JP2022538481A - タバコ植物のアルカロイド含有量を調節する方法 - Google Patents

タバコ植物のアルカロイド含有量を調節する方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、植物若しくはその一部のアルカロイド含有量を調節する方法であって、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の活性又は発現を調節することによって植物を改変するステップを含む方法に関する。本発明はまた、タバコにおいて少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）前駆体の含有量を低減する方法であって、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の活性又は発現を調節するステップを含む方法に関する。

Description

本発明は、植物若しくはその一部又は細胞又は細胞培養物のアルカロイド含有量を調節する方法に関する。本発明はまた、植物内のアルカロイド含有量を調節するポリペプチドの発現及び／又は活性を調節する方法に及ぶ。或いは、本発明は、植物内のアルカロイド含有量を調節するポリペプチドをコードする遺伝子の発現及び／又は活性を調節する方法を提供する。本発明はまた、ポリペプチドを調節するために使用できるコンストラクトに及ぶ。本発明はさらに、アルカロイド含有量の調節を達成するように改変された植物細胞及び植物に関する。本発明はまた、このような調節された植物から処理され、収穫葉及び可燃性喫煙物品を含むタバコ産業製品におけるその使用に関する。
アルカロイドは、主に塩基性窒素原子を含有し、細菌、真菌、植物及び動物を含む多種多様な生物によって産生される天然に存在する化合物の群である。
アルカロイドは、炭素骨格の類似性に従い、例えば、インドール様、イソキノリン様及びピリジン様に分類できる。ピリジン誘導体は、単量体アルカロイドの１つのクラスであり、このクラスは、ピリジンの簡単な誘導体、多環縮合された及び非縮合ピリジン誘導体及びセスキテルペンピリジン誘導体を含む。例として、ニコチン、ノルニコチン、シュードオキシニコチン、アナバシン、ミオスミン（myosmine）及びアナタビンがある。
アルカロイドの既知の生物学的機能のほとんどは、防御に関連する。向神経活性分子、例えば、カフェイン、コカイン、モルヒネ及びニコチンは、侵入する捕食者に対する防御化合物として作用する。これらのアルカロイドの蓄積は、遺伝子発現、酵素活性及びアルカロイド濃度をモニタリングするシグナル伝達カスケードの結果である。植物中のアルカロイド含有量の微調整には、ネガティブフィードバックループ及び分解経路が含まれる。
ニコチンは、数種類の植物では天然に生じるが、タバコ植物において最高レベルで見られる。栽培タバコは、総乾燥重量の２～４％のアルカロイドを産生する。ニコチンは、野生及び栽培されたタバコ属（Nicotiana）の種において産生され、草食動物及び昆虫に対する植物防御において重要な役割を果たす（参照により本明細書に組み込まれる、Voelckel et al. (2001) Oecologia 127(2): 274-280）。ニコチンは総アルカロイド含有量の約９０％を占める。アルカロイドプールの残りの１０％は、大部分は構造的に関連する化合物ノルニコチン、アナタビン、アナバシン及びシュードオキシニコチン（ＰＯＮ，pseudooxynicotine）によって構成される。
タバコにおけるアルカロイド含有量の調節は複雑である。遺伝子型、環境、施肥及び農業的慣行（例えば、摘花（topping））を含むいくつかの因子は、タバコ植物におけるアルカロイドレベルに影響を及ぼす。ニコチン生合成のいくつかの重要な調節因子は、十分に特徴付けられており、例えば、この経路において極めて重要な役割を果たすプトレシンＮ－メチルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ，putrescine N-methyltransferase）は、エチレン応答性因子（ＥＲＦ，ethylene responsive factor）スーパーファミリー、タバコゲノム中の最大の転写因子ファミリーのメンバーによって活性化される（参照により本明細書に組み込まれるRushton et al. (2008) Plant Physiol. 147(1): 280-295）。アルカロイド生合成を誘導する他の転写因子は、ＭＹＣ２様塩基性ヘリックス－ループ－ヘリックス（ｂＨＬＨ，basic helix-loop-helix）ファミリーに属する。ＭＹＣ２様ｂＨＬＨは、アルカロイドレベルをＧｂｏｘ媒介性結合及びアルカロイド構造遺伝子の活性化によって直接的に、及びＥＲＦの活性化によって間接的に調節する。
タバコピリジンアルカロイドは、採取後葉乾燥（curing）の間に形成されるタバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ，tobacco-specific nitrosamine）の前駆体である。乾燥タバコ葉に見られる４種の主要なＴＳＮＡとして、Ｎ’－ニトロソノルニコチン（ＮＮＮ，N’-nitrosonornicotine）、Ｎ’ニトロソアナタビン（ＮＡＴ，N’nitrosoanatabine）、Ｎ’－ニトロソアナバシン（ＮＡＢ，N’-nitrosoanabasine）及び４－（メチルニトロソアミノ）－１－（３－ピリジル）－１－ブタノン（ＮＮＫ，4-(methyl nitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone）がある。採取後葉乾燥の間に、ピリジンアルカロイドとニトロソ化種の間の反応は、タバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）の形成につながる。ＰＯＮは、ＴＳＮＡ ＮＮＫの合成において直接前駆体として機能する可能性が高い（参照によって本明細書に組み込まれる、Bush et al., 2001）。ＴＳＮＡの産生及び蓄積の低減は、極めて重要である。ニコチンデメチラーゼ遺伝子のＣＹＰ８２Ｅファミリーは、ニコチンのノルニコチンへの変換の主要な調節因子のうちの１つであり、その活性又は蓄積を変更することは、ＮＮＮレベルの低下をもたらす可能性がある。しかし、ＰＯＮの産生に関与する酵素又は遺伝子は、これまでのところ同定されていない。
実施例に記載されるように、本発明者らは、植物においてアルカロイド含有量を調節する、例えば、タバコにおいてＴＳＮＡ含有量を減少させる目的でアルカロイド及び／又はＴＳＮＡ前駆体合成に関与する遺伝子を調査しようとした。
Voelckel et al. (2001) Oecologia 127(2): 274-280 Rushton et al. (2008) Plant Physiol. 147(1): 280-295 Bush et al., 2001
驚くべきことに、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする遺伝子の活性又は発現を調節することによって、植物のアルカロイド含有量及び／又はＴＳＮＡ含有量若しくはＴＳＮＡの前駆体含有量を調節できるということがわかった。ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする、本明細書において教示される遺伝子（複数可）、例えばＮｉｔａｂ４．５＿００１３６８５ｇ００１０．２は、栽培タバコにおけるアルカロイド及びＴＳＮＡ前駆体含有量の調節因子である。特に、本明細書において教示される遺伝子（複数可）、例えばＮｉｔａｂ４．５＿００１３６８５ｇ００１０．２は、栽培タバコにおけるアルカロイド含有量の調節因子である。Ｎｉｔａｂ４．５＿００１３６８５ｇ００１０．２は、本発明によるＲＮＡ結合性タンパク質をコードする。Ｎｉｔａｂ４．５＿００００３０８ｇ０１５０．２、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００３９１９ｇ００１０．２、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００２９７８ｇ００２０．２、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００１３６１ｇ０２２０．２、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００２９７８ｇ００３０．２、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００１３６１ｇ０２２５．２、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００３９７８ｇ００２０．２、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００００７８ｇ０２４０．２、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００５０７９ｇ００５０．２、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００８１８５ｇ００３０．２は、本発明によるＮｉｔａｂ４．５＿００１３６８５ｇ００１０．２のホモログである。
本発明によるＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン（ＲＢＤ）及びＲＧＧドメインと称される保存されたドメインを含有し得る。
本発明によれば、アルカロイド含有量が調節され、タバコ産業製品の消費者が望む商業的に望ましい形質を有するタバコ産業製品を製造できる。一部の例では、消費者は、低レベルのアルカロイド含有量を有する製品を望む場合がある。一部の例では、消費者は、低レベルのＴＳＮＡ前駆体を有する製品を望む場合がある。
本発明は、植物（タバコ及び他のタバコ属（Nicotiana）の種など）が、タンパク質、ペプチド及び代謝産物の生成のために、例えば、治療薬及び医薬品、例えば、抗生物質、ウイルス様粒子又は栄養補助食品（neutraceuticals）又は小分子の生成のために使用される植物分子農業の分野において特に有用であり得る。タバコは、ＰｈａｒｍＰｌａｎｔと呼ばれるＥＵの出資によるプロジェクトにおいてＨＩＶ中和抗体の開発のために使用されており、またＭｅｄｉｃａｇｏ社、Ｃａｎａｄａは、インフルエンザワクチン製造のためのウイルス様粒子の生成のためのタバコベースのプラットフォームに取り組んできた。
したがって、本発明による植物をニコチン性アルカロイドの存在を低減又は排除するための分子農業のために使用できる。低ニコチン植物又は台木（rootsock）の使用は、分子農業において有益であり、精製と関連する下流処理コストを低減するであろう。
本発明者らは、驚くべきことに、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする遺伝子の活性又は発現を調節する（例えば、低下させる）ことによって、植物（例えば、タバコ植物）のアルカロイド含有量を調節する（例えば、減少させる）方法を決定した。植物（例えば、タバコ植物）のアルカロイド含有量（例えば、ノルニコチン、ＰＯＮ、アナバシン、アナタビン又はミオスミンのうち１又は２以上の含有量、適切には、ノルニコチン、ＰＯＮ、アナバシン又はアナタビンのうち１又は２以上の含有量）は、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする遺伝子の活性又は発現を低下させることによって減少させることができる、或いはＲＮＡ結合性タンパク質をコードする遺伝子の活性又は発現を増大させることによって増加させることができる。本発明の前には、本明細書において記載されるＲＮＡ結合性タンパク質をコードする遺伝子の活性又は発現の調節を使用して、アルカロイド含有量を調節できる、又はＴＳＮＡ前駆体含有量、特に、ノルニコチン、ＰＯＮ、アナバシン及び／又はアナタビン含有量を調節できるであろうということは知られていなかった。
一態様では、本発明は、タバコ植物若しくはその一部又はタバコ細胞又はタバコ細胞培養物のアルカロイド含有量を調節する（例えば、低減する）方法であって、配列番号１として示されるアミノ酸配列又は配列番号１に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列又は配列番号１のホモログを有するＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の活性又は発現を低下させることによって、前記植物若しくはその一部又は細胞を改変するステップを含む方法を提供する。
一態様では、本発明は、タバコ植物若しくはその一部又はタバコ細胞又はタバコ細胞培養物のアルカロイド含有量を調節する（例えば、低減する）方法であって、配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８若しくは３１として示されるアミノ酸配列又は配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８若しくは３１に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を有するＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の活性又は発現を低下させることによって、前記植物若しくはその一部又は細胞を改変するステップを含む方法を提供する。
別の態様では、本発明は、タバコ植物若しくはその一部又はタバコ細胞又はタバコ細胞培養物においてタバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）前駆体の含有量を低減する方法であって、配列番号１として示されるアミノ酸配列又は配列番号１に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列又は配列番号１のホモログを有するＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の活性又は発現を低下させることによって、前記植物若しくはその一部又は細胞を改変するステップを含む方法を提供する。
一態様では、本発明は、タバコ植物若しくはその一部又はタバコ細胞又はタバコ細胞培養物においてタバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）前駆体の含有量を低減する方法であって、配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８若しくは３１として示されるアミノ酸配列又は配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８若しくは３１に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を有するＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の活性又は発現を低下させることによって、前記植物若しくはその一部又は細胞を改変するステップを含む方法を提供する。
別の態様では、本発明は、タバコ細胞又はタバコ植物若しくはその一部又はタバコ細胞培養物においてアルカロイド含有量を調節する（例えば、減少させる）又はＴＳＮＡ前駆体含有量を低減するための、配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８若しくは３１として示されるアミノ酸配列又は配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８若しくは３１に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を有するＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の使用を提供する。
さらなる態様において、アルカロイド含有量が調節された（例えば、減少した）又はＴＳＮＡ前駆体含有量が低減された、植物若しくはその一部、タバコ細胞又はタバコ細胞培養物、植物増殖材料、葉、カットされた収穫葉、処理葉又はカットされた処理葉を生成する方法であって、配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８若しくは３１として示されるアミノ酸配列又は配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８若しくは３１に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を有するＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の活性又は発現を低下させるために、前記植物若しくはその一部又は細胞又は細胞培養物又は植物増殖材料を改変するステップを含む方法を提供する。
適切には、アルカロイド含有量又はＴＳＮＡ前駆体含有量を、配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８若しくは３１として示されるアミノ酸配列又は配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８若しくは３１に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を有する前記ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の活性又は発現を低下させるように改変されていない植物若しくはその一部又は細胞又は細胞培養物又は植物増殖材料又は葉と比較して低減できる。
別の態様では、本発明は、未改変植物若しくはその一部又は未改変細胞培養物と比較してアルカロイド含有量の調節（例えば、減少）又はＴＳＮＡ前駆体含有量の低減を達成するように改変されている植物若しくはその一部又は細胞又は細胞培養物であって、改変が、配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８若しくは３１として示されるアミノ酸配列又は配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８若しくは３１に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を有するＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の活性又は発現の低減である、植物若しくはその一部又は細胞又は細胞培養物を提供する。
一態様では、本発明は、本発明による植物から、又は本発明による方法によって生成された植物若しくは細胞培養物から得ることができる（例えば、得られた）植物増殖材料を提供する。
適切には、ＴＳＮＡ前駆体は、ノルニコチン、ＰＯＮ、アナバシン及びアナタビンから選択され得る。適切には、ＴＳＮＡ前駆体は、ノルニコチンであり得る。適切には、ＴＳＮＡ前駆体は、ＰＯＮであり得る。適切には、ＴＳＮＡ前駆体は、アナバシンであり得る。適切には、ＴＳＮＡ前駆体は、アナタビンであり得る。
一態様では、本発明は、植物を育種するための、本発明による植物若しくはその一部若しくは細胞培養物の、又は本発明による方法によって生成された植物の使用を提供する。
別の態様では、本発明は、製品の製造のための、本発明による植物若しくはその一部若しくは細胞培養物の、又は本発明による方法によって生成された植物の使用を提供する。
さらなる態様では、本発明は、作物を作るための、本発明による植物若しくはその一部の、又は本発明による方法によって生成された植物の使用を提供する。
別の態様では、本発明は、葉を生産するための、本発明による植物若しくはその一部の、又は本発明による方法によって生成された植物の使用を提供する。
さらなる態様では、本発明は、本発明による植物の、又は本発明による増殖材料から増殖させた植物から得ることができる（例えば、得られた）、又は本発明による使用によって得られた植物から得ることができる（例えば、得られた）、又は本発明による方法によって生成された植物から得ることができる（例えば、得られた）収穫葉を提供する。
適切には、植物の収穫葉は、カットされた収穫葉であり得る。
別の態様では、本発明は、
本発明による使用から得ることができる（例えば、得られた）植物から得ることができる（例えば、得られた）、
本発明に従って植物を処理することによって得ることができる（例えば、得られた）、
本発明による植物増殖材料から増殖させた植物から得ることができる（例えば、得られた）、又は
本発明による収穫葉を処理することによって得ることができる（例えば、得られた）、又は
本発明の方法によって生成された植物から得ることができる（例えば、得られた）
処理葉、好ましくは、処理されたタバコの葉、好ましくは、生育不能な処理されたタバコの葉を提供する。
適切には、葉は、乾燥させること、発酵させること、低温殺菌すること又はそれらの組合せによって処理され得る。
適切には、Ｎ’－ニトロソノルニコチン（ＮＮＮ）、４－（メチルニトロソアミノ）－１－（３－ピリジル）－１－ブタノン（ＮＮＫ）、Ｎ’－ニトロソアナタビン（ＮＡＴ）及びＮ－ニトロソアナバシン（ＮＡＢ）から選択される１又は２以上のＴＳＮＡの含有量が低減される場合があり、好ましくは、ＮＮＮ及び／又はＮＮＫの含有量が低減され、より好ましくは、少なくともＮＮＮの含有量が低減される。
適切には、処理葉は、カットされた処理葉であり得る。
さらなる態様において、本発明は、本発明による植物若しくはその一部若しくはその抽出物から、又は本発明による葉若しくはその抽出物から作製された乾燥タバコ材料を提供する。
一態様では、本発明は、本発明による乾燥タバコ材料を含むタバコブレンドを提供する。
一態様では、本発明は、
本発明によるタバコ植物若しくはその一部若しくはタバコ細胞若しくは細胞培養物、
本発明によるタバコ植物増殖材料から増殖させたタバコ植物若しくはその一部、
本発明による植物の収穫葉、
本発明による処理葉、
本発明の方法によって生成された植物、
本発明による乾燥タバコ、又は
本発明によるタバコブレンド
から調製されたタバコ産業製品を提供する。
適切には、タバコ産業製品は、可燃性喫煙物品であり得る。
適切には、タバコ産業製品は、無煙のタバコ製品であり得る。
適切には、タバコ産業製品は、非可燃性エアロゾル供給システム、例えば、タバコ加熱デバイス又はエアロゾル生成デバイスであり得る。
別の態様では、本発明は、本発明による植物若しくはその一部、又は本発明によるタバコ細胞若しくは細胞培養物、又は本発明による収穫葉、又は本発明による処理葉、又は本発明による乾燥タバコ材料、又は本発明によるタバコブレンドを含む、可燃性喫煙物品、非可燃性エアロゾル供給システム、無煙タバコ製品又はタバコ加熱デバイスを提供する。
さらなる態様において、本発明は、アルカロイド含有量が調節された（例えば、減少した）及び／又はタバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）前駆体の含有量が低減された植物を選択するための、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子のヌクレオチド配列の使用であって、ＲＮＡ結合性タンパク質の配列は、配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８若しくは３１又は配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８若しくは３１に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列から選択される、或いは、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子は、配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９、３０、３２若しくは３３で示されるヌクレオチド配列又は配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９、３０、３２若しくは３３に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、使用を提供する。
別の態様では、本発明は、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子のヌクレオチド配列中に遺伝的変異を保持する植物の変異体であって、遺伝子は、配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９、３０、３２若しくは３３又は配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９、３０、３２若しくは３３に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列から選択され、前記遺伝的変異は、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の活性又は発現を低下させ、変異体植物は、前記遺伝的変異を保持しない比較できる植物と比較して、調節された（例えば、減少した）アルカロイド含有量及び／又は低減されたタバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）前駆体を有する、変異体を提供する。
別の態様では、本発明は、本発明による遺伝的変異を保持する変異体植物の後代又は種子を提供する。
一態様では、本発明は、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子のヌクレオチド配列中に改変を含む植物から生成された収穫葉、処理葉又は乾燥タバコ材料であって、少なくとも１つの遺伝子は、配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９、３０、３２若しくは３３又は配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９、３０、３２若しくは３３に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列から選択され、前記改変は、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の活性又は発現を低下させ、前記植物は、前記ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子中に前記改変を保持しない比較できる植物と比較して、調節された（例えば、減少した）アルカロイド含有量及び／又は低減されたタバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）前駆体含有量を有する、収穫葉、処理葉又は乾燥タバコ材料を提供する。
別の態様では、本発明は、説明及び図面を参照して本明細書において記載された方法、葉、植物、植物増殖材料、収穫葉、処理されたタバコ、タバコ製品、使用又はそれらの組合せを提供する。
本発明の実施形態を、添付の図面を参照して、一例として以下に記載する。
Ｎｉｔａｂ４．５＿００１３６８５ｇ００１０．２を過剰発現する５週齢のタバコ葉のアルカロイド含有量を示す図である。アルカロイド含有量はコントロールと比較して表されており、一元配置ＡＮＯＶＡ及びテューキーの多重比較事後検定によって分析された２つの生物学的反復の代表である。値は、平均±ＳＥＭとして示されている。アスタリスクは、Ｐ値が０．０１以下の統計上の有意性を示す。 Ｎｉｔａｂ４．５＿００１３６８５ｇ００１０．２を標的化する人工ｍｉＲＮＡを発現する５週齢のタバコ葉のアルカロイド含有量を示す図である。アルカロイド含有量はコントロールと比較して表されており、一元配置ＡＮＯＶＡ及びテューキーの多重比較事後検定によって分析された２つの生物学的反復を含む。値は、平均±ＳＥＭとして示されている。アスタリスクは、Ｐ値が０．０１以下の統計上の有意性を示す。 Ｎｉｔａｂ４．５＿００１３６８５ｇ００１０．２＿ｄｅｌｔａＲＢＤ－ＲＧＧを発現する５週齢タバコ葉のアルカロイド含有量を示す図である。アルカロイド含有量は、コントロールと比較して表されており、一元配置ＡＮＯＶＡ及びテューキーの多重比較事後検定によって分析された２つの生物学的反復の代表である。値は平均±ＳＥＭとして示されている。アスタリスクは、Ｐ値が０．０５以下の統計上有意性を示す。 本発明に従ったニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）由来のタンパク質であるＮｉｔａｂ４．５＿００１３６８５ｇ００１０．２のアミノ酸配列－配列番号１を示す図である。 本発明に従ったニコチアナ・タバカム由来のタンパク質をコードする、Ｎｉｔａｂ４．５＿００１３６８５ｇ００１０．２のコード配列－配列番号２を示す図である。 本発明に従ったニコチアナ・タバカム由来のタンパク質をコードする、Ｎｉｔａｂ４．５＿００１３６８５ｇ００１０．２のゲノム配列－配列番号３を示す図である。 本発明に従ったニコチアナ・タバカム由来のタンパク質であるＮｉｔａｂ４．５＿００００３０８ｇ０１５０．２のアミノ酸配列－配列番号４を示す図である。 本発明に従ったニコチアナ・タバカム由来のタンパク質をコードする、Ｎｉｔａｂ４．５＿００００３０８ｇ０１５０．２のコード配列－配列番号５を示す図である。 本発明に従ったニコチアナ・タバカム由来のタンパク質をコードする、Ｎｉｔａｂ４．５＿００００３０８ｇ０１５０．２のゲノム配列－配列番号６を示す図である。 本発明に従ったニコチアナ・タバカム由来のタンパク質であるＮｉｔａｂ４．５＿０００３９１９ｇ００１０．２のアミノ酸配列－配列番号７を示す図である。 本発明に従ったニコチアナ・タバカム由来のタンパク質をコードする、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００３９１９ｇ００１０．２のコード配列－配列番号８を示す図である。 本発明に従ったニコチアナ・タバカム由来のタンパク質をコードする、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００３９１９ｇ００１０．２のゲノム配列－配列番号９を示す図である。 本発明に従ったニコチアナ・タバカム由来のタンパク質であるＮｉｔａｂ４．５＿０００２９７８ｇ００２０．２のアミノ酸配列－配列番号１０を示す図である。 本発明に従ったニコチアナ・タバカム由来のタンパク質をコードする、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００２９７８ｇ００２０．２のコード配列－配列番号１１を示す図である。 本発明に従ったニコチアナ・タバカム由来のタンパク質をコードする、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００２９７８ｇ００２０．２のゲノム配列－配列番号１２を示す図である。 本発明に従ったニコチアナ・タバカム由来のタンパク質であるＮｉｔａｂ４．５＿０００１３６１ｇ０２２０．２のアミノ酸配列－配列番号１３を示す図である。 本発明に従ったニコチアナ・タバカム由来のタンパク質をコードする、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００１３６１ｇ０２２０．２のコード配列－配列番号１４を示す図である。 本発明に従ったニコチアナ・タバカム由来のタンパク質をコードする、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００１３６１ｇ０２２０．２のゲノム配列－配列番号１５を示す図である。 本発明に従ったニコチアナ・タバカム由来のタンパク質であるＮｉｔａｂ４．５＿０００２９７８ｇ００３０．２のアミノ酸配列－配列番号１６を示す図である。 本発明に従ったニコチアナ・タバカム由来のタンパク質をコードする、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００２９７８ｇ００３０．２のコード配列－配列番号１７を示す図である。 本発明に従ったニコチアナ・タバカム由来のタンパク質をコードする、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００２９７８ｇ００３０．２のゲノム配列－配列番号１８を示す図である。 本発明に従ったニコチアナ・タバカム由来のタンパク質であるＮｉｔａｂ４．５＿０００１３６１ｇ０２２５．２のアミノ酸配列－配列番号１９を示す図である。 本発明に従ったニコチアナ・タバカム由来のタンパク質をコードする、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００１３６１ｇ０２２５．２のコード配列－配列番号２０を示す図である。 本発明に従ったニコチアナ・タバカム由来のタンパク質をコードする、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００１３６１ｇ０２２５．２のゲノム配列－配列番号２１を示す図である。 本発明に従ったニコチアナ・タバカム由来のタンパク質であるＮｉｔａｂ４．５＿０００３９７８ｇ００２０．２のアミノ酸配列－配列番号２２を示す図である。 本発明に従ったニコチアナ・タバカム由来のタンパク質をコードする、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００３９７８ｇ００２０．２のコード配列－配列番号２３を示す図である。 本発明に従ったニコチアナ・タバカム由来のタンパク質をコードする、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００３９７８ｇ００２０．２のゲノム配列－配列番号２４を示す図である。 本発明に従ったニコチアナ・タバカム由来のタンパク質であるＮｉｔａｂ４．５＿０００００７８ｇ０２４０．２のアミノ酸配列－配列番号２５を示す図である。 本発明に従ったニコチアナ・タバカム由来のタンパク質をコードする、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００００７８ｇ０２４０．２のコード配列－配列番号２６を示す図である。 ～ 本発明に従ったニコチアナ・タバカム由来のタンパク質をコードする、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００００７８ｇ０２４０．２のゲノム配列－配列番号２７を示す図である。 本発明に従ったニコチアナ・タバカム由来のタンパク質であるＮｉｔａｂ４．５＿０００５０７９ｇ００５０．２のアミノ酸配列－配列番号２８を示す図である。 本発明に従ったニコチアナ・タバカム由来のタンパク質をコードする、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００５０７９ｇ００５０．２のコード配列－配列番号２９を示す図である。 ～ 本発明に従ったニコチアナ・タバカム由来のタンパク質をコードする、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００５０７９ｇ００５０．２のゲノム配列－配列番号３０を示す図である。 本発明に従ったニコチアナ・タバカム由来のタンパク質であるＮｉｔａｂ４．５＿０００８１８５ｇ００３０．２のアミノ酸配列－配列番号３１を示す図である。 本発明に従ったニコチアナ・タバカム由来のタンパク質をコードするＮｉｔａｂ４．５＿０００８１８５ｇ００３０．２のコード配列－配列番号３２を示す図である。 ～ 本発明に従ったニコチアナ・タバカム由来のタンパク質をコードするＮｉｔａｂ４．５＿０００８１８５ｇ００３０．２のゲノム配列－配列番号３３を示す図である。 実施例３に記載されるＮｉｔａｂ４．５＿００１３６８５ｇ００１０．２＿ｄｅｌｔａＲＢＤ－ＲＧＧのヌクレオチド配列に対応する配列番号３４を示す図である。 実施例３に記載されるＮｉｔａｂ４．５＿００１３６８５ｇ００１０．２＿ｄｅｌｔａＲＢＤ－ＲＧＧのアミノ酸配列に対応する配列番号３５を示す図である。 ＲＮＡ結合性ドメイン（ＲＢＤ）のアミノ酸配列（配列番号１のアミノ酸残基６～８４）に対応する配列番号３６を示す図である。 ＲＧＧモチーフ（配列番号１のアミノ酸残基９７～９９）に対応する配列番号３７を示す図である。 Ｎｉｔａｂ４．５＿００１３６８５ｇ００１０．２の相互作用物質であるＮｉｔａｂ４．５＿０００５４８７ｇ００３０．２のアミノ酸配列に対応する配列番号３８を示す図である。 ～ Ｎｉｔａｂ４．５＿００１３６８５ｇ００１０．２の相互作用物質であるＮｉｔａｂ４．５＿０００５４８７ｇ００３０．２のコード配列に対応する配列番号３９を示す図である。 ～ Ｎｉｔａｂ４．５＿００１３６８５ｇ００１０．２の相互作用物質であるＮｉｔａｂ４．５＿０００５４８７ｇ００３０．２のゲノム酸（genomic acid）配列に対応する配列番号４０を示す図である。 Ｎｉｔａｂ４．５＿００１３６８５ｇ００１０．２の相互作用物質であるＮｉｔａｂ４．５＿０００７８３１ｇ００２０．２のアミノ酸配列に対応する配列番号４１を示す図である。 Ｎｉｔａｂ４．５＿００１３６８５ｇ００１０．２の相互作用物質であるＮｉｔａｂ４．５＿０００７８３１ｇ００２０．２のコード配列に対応する配列番号４２を示す図である。 ～ Ｎｉｔａｂ４．５＿００１３６８５ｇ００１０．２の相互作用物質であるＮｉｔａｂ４．５＿０００７８３１ｇ００２０．２のゲノム配列に対応する配列番号４３を示す図である。 Ｎｉｔａｂ４．５＿００１３６８５ｇ００１０．２の相互作用物質であるＮｉｔａｂ４．５＿０００２９７８ｇ００２０．２のアミノ酸配列に対応する配列番号４４を示す図である。 Ｎｉｔａｂ４．５＿００１３６８５ｇ００１０．２の相互作用物質であるＮｉｔａｂ４．５＿０００２９７８ｇ００２０．２のコード配列に対応する配列番号４５を示す図である。 Ｎｉｔａｂ４．５＿００１３６８５ｇ００１０．２の相互作用物質であるＮｉｔａｂ４．５＿０００２９７８ｇ００２０．２のゲノム配列に対応する配列番号４６を示す図である。 Ｎｉｔａｂ４．５＿００１３６８５ｇ００１０．２の相互作用物質であるＮｉｔａｂ４．５＿０００５５５２ｇ００１０．２のアミノ酸配列に対応する配列番号４７を示す図である。 Ｎｉｔａｂ４．５＿００１３６８５ｇ００１０．２の相互作用物質であるＮｉｔａｂ４．５＿０００５５５２ｇ００１０．２のコード配列に対応する配列番号４８を示す図である。 ～ Ｎｉｔａｂ４．５＿００１３６８５ｇ００１０．２の相互作用物質であるＮｉｔａｂ４．５＿０００５５５２ｇ００１０．２のゲノム配列に対応する配列番号４９を示す図である。 Ｎｉｔａｂ４．５＿００１３６８５ｇ００１０．２の相互作用物質であるＮｉｔａｂ４．５＿０００３６７９ｇ００６０．２のアミノ酸配列に対応する配列番号５０を示す図である。 Ｎｉｔａｂ４．５＿００１３６８５ｇ００１０．２の相互作用物質であるＮｉｔａｂ４．５＿０００３６７９ｇ００６０．２のコード配列に対応する配列番号５１を示す図である。 ～ Ｎｉｔａｂ４．５＿００１３６８５ｇ００１０．２の相互作用物質であるＮｉｔａｂ４．５＿０００３６７９ｇ００６０．２のゲノム配列に対応する配列番号５２を示す図である。
