KR20220074886A - 초고해상도 이미징을 위한 고속 스캐닝 시스템 - Google Patents
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Abstract
초해상도 이미지를 생성하기 위한 고처리량 광학 스캐닝 시스템 및 사용 방법이 본 명세서에 개시된다. 본 명세서에 제공된 광학 스캐닝 장치 및 사용 방법은 스테이지 속도 내 변동에도 불구하고 고해상도로 연속적으로 움직이는 물체의 높은 처리량의 스캐닝을 허용할 수 있다. 이것은 형광단을 포함하는 생물학적 칩과 같은, 기판의 높은 처리량의 스캐닝을 도울 수 있다. 또한 본 명세서에는 개선된 광학 릴레이 시스템 및 스캐닝 광학 장치가 제공된다.
Description
본 출원은 2019년 9월 5일에 출원된 미국 가출원 제62/896,541호의 이익을 주장하며, 이는 그 전체가 본 명세서에 참조로 포함된다.
오늘날의 사회에서 상품의 가격은 사업을 성사시키거나 중단시킬 수 있다. 종종, 이러한 매출원가(cost of goods sold; COGS)는 특정 프로세스에 대한 처리량을 증가시킴으로써 감소될 수 있다. 따라서, 상품을 최대한 빠르고 효율적으로 처리할 수 있는 것은 종종 사업에서 "반드시 해야할 일"이다. 상품의 자동화 된 검사는 비전(Vision) 또는 이미징 시스템(Imaging Systems)을 통해 일상적으로 수행된다. 이러한 시스템은 물체의 정지(still) 또는 동영상 이미지를 촬영하고 해당 동영상 또는 정지 이미지의 분석에 기초하여 해당 물체의 상태를 결정하기 위해 사용된다. 따라서, 정량화 가능한 데이터는 다음의 해당 물체에 어떤 일이 발생하는지를 결정하기 위해 동영상 또는 정지 이미지에서 추출될 필요성이 있다. 정량화 가능한 데이터를 추출하는 것은 항상 이미지 품질(이미지 피처가 얼마나 잘 정의되었는지(블러), 대비가 적절한지, 등)에 따라 달라진다. 이러한 필요성과 높은 처리량의 이미징(샘플이 계속해서 움직이는 동안 샘플을 이미징)에 대한 요구를 간단하고, 효율적인 비용의 방식으로 결합하는 것은 어려운 과제이다. 즉각적인 또는 고처리량의 이미징의 중요한 태양 중 하나는 샘플 스테이지의 속도를 거의 일정하게 유지하는 것이다. 샘플 스테이지 속도가 변경되면, 이미지가 흐릿해질 것이고 불충분한 데이터가 추출될 수 있다. 일부 고처리량 프로세스의 경우, 스캐닝 동안 초고해상도(서브 회절 한계) 이미징 및 0.5미만의 픽셀 블러가 요구된다. 이러한 정량적 개선은 두 개의 미러(속도 및 가속도 추적 미러) 또는 피드포워드 접근법(다음 필드에 속도 보정 항을 계산하고 제공하기 위해 현재 필드의 평균 속도 사용함)을 사용하는 단일 미러로 달성될 수 있다. 현재까지, 이미지 안정화 정확도가 40nm미만이고 속도가 20FPS(초당 프레임; Frames Per Second) 이상인 실시간 위치 데이터만 사용하는 초해상도 시스템에서 이미지 안정화에 사용되는 단일 또는 이중 미러에 대한 출원은 공지되어 있지 않다.
전형적인 단일 분자, 단일 형광 감도 생물학적 형광 광학 스캐닝 시스템은 긴 노출 시간을 갖는 저잡음 카메라를 요구한다. 이러한 시스템은 종종 화강암 또는 그와 등가물에 놓인 정밀도가 높고 안정적인 이미징 플랫폼을 요구한다. 또한, 이러한 시스템은 다중 필드의 높은 처리량, 안정적인 이미징을 달성하기 위해 높은 가속 및 감속뿐만 아니라 높은 질량을 필요로 하는 "단계 및 반복" 스테이징을 사용한다. 고배율에서 짧은 양의 시간(~5분) 내 넓은 면적 칩(2000mm2)을 스캔하기 위해서는 단계 및 반복 시스템이 허용하는 것보다 더 짧은 프레임 이미징 시간이 요구된다.
"즉각적인 이미지" 접근법은 스테이지 가속도 및 단계 및 반복 시스템에 내재된 안정화 시간으로 인한 처리량 내 손실을 방지하기 위해 요구된다. 기존의 실시간 이미지 출원들은 거의 일정한(~+/-0.05%) 속도를 제공할 수 있는 샘플 스테이지, 및 샘플이 움직일 때 샘플을 이미지화하는 스캐닝 광학계를 요구한다. 샘플이 움직이는 동안 스테이지 속도가 거의 일정하지 않은 경우, 스테이지가 이동할 때 스캐닝 광학계는 샘플과 완전히 동일한 영역을 이미지화하지 않을 것이다. 이는 흐릿한 이미지(예: ~+/-3 픽셀의 픽셀 스미어(smear)가 있음)를 초래할 수 있다. 이러한 문제는 일반적으로 무거운 스테이지 및 강력한 스테이지 드라이브를 사용하여 거의 일정한 속도를 제공하는 고가의 스테이지를 사용함으로써 해결된다. 공교롭게도, 이는 제품의 비용을 증가시키고 벤치탑(benchtop) 시스템으로서 사용하는 것을 비실용적으로 만든다.
전형적인 저비용, 소형 및/또는 경량 스테이지는 패임(pits), 버(burrs), 가공 홈, 디봇(divots) 및 기형 공동(cavities)과 같은 다양한 표면 불규칙성을 갖는 구성요소로 제작된다. 이러한 불규칙성은 일반적으로 일정하지 않은 속도를 초래한다. 예를 들어, 스테이지의 방식에 있는 버 또는 디봇은 스테이지가 불규칙성을 마주치기 전의 속도로 되돌아가기 전에 스테이지를 일시적으로 느려지게 한 후 속도를 높일 수 있을 것이다. 스테이지의 속도 변동은 허용할 수 없는 수준의 이미지 블러의 생성으로 인해 현재 이미지에 대해 즉각적이고 높은 처리량을 갖는 스캐닝 접근법과 양립할 수 없는 이러한 저가의, 더 작은 구성요소의 사용을 만든다.
따라서 필요한 것은, 속도 변동 허용 오차를 증가시키는 향상된 스캐닝 광학계로서, 더 작고, 가볍고, 단일 형광 감도를 갖는 즉석 스캐닝 및 저가 광학 스캐닝 시스템을 이용하여 안정성이 향상된 이미지를 획득될 수 있도록 허용하는 것이다.
본 발명은 적어도 부분적으로, 이동하는 스테이지 상의 물체의 이미징에서 픽셀 스미어(smear)를 감소시키기 위한 새로운 방법 및 장치의 발견에, 기초한다.
본 명세서에 기재된 본 개시 내용의 태양은 다음을 포함하는 이미징 시스템을 제공한다: 광원; 복수의 필드를 캡처하기 위해 대물 렌즈에 작동 가능하게 결합된 하나 이상의 카메라; 기판을 지지하도록 구성된 스테이지로, 상기 스테이지는 상기 광원에 인접한 정의된 경로를 따라 이동하도록 구성됨 -; 상기 스테이지에 기계적으로 작동 가능하게 결합된 인코더; 상기 인코더로부터 위치 정보를 수신하고 상기 스테이지에 대한 복수의 위치에 의 복수의 계산을 수행하도록 구성된 위치 처리 모듈; 상기 스테이지에 대한 상기 복수의 위치의 상기 복수의 계산을 수신하기 위해 상기 위치 처리 모듈에 작동 가능하게 결합된 상기 정의된 경로에 인접한 축에 결합된 스캐닝 미러; 및 시스템의 구성요소를 동기적으로 작동하도록 구성된 제어 모듈. 일부 실시예에서, 시스템은 이미지 처리 모듈을 더 포함하고, 상기 처리 모듈은 (i) 상기 기판 상에 변위된 복수의 분석물들 중 분석물의 위치 또는 상기 기판 상에서 변위된 다른 분석물에 대한 상기 기판 상에 변위된 분석물의 상대적인 위치를 식별하도록 복수의 이미지를 처리하여 이미징 알고리즘을 사용하고; (ii) 상기 위치 또는 상대적인 위치에서 상기 분석물을 식별하자마자, 상기 분석물을 분석하고, 상기 복수의 분석물은 상기 복수의 분석물의 분석물과 상기 복수의 분석물의 다른 분석물 사이의 최소 유효 피치가 λ/(2*NA) 미만이 되게 하는 밀도로 상기 기판 상에 배치되고, 상기 λ는 광학 경로에 사용된 광의 파장이고 'NA'는 하나 이상의 카메라의 개구수이다. 일부 실시예에서, 상기 광원은 레이저를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 광원은 복수의 레이저를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 이미징 처리 모듈은 복수의 초해상도 이미지를 생성하도록 구성된다. 일부 실시예에서, 상기 스캐닝 미러의 복수의 움직임은 상기 위치 처리 모듈의 상기 복수의 계산으로부터 생성된다. 일부 실시예에서, 상기 복수의 계산은 상기 스테이지의 속도 측정 또는 위치 측정의 함수이다. 일부 실시예에서, 상기 위치 처리 모듈은 상기 복수의 계산을 파형으로 출력하도록 구성된다. 일부 실시예에서, 상기 기판은 복수의 필드를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 인코더는: 상기 기판 상에 변위된 상기 복수의 분석물들 중 상기 분석물의 상기 위치 또는 상기 기판 상에 변위된 다른 분석물에 대한 상기 기판 상에 변위된 상기 분석물의 상기 상대적인 위치에 대한 하나 이상의 보정 값을 생성하고; 상기 파형에 상기 하나 이상의 보정 값을 적용하도록 구성된다. 일부 실시예에서, 상기 스캐닝 미러는 상기 복수의 필드 중 하나의 필드의 스캔을 완료하자마자 원래의 위치로 이동하고 상기 복수의 필드 중 후속 필드의 스캔을 시작하도록 구성된다. 일부 실시예에서, 상기 광원은 약 400 내지 800 나노미터의 파장을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 인코더는 상기 스테이지의 상기 복수의 움직임에 기초하여 복수의 인코더 카운트를 수행하도록 구성된다. 일부 실시예에서, 상기 인코더는 상기 복수의 인코더 카운트로부터 신호 주기를 생성하도록 구성된다. 일부 실시예에서, 상기 인코더 카운트는 약 0.05 마이크로미터 내지 약 30 마이크로미터의 거리에 위치한다. 일부 실시예에서, 상기 인코더는 512 나노미터에서 상기 복수의 인코더 카운트로부터 신호 주기를 생성한다. 일부 실시예에서, 상기 기판은 복수의 정의된 레인을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 복수의 정의된 레인의 레인은 복수의 열을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 복수의 초해상도 이미지는 약 10 내지 약 40 나노미터 미만의 블러를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 블러는 초당 약 20 내지 약 150 프레임의 프레임 레이트에서 생성된다. 일부 실시예에서, 상기 복수의 분석물은 상기 이미징 시스템의 회절 한계 또는 λ/(2*NA) 미만의 중심 대 중심 간격으로 상기 기판 상에 배치된다. 일부 실시예에서, 상기 복수의 계산은 즉각적인 계산을 포함한다.
본 명세서에 개시된 다른 태양은 전술한 실시예들 중 어느 하나의 시스템을 이용하여 이동 기판 상의 복수의 필드를 이미징하는 방법을 제공한다.
본 명세서에 개시된 다른 태양은 이동 기판을 이미징하는 방법으로서, 상기 이동 기판은 복수의 필드를 포함하고, 다음을 포함하는 상기 이동 기판을 이미징하는 방법을 개시한다: 스테이지 상에 상기 기판을 배치하는 단계 - 상기 스테이지는 광원에 인접한 정의된 경로를 따라 이동하도록 구성됨 -; 상기 스테이지에 기계적으로 작동 가능하게 연결된 인코더로부터 위치 정보를 수신하도록 위치 처리 모듈을 구성하는 단계 - 상기 위치 처리 모듈은 상기 스테이지에 대한 복수의 위치에 대해 복수의 계산을 더 수행하도록 구성됨 -; 상기 스테이지에 대한 상기 위치의 상기 복수의 계산을 수신하기 위해 상기 위치 처리 모듈에 작동 가능하게 결합된 상기 정의된 경로에 인접한 축에 결합된 스캐닝 미러를 구성하는 단계; 및 하나 이상의 카메라로 상기 복수의 필드 중 적어도 하나의 필드를 이미징하는 단계. 일부 실시예에서, 상기 방법의 일부는 동기적으로 수행된다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 상기 기판 상에 변위된 복수의 분석물들 중 분석물의 위치 또는 상기 기판 상에서 변위된 다른 분석물에 대한 상기 기판 상에 변위된 분석물의 상대적인 위치를 식별하도록 복수의 이미지를 처리하여 이미징 알고리즘을 사용하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 복수의 분석물은 상기 복수의 분석물의 분석물과 상기 복수의 분석물의 다른 분석물 사이의 최소 유효 피치가 λ/(2*NA) 미만이 되게 하는 밀도로 상기 기판 상에 배치되고, 상기 λ는 광학 경로에 사용된 광의 파장이고 'NA'는 상기 광학 이미징 모듈의 개구수이다. 일부 실시예에서, 상기 스캐닝 미러의 복수의 움직임은 상기 위치 처리 모듈의 상기 복수의 계산으로부터 생성된다. 일부 실시예에서, 상기 복수의 계산은 상기 스테이지의 속도 측정 또는 위치 측정의 함수이다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 파형으로 상기 복수의 계산을 출력하도록 상기 위치 처리 모듈을 구성하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 상기 위치 처리 모듈이: 상기 기판 상에서 변위된 상기 복수의 분석물들 중 상기 분석물의 상기 위치 또는 상기 기판 상에서 변위된 다른 분석물에 대한 상기 기판 상에서 변위된 상기 분석물의 상기 상대적인 위치에 대한 하나 이상의 보정 값을 생성하고; 상기 파형에 상기 하나 이상의 보정 값을 적용하도록 구성하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 상기 스캐닝 미러가 상기 복수의 필드 중 하나의 필드의 스캔을 완료하자마자 원래의 위치로 이동하고 상기 복수의 필드 중 후속 필드의 스캔을 시작하도록 구성하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 복수의 인코더 카운트로부터 신호 주기를 생성하도록 상기 인코더를 구성하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 인코더 카운트는 약 0.05 마이크로미터 내지 약 30 마이크로미터의 거리에 위치한다. 일부 실시예에서, 상기 인코더는 512 나노미터에서 상기 복수의 인코더 카운트로부터 신호 주기를 생성한다. 일부 실시예에서, 상기 복수의 이미지 중 하나의 이미지는 약 10 내지 약 40 나노미터 미만의 블러를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 블러는 초당 약 20 내지 약 150 프레임의 프레임 레이트에서 생성된다.
전술한 및 다른 목적, 특징 및 이점은 첨부 도면에 도시된 바와 같이 본 발명의 특정 실시예에 대한 다음의 설명으로부터 명백할 것이며, 여기서 동일한 참조 부호는 상이한 도면 전체에 걸쳐 동일한 부분을 지칭한다. 도면은 반드시 축척에 맞춰진 것은 아니며, 대신에 본 발명의 다양한 실시예들의 원리를 설명하기 위해 중점을 둔다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 가속 추적 미러 및 속도 추적 미러(즉, 이중 미러 실시예)를 포함하는 검출기에서 기판으로부터 광학적 경로를 따르는 광학적 스캐닝 장치의 구성요소의 도면이다.
도 2는 일 실시예에 따른 속도 추적 미러와 같이, 이동하는 스테이지 추적 미러의 모션을 제어하기 위한 톱니파형 및 시간에 따른 축을 따라 이동식 스테이지의 위치 변화에 대한 상관 관계를 표현한다.
도 3은 측정되거나 예상되는 스테이지 속도 오차 및 예상되는 스테이지 속도에 기초하여 이동 기판의 이미지를 안정화하기 위해 속도 추적 미러 및 가속도 추적 미러(이중 미러 실시예에서)에 대한 구동 신호를 생성하기 위해 사용될 수 있는 파형들의 예시를 제공한다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따른 단일 모션 추적 미러(즉, 단일 미러 실시예)를 포함하는 검출기에서 기판으로부터 광학 경로를 따르는 광학 스캐닝 장치의 구성요소의 도면이다.
도 5는 측정되거나 예상되는 스테이지 속도 오차 및 예상되는 스테이지 속도에 기초하여 이동 기판의 이미지를 안정화하기 위해 모션 추적 미러(단일 미러 실시예에서)에 대한 구동 신호를 생성하기 위해 사용될 수 있는 파형들의 예시를 제공한다.
도 6은 기판 또는 이동식 스테이지의 속도 변동에 응답하여 이동식 장치의 미러에 제공된 구동 신호를 조정하기 위한 보정 항을 제공하기 위해 필드 레벨 피드포워드 메커니즘(field level feed-forward mechanism) 중 가능한 하나의 구현의 개략도를 제공한다.
도 7a 및 도 7b는 위치 처리 모듈의 구성요소 및 조정 가능한 추적 미러(들)와 기판 또는 이동식 스테이지 위치 감지 장치를 포함하는, 장치의 특정 구성요소에 대한 연결의 도면이다. 연결은 화살표로 표시된다. 실선 화살표는 위치 처리 모듈에서 각 구성 요소로 전송된 신호를 나타낸다. 점선 화살표는 스테이지 또는 기판의 속도 변동의 측정 및 가속 또는 모션 추적 미러에 작동 가능하게 연결된 모터를 제어하는 구동 신호로의 변환을 위한 경로를 나타낸다. 파선 화살표는 광학 스캐닝 시스템의 구성 요소 사이의 광학 경로를 따르는 광의 움직임을 나타낸다. 도 7a는 이중 미러 실시예와 관련된 반면, 도 7b는 단일 미러 실시예와 관련된다.
도 8a는 이동 기판의 필드의 안정화된 이미지를 캡처하기 위해 장치의 이중 추적 미러 실시예를 작동하는 방법의 흐름도를 제공한다.
도 8b는 이동 기판의 필드의 안정화된 이미지를 캡처하기 위해 장치의 단일 추적 미러 실시예를 작동하는 방법의 흐름도를 제공한다.
도 9a 및 9b는 각각 +1 및 +2의 이미지의 픽셀 스미어(smear)의 예시를 예시한다. 각 사각형은 픽셀을 나타낸다.
도 10은 시스템으로부터 데이터를 제어하고 저장하기 위한 구성요소를 포함하는, 광학 스캐닝 시스템의 실시예를 도시한다.
도 11은 어레이 피치(pitch) 대 시퀀서 처리량를 도시하고 $10 게놈에 필요한 기준을 충족하는 시스템 설계의 개요를 설명한다.
도 12a는 저비용 시퀀싱을 위한 240nm 피치 상의 80nm 직경의 결합 영역(스팟)의 고밀도 영역의 제안된 실시예를 도시한다.
도 12b는 제안된 기판 밀도와 $1,000 게놈에 사용된 샘플 유효 밀도를 비교한 것이다.
도 13은 2Х 필터로 처리된 600nm 피치에서 시뮬레이션 된 단일 분자에 대한 크로스토크(crosstalk) 계산을 도시한다.
도 14는 600 nm, 400 nm 및 300 nm의 중심 간 거리에서 기판 상의 단일 분자 분석 물질 검출 이미지의 2X 오버샘플링 (좌측) 대 4X오버샘플링 및 디컨볼루션(우측쪽) 시뮬레이션을 도시한다.
도 15는 2X 오버샘플링 대 4X 오버샘플링 및 디컨볼루션 된 시뮬레이션을 사용하여 처리된 단일 분석물(어레이 피치 (nm)) 사이의 서로 다른 중심 간 거리에서 인접 지점 간의 크로스토크의 플롯을 도시한다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따라, 기판 상의 분석물의 상대적인 위치를 높은 정확도로 결정하는 방법에 대한 흐름도를 도시한다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른, 기판으로부터 검출된 디컨볼루션 된 광 신호로부터 개별 분석물을 식별하는 방법에 대한 흐름도를 도시한다.
도 18은 본 발명의 구현예에 따른, 기판 상에 고정된 폴리뉴클레오티드를 시퀀싱하는 방법에 대한 흐름도를 도시한다.
도 19는 본 발명의 일 실시예에 따른, 순환 검출로부터 광 신호 검출 프로세스 내 단계들의 개요를 도시한다.
도 20a는 본 발명의 일 실시예에 따른, 초기 원시 이미지 분석에 대한 단계들의 흐름도를 도시한다.
도 20b는 본 발명의 일 실시예에 따른, 복수의 사이클로부터의 광 신호 피크 정보로부터 위치 결정을 위한 단계들의 흐름도를 도시한다.
도 20c는 본 발명의 일 실시예에 따른, 정확한 상대적인 위치 정보 및 이미지 디컨볼루션 알고리즘을 사용하여 이미지로부터 중첩된 광학 신호를 식별하기 위한 단계들의 흐름도를 도시한다.
도 21은 본 발명의 일 실시예에 따른, 밀집하게 패킹된 기판의 순환 검출에서의 이미지에 대한 광 신호 검출 및 디컨볼루션 프로세스를 위한 단계의 상세한 흐름도를 도시한다.
도 22a는 원시 이미지로부터 검출된 광학 신호로부터의 네 개의 형광단 사이의 형광단 강도의 크로스토크 플롯을 도시한다.
도 22b는 4Х 오버샘플링 된 이미지로부터 네 개의 형광단 사이의 형광단 강도의 크로스토크 플롯을 도시한다.
도 23a는 4Х 오버샘플링 된 이미지로부터의 네 개의 형광단 사이의 형광단 강도의 크로스토크 플롯을 도시한다.
도 23b는 동일한 이미징 영역에 대한 크로스토크 플롯을 도시하나, 도 11에 도시되고 본 명세서에서 설명된 바와 같이 디컨볼루션 및 최근접 이웃 회귀로 수행된다.
도 24a는 약 315 nm의 분석물 사이의 중심 간 거리에서 필드의 원시 이미지의 시뮬레이션 된 4색 합성물을 도시한다.
도 24b는 약 315 nm의 분석물 사이의 중심 간 거리에서 디컨볼루션 된 이미지의 시뮬레이션 된 4색 합성물을 도시한다.
도 25a는 동일한 양의 돌연변이 및 야생형(Wild Type; WT) 표적을 함유하는 EGFR 유전자 내 코돈(790) 주변 영역에 해당하는 합성 올리고뉴클레오티드 주형의 1:1 혼합물의 시퀀싱 결과를 도시한다.
도 25b는 염기 혼입 및 절단 사이클이 교대하는 이미지를 도시한다.
도 26은 기판에 고정되고 본 명세서에 설명된 시스템 및 방법에 의해 생성된 형광단을 포함하는 프로브에 의해 결합된 단일 분자의 이미지이다.
도 27, 우측 패널은, 기판(피크의 군집)에 여러 분석물에서 중첩된 각 사이클로부터 필드의 오버샘플링 된 이미지로부터 피크를 도시한다. 좌측 패널은 상대적인 위치 정보를 나타내는 매우 정확한 피크로 복수의 사이클에 걸쳐 분석물로부터 피크의 가우스 분포(Gaussian distribution)를 요약한, 우측 패널에 대해 평활화 된 버전이다.
도 28은 필드에서 발견되는 복수의 분자 각각에 대한 위치 변화를 도시한다. 미디안(median) 로컬라이제이션(localization) 분산은 5 nm이고 3 시그마(3 sigma) 로컬라이제이션 분산은 10 nm 미만이다.
도 29는 고속 스캐닝 이미지가 스텝 및 슛 매핑 밀도에 필적하는 매핑 밀도를 산출함을 입증하는 예시 1의 실험으로부터 획득된 예시적인 데이터를 도시한다.
도 30은 고속 스캐닝 이미지가 스텝 및 슛 매핑 밀도에 필적하는 매핑 밀도를 산출함을 입증하는 예시 1의 실험으로부터 획득된 예시 데이터를 도시한다. 데이터는 고속 스캐닝 필드가 매핑된 스텝 및 슛 필드의 95% 이상을 포함하고 있음을 도시한다.
도 31a는 본 명세서에 기술된 시스템("HSS": High Speed Scanning) 및 기존 시스템("SnS": Step and Shoot) 모두에 대해 유체 공동 내 모든 필드를 걸쳐 측정된 평균 분석물 밀도(분석물/μm2)를 도시한다. 박스의 중앙의 선은 분포의 중앙값이다. 박스는 데이터 포인트의 1/2을 포함하고 박스는 중앙값(선)의 중앙에 있다. 위스커(whisker)는 데이터 포인트의 10% 표시와 90% 표시를 도시한다.
도 31b는 본 명세서에 설명된 시스템("HSS") 및 기존 시스템("SnS") 모두에 대해 유체 공동의 모든 필드에 걸쳐 측정된 평균 분석물 밀도(분석물/μm2)를 도시한다. 박스의 중앙의 선은 분포의 중앙값이다박스는 데이터 포인트의 1/2을 포함하고 박스는 중앙값(선)의 중앙에 있다. 위스커는 데이터 포인트의 10% 표시 및 90% 표시를 도시한다.
도 31c는 본 명세서에 기술된 시스템("HSS") 및 기존 시스템("SnS") 모두에 대해 이미징 된 수많은 필드에 대한 함수로서 평균 분석물 밀도를 도시한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 가속 추적 미러 및 속도 추적 미러(즉, 이중 미러 실시예)를 포함하는 검출기에서 기판으로부터 광학적 경로를 따르는 광학적 스캐닝 장치의 구성요소의 도면이다.
도 2는 일 실시예에 따른 속도 추적 미러와 같이, 이동하는 스테이지 추적 미러의 모션을 제어하기 위한 톱니파형 및 시간에 따른 축을 따라 이동식 스테이지의 위치 변화에 대한 상관 관계를 표현한다.
도 3은 측정되거나 예상되는 스테이지 속도 오차 및 예상되는 스테이지 속도에 기초하여 이동 기판의 이미지를 안정화하기 위해 속도 추적 미러 및 가속도 추적 미러(이중 미러 실시예에서)에 대한 구동 신호를 생성하기 위해 사용될 수 있는 파형들의 예시를 제공한다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따른 단일 모션 추적 미러(즉, 단일 미러 실시예)를 포함하는 검출기에서 기판으로부터 광학 경로를 따르는 광학 스캐닝 장치의 구성요소의 도면이다.
도 5는 측정되거나 예상되는 스테이지 속도 오차 및 예상되는 스테이지 속도에 기초하여 이동 기판의 이미지를 안정화하기 위해 모션 추적 미러(단일 미러 실시예에서)에 대한 구동 신호를 생성하기 위해 사용될 수 있는 파형들의 예시를 제공한다.
도 6은 기판 또는 이동식 스테이지의 속도 변동에 응답하여 이동식 장치의 미러에 제공된 구동 신호를 조정하기 위한 보정 항을 제공하기 위해 필드 레벨 피드포워드 메커니즘(field level feed-forward mechanism) 중 가능한 하나의 구현의 개략도를 제공한다.
