JP2022535692A - ナノポア配列決定で使用するための移動制御エレメント、レポーターコード、および移動制御のためのさらなる手段 - Google Patents
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Abstract
ホスホルアミデート系モノマーは、ナノポアに基づく感知のための拡張性ポリマーの合成に使用するために提供される。そのようなモノマーは、第１のレポーターコード、移動制御エレメントを保有する対称化学分枝鎖、および第２のレポーターコードを含むレポーター構築物を含み、レポーター構築物の末端は、ホスホルアミデート－ヌクレオシドに結合している。関連する方法および製品も提供される。【選択図】図４
Description
本発明は、一般的に、新規の合成レポーター構築物に関し、より具体的には、新規のヌクレオチドを含まないホスホラミダイトベースの移動制御エレメント、レポーターコードおよびナノポアを通過するときに固有のシグナルを生成する他の特徴、ならびに特にナノポアベースのポリマー配列決定法におけるその製造および利用のための方法に関する。
生体分子の測定は、現代医学の基礎であり、医学研究、より具体的には診断および治療、ならびに薬物開発において広く使用されている。核酸は、生物が機能し、再生するために必要な情報をコードし、本質的に生命の設計図である。そのような設計図を決定することは、純粋な研究および応用科学において有用である。医学では、配列決定は、癌、心疾患、自己免疫障害、多発性硬化症、および肥満を含む様々な病状の診断および処置の開発に使用することができる。業界では、配列決定を使用して、改良された酵素プロセスまたは合成生物を設計することができる。生物学において、このツールは、例えば、生態系の健康を研究するために使用することができ、したがって、広範囲の有用性を有する。同様に、タンパク質および他の生体分子の測定は、疾患および病原性伝播のマーカーおよび理解を提供している。
個体の固有のＤＮＡ配列は、特定の疾患に対する感受性に関する貴重な情報を提供する。それはまた、早期検出のためのスクリーニングおよび／または予防処置を受ける機会を患者に提供する。さらに、患者の個々の設計図を考慮すると、臨床医は、薬物有効性を最大化するため、および／または薬物有害反応のリスクを最小化するために、個別化治療を投与することができるであろう。同様に、病原性生物の設計図を決定することは、感染性疾患の新しい処置およびよりロバストな病原体監視をもたらし得る。低コストの全ゲノムＤＮＡ配列決定は、現代医学の基礎を提供するであろう。この目的を達成するために、配列決定技術は、スループット、精度、およびリード長に関して前進し続けなければならない。
過去１０年間にわたって、多数の次世代ＤＮＡ配列決定技術が、市販されるようになり、全ゲノムの配列決定のコストを劇的に削減した。これらには、合成による配列決定（「ＳＢＳ」）プラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．，４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ，Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）および類似体連結ベースのプラットフォーム（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）が含まれる。多種多様な試料処理および検出方法を利用する多くの他の技術が開発されている。例えば、ＧｎｕＢｉｏ，Ｉｎｃ．（マサチューセッツ州ケンブリッジ）は、ピコリットル反応容器を使用して数百万の目立たないプローブシーケンシング反応を制御するが、Ｈａｌｃｙｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ（カリフォルニア州レッドウッドシティ）は、透過型電子顕微鏡を使用した直接ＤＮＡ測定のための技術を開発しようと試みていた。
ナノポアベースの核酸配列決定は、広く研究されてきた説得力のあるアプローチである。Ｋａｓｉａｎｏｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１３７７０－１３７７３，１９９６）は、脂質二重層に埋め込まれたアルファ溶血素ナノポアを介して電気的に移動した一本鎖ポリヌクレオチドを特徴付けた。ポリヌクレオチド移動の間、ナノポア開口部の部分的な遮断は、イオン電流の減少として測定できることが実証された。しかしながら、ナノポアにおけるポリヌクレオチド配列決定は、有意なバックグラウンドノイズに浸漬された小さなシグナル差を有する狭い間隔の塩基（０．３４ｎｍ）を分解しなければならないことによって負担がかかる。ナノポアにおける単一塩基分解能の測定課題は、ポリヌクレオチドについて観察される急速な移動速度のために、より要求が厳しくなり、典型的にマイクロ秒当たり１塩基のオーダーである。いくつか例を挙げると、電圧、塩組成、ｐＨ、温度および粘度などの実行パラメータを調整することによって、移動速度を低下させることができる。しかしながら、そのような調整は、一塩基分解能を可能にするレベルまで移動速度を低下させることができなかった。
Ｓｔｒａｔｏｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓは、生化学的プロセスを使用してＤＮＡの配列を「Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ」と呼ばれる測定可能なポリマー上に転写する、拡張による配列決定（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ（ＳＢＸ））と呼ばれる方法を開発した（Ｋｏｋｏｒｉｓ ｅｔ ａｌ．、米国特許第７，９３９，２５９号、「Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ」）。転写された配列は、約１０ｎｍ離れた高シグナル対ノイズレポーターにおいてＸｐａｎｄｏｍｅｒ骨格に沿ってコード化され、高シグナル対ノイズ、高分化応答のために設計される。これらの違いは、ネイティブＤＮＡと比較して、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒの配列リード効率および精度の著しい性能向上を提供する。Ｘｐａｎｄｏｍｅｒは、いくつかの次世代ＤＮＡ配列決定検出技術を可能にすることができ、ナノポア配列決定によく適している。
ナノポアは、その高度に活用された先行技術であるＣｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒと同様に、強力な増幅器であることが証明されている。しかしながら、ＤＮＡの塩基認識を担ってきた有機ナノポア（例えば、溶血素およびＭｓｐＡ）の現在の世代は、天然ではＤＮＡと相互作用しない膜貫通タンパク質である。それらは、ＤＮＡ移動を制御するための天然の機能を有さない。これは、いくつかがナノポアに隣接するタンパク質モーターにより機能性を付加することによって修正しようとしているという認識された欠点である。例えば、Ａｋｅｓｏｎのグループは、ｓｓ－ＤＮＡが制御された速度でポアに供給され得るように、ｐｈｉ ２９ポリメラーゼをα－溶血素ナノポアに隣接して付加した（Ｇ．Ｍ．Ｃｈｅｒｆ ｅｔ ａｌ．「Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｆｏｒｗａｒｄ ａｎｄ ｒｅｖｅｒｓｅ ｒａｔｃｈｅｔｉｎｇ ｏｆ ＤＮＡ ｉｎ ａ ｎａｎｏｐｏｒｅ ａｔ ５－Ａ ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ」，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ，ｖｏｌ．ａｄｖａｎｃｅ ｏｎｌｉｎｅ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１２を参照のこと）。このアプローチは、アッセイを複雑にし、α溶血素中の測定領域をポリメラーゼ中の位置制御から分離させ、測定にさらなるノイズおよび配列依存性変異を導入し得る。
ハイブリダイゼーションによる移動制御（ＴＣＨ）と呼ばれる他のアプローチでは、ナノポア移動イベントは、ハイブリダイゼーションによって作製された構造を使用することによって休止し、これは移動が進行するために解離する（例えば、ＭｃＲｕｅｒおよびＫｏｋｏｒｉｓの米国特許第１０，４５７，９７９号を参照のこと）。Ａｋｅｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（米国特許第６，４６５，１９３号）は、連続的なヘアピン二重鎖領域を用いてＤＮＡ移動を休止することによって、最初にこれを実証した。移動は二本鎖で停止したが、これは、α－溶血素ナノポア開口部よりも大きかったためである。二重鎖が確率的熱揺らぎによって解放されると、移動は次の二重鎖に進行した。各休止中に、ナノポア内に位置する（二本鎖に隣接する）ＤＮＡの領域を測定および同定し得る。ナノポア配列決定に適用される場合、移動制御に対するこの二重鎖形成アプローチは、欠失または挿入イベントをもたらし得る、不完全な二重鎖形成またはハイブリダイゼーション充填率、および二重鎖解離の確率論を含む制限を被る。局在化できない挿入および欠失は、データ品質を著しく低下させる可能性がある。
この分野では著しい進歩がなされているが、例えばＸｐａｎｄｏｍｅｒによる移動制御の商業的に実行可能な実施は、二本鎖形成によって引き起こされる制限を克服する改善から利益を得るであろう。本発明は、これらのニーズを満たし、以下で説明するようにさらなる関連する利点を提供する。
背景技術のセクションで説明した主題の全てが必ずしも先行技術ではなく、単に背景技術のセクションにおける説明の結果として先行技術であると仮定すべきではない。これらの道筋に沿って、背景技術のセクションで説明されているか、またはそのような主題に関連する先行技術の問題の認識は、先行技術であると明示的に述べられていない限り、先行技術として扱われるべきではない。代わりに、背景技術のセクションにおける任意の主題の議論は、それ自体もまた発明的であり得る特定の問題に対する発明者のアプローチの一部として扱われるべきである。
簡潔に記載すると、ポリマー分析物（例えば、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ）の改善されたナノポア配列決定（例えば、より高いリード長、精度、および／またはスループットの配列を生成すること）のために、新規のホスホラミダイトモノマー単位の集合から合成されたポリマーレポーターおよびリンカー構築物を含む化合物（例えば、ＸＮＴＰ）および方法が開示される。
いくつかの実施形態において、ポリマー構築物は、ヌクレオチドを完全に欠くように設計され得る。
一態様において、本開示は、以下の構造を有する化合物（すなわち、ＸＮＴＰ）を提供し、
一態様において、本開示は、以下の構造を有する化合物（すなわち、ＸＮＴＰ）を提供し、
式中、ＲはＯＨまたはＨであり、核酸塩基は、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシルまたは核酸塩基類似体であり、レポーター構築物は、第１の末端および第２の末端を有するポリマーであり、第１の末端から第２の末端まで連続して、第１のレポーターコード、移動制御エレメントを保有する対称化学分枝鎖、および第２のレポーターコードを含み、リンカーＡは、アルファホスホルアミデートの酸素原子をレポーター構築物の第１の末端に連結させ、リンカーＢは、核酸塩基をレポーター構築物の第２の末端に連結させ、前記移動制御エレメントは、以下に記載するようなポリマーである。
一実施形態において、移動制御エレメントは、以下から選択される２つ以上の反復単位を含むポリマーである、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２Ｓ－Ｏ－ｍＰＥＧ４－プロパン（化合物１２ｂ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２－（４－Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ３）－１－（Ｅｔ－Ｏ－Ａｃ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ｂ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２ｓ－Ｏ－ｍＰＥＧ６－プロパン（化合物１２ｃ）、１，２－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－３－Ｏ－ｍＰＥＧ２－プロパン（化合物１６）、２，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－１－（５－ベンゾフラン）－プロパン（化合物２０ｉ）、１，２－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－３－（４－メチルピペラジン－１－イル）－プロパン（化合物２０ｊ）、２，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－１－（Ｎ１－（２－Ｍｅ－５－ニトロインドール）－プロパン（化合物２０ｇ）、１，８－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－Ｎ，Ｎ－ジエチルピペラジン（化合物２６ｈ）、１，２－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－３－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ３－Ｏ－Ｂｚ））－１－（１，２，３－トリアゾール））－プロパン（化合物３１ｄ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２ｓ－Ｏ－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ２）－１－（Ｅｔ－ＯＢｚ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ａ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ５）－１－（Ｅｔ－Ｏ－Ａｃ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ｃ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２ｓ－Ｏ－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ７）－１－（Ｅｔ－ＯＢｚ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ｄ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２ｓ－Ｏ－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ３）－１－（Ｍｅ－アセテート）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ｅ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２ｓ－Ｏ－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ３）－１－（Ｅｔ－２，２，２－トリス－（Ｍｅ－Ｏ－Ｂｚ））－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３７ａ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ５）－１－（Ｅｔ－２，２，２－トリス－（Ｍｅ－Ｏ－Ａｃ））－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３７ｂ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２Ｓ－Ｏ－（ＰＥＧ４－Ｏ－Ｂｚ）－プロパン（化合物３８ｂ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２，２－ビス（Ｍｅ－Ｏ－ｍＰＥＧ２）－プロパン（化合物４５ｂ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２，２－ビス（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ２－Ｏ－Ｍｅ）－１－（Ｅｔ－Ｏ－Ｂｚ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物４７ｆ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２，２－ビス（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ３－Ｏ－Ｍｅ）－１－（Ｅｔ－Ｏ－Ｂｚ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物４７ｇ、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２，２－ビス（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ３－Ｏ－Ｍｅ）－１－（Ｅｔ－２，２，２－トリス－（Ｍｅ－Ｏ－Ｂｚ））－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物４７ｉ）、または１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２，２－ビス（１－Ｍｅ－４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ２）－Ｏ－Ｂｚ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物５２）。
いくつかの実施形態において、Ｒは、ＯＨである。
いくつかの実施形態において、Ｒは、Ｈである。
他の実施形態において、核酸塩基は、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、またはウラシルである。
いくつかの実施形態において、Ｒは、Ｈである。
他の実施形態において、核酸塩基は、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、またはウラシルである。
他の実施形態において、核酸塩基は核酸塩基類似体である。
他の実施形態において、対称化学分枝鎖は、１，２，３－Ｏ－トリス－（ホスホジエステル）－プロパン、１，３－ビス－（５－Ｏ－ホスホジエステル－ペンチルアミド）－２－Ｏ－ホスホジエステル－プロパン、または１，４，７－Ｏ－トリス－（ホスホジエステル）－ヘプタンである。
他の実施形態において、対称化学分枝鎖は、１，２，３－Ｏ－トリス－（ホスホジエステル）－プロパン、１，３－ビス－（５－Ｏ－ホスホジエステル－ペンチルアミド）－２－Ｏ－ホスホジエステル－プロパン、または１，４，７－Ｏ－トリス－（ホスホジエステル）－ヘプタンである。
他の実施形態において、対称化学分枝鎖は、１，２，３－Ｏ－トリス－（ホスホジエステル）－プロパンである。
他の実施形態において、移動制御エレメントは、表１Ａから選択される２つ以上の反復単位を含むポリマーである。
他の実施形態において、移動制御エレメントは、表１Ａから選択される２つ以上の反復単位を含むポリマーである。
他の実施形態において、移動制御エレメントは、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２Ｓ－Ｏ－ｍＰＥＧ４－プロパン（化合物１２ｂ）および１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２－（４－Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ３）－１－（Ｅｔ－Ｏ－Ａｃ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ｂ）から選択される２つ以上の反復単位を含むポリマーである。
さらに他の実施形態において、移動制御エレメントは、以下の配列、［（１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２Ｓ－Ｏ－ｍＰＥＧ４－プロパン（化合物１２ｂ））］ｎ１［（１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２－（４－Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ３）－１－（Ｅｔ－Ｏ－Ａｃ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ｂ）］ｎ２を含むポリマーであり、式中、ｎ１は０から６であり、ｎ２は６から１０である。
他の実施形態において、第１のレポーターコードおよび第２のレポーターコードは同一である。
