JP2022540186A - ビフィドバクテリウム・ビフィダム菌株、その組成物及び関連用途 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ビフィドバクテリウム・ビフィダムMIMBb23sg(=BbfIBS01) DSM 32708の菌株、上記菌株を含む組成物、及び胃腸障害、特に例えば過敏性腸症候群(IBS)又は炎症性腸疾患(IBD)などの機能性胃腸障害の治療方法へのそれらの用途に関する。
Description
本発明は、ビフィドバクテリウム・ビフィダムMIMBb23sg=BbfIBS01(つまり、B.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708又はB.ビフィダムBbfIBS01 DSM 32708)として同定されるビフィドバクテリウム・ビフィダム属に属する菌株に関する。さらに、本発明は、上記ビフィドバクテリウム・ビフィダムMIMBb23sg(=BbfIBS01) DSM 32708を含む、又は代替的にそれからなる混合物を含む組成物に関し、任意選択的に、上記組成物は、少なくとも1種の食品又は医薬品グレードの添加剤及び/又は賦形剤を含む。さらに、本発明は、胃腸疾患、障害又は症状、特に、例えば過敏性腸症候群(IBS)又は慢性炎症性腸疾患(IBD)などの機能性又は炎症性胃腸障害の治療方法に使用される上記ビフィドバクテリウム・ビフィダムMIMBb23sg(=BbfIBS01) DSM 32708及び上記組成物に関する。
過敏性腸症候群(IBS)は、症候性症状のみに基づいて定義し得る診断カテゴリーである機能性胃腸障害(FGID)群に属し、明らかな病原となる基質が存在しないことを特徴とする。IBSは、約15~20%の人口に影響を及ぼす最も一般的な胃腸障害の1つであり、腹部の不快感又は痛みは腸内環境の変化に関連している。既に文献に報告されているが、組織、細胞又は分子レベルでの管腔又は胃腸粘膜の顕著な変化は多様な事象であり、IBSにおいて疑いなく同定されてはいない。免疫応答の変化が関与していると思われるが、症状を完全に説明することはできない。同様に、腸内微生物叢の変化(すなわち、腸内毒素症)は、病態生理学に関係しているが、IBSと確実に関連する特定の病原体又は病原性共生生物はまだ見つかっていない。
現在、IBSの治療に利用可能な治療法は、IBSの原因となる病原的事象の解消を目的としている。下痢の処置では、フルクトース、ソルビトール、マンニトールなどの小腸(Fodmap)に吸収されにくい短鎖炭水化物の摂取を抑制することで、腸運動の頻度を低減することができる。これらの溶液にジオスメクタイトなどのカオリン系製剤を組み合わせることも有用である。主に小腸通過障害による便秘及び腹部の膨張が見られる対象は、低濃度のポリエチレングリコール/鉱物塩を含む製剤を毎日服用することができる。さらに、中等度~重度の便秘に苦しむこれらの対象者には、リナクロチド、グアニル酸シクラーゼC受容体アゴニストも使用可能である。患者が便秘の不安を認識した場合、短期間抗不安剤(例えば、ベンゾジアゼピン)を用いることにより、痛みへの心理的関与を低減しつつ、不安を軽減するのに有用である。同様に、三環系抗鬱薬及び選択的セロトニン再取り込み阻害薬(SSRI)などの抗鬱薬を用いることにより、精神機能を変化させずに痛みを直接調節するほか、睡眠の質を向上させ、発作の頻度を減らすことができる。代替的に、痛みを抑制することを目的とした他の治療法もあり、この意味では、いくつかの鎮痙薬が特に有用である。例えば、アトロピン、スコポラミン、メべベリンなどの抗コリン型鎮痙薬(抗コリン薬)は、胃液分泌及び腸運動を低減するために用いられる。また、憩室疾患の治療法と同様に、例えば、リファキシミンなどの難吸収性の抗生物質及び腸管内菌叢を調整するプロバイオティクスを用いることにより、ティンパニ症候群を低減することができる。
しかしながら、上述した治療は、疾患及びその症状を完全にかつ持続的に解消することができない場合が多い。
したがって、胃腸障害、特に機能性又は炎症性胃腸障害、さらに特に過敏性腸症候群(IBS)又は慢性炎症性腸疾患(IBD)の治療に有効な対処法を提供する必要性は依然として高い。
本出願人は、広範な研究及び開発活動を経て、本明細書及び特許請求の範囲に記載されているように、ビフィドバクテリウム・ビフィダム属に属する新規な単離菌株であるB.ビフィダムMIMBb23sg(=BbfIBS01)DSM 32708又はその誘導体(つまり、本発明の菌株)、上記菌株又はその誘導体を含む組成物(つまり、本発明の組成物)、及び胃腸障害、好ましくは機能性又は炎症性胃腸障害、より好ましくは過敏性腸症候群(IBS)又は慢性炎症性腸疾患(IBD)の治療のためのそれらの使用を提供することにより、現在の必要性に対処し、解決する。
ビフィドバクテリウム属の細菌は、放線菌門に属する偏性嫌気性のグラム陽性菌であり、「適量投与されると宿主に健康上の利益をもたらす生きた微生物」であるプロバイオティクスとして広く利用されている。工業生産時のストレスに対する耐性のため、ビフィドバクテリウム属のプロバイオティクスの微生物バイオマスの大部分は、B.アニマリス・サブスピーシーズ・ラクティスである。しかしながら、科学文献には、ビフィドバクテリウムの他の種も有望なプロバイオティクス特性を示すことが示されている。特に、B.ビフィダム種は、ヒト宿主と微生物との共進化の最適な一例であると考えられる。
具体的には、本発明のB.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708菌株又はその誘導体、及び上記菌株を含む組成物は、胃腸障害の治療に有効であり、特に、IBSなどの機能性胃腸障害に関しては、実験部分に詳細に記載されているように、B.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708菌株は、回腸内のセロトニンの有効性をより高く誘導することでセロトニン作動性遺伝子発現を調節し、それによって回腸の運動を大きくして蠕動を増強する。また、B.ビフィダムMIMBb23sg(=BbfIBS01)DSM 32708菌株は、腸内、特に回腸内の免疫応答に関与する様々な遺伝子の発現に影響を与え、腸内での上記菌株の抗炎症/制御活性を発現させることができる。
さらに、本発明の菌株及び組成物は、顕著な副作用がなく、全ての対象、特に小児対象及び妊婦に投与することができる。
最後に、本発明の組成物は、製造しやすく、経済的に有利である。
なお、添付の特許請求の範囲に記載された技術的特徴を有する本発明の菌株、組成物及び混合物は、上述した目的及び以下の詳細な説明からより明確になるその他の目的を達成する。
本発明の1つの目的を形成するのは、ビフィドバクテリウム・ビフィダムMIMBb23sg(=BbfIBS01)DSM 32708として同定されるビフィドバクテリウム・ビフィダム属に属する菌株又はその誘導体であり、上記菌株は、ブタペスト条約に規定されているように、2017年12月4日にSofar S.p.Aによってドイツ微生物細胞培養コレクション(DSMZ)において寄託番号DSM 32708の下に寄託されている(つまり、B.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708又はB.ビフィダムBbfIBS01 DSM 32708又は本発明の菌株)。本出願人が使用している内部名称MIMBb23sg=BbfIBS01に関係なく、依然として同じ菌株のみであることが指摘されている。
B.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708菌株は、健康な成人女性の糞便から単離された菌株である。
好ましくは、ビフィドバクテリウム・ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708菌株又はビフィドバクテリウム・ビフィダムBbfIBS01 DSM 32708は、プロバイオティクスの菌株である。「プロバイオティクス」は、前生は、生死菌として定義されており、適量投与されると宿主に対して健康上の利益をもたらす生きた微生物の生菌として定義されている(FAO及びWHOによる定義)。
