切ることによって、基材を画像化する。
光学スキャニングシステムの対物レンズは、基材またはその一部分をカメラ上で画像化するように構成されており、かつそうするように作動する。いくつかの態様において、対物レンズは、光学スキャニングシステムにおける、1つの素子であるかまたは素子の1群であって、1つまたは複数のレンズを含み、かつ、電磁シグナル（たとえば、光学シグナルなど）を拡大するように構成されており、かつそうするように作動する。いくつかの態様において、対物レンズは、大きい開口数（NA）（たとえば、0.6～1.5の範囲内のNA）を有し、かつ、空気中で、または液浸（たとえば、水、油、もしくは他の浸液など）を介して、画像化を行う。さまざまな態様において、対物レンズは、2 mm～40 mmの範囲内の焦点距離を有し得る。対物レンズは、オフザシェルフの顕微鏡用対物レンズであってよく、またはカスタム設計された多素子光学要素であってもよい。いくつかの態様において、2次元画像を生成するため、対物レンズは、カメラの2次元フルフレーム電子センサー上に、基材の2次元の少なくとも一部分を画像化するように、構成されている。
対物レンズの倍率とは、画像スペースのピクセル（すなわちカメラピクセル）のサイズの、カメラによって観察された際の該画像スペースのピクセルに対応する物体スペースの領域の実際のサイズに対する、比率である。たとえば、16Xの倍率は、500 nmの物体スペースのピクセルを観察するために、カメラが8μmのピクセルを使用することを可能にする。いくつかの態様において、対物レンズは4X～100Xの倍率を有する。いくつかの態様において、対物レンズは20X～50Xの倍率を有する。いくつかの態様において、対物レンズは40Xの倍率を有する。
いくつかの態様において、対物レンズは、自動焦点合わせを可能にするように対物レンズを位置調整するための電気モーターに、機能的に接続されている。いくつかの態様において、装置は焦点合わせセンサーを含む。いくつかの態様において、装置は、焦点合わせセンサーのアレイを含む。
いくつかの態様において、使用される自動焦点合わせ機構は、光学的検知法に基づく。いくつかの態様において、自動焦点合わせは、画像のコンテント解析によって実施される。いくつかの態様において、自動焦点合わせは、複数の焦点距離において基材の複数の画像を取得すること、画像のそれぞれについて最適な焦点距離を決定すること、および焦点距離を調節するフィードバックループを使用することによって、実施される。
自動焦点合わせは、基材にレーザービームを当てること、基準点を準備するために、基材からのレーザービームの反射を測定すること、および焦点距離を調節するフィードバックループを使用することによって、実施され得る。いくつかの態様において、光学型ではない非接触式位置センサーが使用される。これらのセンサーは、高帯域幅および0.1μm以下の追尾精度での、位置の読み取りを行うことが可能である。いくつかの態様において、静電容量式センサーが使用され得る（たとえば、その開示が参照により本明細書に組み入れられるUS 2002/0001403を参照されたい）。
いくつかの態様において、対物レンズの自動焦点合わせは、100 ms未満で達成される。いくつかの態様において、装置によって提供される自動焦点合わせの範囲は、+/- 200μmである。
いくつかの態様において、光学スキャニング装置は、アクティブ方式の自動焦点システムを含み、これは、光学システムから独立して、対象までの距離を測定し、そして続いて、正しい焦点へと対物レンズを調節する。いくつかの態様において、パッシブ方式の自動焦点システムが使用され、これは、光学システム内に入っている画像のパッシブ解析を実施することによって、正しい焦点を決定する。パッシブ方式の自動焦点合わせは、たとえば、位相差検出またはコントラスト測定によって達成され得る。
いくつかの態様において、光学スキャニングシステムは、基材が可動ステージによって移動している最中に、基材のフィールドの2次元静止画をキャプチャー可能なカメラを含む。いくつかの態様において、光学スキャニングシステムはフルフレームカメラを含む。いくつかの態様において、フルフレームカメラは、相補型金属酸化物半導体（CMOS）カメラである。これらのフルフレームカメラは、高速であり、高分解能であり、かつ低コストである。さらにそれらは、連続的に移動している基材の画像を高い分解能でキャプチャーするための光学スキャニングシステムに対して、互換性がある。いくつかの態様において、カメラは、サイエンティフィックCMOS（sCMOS）カメラである。いくつかの態様において、カメラは、CMOSカメラ以外の、フルフレームモードで作動可能なカメラである。
本明細書において記載される光学スキャニングシステムは、画像化される基材が移動している最中に、静止画の連続的な露光を達成するために、スキャニング光学素子（たとえば、ミラーが1つの態様またはミラーが2つの態様）と連結させた高速カメラを使用するように構成されている。いくつかの態様において、カメラピクセルのサイズ（長さおよび／または幅）は、5μm～10μmの範囲内、好ましくは6～8μmの範囲内であるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、カメラピクセルのサイズは6.5μmである。いくつかの態様において、カメラは、15 x 15 mm～10 x 10 mmの範囲内の画像化センサーを含む。
さまざまな態様において、本明細書において記載される光学スキャニングシステムは、カメラ中で画像を動かさない高速カメラを、たとえば、フルフレーム2Dモードで作動する、TDIカメラ以外のカメラおよび他のカメラ（TDIカメラを含む）などを、使用することによって、連続的に移動している基材（たとえばアレイチップ）をスキャンするように構成されている。CMOSカメラは、そのようなカメラのクラスの一例である。CMOSカメラは、典型的にはアクティブピクセルセンサー（APS）を使用しており、該センサーは、ピクセルのアレイを含む集積回路を含む画像センサーであって、該ピクセルのそれぞれは、光検出器およびアクティブ増幅器を含んでいる。
高速カメラは、ある単位時間内に該カメラで露光することができるピクセル数、という観点から定義され得る。たとえば、カメラのスピードは、視野内のピクセルの数と、該カメラが撮影可能なフレーム毎秒との掛け算の積によって、定義され得る。したがって、5.5メガピクセルの視野（たとえば、2560ピクセル x 2160ピクセルの視野）を有するカメラを100フレーム毎秒（fps）で作動させると、550メガピクセル毎秒を露光することが可能であろう；したがって、そのようなカメラは、本明細書において「550」メガピクセルカメラと呼ばれる。そのようなカメラの例には、CMOSカメラ、sCMOSカメラ、および同様のカメラが含まれるが、これらに限定されない。さまざまな態様において、本明細書において記載される光学スキャニングシステムには、10メガピクセル～2500メガピクセルの範囲内のカメラが使用され得る。いくつかの態様において、カメラは、2次元のフルフレーム電子センサーを含む。
本明細書において、光学スキャニングシステムの一部として記載されるスキャニング光学素子は、追尾ミラーが1つおよび2つの態様を含み得、該態様は、画像化される物体とカメラとの間の、システムの光路に沿って設置された、1つまたは複数の回転可能なミラーを有する。ミラーが2つの態様においては、2セットのスキャニング光学素子が使用され、そのそれぞれは、画像化中の、軸に沿った可動ステージの移動を追尾するために、協調して作動することが可能である。第1のスキャニング光学素子（たとえば速度追尾ミラー）は、予想された速度または速度パターンでのステージの移動を追尾して、フィールドの移動中にカメラによってフィールドを画像化することを可能にするために、使用される。第2のスキャニング光学素子（たとえば加速追尾ミラー）は、許容できないピクセルスミアをもたらし得る、局所的なステージ加速を補正するために使用されて、それにより画像が安定化する。追尾ミラーが1つの態様においては、1セットのスキャニング光学素子が、予想された速度または速度パターンでのステージの移動を追尾すること、および許容できないピクセルスミアをもたらし得る、局所的なステージ加速（すなわち速度変動）を補正することの、両方のために使用されて、それにより画像が安定化する。ミラーが1つの態様に関し、1セットのスキャニング光学素子は、速度および加速（または速度変動）を含む、すべてのステージ移動を補正する。いくつかの態様において、1セットのスキャニング光学素子は、一定のまたは予想された、速度または速度パターンと、測定されたかまたはあらかじめ定められた速度変動（加速）との両方についての、その補正を指示するための、移動追尾ミラーを含む。
いくつかの態様において、可動ステージの速度変動に応答する、追尾ミラーの動作は、フィードバック制御機構に基づく。いくつかの態様において、フィードバック制御機構は、基材の位置を経時的に測定する装置、たとえばエンコーダーなどを含む。いくつかの態様において、速度変動に応答する、ミラーの動作は、可動ステージに関してあらかじめ定められた速度変動に基づく。いくつかの態様において、回転可能なスキャニング光学素子のすべては、複数のカメラに画像を分配するために使用される任意の分配器よりも前において、光路に沿って位置する。
いくつかの態様において、可動ステージ上を軸に沿って移動している基材のフィールドを、カメラセンサーが画像化することを可能にするために、回転するように構成されている速度追尾ミラーを含む、光学スキャニング装置が、本明細書において提供される。速度追尾ミラーは、対物レンズからカメラへの光路に沿って光を反射させるように、装置に機能的にマウントされている。
移動している基材の静止画を維持することを目的として、可動ステージが基材を同じ特定の方向に移動させている最中に、光を対物レンズからカメラへと反射させるために、速度追尾ミラーは、可動ステージと協調して動作するように構成されており、かつそうするように作動する。したがって、速度追尾ミラーは、固定軸の周りを回転するように、装置に機能的にマウントされ得る。いくつかの態様において、固定軸は、2次元の基材画像の平面に対して平行である。いくつかの態様において、固定軸は、光路に対して直交している。したがって、速度追尾ミラーは、基材が可動ステージによって移動している最中に、カメラが、対物レンズを通して基材のフィールドの静止画を取得することを可能にする、角度のある動作を実施するように構成されており、かつそうするように作動する。
速度追尾ミラーは、速度追尾ミラーの回転を引き起こす電気モーターに、機能的に連結され得る。好ましい態様において、速度追尾ミラーに機能的に連結されている電気モーターはガルバノメーターであるが、他のタイプの電気モーターも使用され得る。適切なガルバノメーターの一例は、Nutfield QS-7 OPDガルバノメータースキャナー（Nutfield Technology）である。いくつかの態様において、速度追尾ミラーを作動させる他の機構、たとえば、油圧の、空気圧の、または磁気の原理に基づく機構などもまた、使用され得る。いくつかの態様において、電気モーターは、速度追尾ミラーに作動可能に連結されており、かつ該電気モーターは、対物レンズを通じて画像を取得している最中に、基材（またはフィールド）の画像をカメラに対して静止させておくために、可動ステージが基材を移動させている最中に、速度追尾ミラーが可動ステージと協調して角度のある動作を行うように、作動する。
速度追尾ミラーの動作は、速度追尾ミラーに機能的に接続されている電気モーターへと、駆動シグナルを送るように構成されている位置処理モジュールを通じて、調整され得る。位置処理モジュールは、以下を含み得る：所望の出力または動作プロファイルを生成する、動作制御器要素、および、動作制御器からの制御シグナルを、電気モーターを作動させる電気シグナルまたは駆動シグナルへと変換する、駆動または増幅器要素。
いくつかの態様において、速度追尾ミラーは、約60度、50度、40度、30度、20度、15度、10度、または5度の、回転の角度範囲を有する。いくつかの好ましい態様において、速度追尾ミラーは、約3度、2度、1度、1/2度、1/4度、または1/10度の、回転の角度範囲を有する。
移動している基材を画像化するために速度追尾ミラーを使用する、光学スキャニングシステムにおいては、移動している基材上の固定領域をカメラがとらえることができるように、ミラーの角度は経時的に調節される。これは、「フォワードスキャン」時間と称される。速度追尾ミラーはその後、その初期位置に戻るために、迅速に回転することが可能である。これは、「フライバック」時間または「バックスキャン」時間と称される。フライバック時間中は、カメラ上に投影されている画像は、安定していない。
図2は、例示的な一態様にしたがった、速度追尾ミラーの、角度のある動作およびタイミングの概略図を示す。作動中、対物レンズは、画像化中に軸に沿って移動している基材（たとえばアレイチップ）へと、焦点を合わせる。図2は、時間210の最中のステージの移動を示す。この移動中に、速度追尾ミラーはその初期位置からその最終位置へと回転して、基材の移動を追尾し、これはフォワードスキャン時間220として表わされる。1回のフォワードスキャンの最中に、基材の一部分が画像化され、これは本明細書においてフィールドと称される。速度追尾ミラーの回転により、フィールドに対応する基材の一部分の、露光時間内でのカメラによる画像化が可能となり、それにより、カメラセンサー上での十分な露光が可能となる。カメラに対する、フィールドのそれ以外の移動はいずれも、速度変動か、または予想された速度からの基材速度の逸脱に起因し得る。速度追尾ミラーがその極限の最終位置に到達すると、その後該ミラーは、新しいスキャンの準備のためにその初期位置へと戻り、これは、230におけるミラーの波形または動作として表わされる（フライバック時間）。基材の静止画は、フライバック時間の最中には取得されない。速度追尾ミラーのフォワードスキャン動作およびフライバック動作は、鋸歯状波形として表わされ（図2）、これは、スキャニング中およびフライバック中の速度追尾ミラーの動作と、速度追尾ミラーを作動させるために該ミラーに機能的に接続されている電気モーターへと送られる駆動シグナルとの、両方を反映している。
ミラーを駆動させるための鋸歯状波形（フォワードスキャンセグメントおよびバックスキャンセグメントを含む）の態様は、図2および3に示される。いくつかの態様において、速度追尾ミラーは、その動作範囲のセグメントにわたって、非直線性の応答を有し得る。この場合、速度追尾ミラーからの応答を直線化するように、波形または駆動シグナルを調節することによって、速度追尾ミラーの応答は直線化され得る。
いくつかの態様において、速度追尾ミラーは、加速追尾ミラーの回転を引き起こす電気モーターに、機能的に連結されている。好ましい態様において、速度追尾ミラーに機能的に連結されている電気モーターは、ガルバノメーター、または電流に応答して動く、磁界中の電気コイルである。いくつかの態様において、速度追尾ミラーの作動を引き起こす他の機構、たとえば、油圧の、空気圧の、または磁気の原理に基づく機構などもまた、使用され得る。いくつかの態様において、速度追尾ミラーに作動可能に連結されている電気モーターは、可動ステージまたは基材の速度の関数としての、速度追尾ミラーの角度のある動作を、生じさせるように作動する。
いくつかの態様において、速度追尾ミラーの動作は、該速度追尾ミラーに機能的に連結されている電気モーターへと、駆動シグナルを送るように構成されている位置処理モジュールを通じて、調整される。位置処理モジュールは、以下を含み得る：所望の出力または動作プロファイルを生成する、動作制御器要素、および、動作制御器からの制御シグナルを、電気シグナルまたは駆動シグナルとして電気モーターに伝えられるエネルギーへと変換する、駆動または増幅器要素。
いくつかの態様において、速度追尾ミラーに機能的に連結されている電気モーターに送られる駆動シグナルまたは電気シグナルは、直線化された、速度追尾誤差の波形であって、G(0,o.),c(0)) という関数として定義される波形であり得、ここでGは、0 = 角度位置、 o.) = 周波数を有する変形三角波であり、かつ 6(0) = 振幅である。
