KR20220063153A - 클로스트리디아 집합체 조성물 및 비만, 대사 증후군 및 과민성 대장 증후군을 치료하는 방법 - Google Patents

Abstract

본원에는 클로스트리디아의 집합체를 포함하는 조성물, 및 상기 조성물을 대상체에게 투여함으로써 비만, 대사 증후군, 과민성 대장 증후군을 치료할 뿐만 아니라 체중 증가를 감소시키고 소장에서 지질 흡수를 억제하는 방법이 개시된다.

Description

클로스트리디아 집합체 조성물 및 비만, 대사 증후군 및 과민성 대장 증후군을 치료하는 방법

관련 출원의 상호 참조

본원은 2019년 7월 17일에 출원된 미국 가출원 제62/875,194호의 출원일의 이익을 주장한다. 이의 선행 출원된 출원의 내용은 본원에 그 전체가 참고로 포함된다.

서열 목록의 참조

2020년 7월 16일에 생성되고 24,576 바이트의 크기를 갖는 명칭 "21101_0401P1_SL.txt"의 텍스트 파일로서 본원에서 제출된 서열 목록은 37 C.F.R. § 1.52(e)(5)에 따라 본원에 참고로 포함된다.

미생물총은 숙주 대사 및 비만에 영향을 미치지만, 질환으로부터 보호하는 유기체는 알려져 있지 않다.

요약

본원에는 박테리아의 집합체가 개시되어 있다. 본원에는 클로스트리듐 집합체(Clostridium consortia)가 개시되어 있다.

본원에는 클로스트리디아 집합체로부터의 상청액을 포함하는 조성물이 개시되어 있다.

본원에는 클로스트리듐 집합체를 포함하는 조성물이 개시되어 있다.

본원에는 클로스트리디아 아나에로보락스(Clostridia anaerovorax) 균주, 클로스트리듐 XIVa, 클로스트리듐 IV 및 라크노스피라세아에 종을 포함하는 박테리아의 집합체가 개시되어 있고, 집합체는 집합체가 투여되지 않는 대상체와 비교하여 대상체에서의 장 상피 내의 지질 흡수 유전자의 발현을 억제한다.

본원에는 대상체에서 미생물총의 상대 풍부도를 변경하는 방법이 개시되어 있고, 상기 방법은 본원에 기재된 임의의 조성물의 유효 용량을 대상체에게 투여하여서 대상체에서 미생물총의 상대 풍부도를 변경하는 단계를 포함한다.

본원에는 비만을 갖는 대상체를 치료하는 방법이 개시되어 있다. 일부 양태에서, 상기 방법은 본원에 기재된 임의의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있고, 대상체에서 클로스트리디아의 상대 풍부도는 투여 전의 상대 풍부도에 비해 증가한다.

본원에는 대사 증후군을 갖는 대상체를 치료하는 방법이 개시되어 있다. 일부 양태에서, 상기 방법은 본원에 기재된 임의의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있고, 대상체에서 클로스트리디아의 상대 풍부도는 투여 전의 상대 풍부도에 비해 증가한다.

본원에는 과민성 대장 증후군을 갖는 대상체를 치료하는 방법이 개시되어 있다. 일부 양태에서, 상기 방법은 본원에 기재된 임의의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있고, 대상체에서 클로스트리디아의 상대 풍부도는 투여 전의 상대 풍부도에 비해 증가한다.

본원에는 대상체에서 체중 증가를 감소시키는 방법이 개시되어 있다. 일부 양태에서, 상기 방법은 본원에 기재된 임의의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있고, 대상체에서 클로스트리디아의 상대 풍부도는 투여 전의 상대 풍부도에 비해 증가한다.

본원에는 대상체의 소장에서 지질 흡수를 억제하는 방법이 개시되어 있다. 일부 양태에서, 상기 방법은 본원에 기재된 임의의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있고, 대상체에서 클로스트리디아의 상대 풍부도는 투여 전의 상대 풍부도에 비해 증가한다.

본원에서 대상체의 간에서 CD36을 하향조절하는 방법이 개시되어 있다. 일부 양태에서, 상기 방법은 본원에 기재된 임의의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있고, 대상체에서 클로스트리디아의 상대 풍부도는 투여 전의 상대 풍부도에 비해 증가한다.

본 명세서에 포함되고 이의 일부를 구성하는 첨부 도면은 몇몇 양태를 예시하고, 상세한 설명과 함께 본 발명의 원칙을 설명하는 역할을 한다.
본 발명의 추가의 이점은 부분적으로 하기 설명에서 기재될 것이고, 부분적으로 상세한 설명으로부터 자명해지거나, 본 발명의 실시에 의해 학습될 수 있다. 본 발명의 이점은 첨부된 청구항에 특히 제시된 요소 및 조합에 의해 실현되고 획득될 것이다. 상기 일반 설명 및 하기 상세한 설명 둘 모두는 오직 예시 및 설명을 위한 것이고, 본 발명을 제시된 것에 제한하지 않는다고 이해되어야 한다.
도 1a 내지 도 1j는 장에서의 결함 있는 T 세포 신호전달이 노화성 비만으로 이어진다는 것을 보여준다. 도 1a는 6개월령 WT 및 T-Myd88^-/- 마우스의 대표적인 영상을 보여준다. 도 1b는 2개월령에 시작하여 마우스가 나이들어가면서 증가하는 체중의 백분율을 보여준다(WT, n = 8; T-Myd88^-/-, n = 7 작도됨). 3개의 독립 실험을 나타냄. 도 1c는 2개월령에 시작하여 마우스가 나이들어감에 따른 지방 축적을 보여준다(WT, n = 8; T-Myd88^-/-, n = 7 작도됨). 3개의 독립 실험을 나타냄. 도 1d는 1년령 WT 및 T-Myd88^-/- 마우스의 총 중량을 보여준다(n = 6). 3개의 독립 실험을 나타냄. 도 1e는 1년령 WT 및 T-Myd88^-/- 마우스의 NMR에 의해 측정된 것과 같은 총 지방 백분율을 보여준다(n = 6). 3개의 독립 실험을 나타냄. 도 1f는 1년령 WT 및 T-Myd88^-/- 마우스의 공복 혈청 인슐린 농도를 보여준다(WT, n = 9; T-Myd88^-/-, n = 10). 3개의 독립 실험으로부터 수집된 데이터. 도 1g는 1년령 WT 및 T-Myd88^-/- 마우스의 항상성 모델 평가(HOMA-IR)를 보여준다. (WT, n = 9; T-Myd88^-/-, n = 10). 3개의 독립 실험으로부터 수집된 데이터. 도 1h는 인슐린-저항성 시험 동안 i.p. 인슐린(0.75 U/kg) 주사 후 시간에 걸쳐 측정된 혈당 수치를 보여준다(WT, n = 9; T-Myd88^-/-, n = 10). 3개의 독립 실험으로부터 수집된 데이터. 도 1i는 20배 배율로 취한 WT 및 T-Myd88^-/- 마우스로부터의 간 및 VAT 조직의 대표적인 헤마톡실린 및 에오신 염색을 보여준다. 축적 막대는 100 μm을 나타낸다. 도 1j는 대조군 또는 HFD를 섭식한 WT 및 T-Myd88^-/- 마우스의 증가된 체중의 백분율을 보여준다(WT CTRL, n = 8; WT HFD, n = 15; T-Myd88^-/- CTRL, n = 9; T-Myd88^-/- HFD, n = 13). 2꼬리, 독립 t 시험(b-g) 및 반복 측정 ANOVA(h, j)를 사용한 P-값<0.05(^*); P-값<0.01(^**); P-값<0.001(^***); P-값<0.0001(^****). 오차 막대는 SD를 나타낸다.
도 2a 및 도 2d는 T-Myd88^-/- 마우스와 연관된 체중 증가에 미생물총이 필요하다는 것을 보여준다. 도 2a는 시간에 걸쳐 측정된 증가된 체중의 그램을 보여준다(평균 +/- SD). 도 2b는 증가된 총 체중(AUC)을 보여준다. 도 2c는 VAT의 그램을 보여준다. 도 2d는 WT 및 T-Myd88^-/- 마우스가 항생제와 함께 또는 이것 없이 HFD를 섭식할 때 최종 체지방 백분율을 보여준다(WT CTRL, n = 5; TMYD CTRL, n = 4; WT ABX, n = 5, TMYD ABX, n = 5). 2개의 독립 실험을 나타냄. 반복 측정 ANOVA(a) 및 2꼬리, 독립 t 시험(b-d)을 사용한 P-값<0.05(^*); P-값<0.01(^**); P-값<0.001(^***); P-값<0.0001 (^****).
도 3a 내지 도 3f는 다양성 및 클로스트리디아 풍부도의 소실이 T-Myd88^-/- 마우스에서 체중 증가와 연관된다는 것을 보여준다. 도 3a는 PCoA 선도를 보여주고, 도 3b는 표시된 동물의 회장 미생물총으로부터 관찰된 OTU의 수를 보여준다(WT, n = 8; T-Myd88^-/-, n = 7). 도 3c는 WT와 T-Myd88^-/- 회장 미생물총 사이의 랜덤 포레스트 분류의 평균 정확성에 영향을 미치는 상위 10개의 박테리아 속을 보여준다. WT 동물에서 풍부한 상대 풍부도를 갖는 속(genera)은 청색 음영이고, T-Myd88^-/- 동물에서 풍부한 상대 풍부도를 갖는 속은 적색 음영이다(WT, n = 8; T-Myd88-/-, n = 7). 도 3d는 체중 증가 및 회장 미생물총의 랜덤 포레스트 선형화에서의 표준 오차에 영향을 미치는 상위 10개의 박테리아 속을 보여준다. WT 동물에서 풍부한 상대 풍부도를 갖는 속은 청색 음영이고, T-Myd88^-/- 동물에서 풍부한 상대 풍부도를 갖는 속은 적색 음영이다(WT, n = 8; T-Myd88-/-, n = 7). 도 3e는 회장 샘플에서 박테리아 UniRef90 유전자 패밀리 전사체 풍부도의 비의 화산 선도(volcano plot)를 보여준다(코호트당 n = 6). 도 3f는 WT 및 T-Myd88^-/- 회장 미생물총 전사체로부터의 상당히 상이한 종의 100만개당 맵핑된 리드를 보여준다(유전자형당 n = 6). 오차 막대는 SD를 나타낸다. 도 3a, 도 3b, 도 3c 및 도 3d에서의 데이터는 하나의 실험에서 얻고, 도 3e 및 도 3f로부터의 데이터는 하나의 실험에서 얻는다. permanova(a) 및 2꼬리 독립 t 시험(b, f)을 사용한 P-값<0.05(^*); P-값<0.01(^**); P-값<0.001(^***); P-값<0.0001(^****).
도 4a 내지 도 4g는 장 미생물총의 조작이 T-Myd88^-/- 연관된 체중 증가에 영향을 미친다는 것을 보여준다. 도 4a는 증가된 체중의 곡선 하 면적(AUC)을 보여주고, 도 4b는 별개의 우리에서 유지되거나 동시수용되고 HFD를 석십한 WT 및 T-Myd88^-/- 마우스에서의 데설포비브리오의 상대 풍부도를 보여준다(유전자형당 n = 4). 2개의 독립 실험을 나타냄. 도 4c는 D. 데설푸리칸스와 함께 또는 이것 없이 콜로니화된 SPF 마우스로부터의 대변 샘플 내의 표시된 박테리아의 상대 풍부도를 보여준다(유전자형당 n = 5). 도 4d는 단독으로 또는 D. 데설푸리칸스와 함께 클로스트리디아 집합체에 의해 콜로니화된 무균 마우스에서 16S 시퀀싱으로부터의 표시된 박테리아의 상대 풍부도를 보여준다(코호트당 n = 5). 오차 막대는 SD를 나타낸다. 도 4e 내지 도 4g는 비히클 대조군 또는 포자-형성 클로스트리디아 집합체가 위관영양된 T-Myd88^-/- 마우스를 보여준다(비히클(CTRL), n = 4; 클로스트리디아 집합체, n = 5). 2개의 독립 실험을 나타냄. (e) 증가된 체중의 AUC. 도 4f는 NMR에 의해 측정된 것과 같은 총 지방 백분율을 보여준다. (g) VAT의 그램. 2꼬리, 독립 t 시험(a, e-g) 및 만-휘트니 U 시험(b-d)을 사용한 P-값<0.05 (^*); P-값<0.01 (^**); P-값<0.001 (^***); P-값<0.0001 (^****).
도 5a 내지 도 5h는 미생물총의 TFH 세포 조절이 비만을 방지한다는 것을 보여준다. 도 5a 내지 도 5h는 WT 또는 T-Myd88^-/- T 세포 중 어느 하나가 제공되기 전 1주에 WT 및 T-Myd88^-/- 미생물총의 혼합물이 제공된 Tcrb^-'^- 마우스를 보여준다. 이후, 마우스를 8주 동안 개별적으로 수용하고, 일반 음식을 섭식하면서 체중 증가 및 미생물총 조성에 대해 측정되었다(코호트당 n = 6). 도 5a는 증가된 체중의 곡선 하 면적(AUC) 분석을 보여준다. 도 5b는 대표적인 유세포분석법 선도가 8주에 항체 결합된 박테리아의 백분율을 정량화하기 위해 SYBR Green+ 세포에서 이전에 개폐되었다는 것을 보여준다. Rag1^-'^- 대변 대조군(회색 음영 영역); Tcrb^-'^- 대변(회색 선); WT(청색 선); T-Myd88^-/-(적색 선). 오른쪽으로의 다중 동물의 정량화. 도 5c는 0일, 7일 및 28일에 WT 또는 T-Myd88^-/- T 세포가 제공된 TCRβ^-'^- 마우스의 미생물총 사이의 브레이-커티스(Bray-Curtis) 거리의 바이올린 선도를 보여준다. 도 5d는 WT 또는 T-Myd88^-/- CD4+ T 세포가 제공된 Tcrb^-'^- 마우스에서 데설포비브리오나세아에 풍부도와 클로스트리데아세아에 풍부도 사이의 보정을 보여준다(n = 12). 도 5e는 클로스트리디아세아에의 상대 풍부도를 보여준다(4주. 오차 막대는 SD를 나타낸다. 도 5f는 IgA-결합된 및 IgA-비결합된 박테리아가 WT 또는 T-Myd88-'-가 제공된 Tcrb^-'^- 마우스의 맹장 내용물로부터 분석되었다는 것을 보여준다.
CD4⁺ T 세포. IgA 지수는 결합의 차이를 나타내도록 각각의 OTU에 계산되었다. 양수 값은 결합된 분획에서의 농후화를 나타내고, 음수 값은 비결합된 분획에서의 농후화를 나타낸다. 통계학적 유의차를 갖는 모든 OTU가 도시되어 있다(p<0.05, 윌콕슨 순위합 시험). 각각의 패널은 이의 가장 정밀한 분류 수치(속(g), 과(f) 또는 목(o))에 따른 동일한 분류학적 콜로 OTU를 그룹화한다. 각각의 점은 개별 동물을 나타내지만, 패널 내의 상이한 색상은 분류군 내의 OTU를 구별하고, 각각의 선은 각각의 OTU로부터의 평균을 연결한다. 하나의 실험으로부터의 데이터. 도 5g는 WT 또는 T-Myd88^-/- 대변 미생물총에 의해 콜로니화된 Rag1^-'^- 마우스의 퍼센트 증가된 체중을 보여준다(코호트당 n = 7). 2개의 독립 실험을 나타냄. 도 5h는 공여자 WT 또는 Bcl6^-'^- T 세포를 받고 일반 음식을 섭식한 T-Myd88^-/- 마우스에서 증가된 체중의 AUC를 보여준다(WT 공여자, n = 5; T-Myd88^-/- 공여자, n = 6). 2개의 독립 실험을 나타냄. 2꼬리, 독립 t 시험(a, b, h), Tukey 다중 비교와 함께 반복 측정 ANOVA(c), 스피어먼 순위 보정(d), 반복 측정 ANOVA 다중 비교를 위한 Sidak 보정(g) 및 만-휘트니 U 시험(e)을 사용한 P-값<0.05(^*); P-값<0. 01(^**); P-값<0.001(^***); P-값<0.0001(^****). 오차 막대는 SD를 나타낸다(d, g).
도 6a 내지 도 6m은 클로스트리디아가 장 내에 지질 흡수를 억제한다는 것을 보여준다. 도 6a는 .25 이하의 유의적 FDR를 갖는 경로가 포함된 1년령 WT 및 T-Myd88^-'^- 마우스로부터의 간에서 RNA 발현으로부터의 GSEA 분석을 보여준다. 도 6b는 간 전사체의 비의 화산 선도를 보여준다. 강조된 유전자는 지질 대사에 관여된다. 도 6c는 항생제(ABX)와 함께 또는 이것 없이 HFD를 섭식한 WT 및 T-Myd88^-'^- 마우스의 간 내의 Cd36 RNA 발현을 보여준다(WT, n = 5; T-Myd88^-/-, n = 4; WT ABX, n = 5, T-Myd88^-/- ABX, n = 5). 2개의 독립 실험을 나타냄. 도 6d는 비히클 대조군 또는 포자-형성 클로스트리디아 집합체가 위관영양된 T-Myd88^-'^- 마우스의 간에서의 Cd36 RNA 발현을 보여준다(대조군 n = 4; 클로스트리디아 집합체, n = 5). 2개의 독립 실험을 나타냄. 도 6e 내지 도 6g는 클로스트리디아 집합체의 콜로니화를 갖거나 갖지 않는 무균 마우스를 보여준다(GF, n = 8; 클로스트리디아, n = 10). 도 6e는 간에서의 Cd36 RNA 발현을 보여준다. 도 6f는 소장(SI)에서의 Cd36 RNA 발현을 보여준다. 도 6g는 SI에서의 Fasn RNA 발현을 보여준다. 도 6h는 4시간 동안 배지 또는 박테리아 무세포-상청액(CFS)과 항온처리된 MODE-K 세포에서의 Cd36 RNA 발현을 보여준다. 3개의 독립 실험을 나타냄. 도 6i는 무균 마우스가 클로스트리디아 집합체 또는 2개의 데설포비브리오 종(D. 피게르 및 D. 데설푸리칸스)와 연관된다는 것을 보여준다. 체지방 백분율은 NMR 분석에 의해 측정되었다. (무균 마우스 n = 12; 클로스트리디아, n = 16, 데설포비브리오, n = 14). 도 6j, 도 6k는 무균 마우스가 D. 피게르 및 D. 데설푸리칸스(DSV)를 갖거나 갖지 않는 클로스트리디아 집합체와 연관된다는 것을 보여준다. 체지방 백분율은 NMR(클로스트리디아 단독 n = 16; 클로스트리디아 + DSV n = 21)(j) 및 q-PCR에 의해 소장 내의 Cd36에 의해 측정되었다(도 6k). 도 6l, 도 6m은 HFD를 섭식한 WT 및 T-Myd88^-/- 마우스의 혈청 및 맹장 내용물 내의 GC-MS-검출된 대사물질을 보여준다(코호트당 n = 6). <0.06의 P-값(

