JP2022536934A - ｉｎ ｖｉｖｏ二重リコンビナーゼ媒介カセット交換（ｄＲＭＣＥ）のためのシステム及び方法ならびにその疾患モデル - Google Patents

ｉｎ ｖｉｖｏ二重リコンビナーゼ媒介カセット交換（ｄＲＭＣＥ）のためのシステム及び方法ならびにその疾患モデル Download PDF

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Abstract

本明細書には、二重リコンビナーゼ媒介カセット交換において使用するためのドナーベクター及びシステムが記載されている。また、導入遺伝子発現についての、一貫性があり正確で容易な調査のための、動物モデル及びヒト細胞が記載されている。さらに、これらの動物モデルを使用して治療用薬物についてスクリーニングする方法、及び処置方法が記載されている。【選択図】図１５

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年６月１７日に出願された米国仮特許出願番号６２／８６２，５７６に対する３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）下の優先権の主張を含み、その仮出願の全体が参照により本明細書に組み込まれる。
連邦政府が後援する研究または開発に関する声明
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈによって授与されたＣＡ２０２９００及びＣＡ２３６６８７に基づく政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明において所定の権利を有する。
遺伝子修飾されたマウスモデル（ＧＥＭＭ）は、時間特異的及び組織特異的方法でｉｎ ｖｉｖｏで遺伝子機能を分析するためのパラダイムとなっている。しかしながら、ＧＥＭＭ生成は、高価で労力を要するプロセスであるため、エレクトロポレーション（ＥＰ）媒介及びウイルス遺伝子送達などの多くの代替的トランスジェニックアプローチが、体細胞モザイクを生成するより迅速で効率的な方法としてますます適応されている。いずれの方法も、特定の組織にウイルスまたは外来ＤＮＡを注射して周囲細胞を形質導入し、体細胞モザイクを生成することを伴う。ＥＰは、トランスポゾンを使用して、またはあまり効率的ではないＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９及びその後のドナーテンプレートの挿入を用いてゲノムに挿入されたＤＮＡを生成し得る。それらの速度にもかかわらず、これらの方法は、より広い普及を阻む大きな落とし穴を有する。ウイルスベクターは、限られたペイロードを有し、免疫反応を誘発し、特別な専門技術を必要とするのに対し、トランスポゾン及びウイルス法はいずれとも、それらの予測不能なゲノム組み込みパターン、挿入変異生成の可能性、及びエピジェネティックな導入遺伝子サイレンシングの問題がある。その両方は、導入遺伝子コピー数のばらつき及び過剰発現アーティファクト、例えば、細胞傷害性及び転写抑制が問題であり、それ故、クローンの遺伝子型／表現型のばらつきが大きな混同要因である。
数百の再発性推定がんドライバー変異（その多くは機能獲得（ＧＯＦ）がん遺伝子である）が同定されており、これらの潜在的がん遺伝子を、場合により腫瘍サプレッサー変異と併せてモデリングし得る扱いやすいｉｎ ｖｉｖｏプラットフォームを作製することが必要不可欠である。各ＧＯＦがん遺伝子について、異なる様式で機能し得る数十の異なる再発性ミスセンス変異がしばしば存在する。よく知られている多くの腫瘍サプレッサー変異体は、大規模ＫＯマウスコンソーシアを利用して多重ＫＯマウス（例えば、Ｐｔｅｎ／ｐ５３／Ｎｆ１－ＫＯ）を繁殖させ得る機能喪失（ＬＯＦ）表現型である。そうであっても、そのようなマウスの生成は、非常に時間がかかり、高価であり、いくつかの方法論的混同をする傾向がある。代替的には、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、マウスにおいてｉｎ ｖｉｖｏで複数のＫＯを同時に誘導し得るが、かなりの意図されていないオフターゲットゲノム変化を有し得る。
一態様では、本明細書では、安価にだけでなく、ＧＥＭＭ様様式でＧＯＦ及びＬＯＦ変異の組み合わせを同時に生成し得るフレキシブルなｉｎ ｖｉｖｏプラットフォームが提供される。我々は、成功裏の二重リコンビナーゼ媒介カセット交換（ｄＲＭＣＥ、またはＭＡＤＲ）が、組換え細胞の明確な遺伝子標識により、よく特徴づけられたレポーターマウスにおいて体細胞でｉｎ ｓｉｔｕで触媒され得ることを実証する。その上、我々は、患者特異的ドライバー変異を含むＧＯＦ及びＬＯＦ変異の混合体を有するモザイクの生成におけるこのシステムの実用性を実証する。究極的には、我々のＭＡＤＲ腫瘍モデルは、この方法が、様々な推定腫瘍ドライバー変異を試験及び研究するためのより高いスループットの初回実験になる潜在性を有し、患者特異的な様式で前臨床薬物発見のための迅速パイプラインを提供することを実証する。
本明細書には、細胞療法において使用するためのトランスジェニック細胞を確立するのに有用なシステム、核酸、及びベクターが記載されている。これらのベクターは、ゲノム位置に安定に組み込まれた導入遺伝子を有する細胞を生成する際に使用される現在の方法に伴う問題を回避する。現在の問題には、倍数性の制御の欠如、組み込み部位の制御の欠如、及びトランスジェニック挿入サイズの制限が含まれる。本明細書に記載のシステムは、これらの問題を解決し、細胞療法のより安全な再現性のある方法を可能とする。これらのシステム及びそれらを使用するための方法は、神経栄養因子及び／または成長因子などの遺伝子産物を、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、またはアルツハイマー病などの神経変性疾患を有する対象に送達するのに有用な細胞及び細胞株の確立に適用可能である。
一態様では、本明細書には、ゲノムに組み込まれた導入遺伝子を含む哺乳動物細胞が記載されており、当該ゲノムに組み込まれた導入遺伝子は、神経栄養因子を含み、ＡＡＶＳ１遺伝子座、Ｈ１１遺伝子座、またはＨＰＲＴ１遺伝子座を含むゲノム部位に組み込まれている。ある特定の実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。ある特定の実施形態では、ヒト細胞は、誘導多能性幹細胞である。ある特定の実施形態では、神経栄養因子は、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、成長／分化因子（ＧＤＦ）５、中脳アストロサイト由来神経栄養因子（ＭＡＮＦ）、脳ドーパミン作動性神経栄養因子（ＣＤＮＦ）、またはそれらの組み合わせを含む。ある特定の実施形態では、神経栄養因子は、ＧＤＮＦである。ある特定の実施形態では、神経栄養因子は、誘導性プロモーターの制御下にある。ある特定の実施形態では、誘導性プロモーターは、テトラサイクリンまたはドキシサイクリン誘導性プロモーターである。ある特定の実施形態では、神経栄養因子及び／または誘導性プロモーターは、リコンビナーゼ認識部位、転移性因子のタンデムリピート、またはインシュレーター配列のうちの１つ以上に隣接している。ある特定の実施形態では、導入遺伝子の単一コピーが細胞のゲノムに組み込まれる。様々な実施形態では、神経栄養因子及び／または誘導性プロモーターは、対をなしたリコンビナーゼ認識部位に隣接している。様々な実施形態では、対をなしたリコンビナーゼ認識部位は、バリアント型リコンビナーゼ認識部位及び野生型リコンビナーゼ認識部位を含む。様々な実施形態では、バリアント型リコンビナーゼ認識部位は、野生型リコンビナーゼ認識部位と比較してリコンビナーゼによる切断の減少を示す。様々な実施形態では、対をなしたリコンビナーゼ認識部位は、ＬｏｘＰ部位またはＦＲＴ部位を含む。
別の態様では、本明細書には、（ａ）導入遺伝子、またはＲＮＡをコードする核酸の上流の、ポリアデニル化シグナルまたは転写停止要素、導入遺伝子、またはＲＮＡをコードする核酸、及び対をなしたリコンビナーゼ認識部位を含むプロモーターレスドナーベクター、（ｂ）ならびに対をなしたリコンビナーゼ認識部位に特異的なリコンビナーゼをコードする２つの遺伝子を含む１つの発現ベクター、または２つの発現ベクターであって、第１の発現ベクターは、対をなしたリコンビナーゼ認識部位のうちの一方に特異的な第１のリコンビナーゼをコードする１つの遺伝子を含み、第２の発現ベクターは、対をなしたリコンビナーゼ認識部位のうちの他方に特異的な第２のリコンビナーゼをコードする１つの遺伝子を含む、２つの発現ベクターを含むシステムが記載されている。ある特定の実施形態では、プロモーターレスドナーベクターは、プラスミド、ウイルスベクター、及び細菌性人工染色体（ＢＡＣ）からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、プロモーターレスドナーベクターは、導入遺伝子、またはＲＮＡをコードする核酸の上流に、少なくとも４つのポリアデニル化シグナルを含む。ある特定の実施形態では、プロモーターレスドナーベクターは、転写後制御要素をさらに含む。ある特定の実施形態では、プロモーターレスドナーベクターは、導入遺伝子、またはＲＮＡをコードする核酸の下流に、ポリアデニル化シグナルをさらに含む。ある特定の実施形態では、プロモーターレスドナーベクターは、ＰＧＫポリアデニル化シグナル（ｐＡ）、三量化ＳＶ４０ｐＡ、導入遺伝子、またはＲＮＡをコードする核酸、ｌｏｘＰ及びフリッパーゼ認識標的（ＦＲＴ）、ウサギベータ－グロビンｐＡ、ならびにウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御要素（ＷＰＲＥ）を含む。ある特定の実施形態では、対をなしたリコンビナーゼ認識部位は、ｌｏｘＰ及びフリッパーゼ認識標的（ＦＲＴ）であり、リコンビナーゼは、ｃｒｅ及びｆｌｐである。ある特定の実施形態では、対をなしたリコンビナーゼ認識部位は、ＶｌｏｘＰ及びフリッパーゼ認識標的（ＦＲＴ）であり、リコンビナーゼは、ＶＣｒｅ及びｆｌｐである。ある特定の実施形態では、対をなしたリコンビナーゼ認識部位は、ＳｌｏｘＰ及びフリッパーゼ認識標的（ＦＲＴ）であり、リコンビナーゼは、ＳＣｒｅ及びｆｌｐである。ある特定の実施形態では、リコンビナーゼは、ＰｈｉＣ３１リコンビナーゼであり、リコンビナーゼ認識部位は、ａｔｔＢ及びａｔｔＰである。ある特定の実施形態では、リコンビナーゼは、Ｎｉｇｒｉ、Ｐａｎｔｏ、またはＶｉｋａであり、リコンビナーゼ認識部位は、それぞれ、ｎｏｘ、ｐｏｘ、及びｖｏｘである。ある特定の実施形態では、対をなしたリコンビナーゼ認識部位の一方または両方は、変異を含む。ある特定の実施形態では、ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡまたはｍｉＲＮＡである。ある特定の実施形態では、導入遺伝子、またはＲＮＡをコードする核酸は、疾患に関連する変異を含む。ある特定の実施形態では、導入遺伝子、またはＲＮＡをコードする核酸は、機能獲得（ＧＯＦ）遺伝子変異、機能喪失（ＬＯＦ）遺伝子変異、またはその両方を含む。ある特定の実施形態では、導入遺伝子は、アポトーシスを防止する、またはニューロン細胞の生存を促進する、ニューロン細胞の増殖を増加させる、もしくはニューロン細胞の分化を促進する因子を含む。ある特定の実施形態では、因子は、成長因子である。ある特定の実施形態では、成長因子は、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、成長／分化因子（ＧＤＦ）５、中脳アストロサイト由来神経栄養因子（ＭＡＮＦ）、脳ドーパミン作動性神経栄養因子（ＣＤＮＦ）、またはそれらの組み合わせを含む。ある特定の実施形態では、成長因子は、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）を含む。ある特定の実施形態では、ドナーベクターは、スプライスアクセプターで開始するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。ある特定の実施形態では、ドナーベクターは、蛍光レポーターを含む。ある特定の実施形態では、本明細書では、そのシステムを含む哺乳動物細胞が提供される。ある特定の実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。ある特定の実施形態では、細胞は、多能性細胞である。ある特定の実施形態では、多能性細胞は、誘導多能性細胞である。ある特定の実施形態では、細胞は、遺伝子産物（例えば、成長因子、神経栄養因子）を神経変性障害を有する対象に送達する方法において使用するためのものであり、その方法は、哺乳動物細胞を個体に投与することを含む。ある特定の実施形態では、神経変性障害は、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、またはアルツハイマー病を含む。ある特定の実施形態では、神経変性障害は、パーキンソン病を含む。ある特定の実施形態では、神経変性障害は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を含む。ある特定の実施形態では、細胞は、個体の脳におけるＧＤＮＦタンパク質レベルを増加させる方法において使用するためのものであり、その方法は、哺乳動物細胞を個体に投与することを含む。
別の態様では、本明細書では、導入遺伝子、またはＲＮＡをコードする核酸の上流の、ポリアデニル化シグナルまたは転写停止要素；導入遺伝子、またはＲＮＡをコードする核酸；及び対をなしたリコンビナーゼ認識部位を含む、プロモーターレスドナーベクターが提供される。ある特定の実施形態では、プロモーターレスドナーベクターは、プラスミド、ウイルスベクター、及び細菌性人工染色体（ＢＡＣ）からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、プロモーターレスドナーベクターは、導入遺伝子、またはＲＮＡをコードする核酸の上流に、少なくとも４つのポリアデニル化シグナルを含む。ある特定の実施形態では、導入遺伝子またはＲＮＡは、がん遺伝子、腫瘍サプレッサー遺伝子の機能喪失（ＬＯＦ）変異、がん原遺伝子の機能獲得（ＧＯＦ）変異、偽遺伝子、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、エピジェネティック改変、ヒト疾患に関連するノンコーディング遺伝子異常またはエピジェネティック異常、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、プロモーターレスドナーベクターは、転写後制御要素をさらに含む。ある特定の実施形態では、プロモーターレスドナーベクターは、導入遺伝子、またはＲＮＡをコードする核酸の下流に、ポリアデニル化シグナルをさらに含む。ある特定の実施形態では、対をなしたリコンビナーゼ認識部位の一方または両方は、変異を含む。ある特定の実施形態では、プロモーターレスドナーベクターは、ＰＧＫポリアデニル化シグナル（ｐＡ）、三量化ＳＶ４０ｐＡ、導入遺伝子またはＲＮＡ、ｌｏｘＰ及びフリッパーゼ認識標的（ＦＲＴ）、ウサギベータ－グロビンｐＡ、ならびにウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御要素（ＷＰＲＥ）を含む。ある特定の実施形態では、導入遺伝子は、アポトーシスを防止し、またはニューロン細胞の生存を促進し、ニューロン細胞の増殖を増加させ、もしくはニューロン細胞の分化を促進する因子を含む。ある特定の実施形態では、因子は、成長因子である。ある特定の実施形態では、成長因子は、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、成長／分化因子（ＧＤＦ）５、中脳アストロサイト由来神経栄養因子（ＭＡＮＦ）、脳ドーパミン作動性神経栄養因子（ＣＤＮＦ）、またはそれらの組み合わせを含む。ある特定の実施形態では、成長因子は、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）を含む。ある特定の実施形態では、本明細書では、プロモーターレスドナーベクターを含む哺乳動物細胞が提供される。ある特定の実施形態では、哺乳動物細胞は、ヒト細胞である。ある特定の実施形態では、哺乳動物細胞は、多能性細胞である。ある特定の実施形態では、多能性細胞は、誘導多能性細胞である。ある特定の実施形態では、細胞は、遺伝子産物（例えば、成長因子、神経栄養因子）を個体における神経変性障害を有する対象に送達する方法において使用するためのものであり、その方法は、哺乳動物細胞を個体に投与することを含む。ある特定の実施形態では、神経変性障害は、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、またはアルツハイマー病を含む。ある特定の実施形態では、神経変性障害は、パーキンソン病を含む。ある特定の実施形態では、神経変性障害は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を含む。ある特定の実施形態では、細胞は、個体の脳におけるＧＤＮＦタンパク質レベルを増加させる方法において使用するためのものであり、その方法は、哺乳動物細胞を個体に投与することを含む。
別の態様では、本明細書では、哺乳動物細胞の遺伝子操作方法であって、哺乳動物細胞に本明細書に記載のシステムをトランスフェクションまたは形質導入することを含む、方法が提供される。ある特定の実施形態では、哺乳動物細胞は、ヒト細胞であり、システムは、ＡＡＶＳ１遺伝子座、Ｈ１１遺伝子座、またはＨＰＲＴ１遺伝子座を標的とし、方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ方法である。ある特定の実施形態では、哺乳動物細胞は、マウス細胞であり、システムは、ＲＯＳＡ２６遺伝子座、Ｈｉｐｐ１１遺伝子座、Ｔｉｇｒｅ遺伝子座、ＣｏｌＡ１遺伝子座、またはＨｐｒｔ遺伝子座を標的とする。ある特定の実施形態では、方法は、細胞に１つ以上のリコンビナーゼ酵素を投与することまたは細胞を１つ以上のリコンビナーゼ酵素と接触させることをさらに含む。ある特定の実施形態では、１つ以上のリコンビナーゼ酵素は、Ｃｒｅリコンビナーゼ、フリッパーゼリコンビナーゼ、Ｃｒｅ及びフリッパーゼリコンビナーゼ、Ｎｉｇｒｉリコンビナーゼ、ＰａｎｔｏリコンビナーゼまたはＶｉｋａリコンビナーゼを含む。
例示的な実施形態が参照される図に示されている。本明細書に開示される実施形態及び図は、限定的ではなく例示的とみなされることが意図されている。
パネルＡ～Ｍは、ｍＴｍＧマウスまたはヒト系統におけるＭＡＤＲが、ｉｎ ｖｉｔｒｏにて、遺伝子レポーターで画定された集団を生成することを示している。Ａ）Ｆｌｐ－Ｃｒｅベクターは、ＭＡＤＲドナーベクターの存在下で、Ｒｏｓａ２６ｍＴｍＧアレル上、Ｃｒｅ媒介切除またはｄＲＭＣＥのいずれかを触媒し、２つの異なる組換え産物をもたらす。Ｂ）ヘテロ接合型Ｒｏｓａ２６ＷＴ／ｍＴｍＧｍＮＳＣのヌクレオフェクションは、可能性のある３つの系統、すなわちｔｄＴｏｍａｔｏ＋、ＥＧＦＰ＋、及びＴａｇＢＦＰ２＋をもたらす。Ｃ）非重複蛍光色での代表的な細胞のライブイメージング。スケールバー：１００μｍ。Ｄ）シングルセルウエスタンブロットのための細胞調製の概略図。Ｅ）ＭＡＤＲ及びＰｉｇｇｙＢａｃトランスジェニック細胞を比較する蛍光強度の頻度。Ｆ）ＰｉｇｇｙＢａｃ及びＭＡＤＲ群についてのシングルセルウエスタンブロットの代表的な例。（これは純粋な集団ではないので、一部の細胞は、ヒストンＨ３搭載対照タンパク質を発現するが、ＴａｇＢＦＰ２は発現しないことに留意されたい。また、多くのレーンは、このアッセイでは典型的であるように空である。）Ｇ）ＭＡＤＲ ＭＡＸのためのＭＡＤＲ適合性ＴＲＥ－ＳＭ－ＦＰプラスミド。Ｈ）Ｄｏｘは効率的なＳＭ－ＦＰ発現を誘導し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの４つの独立したレポーターの直交画像化を可能にする。スケールバー：１００μｍ。Ｉ）高倍率共焦点ｚ－セクションは、各細胞が単一のＳＭ－ＦＰレポーターを発現することを実証している。スケールバー：１０μｍ。Ｊ）ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるＨＵＭＡＮ ＭＡＤＲのためのＡＡＶＳ１遺伝子座標的化の概略図。Ｋ）ｔｄＴｏｍａｔｏ及びＴａｇＢＦＰ２－Ｖ５－ｎｌｓを発現するＡＡＶＳ１標的化ＭＡＤＲレシピエント部位を含有するＨＥＫ２９３Ｔ細胞。スケールバー：１００μｍ。Ｌ）非挿入ｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞の中でＧＦＰまたはＢＦＰ自己蛍光を示す、ｐＤＯＮＯＲ ＳＭ－ＦＰ－ｍｙｃ（明）またはＴａｇＢＦＰ－３ＸＦｌａｇをトランスフェクションされたＭＡＤＲ－ＨＥＫ２９３Ｔ細胞。スケールバー：１００μｍＭ）相互排他的様式でのｔｄＴｏｍａｔｏ及びＳＭ－ＦＰ－ｍｙｃを示す、Ｌからの細胞の高倍率画像。スケールバー：１０μｍ。 図１－１の説明を参照されたい。 図１－１の説明を参照されたい。 パネルＡ～Ｏは、ヘテロ接合型ｍＴｍＧにおけるＭＡＤＲが、ｉｎ ｖｉｖｏで効率的な系統の追跡を可能にすることを示している。Ａ）Ｆｌｐ－Ｃｒｅベクター及びドナープラスミドのＤＮＡ混合物を用いる、Ｐ２ヘテロ接合型Ｒｏｓａ２６ＷＴ／ｍＴｍＧ仔におけるＶＺ／ＳＶＺ細胞を標的とする標準的な出生後エレクトロポレーションプロトコル。Ｂ）出生後ＥＰは、ｉｎ ｖｉｔｒｏヌクレオフェクション実験を再現し、ＥＰから２週間後においてＥＧＦＰ＋及びｔｄＴｏｍａｔｏ＋系統と共にＴａｇＢＦＰ２＋ＭＡＤＲを生成する。スケールバー：１００μｍ。Ｃ）異なる濃度のリコンビナーゼ及びドナープラスミドが、ｉｎ ｖｉｖｏでのＭＡＤＲ及びＣｒｅ切除組換え反応の両方の様々な効率をもたらす。すべての混合物は、核ＴａｇＢｆｐ２レポータープラスミドを含有していた。（この定量からの代表的な画像については図９Ｄを参照）エラーバーは標準誤差（ＳＥＭ）を示す。Ｄ）コンビナトリアルＭＡＤＲ ＭＡＸ「ブレインボウ（ｂｒａｉｎｂｏｗ）」様の多重標識のためのプラスミド送達の概略図。Ｅ）多重ＳＭ－ＦＰベースのＭＡＤＲ ＭＡＸでエレクトロポレーションされた細胞及びＳＭ－ＦＰ連結エピトープタグについての免疫染色を示す嗅球の低倍率画像。スケールバー：１００μｍ。 Ｆ）ニューロン当たり単一のＳＭ－ＦＰエピトープタグの発現を示すＥからの細胞の高倍率画像。スケールバー：１０μｍ。Ｇ）膨張顕微鏡法の概略図及び明視野画像例。Ｈ）トランスジェニック細胞のＮｆ１及びＳＭ－ＦＰ－ｍｙｃ標識の同時ノックダウンのためのｐＤｏｎｏｒ ＳＭ－ＦＰ－ｍｙｃ ｓｈ．Ｎｆ１ ｍｉＲ－Ｅプラスミド。Ｉ）レポーター標識細胞の２つの集団（ＥＧＦＰ及びＳＭ－ＦＰ－ｍｙｃ）を示すエレクトロポレーションされた線条体の画像（すなわち、Ｎｆ１ノックダウン細胞）。Ｊ）膨張前ＳＭ－ＦＰ－ｍｙｃ細胞体。Ｋ）Ｊにおける細胞の膨張後。Ｌ）「超分解能」細部を示す膨張後ＥＧＦＰアストロサイト。Ｍ）ＭＡＴＲ（３次リコンビナーゼでのモザイク分析）のためのｐＤｏｎｏｒ－ＴａｇＢＦＰ２－Ｐ２Ａ－ＶＣｒｅ及びＦｌＥｘ ＶＣｒｅレポータープラスミドの概略図。Ｎ）ＦｌｐＯ－２Ａ－Ｃｒｅ、ｐＤｏｎｏｒ－ＴａｇＢＦＰ２、ＨｙｐＢａｓｅ及びＦｌＥｘ ＶＣｒｅレポーターを有するエレクトロポレーションされた線条体。スケールバー：５０μｍ。Ｏ）ＦｌｐＯ－２Ａ－Ｃｒｅ、ｐＤｏｎｏｒ－ＴａｇＢＦＰ２－２Ａ－ＶＣｒｅ、ＨｙｐＢａｓｅ及びＶＣｒｅ依存性ＦｌＥｘレポーター（ＳＭ－ＦＰ－ｍｙｃ）を示すＦｌＥｘ ＶＣｒｅレポーターを有するＮに示されたマウスの同腹仔の線条体。スケールバー：５０μｍ。 図２－１の説明を参照されたい。 図２－１の説明を参照されたい。 パネルＡ～Ｍは、ＭＡＤＲ遺伝子組み換えを使用する機能喪失操作を示している。Ａ）ＴａｇＢＦＰ２レポーターに連結されたＮｆ１、Ｐｔｅｎ、及びＴｒｐ５３に対するｍｉＲ－Ｅ ｓｈＲＮＡのためのドナーコンストラクト。Ｂ）ｑＰＣＲによるｍｕｌｔｉ－ｍｉＲ－Ｅ機能のノックダウン有効性の検証。Ｃ）ＴａｇＢＦＰ２＋細胞の過形成があるが腫瘍はないことを示す６か月齢マウスの矢状断面。スケールバー：１ｍｍ。Ｄ）ＴａｇＢＦＰ２－Ｖ５レポータータンパク質及びＳｐＣａｓ９のＭＡＤＲ用のプラスミド。Ｅ）ＴｄＴｏｍａｔｏ－／ＥＧＦＰ－神経膠腫細胞のシーケンシングは、Ｎｆ１及びＴｒｐ５３におけるインデルを示す。上から下までそれぞれ配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６。Ｆ）共エレクトロポレーションされたＰＣＲ由来ｓｇＲＮＡを伴うＴａｇＢＦＰ２－Ｖ５レポーター及びＣａｓ９のＭＡＤＲ挿入は、両方の半球の冠状断面において３つの遺伝子レポーターで画定された集団の標識により観察可能な高悪性神経膠腫を生成する。スケールバー：１０００μｍ。Ｇ）神経膠腫細胞は概ね、有意な不均一性の小さな領域（白色の矢印）を有するＯｌｉｇ２＋である。スケールバー：１０００μｍ。Ｈ）図３Ｇにおいて白色の矢印によって示される領域に焦点を当てた高倍率Ｏｌｉｇ２及びｔｄＴｏｍａｔｏ画像。スケールバー：１００μｍ。Ｉ）ＣＤ４４間葉腫瘍マーカーについて陽性を示す、図３Ｈからのおおよそ隣接した断面及び領域におけるＣＤ４４及びｔｄＴｏｍａｔｏ免疫染色。スケールバー：１００μｍ。Ｊ）ＳＭ＿ＦＰ－ｍｙｃレポータータンパク質及びＦＮＬＳ Ｃａｓ９ｎ塩基エディターのＭＡＤＲ用のプラスミド。Ｋ）ｓｇＲＮＡ標的化部位（緑色の文字）は、Ｃ→Ｔ塩基変換（赤色の小文字「ｃ」が標的とされる）を誘発して、Ｎｆ１、Ｔｒｐ５３、及びＰｔｅｎにおいて未成熟終止コドンを生成する。上から下までそれぞれｓｇＲＮＡ標的化部位を含む配列である配列番号７、配列番号８、配列番号９。上から下までそれぞれペプチドである配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５。Ｌ）共エレクトロポレーションされたＰＣＲ由来ｓｇＲＮＡを伴うｍｙｃレポーター及びＦＮＬＳ Ｃａｓ９ｎのＭＡＤＲ挿入は、冠状断面において３つの遺伝子レポーターで画定された集団の標識によりＥＰから２か月後にＯＰＣ前駆体の観察可能な増殖をもたらす。スケールバー：１０００μｍ。Ｍ）ｍｙｃ＋集団を示す高倍率ｔｄＴｏｍａｔｏ（１）、ＥＧＦＰ（２）、及びＭｙｃタグ（３）画像。スケールバー：１００μｍ。 図３－１の説明を参照されたい。 図３－１の説明を参照されたい。 パネルＡ～Ｌは、ＨｒａｓＧ１２Ｖでのｉｎ ｖｉｖｏ ＭＡＤＲを使用する体細胞神経膠腫の生成が、このがん遺伝子の投与効果を示し、ヒトがん融合タンパク質が上衣腫瘍を生成することを示唆している。Ａ～Ｂ）Ｅ１４．５ ＲＣＥ＋／－母親へのＭＡＤＲの子宮内ＥＰのための概略図。Ｃ）ＨｒａｓＧ１２Ｖがん遺伝子でのＲＣＥマウスにおける子宮内ＥＰは、ＴａｇＢＦＰ＋アストロサイトＲｏｓａ２６ＨｒａｓＧ１２のモザイクパッチを生成するが、侵襲性神経膠腫の形跡はない。Ｄ）ホモ接合型ｍｔ／ｍｇレシピエントマウスにおけるＭＡＤＲ後の可能性のある帰結の概略図。Ｅ）ホモ接合型ｍｔ／ｍｇマウスのＴａｇＢＦＰ２－ＨｒａｓＧ１２Ｖがん遺伝子でのＰ２ ＥＰＦ）ＨｒａｓＧ１２Ｖがん遺伝子でのホモ接合型Ｒｏｓａ２６ｍＴｍＧのＰ２仔における出生後ＥＰは、２つの異なる腫瘍タイプをもたらす（青色のみのＲｏｓａ２６ＨｒａｓＧ１２Ｖ×２及び青色及び緑色のＲｏｓａ２６ＨｒａｓＧ１２Ｖ×１）。スケールバー：２ｍｍ。Ｇ）ＥＰから３か月後のホモ接合型ｍＴｍＧにおける代表的な腫瘍形成。青色のみのＲｏｓａ２６ＨｒａｓＧ１２Ｖ×２細胞は、青色及び緑色のＲｏｓａ２６ＨｒａｓＧ１２Ｖ×１よりも大きな腫瘍断面を占め、リン－Ｒｂ１タンパク質発現と相関している。スケールバー：１ｍｍＨ）Ｇからの領域１及び２の拡大画像は、リン酸化－Ｒｂ１発現が、青色のみの細胞と概ね相関することを示している。スケールバー：５０μｍ。Ｉ）上衣腫関連融合タンパク質の発現のためのプラスミド概略図。Ｊ）ＹＡＰ１－ＭＡＭＬ１Ｄのステッチ、ｐ１６／ｐ１９ Ｃａｓ９標的化は、上衣腫様腫瘍を誘導した。Ｋ）上衣腫ＭＡＤＲモデルマウスの生存分析Ｌ）３か月齢のＣ１１ｏｒｆ９５－ＲＥＬＡ、ｐ１６／ｐ１９ Ｃａｓ９標的化マウスにおける上衣腫様腫瘍。 