JP2022541528A - クロストリジウム綱コンソーシアムの組成ならびに肥満、メタボリックシンドローム及び過敏性腸疾患の治療法 - Google Patents
クロストリジウム綱コンソーシアムの組成ならびに肥満、メタボリックシンドローム及び過敏性腸疾患の治療法 Download PDFInfo
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Abstract
本明細書に開示されるのは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａのコンソーシアムを含む組成物、ならびにこの組成物を対象に投与することによって、肥満、メタボリックシンドローム、過敏性腸症候群を治療する方法、ならびに体重増加を軽減し、小腸における脂質吸収を阻害する方法である。【選択図】図１Ａ
Description
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年７月１７日に出願された米国仮出願６２／８７５，１９４の出願日の利益を主張する。この先願出願の内容は、その全体が参照により、本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１９年７月１７日に出願された米国仮出願６２／８７５，１９４の出願日の利益を主張する。この先願出願の内容は、その全体が参照により、本明細書に組み込まれる。
配列表の参照
２０２０年７月１６日に作成され、２４，５７６バイトのサイズを有するテキストファイル名「２１１０１＿０４０１Ｐ１＿ＳＬ．ｔｘｔ」として本明細書に提出された配列表は、米国特許規則第１．５２条（ｅ）（５）項に従って、参照することにより本明細書に組み込まれる。
２０２０年７月１６日に作成され、２４，５７６バイトのサイズを有するテキストファイル名「２１１０１＿０４０１Ｐ１＿ＳＬ．ｔｘｔ」として本明細書に提出された配列表は、米国特許規則第１．５２条（ｅ）（５）項に従って、参照することにより本明細書に組み込まれる。
微生物叢は、宿主の代謝及び肥満に影響を及ぼすが、疾患から防御する生物体は不明なままである。
本明細書には、細菌のコンソーシアムが開示されている。本明細書には、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ（クロストリジウム属）のコンソーシアムが開示されている。
本明細書には、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ（クロストリジウム綱）のコンソーシアム由来の上清を含む組成物が開示されている。
本明細書には、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍのコンソーシアムを含む組成物が開示されている。
本明細書には、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ ａｎａｅｒｏｖｏｒａｘ株、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ＸＩＶａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ＩＶ、及びＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｓｐｐｓを含む細菌のコンソーシアムであって、このコンソーシアムは、このコンソーシアムが投与されていない対象と比較して対象における腸上皮内の脂質吸収遺伝子の発現を抑制するコンソーシアムが開示される。
本明細書には、対象における微生物叢の相対量を変更する方法であって、本明細書に記載される任意の組成物の有効量を対象に投与して、これによってその対象における微生物叢の相対量を変更することを含む方法が開示される。
本明細書には、肥満の対象を治療する方法が開示される。いくつかの態様では、この方法は、本明細書に開示される任意の組成物を対象に投与することであって、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａの相対量が、投与前の相対量と比較して対象において増大されることを含み得る。
本明細書には、メタボリックシンドロームを有する対象を治療する方法が開示される。いくつかの態様では、この方法は、本明細書に開示される任意の組成物を対象に投与することであって、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａの相対量が、投与前の相対量と比較して対象において増大されることを含み得る。
本明細書には、過敏性腸症候群を有する対象を治療する方法が開示される。いくつかの態様では、この方法は、本明細書に開示される任意の組成物を対象に投与することであって、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａの相対量が、投与前の相対量と比較して対象において増大されることを含み得る。
本明細書には、対象の体重増加を軽減する方法が開示される。いくつかの態様では、この方法は、本明細書に開示される任意の組成物を対象に投与することであって、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａの相対量が、投与前の相対量と比較して対象において増大されることを含み得る。
本明細書には、対象の小腸において脂肪吸収を阻害する方法が開示される。いくつかの態様では、この方法は、本明細書に開示される任意の組成物を対象に投与することであって、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａの相対量が、投与前の相対量と比較して対象において増大されることを含み得る。
本明細書には、対象の肝臓においてＣＤ３６を下方制御する方法が開示される。いくつかの態様では、この方法は、本明細書に開示される任意の組成物を対象に投与することであって、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａの相対量が、投与前の相対量と比較して対象において増大されることを含み得る。
添付の図面は、本明細書に組み込まれてその一部を構成し、複数の態様を例示し、説明と合わせて本発明の原則を説明する役割を果たす。
本発明のさらなる利点は、一部は以下の説明において記載されることになり、一部は説明から明らかとなるか、または本発明を実施することにより学習され得る。本発明の利点は、特に添付の特許請求の範囲で指摘される要素及び組み合わせにより、理解及び達成されることになる。当然のことながら、上記の全般的な説明及び以下の詳細な説明は、両方とも、例示及び説明にすぎず、特許請求されるとおりの本発明を限定するものではない。
本開示は、本明細書に含まれる以下の本発明の詳細な説明、図面及び実施例を参照することによってより容易に理解することができる。
本方法及び組成物を開示ならびに説明する前に、それらは、他に特定されない限り、特定の合成方法に限定されず、他に特定されない限り、特定の試薬にも限定されず、よって、当然のことながら、異なるものになってもよいことを理解されたい。本明細書で使用する用語は、特定の態様のみを説明するためのものであり、限定することを意図するものではないことも理解されたい。本明細書に記載のものと類似または同等の任意の方法及び材料を、本発明の実施または試験において使用することができるが、例示的な方法及び材料をここで記載する。
さらに、別段に明記しない限り、本明細書に記載のいずれの方法も、そのステップが特定の順序で実行されることを必要とすると解釈されることを決して意図するものではないことを理解されたい。したがって、方法の請求項がそのステップが従うべき順序を実際に記載していない場合、または該ステップが特定の順序に限定されるべきであることが請求項または説明に具体的に述べられていない場合、いかなる点でも順序が推測されることを決して意図しない。これは、ステップの配置または操作の流れに関する論理的な問題、文法構成または句読法から派生する明らかな意味、及び本明細書に記載の態様の数または種類を含めた、任意のあり得る非明示的な解釈の根拠に対して成り立つ。
本明細書で言及されるすべての刊行物は、それらの刊行物が引用される方法及び／または材料を開示及び説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で考察される刊行物は、本出願の出願日前のそれらの開示に対してのみ提供される。明細書中、本発明を、先行発明を理由にそのような刊行物に先行する権利がないとする承認として解釈されるべきものはなにもない。さらに、本明細書に提供する公開日は、実際の公開日と異なる場合があり、個別の確認が必要な場合がある。
定義
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈上別途明確に示されない限り、複数の指示対象を含む。
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈上別途明確に示されない限り、複数の指示対象を含む。
本明細書で使用される「または」という用語は、特定のリストの任意の１つのメンバーを意味するとともに、そのリストのメンバーの任意の組み合わせも含む。
範囲は、本明細書では、「約」もしくは「およそ」１つの特定の値から、及び／または「約」もしくは「およそ」別の特定の値までのように表されてもよい。かかる範囲が表される場合、さらなる態様は、該１つの特定の値から、及び／または該他の特定の値までを含む。同様に、値が近似値として表される場合、先行詞「約」または「およそ」を使用することによって、該特定の値がさらなる態様を形成することが理解される。さらに、該範囲の各々の終末点は、他の終末点との関連において、及び他の終末点とは独立しての両方で重要であることが理解される。また、本明細書に開示される多くの値があること、及び各値もまた、該値自体に加えて、「約」その特定の値として本明細書に開示されることも理解される。例えば、値「１０」が開示される場合、「約１０」もまた開示される。また、２つの特定の単位間の各単位も開示されることが理解される。例えば、１０及び１５が開示される場合、１１、１２、１３、及び１４も開示される。
本明細書で使用される、「任意の」または「任意に」という用語は、その後に記載される事象または状況が生じても生じなくてもよいこと、ならびにその記載が、当該事象または状況が生じる場合及びそれが生じない場合を含むことを意味する。
本明細書で使用される、「試料」という用語は、対象由来の組織または器官、細胞（対象内、対象から直接採取、または培養中で維持された細胞もしくは培養細胞株由来の細胞のいずれか）、細胞溶解物（もしくは溶解物画分）または細胞抽出物、あるいは、細胞または細胞物質（例えば、ポリペプチドもしくは核酸）由来の１つ以上分子を含む溶液を意味し、本明細書に記載のとおりにアッセイされる。試料はまた、細胞もしくは細胞成分を含む任意の体液または排出物（例えば、限定するものではないが、血液、尿、ふん便、唾液、涙液、胆汁、脳脊髄液）であってもよい。いくつかの態様では、試料は、脳、脊髄、脳脊髄液または血液から採取してもよい。
本明細書で使用する場合、「対象」という用語は、投与の標的、例えば、ヒトを指す。したがって、本開示の方法の対象は、脊椎動物、例えば、哺乳動物、魚類、鳥類、爬虫類、または両生類であり得る。「対象」という用語にはまた、飼育動物（例えば、ネコ、イヌなど）、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなど）、及び実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット、ショウジョウバエなど）も含まれる。一態様では、対象は哺乳動物である。別の態様では、対象はヒトである。この用語は、特定の年齢または性別を示さない。したがって、雌雄にかかわらず、成年、幼年、青年、及び新生の対象、ならびに胎児が包含されることが意図される。
本明細書で使用する場合、「患者」という用語は、疾患または障害に罹患している対象を指す。「患者」という用語は、ヒト及び脊椎動物対象を含む。開示されている方法のいくつかの態様では、「患者」は、例えば、投与する工程の前などに多発性硬化症の治療が必要であると診断されている。本開示の方法のいくつかの態様では、「患者」は、例えば、投与するステップの前などにＩＩ型糖尿病、肥満または炎症性腸疾患の処置が必要であると診断されている。
本明細書で使用されるとき、「正常」という用語はＩＩ型糖尿病、肥満もしくは炎症性腸疾患を有さないか、またはＩＩ型糖尿病、肥満もしくは炎症性腸疾患を発症する高い易罹患性を有さない個体、試料、または対象を指す。
本明細書で使用されるとき、「易罹患性」という用語は、対象が疾患と臨床的に診断される可能性を指す。例えば、ＩＩ型糖尿病、肥満、または炎症性腸疾患に対する感受性が高いヒト対象とは、対象がＩＩ型糖尿病、肥満、または炎症性腸疾患と臨床的に診断される可能性が高いヒト対象を指し得る。
本明細書で使用される、「含む」という用語は、「～からなる」及び「～から本質的になる」態様を含むことができる。
本明細書で使用される場合、「対照」とは、正常な対象由来の、またはＩＩ型糖尿病、肥満、もしくは炎症性腸疾患を有さない正常な対象由来の組織由来の試料である。
本明細書で使用される場合、「過剰発現」とは、正常な試料で検出される発現よりも多い発現を意味する。例えば、過剰発現される核酸は、正常より約１標準偏差、または正常より約２標準偏差、または正常レベルの発現より約３標準偏差上回って発現されてもよい。したがって、対照レベルの発現を約３標準偏差上回って発現される核酸は過剰発現される核酸である。
本明細書で使用される場合、「治療する」とは、ＩＩ型糖尿病、肥満、または炎症性腸疾患を有するヒトまたは他の哺乳動物（例えば、動物モデル）などの対象に本発明の化合物または分子を投与して、その疾患もしくは状態の影響の悪化を防止もしくは遅らせるか、またはその疾患の影響を部分的もしくは完全に逆転させることを意味する。
本明細書で使用される場合、「予防する」とは、ＩＩ型糖尿病、肥満、もしくは炎症性腸疾患を発症する易罹患性が高い対象、またはＩＩ型糖尿病、肥満、もしくは炎症性腸疾患を発症する可能性を最小限に抑えることを意味する。
本明細書で使用される、用語「参照」、「参照発現」、「参照試料」、「参照値」、「対照」、「対照試料」などは、試料または１以上の微生物の発現レベルの文脈で用いられる場合、参照基準を指し、その際、該参照は、異なる組織（すなわち、同じ組織ではないが複数の組織）間で一定のレベルで発現され、実験条件によって影響を受けず、所定の病態（例えば、ＩＩ型糖尿病、肥満、もしくは炎症性腸疾患に罹患していない）の試料におけるレベルを示す。該参照値は、所定の基準値でも所定の基準値の範囲でもよく、無病、または所定の型もしくは重症度の病気を表す。
組成物
本開示は、細菌分離株及び群落を含む組成物及び使用方法に関する。具体的には、本開示は、本明細書、特に表１に開示されている細菌コンソーシアムからの１つ以上の微生物またはそれらの混合物を含む組成物に関する。好ましい実施形態では、組成物は、配列番号１、２、３、及び４を含む１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を有する細菌の２つ以上の株を含む。微生物は、配列番号１～４に対応し、少なくとも９８％同一である１６Ｓ リボソーム遺伝子配列を同定することによって特徴付けられ得る。
本開示は、細菌分離株及び群落を含む組成物及び使用方法に関する。具体的には、本開示は、本明細書、特に表１に開示されている細菌コンソーシアムからの１つ以上の微生物またはそれらの混合物を含む組成物に関する。好ましい実施形態では、組成物は、配列番号１、２、３、及び４を含む１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を有する細菌の２つ以上の株を含む。微生物は、配列番号１～４に対応し、少なくとも９８％同一である１６Ｓ リボソーム遺伝子配列を同定することによって特徴付けられ得る。
本明細書に開示されているのは、新たに同定された細菌である。配列番号１、２、３、及び４を含む１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を有する細菌は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属に属することが見出された。いくつかの態様において、本明細書に記載される組成物は、細菌がＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．（クロストリジウム種）である少なくとも１つの細菌を含む。
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ ａｎａｅｒｏｖｏｒａｘ。本明細書には、細菌Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ ａｎａｅｒｏｖｏｒａｘが開示される。本明細書で使用されるＣｌｏｓｔｒｉｄｉａ ａｎａｅｒｏｖｏｒａｘとは、配列番号１に対して少なくとも少なくとも９８％の配列同一性を共有する１６Ｓ 核酸配列を有する細菌を指す。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ ａｎａｅｒｏｖｏｒａｘは、ＮＲＲＬまたはＡＴＣＣアクセッション番号＿＿＿＿＿を有する。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ ａｎａｅｒｏｖｏｒａｘは、ＣＤ４－Ｃｒｅ+マウス（ＷＴ）の小腸下部由来の糞便ペレット及び管腔内容物から分離された。
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ＸＩＶａ。本明細書では、細菌、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ＸＩＶａが開示される。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ＸＩＶａとは、本明細書において用いる場合、配列番号２に対して少なくとも少なくとも９８％の配列同一性を共有する１６Ｓ 核酸配列を有する細菌を指す。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ＸＩＶａは、ＮＲＲＬまたはＡＴＣＣ アクセッション番号＿＿＿＿＿を有する。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ＸＩＶａは、ＣＤ４－Ｃｒｅ+マウス（ＷＴ）の小腸下部由来の糞便ペレット及び管腔内容物から分離された。
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ＩＶ。本明細書では、細菌、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ＩＶが開示される。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ＩＶとは、本明細書において用いる場合、配列番号３に対して少なくとも少なくとも９８％の配列同一性を共有する１６Ｓ 核酸配列を有する細菌を指す。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ＩＶは、ＮＲＲＬまたはＡＴＣＣ アクセッション番号＿＿＿＿＿を有する。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ＩＶは、ＣＤ４－Ｃｒｅ+マウス（ＷＴ）の小腸下部由来の糞便ペレット及び管腔内容物から分離された。
Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｓｐｐｓ。本明細書では、細菌、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｓｐｐｓが開示される。Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｓｐｐｓとは、本明細書において用いる場合、配列番号４に対して少なくとも少なくとも９８％の配列同一性を共有する１６Ｓ 核酸配列を有する細菌を指す。Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｓｐｐｓは、ＮＲＲＬまたはＡＴＣＣ アクセッション番号＿＿＿＿＿を有する。Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｓｐｐｓは、ＣＤ４－Ｃｒｅ+マウス（ＷＴ）の小腸下部由来の糞便ペレット及び管腔内容物から分離された。
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ．本開示は、細菌分離株及び群落を含む組成物及び使用方法に関する。本明細書には、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａコンソーシアム（２つ以上の異なる菌株の混合物）が開示される。具体的には、本開示は、本明細書、特に表１に開示されている細菌コンソーシアム由来の１つ以上の微生物またはそれらの混合物を含む組成物に関する。いくつかの態様では、この組成物は、表１に列挙される２つ以上の菌株を含む。この微生物は、配列番号１～４に相当し、それ対して少なくとも少なくとも９８％同一である１６Ｓリボソーム遺伝子配列を特定することによって、ならびに／またはそれぞれ、ＮＲＲＬもしくはＡＴＣＣアクセッション番号： ＿＿＿＿、＿＿＿＿、＿＿＿＿、及び＿＿＿＿を有する細菌に対する比較によって、特徴付けられ得る。いくつかの態様では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａコンソーシアムは、配列番号１、２、３、及び４を含む１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を有する２つ以上の細菌株を含む。いくつかの態様では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａコンソーシアムは、配列番号１、２、３、及び４を含む１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を有する３つ以上の細菌株を含む。いくつかの態様では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａコンソーシアムは、それぞれ配列番号１、２、３、及び４を含む１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を有する４つの菌株を含む。