), P-값<0.05(^*); P-값<0.01(^**); P-값<0.001(^***); P-값<0.0001(^****) 다중 비교를 위한 2꼬리, 독립 t 시험(c-g, i-k) 및 1방향 ANOVA Sidak 보정(도 6h). 데이터는 평균 +/- SD로 제시된다.
도 7a 내지 도 7g는 T 세포 내의 Myd88 신호전달이 결여된 마우스가 노화성 비만을 발생시킨다는 것을 보여준다. 도 7a는 2개월령에 시작하여 마우스가 늙으면서 체중이 증가한다는 것을 보여준다(WT, n = 8; T-Myd88^-/- n = 7). 도 7b는 2개월령에 시작하여 마우스가 늙으면서 증가된 지방의 백분율을 보여준다(WT, n = 8; T-Myd88^-/-, n = 7). 도 7c는 1년령 WT 및 T-Myd88^-/- 마우스의 내당능 시험 동안 i.p. 포도당(1 mg/g) 주사 후에 시간에 걸쳐 측정된 혈당 수치(mg/dL)를 보여준다. 도 7d는 2개월에 일반 음식을 섭식하면서 마우스당 음식 섭취의 그램을 보여준다(코호트당 n = 3). 도 7e는 1년령 마우스가 일반 음식을 섭식하면서 마우스당 음식 섭취의 그램을 보여준다(그룹당 n = 5). 도 7f는 2개월령의 열, 에너지 소비 및 총 이동을 보여준다(그룹당 n = 3). 도 7g는 1년령 마우스의 열, 에너지 소비 및 총 이동을 보여준다(그룹당 n = 5). 통계: 다중 비교를 위한 Sidak 보정에 의한 반복 측정 ANOVA(도 7a, 도 7b, 도 7c), 2꼬리, 독립 t 시험(도 7d 내지 도 7g)을 사용한 p-값<0.05(^*); p-값<0.01 (^**); p-값<0.001(^***). 오차 막대는 SD를 나타낸다.
도 8a 내지 도 8b는 T-Myd88^-/- 마우스의 비만이 지방 식이 섭취 증가에 의해 가속된다는 것을 보여준다. 도 8a는 고지방 식이 섭식 후 동물 체중을 시간 경과에 따라 보여준다. 도 8b는 대조군 음식에서 또는 HFD 섭식 후 16주에 연령 일치된 표시된 동물에서 내장 지방 질량을 보여준다. 통계: 반복 측정 ANOVA(도 8a) 및 2꼬리, 독립 t 시험(도 8b)을 사용한 P-값<0.05(^*); P-값<0.01(^**); P-값<0.001(^***). 오차 막대는 SD를 나타낸다.
도 9a 내지 도 9c는 T-Myd88^-/- 마우스 내의 미생물 조성의 변화가 자발적인 체중 증가와 연관된다는 것을 보여준다. 도 9a는 비가중 unifrac 및 가중 unifrac에 의해 측정된 1년령 WT 및 T-Myd88^-'^- 마우스로부터의 회장 및 대변 16S 시퀀싱 샘플의 베타-다양성 분석을 보여준다(WT, n = 8; T-Myd88^-'^-, n = 7). 도 9b는 미생물 공동체의 랜덤 포레스트 분석을 보여준다. 도 9c는 대변 및 회장 미생물총에서의 클로스트리디아 OTU의 수 및 상대 풍부도를 보여준다(WT, n = 8; T-Myd88^-'^- n = 7). 통계: PERMANOVA(c)를 사용한 p-값<0.05(*); p-값<0.01(**); p-값<0.001(***).
도 10a 내지 도 10c는 WT 또는 T-Myd88^-/- 마우스로부터의 미생물총의 전사체학적 데이터를 보여준다. 도 10a는 대변 샘플에서의 박테리아 UniRef90 유전자 패밀리 전사체 풍부도의 비의 화산 선도를 보여준다. 도 10b는 WT 및 T-Myd88^-'^- 마우스 회장 및 대변에서 100만개당 독특하게 맵핑된 리드를 보여준다. 도 10c는 WT 및 T-Myd88^-'^- 대변 전사체로부터의 상당히 상이한 종의 100만개당 맵핑된 리드를 보여준다(유전자형당 n = 6). 통계: 2꼬리, 독립 t 시험을 사용한 p-값<0.05(^*); p-값<0.01(^**); p-값<0.001(^***). 오차 막대는 SD를 나타낸다.
도 11a 내지 도 11e는 T-Myd88^-/- 마우스 내의 군집붕괴가 동시수용 동안 WT 동물에 비만을 전달한다는 것을 보여준다. 도 11a는 동시수용 실험의 도식 및 동시수용 실험에 대한 시각표의 도식을 보여준다. 도 11b는 퍼센트 체중 증가를 보여주고, 도 11c는 퍼센트 지방을 보여주고, 도 11d는 HFD를 섭식한 분리된 또는 동시수용된 WT 및 T-Myd88^-/- 마우스에서의 VAT의 그램을 보여준다(코호트당 n = 4). 2개의 독립 실험을 나타냄. 도 11e는 HFD를 섭식한 분리된 또는 동시수용된 WT 및 T-Myd88^-/- 마우스의 내당능 시험 동안 i.p. 포도당(1 mg/g) 주사 후에 시간에 걸쳐 측정된 혈당 수치(mg/dL)를 보여준다(코호트당 n = 4). 통계: p-값<0.05(^*); p-값<0.01(^**); p-값<0.001(^***) 반복 측정 ANOVA(b, e), 2꼬리, 독립 t 시험(c, d). 오차 막대는 SD를 나타낸다.
도 12a 내지 도 12f는 동시수용 동안 전파 가능한 유기체의 결정을 보여준다. 도 a 및 도 b는 동시수용 전에 및 동시수용 후 1주에 둘 다에서(도 12a) 및 이후 HFD의 14주 후에(도 12b) 일반 음식을 섭식한 분리된 또는 동시수용된 WT 및 T-Myd88^-'^- 마우스의 가중 Unifrac 분석에 의해 측정된 베타 다양성을 보여준다. 도 12c 및 도 12d는 최종 시점에 분리된 또는 동시수용된 WT 및 T-Myd88^-'^- 마우스로부터의 대변 16S 시퀀싱 샘플 내에 표시된 유기체의 상대 풍부도를 보여준다(코호트당 n = 4). 도 12e는 동시수용 후 바로 1주에 표시된 동물로부터의 대변 샘플 내의 데설포비브리오의 상대 풍부도를 보여준다. 도 12f는 동시수용의 12주 후에 표시된 동물에서의 데레아의 상대 풍부도를 보여준다. 통계: p-값<0.05(^*); p-값<0.01(^**); p-값<0.001(^***) permanova(a, b) 및 만-휘트니 U 시험(c-f).
도 13은 데설포비브리오의 증식이 클로스트리디아의 소실로 이어진다는 것을 보여준다. 그래프는 D. 데설푸리칸스와 함께 또는 이것 없이 콜로니화되고 HFD를 섭식한 마우스로부터의 대변 16S 시퀀싱 샘플 내의 라크노스피라세아에의 상대 풍부도를 보여준다(코호트당 n = 5). 통계: p-값<0.05(^*); p-값<0.01(^**); p-값<0.001(^***) 만-휘트니 U 시험.
도 14는 포자-형성 미생물에 의해 콜로니화된 무균 마우스로부터의 미생물총 조성을 보여준다. 포자-형성 클로스트리디아 집합체에 의해 콜로니화된 무균 마우스의 대변 미생물총의 16s 시퀀싱으로부터의 전체 그래프의 부분.
도 15a 내지 도 15i는 미생물총의 T 세포 형성화가 자발적인 체중 증가와 연관된다는 것을 보여준다. 도 15a는 전달의 다수의 방법을 통해 WT 또는 T-Myd88^-/- 미생물총이 제공된 무균 마우스에 체중이 증가하였다는 것을 보여준다(CF = 교차 촉진됨). 도 15b는 실험 전략의 도식을 보여준다. Tcrb^-/- 동물은 항생제 처리에 의해 미생물총이 고갈되고, 후속하여 WT 또는 T-Myd88^-/- 동물로부터의 미생물총의 1:1 혼합물이 경구영양되었다. WT 또는 T-Myd88^-/- T 세포는 T 세포 결핍 동물로 이식되었다. 도 15c는 0일, 1주 및 8주에 WT 또는 T-Myd88^-/- 세포가 제공된 Tcrb^-/- 마우스 내의 IgA 결합된 박테리아의 백분율을 정량화하도록 사용된 유세포분석법을 보여준다(코호트당 n = 6). 도 15d, 도 15e는 0일, 1주 및 8주에 WT 또는 T-Myd88^-/- 세포가 제공된 Tcrb^-/- 마우스 내의 IgG1 결합된 박테리아의 백분율을 정량화하도록 사용된 유세포분석법을 보여준다. 도 15f는 0일, 1주 및 8주에 WT 또는 T-Myd88^-/- 세포가 제공된 Tcrb^-/- 마우스 내의 IgG3 결합된 박테리아의 백분율을 정량화하도록 사용된 유세포분석법을 보여준다. 도 15g는 내강 IgA의 농도(μg/mL)가 ELISA를 사용하여 8주 후 WT 또는 T-Myd88^-/- 세포가 제공된 Tcrb^-/- 마우스 내에 측정되었다는 것을 보여준다. 오차 막대는 SD를 나타낸다. 도 15h는 대표적인 유세포분석법 선도가 8주 후 WT 또는 T-Myd88^-/- 세포가 제공된 Tcrb^-/- 마우스 내에 IgG3 결합된 박테리아의 백분율을 정량화하기 위해 SyBR Green⁺ 세포에서 이전에 개폐되었다는 것을 보여준다. 도 15i는 WT 또는 T-Myd88^-/- 대변 미생물총에 의해 콜로니화된 Rag1 -/- 마우스의 증가된 체중의 AUC를 보여준다(코호트당 n = 7). 통계: p-값<0.05(^*); p-값<0.01(^**); p-값<0.001(^***) 2꼬리, 독립 t 시험(a, c-i).
도 16a 내지 도 16b는, 박테리아 공동체의 IgA 표적화(도 16a), IgA 결합된 및 비결합된 박테리아가 WT 또는 T-Myd88^-/- T 세포가 제공된 Tcrb^-/-의 맹장 내용물로부터 분석되었다는 것을 보여준다. IgA 지수는 각각의 동물에서의 각각의 속에 대해 계산되었다(열). 버블은 결합된 또는 비결합된 분획에서의 농후화에 의해 색상표시되고 농후의 양에 의해 크기화되었다(IgA 지수의 절대 값). 속 분류군 줄은 이의 분류학적 종류에 따라 색상표시된다. 유전자형 사이에 상당히 차등적으로 결합된 속이 표시된다(^*, p<0.05; 윌콕슨 순위합 시험). 도 16b는 이 데이터세트에서의 데설포비브리오 IgA 표적화를 보여준다. 오차 막대는 SD를 나타낸다.
도 17a 내지 도 17c는 장 대사물질이 체중 증가와 연관된다는 것(도 17a), WT 및 T-Myd88^-/- 마우스의 맹장 내용물의 GC-MS 검출된 SCFA(WT, n = 3; T-Myd88^-/- n = 5)를 보여준다. 도 17b는 2개월령에 시작하여 대조군 식이 또는 5-ASA 식이를 섭식한 WT 및 T-Myd88^-/- 마우스에 의해 증가된 체중의 그램을 보여준다(WT CTRL, n = 3; WT 5-ASA, n = 4; T-MYD CTRL, n = 3; TMYD 5-ASA, n = 4). 오차 막대는 SD를 나타낸다. 도 17c는 클로스트리디아 및 지방산 및 모노아실글리세롤 대사물질의 상대 풍부도 사이의 스피어먼 순위 상관관계를 보여준다(n = 12). 통계: p-값<0.05(^*); p-값<0.01(^**); p-값<0.001(^***) 2꼬리, 독립 t 시험(a) 및 반복 측정 ANOVA(b).
도 18은 4개의 균주(즉, 클로스트리디아 아나에로보락스 균주, 클로스트리듐 XIVa, 클로스트리듐 IV 및 라크노스피라세아에 종)의 개선된 클로스트리디아 집합체(rCC-4)가 지방증을 감소시키는 데 충분하다는 것을 보여준다. 암컷(F) 및 수컷(M) 무균 마우스를 더 복잡한 클로스트리디아 집합체로부터 배양된 4개의 균주(rCC)에 의해 콜로니화하고, 콜로니화 후 4주에 NMR에 의해 분석하였다. rCC-4는 암컷이 아닌 수컷에서 복잡한 클로스트리디아 집합체와 동일한 정도로 지방증을 감소시켰다.
도 19a 내지 도 19g는 클로스트리디아 처리가 MetS 및 IBD를 개선한다는 것을 보여준다. 도 19a 내지 도 19c는 HFD에 있으면서 3개월 동안 3일마다 비히클 대조군 또는 포자-형성 클로스트리디아 집합체가 위관영양된 T-MyD88^-/- 마우스를 보여준다. 도 19a, 증가된 체중; 및 도 19b, NMR에 의해 측정된 것과 같은 총 지방 백분율. c, 내장 지방 조직. 도 20d 및 도 20e는 둘 다 도 19a 및 도 19d, 공복 혈당에서처럼 HFD에 놓이고 클로스트리디아에 의해 처리된 야생형(WT) 및 T-MyD88^-/-(KO)를 보여준다. 도 19e는 HOMA-IR 값을 보여준다. 도 19f 및 도 19g는 제공된 동물이 DSS 대장염의 3회 사이클(DSS 5일 및 물 10일)에 있으면서 격일마다 클로스트리디아 집합체가 경구로 위관영양된다는 것을 보여준다. f는 결장 길이이고, g는 결장의 H&E 염색된 절편으로부터의 병리학 점수이다. p-값<0.05(^*); p-값<0.001.

본 개시내용은 본 발명의 하기 상세한 설명, 도면 및 본원에 포함된 실시예를 참조하여 더 용이하게 이해될 수 있다.

본 방법 및 조성물은 개시 및 기재에 앞서, 이들이 달리 규정되지 않는 한 특정 합성 방법, 또는 달리 규정되지 않는 한 특정 시약으로 제한되지 않고, 따라서 변경될 수 있음을 당연한 것으로 이해해야 한다. 본원에 사용된 전문용어가 오직 특정 양태를 기술할 목적이고 제한을 의도하지 않음을 또한 이해해야 한다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실행 또는 시험에 사용될 수 있지만, 예시적인 방법 및 재료가 이제 기재된다.

더욱이, 달리 명확히 기술되지 않는 한, 이것은 어떤 방식이든 본원에 기재된 임의의 방법이 이의 단계가 특정 순서로 실행될 것을 요하는 것으로 해석되도록 의도되지 않는다고 이해되어야 한다. 따라서, 방법 청구항이 실제로 이의 단계가 후행하는 순서를 열거하지 않거나 이것이 특정 순서로 단계가 제한되는 것으로 청구항 또는 설명에서 달리 구체적으로 기술하지 않는 경우, 어떤 방식이든 순서가 어느 모로 보나 추론되는 것으로 의도되지 않는다. 이는 단계 또는 조작 흐름의 배열, 문법상 구성 또는 구두법으로부터 유래된 명백한 의미, 및 본 명세서에 기재된 양태의 수 또는 유형과 관련하여 논리적인 문제를 포함하여 해석에 대한 임의의 가능한 비표현된 기준을 유보한다.

본원에 언급된 모든 공보는 그 공보가 인용된 것과 연결되어 방법 및/또는 재료를 개시하고 기술하도록 본원에 참고로 포함된다. 본원에 기술된 공보는 본원의 출원일 전에 오로지 이의 개시내용을 위해 제공된다. 본 발명이 선행 발명 덕분에 이러한 공보에 선행할 자격이 부여되지 않는다는 인정으로 본원에서 해석되지 않아야 한다. 추가로, 본원에 제공된 공보일은 실제 공보 일자와 상이할 수 있고, 독자적인 확인을 요할 수 있다.

정의

본 명세서 및 첨부된 청구항에 사용된 것과 같이, 단수 형태("a", "an" 및 "the")는 문맥이 명확히 달리 기술하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다.

본원에 사용된 것과 같이 "또는"이라는 단어는 특정 목록의 임의의 하나의 구성원을 의미하고, 또한 그 목록의 구성원의 임의의 조합을 포함한다.

범위는 본원에서 "약" 또는 "대략" 하나의 특정 값에서, 및/또는 "약" 또는 "대략" 다른 특정 값까지로 표현될 수 있다. 이러한 범위가 표현될 때, 추가의 양태는 하나의 특정 값에서 및/또는 다른 특정 값까지를 포함한다. 유사하게, 값이 근사치로 표현될 때, "약," 또는 "대략"의 선행사의 사용에 의해, 특정 값이 추가의 양태를 형성한다고 이해될 것이다. 각각의 범위의 종점이 다른 종점과 관련하여 유의미할 뿐만 아니라 다른 종점과 무관하게 유의미하다고 추가로 이해될 것이다. 본원에 개시된 다수의 값이 있고, 각각의 값이 그 특정 값을 값 자체 이외에 "약" 그 특정 값으로 본원에서 또한 개시되는 것으로 또한 이해된다. 예를 들어, 값 "10"이 개시되면, "약 10"이 또한 개시된다. 2의 특정 단위 사이에 각각의 단위가 또한 개시되는 것으로 또한 이해된다. 예를 들어, 10 및 15가 개시되면, 11, 12, 13 및 14가 또한 개시된다.

본원에 사용된 것과 같이, "선택적인" 또는 "선택적으로"라는 용어는 후속하여 기재된 사건 또는 상황이 발생할 수 있거나 발생하지 않을 수 있다는 것, 및 설명이 상기 사건 또는 상황이 발생하는 경우 및 그렇지 않은 경우를 포함한다는 것을 의미한다.

본원에 사용된 것과 같이, "샘플"이라는 용어는 대상체로부터의 조직 또는 장기; (대상체 내의, 대상체, 또는 배양물에서 유지된 세포 또는 배양된 세포주로부터 직접 취한) 세포; 세포 용해물(또는 용해물 분획) 또는 세포 추출물; 또는 본원에 기재된 것과 같이 분석된 세포 또는 세포 재료로부터 유래된 하나 이상의 분자를 함유하는 용액(예를 들어, 폴리펩타이드 또는 핵산)이 의도된다. 샘플은 또한 세포 또는 세포 성분을 함유하는 임의의 체액 또는 분비물(예를 들어, 비제한적인 예로서 혈액, 뇨, 대변, 타액, 눈물, 담즙, 뇌척수액)일 수 있다. 일부 양태에서, 뇌, 척수, 뇌척수액 또는 혈액으로부터 샘플을 취할 수 있다.

본원에 사용된 것과 같이, "대상체"라는 용어는 투여의 표적, 예를 들어 인간을 지칭한다. 이와 같이 개시된 방법의 대상체는 포유류, 어류, 조류, 파충류 또는 양서류와 같은 척추동물일 수 있다. "대상체"라는 용어는 또한 가축 동물(예를 들어, 고양이, 개 등), 가축(예를 들어, 소, 말, 돼지, 양, 염소 등) 및 실험실 동물(예를 들어, 마우스, 토끼, 래트, 기니아 피그, 초파리 등)을 포함한다. 일 양태에서, 대상체는 포유류이다. 다른 양태에서, 대상체는 인간이다. 상기 용어는 특정 연령 또는 성별을 나타내지 않는다. 이와 같이, 성인, 어린이, 청소년 및 신생아 대상체뿐만 아니라 태아가, 남성이든 또는 여싱이든, 포괄되는 것으로 의도된다.

본원에 사용된 것과 같이, "환자"라는 용어는 질환 또는 장애로 이환된 대상체를 지칭한다. "환자"라는 용어는 인간 및 수의학적 대상체를 포함한다. 개시된 방법의 일부 양태에서, "환자"는 예를 들어 투여 단계 전에 다발성 경화증의 치료의 필요성이 진단된다. 개시된 방법의 일부 양태에서, "환자"는 예를 들어 투여 단계 전에 II형 당뇨병, 비만 또는 염증성 장 질환의 치료의 필요성이 진단된다.

본원에 사용된 것과 같이, "정상"이라는 용어는 II형 당뇨병, 비만 또는 염증성 장 질환을 갖지 않거나 II형 당뇨병, 비만 또는 염증성 장 질환을 발생시킬 감수성이 증가되지 않는 개체, 샘플 또는 대상체를 지칭한다.

본원에 사용된 것과 같이, "감수성"이라는 용어는 대상체가 질환을 갖는 것으로 임상적으로 진단되는 확률(likelihood)을 지칭한다. 예를 들어, II형 당뇨병, 비만 또는 염증성 장 질환에 대하여 증가된 감수성을 갖는 인간 대상체는 대상체가 II형 당뇨병, 비만 또는 염증성 장 질환을 갖는 것으로 임상적으로 진단되는 확률이 증가된 인간 대상체를 지칭할 수 있다.

본원에 사용된 것과 같이, "포함하는"이라는 용어는 "이루어진" 및 "본질적으로 이루어진"의 양태를 포함할 수 있다.

본원에 사용된 것과 같이, "대조군"은 II형 당뇨병, 비만 또는 염증성 장 질환을 갖지 않는 정상 대상체 또는 정상 대상체로부터의 조직 중 어느 하나로부터의 샘플이다.

본원에 사용된 것과 같이, "과발현"은 정상 샘플에서 검출된 발현보다 큰 발현을 의미한다. 예를 들어, 과발현된 핵산은 정상보다 높은 약 1의 표준 편차, 또는 정상보다 높은 약 2의 표준 편차, 또는 정상 발현 수준보다 높은 약 3의 표준 편차로 발현될 수 있다. 따라서, 대조군 발현 수준보다 높은 약 3의 표준 편차로 발현된 핵산은 과발현된 핵산이다.

본원에 사용된 것과 같이, "치료한다"는 질환 또는 병태를 예방하거나, 이의 효과의 악화를 지연시키거나, 질환의 효과를 부분적으로 또는 완전히 역전하기 위해 II형 당뇨병, 비만 또는 염증성 장 질환을 갖는 대상체, 예컨대 인간 또는 다른 포유류(예를 들어, 동물 모델)에게 본 발명의 화합물 또는 분자를 투여하는 것을 의미하도록 의도된다.

본원에 사용된 것과 같이, "예방한다"는 감수성이 증가된 대상체가 II형 당뇨병, 비만 또는 염증성 장 질환을 발생시키거나 II형 당뇨병, 비만 또는 염증성 장 질환을 발생시킬 기회를 최소화하는 것을 의미하도록 의도된다.

본원에 사용된 것과 같이, "기준품", "기준 발현", "기준 샘플", "기준 값", "대조군", "대조군 샘플" 및 기타와 같은 용어는, 하나 이상의 미생물의 샘플 또는 발현 수준의 맥락에서 사용될 때, 기준 표준품을 지칭하는데, 여기서 기준품은 상이한 조직(즉, 동일한 조직이 아니라, 다수의 조직) 중에서 일정한 수준으로 발현되고, 실험 상태에 의해 영향을 받지 않고, (예를 들어, II형 당뇨병, 비만 또는 염증성 장 질환을 겪지 않는) 미리결정된 질환 상태의 샘플에서의 수준을 나타낸다. 기준 값은 미리결정된 표준 값 또는 미리결정된 표준 값의 범위일 수 있어서, 무병, 또는 병의 미리결정된 유형 또는 중증도를 나타낸다.