追尾ミラーの動作は、そのデューティサイクルによって特徴付けることができ、デューティサイクルは、追尾ミラー（tracking minor）が、基材の能動的な画像化を可能にするフォワードスキャン動作において機能的に動作している時間の部分として、定義される。たとえば、追尾ミラーが、追尾ミラーサイクルの少なくとも90%の最中に、カメラによる画像化を可能にするように基材を追尾する場合（たとえば、追尾ミラーのフライバック時間が、サイクルの10%以下である場合）、この技術は、少なくとも－90%の全体的なリードアウト効率で、カメラが作動することを可能にする。
たとえば蛍光での画像化、これはより長い露光時間が必要とされ得るものであるが、そのようないくつかの態様においては、蛍光での画像化の光のレベルが典型的には非常に弱いために、カメラによって画像が収集される時間であるスキャン時間は、適切なシグナル対ノイズ比を確立するのに十分に長いものでなくてはならない。
デューティサイクルはまた、追尾ミラーがその初期位置に戻る際のスピードによっても、影響を受ける。このフライバック時間は、追尾ミラーサイクルのうちのごく一部のみとなるように構成され得、したがってデューティサイクルを最大化し得る。効率を向上させるためには、画像化される領域のそれぞれに対して追尾ミラーが費やす時間を、カメラのフレームレートと釣り合うようにして、それにより、カメラ上で各フィールドの画像が露光されるのに十分な時間を確保する。
いくつかの態様において、デューティサイクルは60%より大きい。いくつかの態様において、デューティサイクルは60%～90%である。いくつかの態様において、画像キャプチャーのデューティサイクルは、少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、または10%である。いくつかの態様において、デューティサイクルは、10%と低いか、または20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、もしくは90%の範囲内であり得る。いくつかの態様において、これらのデューティサイクルは、30～200 Hzの画像化頻度で達成される。いくつかの態様において、これらのデューティサイクルは、30～40 Hzの画像化頻度で達成される。いくつかの態様において、これらのデューティサイクルは、30 Hz、35 Hz、40 Hz、45 Hz、または50 Hzの画像化頻度で達成される。
フライバック時間の最中は、光学スキャニングシステムは画像化を停止すべきである、これは、取得される画像が安定していないからである。したがって、フライバック時間の最中にカメラが画像を露光することを防止するために、さまざまな態様において、さまざまな機構が使用され得る。たとえば、いくつかの態様において、画像化されている基材上に入射する照射光を点けるため、および消すために、音響光学変調器（AOM）スイッチ（または他のタイプの高速スイッチ）が使用され得る。他の態様において、照射光の光路上に、適切な開口絞りが設置され得、ここで照射光はオーバースキャンし得るが、開口絞りは、視野以外の光を遮ることによって、フライバック時間中に光が基材を照射することを防止する。さらに他の態様において、照射光の光路上に、適切なシャッターが設置され得、ここで該シャッターは、露光時間中は開いたままであり、かつ追尾ミラーのフライバック時間中には閉じている。
ミラーが2つの態様において、光学スキャニング装置は、加速ミラーをさらに含み、該加速ミラーは、基材（またはその一部分）の画像化中の、基材からカメラへの光の伝達を安定化するために、オフセット補正を光路に提供するように構成されており、かつそうするように作動する。オフセット補正は、速度追尾ミラーによって追尾された速度と比較した、軸に沿った可動ステージの移動における、速度変動の関数である。これらの速度変動は、速度追尾ミラーによる可動ステージ追尾の正確性に影響を及ぼし得、そして結果的に、許容不可能なピクセルスミアを有する画像をもたらし得る。本明細書において提供される、加速追尾ミラーの回転は、カメラによってキャプチャーされたフィールドの画像を安定化させて、ステージまたは基材の速度変動に由来するピクセルスミアを減少させる。
図3は、フィールドについての平均ステージ速度誤差に応答して生成された、加速追尾ミラーの波形の一例を提供する。ステージ速度が正の誤差を有する場合、加速追尾ミラーの波形は、ステージの増加した速度を追尾するように生成される。逆に、ステージ速度が負の速度誤差を有する場合、加速追尾の波形は、ステージのより遅い速度を追尾するように生成される（すなわち、正の速度誤差とは逆の方向に回転する）。いくつかの態様において、加速追尾ミラーの波形は、速度誤差が検知された直後に、生成されそして駆動シグナルへと変換される。いくつかの態様において、加速追尾ミラーの波形は、n-1番目のフィールドの画像化中の速度の平均測定値に基づいて生成され、かつこの波形から駆動シグナルが生成されて、n番目のフィールドの画像化中の加速追尾ミラーの動作を駆動する。
ステージの速度誤差は、振幅（A）、ステージ位置（x）、および時間（t）の関数としてモデル化することができ、以下の関数が得られる：
F(A,x,t) = A(x)*Err(x,t)
いくつかの態様において、加速追尾ミラーに機能的に接続されている電気モーターの動作を制御する、電気シグナルまたは駆動シグナル（D）は、以下に表される関数により、ステージ速度誤差に基づいて決定され得る：
D(F,C,x,E) = F(A,x,t)y*C*x + E
式中、Cはスケール因子であり、x = ステージ位置であり、かつEはオフセットである。本明細書において記載されるように、F(A,x,t)yは、傾斜範囲 = yでの、または前のフィールドでの、F(A,x,t)の平均値である。不連続性を平滑化する関数もまた、加速追尾ミラーの駆動シグナルを生成するために使用され得る。
いくつかの態様において、加速追尾ミラーは、加速追尾ミラーの回転を引き起こす電気モーターに、機能的に連結されている。好ましい態様において、加速追尾ミラーに機能的に連結されている電気モーターは、圧電アクチュエーターであるが、他のタイプの電気モーターも使用され得る。いくつかの態様において、加速追尾ミラーの作動を引き起こす他の機構、たとえば、油圧の、空気圧の、または磁気の原理に基づく機構などもまた、使用され得る。いくつかの態様において、加速追尾ミラーに作動可能に連結されている電気モーターは、画像化中の速度変動を補正するために、可動ステージの速度における変動の関数としての、加速追尾ミラーの角度のある動作を、生じさせるように作動する。
いくつかの態様において、加速追尾ミラーの動作は、該加速追尾ミラーに機能的に接続されている電気モーターへと、駆動シグナルを送るように構成されている位置処理モジュールを通じて、調整される。位置処理モジュールは、以下を含み得る：所望の出力または動作プロファイルを生成する、動作制御器要素、および、動作制御器からの制御シグナルを、電気シグナルまたは駆動シグナルとして電気モーターに伝えられるエネルギーへと変換する、駆動または増幅器要素。加速追尾ミラーの動作は、可動ステージの速度における変動の関数であるため、位置処理モジュールは、位置センサー、速度センサー、または加速センサーをさらに含み得る。このセンサーは、基材または可動ステージの、位置および／または移動についての情報を決定する、一種のフィードバックセンサーとしての役割を果たすことができる。いくつかの態様において、センサーは、スキャニング装置に機能的にマウントされている、エンコーダー（たとえばリニアエンコーダー）または干渉計を含む。いくつかの態様において、エンコーダーは、干渉法によらないエンコーダーである。いくつかの態様において、速度の変化を決定するために、加速度計が使用され得る。いくつかの態様において、センサーは、速度変動テーブルからの情報を提供する構成要素であり、ここで該速度変動テーブルは、加速追尾ミラーに機能的に連結されている電気モーターのための駆動シグナルへと組み込むための、ステージについての予想された速度変動値を含む。
基材もしくはステージの位置からの、または移動センサーからの、位置測定値は、基材または可動ステージの測定された速度を表すデータセットを提供するために、使用される。測定された速度は、ステージにおける速度変動を決定するために、予想された速度と比較され得る。これらの速度変動はその後、電気シグナル（たとえば駆動シグナル）に転換され得、該シグナルは加速追尾ミラーに機能的に接続されている電気モーターの、制御された運動を引き起こす。加速追尾ミラーの制御された動作は、基材とカメラとの間の光路の位置を調節して、安定性が増加している、シャープネスが増加している、および／またはぼけもしくはピクセルスミアが減少している、画像を提供する。
電気モーターは、測定された速度変動に基づく補正項を含む駆動シグナルに、迅速に応答するというその能力に基づいて、選択され得る。迅速に応答するために、いくつかの態様において、電気モーターは、1度未満という、回転角度の全範囲を有する。いくつかの態様において、電気モーターは、圧電アクチュエーターか、または補正シグナルに対して類似の応答時間を有する別のモーターである。いくつかの態様において、位置センサーは、500 Hz、1 kHz、2 kHz、3 kHz、4 kHz、5 kHz、10 kHz、20 kHz、50 kHz、100 kHz、および250 kHzと等しいか、またはそれらよりも大きいレートで、位置情報を取得する。ある態様において、より高い頻度、たとえば5 kHz以上の位置検出は、ステージのより厳密な測定を可能にして、速度変動の分解能を増大させ、かつしたがって、よりシャープな画像を提供する。しかしながら、より低い頻度も、2ピクセルよりも大きいピクセルスミアを防止するための補正を提供するのに十分であれば、使用され得る。
たとえば、いくつかの態様において、エンコーダーは、基材またはステージの位置または移動についての測定情報を、計算装置において、たとえば動作制御器などにおいて実行するロジックに提供し、ここで該ロジックは、該測定情報を使用して、ステージ移動の方向について必要な補正項を計算し、かつサーボ機構、たとえば電気モーターなどを駆動して、可動ステージの速度変動の関数である、計算された補正項に基づいて、加速追尾ミラーを回転させる。
速度変動の決定は、位置センサーからの2つ以上の位置測定値から決定され得る。いくつかの態様において、近似の瞬間速度は、基材において測定された、直近の2つまたは3つの位置から決定され得る。
いくつかの態様において、駆動シグナルを生成するために使用される速度変動は、あらかじめ計算されているテーブルから、決定される。ステージに関する速度変動は既知であり得、かつ該速度変動は、動作制御器要素がアクセスするテーブルに、記録され得る。したがって、これらの態様において、位置センサーは、速度変動テーブルから動作制御器へとデータを提供する位置処理モジュールの、構成要素の1つである。
本明細書において記載されるように加速追尾ミラーを使用することによって、光学スキャニングシステムは、移動している基材の静止画を+7-1ピクセル以内の正確性で取得するために、フルフレームモードで作動するカメラ（たとえば、TDIモードで作動するのではないCMOSカメラなど）を使用し得る。生物学用の画像化のために採用されるいくつかの態様において、たとえば、DNA配列決定、または他の単一分子検出技術において、蛍光での画像化は、極度のアラインメント正確性を必要とし、そのため、速度変動を含む、軸に沿った基材の移動を補正して、可動ステージの移動における非直線性を除去するために、速度追尾ミラーおよび加速追尾ミラーの、少なくとも1対の使用が必要となり得る。
いくつかの態様において、ステージの速度およびステージの速度変動の両方を含む、軸に沿ったステージの移動の追尾は、1つの追尾ミラー（ミラーが1つの態様）によって実施され、これは本明細書において、移動追尾ミラーと称される。この態様において、1つの移動追尾ミラーは、上述の速度追尾ミラーおよび加速追尾ミラーの両方の機能を実施する。したがって、ミラーが1つの態様においては、駆動シグナルが、1つの移動追尾ミラーに機能的に連結されている電気モーターへと送られ、ここで該駆動シグナルは、スキャニング波形およびフライバック波形の両方（たとえば鋸歯状波）を含む、あらかじめ定められたステージ速度の関数であり、かつステージまたは基材の速度変動の関数でもあり、該速度変動は、あらかじめ定められたものであり得、または基材または可動ステージの移動についての情報を提供して、ステージまたは基材の速度変動を決定する、1つまたは複数の測定値に基づくものであり得る。
光学スキャニングシステムの、ミラーが1つの態様において提供されるスキャニング光学素子は、図4に示される。この態様において、光学スキャニングシステムは、マウントされた基材120を軸に沿って移動させるように構成されている、可動ステージ110を含む。基材120は、1つまたは複数のフィールド121を含み、該フィールドは、ステージが連続的に移動しているときに、光学スキャニングシステムによって個々に画像化される。基材は、照射機構（示されていない）によって照射され、そして基材からの光は、対物レンズ130を通って、光路に沿って進む。移動している基材の画像は、移動追尾ミラー145によって、画像センサーに対して安定化される。フィールド121の画像は、画像センサーを含むカメラ160によってキャプチャーされる。移動追尾ミラー145は、画像フィールドの平面に対して平行である軸の回りを回転するように構成されている。移動追尾ミラー145の回転は、カメラ160による画像のキャプチャー中に、光路を調節して、フィールドの画像を安定化させる。追尾ミラー145の回転は、あらかじめ定められたステージ速度と、ステージまたは基材の速度変動の両方の、関数である。したがって、光学スキャニングシステムの、ミラーが1つの態様は、移動している基材の画像化中に、ステージの速度変動を補正しないシステムによって、シャープネスが改善されているか、またはピクセルスミアが減少している、安定化された画像を提供する。
1つの移動追尾ミラーの動作を駆動するように構成されている位置処理モジュールは、上述のミラーが2つの態様における、速度追尾ミラーに機能的に接続されている位置処理モジュールの構成要素、および加速追尾ミラーに機能的に接続されている位置処理モジュールの構成要素の、両方を含む。したがって、いくつかの態様において、位置処理モジュールは以下を含む：所望の出力または動作プロファイルを生成する、動作制御器要素と、動作制御器からの制御シグナルを、電気シグナルまたは駆動シグナルへと変換する、駆動または増幅器要素。位置処理モジュールはまた、基材のまたは可動ステージの位置または移動を決定するように、および、所望の出力または動作プロファイルをセンサーからの情報の関数として生成するのに使用される動作制御器要素へとこのシグナルを送るように構成されている、位置センサー、速度センサー、または加速センサーをも含み得る。動作制御器要素はその後、1つの移動追尾ミラーのための動作プロファイルを生成し得、該動作プロファイルは、基材またはステージの、一定の速度あるいは予想された速度（たとえば鋸歯状波形）と、センサーからのシグナルから決定された速度変動か、またはステージについてあらかじめ定められた速度変動との、両方の関数である。したがって、速度を追尾するために使用される鋸歯状波形は、位置センサーからのシグナルから、またはあらかじめ定められた速度変動から決定される、リアルタイムの速度測定値にしたがって、修正され得る。
図5は、位置センサー、速度センサー、または加速センサーによってもたらされたデータから生成された、ステージ速度誤差の波形の一例を提供する。必要とされる近似の速度補正もまた示され、これはあるいは、フィールドについての平均速度誤差としても知られるものである。次の波形（実線）は、補正項によって修正された速度追尾波形を示し、該波形は、平均速度誤差（たとえば、フィールドについての平均速度誤差）の関数である。破線は、直線化された未補正の移動追尾ミラーの波形を表す（ミラーが2つの態様において、速度追尾ミラーを駆動するために使用された波形と類似している）。正の速度誤差が存在する場合、スキャニング中の波形の傾きは増加し、それにより、ミラーの回転スピードが増加して、該速度誤差を補正する。負の速度誤差が存在する場合、波形の傾きは減少し、それにより、ミラーの回転スピードが減少して、該速度誤差を補正する。