配列表
本明細書及び対応する配列表の全体を通して使用される配列識別子の概要は、以下の通りである。
配列番号１は、Ｎｉｔａｂ４．５＿００１３６８５ｇ００１０．２のアミノ酸配列に対応する。
配列番号２は、Ｎｉｔａｂ４．５＿００１３６８５ｇ００１０．２のコード配列に対応する。
配列番号３は、Ｎｉｔａｂ４．５＿００１３６８５ｇ００１０．２のゲノム配列に対応する。
配列番号４は、Ｎｉｔａｂ４．５＿００００３０８ｇ０１５０．２のアミノ酸配列に対応する。
配列番号５は、Ｎｉｔａｂ４．５＿００００３０８ｇ０１５０．２のコード配列に対応する。
配列番号６は、Ｎｉｔａｂ４．５＿００００３０８ｇ０１５０．２のゲノム配列に対応する。
配列番号７は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００３９１９ｇ００１０．２のアミノ酸配列に対応する。
配列番号８は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００３９１９ｇ００１０．２のコード配列に対応する。
配列番号９は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００３９１９ｇ００１０．２のゲノム配列に対応する。
配列番号１０は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００２９７８ｇ００２０．２のアミノ酸配列に対応する。
配列番号１１は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００２９７８ｇ００２０．２のコード配列に対応する。
配列番号１２は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００２９７８ｇ００２０．２のゲノム配列に対応する。
配列番号１３は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００１３６１ｇ０２２０．２のアミノ酸配列に対応する。
配列番号１４は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００１３６１ｇ０２２０．２のコード配列に対応する。
配列番号１５は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００１３６１ｇ０２２０．２のゲノム配列に対応する。
配列番号１６は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００２９７８ｇ００３０．２のアミノ酸配列に対応する。
配列番号１７は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００２９７８ｇ００３０．２のコード配列に対応する。
配列番号１８は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００２９７８ｇ００３０．２のゲノム配列に対応する。
配列番号１９は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００１３６１ｇ０２２５．２のアミノ酸配列に対応する。
配列番号２０は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００１３６１ｇ０２２５．２のコード配列に対応する。
配列番号２１は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００１３６１ｇ０２２５．２のゲノム配列に対応する。
配列番号２２は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００３９７８ｇ００２０．２のアミノ酸配列に対応する。
配列番号２３は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００３９７８ｇ００２０．２のコード配列に対応する。
配列番号２４は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００３９７８ｇ００２０．２のゲノム配列に対応する。
配列番号２５は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００００７８ｇ０２４０．２のアミノ酸配列に対応する。
配列番号２６は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００００７８ｇ０２４０．２のコード配列に対応する。
配列番号２７は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００００７８ｇ０２４０．２のゲノム配列に対応する。
配列番号２８は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００５０７９ｇ００５０．２のアミノ酸配列に対応する。
配列番号２９は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００５０７９ｇ００５０．２のコード配列に対応する。
配列番号３０は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００５０７９ｇ００５０．２のゲノム配列に対応する。
配列番号３１は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００８１８５ｇ００３０．２のアミノ酸配列に対応する。
配列番号３２は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００８１８５ｇ００３０．２のコード配列に対応する。
配列番号３３は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００８１８５ｇ００３０．２のゲノム配列に対応する。
配列番号３４は、実施例３に記載されるＮｉｔａｂ４．５＿００１３６８５ｇ００１０．２＿ｄｅｌｔａＲＢＤ－ＲＧＧのヌクレオチド配列に対応する。
配列番号３５は、実施例３に記載されるＮｉｔａｂ４．５＿００１３６８５ｇ００１０．２＿ｄｅｌｔａＲＢＤ－ＲＧＧのアミノ酸配列に対応する。
配列番号３６は、ＲＮＡ－結合ドメイン（ＲＢＤ）のアミノ酸配列（配列番号１のアミノ酸残基６～８４）に対応する。
配列番号３７は、ＲＧＧモチーフ（配列番号１のアミノ酸残基９７～９９）に対応する。
配列番号３８は、Ｎｉｔａｂ４．５＿００１３６８５ｇ００１０．２の相互作用物質であるＮｉｔａｂ４．５＿０００５４８７ｇ００３０．２のアミノ酸配列に対応する。
配列番号３９は、Ｎｉｔａｂ４．５＿００１３６８５ｇ００１０．２の相互作用物質であるＮｉｔａｂ４．５＿０００５４８７ｇ００３０．２のコード配列に対応する。
配列番号４０は、Ｎｉｔａｂ４．５＿００１３６８５ｇ００１０．２の相互作用物質であるＮｉｔａｂ４．５＿０００５４８７ｇ００３０．２のゲノム配列に対応する。
配列番号４１は、Ｎｉｔａｂ４．５＿００１３６８５ｇ００１０．２の相互作用物質であるＮｉｔａｂ４．５＿０００７８３１ｇ００２０．２のアミノ酸配列に対応する。
配列番号４２は、Ｎｉｔａｂ４．５＿００１３６８５ｇ００１０．２の相互作用物質であるＮｉｔａｂ４．５＿０００７８３１ｇ００２０．２のコード配列に対応する。
配列番号４３は、Ｎｉｔａｂ４．５＿００１３６８５ｇ００１０．２の相互作用物質であるＮｉｔａｂ４．５＿０００７８３１ｇ００２０．２のゲノム配列に対応する。
配列番号４４は、Ｎｉｔａｂ４．５＿００１３６８５ｇ００１０．２の相互作用物質であるＮｉｔａｂ４．５＿０００２９７８ｇ００２０．２のアミノ酸配列に対応する。
配列番号４５は、Ｎｉｔａｂ４．５＿００１３６８５ｇ００１０．２の相互作用物質であるＮｉｔａｂ４．５＿０００２９７８ｇ００２０．２のコード配列に対応する。
配列番号４６は、Ｎｉｔａｂ４．５＿００１３６８５ｇ００１０．２の相互作用物質であるＮｉｔａｂ４．５＿０００２９７８ｇ００２０．２のゲノム配列に対応する。
配列番号４７は、Ｎｉｔａｂ４．５＿００１３６８５ｇ００１０．２の相互作用物質であるＮｉｔａｂ４．５＿０００５５５２ｇ００１０．２のアミノ酸配列に対応する。
配列番号４８は、Ｎｉｔａｂ４．５＿００１３６８５ｇ００１０．２の相互作用物質であるＮｉｔａｂ４．５＿０００５５５２ｇ００１０．２のコード配列に対応する。
配列番号４９は、Ｎｉｔａｂ４．５＿００１３６８５ｇ００１０．２の相互作用物質であるＮｉｔａｂ４．５＿０００５５５２ｇ００１０．２のゲノム配列に対応する。
配列番号５０は、Ｎｉｔａｂ４．５＿００１３６８５ｇ００１０．２の相互作用物質であるＮｉｔａｂ４．５＿０００３６７９ｇ００６０．２のアミノ酸配列に対応する。
配列番号５１は、Ｎｉｔａｂ４．５＿００１３６８５ｇ００１０．２の相互作用物質であるＮｉｔａｂ４．５＿０００３６７９ｇ００６０．２のコード配列に対応する。
配列番号５２は、Ｎｉｔａｂ４．５＿００１３６８５ｇ００１０．２の相互作用物質であるＮｉｔａｂ４．５＿０００３６７９ｇ００６０．２のゲノム配列に対応する。
本明細書において開示されている一部の配列は、ヌクレオチド配列中に「Ｘ」又は「Ｎ」を含有する。「Ｘ」又は「Ｎ」は、任意のヌクレオチド、又は１若しくは２以上のヌクレオチドの欠失若しくは挿入であり得る。例えば、一部のケースでは、一続きの「Ｘ」又は「Ｎ」が示されている。「Ｘ」又は「Ｎ」の数は、その位置にあるヌクレオチドの実際の数と必ずしも相関しない。配列中で「Ｘ」又は「Ｎ」として示されているものより多くの又は少ないヌクレオチドが存在し得る。
本発明者らは、初めて、植物（例えば、タバコ植物）又は細胞（例えば、タバコ細胞）においてＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の活性又は発現を調節することによって、植物（又は処理された植物）又は細胞のアルカロイド及び／又はＴＳＮＡ前駆体含有量を調節できるということを示した。
本発明は、植物若しくはその一部のアルカロイド含有量を調節する（例えば、減少させる）方法であって、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の活性又は発現を調節すること（例えば、減少させること）によって、前記植物を改変するステップを含む方法を提供する。
また、タバコ植物又はその植物の一部においてタバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）前駆体の含有量を調節する（例えば、減少させる）方法が提供され、方法は、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の活性又は発現を調節する（例えば、低下させる）ことによって、前記植物を改変するステップを含む。
ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子は、配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５若しくは２８で示されるアミノ酸配列又はその機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログ又は配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５若しくは２８に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列をコードする少なくとも１つの遺伝子から選択できる、或いは、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子は、配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２７若しくは３０で示されるヌクレオチド配列又は配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２７若しくは３０の機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログ又は配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２７若しくは３０に対して少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列を含み得る。
適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及び／又はＲＧＧドメインを含み得る。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及びＲＧＧドメインを含み得る。一実施形態では、配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５若しくは２８で示されるアミノ酸配列又はその機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログ又は配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５若しくは２８に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子、或いは、配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２７若しくは３０で示されるヌクレオチド配列又は配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２７若しくは３０の機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログ又は配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２７若しくは３０に対して少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列を含むＲＮＡ結合性タンパク質をコードする遺伝子の群から選択される、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも２つの遺伝子が改変される。
一実施形態では、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも３つの、例えば、少なくとも４つの、例えば、少なくとも５つの、例えば、少なくとも６つの、例えば、少なくとも７つの、例えば、少なくとも８つの、例えば、少なくとも９つの、例えば、１０の遺伝子が調節され、遺伝子は、配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５若しくは２８で示されるアミノ酸配列若しくはその機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログ又は配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５若しくは２８に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むポリペプチドをコードするものから選択され、或いはＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子は、配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２７若しくは３０で示されるヌクレオチド配列又は配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２７若しくは３０の機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログ又は配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２７若しくは３０に対して少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列を含む。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性タンパク質及び／又はＲＧＧドメインを含み得る。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及びＲＧＧドメインを含み得る。一態様では、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子は、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド若しくはその機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログ又は配列番号１に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列をコードし、或いは、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子は、配列番号２若しくは３で示されるヌクレオチド配列又は配列番号２若しくは３の機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログ又は配列番号２若しくは３に対して少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列を含む。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及び／又はＲＧＧドメインを含み得る。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及びＲＧＧドメインを含み得る。
一態様では、少なくとも１つのさらなる遺伝子の活性又は発現が調節される。適切には、配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２７若しくは３０から選択される少なくとも２つ（又は少なくとも３つ又は少なくとも４つ又は少なくとも５つ又は少なくとも６つ又は少なくとも７つ又は少なくとも８つ又は少なくとも９つ）のさらなる遺伝子又は配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２７若しくは３０の機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログ又は配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２７若しくは３０に対して少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列も調節できる。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及び／又はＲＧＧドメインを含み得る。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及びＲＧＧドメインを含み得る。
ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする遺伝子の「発現」は、転写、翻訳、すなわち、タンパク質発現のレベルを指す場合がある。
遺伝子産物のレベル又は量の測定は、いかなる適切な方法によっても、例えば、改変された植物と、本発明に従って改変されていない比較できる植物の間のｍＲＮＡ転写物レベル、タンパク質若しくはペプチドレベル及び／又は植物の表現型の比較によって実施できる。
本明細書において定義される「比較できる製品」という用語は、本発明に従って改変されていないが、すべての他の関連特徴（例えば、植物種、成長条件、植物、例えばタバコを処理する方法など）が同一である植物（例えば、タバコ植物）に由来するものであろう。本発明による比較できる製品は、例えば、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする遺伝子の活性又は発現を調節するために、本発明に従って改変されていない植物から得ることができる、又は得られた、植物（例えば、タバコ植物）又はその一部、例えば、葉（例えば、タバコの葉）、収穫葉（例えば、タバコの収穫葉）、カットされた収穫葉（例えば、カットされたタバコの収穫葉）、処理葉（例えば、タバコの処理葉）又は植物増殖材料（例えば、タバコ植物増殖材料）又は前記植物若しくはその一部（part therefore）を含む製品、例えば、タバコ産業製品又はそれらの組合せを意味し得る。一実施形態では、比較できる製品は、その活性又は発現が調節されているＲＮＡ結合性タンパク質をコードする遺伝子を含まないものである。
「改変する」又は「改変された」という用語は、本明細書で使用される場合、変更された、若しくは変化した植物（例えば、タバコ植物）又は核酸配列を意味する。本発明は、植物の遺伝子改変又は植物の非遺伝子改変のための技術を使用する植物の改変を含む。このような方法は、当技術分野で周知であり、遺伝子改変技術の例として、形質転換、トランスジェニック、シスジェニック及び遺伝子編集方法が挙げられる。非遺伝子改変技術の例として、高速中性子突然変異誘発、化学的突然変異誘発、例えば、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）突然変異誘発及び最新の集団分析アプローチが挙げられる。
一実施形態では、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする改変遺伝子を有する天然バリアントが選択され、その形質又は遺伝子が、商業的に望ましい形質を有し得る第２の植物に育種される。
一実施形態では、本発明による植物は、トランスジェニック植物である。一実施形態では、本発明による植物は、非トランスジェニック植物である。
本明細書において定義される「未改変植物」という用語は、例えば、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする遺伝子の活性又は発現を調節するために、又はＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の核酸配列を改変するために、本発明に従って改変されていない、すべての他の関連特徴（例えば、植物種、成長条件、タバコを処理する方法など）が同一である植物（例えば、タバコ植物）であろう。一実施形態では、未改変植物は、その活性又は発現が調製されているＲＮＡ結合性タンパク質をコードする遺伝子を含まないものである。一実施形態では、未改変植物は、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子をコードする改変された核酸配列を含まないものである。
ＲＮＡ結合性タンパク質
「ＲＮＡ結合性タンパク質」とは、本明細書で使用される場合、当技術分野におけるその通常の意味を有し、ＲＮＡに結合可能であるタンパク質を指す。タンパク質とＲＮＡの間の結合を測定する方法は当技術分野で公知であり、例えば、電気泳動移動度シフトアッセイが挙げられる。
タバコ由来のＲＮＡ結合性タンパク質の例示的配列は、配列番号１に示されている。
「ＲＮＡ結合性ドメイン」とは、本明細書で使用される場合、当技術分野におけるその通常の意味を有し、一本鎖ＲＮＡに結合する一般的なタンパク質構造ドメインを指す。
ＲＮＡ結合性ドメインは、ＲＮＡ結合に寄与する。
ＲＮＡ結合性ドメインの例示的配列は、配列番号１のアミノ酸６～８４で示され、配列番号３５としても提示されている。
ＲＮＡ結合性ドメインは、問題のタンパク質を、配列番号３５及び／又は配列番号１と比較することによって同定できる。
適切には、ＲＮＡ結合性ドメインは、本明細書で使用される場合、配列番号３５で示される配列又はそれに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を指す場合がある。適切には、ＲＮＡ結合性ドメインは、本明細書で使用される場合、配列番号１とアラインされる場合に配列番号１のアミノ酸６～８４に対応する配列を指す場合がある。
「ＲＧＧドメイン」又は「ＲＧＧモチーフ」とは、本明細書で使用される場合、当技術分野におけるその通常の意味を有し、ＲＧＧ配列（配列番号３６）を指す。ＲＧＧドメイン又はモチーフは、多数のＲＮＡ結合性タンパク質における共通特徴である。
ＲＧＧドメインのすべての例示的配列は、配列番号１のアミノ酸９７～９９で示され、また、配列番号３６としても提示されている。
ＲＧＧドメインは、問題のタンパク質を配列番号３６及び／又は配列番号１と比較することによって同定できる。
タンパク質のアミノ酸配列内のドメインは、当技術分野で公知のドメイン予測ソフトウェアを使用して同定できる。ドメインはまた、タンパク質データベース、例えば、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢにも記載されている。
理論に捉われようとは思わないが、植物細胞におけるＲＮＡ結合性タンパク質の含有量を調節すること又は植物において活性、例えば、ＲＮＡ結合性タンパク質のＲＮＡ結合活性を調節することは、アルカロイド及びＴＳＮＡ前駆体、例えば、ノルニコチン及び／又はＰＯＮを産生する代謝経路を変更し、調節されたアルカロイド及び／又はＴＳＮＡ前駆体含有量をもたらすであろうということが仮定される。
一実施形態では、ＲＮＡ結合性タンパク質は、配列番号１として示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列又はそのホモログを含む。タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及びＲＧＧドメインを含む。適切には、配列番号１のホモログは、配列番号４、７、１０、１３、１６、１９、２２ ２５若しくは２８又はそれに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む群から選択され得る。適切には、配列番号１のホモログは、ＲＮＡ結合性ドメイン及びＲＧＧドメインを含む、配列番号４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５若しくは２８又は配列番号４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５若しくは２８に対して少なくとも８０％の同一性を有し、ＲＮＡ結合性ドメイン及びＲＧＧドメインを含む配列を含む群から選択され得る。
一実施形態では、ＲＮＡ結合性タンパク質は、配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２ ２５若しくは２８として示されたアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも８０％の同一性（好ましくは、それに対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性）を有する配列を含む。一実施形態では、ＲＮＡ結合性タンパク質は、配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２ ２５若しくは２８として示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも８０％の同一性（好ましくは、それに対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性）を有し、ＲＮＡ結合性ドメイン及びＲＧＧドメインを含む配列を含む。
適切には、本発明によるＲＮＡ結合性タンパク質は、配列番号１として示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも８０％の同一性（好ましくは、それに対して少なくとも８５％、好ましくは、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９３％、好ましくは、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性）を有する配列を含み得る。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及び／又はＲＧＧドメインを含み得る。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及びＲＧＧドメインを含み得る。
適切には、本発明によるＲＮＡ結合性タンパク質は、配列番号４として示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも８０％の同一性（好ましくは、それに対して少なくとも８５％、好ましくは、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９３％、好ましくは、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性）を有する配列を含み得る。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及び／又はＲＧＧドメインを含み得る。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及びＲＧＧドメインを含み得る。
適切には、本発明によるＲＮＡ結合性タンパク質は、配列番号７として示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも８０％（好ましくは、それに対して少なくとも８５％、好ましくは、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９３％、好ましくは、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性）を有する配列を含み得る。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及び／又はＲＧＧドメインを含み得る。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及びＲＧＧドメインを含み得る。
適切には、本発明によるＲＮＡ結合性タンパク質は、配列番号１０として示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも８０％の同一性（好ましくは、それに対して少なくとも８５％、好ましくは、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９３％、好ましくは、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性）を有する配列を含み得る。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及び／又はＲＧＧドメインを含み得る。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及びＲＧＧドメインを含み得る。
適切には、本発明によるＲＮＡ結合性タンパク質は、配列番号１３として示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも８０％の同一性（好ましくは、それに対して少なくとも８５％、好ましくは、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９３％、好ましくは、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性）を有する配列を含み得る。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及び／又はＲＧＧドメインを含み得る。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及びＲＧＧドメインを含み得る。
適切には、本発明によるＲＮＡ結合性タンパク質は、配列番号１６として示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも８０％の同一性（好ましくは、それに対して少なくとも８５％、好ましくは、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９３％、好ましくは、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性）を有する配列を含み得る。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及び／又はＲＧＧドメインを含み得る。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及びＲＧＧドメインを含み得る。
適切には、本発明によるＲＮＡ結合性タンパク質は、配列番号１９として示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも８０％の同一性（好ましくは、それに対して少なくとも８５％、好ましくは、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９３％、好ましくは、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性）を有する配列を含み得る。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及び／又はＲＧＧドメインを含み得る。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及びＲＧＧドメインを含み得る。
適切には、本発明によるＲＮＡ結合性タンパク質は、配列番号２２として示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも８０％の同一性（好ましくは、それに対して少なくとも８５％、好ましくは、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９３％、好ましくは、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性）を有する配列を含み得る。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及び／又はＲＧＧドメインを含み得る。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及びＲＧＧドメインを含み得る。
適切には、本発明によるＲＮＡ結合性タンパク質は、配列番号２５として示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも８０％の同一性（好ましくは、それに対して少なくとも８５％、好ましくは、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９３％、好ましくは、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性）を有する配列を含み得る。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及び／又はＲＧＧドメインを含み得る。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及びＲＧＧドメインを含み得る。
適切には、本発明によるＲＮＡ結合性タンパク質は、配列番号２８として示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも８０％の同一性（好ましくは、それに対して少なくとも８５％、好ましくは、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９３％、好ましくは、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性）を有する配列を含み得る。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及び／又はＲＧＧドメインを含み得る。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及びＲＧＧドメインを含み得る。
一実施形態では、本発明によるＲＮＡ結合性タンパク質は、配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５又は２８から選択されるアミノ酸配列を含む、又はそれからなる。
適切には、タンパク質は、ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）に由来し得る。
一実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡ結合性タンパク質は、遺伝子（変異前）が、配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９若しくは３０として示される配列又はそれに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むポリヌクレオチド配列によってコードされる。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及び／又はＲＧＧドメインを含み得る。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及びＲＧＧドメインを含み得る。
適切には、本発明による使用のためのＲＮＡ結合性タンパク質は、遺伝子（変異前）が、配列番号２として示される配列又はそれに対して少なくとも８０％の配列同一性（好ましくは、それに対して少なくとも８５％、好ましくは、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９３％、好ましくは、少なくとも９５％、少なくとも、９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性）を有する配列を含むポリヌクレオチド配列によってコードされ得る。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及び／又はＲＧＧドメインを含み得る。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及びＲＧＧドメインを含み得る。