조성물

본 개시내용은 박테리아 단리물 및 공동체를 함유하는 조성물 및 이를 사용하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 개시내용은 본원에, 특히 표 1에 개시된 것과 같이 박테리아 집합체로부터의 하나 이상의 미생물, 또는 이들의 혼합물을 함유하는 조성물에 관한 것이다. 바람직한 실시형태에서, 상기 조성물은 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3 및 서열 번호 4를 포함하는 16S rDNA 서열을 갖는 2개 이상의 박테리아 균주를 포함할 것이다. 미생물은 서열 번호 1 내지 서열 번호 4에 상응하고 이것과 적어도 98% 동일한 16S 리보솜 유전자 서열을 확인하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본원에는 새로 확인된 박테리아가 개시되어 있다. 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3 및 서열 번호 4를 포함하는 16S rDNA 서열을 갖는 박테리아가 클로스트리듐 속에 속한다는 것이 발견되었다. 일부 양태에서, 본원에 기재된 조성물은 적어도 하나의 박테리아를 포함하고, 박테리아는 클로스트리듐 종이다.

클로스트리디아 아나에로보락스. 본원에는 박테리아, 클로스트리디아 아나에로보락스가 개시되어 있다. 본원에 사용된 것과 같이 클로스트리디아 아나에로보락스는 서열 번호 1과 적어도 98%의 서열 동일성을 공유하는 16S 핵산 서열을 갖는 박테리아를 지칭한다. 클로스트리디아 아나에로보락스는 NRRL 또는 ATCC 수탁 번호 _____를 갖는다. 클로스트리디아 아나에로보락스는 CD4-Cre⁺ 마우스(WT)의 소장의 하부로부터 대변 펠릿 및 내강 내용물로부터 단리되었다.

클로스트리듐 XIVa. 본원에는 박테리아, 클로스트리듐 XIVa가 개시되어 있다. 본원에 사용된 것과 같이 클로스트리듐 XIVa는 서열 번호 2와 적어도 98%의 서열 동일성을 공유하는 16S 핵산 서열을 갖는 박테리아를 지칭한다. 클로스트리듐 XIVa는 NRRL 또는 ATCC 수탁 번호 _____를 갖는다. 클로스트리듐 XIVa는 CD4-Cre⁺ 마우스(WT)의 소장의 하부로부터 대변 펠릿 및 내강 내용물로부터 단리되었다.

클로스트리듐 IV. 본원에는 박테리아, 클로스트리듐 IV가 개시되어 있다. 본원에 사용된 것과 같이 클로스트리듐 IV는 서열 번호 3과 적어도 98%의 서열 동일성을 공유하는 16S 핵산 서열을 갖는 박테리아를 지칭한다. 클로스트리듐 IV는 NRRL 또는 ATCC 수탁 번호 _____를 갖는다. 클로스트리듐 IV는 CD4-Cre⁺ 마우스(WT)의 소장의 하부로부터 대변 펠릿 및 내강 내용물로부터 단리되었다.

라크노스피라세아에 종. 본원에는 박테리아, 라크노스피라세아에 종이 개시되어 있다. 본원에 사용된 것과 같이 라크노스피라세아에 종은 서열 번호 4와 적어도 98%의 서열 동일성을 공유하는 16S 핵산 서열을 갖는 박테리아를 지칭한다. 라크노스피라세아에 종은 NRRL 또는 ATCC 수탁 번호 _____를 갖는다. 라크노스피라세아에 종은 CD4-Cre⁺ 마우스(WT)의 소장의 하부로부터 대변 펠릿 및 내강 내용물로부터 단리되었다.

클로스트리디아 집합체. 본 개시내용은 박테리아 단리물 및 공동체를 함유하는 조성물 및 이를 사용하는 방법에 관한 것이다. 클로스트리디아 집합체(2개 이상의 구별되는 박테리아 균주의 혼합물)이 본원에 개시된다. 특히, 본 개시내용은 본원에, 특히 표 1에 개시된 것과 같이 박테리아 집합체로부터의 하나 이상의 미생물 또는 이들의 혼합물을 함유하는 조성물에 관한 것이다. 일부 양태에서, 상기 조성물은 표 1에 열거된 것으로부터 2개 이상의 박테리아 균주를 포함할 것이다. 미생물은 서열 번호 1 내지 서열 번호 4에 상응하고 이것과 적어도 98% 동일한 16S 리보솜 유전자 서열을 확인하는 것 및/또는 박테리아를 각각 NRRL 또는 ATCC 수탁 번호 ____, ____, ____ 및 ____와 비교하는 것을 특징으로 할 수 있다. 일부 양태에서, 클로스트리디아 집합체는 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3 및 서열 번호 4를 포함하는 16S rDNA 서열을 갖는 박테리아의 2개 이상의 균주를 포함한다. 일부 양태에서, 클로스트리디아 집합체는 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3 및 서열 번호 4를 포함하는 16S rDNA 서열을 갖는 박테리아의 3개 이상의 균주를 포함한다. 일부 양태에서, 클로스트리디아 집합체는 각각 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3 및 서열 번호 4를 포함하는 16S rDNA 서열을 갖는 박테리아의 4개의 균주를 포함한다.

일부 양태에서, 클로스트리디아 집합체는 박테리아의 임의의 다른 균주의 부재 하에 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3 및 서열 번호 4를 포함하는 16S rDNA 서열을 갖는 박테리아의 2개 이상의 균주를 포함한다. 일부 양태에서, 클로스트리디아 집합체는 박테리아의 임의의 다른 균주의 부재 하에 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3 및 서열 번호 4를 포함하는 16S rDNA 서열을 갖는 박테리아의 3개 이상의 균주를 포함한다. 일부 양태에서, 클로스트리디아 집합체는 박테리아의 임의의 다른 균주의 부재 하에 각각 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3 및 서열 번호 4를 포함하는 16S rDNA 서열을 갖는 박테리아의 4개의 균주를 포함한다.

일부 양태에서, 클로스트리디아 집합체는 표 1에 열거된 박테리아 균주 4개 이하를 포함한다. 일부 양태에서, 클로스트리디아 집합체는 표 1의 박테리아 균주 2개 이상을 포함한다. 일부 양태에서, 클로스트리디아 집합체는 클로스트리디아 아나에로보락스 속, 클로스트리듐 XIVa 및 클로스트리듐 IV 및 라크노스피라세아에 종을 포함한다. 일부 양태에서, 클로스트리디아 집합체는 클로스트리디아 아나에로보락스, 클로스트리듐 XIVa, 클로스트리듐 IV, 라크노스피라세아에 종 및 표 1의 박테리아 균주 하나 이상을 포함한다. 일부 양태에서, 집합체에서의 다양한 박테리아는 이의 16S 리보솜 유전자 서열에 의해 확인될 수 있다.

일부 양태에서, 본원에 개시된 클로스트리디아 집합체는 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3 및 서열 번호 4를 포함하는 16S rDNA 서열을 갖는 박테리아의 4개 초과의 균주를 포함하는 더 복잡한 클로스트리디아 집합체를 포함하는 복합 미생물 공동체와 동일한 정도로 대상체에서 콜로니화될 때 대상체에서 지방증을 감소시킬 수 있다.

일부 양태에서, 본원에 개시된 클로스트리디아 집합체는 각각 비치료된 WT 마우스 또는 T-MyD88-/- 마우스와 비교할 때 고지방 식이를 섭식할 때 WT 마우스 또는 비만 취약 T-MyD88-/- 마우스에서 체중 증가 및 지방 축적을 감소시킬 수 있다.

일부 양태에서, 본원에 개시된 클로스트리디아 집합체는 각각 비치료된 WT 마우스 또는 T-MyD88-/- 마우스와 비교할 때 고지방 식이를 섭식할 때 WT 마우스 또는 비만 취약 T-MyD88-/- 마우스에서 체지방 백분율을 낮추고 VAT 질량을 감소시킬 수 있다.

일부 양태에서, 본원에 개시된 클로스트리디아 집합체는 각각 비치료된 WT 마우스 또는 T-MyD88-/- 마우스와 비교할 때 고지방 식이를 섭식할 때 WT 마우스 또는 비만 취약 T-MyD88-/- 마우스에서 혈당 수치를 감소시키고 인슐린 저항성을 감소시킬 수 있다.

본원에는 대상체에서 지방증을 감소시키고, 대상체에서 체중 증가 및/또는 지방 축적을 감소시키고, 대상체에서 체지방 백분율을 저하하고/하거나 내장 지방 조직(VAT) 질량을 감소시키고, 대상체에서 혈당 수치를 감소시키고/시키거나 인슐린 저항성을 감소시키고, 대상체의 소장에서 지질 흡수를 억제하고, 대상체의 간에서 CD36을 하향조절하고 대상체에서 장 상피 내의 지질 흡수 유전자의 발현을 억제하기 위한 클로스트리디아 집합체가 개시되어 있다. 일부 양태에서, 클로스트리디아 집합체는 표 1에 열거된 박테리아 균주 4개 이하를 포함한다. 일부 양태에서, 표 1의 박테리아 균주의 임의의 2개 이상의 조합은 클로스트리디아 집합체에 사용될 수 있다. 일부 양태에서, 클로스트리디아 집합체는 클로스트리디아 아나에로보락스 속, 클로스트리듐 XIVa 및 클로스트리듐 IV 및 라크노스피라세아에 종을 포함한다. 일부 양태에서, 집합체에서의 다양한 박테리아는 이의 16S 리보솜 유전자 서열에 의해 확인될 수 있다.

본원에는 클로스트리디아 집합체로부터의 상청액을 포함하는 조성물이 개시되어 있다. 본원에는 또한 클로스트리듐 집합체를 포함하는 조성물이 개시되어 있다. 일부 양태에서, 클로스트리디아 집합체는 클로스트리디아 아나에로보락스 속, 클로스트리듐 XIVa, 클로스트리듐 IV 및 라크노스피라세아에 종을 포함한다. 일부 양태에서, 클로스트리디아 집합체는 클로스트리디아 아나에로보락스 속, 클로스트리듐 XIVa, 클로스트리듐 IV 및 라크노스피라세아에 종 중 하나 이상을 포함한다. 일부 양태에서, 클로스트리디아 집합체는 클로스트리디아 아나에로보락스 속, 클로스트리듐 XIVa, 클로스트리듐 IV 및 라크노스피라세아에 종 중 2개 이상을 포함한다. 일부 양태에서, 클로스트리디아 집합체는 클로스트리디아 아나에로보락스 속, 클로스트리듐 XIVa, 클로스트리듐 IV 및 라크노스피라세아에 종 중 3개 이상을 포함한다. 일부 양태에서, 클로스트리디아 집합체는 클로스트리디아 아나에로보락스 속, 클로스트리듐 XIVa, 클로스트리듐 IV 및 라크노스피라세아에 종으로 이루어진다. 일부 양태에서, 클로스트리디아 집합체는 클로스트리디아 아나에로보락스 속, 클로스트리듐 XIVa, 클로스트리듐 IV 및 라크노스피라세아에 종 중 하나 이상으로 이루어진다. 일부 양태에서, 클로스트리디아 집합체는 클로스트리디아 아나에로보락스 속, 클로스트리듐 XIVa, 클로스트리듐 IV 및 라크노스피라세아에 종 중 2개 이상으로 이루어진다. 일부 양태에서, 클로스트리디아 집합체는 클로스트리디아 아나에로보락스 속, 클로스트리듐 XIVa, 클로스트리듐 IV 및 라크노스피라세아에 종 중 3개 이상으로 이루어진다.

일부 양태에서, 본원에 기재된 임의의 조성물은 대상체에서 장 상피 내의 지질 흡수 유전자의 발현을 억제할 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 기재된 임의의 조성물은 하나 이상의 지질 흡수 및/또는 합성 유전자를 억제할 수 있다. 일부 양태에서, 지질 흡수 유전자는 CD36, FasN, Dgat, Srepbf1, SLC27a1 및 SLC27a4일 수 있다.

일부 양태에서, 본원에 기재된 임의의 조성물은 대상체의 소장에서 지질 흡수를 억제할 수 있다.

일부 양태에서, 본원에 기재된 임의의 조성물은 대상체에서 체중 증가를 감소시킬 수 있다.

일부 양태에서, 본원에 기재된 임의의 조성물은 대상체의 간에서 CD36을 억제할 수 있다.

또한, 본원에는 2개 이상의 클로스트리디아 아나에로보락스 균주, 클로스트리듐 XIVa, 클로스트리듐 IV 및 라크노스피라세아에 종을 포함하는 박테리아의 집합체가 개시되어 있고, 집합체는 집합체가 투여되지 않는 대상체와 비교하여 대상체에서의 장 상피 내의 지질 흡수 유전자의 발현을 억제한다.

일부 양태에서, 본원에 기재된 조성물은 표 1로부터 선택된 하나 이상의 클로스트리디아 균주를 추가로 포함할 수 있다.

일부 양태에서, 개시된 조성물은 서열 번호 1 내지 서열 번호 4의 16S 리보솜 서열과 적어도 95, 96, 97, 98, 99 또는 이것 초과의 퍼센트 동일성의 상동성에 의해 확인 가능한 적어도 2개 이상의 박테리아 미생물을 포함한다. 일부 양태에서, 16S 서열의 양은 약 1.2 kb, 1.1 kb, 1.0 kb, 0.9 kb, 8 kb, 0.7 kb, 0.6 kb, 0.5 kb, 0.4 kb, 0.3 kb, 0.2 kb 또는 0.1 kb 미만 및 약 50 nt, 0.1 kb, 2 kb, 0.3 kb, 0.4 kb, 0.5 kb, 0.6 kb, 0.7 kb, 0.8 kb, 0.9 kb, 1.0 kb 또는 1.1 kb 초과이다. 일부 양태에서, 16S 리보솜 서열 상동성의 양은 약 150 nt 내지 500 nt, 예를 들어 약 250 nt이다. 2개의 핵산의 퍼센트 동일성을 결정하기 위해, 서열은 최적 비교 목적을 위해 정렬된다(예를 들어, 갭은 제2 핵산 서열에 의한 최적 정렬을 위해 제1 핵산 서열의 서열에서 도입될 수 있다). 상응하는 뉴클레오타이드 위치에서의 뉴클레오타이드는 이후 비교된다. 제1 서열에서의 위치가 제2 서열에서 상응하는 위치와 동일한 뉴클레오타이드에 의해 점유될 때, 그 분자는 그 위치에서 동일하다. 2개의 서열 사이의 퍼센트 동일성은 서열에 의해 공유된 동일한 위치의 수의 함수(즉, % 동일성 = 동일한 위치의 수/ 위치의 총 수 x 100)이다.

2개의 서열 사이의 퍼센트 상동성의 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다. 2개의 서열의 비교를 위해 사용된 수학적 알고리즘의 바람직한 비제한적인 예는 Karlin and Altschul (1993) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90:5873-5877에서처럼 변형된 Karlin and Altschul (1990) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 87:2264-2268의 알고리즘이다. 이러한 알고리즘은 Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램으로 도입된다. BLAST 뉴클레오타이드 검색은 본 개시내용의 핵산 분자와 유사하거나 상동성인 뉴클레오타이드 서열을 얻기 위해 NBLAST 프로그램, 점수 = 100, 워드 길이 =12로 수행될 수 있다. 비교 목적을 위해 갭핑된 정렬을 얻기 위해, Gapped BLAST는 Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402에 기재된 것처럼 사용될 수 있다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 사용할 때, 각각의 프로그램(예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 매개변수를 사용할 수 있다. 이 알고리즘은 DNA를 RNA와 정렬하도록 사용될 수 있고, 일부 경우에 단백질을 번역된 뉴클레오타이드 서열과 정렬하도록 사용될 수 있다.

일부 양태에서, 적어도 2개 이상의 미생물은 본 개시내용의 조성물에 포함된다. 2개 이상의 미생물이 조성물을 형성하는 경우, 미생물이 개시된 조성물을 생성하도록 동시배양될 수 있다는 것이 고려된다. 일부 양태에서, 개시된 조성물은 2개 이상의 균주의 개별 배양물을 조합하여 형성될 수 있다. 미생물은 당해 분야에 공지된 방법에 의해 전파될 수 있다. 예를 들어, 미생물은 혐기성 또는 호기성 조건 하에 액체 배지에서 전파될 수 있다. 미생물을 성장시키기 위해 사용된 적합한 액체 배지는 뉴트리언트 브로쓰 앤 트립틱 소이 아가(TSA: Tryptic soy agar) 등과 같은 당업자에게 공지된 것을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 조성물은 표 1에 열거된 균주의 전체 목록을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 조성물은 클로스트리디아 아나에로보락스, 클로스트리듐 XIVa, 클로스트리듐 IV 및 라크노스피라세아에 종의 균주 중 적어도 2개 이상을 포함한다.

일부 양태에서, 본원에 개시된 조성물은 각각의 클로스트리디아 균주의 적어도 1x10^-5개의 세포를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 조성물은 각각의 클로스트리디아 균주의 적어도 1x10^-6개의 세포를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 조성물은 각각의 클로스트리디아 균주의 적어도 1x10^-7개의 세포를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 조성물은 각각의 클로스트리디아 균주의 적어도 1x10^-8개의 세포를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 조성물은 각각의 클로스트리디아 균주의 적어도 1x10^-9개의 세포를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 조성물은 각각의 클로스트리디아 균주의 적어도 1x10^-10개의 세포를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 임의의 조성물의 단일 투여량은 각각의 클로스트리디아 균주의 1x10^-5개 내지 1x10^-10개의 세포를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 집합체의 세포는 활성이다.

일부 양태에서, 본원에 개시된 조성물은 불균형 미생물총과 연관된 질환 또는 장애를 갖는 대상체의 미생물총을 대체할 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 조성물은 기능이상 미생물총과 연관된 질환 또는 장애를 갖는 대상체의 미생물총을 대체할 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 조성물은 기능적 다양성이 감소된 미생물총과 연관된 질환 또는 장애를 갖는 대상체의 미생물총을 대체할 수 있다. 일부 양태에서, 불균형 미생물총(또는 기능이상 미생물총 또는 기능적 다양성이 감소된 미생물총)은 데설포비브리오의 증가 및 클로스트리디아의 감소일 수 있다. 일부 양태에서, 불균형 미생물총(또는 기능이상 미생물총 또는 기능적 다양성이 감소된 미생물총)은 데설포비브리오의 무 변화(또는 무 증식) 및 클로스트리디아의 감소일 수 있다. 일부 양태에서, 불균형 미생물총(또는 기능이상 미생물총 또는 기능적 다양성이 감소된 미생물총)은 클로스트리디아의 감소일 수 있다. 일부 양태에서, 불균형 미생물총(또는 기능이상 미생물총 또는 기능적 다양성이 감소된 미생물총)은 클로스트리디아의 부재 또는 결여일 수 있다.

일부 양태에서, 질환 또는 장애는 비만, 대사 증후군, 인슐린 결핍, 인슐린-저항성 관련된 장애, 포도당 과민증, 당뇨병 또는 염증성 장 질환일 수 있다. 일부 양태에서, 염증성 장 질환은 크론병 또는 궤양성 대장염일 수 있다. 일부 양태에서, 인슐린-저항성 관련된 장애는 당뇨병, 고혈압, 이상지질혈증 또는 심혈관 질환일 수 있다. 일부 양태에서, 당뇨병은 I형 당뇨병일 수 있다. 일부 양태에서, 당뇨병은 II형 당뇨병일 수 있다.

일부 양태에서, 본원에 개시된 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 상기 조성물은 또한 첨가제를 포함할 수 있다. 적합한 첨가제는 성장, 미생물에 의한 특정 대사물질의 생성을 지지하고, pH를 변경하고, 표적 대사물질을 농후화하고, 살충 효과를 향상시키는 당해 분야에 공지된 물질, 및 이들의 조합을 포함한다. 예시적인 첨가제는 탄소원, 질소원, 인원, 무기 염, 유기 산, 성장 배지, 비타민, 미네랄, 아세트산, 아미노산 및 기타를 포함한다.

적합한 탄소원의 예는 제한 없이 전분, 펩톤, 효모 추출물, 아미노산, 당, 예컨대 수크로스, 포도당, 아라비노스, 만노스, 글루코사민, 말토스, 사탕수수, 알팔파 추출물, 당밀, 럼 및 기타; 유기 산의 염, 예컨대 아세트산, 푸마르산, 아디프산, 프로피온산, 시트르산, 글루콘산, 말산, 피루브산, 말론산 및 기타; 알코올, 예컨대 에탄올, 글리세롤 및 기타; 오일 또는 지방, 예컨대 대두유, 미강유, 올리브유, 옥수수유 및 참깨유를 포함한다. 첨가된 탄소원의 양은 탄소원의 종류에 따라 변하고, 통상적으로 배지의 리터당 1 내지 100 그램이다. 상기 조성물에서의 탄소원의 중량 분획은 상기 조성물의 총 중량의 약 98% 이하, 약 95% 이하, 약 90% 이하, 약 85% 이하, 약 80% 이하, 약 75% 이하, 약 70% 이하, 약 65% 이하, 약 60% 이하, 약 55% 이하, 약 50% 이하, 약 45% 이하, 약 40% 이하, 약 35% 이하, 약 30% 이하, 약 25% 이하, 약 20% 이하, 약 15% 이하, 약 10% 이하, 약 5% 이하, 약 2% 또는 약 1% 이하일 수 있다. 바람직하게는, 알팔파는 약 1 내지 20%(w/v)의 농도로 주요 탄소원으로서 배지에 함유된다. 더 바람직하게는, 알팔파는 약 5 내지 12%(w/v)의 농도이다.