本発明の文脈において、B.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708菌株又はB.ビフィダムBbfIBS01 DSM 32708菌株の「誘導体」という用語は、ガンマ線照射又は音波破砕などの他の方法で間欠滅菌又は不活性化されたB.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708菌株又はB.ビフィダムBbfIBS01 DSM 32708菌株、B.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708菌株又はB.ビフィダムBbfIBS01 DSM 32708菌株の溶解物又は抽出物(パラプロバイオティクス)又はB.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708又はB.ビフィダムBbfIBS01 DSM 32708の任意の誘導体及び/又は成分、好ましくはB.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708又はB.ビフィダムBbfIBS01 DSM 32708により生成される菌体外多糖、壁側画分、代謝物又は代謝副産物(ポストバイオティクス)及び/又はB.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708又はB.ビフィダムBbfIBS01 DSM 32708から由来する他の生成物を示すために使用される。
本発明の1つの目的を形成するのは、ビフィドバクテリウム・ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708菌株又はBbfIBS01 DSM 32708菌株、又はその誘導体を含む、又は代替的にそれからなる混合物を含む組成物(つまり、本発明の組成物)であり、任意選択的に、上記組成物は、少なくとも1種の食品又は医薬品グレードの添加剤及び/又は賦形剤を含む。
本開示の一態様によれば、本発明の組成物は、MIMBb23sg DSM 32708株のような単一の菌株を含む。
好ましくは、本発明の組成物は、1日の摂取量に対して、1×106CFU~1×1012CFU、好ましくは1×107CFU~1×1011CFU、より好ましくは1×108CFU~1×1010CFU、例えば1×109CFUの範囲の濃度でB.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708菌株を含む(CFUはコロニー形成単位である)。
一実施形態では、本発明の組成物に含まれる混合物は、B.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708菌株の他に、他のプロバイオティクス及び/又はパラプロバイオティクス及び/又はポストバイオティクス株及び/又は溶解及び/又は間欠滅菌された菌株、酵素、直接的又は間接的な制酸効果を有する物質、酵母菌又は細菌族に属するプレバイオティクス物質、プロバイオティクス物質、免疫調節物質、下痢止め物質、栄養物質、ビタミンB、C、D、E、マグネシウム、セレン、亜鉛の有機及び/又は無機塩、メラトニン、バレリアン、トケイソウ、レモンバーム、サンザシ、カモミール、ホップ、抗酸化剤、抗ラジカル剤を含む又は代替的にそれらからなる群から選択される少なくとも1種の有効成分をさらに含んでよい。
本発明の組成物は、錠剤、チュアブル錠、カプセル、トローチ剤、顆粒、フレーク、粉末などの固形であってもよく、ソフトゲル、ゲル、クリーム、バルムなどの半固形であってもよく、溶液、懸濁液、分散液、乳液、シロップなどの液形であってもよい。
本発明の組成物は、経口(又は経胃腸)、経舌下(又は経頬)、経粘膜、外用、経直腸、経皮、経膣使用(又は投与)のために製剤化することができ、経口使用に製剤化されることが好ましい。
本発明の組成物は、任意選択的に、少なくとも1種の食品又は医薬品グレードの添加剤及び/又は賦形剤、すなわち医薬品又は食品用途に適する治療活性を欠く物質を含む。本発明の文脈において、医薬品又は食品用途の許容できる添加剤及び/又は賦形剤としては、例えば、希釈剤、溶剤(水、グリセリン、エチルアルコールなどを含む)、可溶化剤、酸性化剤、増粘剤、甘味料、調味料、着色剤、甘味料、潤滑剤、界面活性剤、防腐剤、pH安定化緩衝剤、又はそれらの混合物など、固形、半固形又は液形の組成物の調製に使用される当業者に公知の全ての補助物質が挙げられる。
本発明のいくつかの実施形態では、B.ビフィダムMIMBb23sg(=BbfIBS01)DSM 32708菌株を含む本発明の組成物は、医薬組成物(生きた生物学的製剤)、医療機器用組成物、栄養補助食品、食品(又は新規な食品又は病人向けの特別食)、栄養補助食品又は食品用の組成物、化粧料組成物、特別医療目的用食品(FSMP)用の組成物であってよい。
本発明の文脈において、「医療機器」という表現は、1997年2月24日付イタリア立法令第46号に準ずるか又は新しい医療機器規則(EU)2017/745(MDR)に準じる意味で使用される。
本発明の文脈において、「新規な食品」という用語は、2015年11月25付の2015/2283に準じる意味で使用される。
本発明の更なる目的を形成するのは、薬剤として使用される、本発明のB.ビフィダムMIMBb23sg(=BbfIBS01)DSM 32708菌株又はその誘導体、及びB.ビフィダムMIMBb23sg(=BbfIBS01)DSM 32708を含むか又は代替的にそれからなる組成物である。
一実施形態では、本発明のB.ビフィダムMIMBb23sg(=BbfIBS01)DSM 32708菌株又はその誘導体、及びB.ビフィダムMIMBb23sg(=BbfIBS01)DSM 32708を含むか又は代替的にそれからなる混合物を含む組成物は、必要がある対象の胃腸疾患、障害又は症状、好ましくは過敏性腸症候群(IBS)と、消化不良と、胸やけと、食道、胃及び十二指腸の障害などの機能性胃腸障害と、小腸内細菌異常増殖症(SIBO)と、例えば高齢者又はセリアック病患者又は憩室疾患の罹患者の軽度炎症状態を伴う障害と、の予防的及び/又は治療的処置方法に使用される。
更なる実施形態では、本発明のB.ビフィダムMIMBb23sg(=BbfIBS01)DSM 32708菌株又はその誘導体、及びB.ビフィダムMIMBb23sg(=BbfIBS01)DSM 32708を含むか又は代替的にそれらからなる混合物を含む組成物は、必要がある対象の、ヘリコバクターピロリ、消化性潰瘍又は胃潰瘍、十二指腸潰瘍などの炎症性胃腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、顕微鏡的大腸炎、セリアック病、憩室疾患及び憩室炎などの慢性炎症性腸疾患、障害又は症状の予防的及び/又は治療的処置方法に使用される。
炎症性胃腸障害又は症状を治療するB.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708株の有効性は、マウスのIL-10(T-re、抗炎症)サイトカイン発現のレベルをインビボで向上させる能力、及びIL-8(T-re、炎症誘発)サイトカイン発現のレベルをインビトロで低下させる能力によって実証されている。
特に、本発明のB.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708菌株又はその誘導体、及びB.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708を含むか又は代替的にそれらからなる混合物を含む組成物は、特に、投与すべき対象のIL-10(T-re、抗炎症性)サイトカインを上方制御することにより免疫系を調節することができる免疫調節剤として使用される。したがって、本発明の菌株又はその誘導体及び組成物は、免疫系の変化に関する疾患、特に自己免疫疾患及びアレルギー(又はアレルギー疾患)、座瘡、アトピー性皮膚炎などの皮膚疾患の予防的又は治療的処置のための有効な用途を有する。
本発明の菌株は、腸内の株がセロトニンの産生を増大させ、再取り込みを低減するため、中枢神経系疾患、好ましくは不安及び/又は鬱病又は関連症状の治療方法に使用することもできる。
本発明の1つの目的を形成するのは、本発明のB.ビフィダムMIMBb23sg(=BbfIBS01)DSM 32708菌株又は組成物を必要がある対象に投与するために提供される、胃腸疾患、障害又は症状、特に機能性胃腸障害、好ましくはIBSの予防的又は治療的処置方法である。
本発明の文脈において、「対象」という表現は、ヒト対象又は動物対象(例えば、イヌ又はネコ又は他の哺乳動物などのペット)を示すために使用される。好ましくは、本発明の組成物は、ヒト対象の治療方法に使用される。
本発明の文脈において、「治療方法」という表現は、疾患又は病気及びその症状又は障害を除去、軽減/低減又は防止するために、本発明の菌株又は組成物を治療上有効な量で対象に投与することを含む、必要がある対象への介入治療を示すために使用される。
「治療上有効な量」という表現は、個人、研究者、獣医、医師又は他の臨床医もしくは医療従事者によって探求され定義された組織、系、哺乳動物、又はヒトにおいて生物学的又は医薬的反応を引き出す組成物及び/又は菌株の量を指す。