図４－１の説明を参照されたい。 図４－１の説明を参照されたい。 図４－１の説明を参照されたい。 パネルＡ～Ｑは、小児ＧＢＭで観察される再発性変異を利用するＭＡＤＲ神経膠腫モデルの生成が、ヒトサブタイプと一致する表現型をもたらすことを示している。Ａ）複数の再発性小児神経膠腫ドライバー変異を有するＭＡＤＲのためのドナープラスミドの概略図。Ｂ）線条体及び皮質の初期割れ目を同時に標的とするために用いられるプラスミド送達及び電極スイープの概略図。Ｃ）標的とされたそれぞれの皮質（マゼンタ）及び線条体（橙色）の胚ニッチを示すＢからの拡大図。Ｄ）ＥＰから１００日後のヘテロ接合型ｍＴｍＧにおける代表的な腫瘍形成。大きな線条体腫瘍からの核ＥＧＦＰ＋Ｒｏｓａ２６Ｈ３ｆ３ａ－Ｋ２７Ｍ／Ｐｄｇｆｒａ／Ｔｒｐ５３細胞。挿入図Ｄ－１は、有意な皮質浸潤の欠如を示している。Ｅ）同腹子Ｒｏｓａ２６Ｈ３ｆ３ａＧ３４Ｒ／Ｐｄｇｆｒａ／Ｔｒｐ５３は、線条体及び皮質におけるグリア過形成を示すが、明らかな腫瘍はない。Ｆ）ＥＰから１２０日後におけるＫ２７Ｍ腫瘍は主に皮質下にある。Ｇ）ＥＰから１２０日後における皮質浸潤Ｇ３４Ｒ腫瘍。Ｈ～Ｉ）低倍率（Ｈ）及び高倍率（Ｉ）でのＫ２７Ｍ腫瘍の共焦点病理。Ｊ）Ｇ３４Ｒ腫瘍の低倍率病理。Ｋ）Ｐｄｇｆｒａ Ｄ８４２Ｖ及びＴｒｐ５３ Ｒ２７０Ｈをすべてが含有するＨ３．３．群（ＷＴ：青色、Ｋ２７Ｍ：緑色、及びＧ３４Ｒ：赤色）にわたる生存の比較。Ｌ）Ｋ２７Ｍ対Ｇ３４Ｒ腫瘍の部位のチャート。＊Ｇ３４Ｒ群における腫瘍成長のより遅い開始及びそれらの一貫性のない生存時間のため、我々は、初期腫瘍部位を決定的に解明するために死亡前に７つのＧ３４Ｒサンプルのうち２つを収集することができなかった。Ｍ～Ｎ）Ｋ２７Ｍ及びＧ３４Ｒプラスミドの共エレクトロポレーションのための実験概略図。Ｏ～Ｐ）連続断面における共エレクトロポレーションされた腫瘍のＧ３４Ｒ及びＫ２７Ｍ免疫染色。（ＳＭ＿ＦＰ－ｍｙｃが挿入図で示されている。）Ｑ）腫瘍からの正規化された細胞数の定量。 図５－１の説明を参照されたい。 図５－１の説明を参照されたい。 図５－１の説明を参照されたい。 パネルＡ～Ｌは、ＭＡＤＲ神経膠腫モデルのシングルセルＲＮＡシーケンシングベースの分析を示している。Ａ）細胞解離及びｓｃＲＮＡ－ｓｅｑの概略図。Ｂ）（Ｆｉｌｂｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８）からのＨＶＧプログラムＰ１－４に基づくクラスター毎に着色された３つの異なる腫瘍からの３つのＭＡＤＲマウスＫ２７ＭのｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータセットのＣＣＡアライメントを示すＵＭＡＰ。Ｃ）マウスＫ２７Ｍ細胞のバイアスのないクラスタリングから現れるマーカー遺伝子を示すヒートマップ。Ｄ）マウスＫ２７Ｍ腫瘍のＣＣＡからのプログラム及び発現特徴プロット。Ｅ）クラスター毎に着色された６つの異なる腫瘍からの６つのヒトＫ２７Ｍデータセット（Ｆｉｌｂｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８）のＣＣＡアライメントを示すＵＭＡＰＦ）ヒトＫ２７Ｍ細胞のバイアスのないクラスタリングから現れるマーカー遺伝子を示すヒートマップ。Ｇ）ヒトＫ２７Ｍ腫瘍のＣＣＡからのプログラム及び発現特徴プロット。Ｈ）クラスター毎に着色された３つのＭＡＤＲマウスＫ２７Ｍデータセット及び６つのヒトＫ２７Ｍデータセット（Ｆｉｌｂｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８）のＣＣＡアライメントを示すＵＭＡＰ。Ｉ）組み合わされたマウス及びヒトのＫ２７Ｍ腫瘍のＣＣＡからのプログラム及び発現特徴プロット。Ｊ）サンプル毎に着色されたマウス及びヒトの脳からの９つのＫ２７ＭデータセットのＣＣＡアライメントを示すＵＭＡＰ。Ｋ）（Ｆｉｌｂｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８）からの遺伝子リストを使用したヒートマップは、ネズミ科動物及びヒトのＫ２７Ｍ神経膠腫細胞の間の遺伝子発現の高い一致を示している。Ｌ）ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑに由来する増殖指標は、マウスとヒトのサンプル間で同等である。 図６－１の説明を参照されたい。 パネルＡ～Ｎは、Ｈ３．３ Ｋ２７Ｍ転写ネットワーク及びｓｎＡＴＡＣ－ｓｅｑ分析を示している。Ａ）ヒトＫ２７Ｍ細胞のＳＣＥＮＩＣ二元レギュロンベースのクラスタリングから明らかになるマーカー遺伝子を示すヒートマップ。Ｂ）マウスＫ２７Ｍ細胞からのＳＣＥＮＩＣヒートマップ。Ｃ）ヒトＫ２７ＭサンプルからのＥＺＨ２、Ｅ２Ｆ１、ＭＹＢＬ１、及びＢＲＣＡ１についてのレギュロン発現を示す二元化ｔ－ＳＮＥ。Ｄ）マウスＫ２７ＭサンプルからのＥｚｈ２、Ｅ２ｆ１、Ｍｙｂｌ１、及びＢＲＣＡ１についてのレギュロン発現を示す二元化ｔ－ＳＮＥ。Ｅ～Ｆ）Ｃ及びＤにおける遺伝子についてのｍＲＮＡ発現特徴プロットを示すｔ－ＳＮＥ。Ｃ及びＤにおけるレギュロンと比較したクラスター特異性の欠如に留意されたい。Ｇ～Ｈ）細胞タイプ特異的上方制御ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＭＹＣ標的遺伝子、及び胚性幹細胞（ＥＳ）関連遺伝子セット及びＰＲＣ２、ＳＵＺ１２、ＥＥＤ、及びＨ３Ｋ２７結合遺伝子セットの下方制御（Ｇ）ならびにマウスにおける類似遺伝子／遺伝子セット（Ｈ）を示すｔ－ＳＮＥ特徴プロット。Ｉ）ｓｎＡＴＡＣ－ｓｅｑサンプル調製の概略図。Ｊ）Ｐ５０、Ｋ）Ｅ１８、及びＬ）Ｋ２７Ｍマウス脳からのｓｃ－及びｓｎＡＴＡＣデータセットのｔＳＮＥ。Ｍ）ｓｎＡＴＡＣ－ｓｅｑ Ｋ２７Ｍ腫瘍細胞からのＭＳｉｇＤＢ条項。Ｎ）ｓｎＡＴＡＣ－ｓｅｑ、ｓｃＡＴＡＣ－ｓｅｑ、及びバルクＡＴＡＣ－ｓｅｑのゲノムブラウザアライメント。＊腫瘍ＭＧは、Ｋ２７Ｍ細胞と共に捕捉されたｓｎＡＴＡＣ－ｓｅｑミクログリアクラスターの重ね合わせた（赤色／黒色）アライメントである。ＮＰＣ：出生後神経前駆体細胞、Ｋ２７Ｍ ＡＴＡＣ：バルクマウスＫ２７Ｍ腫瘍細胞。 図７－１の説明を参照されたい。 パネルＡ～Ｎは、ＦＡＣＳ分析によるヘテロ接合型ｍＴｍＧｍＮＳＣにおけるＭＡＤＲ効率の測定、非クローン集団レベルでの正確なタンパク質翻訳の確認、誘導性ＭＡＤＲ、及びＭＡＤＲ「代用」株を示しており、図１に関連する。この研究で用いられたリコンビナーゼ発現プラスミド（及びミニサークル）の概略図。Ａ）ＦＡＣＳ分析は、神経幹細胞におけるおおよそのＭＡＤＲ効率を示しており、それらの触媒的効率におけるＦｌｐ－２Ａ－ＣｒｅとＦｌｐ－ＩＲＥＳ－Ｃｒｅとの間の明らかな差はないことを示している。Ｂ）選別された細胞は、ＨｒａｓＧ１２Ｖを発現するが、ｔｄＴｏｍａｔｏまたはＥＧＦＰを発現しない。スケールバー：５０μｍ。Ｃ）非クローン性凝集細胞からの正常な導入遺伝子生成及びＦＡＣＳ陰性集団におけるその欠如を示すウエスタンブロット。ｔｄＴｏｍａｔｏ発現の除去も観察される。Ｄ）示された部位でＰＣＲ分析に供されるプラスミド及びアレルの概略図。Ｅ）ＰＣＲスクリーニング分析は、ｒｔＴＡ－Ｖ１０－ＡＵ１カセットが、ピューロマイシン処置に抵抗性の細胞においてＣＡＧプロモーターの下流に正確に組み込まれていることを明らかにしている。Ｆ）ドキシサイクリン誘導によるｒｔＴＡ－Ｖ１０－ＡＵ１及びさらにＥＧＦＰの発現を示す、図２Ｃからの細胞株のウエスタンブロット分析Ｇ）ＭＡＤＲ適合性ＴＲＥ－ＥＧＦＰプラスミドＨ）ヘテロ接合型ｍＴｍＧ ｍＮＳＣは、ピューロマイシンで処置されたＧにおけるプラスミドでヌクレオフェクションされ、無色の集団に変化する。スケールバー：１０μｍ。Ｉ）ｒｔＴＡ－Ｖ１０－ＡＵ１を構成的に発現する細胞株におけるＥＧＦＰ発現の誘導スケールバー：５０μｍ。Ｊ）ドキシサイクリン処置をするとＥＧＦＰ及びＤｌｌ１を発現する二方向性ｔｅｔ－反応要素を有するＴＲＥ細胞株。Ｋ）Ｄｏｘを用いないまたは用いた細胞の免疫蛍光は、漏出の相対的欠如ならびにＥＧＦＰ及びｍＤｌｌ１の均質な発現レベルを示している。スケールバー：２０μｍＬ）培地へのＤｏｘ添加の前及び後のｍＲＮＡ存在量のｑＰＣＲ測定。（対照プラスミドは、ｍＤｌｌ１ ＣＤＳを欠くが、それ以外はＫにおけるプラスミドと同一である。）Ｍ）ｉｎ ｖｉｔｒｏでＭＡＤＲコンストラクトを試験するためのｍＴ／ｍＧベースの「代用」細胞株。マウスＮ２ａ細胞は、ＲＯＳＡ２６ ｍＴ／ｍＧを修飾するために使用されたものと同じプラスミドでＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９－依存性相同性依存修復（ＨＤＲ）を受けた。その後のＭＡＤＲ形質導入及び選別を使用して代替レポーター株をクローニングした。Ｎ）マウスＮ２ａ細胞をＲＯＳＡ２６遺伝子座におけるＣＡＧ－ＬＦ－ｍＴＦＰ１の安定挿入を用いて生成した。この株のｄＲＭＣＥを示すためにＦｌｐＯ－２Ａ－Ｃｒｅ及びｐＤｏｎｏｒ ｍＳｃａｒｌｅｔが使用される。 図８－１の説明を参照されたい。 図８－１の説明を参照されたい。 図８－１の説明を参照されたい。 図８－１の説明を参照されたい。 パネルＡ～Ｎは、組み込みの特異性を確認するｉｎ ｖｉｖｏ ＭＡＤＲ及び対照実験の特性化を示しており、図２に関連する。Ａ）ＥＰから２日後に、細胞はＴａｇＢＦＰ２を発現し始める。スケールバー：５０μｍ、挿入図：１０μｍ。Ｂ）ＥＰから２週間後のグリア新生及び放射状グリア。矢印は、ＶＺにおけるまれな緑色及び青色の二重陽性細胞を示している。両方のマーカーを有するニューロンは、この時点でＯＢにおいて観察され得る。スケールバー：１００μｍ、挿入図：２０μｍ。Ｃ）ＥＰから１週間後のＥＧＦＰ（ｍＧ）及びＴａｇＢＦＰ（ＭＡＤＲ）を示す共焦点ｚスタックの投影。Ｄ）Ｃに示される同じ領域のＦｏｘｊ１免疫染色。ＶＺ領域に沿って局在化した核標識に留意されたい。＊「マウスオンマウス」免疫染色による血管染色。Ｅ）ＥＧＦＰ（ｍＧ）がないことを示す、ＭＡＤＲ ＴａｇＢＦＰ単一陽性放射状グリア細胞。Ｆ）３つのＭＡＤＲ ＴａｇＢＦＰ及びＥＧＦＰ（ｍＧ）二重陽性細胞：すべてＦｏｘｊ１転写因子を発現する。ＴａｇＢＦＰ及びＥＧＦＰ発現の逆相関があるようであることに留意されたい。Ｇ）Ｆからの白色ボックスの拡大は、最も明るいＭＡＤＲ標識を有する細胞が最も暗いＥＧＦＰを有することを示している。Ｈ）ｔｄＴｏｍａｔｏ及びＥＧＦＰについて陰性である一対のＴａｇＢＦＰ２＋サテライトグリアの高倍率共焦点画像。スケールバー：１０μｍＩ）図２Ｄに示されるプラスミドタイトレーション定量のＶＺからのＳＭ＿ＦＰ－ＨＡ（ドナー）、ＥＧＦＰ（ｍＧ）、及びＴａｇＢＦＰ２－ｎｌｓ（青色）の代表的画像。Ｊ）ｈｙＰＢａｓｅが組み込まれたＥＧＦＰレポーターに加えて様々なドナーベクター及びリコンビナーゼを伴うＶＺ／ＳＶＺにおけるエレクトロポレーションされた細胞の系統追跡は、ＥＰから２週間後までにいかなる組み込みも示さない。スケールバー：１００μｍ。Ｋ）反転したｌｏｘＰ配向を有するドナーベクターは、ＨｒａｓＧ１２Ｖを発現することができず、過形成をもたらさない。（組み込まれたプラスミドの同じ時点での比較については、図１１Ａ参照）スケールバー：１００μｍ。上及び下はそれぞれ配列番号１６、配列番号１７。Ｌ）Ａｌｅｘａ７５０フルオロフォアを使用してスペクトル柔軟性を増加させるための５色の画像化の例。Ｍ）４０５チャンネルの抗ＥＧＦＰ、４８８チャンネルの抗Ｏｌｉｇ２、及び５５５チャンネルの抗Ｐｄｇｆｒａで免疫染色されたｍＴ／ｍＧ脳のステッチ。Ｈ１）強いｔｄＴｏｍａｔｏ自己蛍光に留意されたい。Ｎ）有意に減少したｍＴ ｔｄＴｏｍａｔｏ自己蛍光Ｉ１）を示す、漂白後の同じ脳のステッチ。漂白による４８８波長における検出可能なＥＧＦＰシグナルの同様の欠如に留意されたい。 図９－１の説明を参照されたい。 図９－１の説明を参照されたい。 図９－１の説明を参照されたい。 図９－１の説明を参照されたい。 パネルＡ～Ｇは、ｉｎ ｖｉｖｏ ＭＡＤＲの機能喪失系統の特性化及びＣＲＩＳＰＲとの比較を示しており、図３に関連する。Ａ）ＥＰ後３か月後の時点で、ＴａｇＢＦＰ２レポーターに連結されたｍｕｌｔｉ－ｍｉＲ－Ｅを発現する細胞は、主にＰｄｇｆｒａ＋ＯＰＣである。スケールバー：１００μｍ。Ｂ）ｍｕｌｔｉ－ｍｉＲ－Ｅ ＭＡＤＲマウスの嗅球におけるＴａｇＢＦＰ２＋ニューロン。Ｃ～Ｄ）Ｎｆ１、Ｔｒｐ５３、及びＰｔｅｎのエピソーマルＣａｓ９媒介多重変異は、白質路の近くに局在化したＯｌｉｇ２＋腫瘍へのｐｉｇｇｙＢａｃ転移ＥＧＦＰ＋細胞の形質転換をもたらす。Ｅ）Ｖ５＋腫瘍由来細胞集団は、腫瘍の病巣領域においてＴｄｔｏｍａｔｏ＋血管系に並存していることが分かる。Ｆ）シーケンシングされたアンプリコンのゲノムアライメントを使用した、Ｐｔｅｎにおける未成熟終止コドンを誘導するための塩基編集の確認。Ｇ）Ｃｒｉｓｐｒｉ（ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ－ＭｅＣＰ２）またはＣａｓ１３／ＲＸによるノックダウン、またはＨｉＦｉ ＥｓｐＣａｓ９でのノックアウト／ゲノム編集のために生成されたＭＡＤＲ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９バリアント適切なｓｇＲＮＡバリアントを発現するためのＵ６／ｍｉＲＦＰ６７０レポータープラスミドは、シームレスなｓｇＲＮＡクローニング及び発現のためのＢｓｍＢＩ ＩＩ型制限酵素用の部位を伴って構築された。ＣＳ－二重ＢｓｍＢＩクローニングサイト。 図１０－１の説明を参照されたい。 図１０－１の説明を参照されたい。 パネルＡ～Ｌは、ＭＡＤＲ神経膠腫及び上衣腫の細胞運命の変化及び移動動態の調査を示しており、図４に関連する。Ａ）ＴａｇＢＦＰ２＋領域においてＳｏｘ９／Ｇｆａｐ＋グリオーシスを示すＲＣＥベースのＨｒａｓＧ１２Ｖモザイク。Ｂ１及びＢ２）Ｒｉｂｏｔｒａｐヘテロ接合体を使用して系統追跡研究または直交ＲＮＡ単離を可能にするためのｉｎ ｖｉｖｏ ＭＡＤＲと潜在的に適合性のあるマウス株。また、この方法は、例として、重要なエクソンの近くでｌｏｘＰ及びＦＲＴを挟む何千もの遺伝子トラップマウスに拡大適用され得る。そのような遺伝子座でのｉｎ ｖｉｖｏ ＭＡＤＲは、ｉ）その遺伝子座におけるヘテロ接合型／ホモ接合型ヌル細胞の系統追跡、及びｉｉ）その遺伝子座を導入遺伝子と交換することを可能にするであろう。Ｂ１）上から下までそれぞれ、配列番号１８－最小ＦＲＴ配列、配列番号１９－ＦＲＴ配列、配列番号１８－最小ＦＲＴ配列、配列番号１８－最小ＦＲＴ配列、配列番号１８－最小ＦＲＴ配列。Ｂ２）上から下までそれぞれ、配列番号１８－最小ＦＲＴ配列、配列番号１８－最小ＦＲＴ配列。Ｃ）ＥＰから２週間後は、ｔｄＴｏｍａｔｏカセットのＣｒｅ媒介切除を受けたＥＧＦＰ＋細胞と成功裏のＭＡＤＲを用いたＨｒａｓＧ１２Ｖ＋細胞との間の明らかな系統相違を示している。スケールバー：１００μｍ。Ｄ）ＥＰ混合物において１０ｎｇ／μｌという少ないリコンビナーゼ－発現ベクターでもｉｎ ｖｉｖｏでＭＡＤＲを触媒し得る。スケールバー：１００μｍ。Ｅ）ｐＢａｓｅ媒介組み込み後のより明るいＥＧＰＦ－ＨｒａｓＧ１２Ｖ細胞は、リン酸化Ｒｂ１を発現する。スケールバー：２００μｍＦ～Ｊ）ｐＤｏｎｏｒ－（Ｅ）Ｋｒａｓ Ｇ１２Ａ、（Ｆ～Ｇ）ＹＡＰ１－ＭＡＭＬ１Ｄ、または（Ｈ）Ｃ１１ｏｒｆ９５－ＲＥＬＡのエレクトロポレーションから１か月後の線条体グリア新生。Ｋ～Ｌ）これらの腫瘍の浸潤の欠如を示す上衣腫の活動的縁部の高倍率。 図１１－１の説明を参照されたい。 図１１－１の説明を参照されたい。 図１１－１の説明を参照されたい。 図１１－１の説明を参照されたい。 パネルＡ～Ｘは、マルチシストロン性腫瘍、二次要素、及び生存性スクリーンの特性化を示しており、図５に関連する。Ａ）ヘテロ接合型ｍＴｍＧ ｍＮＳＣにおけるＭＡＤＲ後の導入遺伝子発現のｉｎ ｖｉｔｒｏ評価は、核ＥＧＦＰのＰｄｇｆｒａ、Ｖ５（Ｔｒｐ５３Ｒ２７０Ｈ）、及びＰ５３との共発現を示している。ｍＧ細胞の膜ＥＧＦＰでの混入の存在及びｔｄＴｏｍａｔｏまたは導入遺伝子発現がないことに留意されたい。スケールバー：５０μｍ。Ｂ）核ＥＧＦＰ（Ｈ３ｆ３ａ）とのＴｒｐ５３共発現の確認。スケールバー：５０μｍ。Ｃ）Ｋ２７Ｍを発現する系統の腫瘍前段階を示す冠状断面（核ＥＧＦＰ、及びｍＧ ＥＧＦＰ－膜ＥＧＦＰ）Ｄ～Ｇ）適切な抗体での特異的な免疫標識によってそれぞれの導入遺伝子の発現を確認する、抗Ｈ３ｍｕｔＫ２７Ｍ及び抗Ｈ３ｍｕｔＧ３４Ｒ抗体でのＫ２７Ｍ（Ｄ、Ｇ）及びＧ３４Ｒ（Ｅ～Ｆ）腫瘍の免疫染色。Ｈ）共エレクトロポレーションされた動物（Ｋ２７Ｍ及びＧ３４Ｒを含有するプラスミド）におけるＫ２７Ｍ及びＧ３４Ｒの二重免疫染色は、細胞当たり１つのみのＨ３ｆ３ａ変異体バリアントの発現を確認する。Ｉ）Ｒｏｓａ２６Ｈ３ｆ３ａＧ３４Ｒ／Ｐｄｇｆｒａ／Ｔｒｐ５３ ＥＧＦＰ＋腫瘍細胞は、Ｈ３Ｋ２７で低メチル化されている。Ｊ）腫瘍縁部の高倍率図。Ｋ）Ｋ２７Ｍ変異体腫瘍細胞の免疫標識は、核周囲衛星病変及び隣接するニューロンと比較して減少したＨ３Ｋ２７Ｍｅ標識を実証している。Ｌ）ＧＢＭを誘導するためのＮｆ１／Ｔｒｐ５３のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９標的化は、減少したＨ３Ｋ２７Ｍｅ３をもたらさない。Ｍ～Ｎ）Ｈ３Ｋ２７Ａｃが腫瘍細胞において観察されるが、標識の強度は、周囲の野生型細胞と比較して顕著に増加しない。Ｏ～Ｑ）Ｋ２７Ｍ腫瘍細胞におけるＢｍｉ１上方制御の低倍率（Ｏ～Ｏ２）及び高倍率画像（Ｐ～Ｑ）。矢印は浸潤性細胞を指しており、点線は腫瘍縁部を示している。Ｐ）浸潤性Ｋ２７Ｍ細胞が血管に並存していることを示すＯ～Ｏ１における領域の最大投影。Ｒ）縁部におけるサブセットＫ２７Ｍ及びＧ３４Ｒ変異体細胞は、アストロサイトマーカーＡｌｄｈ１ｌ１で免疫標識しており、肥大を呈し得る。Ｓ）Ｋ２７Ｍ及びＧ３４Ｒ変異体細胞のサブ集団は、オリゴデンドロサイトマーカーＣｓｐｇ４を発現する。Ｔ）神経膠腫の同時生成及びＡｋａｌｕｃを用いた腫瘍成長の非侵襲性画像化のためのＭＡＤＲプラスミドの概略図。Ｕ）Ｔからのプラスミドでエレクトロポレーションされ、アカルミンが注射された同腹子と並べた対照動物。Ｖ）異なる蛍光タンパク質を用いた細胞周期事象の区別のためのＰＩＰデグロン融合体及びｈＧＥＭ１／１１０融合体を含有するＭＡＤＲ ＦＵＣＣＩバリアント。バリアントはまた、神経膠腫の同時生成及び近赤外蛍光タンパク質を用いた細胞周期事象の区別のために生成された。画像は、Ｖｅｎｕｓ／ｍＣｈｅｒｒｙ ＭＡＤＲ ＦＵＣＣＩプラスミドの安定挿入を伴うＮ２ａ代用株を示している。Ｗ）ｔｄＴｏｍａｔｏ＋ＮＰＣ及びＥＧＦＰ＋腫瘍集団の誘導のための概略図は、同時の「対をなした」毒性スクリーニングのための同じ顕微解剖を形成する。Ｘ）Ａｋｔ１／２キナーゼ阻害剤は、ＮＰＣ及びＭＡＤＲ Ｋ２７Ｍ集団の両方で増殖を減少させるのに対し、Ｖａｃｑｕｉｎｏｌ－１は、Ｋ２７Ｍ腫瘍集団で優先的に増殖を減少させる。結果は、４つの生物学的複製から組み合わされ、各細胞タイプの２つの独立した株の代表である。 図１２－１の説明を参照されたい。 図１２－１の説明を参照されたい。 図１２－１の説明を参照されたい。 パネルＡ～Ｍは、ＭＡＤＲ変異体モデルのシングルセルＲＮＡ－ｓｅｑを示しており、図６に関連する。Ａ）３つのマウスＫ２７Ｍ腫瘍ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータセットのＣＮＶ分析。Ｂ）マウスＫ２７Ｍ腫瘍のＣＣ１及びＣＣ２ベクターアライメント。Ｃ）ＣＣにわたるマウスＫ２７Ｍ腫瘍のＢｉｗｅｉｇｈｔ ｍｉｄｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎプロット。Ｄ）サンプル毎に着色されたマウス脳からの３つのＫ２７ＭデータセットのＣＣＡアライメントを示すＵＭＡＰ。Ｅ）マウスＫ２７Ｍ腫瘍における遺伝子の発現を示す特徴プロット。Ｆ）Ｆｉｌｂｉｎ ｅｔ ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１８）からのヒトＫ２７Ｍ ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ腫瘍のＬｏｕｖａｉｎクラスタリング。Ｇ）ＣＣＡに移行する前にフィルタリングされたクラスターを示すＣＳＦＩ１Ｒ発現マップ。Ｈ）ＣＣＡに移行する前にフィルタリングされたクラスターを示すＭＯＧ発現マップ。Ｉ）フィルタリング後のヒトＫ２７Ｍ腫瘍のクラスタリング。Ｊ）ＣＣにわたるヒトＫ２７Ｍ腫瘍のＢｉｗｅｉｇｈｔ ｍｉｄｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎプロットＫ）サンプル毎に着色されたＣＣＡアライメントヒトＫ２７Ｍ腫瘍のＵＭＡＰ。Ｌ）ヒトＫ２７Ｍ腫瘍における遺伝子の発現を示す特徴プロット。Ｍ）すべてのサンプルのＣＣＡ（すなわち、図６Ｈ）から分割され、オリジナルサンプル毎に示されたプログラム特徴プロット。Ｆｉｌｂｉｎ ｅｔ ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１８）からのプログラムではなく、高可変遺伝子によるクラスタリングは、選択されたクラスタリングパラメータに応じてわずかに変化したクラスタリングをもたらす。 図１３－１の説明を参照されたい。 図１３－１の説明を参照されたい。 図１３－１の説明を参照されたい。 パネルＡ～Ｚは、ＭＡＤＲ変異体モデルのＳＣＥＮＩＣ、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３ ＣｈＩＰ－ｓｅｑ、及びｓｎＡＴＡＣ－ｓｅｑ分析を示しており、図７に関連する。（Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ、Ｉ）ＳＣＥＮＩＣ処理したＫ２７Ｍヒト腫瘍細胞のｔ分布型確率的近傍埋め込み（ｔ－ＳＮＥ）。（Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｊ）Ｋ２７Ｍマウス腫瘍細胞のＳＣＥＮＩＣ由来ｔ－ＳＮＥ。サンプルは、サンプル（Ａ、Ｂ；すなわち、患者またはマウス）、細胞タイプ（Ｃ、Ｄ）、Ｓ期スコア（Ｅ、Ｆ）、Ｇ２Ｍ期スコア（Ｇ、Ｈ）、及び重複細胞周期期（Ｉ、Ｊ）毎にグループ化されている。Ｋ）腫瘍解離及び下流分析、例えば、Ｈ３Ｋ２７Ｍｅ３についてのｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ、ｓｃＡＴＡＣ－ｓｅｑ、またはＣｈＩＰ－ｓｅｑのための一般的なワークフロー。ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ分析及びＣｈＩＰ－ｓｅｑのために同じ腫瘍源を使用したが、独立した腫瘍をｓｃＡＴＡＣ－ｓｅｑサンプルのために使用したことに留意されたい。Ｌ）３つのマウスＫ２７Ｍ腫瘍からのＨ３Ｋ２７Ｍｅ３ ＣｈＩＰ－ｓｅｑデータのクラスタリングＭ）Ｌにおけるクラスターからの遺伝子についてのｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ由来ＵＭＡＰのスコアリングＮ）付番したクラスターを有するＰ５０脳からのｓｃＡＴＡＣ－ｓｅｑデータセットのｔＳＮＥＯ）オリゴデンドロサイト（Ｍｏｇ）、ＯＰＣ（Ｐｄｇｆｒａ）、アストロサイト（Ａｑｐ４）、ミクログリア（Ｃ１ｑｂ）、ニューロン（Ｓｎａｐ２５）、及び介在ニューロン（Ｇａｄ２、Ｐｖａｌｂ、Ｓｓｔ）集団についてのマーカー遺伝子。各クラスターについての異なるシグナル対ノイズに留意されたい。Ｐ）標準的なクラスタリング後のＥ１８脳からの３つの組み合わされたｓｃＡＴＡＣ－ｓｅｑデータセットのｔＳＮＥ。Ｑ）Ｈａｒｍｏｎｙアライメント後のＰからのサンプルのｔＳＮＥ。Ｒ）番号付けされたクラスターを有するＥ１８データセットのｔＳＮＥ。Ｓ）Ｓｏｘ９（アストロサイト／幹細胞）、Ｏｌｉｇ２（幹細胞／オリゴデンドロサイト系統）、Ｃｓｆ１ｒ（ミクログリア）、及びＧｆａｐ（アストロサイト）についての遺伝子アクセス性。個別の集団に対してより限定され、グリアクラスターに明らかに関連するＧｆａｐと比較して、Ｓｏｘ９及びＯｌｉｇ２のミクログリアまたはグリア特異性についての明確な集団／クラスター分離の欠如に留意されたい。Ｔ）Ｋ２７Ｍ腫瘍細胞及び共捕捉自然免疫集団に由来するｓｃＡＴＡＣ－ｓｅｑデータセットのｔＳＮＥＵ）Ｓｏｘ９、Ｏｌｉｇ２、Ｃｓｆ１ｒ、及びＧｆａｐについての遺伝子アクセス性。この場合もまた、より高いアクセス性を示す、Ｇｆａｐと比較したＳｏｘ９及びＯｌｉｇ２の明確な集団／クラスター分離の欠如に留意されたい。Ｃｓｆ１ｒは、Ｓｏｘ９及びＯｌｉｇ２よりも著しくアクセス性が高く、自然免疫クラスターに関連する。Ｖ）Ｋ２７Ｍ腫瘍集団のＣｉｓＴｏｐｉｃ及びＣｅｌｌＲａｎｇｅｒベースのクラスタリングは、腫瘍及び免疫集団の微妙に異なるサブクラスタリングをもたらす。Ｗ）遺伝子アクセス性は、ミクログリア集団を明確に画定するが、Ｓｏｘ９及びＳｏｘ１０は、Ｐ５０正常脳とは異なり、腫瘍では共分離することができない。Ｘ）Ｓｏｘ１０（緑色）及びＳｏｘ９（赤色）を組み合わせたＫ２７Ｍ ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ特徴プロットは、Ｓｏｘ１０及びＳｏｘ９が、腫瘍クラスター全体にわたって、また、個々の細胞内でさえも高度に発現し、Ｗ及びゲノムブラウザデータ（図７Ｎ）における遺伝子アクセス性と一致することを実証しているＹ）Ｐ５０アストロサイト及びＯＰＣクラスターについてのｍＳｉｇＤＢ項目Ｚ）Ｋ２７Ｍ腫瘍クラスターからのＤＡＲが濃縮されたモチーフ。ＩＥＧ及びＥＳ関連ＴＦの濃縮に留意されたい。１．配列番号２０、２．配列番号２１、３．配列番号２２、９．配列番号２３、１２．配列番号２４、３０．配列番号２５、４１．配列番号２６、５６．配列番号２７；６１．配列番号２８、６２．配列番号２９、６４．配列番号３０、７１．配列番号３１、８５．配列番号３２、８６．配列番号３３、８９．配列番号３４、１００．配列番号３５。 図１４－１の説明を参照されたい。 図１４－１の説明を参照されたい。 図１４－１の説明を参照されたい。 図１４－１の説明を参照されたい。 図１４－１の説明を参照されたい。 図１４－１の説明を参照されたい。 図１４－１の説明を参照されたい。 図１４－１の説明を参照されたい。 図１４－１の説明を参照されたい。 ２つのレシピエントＨＥＫ代用細胞株及び２つのｐＤｏｎｏｒｓ ｍＳｃａｒｌｅｔ、よって、４つの実験条件におけるＭＡＤＲ、「ｌｏｘＰ」ＭＡＤＲにおけるＳＥＭＩ－Ｌｏｃｋｉｎ、及び「ｌｏｘＰ」ＭＡＤＲにおけるＬｏｃｋｅｄについて試験された条件の概略図を示している。 ＩｎｃｕＣｙｔｅタイムラプス顕微鏡でのトランスフェクションから１８及び２４時間後の通常のＭＡＤＲ及び「ｌｏｘＰ」ＭＡＤＲ－１におけるＳＥＭＩ－Ｌｏｃｋを示している（ＲＥ－ｌｏｘＰ変異体における赤色蛍光細胞の増加に留意されたい）。 ＩｎｃｕＣｙｔｅタイムラプス顕微鏡でのトランスフェクションから１８及び２４時間後の「ｌｏｘＰ」ＭＡＤＲにおけるＬｏｃｋ及び「ｌｏｘＰ」ＭＡＤＲ－２におけるＳＥＭＩ－Ｌｏｃｋを示している。（ＲＥ－ｌｏｘＰ変異体＋ＬＥ－ＬｏｘＰレシピエント状態における赤色蛍光細胞の増加に留意されたい） ＭＡＤＲ－１におけるＳＥＭＩ－Ｌｏｃｋ、ＭＡＤＲにおけるＬｏｃｋ、ＭＡＤＲ及び「ｌｏｘＰ」ＭＡＤＲ－２におけるＳＥＭＩ－Ｌｏｃｋの速度及び効率を示す結果の要約を示している。（変異したドナーを有する両方の条件は、より良好なＭＡＤＲ挿入を示したことに留意されたい。） ＭＡＤＲ－１におけるＳＥＭＩ－Ｌｏｃｋ及び「ｌｏｘＰ」ＭＡＤＲにおけるＬｏｃｋの比較を示している。 トランスフェクションから１８、２４、３０及び３６時間後のＭＡＤＲ－１におけるＳＥＭＩ－Ｌｏｃｋ、ＭＡＤＲにおけるＬｏｃｋを示しており、野生型ＬｏｘＰ部位と比較してＭＡＤＲ効率の顕著な増加を示している。 トランスフェクションから１８、２４、３０及び３６時間後のＭＡＤＲ－１におけるＳＥＭＩ－Ｌｏｃｋ、ＭＡＤＲにおけるＬｏｃｋを示しており、野生型ＬｏｘＰ部位と比較してＭＡＤＲ効率の顕著な増加を示している。 結合特性によるＭＡＤＲにおけるＱＵＡＳＩ Ｌｏｃｋを示している。 「ＦＲＴ」ＭＡＤＲ－１におけるＳＩＭＩ－Ｌｏｃｋ及びＭＡＤＲにおけるＱｕａｓｉ－Ｌｏｃｋの比較を示している。 ＩｎｃｕＣｙｔｅタイムラプス顕微鏡でのトランスフェクションから１２、１６、及び２０時間後の「ＦＲＴ」ＭＡＤＲ－１におけるＳＥＭＩ－Ｌｏｃｋ、Ｑｕａｓｉ－Ｌｏｃｋを示している。ＲＥ－ｌｏｘＰ変異体＋ＬＥ－ＦＲＴ変異体を保有するｐＤｏｎｏｒｓでのＭＡＤＲ挿入がより早いこと及びその増加に留意されたい）。矢じりは、赤色蛍光細胞を示している。 ＭＡＤＲ ｍＴ／ｍＧレシピエント細胞株及び示されたプラスミド要素を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏでのＡＡＶを使用した代表的なウイルスＭＡＤＲを示している。２つのＡＡＶウイルスを使用し、一方はＦｌｐＯ－２Ａ－Ｃｒｅを発現するのに対し、他方は非発現（反転）ＴａｇＢＦＰレポーター遺伝子を有する。ＴａｇＢＦＰは、単独で細胞に形質導入された場合、発現しないようである。しかしながら、ＦｌｐＯ－２Ａ－Ｃｒｅウイルスの存在下では、ＭＡＤＲレシピエント遺伝子座を有する細胞は、ｔｄＴｏｍａｔｏ及びＥＧＦＰ導入遺伝子の発現を失い、ＴａｇＢＦＰの発現を開始するようである。 ＡＡＶ ｐＤｏｎｏｒ ＣＭＶ ＲｅｖＯｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ ＴａｇＢＦＰ２ ３Ｆｌａｇ＋ＡＡＶ ＦｌｐＯ Ｃｒｅを示している。ｍＴｍＧマウスにおける形質導入から３０日後（この条件のみにおける多くの青色自己蛍光ニューロン細胞体の存在に留意されたい）。 ＡＡＶ ｐＤｏｎｏｒ ＣＭＶ ＲｅｖＯｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ ＴａｇＢＦＰ２ ３Ｆｌａｇ陰性対照を示している（ｔａｇＢＦＰ自己蛍光またはＣｒｅ組換え［すなわち、ＥＧＦＰ］がないことに留意されたい） ＡＡＶ ＦｌｐＯ Ｃｒｅ陰性対照を示している（Ｃｒｅ組換えからの広範囲なＥＧＦＰがあるが、ＴａｇＢＦＰはないことに留意されたい）。 ヒト誘導多能性幹細胞において検証された、機能ＭＡＤＲカセット、ＡＡＶＳ－ｐＡＣＴ－ｌｏｘＰ－ＴａｇＢＦＰ－Ｖ５－ｎｌｓ ＷＰＲＥ ＦＲＴを示している。 マウス脳においてｉｎ ｖｉｖｏで検証されたＭＡＤＲ、ＧＬＡＳＴ－Ｆｌｐ－Ｃｒｅ及びＧＦＡＰ－Ｆｌｐ－ＣＲＥの組織特異的作用を示している。