いくつかの態様において、フィールドの画像化中に取得された複数の測定値に基づいて、センサーは、ステージまたは基材の平均速度を決定する。いくつかの態様において、センサーは位置センサーである。いくつかの態様において、位置センサーは、スキャニング装置に機能的にマウントされている、エンコーダー（たとえばリニアエンコーダー）または干渉計である。位置センサーからのシグナルは、位置センサーによってキャプチャーされた直近の位置測定値のうちの2以上を用いて、可動ステージまたは基材の平均速度を決定するために、使用され得る。いくつかの態様において、これらの測定値は、検知後に移動追尾ミラーの角度を調節するために、使用され得る。
いくつかの態様において、基材またはステージの平均速度は、n-1番目のフィールドにおいて決定され、かつ補正項、これは、n番目のフィールドのための移動追尾ミラーの動作プロファイルを生成するために使用されるものであるが、該補正項を提供するために使用される。図6に例示されるように、これは、フィールドレベルのフィードフォワード補正として知られている。フィールドレベルのフィードフォワード補正機構のいくつかの態様において、動作制御器要素は、移動追尾ミラー（ミラーが1つの態様）の動作のための動作プロファイル、または加速追尾ミラー（ミラーが2つの態様）の動作のための動作プロファイルを、直前に画像化されたフィールドの平均速度の関数として、生成する。フィールドレベルのフィードフォワード速度追尾および補正機構は、他のタイプの補正とは、たとえばスキャンラインレベルのフィードフォワード機構などとは、異なっている。フィールドレベルのフィードフォワード補正は、それが、迅速なシグナル処理のストリンジェンシーを減少させる一方で、1ピクセルのレベルで情報をモニタリングするのに許容可能なシャープな画像（すなわち、+/- 1ピクセル以下のピクセルスミアの画像）を生成するのに十分な補正情報を依然として提供する点において、有益である。画像のぼけまたはピクセルスミアの一部は、フィールドレベルのフィードフォワード補正機構によって補正されない可能性があるが、しかしながら、いくつかの態様において、たとえば、単一分子の画像化への適用（たとえば生体分子の検知のためのもの）において、n-1番目のフィールドからn番目のフィールドへの速度変動が許容されるレベル内である（たとえば、+/- 1ピクセル以下のピクセルスミアしか生じさせない）場合には、最大で+/- 1ピクセルのピクセルスミアは許容可能であり、かつフィールドレベルのフィードフォワード補正でもたらされるスミアは、許容可能であり得る。
図6において、フィールドレベルのフィードフォワード補正の一態様の概略図が提供される。この態様においては、移動しているステージの速度変動を組み込んでいる、ミラーの回転駆動シグナルを生成するために、チップまたはステージの速度追尾の測定値が取得される。ここでは、ステージが移動し始めると、プレ・フィールドのステージ速度の非直線性（速度変動）を決定するために、経時的に位置情報が取得される（または速度情報が取得される）。第1のフィールドが画像化される際に、ステージのプレ・フィールドにおいて測定された平均速度の関数である、駆動シグナルが、移動追尾ミラー（または、ミラーが2つの態様における加速追尾ミラー）に送られる。連続している次のフィールドについて、直前（N-1番目）のフィールドの位置情報から経時的に決定された速度誤差を用いて、プロセスが繰り返される。駆動シグナルは、この速度誤差の関数として決定され、そして、N番目のフィールドの最中に回転させるために、移動追尾ミラーに送られる。図6は経時的なステージ速度誤差を示し、かつフィールドごとの近似の速度誤差をも示す。ステージ速度誤差から下へ向かう第1の矢印は、フィールドからの平均速度誤差の決定、および「同じフィールド」の加速補正波形への転換を示す。フィードフォワード機構は、下向きの第2の矢印によって示されており、該機構はこの波形を、n-1番目のフィールドに由来する波形に基づいて、次のn番目のフィールドのためにミラーを駆動させるために、転換する。この様式において、各フィールドについてのステージ速度誤差は、直前のn-1番目のフィールドに基づいて近似される。
1つの態様において、フィールドレベルのフィードフォワード機構は、以下のステップにしたがって進行する：n-1番目のフィールドについて、基材の複数の位置を測定する。n-1番目のフィールドについて、平均速度を決定する。n-1番目のフィールドについての速度変動を、およびこの速度変動に基づく補正項を、計算する。駆動器または増幅器に送る動作プロファイル（たとえば、電気モーターの波形）に、補正項を適用する。n番目のフィールドの画像キャプチャー中の移動追尾ミラーまたは加速追尾ミラーの動作を生じさせるために、駆動シグナルを、該追尾ミラーに機能的に連結されている電気モーターに送る。レーンにおける残りのフィールドに対して、プロセスを繰り返す。
いくつかの態様において、フィールドレベルのフィードフォワード速度追尾に基づくサーボ機構における、全フィードバックループは、100 ms未満、90 ms未満、80 ms未満、70 ms未満、60 ms未満、50 ms未満、40 ms未満、30 ms未満、20 ms未満、10 ms未満、5 ms未満、または2 ms未満である。いくつかの態様において、フィードフォワード速度追尾は、2つのミラーによる光路のアラインメント補正の態様において、加速追尾ミラーの動作を調節するために使用される。
いくつかの態様において、電気モーターで制御された1つのミラーの直線傾斜に起因する誤差を最小限に抑えるために、電気モーター駆動シグナルまたは波形は、追尾における規則正しい誤差を補正するように調節される。電気モーターの直線傾斜（たとえば、フォワードスキャンまたはフライバック）が生じる際の誤差の最小化はまた、ミラーの動作スピードを減少させることによっても、たとえば、光学スキャニングシステムの画像化頻度を減少させることなどによっても、達成され得る。いくつかの態様において、ミラーが1つの態様における、電気モーターを制御するための鋸歯状波形の周波数は、200 Hz以下に維持される。いくつかの態様において、ミラーが1つの態様における、電気モーターを制御するための鋸歯状波形の周波数は、50 Hz～30 Hzである。いくつかの態様において、ミラーが1つの態様における、電気モーターを制御するための鋸歯状波形の周波数は、45 Hz～35 Hzである。いくつかの態様において、ミラーが1つの態様における、電気モーターを制御するための鋸歯状波形のデューティサイクルは、70%以下である。いくつかの態様において、ミラーが1つの態様における、電気モーターを制御するための鋸歯状波形のデューティサイクルは、60%～80%である。いくつかの態様において、ミラーが1つの態様における、画像キャプチャーの頻度およびデューティサイクルの周波数は、2%未満という、全速度追尾誤差を有するように調節される。いくつかの態様において、ミラーが1つの態様における、画像キャプチャーの頻度およびデューティサイクルの周波数は、2ピクセル未満または1ピクセル未満という、全ピクセルスミアを有するように調節される。
本明細書において論じられるように、いくつかの態様にしたがって、位置処理モジュールとは、以下を含む構成要素の、集合物を指す：i) 光学スキャニングシステムの一部の状態を決定するセンサーであって、フィードバック制御のためのセンサー（たとえば、ステージ位置センサー）、ii) 光学スキャニング装置の構成要素の動作を引き起こすための波形（たとえば、速度追尾ミラーを駆動する鋸歯状波）を、計算するかあるいは提供する機構、またはiii) 構成要素の動作を引き起こすために、波形に基づいて駆動シグナルをアクチュエーターへと送る、機構。
たとえば、上で論じたように、ある構成要素、たとえば光路を調節する回転可能なミラーなどの動作を駆動するための、および、ステージエンコーダーまたはマスタークロックの値に基づいて、それら構成要素をステージ移動と同期させるための、正確な波形を生成するために、位置処理モジュールは使用され得る。速度追尾ミラーのための波形は、傾斜を有する鋸歯状波形であり得、該波形は、速度追尾ミラーを正しいスピードで傾けて、ステージの速度と整合させる。加速追尾ミラーへと送られる波形、またはミラーが1つの態様における、1つの回転可能なミラーへと送られる波形は、可動ステージの速度に生じる速度変動のための補正項を含まなくてはならない。この波形は、その上に較正目盛りを有するレチクルを用いてステージ速度の非直線性を「マッピング」することによって、生成され得、または該波形は、直前のフィールドで測定されたステージ速度を取得すること、速度の非直線性を補正する波形を生成すること、および次のフィールドにおいて速度変動を補正するために、該波形を使用すること、すなわち、フィールドレベルの「フィードフォワード」アプローチによって、生成され得る。波形はまた、速度変動テーブルから位置処理モジュールへと情報を提供することによっても生成される。
本明細書において記載される技術にしたがって、1つもしくは複数の計算装置、および／またはそのさまざまなロジックは、単数のスキャニングミラーまたは複数のスキャニングミラー（たとえば加速追尾ミラーおよび速度追尾ミラー）、ならびに可動ステージの、協調した動作を制御するように構成されており、かつそうするように作動する。そのため、いくつかの態様において、可動ステージ（およびしたがって、そこにマウントされた基材）は、一定の速度で移動するように構成され得、この場合、追尾ミラーのバックスキャン動作もまた、適切な一定の速度となるであろう。他の態様において、可動ステージは、一定でない速度で移動するように構成され得、この場合、追尾ミラーのバックスキャン動作もまた、適切な、一定でない速度となるであろう。
位置処理モジュールはまた、光学スキャニング装置の構成要素を同期させて、移動しているステージ上の基材のフィールドの画像のキャプチャーを可能にするためにも、使用され得る。回転可能なミラーの動作を、可動ステージの速度と連携させることに加えて、位置処理モジュールはまた、装置の他の構成要素をも制御し得る。いくつかの態様において、位置処理モジュールは、フィールドへの照射を制御する機構を含む。たとえば位置処理モジュールは、画像キャプチャーのプロセスに合わせて照射時間を調節するために、照射装置に、たとえばレーザーなどに、シグナルを送り得る。いくつかの態様において、照射の状態は、速度追尾ミラーへと送られる鋸歯状波形に応じて変わる。いくつかの態様において、基材上のいくつかのフィールドを画像化するために、選択された速度での可動ステージの移動、または選択された経路に沿った、たとえば蛇行する経路などに沿った可動ステージの移動を制御するためのシグナルを、位置処理モジュールは送る。
ミラーが2つの態様にしたがった光学スキャニングシステムの、位置処理モジュールからいくつかの構成要素への接続は、図7Aに示される。この態様において例示されるように、位置処理モジュールは、照射要素に機能的に接続されていて、たとえば、画像キャプチャーのタイミングに合わせて照射時間を調節することなどによって、基材への照射を制御する。位置処理モジュールは、カメラに機能的に接続されていて、回転しているミラーの動作と協調するように、カメラによる画像キャプチャーを制御し、これはたとえば、各フィールドの追尾中には画像が取得され、かつ追尾ミラーのフライバック期間中には画像は取得されない、というようなものである。本明細書においてより詳細に記載されるように、位置処理モジュールは、メモリー、プロセッサ、および駆動器を含み得る。メモリーは、あらかじめ定められた速度、または速度変動についての情報を保持し得、これらの情報は、波形を生成するために、プロセッサによって使用され得る。メモリーはまた、あらかじめ定められた波形をも保持し得る。波形は、駆動シグナルを生成するために、駆動器に送られ得る。いくつかの態様において、位置処理モジュールは、エンコーダー（たとえばリニアエンコーダー）に機能的に接続されていて、移動しているステージについての位置情報を経時的に受け取る。位置処理モジュールはその後、リニアエンコーダーからの情報から、速度変動の関数として駆動シグナルを生成し得、該駆動シグナルはその後、駆動器へと送られ得、該駆動器は、駆動シグナルを、加速追尾ミラー（または、ミラーが1つの態様における基材追尾ミラー（図7B））へと送る。ステージからのデータ収集から、追尾ミラーの動作へと向かう経路は、点線の矢印によって示されており、これはまた、位置処理モジュールから、加速追尾ミラー150または移動追尾ミラー145に機能的に接続されているモーターへと送られる、駆動シグナルをも含む。図7Aおよび7Bはまた、ミラーが2つの態様にしたがった、照射源からカメラによる検出へと向かう光の、光路をも示す。図7Aおよび7Bにおける実線（矢印でないもの）は、モーターと、装置のうちの該モーターによって作動する構成要素との間の、機能的な接続を示す。
例示的な一態様において、光学スキャニングシステムは、照射用の光源をさらに含む。さまざまな態様において、照射源は、生体分子の検出に使用され得るさまざまなフルオロフォアに対応可能な、さまざまな波長の光を放出し得、これはたとえば、400 nm～800 nmの範囲内の波長の光である。
いくつかの態様において、光の波長は、約400 nm～約800 nmの範囲内である。いくつかの態様において、光の波長は、以下の範囲内である：約400 nm～約450 nm、約400 nm～約500 nm、約400 nm～約550 nm、約400 nm～約600 nm、約400 nm～約650 nm、約400 nm～約700 nm、約400 nm～約750 nm、約400 nm～約800 nm、約450 nm～約500 nm、約450 nm～約550 nm、約450 nm～約600 nm、約450 nm～約650 nm、約450 nm～約700 nm、約450 nm～約750 nm、約450 nm～約800 nm、約500 nm～約550 nm、約500 nm～約600 nm、約500 nm～約650 nm、約500 nm～約700 nm、約500 nm～約750 nm、約500 nm～約800 nm、約550 nm～約600 nm、約550 nm～約650 nm、約550 nm～約700 nm、約550 nm～約750 nm、約550 nm～約800 nm、約600 nm～約650 nm、約600 nm～約700 nm、約600 nm～約750 nm、約600 nm～約800 nm、約650 nm～約700 nm、約650 nm～約750 nm、約650 nm～約800 nm、約700 nm～約750 nm、約700 nm～約800 nm、または約750 nm～約800 nm。いくつかの態様において、光の波長は、約400 nm、約450 nm、約500 nm、約550 nm、約600 nm、約650 nm、約700 nm、約750 nm、または約800 nmの範囲内である。いくつかの態様において、光の波長は、少なくとも、約400 nm、約450 nm、約500 nm、約550 nm、約600 nm、約650 nm、約700 nm、または約750 nmの範囲内である。いくつかの態様において、光の波長は、最大で、約450 nm、約500 nm、約550 nm、約600 nm、約650 nm、約700 nm、約750 nm、または約800 nmの範囲内である。
いくつかの態様において、照射源は基材の下にマウントされており、そのような場合には、対物レンズによって集光された光は、フィールドを通過して対物レンズへと伝達されている。他の態様において、照射源は基材の上にマウントされており、そのような場合には、対物レンズによって集光された光は、フィールドによって、対物レンズへと反射している。
光学スキャニングシステムは、ダイクロイックミラーをさらに含み得る。例示的な一態様において、光学スキャニングシステムは、照射源およびダイクロイックミラーをさらに含み、ここでダイクロイックミラーは、少なくとも：(a) 基材のフィールドまたはその一部分を照射するために、照射源からの光を反射するように構成されており、かつかつそうするように作動し；かつ(b) 試料によって放出されかつ対物レンズを透過する光を、透過させるように構成されており、かつそうさせるように作動する。
