JP2022539517A - Ｔｄｐ－４３タンパク症のモデル化 - Google Patents

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Abstract

本明細書に記載されているのは、ＴＤＰ－４３の核局在化シグナル（ＮＬＳ）もプリオン様ドメイン（ＰＬＤ）も、胚性幹細胞の培養及び試験管内での運動ニューロンへの分化に必要ではないという発見である。これらのＴＤＰ－４３変異型を発現し、ＡＬＳのような表現型（それによってＴＤＰ－４３変異型は細胞質に再分布して凝集し、隠れエクソンのスプライシングの調節に失敗する）を示す運動ニューロンに分化するＥＳ細胞の能力は、これらの細胞がＴＤＰ－４３タンパク症を解決し得る候補治療剤を調べるためのＴＤＰ－４３タンパク症のモデルとして作用するのを可能にする。さらに、これらのＥＳ細胞は、ＡＬＳの特徴的な症状も示し、ＴＤＰ－４３タンパク症の治療に有用な候補薬剤を調べるのに使用されてもよい非ヒト動物、例えばマウスを首尾よく生成するのに使用されてもよい。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、その開示が参照によって全体として本明細書に組み込まれる米国仮出願第６２／８６７，７８５号（２０１９年６月２７日に出願）の、米国特許法第１１９条（３）に基づく利益を主張する。
ＥＦＳウェブ経由でテキストファイルとして提出された配列表への参照
ファイル１０３１２ＷＯ０１＿ＳＴ２５．ｔｘｔに記述された配列表は３５キロバイトであり、２０２０年６月２５日に作成され、参照によって本明細書に組み込まれる。
技術分野
本明細書に記載されているのは、ＴＤＰ－４３及びそのドメイン、それらについての非ヒト動物及び非ヒト動物細胞、ならびにそれらについての核酸の生物学的役割（複数可）を評価する方法である。そのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞または核酸を含むＴＤＰ－４３タンパク症のモデル、及びそれらを使用する方法も提供される。
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、運動ニューロンに影響を及ぼし、四肢麻痺と横隔膜筋の障害の結果として最終的な死を引き起こす壊滅的な神経変性疾患である。ＡＬＳ患者組織の死後検査におけるほぼ普遍的な病理学的所見は、細胞質封入体におけるＴＤＰ－４３（トランスアクティブ応答ＤＮＡ結合タンパク質４３ｋＤａ）の蓄積である。
ＴＤＰ－４３は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）ドメインと、２つのＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲＭ１及びＲＲＭ２）と、推定核外輸送シグナル（ＮＥＳ）ドメインと、グリシンが豊富なプリオン様ドメイン（ＰＬＤ）とを有することを特徴とする。異種核リボ核タンパク質（ｈｎＲＮＰ）ファミリーのメンバーと同様に、ＴＤＰ－４３は、すべての哺乳類細胞の生存と動物の正常な発育に必要な主に核ＲＮＡ結合タンパク質である。核から細胞質へのＴＤＰ－４３の再分布と不溶性凝集体におけるその蓄積は、ＡＬＳ疾患の２つの重要な診断上の特徴である。
ＴＤＰ－４３の細胞質内蓄積はＡＬＳに関連しているが、ＴＤＰ－４３の各構造ドメインとＴＤＰ－４３の生物学的機能（複数可）との関係は明らかではない。
本明細書で提供されているのは、胚性幹（ＥＳ）細胞、それから培養される組織（例えば、原始外胚葉、胚様体、運動ニューロン）、及び機能的構造ドメインを欠く変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドを発現している、且つＡＬＳのような表現型を呈してもよいそれに由来する非ヒト動物である。それを作成し、且つ使用するための組成物及び方法も提供される。機能的構造ドメインを欠く変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子及び機能的構造ドメインを欠く変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドも提供される。提供されるのはまた、ＴＡＲＤＢＰ発現の自己調節を復元してもよい例示的な治療用オリゴヌクレオチド、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
本明細書に記載されているのは、変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子を含む非ヒト動物（例えば、齧歯類（例えば、ラットまたはマウス））及び非ヒト動物細胞（例えば、胚性幹（ＥＳ）細胞、胚様体、胚性幹細胞由来運動ニューロン（ＥＳＭＮ）など）であり、その際、変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子は、変異型ＴＤＰ－４３が突然変異（例えば、点突然変異、置換、置き換え、挿入、欠失などの１以上）を別にすれば対応する野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドのアミノ酸配列を含むように突然変異を含む野生型ＴＡＲＤＢＰ遺伝子のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、野生型ＴＡＲＤＢＰ遺伝子は、配列番号２（その縮重変異体を含む）、配列番号４（その縮重変異体を含む）、または配列番号６（その縮重変異体を含む）に示される配列を含み、それらはそれぞれ、配列番号１、配列番号３、または配列番号５として示されるアミノ酸配列を含む野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする。
いくつかの実施形態では、変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子は、非ヒト動物または非ヒト動物細胞の内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子座にて内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子に取って代わる。いくつかの実施形態では、非ヒト動物細胞または非ヒト動物は、変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子についてヘテロ接合性である。例えば、いくつかの実施形態では、非ヒト動物または非ヒト動物細胞はさらに、本明細書に記載されているような変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子に加えて、（ａ）野生型ＴＡＲＤＢＰ遺伝子または（ｂ）ノックアウト突然変異、例えば、条件付きノックアウト突然変異を含むＴＡＲＤＢＰ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、条件付きノックアウト突然変異は、部位特異的組換え認識配列、例えば、ｌｏｘｐ配列を含み、任意で、部位特異的組換え認識配列（例えば、ｌｏｘｐ配列）はコーディングエクソン、例えば、エクソン３に隣接する。いくつかの実施形態では、ノックアウト突然変異を含むＴＡＲＤＢＰ遺伝子はＴＡＲＤＢＰ遺伝子の欠失したエクソン３に隣接するｌｏｘｐ配列を含む。いくつかの実施形態では、ノックアウト突然変異はＴＤＰ－４３ペプチドの全コード配列の欠失を含む。
いくつかの実施形態では、非ヒト動物または非ヒト動物細胞は、（ｉ）内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子座にて内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子の変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子による置換を含み、且つ（ｉｉ）相同染色体の他方の内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子座にてノックアウト突然変異を含むＴＡＲＤＢＰ遺伝子または野生型ＴＡＲＤＢＰ遺伝子のいずれかを含む。
いくつかの実施形態では、非ヒト動物または非ヒト動物細胞は、内在性ＴＲＡＤＢＰ遺伝子座にて条件付きノックアウト突然変異を含むＴＡＲＤＢＰ遺伝子を含み、且つ相同染色体の他方の内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子座にてＴＡＲＤＢＰコード配列全体の欠失を含むＴＡＲＤＢＰ遺伝子を含む。
いくつかの実施形態では、非ヒト動物細胞または非ヒト動物は、変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子についてホモ接合性である。
いくつかの実施形態では、非ヒト動物または非ヒト動物細胞は、野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドを発現しない。
いくつかの実施形態では、非ヒト動物または非ヒト動物細胞は、野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドを発現する。
いくつかの実施形態では、先行請求項のいずれか１項に記載の非ヒト動物または非ヒト動物細胞は、対照細胞における野生型ＴＡＲＤＢＰ遺伝子のｍＲＮＡ転写レベルに匹敵する、変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子のｍＲＮＡ転写レベルを含み、対照細胞における野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドのレベルと比べて増加したレベルの変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドを含み、例えば運動ニューロンの核よりも細胞質にて見られるさらに高い濃度の変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドを含み、変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドを含む野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチド細胞質凝集体と比べて不溶性が増した変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドを含み、隠れエクソンのスプライシングの増加、及び／または選択的スプライシングを受けたＴＤＰ－４３型のレベルの低下を含む。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、前脛骨筋のような主に速筋で構成される筋肉組織の脱神経、及び／または肋間筋のような主に遅筋で構成される筋肉組織の正常な神経支配を示す。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているような非ヒト動物細胞は試験管内で培養される。本明細書に記載されているのはまた、本明細書に記載されている非ヒト動物細胞を含む非ヒト動物組織である。
いくつかの実施形態では、非ヒト動物組織及び／または非ヒト動物細胞は組成物に含まれる。
いくつかの実施形態では、変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドは、野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドと比べて機能的構造ドメインを欠き、非ヒト動物または非ヒト動物細胞は変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドを発現し、任意で、野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドは配列番号１、配列番号３、または配列番号５として示される配列を含む。
いくつかの実施形態では、変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、ＲＮＡ認識モチーフ１（ＲＲＭ１）、ＲＮＡ認識モチーフ２（ＲＲＭ２）、推定核外輸送シグナル（Ｅ）、プリオン様ドメイン（ＰＬＤ）、またはそれらの組み合わせから成る群から選択される機能的構造ドメインを欠いている。いくつかの実施形態では、変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子は、突然変異、例えば、点突然変異、置換、挿入、欠失、またはそれらの組み合わせを含む、非ヒト動物のＴＡＲＤＢＰ遺伝子である。いくつかの実施形態では、非ヒト動物のＴＡＲＤＢＰ遺伝子は配列番号２または配列番号４として示されている。いくつかの実施形態では、変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子は、突然変異、例えば、点突然変異、置換、挿入、欠失、またはそれらの組み合わせを含むヒトのＴＡＲＤＢＰ遺伝子である。いくつかの実施形態では、変異させたＴＡＲＤＢＰ。いくつかの実施形態では、ヒトのＴＡＲＤＢＰ遺伝子は配列番号５として示されている。
いくつかの実施形態では、変異型ＴＤＰ４３ポリペプチドは、以下（ａ）ＮＬＳにおけるアミノ酸の点突然変異、（ｂ）ＲＲＭ１におけるアミノ酸の点突然変異、（ｃ）ＲＲＭ２におけるアミノ酸の点突然変異、（ｄ）核外輸送シグナルの少なくとも一部の欠失、及び（ｅ）プリオン様ドメインの少なくとも一部の欠失のうちの１以上に起因して機能的構造ドメインを欠いている。例えば、いくつかの実施形態では、変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドは、さらに（ａ）ＮＬＳにおけるアミノ酸の点突然変異、（ｂ）ＲＲＭ１におけるアミノ酸の点突然変異、（ｃ）ＲＲＭ２におけるアミノ酸の点突然変異、（ｄ）核外輸送シグナルの少なくとも一部の欠失、及び（ｅ）プリオン様ドメインの少なくとも一部の欠失を含む配列番号１、配列番号３、または配列番号５として示される配列を含む。いくつかの実施形態では、（ａ）ＮＬＳにおけるアミノ酸の点突然変異はＫ８２Ａ Ｋ８３Ａ、Ｒ８４Ａ、Ｋ９５Ａ、Ｋ９７Ａ、Ｋ９８Ａまたはそれらの組み合わせを含み、（ｂ）ＲＲＭ１における点突然変異はＦ１４７Ｌ及び／またはＦ１４９Ｌを含み、（ｃ）ＲＲＭ２における点突然変異はＦ１９４Ｌ及び／またはＦ２２９Ｌを含み、（ｄ）核外輸送シグナル欠失の少なくとも一部の欠失は野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドの２３９位と２５０位にて及びその間でアミノ酸の欠失を含み、且つ（Ｅ）プリオン様ドメインの少なくとも一部の欠失は野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドの２７４位と４１４位にて及びその間でアミノ酸の欠失を含む。いくつかの実施形態では、変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドは、野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドと比べてＫ８２Ａ Ｋ８３Ａ、Ｒ８４Ａ、Ｋ９５Ａ、Ｋ９７Ａ、及び／またはＫ９８Ａを含み、任意で、野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドは、配列番号１、配列番号３または配列番号５として示される配列を含む。いくつかの実施形態では、変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドは野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドの２７４位から４１４位のアミノ酸でプリオン様ドメインを欠き、任意で、野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドは、配列番号１、配列番号３、または配列番号５として示される配列を含む。いくつかの実施形態では、変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドは野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドと比べてＦ１４７Ｌ及びＦ１４９Ｌを含み、任意で、野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドは、配列番号１、配列番号３または配列番号５として示される配列を含む。いくつかの実施形態では、変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドは野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドと比べてＦ１９４Ｌ及びＦ２２９Ｌを含み、任意で、野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドは配列番号１、配列番号３または配列番号５として示される配列を含む。いくつかの実施形態では、変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドは、野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドと比べて２３９位から２５０位のアミノ酸で核外輸送シグナルを欠き、任意で、野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドは配列番号１、配列番号３、または配列番号５として示される配列を含む。
本明細書に記載されている変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチド及びそれをコードする核酸分子も提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているような変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする核酸分子はさらに、５’から３’に向かって：５’相同性アームと、変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする核酸配列と、３’相同性アームとを含み、その際、核酸は齧歯類細胞において相同組換えを受ける。いくつかの実施形態では、核酸が内在性ラットＴＡＲＤＢＰ遺伝子座にて相同組換えを受け、変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする核酸配列が内在性ＴＡＲＤＢＰコード配列に取って代わるように、５’及び３’の相同性アームはラットの配列に相同である。いくつかの実施形態では、核酸が内在性マウスＴＡＲＤＢＰ遺伝子座にて相同組換えを受け、変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする核酸配列が内在性ＴＡＲＤＢＰコード配列を置き換えるように、５’及び３’の相同性アームはマウスの配列に相同である。
本明細書に記載されているのはまた、本明細書に記載されている非ヒト動物及び非ヒト動物細胞を作製するための方法である。いくつかの実施形態では、該方法は、変異ＴＤＰ４３ポリペプチドをコードする変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子を含むように非ヒト動物または非ヒト動物細胞のゲノムを操作することを含み、その際、変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドは野生型ＴＤＰ－４３と比べて機能的構造ドメインを欠き、任意で、野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドは、配列番号１、配列番号３、または配列番号５として示される配列を含む。いくつかの実施形態では、操作することは内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子を、本明細書に記載されているような変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子で置き換えることを含む。いくつかの実施形態では、操作することはさらに、内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子を、ノックアウト突然変異、例えば、条件付きノックアウト突然変異を含むＴＡＲＤＢＰ遺伝子で置き換えることを含む。いくつかの実施形態では、該方法はさらに、ノックアウト突然変異を含むＴＡＲＤＢＰ遺伝子の発現を排除する条件で細胞を培養することを含む。
本明細書に記載されているのはまた、非ヒト動物、非ヒト動物細胞、非ヒト動物組織、及び組成物を使用する方法である。いくつかの実施形態では、非ヒト動物、非ヒト動物細胞、非ヒト動物組織、及び組成物は、方法、例えば、疾患の治療のための治療候補を特定する方法及び／またはＴＤＰ－４３構造ドメインの生物学的機能を評価する方法にて使用される。治療候補を特定するいくつかの実施形態では、方法は、（ａ）非本明細書に記載されているようなヒト動物、非ヒト動物細胞、非ヒト動物、または非ヒト動物細胞または組織を含む組成物（例えば、試験管内培養）を候補薬剤と接触させることと、（ｂ）非ヒト動物、非ヒト細胞または組織の表現型及び／またはＴＤＰ－４３生物活性を評価することと、（ｃ）野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドを発現している対照の細胞または組織の表現型及び／またはＴＤＰ－４３生物活性に匹敵する表現型及び／またはＴＤＰ－４３生物活性を非ヒト動物、非ヒト細胞または組織に復元させる候補薬剤を特定することとを含む。
ＴＤＰ－４の生物学的機能を評価するいくつかの実施形態では、方法は、（ａ）核局在化シグナル（ＮＬＳ）、第１のＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲＭ１）、第１のＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲＭ２）、推定核外輸送シグナル（Ｅ）、プリオン様ドメイン（ＰＬＤ）、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される機能的構造ドメインを欠く変異型ＴＤＰ４３ポリペプチドをコードする変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子を含むように胚性幹（ＥＳ）細胞を操作することと、（ｂ）任意で、操作されたＥＳ細胞を試験管内で分化させ、及び／または操作されたＥＳ細胞から遺伝子操作された非ヒト動物を取得することと、（ｃ）遺伝子操作されたＥＳ細胞、それに由来する原始外胚葉、それに由来する運動ニューロン、またはそれに由来する非ヒト動物の表現型及び／またはＴＤＰ－４３生物活性を評価することとを含む。いくつかの実施形態では、表現型が、細胞培養、蛍光原位置ハイブリッド形成、ウエスタンブロット分析、またはそれらの組み合わせによって評価される、請求項３９または請求項４０に記載の方法。いくつかの実施形態では、表現型を評価することは、遺伝子操作されたＥＳ細胞、それに由来する原始外胚葉、それに由来する運動ニューロン、またはそれに由来する非ヒト動物の生存能力を測定することを含む。いくつかの実施形態では、表現型を評価することは、変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドの細胞での位置を決定することを含む。いくつかの実施形態では、変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドの生物活性を評価することは、ＴＤＰ－４３によって調節される隠れエクソンを含む遺伝子のスプライス産物を測定することを含む。いくつかの実施形態では、ＴＤＰ－４３によって調節される隠れエクソンを含む遺伝子は、Ｃｒｅｍ、Ｆｙｘｄ２、Ｃｌｆ１を含む。いくつかの実施形態では、変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドの生物活性は選択的スプライシングを受けたＴＤＰ－４３のレベルを測定することを含む。
本明細書に記載されているのはまた、ＴＤＰ－４３タンパク症を治療する際の候補薬剤として有用であってもよいオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムなど）である。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’及び３’の選択的スプライス部位間のＴＤＰ－４３ ｍＲＮＡ配列を標的とするギャップマーモチーフを含む。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’及び３’の選択的スプライス部位間のＴＤＰ－４３ ｍＲＮＡ配列を標的とするギャップマーモチーフを含み、その際、５’選択的スプライス部位は、（ａ）染色体４：１４８，６１８，６４７；（ｂ）染色体４：１４８，６１８，６６５；及び（ｃ）染色体４：１４８，６１８，６７４から成る群から選択されるＴＡＲＤＢＰゲノム位置に相関し、３’選択的スプライス部位は染色体４：１４８，６１７，７０５のＴＡＲＤＢＰゲノム位置と相関する。いくつかのｓｉＲＮＡの実施形態では、ｓｉＲＮＡは５’及び３’の選択的スプライス部位の間のＴＤＰ－４３ ｍＲＮＡ配列を標的とする配列を含む。いくつかの実施形態では、配列を含むｓｉＲＮＡは、５’及び３’の選択的スプライス部位間のＴＤＰ－４３ ｍＲＮＡ配列を標的とし、その際、５’選択的スプライス部位は、（ａ）第４染色体：１４８，６１８，６４７；（ｂ）第４染色体：１４８，６１８，６６５；（ｃ）第４染色体：１４８，６１８，６７４から成る群から選択されるＴＡＲＤＢＰゲノム位置に相関し、３’選択的スプライス部位は第４染色体：１４８，６１７，７０５のＴＡＲＤＢＰゲノム位置に相関する。いくつかのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの実施形態では、システムはＣａｓ９タンパク質及び少なくとも１つのｇＲＮＡを含み、ｇＲＮＡはＴＤＰ－４３ ｍＲＮＡの５’選択的スプライス部位またはその近傍及び／または３’選択的スプライス部位またはその近傍の配列を認識する。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムはＣａｓ９タンパク質及び少なくとも１つのｇＲＮＡを含み、その際、ｇＲＮＡは、（ａ）第４染色体：１４８，６１８，６４７；（ｂ）第４染色体：１４８，６１８，６６５；（ｃ）第４染色体：１４８，６１８，６７４、（ｄ）第４染色体：１４８，６１７，７０５及びそれらの組み合わせから成る群から選択されるＴＡＲＤＢＰゲノム位置のまたはその近傍の配列を認識する。
本特許または出願書類はカラーで作成された少なくとも１つの図面を含有する。カラー図面（複数可）付きの本特許または本特許出願公開の写しは請求及び必要手数料の支払いに応じて米国特許庁より提供されるであろう。
ＴＤＰ－４３、核局在化シグナル（ＮＬＳ；アミノ酸８２～９８）の相対位置、２つのＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲＭ１；アミノ酸１０６～１７６、及びＲＲＭ２；アミノ酸１９１～２６２）の相対位置、推定核外輸送シグナル（Ｅ；アミノ酸２３９～２４８）の相対位置、プリオン様ドメイン（ＰＬＤ；アミノ酸２７４～４１４）の相対位置、ＡＬＳに関連するアミノ酸置換変異、及びＡＬＳに関連するＣ末端断片の説明（正確な縮尺ではない）を提供する図である。星印はＡＬＳの有無にかかわらずＦＴＤ症状に関連する突然変異を強調する。Ａ９０Ｖ、Ｓ９２Ｌ、Ｎ２６７Ｓ、Ｇ２８７Ｓ、Ｇ２９４Ｖ、Ｇ３６８Ｓ、Ｓ３７５Ｇ、Ａ３８２Ｔ、Ｉ３８３Ｖ、Ｎ３９０Ｓ、及びＮ３９０Ｄの突然変異は健康な人でも観察されている。 ＡＴＧ開始コドンで始まる、エクソン１～６（長方形）、非翻訳領域（塗りつぶされていない長方形）、及び翻訳領域（塗りつぶされた長方形）を示す、マウスＴＡＲＤＢＰゲノム構造の図（正確な縮尺ではない）を提供する図である。 マウス（ｍ）ＴＤＰ－４３及びヒト（ｈ）ＴＤＰ－４３ポリペプチドのアミノ酸配列配列比較、ポリペプチドのアミノ酸位置、及びｍＴＤＰ－４３配列及びｈＴＤＰ－４３配列の下のコンセンサス配列を提供する図である。一般に、配列比較内の四角で囲まれた領域は、核局在化シグナル（ＮＬＳ：アミノ酸８２－９８）、ＲＮＡ認識モチーフ１（ＲＲＭ１：アミノ酸１０６－１７６）、ＲＮＡ認識モチーフ２（ＲＲＭ２：アミノ酸１９１－２６２）、推定上の核外輸送シグナル（Ｅ：アミノ酸２３９－２４８）、及びグリシンに富むプリオン様ドメイン（ＰＬＤ：アミノ酸２７４－４１４）を示す。マウスＴＤＰ－４３とヒトＴＤＰ－４３の間のアミノ酸のミスマッチも四角で囲まれ、コンセンサス配列におけるダッシュで示される。エクソン接合部は示された接合部にて連結されたエクソン（ＥＸ）を示す垂直線としても示される。アミノ酸２８６と２８７の間の垂直線は選択的５’－スプライス部位を提供する（図１１Ａを参照のこと）。 ２つの例示的なＴＡＲＤＢＰヌル対立遺伝子の図解（正確な縮尺ではない）を提供する：（１）ｃｒｅが介在する組換えの際にエクソン３を除去した後、今後「－」とされるｌｏｘＰ部位特異的組換え認識部位（三角形）に隣接するエクソン３を含む条件付きノックアウト対立遺伝子、及び（２）今後「ΔＣＤＳ」と呼ばれるＴＡＲＤＢＰコード配列全体の欠失を含むＴＡＲＤＢＰヌル対立遺伝子。エクソン１～６（長方形）、非翻訳領域（塗りつぶされていない長方形）、翻訳領域（塗りつぶされた長方形）、及び開始ＡＴＧと停止ＴＧＡのコドンの相対位置が示されている。 種々の形態の変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子によってコードされる非限定的変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドの例示的な描写（正確な縮尺ではない）を提供する図である。具体的には、これらの例と関連する図全体を通して：「ＷＴ」は野生型ＴＡＲＤＢＰ遺伝子を指し、「ｌｏｘＰ－Ｅｘ３ｌｏｘＰ」は、ｌｏｘＰが導入されたエクソン３を含む変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子を指し、「－」は、ｌｏｘＰ－Ｅｘ３ｌｏｘＰのｃｒｅが介在する組換えの際に野生型ＴＡＲＤＢＰ遺伝子のエクソン３の配列を含むヌクレオチド配列を欠く変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子を指し、「ΔＣＤＳ」とは、ＴＡＲＤＢＰの全コード配列を欠く変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子を指し、「ΔＮＬＳ」は、以下の点突然変異Ｋ８２Ａ Ｋ８３Ａ、Ｒ８４Ａ、Ｋ９５Ａ、Ｋ９７Ａ、及びＫ９８Ａを含む変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子を指し、「ΔＲＲＭ１」は、以下の点突然変異：Ｆ１４７Ｌ及びＦ１４９Ｌを含む変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子を指し、「ΔＲＲＭ２」は、以下の点突然変異：Ｆ１９４Ｌ及びＦ２２９Ｌを含む変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子を指し、「ΔＥ」は、野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドのアミノ酸２３９～２５０を欠く変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子を指し、及び「ΔＰＬＤ」は、野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドのアミノ酸２７４～４１４を欠く変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子を指す。ΔＥ及びΔＰＬＤの変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドの場合、斜線は欠失させた領域を表す。 胚性幹（ＥＳ）細胞を運動ニューロンに分化させるのに使用されるプロトコールを示す図である。示されているのはまた、ＥＳ細胞の段階でのエクソン３のＣｒｅが介在する欠失（－）の後、生存能力を維持し、原始外胚葉（ＰＥ）段階に到達し、及び／または運動ニューロン（ＭＮ）段階に到達することが示された、変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子を含むＥＳ細胞の能力である。 胚性幹細胞由来の運動ニューロン（ＥＳＭＮ）の生存能力を評価するのに使用されるプロトコールを示す図である。示されているのはまた、条件付きノックアウト対立遺伝子（－）の活性化後に示されるような、変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子を含むＥＳＭＮの生存能力に関する結果である。 ＴＤＰ－４３のＮ末端（α－ＴＤＰ－４３Ｎ－ｔｅｒｍ）を認識する抗ＴＤＰ－４３抗体またＴＤＰ－４３のＣ末端（α－ＴＤＰ－４３Ｃ－ｔｅｒｍ）を認識する抗ＴＤＰ－４３抗体によって認識されるＴＤＰ－４３の領域の正確な縮尺ではない描写を提供する。 図６Ａに示されているようなＴＤＰ－４３のＮ末端（αＴＤＰ－４３Ｎ－ｔｅｒｍ）またはＴＤＰ－４３のＣ末端（αＴＤＰ－４３Ｃ－ｔｅｒｍ）を認識する抗体で染色した細胞の細胞質及び核の画分のウエスタンブロットを提供する。エクソン３（－）のＣｒｅが介在する欠失は、ＥＳ細胞段階で発生し、細胞を図４に示すプロトコールに従ってＥＳ培地、ＡＤＦＮＫ培地、レチノイン酸とソニックヘッジホッグを含むＡＤＦＮＫ培地、及びＥＳＭＮ培地で培養し、幹細胞由来の運動ニューロン（ＥＳＭＮ）を作り出した。細胞質及び核の画分は、ＴＤＰ－４３ ＷＴ／－操作ＥＳＭＮ、ΔＮＬＳ／－操作ＥＳＭＮ、ΔＥ／－操作ＥＳＭＮ、ΔＰＬＤ／－操作ＥＳＭＮ、または死にかけているΔＲＲＭ１／－操作細胞から単離した。対照ＴＤＰ－４３ＷＴ／－ＥＳＭＮ（●）、ΔＮＬＳ／－操作ＥＳＭＮ（▲）、ΔＲＲＭ１／－操作細胞（▼）、またはΔＰＬＤ／－操作ＥＳＭＮ（■）の細胞質と核のＴＤＰ－４３の比率を示すグラフも提供される。 示されるような変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子を含む操作された胚性幹細胞由来運動ニューロン（ＥＳＭＮ）の４０倍の倍率での蛍光原位置ハイブリッド形成の画像を提供する。ＥＳ細胞段階で変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子のエクソン３を取り除き（－）、細胞を図４に示すプロトコールに従ってＥＳ培地、ＡＤＦＮＫ培地、レチノイン酸とソニックヘッジホッグを含むＡＤＦＮＫ培地、及びＥＳＭＮ培地で培養し、幹細胞由来の運動ニューロン（ＥＳＭＮ）を作り出した後、画像を捕捉した。ＴＤＰ－４３のＣ末端（αＴＤＰ－４３Ｃ－ｔｅｒｍ；上のパネル）を認識する抗体または抗ＭＡＰ２抗体とＤＡＰＩ（下のパネル）で細胞を染色した。 示されるような変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子を含む操作された胚性幹細胞由来運動ニューロン（ＥＳＭＮ）の４０倍の倍率での蛍光原位置ハイブリッド形成の画像を提供する。ＥＳ細胞段階で変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子のエクソン３を取り除き（－）、細胞を図４に示すプロトコールに従ってＥＳ培地、ＡＤＦＮＫ培地、レチノイン酸とソニックヘッジホッグを含むＡＤＦＮＫ培地、及びＥＳＭＮ培地で培養し、胚性幹細胞由来の運動ニューロン（ＥＳＭＮ）を作り出した後、画像を捕捉した。ＴＤＰ－４３のＮ末端（αＴＤＰ－４３Ｎ－ｔｅｒｍ；上のパネル）を認識する抗体または抗ＭＡＰ２抗体とＤＡＰＩ（下のパネル）で細胞を染色した。 細胞のサルコシル可溶性画分及びサルコシル不溶性画分の、抗ＴＤＰ－４３抗体で染色したウエスタンブロットを提供する。エクソン３（－）のＣｒｅが介在する欠失はＥＳ細胞段階で発生し、細胞を図４に示すプロトコールに従ってＥＳ培地、ＡＤＦＮＫ培地、レチノイン酸とソニックヘッジホッグを含むＡＤＦＮＫ培地、及びＥＳＭＮ培地で培養し、胚性幹細胞由来の運動ニューロン（ＥＳＭＮ）を作り出した。サルコシル可溶性画分及びサルコシル不溶性画分は、ＴＤＰ－４３ ＷＴ／－操作ＥＳＭＮ、ΔＮＬＳ／－操作ＥＳＭＮ、ΔＥ／－操作ＥＳＭＮ、ΔＰＬＤ／－操作ＥＳＭＮ、またはΔＲＲＭ１／－操作細胞から単離した。これらのＥＳＭＮによって発現される不溶性／可溶性ＴＤＰ－４３の比率を提供するグラフも提供する。 ＴＤＰ－４３のｍＲＮＡ（左パネル；ｙ軸）またはタンパク質（右パネル；ｙ軸）の発現レベルを示すグラフを提供する。エクソン３（－）のＣｒｅが介在する欠失はＥＳ細胞段階で発生し、細胞を図４に示すプロトコールに従ってＥＳ培地、ＡＤＦＮＫ培地、レチノイン酸とソニックヘッジホッグを含むＡＤＦＮＫ培地、及びＥＳＭＮ培地で培養し、胚性幹細胞由来の運動ニューロン（ＥＳＭＮ）を作り出した。ΔＮＬＳ／－操作ＥＳＭＮ、ΔＥ／－操作ＥＳＭＮ、ΔＰＬＤ／－操作ＥＳＭＮ、または死にかけているΔＲＲＭ１／－操作細胞のｍＲＮＡレベルを対照（ＴＤＰ－４３ＷＴ／－操作ＥＳＭＮ（ＷＴ／－））と比較する。 細胞溶解物の抗ＴＤＰ－４３抗体または抗ＧＡＰＤＨ抗体で染色したウエスタンブロットを提供する。エクソン３（－）のＣｒｅが介在する欠失はＥＳ細胞段階で発生し、細胞を図４に示すプロトコールに従ってＥＳ培地、ＡＤＦＮＫ培地、レチノイン酸とソニックヘッジホッグを含むＡＤＦＮＫ培地、及びＥＳＭＮ培地で培養し、胚性幹細胞由来の運動ニューロン（ＥＳＭＮ）を作り出した。細胞溶解物は、最大１６時間までのシクロヘキシミド（ＣＨＸ＋）処理後、ＴＤＰ－４３ ＷＴ／－操作ＥＳＭＮ、ΔＮＬＳ／－操作ＥＳＭＮ、ΔＥ／－操作ＥＳＭＮ、ΔＰＬＤ／－操作ＥＳＭＮ、または死にかけているΔＲＲＭ１／－操作細胞から単離した。シクロヘキシミド処理（ｘ軸；時間）後の対照のＴＤＰ－４３ＷＴ／－操作ＥＳＭＮ（●）、ΔＮＬＳ／－操作ＥＳＭＮ（■）、ΔＲＲＭ１／－操作細胞（▲）、またはΔＰＬＤ／－操作ＥＳＭＮ（▼）によって発現されるＴＤＰ－４３タンパク質（ｙ軸）の％を提供するグラフも提供される。 ＴＤＰ－４３によって調節されると考えられる３つの遺伝子であるＣｒｅｍ、Ｆｙｘｄ２、及びＣｌｆ１で発生する正常なエクソン及び隠れエクソンのスプライシングの説明（正確な縮尺ではない）、ならびに正常なスプライシング産物（塗りつぶされたバー）の及び異常なスプライシング産物（パターン化されたバーと塗りつぶされていないバー）のレベルを示すグラフを提供する。エクソン３（－）のＣｒｅが介在する欠失はＥＳ細胞段階で発生し、細胞を図４に示すプロトコールに従ってＥＳ培地、ＡＤＦＮＫ培地、レチノイン酸とソニックヘッジホッグを含むＡＤＦＮＫ培地、及びＥＳＭＮ培地で培養し、胚性幹細胞由来の運動ニューロン（ＥＳＭＮ）を作り出した。ΔＮＬＳ／－操作ＥＳＭＮ、ΔＥ／－操作ＥＳＭＮ、ΔＰＬＤ／－操作ＥＳＭＮ、またはΔＲＲＭ１／－操作細胞と対照（ＴＤＰ－４３ＷＴ／－）によるＣｒｅｍ、Ｆｙｘｄ２、及びＣｌｆ１の隠れエクソンスプライシングのレベルを示す。 ＴＤＰ－４３遺伝子で発生する正常な及び選択的なスプライシング事象の説明（正確な縮尺ではない）を提供する図である。 選択的スプライシングを受けたＴＤＰ－４３ ｍＲＮＡのレベルを示すグラフを提供する。エクソン３（－）のＣｒｅが介在する欠失はＥＳ細胞段階で発生し、細胞を図４に示すプロトコールに従ってＡＤＦＮＫ培地、レチノイン酸とソニックヘッジホッグを含むＡＤＦＮＫ培地、及びＥＳＭＮ培地で培養し、胚性幹細胞由来の運動ニューロン（ＥＳＭＮ）を作り出した。未操作ＥＳ細胞（ＷＴ／ＷＴ）、ΔＮＬＳ／－操作ＥＳＭＮ、ΔＥ／－操作ＥＳＭＮ、ΔＰＬＤ／－操作ＥＳＭＮ、または死にかけているΔＲＲＭ１／－操作細胞による選択的スプライシングを受けたＴＤＰ－４３ ｍＲＮＡのレベルを示す。 ＴＤＰ－４３－／－ＥＳ細胞、ＴＤＰ－４３ΔＮＬＳ／－操作ＥＳ細胞、ＴＤＰ－４３ΔＰＬＤ／－操作ＥＳ細胞、ＴＤＰ－４３ΔＮＬＳ／ＷＴ操作ＥＳ細胞、ＴＤＰ－４３ΔＰＬＤ／ＷＴ操作ＥＳ細胞、ＴＤＰ－４３ＷＴ／－操作ＥＳ細胞、ＴＤＰ－４３ｌｏｘＰ－Ｅｘ３－ｌｏｘＰ／ＷＴ操作ＥＳ細胞、または野生型ＴＤＰ－４３ＷＴ／ＷＴＥＳ細胞を注入した８細胞胚の受精後の生存時間を示すグラフを提供する。Ｅ３．５（胎生期３．５日）、Ｅ１０．５（胎生期１０．５日）、Ｅ１５．５（胎生期１５．５日）、Ｐ０（出生後０日）。 １６週齢のマウス（ｎ＝２）から単離された脊髄組織から単離された運動ニューロンのウエスタンブロットを提供する。調べたマウスは、（ｉ）内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子座から：ｌｏｘＰが導入されたエクソン３（ｌｏｘＰ－Ｅｘ３－ｌｏｘＰ）を含む変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子、ＮＬＳのノックアウト突然変異（ΔＮＬＳ）を含む変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子、またはプリオン様ドメインの欠失（ΔＰＬＤ）を含む変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子と、（ｉｉ）相同染色体上の他方のＴＡＲＤＢＰ遺伝子座にある野生型（ＷＴ）ＴＡＲＤＢＰ遺伝子とを発現した。ＴＤＰ－４３のＮ末端またはＴＤＰ－４３のＣ末端を認識するそれぞれのα－ＴＤＰ－４３Ｎ－ｔｅｒｍ抗体またはα－ＴＤＰ－４３Ｃ－ｔｅｒｍ抗体で染色した運動ニューロンの細胞質及び核の画分を示す（例えば、図６Ａを参照）。ｌｏｘＰ－Ｅｘ３－ｌｏｘＰ／ＷＴマウス（●）、ΔＮＬＳ／ＷＴマウス（▲）、またはΔＰＬＤ／ＷＴマウス（▼）から単離された脊髄組織の細胞質の核に対するＴＤＰ－４３の比率を示すグラフも提供される。 １６週齢のマウス（ｎ＝２）から単離された脊髄組織から単離された運動ニューロンのウエスタンブロットを提供する。調べたマウスは、（ｉ）内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子座から：ｌｏｘＰが導入されたエクソン３（ｌｏｘＰ－Ｅｘ３－ｌｏｘＰ）を含む変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子、ＮＬＳのノックアウト突然変異（ΔＮＬＳ）を含む変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子、またはプリオン様ドメインの欠失（ΔＰＬＤ）を含む変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子と、（ｉｉ）相同染色体上の他方のＴＡＲＤＢＰ遺伝子座にある野生型（ＷＴ）ＴＡＲＤＢＰ遺伝子とを発現した。１６週齢のマウスで単離され、リン酸化されたＴＤＰ－４３を認識する抗体で染色した脊髄組織の細胞質及び核の画分のウエスタンブロットを提供する。 １６週齢のマウス（ｎ＝２）から単離された脊髄組織から単離された運動ニューロンのウエスタンブロットを提供する。調べたマウスは、（ｉ）内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子座から：ｌｏｘＰが導入されたエクソン３（ｌｏｘＰ－Ｅｘ３－ｌｏｘＰ）を含む変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子、ＮＬＳのノックアウト突然変異（ΔＮＬＳ）を含む変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子、またはプリオン様ドメインの欠失（ΔＰＬＤ）を含む変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子と、（ｉｉ）相同染色体上の他方のＴＡＲＤＢＰ遺伝子座にある野生型（ＷＴ）ＴＡＲＤＢＰ遺伝子とを発現した。ＴＤＰ－４３のＮ末端またはＴＤＰ－４３のＣ末端を認識するそれぞれのα－ＴＤＰ－４３Ｎ－ｔｅｒｍ抗体（例えば、図６Ａを参照）またはα－ＴＤＰ－４３Ｃ－ｔｅｒｍ抗体（例えば、図６Ａを参照）で染色した細胞のサルコシル可溶性及びサルコシル不溶性の画分のウエスタンブロットを提供する。 １６週齢のマウスから単離された脊髄組織から単離された運動ニューロンの４０倍の倍率での蛍光原位置ハイブリッド形成の画像を提供する。調べたマウスは、（ｉ）内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子座から：ｌｏｘＰが導入されたエクソン３（ｌｏｘＰ－Ｅｘ３－ｌｏｘＰ）を含む変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子、ＮＬＳのノックアウト突然変異（ΔＮＬＳ）を含む変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子、またはプリオン様ドメインの欠失（ΔＰＬＤ）を含む変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子と、（ｉｉ）相同染色体上の他方のＴＡＲＤＢＰ遺伝子座にある野生型（ＷＴ）ＴＡＲＤＢＰ遺伝子とを発現した。ＴＤＰ－４３のＮ末端（αＴＤＰ－４３Ｎ－ｔｅｒｍ；上のパネル）を認識する抗体または抗ｃｈＡＴ抗体及び抗ＮｅｕＮ抗体（下のパネル）で細胞を染色した。示されているのはまた、野生型ＴＤＰ－４３のみ（●）、変異型ΔＮＬＳ ＴＤＰ－４３ポリペプチドと野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチド（■）、変異型ΔＮＬＳ ＴＤＰ－４３ポリペプチドと野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドの双方（■）、または変異型ΔＰＬＤ ＴＤＰ－４３ポリペプチドと野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドの双方（▲）を発現している動物にて細胞質凝集体を示す運動ニューロンの百分率を示すグラフである。 １６週齢のマウスから単離された前脛骨筋組織または肋間筋組織の１０倍または４０倍の倍率での蛍光原位置ハイブリッド形成の画像を提供する。組織を、シナプトフィジン、ブンガロトキシンを認識する抗体、及び／またはＤＡＰＩで染色した。矢印は脱神経された神経筋接合部を示し、星印は部分的に神経支配された神経筋接合部を示す。 ｌｏｘＰ－Ｅｘ３－ｌｏｘＰ／ＷＴマウス（●）、ΔＮＬＳ／ＷＴマウス（▲）、またはΔＰＬＤ／ＷＴマウス（▼）から単離された前脛骨（ＴＡ）筋組織または肋間筋における神経支配された神経筋接合部の割合（ＮＭＪｓ；ｙ軸）を提供するグラフである。
