JP2022541551A - 三官能性抗体を用いることによる術中自己血回収からの腫瘍細胞の除去 - Google Patents

Abstract

本発明は、三官能性抗体が白血球、腫瘍細胞及びＦｃ受容体陽性細胞と結合するために用いられる、術中に得られた回収血液から腫瘍細胞を除去するためのｅｘ ｖｉｖｏで行われる方法に関する。本発明は、そのようにして得られた精製回収血液又は前記方法により精製された赤血球の濃縮物を術中に回収した血液を得た患者に再導入することが後に続く、術中に得られた回収血液から腫瘍細胞を除去するためのｅｘ ｖｉｖｏ方法の使用にも関する。【選択図】図１

Description

本発明は、三官能性抗体を用いることによる術中に回収した血液からの腫瘍細胞の除去のためのｅｘ ｖｉｖｏで行われる方法と、そのようにして得られた精製回収血液、又は前記方法により精製された赤血球の濃縮物を術中に回収した血液を得た患者に再導入することが後に続く、術中に回収した血液からの腫瘍細胞の除去のための前記ｅｘ ｖｉｖｏ方法の使用とに関する。

１９８０年代初期のＡＩＤＳエピデミック以来、特に待機手術について同種血輸血の代案に対する興味が増加してきている。米国及び欧州のいくつかの国で提供される血液の５％より多くを現在占めるある代案は、術前供血により主に得られる自己血輸血である。術前供血に加えて、手術野からの術中血液回収（ＩＢＳ）（表１）は、輸血需要を担保する重要な選択肢である。このＩＢＳプロセスに伴い、外科手術患者から失われる血液は、回収され、浄化され、その患者への再注入のために用いることができるようにされる。

簡単に述べると、手術野に流れる血液は、その部位から特に設計された囲いの中に吸引される。クエン酸塩又はヘパリン凝固剤を加え、内容物を遠心分離及び／又は濾過して、白血球及び血塊及びデブリを除去する。用いるＩＢＳ装置は、抗凝固剤を充填した単純、安価な滅菌ボトルから、高価で洗練された高速細胞洗浄装置までさまざまであり得る（例えばＭｅｄｔｒｏｎｉｃ Ｓｅｑｕｅｓｔｒａ １０００、Ｃｏｂｅ ＢＲＡＴ ２、Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ Ａｕｔｏｌｏｇ、Ｈａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｅｌｌ Ｓａｖｅｒ－５（登録商標）及びＦｒｅｓｅｎｉｕｓ ＣＡＴＳ（登録商標）；Ｂｅｎｔｚｉｅｎら、Ａｎａｅｓｔｈｅｓｉｓｔ４９：５０５、２０００；Ｓｅｒｒｉｃｋら、Ｊ．Ｅｘｔｒａ Ｃｏｒｐｏｒ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．３５（１）：２８、２００３；Ｃａｒｌｅｓｓら、Ｔｈｅ Ｃｏｃｈｒａｎｅ Ｌｉｂｒａｒｙ、Ｔｈｅ Ｃｏｃｈｒａｎｅ Ｒｅｖｉｅｗ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ．、第３巻、ｐｐ．１～１８０、２０１０）。米国において毎年百万件近い手術において用いられているＩＢＳ手順は、病院の血液管理及び保存プログラムの肝要な部分になってきている。

術前貧血の症例が増加していることに伴い、術前の供血は、全体的な輸血率が高いことにより、深刻な経済的疑問をさらに生じる（Ｃａｒｌｅｓｓら、Ｔｒａｎｓｆｕｓ．Ｍｅｄ．１４：１２３、２００４）。さらに、規制ガイドラインに従って、必要でない自己血液生成物は同種血輸血自体から除かれるために、イタリアでは、約３０％の術前自己供血が廃棄されている。この点で、ＩＢＳ及びその後の自己輸血は、全般的に、血液管理において安全でより費用効果的な施策である。

術中血液回収の利点
同種赤血球細胞輸血とは対照的に、ＩＢＳは、安全で効力のある代案であると考えられる。重要なことに、優れたウイルス診断薬にもかかわらず、ＨＩＶ感染の伝達の危険性は、４９３，０００同種血輸血あたり１であり、Ｃ型肝炎ウイルス感染の伝達の危険性は、１０３，０００あたり１であり、Ｂ型肝炎ウイルス感染の伝染の危険性は、６３，０００あたり１である（Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３４：１６８５、１９９６）。１９９６年から２００１年まで行われた「輸血の深刻な危険要因（Ｓｅｒｉｏｕｓ Ｈａｚａｒｄｓ ｏｆ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎｓ）」研究の結果は、同種輸血発生率のこれらの危険性を文書化した（Ｄｚｉｋら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ４３：１１９０、２００３）。著しいことに、汚染血液輸血による感染性疾患の伝染は、供血及び輸血プロセスとともに管理事務上又は人的不備によるＡＢＯ不適合血液による重大な危険性と比較して、小さい危険性であることがわかる（Ｓａｚａｍａ、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ３０：５８３、１９９０；Ｄｚｉｋら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ４３：１１９０、２００３）。輸血発生率の７０％より多くが、管理事務上の不備並びにサンプリング、指示及び成分収集における過誤を主な原因とする間違って輸血される血液成分に帰する可能性がある（Ｄｚｉｋら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ４３：１１９０、２００３）。術前及び術中の赤血球細胞の自己輸血は、同種血輸血に固有のこれらの危険性自体を回避する。全般的に、自己血液回収技術は、利点を提供するが、血液容量を保つために晶質又はコロイドの注入を必要としない（表１）。他の自家技術よりもかなり多くの容量の血液を、過度の出血中に術中に回収できる。

患者のＩＢＳへの適性
術中血液回収は、２５年以上前から利用されている。これは、心胸郭（ｃａｒｄｉｏｔｈｏｒｉａｃ）手術、血管及び外傷手術、並びに肝臓移植において広く用いられている。この使用に対する禁忌は、細菌感染及び手術野の血液中におそらく脱落する腫瘍細胞、並びに手術部位でのミクロフィブリルコラーゲン又はその他の外来物質の使用である。現在、ドナー血液不足及び感染の伝染への恐れから、血液喪失が大きい癌手術においてもＩＢＳの使用に対する興味が増加している。癌手術における自己血輸血の使用を外科医が渋ることは少なくなってきており、標準的な生存データと比較して、報告は、局所再発又は転移疾患の増加を示していない（Ｋｌｉｍｂｅｒｇら、Ａｒｃｈ．Ｓｕｒｇ．２１２：１３２６、１９８６；Ｐｅｒｓｅｇｈｉｎら、Ｖｏｘ Ｓａｎｇ．７２：２２１、１９９７）。Ｖａｎｄｅｒｌｉｎｄｅら（ＢＭＪ３２４：７７２、２００２）により概説されるように、術前供血血液から回収される赤血球細胞自己輸血は、同種輸血と比較して結腸直腸癌手術中の感染及び再発の発生率の低減を著しく導くことができた（表２）。これらの概説された臨床試験のいくつかは、結腸直腸手術がそれ自体細菌感染の伝染の固有の危険性のためにＩＢＳの推奨から除かれているので、さらにより重要である。

それにもかかわらず、ある研究は、腫瘍細胞が手術野において検出可能であったことを明確に示すが、癌再発に対するその影響は明確でないままであった（Ｈａｎｓｅｎら、Ａｒｃｈ．Ｓｕｒｇ．１３０：３８７、１９９５）。例えば、腹部、整形外科、泌尿器科、婦人科又は頭頚部の悪性腫瘍の癌手術を受けた６１名の患者の末梢血及びＩＢＳ中の腫瘍細胞の数を比較した。６１名の患者のうち５７名において、腫瘍細胞が、腫瘍学的手術中に流出した血液中で検出された。これらの腫瘍細胞は、５００ｍＬ血液あたり１０腫瘍細胞の感度で、増殖能、侵襲性及び腫瘍形成能により同定された（Ｈａｎｓｅｎら、Ａｒｃｈ．Ｓｕｒｇ．１３０：３８７、１９９５）。興味深いことに、流出血液中の腫瘍細胞数は、血液喪失量とは相関せず、これらの患者の２６％のみにおいて、循環腫瘍細胞が末梢血において検出できた。よって、手術野に流出した血液中の腫瘍細胞数は、１０から１０^７までの範囲であり得ると推定される。これらの結果は、Ｄａｌｅら、Ｂｒ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．７５：５８１、１９８８及びＭｕｌｌｅｒら、Ａｎａｅｓｔｈｅｓｉｓｔ４５：８３４、１９９６によっても独立して確認された。

ＩＢＳ試料中の残存腫瘍細胞の危険性に関する安全性の懸念にさらに対処するために、混入腫瘍細胞を効率的に排除するためにさらなるアプローチが必要である：
・ 自動化ＩＢＳ装置、例えばＣｅｌｌ Ｓａｖｅｒ－５（登録商標）と組み合わせて用いるある方法が、白血球枯渇フィルター（例えばＰａｌｌ ＲＣ４００、ＲＣＥＺ１Ｔ）、ＲＣ ＸＬ－１）を通すさらなる試料の濾過により示されている（Ｂｏｎｔａｄｉｎｉら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ３４．５３１、１９９４；Ｙａｐｒａｋら、Ｔｕｒｋ．Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．４０：８９、１９９８；Ｇｗａｋら、Ｌｉｖｅｒ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１１：３３１、２００５）。ＩＢＳにより回収された赤血球の安全な輸血は、いくつかの試験において評価されているように、臨床成績を損なわない（ＥｄｅｌｍａｎらＵｒｏｌｏｇｙ４７：１７９、１９９６；Ｐｅｒｓｅｇｈｉｎら、Ｖｏｘ Ｓａｎｇ．７２：２２１、１９９６；Ｄａｖｉｓら、ＢＪＵ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ９１：４７４、２００３）。
・ 別のＩＢＳアプローチにおいて、有核癌細胞の放射線感受性の根底にある原理及び無核赤血球細胞の放射線耐性のために、試料を５０Ｇｙにて照射する。

さらなるスタッフの必要性、線量測定の問題、臨床部門における適切かつ認可された照射設備を含むこのＩＢＳ／照射アプローチの複雑なロジスティクスにおける要求のために、この後者の手順は、広い応用において好ましくない。これとは対照的に、白血球枯渇のための濾過手順は、ＩＢＳ中の残存腫瘍細胞を低減するための手際のよいアプローチであるが、この技術は、残存腫瘍細胞がフィルターをまだ通過するという固有の危険性をまだ有する。

Ｅｄｍｕｎｄ Ａ．Ｍ．Ｎｅｕｇｅｂａｕｅｒ：“Ｊａｈｒｅｓｂｅｒｉｃｈｔ ２０１０、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ｆｕｒ Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇ ｉｎ ｄｅｒ Ｏｐｅｒａｔｉｖｅｎ Ｍｅｄｉｚｉｎ”、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔ Ｗｉｔｔｅｎ／Ｈｅｒｄｅｃｋｅ、２０１１年３月１日（２０１１－０３－０１）、第１～９８頁は、腫瘍学的手術中の自己血輸血のための、創傷の術中に回収した血液からの遊離腫瘍細胞の排除のための三官能性抗体カツマキソマブを開示している。

Ａｌｅｘａｎｄｒａ Ｓｃｈｏｂｅｒｔｈ：“Ｅｎｔｗｉｃｋｌｕｎｇ ｕｎｄ Ｖｅｒｂｅｓｓｅｒｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｅｎ ｚｕｒ Ｃｈａｒａｋｔｅｒｉｓｉｅｒｕｎｇ－ｄｉｓｓｅｍｉｎｉｅｒｔｅｒ Ｔｕｍｏｒｚｅｌｌｅｎ ｂｅｉ ｓｏｌｉｄｅｎ Ｔｕｍｏｒｅｎ“、Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ ａｎ ｄｅｒ Ｍｅｄｉｚｉｎｉｓｃｈｅｎ Ｆａｋｕｌｔａｔ ｄｅｒ Ｌｕｄｗｉｇ－Ｍａｘｉｍｉｌｉａｎｓ－Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔ ｚｕ Ｍｕｎｃｈｅｎ、２００４年１２月９日（２００４－１２－０９）は、三官能性抗体を用いるｅｘ ｖｉｖｏ除去（（再投与のために）自己幹細胞アフェレーシス生成物から腫瘍細胞をパージする）を開示している。

Ｓｃｈｏｂｅｒｔｈ Ａら：“Ａ ｎｅｗ ｃｌａｓｓ ｏｆ ｔｒｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｕｒｇｉｎｇ ｏｆ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ“、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ、第３７巻、２００１年９月１日（２００１－０９－０１）、第Ｓ５１頁は、三官能性二重特異性抗体を、末梢血幹細胞の免疫学的パージのために効果的に用いることができることを記載している。

ＥＰ６３１７３３０は、Ｔ細胞に、腫瘍細胞上の腫瘍関連抗原に、そしてそのＦｃ部分を介してＦｃ受容体陽性細胞に結合する三官能性二重特異性抗体を用いて、術中に回収した血液から腫瘍細胞を除去するｅｘ ｖｉｖｏ方法を記載している。しかし、Ｔ細胞、特にＴ細胞表面マーカーとしてのＣＤ３及びＣＤ２８への結合は、サイトカイン放出のある程度の危険性を含み、前記サイトカインは、患者に再注入するために回収された赤血球濃縮物に入り込む可能性がある。サイトカインを含む可能性がある前記赤血球濃縮物の再注入は、受容者において重篤な炎症反応を引き起こす可能性がある。さらに、この方法は、Ｔ細胞数が低減した患者において腫瘍細胞を十分に除去できない可能性がある。

よって、癌手術における安全性をさらに増進して残存腫瘍細胞を除去するために、例えば腫瘍を有する患者の創傷から手術中に得られた自己血液を再導入するための全ての既知の方法を改善して、混入する可能性がある腫瘍細胞の信頼できる除去を提供しなければならない。この改善は、患者の自己血液からの腫瘍細胞の効率の高い除去も含むべきであり、さらに、この改善は、例えばＣｅｌｌ Ｓａｖｅｒ－５（登録商標）若しくはＣＡＴＳ（登録商標）のような装置、又は手術を受けた患者からの腫瘍細胞を含まないか若しくは少なくとも実質的に含まない血液を再導入するための任意のその他の方法において容易に実行でき、好ましくは前記影響の発生が著しく減少しているべきである。

本発明者らが見出した新規なアプローチは、抗体駆動性腫瘍関連抗原認識と、さらに白血球及び／又はＦｃ受容体陽性アクセサリー細胞並びに／或いはさらに腫瘍細胞の認識により認識される腫瘍細胞を含む多重細胞複合体、すなわち会合体及び／又は凝集体の抗体媒介形成と、その後の例えば遠心分離及び／又は濾過工程による前記会合体の除去とに基づく。請求項１に記載する抗体の代わり又はそれと組み合わせて、抗体を模倣するタンパク質足場も用いることができる。

発明及び好ましい実施形態の詳細な説明
以下の議論は、本発明について説明し、その好ましい実施形態について示す目的のために含まれる。

そうでないと説明しない限り、本明細書で用いる全ての技術的及び科学的用語は、本開示が属する当該技術の熟練者が一般的に理解するものと同じ意味を有する。単数形の用語「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈がそうでないと明確に示さない限り、複数形の言及を含む。同様に、語句「又は（或いは、若しくは）」は、文脈がそうでないと明確に示さない限り、「及び」を含む意図である。本明細書に記載するものと同様又は等価な方法及び材料は本開示の実施又は試験において用いることができるが、適切な方法及び材料を以下に記載する。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」を意味する。本明細書に記載する全ての出版物、特許出願、特許及びその他の参考文献は、それらの全体が参照により組込まれている。矛盾がある場合、用語の説明を含む本明細書が支配する。また、材料、方法及び実施例は、例示のためだけであり、限定することを意図しない。