さらなる実施形態において、第１のレポーターコードおよび第２のレポーターコードは、ヘキサエチレングリコール（Ｄ）、エタン（Ｌ）、トリアエチレングリコール（Ｘ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２Ｓ－Ｏ－ｍＰＥＧ４－プロパン（化合物１２ｂ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２－（４－Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ３）－１－（Ｅｔ－Ｏ－Ａｃ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ｂ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２，２－ビス（Ｍｅ－Ｏ－ｍＰＥＧ２）－プロパン（化合物４５ｂ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２Ｓ－Ｏ－（ＰＥＧ４－Ｏ－Ｂｚ）－プロパン（化合物３８ｂ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２ｓ－Ｏ－ｍＰＥＧ６－プロパン（化合物１２ｃ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２ｓ－Ｏ－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ３）－１－（Ｅｔ－２，２，２－トリス－（Ｍｅ－Ｏ－Ｂｚ））－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３７ａ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２ｓ－Ｏ－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ３）－１－（Ｍｅ－アセテート）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ｅ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２ｓ－Ｏ－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ２）－１－（Ｅｔ－ＯＢｚ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ａ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２－（４－Ｅｔ－１－（Ｅｔ－Ｏ－ｍＰＥＧ１）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３１ａ）、２，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－１－（１ージメトキシキナゾリンジオン）－プロパン（化合物２０ｃ）、２，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－１－（Ｎ９－（３，６－ジメトキシカルバゾール）－プロパン（化合物２０ｅ）、１，１’－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２，２’－（スルホニルビス（ベンズ－４－イル））－ジエタノール（化合物２６ｄ）、１，１’－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２，２’－ビピリジン－４，４’－イル）－ジメタノール（化合物２６ａ）、２，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－１－（Ｎ１－（４，６－ジメトキシ－３－Ｍｅ－インドール）－プロパン（化合物２０ｂ）、３－（１，２－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－プロピル）－８，８－ジメチルヘキサヒドロ－３Ｈ－３ａ，６－メタノベンゾ［ｃ］イソチアゾール２，２－ジオキシド（化合物２０ｄ）、２，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－１－（Ｎ１－（６－アザチミン））－プロパン（化合物２０ｆ）、１，５－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－ヘキサヒドロフロ［２，６］フラン（化合物２３）、１，１’－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－オクタヒドロ－２，６－ジメチル－３，８：４，７－ジメタノ－２，６－ナフチリジン－４，８－ジイル）－ジメタノール（化合物２６ｅ）、２，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－１－（Ｎ１－（２－Ｍｅ－５－ニトロインドール）－プロパン（化合物２０ｈ）、２，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－１－（Ｎ１－（２－Ｍｅ－５－ニトロインドール）－プロパン（化合物２０ｇ）、２，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－１－（５－ベンゾフラン）－プロパン（化合物２０ｉ）、１，２－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－３－Ｏ－ｍＰＥＧ２－プロパン（化合物５ｂ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２－（４－Ｅｔ－１－（Ｅｔ－Ｏ－ｍＰＥＧ３）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３１ｂ）、および１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－３－Ｏ－ｍＰＥＧ４－プロパン（化合物５ａ）から選択される２つ以上の反復単位を含むポリマーである。
さらなる実施形態において、第１のレポーターコードおよび第２のレポーターコードは、ヘキサエチレングリコール（Ｄ）、エタン（Ｌ）、トリアエチレングリコール（Ｘ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２Ｓ－Ｏ－ｍＰＥＧ４－プロパン（化合物１２ｂ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２－（４－Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ３）－１－（Ｅｔ－Ｏ－Ａｃ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ｂ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２，２－ビス（Ｍｅ－Ｏ－ｍＰＥＧ２）－プロパン（化合物４５ｂ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２Ｓ－Ｏ－（ＰＥＧ４－Ｏ－Ｂｚ）－プロパン（化合物３８ｂ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２ｓ－Ｏ－ｍＰＥＧ６－プロパン（化合物１２ｃ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２ｓ－Ｏ－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ３）－１－（Ｅｔ－２，２，２－トリス－（Ｍｅ－Ｏ－Ｂｚ））－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３７ａ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２ｓ－Ｏ－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ３）－１－（Ｍｅ－アセテート）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ｅ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２ｓ－Ｏ－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ２）－１－（Ｅｔ－ＯＢｚ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ａ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２－（４－Ｅｔ－１－（Ｅｔ－Ｏ－ｍＰＥＧ１）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３１ａ）、２，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－１－（１ージメトキシキナゾリンジオン）－プロパン（化合物２０ｃ）、２，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－１－（Ｎ９－（３，６－ジメトキシカルバゾール）－プロパン（化合物２０ｅ）、１，１’－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２，２’－（スルホニルビス（ベンズ－４－イル））－ジエタノール（化合物２６ｄ）、１，１’－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２，２’－ビピリジン－４，４’－イル）－ジメタノール（化合物２６ａ）、２，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－１－（Ｎ１－（４，６－ジメトキシ－３－Ｍｅ－インドール）－プロパン（化合物２０ｂ）、３－（１，２－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－プロピル）－８，８－ジメチルヘキサヒドロ－３Ｈ－３ａ，６－メタノベンゾ［ｃ］イソチアゾール２，２－ジオキシド（化合物２０ｄ）、２，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－１－（Ｎ１－（６－アザチミン））－プロパン（化合物２０ｆ）、１，５－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－ヘキサヒドロフロ［２，６］フラン（化合物２３）、１，１’－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－オクタヒドロ－２，６－ジメチル－３，８：４，７－ジメタノ－２，６－ナフチリジン－４，８－ジイル）－ジメタノール（化合物２６ｅ）、２，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－１－（Ｎ１－（２－Ｍｅ－５－ニトロインドール）－プロパン（化合物２０ｈ）、２，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－１－（Ｎ１－（２－Ｍｅ－５－ニトロインドール）－プロパン（化合物２０ｇ）、２，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－１－（５－ベンゾフラン）－プロパン（化合物２０ｉ）、１，２－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－３－Ｏ－ｍＰＥＧ２－プロパン（化合物５ｂ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２－（４－Ｅｔ－１－（Ｅｔ－Ｏ－ｍＰＥＧ３）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３１ｂ）、および１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－３－Ｏ－ｍＰＥＧ４－プロパン（化合物５ａ）から選択される２つ以上の反復単位を含むポリマーである。
他の実施形態において、第１のレポーターコードおよび第２のレポーターコードは、ヘキサエチレングリコール、エタン、トリアエチレングリコール、および表１Ａに示される任意の化合物から選択される２つ以上の反復単位を含むポリマーである。
さらなる実施形態において、第１のレポーターコードおよび第２のレポーターコードは、ヘキサエチレングリコール、エタン、トリアエチレングリコールおよび１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２Ｓ－Ｏ－ｍＰＥＧ４－プロパン（化合物１２ｂ）から選択される２つ以上の反復単位を含むポリマーである。
より具体的な実施形態において、第１のレポーターコードおよび第２のレポーターコードは、（ｉ）［（ヘキサエチレングリコール）２（エタン）３（ヘキサエチレングリコール）（トリアエチレングリコール）］、（ｉｉ）［（ヘキサエチレングリコール）２（１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２Ｓ－Ｏ－ｍＰＥＧ４－プロパン（化合物１２ｂ））２（エタン）（トリアエチレングリコール）３］、（ｉｉｉ）［（ヘキサエチレングリコール）２（１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２Ｓ－Ｏ－ｍＰＥＧ４－プロパン（化合物１２ｂ））３（エタン）２（ヘキサエチレングリコール）（トリアエチレングリコール）］、および（ｉｖ）［（トリアエチレングリコール）２（エタン）（１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２Ｓ－Ｏ－ｍＰＥＧ４－プロパン（化合物１２ｂ））６（エタン）７］から選択される配列を含むポリマーである。
他の実施形態において、リンカーＡおよびリンカーＢは、スペルミン（Ｑ）、ヘキサエチレングリコール（Ｄ）、２－（（４－（（３－（ベンゾイルオキシ）－２－（（（１－（３－（ベンゾイルオキシ）－２－（（ベンゾイルオキシ）メチル）－２－（（ホスホジエステル－オキシ）メチル）プロピル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－イル）メトキシ）メチル）－２－（（ベンゾイルオキシ）メチル）プロポキシ）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）メチル）－２－Ｏ－ホスホジエステル－プロパン－１，３－ジイルジベンゾエート（化合物６２）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２，２－ビス（１－Ｍｅ－４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ２－Ｏ－Ｂｚ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物５２）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ５）－１－（Ｅｔ－Ｏ－Ａｃ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ｃ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２ｓ－Ｏ－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ７）－１－（Ｅｔ－ＯＢｚ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ｄ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２ｓ－Ｏ－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ３）－１－（Ｅｔ－２，２，２－トリス－（Ｍｅ－Ｏ－Ｂｚ））－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３７ａ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ５）－１－（Ｅｔ－２，２，２－トリス－（Ｍｅ－Ｏ－Ａｃ））－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３７ｂ）、１，２－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－３－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ３－Ｏ－Ｂｚ）－１－（１，２，３－トリアゾール））－プロパン（化合物３１ｄ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２，２－ビス（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ２－Ｏ－Ｍｅ）－１－（Ｅｔ－Ｏ－Ｂｚ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物４７ｆ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２，２－ビス（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ３－Ｏ－Ｍｅ）－１－（Ｅｔ－２，２，２－トリス－（Ｍｅ－Ｏ－Ｂｚ））－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物４７ｉ）、１，２－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－３－（４－メチルピペラジン－１－イル）－プロパン（化合物２０ｊ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２，２－ビス（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ３－Ｏ－Ｍｅ）－１－（Ｅｔ－Ｏ－Ｂｚ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物４７ｇ）、および１，１’－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－Ｎ（ｐ－トリル）－ジエタノールアミン（化合物２６ｂ）から選択される２つ以上の反復単位を含むポリマーである。
他の実施形態において、リンカーＡおよびリンカーＢは、スペルミンおよび表１Ａに示される任意の化合物から選択される２つ以上の反復単位を含むポリマーである。
さらに他の実施形態において、リンカーＡおよびリンカーＢは、スペルミンの２つの反復単位を含むポリメラーゼ増強領域を含む。
さらに他の実施形態において、リンカーＡおよびリンカーＢは、スペルミンの２つの反復単位を含むポリメラーゼ増強領域を含む。
さらなる実施形態において、リンカーＡおよびリンカーＢは、以下から選択される２つ以上の反復単位を含む移動減速領域を含む、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ５）－１－（Ｅｔ－Ｏ－Ａｃ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ｃ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２ｓ－Ｏ－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ７）－１－（Ｅｔ－ＯＢｚ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ｄ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２ｓ－Ｏ－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ３）－１－（Ｅｔ－２，２，２－トリス－（Ｍｅ－Ｏ－Ｂｚ））－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３７ａ）、および１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ５）－１－（Ｅｔ－２，２，２－トリス－（Ｍｅ－Ｏ－Ａｃ））－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３７ｂ）。
より具体的な実施形態において、リンカーＡおよびリンカーＢは、（ｉ）［（（ヘキサエチレングリコール）（１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ５）－１－（Ｅｔ－Ｏ－Ａｃ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ｃ））３（ヘキサエチレングリコール）２］、（ｉｉ）［（（ヘキサチレングリコール）（１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ５）－１－（Ｅｔ－Ｏ－Ａｃ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ｃ））４（ヘキサエチレングリコール）２］、（ｉｉｉ）［（（ヘキサチレングリコール）（１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２ｓ－Ｏ－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ７）－１－（Ｅｔ－ＯＢｚ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ｄ））４（ヘキサエチレングリコール）２］、（ｉｖ）［（（ヘキサチレングリコール）（１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ５）－１－（Ｅｔ－２，２，２－トリス－（Ｍｅ－Ｏ－Ａｃ））－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３７ｂ））４（ヘキサエチレングリコール）２］から選択されるポリマーを含む移動減速領域を含む。
他の実施形態において、リンカーＡは、トリアゾールを含む連結によってアルファホスホルアミデートの酸素原子に連結され、リンカーＢは、トリアゾールを含む連結によって核酸塩基に連結される。
他の態様において、本発明は、第１の末端および第２の末端を有するポリマーを含み、第１の末端から第２の末端に向かって連続的に、第１のレポーターコード、移動制御エレメントを保有する対称化学分枝鎖、および第２のレポーターコードを含むレポーター構築物を提供し、ここで、前記移動制御エレメントは、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２Ｓ－Ｏ－ｍＰＥＧ４－プロパン（化合物１２ｂ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２－（４－Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ３）－１－（Ｅｔ－Ｏ－Ａｃ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ｂ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２ｓ－Ｏ－ｍＰＥＧ６－プロパン（化合物１２ｃ）、１，２－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－３－Ｏ－ｍＰＥＧ２－プロパン（化合物１６）、２，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－１－（５－ベンゾフラン）－プロパン（化合物２０ｉ）、１，２－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－３－（４－メチルピペラジン－１－イル）－プロパン（化合物２０ｊ）、２，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－１－（Ｎ１－（２－Ｍｅ－５－ニトロインドール）－プロパン（化合物２０ｇ）、１，８－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－Ｎ，Ｎ－ジエチルピペラジン（化合物２６ｈ）、１，２－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－３－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ３－Ｏ－Ｂｚ））－１－（１，２，３－トリアゾール））－プロパン（化合物３１ｄ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２ｓ－Ｏ－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ２）－１－（Ｅｔ－ＯＢｚ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ａ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ５）－１－（Ｅｔ－Ｏ－Ａｃ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ｃ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２ｓ－Ｏ－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ７）－１－（Ｅｔ－ＯＢｚ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ｄ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２ｓ－Ｏ－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ３）－１－（Ｍｅ－アセテート）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ｅ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２ｓ－Ｏ－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ３）－１－（Ｅｔ－２，２，２－トリス－（Ｍｅ－Ｏ－Ｂｚ））－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３７ａ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ５）－１－（Ｅｔ－２，２，２－トリス－（Ｍｅ－Ｏ－Ａｃ））－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３７ｂ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２Ｓ－Ｏ－（ＰＥＧ４－Ｏ－Ｂｚ）－プロパン（化合物３８ｂ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２，２－ビス（Ｍｅ－Ｏ－ｍＰＥＧ２）－プロパン（化合物４５ｂ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２，２－ビス（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ２－Ｏ－Ｍｅ）－１－（Ｅｔ－Ｏ－Ｂｚ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物４７ｆ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２，２－ビス（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ３－Ｏ－Ｍｅ）－１－（Ｅｔ－Ｏ－Ｂｚ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物４７ｇ、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２，２－ビス（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ３－Ｏ－Ｍｅ）－１－（Ｅｔ－２，２，２－トリス－（Ｍｅ－Ｏ－Ｂｚ））－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物４７ｉ）、または１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２，２－ビス（１－Ｍｅ－４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ２）－Ｏ－Ｂｚ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物５２）から選択される２つ以上の反復単位を含むポリマーである。