概要
ＴＤＰ－４３は主に、ＲＮＡの転写、スプライシング、輸送、及び安定性を含むＲＮＡのプロセシング及び代謝で機能する核内ＲＮＡ／ＤＮＡ結合タンパク質である。ＴＤＰ－４３のＲＮＡ結合特性は、それ自体のｍＲＮＡにおける３’ＵＴＲ配列への結合を介して介在するその自己調節活性に不可欠であると思われる。Ａｙａｌａ ｅｔ ａｌ．（２０１１），ＥＭＢＯ Ｊ．３０：２７７－８８．細胞ストレスに続いて、ＴＤＰ－４３は細胞質ストレス顆粒に局在し、ストレス顆粒形成で役割を担ってもよい。ＴＤＰ－４３はその核内の通常の位置から細胞質に誤って局在し、そこで凝集する。凝集したＴＤＰ－４３はユビキチン化され、過剰リン酸化され、及び切り詰められる。さらに、細胞質でのＴＤＰ－４３凝集はＡＬＳのほぼすべての症例の構成要素である。Ｂｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１７），Ｎａｔｕｒｅ，５４４：３６７－３７１．ＡＬＳ症例の９７％は細胞質ＴＤＰ－４３凝集体の死後の病理を示す。同じ病変は散発性前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤＵ）の約４５％に見られる。ＴＤＰ－４３は、ＦＴＬＤＵのユビキチン陽性、タウ陰性の封入体、運動ニューロン疾患を伴うＦＴＬＤ（ＦＴＤＭＮＤ）、及びＡＬＳ／ＭＮＤ（ＡＬＳ１０）の主要な病理学的タンパク質として最初に特定され、これらの障害は、現在、ＴＤＰ－４３タンパク症のさまざまな臨床症状を表すと見なされている。Ｇｉｔｃｈｏ ｅｔ ａｌ．（２００９），Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈ．１１８：６３３－６４５．ＴＡＲＤＢＰＢ突然変異は家族性ＡＬＳ患者の約３％で発生し、散発性疾患の患者の約１．５％で発生する。Ｌａｔｔａｎｔｅ ｅｔ ａｌ．（２０１３），Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．３４：８１２－２６．ＴＡＲＤＢＰ遺伝子の種々の突然変異は、症例の１％未満でＡＬＳに関連している。図１を参照のこと。図１に示すように、ＡＬＳに関連するＴＡＲＤＢＰ遺伝子の大部分の突然変異はプリオン様ドメイン（ＰＬＤ）に見いだされる。したがって、ＴＤＰ－４３が担うすべての機能を理解することはＡＬＳ、ＦＬＴＤＵ、ＦＬＴＤ等のような神経病理学におけるその役割を解明する可能性がある。
ＴＤＰ－４３が細胞及び生物の生命に不可欠であることは明らかである。ＴＤＰ－４３の枯渇は胚の致死性をもたらす。したがって、初期モデルはＴＤＰ－４３の過剰発現またはその変異型、またはＴＤＰ－４３の欠失に依存した。ＡＬＳ病理におけるＴＤＰ－４３の役割を評価する種々のモデルが作り出されてきた。Ｔｓａｏ ｅｔ ａｌ．（２０１２），Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．１４６２：２６－３９にて概説されている。
例えば、ＴＤＰ－４３のＡ３１５Ｔ変異型を過剰発現するトランスジェニックマウスは、約３～４ヵ月齢で進行性の異常を発症し、５ヵ月齢で死亡した。Ｗｅｇｏｒｚｅｗｓｋａ ｅｔ ａｌ．（２００９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１０６：１８８０９－８１４．異常はこれらの変異型マウスの脳と脊髄におけるＴＤＰ－４３Ｃ末端断片の存在と相関していたが、細胞質ＴＤＰ－４３凝集体は検出されなかった。これらの観察はＷｅｇｏｒｚｅｗｓｋａ ｅｔ ａｌがＴＤＰ－４３関連神経変性に対するニューロンの脆弱性は、毒性凝集ではなく、ＤＮＡ／ＲＮＡ結合タンパク質機能の変化に関連していることを示唆するように導いた。Ｗｅｇｏｒｚｅｗｓｋａ ｅｔ ａｌ．（２００９）、前出。対照的に、ＴＤＰ－４３の過剰発現を含む２つの独立した研究では、トランスジェニックマウスは細胞質凝集と相関する進行性運動機能障害を含む神経変性特質を示した。Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．（２０１０），Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０７：１６６１－１６７３及びＷｉｌｓ ｅｔ ａｌ．（２０１０），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１０７：３８５８－６３）．
機能喪失研究では、条件付きノックアウト突然変異を使用したＴＤＰ－４３の遍在的な欠失はマウスが代謝表現型と早死を示す原因となった。Ｃｈｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１０），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１０７：１６３２０－３２４．マウス胚性幹細胞におけるＴＤＰ－４３の枯渇は、特定の遺伝子の隠れエクソンのｍＲＮＡへのスプライシング、ｍＲＮＡの翻訳の妨害、非センスが介在するｍＲＮＡ分解の促進をもたらした。Ｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１５），Ｓｃｉｅｎｃｅ，３４９：６５０－６５５．ＡＬＳ／ＦＴＤ患者の死後の脳組織は隠れエクソンスプライシングの抑制障害を示すので、この研究は、ＴＤＰ－４３が通常、隠れエクソンのスプライシングを抑制し、イントロンの完全性を維持するように作用し、ＴＤＰ－４３スプライシング欠陥が特定の神経変性疾患におけるＴＤＰ－４３タンパク症に寄与してもよいことを示唆している。Ｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１５）、前出。ＴＤＰ－４３のＮ末端（例えば、ＮＬＳ）の点突然変異は、核におけるＴＤＰ－４３オリゴマー化の不安定化と隠れスプライシング調節の喪失をもたらすので、Ｎ末端によって駆動されるＴＤＰ－４３の頭部から尾部へのオリゴマー化は、凝集しやすいＣ末端ドメイン（例えば、ＰＬＤ）を分離するように作用し、したがって、病的凝集体の形成を防ぐことが仮定される。Ａｆｒｏｚ ｅｔ ａｌ．（２０１７），Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，８：４５．
ＡＬＳでは、最初に現れる病的特徴の１つは軸索が神経筋接合部から収縮し、筋肉が脱神経されることである。この脱神経は進行し続け、運動ニューロン細胞体の喪失と筋萎縮をもたらす。脱神経は、軸索神経支配のシナプス前マーカー：ＶＡＣｈＴ、シナプス小胞タンパク質２（ＳＶ２）、シナプトフィジン、及びニューロフィラメントの喪失によって観察されてもよい。運動終板は残るが、最終的には断片化し、消失する。最近、疾患に関連する突然変異を含むノックインＴＡＲＤＢＰ遺伝子がホモ接合性であるマウスにて用量依存的な脱神経が示された。Ｅｂｓｔｅｉｎ，（２０１９），Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，２６：３６４－３７３．
ＴＤＰ－４３枯渇の胚性致死にもかかわらず、本発明者らはここに機能的構造ドメインを欠くＴＤＰ－４３変異型を発現する胚性幹（ＥＳ）細胞が生存し続け、運動ニューロン（ＥＳＭＮ）に分化してもよいことを示す。図４～５を参照のこと。これらの観察は、本明細書に記載されているようなＥＳまたはＥＳＭＮが以下の変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドを発現するという点で独特である：
（１）機能的構造ドメインを欠く、例えば、機能的ＮＬＳを欠く、機能的ＲＲＭ１を欠く、機能的ＲＲＭ２を欠く、機能的Ｅを欠く、または機能的ＰＬＤを欠く、且つ
（２）内在性転写プロモーター及びプレｍＲＮＡスプライシングシグナルから正常レベルで発現される。例えば、図２及び図９を参照のこと。
本明細書に記載されているＥＳ及びＥＳＭＮを使用して、ＲＲＭ１がＥＳ細胞及びそれに由来する運動ニューロンの生存に必要であることが示されている。図４～５を参照のこと。さらに、（１）機能的ＮＬＳまたは機能的ＰＬＤを欠く、且つ（２）内在性遺伝子座からの正常レベルでの変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドの発現はＥＳＭＮにおけるＡＬＳ疾患の２つの特徴：
（ｉ）核から細胞質へのＴＤＰ－４３の再分布、及び
（ｉｉ）細胞質封入体への蓄積を再現する。図６～８を参照のこと。
ΔＰＬＤ変異型、すなわち機能的なＮＬＳを含むが、ＰＬＤを欠くＴＤＰ－４３ポリペプチドが細胞質にて凝集することは驚くべきことである。例えば、Ａｆｒｏｚ ｅｔ ａｌ．（２０１７）、前出を参照のこと。特に、ΔＰＬＤ変異型によって形成された点状の封入体は、ΔＮＬＳ変異型、すなわち機能的なＮＬＳを欠き、ＰＬＤを含むＴＤＰ－４３ポリペプチドによって形成された封入体よりも豊富ではなく、質的に異なると思われる。さらに、ΔＰＬＤまたはΔＮＬＳを発現するＥＳＭＮのＡＬＳ様表現型は、スプライス事象は通常野生型ＴＤＰ－４３によって調節される、遺伝子の隠れエクソンスプライシングの抑制の減少と相関する。図９。示されているのはまた、ＥＳＭＮにおけるΔＰＬＤまたはΔＮＬＳの変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子の発現と、ＰＬＤドメイン、またはその一部及び終止コドンをコードする配列を欠く選択的スプライシングを受けたＴＤＰ－４３のｍＲＮＡをもたらす３’非翻訳領域イントロンが関与する選択的スプライシング事象の減少との間にて相関関係である。図１０；Ａｖｅｎｄａｎｏ－Ｖａｚｑｕｅｚ ｅｔ ａｌ．（２０１２），Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ．２６：１６７９－８４；Ａｙａｌａ，ＹＭ．ｅｔ ａｌ．（２０１１），ＥＭＢＯ Ｊ．３０：２７７－２８８も参照のこと。この後者の観察は、正常なスプライス事象に起因する野生型またはＡＬＳ関連の配列のみを枯渇させることが、ＰＬＤ突然変異に関連するＡＬＳの治療に治療上役立ってもよいことを示唆している。
内在性遺伝子座から野生型ＴＡＲＤＢＰ遺伝子及びΔＰＬＤまたはΔＮＬＳの変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子を発現しているマウスもＴＤＰ－４３タンパク症の特徴を示した。野生型タンパク質のみしか発現していない動物と比べて核から細胞質へのＴＤＰ－４３の誤った局在、細胞質ＴＤＰ－４３のリン酸化、及びＴＤＰ－４３の細胞質凝集の増加が、変異型ΔＰＬＤまたはΔＮＬＳのＴＤＰ－４３ポリペプチドを発現している動物の脊髄運動ニューロンで観察された（図１３Ａ～１３Ｂ、及び１４）。機能的なＮＬＳを欠くＴＤＰ－４３変異型は不溶性だったが、ＰＬＤを欠くＴＤＰ－４３変異型は不溶性ではなかった（図１３Ｃ）。さらに、変異型ΔＰＬＤまたはΔＮＬＳのＴＤＰ－４３タンパク質を発現しているこれらのマウスでは、主に速筋線維で構成される筋肉の脱神経が観察されたが、主に遅筋線維で構成される筋肉の脱神経は観察されなかった（図１５Ａ～Ｂ）。
本明細書で提供されている発見は、生存可能な胚性幹（ＥＳ）細胞、及びそれに由来する組織及び非ヒト動物（例えば、それに由来する原始外胚葉、運動ニューロン（ＥＳＭＮ））におけるＴＤＰ－４３突然変異を評価する方法だけでなく、機能的構造ドメインを欠く変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドを発現するＥＳ細胞、ＥＳＭＮ細胞、及び非ヒト動物も提供する。機能的構造ドメインを欠く変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドを発現しているＥＳ細胞、ＥＳＭＮ細胞、非ヒト動物（例、齧歯類、例、ラット及びマウス）は、それぞれＴＤＰ－４３タンパク症の試験管内または生体内のモデルとして、例えば、そのための治療候補を特定する方法にて使用されてもよい。
ＴＡＲＤＢＰ遺伝子及びＴＤＰ－４３ポリペプチド
ＴＡＲＤＢＰ遺伝子は、ＴＡＲＤＮＡ結合タンパク質、ＴＡＲＤＢＰ、４３－ＫＤ、及びＴＤＰ４３、及びＴＤＰ－４３とも呼ばれるＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする。さまざまな種の野生型ＴＡＲＤＢＰ遺伝子の核酸配列及びそれからコードされる野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドは当該技術分野で周知である。例えば、野生型ＴＡＲＤＢＰ遺伝子及び野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドのそれぞれの核酸及びアミノ酸の配列は、米国国立医学図書館（ＮＩＨ）国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）遺伝子データベースで見いだされてもよい。例えば、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖｅ／ｇｅｎｅ／？ｔｅｒｍ＝ＴＡＲＤＢＰのウェブサイトを参照のこと。いくつかの実施形態では、野生型マウスのＴＡＲＤＢＰ遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿６６３５３１（配列番号１）として示されるアミノ酸配列を含む野生型マウスＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、または保存的なアミノ酸置換のためにそれとは異なるその変異体を含む。いくつかの実施形態では、野生型マウスＴＡＲＤＢＰ遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿１４５５５６．４（配列番号２）として示される核酸配列を含み、または遺伝子コードの縮重及び／または保存的なコドン置換のためにそれとは異なるその変異体を含む。いくつかの実施形態では、野生型ラットＴＡＲＤＢＰ遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿００１０１１９７９（配列番号３）として示されるアミノ酸配列を含む野生型ラットＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、または保存的なアミノ酸置換のためにそれとは異なるその変異体を含む。いくつかの実施形態では、野生型ラットＴＡＲＤＢＰ遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００１０１１９７９．２（配列番号４）として示される核酸配列を含み、または遺伝子コードの縮重及び／または保存的なコドン置換のためにそれとは異なるその変異体を含む。いくつかの実施形態では、野生型ヒトＴＡＲＤＢＰ遺伝子はＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０３１４０１．１（配列番号５）として示されるアミノ酸、または保存的アミノ酸置換のためにそれとは異なるその変異体を含むＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、野生型ヒトＴＡＲＤＢＰ遺伝子はＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００７３７５．３（配列番号６）として示される核酸配列、または遺伝子コードの縮重及び／または保存的なコドン置換のためにそれとは異なるその変異体を含む。
本明細書に記載されているのは変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子である。変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子はノックアウト突然変異を含んでもよい。変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子は、変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードしてもよく、その際、変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドは機能的構造ドメインを欠いている。例えば、変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子は、点突然変異、構造ドメインの一部または全部の範囲内での挿入、及び／または一部または全部の欠失を含むＴＤＰ－４３構造ドメインをコードするヌクレオチド配列を含んでもよく、その際、点突然変異、挿入、及び／または欠失は、構造ドメインの機能喪失をもたらし、且つ、突然変異のために機能的構造ドメインを欠く変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドにもかかわらず、変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子は依然としてＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする。ポリペプチドは変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドと呼ばれてもよく、その際、それは少なくとも１つの野生型ＴＤＰ－４３構造ドメインまたはその変異体を含む、及び／またはそれは抗ＴＤＰ－４３抗体またはその抗原結合部分によって特異的に結合される。同様に、変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子は、変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子が変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチド、例えば、少なくとも１つの野生型ＴＤＰ－４３構造ドメインまたはその変異体を含む、及び／または抗ＴＤＰ－４３抗体またはその抗原結合部分によって特異的に結合されてもよいポリペプチドをコードするように分類されてもよい。
ＴＤＰ－４３構造ドメインは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、２つのＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲＭ１及びＲＲＭ２）、推定核外輸送シグナル（Ｅ）、及びグリシンに富むプリオン様ドメイン（ＰＬＤ）として特定されている。図１及び２を参照のこと。野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドは、アミノ酸８２～９９にてＴＤＰ－４３のＮＬＳ、アミノ酸１０６～１７６にてＴＤＰ－４３のＲＲＭ１、アミノ酸１９１～２６２にてＴＤＰ－４３のＲＲＭ２、アミノ酸２３９～２４８にてＴＤＰ－４３のＥ、及びアミノ酸２７４～４１４にてＴＤＰ－４３のＰＬＤを含む。
従来のＮＬＳ配列は、塩基性アミノ酸の区間、主にリジン（Ｋ）及びアルギニン（Ｒ）残基を含み、二分割ＮＬＳは、約１０～１３のアミノ酸を含むリンカー領域によって分離されたこれらの塩基性アミノ酸の２つのクラスターを含む。従来のＮＬＳの塩基性アミノ酸配列のアミノ酸の置換及び／または欠失は従来のＮＬＳの機能を無効にしてもよい。ＭｃＬａｎｅ ａｎｄ Ｃｏｒｂｅｔｔ，（２００９），ＩＵＢＭＢ Ｌｉｆｅ，６１：６９７－７０６． ＴＤＰ－４３のＮＬＳは、８２、８３、８４、９５、９７、及び９８位にてリジン残基及びアルギニン残基を含む。８２、８３、８４、９５、９７、及び／または９８位にてアミノ酸の置換及び／または欠失を含むように修飾された野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドは機能的ＮＬＳを欠いてもよい。機能的ＮＬＳを欠く変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドは、８２、８３、８４、９５、９７、及び／または９８位にてアミノ酸の置換及び／または欠失を含むように修飾された配列番号１に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。機能的ＮＬＳを欠く変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドは、８２、８３、８４、９５、９７、及び／または９８位にてアミノ酸の置換及び／または欠失を含むように修飾された配列番号３に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。機能的ＮＬＳを欠く変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドは、８２、８３、８４、９５、９７、及び／または９８位にてアミノ酸の置換及び／または欠失を含むように修飾された配列番号５に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。したがって、機能的ＴＤＰ－４３のＮＬＳを欠く変異型ＴＤＰ－４３タンパク質をコードする変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子は、（ｉ）８２、８３、８４、９５、９７、及び／または９８及びそれらの組み合わせから成る群から選択される位置にてアミノ酸置換を、及び／または（ｉｉ）８２位と９８位での及びその間のアミノ酸の欠失を含むように修飾された配列番号１、配列番号３または配列番号５として示される配列を含むＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする配列を含んでもよい。機能的なＴＤＰ－４３のＮＬＳを欠く変異型ＴＤＰ－４３タンパク質をコードする変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子は、Ｋ８２Ａ Ｋ８３Ａ、Ｒ８４Ａ、Ｋ９５Ａ、Ｋ９７Ａ、Ｋ９８Ａまたはそれらの組み合わせから成る群から選択されるアミノ酸置換を含むように修飾された配列番号１、配列番号３または配列番号５として示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。機能的なＴＤＰ－４３のＮＬＳを欠く変異型ＴＤＰ－４３タンパク質をコードする変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子は、以下のアミノ酸置換：Ｋ８２Ａ Ｋ８３Ａ、Ｒ８４Ａ、Ｋ９５Ａ、Ｋ９７Ａ、及びＫ９８Ａを含むように修飾された配列番号１、配列番号３または配列番号５として示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。
典型的なＲＲＭによるＲＮＡ結合はふつう、典型的なＲＲＭの４本鎖逆平行βシートの表面と一本鎖ＲＮＡとの間で行われる接触によって達成される。Ｍｅｌａｍｅｄ ｅｔ ａｌ．（２０１３），ＲＮＡ，１９：１５３７－１５５１．中央の２つのβ鎖における２つの高度に保存されたモチーフ、ＲＮＰ１（コンセンサスＫ／Ｒ－Ｇ－Ｆ／Ｙ－Ｇ／Ａ－Ｆ／Ｙ－Ｖ／Ｉ／Ｌ－Ｘ－Ｆ／Ｙ、Ｘは任意のアミノ酸）とＲＮＰ２（コンセンサスＩ／Ｖ／Ｌ－Ｆ／Ｙ－Ｉ／Ｖ／Ｌ－Ｘ－Ｎ－Ｌ、Ｘは任意のアミノ酸）はＲＮＡ結合の主要なメディエーターである。Ｍｅｌａｍｅｄ ｅｔ ａｌ．（２０１３）、前出。
野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドのアミノ酸１０６位～１７６位に位置するＴＤＰ－４３のＲＲＭ１は、アミノ酸１０６位～１１１位に位置するＲＮＰ２コンセンサス配列（ＬＩＶＬＧＬ；配列番号７）及びアミノ酸１４５位～１５２位に位置するＲＮＰ１コンセンサス配列（ＫＧＦＧＦＶＲＦ；配列番号８）を含む。以前、Ｗ１１３、Ｔ１１５、Ｆ１４７、Ｆ１４９、Ｄ１６９、Ｒ１７１、及びＮ１７９は核酸結合の重要な残基として特定された。（ｉ）１１３、１１５、１４７、１４９、１６９、１７１、１７９及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される位置でのアミノ酸置換、（ｉｉ）１０６～１７６位にて及びその間での任意のアミノ酸の欠失または置換、（ｉｉｉ）１０６～１１１位にて及びその間の任意のアミノ酸の欠失または置換、（ｉｖ）１４５～１５２位にて及びその間の任意のアミノ酸の欠失または置換、または（ｖ）（ｉ）～（ｉｖ）の任意の組み合わせを含むように修飾された野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドは機能的なＲＲＭ１を欠いてもよい。機能的なＲＲＭ１を欠く変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドは、（ｉ）１１３、１１５、１４７、１４９、１６９、１７１、１７９及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される位置でのアミノ酸置換、（ｉｉ）１０６～１７６位にて及びその間での任意のアミノ酸の欠失または置換、（ｉｉｉ）１０６～１１１位にて及びその間の任意のアミノ酸の欠失または置換、（ｉｖ）１４５～１５２位にて及びその間の任意のアミノ酸の欠失または置換、または（ｖ）（ｉ）～（ｉｖ）の任意の組み合わせを含むように修飾された配列番号１として示される配列を含んでもよい。機能的なＲＲＭ１を欠く変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドは、（ｉ）１１３、１１５、１４７、１４９、１６９、１７１、１７９及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される位置でのアミノ酸置換、（ｉｉ）１０６～１７６位にて及びその間での任意のアミノ酸の欠失または置換、（ｉｉｉ）１０６～１１１位にて及びその間の任意のアミノ酸の欠失または置換、（ｉｖ）１４５～１５２位にて及びその間の任意のアミノ酸の欠失または置換、または（ｖ）（ｉ）～（ｉｖ）の任意の組み合わせを含むように修飾された配列番号３として示される配列を含んでもよい。機能的なＲＲＭ１を欠く変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドは、（ｉ）１１３、１１５、１４７、１４９、１６９、１７１、１７９及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される位置でのアミノ酸置換、（ｉｉ）１０６～１７６位にて及びその間での任意のアミノ酸の欠失または置換、（ｉｉｉ）１０６～１１１位にて及びその間の任意のアミノ酸の欠失または置換、（ｉｖ）１４５～１５２位にて及びその間の任意のアミノ酸の欠失または置換、または（ｖ）（ｉ）～（ｉｖ）の任意の組み合わせを含むように修飾された配列番号５として示される配列を含んでもよい。したがって、機能的なＲＲＭ１を欠く変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子は、（ｉ）１１３、１１５、１４７、１４９、１６９、１７１、１７９及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される位置でのアミノ酸置換、（ｉｉ）１０６～１７６位にて及びその間での任意のアミノ酸の欠失または置換、（ｉｉｉ）１０６～１１１位にて及びその間の任意のアミノ酸の欠失または置換、（ｉｖ）１４５～１５２位にて及びその間の任意のアミノ酸の欠失または置換、または（ｖ）（ｉ）～（ｉｖ）の任意の組み合わせを含むように修飾された配列番号１、配列番号３、または配列番号５として示されるアミノ酸配列を含むＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。機能的ＲＲＭ１を欠く変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子は、Ｆ１４７Ｌ及び／またはＦ１４９Ｌの突然変異を含むように修飾された配列番号１、配列番号３、または配列番号５として示されるアミノ酸配列を含むＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。機能的ＲＲＭ１を欠く変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子は、以下のアミノ酸置換 Ｆ１４７Ｌ及び／またはＦ１４９Ｌを含むように修飾された配列番号１、配列番号３、または配列番号５として示されるアミノ酸配列を含むＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。
野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドのアミノ酸１９１位～２６２位に位置するＴＤＰ－４３のＲＲＭ２は、アミノ酸１９３位～１９８位に位置するＲＮＰ２コンセンサス配列（ＶＦＶＧＲＣ；配列番号９）及びアミノ酸２２７位～２３３位に位置するＲＮＰ１コンセンサス配列（ＲＡＦＡＦＶＴ；配列番号１０）を含む。Ｆ１９４及びＦ２２９は核酸結合の重要な残基と見なされてもよい。（ｉ）１９４及び／または２２９から成る群から選択される位置でのアミノ酸置換、（ｉｉ）１９３～１９８位にて及びその間での任意のアミノ酸の欠失または置換、（ｉｉｉ）２２７～２３３位にて及びその間の任意のアミノ酸の欠失または置換、（ｉｖ）１９１～２６２位にて及びその間の任意のアミノ酸の欠失または置換、または（ｖ）（ｉ）～（ｉｖ）の任意の組み合わせを含むように修飾された野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドは機能的なＲＲＭ２を欠いてもよい。機能的なＲＲＭ２を欠く変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドは、（ｉ）１９４及び／または２２９から成る群から選択される位置でのアミノ酸置換、（ｉｉ）１９３～１９８位にて及びその間での任意のアミノ酸の欠失または置換、（ｉｉｉ）２２７～２３３位にて及びその間の任意のアミノ酸の欠失または置換、（ｉｖ）１９１～２６２位にて及びその間の任意のアミノ酸の欠失または置換、または（ｖ）（ｉ）～（ｉｖ）の任意の組み合わせを含むように修飾された配列番号１として示される配列を含んでもよい。機能的なＲＲＭ２を欠く変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドは、（ｉ）１９４及び／または２２９から成る群から選択される位置でのアミノ酸置換、（ｉｉ）１９３～１９８位にて及びその間での任意のアミノ酸の欠失または置換、（ｉｉｉ）２２７～２３３位にて及びその間の任意のアミノ酸の欠失または置換、（ｉｖ）１９１～２６２位にて及びその間の任意のアミノ酸の欠失または置換、または（ｖ）（ｉ）～（ｉｖ）の任意の組み合わせを含むように修飾された配列番号３として示される配列を含んでもよい。機能的なＲＲＭ２を欠く変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドは、（ｉ）１９４及び／または２２９から成る群から選択される位置でのアミノ酸置換、（ｉｉ）１９３～１９８位にて及びその間での任意のアミノ酸の欠失または置換、（ｉｉｉ）２２７～２３３位にて及びその間の任意のアミノ酸の欠失または置換、（ｉｖ）１９１～２６２位にて及びその間の任意のアミノ酸の欠失または置換、または（ｖ）（ｉ）～（ｉｖ）の任意の組み合わせを含むように修飾された配列番号５として示される配列を含んでもよい。したがって、機能的ＲＲＭ２を欠く変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子は、（ｉ）野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドの１９４位及び／または２２９位でのアミノ酸置換、（ｉｉ）１９１位～２６２位でのまたはその間での任意のアミノ酸の欠失または置換、または（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の双方を含むように修飾された配列番号１、配列番号３、または配列番号５として示されるアミノ酸配列を含むＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。機能的ＲＲＭ２を欠く変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子は、Ｆ１９４Ｌ及び／またはＦ２２９Ｌの突然変異を含むように修飾された配列番号１、配列番号３、または配列番号５として示されるアミノ酸配列を含むＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。機能的ＲＲＭ２を欠く変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子は、Ｆ１９４Ｌ及びＦ２２９Ｌの突然変異を含むように修飾された配列番号１、配列番号３、または配列番号５として示されるアミノ酸配列を含むＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。
野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドの核外輸送シグナルはアミノ酸２３９位～２４８位に位置してもよい。機能的な核外輸送シグナルを欠く変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドは、２３６～２５１位にて及びその間で任意のアミノ酸の欠失を含むように修飾された配列番号１として示されるアミノ酸配列を含んでもよい。核外輸送シグナルを欠く変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドは、少なくともアミノ酸２３９～２５０の欠失を含むように修飾された配列番号１として示されるアミノ酸配列を含んでもよい。核外輸送シグナルを欠く変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドは、２３６位～２５１位にて及びその間で任意のアミノ酸の欠失を含むように修飾された配列番号３として示されるアミノ酸配列を含んでもよい。核外輸送シグナルを欠く変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドは、少なくともアミノ酸２３９～２５０の欠失を含むように修飾された配列番号３として示されるアミノ酸配列を含んでもよい。核外輸送シグナルを欠く変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドは、２３６～２５１位にて及びその間で任意のアミノ酸の欠失を含むように修飾された配列番号５として示されるアミノ酸配列を含んでもよい。核外輸送シグナルを欠く変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドは、少なくともアミノ酸２３９～２５０の欠失を含むように修飾された配列番号５として示されるアミノ酸配列を含んでもよい。したがって、機能的な核外輸送シグナルを欠く変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子は、２３６～２５１にて及びその間でアミノ酸の欠失、例えば、２３９～２５０にて及びその間でアミノ酸の欠失を含むように修飾された配列番号１、配列番号３、または配列番号５として示されるアミノ酸配列を含むＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。
野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドのプリオン様ドメイン（ＰＬＤ）はアミノ酸２７４～４１４に位置してもよい。機能的ＰＬＤを欠く変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドは、２７４～４１４位にて及びその間で少なくとも１つまたはすべてのアミノ酸の欠失を含むように修飾された配列番号１として示されるアミノ酸配列を含んでもよい。機能的ＰＬＤを欠く変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドは、２７４～４１４位にて及びその間で少なくとも１つまたはすべてのアミノ酸の欠失を含むように修飾された配列番号３として示されるアミノ酸配列を含んでもよい。機能的ＰＬＤを欠く変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドは、２７４～４１４位にて及びその間で少なくとも１つまたはすべてのアミノ酸の欠失を含むように修飾された配列番号５として示されるアミノ酸配列を含んでもよい。したがって、変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子は、２７４～４１４位にて及びその間で少なくとも１つまたはすべてのアミノ酸の欠失を含むように修飾された配列番号１、配列番号３、または配列番号５として示されるアミノ酸配列を含むＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。
変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子は図３Ａに示す構造を含んでもよい。変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子は図３Ａに示す変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードしてもよい。
変異型ＴＡＲＤＢＰ遺伝子を含み、発現する細胞及び非ヒト動物の作製方法
上記で概説したように、例えば、変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子を含む細胞を作製するために、及び／またはＴＤＰ－４３構造ドメインの生物学的機能を評価するために、ＴＡＲＤＢＰ遺伝子座の標的遺伝子操作を可能にする方法及び組成物が本明細書で提供されている。さらに、追加の標的遺伝子操作を行うことができることが認識されている。これらの標的遺伝子操作を可能にするそのようなシステムは、種々の構成要素を採用することができ、参照を容易にするために、本明細書では、「標的ゲノム統合システム」という用語は一般的に、統合事象に必要なすべての構成要素（すなわち、種々のヌクレアーゼ剤、認識部位、挿入ＤＮＡポリヌクレオチド、標的指向化ベクター、標的ゲノム遺伝子座等）を含む。
変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドを発現する非ヒト動物細胞を作製する方法及び／またはＴＤＰ－４３構造ドメインの生物学的機能を評価するための方法は、変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子を含むように細胞のゲノムを操作することを含んでもよい。変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子は変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードしてもよく、その際、変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドは機能的構造ドメインを欠く。
変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドを発現する非ヒト動物細胞を作製する方法及び／またはＴＤＰ－４３構造ドメインの生物学的機能を評価するための方法は、変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子を含むように細胞のゲノムを操作することを含んでもよく、その際、変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子はノックアウト突然変異を含む。
本明細書で提供されている方法は、標的ゲノム統合システムの種々の構成要素を含む１以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチド構築物を細胞に導入することを含む。「導入すること」は、配列が細胞の内部にアクセスできるように配列（ポリペプチドまたはポリヌクレオチド）を細胞に提示することを意味する。本明細書で提供されている方法は、標的ゲノム統合システムの任意の構成要素を細胞に導入するための特定の方法に依存せず、ポリヌクレオチドが少なくとも１つの細胞の内部にアクセスできるということだけある。ポリヌクレオチドを種々の細胞型に導入する方法は当該技術分野で既知であり、安定的形質移入法、一過性形質移入法、及びウイルスが介在する方法が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、方法及び組成物で採用される細胞はそれらのゲノムに安定して組み込まれるＤＮＡ構築物を有する。「安定して組み込まれる」または「安定して導入される」とは、ヌクレオチド配列が細胞のゲノムに組み込まれ、その子孫によって受け継がれることができるように、ポリヌクレオチドを細胞に導入することを意味する。ＤＮＡ構築物または標的ゲノム統合システムの種々の構成要素の安定した組み込みに任意のプロトコールが使用されてもよい。
形質移入プロトコールならびにポリペプチドまたはポリヌクレオチの配列を細胞に導入するためのプロトコールはさまざまであってもよい。非限定的な形質移入法には、リポソーム；ナノ粒子；リン酸カルシウム（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．（１９７３）．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２（２）：４５６－６７，Ｂａｃｃｈｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．（１９７７），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．７４（４）：１５９０－４ ａｎｄ，Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｍ（１９９１）．Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ．ｐｐ．９６－９７）；デンドリマー；またはＤＥＡＥデキストランもしくはポリエチレンイミンのようなカチオンポリマーの使用を含む化学系の形質移入法が挙げられる。非化学的方法には、電気穿孔法、ソノポレーション、及び光学形質移入が挙げられる。粒子に基づく形質移入には、遺伝子銃の使用、磁石支援形質移入が挙げられる（Ｂｅｒｔｒａｍ，Ｊ．（２００６），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，７，２７７－２８）。ウイルスによる方法も形質移入に使用することができる。