発明の説明
本発明の実施において使用することができる本明細書に記載されるものと類似または同等の多くの方法及び材料を、当業者は認識するであろう。実際に、本発明は、記載されている方法及び材料に決して限定されるものではない。本発明の目的のため、以下の用語を以下に定義する。
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、参照される数値表示と組み合わせて使用される場合、本明細書で特に提供されない限り、参照される数値表示のプラスまたはマイナス５％までを意味する。例えば、「約５０％」という表現は、４５％～５５％の範囲を包含する。様々な実施形態では、「約」という用語は、参照される数値表示と組み合わせて使用される場合、特に特許請求の範囲において提供される場合、その参照される数値表示の最大で４％、３％、２％、１％、０．５％、または０．２５％プラスまたはマイナスの参照される数値表示を意味し得る。
いくつかの実施形態では、「制御要素」は、プロモーター領域、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流制御ドメイン、複製起点、内部リボソーム進入部位（「ＩＲＥＳ」）、エンハンサーなどを集合的に指す。これらは、レシピエント細胞におけるコーディング配列の複製、転写、及び翻訳を集合的に提供する。選択されたコーディング配列が適切な宿主細胞において複製、転写、及び翻訳されることが可能である限り、これらの制御要素のすべてが常に存在する必要はない。
本明細書で使用される場合、リコンビナーゼ認識部位に関して「対をなした」は、２つのリコンビナーゼ認識部位、すなわち、記述された遺伝子要素（例えば、対象となる遺伝子、プロモーターまたは他の制御要素）に対して５’のもの及び記述された遺伝子要素に対して３’のものを指す。対をなしたリコンビナーゼ認識部位は、同一であり得（例えば、ＬｏｘＰ－ＬｏｘＰ）、野生型及びバリアント部位（例えば、ＬｏｘＰ－Ｌｏｘ７１またはその逆）を含み得、または野生型もしくはバリアントにかかわらず２つの異なる起源の部位（例えば、ＦＲＴ－ＬｏｘＰまたはＦＲＴ－Ｌｏｘ６６）を含み得る。野生型ＬｏｘＰは、配列ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＧＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ（配列番号１７）を含む。野生型ＦＲＴは、配列ＧＡＡＧＴＴＣＣＴＡＴＴＣＴＣＴＡＧＡＡＡＧＴＡＴＡＧＧＡＡＣＴＴＣ（配列番号１８）を含む。これらの配列のバリアントは、１つ以上のヌクレオチドが変化し、そのリコンビナーゼ（例えば、Ｌｏｘ部位の場合はＣｒｅ及びＦＲＴ部位の場合はフリッパーゼ）によって切断され得る任意の配列である。ある特定の実施形態では、そのようなバリアントは、それらのリコンビナーゼによってより低い効率で切断され得る。
いくつかの実施形態では、「プロモーター領域」は、その通常の意味で、ＤＮＡ制御配列を含むヌクレオチド領域であって、その制御配列が、ＲＮＡポリメラーゼに結合し、下流（３’方向）のコーディング配列の転写を開始させることが可能な遺伝子に由来するものを指すために本明細書で使用される。
いくつかの実施形態では、「作動可能に連結された」は、そのように記載された成分がそれらの通常の機能を発揮するように構成されている要素の配置を指す。よって、コーディング配列に作動可能に連結された制御要素は、コーディング配列の発現を達成することが可能である。制御要素は、発現を誘導するように機能する限り、コーディング配列と隣接する必要はない。従って、例えば、介在する非翻訳であるが転写された配列は、プロモーター配列及びコード配列間に存在し得、プロモーター配列は依然として、コード配列に「作動可能に連結されている」とみなすことができる。
いくつかの実施形態では、「プロモーターレス」は、ドナーベクターに関して本明細書で使用される場合、真核プロモーターを有さないベクターを指す。
本明細書には、細胞をトランスジェニックなものにする際に使用するための外因性核酸及びベクターが記載されている。ある特定の実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。ある特定の実施形態では、哺乳動物細胞は、ヒト細胞である。ある特定の実施形態では、哺乳動物細胞は、多能性能力を有するヒト細胞、例えば、胎児細胞、胚性幹細胞、前駆体細胞または誘導多能性細胞である。ある特定の実施形態では、これらのトランスジェニック細胞は、神経変性疾患のための療法として展開するのに有用である。
いくつかの実施形態では、核酸に関する「外因性」は、核酸が組換え核酸コンストラクトの一部である、またはその天然環境にはないことを示す。例えば、外因性核酸は、別の種に導入されたある種からの配列、すなわち、異種核酸であり得る。典型的には、そのような外因性核酸は、組換え核酸コンストラクトを介して他の種に導入される。外因性核酸はまた、生物に対してネイティブであり、かつその生物の細胞に再導入された配列であり得る。ネイティブ配列を含む外因性核酸はしばしば、外因性核酸に連結された非天然配列、例えば、組換え核酸コンストラクトにおいてネイティブ配列を挟む非ネイティブ制御配列の存在によって天然に存在する配列から区別され得る。また、安定的に形質転換された外因性核酸は典型的には、ネイティブ配列が見られる位置以外の位置に組み込まれる。ある特定の実施形態では、外因性核酸は、「安全」ランディング部位に標的化される。「安全」部位は、遺伝子及びそれらの関連する制御配列がないゲノム領域であり、正常な細胞機能を妨げるまたは細胞の発がん形質転換を開始させる可能性が低い。ある特定の実施形態では、既知の安全部位は、ＡＡＶＳ１遺伝子座である。外因性要素は、例えば、遺伝子組換えを使用して核酸コンストラクトに加えられ得る。遺伝子組換えは、新規な遺伝子情報のセットをコードするＤＮＡの新たな分子を形成するためのＤＮＡ鎖の破断及び再結合である。
本明細書で使用される場合、参照配列に対する「相同な」「相同性」または「相同パーセント」は、核酸配列を記述するために本明細書で使用される場合、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４－２２６８，１９９０，ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｓ ｉｎ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－５８７７，１９９３）によって記載されている式を使用して決定され得る。そのような式は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０，１９９０）のベーシックローカルアライメント検索ツール（ＢＬＡＳＴ）プログラムに組み込まれる。配列の相同％は、本出願の出願日時点でＢＬＡＳＴの最近のバージョンを使用して決定され得る。
また、本明細書には、本開示の核酸によってコードされるポリペプチドが記載されている。「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために互換的に使用され、最小長さに限定されない。抗体及び抗体鎖ならびに他のペプチド、例えば、リンカー及び結合ペプチドを含むポリペプチドは、天然及び／または非天然アミノ酸残基を含むアミノ酸残基を含み得る。その用語にはまた、ポリペプチドの発現後改変、例えば、グリコシル化、シアリル化、アセチル化、リン酸化などが含まれる。いくつかの態様では、ポリペプチドは、タンパク質が所望の活性を維持する限り、ネイティブまたは天然配列に関して改変を含有し得る。これらの改変は、部位誘導変異誘発を介してなど意図的であり得、またはタンパク質を生成する宿主の変異またはＰＣＲ増幅によるエラーを介するものなどの偶発的なものであり得る。
参照ポリペプチド配列に関する配列同一性パーセント（％）は、配列をアライメントし、配列同一性最大パーセントを得るのに必要な場合はギャップを導入した後に、配列同一性の部分としていかなる保存的置換も考慮に入れずに、参照ポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である、候補配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージである。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のためのアライメントは、既知の種々の方式で、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア等の、公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して、達成することができる。比較されている配列の完全長にわたる最大のアライメントを得るために必要とされる任意のアルゴリズムを含む、配列をアライメントするために適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、本明細書の目的のため、アミノ酸配列同一性％値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ－２を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ－２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．によって作成され、ソースコードは、ユーザ文書と共に米国著作権庁（Ｕ．Ｓ．Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ Ｏｆｆｉｃｅ），Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，２０５５９に提出されており、米国著作権番号ＴＸＵ５１００８７の下に登録されている。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆ．から公的に入手可能であるか、またはソースコードからコンパイルされ得る。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ Ｖ４．０Ｄを含むＵＮＩＸオペレーティングシステムで使用する場合はコンパイルすべきである。すべての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ－２プログラムによって設定され、変更はない。
アミノ酸配列比較のためにＡＬＩＧＮ－２が用いられる状況下で、所与のアミノ酸配列Ａの、所与のアミノ酸配列Ｂへの、所与のアミノ酸配列Ｂとの、または所与のアミノ酸配列Ｂに対するアミノ酸配列同一性％（あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂへの、所与のアミノ酸配列Ｂとの、または所与のアミノ酸配列Ｂに対するある特定のアミノ酸配列同一性％を有するか、または含む所与のアミノ酸配列Ａと表現され得る）は、以下のように計算される：１００×分数Ｘ／Ｙ（式中、Ｘは、配列整列プログラムＡＬＩＧＮ－２によりそのプログラムのＡとＢとの整列において完全な一致とスコア化されるアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂ内のアミノ酸残基の総数である）。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、ＡのＢに対するアミノ酸配列同一性％が、ＢのＡに対するアミノ酸配列同一性％と等しくないことが理解される。別途具体的に明記されない限り、本明細書で使用されるすべてのアミノ酸配列同一性％値は、直前の段落に記載されるようにＡＬＩＧＮ－２コンピュータプログラムを使用して得られる。
本明細書で使用される場合、「個体」、「対象」、及び「患者」という用語は、互換可能であり、神経変性疾患と診断された、罹患していることが疑われる、または神経変性疾患の１つ以上のリスク要因を有するものとして選択された個体を含む。ある特定の実施形態では、個体は、哺乳動物である。ある特定の実施形態では、個体は、ヒト個人である。
ＧＥＭＭベースのアプローチは依然として、煩わしいマウス修飾及び多くの交配を伴う。逆に、エレクトロポレーション及びウイルス遺伝子組み換えは、発生及び疾患の迅速な体細胞トランスジェニック調査を可能にしてきたが、ＧＥＭＭＳの正確性を欠く。トランスポゾンは、発生研究及びｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍モデリングにおいて安定な体細胞トランスジェニック体を生成するために普及してきている。しかしながら、これらの方法は、ランダムなゲノム挿入、導入遺伝子シャットダウンを含む位置作用バリエーション、及びコピー数ばらつきの問題がある。ＭＡＤＲは、これらの方法に関連する内在の欠点を克服し、既定の挿入部位及びコピー数を有する体細胞モザイクを生成し、無視できるほどの量のコロニー維持を必要とする頑強なストラテジーである。我々は、複数の腫瘍ドライバーについての組み合わされた様式（ＧＯＦ／ＬＯＦ）の変異を迅速かつ柔軟に生成するためのＭＡＤＲの多用途性を実証した。
一態様では、本明細書の方法は、組織の宿主においてモザイク及び腫瘍を生成するためにＭＡＤＲを利用する。また、非組み込みウイルスベクターが、挿入変異生成を回避するためにＭＡＤＲ構成要素を送達するために用いられ得る。表１において、ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子操作アプローチの比較が提供されている。ＭＡＤＲ法のいくつかの実施形態では、修飾のための時間は、プラスミド当たり約２週間である。ＭＡＤＲ法のいくつかの実施形態では、コピー数は、レシピエントの接合性に応じて１～２である。ＭＡＤＲ法のいくつかの実施形態では、交配は、標的系統当たり１つの系統を用いて実施される。ＭＡＤＲ法のいくつかの実施形態では、発現は通常、遺伝子座サイレンシングに応じて安定である。ＭＡＤＲ法のいくつかの実施形態では、ペイロードは、プラスミド制限によって支配される。ＭＡＤＲ法のいくつかの実施形態では、病巣性は、電極配向に依存する。ＭＡＤＲ法のいくつかの実施形態では、効率は、１００％挿入に近づくように調整され得る。ＭＡＤＲ法のいくつかの実施形態では、導入遺伝子は、Ｆｌｐ／Ｃｒｅ希釈の前に、潜在的に出入りし得る。いくつかの実施形態では、ＭＡＤＲ法は、他の方法と適合性／相補性があり、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓバリアント、ＨＩＴＩ、Ｓｌｅｎｄｒ、及び／または塩基ライターと直交する。
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Figure 2022536934000003
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ＭＡＤＲ法は、２つの異なるリコンビナーゼの利用を伴う。リコンビナーゼの発現を誘発させるプロモーターの組み合わせを慎重に選択することによってＭＡＤＲ標的化の細胞タイプ特異性を制限することができる。いくつかの実施形態では、ｉｎ ｖｉｖｏ ＭＡＤＲは、細菌性人工染色体を用いて実施される。蛍光レポーターまたはリコンビナーゼ、例えば、ＶＣｒｅの発現を誘発させるゲノム断片の大部分を保有するドナープラスミドが、ｌｏｘＰ及びＦＲＴ部位を各端に付加して作成され得、さらにより複雑性の系統追跡研究が可能になる。いくつかの実施形態では、本明細書には、反応平衡を完全組み込みにシフトさせる自己切除性ＦｌｐＯ－２Ａ－Ｃｒｅが記載されている。いくつかの場合では、これはＭＡＤＲ効率を最大化する。
次世代シーケンシングは、腫瘍に見られる再発性体細胞変異の一覧を指数関数的に増加させてきた。さらに、組織学的に同様の腫瘍はしばしば、異なる表現型を伴う異質な遺伝子的基礎（例えば、Ｋ２７Ｍ対Ｇ３４Ｒ）を有し得ることが今ではますます理解されている。我々は、ＧＯＦ及びＬＯＦ変異を組み合わせることによって多様な神経膠腫タイプの迅速「個別化」モデリングのためのプラットフォームとしてＭＡＤＲを使用するための原理の証拠を示す。我々の知る限り、我々のＭＡＤＲベースのモデルは、Ｋ２７Ｍ対Ｇ３４Ｒ変異によって腫瘍成長の時空制御を繰り返すのに成功する唯一のものである。さらに、個々の動物においてｉｎ ｖｉｖｏにて、並列でＫ２７Ｍ及びＧ３４Ｒ変異体細胞を明確に比較することによって（ＭＡＤＲの独自の利点）、我々は、Ｋ２７Ｍが、Ｇ３４Ｒと比較して腫瘍成長を加速させる能力が高いことを観察した。よって、我々のＫ２７Ｍ及びＧ３４Ｒモデルはいずれとも１００％浸透性であるが、近接して位置する残基におけるこれらの異なる変異は、腫瘍成長動態及び腫瘍起源部位に対して独特で強力な影響を発揮する。我々は、ＹＡＰ１－ＭＡＭＬＤ１及びＣ１１ｏｒｆ９５－ＲＥＬＡ上衣腫モデルの我々の新規な並列比較において類似に顕著なパターンにより、同じ細胞集団における同時発生したＭＡＤＲ遺伝子組み換えは、異なる生存時間をもたらすことを認めた。このことは、腫瘍サブタイプについての臨床開始年齢が、細胞起源または変異の時間を反映し得るだけでなく、ドライバー変異で決定づけられる成長動態にも非常に依存することを示唆している。ＰＲＣ２複合体不活性化の後に活性化されるエンハンサーに関する「リバースクロノロジー」が存在する。シングルセルアプローチと組み合わされた我々の新規モデルを使用して、Ｋ２７Ｍ腫瘍細胞が、初期ＥＳ様転写及びエピジェネティック状態に至る長引く腫瘍前段階を示すという我々の所見は、Ｋ２７Ｍ変異が、発生エンハンサーの同じリバースクロノロジー再活性化を示す可能性と一貫している。
要約すると、我々の知見は、高分解能ＧＯＦ及びＬＯＦモザイクの生成を大衆化する見込みがある頑強な遺伝子的方法論としてＭＡＤＲを確立し、小規模の実験室でｉｎ ｖｉｖｏで広範囲の遺伝子サブタイプをモデリングすることが可能になる。また、この遺伝子フレームワークは、二重リコンビナーゼ認識部位ですでに修飾された何千ものマウス系統に適応可能であり、ＭＡＤＲレシピエント部位で修飾され得る任意の細胞、オルガノイドまたは生物に容易に適応され得る。遺伝子アプローチの既存の手段と組み合わされるＭＡＤＲの能力、そのシングルセル分解能、及びそのシーケンシング技術との適合性を考慮すると、これらのツールにより、発生及び疾患における遺伝子機能の効率的でより高いスループットの調査が可能になる。
したがって、本発明の実施形態は、少なくとも部分的に、これらの知見に基づく。
本明細書には、細胞を、対象となる導入遺伝子を用いてトランスジェニックなものにするための核酸及び／またはベクターシステムが記載されている。導入遺伝子は、ＬｏｘＰ及びＦＬＴなどの２つの異なるリコンビナーゼ認識部位に隣接し、細胞のゲノムの特定の部位に対象となる導入遺伝子を導入することが可能となり得る。ある特定の実施形態では、対象となる導入遺伝子は、神経栄養因子を含む。ある特定の実施形態では、神経栄養因子は、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、成長／分化因子（ＧＤＦ）５、中脳アストロサイト由来神経栄養因子（ＭＡＮＦ）、脳ドーパミン作動性神経栄養因子（ＣＤＮＦ）、またはそれらの組み合わせを含む。ある特定の実施形態では、神経栄養因子は、ＧＤＮＦを含む。ある特定の実施形態では、２つ以上の神経栄養因子は、細胞のゲノムに標的化するための同じまたは異なる核酸／ベクターに含まれ得る。
ある特定の実施形態では、対象となる導入遺伝子は、誘導性プロモーターの制御下にある。誘導性プロモーターにより、誘導剤の投与によって制御される対象となる導入遺伝子によってコードされるポリペプチドの転写、及びよって生成が可能となる。誘導性プロモーターは、誘導剤の非存在下では活性化されないまたは最小にしか活性化されないものである。これにより、導入遺伝子を含むベクターまたは導入遺伝子を含むベクターを含む細胞が投与された個体において神経栄養因子の生成を調整または調節することが可能となる。過度に高い神経栄養因子のレベルは不要な副作用を有し、過度に低いレベルは治療的に有効ではない場合があるので、これにより、向上した安全性及び増大した治療潜在性がもたらされる。ある特定の実施形態では、誘導性プロモーターは、テトラサイクリン制御プロモーターである。ある特定の実施形態では、誘導性プロモーターの制御下にある対象となる導入遺伝子は、ＧＤＮＦ、ニュールツリン、ＧＤＦ５、ＭＡＮＦ、ＣＤＮＦ、またはそれらの組み合わせを含む。ある特定の実施形態では、誘導性プロモーターの制御下にある対象となる導入遺伝子は、ＧＤＮＦである。
ある特定の実施形態では、システム、核酸及び／またはベクターは、小分子化合物によって活性化される合成転写因子を構成的に発現する発現カセットをさらに含む。ある特定の実施形態では、合成誘導性転写因子は、逆テトラサイクリン制御トランスアクチベーター（ｒｔＴＡ）である。ｒｔＴＡトランスアクチベーターは、ドキシサイクリンなどのテトラサイクリンクラスの抗生物質によって誘導性である。ある特定の実施形態では、合成転写因子は、第２の核酸／ベクターまたは誘導性要素の制御下の神経栄養因子のものと同じ核酸／ベクターに提供される。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載のシステム、ベクター、及び核酸によって提供され得る神経栄養因子は、ＧＤＮＦを含む。ＧＤＮＦ遺伝子は、転写及び翻訳されると、むき出しの（複数可）ベクターまたはベクターを含む細胞（複数可）のいずれかが投与された個体にＧＤＮＦポリペプチドを提供する。ＧＤＮＦ遺伝子は、ＧＤＮＦポリペプチドをコードする核酸配列であり、例えば、内因性ＧＤＮＦ遺伝子からの少なくとも１つのまたはすべてのイントロンを欠くオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。ある特定の実施形態では、ＧＤＮＦ遺伝子は、配列番号１に示されるＤＮＡ配列と少なくとも約８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％相同である。ある特定の実施形態では、ＧＤＮＦ遺伝子は、配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のポリペプチドをコードする。
ある特定の実施形態では、導入遺伝子は、インシュレーター配列に隣接していてもよい。インシュレーター配列は、ヘテロクロマチンの増殖を防止する遺伝子要素であり、導入遺伝子を「隔てる」するために使用され得、その制御配列はエピジェネティックサイレンシングを形成する。ある特定の実施形態では、インシュレーター配列は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａのジプシーインシュレーター、Ｆａｂファミリーインシュレーター、またはニワトリβ－グロビンインシュレーター（ｃＨＳ４）であり得る。
本明細書に記載のシステム、核酸及び／またはベクターは、遺伝子産物を神経変性疾患または病態を有する対象に送達するための方法において有用である。ある特定の実施形態では、核酸及び／またはベクターは、神経変性疾患を有する個体に投与される細胞におけるゲノム中の既知の安全部位に組み込まれる。神経変性疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、または筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）であり得る。また、これらの核酸及び／またはベクターは、個体の脳、個体の中脳、または個体の黒質においてＧＤＮＦ、ニュールツリン、ＧＤＦ５、ＭＡＮＦまたはＣＤＮＦタンパク質のレベルを増加させるための方法において有用である。ある特定の実施形態では、核酸／ベクターは、個体の脳、個体の中脳、または個体の黒質においてＧＤＮＦタンパク質のレベルを増加させるための方法において使用される。
遺伝子産物を神経変性疾患または病態を有する対象に送達する方法もまた、本明細書に記載されている。ある特定の実施形態では、神経変性障害は、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、またはアルツハイマー病を含む。ある特定の実施形態では、方法は、本明細書に記載の核酸／ベクターを含む細胞を、それを必要とする個体に投与することを含む。ある特定の実施形態では、方法は、本明細書に記載の誘導性ＧＤＮＦを含む核酸／ベクターを含む細胞を、それを必要とする個体に投与することを含む。
本明細書には、神経変性疾患または病態を有する対象、または神経変性疾患または病態に罹患した個体に遺伝子産物を送達するための方法が記載されており、当該方法は、神経変性疾患または病態に罹患した個体に所定量の細胞を投与することを含み、細胞は、誘導性プロモーターと作動可能に連結されたＧＤＮＦ遺伝子を含むゲノムに組み込まれたベクターを含み、ＧＤＮＦ遺伝子及び誘導性プロモーターは、非ウイルス性タンデムリピートまたはリコンビナーゼ認識部位に隣接している。
また、本明細書には、神経変性疾患または病態に罹患した個体の脳におけるＧＤＮＦレベルを増加させる方法が記載されており、当該方法は、ａ）神経変性疾患または病態に罹患した個体に所定量の細胞を投与することであって、細胞は、誘導性プロモーターに作動可能に連結されたＧＤＮＦ遺伝子を含むゲノムに組み込まれたベクターを含み、ＧＤＮＦ遺伝子及び誘導性プロモーターは、非ウイルス性タンデムリピートによって挟まれている、投与すること、及びｂ）誘導剤を個体に投与することを含む。ある特定の実施形態では、誘導剤は、ドキシサイクリンである。