도 7a 및 도 7b는 위치 처리 모듈의 구성요소 및 조정 가능한 추적 미러(들)와 기판 또는 이동식 스테이지 위치 감지 장치를 포함하는, 장치의 특정 구성요소에 대한 연결의 도면이다. 연결은 화살표로 표시된다. 실선 화살표는 위치 처리 모듈에서 각 구성 요소로 전송된 신호를 나타낸다. 점선 화살표는 스테이지 또는 기판의 속도 변동의 측정 및 가속 또는 모션 추적 미러에 작동 가능하게 연결된 모터를 제어하는 구동 신호로의 변환을 위한 경로를 나타낸다. 파선 화살표는 광학 스캐닝 시스템의 구성 요소 사이의 광학 경로를 따르는 광의 움직임을 나타낸다. 도 7a는 이중 미러 실시예와 관련된 반면, 도 7b는 단일 미러 실시예와 관련된다.
도 8a는 이동 기판의 필드의 안정화된 이미지를 캡처하기 위해 장치의 이중 추적 미러 실시예를 작동하는 방법의 흐름도를 제공한다.
도 8b는 이동 기판의 필드의 안정화된 이미지를 캡처하기 위해 장치의 단일 추적 미러 실시예를 작동하는 방법의 흐름도를 제공한다.
도 9a 및 9b는 각각 +1 및 +2의 이미지의 픽셀 스미어(smear)의 예시를 예시한다. 각 사각형은 픽셀을 나타낸다.
도 10은 시스템으로부터 데이터를 제어하고 저장하기 위한 구성요소를 포함하는, 광학 스캐닝 시스템의 실시예를 도시한다.
도 11은 어레이 피치(pitch) 대 시퀀서 처리량를 도시하고 $10 게놈에 필요한 기준을 충족하는 시스템 설계의 개요를 설명한다.
도 12a는 저비용 시퀀싱을 위한 240nm 피치 상의 80nm 직경의 결합 영역(스팟)의 고밀도 영역의 제안된 실시예를 도시한다.
도 12b는 제안된 기판 밀도와 $1,000 게놈에 사용된 샘플 유효 밀도를 비교한 것이다.
도 13은 2Х 필터로 처리된 600nm 피치에서 시뮬레이션 된 단일 분자에 대한 크로스토크(crosstalk) 계산을 도시한다.
도 14는 600 nm, 400 nm 및 300 nm의 중심 간 거리에서 기판 상의 단일 분자 분석 물질 검출 이미지의 2X 오버샘플링 (좌측) 대 4X오버샘플링 및 디컨볼루션(우측쪽) 시뮬레이션을 도시한다.
도 15는 2X 오버샘플링 대 4X 오버샘플링 및 디컨볼루션 된 시뮬레이션을 사용하여 처리된 단일 분석물(어레이 피치 (nm)) 사이의 서로 다른 중심 간 거리에서 인접 지점 간의 크로스토크의 플롯을 도시한다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따라, 기판 상의 분석물의 상대적인 위치를 높은 정확도로 결정하는 방법에 대한 흐름도를 도시한다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른, 기판으로부터 검출된 디컨볼루션 된 광 신호로부터 개별 분석물을 식별하는 방법에 대한 흐름도를 도시한다.
도 18은 본 발명의 구현예에 따른, 기판 상에 고정된 폴리뉴클레오티드를 시퀀싱하는 방법에 대한 흐름도를 도시한다.
도 19는 본 발명의 일 실시예에 따른, 순환 검출로부터 광 신호 검출 프로세스 내 단계들의 개요를 도시한다.
도 20a는 본 발명의 일 실시예에 따른, 초기 원시 이미지 분석에 대한 단계들의 흐름도를 도시한다.
도 20b는 본 발명의 일 실시예에 따른, 복수의 사이클로부터의 광 신호 피크 정보로부터 위치 결정을 위한 단계들의 흐름도를 도시한다.
도 20c는 본 발명의 일 실시예에 따른, 정확한 상대적인 위치 정보 및 이미지 디컨볼루션 알고리즘을 사용하여 이미지로부터 중첩된 광학 신호를 식별하기 위한 단계들의 흐름도를 도시한다.
도 21은 본 발명의 일 실시예에 따른, 밀집하게 패킹된 기판의 순환 검출에서의 이미지에 대한 광 신호 검출 및 디컨볼루션 프로세스를 위한 단계의 상세한 흐름도를 도시한다.
도 22a는 원시 이미지로부터 검출된 광학 신호로부터의 네 개의 형광단 사이의 형광단 강도의 크로스토크 플롯을 도시한다.
도 22b는 4Х 오버샘플링 된 이미지로부터 네 개의 형광단 사이의 형광단 강도의 크로스토크 플롯을 도시한다.
도 23a는 4Х 오버샘플링 된 이미지로부터의 네 개의 형광단 사이의 형광단 강도의 크로스토크 플롯을 도시한다.
도 23b는 동일한 이미징 영역에 대한 크로스토크 플롯을 도시하나, 도 11에 도시되고 본 명세서에서 설명된 바와 같이 디컨볼루션 및 최근접 이웃 회귀로 수행된다.
도 24a는 약 315 nm의 분석물 사이의 중심 간 거리에서 필드의 원시 이미지의 시뮬레이션 된 4색 합성물을 도시한다.
도 24b는 약 315 nm의 분석물 사이의 중심 간 거리에서 디컨볼루션 된 이미지의 시뮬레이션 된 4색 합성물을 도시한다.
도 25a는 동일한 양의 돌연변이 및 야생형(Wild Type; WT) 표적을 함유하는 EGFR 유전자 내 코돈(790) 주변 영역에 해당하는 합성 올리고뉴클레오티드 주형의 1:1 혼합물의 시퀀싱 결과를 도시한다.
도 25b는 염기 혼입 및 절단 사이클이 교대하는 이미지를 도시한다.
도 26은 기판에 고정되고 본 명세서에 설명된 시스템 및 방법에 의해 생성된 형광단을 포함하는 프로브에 의해 결합된 단일 분자의 이미지이다.
도 27, 우측 패널은, 기판(피크의 군집)에 여러 분석물에서 중첩된 각 사이클로부터 필드의 오버샘플링 된 이미지로부터 피크를 도시한다. 좌측 패널은 상대적인 위치 정보를 나타내는 매우 정확한 피크로 복수의 사이클에 걸쳐 분석물로부터 피크의 가우스 분포(Gaussian distribution)를 요약한, 우측 패널에 대해 평활화 된 버전이다.
도 28은 필드에서 발견되는 복수의 분자 각각에 대한 위치 변화를 도시한다. 미디안(median) 로컬라이제이션(localization) 분산은 5 nm이고 3 시그마(3 sigma) 로컬라이제이션 분산은 10 nm 미만이다.
도 29는 고속 스캐닝 이미지가 스텝 및 슛 매핑 밀도에 필적하는 매핑 밀도를 산출함을 입증하는 예시 1의 실험으로부터 획득된 예시적인 데이터를 도시한다.
도 30은 고속 스캐닝 이미지가 스텝 및 슛 매핑 밀도에 필적하는 매핑 밀도를 산출함을 입증하는 예시 1의 실험으로부터 획득된 예시 데이터를 도시한다. 데이터는 고속 스캐닝 필드가 매핑된 스텝 및 슛 필드의 95% 이상을 포함하고 있음을 도시한다.
도 31a는 본 명세서에 기술된 시스템("HSS": High Speed Scanning) 및 기존 시스템("SnS": Step and Shoot) 모두에 대해 유체 공동 내 모든 필드를 걸쳐 측정된 평균 분석물 밀도(분석물/μm2)를 도시한다. 박스의 중앙의 선은 분포의 중앙값이다. 박스는 데이터 포인트의 1/2을 포함하고 박스는 중앙값(선)의 중앙에 있다. 위스커(whisker)는 데이터 포인트의 10% 표시와 90% 표시를 도시한다.
도 31b는 본 명세서에 설명된 시스템("HSS") 및 기존 시스템("SnS") 모두에 대해 유체 공동의 모든 필드에 걸쳐 측정된 평균 분석물 밀도(분석물/μm2)를 도시한다. 박스의 중앙의 선은 분포의 중앙값이다박스는 데이터 포인트의 1/2을 포함하고 박스는 중앙값(선)의 중앙에 있다. 위스커는 데이터 포인트의 10% 표시 및 90% 표시를 도시한다.
도 31c는 본 명세서에 기술된 시스템("HSS") 및 기존 시스템("SnS") 모두에 대해 이미징 된 수많은 필드에 대한 함수로서 평균 분석물 밀도를 도시한다.
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허, 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 표시된 것처럼, 동일한 정도로 참조로서 본 명세서에 포함된다. 본 명세서는 참조로 포함된 간행물 및 특허 또는 특허 출원은 본 명세서에 포함된 개시 내용과 모순되는 범위 내에서, 그러한 모순되는 자료를 대체 및/또는 우선하기 위한 것이다.
본 발명의 다양한 실시예가 본 명세서에 도시되고 설명되었으나, 그러한 실시예들은 예시의 수단으로 제공됨이 본 발명의 기술분야에 속한 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 수많은 변형, 변경 및 대체들은 본 발명을 벗어남이 없이 본 발명의 기술분야에 속한 통상의 기술자에게 발생할 수 있다. 본 명세서에 설명된 본 발명의 실시예에 대한 다양한 대안이 사용될 수 있음이 이해되어야 한다.
본 발명의 다양한 실시예의 세부사항은 후술된다. 본 발명의 다른 특징, 목적 및 이점은 상세한 설명과 도면, 및 청구범위로부터 명백해질 것이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "대물 렌즈"는 하나 이상의 렌즈를 포함하고, 전자기(예: 광학과 같은) 신호를 확대하도록 구성되고 작동하는, 광학적 스캐닝 시스템 내, 하나의 요소 또는 요소들의 그룹을 의미한다. 일부 실시예에서, 대물 렌즈는 0.6 내지 1.5 범위의 NA(Numerical Aperture; 개구수)와 같은, 큰 개구수(NA)를 갖고 공기 침지 또는 액체 침지(예: 물, 오일 또는 기타 침지 유체)를 통해 이미징을 수행한다. 다양한 실시예에서, 대물 렌즈는 2mm내지 25mm 범위의 초점 거리를 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "기판"은 이미징을 위한 표적인 다수의 별개의 피처를 갖는 물체를 나타낸다. 이러한 피처들은 공간적으로 균일한 패턴으로 배열되거나 배열되지 않을 수 있다. 예를 들어, 일부 실시예에서 기판은 표적 생체분자가 표적 피처로서 부착된, 비드(bead) 또는 웰(well)과 같이, 표면이 있는 비평면 구조를 포함한다. 다른 예에서, 일부 실시예에서 기판은 어레이 칩을 포함한다. 어레이 칩(즉, 어레이, 마이크로어레이 또는 칩)은 표면이 있는 고체상 지지체를 의미하고, 바람직하게는 평면 또는 실질적으로 평면 표면으로 표적 생체분자(예: 단백질 또는 핵산과 같은)이 표적 피처로 부착된 부착 부위를 운반한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "레인"은 분석물 프로브 결합을 포함하는, 검출 가능한 이벤트를 포함하는 기판의 일부를 의미하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "필드"는 카메라에 의해 단일 이미지 내에서 캡처될 수 있는 기판의 영역을 의미한다. 기판의 필드는 카메라의 시야와 관련이 있다. 전체 기판은 기판 상에 복수의 필드의 이미지들을 촬영함으로써 스캔될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "광학 경로" 또는 "광 경로"는 광원에서 카메라 센서까지의 광 또는 기타 전자기 복사의 경로를 의미한다. 광학 경로를 따른 미러에 의한 광학 경로의 조작은 무작위 또는 체계적인 속도 변동으로 연속적으로 움직이는 기판으로부터 정지 이미지(still image)의 캡처를 가능하게 한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "스캐닝"은 기판의 상태를 관찰하고 기록하는 작업을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "초해상도"는 이미징 시스템의 회절 한계보다 작은 간격으로 배치된 피처들을 나타낸다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "속도 추적 미러"은 속도로 기판의 움직임을 추적하도록 구성된 미러를 의미한다. 이러한 속도는 고정되거나 가변적일 수 있다. 속도는 기 결정될 수 있거나, 속도의 시스템적 또는 무작위적 오류를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "속도 추적 오류"는 속도 추적 미러에 의한 기판 또는 스테이지 속도의 추적 오류를 의미한다. 일부 실시예에서, 이는 속도 추적 미러에 의해 추적되는 속도로부터 기판의 속도의 편차의 결과이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "가속 추적 미러"은 스테이지 속도의 시스템적 또는 무작위적 오류, 또는 예상 또는 일정한 스테이지 속도로부터의 기타 편차와 같은, 비선형성에 응답하여 회전하도록 광학 스캐닝 시스템에 작동 가능하게 연결된 미러를 의미한다. 일부 실시예에서, 가속도 추적 미러는 속도 추적 미러와 쌍을 이루어 픽셀 스미어(smear)가 감소된 이동 기판의 정지 이미지를 제공한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "전기 모터"는 전기 에너지에 응답하여 회전하는 모터와 같이, 전기 신호를 물리적 움직임으로 변환하는 장치를 의미한다. 일부 실시예에서, 전기 모터는 속도 추적 미러 또는 가속도 추적 미러를 회전시키기 위한 회전 메커니즘을 제공한다. 전기 모터는 전기 모터의 제어된 움직임에 영향을 미치기 위해 전기 신호 또는 구동 신호를 보내는 위치 처리 모듈에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 전기 모터는 검류계 또는 압전 액추에이터일 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "검류계"는 전기 신호에 응답하여 이동하는 자기장의 코일을 의미한다. 이는 추적 미러의 회전 운동을 작동시키는 전기 모터로 작동할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "압전 액추에이터"는 전기장을 인가했을 때 압전 물질의 형태 변화에 따른 전동기의 일종을 의미한다. 본 명세서에서 전기 모터는 바람직한 실시예로 언급되나, 유압, 공압, 또는 자기 원리에 기초한 것과 같이, 본 명세서에 설명된 본 발명의 일부의 구성요소의 작동을 제공하는 다른 장치 또한 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "위치 처리 모듈"은 광학 스캐닝 시스템의 구성 요소에 대한 제어를 제공하는 장치의 하나 이상의 구성 요소를 의미한다. 특히, 위치 처리 모듈은 하나 이상의 추적 미러에 작동 가능하게 연결된 전기 모터의 움직임을 제어하는 장치를 포함한다. 따라서 위치 처리 모듈은 이러한 전기 모터에 구동 신호를 생성하고 전송한다. 구동 신호는 미리 프로그래밍 되거나 관찰된 스테이지 또는 기판 모션으로부터 생성될 수 있다. 구동 신호는 인코더와 같은 위치 또는 속도 센서에 의해 수집된 정보로부터 생성될 수 있고, 하나 이상의 추적 미러의 움직임을 제어하기 위해 응답 구동 신호로 변환되는 속도 측정치를 생성하기 위해 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "전기 신호" 또는 "구동 신호"는 모터를 물리적 움직임으로 바꾸는 전기 모터에 전송되는 제어된 에너지 양을 의미한다. 예를 들어, 검류계는 이동식 스테이지를 추적하고 톱니파와 유사한 구동 신호를 전송하여 이미징이 완료된 후 원래 위치로 돌아가도록 미러를 회전시킬 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "듀티 사이클"은 추적 미러가 스테이지를 추적하고 카메라가 필드를 이미징하는 시간의 퍼센트를 의미한다(추적 미러가 초기 위치로 돌아가는 플라이백 시간과 반대).
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "이미징 주파수" 또는 "이미지 캡처 주파수"는 기판 상의 필드의 이미지 캡처의 빈도를 의미한다
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "픽셀 스미어"는 이미지 캡처 동안 이미지화 된 물체의 이동으로 인해 축을 따라 픽셀이 퍼지는 정도를 나타낸다. 많은 양의 픽셀 스미어는 덜 선명하고 더 많은 양의 블러 효과가 있는 이미지를 생성할 것이다. 일부 실시예에서, 픽셀 스미어는 광학 경로 또는 하나 이상의 추적 미러의 움직임에서 보상되지 않는 속도 변동으로 인해 생성된다. 본 명세서에, 일부 실시예에서, 속도 변동이 있는 이동식 스테이지에서 연속적으로 이동 기판의 이미지를 캡처하는 장치 및 방법이 제공되고 상기 기판의 이동의 주요 축을 따른 픽셀 스미어의 양은 광학 경로를 따른 하나 이상의 추적 미러의 회전에 의해 완화된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "로직"은 하나 이상의 컴퓨팅 장치의 하나 이상의 프로세서(예: CPU)에 의해 실행될 때 하나 이상의 기능 및/또는 하나 이상의 결과 또는 다른 논리 요소 및/또는 기계 장치(예: 서보(servo) 등)의 작동을 제어하는 요소에 의해 사용되는 입력 데이터의 형태로 데이터를 반환한다. 다양한 실시예 및 구현들에서, 임의의 주어진 로직은 하나 이상의 프로세서(예: CPU)에 의해 실행 가능한 하나 이상의 소프트웨어 구성요소로 구현될 수 있고, ASIC(Application-Specific Integrated Circuits; 특정 용도용 집적 회로) 및/또는 FPGA(Field-Programmable Gate Arrays; 필드 프로그래머블 게이트 어레이)와 같은 하나 이상의 하드웨어 구성 요소 또는 하나 이상의 소프트웨어 구성 요소와 하나 이상의 하드웨어 구성 요소의 조합으로 사용된다. 특정 논리의 소프트웨어 구성 요소는, 제한 없이, 독립 실행형 소프트웨어 응용 프로그램으로, 클라이언트-서버 시스템에서 클라이언트로, 클라이언트-서버 시스템에서 서버로, 하나 이상의 소프트웨어 모듈, 하나 이상의 라이브러리의 함수, 하나 이상의 정적 및/또는 동적으로 연결된 라이브러리로 구현될 수 있다. 실행하는 동안, 특정 논리의 명령은 하나 이상의 컴퓨터 프로세스, 스레드, 파이버, 및 하나 이상의 컴퓨팅 장치의 하드웨어에서 인스턴스화 될 수 있고 제한 없이, 메모리, CPU 시간, 저장 공간 및 네트워크 대역폭을 포함할 수 있는, 컴퓨팅 리소스가 할당될 수 있는 임의의 다른 적절한 런타임 엔티티로 구현될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 중심 간 거리는 기판 상의 각 분자의 평균 위치의 차이에 의해 측정된 두 개의 인접한 분자 사이의 거리를 의미한다. 용어 평균 최소 중심 간 거리는 특히 기판에 배치된 각 분석물의 중심과 가장 가까이 이웃한 분석물의 중심 사이의 평균 거리를 의미하기는 하지만, 용어 중심 간 거리도 또한 기판 상의 분석물의 밀도에 해당하는 컨텍스트의 한계 내 최소 중심 간 거리를 의미한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "피치(pitch)" 또는 "평균 유효 피치"는 일반적으로 평균 최소 중심 간 거리를 나타내는 데 사용된다. 분석물의 규칙적인 어레이의 컨텍스트에서, 피치는 정의된 축을 따라 인접한 분자 사이의 중심 간 거리를 결정하기 위해 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "오버레이"(예: 이미지 오버레이)는 복수의 사이클에 걸쳐 각 분석물로부터 검출된 광학 신호(예: 위치 및 강도, 피크 위치)의 분포를 생성하기 위해 상이한 사이클로부터 이미지를 오버레이하는 것을 의미한다. 이러한 검출된 광학 신호의 분포는 이미지를 오버레이하거나, 인위적으로 처리된 이미지를 오버레이하거나, 위치 정보를 포함하기 위해 데이터셋을 오버레이하여 생성될 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "오버레이 이미지"는 복수의 사이클 각각에 대해 단일 분석물에 결합된 단일 프로브로부터 광학 신호에 대한 위치 정보의 분포를 생성하기 위한 이러한 메커니즘들 중 임의의 하나를 포함한다.
"사이클"은 하나 이상의 패스(pass)를 완료하고 기판에서 검출 가능한 라벨을 스트리핑(stripping)으로써 정의된다. 사이클 당 하나 이상의 패스의 후속 사이클이 수행될 수 있다. 본 명세서에 설명된 방법 및 시스템의 경우, 단일한 기판 또는 샘플에 대해 여러 사이클이 수행된다. DNA 시퀀싱의 경우, 다중 사이클은 통합된 뉴클레오티드로부터 제거 가능한 검출 가능한 라벨 및 가역적 종결자의 사용을 필요로 한다. 단백질의 경우, 다중 사이클은 프로브 제거(스트리핑) 조건이 단백질을 적절한 구성으로 접은 상태로 유지하거나 결합 효율이 단백질 접힘 구성과 독립적일 수 있도록 사용된 프로브가 펩티드 시퀀스에 결합하도록 선택되는 것이 요구된다.
검출 분석에서 "패스"는 검출 가능한 라벨을 포함하는 복수의 프로브가 결합된 분석물에 도입되어, 프로브와 별개의 표적 분석물 사이에 선택적 결합이 발생하고, 검출 가능한 라벨로부터 복수의 신호가 검출되는 프로세스를 의미한다. 패스는 표적 분석물에 특이적으로 결합하는 항체 세트의 도입을 포함한다. 패스는 또한 합성에 의한 시퀀싱 동안 성장 가닥으로의 통합을 위한 라벨링 된 뉴클레오티드의 세트의 도입을 포함할 수 있다. 기판이 검출 가능한 모든 라벨들을 제거하기 전, 또는 검출 가능한 라벨 또는 가역적 종결자가 시퀀싱 동안 통합된 뉴클레오티드로부터 제거되기 전에는 다양한 프로브의 세트에 대한 다수의 패스들이 있을 수 있다. 일반적으로, 하나의 패스 동안 네 개의 뉴클레오티드가 사용되는 경우, 사이클은 합성에 의한 표준 네 개 뉴클레오티드 시퀀싱을 위해 단일 패스로만 이루어질 것이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 이미지는 하나의 사이클 또는 사이클 내의 패스 동안 찍힌 필드의 이미지를 나타낸다. 일부 구현에서, 단일 이미지는 검출 가능한 라벨의 단일 색상의 검출로 제한된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "필드"는 이미징 되는 기판의 단일한 영역을 의미한다. 일반적인 분석 동안 단일 필드는 사이클 당 적어도 한 번 이미지화 된다. 예를 들어, 4색의, 20회의 사이클 분석의 경우, 동일한 필드 전체에서, 20*4=80 개의 이미지들이 있을 수 있다.
"표적 분석물" 또는 "분석물"은 식별, 정량화 및 다른 방법으로 특성화되어야 하는 단일 분자, 화합물, 복합체, 물질 또는 성분을 나타낸다. 표적 분석물은 예시의 방법으로, 단일 분자(임의의 분자 크기), 단일 생체분자, 폴리펩티드, 단백질(접히거나 또는 접히지 않음), 폴리뉴클레오티드 분자(RNA, cDNA 또는 DNA), 이들의 단편, 변형된 핵산, 또는 이들의 조합과 같이, 이들의 변형된 분자를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 실시예에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 합성에 의한 시퀀싱을 용이하게 하기 위해 혼성화 된 프라이머를 포함한다. 표적 분석물은 본 명세서에 설명된 광학 검출 방법을 사용하여 표적 분석물을 시퀀싱, 식별화 및 정량화하기 위해 사용될 수 있는 프로브에 의해 인식된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이 "프로브"는 다른 분자(예: 합성에 의한 시퀀싱 동안 라벨링 된 상보적인 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 전장 단백질 등), 세포적 구성 요소 또는 구조체(지질, 세포벽 등), 또는 분자의 특성을 검출하거나 평가하기 위한 세포, 세포적 구성 요소 또는 구조체 또는 세포에 결합할 수 있는 분자를 의미한다프로브는 표적 분석물에 결합하는 구조 또는 구성요소를 포함한다. 일부 실시예에서, 다중 프로브는 동일한 표적 분석물의 상이한 부분을 인식할 수 있다. 예시적인 프로브들은 라벨링 된 가역적 종결자 뉴클레오티드, 압타머, 항체, 폴리펩티드, 올리고뉴클레오티드(DNA, RNA), 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 항체, 압타머, 올리고뉴클레오티드 시퀀스 및 프로브로서 이들의 조합은 또한 자세히 후술된다.
프로브는 표적 분석물에 대한 프로브의 결합을 검출하기 위해 사용되는 검출 가능한 라벨을 포함할 수 있다. 프로브는 직접 또는 간접적으로, 표적 분석물에 결합, 혼성화, 접합, 또는 공유 결합될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 검출 가능한 라벨은 프로브가 표적 분석물에 결합되고 광학 이미징 시스템을 사용하여 이미지화 되는 경우 검출 가능한 광학 신호를 생성할 수 있는 프로브에 결합된 분자를 의미한다. 검출 가능한 라벨은 직접 또는 간접적으로 프로브에 결합, 혼성화, 접합 또는 공유 결합될 수 있다. 일부 실시예에서, 검출 가능한 라벨은 형광 분자 또는 화학발광 분자이다. 프로브는 검출 가능한 라벨을 통해 광학적으로 검출될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 광 분포 모델은 점광원으로부터 광 검출에 대한 확률의 통계적 분포를 의미한다. 이는, 예를 들어, 가우스 분포(Gaussian distribution)를 포함한다. 가우스 분포는 광학 분포 모델로서 포인트 스프레드 함수를 생성하기 위해 검출에 있어 예상 수차를 포함하도록 수정될 수 있다.
광학 스캐닝 시스템 및 방법의 사용
본 명세서에서 기판이 이동식 스테이지에서 이동하는 동안 고감도로 기판의 부분 또는 필드의 높은 프레임 레이트 이미지 캡처를 위한 시스템이 제공된다. 광학 스캐닝 시스템은 스테이지 이동을 정밀하게 제어해야 하는 무겁고 값비싼 시스템이나 더 느린 단계 및 반복 광학 스캐닝 시스템을 통해서만 제공되었던, 고속의, 단일 분자, 단일 형광 이미징이 가능하다. 본 명세서에 제공된 광학 스캐닝 시스템은 이미지(1%에서 10%까지 변하는 스테이지 속도와 적어도 몇 픽셀의 이미지 블러를 보상하는 단일 미러 또는 이중 미러 스캐닝 광학 장치를 사용하여 연속적으로 움직이는 스테이지)로서 사용될 수 있다. 이러한 보상은 0.1% 미만의 변동으로 추적된 스테이지 별 속도 또는 +/-1 픽셀 이하의 이미지의 픽셀 스미어와 같은 이미지를 초래할 수 있다. 따라서, 본 명세서에 개시된 스캐닝 광학계는 픽셀 스미어를 줄이기 위해 연속적으로 움직이는 이동식 스테이지를 이미징하는 동안 카메라에 안정화된 이미지 필드를 제공하기 위해, 이동식 스테이지 또는 기판의 국부적 가속 및 감속과 같은, 속도 오차(즉, 속도 변동)를 보상하기 위한 시스템을 제공한다.