いくつかの態様において、光学スキャニングシステムは、分配器をさらに含む。フィールド画像を含む光学シグナルを2つ以上のカメラに分配するために、分配器は、加速追尾ミラーおよび速度追尾ミラー（または1つの追尾ミラー）よりも後で、光路に沿って設置され得る。
光学スキャニングシステムはまた、追尾ミラーと対物レンズとの間の光路に位置する、チューブレンズ要素をも含み得、その場合、追尾ミラーは、対物レンズの瞳の位置に設置可能である。リレーレンズまたはチューブレンズはまた、画像を反転させるためにも、または光路を延長するためにも、光路に沿った他の位置において、使用され得る。
いくつかの態様において、光学スキャニングシステムはリレーレンズシステムを含み、該リレーレンズシステムは、光路上のある領域であって、そこではすべての光線が名目上平行であり、かつ小さなビーム直径をも有しているという領域を作り出すために、使用される。いくつかの態様において、スキャニング光学素子は、該スキャニング光学素子の設置によって以下が確実となるように、光路が小さなビーム直径を有する位置に設置される：(i) 電力損失を最小限に抑えること、(ii) 画像の劣化を最小限に抑えること、および(iii) 光学素子の質量を可能な限り小さくできるように、光学素子のサイズを最小限に抑えること。これは、より高頻度なスキャニング、およびより軽量なシステムを可能にする。
蛍光ベースの光学スキャニングシステムは、典型的には、不鮮明な蛍光画像で非常に低いレベルの光を利用するので、リレーレンズシステムの使用は、基材上の生体分子を検出するのに使用される該システムを、補助するものとなり得る。したがって、リレーレンズは、光学スキャニングシステムの効率および感度を増大させて、画像の取得時間を最小限に抑えるのに有効である。さらに、いくつかの態様において、照射の強度は、基材上の生体分子にダメージを与え得る点を、下回ったままでなくてはならない。
図8Aは、ミラーが2つの態様にしたがった、基材を画像化するための方法の一例を示す。図8Aにおける方法は、何らかの特定の型の機械または装置による実施に限定されるものではなく、かつしたがって、方法についての以下の説明は、制限としての意図ではなく、例示としての意図で解釈されるべきである。
ステップ810において、可動ステージは、対物レンズの光軸に対して垂直な平面において、対物レンズの下で基材を移動させる。基材の移動中に、ステップ820において、サーボ機構（たとえば電気モーター）は、基材のフィールドの画像のキャプチャー中に、移動しているステージの速度を追尾するように、速度追尾ミラーの角度を変化させる。いくつかの局面において、速度追尾ミラーの一部であるか、または速度追尾ミラーに連結されている位置処理モジュールは、速度追尾ミラーに機能的に接続されているサーボ機構を制御するロジックを、実行する。ステップ840において、サーボ機構は、基材のフィールドの画像のキャプチャー中に、移動しているステージの速度変動を追尾するように、加速追尾ミラーの角度を変化させる。いくつかの局面において、加速追尾ミラーの一部であるか、または加速追尾ミラーに連結されている位置処理モジュールは、可動ステージと協調して、サーボ機構を制御するロジックを実行する。いくつかの態様において、ロジックは、可動ステージの移動（たとえば速度変動）を表すフィードバック制御情報を受け取り、そしてこの情報を、サーボ機構への入力シグナルを調節するために使用し、該サーボ機構は次に、加速追尾ミラーの角度を変化させ、それにより、速度追尾ミラーと加速追尾ミラーとが組み合わせられた動作を、可動ステージの移動と同期させる。いくつかの局面において、このフィードバック情報を、830における、可動ステージの移動において何らかの非直線性が存在するかどうかを検出するリニア制御器から、831において受け取る。その後ロジックは、この情報を使用してオフセット補正を計算し、そして、該オフセット補正を入力シグナルとして、加速追尾ミラーとカメラとの間の光路において該追尾ミラーの角度を制御するサーボ機構へと、渡す。この様式において、加速追尾ミラーの角度のわずかな調節を行うことにより、ロジックは、可動ステージの移動における非直線性によって生じる何らかの誤差を、取得中の画像から効果的に除去する。
ステップ850において、基材が可動ステージによって移動している最中に、カメラは基材（またはその一部分）の静止画を記録する。
図8Bは、ミラーが1つの態様にしたがった、基材を画像化するための方法の一例を示す。図8Bにおける方法は、何らかの特定の型の機械または装置による実施に限定されるものではなく、かつしたがって、方法についての以下の説明は、制限としての意図ではなく、例示としての意図で解釈されるべきである。
ステップ810において、可動ステージは、対物レンズの光軸に対して垂直な平面において、対物レンズの下で基材を移動させるが、ここで基材は、画像化のための標的である、多数の異なった特徴物を含んでいる。
基材の移動中に、ステップ845において、サーボ機構は、基材のフィールドの画像のキャプチャー中に、移動しているステージの速度変動を追尾するように、移動追尾ミラーの角度を変化させる。いくつかの局面において、移動追尾ミラーの一部であるか、または移動追尾ミラーに連結されている位置処理モジュールは、可動ステージと協調して、サーボ機構を制御するロジックを実行する。いくつかの態様において、ロジックは、可動ステージの移動（たとえば速度変動）を表すフィードバック制御情報を受け取り、そしてこの情報を、サーボ機構への入力シグナルを調節するために使用し、該サーボ機構は次に、可動ステージの速度変動を補正するように、移動追尾ミラーの角度を変化させる。いくつかの態様において、位置処理モジュールは、可動ステージの速度変動を、あらかじめ定められた速度を追尾するための鋸歯状波形へと組み込み、該鋸歯状波形は、移動追尾ミラーの動作を制御するための駆動シグナルとして使用される。いくつかの局面において、このフィードバック情報を、830における、可動ステージの移動において何らかの非直線性が存在するかどうかを検出するリニア制御器から、831において受け取る。その後ロジックは、この情報を使用してオフセット補正を計算し、そして、該オフセット補正を入力シグナルとして、光路において移動追尾ミラーの角度を制御するサーボ機構へと、渡す。この様式において、移動追尾ミラーの角度のわずかな調節を行うことにより、ロジックは、可動ステージの移動における非直線性によって生じる何らかの誤差を、取得中の画像から効果的に除去する。
ステップ850において、基材が可動ステージによって移動している最中に、カメラは基材（またはその一部分）の静止画を記録する。
本明細書において提供される光学スキャニングシステムは、ステージ速度のみを追尾する装置において通常ぼやけた画像を生じさせ得る、ステージ速度（または任意の他の、移動している構成要素の画像化）の非直線性（たとえば局所的なステージ加速）を補正するが、ステージの速度変動を補正するための機構は有さない。いくつかの態様において、光学スキャニングシステムは、連続的に移動している基材または他の物体の安定化された画像を、30フレーム毎秒で生成することが可能である。いくつかの態様において、光学スキャニングシステムは、連続的に移動している基材または他の物体の静止画を、10～30フレーム毎秒で生成することが可能である。いくつかの態様において、光学スキャニングシステムは、連続的に移動している基材または他の物体の静止画を、40フレーム毎秒で生成することが可能である。いくつかの態様において、光学スキャニングシステムは、連続的に移動している基材または他の物体の静止画を、30フレーム毎秒か、40フレーム毎秒か、50フレーム毎秒か、60フレーム毎秒か、70フレーム毎秒か、80フレーム毎秒か、90フレーム毎秒か、100フレーム毎秒か、120フレーム毎秒か、150フレーム毎秒か、または200フレーム毎秒を超える値で生成することが可能である。
いくつかの態様において、光学スキャニングシステムのステージの速度変動は、+/- 0.5%より大きい。いくつかの態様において、光学スキャニングシステムのステージの速度変動は、+/- 0.1%より大きい。いくつかの態様において、光学スキャニングシステムのステージの速度変動は、+/- 0.1%より大きく、かつカメラによって観察された場合に、+/- 0.1%未満に減少する。
いくつかの態様において、光学スキャニングシステムのステージの速度変動は、+/- 1%より大きい。いくつかの態様において、光学スキャニングシステムのステージの速度変動は、+/- 1%より大きく、かつカメラによって観察された場合に、+/- 1% 未満に減少する。
いくつかの態様において、本明細書において記載される光学スキャニングシステムは、連続的に移動しているステージにおいて速度変動を補正しないシステムによって、画像におけるシャープネスの増加をもたらす。
いくつかの態様において、フィールドの画像化中に基材が移動する総距離は、フィールド画像のキャプチャー中の予想された速度に基づいてあらかじめ定められた動きから、+/- 1ピクセルよりも大きく（センサー上に投影された基材の画像によって測定された場合）逸脱する一方で、光学スキャニングシステムは、1ピクセル未満のぼけを有する画像を生成する。いくつかの態様において、1ピクセルは、－150 nm x 150 nmのフィールド面積と相関する。いくつかの態様において、1ピクセルは、－162.5nm x 162.5 nmのフィールド面積と相関する。いくつかの態様において、1ピクセルは、フルオロフォア1つのサイズよりも大きいフィールド面積と、相関する。
ピクセルスミアは、画像のシャープネスの測定値の1つであり、かつこれは、画像センサーに対する、光学フィールド上の基材の移動によって生じる、画像アーティファクトを指す。ピクセルスミアを測定する1つの手段は、離心率（eccentricity）としても知られる、1つのスポットの長軸と短軸との比を求めることである。いくつかの態様において、光学スキャニングシステムによって生成された画像の離心率は、3未満である。いくつかの態様において、該画像の離心率は、フルオロフォア1つの検出に信頼性を有する。
図9Aおよび9Bは、本明細書において提供される光学スキャニングシステムからもたらされる基材画像の、ピクセルスミアおよび離心率の一例を提供する。青いスポットは、照射された単一のフルオロフォアを表し、かつそれぞれの四角形は約162 nmのピクセルである。図9Aに示されるのは、ピクセルスミアが+1ピクセルである一例であって、これは+/- 1ピクセルという好ましい範囲内にあり、離心率2を有する。図9Bに示されるのは、ピクセルスミアが+2ピクセルである一例であって、これは+/- 1ピクセルという好ましい範囲の外にあり、離心率3を有する。
図10は、光学スキャニング装置へと、または光学スキャニング装置から、情報を伝達するためのシステム環境を例示する。システム環境は、1つまたは複数のクライアント装置1010、1つまたは複数のサーバー1030、サーバー1030にアクセス可能なデータベース1005を含み得、ここでこれら一式のすべては、ネットワーク1020を経由して接続される。他の態様において、システム環境には、別のおよび／または追加のエンティティが含まれ得る。
システム環境は、ネットワーク1020を介して、光学スキャニング装置1040からの結果を、1人または複数人の他のユーザーと、彼らのクライアント装置1010上で共有することを可能にする。結果はまた、ウェブ上へもアップロードされ得る。
ネットワーク1020は、システム環境の構成要素間の通信を容易にする。ネットワーク1020は、任意の有線または無線の、ローカル・エリア・ネットワーク（LAN）および／またはワイド・エリア・ネットワーク（WAN）であり得、これはたとえば、イントラネット、エクストラネット、またはインターネットなどである。さまざまな態様において、ネットワーク1020は、標準的な通信技術および／または通信プロトコルを使用する。ネットワーク1020によって使用される技術の例は、イーサネット、802.11、3G、4G、802.16、または任意の適切な他の通信技術を含む。ネットワーク1020は、無線の、有線の、または無線および有線の組み合わせの、通信技術を使用し得る。ネットワーク1020を介する通信に使用されるネットワークプロトコルの例は、マルチプロトコル・ラベル・スイッチング（MPLS）、トランスミッション・コントロール・プロトコル／インターネット・プロトコル（TCP/IP）、ハイパーテキスト・トランスポート・プロトコル（HTTP）、シンプル・メール・トランスファー・プロトコル（SMTP）、およびファイル・トランスファー・プロトコル（FTP）を含む。ネットワーク1020上で取り交わされるデータは、任意の適切なフォーマットで記述されてよく、これはたとえば、ハイパーテキスト・マークアップ・ランゲージ（HTML）またはエクステンシブル・マークアップ・ランゲージ（XML）などである。いくつかの態様において、ネットワーク1020の通信リンクのすべてまたは一部は、1つまたは複数の任意の適切な技術を用いて暗号化され得る。
クライアント装置1010は、ネットワーク1020を介して、ユーザーの入力を受け取ることができる、ならびにデータを伝達するおよび／または受け取ることができる、計算装置である。1つの態様において、クライアント装置1010は、通常のコンピューターシステムであり、これはたとえば、デスクトップコンピューターまたはラップトップコンピューターなどである。あるいは、クライアント装置1010は、コンピューター機能を有する装置であり得、これはたとえば、パーソナルデジタルアシスタント（PDA）、携帯電話、スマートフォン、または別の適切な装置などである。クライアント装置1010は、ネットワーク1020を介して通信するように構成されている。
いくつかの態様において、システム環境は、1つまたは複数のサーバーを含み得、たとえば、診断用システムであるサーバーは、ネットワーク1020を介して、光学スキャニング装置1040と、および／またはクライアント装置1010の任意のものと通信するエンティティによって管理されるサービスを含む。サーバー1030は、データベース1005にデータを保管することができ、かつデータベース1005に保管されたデータにアクセスすることができる。サーバー1030はまた、クラウド上にデータを保管してもよい。いくつかの態様において、サーバー1030は時折、光学スキャニング装置1040に更新情報を送り込んでよく、またはサーバー1030は、光学スキャニング装置1040から結果データを受け取ってもよく、かつ該結果データに対して何らかの解析を実施してもよく、かつ解析されたデータを光学スキャニング装置1040へと返送してもよく、もしくは該データをクライアント装置1010へ提供してもよい。
いくつかの態様において、光学スキャニング装置1040の機能を、クライアント装置1010、たとえば携帯電話などに包含させることが可能であり、かつ該機能は、該携帯電話にインストールされているモバイルアプリケーションを介して操作することが可能である。該携帯電話に保管されているモバイルアプリケーションは、光学スキャニング装置からの読み取り結果を処理することが可能であり、かつ該結果を、ネットワーク820上で他の装置810と共有することが可能である。
2つ以上の数値が連続していて、最初／最後の数値の前／後に「少なくとも」、「超」、または「より大きいかまたは等しい」との語が置かれている場合は常に、該「少なくとも」、「超」、または「より大きいかまたは等しい」との語は、該連続している数値において、それぞれの数値に適用される。たとえば、1、2、もしくは3より大きいかまたはそれらと等しい、とは、1より大きいかもしくは1と等しい、2より大きいかもしくは2と等しい、または3より大きいかもしくは3と等しい、と同義である。
2つ以上の数値が連続していて、最後の数値の後に「以下」、「未満」、または「より小さいかまたは等しい」との語が置かれている場合は常に、該「以下」、「未満」、または「より小さいかまたは等しい」との語は、該連続している数値において、それぞれの数値に適用される。たとえば、3、2、もしくは1より小さいかまたはそれらと等しい、とは、3より小さいかもしくは3と等しい、2より小さいかもしくは2と等しい、または1より小さいかもしくは1と等しい、と同義である。