적합한 질소원의 예는 제한 없이 아미노산, 효모 추출물, 알팔파 추출물, 트립톤, 육추출물, 펩톤, 질산칼륨, 질산암모늄, 염화암모늄, 황산암모늄, 인산암모늄, 암모니아 또는 이들의 조합을 포함한다. 질소원의 양은 질소원에 따라 변하고, 통상적으로 배지의 리터당 0.1 내지 30 그램이다. 상기 조성물에서의 질소원의 중량 분획은 상기 조성물의 총 중량의 약 98% 이하, 약 95% 이하, 약 90% 이하, 약 85% 이하, 약 80% 이하, 약 75% 이하, 약 70% 이하, 약 65% 이하, 약 60% 이하, 약 55% 이하, 약 50% 이하, 약 45% 이하, 약 40% 이하, 약 35% 이하, 약 30% 이하, 약 25% 이하, 약 20% 이하, 약 15% 이하, 약 10% 이하, 약 5% 이하, 약 2% 또는 약 1% 이하일 수 있다.

적합한 무기 염의 예는 제한 없이 인산이수소칼륨, 제이인산칼륨, 인산수소이나트륨, 황산마그네슘, 염화마그네슘, 황산제이철, 황산제일철, 염화제이철, 염화제일철, 황산제일망간, 염화제일망간, 황산아연, 염화아연, 황산동, 염화칼슘, 염화나트륨, 탄산칼슘, 탄산나트륨, 및 이들의 조합을 포함한다. 상기 조성물에서의 무기 염의 중량 분획은 상기 조성물의 총 중량의 약 98% 이하, 약 95% 이하, 약 90% 이하, 약 85% 이하, 약 80% 이하, 약 75% 이하, 약 70% 이하, 약 65% 이하, 약 60% 이하, 약 55% 이하, 약 50% 이하, 약 45% 이하, 약 40% 이하, 약 35% 이하, 약 30% 이하, 약 25% 이하, 약 20% 이하, 약 15% 이하, 약 10% 이하, 약 5% 이하, 약 2% 또는 약 1% 이하일 수 있다.

일부 양태에서, 본 개시내용의 조성물은 아세트산 또는 카복실산을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 아세트산은 제한 없이 포름산, 아세트산, 프로피온산, 부탄산, 이소부티르산, 3-메틸 부탄산, 메틸 아세테이트 에틸 아세테이트, 프로필 아세테이트, 부틸 아세테이트, 이소부틸 아세테이트 및 2-메틸 부틸 아세테이트를 포함하여 당해 분야에 공지된 임의의 것을 포함한다. 일부 양태에서, 아세트산은 비니거를 사용함으로써 포함된다. 상기 조성물에서의 아세트산의 중량 분획은 상기 조성물의 총 중량의 약 98% 이하, 약 95% 이하, 약 90% 이하, 약 85% 이하, 약 80% 이하, 약 75% 이하, 약 70% 이하, 약 65% 이하, 약 60% 이하, 약 55% 이하, 약 50% 이하, 약 45% 이하, 약 40% 이하, 약 35% 이하, 약 30% 이하, 약 25% 이하, 약 20% 이하, 약 15% 이하, 약 10% 이하, 약 5% 이하, 약 2% 또는 약 1% 이하일 수 있다.

일부 양태에서, 본원에 개시된 조성물은 동결될 수 있다. 본 개시내용의 조성물은 액체 또는 건조 형태일 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 조성물은 고체일 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 조성물은 액체일 수 있다. 일부 양태에서, 상기 조성물은 성분의 수성 현탁액을 포함할 수 있다. 이 수성 현탁액은 적용 전에 희석되는 진한 스톡 용액으로서 또는 바로 사용 가능한 희석된 용액로서 제공될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 분말, 과립, 더스트, 펠릿 또는 콜로이드성 농축물일 수 있다. 이러한 건조 형태는 습윤 시 바로 용해하도록 또는 제어-방출, 지속-방출 또는 다른 시간-의존적 방식으로 용해하도록 제형화될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 효과적인 습윤 또는 용해에 따라 달라지지 않는 건조 형태일 수 있다.

일부 양태에서, 본 개시내용의 조성물은 적어도 하나의 선택적인 부형제를 포함할 수 있다. 적합한 부형제의 비제한적인 예는 항산화제, 첨가제, 희석제, 결합제, 충전제, 완충제, 미네랄 염, pH 변형제, 붕괴제, 분산제, 향료, 영양제, 종양성 및 삼투성 제제, 안정화제, 보존제, 식미 향상제 및 착색제를 포함한다. 조합을 형성하기 위해 사용된 부형제의 양 및 유형은 과학의 공지된 원칙에 따라 선택될 수 있다.

일부 양태에서, 부형제는 적어도 하나의 희석제를 포함할 수 있다. 적합한 희석제의 비제한적인 예는 미정질 셀룰로스(MCC), 셀룰로스 유도체, 셀룰로스 분말, 셀룰로스 에스테르(즉, 아세테이트 및 부티레이트 혼합 에스테르), 에틸 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 하이드록시프로필 셀룰로스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스, 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 옥수수 전분, 인산염화 옥수수 전분, 호화 옥수수 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 타피오카 전분, 전분-락토스, 전분-탄산칼슘, 나트륨 전분 글리콜레이트, 포도당, 프럭토스, 락토스, 락토스 1수화물, 수크로스, 자일로스, 락티톨, 만니톨, 말리톨, 소르비톨, 자일리톨, 말토덱스트린 및 트레할로스를 포함한다.

일부 양태에서, 부형제는 결합제를 포함할 수 있다. 적합한 결합제는 전분, 호화 전분, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 메틸셀룰로스, 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 에틸셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 폴리비닐옥소아졸리돈, 폴리비닐알코올, C12-C18 지방산 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리올, 사카라이드, 올리고사카라이드, 폴리펩타이드, 올리고펩타이드, 및 이들의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.

일부 양태에서, 부형제는 충전제를 포함할 수 있다. 적합한 충전제는 탄수화물, 무기 화합물 및 폴리비닐피롤리돈을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 비제한적인 예로서, 충전제는 황산칼슘, 이염기성 및 삼염기성 둘 다, 전분, 탄산칼슘, 탄산마그네슘, 미정질 셀룰로스, 이염기성 인산칼슘, 탄산마그네슘, 산화마그네슘, 규산칼슘, 탈크, 변형 전분, 락토스, 수크로스, 만니톨 또는 소르비톨일 수 있다.

일부 양태에서, 부형제는 완충제를 포함할 수 있다. 적합한 완충제의 대표적인 예는 MOPS, HEPES, TAPS, Bicine, Tricine, TES, PIPES, MES, Tris 완충액 또는 완충 식염수 염(예를 들어, Tris 완충 식염수 또는 포스페이트 완충 식염수)을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.

일부 양태에서, 부형제는 붕괴제를 포함할 수 있다. 적합한 붕괴제는 전분, 예컨대 옥수수 전분, 감자 전분, 이의 호화 및 변형 전분, 감미료, 점토, 예컨대 벤토나이트, 미정질 셀룰로스, 알기네이트, 나트륨 전분 글리콜레이트, 검, 예컨대 아가, 구아, 로커스트 콩, 카라야, 페시틴 및 트라가칸트를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.

일부 양태에서, 부형제는 분산 향상제를 포함할 수 있다. 적합한 분산제는 전분, 알긴산, 폴리비닐피롤리돈, 구아 검, 카올린, 벤토나이트, 정제된 나무 셀룰로스, 나트륨 전분 글리콜레이트, 이소아모르포러스 실리케이트 및 미정질 셀룰로스를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.

일부 양태에서, 부형제는 활택제를 포함할 수 있다. 적합한 활택제의 비제한적인 예는 미네랄, 예컨대 탈크 또는 실리카; 및 지방, 예컨대 식물성 스테아린, 스테아르산마그네슘 또는 스테아르산을 포함한다.

부형제(들)을 합한 중량 분획은 전체 합한 중량의 약 98% 이하, 약 95% 이하, 약 90% 이하, 약 85% 이하, 약 80% 이하, 약 75% 이하, 약 70% 이하, 약 65% 이하, 약 60% 이하, 약 55% 이하, 약 50% 이하, 약 45% 이하, 약 40% 이하, 약 35% 이하, 약 30% 이하, 약 25% 이하, 약 20% 이하, 약 15% 이하, 약 10% 이하, 약 5% 이하, 약 2% 또는 약 1% 이하일 수 있다.

일부 양태에서, 본 개시내용의 조성물은 실온에서 안정하다.

일부 양태에서, 집합체는 살아 있는 미생물의 생존능력을 유의미하게 손상시키지 않으면서 저장 및 수송을 위해 감소된 온도에서 유지될 수 있다. 집합체 또는 이를 포함하는 조성물은 동결, 냉동 또는 동결건조될 수 있다. 상기 조성물은 32℉ 내지 44℉에 냉동될 수 있다.

일부 양태에서, 집합체 또는 이를 포함하는 조성물은 동결 상태에서 저장되고 수송될 수 있다. 살아 있는 유리한 미생물은 바람직하게는 에어레이션 및/또는 진탕에 의해 조성물이 해동되고 주변 온도가 되면 빨리 재활성화될 수 있다.

일부 양태에서, 집합체는 동결건조될 수 있다. 집합체는 처음에 동결된다. 이후, 물을 진공 하에 개정 제거한다. 이 과정은 저장 및 수송을 위해 조성물의 중량을 추가로 감소시킨다. 이를 포함하는 조성물의 집합체는 적용 또는 투여 전에 재구성되고 재활성화될 수 있다.

일부 양태에서, 농축 집합체, 또는 이를 포함하는 조성물은 적용 또는 투여 전에 물로 희석될 수 있다. 희석된 조성물은 생존능력을 잃지 않으면서 장기간 동안, 예를 들어 30일만큼 길게 저장될 수 있다. 실질적으로 호기성인 상태에서 살아 있는 유리한 미생물을 유지시키기 위해, 본 개시내용의 희석된 조성물의 용존 산소는 바람직하게는 최적 수준으로 유지된다. 느린 에어레이션을 통해 희석된 조성물에 산소의 최적 양을 공급하는 것이 바람직하다.

일부 양태에서, 본원에 개시된 임의의 조성물은 분말, 과립, 바로 사용 가능한 음료, 푸드바, 압출 형태, 캡슐, 젤 캡 및 분산성 정제로 이루어진 군으로부터 선택된 형태로 투여될 수 있다.

기탁 정보. 본원에 개시된 박테리아 XXX은 버지니아 20110-2209 매너서스 10801 유니버시티 블리버드 소재의 미국 균주 협회(ATCC: American Type Culture Collection)에 기탁될 것이다. 기탁일은 ______이고, 기탁된 박테리아 XXX의 수탁 번호는 ATCC 수탁 번호 - - - - -이다. 기탁에 대한 모든 제한이 제거되었고, 기탁은 37 C.F.R. §1.801-1.809의 요건의 모두를 충족하도록 의도된다. 기탁물은 어느 것이 더 길든 30년의 기간 또는 마지막 의뢰 후 5년 동안, 또는 특허 유효일 동안 기탁소에서 유지될 것이고, 그 기간 동안 필요하면 대체될 것이다.

방법

본원에는 대상체에서 미생물총의 상대 풍부도를 변경하는 방법이 개시되어 있다. 일부 양태에서, 상기 방법은 본원에 개시된 임의의 조성물의 유효 용량을 대상체에게 투여하여서 대상체에서 미생물총의 상대 풍부도를 변경하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 상기 방법은 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3 및 서열 번호 4를 포함하는 16S rDNA 서열을 갖는 2개 이상의 박테리아 균주를 포함하는 조성물의 유효 용량을 대상체에게 투여하여서 대상체에서 미생물총의 상대 풍부도를 감소시키는 단계를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 클로스트리디아 박테리아의 상대 풍부도는 증가할 수 있다. 일부 양태에서, 클로스트리디아 박테리아의 상대 풍부도는 대체될 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 조성물은 불균형 미생물총(또는 기능이상 미생물총 또는 기능적 다양성이 감소된 미생물총)과 연관된 질환 또는 장애를 갖는 대상체의 미생물총을 대체할 수 있다.

미생물총을 변경하는 방법은 또한 대상체로부터의 샘플에서 하나 이상의 미생물총의 상대 풍부도를 측정하는 것을 포함한다. 본원에 사용된 것과 같이, "상대 풍부도"라는 용어는 한정된 위치 또는 공동체에서 다른 유기체에 비하여 어느 유기체의 공통성 또는 희귀성을 지칭한다. 예를 들어, 상대 풍부도는 샘플에서 유기체의 총 존재와 비교하여 특정한 유기체의 존재를 일반적으로 측정함으로써 결정될 수 있다.

미생물총의 상대 풍부도는 직접적으로 또는 간접적으로 측정될 수 있다. 직접적인 측정은 배양 기반 방법을 포함할 수 있다. 간접적인 측정은 전체 샘플과 관련하여 유기체 또는 유기체의 그룹에 특이적인 리보솜 RNA(rRNA) 유전자 서열과 같은 동일성의 분자 표시자의 출현율을 비교하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 맹장 샘플로부터 얻은 rRNA 유전자 서열의 총 수에서의 데설포비브리오 및 클로스트리디아에 특이적인 rRNA의 비는 맹장 샘플에서의 데설포비브리오 및 클로스트리디아의 상대 풍부도를 결정하도록 사용될 수 있다.

본원에 사용된 것과 같이, "미생물총"이라는 용어는 유기체의 위장관 내에 발견될 수 있거나 존재(국재화)할 수 있는 하나 이상의 박테리아 공동체를 지칭하도록 사용된다. 하나 초과의 미생물총을 언급할 때, 미생물총은 동일한 유형(균주)일 수 있거나 이것은 분류군의 혼합물일 수 있다. 일부 양태에서, 대상체의 위장관에서 클로스트리듐과 같은 속으로부터의 미생물총의 상대 풍부도를 변경하는 본원에 개시된 방법 및 조성물. 상대 풍부도 미생물총은 클로스트리듐과 같은 속으로부터의 미생물총을 포함하거나 클로스트리듐과 같은 속으로부터의 미생물총의 상대 풍부도를 실질적으로 증가시키거나 데설포비브리오날레스와 같은 속으로부터의 미생물총의 상대 풍부도를 실질적으로 감소시키는 화합물을 포함하는 약제학적 조성물을 투여함으로써 변경될 수 있다.

일부 양태에서, 클로스트리디아의 상대 풍부도는 대상체에서 적어도 약 5%만큼 증가할 수 있다. 일부 양태에서, 클로스트리디아의 상대 풍부도는 대상체에서 적어도 약 10%만큼 증가할 수 있다. 일부 양태에서, 클로스트리디아의 상대 풍부도는 대상체에서 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 또는 10%만큼 증가할 수 있다. 일부 양태에서, 클로스트리디아의 종 중 적어도 하나의 상대 풍부도는 5%만큼 증가할 수 있다.

일부 양태에서, 본원에 개시된 방법은 대상체에게 제2 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 제2 치료제는 하나 이상의 박테리오파지일 수 있다. 일부 양태에서, 하나 이상의 박테리오파지는 데설포비브리오를 특이적으로 표적화하고 사멸할 수 있다. 일부 양태에서, 제2 치료제는 비만, II형 당뇨병, 및/또는 염증성 장 질환을 치료하기 위해 투여될 수 있는 하나 이상의 상업적으로 이용 가능한 치료제일 수 있다. 일부 양태에서, 제2 치료제는 소염제일 수 있다.

본원에는 비만을 갖는 대상체를 치료하는 방법이 개시되어 있다. 일부 양태에서, 상기 방법은 본원에 기재된 임의의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있고, 클로스트리디아의 상대 풍부도는 투여 전의 상대 풍부도와 비교하여 대상체에서 증가한다. 일부 양태에서, 상기 방법은 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3 및 서열 번호 4를 포함하는 16S rDNA 서열을 갖는 2개 이상의 박테리아 균주를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 클로스트리디아의 상대 풍부도는 투여 전의 상대 풍부도와 비교하여 대상체에서 증가한다.

본원에는 대사 증후군을 갖는 대상체를 치료하는 방법이 개시되어 있다. 일부 양태에서, 상기 방법은 본원에 기재된 임의의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있고, 클로스트리디아의 상대 풍부도는 투여 전의 상대 풍부도와 비교하여 대상체에서 증가한다. 일부 양태에서, 상기 방법은 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3 및 서열 번호 4를 포함하는 16S rDNA 서열을 갖는 2개 이상의 박테리아 균주를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있고, 클로스트리디아의 상대 풍부도는 투여 전의 상대 풍부도와 비교하여 대상체에서 증가한다.

본원에는 과민성 대장 증후군을 갖는 대상체를 치료하는 방법이 개시되어 있다. 일부 양태에서, 상기 방법은 본원에 기재된 임의의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있고, 클로스트리디아의 상대 풍부도는 투여 전의 상대 풍부도와 비교하여 대상체에서 증가한다. 일부 양태에서, 상기 방법은 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3 및 서열 번호 4를 포함하는 16S rDNA 서열을 갖는 2개 이상의 박테리아 균주를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있고, 클로스트리디아의 상대 풍부도는 투여 전의 상대 풍부도와 비교하여 대상체에서 증가한다.

본원에는 대상체에서 체중 증가를 감소시키는 방법이 개시되어 있다. 일부 양태에서, 상기 방법은 본원에 기재된 임의의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있고, 클로스트리디아의 상대 풍부도는 투여 전의 상대 풍부도와 비교하여 대상체에서 증가한다. 일부 양태에서, 상기 방법은 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3 및 서열 번호 4를 포함하는 16S rDNA 서열을 갖는 2개 이상의 박테리아 균주를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있고, 클로스트리디아의 상대 풍부도는 투여 전의 상대 풍부도와 비교하여 대상체에서 증가한다.

본원에는 대상체의 소장에서 지질 흡수를 억제하는 방법이 개시되어 있다. 일부 양태에서, 상기 방법은 본원에 기재된 임의의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있고, 클로스트리디아의 상대 풍부도는 투여 전의 상대 풍부도와 비교하여 대상체에서 증가한다. 일부 양태에서, 상기 방법은 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3 및 서열 번호 4를 포함하는 16S rDNA 서열을 갖는 2개 이상의 박테리아 균주를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있고, 클로스트리디아의 상대 풍부도는 투여 전의 상대 풍부도와 비교하여 대상체에서 증가한다. 일부 양태에서, 본원에 기재된 임의의 조성물은 하나 이상의 지질 흡수 및/또는 합성 유전자를 억제할 수 있다. 일부 양태에서, 지질 흡수 유전자는 CD36, FasN, Dgat, Srepbf1, SLC27a1 및 SLC27a4일 수 있다.

본원에서 대상체의 간에서 CD36을 하향조절하는 방법이 개시되어 있다. 일부 양태에서, 상기 방법은 본원에 기재된 임의의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있고, 클로스트리디아의 상대 풍부도는 투여 전의 상대 풍부도와 비교하여 대상체에서 증가한다. 일부 양태에서, 상기 방법은 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3 및 서열 번호 4를 포함하는 16S rDNA 서열을 갖는 2개 이상의 박테리아 균주를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있고, 클로스트리디아의 상대 풍부도는 투여 전의 상대 풍부도와 비교하여 대상체에서 증가한다.

본원에는 대상체에서 지방증을 감소시키는 방법이 개시되어 있다. 일부 양태에서, 상기 방법은 본원에 기재된 임의의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있고, 클로스트리디아의 상대 풍부도는 투여 전의 상대 풍부도와 비교하여 대상체에서 증가한다. 일부 양태에서, 상기 방법은 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3 및 서열 번호 4를 포함하는 16S rDNA 서열을 갖는 2개 이상의 박테리아 균주를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있고, 클로스트리디아의 상대 풍부도는 투여 전의 상대 풍부도와 비교하여 대상체에서 증가한다.

본원에는 대상체에서 체중 증가를 감소시키는 방법이 개시되어 있다. 일부 양태에서, 상기 방법은 본원에 기재된 임의의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있고, 클로스트리디아의 상대 풍부도는 투여 전의 상대 풍부도와 비교하여 대상체에서 증가한다. 일부 양태에서, 상기 방법은 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3 및 서열 번호 4를 포함하는 16S rDNA 서열을 갖는 2개 이상의 박테리아 균주를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있고, 클로스트리디아의 상대 풍부도는 투여 전의 상대 풍부도와 비교하여 대상체에서 증가한다.

본원에는 대상체에서 지방 축적을 감소시키는 방법이 개시되어 있다. 일부 양태에서, 상기 방법은 본원에 기재된 임의의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있고, 클로스트리디아의 상대 풍부도는 투여 전의 상대 풍부도와 비교하여 대상체에서 증가한다. 일부 양태에서, 상기 방법은 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3 및 서열 번호 4를 포함하는 16S rDNA 서열을 갖는 2개 이상의 박테리아 균주를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있고, 클로스트리디아의 상대 풍부도는 투여 전의 상대 풍부도와 비교하여 대상체에서 증가한다.