変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子を含む細胞は、本明細書で開示されている種々の方法を使用して生成することができる。操作することは、内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子を、変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子で置き換えること、及び／または内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子を、条件付きノックアウト突然変異のようなノックアウト突然変異を含むＴＡＲＤＢＰ遺伝子で置き換えることを含んでもよい。操作することは、ノックアウト突然変異を含むＴＡＲＤＢＰ遺伝子の発現を排除する条件で細胞を培養することを含んでもよい。ＴＡＲＤＢＰ遺伝子の発現を排除してもよい条件には、リコンビナーゼタンパク質、例えば、ｃｒｅ－リコンビナーゼの発現が含まれてもよい。
そのような操作方法は、（１）本明細書で開示されている方法を用いて非ヒト動物の多能性細胞の目的の標的ＴＡＲＤＢＰゲノム遺伝子座に変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子を組み込み、該標的ＴＡＲＤＢＰゲノム遺伝子座にて変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子を含む遺伝子操作された多能性細胞を生成することと；（２）標的ＴＡＲＤＢＰゲノム遺伝子座に変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子を有する遺伝子操作された多能性細胞を選択することとを含んでもよい。（３）遺伝子操作された多能性細胞を、例えば、桑実胚前の段階で非ヒト動物の宿主胚に導入することと；（４）遺伝子操作された多能性細胞を含む宿主胚を代理母に着床させて、遺伝子操作された多能性細胞に由来するＦ０世代を生成することとによってさらに動物が生成されてもよい。非ヒト動物は、非ヒト哺乳動物、齧歯類、マウス、ラット、ハムスター、サル、農業用哺乳動物または家畜、または魚または鳥であることができる。
多能性細胞は、ヒトＥＳ細胞、非ヒトＥＳ細胞、齧歯類ＥＳ細胞、マウスＥＳ細胞、ラットＥＳ細胞、ハムスターＥＳ細胞、サルＥＳ細胞、農業用哺乳類ＥＳ細胞、または家畜化された哺乳類ＥＳ細胞であることができる。他の実施形態では、多能性細胞は非ヒト細胞、哺乳類細胞、ヒト細胞、非ヒト哺乳類細胞、ヒト多能性細胞、ヒトＥＳ細胞、ヒト成人幹細胞、発達が制限されたヒト前駆細胞、ヒトｉＰＳ細胞、齧歯類細胞、ラット細胞、マウス細胞、ハムスター細胞である。一実施形態では、標的にされた遺伝子操作は変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子をもたらす。
マウス多能性細胞、全能性細胞、または宿主胚は、例えば、近交系、交雑系、及び非近交系を含む任意のマウス系統に由来することができる。マウス系統の例には、１２９系統、Ｃ５７ＢＬ系統（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６系統）、１２９とＣ５７ＢＬ／６の交雑（例えば、５０％１２９及び５０％Ｃ５７ＢＬ／６）、ＢＡＬＢ／ｃ系統、及びＳｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒ系統が挙げられる。１２９系統の例には、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例、１２９５１／ＳＶ、１２９５１／ＳｖＩｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９５９／ＳｖＥｖＨ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、及び１２９Ｔ２が挙げられる（例えば、Ｆｅｓｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９９），Ｒｅｖｉｓｅｄ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｆｏｒ ｓｔｒａｉｎ １２９ ｍｉｃｅ，Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｇｅｎｏｍｅ，１０：８３６を参照のこと）。Ｃ５７ＢＬ系統の例には、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、及びＣ５７ＢＬ／０１ａが挙げられる。マウスは、前述の１２９系統（例えば、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）系統）と前述のＣ５７ＢＬ／６系統の交雑、１以上の前述の１２９系統の交雑、または１以上の前述のＣ５７ＢＬ系統の交雑であることができる。マウスは１２９系統を除く系統に由来することもできる。
ラットの多能性細胞、全能性細胞、または宿主胚は、例えば、近交系、交雑系、及び非近交系を含む任意のラット系統に由来することができる。ラット系統の例には、ＡＣＩラット系統、Ｄａｒｋ Ａｇｏｕｔｉ（ＤＡ）ラット系統、Ｗｉｓｔａｒラット系統、ＬＥＡラット系統、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット系統、またはＦｉｓｈｅｒＦ３４４やＦｉｓｈｅｒＦ６のようなＦｉｓｃｈｅｒラット系統が挙げられる。ラットの多能性細胞、全能性細胞、または宿主胚はまた、上記の２以上の系統の交雑に由来する系統から得ることもできる。例えば、ラット多能性細胞、全能性細胞、または宿主胚はＤＡ系統及びＡＣＩ系統から選択される系統に由来することができる。ＡＣＩラット系統は白い腹と足、及びＲＴ１ａｖ１ハプロタイプと共に黒アグーチを有することを特徴とする。このような系統は、Ｈａｒｋａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓを含む種々の供給源から入手できる。ＡＣＩラット由来のラットＥＳ細胞株の例はＡＣＩ．Ｇ１ラットＥＳ細胞である。Ｄａｒｋ Ａｇｏｕｔｉ（ＤＡ）ラット系統は、アグーチ被毛とＲＴ１ａｖ１ハプロタイプを有することを特徴とする。そのようなラットは、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ及びＨａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓを含む種々の供給源から入手できる。ＤＡラット由来のラットＥＳ細胞株の例は、ＤＡ．２ＢラットＥＳ細胞株またはＤＡ．２ＣラットＥＳ細胞株である。ラット系統の他の例は、例えば、ＵＳ２０１４／０２３５９３３、ＵＳ２０１４／０３１０８２８、及びＵＳ２０１４／０３０９４８７に提供されており、それらのそれぞれは、すべての目的のためにその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
例えば、生殖細胞系列伝達性のラットＥＳ細胞は、Ｎ２サプリメント、Ｂ２７サプリメント、約５０Ｕ／ｍＬ～約１５０Ｕ／ｍＬの白血病抑制因子（ＬＩＦ）及びＭＥＫ阻害剤とＧＳＫ３阻害剤からなる阻害剤の組み合わせを含む培地にてフィーダー細胞層上で単離されたラットＥＳ細胞を培養することによって得ることができ、その際、フィーダー細胞層はＬＩＦを発現するように操作されておらず、ラットＥＳ細胞は：（ｉ）選択マーカーを含む異種ポリヌクレオチドのラットＥＳ細胞のゲノムへの少なくとも１回の挿入を含む標的遺伝子操作を含むように操作されており、生殖細胞系列を介して標的遺伝子操作を伝達することができ；（ｉｉ）正常な核型を有し；（ｉｉｉ）ｃ－Ｍｙｃの発現を欠き；且つ（ｉｖ）培養物中に球状の浮遊コロニーを形成する（例えば、それぞれが参照によってその全体が組み込まれる、ＵＳ ２０１４－０２３５９３３ Ａ１及びＵＳ ２０１４－０３１０８２８ Ａ１を参照のこと）。ラット胚性幹細胞の派生及び標的操作の他の例は、例えば、Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（”Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｒａｔ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅａｓｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－２ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｒａｔｓ，”Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．２１：７４３－７５５，２０１２）及びＫｗａｍａｔａ ａｎｄ Ｏｃｈｉｙａ（”Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｒａｔｓ ｆｒｏｍ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１０７（３２）：１４２２３－１４２２８，２０１０）に提供されている。
核移植技術も非ヒト動物を生成するのに使用することができる。簡単に言えば、核移植の方法には、（１）卵母細胞を除核すること；（２）脱核した卵母細胞と結合するドナー細胞または核を単離すること；（３）細胞または核を脱核した卵母細胞に挿入して再構成された細胞を形成すること；（４）再構成された細胞を動物の子宮に移植して胚を形成すること；及び（５）胚の発生を可能にすることという工程が含まれる。そのような方法では、卵母細胞は一般に死亡した動物から採取されるが、生きている動物の卵管及び／または卵巣からも分離されてもよい。卵母細胞は、除核の前に当業者に知られている種々の培地で成熟させることができる。卵母細胞の除核は当業者に周知の多くの方法で実施することができる。脱核した卵母細胞にドナーの細胞または核を挿入して再構成細胞を形成することはふつう、融合前に透明帯の下にドナー細胞を微量注入することによる。融合は、接触／融合面を横切るＤＣ電気パルスの印加（電気融合）によって、ポリエチレングリコールのような融合促進化学物質への細胞の曝露によって、またはセンダイウイルスのような不活化ウイルスによって誘導されてもよい。再構成された細胞は通常、核ドナー及びレシピエント卵母細胞の融合の前に、最中に、及び／または後に電気的及び／または非電気的手段によって活性化される。活性化の方法には、電気パルス、化学的に誘導されるショック、精子による侵入、卵母細胞における二価カチオンのレベルの上昇、及び卵母細胞における細胞タンパク質のリン酸化の減少（キナーゼ阻害剤による）が挙げられる。活性化された再構成された細胞、または胚は通常、当業者に周知の培地で培養され、次いで、動物の子宮に移される。例えば、ＵＳ２００８００９２２４９、ＷＯ／１９９９／００５２６６Ａ２、ＵＳ２００４０１７７３９０、ＷＯ／２００８／０１７２３４Ａ１、及び米国特許第７，６１２，２５０号を参照のこと、これらのそれぞれは参照によって本明細書に組み込まれる。
（ａ）本明細書に記載されている種々の方法を用いて原核細胞にて非ヒト動物の標的ゲノムＴＡＲＤＢＰ遺伝子座を操作することと；（ｂ）標的ゲノム遺伝子座にて遺伝子操作を含む操作された原核細胞を選択することと；（ｃ）操作された原核細胞のゲノムから遺伝子操作された標的指向化ベクターを単離することと；（ｄ）非ヒト動物の多能性細胞に遺伝子操作された標的指向化ベクターを導入して、標的ＴＡＲＤＢＰゲノム遺伝子座に挿入核酸を含む遺伝子操作された多能性細胞を生成することと；（ｅ）遺伝子操作された多能性細胞を選択することと；（ｆ）桑実胚前の段階で、遺伝子操作された多能性細胞を非ヒト動物の宿主胚に導入することと；（ｇ）遺伝子操作された多能性細胞を含む宿主胚を代理母に移植して、遺伝子操作された多能性細胞に由来するＦ０世代を生成することとを含む、生殖細胞系列に本明細書に記載されている１以上の遺伝子操作を含む非ヒト動物を作製するための他の方法が提供される。そのような方法では、標的指向化ベクターは大きな標的指向化ベクターを含むことができる。非ヒト動物は、非ヒト哺乳動物、齧歯類、マウス、ラット、ハムスター、サル、農業用哺乳動物または家畜哺乳動物であることができる。多能性細胞は、ヒトＥＳ細胞、非ヒトＥＳ細胞、齧歯類ＥＳ細胞、マウスＥＳ細胞、ラットＥＳ細胞、ハムスターＥＳ細胞、サルＥＳ細胞、農業用哺乳類ＥＳ細胞、または家畜哺乳類ＥＳ細胞であることができる。他の実施形態では、多能性細胞は、非ヒト細胞、哺乳類細胞、ヒト細胞、非ヒト哺乳類細胞、ヒト多能性細胞、ヒトＥＳ細胞、ヒト成人幹細胞、発達が制限されたヒト前駆細胞、ヒトｉＰＳ細胞、ヒト細胞、齧歯類細胞、ラット細胞、マウス細胞、ハムスター細胞である。一実施形態では、標的にされた遺伝子操作は、変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子、例えば、機能的構造ドメインを欠く変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子及び／またはノックアウト突然変異を含む変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子をもたらす。
さらなる方法では、単離工程（ｃ）は、（ｃ１）遺伝子操作された標的指向化ベクター（すなわち、遺伝子操作されたＬＴＶＥＣ）を線形化することをさらに含む。その上さらなる実施形態では、導入工程（ｄ）はさらに、（ｄ１）多能性細胞にヌクレアーゼ剤を導入して相同組換えを促進することを含む。一実施形態では、選択工程（ｂ）及び／または（ｅ）は、本明細書に記載されているように選択可能な薬剤を原核細胞または多能性細胞に適用することによって実行される。一実施形態では、選択工程（ｂ）及び／または（ｅ）は、本明細書に記載されているような対立遺伝子操作（ＭＯＡ）アッセイを介して実行される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている標的ゲノム遺伝子座の種々の遺伝子操作は、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）遺伝子工学技術（例えば、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第６，５８６，２５１号及びＶａｌｅｎｚｕｅｌａ， Ｄ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２００３）、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２１（６）：６５２－６５９を参照のこと）を用いた細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＤＮＡに由来するＬＴＶＥＣを用いた細菌細胞における一連の相同組換え反応（ＢＨＲ）によって実行することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているような種々の遺伝子操作を含む標的にされた多能性細胞及び／または全能性細胞は、挿入ドナー細胞として使用され、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法（例えば、すべて参照によってその全体が本明細書に組み込まれるＵＳ７，５７６，２５９、ＵＳ７，６５９，４４２、ＵＳ７，２９４，７５４、及びＵＳ２００８－００７８０００Ａ１を参照のこと）を介して対応する生物、例えば、８細胞期マウス胚から前桑実胚期に導入される。遺伝子操作された多能性細胞及び／または全能性細胞を含む非ヒト動物胚は胚盤胞期までインキュベートし、次に代理母に着床させてＦ０世代を生成する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているような種々の遺伝子操作を含む標的にされた哺乳動物ＥＳ細胞は胚盤胞期胚に導入される。遺伝子操作されたゲノム遺伝子座（すなわち、ＴＡＲＤＢＰ遺伝子座）を持つ非ヒト動物は、本明細書に記載されているような対立遺伝子の操作（ＭＯＡ）アッセイを介して特定することができる。遺伝子操作された多能性及び／または全能性細胞に由来する得られたＦ０世代の非ヒト動物を野生型の非ヒト動物と交配してＦ１世代の子孫を得る。特定のプライマー及び／またはプローブによる遺伝子型決定に続いて、遺伝子操作されたゲノム遺伝子座についてヘテロ接合性であるＦ１非ヒト動物を互いに交配して、遺伝子操作されたゲノム遺伝子座についてホモ接合性であるＦ２世代の非ヒト動物の子孫を作り出す。
一実施形態では、変異させたＴＲＡＤＢＰ遺伝子を含む細胞を作製する方法が提供される。（ａ）多能性細胞を、変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子または５’及び３’の相同性アームに隣接するその変異させた部分を含む標的指向化構築物と接触させることを含むそのような方法；その際、標的指向化構築物は、細胞のゲノム内のＴＡＲＤＢＰ遺伝子座との相同組換えを受けて操作された多能性細胞を形成する。非ヒト動物を作製する方法はさらに、（ｂ）操作された多能性細胞を宿主胚に導入することと；（ｃ）代理母にて宿主胚を妊娠させることとを含み、その際、代理母は操作されたＴＡＲＤＢＰ遺伝子座を含む子孫を生み出し、前記遺伝子操作は、機能的構造ドメインを欠く変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをもたらす。
いくつかの実施形態では、変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子を含む細胞は、変異させたＴＡＲＤＢ遺伝子を含むようにＥＳ細胞を操作し、分化培地にてＥＳ細胞を試験管内で培養することによって作製されてもよい。いくつかの実施形態では、ＥＳ細胞を試験管内で培養することは、ＥＳ細胞を原始外胚葉細胞または胚性幹細胞由来運動ニューロン（ＥＳＭＮ）に分化させることを含む。
細胞及び動物
本明細書で開示されている細胞（非ヒト動物組織または非ヒト動物内に含まれてもよい）は、本明細書で開示されているような変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子を含む任意の種類の細胞であってもよい。細胞は、変異させた非ヒト動物のＴＡＲＤＢＰ遺伝子（例えば、非ヒト動物の変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子）または変異させたヒトＴＡＲＤＢＰ遺伝子を含んでもよい。
細胞は、変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子を含んでもよく、その際、変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドは機能的構造ドメインを欠き、細胞は変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドを発現する。例えば、細胞は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、ＲＮＡ認識モチーフ１（ＲＲＭ１）、ＲＮＡ認識モチーフ２（ＲＲＭ２）、推定核外輸送シグナル（Ｅ）、プリオン様ドメイン（ＰＬＤ）、またはそれらの組み合わせを含む機能的構造ドメインを欠く変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子を含んでもよい。細胞は、以下：（ａ）ＮＬＳにおけるアミノ酸の点突然変異（例えば、Ｋ８２Ａ Ｋ８３Ａ、Ｒ８４Ａ、Ｋ９５Ａ、Ｋ９７Ａ、Ｋ９８Ａまたはそれらの組み合わせ）、（ｂ）ＲＲＭ１のアミノ酸の点突然変異（例えば、Ｆ１４７Ｌ及び／またはＦ１４９Ｌ）（ｃ）ＲＲＭ２のアミノ酸の点突然変異（Ｆ１９４Ｌ及び／またはＦ２２９Ｌ）、（ｄ）核外輸送シグナルの少なくとも一部の欠失（例えば、野生型ＴＤＰ－４３タンパク質の２３９位と２５０位での及びその間のアミノ酸の欠失）、及び（ｅ）プリオン様ドメインの少なくとも一部の欠失（例えば、野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドの２７４位及び４１４位での及びその間のアミノ酸の欠失）の１以上に起因して機能的構造ドメインを欠く変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子を含んでもよい。細胞は、以下の突然変異：Ｋ８２Ａ Ｋ８３Ａ、Ｒ８４Ａ、Ｋ９５Ａ、Ｋ９７Ａ、及びＫ９８Ａを含む変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子を含んでもよく、その際、変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドは機能的ＮＬＳを欠く。細胞は、野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドの２７４位から４１４位のアミノ酸で欠失を含む変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子を含んでもよく、その際、変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドは機能的ＰＬＤを欠く。細胞は、点突然変異Ｆ１４７Ｌ及びＦ１４９Ｌを含む変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子を含んでもよく、その際、変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドは機能的ＲＲＭ１を欠く。細胞は、点突然変異Ｆ１９４Ｌ及びＦ２２９Ｌを含む変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子を含んでもよく、その際、変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドは機能的ＲＲＭ２を欠く。細胞は、野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドの２３９位から２５０位のアミノ酸で核外輸送シグナルの欠失を含む変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子を含んでもよく、その際、変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドは機能的Ｅを欠く。
細胞は、ＴＡＲＤＢＰ遺伝子の全コード配列のノックアウト突然変異、例えば、条件付きノックアウト突然変異、欠失などを含む変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子を含んでもよい。細胞は、条件付きノックアウト突然変異を含む変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子を含んでもよく、例えば、変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子は、部位特異的組換え認識配列、例えば、ｌｏｘｐ配列を含んでもよい。細胞はＴＤＰ－４３コード配列を含むエクソン、例えば、エクソン３に隣接するｌｏｘｐ配列を含む変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子を含んでもよい。細胞はｌｏｘｐ配列を含み、且つＴＤＰ－４３コード配列、例えば、エクソン３を欠く変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子を含んでもよい。細胞はＴＤＰ－４３コード配列全体を欠く変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子、例えば、ＴＤＰ－４３ポリペプチドのコード配列全体の欠失を含む変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子を含んでもよい。
いくつかの実施形態では、細胞は例えば、その生殖細胞系列ゲノムにて内在性のＴＡＲＤＢＰ遺伝子座に挿入された変異させたＴＲＡＤＢＰ遺伝子を含んでもよい。いくつかの実施形態では、細胞は、変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子、例えば、ノックアウト突然変異を含む変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子、及び／または内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子座にて内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子を置換する変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子は内在性ＴＡＲＤＢＰプロモーター及び／または調節要素に作動可能に連結される。
細胞は変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子に対してヘテロ接合性またはホモ接合性であってもよい。二倍体生物には２つの対立遺伝子を有し、相同染色体の対の各遺伝子座で１つの対立遺伝子を有する。対立遺伝子の各対は特定の遺伝子座の遺伝子型を表す。遺伝子型は、特定の遺伝子座に２つの同一の対立遺伝子がある場合はホモ接合性であり、２つの対立遺伝子が異なる場合はヘテロ接合性であると説明される。
細胞は、（ｉ）内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子座にて、変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子によって内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子を置換すること、及び（ｉｉ）相同染色体の他方の内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子座にて、ノックアウト突然変異を含む変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子を含んでもよい。
変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子を含む細胞はそこからコードされる変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドを発現してもよい。変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子を含み、そこからコードされる変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドを発現する細胞は、野生型ＴＤＢ－４３ポリペプチドを発現してもよいし、または発現しなくてもよい。
変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子を含む細胞は、そこからコードされる変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドを発現してもよく、以下（ｉ）対照細胞における野生型ＴＡＲＤＢＰ遺伝子のｍＲＮＡ転写レベルに匹敵するレベルの変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子のｍＲＮＡ転写物のレベル、（ｉｉ）対照細胞における野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドのレベルと比べて変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドのレベルの上昇、（ｉｉｉ）変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドは細胞の核よりも細胞質にて高い濃度で見いだされる、（ｉｖ）変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドは野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドと比べて不溶性の増加を示す、（ｖ）変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドを含む細胞質凝集体、（ｖｉ）野生型ＴＤＰ－４３を発現する細胞と比べて遺伝子の隠れエクソンのスプライシングの増加、（ｖｉｉ）ＴＤＰ－４３のＰＬＤをコードする配列を欠く選択的スプライシングを受けたＴＤＰ－４３ ｍＲＮＡのレベルの減少；の１以上を特徴としてもよい。
細胞は、試験管内で培養されてもよく、生体外または生体内で調べられてもよい。例えば、細胞は動物内で生体内にあることができる。
細胞は、例えば、真菌細胞（例えば、酵母）、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、及びヒト細胞を含む真核細胞であってもよい。「動物」という用語は、例えば、哺乳類、魚類、爬虫類、両生類、鳥類、及び虫類を含む、動物界の任意のメンバーを含む。哺乳動物細胞は、例えば、非ヒト哺乳動物細胞、齧歯類細胞、ラット細胞、マウス細胞、またはハムスター細胞であることができる。他の非ヒト哺乳動物には、例えば、非ヒト霊長類、サル、類人猿、オランウータン、ネコ、イヌ、ウサギ、ウマ、雄ウシ、シカ、バイソン、ヒツジ、家畜（例えば、雌ウシ、去勢雄ウシ等のようなウシ種；ヒツジ、ヤギ等のようなヒツジ種；及びブタ及び雄ブタ等のようなブタ種）が挙げられる。鳥類には、例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、ダチョウ、ガチョウ、アヒルなどが挙げられる。家畜や農業用動物も含まれる。「非ヒト動物」という用語はヒトを除外する。いくつかの実施形態では、動物はヒト、またはマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、及びサルやチンパンジーを含むが、これらに限定されない非ヒト霊長類を含むが、これらに限定されない非ヒト動物であることができる。いくつかの実施形態では、非ヒト動物細胞は、齧歯類細胞、例えば、ラット細胞またはマウス細胞である。
非ヒト動物は任意の遺伝的背景に由来することができる。例えば、好適なマウスは、１２９系統、Ｃ５７ＢＬ／６系統、１２９とＣ５７ＢＬ／６の交雑、ＢＡＬＢ／ｃ系統、またはＳｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒ系統に由来することができる。いくつかの実施形態では、１２９系統には、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／Ｓｖｌｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、及び１２９Ｔ２が挙げられる。例えば、すべての目的のためにその全体が参照によって本明細書に組み込まれるＦｅｓｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９９），Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｇｅｎｏｍｅ，１０：８３６を参照のこと。Ｃ５７ＢＬ系統の例には、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬ＿ｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、及びＣ５７ＢＬ／Ｏｌａが挙げられる。好適なマウスはまた、前述の１２９系統と前述のＣ５７ＢＬ／６系統（例えば、５０％１２９及び５０％Ｃ５７ＢＬ／６）の交雑に由来することもできる。同様に、好適なマウスは、前述の１２９系統の交雑または前述のＢＬ／６系統の交雑（例えば、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）系統）に由来することができる。
同様に、ラットは、例えば、ＡＣＩラット系統、Ｄａｒｋ Ａｇｏｕｔｉ（ＤＡ）ラット系統、Ｗｉｓｔａｒラット系統、ＬＥＡラット系統、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット系統、またはＦｉｓｈｅｒＦ３４４やＦｉｓｈｅｒＦ６のようなＦｉｓｃｈｅｒラット系統を含むラット系統に由来することができる。ラットはまた、上記の２以上の系統の交雑に由来する系統から得ることもできる。例えば、好適なラットはＤＡ系統またはＡＣＩ系統に由来することができる。ＡＣＩラット系統は、白い腹と足、及び ＲＴ１ａｖ１ハプロタイプを持つ黒いアグーチを持っていることを特徴とする 。このような系統はＨａｒｋａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓを含む種々の供給源から入手できる。Ｄａｒｋ Ａｇｏｕｔｉ（ＤＡ）ラット系統は、アグーチ被毛とＲＴ１ａｖ１ハプロタイプを有することを特徴とする。そのようなラットは、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ及びＨａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓを含む種々の供給源から入手できる。いくつかの好適なラットは近交系ラット系統に由来することができる。例えば、すべての目的のためにその全体が参照によって本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１４／０２３５９３３号を参照のこと。
細胞はまた、任意のタイプの未分化状態または分化状態であることもできる。例えば、細胞は、全能性細胞、多能性細胞（例えば、ヒト多能性細胞、またはマウス胚性幹（ＥＳ）細胞またはラットＥＳ細胞のような非ヒト多能性細胞）、または非多能性細胞であってもよい。全能性細胞には、任意の細胞型を生じさせることができる未分化細胞が含まれ、多能性細胞には、複数の分化細胞型に発達する能力を有する未分化細胞が含まれる。そのような多能性及び／または全能性細胞は、例えば、ＥＳ細胞または人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞のようなＥＳ様細胞であることができる。ＥＳ細胞には、胚への導入時に発生中の胚の任意の組織に寄与することができる胚由来の全能性細胞または多能性細胞が含まれる。ＥＳ細胞は胚盤胞の内部細胞塊に由来することができ、３つの脊椎動物の胚葉（内胚葉、外胚葉、及び中胚葉）のいずれかの細胞に分化することができる。
細胞はまた、ＥＳ細胞に由来してもよい。例えば、細胞は、ニューロン細胞（例えば、ＥＳ細胞由来運動ニューロン（ＥＳＭＮ））、原始外胚葉様細胞、胚様体細胞などであることができる。
本明細書で提供されている細胞はまた、生殖細胞（例えば、精子または卵母細胞）であることもできる。細胞は、有糸分裂能力のある細胞または有糸分裂で不活性な細胞、減数分裂で有能な細胞または減数分裂で不活性な細胞であることができる。同様に、細胞はまた、初代体細胞または初代体細胞ではない細胞であることもできる。体細胞には、配偶子、生殖細胞、配偶子細胞、または未分化幹細胞ではない任意の細胞が含まれる。
本明細書で提供されている好適な細胞には初代細胞も含まれる。初代細胞には、生物、臓器、または組織から直接単離されている細胞または細胞の培養物が含まれる。初代細胞には形質転換されず、不死でもない細胞が含まれる。初代細胞には、組織培養で以前に継代されていない、または組織培養で以前に継代されているが、組織培養で無期限に継代することができない生物、臓器、または組織から得られる任意の細胞が含まれる。
本明細書で提供されている他の好適な細胞には不死化細胞が含まれる。不死化細胞には、通常無期限に増殖しないが、突然変異または変化のせいで正常な細胞老化を回避し、代わりに分裂を受け続けることができる多細胞生物由来の細胞が含まれる。このような突然変異または変化は、天然に生じることができ、または意図的に誘導され得る。多数の種類の不死化細胞が周知である。不死化細胞または初代細胞には、組換え遺伝子または組換えタンパク質を培養するまたは発現させるのに通常使用される細胞が含まれる。
本明細書で提供されている細胞にはまた、１細胞期の胚（すなわち、受精した卵母細胞または接合子）も含まれる。そのような１細胞期の胚は、任意の遺伝的背景（例えば、マウスについてはＢＡＬＢ／ｃ、Ｃ５７ＢＬ／６、１２９、またはそれらの組み合わせ）に由来することができ、新鮮であることができ、または凍結することができ、且つ自然繁殖または体外受精に由来することができる。
変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドを発現するシステムを採用する方法
変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子を含み、本明細書に記載されているようにそこからコードされる機能的構造ドメインを欠く変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドを発現する細胞及び非ヒト動物（及びそのような細胞を含む組織または動物）は、ＴＤＰ－４３構造ドメインの機能及び／またはＴＤＰ－４３タンパク症を研究するためのモデルを提供する。例えば、変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子を含み、機能的構造ドメインを欠くそれからコードされる変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドを発現する細胞または非ヒト動物はＴＤＰ－４３タンパク症に特徴的な表現型を示してもよい。いくつかの実施形態では、例えば、（ａ）変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子を含み、機能的構造ドメインを欠くそれからコードされる変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドを発現する胚性幹細胞由来運動ニューロン（ＥＳＭＮ）、及び／または（ｂ）内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子座にて内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子の変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子による置換を含み、そこから変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドを発現する非ヒト動物から単離された、細胞は、以下（ｉ）対照細胞における野生型ＴＡＲＤＢＰ遺伝子のｍＲＮＡ転写レベルのレベルに匹敵する変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子のｍＲＮＡ転写物のレベル、（ｉｉ）対照細胞における野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドのレベルと比べて変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドのレベルの上昇 、（ｉｉｉ）変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドは細胞の核よりも細胞質に高濃度で見いだされる、（ｉｖ）変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドは野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドと比べて不溶性の増加を示す、（ｖ）変異ＴＤＰ－４３ポリペプチドを含む細胞質凝集体、（ｖｉ）野生型ＴＤＰ－４３を発現する細胞と比べて遺伝子の隠れエクソンのスプライシングの増加、（ｖｉｉ）ＴＤＰ－４３のＰＬＤをコードする配列を欠く選択的スプライシングを受けたＴＤＰ－４３ ｍＲＮＡのレベルの低下、の１以上を特徴としてもよい。
したがって、変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子を含み、本明細書に記載されているようにそこからコードされる機能的構造ドメインを欠く変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドを発現する細胞（及びそのような細胞を含む組織または動物）は、ＴＤＰ－４３タンパク症の１以上の症状の阻害（例えば、変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドの細胞質蓄積）を治療する、予防する及び／または抑制するための治療候補薬剤を特定するためのシステム、及び／または野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドの生物学的機能を復元する（例えば、隠れエクソンスプライシングの抑制及び／またはＴＤＰ－４３ ｍＲＮＡの選択的スプライシングのレベルを上げる）ためのシステムを提供する。いくつかの実施形態では、治療剤の効果は、変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子を含み、そこからコードされる機能的構造ドメインを欠く変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドを発現している細胞を治療候補薬剤と接触させることによって判定される。接触は試験管内で実行されてもよい。接触は動物に治療候補薬剤を投与することを含んでもよい。
いくつかの実施形態では、アッセイを実施することは、薬物と接触した細胞または動物の表現型及び／または遺伝子型に対する効果を判定することを含む。いくつかの実施形態では、アッセイを実施することは、薬物のロット間の変動性を決定することを含む（いくつかの実施形態では、アッセイを実施することは、投与された薬物と接触した本明細書に記載されている細胞または動物に対する効果と対照細胞または対照動物（例えば、野生型ＴＤＰ－４３を発現する）との間の差異を判定することを含む）。
薬物の薬物動態特性を評価するために非ヒト動物で（またはそこから単離された細胞にて及び／またはそれを使用して）測定されてもよい例示的なパラメーターには、凝集、自食作用、細胞分裂、細胞死、補体介在性の溶血、ＤＮＡ完全性、薬物特異的抗体力価、薬物代謝、遺伝子発現アレイ、代謝活性、ミトコンドリア活性、酸化ストレス、食作用、タンパク質生合成、タンパク質分解、タンパク質分泌、ストレス応答、標的組織薬物濃度、非標的組織薬物濃度、転写活性などが挙げられるが、これらに限定されない。
完全長ＴＤＰ－４３ ｍＲＮＡを選択的に減らすためのオリゴヌクレオチド
図１１Ａは、完全長のＴＤＰ－４３のプレ－ｍＲＮＡと、その３’末端で発生する正常な（上部パネル）及び選択的な（下部パネル）のスプライス事象を説明する。示されているように、エクソン６は、正常なスプライス事象で形成された完全長ＴＤＰ－４３タンパク質のプリオン様ドメイン（ＰＬＤ）をコードし、そのコード配列はＰＬＤの末端で終結する。２つの新しいエクソン（７及び８）は、エクソン６内の少なくとも３つの選択的５’－スプライス部位の１つから下流の選択的３’－スプライス部位まででの、例えば、新しいエクソン７に隣接する選択的スプライシング事象によって形成される。選択的エクソン７から選択的エクソン８までの第２の選択的スプライシング事象の証拠がある。