本発明は、以下に関する：
（１）以下の工程：
－ 腫瘍細胞を含み得る術中に回収した血液を準備する工程と、
－ 前記術中に回収した血液を、
－ 二重特異性、三重特異性、四重特異性及び多重特異性抗体、並びに二価、三価、四価及び多価抗体からなる群より選択される少なくとも１つの抗体、並びに／或いは
－ 抗体と同様の多重特異的又は多価結合特性を有する少なくとも足場タンパク質
と接触させる工程であって、
前記少なくとも１つの抗体及び／又は前記少なくとも１つの足場タンパク質が、以下の特性：
ａ）ＣＤ１１ａ、ＣＤ１５、ＣＤ１８、ＣＤ２９、ＣＤ３９、ＣＤ４５、ＣＤ４８、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ８２、ＣＤ９５、ＣＤ９７、ＣＤ１２２、ＣＤ１２４、ＣＤ１３２及びＣＤｗ１３７からなる群の少なくとも１つのメンバーから選択されるパン白血球（ｐａｎ－ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ）抗原と結合する、
ｂ）腫瘍細胞上の腫瘍関連抗原と結合する、
ｃ）そのＦｃ部分を介してＦｃ受容体陽性細胞と結合する
を有し、
前記少なくとも１つの抗体及び／又は前記少なくとも１つの足場タンパク質が、血液に含まれる少なくとも腫瘍細胞及び白血球細胞と三次元ネットワークを形成でき、
前記少なくとも１つの抗体及び／又は前記少なくとも１つの足場タンパク質が、１０～２４０分、好ましくは１０～１８０分の期間、前記術中に回収した血液と接触され、該期間は、前記抗体及び／又は前記足場タンパク質を含む会合体及び／又は凝集体を得るために前記腫瘍関連抗原を含む腫瘍細胞、及び前記パン白血球抗原を含む白血球細胞、及び／又は他の腫瘍細胞を架橋するために十分であり、前記腫瘍細胞、前記他の腫瘍細胞及び前記白血球細胞が、術中に回収した血液中に存在する可能性があり、前記腫瘍細胞が、前記少なくとも１つの抗体及び／又は前記少なくとも１つの足場タンパク質により特異的に認識される、工程と、
－ 前記会合体及び／又は凝集体を、前記術中に回収した血液から機械的に除去する工程と
を含む、術中に得られた回収血液から腫瘍細胞を除去するためのｅｘ ｖｉｖｏ方法。

（２）好ましくは、（１）によるｅｘ ｖｉｖｏ方法において、前記少なくとも１つの抗体は、三官能性二重特異性抗体である。

（３）好ましくは、（２）によるｅｘ ｖｉｖｏ方法において、前記三官能性二重特異性抗体は、以下のアイソタイプの組み合わせ：
ラット－ＩｇＧ２ｂ／マウス－ＩｇＧ２ａ、
ラット－ＩｇＧ２ｂ／マウス－ＩｇＧ２ｂ、
ラット－ＩｇＧ２ｂ／ヒト－ＩｇＧ１、
マウス－［ＶＨ－ＣＨ１；ＶＬ－ＣＬ］－ヒト－ＩｇＧ１／ラット－［ＶＨ－ＣＨ１，ＶＬ－ＣＬ］－ヒト－ＩｇＧ１－［ヒンジ］－ヒト－ＩｇＧ３^＊－［ＣＨ２－ＣＨ３］
［＊＝白人のアロタイプＧ３ｍ（ｂ＋ｇ）＝プロテインＡと結合しない］
を有する抗体の群から選択される。

（４）好ましくは、（１）から（３）のいずれか１つによるｅｘ ｖｉｖｏ方法において、前記パン白血球抗原は、ＣＤ５２である。

（５）好ましくは、（１）から（４）のいずれか１つによるｅｘ ｖｉｖｏ方法において、腫瘍抗原特異性及び／又はパン白血球抗原特異性が互いに異なる少なくとも２つの異なる抗体を用いる。

（６）好ましくは、（１）から（５）のいずれか１つによるｅｘ ｖｉｖｏ方法において、前記会合体は、抗体、腫瘍細胞及び白血球細胞で構成される。

（７）好ましくは、（１）から（６）のいずれか１つによるｅｘ ｖｉｖｏ方法において、前記１つ以上の抗体及び／又は足場タンパク質は、術中に回収した血液１リットルあたり１μｇから２０μｇ、好ましくは１から１０μｇ又は１から５μｇ又は１から２μｇの量で用いられる。

（８）好ましくは、（１）から（７）のいずれか１つによるｅｘ ｖｉｖｏ方法は、以下のさらなる工程：
ａ） 前記少なくとも１つの抗体及び／又は前記少なくとも１つの足場タンパク質を添加する前に、術中に回収した血液を、少なくとも１つの抗凝固剤と混合する工程、
ｂ） 前記会合体及び／又は凝集体並びにさらなる血液成分から赤血球を、遠心分離により、好ましくは密度勾配遠心分離により分離する工程、
ｃ） 前記混合物を所望により濾過して、存在する可能性がある残存会合体及び／又は凝集体並びに残存細胞複合体を除去する工程、並びに
ｄ） 赤血球含有画分及びさらなる血液成分を、別の容器に回収する工程
の少なくとも１つを含む。

（９）好ましくは、（１）から（８）のいずれか１つによるｅｘ ｖｉｖｏ方法において、前記術中に回収した血液との前記少なくとも１つの抗体及び／又は前記少なくとも１つの足場タンパク質のインキュベーション時間は、１０と９０分の間、さらに好ましくは２０と６０分の間であり、所望により、前記インキュベーションは、１９から２５℃の間の温度、好ましくは室温にて行われる。

（１０）好ましくは、（１）から（９）のいずれか１つによるｅｘ ｖｉｖｏ方法において、会合体及び／又は凝集体の前記除去は、遠心分離、濾過又はそれらの組み合わせによる。

（１１）好ましくは、（１）から（１０）のいずれか１つによるｅｘ ｖｉｖｏ方法において、白血球及び／又は腫瘍細胞を含む細胞複合体は、白血球吸着フィルターを用いて別の工程において除去される。

（１２）好ましくは、（１）から（１１）の１つ以上によるｅｘ ｖｉｖｏ方法において、前記腫瘍細胞は、上皮性、血液又は神経外胚葉性腫瘍からである。

（１３）好ましくは、（１）から（１２）の１つ以上によるｅｘ ｖｉｖｏ方法において、Ｔ細胞、腫瘍細胞上の腫瘍関連抗原、及びそのＦｃ部分を介してＦｃ受容体陽性細胞に結合する追加の三官能性二重特異性抗体を施用する。

（１４）好ましくは、（１）から（１３）のいずれか１つによるｅｘ ｖｉｖｏ方法において、前記少なくとも１つの抗体及び／又は前記少なくとも１つの足場タンパク質は、２つの異なる腫瘍関連抗原と結合する特性を有する。前記２つの異なる腫瘍関連抗原は、それぞれ２つの異なる腫瘍細胞上にあり得るか、又は同じ腫瘍細胞上にあり得る。

（１５）以下の特性：
ａ）ＣＤ１１ａ、ＣＤ１５、ＣＤ１８、ＣＤ２９、ＣＤ３９、ＣＤ４５、ＣＤ４８、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ８２、ＣＤ９５、ＣＤ９７、ＣＤ１２２、ＣＤ１２４、ＣＤ１３２及びＣＤｗ１３７からなる群の少なくとも１つのメンバーから選択されるパン白血球抗原と結合する、
ｂ）腫瘍細胞上の腫瘍関連抗原と結合する、
ｃ）そのＦｃ部分を介してＦｃ受容体陽性細胞と結合する
を有する二重特異性、三重特異性、四重特異性若しくは多重特異性抗体、二価、三価、四価若しくは多価抗体及び／又は抗体に類似の多重特異的若しくは多価結合特性を有する足場タンパク質、特に二重特異性三官能性抗体であって、血液中に含まれる腫瘍細胞及び白血球細胞と三次元ネットワークを形成できる抗体の、（１）から（１３）のいずれか１つ以上によるｅｘ ｖｉｖｏ方法における使用。

（１６）好ましくは、請求項１５に記載の使用において、前記少なくとも１つの抗体及び／又は前記少なくとも１つの足場タンパク質は、２つの異なる腫瘍関連抗原と結合する特性を含む。前記２つの異なる腫瘍関連抗原は、それぞれ２つの異なる腫瘍細胞上にあり得るか、又は同じ腫瘍細胞上にあり得る。

（１７）以下の工程：
－ 腫瘍細胞を含み得る術中に回収した血液を準備する工程と、
－ 前記術中に回収した血液を抗体と接触させる工程であって、前記抗体が、以下の特性：
ａ）ＣＤ１１ａ、ＣＤ１５、ＣＤ１８、ＣＤ２９、ＣＤ３９、ＣＤ４５、ＣＤ４８、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ８２、ＣＤ９５、ＣＤ９７、ＣＤ１２２、ＣＤ１２４、ＣＤ１３２及びＣＤｗ１３７からなる群の少なくとも１つのメンバーから選択されるパン白血球抗原と結合する、
ｂ）腫瘍細胞上の腫瘍関連抗原と結合する、
ｃ）そのＦｃ部分を介してＦｃ受容体陽性細胞と結合する
を有し、
前記抗体が、血液に含まれる少なくとも腫瘍細胞及び白血球細胞と三次元ネットワークを形成でき、
前記抗体が、１０～２４０分、好ましくは１０～１８０分の期間、前記術中に回収した血液と接触され、該期間は、前記抗体を含む会合体及び／又は凝集体を得るために前記腫瘍関連抗原を含む腫瘍細胞、及び前記パン白血球抗原を含む白血球細胞、及び／又は他の腫瘍細胞を架橋するために十分であり、前記腫瘍細胞、前記他の腫瘍細胞及び前記白血球細胞が、術中に回収した血液中に存在する可能性があり、前記腫瘍細胞が、前記抗体により特異的に認識される、工程と、
－ 前記会合体及び／又は凝集体を、前記術中に回収した血液から機械的に除去する工程と
を含む腫瘍又は癌の処置における使用のための、二重特異性、三重特異性、四重特異性及び多重特異性抗体、並びに二価、三価、四価及び多価抗体からなる群より選択される抗体。

（１８）好ましくは、（１７）による使用のための抗体は、２つの異なる腫瘍関連抗原と結合する特性を有する。前記２つの異なる腫瘍関連抗原は、それぞれ２つの異なる腫瘍細胞上にあり得るか、又は同じ腫瘍細胞上にあり得る。

（１９）以下の工程：
－ 腫瘍細胞を含み得る術中に回収した血液を準備する工程と、
－ 前記術中に回収した血液を足場タンパク質と接触させる工程であって、前記足場タンパク質が、以下の特性；
ａ）ＣＤ１１ａ、ＣＤ１５、ＣＤ１８、ＣＤ２９、ＣＤ３９、ＣＤ４５、ＣＤ４８、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ８２、ＣＤ９５、ＣＤ９７、ＣＤ１２２、ＣＤ１２４、ＣＤ１３２及びＣＤｗ１３７からなる群の少なくとも１つのメンバーから選択されるパン白血球抗原と結合する、
ｂ）腫瘍細胞上の腫瘍関連抗原と結合する、
ｃ）そのＦｃ部分を介してＦｃ受容体陽性細胞と結合する
を有し、
前記足場タンパク質が、血液に含まれる少なくとも腫瘍細胞及び白血球細胞と三次元ネットワークを形成でき、
前記足場タンパク質が、１０～２４０分、好ましくは１０～１８０分の期間、前記術中に回収した血液と接触され、該期間は、前記足場タンパク質を含む会合体及び／又は凝集体を得るために前記腫瘍関連抗原を含む腫瘍細胞、及び前記パン白血球抗原を含む白血球細胞、及び／又は他の腫瘍細胞を架橋するために十分であり、前記腫瘍細胞、前記他の腫瘍細胞及び前記白血球細胞が、術中に回収した血液中に存在する可能性があり、前記腫瘍細胞が、前記足場タンパク質により特異的に認識される、工程と、
－ 前記会合体及び／又は凝集体を、前記術中に回収した血液から機械的に除去する工程と
を含む腫瘍又は癌の処置における使用のための、抗体に類似の多重特異的又は多価結合特性を有する足場タンパク質。

（２０）（１９）による使用のための足場タンパク質は、２つの異なる腫瘍関連抗原と結合する特性を有する。前記２つの異なる腫瘍関連抗原は、それぞれ２つの異なる腫瘍細胞上にあり得るか、又は同じ腫瘍細胞上にあり得る。

他の好ましい実施形態は、図面を組み合わせた以下の説明及び実施例に記載される。本発明のさらに好ましい特長は、特許請求の範囲から理解できる。
本明細書に記載する方法は、ｅｘ ｖｉｖｏ、すなわち人体の外で行われる。術中回収血液（ＩＢＳ）は、当該技術において公知であり、「自己回収血液」とも記載される。手術中に喪失される血液は、取り戻され、手術中に喪失された血液を得る同じ患者に再注入される。

術中に回収した血液から腫瘍細胞を除去する方法は、ｅｘ ｖｉｖｏ方法について本明細書に記載する工程を含み、ｅｘ ｖｉｖｏ方法に関して述べたことが、適切である場合に本方法に当てはまる。

本明細書に記載する方法は、術中に得られた回収血液に混入する可能性がある腫瘍細胞の除去を指向する。血液は、好ましくは、手術処置を受け、かつ腫瘍及び／若しくは癌に罹患しているか、又は腫瘍形成性と考えられ得る細胞を有する疑いがある患者から得られる。
好ましくは、方法は、手術野から血液を吸引する外科医から開始する。回収工程は、好ましくは、吸引装置により行われ、希釈剤（ｄｉｌｕｔｉｖｅ）、例えばステロファンジンもこの工程中で用いることができる。その他の希釈剤、例えばヘパリンを含む０．９％ＮａＣｌも用いることができる。吸引血液は、次いで、血液の凝固を避けるために抗凝固剤と混合できる。吸引血液は、処理のために十分な血液が得られるまでレザーバに回収できる。
好ましくは、吸引血液は、希釈剤、例えばステロファンジン及び／又はヘパリンを含む０．９％ＮａＣｌで希釈される。

「抗凝固剤」への言及は、抗凝固剤、例えば抗凝固剤、血小板凝集抑制剤、血栓溶解及び繊維素溶解剤、並びに金属イオンキレート化剤、例えばクエン酸塩、クエン酸デキストロース（ＡＣＤ）及びＥＤＴＡ並びにシュウ酸塩のクラスを含む。関連する態様において、抗凝固剤は、ヘパリン及びグリコサミノグリカン、例えば低分子量ヘパリン、例えばベミパリン、セルトパリン、ダルテパリン、エノキサパリン、ナドロパリン、パマパリン（Ｐａｍａｐａｒｉｎ）、レビパリン及びチンザパリン、並びにヘパリン類似物質、例えばダナパロイド、スロデキシド、デルマタン硫酸；直接トロンビン（ＩＩ）阻害剤、例えばアルガトロバン、ビバリルジン、ダビガトラン、デシルジン、ヒルジン、レピルジン、メラガトラン、キシメラガトラン；第Ｘａ因子阻害剤（例えばダニ抗凝固ペプチド）、例えばアピキサバン、オタミキサバン、リバーロキサバン、並びにオリゴ糖類、例えばフォンダパリヌクス及びイドラパリヌクス；ビタミンＫアンタゴニスト、例えばアセノクマロール、クロリンジオン、クマテトラリル、ジクマロール、ジフェナジオン、エチルビスクムアセテート、フェンプロクモン、フェニンジオン、チオクロマロール及びワルファリンを含む。

本発明の一実施形態では、いわゆる回収血液は、腫瘍細胞の存在について試験でき、ここで、特に好ましくは、腫瘍関連抗原の種類を、前記抗体が結合し、本発明において用いる腫瘍抗原の種類を決定するために、当該技術において公知の方法、例えば腫瘍関連抗原のエピトープと特異的に反応する標識抗体により決定する。

本発明では、用語「腫瘍細胞」は、絶え間なく分裂でき、かつ固形腫瘍を形成できるか又は異常細胞で血液をみなぎらせることができる任意の細胞のことをいう。好ましくは、本発明では、術中に回収した血液中に存在する腫瘍細胞は、上皮性、血液又は神経外胚葉性腫瘍からであり得る。

本発明に含まれる腫瘍の例（それらに限定されないが）は、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫及びその他の肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌腫、リンパ性腫瘍、膵癌、乳癌（基底乳癌、乳管癌及び小葉乳癌を含む）、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、肝細胞癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髄様癌、甲状腺乳頭癌、褐色細胞腫、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、髄様癌、気管支原性肺癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛癌、ウィルムス腫瘍、子宮頚癌、精巣腫瘍、精上皮腫、膀胱癌及びＣＮＳ腫瘍（例えば神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫瘍、乏突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽腫及び網膜芽細胞腫）を含む肉腫並びに癌腫を含む。さらなる例は、上皮性腫瘍、血液腫瘍及び神経外胚葉性腫瘍を含む。
好ましくは、本発明の方法では、前記腫瘍細胞は、上皮性、血液又は神経外胚葉性腫瘍からである。

本発明では、「免疫細胞」は、白血球及びＦｃ受容体陽性細胞を含む。本発明では、「Ｆｃ受容体細胞」は、細胞表面にＦｃ受容体が存在する細胞のことをいう。好ましくは、「Ｆｃ受容体陽性細胞」は、単球、マクロファージ、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、好中球及び好酸球性細胞の１つ以上のことをいう。
好ましくは、術中に回収した血液は、レザーバに回収された後に、前記抗体又は前記足場タンパク質と接触させる。

術中回収血液を、次いで、少なくとも１つの腫瘍細胞の少なくとも１つの腫瘍関連抗原の少なくとも１つのエピトープと特異的に結合できる抗体又は適当なタンパク質足場と接触させる。
本発明では、「赤血球濃縮物」は、濃厚赤血球のことをいう。
本発明では、「細胞凝集体」は、互いに接着した細胞のことをいい、前記表現は、「会合体」又は「細胞会合体」と交換可能である。同様に、「会合する」と「凝集する」も交換可能である。