適切には、本発明による使用のためのＲＮＡ結合性タンパク質は、遺伝子（変異前）が、配列番号３として示される配列又はそれに対して少なくとも８０％の配列同一性（好ましくは、それに対して少なくとも８５％、好ましくは、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９３％、好ましくは、少なくとも９５％、少なくとも、９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性）を有する配列を含むポリヌクレオチド配列によってコードされ得る。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及び／又はＲＧＧドメインを含み得る。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及びＲＧＧドメインを含み得る。
適切には、本発明による使用のためのＲＮＡ結合性タンパク質は、遺伝子（変異前）が、配列番号５として示される配列又はそれに対して少なくとも８０％の配列同一性（好ましくは、それに対して少なくとも８５％、好ましくは、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９３％、好ましくは、少なくとも９５％、少なくとも、９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性）を有する配列を含むポリヌクレオチド配列によってコードされ得る。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及び／又はＲＧＧドメインを含み得る。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及びＲＧＧドメインを含み得る。
適切には、本発明による使用のためのＲＮＡ結合性タンパク質は、遺伝子（変異前）が、配列番号６として示される配列又はそれに対して少なくとも８０％の配列同一性（好ましくは、それに対して少なくとも８５％、好ましくは、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９３％、好ましくは、少なくとも９５％、少なくとも、９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性）を有する配列を含むポリヌクレオチド配列によってコードされ得る。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及び／又はＲＧＧドメインを含み得る。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及びＲＧＧドメインを含み得る。
適切には、本発明による使用のためのＲＮＡ結合性タンパク質は、遺伝子（変異前）が、配列番号８として示される配列又はそれに対して少なくとも８０％の配列同一性（好ましくは、それに対して少なくとも８５％、好ましくは、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９３％、好ましくは、少なくとも９５％、少なくとも、９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性）を有する配列を含むポリヌクレオチド配列によってコードされ得る。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及び／又はＲＧＧドメインを含み得る。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及びＲＧＧドメインを含み得る。
適切には、本発明による使用のためのＲＮＡ結合性タンパク質は、遺伝子（変異前）が、配列番号９として示される配列又はそれに対して少なくとも８０％の配列同一性（好ましくは、それに対して少なくとも８５％、好ましくは、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９３％、好ましくは、少なくとも９５％、少なくとも、９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性）を有する配列を含むポリヌクレオチド配列によってコードされ得る。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及び／又はＲＧＧドメインを含み得る。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及びＲＧＧドメインを含み得る。
適切には、本発明による使用のためのＲＮＡ結合性タンパク質は、遺伝子（変異前）が、配列番号１１として示される配列又はそれに対して少なくとも８０％の配列同一性（好ましくは、それに対して少なくとも８５％、好ましくは、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９３％、好ましくは、少なくとも９５％、少なくとも、９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性）を有する配列を含むポリヌクレオチド配列によってコードされ得る。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及び／又はＲＧＧドメインを含み得る。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及びＲＧＧドメインを含み得る。
適切には、本発明による使用のためのＲＮＡ結合性タンパク質は、遺伝子（変異前）が、配列番号１２として示される配列又はそれに対して少なくとも８０％の配列同一性（好ましくは、それに対して少なくとも８５％、好ましくは、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９３％、好ましくは、少なくとも９５％、少なくとも、９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性）を有する配列を含むポリヌクレオチド配列によってコードされ得る。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及び／又はＲＧＧドメインを含み得る。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及びＲＧＧドメインを含み得る。
適切には、本発明による使用のためのＲＮＡ結合性タンパク質は、遺伝子（変異前）が、配列番号１４として示される配列又はそれに対して少なくとも８０％の配列同一性（好ましくは、それに対して少なくとも８５％、好ましくは、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９３％、好ましくは、少なくとも９５％、少なくとも、９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性）を有する配列を含むポリヌクレオチド配列によってコードされ得る。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及び／又はＲＧＧドメインを含み得る。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及びＲＧＧドメインを含み得る。
適切には、本発明による使用のためのＲＮＡ結合性タンパク質は、遺伝子（変異前）が、配列番号１５として示される配列又はそれに対して少なくとも８０％の配列同一性（好ましくは、それに対して少なくとも８５％、好ましくは、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９３％、好ましくは、少なくとも９５％、少なくとも、９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性）を有する配列を含むポリヌクレオチド配列によってコードされ得る。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及び／又はＲＧＧドメインを含み得る。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及びＲＧＧドメインを含み得る。
適切には、本発明による使用のためのＲＮＡ結合性タンパク質は、遺伝子（変異前）が、配列番号１７として示される配列又はそれに対して少なくとも８０％の配列同一性（好ましくは、それに対して少なくとも８５％、好ましくは、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９３％、好ましくは、少なくとも９５％、少なくとも、９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性）を有する配列を含むポリヌクレオチド配列によってコードされ得る。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及び／又はＲＧＧドメインを含み得る。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及びＲＧＧドメインを含み得る。
適切には、本発明による使用のためのＲＮＡ結合性タンパク質は、遺伝子（変異前）が、配列番号１８として示される配列又はそれに対して少なくとも８０％の配列同一性（好ましくは、それに対して少なくとも８５％、好ましくは、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９３％、好ましくは、少なくとも９５％、少なくとも、９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性）を有する配列を含むポリヌクレオチド配列によってコードされ得る。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及び／又はＲＧＧドメインを含み得る。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及びＲＧＧドメインを含み得る。
適切には、本発明による使用のためのＲＮＡ結合性タンパク質は、遺伝子（変異前）が、配列番号２０として示される配列又はそれに対して少なくとも８０％の配列同一性（好ましくは、それに対して少なくとも８５％、好ましくは、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９３％、好ましくは、少なくとも９５％、少なくとも、９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性）を有する配列を含むポリヌクレオチド配列によってコードされ得る。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及び／又はＲＧＧドメインを含み得る。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及びＲＧＧドメインを含み得る。
適切には、本発明による使用のためのＲＮＡ結合性タンパク質は、遺伝子（変異前）が、配列番号２１として示される配列又はそれに対して少なくとも８０％の配列同一性（好ましくは、それに対して少なくとも８５％、好ましくは、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９３％、好ましくは、少なくとも９５％、少なくとも、９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性）を有する配列を含むポリヌクレオチド配列によってコードされ得る。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及び／又はＲＧＧドメインを含み得る。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及びＲＧＧドメインを含み得る。
適切には、本発明による使用のためのＲＮＡ結合は、遺伝子（変異前）が、配列番号２３として示される配列又はそれに対して少なくとも８０％の配列同一性（好ましくは、それに対して少なくとも８５％、好ましくは、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９３％、好ましくは、少なくとも９５％、少なくとも、９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性）を有する配列を含むポリヌクレオチド配列によってコードされ得る。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及び／又はＲＧＧドメインを含み得る。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及びＲＧＧドメインを含み得る。
適切には、本発明による使用のためのＲＮＡ結合は、遺伝子（変異前）が、配列番号２４として示される配列又はそれに対して少なくとも８０％の配列同一性（好ましくは、それに対して少なくとも８５％、好ましくは、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９３％、好ましくは、少なくとも９５％、少なくとも、９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性）を有する配列を含むポリヌクレオチド配列によってコードされ得る。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及び／又はＲＧＧドメインを含み得る。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及びＲＧＧドメインを含み得る。
適切には、本発明による使用のためのＲＮＡ結合性タンパク質は、遺伝子（変異前）が、配列番号２６として示される配列又はそれに対して少なくとも８０％の配列同一性（好ましくは、それに対して少なくとも８５％、好ましくは、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９３％、好ましくは、少なくとも９５％、少なくとも、９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性）を有する配列を含むポリヌクレオチド配列によってコードされ得る。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及び／又はＲＧＧドメインを含み得る。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及びＲＧＧドメインを含み得る。
適切には、本発明による使用のためのＲＮＡ結合性タンパク質は、遺伝子（変異前）が、配列番号２７として示される配列又はそれに対して少なくとも８０％の配列同一性（好ましくは、それに対して少なくとも８５％、好ましくは、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９３％、好ましくは、少なくとも９５％、少なくとも、９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性）を有する配列を含むポリヌクレオチド配列によってコードされ得る。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及び／又はＲＧＧドメインを含み得る。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及びＲＧＧドメインを含み得る。
適切には、本発明による使用のためのＲＮＡ結合性タンパク質は、遺伝子（変異前）が、配列番号２９として示される配列又はそれに対して少なくとも８０％の配列同一性（好ましくは、それに対して少なくとも８５％、好ましくは、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９３％、好ましくは、少なくとも９５％、少なくとも、９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性）を有する配列を含むポリヌクレオチド配列によってコードされ得る。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及び／又はＲＧＧドメインを含み得る。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及びＲＧＧドメインを含み得る。
適切には、本発明による使用のためのＲＮＡ結合性タンパク質は、遺伝子（変異前）が、配列番号３０として示される配列又はそれに対して少なくとも８０％の配列同一性（好ましくは、それに対して少なくとも８５％、好ましくは、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９３％、好ましくは、少なくとも９５％、少なくとも、９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性）を有する配列を含むポリヌクレオチド配列によってコードされ得る。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及び／又はＲＧＧドメインを含み得る。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及びＲＧＧドメインを含み得る。
一実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡ結合性タンパク質は、遺伝子（変異前）が、配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９又は３０から選択されるポリヌクレオチド配列によってコードされる。
適切には、本発明による使用のためのタンパク質は、ニコチアナ・タバカムに由来するポリヌクレオチド配列によってコードされ得る。
一態様では、本発明は、植物若しくはその一部又は細胞（例えば、植物細胞）のアルカロイド含有量を減少させる方法であって、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の活性又は発現を低下又は阻害することによって前記植物を改変するステップを含む方法を提供する。
一態様では、本発明は、植物若しくはその一部又は植物細胞のアルカロイド含有量を減少させる方法であって、配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５若しくは２８として示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の活性又は発現を低下又は阻害することによって前記植物を改変するステップを含み、或いはＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子は、配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９若しくは３０で示されるヌクレオチド配列又は配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９若しくは３０の機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログ又は配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９若しくは３０に対して少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列を含む、方法を提供する。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及び／又はＲＧＧドメインを含み得る。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及びＲＧＧドメインを含み得る。
一態様では、本発明は、植物若しくはその一部（例えば、葉）においてタバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）前駆体の含有量を減少させる方法であって、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の活性又は発現を低下又は阻害することによって前記植物を改変するステップを含む方法を提供する。
一態様では、本発明は、植物若しくはその一部（例えば、葉）においてタバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）前駆体の含有量を減少させる方法であって、配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９若しくは３０として示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、或いは、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子が、配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９若しくは３０で示されるヌクレオチド配列又は配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９若しくは３０の機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログ又は配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９若しくは３０に対して少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列を含む、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の活性又は発現を低下又は阻害することによって前記植物を改変するステップを含む方法を提供する。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及び／又はＲＧＧドメインを含み得る。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及びＲＧＧドメインを含み得る。
一態様では、本発明は、処理葉、例えば、乾燥葉においてＴＳＮＡの含有量を減少させる方法であって、
ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の活性又は発現を低下又は阻害することによって植物を改変するステップ、
前記植物から葉を採取するステップ、
及び処理するステップ、例えば、前記収穫葉を乾燥させるステップ
を含む方法を提供する。
適切には、処理葉においてＴＳＮＡの含有量を減少させる方法は、配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９若しくは３０として示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の活性又は発現を低下又は阻害することによって前記植物を改変するステップを含む場合があり、或いはＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子は、配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９若しくは３０で示されるヌクレオチド配列又は配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９若しくは３０の機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログ又は配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９若しくは３０に対して少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列を含む。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及び／又はＲＧＧドメインを含み得る。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及びＲＧＧドメインを含み得る。
「低下させること」又は「阻害すること」（例えば、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする遺伝子の活性又は発現を阻害すること）という用語は、本明細書で使用される場合、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする遺伝子の活性又は発現が、比較できる製品における遺伝子の活性又は発現と比較して低く又は低下していることを意味する。
一態様では、本発明は、植物若しくはその一部又は細胞（例えば、植物細胞）のアルカロイド含有量を増加させる方法であって、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の活性又は発現を増大又は増強することによって前記植物を改変するステップを含む方法を提供する。
一態様では、本発明は、植物若しくはその一部又は植物細胞のアルカロイド含有量を増加させる方法をであって、配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５若しくは２８として示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の活性又は発現を増大又は増強することによって前記植物を改変するステップを含み、或いはＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子は、配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９若しくは３０で示されるヌクレオチド配列又は配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９若しくは３０の機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログ又は配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９若しくは３０に対して少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列を含む、方法を提供する。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及び／又はＲＧＧドメインを含み得る。適切には、タンパク質は、ＲＮＡ結合性ドメイン及びＲＧＧドメインを含み得る。一態様では、本発明は、植物若しくはその一部（例えば、葉）においてタバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）前駆体の含有量を増加させる方法であって、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の活性又は発現を増大又は増強することによって前記植物を改変するステップを含む方法を提供する。
一態様では、本発明は、植物若しくはその一部（例えば、葉）においてタバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）前駆体の含有量を増加させる方法であって、配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９若しくは３０として示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の活性又は発現を増大又は増強することによって前記植物を改変するステップを含み、或いはＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子は、配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９若しくは３０で示されるヌクレオチド配列又は配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９若しくは３０の機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログ又は配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９若しくは３０に対して少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列を含む、方法を提供する。
「増大させること」又は「増強すること」（例えば、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする遺伝子の活性又は発現を増大させること）という用語は、本明細書で使用される場合、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする遺伝子の活性又は発現が、比較できる製品における遺伝子の活性又は発現と比較して、より高い又は増大していることを意味する。
本発明によれば、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする遺伝子の活性又は発現が調節される。
一態様では、本発明は、植物若しくはその一部又は細胞（例えば、植物細胞）のアルカロイド含有量を調節する（すなわち、増加させる又は減少させる）方法であって、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の活性を調節する（すなわち、増大させること又は低下させること）によって前記植物を改変するステップを含む方法を提供する。
「活性」という用語は、少なくとも１つの遺伝子によってコードされるＲＮＡ結合性タンパク質のいかなる機能性も指す。活性の例として、タンパク質：タンパク質相互作用の形成、酵素活性又はＲＮＡ結合性タンパク質の局在性が挙げられる。
適切には、活性は、ＲＮＡ結合性タンパク質の別の分子（単数又は複数）と相互作用する能力であり得る。一部の実施形態では、本発明は、植物若しくはその一部又は細胞（例えば、植物細胞）のアルカロイド含有量を調節する（すなわち、増加させる又は減少させる）方法であって、ＲＮＡ結合性タンパク質の別の分子と相互作用する能力を調節する（すなわち、増大させる又は低下させる）ことによって前記植物を改変するステップを含む方法を提供する。
適切には、ＲＮＡ結合性タンパク質の他の分子と相互作用する能力は、他の分子に結合する能力であり得る。他の分子は、タンパク質、例えば、別のＲＮＡ結合性タンパク質であり得る。適切には、他の分子は、１つより多い分子、例えば、１つ又は２つ以上の分子、例えば、２つ又は３つ以上の分子、例えば、３つ又は４つ以上の分子であり得る。他の分子が、１つより多い分子である場合には、他の分子は、同一分子である場合も、異なる分子である場合もある。適切には、他の分子は、ＲＮＡであり得る。
適切には、活性は、ＲＮＡ結合性タンパク質のＲＮＡに結合する能力であり得る。一部の実施形態では、本発明は、植物若しくはその一部又は細胞（例えば、植物細胞）のアルカロイド含有量を調節する（すなわち、増加させる又は減少させる）方法であって、ＲＮＡ結合性タンパク質のＲＮＡに結合する能力を調節する（すなわち、増大させる又は低下させる）ことによって前記植物を改変するステップを含む方法を提供する。
ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする遺伝子の活性の調節は、ＲＮＡ結合性タンパク質の活性を増大させること又は低下させることを必要とし得る。
ＲＮＡ結合性タンパク質の活性を増大させることは、本発明に従って改変されていない植物におけるＲＮＡ結合性タンパク質と比較して、ＲＮＡ結合性タンパク質の特定の機能を実施する能力を増強又は改善することを指す。
ＲＮＡ結合性タンパク質の活性を低下させることは、本発明に従って改変されていない植物におけるＲＮＡ結合性タンパク質と比較して、ＲＮＡ結合性タンパク質の特定の機能を実施する能力を低減、阻害又は攪乱することを指す。ＲＮＡ結合性ドメイン含有タンパク質の活性は、活性が妨げられる又は排除されるような程度に低減され得る。
一部の実施形態では、ＲＮＡ結合性タンパク質の活性は、本発明に従って改変されていない植物（例えば、タバコ植物）におけるＲＮＡ結合性タンパク質をコードする遺伝子の活性と比較して、少なくとも約１０％ ２０％ ３０％又は４０％、適切には、少なくとも約５０％、６０％、７０％、より適切には、少なくとも約８０％、９０％、９５％又は１００％調節され得る（すなわち、増大され得る又は低下され得る）。
一部の実施形態では、調節されたＲＮＡ結合性タンパク質は、未改変ＲＮＡ結合性タンパク質と比較して増大した又は低下した活性を呈示する。調節されたＲＮＡ結合性タンパク質は、未改変ＲＮＡ結合性タンパク質と比較して、少なくとも約１％、少なくとも約３％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％又は少なくとも約９０％増大した又は低下した活性を呈示し得る。
タンパク質活性を測定するための技術は、当技術分野で公知である。例えば、タンパク質の酵素活性を測定するためのアッセイは、公知であり、タンパク質の局在性は、顕微鏡技術を使用して同定できる。
特に、ＲＮＡ結合性タンパク質の別の分子に結合する能力は、当技術分野で公知の技術を使用して測定できる。このような技術の例として、免疫沈降、等温熱量測定、表面プラズモン共鳴及びマイクロスケール熱泳動が挙げられる。例えば、調節された又は変異したＲＮＡ結合性タンパク質の他の分子に結合する能力は、例えば、調節された、又は変異したＲＮＡ結合性タンパク質及び対応する未改変又は変異していないＲＮＡ結合性タンパク質を使用して共免疫沈降実験を行うことによって決定できる。ＲＮＡ結合性タンパク質における調節又は変異が、ＲＮＡ結合性タンパク質の他の分子に結合する能力を低減、阻害又は排除する場合には、共免疫沈降によって、調節された又は変異したＲＮＡ結合性タンパク質が、より少ない他の分子に結合することが示されるであろう。
ＲＮＡ結合性タンパク質のＲＮＡに結合する能力は、当技術分野で公知の技術を使用して測定できる。このような技術の例として、バンドシフトアッセイ（例えば、ＲＮＡ－電気泳動移動度シフトアッセイ）、親和性タグを使用するＲＮＡプルダウンアッセイ、ＲＮＡ免疫沈降と、それに続くＲＴ－ＰＣＲ又はポリ（Ａ）ノーザン若しくはオリゴヌクレオチド標的化ＲＮａｓｅＨプロテクションアッセイなどの非特異的アッセイなどの技術が挙げられる。
一態様では、本発明は、植物若しくはその一部又は細胞（例えば、植物細胞）のアルカロイド含有量を調節する（すなわち、増加させる又は減少させる）方法であって、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現を調節する（すなわち、増大させる又は低下させる）ことによって前記植物を改変するステップを含む方法を提供する。
遺伝子の「発現」とは、遺伝子にコードされる情報が機能性に変換される程度を指す。遺伝子の発現のレベルは、細胞又は生物中に存在する遺伝子の産物の量と同じと考えることができる。遺伝子の発現を調節する（すなわち、増大させる又は低下させる）改変とは、未改変植物又は細胞と比較して、植物又は細胞中のその遺伝子の産物の量を増大させるものである。
一部の実施形態では、ＲＮＡ結合性タンパク質の発現が、本発明に従って改変されていない植物（例えば、タバコ植物）におけるＲＮＡ結合性タンパク質をコードする遺伝子の発現と比較して、調節される（すなわち、増大される又は低下される）。
一部の実施形態では、ＲＮＡ結合性タンパク質の発現が、本発明に従って改変されていない植物（例えば、タバコ植物）におけるＲＮＡ結合性タンパク質をコードする遺伝子の発現と比較して、少なくとも約１０％ ２０％ ３０％又は４０％、適切には、少なくとも約５０％、６０％、７０％、より適切には、少なくとも約８０％、９０％、９５％又は１００％調節され得る（すなわち、増大され得る又は低下され得る）。
一部の実施形態では、調節されたＲＮＡ結合性タンパク質は、未改変ＲＮＡ結合性タンパク質と比較して増大した又は低下した発現を呈示する。調節されたＲＮＡ結合性タンパク質は、未改変ＲＮＡ結合性タンパク質と比較して、少なくとも約１％、少なくとも約３％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％又は少なくとも約９０％増大した又は低下した発現を呈示し得る。
典型的に、遺伝子はｍＲＮＡに転写され、これが、タンパク質、最終遺伝子産物に翻訳される。タンパク質は、細胞ストアに隔離され、及び／又は分解される場合がある。遺伝子の発現は、これらのステップのいずれか又はすべてを調節することによって調節され得る。したがって、一部の実施形態では、改変は、以下の方法のうち１つでＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現を調節する：
ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子からの転写を調節すること、
ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子からのｍＲＮＡの翻訳を調節すること、
細胞内ストアからのＲＮＡ結合性タンパク質の放出を調節すること、及び／又は
ＲＮＡ結合性タンパク質の分解の速度を調節すること。
ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする特定の遺伝子の発現は、遺伝子の転写及び／又は翻訳を測定することによって測定できる。転写を測定する方法は、当技術分野で周知であり、中でも、ノーザンブロット、ＲＮＡ－Ｓｅｑ、インサイツハイブリダイゼーション、ＤＮＡマイクロアレイ及びＲＴ－ＰＣＲが挙げられる。或いは、遺伝子の発現は、遺伝子産物、例えば、前記遺伝子によってコードされるタンパク質のレベルを測定することによって間接的に測定できる。例えば、ＲＮＡ結合性タンパク質の発現は、ウエスタンブロットによってＲＮＡ結合性タンパク質に特異的な抗体（例えば、ＲＮＡ結合性ドメインに対して特異的な抗体）を使用してタンパク質の存在を測定することによって決定できる。
改変
植物又は細胞は、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の活性又は発現を調節するいかなる方法でも改変できる。遺伝子の活性又は発現を調節する植物及び細胞への改変の種類並びにそれらの改変を達成するための技術は、当技術分野で公知である。