いくつかの実施形態において、対称化学分枝鎖は、１，２，３－Ｏ－トリス－（ホスホジエステル）－プロパン、１，３－ビス－（５－Ｏ－ホスホジエステル－ペンチルアミド）－２－Ｏ－ホスホジエステル－プロパン、または１，４，７－Ｏ－トリス－（ホスホジエステル）－ヘプタンである。
他の実施形態において、対称化学分枝鎖は、１，２，３－Ｏ－トリス－（ホスホジエステル）－プロパンである。
他の実施形態において、移動制御エレメントは、表１Ａから選択される２つ以上の反復単位を含むポリマーである。
他の実施形態において、移動制御エレメントは、表１Ａから選択される２つ以上の反復単位を含むポリマーである。
さらに他の実施形態において、移動制御エレメントは、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２Ｓ－Ｏ－ｍＰＥＧ４－プロパン（化合物１２ｂ）および１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２－（４－Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ３）－１－（Ｅｔ－Ｏ－Ａｃ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ｂ）から選択される２つ以上の反復単位を含むポリマーである。
さらなる実施形態において、移動制御エレメントは、以下の配列、［（１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２Ｓ－Ｏ－ｍＰＥＧ４－プロパン（化合物１２ｂ））］ｎ１［（１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２－（４－Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ３）－１－（Ｅｔ－Ｏ－Ａｃ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ｂ）］ｎ２を含むポリマーであり、式中、ｎ１は０～６であり、ｎ２は６～１０である。
他の実施形態において、第１のレポーターコードおよび第２のレポーターコードは同一である。
いくつかの実施形態において、第１のレポーターコードおよび第２のレポーターコードは、ヘキサエチレングリコール（Ｄ）、エタン（Ｌ）、トリアエチレングリコール（Ｘ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２Ｓ－Ｏ－ｍＰＥＧ４－プロパン（化合物１２ｂ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２－（４－Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ３）－１－（Ｅｔ－Ｏ－Ａｃ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ｂ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２，２－ビス（Ｍｅ－Ｏ－ｍＰＥＧ２）－プロパン（化合物４５ｂ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２Ｓ－Ｏ－（ＰＥＧ４－Ｏ－Ｂｚ）－プロパン（化合物３８ｂ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２ｓ－Ｏ－ｍＰＥＧ６－プロパン（化合物１２ｃ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２ｓ－Ｏ－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ３）－１－（Ｅｔ－２，２，２－トリス－（Ｍｅ－Ｏ－Ｂｚ））－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３７ａ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２ｓ－Ｏ－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ３）－１－（Ｍｅ－アセテート）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ｅ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２ｓ－Ｏ－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ２）－１－（Ｅｔ－ＯＢｚ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ａ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２－（４－Ｅｔ－１－（Ｅｔ－Ｏ－ｍＰＥＧ１）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３１ａ）、２，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－１－（１ージメトキシキナゾリンジオン）－プロパン（化合物２０ｃ）、２，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－１－（Ｎ９－（３，６－ジメトキシカルバゾール）－プロパン（化合物２０ｅ）、１，１’－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２，２’－（スルホニルビス（ベンズ－４－イル））－ジエタノール（化合物２６ｄ）、１，１’－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２，２’－ビピリジン－４，４’－イル）－ジメタノール（化合物２６ａ）、２，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－１－（Ｎ１－（４，６－ジメトキシ－３－Ｍｅ－インドール）－プロパン（化合物２０ｂ）、３－（１，２－Ｏ－ビス（ホスホジエステル））－プロピル）－８，８－ジメチルヘキサヒドロ－３Ｈ－３ａ，６－メタノベンゾ［ｃ］イソチアゾール２，２－ジオキシド（化合物２０ｄ）、２，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－１－（Ｎ１－（６－アザチミン））－プロパン（化合物２０ｆ）、１，５－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－ヘキサヒドロフロ［２，６］フラン（化合物２３）、１，１’－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－オクタヒドロ－２，６－ジメチル－３，８：４，７－ジメタノ－２，６－ナフチリジン－４，８－ジイル）－ジメタノール（化合物２６ｅ）、２，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－１－（Ｎ１－（２－Ｍｅ－５－ニトロインドール）－プロパン（化合物２０ｈ）、２，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－１－（Ｎ１－（２－Ｍｅ－５－ニトロインドール）－プロパン（化合物２０ｇ）、２，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－１－（５－ベンゾフラン）－プロパン（化合物２０ｉ）、１，２－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－３－Ｏ－ｍＰＥＧ２－プロパン（化合物５ｂ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２－（４－Ｅｔ－１－（Ｅｔ－Ｏ－ｍＰＥＧ３）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３１ｂ）、および１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－３－Ｏ－ｍＰＥＧ４－プロパン（化合物５ａ）から選択される２つ以上の反復単位を含むポリマーである。
いくつかの実施形態において、第１のレポーターコードおよび第２のレポーターコードは、ヘキサエチレングリコール（Ｄ）、エタン（Ｌ）、トリアエチレングリコール（Ｘ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２Ｓ－Ｏ－ｍＰＥＧ４－プロパン（化合物１２ｂ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２－（４－Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ３）－１－（Ｅｔ－Ｏ－Ａｃ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ｂ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２，２－ビス（Ｍｅ－Ｏ－ｍＰＥＧ２）－プロパン（化合物４５ｂ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２Ｓ－Ｏ－（ＰＥＧ４－Ｏ－Ｂｚ）－プロパン（化合物３８ｂ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２ｓ－Ｏ－ｍＰＥＧ６－プロパン（化合物１２ｃ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２ｓ－Ｏ－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ３）－１－（Ｅｔ－２，２，２－トリス－（Ｍｅ－Ｏ－Ｂｚ））－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３７ａ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２ｓ－Ｏ－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ３）－１－（Ｍｅ－アセテート）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ｅ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２ｓ－Ｏ－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ２）－１－（Ｅｔ－ＯＢｚ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ａ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２－（４－Ｅｔ－１－（Ｅｔ－Ｏ－ｍＰＥＧ１）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３１ａ）、２，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－１－（１ージメトキシキナゾリンジオン）－プロパン（化合物２０ｃ）、２，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－１－（Ｎ９－（３，６－ジメトキシカルバゾール）－プロパン（化合物２０ｅ）、１，１’－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２，２’－（スルホニルビス（ベンズ－４－イル））－ジエタノール（化合物２６ｄ）、１，１’－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２，２’－ビピリジン－４，４’－イル）－ジメタノール（化合物２６ａ）、２，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－１－（Ｎ１－（４，６－ジメトキシ－３－Ｍｅ－インドール）－プロパン（化合物２０ｂ）、３－（１，２－Ｏ－ビス（ホスホジエステル））－プロピル）－８，８－ジメチルヘキサヒドロ－３Ｈ－３ａ，６－メタノベンゾ［ｃ］イソチアゾール２，２－ジオキシド（化合物２０ｄ）、２，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－１－（Ｎ１－（６－アザチミン））－プロパン（化合物２０ｆ）、１，５－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－ヘキサヒドロフロ［２，６］フラン（化合物２３）、１，１’－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－オクタヒドロ－２，６－ジメチル－３，８：４，７－ジメタノ－２，６－ナフチリジン－４，８－ジイル）－ジメタノール（化合物２６ｅ）、２，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－１－（Ｎ１－（２－Ｍｅ－５－ニトロインドール）－プロパン（化合物２０ｈ）、２，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－１－（Ｎ１－（２－Ｍｅ－５－ニトロインドール）－プロパン（化合物２０ｇ）、２，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－１－（５－ベンゾフラン）－プロパン（化合物２０ｉ）、１，２－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－３－Ｏ－ｍＰＥＧ２－プロパン（化合物５ｂ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２－（４－Ｅｔ－１－（Ｅｔ－Ｏ－ｍＰＥＧ３）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３１ｂ）、および１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－３－Ｏ－ｍＰＥＧ４－プロパン（化合物５ａ）から選択される２つ以上の反復単位を含むポリマーである。
他の実施形態において、第１のレポーターコードおよび第２のレポーターコードは、ヘキサエチレングリコール、エタン、トリアエチレングリコール、および表１Ａに示される任意の化合物から選択される２つ以上の反復単位を含むポリマーである。
さらなる実施形態において、第１のレポーターコードおよび第２のレポーターコードは、ヘキサエチレングリコール、エタン、トリアエチレングリコール、および１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２Ｓ－Ｏ－ｍＰＥＧ４－プロパン（化合物１２ｂ）から選択される２つ以上の反復単位を含むポリマーである。
さらなる実施形態において、第１のレポーターコードおよび第２のレポーターコードは、（ｉ）［（ヘキサエチレングリコール）２（エタン）３（ヘキサエチレングリコール）（トリアエチレングリコール）］、（ｉｉ）［（ヘキサエチレングリコール）２（１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２Ｓ－Ｏ－ｍＰＥＧ４－プロパン（化合物１２ｂ））２（エタン）（トリアエチレングリコール）３］、（ｉｉｉ）［（ヘキサエチレングリコール）２（１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２Ｓ－Ｏ－ｍＰＥＧ４－プロパン（化合物１２ｂ））３（エタン）２（ヘキサエチレングリコール）（トリアエチレングリコール）］、および（ｉｖ）［（トリアエチレングリコール）２（エタン）（１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２Ｓ－Ｏ－ｍＰＥＧ４－プロパン（化合物１２ｂ））６（エタン）７］から選択される配列を含むポリマーである。
他の態様において、本発明は、対称的に合成されたレポーターテザー（ＳＳＲＴ）を提供し、ここで、対称的に合成されたレポーターテザーは、第１の末端および第２の末端を有するポリマーであり、第１の末端から第２の末端に向かって連続的に、第１のリンカー、上記のレポーター構築物の任意の１つによるレポーター構築物、および第２のリンカーを含み、ここで、第１および第２のリンカーは同一であり、スペルミン（Ｑ）、ヘキサエチレングリコール（Ｄ）、２－（（４－（（３－（ベンゾイルオキシ）－２－（（（１－（３－（ベンゾイルオキシ）－２－（（ベンゾイルオキシ）メチル）－２－（（ホスホジエステル－オキシ）メチル）プロピル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－イル）メトキシ）メチル）－２－（（ベンゾイルオキシ）メチル）プロポキシ）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）メチル）－２－Ｏ－ホスホジエステル－プロパン－１，３－ジイルジベンゾエート（化合物６２）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２，２－ビス（１－Ｍｅ－４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ２－Ｏ－Ｂｚ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物５２）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ５）－１－（Ｅｔ－Ｏ－Ａｃ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ｃ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２ｓ－Ｏ－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ７）－１－（Ｅｔ－ＯＢｚ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ｄ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２ｓ－Ｏ－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ３）－１－（Ｅｔ－２，２，２－トリス－（Ｍｅ－Ｏ－Ｂｚ））－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３７ａ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ５）－１－（Ｅｔ－２，２，２－トリス－（Ｍｅ－Ｏ－Ａｃ））－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３７ｂ）、１，２－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－３－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ３－Ｏ－Ｂｚ）－１－（１，２，３－トリアゾール））－プロパン（化合物３１ｄ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２，２－ビス（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ２－Ｏ－Ｍｅ）－１－（Ｅｔ－Ｏ－Ｂｚ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物４７ｆ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２，２－ビス（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ３－Ｏ－Ｍｅ）－１－（Ｅｔ－２，２，２－トリス－（Ｍｅ－Ｏ－Ｂｚ））－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物４７ｉ）、１，２－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－３－（４－メチルピペラジン－１－イル）－プロパン（化合物２０ｊ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２，２－ビス（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ３－Ｏ－Ｍｅ）－１－（Ｅｔ－Ｏ－Ｂｚ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物４７ｇ）、および１，１’－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－Ｎ（ｐ－トリル）－ジエタノールアミン（化合物２６ｂ）から選択される２つ以上の反復単位を含むポリマーである。