いくつかの態様では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａコンソーシアムは、他の細菌株が存在しない場合に、配列番号１、２、３、及び４を含む１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を有する２つ以上の細菌株を含む。いくつかの態様では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａコンソーシアムは、他の細菌株が存在しない場合に、配列番号１、２、３、及び４を含む１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を有する３つ以上の細菌株を含む。いくつかの態様では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａコンソーシアムは、他の細菌株が存在しない場合に、それぞれ、配列番号１、２、３、及び４を含む１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を有する４つの細菌株を含む。
いくつかの態様では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａコンソーシアムは、表１に列挙された最大４つの細菌株を含む。いくつかの態様では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａコンソーシアムは、表１の２つ以上の細菌株を含む。いくつかの態様では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａコンソーシアムは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ ａｎａｅｒｏｖｏｒａｘ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ＸＩＶａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ＩＶ及びＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｓｐｐｓを含む。いくつかの態様では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａコンソーシアムは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ ａｎａｅｒｏｖｏｒａｘ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ＸＩＶａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ＩＶ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｓｐｐｓ、及び表１の１つ以上の細菌株を含む。いくつかの態様では、このコンソーシアムの種々の細菌は、それらの１６Ｓリボソーム遺伝子配列によって特定され得る。
いくつかの態様では、本明細書に開示されるＣｌｏｓｔｒｉｄｉａコンソーシアムは、配列番号１、２、３、及び４を含む１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を有する細菌の４つを超える菌株を含む、より複雑なＣｌｏｓｔｒｉｄｉａコンソーシアムを含む、複雑な微生物群落と同程度に対象にコロニー形成された場合、対象における脂肪症を軽減し得る。
いくつかの態様では、本明細書に開示されるＣｌｏｓｔｒｉｄｉａコンソーシアムは、それぞれ、未処理のＷＴマウスまたはＴ－ＭｙＤ８８－／－マウスと比較した場合、高脂肪食を与えられたときに、ＷＴマウスまたは肥満傾向のＴ－ＭｙＤ８８－／－マウスにおける体重増加及び脂肪蓄積を減少し得る。
いくつかの態様では、本明細書に開示されるＣｌｏｓｔｒｉｄｉａコンソーシアムは、それぞれ、未処理のＷＴマウスまたはＴ－ＭｙＤ８８－／－マウスと比較した場合、高脂肪食を与えられたときに、ＷＴマウスまたは肥満傾向のＴ－ＭｙＤ８８－／－マウスにおける、体脂肪率を下げ、及びＶＡＴ量を減少し得る。
いくつかの態様では、本明細書に開示されるＣｌｏｓｔｒｉｄｉａコンソーシアムは、それぞれ、未処理のＷＴマウスまたはＴ－ＭｙＤ８８－／－マウスと比較した場合、高脂肪食を与えられたときに、ＷＴマウスまたは肥満傾向のＴ－ＭｙＤ８８－／－マウスにおける血糖値を低下及びインスリン抵抗性を減少し得る。
本明細書に開示されるのは、対象の脂肪症を軽減し、対象の体重増加及び／または脂肪蓄積を減らし、対象の体脂肪率を下げ、及び／または対象の内臓脂肪組織（ＶＡＴ）量を減らし、血糖値を下げる、及び／または、対象のインスリン抵抗性を低下させ、対象の小腸での脂質吸収を阻害し、対象の肝臓でＣＤ３６を下方制御し、ならびに対象の腸上皮内での脂質吸収遺伝子の発現を抑制するためのＣｌｏｓｔｒｉｄｉａコンソーシアムである。いくつかの態様では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａコンソーシアムは、表１に列挙された最大４つの細菌株を含む。いくつかの態様では、表１の任意の２つ以上の細菌株の組み合わせが、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａコンソーシアムにおいて使用され得る。いくつかの態様では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａコンソーシアムは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ ａｎａｅｒｏｖｏｒａｘ，Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ＸＩＶａ，Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ＩＶ ａｎｄ Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｓｐｐｓを含む。いくつかの態様では、コンソーシアム内のさまざまな細菌は、それらの１６Ｓリボソーム遺伝子配列によって同定され得る。
本明細書には、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａのコンソーシアム由来の上清を含む組成物が開示されている。本明細書にはまた、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍのコンソーシアムを含む組成物が開示されている。いくつかの態様では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａコンソーシアムは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ ａｎａｅｒｏｖｏｒａｘ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ＸＩＶａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ＩＶ及びＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｓｐｐｓを含む。いくつかの態様では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａコンソーシアムは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ ａｎａｅｒｏｖｏｒａｘ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ＸＩＶａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ＩＶ及びＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｓｐｐｓのうちの１つ以上を含む。いくつかの態様では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａコンソーシアムは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ ａｎａｅｒｏｖｏｒａｘ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ＸＩＶａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ＩＶ及びＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｓｐｐｓのうちの２つ以上を含む。いくつかの態様では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａコンソーシアムは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ ａｎａｅｒｏｖｏｒａｘ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ＸＩＶａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ＩＶ及びＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｓｐｐｓのうちの３つ以上を含む。いくつかの態様では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａコンソーシアムは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ ａｎａｅｒｏｖｏｒａｘ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ＸＩＶａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ＩＶ及びＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｓｐｐｓからなる。いくつかの態様では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａコンソーシアムは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ ａｎａｅｒｏｖｏｒａｘ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ＸＩＶａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ＩＶ及びＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｓｐｐｓのうちの１つ以上からなる。いくつかの態様では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａコンソーシアムは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ ａｎａｅｒｏｖｏｒａｘ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ＸＩＶａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ＩＶ及びＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｓｐｐｓのうちの２つ以上からなる。いくつかの態様では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａコンソーシアムは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ ａｎａｅｒｏｖｏｒａｘ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ＸＩＶａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ＩＶ及びＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｓｐｐｓのうちの３つ以上からなる。
いくつかの態様では、本明細書に記載される任意の組成物は、対象の腸上皮内の脂質吸収遺伝子の発現を抑制し得る。いくつかの態様では、本明細書に開示される任意の組成物は、１つ以上の脂質吸収及び／または合成遺伝子を抑制し得る。いくつかの態様では、脂質吸収遺伝子は、ＣＤ３６、ＦａｓＮ、Ｄｇａｔ、Ｓｒｅｐｂｆ１、ＳＬＣ２７ａ１、及びＳＬＣ２７ａ４であり得る。
いくつかの態様では、本明細書に記載される任意の組成物は、対象の小腸の脂質吸収を阻害し得る。
いくつかの態様では、本明細書に記載される任意の組成物は、対象の体重増加を軽減し得る。
いくつかの態様では、本明細書に記載される任意の組成物は、対象の肝臓においてＣＤ３６を下方制御し得る。
また、本明細書には、２つ以上のＣｌｏｓｔｒｉｄｉａ ａｎａｅｒｏｖｏｒａｘ株、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ＸＩＶａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ＩＶ、及びＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｓｐｐｓを含む細菌のコンソーシアムであって、このコンソーシアムは、このコンソーシアムが投与されていない対象と比較して対象における腸上皮内の脂質吸収遺伝子の発現を抑制するコンソーシアムも開示される。
いくつかの態様において、本明細書に記載される組成物は、表１から選択される１つ以上のＣｌｏｓｔｒｉｄｉａ株をさらに含み得る。
いくつかの態様では、開示される組成物は、配列番号１～４の１６Ｓリボソーム配列に対して少なくとも９５、９６、９７、９８、９９またはそれ以上の同一性パーセントの相同性によって同定可能な少なくとも２つ以上の細菌微生物を含む。いくつかの態様では、１６Ｓ配列の量は、約１．２ｋｂ、１．１ｋｂ、１．０ｋｂ、０．９ｋｂ、８ｋｂ、０．７ｋｂ、０．６ｋｂ、０．５ｋｂ、０．４ｋｂ、０．３ｋｂ、０．２ｋｂ、または０．１ｋｂ未満であり、かつ約５０ｎｔ、０．１ｋｂ、２ｋｂ、０．３ｋｂ、０．４ｋｂ、０．５ｋｂ、０．６ｋｂ、０．７ｋｂ、０．８ｋｂ、０．９ｋｂ、１．０ｋｂ、または１．１ｋｂを超える。いくつかの態様では、１６Ｓリボソーム配列相同性の量は、約１５０ｎｔ～５００ｎｔの間、例えば、約２５０ｎｔである。２つの核酸配列の同一性パーセントを決定するために、配列を最適な比較目的のために整列させる（例えば、第２の核酸配列との最適な整列のためにギャップを、第１の核酸配列の配列に導入してもよい）。次に、対応するヌクレオチド位置にあるヌクレオチドを比較する。第１の配列における位置が、第２の配列における対応する位置と同じヌクレオチドによって占有される場合には、その分子は、その位置にて同一である。２つの配列の間の同一性パーセントは、その配列によって共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、同一性％＝同一の位置の数／位置の総数×１００）。
２つの配列間の相同性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。２つの配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの好ましい非限定的な例は、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４－２２６８のアルゴリズムであって、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－５８７７のように改変されたアルゴリズムである。かかるアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９０） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて実施して、本開示の核酸分子に対して類似または相同なヌクレオチド配列を得てもよい。比較目的のためのギャップアライメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２に記載のように利用してもよい。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータ（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）を使用してもよい。これらのアルゴリズムを、ＤＮＡをＲＮＡと整列させるために使用してもよく、場合によっては、タンパク質を翻訳されたヌクレオチド配列と整列させるために使用してもよい。
いくつかの態様では、少なくとも２つ以上の微生物が本開示の組成物に含まれる。２つ以上の微生物が組成物を形成する場合、その微生物を共培養して、開示された組成物を生成し得ると考えられる。いくつかの態様では、開示された組成物は、２つ以上の株の個々の培養物を組み合わせることによって形成され得る。微生物は、当技術分野で公知の方法によって増殖され得る。例えば、微生物は、嫌気性または好気性の条件下で液体培地中で増殖され得る。微生物の増殖に使用される適切な液体培地としては、栄養ブロス及びトリプシンダイズ天（ＴＳＡ）などのような当技術分野で公知の培地が挙げられる。いくつかの態様では、この組成物は、表１に列挙された菌株の全リストを含む。いくつかの態様では、組成物は、以下の菌株のうちの少なくとも２つ以上を含む：Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ ａｎａｅｒｏｖｏｒａｘ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ＸＩＶａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ＩＶ、及びＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｓｐｐｓ。
いくつかの態様では、本明細書に開示される組成物は、少なくとも１×１０-5細胞の各Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ株を含んでもよい。いくつかの態様では、本明細書に開示される組成物は、少なくとも１×１０-6細胞の各Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ株を含んでもよい。いくつかの態様では、本明細書に開示される組成物は、少なくとも１×１０-7細胞の各Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ株を含んでもよい。いくつかの態様では、本明細書に開示される組成物は、少なくとも１×１０-8細胞の各Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ株を含んでもよい。いくつかの態様では、本明細書に開示される組成物は、少なくとも１×１０-9細胞の各Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ株を含んでもよい。いくつかの態様では、本明細書に開示される組成物は、少なくとも１×１０-10細胞の各Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ株を含んでもよい。いくつかの態様では、本明細書に開示される任意の組成物の単一投薬量は、１×１０-5 ～１×１０-10細胞の各Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ株を含んでもよい。いくつかの態様では、このコンソーシアムの細胞は活性である。
いくつかの態様では、本明細書に開示される組成物は、不均衡な微生物叢に関連する疾患または障害を有する対象の微生物叢を置き換え得る。いくつかの態様では、本明細書に開示される組成物は、対象の微生物叢を、機能不全の微生物叢に関連する疾患または障害で置き換え得る。いくつかの態様では、本明細書に開示される組成物は、対象の微生物叢を、機能的多様性が減少する微生物叢に関連する疾患または障害で置き換え得る。いくつかの態様では、不均衡な微生物叢（または機能不全の微生物叢もしくは機能的多様性が減少する微生物叢）とは、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏの増加及びクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）の減少である場合がある。いくつかの態様では、不均衡な微生物叢（または機能不全の微生物叢もしくは機能的多様性が減少する微生物叢）とは、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏの無変化（または増加なし）及びクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）の減少である場合がある。いくつかの態様では、不均衡な微生物叢（または機能不全の微生物叢もしくは機能的多様性が減少する微生物叢）とは、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）の減少である場合がある。いくつかの態様では、不均衡な微生物叢（または機能不全の微生物叢もしくは機能的多様性が減少する微生物叢）とは、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）の非存在または欠失である場合がある。