一部の実施形態では、本発明は、植物若しくはその一部又は細胞（例えば、植物細胞）のアルカロイド含有量を減少させる方法であって、本明細書において記載されるＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の活性又は発現を低下又は阻害することによって前記植物を改変するステップを含む方法を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、タバコ植物又はその植物の一部においてタバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）又はＴＳＮＡの前駆体の含有量を減少させる方法であって、本明細書において記載されるＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の活性又は発現を低下させることによって前記植物又は細胞培養物を改変するステップを含む方法を提供する。
遺伝子の活性又は発現を低下させる又は阻害する当技術分野で公知のいかなる方法も、本発明による方法において使用できる。
適切には、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする遺伝子の活性又は発現は、タンパク質活性、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする遺伝子の発現又は機能が検出可能ではない場合があるように、低減され、部分不活化され、阻害され、排除され、ノックアウトされ、又は失われ得る。
一態様では、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子がノックアウトされる。言い換えれば、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする遺伝子は、完全に無効にされている。
例として、本方法は、
・配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５若しくは２８として示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列中に変異を提供するステップ、
・配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５若しくは２８として示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質の発現を制御することに寄与する調節領域（例えば、プロモーター又はエンハンサー）中に変異を提供するステップ、
・配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５若しくは２８として示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列のレベルを低減するアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡを提供するステップ
を含み得る。
上記のアプローチの各々は、配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５若しくは２８として示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質の活性又は発現の低減又は阻止をもたらし、或いはＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子は、配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９若しくは３０で示されるヌクレオチド配列又は配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９若しくは３０の機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログ又は配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９若しくは３０に対して少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列を含む。
本明細書において、「変異」という用語は、天然の遺伝子バリアント又は操作されたバリアントを包含する。特に、「変異」という用語は、配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５若しくは２８として示される配列、又はそれに対して少なくとも８０％（好ましくは、少なくとも８５％、好ましくは、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９３％、好ましくは、少なくとも９５％、好ましくは、少なくとも９８％、好ましくは、少なくとも９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列と比較される、アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列中の、又はアミノ酸配列中の変動を指す。
一実施形態では、変異は、植物のアルカロイド含有量を減少させる。別の実施形態では、変異は、植物若しくはその一部又は葉、例えば、収穫された若しくは処理された葉において、少なくとも１つのＴＳＮＡ前駆体の含有量を減少させる。一実施形態では、変異は、ＮＮＮ、ＮＮＫ、ＮＡＴ、ＮＡＢから選択される１つ又は２つ以上のＴＳＮＡの含有量を減少させる、好ましくは、処理葉においてＮＮＫ及び／又はＮＮＫ含有量が減少する。適切には、比較できる製品との関連で、ＴＳＮＡ含有量が低減される。
一実施形態では、本発明による方法は、植物若しくはその一部又は植物細胞に核酸配列を提供するステップを含む場合があり、前記核酸は、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の活性又は発現の低減又は排除をもたらす。
一実施形態では、本発明による方法は、植物若しくはその一部又は植物細胞に核酸配列を提供するステップを含む場合があり、前記核酸は、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の核酸配列の改変をもたらす。
適切には、前記核酸配列は、植物若しくはその一部又は細胞に導入され得る。適切には、植物若しくはその一部又は細胞中の内因性核酸配列は、本発明によるポリペプチドをコードするように改変され得る（例えば、遺伝子編集によって）。例えば、内因性ヌクレオチド配列は、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の活性又は発現を低下するように改変され得る。
好ましい実施形態では、植物中に存在する、配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５若しくは２８として示される配列又はそれに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、或いはＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子が、配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９若しくは３０で示されるヌクレオチド配列又は配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９若しくは３０の機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログ又は配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９若しくは３０に対して少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列を含む、タンパク質をコードする核酸配列の各コピーが、本明細書において定義されるように改変される、例えば、変異される（例えば、植物中の前記タンパク質をコードする遺伝子の各ゲノムコピーが変異される）。例えば、ニコチアナ・タバカムの異質四倍体ゲノム中の遺伝子の各コピーが変異され得る。
好ましい実施形態では、本明細書において記載されるＲＮＡ結合性タンパク質のホモログのいくつか又はすべてが、改変される、例えば、阻害される又は変異される。適切には、配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５若しくは２８のいくつか若しくはすべて、又はそれに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する対応する配列が、改変される、例えば、阻害される又は変異される。
一部の実施形態では、本発明による植物又は植物細胞は、ホモ接合性である。適切には、植物又は植物細胞は、改変、例えば、阻害又は変異についてホモ接合性であり得る。
一部の実施形態では、本発明による植物又は植物細胞は、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする改変された、例えば、変異された核酸のみを発現する。言い換えれば、一部の実施形態では、本発明による植物中に内因性（又は内因性及び機能性タンパク質）は存在しない。言い換えれば、いかなる内因性タンパク質が存在する場合も、不活性の形態であることが好ましい。
一実施形態では、本方法は、配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９若しくは３０として示される核酸配列又はそれに対して少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列中に変異を提供するステップを含み得る。
変異は、配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５若しくは２８として示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列が、完全に若しくは部分的に欠失される、又はそうでなければＲＮＡ結合性タンパク質のＲＮＡに結合する能力を阻害又は排除するように改変されるように植物ゲノムを変更し得る。一部の実施形態では、変異は、タンパク質の発現のレベルを変更しないが、ＲＮＡ結合性タンパク質のＲＮＡに結合する能力を低減、阻害又は排除する。
適切には、変異は、ＲＮＡ結合性タンパク質のＲＮＡ結合性ドメイン中であり得る。適切には、変異は、ＲＮＡ結合性タンパク質のＲＧＧドメイン中であり得る。適切には、ＲＮＡ結合性タンパク質は、各々異なるドメイン中に複数の変異を、例えば、ＲＮＡ結合性ドメイン中に少なくとも１つの変異及びＲＧＧドメイン中に少なくとも１つの変異を含み得る。一部の実施形態では、変異ｉは、ＲＮＡ結合性タンパク質のＲＮＡに結合する能力を改変する。適切には、変異は、ＲＮＡ結合を妨げることができる、又は低減できる。適切には、変異は、ＲＮＡ結合を妨げる又は低減し、ＲＮＡ結合性タンパク質の活性を低減し得る。
変異は、ＲＮＡ結合性タンパク質の１つ又は２つ以上のドメイン中、例えば、ＲＮＡ結合性ドメイン及び／又はＲＧＧドメイン中であり得る。一部の実施形態では、ＲＮＡ結合性ドメイン及び／又はＲＧＧドメイン中などのＲＮＡ結合性タンパク質の１つ又は２つ以上のドメインが変異され、それによって、タンパク質のＲＮＡに結合する能力を改変し得る。一部の実施形態では、１つ又は２つ以上のドメイン、例えば、ＲＮＡ結合性ドメイン及び／又はＲＧＧドメインは、ＲＮＡ結合性タンパク質から欠失される。
変異は、配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５若しくは２８として示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列を中断する場合がある。
中断は、転写及び／又は翻訳されない核酸配列を引き起こし得る。
核酸配列は、例えば、核酸配列のＡＴＧ開始コドンを欠失することによって、又はそうでなければ改変することによって中断される場合があり、その結果、タンパク質の翻訳は低減される、又は妨げられる。
核酸配列は、タンパク質の発現を低減する若しくは妨げる、又はタンパク質輸送に影響を及ぼす１つ又は２つ以上のヌクレオチド変化を含み得る。例えば、タンパク質の発現は、オープンリーディングフレーム中に１つ又は２つ以上の未熟終止コドン、フレームシフト、スプライス変異又は許容されないアミノ酸置換を導入することによって低減する又は妨げることができる。
未熟終止コドンとは、オープンリーディングフレーム中に終止コドンを導入し、全アミノ酸配列の翻訳を妨げる変異を指す。未熟終止コドンは、ＴＡＧ（「アンバー（amber）」）、ＴＡＡ（「オーカー」）又はＴＧＡ（「オパール」又は「アンバー（umber）」）コドンであり得る。
フレームシフト変異（フレーミングエラー又はリーディングフレームシフトとも呼ばれる）は、３で割り切れない核酸配列中のいくつかのヌクレオチドの挿入欠失（挿入又は欠失）によって引き起こされる変異である。コドンによる遺伝子発現のトリプレット性のために、挿入又は欠失は、リーディングフレームを変化させ、元とは完全に異なる翻訳をもたらし得る。フレームシフト変異は、変異後のコドンのリーディングが異なるアミノ酸をコードすることを引き起こすことが多い。フレームシフト変異は、一般に未熟終止コドンの導入をもたらす。
スプライス変異は、成熟メッセンジャーＲＮＡへの前駆体メッセンジャーＲＮＡのプロセシングの際にスプライシングが起こる指定の部位において、いくつかのヌクレオチドを挿入、欠失又は変化させる。スプライシング部位の欠失は、成熟ｍＲＮＡ中に残存する１つ又は２つ以上のイントロンをもたらし、異常タンパク質の生成につながり得る。
許容されないアミノ酸置換とは、タンパク質において非同義アミノ酸置換を引き起こす変異を指し、これは、タンパク質の低減された又は取り除かれた機能をもたらす。
核酸配列中に変異を提供するための当技術分野で公知のいかなる方法も、本発明による方法において使用できる。例えば、関連核酸配列が変異され、植物又は植物細胞を形質転換するために使用されるベクターが作出される相同組換えを使用できる。次いで、変異された配列を発現する組換え植物又は植物細胞が選択され得る。
一実施形態では、変異は、配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５若しくは２８として示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むタンパク質中に許容されないアミノ酸置換を導入する。
一部の実施形態では、ＲＮＡ結合性ドメインは、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現を低下させる変異を含有し得る。
一部の実施形態では、ＲＧＧドメインは、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現を低下させる変異を含有し得る。
変異は、欠失、スプライス変異体又は許容されないアミノ酸置換をコードするコドンであり得る。
一実施形態では、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする核酸配列は、全体的に又は部分的に欠失され得る。欠失は、連続である場合も、配列の複数のセクションを含む場合もある。欠失は、好ましくは、核酸配列がもはや機能的なＲＮＡ結合性タンパク質をコードしないような十分な量のヌクレオチド配列を除去する。欠失は、比較できる未改変植物の対応するゲノムと比較された場合に、核酸配列のコーディング部分の１００％が存在しない場合に完全であり得る。欠失は、例えば、核酸配列のコーディング部分の少なくとも５０、６０、７０、８０又は９０％を除去し得る。適切には、タンパク質の少なくとも一部が欠失され得る。欠失は、例えば、タンパク質のコーディング部分の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０又は９０％を除去し得る。
欠失は、ＲＮＡ結合性タンパク質のＣ末端から少なくとも１０個のアミノ酸（例えば、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個のアミノ酸）を除去し得る。適切には、欠失は、ＲＮＡ結合性タンパク質の配列が配列番号１とアラインされるＲＮＡ結合性タンパク質のＣ末端に対応する少なくとも１０個のアミノ酸（例えば、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個のアミノ酸）を除去し得る。適切には、欠失は、ＲＮＡ結合性タンパク質のＣ末端から少なくとも１０個のアミノ酸（例えば、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個のアミノ酸）を除去する場合があり、欠失の前のＲＮＡ結合性タンパク質は、配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５若しくは２８で示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む。適切には、欠失は、ＲＮＡ結合性タンパク質のＣ末端から少なくとも１０個のアミノ酸（例えば、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個のアミノ酸）を除去する場合があり、欠失の前のＲＮＡ結合性タンパク質は、配列番号１で示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む。
適切には、本発明による使用のためのタンパク質は、末端切断型ＲＮＡ結合性タンパク質を含み得る。適切には、末端切断型タンパク質は、配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５若しくは２８で示されるアミノ酸配列の末端切断型バージョン又はそれに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列であり得る。適切には、末端切断型タンパク質は、ＲＮＡ結合性タンパク質のＣ末端から少なくとも１０個のアミノ酸（例えば、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個のアミノ酸）を欠く。
欠失は、ＲＮＡ結合性ドメインの少なくとも一部を除去し得る。欠失は、例えば、ＲＮＡ結合性ドメインの少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０又は９０％を除去し得る。適切には、欠失は、ＲＮＡ結合性ドメインの少なくとも５個のアミノ酸、少なくとも１０個のアミノ酸、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個のアミノ酸、少なくとも４０個のアミノ酸、少なくとも５０個のアミノ酸、少なくとも６０個のアミノ酸、少なくとも７０個のアミノ酸、少なくとも８０個のアミノ酸を除去し得る。適切には、欠失は、ＲＮＡ結合性ドメインの５個のアミノ酸、１０個のアミノ酸、１５個、２０個のアミノ酸、２５個のアミノ酸、３０個のアミノ酸、４０個のアミノ酸、５０個のアミノ酸、６０個のアミノ酸、７０個のアミノ酸、８０個のアミノ酸を除去し得る。
欠失は、ＲＧＧモチーフの少なくとも一部を除去し得る。欠失は、例えば、ＲＧＧドメインから少なくとも１個の、又は少なくとも２個のアミノ酸を除去し得る。適切には、ＲＧＧドメインは、完全に欠失され得る。
一実施形態では、ＲＮＡ結合性タンパク質は、配列番号３４で示される配列を含む、又はそれからなるヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも８０％の同一性（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％の同一性）を有する配列によってコードされる。
一実施形態では、ＲＮＡ結合性タンパク質は、配列番号３５で示される配列又はそれに対して少なくとも８０％の同一性（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％の同一性）を有する配列を含む、又はそれからなる。
植物における核酸配列の欠失のための方法は、当技術分野で公知である。例えば、関連核酸配列（複数可）を欠き、植物又は植物細胞を形質転換するために使用されるベクターが作出される相同組換えを使用できる。次いで、配列の新規部分を発現する組換え植物又は植物細胞が選択され得る。
本明細書において記載されるベクターで形質転換された植物細胞は、周知の組織培養法に従って、例えば、必要な増殖因子、例えば、アミノ酸、植物ホルモン、ビタミンなどが補給された適切な培養培地で細胞を培養することによって増殖され、維持され得る。
核酸配列の改変は、標的化突然変異誘発法（標的化ヌクレオチド交換（ＴＮＥ，targeted nucleotide exchange）又はオリゴ指示突然変異誘発（ＯＤＭ，oligo-directed mutagenesis）とも呼ばれる）を使用して行うことができる。標的化突然変異誘発法として、制限されるものではないが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ（国際公開第２０１１／０７２２４６号パンフレット及び国際公開第２０１０／０７９４３０号パンフレットを参照されたい）、Ｃａｓ９様、Ｃａｓ９／ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ又は他のＣＲＩＳＰＲシステム（国際公開第２０１４／０７１００６号パンフレット及び国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレットを参照されたい）、メガヌクレアーゼ（国際公開第２００７／０４７８５９号パンフレット及び国際公開第２００９／０５９１９５号パンフレットを参照されたい）を採用するもの又は植物プロトプラストへの遺伝子に対する配列相補性を用いて突然変異誘発を増強するための化学的に修飾されたヌクレオチドをおそらくは含有する変異原性オリゴヌクレオチドを採用する標的化突然変異誘発方法（例えば、ＫｅｙＢａｓｅ（登録商標）又はＴＡＬＥＮ）が挙げられる。
或いは、ＴＩＬＬＩＮＧ（ゲノミクスにおいて誘発された局所病変を標的とする，Targeting Induced Local Lesions IN Genomics；McCallum et al. (2000) Nat. Biotech. 18:455、及び McCallum et al. (2000) Plant Physiol. 123, 439-442、両方とも参照により本明細書に組み込まれる）などの突然変異誘発システムを使用して、変異を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む植物株を生成できる。ＴＩＬＬＩＮＧは、伝統的な化学的突然変異誘発（例えば、ランダム変異を生成するメタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ，ethyl methanesulfonate）突然変異誘発）と、それに続く変異についてのハイスループットスクリーニングを使用する。このように、所望の変異を有する遺伝子を含む植物、種子、細胞及び組織を得ることができる。
方法は、植物種子を突然変異誘発するステップ（例えば、ＥＭＳ突然変異誘発）、植物個体又はＤＮＡをプールするステップ、目的の領域のＰＣＲ増幅、ヘテロ二本鎖形成及びハイスループット検出、変異体植物の同定、変異体ＰＣＲ産物のシーケンシングを含み得る。他の突然変異誘発及び選択方法も同等に使用して、このような改変された植物を生成できるということは理解される。例えば、種子を放射線照射又は化学的処置でき、植物を改変された表現型についてスクリーニングできる。
高速中性子欠失突然変異誘発を、逆遺伝学の意味で（すなわち、ＰＣＲを用いて）使用して、内因性遺伝子中に欠失を保持する植物株を同定できる。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ohshima et al. (1998) Virology 213:472-481；Okubara et al. (1994) Genetics 137:867-874；及びQuesada et al. (2000) Genetics 154:421-4315を参照されたい。
別のアプローチでは、優性変異体を使用して、遺伝子逆位及び重複した遺伝子座の組換えによってＲＮＡサイレンシングを誘因することができる。例えば、Kusaba et al. (2003) Plant Cell 15:1455-1467（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
改変された植物は、分子的方法、例えば、ＤＮＡ中に存在する変異（複数可）によって、及び改変された表現型の特性によって改変されていない植物、すなわち、野生型植物と区別することができる。改変された植物は、改変についてホモ接合性である場合も、ヘテロ接合性である場合もある。好ましくは、改変された植物は、改変についてホモ接合性である。
一実施形態では、配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５若しくは２８として示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質の活性又は発現を低減する又は妨げる方法は、化学物質（例えば、農業化学品）を用いて植物を処置するステップを含まない。
発現を低減する又は妨げる他の方法は、当業者に明らかであり、ウイルス誘導性遺伝子サイレンシング（ＶＩＧｓ，virus-induced gene silencing）、マイクロＲＮＡサイレンシング、ＲＮＡｉ、アンチセンス、ｔＤＮＡ挿入又はドミナントネガティブコンストラクト（又はアンチモルフ変異）の使用が含まれる。
一実施形態では、配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５若しくは２８として示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする遺伝子の発現が、ウイルス誘導性遺伝子サイレンシングによって低減又は排除され得る。
一実施形態では、配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５若しくは２８として示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする遺伝子の発現が、マイクロＲＮＡによって低減又は排除され得る。
一実施形態では、配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５若しくは２８として示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする遺伝子の発現が、ＲＮＡｉによって低減又は排除され得る。
一実施形態では、配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５若しくは２８として示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする遺伝子の発現が、アンチセンス抑制によって低減又は排除され得る。
一実施形態では、配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５若しくは２８として示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする遺伝子の発現が、センス抑制によって低減又は排除され得る。
一実施形態では、配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５若しくは２８として示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする遺伝子の発現が、ｔＤＮＡ挿入によって低減又は排除され得る。
一実施形態では、配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５若しくは２８として示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする遺伝子の発現が、ドミナントネガティブコンストラクト（又は、アンチモルフ変異）によって低減又は排除され得る。
一実施形態では、配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５若しくは２８として示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする遺伝子の発現が、標的化突然変異誘発ベースのシステムによって低減又は排除され得る。
一実施形態では、配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５若しくは２８として示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする遺伝子の発現が、遺伝子編集、例えば、ＣＲＩＳＰＲベースのシステムによって低減又は排除され得る。
一実施形態では、配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５若しくは２８として示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする遺伝子の発現が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ、変異原性オリゴヌクレオチド又はＴＩＬＬＩＮＧによって低減又は排除され得る。
一部の実施形態では、本発明は、植物若しくはその一部又は細胞（例えば、植物細胞）のアルカロイド含有量を増加させる方法であって、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の活性又は発現を増大又は増強することによって前記植物を改変するステップを含む方法を提供する。
遺伝子の活性又は発現を増大又は増強するための当技術分野で公知のいかなる方法も、本発明による方法において使用できる。
一部の実施形態では、方法は、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子を過剰発現させるステップを含み得る。適切には、方法は、植物又は細胞においてＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の１つ又は２つ以上のさらなるコピーを発現させることを含み得る。適切には、方法は、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の内因性コピーを、その発現が増大されるように改変するステップを含み得る。方法は、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子のコード配列を変異させることを含み得る。方法は、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現を調節する調節配列を変異させることを含み得る。
適切には、方法は、配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５若しくは２８で示されるアミノ酸配列又はその機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログ又は配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５若しくは２８に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む少なくとも１つのＲＮＡ結合性タンパク質をコードする、或いは、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子が、配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９若しくは３０で示されるヌクレオチド配列又は配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９若しくは３０の機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログ又は配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９若しくは３０に対して少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列を含む、或いは、少なくとも１つの内因性ＲＮＡ結合性タンパク質を促進又は増強可能であるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子コンストラクトで植物（例えば、タバコ植物）の細胞を形質転換するステップを含み得る。これらの選択肢の各々は、少なくとも１つのＲＮＡ結合性タンパク質によってコードされるポリペプチドの活性及び発現の増大をもたらすということは認められよう。方法は、形質転換された細胞から植物を再生するステップを含み得る。コンストラクトで形質転換された植物若しくはその一部又は細胞においてアルカロイド含有量（例えば、ニコチン含有量）を増加させるための、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子によってコードされるポリペプチドの活性及び／又は発現を増大可能である遺伝子コンストラクトの使用が提供される。
遺伝子コンストラクトは、アミノ酸配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５若しくは２８又はその機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログ又は配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５若しくは２８に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、或いはＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子が、配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９若しくは３０で示されるヌクレオチド配列又は配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９若しくは３０の機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログ又は配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９若しくは３０に対して少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列を含むポリペプチドをコードし得る。
別の実施形態では、本発明は、植物若しくはその一部又は細胞のアルカロイド含有量を増加させる方法であって、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の活性を増大させることによって前記植物又は細胞を改変するステップを含む方法に関する。
一実施形態では、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の活性は、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子に変異を導入する（又は提供する）ことによって増大され得る。
適切には、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の活性は、配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５若しくは２８で示されるアミノ酸配列又はその機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログ又は配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５若しくは２８に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、或いは、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子が、配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９若しくは３０で示されるヌクレオチド配列又は配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９若しくは３０の機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログ又は配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９若しくは３０に対して少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列を含むＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子に変異を導入することによって増大され得る。
一部の実施形態では、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の活性又は発現を増大させ、それによって以下：
ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子からの転写を調節すること、
ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子からのｍＲＮＡの翻訳を調節すること、
細胞内ストアからのＲＮＡ結合性タンパク質の放出を調節すること、及び／又は
ＲＮＡ結合性タンパク質の分解の速度を調節すること
のうち１つによってアルカロイド含有量を増加させる改変。
一態様では、本明細書において定義されるＲＮＡ結合性タンパク質の活性及び又は発現は、相互作用物質タンパク質の活性又は発現を改変することによって調節、例えば、低下させ得る。
理論に捉われようとは思わないが、一態様では、相互作用物質タンパク質は、前記ＲＮＡ結合性タンパク質の活性及び／又は発現を低減又は遮断し得る。例えば、相互作用物質タンパク質は、ＲＮＡ結合性タンパク質に結合及び／又はそれを隔離でき、したがって、相互作用物質タンパク質の活性及び／又は発現の増大が、ＲＮＡ結合性タンパク質の活性及び／又は発現を低減し得る。
代替態様では、相互作用物質タンパク質は、本明細書において定義されるＲＮＡ結合性タンパク質の活性及び／又は発現を増大又は増強し得る。例えば、相互作用物質タンパク質は、ＲＮＡ結合性タンパク質の補助因子として作用することができ、したがって、相互作用物質タンパク質の活性及び／又は発現を低下することは、ＲＮＡ結合性タンパク質の活性及び／又は発現を低減し得る。