以下、本発明の実施形態(FRn)について説明する。
FR1、ビフィドバクテリウム・ビフィダムMIMBb23sg=BbfIBS01Tとして同定されるビフィドバクテリウム・ビフィダム属に属する菌株であって、前記菌株は、2017年12月4日にSofar S.p.Aによってドイツ微生物細胞培養コレクション(DSMZ)において寄託番号DSM 32708の下に寄託されている、菌株。
FR2、薬剤として使用される、FR1に記載の菌株。
FR3、胃腸疾患、障害又は症状、好ましくは機能性胃腸障害又は炎症性胃腸障害の予防的又は治療的処置に使用される、FR1又はFR2に記載の菌株。
FR4、過敏性腸症候群(IBS)と、消化不良と、胸やけと、食道、胃及び十二指腸の障害と、小腸内細菌異常増殖症(SIBO)と、軽度炎症状態を伴う障害と、から選択される機能性胃腸障害の予防的及び/又は治療的処置方法に使用され、好ましくは、前記軽度炎症性障害は、高齢者又はセリアック病患者又は憩室疾患の罹患者に現れる、FR3に記載の菌株。
FR5、クローン病、潰瘍性大腸炎、顕微鏡的大腸炎、ヘリコバクターピロリ、消化性潰瘍又は胃潰瘍、十二指腸潰瘍、セリアック病、憩室疾患及び憩室炎から選択される炎症性胃腸障害又は症状の予防的及び/又は治療的処置方法に使用される、FR3に記載の菌株。
FR6、FR1に記載のビフィドバクテリウム・ビフィダムMIMBb23sg=BbfIBS01 DSM 32708菌株を含むか又は代替的にそれからなる混合物を含み、
そして任意選択的に、少なくとも1種の食品グレード又は医薬品の添加剤及び/又は賦形剤を含む、組成物。
そして任意選択的に、少なくとも1種の食品グレード又は医薬品の添加剤及び/又は賦形剤を含む、組成物。
FR7、前記混合物は、1日の摂取量に対して、1×106CFU~1×1012CFU、好ましくは1×107CFU~1×1011CFU、より好ましくは1×108CFU~1×1010CFUの範囲の濃度でB.ビフィダムMIMBb23sg=BbfIBS01 DSM 32708菌株を含む、FR6に記載の組成物。
FR8、薬剤として使用される、FR6又はFR7に記載の組成物。
FR9、胃腸疾患、障害又は症状、好ましくは機能性胃腸障害又は炎症性胃腸障害の予防的又は治療的処置に使用される、FR6又はFR7に記載の組成物。
FR10、過敏性腸症候群(IBS)と、消化不良と、胸やけと、食道、胃及び十二指腸の障害と、小腸内細菌異常増殖症(SIBO)と、高齢者又はセリアック病患者又は憩室疾患の罹患者に現れる、軽度炎症状態を伴う障害と、から選択される機能性胃腸障害の予防的及び/又は治療的処置方法に使用される、FR9に記載の組成物。
FR11、クローン病、潰瘍性大腸炎、顕微鏡的大腸炎、ヘリコバクターピロリ、消化性潰瘍又は胃潰瘍、十二指腸潰瘍、セリアック病、憩室疾患及び憩室炎から選択される炎症性胃腸障害又は症状の予防的及び/又は治療的処置方法に使用される、FR9に記載の組成物。
FR12、不安及び/又は鬱病又は関連症状の予防的及び/又は治療的処置方法に使用される、FR2に記載の用途の菌株又は代替的にFR8に記載の用途の組成物。
実験部分
宿主の腸内におけるB.ビフィダムMIMBb23sg(=BbfIBS01)DSM 32708の作用機序の理解に資するために、B.ビフィダムMIMBb23sg(=BbfIBS01)DSM 32708のインビボ摂取が各腸内領域で宿主の微生物叢及び遺伝子発現に与える影響を、マウスモデルにおいて研究した。また、日常環境から隔離された宿主と相互作用する能力が実証されたプロバイオティクス株であるラクトバチルスヘルベティカスMIMLh5を参照細菌として選択し、同様の実験を行った。
宿主の腸内におけるB.ビフィダムMIMBb23sg(=BbfIBS01)DSM 32708の作用機序の理解に資するために、B.ビフィダムMIMBb23sg(=BbfIBS01)DSM 32708のインビボ摂取が各腸内領域で宿主の微生物叢及び遺伝子発現に与える影響を、マウスモデルにおいて研究した。また、日常環境から隔離された宿主と相互作用する能力が実証されたプロバイオティクス株であるラクトバチルスヘルベティカスMIMLh5を参照細菌として選択し、同様の実験を行った。
下記に報告された実験部分は、両方の株が消化管微生物叢の組成に影響を及ぼし得るが、ヒト単離型BビフィダムMIMBb23sg(=BbfIBS01)DSM 32708が、乳製品分離型L.ヘルベティカスMIMLh5に比べて、宿主粘膜の遺伝子発現に影響を及ぼす能力が明らかに高いことを示している。
材料及び方法
(I)菌株、調製、成長条件
L.ヘルベティカスMIMLh5及びB.ビフィダムMIMBb23sg(=BbfIBS01)DSM 32708を寒天(MRS)培地(ディフコ研究所、デトロイト、ミシガン州、アメリカ)において培養し、0.05%のL-システイン塩酸塩(シグマアルドリッチ社製)をB.ビフィダムMIMBb23sgに添加した(cMRS)。菌株をグリセロールに凍結した株から植菌し、1:100の接種材料を用いるMRS又はcMRSで2回継代培養した。L.ヘルベティカスMIMLh5の好気条件下での培養温度を37℃とし、B.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708を、AnaercocultRストリップ(メルクミリポア社)で培養した。インビボ実験に用いた新鮮な培養物を調製するために、一晩増殖した培養物(18時間増殖)に由来する細菌性細胞を収集し、滅菌PBSで2回洗浄した後、ノイバウエル改良型血球計算盤による1×109細胞ml-1の濃度でPBS中で再懸濁した。マウスの処理日毎に新鮮な細菌性細胞を作製した。
(I)菌株、調製、成長条件
L.ヘルベティカスMIMLh5及びB.ビフィダムMIMBb23sg(=BbfIBS01)DSM 32708を寒天(MRS)培地(ディフコ研究所、デトロイト、ミシガン州、アメリカ)において培養し、0.05%のL-システイン塩酸塩(シグマアルドリッチ社製)をB.ビフィダムMIMBb23sgに添加した(cMRS)。菌株をグリセロールに凍結した株から植菌し、1:100の接種材料を用いるMRS又はcMRSで2回継代培養した。L.ヘルベティカスMIMLh5の好気条件下での培養温度を37℃とし、B.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708を、AnaercocultRストリップ(メルクミリポア社)で培養した。インビボ実験に用いた新鮮な培養物を調製するために、一晩増殖した培養物(18時間増殖)に由来する細菌性細胞を収集し、滅菌PBSで2回洗浄した後、ノイバウエル改良型血球計算盤による1×109細胞ml-1の濃度でPBS中で再懸濁した。マウスの処理日毎に新鮮な細菌性細胞を作製した。
(II)マウスに対するプロバイオティクス株による処理
2月齢の雌のC57BL/6マウス(チャールズリバー、レッコ、イタリア)を、従来の、非滅菌で、病原体のない家畜小屋に収容した。1週間順応させた後、マウスを5匹ずつ3群に分け、ケージに入れた。各群に、懸濁液又は担体(PBS、リン酸緩衝生理食塩水)を1日1回、5日間投与した。LL.ヘルベティカスMIMLh5又はB.ビフィダムMIMBb23sg(=BbfIBS01)DSM 32708の細菌性細胞を、200μlの懸濁液として経口胃プローブを用いて投与した。対照群の担体として用いた滅菌PBSを同様の手順で投与した。最後の投与から4時間後にマウスを殺処分した。殺処分後、各マウスから、遠位回腸、盲腸、及び近位結腸の2つの生検試料を収集した。各腸管から収集した2つの生検試料の一方を、DNA抽出(微生物叢解析)のために、-80℃で保存し、他方を、RNA抽出(遺伝子発現解析)のために、滅菌PBSを含む注射器で組織を洗浄して腸内容物から除去し、直ちに1mLのRNAlater(キアゲン社)を含む試験管に移し、-80℃で保存した。これらの全ての工程を、マウス及び組織を冷却したトレーに保持して行った。
2月齢の雌のC57BL/6マウス(チャールズリバー、レッコ、イタリア)を、従来の、非滅菌で、病原体のない家畜小屋に収容した。1週間順応させた後、マウスを5匹ずつ3群に分け、ケージに入れた。各群に、懸濁液又は担体(PBS、リン酸緩衝生理食塩水)を1日1回、5日間投与した。LL.ヘルベティカスMIMLh5又はB.ビフィダムMIMBb23sg(=BbfIBS01)DSM 32708の細菌性細胞を、200μlの懸濁液として経口胃プローブを用いて投与した。対照群の担体として用いた滅菌PBSを同様の手順で投与した。最後の投与から4時間後にマウスを殺処分した。殺処分後、各マウスから、遠位回腸、盲腸、及び近位結腸の2つの生検試料を収集した。各腸管から収集した2つの生検試料の一方を、DNA抽出(微生物叢解析)のために、-80℃で保存し、他方を、RNA抽出(遺伝子発現解析)のために、滅菌PBSを含む注射器で組織を洗浄して腸内容物から除去し、直ちに1mLのRNAlater(キアゲン社)を含む試験管に移し、-80℃で保存した。これらの全ての工程を、マウス及び組織を冷却したトレーに保持して行った。