いくつかの態様では、疾患または障害は、肥満、メタボリックシンドローム、インスリン欠乏、インスリン抵抗性関連障害、耐糖能異常、糖尿病、または炎症性腸疾患であり得る。いくつかの態様では、炎症性腸疾患は、クローン病であっても、または潰瘍性大腸炎であってもよい。いくつかの態様では、インスリン抵抗性関連障害は、糖尿病、高血圧、脂質異常症、または心血管疾患であってもよい。いくつかの態様では、糖尿病はＩ型糖尿病であってもよい。いくつかの態様では、糖尿病はＩＩ型糖尿病であってもよい。
いくつかの態様では、本明細書に開示される組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含んでもよい。いくつかの態様では、この組成物はまた、添加剤も含んでもよい。適切な添加剤としては、成長、微生物による特定の代謝産物の生成を支持し、ｐＨを変化させ、標的代謝産物を濃縮し、殺虫効果を高め、及びそれらの組み合わせを支持し得る当技術分野で公知の物質が挙げられる。例示的な添加剤としては、炭素源、窒素源、リン源、無機塩、有機酸、増殖培地、ビタミン、ミネラル、酢酸、アミノ酸などが挙げられる。
適切な炭素源の例としては、限定するものではないが、デンプン、ペプトン、酵母エキス、アミノ酸、糖、例えば、スクロース、グルコース、アラビノース、マンノース、グルコサミン、マルトース、サトウキビ、アルファルファ抽出物、糖蜜、ラムなど；有機酸、例えば、酢酸、フマル酸、アジピン酸、プロピオン酸、クエン酸、グルコン酸、リンゴ酸、ピルビン酸、マロン酸などの塩；エタノール、グリセロールなどのアルコール；オイルまたは油脂、例えば、ダイズ油、米ぬか油、オリーブ油、コーン油、及びゴマ油が挙げられる。添加される炭素源の量は、炭素源の種類によって異なり、通常、培地１リットルあたり１～１００グラムである。組成物中の炭素源の重量分率は、組成物の総重量の約９８％以下、約９５％以下、約９０％以下、約８５％以下、約８０％以下、約７５％以下、約７０％以下、約６５％以下、約６０％以下、約５５％以下、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約２％、または約１％以下であり得る。好ましくは、アルファルファは、約１～２０％（ｗ／ｖ）の濃度で、主要な炭素源として培地に含まれる。より好ましくは、アルファルファは、約５～１２％（ｗ／ｖ）の濃度である。
適切な窒素源の例としては、限定するものではないが、アミノ酸、酵母抽出物、アルファルファ抽出物、トリプトン、牛肉抽出物、ペプトン、硝酸カリウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、アンモニア、またはそれらの組み合わせが挙げられる。窒素源の量は、窒素源によって異なり、通常、培地１リットルあたり０．１～３０グラムである。組成物中の窒素源の重量分率は、組成物の総重量の約９８％以下、約９５％以下、約９０％以下、約８５％以下、約８０％以下、約７５％以下、約７０％以下、約６５％以下、約６０％以下、約５５％以下、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約２％、または約１％以下であり得る。
適切な無機塩の例としては、限定するものではないが、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸水素二ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、硫酸第二鉄、硫酸第一鉄、塩化第二鉄、塩化第一鉄、硫酸マンガン、塩化マンガン、硫酸亜鉛、塩化亜鉛、硫酸第二銅、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、及びそれらの組み合わせが挙げられる。組成物中の無機塩の重量分率は、組成物の総重量の約９８％以下、約９５％以下、約９０％以下、約８５％以下、約８０％以下、約７５％以下、約７０％以下、約６５％以下、約６０％以下、約５５％以下、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約２％、または約１％以下であり得る。
いくつかの態様では、本開示の組成物は、酢酸またはカルボン酸をさらに含み得る。適切な酢酸としては、限定するものではないが、ホルミン酸、酢酸、プロピオン酸、ブタン酸、イソ酪酸、３－メチルブタン酸、酢酸メチル酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル、酢酸イソブチル、及び酢酸２－メチルブチルを含む、任意の当技術分野で公知のものが挙げられる。いくつかの態様では、酢酸は、酢を用いることによって含まれる。組成物中の酢酸の重量分率は、組成物の総重量の約９８％以下、約９５％以下、約９０％以下、約８５％以下、約８０％以下、約７５％以下、約７０％以下、約６５％以下、約６０％以下、約５５％以下、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約２％、または約１％以下であり得る。
いくつかの態様では、本明細書に開示される組成物は、凍結されてもよい。本開示の組成物は、液体であっても、または乾燥形態であってもよい。いくつかの態様では、本明細書に開示される組成物は、固体であってもよい。いくつかの態様では、本明細書に開示される組成物は、液体であってもよい。いくつかの態様では、この組成物は、水性懸濁液の成分を含んでもよい。この水性懸濁液は、適用前に希釈される濃縮原液として提供されてもよいし、またはすぐに使用できる希釈溶液として提供されてもよい。また、組成物は、粉末、顆粒、粉塵、ペレットまたはコロイド状濃縮物であってもよい。このような乾燥形態は、湿潤するとすぐに溶解するように、または徐放性、持続放出性、もしくは他の時間依存的方式で溶解するように処方されてもよい。また、この組成物は、効果的であるために湿潤または溶解に依存しない乾燥形態であってもよい。
いくつかの態様では、本開示の組成物は、少なくとも１つの任意の賦形剤を含み得る。適切な賦形剤の非限定的な例としては、抗酸化剤、添加剤、希釈剤、結合剤、充填剤、緩衝剤、ミネラル塩、ｐＨ調整剤、崩壊剤、分散剤、香味剤、栄養剤、膠質浸透圧剤、安定剤、防腐剤、嗜好性増強剤及び着色剤が挙げられる。組み合わせを形成するために利用される賦形剤の量及び種類は、科学の公知の原理に従って選択され得る。
いくつかの態様では、賦形剤は、少なくとも１つの希釈剤を含み得る。適切な希釈剤の非限定的な例としては、微結晶性セルロース（ＭＣＣ）、セルロース誘導体、セルロース粉末、セルロースエステル（すなわち、酢酸塩及び酪酸塩混合エステル）、エチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、リン酸化コーンスターチ、アルファ化コーンスターチ、コメデンプン、ジャガイモデンプン、タピオカデンプン、デンプン－ラクトース、デンプン－炭酸カルシウム、デンプングリコール酸ナトリウム、グルコース、フルクトース、ラクトース、ラクトース一水和物、スクロース、キシロース、ラシトール、マンニトール、マリトール、ソルビトール、キシリトール、マルトデキストリン、及びトレハロースが挙げられる。
いくつかの態様では、この賦形剤は、結合剤を含み得る。好適な結合剤としては、限定するものではないが、デンプン、アルファ化デンプン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、ポリアクリルアミド、ポリビニルオキソアゾリドン、ポリビニルアルコール、Ｃ１２－Ｃ１８ 脂肪酸アルコール、ポリエチレングリコール、ポリオール、糖類、オリゴ糖類、ポリペプチド類、オリゴペプチド類、及びそれらの組み合わせが挙げられる。
いくつかの態様では、賦形剤は、充填剤を含んでもよい。適切な充填剤としては、限定するものではないが、炭水化物、無機化合物、及びポリビニルピロリドンが挙げられる。非限定的な例として、充填剤は、二塩基性及び三塩基性の両方の硫酸カルシウム、デンプン、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、微結晶性セルロース、二塩基性リン酸カルシウム、炭酸マグネシウム、酸化マグネシウム、ケイ酸カルシウム、タルク、化工デンプン、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールであってもよい。
いくつかの態様では、この賦形剤は、緩衝剤を含んでもよい。適切な緩衝剤の代表的な例としては、限定するものではないが、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＡＰＳ、ビシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、トリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、ＴＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＥＳ、トリス緩衝液または緩衝生理食塩水（例えば、トリス緩衝生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水）が挙げられる。
いくつかの態様では、賦形剤は、崩壊剤を含んでもよい。好適な崩壊剤としては限定するものではないが、デンプン、例えば、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、それらのアルファ化デンプン及び化工デンプン、甘味剤、クレー、例えば、ベントナイト、微晶質セルロース、アルギン酸塩、デンプングリコール酸ナトリウム、増粘剤、例えば、寒天、グアー、ローカストビーン、カラヤ、ペクチン、及びトラガカントが挙げられる。
いくつかの態様では、賦形剤は、分散増強剤を含んでもよい。適切な分散剤としては、限定するものではないが、デンプン、アルギン酸、ポリビニルピロリドン、グアーガム、カオリン、ベントナイト、精製木質セルロース、デンプングリコール酸ナトリウム、イソアモルファスケイ酸塩、及び微結晶性セルロースが挙げられる。
いくつかの態様では、賦形剤は、潤滑剤を含んでもよい。適切な潤滑剤の非限定的な例としては、タルクまたはシリカなどの鉱物；及び脂肪、例えば、植物性ステアリン、ステアリン酸マグネシウム、またはステアリン酸が挙げられる。
組成物中の賦形剤（複数可）の重量分率は、組成物の総重量の約９８％以下、約９５％以下、約９０％以下、約８５％以下、約８０％以下、約７５％以下、約７０％以下、約６５％以下、約６０％以下、約５５％以下、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約２％、または約１％以下であり得る。
いくつかの態様では、本開示の組成物は、室温で安定である。
いくつかの態様では、コンソーシアムは、生きている微生物の生存能力を有意に損なうことなく、貯蔵及び輸送のために低温に保たれ得る。コンソーシアムまたはそれを含む組成物は、冷蔵しても、冷凍しても、または凍結乾燥してもよい。組成物は、３２°Ｆ～４４°Ｆの間で冷蔵してもよい。
いくつかの態様では、コンソーシアムまたはそれを含む組成物は、凍結状態で貯蔵及び輸送され得る。生きている有益な微生物は、一旦、組成物が解凍されて周囲温度にされると、好ましくは曝気及び／または攪拌により、迅速に再活性化され得る。
いくつかの態様では、コンソーシアムは凍結乾燥されてもよい。コンソーシアムは最初に凍結される。次いで、水は真空下で修正物が除去される。このプロセスは、保管及び輸送のための組成物の重量をさらに減らす。同じものを含む組成物のコンソーシアムは、適用または投与の前に再構成及び再活性化され得る。
いくつかの態様では、濃縮されたコンソーシアム、またはそれを含む組成物は、適用または投与の前に水で希釈してもよい。希釈された組成物は、生存能力を失うことなく、長期間、例えば、３０日まで保存され得る。生きている有益な微生物を実質的に好気性の状態に維持するために、本開示の希釈された組成物中の溶存酸素は、好ましくは、最適なレベルに保たれる。ゆっくりと曝気しながら、希釈した組成物に最適な量の酸素を供給することが好ましい。
いくつかの態様では、本明細書に開示される任意の組成物を、粉末、顆粒、すぐに使用できる飲料、食品バー、押し出し形態、カプセル、ゲルカプセル、及び分散性錠剤からなる群より選択される形態で投与してもよい。
寄託情報。本明細書に開示されている細菌ＸＸＸの寄託は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ２０１１０－２２０９で行われる。寄託日は＿＿＿＿＿＿であり、寄託された細菌ＸＸＸのアクセッション番号はＡＴＣＣアクセッション番号－－－－－－－－である。寄託に関する全ての制限が解除され、寄託は米国特許規則第１．８０１－１．８０９条の全ての要件を満たすことを目的としている。寄託物は、３０年間、または最後の請求から５年間、または特許の有効期間のいずれか長い方の期間、寄託機関に保持され、その期間中に必要に応じて交換される。
方法
本明細書には、対象における微生物叢の相対量を変化させる方法が開示される。いくつかの態様では、この方法は、本明細書に開示される任意の組成物の有効量を対象に投与し、それにより、その対象における微生物叢の相対的存在量を変化させるすることを含み得る。いくつかの態様では、この方法は、配列番号１、２、３、及び４を含む１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を有する細菌の２つ以上の株を含む組成物の有効用量を対象に投与し、それにより、その対象における微生物叢の相対量を変更することを含み得る。いくつかの態様では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ菌の相対量を増大し得る。いくつかの態様では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ菌の相対量を置き換え得る。いくつかの態様では、本明細書に開示される組成物は、不均衡な微生物叢（または機能不全の微生物叢もしくは機能的多様性が低下している微生物叢）に関連する疾患または障害を有する対象の微生物叢を置き換え得る。
本明細書には、対象における微生物叢の相対量を変化させる方法が開示される。いくつかの態様では、この方法は、本明細書に開示される任意の組成物の有効量を対象に投与し、それにより、その対象における微生物叢の相対的存在量を変化させるすることを含み得る。いくつかの態様では、この方法は、配列番号１、２、３、及び４を含む１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を有する細菌の２つ以上の株を含む組成物の有効用量を対象に投与し、それにより、その対象における微生物叢の相対量を変更することを含み得る。いくつかの態様では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ菌の相対量を増大し得る。いくつかの態様では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ菌の相対量を置き換え得る。いくつかの態様では、本明細書に開示される組成物は、不均衡な微生物叢（または機能不全の微生物叢もしくは機能的多様性が低下している微生物叢）に関連する疾患または障害を有する対象の微生物叢を置き換え得る。
微生物叢を変更する方法はまた、対象からの試料中の１つ以上の微生物叢の相対的存在量を測定することを含み得る。本明細書で使用される場合、「相対量」という用語は、定義された場所または群落内の他の生物体と比較したある生物体の共通性または希少性を指す。例えば、相対量は、試料内の生物体の総存在量と比較して、特定の生物体の存在を一般的に測定することによって決定され得る。
微生物叢の相対量は、直接的に測定してもよいし、または間接的に測定してもよい。直接測定には、培養ベースの方法が含まれ得る。間接的な測定としては、試料全体に関連して、生物体または生物体の群に特異的なリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子配列などの同一性の分子指標の有病率を比較することが含まれ得る。例えば、盲腸試料から得られたｒＲＮＡ遺伝子配列の総数におけるＤｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉａに特異的なｒＲＮＡの比率を使用して、盲腸試料中のＤｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉａの相対量を決定し得る。
本明細書で使用される場合、「微生物叢」という用語は、生物体の胃腸管内で見出され得る、または存在し得る（コロニーを形成する）１つ以上の細菌群落を指すために使用される。複数の微生物叢を指す場合、その微生物叢は同じタイプ（株）であってもよいし、分類群の混合物であってもよい。いくつかの態様では、本明細書に開示される方法及び組成物は、対象の胃腸管におけるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍなどの属由来の微生物叢の相対量を変更する。微生物叢の相対量は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍなどの属由来の微生物叢を含む医薬組成物、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍなどの属由来の微生物叢の相対量を実質的に増大させるか、もしくはそのようなＤｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏｎａｌｅｓ由来の微生物叢の相対存在量を実質的に減少させる化合物を投与することによって変更され得る。
いくつかの態様では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａの相対量は、少なくとも約５％対象で増大され得る。いくつかの態様では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａの相対量は、少なくとも約１０％対象で増大され得る。いくつかの態様では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａの相対量は、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、または１０％対象で増大され得る。いくつかの態様では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａの少なくとも１つの種の相対量は、５％増大され得る。
いくつかの態様では、本明細書に開示される方法は、対象に第２の治療薬を投与することをさらに含み得る。いくつかの態様では、第２の治療剤は、１つ以上のバクテリオファージであってもよい。いくつかの態様では、１つ以上のバクテリオファージは、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏを特異的に標的にして殺滅し得る。いくつかの態様では、第２の治療剤は、肥満、ＩＩ型糖尿病、及び／または炎症性腸疾患を治療するために投与され得る１つ以上の市販の治療剤であり得る。いくつかの態様では、第２の治療剤は、抗炎症剤であり得る。
本明細書には、肥満の対象を治療する方法が開示される。いくつかの態様では、この方法は、本明細書に開示される任意の組成物を対象に投与することであって、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａの相対量が、投与前の相対量と比較して対象において増大されることを含み得る。いくつかの態様では、この方法は、配列番号１、２、３、及び４を含む１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を有する細菌の２つ以上の株を含む組成物を対象に投与することを含み、ここでＣｌｏｓｔｒｉｄｉａの相対量が、投与前の相対量と比較して、その対象において増大される。
本明細書に開示するのは、メタボリックシンドロームを有する対象を治療する方法である。いくつかの態様では、この方法は、本明細書に開示される任意の組成物を対象に投与することであって、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａの相対量が、投与前の相対量と比較して対象において増大されることを含み得る。いくつかの態様では、この方法は、配列番号１、２、３、及び４を含む１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を有する細菌の２つ以上の株を含む組成物を対象に投与することであって、ここでＣｌｏｓｔｒｉｄｉａの相対量が、投与前の相対量と比較して、その対象において増大されることを含み得る。
本明細書には、過敏性腸症候群を有する対象を治療する方法が開示される。いくつかの態様では、この方法は、本明細書に開示される任意の組成物を対象に投与することであって、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａの相対量が、投与前の相対量と比較して対象において増大されることを含み得る。いくつかの態様では、この方法は、配列番号１、２、３、及び４を含む１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を有する細菌の２つ以上の株を含む組成物を対象に投与することであって、ここでＣｌｏｓｔｒｉｄｉａの相対量が、投与前の相対量と比較して、その対象において増大されることを含み得る。