さらなる要件として、前記抗体は、抗体及び腫瘍細胞を含む凝集体又は会合体を得るために、血液中に含まれる少なくとも前記抗体及び前記腫瘍細胞の三次元ネットワークを形成できなければならない。本発明のさらに特定の好ましい実施形態では、前記抗体は、抗体及び腫瘍細胞、所望により免疫細胞、並びに所望によりさらなる腫瘍細胞の三次元ネットワークを形成するために、１より多い腫瘍細胞及び／又は免疫細胞とも結合できる。多重細胞複合体の形成に起因する前記会合体の組成、構造及びサイズのために、会合体は、遠心分離若しくは濾過又はその組み合わせにより前記ＩＢＳから除去できる。濾過及び遠心分離は、好ましい方法であるが、残存腫瘍細胞を含む前記会合体を効率的に除去するために、当業者は他の方法を認識し得ることが理解される。

本発明は、よって、好ましくは、腫瘍細胞上の腫瘍関連抗原、並びに所望により免疫細胞及び／又はその他の腫瘍細胞との抗体の会合及び凝集により形成される会合体及び凝集体の機械的除去に焦点を当て、抗体特異的相互作用及び免疫学的効果による前記腫瘍細胞の破壊による腫瘍関連抗原を保有する腫瘍細胞の枯渇に焦点を当てない。免疫細胞と相互作用することにより腫瘍細胞を破壊するために、免疫学的物質と同様の従来の様式で抗体を用いるが、本発明は、本発明の場合は腫瘍細胞上にある抗原又はその断片を架橋できる抗体の能力から好ましくは恩恵を受ける。本発明の効果は、前記腫瘍細胞との抗体の相互作用により、特に遠心分離及び／又は濾過分離法による前記三次元ネットワークの除去により達成される。

本方法は、抗体又は抗体様分子が磁性成分、例えば磁性ビーズ又は構造要素を介する抗体複合体の除去を容易にするその他の構造要素と連結され得るか、或いは腫瘍細胞が細胞ソーティング法、例えばフローサイトメトリーにより除去される当該技術において既知の他の方法を組み合わせて用いることもできる。腫瘍細胞上の抗原、例えば腫瘍関連抗原又はその断片並びに所望により免疫細胞及び／又はその他の腫瘍細胞との抗体の三次元ネットワークの形成だけを理由として、前記会合体の機械的除去が可能である。この点で、本発明では、他の構造的成分、例えば磁性ビーズ又は蛍光分子を含めることにより前記除去を容易にする必要がなく、このことにより、本方法は、より単純で容易に行われる。

本発明は、本発明の限定内での三官能性二重特異性抗体に関して本明細書に記載され、特許請求の範囲に記載され、三官能性二重特異性抗体、抗ＣＤ５２×抗ＥｐＣＡＭに関して例示される。前記抗ＣＤ５２×抗ＥｐＣＡＭ三官能性二重特異性抗体は、腫瘍関連抗原ＥｐＣＡＭを指向し、パン白血球マーカーであるＣＤ５２、及びそのＦｃ部分によりＦｃ受容体陽性細胞とさらに結合する。実施例に記載する具体的な実施形態は、本発明の実行可能性の証拠を提供する例示的実施形態として理解されなければならない。カツマキソマブによるＩＢＳからの腫瘍細胞の優れた除去についての証拠が示されているが、ここで請求する方法が基づく原理についての概念の証明が与えられる。この証拠を示して、当業者は、本発明によりカバーされる限り、この概念を、三次元ネットワーク、すなわち例えば遠心分離及び／又は濾過により除去できる多重細胞複合体を提供するために前記腫瘍細胞及び所望により前記免疫細胞と相互作用できる他の腫瘍及び他の抗体に拡張する可能性を必然的に有する。

好ましくは、本発明の抗体は、三官能性抗体から具体的に選択される。好ましくは、本発明における三官能性抗体は、二重、三重、四重及び多重特異性抗体であり得る。上で開示する三官能性抗体は、三官能性二重特異性抗体のことをいう。しかし、三重、四重及び多重特異性抗体も同じ特性又は作用を示すならば、前記三官能性抗体は、本明細書で用いるように、三官能性三重、四重及び多重特異性抗体ということもできる。

本発明の抗体は、三官能性抗体から具体的に選択される。二重特異性抗体は、２つの異なるタイプの抗原と、好ましくはその可変領域を介して結合できる抗体と定義され、三重特異性抗体は、３つの異なるタイプの抗原と、好ましくはその可変領域を介して結合することを特徴とし、四重特異性抗体は、４つの異なるタイプの抗原と、好ましくはその可変領域を介して結合することを特徴とするが、多重特異性抗体は、複数の異なるタイプの抗原と、好ましくはその可変領域を介して結合できると定義される。ある具体的な一例として、三官能性二重特異性抗体である抗ＣＤ５２×抗ＥｐＣＡＭは、腫瘍関連抗原ＥｐＣＡＭと一方で、パン白血球マーカーＣＤ５２と他方で、そしてそのＦｃ部分によりアクセサリー細胞とも結合することにより定義される。

上記の二重、三重、四重及び多重特異性抗体は、一価、二価、三価、四価又は多価であり得る。一価結合特性を有する抗体は、１つの腫瘍関連抗原と結合できる抗体と定義される。二価モノクローナル抗体は、２つの腫瘍関連抗原又は１つの腫瘍関連抗原及び１つの免疫細胞関連抗原と結合できる抗体と定義される。三価モノクローナル抗体は、３つの異なる腫瘍関連抗原、又は２つの腫瘍関連抗原及び１つの免疫細胞関連抗原、又は１つの腫瘍関連抗原及び２つの免疫細胞関連抗原と結合できる抗体と定義される。四価モノクローナル抗体は、４つの異なる腫瘍関連抗原、又はそれぞれが２つの同一抗原結合アームを有する２つの異なる腫瘍関連抗原、又は２つ／３つの腫瘍関連抗原及び１つの免疫細胞関連抗原、又は２つの腫瘍関連抗原及び２つの免疫細胞関連抗原と結合できる抗体と定義される。多価モノクローナル抗体は、１つ以上の腫瘍関連抗原及び／又は１つ以上の免疫細胞関連抗原と結合できる抗体と定義される。用語「腫瘍関連抗原と結合」は、腫瘍細胞上の前記腫瘍関連抗原のエピトープとの結合と定義される。請求項１に記載する三官能性二重特異性フォーマットを有する抗体のみが、本発明によりカバーされる。他の全ての抗体は、情報の目的のためにのみ記載される。

二官能性又は三官能性抗体の一般的な記載は、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ＲＥ（編）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ Ｌｏｎｄｏｎ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１～２８頁（２０１１）に記載され、二重特異性又は三重特異性（１つの腫瘍関連抗原及び白血球（すなわち免疫系の細胞）の１つ以上の表面抗原との二価、三価及び四価結合特性を有する三官能性フォーマットが本出願にとって重要である。

・二価抗原結合特徴を有する二重特異性抗体フォーマット：
例えば、ｓｃＦｖ（例えばＢｉＴＥクラス）、Ｄｂ、ｓｃＤｂ、ｄｓＤｂ、ＤＡＲＴ、ｄＡｂ_２／ＶＨＨ_２、ノブ・イントゥ・ホール派生物、ＳＥＥＤ－ＩｇＧ、ヘテロＦｃ－ｓｃｆｖ、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ、ＣｒｏｓｓＭａｂ
・三価抗原結合特長を有する二重（三重）特異性抗体フォーマット：
例えば、トリプルボディ、ＤＮＬ－Ｆ（ａｂ）_３、ｓｃＦｖ_{２－ＣＨ１／ＣＬ}、ｄＡｂ_３、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ_２、ＩｇＧ－ｓｃＦａｂ
・四価抗原結合特長を有する二重（三重）特異性抗体フォーマット：
例えば、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－ＩｇＧ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、Ｆ（ａｂ’）_２－ｓｃＦｖ_２、ｓＤｂ－Ｆｃ、ｓｃＤｂ－Ｃ_Ｈ３、Ｄｂ－Ｆｃ、ｓｃＦｖ_２－Ｈ／Ｌ、ＤＶＤ－Ｉｇ、ｔａｎｄＡｂ、ｓｃＦｖ－ｄｈｌｘ－ｓｃＦｖ、ｄＡｂ_２－ＩｇＧ、２－イン－１ ｍＡｂ、ｍＡｂ^２、ｄＡｂ－ＩｇＧ、ｄＡｂ－Ｆｃ－ｄＡｂ。
本発明に従って用いる抗体のさらなる例を、同封の図２に示す。

本発明に従って用いるさらなる抗体は、以下の参考文献に記載されている。
Ｍｕｌｌｅｒ Ｄ及びＲＥ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ．Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ＲＥ（編）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ Ｌｏｎｄｏｎ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、８３～１００頁（２０１１）
ｓｃＦｖ （ＢｉＴＥ）
Ｂａｅｕｅｒｌｅ ＰＡ、Ｚｕｇｍａｉｅｒ Ｇ及びＤ Ｒｕｔｔｉｎｇｅｒ．Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ＲＥ（編）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ Ｌｏｎｄｏｎ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２７３～２８８頁（２０１１）
ＤＶＤ－Ｉｇ
Ｔａｒｃｓａ Ｅ、Ｆｒａｕｎｈｏｆｅｒ Ｗ、Ｇｈａｙｕｒ Ｔ、Ｓａｌｆｅｌｄ Ｊ及びＪ Ｇｕ．Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ＲＥ（編）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ Ｌｏｎｄｏｎ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１７１～１８６頁（２０１１）
ＤＮＬ誘導体
Ｃｈａｎｇ Ｃ－Ｈ、Ｒｏｓｓｉ ＥＡ、Ｓｈａｒｋｅｙ ＲＭ、ＤＭ Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ．Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ＲＥ（編）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ Ｌｏｎｄｏｎ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９～２１６頁（２０１１）
２－イン－１抗体
Ｋｏｅｉｎｇ Ｐ及びＧ Ｆｕｈ．Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ＲＥ（編）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ Ｌｏｎｄｏｎ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１８７～１９８頁（２０１１）
クロスＭａｂ
Ｓｃｈａｅｆｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０８：１１１８７（２０１１）

好ましくは、異なる特異性を有する２つ以上の三官能性抗体を、前記会合体の形成を媒介するために組み合わせることができる。

本発明で用いる三官能性二重特異性抗体は、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１５、ＣＤ１８、ＣＤ２９、ＣＤ３９、ＣＤ４５、ＣＤ４８、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ８２、ＣＤ９５、ＣＤ９７、ＣＤ１２２、ＣＤ１２４、ＣＤ１３２及びＣＤｗ１３７からなる群より選択されるパン白血球抗原を指向する。
好ましくは、本発明で用いる三官能性二重特異性抗体は、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８、ＣＤ４５、ＣＤ５２、ＣＤ８２又はＣＤ９７を指向する。さらに好ましい実施形態では、抗体は、ＣＤ５２を指向する。

好ましい実施形態では、本発明で用いる抗体は、モノクローナル抗体である。これは、本明細書に詳細に記載する三官能性二重特異性抗体について具体的に当てはまる。

相対的に規定された三次元構造を有するタンパク質は、タンパク質足場と一般的によばれる。これらのタンパク質足場は、人工的に改変された抗体の設計のための試剤として用いられる。これらの足場は、典型的に、特異的又は無作為配列変動に適する１つ以上の領域を含み、このような配列無作為化は、所望の抗体足場をそこから選択できるタンパク質のライブラリーを生成するためにしばしば行われる。このような足場は、抗体設計の分野において特に有用である。

これらの抗体足場は、例えば腫瘍細胞及び免疫細胞との結合活性に関してモノクローナル抗体の特性を模倣する非免疫グロブリンタンパク質である。足場は、前記抗体足場の結合部位を形成するループ又はドメインをしばしば含む。これらの抗体模倣物は、実質的に任意の興味対象化合物と結合できるタンパク質を設計する目的のために用いることができる。この定方向進化アプローチは、興味対象の抗原について高い親和性を有する抗体様分子の生成をもたらす。さらに、これらの足場は、導入されたループと結合する分子の進化を駆動するために、規定された露出ループ（例えば以前に無作為化され、抗原結合に基づいて選択されたループ）を提示するために用いることができる。抗体様足場タンパク質をどのようにして得るかについての方法は、当該技術において既知である。以下に、抗体様足場タンパク質を得るための一つの可能性のあるアプローチを記載する。

興味対象の無作為化又は変異タンパク質を単離又は同定するために有用な第一のスクリーニング方法は、（ａ）興味対象の化合物を、候補タンパク質と接触させることであって、候補タンパク質が、免疫グロブリン様折り畳みを有するドメインを含む誘導非抗体タンパク質であり、非抗体タンパク質が、変異アミノ酸配列を有することにより参照タンパク質から導かれ、非抗体タンパク質が、少なくとも１マイクロＭほどきついＫｄで、参照タンパク質とはそれほどきつくは結合しない化合物と結合し、前記接触が、化合物－タンパク質複合体形成を可能にする条件下で行われることと、（ｂ）複合体から、化合物と結合する誘導タンパク質を得ることとを含む。

第二のスクリーニング方法は、興味対象の腫瘍関連タンパク質と結合する化合物を単離又は同定するためである。この方法は、免疫グロブリン様折り畳みを有し、変異アミノ酸配列を有することにより参照タンパク質から導かれるドメインを含む非抗体タンパク質から始まり、非抗体タンパク質は、少なくとも１マイクロＭほどきついＫｄで、参照タンパク質とはそれほどきつくは結合しない化合物と結合する。この誘導タンパク質を、次いで、候補化合物（腫瘍関連抗原又はそのエピトープ）と接触させ、前記接触は、化合物－タンパク質複合体形成を可能にする条件下で行われ、誘導タンパク質と結合する化合物が、複合体から得られる。ここでもまた、この一般的な技術は、任意のタンパク質を用いて行うことができる。

興味対象の化合物（腫瘍関連抗原又はそのエピトープ）と結合する非抗体タンパク質を得るさらなる方法を、以下に記載する。このような方法の一つは、（ａ）免疫グロブリン様折り畳みを含む非抗体足場タンパク質を準備することであって、足場タンパク質が、１マイクロＭほどきついＫｄで化合物と結合しないことと、（ｂ）非抗体足場タンパク質の変異誘導体を作製することにより、変異タンパク質のライブラリーを生成することと、（ｃ）ライブラリーを化合物と接触させることと、（ｄ）ライブラリーから、少なくとも１マイクロＭほどきついＫｄで化合物と結合する少なくとも１つの誘導タンパク質を選択することと、（ｅ）反復工程（ｂ）における非抗体足場タンパク質を先の工程（ｄ）からの生成物で置換して工程（ｂ）～（ｄ）を所望により反復することとを含む。ここでもまた、この一般的な技術は、任意のタンパク質を用いて行うことができる。

そのようにして生成された足場タンパク質は、上及び下に記載する抗体の機能を模倣し、免疫グロブリンベースの抗体の代わりに又はそれと組み合わせて用いることができる。本発明では、前記三官能性抗体は、白血球との結合、腫瘍細胞上の腫瘍関連抗原との結合、及びＦｃ部分を介するＦｃ受容体陽性細胞との結合に関して同じ機能をともに示す限り、前記足場タンパク質で置き換えて、細胞凝集体を含む術中に回収した血液を得ることができる。

本発明では、前記三官能性抗体及び前記足場タンパク質は、単独又は組み合わせて用いることができる。

以下に、三官能性二重特異性及び三重特異性抗体についてより詳細に記載する。
好ましくは、本発明に従って用いる抗体は、そのＦｃ部分中にＦｃγ（Ｆｃガンマ）受容体Ｉ、ＩＩ及び／又はＩＩＩ型との結合部位を含む。
好ましくは、本発明に従って用いる抗体は、Ｆｃγ受容体陽性細胞である単球、マクロファージ、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、好中球及び／又は好酸球性細胞と結合できる。

本発明では、腫瘍関連抗原は、腫瘍細胞で生成される抗原性物質のことをいう。
好ましくは、抗体又は足場タンパク質、三官能性二重特異性抗体が結合する前記腫瘍関連抗原は、ＥｐＣＡＭ、Ｈｅｒ２ｎｅｕ、ＥＧＦＲ、ＣＤ３０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＭＵＣ１、糖鎖付加パターンが変化したＭＵＣ１^＊、ＰＳＭＡ、ＣＤ３３、ＭＣＳＰ、ｃＭｅｔ、ＥｐｈＡ２、エンドシアリン、炭酸脱水酵素、ＩＧＦ－１Ｒ、ＦＡＰ－アルファ、ＣＤ１９、ＧＤ２、ＣＥＡ、ＦＲ、プロテオグリカン、Ｇ２５０、ＧＣ１８２、ＧＴ４６８、ＧＴ５１２からなる群より選択される。
より具体的に、本発明の抗体又は足場タンパク質、三官能性二重特異性抗体が結合する前記腫瘍関連抗原は、ＥｐＣＡＭ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＥｐｈＡ２、ＧＤ２又はＣＤ２０である。