一態様では、相互作用物質タンパク質の活性又は発現を改変することによって、ＲＮＡ結合性タンパク質の活性及び／又は発現を調節（例えば、低減）し得る。
適切には、相互作用物質タンパク質は、配列番号３８、配列番号４１、配列番号４４、配列番号４７、配列番号５０又はそれに対して少なくとも８０％の同一性（例えば、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性）を有するそのバリアントから選択され得る。
適切には、相互作用物質タンパク質は、配列番号３９、配列番号４２、配列番号４５、配列番号４８、配列番号５１又はそれに対して少なくとも８０％の同一性（例えば、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性）を有するそのバリアントから選択され得るコード配列を有し得る。
適切には、相互作用物質タンパク質は、配列番号４０、配列番号４３、配列番号４６、配列番号４９、配列番号５２又はそれに対して少なくとも８０％の同一性（例えば、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性）を有するそのバリアントから選択され得るヌクレオチド配列によってコードされ得る。
アルカロイド含有量
一実施形態では、本発明は、植物（例えば、タバコ植物）又はその一部のアルカロイド含有量を調節する方法であって、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の活性又は発現を調節することによって前記植物を改変するステップを含む方法を提供する。
「調節すること」という用語は、増大させること又は減少させることのいずれかを意味するように本明細書において使用される。
「アルカロイド含有量を増加させること」という用語は、本発明の製品（例えば、植物、その一部（例えば葉）、処理葉又は植物から作製された製品（例えば、タバコ産業製品））中のアルカロイド含有量が、本発明に従って改変されていない比較できる製品と比較して高いことを意味するように本明細書において使用される。
「アルカロイド含有量を減少させること」という用語は、本発明の製品（例えば、植物、その一部（例えば葉）、処理葉又は植物から作製された製品（例えば、タバコ産業製品））中のアルカロイド含有量が、本発明に従って改変されていない比較できる製品と比較して低いことを意味するように本明細書において使用される。
一部の実施形態では、アルカロイド含有量の調節とは、アルカロイド含有量の増加を指し、ＲＮＡ結合性タンパク質ドメイン含有タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の活性又は発現が増大される（又は言い換えれば、タンパク質が過剰発現される）。
一部の実施形態では、アルカロイド含有量の調節とは、アルカロイド含有量の減少を指し、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現が低下又は阻害又は排除される。
さらなる態様において、アルカロイド含有量は、葉から測定される。一態様では、アルカロイド含有量は、緑色葉から測定される。さらなる態様において、アルカロイド含有量は、乾燥葉から、例えば、空気乾燥（air-cured）、熱気送管乾燥（flue-cured）、火力乾燥（fire-cured）又は日光乾燥（sun-cured）葉から測定される。さらなる態様において、アルカロイド含有量は、熱気送管乾燥葉から測定される。さらなる態様において、アルカロイド含有量は、空気乾燥葉から測定される。
「アルカロイド含有量」という用語は、アルカロイドとして分類される化合物の群全体の濃度及び／若しくは総量又はアルカロイドとして分類される１つ又は２つ以上の化合物の濃度及び／若しくは総量を意味するように本明細書において使用される。タバコ中に典型的に存在するアルカロイドとして、ノルニコチン、ＰＯＮ、アナタビン、アナバシン、ニコチン及びミオスミンが挙げられる。一部の実施形態ではニコチン、ノルニコチン、ＰＯＮ、アナタビン、アナバシン及びミオスミンから選択される１種又は２種以上のアルカロイド、例えば、２種又は３種以上のアルカロイド、例えば、３種又は４種以上のアルカロイド、例えば、４種又は５種以上のアルカロイド、例えば、５種又は６種以上のアルカロイド、例えば、６種すべてのアルカロイドの含有量が調節される。一部の実施形態では、ニコチン、ノルニコチン、ＰＯＮ、アナタビン、アナバシン及びミオスミンから選択される１種又は２種以上のアルカロイド、例えば、２種又は３種以上のアルカロイド、例えば、３種又は４種以上のアルカロイド、例えば、４種又は５種以上のアルカロイド、例えば、５種又は６種以上のアルカロイド、例えば、６種すべてのアルカロイドの含有量が増加する。一部の実施形態では、ニコチン、ノルニコチン、ＰＯＮ、アナタビン、アナバシン及びミオスミンから選択される１種又は２種以上のアルカロイド、例えば、２種又は３種以上のアルカロイド、例えば、３種又は４種以上のアルカロイド、例えば、４種又は５種以上のアルカロイド、例えば、５種又は６種以上のアルカロイド、例えば、６種すべてのアルカロイドの含有量が減少する。一部の実施形態では、植物又は細胞の総アルカロイド含有量が調節される。一部の実施形態では、総アルカロイド含有量が増加する。一部の実施形態では、総アルカロイド含有量が増加する。
アルカロイドの濃度及び／又は総含有量を決定するための当技術分野で公知のいかなる方法も使用できる。アルカロイド含有量を分析するための１つの好ましい方法には、ガスクロマトグラフィー－水素炎イオン化検出方法（ＧＣ－ＦＩＤ，gas chromatography-flame ionization detection）による分析又はタンデム質量分析を備えた逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ，liquid chromatography with tandem mass spectrometry）による分析が含まれる。
一実施形態では、アルカロイド含有量が調節された本発明の植物によって得ることができる、又は得られた、植物（例えば、タバコ植物）又はその一部、植物増殖材料（例えば、タバコ植物増殖材料）、細胞（例えば、タバコ細胞）、葉（例えば、タバコの葉）、収穫葉（例えば、タバコの収穫葉）、カットされた収穫葉（例えば、カットされたタバコの収穫葉）、処理葉（例えば、タバコの処理葉）、カットされ処理葉（例えば、カットされ処理されたタバコの葉）、前記植物若しくは又はその一部を含む製品（例えば、タバコ産業製品）又はそれらの組合せを生成する方法であって、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする遺伝子の活性又は発現を調節するために前記植物を改変するステップを含む方法を提供する。調節されたアルカロイド含有量は、植物（例えば、タバコ植物）又はその一部、植物増殖材料（例えば、タバコ植物増殖材料）、細胞（例えば、タバコ細胞）、葉（例えば、タバコの葉）、収穫葉（例えば、タバコの収穫葉）、カットされた収穫葉（例えば、カットされたタバコの収穫葉）、処理葉（例えば、タバコの処理葉）、カットされ処理葉（例えば、カットされたタバコの処理葉）、本発明の植物若しくはその一部を含む製品、例えば、タバコ産業製品又はそれらの組合せ中のアルカロイド含有量を、比較できる製品と比較することによって決定できる。
適切には、植物、例えば、タバコ植物、例えば、改変されたタバコ植物においてアルカロイド含有量を調節できる。適切には、葉（例えば、タバコの葉、例えば、改変されたタバコ植物からのタバコの葉）においてアルカロイド含有量を調節できる。適切には、収穫葉（例えば、改変されたタバコ植物からのタバコの収穫葉）においてアルカロイド含有量を調節できる。適切には、カットされた収穫葉（例えば、改変されたタバコ植物からのカットされたタバコの収穫葉）においてアルカロイド含有量を調節できる。適切には、処理葉（例えば、処理されたタバコの葉、例えば、改変されたタバコ植物からの処理されたタバコの葉）においてアルカロイド含有量を調節できる。適切には、カットされた処理葉（例えば、カットされ処理されたタバコの葉、例えば、改変されたタバコ植物からのカットされ処理されたタバコの葉）においてアルカロイド含有量を調節できる。適切には、乾燥葉（例えば、改変されたタバコ植物からの乾燥タバコ葉）においてアルカロイド含有量を調節できる。適切には、緑色葉（例えば、改変されたタバコ植物からの緑色タバコ葉）の抽出物においてアルカロイド含有量を調節できる。適切には、本発明の植物若しくはその一部を含む製品（例えば、タバコ産業製品、例えば、改変されたタバコ植物若しくはその一部から生成されたタバコ産業製品）においてアルカロイド含有量を調節できる。適切には、上記の製品のうちのいずれか又はそれらの組合せにおいてアルカロイド含有量を調節できる。適切には、上記のアルカロイド含有量の調節は、アルカロイド含有量の増加であり得る。適切には、上記のアルカロイド含有量の調節は、アルカロイド含有量の減少（例えば、ノルニコチン及び／又はＰＯＮ含有量の減少）であり得る。
一実施形態では、ノルニコチン、ＰＯＮ、アナタビン及びアナバシンから選択される１つ又は２つ以上のアルカロイドの含有量が減少する。一実施形態では、ノルニコチンの含有量が減少する。一実施形態では、ＰＯＮの含有量が減少する。一実施形態では、アナタビンの含有量が減少する。一実施形態では、アナバシンの含有量が減少する。
一実施形態では、改変された植物（例えば、タバコ植物）、植物増殖材料（例えば、タバコ植物増殖材料）、葉（例えば、タバコの葉）、収穫葉（例えば、タバコの収穫葉）、カットされた収穫葉（例えば、カットされたタバコの収穫葉）、処理葉（例えば、タバコの処理葉）、カットされた処理葉（例えば、カットされたタバコの処理葉）又は改変されたタバコ植物からのタバコ産業製品のニコチン含有量は、実質的に減少しない。適切には、ニコチン含有量は、比較できる製品のニコチン含有量の少なくとも８５％（例えば、少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％、例えば、少なくとも９８％、例えば、少なくとも９９％）である。
一実施形態では、植物（例えば、タバコ植物）又はその一部のアルカロイド含有量は、それぞれ、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の活性又は発現を調節するために改変されていない、同様の成長条件下で生育された植物（例えば、タバコ植物）又はその一部のアルカロイド含有量と比較した場合に、少なくとも０．５、１．５、２、３又は４倍調節され得る。適切には、アルカロイド含有量は、約０．５倍～約４倍調節され得る。適切には、アルカロイド含有量は、約４倍調節され得る。適切には、改変は、アルカロイド含有量の増加又は減少であり得る。適切には、調節は、ニコチン、ノルニコチン、ＰＯＮ、アナタビン、アナバシン及びミオスミンから選択される１つ又は２つ以上のアルカロイドのものであり得る。適切には、調節は、ニコチン、ノルニコチン、ＰＯＮ、アナタビン及びアナバシンから選択される１つ又は２つ以上のアルカロイドのものであり得る。適切には、ノルニコチン含有量が低減され得る。適切には、ＰＯＮ含有量が低減され得る。適切には、アナタビン含有量が低減され得る。適切には、アナバシン含有量が低減され得る。
本発明の一実施形態では、植物（例えば、タバコ植物）又はその一部のアルカロイド含有量は、本発明に従って改変されていない植物（例えば、タバコ植物）又はその一部と比較して、少なくとも１％、２％、５％、８％、１０％、１２％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％調節され得る。一実施形態では、アルカロイド含有量は、未改変植物若しくはその一部と比較して少なくとも３０％調節され得る。一実施形態では、アルカロイド含有量は、未改変植物若しくはその一部と比較して少なくとも４０％調節され得る。一実施形態では、アルカロイド含有量は、未改変植物若しくはその一部と比較して少なくとも５０％調節され得る。一実施形態では、アルカロイド含有量は、未改変植物若しくはその一部と比較して少なくとも６０％調節され得る。調節は、未改変植物（例えば、タバコ植物）又はその一部と比較した場合のアルカロイド含有量の増加又は減少であり得る。
適切には、調節は、総アルカロイド含有量の調節であり得る。適切には、調節は、ノルニコチン、ニコチン、ＰＯＮ、アナタビン、アナバシン及びミオスミンから選択される１つ又は２つ以上のアルカロイドのものであり得る。適切には、調節は、ニコチン、ノルニコチン、ＰＯＮ、アナタビン及びアナバシンから選択される１つ又は２つ以上のアルカロイドのものであり得る。適切には、調節は、ノルニコチン含有量の調節、例えば、ノルニコチン含有量の減少であり得る。適切には、調節は、アナバシン含有量の調節、例えば、アナバシン含有量の減少であり得る。適切には、調節は、ＰＯＮ含有量の調節、例えば、ＰＯＮ含有量の減少であり得る。適切には、調節は、アナタビン含有量の調節、例えば、アナタビン含有量の減少であり得る。
適切には、調節は、ニコチン、ノルニコチン、ＰＯＮ、アナタビン、アナバシン及びミオスミンから選択される１種より多いアルカロイド、例えば、２種又は３種以上のアルカロイド、例えば、３種又は４種以上のアルカロイド、例えば、４種又は５種以上のアルカロイド、例えば、５種又は６種以上のアルカロイド、例えば、６種すべてのアルカロイドのものであり得る。
一部の実施形態では、植物のアルカロイド含有量は、約５％から約１００％の間、約１０％から約９０％の間、約２０％から約８０％の間、約３０％から約７０％の間、約４０％から６０％の間、約４０％から５０％の間又は約５０％から６０％の間調節され得る。
タバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）含有量
一実施形態では、本発明は、植物（例えば、タバコ植物）又はその一部において、又はタバコ細胞において少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）前駆体の含有量を減少させる方法を提供する。適切には、方法は、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の活性又は発現を調節することによって前記植物を改変するステップを含み得る。一実施形態では、本発明は、ＴＳＮＡ含有量が減少した（例えば、比較できる製品に対して）処理葉を生成する方法を提供する。ＴＳＮＡ含有量が減少した処理葉を生成する方法は、
ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の活性又は発現を低下又は阻害することによって植物を改変するステップ、
処理するステップ、例えば、前記植物から葉を採取するステップ、
及び前記収穫葉を乾燥させるステップ
を含み得る。
ＴＳＮＡは、処理されたタバコ、例えば、乾燥タバコ又は再構成されたタバコにおいて測定できる。一実施形態では、ＴＳＮＡ含有量は、乾燥タバコ植物若しくはその一部において（例えば、乾燥タバコ葉において）測定され、及び／又は改変される（例えば、低減される）。
「タバコ特異的ニトロソアミン」又は「ＴＳＮＡ」という用語は、本明細書で使用される場合、当技術分野におけるその通常の意味、すなわち、タバコ産業製品又は他のニコチン含有製品においてのみ見出されるニトロソアミンを有する。適切には、少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミンは、Ｎ’－ニトロソノルニコチン（ＮＮＮ）、４－（メチルニトロソアミノ）－１－（３－ピリジル）－１－ブタノン（ＮＮＫ）、Ｎ’－ニトロソアナタビン（ＮＡＴ）又はＮ－ニトロソアナバシン（ＮＡＢ）であり得る。
「その前駆体」という用語は、少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミンと関連して使用される場合、タバコ特異的ニトロソアミンの形成を生じさせるか、又はタバコ特異的ニトロソアミン生成につながるニトロソ化反応に関与している、タバコ植物の１つ又は２つ以上の化学物質又は化合物を指す。
一実施形態では、ＴＳＮＡは、Ｎ’－ニトロソノルニコチン（ＮＮＮ）、４－（メチルニトロソアミノ）－１－（３－ピリジル）－１－ブタノン（ＮＮＫ）、Ｎ’ニトロソアナタビン（ＮＡＴ）及びＮ’－ニトロソアナバシン（ＮＡＢ）から選択される群のうち１又は２以上であり得る。適切には、少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミンは、ＮＮＫ又はＮＮＮであり得る。一実施形態では、タバコ特異的ニトロソアミンは、ＮＮＮである。別の実施形態では、タバコ特異的ニトロソアミンは、ＮＮＫである。
一実施形態では、ＴＳＮＡの前駆体は、ノルニコチン、アナバシン、アナタビン及びニコチンの酸化派生物、例えば、シュードオキシニコチン（ＰＯＮ）から選択される群のうち１つ又は２つ以上である。
一実施形態では、ＴＳＮＡは、Ｎ’ニトロソノルニコチン（ＮＮＮ）であり、及び／又は前駆体はノルニコチンである。一実施形態では、ＮＮＮの含有量が減少する。一実施形態では、ノルニコチンの含有量が減少する。一実施形態では、ＮＮＮ及びノルニコチンの含有量が減少する。
一実施形態では、ＴＳＮＡは、４－（メチルニトロソアミノ）－１－（３－ピリジル）－１－ブタノン（ＮＮＫ）であり、及び／又は前駆体はＰＯＮである。一実施形態では、ＮＮＫの含有量が減少する。一実施形態では、ＰＯＮの含有量が減少する。一実施形態では、ＮＮＫ及びＰＯＮの含有量が減少する。
一実施形態では、ＴＳＮＡは、Ｎ’ニトロソアナタビン（ＮＡＴ）であり、及び／又は前駆体はアナタビンである。一実施形態では、ＮＡＴの含有量が減少する。一実施形態では、アナタビンの含有量が減少する。一実施形態では、ＮＡＴ及びアナタビンの含有量が減少する。
一実施形態では、ＴＳＮＡは、Ｎ’－ニトロソアナバシン（ＮＡＢ）であり、及び／又は前駆体はアナバシンである。
一実施形態では、ＮＡＢの含有量が減少する。一実施形態では、ノルニコチンの含有量が減少する。一実施形態では、ＮＡＢ及びアナバシンの含有量が減少する。
ＴＳＮＡ（例えば、ＮＮＫ、ＮＮＮ、ＮＡＢ及び／又はＮＡＴ）の前駆体は、例えば、処理の前に、例えば、乾燥の前に緑色のタバコの葉において測定できる。一実施形態では、ＴＳＮＡ（例えば、ＮＮＫ、ＮＮＮ、ＮＡＢ及び／又はＮＡＴ）の前駆体は、例えば、処理の前に、例えば、乾燥の前に緑色のタバコの葉において測定及び／又は改変される（例えば、低減される）。
一実施形態では、本発明の方法を実施すること及び又は本発明の使用は、本発明に従って改変されていないタバコ植物（又はその一部）と比較した場合に、改変されたタバコ植物（又はその一部）における少なくとも１つのＴＳＮＡ又はその前駆体の低減をもたらす。
「少なくとも１つのＴＳＮＡ又はその前駆体を低減すること」又は「少なくとも１つのＴＳＮＡ又はその前駆体の低減」という用語は、本発明の製品、方法又は使用における少なくとも１つのＴＳＮＡ又はその前駆体の濃度及び／又は総含有量が、比較できる製品、方法又は使用との関連で低いことを意味するように本明細書において使用される。例えば、比較できるタバコ産業製品は、本発明に従って改変されていないが、すべての他の関連特徴が同一である（例えば、植物種、成長条件、タバコを処理する方法など）タバコ植物に由来するであろう。
少なくとも１つのＴＳＮＡ又はその前駆体の濃度及び／又はレベルを決定するための当技術分野で公知のいかなる方法も使用できる。特に、このような方法は、重水素標識された内部標準の付加、水性抽出及び濾過と、それに続くタンデム質量分析の使用の可能性を備えた逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）を使用する分析を含み得る。タバコ特異的ニトロソアミンの前駆体の濃度及び／又はレベルを決定するための他の例として、参照によりすべて本明細書に組み込まれる、ＣＯＲＥＳＴＡが推奨する方法ＣＲＭ－７２：ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによるタバコ及びタバコ製品中のタバコ特異的ニトロソアミンの決定（Determination of Tobacco Specific Nitrosamines in Tobacco and Tobacco Products by LC-MS/MS）；ＩＳＯ／ＤＩＳ ２１７６６に開発されているＣＲＭ又はWagner et al. (2005) Analytical Chemistry 77(4), 1001-1006に詳述されるもののような方法が挙げられる。
適切には、少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミン又はその前駆体の濃度及び／又は総含有量を、本発明の方法及び／又は使用を実施することによって低減できる。適切には、本発明のタバコ植物（例えば、本発明の方法及び／又は使用によって得ることができる、又は得られた）において、少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミン又はその前駆体の濃度及び／又はレベルを、本発明に従って改変されていないタバコ植物における少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミン又はその前駆体の濃度及び／又はレベルと比較した場合に低減できる。
本発明のタバコ植物（又はタバコ植物の一部又はタバコ細胞培養物）から得ることができる、又は得られたタバコの葉、収穫葉、処理されたタバコの葉、タバコ産業製品又はそれらの組合せにおいて、少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミン又はその前駆体の濃度及び／又は総含有量を、本発明に従って改変されていないタバコ植物（又はタバコ植物の一部又はタバコ細胞培養物）から得ることができる、又は得られたタバコの葉、収穫葉、処理されたタバコの葉、タバコ産業製品又はそれらの組合せと比較した場合に低減できる。
適切には、処理されたタバコの葉において少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミン又はその前駆体の濃度及び／又は総含有量を低減できる。
適切には、タバコ産業製品において少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミン又はその前駆体の濃度及び／又はレベルを低減できる。
一実施形態では、少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミン又はその前駆体を、少なくとも約１％、少なくとも約３％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％又は少なくとも約５０％低減できる。一部の実施形態では、少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミン又はその前駆体を、約５％から約５０％の間、約１０％から約５０％の間、約２０％から約５０％の間、約３０％から約５０％の間又は約４０％から５０％の間低減できる。
処理された（例えば、乾燥された）タバコの葉（例えば、乾燥された又は再構成された）との関連で、少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミン又はその前駆体を、約５０００ｎｇ／ｇから約５０ｎｇ／ｇの間、約４０００ｎｇ／ｇから約１００ｎｇ／ｇの間、約３０００ｎｇ／ｇから５００ｎｇ／ｇの間又は２０００ｎｇ／ｇから１０００ｎｇ／ｇの間低減できる。一部の実施形態では、少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミン又はその前駆体を、少なくとも約５０００ｎｇ／ｇ、少なくとも約４０００ｎｇ／ｇ、少なくとも約３０００ｎｇ／ｇ、少なくとも約２０００ｎｇ／ｇ、少なくとも約１０００ｎｇ／ｇ、少なくとも約５００ｎｇ／ｇ、少なくとも約１００ｎｇ／ｇ又は少なくとも約５０ｎｇ／ｇ低減できる。
バイオマス生成
一部の例では、高アルカロイドレベル、例えば、ニコチンを精製して、例えば、ニコチンを含有する液体を利用するデバイス（例えば、電子タバコ）において、又はタバコ加熱デバイス内で使用するための純粋なニコチン製品を生成できるように、高レベルのニコチン含有量を有する植物又はバイオマスを生成することが望ましいものである場合がある。例えば、この方法でのニコチンの生成は、電子タバコ用の電子リキッドの生成のためのニコチン抽出の費用を低減できるであろう。
一態様では、本発明は、バイオマスを生成する方法であって、
ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする遺伝子の活性又は発現を調節する（例えば、増大させる）ように操作されている細胞を、バイオマスを生成する条件下で増殖させるステップ
を含む方法を提供する。適切には、濃度及び／又は総ニコチン含有量を増加させるためにＲＮＡ結合性タンパク質の活性又は発現を増大できる。
一実施形態では、本発明は、ニコチンの濃度及び／又は総含有量が改変されている（例えば、増加されている）バイオマスを生成する方法であって、配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５若しくは２８で示されるアミノ酸配列又はその機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログ又は配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５若しくは２８に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の活性又は発現を増大させるように操作されている細胞を増殖させるステップを含み、或いはＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子が、配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９若しくは３０で示されるヌクレオチド配列又は配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９若しくは３０の機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログ又は配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９若しくは３０に対して少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列を含む方法を提供する。
ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の活性又は発現を改変するために、当技術分野で公知のいかなる方法によっても細胞を操作できる。適切には、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする外因性遺伝子を発現させるように細胞を操作できる。適切には、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする遺伝子を過剰発現させるように細胞を操作できる。
適切には、バイオマスは、本発明に従って改変されていない比較できる細胞によって産生されたバイオマスと比較して、より高い濃度及び／又は総含有量のニコチンを含有し得る。
適切には、バイオマス産生において使用するための細胞は、植物細胞、例えば、タバコ細胞であり得る。
適切には、バイオマス産生において使用するための細胞は、酵母細胞であり得る。
一実施形態では、細胞（例えば、酵母細胞）を、ニコチン性アルカロイド生合成を増大させる１つ又は２つ以上の配列を含むようにさらに改変できる。適切には、これらの１つ又は２つ以上の配列を、細胞（例えば、酵母細胞）形質転換にとって適切である核酸コンストラクト中に組み込むことができる。１つ又は２つ以上の配列を、細胞（例えば、酵母細胞）において過剰発現させることができる。配列は、以下の遺伝子のうち１つ又は２つ以上から選択され得る。：ＭＰＯ（又はメチルプトレシンオキシダーゼ又はＭＰＯ１又はＭＰＯ２）、Ａ６２２（又はイソフラボンレダクターゼ様タンパク質又はイソフラボンレダクターゼホモログ又はイソフラボンレダクターゼ様タンパク質）、ＢＢＬ（又はベルベリンブリッジ酵素又はベルベリンブリッジ酵素様又はＢＢＥ又はＮＢＢ１）、ＰＭＴ（又はプトレシンＮ－メチルトランスフェラーゼ又はプトレシンメチルトランスフェラーゼ又はＳ－アデノシル－Ｌ－メチオニン：プトレシンＮ－メチルトランスフェラーゼ又はＰＭＴ又はＰＭＴ１又はＰＭＴ２又はＰＭＴ３又はＰＭＴ４）及びＱＰＴ（又はキノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ）。一実施形態では、配列は、以下の遺伝子のうち１つ又は２つ以上から選択され得る：ＢＢＬ、Ａ６２２、ＰＭＴ及びＭＰＯ（ＭＰＯ１又はＭＰＯ２）。この方法での改変にとって適切な遺伝子は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第２０１６０３２２９９号明細書において教示され得る。
商業的に望ましい形質
一実施形態では、本発明の植物は、香りの特性及び／又は他の商業的に望ましい形質は少なくとも維持されながら、総アルカロイド含有量が改変されている（例えば、増加又は減少している）、及び／又は１つ又は２つ以上のアルカロイドの含有量が改変されている（例えば、増加又は減少している）。適切には、本発明の植物は、香りの特性及び／又は他の商業的に望ましい形質は少なくとも維持されながら、総アルカロイド含有量が減少している、及び／又は１つ又は２つ以上のアルカロイドの含有量が減少している場合がある。
一実施形態では、本発明の植物は、本発明に従って改変されていない植物と同様の等級及び／又は品質の葉を生成する。
一実施形態では、本発明の植物は、ノルニコチン及び／又はＰＯＮ及び／又はアナバシン及び／又はアナタビン含有量が低減されているが、植物の香りの特性には大幅な変化を伴わない（例えば、本発明に従って改変されていない同一植物と比較して）。
一実施形態では、本発明の植物は、ＴＳＮＡ前駆体含有量が減少しているが、植物の他の商業的に望ましい形質の大幅な変化（例えば、減少）は伴わない（例えば、本発明に従って改変されていない同一植物と比較して）。特に、改変された植物の収量は、好ましくは、本発明に従って改変されていない同一植物と比較して低減されない。
したがって、一実施形態では、本発明の方法及び使用は、香りの特性及び／又は他の商業的に望ましい形質（例えば、収量）を維持しながらのＴＳＮＡ前駆体含有量の減少に関する。
「商業的に望ましい形質」という用語は、本明細書で使用される場合、収量、成熟植物高、採取可能な葉の数、平均節長、カッター葉の長さ、カッター葉の幅、品質（例えば、葉の品質、適切には、乾燥葉の品質）、非生物的（例えば、干ばつ）ストレス耐性、除草剤耐性及び／又は生物的（例えば、昆虫、細菌又は真菌）ストレス耐性などの形質を含む。
葉の品質は、例えば、米国農務省（ＵＳＤＡ，United States Department of Agriculture）の等級と基準に従って、乾燥葉の色、質感及び芳香に基づいて測定できる。
タバコの等級は、それだけには限らないが、葉柄の位置、葉の大きさ、葉色、葉の均一性及び完全性、熟度、質感、弾性、光沢（葉の呈色の強度及び深度並びに輝きと関連する）、吸湿性（タバコ葉の環境湿度を吸収し、保持する能力）及び緑色の陰影又は外観を含む因子に基づいて評価される。
葉の等級は、当技術分野で公知の標準方法を使用して、例えば、米国農務省の農業マーケティングサービス局（Agricultural Marketing Service）によって発行された公式基準等級（７ＵＳＣ§５１１）を使用して決定できる。例えば、バーレータバコの公式基準等級（米国タイプ３１及び外来タイプ９３）、１９９０年１１月５日発効（５５ Ｆ．Ｒ． ４０６４５）；熱気送管乾燥タバコの公式基準等級（米国タイプ１１、１２、１３、１４及び外来タイプ９２）、１９８９年３月２７日発効（５４ Ｆ．Ｒ． ７９２５）；ペンシルバニアシードリーフタバコの公式基準等級（米国タイプ４１）、１９６５年１月８日発効（２９ Ｆ．Ｒ． １６８５４）；オハイオシガーリーフタバコの公式基準等級（米国タイプ４２、４３及び４４）、１９６３年１２月８日発効（２８ Ｆ．Ｒ． １１７１９及び２８ Ｆ．Ｒ． １１９２６）；ウィスコンシンシガーバインダータバコの公式基準等級（米国タイプ５４及び５５）、１９６９年１１月２０日発効（３４ Ｆ．Ｒ． １７０６１）；ウィスコンシンシガーバインダータバコの公式基準等級（米国タイプ５４及び５５）、１９６９年１１月２０日発効（３４ Ｆ．Ｒ． １７０６１）；ジョージア及びフロリダ日陰栽培シガー－ラッパータバコの公式基準等級（米国タイプ６２）、１９７１年４月発効を参照されたい。ＵＳＤＡ等級指数値は、業界で認められる等級指数に従って決定できる。例えば、Bowman et al. (1988) Tobacco Science, 32:39-40; Legacy Tobacco Document Library (Bates Document #523267826-523267833, July 1, 1988, Memorandum on the Proposed Burley Tobacco Grade Index); and Miller et al. (1990) Tobacco Intern., 192:55-57（すべての前記参考文献はその全文で本明細書に組み込まれる）。
一態様では、ＵＳＤＡ等級指数は、受け取られた連邦政府等級の０～１００の数値表示であり、すべての葉柄位置の加重平均である。等級指数が高いほど、高い品質を指し示す。或いは、葉の等級は、ハイパースペクトルイメージングによって決定できる。例えば、国際公開第２０１１／０２７３１５号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
一実施形態では、本発明のタバコ植物は、商業的に許容される等級のタバコを提供する。
適切には、本発明のタバコ植物は、商業的に許容される等級の乾燥タバコを提供する。
一実施形態では、本発明のタバコ植物は、同様の成長条件で生育された場合に比較できる植物の葉のＵＳＤＡ等級指数値の少なくとも約７０％のＵＳＤＡ等級指数値を有する葉を生成可能である。適切には、本明細書において開示されるタバコ植物は、同様の成長条件で生育された場合にコントロール植物のＵＳＤＡ等級指数値の少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又は少なくとも約９８％のＵＳＤＡ等級指数値を有する葉を生成可能であり得る。適切には、本明細書において開示されるタバコ植物は、比較できる植物のＵＳＤＡ等級指数値の６５％から１３０％の間、７０％から１３０％の間、７５％から１３０％の間、８０％から１３０％の間、８５％から１３０％の間、９０％から１３０％の間、９５％から１３０％の間、１００％から１３０％の間、１０５％から１３０％の間、１１０％から１３０％の間、１１５％から１３０％の間又は１２０％から１３０％の間のＵＳＤＡ等級指数値を有する葉を生成可能であり得る。
一態様では、本発明のタバコ植物は、少なくとも５０のＵＳＤＡ等級指数値を有する葉を生成可能である。適切には、本明細書において開示されるタバコ植物は、５５又はそれ以上、６０又はそれ以上、６５又はそれ以上、７０又はそれ以上、７５又はそれ以上、８０又はそれ以上、８５又はそれ以上、９０又はそれ以上及び９５又はそれ以上のＵＳＤＡ等級指数値を有する葉を生成可能であり得る。
特に指定されない限り、本明細書において使用される、タバコ収量は、標準の農業及び乾燥慣行に従い標準圃場条件下でのエーカーあたりの乾燥タバコ葉の重量に基づいて計算される乾燥葉収量を指す。
一態様では、本発明の植物（例えば、タバコ植物）は、同様の圃場条件で生育された比較できる植物の収量の５０％から１５０％の間、５５％から１４５％の間、６０％から１４０％の間、６５％から１３５％の間、７０％から１３０％の間、７５％から１２５％の間、８０％から１２０％の間、８５％から１１５％の間、９０％から１１０％の間、９５％から１０５％の間、５０％から１００％の間、５５％から１００％の間、６０％から１００％の間、６５％から１００％の間、７０％から１００％の間、７５％から１００％の間、８０％から１００％の間、８５％から１００％の間、９０％から１００％の間、９５％から１００％の間、１００％から１５０％の間、１０５％から１５０％の間、１１０％から１５０％の間、１１５％から１５０％の間、１２０％から１５０％の間、１２５％から１５０％の間、１３０％から１５０％の間、１３５％から１５０％の間、１４０％から１５０％の間又は１４５％から１５０％の間の収量を有する。
別の態様では、本発明の植物（例えば、タバコ植物）の収量は、同様の圃場条件で生育された比較できる植物の収量のおよそ１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９又は３．０倍である。
別の態様では、本発明のタバコ植物の収量は、同様の圃場条件で生育された場合の熱気送管乾燥された比較できる植物の収量に匹敵する。
一態様では、本発明のタバコ植物は、約１２００から３５００の間、１３００から３４００の間、１４００から３３００の間、１５００から３２００の間、１６００から３１００の間、１７００から３０００の間、１８００から２９００の間、１９００から２８００の間、２０００から２７００の間、２１００から２６００の間、２２００から２５００の間及び２３００から２４００ポンド／エーカーの間からなる群から選択される収量を提供する。
別の態様では、本発明のタバコ植物は、約１２００から３５００の間、１３００から３５００の間、１４００から３５００の間、１５００から３５００の間、１６００から３５００の間、１７００から３５００の間、１８００から３５００の間、１９００から３５００の間、２０００から３５００の間、２１００から３５００の間、２２００から３５００の間、２３００から３５００の間、２４００から３５００の間、２５００から３５００の間、２６００から３５００の間、２７００から３５００の間、２８００から３５００の間、２９００から３５００の間、３０００から３５００の間及び３１００から３５００ポンド／エーカーの間からなる群から選択される収量を提供する。
さらなる態様において、本発明のタバコ植物は、約１２００から３５００の間、１２００から３４００の間、１２００から３３００の間、１２００から３２００の間、１２００から３１００の間、１２００から３０００の間、１２００から２９００の間、１２００から２８００の間、１２００から２７００の間、１２００から２６００の間、１２００から２５００の間、１２００から２４００の間、１２００から２３００の間、１２００から２２００の間、１２００から２１００の間、１２００から２０００の間、１２００から１９００の間、１２００から１８００の間、１２００から１７００の間、１２００から１６００の間、１２００から１５００の間及び１２００から１４００ポンド／エーカーの間からなる群から選択される収量を提供する。