본 명세서에서 광학 스캐닝 시스템은 고속 스캐닝을 위한 속도 추적을 위한 단일 스캐닝 미러를 포함하는 초해상도 이미징 시스템을 제공한다. 초해상도 이미징 시스템은 인코더, FPGA, 레이저 조명원, 단일 미러 또는 고속 스캐닝 광학 장치, 카메라 또는 이미지 검출 수단이 있는 샘플 스테이지를 포함할 수 있다. 어떤 경우 시스템은 두 개의 스캐닝 미러를 포함할 수 있다. 상기, 고속 스캐닝 시스템은 샘플 스테이지 모션과 동기화된 방식으로 단일 미러를 회전하기 위해 사용되는 파형을 생성하고 업데이트하기 위해 실시간 샘플 스테이지 위치 정보를 활용하고 상기 미러의 동기화된 회전은 회전 범위를 통해 상기 회전 범위의 끝까지 계속될 수 있다. 두 개의 미러 시스템을 포함하는 특정한 경우에, 고속 스캐닝 시스템은 샘플 스테이지 모션과 동기화된 방식으로 두 개의 미러를 회전시키기 위해 사용되는 파형을 생성하고 업데이트하기 위해 실시간 샘플 스테이지 위치 정보를 활용하고 상기 하나 또는 두 개 모두의 미러의 동기화된 회전은 회전 범위를 통해 상기 회전 범위의 끝까지 계속될 수 있다. 특정 예시에서, 인코더는 위치 정보를 포함할 수 있다. 이 회전 범위 동안 획득된 이미지는 정방향 스캔 이미지를 포함한다. 어떤 경우에서, 정방향 스캔이 완료된 후, 미러의 회전은 역방향 스캔, 미러 회전 범위의 시작 부분으로 역회전, 스테이지가 연속적으로 움직이는 동안 다음 필드에 대한 정방향 스캔으로 구성된다.
어떤 경우에, 초해상도 이미지는 약 10nm 미만에서 약 40nm의 블러를 포함한다. 어떤 경우에, 초해상도 이미지는 약 40 nm 내지 약 35 nm, 약 40 nm 내지 약 30 nm, 약 40 nm 내지 약 25 nm, 약 40 nm 내지 약 20 nm, 약 40 nm 내지 약 20 nm, 40 nm 내지 약 15 nm, 약 40 nm 내지 약 10 nm, 약 35 nm 내지 약 30 nm, 약 35 nm 내지 약 25 nm, 약 35 nm 내지 약 20 nm, 약 35 nm 내지 약 15 nm, 약 35 nm 약 10 nm 내지 약 30 nm 내지 약 25 nm, 약 30 nm 내지 약 20 nm, 약 30 nm 내지 약 15 nm, 약 30 nm 내지 약 10 nm, 약 25 nm 내지 약 20 nm, 약 25 nm 내지 약 15 nm, 약 25 nm 내지 약 10 nm, 약 20 nm 내지 약 15 nm, 약 20 nm 내지 약 10 nm, 또는 약 15 nm 내지 약 10 nm미만의 블러를 포함한다. 어떤 경우에, 초해상도 이미지는 약 40 nm, 약 35 nm, 약 30 nm, 약 25 nm, 약 20 nm, 약 15 nm 또는 약 10 nm 미만의 블러를 포함한다. 어떤 경우에, 초해상도 이미지는 적어도 약 40 nm, 약 35 nm, 약 30 nm, 약 25 nm, 약 20 nm, 또는 약 15 nm 미만의 블러를 포함한다. 어떤 경우에, 초해상도 이미지는 최대 약 35 nm, 약 30 nm, 약 25 nm, 약 20 nm, 약 15 nm 또는 약 10 nm 미만의 블러를 포함한다.
어떤 경우에, 감소된 블러는 약 20 초당 프레임(frames per second; FPS) 내지 약 150 FPS의 프레임 레이트에서 달성된다. 어떤 경우에, 감소된 블러는 약 20 FPS 내지 약 30 FPS, 약 20 FPS 내지 약 40 FPS, 약 20 FPS 내지 약 50 FPS, 약 20 FPS 내지 약 75 FPS, 약 20 FPS 내지 약 100 FPS, 약 20 FPS 내지 약 125 FPS, 약 20 FPS 내지 약 150 FPS, 약 30 FPS 내지 약 40 FPS, 약 30 FPS 내지 약 50 FPS, 약 30 FPS 내지 약 75 FPS, 약 30 FPS 내지 약 100 FPS, 약 30 FPS 내지 약 125 FPS, 약 30 FPS 내지 약 150 FPS, 약 40 FPS 내지 약 50 FPS, 약 40 FPS 내지 약 75 FPS, 약 40 FPS 내지 약 100 FPS, 약 40 FPS 내지 약 125 FPS, 약 40 FPS 내지 약 150 FPS, 약 50 FPS 내지 약 75 FPS, 약 50 FPS 내지 약 100 FPS, 약 50 FPS 내지 약 125 FPS, 약 50 FPS 내지 약 150 FPS, 약 75 FPS 내지 약 100 FPS, 약 75 FPS 내지 약 125 FPS, 약 75 FPS 내지 약 150 FPS, 약 100 FPS 내지 약 125 FPS, 약 100FPS에서 약 150FPS, 또는 약 125FPS 내지 150FPS의 프레임 레이트에서 달성된다. 어떤 경우에, 감소된 블러는 약 20 FPS, 약 30 FPS, 약 40 FPS, 약 50 FPS, 약 75 FPS, 약 100 FPS, 약 125 FPS, 또는 약 150 FPS의 프레임 레이트에서 달성된다. 어떤 경우에, 감소된 블러는 적어도 약 20 FPS, 약 30 FPS, 약 40 FPS, 약 50 FPS, 약 75 FPS, 약 100 FPS, 또는 약 125 FPS의 프레임 레이트에서 달성된다. 어떤 경우에, 감소된 블러는 최대 약 30 FPS, 약 40 FPS, 약 50 FPS, 약 75 FPS, 약 100 FPS, 약 125 FPS, 또는 약 150 FPS의 프레임 레이트에서 달성된다.
인코더는 위치를 인코딩하는 스케일로 쌍을 이루는 센서, 변환기 또는 판독 헤드일 수 있다. 어떤 경우에, 인코딩된 위치를 아날로그 또는 디지털 신호로 변환하기 위해 스케일(예: 인코더 카운트)을 판독할 수 있고, 신호는 이후 DRO(디지털 판독값; Digital ReadOut) 또는 모션 제어기에서 해당 위치로 디코딩할 수 있다. 따라서, 어떤 경우에, 위치 센서(위치, 속도 및/또는 가속도 센서를 포함함)는 기판 또는 이동식 스테이지의 인코더 카운트(또는 다른 스케일)로 인터페이스하는 선형 인코더이다. 특정 경우에, 기판 상의 인코더 카운트는 약 0.05㎛ 내지 약 30㎛의 거리에 위치된다. 특정 경우에, 기판 상의 인코더 카운트는 약 0.05 ㎛ 내지 약 0.1 ㎛, 약 0.05 ㎛ 내지 약 1 ㎛, 약 0.05 ㎛ 내지 약 2 ㎛, 약 0.05 ㎛ 내지 약 3 ㎛, 약 0.05 ㎛ 내지 약 5 ㎛, 약 0.05 ㎛ 내지 약 7 ㎛, 약 0.05 ㎛ 내지 약 10 ㎛, 약 0.05 ㎛ 내지 약 15 ㎛, 약 0.05 ㎛ 내지 약 20 ㎛, 약 0.05 ㎛ 내지 약 25 ㎛, 0.05 ㎛ 내지 약 30 ㎛, 약 0.1 ㎛ 내지 약 1 ㎛, 약 0.1 ㎛ 내지 약 2 ㎛, 약 0.1 ㎛ 내지 약 3 ㎛, 약 0.1 ㎛ 내지 약 5 ㎛, 약 0.1 ㎛ 내지 약 7 ㎛, 약 0.1 ㎛ 내지 약 10 ㎛, 약 0.1 ㎛ 내지 약 15 ㎛, 약 0.1 ㎛ 내지 약 20 ㎛, 약 0.1 ㎛ 내지 약 25 ㎛, 약 0.1 ㎛ 내지 약 30 ㎛, 약 1 ㎛ 내지 약 2 ㎛, 약 1 ㎛ 내지 약 3 ㎛, 약 1 ㎛ 내지 약 5 ㎛, 약 1 ㎛ 내지 약 7 ㎛, 약 1 ㎛ 내지 약 10 ㎛, 약 1 ㎛ 내지 약 15 ㎛, 약 1 ㎛ 내지 약 20 ㎛, 약 1 ㎛ 내지 약 25 ㎛ , 약 1μm 내지 약 30μm, 약 2μm 내지 약 3μm, 약 2μm 내지 약 5μm, 약 2 ㎛ 내지 약 7 ㎛, 약 2 ㎛ 내지 약 10 ㎛, 약 2 ㎛ 내지 약 15 ㎛, 약 2 ㎛ 내지 약 20 ㎛, 약 2 ㎛ 내지 약 25 ㎛, 약 2 ㎛ 내지 약 30 ㎛, 약 3 ㎛ 내지 약 5 ㎛, 약 3 ㎛ 내지 약 7 ㎛, 약 3 ㎛ 내지 약 10 ㎛, 약 3 ㎛ 내지 약 15 ㎛, 약 3 ㎛ 내지 약 20 ㎛, 약 3 ㎛ 내지 약 25 ㎛, 약 3 ㎛ 내지 약 30 ㎛, 약 5 ㎛ 내지 약 7 ㎛, 약 5 ㎛ 내지 약 10 ㎛, 약 5 ㎛ 내지 약 15 ㎛, 약 5 ㎛ 내지 약 20 ㎛, 약 5 ㎛ 내지 약 25 ㎛, 약 5 ㎛ 내지 약 30 ㎛, 약 7 ㎛ 내지 약 10 ㎛, 약 7 ㎛ 내지 약 15 ㎛, 약 7 ㎛ 내지 약 20 ㎛, 약 7 ㎛ 내지 약 25 ㎛, 약 7 ㎛ 내지 약 30 ㎛, 약 10 ㎛ 내지 약 15 ㎛, 약 10 ㎛ 내지 약 20 ㎛, 약 10 ㎛ 내지 약 25 ㎛, 약 10 ㎛ 내지 약 30 ㎛, 약 15 ㎛ 내지 약 20 ㎛, 약 15 ㎛ 내지 약 25 ㎛, 약 15 ㎛ 내지 약 30 ㎛, 약 20 ㎛ 내지 약 25㎛, 약 20㎛ 내지 약 30㎛, 또는 약 25㎛ 내지 약 30㎛의 거리에 위치한다. 특정 경우에, 기판 상의 인코더 카운트는 약 0.05μm, 약 0.1μm, 약 1μm, 약 2μm, 약 3μm, 약 5μm, 약 7μm, 약 10μm, 약 15μm, 약 20μm, 약 25μm, 또는 약 30μm의 거리에 위치한다. 특정 경우에, 기판 상의 인코더 카운트는 적어도 약 0.05 ㎛, 약 0.1 ㎛, 약 1 ㎛, 약 2 ㎛, 약 3 ㎛, 약 5 ㎛, 약 7 ㎛, 10μm, 약 15μm, 약 20μm, 또는 약 25μm의 거리에 위치한다. 특정 경우에, 기판 상의 인코더 카운트는 최대 약 0.1μm, 약 1μm, 약 2μm, 약 3μm, 약 5μm, 약 7μm, 약 10μm, 약 15μm, 약 20μm, 약 25μm, 또는 약 30μm의 거리에 위치한다. 특정 경우에, 인코더에 의해 검출 가능한 위치의 분해능은 1 nm 이하이다. 이는 예를 들어, 기판의 라인 사이 또는 인코더 카운트 사이의 보간을 사용하여, 수행될 수 있다. 인코더 카운트 사이의 간격은 스테이지 스캔 속도 및 위치 측정의 주파수와 상관관계가 있을 수 있다.
선형 인코더와 같은, 인코더에 의해 사용되는 스케일은, 와전류에 기초하여, 광학, 자기, 용량성, 유도성일 수 있다. 특정 경우에, 위치 검출은 예를 들어, 이미지 상관 방법에 기초한 광학 이미지 센서를 사용함으로써, 기판 또는 이동식 스테이지의 스케일 없이 수행될 수 있다.
특정 경우에, 초해상도 이미징 시스템은 게놈 시퀀싱을 위한 데이터를 획득하기 위해 사용될 수 있다. 일부 경우에, 본 명세서에서 제공된 시스템 및 방법은 회절 한계 이하의 중심 간 중심 간격으로 표면에 고정된 분석물로부터 신호의 이미징을 용이하게 위해 제공된다. 이러한 시스템 및 방법은 고해상도 이미지를 생성하기 위해 고급 이미징 시스템을 사용하고 기판 상의 분자 위치 결정을 높은 정확도로 용이하게 하기 위해 순환 검출을 사용하고 고밀도로 패킹 된 표면 상에 각 분자에 대한 신호 식별자를 획득하기 위해 이미지의 디컨볼루션을 사용한다. 이러한 방법 및 시스템은 높은 정확도로 매우 효율적이고 매우 높은 처리량의 폴리뉴클레오티드 시퀀스 결정을 제공하기 위해 고밀도로 패킹 된 기판 상 합성에 의해 단일 분자 시퀀싱을 허용한다.
광학 스캐닝 시스템의 단일 미러 실시예에 제공된 스캐닝 광학 장치는 도4에 도시된다. 이러한 실시예에서, 광학 스캐닝 시스템은 축을 따라 장착된 기판(120)을 이동시키도록 구성된 이동식 스테이지(110)를 포함한다. 기판(120)은 스테이지가 연속적으로 이동할 때 광학 스캐닝 시스템에 의해 개별적으로 이미징되는 하나 이상의 필드(121)를 포함한다. 기판은 조명 메커니즘(미도시)에 의해 조명되고, 기판으로부터의 광은 대물 렌즈(130)를 통해 광학 경로를 따라 이동한다. 움직이는 기판의 이미지는 모션 추적 미러(145)에 의해 이미지 센서에 대해 안정화된다. 필드(121)의 이미지는 이미지 센서를 포함하는 카메라(160)에 의해 캡처된다. 모션 추적 미러(145)는 이미지 필드의 평면에 평행한 축을 중심으로 회전하도록 구성된다. 모션 추적 미러(145)의 회전은 카메라(160)에 의한 이미지 캡처 동안 필드의 이미지를 안정화하도록 광학 경로를 조정한다. 따라서, 광학 스캐닝 시스템의 단일 미러 실시예는 이동 기판을 이미징하는 동안 스테이지 속도 변동을 보정하지 않는 시스템에 대해 개선된 선명도 또는 감소된 픽셀 스미어로 안정화된 이미지를 제공한다.
여러 실시예에서 광학 스캐닝 시스템은 이동식 스테이지에 장착된 기판과 같이, 연속적으로 움직이는 물체를 스캐닝 방식으로, 이미징하도록 구성된다. 이러한 실시예들에서, 기판은 일반적으로 카메라가 기판의 필드의 이미지를 캡처하는 동안 대물 렌즈 아래에서 기판을 계속해서 이동시킬 수 있는 하나 이상의 메커니즘(예: 모터 또는 기타 작동기)에 결합된 이동식 스테이지에 장착(또는 다른 방식으로 놓여짐)된다. 이동식 스테이지는 대물 렌즈의 광축에 수직인 방향을 따라 기판을 이동시키도록 구성되고 작동한다. 일부 실시예에서, 이동식 스테이지의 이동의 축은 일반적으로 대물 렌즈의 광학 축을 따라 이미징 된 물체 및/또는 대물 렌즈를 이동시키는, 자동포커싱 유형의 메커니즘의 작동과 직교한다.
다양한 실시예에서, 이동식 스테이지의 속도는 초당 0.1mm에서 초당 1000mm (또는 그 이상)의 범위에 있을 수 있다. 일부 실시예에서, 이동식 스테이지의 속도는 초당 10mm에서 초당 100mm의 범위에 있을 수 있다. 일부 실시예에서 이동식 스테이지(따라서 그 위에 장착된 기판)는 일정한 속도로 이동하도록 구성될 수 있으나, 스테이지는 본 명세서에 제공된 광학 시스템에 의해 보상되는 속도 변동 오차에 여전히 영향을 받기도 한다. 일부 실시예에서, 이동식 스테이지는 초당 10 내지 50mm의 속도로 이동한다. 일부 실시예에서, 이동식 스테이지의 속도는 초당 약 25mm이다. 다른 실시예에서, 이동식 스테이지는 일정하지 않은 속도로 이동하도록 구성될 수 있다. 이러한 일정하지 않은 속도는 또한 본 명세서에 제공된 광학 시스템에 의해 보상되는 변동 오차의 영향을 받을 수 있다.
일부 실시예에서, 메커니즘은 주어진 원하는 속도로 이동식 스테이지의 모션을 용이하게 하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 메커니즘은 모션(예: 리니어 모터(linear motors), 리드 스크류(lead screws), 스크류 모터(screw motors), 스피드 스크류(speed screws) 등)을 유발하는 하나 이상의 구성 요소 및 마찰을 줄이는 하나 이상의 구성 요소(예: 다양한 유형의 베어링 등)를 포함할 수 있다.
예를 들어, 일부 실시예에서, 이동식 스테이지는 주어진 원하는 속도로 이동식 스테이지의 움직임을 용이하게 하기 위해 수 마이크론의 반복성을 갖는 금속 베어링(예: 볼 베어링(ball bearings), 실린더 베어링(cylinder bearings), 크로스 롤러 볼 베어링(cross-roller ball bearings) 등)을 사용할 수 있다. 반복성은 기본적으로 금속 베어링을 오일에서 롤링하는 효과로서--금속 베어링은 롤링하고 바운스할 때 이러한 바운스는 베어링에서 움직이는 물체의 모션에 지터(jitter)를 도입한다. 이러한 모션의 "반복성"은 두 개의 금속 베어링이 특정 허용 오차 내에서만 동일한 방식으로 바운스될 수 있기 때문에 특정 범위 이상에서만 균일할 수 있다. 따라서, 볼 베어링을 사용하는 실시예는 일반적으로 더 큰 속도 변동을 가지므로 이미지 블러(예: 픽셀 스미어)가 발생한다. 그러나, 볼 베어링을 사용하는 스테이지는 유사한 에어 베어링 스테이지보다 더 가볍고 더 작고 더 저렴하다는 점을 포함하여 몇 가지 이점을 제공한다. 따라서, 일부 실시예에 따라 본 명세서에서 제공된 개선된 스캐닝 광학 장치는 볼 베어링 또는 일부 속도 변동의 대상이 되는 모션을 제공하는 기타 구성 요소가 있는 스테이지를 포함하여, 이동식 스테이지 속도 변동으로 인해 이미지 블러 또는 픽셀 스미어를 감소시킨다.
일부 실시예에서, 이동식 스테이지의 속도는 연속 광학 스캐닝 동안 정해진 속도에서 0.1% 이상 변동한다. 일부 실시예에서, 이동식 스테이지의 속도는 연속 광학 스캐닝 동안 정해진 속도에서 0.5% 이상 변동한다. 일부 실시예에서, 이동식 스테이지의 속도는 연속 광학 스캐닝 동안 0.1%와 1% 사이에서 변동한다. 일부 실시예에서, 본 명세서에 제공된 광학 스캐닝 시스템은 0.1%와 1% 사이에서 0.1% 미만까지의 속도 변동을 갖는 이동식 스테이지로부터 이미지 블러 또는 픽셀 스미어를 줄이다. 일부 실시예에서, 안정화된 이미지에 대한 픽셀 스미어는 +1-1 픽셀 미만이다. 일부 실시예에서, 이동식 스테이지는 2차원 풀프레임 전자 센서가 있는 카메라가 2차원 이미지를 생성하는 동안 대물 렌즈에 대해 알려진 제1 측면 방향의 연속적인 모션으로 기판을 이동시키도록 구성된다. . 일부 실시예에서, 이동식 스테이지는 기판 상의 필드의 복수의 행 또는 열을 이미지화 하기 위해 연속적인 서펜타인(serpentine) 방식으로 이동하도록 구성된다.
일부 실시예에서 기판은 이동식 스테이지에 장착(또는 다른 방식으로 놓여짐)된다. 일부 실시예에서, 기판은 그 위에 배치된 표적 생체분자를 갖는 어레이를 포함한다. 일부 실시예에서, 기판은 이미징을 위한 표적인 다수의 별개의 피처를 포함한다. 예를 들어, 어레이 칩과 같은 것이다. 일부 실시예에서, 기판은 이미징을 위해 무작위로 배치된 표적 어레이를 포함한다.
일부 실시예에서, 기판은 이미징을 위한 표적인 다수의 별개의 피처를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시예에서 기판은 표적 생체분자가 표적 피처로서 부착된, 비드 또는 웰과 같은, 표면이 있는 비평면 구조를 포함한다. 일부 실시예에서 기판은 어레이 칩을 포함한다. 일부 실시예에서, 어레이 칩은 생체분자가 표적 피처로 부착되는 부착 부위를 운반하는 표면, 예: 평면 또는 실질적으로 평면인 표면과 같은, 평면을 갖는 고체상 지지체이다. 일부 실시예에서 어레이 칩의 부착 부위는 정렬된 패턴 또는 무작위 방식으로 배열될 수 있다. 일부 실시예에서, 부착 부위는 표적 생체분자의 부착에 적합한 치수를 갖도록 구성된다. 따라서 첨부 사이트는 공간적으로 정의되고 다른 사이트와 겹치지 않는다; 즉, 부착 사이트는 어레이 칩에서 공간적으로 분리된다. 부착 부위에 부착될 때, 생체분자는 어레이 칩에 공유적으로 또는 비공유적으로 결합될 수 있다.
일부 실시예에서, 기판은 바이오칩이다. 일부 실시예에서, 바이오칩은 고처리량의 미세유체(microfluidics)를 포함한다. 일부 실시예에서, 바이오칩은 샘플에서 단일 분자의 검출을 위한 생체분자를 포함한다. 일부 실시예에서, 기판은 어레이 위에 배치된 표적 핵산을 갖는 어레이를 포함한다. 다른 실시예에서, 기판은 이미징을 위한 표적인 다수의 별개의 피처를 포함한다.
일부 실시예에서, 기판 상의 부착 부위는 각각 별도로 이미징 되는 필드로 분할된다. 일반적인 기판은 행과 열의 직사각형 패턴으로 배열된 수백 또는 수천 개의 필드로 분할될 수 있다. (예를 들어, 필드의 행 및 열은 각각 수평 치수 및 수직 치수를 따라 실질적으로 정렬된 추적 영역을 포함할 수 있다.)
이러한 실시예에서, 본 명세서에 설명된 기술은 기판을 필드 별로 스캐닝하고 이미징하기 위해 제공된다. 일 예시에서, 광학 스캐닝 시스템은 이동식 스테이지가 대물 렌즈의 광축에 실질적으로 수직인 평면 및/또는 축에서 y-방향을 따라 기판을 이동시키는 동안 스캐닝 방식으로(본 명세서에 설명됨) 기판을 이미지화 한다. 이 예에서, 광학 스캐닝 시스템은 이미징 되는 필드의 열의 끝에 도달할 때 이미징을 중단하여 이동식 스테이지가 필드의 다음 열의 이미징을 위해 기판을 배치할 수 있도록 한다. 다른 예에서, 광학 스캐닝 시스템은 이동식 스테이지가 대물 렌즈의 광학 축에 실질적으로 수직인 평면에서 서펜타인 방식(예: y 방향을 따라)으로 기판을 앞뒤로 움직이는 동안 스캐닝 방식으로 (본 명세서에 설명된 대로) 기판을 이미지화 한다. 광학 스캐닝 시스템은 이동식 스테이지가 기판을 한 방향으로 이동하는 동안 필드 열을 이미지화하고 이동식 스테이지가 반대 방향으로 기판을 이동/반환하는 동안 필드의 다음/인접 열을 이미지화 하고, 예를 들어, 광학 스캐닝 시스템은 연속적인 서펜타인 방식으로 필드의 열을 효과적으로 횡단하여 기판을 이미지화 한다.
광학 스캐닝 시스템의 대물 렌즈는 기판 또는 기판의 일부를 카메라에 이미징하도록 구성되고 작동한다. 일부 실시예에서, 대물 렌즈는 하나 이상의 렌즈를 포함하고 전자기(예: 광학과 같은) 신호를 확대하도록 구성되고 작동하는 광학 스캐닝 시스템의 요소 또는 요소 그룹이다. 일부 실시예에서, 대물 렌즈는 큰 개구수(NA)(예: 0.6 내지 1.5 범위의 NA)를 갖고 공기 침지 또는 액체 침지(예: 물, 오일 또는 기타 침지 유체)를 통해 이미징을 수행한다. . 다양한 실시예에서, 대물 렌즈는 2mm에서 40mm 범위의 초점 거리를 가질 수 있다. 대물 렌즈는 기성품의 현미경 대물렌즈 또는 맞춤형으로 설계된 다중 요소 광학 구성요소가 될 수 있다. 일부 실시예에서, 대물 렌즈는 2차원 이미지를 생성하기 위해 카메라의 2차원 전체 프레임 전자 센서에 기판의 적어도 2차원 부분을 이미징하도록 구성된다.
대물 렌즈의 배율은 카메라에 의해 관찰된 이미지 공간 픽셀에 대응하는 물체 공간 영역의 실제 크기에 대한 이미지 공간 픽셀(즉, 카메라 픽셀)의 크기의 비율이다. 예를 들어, 16X의 배율은 8μm 픽셀을 사용하는 카메라가 500nm 물체 공간 픽셀을 관찰할 수 있게 한다. 일부 실시예에서, 대물 렌즈는 4X에서 100X의 배율을 갖는다. 일부 실시예에서, 대물 렌즈는 20X에서 50X의 배율을 갖는다. 일부 실시예에서 대물 렌즈는 40X의 배율을 갖는다.
일부 실시예에서, 대물 렌즈는 자동-포커싱이 가능하도록 대물 렌즈를 위치시키기 위해 전기 모터에 작동 가능하게 연결되어 있다. 일부 실시예에서, 장치는 포커싱 센서를 포함한다. 일부 실시예에서, 장치는 집속 센서의 어레이를 포함한다.
일부 실시예에서, 사용되는 자동-포커싱 메커니즘은 광학 검출 방법을 기반으로 한다. 일부 실시예에서, 자동-포커싱은 이미지 콘텐츠 분석에 의해 수행된다. 일부 실시예에서, 자동포커싱은 다중 초점 거리에서 기판의 다중 이미지를 획득하고, 각각의 이미지에 대한 최적 초점 거리를 결정하고, 피드백 루프를 사용하여 초점 거리를 조정함으로써 수행된다.
자동포커싱은 레이저 빔을 기판으로 향하게 하고, 기준점을 제공하기 위해 기판에서 레이저 빔의 반사도를 측정하고, 초점 거리를 조정하기 위해 피드백 루프를 사용함으로써 수행될 수 있다. 일부 실시예에서, 비광학 유형의 비접촉 위치 센서가 사용된다. 이러한 센서는 높은 대역폭과 0.1μm 이하의 추적 정밀도로 위치 판독을 수행할 수 있다. 일부 실시예들에서, 용량성 위치 센서들이 사용될 수 있다(예를 들어, US 2002/0001403 참조, 그 개시 내용은 참조로 본 명세서에 포함됨).
일부 실시예에서, 대물 렌즈의 자동포커싱은 100ms 미만으로 달성된다. 일부 실시예에서, 장치에 의해 제공되는 자동포커싱의 범위는 +/- 200 μm이다.
일부 실시예에서, 광학 스캐닝 장치는 광학 시스템과 독립적으로 피사체까지의 거리를 측정하고, 이어 초점을 교정하기 위해 대물 렌즈를 조정하는 능동적 자동포커싱 시스템을 포함한다. 일부 실시예에서, 광학 시스템에 들어가는 이미지의 수동 분석을 수행하여 정확한 초점을 결정하는 수동적 자동포커싱 시스템이 사용된다. 수동 자동포커싱은 예를 들어, 위상 검출 또는 대비 측정에 의해, 달성될 수 있다.