好ましくは、本発明の三官能性二重特異性抗体は、１つのパン白血球抗原及び１つの腫瘍関連抗原を指向し、このような２つの抗原の組み合わせは、ＥｐＣＡＭ／ＣＤ１１ａ、ＥｐＣＡＭ／ＣＤ１５、ＥｐＣＡＭ／ＣＤ１８、ＥｐＣＡＭ／ＣＤ２９、ＥｐＣＡＭ／ＣＤ３９、ＥｐＣＡＭ／ＣＤ４５、ＥｐＣＡＭ／ＣＤ４８、ＥｐＣＡＭ／ＣＤ５２、ＥｐＣＡＭ／ＣＤ５５、ＥｐＣＡＭ／ＣＤ５８、ＥｐＣＡＭ／ＣＤ５９、ＥｐＣＡＭ／ＣＤ８２、ＥｐＣＡＭ／ＣＤ９５、ＥｐＣＡＭ／ＣＤ９７、ＥｐＣＡＭ／ＣＤ１２２、ＥｐＣＡＭ／ＣＤ１２４、ＥｐＣＡＭ／ＣＤ１３２、ＥｐＣＡＭ／ＣＤｗ１３７、Ｈｅｒ２ｎｅｕ／ＣＤ１１ａ、Ｈｅｒ２ｎｅｕ／ＣＤ１５、Ｈｅｒ２ｎｅｕ／ＣＤ１８、Ｈｅｒ２ｎｅｕ／ＣＤ２９、Ｈｅｒ２ｎｅｕ／ＣＤ３９、Ｈｅｒ２ｎｅｕ／ＣＤ４５、Ｈｅｒ２ｎｅｕ／ＣＤ４８、Ｈｅｒ２ｎｅｕ／ＣＤ５２、Ｈｅｒ２ｎｅｕ／ＣＤ５５、Ｈｅｒ２ｎｅｕ／ＣＤ５８、Ｈｅｒ２ｎｅｕ／ＣＤ５９、Ｈｅｒ２ｎｅｕ／ＣＤ８２、Ｈｅｒ２ｎｅｕ／ＣＤ９５、Ｈｅｒ２ｎｅｕ／ＣＤ９７、Ｈｅｒ２ｎｅｕ／ＣＤ１２２、Ｈｅｒ２ｎｅｕ／ＣＤ１２４、Ｈｅｒ２ｎｅｕ／ＣＤ１３２、Ｈｅｒ２ｎｅｕ／ＣＤｗ１３７、ＥＧＦＲ／ＣＤ１１ａ、ＥＧＦＲ／ＣＤ１５、ＥＧＦＲ／ＣＤ１８、ＥＧＦＲ／ＣＤ２９、ＥＧＦＲ／ＣＤ３９、ＥＧＦＲ／ＣＤ４５、ＥＧＦＲ／ＣＤ４８、ＥＧＦＲ／ＣＤ５２、ＥＧＦＲ／ＣＤ５５、ＥＧＦＲ／ＣＤ５８、ＥＧＦＲ／ＣＤ５９、ＥＧＦＲ／ＣＤ８２、ＥＧＦＲ／ＣＤ９５、ＥＧＦＲ／ＣＤ９７、ＥＧＦＲ／ＣＤ１２２、ＥＧＦＲ／ＣＤ１２４、ＥＧＦＲ／ＣＤ１３２、ＥＧＦＲ／ＣＤｗ１３７、ＣＤ３０／ＣＤ１１ａ、ＣＤ３０／ＣＤ１５、ＣＤ３０／ＣＤ１８、ＣＤ３０／ＣＤ２９、ＣＤ３０／ＣＤ３９、ＣＤ３０／ＣＤ４５、ＣＤ３０／ＣＤ４８、ＣＤ３０／ＣＤ５２、ＣＤ３０／ＣＤ５５、ＣＤ３０／ＣＤ５８、ＣＤ３０／ＣＤ５９、ＣＤ３０／ＣＤ８２、ＣＤ３０／ＣＤ９５、ＣＤ３０／ＣＤ９７、ＣＤ３０／ＣＤ１２２、ＣＤ３０／ＣＤ１２４、ＣＤ３０／ＣＤ１３２、ＣＤ３０／ＣＤｗ１３７、ＣＤ２０／ＣＤ１１ａ、ＣＤ２０／ＣＤ１５、ＣＤ２０／ＣＤ１８、ＣＤ２０／ＣＤ２９、ＣＤ２０／ＣＤ３９、ＣＤ２０／ＣＤ４８、ＣＤ２０／ＣＤ５５、ＣＤ２０／ＣＤ５８、ＣＤ２０／ＣＤ５９、ＣＤ２０／ＣＤ８２、ＣＤ２０／ＣＤ９５、ＣＤ２０／ＣＤ９７、ＣＤ２０／ＣＤ１２２、ＣＤ２０／ＣＤ１２４、ＣＤ２０／ＣＤ１３２、ＣＤ２０／ＣＤｗ１３７、ＣＤ２２／ＣＤ１１ａ、ＣＤ２２／ＣＤ１５、ＣＤ２２／ＣＤ１８、ＣＤ２２／ＣＤ２９、ＣＤ２２／ＣＤ３９、ＣＤ２２／ＣＤ４５、ＣＤ２２／ＣＤ４８、ＣＤ２２／ＣＤ５２、ＣＤ２２／ＣＤ５５、ＣＤ２２／ＣＤ５８、ＣＤ２２／ＣＤ５９、ＣＤ２２／ＣＤ８２、ＣＤ２２／ＣＤ９５、ＣＤ２２／ＣＤ９７、ＣＤ２２／ＣＤ１２２、ＣＤ２２／ＣＤ１２４、ＣＤ２２／ＣＤ１３２、ＣＤ２２／ＣＤｗ１３７、ＭＵＣ１／ＣＤ１１ａ、ＭＵＣ１／ＣＤ１５、ＭＵＣ１／ＣＤ１８、ＭＵＣ１／ＣＤ２９、ＭＵＣ１／ＣＤ３９、ＭＵＣ１／ＣＤ４５、ＭＵＣ１／ＣＤ４８、ＭＵＣ１／ＣＤ５２、ＭＵＣ１／ＣＤ５５、ＭＵＣ１／ＣＤ５８、ＭＵＣ１／ＣＤ５９、ＭＵＣ１／ＣＤ８２、ＭＵＣ１／ＣＤ９５、ＭＵＣ１／ＣＤ９７、ＭＵＣ１／ＣＤ１２２、ＭＵＣ１／ＣＤ１２４、ＭＵＣ１／ＣＤ１３２、ＭＵＣ１／ＣＤｗ１３７、ＭＵＣ１^＊／ＣＤ１１ａ、ＭＵＣ１^＊／ＣＤ１５、ＭＵＣ１^＊／ＣＤ１８、ＭＵＣ１^＊／ＣＤ２９、ＭＵＣ１^＊／ＣＤ３９、ＭＵＣ１^＊／ＣＤ４５、ＭＵＣ１^＊／ＣＤ４８、ＭＵＣ１^＊／ＣＤ５２、ＭＵＣ１^＊／ＣＤ５５、ＭＵＣ１^＊／ＣＤ５８、ＭＵＣ１^＊／ＣＤ５９、ＭＵＣ１^＊／ＣＤ８２、ＭＵＣ１^＊／ＣＤ９５、ＭＵＣ１^＊／ＣＤ９７、ＭＵＣ１^＊／ＣＤ１２２、ＭＵＣ１^＊／ＣＤ１２４、ＭＵＣ１^＊／ＣＤ１３２、ＭＵＣ１^＊／ＣＤｗ１３７、ＰＳＭＡ／ＣＤ１１ａ、ＰＳＭＡ／ＣＤ１５、ＰＳＭＡ／ＣＤ１８、ＰＳＭＡ／ＣＤ２９、ＰＳＭＡ／ＣＤ３９、ＰＳＭＡ／ＣＤ４５、ＰＳＭＡ／ＣＤ４８、ＰＳＭＡ／ＣＤ５２、ＰＳＭＡ／ＣＤ５５、ＰＳＭＡ／ＣＤ５８、ＰＳＭＡ／ＣＤ５９、ＰＳＭＡ／ＣＤ８２、ＰＳＭＡ／ＣＤ９５、ＰＳＭＡ／ＣＤ９７、ＰＳＭＡ／ＣＤ１２２、ＰＳＭＡ／ＣＤ１２４、ＰＳＭＡ／ＣＤ１３２、ＰＳＭＡ／ＣＤｗ１３７、ＣＤ３３／ＣＤ１１ａ、ＣＤ３３／ＣＤ１５、ＣＤ３３／ＣＤ１８、ＣＤ３３／ＣＤ２９、ＣＤ３３／ＣＤ３９、ＣＤ３３／ＣＤ４５、ＣＤ３３／ＣＤ４８、ＣＤ３３／ＣＤ５２、ＣＤ３３／ＣＤ５５、ＣＤ３３／ＣＤ５８、ＣＤ３３／ＣＤ５９、ＣＤ３３／ＣＤ８２、ＣＤ３３／ＣＤ９５、ＣＤ３３／ＣＤ９７、ＣＤ３３／ＣＤ１２２、ＣＤ３３／ＣＤ１２４、ＣＤ３３／ＣＤ１３２、ＣＤ３３／ＣＤｗ１３７、ＭＣＳＰ／ＣＤ１１ａ、ＭＣＳＰ／ＣＤ１５、ＭＣＳＰ／ＣＤ１８、ＭＣＳＰ／ＣＤ２９、ＭＣＳＰ／ＣＤ３９、ＭＣＳＰ／ＣＤ４５、ＭＣＳＰ／ＣＤ４８、ＭＣＳＰ／ＣＤ５２、ＭＣＳＰ／ＣＤ５５、ＭＣＳＰ／ＣＤ５８、ＭＣＳＰ／ＣＤ５９、ＭＣＳＰ／ＣＤ８２、ＭＣＳＰ／ＣＤ９５、ＭＣＳＰ／ＣＤ９７、ＭＣＳＰ／ＣＤ１２２、ＭＣＳＰ／ＣＤ１２４、ＭＣＳＰ／ＣＤ１３２、ＭＣＳＰ／ＣＤｗ１３７、ｃＭｅｔ／ＣＤ１１ａ、ｃＭｅｔ／ＣＤ１５、ｃＭｅｔ／ＣＤ１８、ｃＭｅｔ／ＣＤ２９、ｃＭｅｔ／ＣＤ３９、ｃＭｅｔ／ＣＤ４５、ｃＭｅｔ／ＣＤ４８、ｃＭｅｔ／ＣＤ５２、ｃＭｅｔ／ＣＤ５５、ｃＭｅｔ／ＣＤ５８、ｃＭｅｔ／ＣＤ５９、ｃＭｅｔ／ＣＤ８２、ｃＭｅｔ／ＣＤ９５、ｃＭｅｔ／ＣＤ９７、ｃＭｅｔ／ＣＤ１２２、ｃＭｅｔ／ＣＤ１２４、ｃＭｅｔ／ＣＤ１３２、ｃＭｅｔ／ＣＤｗ１３７、ＥｐｈＡ２／ＣＤ１１ａ、ＥｐｈＡ２／ＣＤ１５、ＥｐｈＡ２／ＣＤ１８、ＥｐｈＡ２／ＣＤ２９、ＥｐｈＡ２／ＣＤ３９、ＥｐｈＡ２／ＣＤ４５、ＥｐｈＡ２／ＣＤ４８、ＥｐｈＡ２／ＣＤ５２、ＥｐｈＡ２／ＣＤ５５、ＥｐｈＡ２／ＣＤ５８、ＥｐｈＡ２／ＣＤ５９、ＥｐｈＡ２／ＣＤ８２、ＥｐｈＡ２／ＣＤ９５、ＥｐｈＡ２／ＣＤ９７、ＥｐｈＡ２／ＣＤ１２２、ＥｐｈＡ２／ＣＤ１２４、ＥｐｈＡ２／ＣＤ１３２、ＥｐｈＡ２／ＣＤｗ１３７、エンドシアリン／ＣＤ１１ａ、エンドシアリン／ＣＤ１５、エンドシアリン／ＣＤ１８、エンドシアリン／ＣＤ２９、エンドシアリン／ＣＤ３９、エンドシアリン／ＣＤ４５、エンドシアリン／ＣＤ４８、エンドシアリン／ＣＤ５２、エンドシアリン／ＣＤ５５、エンドシアリン／ＣＤ５８、エンドシアリン／ＣＤ５９、エンドシアリン／ＣＤ８２、エンドシアリン／ＣＤ９５、エンドシアリン／ＣＤ９７、エンドシアリン／ＣＤ１２２、エンドシアリン／ＣＤ１２４、エンドシアリン／ＣＤ１３２、エンドシアリン／ＣＤｗ１３７、炭酸脱水酵素／ＣＤ１１ａ、炭酸脱水酵素／ＣＤ１５、炭酸脱水酵素／ＣＤ１８、炭酸脱水酵素／ＣＤ２９、炭酸脱水酵素／ＣＤ３９、炭酸脱水酵素／ＣＤ４５、炭酸脱水酵素／ＣＤ４８、炭酸脱水酵素／ＣＤ５２、炭酸脱水酵素／ＣＤ５５、炭酸脱水酵素／ＣＤ５８、炭酸脱水酵素／ＣＤ５９、炭酸脱水酵素／ＣＤ８２、炭酸脱水酵素／ＣＤ９５、炭酸脱水酵素／ＣＤ９７、炭酸脱水酵素／ＣＤ１２２、炭酸脱水酵素／ＣＤ１２４、炭酸脱水酵素／ＣＤ１３２、炭酸脱水酵素／ＣＤｗ１３７、ＩＧＦ－１Ｒ／ＣＤ１１ａ、ＩＧＦ－１Ｒ／ＣＤ１５、ＩＧＦ－１Ｒ／ＣＤ１８、ＩＧＦ－１Ｒ／ＣＤ２９、ＩＧＦ－１Ｒ／ＣＤ３９、ＩＧＦ－１Ｒ／ＣＤ４５、ＩＧＦ－１Ｒ／ＣＤ４８、ＩＧＦ－１Ｒ／ＣＤ５２、ＩＧＦ－１Ｒ／ＣＤ５５、ＩＧＦ－１Ｒ／ＣＤ５８、ＩＧＦ－１Ｒ／ＣＤ５９、ＩＧＦ－１Ｒ／ＣＤ８２、ＩＧＦ－１Ｒ／ＣＤ９５、ＩＧＦ－１Ｒ／ＣＤ９７、ＩＧＦ－１Ｒ／ＣＤ１２２、ＩＧＦ－１Ｒ／ＣＤ１２４、ＩＧＦ－１Ｒ／ＣＤ１３２、ＩＧＦ－１Ｒ／ＣＤｗ１３７、ＦＡＰ－アルファ／ＣＤ１１ａ、ＦＡＰ－アルファ／ＣＤ１５、ＦＡＰ－アルファ／ＣＤ１８、ＦＡＰ－アルファ／ＣＤ２９、ＦＡＰ－アルファ／ＣＤ３９、ＦＡＰ－アルファ／ＣＤ４５、ＦＡＰ－アルファ／ＣＤ４８、ＦＡＰ－アルファ／ＣＤ５２、ＦＡＰ－アルファ／ＣＤ５５、ＦＡＰ－アルファ／ＣＤ５８、ＦＡＰ－アルファ／ＣＤ５９、ＦＡＰ－アルファ／ＣＤ８２、ＦＡＰ－アルファ／ＣＤ９５、ＦＡＰ－アルファ／ＣＤ９７、ＦＡＰ－アルファ／ＣＤ１２２、ＦＡＰ－アルファ／ＣＤ１２４、ＦＡＰ－アルファ／ＣＤ１３２、ＦＡＰ－アルファ／ＣＤｗ１３７、ＣＤ１９／ＣＤ１１ａ、ＣＤ１９／ＣＤ１５、ＣＤ１９／ＣＤ１８、ＣＤ１９／ＣＤ２９、ＣＤ１９／ＣＤ３９、ＣＤ１９／ＣＤ４５、ＣＤ１９／ＣＤ４８、ＣＤ１９／ＣＤ５２、ＣＤ１９／ＣＤ５５、ＣＤ１９／ＣＤ５８、ＣＤ１９／ＣＤ５９、ＣＤ１９／ＣＤ８２、ＣＤ１９／ＣＤ９５、ＣＤ１９／ＣＤ９７、ＣＤ１９／ＣＤ１２２、ＣＤ１９／ＣＤ１２４、ＣＤ１９／ＣＤ１３２、ＣＤ１９／ＣＤｗ１３７、ＣＤ５２／ＣＤ１１ａ、ＣＤ５２／ＣＤ１５、ＣＤ５２／ＣＤ１８、ＣＤ５２／ＣＤ２９、ＣＤ５２／ＣＤ３９、ＣＤ５２／ＣＤ４５、ＣＤ５２／ＣＤ４８、ＣＤ５２／ＣＤ５２、ＣＤ５２／ＣＤ５５、ＣＤ５２／ＣＤ５８、ＣＤ５２／ＣＤ５９、ＣＤ５２／ＣＤ８２、ＣＤ５２／ＣＤ９５、ＣＤ５２／ＣＤ９７、ＣＤ５２／ＣＤ１２２、ＣＤ５２／ＣＤ１２４、ＣＤ５２／ＣＤ１３２、ＣＤ５２／ＣＤｗ１３７、ＧＤ２／ＣＤ１１ａ、ＧＤ２／ＣＤ１５、ＧＤ２／ＣＤ１８、ＧＤ２／ＣＤ２９、ＧＤ２／ＣＤ３９、ＧＤ２／ＣＤ４５、ＧＤ２／ＣＤ４８、ＧＤ２／ＣＤ５２、ＧＤ２／ＣＤ５５、ＧＤ２／ＣＤ５８、ＧＤ２／ＣＤ５９、ＧＤ２／ＣＤ８２、ＧＤ２／ＣＤ９５、ＧＤ２／ＣＤ９７、ＧＤ２／ＣＤ１２２、ＧＤ２／ＣＤ１２４、ＧＤ２／ＣＤ１３２、ＧＤ２／ＣＤｗ１３７、ＣＥＡ／ＣＤ１１ａ、ＣＥＡ／ＣＤ１５、ＣＥＡ／ＣＤ１８、ＣＥＡ／ＣＤ２９、ＣＥＡ／ＣＤ３９、ＣＥＡ／ＣＤ４５、ＣＥＡ／ＣＤ４８、ＣＥＡ／ＣＤ５２、ＣＥＡ／ＣＤ５５、ＣＥＡ／ＣＤ５８、ＣＥＡ／ＣＤ５９、ＣＥＡ／ＣＤ８２、ＣＥＡ／ＣＤ９５、ＣＥＡ／ＣＤ９７、ＣＥＡ／ＣＤ１２２、ＣＥＡ／ＣＤ１２４、ＣＥＡ／ＣＤ１３２、ＣＥＡ／ＣＤｗ１３７、ＦＲ／ＣＤ１１ａ、ＦＲ／ＣＤ１５、ＦＲ／ＣＤ１８、ＦＲ／ＣＤ２９、ＦＲ／ＣＤ３９、ＦＲ／ＣＤ４５、ＦＲ／ＣＤ４８、ＦＲ／ＣＤ５２、ＦＲ／ＣＤ５５、ＦＲ／ＣＤ５８、ＦＲ／ＣＤ５９、ＦＲ／ＣＤ８２、ＦＲ／ＣＤ９５、ＦＲ／ＣＤ９７、ＦＲ／ＣＤ１２２、ＦＲ／ＣＤ１２４、ＦＲ／ＣＤ１３２、ＦＲ／ＣＤｗ１３７、プロテオグリカン／ＣＤ１１ａ、プロテオグリカン／ＣＤ１５、プロテオグリカン／ＣＤ１８、プロテオグリカン／ＣＤ２９、プロテオグリカン／ＣＤ３９、プロテオグリカン／ＣＤ４５、プロテオグリカン／ＣＤ４８、プロテオグリカン／ＣＤ５２、プロテオグリカン／ＣＤ５５、プロテオグリカン／ＣＤ５８、プロテオグリカン／ＣＤ５９、プロテオグリカン／ＣＤ８２、プロテオグリカン／ＣＤ９５、プロテオグリカン／ＣＤ９７、プロテオグリカン／ＣＤ１２２、プロテオグリカン／ＣＤ１２４、プロテオグリカン／ＣＤ１３２、プロテオグリカン／ＣＤｗ１３７、Ｇ２５０／ＣＤ１１ａ、Ｇ２５０／ＣＤ１５、Ｇ２５０／ＣＤ１８、Ｇ２５０／ＣＤ２９、Ｇ２５０／ＣＤ３９、Ｇ２５０／ＣＤ４５、Ｇ２５０／ＣＤ４８、Ｇ２５０／ＣＤ５２、Ｇ２５０／ＣＤ５５、Ｇ２５０／ＣＤ５８、Ｇ２５０／ＣＤ５９、Ｇ２５０／ＣＤ８２、Ｇ２５０／ＣＤ９５、Ｇ２５０／ＣＤ９７、Ｇ２５０／ＣＤ１２２、Ｇ２５０／ＣＤ１２４、Ｇ２５０／ＣＤ１３２、Ｇ２５０／ＣＤｗ１３７、ＧＣ１８２／ＣＤ１１ａ、ＧＣ１８２／ＣＤ１５、ＧＣ１８２／ＣＤ１８、ＧＣ１８２／ＣＤ２９、ＧＣ１８２／ＣＤ３９、ＧＣ１８２／ＣＤ４５、ＧＣ１８２／ＣＤ４８、ＧＣ１８２／ＣＤ５２、ＧＣ１８２／ＣＤ５５、ＧＣ１８２／ＣＤ５８、ＧＣ１８２／ＣＤ５９、ＧＣ１８２／ＣＤ８２、ＧＣ１８２／ＣＤ９５、ＧＣ１８２／ＣＤ９７、ＧＣ１８２／ＣＤ１２２、ＧＣ１８２／ＣＤ１２４、ＧＣ１８２／ＣＤ１３２、ＧＣ１８２／ＣＤｗ１３７、
ＧＴ４６８／ＣＤ１１ａ、ＧＴ４６８／ＣＤ１５、ＧＴ４６８／ＣＤ１８、ＧＴ４６８／ＣＤ２９、ＧＴ４６８／ＣＤ３９、ＧＴ４６８／ＣＤ４５、ＧＴ４６８／ＣＤ４８、ＧＴ４６８／ＣＤ５２、ＧＴ４６８／ＣＤ５５、ＧＴ４６８／ＣＤ５８、ＧＴ４６８／ＣＤ５９、ＧＴ４６８／ＣＤ８２、ＧＴ４６８／ＣＤ９５、ＧＴ４６８／ＣＤ９７、ＧＴ４６８／ＣＤ１２２、ＧＴ４６８／ＣＤ１２４、ＧＴ４６８／ＣＤ１３２、ＧＴ４６８／ＣＤｗ１３７、ＧＴ５１２／ＣＤ１１ａ、ＧＴ５１２／ＣＤ１５、ＧＴ５１２／ＣＤ１８、ＧＴ５１２／ＣＤ２９、ＧＴ５１２／ＣＤ３９、ＧＴ５１２／ＣＤ４５、ＧＴ５１２／ＣＤ４８、ＧＴ５１２／ＣＤ５２、ＧＴ５１２／ＣＤ５５、ＧＴ５１２／ＣＤ５８、ＧＴ５１２／ＣＤ５９、ＧＴ５１２／ＣＤ８２、ＧＴ５１２／ＣＤ９５、ＧＴ５１２／ＣＤ９７、ＧＴ５１２／ＣＤ１２２、ＧＴ５１２／ＣＤ１２４、ＧＴ５１２／ＣＤ１３２及びＧＴ５１２／ＣＤｗ１３７からなる群より選択される。