マウスでは、本明細書に記載されているエクソン６内またはエクソン６の先頭にある選択的５’－スプライス部位は以下の位置：（ａ）第４染色体：１４８，６１８，６４７；（ｂ）第４染色体：１４８，６１８，６６５；（ｃ）第４染色体：１４８，６１８，６７４にマッピングされる。エクソン７の選択的３’－スプライス部位は第４染色体の位置：１４８，６１７，７０５にマッピングされる。エクソン７からエクソン８までの第２の選択的スプライシング事象は第４染色体：１４８，６１７，５６６から第４染色体：１４８，６１６，８４４で発生する。当業者は、他のＴＡＲＤＢＰ遺伝子、例えば、ヒトＴＡＲＤＢＰ遺伝子における同様の選択的５’及び３’スプライス部位を決定することができるであろう。
エクソン６内の選択的５’－スプライス部位から下流の選択的３’－スプライス部位までの選択的スプライシングは、ＰＬＤコード配列のほとんどがＰＬＤを欠くＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする配列で置き換えられたｍＲＮＡを生成すると予測される。例えば、（ａ）第４染色体：１４８，６１８，６４７；（ｂ）第４染色体：１４８，６１８，６６５；及び（ｃ）第４染色体：１４８，６１８，６７４のいずれか１つから第４染色体：１４８，６１７，７０５（及びヒトＴＡＲＤＢＰ遺伝子のいずれかの対応する位置）までの選択的スプライシングは、ＰＬＤコード配列のほとんどが、ＰＬＤが１８アミノ酸に置き換えられているＰＬＤを欠くＴＤＰ－４３の切り詰めた形態をコードすると予測される選択的ｍＲＮＡで置き換えられたｍＲＮＡを作り出してもよい。オープンリーディングフレームはエクソン７の５’－スプライス部位の上流にてエクソン７で停止するので、この第２の選択的スプライシング事象は新しい形態のＴＤＰ－４３タンパク質を作り出さない。
ＰＬＤを欠くＴＤＰ－４３が特に運動ニューロンにて生存能力を支えることができるという観察結果、及びΔＰＬＤまたはΔＮＬＳの変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子を発現している細胞におけるこの選択的スプライシングを受けたＴＤＰ－４３ ｍＲＮＡのレベルの低下は、それらのＡＬＳ様の表現型と共に、この選択的スプライシングを受けたＴＤＰ－４３ ｍＲＮＡ及びその翻訳された切り詰め産物がＴＤＰ－４３タンパク症に寄与しなくてもよく、且つＴＤＰ－４３タンパク症に対して予防的であってもよいことを示唆している。ＰＬＤを含有するタンパク質の形態をコードするＴＤＰ－４３のｍＲＮＡアイソフォームを除去するまたは不活性化するように設計されたｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド及び／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの適用は、ＰＬＤがない切り詰められたＴＤＰ－４３タンパク質を生じる選択的スプライシングを受けたｍＲＮＡを温存する一方で病的凝集を起こしやすいＴＤＰ－４３の変異体を枯渇させてもよい。ＴＤＰ－４３の切り詰め形態は、細胞の生命、特に運動ニューロンの生存能力をさらに支える一方で、病的凝集に耐性であってもよい。
したがって、治療戦略は、ＰＬＤをコードする配列を含むそれらのＴＤＰ－４３ ｍＲＮＡ配列、例えば、エクソン６内の選択的スプライス部位に続くゲノム配列によってコードされる配列を含むそれらのｍＲＮＡのみを標的とする活性アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）またはｓｉＲＮＡを見つけることから成る。非限定的な例として、ＡＳＯまたはｓｉＲＮＡはＰＬＤドメインをスプライシングで取り除く選択的５’スプライス部位をコードするコドン（複数可）の後にＴＡＲＤＢＰ遺伝子から転写された配列を含むｍＲＮＡを標的としてもよい。ＴＤＰ－４３ ｍＲＮＡのこの領域を標的とするように設計されたＡＳＯまたはｓｉＲＮＡは、ＰＬＤを含むＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする完全長ＴＤＰ－４３ ｍＲＮＡのみを認識する一方で、ＰＬＤを欠く、切り詰められ、保護された可能性があるＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする選択的スプライシングを受けたＴＤＰ－４３ ｍＲＮＡを温存する。言い換えれば、そのようなＡＳＯまたはｓｉＲＮＡは、選択的スプライシングを受けたＴＤＰ－４３ ｍＲＮＡの分解を認識するまたは増強することができるはずがない。ＡＳＯまたはｓｉＲＮＡは、ＴＤＰ－４３ポリペプチドのアミノ酸２８７～４１４またはエクソン７の３’選択的スプライス部位の上流にある任意の３’非翻訳領域をコードするＴＤＰ－４３ ｍＲＮＡ配列を標的としてもよい。ＡＳＯはＲＮＡ分解酵素Ｈが介在する切断による、例えば、－５－１０－５ギャップマーを介したｍＲＮＡの分解を促進してもよい。ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉によるｍＲＮＡの分解及びまたはタンパク質合成を促進してもよい。
別の治療戦略は、ＴＡＲＤＢＰ遺伝子のエクソン６内の選択的５’スプライス部位及び下流の３’スプライス部位、例えば、エクソン７にまたがるゲノム配列を選択的に標的にして欠失させるためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの適用である。このようにして、ＰＬＤを欠く切り詰められたＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードするｍＲＮＡのみが転写されてもよい。
Ａ．アンチセンスオリゴヌクレオチド及びｓｉＲＮＡ
プレｍＲＮＡ内の配列を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）及び低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は望ましくないアイソフォームの分解を増強してもよい。本明細書で設計されるように、ＡＳＯまたはｓｉＲＮＡは、選択的スプライシングを受けたＴＤＰ－４３ ｍＲＮＡを温存しながら、ＰＬＤをコードするＴＤＰ－４３ ｍＲＮＡを破壊するのに使用されてもよい。完全長ＴＤＰ－４３ ｍＲＮＡのみのレベルを低下させるために、ＡＳＯまたはｓｉＲＮＡは、エクソン６内の選択的５’スプライス部位から（ｉｉ）下流の選択的３’スプライス部位までの間の配列を含むＴＤＰ－４３ ｍＲＮＡ、例えば、ＴＤＰ－４３ポリペプチドのアミノ酸２８７～４１４をコードする配列及び／または選択的スプライス部位の上流の任意の３’非翻訳領域を含むＴＤＰ－４３ ｍＲＮＡを標的としてもよい。図１１Ａを参照のこと。いくつかの実施形態では、エクソン６内の選択的５’スプライス部位は、（ａ）マウス第４染色体：１４８，６１８，６４７；（ｂ）マウス第４染色体：１４８，６１８，６６５；（ｃ）マウス第４染色体：１４８，６１８，６７４、及び（ｄ）ヒトＴＡＲＤＢＰ遺伝子のいずれかの対応する位置から成る群から選択されるＴＡＲＤＢＰゲノム位置に相関する。いくつかの実施形態では、下流の選択的３’スプライス部位はマウス染色体４：１４８，６１７，７０５またはヒトＴＡＲＤＢＰ遺伝子の対応する位置に相関する。
ＰＬＤをコードするＴＤＰ－４３ ｍＲＮＡを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡは、強化された阻害活性、標的核酸に対する結合親和性の増大、または生体内ヌクレアーゼによる分解に対する耐性のような特性をアンチセンスオリゴヌクレオチドに付与するためにパターンまたはモチーフで配置された化学修飾サブユニットを有してもよい。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは通常、ヌクレアーゼ分解に対する耐性の増大、細胞取り込みの増加、標的核酸に対する結合親和性の増大、及び／または阻害活性の上昇を付与するように修飾された少なくとも１つの領域を含有する。アンチセンスオリゴヌクレオチドの第２の領域は任意で、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼＲＮＡ分解酵素Ｈの基質として役立ってもよい。
ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは均一な糖修飾オリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドはギャップマーモチーフを含んでもよい。ギャップマーでは、ＲＮＡ分解酵素Ｈの切断を支援する複数のヌクレオチドを有する内側領域が、内側領域のヌクレオシドとは化学的に異なる複数のヌクレオチドを有する外側領域の間に配置される。ギャップマーモチーフを有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの場合、ギャップセグメントは一般にエンドヌクレアーゼ切断の基質として役立つ一方で、ウイングセグメントは修飾ヌクレオシドを含む。特定の実施形態では、ギャップマーの領域は各別個の領域を含む糖部分の種類によって区別される。ギャップマーの領域を区別するのに使用される糖部分の種類には、いくつかの実施形態では、β－Ｄ－リボヌクレオシド、β－Ｄ－デオキシリボヌクレオシド、２’－修飾ヌクレオシド（そのような２’－修飾ヌクレオシドには、とりわけ２’－ＭＯＥや２’－Ｏ－ＣＨ３が挙げられてもよい）、及び二環式糖修飾ヌクレオシドが挙げられてもよい。特定の実施形態では、ウイングは、例えば、２’－ＭＯＥを含むいくつかの修飾糖部分を含んでもよい。特定の実施形態では、ウイングはいくつかの修飾糖部分と無修飾糖部分を含んでもよい。特定の実施形態では、ウィングには２’－ＭＯＥヌクレオシド及び２’－デオキシヌクレオシドの種々の組み合わせが含まれてもよい。
異なる領域はそれぞれ均一な糖部分、変異体、または交互の糖部分を含んでもよい。ウイング－ギャップ－ウイングのモチーフは「Ｘ－Ｙ－Ｚ」と記載されることが多く、その際、「Ｘ」は５’－ウイングの長さを表し、「Ｙ」はギャップの長さを表し、「Ｚ」は３’－ウイングの長さを表す。「Ｘ」及び「Ｚ」は均一糖部分、変異体糖部分、または交互の糖部分を含んでもよい。特定の実施形態では、「Ｘ」及び「Ｙ」は１以上の２’－デオキシヌクレオシドを含んでもよい。「Ｙ」は２’－デオキシヌクレオシドを含んでもよい。本明細書で使用されるとき「Ｘ－Ｙ－Ｚ」と記述されるギャップマーは、ギャップが５’－ウイング及び３’－ウイングのそれぞれと直接隣接して配置されるような構成を有する。したがって、５’－ウイングとギャップの間にも、ギャップと３’－ウイングの間にも介在するヌクレオチドは存在しない。本明細書に記載されているアンチセンス化合物はいずれもギャップマーモチーフを有することができる。特定の実施形態では、「Ｘ」及び「Ｚ」が同じであり、他の実施形態では、それらは異なる。特定の実施形態では、「Ｙ」は８～１５の間のヌクレオシドである。Ｘ、Ｙ、またはＺは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０またはそれ以上のヌクレオシドのいずれかであることができる。したがって、本明細書に記載されているギャップマーには、例えば、５－１０－５、５－１０－４、４－１０－４、４－１０－３、３－１０－３、２－１０－２、５－９－５、５－９－４、４－９－５、５－８－５、５－８－４、４－８－５、５－７－５、４－７－５、５－７－４、または４－７－４が含まれるが、これらに限定されない。
ＰＬＤをコードするＴＤＰ－４３ ｍＲＮＡ配列を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは５－１０－５ギャップマーモチーフを持ってもよい。
ＰＬＤをコードするＴＤＰ－４３ ｍＲＮＡ配列を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドはギャップが狭くなったモチーフを含んでもよい。ＴＤＰ－４３ ｍＲＮＡを標的とするギャップが狭くなったアンチセンスオリゴヌクレオチドは５、４、３、２、または１の化学的に修飾されたヌクレオシドのウィングセグメントのすぐ隣及びその間に位置する９、８、７、または６の２’－デオキシヌクレオチドのギャップセグメントを有してもよい。化学的に修飾されたヌクレオシドは二環式糖を含んでもよい。二環式糖はｎが１または２である４’－（ＣＨ２）ｎ－Ｏ－２’架橋；及び４’－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－２’の中から選択される４’から２’への架橋を含んでもよい。二環式糖は４’－ＣＨ（ＣＨ３）－Ｏ－２’架橋を含んでもよい。化学修飾は、非二環式２’修飾糖部分、例えば、２’－Ｏ－メチルエチル基または２’－Ｏ－メチル基を含んでもよい。いくつかの実施形態では、選択的５’スプライス部位がエクソン６内にあり、例えば、選択的な５’スプライス部位が（ａ）マウス第４染色体：１４８，６１８，６４７；（ｂ）マウス第４染色体：１４８，６１８，６６５；（ｃ）マウス第４染色体：１４８，６１８，６７４、及び（ｄ）ヒトＴＡＲＤＢＰ遺伝子のいずれかの対応する位置から成る群から選択されるＴＡＲＤＢＰゲノム位置と相関し、且つ選択的３’スプライス部位が第４染色体：１４８，６１７，７０５のＴＡＲＤＢＰゲノム位置と相関する、選択的な５’及び３’スプライス部位の間のＴＤＰ－４３ ｍＲＮＡ配列を標的とするギャップマーモチーフを含むアンチセンスオリゴヌクレオチド。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは選択的５’スプライス部位と選択的３’スプライス部位の間でＴＤＰ－４３ ｍＲＮＡ配列を標的とする配列を含み、その際、選択的５’スプライス部位はエクソン６内にあり、例えば、選択的５’スプライス部位は、（ａ）マウス第４染色体：１４８，６１８，６４７；（ｂ）マウス第４染色体：１４８，６１８，６６５；（ｃ）マウス第４染色体：１４８，６１８，６７４、及び（ｄ）ヒトＴＡＲＤＢＰ遺伝子のいずれかの対応する位置からなる群から選択されるＴＡＲＤＢＰゲノム位置と相関し、且つ選択的３’スプライス部位は第４染色体：１４８，６１７，７０５のＴＡＲＤＢＰゲノム位置と相関する。
ＰＬＤをコードするＴＤＰ－４３ ｍＲＮＡ配列を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡは均一に修飾されてもよい。特定の実施形態では、各ヌクレオシドは化学修飾される。特定の実施形態では、化学修飾は非二環式２’修飾糖部分を含む。特定の実施形態では、２’－修飾糖部分は２’－Ｏ－メトキシエチル基を含む。特定の実施形態では、２’－修飾糖部分は２’－Ｏ－メチル基を含む。
ＡＳＯまたはｓｉＲＮＡはまた、得られたＡＳＯまたはｓｉＲＮＡの活性、細胞分布または細胞取り込みを増強する１以上の部分または抱合体に共有結合させてもよい。典型的な抱合基にはコレステロール部分及び脂質部分が挙げられる。追加の抱合基には、炭水化物、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸塩、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン及び色素が含まれる。
ＡＳＯまたはｓｉＲＮＡはまた、一般に一方または双方の末端に結合される１以上の安定化基を有するように修飾されてもよい。安定化基に含まれるのはキャップ構造である。これらの末端修飾は、末端核酸を有するＡＳＯまたはｓｉＲＮＡをエキソヌクレアーゼ分解から保護し、細胞内での送達及び／または局在化に役立つことができる。キャップは、５’末端（５’キャップ）または３’末端（３’キャップ）に存在することができる、または双方の末端に存在することができる。キャップ構造は周知であり、例えば、逆デオキシ脱塩基キャップが含まれる。
ＡＳＯまたはｓｉＲＮＡは、標的核酸（例えば、ＴＤＰ－４３ プレ－ｍＲＮＡ）に結合する且つ所望の効果を有するのに好適な任意の長さであってもよい。例えば、ＡＳＯは、長さ約１２～約３０、約１２～約２４、約１３～約２３、約１４～約２２、約１５～約２１、約１６～約２０、約１７～約１９、または約１８のヌクレオシドであることができる。別の例として、ＡＳＯは約８～約８０、約１２～約５０、約１５～約３０、約１８～約２４、約１９～約２２、または約２０の連結ヌクレオシドであることができる。あるいは、ＡＳＯは長さ約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、約５０、約５１、約５２、約５３、約５４、約５５、約５６、約５７、約５８、約５９、約６０、約６１、約６２、約６３、約６４、約６５、約６６、約６７、約６８、約６９、約７０、約７１、約７２、約７３、約７４、約７５、約７６、約７７、約７８、約７９，または約８０の連結されたヌクレオシドであることができる。例えば、ＡＳＯは、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、または約２５の連結されたヌクレオシドから成ることができる。具体的な例では、ＡＳＯは約１５～約２５の連結されたヌクレオシドであることができる。
ＡＳＯまたはｓｉＲＮＡは、標的核酸（例えば、ＴＤＰ－４３プレｍＲＮＡ、例えば、ＰＬＤをコードするｍＲＮＡ配列）に相補性であることができ、及び／または特異的にハイブリッド形成することができる。ＡＳＯの十分な数の核酸塩基が標的核酸の対応する核酸塩基と水素結合することができるので所望の効果が生じる場合、ＡＳＯと標的核酸とは互いに相補性である。特異的にハイブリッド形成可能なとは、特異的結合が所望される条件下で（例えば、生理学的条件下で）非標的核酸にほとんどまたはまったく影響を及ぼさない一方で、所望の効果を引き起こすのに十分な程度のＡＳＯと標的核酸との間で相補性を有するＡＳＯを指す。
一部のＡＳＯまたはｓｉＲＮＡはＴＤＰ－４３プレ－ｍＲＮＡの等しい長さ部分に対して少なくとも少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％相補性である。あるいは、ＡＳＯはＴＤＰ－４３プレｍＲＮＡの等しい長さ部分に対して約１００％相補性であることができる。標的核酸とのＡＳＯの相補性パーセントは常法を使って決定することができる。例えば、ＡＳＯの２０核酸塩基中１８核酸塩基が標的領域に相補性であるので特異的にハイブリッド形成するＡＳＯは９０パーセントの相補性を示す。標的核酸の領域に対するＡＳＯの相補性パーセントはＢＬＡＳＴプログラム（基本局所配列比較検索ツール）、及び周知であるＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラム（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１５，４０３－４１０、Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｍａｄｄｅｎ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，１９９７，７，６４９－６５６を参照のこと）を使用して日常的に決定することができる。相同性パーセント、配列同一性パーセントまたは相補性パーセントは、例えばＳｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズム（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，１９８１，２，４８２ ４８９）を使用するＧａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓ．）によって、デフォルト設定を使用して決定することができる。
ＡＳＯまたはｓｉＲＮＡが標的核酸と特異的にハイブリッド形成し続けることができるという条件で、ＡＳＯまたはｓｉＲＮＡとＴＤＰ－４３プレｍＲＮＡとの間の非相補性の核酸塩基は認容されてもよい。さらに、ＡＳＯまたはｓｉＲＮＡは、介在セグメントまたは隣接セグメントがハイブリッド形成事象（例えば、ループ構造、ミスマッチ、またはヘアピン構造）に関与しないようにＴＤＰ－４３プレ－ｍＲＮＡの１以上のセグメントにわたってハイブリッド形成してもよい。非相補性核酸塩基の位置はＡＳＯまたはｓｉＲＮＡの５’末端または３’末端であってもよい。あるいは、非相補性の核酸塩基（単数）または核酸塩基（複数）はＡＳＯまたはｓｉＲＮＡの内部位置にあってもよい。２以上の非相補性核酸塩基が存在する場合、それらは連続して（すなわち連結されて）いてもよいし、または不連続であってもよい。
Ｂ．ＴＤＰ－４３のＰＬＤをコードするゲノム配列の欠失
本明細書に示されるように、細胞は機能的なＰＬＤを欠く変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドのみを発現しているにもかかわらず、生存し続ける。本明細書に記載されているのはまた、クラスター化された規則的に散在する短いパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）システム、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの１以上の構成要素であり、それを使用して細胞、例えば、胚性幹細胞から、本明細書に記載されているような内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子座のタンパク質様ドメイン（またはその一部）を欠失させてもよい。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、細胞、例えば胚性幹細胞から、エクソン６の短い形態の５’スプライス部位でのまたはその近傍での、及びエクソン７の３’スプライス部位でのまたはその近傍でのゲノム配列を欠失させてもよい。そのような構成要素には、例えば、Ｃａｓタンパク質及び／またはガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）が挙げられ、ｇＲＮＡは２つの別個のＲＮＡ分子、例えば、ターゲッターＲＮＡ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びアクチベーターＲＮＡ（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ）；または単一のガイドＲＮＡ（例えば、単一分子ｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ））を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムはＣａｓ９タンパク質及び少なくとも１つのｇＲＮＡを含み、その際、ｇＲＮＡは、（ａ）第４染色体：１４８，６１８，６４７；（ｂ）第４染色体：１４８，６１８，６６５；（ｃ）第４染色体：１４８，６１８，６７４、（ｄ）第４染色体：１４８，６１７，７０５及びそれらの組み合わせから成る群から選択されるＴＡＲＤＢＰゲノム位置のまたはその近傍の配列を認識する。
ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムはＣａｓ遺伝子の発現に関与する、またはＣａｓ遺伝子の活性を誘導する転写物及び他の要素を含む。ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムはＩ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型のシステムであることができる。あるいは、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムはＶ型のシステム（例えば、亜型Ｖ－Ａまたは亜型Ｖ－Ｂ）であることができる。本明細書に記載されている内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子座におけるＴＤＰ－４３のプリオン様ドメイン（またはその一部）をコードする配列、または５’選択的スプライス部位（例えば、アミノ酸２８８をコードする配列）と３’選択的スプライス部位（例えば、選択的エクソン７に隣接する）の間の配列は、核酸の部位特異的切断のためにＣＲＩＳＰＲ複合体（Ｃａｓタンパク質と複合体を形成したガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む）を利用することによって欠失させてもよい。
本明細書に記載されているＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムはＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（ＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１またはＣｓｘ１２）、Ｃａｓ１０、Ｃａｓｌ０ｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１（ＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（ＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（ＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（ＣａｓＣ）、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、Ｃｕ１９６６、及びその相同体または改変体）及び／またはガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）認識配列を標的とする１以上のｇＲＮＡを含んでもよい。本明細書に記載されているようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸（例えば、プロモーターに作動可能に連結されてもよい）及び／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡを含む少なくとも１つの発現構築物をさらに含んでもよい。
Ｃａｓタンパク質によるＴＡＲＤＢＰ遺伝子の部位特異的な結合及び切断は、標的ＤＮＡにおける（ｉ）ｇＲＮＡと標的ＤＮＡとの間の塩基対の相補性及び（ｉｉ）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる短いモチーフの双方によって決定される位置で発生することができる。ＰＡＭはガイドＲＮＡ認識配列に隣接することができる。任意で、ガイドＲＮＡ認識配列を３’末端でＰＡＭに隣接させることができる。あるいは、ガイドＲＮＡ認識配列を５’末端でＰＡＭに隣接させることができる。例えば、Ｃａｓタンパク質の切断部位はＰＡＭ配列の上流または下流における約１～約１０、または約２～約５の塩基対（例えば３塩基対）であることができる。場合によっては（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９または密接に関連するＣａｓ９を使用する場合）、非相補鎖のＰＡＭ配列は５’－Ｎ１ＧＧ－３’であることができ、式中、Ｎ１は任意のＤＮＡヌクレオチドであり、標的ＤＮＡの非相補鎖のガイドＲＮＡ認識配列の直近の３’側である。したがって、相補鎖のＰＡＭ配列は５’－ＣＣＮ２－３’であり、式中、Ｎ２は任意のＤＮＡヌクレオチドであり、標的ＤＮＡの相補鎖のガイドＲＮＡ認識配列の直近の５’側である。いくつかのそのような場合では、Ｎ１とＮ２は相補性であることができ、Ｎ１－Ｎ２塩基対は任意の塩基対であることができる（例えば、Ｎ１＝Ｃ及びＮ２＝Ｇ；Ｎ１＝Ｇ及びＮ２＝Ｃ；Ｎ１＝Ａ及びＮ２＝Ｔ；またはＮ１＝Ｔ、及びＮ２＝Ａ）。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９の場合、ＰＡＭはＮＮＧＲＲＴまたはＮＮＧＲＲであることができ、式中、ＮはＡ、Ｇ、Ｃ、またはＴであることができ、ＲはＧまたはＡであることができる。
本明細書で開示されているように、ガイドＲＮＡは任意の形態で提供されてもよい。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは２つの分子（別個のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ）または１つの分子（ｓｇＲＮＡ）のいずれかのＲＮＡの形態で、及び任意でＣａｓタンパク質との複合体の形態で提供され得る。ｇＲＮＡはまた、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡの形態で提供されることもできる。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、単一のＲＮＡ分子（ｓｇＲＮＡ）または別個のＲＮＡ分子（例えば、別個のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードすることができる（その際、別個のＲＮＡ分子は、１つのＤＮＡ分子として、またはそれぞれｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡをコードする別個のＤＮＡ分子として提供されてもよい）。
一実施形態では、本明細書に記載されているＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｃａｓ９タンパク質、またはＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムからのＣａｓ９に由来するタンパク質、及び／または少なくとも１つのｇＲＮＡを含み、その際、少なくとも１つのｇＲＮＡはｃｒＲＮＡ及び／またはｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡによってコードされる。
標的にされた遺伝子操作は、細胞をＣａｓタンパク質及び標的ゲノム遺伝子座内の１以上のガイドＲＮＡ認識配列とハイブリッド形成する１以上のガイドＲＮＡと接触させることによって生成することができる。１以上のガイドＲＮＡの少なくとも１つは、Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、１以上のガイドＲＮＡ認識配列の少なくとも１つに誘導することができ、Ｃａｓタンパク質は１以上のガイドＲＮＡ認識配列の少なくとも１つ内の標的ゲノム遺伝子座を切断することができる。Ｃａｓタンパク質による切断は、二本鎖切断または一本鎖切断（例えば、Ｃａｓタンパク質がニッカーゼである場合）を作り出すことができる。次に、二本鎖切断または一本鎖切断によって生成された末端配列は組換えを受けることができる。
Ｃ．オリゴヌクレオチドを導入するための方法
オリゴヌクレオチドの細胞への導入を可能にするために、種々の方法及び組成物が本明細書で提供されている。オリゴヌクレオチドを種々の細胞型に導入する方法は公知であり、それらには、例えば、安定的形質移入法、一過性形質移入法、及びウイルス介在性の方法が挙げられる。
形質移入プロトコール、と同様にオリゴヌクレオチドを細胞に導入するためのプロトコールは様々であってもよい。非限定的な形質移入法には、リポソーム；ナノ粒子；リン酸カルシウム（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．（１９７３），Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２（２）：４５－４６７，Ｂａｃｃｈｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．（１９７７），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７４（４）：１５９０－１５９４，及びＫｒｉｅｇｌｅｒ，Ｍ（１９９１），Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ．ｐｐ．９６－９７）；デンドリマー；またはＤＥＡＥ－デキストランもしくはポリエチレンイミンのようなカチオン性ポリマーを使用した化学系の形質移入法が挙げられる。非化学的方法には電気穿孔法、ソノポレーション、及び光学形質移入が挙げられる。粒子に基づく形質移入方法には遺伝子銃の使用、または磁石補助型形質移入が挙げられる（Ｂｅｒｔｒａｍ，（２００６），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，７，２７７－２８）。ウイルスによる方法も形質移入に使用することができる。
細胞へのオリゴヌクレオチドの導入には、電気穿孔法、細胞質内注射、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、レトロウイルスによるウイルス感染、形質移入、脂質を介した形質移入、またはヌクレオフェクションが介在することができる。ヌクレオフェクションは、核酸基質を細胞質だけでなく核膜を介して核内に送達できるようにする改良された電気穿孔法である。加えて、本明細書で開示されている方法におけるヌクレオフェクションの使用は通常、いつもの電気穿孔法よりもはるかに少ない細胞しか必要としない（例えば、いつもの電気穿孔法による７００万と比べてたった約２００万）。一例では、ヌクレオフェクションは、ＬＯＮＺＡ（登録商標）ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲ（商標）システムを使用して行われる。
細胞へのオリゴヌクレオチドの導入は微量注入によって達成することもできる。接合子（すなわち、１細胞期の胚）では、微量注入は母体及び／または父方の前核または細胞質に行うことができる。微量注入が１つの前核のみに行われる場合は、サイズが大きいため父方の前核が好ましい。微量注入を実行する方法は周知である。例えば、Ｎａｇｙ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｇｙ Ａ，Ｇｅｒｔｓｅｎｓｔｅｉｎ Ｍ，Ｖｉｎｔｅｒｓｔｅｎ Ｋ，Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｒ．，２００３，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）を参照のこと；Ｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１０），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１０７：１５０２２－１５０２６及びＭｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１２），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１０９：９３５４－９３５９も参照のこと。
オリゴヌクレオチドを細胞に導入するための他の方法には、例えば、ベクター送達、粒子が介在する送達、エクソソームが介在する送達、脂質ナノ粒子が介在する送達、細胞透過性ペプチドが介在する送達、または埋め込み型デバイスが介在する送達が挙げられる。具体例として、オリゴヌクレオチドを、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）ミクロスフェア、ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸－コグリコール酸）（ＰＬＧＡ）ミクロスフェア、リポソーム、ミセル、逆ミセル、脂質コクリエート、または脂質微小管のような担体にて細胞または非ヒト動物に導入することができる。
オリゴヌクレオチドの導入は、ＡＡＶが介在する送達またはレンチウイルスが介在する送達のようなウイルスが介在する送達によっても達成することができる。他の例示的なウイルス／ウイルスベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、及び単純ヘルペスウイルスが挙げられる。ウイルスは、分裂細胞、非分裂細胞、または分裂細胞と非分裂細胞の双方に感染することができる。ウイルスは宿主ゲノムに統合することができ、または代わりに宿主ゲノムに統合されない。そのようなウイルスは、低下した免疫を有するように操作することもできる。ウイルスは、複製能力があることができ、または複製に欠陥があることができる（例えば、ビリオン複製及び／またはパッケージングの追加ラウンドに必要な１以上の遺伝子に欠陥がある）。ウイルスは、一過性の発現、長期的な発現（例えば、少なくとも１週間、２週間、１ヵ月、２ヵ月、または３ヵ月）、または永続的な発現を引き起こすことができる。例示的なウイルス力価（例えば、ＡＡＶ力価）には、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５、及び１０１６ベクターゲノム／ｍＬが含まれる。
ｓｓＤＮＡ ＡＡＶゲノムは、２つのオープンリーディングフレーム、ＲｅｐとＣａｐから成り、相補ＤＮＡ鎖の合成を可能にする２つの逆方向末端反復配列が隣接している。ＡＡＶ伝達プラスミドを構築する場合、導入遺伝子は２つのＩＴＲの間に配置され、ＲｅｐとＣａｐはトランスで供給され得る。ＲｅｐとＣａｐに加えて、ＡＡＶはアデノウイルスからの遺伝子を含有するヘルパープラスミドを必要とすることができる。これらの遺伝子（Ｅ４、Ｅ２ａ、及びＶＡ）はＡＡＶ複製に介在した。例えば、伝達プラスミド、Ｒｅｐ／Ｃａｐ、及びヘルパープラスミドでアデノウイルス遺伝子Ｅ１＋を含有するＨＥＫ２９３細胞に形質移入して、感染性ＡＡＶ粒子を作り出すことができる。あるいは、Ｒｅｐ、Ｃａｐ、及びアデノウイルスヘルパー遺伝子を組み合わせて単一のプラスミドにしてもよい。同様のパッケージング細胞及び方法はレトロウイルスのような他のウイルスにも使用することができる。
ＡＡＶの複数の血清型が確認されている。これらの血清型はそれらが感染する細胞の種類（すなわち、それらの向性）で異なり、特定の細胞型の優先的な形質導入を可能にする。ＣＮＳ組織の血清型にはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９が挙げられる。心臓組織の血清型には、ＡＡＶ１、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９が挙げられる。腎臓組織の血清型にはＡＡＶ２が挙げられる。肺組織の血清型には、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、及びＡＡＶ９が挙げられる。膵臓組織の血清型にはＡＡＶ８が挙げられる。光受容細胞の血清型にはＡＡＶ２、ＡＡＶ５、及びＡＡＶ８が挙げられる。網膜色素上皮組織の血清型にはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、及びＡＡＶ８が挙げられる。骨格筋組織の血清型にはＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９が挙げられる。肝臓組織の血清型にはＡＡＶ７、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９、特にＡＡＶ８が挙げられる。
向性は、キャプシドと異なるウイルス血清型からのゲノムとの混合であるシュードタイピングによってさらに洗練することができる。例えば、ＡＡＶ２／５は、血清型５のキャプシドにパッケージされた血清型２のゲノムを含有するウイルスを示す。シュードタイプ化ウイルスを使用すると、形質導入効率が改善することができ、同様に向性を変化させることができる。異なる血清型に由来するハイブリッドキャプシドを使用して、ウイルスの向性を変化させることもできる。例えば、ＡＡＶ－ＤＪは８の血清型のハイブリッドキャプシドを含有し、生体内で幅広い細胞型にわたって高い感染力を示す。ＡＡＶ－ＤＪ８は、ＡＡＶ－ＤＪの特性を表示するが、脳への取り込みが強化された別の例である。ＡＡＶ血清型は突然変異を介しても改変することができる。ＡＡＶ２の変異修飾の例にはＹ４４４Ｆ、Ｙ５００Ｆ、Ｙ７３０Ｆ、及びＳ６６２Ｖが挙げられる。ＡＡＶ３の変異修飾の例には、Ｙ７０５Ｆ、Ｙ７３１Ｆ、及びＴ４９２Ｖが挙げられる。ＡＡＶ６の変異修飾の例にはＳ６６３Ｖ及びＴ４９２Ｖが挙げられる。他のシュードタイプ化された／修飾されたＡＡＶ変異体にはＡＡＶ２／１、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／７、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／９、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ８．２、及びＡＡＶ／ＳＡＳＴＧが挙げられる。
導入遺伝子の発現を加速するために、自己相補性ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）変異体を使用することができる。ＡＡＶは細胞のＤＮＡ複製機構に依存してＡＡＶの一本鎖ＤＮＡゲノムの相補鎖を合成するので、導入遺伝子の発現が遅延してもよい。この遅延に対処するために、感染時に自発的にアニーリングすることができる相補性配列を含有するｓｃＡＡＶを使用することができ、宿主細胞のＤＮＡ合成の必要性を排除する。しかしながら、一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）ベクターも使用することができる。
オリゴヌクレオチドの導入は脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）が介在する送達によっても達成することができる。脂質製剤は細胞への取り込みを改善する一方で、生体分子を分解から保護することができる。脂質ナノ粒子は分子間力によって互いに物理的に結合した複数の脂質分子を含む粒子である。これらには、ミクロスフェア（単層及び多層ベシクル、例えばリポソームを含む）、エマルジョン中の分散相、ミセル、または懸濁液中の内相が含まれる。そのような脂質ナノ粒子は、送達のために１以上のオリゴヌクレオチドをカプセル化するのに使用することができる。カチオン性脂質を含有する製剤は核酸のようなポリアニオンを送達するのに有用である。含めることができる他の脂質は、中性脂質（すなわち、非荷電または双性イオン脂質）、アニオン性脂質、形質移入を強化するヘルパー脂質、及びナノ粒子が生体内で存在できる時間を長くするステルス脂質である。好適なカチオン性脂質、中性脂質、アニオン性脂質、ヘルパー脂質、及びステルス脂質の例はＷＯ２０１６／０１０８４０Ａ１に見いだすことができ、すべての目的のためにその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
生体内での投与は、例えば、非経口、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、くも膜下腔内、腹腔内、局所、鼻腔内、または筋肉内を含む任意の好適な経路によることができる。全身投与様式には、例えば、経口経路及び非経口経路が含まれる。非経口経路の例には、静脈内、動脈内、骨内、筋肉内、皮内、皮下、鼻腔内、及び腹腔内の経路が挙げられる。具体的な例は静脈内注入である。鼻腔内注入及び硝子体内注射は他の特定の例である。局所投与様式には、例えば、髄腔内、脳室内、実質内（例えば、線条体への局所的な実質内送達（例えば、尾状または被殻へ）、大脳皮質、中心前回、海馬（例えば、歯状回またはＣＡ３領域）、側頭皮質、扁桃体、前頭皮質、視床、小脳、髄質、視床下部、蓋、被蓋、または黒質）、眼内、眼窩内、結膜下、硝子体内、網膜下、及び経強膜の経路が挙げられる。（全身性アプローチと比べて）有意に少量の成分は、全身性（例えば、静脈内）に投与された場合と比べて、局所性（例えば、実質内または硝子体内）に投与された場合に効果を発揮してもよい。局所投与様式はまた、治療有効量の成分が全身投与されるときに起こってもよい潜在的に毒性の副作用の発生を低減してもよく、または排除してもよい。
細胞培養における試薬（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）の取り込みを促進するための１つの一般的な方法は、核酸を形質移入するためのカチオン性脂質の使用を含む。カチオン性脂質を負に帯電した核酸と混合すると、細胞膜を通過して活性核酸を細胞の細胞質に放出することができる複合体が得られる。試薬（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）を細胞に電気穿孔法で入れることも可能である。この方法は、脂質によって容易に形質移入することができない細胞株に非常に効果的で且つ有用である。