いくつかの実施形態において、対称的に合成されたレポーターテザー（ＳＳＲＴ）は、スペルミンの２つの反復単位を含むポリメラーゼ増強領域を含む。
他の実施形態において、対称的に合成されたレポーターテザー（ＳＳＲＴ）は、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ５）－１－（Ｅｔ－Ｏ－Ａｃ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ｃ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２ｓ－Ｏ－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ７）－１－（Ｅｔ－ＯＢｚ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ｄ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２ｓ－Ｏ－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ３）－１－（Ｅｔ－２，２，２－トリス－（Ｍｅ－Ｏ－Ｂｚ））－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３７ａ）、および１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ５）－１－（Ｅｔ－２，２，２－トリス－（Ｍｅ－Ｏ－Ａｃ））－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３７ｂ）から選択される２つ以上の反復単位を含む移動減速領域を含む。
他の実施形態において、対称的に合成されたレポーターテザー（ＳＳＲＴ）は、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ５）－１－（Ｅｔ－Ｏ－Ａｃ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ｃ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２ｓ－Ｏ－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ７）－１－（Ｅｔ－ＯＢｚ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ｄ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２ｓ－Ｏ－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ３）－１－（Ｅｔ－２，２，２－トリス－（Ｍｅ－Ｏ－Ｂｚ））－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３７ａ）、および１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ５）－１－（Ｅｔ－２，２，２－トリス－（Ｍｅ－Ｏ－Ａｃ））－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３７ｂ）から選択される２つ以上の反復単位を含む移動減速領域を含む。
他の実施形態において、対称的に合成されたレポーターテザー（ＳＳＲＴ）は、（ｉ）［（（ヘキサエチレングリコール）（１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ５）－１－（Ｅｔ－Ｏ－Ａｃ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ｃ））３（ヘキサエチレングリコール）２］、（ｉｉ）［（（ヘキサチレングリコール）（１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ５）－１－（Ｅｔ－Ｏ－Ａｃ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ｃ））４（ヘキサエチレングリコール）２］、（ｉｉｉ）［（（ヘキサチレングリコール）（１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２ｓ－Ｏ－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ７）－１－（Ｅｔ－ＯＢｚ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ｄ））４（ヘキサエチレングリコール）２］、および（ｉｖ）［（（ヘキサチレングリコール）（１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ５）－１－（Ｅｔ－２，２，２－トリス－（Ｍｅ－Ｏ－Ａｃ））－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３７ｂ））４（ヘキサエチレングリコール）２］から選択されるポリマーを含む移動減速領域を含む。
さらに他の実施形態において、対称的に合成されたレポーターテザー（ＳＳＲＴ）の第１の末端および第２の末端は連結部分を含み、特定の実施形態において、連結部分はアジド（－Ｎ３）基である。
他の態様において、本発明は、標的核酸を配列決定するための方法であって、ａ）鋳型指向性合成によって産生される娘鎖を提供し、前記娘鎖が、前記標的核酸の全部または一部の連続的なヌクレオチド配列に対応する配列においてカップリングされた複数のＸＮＴＰサブユニットを含み、前記娘鎖の個々のＸＮＴＰサブユニットが、レポーター構築物、核酸塩基残基および選択的に切断可能な結合を含み、前記レポーター構築物が、前記選択的に切断可能な結合の切断時に、前記娘鎖の前記サブユニットの伸長を可能にするステップ、ｂ）選択的に切断可能な結合を切断して、娘鎖の複数のサブユニットよりも長い長さのＸｐａｎｄｏｍｅｒを生じさせ、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒが、標的核酸の全部または一部の連続的なヌクレオチド配列に対応する配列中の遺伝情報を解析するためのレポーター構築物を含むステップ、およびｃ）前記Ｘｐａｎｄｏｍｅｒのレポーター構築物を検出するステップを含む、方法を提供する。
いくつかの態様において、遺伝情報を解析するためのレポーター構築物は、レポーターコードおよび移動制御エレメントを含み、ここで、移動制御エレメントは、立体障害による移動制御を提供し、ベースライン電圧に供されたナノポアを通過する際にＸｐａｎｄｏｍｅｒの移動を休止させ、移動制御エレメントは、ナノポアの開口部内のレポーターコードと係合し、レポーターコードは、ナノポアによって感知される。
いくつかの実施形態において、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒは、パルス電圧の印加によってナノポアを介した移動を再開し、ここで、パルス電圧は移動制御エレメントの移動を可能にするのに十分であるが、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ構築物の次のレポーター構築物は自由にナノポアと係合できるままである。
他の実施形態において、立体障害によってナノポアと係合したレポーター構築物の移動制御エレメントは、パルス電圧の各パルスで移動する。
いくつかの実施形態において、標的構築物は、パルス電圧のパルス間の期間中にナノポアによって感知される。
いくつかの実施形態において、標的構築物は、パルス電圧のパルス間の期間中にナノポアによって感知される。
特定の実施形態において、ベースライン電圧は約５５ｍＶ～約７５ｍＶであり、パルス電圧は約５５０ｍＶ～約７００ｍＶである。
いくつかの実施形態において、パルス電圧は、約５μｓ～約１０μｓの持続時間および約０．５ｍｓ～１．５ｍｓの周期性を有する。
いくつかの実施形態において、パルス電圧は、約５μｓ～約１０μｓの持続時間および約０．５ｍｓ～１．５ｍｓの周期性を有する。
他の実施形態において、ナノポアは交流（ＡＣ）に供される。
さらなる実施形態において、ＸＮＴＰサブユニットの１つ以上は、２’フルオロアラビノシルエピマーを含む。
さらなる実施形態において、ＸＮＴＰサブユニットの１つ以上は、２’フルオロアラビノシルエピマーを含む。
他の態様において、本開示は、ＮＨ４Ｃｌ、ＭｇＣｌ２、ＬｉＣｌ、ＫＣｌ、ＣｓＣｌ、ＮａＣｌおよびＣａＣｌ２からなる群から選択される少なくとも１つの塩を含むナノポアを通るポリマーの移動速度を制御するための緩衝剤を提供する。
いくつかの実施形態において、緩衝剤は、３－メチル－２－オキサゾリジノン（ＭＯＡ）、ＤＭＦ、ＡＣＮ、ＤＭＳＯおよびＮＭＰからなる群から選択される少なくとも１つの溶媒をさらに含み、ここで、溶媒は、約１％体積／体積～約３５％体積／体積の範囲で存在する。
他の実施形態において、緩衝剤は、ヘキサン酸ナトリウム（ＮａＨｅｘ）、ＥＤＴＡ、レドックス試薬、ＰＥＧ、グリセロール、およびフィコール等からなる群から選択される少なくとも１つの添加剤をさらに含む。
他の態様において、本開示は、シス緩衝剤およびトランス緩衝剤を含むナノポア検出器を通るポリマーの移動速度を制御するための緩衝システムを提供し、ここで、シス緩衝剤は第１の塩濃度を有し、トランス緩衝剤は第２の塩濃度を有し、第１の塩濃度は第２の塩濃度よりも低い。
本発明は、本発明の好ましい実施形態および本明細書に含まれる実施例の以下の詳細な説明を参照することによってより容易に理解され得る。別段の説明がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する当技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
本明細書全体を通して「一実施形態」または「実施形態」およびその変形への言及は、前記実施形態に関連して記載される特定の特徴、構造、または特性が少なくとも一実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体を通して種々の場所における「一実施形態において」または「実施形態において」という句の出現は、必ずしも全てが同じ実施形態を指すとは限らない。さらに、特定の特徴、構造、または特性は、１つ以上の実施形態において、任意の適切な方法で組み合わせることができる。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、内容および文脈が、明確に別段の指示をしない限り、複数の指示対象、すなわち１つ以上を含む。また、接続的用語「および（ａｎｄ）」および「または（ｏｒ）」は、一般的に、内容および文脈が場合によって包括性または排他性を明確に指示しない限り、「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」を含むように最も広い意味で用いられることにも留意されたい。したがって、代替形態（例えば、「または」）の使用は、代替形態のいずれか１つ、両方、またはそれらの任意の組み合わせを意味すると理解されるべきである。さらに、本明細書で「および／または」と記載されている場合の「および」および「または」の構成は、全ての関連する項目またはアイデアを含む実施形態、および全てよりは少ない、関連する項目またはアイデアを含む１つ以上の他の代替実施形態を包含することを意図している。
文脈上他の意味に解釈すべき場合を除き、明細書およびその後の特許請求の範囲を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語、ならびに「有する（ｈａｖｅ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」等のその同義語および変形、ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などのその変形は、オープンで包括的な意味、例えば、「含むが、限定されない」と解釈されるべきである。「本質的にからなる」という用語は、特定の材料もしくはステップ、または特許請求される本発明の基本的かつ新規の特徴に実質的に影響を及ぼさないものに特許請求の範囲を限定する。
略語「例えば（ｅ．ｇ．）」は、ラテン語ｅｘｅｍｐｌｉ ｇｒａｔｉａに由来し、本明細書では非限定的な例を示すために使用される。したがって、略語「例えば（ｅ．ｇ．）」は、用語「例えば（ｆｏｒ ｅｘａｍｐｌｅ）」と同義である。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が、明確に別段の指示をしない限り、複数への言及を含み、「Ｘおよび／またはＹ」という用語は、「Ｘ」または「Ｙ」、または「Ｘ」と「Ｙ」の両方を意味し、名詞に続く文字「ｓ」は、前記名詞の複数形と単数形の両方を示すことも理解されたい。さらに、本発明の特徴または態様がマーカッシュ群に関して記載されている場合、本発明は、マーカッシュ群の任意の個々のメンバーおよびメンバーの任意のサブグループに関しても包含し、それによって記載されることが意図されており、当業者により認識されることであり、出願人は、マーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたはメンバーの任意のサブグループを具体的に指すように、本出願または特許請求の範囲を修正する権利を留保する。
本文書内で使用される任意の見出しは、読者によるその検討を促進するために利用されているにすぎず、本発明または特許請求の範囲を限定するものとして決して解釈されるべきではない。したがって、本明細書で提供される見出しおよび開示の要約は、便宜上のものに過ぎず、実施形態の範囲または意味を解釈するものではない。
ある範囲の値が本明細書で提供される場合、文脈が、明確に別段の指示をしない限り、その範囲の上限と下限との間における、下限の単位の１０分の１までの各介在値、および記載された範囲内の任意の他の記載値または介在値は、本発明に包含されることは理解される。これらのより小さい範囲の上限および下限が、より小さい範囲に独立して含まれ得ることも、記載された範囲内の任意の具体的に除外された限界を条件として、本発明に包含される。記載された範囲が限界の一方または両方を含む場合は、包あれる限界の一方または両方を除いた範囲もまた、本発明に含まれる。
例えば、本明細書で提供される任意の濃度範囲、ペーセンテージ範囲、比率範囲、または整数範囲は、特に別段の説明がない限り、記載された範囲内の任意の整数、および適切な場合、その分数（例えば、整数の１０分の１および１００分の１）の値を含むと理解されるべきである。また、ポリマーサブユニット、サイズ、または厚さ等の任意の物理的特徴に関する本明細書に記載された任意の数の範囲は、別段の説明がない限り、記載された範囲内の任意の整数を含むと理解されるべきである。本明細書で使用される場合、「約」という用語は、別段の説明がない限り、示された範囲、値、または構造の±２０％を意味する。
拡張による配列決定
Ｓｔｒａｔｏｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（例えば、Ｋｏｋｏｒｉｓら、米国特許第７，９３９，２５９号、「増殖によるハイスループット核酸配列決定」）によって開発された「拡張による配列決定」（ＳＢＸ）プロトコルは、「ＸＮＴＰ」と呼ばれる高度に改変された非天然ヌクレオチド類似体の重合に基づいている。一般的に、ＳＢＸは、生化学的重合を使用して、ＤＮＡ鋳型の配列を「Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ」と呼ばれる測定可能なポリマー上に転写する。転写された配列は、約１０ｎｍ離れた高シグナル対ノイズレポーターにおいてＸｐａｎｄｏｍｅｒ骨格に沿ってコード化され、高シグナル対ノイズ、高分化応答のために設計される。これらの違いは、ネイティブＤＮＡと比較して、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒの配列リード効率および精度の著しい性能向上を提供する。ＳＢＸプロセスの一般化された概要を図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ、および図１Ｄに示す。
Ｓｔｒａｔｏｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（例えば、Ｋｏｋｏｒｉｓら、米国特許第７，９３９，２５９号、「増殖によるハイスループット核酸配列決定」）によって開発された「拡張による配列決定」（ＳＢＸ）プロトコルは、「ＸＮＴＰ」と呼ばれる高度に改変された非天然ヌクレオチド類似体の重合に基づいている。一般的に、ＳＢＸは、生化学的重合を使用して、ＤＮＡ鋳型の配列を「Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ」と呼ばれる測定可能なポリマー上に転写する。転写された配列は、約１０ｎｍ離れた高シグナル対ノイズレポーターにおいてＸｐａｎｄｏｍｅｒ骨格に沿ってコード化され、高シグナル対ノイズ、高分化応答のために設計される。これらの違いは、ネイティブＤＮＡと比較して、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒの配列リード効率および精度の著しい性能向上を提供する。ＳＢＸプロセスの一般化された概要を図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ、および図１Ｄに示す。
ＸＮＴＰは、鋳型依存性酵素重合と適合性の拡張可能な５’三トリホスフェート改変非天然ヌクレオチド類似体である。高度に単純化されたＸＮＴＰが図１Ａに示されており、これは、これらの非天然基質の固有の特徴を強調している、ＸＮＴＰ１００は、２つの異なる機能領域を有し、すなわち、５’α－ホスフェート１１５を核酸塩基１０５に連結する、選択的に切断可能なホスホルアミデート結合１１０および、ホスホルアミデート結合の切断による制御された拡張を可能にする位置でヌクレオシドトリホスホルアミデート内に結合される合成レポーターテザー（ＳＳＲＴ）１２０。ＳＳＲＴは、選択的に切断可能なホスホルアミデート結合によって分離されたリンカー１２５Ａおよび１２５Ｂを含む。各リンカーは、レポーターコード１３０の一端に結合する。ＸＮＴＰ１００は、ＸＮＴＰ基質および鋳型依存性重合の娘鎖産物に特徴的な「拘束された構成」に示されている。重合ＸＮＴＰの拘束された構成は、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ産物に見られるように、拡張された構成の前駆体である。拘束された構成から拡張された構成への移行は、娘鎖の一次骨格内のホスホルアミデートのＰ－－Ｎ結合の切断時に起こる。
Ｘｐａｎｄｏｍｅｒポリマーの合成を図１Ｂおよび図１Ｃに要約する。アセンブリ中、モノマーＸＮＴＰ基質１４５（ＸＡＴＰ、ＸＣＴＰ、ＸＧＴＰ、およびＸＴＴＰ）は、ガイドとして一本鎖鋳型１４０を使用する鋳型指向性重合のプロセスによって新生娘鎖１５０の伸長可能末端上で重合される。一般的に、このプロセスは、プライマーから開始され、５’から３’方向に進行する。一般的に、ＤＮＡポリメラーゼまたは他のポリメラーゼを使用して娘鎖を形成し、鋳型鎖の相補的コピーが得られるように条件を選択する。娘鎖が合成された後、カップリングされたＳＳＲＴは、娘鎖をさらに形成する拘束されたＸｐａｎｄｏｍｅｒを形成する。娘鎖中のＳＳＲＴは、ＸＮＴＰ基質の「拘束された構成」を有する。ＳＳＲＴの拘束された構成は、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ産物に見られるように、拡張された構成の前駆体である。
図１Ｃに示されるように、拘束された構成１６０から、拡張された構成１６５への移行は、娘鎖の一次骨格内の選択的に切断可能なホスホルアミデート結合（単純化のために陰影のない楕円によって示す）の切断に起因する。本実施形態において、ＳＳＲＴ鎖は、それらが連結されている核酸塩基に特異的な１つ以上のレポーターまたはレポーターコード１３０Ａ、１３０Ｃ、１３０Ｇ、または１３０Ｔを含み、それによって鋳型の配列情報をコードする。このようにして、ＳＳＲＴは、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒの長さを拡張し、親鎖の配列情報の線密度を低下させる手段を提供する。
図１Ｄは、シスリザーバ１７５からトランスリザーバ１８５にナノポア１８０を通過して移動するＸｐａｎｄｏｍｅｒ１６５を示す。ナノポアを通過する際、線状化Ｘｐａｎｄｏｍｅｒのレポーターコード（この図では、「Ｇ」、「Ｃ」、および「Ｔ」とラベル付けされている）のそれぞれは、それが連結されている核酸塩基に特異的な別個の再現性のある電子シグナル（重畳トレース１９０によって示す）を生成する。
図２は、ＸＮＴＰの一実施形態の一般化された構造をより詳細に示す。ＸＮＴＰ２００は、選択的に切断可能なホスホルアミデート結合２３０によって分離されたリンカーアーム部分２２０Ａおよび２２０Ｂを有するヌクレオシドトリホスホルアミデート２１０を含む。ＳＳＲＴは、連結基２５０Ａおよび２５０Ｂにおいてヌクレオシドトリホスホルアミデートに連結され、ここで、第１のＳＳＲＴは、ヘテロ環２６０（ここではシトシンによって表されるが、ヘテロ環は、４つの標準的な核酸塩基、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴの任意の１つであり得る）に連結され、第２のＳＳＲＴは、核酸塩基骨格のアルファホスフェート２７０に連結される。当業者は、当技術分野で公知の多くの適切なカップリング化学物質を使用して、最終的なＸＮＴＰ基質産物を形成することができ、例えば、ＳＳＲＴコンジュゲートがトリアゾール連結基の形成によって達成され得ることを理解するであろう。
本実施形態において、ＳＳＲＴ２７５は、いくつかの機能的エレメント、または「特徴」、例えばポリメラーゼ増強領域２８０Ａおよび２８０Ｂ、レポーターコード２８５Ａおよび２８５Ｂ、ならびに翻訳制御エレメント（ＴＣＥ）２９０Ａおよび２９０Ｂを含む。他の実施形態において、ＳＳＲＴは単一のＴＣＥを含む。これらの特徴のそれぞれは、ナノポアを通過するＸｐａｎｄｏｍｅｒの移動の間に、固有の機能を果たし、一連の独特かつ再現性のある電子シグナルを生成する。ＳＳＲＴ２７５は、本明細書でさらに論じるように、立体および／または電気反発の組合せを介してＴＣＥによるＸｐａｎｄｏｍｅｒ移動の速度を制御するように設計されている。異なるレポーターコードは、異なる測定可能なレベルでナノポアを通過するイオン流を遮断するようなサイズである。オリゴヌクレオチド合成に典型的に使用されるホスホラミダイト化学を使用して、特定のＳＳＲＴポリマー配列を効率的に合成することができる。レポーターコードおよび他の特徴は、市販のおよび／または独自のライブラリから特定のホスホラミダイトの配列を選択することによって設計することができる。そのようなライブラリには、１～１２またはそれを超えるエチレングリコール単位の長さを有するポリエチレングリコール、および１～１２またはそれを超える炭素単位の長さを有する脂肪族ポリマーが含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、ＳＳＲＴは、ヌクレオチドトリホスホルアミデートジエステルに近位のＳＳＲＴの末端に「ポリメラーゼ増強領域」と呼ばれる特徴を含む。ポリメラーゼ増強領域は、核酸ポリメラーゼによるＸＮＴＰ構造の取り込みを促進する、正に荷電したポリアミンスペーサ（例えば、第一級、第二級、第三級または第四級アミン）またはトリアミンスペーサ（それぞれ３つの炭素によって分離された３つの第二級アミン）を含み得る。特定の実施形態において、ポリメラーゼ増強領域は、スペルミン部分が以下の構造（当業者が認識するように、トリフルオロアセトアミド保護基は、スペルミン上のアミン基を露出させるためにＳＳＲＴ合成の最後に除去される）を有するホスホラミダイトモノマーによって提供される、スペルミンの２つの反復単位を含む：