より好ましくは、本発明の三官能性二重特異性抗体は、２つの抗原を指向し、このような２つの抗原の組み合わせは、ＥｐＣＡＭ／ＣＤ１１ａ、ＥｐＣＡＭ／ＣＤ１８、ＥｐＣＡＭ／ＣＤ４５、ＥｐＣＡＭ／ＣＤ５２、ＥｐＣＡＭ／ＣＤ８２、ＥｐＣＡＭ／ＣＤ９７、Ｈｅｒ２ｎｅｕ／ＣＤ１１ａ、Ｈｅｒ２ｎｅｕ／ＣＤ１８、Ｈｅｒ２ｎｅｕ／ＣＤ４５、Ｈｅｒ２ｎｅｕ／ＣＤ５２、Ｈｅｒ２ｎｅｕ／ＣＤ８２、Ｈｅｒ２ｎｅｕ／ＣＤ９７、ＭＵＣ１／ＣＤ１１ａ、ＭＵＣ１／ＣＤ１８、ＭＵＣ１／ＣＤ４５、ＭＵＣ１／ＣＤ５２、ＭＵＣ１／ＣＤ８２、ＭＵＣ１／ＣＤ９７、ＥＧＦＲ／ＣＤ１１ａ、ＥＧＦＲ／ＣＤ１８、ＥＧＦＲ／ＣＤ４５、ＥＧＦＲ／ＣＤ５２、ＥＧＦＲ／ＣＤ８２、ＥＧＦＲ／ＣＤ９７、ＥｐｈＡ２／ＣＤ１１ａ、ＥｐｈＡ２／ＣＤ１８、ＥｐｈＡ２／ＣＤ４５、ＥｐｈＡ２／ＣＤ５２、ＥｐｈＡ２／ＣＤ８２、ＥｐｈＡ２／ＣＤ９７、ＧＤ２／ＣＤ１１ａ、ＧＤ２／ＣＤ１８、ＧＤ２／ＣＤ４５、ＧＤ２／ＣＤ５２、ＧＤ２／ＣＤ８２、ＧＤ２／ＣＤ９７、ＣＤ２０／ＣＤ１１ａ、ＣＤ２０／ＣＤ１８、ＣＤ２０／ＣＤ８２及びＣＤ２０／ＣＤ９７からなる群より選択される。

好ましい抗体は、以下のアイソタイプの組み合わせの１つ以上から選択される、好ましくはモノクローナルの、異種三官能性二重特異性抗体である：
・ ラット－ＩｇＧ２ｂ／マウス－ＩｇＧ２ａ、
・ ラット－ＩｇＧ２ｂ／マウス－ＩｇＧ２ｂ、
・ ラット－ＩｇＧ２ｂ／マウス－ＩｇＧ３、
・ ラット－ＩｇＧ２ｂ／ヒト－ＩｇＧ１、
・ ラット－ＩｇＧ２ｂ／ヒト－ＩｇＧ２、
・ ラット－ＩｇＧ２ｂ／ヒト－ＩｇＧ３［東洋のアロタイプＧ３ｍ（ｓｔ）＝プロテインＡと結合］、
ラット－ＩｇＧ２ｂ／ヒト－ＩｇＧ４；
・ ラット－ＩｇＧ２ｂ／ラット－ＩｇＧ２ｃ；
・ マウス－ＩｇＧ２ａ／ヒト－ＩｇＧ３［白人のアロタイプＧ３ｍ（ｂ＋ｇ）＝プロテインＡと結合しない、以下において、＊で示す］
・ マウス－ＩｇＧ２ａ／マウス－［ＶＨ－ＣＨ１，ＶＬ－ＣＬ］－ヒト－ＩｇＧ１－［ヒンジ］－ヒト－ＩｇＧ３^＊－［ＣＨ２－ＣＨ３］
・ マウス－ＩｇＧ２ａ／ラット－［ＶＨ－ＣＨ１，ＶＬ－ＣＬ］－ヒト－ＩｇＧ１－［ヒンジ］－ヒト－ＩｇＧ３^＊－［ＣＨ２－ＣＨ３］
・ マウス－ＩｇＧ２ａ／ヒト－［ＶＨ－ＣＨ１， ＶＬ－ＣＬ］－ヒト－ＩｇＧ１－［ヒンジ］－ヒト－ＩｇＧ３^＊－［ＣＨ２－ＣＨ３］
・ マウス－［ＶＨ－ＣＨ１，ＶＬ－ＣＬ］－ヒト－ＩｇＧ１／ラット－［ＶＨ－ＣＨ１，ＶＬ－ＣＬ］－ヒト－ＩｇＧ１－［ヒンジ］－ヒト－ＩｇＧ３^＊－［ＣＨ２－ＣＨ３］
・ マウス－［ＶＨ－ＣＨ１， ＶＬ－ＣＬ］－ヒト－ＩｇＧ４／ラット－［ＶＨ－ＣＨ１， ＶＬ－ＣＬ］－ヒト－ＩｇＧ４－［ヒンジ］－ヒト－ＩｇＧ４［ＣＨ２のＮ末端領域］－ヒト－ＩｇＧ３^＊［ＣＨ２のＣ末端領域：＞ａａ２５１位］－ヒト－ＩｇＧ３^＊［ＣＨ３］
・ ａｔ－ＩｇＧ２ｂ／マウス－［ＶＨ－ＣＨ１，ＶＬ－ＣＬ］－ヒト－ＩｇＧ１－［ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３］
・ ラット－ＩｇＧ２ｂ／マウス－［ＶＨ－ＣＨ１，ＶＬ－ＣＬ］－ヒト－ＩｇＧ２－［ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３］
・ ラット－ＩｇＧ２ｂ／マウス－［ＶＨ－ＣＨ１，ＶＬ－ＣＬ］－ヒト－ＩｇＧ３－［ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３，東洋のアロタイプ］
・ ラット－ＩｇＧ２ｂ／マウス－［ＶＨ－ＣＨ１，ＶＬ－ＣＬ］－ヒト－ＩｇＧ４－［ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３］
・ ヒト－ＩｇＧ１／ヒト－［ＶＨ－ＣＨ１，ＶＬ－ＣＬ］－ヒト－ＩｇＧ１－［ヒンジ］－ヒト－ＩｇＧ３^＊－［ＣＨ２－ＣＨ３］
・ ヒト－ＩｇＧ１／ラット－［ＶＨ－ＣＨ１，ＶＬ－ＣＬ］－ヒト－ＩｇＧ１－［ヒンジ］－ヒト－ＩｇＧ４［ＣＨ２のＮ末端領域］－ヒト－ＩｇＧ３^＊［ＣＨ２のＣ末端領域：＞ ａａ２５１位］－ヒト－ＩｇＧ３＊［ＣＨ３］
・ ヒト－ＩｇＧ１／マウス－［ＶＨ－ＣＨ１，ＶＬ－ＣＬ］－ヒト－ＩｇＧ１－［ヒンジ］－ヒト－ＩｇＧ４［ＣＨ２のＮ末端領域］－ヒト－ＩｇＧ３^＊［ＣＨ２のＣ末端領域：＞ａａ２５１位］－ヒト－ＩｇＧ３^＊［ＣＨ３］
・ ヒト－ＩｇＧ１／ラット－［ＶＨ－ＣＨ１，ＶＬ－ＣＬ］－ヒト－ＩｇＧ１－［ヒンジ］－ヒト－ＩｇＧ２［ＣＨ２のＮ末端領域］－ヒト－ＩｇＧ３^＊［ＣＨ２のＣ末端領域：＞ａａ２５１位］－ヒト－ＩｇＧ３^＊［ＣＨ３］
ヒト－ＩｇＧ１／マウス－［ＶＨ－ＣＨ１，ＶＬ－ＣＬ］－ヒト－ＩｇＧ１－［ヒンジ］－ヒト－ＩｇＧ２［ＣＨ２のＮ末端領域］－ヒト－ＩｇＧ３^＊［ＣＨ２のＣ末端領域：＞ａａ２５１位］－ヒト－ＩｇＧ３^＊［ＣＨ３］
・ ヒト－ＩｇＧ１／ラット－［ＶＨ－ＣＨ１，ＶＬ－ＣＬ］－ヒト－ＩｇＧ１－［ヒンジ］－ヒト－ＩｇＧ３^＊－［ＣＨ２－ＣＨ３］
・ ヒト－ＩｇＧ１／マウス－［ＶＨ－ＣＨ１，ＶＬ－ＣＬ］－ヒト－ＩｇＧ１－［ヒンジ］－ヒト－ＩｇＧ３^＊－［ＣＨ２－ＣＨ３］
・ ヒト－ＩｇＧ２／ヒト－［ＶＨ－ＣＨ１，ＶＬ－ＣＬ］－ヒト－ＩｇＧ２－［ヒンジ］－ヒト－ＩｇＧ３^＊－［ＣＨ２－ＣＨ３］
・ ヒト－ＩｇＧ４／ヒト－［ＶＨ－ＣＨ１，ＶＬ－ＣＬ］－ヒト－ＩｇＧ４－［ヒンジ］－ヒト－ＩｇＧ３^＊－［ＣＨ２－ＣＨ３］
・ ヒト－ＩｇＧ４／ヒト－［ＶＨ－ＣＨ１，ＶＬ－ＣＬ］－ヒト－ＩｇＧ４－［ヒンジ］－ヒト－ＩｇＧ４［ＣＨ２のＮ末端領域］－ヒト－ＩｇＧ３^＊［ＣＨ２のＣ末端領域：＞ａａ２５１位］－ヒト－ＩｇＧ３^＊［ＣＨ３］
・ マウス－ＩｇＧ２ｂ／ラット－［ＶＨ－ＣＨ１，ＶＬ－ＣＬ］－ヒト－ＩｇＧ１－［ヒンジ］－ヒト－ＩｇＧ３^＊－［ＣＨ２－ＣＨ３］
・ マウス－ＩｇＧ２ｂ／ヒト－［ＶＨ－ＣＨ１，ＶＬ－ＣＬ］－ヒト－ＩｇＧ１－［ヒンジ］－ヒト－ＩｇＧ３^＊－［ＣＨ２－ＣＨ３］
・ マウス－ＩｇＧ２ｂ／マウス－［ＶＨ－ＣＨ１，ＶＬ－ＣＬ］－ヒト－ＩｇＧ１－［ヒンジ］－ヒト－ＩｇＧ３^＊－［ＣＨ２－ＣＨ３］