細胞が生体内にある場合（例えば、動物において）、動物への投与は任意の好適な手段によって行うことができる。例えば、投与は、腹腔内、静脈内、及び皮下のような非経口投与経路を含むことができる。非経口投与とは注入または輸液を介する投与を意味する。非経口投与には、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、動脈内投与、腹腔内投与、または頭蓋内投与（例えば、髄腔内もしくは脳室内投与）が挙げられる。
いくつかの方法では、投与は、導入される試薬がニューロンまたは神経系に到達するような手段によるものである。これは、例えば、末梢送達または神経系への直接送達によって達成することができる。例えば、Ｅｖｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（２０１５），Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｓ．８７：９０－１０３（あらゆる目的でその全体が参照によって本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
試薬（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）が神経系に到達するためには、それらは最初に、血液脳関門または血液脊髄関門で構成される血管関門を通過しなければならない。血管関門を通過するのに使用することができる１つのメカニズムは受容体が介在するエンドサイトーシスである。使用することができる別のメカニズムは、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）に基づいた送達システムである。異なるＣＰＰは、細胞の種類とカーゴに依存する別個の細胞転位経路を使用する。例えば、アルギニンに富むＣＰＰでタグ付けされた全身送達されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは血液脳関門を通過することができる。使用することができる別の送達メカニズムは、タンパク質と核酸の移動を介して細胞間のコミュニケーションに介在することが知られている細胞外小胞であるエクソソームである。例えば、狂犬病ウイルス糖タンパク質（ＲＶＧ）に由来する短いウイルスペプチドで形質導入されたエクソソームのＩＶ注射は、血液脳関門を通過して脳に送達され得る。
脳脊髄液への直接注入を介して血管関門を迂回する技術も利用できる。例えば、試薬（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）を脳室内（ＩＣＶ）に注入することができ、その後、試薬（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、実質に入るために脳室系を満たす上衣細胞層を通過しなければならない。髄腔内（ＩＴ）送達とは、脊髄のクモ膜下腔への試薬（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）の送達を意味する。ここから、試薬（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は実質に入るには軟膜を通過する必要がある。試薬（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、埋め込まれたリザーバーに接続されている出口カテーテルを介してＩＣＴまたはＩＴで送達することができる。薬物はリザーバーに注入され、ＣＳＦに直接送達される。鼻腔内投与は使用することができる代替の送達経路である。
本発明の範囲は、本明細書に添付された特許請求の範囲によって定義され、本明細書に記載されている特定の実施形態によって限定されない；本開示を読む当業者は、そのような記載された実施形態と同等であってもよい、そうでなければクレーム内にあってもよい種々の修正に気付くであろう。一般に、用語は、特に明記しない限り、当該技術分野で理解されている意味に従う。本明細書の範囲内で引用された参考文献、またはその関連部分はその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
請求項要素を修飾するための特許請求の範囲での「第１」、「第２」、「第３」のような序数用語の使用は、それ自体では、ある請求項要素の別の請求項要素に対する優先順位、優位順位、または順序、または方法の動作が実行される時間的順序を意味するものではないが、特定の名称を有する１つの請求項要素を同じ名称（序数用語の使用を別にして）を有する別の要素から区別して請求項要素を区別するためのラベルとして単に使用される。
明細書及び特許請求の範囲の冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、特に反対に明確に示されていない限り、複数の指示対象を含むと理解されるべきである。群の１以上のメンバーの間に「または」を含む請求項または記載は、その反対が示される、または別途文脈から明白でない限り、１つ、１を超える、または全ての群メンバーが所与の製品または過程において存在する、採用される、または別途関連していれば、満たされると見なされる。本発明は、群の正確に１つのメンバーが、所与の製品または過程において存在する、採用される、または別途関連している実施形態を含む。本発明は、１を超える、または全ての群メンバーが、所与の製品または過程において存在する、採用される、または別途それらに関連している実施形態も含む。さらに、本発明は、列挙された請求項の１以上からの１以上の限定、要素、条項、記述用語等が、別段の指示がない限り、または当業者に矛盾または不一致が生じることが明らかでない限り、同じ基本請求項（または関連する場合は他の請求項）に依存する別の請求項に導入されるすべての変形、組み合わせ、及び順列を包含することを理解すべきである。要素が一覧（例えば、Ｍａｒｋｕｓｈ群形式または類似の形式で）として提示された場合、要素の各亜群も開示され、いずれの要素（複数可）もこの群から除去され得ることが理解されるべきである。一般的に、本発明、または本発明の態様が特定の要素、特徴等を含むとして言及している場合、本発明の実施形態または本発明の態様は、そのような要素、特徴等から成る、または本質的に成ることが理解されるべきである。簡潔さを目的として、それらの実施形態はあらゆる場合に、本明細書で文字どおり具体的に記述されているわけではない。特定の除外が明細書に記載されているかどうかに関係なく、本発明の任意の実施形態または態様を特許請求の範囲から明示的に除外できることも理解すべきである。
「対照」は、結果が比較される標準であるという「対照」の当該技術分野で理解された意味を含む。通常、対照は、変数についての結論を出すためにそのような変数を分離することによって実験における完全性を増強するのに使用される。いくつかの実施形態では、対照は、比較基準を提供するための試験反応またはアッセイと同時に実施される反応またはアッセイである。「対照」は「対照動物」も含む。「対照動物」は本明細書に記載されている改変、本明細書に記載されている異なる改変、または改変なし（すなわち、野生型動物）を有してもよい。１つの実験では、「試験」（すなわち、調べられる変数）が適用される。第２の実験では、「対照」、調べられる変数は適用されない。いくつかの実施形態では、対照は、既存対照（すなわち、既に実施された試験もしくはアッセイ、または既に知られている量もしくは結果の）である。いくつかの実施形態では、対照は、印刷されたまたは別の方法で保存された記録である、またはそれを含む。対照は、正の対照または負の対照であってもよい。
「決定すること」、「測定すること」、「評価すること」、「評価すること」、「アッセイすること」及び「分析すること」は、任意の形態の測定を含み、要素が存在するかどうかを決定することを含む。これらの用語には、定量的及び／または定性的な決定の双方が含まれる。アッセイは相対的であってもよいし、または絶対的であってもよい。「存在について分析すること」は、存在するものの量を決定すること、及び／またはそれが存在するか存在しないかを決定することであることができる。
本明細書で相互交換可能に使用される「核酸」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはそれらの類似体または修飾型を含む、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を含む。それらには、一本鎖、二本鎖、及び多本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、及びプリン塩基、ピリミジン塩基、または他の天然の、化学修飾された、生化学修飾された、非天然の、または誘導体化されたヌクレオチド塩基が含まれる。
本明細書で相互交換可能に使用される「タンパク質」、「ポリペプチド」、及び「ペプチド」という用語は、コード化された及びコード化されないアミノ酸及び化学的または生化学的に修飾されたまたは誘導体化されたアミノ酸を含む、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を含む。この用語はまた、修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドのような修飾されているポリマーも含む。「ドメイン」という用語は、特定の機能または構造を有するタンパク質またはポリペプチドの任意の部分を指す。特に明記しない限り、本明細書で言及される任意の構造ドメインはＴＤＰ－４３構造ドメインを指す。
「野生型」という用語には、正常の（変異型、病気、変化などとは対照的な）状態または状況で見られるような構造及び／または活性を有する実体が含まれる。野生型の遺伝子及びポリペプチドは、複数の異なる形態（例えば、対立遺伝子）で存在することが多い。
「内在性」という用語は、細胞内または動物内で自然に見いだされる、または存在する位置、核酸またはアミノ酸の配列を指す。例えば、非ヒト動物の内在性ＴＡＲＤＢＰ配列は、非ヒト動物の内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子座で自然に存在する野生型ＴＡＲＤＢＰ配列を指す。
「遺伝子座」という用語は、遺伝子（または重要な配列）、ＤＮＡ配列、ポリペプチドをコードする配列の特定の位置、または生物のゲノムの染色体上の位置を指す。例えば、「ＴＡＲＤＢＰ遺伝子座」は、ＴＡＲＤＢＰ遺伝子、ＴＡＲＤＢＰのＤＮＡ配列、ＴＡＲＤＢＰ２をコードする配列の特定の位置、またはどこにそのような配列が存在するかを特定されている生物のゲノムの染色体上のＴＡＲＤＢＰ位置を指してもよい。「ＴＡＲＤＢＰ遺伝子座」は、例えば、エンハンサー、プロモーター、５’及び／または３’の非翻訳領域（ＵＴＲ）、またはそれらの組み合わせを含む、ＴＡＲＤＢＰ遺伝子の調節要素を含んでもよい。
「遺伝子」という用語は、産物（例えば、ＲＮＡ産物及び／またはポリペプチド産物）をコードする染色体におけるＤＮＡ配列を指し、遺伝子が完全長ｍＲＮＡ（５’及び３’非翻訳配列を含む）に対応するように非コードイントロンによって中断されるコード領域と５’及び３’末端の双方でコード領域に隣接して位置する配列を含む。遺伝子の他の非コード配列には、調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、及び転写因子結合部位）、ポリアデニル化シグナル、内部リボソーム進入部位、サイレンサー隔離配列、及びマトリックス結合領域が含まれる。これらの配列は、遺伝子のコード領域に近くてもよく（例えば、１０ｋｂ以内）、または離れた部位にあってもよく、それらは、遺伝子の転写及び翻訳のレベルまたは速度に影響を与える。
「対立遺伝子」という用語は遺伝子の変異形態を指す。いくつかの遺伝子は、染色体上の同じ位置、または遺伝子座に位置する種々の異なる形態を有する。二倍体生物は２つの対立遺伝子を有し、それぞれが相同染色体の内在性遺伝子座にある。対立遺伝子の各対は特定の遺伝子座の遺伝子型を表す。遺伝子型は、特定の遺伝子座に２つの同一の対立遺伝子がある場合はホモ接合性であり、２つの対立遺伝子が異なる場合はヘテロ接合性であると記載される。
「作動可能に連結された」は、記載されている構成要素がその意図される様式で機能することを可能する関係にある並置を含む。コード配列に「作動可能に連結された」制御配列は、コード配列の発現が制御配列と適合する条件下で達成されるような方法で連結される。「作動可能に連結された」配列は、目的の遺伝子と連続する発現制御配列、及び目的の遺伝子を制御するためにトランスでまたは遠隔で作用する発現制御配列の双方を含む。「発現制御配列」という用語は、それらが連結しているコード配列の発現及びプロセシングに影響を及ぼすのに必要なポリヌクレオチド配列を含む。発現制御配列は、適切な転写開始配列、終結配列、プロモーター及びエンハンサー配列；スプライシングシグナル及びポリアデニル化シグナルのような効率的なＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定させる配列；翻訳効率を高める配列（例えば、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）；タンパク質の安定性を高める配列；ならびに所望であれば、タンパク質の分泌を高める配列を含む。そのような制御配列の性質は宿主生物に応じて異なる。例えば、原核生物ではそのような制御配列は一般にプロモーター、リボソーム結合部位、及び転写終結配列を含む一方で、真核生物では通常、そのような制御配列はプロモーター及び転写終結配列を含む。「制御配列」という用語は、その存在が発現及びプロセシングに必須である構成要素を含むことが意図され、その存在が有利である、例えば、リーダー配列及び融合パートナー配列である追加の構成要素も含むことができる。
「表現型」には、細胞もしくは生物によって示される形質、または形質のクラスまたはセットが含まれる。いくつかの実施形態では、特定の表現型は特定の対立遺伝子または遺伝子型と相関してもよい。いくつかの実施形態では、表現型は離散的であってもよく；いくつかの実施形態では、表現型は連続的であってもよい。表現型は細胞の生存能力または細胞適応度を含んでもよい。表現型は、タンパク質、例えば、変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドの発現レベル、細胞局在性及び／または溶解性／安定性のプロファイルを含んでもよく、これらの表現型のそれぞれは、ウエスタンブロット分析、蛍光原位置ハイブリッド形成、定性的ＲＴ－ＰＣＲ等のような周知の方法を用いて決定されてもよい。
「プロモーター」は、特定のポリヌクレオチド配列の適切な転写開始部位でＲＮＡ合成を開始するようにＲＮＡポリメラーゼＩＩに指示することができるＴＡＴＡボックスをふつう含むＤＮＡの調節領域である。プロモーターは転写開始速度に影響を与える他の領域をさらに含んでもよい。本明細書で開示されているプロモーター配列は作動可能に連結されたポリヌクレオチドの転写を調節する。プロモーターは、本明細書で開示されている１以上の細胞型（例えば、真核細胞、非ヒト哺乳動物細胞、ヒト細胞、齧歯類細胞、多能性細胞、一細胞期胚、分化した細胞またはそれらの組み合わせ）において活性があることができる。プロモーターは、例えば、構成的に活性があるプロモーター、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、時間的に制限されたプロモーター（例えば、発生上調節されるプロモーター）、または空間的に制限されたプロモーター（例えば、細胞特異的または組織特異的プロモーター）であることができる。プロモーターの例は、例えば、ＷＯ２０１３／１７６７７２に見いだすことができ、あらゆる目的のためにその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
「参照」には、対象の薬剤、細胞、動物、コホート、個体、集団、試料、配列または値が比較される標準または対照の薬剤、細胞、動物、コホート、個体、集団、試料、配列、または値が含まれる。いくつかの実施形態では、参照の薬剤、細胞、動物、コホート、個体、集団、試料、配列または値は、対象の薬剤、細胞、動物、コホート、個体、集団、試料、配列、または値の試験または決定と実質的に同時に試験され、及び／または決定される。いくつかの実施形態では、参照の薬剤、細胞、動物、コホート、個体、集団、試料、配列または値は、歴史的参照であり、任意で有形媒体に具体化される。いくつかの実施形態では、参照は対照を指してもよい。「参照」には「参照細胞」も含まれる。「参照細胞」は、本明細書に記載されている修飾、本明細書に記載されているように異なる修飾、または修飾なし（すなわち、野生型細胞）を有してもよい。通常、当業者によって理解されるように、参照の薬剤、細胞、動物、コホート、個体、集団、試料、配列または値は、対象の薬剤、動物（例えば、哺乳類）、コホート、個人、母集団、試料、配列、また値を決定するまたは特徴付けるために利用される条件に匹敵する条件下で決定される、または特徴付けられる。
「変異体」という用語は、参照ヌクレオチド配列とは異なるヌクレオチド配列（例えば、１つのヌクレオチドによって）、または参照アミノ酸配列とは異なるが（例えば、１つのアミノ酸によって）、参照配列の生物学的機能を保持しているタンパク質配列を指す。いくつかの実施形態では、変異体は、遺伝子コードの縮重及び／または保存的コドン／アミノ酸置換のせいで参照配列とは異なる。
２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列との関係における「配列同一性」または「同一性」という用語は、特定の比較ウィンドウにわたって最大一致するように配列比較したときに同じである、その２つの配列における残基に言及する。タンパク質に関して配列同一性の百分率を使用する場合、同一ではない残基の位置は、保存的なアミノ酸置換によって異なることが多く、アミノ酸残基は、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を持つ他のアミノ酸残基に置換されるので、分子の機能特性を変えない。配列が保存的置換で異なる場合、配列同一性パーセントは置換の保存的な性質によって補正するように上方調整されてもよい。そのような保守的な置換によって異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有すると言われる。この調整を行うための手段は周知である。通常、これには、完全なミスマッチではなく部分的なミスマッチとして保守的な置換をスコア化することが含まれ、それによって配列同一性の百分率が増加する。したがって、例えば、同一のアミノ酸に１のスコアが与えられ、非保存的置換にゼロのスコアが与えられる場合、保存的置換にはゼロから１の間のスコアが与えられる。保存的置換のスコア化は、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）に実装されているように計算される。
「配列同一性の百分率」は、比較ウィンドウにわたって２つの最適に整列させた配列を比較することによって決定される値（完全に一致する残基の最大数）を含み、その際、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適な配列比較のための参照配列（付加または欠失を含まない）と比べて付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。百分率は、双方の配列で一致する核酸塩基またはアミノ酸残基が存在する位置の数を決定して一致する位置の数を得ることと、一致した位置の数を比較のウインドウにおける位置の総数で割ることと、結果に１００を乗じて配列同一性の百分率を得ることとによって算出される。特に明記されていない限り（例えば、短い方の配列には連結された異種配列が含まれる）、比較ウィンドウは比較される２つの配列のうち短い方の完全長である。
特に明記しない限り、配列の同一性／類似性の値には、以下のパラメーター：５０のＧＡＰ加重及び３の長さ加重を用いたヌクレオチド配列についての％同一性及び％類似性、及びｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコア化マトリックス；２のＧＡＰ加重及び３の長さ加重を用いたアミノ酸配列についての％同一性及び％類似性、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコア化マトリックス；またはその同等のプログラムを用いたＧＡＰバージョン１０を使用して取得した値が含まれる。「同等のプログラム」には、問題の任意の２つの配列について、ＧＡＰバージョン１０によって生成された対応する配列比較と比較した場合に、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の一致と同一のパーセント配列同一性を有する配列比較を生成する任意の配列比較プログラムが含まれる。
「保存的アミノ酸置換」という用語は、配列に通常存在するアミノ酸を、類似のサイズ、電荷、または極性を持つ異なるアミノ酸で置換することを指す。保存的置換の例には、イソロイシン、バリン、またはロイシンのような非極性（疎水性）残基の別の非極性残基への置換が挙げられる。同様に、保存的置換の例には、アルギニンとリジンの間、グルタミンとアスパラギンの間、またはグリシンとセリンの間のような、ある極性（親水性）残基の別の残基への置換が挙げられる。さらに、リシン、アルギニン、またはヒスチジンのような塩基性残基を別の残基に置換すること、またはアスパラギン酸またはグルタミン酸のようなある酸性残基を別の酸性残基に置換することは、保存的置換の追加の例である。非保存的置換の例には、システイン、グルタミン、グルタミン酸またはリジンのような極性（親水性）残基のイソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、またはメチオニンのような非極性（疎水性）アミノ酸残基による置換、及び／または非極性残基の極性残基による置換が挙げられる。典型的なアミノ酸の分類は以下の表１に要約されている。
表１．アミノ酸の分類。
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「試験管内」という用語は、人工的環境（例えば、試験管）、及び人工的環境内で生じるプロセスまたは反応を含む。「生体内」という用語は、自然環境（例えば、細胞または生物または生体）及び自然環境内で生じるプロセスまたは反応を含む。「生体外」という用語は、個体の体から取り除かれた細胞、及びそのような細胞内で生じるプロセスまたは反応を含む。
非限定的な例示的な実施形態には以下が含まれる。
実施形態１．変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子を含む非ヒト動物細胞であって、
前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドは、野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドに見られる機能的構造ドメインを欠き、
前記非ヒト動物または非ヒト動物細胞は、前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドを発現し、
任意で、前記野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドは、配列番号１、配列番号３、または配列番号５として示される配列を含む、前記非ヒト動物細胞。
実施形態２．前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドが、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、ＲＮＡ認識モチーフ１（ＲＲＭ１）、ＲＮＡ認識モチーフ２（ＲＲＭ２）、推定核外輸送シグナル（Ｅ）、プリオン様ドメイン（ＰＬＤ）、またはそれらの組み合わせを含む機能的構造ドメインを欠く、実施形態１に記載の非ヒト動物細胞。
実施形態３．前記非ヒト動物細胞が胚性幹（ＥＳ）細胞、胚様体、または胚性幹細胞由来運動ニューロン（ＥＳＭＮ）である、実施形態１または実施形態２に記載の非ヒト動物細胞。
実施形態４．前記変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子が前記非ヒト動物の変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子である、先行実施形態のいずれか１つに記載の非ヒト動物細胞。
実施形態５．前記変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子が変異させたヒトＴＡＲＤＢＰ遺伝子である、実施形態１～３のいずれか１つに記載の非ヒト動物細胞。
実施形態６．前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドが以下：
（ａ）前記ＮＬＳにおけるアミノ酸の点突然変異、
（ｂ）前記ＲＲＭ１におけるアミノ酸の点突然変異、
（ｃ）前記ＲＲＭ２におけるアミノ酸の点突然変異、
（ｄ）前記核外輸送シグナルの少なくとも一部の欠失、及び
（ｅ）前記プリオン様ドメインの少なくとも一部の欠失、の１以上に起因して機能的構造ドメインを欠く、先行実施形態のいずれか１つに記載の非ヒト動物細胞。
実施形態７．
（ａ）前記ＮＬＳにおけるアミノ酸の前記点突然変異がＫ８２Ａ Ｋ８３Ａ、Ｒ８４Ａ、Ｋ９５Ａ、Ｋ９７Ａ、Ｋ９８Ａ、またはそれらの組み合わせを含み、
（ｂ）ＲＲＭ１における前記点突然変異がＦ１４７Ｌ及び／またはＦ１４９Ｌを含み、
（ｃ）ＲＲＭ２における前記点突然変異がＦ１９４Ｌ及び／またはＦ２２９Ｌを含み、
（ｄ）前記核外輸送シグナル欠失の少なくとも一部の前記欠失が野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドの２３９位と２５０位にて及びその間でアミノ酸の欠失を含み、且つ
（ｅ）前記プリオン様ドメインの少なくとも一部の前記欠失が野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドの２７４位と４１４位にて及びその間でアミノ酸の欠失を含む、実施形態６に記載の非ヒト動物細胞。
実施形態８．前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドがＫ８２Ａ Ｋ８３Ａ、Ｒ８４Ａ、Ｋ９５Ａ、Ｋ９７Ａ、及びＫ９８Ａを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の非ヒト動物細胞。
実施形態９．前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドが野生型ポリペプチドの２７４位から４１４位のアミノ酸で前記プリオン様ドメインを欠く、先行実施形態のいずれか１つに記載の非ヒト動物細胞。
実施形態１０．前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドがＦ１４７Ｌ及びＦ１４９Ｌを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の非ヒト動物細胞。
実施形態１１．前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドがＦ１９４Ｌ及びＦ２２９Ｌを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の非ヒト動物細胞。
実施形態１２．前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドが２３９位から２５０位のアミノ酸で前記核外輸送シグナルを欠く、先行実施形態のいずれか１つに記載の非ヒト動物細胞。
実施形態１３．変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする前記変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子が内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子座にて内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子に取って代わる、先行実施形態のいずれか１つに記載の非ヒト動物細胞。
実施形態１４．前記非ヒト動物細胞が、変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする前記変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子についてヘテロ接合性である、実施形態１３に記載の非ヒト動物細胞。
実施形態１５．前記非ヒト動物細胞が、変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする前記変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子についてホモ接合性である、実施形態１３に記載の非ヒト動物細胞。
実施形態１６．前記非ヒト動物細胞がさらに、ノックアウト突然変異を含むＴＡＲＤＢＰ遺伝子を含む、実施形態１～１４のいずれか１つに記載の非ヒト動物細胞。
実施形態１７．前記ノックアウト突然変異が条件付きノックアウト突然変異を含む、実施形態１６に記載の非ヒト動物細胞。
実施形態１８．前記ノックアウト突然変異が部位特異的組換え認識配列を含む、実施形態１６または実施形態１７に記載の非ヒト動物細胞。
実施形態１９．前記ノックアウト突然変異がｌｏｘｐ配列を含む、実施形態１６～１８のいずれか１つに記載の非ヒト動物細胞。
実施形態２０．前記ｌｏｘｐ配列がノックアウト突然変異を含む前記ＴＡＲＤＢＰ遺伝子のエクソン３に隣接する、実施形態１９に記載の非ヒト動物細胞。
実施形態２１．前記ノックアウト突然変異が、ＴＤＰ－４３ペプチドのコード配列全体の欠失を含む、実施形態１６に記載の非ヒト動物細胞。
実施形態２２．前記非ヒト動物細胞が前記操作されたＴＡＲＤＢＰ遺伝子座についてヘテロ接合性であり、且つ
（ｉ）一方の染色体にて内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子座での内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子の変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする前記変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子による置換、及び
（ｉｉ）他方の相同染色体にて前記内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子座での前記ノックアウト突然変異を含む前記ＴＡＲＤＢＰ遺伝子または野生型ＴＡＲＤＢＰ遺伝子のいずれか、を含む、実施形態１６～２１のいずれか１つに記載の非ヒト動物細胞。
実施形態２３．前記非ヒト動物細胞が野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドを発現しない、先行実施形態のいずれか１つに記載の非ヒト動物細胞。
実施形態２４．前記非ヒト動物細胞が野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドを発現する、１～２２のいずれか１つに記載の非ヒト動物細胞。
実施形態２５．
（ｉ）対照細胞における野生型ＴＡＲＤＢＰ遺伝子のｍＲＮＡ転写物レベルに匹敵する前記変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子のｍＲＮＡ転写物レベル、
（ｉｉ）対照細胞における野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドのレベルと比べて前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドのレベルの増加、
（ｉｉｉ）例えば、運動ニューロンの核よりも細胞質に高濃度で見られる変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチド、
（ｉｖ）野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドと比べて不溶性が増した変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチド、
（ｖ）前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドを含む細胞質凝集体、
（ｖｉ）隠れエクソンのスプライシングの増加、及び／または
（ｖｉｉ）選択的スプライシングを受けたＴＤＰ－４３形態のレベルの低下、を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の非ヒト動物細胞。
実施形態２６．（ｉ）一方の染色体にて内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子座でのＴＡＲＤＢＰ遺伝子の条件付きノックアウト突然変異と、（ｉｉ）他方の相同染色体にて前記内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子座でのＴＡＲＤＢＰコード配列全体の欠失と、を含む、非ヒト動物細胞。
実施形態２７．前記細胞が胚性幹（ＥＳ）細胞、原始外胚葉細胞、または運動ニューロン（ＥＳＭＮ）に由来する運動ニューロンである、先行実施形態のいずれか１つに記載の非ヒト動物細胞。
実施形態２８．前記非ヒト動物細胞が齧歯類細胞である、先行実施形態のいずれか１つに記載の非ヒト動物細胞。
実施形態２９．前記非ヒト動物細胞がラット細胞である、先行実施形態のいずれか１つに記載の非ヒト動物細胞。
実施形態３０．前記非ヒト動物細胞がマウス細胞である、実施形態１～２８のいずれか１つに記載の非ヒト動物細胞。
実施形態３１．前記非ヒト動物細胞が試験管内で培養される、先行実施形態のいずれか１つに記載の非ヒト動物細胞。
実施形態３２．先行実施形態のいずれか１つに記載の非ヒト動物細胞を含む非ヒト動物組織。
実施形態３３．先行実施形態のいずれか１つに記載の非ヒト動物細胞または組織を含む組成物。
実施形態３４．変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドを発現する非ヒト動物または非ヒト動物細胞を作製する方法であって、前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子を含むように前記非ヒト動物または非ヒト動物細胞のゲノムを操作することを含み、その際、前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドは野生型ＴＤＰ－４３と比べて機能的構造ドメインを欠き、任意で、前記野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドは、配列番号１、配列番号３、または配列番号５として示される配列を含む、前記方法。
実施形態３５．操作することが、内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子を、前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする前記変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子で置き換えることを含む、実施形態３４に記載の方法。
実施形態３６．操作することがさらに、内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子を、ノックアウト突然変異を含むＴＡＲＤＢＰ遺伝子で置き換えることを含む、実施形態３４または実施形態３５に記載の方法。
実施形態３７．前記ノックアウト突然変異が条件付きノックアウト突然変異を含む、実施形態３６に記載の方法。
実施形態３８．さらに、ノックアウト突然変異を含む前記ＴＡＲＤＢＰ遺伝子の発現を排除する条件で前記細胞を培養することを含む、実施形態３７に記載の方法。
実施形態３９．疾患の治療のための治療候補を特定する方法であって、
（ａ）実施形態１～３１のいずれか１つに記載の非ヒト動物細胞もしくは組織、または実施形態３２に記載の組成物を候補薬剤と接触させることと、
（ｂ）前記非ヒト細胞または組織の表現型及び／またはＴＤＰ－４３生物活性を評価することと、
（ｃ）野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドを発現する対照の細胞または組織の表現型及び／またはＴＤＰ－４３生物活性に匹敵する表現型及び／またはＴＤＰ－４３生物活性を非ヒト細胞または組織に取り戻す前記候補薬剤を特定することと、を含む、前記方法。
実施形態４０．ＴＤＰ－４３構造ドメインの生物学的機能を評価する方法であって、
（ａ）核局在化シグナル（ＮＬＳ）、第１のＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲＭ１）、第１のＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲＭ２）、推定核外輸送シグナル（Ｅ）、プリオン様ドメイン（ＰＬＤ）、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される機能的構造ドメインを欠く変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子を含むように胚性幹（ＥＳ）細胞を操作することと、
（ｂ）任意で、前記操作されたＥＳ細胞を試験管内で分化させることと、及び／または前記操作されたＥＳ細胞から遺伝子操作された非ヒト動物を取得することと、
（ｃ）前記遺伝子操作されたＥＳ細胞、それに由来する原始外胚葉、それに由来する運動ニューロン、またはそれに由来する非ヒト動物の表現型及び／またはＴＤＰ－４３生物活性を評価することと、を含む、前記方法。
実施形態４１．前記表現型が、細胞培養、蛍光原位置ハイブリッド形成、ウエスタンブロット分析、またはそれらの組み合わせによって評価される、実施形態３９または実施形態４０に記載の方法。
実施形態４２．前記表現型を評価することが、前記遺伝子操作されたＥＳ細胞、それに由来する原始外胚葉、それに由来する運動ニューロン、またはそれに由来する非ヒト動物の生存能力を測定することを含む、実施形態３９～４１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４３．前記表現型を評価することが、前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドの細胞での位置を決定することを含む、実施形態３９～４２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４４．前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドの前記生物活性を評価することが、ＴＤＰ－４３によって調節される隠れエクソンを含む遺伝子のスプライス産物を測定することを含む、実施形態３９～４３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４５．ＴＤＰ－４３によって調節される隠れエクソンを含む前記遺伝子がＣｒｅｍ、Ｆｙｘｄ２、Ｃｌｆ１を含む、実施形態４４に記載の方法。
実施形態４６．前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドの前記生物活性を評価することが、選択的スプライシングを受けたＴＤＰ－４３のレベルを測定することを含む、実施形態３９～４５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４７．ＴＤＰ－４３ポリペプチドのＰＬＤをコードし、及び／またはエクソン６の下流とエクソン７の上流の非翻訳配列を含むＴＤＰ－４３ ｍＲＮＡ配列を標的とするギャップマーモチーフを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、
任意で、前記ＴＤＰ－ｍＲＮＡがエクソン６内の選択的５’スプライス部位と下流の選択的３’スプライス部位との間の配列を含み、
任意で、前記選択的５’スプライス部位が、（ａ）マウス第４染色体：１４８，６１８，６４７；（ｂ）マウス第４染色体：１４８，６１８，６６５；（ｃ）マウス第４染色体：１４８，６１８，６７４、及び（ｄ）ヒトＴＡＲＤＢＰ遺伝子のいずれかの対応する位置から成る群から選択されるＴＡＲＤＢＰゲノム位置に相関し、及び／または前記選択的３’スプライス部位が第４染色体：１４８，６１７，７０５のＴＡＲＤＢＰゲノム位置と相関する、前記アンチセンスオリゴヌクレオチド。
実施形態４８．ＴＤＰ－４３ポリペプチドのＰＬＤをコードし、及び／またはエクソン６の下流とエクソン７の上流の非翻訳配列を含むＴＤＰ－４３ ｍＲＮＡ配列を標的とする配列を含むｓｉＲＮＡであって、
任意で、前記ＴＤＰ－ｍＲＮＡ配列がエクソン６内の選択的５’スプライス部位と下流の選択的３’スプライス部位との間にあり、
任意で、前記選択的５’スプライス部位が、（ａ）マウス第４染色体：１４８，６１８，６４７；（ｂ）マウス第４染色体：１４８，６１８，６６５；（ｃ）マウス第４染色体：１４８，６１８，６７４、及び（ｄ）ヒトＴＡＲＤＢＰ遺伝子のいずれかの対応する位置から成る群から選択されるＴＡＲＤＢＰゲノム位置に相関し、及び／または前記選択的３’スプライス部位が第４染色体：１４８，６１７，７０５のＴＡＲＤＢＰゲノム位置と相関する、前記ｓｉＲＮＡ。
実施形態４９．Ｃａｓ９タンパク質と少なくとも１つのｇＲＮＡとを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムであって、前記ｇＲＮＡが、ＰＬＤを欠く切り詰めたＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする選択的ｍＲＮＡをもたらす選択的スプライス部位をコードする配列でのまたはその近傍の配列を認識し、
任意で、選択的スプライス部位はエクソン６内の選択的５’スプライス部位と下流の選択的３’スプライス部位とを含み、
任意で、前記選択的５’スプライス部位は、（ａ）マウス第４染色体：１４８，６１８，６４７；（ｂ）マウス第４染色体：１４８，６１８，６６５；（ｃ）マウス第４染色体：１４８，６１８，６７４、及び（ｄ）ヒトＴＡＲＤＢＰ遺伝子のいずれかの対応する位置から成る群から選択されるＴＡＲＤＢＰゲノム位置と相関し、及び／または前記選択的３’スプライス部位は第４染色体：１４８，６１７，７０５のＴＡＲＤＢＰゲノム位置と相関する、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム。
実施形態５０．実施形態２に記載の胚性幹細胞を含む、非ヒト動物。
実施形態５１．変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子を含む非ヒト動物であって、
前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドは野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドと比べて機能的構造ドメインを欠き、且つ
前記非ヒト動物は前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドを発現する、
任意で、前記野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドは配列番号１、配列番号３、または配列番号５として示される配列を含む、前記非ヒト動物。
実施形態５２．前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドが、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、ＲＮＡ認識モチーフ１（ＲＲＭ１）、ＲＮＡ認識モチーフ２（ＲＲＭ２）、推定核外輸送シグナル（Ｅ）、プリオン様ドメイン（ＰＬＤ）、またはそれらの組み合わせを含む機能的構造ドメインを欠く、実施形態５１に記載の非ヒト動物。
実施形態５３．前記変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子が前記非ヒト動物の変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子である、実施形態５１または実施形態５２に記載の非ヒト動物。