(III)腸生検切片からの核酸の分離
PowerFecalRDNA分離キット(MO BIO Laboratories社)を用いて、マウス生検切片からDNAを取得した。プリセリーズビーズ式破砕器(6800rpmで3×30''、Advanced Biotech Italia s.r.l.社、セーヴェゾ、イタリア)を用いてマウス生検切片の均質化を行った。その後、製造元の説明書に従ってDNA単離を行った。RNAを単離するために、-80℃で保存した洗浄された生検切片を、その後のRNA抽出のために、氷上で解凍した。その後、生検切片を直ちにQiazol(キアゲン社)に再懸濁し、IKA社製のT10ベーシックのUltraturraxを用いて均質化した(30000rpm、30秒間)。その後に、RNeasy Lipid Tissue Mini Kit(キアゲン社)を用いて、製造元の説明書に従ってRNA抽出工程を行った。Take3 Micro-Volume(バイオテック機器社)を用いて核酸の濃度及び純度を測定した。
PowerFecalRDNA分離キット(MO BIO Laboratories社)を用いて、マウス生検切片からDNAを取得した。プリセリーズビーズ式破砕器(6800rpmで3×30''、Advanced Biotech Italia s.r.l.社、セーヴェゾ、イタリア)を用いてマウス生検切片の均質化を行った。その後、製造元の説明書に従ってDNA単離を行った。RNAを単離するために、-80℃で保存した洗浄された生検切片を、その後のRNA抽出のために、氷上で解凍した。その後、生検切片を直ちにQiazol(キアゲン社)に再懸濁し、IKA社製のT10ベーシックのUltraturraxを用いて均質化した(30000rpm、30秒間)。その後に、RNeasy Lipid Tissue Mini Kit(キアゲン社)を用いて、製造元の説明書に従ってRNA抽出工程を行った。Take3 Micro-Volume(バイオテック機器社)を用いて核酸の濃度及び純度を測定した。
(IV)微生物叢解析
様々な腸領域における細菌の構造を定義するために、上述したように腸生検切片から抽出された総DNAを用いて、イタリア工科大学の生命-ナノ科学センター(ローマ、イタリア)のイルミナMiSeqシステムにより、16SリボソームRNAサブユニットをコードする遺伝子領域の解析からプロファイリングを行った。つまり、16S rRNA遺伝子のV3及びV4領域を含むDNA領域を、クリントヴォルトらに記載されたプライマー対で増幅した。(クリントヴォルトら、2013)。GreenGene(dd_13_5)を参照用分類データベースとして用いる微生物生態系への適量的洞察(QIIME)ソフトウェア1.7.0版を用いて配列の数値を解析した。操作的分類単位(OTU)レベルで各試料の細菌存在量を解析した。なお、16SリボソームRNAの遺伝子プロファイル配列は、欧州バイオインフォマティクス研究所の欧州ヌクレオチドアーカイブ(ENA)においてアクセスコードPRJEB00000で寄託されている。
様々な腸領域における細菌の構造を定義するために、上述したように腸生検切片から抽出された総DNAを用いて、イタリア工科大学の生命-ナノ科学センター(ローマ、イタリア)のイルミナMiSeqシステムにより、16SリボソームRNAサブユニットをコードする遺伝子領域の解析からプロファイリングを行った。つまり、16S rRNA遺伝子のV3及びV4領域を含むDNA領域を、クリントヴォルトらに記載されたプライマー対で増幅した。(クリントヴォルトら、2013)。GreenGene(dd_13_5)を参照用分類データベースとして用いる微生物生態系への適量的洞察(QIIME)ソフトウェア1.7.0版を用いて配列の数値を解析した。操作的分類単位(OTU)レベルで各試料の細菌存在量を解析した。なお、16SリボソームRNAの遺伝子プロファイル配列は、欧州バイオインフォマティクス研究所の欧州ヌクレオチドアーカイブ(ENA)においてアクセスコードPRJEB00000で寄託されている。
(V)RNAの調製及び逆転写
抽出後、非変性条件下で1%のアガロースゲルに100ngのRNAを導入することによりRNA完全性を確認した。その後、製造元のプロトコルに従って、DNase I(シグマアルドリッチ社製)を用いてDNAを除去した。つまり、8μlのRNAを、1μlのDNase Iと共に室温で30分間インキュベートした後、1μlの停止液(シグマアルドリッチ社製)を添加し、かつ70℃で10分間インキュベートすることにより、DNaseを失活させた。DNAを除去した後、RNAを再定量した。その後、25℃で5分間、42℃で30分間及び85℃で5分間の熱サイクルを用いて、iScript Select cDNA Synthesis Kit(バイオ・ラッドイタリア社製、セグラーテ、イタリア)により1μgの総RNAを逆転写した。製造元の説明書に従ってバイオ・ラッドCFX96マシン上でSsoFast EvaGreen Supermix(バイオ・ラッドイタリア社製、セグラーテ、イタリア)を用いて、SYBRのグリーン技術を用いて逆転写法(RT-qPCR法)により得られた相補DNA(cDNA)の定量的PCRにより、目的の遺伝子の発現量を求めた。プライマーは、文献由来及び適用されたものでなければ、プライマー-3ツールを用いて設計し、オリゴアナライザー3.1ツールを用いて検証し、かつNucleotide BLASTを用いて特異性を検証した。使用したプライマーを表1に示す。
抽出後、非変性条件下で1%のアガロースゲルに100ngのRNAを導入することによりRNA完全性を確認した。その後、製造元のプロトコルに従って、DNase I(シグマアルドリッチ社製)を用いてDNAを除去した。つまり、8μlのRNAを、1μlのDNase Iと共に室温で30分間インキュベートした後、1μlの停止液(シグマアルドリッチ社製)を添加し、かつ70℃で10分間インキュベートすることにより、DNaseを失活させた。DNAを除去した後、RNAを再定量した。その後、25℃で5分間、42℃で30分間及び85℃で5分間の熱サイクルを用いて、iScript Select cDNA Synthesis Kit(バイオ・ラッドイタリア社製、セグラーテ、イタリア)により1μgの総RNAを逆転写した。製造元の説明書に従ってバイオ・ラッドCFX96マシン上でSsoFast EvaGreen Supermix(バイオ・ラッドイタリア社製、セグラーテ、イタリア)を用いて、SYBRのグリーン技術を用いて逆転写法(RT-qPCR法)により得られた相補DNA(cDNA)の定量的PCRにより、目的の遺伝子の発現量を求めた。プライマーは、文献由来及び適用されたものでなければ、プライマー-3ツールを用いて設計し、オリゴアナライザー3.1ツールを用いて検証し、かつNucleotide BLASTを用いて特異性を検証した。使用したプライマーを表1に示す。
勾配及び効率を解析して、プライマーアニーリングのための最適な温度及び濃度を選択した。その後に、選択された標的遺伝子の増幅を、2×SsoFast EvaGreen Supermix、順方向及び逆方向プライマー(ZONU、5HTR3及び5HTR4の場合、濃度が300μMであり、他のプライマー対の場合、濃度が500μmである)、超純滅菌水及びcDNA(反応中に15ng)を含む総体積15μlで行った。qPCRサイクルのパラメータは、95℃で3分間、続いてバイオ・ラッドCFX 96機器を用いて95℃で10秒間、58℃で30秒間、72℃で5秒間のサイクルを44回行った。THP1及びZONUのプライマーの場合、55.5℃のアニーリング温度を用いた。増幅反応を重複して行い、ゲノムDNAによる汚染の可能性を抑制した。増幅量は、グリセルアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の発現に対して正規化し、この遺伝子は、18S及びβ-アクチン遺伝子に対する予備比較実験で最も安定な参照遺伝子であることが判明した(データは示されていない)。2(-ΔΔCT)法を用いて相対転写レベルを算出した。特異的増幅は、融解曲線を解析により検証し、アガロースゲルの増幅産物の解析により確認した。
(VI)統計解析
グラフパッドプリズム5のソフトウェアプログラムを用いて統計計算を行った。両側分布を有するマン・ホイットニー対応のない検定を用いて、得られた結果の有意性を解析した。p<0.05の値が有意であると見なした。