本明細書に開示するのは、対象の体重増加を軽減する方法である。いくつかの態様では、この方法は、本明細書に開示される任意の組成物を対象に投与することであって、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａの相対量が、投与前の相対量と比較して対象において増大されることを含み得る。いくつかの態様では、この方法は、配列番号１、２、３、及び４を含む１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を有する細菌の２つ以上の株を含む組成物を対象に投与することであって、ここでＣｌｏｓｔｒｉｄｉａの相対量が、投与前の相対量と比較して、その対象において増大されることを含み得る。
本明細書に開示するのは、対象の小腸において脂肪吸収を阻害する方法である。いくつかの態様では、この方法は、本明細書に開示される任意の組成物を対象に投与することであって、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａの相対量が、投与前の相対量と比較して対象において増大されることを含み得る。いくつかの態様では、この方法は、配列番号１、２、３、及び４を含む１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を有する細菌の２つ以上の株を含む組成物を対象に投与することであって、ここでＣｌｏｓｔｒｉｄｉａの相対量が、投与前の相対量と比較して、その対象において増大されることを含み得る。いくつかの態様では、本明細書に開示される組成物のいずれも、１つ以上の脂質吸収及び／または合成遺伝子を抑制し得る。いくつかの態様では、脂質吸収遺伝子は、ＣＤ３６、ＦａｓＮ、Ｄｇａｔ、Ｓｒｅｐｂｆ１、ＳＬＣ２７ａ１、及びＳＬＣ２７ａ４であり得る。
本明細書には、対象の肝臓においてＣＤ３６を下方制御する方法が開示される。いくつかの態様では、この方法は、本明細書に開示される任意の組成物を対象に投与することであって、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａの相対量が、投与前の相対量と比較して対象において増大されることを含み得る。いくつかの態様では、この方法は、配列番号１、２、３、及び４を含む１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を有する細菌の２つ以上の株を含む組成物を対象に投与することであって、ここでＣｌｏｓｔｒｉｄｉａの相対量が、投与前の相対量と比較して、その対象において増大されることを含み得る。
本明細書に開示するのは、対象の脂肪症を軽減する方法である。いくつかの態様では、この方法は、本明細書に開示される任意の組成物を対象に投与することであって、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａの相対量が、投与前の相対量と比較して対象において増大されることを含み得る。いくつかの態様では、この方法は、配列番号１、２、３、及び４を含む１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を有する細菌の２つ以上の株を含む組成物を対象に投与することであって、ここでＣｌｏｓｔｒｉｄｉａの相対量が、投与前の相対量と比較して、その対象において増大されることを含み得る。
本明細書に開示するのは、対象の体重増加を軽減する方法である。いくつかの態様では、この方法は、本明細書に開示される任意の組成物を対象に投与することであって、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａの相対量が、投与前の相対量と比較して対象において増大されることを含み得る。いくつかの態様では、この方法は、配列番号１、２、３、及び４を含む１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を有する細菌の２つ以上の株を含む組成物を対象に投与することであって、ここでＣｌｏｓｔｒｉｄｉａの相対量が、投与前の相対量と比較して、その対象において増大されることを含み得る。
本明細書に開示するのは、対象の脂肪蓄積を軽減する方法である。いくつかの態様では、この方法は、本明細書に開示される任意の組成物を対象に投与することであって、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａの相対量が、投与前の相対量と比較して対象において増大されることを含み得る。いくつかの態様では、この方法は、配列番号１、２、３、及び４を含む１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を有する細菌の２つ以上の株を含む組成物を対象に投与することであって、ここでＣｌｏｓｔｒｉｄｉａの相対量が、投与前の相対量と比較して、その対象において増大されることを含み得る。
本明細書では、対象において体脂肪率を低下させる、及び／または内臓脂肪組織（ＶＡＴ）量を低減する方法が開示される。いくつかの態様では、この方法は、本明細書に開示される任意の組成物を対象に投与することであって、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａの相対量が、投与前の相対量と比較して対象において増大されることを含み得る。いくつかの態様では、この方法は、配列番号１、２、３、及び４を含む１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を有する細菌の２つ以上の株を含む組成物を対象に投与することであって、ここでＣｌｏｓｔｒｉｄｉａの相対量が、投与前の相対量と比較して、その対象において増大されることを含み得る。
本明細書では、対象において血糖値を低下させる、及び／またはインスリン抵抗性を低下させる方法が開示される。いくつかの態様では、この方法は、本明細書に開示される任意の組成物を対象に投与することであって、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａの相対量が、投与前の相対量と比較して対象において増大されることを含み得る。いくつかの態様では、この方法は、配列番号１、２、３、及び４を含む１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を有する細菌の２つ以上の株を含む組成物を対象に投与することであって、ここでＣｌｏｓｔｒｉｄｉａの相対量が、投与前の相対量と比較して、その対象において増大されることを含み得る。
いくつかの態様では、本明細書で開示される任意の方法において、対象は、治療が必要であると特定されている。いくつかの態様では、対象は、肥満、メタボリックシンドローム、インスリン欠乏、インスリン抵抗性関連障害、耐糖能異常、糖尿病、または炎症性腸疾患を有する。いくつかの態様では、炎症性腸疾患は、クローン病であっても、または潰瘍性大腸炎であってもよい。いくつかの態様では、インスリン抵抗性関連障害は、糖尿病、高血圧、脂質異常症、または心血管疾患であってもよい。いくつかの態様では、糖尿病はＩ型糖尿病であり得る。いくつかの態様では、糖尿病はＩＩ型糖尿病であり得る。
本明細書で使用される場合、「代謝障害」または「メタボリックシンドローム」という用語は、異常な体重増加、エネルギーの使用または消費、摂取栄養もしくは内因性の栄養素、エネルギー源、ホルモンもしくは体内の他のシグナル伝達分子に対する反応の変化、または炭水化物、脂質、タンパク質、核酸、もしくはそれらの組み合わせの代謝の変化によって引き起こされるか特徴付けられる障害、疾患及び状態を指す。代謝障害は、代謝経路の不足または過剰のいずれかに関連しており、核酸、タンパク質、脂質、及び／または炭水化物の代謝の不均衡をもたらす。代謝に影響を与える要因としては、限定するものではないが、内分泌（ホルモン）制御系（例えば、インスリン経路、ＧＬＰ－１、ＰＹＹなどを含む腸内分泌ホルモン）、神経制御系（例えば、ＧＬＰ－１または他の神経伝達物質または脳内の調節タンパク質）などが挙げられる。いくつかの非限定的な例は、肥満、ＩＩ型糖尿病を含む糖尿病、インスリン欠乏症、インスリン抵抗性、インスリン抵抗性関連障害、耐糖能異常、症候群Ｘ、炎症性及び免疫障害、骨関節炎、脂質異常症、メタボリックシンドローム、非アルコール性脂肪肝、異常な脂質代謝、がん、神経変性障害、睡眠時無呼吸、高血圧、高コレステロール、アテローム発生性脂質異常症、高脂血症状態、例えば、アテローム性動脈硬化症、高コレステロール血症、及び哺乳類における他の冠状動脈疾患、ならびに他の代謝障害であり得る。
挙げられる障害とはまた、発生するか、または一緒にクラスター化する状態であり、心臓病、脳卒中、糖尿病、及び肥満のリスクを高める。血圧の上昇、インスリンレベルの上昇、腰の周りの過剰な体脂肪、またはコレステロール値の異常など、これらの状態の１つだけが発生しても、上記の疾患のリスクが上昇し得る。組み合わせて、冠状動脈性心臓病、脳卒中、インスリン抵抗性症候群、及び糖尿病のリスクはさらに高くなる。
いくつかの態様では、本明細書に開示される任意の組成物を投与するステップは、組成物を対象の少なくとも胃、小腸、または大腸に送達することを含み得る。いくつかの態様では、この組成物は、経口的に投与されてもよい。
いくつかの態様では、この対象は、ヒトであってもよい。
いくつかの態様では、このコンソーシアムの細胞は活性である。
キット
いくつかの態様では、対象の脂肪症を軽減し、対象の体重増加及び／または脂肪蓄積を減らし、対象の体脂肪率を下げる、及び／または対象の内臓脂肪組織（ＶＡＴ）量を減らし、血糖値を下げる、及び／または、対象のインスリン抵抗性を低下させ、対象の小腸での脂質吸収を阻害し、対象の肝臓でＣＤ３６を下方制御し、ならびに対象の腸上皮内での脂質吸収遺伝子の発現を抑制し得る１つ以上の細菌、菌株または微生物を備えるキットが開示される。
いくつかの態様では、対象の脂肪症を軽減し、対象の体重増加及び／または脂肪蓄積を減らし、対象の体脂肪率を下げる、及び／または対象の内臓脂肪組織（ＶＡＴ）量を減らし、血糖値を下げる、及び／または、対象のインスリン抵抗性を低下させ、対象の小腸での脂質吸収を阻害し、対象の肝臓でＣＤ３６を下方制御し、ならびに対象の腸上皮内での脂質吸収遺伝子の発現を抑制し得る１つ以上の細菌、菌株または微生物を備えるキットが開示される。
実施例１：微生物叢のＴ細胞媒介調節は、肥満を防ぐ。
要約：微生物叢は、宿主の代謝及び肥満に影響を及ぼすが、疾患から保護する生物は不明なままである。微生物叢の組成を調節する免疫経路を調査する研究中に、微生物叢によって引き起こされる加齢に伴うメタボリックシンドロームの発症が観察された。Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏの増殖及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉａの喪失は、このモデルの肥満に関連する重要な特徴であり、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａの交換は肥満を救済する。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａの喪失及びＤｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏの増殖を防ぐために、Ｔ細胞依存性の事象が必要であった。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａの不適切なＩｇＡ標的化及びＤｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏの増大は、有益なＣｌｏｓｔｒｉｄｉａのコロニー形成に拮抗した。転写及び代謝分析により、肥満宿主における脂質吸収の増強が明らかになった。Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏでは違うが、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａによる無菌動物のコロニー形成は、脂質吸収を制御する遺伝子の発現を下方制御し、肥満症を軽減させた。さらに、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａの上清は、腸上皮内の脂質吸収遺伝子の発現を抑制した。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａの減少及びＤｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏの増加は、メタボリックシンドローム及び肥満のヒトに見られる微生物叢の特徴であった。したがって、微生物叢の免疫制御は、脂質代謝を抑制して代謝欠陥を防ぐように機能する有益な微生物集団を維持しているように見える。
要約：微生物叢は、宿主の代謝及び肥満に影響を及ぼすが、疾患から保護する生物は不明なままである。微生物叢の組成を調節する免疫経路を調査する研究中に、微生物叢によって引き起こされる加齢に伴うメタボリックシンドロームの発症が観察された。Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏの増殖及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉａの喪失は、このモデルの肥満に関連する重要な特徴であり、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａの交換は肥満を救済する。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａの喪失及びＤｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏの増殖を防ぐために、Ｔ細胞依存性の事象が必要であった。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａの不適切なＩｇＡ標的化及びＤｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏの増大は、有益なＣｌｏｓｔｒｉｄｉａのコロニー形成に拮抗した。転写及び代謝分析により、肥満宿主における脂質吸収の増強が明らかになった。Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏでは違うが、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａによる無菌動物のコロニー形成は、脂質吸収を制御する遺伝子の発現を下方制御し、肥満症を軽減させた。さらに、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａの上清は、腸上皮内の脂質吸収遺伝子の発現を抑制した。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａの減少及びＤｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏの増加は、メタボリックシンドローム及び肥満のヒトに見られる微生物叢の特徴であった。したがって、微生物叢の免疫制御は、脂質代謝を抑制して代謝欠陥を防ぐように機能する有益な微生物集団を維持しているように見える。
序論。過去１世紀にわたって、肥満及びメタボリックシンドロームは、世界的な大流行に発展した。現在、１９億人以上が肥満であり、ＩＩ型糖尿病、心血管疾患、及び肝疾患などの代謝機能障害を発症するリスクがある（Ｄ．Ｍｏｚａｆｆａｒｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １３１，ｅ２９－３２２（２０１５））。複数の研究で、代謝性疾患の免疫系調節の役割を強調している。これらの報告は、主に肥満時の炎症反応の役割に焦点を当てている。彼らは、体重増加中の脂肪組織内のマクロファージ浸潤の増大及び制御性Ｔ細胞の減少を報告した（Ｍ．Ｆ．Ｇｒｅｇｏｒ，及びＧ．Ｓ．Ｈｏｔａｍｉｓｌｉｇｉｌ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２９，４１５－４４５（２０１１）；ならびにＦ．Ｅｍａｎｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ２０１２，４７６３８０（２０１２））。しかし、多くのヒトでの研究によって、次善の免疫応答もメタボリックシンドローム及び肥満に関連していることが示唆されている。確かに、肥満の成人は、免疫化に対する免疫応答の不足、感染の発生率の増大、及び粘膜ＩｇＡレベルの低下を示し、これらの個人内で効果的な免疫を確立できないことを示唆している（Ａ．Ｐａｌｌａｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｕｔｒ Ｂｉｏｃｈｅｍ １３，５３９（２００２）；Ａ．Ｍｕｓｔ ｅｔ ａｌ．，ＪＡＭＡ ２８２，１５２３－１５２９（１９９９）；Ｄ．Ｃ．Ｎｉｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｄｉｅｔ Ａｓｓｏｃ ９９，２９４－２９９（１９９９）；Ｄ．Ｎ．ＭｃＭｕｒｒａｙ，Ｐ．Ａ．Ｂｅｓｋｉｔｔ，Ｓ．Ｒ．Ｎｅｗｍａｒｋ，Ｉｎｔ Ｊ Ｏｂｅｓ ６，６１－６８（１９８２）；Ｊ．Ｈｉｒｏｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，２３５，９４－９８（１９９７）；ａｎｄ Ｓ．Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｏｂｅｓ Ｒｅｌａｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓｏｒｄ １７，６３１－６３６（１９９３））。欠陥のある免疫反応が代謝性疾患に影響を与える機構は不明なままである。
微生物叢は哺乳類宿主内の代謝の重要な調節因子として浮上しており、肥満の個体の微生物叢の組成は、動物に移されたときに代謝障害を与えるのに十分である（Ｐ．Ｊ．Ｔｕｒｎｂａｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４４４，１０２７－１０３１（２００６））。特に、微生物叢の遺伝子の豊富さの減少は、酪酸及びメタンの生成の減少を含む、代謝性疾患の間に報告されている。逆に、硫化水素及び粘液分解などの一部の微生物叢機能は、代謝性疾患のある個人で強化される（Ｊ．Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４９０，５５－６０（２０１２））。最近、腸の免疫応答が微生物叢の組成を調節するのに重要であることが示された（Ｊ．Ｌ．Ｋｕｂｉｎａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ １７，１５３－１６３（２０１５）；及びＳ．Ｋａｗａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４１，１５２－１６５（２０１４））。特にＩｇＡは、特定の微生物の増殖を抑制し、微生物叢を多様化するように機能する。微生物のＩｇＡ結合の変化、または腸のＩｇＡのわずかな減少でさえ、多様性に悪影響を与え得る（Ｊ．Ｌ．Ｋｕｂｉｎａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ １７，１５３－１６３（２０１５）；Ｓ．Ｋａｗａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４１，１５２－１６５（２０１４）；及びＳ．Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４３，２８９－３０３（２０１５））。したがって、微生物叢の免疫制御の欠陥は、代謝性疾患の一因となり得る。
結果。最近、微生物叢のＴ細胞依存性ＩｇＡ標的化の適切な開発を指示する分子経路が特定された。先天性アダプター分子であるＭｙｄ８８（Ｔ－Ｍｙｄ８８-/-マウス）のＴ細胞特異的除去を有する動物は、腸内での濾胞性ヘルパーＴ（ＴＦＨ）細胞の発達及びＩｇＡ産生に欠陥がある。これは、腸内微生物の調節不全のＩｇＡ標的化、及び遺伝子型間の微生物叢内の組成の違いに関連していた（Ｊ．Ｌ．Ｋｕｂｉｎａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ １７，１５３－１６３（２０１５）；及びＳ．Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４３，２８９－３０３（２０１５））。これらの研究中、より古いＴ－Ｍｙｄ８８-/-マウスは、野生型対照と比較して一貫して肥満であることが観察された（図１Ａ）。標準的な固形飼料を与えられたにもかかわらず、Ｔ－Ｍｙｄ８８-/-マウスは、加齢とともに体重増加と脂肪蓄積の有意な増大を示した（図１Ｂ及び図１Ｃならびに図７Ａ及び図７Ｂ）。１歳までに、オスのＴ－Ｍｙｄ８８-/-マウスの体重は６０ｇまで増量し、ＮＭＲ分析に基づいて５０％の体脂肪組成を示した（図１Ｄ及び図１Ｅ）。