일부 실시예에서, 광학 스캐닝 시스템은 기판이 이동식 스테이지에 의해 이동되는 동안 기판의 필드의 2차원 정지 이미지를 캡처할 수 있는 카메라를 포함한다. 일부 실시예에서, 광학 스캐닝 시스템은 전체 프레임 카메라를 포함한다. 일부 실시예에서, 전체 프레임 카메라는 CMOS(Complementary Metal-Oxide Semiconductor; 상보성 금속 산화막 반도체) 카메라이다. 이러한 풀 프레임 카메라는 고속, 고해상도 및 저비용이다. 또한, 이들은 고해상도로 연속적으로 움직이는 기판의 이미지를 캡처하기 위한 광학 스캐닝 시스템과 호환된다. 일부 실시예에서, 카메라는 과학적 CMOS(scientific CMOS; sCMOS) 카메라이다. 일부 실시예에서 카메라는 전체 프레임 모드에서 작동할 수 있는 비 CMOS 카메라이다.
본 명세서에 설명된 광학 스캐닝 시스템은 이미징되는 기판이 움직이는 동안 정지 이미지의 연속 노출을 달성하기 위해 스캐닝 광학 장치(예: 단일 미러 또는 이중 미러 실시예)와 함께 고속 카메라를 사용하도록 구성된다. 일부 실시예에서, 카메라 픽셀의 크기(길이 및/또는 폭)는 5㎛ 내지 10㎛ 범위, 바람직하게는 6 내지 8㎛ 범위이지만 독점적인 것은 아니다. 일부 실시예에서, 카메라 픽셀의 크기는 6.5μm이다. 일부 실시예에서, 카메라는 15 x 15 mm에서 10 x 10 mm 범위의 이미징 센서를 포함한다.
다양한 실시예에서, 본 명세서에 설명된 광학 스캐닝 시스템은 고속 카메라를 사용하여 연속적으로 움직이는 기판(예: 어레이 칩)을 스캔하도록 구성되고, 고속 카메라는 전체 프레임 2D 모드에서 작동하는 비 TDI카메라(Time Delay and Integration camera; 시간 지연 통합 카메라) 및 기타 카메라(TDI 카메라 포함)와 같이 카메라를 통해 이미지를 이동하지 않는다. CMOS 카메라는 그러한 카메라의 예시적인 부류이다. CMOS 카메라는 일반적으로 픽셀 어레이를 포함하는 집적 회로로 구성된 이미지 센서인 액티브 픽셀 센서(Active-Pixel Sensor; APS)를 사용하며, 여기서 각 픽셀은 광검출기와 능동 증폭기를 포함한다.
고속 카메라는 카메라가 단위 시간에 노출할 수 있는 픽셀의 수로 정의될 수 있다. 예를 들어, 카메라의 속도는 시야의 픽셀 수와 카메라가 촬영할 수 있는 초당 프레임 수의 수학적 곱에 의해 정의될 수 있다. 따라서, 초당 100프레임(fps)에서 작동되는 5.5메가픽셀의 시야(예: 2560픽셀 x 2160픽셀의 뷰)가 있는 카메라는 초당 550메가픽셀을 노출할 수 있다; 따라서, 이러한 카메라는 본 명세서에서 "550" 메가픽셀 카메라라고 한다. 이러한 카메라의 예에는 CMOS, sCMOS 및 유사한 카메라가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 다양한 실시예에서, 본 명세서에 설명된 광학 스캐닝 시스템은 10메가픽셀에서 2500메가픽셀 범위의 카메라를 사용할 수 있다. 일부 실시예에서, 카메라는 2차원, 전체 프레임 전자 센서를 포함한다.
광학 스캐닝 시스템의 일부로 본 명세서에 설명된 스캐닝 광학 장치는 이미징 된 물체와 카메라 사이의 시스템의 광학 경로를 따라 부착된 하나 이상의 회전 가능한 미러를 갖는 단일 추적 미러 및 이중 추적 미러 실시예를 포함할 수 있다. 이중 추적 미러 실시예에서, 두 세트의 스캐닝 광학계가 사용되는데, 각각은 이미징 동안 축을 따라 이동식 스테이지의 움직임을 추적하기 위해 협력하여 이동할 수 있다. 제1 스캐닝 광학계(예: 속도 추적 미러)는 예상 속도 또는 속도 패턴으로 필드가 움직이는 동안 카메라로 필드를 이미징할 수 있도록 스테이지의 움직임을 추적하기 위해 사용된다. 제2 스캐닝 광학 장치(예: 가속도 추적 미러)는 허용할 수 없는 픽셀 스미어를 초래할 수 있는 로컬 스테이지 가속도를 보정하여 이미지를 안정화하기 위해 사용된다. 단일 추적 미러 실시예에서, 단일 세트의 스캐닝 광학 장치는 예상 속도 또는 속도 패턴에서 스테이지의 움직임을 추적하고 허용할 수 없는 픽셀 스미어가 초래할 수 있는, 로컬 스테이지 가속도(즉, 속도 변동)를 보상하기 위해 모두 사용됨으로써, 이미지를 안정할 수 있다. 단일 추적 미러 실시예의 경우, 단일 세트의 스캐닝 광학계는 속도 및 가속도(또는 속도 변동)를 포함한 모든 스테이지 모션을 보상한다. 일부 실시예에서, 스캐닝 광학계의 단일 세트는 일정하거나 예상되는 속도 또는 속도 패턴과 측정되거나 미리 결정된 속도 변동(가속도) 모두에 대한 보상을 나타내는 모션 추적 미러를 포함한다.
일부 실시예에서, 이동식 스테이지의 속도 변동에 응답하는 추적 미러의 이동은 피드백 제어 메커니즘을 기반으로 한다. 일부 실시예에서, 피드백 제어 메커니즘은 인코더와 같이, 시간 경과에 따른 기판의 위치를 측정하는 장치를 포함한다. 일부 실시예에서, 속도 변동에 대한 미러의 이동은 이동식 스테이지에 대한 기 결정된 속도 변동에 기초한다. 일부 실시예에서, 모든 회전 가능한 스캐닝 광학계는 이미지를 다중 카메라들로 나누기 위해 사용되는 임의의 분할기 앞에 광학 경로를 따라 위치한다.
일부 실시예에서, 본 명세서에서 제공된 광학 스캐닝 장치는 카메라 센서가 이동식 스테이지의 축을 따라 이동 기판의 필드를 이미지화 하는 카메라가 회전할 수 있도록 구성된 속도 추적 미러를 포함한다. 속도 추적 미러는 대물 렌즈에서 카메라까지의 광학 경로를 따라 광을 반사하도록 장치에 작동 가능하게 장착된다.
움직이는 기판의 정지 이미지을 유지하기 위해, 속도 추적 미러는 이동식 스테이지와 협력하여 이동하도록 구성되고 작동하는, 반면 이동식 스테이지는 대물렌즈에서 나오는 광을 카메라로 반사시키기 위해, 동일하게 지정된 방향으로 기판을 이동시킨다. 따라서, 속도 추적 미러는 장치에 고정된 축을 중심으로 회전하도록 작동 가능하게 장착될 수 있다. 일부 실시예에서, 고정 축은 2차원 기판 이미지의 평면에 평행하다. 일부 실시예에서, 고정 축은 광학 경로와 직교한다. 따라서, 속도 추적 미러는 기판이 이동식 스테이지에 의해 이동되는 동안 카메라가 대물 렌즈를 통해 기판의 필드의 정지 이미지를 획득할 수 있게 하는 각도 운동을 수행하도록 작동하고 구성된다.
속도 추적 미러는 속도 추적 미러의 회전에 영향을 미치도록 전기 모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 속도 추적 미러에 작동 가능하게 연결된 전기 모터는 검류계이나, 다른 유형의 전기 모터가 사용될 수도 있다. 적합한 검류계의 예는 넛필드(Nutfield) QS-7 OPD 검류계 스캐너(넛필드 테크놀로지(Nutfield Technology))이다. 일부 실시예에서, 속도 추적 미러를 작동시키기 위한 기타 매커니즘, 예를 들어, 유압, 공압 또는 자기 원리를 기반으로 하는 것이, 사용될 수도 있다. 일부 실시예에서, 전기 모터는 속도 추적 미러에 작동 가능하게 연결되고 이동식 스테이지와 협력하여 속도 추적 미러를 각지게 이동하도록 작동하나, 이동식 스테이지는 동안 이미지가 대물 렌즈를 통해 획득되는 동안 카메라에 대해 기판(또는 필드)의 이미지를 유지하기 위해, 기판을 이동시킨다.
속도 추적 미러의 움직임은 속도 추적 미러에 작동 가능하게 연결된 전기 모터에 구동 신호를 전송하도록 구성된 위치 처리 모듈을 통해 조정될 수 있다. 위치 처리 모듈은 원하는 출력 또는 모션 프로파일을 생성하기 위한 모션 제어기 구성요소 및 모션 제어기로부터의 제어 신호를 전기 모터를 작동시키는 전기 신호 또는 구동 신호로 변환하는 드라이브 또는 증폭기 구성요소를 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 속도 추적 미러는 약 60도, 50도, 40도, 30도, 20도, 15도, 10도 또는 5도의 회전의 각도 범위를 갖는다. 일부 바람직한 실시예에서, 속도 추적 미러는 약 3도, 2도, 1도, 1/2도, 1/4도, 또는 1/10도의 회전의 각도 범위를 갖는다.
이동 기판을 이미지화하기 위해 속도 추적 미러를 사용하는 광학 스캐닝 시스템에서, 미러 각도는 카메라가 이동 기판의 고정 영역을 볼 수 있도록 시간에 따라 조정된다. 이것을 "정방향 스캔" 시간이라고 한다. 속도 추적 미러는 이후 초기 위치로 돌아가기 위해 빠르게 회전할 수 있다. 이것은 "플라이백(fly-back)" 시간 또는 "백스캔(backscan)" 시간이라고 한다. 플라이백 시간 동안 카메라에 투영된 이미지는 안정적이지 않는다.
도 2는 예시적인 실시예에 따른 속도 추적 미러 각도 이동 및 타이밍의 다이어그램을 예시한다. 작동 시 대물 렌즈는 이미징 동안 축을 따라 이동 기판(예: 어레이 칩)에 초점이 맞춰진다. 도 2는 시간(210)에 따른 스테이지의 움직임을 도시한다. 이러한 이동 동안, 속도 추적 미러는 정방향 스캔 시간(220)으로 표시되는 기판의 이동을 추적하기 위해 초기 위치에서 끝 위치로 회전한다. 단일 정방향 스캔 동안 기판의 일부가 이미징되고, 이를 여기서 필드라고 지칭한다. 속도 추적 미러의 회전은 노출 시간 동안 카메라에 의해 필드에 해당하는 기판 부분의 이미징을 허용하여 카메라 센서에 충분한 노출을 허용한다. 카메라에 대한 필드의 나머지 움직임은 속도 변동 또는 예상 속도에서 기판 속도의 편차로 인한 것일 수 있다. 속도 추적 미러가 끝 위치에 도달하면 새 스캔을 준비하기 위해 초기 위치로 다시 이동하고, 이러한 새 스캔은 230(플라이백 시간)에서 미러의 움직임이나 파형으로 표시된다. 기판의 정지 이미지는 플라이백 시간 간격 동안에는 획득되지 않는다. 속도 추적 미러의 정방향 스캔 및 플라이백 모션은 톱니파형(도 2)으로 표시되며, 이는 스캐닝 및 플라이백 동안 속도 추적 미러의 움직임과 미러를 작동시키기 위해 속도 추적 미러에 작동 가능하게 연결된 전기 모터로 전송된 구동 신호를 모두 반영한다.
미러(정방향 스캔 및 역방향 스캔 세그먼트 포함)를 구동하기 위한 톱니파형의 실시예는 도 2 및 3에 도시된다. 일부 실시예에서, 속도 추적 미러는 모션 범위의 세그먼트에 대해 비선형 응답을 가질 수 있다. 이 경우, 속도 추적 미러 응답은 속도 추적 미러로부터의 응답을 선형화할 수 있도록, 파형 또는 구동 신호를 조정하여 선형화될 수 있다.
일부 실시예에서, 속도 추적 미러는 가속 추적 미러의 회전에 영향을 미치도록 전기 모터에 작동 가능하게 연결된다. 바람직한 실시예에서, 속도 추적 미러에 작동 가능하게 결합된 전기 모터는 전류에 응답하여 움직이는 자기장의 전기 코일 또는 검류계이다. 일부 실시예에서, 속도 추적 미러의 작동을 제공하는 다른 메커니즘, 예를 들어 유압, 공압 또는 자기 원리에 기반한 것도 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, 속도 추적 미러에 작동 가능하게 연결된 전기 모터는 이동식 스테이지 또는 기판의 속도의 함수로서 속도 추적 미러의 각 운동을 생성하도록 작동한다.
일부 실시예에서, 속도 추적 미러의 움직임은 속도 추적 미러와 작동 가능하게 결합된 전기 모터에 구동 신호를 전송하도록 구성된 위치 처리 모듈을 통해 조정된다. 위치 처리 모듈은 원하는 출력 또는 모션 프로파일을 생성하기 위한 모션 제어기 구성요소 및 모션 제어기의 제어 신호를 전기 신호 또는 구동 신호로서 전기 모터에 제공되는 에너지로 변환하는 구동 또는 증폭기 구성요소를 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 속도 추적 미러와 작동 가능하게 결합된 전기 모터에 전송된 구동 신호 또는 전기 신호는 G(0,o.),c(0))의 함수로서 정의된 선형화된 속도 추적 오류 파형일 수 있고, 여기서 G는 0=각도 위치, o.)=주파수, 6(0)=진폭으로 수정된 삼각파이다.
추적 미러의 움직임은 기판의 능동 이미징을 허용하기 위해 추적 미러가 정방향 스캔 모션으로 작동 가능하게 움직이는 시간의 일부로 정의된, 듀티 사이클에 의해 특징화될 수 있다. 예를 들어, 추적 미러가 추적 미러 사이클의 적어도 90% 동안 카메라가 이미징할 수 있도록 기판을 추적하면(예: 추적 미러 플라이백 시간이 사이클의 10% 이하인 경우), 이후 이러한 기술은 카메라가 전반적인 판독 효율을 적어도 ―90%로 작동하게 할 수 있다.
일부 실시예에서, 더 긴 노출 시간이 필요할 수 있는 형광 이미징, 카메라에 의해 이미지가 수집되는 스캔 시간 간격과 같은 것들은, 형광 이미징 광 레벨이 일반적으로 매우 약하기 때문에 적절한 신호 대 잡음비를 구축할 수 있을 만큼 충분히 길어야 한다.
듀티 사이클은 또한 추적 미러가 초기 위치로 돌아가는 속도에 의해 영향을 받는다. 이 플라이백 시간 간격은 추적 미러 사이클의 작은 부분으로만 구성되어, 듀티 사이클을 최대화할 수 있다. 더 나은 효율을 위해, 각 이미지 영역에서 추적 미러에 의해 소비된 시간의 양은 카메라의 프레임 속도에 비례하여 만들어지고, 그에 따라 각 필드의 이미지를 카메라에 노출하기에 충분한 시간을 허용한다.
일부 실시예에서 듀티 사이클은 60%보다 크다. 일부 실시예에서, 듀티 사이클은 60%에서 90%이다. 일부 실시예에서, 이미지 캡처의 듀티 사이클은 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 또는 10%이다. 일부 실시예에서, 듀티 사이클은 10%만큼 낮을 수 있거나 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%의 범위에 있을 수 있다. 일부 실시예에서, 이러한 듀티 사이클은 30에서 200Hz의 이미징 주파수로 달성된다. 일부 실시예에서, 이러한 듀티 사이클은 30 에서 40Hz의 이미징 주파수로 달성된다. 일부 실시예에서, 이러한 듀티 사이클은 30Hz, 35Hz, 40Hz, 45Hz 또는 50Hz의 이미징 주파수로 달성된다.
플라이백 시간 간격 동안, 광학 스캐닝 시스템은 획득되는 이미지가 안정적이지 않기 때문에 이미징을 중단해야 한다. 따라서, 다양한 실시예에서 다양한 메커니즘이 플라이백 시간 간격 동안 카메라에 대한 이미지 노출을 방지하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시예에서 음향 광학 변조기(Acousto-Optic Modulator AOM) 스위치(또는 다른 유형의 고속 스위치)는 이미징 되는 중인 기판에 입사하는 조명 광을 켜고 끄기 위해 사용된다. 다른 실시예에서, 적절한 개구는 조명 광의 광학 경로에 배치될 수 있고, 여기서 조명 광은 오버스캔할 수 있도록 허용되나, 개구는 시야 외부의 광을 차단하여 플라이백 시간 간격 동안 광이 기판을 비추는 것을 방지한다. 또 다른 실시예에서, 적절한 셔터는 조명 광의 광학 경로에 배치될 수 있으며, 여기서 셔터는 노출 간격 동안 열린 상태로 유지되고 추적 미러 플라이백 시간 간격 동안 닫힌다.
이중 추적 미러 실시예에서, 광학 스캐닝 장치는 기판(또는 그 일부)의 이미징 동안 기판으로부터 카메라로의 광 전송을 안정화하기 위해 광학 경로에 오프셋 보정을 제공하도록 구성되고 작동하는 가속도 추적 미러를 더 포함한다. 오프셋 보정은 속도 추적 미러에 의해 추적된 속도와 비교하여 축을 따라 이동식 스테이지의 움직임 내 속도 변동의 함수이다. 이러한 속도 변동은 속도 추적 미러에 의한 이동식 스테이지의 추적 정확도에 영향을 미치고 허용할 수 없는 픽셀 스미어가 있는 이미지를 초래할 수 있다. 본 명세서에 제공된, 가속도 추적 미러의 회전은, 스테이지 또는 기판의 속도 변동으로 인한 픽셀 스미어를 줄이기 위해 카메라에 의해 캡처된 필드의 이미지를 안정화한다.
도 3은 필드에 대한 평균 스테이지 속도 오차에 응답하여 생성된 가속도 추적 미러 파형의 하나의 예시를 제공한다. 스테이지 속도에 양의 오차가 있는 경우, 가속도 추적 미러 파형은 스테이지의 추가 속도를 추적하기 위해 생성된다. 반대로, 스테이지 속도에 음의 속도 오차가 있는 경우, 가속도 추적 파형은 스테이지의 더 느린 속도 (즉, 양의 속도 오차로서 반대 방향으로 회전함)를 추적하기 위해 생성된다. 일부 실시예에서, 가속도 추적 미러 파형은 속도 오차를 감지한 후 구동 신호로 변환되고 생성된다. 일부 실시예에서, 가속도 추적 미러 파형은 필드 n-1의 이미징 동안 속도의 평균 측정값에 기초하여 생성되고, 구동 신호는 필드 n의 이미징 동안 가속도 추적 미러의 움직임을 구동하기 위해 이 파형으로부터 생성된다.
스테이지 속도 오차는 다음의 함수를 제공하기 위해, 진폭(A), 스테이지 위치
(x) 및 시간(t)의 함수로 모델링될 수 있다.
F(A,x,t)=A(x)* Err(x,t)를 제공하기 위해,
일부 실시예에서, 가속 추적 미러에 작동 가능하게 연결된 전기 모터의 움직임을 제어하기 위한 전기 신호 또는 구동 신호(D)는 다음과 같이 표현되는 함수에 의해 스테이지 속도 오차에 기초하여 결정될 수 있다:
D(F,C,x,E)=F(A,x,t)y*C*x + E,
여기서 C는 스케일링 팩터, x=스테이지 위치 및E는 오프셋이다. F(A,x,t)y는 본 명세서에 설명된 바와 같이, 램프 범위 = y 또는 이전 필드에 대한 F(A,x,t)의 평균값이다. 불연속을 평활화하기 위한 함수는 가속 추적 미러 구동 신호를 생성하기 위해 사용될 수도 있다.
일부 실시예에서, 가속 추적 미러는 가속 추적 미러의 회전에 영향을 미치도록 전기 모터에 작동 가능하게 연결된다. 바람직한 실시예에서, 가속 추적 미러에 작동 가능하게 결합된 전기 모터는 압전 액추에이터이나, 다른 유형의 전기 모터가 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, 유압, 공압 또는 자기 원리를 기반으로 하는 것과 같은, 가속 추적 미러의 작동을 제공하는 다른 메커니즘도 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, 가속도 추적 미러에 작동적으로 결합된 전기 모터는 이미징 동안 속도 변동을 보상하기 위해 이동식 스테이지의 속도 변동의 함수로서 가속도 추적 미러의 각운동을 생성하도록 동작한다.
일부 실시예에서, 가속 추적 미러의 움직임은 가속 추적 미러에 작동 가능하게 연결된 전기 모터에 구동 신호를 전송하도록 구성된 위치 처리 모듈을 통해 조정된다. 위치 처리 모듈은 원하는 출력 또는 모션 프로파일을 생성하기 위한 모션 제어기 구성요소 및 모션 제어기로부터의 제어 신호를 전기 신호 또는 구동 신호로 전기 모터에 제공되는 에너지로 변환하는 구동 또는 증폭기 구성요소를 포함할 수 있다. 가속도 추적 미러의 이동은 이동식 스테이지의 속도 변동의 함수이기 때문에, 위치 처리 모듈은 위치, 속도 또는 가속도 센서를 더 포함할 수 있다. 이 센서는 기판 또는 이동식 스테이지의 위치 및/또는 움직임에 대한 정보를 결정하는 일종의 피드백 센서로 작용할 수 있다. 일부 실시예에서, 센서는 스캐닝 장치에 작동 가능하게 장착된 인코더(예: 선형 인코더) 또는 간섭계를 포함한다. 일부 실시예에서, 인코더는 비간섭 인코더이다. 일부 실시예에서, 가속도계는 속도의 변화를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, 센서는 가속도 추적 미러에 작동 가능하게 결합된 전기 모터에 대한 구동 신호에 통합할 스테이지에 대한 예상 속도 변동 값을 포함하는 속도 변동 테이블의 정보를 제공하는 구성요소이다.
기판 또는 스테이지 위치 또는 모션 센서의 위치 측정은 기판 또는 이동식 스테이지의 측정된 속도를 나타내는 데이터의 세트를 제공하기 위해 사용된다. 측정된 속도는 예상 속도와 비교되어 스테이지의 속도 변동을 결정할 수 있다. 이러한 속도 변동은 가속 추적 미러에 작동 가능하게 연결된 전기 모터의 제어된 움직임에 영향을 미치는 전기 신호(예: 구동 신호)로 변환될 수 있다. 가속 추적 미러의 제어된 움직임은 기판과 카메라 사이의 광학 경로의 위치를 조정하여 안정성이 증가하고 선명도가 증가하고 흐림 또는 픽셀 스미어가 감소된 이미지를 제공한다.
전기 모터는 측정된 속도 변동에 기초한 보정 항을 포함하는 구동 신호에 신속하게 응답하는 능력에 기초하여 선택될 수 있다. 빠른 응답을 제공하기 위해, 일부 실시예에서, 전기 모터는 1도 미만의 회전의 총 각도 범위를 갖는다. 일부 실시예에서, 전기 모터는 압전 액추에이터 또는 보정 신호에 대해 유사한 응답 시간을 갖는 다른 모터이다. 일부 실시예에서, 위치 센서는 500Hz, 1kHz, 2kHz, 3kHz, 4kHz, 5kHz, 10kHz, 20kHz, 50kHz, 100kHz 및 250kHz 이상의 속도로 위치 정보를 획득한다. 특정 실시예에서, 위치 검출의 더 높은 주파수는, 예: 5kHz 이상, 속도 변동의 분해능을 증가시키고 따라서 더 선명한 이미지를 제공하기 위해 스테이지의 보다 정확한 측정을 허용한다. 그러나, 두 개 이상의 픽셀의 픽셀 스미어를 방지하기 위해 보정을 충분히 제공하는 더 낮은 주파수가 사용될 수 있다.
예를 들어, 일부 실시예에서 인코더는 기판 또는 스테이지 위치 또는 모션 측정 정보를 컴퓨팅 장치에서 실행하는 모션 제어기와 같은, 로직에 제공하고, 여기서 로직은 이동식 스테이지의 속도 변동의 함수인 계산된 보정 항에 기반하는 가속도 추적 미러를 회전시키기 위해, 이동 방향에 필요한 보정 항을 계산하고 전기 모터와 같은, 서보 메커니즘을 유발하기 위해 측정 정보를 사용한다.
속도 변동의 결정은 위치 센서로부터의 두 개 이상의 위치 측정으로부터 결정될 수 있다. 일부 실시예에서, 거의 순간 속도는 기판에서 측정된 가장 최근의 2개 또는 3개의 위치로부터 결정될 수 있다.
일부 실시예에서, 구동 신호를 생성하기 위해 사용되는 속도 변동은 미리 계산된 테이블으로부터 결정된다. 속도 변동은 스테이지에 대해 이미 알려져 있을 수 있고, 모션 제어기 구성요소에 의해 액세스되는 테이블에 기록될 수 있다. 따라서, 이러한 실시예에서, 위치 센서는 속도 변동 테이블에서 모션 제어기로 데이터를 제공하는 위치 처리 모듈의 구성요소이다.
본 명세서에 설명된 가속도 추적 미러를 사용함으로써, 광학 스캐닝 시스템은 전체 프레임 모드에서 작동하는 카메라(예: TDI 모드에서 작동하지 않는 CMOS 카메라와 같은)를 사용하여 +/-1의 픽셀의 정확도 내에서 움직이는 기판의 정지 이미지를 얻을 수 있다. 생물학적 영상화, 예: DNA 시퀀싱 또는 기타 단일 분자 검출 기술에서 채용되는 일부 실시예에서, 형광 이미징의 극도의 정렬 정확도 요구 사항은 이동식 스테이지의 움직임에서 비선형성을 제거하기 위해 축을 따른 기판의 움직임(속도 변동 포함)을 수정하기 위해 적어도 하나의 속도 및 가속도 추적 미러 쌍의 사용을 필요로 할 수 있고, 이동식 스테이지의 움직임에서 비선형성을 제거하기 위해 축을 따른 기판의, 속도 변동을 포함한다.
일부 실시예에서, 스테이지의 속도와 축을 따른 스테이지의 속도 변동을 모두 포함하여, 스테이지의 움직임을 추적하는 것은, 본 명세서에서 모션 추적 미러라고 지칭되는, 단일 추적 미러(단일 미러 실시예)에 의해 수행된다. 이 실시예에서, 단일 모션 추적 미러는 상술된 속도 및 가속도 추적 미러 두 개 모두의 기능을 수행한다. 따라서, 단일 미러 실시예에서, 구동 신호는 스캐닝 및 플라이백 파형(예: 톱니파형)을 모두 포함하는 기 결정된 스테이지 속도의 함수인 단일 모션 추적 미러에 작동 가능하게 연결된 전기 모터에 전송되고 또한 스테이지 또는 기판의 속도 변동의 함수로서, 이는 기 결정될 수 있거나 스테이지 또는 기판의 속도 변동을 결정하기 위해 기판 또는 이동식 스테이지의 움직임에 대한 정보를 제공하는 하나 이상의 측정치에 기초할 수 있다.