본원에는 대상체에서 체지방 백분율을 낮추고/낮추거나 내장 지방 조직(VAT) 질량을 감소시키는 방법이 개시되어 있다. 일부 양태에서, 상기 방법은 본원에 기재된 임의의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있고, 클로스트리디아의 상대 풍부도는 투여 전의 상대 풍부도와 비교하여 대상체에서 증가한다. 일부 양태에서, 상기 방법은 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3 및 서열 번호 4를 포함하는 16S rDNA 서열을 갖는 2개 이상의 박테리아 균주를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있고, 클로스트리디아의 상대 풍부도는 투여 전의 상대 풍부도와 비교하여 대상체에서 증가한다.

본원에는 대상체에서 혈당 수치를 감소시키고/시키거나 인슐린 저항성을 감소시키는 방법이 개시되어 있다. 일부 양태에서, 상기 방법은 본원에 기재된 임의의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있고, 클로스트리디아의 상대 풍부도는 투여 전의 상대 풍부도와 비교하여 대상체에서 증가한다. 일부 양태에서, 상기 방법은 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3 및 서열 번호 4를 포함하는 16S rDNA 서열을 갖는 2개 이상의 박테리아 균주를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있고, 클로스트리디아의 상대 풍부도는 투여 전의 상대 풍부도와 비교하여 대상체에서 증가한다.

일부 양태에서, 본원에 개시된 임의의 방법에서, 대상체는 치료를 필요로 하는 것으로 확인되었다. 일부 양태에서, 대상체는 비만, 대사 증후군, 인슐린 결핍, 인슐린-저항성 관련된 장애, 포도당 과민증, 당뇨병 또는 염증성 장 질환을 갖는다. 일부 양태에서, 염증성 장 질환은 크론병 또는 궤양성 대장염일 수 있다. 일부 양태에서, 인슐린-저항성 관련된 장애는 당뇨병, 고혈압, 이상지질혈증 또는 심혈관 질환일 수 있다. 일부 양태에서, 당뇨병은 I형 당뇨병일 수 있다. 일부 양태에서, 당뇨병은 II형 당뇨병일 수 있다.

본원에 사용된 것과 같이, "대사 장애" 또는 "대사 증후군"과 같은 용어는 비정상 체중 증가, 에너지 사용 또는 소비, 신체 내 섭취된 또는 내인성 영양소, 에너지원, 호르몬 또는 다른 신호전달 분자에 대한 변경된 반응 또는 탄수화물, 지질, 단백질, 핵산의 변경된 대사 또는 이들의 조합에 의해 야기되거나 이들을 특징으로 하는 장애, 질환 및 병태를 지칭한다. 대사 장애는 핵산, 단백질, 지질 및/또는 탄수화물의 대사를 불균형시키는 대사 경로의 결핍 또는 과다 중 어느 하나와 연관된다. 대사에 영향을 미치는 인자는 내인성(호르몬) 제어 시스템(예를 들어, 인슐린 경로, GLP-1, PYY 등을 포함하는 장내분비 호르몬), 신경 제어 시스템(예를 들어, 뇌에서의 GLP-1 또는 다른 신경전달물질 또는 조절 단백질) 또는 기타를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 일부 비제한적인 예는 비만, II형 당뇨병, 인슐린-결핍, 인슐린-저항성, 인슐린-저항성 관련된 장애, 포도당 과민증, X 증후군을 포함하는 당뇨병, 염증성 및 면역 장애, 골관절염, 이상지질혈증, 대사 증후군, 비알코올성 지방 간, 비정상 지질 대사, 암, 신경퇴행성 장애, 수면 무호흡, 고혈압, 고콜레스테롤, 죽상경화성 이상지질혈증, 고지혈성 병태, 예컨대 죽상동맥경화증, 고콜레스테롤혈증 및 포유류에서의 다른 관상동맥 질환, 및 대사의 다른 장애일 수 있다.

또한 포함된 장애는 함께 발생하거나 클러스터될 수 있고, 심장 질환, 뇌졸중, 당뇨병 및 비만의 위험을 증가시키는 병태이다. 혈압 증가, 인슐린 수치 상승, 허리 주의의 과도한 체지방 또는 비정상 콜레스테롤 수치와 같은 이들 병태 중 오직 하나를 갖는 것은 상기 언급된 질환의 위험을 증가시킬 수 있다. 조합에서, 관상동맥 심장 질환, 뇌졸중, 인슐린-저항성 증후군 및 당뇨병의 위험은 심지어 더 크다.

일부 양태에서, 본원에 개시된 임의의 조성물을 투여하는 단계는 대상체의 적어도 위, 소장 또는 대장에 조성물을 전달하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 상기 조성물은 경구로 투여될 수 있다.

일부 양태에서, 대상체는 인간일 수 있다.

일부 양태에서, 집합체의 세포는 활성이다.

키트

일부 양태에서, 대상체에서 지방증을 감소시키고, 대상체에서 체중 증가 및/또는 지방 축적을 감소시키고, 대상체에서 체지방 백분율을 저하하고/하거나 내장 지방 조직(VAT) 질량을 감소시키고, 대상체에서 혈당 수치를 감소시키고/시키거나 인슐린 저항성을 감소시키고, 대상체의 소장에서 지질 흡수를 억제하고, 대상체의 간에서 CD36을 하향조절하고, 대상체에서 장 상피 내의 지질 흡수 유전자의 발현을 억제할 수 있는 하나 이상의 박테리아, 균주 또는 미생물을 포함하는 키트가 개시되어 있다.

실시예

실시예 1: 미생물총의 T 세포-매개된 조절은 비만을 보호한다

요약: 미생물총은 숙주 대사 및 비만에 영향을 미치지만, 질환으로부터 보호하는 유기체는 공지되지 않고 있다. 미생물총 조성을 조절하는 면역 경로를 조사하는 연구 동안, 미생물총에 의해 유발된 노화성 대사-증후군의 발생이 관찰되었다. 데설포비브리오의 증식 및 클로스트리디아의 소실은 이 모델에서 비만과 연관된 중요한 특징이고, 클로스트리디아의 교체는 비만을 구제한다. T-세포 의존적 사건은 클로스트리디아의 소실 및 데설포비브리오의 증식을 방지하는 데 필요하였다. 클로스트리디아의 부적절한 IgA 표적화 및 증가된 데설포비브리오는 유리한 클로스트리디아의 콜로니화를 길항시켰다. 전사 및 대사 분석은 비만 숙주에서 향상된 지질 흡수를 밝혀냈다. 데설포비브리오가 아닌 클로스트리디아에 의한 무균 동물의 콜로니화는 지질 흡수를 제어하는 유전자의 발현을 하향조절하고 지방증을 감소시켰다. 더욱이, 클로스트리디아로부터의 상청액은 장 상피 내의 지질 흡수 유전자의 발현을 억제하였다. 클로스트리디아 감소 및 데설포비브리오 증가는 대사 증후군 및 비만을 갖는 인간에서 발견되는 미생물총 특징이었다. 이와 같이, 미생물총의 면역 제어는 대사 결함을 방지하도록 지질 대사를 제약하도록 작용하는 유리한 미생물 집단을 유지시키는 것으로 보인다.

도입. 지난 세기에 걸쳐, 비만 및 대사 증후군은 세계적 유행병으로 발생하였다. 현재, 19억명이 넘는 사람들이 비만이고 II형 당뇨병, 심혈관 및 간 질환과 같은 대사 장애를 발생시킬 위험에 있다(D. Mozaffarian et al., Circulation 131, e29-322 (2015)). 다수의 연구는 대사 질환의 면역계 조절에 대한 역할을 강조하였다. 이들 보고서는 대체로 비만 동안 염증성 반응의 역할에 초점을 두었다. 이들은 체중 증가 동안 지방 조직 내에 증가된 대식세포 침윤 및 조절 T 세포의 감소를 보고하였다(M. F. Gregor, and G. S. Hotamisligil, Annu Rev Immunol 29, 415-445 (2011); 및 F. Emanuela et al., Journal of nutrition and metabolism 2012, 476380 (2012)). 그러나, 많은 인간 연구는 준최적 면역 반응이 또한 대사 증후군 및 비만과 연관된다는 것을 제시한다. 실제로, 비만 성인은 면역화에 대한 결핍된 면역 반응, 증가된 감염 발생률 및 감소된 점막 IgA 수치를 나타내고, 이는 효과적인 면역력이 이들 개체 내에서 개시될 수 없다는 것을 제시한다(A. Pallaro et al., J Nutr Biochem 13, 539 (2002); A. Must et al., JAMA 282, 1523-1529 (1999); D. C. Nieman et al., J Am Diet Assoc 99 , 294-299 (1999); D. N. McMurray, P. A. Beskitt, S. R. Newmark, Int J Obes 6 , 61-68 (1982); J. Hirokawa et al., Biochem Biophys Res Commun, 235 , 94-98 (1997); 및 S. Tanaka et al., Int J Obes Relat Metab Disord 17 , 631-636 (1993)). 결함 있는 면역 반응이 대사 질환에 영향을 미치는 기전은 명확하지 않게 있다.

미생물총은 포유류 숙주 내에 중요한 대사 조절자로서 출현하였고, 비만 개체에서의 미생물총의 조성은 동물로 전달될 때 대사 결핍을 부여하기에 충분하다(P. J. Turnbaugh et al., Nature 444 , 1027-1031 (2006)). 특히, 부티레이트 및 메탄 생성의 감소를 포함하여 대사 질환 동안 미생물총의 유전자 농후의 감소가 보고되었다. 정반대로, 황화수소 및 점액 분해와 같은 일부 미생물총 기능은 대사 질환을 갖는 개체에서 향상된다(J. Qin et al., Nature 490 , 55-60 (2012)). 장 면역 반응이 미생물총의 조성을 조절하는 데 중요하다는 것이 최근에 밝혀졌다(J. L. Kubinak et al., Cell Host Microbe 17 , 153-163 (2015); 및 S. Kawamoto et al., Immunity 41 , 152-165 (2014)). IgA는 특히 소정의 미생물의 생육을 제약하고 미생물총을 다양화하도록 작용하고; 미생물의 IgA 결합의 변경 또는 심지어 장 IgA의 약간의 감소는 다양성에 부정적으로 영향을 미칠 수 있다(J. L. Kubinak et al., Cell Host Microbe 17 , 153-163 (2015); S. Kawamoto et al., Immunity 41 , 152-165 (2014); 및 S. Wang et al., Immunity 43 , 289-303 (2015)). 이와 같이, 미생물총의 결함 있는 면역 제어는 대사 질환에 기여할 수 있다.

결과. 최근에, 미생물총의 T 세포-의존적 IgA 표적화의 적절한 발생을 지시하는 분자 경로가 확인되었다. 선천성 어댑터 분자의 T 세포 특이적 제거를 보유하는 동물인, Myd88(T-Myd88^-/- 마우스)은 장 내에 결함 있는 T 소포성 헬퍼(TFH) 세포 발생 및 IgA 생성을 갖는다. 이는 장 미생물의 하향조절된 IgA 표적화 및 유전자형 간의 미생물총 내의 조성차와 연관되었다(J. L. Kubinak et al., Cell Host Microbe 17 , 153-163 (2015); 및 S. Wang et al., Immunity 43 , 289-303 (2015)). 이 연구 동안, 더 늙은 T-Myd88^-/- 마우스가 야생형 대조군과 비교하여 지속적으로 비만이었다는 것이 관찰되었다(도 1a). 표준 음식 식이를 섭식함에도 불구하고, T-Myd88^-/- 마우스는 나이들어가면서 유의미하게 증가된 체중 증가 및 지방 축적을 나타냈다(도 1b 및 도 1c 및 도 7a 및 도 7b). 1년령에, 수컷 T-Myd88^-/- 마우스는 체중이 60g 이하이고, NMR 분석에 기초하여 50%의 체지방 조성을 나타냈다(도 1d 및 도 1e).

T-Myd88^-/- 동물은 인간에서 발견된 많은 대사 질환 공존이환을 발생시켰다(F. X. Pi-Sunyer, Med Sci Sports Exerc 31 , S602-608 (1999)). 표준 식이에서 키워진 1년령 T-Myd88^-/- 마우스가 포도당을 이의 WT 대응물과 유사한 수준으로 제거하였지만(도 7c), 이들은 순환 인슐린의 더 높은 수치를 가져서, 더 높은 HOMA-IR 지수를 생성시켰다(도 1f 및 도 1g). 더욱이, 추가 인슐린에 의해 시험주입될 때, T-Myd88^-/- 마우스는 WT 동물과 유사한 동역학으로 포도당을 제거하지 못하는데, 이는 인슐린 저항성의 발생을 나타낸다(도 1h). 음식 섭취는 WT 대조군과 비교하여 2개월령에서의 T-Myd88^-/- 마우스에서 감소하였지만 1년령 동물에서는 동등하였다(도 7d 및 도 7e). 추가로, 에너지 소비량이 어린 마우스에서는 감소하였지만, 시간이 지나면서 이 변화는 지속하지 않았다(도 7d). 이동은 연령 둘 다에서의 WT와 T-Myd88^-/- 마우스 사이에 또한 유사하였고, 적절한 열 생성 증가는 WT 대조군과 비교하여 더 늙은 T-MyD88^-/- 마우스에서 측정되었는데, 이는 이들이 다른 모델에서 보이는 것처럼 증가된 체중 증가의 주원인이 아니라는 것을 제시한다(도 7f 및 도 7g) (M. Vijay-Kumar et al., Science 328 , 228-231 (2010)). T-Myd88^-/- 마우스는 또한 지방 간 질환을 발생시켰고, 크라운-유사 구조 및 이상조절된 지방세포 크기로 표시된 지방 조직 내의 염증성 표현형을 나타냈다(도 1i). 표준 마우스 음식 식이에서 비만이 발생하는 데 여러 개월이 요구한다. 그에 반해서, 동물이 고지방 식이(HFD, 45% 지방)에 놓일 때, T-Myd88^-/- 동물은 식이 개시 후 8주만큼 빨리 WT 마우스보다 체중 및 내장 지방 조직(VAT) 질량을 더 많이 축적하였다(도 1j 및 도 8a 및 도 8b). 이와 같이, T-Myd88^-/- 동물은 증가된 식이 지방 섭취에 의해 가속될 수 있는 대사 증후군 및 비만을 발생시키기 쉽다.

T-Myd88^-/- 미생물총의 조성은 어린 동물에서 WT와 다르다(J. L. Kubinak et al., Cell Host Microbe 17 , 153-163 (2015)). 미생물총은 대사 기능에 대한 공지된 기여자이고, 인간 비만의 발생과 연결되었다(S. Ussar et al., Cell Metab 22, 516-530 (2015); 및 E. Le Chatelier et la., Nature 500, 541-546 (2013)). 미생물총이 T-Myd88^-/- 마우스에서 보인 대사 증후군에 관여되는지를 초기에 결정하기 위해, WT 및 T-Myd88- 마우스가 HFD를 섭식하면서 이들을 광범위 항생제에 놓았다. WT 마우스는 항생제에 대해 체중 증가의 차이를 나타내지 않았다. 그에 반해서, 체중 증가는 T-Myd88^-/- 동물에서 항생제 처리에 의해 완전히 구제되었다(도 2a 및 도 2b). 이것에 마른 동물에서 관찰된 지방 축적과 유사한 수준으로의 이의 체지방 백분율 및 VAT 질량의 감소가 수반되었다(도 2c 및 도 2d).

T-Myd88^-/- 마우스에서 대사 증후군에 영향을 미치는 미생물총의 특징을 결정하기 위해, 16S rRNA 유전자 시퀀싱은 비만 T-Myd88^-/- 마우스에서 분류학적 조성 및 미생물총의 다양성을 평가하기 위해 일반-식사-섭식된 늙은 동물에서 수행되었다. 늙은 WT 및 T-Myd88^-/- 마우스의 회장 및 대변 내용물에서의 상당히 상이한 공동체가 있었다(도 3a 및 도 9a). 추가로, 늙은 마우스의 대변에서 약간 감소한 종 풍부성이 있었다(도 3b). WT와 T-Myd88^-/- 미생물총 공동체 사이의 주요 차이를 설명한 유기체를 확인하기 위해, 랜덤 포레스트 분석은 16S rRNA 데이터에서 수행되었다. 대변 미생물총은 86% 정확성으로 유전자형을 정확히 분류할 수 있지만, 회장 미생물총은 100% 정확성으로 유전자형을 예측하였다. 정확성에 가장 강한 영향을 미친 미생물총의 구성원은 주로 넓은 분류학적 클로스트리디아 강에 속했고, T-Myd88^-/- 마우스와 비교하여 WT 마우스에서 농후화되었다(도 3c 및 도 9b). 추가의 랜덤 포레스트 접근법은 대변 및 회장 미생물총이 각각 R² = 0.5 및 R² = 0.76로 총 체중을 예측할 수 있다는 것을 나타냈고, 클로스트리디아의 많은 구성원은 이 예측에 강하게 영향을 미친다(도 3d 및 도 9b). WT 마우스와 비교하여, T-Myd88^-/- 마우스는 데레아, SMB53, 미분류 펩토스트렙토코카세아에 및 클로스트리듐을 포함하는 다수의 클로스트리디아 분류군의 다양성 및 전체 풍부도의 넓은 감소를 나타냈다(도 9c).

미생물 다양성의 감소를 포함하는 미생물총의 조성 이동은 미생물총의 기능성에 부정적인 효과를 가질 수 있고, 대사 증후군을 포함하는 많은 서구 생활양식-연관된 질환과 상관되었다(M. Vijay-Kumar et al., Science 328 , 228-231 (2010); 및 S. Ussar et al., Cell Metab 22 , 516-530 (2015)). 추가로, 더 적은 유전자 풍부함을 갖는 미생물총을 보유하는 개체는 더 비만일 것이다(E. Le Chatelier et al., Nature 500 , 541-546 (2013)). 대변 및 회장 미생물 전사체에서, T-Myd88^-/- 동물 내의 많은 유전자 패밀리로부터의 전사체의 표시가 일반적으로 감소하였다. 16S rRNA 유전자 시퀀싱에 의해 회장 내에 검출된 유기체의 수가 동일하므로, 이는 이 부위에서의 미생물총이 대사 기능 감소를 갖는다는 가설을 지지한다(도 3e 및 도 10a). 총 리드의 필적하는 비율이 독특하게 2개의 유전자형 사이의 기준 게놈에 맵핑되어서, 동물에서의 전사체의 동일한 커버리지를 제시한다. 그러나, T-Myd88^-/- 마우스의 회장 및 대변 전사체에서의 클로스트리디아세아에 기준 게놈에 맵핑된 리드의 비율은 특히 두드러지게 감소하였다(도 3f 및 도 10b 및 도 10c). 이와 같이, 비만 동물에 존재하는 클로스트리디아는 마이크로바이옴에 대한 감소된 기능적 기여를 갖는다. 더욱이, 비만은 대사 질환을 갖는 인간에서 유사하게 보고된 것처럼 클로스트리디아 내에 미생물 기능적 다양성의 소실과 연관된다(J. Qin et al., Nature 490 , 55-60 (2012)).

중요한 클로스트리디아 유기체의 소실이 질환 동안 역할을 할 수 있으면서, 동시수용 실험은 미생물 전달이 비만을 구제할 수 있는지를 결정하도록 수행되었다(도 11a). 마우스가 식분성이므로, 동시수용은 유전자형 사이의 미생물의 효율적이고 빈번한 전달을 허용하고, 미생물총에 대한 공지된 균질화 효과를 갖는다. WT 또는 T-Myd88^-/- 동물은 동일한 유전자형의 동물과 함께 수용되거나 이유 시 반대의 유전자형의 동물과 동시수용되었다. 동시수용 전에, T-Myd88^-/- 마우스는 구별되는 미생물총 조성을 가졌고, 동시수용의 1주는 2개의 공동체의 혼합을 야기하였다(도 12a).

1주 후, 동물을 HFD에 넣고, 지방 축적의 신호에 대해 모니터링하였다. 분리된 WT 마우스와 비교하여, T-Myd88^-/- 마우스 및 이들과 동시수용된 임의의 동물은 유의미하게 체중이 더 증가하였고, 인슐린 저항성을 발생시켰고, 증가된 VAT 및 총 체지방을 가졌다(도 4a 및 도 11b 내지 도 11e). 더욱이, 3개월 후, 동시수용된 WT 동물로부터의 미생물총은 별개로 수용된 WT 마우스와 상당히 달라졌고, 별개로 수용된 T-Myd88^-/-의 미생물총과 더 큰 유사성을 나타냈다(도 12b). 이와 같이, 미생물총의 전달 가능한 성분이 달리 건강한 WT 동물에서 대사 증후군을 야기할 수 있는 T-Myd88^-/- 동물에서 형성되었다.