本発明の好ましい態様は本明細書において示されかつ記載されているが、そのような態様が、単なる例として提供されていることは、当業者には明らかである。本発明が、本明細書中に提供される特定の例によって限定されることを目的としているわけではない。本発明は前述の明細書を参照して記載されているが、本明細書における態様の説明および図面は、制限する意味に解釈されるべきではない。無数の変更、改変、および置き換えが、本発明から逸脱することなく、今や当業者に想起されるであろう。さらに、本発明のすべての局面は、本明細書において記載される特定の描写にも構成にも相対的な比率にも限定されず、それらは、多様な条件および可変のものに応じて変わることが、理解されるべきである。本明細書において記載される本発明の態様のさまざまな代替物が、本発明を実践する際に採用され得ることが、理解されるべきである。したがって、本発明はまた、任意のそのような代替のもの、修飾したもの、変更したもの、または同等のものを包含することが、企図される。添付の特許請求の範囲は、本発明の範囲を定義し、かつこの特許請求の範囲内の方法および構成、ならびにそれらの等価物がそれにより包含されることを定義することを、意図する。
配列決定
本明細書において、回折限界であるλ/(2*NA)未満の中心間の間隔で表面上に置かれた分析物からのシグナルの画像化を容易にするためのシステムおよび方法が提供される。これらのシステムおよび方法は、高分解能の画像を生成するために、先進の画像化システムを使用し、かつ、高い正確性での基材上の分子の位置決定を容易にするために、反復検出を使用し、かつ、高密度に詰め込まれた表面上の各分子についてのシグナルのアイデンティティを高い正確性で取得するために、画像のデコンボリューションを使用する。これらの方法およびシステムは、高密度に詰め込まれた基材上での、合成による単一分子配列決定を可能にして、高い正確性での高効率かつ非常に高スループットのポリヌクレオチドの配列決定を提供する。
配列決定システムに関する主なコスト構成要素は、第一にはバイオチップおよび試薬を含む消耗品、そして第二には機器コストである。10ドルの30xゲノム、すなわち100倍のコスト削減に到達するためには、単位面積あたりのデータの量を100倍増大させる必要があり、かつデータ点あたりの試薬の量を100倍低下させる必要がある。
図11は、シーケンサーのスループット 対 アレイのピッチを示し、そして10ドルゲノムのために必要とされる基準を満たすシステム設計を概説する。基本的な考え方は、100倍のコスト削減を達成するために、単位面積あたりのデータの量を100倍増大させる必要があり、かつデータ点あたりの試薬の量を100倍低下させる必要がある、というものである。コストにおけるこれらの削減を達成するために、本明細書において、回折限界未満の密度で基材の表面上に固定化されたポリヌクレオチドの、信頼性のある配列決定を容易にする方法およびシステムが提供される。これらの高密度アレイは、より効率の良い試薬の使用を可能にし、かつ単位面積あたりのデータの量を増大させる。加えて、検出の信頼性の増大は、配列決定および検出において、誤差を同定しそして補正するために合成されねばならないクローンコピーの数の減少を可能にし、試薬のコストおよびデータ処理のコストをさらに減少させる。
基材の表面上における、分析物の高密度分布
図12Aは、240 nmのピッチで80 nmの直径の結合領域（スポット）という高密度領域の、提案される態様を示す。この態様において、単鎖DNA分子のみがチップ上の特定の領域に結合した、規則的なアレイが使用され得る。いくつかの態様において、スポットを埋め尽くさないよう、40 kBより小さいコンカテマー（すなわち、連続して連結された同じDNA配列の複数のコピーを含む、長く連続したDNA分子）が使用される。コンカテマーのサイズはほぼ領域に対応しており、同じ増幅プロセスが使用される場合、より小さいコンカテマーの予測される長さは、およそ10コピーをもたらすおよそ4 kB～5 kBとなることを意味する。4 kBの長さのDNAを使用し、そして単一分子を直接的に配列決定することもまた、可能である。別の選択肢は、排他的な分子を作るのに必要なサイズまで全長を伸ばすために、DNAのより短いセグメントに、配列決定されないフィラーDNAを結合させることである。
図12Bは、1,000ドルゲノムのために使用される試料の有効ピッチと比較した、提案されるピッチの比較である。新規なアレイの密度は170倍高く、100倍高い密度を達成するという基準を満たす。単位面積あたりの画像化スポットあたりのコピーの数もまた、先行する既存のプラットフォームよりも少なくとも100倍低いという基準を満たす。これは、試薬コストが基準よりも100倍費用効果が高いことを確実にする助けとなる。
高密度に詰め込まれた単一生体分子の画像化および回折限界
画像化プラットフォームの増大した分子密度に関する第1の制約は、回折限界である。光学システムの回折限界のための方程式は、
D = λ/2*NA
であり、式中、Dは回折限界であり、λは光の波長であり、かつNAは光学システムの開口数である。典型的な空気中の画像化システムは、0.6～0.8のNAを有する。λ = 600 nmを用いると、回折限界は375 nm～500 nmとなる。水浸システムに関して、NAは約1.0であり、300 nmの回折限界となる。
もしも、生体分子を含む、アレイ上または他の基材表面上の特徴物が近すぎると、2つの光学シグナルは実質的にオーバーラップして、画像のみに基づいて信頼性をもって解像することができない、単一のブロブしか見えない。これは、動く基材の不正確な追尾によるぼけ、またはセンサーと基材の表面との間の光路における光学的変動などの、光学画像化システムによって導入される誤差によって悪化し得る。
顕微鏡の試料平面における1点から発せられる透過光または蛍光放出の波面は、波面を効果的に広げる対物レンズの開口の端で回折し、有限であるが元の点より大きいサイズの中心ディスクを有する回折パターンへと広がった、点光源の画像を生成する。したがって、光の回折のため、試料の画像は、試料に存在する実際の細部を完全に表現することはない、なぜならば、それを下回って顕微鏡の光学システムが構造の細部を解像することができない、下限が存在するからである。
顕微鏡での、波長以下の構造の観察は、回折限界のために困難である。蛍光タンパク質またはヌクレオチド単一分子などの、顕微鏡における点物体は、中間平面において、干渉の作用によって作り出された回折パターンからなる画像を生成する。高度に拡大されると、点物体の回折パターンは、一連の回折環によって囲まれた中心のスポット（回折ディスク）からなるように観察される。組み合わせて、この点光源回折パターンは、エアリーディスクと称される。
エアリーパターンの中心スポットのサイズは、光の波長、および対物レンズの開口角に関連付けられる。顕微鏡の対物レンズに関して、開口角は開口数（NA）によって記述され、これは試料から光を集めることができる対物レンズの半角である、 sinθとの語を含む。分解能に関して、横方向の（x, y）画像平面における回折エアリーディスクの半径は、以下の式によって定義される：アッベ分解能x, y = λ/2NA、式中、λは透過光における光の平均波長、または蛍光における励起波長帯域である。対物レンズの開口数（NA = n・sin(θ)）は、開口角のサイン（sin(θ)）を乗じた画像化媒質（n；通常は空気、水、グリセリン、または油）の屈折率によって定義される。この関連性の結果、点光源によって作られるスポットのサイズは、波長が減少するにつれて、および開口数が増大するにつれて、減少するが、常に有限の直径のディスクを維持する。アッベの分解能（すなわちアッベ限界）はまた、本明細書において回折限界と称され、かつ光学システムの分解能の限界を定義する。
2つのエアリーディスクまたは点像分布関数の間の距離がこの値よりも大きい場合、2つの点光源は解像されるとみなされる（そして、容易に区別され得る）。そうでなければ、エアリーディスクはともに合体し、そして解像されないとみなされる。
したがって、波長λで単一分子を検出可能な標識の点光源から放出され、屈折率 n で媒質中を進み、そして半角θでスポットに収束する光は、直径：d = λ/2*NA を有する回折限界のスポットを作り出す。500 nm付近の緑色光で1のNA（開口数）であるとすると、回折限界はおよそ d = λ/2 = 250 nm（0.25μm）であり、これは従来の画像化技術によって画像化され得る、表面上の単一分子タンパク質およびヌクレオチドなどの分析物の密度を制限する。光学顕微鏡が、利用可能な最高の品質のレンズ要素を備え、完璧に調整され、かつ最大の開口数を有する場合でさえも、分解能は、最良のシナリオにおいて、光の波長のおよそ半分に制限されたままである。分解能を増大させるために、UV顕微鏡およびX線顕微鏡など、より短い波長が使用され得る。これらの技術は、より良い分解能を提供するが、しかし高価であり、生物学的試料におけるコントラストの欠如という難点があり、かつ試料に損傷を与え得る。
デコンボリューション
デコンボリューションは、記録されたデータに対するコンボリューションの作用を逆転させるために使用される、アルゴリズムに基づくプロセスである。デコンボリューションの概念は、シグナル処理および画像処理の技術において広く使用されている。これらの技術は次々に、多くの科学および工学の分野において広く使用されているので、デコンボリューションは多くの応用性を提供している。
光学系および画像化において、「デコンボリューション」との語は、光学顕微鏡、電子顕微鏡、望遠鏡、または他の画像化機器において起こる光学ひずみを逆転させるプロセスを指すために特に使われ、そうしてより明瞭な画像を作り出す。それは、通常、一連の顕微鏡画像処理技術の一部として、ソフトウェアアルゴリズムによって、デジタル領域においてなされる。
通常の方法は、機器を通り抜ける光路が光学的に完璧であると仮定して、光（または他の波）の理論上の点光源が機器を通り抜ける経路に関してひずみを記述する数学関数である、点像分布関数（PSF）を用いてコンボリューションされている。通常、そのような点光源は、最終的な画像に、小さなぼやけた領域をもたらす。この関数が決定され得る場合、その後は、その逆関数または補関数をコンピューターで計算し、そして取得された画像をそれでコンボリューションすればよい。デコンボリューションは、フーリエ終域における除算に写像する。これは、フーリエ変換の対象である実験データにデコンボリューションが容易に適用されることを可能にする。一例はNMR分光法であり、これにおいてはデータは時間領域において記録されるが、周波数領域において分析される。指数関数による時間領域データの除算は、周波数領域におけるローレンツ（Lorenzian）線の幅を減少させる作用を有する。結果は、本来の、ひずみのない画像である。
しかしながら、回折限界の画像化のためには、点像分布関数が完全に既知であるとしても、デコンボリューションは、回折限界を超えて分解能を改善するために、シグナルをさらに精製することも必要とする。ナイキスト距離より短い距離にある2つの物体を信頼性をもって分離することは、非常に困難である。しかしながら、ナイキスト距離よりもはるかに短い距離で隔てられている物体を信頼性をもって検出するために、反復検出、分析物の位置決定、アラインメント、およびデコンボリューションを用いる方法ならびにシステムが、本明細書において記載される。
配列決定
光学的検出画像化システムには回折限界があり、そのためこれは、配列決定において典型的に使用されるフルオロフォアに関して、約300 nmの、理論上の最大分解能を有する。現在まで、最良の配列決定システムは、それらのアレイ上で約600 nmの、または約2x回折限界の、近接するポリヌクレオチドの間の中心間の間隔を有している。この 2xという係数は、結果として位置の誤差を生じ得る、強度の、アレイの、および生物学的な変動を明らかにするために、必要とされる。10ドルゲノムを達成するために、およそ200 nmの中心間の間隔が必要とされ、これは回折限界未満の画像化能力を必要とする。
配列決定に関して、本明細書において記載されるシステムおよび方法の目的は、光学システムの回折限界未満の中心間の間隔を有する基材上で、配列決定されるポリヌクレオチドを解像することである。
本明細書において記載されるように、本発明者らは、部分的には、各分析物の位置を高い正確性（たとえば10 nm以下のRMS）で同定することにより、回折限界未満での画像化を達成するための方法およびシステムを提供する。比較として、最新のSuper Resolution systems（Harvard/STORM）は、20 nm RMSにまで下げた正確性でしか位置を同定することができず、本システムより2xで劣る。したがって、本明細書において開示される方法およびシステムは、回折限界未満の画像化が基材上に高密度に詰め込まれた分子を同定することを可能にして、10ドルゲノムを達成するための酵素1単位あたりの高いデータレート、時間1単位あたりの高いデータレート、および高いデータ正確性を達成する。本明細書において記載されるように、これらの回折限界未満の画像化技術は、反復検出を用いる技術に対して広く適用可能である。
画像化および反復検出
本明細書において記載されるように、検出方法およびシステムのそれぞれは、回折限界未満の画像化を達成するために、反復検出を必要とした。反復検出は、結合および画像化、または可視光の光学シグナルを放出することができる検出可能な標識に結合した抗体もしくはヌクレオチドなどのプローブを含む。異なるサイクルからの、フィールドの一連の画像からの位置情報を用いることにより、高密度に詰め込まれた基材からのシグナルを解像するデコンボリューションを、光学画像化の回折限界のために不明瞭にされたシグナルからの個々の光学シグナルを効果的に同定するために、使用することができる。複数のサイクル後、分子の厳密な位置は、ますますより正確となる。この情報を用いて、ピクセルへの離散化作用のために生じる、クロストークマトリックスにおける既知の非対称に関するクロストーク補正を補助するために、追加の計算が実施され得る。
反復されるプローブ結合および光学的検出を用いる方法ならびにシステムは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、2015年11月19日発行の米国特許出願公開第2015/0330974号Digital Analysis of Molecular Analytes Using Single Molecule Detectionに記載されている。
いくつかの態様において、生画像は、オーバーサンプリングされた画像のより正確な決定を容易にするために、少なくともナイキスト限界であるサンプリングを用いて取得される。ナイキスト限界より大きいサンプリング（オーバーサンプリング）による、画像を表すために使用されるピクセルの数の増大は、画像処理および表示に利用可能なピクセルデータを増大させる。
理論上、帯域制限されたシグナルは、ナイキストレート以上でサンプリングされた場合に、完全に再構成され得る。ナイキストレートは、シグナルにおける最高の周波数成分の2倍として定義される。オーバーサンプリングは、分解能を改善し、ノイズを減少させ、そしてアンチエイリアシングフィルターの性能要件を緩和することによって、エイリアシングおよび位相ひずみを回避する助けとなる。シグナルは、それがナイキストレートのN倍でサンプリングされた場合に、N倍オーバーサンプリングされた、と言われる。
したがって、いくつかの態様において、各画像は、観察している光の波長の半分以下のピクセルサイズで取得される。いくつかの態様において、ナイキスト限界以上でのサンプリングを達成するために、162.5 nm x 162.5 nmのピクセルサイズが検出において使用される。基材の生画像形成中の、少なくともナイキスト限界の周波数でのサンプリングは、本明細書において記載されるシステムまたは方法の分解能を最適化するために好ましい。これは、高い正確性で、回折限界未満で基材上で特徴物を解像するために、本明細書において記載されるデコンボリューション方法および光学システムとともになされ得る。
異なるサイクルからの画像の処理
回折限界未満での画像化を達成するために、本発明によって克服されるいくつかの障壁がある。
ピクセル化の誤差は生画像に存在し、そしてピクセル化のために、存在している情報の光学シグナルからの同定を妨害する。本明細書において記載されるような、少なくともナイキスト周波数でのサンプリング、およびオーバーサンプリングされた画像の生成はそれぞれ、ピクセル化（pixilation）の誤差を克服する助けとなる。