광학 스캐닝 시스템의 단일 미러 실시예에 제공된 스캐닝 광학 장치는 도 4에 도시된다. 이 실시예에서, 광학 스캐닝 시스템은 축을 따라 장착된 기판(120)을 이동시키도록 구성된 이동식 스테이지(110)를 포함한다. 기판(120)은 스테이지가 연속적으로 이동함에 따라 광학 스캐닝 시스템에 의해 개별적으로 이미징되는 하나 이상의 필드(121)를 포함한다. 기판은 조명 메커니즘(미도시)에 의해 조명되고, 기판으로부터의 광은 대물 렌즈(130)를 통해 광학 경로를 따라 이동한다. 움직이는 기판의 이미지는 모션 추적 미러(145)에 의해 이미지 센서에 대해 안정화된다. 필드(121)의 이미지는 이미지 센서를 포함하는 카메라(160)에 의해 캡처된다. 모션 추적 미러(145)는 이미지 필드의 평면에 평행한 축을 중심으로 회전하도록 구성된다. 모션 추적 미러(145)의 회전은 카메라(160)에 의한 이미지 캡처 동안 필드의 이미지를 안정화하기 위해 광학 경로를 조정한다. 모션 추적 미러(145)의 회전은 기 결정된 스테이지 속도 및 스테이지 또는 기판의 속도 변동 모두에 대한 함수이다. 따라서, 광학 스캐닝 시스템의 단일 미러 실시예는 이동 기판을 이미징하는 동안 스테이지 속도 변동을 보정하지 않는 시스템에 대해 개선된 선명도 또는 감소된 픽셀 스미어로 안정화된 이미지를 제공한다.
단일 모션 추적 미러의 움직임을 구동하도록 구성된 위치 처리 모듈은 2개의 미러 실시예에서 상술된 바와 같이, 속도 추적 미러에 작동 가능하게 연결된 위치 처리 모듈의 구성 요소 및 가속도 추적 미러에 작동 가능하게 연결된 위치 처리 모듈의 구성요소를 포함한다. 따라서, 일부 실시예에서, 위치 처리 모듈은 원하는 출력 또는 모션 프로파일을 생성하는 모션 제어기 구성요소, 모션 제어기로부터의 제어 신호를 전기 신호 또는 구동 신호로 변환하는 구동 또는 증폭기 구성요소를 포함한다. 위치 처리 모듈은 또한 기판 또는 이동식 스테이지의 위치 또는 움직임을 결정하고 센서로부터의 정보의 함수로서 원하는 출력 또는 모션 프로파일을 생성하기 위해 사용할 모션 제어기 구성요소에 이 신호를 전송하도록 구성된 위치, 속도 또는 가속도 센서를 포함할 수 있다. 모션 제어기 컴포넌트는 센서로부터의 신호로부터 결정되거나 스테이지에 대해 미리 결정된 단일 모션 추적 미러 및 속도 변동에 대한 모션 프로파일을 생성할 수 있고, 이는 기판 또는 스테이지의 일정하거나 예상되는 속도(예: 톱니파형)의 함수이다. 따라서, 속도를 추적하기 위해 사용되는 톱니파형은 위치 센서의 신호 또는 미리 결정된 속도 변동으로부터 결정된 실시간 속도 측정에 따라 수정될 수 있다.
도 5는 위치, 속도 또는 가속도 센서에 의해 제공되는 데이터로부터 생성된 예시적인 스테이지 속도 오차 파형을 제공한다. 또한 요구되거나, 아니면 필드에 대한 평균 속도 오류로 알려진 대략적인 속도 보정도 도시된다. 다음 파형(실선)은 평균 속도 오류(예: 필드에 대한 평균 속도 오류)의 함수인 보정 항에 의해 보정된 속도 추적 파형을 도시한다. 점선은 선형화되고, 보정되지 않은 모션 추적 미러 파형(이중 미러 실시예에서 속도 추적 미러를 구동하기 위해 사용되는 파형과 유사함)을 나타낸다. 양의 속도 오차가 있는 경우, 스캐닝 중 파형의 기울기는 증가하여, 속도 오차를 보상하기 위해 미러의 회전 속도를 증가시킨다. 음의 속도 오차가 있는 경우, 파형의 기울기가 감소하여, 속도 오차를 보상하기 위해 미러의 회전 속도가 감소한다.
일부 실시예에서, 센서는 필드의 이미징 동안 취해진 복수의 측정치에 기초하여 스테이지 또는 기판의 평균 속도를 결정한다. 일부 실시예에서, 센서는 위치 센서이다. 일부 실시예에서, 위치 센서는 인코더(예: 선형 인코더) 또는 스캐닝 장치에 작동 가능하게 장착된 간섭계이다. 위치 센서의 신호는 위치 센서에 의해 캡처된 가장 최근의 위치 측정값 중 두 개 이상을 사용하여 이동식 스테이지 또는 기판의 평균 속도를 결정하기 위해 사용할 수 있다. 일부 실시예에서, 이러한 측정값들은 감지 후 모션 추적 미러의 각도를 조정하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시예에서, 기판 또는 스테이지의 평균 속도는 필드 n-1에 대해 결정되고 필드 n에 대한 모션 추적 미러의 모션 프로파일을 생성하기 위해 사용되는 보정 항을 제공하기 위해 사용된다. 이는 도 6과 같이 필드 레벨 피드포워드 메커니즘으로 알려져 있다. 필드 레벨 피드포워드 보정 메커니즘의 일부 실시예에서, 모션 제어기 구성요소는 이전에 이미징 된 필드의 평균 속도의 함수로서 모션 추적 미러(단일 미러 실시예에서) 또는 가속도 추적 미러(이중 미러 실시예에서)의 이동을 위한 모션 프로파일을 생성한다. 필드 레벨 피드포워드 속도 추적 및 보정 메커니즘은 스캔라인 레벨 피드포워드 메커니즘과 같은, 다른 유형의 보정과 구별된다. 필드 레벨 피드포워드 보정은 즉각적인 신호 처리의 엄격함을 줄이는 동시에 단일 픽셀의 정보(즉, +/- 1픽셀 이하의 픽셀 스미어)를 모니터링하기 위해 허용 가능한 선명한 이미지를 생성하기에 충분한 보정 정보를 계속 제공한다는 점에서 장점이 있다. 일부 이미지 블러 또는 픽셀 스미어는 필드 레벨 피드포워드 메커니즘에 의해 보정되지 않을 수 있으나, 단일 분자 이미징 분야(예: 생체분자 감지용)과 같은, 일부 실시예에서, 최대 +/- 1픽셀의 픽셀 스미어가 허용되고, 필드 레벨 피드포워드 보정은 허용 가능한 레벨 내에 있는 필드 n-1에서 필드 n으로의 속도 변동이 있을 때 허용 가능한 스미어를 생성할 수 있다(예: +/- 1픽셀 이하의 픽셀 스미어가 발생함).
도 6에는 필드 레벨 피드포워드 보정의 실시예의 다이어그램이 제공된다. 이러한 실시예에서, 칩 또는 스테이지의 속도 추적 측정값은 이동 스테이지의 속도 변동을 통합하는 미러 회전 구동 신호를 생성하기 위해 획득된다. 여기서, 스테이지는 움직이기 시작하고, 스테이지 속도(속도 변동)의 프리-필드(pre-field) 비선형성을 결정하기 위해 시간 경과에 따라 위치 정보가 획득된다(또는 속도 정보가 획득됨). 제1 필드가 이미징될 때, 프리-필드 스테이지에서 측정된 평균 속도의 함수인 구동 신호는 모션 추적 미러(또는 두 개의 미러 실시예에서 가속도 추적 미러)로 전송된다. 다음 연속적인 필드들에 대해서, 상기 과정은 시간 경과에 따른 이전 필드(N-1)의 위치 정보로부터 결정된 속도 오차를 이용하여 반복된다. 구동 신호는 이러한 속도 오차의 함수로서 결정되고 필드 N 개 동안 회전을 위해 모션 추적 미러로 전송된다. 도 6은 시간에 따른 스테이지 속도 오차와 필드 당 대략적인 속도 오차를 도시한다. 스테이지 속도 오류에서 제1 아래 화살표는 필드로부터 평균 속도 오류의 결정, 및 "동일 필드" 가속도 보정 파형으로의 변환을 나타낸다. 피드포워드 메커니즘은 제2 아래 화살표로 표시되고, 이 파형을 변환하여 필드 n-1에서 파생된 파형을 기반으로 다음 필드 n에 대한 미러를 구동한다. 이러한 방식으로, 스테이지 속도 오차는 이전 필드 n-1을 기반으로 각 필드에 대해 근사화된다.
일 실시예에서, 필드 레벨 피드포워드 메커니즘은 다음 단계에 따라 진행된다: 필드 n-1에 걸쳐 기판의 여러 위치를 측정한다. 필드 n-1에 대한 평균 속도를 결정한다. 필드 n-1에 대한 속도 변동 및 이 속도 변동에 기초한 보정 항을 계산한다. 드라이버 또는 증폭기에 보낼 모션 프로필(예: 전기 모터 파형)에 수정 항을 적용한다. 필드 n의 이미지 캡처 동안 추적 미러의 움직임을 생성하기 위해 모션 추적 미러 또는 가속도 추적 미러에 작동 가능하게 연결된 전기 모터에 구동 신호를 전송한다. 레인의 나머지 필드에 대해 프로세스를 반복한다.
일부 실시예에서, 필드 레벨 피드포워드 속도 추적에 기반한 서보 메커니즘의 전체 피드백 루프는 100ms 미만, 90ms 미만, 80ms 미만, 70ms 미만, 60ms 미만, 50ms 미만, 40ms 미만, 30ms 미만, 20ms 미만, 10ms 미만, 5ms 미만 또는 2ms 미만이다. 일부 실시예에서, 피드포워드 속도 추적은 두 개의 미러 광 경로 정렬 보정 실시예에서 가속도 추적 미러의 움직임을 조정하기 위해 사용된다.
일부 실시예에서, 전기 모터로 제어되는 단일 미러의 선형 램프로 인한 오류를 최소화하기 위해, 전기 모터 구동 신호 또는 파형은 추적의 체계적인 오류를 보상하도록 조정된다. 전기 모터의 선형 램프(예: 정방향 스캔 또는 플라이백) 생성 시 오류 최소화는 광학 스캐닝 시스템의 이미징 주파수를 줄이는 것과 같이, 미러의 움직임 속도를 줄임으로써 달성될 수도 있다. 일부 실시예에서, 단일 미러 실시예 내 전기 모터를 제어하기 위한 톱니파형의 주파수는 200Hz 이하로 유지된다. 일부 실시예에서, 단일 미러 실시예 내 전기 모터를 제어하기 위한 톱니파형의 주파수는 50Hz 내지 30Hz이다. 일부 실시예에서, 단일 미러 실시예 내 전기 모터를 제어하기 위한 톱니파형의 주파수는 45Hz 내지 35Hz이다. 일부 실시예에서, 단일 미러 실시예 내 전기 모터를 제어하기 위한 톱니파형의 듀티 사이클은 70% 이하이다. 일부 실시예에서, 단일 미러 실시예 내 전기 모터를 제어하기 위한 톱니파형의 듀티 사이클은 60% 내지 80%이다. 일부 실시예에서, 단일 미러 실시예 내 이미지 캡처의 주파수 및 듀티 사이클은 2% 미만의 총 속도 추적 오류를 갖도록 조정된다. 일부 실시예에서, 단일 미러 실시예 내 이미지 캡처의 주파수 및 듀티 사이클은 2픽셀 미만 또는 1픽셀 미만의 전체 픽셀 스미어를 갖도록 조정된다.
본 명세서에서 논의된 바와 같이, 일부 실시예에 따르면, 위치 처리 모듈은 i) 피드백 제어를 위한 광학 스캐닝 시스템의 부품(예: 스테이지 위치 센서)의 상태를 결정하기 위한 센서, ii) 광학 스캐닝 장치의 구성요소(예: 속도 추적 미러를 구동하기 위한 톱니파형)의 이동에 영향을 미치는 파형을 계산하거나 제공하는 메커니즘, 또는 iii) 구성요소의 움직임에 영향을 미치기 위해 파형에 기초하여 구동 신호를 액추에이터에 보내는 메커니즘을 포함하는 구성 요소들의 컬렉션을 나타낸다.
예를 들어, 위에서 논의된 바와 같이, 위치 처리 모듈은 광학 경로를 조정하기 위한 회전 가능한 미러와 같은, 특정 구성 요소의 움직임을 구동하기 위한 올바른 파형을 생성하기 위해 사용될 수 있고, 스테이지 인코더 또는 마스터 클록 값을 기반으로 스테이지 모션에 이들을 동기화한다. 속도 추적 미러의 파형은 스테이지의 속도와 일치하도록 속도 추적 미러를 올바른 속도로 기울이는 램프가 있는 톱니파형일 수 있다. 단일 미러 실시예에서 가속도 추적 미러 또는 단일 회전 미러로 전송된 파형은 이동식 스테이지 속도에서 발생하는 속도 변동을 보정하기 위한 항을 포함해야 한다. 이러한 파형은 교정 표시가 있는 십자선(reticle)을 사용하여 스테이지 속도 비선형성을 "매핑"함으로써 생성될 수 있거나, 또는 이는 이전 필드에서 측정된 스테이지 속도를 취하거나, 속도 비선형성을 보상하는 파형 생성하거나, 다음 필드 내 속도 변동을 보정하기 위한 파형 즉, 필드 레벨 "피드포워드" 접근 방식을 사용함으로써 생성될 수 있다. 파형은 속도 변동 테이블로부터 위치 처리 모듈로 정보를 제공함으로써 생성될 수도 있다.
본 명세서에 설명된 기술에 따르면, 하나 이상의 컴퓨팅 디바이스 및/또는 그 다양한 로직은 스캐닝 미러 또는 미러들(예: 가속도 및 속도 추적 미러)과 이동식 스테이지의 조정된 모션을 제어하도록 구성되고 작동한다. . 따라서, 일부 실시예에서 이동식 스테이지(및 그에 따라 그 위에 장착된 기판)는 일정한 속도로 이동하도록 구성될 수 있으며, 이 경우 추적 미러의 백-스캔 모션도 적절한 일정한 속도로 될 것이다. 다른 실시예에서, 이동식 스테이지는 일정하지 않은 속도로 이동하도록 구성될 수 있으며, 이 경우 추적 미러의 백-스캔 모션은 또한 적절한 일정하지 않은 일정 속도로 될 것이다.
위치 처리 모듈은 또한 이동 스테이지 상의 기판의 필드의 이미지를 캡처할 수 있도록 광학 스캐닝 장치의 구성요소를 동기화하기 위해 사용될 수 있다. 회전 가능한 미러의 움직임을 이동식 스테이지의 속도에 연결하는 것 외에도 위치 처리 모듈은 장치의 다른 구성 요소도 제어할 수 있다. 일부 실시예에서, 위치 처리 모듈은 필드의 조명을 제어하는 메커니즘을 포함한다. 예를 들어, 위치 처리 모듈은 이미지 캡처 프로세스로 조명 시간을 맞추기 위해 레이저와 같은 조명 장치에 신호를 보낼 수 있다. 일부 실시예에서, 조명 상태는 속도 추적 미러로 전송되는 톱니파형에 따라 달라진다. 일부 실시예에서, 위치 처리 모듈은 기판 상의 여러 필드를 이미지화하기 위한 서펜타인 경로와 같은, 선택된 경로를 따라 또는 선택된 속도로 이동식 스테이지의 움직임을 제어하기 위해 신호를 전송한다.
이중 미러 실시예에 따른 광학 스캐닝 시스템의 특정 구성요소에 대한 위치 처리 모듈의 연결은 도 7a에 도시된다. 이 실시예에 예시된 바와 같이, 위치 처리 모듈은 이미지 캡처 타이밍으로 조명을 타이밍하는 것과 같이 기판의 조명을 제어하기 위해 조명 구성요소에 작동 가능하게 연결된다. 위치 처리 모듈은 카메라에 작동 가능하게 연결되어 카메라에 의한 이미지 캡처를 제어하여 회전하는 미러의 움직임과 조정하고, 예를 들어, 이러한 이미지는 각 필드를 추적하는 동안 획득되고, 어떠한 이미지도 추적 미러의 플라이백 기간 동안에는 획득되지 않는다. 본 명세서에 더 자세히 설명된 바와 같이, 위치 처리 모듈은 메모리, 프로세서, 및 드라이버를 포함할 수 있다. 메모리는 파형을 생성하기 위해 프로세서에 의해 사용될 미리 결정된 속도 또는 속도 변동 정보를 보유할 수 있다. 메모리는 또한 미리 결정된 파형을 유지할 수 있다. 파형은 구동 신호를 생성하기 위해 드라이버에 전송될 수 있다. 일부 실시예에서, 위치 처리 모듈은 시간 경과에 따른 이동 스테이지에 대한 위치 정보를 수신하기 위해 인코더(예를 들어, 선형 인코더)에 작동 가능하게 연결된다. 위치 처리 모듈은 선형 인코더의 정보에서 속도 변동의 함수로 구동 신호를 생성할 수 있고, 이는 이후 가속 추적 미러 (또는 단일 미러 실시예에서 기판 추적 미러(도 7b))에 구동 신호를 보내기 위해 드라이버에 전송할 수 있다. 스테이지에서 추적 미러의 이동까지의 데이터 수집 경로는 점선 화살표로 표시되고, 이는 위치 처리 모듈에서 가속도 추적 미러(150) 또는 모션 추적 미러(145)에 작동 가능하게 연결된 모터로 전송되는 구동 신호 또한 포함한다. 도 7a 및 7b는 또한 이중 미러 실시예에 따라 조명원으로부터 카메라에 의한 검출까지의 광의 광학적 경로를 도시한다. 도 7a 및 7b에서 실선(화살표 아님)은 모터와 모터에 의해 작동되는 장치의 구성요소 사이의 작동 가능한 연결을 나타낸다.
예시적인 실시예에서, 광학 스캐닝 시스템은 조명 광원을 더 포함한다. 다양일 실시예에서, 조명원은 생체분자 검출에 사용될 수 있는 다양한 형광단과 양립가능한 다양한 파장의 광, 예를 들어 400 nm 내지 800 nm 범위의 파장의 광을 방출할 수 있다.
일부 실시예에서, 광의 파장은 약 400 nm 내지 약 800 nm의 범위에 있다. 일부 실시예에서, 광의 파장은 약 400 nm 내지 약 450 nm, 약 400 nm 내지 약 500 nm, 약 400 nm 내지 약 550 nm, 약 400 nm 내지 약 600 nm, 약 400 nm 내지 약 650 nm, 약 400 nm 내지 약 700 nm, 약 400 nm 내지 약 750 nm, 약 400 nm 내지 약 800 nm, 약 450 nm 내지 약 500 nm, 약 450 nm 내지 약 550 nm, 약 450 nm 내지 약 600 nm, 약 450 nm 내지 약 650 nm, 약 450 nm 내지 약 700 nm, 약 450 nm 내지 약 750 nm, 약 450 nm 내지 약 800 nm, 약 500 nm 내지 약 550 nm, 약 500 nm 내지 약 600 nm, 약 500 nm 내지 약 650 nm, 약 500 nm 내지 약 700 nm, 약 500 nm 내지 약 750 nm, 약 500 nm 내지 약 800 nm, 약 550 nm 내지 약 600 nm, 약 550 nm 내지 약 650 nm, 약 550 nm 내지 약 700 nm, 약 550 nm 내지 약 750 nm, 약 550 nm 내지 약 800 nm, 약 600 nm 내지 약 650 nm, 약 600 nm 내지 약 700 nm, 약 600 nm 내지 약 750 nm, 약 600 nm 내지 약 800 nm, 약 650 nm 내지 약 700 nm, 약 650 nm 내지 약 750 nm, 약 650 nm 내지 약 800 nm, 약 700 nm 내지 약 750 nm, 약 700 nm 내지 약 800 nm, 또는 약 750 nm 내지 약 800 nm 의 범위에 있다. 일부 실시예에서, 광의 파장은 약 400 nm, 약 450 nm, 약 500 nm, 약 550 nm, 약 600 nm, 약 650 nm, 약 700 nm, 약 750 nm, 또는 약 750 nm, 약 800 nm의 범위에 있다. 일부 실시예에서, 광의 파장은 적어도 약 400 nm, 약 450 nm, 약 500 nm, 약 550 nm, 약 600 nm, 약 650 nm, 약 700 nm, 또는 약 750 nm 의 범위에 있다. . 일부 실시예에서, 광의 파장은 최대 약 450 nm, 약 500 nm, 약 550 nm, 약 600 nm, 약 650 nm, 약 700 nm, 약 750 nm, 또는 약 800 nm 의 범위에 있다.
일부 실시예에서, 조명원은 대물 렌즈에 의해 수집된 광이 필드를 통해 대물 렌즈로 전달되도록 기판 아래에 장착된다. 다른 실시예에서, 조명원은 대물 렌즈에 의해 수집된 광이 필드에 의해 대물 렌즈로 반사되도록 기판 위에 장착된다.
광학 스캐닝 시스템은 이색 미러(dichroic mirror)를 더 포함할 수 있다. 예시적인 실시예에서, 광학 스캐닝 시스템은 조명원 및 이색 미러를 더 포함하고, 이색 미러는 적어도: (a) 기판의 필드를 조명하기 위해 조명원으로부터의 광을 반사하고; (b) 샘플에서 방출되고 대물 렌즈를 통과하는 광을 통과시키도록 구성되고 작동한다.
일부 실시예에서, 광학 스캐닝 시스템은 스플리터를 더 포함한다. 스플리터는 가속도 및 속도 추적 미러(또는 단일 추적 미러) 후 광학 경로를 따라 배치되어 필드 이미지를 포함하는 광학 신호를 2개 이상의 카메라로 분할할 수 있다.
광학 스캐닝 시스템은 또한 추적 미러와 대물 렌즈 사이의 광학 경로에 위치된 튜브 렌즈 구성요소를 포함할 수 있어, 추적 미러가 대물 렌즈의 동(pupil)에 위치할 수 있게 한다. 릴레이 렌즈 또는 튜브 렌즈는 이미지를 반전시키거나 광학 경로를 확장하기 위해 다른 위치에서 광학 경로를 따라 사용될 수도 있다.
일부 실시예에서, 광학 스캐닝 시스템은 모든 광선이 명목상 평행하고 또한 작은 빔 직경을 갖는 광학 경로의 영역을 생성하기 위해 사용되는 릴레이 렌즈 시스템을 포함한다. 일부 실시예에서, 스캐닝 광학 요소는 광학 경로가 작은 빔 직경을 갖는 곳에 배치되어 다음과 같은 배치를 보장한다: (i) 전력 손실을 최소화하고, (ii) 이미지 품질 저하를 최소화하고, (iii) 광학 요소의 크기를 최소화하여 질량이 가능한 한 작을 수 있다. 이는 더 높은 스캐닝 주파수와 더 가벼운 시스템을 가능하게 한다.
릴레이 렌즈 시스템의 사용은 기판 상의 생체분자 검출에 사용되는 형광 기반 광학 스캐닝 시스템을 용이하게 할 수 있고, 이러한 시스템은 일반적으로 희미한 형광 이미지와 함께 매우 낮은 광 레벨을 사용하기 때문이다. 따라서 릴레이 렌즈는 이미지 획득 시간을 최소화하기 위해 광학 스캐닝 시스템의 효율성과 감도를 높이는 데 효과적이다. 또한, 일부 실시예에서, 조명 강도는 기판 상의 생체분자를 손상시킬 수 있는 지점 아래로 유지되어야 한다.
도 8a는 이중 미러 실시예에 따라 기판을 이미징하기 위한 예시적인 방법을 예시한다. 도 8a의 방법은 특정 유형의 기계 또는 장치에 의해 수행되는 것으로 제한되지 않으며, 따라서 이하의 방법 설명은 제한적인 의미가 아니라 예시적인 것으로 간주되어야 한다.
단계 810에서, 이동식 스테이지는 대물 렌즈의 광축에 수직인 평면에서 대물 렌즈 아래의 기판을 이동한다. 기판이 움직이는 동안, 단계 820에서 서보 메커니즘(예: 전기 모터)은 기판의 필드의 이미지를 캡처하는 동안 이동 스테이지의 속도를 추적하기 위해 속도 추적 미러의 각도를 변경한다. 일부 태양에서, 속도 추적 미러의 일부이거나 이에 결합된 위치 처리 모듈은 속도 추적 미러에 작동 가능하게 연결된 서보 메커니즘을 제어하는 로직을 실행한다. 단계 840에서 서보 메커니즘은 기판의 필드의 이미지를 캡처하는 동안 이동 스테이지의 속도 변동을 추적하기 위해 가속도 추적 미러의 각도를 변경한다. 일부 태양에서, 가속도 추적 미러의 일부이거나 이에 결합된 위치 처리 모듈은 이동식 스테이지와 협력하여 서보 메커니즘을 제어하는 로직을 실행한다. 일부 실시예에서, 로직은 이동식 스테이지의 움직임(예: 속도 변동)을 나타내는 피드백 제어 정보를 수신하고 이 정보를 사용하여 차례로 가속도 추적 미러의 각도를 변경하는, 서보 메커니즘에 대한 입력 신호를 조정하여, 속도 추적 미러와 가속도 추적 미러의 결합된 움직임을 이동식 스테이지의 움직임과 동기화한다. 일부 양상들에서, 이 피드백 정보는 이동식 스테이지(830)의 움직임에 임의의 비선형성이 있는지 여부를 검출하는 선형 제어기로부터 수신(831)된다. 로직은 이후 이 정보를 사용하여 오프셋 보정값을 계산하고 오프셋 보정값을 추적 미러와 카메라 사이의 광학 경로에서 가속도 추적 미러의 각도를 제어하는 서보 메커니즘에 대한 입력 신호로 전달한다. 이러한 방식으로, 가속도 추적 미러의 각도에 작은 조정을 함으로써, 로직은 획득되는 중인 이미지로부터 이동식 스테이지의 움직임에서 비선형성에 의해 유발되는 모든 오류를 효과적으로 제거한다.
단계 850에서, 카메라는 기판이 이동식 스테이지에 의해 이동되는 동안 기판(또는 그 일부)의 정지 이미지를 기록한다.
도 8b는 단일 미러 실시예에 따라 기판을 이미징하기 위한 예시적인 방법을 예시한다. 도 8b의 방법은 특정 유형의 기계 또는 장치에 의해 수행되는 것으로 제한되지 않으며, 따라서 이하의 방법 설명은 제한적인 의미라기 보다 예시적인 것으로 간주되어야 한다.
단계 810에서, 이동식 스테이지는 대물 렌즈의 광학 축에 수직인 평면에서 대물 렌즈 아래의 기판을 이동시키며, 여기서 기판은 이미징의 표적인 다수의 별개의 피처를 포함한다.
기판이 움직이는 동안, 단계 845에서 서보 메커니즘은 기판의 필드의 이미지를 캡처하는 동안 이동 스테이지의 속도 변동을 추적하기 위해 모션 추적 미러의 각도를 변경한다. 일부 태양에서, 모션 추적 미러의 일부이거나 그에 결합된 위치 처리 모듈은 이동식 스테이지와 협력하여 서보 메커니즘을 제어하는 로직을 실행한다. 일부 실시예에서, 로직은 이동식 스테이지의 움직임(예: 속도 변동)을 나타내는 피드백 제어 정보를 수신하고 이 정보를 사용하여, 차례로 이동식 스테이지의 속도 변동을 보상하기 위해 모션 추적 미러의 각도를 변경하는, 서보 메커니즘에 대한 입력 신호를 조정한다. 일부 실시예에서, 위치 처리 모듈은 이동식 스테이지의 속도 변동을 미리 결정된 속도를 추적하기 위한 톱니파형으로 통합하며, 이는 모션 추적 미러의 움직임을 제어하기 위한 구동 신호로 사용된다. 일부 태양에서, 이 피드백 정보는 이동식 스테이지(830)의 모션에 임의의 비선형성이 있는지 여부를 검출하는 선형 제어기로부터 수신(831)된다. 이후, 로직은 오프셋 보정값을 계산하기 위해 이 정보를 사용하고 광학 경로에서 모션 추적 미러의 각도를 제어하는 서보 메커니즘에 대한 입력 신호로서 오프셋 보정값을 전달한다. 이러한 방식으로, 모션 추적 미러의 각도를 약간 조정함으로써, 로직은 획득되는 중인 이미지로부터 이동식 스테이지의 모션에서 비선형성에 의해 유발되는 모든 오류를 효과적으로 제거한다.