グラフパッドプリズム5のソフトウェアプログラムを用いて統計計算を行った。両側分布を有するマン・ホイットニー対応のない検定を用いて、得られた結果の有意性を解析した。p<0.05の値が有意であると見なした。
DESeq2の数値の総数を正規化した後にワルド検定を用いて、マウス群の間の微生物叢組成の違いを決定した。また、群の間の微生物叢組成の違いについても、LDA効果量(LEfSe解析)解析で定義した。具体的には、データが対となるクラスカル・ウォリス検定とウィルコクソン検定を、その両方の検定法に関してp<0.05の値を有意であると考慮して、LEfSe解析の過程において行った。
(VII)倫理の宣言
全ての実験は、ミラノ大学の倫理委員会によって認められた(協定第3/2013号)。
全ての実験は、ミラノ大学の倫理委員会によって認められた(協定第3/2013号)。
結果
(VIII)ビフィドバクテリウム・ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708は、その属に特徴的な株である。
(VIII)ビフィドバクテリウム・ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708は、その属に特徴的な株である。
本研究では、健康な成人女性の糞便から単離された菌株であるB.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708を評価した。B.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708のプロバイオティクス有効性を事前に定義するために、他のB.ビフィダムゲノムと一致するようにグアニンとシトシンの含有量が62.6%である、合計2263289bpに対して9つのコンティグからなるゲノム配列ドラフトを生成した(Guglielmettiら、2014b)。比較ゲノム解析の結果は、B.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708の90%を超える推定上のコード配列が、GenBankで利用可能なB.ビフィダムの他のゲノムの類似領域の配列と高い類似度を共有していることが示された。以上のように、B.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708は、B.ビフィダムの他の株において、宿主由来及び食事由来の炭水化物、例えば母乳のムチン、オリゴ糖などの輸送及び代謝に関与する遺伝子を有することが確認された(図1)。また、推定されたタンパク質生成物、例えばピリ、リポタンパク質Bop A、トランスアルドラーゼ(Tal)が宿主腸粘膜との相互作用に関与している遺伝子も観察された。
B.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708のゲノム解析では、国際標準化機構(ISO、2010)が推奨している微量希釈解析法で求めた抗生物質耐性プロファイルに従って、抗生物質耐性として知られる遺伝子の存在は明らかにならなかった。実際、B.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708の最小発育阻止濃度(MIC)は、検定されたいずれの抗生物質についても、ビフィズス菌に供されるEFSA制限値(EFSA、2012)を超えていなかった(表2)。
以上より、これらの結果は、B.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708が、宿主の腸管にコロニーを形成する能力を確認する重要な遺伝子特性を保有し、B.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708は、後天的な抗生物質耐性を報告していないため、食品/プロバイオティクス用途にも適していることを示している。
これらの結果を考慮して、マウスのインビボ試験には、B.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708を用いた。
(IX)B.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708及びL.ヘルベティカスMIMLh5は、マウスの異なる腸部位の細菌負荷を変更している。
株特異的プライマーを用いた定量的PCRを用いて、胃プローブにより細菌性細胞又はPBSで処理されたマウスの回腸、C盲腸及び結腸内のB.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708及びL.ヘルベティカスMIMLh5を、1日1回5日間定量した。
予期された通り、qPCRは、胃プローブによりPBSで処理されたマウス試料では陰性であった。これに対し、胃プローブによりB.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708で処理されたマウスの回腸、盲腸、結腸内では、それぞれ6.4、8.5及び8.1log10細胞/gを定量し、また胃プローブによりL.ヘルベティカスMIMLh5で処理されたマウスの回腸、盲腸、結腸では、それぞれ5.0、8.9及び9.2log10細胞/gを定量した。その結果、いずれの株の数も、回腸に比べて、盲腸及び結腸内で有意に多く(図2)、また、L.ヘルベティカスMIMLh5と比べて、B.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708株は回腸内で有意に豊富であったが、盲腸内及び結腸内ではあまり多くなかった。
続いて、B.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708及びL.ヘルベティカスMIMLh5の定量化に使用した同じマウス腸試料の総細菌性細胞を定量化するために16S rRNA遺伝子を標的としたパン菌プライマーを用いたqPCRを行った。予期された通り、回腸(9.0log10細胞/g)と比べて、盲腸及び結腸(それぞれ10.9及び10.1log10細胞/g)の細菌性細胞の有意な濃度が観測され、盲腸の細菌濃度と結腸の細菌濃度との差も統計的に有意であった(図2)。特に、PBSで処理されたマウスと比べて、胃プローブによりB.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708及びL.ヘルベティカスMIMLh5で処理されたマウスの回腸では、細菌濃度の大幅な低下が観察された。これに対し、L.ヘルベティカスMIMLh5の投与により、PBSによる処理に比べて、盲腸内の細菌負荷の有意な増加を誘発し、そしてPBS及びB.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708の両方と比較して、結腸内の細菌負荷の有意な増加を誘発した(図2)。
以上より、これらのデータは、B.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708及びL.ヘルベティカスMIMLh5が、主に結腸及び盲腸にコロニーを形成し、そして回腸内の総細菌数を減少させたことを示している。また、これらの結果は、B.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708が、回腸においてL.ヘルベティカスMIMLh5よりも多くコロニーを形成しており、一方、盲腸及び結腸内では、L.ヘルベティカスMIMLh5が、B.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708よりも豊富であったことも示している。
(X)B.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708とL.ヘルベティカスMIMLh5とでは、回腸、盲腸及び結腸の微生物叢の調節方法が異なっている。
腸微生物叢の全体組成に対するB.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708及びL.ヘルベティカスMIMLh5の摂取による影響をより良く理解するために、qPCR実験に使用された同一の腸試料上の16S rRNA遺伝子を解析することによりプロファイリングを行った。試料内多様性(α-多様性)解析により、強制投与によって細菌で処理されたマウスは、盲腸のみでChao1指数(L.ヘルベティカスMIMLh5のみ)、フェイスの系統学的多様性及びシャノン多様性指数が増加したことが明らかとなった(図3)。続いて、UniFracアルゴリズムを用いて試料間多様性(β-多様性)を解析したところ、重み付けされていないUniFracは、回腸の微生物叢が盲腸及び結腸の微生物叢と異なっていることを示しており(図4)、重み付けされていないUniFracによれば、B.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708は、L.ヘルベティカスMIMLh5株に対して、回腸の微生物叢に与える影響が大きいことが観察された。これに対して、重み付けされたUniFracは、L.ヘルベティカスMIMLh5が、B.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708に対して、3つの腸部位の微生物叢の組成をより大きく変更していることを示している(図4)。