Ｔ－Ｍｙｄ８８-/-動物は、ヒトに見られる代謝性疾患の併存疾患の多くを発症した（Ｆ．Ｘ．Ｐｉ－Ｓｕｎｙｅｒ，Ｍｅｄ Ｓｃｉ Ｓｐｏｒｔｓ Ｅｘｅｒｃ ３１，Ｓ６０２－６０８（１９９９））。標準食で飼育された１歳齢のＴ－Ｍｙｄ８８-/-マウスは、そのＷＴ（野性型）対応動物と同様のレベルまでグルコースを除去したが（図７Ｃ）、循環インスリンのレベルが高く、ＨＯＭＡ－ＩＲ指数が高くなった（図１Ｆ及び図１Ｇ）。さらに、追加のインスリンでチャレンジした場合、Ｔ－Ｍｙｄ８８-/-マウスは、ＷＴ（野性型）動物と同様の動態でグルコースを除去できず、インスリン抵抗性の発症を示している（図１Ｈ）。食物摂取量は、ＷＴ（野性型）対照と比較して２か月齢のＴ－Ｍｙｄ８８-/-マウスで減少したが、１歳齢の動物では同等であった（図７Ｄ及び図７Ｅ）。さらに、若いマウスではエネルギー消費量が減少したが、これらの変化は時間の経過とともに持続しなかった（図７Ｄ）。運動もＷＴ（野性型）とＴ－Ｍｙｄ８８-/-マウスとの間で両方の年齢で類似しており、熱産生の適度な増加が、ＷＴコントロールと比較して高齢のＴ－ＭｙＤ８８-/-マウスで測定され、これらによって、他のモデルで見られるような体重増加の主な原因ではないことが示唆されている（図７Ｆ及び図７Ｇ）（Ｍ．Ｖｉｊａｙ－Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２８，２２８－２３１（２０１０））。Ｔ－Ｍｙｄ８８-/-マウスも脂肪肝疾患を発症し、脂肪組織内に炎症性の表現型を示し、これは、冠状構造及び調節不全の脂肪細胞の大きさによって特徴付けられた（図１Ｉ）。標準的なマウスの固形飼料での肥満は、発症するのに数か月を要する。対照的に、動物に高脂肪食（ＨＦＤ、４５％脂肪）を与えた場合、Ｔ－Ｍｙｄ８８-/-動物は、食餌療法開始後早ければ８週間でも、ＷＴマウスよりも多くの体重及び内臓脂肪組織（ＶＡＴ）の質量を蓄積した（図１Ｊ及び図８Ａ及びＢ）。したがって、Ｔ－Ｍｙｄ８８-/-動物は、メタボリックシンドローム及び肥満を発症する傾向があり、これは食餌の脂肪の摂取量の増加によって加速され得る。
Ｔ－Ｍｙｄ８８-/-微生物叢の組成は、若い動物のＷＴとは異なる（Ｊ．Ｌ．Ｋｕｂｉｎａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ １７，１５３－１６３（２０１５））。微生物叢とは、代謝機能の公知の原因因子であり、ヒトの肥満の発症と関連している（Ｓ．Ｕｓｓａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ ２２，５１６－５３０（２０１５）；及びＥ．Ｌｅ Ｃｈａｔｅｌｉｅｒ ｅｔ ｌａ．，Ｎａｔｕｒｅ ５００，５４１－５４６（２０１３））。微生物叢がＴ－Ｍｙｄ８８-/-マウスに見られるメタボリックシンドロームに関与しているか否かを最初に判断するために、ＷＴ及びＴ－Ｍｙｄ８８－マウスにＨＦＤを与えながら広域の抗生物質を与えた。ＷＴマウスは、抗生物質の体重増加に差を示さなかった。対照的に、体重増加は、Ｔ－Ｍｙｄ８８-/-動物の抗生物質治療によって完全に救済された（図２Ａ及びＢ）。これには、体脂肪率とＶＡＴ量が、痩せた動物で観察された脂肪蓄積と同様のレベルまで低下することを伴った（図２Ｃ及び図２Ｄ）。
Ｔ－Ｍｙｄ８８-/-マウスのメタボリックシンドロームに影響を与える微生物叢の特徴を特定するために、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列決定を通常の固形飼料を与えられた老齢動物で実施し、肥満Ｔ－Ｍｙｄ８８-/-マウスの微生物叢の分類学的組成及び多様性を評価した。老齢のＷＴマウス及びＴ－Ｍｙｄ８８-/-マウスの回腸及び糞便の内容物には、有意に異なる群落があった（図３Ａ及び図９Ａ）。さらに、老齢マウスの糞便では種の豊富さがわずかに減少していた（図３Ｂ）。ＷＴとＴ－Ｍｙｄ８８-/-との間の微生物叢群落の主な相違を説明し得る生物体を特定するために、１６Ｓ ｒＲＮＡデータに対してランダムフォレスト分析を実施した。糞便微生物叢は、８６％の精度で遺伝子型を正確に分類できたが、回腸微生物叢は、１００％の精度で遺伝子型を予測した。精度に最も強い影響を与えた微生物叢のメンバーは、主に幅広い分類学クラスのＣｌｏｓｔｒｉｄｉａに属し、Ｔ－Ｍｙｄ８８-/-マウスと比較してＷＴマウスに富んでいた（図３Ｃ及び図９Ｂ）。追加のランダムフォレストアプローチによって、糞便と回腸の微生物叢がそれぞれＲ2＝０．５及びＲ2＝０．７６で総重量を予測し得、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａの多くのメンバーがこの予測に強く影響することが示された（図３Ｄ及び図９Ｂ）。ＷＴマウスと比較して、Ｔ－Ｍｙｄ８８-/-マウスは、Ｄｏｒｅａ、ＳＭＢ５３、未分類のペプトストレプトコッカス科（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、及びクロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）を含む複数のクロストリジウム綱（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）分類群の多様性及び全体的な存在量の大幅な減少を示した（図９Ｃ）。
微生物の多様性の低下を含む微生物叢の組成のシフトは、その微生物叢の機能に悪影響を与える可能性があり、メタボリックシンドロームを含む多くの西洋の生活習慣病と相関している（Ｍ．Ｖｉｊａｙ－Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２８，２２８－２３１（２０１０）；及びＳ．Ｕｓｓａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ ２２，５１６－５３０（２０１５））。さらに、遺伝子の豊富さが低い微生物叢を保有する個体は、肥満である可能性が高くなる（Ｅ．Ｌｅ Ｃｈａｔｅｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５００，５４１－５４６（２０１３））。糞便及び回腸の微生物叢トランスクリプトームでは、Ｔ－Ｍｙｄ８８-/-動物内の多くの遺伝子ファミリーからの転写物の提示は一般的に減少した。１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列決定によって回腸内で同じ数の生物体が検出されたため、これによって、これらの部位の微生物叢が代謝機能を低下させたという仮説が支持される（図３Ｅ及び図１０Ａ）。２つの遺伝子型間の参照ゲノムに一意にマッピングされた全読み取りの割合が同等であることで、動物のトランスクリプトームの同じカバレッジを示唆している。ただし、Ｔ－Ｍｙｄ８８-/-マウスの回腸及び糞便トランスクリプトームのクロストリジウム科（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｃｅａｅ）参照ゲノムにマッピングされた読み取りの割合は、特に著しく減少した（図３Ｆ及び図１０Ｂ及び図１０Ｃ）。したがって、肥満動物に存在するＣｌｏｓｔｒｉｄｉａは、微生物叢への機能的寄与が低下している。さらに、肥満は、代謝性疾患を患うヒトで同様に報告されているとおり、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ内の微生物の機能的多様性の喪失と関連している（Ｊ．Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４９０，５５－６０（２０１２））。
重要なＣｌｏｓｔｒｉｄｉａ生物体の喪失が、病気の際にある役割を果たし得るので、微生物の移動が肥満を救済し得るか否かを判断するために、共同飼育実験を行った（図１１Ａ）。マウスは食糞性であるので、共同飼育によって、遺伝子型間の微生物の効率的かつ頻繁な移動が可能になり、微生物叢に対する既知の均質化効果を有する。ＷＴまたはＴ－Ｍｙｄ８８-/-動物は、同じ遺伝子型の動物と一緒に飼育されるか、離乳時に反対の遺伝子型の動物と共同飼育された。共同飼育の前に、Ｔ－Ｍｙｄ８８-/-マウスは、明確な微生物叢の組成を有しており、１週間の共同飼育は、２つの群落の混合を引き起こした（図１２Ａ）。
１週間後、動物をＨＦＤに配して、脂肪蓄積の兆候をモニターした。分離されたＷＴマウスと比較して、Ｔ－Ｍｙｄ８８-/-マウス及びそれらと共同飼育された動物は、体重が有意に増加し、インスリン抵抗性を発症し、ＶＡＴ及び総体脂肪が増大した（図４Ａ及び図１１Ｂ～図１１Ｅ）。さらに、３か月後、共同飼育されたＷＴ動物の微生物叢は、個別に飼育されたＷＴマウスとは有意に異なり、個別に飼育されたＴ－Ｍｙｄ８８-/-の微生物叢との類似性が高くなった（図１２Ｂ）。したがって、Ｔ－Ｍｙｄ８８-/-動物で形成された微生物叢の移動可能な成分は、そうでなければ健康なＷＴ動物において、メタボリックシンドロームを生じ得る。
共同飼育された動物の体重増加の相違が最初の３週間以内に検出されたので、初期と最終の両方の時点で検出可能な微生物組成の違いに焦点が当てられた。共同飼育の３か月後、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ、及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｌｏｎｇｕｍは、共飼育されたＷＴマウス内により多く存在した（図４Ｂ及び図１２Ｃ及びＤ）。しかし、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ属は、別々に飼育されたＴ－Ｍｙｄ８８-/-動物及び共同飼育された動物で、わずか１週間の共同飼育後に有意に多くの量を示した（図１２Ｅ）。Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏは、ムチン内のジスルフィド結合分解の副産物として硫化水素を生成する粘液溶解性ｄ－プロテオバクテリアである（Ｇ．Ｒ．Ｇｉｂｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．Ｍａｃｆａｒｌａｎｅ，Ｊ．Ｈ．Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，Ｊ Ａｐｐｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ ６５，１０３－１１１（１９８８）；Ｍ．Ｃ．Ｐｉｔｃｈｅｒ，Ｊ．Ｈ．Ｃｕｍｍｉｎｇｓ， Ｇｕｔ ３９，１－４（１９９６）；Ｆ．Ｅ．Ｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１０，１３５８２－１３５８７（２０１３）；及びＭ．Ｓ．Ｄｅｓａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １６７，１３３９－１３５３（２０１６））。炎症性腸疾患（ＩＢＤ）との関連に加えて、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏのコロニー形成の増加及び硫化水素産生に関連する遺伝子が、ＩＩ型糖尿病及び肥満の患者で検出される（Ｊ．Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４９０，５５－６０（２０１２））。したがって、肥満マウスの群落の変化は、人間に見られるものの多くを模倣しており、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａの喪失及びＤｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏの増加が、代謝性疾患に非常に関連していることを示唆している（Ｊ．Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４９０，５５－６０（２０１２）；Ｊ．Ｚｉｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ５０，７９０－７９５（２０１８）；ａｎｄ Ｓ．Ｍ．Ｈａｒａｋｅｈ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｃｅｌｌ Ｉｎｆｅｃｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ６，９５（２０１６））。
肥満につながるＴ－Ｍｙｄ８８-/-動物とのＷＴマウスの共同飼育は、ＷＴ動物におけるＣｌｏｓｔｒｉｄｉａのメンバーのコロニー形成の減少とも関連している（図１２Ｆ）。したがって、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏのコロニー形成がこれらの生物体の存在量を減少し得るか否かを試験した。
特定病原体除去（ＳＰＦ）マウスに、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ ｓｕｂｓｐ．ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ（マウスで同定されたＤｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏと９７％を超える１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列類似性を有する株である）を、１週間コロニー形成させた。結果は、ＷＴ ＳＰＦ動物がＣｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ目Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ科及びＤｏｒｅａ属に有意な減少があったことを示している（図４Ｃ及び図１３Ａ）。Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏによるコロニー形成は、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの有意な増加があったため、全ての生物の全体的な減少をもたらさなかった（図４Ｃ）。群落へのこれらの変化は、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏのコロニー形成の間接的な影響であり得るので、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏが無菌系のＣｌｏｓｔｒｉｄｉａメンバーのコロニー形成に影響を与え得るか否かを試験した。
クロロホルム処理した糞便スラリーでコロニー形成した無菌動物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｃｅａｅ及びＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅについて濃縮された（図１４）。次に、この群落を、Ｄ．ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓの有無のもとで分析した。Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏのコロニー形成は、遺伝子型及び体重の両方の予測精度に強く影響する属であるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍの有意な減少をもたらす（図４Ｄ）。したがって、Ｔ－Ｍｙｄ８８－/－マウス及びＩＩ型糖尿病のヒトに見られるように、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ種の拡大は、痩せに関連する微生物のコロニー形成に拮抗し得る。
本発明者らは、これらの痩せ関連微生物を再導入することで、Ｔ－Ｍｙｄ８８-/-マウス内の肥満を防ぐことができるか否かを特定しようとした。肥満になりやすいＴ－Ｍｙｄ８８-/-動物を胞子形成細菌のカクテルで隔日で治療すると、体重増加及び脂肪蓄積が有意に減少した（図４Ｅ及びＦ）。３か月の終わりに、胞子形成微生物で処理されたＴ－Ｍｙｄ８８-/-マウスは、未処理のＴ－Ｍｙｄ８８-/-マウスと比較した場合、体脂肪率が低く、ＶＡＴ量が減少した（図４Ｆ及び図４Ｇ）。したがって、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａの喪失は、Ｔ－Ｍｙｄ８８-/-マウスの肥満及びメタボリックシンドロームと因果関係がある。
腸の免疫不全の間に形成された微生物叢は、メタボリックシンドロームを引き起こすようである。動物を１２週間共同飼育すると、ＷＴ（野性型）宿主に肥満が伝染したが、Ｔ－Ｍｙｄ８８-/-からＷＴ無菌レシピエントへの糞便移植では、肥満を移すには不十分であった（図１５Ａ）。さらに、ＳＰＦＷＴまたはＴ－Ｍｙｄ８８-/-妊娠母獣のいずれかが無菌ＷＴ妊娠母獣と共同飼育された場合、離乳時に分離された、得られた、コロニー形成した子犬は、肥満の表現型を伝達しなかった（図１５Ａ）。したがって、Ｔ－Ｍｙｄ８８-/-マウスの免疫欠陥が、肥満誘発性微生物叢の持続を可能にするために必要であるか否かを試験した。対照的に、微生物叢は完全にインタクトな免疫系の存在下で適切に制御された。内因性Ｔ細胞を欠くＴｃｒｂ-’-マウスは、広域抗生物質処理により内因性微生物叢を枯渇させ、次いで、ＷＴまたはＴ－Ｍｙｄ８８-’-ＣＤ４+Ｔ細胞のいずれかの養子移入の前に、ＷＴ及びＴ－Ｍｙｄ８８-/-微生物叢の１：１混合物でコロニー形成した（図１５Ｂ）。微生物叢の形成がケージ内の他の動物の存在によって影響されないように、そして各微生物群落が独立して形成されるように、マウスを個別に収容されたケージに分けた。これらのマウスは最初に同じ微生物叢でコロニー形成されたという事実にもかかわらず、Ｔ－Ｍｙｄ８８-/-ＣＤ４+Ｔ細胞を与えられたＴｃｒｂ-’-マウスは、ＷＴ ＣＤ４+Ｔ細胞を与えられたＴｃｒｂ-’-マウスと比較して有意に体重が増えた（図５Ａ）。したがって、Ｔ細胞内のＭｙｄ８８シグナル伝達の欠陥は、動物の代謝欠陥を促進する。細菌の１０％が、Ｔｃｒｂ-’-マウス内でＩｇＡによってコーティングされており、微生物叢をＩｇＡで標的化するためのＴ細胞の重要性を示している（図３Ｂ）。しかし、Ｔ細胞移植の１週間後、ＷＴ（野性型）Ｔ細胞を与えられたマウスは、ＩｇＡ結合微生物の３倍の増大を示した（図１５Ｃ）。微生物叢に対するＩｇＧ１またはＩｇＧ３の応答は、発生に時間がかかったが、Ｔ細胞移植の８週間後に検出可能であった（図１５Ｄ～図１５Ｆ）。総ＩｇＡレベルは、この実験環境内の動物で類似していたが、微生物叢へのＩｇＡ及びＩｇＧ１の結合は、ノックアウトＴ細胞を投与された動物では欠陥があった（図５Ｂ及び図１５Ｅ及び図１５Ｇ）。Ｔ細胞非依存性の機構によって支配されていると考えられているＩｇＧ３による微生物叢の標的化は、Ｔ－Ｍｙｄ８８-/-Ｔ細胞を投与されたＴｃｒｂ-’-マウスでは欠陥がなかった（図１５Ｈ）（Ｍ．Ａ．Ｋｏｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １６５，８２７－８４１（２０１６））。微生物叢の組成は、時間の経過とともに遺伝子型間でますます異なった（図５Ｃ）。さらに、肥満誘発性マウスからＴ細胞を投与された動物の群楽の変化は、Ｔ－Ｍｙｄ８８-/-動物で観察された変化と類似している。確かに、両方の遺伝子型でＤｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅとＣｌｏｓｔｒｉｄｉａｃｅａｅとの存在量の間に有意な負の相関があった。
Ｔ－Ｍｙｄ８８-/-Ｔ細胞を投与された動物は、同じ微生物叢混合物で開始したにもかかわらず、最終的には有意に少ないＣｌｏｓｔｒｉｄｉａｃｅａｅでコロニー形成された（図５Ｄ及び図５Ｅ）。３つの分類群は、属のレベルで、ＣｌｏｓｔｒｉｄｉａのＯｓｃｉｌｌｏｓｐｉｒａ属を含むＩｇＡによって示差的に標的されたが、ほとんどのＣｌｏｓｔｒｉｄｉａ属は、このレベルの分類学的な分離で大きく変動した（図１６Ａ）。ＩｇＡ結合インデックスは、より細かいＯＴＵレベル（９７％の類似性）で評価され、Ｔ－Ｍｙｄ８８-/- Ｔ細胞を投与された動物でＩｇＡが特異的に標的とするＣｌｏｓｔｒｉｄｉａ分類ＯＴＵの富化が見られた（図５Ｆ）。Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏを標的とするＩｇＡの増加傾向が観察された（図１６Ａ及びＢ）。したがって、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａの減少及びその機能的寄与は、ＩｇＡによる不適切な標的化とＤｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏの拡大の組み合わせから生じ得る。
抗体反応が代謝障害に影響を与えるという仮説を支持するために、肥満誘発性微生物叢を、抗生物質で処理したＷＴまたはＲａｇ１-’-動物に移入した。実際、肥満誘発性微生物叢のＷＴマウスへの移入は、表現型を付与しなかったが、抗体を欠くＲａｇ１-’-動物への移入は、ＷＴ微生物叢を投与された動物と比較して有意に大きな体重増加をもたらした（図５Ｇ及び図１５Ｉ）。ＴＦＨは、胚中心のＢ細胞内で抗体クラススイッチ及び突然変異を指示するように機能するＴ細胞である。Ｔ－Ｍｙｄ８８-/-マウスのＴ細胞発達障害は、ＴＦＨ細胞内にあることが以前に確立されていた。
ＴＦＨ細胞に分化できないＢｃｌ６-’-Ｔ細胞を投与されたＴ－Ｍｙｄ８８-/-動物は、ＷＴ Ｔ細胞を投与された動物と比較して有意に体重が多かった（図５Ｈ）（Ｓ．Ｃｒｏｔｔｙ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２９，６２１－６６３（２０１１））。したがって、ＴＦＨ細胞に発達する能力を持たないＴ細胞は、肥満の表現型を救うことができない。したがって、肥満を防ぐために微生物叢を調節するには、適切なＴＦＨ細胞機能が必要である。