さまざまな分子の点像分布（PSF）はオーバーラップする、これは、PSFのサイズがピクセルサイズ（ナイキストを下回る）より大きいからであり、かつ中心間の間隔が、空間上のオーバーラップに起因するクロストークが生じるほど小さいからである。最近傍変数回帰（中心間のクロストークに関して）は、複数のオーバーラップする光学シグナルのデコンボリューションを助けるために使用され得る。しかしこれは、基材上の各分析物の相対位置が既知であり、かつフィールドの画像の優れたアラインメントを有していれば、改善され得る。
複数のサイクル後、分子の厳密な位置は、ますますより正確となる。この情報を用いて、ピクセルへの離散化作用および回折限界のために生じる、光学シグナルの空間上のオーバーラップにおける既知の非対称を補正することによってデコンボリューションを補助するために、追加の計算が実施され得る。それらはまた、放出スペクトルにおける、異なる放出スペクトルからのオーバーラップを補正するために、使用され得る。
各分析物についての高度に正確な相対位置情報は、各分析物に結合した異なるプローブの光学シグナルからの測定されたピークの分布を生成するために、異なるサイクルからの同じフィールドの画像をオーバーレイすることによって、獲得され得る。この分布はその後、分析物の単一の相対位置に対応するピークシグナルを生成するために使用され得る。サイクルのサブセットからの画像は、各分析物についての相対位置情報を生成するために使用され得る。いくつかの態様において、この相対位置情報は、ローカライゼーションファイルにおいて提供される。
各サイクルについて、フィールドの画像化される特定の領域は、サイクルからサイクルへと変更されてよい。したがって、各画像について分析物の位置の同定の正確性を改善するために、複数のサイクルにわたるフィールドの画像間のアラインメントが実施され得る。このアラインメントから、参照ファイルと比較したオフセット情報が、その後、同定され得、そして、回折限界のために不明瞭にされた光学シグナルについてデコンボリューションおよびシグナル同定の正確性をさらに増大させるために、デコンボリューションアルゴリズムに組み込まれ得る。いくつかの態様において、この情報はフィールドアラインメントファイルとして提供される。
シグナル検出（クロストーク／最近傍）
基材上の分析物について相対位置情報が正確に決定され、そして各サイクルからのフィールド画像がこの位置情報とアラインされると、クロストークおよび最近傍回帰を用いる、オーバーサンプリングされた各画像の分析が、各画像における各分析物からの光学シグナルを正確に同定するために、使用され得る。
いくつかの態様において、光学システムの回折限界によって不明瞭にされた複数の光学シグナルは、基材上に固定化され、かつ検出可能な標識を含むプローブに結合された、複数の生体分子のそれぞれに関して、同定される。いくつかの態様において、プローブがヌクレオチドに組み込まれ、そして一連のサイクルが、アレイ上に固定化されたポリヌクレオチドの配列を、合成による単一分子配列決定を用いて決定するために、使用される。
画像に適用されるデコンボリューションのシミュレーション
分子の密度は、隣接する分子からのクロストークにより制約を受ける。図13は、単一分子のシミュレートされた画像を示す。この特定の画像は、2xオーバーサンプリングフィルターで処理された、600 nmのピッチの単一分子アレイのシミュレーションである。8つの近接するスポット中へのクロストークは、アレイのピッチおよびアルゴリズムのタイプの関数として平均される。
図14は、複数のピッチ、および画像処理アルゴリズムの2つのバリエーションで処理された、一連の画像であり、1つ目は2xオーバーサンプリングされた画像であり、そして二つ目は、本明細書において記載されるようにデコンボリューションをともなって4xオーバーサンプリングされた画像である。図15は、200 nmに下げたピッチでのこれら2つのタイプの画像処理の、クロストーク分析である。2xオーバーサンプリングでの、25%以下の許容可能なクロストークレベルは、275 nm以上のピッチについて生じる。光学システムの点像分布関数を用いる4xデコンボリューションでの、25%以下の許容可能なクロストークレベルは、210 nm以上のピッチについて生じる。
分子の物理的なサイズは、スポットを、結合領域のサイズのほぼ半分、拡張させる。たとえば、80 nmのスポットについて、ピッチはおよそ40 nm増大される。より小さいスポットサイズが使用されてよいが、しかしこれは、より少ないコピーしか許容されず、かつより強い光の強度が必要であるという、代償を有する。単一のコピーは、最も単純な試料調製をもたらすが、しかし、最も強い光の強度を必要とする。
この点を取り扱う回折限界未満の画像化のための方法は、オーバーサンプリング、デコンボリューション、およびクロストーク補正の画像処理技術を含む。本明細書において、分析物についての、プローブの光学シグナル画像化の複数のサイクルからの情報を用いる、基材上の分析物の正確な相対位置の決定を組み込む方法およびシステムが、記載される。この情報を用いて、ピクセルへの離散化作用のために生じる、クロストークマトリックスにおける既知の非対称に関するクロストーク補正を補助するために、追加の計算が実施され得る。
方法
いくつかの態様において、図16に示されるように、本明細書において、高密度に詰め込まれた基材の表面上に固定化された分析物の相対位置を正確に決定するための方法が提供される。該方法は、表面を含む基材を提供する工程を最初に含み、ここで表面は、表面上で別々の位置に固定化された複数の分析物を含む。その後、該表面上でのプローブ結合およびシグナル検出の複数のサイクルが実施される。検出の各サイクルは、分析物を、表面上に固定化された標的分析物に結合することができるプローブセットと接触させる工程、該表面上の別々の位置で該分析物に結合した個々のプローブからの複数の光学シグナルを検出するために、光学システムを用いて該表面のフィールドを画像化する工程、および検出の別のサイクルが実施されようとする場合に、結合したプローブを除去する工程を含む。各画像から、該複数のサイクルの少なくとも2つからの該フィールドの画像から、該複数の光学シグナルのそれぞれからのピーク位置が検出される。各分析物についてのピークの位置がオーバーレイされて、それから基材上の各分析物の正確な相対位置がその後決定される、ピークのクラスターが生成される。
いくつかの態様において、図17に示されるように、基材上での分析物についての正確な位置情報はその後、該画像のそれぞれからのオーバーラップする光学シグナルをデコンボリューションするために画像に適用され得る、位置情報を組み込む（たとえば、基材における隣接する分析物間の中心間の間隔を同定するため）デコンボリューションアルゴリズムにおいて使用される。いくつかの態様において、デコンボリューションアルゴリズムは、オーバーラップする光学シグナルを有する隣接する分析物の間の空間上の識別のための、最近傍変数回帰を含む。
いくつかの態様において、図18に示されるように、分析物検出の方法は、基材上に固定化された個々のポリヌクレオチドの配列決定に適用される。
いくつかの態様において、図11に示されるように、光学シグナルは、高密度に詰め込まれた基材からデコンボリューションされる。図19に示されるように、工程は、4つの異なるセクションに分割されることができる：1) 画像分析、これは各サイクルについてのフィールドの各画像からのオーバーサンプリングされた画像の生成、ならびに画像における検出される各光学シグナルのピーク位置および強度を含むピークファイル（すなわちデータセット）の生成を含む。2) ローカライゼーションファイルの生成、これは基材上の分析物の正確な相対位置を決定するための、各分析物についての光学シグナル検出の複数のサイクルから生成される複数のピークのアラインメントを含む。3) フィールドアラインメントファイルの生成、これは選択された参照画像に対して、異なる検出サイクルからのフィールドの画像をアラインするための、各画像についてのオフセット情報を含む。4) 強度の抽出、これは、オーバーサンプリングされた各画像から検出されるシグナルの正確なアイデンティティを決定するために、デコンボリューションモデリングとともに、オフセット情報および位置情報を使用する。「強度の抽出」工程はまた、合成による配列決定の処理および検出における誤差を補正するために使用される、前のサイクルの回帰などの、他の誤差の補正を含み得る。各セクションにおいて実施される工程は、以下に、さらに詳細に記載される。
図20Aおよび図21に示される画像分析工程において、各サイクルからの各フィールドの画像は、検出された各シグナルについてピクセルの数を増大させるように、各シグナルについてピークを鋭利にするように、そして各シグナルからのピーク強度を同定するように、処理される。この情報は、各サイクルについての各フィールドのピークファイルを生成するために使用され、ピークファイルは、各分析物の位置の測定値（観察された光学シグナルのピークから）、および各シグナルからのピーク強度からの強度を含む。いくつかの態様において、各フィールドからの画像は、画像からのノイズの最初の除去を実施するために、バックグラウンド除去を最初に受ける。その後画像は、各画像において観察されたシグナルのモデリングに基づく人工的に生成されたピクセルを含むオーバーサンプリングされた画像を生成するために、平滑化およびデコンボリューションを用いて処理される。いくつかの態様において、オーバーサンプリングされた画像は、生画像からの各ピクセルから、4ピクセル、9ピクセル、または16ピクセルを生成することができる。
各生画像において検出される、またはオーバーサンプリングされた画像に存在する、光学シグナルからのピークはその後同定され、そして検出される各分析物についての強度および位置情報は、さらなる処理のためにピークファイル中に置かれる。
いくつかの態様において、基材の各サイクルおよび各フィールドから検出されるすべての画像に対応するN枚の生画像、または画像化された各フィールドについてのN枚のオーバーサンプリングされた画像およびN個のピークファイルへの出力。ピークファイルは、各画像に関して検出される各分析物の、相対位置を含む。いくつかの態様において、ピークファイルはまた、検出される各分析物についての強度情報を含む。いくつかの態様において、1つのピークファイルが、各色、および各サイクルにおける各フィールドについて生成される。いくつかの態様において、各サイクルは、1つのピークファイルが、各色、および各サイクルにおける各パスの各フィールドについて生成され得るように、複数のパスをさらに含む。いくつかの態様において、ピークファイルは、単一のフィールド中の光学シグナルからピーク位置を特定する。
好ましい態様において、ピークファイルは、各サイクルについてのフィールドの、処理された、オーバーサンプリングされた各画像からの、XY位置情報を含む。XY位置情報は、プローブからの検出された検出可能な各標識（フルオロフォアなど）の位置の、オーバーサンプリングされた画像から判断された座標を含む。ピークファイルは、個々の検出可能な標識それぞれからのシグナルからの強度情報もまた、含み得る。
オーバーサンプリングされた画像の生成は、ピクセル化のために抽出することができない、存在している情報を同定して、ピクセル化の誤差を克服するために、使用される。平滑化およびデコンボリューションによる生画像の最初の処理は、各分析物の位置をより高い正確性をもって決定できるように、ピークファイルにおいてより正確な情報を提供する助けとなり、そしてこの情報は続いて、回折限界での画像化において不明瞭にされたシグナルのより正確な決定を提供するために使用され得る。
いくつかの態様において、生画像は、オーバーサンプリングされた画像のより正確な決定を容易にするために、少なくともナイキスト限界であるサンプリングを用いて取得される。ナイキスト限界より大きいサンプリング（オーバーサンプリング）による、画像を表すために使用されるピクセルの数の増大は、画像処理および表示に利用可能なピクセルデータを増大させる。
理論上、帯域制限されたシグナルは、ナイキストレート以上でサンプリングされた場合に、完全に再構成され得る。ナイキストレートは、シグナルにおける最高の周波数成分の2倍として定義される。オーバーサンプリングは、分解能を改善し、ノイズを減少させ、そしてアンチエイリアシングフィルターの性能要件を緩和することによって、エイリアシングおよび位相ひずみを回避する助けとなる。シグナルは、それがナイキストレートのN倍でサンプリングされた場合に、N倍オーバーサンプリングされた、と言われる。
したがって、いくつかの態様において、各画像は、観察されている光の波長の半分以下のピクセルサイズで取得される。いくつかの態様において、ナイキスト限界以上でのサンプリングを達成するために、162.5 nm x 162.5 nmのピクセルサイズが検出において使用される。
平滑化は、データにおける重要なパターンを捕捉するが一方でノイズまたは他の微細な規模の構造／急速な現象を排除する近似関数を、使用する。平滑化において、シグナルのデータ点は、個々の点が減少し、かつ近接する点よりも低い点が増やされるように修正されて、より平滑なシグナルがもたらされる。平滑化は、本明細書において、各画像において検出される回折限界の光学シグナルを平滑化して、シグナルからのピークおよび強度をより良く同定するために、使用される。
各生画像には回折限界があるが、本明細書において、異なるサイクルからの同じ分析物からの複数のシグナルの収集をもたらす方法が記載される。この方法の態様は、図20Bのフローチャートにおいて示される。各分析物からのこれらの複数のシグナルは、それぞれの個々の画像からの回折限界のシグナルよりもはるかにより正確な位置を決定するために使用される。それらは、5 nm未満の分解能でフィールド内の分子を同定するために使用され得る。この情報はその後、図21に示されるように、ローカライゼーションファイルとして保管される。高度に正確な位置情報は、クロストーク回帰および最近傍変数回帰などのデコンボリューションアルゴリズムと組み合わせて、それぞれの個々のフィールド画像からのシグナル同定を大幅に改善するために、その後使用され得る。
図21に示されるように、ローカライゼーションファイルを生成する工程は、基材上の分析物のセットの相対位置を決定するために、ピークファイルにおいて提供される位置情報を使用する。いくつかの態様において、各ローカライゼーションファイルは、基材の単一の画像化フィールドからの分析物のセットからの相対位置を含む。ローカライゼーションファイルは、回折限界未満で検出される分析物についての高度に正確な位置情報を生成するために、複数のサイクルからの位置情報を組み合わせる。
いくつかの態様において、各分析物についての相対位置情報は、平均で、10 nm未満までの標準偏差（すなわちRMSまたは二乗平均平方根）で決定される。いくつかの態様において、各分析物についての相対位置情報は、平均で、10 nm未満までの2x標準偏差で決定される。いくつかの態様において、各分析物についての相対位置情報は、平均で、10 nm未満までの3x標準偏差で決定される。いくつかの態様において、各分析物についての相対位置情報は、10 nm未満までの中央値の標準偏差で決定される。いくつかの態様において、各分析物についての相対位置情報は、10 nm未満までの中央値の2x標準偏差で決定される。いくつかの態様において、各分析物についての相対位置情報は、10 nm未満までの中央値の3x標準偏差で決定される。
異なるサイクルからのフィールドについてのピークファイルのサブセットから、ローカライゼーションファイルが、アレイ上の分析物の位置を決定するために生成される。図21に示されるように、いくつかの態様において、ピークファイルは最初に、光学システムにおける収差を明らかにするために、点像分布関数を用いて正規化される。正規化されたピークファイルは、ピークファイルにおいて提供される位置および強度情報に基づき、人工的な正規化された画像を生成するために使用され得る。各画像は、その後アラインされる。いくつかの態様において、アラインメントは、各画像ペアを相関させ、そしてファインフィット（fine fit）を実施することによって、実施され得る。アラインされたら、各サイクルからの各分析物についての位置情報は、基材上の位置測定値の分布を提供するために、その後オーバーレイされ得る。この分布は、基材上の分析物の高度に正確な相対位置を提供する単一のピーク位置を決定するために使用される。いくつかの態様において、ポアソン分布が、単一のピークを決定するために、各分析物についてのオーバーレイされた位置に適用される。