実施形態５４．前記変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子が変異させたヒトＴＡＲＤＢＰ遺伝子である、実施形態５１～５３のいずれか１つに記載の非ヒト動物。
実施形態５５．前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドが以下：
（ａ）前記ＮＬＳにおけるアミノ酸の点突然変異、
（ｂ）前記ＲＲＭ１におけるアミノ酸の点突然変異、
（ｃ）前記ＲＲＭ２におけるアミノ酸の点突然変異、
（ｄ）前記核外輸送シグナルの少なくとも一部の欠失、及び
（ｅ）前記プリオン様ドメインの少なくとも一部の欠失、の１以上に起因して機能的構造ドメインを欠く、実施形態５１～５４のいずれか１つに記載の非ヒト動物。
実施形態５６．
（ａ）前記ＮＬＳにおけるアミノ酸の前記点突然変異が、Ｋ８２Ａ Ｋ８３Ａ、Ｒ８４Ａ、Ｋ９５Ａ、Ｋ９７Ａ、Ｋ９８Ａ、またはそれらの組み合わせを含み、
（ｂ）ＲＲＭ１における前記点突然変異がＦ１４７Ｌ及び／またはＦ１４９Ｌを含み、
（ｃ）ＲＲＭ２における前記点突然変異がＦ１９４Ｌ及び／またはＦ２２９Ｌを含み、
（ｄ）前記核外輸送シグナル欠失の少なくとも一部の前記欠失が野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドの２３９位と２５０位にて及びその間でアミノ酸の欠失を含み、且つ
（ｅ）前記プリオン様ドメインの少なくとも一部の前記欠失が野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドの２７４位と４１４位にて及びその間でアミノ酸の欠失を含む、実施形態５５に記載の非ヒト動物。
実施形態５７．前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドがＫ８２Ａ Ｋ８３Ａ、Ｒ８４Ａ、Ｋ９５Ａ、Ｋ９７Ａ、及びＫ９８Ａを含む、実施形態５１～５６のいずれか１つに記載の非ヒト動物。
実施形態５８．前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドが野生型ポリペプチドの２７４位から４１４位のアミノ酸で前記プリオン様ドメインを欠く、実施形態５１～５７のいずれか１つに記載の非ヒト動物。
実施形態５９．前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドがＦ１４７Ｌ及びＦ１４９Ｌを含む、実施形態５１～５８のいずれか１つに記載の非ヒト動物。
実施形態６０．前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドがＦ１９４Ｌ及びＦ２２９Ｌを含む、実施形態５１～５９のいずれか１つに記載の非ヒト動物。
実施形態６１．前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドが２３９位から２５０位のアミノ酸で前記核外輸送シグナルを欠く、実施形態５１～６０のいずれか１つに記載の非ヒト動物。
実施形態６２．変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする前記変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子が内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子座にて内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子に取って代わる、実施形態５１～６１のいずれか１つに記載の非ヒト動物。
実施形態６３．前記非ヒト動物が、変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする前記変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子についてヘテロ接合性である、実施形態６２に記載の非ヒト動物。
実施形態６４．前記非ヒト動物がさらに、ノックアウト突然変異を含むＴＡＲＤＢＰ遺伝子を含む、実施形態５１～６３のいずれか１つに記載の非ヒト動物。
実施形態６５．前記ノックアウト突然変異が条件付きノックアウト突然変異を含む、実施形態６４に記載の非ヒト動物。
実施形態６６．前記ノックアウト突然変異が部位特異的組換え認識配列を含む、実施形態６４または実施形態６５に記載の非ヒト動物。
実施形態６７．前記ノックアウト突然変異がｌｏｘｐ配列を含む、実施形態６４～６６のいずれか１つに記載の非ヒト動物。
実施形態６８．前記ｌｏｘｐ配列がノックアウト突然変異を含む前記ＴＡＲＤＢＰ遺伝子のエクソン３に隣接する、実施形態６７に記載の非ヒト動物。
実施形態６９．前記ノックアウト突然変異がＴＤＰ－４３ペプチドのコード配列全体の欠失を含む、実施形態６４に記載の非ヒト動物。
実施形態７０．前記非ヒト動物が前記操作されたＴＡＲＤＢＰ遺伝子座についてヘテロ接合性であり、且つ
（ｉ）一方の染色体にて内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子座での内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子の、変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする前記変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子による置換、及び
（ｉｉ）他方の相同染色体にて前記内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子座での、前記ノックアウト突然変異を含む前記ＴＡＲＤＢＰ遺伝子または野生型ＴＡＲＤＢＰ遺伝子のいずれか、を含む、実施形態６４～６９のいずれか１つに記載の非ヒト動物。
実施形態７１．前記非ヒト動物が野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドを発現する、実施形態５０～７０のいずれか１つに記載の非ヒト動物。
実施形態７２．
（ｉ）対照動物における野生型ＴＡＲＤＢＰ遺伝子のｍＲＮＡ転写物レベルに匹敵する前記変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子のｍＲＮＡ転写物レベル、
（ｉｉ）対照動物における野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドのレベルと比べて前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドのレベルの増加、
（ｉｉｉ）例えば、運動ニューロンの核よりも細胞質に高濃度で見られる変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチド、
（ｉｖ）野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドと比べて不溶性が増した変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチド、
（ｖ）前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドを含む細胞質凝集体、
（ｖｉ）隠れエクソンのスプライシングの増加、
（ｖｉｉ）選択的スプライシングを受けたＴＤＰ－４３形態のレベルの低下、
（ｖｉｉｉ）前脛骨筋のような主に速筋で構成される筋肉組織の脱神経、及び／または
（ｉｘ）肋間筋のような主に遅筋で構成される筋肉組織の正常な神経支配、を含む、実施形態５０～７１のいずれか１つに記載の非ヒト動物。
実施形態７３．内在性ＴＲＡＤＢＰ遺伝子座にて条件付きノックアウト突然変異を含むＴＡＲＤＢＰ遺伝子を含み、且つ相同染色体の他方の内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子座にて、ＴＡＲＤＢＰコード配列全体の欠失を含むＴＡＲＤＢＰ遺伝子を含む、非ヒト動物。
実施形態７４．前記非ヒト動物が齧歯動物である、実施形態５０～７３のいずれか１つに記載の非ヒト動物。
実施形態７５．前記非ヒト動物がラットである、実施形態５０～７４のいずれか１つに記載の非ヒト動物。
実施形態７６．前記非ヒト動物がマウスである、実施形態５０～７４のいずれか１つに記載の非ヒト動物。
実施形態７７．疾患の治療のための治療候補を特定する方法であって、
（ａ）実施形態５０～７６のいずれか１つに記載の非ヒト動物を候補薬剤と接触させることと、
（ｂ）前記非ヒト動物の表現型及び／またはＴＤＰ－４３生物活性を評価することと、
（ｃ）前記非ヒトが表現型及び／またはＴＤＰ－４３生物活性を取り戻す前記候補薬剤を特定することとを含む、前記方法。
実施形態７８．変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドであって、以下：
（ａ）ＮＬＳにおけるアミノ酸の点突然変異、
（ｂ）ＲＲＭ１におけるアミノ酸の点突然変異、
（ｃ）ＲＲＭ２におけるアミノ酸の点突然変異、
（ｄ）核外輸送シグナルの少なくとも一部の欠失、及び
（ｅ）プリオン様ドメインの少なくとも一部の欠失、の１以上を含むように修飾された配列番号１、３、または５として示される配列を含む、前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチド。
実施形態７９．
（ａ）前記ＮＬＳにおけるアミノ酸の前記点突然変異が、Ｋ８２Ａ Ｋ８３Ａ、Ｒ８４Ａ、Ｋ９５Ａ、Ｋ９７Ａ、Ｋ９８Ａ、またはそれらの組み合わせを含み、
（ｂ）ＲＲＭ１における前記点突然変異がＦ１４７Ｌ及び／またはＦ１４９Ｌを含み、
（ｃ）ＲＲＭ２における前記点突然変異がＦ１９４Ｌ及び／またはＦ２２９Ｌを含み、
（ｄ）前記核外輸送シグナル欠失の少なくとも一部の前記欠失が、野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドの２３９位と２５０位にて及びその間でアミノ酸の欠失を含み、且つ
（ｅ）前記プリオン様ドメインの少なくとも一部の前記欠失が、野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドの２７４位と４１４位にて及びその間でアミノ酸の欠失を含む、実施形態７８に記載の変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチド。
実施形態８０．Ｋ８２Ａ突然変異、Ｋ８３Ａ突然変異、Ｒ８４Ａ突然変異、Ｋ９５Ａ突然変異、Ｋ９７Ａ突然変異、及び／またはＫ９８Ａ突然変異を含む、実施形態７８または実施形態７９に記載の変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチド。
実施形態８１．野生型ポリペプチドの２７４位から４１４位のアミノ酸で前記プリオン様ドメインの欠失を含む、実施形態７８～８０のいずれか１つに記載の変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチド。
実施形態８２．前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドがＦ１４７Ｌ突然変異及び／またはＦ１４９Ｌ突然変異を含む、実施形態７８～８１のいずれか１つに記載の変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチド。
実施形態８３．前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドがＦ１９４Ｌ突然変異及び／またはＦ２２９Ｌ突然変異を含む、実施形態７８～８２のいずれか１つに記載の変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチド。
実施形態８４．前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドが２３９位から２５０位のアミノ酸で前記核外輸送シグナルを欠く、実施形態７８～８３のいずれか１つに記載の変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチド。
実施形態８５．実施形態７８～８４のいずれか１つに記載の変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、核酸。
実施形態８６．さらに、５’から３’に向かって：５’相同性アームと、前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする前記核酸配列と、３’相同性アームとを含み、前記核酸が齧歯類細胞にて相同組換えを受ける、実施形態８５に記載の核酸。
実施形態８７．前記核酸が内在性ラットＴＡＲＤＢＰ遺伝子座にて相同組換えを受け、前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする前記核酸配列が前記内在性ＴＡＲＤＢＰコード配列を置き換えるように前記５’及び３’の相同性アームがラット配列に相同である、実施形態８６に記載の核酸。
実施形態８８．前記核酸が内在性マウスＴＡＲＤＢＰ遺伝子座にて相同組換えを受け、前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする前記核酸配列が前記内在性ＴＡＲＤＢＰコード配列を置き換えるように前記５’及び３’の相同性アームがマウス配列に相同である、実施形態８６に記載の核酸。
実施形態８９．細胞にてＰＬＤを欠く切り詰めたＴＤＰ－４３をコードする選択的ＴＤＰ－４３ ｍＲＮＡを温存しながら、ＰＬＤを含むＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードするＴＤＰ－４３ ｍＲＮＡを選択的に減少させる方法であって、
（ｉ）ＴＤＰ－４３ポリペプチドのＰＬＤをコードし、及び／またはエクソン６の下流及びエクソン７の上流の非翻訳配列を含むＴＤＰ－４３ ｍＲＮＡ配列を標的とするギャップマーモチーフを含むアンチセンスオリゴヌクレオチド、
（ｉｉ）ＴＤＰ－４３ポリペプチドのＰＬＤをコードし、及び／またはエクソン６の下流及びエクソン７の上流の非翻訳配列を含むＴＤＰ－４３ ｍＲＮＡ配列を標的とする配列を含むｓｉＲＮＡ、及び／または
（ｉｉｉ）ＰＬＤを欠く切り詰め型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする選択的ｍＲＮＡをもたらす選択的スプライス部位をコードする配列でのまたはその近傍の配列を、ｇＲＮＡが認識する、Ｃａｓ９タンパク質と少なくとも１つの前記ｇＲＮＡとを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、を前記細胞に導入することを含む、前記方法。
実施形態９０．
（ｉ）前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが実施形態４７のＡＳＯであり、
（ｉｉ）前記ｓｉＲＮＡが実施形態４８のｓｉＲＮＡであり、及び／または
（ｉｉｉ）前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが実施形態４９のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムである、実施形態８９に記載の方法。
実施形態９１．前記細胞が生体内に存在する、実施形態８９または９０に記載の方法。
配列の簡単な説明
Figure 2022539517000002
Figure 2022539517000003
以下の実施例は、例証目的のためのみに提供されており、本発明の範囲を限定するようには意図されていない。
実施例１：変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子を発現する胚性幹細胞の生成
ＴＤＰ－４３は生存能力に不可欠であるので、第１の内在性対立遺伝子由来の野生型ＴＤＰ－４３が状態の活性化までＥＳ細胞の生存能力を持続させ、その活性化後、第２の対立遺伝子から発現される変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドの効果が確かめられてもよいように、第１の内在性ＴＤＰ－４３対立遺伝子における条件付きノックアウトと他方の第２の内在性ＴＤＰ－４３対立遺伝子における変異とを含む胚性幹（ＥＳ）細胞が生成されてもよい。
種々のＴＤＰ－４３構造ドメインが担う生物学的、生化学的、及び／または病原性の役割を評価するために、（ｉ）内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子座にて条件付きノックアウト突然変異と、（ｉｉ）相同染色体上の他方のＴＡＲＤＢＰ遺伝子座にて、５つの構造ドメイン―核局在化シグナル（ＮＬＳ）、ＲＮＡ認識モチーフ１（ＲＲＭ１）、ＲＮＡ認識モチーフ２（ＲＲＭ２）、推定核外輸送シグナル（Ｅ）、またはプリオン様ドメイン（ＰＬＤ）―のうち１つが機能を無効すると予測される方法で変更された、または欠失させられた変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子と、を含むようにマウスＥＳ細胞を操作した。図３を参照のこと。変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子（複数可）を内部に持ち、且つ機能的なＮＬＳ、ＲＲＭ１、ＲＲＭ２、ＥまたはＰＬＤを欠く変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドを発現する細胞の変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドの（１）表現型及び（２）生物活性の双方をそれぞれ実施例２及び３に記載されているように分析した。
条件付き対立遺伝子は、ＴＤＰ－４３エクソン３の欠失が機能的タンパク質を生成しないことを示す以前に発表された研究に基づいて設計した。Ｃｈｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１０），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１０７：１６３２０－３２４．内在性マウスＴＡＲＤＢＰ遺伝子のエクソン３はｌｏｘＰ部位にてｌｏｘＰが導入された。Ｃｒｅが介在する組換えの後、ゲノム座標ｃｈｒ４：１４７９９５８４４－１４７９９６８４１の欠失が達成された。ｌｏｘＰが導入されたエクソン３を含むＥＳ細胞をさらに、本明細書に記載されているように変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子で操作した。対照として、一方の対立遺伝子での条件付きノックアウト突然変異と、他方の対立遺伝子での第２エクソンの開始コドンから終止コドンまでの欠失（ゲノム座標ｃｈｒ４：１４７９９２３７０－１４７９９９４７１）とによって操作されたマウスＥＳ細胞も作り出した。
実施例２：変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子を発現する細胞の表現型分析
実施例１で生成された胚性幹（ＥＳ）細胞、それに由来する原始外胚葉、またはそれに由来する運動ニューロン（ＥＳＭＮ）の表現型を、細胞の生存能力及び変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドの局在化と安定性を評価することによって分析した。
特に、機能的なＮＬＳまたは機能的なＰＬＤを欠く変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドを発現しているＥＳ細胞は生存可能だった；ただし、機能的なＰＬＤを欠く変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドを発現している細胞は適応度が低下していると思われた。図４。機能的なＲＲＭ１またはＲＲＭ２を欠く変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドを発現しているＥＳ細胞もＥＳＭＮも生存し続けなかった。図４及び５。
機能的なＮＬＳを欠く変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドはＥＳＭＮの核から細胞質に再分布し、変異型ＴＤＰ－４３はＡＬＳ病理を連想させる多くの大きな凝集体様封入体に蓄積した。図６～８。機能的なＮＬＳの欠如は、核染色の喪失を伴う、変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドの広範な細胞質凝集を引き起こした。図７～８。機能的ＰＬＤを欠く変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドもＥＳＭＮの細胞質に再分布し、機能的ＮＬＳを欠く変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドによって生成されるものよりも豊富でない質的に異なるように見える点状封入体に蓄積した。図６～８。ＰＬＤの欠失は、核染色は保持されたものの、変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドの細胞質への最大の誤った局在を引き起こした。図７～８。
機能的なＮＬＳまたはＰＬＤを欠く変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドは変異型ＴＤＰ－４４の溶解度の増加を示した。図９Ａ。機能的ＥまたはＲＲＭ１を欠く変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドの溶解度は、野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドと比べて変化しなかった。図９Ａ。変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドのいずれについてもｍＲＮＡ発現レベルに差はなかったが、機能的なＮＬＳ、ＰＬＤ、またはＲＲＭ１を欠く変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドではタンパク質レベルの増加が見られた。図９Ｂ。これらの変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドのｍＲＮＡ発現レベルは野生型ＴＤＰ－４３の発現レベルに匹敵するので、タンパク質レベルの上昇は変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドの安定性の向上による可能性があった。図９Ｃ。
機能的構造ドメインを欠く変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドを発現する細胞の表現型を分析するのに使用される材料及び方法を以下に記載する。
細胞培養
細胞によって発現されるタンパク質の唯一の形態としての変異型ＴＤＰ－４３タンパク質の、胚性幹（ＥＳ）細胞及びそれらに由来する運動ニューロン（ＥＳＭＮ）の生存能力を支援する能力を培養での分化によって調べた。ＥＳ細胞を胚性幹細胞培地（ＥＳＭ；ＤＭＥＭ＋１５％ウシ胎児血清＋ペニシリン／ストレプトマイシン＋グルタミン＋非必須アミノ酸＋ヌクレオシド＋β－メルカプトエタノール＋ピルビン酸ナトリウム＋ＬＩＦ）で２日間培養したが、その間、培地を毎日交換した。トリプシン処理の１時間前に、ＥＳ培地を７ｍＬのＡＤＦＮＫ培地（高度なＤＭＥＭ／Ｆ１２＋神経基礎培地＋１０％ノックアウト血清＋ペニシリン／ストレプトマイシン＋グルタミン＋β－メルカプトエタノール）に交換した。ＡＤＦＮＫ培地を吸引し、ＥＳＣを０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡでトリプシン処理した。ペレットにした細胞を１２ｍＬのＡＤＦＮＫに再懸濁させ、懸濁液中で２日間増殖させた。細胞を、レチノイン酸（ＲＡ）、スムーズンドアゴニスト、及びプルモルファミンで補完したＡＤＦＮＫにてさらに４日間培養し、手足のような運動ニューロン（ＥＳＭＮ）を得た。解離させた運動ニューロンを、胚性幹細胞由来運動ニューロン培地（ＥＳＭＮ；神経基礎培地＋２％ウマ血清＋Ｂ２７＋グルタミン＋ペニシリン／ストレプトマイシン＋β－メルカプトエタノール＋１０ｎｇ／ｍＬのＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ）のプレートに入れ、成熟させた。ＥＳ細胞段階（図４、６～９）またはプレートに入れた７日後（図５）に電気穿孔を介して送達されたＣｒｅリコンビナーゼを使用して条件付きノックアウト対立遺伝子を活性化した。
変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドの細胞内局在
ＴＤＰ－４３ポリペプチドのＮ末端を認識する抗体（α－ＴＤＰ－４３Ｎ－ｔｅｒｍ）とＴＤＰ－４３ポリペプチドのＣ末端プリオン様ドメインを認識する抗体（α－ＴＤＰ－４３Ｃ－ｔｅｒｍ）（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ，Ｒｏｓｅｍｏｎｔ，ＩＬ）を使用してＴＤＰ－４３変異体の細胞内局在を分析した。可溶性細胞質タンパク質抽出物は、ＥＳ細胞由来のＭＮをプロテアーゼ及びホスファターゼの阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）で補完した氷冷溶解緩衝液（１０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、０．０１％ＮＰ－４０）にて氷上で１０分間インキュベートすることによって調製した。次に、細胞を２７ゲージの注射器に５回通した。４℃にて４０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、可溶性細胞質抽出物を含むタンパク質上清を回収した。不溶性核タンパク質抽出物は、プロテアーゼとホスファターゼで補完した等量のＲＢＳ－１００緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．４、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．１％ＮＰ－４０）にペレットを再懸濁させることによって調製した。等量の２×ＳＤＳ試料緩衝液を各画分に加え、試料を９０℃に加熱した。次に、等量の各画分を１４％ＳＤＳゲルに載せ、２２５Ｖで５０分間電気泳動した後、α－ＴＤＰ－４３－Ｎ－ｔｅｒｍ抗体またはα－ＴＤＰ－４３－Ｃ－ｔｅｒｍ抗体を使用してＴＤＰ－４３のウエスタンブロッティングを行ったが、その後者はＰＬＤ欠失変異型を認識しない。デンシトメトリーはＩｍａｇｅＪを使用して実行した。図６Ｂ。細胞質／核のＴＤＰ－４３の比率をプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ ｆｏｒ Ｐｒｉｓｍを使用して統計的に分析した。図６Ｂ；図９Ｂ、右パネル。
蛍光原位置ハイブリッド形成（ＦＩＳＨ）
ＥＳ細胞由来のＭＮをポリオルニチン／ラミニンでコーティングしたカバースリップに置き、７日間培養した。カバースリップを氷冷４％ＰＦＡにて１５分間浸漬固定し、１×ＰＢＳで洗浄した。細胞は、０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（ＴＢＳ－Ｔ）を含むＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）で希釈した５％正常ロバ血清でブロックし、５％の正常なロバ血清と共にＴＢＳ－Ｔで希釈した一次抗血清（ＴＤＰ－４３ Ｃ－ｔｅｒｍ及びＭＡＰ２）にて４℃で一晩インキュベートした。ＴＢＳ－Ｔで洗浄した後、Ａｌｅｘａ４８８及びＡｌｅｘａ５６８（１：１，０００；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）に結合した種特異的二次抗体とともに細胞を室温で１時間インキュベートした。ＴＢＳ－Ｔで洗浄した後、染色した組織カバースリップをＦｌｏｕｒｏｍｏｕｎｔ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ、ＵＳＡ）の顕微鏡スライドにて標本化し、Ｌｅｉｃａ７１０ＬＳＭ共焦点顕微鏡を使用して４０倍の倍率で画像化した。図７及び図８。
変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドの溶解度
このプロトコールは、Ｊｏ ｅｔ ａｌ．（２０１４），Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，５：３４９６から採用された。５０ｍＭのＮ－エチルマレイミド（ＮＥＭ）、１ｍＭのＮａＦ、１ｍＭのＮａ３ＶＯ４、１ｍＭのＰＭＳＦ及び各１０ｕｇ／ｍＬのアプロチニン、ロイペプチン、及びペプスタチンを含有する５００ｕｌの氷冷可溶性緩衝液（０．１ＭのＭＥＳ（ｐＨ７）、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ｍＭのＭｇＳＯ４、１Ｍのスクロース）。細胞は２１ゲージの針を３～５回通過させた後、２３ゲージの針を３～５回通過させた。次に、等量のホモジネートを各試料から回収し、５０，０００×ｇにて２０分間４℃で遠心分離し、残りを－８０℃で保存した。上清を除去し、各ペレットを、１％Ｎ－ラウロイルサルコシン（Ｓａｒｋｏｓｙｌ）及びプロテアーゼ阻害剤（１ｍＭのＰＭＳＦ、５０ｍＭのＮＥＭ、及び各１０ｕｇ／ｍＬのアプロチニン、ロイペプチン、ペプスタチン）を含有する７００ｕｌのＲＡＢ緩衝液（１００ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ６．８）、１０％スクロース、２ｍＭのＥＧＴＡ、０．５ｍＭのＭｇＳＯ４、５００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、２０ｍＭのＮａＦ）に再懸濁させ、ＲＴで１分間ボルテックスし、転倒回転しながら４℃で一晩インキュベートした。次に、試料を２００，０００×ｇで１２℃にて３０分間遠心分離し、上清をサルコシル可溶性画分として回収した。ペレットを７００ｕｌのＲＡＢ緩衝液に再懸濁させ、２６ゲージの針に３～５回通してペレットを完全に分散させ、サルコシル不溶性画分を作成した。次に、サルコシル可溶性及び不溶性の画分の等量を等分し、等量の２×ＳＤＳ試料緩衝液をそれぞれに加えた。試料を９０℃に加熱した。次に、等量の各画分を１４％ＳＤＳゲルに載せ、２２５Ｖで５０分間電気泳動した後、ＴＤＰ－４３のウエスタンブロッティングを行った。デンシトメトリーはＩｍａｇｅＪを使用して実行した。図９Ａ。可溶性：不溶性のＴＤＰ－４３の比率をプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ ｆｏｒ Ｐｒｉｓｍを使用して統計的に分析した。図９Ａ。
変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドの発現レベル
ＴＤＰ－４３変異型の発現レベルは、本明細書に記載されているようなウエスタンブロット分析によって分析した。この実施例におけるメッセンジャーＲＮＡレベルは、定量的ポリメラーゼ連鎖反応によって実行された。
各試料からの全ＲＮＡを抽出し、通常のエクソン４とエクソン５の接合部にまたがるプライマーと、マウスＴＤＰ－４３遺伝子座の領域を検出するプローブを使用して逆転写した。ＤＲＯＳＨＡのｑＰＣＲは容易に入手できるキットのプローブとプライマーを使用して実行した。
具体的には、ＲＮＡは実施例１に記載されているように胚性幹細胞由来の運動ニューロン（ＥＳＭＮ）から単離された。
製造元のプロトコール（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）に従ってＤｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｐｌｕｓキットを使用して全ＲＮＡを単離した。製造元のプロトコール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従ってＴｕｒｂｏ ＤＮＡ－ｆｒｅｅキットを使用してＤＮＡ分解酵素で全ＲＮＡを処理し、２０ｎｇ／μｌに希釈した。逆転写（ＲＴ）及びＰＣＲはＱｕａｎｔｉｔｅｃｔプローブＲＴ－ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用した一工程反応で実行した。ｑＲＴ－ＰＣＲ反応は、２μＬのＲＮＡと、ＲＴ－ＰＣＲマスターミックス、ＲＯＸ色素、ＲＴミックス、及び２０×遺伝子特異的プライマー・プローブのミックスを含有する８μＬの混合物とを含有して最終容量を１０μＬにした。
特に言及されない限り、最終的なプライマーとプローブの濃度はそれぞれ０．５μＭと０．２５μＭだった。ｑＲＴ－ＰＣＲはＶｉｉＡ（商標）７リアルタイムＰＣＲ検出システム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で実行した。ＰＣＲ反応は光学３８４ウェルプレートにおいて４５℃で１０分間その後の９５℃で１０分間のＲＴ工程と、９５℃で５秒間、６０℃で３０秒間を４５サイクルの２工程サイクリングにて４つ組で行った。分析（パンアッセイ）で使用したプライマーとプローブの配列を以下の表２に提供する。

表２
Figure 2022539517000004
変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドの溶解度
ＥＳ細胞コロニーを２日後に解離し、それをＡＤＦＮＫ培地で培養した。培地を２日目に交換し、レチノイン酸（１００ｎＭ～２μＭ）（Ｓｉｇｍａ）及びソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ－Ｎ；３００ｎＭ）（Ｃｕｒｉｓ Ｉｎｃ．）で補完し、胚様体（ＥＢ）を４日間培養した。４日目の胚様体をシクロヘキシミド（１００μｇ／ｍＬ）で処理して新しいタンパク質合成を阻止した。培地は４時間ごとに交換し、新鮮なシクロヘキシミドを加えた。示された時点で細胞溶解物を回収し、ＴＤＰ－４３抗体及びＧＡＰＤＨ抗体を用いた免疫ブロッティングによって分析した。図９Ｃ。
実施例３：ＴＤＰ－４３変異型によるＴＤＰ－４３生物活性の分析
隠れエクソンはＧＵに富むＴＤＰ－４３結合部位を有することが多く、ＴＤＰ－４３は隠れエクソンの認識を抑制し、それによって正常なスプライシングを促進することが示されている。ＴＤＰ－４３が失われると、調節された遺伝子の正常なｍＲＮＡ及びタンパク質レベルが失われる。ＴＤＰ－４３はまた、ＴＤＰ－４３レベルを維持するために負のフィードバック自己調節ループとして自身の転写産物の３’末端にも結合する。機能的構造ドメインを欠く変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドの生物活性を、隠れエクソンのスプライシングを抑制し続ける変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドの能力を評価することによって調べ、及び／またはその自己調節ループへの参加を調べた。
野生型ＴＡＲＤＢＰ遺伝子または機能的なＲＲＭ１、ＮＬＳ、またはＰＬＤを欠く変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子についてヘテロ接合性のＥＳＭＮを、そのスプライシングが野生型ＴＤＰ－４３によって抑制されることが知られている隠れエクソンを含む３つの遺伝子：Ｃｒｅｍ、Ｆｙｘｄ２、及びＣｌｆ１の発現産物について分析した。図１０。正常なスプライシングを受けたＣｒｅｍ、Ｆｙｘｄ２、及びＣｌｆ１の産物は、機能的なＲＲＭ１、ＮＬＳ、またはＰＬＤを欠く変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドを発現するすべてのＥＳＭＮで見られ、正常なスプライス産物は野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドを発現するＥＳＭＮと同等の量で見られた。図１０しかしながら、隠れエクソンのスプライシングは、野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドを発現しているＥＳＭＮと比べて、機能的なＲＲＭ１、ＮＬＳ、またはＰＬＤを欠く変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドを発現しているＥＳＭＮで増加した。図１０。このデータは、機能的なＲＲＭ１、ＮＬＳ、またはＰＬＤを欠く変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドが、Ｃｒｅｍ、Ｆｙｘｄ２、及びＣｌｆ１遺伝子の隠れエクソンスのプライシングを抑制できないことを示唆している。図１０。
野生型ＴＡＲＤＢＰ遺伝子または機能的なＮＬＳ、ＲＲＭ１、ＲＲＭ２、Ｅ、またはＰＬＤを欠く変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子についてヘテロ接合性のＥＳＭＮを、選択的スプライシングを受けたＴＤＰ－４３ ｍＲＮＡのレベルについて分析した。図１１Ｂ。野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドを発現している対照ＥＳＭＮと比べて、機能的なＮＬＳ、ＲＲＭ１、Ｅ、またはＰＬＤを欠く変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドを発現しているＥＳＭＮは、選択的スプライシングを受けたＴＤＰ－４３ ｍＲＮＡのレベルの低下を示した。図１１Ｂ。機能的Ｅを欠く変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドを発現しているＥＳＭＮは、同等レベルの選択的スプライシングを受けたＴＤＰ－４３ ｍＲＮＡを示した。図１１Ｂ。このデータは、機能的なＮＬＳまたはＰＬＤを欠くＴＤＰ－４３変異型を発現しているＥＳＭＮがＡＬＳ表現型を示すことを示す実施例２で提供されたデータと併せて（図５）、選択的スプライシングを受けたＴＤＰ－４３ ｍＲＮＡを温存しながら正常なスプライシングを受けたＴＤＰ－４３ ｍＲＮＡのレベルを低下させる戦略はＴＤＰ－４３関連の病状にとっての治療法であってもよいことを示唆している。
機能的構造ドメインを欠く変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドを発現する細胞の表現型を分析するのに使用される材料及び方法を以下に記載する。
定量的ポリメラーゼ連鎖反応
各試料からの全ＲＮＡを抽出し、スプライシング領域に隣接するプライマーと、調査される遺伝子の遺伝子座（Ｃｒｅｍ、Ｆｘｙｄ２、Ｃｌｆ１、ＴＤＰ－４３）の領域を検出するプローブとを使用して逆転写した。調査されたＣｒｅｍ、Ｆｘｙｄ２、及びＣｌｆ１の遺伝子についての検出可能な領域には、調査された各遺伝子の正常なエクソンと隠れエクソンのマウス配列の接合部にまたがる領域が含まれた。調査されたＴＤＰ－４３領域についての検出可能な領域には、選択的スプライシング領域にまたがる領域が含まれた。ＤＲＯＳＨＡのｑＰＣＲは容易に利用できるキットのプローブとプライマーを使用して実行された。
具体的には、実施例２に記載されているように分化した胚性幹細胞由来運動ニューロン（ＥＳＭＮ）からＲＮＡを単離した。製造元のプロトコール（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）に従ってＤｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｐｌｕｓキットを使用して全ＲＮＡを単離した。製造元のプロトコール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従ってＴｕｒｂｏ ＤＮＡ－ｆｒｅｅキットを使用してＤＮＡ分解酵素で全ＲＮＡを処理し、２０ｎｇ／μｌに希釈した。逆転写（ＲＴ）及びＰＣＲはＱｕａｎｔｉｔｅｃｔプローブＲＴ－ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用した一工程反応で実行した。ｑＲＴ－ＰＣＲ反応は、２μＬのＲＮＡと、ＲＴ－ＰＣＲマスターミックス、ＲＯＸ色素、ＲＴミックス、及び２０×遺伝子特異的プライマー・プローブのミックスを含有する８μＬの混合物とを含有して最終容量を１０μＬにした。
特に言及されない限り、最終的なプライマーとプローブの濃度は、それぞれ０．５μＭと０．２５μＭだった。ｑＲＴ－ＰＣＲはＶｉｉＡ（商標）７リアルタイムＰＣＲ検出システム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で実行した。ＰＣＲ反応は光学３８４ウェルプレートにおいて４５℃で１０分間その後の９５℃で１０分間のＲＴ工程と、９５℃で５秒間、６０℃で３０秒間を５０サイクルの２工程サイクリングにて４つ組で行った。
Ｃｒｅｍのエクソン１からエクソン２への生産的なＣｒｅｍスプライシングを評価するためのｑＲＴ－ＰＣＲは、配列番号１４及び配列番号１５として示されるヌクレオチド配列を含むプライマー、及び配列番号１６として示されるヌクレオチド配列を含むプライマーによって実施した。Ｃｒｅｍのエクソン１から隠れエクソンまでのスプライシングは、配列番号１７及び配列番号１８として示されるヌクレオチド配列を含むプライマー、及び配列番号１９として示されるヌクレオチド配列を含むプライマーを用いて評価した。Ｃｒｅｍの隠れエクソンからエクソン２までのスプライシングは、配列番号２０及び配列番号２１として示されるヌクレオチド配列を含むプライマー、及び配列番号２２として示されるヌクレオチド配列を含むプライマーを用いて評価した。
エクソン３からエクソン４までの生産的なＦｙｘｄ２のスプライシングを評価するためのｑＲＴ－ＰＣＲは、配列番号２３及び配列番号２４として示されるヌクレオチド配列を含むプライマー、及び配列番号２５として示されるヌクレオチド配列を含むプライマーによって実施した。Ｆｙｘｄ２のエクソン３から隠れエクソンまでのスプライシングは、配列番号２６及び配列番号２７として示されるヌクレオチド配列を含むプライマー、及び配列番号２８として示されるヌクレオチド配列を含むプライマーによって評価した。Ｆｙｘｄ２隠れエクソンからエクソン４までのスプライシングは、配列番号２９及び配列番号３０として示されるヌクレオチド配列を含むプライマー、及び配列番号３１として示されるヌクレオチド配列を含むプライマーによって評価した。
生産的なＣｒｌｆ１スプライス産物のｑＲＴ－ＰＣＲは、配列番号３２及び配列番号３３として示されるヌクレオチド配列を含むプライマー、及び配列番号３４として示されるヌクレオチド配列を含むプライマーによって実施した。Ｃｒｌｆ１のエクソン１から隠れエクソンまでのスプライシングは、配列番号３５び配列番号３６として示されるヌクレオチド配列を含むプライマー、及び配列番号３７として示されるヌクレオチド配列を含むプライマーを用いて評価した。Ｃｒｌｆ１の隠れエクソンからエクソン２までのスプライシングは、配列番号３８及び配列番号３９として示されるヌクレオチド配列を含むプライマー、及び配列番号４０として示されるヌクレオチド配列を含むプライマーを用いて評価した。
ＰＬＤドメインをコードする配列を欠く選択的スプライシングを受けたＴＤＰ－４３ ｍＲＮＡを、配列番号４１及び配列番号４２として示されるヌクレオチド配列を含むプライマー、及び配列番号４３として示されるヌクレオチド配列を含むプライマーを使用して評価した。
この実施例の各ｑＰＣＲ分析（正常なスプライシング及び隠れスプライシング）で使用されるプライマー及びプローブの配列を以下の表３に提供する。
表３
Figure 2022539517000005
Figure 2022539517000006
実施例４：変異させたＴＤＰ－４３タンパク質を発現するマウスの作製
ＴＤＰ－４３の欠失は胚致死をもたらすが、内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子座から変異型ΔＮＬＳ ＴＤＰ－４３遺伝子または変異型ΔＰＬＤ ＴＤＰ－４３遺伝子のみを発現する胚性幹細胞は生存可能であり、試験管内で運動ニューロンに分化してもよい。このデータは、内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子座から機能的構造ドメインを欠く変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドを発現する胚性幹細胞が生存可能であってもよく、且つＴＤＰ－４３タンパク症の動物モデルを作り出すのに有用であってもよい可能性を高めている。例えば、そのような胚性幹細胞は、正常な及び病的な生物プロセスにおけるＴＤＰ－４３構造ドメインの役割を調べるために、機能的構造ドメインを欠く変異型ＴＤＰ－４３タンパク質を発現する非ヒト動物、例えばマウスを生成するのに使用されてもよい。