短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）は、宿主の代謝に影響を与える、よく研究された微生物叢依存の機構である。ただし、ＳＣＦＡの生成は、ＷＴ動物とＴ－Ｍｙｄ８８-/-動物との間で相違はなかった（図１７Ａ）。脂肪組織内で軽度の炎症を誘発する腸透過性及び細菌産物の漏出の増大も提唱されている（Ｆ．Ｅ．Ｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１０，１３５８２－１３５８７（２０１３）；及びＰ．Ｄ．Ｃａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，５６，１７６１－１７７２（２００７））。ただし、Ｔ－Ｍｙｄ８８-/-動物の血清内の細菌リガンドの相違は検出されなかった。さらに、抗炎症性の５－ＡＳＡを注入した食事にＴ－Ｍｙｄ８８-/-を配すると（Ｈ．Ｌｕｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ ２１，５２７－５４２（２０１５））、体重増加を救うことができなかった（図１７Ｂ）。肝臓のＲＮＡ－ｓｅｑ及び遺伝子セット濃縮分析（ＧＳＥＡ）により、動物に標準的なマウス飼料を与えたにもかかわらず、グリセロ脂質及びグリセロ脂質代謝を含む脂質代謝に関与する経路は、ＷＴ対照と比較して、Ｔ－Ｍｙｄ８８-/-動物内で最も有意に濃縮された経路であることが明らかになった（図６Ａ）。特に、Ｆａｓｎ、Ｄｇａｔ２、及びＳｒｅｂｐｆ１などの脂質合成に必要な遺伝子、ならびにＳｌｃ２７ａ４及びＣｄ３６などの脂質吸収に関与する遺伝子の発現は、Ｔ－Ｍｙｄ８８-/-動物の肝臓内で高度に上方制御された（図６Ｂ）。ＣＤ３６は、Ｔ－Ｍｙｄ８８-/-動物で上方制御されたが、抗生物質治療は、ＣＤ３６発現を有意に下方制御した（図６Ｃ）。さらに、肥満のＴ－Ｍｙｄ８８-/-動物のＣｌｏｓｔｒｉｄｉａ処置は、ＣＤ３６の有意な下方制御を引き起こし、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａが脂質の取り込みを減少させるように機能することを示唆している（図６Ｄ）。確かに、ノトバイオートの動物は、無菌マウスと比較した場合、肝臓のＣＤ３６発現内で有意な減少を示したＣｌｏｓｔｒｉｄｉａコンソーシアムでコロニーを形成した（図６Ｅ）。したがって、Ｔ－Ｍｙｄ８８-/-での脂質の取り込みは、微生物叢に依存した方式に見える。
無菌動物にＣｌｏｓｔｒｉｄｉａを定着させると、小腸内のＣＤ３６及びＦＡＳＮの両方が有意に下方制御され（図６Ｆ及び図６Ｇ）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａが腸内の脂質吸収と代謝に影響を与えることが示唆される。さらに、培養Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａコンソーシアムから収集された無細胞上清（ＣＦＳ）は、培養腸上皮細胞（ＩＥＣ）のＣＤ３６を有意に下方制御した（図６Ｈ）。対照的に、培養されたＤｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ種から収集されたＣＦＳは、ＩＥＣでのＣＤ３６の発現を直接上昇させた（図６Ｈ）。さらに、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａコンソーシアムに単一関連する無菌動物は、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏに単一関連する動物または無菌動物と比較して、体脂肪率の有意な減少を示した（図６Ｉ）。特に、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａコンソーシアムのみでコロニー形成した無菌マウスにＤｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏを添加すると、小腸での体脂肪率及びＣＤ３６発現が増大した（図６Ｊ及び図６Ｋ）。したがって、微生物叢は、腸上皮内の脂質代謝を直接調節し得る。
脂質吸収の増大をサポートするために、ＨＦＤを給餌されたＴ－Ｍｙｄ８８-/-は、盲腸内のいくつかの長鎖脂肪酸（ＬＣＦＡ）の有意な減少、及びそれに伴う血清の増大があった（図６Ｌ及び図６Ｍ）。内腔脂質プロファイル及び１６Ｓ配列決定の比較により、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉａのメンバーと、ＬＣＦＡ及び他の脂質の存在量との間の相反する相関関係が明らかになった。盲腸内容物内のＬＣＦＡの枯渇は、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏの存在と有意に相関していた。対照的に、ＳＭＢ５３及びＤｏｒｅａを含むＣｌｏｓｔｒｉｄｉａの複数のメンバーは、ＬＣＦＡの蓄積と関連しており（図１７Ｃ）、微生物組成が脂質吸収を調節できるという仮説をさらに支持している。したがって、肥満及び２型糖尿病の個体に見られる特定のＣｌｏｓｔｒｉｄｉａ種の喪失は、腸の吸収及び脂肪の代謝の増大につながる場合があり、健康に対する適切な微生物叢組成の重要性を強調している。
考察。微生物叢は、さまざまな自己免疫及び代謝状態に関係している。しかし、これらの疾患は必ずしも病原性生物の獲得に関連しているわけではなく、代わりに有益な種の喪失が原因因子であると提唱されている（Ｉ．Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４８８，６２１－６２６（２０１２））。有益な細菌の喪失につながる機構としては、抗生物質の使用、衛生状態の向上、及び低繊維食が挙げられる（Ｎ．Ｍ．Ｋｏｒｏｐａｔｋｉｎ，Ｅ．Ａ．Ｃａｍｅｒｏｎ，Ｅ．Ｃ．Ｍａｒｔｅｎｓ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １０，３２３－３３５（２０１２））。本明細書に記載の結果は、健康な微生物群落を維持するための別の機構が、腸内のこれらの集団の適切な免疫制御によるものであることを示している。Ｔ－Ｍｙｄ８８-/-動物内に形成された微生物叢は、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏの拡大及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉａの喪失など、ＩＩ型糖尿病及び肥満の個体に見られる腸内毒素症を反映している（Ｊ．Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４９０，５５－６０（２０１２））。包括的なヒトの研究は不足しているが、肥満及び２型糖尿病の個体は、粘膜ＩｇＡが低く、免疫化に対する反応が低下していることも報告されている。これは、これらの個体が腸内細菌叢に対して最適ではないが完全に欠乏しているわけではない免疫応答を有していることを示唆しており、これは食事の欠乏と相まって代謝性疾患につながる。これらのデータは、微生物叢のＴ細胞依存性標的化が健康な群落の維持に重要であることを示唆している。細菌のＩｇＡ結合は通常、その根絶につながると考えられているが、ＩｇＡは、特定の細菌の機能的遺伝子発現を調節し、特定の共生生物の粘膜結合を助けることさえできる（Ｇ．Ｐ．Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６０，７９５－８００（２０１８）；Ｔ．Ｃ．Ｃｕｌｌｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ １４，５７１－５８１（２０１３）；及びＤ．Ａ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｎｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ ２，３２８－３３９（２００７））／実際、この結果は、Ｔ－Ｍｙｄ８８-/-動物では、ＩｇＡのレベルが低いにもかかわらず、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ及びいくつかのＣｌｏｓｔｒｉｄｉａ種がＩｇＡコーティングの増大を示すことを示す。したがって、ＩｇＡによるＣｌｏｓｔｒｉｄｉａの不適切な標的化は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａのコロニー形成を減少させるか、または代謝機能を変化させて肥満の発症に影響を与え得る。
さらに、いくつかのＣｌｏｓｔｒｉｄｉａは、ＩｇＡの標的になりにくい。興味深いことに、ＩｇＡ欠損症の個体内の微生物叢の最近の評価では、いくつかのＣｌｏｓｔｒｉｄｉａによるコロニー形成の有意な減少が示された（Ｊ．Ｆａｄｌａｌｌａｈ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ １０，（２０１８））。したがって、ＩｇＡは、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓで示されているように、一部のＣｌｏｓｔｒｉｄｉａ種のコロニー形成を増強するようにも機能し得る（Ｇ．Ｐ．Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６０，７９５－８００（２０１８））。Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏがこのモデル及びメタボリックシンドロームの個体で拡大する機構はまだ不明である。
ただし、本明細書で説明する結果は、この拡大が、特定のＣｌｏｓｔｒｉｄｉａのメンバーのコロニー形成に直接影響を与え得ることを示しているが、これがどのように発生するかは謎のままである。腸内微生物のＩｇＡ標的化が、無菌環境でのコロニー形成及び機能にどのように影響するかを理解することで、免疫系がこの微生物の関係にどのように影響するかについての洞察が得られる場合がある。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａのメンバーがいくつかの状況でますます認識されるようになると（２４）、他の微生物によるコロニー形成及び免疫系が一緒になってＣｌｏｓｔｒｉｄｉａの機能にどのように影響するかを決定することが重要になる。
ＣＤ３６は、腸内の脂質吸収の重要な調節因子であり、その欠乏は、ＨＦＤ摂食時の肥満及びメタボリックシンドロームの発症に対する抵抗性をもたらす（Ｍ．Ｂｕｔｔｅｔ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １１，ｅ０１４５６２６（２０１６）；ａｎｄ Ｍ．Ｂｕｔｔｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ９６，３７－４７（２０１４））。ヒト肝臓内でのＣＤ３６の発現増大は、脂肪肝疾患に関連している。さらに、腸内での発現がわずか２分の１に減少する、ＣＤ３６の多型を有する個体は、代謝性疾患に耐性がある（Ｌ．Ｌｏｖｅ－Ｇｒｅｇｏｒｙ，Ｎ．Ａ．Ａｂｕｍｒａｄ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ Ｍｅｔａｂ Ｃａｒｅ １４，５２７－５３４（２０１１））。したがって、ＣＤ３６の相対的な発現レベルは、哺乳類での脂質吸収及び恒常性にとって重要である。最近の研究では、微生物叢がＣＤ３６発現の増強を通じて、腸内の脂質の宿主吸収を上方制御し得ることが実証されている（Ｙ．Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５７，９１２－９１６（２０１７））。しかし、細菌も宿主の脂質吸収を抑制し得る可能性があることが判明した。
したがって、腸内細菌は、脂質代謝を差別的に調節し得る。確かに、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏによって分泌された生成物は、ＣＤ３６の発現を上方制御するが、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａによって生成された生成物は、ＣＤ３６の発現を下方制御し得る。したがって、ＣＤ３６の発現を抑えるように機能する生物体の喪失は、脂質の不適切な吸収につながる場合があり、脂質は時間の経過とともに蓄積し得、肥満及びメタボリックシンドロームにつながる。Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉａなどの生物体の相互作用のさらなる特徴付け、ならびにＣＤ３６の発現に影響を与える分泌分子の同定は、将来の標的療法にとって情報提供する場合がある。
材料及び方法。マウス。Ｃ５７Ｂｌ／６ Ｍｙｄ８８LoxP/LoxPマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、Ｃ５７Ｂｌ／６ ＣＤ４－Ｃｒｅ動物（Ｔａｃｏｎｉｃ）と交配して、Ｍｙｄ８８+/+；ＣＤ４－Ｃｒｅ+マウス（ＷＴ）及びＭｙｄ８８LoxP/LoxP；ＣＤ４－Ｃｒｅ+（Ｔ－ＭｙＤ８８-/-）Ｍｙｄ８８＋／＋動物を作成した。年齢を一致させた雄性マウスを使用して、標準的な食餌で免疫及び微生物叢の反応を含む自発的な体重の表現型を比較した。年齢を一致させた雄性及び雌性のマウスを使用して、高脂肪食餌（ＨＦＤ）で免疫及び微生物叢の反応を含む体重の表現型を比較した。微生物叢のＴ細胞依存性の形成を測定するために、４週齢のＴｃｒｂ-/-マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用した。Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ依存性の微生物叢の形成を調査するために、６週齢のＷＴ Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）または年齢を一致させたＣＤ４－Ｃｒｅ+（ＷＴ）マウスを使用した。免疫不全マウスの体重増加に対する微生物叢の影響を測定するために、４週齢のＲａｇ１-/-マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用した。ＧＦマウスを滅菌アイソレーターで維持し、糞便のプレーティング及びＰＣＲによって、ＧＦの状態を毎月確認した。この研究では、ＧＦ Ｃ５７Ｂｌ／６動物を使用した。
胞子形成微生物によるマウスのコロニー形成。糞便ペレットを、ＷＴマウスから採取し、３％クロロホルム（ｖ／ｖ）を含む還元ＰＢＳで、嫌気性チャンバー内で３７℃で１時間インキュベートした。還元ＰＢＳ及び３％クロロホルムを含む対照のチューブも嫌気性チャンバー内で３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、チューブを穏やかに混合し、糞便物質を１０秒間静置させた。上清を新しいチューブに移し、ＣＯ２をチューブに押し込むことによってクロロホルムを除去した。従来の条件での胞子形成（ＳＦ）実験では、ＳＦコホート内のマウスに１００μＬの胞子形成糞便画分を強制経口投与し、ＣＴＲＬコホート内のマウスに１００μＬのＰＢＳ対照を経口投与し、これはまた３日目ごとにクロロホルム除去した。無菌動物との胞子形成の関連性のために、強制経口投与用のアイソレーターにそれらを引き込む前に、強制経口投与材料を含むチューブを、無菌アイソレーターのポートで１時間滅菌した。次に、ブリーダーペアに１００μＬの胞子形成カクテルを強制経口投与した。彼らの子孫は、小腸と肝臓の分析のために８週齢で屠殺した。
Ｔ細胞のＴ－Ｍｙｄ８８-/-マウスへの移入。Ｔ－Ｍｙｄ８８-/-マウスは、Ｔ細胞移入の前日に５００ラドで亜致死的に照射した。ＷＴ（ＣＤ４－ｃｒｅ+）及びＢＣＬ６ＫＯ（Ｂｃｌ６LoxP/LoxPＣＤ４－ｃｒｅ+）マウスの脾臓を使用し、ＣＤ４+Ｔ細胞分離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用してＴ細胞を分離した。Ｔ－Ｍｙｄ８８-/-に、ＷＴまたはＢｃｌ６-/-ＭＡＣＳが豊富なＴ細胞のいずれかを５×１０6で回眼窩後方に注入し、５週間にわたって毎週体重を秤量した。
食餌療法。ＳＰＦ施設内に収容された動物には、照射された２９２０×（Ｅｎｖｉｇｏ）の標準的な固形飼料を与えた。ＨＦＤ実験中、対照として、マウスに４５ｋｃａｌ％の脂肪ＤＩＯマウス飼料（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ）という高脂肪食または１０ ｋｃａｌ％の脂肪ＤＩＯマウス飼料（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ）の食餌を対照として、与えた。マウスはまた、５－ＡＳＡ炎症実験中に、１％の５－ＡＳＡ（Ｅｎｖｉｇｏ）を含む照射された標準２０２０固形飼料を含むカスタムの食餌、または５－ＡＳＡ（Ｅｎｖｉｇｏ）を欠く対照食餌を与えられた。
抗生物質治療。ＷＴ及びＴ－Ｍｙｄ８８-/-マウスは、その飲料水内の０．５ｍｇ／ｍＬのアンピシリン（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ネオマイシン（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、エリスロマイシン（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、及びゲンタマイシン（ＧｏｌｄＢｉｏ）で、ＨＦＤ給餌中１４週間、維持し、体重増加表現型に対する微生物叢の相対的な寄与を決定した。ＴＣＲｂ-/-及びＲａｇ１-/-マウスを、その飲料水内に含まれる０．５ｍｇ／ｍＬのアンピシリン（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ネオマイシン（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、エリスロマイシン（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、及びゲンタマイシン（ＧｏｌｄＢｉｏ）に１週間配し、糞便移動によって再コロニー化される前の内因性微生物叢を減少させた。
Ｔｃｒｂ-/-マウス内の微生物叢のＴ細胞形成。４匹のＴｃｒｂ-/-マウスの３つの別々のケージを、飲料水中の抗生物質カクテルに１週間入れた。抗生物質は、さらなる治療の前に２４時間除去した。ＷＴドナー由来の１つの糞便ペレット及びＴ－Ｍｙｄ８８-/-ドナーからの１つの糞便ペレットを、０．１％システインを含む還元ＰＢＳ中で粉砕し、直ちにＴｃｒｂ-/-マウスに経口投与した。この強制経口投与は、１週間の間１日おきに繰り返した。最後の強制経口投与の４８時間後、マウスを個別に収容されたケージに入れ、５×１０6個のＣＤ４+ＭＡＣＳ－富化ＷＴまたはＴ－Ｍｙｄ８８-/-細胞を眼窩後方に注射した。これはＤ０と表示した。
ブドウ糖負荷試験。グルコースでチャレンジする前に、マウスを６時間絶食させた。空腹時血糖値は、Ｃｏｎｔｏｕｒ Ｇｌｕｃｏｓｅ Ｍｅｔｅｒ（Ｂａｙｅｒ）及びＣｏｎｔｏｕｒ Ｇｌｕｃｏｓｅ Ｓｔｒｉｐｓ（Ｂａｙｅｒ）を使用して検出した。体重１グラムあたり１ミリグラムのグルコースを、時点ゼロで動物に腹腔内注射した。血糖値は、血糖計とストリップを使用して、５分、１５分、３０分、６０分、及び１２０分の時点で測定された。
インスリンＥＬＩＳＡ。６時間絶食させたマウスから血清を採取し、マウスインスリンＥＬＩＳＡキット（Ｃｒｙｓｔａｌ Ｃｈｅｍ）を用いてインスリンを測定した。血清試料は、製造業者の指示に従って重複して実行された。
インスリン抵抗性試験。グルコースでチャレンジする前に、マウスを６時間絶食させた。空腹時血糖値は、Ｃｏｎｔｏｕｒ Ｇｌｕｃｏｓｅ Ｍｅｔｅｒ（Ｂａｙｅｒ）及びＣｏｎｔｏｕｒ Ｇｌｕｃｏｓｅ Ｓｔｒｉｐｓ（Ｂａｙｅｒ）を使用して検出した。インスリン（体重１ｋｇあたり０．７５Ｕ）を、時点ゼロで動物に腹腔内注射した。血糖値は、血糖計及びストリップを使用して、５分、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、４０分、及び６０分の時点で測定した。血糖値が３０ｍｇ／ｄＬに低下した場合は、２５％ブドウ糖の１５０μＬ（ｉ．ｐ．）注射に続いて、動物を実験から除外した。
マウス腸上皮細胞（ＭＯＤＥ－Ｋ細胞）を使用したインビトロ実験。マウス腸上皮細胞は、Ｌ－グルタミン及びピルビン酸ナトリウムを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で維持した。ＤＭＥＭには、１０％ＦＢＳ、１％（ｖ／ｖ）グルタミン、ペニシリン－ストレプトマイシン、及び１％ＨＥＰＥＳを補充した。細菌が遺伝子発現を調節するか否かを決定するために、細胞のコンフルエントな単層を、（１：１）のペニシリン－ストレプトマイシンを含まないＤＭＥＭ：ＣＦＳ（培養ＣｌｏｓｔｒｉｄｉａコンソーシアムまたはＤｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ種のいずれかから収集した）で４時間インキュベートした。次に培地を吸引し、細胞を後で分析するために６００ｔＬ ＲｉｂｏＺｏｌ（ＶＷＲ）に入れた。
ｑＰＣＲ及びＲＮＡ－ｓｅｑのための小腸、細胞培養及び肝臓組織からのＲＮＡ分離。長さ０．５ｃｍの組織切片または１ｘ１０5個の細胞を、７００ｔＬのＲｉｂｏＺｏｌ（ＶＷＲ）に－７０℃で保存した。Ｄｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ ＲＮＡ ＭｉｎｉＰｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用してＲＮＡを単離した。ｑＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ合成キット（Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してｃＤＮＡを合成した。ｑＰＣＲは、Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）を使用して実施した。ｑＰＣＲ実験は、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ＬＣ４８０装置（Ｒｏｃｈｅ）で実施した。肝臓ＲＮＡ配列では、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ Ｓａｍｐｌｅ ＰｒｅｐとＲｉｂｏＺｅｒｏ処理（ヒト、マウス、ラットなど）を使用してＱＣに続いてＲＮＡを調製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇを使用して分析した。