처음 3주 내에 동시수용된 동물의 체중 증가의 차이가 검출되었으므로, 초기 시점 및 최종 시점 둘 다에서 검출 가능한 미생물 조성의 차이가 초점이었다. 동시수용의 3개월 후, 데설포비브리오, 락토바실랄레스 및 비피도박테리아 슈도롱검은 동시수용된 WT 마우스 내에 더 높은 풍부도로 존재했다(도 4b 및 도 12c 및 도 12d). 그러나, 데설포비브리오 속은 동시수용의 바로 1주 후 별개로 수용된 T-Myd88^-/- 동물 및 동시수용된 동물에서 유의미하게 더 높은 풍부도를 나타냈다(도 12e). 데설포비브리오는 뮤신 내의 디설파이드-결합 분해의 부산물로서 황화수소를 생성하는 점액용해성 d-프로테오박테리아이다(G. R. Gibson, G. T. Macfarlane, J. H. Cummings, J Appl Bacteriol 65 , 103-111 (1988); M. C. Pitcher, J. H. Cummings, Gut 39 , 1-4 (1996); F. E. Rey et al., Proc Natl Acad Sci U S A 110 , 13582-13587 (2013); 및 M. S. Desai et al., Cell 167 , 1339-1353 (2016)). 염증성 장 질환(IBD)과의 이의 연관 이외에, 데설포비브리오의 증가된 콜로니화 및 황화수소 생성과 연관된 유전자는 II형 당뇨병 및 비만을 갖는 환자에서 검출된다(J. Qin et al., Nature 490 , 55-60 (2012)). 이와 같이, 비만 마우스에서의 공동체 변화는 인간에서 보인 것을 훨씬 더 모방하고, 클로스트리디아의 소실 및 데설포비브리오의 증가가 대사 질환과 고도로 관련된다는 것을 제시한다(J. Qin et al., Nature 490 , 55-60 (2012); J. Zierer et al., Nat Genet 50 , 790-795 (2018); 및 S. M. Harakeh et al., Front Cell Infect Microbiol 6 , 95 (2016)).

비만으로 이어지는 T-Myd88^-/- 동물과의 WT 마우스의 동시수용은 또한 WT 동물에서의 클로스트리디아의 구성원의 콜로니화의 감소와 연관된다(도 12f). 따라서, 데설포비브리오 콜로니화가 이들 유기체의 풍부도를 감소시킬 수 있는지가 시험되었다.

특이적-병원균-무(SPF: specific-pathogen-free) 마우스를 마우스에서 확인된 데설포비브리오와 97% 초과의 16S rRNA 유전자 서열 유사성을 갖는 균주인 데설포비브리오 데설푸리칸스 아종 데설푸리칸스에 의해 1주 동안 콜로니화하였다. 결과는 WT SPF 동물이 클로스트리디알레스 과 라크노스피라세아에 및 속 데레아의 유의미한 감소를 가졌다는 것을 보여준다(도 4c 및 도 13a). 비피도박테리아가 유의미하게 증가하면서, 데설포비브리오에 의한 콜로니화는 모든 유기체의 전체 감소를 생성시키지 않았다(도 4c). 공동체에 대한 이 변화가 데설포비브리오 콜로니화의 간접적인 효과이므로, 데설포비브리오가 무균 시스템에서 클로스트리디아 구성원의 콜로니화에 영향을 미치는지가 시험되었다.

클로로포름-처리된 대변 슬러리에 의해 콜로니화된 무균 동물은 클로스트리디아세아에 및 라크노스피라세아에가 농후하였다(도 14). 이후, 이 공동체를 D. 데설푸리칸스의 존재 또는 부재 하에 분석하였다. 데설포비브리오 콜로니화는 유전자형 및 체중 둘 다의 예측적 정확성에 강하게 영향을 미치는 속인 클로스트리듐을 유의미하게 감소시켰다(도 4d). 이와 같이, II형 당뇨병을 갖는 T-Myd88^-/- 마우스 및 인간에서 보인 데설포비브리오 종의 증식은 마름과 연관된 미생물의 콜로니화를 길항시킬 수 있다.

본 발명자들은 이 마름-연관된 미생물의 재도입이 T-Myd88^-/- 마우스 내에서 비만을 보호할 수 있는지를 확인하고자 추구하였다. 격일로 비만-취약 T-Myd88^-/- 동물의 포자-형성 박테리아의 칵테일에 의한 처리는 체중 증가 및 지방 축적을 유의미하게 감소시켰다(도 4e 및 도 4f). 3개월의 마지막에, 포자-형성 미생물에 의해 처리된 T-Myd88^-/- 마우스는 비처리된 T-Myd88^-/- 마우스와 비교할 때 더 낮은 체지방 백분율 및 감소된 VAT 질량을 가졌다(도 4f 및 도 4g). 이와 같이, 클로스트리디아의 소실은 T-Myd88^-/- 마우스에서 비만 및 대사 증후군과 원인에서 연관된다.

결함 있는 장 면역력 동안 형성된 미생물총은 대사 증후군을 생성시키는 것으로 보인다. 12주 동안 동물의 동시수용이 WT 숙주로의 비만의 전파를 야기하였지만, WT 무균 수혜자로의 T-Myd88^-/-로부터의 대변 이식물은 비만을 전달하는 데 불충분하였다(도 15a). 추가로, SPF WT 또는 T-Myd88^-/- 임신한 어미가 무균 WT 임신한 어미와 동시수용될 때, 이유 시 분리된 생성된 콜로니화된 새끼는 비만 표현형을 전파하지 않았다(도 15a). 이와 같이, T-Myd88^-/- 마우스에서의 면역 결함이 비만발생 미생물총의 지속성을 허용하는 데 필요한지가 시험되었다. 그에 반해서, 미생물총은 완전히 온전한 면역계의 존재 하에 적절히 제어되었다. 내인성 T 세포가 결여된 Tcrb^-'^- 마우스는 광범위 항생제 처리에 의해 내인성 미생물총이 고갈되었고, 이후 WT 또는 T-Myd88^-'^-CD4⁺ T 세포 중 어느 하나의 입양 전달 전에 WT 및 T-Myd88^-/- 미생물총의 1:1 혼합물에 의해 콜로니화되었다(도 15b). 마우스를 개별적으로 수용된 우리로 분리하여서 미생물총 형성은 우리 내의 다른 동물의 존재에 의해 영향을 받지 않을 것이고, 각각의 미생물 공동체가 개별적으로 형상화될 것이다. 이 마우스가 동일한 미생물총에 의해 초기에 콜로니화되었다는 사실에도 불구하고, T-Myd88^-/- CD4⁺ T 세포가 제공된 Tcrb^-'^- 마우스는 WT CD4⁺ T 세포가 제공된 Tcrb^-'^- 마우스와 비교할 때 유의미하게 체중을 더 증가하였다(도 5a). 이와 같이, T 세포 내의 Myd88 신호전달의 결함은 동물에서 대사 결함을 유발한다. 박테리아의 10%는 Tcrb^-'^- 마우스 내에 IgA에 의해 코팅되어서, 미생물총의 IgA 표적화에 대한 T 세포의 중요성을 입증한다(도 3b). 그러나, T 세포 전달 후 1주에, WT T 세포가 제공된 마우스는 IgA-결합된 미생물의 3배 증가를 보여주었다(도 15c). 미생물총에 대한 IgG1 또는 IgG3 반응은 발생하는 데 더 오래 걸렸지만, T 세포 전달 후 8주에 검출 가능하였다(도 15d 내지 도 15f). 총 IgA 수준이 이 실험 설정 내에 동물에서 유사하였지만, 미생물총에 결합하는 IgA 및 IgG1은 넉아웃 T 세포를 받는 동물에서 결함이었다(도 5b 및 도 15e 및 도 15g). T-세포-독립적 기전에 의해 좌우되는 것으로 생각되는 IgG3에 의한 미생물총의 표적화는 T-Myd88^-/- T 세포를 받는 Tcrb^-'^- 마우스에서 결함이 아니었다(도 15h)(M. A. Koch et al., Cell 165 , 827-841 (2016)). 미생물총 조성은 시간에 따른 유전자형 간에 더욱 더 상이하였다(도 5c). 더욱이, 비만발생 마우스로부터의 T 세포를 받는 동물에서의 공동체 변화는 T-Myd88^-/- 동물에서 관찰된 것과 유사하다. 실제로, 유전자형 둘 다에서의 데설포비브리오나세아에와 클로스트리디아세아에의 풍부도 사이의 상당히 부적인 상관관계가 있다.

T-Myd88^-/- T 세포를 받는 동물은 궁극적으로 동일한 미생물총 혼합물에 의해 출발함에도 불구하고 유의미하게 더 적은 클로스트리디아세아에에 의해 콜로니화되었다(도 5d 및 도 5e). 속 수준에서의 이 분류군은 클로스트리디아의 오스실로스피라 속을 포함하는 IgA에 의해 차등적으로 표적화되었지만, 대부분의 클로스트리디아 속은 분류학적 분석의 이 수준에서 고도로 가변적이었다(도 16a). IgA-결합 지수는 더 섬세한 OTU-수준(97% 유사성)에서 평가되었고, T-Myd88^-/- T 세포를 받는 동물에서 IgA에 의해 차등적으로 표적화된 클로스트리디아-분류된 OTU의 풍부도를 발견하였다(도 5f). 데설포비브리오의 IgA 표적화의 증가의 경향이 관찰되었다(도 16a 및 도 16b). 이와 같이, 클로스트리디아 및 이의 기능적 기여의 감소는 IgA에 의한 부적절한 표적화와 데설포비브리오의 증식의 조합으로부터 생길 수 있다.

항체 반응이 대사 결함에 영향을 미친다는 가설을 지지하기 위해, 비만발생 미생물총을 항생제-처리된 WT 또는 Rag1^-'^- 동물 중 어느 하나로 옮겼다. 실제로, WT 마우스로의 비만발생 미생물총의 전달은 표현형을 부여하지 않지만, 항체가 결여된 Rag1^-'^- 동물로의 전달은 WT 미생물총을 받는 동물과 비교하여 유의미하게 더 큰 체중 증가를 생성시켰다(도 5g 및 도 15i). TFH는 종자 중심에서 B 세포 내의 항체 클래스 스위칭 및 돌연변이를 지시하도록 작용하는 T 세포이다. T-Myd88^-/- 마우스에서의 T 세포 발생 결함이 TFH 세포 내에 있다는 것이 이전에 확립되었다.

TFH 세포로 분화할 수 없는 Bcl6^-'^- T 세포를 받는 T-Myd88^-/- 동물은 WT T 세포를 받는 동물과 비교하여 체중이 유의미하게 더 증가하였다(도 5h)(S. Crotty, Annu Rev Immunol 29 , 621-663 (2011)). 이와 같이, TFH 세포로 발생하는 능력을 갖지 않는 T 세포는 비만 표현형을 구제할 수 없다. 적절한 TFH 세포 기능은 따라서 비만을 예방하도록 미생물총을 조절하는 데 필요하다.

단사슬 지방산(SCFA)은 숙주 대사에 영향을 미치는 잘 연구된 미생물총-의존적 기전이다. 그러나, SCFA 생성은 WT 동물과 T-Myd88^-/- 동물 사이에 다르지 않았다(도 17a). 지방 조직 내에 저등급 염증을 유도하는 증가된 장 투과성 및 박테리아 생성물의 누출이 또한 제안되었다(F. E. Rey et al., Proc Natl Acad Sci U S A 110 , 13582-13587 (2013); 및 P. D. Cani et al., Diabetes, 56 , 1761-1772 (2007)). 그러나, T-Myd88^-/- 동물의 혈청 내의 박테리아 리간드의 차이가 검출되지 않았다. 더욱이, T-Myd88^-/-를 5-ASA인 항염증제가 주입된 식이에 배치하는 것(H. Luck et al., Cell Metab 21 , 527-542 (2015))은 체중 증가를 구제하지 못했다(도 17b). 간 RNA-seq 및 유전자 세트 농축 분석(GSEA: gene set enrichment analysis)은 동물이 표준 마우스 음식을 섭식함에도 불구하고, 글리세롤인지질 및 글리세로지질 대사를 포함하는 지질 대사에 관여된 경로가 WT 대조군과 비교하여 T-Myd88^-/- 동물 내에서 가장 상당히 농후화된 경로라는 것을 밝혀냈다(도 6a). 특히, Fasn, Dgat2 및 Srebpf1을 포함하는 지질의 합성에 필요한 유전자, 및 Slc27a4 및 Cd36을 포함하는 지질 흡수에 관여된 유전자의 발현은 T-Myd88^-/- 동물의 간 내에 고도로 상향조절되었다(도 6b). CD36이 T-Myd88^-/- 동물에서 상향조절되었지만, 항생제 처리는 CD36 발현을 유의미하게 하향조절하였다(도 6c). 더욱이, 비만 T-Myd88^-/- 동물의 클로스트리디아 처리는 CD36의 유의미한 하향조절을 생성하였고, 이는 클로스트리디아가 지질 흡수를 감소시키도록 작용한다는 것을 제시한다(도 6d). 실제로, 노토바이오틱 동물은 무균 마우스와 비교할 때 간 CD36 발현 내에 유의미하게 감소된 클로스트리디아 집합체에 의해 콜로니화되었다(도 6e). 이와 같이, T-Myd88^-/-에서의 지질 흡수는 미생물총-의존적 방식인 것으로 보인다.

클로스트리디아에 의한 무균 동물의 콜로니화는 소장 내의 CD36 및 FASN 둘 다를 유의미하게 하향조절하였고(도 6f 및 도 6g), 이는 클로스트리디아가 장 내에 지질 흡수 및 대사에 영향을 미친다는 것을 제시한다. 더욱이, 배양된 클로스트리디아 집합체로부터 수집된 무세포 상청액(CFS: cell-free supernatant)은 배양된 장 상피 세포(IEC: intestinal epithelial cell)에서 CD36을 유의미하게 하향조절하였다(도 6h). 그에 반해서, 배양된 데설포비브리오 종으로부터 수집된 CFS는 IEC에서의 CD36의 발현을 직접적으로 상승시켰다(도 6h). 더욱이, 클로스트리디아 집합체와 단일-연관된 무균 동물은 데설포비브리오 또는 무균 동물과 단일-연관된 동물과 비교하여 체지방 백분율의 유의미한 감소를 나타냈다(도 6i). 특히, 클로스트리디아 집합체 단독에 의해 콜로니화된 무균 마우스에 대한 데설포비브리오의 첨가는 소장에서의 체지방 백분율 및 CD36 발현의 증가로 이어졌다(도 6j 및 도 6k). 이와 같이, 미생물총은 장 상피 내에 지질 대사를 직접적으로 조절할 수 있다.

HFD-섭식 T-Myd88^-/-는 지질 흡수 증가를 뒷받침하면서, 맹장 내의 몇몇 장쇄 지방산(LCFA)을 유의미하게 감소시키고 혈청에서의 증가를 동반하였다(도 6l 및 도 6m). 내강 지질 프로파일 및 16S 시퀀싱의 비교는 데설포비브리오와 클로스트리디아의 구성원 사이의 역상관관계 및 LCFA 및 다른 지질의 풍부도를 밝혀냈다. 맹장 내용물 내의 LCFA의 고갈은 데설포비브리오의 존재와 상당히 상관되었다. 그에 반해서, SMB53 및 데레아를 포함하는 클로스트리디아의 다수의 구성원은 LCFA 축적과 연관되었고(도 17c), 이는 미생물 조성이 지질 흡수를 조절할 수 있다는 가설을 더 지지한다. 이와 같이, 비만 및 T2D를 갖는 개체에서 보인 특정 클로스트리디아 종의 소실은 장 흡수 및 지방 대사를 증가시킬 수 있어서, 건강에 대한 적절한 미생물총 조성의 중요성을 강조한다.

토의. 미생물총은 매우 다양한 자가면역 및 대사 병태에 연루되었다. 그러나, 이 질환은 병원성 유기체의 획득과 항상 연관되지는 않고, 대신에 유리한 종의 소실은 원인 인자인 것으로 제안되었다(I. Cho et al., Nature 488 , 621-626 (2012)). 유리한 박테리아 소실로 이어지는 기전은 항생제 사용, 위생관리 증가 및 저섬유 식이를 포함할 수 있다(N. M. Koropatkin, E. A. Cameron, E. C. Martens, Nat Rev Microbiol 10 , 323-335 (2012)). 본원에 기재된 결과는 건강한 미생물 공동체를 유지시키는 다른 기전이 장 내에 이 집단의 적절한 면역 제어를 통해서라는 것을 나타낸다. T-Myd88^-/- 동물 내에 형성된 미생물총은 데설포비브리오의 증식 및 클로스트리디아의 소실을 포함하는 II형 당뇨병 및 비만을 갖는 개체에서 보인 군집붕괴를 반영한다(J. Qin et al., Nature 490 , 55-60 (2012)). 포괄적인 인간 연구가 부족한데, 비만 및 II형 당뇨병을 갖는 개체는 더 적은 점막 IgA 및 감소된 면역화 반응을 갖는 것으로 또한 보고되었다. 이는 이 개체가, 식이 결핍과 커플링되어 대사 질환으로 이어지는, 장 미생물총에 대한 완전히 결핍이 아니지만 준최적인 면역 반응을 갖는다는 것을 제시한다. 이 데이터는 미생물총의 T 세포-의존적 표적화가 건강한 공동체의 유지에 중요하다는 것을 제시한다. 박테리아의 IgA 결합이 통상적으로 이의 근절로 이어진다고 생각되지만, IgA는 소정의 박테리아의 기능적 유전자 발현을 조절하고 심지어 소정의 공생균의 점막 연관을 도울 수 있다(G. P. Donaldson et al., Science 360 , 795-800 (2018); T. C. Cullender et al., Cell Host Microbe 14 , 571-581 (2013); 및 D. A. Peterson, Net al., Cell Host Microbe 2 , 328-339 (2007))/ 실제로, 결과는 T-Myd88^-/- 동물에서의 IgA의 더 낮은 수준에도 불구하고 데설포비브리오 및 몇몇 클로스트리디아 종이 IgA 코팅의 증가를 나타낸다는 것을 보여준다. 이와 같이, IgA에 의한 클로스트리디아의 부적절한 표적화는 이의 콜로니화를 감소시키거나 비만의 발생에 영향을 미치는 이의 대사 기능을 변경할 수 있다.

추가로, 몇몇 클로스트리디아는 IgA에 의해 덜 표적화된다. 흥미롭게도, IgA 결핍을 갖는 개체 내의 미생물총의 최근의 평가는 몇몇 클로스트리디아에 의한 콜로니화의 유의미한 감소를 나타냈다(J. Fadlallah et al., Sci Transl Med 10 , (2018)). 따라서, IgA는 또한 박테로이데스 프라질리스에 대해 보인 것처럼 일부 클로스트리디아 종의 콜로니화를 향상시키도록 작용할 수 있다(G. P. Donaldson et al., Science 360 , 795-800 (2018)). 데설포비브리오가 이 모델에서 그리고 대사 증후군을 갖는 개체에서 증식하는 기전은 여전히 명확하지 않다.

그러나, 본원에 기재된 결과는 이 증식이 어떻게 일어나는지는 불가사의하게 남아 있지만 이것이 특이적 클로스트리디아 구성원의 콜로니화에 직접적으로 영향을 미칠 수 있다는 것을 나타낸다. 어떻게 장 미생물의 IgA 표적화가 이의 콜로니화에 영향을 미치고 무균 설정에서 작용하는지의 이해는 어떻게 면역계가 이 미생물 관계에 영향을 미치는지의 통찰을 제공할 수 있다. 클로스트리디아의 구성원이 몇몇 설정에서 점점 더 인식되면서(24), 다른 미생물에 의한 콜로니화 및 면역계가 어떻게 함께 클로스트리디아의 기능에 영향을 미치는지를 결정하는 것이 중요할 것이다.

CD36은 장 내의 지질 흡수의 중요한 조절자이고, 이의 결핍은 HFD 섭식 시 비만 및 대사 증후군의 발생에 대한 저항을 초래한다(M. Buttet et al., PLoS One 11 , e0145626 (2016); 및 M. Buttet et al., Biochimie 96 , 37-47 (2014)). 인간 간 내의 CD36의 발현의 증가는 지방 간 질환과 연관된다. 더욱이, 장 내의 이의 발현을 바로 2배 감소시킨 CD36에서의 다형을 갖는 개체는 대사 질환에 저항이다(L. Love-Gregory, N. A. Abumrad, Curr Opin Clin Nutr Metab Care 14 , 527-534 (2011)). 이와 같이, CD36의 상대 발현 수준은 포유류 내의 지질 흡수 및 항상성에 중요하다. 최근의 연구는 미생물총이 향상된 CD36 발현을 통해 장 내의 지질의 숙주 흡수를 상향조절할 수 있다는 것을 입증하였다(Y. Wang et al., Science 357 , 912-916 (2017)). 그러나, 박테리아가 또한 숙주 지질 흡수를 제지할 수 있다는 것이 발견되었다.

이와 같이, 장 박테리아는 지질 대사를 차등적으로 조절할 수 있다. 실제로, 데설포비브리오에 의해 분비된 생성물은 CD36 발현을 상향조절하는 반면, 클로스트리디아에 의해 생성된 생성물은 CD36 발현을 하향조절할 수 있다. 따라서, CD36 발현을 누그러 뜨리도록 작용하는 유기체의 소실이 부적절한 지질 흡수로 이어질 수 있고, 이는 시간에 걸쳐 축적하여서 비만 및 대사 증후군으로 이어질 수 있다. 데설포비브리오 및 클로스트리디아와 같은 유기체의 상호작용의 추가의 규명뿐만 아니라 CD36 발현에 영향을 미치는 분비된 분자의 확인은 미래의 표적화된 치료를 알려줄 수 있다.