本発明による特に好ましい一実施形態において用いられる一価結合特異性を有する三官能性二重特異性抗体は、以下の特性を有する：
ａ）ＣＤ１１ａ、ＣＤ１５、ＣＤ１８、ＣＤ２９、ＣＤ３９、ＣＤ４５、ＣＤ４８、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ８２、ＣＤ９５、ＣＤ９７、ＣＤ１２２、ＣＤ１２４、ＣＤ１３２及びＣＤｗ１３７からなる群の少なくとも１つのメンバーから選択されるパン白血球抗原と結合する、
ｂ）腫瘍細胞上の腫瘍関連抗原と結合する、
ｃ）そのＦｃ部分を介してＦｃ受容体陽性細胞と結合する、
三官能性二重特異性抗体は、さらに好ましくは、以下のアイソタイプの組み合わせを有する抗体の群から選択される：
ラット－ＩｇＧ２ｂ／マウス－ＩｇＧ２ａ、
ラット－ＩｇＧ２ｂ／マウス－ＩｇＧ２ｂ、
ラット－ＩｇＧ２ｂ／ヒト－ＩｇＧ１、
マウス－［ＶＨ－ＣＨ１；ＶＬ－ＣＬ］－ヒト－ＩｇＧ１／ラット－［ＶＨ－ＣＨ１，ＶＬ－ＣＬ］－ヒト－ＩｇＧ１－［ヒンジ］－ヒト－ＩｇＧ３^＊－［ＣＨ２－ＣＨ３］
［＊＝白人のアロタイプＧ３ｍ（ｂ＋ｇ）＝プロテインＡと結合しない］。

特に好ましくは、抗体、好ましくは、ラット－ＩｇＧ２ｂ／マウス－ＩｇＧ２ａのアイソタイプの組み合わせで、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ５２を指向する三官能性二重特異性抗体及び／又は足場タンパク質である。前記三官能性二重特異性抗体の好ましい例は、抗ＣＤ５２×抗ＥｐＣＡＭ抗体である。好ましくは、前記抗体は、モノクローナルである。

好ましくは、本発明による抗体は、例えばＦｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ又はＦ（ａｂ）２断片を有する、モノクローナル、キメラ、組換え、合成、半合成又は化学改変インタクト抗体である。

本発明の方法では、ヒト起源の抗体又は誘導体若しくは断片、又はヒトでの使用に適するように改変された抗体（いわゆる「ヒト化抗体」）を用いることができる（例えば、Ｓｈａｌａｂｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５（１９９２）、２１７；Ｍｏｃｉｋａｔら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ５７（１９９４）、４０５を参照されたい）。

上記の異なるタイプの抗体及び抗体断片の調製は、当業者に明らかである。好ましくは哺乳動物起源、例えばヒト、ラット、マウス、ウサギ又はヤギのモノクローナル抗体の調製は、例えばＫｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ２５６（１９７５）、４９５）、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８８）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）又はＧａｌｆｒｅ（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３（１９８１）、３）に記載された従来の方法を用いて行うことができる。

さらに、当業者に明らかな技術に従って組換えＤＮＡ技術により記載される抗体を調製することが可能である（Ｋｕｒｕｃｚら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４（１９９５）、４５７６；Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０（１９９３）、６４４４を参照されたい）。

２つの異なる特異性を有する抗体、いわゆる二重特異性抗体の調製は、例えば、組換えＤＮＡ技術を用いて行うことができるが、いわゆるハイブリッドハイブリドーマ融合技術（例えばＭｉｌｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ３０５（１９８３）、５３７を参照されたい）によっても行うことができる。この技術は、所望の特異性の１つを有する抗体をそれぞれ生成するハイブリドーマ株化細胞を融合し、両方の特異性を有する抗体を生成する組換え株化細胞を同定及び単離することを含む。

本発明の基礎をなす課題は、好ましい実施形態において、本明細書に記載する特性及び効果を示すならば三官能性二重特異性又は三重特異性三官能性抗体のいずれかを用いることにより克服できる。本発明は、特に、三官能性二重特異性抗体により記載される。しかし、同様の効果を示す以下の三重特異性抗体もカバーすることが理解される。上において、用語「抗体」又は「足場タンパク質」が三官能性二重特異性抗体に言及し得るが、これは、同様の効果を示す以下の三重特異性抗体もカバーできることが理解される。

本発明の課題を解決するためにこれもまた適切である３つの特異性を示す抗体、いわゆる三重特異性抗体の調製も、例えば、例えば「単鎖可変断片」（ｓｃＦｖ）の形でさらなる特異性を有する第三抗原結合部位を、二重特異性抗体のＩｇＧ重鎖の１つに結合させることにより行うことができる。さらに、組換え技術、例えばタンパク質合成又はオリゴヌクレオチド合成のためのベクターに基づく方法を用いることができる。

同様に、三重特異性Ｆ（ａｂ）２構築物は、二重特異性抗体の１つの特異性の重鎖のＣＨ２－ＣＨ３領域を、第三の特異性を有するｓｃＦｖで置き換えることにより調製でき、他方の特異性を有する重鎖のＣＨ２－ＣＨ３領域は、例えば、例えば相同組換えによりコード遺伝子に停止コドン（「ヒンジ」５領域の末端に）を挿入することにより除去できる。

３つの異なる特異性を示す３つのＶＨ－ＶＬ領域が直列に配置された三重特異性ｓｃＦｖ構築物を調製することもできる。

インタクトな二重特異性抗体は、それぞれある特異性を示す２つの抗体半分子（それぞれＨ及びＬ免疫グロブリン鎖を有する）と、さらに公知のエフェクター機能を行うＦｃ部分を有する例えば通常の抗体とで構成される。これらは、好ましくは、クアドローマ技術を用いて調製される。この調製方法は、ＤＥ－Ａ－４４１９３９９に例示される。完全な開示のために、この文献は、二重特異性抗体の定義に関しても参照によりその全体が組込まれている。本発明により必要とされる上記の定義に従うインタクトな二重特異性抗体を導くならば、他の調製方法も有用であることが理解される。

例えば、インタクトな二重特異性抗体は、新しく開発された調製方法を用いて、十分な量で生成できる（Ｌｉｎｄｈｏｆｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１５５：２１９（１９９５））。乳癌細胞上の２つの異なる腫瘍関連抗原（例えばｃ－ｅｒｂ－Ｂ２、ＥｐＣＡＭ、例えばＧＡ－７３３－２＝Ｃ２１５）を指向する２つの二重特異性抗体の組み合わせは、抗原の一方のみを発現する腫瘍細胞が同定されないままになる危険性を最小限にする。

本発明の方法に従って、腫瘍細胞上の腫瘍関連抗原を認識する抗体又は足場タンパク質は、前記腫瘍細胞及び所望により免疫細胞への前記抗体の結合により形成される会合体を除去するために、ツールとして当該技術において用いられてきたであろう磁性粒子又は磁性ビーズのような手段と又はそれにより結合しない。さらに、従来技術は、例えば発色物質、例えば蛍光色素での腫瘍細胞又は抗体の標識化と、その後の細胞ソーティング、例えばフローサイトメトリーについて記載している。これとは反対に、本発明の原理は、フィルターに保持され得るか又は遠心力により分離されるのに十分なサイズの上記の三次元ネットワーク（会合体）の形成と、機械的手段、例えば濾過又は遠心分離又はそれらの組み合わせによる前記ネットワークの直接的除去にある。抗体との相互作用により形成される会合体のサイズは、濾過又は遠心分離により除去され得る大きさにある。抗体と腫瘍細胞との間の会合体を除去するための間接的補助手段として抗体又は腫瘍細胞と結合する磁性ビーズ又は類似のツールを用いる実施形態は、本発明と組み合わせることができる。腫瘍細胞を通常細胞から分離する分離方法、例えばフローサイトメトリー法も、本発明と組み合わせて用いることができる。

用語「会合体」、「多重細胞複合体」及び「凝集体」は、交換可能に用いられ、遠心分離又は濾過又はそれらの組み合わせにより除去できる架橋腫瘍細胞を形成するための抗体及び／又は足場タンパク質、腫瘍細胞及び／又は免疫細胞並びに／或いはさらなる腫瘍細胞の間の三次元ネットワークを常に定義する。前記会合体は、抗体と、腫瘍細胞と、白血球及び／又はＦｃ受容体陽性細胞である免疫細胞とで具体的に構成される。

前記細胞凝集体を含む術中に回収した血液を得るために本発明において用いられる期間は、１０から２４０分間、好ましくは１０から１８０分間である。本発明では、接触期間も好ましくは２０と２１０分間の間、より好ましくは３０と１８０分間の間、さらにより好ましくは３０と１２０分間の間である。この点で、所望の効果を達成するために前記期間が驚くべきことに重要であることがわかる。前記期間が１０分未満の場合、凝集体が十分に形成されない。期間が１８０分を超える場合、結合した抗体から免疫細胞に対して免疫学的プロセスが開始され得る。特に期間が２４０分を超える場合、望ましくない免疫学的プロセスの開始が観察され得る。温度は、好ましくは、室温であり、その範囲は１９℃から２５℃まで、好ましくは約２１℃である。
本発明の方法を用いて得られる血液生成物は、好ましい実施形態によると、次いで、最初の血液試料を得た患者に再投与され、このことは、重篤な副作用を引き起こさない。

ＩＢＳとの抗体及び／又は足場タンパク質の接触
好ましくは、抗体のいずれも免疫細胞と結合できないが、同一又は異なる腫瘍関連抗原とのみ結合できることを条件として、抗体と少なくとも２つの腫瘍細胞との間の会合体を得るために、少なくとも２つの異なる腫瘍細胞の間が架橋されることが非常に重要である。

用語「会合体」、「多重細胞複合体」及び「凝集体」は、交換可能に用いられ、遠心分離又は濾過又はそれらの組み合わせにより除去できる架橋腫瘍細胞を形成するための抗体、足場タンパク質、腫瘍細胞及び／又は免疫細胞及び／又はさらなる腫瘍細胞の間の三次元ネットワークを常に定義する。前記会合体は、抗体と、腫瘍細胞と、白血球細胞とで具体的に構成される。
好ましくは、少なくとも１つの抗体は、会合体を得るために腫瘍細胞並びに所望により免疫細胞及び／又は他の腫瘍細胞を架橋するために十分な期間、前記術中に得られた回収血液と接触させる。好ましくは、前記腫瘍細胞及び前記免疫細胞は、前記術中に得られた回収血液中に存在する。前記腫瘍細胞は、前記少なくとも１つの抗体又は前記少なくとも１つの足場タンパク質により特異的に認識され得る。

前記架橋を達成するために必要な期間は、慣例の方法を用いて当業者が決定できる。本発明において用いる期間は、１０から２４０分間、好ましくは１０から１８０分間である。好ましくは、接触期間は、１０と１１８分間の間、より好ましくは２０と９０分間の間、さらにより好ましくは３０と６０分間の間である。温度は、好ましくは、室温であり、その範囲は１９℃から２５℃、好ましくは約２１℃であり得る。

抗体を含む前記会合体を得るために用いられなければならない抗体の量は、当業者が慣例の測定により決定できる。用いられる抗体及び／又は足場タンパク質の量は、前記腫瘍抗原への抗体及び／又は足場タンパク質の結合親和性に一般的に依存する。好ましくは、さらなる量は、ＩＢＳ １リットルあたり１μｇから２０μｇ、より好ましくはＩＢＳ １リットルあたり１μｇから１０μ、ＩＢＳ １リットルあたり１μｇから５μｇ又はＩＢＳ １リットルあたり１μｇから２μｇである。

好ましくは、腫瘍抗原特異性又はパン白血球表面マーカー特異性が互いに異なる少なくとも２つの異なる抗体及び／又は足場タンパク質が、抗体の少なくとも１つが請求項１の限定内にあることを条件として、施用される。

ＩＢＳからの腫瘍細胞及び抗体／足場タンパク質会合体の除去
会合体は、腫瘍細胞を本質的に含まないＩＢＳを得るために、前記術中に得られた回収血液（ＩＢＳ）から最終的に除去される。前記細胞凝集体の枯渇は、好ましくは、遠心分離、濾過又はその組み合わせにより達成される。好ましい方法では、少なくとも１つの遠心分離工程及び好ましくは少なくとも１つのさらなる濾過工程が含まれる。

濾過は、好ましくは、前記腫瘍細胞が混入した全ての白血球が全て又は実質的に除去されるが、赤血球はフィルターを通過して回収される、白血球低減又は枯渇濾過である。フィルターは、本発明の方法により形成される会合体、並びに例えばフィブリンストランド及び死滅細胞の塊を保持する２０μｍから４０μｍの間の孔サイズを有するスクリーンフィルターから選択され得る。約８μｍのサイズの赤血球は、フィルターを通過し得る。微小凝集体フィルターは、好ましくは、手術中又は後に回収される流出自己血液の再注入のために用いられる。白血球低減赤血球細胞を受容するために、１７０μｍから２６０μｍの間の孔サイズを有する標準的な輸血フィルターによる濾過も用い得る。

分離方法を含むｃｅｌｌ ｓａｖｅｒ装置について記載する概説は、Ｃａｒｌｅｓｓ ＰＡ、Ｈｅｎｒｙ ＤＡ、Ｍｏｘｅｙ ＡＪ、Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ Ｄ、Ｂｒｏｗｎ Ｔ、Ｆｅｒｇｕｓｓｏｎ ＤＡ、Ｃｅｌｌ ｓａｌｖａｇｅ ｆｏｒ ｍｉｎｉｍｉｚｉｎｇ ｐｅｒｉｏｐｅｒａｔｉｖｅ ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｂｌｏｏｄ ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ、２０１０、Ｔｈｅ Ｃｏｃｈｒａｎｅ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｏｎ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ．であり、これは、参照により全体が組込まれている。

赤血球含有画分のみを受容するための微小凝集体血液フィルターの例は、Ｐａｌｌ ＳＱ ４０Ｓ輸血フィルターである。
好ましくは、遠心分離は、密度勾配遠心分離工程と、その後の、例えば生理食塩水を用いて、前記腫瘍細胞を含む会合体を除去し、かつ前記腫瘍細胞会合体及び白血球から赤血球を分離するために十分な時間及び回転速度で洗浄することにより行われる。
好ましくは、濾過は、一般的に、前記腫瘍細胞を含む会合体を少なくとも実質的に除去し、前記腫瘍細胞会合体及び白血球から赤血球を分離するために十分な期間行われる。
好ましい実施形態では、混入腫瘍細胞を含まないか又は実質的に含まない前記赤血球の濃縮物は、生理食塩水の添加なしで用いられる。

さらなる濾過工程は、残存会合体及び／又は白血球を除去するために用いることができる。
根底にある白血球濾過技術は、目詰まりの問題を含む古典的でミクロン定格の濾過手順とは異なるので、この進歩した腫瘍細胞除去方策は、実行可能であると考えられる。
腫瘍細胞の前記除去に含まれる操作の時間、複雑さ、選択度、強度が、抗体を用いる破壊による腫瘍細胞の枯渇、或いは腫瘍手術中の限定された時間だけ実行できる腫瘍細胞の除去を可能にする磁性ビーズを用いる除去又は放射線照射又は細胞ソーティング方法と比較して、劇的に低減されることが、本発明の利点の一つである。

本発明のその他の利点は、手術の血液から生成される赤血球濃縮物からの腫瘍細胞が著しく低減され、手術を通じて外傷により手術野において生成される炎症誘発性サイトカインも著しく低減されることを含む。また、残存三官能性抗体は、再注入の準備ができた最終ＥＣ濃縮物中で問題にならない量まで低減できる。
好ましくは、本発明の方法を用いて得られる血液生成物は、次いで、最初の血液試料が得られた患者に再投与される。