本開示全体を通して使用される場合、「レポーター構築物」という用語は、レポーターコード、対称化学分枝鎖および移動制御エレメントを含むＳＳＲＴのエレメントを指す。特定の実施形態において、レポーター構築物は、第１の末端から第２の末端まで連続的に、第１のレポーターコード、移動制御エレメントを保有する対称化学分枝鎖、および第２のレポーターコードを含むポリマーである。「保有する」という用語は、対称分枝鎖と移動制御エレメントとの間の共有結合を指し、これは、２つのレポーターコードに対する移動制御エレメントの有利な配向をもたらす。本明細書および図６～図８を参照してさらに論じるように、対称化学分枝鎖は、文字「Ｙ」によって表すことができ、ここで、２つのレポーターコードはＹのアームに連結され、移動制御エレメントはＹの基部に連結されている。したがって、２つのレポーターコードは、分枝鎖によってインライン連結され、一方、分枝鎖は、直鎖インラインＳＳＲＴに対して垂直方向に移動制御エレメントを保有する。
本開示を通して使用される場合、「リンカーＡ」および「リンカーＢ」という用語は、それぞれポリメラーゼ増強領域および１つ以上の移動減速特徴または領域、ならびに特定の実施形態において、ナノポア内を横断するＳＳＲＴの長さを調節するようにカスタマイズすることができる、例えばＰＥＧ６のポリマーを含むスペーサ領域を含むＳＳＲＴの領域を指す。
特定の実施形態において、ＸＮＴＰは、以下の一般化構造を有する化合物であり得る、
一実施形態において、例えば、化合物を使用してＤＮＡ鋳型を配列決定する場合、ＲはＨであり得る。他の実施形態において、例えば、化合物を使用してＲＮＡ鋳型を配列決定する場合、ＲはＯＨであり得る。
特定の実施形態において、核酸塩基は、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシルまたは核酸塩基類似体である。当業者が理解するように、アデニン、シトシン、グアニン、チミンおよびウラシルは、天然に存在する核酸塩基である。本明細書で使用される場合、「核酸塩基類似体」という用語は、隣接する一本鎖核酸鋳型上の相補的核酸塩基とワトソン・クリック塩基対を形成することができる天然に存在しない核酸塩基を指す。例示的な核酸塩基類似体には、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－クロロウラシル、５－ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４－アセチルシトシン、５－（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ－Ｄ－ガラクトシルケオシン、イノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデニン、１－メチルグアニン、１－メチルイノシン、２，２－ジメチルグアニン、２－メチルアデニン、２－メチルグアニン、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、Ｎ６－アデニン、７－メチルグアニン、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、ベータ－Ｄ－マンノシルケオシン、５’－メトキシカルボキシメチルウラシル、５－メトキシウラシル、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、ウィブトキソシン、シュードウラシル、クエオシン、２－チオシトシン、５－メチル－２－チオウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－メチルウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、５－メチル－２－チオウラシル、３－（３－アミノ－３－Ｎ－２－カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、２，６－ジアミノプリン、３－ニトロピロール、８－アザ－７－デアザグアニン、８－アザ－７－デアザイノシン、および８－アザ－７－デアザアデニンが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で論じられるように、レポーター構築物は、第１の末端および第２の末端を有するポリマーであり、第１の末端から第２の末端まで連続的に、第１のレポーターコード、移動制御エレメントを保有する対称化学分枝鎖、および第２のレポーターコードを含む。この一連の特徴は、レポーター構築物（および対称リンカー、リンカーＡおよびリンカーＢを含むＳＳＲＴ全体）の対称構造を反映しており、ここで、２つのレポーターコードの配列は同一であり、対称化学分枝鎖によって逆向きにインライン連結されている。レポーター構築物を含むＳＳＲＴ全体の合成は、図６～８）を参照して本明細書でさらに論じられる。簡潔には、合成は３’から５’方向に進行し、ＴＣＥの３’末端で開始する。対称分枝鎖をＴＣＥの５’末端に付加することにより、分枝鎖の各アームからの第１のレポーターコードおよび第２のレポーターコードの同時重合、続くリンカーＡおよびリンカーＢの同時合成が可能になり、ＳＳＲＴの第１の末端および第２の末端の５’末端で終結する。移動制御エレメントを保有する対称分岐鎖によって分離された２つの同一のレポーターコードによって提供されるインライン冗長性は、ナノポア配列決定中にいくつかの利点を提供することが見出された。例えば、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒは、いずれかの方向に移動した場合に、ナノポアによって潜在的に読み取られ得る、すなわち、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒは「前方」または「後方」のいずれかに読み取られ得る。この柔軟性により、本明細書でさらに論じられる、配列決定の「ラチェット」方法、および他の方法、例えば電圧印加のＡＣパターンに基づく「フロッシング」が可能になる。
図３は、α－溶血素ナノポアを移動させるプロセスにおける切断されたＸｐａｎｄｏｍｅｒの一実施形態を示す。この生物学的ナノポアは、電解質の２つの貯蔵部を分離し電気的に隔離する脂質二重層膜に埋め込まれている。典型的な電解質は、ｐＨ７．０に緩衝された１モル濃度のＫＣｌを有する。典型的には１００ｍＶの小さい電圧が、二重層を通過して印加される場合、ナノポアは、イオン電流の流れを拘束し、回路内の一次抵抗である。Ｘｐａｎｄｏｍｅｒレポーターコードは、特定のイオン電流遮断レベルを与えるように設計されており、レポーターコードの配列がナノポアを移動する際に、イオン電流レベルの配列を測定することによって配列情報を読み取ることができる。
α－溶血素ナノポアは、典型的には、移動が、前庭部側に入り、基部側から出ることによって起こるように配向されている。図３に示すように、ナノポアは、最初に基部側からＸｐａｎｄｏｍｅｒを捕捉するように配向されている。いくつかの状況において、この配向は、最初に前庭部に入るときよりも少ない遮断アーチファクトを引き起こす可能性がある。しかし、本発明によれば、α－溶血素ナノポアはいずれの方向に配向していてもよい。Ｘｐａｎｄｏｍｅｒが移動すると、レポーターは、その移動制御エレメントが基部入口で停止するまで基部に入る。ＴＣＥが基部に入り、基部を通過することが可能になるまで、レポーターは基部に保持され、その後、移動は次のレポーターに進む。本実施形態において、基部へのＴＣＥの通過は、移動制御部分をＴＣＥから解離することによって可能になる。好都合なことに、本発明者らは、新規クラスのペンダント－ＰＥＧホルホラミダイトから構築されたＴＣＥが、固有の物理化学的および立体的特性に基づいて有意に改善された移動制御を提供し、したがってトランスで作用する移動制御部分の会合および解離への依存を回避することを見出した。
ＳＳＲＴ特徴設計のための新規化合物
自動オリゴヌクレオチド合成に典型的に使用されるホスホラミダイト化学は、ポリマーＳＳＲＴを合成するための効率的で便利な手段を提供する。しかしながら、ＳＳＲＴ特徴設計の最終的な可能性は、市販のライブラリで利用可能なホスホラミダイトモノマー（ＰＰＡ）のレパートリーによって著しく制限される。市販のＰＰＡは、大部分がヌクレオシドのコア構造に基づいており、したがって、ナノポアリードの効率および精度を改善する、より広範の特徴の設計に必要な物理化学的特性の範囲を提供しない。当技術分野におけるこの欠点に対処するために、本発明者らは、新しいＰＰＡモノマー化合物の大きな集合を設計および合成した。重要なことに、これらの化合物は、当技術分野で周知であり、上述のように特徴設計を拘束するヌクレオシドコア構造に基づいていない。
自動オリゴヌクレオチド合成に典型的に使用されるホスホラミダイト化学は、ポリマーＳＳＲＴを合成するための効率的で便利な手段を提供する。しかしながら、ＳＳＲＴ特徴設計の最終的な可能性は、市販のライブラリで利用可能なホスホラミダイトモノマー（ＰＰＡ）のレパートリーによって著しく制限される。市販のＰＰＡは、大部分がヌクレオシドのコア構造に基づいており、したがって、ナノポアリードの効率および精度を改善する、より広範の特徴の設計に必要な物理化学的特性の範囲を提供しない。当技術分野におけるこの欠点に対処するために、本発明者らは、新しいＰＰＡモノマー化合物の大きな集合を設計および合成した。重要なことに、これらの化合物は、当技術分野で周知であり、上述のように特徴設計を拘束するヌクレオシドコア構造に基づいていない。
本明細書で使用される場合、略語「ＰＰＡ」は、Ｏ－（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）－ホスホラミダイトであるホスホラミダイトを指す。「ホスホラミダイト」という用語が、モノマー前駆体の構造を指すことは、当業者によって容易に理解されることであり、ＰＰＡのＳＳＲＴへのインライン重合後、モノマーはホスホジエステル結合オリゴマー産物に変換される。
ホスホジエステル骨格ポリマーを作製するために使用される他の方法を使用して、ＳＳＲＴを合成することができる。したがって、これらの化学的性質と共に使用されるモノマーは、非ヌクレオシドエレメントを有するＳＳＲＴも生成することができる。さらなるアセンブリの方法は、溶液相または固体支持体上で行われる自動または手動のアセンブリ戦略の使用を伴い得る。Ｈ－ホスホネート合成およびホスホトリエステル合成は、当技術分野で公知の例である。さらに、酵素合成を使用する方法は、ＳＳＲＴ（例えば、酵素オリゴヌクレオチド合成に使用されるもの）を合成するように適合され得る。いくつかの実施形態において、ＳＳＲＴの合成は、任意の上記の合成方法の組み合わせに基づいてもよい。
以下は、ＰＰＡモノマー設計をガイドするために使用される特定の原理の簡潔で非限定的な概要である。１）ホスフェート間隔天然ヌクレオチド骨格の間隔を模倣する、Ｃ３（３原子）間隔を維持する化合物を設計した。他の適切な間隔は、特定の実施形態において、２～２０原子間隔を含む。予想外にも、原子間隔は、ナノポア移動の速度に影響を及ぼし、移動制御の微調整を可能にすることが見出された。２）親水性化合物は、特定の機能性について所望されるように、ＳＳＲＴ特徴の親水性を最適化するように設計された。いくつかのモノマー設計は、例えばレポーターコードの重要な特性である水溶性を上昇させる能力のためにＰＥＧに基づいていた。本発明者らは、ＰＥＧポリマーの長さを調整することによって、ならびにＰＥＧポリマーをメチルエーテルで終端させることによって、または１，２，３－トリアゾールをポリマーに導入することによって、ＰＰＡモノマーの親水性を微調整することができ、これは、水溶性をさらに改善するという予想外の効果を有していた。３）立体体積直鎖、分枝、環状、およびデンドリマー状ＰＰＡ構造のいくつかの代替構成を設計および試験して、ナノポアを通過する電流の流れに対する立体体積の影響を評価した。４）骨格中のキラリティーナノポアはキラル環境である。エナンチオマー化合物を設計して、重要なナノポアシグナル特性が何らかの形で影響を受けるかどうかを決定した。５）電荷逆ホスフェート電荷に加えて、特定の化合物は、正電荷、例えば第三級アミンまたは負電荷、例えばカルボン酸のいずれかを有する。６）芳香族性種々の芳香族炭化水素およびヘテロ芳香族構造から構成される化合物を骨格に組み込んで、ナノポアとの相互作用が所望のシグナル特性を生じるかどうかを決定した。
ＰＰＡモノマー化合物は、移動速度制御または電流レベル制御等のナノポアシグナル特性を減衰させることに加えて、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒの物理化学的特性にも影響を及ぼす。半合成ポリマーとしてのＸｐａｎｄｏｍｅｒは、天然ポリマー、例えばＤＮＡおよび合成ポリマーの両方に関連する特性を示す。いくつかの実施形態において、特定のＰＰＡモノマーは、ＸｐａｎｏｄｍｅｒとＳＢＸワークフローの特定のプロセスエレメントとの間の望ましくないＸｐａｎｄｏｍｅｒ間相互作用または相互作用の減衰を可能にし得る。例えば、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒの自己凝集、より高次のガラスまたはゼラチンの形成、単離、膜およびナノポアを含む容器の表面、ナノチャネルの壁、または製造デバイスへの受動的吸着、またはそれらとの相互作用を低減することが可能であり得る。
ＳＳＲＴ特徴に組み込まれた場合に優れた機能性を提供することが証明されている化合物の１つのクラスは、本明細書では「ペンダントＰＥＧ」と呼ばれる。これらの構造は、コアに対してペンダント構成で１つ以上のＰＥＧ含有ポリマーの連結を可能にする分子コアに基づく。ペンダントＰＥＧ化合物とコームとの間に構造類似性を描くことができ、ここで、個々の化合物間のホスホジエステル結合がコームの基部を形成し、ＰＥＧ系ポリマーが歯部を形成する。好都合なことに、ペンダントＰＥＧ「歯部」のいくつかの特性は、特定のＳＳＲＴ特徴、例えばポリマー歯部の間隔、長さ、および組成の１つ以上に合わせてカスタマイズすることができる。以下の構造１ａ、２ａ、３ａおよび４ａは、ペンダントＰＥＧコア構造の４つの例示的な実施形態を示す。
特定の非限定的な実施形態において、ＸまたはＸ’は、－ＣＨ２Ｏ－［ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－］ｍＯ－を表していてよく、式中、ｍは１～１０であり、ＹまたはＹ’は－Ｈ、ＣＨ３、
表１Ａ～Ｃは、例えばＳＳＲＴ特徴設計で使用するための新規ホスホラミダイトモノマー化合物の非限定的な集合を示す。各化合物の合成スキームは、関連する実施例を参照して参照され、それぞれに特定の前駆体が含まれる。精製された合成化合物を特徴付ける分析データも表１Ａに示す。これらの化合物は、本明細書でさらに詳細に記載されるように、任意の適切なポリマー特徴、例えばＳＳＲＴレポーターコード、移動制御エレメントおよび移動減速特徴を合成するために使用し得る。表１Ａはまた、合成ポリマーへの組み込み後に化合物がとると想定されるインライン構造を参照して化合物の名称を提供する。
新規のホスホラミダイトモノマーに基づく移動制御エレメント（ＴＣＥ）
本明細書で論じるように、ＳＳＲＴのＴＣＥ特徴は、測定のためにレポーターコードをナノポア開口部内に配置するように、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ移動をストールするように設計されている。本発明の新しいホスホラミダイトモノマー化合物の利用可能性により、立体障害、電気反発、およびナノポアとの優先的相互作用の１つ以上を介して移動速度を制御する、次世代ＴＣＥ構造の設計が可能になった。ポア開口部に配置された際のイオン電流の駆動力に対するＴＣＥの抵抗、およびその結果の、停止を克服し移動を再開するために必要な印加電圧（すなわち、電圧パルス）の増加は、ＴＣＥの種々の特性（およびいくつかの実施形態において、レポーターコードおよびＳＳＲＴの他のエレメント）、例えば、かさ、長さ、および／または電荷密度を調整することによってカスタマイズすることができる。重要なことに、移動速度はＴＣＥに固有の特性によって制御されるため、移動制御は、例えば可溶性オリゴヌクレオチドとの可逆的相互作用に基づくヌクレオチドハイブリダイゼーション戦略を用いる先行技術の戦略に依存する負担から解放される。
本明細書で論じるように、ＳＳＲＴのＴＣＥ特徴は、測定のためにレポーターコードをナノポア開口部内に配置するように、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ移動をストールするように設計されている。本発明の新しいホスホラミダイトモノマー化合物の利用可能性により、立体障害、電気反発、およびナノポアとの優先的相互作用の１つ以上を介して移動速度を制御する、次世代ＴＣＥ構造の設計が可能になった。ポア開口部に配置された際のイオン電流の駆動力に対するＴＣＥの抵抗、およびその結果の、停止を克服し移動を再開するために必要な印加電圧（すなわち、電圧パルス）の増加は、ＴＣＥの種々の特性（およびいくつかの実施形態において、レポーターコードおよびＳＳＲＴの他のエレメント）、例えば、かさ、長さ、および／または電荷密度を調整することによってカスタマイズすることができる。重要なことに、移動速度はＴＣＥに固有の特性によって制御されるため、移動制御は、例えば可溶性オリゴヌクレオチドとの可逆的相互作用に基づくヌクレオチドハイブリダイゼーション戦略を用いる先行技術の戦略に依存する負担から解放される。
特定の実施形態において、ＴＣＥは、分枝構造（すなわち、「分枝鎖」）で終端する適切なモノマー構成要素を使用してホスホラミダイト法を使用する固相合成によって産生されるポリマーである。分枝ホスホラミダイトは当技術分野で公知であり、例えばＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ ＣｈｅｍＧｅｎｅｓから市販されている対称および非対称の両方の分枝鎖を含む。一実施形態において、ＴＣＥ分枝鎖は対称分枝ＣＥＤホスホラミダイトであり、分枝鎖の各アームはレポーターコードに連結されている。例示的な対称化学分枝鎖には、１，２，３－Ｏ－トリス－（ホスホジエステル）－プロパン、１，３－ビス－（５－Ｏ－ホスホジエステル－ペンチルアミド）－２－Ｏ－ホスホジエステル－プロパン、および１，４，７－Ｏ－トリス－（ホスホジエステル）－ヘプタンが含まれる。
図４は、ＴＣＥがナノポアを通過したＸｐａｎｄｏｍｅｒ移動をどのように停止するかを簡略化した形で示す。ここで、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒの各ＳＳＲＴは、ＴＣＥの分枝鎖構造４９３のアームの末端でＴＣＥ４９０に連結されたレポーターコード４８５Ａおよび４８５Ｂを含む。本実施形態において、ＴＣＥ４９０は、レポーターコードの物理的かさよりも大きい物理的かさを有する構造４９５を含む。ナノポア４５０のバレルを通過するＸｐａｎｄｏｍｅｒ移動は、ＴＣＥ４９０がポア開口部に遭遇する時に停止する。特定の実施形態において、ＴＣＥのかさおよびレポーターコード（すなわち、停止部位における局所電場）の電荷密度の両方が移動停止に寄与する。休止中、レポーターコード４９５Ａは、ナノポアのバレル内に保持され、特徴的かつ検出可能な様式でポアを通過する電流の流れを遮断する。停止を克服するために、電圧パルスがシステムに印加され、これにより、ＴＣＥがポアに入り、通過するように強制される。その後、次のＴＣＥがポア開口部に遭遇するまで移動が再開する。
移動制御をカスタマイズするために、ＴＣＥのいくつかの構造特性（および特定の実施形態において、ＳＳＲＴの他の特徴）を適応させることができる。例えば、ＴＣＥの長さ、かさ、および電荷密度、ならびにナノポアのバレル内の荷電元素の空間的位置の１つ以上を改変することができる。いくつかの実施形態において、ＴＣＥのかさは、１つ以上のペンダントＰＥＧホスホラミダイトをポリマー構造に組み込むことによって増加する。例えば、ＴＣＥは、２～３０、２～２０、３～１５、または４～１４のペンダントＰＥＧホスホラミダイト化合物を組み込むことができる。他の実施形態において、ＴＣＥは、表１Ａ～Ｃに示される任意の適切な数および組み合わせのホスホラミダイト化合物を含み得る。例えば、ＴＣＥは、任意の順序で、１～１０、２～８、または２もしくは３つの異なるホスホラミダイト化合物を含んでもよく、特定の実施形態において、ホスホラミダイト化合物の少なくとも１つはペンダントＰＥＧホスホラミダイトである。特定の実施形態において、ＴＣＥ全体の長さは、２～３０、２～２０、３～１５、または４～１４のホスホラミダイト化合物を含み得る。いくつかの実施形態において、ＴＣＥの式は、（ＰＰＡ１）ｎ１（ＰＰＡ２）ｎ２で表されてもよく、式中、ＰＰＡ１および／またはＰＰＡ２は、ペンダントＰＥＧホスホラミダイト化合物を表し、ｎ１＝１～１２およびｎ２＝０～１０である。本発明者らは、この式に基づくＴＣＥが配列決定エラー（例えば、挿入または欠失イベント）を大幅に低減し、連続的なＳＳＲＴ間の単一パルス遷移を可能にすることを発見した。特定の実施形態において、ＴＣＥは、以下の配列、［（１－Ｏ－ＤＭＴ－３－Ｏ－ＰＰＡ－２Ｓ－Ｏ－ｍＰＥＧ４－プロパン（化合物１２ｂ））］ｎ１［（１－Ｏ－ＤＭＴ－３－Ｏ－ＰＰＡ－２－（４－Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ３）－１－（Ｅｔ－Ｏ－Ａｃ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ｂ）］ｎ２を有するホスホラミダイト化合物から合成されたポリマーを含み、式中、ｎ１は０～６であり、ｎ２は６～１０である。他の実施形態において、ＴＣＥは、ＵＶ放射によって検出することができる１つ以上のホスホラミダイト発色団、例えばベンゾフランまたはトリアゾール含有ＰＰＡを含む。
他の実施形態において、ＴＣＥは、３つ以上のアームを有する分岐鎖構造を含み得る。一実施形態において、ホスホラミダイト分枝鎖は末端分岐構造を有し得る。本実施形態において、分枝鎖は４つのアームを有し、そのうちの２つはレポーターコードに連結しており、２つは移動制御に寄与する。他の実施形態分枝鎖は、サイズ、極性、および安定性などの特徴を最適化するようにカスタマイズすることができる。一実施形態において、分枝鎖は、イソシアネート三量体を含む。
さらなる実施形態において、本発明のＴＣＥは、２つの分枝鎖（すなわち、「二重分枝鎖」ＴＣＥ）を含むことができ、ここで、分枝鎖は複数の非分枝ホスホラミダイトによって分離されている。分枝鎖は、対称または非対称構造であってもよい。非対称構造は、単一のエナンチオマーまたはラセミ体であり得る。さらに、ラセミ体および／または両方のエナンチオマーの組合せを、ＴＣＥの異なる位置で使用することができる。本実施形態において、各分枝鎖は、別個の移動休止イベントに寄与し、そのうちの第１の分岐鎖は、ナノポア内のレポーターコードを維持する「コード休止」と呼ぶことができ、そのうちの第２の分岐鎖は、先行するレポーターコードが検出システムによって「読み取られた」ことを示す固有の信号を生成する「クロック休止」と呼ぶことができる。