植物育種
一実施形態では、本発明は、
ａ．ニコチン含有量が変化している及び／又はタバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ、tobacco specific nitrosamine）前駆体の含有量が変化しており、かつ、本発明に従ったＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の活性又は発現が本発明に従って調節されている、ドナー植物を、ニコチン含有量が変化していない又はタバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）前駆体の含有量が変化しておらず、かつ商業的に望ましい形質を有する、レシピエントタバコ植物と交配させるステップ、
ｂ．前記レシピエント植物と交配した前記ドナー植物の子孫から遺伝物質を単離するステップ、並びに
ｃ．分子マーカーを用いて分子マーカー支援選択を行うステップであって、
ｉ． ａ．で定義されたタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列における、変異を含む遺伝子移入領域を同定するステップ
を含む、分子マーカー支援選択を行うステップ
を含む、アルカロイド含有量が変化した及び／又はタバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）前駆体の含有量が変化した植物を生成する方法を提供する。
適切には、配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、若しくは２８で示されるアミノ酸配列、又はこれらの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログ、又は配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９、若しくは３０に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むタンパク質、或いは、配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９、若しくは３０で示されるヌクレオチド配列、又は配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９、若しくは３０の機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログ、又は配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９、若しくは３０に対して少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列によってコードされるタンパク質の活性又は発現が、同等の植物と比較した場合に、ドナー植物において調節されている。適切には、前記方法によってアルカロイド含有量及び／又はＴＳＮＡ前駆体含有量が減少する。適切には、アルカロイド含有量及び／又はＴＳＮＡ前駆体含有量が減少し、前記ＲＮＡ結合性タンパク質の活性又は発現が低下又は阻害される。
分子マーカー支援選択は、ＰＣＲを行って、配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、若しくは２８で示されるアミノ酸配列、又はこれらに対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質の活性又は発現を調節する変異を含む遺伝子移入核酸配列を同定することを含み得る。
植物
一実施形態では、本発明は、植物、又はこの一部分、又は植物細胞におけるアルカロイド含有量を調節する（例えば減少させる）方法に関する。
本発明に従った適切な植物としてはナス科（Solanaceae）植物が含まれ、これとしては、例えば、シロバナヨウシュチョウセンアサガオ、ナス、マンドレイク、ベラドンナ（deadly nightshade、belladonna）、トウガラシ（パプリカ、チリペッパー）、ジャガイモ、及びタバコが含まれる。
一実施形態では、ナス科の適切な属は、タバコ属（Nicotiana）、例えば、ニコチアナ・タバカム又はニコチアナ・ルスティカ（Nicotiana rustica）である。
タバコ属の適切な種は、ニコチアナ・タバカムであり得る。タバコ属の種は、本明細書において、タバコ植物、又は単純にタバコと呼ばれ得る。
タバコ植物
本発明は、植物（例えばタバコ植物）に向けられた方法、使用、並びに、細胞（例えばタバコ細胞）、植物（例えばタバコ植物）、及び植物増殖材料を提供する。
本明細書において使用される用語「タバコ植物」は、タバコ産業製品の製造において使用されるタバコ属の植物を指す。適切な「タバコ」植物の非限定的な例としては、Ｎ．タバカム（N. tabacum）及びＮ．ルスティカ（N. rustica）（例えば、Ｎ．タバカムＬ．、ＬＡ Ｂ２１、ＬＮ ＫＹ１７１、ＴＩ １４０６、Ｂａｓｍａ、Ｇａｌｐａｏ、Ｐｅｒｉｑｕｅ、Ｂｅｉｎｈａｒｔ １０００－１、及びＰｅｔｉｃｏ）が挙げられる。
一態様において、本発明に従ったタバコ植物は、非天然のタバコ植物である。適切には、タバコ植物は、変異体の、非天然のタバコ植物であり得る。適切には、タバコ植物は、トランスジェニックタバコ植物であり得る。
一態様において、本発明に従ったタバコ植物は、本明細書において定義される少なくとも１つのＲＮＡ結合性タンパク質の活性又は発現を調節する（例えば低下させる）非天然の変異を含む。適切には、タバコ植物は、変異が導入されていてもよい。
タバコ材料は、バーレー種、フルー（flue）又はブライト種、及びダーク種として一般に知られている、様々なニコチアナ・タバカムタイプに由来し得るか又はこれらから得ることができる。一部の実施形態では、タバコ材料は、バーレー、バージニア、又はダークタバコ植物に由来する。タバコ植物は、バーレータバコ、レア（rare）タバコ、スペシャリティータバコ、膨張型（expanded）タバコ、又はそれに類するものから選択され得る。
タバコ栽培品種及び優良タバコ栽培品種の使用もまた、本明細書において企図される。本明細書において使用するためのタバコ植物はしたがって、タバコ種又は優良タバコ栽培品種であり得る。特に有用なニコチアナ・タバカム種としては、黄色種バージニアタイプ、バーレータイプ、及びオリエンタルタイプが挙げられる。
一部の実施形態では、タバコ植物は、例えば、以下の種の１又は２以上から選択され得る：Ｌ．栽培品種Ｔ．Ｉ．１０６８、ＡＡ３７－１、Ｂ １３Ｐ、Ｘａｎｔｈｉ（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ－Ｍｏｒ）、ＫＴ Ｄ＃３ハイブリッド１０７、Ｂｅｌ－Ｗ３、７９－６１５、Ｓａｍｓｕｎ Ｈｏｌｍｅｓ ＮＮ、ＢＵ２１×Ｈｏｊａ Ｐａｒａｄｏの交配に由来するＦ４、系統９７、ＫＴＲＤＣ＃２ハイブリッド４９、ＫＴＲＤＣ＃４ハイブリッド１ １０、バーレー２１、ＰＭ０１６、ＫＴＲＤＣ＃５ ＫＹ １６０ ＳＩ、ＫＴＲＤＣ＃７ ＦＣＡ、ＫＴＲＤＣ＃６ ＴＮ ８６ ＳＩ、ＰＭ０２１、Ｋ １４９、Ｋ ３２６、Ｋ ３４６、Ｋ ３５８、Ｋ ３９４、Ｋ ３９９、Ｋ ７３０、ＫＹ １０、ＫＹ １４、ＫＹ １６０、ＫＹ １７、ＫＹ ８９５９、ＫＹ ９、ＫＹ ９０７、ＭＤ ６０９、ＭｃＮａｉｒ ３７３、ＮＣ ２０００、ＰＧ ０１、ＰＧ ０４、Ｐ０１、Ｐ０２、Ｐ０３、ＲＧ １１、ＲＧ １７、ＲＧ ８、Ｓｐｅｉｇｈｔ Ｇ－２８、ＴＮ ８６、ＴＮ ９０、ＶＡ ５０９、ＡＳ４４、Ｂａｎｋｅｔ Ａ１、Ｂａｓｍａ Ｄｒａｍａ Ｂ８４／３１、Ｂａｓｍａ Ｉ Ｚｉｃｈｎａ ＺＰ４／Ｂ、Ｂａｓｍａ Ｘａｎｔｈｉ ＢＸ ２Ａ、Ｂａｔｅｋ、Ｂｅｓｕｋｉ Ｊｅｍｂｅｒ、Ｃ１０４、Ｃｏｋｅｒ ３１９、Ｃｏｋｅｒ ３４７、Ｃｒｉｏｌｌｏ Ｍｉｓｉｏｎｅｒｏ、ＰＭ０９２、Ｄｅｌｃｒｅｓｔ、Ｄｊｅｂｅｌ ８１、ＤＶＨ ４０５、Ｇａｌｐａｏ Ｃｏｍｕｍ、ＨＢ０４Ｐ、Ｈｉｃｋｓ Ｂｒｏａｄｌｅａｆ、Ｋａｂａｋｕｌａｋ Ｅｌａｓｓｏｎａ、ＰＭ１０２、Ｋｕｔｓａｇｅ Ｅ１、ＫＹ １４×Ｌ８、ＫＹ １７１、ＬＡ ＢＵ ２１、ＭｃＮａｉｒ ９４４、ＮＣ ２３２６、ＮＣ ７１、ＮＣ ２９７、ＮＣ ３、ＰＶＨ ０３、ＰＶＨ ０９、ＰＶＨ １９、ＰＶＨ ２１ １０、Ｒｅｄ Ｒｕｓｓｉａｎ、Ｓａｍｓｕｎ、Ｓａｐｌａｋ、Ｓｉｍｍａｂａ、Ｔａｌｇａｒ ２８、ＰＭ１３２、Ｗｉｓｌｉｃａ、Ｙａｙａｌｄａｇ、ＮＣ ４、ＴＲ Ｍａｄｏｌｅ、Ｐｒｉｌｅｐ ＨＣ－７２、Ｐｒｉｌｅｐ Ｐ２３、Ｐｒｉｌｅｐ ＰＢ １５６／１、Ｐｒｉｌｅｐ Ｐ１２－２／１、Ｙａｋａ ＪＫ－４８、Ｙａｋａ ＪＢ １２５／３、ΤΙ－１０６８、ＫＤＨ－９６０、ＴＩ－１０７０、ＴＷ１３６、ＰＭ２０４、ＰＭ２０５、Ｂａｓｍａ、ＴＫＦ ４０２８、Ｌ８、ＴＫＦ ２００２、ＴＮ ９０、ＧＲ１４１、Ｂａｓｍａ ｘａｎｔｈｉ、ＧＲ１４９、ＧＲ１５３、及びＰｅｔｉｔ Ｈａｖａｎａ。
種又は栽培品種の非限定的な例は、以下の通りである：ＢＤ ６４、ＣＣ １０１、ＣＣ ２００、ＣＣ ２７、ＣＣ ３０１、ＣＣ ４００、ＣＣ ５００、ＣＣ ６００、ＣＣ ７００、ＣＣ ８００、ＣＣ ９００、Ｃｏｋｅｒ １７６、Ｃｏｋｅｒ ３１９、Ｃｏｋｅｒ ３７１ Ｇｏｌｄ、Ｃｏｋｅｒ ４８、ＣＤ ２６３、ＤＦ９１ １、ＤＴ ５３８ ＬＣ、Ｇａｌｐａｏタバコ、ＧＬ ２６Ｈ、ＧＬ ３５０、ＧＬ ６００、ＧＬ ７３７、ＧＬ ９３９、ＧＬ ９７３、ＨＢ ０４Ｐ、ＨＢ ０４Ｐ ＬＣ、ＨＢ３３０７ＰＬＣ、ハイブリッド ４０３ＬＣ、ハイブリッド ４０４ＬＣ、ハイブリッド ５０１ ＬＣ、Ｋ １４９、Ｋ ３２６、Ｋ ３４６、Ｋ ３５８、Ｋ３９４、Ｋ ３９９、Ｋ ７３０、ＫＤＨ ９５９、ＫＴ ２００、ＫＴ２０４ＬＣ、ＫＹ１０、ＫＹ１４、ＫＹ １６０、ＫＹ １７、ＫＹ １７１、ＫＹ ９０７、ＫＹ９０７ＬＣ、ＫＴＹ１４ｘＬ８ ＬＣ、Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｒｉｔｔｅｎｄｅｎ、ＭｃＮａｉｒ ３７３、ＭｃＮａｉｒ ９４４、ｍｓＫＹ １４ｘＬ８、Ｎａｒｒｏｗ Ｌｅａｆ Ｍａｄｏｌｅ、Ｎａｒｒｏｗ Ｌｅａｆ Ｍａｄｏｌｅ ＬＣ、ＮＢＨ ９８、Ｎ－１２６、Ｎ－７７７ＬＣ、Ｎ－７３７１ ＬＣ、ＮＣ １００、ＮＣ １０２、ＮＣ ２０００、ＮＣ ２９１、ＮＣ ２９７、ＮＣ ２９９、ＮＣ ３、ＮＣ ４、ＮＣ ５、ＮＣ ６、ＮＣ７、ＮＣ ６０６、ＮＣ ７１、ＮＣ ７２、ＮＣ ８１０、ＮＣ ＢＨ １２９、ＮＣ ２００２、Ｎｅａｌ Ｓｍｉｔｈ Ｍａｄｏｌｅ、ＯＸＦＯＲＤ ２０７、ＰＤ ７３０２ ＬＣ、ＰＤ ７３０９ ＬＣ、ＰＤ ７３１２ ＬＣ「Ｐｅｒｉｑ’ｅ」タバコ、ＰＶＨ０３、ＰＶＨ０９、ＰＶＨ１９、ＰＶＨ５０、ＰＶＨ５１、Ｒ ６１０、Ｒ ６３０、Ｒ ７－１ １、Ｒ ７－１２、ＲＧ １７、ＲＧ ８１、ＲＧ Ｈ５１、ＲＧＨ ４、ＲＧＨ ５１、ＲＳ １４１０、Ｓｐｅｉｇｈｔ １６８、Ｓｐｅｉｇｈｔ １７２、Ｓｐｅｉｇｈｔ １７９、Ｓｐｅｉｇｈｔ ２１０、Ｓｐｅｉｇｈｔ ２２０、Ｓｐｅｉｇｈｔ ２２５、Ｓｐｅｉｇｈｔ ２２７、Ｓｐｅｉｇｈｔ ２３４、Ｓｐｅｉｇｈｔ Ｇ－２８、Ｓｐｅｉｇｈｔ Ｇ－７０、Ｓｐｅｉｇｈｔ Ｈ－６、Ｓｐｅｉｇｈｔ Ｈ２０、Ｓｐｅｉｇｈｔ ＮＦ３、Ｔｌ １４０６、Ｔｌ １２６９、ＴＮ ８６、ＴＮ８６ＬＣ、ＴＮ ９０、ＴＮ ９７、ＴＮ９７ＬＣ、ＴＮ Ｄ９４、ＴＮ Ｄ９５０、ＴＲ（Ｔｏｍ Ｒｏｓｓｏｎ）Ｍａｄｏｌｅ、ＶＡ ３０９、ＶＡ３５９、ＡＡ ３７－１、Ｂ １３Ｐ、Ｘａｎｔｈｉ（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ－Ｍｏｒ）、Ｂｅｌ－Ｗ３、７９－６１５、Ｓａｍｓｕｎ Ｈｏｌｍｅｓ ＮＮ、ＫＴＲＤＣ ｎｕｍｂｅｒ ２ハイブリッド４９、バーレー ２１、ＫＹ ８９５９、ＫＹ ９、ＭＤ ６０９、ＰＧ ０１、ＰＧ ０４、Ｐ０１、Ｐ０２、Ｐ０３、ＲＧ １ １、ＲＧ ８、ＶＡ ５０９、ＡＳ４４、Ｂａｎｋｅｔ Ａ１、Ｂａｓｍａ Ｄｒａｍａ Ｂ８４／３１、Ｂａｓｍａ Ｉ Ｚｉｃｈｎａ ＺＰ４／Ｂ、Ｂａｓｍａ Ｘａｎｔｈｉ ＢＸ ２Ａ、Ｂａｔｅｋ、Ｂｅｓｕｋｉ Ｊｅｍｂｅｒ、Ｃ１０４、Ｃｏｋｅｒ ３４７、Ｃｒｉｏｌｌｏ Ｍｉｓｉｏｎｅｒｏ、Ｄｅｌｃｒｅｓｔ、Ｄｊｅｂｅｌ ８１、ＤＶＨ ４０５、Ｇａｌｐａｏ Ｃｏｍｕｍ、ＨＢ０４Ｐ、Ｈｉｃｋｓ Ｂｒｏａｄｌｅａｆ、Ｋａｂａｋｕｌａｋ Ｅｌａｓｓｏｎａ、Ｋｕｔｓａｇｅ Ｅ１、ＬＡ ＢＵ ２１、ＮＣ ２３２６、ＮＣ ２９７、ＰＶＨ ２１ １０、Ｒｅｄ Ｒｕｓｓｉａｎ、Ｓａｍｓｕｎ、Ｓａｐｌａｋ、Ｓｉｍｍａｂａ、Ｔａｌｇａｒ ２８、Ｗｉｓｌｉｃａ、Ｙａｙａｌｄａｇ、Ｐｒｉｌｅｐ ＨＣ－７２、Ｐｒｉｌｅｐ Ｐ２３、Ｐｒｉｌｅｐ ＰＢ １５６／１、Ｐｒｉｌｅｐ Ｐ１２－２／１、Ｙａｋａ ＪＫ－４８、Ｙａｋａ ＪＢ １２５／３、ＴＩ－１０６８、ＫＤＨ－９６０、Ｔｌ－１０７０、ＴＷ１３６、Ｂａｓｍａ、ＴＫＦ ４０２８、Ｌ８、ＴＫＦ ２００２、ＧＲ１４１、Ｂａｓｍａ ｘａｎｔｈｉ、ＧＲ１４９、ＧＲ１５３、Ｐｅｔｉｔ Ｈａｖａｎａ。上記のものの、変換の少ない亜種もまた、本明細書において具体的に同定されていなくても、企図される。
タバコ植物は、バーレー、黄色種バージニア、又はオリエンタルであり得る。
一実施形態では、植物増殖材料は、本発明の植物（例えばタバコ植物）から得ることができる。
本明細書において使用される「植物増殖材料」は、さらなる植物がそこから生成され得る植物から得られる、任意の植物体を指す。適切には、植物増殖材料は、種子、植物カルス、及び植物塊から選択され得る。適切には、植物増殖材料は種子であり得る。適切には、植物増殖材料は植物カルスであり得る。適切には、植物増殖材料は植物塊であり得る。
一実施形態では、細胞（例えばタバコ細胞）、タバコ植物、及び／又は植物増殖材料は、本発明に従った方法によって得ることができる（例えば得られ得る）。
適切には、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの（at least on one）遺伝子の活性又は発現を調節する（例えば、低下させる）ように改変されている本発明によるタバコ植物は、未改変タバコ植物と比較した場合に、調節された（例えば、減少した）ニコチン含有量を有し得る。適切には、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの（at least on one）遺伝子の活性又は発現を低下又は阻害するように改変されている本発明によるタバコ植物は、未改変タバコ植物と比較した場合に、減少したニコチン含有量を有し得る。
適切には、本発明に従ったタバコ植物は、未改変タバコ植物と比較した場合、タバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）前駆体の含有量が調節されている（例えば減少している）場合があり、この場合、タバコ植物は、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の活性又は発現を調節する（例えば増大させる）ように改変されている。
適切には、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの（at least on one）遺伝子の活性又は発現を低下又は阻害するように改変されている本発明によるタバコ植物は、未改変タバコ植物と比較した場合に、減少したタバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）前駆体含有量を有し得る。
一実施形態では、本発明に従ったタバコ植物は、本発明のタバコ細胞を含む。
別の実施形態では、植物増殖材料は、本発明のタバコ植物から得ることができる（例えば得られ得る）。
一実施形態では、タバコ植物を育種するための、本明細書において記載されるタバコ植物の使用が提供される。
本発明はまた、別の実施形態では、タバコ産業製品を生成するための、前述の実施形態のタバコ植物の使用も提供する。
別の実施形態では、作物を作るための、本発明のタバコ植物の使用が提供される。
一実施形態では、本明細書において定義されるＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の活性又は発現が調節されている、植物細胞などの細胞、例えばタバコ植物細胞が提供される。適切には、細胞は、非天然の細胞であり得る。適切には、細胞は、変異体細胞であり得る。適切には、細胞は、非天然の変異体細胞であり得る。例えば、細胞は、本明細書において定義されるＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の活性又は発現を調節する（例えば、低下させる）非天然の変異を含み得る。
一実施形態では、タバコ産業製品を生成するための、前述の実施形態において提供される細胞の使用が提供される。
一実施形態では、本発明は、細胞培養物（例えばインビトロ培養物）を提供する。
タバコ細胞培養物は、細胞懸濁液培養物であり得る。インビトロで培養されたこれらの細胞は、タバコ産業製品に、例えば、従来のタバコの粒子、細片、ファインカット若しくはロングカットのタバコ薄片の代替物として、添加物成分として、又は代替物及び添加物の両方として、組み込むことができる。適切には、細胞培養物は、ニコチンを生成し得る。
一実施形態では、タバコ産業製品を生成するための、本発明に従った細胞培養物、例えば採取及び／又は処理された細胞培養物の使用が提供される。
インビトロ培養物から採取されたタバコ細胞は、例えば粉末を生成するために、乾燥、例えば凍結乾燥させることができる。
一実施形態では、細胞培養物はタバコ細胞培養物である。当業者には、タバコ細胞のインビトロ培養物を確立するための公知の方法が認識されよう。ほんの一例として、以下の方法が使用され得る：所望のタバコ植物から（form）種子を回収し、これら種子の外側を滅菌して望ましくない生物を排除すること、前記種子を植え付けて、所望のタバコ植物を成長させること、タバコ植物から（例えばタバコの茎から）組織を取り出して、外植片として使用すること、タバコ外植片からカルス培養物を確立すること、カルス培養物から細胞懸濁液培養物を確立すること、及び培養材料（例えばタバコ細胞を含む）を採取して、タバコ細胞培養物を生成すること。
タバコ細胞は、濾過、例えば真空濾過を含む、様々な方法によって採取することができる。試料は、水を添加することによってフィルター中で洗浄され得、残っている液体は、濾過、例えば真空濾過によって除去される。
採取されたタバコ細胞培養物は、さらに処理することができ、例えば乾燥、例えば空気乾燥及び／又は凍結乾燥することができる。採取されたタバコ細胞培養物若しくは乾燥された採取されたタバコ細胞培養物又はこれらの抽出物は、本発明に従ったタバコ産業製品に組み込むことができる。
一実施形態では、本発明は、分子農業において使用するための植物（例えばタバコ植物）又はその一部分を提供する。適切には、本発明に従って改変された植物若しくはその一部分は、治療物質などのタンパク質、例えば、抗生物質、ウイルス様粒子、ニュートラシューティカルズ、又は低分子の製造において使用することができる。
一実施形態では、本発明は、タンパク質（例えば治療用タンパク質）を生成するための方法であって、配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、若しくは２８で示されるアミノ酸配列、又はこれらの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログ、又は配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、若しくは２８に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を有するＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子、或いは、配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９、若しくは３０で示されるヌクレオチド配列、又は配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９、若しくは３０の機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログ、又は配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９、若しくは３０に対して少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列を含むＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の活性又は発現を調節することによって、前記タンパク質（例えば治療用タンパク質）を生成し得る植物若しくはその一部分を改変するステップ、及び、前記タンパク質（例えば治療用タンパク質）の生成を可能にするために十分な条件下で当該植物を培養するステップを含む方法を提供する。
製品
本発明はまた、本発明に従った植物から得ることができる又は得られる製品も提供する。ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする遺伝子の活性又は発現が改変されている植物から得ることができる又は得られる製品が提供される。
一実施形態では、製品は、本明細書において定義されるＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の活性又は発現を調節する本発明のコンストラクトを含み得る。一実施形態では、製品は、本明細書において定義されるＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の核酸配列を改変する本発明のコンストラクトを含み得る。
本発明はまた、本発明に従ったタバコから得ることができる又は得られる製品も提供する。
一実施形態では、タバコ葉を生産するための本発明のタバコ植物の使用が提供される。
適切には、タバコ葉は、処理などの下流の適用を受け得る。
したがって、一実施形態では、前述の実施形態の使用は、処理済のタバコ葉を提供し得る。適切には、タバコ葉は、乾燥、発酵、低温殺菌、又はこれらの組合せを受け得る。別の実施形態では、タバコ葉はカットされ得る。一部の実施形態では、タバコ葉は、乾燥、発酵、低温殺菌、又はこれらの組合せを受ける前又は後にカットされ得る。
一実施形態では、本発明は、本発明のタバコ植物の収穫葉を提供する。
さらなる実施形態では、収穫葉は、本発明の増殖材料から増殖させたタバコ植物から得ることができる（例えば得られ得る）。
別の実施形態では、本発明の方法又は使用から得ることができる収穫葉が提供される。
適切には、収穫葉は、カットされた収穫葉であり得る。
一部の実施形態では、収穫葉は、生存しているタバコ細胞を含み得る。他の実施形態では、収穫葉は、さらなる処理を受け得る。
処理済のタバコ葉も提供される。
処理済のタバコ葉は、本発明のタバコ植物から得ることができる。適切には、処理済のタバコ葉は、本発明の任意の方法及び／又は使用に従って得られるタバコ植物から得ることができる。
適切には、処理済の葉は、ＮＮＮ、ＮＮＫ、ＮＡＴ、及びＮＡＢから選択される１又は２以上のＴＳＮＡの含有量が低減している場合がある。適切には、ＮＮＮの含有量が低減され得る。好ましくは、ＮＮＫの含有量が低減され得る。適切には、ＮＡＴの含有量が低減され得る。適切には、ＮＡＢの含有量が低減され得る。適切には、ＴＳＮＡ含有量の低減は、本発明に従った改変をされていない同等の製品と比較したものである。
別の実施形態では、処理済のタバコ葉は、本発明に従ったタバコ植物増殖材料から増殖させたタバコ植物から得ることができる（例えば、得られた）。
本発明の処理済のタバコ葉は、本発明の収穫葉を処理することによって得ることができる（例えば、得られた）。
本明細書において使用される用語「処理済のタバコ葉」は、当技術分野においてタバコが受ける１又は２以上の処理ステップを受けているタバコ葉を指す。「処理済のタバコ葉」は、生存細胞を含まないか又は実質的に含まない。
用語「生存細胞」は、増殖することができる及び／又は代謝的に活性な細胞を指す。したがって、細胞が生存していないと言われる場合、「非生存」とも呼ばれるが、細胞は生存細胞の特徴を示さない。
用語「生存細胞が実質的にない」は、全細胞の約５％未満が生存していることを意味する。好ましくは、全細胞の約３％未満、さらに好ましくは約１％未満、またさらに好ましくは約０．１％未満が生存している。
一実施形態では、処理済のタバコ葉は、乾燥、発酵、及び／又は低温殺菌の１又は２以上によって処理され得る。
適切には、処理済のタバコ葉は、乾燥によって処理され得る。
タバコ葉は、当技術分野において公知のあらゆる方法によって乾燥され得る。一実施形態では、タバコ葉は、空気乾燥、火力乾燥、熱気送管乾燥、及び日光乾燥からなる群から選択される乾燥方法の１又は２以上によって乾燥され得る。
適切には、タバコ葉は、空気乾燥され得る。
典型的には、空気乾燥は、良く通気された納屋にタバコ葉を吊るし、乾燥させることによって行われる。これは通常、４～８週間の期間にわたり行われる。空気乾燥は、バーレータバコに特に適している。
適切には、タバコ葉は、火力乾燥され得る。火力乾燥は、タバコ葉を大きな納屋に吊るし、ここで堅木を連続的な又は断続的な弱い燻煙で燃やし続けることによって典型的には行われ、通常は、処理及びタバコに応じて、３日間～１０週間かかる。
別の実施形態では、タバコ葉は、熱気送管乾燥され得る。熱気送管乾燥は、タバコ葉をタバコスティックに巻き付けること、及びこれを乾燥用納屋内の階段状のポールから吊るすことを含み得る。納屋は通常、外部で燃料を供給される火室から続いている、送気管を有する。典型的には、これによって、煙に曝露させることなく熱乾燥タバコが得られる。通常、温度は乾燥の過程でゆっくりと上昇し、処理全体はおよそ１週間かかる。
適切には、タバコ葉は、日光乾燥され得る。この方法は、典型的には、被覆されていないタバコを日光に曝露させることを伴う。
適切には、処理済のタバコ葉は、発酵によって処理され得る。
発酵は、当技術分野において公知の任意の様式で行うことができる。典型的には、発酵の間、タバコ葉は積み重ねられて、水分を保持するために例えばバーラップで被覆されている、乾燥タバコの山（バルク）にされる。葉の内部の残留水分とタバコの重量との組合せによって自然熱が生じ、これがタバコを円熟させる。バルクの中心の温度を、１日に１回モニタリングする。一部の方法においては、毎週、バルク全体を開く。次いで葉を取り出して振とうし、湿らせ、そしてバルクを回転させて、バルクの内側の葉と外側の葉を入れ替え、底の葉を上部にもってくる。これによって、バルク全体での均等な発酵が確実に行われる。葉の上のさらなる水分と、葉自体の実際の回転とによって熱が生じ、タバコの天然アンモニアが放出され、ニコチンが低減し、その一方でまた、色が濃くなり、タバコの香りが向上する。典型的には、発酵処理は、タバコの種、葉における葉柄の位置、厚さ、及び葉の目的の使用に応じて、最長６カ月間継続する。
適切には、処理済のタバコ葉は、低温殺菌によって処理され得る。低温殺菌は、無煙タバコ産業製品、最も好ましくはスヌースを作製するためにタバコ葉を使用する場合に、特に好ましい場合がある。
タバコ葉の低温殺菌は、当技術分野において公知のあらゆる方法によって行うことができる。例えば、低温殺菌は、その教示が参照によって本明細書に組み込まれる、J Foulds, L Ramstrom, M Burke, K Fagerstrom. Effect of smokeless tobacco (snus) on smoking and public health in Sweden Tobacco Control (2003) 12: 349-359において詳述されているように行うことができる。
スヌースの生成の際に、低温殺菌は、タバコを蒸気で２４～３６時間熱処理する（およそ１００℃の温度に達する）処理によって典型的には行われる。これによって、ほとんど無菌の製品が得られ、理論に拘束されることは望まないが、この結果の１つは、さらなるＴＳＮＡ形成を制限するものであると考えられる。
一実施形態では、低温殺菌は、蒸気低温殺菌であり得る。
一部の実施形態では、処理済のタバコ葉はカットされ得る。処理済のタバコ葉は、処理の前又は後にカットされ得る。適切には、処理済のタバコ葉は、処理の後にカットされ得る。
一実施形態では、前述の実施形態の使用は、再構成タバコを提供し得る。
一実施形態では、再構成タバコが提供される。
本明細書において使用される「再構成」は、再利用又は均質化されたシートタバコであるリーコン（recon）とも呼ばれ得、処理後に残ったタバコ葉から生成されるタバコ材料を指す。再構成タバコによって、一貫した、質の高いブレンドの生成が可能となり、個々の構成成分の比率の調整が可能となる。
再構成タバコは、ナノファイバーリーコン（ナノファイバーは固体若又は液体形態で抽出され得る）、紙製リーコン（これは、茎、小片、及び中央脈などを原材料として使用する）、又はスラリータイプリーコン（これは、微紛と、粉に粉砕し水及び植物性結合剤と混合したタバコの茎との混合物を使用し、可溶性残渣が、水を抽出することによってシート状に形成される）であり得る。
当技術分野において公知のあらゆる方法を、再構成タバコを作製するために使用することができ、例えば、CORESTA Congress, Sapporo, 2012, Smoke Science/Product Technology Groups, SSPT 12（参照によって本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
一部の実施形態では、タバコ植物、タバコ植物の収穫葉、及び／又は処理済のタバコ葉は、ニコチンを抽出するために使用することができる。ニコチンの抽出は、当技術分野において公知のあらゆる方法を使用して行うことができる。例えば、タバコからニコチンを抽出するための方法は、参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第２，１６２，７３８号明細書において教示されている。
一態様において、本発明は、本発明に従ったタバコ植物若しくはその一部分から作製された乾燥タバコ材料を提供する。
適切には、乾燥タバコは、ＮＮＫ、ＮＮＮ、ＮＡＴ、及びＮＡＢから選択される１又は２以上のＴＳＮＡの含有量が低減している場合がある。適切には、ＮＮＮの含有量が低減され得る。好ましくは、ＮＮＫの含有量が低減され得る。適切には、ＮＡＴの含有量が低減され得る。適切には、ＮＡＢの含有量が低減され得る。適切には、ＴＳＮＡ含有量の低減は、本発明に従った改変をされていない同等の製品と比較したものである。
別の態様において、本発明は、本発明に従ったタバコ植物若しくはその一部分から又は本発明に従ったタバコ細胞培養物から作製されたタバコ材料を含むタバコブレンドを提供する。一態様において、本発明は、本発明に従った乾燥タバコ材料を含むタバコブレンドを提供する。
適切には、本発明に従ったタバコブレンドは、およそ１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％の、本発明に従ったタバコ植物若しくはその一部分又は本発明に従ったタバコ細胞培養物に由来するタバコを含み得る。適切には、タバコブレンドは、およそ１０％の、本発明に従ったタバコ植物若しくはその一部分又は本発明に従ったタバコ細胞培養物に由来するタバコを含み得る。適切には、タバコブレンドは、およそ２０％の、本発明に従ったタバコ植物若しくはその一部分又は本発明に従ったタバコ細胞培養物に由来するタバコを含み得る。適切には、タバコブレンドは、およそ３０％の、本発明に従ったタバコ植物若しくはその一部分又は本発明に従ったタバコ細胞培養物に由来するタバコを含み得る。適切には、タバコブレンドは、およそ４０％の、本発明に従ったタバコ植物若しくはその一部分又は本発明に従ったタバコ細胞培養物に由来するタバコを含み得る。適切には、タバコブレンドは、およそ５０％の、本発明に従ったタバコ植物若しくはその一部分又は本発明に従ったタバコ細胞培養物に由来するタバコを含み得る。適切には、タバコブレンドは、およそ６０％の、本発明に従ったタバコ植物若しくはその一部分又は本発明に従ったタバコ細胞培養物に由来するタバコを含み得る。適切には、タバコブレンドは、およそ７０％の、本発明に従ったタバコ植物若しくはその一部分又は本発明に従ったタバコ細胞培養物に由来するタバコを含み得る。適切には、タバコブレンドは、およそ８０％の、本発明に従ったタバコ植物若しくはその一部分又は本発明に従ったタバコ細胞培養物に由来するタバコを含み得る。適切には、タバコブレンドは、およそ９０％の、本発明に従ったタバコ植物若しくはその一部分又は本発明に従ったタバコ細胞培養物に由来するタバコを含み得る。
一態様において、本発明のタバコブレンド製品は、少なくとも約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０，又は９５乾燥重量パーセントの、本発明に従ったタバコ植物若しくはその一部分から又は本発明に従ったタバコ細胞培養物から乾燥タバコを含む。
適切には、乾燥タバコ材料は、空気乾燥され得る。適切には、乾燥タバコ材料は、熱気送管乾燥され得る。適切には、乾燥タバコ材料は、日光乾燥され得る。適切には、乾燥タバコ材料は、火力乾燥され得る。
本発明に従ったタバコ産業製品又は喫煙用品は、本発明に従ったタバコ材料（例えば、乾燥タバコ材料又は再構成タバコ材料）を含み得る。
別の態様において、本発明は、タバコ産業製品を提供する。
一実施形態では、本発明に従ったタバコ産業製品は、ブレンドタバコ産業製品であり得る。適切には、タバコブレンドは、本発明に従った乾燥タバコ材料を含み得る。
一実施形態では、タバコ産業製品は、本発明のタバコ植物若しくはその一部分から調製することができる。
適切には、タバコ植物若しくはその一部分は、本発明に従ったタバコ植物増殖材料から増殖させることができる。
本明細書において使用される用語「その一部分」は、タバコ植物の文脈において、タバコ植物の一部を指す。適切には、「その一部分」は、タバコ植物の葉、根、若しくは茎、又は花であり得る。適切には、「その一部分」は、タバコ植物の葉、根、又は茎であり得る。
送達システム
本明細書において使用される場合、用語「送達システム」は、少なくとも１つの物質をユーザーに送達するシステムを包含するものであり、これとしては、
紙巻タバコ、シガリロ、葉巻タバコ、及びパイプ用又は手巻き紙巻タバコ用又は手作り紙巻タバコ用のタバコなどの、可燃性エアロゾル供給システム（タバコ、タバコ派生物、膨張型タバコ、再構成タバコ、タバコ代替物、又は他の喫煙可能材料に基づくかにかかわらず）、
電子紙巻タバコ、タバコ加熱製品、及びエアロゾル生成材料の組合せを使用してエアロゾルを生成させるためのハイブリッドシステムなどの、エアロゾル生成材料を燃焼させることなくエアロゾル生成材料から化合物を放出する非可燃性エアロゾル供給システム、並びに
限定はしないが、薬用キャンディー剤、ガム、パッチ、吸入可能な粉末を含む用品、及びスヌース又はモイストスナッフを含む経口タバコなどの経口製品を含む、エアロゾルを形成することなく、ニコチンを含んでいてもいなくてもよい少なくとも１つの物質をユーザーに経口的に、経鼻的に、経皮的に、又は別の方法で送達する、エアロゾルフリーの送達システム
が含まれる。
本開示に従うと、「可燃性」エアロゾル供給システムは、ユーザーへの少なくとも１つの物質の送達を促進するために、使用の際にエアロゾル供給システムの構成要素であるエアロゾル生成材料（又はその構成成分）が燃焼する又は燃えるシステムである。
一部の実施形態では、送達システムは、紙巻タバコ、シガリロ、及び葉巻タバコからなる群から選択されるシステムなどの、可燃性エアロゾル供給システムである。
一部の実施形態では、本開示は、フィルター、フィルターロッド、フィルターセグメント、タバコロッド、付け木、エアロゾル変性剤放出部品、例えばカプセル、糸、若しくはビーズ、又は紙、例えば、プラグラップ、チップペーパー、若しくは紙巻タバコ用の紙などの、可燃性エアロゾル供給システムで使用するための部品に関する。
本開示に従うと、「非可燃性」エアロゾル供給システムは、ユーザーへの少なくとも１つの物質の送達を促進するために、エアロゾル供給システムの構成要素であるエアロゾル生成材料（又はその構成成分）が燃焼も燃えもしないシステムである。
一部の実施形態では、送達システムは、動力付きの非可燃性エアロゾル供給システムなどの、非可燃性エアロゾル供給システムである。
一部の実施形態では、非可燃性エアロゾル供給システムは、ベイピングデバイス又は電子ニコチン送達システム（ＥＮＤ、electronic nicotine delivery system）としても知られている電子紙巻タバコであるが、エアロゾル生成材料中のニコチンの存在は必須ではないことに留意されたい。
一部の実施形態では、非可燃性エアロゾル供給システムは、加熱式システムとしても知られているエアロゾル生成材料加熱システムである。このようなシステムの例は、タバコ加熱システムである。
一部の実施形態では、非可燃性エアロゾル供給システムは、その１又は複数が加熱され得るエアロゾル生成材料の組合せを使用する、エアロゾルを生成させるためのハイブリッドシステムである。エアロゾル生成材料の各々は、例えば固体、液体、又はゲルの形態であり得、ニコチンを含有していてもしていなくてもよい。一部の実施形態では、ハイブリッドシステムは、液体又はゲル状のエアロゾル生成材料及び固体のエアロゾル生成材料を含む。固体のエアロゾル生成材料は、例えばタバコ製品又は非タバコ製品を含み得る。
典型的には、非可燃性エアロゾル供給システムは、非可燃性エアロゾル供給デバイス、及び非可燃性エアロゾル供給デバイスと共に使用するための消耗品を含み得る。
一部の実施形態では、本開示は、エアロゾル生成材料を含み、非可燃性エアロゾル供給デバイスと共に使用するように構成された、消耗品に関する。これらの消耗品は、本開示の全体を通して、用品と呼ばれることもある。
一部の実施形態では、非可燃性エアロゾル供給システム、例えば、その非可燃性エアロゾル供給デバイスは、動力源及びコントローラーを含み得る。動力源は、例えば電力源又は発熱動力源であり得る。一部の実施形態では、発熱動力源は、エネルギーを受けて熱形態の動力を発熱動力源の近傍にあるエアロゾル生成材料又は伝熱材料に分配し得る、炭素基質を含む。
一部の実施形態では、非可燃性エアロゾル供給システムは、消耗品を入れるための区域、エアロゾル生成器、エアロゾル生成区域、格納箱、マウスピース、フィルター、及び／又はエアロゾル変性剤を含み得る。
一部の実施形態では、非可燃性エアロゾル供給デバイスと共に使用するための消耗品は、エアロゾル生成材料、エアロゾル生成材料保存区域、エアロゾル生成材料移送部品、エアロゾル生成器、エアロゾル生成区域、格納箱、上包み、フィルター、マウスピース，及び／又はエアロゾル変性剤を含み得る。