本発明において用いる三官能性抗体、例えば抗ＣＤ５２×抗ＥｐＣＡＭ抗体により誘導される大きい多重細胞複合体の形成の原理を示す。前記複合体の形成は、術中の血液試料装置特異的処理工程（例えば遠心分離及び濾過）による腫瘍細胞の除去を可能にする。 腫瘍細胞及び末梢血液白血球（すなわち免疫細胞）からなる多重細胞複合体を形成する能力を有する代表的な抗体フォーマットの模式図。この図は、Ｊｉｎ Ｐ及びＺ Ｚｈｕ、Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ＲＥ（編）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ Ｌｏｎｄｏｎ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１５１～１７０頁（２０１１）から抜粋し、わずかに改変した。現在の請求項１によりカバーされる抗体のみが、本発明の範囲内である。その他全ての抗体フォーマットは、情報の目的のためだけに記載される。 本発明の三官能性二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）、例えば抗ＣＤ５２×抗ＥｐＣＡＭ抗体を用いる本発明の方法の例示的実施形態。 流加培養の生細胞密度（ＶＣＤ）及び生存率（ＶＩＡ）。Ｆ１～Ｆ４－１Ｌフラスコ反復。 ＰＧＢ０００５二重特異性抗体精製のＡＣクロマトグラム。 ＤＴＴで処理したＰＧＢ０００５二重特異性抗体－軽鎖。 ＤＴＴで処理したＰＧＢ０００５二重特異性抗体－重鎖。 ＰＮＧアーゼＦ及びＤＴＴで処理したＰＧＢ０００５二重特異性抗体－重鎖。 精製ＰＧＢ０００５二重特異性抗体のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。レーン１及び１２－ＦＢブランク、レーン２～６還元条件、レーン７～１２－非還元条件。レーン４及び９－ＰＮＧアーゼＦ酵素、レーン２及び１１－非脱グリコシル化ＰＧＢ０００５二重特異性抗体、レーン３、５、６、７、８及び１０－脱グリコシル化ＰＧＢ０００５二重特異性抗体。 ＰＧＢ０００５二重特異性抗体のＦｃγ受容体（Ｆｃガンマ受容体）結合活性。 （ａ）全てのデータ点を含む、及び（ｂ）単一のＨｏｏｋ効果データ点を除去した、ＰＧＢ０００５二重特異性抗体のＥｐＣＡＭ結合活性。 （ａ）ｐＨ＝６．１の緩衝液、及び（ｂ）ｐＨ＝７．４の緩衝液を用いたＰＧＢ０００５二重特異性抗体のＣＤ５２結合活性。アッセイにおいて用いたＢｓＡｂ ＦＩＴＣ抗マウス、ＢｓＡｂ ＦＩＴＣ抗ラット－検出抗体。

実施例
以下において、本発明を行うための一つの例示的な例を記載する。このアプローチに従う当業者は、請求する利益を必ず得る。この例に従って、本発明から逸脱することなく様々な改変を行うことができる。

ＩＢＳ中の遠心分離及び／又は濾過による多重細胞複合体枯渇による腫瘍細胞の抗ＥｐＣＡＭ媒介除去
組織マイクロアレイ染色により分類される膜貫通糖タンパク質ＥｐＣＡＭの発現プロファイルは、様々な腫瘍の癌腫において生じる（表３）。この広い発現ＥｐＣＡＭパターンは、治療用のために考慮できるだけでなく、癌手術中の改良ＩＢＳプロトコールのためにも考慮できる癌腫の興味深い特質を表す。それにも関わらず、ほとんどの軟部腫瘍及び全てのリンパ腫は、完全にＥｐＣＡＭ陰性であったことに注目すべきである。

実施例１
１．抗ＣＤ５２×抗ＥｐＣＡＭ三官能性二重特異性抗体の取得
三官能性二重特異性抗体の主鎖において、抗リンパ球パラトープを、白血球と結合する抗ＣＤ５２特異的可変領域のパラトープと交換した。抗ＣＤ５２特異的可変領域（Ｈ＋Ｌ ＩｇＧ鎖）の配列は、Ｃｒｏｗｅら（Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ、第８７巻、１９９２、図２）に発表されている。

抗ＥｐＣＡＭ半抗体を示す重及び軽Ｉｇ遺伝子、並びに抗ＣＤ５２半抗体を示す重及び軽遺伝子の抗体コーディング遺伝子を、ＣＨＯ株化細胞に移した。培養したトランスフェクションされたＣＨＯ細胞の上清に分泌された抗ＥｐＣＡＭ及び抗ＣＤ５２特異性を有する三官能性抗体を、標準的なクロマトグラフィー法で精製した。
２つの結合アームの機能性を確認するために、ＥｐＣＡＭ又はＣＤ５２のいずれかを発現する２つの異なる株化細胞への結合のフローサイトメトリー分析を行った。

２．異なる標的抗原との三官能性二重特異性抗ＣＤ５２×抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合の評価
抗体結合は、ＦＡＣＳ分析により評価した。５×１０^５標的細胞（ＣＤ５２陽性Ｊｕｒｋａｔ細胞又はＥｐＣＡＭ陽性ＨＣＴ－８細胞を、記載する抗体濃度にて２～８℃にて６０分間インキュベーションした。標的細胞を、ＰＢＳ緩衝液に再懸濁した。次いで、細胞を２回洗浄し、細胞上での抗体結合を、蛍光標識（ＦＩＴＣ）ラット－抗マウスＩｇＧ（Ｊｕｒｋａｔ細胞）又はマウス－抗ラットＩｇＧ（ＨＣＴ－８細胞）二次検出抗体（Ｄｉａｎｏｖａ）を用いて検出した。陽性染色された細胞を、ＦＡＣＳ－Ｃａｌｉｂｕｒサイトメータ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて評価した。

３．Ｆｃ－ガンマ受容体との三官能性二重特異性抗ＣＤ５２×抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合の評価
抗体結合は、ＦＡＣＳ分析により評価した。５×１０^５標的細胞（Ｆｃ－ガンマ受容体陽性ＴＨＰ－１細胞）を、記載する抗体濃度にて２～８℃にて６０分間インキュベーションした。標的細胞を、ＰＢＳ緩衝液に再懸濁した。次いで、細胞を２回洗浄し、細胞上での抗体結合を、蛍光標識（ＦＩＴＣ）Ｆ（ａｂ）２ヤギ－抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ）２二次検出抗体（Ｄｉａｎｏｖａ）を用いて検出した。陽性染色された細胞を、ＦＡＣＳ－Ｃａｌｉｂｕｒサイトメータ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて評価した。

実施例２
１．標的分子構造
ＰＧＢ０００５二重特異性抗体は、その可変領域を用いてＣＤ５２及びＥｐＣＡＭ受容体を標的にするように設計されたラット／マウス三官能性抗体である。ラット半抗体の元来の可変領域を、文献に記載されるＣａｍｐａｔｈ配列に由来する、ＣＤ５２を標的にするものと交換している。ＥｐＣＡＭを標的にする可変領域を有するカツマキソマブのマウス半抗体は、改変しなかった。両方の半抗体の遺伝子配列は、ＣＨＯ発現のために最適化した。

２．バッチ培養
方法：
ＰＧＢ０００５安定細胞プール５を、４本の１Ｌフラスコ中、３００ｍｌの作業容量のＥｘｃｅｌｌ－Ａｄｖａｎｃｅｄ流加培養培地中で、０．５×１０^６細胞／ｍｌの細胞密度を初期に播種して培養した。細胞ブースト７ａ及び７ｂ供給培地を、培養プロセスの第３日から開始して、作業容量のそれぞれ３％及び０．３％で毎日加えた。

結果：
約２３×１０^６細胞／ｍｌの最大細胞密度が、培養プロセスの第９日目に達成された。細胞生存率は、第１１日に９０％未満に下落し、培養物を第１２日に採集し、４本のフラスコにわたる平均生細胞密度は２３×１０^６細胞／ｍｌ、及び平均生存率は８６％であった（図４）。

３．精製
方法：
１Ｌの培養上清を、定組成アフィニティークロマトグラフィーにより精製した。４２ｍｌのカラム容量で、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ樹脂を用いた。０．１Ｍクエン酸Ｎａを溶出緩衝液として用い、抗体画分の分離のために以下の条件を用いた：親のラット抗体の溶出のためにｐＨ５．８、標的ＰＧＢ０００５二重特異性抗体の溶出のためにｐＨ５．１５、親のマウス抗体の溶出のためにｐＨ３．５。

結果：
標的二重特異性抗体は、両方の親の抗体からうまく分離された（図５）。

４．定性分析
記載する試料の流加培養生成を開始する前に、ＰＧＢ０００５安定細胞プール５により生成されるタンパク質のアイデンティティーを、ＬＣ－ＭＳにより確認した。流加培養により生成された精製ＰＧＢ０００５二重特異性抗体試料を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析し、Ｆｃγ－受容体結合活性、ＥｐＣＡＭ結合活性及びＣＤ５２結合活性について試験した。

４．１．精製安定細胞プール５により生成される試料のＬＣ－ＭＳ分析
方法：
フラスコ培養により生成され、ＡＣクロマトグラフィーにより精製されたＰＧＢ０００５二重特異性抗体試料を、ＬＣ－ＭＳにより分析した。ＬＣ－ＭＳ分析の前に、試料を２つの異なる処理に付した：１）変性と、ＰＮＧアーゼＦ処理及びＤＴＴ処理によるその後の脱グリコシル化、並びに２）変性と、その後のＤＴＴ処理。試料を、次いで、分離のためにＢＥＨ Ｃ４カラムに注入し、Ｑ－Ｔｏｆ質量分析計により分析した。
標的タンパク質についての理論的分子量の情報を、表１に示す。翻訳後修飾の後の理論的分子量情報を、表２及び３に示す。

結果
抗ＣＤ５２軽鎖及び抗ＥｐＣＡＭ軽鎖が、非ＰＮＧアーゼＦ処理試料においてＭＳにより同定された（図６）。抗ＣＤ５２軽鎖について得られた実測ＭＷは２３１７７．０Ｄａであり、これは、理論的ＭＶである２３１７５．９Ｄａとよく対応する（表４）。抗ＣＤ５２軽鎖について得られた実測ＭＷは２４４２６．０Ｄａであり、これは、理論的ＭＷである２４４２４．８Ｄａとよく対応する（表１）。
抗ＣＤ５２グリコシル化重鎖が同定され、ＭＷは５１１５６．０Ｄａであり（図７）、これは、翻訳後修飾を考慮した場合に、抗ＣＤ５２重鎖についての理論値５１１５０．５Ｄａとよく対応する（表５）。Ｇ０Ｆグリコシル化（５１３２０．９Ｄａ）及びＧ１Ｆグリコシル化（５１４８３．１Ｄａ）をそれぞれ有する抗ＥｐＣＡＭ重鎖の予測ＭＷに相当する５１１５６．０Ｄａ及び５１４８７．０Ｄａの２つのＭＳピーク（図７）が同定された（表６）。ＧｏＦグリコシル化抗ＥｐＣＡＭ重鎖についてのおよそ６Ｄａと、Ｇ１Ｆグリコシル化抗ＥｐＣＡＭ重鎖についてのおよそ４Ｄａの予測値と実測値との間の不一致は、ＤＴＴ処理によるジスルフィド結合の開放により説明され得る。Ｇ０Ｆグリコシル化を有する抗ＥｐＣＡＭ重鎖とＧ１Ｆグリコシル化を有する抗ＣＤ５２鎖との間の質量の差は１０Ｄａ未満であり、これらのシグナルが互いに干渉している可能性がある。

図８では、観察された４９７１２．０Ｄａのピークは、抗ＣＤ５２重鎖の予測ＭＷの４９７０５．２Ｄａと一致した（表７）。およそ６Ｄａの差は、ＤＴＴ処理によるジスルフィド結合の開放により説明され得る。

４．２．ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析
方法：
精製ＰＧＢ０００５試料を、２つのバッチ：１）非脱グリコシル化及び２）脱グリコシル化（ＰＮＧアーゼＦでの処理）に分けた。２つのバッチは、還元及び非還元条件下でＳＤＳポリアクリルアミドゲル上の電気泳動により分析した。

結果：
およそ５０ｋＤのＭＷでの２つの重鎖バンドが、レーン２（非脱グリコシル化試料）並びにレーン３、５及び６（脱グリコシル化試料）で見られる。レーン２（非脱グリコシル化）の重鎖バンドは、レーン３、５及び６（脱グリコシル化）のものより低いＭＷを有する（図９）。

およそ２５ｋＤのＭＷの２つの軽鎖バンドが、レーン２、３、５及び６において一緒にスミアする。
それぞれおよそ１５０ｋＤ及び２００ｋＤのＭＷを有する２つの主なバンドが、レーン７、８、１０及び１１において見られる。レーン１１（非脱グリコシル化）におけるバンドは、レーン７、８及び１０（脱グリコシル化）と比較して、より低いＭＷのものである。
それぞれおよそ１２０ｋＤ、８５ｋＤ及び２２．５ｋＤのＭＷを有する３つのさらなるバンドが、レーン７、８、１０及び１１において観察される。

４．３．Ｆｃγ－受容体結合活性
方法：
ＰＧＢ０００５精製二重特異性抗体試料を、Ｆｃγ－受容体結合活性について、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により試験した。
ＴＨＰ－１細胞培養懸濁物を、ウェルあたり５０μｌにて、４×１０^６細胞／ｍｌの密度にて用いた。ＰＧＢ０００５二重特異性抗体について用いた作業試料濃度は、ウェルあたり５０μｌで、０．００１７～１００μｇ／ｍｌの範囲であった。
結合反応は、２～８℃にて１時間行った。ｐＨ７．４のＰＢＳを、希釈緩衝液として用い、２％ＦＢＳを含むｐＨ７．４のＰＢＳを、洗浄緩衝液として用いた。
ＦＩＴＣ－ヤギ抗マウスＦ（ａｂ’）２断片特異的を、検出抗体として用いた。
抗体検出反応は、２～８℃にて３０分間行った。

結果：
ＰＧＢ０００５二重特異性抗体は、Ｆｃγ－受容体結合活性を示す（図１０）。

４．４．ＥｐＣＡＭ結合活性
方法：
ＰＧＢ０００５精製二重特異性抗体試料を、ＥｐＣＡＭ結合活性について、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により試験した。
ＨＣＴ－８接着細胞培養物を、ウェルあたり１００μｌにて、１．５×１０^６細胞／ｍｌの密度にて用いた。ＰＧＢ０００５二重特異性抗体について用いた作業試料濃度は、ウェルあたり５０μｌで、０．００１７～１００μｇ／ｍｌの範囲であった。
結合反応は、室温にて１時間行った。２％ＦＢＳを含むｐＨ７．４のＰＢＳを、希釈緩衝液及び細胞清浄溶液としても用いた。
ＦＩＴＣ－マウス抗ラット（Ｈ＋Ｌ）を検出抗体として用いた。
抗体検出反応は、２～８℃にて３０分間行った。

結果：
ＰＧＢ０００５二重特異性抗体は、ＥｐＣＡＭ結合活性を示す（図１１）。１００μｇ／ｍｌの濃度での単独データ点は、Ｈｏｏｋ効果により除いた。

４．５．ＣＤ５２結合活性
方法：
精製ＰＧＢ０００５二重特異性抗体試料を、２つの異なるｐＨ値、７．４及び６．１にてＰＢＳ緩衝液中に溶解し、ＣＤ５２結合についてフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により試験した。２つの異なる検出抗体を用いた。２回の反復実験を行った。
Ｒａｍｏｓ細胞培養懸濁物を、ウェルあたり５０μｌにて、４×１０^６細胞／ｍｌの密度にて用いた。ＰＧＢ０００５二重特異性抗体試料について用いた作業試料濃度を、以下の表に示す。

結合反応は、２～８℃にて１時間行った。試料緩衝液（ｐＨ７．４又はｐＨ６．１のＰＢＳ）も希釈緩衝液として用い、２％ＦＢＳを含むｐＨ７．４のＰＢＳを、洗浄緩衝液として用いた。
ＦＩＴＣ－マウス抗ラット（Ｈ＋Ｌ）及びＦＩＴＣ－ラット抗マウス（Ｈ＋Ｌ）を、検出抗体として用いた。
抗体検出反応は、２～８℃にて３０分間行った。

結果：
ＰＧＢ０００５二重特異性抗体は、６．１及び７．４の両方のｐＨ値にてＣＤ５２結合活性を示す（図１２）。ラット－抗マウス検出抗体は、マウス抗ラット検出抗体と比較して、より強く標的二重特異性抗体と結合することがわかる。結果は、２回の独立した実験間で一貫している。

まとめ
Ｃｅｌｌ ｓａｖｅｒシステム、及び三官能性二重特異性抗ＣＤ５２×抗ＥｐＣＡＭ抗体を用いて精製した癌患者の血液試料はともに、赤血球濃縮物において実質的に又は全く残存腫瘍細胞（０）が検出できない。さらに、手術中に分泌されるサイトカインは、記載する手順の後の赤血球濃縮物において明確に減少し、このことは、患者に安全性の問題がないことを明らかにする。重要なことに、残存抗ＣＤ５２×抗ＥｐＣＡＭ抗体は、非常に感度の高いＥＬＩＳＡ法（検出限界：２５０ｐｇ／ｍｌ）を用いても、生成された赤血球濃度において全く又は実質的に検出できず、このことは、これらの精製自己赤血球濃縮物を受容する可能性のある患者の安全性を確認する。