糞便免疫グロブリンの定量化。管腔ＩｇＡを定量するために、糞便ペレットを、１．５ｍＬマイクロ遠心チューブに収集し、秤量した。管腔内容物を、糞便重量１ミリグラムあたり１０ｔＬの滅菌１Ｘ ＨＢＳＳに再懸濁し、１００×ｇで５分間回転させて、粗材料を除去した。次に、上清を新しい１．５ｍＬマイクロ遠心チューブに入れ、８０００×ｇで５分間回転させて、細菌をペレット化した。
次に、上清（ＩｇＡを含む）を新しい１．５ ｍＬマイクロ遠心チューブに入れ、ＩｇＡ固有のＥＬＩＳＡキット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、製造元の指示に従って実行）の試料（１／１０及び１／１００（ｖ／ｖ）希釈）として使用した。４５０ｎｍで吸光度を読み取り、標準曲線を使用してＩｇＡの濃度を計算した。濃度は糞便重量に対して正規化した。
細菌ペレットを、５００ｔＬの滅菌ＰＢＳに再懸濁し、８０００×ｇで５分間回転させて２回洗浄した。次に、洗浄した細菌ペレットを、糞便１ｍｇあたり１０ｔＬの滅菌ＰＢＳに再懸濁した。各試料の５マイクロリットルを９６ウェル丸底プレートにプレートした。細菌は、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含む１００ｔＬの滅菌ＨＢＳＳで室温で１５分間ブロックした。細胞を洗浄せずに、１００ｔＬの抗ＩｇＡ（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ｃｌｏｎｅ ｍＡ－６Ｅ１ ＰＥ）、抗ＩｇＧ１（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ ＣｒｕｚＦｌｕｏｒ５５５）、または抗ＩｇＧ３（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ ＣｒｕｚＦｌｕｏｒ５５５）（１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含む滅菌ＨＢＳＳで１：５００に希釈）を、ウェルに追加した。ウェルを４℃で３０分間インキュベートした。プレートを２５００×ｇで５分間回転させて２回洗浄した後、上清を除去し、細胞を滅菌ＨＢＳＳに再懸濁した。最終洗浄後、細菌ウェルを、５ｔＬの１×ＳＹＢＲグリーン染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ｓ７５６３）を含む２５０ｔＬのＨＢＳＳに再懸濁した。ウェルを４℃で２０分間インキュベートした後、フローサイトメーターで直ちに数えた。Ｒａｇ１-/-糞便ペレットを、ネガティブコントロールとして全ての実験に含んだ。
Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ ＡＴＣＣ ２７７７４及びＤｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｐｉｇｅｒ ＡＴＣＣ ２９０９８の増殖。細菌種Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓは、ＡＴＣＣ（＃２７７７４）から購入した。細菌種Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｐｉｇｅｒは、ＡＴＣＣ（＃２９０９８）から購入した。バイアルは嫌気性細菌のＡＴＣＣの指示に従って取り扱って、開き、細胞は前述のＤｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ培地で増殖させた（Ｆ．Ｅ．Ｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１０，１３５８２－１３５８７（２０１３））。培地は、ＮＨ４Ｃｌ（１ｇ／Ｌ）（Ｆｉｓｈｅｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、Ｎａ２ＳＯ４（２ｇ／Ｌ）（Ｆｉｓｈｅｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、Ｎａ２Ｓ２Ｏ３・５Ｈ２Ｏ（１ｇ／Ｌ）（Ｓｉｇｍａ）、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（１ ｇ／Ｌ）（Ｆｉｓｈｅｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（０．１ｇ／Ｌ）（Ｆｉｓｈｅｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、ＫＨ２ＰＯ４（０．５ｇ／Ｌ）（Ｆｉｓｈｅｒ Ｂｉｏｒｅａｇｅｎｔｓ）、Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ（１ｇ／Ｌ）（Ａｍｒｅｓｃｏ）、Ｒｅｓａｚｕｒｉｎ（０．５ｍＬ／Ｌ）（Ｓｉｇｍａ）、システイン（０．６ｇ／Ｌ）（Ｓｉｇｍａ），ＤＴＴ（０．６ｇ／Ｌ）（Ｓｉｇｍａ）、ＮａＨＣＯ３（１ｇ／Ｌ）（Ｆｉｓｈｅｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、ピルビン酸（３ｇ／Ｌ）（Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ）、マレイン酸（３ｇ／Ｌ）（Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ）、ＡＴＣＣ Ｔｒａｃｅ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｍｉｘ（１０ｍＬ／Ｌ）、ＡＴＣＣ Ｖｉｔａｍｉｎ Ｍｉｘ（１０ｍＬ／Ｌ）で構成されており、ｐＨ７．２に調製した。細菌を、嫌気性チャンバー（Ｃｏｙ Ｌａｂｓ）で４８時間増殖させ、２５％グリセロールを含む増殖培地に７０℃で保存した。２．５×１０8の細菌ＣＦＵを、マウスの飲料水２５０μＬに１週間添加した。
糞便、回腸、及びＩｇＡに結合した微生物ＤＮＡの分離及び１６Ｓ配列決定。動物を屠殺し、それらの下部消化管全体（十二指腸から直腸まで）を取り出し、縦方向に切断した。小腸の下部１０ｃｍ由来の１つの糞便ペレット及び管腔内容物を各動物から収集して、それぞれ糞便及び回腸の微生物群落を特徴付けた。糞便及び回腸の試料は、約２５０ｍｇの０．１５ｍｍガーネットビーズ（ＭｏＢｉｏ、カタログ番号１３１２２－５００）を含む２ｍＬのスクリューキャップチューブ内で－７０℃で直ちに凍結した。Ｐｏｗｅｒ Ｆｅｃａｌ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＭｏＢｉｏ）を使用して、製造元の指示に従ってＤＮＡを抽出した。Ｔ細胞移植実験からのＩｇＡ結合細菌及びＩｇＡ非結合細菌を、盲腸内容物から単離し、処理前に－７０℃で凍結した。ＩｇＡ結合細菌分離、１６Ｓ ｒＤＮＡ増幅、配列決定、及び配列プロセシングは、ペアエンド３００サイクルＭｉＳｅｑリードを使用して行った（Ｊ．Ｌ．Ｋｕｂｉｎａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ １７，１５３－１６３（２０１５））。ＩｇＡインデックスを算出した（Ａ．Ｌ．Ｋａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ７，２７６ｒａ２２４（２０１５））。
メタトランスクリプトミクス。糞便ペレットまたは内腔回腸内容物を、直接Ｔｒｉｚｏｌに入れ、ＲＮＡ抽出まで－２０℃で保存した。Ｄｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、＃Ｒ２０５２）を使用して試料からトータルＲＮＡを抽出し、次いで、Ｒｉｂｏ－Ｚｅｒｏ Ｇｏｌｄ ｒＲＮＡ（疫学）除去キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、＃ＭＲＺＥ７２４）を使用して、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｕｔａｈ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｃｏｒｅ ｆａｃｉｌｉｔｙによるＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定のために調製した。Ｉｌｌｕｍｉｎａライブラリは、シングルエンド５０サイクル配列決定を使用してＨｉＳｅｑ２５００で多重化及び配列決定した。ヒト２（ｖ ０．９．９）分析フレームワークは、その後の配列決定処理とデータ分析に使用した（Ｓ．Ａｂｕｂｕｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｌ ８，ｅ１００２３５８（２０１２））。まず、Ｈｕｍａｎｎ２に実装されたニードデータスクリプトを使用して、生の配列を品質トリミングし、Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ（Ａ．Ｍ．Ｂｏｌｇｅｒ，Ｍ．Ｌｏｈｓｅ，Ｂ．Ｕｓａｄｅｌ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ３０，２１１４－２１２０（２０１４））を使用してフィルタリングし、次にフィルタリングしてホスト読み取りを、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓゲノム構築ＧＲＣｍ３８に対して、ｂｏｗｔｉｅ２を使用して除去した（Ｂ．Ｌａｎｇｍｅａｄ，Ｓ．Ｌ．Ｓａｌｚｂｅｒｇ，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ９，３５７－３５９（２０１２）。品質フィルタリングした読み取りには、遺伝子型間で有意差は観察されなかったが、試料全体にわたって、マウスゲノムにマッピングされた回腸試料からの読み取りが多いほど、細菌の転写産物のカバレッジが狭くなった。次に、これらの短い読み取りのマッピングを改善するために、品質フィルタリングした読み取りのマッピングは、ＵｎｉＲｅｆ９０遺伝子のアノテーション付きのマウス分離細菌リファレンスゲノムのカスタムデータベースに制限された。このカスタムデータベースは、マウス腸内細菌コレクション（ｍｉＢＣ）の一部として最近分離及び配列決定された５３の生物体（Ｉ．Ｌａｇｋｏｕｖａｒｄｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １，１６１３１（２０１６））、及びｈｕｍｍａｎ２のチョコフランデータベースに含まれる９つのリファレンスゲノム（１６Ｓ配列決定で検出されたが、ｍｉＢＣコレクションにまだ含まれていない種を表す）で構成されていた。これらの９つのゲノムは以下：Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｌｏｎｇｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｉｍａｌｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｍｕｃｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｃｈａｅｄｌｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ＿ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ、及びＣａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｒｔｈｒｏｍｉｔｕｓであった。Ｕｎｉｒｅｆ９０アノテーションを使用してカスタムデータベースを作成するために、ｍｉＢＣゲノムのアミノ酸配列を、Ｄｉａｍｏｎｄアライナを使用してＵｎｉｒｅｆ９０データベースにアラインメントし（Ｂ．Ｂｕｃｈｆｉｎｋ，Ｃ．Ｘｉｅ，Ｄ．Ｈ．Ｈｕｓｏｎ，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １２，５９－６０（２０１５））５０％のクエリカバレッジ及び９０％の同一性を必要とする。次に、これらのｕｎｉｒｅｆ９０アノテーション付きｍｉＢＣアミノ酸配列を使用して、対応する各遺伝子のヌクレオチド配列にアノテーションを付け、すでにアノテーションが付けられている９つのゲノムと組み合わせて、マウス固有の細菌ゲノムを含むカスタムヌクレオチドマッピングリファレンスを作成した。Ｈｕｍａｎｎ２を使用して、フィルタリングされた配列読み取りをカスタムリファレンスにマッピングするために、リード長が短いことに起因して、ヌクレオチドアラインメント（翻訳されたアラインメントなし）を使用した。次に、ｈｕｍａｎｎ２から出力されたｕｎｉｒｅｆ９０遺伝子ファミリーの１キロベースあたりの整列された読み取りのカウントを、１００万あたりのカウント（試料内）に正規化するか、遺伝子オントロジー（Ｇｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ）（ＧＯ）タームに再グループ化してから、後続の分析のために正規化した。
代謝表現型。総体脂肪組成は、ＮＭＲ Ｂｒｕｋｅｒ Ｍｉｎｉｓｐｅｃで測定した。ＣＬＡＭＳ代謝ケージを使用して間接熱量測定法を測定した。エネルギー消費量（ＥＥ）は、次の式を使用して計算した。発熱量（ＣＶ）＝３．８１５＋（１．２３２＊ＲＥＲ）。ＥＥ＝ＣＶ＊ＶＯ２。
肝臓及び脂肪組織の顕微鏡検査。肝臓及び脂肪組織をホルマリンで固定し、ワックスに包埋し、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した。顕微鏡画像は、ＴｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒのＥＶＯＳコアＸＬイメージングシステムを使用して収集した。
血清及び盲腸内容物のメタボロミクス（ＳＣＦＡ測定値を除く）。試料の抽出及び準備。盲腸内容物は分析前に－７０℃で保存した。内部標準（１試料あたり１ｔｇのｄ４－コハク酸及び５ｔｇの標識アミノ酸（13Ｃ、15Ｎ標識）混合物）を含む５ミリリットルの７５％エタノール溶液を各試料に添加した。試料を激しくボルテックスした後、沸騰水中で１０分間インキュベートした。冷却した試料を５，０００×ｇで５分間スピンダウンした。上清を新しいチューブに移し、次いで、一晩スピードバキュームして乾燥させた。
ＧＣ－ＭＳ分析。ＧＣ－ＭＳ分析は、Ａｇｉｌｅｎｔ６８９０ガスクロマトグラフ及びＧｅｒｓｔｅｌＭＰＳ２オートサンプラーを備えたＷａｔｅｒｓ ＧＣＴ Ｐｒｅｍｉｅｒ質量分析計を使用して実行した。乾燥した試料を、ピリジン中の４０ｍｇ／ｍＬのＯ－メトキシアミン塩酸塩（ＭＯＸ）４０ｔＬに懸濁し、３０℃で１時間インキュベートした。オートサンプラバイアルに、この溶液２５ｔＬを追加した。４０マイクロリットルの４０ｔＬのＮ－メチル－Ｎ－トリメチルシリルトリフルオロアセトアミド（ＭＳＴＦＡ）を、オートサンプラーを介して自動的に添加し、３７℃で６０分間振とうしながらインキュベートした。インキュベーション後、オートサンプラーを介して３ｔＬの脂肪酸メチルエステル標準（ＦＡＭＥＳ）溶液を添加し、次いで１μＬの調製試料を、スプリットモードでガスクロマトグラフの入口に注入し、入口温度は２５０℃に保った。分析には１０：１の分割比を使用した。ガスクロマトグラフの初期温度は９５℃で１分間、続いて４０℃／分の勾配で１１０℃まで、保持時間は２分であった。この後、２回目の５℃／分の勾配で２５０℃まで、３５０℃への３回目の勾配、次に３分の最終保持時間を続けた。クロマトグラフィー分離には、長さ５ｍのガードカラムを備えた３０ｍのＰｈｅｎｏｍｅｘ ＺＢ５－５ ＭＳｉカラムを使用した。ヘリウムを１ｍＬ／分のキャリアガスとして使用した。いくつかの代謝物が大量にあるので、試料を１０倍希釈でもう一度分析した。
ＧＣ－ＭＳデータの分析。ＭａｓｓＬｙｎｘ ４．１ソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ）を使用してデータを収集した。代謝物を同定し、ＱｕａｎＬｙｎｘを使用してそれらのピーク面積を記録した。このデータはＥｘｃｅｌスプレッドシート（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ，Ｒｅｄｍｏｎｄ ＷＡ）に転送した。代謝物の同一性は、純粋に購入した標準を使用して開発された社内の代謝物ライブラリと市販のＮＩＳＴライブラリとの組み合わせを使用して確立された。ＧＣ－ＭＳを使用して全ての代謝物が観察されるわけではない。これはいくつかの理由に起因した。例えば、一部の代謝物は非常に低濃度で存在していた。第二に、代謝物は、揮発するには大きすぎるか、カルニチンなどの第４級アミンであるか、または単に十分にイオン化しないせいで、ＧＣ－ＭＳに適合しない場合がある。十分にイオン化しない代謝物としては、オキサロ酢酸、ヒスチジン、及びアルギニンが挙げられる。システインは、細胞の状態に応じて観察され、タンパク質とジスルフィド結合を形成することが多く、細胞内濃度が低い。
盲腸内容物の短鎖脂肪酸検出。試料の抽出及び準備。試料を冷凍庫から取り出し、ＲＴで５分間解凍させた。これらの試料に、４００ｔＬのｄｄ－Ｈ２Ｏ、１０ｔＬの５－スルホサリチル酸（１ｍｇ／ｔＬ）、及び２ｔＬの内部標準（１Ｍピバル酸）を添加した。試料を３０秒間ボルテックスし、氷上で３０分間静置した。次いで、試料を２０００×ｇで１０分間４℃で遠心分離した。次に、上清を、１０ｔＬの濃ＨＣｌを含むＰＴＦＥで裏打ちされたキャップを備えたガラスバイアルに移した。次に、３ｍＬのエーテルを添加し、その試料を３０秒間ボルテックスした後、１，２００×ｇで１０分間４℃で遠心分離した。次いで、上清を、ＰＴＦＥで裏打ちされたキャップ付きの新しいガラスバイアルに移し、５０ｔＬのＮ－メチル－Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）トリフルオロアセトアミド、ｔｅｒｔブチルジメチルクロロシラン（ＭＴＢＳＴＦＡ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で誘導体化した。試料をボルテックスし、６０℃の砂浴に３０分間入れた。試料をＲＴまで冷却させ、穏やかな窒素流下で約２５０ｔＬの容量まで部分的に蒸発させ、ガラス製ＧＣ－ＭＳバイアルに移した。
ＧＣ－ＭＳ分析。ＧＣ／ＭＳ分析は、Ａｇｉｌｅｎｔ ５７９３質量分析計に接続されたＡｇｉｌｅｎｔ ６８９０ガスクロマトグラフ、及びＤＢ－１カラムを装備したＡｇｉｌｅｎｔ ７６８３（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ） オートインジェクター（１５ｍ×０．２５ｍｍ内径×０．２５μｍの膜厚、Ｊ＆Ｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｆｏｌｓｏｍ、ＣＡ、ＵＳＡ）で行った。ヘリウムキャリアガスを、１．０ｍＬ／分の流量で使用した。１μＬの試料を注入したスプリット比１０：１を、２５０℃に保持された注入口に入れた。使用したＧＣオーブンの勾配は、４０℃（１分間保持）；５℃／分の勾配で７０℃まで（３分間保持）；２０℃／分の勾配で１６０℃まで（０分保持）；４０℃／分の勾配で３３０℃まで（６分間保持）であった。データは、質量範囲４４～２００ｍ／ｚのスキャンモードで取得し、標的は、酢酸の場合は、ｍ／ｚ １１７．０、ブタン酸の場合は、ｍ／ｚ１３１．０、プロパン酸の場合はｍ／ｚ１４５．０、及びピバル酸の場合はｍ／ｚ１５９．０を使用して定量した。
実施例２：４つのＣｌｏｓｔｒｉｄｉａ株が肥満、インスリン抵抗性、炎症性腸疾患を救済する。
４つのＣｌｏｓｔｒｉｄｉａメンバーの製剤は、マウスの脂肪症を軽減させる。肥満症の軽減に寄与する群落の特定のメンバーを絞り込むために、さまざまなインビトロ技術を採用している。これらの実験は、この群落の４つの特定のメンバーの組み合わせの試験につながった。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ ａｎａｅｒｏｖｏｒａｘ 、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｓｐｐｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ＸＩＶａ、及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ＩＶを含む洗練された４つのメンバー群落（本明細書では洗練されたＣｌｏｓｔｒｉｄｉａコンソーシアム－ｒＣＣ－４とも呼ばれる）。これらの４系統を使用して、マウスにコロニーを形成し、脂肪の蓄積をより複雑なＣｌｏｓｔｒｉｄｉａコンソーシアム（図ではＳＦと呼ぶ）と比較した。興味深いことに、これらの４つの菌株は、複雑な微生物群落と同程度まで脂肪症（ｒＣＣ－Ｍ）を減らすのに十分であった（図１８）。
４つのＣｌｏｓｔｒｉｄｉａメンバーの製剤は、マウスの脂肪症を軽減させる。肥満症の軽減に寄与する群落の特定のメンバーを絞り込むために、さまざまなインビトロ技術を採用している。これらの実験は、この群落の４つの特定のメンバーの組み合わせの試験につながった。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ ａｎａｅｒｏｖｏｒａｘ 、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｓｐｐｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ＸＩＶａ、及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ＩＶを含む洗練された４つのメンバー群落（本明細書では洗練されたＣｌｏｓｔｒｉｄｉａコンソーシアム－ｒＣＣ－４とも呼ばれる）。これらの４系統を使用して、マウスにコロニーを形成し、脂肪の蓄積をより複雑なＣｌｏｓｔｒｉｄｉａコンソーシアム（図ではＳＦと呼ぶ）と比較した。興味深いことに、これらの４つの菌株は、複雑な微生物群落と同程度まで脂肪症（ｒＣＣ－Ｍ）を減らすのに十分であった（図１８）。