また、本明細書には、神経変性疾患または病態に罹患した個体の脳におけるＧＤＮＦレベルを増加させる方法が記載されており、当該方法は、誘導剤を個体に投与することを含み、個体は、所定量の細胞が以前に投与されており、細胞は、誘導剤によって活性化される誘導性プロモーターに作動可能に連結されたＧＤＮＦ遺伝子を含むゲノムに組み込まれたベクターを含む。ある特定の実施形態では、誘導剤は、ドキシサイクリンである。
システム
本発明の様々な実施形態は、導入遺伝子、またはＲＮＡをコードする核酸の上流の、ポリアデニル化シグナルまたは転写停止要素、導入遺伝子、またはＲＮＡをコードする核酸、及び対をなしたリコンビナーゼ認識部位を含むプロモーターレスドナーベクター；ならびに対をなしたリコンビナーゼ認識部位に特異的なリコンビナーゼをコードする２つの遺伝子を含む１つの発現ベクターを含むシステムを提供する。ある特定の実施形態では、プロモーターレスドナーベクターは、プラスミド、ウイルスベクター、及び細菌性人工染色体（ＢＡＣ）からなる群から選択される。
本発明の他の実施形態は、導入遺伝子、またはＲＮＡをコードする核酸の上流の、ポリアデニル化シグナルまたは転写停止要素、導入遺伝子、またはＲＮＡをコードする核酸、及び対をなしたリコンビナーゼ認識部位を含むプロモーターレスドナーベクター；ならびに２つの発現ベクターであって、第１の発現ベクターは、対をなしたリコンビナーゼ認識部位のうちの一方に特異的な第１のリコンビナーゼをコードする１つの遺伝子を含み、第２の発現ベクターは、対をなしたリコンビナーゼ認識部位のうちの他方に特異的な第２のリコンビナーゼをコードする１つの遺伝子を含む、２つの発現ベクターを含むシステムを提供する。ある特定の実施形態では、プロモーターレスドナーベクターは、プラスミド、ウイルスベクター、及び細菌性人工染色体（ＢＡＣ）からなる群から選択される。
様々な実施形態では、プロモーターレスドナーベクターは、導入遺伝子、またはＲＮＡをコードする核酸の上流に、少なくとも４つのポリアデニル化シグナルを含む。様々な実施形態では、プロモーターレスドナーベクターは、導入遺伝子、またはＲＮＡをコードする核酸の上流に、２、３、４、５または６つのポリアデニル化シグナルを含む。
様々な実施形態では、プロモーターレスドナーベクターは、転写後制御要素をさらに含む。様々な実施形態では、プロモーターレスドナーベクターは、導入遺伝子、またはＲＮＡをコードする核酸の下流に、ポリアデニル化シグナルをさらに含む。
様々な実施形態では、プロモーターレスドナーベクターは、スプライスアクセプターで開始するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をさらに含む。
様々な実施形態では、プロモーターレスドナーベクターは、蛍光レポーターをさらに含む。
様々な実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。様々な実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９である。様々な実施形態では、ウイルスＡＡＶベクターは、ハイブリッドＡＡＶベクターである。例えば、そのカプシドは、最適な細胞指向性を示す別の血清型に由来する。
特定の実施形態では、プロモーターレスドナーベクターは、ＰＧＫポリアデニル化シグナル（ｐＡ）；三量化ＳＶ４０ｐＡ；導入遺伝子、またはＲＮＡをコードする核酸；ｌｏｘＰ及びフリッパーゼ認識標的（ＦＲＴ）；ウサギベータ－グロビンｐＡ；ならびにウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御要素（ＷＰＲＥ）を含む。
非限定的な例として、対をなしたリコンビナーゼ認識部位は、ｌｏｘＰ及びフリッパーゼ認識標的（ＦＲＴ）であり得、リコンビナーゼは、ｃｒｅ及びｆｌｐであろう。対をなしたリコンビナーゼ認識部位は、ＶｌｏｘＰ及びフリッパーゼ認識標的（ＦＲＴ）であり得、リコンビナーゼは、ＶＣｒｅ及びｆｌｐであろう。対をなしたリコンビナーゼ認識部位は、ＳｌｏｘＰ及びフリッパーゼ認識標的（ＦＲＴ）であり得、リコンビナーゼは、ＳＣｒｅ及びｆｌｐであろう。さらなる非限定的な例として、リコンビナーゼは、ＰｈｉＣ３１リコンビナーゼであり得、ＰｈｉＣ３１認識部位は、ａｔｔＢ及びａｔｔＰであり得る。ＰｈｉＣ３１は、ａｔｔＢ及びａｔｔＰ部位を認識し、ａｔｔＲ及びａｔｔＬ部位を生成する。よって、ａｔｔＢを有するプラスミド及びａｔｔＰを有する標的部位は、ＰｈｉＣ３１の存在下で挿入を触媒する。また、さらなる非限定的な例として、リコンビナーゼは、Ｎｉｇｒｉ、Ｐａｎｔｏ、またはＶｉｋａであり得、それらの関連部位はそれぞれ、ｎｏｘ、ｐｏｘ、及びｖｏｘである。
様々な態様では、対をなしたリコンビナーゼ認識部位は、宿主細胞のゲノムへの導入遺伝子または誘導性導入遺伝子の組み込みの効率を向上させるように選択される。ある特定の実施形態では、バリアントＬｏｘＰ部位は、野生型またはバリアントＦＲＴ部位と対をなす。ある特定の実施形態では、バリアントＦＲＴ部位は、野生型またはバリアントＬｏｘＰ部位と対をなす。ある特定の実施形態では、Ｌｏｘ７１、Ｌｏｘ６６、ｌｏｘ５１１、ｌｏｘ５１７１、ｌｏｘ２２７２から選択されるバリアントＬｏｘが、野生型またはバリアントＦＲＴ部位と対をなす。ある特定の実施形態では、Ｌｏｘ７１部位は、ＦＲＴ部位またはバリアントＦＲＴ部位と対をなす。ある特定の実施形態では、Ｌｏｘ６６部位が、ＦＲＴ部位またはバリアントＦＲＴ部位と対をなす。ある特定の実施形態では、ＦＲＴ１、ＦＲＴ２、ＦＲＴ３、ＦＲＴ４、ＦＲＴ５、ＦＲＴ１２、ＦＲＴ１３、ＦＲＴ１４、ＦＲＴ５４５から選択されるバリアントＦＲＴが、野生型ＦＲＴと対をなす。ある特定の実施形態では、ＦＲＴ１、ＦＲＴ２、ＦＲＴ３、ＦＲＴ４、ＦＲＴ５、ＦＲＴ１２、ＦＲＴ１３、ＦＲＴ１４、ＦＲＴ５４５から選択されるバリアントＦＲＴが、野生型ＬｏｘＰと対をなす。ある特定の実施形態では、対をなした組換え部位の選択は、細胞ゲノムへのトランスジェニック挿入の効率を２５％、５０％、７５％、もしくは１００％またはそれ以上向上させる。
様々な実施形態では、対をなしたリコンビナーゼ認識部位の一方または両方は、変異を含む。様々な実施形態では、ｌｏｘＰについての変異は、ｌｏｘ７１、ｌｏｘ７５、ｌｏｘ４４、ｌｏｘＪＴ１５、ｌｏｘＪＴ１２、ｌｏｘＪＴ５１０、ｌｏｘ６６、ｌｏｘ７６、ｌｏｘ４３、ｌｏｘＪＴＺ２、ｌｏｘＪＴＺ１７、ｌｏｘＫＲ３、ｌｏｘＢａｉｔ、ｌｏｘ５１７１、ｌｏｘ２２７２、ｌｏｘ２７２２、ｍ２、及びそれらの組み合わせから選択される。様々な実施形態では、ＦＲＴについての変異は、ＦＲＴ＋１０、ＦＲＴ＋１１、ＦＲＴ－１０、ＦＲＴ－１１、Ｆ３、Ｆ５、Ｆ１３、Ｆ１４、Ｆ１５、Ｆ５Ｔ２、Ｆ５４５、ｆ２１６１、ｆ２１５１、ｆ２２６２、ｆ６１、及びそれらの組み合わせから選択される。
変異により、より良好な遺伝子組み換えが可能となり、よって、新たなトランスジェニックマウスを生成する必要はない。さらに、コンビナトリアル実験は、２つを超える異なるドナープラスミドが使用される場合に結果を直ちに得ることが可能なより短い時間ウインドウで適用され得る。これはまた、生物がマウスよりも早く発達するモデルにおいて有益である。
様々な実施形態では、システム（複数可）におけるＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡまたはｍｉＲＮＡである。様々な実施形態では、導入遺伝子、またはＲＮＡをコードする核酸は、疾患に関連する変異を含む。様々な実施形態では、導入遺伝子またはＲＮＡは、機能獲得（ＧＯＦ）遺伝子変異、機能喪失（ＬＯＦ）遺伝子変異、またはその両方を含む。様々な実施形態では、導入遺伝子またはＲＮＡは、がん遺伝子、腫瘍サプレッサー遺伝子の機能喪失（ＬＯＦ）変異、がん原遺伝子の機能獲得（ＧＯＦ）変異、偽遺伝子、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、エピジェネティック改変、ヒト疾患に関連するノンコーディング遺伝子異常またはエピジェネティック異常、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
ドナーベクター
本発明の様々な実施形態は、導入遺伝子、またはＲＮＡをコードする核酸の上流の、ポリアデニル化シグナルまたは転写停止要素；導入遺伝子、またはＲＮＡをコードする核酸；及び対をなしたリコンビナーゼ認識部位を含む、プロモーターレスドナーベクターを提供する。ある特定の実施形態では、プロモーターレスドナーベクターは、プラスミド、ウイルスベクター、及び細菌性人工染色体（ＢＡＣ）からなる群から選択される。
様々な実施形態では、プロモーターレスドナーベクターは、導入遺伝子、またはＲＮＡをコードする核酸の上流に、少なくとも４つのポリアデニル化シグナルを含む。様々な実施形態では、プロモーターレスドナーベクターは、導入遺伝子、またはＲＮＡをコードする核酸の上流に、２、３、４、５または６つのポリアデニル化シグナルを含む。
様々な実施形態では、プロモーターレスドナーベクターは、転写後制御要素をさらに含む。様々な実施形態では、プロモーターレスドナーベクターは、導入遺伝子、またはＲＮＡをコードする核酸の下流に、ポリアデニル化シグナルをさらに含む。
様々な実施形態では、プロモーターレスドナーベクターは、スプライスアクセプターで開始するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をさらに含む。
様々な実施形態では、プロモーターレスドナーベクターは、蛍光レポーターをさらに含む。
様々な実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。様々な実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９である。様々な実施形態では、ウイルスＡＡＶベクターは、ハイブリッドＡＡＶベクターである。例えば、そのカプシドは、最適な細胞指向性を示す別の血清型に由来する。
特定の実施形態では、プロモーターレスドナーベクターは、ＰＧＫポリアデニル化シグナル（ｐＡ）；三量化ＳＶ４０ｐＡ；導入遺伝子、またはＲＮＡをコードする核酸；ｌｏｘＰ及びフリッパーゼ認識標的（ＦＲＴ）；ウサギベータ－グロビンｐＡ；ならびにウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御要素（ＷＰＲＥ）を含む。
非限定的な例として、対をなしたリコンビナーゼ認識部位は、ｌｏｘＰ及びフリッパーゼ認識標的（ＦＲＴ）であり得る。対をなしたリコンビナーゼ認識部位は、ＶｌｏｘＰ及びフリッパーゼ認識標的（ＦＲＴ）であり得る。対をなしたリコンビナーゼ認識部位は、ＳｌｏｘＰ及びフリッパーゼ認識標的（ＦＲＴ）であり得る。さらなる非限定的な例として、リコンビナーゼは、ＰｈｉＣ３１リコンビナーゼであり得る。ＰｈｉＣ３１は、ａｔｔＢ及びａｔｔＰ部位を認識し、ａｔｔＲ及びａｔｔＬ部位を生成する。また、さらなる非限定的な例として、リコンビナーゼは、Ｎｉｇｒｉ、Ｐａｎｔｏ、またはＶｉｋａであり得る。
様々な態様では、対をなしたリコンビナーゼ認識部位は、宿主細胞のゲノムへの導入遺伝子または誘導性導入遺伝子の組み込みの効率を向上させるように選択される。ある特定の実施形態では、バリアントＬｏｘＰ部位が、野生型またはバリアントＦＲＴ部位と対をなす。ある特定の実施形態では、バリアントＦＲＴ部位が、野生型またはバリアントＬｏｘＰ部位と対をなす。ある特定の実施形態では、Ｌｏｘ７１、Ｌｏｘ６６、ｌｏｘ５１１、ｌｏｘ５１７１、ｌｏｘ２２７２から選択されるバリアントＬｏｘが、野生型またはバリアントＦＲＴ部位と対をなす。ある特定の実施形態では、Ｌｏｘ７１部位が、ＦＲＴ部位またはバリアントＦＲＴ部位と対をなす。ある特定の実施形態では、Ｌｏｘ６６部位は、ＦＲＴ部位またはバリアントＦＲＴ部位と対をなす。ある特定の実施形態では、ＦＲＴ１、ＦＲＴ２、ＦＲＴ３、ＦＲＴ４、ＦＲＴ５、ＦＲＴ１２、ＦＲＴ１３、ＦＲＴ１４、ＦＲＴ５４５から選択されるバリアントＦＲＴが、野生型ＦＲＴと対をなす。ある特定の実施形態では、ＦＲＴ１、ＦＲＴ２、ＦＲＴ３、ＦＲＴ４、ＦＲＴ５、ＦＲＴ１２、ＦＲＴ１３、ＦＲＴ１４、ＦＲＴ５４５から選択されるバリアントＦＲＴが、野生型ＬｏｘＰと対をなす。ある特定の実施形態では、対をなした組換え部位の選択は、細胞ゲノムへのトランスジェニック挿入の効率を２５％、５０％、７５％、もしくは１００％またはそれ以上向上させる。
様々な実施形態では、対をなしたリコンビナーゼ認識部位の一方または両方は、変異を含む。様々な実施形態では、ｌｏｘＰについての変異は、ｌｏｘ７１、ｌｏｘ７５、ｌｏｘ４４、ｌｏｘＪＴ１５、ｌｏｘＪＴ１２、ｌｏｘＪＴ５１０、ｌｏｘ６６、ｌｏｘ７６、ｌｏｘ４３、ｌｏｘＪＴＺ２、ｌｏｘＪＴＺ１７、ｌｏｘＫＲ３、ｌｏｘＢａｉｔ、ｌｏｘ５１７１、ｌｏｘ２２７２、ｌｏｘ２７２２、ｍ２、及びそれらの組み合わせから選択される。様々な実施形態では、ＦＲＴについての変異は、ＦＲＴ＋１０、ＦＲＴ＋１１、ＦＲＴ－１０、ＦＲＴ－１１、Ｆ３、Ｆ５、Ｆ１３、Ｆ１４、Ｆ１５、Ｆ５Ｔ２、Ｆ５４５、ｆ２１６１、ｆ２１５１、ｆ２２６２、ｆ６１、及びそれらの組み合わせから選択される。変異により、より良好な遺伝子組み換えが可能となり、よって、新たなトランスジェニックマウスを生成する必要はない。さらに、コンビナトリアル実験は、２つを超える異なるドナープラスミドが使用される場合に結果を直ちに得ることが可能なより短い時間ウインドウで適用され得る。これはまた、生物がマウスよりも早く発達するモデルにおいて有益である。
様々な実施形態では、システム（複数可）におけるＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡまたはｍｉＲＮＡである。様々な実施形態では、導入遺伝子、またはＲＮＡをコードする核酸は、疾患に関連する変異を含む。様々な実施形態では、導入遺伝子またはＲＮＡは、機能獲得（ＧＯＦ）遺伝子変異、機能喪失（ＬＯＦ）遺伝子変異、またはその両方を含む。様々な実施形態では、導入遺伝子またはＲＮＡは、がん遺伝子、腫瘍サプレッサー遺伝子の機能喪失（ＬＯＦ）変異、がん原遺伝子の機能獲得（ＧＯＦ）変異、偽遺伝子、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、エピジェネティック改変、ヒト疾患に関連するノンコーディング遺伝子異常またはエピジェネティック異常、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
特定の実施形態では、プロモーターレスドナーベクターは、ＰＧＫポリアデニル化シグナル（ｐＡ）；三量化ＳＶ４０ｐＡ；導入遺伝子、またはＲＮＡをコードする核酸；ｌｏｘＰ及びフリッパーゼ認識標的（ＦＲＴ）；ウサギベータ－グロビンｐＡ；ならびにウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御要素（ＷＰＲＥ）を含む。
方法
様々な実施形態は、哺乳動物細胞の遺伝子操作方法を提供し、当該方法は、哺乳動物細胞に本発明のシステムをトランスフェクションまたは形質導入することを含む。
様々な実施形態では、哺乳動物細胞は、ヒト細胞であり、本発明のシステムは、ＡＡＶＳ１遺伝子座、Ｈ１１、ＨＰＲＴ１、またはＲＯＳＡ２６を標的とし、方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ方法である。
様々な実施形態では、哺乳動物細胞は、マウス細胞であり、本発明のシステムは、ＲＯＳＡ２６、Ｈｉｐｐ１１、Ｔｉｇｒｅ、ＣｏｌＡ１、またはＨｐｒｔを標的とする。これらの実施形態では、方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、またはｅｘ ｖｉｖｏである。
動物モデル
本発明の様々な実施形態は、本発明のシステムを含む非ヒト動物を含む非ヒト動物モデルを提供し、導入遺伝子またはＲＮＡは、がん遺伝子、腫瘍サプレッサー遺伝子の機能喪失（ＬＯＦ）変異、がん原遺伝子の機能獲得（ＧＯＦ）変異、偽遺伝子、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、エピジェネティック改変、ヒト疾患に関連するノンコーディング遺伝子異常またはエピジェネティック異常、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
本発明の様々な実施形態は、非ヒト動物を含む非ヒト動物モデルを提供し、本発明のシステムが非ヒト動物に投与されており、導入遺伝子またはＲＮＡは、がん遺伝子、腫瘍サプレッサー遺伝子の機能喪失（ＬＯＦ）変異、がん原遺伝子の機能獲得（ＧＯＦ）変異、偽遺伝子、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、エピジェネティック改変、ヒト疾患に関連するノンコーディング遺伝子異常またはエピジェネティック異常、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
様々な実施形態では、非ヒト動物モデルは、ヒト対象のがんの個別化非ヒト動物モデルであり、導入遺伝子またはＲＮＡは、ヒト対象のがんに基づく。様々な実施形態では、非ヒト動物モデルは、ヒト対象の疾患または病態の個別化非ヒト動物モデルであり、導入遺伝子またはＲＮＡは、ヒト対象の疾患または病態に基づく。ヒト対象の疾患、病態、またはがんに「基づく」に関して使用される「基づく」は、ヒト対象の疾患、病態またはがんの遺伝子プロファイルの導入遺伝子またはＲＮＡモデルを有することを指す。非限定的な例として、ヒト対象のがんに基づく導入遺伝子は、ヒト対象のがんの原因であると考えられる機能獲得遺伝子変異である遺伝子であり得る。
様々な実施形態では、非ヒト動物モデルは、機能獲得変異（ＧＯＦ）、機能喪失変異（ＬＯＦ）、またはその両方を含む。
非ヒト動物モデルまたはヒト細胞を生成する方法
様々な実施形態は、本発明の非ヒト動物モデルを生成する方法を提供し、当該方法は、非ヒト動物モデルに本発明のシステムをトランスフェクションまたは形質導入することを含み、導入遺伝子またはＲＮＡは、がん遺伝子、腫瘍サプレッサー遺伝子の機能喪失（ＬＯＦ）変異、がん原遺伝子の機能獲得（ＧＯＦ）変異、偽遺伝子、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、エピジェネティック改変、ヒト疾患に関連するノンコーディング遺伝子異常またはエピジェネティック異常、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
本発明のシステムは、上記及び本明細書で記載されているとおりである。
薬物スクリーニング及び評価
本発明の様々な実施形態は、薬物候補の効果を評価する方法を提供し、当該方法は、本発明の非ヒト動物モデルを提供すること、薬物候補を非ヒト動物モデルに投与すること、及び非ヒト動物モデルに対する薬物候補の効果を評価することを含む。
様々な実施形態では、方法は、薬物候補が有益な結果を提供する場合に有益なものとして薬物候補を同定することをさらに含む。様々な実施形態では、方法は、薬物候補が有益な結果を提供しない場合に非有益なものとして薬物候補を同定することをさらに含む。
哺乳動物細胞
本発明の様々な実施形態は、本明細書に記載される本発明のシステムを含む哺乳動物細胞を提供する。他の実施形態は、本明細書に記載される本発明のプロモーターレスドナーベクターを含む哺乳動物細胞を提供する。
様々な実施形態では、哺乳動物細胞は、ヒト細胞である。様々な実施形態では、哺乳動物は、多能性細胞である。様々な実施形態では、多能性細胞は、誘導多能性細胞である。
本発明の様々な実施形態は、ゲノムに組み込まれた導入遺伝子を含む哺乳動物細胞を提供し、ゲノムに組み込まれた導入遺伝子は、神経栄養因子を含み、ＡＡＶＳ１遺伝子座、Ｈ１１遺伝子座、またはＨＰＲＴ１遺伝子座を含むゲノム部位に組み込まれている。
様々な実施形態では、哺乳動物細胞は、ヒト細胞である。様々な実施形態では、ヒト細胞は、誘導多能性幹細胞である。
様々な実施形態では、神経栄養因子は、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、成長／分化因子（ＧＤＦ）５、中脳アストロサイト由来神経栄養因子（ＭＡＮＦ）、脳ドーパミン作動性神経栄養因子（ＣＤＮＦ）、またはそれらの組み合わせを含む。様々な実施形態では、神経栄養因子は、ＧＤＮＦである。
様々な実施形態では、神経栄養因子は、誘導性プロモーターの制御下にある。様々な実施形態では、誘導性プロモーターは、テトラサイクリン誘導性プロモーターである。様々な実施形態では、神経栄養因子及び／または誘導性プロモーターは、リコンビナーゼ認識部位、転移性因子のタンデムリピート、またはインシュレーター配列のうちの１つ以上に隣接している。
使用方法
本発明の様々な実施形態は、遺伝子産物を神経変性疾患または障害を有する個体に送達する方法を提供し、当該方法は、本明細書に記載される本発明の哺乳動物細胞を投与することを含む。
様々な実施形態では、神経変性疾患または障害は、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、またはアルツハイマー病を含む。
様々な実施形態では、神経変性疾患または障害は、パーキンソン病を含む。
様々な実施形態では、神経変性疾患または障害は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を含む。
本発明の様々な実施形態は、個体の脳におけるＧＤＮＦタンパク質レベルを増加させる方法を提供し、当該方法は、本発明の哺乳動物細胞を個体に投与することを含む、方法を提供する。
以下の実施例は、特許請求対象の発明をより十分に例示するために提供されるものであり、本発明の範囲を限定するものとして解釈すべきではない。特定の材料が言及される範囲内で、それは説明の目的のために過ぎず、本発明を限定することは意図されていない。当業者は、発明能力を発揮することなく、また本発明の範囲から逸脱することなく、同等の手段または反応物を開発し得る。
実施例１－実験手順
すべてのマウスは、Ｃｅｄａｒｓ－Ｓｉｎａｉ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅに従って使用した。胚日（Ｅ）０．５を膣栓の日として確立した。野生型ＣＤ１マウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓによって提供された。Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ４（ＡＣＴＢ－ｔｄＴｏｍａｔｏ，－ＥＧＦＰ）Ｌｕｏ／Ｊ及びＧｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ１．１（ＣＡＧ－ＥＧＦＰ）Ｆｓｈ／Ｍｍｊａｘマウス（ＪＡＸマウス）を野生型ＣＤ１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）またはＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスと交配してヘテロ接合型マウスを生成した。Ｅ１２．５～Ｅ１５．５の間の雄及び雌の胚を子宮内エレクトロポレーションのために使用し、出生後日（Ｐ）０～Ｐ２１の間の仔を出生後実験のために使用した。妊娠した母親を単一のケージ内で維持し、仔を標準１２：１２時間の明／暗サイクル下で組織の動物設備内でＰ２１までそれらの母親と一緒に維持した。
プラスミドクローニング
標準的な制限消化技術（Ｂｒｅｕｎｉｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｓｏｒｉａｎｏ，１９９９）と組み合わされたＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎクローニング（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）またはＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＮＥＢ）を使用して、ＰＧＫｎｅｏｔｐＡｌｏｘ２からｐＤｏｎｏｒプラスミドを誘導した。簡潔には、２つのオリゴをアニーリングし、インサートをＰＧＫｎｅｏｔ－ｐＡｌｏｘ２に入れることによってＦＲＴ部位を生成した。ｓｍＦＰ－ＨＡ ＯＲＦ（Ａｄｄｇｅｎｅ ５９７５９）について行われたように、既存のＯＲＦを除去し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎまたはライゲーションを使用して新たなカセットを加えることによってドナープラスミドの下流生成を行った。ＰＢ－ＣＡＧ－プラスミドは先行記載されており、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ、ＮＥＢアセンブリ、及びライゲーションストラテジーの組み合わせを使用して生成した（Ｂｒｅｕｎｉｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｂｒｅｕｎｉｇ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎまたはアセンブリ反応のために使用されるプライマー配列は、請求に応じて利用可能である。ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＰＣＲ試薬を用いる標準的なプロトコルを使用してＰＣＲを行った。オリジナルのＣＭＶ Ｆｌｐ－２Ａ－Ｃｒｅ及びＣＭＶ Ｆｌｐ－ＩＲＥＳ－Ｃｒｅリコンビナーゼ発現コンストラクトは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのｄＲＭＣＥの観点から先行して検証された（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。
ＭＡＤＲ＋ＡＡＶＳ１ヒト細胞株生成
ＡＡＶＳ１標的化ＭＡＤＲベクターを、ＡＡＶＳ１標的化ベクターＡＡＶＳ１＿Ｐｕｒｏ＿ＰＧＫ１＿３ｘＦＬＡＧ＿Ｔｗｉｎ＿Ｓｔｒｅｐ（Ａｄｄｇｅｎｅ ６８３７５）から誘導した。ＴａｇＢＦＰ２－Ｖ５－ｎｌｓ－Ｐ２Ａ－ｐｕｒｏＲ－Ｃａｇ－ＬｏｘＰ－ ＴｄＴｏｍａｔｏ－ＦＲＴをこのＡＡＶＳ１ベクターに挿入し、ヒト細胞株にそれをトランスフェクションし、ピューロマイシン中で選択した。ＭＡＤＲ－ＳＭ＿ＦＰ－ｍｙｃ（明）及びＭＡＤＲ－ＴａｇＢＦＰ２－３ｆｌａｇ ＷＰＲＥを、Ｃａｇ－Ｆｌｐｏ－２Ａ－Ｃｒｅを有する得られた安定細胞株にトランスフェクションしてＭＡＤＲ反応を誘導した。
ＭＡＤＲ組み込み事象のＰＣＲ分析
ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＰＣＲ試薬を使用して、マウスＭＡＤＲ株から収集されたゲノムＤＮＡをＰＣＲした。アンプリコンをＥ－Ｇｅｌ装置にかけ、サイズを評価した。
マウス及びエレクトロポレーション
Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ４（ＡＣＴＢ－ｔｄＴｏｍａｔｏ，－ＥＧＦＰ）Ｌｕｏ／Ｊ及びＧｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ１．１（ＣＡＧ－ＥＧＦＰ）Ｆｓｈ／Ｍｍｊａｘマウス（ＪＡＸマウス）を野生型ＣＤ１（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）またはＣ５７ＢＬ／６Ｊ（ＪＡＸ）マウスと交配してヘテロ接合型マウスを生成した。出生後側脳室ＥＰを先行記載されているように実施した（Ｂｒｅｕｎｉｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。Ｐ１～３の仔を氷上に約５分間載置した。すべてのＤＮＡ混合物は、別段記述されない限り、トリス－ＥＤＴＡ緩衝液に希釈された０．５～１μｇ／μｌのＦｌｐ－Ｃｒｅ発現ベクター、ドナープラスミド、ｈｙｐＢａｓｅ、またはＣＡＧ－レポータープラスミドを含有していた。ファストグリーン色素を混合物に添加し（１０％ｖ／ｖ）、これを側脳室に注射した。Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔｗｅｅｚｅｒｔｒｏｄｅが、ＥＣＭ ８３０ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）から５パルスの１２０Ｖ（５０ｍｓ；９５０ｍｓ間隔）を送った。ＳｉｇｎａＧｅｌを適用してコンダクタンスを増加させた。マウスを熱ランプ下で温め、それらのケージに戻した。