단계 850에서, 카메라는 기판이 이동식 스테이지에 의해 이동되는 동안 기판(또는 그 일부)의 정지 이미지를 기록한다.
본 명세서에 제공된 광학 스캐닝 시스템은 일반적으로 스테이지 속도만 추적하는 장치에서 흐릿한 이미지를 초래하는 스테이지 속도(또는 움직이는 구성요소의 임의의 다른 이미징) 비선형성(예: 로컬 스테이지 가속도)을 보상하나, 스테이지 속도 변동을 보상하는 메커니즘을 갖고 있지 않다. 일부 실시예에서, 광학 스캐닝 시스템은 초당 30프레임으로 연속적으로 움직이는 기판 또는 다른 물체의 안정화된 이미지를 생성할 수 있다. 일부 실시예에서, 광학 스캐닝 시스템은 초당 10 내지 30 프레임으로 연속적으로 움직이는 기판 또는 기타 물체의 정지 이미지를 생성할 수 있다. 일부 실시예에서, 광학 스캐닝 시스템은 초당 40프레임으로 연속적으로 움직이는 기판 또는 기타 물체의 정지 이미지를 생성할 수 있다. 일부 실시예에서, 광학 스캐닝 시스템은 초당 30프레임, 초당 40프레임, 초당 50프레임, 초당 60프레임, 70프레임, 초당 80프레임, 초당 90프레임, 초당 100프레임, 초당 120프레임, 초당 150프레임 또는 초당 200프레임 이상에서 연속적으로 움직이는 기판 또는 기타 물체의 정지 이미지를 생성할 수 있다.
일부 실시예에서, 광학 스캐닝 시스템의 스테이지 속도 변동은 +/- 0.5%보다 크다. 일부 실시예에서, 광학 스캐닝 시스템의 스테이지 속도 변동은 +/- 0.1%보다 크다. 일부 실시예에서, 광학 스캐닝 시스템의 스테이지 속도 변동은 +/- 0.1%보다 크고, 카메라에 의해 관찰되는 바와 같이 +/- 0.1% 미만으로 감소된다.
일부 실시예에서, 광학 스캐닝 시스템의 스테이지 속도 변동은 +/- 1%보다 크다. 일부 실시예에서, 광학 스캐닝 시스템의 스테이지 속도 변동은 +/- 1%보다 크고, 카메라에 의해 관찰되는 바와 같이 +/- 1% 미만으로 감소된다.
일부 실시예에서, 본 명세서에 설명된 광학 스캐닝 시스템은 연속적으로 움직이는 스테이지에서 속도 변동을 보상하지 않는 시스템 보다 이미지의 선명도를 증가시킨다.
일부 실시예에서, 필드의 이미징 동안 기판이 이동하는 총 거리는 필드 이미지를 캡처하는 동안, 예상 속도를 기반으로 기 결정된 움직임에서 +/- 1픽셀 이상 벗어나면서, 동시에(센서에 투사된 기판의 이미지에 의해 측정됨), 광학 스캐닝 시스템은 픽셀 블러가 1 미만인 이미지를 생성한다. 일부 실시예에서, 픽셀은 ―150 nm x 150 nm의 필드 영역과 상호관계가 나타난다. 일부 실시예에서, 픽셀은 ―162.5nm x 162.5nm의 필드 영역과 상호관계가 나타난다. 일부 실시예에서, 픽셀은 단일 형광단의 크기보다 큰 필드의 영역과 상호관계가 나타난다.
픽셀 스미어는 이미지 선명도에 대한 하나의 척도이고 이미지 센서에 대한 광학 필드에서 기판의 움직임으로 인해 발생하는 이미지 아티팩트를 나타낸다. 픽셀 스미어를 측정하는 한 가지 방법은 이심률(eccentricity)이라고도 알려진 단일 지점의 장축과 단축의 비율을 확인하는 것이다. 일부 실시예에서, 광학 스캐닝 시스템에 의해 생성된 이미지의 이심률은 3 미만이다. 일부 실시예에서, 이미지의 이심률은 신뢰할 수 있는 단일 형광단 검출이다.
도 9a 및 9b는 본 명세서에 제공된 광학 스캐닝 시스템으로부터의 기판의 결과 이미지의 픽셀 스미어 및 이심률의 예를 제공한다. 파란색 점은 단일 조명 형광단을 나타내고, 각 사각형은 ~162nm의 픽셀이다. 도 9a는 이심률이 2인 +/- 1픽셀의 바람직한 범위 내에서 +1픽셀의 픽셀 스미어의 예이다. 9b도 9b는 이심률이 3인 선호하는 +/- 1픽셀 범위를 벗어난 +2 픽셀의 픽셀 스미어의 예이다.
도 10은 광학 스캐닝 장치로 또는 광학 스캐닝 장치로부터 정보를 전송하기 위한 시스템 환경을 예시한다. 시스템 환경은 하나 이상의 클라이언트 장치(1010), 하나 이상의 서버(1030), 서버(1030)에 액세스 가능한 데이터베이스(1005)를 포함할 수 있으며, 여기서 이들 당사자 모두는 네트워크(1020)를 통해 연결된다. 다른 실시예에서, 상이한 및/또는 추가 엔티티가 시스템 환경에 포함될 수 있다.
시스템 환경은 광학 스캐닝 장치(1040)의 결과가 네트워크(1020)를 통해 클라이언트 장치(1010)에 있는 하나 이상의 다른 사용자와 공유되도록 한다. 결과는 웹에 업로드될 수도 있다.
네트워크(1020)는 시스템 환경의 구성요소 간의 통신을 용이하게 한다. 네트워크(1020)는 인트라넷, 엑스트라넷 또는 인터넷과 같은 임의의 유선 또는 무선 랜(Local Area Network; LAN) 및/또는 광역 통신망(Wide Area Network)일 수 있다. 다양한 실시예에서, 네트워크(1020)는 표준 통신 기술 및/또는 프로토콜을 사용한다. 네트워크(1020)에 의해 사용되는 기술의 예는 이더넷, 802.11, 3G, 4G, 802.16, 또는 임의의 다른 적절한 통신 기술을 포함한다. 네트워크(1020)는 무선, 유선, 또는 무선 및 유선 통신 기술의 조합을 사용할 수 있다. 네트워크(1020)를 통한 통신에 사용되는 네트워킹 프로토콜의 예는 멀티프로토콜 레이블 스위칭(Multiprotocol Label Switching; MPLS), TCP/IP(Transmission Control Protocol/Internet Protocol), HTTP(Hypertext Transport Protocol), SMTP(Simple Mail Transfer Protocol) 및 파일 전송 프로토콜(File Transfer Protocol; FTP)을 포함한다. 네트워크(1020)를 통해 교환되는 데이터는 HTML(Hypertext Markup Language) 또는 XML(Extensible Markup Language)과 같은 임의의 적절한 형식을 사용하여 표시될 수 있다. 일부 실시예에서, 네트워크(1020)의 통신 링크의 전부 또는 일부는 임의의 적절한 기술 또는 기술들을 사용하여 암호화될 수 있다.
클라이언트 장치(들)(1010)는 사용자 입력을 수신할 수 있을 뿐만 아니라 네트워크(1020)를 통해 데이터를 전송 및/또는 수신할 수 있는 컴퓨팅 장치이다. 일 실시예에서, 클라이언트 장치(1010)는 데스크탑 또는 랩탑 컴퓨터와 같은 통상적인 컴퓨터 시스템이다. 대안적으로, 클라이언트 장치(1010)는 개인 휴대 정보 단말기(Personal Digital Assistant; PDA), 이동 전화, 스마트폰 또는 다른 적절한 장치와 같은 컴퓨터 기능을 갖는 장치일 수 있다. 클라이언트 디바이스(1010)는 네트워크(1020)를 통해 통신하도록 구성된다.
일부 실시예에서, 시스템 환경은 하나 이상의 서버를 포함할 수 있으며, 예를 들어 진단 시스템은 네트워크(1020)를 통해 광학 스캐닝 장치(1040) 및/또는 임의의 클라이언트 장치(1010)와 통신하는 엔티티에 의해 관리되는 서비스를 포함한다. 서버(1030)는 데이터베이스(1005)에 데이터를 저장할 수 있고 데이터베이스(1005)에 저장된 데이터에 액세스할 수 있다. 서버(1030)는 또한 클라우드에 데이터를 저장할 수 있다. 일부 실시예에서, 서버(1030)는 때때로 광학 스캐닝 장치(1040)에 업데이트를 푸시하거나, 광학 스캐닝 장치(1040)로부터 결과 데이터를 수신하고 그 결과 데이터에 대해 특정 분석을 수행하고 분석된 데이터를 다시 광학 스캐닝 장치(1040) 또는 클라이언트 장치(1010)에 제공할 수 있다.
일부 실시예에서, 광학 스캐닝 장치(1040) 기능은 모바일 휴대폰과 같은 클라이언트 장치(1010)에 포함될 수 있고, 휴대폰에 설치된 모바일 애플리케이션을 통해 작동될 수 있다. 휴대폰에 저장된 모바일 애플리케이션은 광학 스캐닝 장치로부터 판독된 결과를 처리하고 그 결과를 네트워크(820)의 다른 장치(810)와 공유할 수 있다.
용어 "적어도", "초과" 또는 "이상"이 일련의 2개 이상의 숫자 값에서 첫 번째 숫자 값 앞에 올 때마다 용어 "적어도", "초과" 또는 "이상"은 일련의 숫자 값에 있는 각 숫자 값에 적용된다. 예를 들어, 1, 2 또는 3이상은 1 이상이거나, 2 이상이거나, 3 이상과 동등하다.
용어 "보다 크지 않음", "미만" 또는 "이하"는 2개 이상의 일련의 숫자 값에서 첫 번째 숫자 값 앞에 올 때마다 용어 "보다 크지 않음", "미만" 또는 "이하"은 일련의 숫자 값에 있는 각 숫자 값에 적용된다. 예를 들어, 3, 2 또는 1이하는, 3이하이거나, 2 이하이거나, 1 이하와 동등하다.
본 발명의 바람직한 실시예는 본 명세서에 도시되고 설명되었지만, 그러한 실시예는 단지 예로서 제공된다는 것이 본 발명의 기술분야에 속한 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 본 발명이 명세서 내에 제공된 특정한 예시에 의해 제한되는 것으로 의도되는 것은 아니다. 본 발명이 전술한 명세서를 참조하여 설명되었지만, 본 명세서의 실시예에 대한 설명 및 예시는 제한적인 의미로 해석되어서는 안 된다. 이제 수많은 변형, 변경 및 대체는 본 발명의 벗어남이 없이 당업자에게 발생될 것이다. 또한, 본 발명의 모든 태양은 다양한 조건 및 변수에 의존하는 본 명세서에 기재된 특정 묘사, 구성 또는 상대적 비율로 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 본 명세서에 기술된 본 발명의 실시예에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실시하기 위해 사용될 수 있음을 이해해야 한다. 따라서, 본 발명은 그러한 대안, 수정, 변형 또는 등가물도 포함할 것으로 생각된다. 다음 청구범위는 본 발명의 범위를 정의하고 이러한 청구범위 및 그 균등물의 범위 내의 방법 및 구조는 이에 의해 포함되도록 의도된다.
시퀀싱
회절 한계 ―λ/(2*NA) 미만의 중심 대 중심 간격을 갖는 표면 상에 배치된 분석물로부터의 신호의 영상화를 용이하게 하는 시스템 및 방법이 본 명세서에 제공된다. 이러한 시스템 및 방법은 고급 이미징 시스템을 사용하여 고해상도 이미지를 생성하고, 기판 상의 분자 위치 결정을 높은 정확도로 용이하기 위해 순환 검출을 사용하고 이미지의 디컨볼루션을 통해 밀집하게 패킹된 표면에서 높은 정확도로 각 분자에 대한 신호 동일성을 획득하기 위해 디컨볼루션을 사용한다. 이러한 방법 및 시스템은 밀집하게 패킹된 기판에서 합성에 의한 단일 분자 시퀀싱을 허용하여 높은 정확도로 매우 효율적이고 매우 높은 처리량의 폴리뉴클레오티드 시퀀스 판단을 제공한다.
시퀀싱 시스템의 주요 비용 요소는 주로 바이오칩 및 시약을 포함하는 소모품이고 이차적으로는 기기 비용이다. $10 30x 게놈에, 100배 비용 절감에 도달하기 위해서, 단위 면적 당 데이터의 양은 100배 증가해야 하고 데이터 포인트 당 시약의 양은 100배 감소해야 한다.
도 11은 어레이 피치에 대한 시퀀서 처리량을 나타내고 $10 게놈에 필요한 기준을 충족하는 시스템 설계를 개략적으로 도시한다. 기본 아이디어는 100배 비용 절감을 달성하기 위해서는 단위 면적 당 데이터 양이 100배 증가해야 하고 데이터 포인트당 시약 양이 100배 감소해야 한다는 것이다. 이러한 비용 절감을 달성하기 위해, 회절 한계 미만의 밀도에서 기판 표면에 고정된 폴리뉴클레오티드의 신뢰할 수 있는 시퀀싱을 용이하게 하는 방법 및 시스템이 제공된다. 이러한 고밀도 어레이는 시약의 보다 효율적인 사용을 허용하고 단위 면적당 데이터의 양을 증가시킨다. 또한, 검출 신뢰도의 증가는 시퀀싱 및 검출의 오류를 식별하고 보정하기 위해 합성되어야 하는 클론 카피의 수를 감소시키게 하고, 나아가 시약 비용 및 데이터 처리 비용을 더욱 감소시킨다.
기판 표면의 분석물의 고밀도 분포
도 12a는 240nm 피치에서 80nm 직경 결합 영역(스팟)의 고밀도 영역의 제안된 실시예를 도시한다. 이 실시예에서, 단일 가닥 DNA 분자가 칩 상의 특정 영역에 독점적으로 결합하는 경우 정렬된 어레이가 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, 40kB보다 작은 연쇄동일서열(즉, 직렬로 연결된 동일한 DNA 시퀀스의 다중 사본을 포함하는 긴 연속 DNA 분자)이 스팟을 과도하게 채우지 않도록 사용된다. 연쇄동일서열의 크기는 면적에 따라 대략적으로 조정되며, 이는 동일한 증폭 프로세스가 사용되는 경우 더 작은 연결기의 투영된 길이가 대략 4kB에서 5kB로 결과적으로 약 10개 사본이 된다는 것을 의미한다. 4kB 길이의 DNA를 사용하고 단일 분자를 직접 시퀀스화하는 것도 가능하다. 또 다른 옵션은 전체 길이를 배제 분자를 생성하기 위해 필요한 크기까지 가져오기 위해 DNA의 더 짧은 세그먼트를 시퀀싱되지 않은 필러 DNA와 결합하는 것이다.
도 12b는 $1,000 게놈에 사용된 샘플 유효 피치와 제안된 피치를 비교한 것이다. 새로운 어레이의 밀도는 170배 더 높아 100배 더 높은 밀도를 달성하는 기준을 충족한다. 단위 면적 별 이미징 스팟 당 사본의 수는 또한 기존의 기존 플랫폼보다 적어도 100배 더 낮다는 기준을 충족한다. 시약 비용이 기준선보다 100배 더 비용 효율적임을 보장하기 위해 도움이 된다.
밀집하게 패킹된 단일 생체분자 이미징 및 회절 한계
밀집하게 포장된 단일 생체 분자 및 회절 한계 이미징이미징 플랫폼의 분자 밀도 증가에 대한 주요 제약은 회절 한계이다. 광학 시스템의 회절 한계에 대한 방정식은 다음과 같다:
D = λ / 2 * NA 여기서 D는 회절 한계, λ는 광의 파장, NA는 광학 시스템의 개구수이다. 전형적인 공기 이미징 시스템은 0.6 내지 0.8의 NA를 갖는다. λ=600 nm를 사용하여, 회절 한계는 375 nm와 500 nm 사이이다. 수침 시스템의 경우, NA는 ~1.0이며, 300nm의 회절 한계를 제공한다.
어레이 또는 생체분자를 포함하는 기타 기판 표면의 피처가 너무 가까우면 두 개의 광학 신호가 너무 많이 중첩되므로 이미지만으로는 안정적으로 해결할 수 없는 단일 얼룩만 보게 된다. 이는 움직이는 기판의 부정확한 추적으로 인한 흐림 또는 센서와 기판 표면 사이의 광 경로의 광학적 변화와 같은, 광학 이미징 시스템에 의해 도입된 오류로 인해 악화될 수 있다.
투과광 또는 형광 방출 파면은 대물 개구의 가장자리에서 회절되고, 파면을 효과적으로 확산시켜 중심 디스크는 유한하나, 원래의 점보다 더 큰 크기의 회절 패턴으로 확대되는 점원의 이미지를 생성한다. 따라서, 광의 회절로 인해 현미경 광학 시스템이 구조적 세부 사항을 해결할 수 없는 하한이 있기 때문에 시편의 이미지는 시편에 존재하는 실제 세부 사항을 완벽하게 나타내지 못한다.
현미경으로 서브 파장 구조를 관찰하는 것은 회절 한계 때문에 어렵다. 형광 단백질 또는 뉴클레오티드 단일 분자와 같은, 현미경의 점 물체는, 간섭 작용에 의해 생성된 회절 패턴으로 구성된 중간 평면에서 이미지를 생성한다. 고배율에서 점 물체의 회절 패턴은 일련의 회절 고리로 둘러싸인 중심 점(회절 디스크)으로 이루어진 것으로 관찰된다. 결합된, 이 점광원 회절 패턴을 에어리(Airy) 디스크라고 한다.
에어리 패턴에서 중심 스팟의 크기는 광의 파장 및 대물렌즈의 개구각과 관련이 있다. 현미경 대물렌즈의 경우, 개구각은 대물렌즈가 시편에서 광을 모을 수 있는 반각인 sin θ라는 용어를 포함하는 개구수(NA)로 설명된다. 해상도 측면에서, 측면(x,y) 이미지 평면에서 회절의 반경 에어리 디스크는 다음 공식으로 정의된다: Abbe Resolutionx,y=λ/2NA, 여기서 λ는 투과광에서 조명의 평균 파장 또는 형광에서 여기 파장 대역이다. 대물렌즈의 개구수(NA=n·sin(θ))는 이미징 매체(n; 일반적으로 공기, 물, 글리세린 또는 오일)의 굴절률에 개구각의 사인(sin(θ))을 곱한 값으로 정의된다. 이 관계의 결과로, 점광원에 의해 생성된 스팟의 크기는 파장이 감소하고 개구수가 증가함에 따라 감소하나, 언제나 유한한 직경의 디스크로 남아 있다. 아베 해상도(즉, 아베 한계)는 본 명세서에서 회절 한계라고도 지칭되고 광학 시스템의 해상도 한계를 정의한다.
두 개의 에어리 디스크 또는 포인트 스프레드 함수 사이의 거리가 이 값보다 큰 경우, 2개의 점광원은 분해된 것으로 간주된다(그리고 쉽게 구별될 수 있음). 그렇지 않으면, 에어리 디스크는 함께 병합되고 분해되지 않은 것으로 간주된다.
따라서, 파장이 λ인 단일 분자 검출이 가능한 라벨 점광원으로부터 방출되고, 굴절률이 n인 매질에서 이동하고 반각 θ의 스팟으로 수렴하는 광은 직경: d=λ/2*NA인 회절 한계 지점을 만든다. 500nm 부근의 녹색광과 1인 NA(개구수)를 고려하면, 기존의 이미징 기술로 이미징할 수 있는 표면의 단일 분자 단백질 및 뉴클레오티드와 같은 분석물의 밀도를 제한하는, 회절 한계는 대략 d=λ/2=250 nm(0.25 μm)이다. 광학 현미경에 이용 가능한 최고 품질의 렌즈 요소가 장착되고, 완벽하게 정렬되고, 가장 높은 개구수를 갖는 경우에도, 최상의 시나리오에서 해상도는 광의 파장의 약 절반으로 제한된다. 해상도를 높이기 위해서는, UV 및 X선 현미경과 같은 더 짧은 파장을 사용할 수 있다. 이러한 기술은 더 나은 해상도를 제공하나, 비용이 많이 들고 생물학적 샘플의 대비의 부족으로 어려움을 겪고 샘플을 손상시킬 수 있다.
디컨볼루션
디컨볼루션은 기록된 데이터에 대한 컨볼루션의 영향을 역전시키는 데 사용되는 알고리즘 기반 프로세스이다. 디컨볼루션의 개념은 신호 처리 및 이미지 처리 기술에서 널리 사용된다. 이러한 기술은 차례로 많은 과학 및 공학 분야에서 널리 사용되기 때문에 디컨볼루션은 많은 응용 분야를 찾아낸다.
광학 및 이미징에서 용어 "디컨볼루션"은 특히 광학 현미경, 전자 현미경, 망원경 또는 기타 이미징 기기에서 발생하는 광학 왜곡을 반전시켜 보다 선명한 이미지를 생성하는 프로세스를 지칭하기 위해 사용된다. 이는 일반적으로 현미경 이미지 처리 기술의 일부로 소프트웨어 알고리즘에 의해 디지털 영역에서 수행된다.
일반적인 방법은 기기를 통한 광학 경로가 광학적으로 완벽하고 포인트 스프레드 함수(Point Spread Function; PSF)로 컨볼루션되어 있다고 가정하는 것으로, 즉, 이론적인 포인트 광원(또는 다른 파동)이 기기를 통과하는 경로의 관점에서 왜곡을 설명하는 수학적 함수이다. 일반적으로, 이러한 포인트 소스는 최종 이미지에 작은 영역의 흐릿함(fuzziness)을 제공한다. 만약 이 함수가 결정될 수 있다면, 이후 그것의 역함수 또는 보완함수를 계산하고, 획득된 이미지를 그것과 컨볼루션하는 것이 문제이다. 디컨볼루션은 푸리에 공동 도메인(Fourier co-domain)의 분할에 매핑된다. 이는 푸리에 변환의 대상이 되는 실험 데이터에 디컨볼루션을 쉽게 적용할 수 있게 한다. 예시는 데이터가 시간 영역에 기록되나, 주파수 영역에서 분석되는 는 NMR 분광법이다. 그러나 주파수 영역에서 분석된다. 지수 함수에 의한 시간 영역 데이터의 분할은 주파수 영역에서 로렌치안 라인의 폭을 줄이는 효과가 있다. 결과는 왜곡되지 않은 원본 이미지이다.
그러나, 회절 한계 이미징의 경우, 포인트 스프레드 함수가 완벽하게 알려져 있더라도, 디컨볼루션은 회절 한계를 넘어 해상도를 개선하기 위해 신호를 추가로 정제하기 위해서도 요구된다. 나이퀴스트 거리보다 작은 거리에서 두 물체를 안정적으로 분리하는 것은 매우 어렵다. 그러나, 나이퀴스트 거리보다 훨씬 작은 거리로 분리된 물체를 안정적으로 검출하기 위해 순환 검출, 분석물 위치 결정, 정렬 및 디컨볼루션을 사용하는 방법 및 시스템이 본 명세서에 설명되어 있다.
시퀀싱
광학 검출 이미징 시스템은 회절 한계적이고, 따라서 시퀀싱에 일반적으로 사용되는 형광단을 사용하여 이론상 최대 해상도가 ~300 nm이다. 현재까지, 최고의 시퀀싱 시스템은 어레이에서 ~600 nm, 또는 회절 한계의 ~2배의 인접한 폴리뉴클레오티드 사이의 중심 간 거리를 가지고 있다. 이러한 2x의 인자는 위치 오류를 유발할 수 있는 강도, 어레이 및 생물학적 변화를 설명하기 위해 요구된다. $10 게놈을 달성하기 위해, 대략 200 nm 중심 대 중심 간격이 필요하고, 이는 서브 회절 한계 이미징 기능을 요구한다.
시퀀싱의 경우, 본 명세서에 설명된 시스템 및 방법의 목적은 광학 시스템의 회절 한계 미만의 중심 간 거리로 기판에서 시퀀싱 된 폴리뉴클레오티드를 분해하는 것이다.
본 명세서에 기술된 바와 같이, 우리는 부분적으로 높은 정확도(예: 10 nm RMS 이하)로 각 분석물의 위치를 식별하여 서브 회절 한계 이미징을 달성하는 방법 및 시스템을 제공한다. 이에 비해, 최첨단 초해상도 시스템(Harvard/STORM)은 이 시스템보다 2배 더 악화된 20nm RMS까지의 정확도로만 위치를 식별할 수 있다. 따라서, 본 명세서에 개시된 방법 및 시스템은 서브-회절 한계 이미징을 통해 기판 상의 밀집하게 패킹된 분자를 식별하여 효소 단위 당 높은 데이터 속도, 단위 시간 당 데이터 속도 및 $10 게놈을 달성하기 위한 높은 데이터 정확도를 달성할 수 있다. . 이러한 서브 회절 한계 이미징 기술은 본 명세서에 설명된 순환 검출을 사용하는 기술에 광범위하게 적용할 수 있다.
이미징 및 순환 검출
본 문서에 기술된 바와 같이, 각각의 검출 방법 및 시스템은 회절 이하의 제한된 이미징을 달성하기 위해 순환 검출을 요구했다. 순환 검출에는 바인딩과 이미지 또는 가시 광선 광학 신호를 방출할 수 있는 검출 가능한 라벨에 결합된, 예를 들어, 항체, 뉴클레오티드와 같은, 프로브를 포함한다. 서로 다른 사이클에서 필드의 일련의 이미지로부터 위치 정보를 사용함으로써, 밀집하게 패킹된 기판으로부터의 신호를 해결하기 위한 디컨볼루션은 광학 이미징의 회절 한계로 인해 가려진 신호로부터 개별 광학 신호를 식별하기 위해 효과적으로 사용될 수 있다. 여러 사이클 후 분자의 정확한 위치는 점점 더 정확해질 것이다. 이 정보를 사용하여 픽셀 이산화 효과로 인해 발생하는 크로스토크 행렬 내 공지된 비대칭에 관한 크로스토크 보정을 지원하기 위해 추가 계산이 수행될 수 있다.
순환 프로브 결합 및 광학 검출을 사용하는 방법 및 시스템은 전체 내용이 참조로 본 명세서에 통합된, 미국 공개 번호 2015/0330974, 2015년 11월 19일 공개된, 단일 분자 검출을 사용한 분자 분석물의 디지털 분에서 설명된다.
일부 실시예에서, 원시 이미지는 오버샘플링 된 이미지의 보다 정확한 판단을 용이하게 하기 위해 적어도 나이퀴스트(Nyquist) 한계인 샘플링을 사용하여 획득된다. 나이퀴스트 한계를 초과하여(오버샘플링) 샘플링하여 이미지를 표현하기 위해 사용되는 픽셀 수를 늘리면 이미지 처리 및 표시에 사용할 수 있는 픽셀 데이터가 증가한다.