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａの置き換えが肥満、インスリン抵抗性、及び炎症性腸疾患を救済する。一連の実験を通じて、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａの有意な減少が、肥満誘発性動物で確認された。したがって、これらの痩せた関連微生物の再導入が肥満を防御し得るか否かを試験した。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａは、胞子形成菌として公知であるので、糞便をクロロホルムで処理してこれらの微生物を濃縮した。動物は、このモデルで体重増加を加速し、西洋化されたライフスタイルをよりよく模倣することが示されている、高脂肪食（ＨＦＤ）に配した。肥満になりやすいＴ－Ｍｙｄ８８-/-動物を、胞子形成細菌のカクテルで治療すると、体重増加及び脂肪蓄積が有意に減少した（図１９Ａ～図１９Ｂ）。ちょうど３か月の終わりに、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａで処置したＴ－Ｍｙｄ８８-/-マウスは、未処理のＴ－Ｍｙｄ８８－／－と比較した場合、体脂肪率が低く、ＶＡＴ量が減少していた（図１９Ｃ）。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ処置はまた、血糖値を低下させ、インスリン抵抗性を低下させる（図１９Ｄ及び図１９Ｅ）。重要なことに、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ処理によるこれらの代謝パラメーターの改善は、ＨＦＤに配されたＷＴ動物でも見られ（図１９Ｄ及び図１９Ｅ；ＷＴ）、ＣｌｏｓｔｒｉｄｉａによるＭｅｔＳの改善がＭｅｔＳ及びＴＩＩＤのいくつかの異なるモデルに関連することを支持する。
ＩＢＤと糖尿病との間の関係は、物議を醸しているが、現在この関係を支持するいくつかの研究がある。ＩＢＤの１２，６０１人の患者を対象とした横断研究では、糖尿病が３番目に多い併存疾患であった。デンマークの４７，３２５人の患者からの別のより最近の横断研究は、糖尿病がＩＢＤ（ＵＣとＣＤの両方）と有意に関連していることを示した。１２００人のＩＢＤ患者の小児コホートでは、糖尿病の有病率もＵＣ患者の方が対照よりも高かった。２０１９年にＩＢＤの患者８０７０人及び健康な対照４０，０３０人を使用した最近の研究では、ステロイドの使用を制御している場合でも、ＩＢＤの個体では糖尿病の発生率が有意に高いことが実証された。最後に、１９７７年から２０１４年にかけてＩＢＤナシに対してＩＢＤと診断された６，０２８，８４４人の個人の全国的な人口ベースのコホートによって、特に２００３年から２０１４年の間にＩＢＤのある個人の糖尿病の発生率の増大が明らかになった。血糖ホメオスタシスに加えて、ＩＢＤの個体は、脂質代謝に変化があると報告されており、代謝性疾患とＩＢＤとの間の関連性を裏付けている。これらの疾患の両方に共通するのは、慢性炎症及び微生物叢の動揺であるが、これらの病気の間の関係の根底にある機構は不明である。
現在、健康な対照と比較して、糖尿病及びＩＢＤを有する個体の微生物叢組成を分析した徹底的な研究があり、いくつかの類似点が明らかになっている。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ及びＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅのメンバーの特定の枯渇を伴う微生物叢の多様性の減少が、糖尿病、肥満、及びＩＢＤの患者で報告されている。系統発生レベルでの微生物叢の組成は一般に個体間で異なるが、微生物叢の機能的能力は非常に安定している。したがって、メタゲノム研究は、微生物叢の疾患への寄与についてより多くの洞察を提供し得る。２型糖尿病とＩＢＤの両方のメタゲノム研究により、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａのメンバーの減少と一致して短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）の産生が減少していることが明らかになった。生物体の特定のサブセットの喪失に加えて、これらの障害の中で特定された同様の病原体がある。ＴＩＩＤがある３５０以上の個体を調査し、微生物叢の組成を健康な個人の組成と比較した研究では、ＴＩＩＤに関連する最も重要なシフトは、硫酸塩還元菌であるＤｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏの富化であることが判明した。別の独立した研究では、ＴＩＩＤも持っていた免疫力が低下した個体でのＤｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏの異常増殖が確認された。ＩＢＤでは、多くの研究がＤｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏの増大を指摘している。ＩＢＤの一般的な治療法であるメサラミンは、糞便中の硫化物を阻害するが、この薬物を服用していない患者では、硫化物のレベルが高くなる。メタゲノム研究は、ＩＢＤ及びＩＩ型糖尿病の系統的研究を確認し、硫黄含有アミノ酸であるシステインの代謝に関与する遺伝子が、疾患のある個体では増大することを実証している。したがって、微生物叢の組成における同様のシフトは、ＩＢＤ及び糖尿病の個体で確認されており、これらの共通点が、これらの疾患の発症の根底にあり得ることが示唆されている。
糖尿病とＩＢＤとの間の関係に基づいて、これらの細菌がＩＢＤのマウスモデルから救済されるか、または保護され得るか否かを試験した。デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）大腸炎の慢性モデルを使用し、ＤＳＳを飲料水に５日間入れた後、通常の水を１０日間続け、さらに２サイクル繰り返した。ＣｌｏｓｔｒｉｄｉａまたはＰＢＳを、１日おきに経口強制投与し、組織学を実施した。確かに、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａで治療された動物は、結腸の長さの増大及び組織病理学的スコアの減少によって決定されるとおり、大腸炎の発症から有意に保護された（図１９Ｆ、１９Ｇ）。したがって、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａはメタボリックシンドローム（ＭｅｔＳ）及びＩＢＤの発症を防ぎ得る。
Claims (44)
- Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａのコンソーシアム由来の上清を含む組成物。
- 前記Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａコンソーシアムが２つ以上の細菌の株を含み、前記２つ以上の細菌の株が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ ａｎａｅｒｏｖｏｒａｘ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ＸＩＶａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ＩＶ及びＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｓｐｐｓである、請求項１に記載の組成物。
- 前記組成物が、対象の腸上皮内の脂質吸収遺伝子の発現を抑制し得、前記Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａコンソーシアムが、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ ａｎａｅｒｏｖｏｒａｘ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ＸＩＶａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ＩＶ及びＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｓｐｐｓのうちの２つ以上を含む、請求項１に記載の組成物。
- 前記組成物が、対象の小腸における脂質吸収を阻害し得、前記Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａコンソーシアムが、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ ａｎａｅｒｏｖｏｒａｘ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ＸＩＶａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ＩＶ及びＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｓｐｐｓのうちの２つ以上を含む、請求項１に記載の組成物。
- 前記組成物が、対象の体重増加を軽減し得、前記Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａコンソーシアムが、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ ａｎａｅｒｏｖｏｒａｘ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ＸＩＶａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ＩＶ及びＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｓｐｐｓのうちの２つ以上を含む、請求項１に記載の組成物。
- 前記組成物が、対象の肝臓においてＣＤ３６を下方制御し得、前記Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａコンソーシアムが、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ ａｎａｅｒｏｖｏｒａｘ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ＸＩＶａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ＩＶ及びＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｓｐｐｓのうちの２つ以上を含む、請求項１に記載の組成物。
- 前記組成物が、対象の脂肪症を軽減し得、前記Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａコンソーシアムが、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ ａｎａｅｒｏｖｏｒａｘ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ＸＩＶａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ＩＶ及びＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｓｐｐｓのうちの２つ以上を含む、請求項１に記載の組成物。
- 前記組成物が、対象の体脂肪率を低下させ得る、及び／または内臓脂肪組織（ＶＡＴ）量を減少し得、かつ前記Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａコンソーシアムが、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ ａｎａｅｒｏｖｏｒａｘ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ＸＩＶａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ＩＶ及びＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｓｐｐｓのうちの２つ以上を含む、請求項１に記載の組成物。
- 前記組成物が、対象の血糖値を低下させる、及び／またはインスリン抵抗性を低下させ得、前記Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａコンソーシアムが、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ ａｎａｅｒｏｖｏｒａｘ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ＸＩＶａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ＩＶ及びＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｓｐｐｓのうちの２つ以上を含む、請求項１に記載の組成物。
- Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍのコンソーシアムを含む組成物。
- 前記組成物が、対象の腸上皮内の脂質吸収遺伝子の発現を抑制し得る、請求項１０に記載の組成物。
- 前記Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍコンソーシアムが、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ ａｎａｅｒｏｖｏｒａｘ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ＸＩＶａ、及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ＩＶ、及びＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｓｐｐｓを含む、請求項１０または１１に記載の組成物。
- 表１から選択される１つ以上の細菌をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
- 薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記組成物が凍結されている、請求項１～１４のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記組成物が固体である、請求項１～１５のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記組成物が各Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ株の少なくとも１×１０-5細胞を含む、請求項１～１６のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記組成物の単一投薬量が、１×１０-5 ～１×１０-10細胞の各Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ株を含む、請求項１～１７のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記組成物が、不均衡な微生物叢に関連する疾患または障害を有する対象の微生物叢を置き換え得る、請求項１～１８のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記不均衡な微生物叢が、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏの増大かつＣｌｏｓｔｒｉｄｉａの減少である、請求項１９に記載の組成物。
- 前記不均衡な微生物叢が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａの減少かつＤｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏの増大なしである、請求項１９に記載の組成物。
- 前記疾患または障害が、肥満、メタボリックシンドローム、インスリン欠乏、インスリン抵抗性関連障害、耐糖能異常、糖尿病、または炎症性腸疾患である、請求項１９に記載の組成物。
- 前記組成物が、粉末、顆粒、すぐに使用できる飲料、食品バー、押出成形形態、カプセル、ゲルカプセル、及び分散性錠剤からなる群より選択される形態で投与される、請求項１～２２のいずれか１項に記載の組成物。
- Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ ａｎａｅｒｏｖｏｒａｘ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ＸＩＶａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ＩＶ、及びＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｓｐｐｓのうちの２つ以上を含む細菌のコンソーシアムであって、前記コンソーシアムは、前記コンソーシアムが投与されていない対象と比較して対象における腸上皮内の脂質吸収遺伝子の発現を抑制する、前記細菌のコンソーシアム。
- 対象における微生物叢の相対量を変更する方法であって、先行請求項のいずれかに記載される組成物の有効量を前記対象に投与して、これによって前記対象における前記微生物叢の相対量を変更することを含む、前記方法。
- 前記Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ菌の相対量が増大または置き換えられる、請求項２５に記載の方法。
- 前記Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａの相対量が、前記対象において少なくとも約５％増大される、請求項２５に記載の方法。
- 第２の治療剤を前記対象に投与することをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
- 肥満の対象を治療する方法であって、請求項１～２４のいずれか１項に記載の組成物を前記対象に投与することを含み、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａの相対量が、投与前の前記相対量と比較して前記対象において増大される、前記方法。
- メタボリックシンドロームの対象を治療する方法であって、請求項１～２４のいずれか１項に記載の組成物を前記対象に投与することを含み、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａの相対量が、投与前の前記相対量と比較して前記対象において増大される、前記方法。
- 過敏性腸症候群の対象を治療する方法であって、請求項１～２４のいずれか１項に記載の組成物を前記対象に投与することを含み、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａの相対量が、投与前の前記相対量と比較して前記対象において増大される、前記方法。
- 対象の体重増加を軽減する方法であって、請求項１～２４のいずれか１項に記載の組成物を前記対象に投与することを含み、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａの相対量が、投与前の前記相対量と比較して前記対象において増大される、前記方法。
- 対象の小腸における脂質吸収を阻害する方法であって、請求項１～２４のいずれか１項に記載の組成物を前記対象に投与することを含み、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａの相対量が、投与前の前記相対量と比較して前記対象において増大される、前記方法。
- 対象の肝臓におけるＣＤ３６を下方制御する方法であって、請求項１～２４のいずれか１項に記載の組成物を前記対象に投与することを含み、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａの相対量が、投与前の前記相対量と比較して前記対象において増大される、前記方法。
- 前記対象が、前記治療が必要であると特定されている、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
- 前記対象が、肥満、メタボリックシンドローム、インスリン欠乏、インスリン抵抗性関連障害、耐糖能異常、糖尿病、または炎症性腸疾患を有する、請求項２５～２８、請求項３２、請求項３３または請求項３４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記炎症性腸疾患が、クローン病または潰瘍性大腸炎である、請求項３６に記載の方法。
- 前記インスリン抵抗性関連障害が、糖尿病、高血圧、脂質異常症、または心血管疾患である、請求項３６に記載の方法。
- 前記組成物を投与する前記ステップが、前記組成物を前記対象の少なくとも胃、小腸、または大腸に送達することを含む、請求項２５～３８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記組成物が、経口的に投与される、請求項２５～３９のいずれか１項に記載の方法。
- Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａの少なくとも１つの種の相対量が、５％増大される、請求項２５～４０のいずれか１項に記載の方法。
- 前記対象が、ヒトである、請求項２５～４１のいずれか１項に記載の方法。
- 前記コンソーシアムの前記細胞が活性である、請求項２５～４２のいずれか１項に記載の組成物または方法。
- 前記組成物が、不均衡な微生物叢に関連する疾患または障害を有する対象の微生物叢を置き換えるためである、請求項２５～４３のいずれか１項に記載の方法。
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