子宮内エレクトロポレーション。
子宮内エレクトロポレーション実験を標準的な方法（ＭｃＫｅｎｎａ ｅｔ ａｌ．，２０１１）に従って実施した。ＴａｇＢＦＰ２－ＨＲａｓＧ１２Ｖ及びＦｌｐ－ＣｒｅプラスミドをＥ１４．５ ＲＣＥマウス胚にエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、胚をＰ１５まで生存させ、この時点でＴａｇＢＦＰ２－ＨｒａｓＧ１２Ｖ（ＭＡＤＲ媒介挿入）、ＥＧＦＰ（非ＭＡＤＲ Ｃｒｅ媒介組換え）及びＳｏｘ２発現を免疫染色によって分析した。
ＭＡＤＲ形質導入に対する補足事項
我々の実験において、我々は、ＭＡＤＲを達成するためにｉｎ ｖｉｖｏエレクトロポレーション、ｉｎ ｖｉｔｒｏエレクトロポレーション（すなわち、ヌクレオフェクション）、及びリポフェクションを成功裏に用いた。
ｉｎ ｖｉｖｏエレクトロポレーションは、プラスミドＤＮＡが細胞膜を通過し、有糸分裂をしている細胞の核空間に進入することを可能にすることによって機能すると考えられている。よって、それは、増殖している集団に概ねに特異的であると考えられている。しかしながら、有糸分裂後細胞もまた、核孔拡張剤をＤＮＡと混合することによって標的とされ得る。
我々がＭＡＤＲの我々の記述において示しているように、このアプローチは、発生及び疾患を研究するための単一コピー導入遺伝子の安定発現を容易化する。ＭＡＤＲで形質導入された細胞の数は、ＭＡＤＲドナーの濃度、ＦｌｐＯ及びＣｒｅリコンビナーゼの濃度、ならびに標的とされた集団の増殖速度によって概ね決定づけられる。具体的には、我々が示したように、ＭＡＤＲ細胞対Ｃｒｅ組換え細胞の数は、ドナープラスミドのリコンビナーゼプラスミドに対する比を変化させることによって既定の集団において調整され得る。
しかしながら、我々の出生後エレクトロポレーションにおいて見られるように、我々は、我々が選択した標準的な条件（１００ｎｇ／ｕｌのリコンビナーゼ：１０００ｎｇ／ｕｌのドナープラスミド）下で、ＭＡＤＲ形質導入が細胞の初期有糸分裂活性と逆相関するパターンが現れることを認めた。具体的には、線条体グリアは、容易にＣｒｅ組換えされるが、まれにしかＭＡＤＲ形質導入されない。逆に、真正の神経幹細胞として比較的より静止している放射状グリア集団は、ＭＡＤＲ細胞の主な集団を構成する。特に、最終的な非対称または対称分裂の結果であると最近報告された上衣細胞は、ＭＡＤＲによって容易に標的とされる傾向がある（恐らく、それらがエレクトロポレーションによって標的とされる初期細胞分裂後にプラスミドを希釈しないという事実による）。ＣＮＳの細胞周期は発達するにつれて長くなり、出生後細胞は、それらの胚対応物よりも比較的静止しているので、より小規模の初期集団が典型的には、出生後エレクトロポレーションによって形質導入される。よって、多数の実質グリアまたは胚生成ニューロンが望まれる場合、子宮内エレクトロポレーションが、局所領域を標的として実施され得る（すなわち、図４Ａ～Ｃ）。
サイズの考慮：
我々は、プラスミドＤＮＡの標準的な範囲（４Ｋｂから１８Ｋｂまで）の間のドナープラスミドサイズに基づくＭＡＤＲ効率の有意な差を観察しなかった。リポフェクションから３日後でのｉｎ ｖｉｔｒｏでの代用細胞へのＭＡＤＲドナーのタイムラプス画像化を使用した実験的試験は、ｉｎ ｖｉｖｏの観察と一致している（データは示されていない）。プラスミドミックスは、同一モル比の個々のドナーバリアントに基づいていた。しかしながら、細胞運命、生存、増殖などに関与するシグナル伝達経路を変化させることはおそらく、遺伝子レポーターのみを使用する場合と比較して全体のＭＡＤＲ細胞数の変化をもたらす。
シス調節エレメント：
我々は典型的には、我々が利用するマウス系統におけるその存在のため、強いＣＡＧプロモーターを用いる。しかしながら、このプロモーターの強度を減弱させるいくつかの様式が存在する：
１）任意のＩＫＮＭマウスアレルは、導入遺伝子が内因性シス調節エレメントによって制御され得るようにＭＡＤＲで標的化され得る。
２）我々は、導入遺伝子の二次誘導のための２つの直交手段（Ｖｃｒｅ、及びＴｅｔ－Ｏｎ）を示した（その一方は、可逆性であり、誘導剤の投与によって調節され得る（Ｔｅｔ－Ｏｎ））。その上、他の技術（例えば、二量化ドメイン及び脱安定化ドメイン）もまた、導入遺伝子機能または発現を変化させるために用いられ得る。
３）ＷＰＲＥ除去、スタッファー配列、及びｍｉＲ－認識配列を含むがこれらに限定されない転写産物のノンコーディング部分の変化は、導入遺伝子発現に対する有意な効果を有し得る。ＷＰＲＥは、転写産物持続性及びタンパク質発現に対して強力な効果を有するので、除去は上流の導入遺伝子の発現を減少させる。また、しばしば全体の発現減少につながるより長い転写産物を生成するためにシストロンにおける要素の数を特異的に増加させ得る。最後に、内因性（または外因性）ｍｉＲ－認識部位は、正確な細胞タイプ（内因性）における発現を調整するために使用され得、または類似するまたはわずかにミスマッチの標的化配列を有するｍｉＲ－ヘアピンは、発現を減弱させ得る。
４）我々のＡｋａｌｕｃプラスミドで示されているように（図８）、減弱したプロモーターを有する二次シストロンは、ＭＡＤＲで挿入され得る。
注射部位炎症：
１）引っ張られたガラスキャピラリーチューブは、極めて微小の直径（３０Ｇシリンジよりもはるかに小さい）を有する。我々は、いくつかの動物の連続切片化を実施し、いかなる針痕も同定することはできなかった。また、注射によって誘発された出血はほとんどない。よって、出生後エレクトロポレーションは、低侵襲技術であり、ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子形質導入の頑強な手段であるとみなされる。
２）１つの明らかな懸念事項は、注射部位における外因性ＤＮＡに対するミクログリアまたはアストログリア反応の可能性である。しかしながら、我々は、我々の針痕分析からその領域においてＥＰから数日後に対照脳半球（注射されていない）と比較していかなる有意な炎症も観察しなかった（データは示されていない）。しかしながら、針を過度に深く指すと、プラスミド混合物からの水圧性外傷につながり得、周囲の脳室壁を変性させ得る。
３）腫瘍モデル化目的のため、長い腫瘍前プロセス（しばしば数か月にわたる）が存在し、これは、任意の組織傷害関連炎症性プロセスが収まるのに実質的な時間を付与する。これでもなお、免疫不全マウスへのウイルス誘導腫瘍または移植よりも間違いなく良好である。
４）より大きな相対サイズを有する脳室及びより未熟な免疫系を有する胚への送達を容易化することによってそのような問題をさらに軽減するための代替的ＭＡＤＲ送達アプローチとして子宮内エレクトロポレーション（すなわち、図４Ａ～Ｃ）が使用され得る。
組織調製
麻酔後、マウス脳を単離し、回転機／振盪機上で４％パラホルムアルデヒドに４℃で一晩固定した。脳を４％低融点アガロース（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に包埋し、ビブラトーム（Ｌｅｉｃａ）上、７０μｍで切片化した。
免疫組織化学
免疫組織化学（ＩＨＣ）を先行記載されているように標準的な手法を使用して実施した（Ｂｒｅｕｎｉｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。アガロース切片を、使用するまで０．０５％ナトリウムアジドを有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で保存した。一次抗体に関する詳細は、表３で見ることができる。すべての一次抗体は、５％の正常ロバ血清を有するＰＢＳ－０．０３％Ｔｒｉｔｏｎ中で使用した。すべての二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）は、１：１０００で使用した。より短い継続時間の実験では脳室標的化のためにファストグリーン色素を含める場合は注意を要した。その色素は、より長い生存実験において急速に希釈するが、近赤外波長での蛍光発光のため、早期（０～２日）単一コピーレポーター検出を混乱させ、これらのケースから除外した。
漂白を伴う免疫組織化学
漂白前免疫組織化学のため、７０μｍの組織切片を、増加する濃度のメタノール（２０％、４０％、６０％、８０％、１００％）で、それぞれ１５分間水中にて室温で脱水し、次いで１００％メタノール中の５％Ｈ２Ｏ２で４℃で一晩処置した。次いで組織を、メタノール（１００％、８０％、６０％、４０％、２０％）を使用してそれぞれ１５分水中で再水和させ、次いでＰＢＳで洗浄してから通常の免疫染色を進行した。
細胞培養及びヌクレオフェクション
３つのヘテロ接合型Ｐ０ ｍＴｍＧ仔の脳を、研究において使用されるマウス神経幹細胞株を解離するために解離した。細胞株を先行記載されているように維持した（Ｂｒｅｕｎｉｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。細胞を、ビタミンＡを有さないＢ－２７（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ １２５８７－０１０）、ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ３５０５０）、抗生物質－抗真菌剤（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ １５２４０）、ヒト上皮成長因子（ｈＥＧＦ）（Ｓｉｇｍａ Ｅ９６４４）、ヘパリン（Ｓｉｇｍａ Ｈ３３９３）、及び塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＧＦ００３）で補充されたＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（登録商標）－Ａ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ １０８８８－０２２）を含有する培地中で成長させた。マウスＮＳＣヌクレオフェクションを、製造業者の推奨（Ｌｏｎｚａ ＡＧ）に従ってＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ２ｂデバイス及びマウス神経幹細胞キットを使用して実施した。ヌクレオフェクション混合物は、１０ｎｇ／μｌの等しい濃度でプラスミドを含有していた。
生細胞画像化
ＰＩＰ－Ｖｅｎｕｓ／ｍＣｈｅｒｒｙ－ｈＧＥＭ１／１１０を発現するＮ２Ａ代用細胞を９６ウェルフォーマットで播種し、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ Ｓ３システム（Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）を使用して位相赤色及び緑色蛍光下で２０ｘ対物レンズを用いて画像化した。画像をＩｎｃｕｃｙｔｅ Ｓ３ソフトウェアを使用して３０分毎に収集した。
ハイスループット薬物試験実験において、腫瘍解離から生成された細胞株からの１０．０００細胞及び非腫瘍対照細胞を９６ウェルプレートに播種した。播種から２４時間後、適切な濃度の各薬物（Ｖａｃｑｕｉｎｏｌ－１（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，ＳＭＬ１１８７）の場合は１μＭ及びＡＫＴ１／２キナーゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ａ６７３０）の場合は０．５μＭ）を培地に添加し、細胞をＩｎｃｕｃｙｔｅ Ｓ３システムを使用して位相差で９２時間画像化した。画像をＩｎｃｕｃｙｔｅ Ｓ３ソフトウェアを使用して２時間毎に収集した。細胞増殖画像分析をＩｎｃｕｃｙｔｅ Ｓ３ソフトウェアを用いて行い、示された結果を正規化し、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ７を用いて分析した。
画像化及び処理
すべての固定画像をＮｉｋｏｎ Ａ１Ｒ倒立レーザー共焦点顕微鏡で収集した。ｍＮＳＣの生画像がＥＶＯＳデジタル蛍光倒立顕微鏡で得られた。脳全体の画像のため、Ｎｉｋｏｎ Ｅｌｅｍｅｎｔｓの自動化ステッチ機能を使用した。次いでＮＤ２ファイルをＩｍａｇｅＪにインポートしてＺ投影画像を生成し、その後これをＡｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ＣＳ６で編集した。いくつかの回転画像（例えば、図３Ｆ）において、回転により、組織切片の完全に外側の空の領域における無色の空間がもたらされ、黒色の塗りつぶしを加えた。Ａｄｏｂｅ Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｏｒ Ｃｓ６を最終図生成のために使用した。
ｉｎ ｖｉｖｏ ＭＡＤＲの効率の定量
各条件について、２匹の仔をｐＣＡＧ－ＴａｇＢＦＰ２－ｎｌｓ、ｐＤｏｎｏｒ－ｓｍＦＰ－ＨＡ、及びＦｌｐ－２Ａ－Ｃｒｅでエレクトロポレーションした。脳をＥＰから２日後に採取し、各々の脳からの２つの非隣接切片をＨＡ－Ｔａｇ抗体及びＥＧＦＰで染色した。各切片について、約２５個のＢＦＰ＋細胞をランダムに選択し、ＢＦＰ＋細胞の中からＨＡ＋及びＥＧＦＰ＋細胞をカウントした。その割合を、各群について４つの切片について平均化した。
フローサイトメトリー
細胞を先行記載されているように収集した（Ｂｒｅｕｎｉｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。細胞をＰＢＳで簡潔にすすぎ、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して酵素解離によって除去し、２５０ｇで３分間ペレット化し、培地に再懸濁した。ＦＡＣＳをＣｅｄａｒｓ－Ｓｉｎａｉ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ＣｏｒｅでＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＭｏＦｌｏで行った。
ウエスタンブロット
細胞ペレットをレムリー緩衝液に再懸濁し、９５℃で５分間沸騰させた。タンパク質濃度をＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００で測定した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分離及びニトロセルロースメンブレン上への移動の後、タンパク質を表３に列挙された抗体を使用して検出し、０．１％ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ中の５％ミルクに希釈した。すべての二次抗体（Ｌｉ－ｃｏｒ ＩＲＤｙｅ（登録商標））を１：１５０００で使用した。タンパク質をＬｉ－Ｃｏｒ Ｏｄｙｓｓｅｙ（登録商標）ＣＬＸ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍを使用して赤外検出によって可視化した。
シングルセルウエスタンブロット
ｍＴｍＧ ｍＮＳＣをＴ７５フラスコ内で６μｇのｐｉｇｇｙｂａｃまたはＭＡＤＲ ＴａｇＢＦＰプラスミド及び６μｇのＦｌｐＯ ２Ａ Ｃｒｅでヌクレオフェクションした（Ｌｏｎｚａ ＶＰＧ－１００４）。４日後、細胞をＦＡＣＳにより選別し、１００，０００～２００，０００個のＢＦＰ＋細胞をＭｉｌｏ ｓｃＷｅｓｔｅｒｎチップ（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ Ｃ３００）に播種した。各チップをモルモットｍＫａｔｅ（Ｋｅｒａｆａｓｔ ＥＭＵ１０８）の場合はＣｙ３中、１：２０で及びウサギヒストンＨ３（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ４４９９）の場合は６４７中で１：２０で染色した。画像化をＩｎｎｏｓｃａｎ ７１０マイクロアレイスキャナーを使用して実施した。
ドキシサイクリン及びピューロマイシン投与
ドキシサイクリン（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ ６３１３１１）を１００ｎｇ／ｍｌの最終濃度で培地に添加した。ピューロマイシン（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ ６３１３０５）を１μｇ／ｍｌで使用した。
ｍｕｌｔｉ－ｍｉＲ－Ｅノックダウン効率の定量
我々は、ＦｌＥｘをベースとする導入遺伝子発現、特にＥＧＦＰカセットのＣｒｅ媒介反転及び活性化（ＦｌＥｘ－ＥＧＦＰ）を以前から使用している。Ｎｆ１、Ｐｔｅｎ、及びＴｒｐ５３を標的とする我々のｍｕｌｔｉ－ｍｉＲ－Ｅを試験するために、我々は、複数のｍｉＲ－Ｅを保有するＣＡＧ駆動ＦｌＥｘベースのコンストラクト（ＦｌＥｘ－ｍｕｌｔｉ－ｍｉＲ－Ｅ）を作製した。出生後ｍＮＳＣ系統を、ＥＧＦＰまたはＦｌＥｘ－ｍｕｌｔｉ－ｍｉＲ－Ｅ及びＣｒｅ－リコンビナーゼベクターをトランスフェクションされたＣＤ１仔の脳を解離することによって確立した。蛍光細胞を選別し、ｍＲＮＡ抽出ならびにＮｆ１、Ｐｔｅｎ、及びＴｒｐ５３用のｑＰＣＲプローブを使用するＳＹＢＲベースのＦｌｕｉｄｉｇｍ ＢｉｏＭａｒｋダイナミックアレイに供した。
組織透明化
全載画像化のため、ｉＤｉｓｃｏ組織透明化法を使用した（Ｒｅｎｉｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１４）。固定したサンプルを２０％、４０％、６０％、８０％、１００％、１００％メタノール／Ｈ２Ｏ中、それぞれ１時間室温で徐々に脱水し、次いで１００％メタノール中の５％Ｈ２Ｏ２中、４℃で一晩漂白し、続いて徐々に再水和した（８０％、６０％、４０％、２０％メタノール／Ｈ２Ｏ、次いで０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を有するＰＢＳ、それぞれ１時間室温で）。次いでサンプルを、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、２０％ＤＭＳＯ、及び０．３Ｍグリシンを有するＰＢＳ中、３７℃で２日間インキュベーションして組織を透過化し、次いで０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１０％ＤＭＳＯ、及び６％の正常ロバ血清を有するＰＢＳ中、３７℃で２日間インキュベーションして染色のために組織をブロッキングした。次いでサンプルを一次抗体と共に０．２％Ｔｒｉｔｏｎ及び１０μｇ／ｍｌヘパリンを有するＰＢＳ（ＰＴｗＨ）中、３７℃で５日間インキュベーションし、続いてＰＴｗＨで５回、それぞれ１時間室温で洗浄し、さらに１回一晩室温で洗浄した。次いでサンプルをＰＴｗＨ中、３７℃で５日間二次抗体中にてインキュベーションし、続いてＰＴｗＨで５回、それぞれ１時間室温で洗浄し、さらに１回一晩室温で洗浄した。
染色後、サンプルを再度２０％、４０％、６０％、８０％、１００％、１００％メタノール／Ｈ２Ｏ中、室温で各々１時間徐々に脱水し、次いで１００％メタノール中で４℃で一晩保存した。次いでサンプルをメタノール中の６６％ジクロロメタン（ＤＣＭ、Ｓｉｇｍａ ２７０９９７）の溶液中、室温で３時間インキュベーションし、続いて１００％ＤＣＭで２回、室温で各々１５分洗浄し、次いで透明化及び画像化のためにジベンジルエーテル（ＤＢＥ、Ｓｉｇｍａ １０８０１４）に直接入れた。透明化したサンプルをガラス容器内のＤＢＥ中、室温で暗所で保存した。ｓＣＭＯＳカメラ（Ａｎｄｏｒ ＮＥＯ ５．５）及び６ｍｍのＷＤディッピングキャップを有する２ｘ／０．５対物レンズを備える軽シート顕微鏡（Ｕｌｔｒａｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ＩＩ，ＬａＶｉｓｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用してサンプルをＤＢＥにおいて画像化した。
光シートデータセットを３Ｄ可視化のためにＩｍａｒｉｓ ９．１（Ｂｉｔｐｌａｎｅ）にインポートした。アーティファクト及び蛍光デブリをデジタルで除去するために、表面ツールを使用して不要な蛍光の表面レンダリングを生成し、表面メニューにおける「ｍａｓｋ ａｌｌ」機能を使用してデブリが除去された蛍光チャンネルを生成した。サンプル全体のデジタル表面を生成するために、ボリュームレンダリングツールを「ノーマルシェーディング」に設定し、色を灰色に設定した。３－Ｄデータセットの動画を「アニメーション」ツールを使用して生成した。
膨張顕微鏡法
Ｐｒｏ－ＥｘＭプロトコル（Ｔｉｌｌｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．２０１５）に従って膨張顕微鏡法のためにサンプルを生成した。簡潔には、１００μｍの切片をＥＧＦＰ及びＨＡ－タグについて染色した。膨張前に、サンプルを、膨張前画像化のために共焦点顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ａ１Ｒ）を使用して水中で画像化した。
１０％ＤＭＳＯを有するＰＢＳ中の０．１ｍｇ／ｍｌのＡｃｒｙｌｏｙｌ－Ｘ、ＳＥ（（６－（（アクリロイル）アミノ）ヘキサン酸、スクシンイミジルエステル；Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）中、室温で一晩サンプルを固定した。ＰＢＳ（３×１０分）で洗浄した後、サンプルを、０．２％（ｗ／ｗ）テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）、０．２％（ｗ／ｗ）過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）、及び０．１％（ｗ／ｗ）４－ヒドロキシ－２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－オキシル（４－ヒドロキシ－ＴＥＭＰＯ）の添加の直後に、モノマー溶液（ＰＢＳ、２ＭのＮａＣｌ、８．６２５％（ｗ／ｗ）アクリル酸ナトリウム、２．５％（ｗ／ｗ）アクリルアミド、０．１５％（ｗ／ｗ）Ｎ，Ｎ－メチレンビスアクリルアミド）中、４℃で３０分間インキュベーションした。次いでスライスをゲル化のために３７℃で２時間インキュベーションした。インキュベーション後、サンプルを、消化緩衝液（５０ｍＭトリスｐＨ８、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１ＭのＮａＣｌ）に８単位／ｍｌまで希釈されたプロテイナーゼＫ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を含有する消化溶液中で振盪せずに６ウェルプレートにおいて室温で一晩インキュベーションした。消化後、サンプルを過剰のＨ２Ｏで４回洗浄し（室温で１回の洗浄当たり１時間）、次いで画像化前にＨ２０中の２％低融点アガロース中で安定化させた。４０ｘロングＷＤ対物レンズ（Ｎｉｋｏｎ ＣＦＩ Ａｐｏ ４０ｘｗ ＮＩＲ）を有する共焦点顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ａ１Ｒ）を使用して画像を取得した。
病理
漂白後、免疫組織化学を実施して４０５チャンネルでＥＧＦＰについて染色した。二次抗体中でのインキュベーション後、切片をＰＢＳ中の５０μＭのＤｒａｑ５（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ４０８４Ｓ）中、２分間室温でインキュベーションし、続いてＰＢＳで洗浄した（３×５分）。次いで切片を８０％エタノール中の２％ｗ／ｗエオシンＹ（Ｓｉｇｍａ Ｅ４００９）中、２分間室温でインキュベーションし、続いてＰＢＳで洗浄した（３×５分）。最後に、切片を別のＤｒａｑ５溶液（ＰＢＳ中５０μＭ）中、３分間インキュベーションしてから、ＰＢＳで洗浄し、マウントし、画像化した。
ｉｎ ｖｉｖｏ ｄＲＭＣＥ効率タイトレーション
各条件について、仔をｐＤｏｎｏｒ－ｓｍＦＰ－Ｍｙｃ及びＦｌｐｏ－２Ａ－Ｃｒｅでエレクトロポレーションした。脳をＥＰから２日後に採取し、各々の脳からの２つの非隣接切片をＭｙｃ－Ｔａｇ抗体及びＥＧＦＰで染色した。各切片について、Ｏｃｕｌｕｓ Ｒｉｆｔシステムを有するＳｙｇｌａｓｓ ＶＲを使用して細胞を挿入（Ｍｙｃ発現）及びｃｒｅ切除（ＥＧＦＰのみ発現）について定量した。切片当たりのカウントされた全細胞の百分率として定量値を示した。割合を、各群について異なる動物からの２つの切片について平均した。ファストグリーンは、その色素がＡｌｅｘａ６４７と同じ波長で蛍光を発することが判明したので、これらのアッセイから除外した。その色素は、より長い生存実験で急速に希釈したが、それは早期（０～２日）単一コピーレポーター検出を混乱させた。
Ｕ６－ｓｇＲＮＡ断片のＰＣＲ生成
リバース骨格及びフォワードプライマー（ＩＤＴ ＤＮＡ）をＰＣＲ反応において組み合わせ、次に精製をして濃縮されたｓｇＲＮＡを作製した（Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。１００ｎｇの各断片をＥＰのためにプラスミドＤＮＡと組み合わせた。我々は、腫瘍モデリングのために先行して検証された標的部位を使用した（Ｘｕｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｈｅｃｋｌ ｅｔ ａｌ．，２０１４）（表３）。
ネズミ科動物腫瘍細胞におけるインデル変異のシーケンシング
腫瘍細胞の純粋な集団をＦＡＣＳによって入手し、ゲノムＤＮＡを単離した（Ｑｉａｇｅｎ ＤＮｅａｓｙ）。我々は、ｇＲＮＡ標的部位に隣接するプライマーを使用して、Ｎｆ１、Ｔｒｐ５３、及びＰｔｅｎについてのインデル変異を含有することが予期される領域をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ増幅された断片をＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯキットを使用してｔｏｐｏクローニングし、Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ ＭＡＸ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ＤＨ５－Ｔ１Ｒ細胞に形質転換した。
ＣＲＩＳＰＲ塩基編集の確認
未成熟終止コドン塩基変換のため、ＥＧＦＰ＋細胞をＦＡＣＳによって得、ゲノムＤＮＡを単離した（Ｑｉａｇｅｎ ＤＮｅａｓｙ）。我々は、ｓｇＲＮＡ標的部位に隣接するプライマーを使用して、Ｎｆ１、Ｔｒｐ５３、及びＰｔｅｎについての塩基変換を含有することが予期される領域をＰＣＲ増幅した。アンプリコンを２０ｎｇ／ｕｌに正規化し、シーケンシングのためにＡＭＰＬＩＣＯＮ－ＥＺサービス（Ｇｅｎｅｗｉｚ）に送付した。
各遺伝子－プライマー対についてのＦａｓｔｑファイルを、デフォルトパラメータを用いてＳＴＡＲｌｏｎｇ及びｂｗａ－ｍｅｍを使用してその遺伝子座を含有するカスタムゲノムファイルにアライメントし、それはすべて同様の結果を得た。ＢＡＭファイルを視覚化のためにＩＧＶにアップロードした。
ｉｎ ｖｉｖｏ生物発光画像化におけるＡｋａｌｕｃ
ストックＡｋａｌｕｍｉｎｅ－ＨＣＬをｄＨ２０に１０ｍＭで再懸濁し、－８０で保存した。アリコートを５ｍＭの最終濃度及び１０ｕＬ／ｇ ｗ／ｖマウスの最終量までｄＨ２０中で希釈し、ＩＰを画像化の前に注射した。マウスをＩＡＣＵＣプロトコルに従ってイソフルランで麻酔し、ＩＶＩＳ Ｉｌｕｍｉｎａ ＸＲＭＳを使用して１．５ＦＯＶ及び６０秒の曝露速度で画像化した。
組織解離