その後、LEfSe解析を用いて、PBSで処理されたマウスの微生物叢と3つの異なる腸部位の細菌とを比較した。得られた分岐図は、回腸内で、B.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708がL.ヘルベティカスMIMLh5株に比べて、より多くのカテゴリーの存在量を変更したが(図5a)、L.ヘルベティカスMIMLh5が、B.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708に比べて、盲腸の微生物叢により大きく影響したことを示している(図5b)。これに対して、結腸の微生物叢も同様に影響を受けている(図5c)。具体的には、B.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708は、回腸内のクロストリジウム目カテゴリーの相対的な存在量を増加させ、バクテロイデス目カテゴリー(特にカテゴリーS24-7)及びクトバシラス目カテゴリーを減少させる一方、L.ヘルベティカスMIMLh5は、盲腸内のクロストリジウム目カテゴリーを減少させ、バクテロイデス目を増加させた。
同じマウス群内の腸領域のうち有意に異なる細菌カテゴリーを同定するために、LEfSe解析も用いた。取得された分岐図は、B.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708で処理されたマウスの回腸と結腸との間で相対的な存在量が有意に異なるカテゴリーが明らかに数的に増加したことを示している(図6a、6b及び6c)。
続いて、微生物叢データの解析において、DESeq2負の二項分布の方法を用いて、胃プローブによりPBS及び細菌で処理されたマウスの間のOTU(操作的分類単位)レベルでの相対的な差別存在量を推定した。3つの腸領域及び2つの細菌株の間には明確な差異が見られた。
特に、正規化されたOTUの存在量は、L.ヘルベティカスMIMLh5及びB.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708の両方により、主に回腸内で減少し、盲腸及び結腸内で増加したことがわかった(図7a、7b及び7c)。より具体的には、大部分がバクテロイデス門S24-7及びファーミキューテス門に属する82個のOTUは、PBSで処理されたマウスに比べて、B.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708で処理されたマウスの回腸内で有意に減少した(図7a)。
ビフィドバクテリウム・ビフィダム株については、推定的にB.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708株に対応するOTUを含む3つのOTUのみが過剰であった(表3A~3B~3C)。これに対し、32個のOTUのみが、回腸内でL.ヘルベティカスMIMLh5株により有意に変更されており、具体的には、ラクトバチルスS24-7及び7の22個のOTUが減少したが、推定的にL.ヘルベティカスMIMLh5株に対応するOTUを含む2つのOTUのみが増加した(表4A~4B~4C)。
盲腸及び結腸内では、B.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708は、それぞれ101個及び59個のOTUで有意に増加し、8個及び15個のOTUで有意に減少した一方、MIMLh5は、それぞれ178個及び112個のOTUで有意に増加し、32個及び13個のOTUで有意に減少した(図7b及び7c、表3A~3B~3C、表4A~4B~4C)。特に、S24-7科に属する細菌で処理されたマウスの盲腸及び結腸内で多数のOTUが大きな比率を占めており、そのうち10個のOTUは、MIMBb23sg DSM 32708で処理されたマウスの回腸内でも減少していた(表3A~3B~3C)。これは、胃プローブによりB.ビフィダムを投与した後に、これらの細菌が回腸からより遠位の腸領域に移動する可能性を示唆している。また、細菌で処理されたマウスの盲腸及び結腸では、多数のクロストリジウムのOTUが有意に調節されたことも観察された(表3A~3B~3C、表4A~4B~4C)。さらに、ラクトバチルスのいくつかのOTUは、胃プローブによりL.ヘルベティカスMIMLh5を投与してから盲腸及び結腸内で調節されているが、アッカーマンシアムシニフィラ種に属する2つのOTUは、B.ビフィダムMIMBb23sgで処理されたマウスで増加した(表3A~3B~3C、表4A~4B~4C)。
以上より、これらのデータは、B.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708及びL.ヘルベティカスMIMLh5が、マウスに投与された後に、特に回腸内の多数の細菌OTUの存在量を減少させ、そして盲腸及び結腸内の多数の細菌の存在量を増加させる観点から、腸微生物叢の組成を調節することができることを実証した。また、MIMBb23sg DSM 32708は、L.ヘルベティカスMIMLh5よりも回腸微生物叢に対する影響が大きく、一方、L.ヘルベティカスMIMLh5は、B.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708よりも盲腸微生物叢に対する影響が大きい。
(XI)B.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708は、L.ヘルベティカスMIMLh5に対して、マウスの腸内のセロトニン作動性経路の遺伝子発現に大きな影響を与える。
また、腸運動の変化は、微生物叢で観察される調節、特に細菌の投与による回腸の細菌負荷の低減に寄与していると仮定した。この仮設を検証するために、セロトニンの腸代謝に関与する遺伝子の発現を評価した。RT-qPCR実験は、両方の株がセロトニン代謝に関与する遺伝子の転写に影響を与えることを示している(図8)。しかしながら、B.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708は、L.ヘルベティカスMIMLh5に比べて、回腸及び結腸内でセロトニン作動性遺伝子発現に対する影響がより顕著であった(図8及び図9a、9b及び9c)。具体的には、L.ヘルベティカスMIMLh5株を投与することにより、盲腸内のセロトニン再取り込み用受容体(選択的ナトリウム及び塩化物結合セロトニントランスポーター、SERT)をコードする遺伝子の発現が増大したが、セロトニン合成に関与するトリプトファンヒドロキシラーゼ(TPH1)の転写は、回腸及び盲腸で減少した。5HTR4セロトニン受容体の発現は回腸及び結腸で減少したが、5HTR3受容体の発現は影響を受けなかった。これに対し、胃プローブによりB.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708で処理されたマウスでは、セロトニンの合成に関与する遺伝子(TPH1)及びセロトニンの再取り込みに関与する遺伝子(SERT)の発現の逆調節が、回腸と結腸との間で観察された(図8及び図9a及び9c)。実際に、胃プローブによりB.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708で処理されたマウスの回腸内では、対照マウスに対して、TPH1の発現が増加し、SERTの発現が減少したが、一方、PBS及びL.ヘルベティカスMIMLh5で処理されたマウスに対して、B.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708で処理されたマウスの結腸内では、TPH1の発現が減少し、SERTの発現が増加した。
また、回腸内でセロトニン5HTR3受容体が有意に誘導され、回腸及び盲腸内で5HTR4及び5HTR3の発現が有意に減少したことが観察された。