재료 및 방법. 마우스. Myd88^+/+; CD4-Cre⁺ 마우스(WT) 및 Myd88^LoxP/LoxP; CD4-Cre⁺(T-MyD88^-/-) 동물을 생성하도록 C57Bl/6 Myd88^LoxP/LoxP 마우스(Jackson Laboratories)를 C57Bl/6 CD4-Cre 동물(Taconic)과 교배하였다. 표준 식이에서 면역 반응 및 미생물총 반응을 포함하는 자발적인 체중 표현형을 비교하도록 연령-일치된 수컷 마우스를 사용하였다. 고지방 식이(HFD)에서 면역 반응 및 미생물총 반응을 포함하는 체중 표현형을 비교하도록 연령-일치된 수컷 및 암컷 마우스를 사용하였다. 미생물총의 T 세포-의존적 형상화를 측정하기 위해, 4주령 Tcrb^-/- 마우스(Jackson Laboratories)를 사용하였다. 미생물총의 데설포비브리오 데설푸리칸스-의존적 형상화를 조사하기 위해, 6주령 WT C57Bl/6 마우스(Jackson Laboratories) 또는 연령-일치된 CD4-Cre⁺(WT) 마우스를 사용하였다. 면역결핍 마우스에서 체중 증가에 대한 미생물총 효과를 측정하기 위해, 4주령 Rag1^-/- 마우스(Jackson Laboratories)를 사용하였다. GF 마우스를 무균 격리장치에서 유지시키고, 대변의 평판도말 및 PCR에 의해 GF 상태에 대해 달마다 검증하였다. GF C57Bl/6 동물을 이 연구에 사용하였다.

포자-형성 미생물에 의한 마우스의 콜로니화. 대변 펠릿을 WT 마우스로부터 취하고, 혐기성 챔버에서 37℃에서 1시간 동안 3% 클로로포름(v/v)을 함유하는 환원 PBS에서 항온처리하였다. 환원 PBS 및 3% 클로로포름을 함유하는 대조군 관을 또한 혐기성 챔버에서 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 항온처리 후, 관을 온화하게 혼합하고, 대변 재료가 10초 동안 침강되게 하였다. 상청액을 새로운 관으로 옮기고, CO2를 관에 강제로 넣어 클로로포름을 제거하였다. 종래의 조건에서 포자-형성(SF) 실험을 위해, SF 코호트 내의 마우스를 100 μL의 포자 형성 대변 분획으로 경구로 위관영양하고, CTRL 코호트 내의 마우스를 100 μL의 PBS 대조군으로 경구로 위관영양하였는데, 이것은 또한 3일마다 클로로포름 제거되었다. 무배아 동물과의 포자-형성 연관에 대해, 위관영양 물질을 함유하는 관을 1시간 동안 무균 격리장치의 포트에서 멸균시킨 후 이들을 위관영양을 위해 격리장치로 밀었다. 이후, 사육자 쌍을 100 μL의 포자-형성 칵테일로 경구로 위관영양하였다. 이의 자손을 소장 및 간의 분석을 위해 8주령에 희생하였다.

T-Myd88 ^-/- 마우스로의 T 세포 전달. T-Myd88^-/- 마우스는 T 세포 전달 전일에 500 rad에 의해 준최적으로 조사되었다. WT(CD4-cre⁺) 및 BCL6KO(Bcl6^LoxP/LoxP CD4-cre⁺) 마우스로부터의 비장을 사용하고, CD4⁺ T Cell Isolation Kit(Miltenyi)로부터 T 세포를 단리하였다. T-Myd88^-/-를 안구뒤로 5×10⁶의 WT 또는 Bcl6^-/- MACS-농후화된 T 세포로 주사하고, 5주 동안 주마다 체중을 쟀다.

식이 치료. SPF 설비 내에 수용된 동물은 조사된 2920x(Envigo)의 표준 음식을 섭식하였다. 마우스는 HFD 실험 동안 대조군으로서 45 kcal%의 지방 DIO 마우스 공급물(Research Diets)의 고지방 식이 또는 10 kcal%의 지방 DIO 마우스 공급물(Research Diets)의 식이를 섭식하였다. 마우스는 또한 5-ASA 염증 실험 동안 1% 5-ASA(Envigo)를 함유하는 조사된 표준 2020 음식을 함유하는 커스텀 식이 또는 5-ASA(Envigo)가 결여된 대조군 식이를 섭식하였다.

항생제 치료. WT 및 T-Myd88^-/- 마우스를 체중 증가 표형형에 대한 미생물총의 상대 분포를 결정하기 위해 HFD가 섭식되는 한편 14주 동안 이의 음용수 내에 0.5 mg/mL의 암피실린(Fisher Scientific), 네오마이신(Fisher Scientific), 에리트로마이신(Fisher Scientific) 및 겐타마이신(GoldBio)에서 유지시켰다. TCRb^-/- 및 Rag1^-/- 마우스는 대변 전달에 의해 재콜로니화되기 전에 내인성 미생물총을 감소시키기 위해 1주 동안 이의 음용수 내에 0.5 mg/mL의 암피실린(Fisher Scientific), 네오마이신(Fisher Scientific), 에리트로마이신(Fisher Scientific) 및 겐타마이신(GoldBio)에 위치하였다.

Tcrb ^-/- 마우스 내의 미생물총의 T 세포 형상화. 4마리의 Tcrb^-/- 마우스의 3개의 별개의 우리를 1주 동안 이의 음용수 내에 항생제 칵테일에 위치시켰다. 항생제를 임의의 추가의 처리 전에 24시간 동안 제거하였다. WT 공여자로부터의 하나의 대변 펠릿 및 T-Myd88^-/- 공여자로부터의 하나의 대변 펠릿을 0.1% 시스테인을 함유하는 환원 PBS에서 으깨고 즉시 Tcrb^-/- 마우스로 경구로 위관영양하였다. 이 경구 위관영양을 1주 동안 격일로 반복하였다. 최종 위관영양 후 48시간에, 마우스를 개별적으로 수용된 우리에 넣고, 5×10⁶개의 CD4⁺ MACS-농후화된 WT 또는 T-Myd88^-/- 세포에 안구뒤로 주사하였다. 이를 D0으로 표지하였다.

포도당 과민증 시험. 포도당으로 시험주입하기 전에 마우스를 6시간 동안 공복시켰다. 칸투어 혈당기(Contour Glucose Meter)(Bayer) 및 칸투어 혈당 스트립(Contour Glucose Strip)(Bayer)을 사용하여 공복 혈당 수치를 검출하였다. 체중 1 그램당 1 밀리그램의 포도당을 0 시점에 동물로 복강내로 주사하였다. 혈당기 및 스트립을 사용하여 5분, 15분, 30분, 60분 및 120분 시점에 혈당 수치를 측정하였다.

인슐린 ELISA. 6시간 공복된 마우스로부터 혈청을 수집하고, 마우스 인슐린 ELISA 키트(Crystal Chem)를 사용하여 인슐린을 측정하였다. 제조사 지시에 따라 혈청 샘플을 2회 실행하였다.

인슐린 저항성 시험. 마우스를 포도당으로 시험주입하기 전에 6시간 동안 공복시켰다. 칸투어 혈당기(Bayer) 및 칸투어 혈당 스트립(Bayer)을 사용하여 공복 혈당 수치를 검출하였다. 인슐린(0.75 U/kg 체중)을 0 시점에 동물로 복강내로 주사하였다. 혈당기 및 스트립을 사용하여 5분, 10분, 15분, 20분, 25분, 30분, 40분 및 60분 시점에 혈당 수치를 측정하였다. 혈당 수치가 30 mg/dL로 떨어지면 25% 포도당의 150 μL i.p. 주사 후 실험으로부터 동물을 제거하였다.

마우스 장 상피 세포(MODE-K 세포)를 사용한 시험관내 실험. 마우스 장 상피 세포를 L-글루타민 및 피루브산나트륨을 갖는 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)에서 유지시켰다. DMEM은 10% FBS, 1%(v/v) 글루타민, 페니실린-스트렙토마이신 및 1% HEPES가 보충되었다. 박테리아가 유전자 발현을 조절하는지를 결정하기 위해, 포화상태 세포 단층을 4시간 동안 클로스트리디아 집합체 또는 데설포비브리오 종으로부터 수집된 (1:1) 페니실린-스트렙토마이신 무 DMEM:CFS와 항온처리하였다. 이후, 배지를 흡입시키고, 세포를 나중의 분석을 취해 600 tL RiboZol(VWR)에 넣었다.

qPCR 및 RNA-seq를 위한 소장, 세포 배양물 및 간 조직으로부터의 RNA 단리. 조직 절편 0.5 cm 길이 또는 1x10⁵개의 세포를 700 tL의 RiboZol(VWR)에서 -70℃에서 저장하였다. Direct-zol RNA MiniPrep Kit(Zymoresearch)를 사용하여 RNA를 단리하였다. qScript cDNA 합성 키트(Quanta Biosciences)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. LightCycler 480 SYBR Green I Master(Roche)를 사용하여 qPCR을 수행하였다. Lightcycler LC480 장치(Roche)에서 qPCR 실험을 수행하였다. 간 RNA 시퀀싱을 위해, RNA를 RiboZero 처리와 함께 Illumina TruSeq Stranded RNA Sample Prep(인간, 마우스, 래트 등)를 통해 QC 후에 준비하고, Illumina HiSeq Sequencing을 사용하여 분석하였다.

대변 면역글로불린의 정량화. 내강 IgA를 정량화하기 위해, 대변 펠릿을 1.5 mL의 마이크로원심분리 관에 수집하고 칭량하였다. 내강 내용물을 대변 중량 1 밀리그램당 10 tL의 무균 1X HBSS에 재현탁하고, 100 x g에서 5분 동안 스피닝하여 과정 재료를 제거하였다. 이후, 상청액을 새로운 1.5 mL의 마이크로원심분리 관에 놓고, 8000 x g에서 5분 동안 스피닝하여 박테리아를 펠릿화하였다.

이후, 상청액(IgA를 함유)을 새로운 1.5 mL의 마이크로원심분리 관에 넣고, IgA-specific ELISA 키트(eBioscience; 제조사 지시에 따라 형성됨)에 대한 샘플(1/10 및 1/100(v/v) 희석)로서 사용하였다. 흡광도를 450 nm에서 판독하고, 표준 곡선을 사용하여 IgA의 농도를 계산하였다. 대변 중량으로 농도를 정규화하였다.

박테리아 펠릿을 500 tL의 무균 PBS에 재현탁하고, 8000x g에서 5분 동안 스피닝하여 2회 세척하였다. 이후, 세척된 박테리아 펠릿을 대변 1 mg당 10 tL의 무균 PBS에 재현탁하였다. 5 마이크로리터의 각각의 샘플을 96웰 환저 플레이트에 평판도말하였다. 박테리아를 10%(v/v) FBS를 함유하는 100 tL의 무균 HBSS에 의해 실온에서 15분 동안 차단하였다. 세포를 세척하지 않으면서, 10%(v/v) FBS를 함유하는 무균 HBSS에 1:500 희석된 100 tL의 항-IgA(ebioscience clone mA-6E1 PE), 항-IgG1(Santacruz CruzFluor555) 또는 항-IgG3(Santacruz CruzFluor555)을 웰에 첨가하였다. 웰을 4℃에서 30분 동안 항온처리하였다. 상청액을 제거하기 전에 2500x g에서 5분 동안 스피닝하고 세포를 무균 HBSS에 재현탁하여 플레이트를 2회 세척하였다. 최종 세척 후, 박테리아 웰을 5 tL의 1x SYBR 그린 스테인(Invitrogen 카탈로그 S7563호)을 함유하는 250 tL의 HBSS에 재현탁하였다. 웰을 유세포분석기에서 열거하기 바로 전에 4℃에서 20분 동안 항온처리하였다. Rag1^-/- 대변 펠릿은 음성 대조군으로서 모든 실험에 포함되었다.

데설포비브리오 데설푸리칸스 ATCC 27774 및 데설포비브리오 피게르 ATCC 29098의 성장. ATCC(#27774)로부터 박테리아 종 데설포비브리오 데설푸리칸스를 구입하였다. ATCC(#29098)로부터 박테리아 종 데설포비브리오 피게르를 구입하였다. 바이러스를 혐기성 박테리아에 대한 ATCC 설명에 따라 취급하고 개봉하고, 세포를 상기에 기재된 데설포비브리오 배지에서 성장시켰다(F. E. Rey et al., Proc Natl Acad Sci U S A 110 , 13582-13587 (2013)). 배지는 NH4Cl(1 g/L)(Fisher Chemical), Na2SO4(2 g/L)(Fisher Chemical), Na2S2O3·5H2O(1 g/L)(Sigma), MgSO4·7H2O(1 g/L)(Fisher Chemical), CaCl2·2H2O(0.1 g/L)(Fisher Chemical), KH2PO4(0.5 g/L)(Fisher Bioreagents), 효모 추출물(1 g/L)(Amresco), 레자주린(0.5 mL/L)(Sigma), 시스테인(0.6 g/L)(Sigma), DTT(0.6 g/L)(Sigma), NaHCO3(1 g/L)(Fisher Chemical), 피루브산(3 g/L)(Acros Organics), 말산(3 g/L)(Acros Organics), ATCC 미량 미네랄 믹스(10 mL/L), ATCC 비타민 믹스(10 mL/L)로 구성되었고 7.2의 pH로 조정되었다. 박테리아를 혐기성 챔버(Coy Labs)에서 48시간 동안 성장시키고, 70℃에서 25% 글리세롤을 함유하는 성장 배지에 저장하였다. 2.5×10⁸개의 박테리아 CFU를 1주일 동안 250 μL의 마우스 음용수에 첨가하였다.

대변, 회장 및 IgA 결합된 미생물 DNA의 단리 및 16S 시퀀싱. 동물을 희생시키고, 이의 전체 하부 소화관(십이지장에서 직장)을 제거하고, 세로로 절편화하였다. 각각 대변 및 회장 미생물총 공동체를 규명하도록 각각의 동물로부터 소장의 10 cm 더 낮은 곳에서의 하나의 대변 펠릿 및 내강 내용물을 수집하였다. 대변 및 회장 샘플을 약 250 mg의 0.15 mm 가넷 비드(MoBio, 카타라로그 13122-500호)를 함유하는 2 mL의 스크류 캡 관에서 -70℃에서에서 바로 동결하였다. 제조사의 지시에 따라 Power Fecal DNA Isolation Kit(MoBio)를 사용하여 DNA를 추출하였다. T 세포 전달 실험으로부터의 IgA 결합된 및 비결합된 박테리아를 맹장 내용물로부터 단리하고, 가공 전에 -70℃에서 동결하였다. 쌍별-말단 300회 사이클 MiSeq 리드를 사용하여 IgA 결합된 박테리아 분리, 16S rDNA 증폭, 시퀀싱 및 서열 가공을 수행하였다(J. L. Kubinak et al., Cell Host Microbe 17 , 153-163 (2015)). IgA 지수를 계산하였다(A. L. Kau et al., Sci Transl Med 7 , 276ra224 (2015)).

메타발현체학. 대변 펠릿 또는 내강 회장 내용물을 트리졸에 바로 넣고, RNA 추출까지 -20℃에서 저장하였다. 총 RNA를 Direct-zol(Zymo Research, #R2052)을 사용하여 샘플로부터 추출하고, 이후 Ribo-Zero Gold rRNA(역학) 제거 키트(Illumina, #MRZE724)를 사용하여 유타 대학 고출력 게놈학 코어 설비에 의해 Illumina 시퀀싱에 대해 준비하였다. Illumina 라이브러리는 다중화되고 단일-말단 50회 사이클 시퀀싱에 의해 HiSeq 2500에서 시퀀싱되었다. humann2(v 0.9.9) 분석 프레임워크는 후속하는 시퀀싱 가공 및 데이터 분석에 사용되었다(S. Abubucker et al., PLoS Comput Biol 8 , e1002358 (2012)). 처음에, Humann2에서 실행된 니드 데이터 스크립트(knead data script)를 사용하여, 원시 서열을 품질 트리밍하고, Trimmomatic을 사용하여 여과시키고(A. M. Bolger, M. Lohse, B. Usadel, Bioinformatics 30 , 2114-2120 (2014)), 이후 bowtie2를 사용하여 무스 무스쿨루스(Mus musculus) 게놈 빌드 GRCm38에 대해 숙주 리드를 제거하도록 여과시켰다(B. Langmead, S. L. Salzberg, Nat Methods 9 , 357-359 (2012). 샘플에 걸쳐 회장 샘플로부터의 많은 더 많은 리드가 마우스 게놈에 맵핑되지만, 유전자형 중에서 품질-여과된 리드의 유의차가 관찰되지 않아서, 더 적은 박테리아 전사체 커버리지를 제공한다. 이후, 이 짧은 리드의 맵핑을 개선하기 위해, 품질-여과된 리드의 맵핑은 UniRef90 유전자 주석화에 의한 마우스 단리된 박테리아 기준 게놈의 커스텀 데이터베이스로 제한되었다. 이 커스텀 데이터베이스는 마우스 장 박테리아 수집(miBC)의 일부로서 최근 단리되고 시퀀싱된 53개의 유기체(I. Lagkouvardos et al., Nat Microbiol 1 , 16131 (2016))뿐만 아니라, 16S 시퀀싱에서 검출되었지만 이미 miBC 수집에 포함되지 않은 종을 나타내는 humman2의 chocophlan 데이터베이스에 포함된 9개의 기준 게놈으로 이루어졌다. 이 9개의 게놈은 비피도박테리아 슈도롱검, 비피도박테리아 아니말리스, 비피도박테리아 롱검, 박테로이데스 프라질리스, 무시스피릴룸 스카에들러리, 락토바실러스 루테리, 클로스트리듐 페르프린겐스, 데설포비브리오_데설푸리칸스 및 칸디다투스 아르쓰로미투스였다. Uniref90 주석화에 의해 커스텀 데이터베이스를 생성하기 위해, miBC 게놈으로부터의 아미노산 서열을 Diamond 얼라이너(B. Buchfink, C. Xie, D. H. Huson, Nat Methods 12 , 59-60 (2015))를 사용하고 50% 쿼리 커버리지 및 90% 동일성을 요하는 Uniref90 데이터베이스로 정렬하였다. 이후, 이 uniref90-주석화된 miBC 아미노산 서열은 각각의 상응하는 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 주석화하도록 사용되었고, 마우스-특이적 박테리아 게놈을 함유하는 커스텀 뉴클레오타이드 맵핍 기준품을 생성하기 위해 이미 주석화된 9개의 게놈과 조합된다. Humann2를 사용하여 여과된 서열 리드를 커스텀 기준품으로 맵핑하기 위해, 짧은 리드 길이로 인해 뉴클레오타이드 정렬(번역된 정렬 무)이 사용되었다. 이후, humannn2로부터의 uniref90 유전자 패밀리 출력을 위한 킬로염기당 정렬된 리드의 계수치는 (샘플 내에) 백만개당 계수치로 정규화되거나, Gene Ontology(GO: Gene Ontology) 조건으로 재그룹화되고, 이후 후속 분석을 위해 정규화되었다.

대사 표현형분석. NMR Bruker Minispec에서 총 체지방 조성을 측정하였다. 간접적인 열량측정법을 측정하도록 CLAMS Metabolic Cage를 사용하였다. 하기 식을 이용하여 에너지 소비량(EE: energy expenditure)을 측정하였다. 발열량(CV) = 3.815 + (1.232 * RER). EE = CV * VO2.

간 및 지방 조직 현미경검사. 간 및 지방 조직을 포르말린에 고정하고, 왁스에 포매하고, 헤마톡실린 및 에오신 염색하였다. Thermofisher로부터의 EVOS 코어 XL 영상화 시스템을 사용하여 현미경검사 영상을 수집하였다.

혈청 및 맹장 내용물 대사체학(SCFA 측정 배제). 샘플 추출 및 준비. 맹장 내용물을 분석 전에 -70℃에서 저장하였다. 내부 표준품(샘플당 1 tg의 d4-숙신산과 5 tg의 표지된 아미노산(¹³C, ¹⁵N-표지된) 혼합물)을 함유하는 5 밀리미터의 75% 에탄올 용액을 각각의 샘플에 첨가하였다. 샘플을 격렬히 와류시키고, 이후 10분 동안 끓는 물에서 항온처리하였다. 냉각된 샘플을 5,000x g에서 5분 동안 스피닝하였다. 상청액을 새로운 관으로 옮기고, 이후 밤새 스피드-진공시켜 건조시켰다.

GC-MS 분석. Agilent 6890 가스 크로마토그래프가 장착된 Waters GCT Premier 질량 분광기 및 Gerstel MPS2 오토샘플러에 의해 GC-MS 분석을 수행하였다. 건조된 샘플을 피리딘 중의 40 tL의 40 mg/mL의 O-메톡실아민 하이드로클로라이드(MOX)에 현탁하고, 30℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 오토샘플러 바이알에 25 tL의 이 용액을 첨가하였다. 40 마이크로리터의 40 tL의 N-메틸-N-트리메틸실릴트리플루오르아세트아미드(MSTFA)를 오토샘플러를 통해 자동으로 첨가하고, 진탕시키면서 37℃에서 60분 동안 항온처리하였다. 3 tL의 지방산 메틸 에스테르 표준품(FAMES) 용액을 오토샘플러를 통해 첨가한 후, 이후 1 μL의 준비된 샘플을 250℃에서 유지된 입구 온도로 분할 모드에서 가스 크로마토그래프 입구에 주입하였다. 분석에 10:1 분할비를 사용하였다. 가스 크로마토그래프는 1분 동안 95℃의 초기 온도, 이어서 110℃까지 40℃/분 상승 및 2분의 유지 시간을 가졌다. 이것에 250℃까지 제2의 5℃/분 상승, 350℃까지 제3의 상승, 이후 3분의 최종 보유 시간이 뒤따랐다. 30-m Phenomex ZB5-5 MSi 열과 5-m 긴 가드 열은 크로마토그래피 분리에 사용되었다. 헬륨은 1 mL/분으로 운반 가스로서 사용되었다. 다량의 몇몇 대사물질로 인해 샘플은 10배 희석으로 한번 더 분석되었다.