マウスをＣＯ２チャンバー内で麻酔し、脳をＰＢＳ中に収集した。直ちに、ＥＧＦＰ＋組織を、Ｒｅｖｏｌｖｅ Ｈｙｂｒｉｄ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（Ｅｃｈｏ Ｌａｂｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）下で微小解剖した。腫瘍のサイズによって可能な場合、残存腫瘍組織を有する脳の一部の残存物を組織分析のために４％ＰＦＡ中で固定した。微小解剖した組織を１ｍｍ未満の片に機械的に解離し、Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ＩＶ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｌａｋｅｗｏｏｄ，ＮＪ）、及びＤＮＡｓｅ Ｉ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｌａｋｅｗｏｏｄ，ＮＪ）でさらに消化した。得られたシングルセル懸濁液を４０ｍｍのセルストレーナー（Ｓｔｅｌｌａｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）を介して濾過し、赤血球をＡＣＫ溶解緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で溶解した。シングルセル懸濁液を３つの部分に分けた。１つ目は、ｓｃＲＮＡｓｅｑまたはｓｃ－ＡＴＡＣｓｅｑ実験のため、シングルセルサンプルからのＧＦＰ＋細胞をＦＡＣＳ選別した（１０Ｘ Ｃｈｒｏｍｉｕｍのための１．５ｍｌチューブ内へ）。２つ目の部分は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞株確立のために使用した。具体的には、細胞を、ペニシリン－ストレプトマイシン－アンフォテリシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、ビタミンＡを有さないＢ－２７補充物（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、ＥＧＦ（Ｓｈｅｎａｎｄｏａｈ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｗａｒｗｉｃｋ，ＰＡ）、ＦＧＦ（Ｓｈｅｎａｎｄｏａｈ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｗａｒｗｉｃｋ，ＰＡ）、ＰＤＧＦ－ＡＡ（Ｓｈｅｎａｎｄｏａｈ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｗａｒｗｉｃｋ，ＰＡ）及びヘパリン（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）で補充されたＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）に再懸濁し、ＣＥＬＬｓｔａｒｔ ＣＴＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で処理されたＴ２５フラスコ内で培養した。最後に、シングルセル懸濁液の最後の３つ目は、８０％メタノール－ＰＢＳ中に固定し、－８０Ｃで保存した。
ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑライブラリ生成
シングルセルＲＮＡ－ｓｅｑライブラリをＳｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ ３’ ｖ２ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔｓ Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅ（１０ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）に従って調製した。細胞懸濁液をＣｈｒｏｍｉｕｍ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ装置（１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）にロードしてシングルセルＧｅｌ Ｂｅａｄ－Ｉｎ－ＥＭｕｌｓｉｏｎ（ＧＥＭ）を生成した。ＧＥＭ－逆転写（ＲＴ）をＶｅｒｉｔｉ ９６ウェルサーマルサイクラー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で実施した。ＲＴの後、ＧＥＭを収穫し、ｃＤＮＡを増幅し、ＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｐａｓａｄｅｎａ，ＣＡ）を用いてクリーンアップした。インデックス化シーケンシングライブラリを、酵素断片化、末端修復、Ａ－テーリング、アダプターライゲーション、ライゲーションクリーンアップ、サンプルインデックスＰＣＲ、及びＰＣＲクリーンアップのためにＣｈｒｏｍｉｕｍ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｃｅｌｌ ３’ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｋｉｔを使用して構築した。バーコード化シーケンシングライブラリをＫＡＰＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＫＡＰＡ Ｂｉｏ－ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）を使用して定量ＰＣＲによって定量した。シーケンシングライブラリをカスタムシーケンシング設定（リード１の場合２６ｂｐ及びリード２の場合９１ｂｐ）を用いてＮｏｖａＳｅｑ ６０００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）にロードした。
ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑリードアライメント
脱多重化された生リードを、すべてのタンパク質コーディング及びロングノンコーディングＲＮＡ遺伝子を含有する、ｍｍ１０アノテーションを有するカスタムＵＣＳＣマウス参照を使用して、デフォルトパラメータを用いてＳＴＡＲ（バージョン２．５．１）（Ｄｏｂｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３）を使用してトランスクリプトームに対してアライメントした。すべてのサンプルにおける各遺伝子についての発現カウントを統合し、Ｃｅｌｌ Ｒａｎｇｅｒソフトウェアバージョン２．０．０（１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を使用して固有分子識別子（ＵＭＩ）カウントに正規化した。結果は、行として細胞バーコード及び列として遺伝子同一性を有する大きなデジタル発現マトリックスである。
集団の動態の２－Ｄ射影を得るために、まず、Ｒ ｖ３．４．２－４でのＳｅｕｒａｔパッケージバージョン２．１－３（Ｂｕｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１８）を使用して次元数を減少させるために上位５，０００種の最も可変性のある遺伝子の正規化された遺伝子－バーコードマトリックスについて主成分分析（ＰＣＡ）を実行した。
ｓｃ－ＡＴＡＣｓｅｑのための核単離
ＧＦＰ＋ＦＡＣＳで選別された細胞を、ｓｃ－ＡＴＡＣｓｅｑのための製造指示（１０ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）に従って処理した。具体的には、選別された細胞を４０ｍｍのセルストレーナーを介して濾過し、ペレット化し、１体積の溶解緩衝液（ヌクレアーゼ非含有水中の１０ｍＭトリス－ＨＣｌ、１０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１％のＴｗｅｅｎ－２０（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，１６１０７８１）、０．１％のＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０代替物（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，７４３８５）、０．０１％ジギトニン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，３００４１０）及び１％ＢＳＡ）に再懸濁し、細胞を最適な細胞溶解まで氷上でインキュベーションした。次いで、溶解緩衝液を、１０体積の洗浄緩衝液（ヌクレアーゼ非含有水中の１０ｍＭトリス－ＨＣｌ、１０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ２、１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０）を添加することによってブロッキングした。単離された核をペレット化し、１×核緩衝液（１０ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）に再懸濁し、最後に、核濃度を血球計数器で算出し、直ちにｓｃ－ＡＴＡＣｓｅｑライブラリ構築プロトコルを進行した。
ｓｃＡＴＡＣ－ｓｅｑライブラリ構築
ｓｃＡＴＡＣシーケンシングライブラリを製造業者のプロトコル（１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １０００１１０）に従って１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｈｒｏｍｉｕｍプラットフォームで調製した。単離された核懸濁液を希釈し、次いで１０，０００細胞の標的化核回収のための転位ミックスと共にインキュベーションした。次いでＧＥＭをＣｈｒｏｍｉｕｍ Ｃｈｉｐ Ｅ（１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １００００８２）で捕捉した。ＧＥＭインキュベーションの後、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｓｉｌａｎｅビーズ（１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２００００４８）及びＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔ試薬（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｂ２３３１８）を使用してクリーンアップを実施した。最後に、ライブラリを合計で１０回のＳＩ ＰＣＲサイクルの間で増幅させた。
ヒトシングルセルＲＮＡ－ｓｅｑデータ処理
３つの公共の処理データ（ＧＳＥ７０６３０、ＧＳＥ８９５６７、及びＧＳＥ１０２１３０）をそれらのそれぞれのＧＥＯウェブサイトから入手した。ＧＳＥ７０６３０及びＧＳＥ８９５６７をＴＰＭ値に逆変換した。ＧＳＥ１０２１３０をＫ２７Ｍ（ＧＳＥ１０２１３０＿Ｋ２７Ｍ）及びＧＢＭ（ＧＳＥ１０２１３０＿ＧＢＭ）データセット（それぞれ６名及び３名の患者）に分けた。データセットにおける非悪性ミクログリア及びｍＯＧを同定するために、我々は、Ｓｃａｎｐｙ（Ｗｏｌｆ ｅｔ ａｌ．，２０１８）で実行されているようにＰＣＡ－ｔＳＮＥ及びＬｏｕｖａｉｎクラスタリングを使用した。ｔ検定及びウィルコクソンによって二重チェックされたミクログリアのマーカー（ＣＳＦ１Ｒ、ＬＡＰＴＭ５、ＣＤ７４、ＴＹ－ＲＯＢＰ）またはｍＯＧのマーカー（ＭＢＰ、ＭＯＧ、ＰＬＰ１）を含有するクラスターを除去した。各データセットについて、悪性腫瘍細胞の数は、原著者によって決定されたものと密接に一致していた（ＧＳＥ７０６３０：４０４４対４０５０、ＧＳＥ８９５６７：５１５７対５０９７、ＧＳＥ１０２１３０：２２７０対２２５９）。ＧＳＥ１０２１３０＿ＧＢＭは、いかなるミクログリアまたはｍＯＧも含有していなかった。Ｓｅｕｒａｔにおける処理のため、ＧＳＥ１０２１３０＿Ｋ２７Ｍを６つのサンプルに分けた。ＭＡＤＲマウスデータセットを含むすべてのデータセットを１０ｅ５のライブラリサイズを有するように正規化した。腫瘍タイプにわたる比較分析のため、我々は、（Ｆｉｌｂｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８）によって定義される相対的発現を使用し、図６Ｋにおけるヒートマップを作成した。
マウスシングルセルＲＮＡ－ｓｅｑデータ処理
３つの１０Ｘ ＵＭＩカウントマトリックス（ｍＫ２７Ｍ１、ｍＫ２７Ｍ２、ｍＫ２７Ｍ３）を各細胞について１０ｅ５のライブラリサイズを有するように正規化した。次いで、我々は、Ｓｃａｎｐｙ（Ｗｏｌｆ ｅｔ ａｌ．，２０１８）でミクログリア及びｍＯＧを区別するために公共データセットと同じ方法でクラスタリングした。１０％超のミトコンドリアリード、１０００未満のユニークリード、または５０００超のユニークリードを有する細胞をＳｅｕｒａｔ（２．３．３）（Ｂｕｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１８）においてフィルタリング除去した。フィルタリング後、ｍＫ２７Ｍ１、ｍＫ２７Ｍ２、及びｍＫ２７Ｍ３にはそれぞれ２７６１細胞、５６２細胞、及び３４６９細胞が存在した。
Ｓｅｕｒａｔ処理
Ｐ１－４遺伝子を（Ｆｉｌｂｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８）から入手し、高可変遺伝子引数（ｇｅｎｅｓ．ｕｓｅ）として使用して、各ヒト及びマウスデータセットにおける共通のサブ構造を同定した。細胞をＣＣＡ－ＵＭＡＰ（ＲｕｎＭｕｌｔｉＣＣＡ及び「ｕｍａｐ」を用いるＤｉｍＰｌｏｔ）を使用してクラスタリングし、クラスター特異的マーカー遺伝子をデフォルト引数でＳｅｕｒａｔの機能「ｆｉｎｄ＿ａｌｌ＿ｍａｒｋｅｒｓ」を使用して同定した。マウス及びヒトＣＣＡ－ＵＭＡＰをマージするために、マウス遺伝子名をＥｎｓｅｍｂｌ ＢｉｏＭａｒｔ（ｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／ｂｉｏｍａｒｔ）を使用してそれらのオーソロガスヒト対応物に変換した。モジュールスコアリングのため、機能ＣｅｌｌＣｙｃｌｅＳｃｏｒｉｎｇ及びＡｄｄＭｏｄｕｌｅＳｃｏｒｅを使用した。４つの遺伝子リスト（ＯＣ、ＡＣ、ＯＰＣ、及びＣｙｃｌｅ）は、Ｐ１－４遺伝子に相当する。各クラスターについて最大で上位５０種の遺伝子を用いてＤｏＨｅａｔｍａｐ機能を使用してヒートマップを作成した。
マウス及びヒトデータセットに対するＳＣＥＮＩＣ
ＳＣＥＮＩＣ（１．０．０－０２）を（Ａｉｂａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１７）に記載されているようにすべてのデフォルト設定で実行した。我々は、各々の種について２つのデフォルトデータベースを使用した（５００ｂｐ－ｕｐｓｔｒｅａｍ及びｔｓｓ－ｃｅｎｔｅｒｅｄ－１０ｋｂ）。各細胞について１０ｅ５のライブラリサイズを有する生マトリックス及びＳｅｕｒａｔ処理からのメタデータデータフレームをＳＣＥＮＩＣのためのインプットとして使用した。ヒートマップ及びｔＳＮＥプロットのため、我々は、二元レギュロンアウトプットを使用した。パッケージ成分ＡＵＣｅｌｌを使用して各レギュロンについての閾値を選択し、次いで各細胞におけるそれらの濃縮について各レギュロンをスコア化した（Ａｉｂａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。次いでスコアを二元化し（オン対オフ）、アウトプットをこの二元活性マトリックスに従ってクラスタリングした（Ａｉｂａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。
マウスシングルセルＡＴＡＣ－ｓｅｑデータ処理
ＣｅｌｌＲａｎｇｅｒを使用して、オープンクロマチン領域を同定及びアノテーションし、サンプルの集成及び細胞の初期クラスタリング及びモチーフ分析を実施した。ＣｅｌｌＲａｎｇｅｒアウトプットをｃｉｓＴｏｐｉｃ及びＳｎａｐＡ－ＴＡＣのためのインプットとして使用し、クラスター、トピックス（Ｔｏｐｉｃｓ）、オントロジー、遺伝子アクセス性、及びモチーフをアノテーションするための推奨設定（Ｂｒａｖｏ Ｇｏｎｚａｌｅｚ－Ｂｌａｓ ｅｔ ａｌ．，２０１９，Ｆａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１９）に従ってサンプルを処理した。Ｈａｒｍｏｎｙパッケージ（Ｋｏｒｓｕｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，２０１８）を、ＳｎａｐＡＴＡＣと併せてデフォルト設定に従って使用してＥ１８データセットをアライメントした。
ＣｈＩＰ－ｓｅｑ調製
我々は、３０μｇのマウス小児脳腫瘍クロマチン及び４μｇの抗体（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ，ｃａｔ ＃３９１５５）を使用してＨ３Ｋ２７ｍｅ３ ＣｈＩＰ反応を完了させた。ＣｈＩＰ反応はまた、シーケンシングデータの正規化のためにショウジョウバエクロマチンスパイクを含有していた。我々は、ごく一部のＣｈＩＰ ＤＮＡを希釈し、同様のアッセイにおいてよく機能した陽性対照プライマー対を使用してｑＰＣＲを実施した。Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３のため、活性遺伝子ＡＣＴＢのプロモーター領域に標的化されたプライマー対は、良好な陰性対照として機能する。
組織学分析
Ｎｉｋｏｎ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ａｎｄ ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して画像を分析した。すべての結果は、別段示される場合を除き、平均±ＳＥＭとして示されている。統計分析のため、以下の規則を使用した：＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１。‘‘スチューデントのｔ検定’’は、対応のない検定を指す。
トランスクリプトーム分析
３つの１０Ｘ ＵＭＩカウントマトリックス（ｍＫ２７Ｍ１、ｍＫ２７Ｍ２、ｍＫ２７Ｍ３）を各細胞について１０ｅ５のライブラリサイズを有するように正規化した。次いで、我々は、Ｓｃａｎｐｙでミクログリア及びｍＯＧを区別するために公共データセットと同じ方法でクラスタリングした。１０％超のミトコンドリアリード、１０００未満のユニークリード、または５０００超のユニークリードを有する細胞をＳｅｕｒａｔ（２．３．３）においてフィルタリング除去した。フィルタリング後、ｍＫ２７Ｍ１、ｍＫ２７Ｍ２、及びｍＫ２７Ｍ３にはそれぞれ２７６１細胞、５６２細胞、及び３４６９細胞が存在した。フィルタリング後、ｍＫ２７Ｍ１、ｍＫ２７Ｍ２、及びｍＫ２７Ｍ３にはそれぞれ２７６１細胞、５６２細胞、及び３４６９細胞が存在した。
ＣｈＩＰ－ｓｅｑ分析
ＣｈＩＰ－ｓｅｑリードを、ｂｗａを使用してマウス参照ゲノムｍｍ１０に対してアライメントした。ＢｉｇＷｉｇトラックを各サンプルについて生成した。
構築されたｍｍ１０マウスゲノムを用いて各サンプルについてｎｇｓ．ｐｌｏｔ（バージョン２．６１）（Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）を使用してＨ３Ｋ２７ｍｅ３クラスタリングを実施した。７つのクラスターに関連する遺伝子のリストをＳｅｕｒａｔにインポートし、遺伝子の各クラスターについての発現をＳｅｕｒａｔ ＡｄｄＭｏｄｕｌｅＳｃｏｒｅを使用して計算した。
塩基エディタージェノタイピング
ＥＤＩＴＯＲを発現する細胞をＰＣＲ増幅に供した（リストプライマー）。各遺伝子－プライマー対についてのＦａｓｔｑファイルを、デフォルトパラメータを用いてＳＴＡＲｌｏｎｇ及びｂｗａ－ｍｅｍを使用してその遺伝子座を含有するカスタムゲノムファイルにアライメントし、その両方は同様の結果を得た。ＢＡＭファイルを視覚化のためにＩＧＶにアップロードした。
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実施例２－結果
ＭＡＤＲストラテジー及び反応検証
ｍＴｍＧは、膜ｔｄＴｏｍａｔｏを構成的に発現し、Ｃｒｅ媒介組換えによりＥＧＦＰ発現に切り替わるマウス系統である。ｍＴｍＧにおけるＭＡＤＲを達成するために、我々は、ｌｏｘＰ及びＦＲＴ部位に隣接するＴａｇＢＦＰ２をコードするプロモーターレスドナープラスミドを作成した（図１Ａ）。我々は、Ｆｌｐ媒介組み込みに対して不応性の最小の３４ｂｐのＦＲＴを使用し、ＦＲＴ部位での繰り返し組換えを防止した。その上、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の前にＰＧＫ及び三量化ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルがあり（図１Ａ）、組み込まれていないエピソーム及びランダムに組み込まれたプラスミド全体からの誤った転写を回避する。ＯＲＦに続いて、発現を増加させるウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御要素（ＷＰＲＥ）及びウサギベータ－グロビンｐＡがある（図１Ａ）。我々は、ｍＴｍＧホモ接合型マウスとＷＴマウスを交配してヘテロ接合型Ｒｏｓａ２６ＷＴ／ｍＴｍＧマウス（ｍＴｍＧＨｅｔ）を生成し、これからヘテロ接合型マウス神経幹細胞株（ｍＮＳＣ）を誘導した。次いで我々は、ＴａｇＢＦＰ２またはＴａｇＢＦＰ２－ＨｒａｓＧ１２Ｖドナー（１０ｎｇ／μｌ）及びＦｌｐ－Ｃｒｅ発現ベクター（Ｆｌｐ－Ｃｒｅ）（１０ｎｇ／μｌ）をヌクレオフェクションすることによって２つのＭＡＤＲ株を作製し、その各々を３つの遺伝子的に明瞭に着色された細胞：ｔｄＴｏｍａｔｏ＋、ＥＧＦＰ＋、及びＴａｇＢＦＰ２＋と混合した（図１Ｂ～Ｃ及び８Ａ）。ヌクレオフェクションから１週間後、ＦＡＣＳ分析は、ＴａｇＢＦＰ２の場合に約１％のＭＡＤＲ効率を示した。ＨｒａｓＧ１２Ｖは、有意により早く増殖した（図８Ｂ）。ＴａｇＢＦＰ２＋細胞の約５％は、ｔｄＴｏｍａｔｏまたはＥＧＦＰのいずれかを保持していた。より多くの細胞がｔｄＴｏｍａｔｏを保持していたが、これは、そのより遅い分解動態によって説明され得る（図８Ｂ～Ｃ）。選別された細胞をさらに１週間培養した後、我々は、ウエスタンブロットによって残存ＥＧＦＰまたはｔｄＴｏｍａｔｏ及び単一バンドＨｒａｓＧ１２Ｖの非存在を確認し、組み換えられたＲｏｓａ２６遺伝子座が、抗生物質選択を伴わずに凝集ポリクローナル集団レベルで単一の正確なサイズのポリペプチドを発現したことを示唆している（図８Ｄ）。細胞単位ベースでタンパク質産生を評価するために、我々は、ｐｉｇｇｙｂａｃ－ＴａｇＢＦＰ２を保有するｍＮＳＣ及びヘテロ接合型ＴａｇＢＦＰ２＋ＭＡＤＲ細胞におけるＴａｇＢＦＰ２タンパク質レベルを比較した。ＭＡＤＲ細胞におけるＴａｇＢＦＰ２の強度は、狭い分布を有していた一方で、ｐｉｇｇｙＢａｃ細胞は、１桁分にわたる広い動的発現範囲を有していた（図１Ｄ～Ｆ）。
単一コピー挿入を検証するために、我々は、ピューロマイシンＮ－アセチル－トランスフェラーゼ（ＰＡＣ）を保有するドナープラスミドを生成し、抗生物質選択を介して導入遺伝子を正確に発現する細胞を濃縮した（図８Ｅ、第２列）。我々は、これらの細胞においてＲｏｓａ２６遺伝子座で正確な組換えを確認した（図８Ｅ～Ｇ）。選択された細胞において、ｔｄＴｏｍａｔｏカセットはもはや、ｄＲＭＣＥをするとＣＡＧ－プロモーターの下流に存在せず、ＰＡＣ細胞が、未知の染色体位置からプロモーターを欠くＰＡＣ ＯＲＦを活発に発現するｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞ではなかったことを示唆している（図８Ｆ、第１～２列）。また、ＰＣＲスクリーニングにより、細胞の小サブセットにおいてＥＧＦＰシストロンの継続した存在が明らかとなった（しかし、ＥＧＦＰ発現はこれらの集団では検出されなかった［データは示されていない］）が、これはＥＧＦＰカセットのＣｒｅ媒介組み込みを有するが、Ｆｌｐ媒介切除を有さなかった少数の細胞において起こる可能性がある（図８Ｅ、第４列）。しかしながら、このＥＧＦＰカセットは、いくつかのポリＡ要素によってブロックされ、ＣＡＧプロモーターのはるか下流に位置し、これによりＥＧＦＰ発現が軽減される（図８Ｆ、第５列）。これを検証するために、我々は、ＴＲＥ反応性ＥＧＦＰ要素を保有する別のプラスミドを使用した（図８Ｇ））。このプラスミドを使用し、ピューロマイシン耐性細胞について選択して、我々は、ウエスタンブロットによってＥＧＦＰ蛍光または発現を観察せず、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）処置でのみＥＧＦＰ発現が生じた（図８Ｈ～Ｊ）。
同じ遺伝子的バックグラウンドを有する複数の誘導性ｉｎ ｖｉｔｒｏシステムのＭＡＤＲ媒介「ワンショット」生成
遺伝子機能のためのアッセイはしばしば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで形質導入またはトランスフェクションされた細胞株を使用して実施されるが、いくつかの導入遺伝子の構成的発現は、変異が適応度を低下させる場合、安定細胞株生成を妨害し得る。これを回避するために、ＴＲＥなどの誘導性遺伝子システムを用いて、まず細胞株を作製し、次いで対象となる遺伝子（複数可）の発現を開始させ得る。単一アレルｍＴｍＧＨｅｔ ｍＮＳＣの有用性を提示するために、我々は、誘導性細胞株生成のためのパイプラインを、これらの細胞をｒｔＴＡ－Ｖ１０及びＴＲＥ－Ｂｉ要素を含有するＭＡＤＲ適合性ベクターでヌクレオフェクションすることによって確立した（図８Ｈ）。この無色のＴＲＥ－Ｂｉ－ＥＧＦＰ細胞株をピューロマイシン選択で濃縮し、標準的なｉｎ ｖｉｔｒｏのＤｏｘ処置を使用して確認した（図８Ｉ～Ｊ）。
このｉｎ ｖｉｔｒｏパイプラインは、より均質な誘導性安定細胞株を提供することによってｌｏｘＰ及びＦｒｔを保有する任意の動物に由来する様々な初代細胞株におけるＧＯＦ変異の帰結を調べるのに有益である。このための原理の証明として、また、ＴＲＥ－Ｂｉ要素の３’シストロンが遠位のプロモーター／エンハンサー領域のために散発的に発現したかどうかを決定するために、我々は、バイシストロン性ＴＲＥ－Ｂｉ－Ｄｌｌ１／ＥＧＦＰドナーベクターを用いて、ＮｏｔｃｈリガンドであるＤｌｌ１を誘導的に発現する細胞株を生成した（図８Ｋ）。この株は、Ｄｏｘがない場合はＤｌｌ１のわずかな生理的レベルのみを示した一方で、ＥＧＦＰ及びＤｌｌ１の両方は、Ｄｏｘ処置ですべての細胞によって同様のレベルで発現した（図８Ｌ～Ｍ）。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、遺伝子量感受性がある多くの分子経路のうちの１つであり、ＭＡＤＲは、そのような経路を研究することが目的とされ得る。
ｍＴｍＧＨｅｔ ｍＮＳＣから、我々はまた、単一ヌクレオフェクションにおいて４種の異なる「スパゲティモンスター」レポータータンパク質（ＳＭ－ＦＰ）を有する異なる細胞株を生成した（Ｖｉｓｗａｎａｔｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。我々は、我々が複合抗原性ＸＦＰを伴うＭＡＤＲ（ＭＡＤＲ ＭＡＸ）と名づけるこのパイプラインを使用して（図１Ｇ）、細胞当たり各プラスミドの複数のコピーが発現することができたかどうかを評価した。ＳＭ－ＦＰは、実質的にすべての細胞において抗生物質選択及びＤｏｘ添加の後に比例した比で発現した（図１Ｈ）。さらに、我々は、複数のＳＭ－ＦＰを発現するいかなる細胞も観察せず、１つの導入遺伝子の１つの細胞への組み込みを示している（図１Ｉ）。よって、安定誘導性細胞株のこの「ワンショット」生成は、抗生物質選択中に異なる遺伝的浮動を引き起こすことなく共通の遺伝的バックグラウンドにおいて複数の導入遺伝子の多重分析を可能にし得る。我々は、ｉｎ ｖｉｖｏでまたはトランスフェクションすることが困難な株を伴ってＭＡＤＲプラスミドを試験することは、多くの労力を必要とし得ることに気づくであろうが、これにより、我々は、ｉｎ ｖｉｔｒｏプロトタイピングのための前述したｍＴｍＧ ＨＥＫ２９３及びマウスＮＳＣに加えて、多くの様々な構成のマウスＮ２ａ「代理」株の宿主を生成した（図８Ｎ～Ｏ）。