表２は、いくつかの例示的なＴＣＥ配列を示す。当業者は、本開示に基づいて、多様なＴＣＥの広範なライブラリを広範囲の試験要件に適合するように設計することができることを理解するため、本発明はこれらの特定の実施形態に限定されることを意図するものではないことを強調すべきである。特定の実施形態において、以下に示す任意のＴＣＥ配列は、Ｃ３、ベンゾフラン、またはＰＥＧ３を含む１つ以上のスペーサ化合物で、分枝鎖の遠位端で終端することができる。表２の重要点は、それらの形態の化合物をホスホラミダイトモノマーとして特定する。「ホスホラミダイト」という記述はモノマー形態の化合物にのみ適用されることが当業者には容易に明らかであり、多量体の「インライン」形態の化合物に適用される記述を表１Ａに示す。
Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ移動中の挿入および欠失イベントの速度を低下させるための方法および構築物
他の態様において、本発明は、ＳＳＲＴに設計された個別の移動減速特徴（本明細書では「Ｄセル」とも呼ばれる）と組み合わせた、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ改変による移動制御の手段を提供する。本明細書に開示されるように、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒは、合成後にアミン改変ステップを含む、いくつかの処理ステップに供される。アミン改変中、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒは無水コハク酸で処理され、これはＳＳＲＴのポリメラーゼ増強領域のスペルミン成分上の第二級アミン基（および特定の状況では、酸開裂ステップによって導入された第一級アミン基）と反応する。アミン基のスクシニル化は、負に電荷したヘミスクシネート基の導入をもたらす。スクシニル化の程度を増加させることによって、スペルミン系エンハンサー上の負荷電の程度も同様に上昇する。各スペルミンホスホラミダイト構成要素は、（＋３）の正味電荷を有し、標準的な改変反応では、個々のアミン部分それぞれの電荷を（＋１）から（－１）に変化させる。本発明者らは、スペルミン成分の正味電荷を（＋３）～（－５）の間で変化させることができるように、様々な程度のスペルミンスクシニル化を与える条件を発見した。特定の条件下では、エンハンサー領域の負電荷を増加させることが、電圧パルスの印加時のＸｐａｎｄｏｍｅｒ移動の速度を増加させるために望ましい場合がある（本明細書ではエンハンサー電気泳動と呼ばれる）。特に、この電気移動度は、配列リード中の挿入エラーのパーセンテージを減少させ、ならびに全体的な配列決定処理量を増加させることが見出されている。
他の態様において、本発明は、ＳＳＲＴに設計された個別の移動減速特徴（本明細書では「Ｄセル」とも呼ばれる）と組み合わせた、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ改変による移動制御の手段を提供する。本明細書に開示されるように、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒは、合成後にアミン改変ステップを含む、いくつかの処理ステップに供される。アミン改変中、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒは無水コハク酸で処理され、これはＳＳＲＴのポリメラーゼ増強領域のスペルミン成分上の第二級アミン基（および特定の状況では、酸開裂ステップによって導入された第一級アミン基）と反応する。アミン基のスクシニル化は、負に電荷したヘミスクシネート基の導入をもたらす。スクシニル化の程度を増加させることによって、スペルミン系エンハンサー上の負荷電の程度も同様に上昇する。各スペルミンホスホラミダイト構成要素は、（＋３）の正味電荷を有し、標準的な改変反応では、個々のアミン部分それぞれの電荷を（＋１）から（－１）に変化させる。本発明者らは、スペルミン成分の正味電荷を（＋３）～（－５）の間で変化させることができるように、様々な程度のスペルミンスクシニル化を与える条件を発見した。特定の条件下では、エンハンサー領域の負電荷を増加させることが、電圧パルスの印加時のＸｐａｎｄｏｍｅｒ移動の速度を増加させるために望ましい場合がある（本明細書ではエンハンサー電気泳動と呼ばれる）。特に、この電気移動度は、配列リード中の挿入エラーのパーセンテージを減少させ、ならびに全体的な配列決定処理量を増加させることが見出されている。
したがって、特定の実施形態において、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ処理はアミン改変ステップを含む。アミン（例えば、スペルミン）改変は、スクシニル化反応条件、例えば反応時間、温度、ｐＨ、および／または反応に使用される無水コハク酸の濃度の１つ以上を変更することによって達成され得る。他の実施形態において、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ処理は、より完全なアミンスクシニル化を達成するために、アミン改変ステップの後に１つ以上のＨＥＰＥＳ洗浄ステップをさらに含む。
他の態様において、本開示は、永久的に荷電した、例えば第三級もしくは第四級アミンおよび／またはかさ高い化合物である、１つ以上の移動減速機構または領域（「特徴」および「領域」という用語は、本文脈では互換的に使用される）を提供する。移動減速機構は、ポリメラーゼエンハンサー内またはそれに隣接する位置でＳＳＲＴに導入され得る。減速特徴は、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ改変（例えば、スクシニル化）反応中に変更されないように選択される。ＳＳＲＴの適切な位置に１つ以上の減速特徴を含めると、エンハンサーの過剰改変に起因する移動速度の増加に起因して生じる、欠失エラーのパーセント比率が減少することが見出された。理論に束縛されるものではないが、減速特徴の大部分は、ナノポア開口部に遭遇するとＸｐａｎｄｏｍｅｒ移動の速度を低下させる「摩擦」型の力を生成すると推測される。典型的には、減速特徴は、ポリメラーゼエンハンサーとレポーターコード（すなわち、エンハンサーに隣接）との間の位置でＳＳＲＴに導入される。
本発明の移動減速特徴は、表１Ａ～１Ｃに示されるホスホラミダイト化合物または市販のホスホラミダイトの任意の適切な数および組み合わせを組み込むことができる。いくつかの実施形態において、減速特徴は、１～４個の異なるモノマー単位の組み合わせを含む。他の実施形態において、減速特徴は、１つまたは２つの異なるモノマー単位を含んでもよい。減速特徴の全長は、１～１５のモノマー単位、または他の実施形態においては、４～１２もしくは６～１０のモノマー単位であり得る。表３は、代替の移動減速特徴の非限定的な例を示す。表３の重要点は、それらの形態の化合物をホスホラミダイトモノマーとして特定する。「ホスホラミダイト」という記述はモノマー形態の化合物にのみ適用されることが当業者には容易に明らかであり、多量体の「インライン」形態の化合物に適用される記載を表１Ａに示す。
レポーターコード
各ＳＳＲＴは、ＴＣＥを使用して、高いイオン電流抵抗を有するナノポアのゾーン内にレポーターコードを配置する。α溶血素では、この領域が基部である。この領域では、異なるレポーターは、異なる測定可能なレベルでイオン流を遮断するようなサイズである。レポーターは、表１Ａ～１Ｃに示されるホスホラミダイトモノマー化合物の集合および／または市販のライブラリから特定のホスホラミダイトの配列を選択することによって設計することができる。適切なモノマー化合物はまた、出願人の米国特許第１０，４５７，９７９号に開示されており、これは、ＰＥＧ３、ＰＥＧ６、およびＣ２を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
各ＳＳＲＴは、ＴＣＥを使用して、高いイオン電流抵抗を有するナノポアのゾーン内にレポーターコードを配置する。α溶血素では、この領域が基部である。この領域では、異なるレポーターは、異なる測定可能なレベルでイオン流を遮断するようなサイズである。レポーターは、表１Ａ～１Ｃに示されるホスホラミダイトモノマー化合物の集合および／または市販のライブラリから特定のホスホラミダイトの配列を選択することによって設計することができる。適切なモノマー化合物はまた、出願人の米国特許第１０，４５７，９７９号に開示されており、これは、ＰＥＧ３、ＰＥＧ６、およびＣ２を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
各成分モノマー化合物は、ナノポア内のその位置、その変位、その電荷、ナノポアとのその相互作用、その化学的および熱的環境ならびに他の要因にしたがって、正味の電流抵抗に寄与する。
レポーターコード設計は、以下を含む測定特性を平衡化することによってガイドされる：（ｉ）正規化イオン電流（Ｉ／Ｉｏ）、式中、Ｉはイオン電流であり、Ｉｏは開チャネル電流であり、（ｉｉ）イオン電流ノイズ、多状態応答、遮断、およびランダムスパイク等を含む、および／または（ｉｉｉ）制御部分の放出時間または他の方法でＴＣＥが基部入口でストールしている時間。
図５Ａ～図５Ｄは、異なるレポーターコードがどのようにして、骨格に沿って同様の電荷密度を維持するように設計され得るかを示し、一方で、それぞれの固有のモノマー成分が占める異なる体積に起因して、特徴的なレベルのポア閉塞を提供する。これらの図では、ナノポアが断面で示されており、バレルおよび前庭部が示されている。レポーターコードは、コードのホスホラミダイト成分によって導入された荷電ホスホジエステル部分を表す黒丸で簡略化された形で示されている。図５Ａは、線形コードを示し、この実施形態において「０ ＰＥＧコード」と特定されているが、本発明はそのように限定されることを意図するものではなく、例えば、特定の実施形態において、線形コードはＰＥＧ部分を含み得る。図５Ｂ、図５Ｃおよび図５Ｄは、例示的なＰＥＧ系構造、例えばペンダントＰＥＧ化合物を示す単一の分岐モノマー化合物の反復単位からどのように固有のコードを構築することができるかを示す。これらの実施形態において、３つの異なるコードの分枝部分は、ポアチャネル内で異なる体積を占め、それにより、互いに区別できる固有のシグナルを生成する。これらの実施形態において、骨格に沿った電荷密度は、各レポーターコードについて同じである。しかしながら、本明細書中でさらに論じられるように、他の実施形態において、レポーターコードは、骨格に沿って電荷密度の勾配を伴って設計され得る。
レポーターイオン電流遮断およびその二重鎖放出時間も、以下のような測定条件によって調節される、本明細書にさらに記載されるように、（ｉ）電圧、（ｉｉ）電解質、（ｉｉｉ）温度、（ｉｖ）圧力、および／または（ｖ）ｐＨ。
いくつかの実施形態において、レポーターに関連するＴＣＥもイオン電流遮断に寄与する。
測定条件の所与のセットについて、レポーターは、測定ダイナミックレンジを定義する最小および最大Ｉ／Ｉｏレベルについて設計することができる。他のレポーターは、ダイナミックレンジ内の異なるＩ／Ｉｏレベルで設計することができる。各レポーターがナノポア内で休止するとき、測定されたＩ／Ｉｏレベルは、レポータータイプを一意的に区別することができる程度に、十分に長く静止したままでなければならず、十分に低いノイズを有さなければならない。ダイナミックレンジは、低インピーダンス分子（レポーターコードポリマー）、典型的には小さな物理的断面および低い線質量密度を有するものの骨格を選択することによって最大化される。
測定条件の所与のセットについて、レポーターは、測定ダイナミックレンジを定義する最小および最大Ｉ／Ｉｏレベルについて設計することができる。他のレポーターは、ダイナミックレンジ内の異なるＩ／Ｉｏレベルで設計することができる。各レポーターがナノポア内で休止するとき、測定されたＩ／Ｉｏレベルは、レポータータイプを一意的に区別することができる程度に、十分に長く静止したままでなければならず、十分に低いノイズを有さなければならない。ダイナミックレンジは、低インピーダンス分子（レポーターコードポリマー）、典型的には小さな物理的断面および低い線質量密度を有するものの骨格を選択することによって最大化される。
表４は例示的なレポーターコードを示すが、本発明は、本明細書に開示される任意の適切な組合せおよび数のホスホラミダイト化合物を組み込んだレポーターコードを意図することは理解されたい。表４の重要点は、それらの形態の化合物をホスホラミダイトモノマーとして特定する。「ホスホラミダイト」という記述はモノマー形態の化合物にのみ適用されることは当業者には容易に明らかであり、多量体の「インライン」形態の化合物に適用される記述を表１Ａに示す。
ＳＳＲＴおよびＸＮＴＰの合成
本明細書に開示されるように、対称的に合成されたレポーターテザー（ＳＳＲＴ）は、標準的な自動オリゴヌクレオチド合成プロトコルを使用して合成される。図６は、ＳＳＲＴ合成を簡略化した形態で示している。ステップＡでは、固体支持体上にホスホラミダイトを固定化し、ステップＢにおいて、ホスホラミダイトカップリングを使用して、支持体上のホスホラミダイトモノマーを重合させ、ステップＣでは、対称分枝鎖を成長中のＳＳＲＴ構造に付加し、ステップＤにおいて、対称的なホスホラミダイト分枝鎖は、対称的分枝鎖の各アームから重合させ、ステップＥにおいて、クリック反応を介したｄＮＴＰ－２ｃへのＳＳＲＴのコンジュゲーションを可能にする末端アジド基を付加し、ステップＦにおいて、ＳＳＲＴは、その最終形態で基質から放出される。
本明細書に開示されるように、対称的に合成されたレポーターテザー（ＳＳＲＴ）は、標準的な自動オリゴヌクレオチド合成プロトコルを使用して合成される。図６は、ＳＳＲＴ合成を簡略化した形態で示している。ステップＡでは、固体支持体上にホスホラミダイトを固定化し、ステップＢにおいて、ホスホラミダイトカップリングを使用して、支持体上のホスホラミダイトモノマーを重合させ、ステップＣでは、対称分枝鎖を成長中のＳＳＲＴ構造に付加し、ステップＤにおいて、対称的なホスホラミダイト分枝鎖は、対称的分枝鎖の各アームから重合させ、ステップＥにおいて、クリック反応を介したｄＮＴＰ－２ｃへのＳＳＲＴのコンジュゲーションを可能にする末端アジド基を付加し、ステップＦにおいて、ＳＳＲＴは、その最終形態で基質から放出される。
一実施形態において、ＳＳＲＴ合成は、１）固体支持制御ポアガラスビーズ上でのＳＳＲＴポリマーの合成（ステップＡ～Ｄの図解に反映される）を含む４ステップ反復プロセスを利用する。このステップでは、ＭｅｒＭａｄｅ（商標）１２ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（ＢｉｏＡｕｔｏｍａｔｉｏｎから市販）を使用して、ＳＳＲＴを１μＭスケールで一度に１つのレポーター構築物を合成する。ＭｅｒＭａｄｅ（商標）配列マネージャを最初に調製し、続いてホスホラミダイトを調製する（例えば、各ホスホラミダイトの０．０６７Ｍ溶液の調製）。各ホスホラミダイトの適切なカップリング時間は、シンセサイザにプログラムされている。ＳＳＲＴ合成サイクルは、従来の４ステッププロセス、脱トリチル化（例えば、ジクロロメタン中３％ ＤＣＡの溶媒を使用する）、モノマーカップリング（例えばアセトニトリル中０．２５Ｍ ＥＴＴの溶媒を使用する）、キャッピング（例えばＴＨＦ／ルチジン／Ａｃ２Ｏ（ＣＡＰ Ａ）およびＴＨＦ中の１６％メチルイミダゾール（ＣＡＰ Ｂ）の溶媒を使用する）および酸化（例えばＴＨＦ／ピリジン／Ｈ２Ｏ中の０．０２Ｍ Ｉ２の溶媒を使用する）に基づく。ステップ２）Ｂｒをアジド（ステップＥのイラストに反映されている）で置換する手動変換、すなわち「アジド改変」による５’末端の官能化。このステップでは、合成カラムをＤＣＭ１ｍＬで洗浄し、２ｍＬチューブに移し、アジド変換溶液を調製し（ＤＭＦ中１００ｍＭヨウ化ナトリウムおよび１００ｍＭアジ化ナトリウム）、１．６ｍＬをチューブに添加し、２時間室温でインキュベーションし、次いで、支持体をＤＭＦ１ｍＬでリンスし、カラムに移し、カラムをＤＭＦ２ｍＬでリンスし、続いてＡＣＮ３ｍＬおよびＤＣＭ１ｍＬでリンスする。ステップ３）シアノエチル保護基の除去このステップでは、ＡＣＮ中で１０％ ＤＥＡ溶液を調製し、これは０．１Ｍニトロメタンスを含んでいてよく、真空で、この溶液の定常流を少なくとも１０分間カラムを通過させ、次いで、カラムをＡＣＮ２ｍＬでリンスし、続いてＤＣＭ１ｍＬでリンスする。ステップ４）固体支持体からのＳＳＲＴの切断完全脱保護（ステップＦのイラストに反映されている）。このステップでは、支持体を２ｍｌチューブに移し、１００ｍＭニトロメタンを含み得る３０％ ＮＨ４ＯＨ ５００μＬをチューブに添加し、５５℃で３０分間インキュベーションし、次いで、チューブを冷凍庫で５分間冷却し、４０％メチルアミン５００μＬをチューブに添加し、６５℃で１時間インキュベーションする。次いで、試料を冷凍庫で５分間冷却し、次いで、試料を、カラムを排水し、Ｈ２Ｏ１５ｍＬでリンスすることによって脱塩し、次いで、ＳＳＲＴを１００ｍＭ ＴＥＡＡでカラムから溶出し、定量する。
図７は、ＸＡＴＰ、ＸＣＴＰ、ＸＧＴＰおよびＸＴＴＰを形成するためのレポーター構築物として使用することができる４つの例示的なＳＳＲＴ産物を示しており、その各々は、ナノポアを通過すると固有の電子シグナルを生成するように設計されている。重要点は、最終ＳＳＲＴレポーター構築物中に存在する、これらの特定のホスホラミダイトの化学構造を示している本開示を通して使用される場合、Ｒはアジドｈｅｘを表し、Ｑはスペルミンを表し、ＤはＰＥＧ６を表し、ＸはＰＥＧ３を表し、ＬはＣ２スペーサを表し、４はペンダントＰＥＧ４を表し、Ｙは対称化学分枝鎖を表し、５はベンゾフランを表す。本実施形態において、Ｒはアジドコンジュゲート特徴を提供し、ＱＱポリマーはエンハンサー特徴を提供し、Ｙ４４４４４４４４４４４４ポリマーはＴＣＥ特徴を提供し、ＤＤＬＬＬＤＸ、ＤＤＤ４４ＬＸＸＸ、ＤＤＤ４４４４ＬＬＤＸ、およびＸＸＬ４４４４４４ＬＬＬＬＬＬＬポリマーは、４つの固有のレポーターコード特徴を提供する。
図８Ａは、銅触媒クリック反応による、ＳＳＲＴおよびｄＮＴＰ－２ｃの環状化による例示的なＸＮＴＰの形成を要約している。本開示を通して使用される「ｄＮＴＰ－２ｃ」は、ヌクレオシドの複素環部分にコンジュゲートされた１，７－オクタジイニルリンカー、およびトリホスホルアミデートのαホスホルアミデート部分にコンジュゲートされた５－ヘキシニルリンカーを含む切断可能なヌクレオシドトリホスホルアミデート類似体を指す。これは、以下を含む３ステッププロセスである：１）クリック反応、一実施形態において、ＳＳＲＴおよびｄＮＴＰ－２ｃを、０．２ｍＭ ＣｕＳＯ４／０．６ｍＭ ＴＨＰＴＡ／１．２ｍＭ ＮａＡｓｃで構成されるクリック反応溶液に添加し、３０時間インキュベートし、２）標準ＨＰＬＣ精製、および３）当技術分野で認識されている方法を使用した脱塩。ｄＮＴＰ－２ｃ化合物の構造および合成のさらなる詳細は、本出願人が発行した米国特許第１０，３０１，３４５号に開示されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。図８Ｂは、詳細な化学構造における例示的なＸＮＴＰを示す。
特定の実施形態において、ＸＮＴＰの核酸塩基は、非天然類似体、例えば、７－デアザアデニン、および７－デアザグアニン等であり得る。
移動制御のさらなる手段
Ｉ． 移動制御部分の可逆的結合による移動制御
移動制御のこの実施形態は、図９Ａおよび図９Ｂに簡略化された形態で示されている。本実施形態において、移動の速度は、ＸｐａｎｄｏｍｅｒのＴＣＥに対する可溶性移動結合部分の結合および解離によって制御される。図９Ａに示されるように、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒの第１のレポーターコードに近接した第１のＴＣＥエレメントへの第１の可溶性移動結合部分の結合は、「コード移動制御複合体」を形成する。この可逆的な相互作用は、ナノポア内の第１のレポーターコードをストール、休止または停止させ（簡潔にするために、これらの用語は、本明細書では互換的に使用される）、第１のコードに固有の電流変化を生成する。これらのコードシグナルは、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒの各モノマー単位を同定するために使用される。続いて、図９Ｂに示されるように、第１の移動結合部分が第１のＴＣＥから解離し、第１のレポーターコードが、ポアに入ったのと反対側のナノポアを通過すること、すなわち、そこから出ることが可能になる。次いで、この移動イベントは、第１のレポーターコードの遠位にあるＸｐａｎｄｏｍｅｒ中の第２のＴＣＥへの第２の移動結合部分の結合によってストールする。この第２の移動制御複合体は、本明細書では「クロック移動制御複合体」と呼ばれる。この移動の中断は、ナノポアを通る第１のコード領域の完全な移動をシグナル伝達する電流の（すなわち、「クロック信号」）の変化を生じさせる。特定の実施形態において、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒの各単位のクロックシグナルは、互いに同一であっても、またはほとんど区別できなくてもよい。当業者は、コードシグナルがそれ自体でＸｐａｎｄｏｍｅｒの配列情報を決定するのに十分であることを理解するであろう。
移動制御のさらなる手段
Ｉ． 移動制御部分の可逆的結合による移動制御
移動制御のこの実施形態は、図９Ａおよび図９Ｂに簡略化された形態で示されている。本実施形態において、移動の速度は、ＸｐａｎｄｏｍｅｒのＴＣＥに対する可溶性移動結合部分の結合および解離によって制御される。図９Ａに示されるように、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒの第１のレポーターコードに近接した第１のＴＣＥエレメントへの第１の可溶性移動結合部分の結合は、「コード移動制御複合体」を形成する。この可逆的な相互作用は、ナノポア内の第１のレポーターコードをストール、休止または停止させ（簡潔にするために、これらの用語は、本明細書では互換的に使用される）、第１のコードに固有の電流変化を生成する。これらのコードシグナルは、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒの各モノマー単位を同定するために使用される。続いて、図９Ｂに示されるように、第１の移動結合部分が第１のＴＣＥから解離し、第１のレポーターコードが、ポアに入ったのと反対側のナノポアを通過すること、すなわち、そこから出ることが可能になる。次いで、この移動イベントは、第１のレポーターコードの遠位にあるＸｐａｎｄｏｍｅｒ中の第２のＴＣＥへの第２の移動結合部分の結合によってストールする。この第２の移動制御複合体は、本明細書では「クロック移動制御複合体」と呼ばれる。この移動の中断は、ナノポアを通る第１のコード領域の完全な移動をシグナル伝達する電流の（すなわち、「クロック信号」）の変化を生じさせる。特定の実施形態において、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒの各単位のクロックシグナルは、互いに同一であっても、またはほとんど区別できなくてもよい。当業者は、コードシグナルがそれ自体でＸｐａｎｄｏｍｅｒの配列情報を決定するのに十分であることを理解するであろう。
可逆的結合パートナーの任意の適切なセットが、本発明による移動制御のために使用され得る。一実施形態において、ＴＣＥはビオチンの誘導体を含み、移動制御部分はストレプトアビジンによって提供される。本実施形態において、ビオチン誘導体は、天然ビオチンよりも低い親和性でストレプトアビジンに結合するように操作され得る。適切なビオチン誘導体の一例は、デスチオビオチン（ＤＴＢ）であり、これを図１０に示す。他の実施形態において、ビオチン－ＳＡ ＴＣＥシステムは、例えば、より弱いビオチン－ＳＡ複合体を形成する他のビオチン類似体を使用すること、および／またはより弱い複合体を形成するＳＡ変異体を使用することによって制御することができる。
ＩＩ．実行条件の調整による移動制御