이론적으로, 대역폭이 제한된 신호는 나이퀴스트 레이트 이상으로 샘플링되는 경우 완벽하게 재구성될 수 있다. 나이퀴스트 레이트는 신호에서 가장 높은 주파수 성분의 2배로 정의된다. 오버샘플링은 해상도를 향상시키고, 노이즈를 줄이며, 앤티 앨리어싱 필터 성능 요구 사항을 완화하여 앨리어싱 및 위상 왜곡을 방지하는데 도움을 준다. 신호가 나이퀴스트 레이트의 N배로 샘플링되는 경우 신호는 N의 인수만큼 오버샘플링 된다고 한다.
따라서, 일부 실시예에서, 각각의 이미지는 관찰되는 광 파장의 절반 이하의 픽셀 크기로 찍힌다. 일부 실시예에서, 162.5 nm x 162.5 nm의 픽셀 크기는 나이퀴스트 한계 이상에서 샘플링을 달성하기 위해 검출에 사용된다. 본 명세서에 설명된 시스템 또는 방법의 해상도를 최적화하기 위해 기판의 원시 이미징 동안 적어도 나이퀴스트 한계의 주파수에서 샘플링하는 것이 바람직하다. 이것은 높은 정확도로 회절 한계 미만에서 기판 상의 피처를 분해하기 위해 본 명세서에 설명된 디컨볼루션 방법 및 광학 시스템과 함께 수행될 수 있다.
다른 사이클에서의 이미지 처리
서브 회절 한계 이미징을 달성하기 위해 본 발명에 의해 극복된 몇 가지 문제점들이 있다.
픽셀화 오류는 원시 이미지에 존재하며 픽셀화로 인해 광학 신호에 존재하는 정보의 식별을 방지한다. 본 명세서에 설명된 적어도 나이퀴스트 주파수에서의 샘플링 및 오버샘플링 된 이미지의 생성은 각각 픽셀화 오류를 극복하는데 있어 도움을 준다.
다양한 분자의 포인트-스프레드(point-spread; PSF)는 PSF 크기가 픽셀 크기(나이퀴스트 이하)보다 크기 때문에 중첩되고 중심 간 거리가 너무 작아서 공간적 중첩으로 인한 혼선이 발생하기 때문에 중첩된다. 최근접 이웃 변수 회귀(중심 간 크로스토크의 경우)는 다중 중첩 광 신호의 디컨볼루션을 돕기 위해 사용될 수 있다. 그러나 이것은 기판 상의 각 분석물의 상대적인 위치를 알고 필드의 이미지가 잘 정렬된 경우 개선될 수 있다.
여러 사이클 후에 분자의 정확한 위치는 점점 더 정확해질 것이다. 이 정보를 사용하여 픽셀 이산화 효과 및 회절 한계로 인해 발생하는 광학 신호의 공간적 중첩에서 알려진 비대칭을 보정함으로써 디컨볼루션을 돕기 위해 추가 계산이 수행될 수 있다. 그것들은 또한 다른 방출 스펙트럼에서 방출 스펙트럼의 중첩을 보정하기위해 사용될 수 있다.
각 분석물에 대한 매우 정확한 상대적인 위치 정보는 각 분석물에 결합된 서로 다른 프로브의 광학 신호로부터 측정된 피크의 분포를 생성하기 위해 서로 다른 사이클에서 동일한 필드의 이미지를 오버레이함으로써 달성될 수 있다. 이 분포는 이후 분석물의 단일 상대적인 위치에 해당하는 피크 신호를 생성하기 위해 사용된다. 사이클의 서브셋에서 이미지는 각 분석물에 대한 상대적인 위치 정보를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, 이 상대적인 위치 정보는 로컬라이제이션 파일에서 제공된다.
각 사이클에 대한 필드에 대해 이미징 된 특정 영역은 사이클마다 다를 수 있다. 따라서, 각 이미지에 대한 분석물 위치의 식별 정확도를 개선하기 위해, 필드의 이미지 사이의 정렬은 여러 사이클에 걸쳐 수행될 수 있다. 이러한 정렬로부터, 참조 파일과 비교되는 오프셋 정보는 이후 식별되고 디컨볼루션 알고리즘에 통합되어 회절 한계로 인해 가려진 광 신호에 대한 디컨볼루션 및 신호 식별의 정확도를 더욱 높일 수 있다. 일부 실시예에서, 이 정보는 필드 정렬 파일에 제공된다.
신호 검출 (크로스토크/최인접 이웃)
기판의 분석물에 대한 상대적인 위치 정보가 정확하게 결정되고 각 사이클의 필드 이미지가 이 위치 정보와 정렬되면 크로스토크 및 최근접이웃 회귀를 사용한 오버샘플링 된 각 이미지의 분석은 각 이미지의 각 분석물질로부터 광학 신호를 정확하게 식별하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시예에서, 광학 시스템의 회절 한계에 의해 가려진 복수의 광학 신호는 기판 상에 고정되고 검출 가능한 라벨을 포함하는 프로브에 결합된 복수의 생체분자 각각에 대해 식별된다. 실시예에서, 프로브는 뉴클레오티드가 포함되고 일련의 사이클은 합성에 의한 단일 분자 시퀀싱을 사용하여 어레이 상에 고정된 폴리뉴클레오티드의 시퀀스를 결정하기 위해 사용된다.
이미지에 적용된 디컨볼루션의 시뮬레이션
분자 밀도는 이웃 분자의 크로스토크에 의해 제한된다. 도 13은 단일 분자의 시뮬레이션 된 이미지를 도시한다. 이 특정 이미지는 2x 오버샘플링 된 필터로 처리된 600nm 피치의 단일 분자 어레이의 시뮬레이션이다. 8개의 인접 지점으로의 크로스토크는 어레이 피치 및 알고리즘 유형의 함수로 평균화된다.
도14는 다중 피치 및 두 가지 변형 이미지 처리 알고리즘으로 처리된 일련의 이미지로, 첫 번째는 2x 오버샘플링 된 이미지이고 두 번째는 디컨볼루션이 있는 4x 오버샘플링 된 이미지이다. 도 15는 200nm까지의 피치에서 이 두 가지 유형의 이미지 처리에 대한 크로스토크 분석이다. 275nm 이상의 피치에 대해 2x 오버샘플로 25% 이하의 허용 가능한 크로스토크 수준이 발생한다. 광학 시스템의 포인트 확산 기능을 사용하는 4x 디컨볼루션으로 25% 이하의 허용 가능한 크로스토크 수준은 210nm 이상의 피치에 대해 발생한다.
분자의 물리적 크기는 대략적으로 결합 영역 크기의 약 절반으로 스팟을 넓힐 것이다. 예를 들어, 80nm 스팟의 경우 피치는 대략 40nm만큼 증가한다. 더 작은 스팟 크기가 사용될 수 있지만, 이것은 더 적은 수의 사본이 허용되고 더 큰 조명 강도가 요구된다는 절충안을 가질 것이다. 단일 사본은 가장 간단한 샘플 준비를 제공하지만 가장 큰 조명 강도를 필요로 한다.
지금까지 논의된 회절 한계 이미징을 위한 방법에는 오버샘플링, 디컨볼루션 및 크로스토크 보정의 이미지 처리 기술이 포함된다. 분석물에 대한 프로브 광학 신호 이미징의 다중 사이클로부터의 정보를 사용하여 기판 상의 정확한 상대적인 위치 분석물을 결정하는 방법 및 시스템이 본 명세서에 설명되어 있다. 이 정보를 사용하여 픽셀 이산화 효과로 인해 발생하는 크로스토크 행렬의 알려진 비대칭에 관한 크로스토크 보정을 돕기 위해 추가 계산이 수행될 수 있다.
방법
일부 실시예에서, 도 16에 도시된 바와 같이, 밀집하게 패킹된 기판의 표면에 고정된 분석물의 상대적인 위치를 정확하게 결정하기 위한 방법이 제공된다. 이러한 방법은 먼저 표면을 포함하는 기판을 제공하는 단계를 포함하며, 여기서 표면은 별개의 위치에서 표면에 고정된 복수의 분석물을 포함한다. 이후, 상기 표면에 대한 프로브 결합 및 신호 검출의 복수 사이클이 수행된다. 각 검출 사이클에는 표면에 고정된 표적 분석물에 결합할 수 있는 프로브 세트와 분석물을 접촉시키는 단계, 상기 표면 상의 개별 위치에서 상기 분석물에 결합된 개별 프로브로부터의 복수의 광학 신호를 검출하기 위해 광학 시스템으로 상기 표면의 필드를 이미징하는 단계, 및 또 다른 검출 사이클이 수행되어야 하는 경우 결합된 프로브를 제거하는 단계를 포함한다. 각각의 이미지로부터, 상기 복수의 사이클 중 적어도 2개로부터의 상기 필드의 이미지로부터 상기 복수의 광 신호 각각으로부터의 피크 위치는 검출된다. 각 분석물에 대한 피크의 위치가 중첩되어 기판 상의 각 분석물의 정확한 상대적인 위치가 결정되는 피크 클러스터를 생성한다.
일부 실시예에서, 도 17에 도시된 바와 같이, 기판 상의 분석물에 대한 정확한 위치 정보는 위치 정보(예: 기판의 인접 분석물 사이의 중심 간 거리 식별하기 위함)를 포함하는 디컨볼루션 알고리즘에 사용되어 상기 이미지 각각에서 중첩되는 광학 신호를 디컨볼루션하기 위해 이미지에 적용될 수 있다. 일부 실시예에서, 디컨볼루션 알고리즘은 중첩되는 광학 신호를 갖는 이웃하는 분석물 사이의 공간적 구별을 위한 최근접 변수 회귀를 포함한다.
일부 실시예에서, 도 18에 도시된 바와 같이, 분석물 검출 방법은 기판 상에 고정된 개별 폴리뉴클레오티드의 시퀀싱에 적용된다.
일부 실시예에서, 광 신호는 도 11에 도시된 바와 같이 밀집하게 패킹된 기판으로부터 디컨볼루션된다. 단계들은 도 19에 도시된 바와 같이 4개의 상이한 섹션으로 분할될 수 있다: 1) 각 사이클에 대한 필드의 각 이미지에서 오버샘플링 된 이미지의 생성을 포함하는, 이미지 분석, 및 이미지에서 각각의 검출된 광 신호에 대한 피크 위치 및 강도를 포함하는, 피크 파일(즉, 데이터 세트)의 생성 단계2) 기판 상의 분석물의 정확한 상대적인 위치를 결정하기 위해 각 분석물에 대한 광 신호 검출의 다중 사이클에서 생성된 다중 피크의 정렬을 포함하는, 로컬라이제이션 파일의 생성 단계3) 선택한 기준 이미지에 대해 서로 다른 검출의 사이클로부터 필드 이미지를 정렬하기 위해 각 이미지에 대한 오프셋 정보가 포함하는, 필드 정렬 파일의 생성 단계. 4) 오프셋 정보 및 위치 정보를 디컨볼루션 모델링과 함께 사용하여 각 오버샘플링 된 이미지에서 검출된 신호의 정확한 ID를 결정하는, 강도 추출 단계. "강도 추출" 단계는 합성 처리 및 검출에 의한 시퀀싱의 오류를 보정하기 위해 사용되는, 이전 사이클 회귀와 같은 다른 오류 보정도 포함할 수 있다. 각 섹션에서 수행되는 단계는 아래에서 더 자세히 설명된다.
도 20a 및 도 21에 도시된 이미지 분석 단계에서, 각 사이클의 각 필드의 이미지는 검출된 각 신호의 픽셀 수를 늘리도록, 각 신호의 피크를 선명하게 하도록, 그리고 각 신호에 대한 피크 강도를 식별하도록 처리된다. 이 정보는 (관찰된 광 신호의 피크로부터의) 각 분석물의 위치 및 각 신호의 피크 강도로부터의 강도 측정을 포함하는 각 사이클의 각 필드에 대한 피크 파일을 생성하기 위해 사용된다. 일부 실시예에서, 각 필드로부터의 이미지는 이미지로부터 노이즈의 초기 제거를 수행하기 위해 먼저 배경 제거를 거친다. 이후, 평활화(smoothing) 및 디컨볼루션을 사용하여 이미지를 처리하여 각 이미지에서 관찰된 신호의 모델링을 기반으로 인공적으로 생성된 픽셀을 포함하는 오버샘플링 된 이미지를 생성한다. 일부 실시예에서, 오버샘플링 된 이미지는 원시 이미지로부터의 각 픽셀에서 4픽셀, 9픽셀 또는 16픽셀을 생성할 수 있다.
이후 각 원시 이미지에서 감출되거나 오버샘플링 된 이미지에 존재하는 광학 신호의 피크들은 식별되고 검출된 각 분석물에 대한 강도 및 위치 정보는 추가 처리를 위해 피크 파일에 배치된다.
일부 실시예에서, 기판의 각 사이클 및 각 필드로부터 검출된 모든 이미지들에 대응하는 N개의 원시 이미지 또는 각 이미지화 된 필드에 대해 N개의 오버샘플링 된 이미지 및 N개의 피크 파일로 출력된다. 피크 파일은 각 이미지에 대해 검출된 각 분석물의 상대적인 위치를 포함한다. 일부 실시예에서, 피크 파일은 또한 각각의 검출된 분석물에 대한 강도 정보를 포함한다. 일부 실시예에서, 각 사이클의 각 색상 및 각 필드에 대해 하나의 피크 파일이 생성된다. 일부 실시예에서, 각 사이클은 각 사이클의 각 패스에 대한 각 색상 및 각 필드에 대해 하나의 피크 파일이 생성될 수 있도록, 다중 패스를 더 포함한다. 일부 실시예에서, 피크 파일은 단일 필드 내의 광 신호로부터 피크 위치를 지정한다.
바람직한 실시예에서, 피크 파일은 각 사이클에 대한 필드의 처리된 오버샘플링 된 각 이미지의 XY 위치 정보를 포함한다. XY 위치 정보는 오버샘플링 된 이미지로부터 프로브(예: 형광단)로부터 검출된 각각의 검출 가능한 라벨의 위치의 추정된 좌표를 포함한다. 피크 파일은 또한 각각의 검출 가능한 라벨의 신호로부터 강도 정보를 포함할 수도 있다.
오버샘플링 된 이미지의 생성은 픽셀화로 인해 추출할 수 없는 존재하는 정보를 식별하기 위해 픽셀화 오류를 극복하기 위해 사용된다. 평활화 및 디컨볼루션을 통한 원시 이미지의 초기 처리는 각 분석물의 위치가 보다 더 정확하게 결정될 수 있도록, 피크 파일에서 보다 정확한 정보를 제공함에 있어 도움이 되고, 이러한 정보는 이후에 회절 한계 이미징에서 가려진 신호의 보다 정확한 결정을 제공하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시예에서, 원시 이미지는 오버샘플링 된 이미지의 보다 정확한 판단을 용이하게 하기 위해 적어도 나이퀴스트 한계에 있는 샘플링을 사용하여 획득된다. 나이퀴스트 한계(오버샘플링)를 초과하여 샘플링하여 이미지를 표현하기 위해 사용되는 픽셀 수의 증가는 이미지 처리 및 표시에 사용할 수 있는 픽셀 데이터를 증가시킨다.
이론적으로 대역폭이 제한된 신호는 나이퀴스트 레이트 이상으로 샘플링되면 완벽하게 재구성될 수 있다. 나이퀴스트 레이트는 신호에서 가장 높은 주파수 성분의 2배로 정의된다. 오버샘플링은 해상도를 향상시키고 노이즈를 줄이며 앤티 앨리어싱 필터 성능 요구 사항을 완화하여 앨리어싱 및 위상 왜곡을 방지하기 위해 도움이 된다. N배의 나이퀴스트 레이트로 샘플링 된 신호는 N의 인수만큼 오버샘플링되었다고 한다.
따라서, 일부 실시예에서, 각각의 이미지는 관찰되는 광 파장의 절반 이하의 픽셀 크기로 찍힌다. 일부 실시예에서, 162.5 nm x 162.5 nm의 픽셀 크기는 나이퀴스트 한계 이상에서 샘플링을 달성하기 위해 검출에 사용된다.
평활화는 근사 함수를 사용하여 데이터의 중요한 패턴을 캡처하면서 노이즈 또는 기타 미세-규모 구조/급속 현상을 배제한다. 평활화에서, 신호의 데이터 점들은 수정되어 개별 점들을 줄이고, 인접한 점들보다 낮은 점들을 증가시켜 보다 평활화 된 신호를 만든다. 평활화는 신호로부터 피크 및 강도를 더 잘 식별하기 위해 각 이미지에서 검출된 회절 한계 광학 신호를 평활화하도록 본 명세서에서 사용된다.
각각의 원시 이미지는 회절이 제한되어 있으나, 본 명세서에 서로 다른 사이클의 동일한 분석물에서 여러 신호를 수집하는 방법이 설명되어 있다. 이러한 방법의 실시예는 도 20b의 흐름도에 도시되어 있다. 각 분석물의 이러한 다중 신호는 각 개별 이미지의 회절 한계 신호보다 위치를 훨씬 더 정확하게 결정하기 위해 사용된다. 그들은 5 nm 미만의 분해능에서 필드 내의 분자를 식별하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 정보는 도 21에 도시된 바와 같이 로컬라이제이션 파일로 저장된다.
도 21에 도시된 바와 같이, 로컬라이제이션 파일을 생성하는 단계는 피크 파일에 제공된 위치 정보를 사용하여 기판 상의 분석물 세트의 상대적인 위치를 결정한다. 일부 실시예에서, 각각의 로컬라이제이션 파일은 기판의 단일 이미지 필드에서 분석물 세트의 상대적인 위치를 포함한다. 로컬라이제이션 파일은 여러 사이클의 위치 정보를 결합하여 회절 한계 미만의 검출된 분석물에 대해 매우 정확한 위치 정보를 생성한다.
일부 실시예에서, 각 분석물에 대한 상대적인 위치 정보는 평균적으로 10 nm 표준 편차(즉, 실효값 또는 제곱 평균 제곱근) 미만으로 결정된다. 일부 실시예에서, 각각의 분석물에 대한 상대적인 위치 정보는 평균적으로 10 nm 2x 표준 편차 미만으로 결정된다. 일부 실시예에서, 각각의 분석물에 대한 상대적인 위치 정보는 평균적으로 10 nm 3x 표준 편차 미만으로 결정된다. 일부 실시예에서, 각각의 분석물에 대한 상대적인 위치 정보는 10 nm 중앙 표준 편차 미만으로 결정된다. 일부 실시예에서, 각각의 분석물에 대한 상대적인 위치 정보는 10 nm 중앙 2x 표준 편차 미만으로 결정된다. 일부 실시예에서, 각각의 분석물에 대한 상대적인 위치 정보는 10 nm 중앙 3x 표준 편차 미만으로 결정된다.
다른 사이클의 필드에 대한 피크 파일의 서브세트로부터 어레이 상의 분석물의 위치를 결정하기 위해, 로컬라이제이션 파일이 생성된다. 도 21에 도시된 바와 같이, 일부 실시예에서, 피크 파일은 먼저 광학 시스템의 수차를 설명하기 위해 포인트 스프레드 함수를 사용하여 정규화된다. 정규화 된 피크 파일은 피크 파일에 제공된 위치 및 강도 정보를 기반으로 정규화된 인공 이미지를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 이후 각 이미지가 정렬된다. 일부 실시예에서, 정렬은 각각의 이미지 쌍을 서로 연관시키고 미세 피팅을 수행함으로써 수행될 수 있다. 일단 정렬되면, 각 사이클의 각 분석물에 대한 위치 정보는 오버레이되어 기판에 대한 위치 측정값의 분포를 제공할 수 있다. 이러한 분포는 기판 상에 분석물에 대한 매우 정확한 상대적인 위치를 제공하는 단일 피크 위치를 결정하기 위해 사용된다. 일부 실시예에서, 푸아송 분포는 단일 피크를 결정하기 위해 각 분석물의 중첩된 위치에 적용된다.
사이클로부터의 위치 정보의 적어도 서브세트에서 결정된 피크는 이후 회절 한계 미만의 정확도로 검출된 각각의 분석물의 상대적인 위치의 측정치를 포함하는 로컬라이제이션 파일에 기록된다. 설명된 바와 같이, 이 정보를 결정하기 위해 사이클의 서브세트에서의 이미지가 요구된다.
도 21에 도시된 바와 같이, 각 사이클 및 색상에 대한 각 필드의 정규화 된 피크 파일 및 정규화 된 로컬라이제이션 파일은 필드의 기준 이미지에 상대적인 필드로부터 각 이미지에 대한 오프셋 정보를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 오프셋 정보는 밀집하게 패킹된 기판 및 회절 한계 이미지로부터의 신호 식별의 추가 개선을 위해 각 원시 이미지에서 분석물의 상대적인 위치 결정의 정확도를 개선하기 위해 사용할 수 있다. 일부 실시예에서, 이 오프셋 정보는 필드 정렬 파일로 저장된다. 일부 실시예에서, 결합된 국소화 파일 및 필드 정렬 파일의 필드에서 각 분석물의 위치 정보는 10 nm RMS 미만, 5 nm RMS 미만, 또는 2 nm RMS 미만이다.
일부 실시예에서, 필드 정렬 파일은 필드의 마스터 파일에 대한 오프셋 정보를 결정함으로써 단일 필드의 이미지를 정렬함으로써 생성된다. 하나의 필드 정렬 파일은 각 필드에 대하여 생성된다. 이 파일은 모든 사이클의 필드의 모든 이미지들로부터 생성되고, 필드의 기준 이미지에 대한 필드의 모든 이미지에 대한 오프셋 정보를 포함한다.
일부 실시예에서, 정렬 전에, 각각의 피크 파일은 포인트 스프레드 함수로 정규화되고, 이어서 정규화 된 피크 파일로부터 인공 이미지의 생성 및 인공 이미지의 푸리에 변환이 뒤따른다. 정규화된 피크 파일의 인공 이미지의 푸리에 변환은 해당 필드에 대한 정규화 된 로컬라이제이션 파일의 인공 이미지의 푸리에 변환의 켤레 복소수와 컨볼루션된다. 이것은 각 사이클의 각 피크 파일에 대해 수행된다. 이후 결과 파일은 이미지 파일을 재생성하기 위해 인버스 푸리에 변환을 치고, 이미지 파일은 각 이미지 파일에 대한 오프셋 정보를 생성하기 위해 필드의 참조 파일에 대해 정렬된다. 일부 실시예에서, 이 정렬은 참조 파일에 대한 미세 피팅을 포함한다.
따라서 필드 정렬 파일은 각 오버샘플링 된 이미지에 대한 오프셋 정보를 포함하고 후속의 "추출 강도" 단계에서 사용하기 위한 각 분석물에 대해 매우 정확한 상대적인 위치를 생성하고자 해당 필드의 로컬라이제이션 파일과 함께 사용될 수 있다.
한 필드에서 20회의 사이클이 수행되고, 검출할 4색 각각에 대해 하나의 이미지가 생성되어, 필드의 80개의 이미지를 생성하는 예시로서, 80개의 이미지(20회의 사이클* 4색) 전부에 대해 하나의 필드 정렬 파일이 생성된다. 일부 실시예에서, 필드 정렬 파일 내용은 필드, 각 이미지에 대해 관찰된 색상, 순환 검출(예: 바인딩 또는 스트립핑)의 단계 유형, 기준 이미지에 대한 이미지 오프셋 좌표를 포함한다.
일부 실시예에서, 정렬 프로세스 동안 2개의 이미지를 정렬하기 위해 필요한 XY "이동" 또는 "잔차"가 계산되고, 상기 프로세스는 나머지 이미지에 대해 반복되며, 모두에 적용할 최적의 잔차가 계산된다.
일부 실시예에서, 임계값을 초과하는 잔차는 폐기되고 최적의 적합이 재계산된다. 이 프로세스는 모든 개별 잔차가 임계값 내에 있을 때까지 반복된다.
각 오버샘플링 된 이미지는 로컬라이제이션 파일의 정확한 위치 정보와 필드 정렬 파일의 오프셋 정보를 사용하여 디컨볼루션된다. 강도 추출 단계의 실시예는 도 20c 및 도 21에 도시되어 있다. 다양한 분자의 포인트 스프레드 함수(PSF)는 중심 간 거리가 너무 작아 인접 분석물로부터의 신호의 포인트 스프레드 함수가 중첩되기 때문에 중첩된다. 정확한 분석물 위치 정보 및/또는 오프셋 정보와 결합된 최근접 이웃 변수 회귀는 회절 한계로 인해 분해능을 억제하는 중심 간 거리를 갖는 인접 분석물로부터의 신호를 디컨볼루션하기 위해 사용할 수 있다. 각 분석물에 대한 정확한 상대적인 위치 정보의 사용은 회절 한계 아래에서 이웃하는 분석물로부터의 광학 신호의 공간적 디컨볼루션을 용이하게 한다. 일부 실시예에서, 인접 분석물의 상대적인 위치는 인접 분석물 간의 정확한 중심 간 거리를 결정하기 위해 사용되며, 인접 분석물 각 개별 이미지의 신호 디컨볼루션에 사용하기 위해 인접 분석물 간의 공간 혼선을 추정하기 위해 광학 시스템의 점 확산 기능과 함께 사용할 수 있다. 이는 폴리뉴클레오티드 시퀀싱과 같은, 광학 검출 기술을 위한 회절 한계 미만의 분석물의 밀도를 갖는 기판의 사용을 가능하게 한다.
특정 실시예에서, 방출 스펙트럼은 서로 다른 신호(즉, "크로스토크") 사이에서 중첩된다. 예를 들어, 합성에 의한 시퀀싱 동안, 시퀀싱 프로세스에 사용된 4가지 염료는 일반적으로 방출 스펙트럼에서 일부 중첩된 부분을 갖는다.
특정 실시예에서, 서로 다른 색상 채널 간에 크로스토크가 발생하고 다른 이미지 세트에 대해 크로스 토크가 다른 경우 한 사이클 동안 획득된 일련의 이미지에서 다른 기능에 색상(예를 들어, 염기 호출)을 할당하는 문제는 사용된 서로 다른 검출 가능한 레이블의 광학 신호에서 겹치는 방출 스펙트럼을 제거하기 위해 각 오버샘플링 된 이미지에 대한 로컬라이제이션 및 필드 정렬 파일과 함께 크로스토크 회귀를 통해 해결될 수 있다. 이는 기판 상의 각 분석물에 결합된 각 프로브에 대한 검출 가능한 라벨 식별자의 식별의 정확도를 추가로 증가시킨다.
따라서, 일부 실시예에서, 본 명세서에 공개된 사이클의 단일 필드 이미지에서 신호 및/또는 신호 강도의 식별은 다음 피처들을 사용한다: 1) 오버샘플링 된 이미지 - 정의된 위치에서 강도와 신호를 제공한다. 2) 정확한 상대적인 위치 - 로컬라이제이션 파일(적어도 사이클의 서브세트에서의 정보로부터 위치 정보 제공) 및 필드 정렬 파일(필드의 모든 이미지에 대한 오프셋/정렬 정보 제공) 3) 이미지 처리 - 필드의 각 분석 대상에 대한 정확한 상대적인 위치 정보를 사용하는 최근접 이웃 변수 회귀(공간 디컨볼루션) 및 크로스토크 회귀(방출 스펙트럼 디컨볼루션). 각 분석물에 대한 프로브(예: 검출용 항체 또는 시퀀싱용 상보적 뉴클레오티드)의 정확한 식별.