以上より、これらのデータは、L.ヘルベティカスMIMLh5が、B.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708に対して、セロトニン代謝遺伝子の発現を適度に調節していること、B.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708が、セロトニン合成に関与する主遺伝子及びセロトニン再取り込みタンパク質をコードする遺伝子の発現に回腸と結腸との間で逆の影響を与えていることを示し、これは、腸の遠位部への潜在的な推進効果を示唆している。
(XII)マウスの腸免疫系に対する主要な効果は、回腸内でB.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708によって発揮される。
腸微生物叢及びセロトニン作動性経路が腸恒常性全体に関連しているため、異なるサイトカイン、シクロオキシゲナーゼ2(COX-2)及びゾヌリンの遺伝子に対して目的とするRT-qPCR解析を行うことにより、免疫応答性及び腸透過性を評価した。セロトニン作動性代謝の遺伝子発現の解析と同様に、B.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708は、L.ヘルベティカスMIMLh5に比べて、免疫系遺伝子の転写をより大きく調節することが観察された。実際、B.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708の投与により、特に回腸内で自然免疫に関与するいくつかの遺伝子の発現が誘導された。具体的には、IL-10は、最も増加した遺伝子であり、回腸内で相対的なFOIが4.7(p<0.01)であった。盲腸内でIL-10が有意に誘導され(FOI=2.2、p<0.01)、IL-10が結腸内で増加する傾向があった(FOI=2.5、p=0.095)ことも観察された(図10、図11a、11b、11c)。また、胃プローブによりB.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708で処理されたマウスの回腸内では、iNOS(FOI=2.3、p<0.01)、IL-1β(FOI=2.2、p<0.01)及びCOX-2(FOI=1.9、p<0.01)をコードする遺伝子の発現の増加が観察された一方で、TNF-α(FOI=1.7、p<0.05)及びIL-6(FOI=1.6、p<0.05)の大きくはないが有意な誘導が回腸に観測された。結腸内では、遺伝子発現の有意な差は、COX-2(FPI=0.4、p<0.05)の減少のみであった。最後に、ゾヌリン遺伝子は盲腸内でのみ調節され、その発現は、B.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708(FOI=0.3、p<0.01)及びL.ヘルベティカスMIMLh5(FOI=0.2、p<0.01)で処理されたマウスにおいて低下した(図10、図11b)。
以上より、これらの結果は、B.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708の投与がマウスの消化管、特に回腸内の免疫応答に関与する様々な遺伝子の発現に影響を与える一方で、L.ヘルベティカスMIMLh5は限定的な効果しかなかったことを実証している。特に、B.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708株は、回腸内のIL-10制御サイトカインの発現を誘導し、そして結腸内のシクロオキシゲナーゼ(COX-2)を減少させており、これは、当該細菌が、腸内で抗炎症/制御活性を発揮する可能性があることを示唆している。
(XIII)B.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708株がIL-8(炎症誘発マーカー)の放出を低減する能力をインビトロで評価した。
当該インビトロ試験では、インターロイキン-8(つまり、IL-8、炎症誘発サイトカイン)のレベルの変化を読み取ることで、本発明の菌株(B.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708)が基準条件及び炎症条件下で腸細胞株(HT-29)の炎症反応を調節する能力を評価した。
これらの結果(図12及び図13)は、本発明の株(B.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708)を炎症条件下で処理した後の腸細胞株によるIL-8の放出に関する正のダウンレギュレーション傾向を示している。
インビトロ試験導の実行法について
つまり、HT-29細胞株を本発明の菌株(B.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708)に2時間暴露した後、プロバイオティクス株を除去し、細胞株を新鮮な培養物に入れ、別の24時間インキュベートした。その後、細胞株の上清のIL-8を定量化した。この試験を基準条件及び炎症条件下で実施した(サルモネラへの暴露により炎症性刺激を与える)。
つまり、HT-29細胞株を本発明の菌株(B.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708)に2時間暴露した後、プロバイオティクス株を除去し、細胞株を新鮮な培養物に入れ、別の24時間インキュベートした。その後、細胞株の上清のIL-8を定量化した。この試験を基準条件及び炎症条件下で実施した(サルモネラへの暴露により炎症性刺激を与える)。
基準条件下での試験について
HT-29株は、結腸腺癌由来の真核細胞株である。この細胞株を、コンフルエントな単層になるまで、適切なインキュベーター内で、DMEM高グルコース(ダルベッコ改変イーグル培地)培地+10%の不活性化ウシ胎児血清、2mmのL-グルタミン及び50μg/mlのゲンタマイシン中に、37℃で5%のCO2の存在下で培養した。この単層をトリプシン処理し、血球分析装置で細胞を計数し、2.5×105細胞/mlの濃度に希釈した細胞懸濁液1mLを24ウェルプレートに播種し、コンフルエントになるまで約48時間インキュベートした。コンフルエントになったら、細胞をHBSSで洗浄し、抗生物質及びFBSを含まないDMEM培地中に2時間放置した。この期間の終了時に、細胞をプロバイオティクス株(MOIが1:100である)に接触させた。共インキュベーション時間の終了後、細胞をFBSで2回洗浄し、FBSを含まないDMEM中で24時間静置した。この更なるインキュベーション後に、細胞上清を回収し、遠心分離し、その後にELISAキットによるIL-8の定量化に使用した。
HT-29株は、結腸腺癌由来の真核細胞株である。この細胞株を、コンフルエントな単層になるまで、適切なインキュベーター内で、DMEM高グルコース(ダルベッコ改変イーグル培地)培地+10%の不活性化ウシ胎児血清、2mmのL-グルタミン及び50μg/mlのゲンタマイシン中に、37℃で5%のCO2の存在下で培養した。この単層をトリプシン処理し、血球分析装置で細胞を計数し、2.5×105細胞/mlの濃度に希釈した細胞懸濁液1mLを24ウェルプレートに播種し、コンフルエントになるまで約48時間インキュベートした。コンフルエントになったら、細胞をHBSSで洗浄し、抗生物質及びFBSを含まないDMEM培地中に2時間放置した。この期間の終了時に、細胞をプロバイオティクス株(MOIが1:100である)に接触させた。共インキュベーション時間の終了後、細胞をFBSで2回洗浄し、FBSを含まないDMEM中で24時間静置した。この更なるインキュベーション後に、細胞上清を回収し、遠心分離し、その後にELISAキットによるIL-8の定量化に使用した。
炎症条件下での試験について
HT-29細胞を、前段落に記載されたように播種し(基準条件下での試験)、コンフルエントになった後、HBSSで2回洗浄し、FBS及び抗生物質を含まない培地で、37℃で2時間静置した。2時間インキュベートした後、病原性菌株のサルモネラエンテリカアボニNCTC6017を用いて、HT-29細胞を2時間抗原投与することにより炎症条件を誘導した。その後、細胞をHBSSで2回洗浄し、プロバイオティクス株(MOIが1:100である)と共インキュベートした。共インキュベーション時間の終了後、細胞をFBSで2回洗浄し、FBSを含まないDMEM中で24時間静置した。この更なるインキュベーション後に、細胞上清を回収し、遠心分離し、その後ELISAキットによるIL-8の定量化に使用した。