GC-MS 데이터의 분석. MassLynx 4.1 소프트웨어(Waters)를 사용하여 데이터를 수집하였다. 대사물질을 확인하고, QuanLynx를 사용하여 이의 피크 면적을 기록하였다. 이 데이터를 Excel 스프레드 시트(Microsoft, 워싱턴주 레드먼드)로 옮겼다. 순수한 구입된 표준품을 사용하여 개발된 인하우스 대사물질 라이브러리와 상업적으로 구입 가능한 NIST 라이브러리의 조합을 사용하여 대사물질 동일성을 확립하였다. GC-MS를 사용하여 모든 대사물질이 관찰되지는 않았다. 이는 여러 이유로 인했다. 예를 들어, 일부 대사물질은 매우 낮은 농도로 존재하였다. 둘째로, 대사물질은 어느 하나가 기화하기 너무 크다는 것으로 인해 GC-MS에 보정 가능하지 않을 수 있거나, 카르니틴과 같은 4차 아민이거나, 바로 잘 이온화하지 않는다. 잘 이온화하지 않는 대사물질은 옥살로아세테이트, 히스티딘 및 아르기닌을 포함한다. 시스테인은 세포 조건에 따라 관찰되고, 대개 단백질과 디설파이드 결합을 형성하고, 낮은 세포내 농도로 있다.

맹장 내용물의 단사슬 지방산 검출. 샘플 추출 및 준비 . 샘플을 동결기로부터 제거하고, 5분 동안 실온에서 해동되게 하였다. 이 샘플에 400 tL의 dd-H2O, 10 tL의 5-설포살리실산(1 mg/tL) 및 2 tL의 내부 표준품(1 M 피발산)을 첨가하였다. 샘플을 30초 동안 와류시키고, 30분 동안 휴지시켰다. 이후, 샘플을 2000 x g에서 4℃에서 10분 동안 원심분리하였다. 이후, 상청액을 10 tL의 진한 HCl을 함유하는 PTFE 라이닝된 캡을 갖는 유리 바이알로 옮겼다. 다음에, 3 mL의 에테르를 첨가하고, 샘플을 30초 동안 와류시키고, 이후 4℃에서 1,200 x g에서 10분 동안 원심분리하였다. 이후, 상청액을 PTFE-라이닝된 캡을 갖는 새로운 유리 바이알로 옮기고, 50 tL의 N-메틸-N-(tert-부틸디메틸실릴) 트리플루오로아세트아미드, tert부틸디메틸클로로실란(MTBSTFA; Thermo Scientific)으로 유도체화하였다. 샘플을 와류시키고, 30분 동안 60℃ 모래 욕에 넣었다. 샘플은 실온으로 냉각되게 하였고, 온화한 질소 스트림 하에 대략 250 tL의 부피로 부분적으로 증발시키고, 유리 GC-MS 바이알로 옮겼다.

GC-MS 분석. Agilent 5793 질량 분광기에 커플링된 Agilent 6890 가스 크로마토그래프 및 DB-1 칼럼(15 m x 0.25-mm 내경 x 0.25-μm 필름 두께; J&W Scientific, 미국 캘리포니아주 폴섬)이 구비된 Agilent 7683(미국 캘리포니아주 산타 클라라) 오토인젝터에서 GC/MS 분석을 수행하였다. 헬륨 운반 가스를 1.0 mL/분의 유속으로 사용하였다. 1-μL의 샘플의 주입에 의한 분할비 10:1은 250℃에서 보유된 입구로 만들어졌다. 사용된 GC 오븐 램프는 40℃(1분 보유); 70℃까지의 5℃/분에서의 상승(3분 보유); 160℃까지의 20℃/분에서의 상승(0분 보유); 330℃까지의 40℃/분에서의 상승(6분 보유)이였다. 데이터는 44 내지 200 m/z의 질량 범위로 스캔 모드로 획득되었고, 표적은 아세트산에 대해 m/z 117.0, 부탄산에 대해 m/z 131.0, 프로판산에 대해 m/z 145.0 및 피발산에 대해 m/z 159.0을 사용하여 정량화되었다.

실시예 2: 4개의 클로스트리디아 균주는 비만, 인슐린 저항성 및 염증성 장 질환을 구제한다

4개의 클로스트리디아 구성원의 제제는 마우스에서 지방증을 감소시킨다. 지방증의 감소에 기여하는 공동체의 특이적 구성원을 좁히도록 다양한 시험관내 기법을 사용하였다. 이 실험은 이 공동체의 4개의 특이적 구성원의 조합의 시험으로 이루어졌다. 클로스트리디아 아나에로보락스, 라크노스피라세아에 종, 클로스트리듐 XIVa 및 클로스트리듐 IV를 함유하는 개선된 4개의 구성원 공동체(본원에서 개선된 클로스트리디아 집합체-rCC-4라고도 칭함). 마우스를 콜로니화하고 지방 축적을 더 복잡한 클로스트리디아 집합체와 비교하도록 이 4개의 균주를 사용하였다(도면에서 SF라 칭함). 흥미롭게도, 이 4개의 균주는 지방증(rCC-M)을 복잡한 미생물 공동체와 동일한 정도로 감소시키기에 충분하였다(도 18).

클로스트리디아의 대체는 비만, 인슐린 저항성 및 염증성 장 질환을 구제한다. 일련의 실험을 통해, 비만발생 동물에서 유의미한 클로스트리디아 강의 감소가 확인되었다. 따라서, 이 빈약-연관된 미생물의 재도입이 비만에 대해 보호하는지가 시험되었다. 클로스트리디아가 공지된 포자-형성자이지만, 대변은 이 미생물이 농후화되도록 클로로포름에 의해 처리되었다. 동물을 고지방 식이(HFD)에 넣고, 이는 이 모델에서 체중 증가를 증속시키는 것으로 나타났고, 서구화된 식이를 더 잘 모방한다. 포자-형성 박테리아의 칵테일에 의한 비만 취약 T-MyD88^-/- 동물의 처리는 체중 증가 및 지방 축적을 유의미하게 감소시켰다(도 19a 내지 도 19b). 바로 3개월 종료 시, 클로스트리디아에 의해 처리된 T-MyD88^-/- 마우스는 비처리된 T-MyD88-/-와 비교할 때 더 낮은 체지방 백분율 및 감소된 VAT 질량을 가졌다(도 19c). 클로스트리디아 처리는 또한 혈당 수치를 감소시키고 인슐린 저항성을 감소시킨다(도 19d 및 도 19e). 중요하게는, 클로스트리디아 처리에 의한 이 대사 매개변수의 개선은 HFD에 위치한 WT 동물에서 또한 보였고(도 19d 및 도 19e; WT), 이는 클로스트리디아에 의한 MetS의 개선이 MetS 및 TIID의 몇몇 상이한 모델에서 관련될 것이라는 것을 제시한다.

IBD와 당뇨병 사이의 관계가 논란이 많지만, 현재 이들 관련성을 뒷받침하는 몇몇 연구가 있다. IBD를 갖는 12,601명의 환자에 의한 횡단 연구에서, 당뇨병은 제3의 가장 흔한 동반이환이었다. 덴마크에서의 47,325명의 환자로부터의 다른 더 최근의 단면 연구는 당뇨병이 IBD(UC 및 CD 둘 다)와 상당히 연관되었다는 것을 나타냈다. 1200명의 IBD 환자의 소아 코호트에서, 당뇨병의 유병률은 또한 대조군보다 UC 환자에서 더 높았다. 2019년에 IBD를 갖는 8070명의 환자 및 40,030명의 건강한 대조군을 사용한 더 최근의 연구는 당뇨병 발병률이 스테로이드 사용을 제어할 때에도 IBD를 갖는 개체에서 유의미하게 더 높았다는 것을 입증하였다. 마지막으로, 1977년에서 2014년에 IBD가 없는 대상체에 비해 IBD의 진단을 갖는 6,028,844명의 대상체의 전국적인 집단 기반 코호트는 특히 2003년 내지 2014년에 IBD를 갖는 개체에서 증가된 당뇨병 발생률을 밝혀냈다. 포도당 항상성 이외에, IBD를 갖는 개체는 또한 지질 대사의 변경을 갖는 것으로 보고되어서, 대사 질환과 IBD 사이의 연결을 지지한다. 이들 질환의 둘 다에 대한 공통성은 만성 염증 및 미생물총에 대한 변화를 포함하지만, 이들 질병 사이의 연결에 기저하는 기전은 공지되어 있지 않다.

이제 건강한 대조군과 비교하여 당뇨병 및 IBD를 갖는 개체에서 미생물총 조성을 분석한 연구가 있고, 몇몇 유사성이 나타났다. 클로스트리디알레스, 루미노코카세아에 및 라크노스피라세아에의 구성원의 특이적 고갈에 의한 미생물총의 다양성 감소는 당뇨병, 비만 및 IBD를 갖는 개체에서 보고된다. 계통발생 수준에서의 미생물총 조성은 일반적으로 개체 간에 가변적이지만, 미생물총의 기능적 능력은 꽤 안정하다. 이와 같이, 메타게놈 연구는 질환에 대한 미생물총의 기여에 대한 통찰을 더 제공할 수 있다. II형 당뇨병 및 IBD 둘 다에서의 메타게놈 연구는 단사슬 지방산(SCFA) 생성의 감소를 밝혀냈고, 이는 클로스트리디아의 구성원의 감소와 일치한다. 유기체의 특이적 하위집단의 소실 이외에, 이들 장애 중에서 확인된 유사한 기회병원성 공생미생물이 있다. TIID를 갖는 350명 초과의 개체를 살펴보고 미생물총의 조성을 건강한 개체의 것과 비교한 연구는 TIID와 연관된 가장 상당한 이동이 데설포비브리오인 설페이트 환원 유기체에서 농후화된다는 것을 확인하였다. 다른 독립적인 연구는 TIID를 또한 갖는 면역-손상된 개체에서 데설포비브리오 과성장을 확인하였다. IBD에서, 많은 연구는 데설포비브리오의 증가를 언급한다. IBD의 흔한 치료인 메살라민은 대변 설파이드를 억제하지만, 이 약물을 섭취하지 않은 환자에서, 더 높은 설파이드 수치를 보유한다. 메타게놈 연구는 IBD 및 II형 당뇨병에서 계통발생학적 연구를 확인시켜주고, 황 함유 아미노산, 시스테인의 대사에 관여된 유전자가 질환을 갖는 개체에서 증가한다는 것을 입증한다. 이와 같이, 미생물총의 조성의 유사한 이동은 IBD 및 당뇨병을 갖는 개체에서 확인되고, 이는 이들 공통성이 이들 질환의 발생의 기저가 될 수 있다는 것을 제시한다.

당뇨병과 IBD 사이의 관련성에 기초하여, 이들 박테리아가 IBD의 마우스 모델로부터 구제하거나 보호성인지가 시험되었다. 황산 덱스트란 나트륨(DSS: dextran sodium sulfate) 대장염의 만성 모델이 사용되었는데, 이로써 DSS는 5일 동안 음용수에 제공되고 이어서 정기적 물의 10일 및 반복된 2의 추가 사이클이 있었다. 클로스트리디아 또는 PBS를 격일로 경구로 위관영양하고, 조직학을 수행하였다. 실제로, 클로스트리디아에 의해 처리된 동물은 결장 길이 증가 및 조직병리학 점수 감소에 의해 결정되는 것처럼 대장염 발생으로부터 상당히 보호되었다(도 19f, 도 19g). 이와 같이, 클로스트리디아는 대사 증후군(MetS) 및 IBD의 발생을 예방할 수 있다.

<110> Round, June <120> CLOSTRIDIA CONSORTIA COMPOSITIONS AND METHODS OF TREATING OBESITY, METABOLIC SYNDROME, IRRITABLE BOWEL DISEASE <130> 21101.0401p1 <150> US 62/875,129 <151> 2019-07-19 <160> 38 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 388 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16S r <400> 1 ctgccctttg cacagggata gccattggaa acgatgatta aaacctgata acaccatttg 60 gttacatgag cagatggtca aagatttatc ggcaaaggat gggcctgcgt ctgattagct 120 agttggtaag gtaacggctt accaaggcga cgatcagtag ccgacctgag agggtgaacg 180 gccacattgg aactgagaca cggtccaaac tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg 240 cacaatgggc gaaagcctga tgcagcaacg ccgcgtgaag gaagaaggcc ttcgggtcgt 300 aaacttctgt ccttggggaa gaagaactga cggtacccaa ggaggaagcc ccggctaact 360 acgtgccagc agccgcggta atacgtag 388 <210> 2 <211> 378 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16S r <400> 2 cagttagaaa tgactgctaa taccgcataa gaccacaaag ccgcatggct rwgtggtaaa 60 aactccggtg gtgtaagatg ggcccgcgtc tgattaggta gttggcgggg taacggccca 120 ccaagccgac 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Claims (44)

1. 조성물로서, 클로스트리디아 집합체(Clostridia consortium)로부터의 상청액을 포함하는 조성물.
2. 제1항에 있어서, 클로스트리디아 집합체는 2개 이상의 박테리아 균주를 포함하고, 2개 이상의 박테리아 균주는 클로스트리디아 아나에로보락스(Clostridia anaerovorax), 클로스트리듐 XIVa, 클로스트리듐 IV 및 라크노스피라세아에 종(Lachnospiraceae spp)인, 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 대상체에서 장 상피 내의 지질 흡수 유전자의 발현을 억제할 수 있고, 클로스트리디아 집합체는 클로스트리디아 아나에로보락스, 클로스트리듐 XIVa, 클로스트리듐 IV 및 라크노스피라세아에 종 중 2개 이상을 포함하는, 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 대상체의 소장에서 지질 흡수를 억제할 수 있고, 클로스트리디아 집합체는 클로스트리디아 아나에로보락스, 클로스트리듐 XIVa, 클로스트리듐 IV 및 라크노스피라세아에 종 중 2개 이상을 포함하는, 조성물.
5. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 대상체에서 체중 증가를 감소시킬 수 있고, 클로스트리디아 집합체는 클로스트리디아 아나에로보락스, 클로스트리듐 XIVa, 클로스트리듐 IV 및 라크노스피라세아에 종 중 2개 이상을 포함하는, 조성물.
6. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 대상체의 간에서 CD36을 하향조절할 수 있고, 클로스트리디아 집합체는 클로스트리디아 아나에로보락스, 클로스트리듐 XIVa, 클로스트리듐 IV 및 라크노스피라세아에 종 중 2개 이상을 포함하는, 조성물.
7. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 대상체에서 지방증을 감소시킬 수 있고, 클로스트리디아 집합체는 클로스트리디아 아나에로보락스, 클로스트리듐 XIVa, 클로스트리듐 IV 및 라크노스피라세아에 종 중 2개 이상을 포함하는, 조성물.
8. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 대상체에서 체지방 백분율을 낮추고/낮추거나 내장 지방 조직(VAT) 질량을 감소시킬 수 있고, 클로스트리디아 집합체는 클로스트리디아 아나에로보락스, 클로스트리듐 XIVa, 클로스트리듐 IV 및 라크노스피라세아에 종 중 2개 이상을 포함하는, 조성물.
9. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 대상체에서 혈당 수치를 감소시키고/시키거나 인슐린 저항성을 감소시킬 수 있고, 클로스트리디아 집합체는 클로스트리디아 아나에로보락스, 클로스트리듐 XIVa, 클로스트리듐 IV 및 라크노스피라세아에 종 중 2개 이상을 포함하는, 조성물.
10. 조성물로서, 클로스트리듐 집합체를 포함하는 조성물.
11. 제10항에 있어서, 상기 조성물은 대상체에서 장 상피 내의 지질 흡수 유전자의 발현을 억제할 수 있는, 조성물.
12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 클로스트리듐 집합체는 클로스트리디아 아나에로보락스(Clostridia anaerovorax) 속, 클로스트리듐 XIVa 및 클로스트리듐 IV 및 라크노스피라세아에 종을 포함하는, 조성물.
13. 제1항에 있어서, 표 1로부터 선택된 하나 이상의 박테리아 균주를 추가로 포함하는, 조성물.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 약제학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함하는, 조성물.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 동결된, 조성물.
16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 고체인, 조성물.
17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 각각의 클로스트리디아 균주의 적어도 1x10^-5개의 세포를 포함하는, 조성물.
18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물의 단일 투여량은 각각의 클로스트리디아 균주의 1x10^-5개 내지 1x10^-10개의 세포를 포함하는, 조성물.
19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 불균형 미생물총과 연관된 질환 또는 장애를 갖는 대상체의 미생물총을 대체할 수 있는, 조성물.
20. 제19항에 있어서, 불균형 미생물총은 데설포비브리오(Desulfovibrio)의 증가 및 클로스트리디아의 감소인, 조성물.
21. 제19항에 있어서, 불균형 미생물총은 클로스트리디아의 감소 및 무 증식 데설포비브리오인, 조성물.
22. 제19항에 있어서, 질환 또는 장애는 비만, 대사 증후군, 인슐린 결핍, 인슐린-저항성 관련된 장애, 포도당 과민증, 당뇨병 또는 염증성 장 질환인, 조성물.
23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 분말, 과립, 바로 사용 가능한 음료, 푸드바, 압출 형태, 캡슐, 젤 캡 및 분산성 정제로 이루어진 군으로부터 선택된 형태로 투여되는, 조성물.
24. 클로스트리디아 아나에로보락스, 클로스트리듐 XIVa, 클로스트리듐 IV 및 라크노스피라세아에 종 중 2개 이상을 포함하는 박테리아의 집합체로서, 집합체는 집합체가 투여되지 않는 대상체와 비교하여 대상체에서의 장 상피 내의 지질 흡수 유전자의 발현을 억제하는, 박테리아의 집합체.
25. 대상체에서 미생물총의 상대 풍부도를 변경하는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 조성물의 유효 용량을 대상체에게 투여하여서 대상체에서 미생물총의 상대 풍부도를 변경하는 단계를 포함하는, 방법.
26. 제25항에 있어서, 클로스트리디아 박테리아의 상대 풍부도는 증가하거나 대체되는, 방법.
27. 제25항에 있어서, 클로스트리디아의 상대 풍부도는 대상체에서 적어도 약 5%만큼 증가한, 방법.
28. 제25항에 있어서, 대상체에게 제2 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
29. 비만을 갖는 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 클로스트리디아의 상대 풍부도는 투여 전의 상대 풍부도와 비교하여 대상체에서 증가한, 방법.
30. 대사 증후군을 갖는 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 클로스트리디아의 상대 풍부도는 투여 전의 상대 풍부도와 비교하여 대상체에서 증가한, 방법.
31. 과민성 대장 증후군을 갖는 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 클로스트리디아의 상대 풍부도는 투여 전의 상대 풍부도와 비교하여 대상체에서 증가한, 방법.
32. 대상체에서 체중 증가를 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 클로스트리디아의 상대 풍부도는 투여 전의 상대 풍부도와 비교하여 대상체에서 증가한, 방법.
33. 대상체의 소장에서 지질 흡수를 억제하는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 클로스트리디아의 상대 풍부도는 투여 전의 상대 풍부도와 비교하여 대상체에서 증가한, 방법.
34. 대상체의 간에서 CD36을 하향조절하는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 클로스트리디아의 상대 풍부도는 투여 전의 상대 풍부도와 비교하여 대상체에서 증가한, 방법.
35. 제25항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 치료를 필요로 하는 것으로 확인되었던, 방법.
36. 제25항 내지 제28항, 제32항, 제33항 및 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 비만, 대사 증후군, 인슐린 결핍, 인슐린-저항성 관련된 장애, 포도당 과민증, 당뇨병 또는 염증성 장 질환을 갖는, 방법.
37. 제36항에 있어서, 염증성 장 질환은 크론병 또는 궤양성 대장염인, 방법.
38. 제36항에 있어서, 인슐린-저항성 관련된 장애는 당뇨병, 고혈압, 이상지질혈증 또는 심혈관 질환인, 방법.
39. 제25항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물을 투여하는 단계는 적어도 대상체의 위, 소장 또는 대장에 상기 조성물을 전달하는 단계를 포함하는, 방법.
40. 제25항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 경구로 투여되는, 방법.
41. 제25항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 클로스트리디아의 종의 적어도 하나의 상대 풍부도는 5%만큼 증가한, 방법.
42. 제25항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 인간인, 방법.
43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 집합체의 세포는 활성인, 조성물 또는 방법.
44. 제25항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 불균형 미생물총과 연관된 질환 또는 장애를 갖는 대상체의 미생물총을 대체하기 위한 것인, 방법.

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