ナノポアベースの検出システムで使用される種々の条件の微調整は、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ移動制御およびコード読み取りの精度を改善することが見出された。したがって、他の態様において、本開示は、以下の実行条件の１つ以上の変更によって、ナノポアを通過するポリマー移動の速度を改善する手段を提供する：
Ａ． 電圧パラメータ
本明細書に記載のナノポアベースの検出システムのシスチャンバからトランスチャンバへのイオンの流れは、「読み取り電圧」または「ベースライン電圧」と互換的に呼ばれる膜を横切る電位の印加から生じる。本発明の一実施形態において、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ移動速度は、ベースライン電圧を変更することによって調節される。いくつかの実施形態において、ベースライン電圧は、約４０ｍＶ～約１５０ｍＶの範囲内であってもよい。他の実施形態において、ベースライン電圧は、約９０ｍＶ～約１１０ｍＶの範囲内であってもよい。さらに他の実施形態において、ベースライン電圧は、約５５ｍＶ～約７５ｍＶの範囲内であってもよい。いくつかの実施形態において、レポーターコード読み取りをより高い速度で捕捉するために、より高いベースライン電圧が望ましい場合がある。
ナノポアベースの検出システムで使用される種々の条件の微調整は、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ移動制御およびコード読み取りの精度を改善することが見出された。したがって、他の態様において、本開示は、以下の実行条件の１つ以上の変更によって、ナノポアを通過するポリマー移動の速度を改善する手段を提供する：
Ａ． 電圧パラメータ
本明細書に記載のナノポアベースの検出システムのシスチャンバからトランスチャンバへのイオンの流れは、「読み取り電圧」または「ベースライン電圧」と互換的に呼ばれる膜を横切る電位の印加から生じる。本発明の一実施形態において、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ移動速度は、ベースライン電圧を変更することによって調節される。いくつかの実施形態において、ベースライン電圧は、約４０ｍＶ～約１５０ｍＶの範囲内であってもよい。他の実施形態において、ベースライン電圧は、約９０ｍＶ～約１１０ｍＶの範囲内であってもよい。さらに他の実施形態において、ベースライン電圧は、約５５ｍＶ～約７５ｍＶの範囲内であってもよい。いくつかの実施形態において、レポーターコード読み取りをより高い速度で捕捉するために、より高いベースライン電圧が望ましい場合がある。
本明細書で論じられるように、レポーターコードに近位のＴＣＥがポアの開口部に遭遇すると、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ移動は停止する。レポーターコードは、ポアに保持されたＴＣＥ構造によって提供される抵抗を克服するのに十分に強い電圧パルスが印加されるまでポア内に維持される。したがって、他の実施形態において、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ移動速度は、パルス電圧の強度を変えることによって調節される。いくつかの実施形態において、パルス電圧は、約２５０ｍＶ～約２０００ｍＶの範囲である。他の実施形態において、パルス電圧は、約５５０ｍＶ～約７００ｍＶの範囲である。同様に、電圧パルスの持続時間は、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ移動の速度に影響を及ぼし得る。いくつかの実施形態において、電圧パルスの持続時間は、約１μｓ～約５０μｓの範囲である。他の実施形態において、電圧パルスの持続時間は、約５μｓ～約１０μｓの範囲である。他の実施形態において、パルス電圧の周期性を最適化することができる。いくつかの実施形態において、周期性は、約０．５ｍｓ～約２０ｍｓの範囲である。さらに他の実施形態において、パルス電圧の周期性は、約０．５ｍｓ～約１．５ｍｓである。当業者は、最適電圧パルスの強度、持続時間、および周期性が多くの要因、例えばＴＣＥの力に依存することを理解するであろう。
Ｂ． 塩
本明細書に記載のナノポアベースの検出システムを通る電流の速度は、システムのシスおよびトランスチャンバを充填する緩衝剤の塩組成によって影響され得る。したがって、特定の実施形態において、ポアを通過するＸｐａｎｄｏｍｅｒ移動の速度は、塩組成によって調節することができる。これらの実施形態において、任意の適切な一価または二価カチオンを含む塩を利用することができる。いくつかの実施形態において、適切な塩としては、ＮＨ４Ｃｌ、ＭｇＣｌ２、ＬｉＣｌ、ＫＣｌ、ＣｓＣｌ、ＮａＣｌおよびＣａＣｌ２が挙げられるが、これらに限定されない。他の実施形態において、適切な塩には、アニオンが酢酸塩であるものが含まれる。より遅い電流が望ましい条件では、より低いイオン移動度を有する塩、例えばＬｉＣｌが有利であり得る。いくつかの実施形態において、トランスチャンバは、２ＭのＮＨ４Ｃｌと、約０．２Ｍの適切なモル濃度を有する第２の任意の塩とを含み、シスチャンバは、約０．４Ｍ～約１Ｍの範囲の適切なモル濃度を有するＮＨ４Ｃｌと、約０．２Ｍ～約０．８Ｍの範囲の適切なモル濃度を有する第２の任意の塩とを含む。他の実施形態において、これらの範囲外にある他のモル濃度および／または塩の他の組合せが望ましい場合がある。
Ｃ． カオトロピック剤
特定の他の態様において、本発明のナノポアベースの検出システムのシスチャンバは、個々のポリマー分析物、例えば線状化Ｘｐａｎｄｏｍｅｒの移動を改善するための１つ以上のカオトロピック剤を含み得る。任意の適切なカオトロピック剤、例えば尿素および／またはグアニジン塩酸塩（ＧｕＣｌ）を使用してもよい。いくつかの実施形態において、シスチャンバの緩衝剤組成物は、約２００ｍＭ～約２Ｍの範囲のＧｕＣｌおよび／または尿素を含む。
Ｄ． 浸透勾配
他の態様において、本発明は、浸透圧勾配が膜を横切って確立され、ポアを通過するＸｐａｎｄｏｍｅｒ移動の速度に影響を及ぼすナノポアベースの検出システムを提供する。理論に束縛されるものではないが、塩および／または他の添加剤の濃度がシスチャンバと比較してトランスチャンバ内でより高い場合、勾配が、ナノポアに向かう水の流れを生成し、それによってポアに向かってＸｐａｎｄｏｍｅｒを引き込むと仮定される。これらの条件下では、より低い実行電圧でイベント周波数（例えば、コード読み取り）の割合の増加が観察され得る。したがって、いくつかの実施形態において、実行条件は、膜を横切る約５０％の浸透圧勾配の確立を含み、例えば、シスチャンバでは約１Ｍの濃度の塩（および／または他の添加剤）、およびトランスチャンバでは約２Ｍの濃度の塩（および／または他の添加剤）である。さらなる実施形態において、任意の他の適切な浸透圧勾配を使用することができる。
Ｅ． 溶媒
特定の溶媒は、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒの溶解度を高め、ナノポアを通過する速度移動を改善することができることが見出された。したがって、特定の実施形態において、本発明の試料緩衝剤は、１つ以上の有機溶媒を含む。適切な溶媒としては、約１％～約２５％の範囲で使用される、３－メチル－２－オキサゾリジノン（ＭＯＡ）、ＤＭＦ、ＡＣＮ、ＤＭＳＯおよびＮＭＰが挙げられるが、これらに限定されない。
Ｆ． 緩衝剤、添加剤、および他の実行条件
本発明での使用に適した緩衝剤としては、約７．４のｐＨを有する２０ｍＭ～１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、および約２５ｍＭ～約２５０ｍＭの範囲のモル濃度および約６～約１０の範囲のｐＨを有するビス－トリス－プロパン緩衝剤が挙げられるが、これらに限定されない。他の態様において、本発明の緩衝剤は、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ移動の速度を高めるために、ヘキサン酸ナトリウム（ＮａＨｅｘ）等の特定の界面活性剤添加剤を含み得る。特定の実施形態において、本発明の試料緩衝剤は、約２０ｍＭのＮａＨｅｘを含む。他の適切な添加剤としては、ＥＤＴＡおよびレドックス試薬等の安定剤が挙げられるが、これらに限定されない。任意の緩衝剤の粘度を、ＰＥＧ、グリセロール、フィコール等の添加剤によって変更することができる。
Ｂ． 塩
本明細書に記載のナノポアベースの検出システムを通る電流の速度は、システムのシスおよびトランスチャンバを充填する緩衝剤の塩組成によって影響され得る。したがって、特定の実施形態において、ポアを通過するＸｐａｎｄｏｍｅｒ移動の速度は、塩組成によって調節することができる。これらの実施形態において、任意の適切な一価または二価カチオンを含む塩を利用することができる。いくつかの実施形態において、適切な塩としては、ＮＨ４Ｃｌ、ＭｇＣｌ２、ＬｉＣｌ、ＫＣｌ、ＣｓＣｌ、ＮａＣｌおよびＣａＣｌ２が挙げられるが、これらに限定されない。他の実施形態において、適切な塩には、アニオンが酢酸塩であるものが含まれる。より遅い電流が望ましい条件では、より低いイオン移動度を有する塩、例えばＬｉＣｌが有利であり得る。いくつかの実施形態において、トランスチャンバは、２ＭのＮＨ４Ｃｌと、約０．２Ｍの適切なモル濃度を有する第２の任意の塩とを含み、シスチャンバは、約０．４Ｍ～約１Ｍの範囲の適切なモル濃度を有するＮＨ４Ｃｌと、約０．２Ｍ～約０．８Ｍの範囲の適切なモル濃度を有する第２の任意の塩とを含む。他の実施形態において、これらの範囲外にある他のモル濃度および／または塩の他の組合せが望ましい場合がある。
Ｃ． カオトロピック剤
特定の他の態様において、本発明のナノポアベースの検出システムのシスチャンバは、個々のポリマー分析物、例えば線状化Ｘｐａｎｄｏｍｅｒの移動を改善するための１つ以上のカオトロピック剤を含み得る。任意の適切なカオトロピック剤、例えば尿素および／またはグアニジン塩酸塩（ＧｕＣｌ）を使用してもよい。いくつかの実施形態において、シスチャンバの緩衝剤組成物は、約２００ｍＭ～約２Ｍの範囲のＧｕＣｌおよび／または尿素を含む。
Ｄ． 浸透勾配
他の態様において、本発明は、浸透圧勾配が膜を横切って確立され、ポアを通過するＸｐａｎｄｏｍｅｒ移動の速度に影響を及ぼすナノポアベースの検出システムを提供する。理論に束縛されるものではないが、塩および／または他の添加剤の濃度がシスチャンバと比較してトランスチャンバ内でより高い場合、勾配が、ナノポアに向かう水の流れを生成し、それによってポアに向かってＸｐａｎｄｏｍｅｒを引き込むと仮定される。これらの条件下では、より低い実行電圧でイベント周波数（例えば、コード読み取り）の割合の増加が観察され得る。したがって、いくつかの実施形態において、実行条件は、膜を横切る約５０％の浸透圧勾配の確立を含み、例えば、シスチャンバでは約１Ｍの濃度の塩（および／または他の添加剤）、およびトランスチャンバでは約２Ｍの濃度の塩（および／または他の添加剤）である。さらなる実施形態において、任意の他の適切な浸透圧勾配を使用することができる。
Ｅ． 溶媒
特定の溶媒は、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒの溶解度を高め、ナノポアを通過する速度移動を改善することができることが見出された。したがって、特定の実施形態において、本発明の試料緩衝剤は、１つ以上の有機溶媒を含む。適切な溶媒としては、約１％～約２５％の範囲で使用される、３－メチル－２－オキサゾリジノン（ＭＯＡ）、ＤＭＦ、ＡＣＮ、ＤＭＳＯおよびＮＭＰが挙げられるが、これらに限定されない。
Ｆ． 緩衝剤、添加剤、および他の実行条件
本発明での使用に適した緩衝剤としては、約７．４のｐＨを有する２０ｍＭ～１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、および約２５ｍＭ～約２５０ｍＭの範囲のモル濃度および約６～約１０の範囲のｐＨを有するビス－トリス－プロパン緩衝剤が挙げられるが、これらに限定されない。他の態様において、本発明の緩衝剤は、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ移動の速度を高めるために、ヘキサン酸ナトリウム（ＮａＨｅｘ）等の特定の界面活性剤添加剤を含み得る。特定の実施形態において、本発明の試料緩衝剤は、約２０ｍＭのＮａＨｅｘを含む。他の適切な添加剤としては、ＥＤＴＡおよびレドックス試薬等の安定剤が挙げられるが、これらに限定されない。任意の緩衝剤の粘度を、ＰＥＧ、グリセロール、フィコール等の添加剤によって変更することができる。
他の態様において、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒの移動速度は温度によって調節され得る。いくつかの実施形態において、実行温度は、約４℃～約４０℃の範囲であり得る。他の実施形態において、実行温度は、約１６℃～約２２℃の範囲であり得る。
切断可能な伸長オリゴヌクレオチド
他の態様において、本開示は、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ合成のための切断可能な伸長オリゴヌクレオチド（ＥＯ）を提供する。切断可能な設計特徴により、合成後およびナノポア分析前に、ＥＯをＸｐａｎｄｏｍｅｒから除去する、すなわち、切断することが可能になっている。この機能性は、ナノポアを通過してポリヌクレオチド配列を移動させることが望ましくない場合に利点を提供する。Ｘｐａｎｄｏｍｅｒの合成、処理およびナノポア配列分析は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる出願人のＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／６７７６３号に記載されているように実施される。
他の態様において、本開示は、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ合成のための切断可能な伸長オリゴヌクレオチド（ＥＯ）を提供する。切断可能な設計特徴により、合成後およびナノポア分析前に、ＥＯをＸｐａｎｄｏｍｅｒから除去する、すなわち、切断することが可能になっている。この機能性は、ナノポアを通過してポリヌクレオチド配列を移動させることが望ましくない場合に利点を提供する。Ｘｐａｎｄｏｍｅｒの合成、処理およびナノポア配列分析は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる出願人のＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／６７７６３号に記載されているように実施される。
切断可能な伸長オリゴヌクレオチドの一実施形態を図１１に簡略化した形態で示す。ＥＯの３’末端は、ここでは「Ｐ－ＮＨ」によって表される切断可能な結合、例えば酸切断可能なホスホルアミデート結合を含むように改変される。切断可能なリンカーによってＥＯに結合した核酸塩基は、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ合成のための遊離３’ヒドロキシル基を提供し、その方向性は破線矢印によって示される。同じ核酸塩基の塩基部分は、ナノポア移動に必要な他の特徴、例えば本明細書で「ペンダントリーダー配列」とも呼ばれるリーダー基を提供するように改変される。したがって、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒを形成するためのＥＯの伸長後、酸処理によりオリゴヌクレオチドプライマーが放出され、一方、リーダー基および他の連結された特徴はＸｐａｎｄｏｍｅｒと会合したままである。好都合なことに、本発明者らは、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ合成が、切断可能な伸長オリゴ上へのペンダントリーダー配列の付加によって影響されないことを見出した。
ラチェット
当技術分野で実施されているナノポアベースの検出システムの１つの欠点は、ＤＣ電圧の連続印加中に起こる電解質枯渇に起因する経時的な電流の枯渇である。例えば、電解質回路がフェロシアン化物－フェリシアン化物酸化還元対に基づく場合、ナノポアアレイ内の各ウェルは限られた体積を有し、したがって限られた数のこれらの酸化還元イオン種を含む。ＤＣ電圧下では、一方の種が他方を変換し、電流の低下を引き起こす。電流枯渇のこの問題を克服し、経時的によりバランスのとれた電流を維持するために、本開示は、代わりに電圧印加の交流（ＡＣ）パターンに依存するナノポアベースの検出システムを用いてポリマー分析物を検出する手段を提供する。このパターンは、本明細書では「ラチェット」と呼ばれる。ラチェットの一般化された概略図を図１２に示す。図１２の上部パネルは、電圧印加の例示的なパターンを示し、本実施形態において、＋７０ｍＶの「順方向」読み取り電圧が印加され、その中間で、本システムは、＋５００ｍＶの短い（５μｓ）パルス電圧を受ける。次いで、「順方向」読み取り電圧の後に、－７０ｍＶの「逆方向」読取り電圧が続き、ポリマー分析物全体がナノポアを通過するまで、＋７０ｍＶの順方向読取り／５００ｍＶパルス／＋７０ｍＶの順方向読取り／－７０ｍＶの逆方向読取りのこのサイクルが繰り返される。ラチェットプロトコルの１つの重要な利点は、各順方向読み出し－逆方向読み取りサイクル中に電解質分布が補充されることである。
当技術分野で実施されているナノポアベースの検出システムの１つの欠点は、ＤＣ電圧の連続印加中に起こる電解質枯渇に起因する経時的な電流の枯渇である。例えば、電解質回路がフェロシアン化物－フェリシアン化物酸化還元対に基づく場合、ナノポアアレイ内の各ウェルは限られた体積を有し、したがって限られた数のこれらの酸化還元イオン種を含む。ＤＣ電圧下では、一方の種が他方を変換し、電流の低下を引き起こす。電流枯渇のこの問題を克服し、経時的によりバランスのとれた電流を維持するために、本開示は、代わりに電圧印加の交流（ＡＣ）パターンに依存するナノポアベースの検出システムを用いてポリマー分析物を検出する手段を提供する。このパターンは、本明細書では「ラチェット」と呼ばれる。ラチェットの一般化された概略図を図１２に示す。図１２の上部パネルは、電圧印加の例示的なパターンを示し、本実施形態において、＋７０ｍＶの「順方向」読み取り電圧が印加され、その中間で、本システムは、＋５００ｍＶの短い（５μｓ）パルス電圧を受ける。次いで、「順方向」読み取り電圧の後に、－７０ｍＶの「逆方向」読取り電圧が続き、ポリマー分析物全体がナノポアを通過するまで、＋７０ｍＶの順方向読取り／５００ｍＶパルス／＋７０ｍＶの順方向読取り／－７０ｍＶの逆方向読取りのこのサイクルが繰り返される。ラチェットプロトコルの１つの重要な利点は、各順方向読み出し－逆方向読み取りサイクル中に電解質分布が補充されることである。
図１２の底部パネルは、ラチェット中にポリマー移動の方向性がどのように変化するかを示す。この実施形態において、ポリマー分析物の各単位は、移動制御エレメント、例えばＴＣＥ１２１５によって分離された２つの同一のレポーターコード（例えば、１２１０Ａおよび１２１０Ｂ）を含む。図１２に示すように、＋７０ｍＭの順方向電圧の印加は、レポーターコード１２１０ＡがＴＣＥ１２１５によって誘導される移動の休止によってポア内で停止するまで、膜のシス側からトランス側へのポアを通過するポリマー移動をもたらす。停止したレポーターコード１２１０Ａによるポアを通る電流の変化は、シグナル「Ｌ１＋」として読み取られる。５００ｍＶパルスを印加すると、ＴＣＥ１２１５およびレポーターコード１２１０Ｂがポアを通過する。５μｓのパルスに続いて、読み取り電圧は＋７０ｍＶに戻り、その後、連続している次のレポーターコード１２２０Ａが、その対応するＴＣＥ １２２５によってポア内で停止する。レポーターコード１２２０Ａによるポアを通る電流の変化は、シグナル「Ｌ２＋」として読み取られる。次に、－７０ｍＭの逆方向読み取り電圧をシステムに印加することによって電圧を反転させ、ポリマー移動の方向を反転させる。この期間中、レポーターコード１２２０Ａは、ポアを通って膜のシス側に押し戻される。移動は、ＴＣＥ １２１５がポアに遭遇するまで進行し、移動が停止すると、レポーターコード１２１０Ｂをポアに配置することで、レベル「Ｌ１－」として測定される電流の変化が生じる。次に、電圧を＋７０ｍＭの順方向実行電圧に戻し、その後、ポリマー移動の方向は、ＴＣＥ１２２５のＩＴＣ効果に起因して停止が起こるまでシス－トランス方向に逆転し、これによりレポーターコード１２２０Ａがポア内に配置される。結果として生じる電流の変化は、レベル「Ｌ２＋」として読み取られる。このラチェットプロトコルの間、ポリマー中の各単位を特徴付けるレポーターコードは３回読み取られる（レポーターコード「Ａ」は２回読み取られ、レポーターコード「Ｂ」は１回読み取られる）。この冗長性は、配列リードの品質管理の手段を提供し、得られる配列データの精度を改善する。挿入および欠失エラーは、予測されるパターンからの逸脱、例えばＬ１＋／Ｌ２＋／Ｌ１－／Ｌ２＋として容易に識別することができる。
図１２に示されているラチェットパターンは、順方向読み出し電圧の「中央」の間に印加されるパルス電圧を示しているが、パルスの他のパターンも本発明によって企図される。例えば、いくつかの実施形態において、パルスは、順方向読み取り電圧の印加の前に印加されてもよく、他の実施形態において、パルスは、逆方向読み取り電圧の印加の直前に、順方向読み取り電圧の終わりに印加されてもよい。
他の実施形態において、ラチェットは、パルスによる電流枯渇および異なるレポーターコードの抵抗性の非対称性の一方または両方を補償または補正する手段を提供する。例えば、いくつかの実施形態において、順方向読み取り電圧の間に印加されるパルスに起因する電流損失を補償するために逆方向読み出し電圧を増加させることができる。逆方向読み出し電圧のパーセント増加はまた、異なるレポーターコードが異なる固有抵抗を有するときに電流を平衡化するように調整され得る。
ラチェットスキームの他の変形例では、順方向、電圧、パルス電圧、および逆方向電圧の順序を変更することができる。例えば、一実施形態において、ラチェットサイクルは、以下のように実行することができる：（順方向読み出し電圧）、（順方向読み出し電圧）、（逆方向読み出し電圧）。他の実施形態において、ラチェットサイクルは、以下のように実行することができる：（順方向リード）ｎ（逆方向リード）ｎ（式中、「ｎ」は、ナノポアによって測定されるポリマー中のモノマー単位の総数を表す）。
関連するアイデアでは、ＤＮＡがその全長に沿ってナノポア内で読み取られ、停止され、次いで反転すると、電圧極性が他の方向に読み取られ得る「フロッシング」が提案された（例えば、Ｋａｓｉａｎｏｗｉｃｚ，Ｊｏｈｎ Ｊ．「Ｎａｎｏｐｏｒｅｓ：Ｆｌｏｓｓｉｎｇ ｗｉｔｈ ＤＮＡ」Ｎａｔｕｒｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ３，ｎｏ．６（２００４）：３５５－５６．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｎｍａｔ１１４３を参照されたい）。ＤＮＡポリマーは同期的に捕捉または停止されないが、ラチェットはこれらの時間スケールでは連続的な順方向プロセスであるため、これはアレイ内ではあまり効率的でない方法である。
ＳＢＸに基づく診断方法およびキット
他の態様において、本発明は、固形組織または体液であり得る標的試料中の遺伝子変更／変異の検出および診断のための方法およびキットを開示する。遺伝子変化は、生殖系列または体細胞変異のいずれかであり得る。本発明は、癌、自己免疫疾患、臓器移植拒絶、遺伝的胎児異常、病原体、および他の適切な症状に関連する検出および診断に使用することができる。
他の態様において、本発明は、固形組織または体液であり得る標的試料中の遺伝子変更／変異の検出および診断のための方法およびキットを開示する。遺伝子変化は、生殖系列または体細胞変異のいずれかであり得る。本発明は、癌、自己免疫疾患、臓器移植拒絶、遺伝的胎児異常、病原体、および他の適切な症状に関連する検出および診断に使用することができる。