HT-29細胞を、前段落に記載されたように播種し(基準条件下での試験)、コンフルエントになった後、HBSSで2回洗浄し、FBS及び抗生物質を含まない培地で、37℃で2時間静置した。2時間インキュベートした後、病原性菌株のサルモネラエンテリカアボニNCTC6017を用いて、HT-29細胞を2時間抗原投与することにより炎症条件を誘導した。その後、細胞をHBSSで2回洗浄し、プロバイオティクス株(MOIが1:100である)と共インキュベートした。共インキュベーション時間の終了後、細胞をFBSで2回洗浄し、FBSを含まないDMEM中で24時間静置した。この更なるインキュベーション後に、細胞上清を回収し、遠心分離し、その後ELISAキットによるIL-8の定量化に使用した。
インビトロ試験で使用された材料及び図12~13で使用された略称について
陰性対照(C-)はHT-29+DMEMである。
陽性対照(C+)はHT-29+サルモネラエンテリカアボニNCTC6017である。
プロバイオティクス株(Bb)はHT-29+B.バイファイウムMIMBb23sg DSM 32708である。
陰性対照(C-)はHT-29+DMEMである。
陽性対照(C+)はHT-29+サルモネラエンテリカアボニNCTC6017である。
プロバイオティクス株(Bb)はHT-29+B.バイファイウムMIMBb23sg DSM 32708である。
結果の討論
本発明の実験部分で報告された結果により、ヒト腸微生物B.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708の有益な性質をサポートするメカニズムを理解することができる。B.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708菌株は、異なるメカニズムを通じて宿主の健康に影響を与えるが、そのメカニズムは主に(i)腸微生物のエコロジーとの相互作用、及び(ii)宿主の腸粘膜代謝の調節、特に免疫調節の2つに分類することができる。本研究では、マウスモデルを用いてこの2つの面を評価した。
本発明の実験部分で報告された結果により、ヒト腸微生物B.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708の有益な性質をサポートするメカニズムを理解することができる。B.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708菌株は、異なるメカニズムを通じて宿主の健康に影響を与えるが、そのメカニズムは主に(i)腸微生物のエコロジーとの相互作用、及び(ii)宿主の腸粘膜代謝の調節、特に免疫調節の2つに分類することができる。本研究では、マウスモデルを用いてこの2つの面を評価した。
このインビボ研究の初期段階では、3つの異なる腸領域の微生物叢に対するB.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708の投与による影響を解析した。B.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708菌株及び対照株L.ヘルベティカスMIMLh5は、いずれも評価対象の3つの腸部位の微生物叢に対して、組成及び総細菌負荷の両方で、有意な影響を与えた。特に、回腸内の細菌性細胞の濃度は、対照に対して、プロバイオティクスで処理されたマウスにおいて有意に低下したことが確認された。小腸内の細菌性細胞の量は、宿主によって常に制御されている必要があるため、その過剰な増殖は、小腸内細菌異常増殖症(SIBO)症候群と総称される潜在的に有害な結果を誘発する可能性がある。近年の18個の臨床試験のメタ分析により、プロバイオティクス融合がH2の生産及び腹痛を低減し、SIBOの治療に効果的であることが明らかとなった。このように、プロバイオティクスを摂取することにより、小腸内の細菌濃度を抑制することが可能であり、それは細菌増殖の直接的阻害及び/又は代替的に小腸の運動性の刺激によるものと考えられる。本明細書において報告されたデータは、最初の仮説を除外することなく、特にB.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708について、後者を裏付ける要素を提供している。初期的には、胃プローブによりこれらの菌体で処理されたマウスの総細菌負荷は、回腸内で減少したにも関わらず、特にL.ヘルベティカスMIMLh5で処理されたマウスの遠位腸部位でより大きいことが観察された。さらに、回腸内での存在量が大幅に減少したいくつかの分類単位は、盲腸及び結腸内で有意に増加した。最後に、さらに重要なことは、回腸の運動性をより高める方向のセロトニン作動性遺伝子発現の調節が観察された。特に、B.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708の5日間の連日投与により、(i)セロトニン生合成における制限酵素を表すトリプトファンヒドロキシラーゼ-1(TPH1)の有意な発現、及び(ii)セロトニントランスポーターSERT再取り込みをコードする遺伝子の減少が誘導され、こうして回腸内におけるセロトニンの有効性の向上を誘導し、結果として蠕動の促進を潜在的に誘導する。
書籍「The second Brain」(Gershon、1998)の出版により、免疫系、微生物叢及び粘膜防御のほか、腸管神経系(ENS)及び特にセロトニン作動性代謝を考慮することで、IBSを治療するための研究中の菌株と宿主の間の相互作用メカニズムをより良く理解することができるという仮説が導かれた。腸管神経系(ENS)は、ホルモン及びセロトニンの神経伝達物質(5-ヒドロキシトリタミン、5-HT)に規定される独立した神経内分泌臓器として定義される。
したがって、本研究は、この仮説を実証するために行われ、B.ビフィダムMIMBb23sg DSM 32708と宿主との相互作用も、5-HTの代謝を調節する能力によって有意に媒介されているという仮説を裏付けるデータを収集し、IBSなどの機能性腸障害の治療に対するこの細菌の有効性について説明を得た。
Claims (12)
- ビフィドバクテリウム・ビフィダムMIMBb23sg=BbfIBS01Tとして同定されるビフィドバクテリウム・ビフィダム属に属する菌株であって、2017年12月4日にSofar S.p.Aによってドイツ微生物細胞培養コレクション(DSMZ)において寄託番号DSM 32708の下に寄託されている、菌株。
- 薬剤として使用される、請求項1に記載の菌株。
- 胃腸疾患、障害又は症状、好ましくは機能性胃腸障害又は炎症性胃腸障害の予防的又は治療的処置に使用される、請求項1又は2に記載の菌株。
- 過敏性腸症候群(IBS)と、消化不良と、胸やけと、食道、胃及び十二指腸の障害と、小腸内細菌異常増殖症(SIBO)と、軽度炎症状態を伴う障害と、から選択される機能性胃腸障害の予防的及び/又は治療的処置方法に使用され、好ましくは、前記軽度炎症性障害は、高齢者又はセリアック病患者又は憩室疾患の罹患者に現れる、請求項3に記載の菌株。
- クローン病、潰瘍性大腸炎、顕微鏡的大腸炎、ヘリコバクターピロリ、消化性潰瘍又は胃潰瘍、十二指腸潰瘍、セリアック病、憩室疾患及び憩室炎から選択される炎症性胃腸障害又は症状の予防的及び/又は治療的処置方法に使用される、請求項3に記載の菌株。
- 請求項1に記載のビフィドバクテリウム・ビフィダムMIMBb23sg=BbfIBS01 DSM 32708菌株を含むか又は代替的にそれからなる混合物を含み、
そして任意選択的に、少なくとも1種の食品グレード又は医薬品の添加剤及び/又は賦形剤を含む、組成物。 - 前記混合物は、1日の摂取量に対して、1×106CFU~1×1012CFU、好ましくは1×107CFU~1×1011CFU、より好ましくは1×108CFU~1×1010CFUの範囲の濃度でB.ビフィダムMIMBb23sg=BbfIBS01 DSM 32708菌株を含む、請求項6に記載の組成物。
- 薬剤として使用される、請求項6又は7に記載の組成物。
- 胃腸疾患、障害又は症状、好ましくは機能性胃腸障害又は炎症性胃腸障害の予防的又は治療的処置に使用される、請求項6又は7に記載の組成物。
- 過敏性腸症候群(IBS)と、消化不良と、胸やけと、食道、胃及び十二指腸の障害と、小腸内細菌異常増殖症(SIBO)と、高齢者又はセリアック病患者又は憩室疾患の罹患者に現れる、軽度炎症状態を伴う障害と、から選択される機能性胃腸障害の予防的及び/又は治療的処置方法に使用される、請求項9に記載の組成物。
- クローン病、潰瘍性大腸炎、顕微鏡的大腸炎、ヘリコバクターピロリ、消化性潰瘍又は胃潰瘍、十二指腸潰瘍、セリアック病、憩室疾患及び憩室炎から選択される炎症性胃腸障害又は症状の予防的及び/又は治療的処置方法に使用される、請求項9に記載の組成物。
- 不安及び/又は鬱病又は関連症状の予防的及び/又は治療的処置方法に使用される、請求項2に記載の用途の菌株又は代替的に請求項8に記載の用途の組成物。
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