結論
同種血輸血による検査済み及び検査されていないウイルスの可能性のある感染の危険性並びにその他の危険性、需要及び経済的必要性の増加のために、病院における血液管理プログラムにおいて、術中血液回収に対する興味が増加している。それにもかかわらず、主な癌手術における術中自己輸血の使用は、腫瘍細胞が患者に再注入されて、再発症例が増加する可能性のために、制限されている。

癌腫細胞、白血球及びアクセサリー細胞への結合能を有する抗ＣＤ５２×抗ＥｐＣＡＭ抗体は、白血球除去の従来の工程である遠心分離及び／又は白血球濾過により単純に除去できる多重細胞複合体の形成を媒介する。本発明は、例えばＣｅｌｌ Ｓａｖｅｒ－５（登録商標）又はＣＡＴＳ（登録商標）のような自動化装置を用いることによる、術中血液回収中の抗ＣＤ５２×抗ＥｐＣＡＭ抗体媒介腫瘍細胞／白血球除去能力の可能性を示す。抗ＣＤ５２×抗ＥｐＣＡＭ抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏでの施用は、癌手術における術中血液回収プロセス中のそれぞれ医療装置及び医療製品としての使用である。

これらの実験的に支持されるデータから始まって、例えば濾過又は遠心分離により除去できる凝集体又は会合体を形成するために腫瘍細胞、並びに所望により免疫細胞及び／又は他の腫瘍細胞と相互作用できることを条件として、この実験的に証明された概念は、他のモノクローナル抗体に効率的に移行することもできることが当業者に対して証明される。これらの理由から、本発明は、腫瘍関連抗原ＥｐＣＡＭ及びパン白血球マーカーＣＤ５２並びに本明細書に示す特異的アイソタイプの組み合わせを認識する三官能性二重特異性抗体、例えば抗ＣＤ５２×抗ＥｐＣＡＭ抗体に限定されない。本明細書において本発明の概念を記載したが、本明細書に記載するように、腫瘍関連抗原を認識でき、かつ除去可能な会合体を形成する能力を有する限り、他の抗体及び腫瘍関連抗原に容易に移行できる。

まとめると、例えば抗ＣＤ５２×抗ＥｐＣＡＭ抗体を用いて残存自己腫瘍細胞の危険性を最小限にすることによる本発明の方法の施用は、癌手術中にＩＢＳを行うために不可欠であろう。
従来の方法と比較して、本発明は、術中に回収した血液から腫瘍細胞を除去するために改良された効率を有するより早い方法を提供する。本発明で開示する抗体、特に三官能性二重特異性抗体は、白血球、腫瘍細胞及びＦｃガンマ受容体陽性アクセサリー細胞と結合して、抗体と、腫瘍細胞及び免疫細胞、並びにさらに所望により又は追加として他の腫瘍細胞との三次元ネットワークを形成する。前記三官能性二重特異性抗体は、特定のパン白血球抗原と結合でき、このことは、Ｔ細胞、リンパ球のほぼ１００％までを含む様々な型の血液細胞の、腫瘍細胞との結合を可能にする。よって、他の既知の方法、例えば抗体が、腫瘍細胞とのＴ細胞の結合を単に媒介する方法と比較して、ここで開示する三官能性二重特異性抗体は、Ｔ細胞の量よりかなり多い白血球及びリンパ球を含む著しく増加した量の血液細胞を媒介して、術中に回収した血液中の腫瘍細胞と相互作用して、よって、腫瘍細胞をより効率的に除去できる。この点で、本発明は、癌患者が末梢血中に有するＴ細胞の量が低い場合に、特に有利である。なぜなら、腫瘍細胞とのＴ細胞の結合に依存する他の既知の方法は、腫瘍細胞を効率的に除去できないことがあるが、前記三官能性二重特異性抗体は、Ｔ細胞に加えて様々な他の型の血液細胞と結合できるので、本発明は、そのような制限がないからである

腫瘍細胞を除去するための血液中の抗体のインキュベーション中に、サイトカインが免疫細胞から放出され、洗浄工程にもかかわらずある状況下で赤血球濃縮物中に蓄積されることがあり、このことは、このような赤血球濃縮物を患者に輸血した後に免疫反応を引き起こす可能性がある。Ｔ細胞が腫瘍細胞との結合を媒介する、特にそのような結合がＴ細胞特異的抗原ＣＤ３又はＣＤ２８による場合の、術中に回収した血液から腫瘍細胞を除去する他の既知の方法において、大量のサイトカインが短時間で血液中に放出されることができ、患者における重篤な炎症応答を導く。この点において、本発明の三官能性二重特異性抗体の使用はサイトカインの放出を理論的に導くことができるが、このような放出の程度及び速度は、著しく低減され、このことは、よって、術中血液中に放出されたサイトカインにより引き起こされる重篤炎症応答の発生の危険性を著しく低減する。

さらに、上で説明したように、本発明で開示する抗体、特に三官能性二重特異性抗体は、白血球及びリンパ球を含む大量の血液細胞が腫瘍細胞と相互作用することを媒介する。よって、例えばＴ細胞だけが腫瘍細胞と相互作用することを媒介する他の既知の方法と比較して、ここで開示する抗体は、血液細胞とより大きい会合体及び／又は凝集体を形成する可能性を有する。さらに、ここで開示する抗体は、赤血球の表面で発現されない白血球抗原と結合し、このことは、よって、赤血球との結合を回避する。特に、ＣＤ５２と結合する本発明の抗体は、赤血球との結合を示さないことが証明されている。よって、本発明の方法は、精製血液を患者に再導入する前に赤血球から腫瘍細胞を効率的に分離する。

Claims (20)

1. 以下の工程：
   － 腫瘍細胞を含み得る術中に回収した血液を準備する工程と、
   － 前記術中に回収した血液を、
   － 二重特異性、三重特異性、四重特異性及び多重特異性抗体、並びに二価、三価、四価及び多価抗体からなる群より選択される少なくとも１つの抗体、並びに／或いは
   － 抗体と同様の多重特異的又は多価結合特性を有する少なくとも足場タンパク質
   と接触させる工程であって、
   前記少なくとも１つの抗体及び／又は前記少なくとも１つの足場タンパク質が、以下の特性：
   ａ）ＣＤ１１ａ、ＣＤ１５、ＣＤ１８、ＣＤ２９、ＣＤ３９、ＣＤ４５、ＣＤ４８、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ８２、ＣＤ９５、ＣＤ９７、ＣＤ１２２、ＣＤ１２４、ＣＤ１３２及びＣＤｗ１３７からなる群の少なくとも１つのメンバーから選択されるパン白血球抗原と結合する、
   ｂ）腫瘍細胞上の腫瘍関連抗原と結合する、
   ｃ）そのＦｃ部分を介してＦｃ受容体陽性細胞と結合する
   を有し、
   前記少なくとも１つの抗体及び／又は前記少なくとも１つの足場タンパク質が、血液に含まれる少なくとも腫瘍細胞及び白血球細胞と三次元ネットワークを形成でき、
   前記少なくとも１つの抗体及び／又は前記少なくとも１つの足場タンパク質が、１０～２４０分、好ましくは１０～１８０分の期間、前記術中に回収した血液と接触され、該期間は、前記抗体及び／又は前記足場タンパク質を含む会合体及び／又は凝集体を得るために前記腫瘍関連抗原を含む腫瘍細胞、及び前記白血球抗原を含む白血球細胞、及び／又は他の腫瘍細胞を架橋するために十分であり、前記腫瘍細胞、前記他の腫瘍細胞及び前記白血球細胞が、術中に回収した血液中に存在する可能性があり、前記腫瘍細胞が、前記少なくとも１つの抗体及び／又は前記足場タンパク質により特異的に認識される、工程と、
   － 前記会合体及び／又は凝集体を、前記術中に回収した血液から機械的に除去する工程と
   を含む、術中に回収した血液から腫瘍細胞を除去するためのｅｘ ｖｉｖｏ方法。
2. 前記少なくとも１つの抗体が、三官能性二重特異性抗体である、請求項１に記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
3. 前記三官能性二重特異性抗体が、以下のアイソタイプの組み合わせ：
   ラット－ＩｇＧ２ｂ／マウス－ＩｇＧ２ａ、
   ラット－ＩｇＧ２ｂ／マウス－ＩｇＧ２ｂ、
   ラット－ＩｇＧ２ｂ／ヒト－ＩｇＧ１、
   マウス－［ＶＨ－ＣＨ１；ＶＬ－ＣＬ］－ヒト－ＩｇＧ１／ｒａｔ－［ＶＨ－ＣＨ１，ＶＬ－ＣＬ］－ヒト－ＩｇＧ１－［ヒンジ］－ヒト－ＩｇＧ３^＊－［ＣＨ２－ＣＨ３］
   ［＊＝白人のアロタイプＧ３ｍ（ｂ＋ｇ）＝プロテインＡと結合しない］
   を有する抗体の群から選択される、請求項２に記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
4. 前記パン白血球抗原が、ＣＤ５２である、請求項１から３のいずれか一項に記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
5. 腫瘍抗原特異性及び／又はパン白血球抗原特異性が互いに異なる少なくとも２つの異なる抗体が、用いられる、請求項１から４のいずれか一項に記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
6. 前記会合体が、抗体、腫瘍細胞及び白血球細胞で構成される、請求項１から５のいずれか一項に記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
7. 前記１つ以上の抗体及び／又は足場タンパク質が、術中に回収した血液１リットルあたり１μｇから２０μｇ、好ましくは１から１０μｇ又は１から５μｇ又は１から２μｇの量で用いられる、請求項１から６のいずれか一項に記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
8. 以下のさらなる工程：
   ａ） 前記少なくとも１つの抗体及び／又は前記少なくとも１つの足場タンパク質を添加する前に、術中に回収した血液を、少なくとも１つの抗凝固剤と混合する工程、
   ｂ） 前記会合体及び／又は凝集体並びにさらなる血液成分から赤血球を、遠心分離により、好ましくは密度勾配遠心分離により分離する工程、
   ｃ） 前記混合物を所望により濾過して、存在する可能性がある残存会合体及び／又は凝集体並びに残存細胞複合体を除去する工程、並びに
   ｄ） 赤血球含有画分及びさらなる血液成分を、別の容器に回収する工程
   の少なくとも１つを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
9. 前記術中に回収した血液との前記少なくとも１つの抗体及び／又は前記少なくとも１つの足場タンパク質のインキュベーション時間が、１０と９０分の間、さらに好ましくは２０と６０分の間であり、所望により、前記インキュベーションが、１９から２５℃の間の温度、好ましくは室温にて行われる、請求項１から８のいずれか一項に記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
10. 会合体及び／又は凝集体の前記除去が、遠心分離、濾過又はそれらの組み合わせによる、請求項１から９のいずれか一項に記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
11. 白血球及び／又は腫瘍細胞を含む細胞複合体が、白血球吸着／枯渇フィルターを用いて別の工程において除去される、請求項１から１０のいずれか一項に記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
12. 前記腫瘍細胞が、上皮性、血液又は神経外胚葉性腫瘍からである、請求項１から１１のいずれか一項に記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
13. Ｔ細胞、腫瘍細胞上の腫瘍関連抗原、及びそのＦｃ部分を介してＦｃ受容体陽性細胞に結合する追加の三官能性二重特異性抗体が、施用される、請求項１から１２のいずれか一項に記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
14. 前記少なくとも１つの抗体及び／又は前記少なくとも１つの足場タンパク質が、２つの異なる腫瘍関連抗原と結合する特性を有する、請求項１から１３のいずれか一項に記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法。
15. 以下の特性：
    ａ）ＣＤ１１ａ、ＣＤ１５、ＣＤ１８、ＣＤ２９、ＣＤ３９、ＣＤ４５、ＣＤ４８、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ８２、ＣＤ９５、ＣＤ９７、ＣＤ１２２、ＣＤ１２４、ＣＤ１３２及びＣＤｗ１３７からなる群の少なくとも１つのメンバーから選択されるパン白血球抗原と結合する、
    ｂ）腫瘍細胞上の腫瘍関連抗原と結合する、
    ｃ）そのＦｃ部分を介してＦｃ受容体陽性細胞と結合する
    を有する二重特異性、三重特異性、四重特異性若しくは多重特異性抗体、二価、三価、四価若しくは多価抗体及び／又は抗体に類似の多重特異的若しくは多価結合特性を有する足場タンパク質、特に二重特異性三官能性抗体であって、血液に含まれる腫瘍細胞及び白血球細胞と三次元ネットワークを形成できる抗体の、請求項１から１３のいずれか一項に記載のｅｘ ｖｉｖｏ方法における使用。
16. 前記少なくとも１つの抗体及び／又は前記少なくとも１つの足場タンパク質が、２つの異なる腫瘍関連抗原と結合する特性を有する、請求項１５に記載の使用。
17. 以下の工程：
    － 腫瘍細胞を含み得る術中に回収した血液を準備する工程と、
    － 前記術中に回収した血液を抗体と接触させる工程であって、前記抗体が、以下の特性：
    ａ）ＣＤ１１ａ、ＣＤ１５、ＣＤ１８、ＣＤ２９、ＣＤ３９、ＣＤ４５、ＣＤ４８、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ８２、ＣＤ９５、ＣＤ９７、ＣＤ１２２、ＣＤ１２４、ＣＤ１３２及びＣＤｗ１３７からなる群の少なくとも１つのメンバーから選択されるパン白血球抗原と結合する、
    ｂ）腫瘍細胞上の腫瘍関連抗原と結合する、
    ｃ）そのＦｃ部分を介してＦｃ受容体陽性細胞と結合する
    を有し、
    前記抗体が、血液に含まれる少なくとも腫瘍細胞及び白血球細胞と三次元ネットワークを形成でき、
    前記抗体が、１０～２４０分、好ましくは１０～１８０分の期間、前記術中に回収した血液と接触され、該期間は、前記抗体を含む会合体及び／又は凝集体を得るために前記腫瘍関連抗原を含む腫瘍細胞、及び前記パン白血球抗原を含む白血球細胞、及び／又は他の腫瘍細胞を架橋するために十分であり、前記腫瘍細胞、前記他の腫瘍細胞及び前記白血球細胞が、術中に回収した血液中に存在する可能性があり、前記腫瘍細胞が、前記抗体により特異的に認識される、工程と、
    － 前記会合体及び／又は凝集体を、前記術中に回収した血液から機械的に除去する工程と
    を含む腫瘍又は癌の処置における使用のための、二重特異性、三重特異性、四重特異性及び多重特異性抗体、並びに二価、三価、四価及び多価抗体からなる群より選択される抗体。
18. 前記抗体が、２つの異なる腫瘍関連抗原と結合する特性を有する、請求項１７に記載の使用のための抗体。
19. 以下の工程：
    － 腫瘍細胞を含み得る術中に回収した血液を準備する工程と、
    － 前記術中に回収した血液を足場タンパク質と接触させる工程であって、前記足場タンパク質が、以下の特性；
    ａ）ＣＤ１１ａ、ＣＤ１５、ＣＤ１８、ＣＤ２９、ＣＤ３９、ＣＤ４５、ＣＤ４８、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ８２、ＣＤ９５、ＣＤ９７、ＣＤ１２２、ＣＤ１２４、ＣＤ１３２及びＣＤｗ１３７からなる群の少なくとも１つのメンバーから選択されるパン白血球抗原と結合する、
    ｂ）腫瘍細胞上の腫瘍関連抗原と結合する、
    ｃ）そのＦｃ部分を介してＦｃ受容体陽性細胞と結合する
    を有し、
    前記足場タンパク質が、血液に含まれる少なくとも腫瘍細胞及び白血球細胞と三次元ネットワークを形成でき、
    前記足場タンパク質が、１０～２４０分、好ましくは１０～１８０分の期間、前記術中に回収した血液と接触され、該期間は、前記足場タンパク質を含む会合体及び／又は凝集体を得るために前記腫瘍関連抗原を含む腫瘍細胞、及び前記パン白血球抗原を含む白血球細胞、及び／又は他の腫瘍細胞を架橋するために十分であり、前記腫瘍細胞、前記他の腫瘍細胞及び前記白血球細胞が、術中に回収した血液中に存在する可能性があり、前記腫瘍細胞が、前記足場タンパク質により特異的に認識される、工程と、
    － 前記会合体及び／又は凝集体を、前記術中に回収した血液から機械的に除去する工程と
    を含む腫瘍又は癌の処置における使用のための、抗体に類似の多重特異的又は多価結合特性を有する足場タンパク質。
20. 前記足場タンパク質が、２つの異なる腫瘍関連抗原と結合する特性を有する、請求項１９に記載の使用のための足場タンパク質。

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