이미지 처리 시뮬레이션
본 명세서에 공개된 방법 및 시스템의 효과는 도 22a, 도 22b, 도 23a 및 도 23b에 도시된 시뮬레이션 된 크로스토크 플롯에 예시된다. 이러한 도면들 각각에 대해, 10μm x 10μm 영역에서 각각의 검출된 분석물에서 4개의 형광단 중 하나와 상관관계가 있는 방출 스펙트럼의 강도를 보여주는 크로스토크 플롯이 도시된다. 4개의 형광단 중 하나에 해당하는 각 축은 플롯의 각 모서리까지 확장된다. 따라서, 플롯의 중앙에 위치한 스팟은 4개의 형광단 모두로부터 동일한 강도 기여를 가질 것이다. 이미징 사이클 동안 개별 형광단에서 검출된 방출 강도는 X, Y; X, -Y; -X, Y; 또는 -X, -Y 중 하나의 방향으로 스팟을 이동하도록 할당된다. 따라서, 이들 4개의 축을 따른 스팟의 집단의 분리는 분석물 위치의 형광단으로부터의 명확한 디컨볼루션 신호를 나타낸다. 각 시뮬레이션은 10.075μm x 10.075μm 영역에서 1024개 분자의 검출을 기반으로 하며, 이는 미크론 제곱당 10.088분자의 밀도 또는 약 315nm의 분자 사이의 평균 중심 간 거리를 나타낸다. 이것은 162.5 nm×162.5 nm의 화소 크기에서 약 62×62 화소의 이미징 영역과 서로 연관이 있다.
도 22a는 원시 이미지에서 검출된 광학 신호로부터 4개의 형광단 사이의 형광단 강도의 크로스토크 플롯을 도시한다. 도 22b 및 도 23a는 각각 4X 오버샘플링 된 이미지를 생성함으로써 달성된 4개의 형광단 사이의 분리를 나타내며, 이는 각 분석물에서 크로스토크의 일부 제거의 달성을 나타낸다. 도 23b는 도 21에 도시되고 본 명세서에 설명된 바와 같이 수행되지만 디컨볼루션 및 최근접 이웃 회귀가 있는 동일한 이미징 영역에 대한 크로스토크 플롯을 도시한다. 도 23a 및 도 22a와 비교하여, 검출된 각각의 분석물은 다른 형광단으로부터의 광학 신호의 명확한 분리를 보여주며, 이는 각 분석물에 대한 매우 정확한 형광단 식별을 나타낸다.
도 24a 및 도 24b는 위에서 시뮬레이션 된 바와 같이 각각의 검출된 10.075μm x 10.075μm 영역의 시뮬레이션 된 4색 합성물을 도시한다. 이것은 원시 이미지(도 24a)와 본 명세서에 설명된 대로 처리된 이미지(도 24b)를 형성하는 분석물 사이의 선명도를 시각적으로 나타낸다.
시퀀싱
도 21에서 상술된 방법은 또한 밀집하게 패킹된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 기판 상의 성장 상보적 가닥에 통합된 상보적 가역적 종결자의 광학적 검출을 사용한 합성에 의한 시퀀싱에 의해 시퀀싱을 용이하게 한다. 따라서, 회절 한계 미만의 중심 간 거리에서 인접 폴리뉴클레오티드의 시퀀스와 상관관계가 있는 신호는 본 명세서에 기재된 방법 및 광학 검출 시스템을 사용하여 안정적으로 검출될 수 있다. 시퀀싱 중 이미지 처리는 기판에서 반복되는 클론 시퀀스를 기반으로 하거나 시퀀싱 반응 또는 검출의 오류를 수정하기 위해 데이터 자체를 기반으로 하는 이전 사이클 회귀를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 시퀀싱을 위해 기판에 고정된 폴리뉴클레오티드는 연쇄동일서열(concatemer)이다. 연쇄동일서열은 시퀀싱 될 폴리뉴클레오티드의 다중 동일한 사본을 포함할 수 있다. 따라서, 본 명세서에 기술된 방법 및 시스템에 의해 확인된 각각의 광학 신호는 통합된 뉴클레오티드로부터 단일 검출 가능한 라벨(예: 형광단)를 지칭할 수 있거나, 신호가 여러 위치의 평균이 되도록, 단일 연쇄 분석기의 여러 위치에 바인딩된 여러 검출 가능한 레이블을 참조할 수 있다. 발생해야 하는 분해능은 개별 검출 가능한 라벨 사이가 아니라 기판에 고정된 서로 다른 연쇄체 사이에서 발생한다.
실시예에서, 단일 또는 다중 사본의, 시퀀스 될 분자는, 표면 상의 올리고뉴클레오티드를 포획하기 위해 혼성화함으로써, 또는 다른 비공유 결합에 의해, 공유 결합을 사용하여 표면에 결합될 것이다. 결합된 분자는 수백 사이클 동안 표면에 남아 있을 것이며 초기 시퀀싱 프라이머를 제거한 후 특정 변이체의 존재를 확인하기 위해 다른 프라이머 세트로 다시 조사될 수 있다.
일 실시예에서, 형광단 및 차단기는 화학 반응을 사용하여 제거될 수 있다.
다른 구체예에서, 형광 및 차단기는 UV 광을 사용하여 제거될 수 있다.
일 실시예에서, 시퀀싱될 분자는 50-100 nM 직경을 갖는 반응성 표면에 고정될 수 있고 이러한 영역은 150-300 nM의 피치로 이격될 것이다. 이들 분자는 표적 디컨볼루션을 위해 그들에 부착된 바코드 및 시퀀싱을 개시하기 위한 시퀀싱 프라이머 결합 영역을 가질 수 있다. 완충액은 연장 반응을 가능하게 하는 적절한 양의 DNA 중합효소를 함유할 것이다. 이들 사이트는 이용 가능한 유전자 증폭 방법(PCR, 전체 게놈 증폭 등)에 의해 생성된 시퀀싱할 표적의 10-100개의 사본을 포함할 수 있다.
또 다른 실시예에서, 바코드 및 프라이머 어닐링 부위로 태그가 지정된 단일 표적 분자는 60-150 nM의 피치로 이격된 20-50 nM 직경의 반응성 표면에 고정될 것이다. 분자는 개별적으로 시퀀싱된다.
일 실시예에서, 프라이머는 표적에 결합하고 단일 또는 다중 형광단(들)과 함께 한 번에 하나의 dNTP를 사용하여 연장될 것이다; 표면은 이미지화 되고, 형광단은 제거되고 세척되고 이 과정을 반복하여 두 번째 확장을 생성한다. 동일한 dNTP에 다중 형광단의 존재는 게놈의 일부 영역(2 내지 5개 이상)에 존재하는 반복 뉴클레오티드의 수를 정의할 수 있게 한다.
다른 실시예에서, 프라이머 어닐링 후, 형광단 및 차단된 3' 히드록시기를 갖는 4개의 dNTP 모두가 중합효소 연장 반응에 사용될 것이고, 표면이 이미지화되고 형광단 및 차단기가 제거되고 이 과정은 다수의 사이클에 대해 반복될 것이다.
다른 구체예에서, 시퀀스는 주어진 위치에서 특정 뉴클레오티드의 존재에 기초하여 결찰하는 특정한 프로브를 어닐링하는 결찰 반응을 기초로 추론될 수 있다.
상술된 기술을 사용하여 종래 기술의 랜덤 어레이보다 향상된 밀도를 갖는 랜덤 어레이가 사용될 수 있지만, 랜덤 어레이는 일반적으로 정렬된 어레이의 4배에서 10배까지 감소된 면적 밀도를 갖는다. 랜덤 어레이의 장점은 더 긴 가닥의 배제 특성에 의존할 필요가 없기 때문에 칩에 대해 균일하고 패턴이 없는 표면 및 더 짧은 핵산 가닥의 사용을 포함한다.
예시 1
시스템은 여러 하위 시스템을 포함한다:
1. 시퀀싱 될 DNA를 포함하는 플로우셀
2. 인코더가 있는 샘플 스테이지
3. FPGA(스캐닝 미러 제어)
4. 레이저 조명원
5. 고속 스캐닝 광학계(단일 미러)
6. 하나 이상의 카메라
7. 기기 제어 소프트웨어
8. 이미지 처리에 사용되는 초해상도 알고리즘
형광 태그가 붙은 DNA(샘플)가 있는 플로우 셀이 샘플 척(sample chuck)에 설치된다. 샘플 척은 높은 처리량 스캐닝 이미징 기기 내부에 장착된다. 샘플에는 플로우 셀의 기판에 형광 분자가 무작위로 배열되어 있다. 이미징 동안, 형광 분자의 레이저 기반 여기는 형광 분자가 더 긴 파장의 광자를 방출하도록 한다. 이 방출된 광자는 이후 형광 분자의 이미지를 생성하기 위해 사용되어 스타-필드(star-field)처럼 보이는 것을 생성한다. 이 이미지는 두 대의 다른 카메라에서 캡처된다. 이후 전체 필드에 걸쳐 사이트 지정 정보가 계산된다. 동일한 필드에서 촬영된 후속 이미지이지만 광범위한 이미지 분석(초해상도 알고리즘 사용)과 함께 다른 DNA 분자가 존재하면 DNA 시퀀스를 결정할 수 있다.
하이덴하인 인코더(Heidenhain Encoder)(#LIP28R LIP 201R 스케일, 512nm 신호 피치)를 사용하 알리오 스테이지(Alio Stage)는 스캔 축을 따라 플로우셀을 배치하기 위해 사용되었다. 스테이지 스캐닝 축은 스캐닝 미러(Scanning Mirror; SM)의 스캔 축에 정렬되어야 했다.
샘플 스테이지에 대한 위치 정보는 512nm 신호 주기를 생성하는, 2.048um 스케일 피치를 사용하는 인코더와 함께 제공되었다. 후속 보간은 전체 기간에 걸쳐 효과적인 20nm 분해능을 산출한다. 이후 이 위치 데이터를 나타내는 4개의 디지털화 된 신호(90도 위상 증분에서)가 FPGA에 공급된다. FPGA는 이 4개의 디지털 신호를 취하여 각 인코더 펄스에서 순간 스테이지 위치를 계산한다.
4색 레이저 조명 시스템은 플로우셀의 형광 분자를 여기시키기 위해 사용된다. 여기 파장은 488nm, 525nm, 590nm 및 640nm이다. 서브 회절 한계 성능은 이미징에 사용되는 광의 파장에 따라 다르다; 이 경우, 방출된 파장은 명목상 520nm, 565nm, 612nm 및 665nm이다. 640nm 여기 파장의 경우, 크기가 302nm 미만인 모든 분해 가능한 기능은 이 광학 시스템의 회절 한계(λ/(2*NA)) 미만이다.
단일 스캐닝 미러는 모든 광학 광선이 평행한 광학 경로의 한 지점에 위치하여(대물 사출 동공의 이미지에서) 스캐닝 중 이미지의 최소 왜곡을 보장한다(가속도 추적 특허 참조). 40X 1.1 개구수 수침 대물렌즈가 이용된다.
8192 포인트 스캐닝 미러(SM) 교정 파형은 목표 스테이지 속도를 기반으로 생성되었다. 이 파형은 이미징에 사용되는 정방향 스캔 방향으로 SM을 편향시키는 데 필요한 SM 단계와 다음 정방향 스캔을 시작하기 위해 미러를 재배치하기 위해 필요한 후방 스캔 방향을 포함한다. 이 파형의 8192포인트 각각을 스캐닝 미러 스텝이라고 한다. 이 파형의 각 스캐닝 미러 단계에서 각 카메라 및 각 레이저에 대한 제어 값을 지정할 수 있다. FPGA는 SM의 위치를 업데이트하기 위해 새 값을 SM 증폭기에 보내기 전에 실시간으로 SM 파형의 각 단계에 순간 단계 위치 값(4개의 디지털 인코더 신호에서 계산됨)을 추가한다. 각 카메라는 전방 스캔 동안 단일 필드의 이미지를 획득한다. 플로우셀 레인의 단일 열 내 최대 120개 필드의 이미지는 스테이지가 멈추고 방향이 변경되기 전에 획득될 수 있다.
SM 드라이브 증폭기는 이 새로운 전압 값을 SM에 적용하여 SM이 카메라의 SCMOS 검출기에서 플로우셀의 기존 필드를 정확히 동일한 위치에 유지하도록 충분히 회전하도록 한다. 따라서, 플로우셀을 홀딩하는 샘플 스테이지가 계속 움직이더라도, SM은 스테이지의 모션을 추적하고 카메라 검출기에 고정된 동일한 이미지화 된 영역을 유지한다. 이 일련의 단계는 대부분의 정방향 스캔 램프에 대해 반복된다. 역방향 스캔 동안에, 이미징은 수행되지 않는다.
두 대의 하마마츠 ORCA 플래쉬 4.0 SCMOS 카메라(Hamamatsu ORCA Flash 4.0 SCMOS cameras)는 외부 트리거 모드에서 사용되었다. 이러한 카메라들은 초당 최대 100프레임의 이미지 획득 속도가 가능하다. 초고해상도 응용 분야에 사용하기 위해 잘 설계된 광학 시스템은 회절이 제한된 광학 성능을 얻기 위해 카메라 검출기 칩 및 픽셀 크기, 대물 배율 및 개구수(NA)가 일치해야 한다.
기기 제어 소프트웨어는 플로우셀에 대한 유체 역학 작용, 이미징 스캔 시작 및 중지 시기, 스테이지 위치뿐만 아니라 기타 여러 중요한 기능을 포함한, 모든 것을 제어하기 위해 사용되었다. 단일 열(120개의 필드)의 스캔이 시작되면, SM 위치, 레이저 상태 및 카메라 상태는 모두 SM 증폭기로 출력되는 SM 파형에 의해 정의된다.
이미지가 획득되면, 서브 회절 한계 해상도를 얻기 위해 많은 단계가 수행된다. 도 28 및 도 29는 매핑된 분자 밀도가 서로 다른 조건을 가진 샘플 필드 범위에 걸쳐 단계 및 슛 이미징과 고속 스캐닝 간에 비교 가능한 방법의 예시들을 도시한다.
예시 2
방법들
본 명세서에 설명된 시스템 및 방법은 현재 기술 상태에 비해 충분한 이점을 제공한다. 본 명세서에 설명된 특징과 일치하는 고속 스캐닝(High-Speed Scanning; "HSS") 시스템은 검출 가능한 라벨(예: 형광 태그가 붙은 핵산 분자)에 결합된 분석물의 이미지를 획득하기 위해 사용되었다. HSS는 약 1200개의 필드에 걸쳐 4가지의 다른 색상으로 이미지를 촬영하도록 구성되었다. HSS 데이터는 단일 스캐닝 미러로 촬영되었으며 선형 인코더의 실시간 피드백을 활용했다. HSS 데이터는 77.7mm2의 영역에 걸쳐 이미지화되었다. 이미지가 획득되면, 이미지 분석 소프트웨어는 각 필드에서 분석물의 위치를 결정하기 위해 사용되었다. 이후 평균 밀도(분석물/ μm2)는 계산되고 측정된 각 필드에 할당되었다.
동일한 측정치는 기존의 "스텝 앤 슛"(Step and Shoot; "SnS") 시스템을 사용하여 수행되었다. 이 SnS 시스템의 경우, 데이터는 44개 필드에 걸쳐 수집되었다. SnS 데이터는 4.85 mm2의 영역에 걸쳐 이미지화되었다. 이미지가 획득되면, 이미지 분석 소프트웨어는 각 필드에서 분석물의 위치를 결정하기 위해 사용된 후 평균 밀도(분석물/μm2)는 계산되어 측정된 각 필드에 할당했다.
결과
HSS 및 SnS 데이터에 대한 이미징 시간 모두 비슷했다. 또한, HSS 데이터에 대한 오차율은 SnS 오차율과 비슷하거나 더 낮았다. 도 31a-B는 HSS 및 SnS 이미징 모두에 대해 유체 공동의 모든 필드에 걸쳐 측정된 평균 분석물 밀도(분석물/μm2)를 도시한다. 도 31c는 HSS 및 SnS 모두에 대한 분석물 밀도(분석물/μm2)에 따라 비닝된(binned) 이미지화 된 필드의 수의 히스토그램이다.
이 데이터는 HSS가 SnS에 필적하는 검출 성능(분석물 밀도)을 가짐과 동시에 동일한 시간에 ~16배 더 많은 데이터(필드 수)를 취한다는 것을 도시한다. 검출 기술에 대한 이러한 상당한 개선은 현재 기술의 상태를 발전시킨다.
본 발명의 바람직한 실시예가 본 명세서에 도시되고 설명되었지만, 그러한 실시예는 단지 예로서 제공된다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명이 명세서 내에 제공된 특정 예에 의해 제한되는 것으로 의도되는 것은 아니다. 본 발명이 전술한 명세서를 참조하여 설명되었지만, 본 명세서의 실시예의 설명 및 예시는 제한적인 의미로 해석되어서는 안 된다. 수많은 변형, 변경 및 대체가 이제 본 발명을 벗어나지 않고 본 발명의 기술분야에 속한 통상의 기술자에게 발생할 것이다. 또한, 본 발명의 모든 태양은 다양한 조건 및 변수에 의존하는 본 명세서에 기재된 특정 묘사, 구성 또는 상대적 비율에 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 본 명세서에 기술된 본 발명의 실시예에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실시하는데 이용될 수 있음을 이해해야 한다. 따라서, 본 발명은 그러한 대안, 수정, 변형 또는 등가물도 포함하는 것으로 고려된다. 다음 청구범위는 본 발명의 범위를 정의하고 이러한 청구범위 및 그 균등물의 범위 내의 방법 및 구조는 이에 의해 포함되는 것으로 의도된다.
Claims (37)
- a. 광원;
b. 복수의 필드를 캡처하기 위해 대물 렌즈에 작동 가능하게 결합된 하나 이상의 카메라;
c. 기판을 지지하도록 구성된 스테이지로, 상기 스테이지는 상기 광원에 인접한 정의된 경로를 따라 이동하도록 구성됨 -;
d. 상기 스테이지에 기계적으로 작동 가능하게 결합된 인코더;
e. 상기 인코더로부터 위치 정보를 수신하고 상기 스테이지에 대한 복수의 위치에 의 복수의 계산을 수행하도록 구성된 위치 처리 모듈;
f. 상기 스테이지에 대한 상기 복수의 위치의 상기 복수의 계산을 수신하기 위해 상기 위치 처리 모듈에 작동 가능하게 결합된 상기 정의된 경로에 인접한 축에 결합된 스캐닝 미러; 및
g. 구성 요소 (a)-(f)를 동기적으로 작동하도록 구성된 제어 모듈을 포함하는, 이미징 시스템.
- 제1항에 있어서, 이미지 처리 모듈을 더 포함하고,
상기 처리 모듈은
(i) 상기 기판 상에 변위된 복수의 분석물들 중 분석물의 위치 또는 상기 기판 상에서 변위된 다른 분석물에 대한 상기 기판 상에 변위된 분석물의 상대적인 위치를 식별하도록 복수의 이미지를 처리하여 이미징 알고리즘을 사용하고;
(ii) 상기 위치 또는 상대적인 위치에서 상기 분석물을 식별하자마자, 상기 분석물을 분석하고, 상기 복수의 분석물은 상기 복수의 분석물의 분석물과 상기 복수의 분석물의 다른 분석물 사이의 최소 유효 피치가 λ/(2*NA) 미만이 되게 하는 밀도로 상기 기판 상에 배치되고, 상기 λ는 광학 경로에 사용된 광의 파장이고 'NA'는 하나 이상의 카메라의 개구수인, 이미징 시스템.
- 제2항에 있어서, 상기 광원은 레이저를 포함하는, 이미징 시스템.
- 제2항에 있어서, 상기 광원은 복수의 레이저를 포함하는, 이미징 시스템.
- 제2항에 있어서, 상기 이미징 처리 모듈은 복수의 초해상도 이미지를 생성하도록 구성되는, 이미징 시스템.
- 제2항에 있어서, 상기 스캐닝 미러의 복수의 움직임은 상기 위치 처리 모듈의 상기 복수의 계산으로부터 생성되는, 이미징 시스템.
- 제2항에 있어서, 상기 복수의 계산은 상기 스테이지의 속도 측정 또는 위치 측정의 함수인, 이미징 시스템.
- 제2항에 있어서, 상기 위치 처리 모듈은 상기 복수의 계산을 파형으로 출력하도록 구성되는, 이미징 시스템.
- 제2항에 있어서, 상기 기판은 복수의 필드를 포함하는, 이미징 시스템.
- 제8항에 있어서, 상기 인코더는:
상기 기판 상에 변위된 상기 복수의 분석물들 중 상기 분석물의 상기 위치 또는 상기 기판 상에 변위된 다른 분석물에 대한 상기 기판 상에 변위된 상기 분석물의 상기 상대적인 위치에 대한 하나 이상의 보정 값을 생성하고;
상기 파형에 상기 하나 이상의 보정 값을 적용하도록 구성되는, 이미징 시스템.
- 제2항에 있어서, 상기 스캐닝 미러는 상기 복수의 필드 중 하나의 필드의 스캔을 완료하자마자 원래의 위치로 이동하고 상기 복수의 필드 중 후속 필드의 스캔을 시작하도록 구성되는, 이미징 시스템.
- 제2항에 있어서, 상기 광원은 약 400 내지 800 나노미터의 파장을 포함하는, 이미징 시스템.
- 제6항에 있어서, 상기 인코더는 상기 스테이지의 상기 복수의 움직임에 기초하여 복수의 인코더 카운트를 수행하도록 구성되는, 이미징 시스템.
- 제13항에 있어서, 상기 인코더는 상기 복수의 인코더 카운트로부터 신호 주기를 생성하도록 구성되는, 이미징 시스템.
- 제13항에 있어서, 상기 인코더 카운트는 약 0.05 마이크로미터 내지 약 30 마이크로미터의 거리에 위치하는, 이미징 시스템.
- 제15항에 있어서, 상기 인코더는 512 나노미터에서 상기 복수의 인코더 카운트로부터 신호 주기를 생성하는, 이미징 시스템.
- 청구항 제2항에 있어서, 상기 기판은 복수의 정의된 레인을 포함하는, 이미징 시스템.
- 제17항에 있어서, 상기 복수의 정의된 레인의 레인은 복수의 열을 포함하는, 이미징 시스템.
- 제5항에 있어서, 상기 복수의 초해상도 이미지는 약 10 내지 약 40 나노미터 미만의 블러를 포함하는, 이미징 시스템.
- 제19항에 있어서, 상기 블러는 초당 약 20 내지 약 150 프레임의 프레임 레이트에서 생성되는, 이미징 시스템.
- 제2항에 있어서, 상기 복수의 분석물은 상기 이미징 시스템의 회절 한계 또는 λ/(2*NA) 미만의 중심 대 중심 간격으로 상기 기판 상에 배치되는, 이미징 시스템.
- 제2항에 있어서, 상기 복수의 계산은 즉각적인 계산을 포함하는, 이미징 시스템.
- 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 시스템을 이용하여 이동 기판 상의 복수의 필드를 이미징하는 방법.
- 이동 기판을 이미징하는 방법으로서, 상기 이동 기판은 복수의 필드를 포함하고, 상기 이동 기판을 이미징하는 방법은:
a. 스테이지 상에 상기 기판을 배치하는 단계 - 상기 스테이지는 광원에 인접한 정의된 경로를 따라 이동하도록 구성됨 -;
b. 상기 스테이지에 기계적으로 작동 가능하게 연결된 인코더로부터 위치 정보를 수신하도록 위치 처리 모듈을 구성하는 단계 - 상기 위치 처리 모듈은 상기 스테이지에 대한 복수의 위치에 대해 복수의 계산을 더 수행하도록 구성됨 -;
c. 상기 스테이지에 대한 상기 위치의 상기 복수의 계산을 수신하기 위해 상기 위치 처리 모듈에 작동 가능하게 결합된 상기 정의된 경로에 인접한 축에 결합된 스캐닝 미러를 구성하는 단계; 및
d. 하나 이상의 카메라로 상기 복수의 필드 중 적어도 하나의 필드를 이미징하는 단계를 포함하는, 이동 기판을 이미징하는 방법.
- 제24항에 있어서, 상기 (b) 내지 (d) 는 동기적으로 수행되는, 이동 기판을 이미징하는 방법.
- 제24항 또는 제25항에 있어서,
상기 기판 상에 변위된 복수의 분석물들 중 분석물의 위치 또는 상기 기판 상에서 변위된 다른 분석물에 대한 상기 기판 상에 변위된 분석물의 상대적인 위치를 식별하도록 복수의 이미지를 처리하여 이미징 알고리즘을 사용하는 단계를 더 포함하는, 이동 기판을 이미징하는 방법.
- 제26항에 있어서,
상기 복수의 분석물은 상기 복수의 분석물의 분석물과 상기 복수의 분석물의 다른 분석물 사이의 최소 유효 피치가 λ/(2*NA) 미만이 되게 하는 밀도로 상기 기판 상에 배치되고, 상기 λ는 광학 경로에 사용된 광의 파장이고 'NA'는 상기 광학 이미징 모듈의 개구수인, 이동 기판을 이미징하는 방법.
- 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 스캐닝 미러의 복수의 움직임은 상기 위치 처리 모듈의 상기 복수의 계산으로부터 생성되는, 이동 기판을 이미징하는 방법.
- 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 복수의 계산은 상기 스테이지의 속도 측정 또는 위치 측정의 함수인, 이동 기판을 이미징하는 방법.
- 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 (b)는 파형으로 상기 복수의 계산을 출력하도록 상기 위치 처리 모듈을 구성하는 단계를 더 포함하는, 이동 기판을 이미징하는 방법.
- 제30항에 있어서, 상기 (b)는 상기 위치 처리 모듈이:
상기 기판 상에서 변위된 상기 복수의 분석물들 중 상기 분석물의 상기 위치 또는 상기 기판 상에서 변위된 다른 분석물에 대한 상기 기판 상에서 변위된 상기 분석물의 상기 상대적인 위치에 대한 하나 이상의 보정 값을 생성하고;
상기 파형에 상기 하나 이상의 보정 값을 적용하도록 구성하는 단계를 더 포함하는, 이동 기판을 이미징하는 방법.
- 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 (c) 는 상기 스캐닝 미러가 상기 복수의 필드 중 하나의 필드의 스캔을 완료하자마자 원래의 위치로 이동하고 상기 복수의 필드 중 후속 필드의 스캔을 시작하도록 구성하는 단계를 더 포함하는, 이동 기판을 이미징하는 방법.
- 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 (b) 는 복수의 인코더 카운트로부터 신호 주기를 생성하도록 상기 인코더를 구성하는 단계를 더 포함하는, 이동 기판을 이미징하는 방법.
- 제33항에 있어서, 상기 인코더 카운트는 약 0.05 마이크로미터 내지 약 30 마이크로미터의 거리에 위치하는, 이동 기판을 이미징하는 방법.
- 제34항에 있어서, 상기 인코더는 512 나노미터에서 상기 복수의 인코더 카운트로부터 신호 주기를 생성하는, 이동 기판을 이미징하는 방법.
- 제26항에 있어서, 상기 복수의 이미지 중 하나의 이미지는 약 10 내지 약 40 나노미터 미만의 블러를 포함하는, 이동 기판을 이미징하는 방법.
- 제36항에 있어서, 상기 블러는 초당 약 20 내지 약 150 프레임의 프레임 레이트에서 생성되는, 이미징 시스템.
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