適切には、送達システムは、本発明に従ったタバコ植物若しくはその一部分から調製することができる（例えば、これを含み得る）。
適切には、送達システムは、本発明に従ったタバコ細胞培養物から調製することができる。
適切には、送達システムは、本発明に従ったタバコ植物増殖材料から増殖させたタバコ植物若しくはその一部分からから調製することができる（例えば、これを含み得る）。
適切には、送達システムは、本発明に従ったタバコ植物の収穫葉から調製することができる（例えば、これを含み得る）。
適切には、送達システムは、本発明に従った処理済のタバコ葉から調製することができる（例えば、これを含み得る）。
適切には、送達システムは、本発明に従った乾燥タバコ材料から調製することができる（例えば、これを含み得る）。
適切には、送達システムは、本発明に従ったタバコブレンドから調製することができる（例えば、これを含み得る）。
一実施形態では、送達システムは、紙巻タバコ、シガリロ、及び葉巻タバコからなる群から選択される可燃性喫煙用品である。
一実施形態では、送達システムは、フィルター、フィルターロッド、フィルターロッドセグメント、タバコ、タバコロッド、タバコロッドセグメント、付け木、添加物放出部品、例えばカプセル、糸、ビーズ、紙、例えば、プラグラップ、チップペーパー、又は紙巻タバコ用の紙などの、可燃性喫煙用品の１又は２以上の部品を含む。
一実施形態では、送達システムは、非可燃性エアロゾル供給システムである。
一実施形態では、送達システムは、ヒーター及びエアロゾル化可能な基質などの、非可燃性エアロゾル供給システムの１又は２以上の部品を含む。
一実施形態では、エアロゾル供給システムは、ベイピングデバイスとしても知られている電子紙巻タバコである。
一実施形態では、電子紙巻タバコは、ヒーター、動力をヒーターに供給し得る動力供給源、液体又はゲルなどのエアロゾル化可能な基質、格納箱を含み、マウスピースを含んでいてもよい。
一実施形態では、エアロゾル化可能な基質は、基質容器に入っている。一実施形態では、基質容器は、ヒーターと組み合わされているか又はヒーターを含む。
一実施形態では、送達システムは、基質材料を燃やすことなく加熱することによって１又は２以上の化合物を放出する、加熱製品である。基質材料は、例えば、ニコチンを含有していてもしていなくてもよいタバコ又は他の非送達システムであり得る、エアロゾル化可能な材料である。一実施形態では、加熱製品は、タバコ加熱製品である。
一実施形態では、加熱製品は電子デバイスである。
一実施形態では、タバコ加熱製品は、ヒーター、動力をヒーターに供給し得る動力供給源、固体又はゲル状の材料などのエアロゾル化可能な基質を含む。
一実施形態では、加熱製品は非電子用品である。
一実施形態では、加熱製品は、固体又はゲル状の材料などのエアロゾル化可能な基質、及び、木炭などの燃焼材料を例えば燃やすことによって、いかなる電子的手段も用いずに熱エネルギーをエアロゾル化可能な基質に供給し得る熱源を含む。
一実施形態では、加熱製品はまた、エアロゾル化可能な基質を加熱することによって生じるエアロゾルを濾過し得るフィルターも含む。
一部の実施形態では、エアロゾル化可能な基質材料は、ベイパー若しくはエアロゾル生成剤、又はグリセロール、プロピレングリコール、トリアセチン、若しくはジエチレングリコールなどの保湿剤を含み得る。
一実施形態では、送達システムは、基質材料の組合せを燃やすことなく加熱することによってエアロゾルを生成させるためのハイブリッドシステムである。基質材料は、例えば、ニコチンを含有していてもしていなくてもよい固体、液体、又はゲルを含み得る。一実施形態では、ハイブリッドシステムは、液体又はゲル状の基質及び固体基質を含む。固体基質は、例えば、ニコチンを含有していてもしていなくてもよいタバコ又は他の非送達システムであり得る。一実施形態では、ハイブリッドシステムは、液体又はゲル状の基質及びタバコを含む。
別の実施形態では、製品は、植物（例えばタバコ植物）において発現した際に、少なくとも１つのＲＮＡ結合性ドメイン含有タンパク質の活性又は発現を調節し、これによってアルカロイド含有量を低下させる、本発明のコンストラクトを含み得る。
タバコ産業製品
本明細書において使用される場合、用語「タバコ産業製品」は、紙巻タバコ、シガリロ、葉巻タバコ、パイプ用又は手巻き紙巻タバコ用のタバコ（タバコ、タバコ派生物、膨張型タバコ、再構成タバコ、タバコ代替物、又は他の喫煙可能な材料に基づくかにかかわらず）などの可燃性喫煙用品、電子紙巻タバコ、タバコ加熱製品、及び基質材料の組合せからエアロゾルを生成させるためのハイブリッドシステム、例えば、液体又はゲル状又は固体の基質を含有するハイブリッドシステムなどの、燃焼を伴わずに基質材料から化合物を放出させる加熱製品などの、非可燃性エアロゾル供給システムと、これらのエアロゾル供給システムと共に使用されるエアロゾル化可能な基質材料；並びに、薬用キャンディー剤、ガム、パッチ、呼吸可能な粉末を含む用品、並びにスヌース及びスナッフなどの無煙タバコ産業製品などの、ニコチンを送達してもしなくてもよいエアロゾルフリーの送達用品を含むものである。
一実施形態では、タバコ産業製品は、本発明のタバコ植物若しくはその一部分から調製することができる（例えば、これを含み得る）。
適切には、タバコ植物若しくはその一部分は、本発明に従ったタバコ植物増殖材料から増殖させることができる。
本明細書において使用される用語「その一部分」は、タバコ植物の文脈において、タバコ植物の一部を指す。好ましくは、「その一部分」は、タバコ植物の葉である。
別の実施形態では、タバコ産業製品は、本発明の収穫葉から調製することができる。
さらなる実施形態では、タバコ産業製品は、本発明の処理済のタバコ葉から調製することができる。
適切には、タバコ産業製品は、乾燥、発酵、及び／又は低温殺菌の１又は２以上によって処理されたタバコ葉から調製することができる。
適切には、タバコ産業製品は、前述の実施形態の通りに処理されていてもよい、カットされたタバコ葉を含み得る。
別の実施形態では、タバコ産業製品は、本発明に従ったタバコ細胞培養物から調製することができる。
別の実施形態では、タバコ産業製品は、本発明に従った乾燥タバコ材料から調製することができる（例えば、これを含み得る）。
別の実施形態では、タバコ産業製品は、本発明に従ったタバコブレンドから調製することができる（例えば、これを含み得る）。
一実施形態では、タバコ産業製品は、喫煙用品であり得る。
本明細書において使用される場合、用語「喫煙用品」としては、タバコ、タバコ派生物、膨張型タバコ、再構成タバコ、又はタバコ代替物に基づくかにかかわらず、巻きタバコ、紙巻タバコ、葉巻、及びシガリロなどの喫煙可能製品が含まれ得る。
別の実施形態では、タバコ産業製品は、無煙タバコ産業製品であり得る。
本明細書において使用される用語「無煙タバコ産業製品」は、煙を出さない及び／又は燃焼されないようにしたタバコ産業製品を指す。
無煙タバコ産業製品（加熱式材料を含む）は、薄片、フィルム、タブ、発泡体、又はビーズなどの任意の形態の他の成分上に載せられた、それらに混合された、それらによって囲まれた、又はそれらと組み合わされた、乾燥粒子、細片、顆粒、粉末、又はスラリーを含む、任意の形態のタバコを含有し得る。
一実施形態では、無煙タバコ産業製品としては、スヌース、スナッフ、噛みタバコ、又はそれに類するものが含まれ得る。
一実施形態では、タバコ産業製品は、紙巻タバコ、シガリロ、及び葉巻タバコからなる群から選択される可燃性喫煙用品である。
一実施形態では、タバコ産業製品は、フィルター、フィルターロッド、フィルターロッドセグメント、タバコ、タバコロッド、タバコロッドセグメント、付け木、添加物放出部品、例えばカプセル、糸、ビーズ、ペーパー、例えばプラグラップ、チップペーパー、又は紙巻タバコ用の紙などの、可燃性喫煙用品の１又は２以上の部品を含む。
一実施形態では、タバコ産業製品は、非可燃性エアロゾル供給システムである。
一実施形態では、タバコ産業製品は、ヒーター及びエアロゾル化可能な基質などの、非可燃性エアロゾル供給システムの１又は２以上の部品を含む。
一実施形態では、エアロゾル供給システムは、ベイピングデバイスとしても知られている電子紙巻タバコである。
一実施形態では、電子紙巻タバコは、ヒーター、動力をヒーターに供給し得る動力供給源、液体又はゲルなどのエアロゾル化可能な基質、格納箱を含み、マウスピースを含んでいてもよい。
一実施形態では、エアロゾル化可能な基質は、基質容器に入っている。一実施形態では、基質容器は、ヒーターと組み合わされているか又はヒーターを含む。
一実施形態では、タバコ産業製品は、基質材料を燃やすことなく加熱することによって１又は２以上の化合物を放出する、加熱製品である。基質材料は、例えば、ニコチンを含有していてもしていなくてもよいタバコ又は他の非タバコ製品であり得る、エアロゾル化可能な材料である。一実施形態では、加熱製品は、タバコ加熱製品である。
一実施形態では、加熱製品は電子デバイスである。
一実施形態では、タバコ加熱製品は、ヒーター、動力をヒーターに供給し得る動力供給源、固体又はゲル状材料などのエアロゾル化可能な基質を含む。
一実施形態では、加熱製品は非電子用品である。
一実施形態では、加熱製品は、固体又はゲル状の材料などのエアロゾル化可能な基質、及び、木炭などの燃焼材料を例えば燃やすことによっていかなる電子的手段も用いずに熱エネルギーをエアロゾル化可能な基質に供給し得る熱源を含む。
一実施形態では、加熱製品はまた、エアロゾル化可能な基質を加熱することによって生じるエアロゾルを濾過し得るフィルターを含む。
一部の実施形態では、エアロゾル化可能な基質材料は、ベイパー若しくはエアロゾル生成剤、又はグリセロール、プロピレングリコール、トリアセチン、若しくはジエチレングリコールなどの保湿剤を含み得る。
一実施形態では、タバコ産業製品は、基質材料の組合せを燃やすことなく加熱することによってエアロゾルを生成させるためのハイブリッドシステムである。基質材料は、例えば、ニコチンを含有していてもしていなくてもよい固体、液体、又はゲルを含み得る。一実施形態では、ハイブリッドシステムは、液体又はゲル状の基質及び固体基質を含む。固体基質は、例えば、ニコチンを含有していてもしていなくてもよいタバコ又は他の非タバコ製品であり得る。一実施形態では、ハイブリッドシステムは、液体又はゲル状の基質及びタバコを含む。
さらなる実施形態では、タバコ産業製品は、タバコ加熱デバイス又はハイブリッドデバイス又は電子紙巻タバコ又はそれに類するものであり得る。
典型的には、タバコ加熱デバイス又はハイブリッドデバイスにおいて、エアロゾルは、熱源から、熱源の中、周り、又は下流に位置し得る物理的に離れたエアロゾル形成基質又は材料への熱の伝導によって生じる。喫煙の間、熱源からの熱伝導によって揮発性化合物がエアロゾル形成基質から放出され、喫煙用品を介して吸い込まれた空気と共に運ばれる。放出された化合物が冷却されるにつれ、これら化合物は凝縮してエアロゾルを形成し、これがユーザーによって吸入される。
タバコ加熱デバイスを消費又は喫煙するためのエアロゾル生成用品及びデバイスは、当技術分野において公知である。これらとしては、例えば、電気的に加熱されるエアロゾル生成デバイスが含まれ得、この場合、エアロゾル生成デバイスの１又は２以上の電気的加熱体からタバコ加熱デバイスのエアロゾル形成基質への熱の伝導によって、エアロゾルが生成される。
適切には、タバコ加熱デバイスは、エアロゾル生成デバイスであり得る。
好ましくは、タバコ加熱デバイスは、加熱式デバイスであり得る。加熱式デバイスは当技術分野において公知であり、タバコを燃やすことなく加熱することによって化合物を放出する。
適切な加熱式デバイスの例は、参照によって本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１３／０３４４５９号パンフレット又は英国特許第２５１５５０２号明細書において教示されているものであり得る。
一実施形態では、タバコ加熱デバイスのエアロゾル形成基質は、本発明に従ったタバコ産業製品であり得る。
一実施形態では、タバコ加熱デバイスは、ハイブリッドデバイスであり得る。
ポリヌクレオチド／ポリペプチド／コンストラクト
本発明の特定の実施形態では、本明細書において記載されるＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの（at least）遺伝子の活性又は発現を調節するコンストラクトが、適切にはプロモーターの指示下で植物細胞に形質転換され得る。
本発明の特定の実施形態では、本明細書において記載されるＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の活性又は発現を低下させる（すなわち阻害する）コンストラクトが、プロモーターの指示下で植物細胞に形質転換され得る。例えば、遺伝子コンストラクトは、遺伝子編集コンストラクトであり得るか、又は低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ、small interfering RNA）分子若しくは短鎖ヘアピンループ（ｓｈＲＮＡ）分子を含み得るＲＮＡｉ分子を含み得る。
本発明の特定の実施形態では、本明細書において記載されるＲＮＡ結合性タンパク質をコードする遺伝子の活性又は発現を増大させるコンストラクト、例えば、内因性ＲＮＡ結合性タンパク質などのＲＮＡ結合性タンパク質をコードする遺伝子をコードするコンストラクトを植物細胞中に、適切には、プロモーターの指示下に形質転換できる。
コンストラクトは、適切なベクター、例えば植物形質転換ベクターによって、本発明に従った植物に導入することができる。植物形質転換ベクターは、転写方向で５’～３’を含む発現カセット、プロモーター配列、本明細書において記載されるＲＮＡ結合性タンパク質をコードする遺伝子を標的化するコンストラクト配列を含み得、ＲＮＡポリメラーゼの終止シグナル及びポリアデニラーゼのためのポリアデニル化シグナルを含む３’未翻訳ターミネーター配列を含んでいてもよい。プロモーター配列は、１又は２以上のコピー内に存在し得、このようなコピーは、上記のようなプロモーター配列と同一であるか又はそのバリアントであり得る。ターミネーター配列は、植物、細菌、又はウイルスの遺伝子から得ることができる。適切なターミネーター配列は、例えば、エンドウｒｂｃＳ Ｅ９ターミネーター配列、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のノパリン合成酵素遺伝子に由来するｎｏｓターミネーター配列、及びカリフラワーモザイクウイルスに由来する３５Ｓターミネーター配列である。当業者には、他の適切なターミネーター配列が容易に認識されよう。
本発明のコンストラクトはまた、プロモーターの強度を増大させるための遺伝子発現増強メカニズムを含み得る。このようなエンハンサーエレメントの例は、参照によって本明細書に組み込まれる、国際特許出願の国際公開第９７／２００５６号パンフレットの主題である、エンドウプラストシアニン遺伝子のプロモーターの一部に由来するものである。適切なエンハンサーエレメントは、例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのノパリン合成酵素遺伝子に由来するｎｏｓエンハンサーエレメント、及びカリフラワーモザイクウイルスに由来する３５Ｓエンハンサーエレメントであり得る。
これらの調節領域は、プロモーターＤＮＡ配列と同一の遺伝子に由来し得るか、或いは、ニコチアナ・タバカム又は他の生物、例えばナス科植物若しくはヤコウカ亜科（Cestroideae）由来の、異なる遺伝子に由来し得る。すべての調節領域は、形質転換対象の組織の細胞において操作可能であるべきである。
プロモーターＤＮＡ配列は、所望の遺伝子、例えば、プロモーターが指示しようとしている遺伝子、例えば、本発明に従ったＲＮＡ結合性タンパク質をコードする遺伝子、本発明において使用されるコード配列と同一の遺伝子に由来し得るか、或いは、ニコチアナ・タバカム又は別の生物、例えばナス科植物若しくはヤコウカ亜科由来の、異なる遺伝子に由来し得る。
発現カセットは、ｐＢＩＮ １９ Ｐｌｕｓ、ｐＢＩ １０１、ｐＫＹＬＸ７１：３５Ｓ２、ｐＣＡＭＢＩＡ２３００などの基本的な植物形質転換ベクター、又は当技術分野において公知の他の適切な植物形質転換ベクターに組み込むことができる。このような配列が形質転換処理に必要であるため、植物形質転換ベクターは、発現カセットに加えて、このような配列を含有することになる。これら配列としては、アグロバクテリウムｖｉｒ遺伝子、１又は２以上のＴ－ＤＮＡ境界配列、及び選択可能マーカー、又はトランスジェニック植物細胞を同定する他の手段が含まれ得る。
用語「発現ベクター又は植物形質転換ベクター」は、インビボ又はインビトロでの発現が可能なコンストラクトを意味する。好ましくは、発現ベクターは、生物のゲノムに組み込まれている。一実施形態では、本発明のベクターは、タンパク質、例えば、本明細書において記載されるＲＮＡ結合性タンパク質を発現する。用語「組み込まれる」は、好ましくは、ゲノム内への安定な組み込みを網羅する。
植物を形質転換するための技術は当技術分野において周知であり、これとしては、例えばアグロバクテリウム媒介性の形質転換が含まれる。遺伝子改変された植物のコンストラクションにおける基本的な原理は、植物ゲノムに遺伝情報を挿入して、挿入された遺伝物質の安定な維持を得ることである。一般的な技術の概要は、参照によって本明細書に組み込まれる、Potrykus（Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:205-225）及びChriston（AgroFood-Industry Hi-Tech March/April1994 17-27）による記事において見ることができる。
典型的には、アグロバクテリウム媒介性の形質転換において、所望の外来ＤＮＡ、すなわち本発明に従ったコンストラクトを有するバイナリーベクターが、アグロバクテリウムと標的植物由来の外植片とを共培養することによって、適切なアグロバクテリウム株から標的植物に移入される。形質転換植物の組織は次いで、選択可能マーカー及び植物成長ホルモンを含んでいる選択培地で再生される。代替方法は、インタクトな植物の花芽を、キメラ遺伝子を含有するアグロバクテリウム株の懸濁液と接触させ、そして、種ができた後、形質転換された個体を発芽させ、選択培地での成長によって同定する、フローラルディップ法（参照によって本明細書に組み込まれる、Clough & Bent, 1998 Plant J. 1998 Dec;16(6):735-43）である。アグロバクテリウムによる植物組織の直接感染は広く利用されている単純な技術であり、これは、参照によって本明細書に組み込まれる、Butcher et al. (1980) Tissue Culture Methods for Plant Pathologists, eds.: D. S. Ingrams and J.P. Helgeson, 203-208において記載されている。
さらなる適切な形質転換方法としては、例えば、ポリエチレングリコール又はエレクトロポレーション技術、パーティクルガン、マイクロインジェクション、及び炭化ケイ素ファイバーの使用を使用する、プロトプラストへの直接的な遺伝子移入が含まれる。バリスティック形質転換を使用する植物の形質転換、及び炭化ケイ素ウィスカー媒介性の形質転換による繁殖力のあるトランスジェニックトウモロコシ植物の生成が、参照によって本明細書に組み込まれる、Frame et al. (1994) The Plant Journal 6(6): 941-948において教示されており、また、ウイルス形質転換技術が、例えば、参照によって本明細書に組み込まれる、Meyer et al. (1992) Mol. Gen. Genet. 231(3): 345-352において教示されている。植物のためのベクターシステムとしてのキャッサバモザイクウイルスの使用が、参照によって本明細書に組み込まれる、Meyer et al. (1992) Gene 110: 213-217において教示されている。植物の形質転換についてのさらなる教示は、参照によって本明細書に組み込まれる、欧州特許出願公開第０４４９３７５号公報で見ることができる。
さらなる態様において、本発明は、コンストラクトを有し、植物などの生物、適切にはタバコ植物のゲノムにこれを導入する、ベクターシステムに関する。ベクターシステムは１つのベクターを含み得るが、２つのベクターを含んでいてもよい。２つのベクターのケースでは、ベクターシステムは、バイナリーベクターシステムと通常呼ばれる。バイナリーベクターシステムは、参照によって本明細書に組み込まれる、Gynheung et al. (1980) Binary Vectors, Plant Molecular Biology Manual A3, 1-19において、より詳細に記載されている。
１つの広く利用されている植物細胞形質転換システムは、参照によって本明細書に組み込まれる、An et al. (1986) Plant Physiol. 81, 301-305、及びButcher et al. (1980) Tissue Culture Methods for Plant Pathologists eds.: D. S. Ingrams and J.P. Helgeson, 203-208によって記載されている、アグロバクテリウム・ツメファシエンス由来のＴｉプラスミド又はアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）由来のＲｉプラスミドを使用する。植物における本発明に従った所望の外因性遺伝子の各導入方法の後に、さらなるＤＮＡ配列の存在及び／又は挿入が必要であり得る。植物細胞の形質転換のためのＴ－ＤＮＡの使用は集中的に研究されており、すべて参照によって本明細書に組み込まれる、欧州特許出願公開第１２０５１６号公報、Hoekema (1985) The Binary Plant Vector System, Offset-drukkerij Kanters B. B., Amsterdam Chapter V、Fraley et al. Crit. Rev. Plant Sci. 4:1-46、及びAn et al. (1985) EMBO J 4: 277-284において記載されている。
ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の活性又は発現を調節するコンストラクトを形質転換された植物細胞は、周知の組織培養方法に従って、例えば、アミノ酸、植物ホルモン、ビタミンなどの必須の増殖因子を添加した適切な培養培地において細胞を培養することによって、増殖させ、維持することができる。
本発明に関連する用語「トランスジェニック植物」としては、本発明に従ったＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の活性又は発現を調節するコンストラクトを含むあらゆる植物が含まれる。したがって、トランスジェニック植物は、本発明に従ったコンストラクトを形質転換されている植物である。好ましくは、トランスジェニック植物は、本発明に従った、調節された（例えば、低減された）アルカロイド含有量及び／又は調節された（例えば、低減された）ＴＳＮＡ前駆体含有量を示す。用語「トランスジェニック植物」は、その天然の環境にある、すなわち、そのネイティブなプロモーター（これも同様にその天然の環境にある）の制御下にある、ネイティブなヌクレオチドコード配列は意味しない。
一態様において、本発明に従ったＲＮＡ結合性タンパク質をコードする遺伝子、コンストラクト、植物形質転換ベクター、又は植物細胞は、単離された形態である。用語「単離された」は、配列が、当該配列が天然の状態において天然において付随している、及び天然で見られる、少なくとも１つの他の構成成分を、少なくとも実質的に有さないことを意味する。
一態様において、本発明に従ったＲＮＡ結合性タンパク質をコードする遺伝子、コンストラクト、植物形質転換ベクター、又は植物細胞は、精製された形態である。用語「精製された」は、比較的純粋な状態、例えば、少なくとも約９０％の純度、又は少なくとも約９５％の純度、又は少なくとも約９８％の純度であることを意味する。
本明細書において使用される用語「ヌクレオチド配列」は、オリゴヌクレオチド配列又はポリヌクレオチド配列、並びにこれらのバリアント、ホモログ、断片、及び誘導体（その部分など）を指す。ヌクレオチド配列は、ゲノム由来又は合成由来又は組換え由来のものであり得、これらは、二本鎖、又はセンス鎖若しくはアンチセンス鎖のいずれかに相当する一本鎖であり得る。
本発明に関連する用語「ヌクレオチド配列」としては、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、及びＲＮＡが含まれる。好ましくは、ヌクレオチド配列は、本発明をコードするＤＮＡ配列、さらに好ましくはｃＤＮＡ配列を意味する。
好ましい実施形態では、本発明の範囲に関する場合、及びそれ自体が本発明の範囲に包含される場合のヌクレオチド配列、すなわち、本発明によるＲＮＡ結合性タンパク質をコードする遺伝子としては、その天然の環境にある場合、及び天然において付随している配列（これも同様にその天然の環境にある）に連結している場合のネイティブなヌクレオチド配列が含まれる。参照を容易にするために、本発明者らは、この好ましい実施形態を「ネイティブなヌクレオチド配列」と呼ぶ。この点に関して、用語「ネイティブなヌクレオチド配列」は、そのネイティブな環境にあり、及びそれが天然において付随しているプロモーター（当該プロモーターも同様にそのネイティブな環境にある）全体に機能可能に連結している、ヌクレオチド配列全体を意味する。
本発明において使用するためのヌクレオチド配列は、適切な宿主生物によるヌクレオチド配列の発現を提供し得る調節配列にヌクレオチド配列が機能可能に連結しているベクター内に存在し得る。本発明において使用するためのコンストラクトは、本発明のポリペプチドの発現を提供するために、本明細書において記載される適切な宿主細胞に形質転換することができる。ベクター、例えばプラスミド、コスミド、又はファージベクターの選択は、それが導入される宿主細胞に依存することが多い。ベクターは、インビトロで、例えばＲＮＡの生成のために使用することができるか、又は宿主細胞にトランスフェクトする、形質転換する、形質導入する、若しくは感染させるために使用することができる。
一部の適用において、本発明において使用するためのヌクレオチド配列は、例えば選択された宿主細胞によるヌクレオチド配列の発現を提供し得る調節配列に機能可能に連結している。例として、本発明は、このような調節配列に機能可能に連結している、本明細書において記載されるＲＮＡ結合性タンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列を含むベクターを網羅し、すなわち、ベクターは発現ベクターである。
用語「機能可能に連結している」は、記載される構成成分が、それらの目的の様式で機能することを可能にする関係にある、並置を指す。コード配列に「機能可能に連結している」調節配列は、制御配列に適合する条件下でコード配列の発現が行われるように、ライゲーションされている。
用語「調節配列」としては、プロモーター及びエンハンサー並びに他の発現調節シグナルが含まれる。用語「プロモーター」は、当技術分野の通常の意味で使用され、例えばＲＮＡポリメラーゼ結合部位である。ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする遺伝子をコードするコンストラクト内のヌクレオチド配列は、少なくとも１つのプロモーターに機能可能に連結していてよい。
用語「コンストラクト」は、「カセット」又は「ベクター」などの用語と同義であるが、これとしては、プロモーターに直接的に又は間接的に結合した、本発明に従って使用するためのヌクレオチド配列が含まれる。
間接的な結合の例は、プロモーターと本発明のヌクレオチド配列との間にある、Ｓｈ１－イントロン又はＡＤＨイントロンなどのイントロン配列などの適切なスペーサー基の提供である。直接的な又は間接的な結合を含む、本発明に関連する「融合した」という用語でも、同様のことが当てはまる。一部のケースにおいて、この用語は、野生型遺伝子プロモーターと通常結び付いているタンパク質をコードするヌクレオチド配列の天然の組合せ（これらが共に、その天然の環境にある場合）は意味しない。コンストラクトはさらに、マーカーを含有又は発現することもでき、このことによって、遺伝子コンストラクトの選択が可能となる。
一部の実施形態では、プロモーターは、細胞若しくは細胞培養物又はタバコ植物若しくはその一部分におけるニコチンの濃度及び／又は総含有量を調節するために使用されるコンストラクト又はベクター内のヌクレオチド配列に機能可能に連結していてもよい。
一部の実施形態では、プロモーターは、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、発生学的に調節されるプロモーター、及び誘導性プロモーターからなる群から選択され得る。
一実施形態では、プロモーターは、構成的プロモーターであり得る。
構成的プロモーターは、植物の発生の際に連続的に植物の様々な部分の全体を通して遺伝子の発現を指示するが、遺伝子は、すべての細胞タイプで同一のレベルで発現されなくてもよい。公知の構成的プロモーターの例としては、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ転写産物（Odell JT, Nagy F, Chua NH. (1985). Identification of DNA sequences required for activity of the cauliflower mosaic virus 35S promoter. Nature. 313 810-2）、イネアクチン１遺伝子（Zhang W, McElroy D, Wu R. (1991). Analysis of rice Act1 5' region activity in transgenic rice plants. Plant Cell 3 1155-65）、及びトウモロコシユビキチン１遺伝子（Cornejo MJ, Luth D, Blankenship KM, Anderson OD, Blechl AE. (1993). Activity of a maize ubiquitin promoter in transgenic rice. Plant Molec. Biol. 23 567-81）に関連するものが挙げられる。カーネーションエッチドリングウイルス（ＣＥＲＶ、Carnation Etched Ring Virus）プロモーターなどの構成的プロモーター（Hull R, Sadler J, LongstaffM (1986) (CaMV/35S), figwort mosaic virus 35S promoter. The sequence of carnation etched ring virus DNA: comparison with cauliflower mosaic virus and retroviruses. EMBO Journal, 5(2):3083-3090）。
構成的プロモーターは、カーネーションエッチドリングウイルス（ＣＥＲＶ）プロモーター、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ、cauliflower mosaic virus）３５Ｓプロモーター、イネアクチン１遺伝子又はトウモロコシユビキチン１遺伝子に由来するプロモーターから選択され得る。
プロモーターは、組織特異的なプロモーターであり得る。組織特異的なプロモーターは、植物の一部分（又はわずかな部分）における遺伝子の発現を、通常はこれら植物部分の生涯を通して、指示するものである。組織特異的プロモーターのカテゴリーとしては、その特異性が絶対的ではないプロモーターも一般に含まれ、すなわち、これらプロモーターは、好ましい組織以外の組織で、より低いレベルでの発現も指示し得る。組織特異的なプロモーターとしては、ファセオリンプロモーター、レグミンｂ４プロモーター、ｕｓｐプロモーター、ｓｂｐプロモーター、ＳＴ－ＬＳ１プロモーター、Ｂ３３（パタチンクラスＩプロモーター）が含まれる。
別の実施形態では、プロモーターは、発生学的に調節されるプロモーターであり得る。
発生学的に調節されるプロモーターは、植物の発生の間の特定の時点で植物の１又は２以上の部分における遺伝子の発現における変化を指示する。遺伝子は、その植物部分において、他の時点で、異なる（通常はより低い）レベルで発現し得、他の植物部分においても発現し得る。
一実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーターであり得る。
誘導性プロモーターは、誘導因子に応答して遺伝子の発現を指示し得る。誘導因子が非存在であると、遺伝子は発現しない。誘導因子は、プロモーター配列に直接作用し得るか、又はリプレッサー分子の影響に反作用することによって作用し得る。誘導因子は、代謝産物、タンパク質、増殖調節因子（ＯＣＳプロモーターを活性化させるオーキシン及びサリチル酸など）、若しくは毒性要素などの化学物質、熱、光（大豆ＳＳＵプロモーターなど）、傷（例えば、ｎｏｓ、ノパリン合成酵素プロモーター）、若しくは浸透圧などの生理学的ストレス、又は病原体若しくは害虫の作用の間接的な結果であり得る。発生学的に調節されるプロモーターは、植物によって産生される内因性誘導因子又は植物のライフサイクルの特定のポイントでの環境刺激に応答する特定のタイプの誘導性プロモーターとして記載され得る。公知の誘導性プロモーターの例としては、Warner SA、Scott R、Draper J. ((1993) Plant J. 3 191-201)によって記載されるものなどの傷応答に関連するもの、Benfey及びChua (1989) (Benfey, P.N., and Chua, N-H. ((1989) Science 244 174-181)によって開示されている温度応答に関連するもの、並びにGatz ((1995) Methods in Cell Biol. 50 411-424)によって記載されているように化学的に誘発されるものが挙げられる。
本明細書において定義されるＲＮＡ結合性タンパク質をコードする遺伝子としての特異的特性を有するタンパク質又は改変に適したタンパク質のいずれかをコードするヌクレオチド配列は、前記タンパク質を産生する任意の細胞又は生物から同定及び／又は単離及び／又は精製することができる。ヌクレオチド配列を同定及び／又は単離及び／又は精製するための様々な方法が、当技術分野において周知である。例として、適切な配列が同定及び／又は単離及び／又は精製されると、２以上の配列を調製するためのＰＣＲ増幅技術を使用することができる。
またさらなる代替において、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、確立された標準的な方法、例えば、参照によって本明細書に組み込まれる、Beucage et al. (1981) Tetrahedron Letters 22, 1859-1869によって記載されているホスホロアミダイト法、又は参照によって本明細書に組み込まれる、Matthes et al. (1984) EMBO J. 3, 801-805によって記載されている方法によって、合成的に調製することができる。ホスホロアミダイト法において、オリゴヌクレオチドは、例えば自動ＤＮＡ合成機において合成され、精製され、アニーリングされ、ライゲーションされ、そして適切なベクターにクローニングされる。
本明細書において使用される場合、用語「アミノ酸配列」は、用語「ポリペプチド」及び／又は用語「タンパク質」と同義である。一部の場合において、用語「アミノ酸配列」は、用語「ペプチド」と同義である。一部の場合において、用語「アミノ酸配列」は、用語「酵素」と同義である。
本発明はまた、本明細書において定義される具体的な特性を有するポリペプチドのアミノ酸配列又は任意のヌクレオチド配列、すなわち、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする遺伝子と、ある程度の配列同一性又は配列相同性を有する配列（以下、「相同配列」と呼ぶ）の使用も包含する。ここで、用語「ホモログ」は、対象アミノ酸配列及び対象ヌクレオチド配列とある程度の相同性を有する実体を意味する。ここで、用語「相同性」は、「同一性」と同等とみなすことができる。
相同なアミノ酸配列及び／又はヌクレオチド配列及び／又は断片は、ＲＮＡ結合性タンパク質の機能的活性を保持する及び／又は活性を増強させるポリペプチドを提供及び／又はコードするべきである。典型的には、相同配列は、例えば対象アミノ酸配列と同一の活性部位などを含むか、又は同一の活性部位をコードする。相同性は類似性（すなわち、類似の化学的特性／機能を有するアミノ酸残基）の点で考慮され得るが、本発明の文脈において、相同性を配列同一性の点で表すことが好ましい。相同配列は、典型的には、機能的なドメイン又はモチーフを保持する。
一実施形態では、相同配列は、対象配列と比較して１、２、又は複数の付加、欠失、及び／又は置換を有するアミノ酸配列又はヌクレオチド配列を含むものである。
配列同一性
配列同一性の比較は、肉眼によって、又はより一般的には、入手が容易な配列比較プログラムを利用して行うことができる。これらの市販されているコンピュータプログラムは、２又は３以上の配列の間の相同性％を計算することができる。相同性％又は同一性％は、連続する配列にわたって計算され得、すなわち、一方の配列が他方の配列とアラインされ、一方の配列における各アミノ酸が、一度に１残基ずつ、他方の配列における対応するアミノ酸と直接比較される。これは、「アンギャップ（ungapped）」アラインメントと呼ばれる。典型的には、このようなアンギャップアラインメントは、比較的少ない数の残基にわたってのみ行われる。
これは非常に単純で一貫性のある方法であるが、この方法は、例えば、その他の点では同一の配列対において、１つの挿入又は欠失がその後のアミノ酸残基で生じてアラインメントに狂いが生じることを考慮することができず、したがって、全アラインメントが行われた場合に相同性％を大きく低減させる可能性がある。その結果として、ほとんどの配列比較方法は、考えられる挿入及び欠失を、全相同性スコアに不当なペナルティーを与えることなく考慮する、最適なアラインメントをもたらすように設計されている。これは、配列アラインメントに「ギャップ」を挿入して局所的相同性を最大にするようにすることによって達成される。