機能的なＮＬＳまたはＰＬＤのドメインを欠く変異型ＴＤＰ－４３タンパク質を発現する胚または動物を作成するには、ＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）法（Ｄｅｃｈｉａｒａ，Ｔ．Ｍ．，（２００９），Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５３０：３１１－３２４；Ｐｏｕｅｙｍｉｒｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００７），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５：９１－９９）を使用したが、その際、（ｉ）内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子座にて、条件付きでｌｏｘＰが導入されたエクソン３（ｌｏｘＰ－Ｅｘ３－ｌｏｘＰ）、ｌｏｘＰが導入されたエクソン３のＣｒｅが介在する欠失の際のヌル対立遺伝子（－）、ＮＬＳのノックアウト突然変異（ΔＮＬＳ）、プリオン様ドメインの欠失（ΔＰＬＤ）を含むＴＡＲＤＢＰ遺伝子、または野生型ＴＡＲＤＢＰ遺伝子（ＷＴ）を含み（図３Ａを参照）、且つ（ｉｉ）相同染色体上の他方のＴＡＲＤＢＰ遺伝子座にて、野生型（ＷＴ）ＴＡＲＤＢＰ遺伝子、またはｌｏｘＰが導入されたエクソン３のＣｒｅが介在する欠失の際のヌル対立遺伝子（－）を含む、標的にされたＥＳ細胞を密ではない８細胞期のＳｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒの胚に注入した。受精後の胚の生存率を調べ、生きて生まれるＦ０世代のマウスを生産する能力を評価した。
以前の実験と一致して、機能的なＴＤＰ－４３タンパク質（ＴＤＰ－４３－／－）を欠く胚は生存できず、Ｅ３．５期（図１２）を超えて生存しなかった。同様に、機能的なＮＬＳを欠くＴＤＰ－４３タンパク質（ＴＤＰ－４３ΔＮＬＳ／－）のみを発現する胚または機能的なＰＬＤを欠くＴＤＰ－４３タンパク質（ＴＤＰ－４３ΔＰＬＤ／－）のみを発現する胚はさらに長く生存はしたものの、生存能力はなかった（図１２）。ＴＡＲＤＢＰ遺伝子座の一方の対立遺伝子からの野生型ＴＤＰ－４３タンパク質の発現は、染色体の他方の対立遺伝子から機能的なＮＬＳを欠くＴＤＰ－４３タンパク質（ＴＤＰ－４３ΔＮＬＳ／－）または機能的なＰＬＤを欠くＴＤＰ－４３タンパク質（ＴＤＰ－４３ΔＰＬＤ／－）を発現している胚を救済した（図１２）。
生きて生まれたＦ０世代のマウスは、（ｉ）内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子座にて、野生型遺伝子（ＷＴ）、ｌｏｘＰが導入されたエクソン３のＣｒｅが介在する欠失、ｌｏｘＰが導入されたエクソン３（ｌｏｘＰ－Ｅｘ３－ｌｏｘＰ）、ＮＬＳのノックアウト突然変異（ΔＮＬＳ）、プリオン様ドメインの欠失（ΔＰＬＤ）を含むＴＡＲＤＢＰ遺伝子を含み（図３Ａを参照）、且つ（ｉｉｉ）相同染色体上の他方のＴＡＲＤＢＰ遺伝子座にて、野生型（ＷＴ）ＴＡＲＤＢＰ遺伝子を含むＥＳ細胞を注入した８細胞期のＳｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒの胚から首尾よく生産された。
実施例４：機能的構造ドメインを欠く変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドを発現するマウスの表現型分析
実施例３で生成された動物の表現型は、該動物から単離された脊髄組織または運動ニューロンにおけるＴＤＰ－４３ポリペプチドの局在化、リン酸化状態、及び溶解度を評価することによって分析した。さらに、動物の筋肉の脱神経または神経支配も決定した。
１６週齢のマウスの脊髄に由来する運動ニューロンの細胞質画分及び核画分を、以下：（１）野生型ＴＤＰ－４３タンパク質のＮ末端を認識するので野生型ＴＤＰ－４３、ΔＮＬＳ ＴＤＰ－４３、及びΔＰＬＤ ＴＤＰ－４３に結合する抗体、（２）野生型ＴＤＰ－４３タンパク質のＣ末端を認識するので野生型ＴＤＰ－４３及びΔＮＬＳ ＴＤＰ－４３に結合するが、ΔＰＬＤ ＴＤＰ－４に結合しない抗体、または（３）ＴＤＰ－４３をリン酸化された形で認識する抗体、を用いたウエスタンブロット分析によって評価した。
図１３Ａ～１３Ｃに示すように、野生型及びΔＮＬＳ変異型のＴＤＰ－４３タンパク質は約４３Ｋｄの予想サイズで検出され、ΔＰＬＤ変異型は約３０Ｋｄの予想サイズで検出された。実施例２で分析されたＥＳＭＮと同様に、機能的ＮＬＳまたはＰＬＤを欠く変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドは、野生型ＴＤＰ－４３タンパク質の存在下でさえ、脊髄組織の核から細胞質に再分布した。図１３Ａ。約４３Ｋｄのリン酸化ＴＤＰ－４３ポリペプチドが、変異型ΔＮＬＳまたはΔＰＬＤポリペプチドを発現しているマウスの脊髄に由来する運動ニューロンの細胞質で検出されたが、野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドのみを発現しているマウスでは検出されなかった。図１３Ｂ。運動ニューロンの核におけるリン酸化ＴＤＰ－４３は調べたすべての試料で検出されないままだった。図１３Ｂ。リン酸化部位はアミノ酸の４０９位／４１０位にあるので、機能的なＰＬＤを欠くリン酸化ＴＤＰ－４３ポリペプチドが検出されなかったことは驚くべきことではない。図１３Ｂ。ＮＬＳドメインにて機能的突然変異を含むΔＮＬＳ変異型ＴＤＰ－４３タンパク質を発現している１６週齢のマウスの脊髄の運動ニューロンは全体的に不溶性ＴＤＰ－４３タンパク質のレベルの上昇を示した。図１３Ｃ。ΔＰＬＤ変異型ＴＤＰ－４３タンパク質を発現しているマウスではＴＤＰ－４３タンパク質の溶解度に上昇があるとは思われなかった。不溶性画分にΔＰＬＤ変異型が検出されなかったので、ΔＰＬＤ変異型は可溶性だと思われる。図１３Ｃ。
ΔＮＬＳドメインにて機能的突然変異を含むΔＮＬＳ変異型ＴＤＰ－４３タンパク質または機能的ＰＬＤを欠くΔＰＬＤ ＴＤＰ－４３変異タンパク質を発現しているマウスの運動ニューロンのサブセットは、広範な細胞質ＴＤＰ－４３凝集を示した。図１４。細胞質凝集は、機能的なＮＬＳを欠く変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドを発現しているマウスと比べて、ΔＰＬＤ変異型タンパク質を発現しているマウスの運動ニューロンで検出される頻度が低かった。図１４。
脱神経はＡＬＳに現れる最初の病理学的特徴の１つであるので、主に速筋線維（前脛骨筋）または遅筋線維（肋間筋）を含む筋肉を脱神経について分析した。ＴＤＰ－４３の誤った局在は、部分的に神経支配された終板（＊）と、主に速筋線維を含むが、遅筋線維を含まない筋肉の脱神経（矢印）をもたらした。図１５Ａ～１５Ｂ。
本明細書に示されるデータは、本明細書に記載されている動物がＡＬＳの貴重な疾患モデルであってもよいことを示唆している。典型的なＡＬＳ患者では、遠位の高速疲労性（ＦＦ）運動単位が最も早く影響を受け、運動ニューロンが失われる前に筋肉の神経原性変化を観察することができる。同様に、最も広く使用されている「ＡＬＳ」モデルであるＳＯＤ１ Ｇ９３Ａマウスの運動ニューロン喪失も、ＦＦ運動単位の早期かつ優先的な関与を伴う骨格筋の脱神経が先行する。対照的に、肋間筋や横隔膜など、主に遅筋線維によって神経支配されている近位筋は一般に、最後まで温存され―且つこれらの筋肉の脱神経は致命的である。疾患が進行するにつれて、肋間筋の脱神経が予想されてもよい。
（ａ）機能的なＮＬＳまたはＰＬＤを欠く変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドと（ｂ）野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチド、との双方を発現するマウスの表現型を分析するのに使用される材料と方法を以下に記載する。
変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドの細胞内局在及びリン酸化の検出
ＴＤＰ－４３ポリペプチドのＮ末端を認識する抗体（α－ＴＤＰ－４３Ｎ－ｔｅｒｍ）とＴＤＰ－４３ポリペプチドのＣ末端プリオン様ドメインを認識する抗体（α－ＴＤＰ－４３Ｃ－ｔｅｒｍ）（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ，Ｒｏｓｅｍｏｎｔ，ＩＬ）を使用してＴＤＰ－４３変異型の細胞内局在を分析した。可溶性細胞質タンパク質抽出物は、脊髄全組織をプロテアーゼ及びホスファターゼの阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）で補完した氷冷溶解緩衝液（１０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、０．０１％ＮＰ－４０）にて氷上で１０分間インキュベートすることによって調製した。次に、細胞を２７ゲージの注射器に５回通した。４℃にて４０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、可溶性細胞質抽出物を含むタンパク質上清を回収した。不溶性核タンパク質抽出物は、プロテアーゼとホスファターゼで補完した等量のＲＢＳ－１００緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．４、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．１％ＮＰ－４０）にペレットを再懸濁させることによって調製した。等量の２×ＳＤＳ試料緩衝液を各画分に加え、試料を９０℃に加熱した。次に、等量の各画分を１４％ＳＤＳゲル上に載せ、２２５Ｖで５０分間電気泳動した後、α－ＴＤＰ－４３－Ｎ－ｔｅｒｍ抗体（図１３Ａ）、α－ＴＤＰ－４３－Ｃ－ｔｅｒｍ抗体（図１３Ａ）、またはアミノ酸４０９／４１０にてＴＤＰ－４３のリン酸化を検出するα－ホスホＴＤＰ－４３抗体（図１３Ｂ）（Ｃｏｓｍｏ Ｂｉｏ ＵＳＡ；カタログ番号ＣＡＣ－ＴＩＰ－ＰＴＤ－Ｍ０１）を使用してＴＤＰ－４３のウエスタンブロッティングを行った。α－ＴＤＰ－４３－Ｃ－ｔｅｒｍ抗体もα－ホスホＴＤＰ－４３抗体もＰＬＤ欠失変異型を認識しない。デンシトメトリーはＩｍａｇｅＪを使用して実行した（図１３Ａ及び１３Ｂ）。細胞質／核のＴＤＰ－４３の比率をプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ ｆｏｒ Ｐｒｉｓｍを使用して統計的に分析した（図１３Ａ、下のパネル）。
蛍光原位置ハイブリッド形成（ＦＩＳＨ）
脊髄を脊柱から分離し、４％ＰＦＡで一晩（またはＦＵＳ免疫染色の場合は１時間）浸漬固定し、１×ＰＢＳで洗浄した。脊髄セグメントを４％低融点アガロース（Ｐｒｏｍｅｇａ）に埋め込み、ビブラトーム（Ｌｅｉｃａ ＶＴ １０００Ｓ）を使用して連続横断面（７０μＭ）を切断し、浮遊処理した。浮遊脊髄切片を、０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（ＴＢＳ－Ｔ）を伴うＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）で希釈した５％正常ロバ血清でブロックし、５％正常ロバ血清を伴うＴＢＳ－Ｔで希釈した一次抗血清にて室温で一晩インキュベートした。使用される一次抗体は：ＣｈＡＴ（１：２５０）ＥＭＤ Ｍｉｌｌｐｏｒｅ Ｃａｔ ＡＢ１４４Ｐ；ＴＤＰ－４３（１：１０，０００）Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ １０７８２－２－ＡＰ及びＮｅｕＮ（１：５００）ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＭＡＢ３７７である。ＴＢＳ－Ｔで洗浄した後、組織切片をＡｌｅｘａ ４８８、５５５、６４７（１：１，０００；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）、Ｃｙ３またはＣｙ５（希釈率１：５００；Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ，ＵＳＡ）に結合した種特異的二次抗体とともに室温で４時間インキュベートした。ＴＢＳ－Ｔで洗浄した後、染色した組織切片をＦｌｏｕｒｏｍｏｕｎｔ Ｇ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ、ＵＳＡ）の顕微鏡スライドにて標本化し、ＬＳＭ５１０共焦点顕微鏡を使用して４０倍の倍率と１．５ズームで画像化した。（図１４）
変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドの溶解度
このプロトコールは、Ｊｏ ｅｔ ａｌ．（２０１４），Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，５：３４９６から採用された。５０ｍＭのＮ－エチルマレイミド（ＮＥＭ）、１ｍＭのＮａＦ、１ｍＭのＮａ３ＶＯ４、１ｍＭのＰＭＳＦ及び各１０ｕｇ／ｍＬのアプロチニン、ロイペプチン、及びペプスタチンを含有する５００ｕｌの氷冷可溶性緩衝液（０．１ＭのＭＥＳ（ｐＨ７）、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ｍＭのＭｇＳＯ４、１Ｍのスクロース）。１６週齢のマウスの脊髄組織の細胞を２１ゲージの針に３～５回通し、続いて２３ゲージの針に３～５回通して溶解した。次に、等量のホモジネートを各試料から回収し、５０，０００×ｇにて２０分間４℃で遠心分離し、残りを－８０℃で保存した。上清を除去し、各ペレットを、１％Ｎ－ラウロイルサルコシン（Ｓａｒｋｏｓｙｌ）及びプロテアーゼ阻害剤（１ｍＭのＰＭＳＦ、５０ｍＭのＮＥＭ、及び各１０ｕｇ／ｍＬのアプロチニン、ロイペプチン、ペプスタチン）を含有する７００ｕｌのＲＡＢ緩衝液（１００ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ６．８）、１０％スクロース、２ｍＭのＥＧＴＡ、０．５ｍＭのＭｇＳＯ４、５００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、２０ｍＭのＮａＦ）に再懸濁させ、ＲＴで１分間ボルテックスし、転倒回転しながら４℃で一晩インキュベートした。次に、試料を２００，０００×ｇで１２℃にて３０分間遠心分離し、上清をサルコシル可溶性画分として回収した。ペレットを７００ｕｌのＲＡＢ緩衝液に再懸濁させ、２６ゲージの針に３～５回通してペレットを完全に分散させ、サルコシル不溶性画分を作成した。次に、サルコシル可溶性及び不溶性の画分の等量を等分し、等量の２×ＳＤＳ試料緩衝液をそれぞれに加えた。試料を９０℃に加熱した。次に、等量の各画分を１４％ＳＤＳゲルに載せ、２２５Ｖで５０分間電気泳動した後、ＴＤＰ－４３のウエスタンブロッティングを行った。デンシトメトリーはＩｍａｇｅＪを使用して実行した（図１３Ｃ）。可溶性：不溶性のＴＤＰ－４３の比率をプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ ｆｏｒ Ｐｒｉｓｍを使用して統計的に分析した。（図１３Ｃ）。
脱神経試験
筋肉分析のために、前脛骨筋（ＴＡ）と肋間筋を切断し、４％ＰＦＡに浸して２時間後固定し、１×リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４（ＰＢＳ）で洗浄した。次に、筋肉をショ糖の勾配（０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．４にて１０％－２０％－３０％のショ糖）で平衡化し、Ｏ．Ｃ．Ｔ．コンパウンド（Ｓａｋｕｒａ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）に包埋し、－２０℃で凍結した。凍結ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ ＣＭ ３０５０Ｓ）を使用して連続切片（厚さ３０μｍ）を切断した。筋肉の凍結切片（３０μｍ）をシナプトフィジン（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に対する抗体で染色してシナプス前終末を特定し、Ａｌｅｘａ４８８結合α－ＢＴＸ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でシナプス後アセチルコリン受容体を検出した。×１０及び×４０の対物レンズを用いたＺｅｉｓｓ Ｐａｓｃａｌ ＬＳＭ５１０共焦点顕微鏡を使用して画像を取得した。ＮＭＪ神経支配百分率（％）は、ＶＡＣｈＴシグナルとα－ＢＴＸシグナルとの間の重複領域の総数（神経支配された終板の総数）を領域α－ＢＴＸシグナルの数（終板の総数）で割ることによって決定した。
(項目１)
変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子を含む非ヒト動物細胞であって、
前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドが、野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドに見いだされる核局在化シグナル（ＮＬＳ）、ＲＮＡ認識モチーフ１（ＲＲＭ１）、ＲＮＡ認識モチーフ２（ＲＲＭ２）、推定核外輸送シグナル（Ｅ）、プリオン様ドメイン（ＰＬＤ）、またはそれらの組み合わせを含む機能的構造ドメインを欠き、且つ
前記非ヒト動物細胞は前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドを発現し、
任意で、前記野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドは、配列番号１、配列番号３、または配列番号５として示される配列を含む、前記非ヒト動物細胞。
(項目２)
前記非ヒト動物細胞が胚性幹（ＥＳ）細胞、胚様体、または胚性幹細胞由来運動ニューロン（ＥＳＭＮ）である、項目１に記載の非ヒト動物細胞。
(項目３)
前記変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子が前記非ヒト動物の変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子である、項目１または項目２に記載の非ヒト動物細胞。
(項目４)
前記変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子が変異させたヒトＴＡＲＤＢＰ遺伝子である、項目１～２のいずれか１項に記載の非ヒト動物細胞。
(項目５)
前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドが以下：
（ａ）前記ＮＬＳにおけるアミノ酸の点突然変異、
（ｂ）前記ＲＲＭ１におけるアミノ酸の点突然変異、
（ｃ）前記ＲＲＭ２におけるアミノ酸の点突然変異、
（ｄ）前記核外輸送シグナルの少なくとも一部の欠失、及び
（ｅ）前記プリオン様ドメインの少なくとも一部の欠失、の１以上に起因して機能的構造ドメインを欠く、先行項目のいずれか１項に記載の非ヒト動物細胞。
(項目６)
（ａ）前記ＮＬＳにおけるアミノ酸の前記点突然変異がＫ８２Ａ Ｋ８３Ａ、Ｒ８４Ａ、Ｋ９５Ａ、Ｋ９７Ａ、Ｋ９８Ａ、またはそれらの組み合わせを含み、
（ｂ）ＲＲＭ１における前記点突然変異がＦ１４７Ｌ及び／またはＦ１４９Ｌを含み、
（ｃ）ＲＲＭ２における前記点突然変異がＦ１９４Ｌ及び／またはＦ２２９Ｌを含み、
（ｄ）前記核外輸送シグナル欠失の少なくとも一部の前記欠失が野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドの２３９位と２５０位にて及びその間でアミノ酸の欠失を含み、且つ
（ｅ）前記プリオン様ドメインの少なくとも一部の前記欠失が野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドの２７４位と４１４位にて及びその間でアミノ酸の欠失を含む、項目５に記載の非ヒト動物細胞。
(項目７)
前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドがＫ８２Ａ Ｋ８３Ａ、Ｒ８４Ａ、Ｋ９５Ａ、Ｋ９７Ａ、及びＫ９８Ａを含む、先行項目のいずれか１項に記載の非ヒト動物細胞。
(項目８)
前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドが野生型ポリペプチドの２７４位から４１４位のアミノ酸で前記プリオン様ドメインを欠く、先行項目のいずれか１項に記載の非ヒト動物細胞。
(項目９)
前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドがＦ１４７Ｌ及びＦ１４９Ｌを含む、先行項目のいずれか１項に記載の非ヒト動物細胞。
(項目１０)
前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドがＦ１９４Ｌ及びＦ２２９Ｌを含む、先行項目のいずれか１項に記載の非ヒト動物細胞。
(項目１１)
前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドが２３９位から２５０位のアミノ酸で前記核外輸送シグナルを欠く、先行項目のいずれか１項に記載の非ヒト動物細胞。
(項目１２)
変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする前記変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子が内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子座にて内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子に取って代わる、先行項目のいずれか１項に記載の非ヒト動物細胞。
(項目１３)
前記非ヒト動物細胞が、変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする前記変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子についてヘテロ接合性である、項目１３に記載の非ヒト動物細胞。
(項目１４)
前記非ヒト動物細胞が、変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする前記変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子についてホモ接合性である、項目１３に記載の非ヒト動物細胞。
(項目１５)
前記非ヒト動物細胞がさらに、ノックアウト突然変異を含むＴＡＲＤＢＰ遺伝子を含む、項目１～１３のいずれか１項に記載の非ヒト動物細胞。
(項目１６)
前記ノックアウト突然変異が条件付きノックアウト突然変異を含む、項目１６に記載の非ヒト動物細胞。
(項目１７)
前記ノックアウト突然変異が部位特異的組換え認識配列を含む、項目１５または項目１６に記載の非ヒト動物細胞。
(項目１８)
前記ノックアウト突然変異がｌｏｘｐ配列を含む、項目１５～１７のいずれか１項に記載の非ヒト動物細胞。
(項目１９)
前記ｌｏｘｐ配列がノックアウト突然変異を含む前記ＴＡＲＤＢＰ遺伝子のエクソン３に隣接する、項目１８に記載の非ヒト動物細胞。
(項目２０)
前記ノックアウト突然変異が、ＴＤＰ－４３ペプチドのコード配列全体の欠失を含む、項目１６に記載の非ヒト動物細胞。
(項目２１)
前記非ヒト動物細胞が前記操作されたＴＡＲＤＢＰ遺伝子座についてヘテロ接合性であり、且つ
（ｉ）一方の染色体にて内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子座での内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子の変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする前記変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子による置換、及び
（ｉｉ）他方の相同染色体にて前記内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子座での前記ノックアウト突然変異を含む前記ＴＡＲＤＢＰ遺伝子または野生型ＴＡＲＤＢＰ遺伝子のいずれかを含む、項目１５～２０のいずれか１項に記載の非ヒト動物細胞。
(項目２２)
前記非ヒト動物細胞が野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドを発現しない、先行項目のいずれか１項に記載の非ヒト動物細胞。
(項目２３)
前記非ヒト動物細胞が野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドを発現する、項目１～２１のいずれか１項に記載の非ヒト動物細胞。
(項目２４)
（ｉ）対照細胞における野生型ＴＡＲＤＢＰ遺伝子のｍＲＮＡ転写物レベルに匹敵する前記変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子のｍＲＮＡ転写物レベル、
（ｉｉ）対照細胞における野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドのレベルと比べて前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドのレベルの増加、
（ｉｉｉ）例えば、運動ニューロンの核よりも細胞質に高濃度で見られる変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチド、
（ｉｖ）野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドと比べて不溶性が増した変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチド、
（ｖ）前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドを含む細胞質凝集体、
（ｖｉ）隠れエクソンのスプライシングの増加、及び／または
（ｖｉｉ）選択的スプライシングを受けたＴＤＰ－４３形態のレベルの低下、を含む、先行項目のいずれか１項に記載の非ヒト動物細胞。
(項目２５)
（ｉ）一方の染色体にて内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子座でのＴＡＲＤＢＰ遺伝子の条件付きノックアウト突然変異と、
（ｉｉ）他方の相同染色体にて前記内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子座でのＴＡＲＤＢＰコード配列全体の欠失と、を含む非ヒト動物細胞。
(項目２６)
前記細胞が胚性幹（ＥＳ）細胞、原始外胚葉細胞、または運動ニューロン（ＥＳＭＮ）に由来する運動ニューロンである、先行項目のいずれか１項に記載の非ヒト動物細胞。
(項目２７)
前記非ヒト動物細胞が齧歯類細胞である、先行項目のいずれか１項に記載の非ヒト動物細胞。
(項目２８)
前記非ヒト動物細胞がラット細胞である、先行項目のいずれか１項に記載の非ヒト動物細胞。
(項目２９)
前記非ヒト動物細胞がマウス細胞である、項目１～２７のいずれか１項に記載の非ヒト動物細胞。
(項目３０)
前記非ヒト動物細胞が試験管内で培養される、先行項目のいずれか１項に記載の非ヒト動物細胞。
(項目３１)
先行項目のいずれか１項に記載の非ヒト動物細胞を含む非ヒト動物組織。
(項目３２)
先行項目のいずれか１項に記載の非ヒト動物細胞または組織を含む組成物。
(項目３３)
変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドを発現する非ヒト動物または非ヒト動物細胞を作製する方法であって、前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子を含むように前記非ヒト動物または非ヒト動物細胞のゲノムを操作することを含み、その際、前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドは野生型ＴＤＰ－４３と比べて機能的構造ドメインを欠き、任意で、前記野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドは、配列番号１、配列番号３、または配列番号５として示される配列を含む、前記方法。
(項目３４)
操作することが、内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子を、前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする前記変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子で置き換えることを含む、項目３３に記載の方法。
(項目３５)
操作することがさらに、内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子を、ノックアウト突然変異を含むＴＡＲＤＢＰ遺伝子で置き換えることを含む、項目３３または項目３４に記載の方法。
(項目３６)
前記ノックアウト突然変異が条件付きノックアウト突然変異を含む、項目３５に記載の方法。
(項目３７)
さらに、ノックアウト突然変異を含む前記ＴＡＲＤＢＰ遺伝子の発現を排除する条件で前記細胞を培養することを含む、項目３６に記載の方法。
(項目３８)
疾患の治療のための治療候補を特定する方法であって、
（ａ）項目１～３１のいずれか１項に記載の非ヒト動物細胞もしくは組織、または項目３２に記載の組成物を候補薬剤と接触させることと、
（ｂ）前記非ヒト細胞または組織の表現型及び／またはＴＤＰ－４３生物活性を評価することと、
（ｃ）野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドを発現する対照の細胞または組織の表現型及び／またはＴＤＰ－４３生物活性に匹敵する表現型及び／またはＴＤＰ－４３生物活性を前記非ヒト細胞または組織に取り戻す前記候補薬剤を特定することと、を含む、前記方法。
(項目３９)
ＴＤＰ－４３構造ドメインの生物学的機能を評価する方法であって、
（ａ）核局在化シグナル（ＮＬＳ）、第１のＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲＭ１）、第１のＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲＭ２）、推定核外輸送シグナル（Ｅ）、プリオン様ドメイン（ＰＬＤ）、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される機能的構造ドメインを欠く変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子を含むように胚性幹（ＥＳ）細胞を操作することと、
（ｂ）任意で、前記操作されたＥＳ細胞を試験管内で分化させること、及び／または前記操作されたＥＳ細胞から遺伝子操作された非ヒト動物を取得することと、
（ｃ）前記遺伝子操作されたＥＳ細胞、それに由来する原始外胚葉、それに由来する運動ニューロン、またはそれに由来する非ヒト動物の表現型及び／またはＴＤＰ－４３生物活性を評価することと、を含む、前記方法。
(項目４０)
前記表現型が、細胞培養、蛍光原位置ハイブリッド形成、ウエスタンブロット分析、またはそれらの組み合わせによって評価される、項目３８または項目３９に記載の方法。
(項目４１)
前記表現型を評価することが、前記遺伝子操作されたＥＳ細胞、それに由来する原始外胚葉、それに由来する運動ニューロン、またはそれに由来する非ヒト動物の生存能力を測定することを含む、項目３８～４０のいずれか１項に記載の方法。
(項目４２)
前記表現型を評価することが、前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドの細胞での位置を決定することを含む、項目３８～４１のいずれか１項に記載の方法。
(項目４３)
前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドの前記生物活性を評価することが、ＴＤＰ－４３によって調節される隠れエクソンを含む遺伝子のスプライス産物を測定することを含む、項目３８～４２のいずれか１項に記載の方法。
(項目４４)
ＴＤＰ－４３によって調節される隠れエクソンを含む前記遺伝子がＣｒｅｍ、Ｆｙｘｄ２、Ｃｌｆ１を含む、項目４３に記載の方法。
(項目４５)
前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドの前記生物活性を評価することが、選択的スプライシングを受けたＴＤＰ－４３のレベルを測定することを含む、項目３８～４４のいずれか１項に記載の方法。
(項目４６)
ＴＤＰ－４３ポリペプチドのＰＬＤをコードし、及び／またはエクソン６の下流とエクソン７の上流の非翻訳配列を含むＴＤＰ－４３ ｍＲＮＡ配列を標的とするギャップマーモチーフを含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
(項目４７)
ＴＤＰ－４３ポリペプチドのＰＬＤをコードし、及び／またはエクソン６の下流とエクソン７の上流の非翻訳配列を含むＴＤＰ－４３ ｍＲＮＡ配列を標的とする配列を含む、ｓｉＲＮＡ。
(項目４８)
Ｃａｓ９タンパク質と少なくとも１つのｇＲＮＡとを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムであって、前記ｇＲＮＡがＰＬＤを欠く切り詰めたＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする選択的ｍＲＮＡをもたらす選択的スプライス部位をコードする配列でのまたはその近傍の配列を認識する、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム。
(項目４９)
項目２に記載の胚性幹細胞を含む、非ヒト動物。
(項目５０)
変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子を含む非ヒト動物であって、
前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドが、野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドに見いだされる核局在化シグナル（ＮＬＳ）、ＲＮＡ認識モチーフ１（ＲＲＭ１）、ＲＮＡ認識モチーフ２（ＲＲＭ２）、推定核外輸送シグナル（Ｅ）、プリオン様ドメイン（ＰＬＤ）、またはそれらの組み合わせを含む機能的構造ドメインを欠き、且つ
任意で、前記野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドが配列番号１、配列番号３、または配列番号５として示される配列を含む、前記非ヒト動物。
(項目５１)
前記変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子が前記非ヒト動物の変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子である、項目５０に記載の非ヒト動物。
(項目５２)
前記変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子が変異させたヒトＴＡＲＤＢＰ遺伝子である、項目５０または項目５１に記載の非ヒト動物。
(項目５３)
前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドが以下：
（ａ）前記ＮＬＳにおけるアミノ酸の点突然変異、
（ｂ）前記ＲＲＭ１におけるアミノ酸の点突然変異、
（ｃ）前記ＲＲＭ２におけるアミノ酸の点突然変異、
（ｄ）前記核外輸送シグナルの少なくとも一部の欠失、及び
（ｅ）前記プリオン様ドメインの少なくとも一部の欠失、の１以上に起因して機能的構造ドメインを欠く、項目５０～５２のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
(項目５４)
（ａ）前記ＮＬＳにおけるアミノ酸の前記点突然変異がＫ８２Ａ Ｋ８３Ａ、Ｒ８４Ａ、Ｋ９５Ａ、Ｋ９７Ａ、Ｋ９８Ａ、またはそれらの組み合わせを含み、
（ｂ）ＲＲＭ１における前記点突然変異がＦ１４７Ｌ及び／またはＦ１４９Ｌを含み、
（ｃ）ＲＲＭ２における前記点突然変異がＦ１９４Ｌ及び／またはＦ２２９Ｌを含み、
（ｄ）前記核外輸送シグナル欠失の少なくとも一部の前記欠失が野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドの２３９位と２５０位にて及びその間でアミノ酸の欠失を含み、且つ
（ｅ）前記プリオン様ドメインの少なくとも一部の前記欠失が野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドの２７４位と４１４位にて及びその間でアミノ酸の欠失、を含む、項目５３に記載の非ヒト動物。
(項目５５)
前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドがＫ８２Ａ Ｋ８３Ａ、Ｒ８４Ａ、Ｋ９５Ａ、Ｋ９７Ａ、及びＫ９８Ａを含む、項目５０～５４のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
(項目５６)
前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドが野生型ポリペプチドの２７４位から４１４位のアミノ酸で前記プリオン様ドメインを欠く、項目５０～５５のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
(項目５７)
前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドがＦ１４７Ｌ及びＦ１４９Ｌを含む、項目５０～５６のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
(項目５８)
前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドがＦ１９４Ｌ及びＦ２２９Ｌを含む、項目５０～５７のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
(項目５９)
前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドが２３９位から２５０位のアミノ酸で前記核外輸送シグナルを欠く、項目５０～５８のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
(項目６０)
変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする前記変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子が内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子座にて内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子に取って代わる、項目５０～５９のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
(項目６１)
前記非ヒト動物が、変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする前記変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子についてヘテロ接合性である、項目６０に記載の非ヒト動物。
(項目６２)
前記非ヒト動物がさらに、ノックアウト突然変異を含むＴＡＲＤＢＰ遺伝子を含む、項目５０～６１のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
(項目６３)
前記ノックアウト突然変異が条件付きノックアウト突然変異を含む、項目６２に記載の非ヒト動物。
(項目６４)
前記ノックアウト突然変異が部位特異的組換え認識配列を含む、項目６２または項目６３に記載の非ヒト動物。
(項目６５)
前記ノックアウト突然変異がｌｏｘｐ配列を含む、項目６２～６４のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
(項目６６)
前記ｌｏｘｐ配列がノックアウト突然変異を含む前記ＴＡＲＤＢＰ遺伝子のエクソン３に隣接する、項目６５に記載の非ヒト動物。
(項目６７)
前記ノックアウト突然変異がＴＤＰ－４３ペプチドのコード配列全体の欠失を含む、項目６２に記載の非ヒト動物。
(項目６８)
前記非ヒト動物が前記操作されたＴＡＲＤＢＰ遺伝子座についてヘテロ接合性であり、且つ
（ｉ）一方の染色体にて内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子座での内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子の、変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする前記変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子による置換、及び
（ｉｉ）他方の相同染色体にて前記内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子座での、前記ノックアウト突然変異を含む前記ＴＡＲＤＢＰ遺伝子または野生型ＴＡＲＤＢＰ遺伝子のいずれか、を含む、項目６２～６７のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
(項目６９)
前記非ヒト動物が野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドを発現する、項目４９～６８のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
(項目７０)
（ｉ）対照動物における野生型ＴＡＲＤＢＰ遺伝子のｍＲＮＡ転写物レベルに匹敵する前記変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子のｍＲＮＡ転写物レベル、
（ｉｉ）対照動物における野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドのレベルと比べて前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドのレベルの増加、
（ｉｉｉ）例えば、運動ニューロンの核よりも細胞質に高濃度で見られる変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチド、
（ｉｖ）野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドと比べて不溶性が増した変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチド、
（ｖ）前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドを含む細胞質凝集体、
（ｖｉ）隠れエクソンのスプライシングの増加、
（ｖｉｉ）選択的スプライシングを受けたＴＤＰ－４３形態のレベルの低下、
（ｖｉｉｉ）前脛骨筋のような主に速筋で構成される筋肉組織の脱神経、及び／または
（ｉｘ）肋間筋のような主に遅筋で構成される筋肉組織の正常な神経支配、を含む、項目４９～６９のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
(項目７１)