サイクルからの位置情報の少なくとも1つのサブセットから決定されるピークはその後、ローカライゼーションファイルに記録され、このローカライゼーションファイルは、正確性を有する、回折限界未満で検出される各分析物の相対位置の測定値を含む。記載されるように、サイクルのサブセットのみからの画像が、この情報を決定するために必要とされる。
図21に示されるように、各サイクルおよび各色についての各フィールドからの正規化されたピークファイル、ならびに正規化されたローカライゼーションファイルが、フィールドの参照画像に対する、フィールドからの各画像についてのオフセット情報を生成するために、使用され得る。このオフセット情報は、高密度に詰め込まれた基材および回折限界の画像からのシグナル同定のさらなる改善の目的で、各生画像における分析物の相対位置決定の正確性を改善するために使用され得る。いくつかの態様において、このオフセット情報は、フィールドアラインメントファイルとして保管される。いくつかの態様において、組み合わされたローカライゼーションファイルおよびフィールドアラインメントファイルからの、フィールドにおける各分析物の位置情報は、10 nm未満のRMS、5 nm未満のRMS、または2 nm未満のRMSである。
いくつかの態様において、フィールドアラインメントファイルは、フィールドのマスターファイルに対するオフセット情報を決定することによる、単一のフィールドからの画像のアラインメントによって、生成される。1つのフィールドアラインメントファイルが、各フィールドについて生成される。このファイルは、すべてのサイクルからのフィールドのすべての画像から生成され、かつフィールドからの参照画像に対する、フィールドのすべての画像についてのオフセット情報を含む。
いくつかの態様において、アラインメントの前に、各ピークファイルは点像分布関数を用いて正規化され、その後に正規化されたピークファイルからの人工的な画像の生成、および人工的な画像のフーリエ変換が続く。正規化されたピークファイルの人工的な画像のフーリエ変換はその後、対応するフィールドについて正規化されたローカライゼーションファイルからの人工的な画像のフーリエ変換の複素共役を用いてコンボリューションされる。これは、各サイクルの各ピークファイルについてなされる。結果として生じるファイルはその後、画像ファイルを再生成するために逆フーリエ変換を受け、そして画像ファイルは、各画像ファイルについてのオフセット情報を生成するために、フィールドからの参照ファイルに対してアラインされる。いくつかの態様において、このアラインメントは、参照ファイルに対するファインフィットを含む。
フィールドアラインメントファイルは、このようにオーバーサンプリングされた各画像についてのオフセット情報を含み、かつ、続く「強度の抽出」工程における使用のための各分析物についての高度に正確な相対位置を生成するために、対応するフィールドについてのローカライゼーションファイルとともに使用され得る。
例として、20サイクルが1つのフィールドにおいて実施され、かつ1枚の画像が検出されようとする4色のそれぞれについて生成されるとすると、フィールドの80枚の画像が生成され、1つのフィールドアラインメントファイルが、フィールドから取得された80枚すべての画像（20サイクル* 4色）について生成される。いくつかの態様において、フィールドアラインメントファイルの内容は、以下を含む：フィールド、各画像について観察された色、反復検出における工程のタイプ（たとえば結合または取り除き）、および参照画像に対する画像のオフセット座標。
いくつかの態様において、アラインメントのプロセス中、2枚の画像をアラインするために必要なXY「シフト」または「残余」が計算され、そしてプロセスは残りの画像について繰り返され、すべてに適用されるベストフィット（best fit）の残余が計算される。
いくつかの態様において、閾値を超える残余は排除され、そしてベストフィットが再度計算される。このプロセスは、すべての個々の残余が閾値内になるまで繰り返される。
オーバーサンプリングされた各画像はその後、ローカライゼーションファイルからの正確な位置情報、およびフィールドアラインメントファイルからのオフセット情報を用いてデコンボリューションされる。強度抽出工程の1つの態様が、図20Cおよび図21において示される。さまざまな分子の点像分布関数（PSF）がオーバーラップする、なぜならば、中心間の間隔は、近接する分析物からのシグナルの点像分布関数がオーバーラップするほど小さいからである。正確な分析物の位置情報および／またはオフセット情報と組み合わせた最近傍変数回帰は、回折限界のために分解能が阻害される中心間距離を有する、近接する分析物からのシグナルをデコンボリューションするために、使用され得る。各分析物についての正確な相対位置情報の使用は、回折限界未満で隣接する分析物からの光学シグナルの空間上のデコンボリューションを容易にする。いくつかの態様において、隣接する分析物の相対位置は、隣接する分析物間の正確な中心間距離を決定するために使用され、これは、それぞれの個々の画像からのシグナルのデコンボリューションにおける使用に関して隣接する分析物間の空間上のクロストークを判断するために、光学システムの点像分布関数と組み合わせて使用され得る。これは、ポリヌクレオチドの配列決定などの光学検出技術について、回折限界未満の分析物の密度での基材の使用を可能にする。
ある態様において、放出スペクトルは、異なるシグナル間でオーバーラップする（すなわち「クロストーク」）。たとえば、合成による配列決定中に、配列決定プロセスにおいて使用される4つの色素は、典型的に、放出スペクトルにおいていくらかのオーバーラップを有する。
特定の態様において、クロストークが異なる色チャンネルの間で生じる場合に、およびクロストークが画像の異なるセットで異なる場合に、サイクルについて得られた画像のセットにおいて、異なる特徴物に対して色を割り当てることの問題（たとえばベースコール）は、使用される異なる検出可能な各標識からの光学シグナルからオーバーラップする放出スペクトルを除去するための、オーバーサンプリングされた各画像についてのローカライゼーションファイルおよびフィールドアラインメントファイルと組み合わせたクロストーク回帰によって、解決され得る。これは、基材上の各分析物に結合する各プローブについての検出可能な標識のアイデンティティの同定の正確性をさらに増大させる。
したがって、いくつかの態様において、本明細書において開示されるように、サイクルからのフィールドの単一の画像からのシグナル、および／またはその強度の同定は、以下の特色を使用する：1) オーバーサンプリングされた画像 － 画定された位置において強度およびシグナルを提供する。2) 正確な相対位置 － ローカライゼーションファイル（サイクルの少なくとも1つのサブセットからの情報からの位置情報を提供する）およびフィールドアラインメントファイル（フィールドにおけるすべての画像についてのオフセット／アラインメント情報を提供する）。3) 画像処理 － フィールドにおける各分析物についての正確な相対位置情報を用いる最近傍変数回帰（空間上のデコンボリューション）およびクロストーク回帰（放出スペクトルデコンボリューション）。各分析物のためのプローブ（たとえば、検出用の抗体、または配列決定用の相補的ヌクレオチド）の正確な同定。
画像処理シミュレーション
本明細書において開示される方法およびシステムの効果は、図22A、図22B、図23A、および図23Bに示される、シミュレートされたクロストークプロットにおいて例示される。これらの図のそれぞれについて、10μm x 10μmの領域での検出された各分析物における4つのフルオロフォアの1つと相関する放出スペクトルの強度を示すクロストークプロットが、示される。4つのフルオロフォアのうちの1つに対応するそれぞれの軸は、プロットのそれぞれの角へと伸長する。したがって、プロットの中心に位置するスポットは、すべての4つのフルオロフォアからの、強度の等しい寄与を有する。画像化サイクル中の個々のフルオロフォアから検出された放出強度は、X, Y；X, -Y；-X, Y；または-X, -Yのいずれかの方向にスポットを移動させるように割り当てられる。したがって、これらの4つの軸に沿ったスポットの集団の分離は、分析物の位置におけるフルオロフォアからの明確なデコンボリューションされたシグナルを示す。各シミュレーションは、10.075μm x 10.075μmの領域における1024分子の検出に基づいており、これは1平方ミクロンあたり10.088分子の密度、または約315 nmの分子間の平均中心間距離を示す。これは、162.5 nm x 162.5 nmのピクセルサイズでの約62 x 62ピクセルの画像領域と相関する。
図22Aは、生画像から検出された光学シグナルからの4つのフルオロフォア間のフルオロフォア強度のクロストークプロットを示す。図22Bおよび図23Aはそれぞれ、4xオーバーサンプリングされた画像を生成することによって達成された、4つのフルオロフォア間の分離を示し、これは各分析物におけるクロストークのいくつかの除去の達成を示す。図23Bは、同じ画像化領域であるが、図21に示されるように、かつ本明細書において記載されるように実施されるデコンボリューションおよび最近傍回帰を用いたクロストークプロットを示す。図23Aおよび図22Aと比べ、検出された各分析物は、その光学シグナルの、他のフルオロフォアからの明確な分離を示し、これは、各分析物についての高度に正確なフルオロフォアの同定を示す。
図24Aおよび図24Bは、上記シミュレートされた場合の、検出された10.075μm x 10.075μmの各領域のシミュレートされた4色合成画を示す。これは、生画像（図24A）および本明細書において記載されるように処理された画像（図24B）からの（form）分析物間の明瞭性を、視覚的に表現する。
配列決定
上述のおよび図21において記載される方法はまた、高密度に詰め込まれたポリヌクレオチドを含む基材上で伸長する相補鎖へと組み込まれる相補的な可逆的ターミネーターの光学的検出を用いる、合成による配列決定による配列決定を容易にする。したがって、回折限界未満の中心間距離で隣接しているポリヌクレオチドの配列と相関するシグナルは、本明細書において記載される方法および光学検出システムを用いて、信頼性をもって検出され得る。配列決定中の画像処理はまた、配列決定反応または検出における誤差を補正するための、基材上の繰り返されたクローン配列に基づく、もしくはデータそれ自体に基づく、前のサイクルの回帰を含み得る。いくつかの態様において、配列決定のために基材上に固定化されているポリヌクレオチドは、コンカテマーである。コンカテマーは、配列決定されようとするポリヌクレオチドの、複数の同一コピーを含み得る。したがって、本明細書において記載される方法およびシステムによって同定される各光学シグナルは、組み込まれたヌクレオチドからの単一の検出可能な標識（たとえばフルオロフォア）を指すことができ、または、シグナルが複数の位置からの平均であるように、単一のコンカテマーにおいて複数の位置に結合した複数の検出可能な標識を指すことができる。生じる分解能は、個々の検出可能な標識の間ではなく、基材に固定化された異なるコンカテマーの間である。
いくつかの態様において、1つまたは複数のコピーの、配列決定されようとする分子は、共有結合を用いて、表面上の捕捉オリゴヌクレオチドへのハイブリダイズによって、または他の非共有結合によって、表面に結合される。結合した分子は、数百サイクルの間、表面上にとどまり、そして特定の変種の存在の確認のため、最初の配列決定プライマーを取り除いた後で、異なるプライマーセットを用いて再度調査されることができる。
1つの態様において、フルオロフォアおよび保護基は、化学反応を用いて除去されてよい。
別の態様において、蛍光基および保護基は、UV光を用いて除去されてよい。
1つの態様において、配列決定されようとする分子は、50～100 nMの直径を有しておりかつこれらの領域が150～300 nMのピッチで配置され得る反応性の表面上に、固定化されることができる。これらの分子は、標的のデコンボリューションのためにそれら分子に結合されたバーコード、および配列決定を開始するために配列決定プライマーが結合する領域を有する。緩衝液は、伸長反応を可能にする適切な量のDNAポリメラーゼを含む。これらは、利用可能な遺伝子増幅方法（PCR、全ゲノム増幅等）のいずれかによって生成された、配列決定されようとする標的の10～100コピーを含み得る。
別の態様において、バーコードおよびプライマーアニール部位でタグ付けされた単一標的分子は、60～150 nMのピッチで配置された直径20～50 nMの反応性の表面上に固定化され得る。分子は個々に配列決定され得る。
1つの態様において、プライマーは標的に結合し得、かつ1回につき1つまたは複数のフルオロフォアを有する1つのdNTPを用いて伸長し得；表面は画像化され得、フルオロフォアは除去されかつ洗浄され得、そしてプロセスは、第二の伸長を産生するために繰り返され得る。同じdNTPにおける複数のフルオロフォアの存在は、ゲノムのいくつかの領域に存在するヌクレオチドのリピートの数（2～5個またはそれより多く）を決定することを可能にする。
異なる態様において、プライマーのアニーリングに続き、フルオロフォアを有する4つすべてのdNTP、および保護された3' ヒドロキシル基は、ポリメラーゼ伸長反応において使用され得、表面は画像化され得、そしてフルオロフォアおよび保護基は除去され得、そしてプロセスは複数のサイクルの間、繰り返され得る。
別の態様において、配列は、所定の位置での特定のヌクレオチドの存在に基づいてライゲーションする特定のプローブにアニールするライゲーション反応に基づいて、推定され得る。
上記概説した技術を用いる、先行技術のランダムなアレイに対して改善された密度を有するランダムなアレイが使用されてよいが、しかしながら、ランダムなアレイは一般的に、規則的なアレイから4x～10x減少した表面密度を有する。ランダムなアレイの利点は、チップの均一な非パターン化表面、およびより短い核酸鎖の使用を含む、なぜならば、より長い鎖の排他的な特性に依存する必要がないからである。
実施例1
記載されるシステムは、いくつかのサブシステムを含む：
1. 配列決定されようとするDNAを含むフローセル
2. エンコーダーを有する試料ステージ
3. FPGA（スキャニングミラーの制御）
4. レーザー照射源
5. 高速スキャニング光学素子（ミラーが1つ）
6. 1つまたは複数のカメラ
7. 機器制御ソフトウェア
8. 画像処理のために使用される超解像アルゴリズム
蛍光でタグ付けされたDNA（試料）を有するフローセルが、試料チャックに取り付けられる。試料チャックは、高スループットスキャニング画像化システム（機器）の内側にマウントされる。試料は、フローセルの基材上の、蛍光分子のランダムアレイを有する。画像化中、レーザーに基づく蛍光分子の励起は、該分子からの、より長い波長の光子の放出を引き起こす。放出されたこれらの光子はその後、蛍光分子の画像を生成するのに使用されて、スターフィールドのように見えるものを生成する。これらの画像は、2つの異なるカメラでキャプチャーされる。部位特異的な情報はその後、フィールド全体にわたって計算される。同じフィールドで取得されているが異なるDNA分子を表す、その後に続く画像を、詳細な画像解析（超解像アルゴリズムを使用する）と組み合わせることで、DNA配列を決定することを可能にする。
Heidenhainエンコーダー（LIP 201Rのスケール、512 nmのシグナルピッチを有する#LIP28R）を用いるAlioステージ（#AI-LM-100000-XY）が、本発明者らのスキャニング軸に沿って本発明者らのフローセルを配置するために使用された。ステージのスキャニング軸は、スキャニングミラー（SM）のスキャン軸と一致させる必要があった。