しかし、これらのより複雑な方法は、「ギャップペナルティー」を、アラインメントにおいて生じる各ギャップに割り当て、こうして、同一のアミノ酸が同数の場合では、できる限り少ないギャップを有する（これは、２つの比較される配列の間の関連性がより高いことを反映する）配列アラインメントが、多くのギャップを有するものよりも高いスコアを達成する。比較的高いコストをギャップの存在に対して課し、より小さなペナルティーをギャップ内のそれぞれの次の残基に課す、「アフィンギャップコスト」が、典型的には使用される。これは、最も一般的に使用されるギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナルティーは当然、よりギャップが少ない最適化アラインメントを生じさせる。ほとんどのアラインメントプログラムでは、ギャップペナルティーを修正することができる。しかし、このようなソフトウェアを配列比較に使用する場合には、デフォルトの値を使用することが好ましい。
最大相同性％の計算は、したがって、ギャップペナルティーを考慮した最適なアラインメントの提供をまず必要とする。このようなアラインメントを行うための適切なコンピュータプログラムは、Vector NTI（Invitrogen Corp.社）である。配列比較を行うことができるソフトウェアの例としては、限定はしないが、例えば、BLASTパッケージ（Ausubel et al. (1999) Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed - Chapter 18を参照されたい）、BLAST2（FEMS Microbiol Lett 1999 174(2): 247-50、FEMS Microbiol Lett 1999 177(1): 187-8、及びtatiana@ncbi.nlm.nih.govを参照されたい）、FASTA（Altschul et al. 1990 J. Mol. Biol. 403-410）、及びAlignXが挙げられる。少なくともBLAST、BLAST2、及びFASTAは、オフライン及びオンライン検索で利用可能である（Ausubel et al. 1999、pages 7-58 to 7-60を参照されたい）。
最終相同性％を同一性の点で測定することができるが、アラインメント処理自体は典型的には、全か無かの対比較に基づくものではない。逆に、化学的類似性又は進化距離に基づいてスコアを各ペアワイズ比較に割り当てる、スケーリングされた類似性スコアマトリクスが、一般に使用される。一般的に使用されるこのようなマトリクスの例は、BLASTプログラム一式のデフォルトマトリクスである、BLOSUM62マトリクスである。Vector NTIプログラムは通常、公開されているデフォルト値、又は提供される場合には特注のシンボル比較テーブル（さらなる詳細については、ユーザーマニュアルを参照されたい）のいずれかを使用する。一部の適用では、Vector NTIパッケージのデフォルト値を使用することが好ましい。
或いは、相同性パーセンテージを、CLUSTAL（Higgins DG & Sharp PM (1988), Gene 73(1), 237-244）に類似のアルゴリズムに基づいて、Vector NTI（Invitrogen Corp.社）における複数のアラインメント特徴を使用して計算することができる。ソフトウェアによって最適なアラインメントがもたらされれば、相同性％、好ましくは配列同一性％を計算することが可能である。ソフトウェアは、典型的には、配列比較の一部としてこれを行い、数値的結果を生成する。
配列同一性の決定の際にギャップペナルティーが使用される場合には、好ましくは、以下のパラメータがペアワイズアラインメントに使用される。
Figure 2022538481000002
Figure 2022538481000003
一実施形態では、CLUSTALは、上記に定義したギャップペナルティー及びギャップ伸長のセットと共に使用することができる。一部の実施形態では、BLAST又はCLUSTALアラインメントに使用されるギャップペナルティーは、上記で詳述したものと異なり得る。当業者には、BLAST及びCLUSTALアラインメントを行うための標準的なパラメータが定期的に変化し得ること、並びに、その時に、BLAST又はCLUSTALアラインメントアルゴリズムのための詳細な標準的パラメータに基づいて適切なパラメータを選択することが可能であることが理解されよう。
適切には、ヌクレオチド配列に関する同一性の程度は、少なくとも５０の連続するヌクレオチドにわたり、好ましくは少なくとも６０の連続するヌクレオチドにわたり、好ましくは少なくとも７０の連続するヌクレオチドにわたり、好ましくは少なくとも８０の連続するヌクレオチドにわたり、好ましくは少なくとも９０の連続するヌクレオチドにわたり、好ましくは少なくとも１００の連続するヌクレオチドにわたり、好ましくは少なくとも１５０の連続するヌクレオチドにわたり、好ましくは少なくとも２００の連続するヌクレオチドにわたり、好ましくは少なくとも２５０の連続するヌクレオチドにわたり、好ましくは少なくとも３００の連続するヌクレオチドにわたり、好ましくは少なくとも３５０の連続するヌクレオチドにわたり、好ましくは少なくとも４００の連続するヌクレオチドにわたり、好ましくは少なくとも４５０の連続するヌクレオチドにわたり、好ましくは少なくとも５００の連続するヌクレオチドにわたり、好ましくは少なくとも５５０の連続するヌクレオチドにわたり、好ましくは少なくとも６００の連続するヌクレオチドにわたり、好ましくは少なくとも６５０の連続するヌクレオチドにわたり、又は好ましくは少なくとも７００の連続するヌクレオチドにわたり決定される。
適切には、ヌクレオチド、ｃＤＮＡ、ｃｄｓ、又はアミノ酸配列に関する同一性の程度は、配列全体にわたり決定され得る。
配列はまた、サイレントな変化をもたらすアミノ酸残基の欠失、挿入、又は置換も有し得、機能的に同等な物質を生じさせ得る。意図的なアミノ酸置換は、物質の副次的結合活性が保持される限り、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性，及び／又は両親媒性の類似性に基づいて行われ得る。例えば、負に荷電したアミノ酸としてはアスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれ、正に荷電したアミノ酸としてはリジン及びアルギニンが含まれ、そして、類似の親水性値を有する非荷電極性頭基を有するアミノ酸としては、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン、及びチロシンが含まれる。
保存的置換は、例えば、以下の表に従って行うことができる。第２列の同じブロック内の、また好ましくは第３列の同じ行のアミノ酸は、互いに置換され得る。
Figure 2022538481000004
本発明はまた、生じ得る相同置換（置換及び置き換えはいずれも、代わりの残基での既存のアミノ酸残基の交換を意味するために、本明細書において使用される）、すなわち、塩基性から塩基性、酸性から酸性、極性から極性などの同種交換の置換も包含する。非相同置換、すなわち、あるクラスの残基から別のクラスの残基への置換、又は、その代わりに、オルニチン（以下、Ｚと呼ぶ）、ジアミノ酪酸オルニチン（以下、Ｂと呼ぶ）、ノルロイシンオルニチン（以下、Ｏと呼ぶ）、ピリジルアラニン（pyriylalanine）、チエニルアラニン、ナフチルアラニン、及びフェニルグリシンなどの非天然アミノ酸を含めることを伴う置換もまた生じ得る。
置き換えはまた、アルファ＊及びアルファ二置換＊アミノ酸、Ｎ－アルキルアミノ酸＊、乳酸＊、天然のアミノ酸のハロゲン化物誘導体、例えば、トリフルオロチロシン＊、ｐ－Ｃｌ－フェニルアラニン＊、ｐ－Ｂｒ－フェニルアラニン＊、ｐ－Ｉ－フェニルアラニン＊、Ｌ－アリル－グリシン＊、β－アラニン＊、Ｌ－α－アミノ酪酸＊、Ｌ－γ－アミノ酪酸＊、Ｌ－α－アミノイソ酪酸＊、Ｌ－ε－アミノカプロン酸＃、７－アミノヘプタン酸＊、Ｌ－メチオニンスルホン＃＊、Ｌ－ノルロイシン＊、Ｌ－ノルバリン＊、ｐ－ニトロ－Ｌ－フェニルアラニン＊、Ｌ－ヒドロキシプロリン＃、Ｌ－チオプロリン＊、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）のメチル誘導体、例えば、４－メチル－Ｐｈｅ＊、ペンタメチル－Ｐｈｅ＊、Ｌ－Ｐｈｅ（４－アミノ）＃、Ｌ－Ｔｙｒ（メチル）＊、Ｌ－Ｐｈｅ（４－イソプロピル）＊、Ｌ－Ｔｉｃ（１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－３－カルボン酸）＊、Ｌ－ジアミノプロピオン酸＃、及びＬ－Ｐｈｅ（４－ベンジル）＊を含む非天然アミノ酸によって行うことができる。注釈＊は、誘導体の疎水性を示すために上記の議論を目的として（相同置換又は非相同置換に関する）利用されており、一方、＃は誘導体の親水性を示すために利用されており、＃＊は両親媒性の特徴を示している。
バリアントアミノ酸配列は、グリシン残基又はβ－アラニン残基などのアミノ酸スペーサーに加えて、配列の任意の２つのアミノ酸残基の間に挿入され得る、メチル、エチル、又はプロピル基などのアルキル基を含む適切なスペーサー基を含み得る。さらなるバリエーション形態は、ペプトイド形態の１又は２以上のアミノ酸残基の存在を伴い、これは当業者に良く理解されるであろう。疑義を避けるために記載すると、「ペプトイド形態」は、残基の窒素原子上にα－炭素ではなくα－炭素置換基があるバリアントアミノ酸残基を指すために使用される。ペプトイド形態のペプチドを調製するための方法は、当技術分野において公知であり、例えば、Simon et al. (1992) PNAS 89(20), 9367-9371、及びHorwell (1995) Trends Biotechnol. 13(4), 132-134である。
本発明において使用するためのヌクレオチド配列は、その中に、合成の又は修飾されたヌクレオチドを含み得る。オリゴヌクレオチドに対するいくつかの異なるタイプの修飾が、当技術分野において公知である。これらとしては、メチルホスホネート骨格及びホスホロチオエート骨格、並びに／又は分子の３’及び／若しくは５’末端でのアクリジン鎖若しくはポリリジン鎖の付加が含まれる。本発明の目的では、本明細書において記載されるヌクレオチド配列は、当技術分野において利用可能な任意の方法によって修飾され得ることが理解される。このような修飾は、本発明のヌクレオチド配列のインビボ活性又は寿命を増強させるために行うことができる。
本発明はまた、本発明の核酸配列に相補的な配列、又は、本発明の配列若しくはこの配列に相補的な配列のいずれかにハイブリダイズし得る配列も包含する。本明細書において使用される用語「ハイブリダイゼーション」は、「核酸の鎖が塩基対合を介して相補鎖と結合するプロセス」及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ、polymerase chain reaction）技術で行われる増幅プロセスを含む。
本発明はまた、本発明のヌクレオチド配列（本明細書において提示される配列の相補配列を含む）にハイブリダイズし得るヌクレオチド配列にも関する。好ましくは、ハイブリダイゼーションは、ストリンジェンシーな条件下（例えば、５０℃及び０．２×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸Ｎａ３、ｐＨ７．０｝）で決定される。さらに好ましくは、ハイブリダイゼーションは、高いストリンジェンシー条件下（例えば、６５℃及び０．１×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸Ｎａ３、ｐＨ７．０｝）で決定される。
植物の形質転換に使用される一般的な技術の概説は、参照によって本明細書に組み込まれる、Potrykus et al. (1991) Annu Rev Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42:205-225、及びChristou et al. (1994) Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 17-27などの記事で見ることができる。植物の形質転換についてのさらなる教示は、参照によって本明細書に組み込まれる、欧州特許出願公開第０４４９３７５号公報で見ることができる。
別段の規定がない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 20 ED., John Wiley and Sons, New York (1994)、及びHale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991)は、本開示において使用される用語の多くについての一般的な辞書を当業者に提供している。
本開示は、本明細書において開示されている典型的な方法及び材料によって限定されず、また、本明細書において記載されるものに類似の又は同等のあらゆる方法及び材料を、本開示の実施形態の実施又は試験において使用することができる。数値範囲は、その範囲を規定する数値を含む。別段の指示がない限り、すべての核酸配列は左から右へ向かって５’から３’の方向で、アミノ酸配列は左から右へ向かってアミノからカルボキシの方向で、それぞれ記載されている。
本明細書において提供される見出しは、参照によって全体として明細書に含まれ得る本開示の様々な態様又は実施形態を限定するものではない。したがって、次に定義する用語は、明細書を全体として参照することによって、さらに完全に規定される。
アミノ酸は、アミノ酸の名称、３文字略語、又は１文字略語を使用して、本明細書において記載される。用語「タンパク質」は、本明細書において使用される場合、タンパク質、ポリペプチド、及びペプチドを含む。本明細書において使用される場合、用語「アミノ酸配列」は、用語「ポリペプチド」及び／又は用語「タンパク質」と同義である。一部の場合において、用語「アミノ酸配列」は、用語「ペプチド」と同義である。一部の場合において、用語「アミノ酸配列」は、用語「酵素」と同義である。
本開示及び特許請求の範囲において、アミノ酸残基の従来の１文字コード及び３文字コードが使用され得る。アミノ酸の３文字コードは、IUPACIUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature（ＪＣＢＮ）に従って定義されている通りである。遺伝子コードの縮重に起因してポリペプチドが２以上のヌクレオチド配列によってコードされ得ることも理解される。
用語の他の定義は、明細書全体を通して見ることができる。典型的な実施形態をより詳細に記載する前に、本開示が、記載される特定の実施形態に限定されず、したがって、当然のことながら変化し得ることが理解されるべきである。本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書において使用される専門用語は特定の実施形態のみを記載する目的のものであり、限定することを意図したものではないことも理解される。
値の範囲が提供される場合、文脈から別段のことが明らかに示されない限り、その範囲の上限と下限との間の、下限の単位の１０分の１までの、それぞれの介在している値もまた、具体的に開示される。言及された範囲内の任意の言及された値又は介在する値と、その言及された範囲内の任意の他の言及された値又は介在する値との間の、それぞれのより小さな範囲は、本開示に包含される。これらのより小さな範囲の上限及び下限は、独立してその範囲に含まれ得るか又はその範囲から除外され得、言及された範囲における任意の具体的に除外される限界に従って、そのより小さな範囲内のいずれかの限界が含まれる、いずれの限界も含まれない、又は両限界が含まれる各範囲もまた、本開示に包含される。言及された範囲が限界の一方又は両方を含む場合、含まれる限界のいずれか又は両方を除外している範囲もまた、本開示に含まれる。
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形態「ａ（１つの）」、「ａｎ（１つの）」、及び「ｔｈｅ（その）」は、文脈から別段のことが明らかに示されない限り、複数形の参照を含むことが留意されなくてはならない。したがって、例えば、「酵素」又は「硝酸レダクターゼ」への言及は、当業者に公知の複数のこのような候補物質及びこれらの同等物などを含む。
利点
驚くべきことに、タバコにおけるアルカロイド含有量の正の調節因子として作用する、本明細書において教示されているＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の活性又は発現を調節することによって、植物のアルカロイド及び／又はＴＳＮＡ前駆体の含有量を調節することができることがわかった。これによって、アルカロイド含有量が調節され（例えば低減し）、及び／又はＴＳＮＡ前駆体含有量が低減し、かつタバコ産業製品の消費者が望む商業的に望ましい形質を有するタバコ産業製品を製造することができる。
本発明者らは、驚くべきことに、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする遺伝子の活性又は発現を調節することによって、植物（例えばタバコ植物）のアルカロイド含有量及び／又はＴＳＮＡ前駆体含有量を調節するための方法を決定した。植物（例えばタバコ植物）のアルカロイド又はＴＳＮＡ前駆体の含有量は、本明細書において記載されるＲＮＡ結合性タンパク質をコードする遺伝子の活性又は発現を低下させる又は阻害することによって、減少させることができる。本発明の前に、本明細書において記載されるＲＮＡ結合性タンパク質をコードする遺伝子の活性又は発現の調節を使用して、植物（例えばタバコ植物）のアルカロイド及び／又はＴＳＮＡ前駆体の含有量を調節することができることは、知られていなかった。
本明細書において論じられる刊行物は、本願の出願日前のそれらの開示についてのみ提供されている。本明細書において、このような刊行物が本明細書に添付の特許請求の範囲に対する先行技術を構成するということの承認として、解釈されるものはない。
［実施例］
ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする遺伝子の一時的な過剰発現は、葉におけるアルカロイド含有量を増加させる
方法及び材料
ＲＮＡ結合性タンパク質発現ベクターのクローニング
本発明によるＲＮＡ結合性タンパク質をコードするＮｉｔａｂ４．５＿００１３６８５ｇ００１０．２遺伝子配列（配列番号３）を、遺伝子配列に隣接する制限部位の外側に位置するプライマーを使用してGateway（商標）に適合するｃＤＮＡライブラリーから増幅した。
得られたプラスミドをシーケンシングし、熱ショックによってアグロバクテリウム・ツメファシエンスＧＶ３１０１ｐＭＰ９０に形質転換し、そしてタバコ葉において一時的に発現させた。
一時的な遺伝子発現
所望のコンストラクトを有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスＧＶ３１０１株を、適切な抗生物質を添加したルリア－ベルターニ（ＬＢ、Luria-Bertani）培地中で一晩増殖させた。培養物を回転させて沈め、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ５．６、及び１００μＭのアセトシリンゴンを含有するバッファー中でＯＤ６００＝０．６まで再懸濁し、そして、１時間、室温でインキュベートした。無針シリンジを用いて、タバコ葉への浸透を行った。試料を浸透の５日後に採取した。
試験は２つの生物学的複製で行った。
アルカロイド測定
ピリジンアルカロイドの相対的含有量を、タンデム質量分析を伴う逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）によって決定した。クロマトグラフィー分離は、Gemini－NXカラム（１００ｍｍ×３．０ｍｍ、粒子径３μｍ、Phenomenex社）を使用して行い、勾配クロマトグラフィー分離は、６．５ｍＭの酢酸アンモニウムバッファー（ａｑ）（ｐＨ１０）及びメタノールを使用して行った。
質量分析計は、計画的なＭＲＭデータ取得を使用して、エレクトロスプレー（ＥＳＩ）ポジティブモードで作動する。２つのＭＲＭトランジションを、各分析物及び同位体標識された内部標準のための一つについてモニタリングした。
Figure 2022538481000005
結果
Ｎｉｔａｂ４．５＿００１３６８５ｇ００１０．２コンストラクトを発現する５週齢のタバコ葉のアルカロイド含有量を図１に示す。アルカロイド含有量は、コントロールと比較して表されており、一元配置ｔ検定によって分析された２つの生物学的複製を含んでいる。値は、平均±ＳＥＭとして示されている。アスタリスクは、Ｐ値が０．０１以下の統計上の有意性を示している。
Ｎｉｔａｂ４．５＿００１３６８５ｇ００１０．２の過剰発現によって、葉におけるアルカロイド含有量が有意に増大する。
結論
Ｎｉｔａｂ４．５＿００１３６８５ｇ００１０は、タバコにおける、アルカロイド含有量の正の調節因子であり、ピリジンアルカロイドの調節因子である。
Ｎｉｔａｂ４．５＿００１３６８５ｇ００２１．２を標的化するアンチセンスＲＮＡの一次的な発現は、葉におけるアルカロイド含有量を減少させる
材料及び方法
Ｎｉｔａｂ４．５＿００１３６８５ｇ００１０．２のコード配列を、ＣＥＲＶプロモーターによって駆動される植物発現ベクターに逆方向でクローニングした。
結果
Ｎｉｔａｂ４．５＿００１３６８５ｇ００１０．２アンチセンスＲＮＡを発現する５週齢のタバコ葉のアルカロイド含有量を図２に示す。アルカロイド含有量は、コントロールと比較して表されており、ｔ検定によって分析された２つの生物学的複製を含んでいる。値は、平均±ＳＥＭとして示されている。アスタリスクは、Ｐ値０．０１以下の統計上の有意性を示している。
アンチセンスＲＮＡを使用してＮｉｔａｂ４．５＿００１３６８５ｇ００１０．２の発現を抑制することによって、葉におけるアルカロイド含有量が減少し、特に、ノルニコチン、ＰＯＮ、ニコチン、アナバシン、及びアナタビンの含有量が減少する。
結論
Ｎｉｔａｂ４．５＿００１３６８５ｇ００１０．２は、タバコにおける、アルカロイド含有量、特に葉におけるアルカロイド含有量の正の調節因子であり、ピリジンアルカロイドの調節因子である。
Ｎｉｔａｂ４．５＿００１３６８５ｇ００１０．２＿ｄｅｌｔａＲＢＤ－ＲＧＧの一時的な発現は、アルカロイドの大幅な低減につながる
材料及び方法
Ｎｉｔａｂ４．５＿００１３６８５ｇ００１０．２＿ｄｅｌｔａＲＢＤ－ＲＧＧコード配列（配列番号３４）を、実施例１で記載されている発現ベクターにクローニングした。
結果
Ｎｉｔａｂ４．５＿００１３６８５ｇ００１０．２＿ｄｅｌｔａＲＢＤ－ＲＧＧを発現する５週齢のタバコ葉のアルカロイド含有量を図３に示す。アルカロイド含有量は、コントロールと比較して表されており、ｔ検定によって分析された２つの生物学的複製を含んでいる。値は平均±ＳＥＭとして示されている。アスタリスクは、Ｐ値が０．０５以下の統計上の有意性を示している。
結論
ＲＮＡ結合性タンパク質中のＲＢＤ－ＲＧＧドメインの撹乱は、タバコ葉におけるアルカロイド含有量を調節する。
ホモログ試験
配列番号３のホモログ、すなわち、配列番号６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７及び３０の影響を、上記の実施例で記載されるアッセイにおいて試験する。
Ｎｉｔａｂ４．５＿００１３６８５ｇ００１０．２のインタラクトーム研究
方法：
Ｎｉｔａｂ４．５＿００１３６８５ｇ００１０．２の三重の共免疫沈降試料を質量分析にかけた。試料をトリプシンで消化し、Thermo Scientific（商標）Orbitrap Fusion（商標）質量分析計で分析した。データを、ＢＡＴタバコプロテオームデータベース及び共通汚染物質データベースに対してProteome Discoverer 2.1を用いて、５％偽発見率を使用して分析した。タンパク質を、候補試料の全複製における同定；候補試料において同定されたペプチドの数；及びコントロール（ＧＦＰ）又は他の候補試料には存在しないペプチドの数に基づいてソートした。これらの基準を使用して、Ｎｉｔａｂ４．５＿００１３６８５ｇ００１０．２の候補相互作用物質のリストを作成した。
結果及び結論：
三重の試料の質量分析によって、各試料においてベイトタンパク質が正しく同定された。さらに、Ｎｉｔａｂ４．５＿００１３６８５ｇ００１０．２プロテオームの特性決定を可能にする他のタンパク質も、各試料において同定された（データは示していない）。いくつかの相互作用物質は、ＲＮＡ結合性タンパク質である。このクラスのグリシンリッチＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡに結合すると知られており、ＲＮＡプロセシングに関与する他のタンパク質と相互作用する。

Claims (30)

  1. タバコ植物若しくはその一部又はタバコ細胞又はタバコ細胞培養物のアルカロイド含有量を調節する（例えば、低減する）方法であって、配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８若しくは３１として示されるアミノ酸配列又は配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８若しくは３１に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を有するＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の活性又は発現を低下させることによって、前記植物若しくはその一部又は細胞を改変するステップを含む、前記方法。
  2. タバコ植物若しくはその一部又はタバコ細胞又はタバコ細胞培養物においてタバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）前駆体の含有量を低減する方法であって、配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８若しくは３１として示されるアミノ酸配列又は配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８若しくは３１に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を有するＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の活性又は発現を低下させることによって前記植物若しくはその一部又は細胞を改変するステップを含む、前記方法。
  3. タバコ細胞又はタバコ植物若しくはその一部又はタバコ細胞培養物において、アルカロイド含有量を調節する（例えば、減少させる）、又はＴＳＮＡ前駆体含有量を低減するための、配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８若しくは３１として示されるアミノ酸配列又は配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８若しくは３１に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を有するＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の使用。
  4. アルカロイド含有量が調節された（例えば、減少した）、又はＴＳＮＡ前駆体含有量が低減された、植物若しくはその一部、タバコ細胞又はタバコ細胞培養物、植物増殖材料、葉、カットされた収穫葉、処理葉又はカットされた処理葉を生成する方法であって、配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８若しくは３１として示されるアミノ酸配列又は配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８若しくは３１に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を有するＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の活性又は発現を低下させるように前記植物若しくはその一部又は細胞又は細胞培養物又は植物増殖材料を改変するステップを含む、前記方法。
  5. アルカロイド含有量又はＴＳＮＡ前駆体含有量が、配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８若しくは３１として示されるアミノ酸配列又は配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８若しくは３１に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を有するＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の活性又は発現を低下させるように改変されていない植物若しくはその一部又は細胞又は細胞培養物又は植物増殖材料又は葉と比較して低減している、請求項１～４のいずれかに記載の方法又は使用。
  6. 未改変植物若しくはその一部又は未改変細胞培養物と比較してアルカロイド含有量の調節（例えば、減少）又はＴＳＮＡ前駆体含有量の低減を達成するように改変されている植物若しくはその一部又は細胞又は細胞培養物であって、前記改変が、配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８若しくは３１として示されるアミノ酸配列又は配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８若しくは３１に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を有するＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の活性又は発現の低減である、前記植物若しくはその一部又は細胞又は細胞培養物。
  7. 請求項６に記載の植物から、又は請求項１、２、４及び５のいずれかの方法によって生成された植物若しくは細胞培養物から得ることができる（例えば、得られた）植物増殖材料。
  8. ＴＳＮＡ前駆体が、ノルニコチン、ＰＯＮ、アナバシン及びアナタビンから選択され、好ましくは、ＴＳＮＡ前駆体がノルニコチンである、請求項１～５のいずれかに記載の方法若しくは使用、請求項６に記載の植物若しくはその一部若しくは細胞培養物、又は請求項７に記載の植物増殖材料。
  9. 植物を育種するための、請求項６若しくは８に記載の植物若しくはその一部若しくは細胞培養物の、又は請求項１、２、４、５及び８のいずれかに記載の方法によって生成された植物の使用。
  10. 製品の製造のための、請求項６若しくは８に記載の植物若しくはその一部若しくは細胞培養物の、又は請求項１、２、４、５及び８のいずれかに記載の方法によって生成された植物の使用。
  11. 作物を作るための、請求項６若しくは８に記載の植物若しくはその一部の、又は請求項１、２、４、５及び８のいずれかに記載の方法によって生成された植物の使用。
  12. 葉を生産するための、請求項６又は８に記載の植物若しくはその一部の、又は請求項１、２、５及び８のいずれかに記載の方法によって生成された植物の使用。
  13. 請求項６若しくは８に記載の植物の、又は請求項７に記載の増殖材料から増殖させた植物から得ることができる（例えば、得られた）、又は請求項３及び９～１２のいずれかに記載の使用によって得られた植物から得ることができる（例えば、得られた）、又は請求項１、２、４、５及び８に記載の方法によって生成された植物から得ることができる（例えば、得られた）収穫葉。
  14. カットされた収穫葉である、請求項１３に記載の植物の収穫葉。
  15. 請求項３及び９～１２のいずれかに記載の使用から得ることができる（例えば、得られた）植物から得ることができる（例えば、得られた）か、
    請求項６若しくは８に記載の植物を処理することによって得ることができる（例えば、得られた）か、
    請求項７に記載の植物増殖材料から増殖させた植物から得ることができる（例えば、得られた）か、又は
    請求項１３若しくは１４に記載の収穫葉を処理することによって得ることができる（例えば、得られた）か、又は
    請求項１、２、４、５及び８のいずれかに記載の方法によって生成された植物から得ることができる（例えば、得られた）
    処理葉、好ましくは、タバコの処理葉、好ましくは、生育不能なタバコの処理葉。
  16. 葉が、乾燥させること、発酵させること、低温殺菌すること又はそれらの組合せによって処理される、請求項１５に記載の処理葉。
  17. Ｎ’－ニトロソノルニコチン（ＮＮＮ）、４－（メチルニトロソアミノ）－１－（３－ピリジル）－１－ブタノン（ＮＮＫ）、Ｎ’－ニトロソアナタビン（ＮＡＴ）及びＮ－ニトロソアナバシン（ＮＡＢ）から選択される１又は２以上のＴＳＮＡの含有量が、低減され、好ましくは、ＮＮＮ及び／又はＮＮＫの含有量が低減され、より好ましくは、少なくともＮＮＮの含有量が低減される、請求項１５又は１６に記載の処理葉。
  18. カットされた処理葉である、請求項１５又は１６に記載の処理葉。
  19. 請求項６に記載の植物若しくはその一部若しくはその抽出物から、又は請求項１３～１８のいずれかに記載の葉若しくはその抽出物から作製された乾燥タバコ材料。
  20. 請求項１９に記載の乾燥タバコ材料を含むタバコブレンド。
  21. 請求項６若しくは８に記載のタバコ植物若しくはその一部若しくはタバコ細胞若しくは細胞培養物、
    請求項７に記載のタバコ植物増殖材料から増殖させたタバコ植物若しくはその一部、
    請求項１３若しくは１４に記載の植物の収穫葉、
    請求項１５～１８のいずれかに記載の処理葉、
    請求項１、２、４、５及び８のいずれかに記載の方法によって生成された植物、
    請求項１９に記載の乾燥タバコ、又は
    請求項２０に記載のタバコブレンド
    から調製された送達システム製品。
  22. 可燃性喫煙物品である、請求項２１に記載の送達システム。
  23. 無煙のタバコ製品である、請求項２１に記載の送達システム。
  24. 非可燃性エアロゾル供給システム、例えば、タバコ加熱デバイス又はエアロゾル生成デバイスである、請求項２１に記載の送達システム。
  25. 請求項６若しくは８に記載の植物若しくはその一部、又は請求項６若しくは８に記載のタバコ細胞若しくは細胞培養物；又は請求項１３若しくは１４に記載の収穫葉、又は請求項１５～１８のいずれかに記載の処理葉；又は請求項１９に記載の乾燥タバコ材料；又は請求項２０に記載のタバコブレンドを含む、可燃性喫煙物品、非可燃性エアロゾル供給システム、無煙タバコ製品又はタバコ加熱デバイス。
  26. アルカロイド含有量が調節された（例えば、減少した）及び／又はタバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）前駆体の含有量が低減された植物を選択するためのＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子のヌクレオチド配列の使用であって、前記ＲＮＡ結合性タンパク質の配列が、配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８若しくは３１又は配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８若しくは３１に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列から選択されるか；或いは、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする前記少なくとも１つの遺伝子が、配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９、３０、３２若しくは３３で示されるヌクレオチド配列又は配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９、３０、３２若しくは３３に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、前記使用。
  27. ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子のヌクレオチド配列中に遺伝的変異を保持する植物の変異体であって、前記遺伝子が、配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９、３０、３２若しくは３３又は配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９、３０、３２若しくは３３に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列から選択され、前記遺伝的変異が、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする前記少なくとも１つの遺伝子の活性又は発現を低下させ、前記植物が、前記遺伝的変異を保持しない比較できる植物と比較して、調節された（例えば、減少した）アルカロイド含有量及び／又は低減されたタバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）前駆体を有する、前記植物の変異体。
  28. 請求項２７に記載の遺伝的変異を保持する変異体植物の後代又は種子。
  29. ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子のヌクレオチド配列中に改変を含む植物から生成された収穫葉、処理葉又は乾燥タバコ材料であって、前記少なくとも１つの遺伝子が、配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９、３０、３２若しくは３３又は配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９、３０、３２若しくは３３に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列から選択され、前記改変が、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする前記少なくとも１つの遺伝子の活性又は発現を低下させ、前記植物が、前記ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする前記少なくとも１つの遺伝子中に前記改変を保持しない比較できる植物と比較して、調節された（例えば、減少した）アルカロイド含有量及び／又は低減されたタバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）前駆体含有量を有する、前記収穫葉、処理葉又は乾燥タバコ材料。
  30. 説明及び図面を参照して本明細書において記載される方法、葉、植物、植物材料、収穫葉、処理タバコ、タバコ製品、使用又はそれらの組合せ。
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