ヒト細胞株におけるＭＡＤＲ反応
ＭＡＤＲがヒト細胞において機能することを確認するために、我々はＭＡＤＲ適合性レシピエント部位を設計し（図１Ｊ）、ＴＡＬＥＮを使用して我々は、このカセットがＡＡＶＳ１遺伝子座に挿入されたヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞株を生成した。ここで、ＭＡＤＲ反応は、ｌｏｘＰ及びＦＲＴ部位に隣接するＣＡＧで駆動するｔｄＴｏｍａｔｏを置き換える（図１Ｊ）。ＭＡＤＲの機能をヒト細胞において試験するために、我々は、細胞株にＳＭ－ＦＰ（明）－ｍｙｃドナー及び代替ＴａｇＢＦＰ２－３ＸＦｌａｇドナーをトランスフェクションした。免疫蛍光分析により、切除を介してｔｄＴｏｍａｔｏを欠いた細胞株が、ＴａｇＢＦＰ２－３ＦｌａｇまたはＳＭ－ＦＰ（明）－ｍｙｃドナー導入遺伝子のいずれかを発現したことが確認された（図１Ｋ～Ｍ）。これらの結果は、ヒト細胞が関与する研究にＭＡＤＲを取り入れる能力を実証している。
ｉｎ ｖｉｖｏ ＭＡＤＲの機能検証
ｉｎ ｖｉｖｏでＭＡＤＲを達成するため、我々は、蛍光タンパク質レポーター（ＴａｇＢＦＰ２または膜タグ化ＳＭ＿ＦＰ－ｍｙｃ）を含有するドナープラスミド及びＦｌｐ－Ｃｒｅ（各々０．５μｇ／μｌ）を出生後２日目（Ｐ２）のｍＴｍＧＨｅｔ仔の脳室／脳室下領域（ＶＺ／ＳＶＺ）を覆う神経幹／前駆細胞にエレクトロポレーション（ＥＰ）した（図２Ａ）。ＥＰから２日後、我々は、ＶＺに沿ってＴａｇＢＦＰ２＋細胞の存在を確認したが、一部の細胞は検出可能なＥＧＦＰも発現した（図９Ａ）。ＥＰから７日後、多くのＶＺ放射状グリア及び移動したばかりの嗅球ニューロンは、ＳＭ＿ＦＰ－ｍｙｃレポーターを発現した。
２週間後までに、分化した線条体グリア及び嗅球ニューロンが現れた（図２Ｂ及び９Ｂ～Ｃ）。この時点で、我々は、上衣系統細胞の形態的特徴（すなわち、立方体状形態を伴う多数の繊毛形成、図９Ｂ）を伴ってＶＺで持続性ＥＧＦＰ発現を有するいくつかの稀なＴａｇＢＦＰ２＋細胞に気づいた。我々は、これらの二重陽性細胞が実際にＦｏｘｊ１＋上衣細胞であることを確認し（図９Ｃ～Ｇ）、ＭＡＤＲレポーターとＥＧＦＰとの間の逆相関を認めた。これらの細胞は、最小レベルのタンパク質翻訳を有し得、よって、一般に遅いタンパク質動態を有し、持続的なＥＧＦＰ発現をもたらす可能性がある。しかしながら、ほとんどのＴａｇＢＦＰ２＋細胞は、ＥＰ後の最初の数日後にｔｄＴｏｍａｔｏ及びＥＧＦＰ発現を欠いていた（図９Ｂ、２Ｈ）。
ｉｎ ｖｉｖｏ組換え効率に対するプラスミド濃度の影響を試験するために、我々は、Ｆｌｐ－Ｃｒｅプラスミド及び組換え細胞の高感度検出のためのＳＭ＿ＦＰＹ－ｍｙｃの濃度を変化させた（図２Ｃ及び図９Ｉ）。我々は、リコンビナーゼ量の増加がＥＧＦＰ＋細胞の増加をもたらすが、より高いドナープラスミド濃度が同様の効果を有していたことを見出した（図２Ｃ及び図９Ｉ）。しかしながら、ＥＧＦＰ及び挿入ドナーは、同じ遺伝子座について競合したので、ゼロサム効果が存在する。さらに、ＥＧＦＰの持続性のため、２日目に多くの細胞が両方の導入遺伝子を発現した。特に、これはおそらく、これらの蛍光タンパク質の半減期の不可避な帰結であり、レポーター減衰が９日を超える時点と推定されたｍＴｍＧにおける組換え後の短い生存時点でｔｄＴｏｍａｔｏ及びＥＧＦＰ細胞の間でみられる重複と同様である。
導入遺伝子発現が、ランダムに組み込まれたまたは組み換えされていないエピソームからの発現によるものであった可能性を排除するために、我々は、一連の対照ＥＰを実施した（図９Ｊ）。まず、高度に濃縮されたＨｒａｓＧ１２Ｖ（約５μｇ／μｌ）及びｐｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）－ＥＧＦＰレポーターのＷＴ仔へのＥＰは、ＦｌｐまたはＣｒｅの存在にもかかわらず、異常成長、過形成、または腫瘍形成をもたらさなかった（図９Ｊ、ＨＲａｓＧ１２Ｖ表現型のＭＡＤＲ後に観察された表現型の例の場合、下記参照）。また、我々は、ｍＴｍＧ仔を、反転ｌｏｘＰを保有するＨｒａｓＧ１２Ｖでエレクトロポレーションしたが、免疫染色によっていかなる青色の組み換え細胞または過形成も検出できず、ｉｎ ｖｉｖｏでのＭＡＤＲ組換え反応の特異性を示している（図９Ｋ）。ＨｒａｓＧ１２Ｖドナープラスミド及びＣｒｅリコンビナーゼ単独のいくつかの独立したＥＰは、ＥＰから２週間後に調べた場合に腫瘍形成を生成できず、Ｃｒｅが、Ｆｌｐ切除がないとＭＡＤＲドナーの顕著な安定組み込みを導入することができないことを示唆している（データは示されていない）。
ＭＡＤＲは、多くの既存のマウスと適合性があるが、ｍＴｍＧは、ネイティブｔｄＴｏｍａｔｏのため、赤色チャンネルを使用することができないという欠点を我々に提供した（例えば、図２Ｂ）。我々は、２つの方法でこの制限を解決した。７５０ｎｍ超の波長のフルオロフォアを用いて第５のレーザーチャンネルを用いること（図９Ｌ）または漂白し、利用可能となった赤色チャンネルを免疫染色すること（図９Ｍ～Ｎ）による。漂白を用いて、我々は、４つのＳＭ－ＦＰベクターをｍＴｍＧＨｅｔ仔に同時にエレクトロポレーションすることによってｉｎ ｖｉｖｏで細胞系統の多重標識について試験した（図２Ｄ）。これは、２週間後までに明確に着色された嗅覚ニューロンの４つの群をもたらし、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの観察（図１Ｈ～Ｉ）と同様の１つの導入遺伝子の１つの細胞への安定な組み込みを確認している（図２Ｅ～Ｆ）。これらの実験は、ＭＡＤＲが、標的遺伝子座で特異的に触媒される周知の生化学的反応に依存する信頼性のある方法であることを示唆している。ＭＡＤＲは、ＳＭ－ＦＰ－ｍｙｃ及びＥＧＦＰレポーターの優れたシグナル特性と組み合わされた増大した細胞サイズのため、アストロサイトプロセスを含む細かい細胞細部の超分解能様細部を利用可能とする膨張顕微鏡法アプローチに理想的である（図２Ｇ～Ｌ）。
３次リコンビナーゼを用いるモザイク分析（ＭＡＴＲ）
ＭＡＤＲの１つの潜在的な制限は、２つの一般的に使用されるリコンビナーゼであるＦｌｐ及びＣｒｅのその利用である。よって、我々は、別の導入遺伝子の重畳的コンディショナルＶＣｒｅ媒介活性化を試験した。これを行うために、我々は、ＴａｇＢＦＰ２－Ｐ２Ａの下流にＶＣｒｅを発現するプラスミドを生成した（図２Ｍ）。次いで我々は、ＳＭ－ＦＰ－ｍｙｃベースのＶＣｒｅ ＦｌＥｘレポーターを用いて（図２Ｍ）、ＴａｇＢＦＰ２－Ｐ２Ａ－ＶＣｒｅドナーを伴うまたは伴わない組換えを調べた。特に、ＳＭ－ＦＰ－ｍｙｃは、代替ＴａｇＢＦＰ２－３ｆｌａｇが挿入された場合は検出されなかったが、ＶＣｒｅ含有ドナーが挿入された場合は容易に発現した（図２Ｎ～Ｏ）。よって、ＭＡＤＲ直交リコンビナーゼは、二次コンディショナル要素の活性化を可能とし得る。
３重ＫＤ対ＫＯモデルを比較するためのＭＡＤＲ
ＭＡＤＲが提供する安定なゲノム挿入及び導入遺伝子発現を考慮して、我々は、単一コピーｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍モデルを生成するためにＭＡＤＲを利用することを模索した。Ｎｆ１、Ｐｔｅｎ、及びＴｒｐ５３などのＬＯＦ腫瘍サプレッサー遺伝子変異は、神経膠腫患者において最も一般的なドライバー遺伝子の一部である。マウス神経膠腫モデルは、これらの腫瘍サプレッサーのノックアウトが重度の神経膠腫につながることを示す。例えば、二重Ｔｒｐ５３／Ｎｆ１－ＫＯは、オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）の悪性腫瘍前過剰増殖を促進する。我々は、腫瘍サプレッサーに対するｍｉＲ－Ｅ ｓｈＲＮＡが腫瘍形成に十分かどうかを試験したいと考えていたが、その理由はこのアプローチが可逆的となり得るからである。
まず、我々は、ＴａｇＢＦＰ２と、それに続くＮｆ１、Ｐｔｅｎ、及びＴｒｐ５３に標的とされた３つの検証されたｍｉＲ－Ｅを保有するドナーコンストラクトを生成した（図３Ａ）。我々は、このｍｕｌｔｉ－ｍｉＲ－Ｅコンストラクトを試験し、それらの標準的なノックダウン効率に匹敵する約８０％でのｍＲＮＡレベルノックダウン効率を観察した（図３Ｂ）。我々は、ｉｎ ｖｉｖｏでＴａｇＢＦＰ２＋／Ｐｄｇｆｒａ＋ＯＰＣの選択的異常増殖を観察した。特に、Ｃｒｅ切除のみを有するＥＧＦＰ＋集団は、アストロサイト細胞のより小さな混合集団を生成した（図３Ｃ）。これらの組換えＥＧＦＰ＋細胞は、内部対照細胞集団として機能することができた。特に、我々は、ＥＰから２００日後にいかなる腫瘍も検出せず、Ｎｆ１、Ｐ５３、及び／またはＰｔｅｎの完全な切除が、高い浸透率の早期発生腫瘍形成に必要であることを示している。
これをさらに試験するために、我々は、これらのサプレッサーのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースのノックアウトに切り替えた。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、ＥＰを使用してｉｎ ｖｉｖｏで遺伝子を変異させるのに非常に有効であることが実証されている。エピソーマルプラスミドを使用して、我々は、Ｎｆ１、Ｔｒｐ５３、及びＰｔｅｎのすべてに対するｓｇＲＮＡが、ＧＥＭＭ、ＭＡＤＭ、及び子宮内ＥＰベースのＣＲＩＳＰＲモデルと一致する白質に関連する重度のＯｌｉｇ２＋腫瘍の形成をもたらしたことを観察した（図１０Ｃ～Ｄ）。トランスポゾン送達ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９研究の欠点は、改変された細胞の系統追跡するための決定的な方法を欠くことであり、その理由は、トランスポゾン送達Ｃａｓ９は、インデルを触媒し得るが、トランスポゾンがその後「ホップ」して出得るという顕著な可能性が存在し、非標識腫瘍をもたらすからである。この問題に対処するために、我々は、ＳＭ＿ＢＦＰ２－Ｐ２Ａ－ＳｐＣａｓ９ドナープラスミドを作成して細胞を同時に標識し、変異させ、ｉｎ ｖｉｖｏで変異体細胞の信頼できる追跡が可能となった（図３Ｄ）。Ｎｆ１及びＴｒｐ５３を標的化するためのｓｇＲＮＡは、エレクトロポレーションされた動物において５か月後までに最終死亡率を引き起こすのに十分であり、病理学的分析は多形性膠芽腫（ＧＢＭ）と診断した。エレクトロポレーションされた細胞における標的化の成功をジェノタイピングによって確認した（図３Ｅ）。
共焦点画像化は、腫瘍が、ｔｄＴｏｍａｔｏで標識された集団を概ね欠く一方で、血管系は赤色のままであったことを実証した（図３Ｆ～Ｆ１、１０Ｅ）。元の標的化部位が存在することが予測された場所の近くで小さなＥＧＦＰ集団観察された（図３Ｆ、Ｆ２；矢じり）。腫瘍のほとんどはＯｌｉｇ２＋であったが、ＣＤ４４＋／Ｏｌｉｇ２－陰性領域が起源部位の近くで観察され、前神経から間葉までのｉｎ ｓｉｔｕ腫瘍進化を示唆している（図３Ｇ～Ｉ；矢じり；３Ｇ２）。
これらのＣａｓ９ベースのＬＯＦ方法を補完するために、我々は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ塩基エディター（ＦＮＬＳ）をＭＡＤＲに加え（図３Ｊ）、これはｓｇＲＮＡ標的部位の近くでＣからＴへの変異を触媒する。我々は、ＳＭ＿ＦＰ－ｍｙｃレポーター、ＦＮＬＳ、ならびにＮｆ１、Ｔｒｐ５３、及びＰｔｅｎにおいて未成熟終止コドンを生成するように設計されたｓｇＲＮＡを導入した（図３Ｋ）。ＧＦＰ選別されたＭＡＤＲ細胞のアンプリコンシーケンシングは、塩基エディターが未成熟終止コドンを誘導することができたことを確認した（図１０Ｆ）。２か月後、我々は、ｍｉｒ－Ｅ及びＣａｓ９ ＬＯＦ研究に類似するＯＰＣの劇的な増殖を認めた（図３Ｌ～Ｍ）。これらのＫＤ対ＫＯ研究のすべては、同じマウス系統（ｍＴｍＧ）において行われ、組み合わされた系統追跡を用いてＬＯＦ分析を多重化するためのＭＡＤＲの様々な手段を実証した。その上、我々は、遺伝子ノックダウン／ノックアウトのためのＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓバリアントのためのＭＡＤＲ要素を生成した（図１０Ｇ）。
ＭＡＤＲによって明らかにされたＧＯＦがん遺伝子量感受性
我々は、ＲＣＥレポーターマウスと適合性のあるＨｒａｓＧ１２ＶベースのＭＡＤＲドナーを作製し、Ｅ１４ ＲＣＥ－ヘテロ接合型胚において子宮内ＥＰ（ＩＵ－ＥＰ）を実施した（図４Ａ～Ｂ）。マウス胚におけるＰｉｇｇｙＢａｃ媒介ＨｒａｓＧ１２Ｖ－過剰発現は、出生から１５～２０日以内に重度腫瘍を誘導することが示されている（Ｇｌａｓｇｏｗ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。対照的に、我々は、ＭＡＤＲ×ＲＣＥ－ｈｅｔ動物をＰ１５で試験したときに腫瘍成長を観察しなかった。しかしながら、我々は、ＴａｇＢＦＰ２－ＨｒａｓＧ１２Ｖ細胞のアストログリア系統への顕著な細胞運命スイッチを認めた（図４Ｃ、１１Ａ）。ＥＧＦＰ＋Ｃｒｅ切除細胞は、ニューロン及びグリアの混合集団からなっていた（図４Ｃ、１１Ａ）。これは、ＭＡＤＲが多コピー導入遺伝子ベースのトランスポゾンモデルと一致しない重要な例であり、遺伝子量に依存するＧＯＦがん遺伝子の帰結を強調している。ｍＴｍＧ及びＲＣＥ系統に加えて、ＭＡＤＲは、ネイティブシス調節エレメント配列下で導入遺伝子を置換する効果を調べるためにスプライスアクセプターを使用してＡｉ１４、Ｒ２６－ＣＡＧ－ＬＦ－ｍＴＦＰ１、Ｒｉｂｏｔａｇ系統及び何千ものＩＫＭＣマウス系統を含む、二重リコンビナーゼ部位を保有する任意のオフザシェルＧＥＭＭを用いて採用され得る（図１１Ｂ）。
我々は、出生後のＷＴ仔にエレクトロポレーションされた場合に１００％浸透性の神経膠腫をもたらすＨｒａｓＧ１２Ｖに基づくＰＢ－腫瘍モデルを先行して研究した。ＭＡＤＲ ＴａｇＢＦＰ２－ＨｒａｓＧ１２Ｖ導入遺伝子が出生後にｍＴｍＧＨｅｔに送達された場合、ＨｒａｓＧ１２Ｖ＋細胞は、ＥＧＦＰ＋集団と比較した場合、同様に過剰増殖した（図１１Ｂ～Ｃ）。ＨｒａｓＧ１２Ｖ量の効果を決定的に調べるために、我々は、ホモ接合型ｍＴｍＧにＨｒａｓＧ１２Ｖをエレクトロポレーションし、我々は、ＨｒａｓＧ１２Ｖ×１またはＨｒａｓＧ１２Ｖ×２細胞を分化させることができることを予期した（図４Ｄ～Ｅ）。すべてのマウスは、神経膠腫を急速に発症し、３～４か月以内に最終死亡率に達した（データは示されていない）。
興味深いことに、ホモ接合型ｍＴｍＧマウスでは、青色及び緑色の両方を発現する細胞（ＨｒａｓＧ１２Ｖ×１）よりも、青色のみの細胞（ＨｒａｓＧ１２Ｖ×２）が、腫瘍断面のより大きなパッチを占有した（図４Ｆ～Ｇ）。ＰＢ－ＥＰを使用して、我々はまた、より明るいＥＧＦＰタグ化ＨｒａｓＧ１２Ｖ細胞のパッチが、より暗いＥＧＦＰ＋細胞よりも多いリン酸化Ｒｂ１（ｐＲｂ１）を発現したことを観察した（図１１Ｄ）。コピー数が明らかなＭＡＤＲにおいて、Ｒｏｓａ２６ＨｒａｓＧ１２Ｖ×２細胞のほとんどがｐＲｂ１を発現したようであったのに対し、それはより少ない半接合型Ｒｏｓａ２６ＨｒａｓＧ１２Ｖ×１細胞で発現した（図４Ｇ～Ｈ）。ＭＡＤＲモザイクにより、これらの２つの群の細胞を遺伝子的に区別し、それらの差異を調べることが可能となるが、ＰＢ腫瘍モデルはそれをすることができず、がん遺伝子のコピー数（多くの体細胞トランスジェニック方法では制御できない）は、生じる腫瘍のプロファイルを有意に変化させ得ることを確認する。
融合タンパク質に基づくＭＡＤＲ上衣腫モデル
多くの腫瘍ドライバーは融合タンパク質であるが、染色体再配置を模倣するコンディショナルＧＥＭＭを作成することは困難であり得る。例えば、融合タンパク質ドライバーであるＹＡＰ１－ＭＡＭＬ１Ｄ及びＣ１１ｏｒｆ９５－ＲＥＬＡは、テント上上衣腫において反復的に見られ、我々は、それらを発現させるためのＭＡＤＲベクターを作成した（図４Ｉ）。ＭＡＤＲ－ＫｒａｓＧ１２Ａ腫瘍モデル（神経膠腫の遺伝子ドライバー）と比較して、ＹＡＰ１－ＭＡＭＬ１Ｄ及びＣ１１ｏｒｆ９５－ＲＥＬＡのＭＡＤＲ腫瘍細胞は、顕著に異なる開始パターンを示した。ＫｒａｓＧ１２Ａ細胞は、線条体に急速に侵入し、増殖したが（図１１Ｅ）、ＹＡＰ１－ＭＡＭＬ１Ｄ腫瘍は、ロゼット様構造に剥離し、周囲のＥＧＦＰ＋対照細胞において非細胞自己反応性グリオーシスを誘導した（図１１Ｆ～Ｇ）。Ｃ１１ｏｒ９５－ＲＥＬＡ細胞は混合表現型を示し、これによりそれらはしばしば、ＶＺ壁に沿って留まり、または腹側ＶＺの近くで小さなクラスターを形成した（図１１Ｈ～Ｉ）。上衣腫において頻繁に見られるＣｄｋｎ２ａの同時喪失を模倣するために、我々は、ｐ１６及びｐ１９に対するｓｇＲＮＡを用いてＣａｓ９を使用した。ＹＡＰ１－ＭＡＭＬ１Ｄ×ｐ１６／１９－ＫＯ動物は、およそ１．５か月以内に最終死亡率に達した（図４Ｊ～Ｋ）。しかしながら、Ｃ１１ｏｒｆ９５－ＲＥＬＡ×ｐ１６／１９－ＫＯ腫瘍は、より長期化した生存を示し、およそ３か月で最終死亡率に達した（図４Ｋ～Ｌ）。我々の神経膠腫モデル及びヒト神経膠腫の浸潤性縁部とは異なり、上衣腫は、患者に見られる活動的縁部に類似する侵入細胞の欠如を伴う明確な縁部を示した（図１１Ｊ～Ｋ）。まとめると、このデータは、融合タンパク質によって誘発されるものを含む多様な腫瘍タイプをモデリングするＭＡＤＲの能力を実証した。
ＭＡＤＲを使用したＨ３ｆ３ａ Ｇ３４Ｒ及びＫ２７Ｍ小児神経膠腫ドライバーの直接比較
ほぼすべてのヒト腫瘍は、パッセンジャーであるか、または直接的にがんの一因となる異なるセットの体細胞及び生殖系列変異を呈する。変異を選別し、これらの変異のセットを比較する能力を用いて、ＭＡＤＲは、各腫瘍サブタイプに対して独特な薬物耐性及び生存に対する重要な含意を用いて意味合いを持たせた独自性を研究するために適合された個別化腫瘍モデルプラットフォームとして機能し得る。原理の証明として、我々は、Ｈ３Ｆ３Ａ Ｋ２７ＭまたはＧ３４Ｒ変異が５０％超の患者で観察されるが、多様な他の変異と共に生じる小児ＧＢＭをモデリングするために選択した。例えば、Ｈ３Ｆ３Ａ変異はしばしば、再発性顕性活性Ｐｄｇｆｒａ（Ｄ８４２Ｖ）、及び顕性陰性Ｔｒｐ５３（Ｒ２７０Ｈ）と同時に生じる。この状況におけるＭＡＤＲの実用性を実証するために、我々は、Ｇ３４ＲまたはＫ２７Ｍについてのミスセンス変異によってのみ異なるバリアントを有する同時Ｈ３ｆ３ａ、Ｐｄｇｆｒａ、及びＴｒｐ５３変異をモデリングするためのドナープラスミドを作製し、これらのドライバー遺伝子の異なる効果を研究した（図５Ａ）。
まず、我々は、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫組織化学によってＨ３ｆ３ａ、Ｐｄｇｆｒａ、及びＴｒｐ５３の適切な発現について確認し、すべてのタンパク質の同時発現を認めた（図１２Ａ～Ｂ）。次に、我々は、出生後ＥＰによってこれらのプラスミドをいくつかの同腹子にわたって兄弟の仔に導入した。皮質及び線条体ＶＺの両方における幹／前駆細胞にトランスフェクションするために、電極を示されているように移動させた（図５Ｂ～Ｃ）。最初の２～４か月間、Ｇ３４Ｒ及びＫ２７Ｍマウスの両方においてＥＧＦＰ＋細胞が拡散増殖したが、ＭＡＤＭ神経膠腫モデルで見られる長期腫瘍前段階と同様に、臨床的病理によって腫瘍を同定することはできなかった（図１２Ｃ）。
Ｋ２７ＭまたはＧ３４Ｒ／Ｖ変異のいずれかを保有する患者腫瘍は、異なるトランスクリプトーム及び臨床的特徴を示す。ヒトＫ２７Ｍ神経膠腫は正中線に沿ってクラスター化するが、脳半球ではＧ３４Ｒが生じる。Ｋ２７Ｍ腫瘍は、Ｇ３４Ｒ／Ｖよりもより若い患者で現れる。外見的には、それらのより早期の臨床所見と一致して、いくつかのＫ２７Ｍ＋マウスはＰ１００までに正中線神経膠腫を示し、その時点でＧ３４Ｒ＋は、びまん性グリア過形成及び極めてまれな小さな腫瘍を示した（図５Ｄ～Ｅ、データは示されていない）。Ｐ１２０で、Ｋ２７Ｍ腫瘍は主に、皮質下構造に局在化したが、細胞は、より深い皮質層において少しの細胞を伴って白質路で観察することができた（図５Ｆ）。対照的に、Ｇ３４Ｒ腫瘍は、脳梁及びより深い皮質層に局在化し、患者に見られる半球局在化と同様のパターンで正中線を横切って「チョウ型」神経膠腫をしばしば形成した（図５Ｇ）。これは、線条体ＶＺの前述の標的化（及びこれらの細胞の一部の観察可能な過形成、図５Ｇにおける黄色の矢印）にかかわらず発生した。
病理学的特徴には、高い細胞密度、微小血管増殖、及び晩期の壊死が含まれた（図５Ｈ～Ｊ）。Ｋ２７Ｍ、及びＧ３４Ｒ腫瘍はいずれも１００％浸透性であり、Ｐｄｇｆｒａ及びＴｒｐ５３変異を含有するＨ３ｆ３ａ ＷＴ腫瘍と比較して加速した終点を示したが（図５Ｋ）、それらの患者の対応物と一致する腫瘍「発生部位」（正中線対皮質）を一貫して示した（図５Ｌ）。適切なＨ３ｆ３ａ変異の発現を解明するために、我々は、交差反応性のないそれぞれの変異体残基に対する抗体を用いた（図１２Ｄ～Ｇ）。
これらの細胞の細胞自己特性を比較するために、我々は、各アレルが１つのみの導入遺伝子挿入を受けることができるＭＡＤＲの独自の特性を探求し、Ｋ２７Ｍ及びＧ３４Ｒプラスミドを１：１の比で共送達した（図５Ｍ～Ｎ）。連続断面における前述した抗Ｋ２７Ｍ及び抗Ｇ３４Ｒ抗体の使用により、個々の腫瘍におけるそれぞれの導入遺伝子の共発現が確認された（図５Ｏ～Ｐ）。さらに、ビオチンコンジュゲートＫ２７Ｍ抗体及びウサギ血清媒介ブロッキングを使用してＧ３４Ｒ変異体細胞の同時存在が可能となり、我々は、各ＳＭ＿ＦＰ－ｍｙｃ＋細胞が、１つのみのＨ３ｆ３ａ変異体バリアントを発現したことを確認した（図１２Ｈ）。Ｋ２７Ｍ及びＧ３４Ｒ細胞の定量は、Ｋ２７Ｍの非常に有意な増加を示し、それらのＧ３４Ｒ対応物を外へと増殖させるそれらの能力を示唆している（図５Ｑ）。これらの知見は、同じ遺伝的バックグラウンド（または動物でさえ）に与えられたＫ２７及びＧ３４残基が、ヒト表現型に類似するこれらの神経膠腫サブタイプの発症の時間及び位置を変化させ得ることを示唆している。
いくつかの研究は、Ｋ２７Ｍ変異がＨ３Ｋ２７残基で低メチル化をもたらすことを示しており、我々は、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３抗体によってＫ２７Ｍ変異体細胞の低メチル化を確認した（図１２Ｉ～Ｊ）。浸潤性腫瘍細胞は、ヒトＫ２７Ｍ腫瘍において記載されている神経周囲衛星病変を示し、並存したＥＧＦＰ＋Ｋ２７Ｍグリア及びニューロンは、高分解能で顕著に異なるＨ３Ｋ２７ｍｅ３レベルを示した（図１２Ｋ）。低メチル化は腫瘍成長のアーティファクトではなく、その理由は、我々のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースのＮｆ１／Ｔｒｐ５３－ＫＯモデルにおいて、神経膠腫は、正常であったか、または高メチル化していたからである（図１２Ｌ）。Ｈ３Ｋ２７におけるアセチル化は、大幅に変化しないようであった（図１２Ｍ～Ｎ）。
ＭＡＤＲ Ｋ２７Ｍは、ヒト腫瘍不均一性及び発生階層を再現する
免疫組織学的分析は、腫瘍細胞が、Ｋ２７Ｍ神経膠腫において濃縮されているものとして最近同定されたＢｍｉ１を上方制御したことを実証した（図１２Ｏ～Ｐ）。集団としては、Ｋ２７Ｍ細胞は、アストログリア系統の標準的なマーカーであるＡｌｄｈ１ｌ１などのグリアマーカーを広く発現した。Ａｌｄｈ１ｌ１は、腫瘍の縁部で最も顕著にＥＧＦＰ＋腫瘍細胞と共に共局在化した（図１２Ｒ）。これらの細胞は、反応性アストロサイトと類似して、より大きなサイズを有する傾向があった。逆に、ＮＧ２標識ＥＧＦＰ＋細胞は、ＯＰＣと類似する形態を伴って、より小さくなる傾向があった（図１２Ｓ）。腫瘍前駆細胞の動態の将来の非侵襲性画像化及び観察を可能にするために、我々は、非侵襲性画像化、及びＦＵＣＣＩでの胞周期段階報告の両方のために二次構成的シストロンを生成した（図１２Ｔ～Ｖ）。さらに、ＭＡＤＲは、必然的に、蛍光マーカーによって正常集団及び腫瘍集団を分離するのに適している（図１２Ｗ）。我々は、この特徴を使用して、Ｋ２７Ｍ腫瘍細胞に対して選択的に毒性であることが判明した２つの先行して同定されたキナーゼ阻害剤（Ａｋｔ１／２阻害剤及びＶａｃｑｕｉｎｏｌ－１）のうち、Ａｋｔ１／２阻害剤が同様にＮＰＣ増殖を阻害したことを実証した（図１２Ｘ）。Ｖａｃｑｕｉｎｏｌ－１は、ＮＰＣ培養成長を変化させないが、Ｋ２７Ｍ成長を阻害するという我々の確認は、これらの腫瘍に関してこの化合物の継続調査のための証拠を提供する。
グリアマーカーのこの不均一性は、ヒトＫ２７Ｍ腫瘍における最近の知見と表面上類似し、これは、シングルセルＲＮＡシーケンシング（ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ）による有意な腫瘍内不均一度を実証した。この類似したヒトＫ２７Ｍデータの利用可能性を考慮して、我々は、それらのヒト対応物に対してＭＡＤＲモデル細胞の信用を与え、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑの使用を介して不均一性に対するより深い洞察を得るための独自の機会を得た。
我々は、３つの独立したＫ２７Ｍ腫瘍からのＥＧＦＰ＋選別された腫瘍細胞を液滴ベースのｓｃＲＮＡ－ｓｅｑに供した（図６Ａ、表２）。コピー数バリエーション（ＣＮＶ）分析は、ヒトＫ２７Ｍ神経膠腫において観察されるように染色体異常を示した（図１３Ａ）。シーケンシング、アライメント、及び品質管理後、我々は、Ｓｅｕｒａｔを使用してマウスＫ２７Ｍ細胞をクラスタリングした。ＣＣＡ－アライメントのための遺伝子セットの選択のため、我々は、ヒトデータセットにおいて同定されたＰ１～４と称される４つのプログラムを使用したが、それはこのデータセット及び関連する分析が、それらのヒト対応物に対してシングルセル分解能で我々の腫瘍に信用を与える独自の機会を提示したからである（図６Ｂ～Ｃ、１３Ｂ～Ｄ）。
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「Ｃｙｃｌｅ」クラスターは、Ｔｏｐ２ａ、ｍＫｉ６７、及びＣｃｎｂ１を含む増殖マーカーを発現する細胞からなっていた（図６Ｂ～Ｃ、図１３Ｅ）。ＡＣ及びＯＣクラスターは、それぞれ、より分化したアストロサイト及びオリゴデンドロサイトに関連する遺伝子を発現したのに対し（図６Ｂ～Ｃ、１３Ｄ）、ヒトＰ４クラスターに基づいて「ＯＰＣ」と称される最大のクラスターは、Ｏｌｉｇ１を含む遺伝子を発現したが、明確には分化した細胞系統にならなかったようである（図６Ｂ～Ｃ、１３Ｄ）。ヒトＫ２７Ｍにおいて同定された遺伝子リストに基づくクラスターのスコアリングは、ＡＣにおけるアストログリアマーカーの濃縮及びＯＣにおけるオリゴデンドログリアマーカーの濃縮を確認した（図６Ｂ～Ｄ）。
Ｋ２７Ｍ神経膠腫の異種間分析を実行するために、我々は、マウス及びヒトＫ２Ｍ腫瘍からのすべての細胞を用いてＳｅｕｒａｔクラスタリングを繰り返し（図６Ｅ～Ｇ、１３Ｆ～Ｉ）、９つの組み合わされたシングルセルデータセットが、個々のマウス及びヒトＣＣＡアライメントにおいて見られた４つのクラスターを継続してもたらしたことを確認した（図６Ｈ～Ｊ）。組み合わされた９つのサンプルのＵＭＡＰを各々のそれぞれのサンプルに分割することにより、我々は、均一ではないものの比較的類似する、各サンプルからの細胞の各々の個々のクラスターへの寄与を認めた（図６Ｊ、１３Ｉ）。我々の特定の変異の組み合わせは、患者ＭＵＶ１０と密接に一致しており、この患者は、我々のマウスＫ２７Ｍ細胞がそうであったように、他の患者よりも少ないＡＣ細胞を含有していた（図１３Ｍ）。
我々はまた、ＣＣＡ、クラスタリング、及びＵＭＡＰ分析のために高可変遺伝子を用いるより一般的な実践でクラスタリングを実施した。このアプローチは、いくつかのほとんど同一のクラスター（例えば、周期集団）をもたらしたが、他の集団のサブクラスター（例えば、ＯＰＣ）への分割をもたらし、これは選択されたパラメータによって変化した（図１３Ｎ）。このクラスタリングのばらつきは、バッチ効果、患者特異的トランスクリプトーム変化に起因してｓｃＲＮＡ－ｓｅｑにおいて、及び種間比較に関連する取り組みにおいて内在する問題である。