試料ステージについての位置情報は、2.048 umのスケールピッチを用いてエンコーダーから供給され、これは512 nmのシグナル周期を生成する。それに続く内挿は、周期全体にわたって、20 nmの有効分解能をもたらす。この位置データを表す4つのデジタル化されたシグナル（90度の位相増分において）は、その後、FPGAに送り込まれる。FPGAは、これらの4つのデジタルシグナルを取得し、そして各エンコーダーパルスにおける瞬間的なステージ位置を計算する。
4色レーザー照射システムは、フローセルにおいて蛍光分子を励起させるために使用された。励起波長は、488nm、525nm、590nm、および640nmである。回折限界未満での性能は、画像化のために使用される光の波長に依存する；この場合では、それらの放出された波長は、名目上520 nm、565 nm、612 nm、および665 nmである。本発明者らの、640 nmでの励起波長に関し、302 nm未満のサイズの解像可能な特徴物はいずれも、この光学システムについての回折限界（λ/(2*NA)）を下回っている。
1つのスキャニングミラーは、光路上のある1点であって、そこではすべての光線が平行である1点（対物レンズの射出瞳の像）に位置しており、これは、スキャニング中の画像のディストーションを最小限にすることを確実にする（加速追尾の特許を参照されたい）。40X、開口数1.1の水浸対物レンズが使用された。
8192個のポイントの、スキャニングミラー（SM）の較正波形が、標的ステージ速度に基づいて生成された。この波形は、SMを、画像化に使用されるフォワードスキャン方向へと偏向させるのに必要な、およびミラーを元の位置に戻して次のフォワードスキャンを開始するのに必要なバックスキャン方向へと偏向させるのに必要な、SMステップを含む。この波形における8192個のポイントのそれぞれは、スキャニングミラーステップと呼ばれる。この波形における、スキャニングミラーステップのそれぞれにおいて、各カメラおよび各レーザーのための制御値が特定され得る。FPGAは、SMの位置を更新するために新しい値をSM増幅器に送る前に、瞬間的なステージ位置の値（4つのデジタルエンコーダーシグナルから計算される）を、SM波形における各ステップにリアルタイムで追加する。フォワードスキャン中に、各カメラはフィールド1つの画像を取得する。ステージが停止し、そして方向を変える前に、フローセルのレーンの列1つにある最大で120のフィールドの画像が、取得され得る。
SM駆動増幅器は、この新しい電圧値をSMに適用し、これは、カメラのSCMOS検出器上において、フローセルの現在のフィールドを正確に同じ位置で維持するのにちょうど合う、SMの回転を引き起こす。したがって、フローセルを保持する試料ステージが連続的に移動していても、SMはステージの移動を追尾しており、かつ正確に同じ画像化領域をカメラの検出器上に固定し続けている。この一連のステップは、フォワードスキャン傾斜の大半で繰り返される。バックスキャン中は、画像化は実施されない。
Hamamatsu ORCA Flash 4.0 SCMOSカメラ2つが、外部トリガーモードで使用された。これらのカメラは、最大100フレーム毎秒という画像取得レートが可能である。超解像への適用に使用するための、優れた設計の光学システムには、カメラの検出器チップおよびピクセルサイズ、ならびに対物レンズの倍率およびNAが、回折限界での光学性能を得るのに適合していることが必要である。
フローセルに関する流体の挙動、画像化スキャンの開始時および停止時のステージ位置、ならびに他の多くの重要な機能を含めたすべてを制御するために、機器制御ソフトウェアが使用された。1つの列（120フィールド）のスキャンが始まったら、SMの位置、レーザーの状態、およびカメラの状態はすべて、SM増幅器へと出力されるSM波形によって、定義される。
画像が取得されたら、回折限界未満の解像を達成するために、多くのステップが実施される。図28および図29は、分子のマッピング密度が、一定の範囲の異なる条件を有する試料フィールドにわたって、ステップアンドシュート方式の画像化と高速スキャニング方式の画像化との間でどの程度同等であるかについての例を示す。
実施例2
方法
本明細書において記載されるシステムおよび方法は、当技術分野における現在の状況に勝る、大きな利点を提供する。検出可能な標識（たとえば、蛍光でタグ付けされた核酸分子）に結合した分析物の画像を取得するために、本明細書において記載される特徴と一致する高速スキャニング（「HSS」）システムが使用された。HSSは、およそ1200のフィールドについて、異なる4色で画像を取得するように構成された。HSSのデータは、スキャニングミラー1つを用いて取得され、かつリニアエンコーダーからのリアルタイムフィードバックを利用した。HSSのデータは、77.7 mm2の面積について画像化された。画像が取得された後、各フィールドにおける分析物の位置を決定するために、画像解析ソフトウェアが使用された。その後、平均密度（分析物／μm2）が計算され、そして、測定された各フィールドに対して割り当てられた。
同じ測定が、従来の「ステップアンドシュート」（「SnS」）システムを用いて実施された。このSnSシステムに関し、データは、44のフィールドについて取得された。SnSのデータは、4.85 mm2の面積について画像化された。画像が取得された後、各フィールドにおける分析物の位置を決定するために、画像解析ソフトウェアが使用され、そしてその後、平均密度（分析物／μm2）が計算され、そして測定された各フィールドに対して割り当てられた。
結果
画像化時間は、HSSのデータおよびSnSのデータの両方について同様であった。さらに、HSSのデータについての誤り率は、SnSの誤り率と同様か、またはそれよりも低かった。図31A～31Bは、HSS画像化およびSnS画像化の両方について、流体キャビティにおけるすべてのフィールドにわたって測定された平均分析物密度（分析物/μm2）を示す。図31Cは、HSSおよびSnSの両方について、それらの分析物密度（分析物/μm2）にしたがって区分けされた、画像化されたフィールドの数のヒストグラムである。
このデータは、HSSが、SnSと同様の検出性能（分析物密度）を有しつつ、同じ時間で約16倍多いデータ（フィールドの数）を取得することを示す。検出技術におけるこの顕著な改善は、当技術分野における現在の状況を進展させる。
本発明の好ましい態様は本明細書において示されかつ記載されているが、そのような態様が、単なる例として提供されていることは、当業者には明らかである。本発明が、本明細書中に提供される特定の例によって限定されることを目的としているわけではない。本発明は前述の明細書を参照して記載されているが、本明細書における態様の説明および図面は、制限する意味に解釈されるべきではない。無数の変更、改変、および置き換えが、本発明から逸脱することなく、今や当業者に想起されるであろう。さらに、本発明のすべての局面は、本明細書において記載される特定の描写にも構成にも相対的な比率にも限定されず、それらは、多様な条件および可変のものに応じて変わることが、理解されるべきである。本明細書において記載される本発明の態様のさまざまな代替物が、本発明を実践する際に採用され得ることが、理解されるべきである。したがって、本発明はまた、任意のそのような代替のもの、修飾したもの、変更したもの、または同等のものを包含することが、企図される。添付の特許請求の範囲は、本発明の範囲を定義し、かつこの特許請求の範囲内の方法および構成、ならびにそれらの等価物がそれにより包含されることを定義することを、意図する。

Claims (37)

  1. a. 光源；
    b. 複数のフィールドをキャプチャーするための、対物レンズと機能的に連結されている1つまたは複数のカメラ；
    c. 基材を支持するように構成されているステージであって、該光源に近接する規定された経路に沿って移動するように構成されている、ステージ；
    d. 該ステージに機械的かつ機能的に連結されているエンコーダー；
    e. 該エンコーダーから位置情報を受け取るように、および該ステージについての複数の位置の複数の計算を実施するように構成されている、位置処理モジュール；
    f. 該ステージについての該複数の位置の該複数の計算を受け取るための、該位置処理モジュールに機能的に連結されている該規定された経路に近接する軸に連結されているスキャニングミラー；および
    g. 構成要素(a)～(f)を同期的に作動させるように構成されている、制御モジュール
    を含む画像化システム。
  2. 画像処理モジュールをさらに含み、該処理モジュールが、
    (i) 前記基材上に配置された複数の分析物のうちのある分析物の位置、または、
    前記基材上に配置されたある分析物の、該基材上に配置された別の分析物に対する相対位置
    を同定するために複数の画像を処理するための画像化アルゴリズムを使用するように；および
    (ii) 該位置または該相対位置において該分析物が同定されたら該分析物を分析するように
    構成されており、ここで、該複数の分析物が、該複数の分析物のうちのある分析物と該複数の分析物のうちの別の分析物との間の最小有効ピッチがλ/(2*NA)未満であるような密度で前記基材上に配置されており、式中、λが、光路において使用される光の波長であり、かつ「NA」が、前記1つまたは複数のカメラの開口数である、請求項1に記載のシステム。
  3. 前記光源がレーザーを含む、請求項2に記載のシステム。
  4. 前記光源が複数のレーザーを含む、請求項2に記載のシステム。
  5. 画像化処理モジュールが、複数の超解像画像を生成するように構成されている、請求項2に記載のシステム。
  6. 前記スキャニングミラーの複数の動作が、前記位置処理モジュールの前記複数の計算から生じる、請求項2に記載のシステム。
  7. 前記複数の計算が、前記ステージの速度測定値または位置測定値の関数である、請求項2に記載のシステム。
  8. 前記位置処理モジュールが、前記複数の計算を波形で出力するように構成されている、請求項2に記載のシステム。
  9. 前記基材が複数のフィールドを含む、請求項2に記載のシステム。
  10. 前記エンコーダーが、
    前記基材上に配置された前記複数の分析物のうちの前記分析物の前記位置、または、
    前記基材上に配置された前記分析物の、該基材上に配置された別の分析物に対する前記相対位置
    についての1つまたは複数の補正値を生成するように；および
    該1つまたは複数の補正値を前記波形に適用するように
    構成されている、請求項8に記載のシステム。
  11. 前記スキャニングミラーが、前記複数のフィールドのうちの1つのフィールドのスキャンが完了したら元の位置へと移動するように、および前記複数のフィールドのうちの次のフィールドのスキャンを開始するように構成されている、請求項2に記載のシステム。
  12. 前記光源が、約400～800ナノメートルの波長を含む、請求項2に記載のシステム。
  13. 前記エンコーダーが、前記ステージの前記複数の移動に基づいて複数のエンコーダーカウントを実施するように構成されている、請求項6に記載のシステム。
  14. 前記エンコーダーが、前記複数のエンコーダーカウントからシグナル周期を生成するように構成されている、請求項13に記載のシステム。
  15. 前記エンコーダーカウントが、約0.05マイクロメートル～約30マイクロメートルの距離に位置付けられる、請求項13に記載のシステム。
  16. 前記エンコーダーが、512ナノメートルにおいて、前記複数のエンコーダーカウントからシグナル周期を生成する、請求項15に記載のシステム。
  17. 前記基材が、規定された複数のレーンを含む、請求項2に記載のシステム。
  18. 前記規定された複数のレーンのうちの1つのレーンが、複数の列を含む、請求項17に記載のシステム。
  19. 前記複数の超解像画像が、約10～約40ナノメートル未満のぼけを含む、請求項5に記載のシステム。
  20. 前記ぼけが、約20～約150フレーム毎秒のフレームレートにおいて生じる、請求項19に記載のシステム。
  21. 前記複数の分析物が、前記画像化システムの回折限界未満またはλ/(2*NA)未満の中心間の間隔で、前記基材上に配置される、請求項2に記載のシステム。
  22. 前記複数の計算が、瞬間的な計算を含む、請求項2に記載のシステム。
  23. 前記請求項のいずれか一項に記載のシステムを利用して、移動している基材上の複数のフィールドを画像化する方法。
  24. 以下の工程を含む、複数のフィールドを含む移動している基材を画像化する方法：
    a. 該基材をステージ上に配置する工程であって、光源に近接する規定された経路に沿って移動するように該ステージが構成されている、工程；
    b. 該ステージに機械的かつ機能的に連結されているエンコーダーから位置情報を受け取るように位置処理モジュールを構成する工程であって、該位置処理モジュールが、該ステージについての複数の位置の複数の計算を実施するようにさらに構成されている、工程；
    c. 該位置処理モジュールに機能的に連結されている該規定された経路に近接する軸に連結されているスキャニングミラーを、該ステージについての該位置の該複数の計算を受け取るように構成する工程；および
    d. 1つまたは複数のカメラを用いて、該複数のフィールドのうちの少なくとも1つのフィールドを画像化する工程。
  25. (b)～(d)が同期的に実施される、請求項24に記載の方法。
  26. 以下の工程をさらに含む、請求項24または25に記載の方法：
    e. 前記基材上に配置された複数の分析物のうちのある分析物の位置、または、
    前記基材上に配置されたある分析物の、該基材上に配置された別の分析物に対する相対位置
    を同定するために複数の画像を処理するための画像化アルゴリズムを使用する工程。
  27. 前記複数の分析物が、該複数の分析物のうちのある分析物と該複数の分析物のうちの別の分析物との間の最小有効ピッチがλ/(2*NA)未満であるような密度で前記基材上に配置されており、式中、λが、光路において使用される光の波長であり、かつ「NA」が、前記光学画像化モジュールの開口数である、請求項26に記載の方法。
  28. 前記スキャニングミラーの複数の動作が、前記位置処理モジュールの前記複数の計算から生じる、請求項24または25に記載の方法。
  29. 前記複数の計算が、前記ステージの速度測定値または位置測定値の関数である、請求項24または25に記載の方法。
  30. (b)が、前記複数の計算を波形で出力するように前記位置処理モジュールをさらに構成することをさらに含む、請求項24または25に記載の方法。
  31. (b)が、
    前記基材上に配置された前記複数の分析物のうちの前記分析物の前記位置、または、
    前記基材上に配置された前記分析物の、該基材上に配置された別の分析物に対する前記相対位置
    についての1つまたは複数の補正値を生成するように；および
    該1つまたは複数の補正値を前記波形に適用するように
    前記位置処理モジュールを構成することをさらに含む、請求項30に記載の方法。
  32. (c)が、
    前記複数のフィールドのうちの1つのフィールドのスキャンが完了したら元の位置へと移動するように、および前記複数のフィールドのうちの次のフィールドのスキャンを開始するように、前記スキャニングミラーをさらに構成すること
    をさらに含む、請求項24または25に記載の方法。
  33. (b)が、複数のエンコーダーカウントからシグナル周期を生成するように該エンコーダーを構成することをさらに含む、請求項24または25に記載の方法。
  34. 前記エンコーダーカウントが、約0.05マイクロメートル～約30マイクロメートルの距離に位置付けられる、請求項33に記載の方法。
  35. 前記エンコーダーが、512ナノメートルにおいて、前記複数のエンコーダーカウントからシグナル周期を生成する、請求項34に記載の方法。
  36. 前記複数の画像のうちのある画像が、約10～約40ナノメートル未満のぼけを含む、請求項26に記載の方法。
  37. 前記ぼけが、約20～約150フレーム毎秒のフレームレートにおいて生じる、請求項36に記載のシステム。
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