（ｉ）一方の染色体にて内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子座での前記ＴＡＲＤＢＰ遺伝子の条件付きノックアウト突然変異、及び（ｉｉ）他方の相同染色体にて前記内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子座でのＴＡＲＤＢＰコード配列全体の欠失、を含む、非ヒト動物。
(項目７２)
前記非ヒト動物が齧歯動物である、項目４９～７１のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
(項目７３)
前記非ヒト動物がラットである、項目４９～７２のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
(項目７４)
前記非ヒト動物がマウスである、項目４９～７２のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
(項目７５)
疾患の治療のための治療候補を特定する方法であって、
（ａ）項目４９～７４のいずれか１項に記載の非ヒト動物を候補薬剤と接触させることと、
（ｂ）前記非ヒト動物の表現型及び／またはＴＤＰ－４３生物活性を評価することと、
（ｃ）前記非ヒトが表現型及び／またはＴＤＰ－４３生物活性を取り戻す前記候補薬剤を特定することと、を含む、前記方法。
(項目７６)
変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドであって、以下：
（ａ）ＮＬＳにおけるアミノ酸の点突然変異、
（ｂ）ＲＲＭ１におけるアミノ酸の点突然変異、
（ｃ）ＲＲＭ２におけるアミノ酸の点突然変異、
（ｄ）核外輸送シグナルの少なくとも一部の欠失、及び
（ｅ）プリオン様ドメインの少なくとも一部の欠失、の１以上を含むように修飾された配列番号１、３、または５として示される配列を含む、前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチド。
(項目７７)
（ａ）前記ＮＬＳにおけるアミノ酸の前記点突然変異がＫ８２Ａ Ｋ８３Ａ、Ｒ８４Ａ、Ｋ９５Ａ、Ｋ９７Ａ、Ｋ９８Ａ、またはそれらの組み合わせを含み、
（ｂ）ＲＲＭ１における前記点突然変異がＦ１４７Ｌ及び／またはＦ１４９Ｌを含み、
（ｃ）ＲＲＭ２における前記点突然変異がＦ１９４Ｌ及び／またはＦ２２９Ｌを含み、
（ｄ）前記核外輸送シグナル欠失の少なくとも一部の前記欠失が野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドの２３９位と２５０位にて及びその間でアミノ酸の欠失を含み、且つ
（ｅ）前記プリオン様ドメインの少なくとも一部の前記欠失が野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドの２７４位と４１４位にて及びその間でアミノ酸の欠失を含む、項目７６に記載の変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチド。
(項目７８)
Ｋ８２Ａ突然変異、Ｋ８３Ａ突然変異、Ｒ８４Ａ突然変異、Ｋ９５Ａ突然変異、Ｋ９７Ａ突然変異、及び／またはＫ９８Ａ突然変異を含む、項目７６または項目７７に記載の変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチド。
(項目７９)
野生型ポリペプチドの２７４位から４１４位のアミノ酸で前記プリオン様ドメインの欠失を含む、項目７６～７８のいずれか１項に記載の変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチド。
(項目８０)
前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドがＦ１４７Ｌ突然変異及び／またはＦ１４９Ｌ突然変異を含む、項目７６～７９のいずれか１項に記載の変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチド。
(項目８１)
前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドがＦ１９４Ｌ突然変異及び／またはＦ２２９Ｌ突然変異を含む、項目７６～８０のいずれか１項に記載の変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチド。
(項目８２)
前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドが２３９位から２５０位のアミノ酸で前記核外輸送シグナルを欠く、項目７６～８１のいずれか１項に記載の変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチド。
(項目８３)
項目７６～８２のいずれか１項に記載の変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸。
(項目８４)
さらに、５’から３’に向かって：５’相同性アームと、前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする前記核酸配列と、３’相同性アームとを含み、前記核酸が齧歯類細胞にて相同組換えを受ける、項目８３に記載の核酸。
(項目８５)
前記核酸が内在性ラットＴＡＲＤＢＰ遺伝子座にて相同組換えを受け、前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする前記核酸配列が前記内在性ＴＡＲＤＢＰコード配列を置き換えるように前記５’及び３’の相同性アームがラット配列に相同である、項目８４に記載の核酸。
(項目８６)
前記核酸が内在性マウスＴＡＲＤＢＰ遺伝子座にて相同組換えを受け、前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする前記核酸配列が前記内在性ＴＡＲＤＢＰコード配列を置き換えるように前記５’及び３’の相同性アームがマウス配列に相同である、項目８４に記載の核酸。
(項目８７)
細胞にてＰＬＤを欠く切り詰めたＴＤＰ－４３をコードする選択的ＴＤＰ－４３ ｍＲＮＡを温存しながら、ＰＬＤを含むＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードするＴＤＰ－４３ ｍＲＮＡを選択的に減少させる方法であって、
（ｉ）ＴＤＰ－４３ポリペプチドのＰＬＤをコードし、及び／またはエクソン６の下流及びエクソン７の上流の非翻訳配列を含むＴＤＰ－４３ ｍＲＮＡ配列を標的とするギャップマーモチーフを含むアンチセンスオリゴヌクレオチド、
（ｉｉ）ＴＤＰ－４３ポリペプチドのＰＬＤをコードし、及び／またはエクソン６の下流及びエクソン７の上流の非翻訳配列を含むＴＤＰ－４３ ｍＲＮＡ配列を標的とする配列を含むｓｉＲＮＡ、及び／または
（ｉｉｉ）ＰＬＤを欠く切り詰め型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする選択的ｍＲＮＡをもたらす選択的スプライス部位をコードする配列でのまたはその近傍の配列を、ｇＲＮＡが認識する、Ｃａｓ９タンパク質と少なくとも１つの前記ｇＲＮＡとを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、を前記細胞に導入することを含む、前記方法。
(項目８８)
本特許出願にて最初に記載され、開示され、または図示された主題が包含する任意の実施形態または任意の適用可能な項目カテゴリー、例えば、製品、プロセス、または使用によって特徴付けられる、変異型ＴＤＰ－４３を発現する非ヒト動物、非ヒト動物を作製する方法、非ヒト動物を作製する前記方法で使用するための核酸、非ヒト動物を作製する前記方法で使用するための細胞、そのように作製された前記非ヒト動物の使用、及び前記非ヒト動物に由来する細胞及び／または変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドを発現する細胞、変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチド及び変異型ポリペプチドをコードする核酸、アンチセンスオリゴヌクレオチド、またはｓｉＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム。

Claims (88)

  1. 変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子を含む非ヒト動物細胞であって、
    前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドが、野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドに見いだされる核局在化シグナル（ＮＬＳ）、ＲＮＡ認識モチーフ１（ＲＲＭ１）、ＲＮＡ認識モチーフ２（ＲＲＭ２）、推定核外輸送シグナル（Ｅ）、プリオン様ドメイン（ＰＬＤ）、またはそれらの組み合わせを含む機能的構造ドメインを欠き、且つ
    前記非ヒト動物細胞は前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドを発現し、
    任意で、前記野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドは、配列番号１、配列番号３、または配列番号５として示される配列を含む、前記非ヒト動物細胞。
  2. 前記非ヒト動物細胞が胚性幹（ＥＳ）細胞、胚様体、または胚性幹細胞由来運動ニューロン（ＥＳＭＮ）である、請求項１に記載の非ヒト動物細胞。
  3. 前記変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子が前記非ヒト動物の変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子である、請求項１または請求項２に記載の非ヒト動物細胞。
  4. 前記変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子が変異させたヒトＴＡＲＤＢＰ遺伝子である、請求項１～２のいずれか１項に記載の非ヒト動物細胞。
  5. 前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドが以下：
    （ａ）前記ＮＬＳにおけるアミノ酸の点突然変異、
    （ｂ）前記ＲＲＭ１におけるアミノ酸の点突然変異、
    （ｃ）前記ＲＲＭ２におけるアミノ酸の点突然変異、
    （ｄ）前記核外輸送シグナルの少なくとも一部の欠失、及び
    （ｅ）前記プリオン様ドメインの少なくとも一部の欠失、の１以上に起因して機能的構造ドメインを欠く、先行請求項のいずれか１項に記載の非ヒト動物細胞。
  6. （ａ）前記ＮＬＳにおけるアミノ酸の前記点突然変異がＫ８２Ａ Ｋ８３Ａ、Ｒ８４Ａ、Ｋ９５Ａ、Ｋ９７Ａ、Ｋ９８Ａ、またはそれらの組み合わせを含み、
    （ｂ）ＲＲＭ１における前記点突然変異がＦ１４７Ｌ及び／またはＦ１４９Ｌを含み、
    （ｃ）ＲＲＭ２における前記点突然変異がＦ１９４Ｌ及び／またはＦ２２９Ｌを含み、
    （ｄ）前記核外輸送シグナル欠失の少なくとも一部の前記欠失が野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドの２３９位と２５０位にて及びその間でアミノ酸の欠失を含み、且つ
    （ｅ）前記プリオン様ドメインの少なくとも一部の前記欠失が野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドの２７４位と４１４位にて及びその間でアミノ酸の欠失を含む、請求項５に記載の非ヒト動物細胞。
  7. 前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドがＫ８２Ａ Ｋ８３Ａ、Ｒ８４Ａ、Ｋ９５Ａ、Ｋ９７Ａ、及びＫ９８Ａを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の非ヒト動物細胞。
  8. 前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドが野生型ポリペプチドの２７４位から４１４位のアミノ酸で前記プリオン様ドメインを欠く、先行請求項のいずれか１項に記載の非ヒト動物細胞。
  9. 前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドがＦ１４７Ｌ及びＦ１４９Ｌを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の非ヒト動物細胞。
  10. 前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドがＦ１９４Ｌ及びＦ２２９Ｌを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の非ヒト動物細胞。
  11. 前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドが２３９位から２５０位のアミノ酸で前記核外輸送シグナルを欠く、先行請求項のいずれか１項に記載の非ヒト動物細胞。
  12. 変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする前記変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子が内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子座にて内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子に取って代わる、先行請求項のいずれか１項に記載の非ヒト動物細胞。
  13. 前記非ヒト動物細胞が、変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする前記変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子についてヘテロ接合性である、請求項１３に記載の非ヒト動物細胞。
  14. 前記非ヒト動物細胞が、変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする前記変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子についてホモ接合性である、請求項１３に記載の非ヒト動物細胞。
  15. 前記非ヒト動物細胞がさらに、ノックアウト突然変異を含むＴＡＲＤＢＰ遺伝子を含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載の非ヒト動物細胞。
  16. 前記ノックアウト突然変異が条件付きノックアウト突然変異を含む、請求項１６に記載の非ヒト動物細胞。
  17. 前記ノックアウト突然変異が部位特異的組換え認識配列を含む、請求項１５または請求項１６に記載の非ヒト動物細胞。
  18. 前記ノックアウト突然変異がｌｏｘｐ配列を含む、請求項１５～１７のいずれか１項に記載の非ヒト動物細胞。
  19. 前記ｌｏｘｐ配列がノックアウト突然変異を含む前記ＴＡＲＤＢＰ遺伝子のエクソン３に隣接する、請求項１８に記載の非ヒト動物細胞。
  20. 前記ノックアウト突然変異が、ＴＤＰ－４３ペプチドのコード配列全体の欠失を含む、請求項１６に記載の非ヒト動物細胞。
  21. 前記非ヒト動物細胞が前記操作されたＴＡＲＤＢＰ遺伝子座についてヘテロ接合性であり、且つ
    （ｉ）一方の染色体にて内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子座での内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子の変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする前記変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子による置換、及び
    （ｉｉ）他方の相同染色体にて前記内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子座での前記ノックアウト突然変異を含む前記ＴＡＲＤＢＰ遺伝子または野生型ＴＡＲＤＢＰ遺伝子のいずれかを含む、請求項１５～２０のいずれか１項に記載の非ヒト動物細胞。
  22. 前記非ヒト動物細胞が野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドを発現しない、先行請求項のいずれか１項に記載の非ヒト動物細胞。
  23. 前記非ヒト動物細胞が野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドを発現する、請求項１～２１のいずれか１項に記載の非ヒト動物細胞。
  24. （ｉ）対照細胞における野生型ＴＡＲＤＢＰ遺伝子のｍＲＮＡ転写物レベルに匹敵する前記変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子のｍＲＮＡ転写物レベル、
    （ｉｉ）対照細胞における野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドのレベルと比べて前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドのレベルの増加、
    （ｉｉｉ）例えば、運動ニューロンの核よりも細胞質に高濃度で見られる変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチド、
    （ｉｖ）野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドと比べて不溶性が増した変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチド、
    （ｖ）前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドを含む細胞質凝集体、
    （ｖｉ）隠れエクソンのスプライシングの増加、及び／または
    （ｖｉｉ）選択的スプライシングを受けたＴＤＰ－４３形態のレベルの低下、を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の非ヒト動物細胞。
  25. （ｉ）一方の染色体にて内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子座でのＴＡＲＤＢＰ遺伝子の条件付きノックアウト突然変異と、
    （ｉｉ）他方の相同染色体にて前記内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子座でのＴＡＲＤＢＰコード配列全体の欠失と、を含む非ヒト動物細胞。
  26. 前記細胞が胚性幹（ＥＳ）細胞、原始外胚葉細胞、または胚性幹細胞に由来する運動ニューロン（ＥＳＭＮ）である、先行請求項のいずれか１項に記載の非ヒト動物細胞。
  27. 前記非ヒト動物細胞が齧歯類細胞である、先行請求項のいずれか１項に記載の非ヒト動物細胞。
  28. 前記非ヒト動物細胞がラット細胞である、先行請求項のいずれか１項に記載の非ヒト動物細胞。
  29. 前記非ヒト動物細胞がマウス細胞である、請求項１～２７のいずれか１項に記載の非ヒト動物細胞。
  30. 前記非ヒト動物細胞が試験管内で培養される、先行請求項のいずれか１項に記載の非ヒト動物細胞。
  31. 先行請求項のいずれか１項に記載の非ヒト動物細胞を含む非ヒト動物組織。
  32. 先行請求項のいずれか１項に記載の非ヒト動物細胞または組織を含む組成物。
  33. 変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドを発現する非ヒト動物または非ヒト動物細胞を作製する方法であって、前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子を含むように前記非ヒト動物または非ヒト動物細胞のゲノムを操作することを含み、その際、前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドは野生型ＴＤＰ－４３と比べて機能的構造ドメインを欠き、任意で、前記野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドは、配列番号１、配列番号３、または配列番号５として示される配列を含む、前記方法。
  34. 操作することが、内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子を、前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする前記変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子で置き換えることを含む、請求項３３に記載の方法。
  35. 操作することがさらに、内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子を、ノックアウト突然変異を含むＴＡＲＤＢＰ遺伝子で置き換えることを含む、請求項３３または請求項３４に記載の方法。
  36. 前記ノックアウト突然変異が条件付きノックアウト突然変異を含む、請求項３５に記載の方法。
  37. さらに、ノックアウト突然変異を含む前記ＴＡＲＤＢＰ遺伝子の発現を排除する条件で前記細胞を培養することを含む、請求項３６に記載の方法。
  38. 疾患の治療のための治療候補を特定する方法であって、
    （ａ）請求項１～３１のいずれか１項に記載の非ヒト動物細胞もしくは組織、または請求項３２に記載の組成物を候補薬剤と接触させることと、
    （ｂ）前記非ヒト細胞または組織の表現型及び／またはＴＤＰ－４３生物活性を評価することと、
    （ｃ）野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドを発現する対照の細胞または組織の表現型及び／またはＴＤＰ－４３生物活性に匹敵する表現型及び／またはＴＤＰ－４３生物活性を前記非ヒト細胞または組織に取り戻す前記候補薬剤を特定することと、を含む、前記方法。
  39. ＴＤＰ－４３構造ドメインの生物学的機能を評価する方法であって、
    （ａ）核局在化シグナル（ＮＬＳ）、第１のＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲＭ１）、第１のＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲＭ２）、推定核外輸送シグナル（Ｅ）、プリオン様ドメイン（ＰＬＤ）、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される機能的構造ドメインを欠く変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子を含むように胚性幹（ＥＳ）細胞を操作することと、
    （ｂ）任意で、前記操作されたＥＳ細胞を試験管内で分化させること、及び／または前記操作されたＥＳ細胞から遺伝子操作された非ヒト動物を取得することと、
    （ｃ）前記遺伝子操作されたＥＳ細胞、それに由来する原始外胚葉、それに由来する運動ニューロン、またはそれに由来する非ヒト動物の表現型及び／またはＴＤＰ－４３生物活性を評価することと、を含む、前記方法。
  40. 前記表現型が、細胞培養、蛍光原位置ハイブリッド形成、ウエスタンブロット分析、またはそれらの組み合わせによって評価される、請求項３８または請求項３９に記載の方法。
  41. 前記表現型を評価することが、前記遺伝子操作されたＥＳ細胞、それに由来する原始外胚葉、それに由来する運動ニューロン、またはそれに由来する非ヒト動物の生存能力を測定することを含む、請求項３８～４０のいずれか１項に記載の方法。
  42. 前記表現型を評価することが、前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドの細胞での位置を決定することを含む、請求項３８～４１のいずれか１項に記載の方法。
  43. 前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドの前記生物活性を評価することが、ＴＤＰ－４３によって調節される隠れエクソンを含む遺伝子のスプライス産物を測定することを含む、請求項３８～４２のいずれか１項に記載の方法。
  44. ＴＤＰ－４３によって調節される隠れエクソンを含む前記遺伝子がＣｒｅｍ、Ｆｙｘｄ２、Ｃｌｆ１を含む、請求項４３に記載の方法。
  45. 前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドの前記生物活性を評価することが、選択的スプライシングを受けたＴＤＰ－４３のレベルを測定することを含む、請求項３８～４４のいずれか１項に記載の方法。
  46. ＴＤＰ－４３ポリペプチドのＰＬＤをコードし、及び／またはエクソン６の下流とエクソン７の上流の非翻訳配列を含むＴＤＰ－４３ ｍＲＮＡ配列を標的とするギャップマーモチーフを含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
  47. ＴＤＰ－４３ポリペプチドのＰＬＤをコードし、及び／またはエクソン６の下流とエクソン７の上流の非翻訳配列を含むＴＤＰ－４３ ｍＲＮＡ配列を標的とする配列を含む、ｓｉＲＮＡ。
  48. Ｃａｓ９タンパク質と少なくとも１つのｇＲＮＡとを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムであって、前記ｇＲＮＡがＰＬＤを欠く切り詰めたＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする選択的ｍＲＮＡをもたらす選択的スプライス部位をコードする配列でのまたはその近傍の配列を認識する、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム。
  49. 請求項２に記載の胚性幹細胞を含む、非ヒト動物。
  50. 変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子を含む非ヒト動物であって、
    前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドが、野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドに見いだされる核局在化シグナル（ＮＬＳ）、ＲＮＡ認識モチーフ１（ＲＲＭ１）、ＲＮＡ認識モチーフ２（ＲＲＭ２）、推定核外輸送シグナル（Ｅ）、プリオン様ドメイン（ＰＬＤ）、またはそれらの組み合わせを含む機能的構造ドメインを欠き、且つ
    任意で、前記野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドが配列番号１、配列番号３、または配列番号５として示される配列を含む、前記非ヒト動物。
  51. 前記変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子が前記非ヒト動物の変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子である、請求項５０に記載の非ヒト動物。
  52. 前記変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子が変異させたヒトＴＡＲＤＢＰ遺伝子である、請求項５０または請求項５１に記載の非ヒト動物。
  53. 前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドが以下：
    （ａ）前記ＮＬＳにおけるアミノ酸の点突然変異、
    （ｂ）前記ＲＲＭ１におけるアミノ酸の点突然変異、
    （ｃ）前記ＲＲＭ２におけるアミノ酸の点突然変異、
    （ｄ）前記核外輸送シグナルの少なくとも一部の欠失、及び
    （ｅ）前記プリオン様ドメインの少なくとも一部の欠失、の１以上に起因して機能的構造ドメインを欠く、請求項５０～５２のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
  54. （ａ）前記ＮＬＳにおけるアミノ酸の前記点突然変異がＫ８２Ａ Ｋ８３Ａ、Ｒ８４Ａ、Ｋ９５Ａ、Ｋ９７Ａ、Ｋ９８Ａ、またはそれらの組み合わせを含み、
    （ｂ）ＲＲＭ１における前記点突然変異がＦ１４７Ｌ及び／またはＦ１４９Ｌを含み、
    （ｃ）ＲＲＭ２における前記点突然変異がＦ１９４Ｌ及び／またはＦ２２９Ｌを含み、
    （ｄ）前記核外輸送シグナル欠失の少なくとも一部の前記欠失が野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドの２３９位と２５０位にて及びその間でアミノ酸の欠失を含み、且つ
    （ｅ）前記プリオン様ドメインの少なくとも一部の前記欠失が野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドの２７４位と４１４位にて及びその間でアミノ酸の欠失、を含む、請求項５３に記載の非ヒト動物。
  55. 前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドがＫ８２Ａ Ｋ８３Ａ、Ｒ８４Ａ、Ｋ９５Ａ、Ｋ９７Ａ、及びＫ９８Ａを含む、請求項５０～５４のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
  56. 前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドが野生型ポリペプチドの２７４位から４１４位のアミノ酸で前記プリオン様ドメインを欠く、請求項５０～５５のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
  57. 前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドがＦ１４７Ｌ及びＦ１４９Ｌを含む、請求項５０～５６のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
  58. 前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドがＦ１９４Ｌ及びＦ２２９Ｌを含む、請求項５０～５７のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
  59. 前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドが２３９位から２５０位のアミノ酸で前記核外輸送シグナルを欠く、請求項５０～５８のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
  60. 変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする前記変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子が内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子座にて内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子に取って代わる、請求項５０～５９のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
  61. 前記非ヒト動物が、変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする前記変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子についてヘテロ接合性である、請求項６０に記載の非ヒト動物。
  62. 前記非ヒト動物がさらに、ノックアウト突然変異を含むＴＡＲＤＢＰ遺伝子を含む、請求項５０～６１のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
  63. 前記ノックアウト突然変異が条件付きノックアウト突然変異を含む、請求項６２に記載の非ヒト動物。
  64. 前記ノックアウト突然変異が部位特異的組換え認識配列を含む、請求項６２または請求項６３に記載の非ヒト動物。
  65. 前記ノックアウト突然変異がｌｏｘｐ配列を含む、請求項６２～６４のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
  66. 前記ｌｏｘｐ配列がノックアウト突然変異を含む前記ＴＡＲＤＢＰ遺伝子のエクソン３に隣接する、請求項６５に記載の非ヒト動物。
  67. 前記ノックアウト突然変異がＴＤＰ－４３ペプチドのコード配列全体の欠失を含む、請求項６２に記載の非ヒト動物。
  68. 前記非ヒト動物が前記操作されたＴＡＲＤＢＰ遺伝子座についてヘテロ接合性であり、且つ
    （ｉ）一方の染色体にて内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子座での内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子の、変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする前記変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子による置換、及び
    （ｉｉ）他方の相同染色体にて前記内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子座での、前記ノックアウト突然変異を含む前記ＴＡＲＤＢＰ遺伝子または野生型ＴＡＲＤＢＰ遺伝子のいずれか、を含む、請求項６２～６７のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
  69. 前記非ヒト動物が野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドを発現する、請求項４９～６８のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
  70. （ｉ）対照動物における野生型ＴＡＲＤＢＰ遺伝子のｍＲＮＡ転写物レベルに匹敵する前記変異させたＴＡＲＤＢＰ遺伝子のｍＲＮＡ転写物レベル、
    （ｉｉ）対照動物における野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドのレベルと比べて前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドのレベルの増加、
    （ｉｉｉ）例えば、運動ニューロンの核よりも細胞質に高濃度で見られる変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチド、
    （ｉｖ）野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドと比べて不溶性が増した変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチド、
    （ｖ）前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドを含む細胞質凝集体、
    （ｖｉ）隠れエクソンのスプライシングの増加、
    （ｖｉｉ）選択的スプライシングを受けたＴＤＰ－４３形態のレベルの低下、
    （ｖｉｉｉ）前脛骨筋のような主に速筋で構成される筋肉組織の脱神経、及び／または
    （ｉｘ）肋間筋のような主に遅筋で構成される筋肉組織の正常な神経支配、を含む、請求項４９～６９のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
  71. （ｉ）一方の染色体にて内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子座での前記ＴＡＲＤＢＰ遺伝子の条件付きノックアウト突然変異、及び（ｉｉ）他方の相同染色体にて前記内在性ＴＡＲＤＢＰ遺伝子座でのＴＡＲＤＢＰコード配列全体の欠失、を含む、非ヒト動物。
  72. 前記非ヒト動物が齧歯動物である、請求項４９～７１のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
  73. 前記非ヒト動物がラットである、請求項４９～７２のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
  74. 前記非ヒト動物がマウスである、請求項４９～７２のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
  75. 疾患の治療のための治療候補を特定する方法であって、
    （ａ）請求項４９～７４のいずれか１項に記載の非ヒト動物を候補薬剤と接触させることと、
    （ｂ）前記非ヒト動物の表現型及び／またはＴＤＰ－４３生物活性を評価することと、
    （ｃ）前記非ヒトが表現型及び／またはＴＤＰ－４３生物活性を取り戻す前記候補薬剤を特定することと、を含む、前記方法。
  76. 変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドであって、以下：
    （ａ）ＮＬＳにおけるアミノ酸の点突然変異、
    （ｂ）ＲＲＭ１におけるアミノ酸の点突然変異、
    （ｃ）ＲＲＭ２におけるアミノ酸の点突然変異、
    （ｄ）核外輸送シグナルの少なくとも一部の欠失、及び
    （ｅ）プリオン様ドメインの少なくとも一部の欠失、の１以上を含むように修飾された配列番号１、３、または５として示される配列を含む、前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチド。
  77. （ａ）前記ＮＬＳにおけるアミノ酸の前記点突然変異がＫ８２Ａ Ｋ８３Ａ、Ｒ８４Ａ、Ｋ９５Ａ、Ｋ９７Ａ、Ｋ９８Ａ、またはそれらの組み合わせを含み、
    （ｂ）ＲＲＭ１における前記点突然変異がＦ１４７Ｌ及び／またはＦ１４９Ｌを含み、
    （ｃ）ＲＲＭ２における前記点突然変異がＦ１９４Ｌ及び／またはＦ２２９Ｌを含み、
    （ｄ）前記核外輸送シグナル欠失の少なくとも一部の前記欠失が野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドの２３９位と２５０位にて及びその間でアミノ酸の欠失を含み、且つ
    （ｅ）前記プリオン様ドメインの少なくとも一部の前記欠失が野生型ＴＤＰ－４３ポリペプチドの２７４位と４１４位にて及びその間でアミノ酸の欠失を含む、請求項７６に記載の変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチド。
  78. Ｋ８２Ａ突然変異、Ｋ８３Ａ突然変異、Ｒ８４Ａ突然変異、Ｋ９５Ａ突然変異、Ｋ９７Ａ突然変異、及び／またはＫ９８Ａ突然変異を含む、請求項７６または請求項７７に記載の変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチド。
  79. 野生型ポリペプチドの２７４位から４１４位のアミノ酸で前記プリオン様ドメインの欠失を含む、請求項７６～７８のいずれか１項に記載の変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチド。
  80. 前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドがＦ１４７Ｌ突然変異及び／またはＦ１４９Ｌ突然変異を含む、請求項７６～７９のいずれか１項に記載の変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチド。
  81. 前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドがＦ１９４Ｌ突然変異及び／またはＦ２２９Ｌ突然変異を含む、請求項７６～８０のいずれか１項に記載の変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチド。
  82. 前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドが２３９位から２５０位のアミノ酸で前記核外輸送シグナルを欠く、請求項７６～８１のいずれか１項に記載の変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチド。
  83. 請求項７６～８２のいずれか１項に記載の変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸。
  84. さらに、５’から３’に向かって：５’相同性アームと、前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする前記核酸配列と、３’相同性アームとを含み、前記核酸が齧歯類細胞にて相同組換えを受ける、請求項８３に記載の核酸。
  85. 前記核酸が内在性ラットＴＡＲＤＢＰ遺伝子座にて相同組換えを受け、前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする前記核酸配列が前記内在性ＴＡＲＤＢＰコード配列を置き換えるように前記５’及び３’の相同性アームがラット配列に相同である、請求項８４に記載の核酸。
  86. 前記核酸が内在性マウスＴＡＲＤＢＰ遺伝子座にて相同組換えを受け、前記変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする前記核酸配列が前記内在性ＴＡＲＤＢＰコード配列を置き換えるように前記５’及び３’の相同性アームがマウス配列に相同である、請求項８４に記載の核酸。
  87. 細胞にてＰＬＤを欠く切り詰めたＴＤＰ－４３をコードする選択的ＴＤＰ－４３ ｍＲＮＡを温存しながら、ＰＬＤを含むＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードするＴＤＰ－４３ ｍＲＮＡを選択的に減少させる方法であって、
    （ｉ）ＴＤＰ－４３ポリペプチドのＰＬＤをコードし、及び／またはエクソン６の下流及びエクソン７の上流の非翻訳配列を含むＴＤＰ－４３ ｍＲＮＡ配列を標的とするギャップマーモチーフを含むアンチセンスオリゴヌクレオチド、
    （ｉｉ）ＴＤＰ－４３ポリペプチドのＰＬＤをコードし、及び／またはエクソン６の下流及びエクソン７の上流の非翻訳配列を含むＴＤＰ－４３ ｍＲＮＡ配列を標的とする配列を含むｓｉＲＮＡ、及び／または
    （ｉｉｉ）ＰＬＤを欠く切り詰め型ＴＤＰ－４３ポリペプチドをコードする選択的ｍＲＮＡをもたらす選択的スプライス部位をコードする配列でのまたはその近傍の配列を、ｇＲＮＡが認識する、Ｃａｓ９タンパク質と少なくとも１つの前記ｇＲＮＡとを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、を前記細胞に導入することを含む、前記方法。
  88. 本特許出願にて最初に記載され、開示され、または図示された主題が包含する任意の実施形態または任意の適用可能な請求項カテゴリー、例えば、製品、プロセス、または使用によって特徴付けられる、変異型ＴＤＰ－４３を発現する非ヒト動物、非ヒト動物を作製する方法、非ヒト動物を作製する前記方法で使用するための核酸、非ヒト動物を作製する前記方法で使用するための細胞、そのように作製された前記非ヒト動物の使用、及び前記非ヒト動物に由来する細胞及び／または変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチドを発現する細胞、変異型ＴＤＰ－４３ポリペプチド及び変異型ポリペプチドをコードする核酸、アンチセンスオリゴヌクレオチド、またはｓｉＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム。
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