我々はまた、ヒトＫ２７Ｍ、ＧＢＭ、ＩＤＨ星細胞腫、ＩＤＨ乏突起膠腫にわたって同定された、異なって発現した遺伝子を使用して、我々の３つのマウスＫ２７Ｍ腫瘍を比較するヒートマップをプロットした。我々のＭＡＤＲ Ｋ２７Ｍ腫瘍は、他の神経膠腫サブタイプよりもヒト対応物に類似していた（図６Ｋ）。さらに、ヒトＫ２７Ｍ細胞は、我々のマウス腫瘍がそうであるように、高い割合の周期細胞を特徴とする（図６Ｌ）。
ＭＡＤＲ Ｋ２７Ｍ制御ネットワーク分析
我々は、ＭＡＤＲベースのＫ２７Ｍマウス及びヒトＫ２７Ｍ神経膠腫のトランスクリプトームの間の全体的な一致を示した（特にそれらが、周期細胞の同様の発生階層及び過剰提示を示すという点において）。我々の知る限り、我々のＫ２７Ｍ ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータセットは、マウス腫瘍モデルを検証するために初めて作成されたもののうちの１つである。そのため、我々は、データセットをさらなる分析に供して新たな洞察を得た。Ｋ２７Ｍ変異は、広く見られるエピジェネティック変動につながり、これにより我々は、同様の転写因子（ＴＦ）ネットワークがヒト及びマウス腫瘍の根底にあるのかどうかに焦点を当てることになった。
ＳＣＥＮＩＣは、レギュロンを同定するためにｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータセットにランダムフォレスト回帰を適用する方法である（レギュロンは、ＴＦ及びその正に相関した標的遺伝子に基づく、キュレートされた既知の共発現モジュールである）。このタイプのレギュロンベースの分析は、その総体的な特質により頑強であり、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑを複雑にし得るバッチ及び患者特異的作用を最小化する（図１４Ａ～Ｊ）。
ＳＣＥＮＩＣにおいてマウス及びヒトＫ２７Ｍ細胞を並列的に処理することから誘導されたｔＳＮＥ－プロットにおいて、細胞は、それらの細胞タイプに沿ってクラスタリングされ、これらの細胞クラスターが、異なるＴＦネットワークを有することを示唆している（図７Ａ～Ｂ）。我々は、我々のモデル及びヒトデータの両方における周期細胞が、Ｅ２Ｆファミリーモジュール（Ｅ２Ｆ１、Ｅ２Ｆ７、Ｅ２Ｆ８）、ＥＺＨ２、ＭＹＢＬ１、及びＢＲＣＡ１の濃縮を示したことを観察した（図７Ａ～Ｄ）。これらのＴＦは、細胞クラスターの中で有意に異なる発現を有さず、それらの活性が概ね転写制御されないことを示唆している（図７Ｅ～Ｆ）。ＥＺＨ２は、Ｋ２７Ｍ変異に診断的かつ機能的に関連する。ＭＹＢＬ１は、小児神経膠腫におけるドライバー遺伝子であり、その機能的重要性を示している。Ｅ２Ｆメンバーは、特に胚段階において、協働して作用することが知られている。有糸分裂クラスターにおけるこれらのタンパク質の劇的に向上した活性を考慮して、我々は、ＳＣＥＮＩＣレギュロンセットでは見られない可能性があるさらなる細胞周期関連遺伝子ネットワークを探すことを決意した。ＧＢＭ及びＫ２７Ｍ小児神経膠腫は、不十分に分化した細胞クラスを特徴とする。ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＭＹＣ２、及び胚性幹発現（ｅｘｐ１）遺伝子セットならびにＰＲＣ２、ＳＵＺ１２、ＥＥＤ、及びＨ３Ｋ２７結合遺伝子セットの低発現は、この不十分に分化した状態を示唆することを示した（図７Ｇ～Ｈ）。ヒト及びマウスデータセットの両方において、この胚性幹－シグネチャは、周期細胞タイプにおいて最も強いようであった（図７Ｇ～Ｈ）。さらなる証拠として、我々は、３つの腫瘍についてＣｈｉｐ－ｓｅｑを実施し、特に低メチル化されている遺伝子を同定し、この遺伝子のサブグループが、周期細胞において高度に発現することを見出した（図７Ｇ；１４Ｋ～Ｍ）。
相違アクセス性ゲノム領域（ＤＡＲ）の調査を介して根底にあるエピジェネティック状態を調べるために、我々は、Ｋ２７Ｍマウス腫瘍の単一核ＡＴＡＣ－ｓｅｑを実施し、それを正常なＰ５０及びＥ１８マウス脳と比較した（図７Ｉ～Ｌ、図１４Ｎ～Ｗ）。Ｐ５０脳は、十分に間隔のあいた標準的なマーカー遺伝子で画定されたクラスターを示したのに対し（図７Ｉ、図１４Ｎ～Ｏ）、Ｅ１８脳（３つの独立したデータセットのアライメント、図７Ｋ、図１４Ｐ～Ｓ）及び腫瘍細胞（共捕捉された腫瘍ミクログリアではない（異なるクラスターを作成する））はいずれも、あまり画定されていないＤＡＲを示した（図７Ｌ、図１４Ｔ～Ｗ）。その上、Ｋ２７Ｍ腫瘍クラスターの経路分析（図７Ｍ）は、純粋なＰ５０アストロサイト及びＯＰＣクラスター（図１４Ｙ）と比較した場合、顕著に変化し、ＳＣＥＮＩＣの知見と一貫するＢＲＣＡ１関連項目を含んでいた。
最後に、これらのｓｃＡＴＡＣサンプル及び類似のバルクデータセットからのＤＡＲのアライメントはさらに、Ｏｌｉｇ２、Ｓｏｘ９、及びＳｏｘ１０のようなグリア系統関連転写因子が、Ｐ５０グリア系統と比較して低下した相対的アクセス性及びＳｏｘ９及びＳｏｘ１０に関して相互排他性を示すというｔＳＮＥの知見を裏付けた（図７Ｎ）。Ｋ２７Ｍ ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータはこれと一致しており、それは、Ｓｏｘ９及びＳｏｘ１０のｍＲＮＡが各腫瘍クラスターにおいて、しばしば個々の細胞において共発現し、これは正常な成人脳では非常にまれであるからである。しかしながら、バルクサンプルで見られたＤＡＲは、ｓｃＡＴＡＣデータセットにおいて再現された（すなわち、Ｋ２７Ｍ腫瘍におけるＣａｃｎｇ８－６．３２２ｌｏｇ２比Ｋ２７Ｍ：ＮＰＣＳ及びＮＰＣにおけるＨｅｓ５－３．２４８ｌｏｇ２比ＮＰＣ：Ｋ２７Ｍ腫瘍、図１４Ｎ）。さらに、共捕捉されたミクログリアは、頑強なＤＡＲを保持し、優勢なバッチ効果と相反していた、図７Ｎ）。最後に、Ｋ２７Ｍ腫瘍細胞は、がんに関連する前初期遺伝子モチーフ及び浸潤性腫瘍において先行して同定された多くのＥＳ関連ＴＦのためのモチーフの優勢を示した（図１４Ｚ）。まとめると、Ｋ２７Ｍオンコヒストンは、初期エピジェネティック状態を作りだすことによってこれらの腫瘍の活発に周期するサブセットにおいてＴＦのサブセットの活性の変化をもたらす。
実施例３
我々は、２つのＡＡＶウイルスを設計した。一方はＦｌｐＯ－２Ａ－Ｃｒｅを発現するのに対し、他方は非発現（反転）ＴａｇＢＦＰレポーター遺伝子を有する。ＴａｇＢＦＰは、単独で細胞に形質導入された場合、発現しないようである。しかしながら、ＦｌｐＯ－２Ａ－Ｃｒｅウイルスの存在下では、ＭＡＤＲレシピエント遺伝子座を有する細胞は、ｔｄＴｏｍａｔｏ及びＥＧＦＰ導入遺伝子の発現を失い、ＴａｇＢＦＰの発現を開始するようである（図２６）。
これの重要性は、増殖の必要性をなくしてＭＡＤＲを容易化し、これにより、単一コピーの遺伝子組み換えで有糸分裂後細胞及び他の組織を標的化することが容易になるであろうことによる。よって、疾患モデルまたはより安全な遺伝子療法投薬の多くの種類が作り出され得る。
実施例４
我々は、ＡＡＶＳ１－ｐＡｃｔ－ＧＦＰｎｌｓをＡＡＶＳ－ｐＡＣＴ－ｌｏｘＰ－ＴａｇＢＦＰ－Ｖ５－ｎｌｓ ＷＰＲＥ ＦＲＴに改変し、ＭＡＤＲの準備ができたｉＰＳＣを有している。このＭＡＤＲカセットの機能をＨＥＫ２９３Ｔ細胞において検証し（図２７）、これにより、我々は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）及び副系統においてｐＤｏｎｏｒ導入遺伝子要素を交換することができる。
実施例５
我々は、レシピエントゲノム及びＭＡＤＲ ｐＤｏｎｏｒｓの両方においてｌｏｘＰ及びＦＲＴ部位を改変した。ＭＡＤＲの機能をＨＥＫ２９３Ｔ細胞において検証し（図１５～２７）、これにより、我々は、改変されたｌｏｘＰ及びＦＲＴ部位を使用してｐＤｏｎｏｒ導入遺伝子要素を交換することができる。
実施例６
我々は、リコンビナーゼ発現ベクターで組織特異的プロモーターを使用した。組織特異的リコンビナーゼベクターの機能をマウス脳においてｉｎ ｖｉｖｏで検証し（図２８）、これにより、我々は、ＭＡＤＲを特定の組織に向けることができる。
本明細書に開示される配列
Figure 2022536934000018
本発明の様々な実施形態が詳細な説明において上述されている。これらの説明は、上記の実施形態を直接的に説明するが、当業者は、本明細書に示され、説明される特定の実施形態に対する修正及び／または変形を着想し得ることが理解される。この説明の範囲内に含まれる、いかなるそのような修正または変形も、その中に含まれることが意図される。具体的に記述されない限り、本発明者らの意図では、明細書及び特許請求の範囲における語句は、適用可能な技術分野（複数可）の当業者にとって通常のかつ慣れ親しんだ意味が与えられる。
出願時に出願人に知られている本発明の様々な実施形態について上記の説明を提示したが、これは例示及び説明の目的で意図されている。本明細書は、網羅的であることも、開示される正確な形態に本発明を限定することも意図しておらず、上記の教示に照らして多くの修正及び変形が可能である。記載される実施形態は、本発明の原理及びその実際的適用を説明し、他の当業者が様々な実施形態において、及び企図される特定の使用に適したように様々な修正と共に、本発明を利用することを可能にするように機能する。したがって、本発明は、本発明を実施するために開示される特定の実施形態に限定されないことが意図される。
本発明の特定の実施形態が示され、説明されたが、本明細書の教示に基づいて、本発明及びそのより広い態様から逸脱することなく変更及び修正が行われ得ることは当業者には明らかであり、したがって、添付の特許請求の範囲が、本発明の真の趣旨及び範囲内にあるすべてのそのような変更及び修正をそれらの範囲内に包含するものである。
本明細書におけるすべての刊行物は、各々の刊行物または特許出願が、参照により援用されているように具体的かつ個別に示されている場合と同じ程度において、参照により援用される。以下の説明は、本発明を理解するのに有用であり得る情報を含む。本明細書で提供される情報のいずれも、ここで特許請求される本発明に対する先行技術であること、もしくはそれに関連すること、または具体的もしくは暗黙的に言及されるいずれの刊行物も先行技術であることを認めるものではない。
本明細書で使用される場合、「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語は、ある実施形態に有用である組成物、方法、及びこれらのそれぞれの構成要素（複数可）に関して使用され、さらに不特定の構成要素を含むことに対しても、有用か否かにかかわらず開かれている。当業者には、一般に、本明細書で使用される用語が概して「開かれた」用語として意図されていることが理解されよう（例えば、「～を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、「限定されるものではないが、～を含む」と解釈されるべきであり、「～を有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語は「少なくとも～を有する」と解釈されるべきであり、「～を含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」という用語は「限定されるものではないが、～を含む」と解釈されるべきであることなど）。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という制限のない用語は、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）、または有する（ｈａｖｉｎｇ）のような用語の同義語として、本明細書では本発明の説明及び特許請求のために使用されているが、本発明またはその実施形態は、「～からなる」または「本質的に～からなる」のような代替的用語を用いて、代替的に説明されることもある。

Claims (70)

  1. システムであって、
    導入遺伝子、またはＲＮＡをコードする核酸の上流の、ポリアデニル化シグナルまたは転写停止要素、
    前記導入遺伝子、またはＲＮＡをコードする核酸、及び
    対をなしたリコンビナーゼ認識部位
    を含むプロモーターレスドナーベクター；ならびに
    前記対をなしたリコンビナーゼ認識部位に特異的なリコンビナーゼをコードする２つの遺伝子を含む１つの発現ベクター、または
    ２つの発現ベクターであって、第１の発現ベクターは、前記対をなしたリコンビナーゼ認識部位のうちの一方に特異的な第１のリコンビナーゼをコードする１つの遺伝子を含み、第２の発現ベクターは、前記対をなしたリコンビナーゼ認識部位のうちの他方に特異的な第２のリコンビナーゼをコードする１つの遺伝子を含む、前記２つの発現ベクター
    を含む、前記システム。
  2. 前記プロモーターレスドナーベクターは、プラスミド、ウイルスベクター、及び細菌性人工染色体（ＢＡＣ）からなる群から選択される、請求項１に記載のシステム。
  3. 前記プロモーターレスドナーベクターは、前記導入遺伝子、またはＲＮＡをコードする核酸の上流に、少なくとも４つのポリアデニル化シグナルを含む、請求項１に記載のシステム。
  4. 前記プロモーターレスドナーベクターは、転写後制御要素をさらに含む、請求項１に記載のシステム。
  5. 前記プロモーターレスドナーベクターは、前記導入遺伝子、または前記ＲＮＡをコードする核酸の下流に、ポリアデニル化シグナルをさらに含む、請求項１に記載のシステム。
  6. 前記プロモーターレスドナーベクターは、スプライスアクセプターで開始するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をさらに含む、請求項１に記載のシステム。
  7. 前記プロモーターレスドナーベクターは、蛍光レポーターをさらに含む、請求項１に記載のシステム。
  8. 前記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項１に記載のシステム。
  9. 前記リコンビナーゼを含む発現ベクターは、組織特異的プロモーター下にある、請求項１に記載のシステム。
  10. 前記対をなしたリコンビナーゼ認識部位は、ｌｏｘＰ及びフリッパーゼ認識標的（ＦＲＴ）であり、前記リコンビナーゼは、ｃｒｅ及びｆｌｐである、請求項１～９のいずれか１項に記載のシステム。
  11. 前記対をなしたリコンビナーゼ認識部位は、改変されたｌｏｘＰ及び／または改変されたフリッパーゼ認識標的（ＦＲＴ）であり、前記リコンビナーゼは、ｃｒｅ及びｆｌｐである、請求項１～９のいずれか１項に記載のシステム。
  12. 前記対をなしたリコンビナーゼ認識部位は、ＶｌｏｘＰ及びフリッパーゼ認識標的（ＦＲＴ）であり、前記リコンビナーゼは、ＶＣｒｅ及びｆｌｐである、請求項１～９のいずれか１項に記載のシステム。
  13. 前記対をなしたリコンビナーゼ認識部位は、ＳｌｏｘＰ及びフリッパーゼ認識標的（ＦＲＴ）であり、前記リコンビナーゼは、ＳＣｒｅ及びｆｌｐである、請求項１～９のいずれか１項に記載のシステム。
  14. 前記リコンビナーゼは、ＰｈｉＣ３１リコンビナーゼであり、前記リコンビナーゼ認識部位は、ａｔｔＢ及びａｔｔＰである、請求項１～９のいずれか１項に記載のシステム。
  15. 前記リコンビナーゼは、Ｎｉｇｒｉ、Ｐａｎｔｏ、またはＶｉｋａであり、リコンビナーゼ認識部位は、それぞれ、ｎｏｘ、ｐｏｘ、及びｖｏｘである、請求項１～９のいずれか１項に記載のシステム。
  16. 前記対をなしたリコンビナーゼ認識部位の一方または両方は、変異を含む、請求項１～９のいずれか１項に記載のシステム。
  17. 前記ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡまたはｍｉＲＮＡである、請求項１～９のいずれか１項に記載のシステム。
  18. 前記導入遺伝子または前記ＲＮＡは、疾患に関連する変異を含む、請求項１～９のいずれか１項に記載のシステム。
  19. 前記導入遺伝子または前記ＲＮＡは、機能獲得（ＧＯＦ）遺伝子変異、機能喪失（ＬＯＦ）遺伝子変異、またはその両方を含む、請求項１～９のいずれか１項に記載のシステム。
  20. 前記導入遺伝子は、アポトーシスを防止する、またはニューロン細胞の生存を促進する、ニューロン細胞の増殖を増加させる、もしくはニューロン細胞の分化を促進する因子を含む、請求項１～９のいずれか１項に記載のシステム。
  21. 前記因子は、成長因子である、請求項２０に記載のシステム。
  22. 前記成長因子は、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、成長／分化因子（ＧＤＦ）５、中脳アストロサイト由来神経栄養因子（ＭＡＮＦ）、脳ドーパミン作動性神経栄養因子（ＣＤＮＦ）、またはそれらの組み合わせを含む、請求項２１に記載のシステム。
  23. 前記成長因子は、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）を含む、請求項２１に記載のシステム。
  24. 前記プロモーターレスドナーベクターは、
    ＰＧＫポリアデニル化シグナル（ｐＡ）、
    三量化ＳＶ４０ｐＡ、
    前記導入遺伝子、またはＲＮＡをコードする核酸、
    ｌｏｘＰ及びフリッパーゼ認識標的（ＦＲＴ）、
    ウサギベータ－グロビンｐＡ、ならびに
    ウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御要素（ＷＰＲＥ）
    を含む、請求項１に記載のシステム。
  25. プロモーターレスドナーベクターであって、
    導入遺伝子、またはＲＮＡをコードする核酸の上流の、ポリアデニル化シグナルまたは転写停止要素、
    前記導入遺伝子、またはＲＮＡをコードする核酸、及び
    対をなしたリコンビナーゼ認識部位
    を含む、前記プロモーターレスドナーベクター。
  26. プラスミド、ウイルスベクター、及び細菌性人工染色体（ＢＡＣ）からなる群から選択される、請求項２５に記載のプロモーターレスドナーベクター。
  27. 前記導入遺伝子、または前記ＲＮＡをコードする核酸の上流に、少なくとも４つのポリアデニル化シグナルを含む、請求項２５に記載のプロモーターレスドナーベクター。
  28. 転写後制御要素をさらに含む、請求項２５に記載のプロモーターレスドナーベクター。
  29. 前記導入遺伝子、または前記ＲＮＡをコードする核酸の下流に、ポリアデニル化シグナルをさらに含む、請求項２５に記載のプロモーターレスドナーベクター。
  30. 前記導入遺伝子またはＲＮＡは、がん遺伝子、腫瘍サプレッサー遺伝子の機能喪失（ＬＯＦ）変異、がん原遺伝子の機能獲得（ＧＯＦ）変異、偽遺伝子、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、エピジェネティック改変、ヒト疾患に関連するノンコーディング遺伝子異常またはエピジェネティック異常、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２５に記載のプロモーターレスドナーベクター。
  31. 前記導入遺伝子は、アポトーシスを防止する、またはニューロン細胞の生存を促進する、ニューロン細胞の増殖を増加させる、もしくはニューロン細胞の分化を促進する因子を含む、請求項２５に記載のプロモーターレスドナーベクター。
  32. 前記因子は、成長因子である、請求項３１に記載のプロモーターレスドナーベクター。
  33. 前記成長因子は、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、成長／分化因子（ＧＤＦ）５、中脳アストロサイト由来神経栄養因子（ＭＡＮＦ）、もしくは脳ドーパミン作動性神経栄養因子（ＣＤＮＦ）、またはそれらの組み合わせを含む、請求項３２に記載のプロモーターレスドナーベクター。
  34. 前記成長因子は、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）を含む、請求項３２に記載のプロモーターレスドナーベクター。
  35. 前記対をなしたリコンビナーゼ認識部位の一方または両方は、変異を含む、請求項２５に記載のプロモーターレスドナーベクター。
  36. 前記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項２５に記載のプロモーターレスドナーベクター。
  37. ＰＧＫポリアデニル化シグナル（ｐＡ）、
    三量化ＳＶ４０ｐＡ、
    導入遺伝子、またはＲＮＡをコードする核酸、
    ｌｏｘＰ及びフリッパーゼ認識標的（ＦＲＴ）、
    ウサギベータ－グロビンｐＡ、ならびに
    ウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御要素（ＷＰＲＥ）
    を含む、請求項２５に記載のプロモーターレスドナーベクター。
  38. 哺乳動物細胞の遺伝子操作方法であって、
    前記哺乳動物細胞に、請求項１～２４のいずれか１項に記載のシステムをトランスフェクションまたは形質導入することを含む、前記方法。
  39. 前記哺乳動物細胞は、ヒト細胞であり、前記システムは、ＡＡＶＳ１遺伝子座、Ｈ１１遺伝子座、またはＨＰＲＴ１遺伝子座を標的とし、前記方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ方法である、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記哺乳動物細胞は、マウス細胞であり、前記システムは、ＲＯＳＡ２６遺伝子座、Ｈｉｐｐ１１遺伝子座、Ｔｉｇｒｅ遺伝子座、ＣｏｌＡ１遺伝子座、またはＨｐｒｔ遺伝子座を標的とする、請求項３８に記載の方法。
  41. 前記細胞に１つ以上のリコンビナーゼ酵素を投与することをさらに含む、請求項３８に記載の方法。
  42. 前記１つ以上のリコンビナーゼ酵素は、Ｃｒｅリコンビナーゼ、フリッパーゼリコンビナーゼ、Ｃｒｅ及びフリッパーゼリコンビナーゼ、Ｎｉｇｒｉリコンビナーゼ、ＰａｎｔｏリコンビナーゼまたはＶｉｋａリコンビナーゼを含む、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記哺乳動物細胞は、胚性幹細胞、成人幹細胞、誘導多能性幹細胞、または組織前駆体細胞を含む、請求項３８に記載の方法。
  44. 請求項１～２４のいずれか１項に記載のシステムを含む非ヒト動物を含む、非ヒト動物モデルであって、
    前記導入遺伝子またはＲＮＡは、がん遺伝子、腫瘍サプレッサー遺伝子の機能喪失（ＬＯＦ）変異、がん原遺伝子の機能獲得（ＧＯＦ）変異、偽遺伝子、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、エピジェネティック改変、ヒト疾患に関連するノンコーディング遺伝子異常またはエピジェネティック異常、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、前記非ヒト動物モデル。
  45. 前記非ヒト動物モデルは、ヒト対象のがんの個別化非ヒト動物モデルであり、前記導入遺伝子またはＲＮＡは、前記ヒト対象のがんに基づく、請求項４４に記載の非ヒト動物モデル。
  46. 前記非ヒト動物モデルは、ヒト対象の疾患または病態の個別化非ヒト動物モデルであり、前記導入遺伝子またはＲＮＡは、前記ヒト対象の疾患または病態に基づく、請求項４４に記載の非ヒト動物モデル。
  47. 機能獲得変異（ＧＯＦ）、機能喪失変異（ＬＯＦ）、またはその両方を含む、請求項４４に記載の非ヒト動物モデル。
  48. 請求項４４に記載の非ヒト動物モデルを生成する方法であって、
    前記非ヒト動物モデルに請求項１に記載のシステムをトランスフェクションまたは形質導入することを含み、
    前記導入遺伝子またはＲＮＡは、がん遺伝子、腫瘍サプレッサー遺伝子の機能喪失（ＬＯＦ）変異、がん原遺伝子の機能獲得（ＧＯＦ）変異、偽遺伝子、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、エピジェネティック改変、ヒト疾患に関連するノンコーディング遺伝子異常またはエピジェネティック異常、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、前記方法。
  49. 薬物候補の効果を評価する方法であって、
    請求項４４に記載の非ヒト動物モデルを提供すること、
    前記薬物候補を前記非ヒト動物モデルに投与すること、及び
    前記非ヒト動物モデルに対する前記薬物候補の前記効果を評価すること
    を含む、前記方法。
  50. 請求項１～２４のいずれか１項に記載のシステムまたは請求項２５～３７のいずれか１項に記載のプロモーターレスドナーベクターを含む哺乳動物細胞。
  51. ヒト細胞である、請求項５０に記載の細胞。
  52. 多能性細胞である、請求項５０に記載の細胞。
  53. 前記多能性細胞は、誘導多能性細胞である、請求項５２に記載の細胞。
  54. 遺伝子産物を神経変性疾患または障害を有する個体に送達する方法であって、請求項５０に記載の哺乳動物細胞を、それを必要とする個体に投与することを含む、前記方法。
  55. 前記神経変性疾患または障害は、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、またはアルツハイマー病を含む、請求項５４に記載の方法。
  56. 前記神経変性疾患または障害は、パーキンソン病を含む、請求項５４に記載の方法。
  57. 前記神経変性疾患または障害は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を含む、請求項５４に記載の方法。
  58. 個体の脳におけるＧＤＮＦタンパク質レベルを増加させる方法であって、請求項５０に記載の哺乳動物細胞を前記個体に投与することを含む、前記方法。
  59. ゲノムに組み込まれた導入遺伝子を含む哺乳動物細胞であって、前記ゲノムに組み込まれた導入遺伝子は神経栄養因子を含み、ＡＡＶＳ１遺伝子座、Ｈ１１遺伝子座、またはＨＰＲＴ１遺伝子座を含むゲノム部位に組み込まれている、前記哺乳動物細胞。
  60. 前記細胞は、ヒト細胞である、請求項５９に記載の哺乳動物細胞。
  61. 前記ヒト細胞は、誘導多能性幹細胞である、請求項６０に記載の哺乳動物細胞。
  62. 前記神経栄養因子は、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、成長／分化因子（ＧＤＦ）５、中脳アストロサイト由来神経栄養因子（ＭＡＮＦ）、脳ドーパミン作動性神経栄養因子（ＣＤＮＦ）、またはそれらの組み合わせを含む、請求項５９～６１のいずれか１項に記載の哺乳動物細胞。
  63. 前記神経栄養因子は、ＧＤＮＦである、請求項６２に記載の哺乳動物細胞。
  64. 前記神経栄養因子は、誘導性プロモーターの制御下にある、請求項５９～６１のいずれか１項に記載の哺乳動物細胞。
  65. 前記誘導性プロモーターは、テトラサイクリン誘導性プロモーターである、請求項６４に記載の哺乳動物細胞。
  66. 前記神経栄養因子及び／または前記誘導性プロモーターは、リコンビナーゼ認識部位、転移性因子のタンデムリピート、またはインシュレーター配列のうちの１つ以上に隣接している、請求項６４または６５に記載の哺乳動物細胞。
  67. 前記神経栄養因子及び／または前記誘導性プロモーターは、対をなしたリコンビナーゼ認識部位に隣接している、請求項６６に記載の哺乳動物細胞。
  68. 前記対をなしたリコンビナーゼ認識部位は、バリアント型リコンビナーゼ認識部位及び野生型リコンビナーゼ認識部位を含む、請求項６７に記載の哺乳動物細胞。
  69. 前記バリアント型リコンビナーゼ認識部位は、前記野生型リコンビナーゼ認識部位と比較してリコンビナーゼによる切断の減少を示す、請求項６７に記載の哺乳動物細胞。
  70. 前記対をなしたリコンビナーゼ認識部位は、ＬｏｘＰ部位またはＦＲＴ部位を含む、請求項６７～６９のいずれか１項に記載の哺乳動物細胞。
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