材料および方法
示されている略語を有する以下の材料は、特段明記しない限り、米国の言及されている供給元から入手した。ＴＣＩ Ａｍｅｒｉｃａ（ポートランド、オレゴン州）製の２－フェニル－１，３－ジオキサン－５－オール、ＴＢＤＰＳ－Ｃｌ（ｔ－ブチルジフェニルクロロシラン）、ＤＭＡＰ（４－ジメチルアミノピリジン）、（Ｒ）－（＋）－グリシドール、（＋）－２，３－Ｏ－イソプロピリデン－Ｌ－トレイトール、イソソルビド、４，４’－ビス（ヒドロキシメチル）－２，２’－ビピリジン、ＴＢＴＡ（トリス［（１－ベンジル－１ Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－イル）メチル］アミン）。ＮａＨ（水素化ナトリウム）、ＭｅＯＨ（メタノール）、トルエン、ＴＨＦ（テトラヒドロフラン）、ＴＢＡＦ（フッ化テトラブチルアンモニウム）、ＤＣＭ（ジクロロメタン）、ＨＣｌ（濃塩酸）、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、アスコルビン酸Ｎａ（アスコルビン酸ナトリウム）、重炭酸ナトリウム、硫酸銅、プロパルギルマロン酸ジメチル、水素化ホウ素リチウムおよび酢酸をＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（ミズーリ州セントルイス）から入手した。ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ウィルミントン、マサチューセッツ州）製のＤＭＴ－Ｃｌ（４，４’－ジメトキシトリチルクロリド）およびＰＰＡ－Ｃｌ（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルアミノシアノエチルホスホナミドクロリド）。ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（ビレリカ、マサチューセッツ州）製のＴＥＡ（トリエチルアミン）、ヘキサン、酢酸エチル、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ジエチルエーテル。ｍ－ＰＥＧ４－Ｔｏｓは、ｍ－ＰＥＧ４－ＯＨ（カタログ番号ＢＰ－２３７４２）から作製した。フロ［３，２－ｃ］ピリジン－４（５ｈ）－オン（Ｃｏｍｂｉ－Ｂｌｏｃｋ、サンディエゴ、カリフォルニア州）。
示されている略語を有する以下の材料は、特段明記しない限り、米国の言及されている供給元から入手した。ＴＣＩ Ａｍｅｒｉｃａ（ポートランド、オレゴン州）製の２－フェニル－１，３－ジオキサン－５－オール、ＴＢＤＰＳ－Ｃｌ（ｔ－ブチルジフェニルクロロシラン）、ＤＭＡＰ（４－ジメチルアミノピリジン）、（Ｒ）－（＋）－グリシドール、（＋）－２，３－Ｏ－イソプロピリデン－Ｌ－トレイトール、イソソルビド、４，４’－ビス（ヒドロキシメチル）－２，２’－ビピリジン、ＴＢＴＡ（トリス［（１－ベンジル－１ Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－イル）メチル］アミン）。ＮａＨ（水素化ナトリウム）、ＭｅＯＨ（メタノール）、トルエン、ＴＨＦ（テトラヒドロフラン）、ＴＢＡＦ（フッ化テトラブチルアンモニウム）、ＤＣＭ（ジクロロメタン）、ＨＣｌ（濃塩酸）、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、アスコルビン酸Ｎａ（アスコルビン酸ナトリウム）、重炭酸ナトリウム、硫酸銅、プロパルギルマロン酸ジメチル、水素化ホウ素リチウムおよび酢酸をＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（ミズーリ州セントルイス）から入手した。ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ウィルミントン、マサチューセッツ州）製のＤＭＴ－Ｃｌ（４，４’－ジメトキシトリチルクロリド）およびＰＰＡ－Ｃｌ（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルアミノシアノエチルホスホナミドクロリド）。ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（ビレリカ、マサチューセッツ州）製のＴＥＡ（トリエチルアミン）、ヘキサン、酢酸エチル、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ジエチルエーテル。ｍ－ＰＥＧ４－Ｔｏｓは、ｍ－ＰＥＧ４－ＯＨ（カタログ番号ＢＰ－２３７４２）から作製した。フロ［３，２－ｃ］ピリジン－４（５ｈ）－オン（Ｃｏｍｂｉ－Ｂｌｏｃｋ、サンディエゴ、カリフォルニア州）。
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を、１０ｍｌのチタンポンプヘッドを有する２つのポンプ（ＰｒｏＳｔａｒ ２１０ Ｓｏｌｖｅｎｔ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｍｏｄｕｌｅ）、カラムオーブン（ＰｒｏＳｔａｒ ５１０ Ａｉｒ Ｏｖｅｎ）、２９２ ｎｍに設定されたＵＶ検出器（ＰｒｏＳｔａｒ ３２０ ＵＶ／Ｖｉｓ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）からなるＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（サンタクララ、カリフォルニア州）製のＰｒｏＳｔａｒ Ｈｅｌｉｘ（商標）ＨＰＬＣシ基部で行った。このシステムは、Ｓｔａｒ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（バージョン６．４１）によって制御される。使用したカラムは、いずれもＩｍｔａｋｔ ＵＳＡ（オレゴン州ポートランド）製のＣａｄｅｎｚａ Ｇｕａｒｄ Ｃｏｌｕｍｎ Ｓｙｓｔｅｍ ＣＤ－Ｃ１８（２．０ｍｍ×５ｍｍ）であった。使用される緩衝剤は、緩衝剤Ａ（１００ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム、ｐＨ ７．０）および緩衝剤Ｂ（９５％体積アセトニトリルを含む１００ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム、ｐＨ ７．０）である。自動固相ホスホラミダイト合成は、ＭｅｒＭａｄｅ（商標）１２シンセサイザ（Ｂｉｏａｕｔｏｍａｔｉｏｎ Ｃｏｒｐ．、プラノ、テキサス州）で行った。ＭｅｒＭａｄｅ（商標）の合成溶液は、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（スターリング、ＶＡ）から購入した。
実施例１
ラセミ体２－（３，６－ジオキサヘプチルオキシ）－１，３－プロパンジオールのＤＭＴホスホラミダイトの合成
ペンダントコード２－グリセリルＰＥＧ－２ホスホラミダイト［ラセミ体］
２－フェニル－１，３－ジオキサン－５－オール（１，２．７ ｇ，１５ｍｍｏｌ）を３０ｍＬの無水ＴＨＦに溶解した。水素化ナトリウム（１．０８ｇ、２７ｍｍｏｌ）を添加してアルコキシドを生成した。バブリングが停止したら、ｍＰＥＧ４－Ｔｏｓ（４．９４ｇ、１８ｍｍｏｌ）をＴＨＦ １０ｍＬに溶解し、少しずつ添加した。反応物を４０℃にし、撹拌しながら３時間インキュベーションし、次いで、室温に一晩下げた。過剰のＮａＨをＭｅＯＨ １ｍＬでクエンチし、次いで、水で希釈し、ＤＣＭで抽出した。合わせた有機層を減圧下で濃縮した。残渣をトルエンに再懸濁し、残りの塩から分離し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、２を収率７３％で得た。
ラセミ体２－（３，６－ジオキサヘプチルオキシ）－１，３－プロパンジオールのＤＭＴホスホラミダイトの合成
ペンダントコード２－グリセリルＰＥＧ－２ホスホラミダイト［ラセミ体］
２－フェニル－１，３－ジオキサン－５－オール（１，２．７ ｇ，１５ｍｍｏｌ）を３０ｍＬの無水ＴＨＦに溶解した。水素化ナトリウム（１．０８ｇ、２７ｍｍｏｌ）を添加してアルコキシドを生成した。バブリングが停止したら、ｍＰＥＧ４－Ｔｏｓ（４．９４ｇ、１８ｍｍｏｌ）をＴＨＦ １０ｍＬに溶解し、少しずつ添加した。反応物を４０℃にし、撹拌しながら３時間インキュベーションし、次いで、室温に一晩下げた。過剰のＮａＨをＭｅＯＨ １ｍＬでクエンチし、次いで、水で希釈し、ＤＣＭで抽出した。合わせた有機層を減圧下で濃縮した。残渣をトルエンに再懸濁し、残りの塩から分離し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、２を収率７３％で得た。
ベンジリジン保護２ｂ（３．０５ｇ、１０．８ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ １０ｍＬに溶解し、ＨＣｌ（０．２ｍＬ、２．３ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を２０分間インキュベーションし、次いで、重炭酸ナトリウム（２００ｍｇ）で中和し、減圧下で乾燥させた。残渣をＤＣＭに再懸濁し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、ジオール３を収率７２％で得た。
ジオール３（１．５２ｇ、７．８ｍｍｏｌ）を２０ｍＬのＤＣＭおよびＴＥＡ（２．１７ｍＬ、１５．６ｍｍｏｌ）に溶解した。ＤＣＭ １０ｍＬの中のＤＭＴ－Ｃｌ（１．８５ｇ、５．４６ｍｍｏｌ）の溶液を９０分間にわたって少しずつ添加して、モノトリチル化を最大にした。ＭｅＯＨ（１ｍＬ）を添加し、反応物を減圧下で乾燥させた。残渣をトルエンに再懸濁し、塩から分離し、次いで、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、モノ－トリチル生成物４を収率４８％で得、同時に出発ジオールを回収した。
モノトリチル４（１．８４ｇ、３．７ｍｍｏｌ）を１０ｍＬのＤＣＭおよびＴＥＡ（１．０３ｍＬの７．４ｍｍｏｌ）に溶解した。ＰＰＡ－Ｃｌ（１．０５ｇ、４．４ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を１５分間インキュベーションした。反応物を減圧下で乾燥させ、１％ ＴＥＡを含むトルエンに再懸濁し、次いで、フラッシュクロマトグラフィーによって精製した。ホスホラミダイト５（２．０３ｇ、２．９ｍｍｏｌ）を収率７９％で得、１Ｈおよび３１ Ｐ ＮＭＲによって確認した。
実施例２
エナンチオマー２－（３，６－ジオキサヘプチルオキシ）－１，３－プロパンジオール（１２ｂ）のＤＭＴホスホラミダイト（ペンダントコード２－グリセリルＰＥＧ－２ホスホラミダイト［エナンチオマー］の合成
２，３－イソプロピリデン－ｓｎ－グリセロール６を無水ＤＣＭおよびＴＥＡに溶解した。ＤＭＡＰおよびＴＢＤＰＳ－Ｃｌを添加した。反応物を水からＤＣＭで抽出し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、生成物７を得た。
エナンチオマー２－（３，６－ジオキサヘプチルオキシ）－１，３－プロパンジオール（１２ｂ）のＤＭＴホスホラミダイト（ペンダントコード２－グリセリルＰＥＧ－２ホスホラミダイト［エナンチオマー］の合成
２，３－イソプロピリデン－ｓｎ－グリセロール６を無水ＤＣＭおよびＴＥＡに溶解した。ＤＭＡＰおよびＴＢＤＰＳ－Ｃｌを添加した。反応物を水からＤＣＭで抽出し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、生成物７を得た。
シリルエーテル７をＭｅＯＨに溶解し、ＨＣｌを添加した。溶液を２０分間インキュベーションし、次いで、重炭酸ナトリウムで中和し、減圧下で乾燥させた。残渣をＤＣＭに再懸濁し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、ジオール８を得た。
ジオール８をＤＣＭおよびＴＥＡに溶解した。ＤＣＭ中のＤＭＴ－Ｃｌの溶液を少しずつ添加した。ＭｅＯＨを添加し、反応物を減圧下で乾燥させた。残渣をトルエンに再懸濁し、塩から分離し、次いで、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、モノ－トリチル生成物９を得た。
第二級アルコール９を無水ＴＨＦに溶解した。水素化ナトリウムを添加してアルコキシドを生成した。バブリングが終了したら、ｍＰＥＧ４－ＴｏｓをＴＨＦに溶解し、少しずつ添加した。反応物を４０℃にし、撹拌しながら３時間インキュベートし、次いで、室温に一晩下げた。過剰のＮａＨをＭｅＯＨ １ｍＬでクエンチし、次いで、水で希釈し、ＤＣＭで抽出した。合わせた有機層を減圧下で乾燥させた。残渣をトルエンに再懸濁し、残りの塩から分離し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、１０を得た。
ｍＰＥＧ４エーテル１０ｂをＴＨＦに再懸濁し、ＴＢＡＦを添加した。反応物を減圧下で濃縮し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、１１を得た。
ＤＭＴ ＰＥＧ４アルコール１１ｂをＤＣＭおよびＴＥＡに溶解した。ＰＰＡ－Ｃｌを添加し、反応物を１５分間インキュベーションした。反応物を減圧下で乾燥させ、１％ ＴＥＡを含むトルエンに再懸濁し、次いで、フラッシュクロマトグラフィーによって精製した。ホスホラミダイト１２を単離し、１Ｈおよび３１Ｐ ＮＭＲによって確認した。
ＤＭＴ ＰＥＧ４アルコール１１ｂをＤＣＭおよびＴＥＡに溶解した。ＰＰＡ－Ｃｌを添加し、反応物を１５分間インキュベーションした。反応物を減圧下で乾燥させ、１％ ＴＥＡを含むトルエンに再懸濁し、次いで、フラッシュクロマトグラフィーによって精製した。ホスホラミダイト１２を単離し、１Ｈおよび３１Ｐ ＮＭＲによって確認した。
実施例３
エナンチオマー１－（３，６－ジオキサヘプチルオキシ）－２，３－プロパンジオール（１６）のＤＭＴホスホラミダイトの合成
ペンダントコード１－グリセリルＰＥＧ－２ホスホラミダイト
２，３－イソプロピリデン－ｓｎ－グリセロール６を無水ＴＨＦに溶解した。水素化ナトリウムを添加してアルコキシドを生成した。バブリングが終了したら、ｍＰＥＧ２－Ｔｏｓ（Ｂｒｏａｄｐｈａｒｍ、カタログ番号ＢＰ－２－９８２）をＴＨＦに溶解し、少しずつ添加した。反応物を２４時間撹拌した。過剰のＮａＨをＭｅＯＨでクエンチし、次いで、水で希釈し、ＤＣＭで抽出した。合わせた有機層を減圧下で濃縮した。残渣をトルエンに再懸濁し、残りの塩から分離し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、１３を得た。
エナンチオマー１－（３，６－ジオキサヘプチルオキシ）－２，３－プロパンジオール（１６）のＤＭＴホスホラミダイトの合成
ペンダントコード１－グリセリルＰＥＧ－２ホスホラミダイト
２，３－イソプロピリデン－ｓｎ－グリセロール６を無水ＴＨＦに溶解した。水素化ナトリウムを添加してアルコキシドを生成した。バブリングが終了したら、ｍＰＥＧ２－Ｔｏｓ（Ｂｒｏａｄｐｈａｒｍ、カタログ番号ＢＰ－２－９８２）をＴＨＦに溶解し、少しずつ添加した。反応物を２４時間撹拌した。過剰のＮａＨをＭｅＯＨでクエンチし、次いで、水で希釈し、ＤＣＭで抽出した。合わせた有機層を減圧下で濃縮した。残渣をトルエンに再懸濁し、残りの塩から分離し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、１３を得た。
ＰＥＧ２産物１３をＭｅＯＨに溶解し、ＨＣｌを添加した。溶液を２０分間インキュベーションし、次いで、重炭酸ナトリウムで中和し、減圧下で乾燥させた。残渣をＤＣＭに再懸濁し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、ジオール１４を得た。
ジオール１４をＤＣＭおよびＴＥＡに溶解した。ＤＣＭ中のＤＭＴ－Ｃｌの溶液を少しずつ添加した。ＭｅＯＨを添加し、反応物を減圧下で乾燥させた。残渣をトルエンに再懸濁し、塩から分離し、次いで、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、モノ－トリチル生成物１５を得た。
モノＤＭＴ１５をＤＣＭおよびＴＥＡに溶解した。ＰＰＡ－Ｃｌを添加し、反応物を１５分間インキュベーションした。反応物を減圧下で乾燥させ、１％ ＴＥＡを含むトルエンに再懸濁し、次いで、フラッシュクロマトグラフィーによって精製した。ホスホラミダイト１６を単離し、１Ｈおよび３１Ｐ ＮＭＲによって確認した。
実施例４
１－（５Ｈ－フロ［３，２－ｃ］ピリジン－４－オン）－２，３－プロパンジオールのＤＭＴホスホラミダイト（２０）の合成
ペンダントコード１－グリセリルヘテロ環ホスホラミダイト
（Ｒ）－（＋）－グリシドール１７をＤＣＭおよびＴＥＡに溶解した。ＤＣＭ中のＤＭＴ－Ｃｌの溶液を少しずつ添加した。ＭｅＯＨを添加し、反応物を減圧下で乾燥させた。残渣をトルエンに再懸濁し、塩から分離し、次いで、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、ＤＭＴエーテル１８を得た。
１－（５Ｈ－フロ［３，２－ｃ］ピリジン－４－オン）－２，３－プロパンジオールのＤＭＴホスホラミダイト（２０）の合成
ペンダントコード１－グリセリルヘテロ環ホスホラミダイト
（Ｒ）－（＋）－グリシドール１７をＤＣＭおよびＴＥＡに溶解した。ＤＣＭ中のＤＭＴ－Ｃｌの溶液を少しずつ添加した。ＭｅＯＨを添加し、反応物を減圧下で乾燥させた。残渣をトルエンに再懸濁し、塩から分離し、次いで、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、ＤＭＴエーテル１８を得た。
ＤＭＴエーテル１８を無水ＤＭＦに溶解した。水素化ナトリウムを添加してアルコキシドを生成した。バブリングが終了したら、フロ［３，２－ｃ］ピリジン－４（５ｈ）－オンをＴＨＦに溶解し、少しずつ添加した。反応物を１００℃にし、撹拌しながら１２時間インキュベーションした。過剰のＮａＨをＭｅＯＨでクエンチし、次いで、水で希釈し、ＤＣＭで抽出した。合わせた有機層を減圧下で濃縮した。残渣をトルエンに再懸濁し、残りの塩から分離し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、１９を得た。
第二級アルコール１９をＤＣＭおよびＴＥＡに溶解した。ＰＰＡ－Ｃｌを添加し、反応物を１５分間インキュベーションした。反応物を減圧下で乾燥させ、１％ ＴＥＡを含むトルエンに再懸濁し、次いで、フラッシュクロマトグラフィーによって精製した。ホスホラミダイト２０を単離し、１Ｈおよび３１Ｐ ＮＭＲによって確認した。
実施例５
イソソルビドのインラインコードＤＭＴホスホラミダイト（２３）の合成
ビス－第二級アルコールコード骨格
イソソルビド２１をＤＣＭおよびＴＥＡに溶解した。ＤＣＭ中のＤＭＴ－Ｃｌの溶液を少しずつ添加した。ＭｅＯＨを添加し、反応物を減圧下で乾燥させた。残渣をトルエンに再懸濁し、塩から分離し、次いで、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、モノトリチル２２を得た。
イソソルビドのインラインコードＤＭＴホスホラミダイト（２３）の合成
ビス－第二級アルコールコード骨格
イソソルビド２１をＤＣＭおよびＴＥＡに溶解した。ＤＣＭ中のＤＭＴ－Ｃｌの溶液を少しずつ添加した。ＭｅＯＨを添加し、反応物を減圧下で乾燥させた。残渣をトルエンに再懸濁し、塩から分離し、次いで、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、モノトリチル２２を得た。
モノトリチル２２をＤＣＭおよびＴＥＡに溶解した。ＰＰＡ－Ｃｌを添加し、反応物を１５分間インキュベーションした。反応物を減圧下で乾燥させ、１％ ＴＥＡを含むトルエンに再懸濁し、次いで、フラッシュクロマトグラフィーによって精製した。ホスホラミダイト２３を単離し、１Ｈおよび３１Ｐ ＮＭＲによって確認した。
実施例６
ビピリジルのインラインコードＤＭＴホスホラミダイト（２６）の合成
ビス－第一級アルコールコード骨格
４，４’－ビス（ヒドロキシメチル）－２，２’－ビピリジン２４をＤＣＭおよびＴＥＡに溶解した。ＤＣＭ中のＤＭＴ－Ｃｌの溶液を少しずつ添加した。ＭｅＯＨを添加し、反応物を減圧下で乾燥させた。残渣をトルエンに再懸濁し、塩から分離し、次いで、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、モノトリチル２５を得た。
ビピリジルのインラインコードＤＭＴホスホラミダイト（２６）の合成
ビス－第一級アルコールコード骨格
４，４’－ビス（ヒドロキシメチル）－２，２’－ビピリジン２４をＤＣＭおよびＴＥＡに溶解した。ＤＣＭ中のＤＭＴ－Ｃｌの溶液を少しずつ添加した。ＭｅＯＨを添加し、反応物を減圧下で乾燥させた。残渣をトルエンに再懸濁し、塩から分離し、次いで、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、モノトリチル２５を得た。
モノトリチル２５をＤＣＭおよびＴＥＡに溶解した。ＰＰＡ－Ｃｌを添加し、反応物を１５分間インキュベーションした。反応物を減圧下で乾燥させ、１％ ＴＥＡを含むトルエンに再懸濁し、次いで、フラッシュクロマトグラフィーによって精製した。ホスホラミダイト２６を単離し、１Ｈおよび３１Ｐ ＮＭＲによって確認した。
実施例７
２－アルキルトリアゾールのペンダントコードＤＭＴホスホラミダイトの合成
ＰＥＧ－２，１，３－プロパンジオール（３１ａ）ペンダントトリアゾールＰＥＧコード
プロパルギルマロン酸ジメチル２７を、ジエチルエーテル中の水素化ホウ素リチウムの冷懸濁液に滴下した。反応物を室温まで加温し、一晩インキュベーションした。反応物をメタノール、次いで水、次いで酢酸でクエンチした。溶液をエーテルで抽出し、合わせた有機層を減圧下で濃縮した。粗製物質をフラッシュクロマトグラフィーによって精製し、ジオール２８を得た。
２－アルキルトリアゾールのペンダントコードＤＭＴホスホラミダイトの合成
ＰＥＧ－２，１，３－プロパンジオール（３１ａ）ペンダントトリアゾールＰＥＧコード
プロパルギルマロン酸ジメチル２７を、ジエチルエーテル中の水素化ホウ素リチウムの冷懸濁液に滴下した。反応物を室温まで加温し、一晩インキュベーションした。反応物をメタノール、次いで水、次いで酢酸でクエンチした。溶液をエーテルで抽出し、合わせた有機層を減圧下で濃縮した。粗製物質をフラッシュクロマトグラフィーによって精製し、ジオール２８を得た。
ジオール２８をＤＣＭおよびＴＥＡに溶解した。ＤＣＭ中のＤＭＴ－Ｃｌの溶液を少しずつ添加した。ＭｅＯＨを添加し、反応物を減圧下で乾燥させた。残渣をトルエンに再懸濁し、塩から分離し、次いで、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、ＤＭＴアルコール２９を得た。
ＤＭＴアルコール２９をＤＭＳＯに溶解し、アジド（カタログ番号ＢＰ－２０９８８、Ｂｒｏａｄｐｈａｒｍ）を添加した。別個に、ＴＢＴＡをＤＭＳＯに溶解し、アスコルビン酸ナトリウムおよび硫酸銅を合わせた。ＴＢＴＡ溶液をアルキン／アジド溶液に撹拌しながら少しずつ添加した。４５分間のインキュベーション後、反応物をＥＤＴＡでクエンチした。溶液を水で希釈し、酢酸エチルで抽出し、次いで、有機層を減圧下で濃縮し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、３０を得た。
１，２，３－トリアゾール３０ａをＤＣＭおよびＴＥＡに溶解した。ＰＰＡ－Ｃｌを添加し、反応物を１５分間インキュベーションした。反応物を減圧下で乾燥させ、１％ ＴＥＡを含むトルエンに再懸濁し、次いで、フラッシュクロマトグラフィーによって精製した。ホスホラミダイト３１を単離し、１Ｈおよび３１Ｐ ＮＭＲによって確認した。
実施例８
ペンダントＰＥＧ－２、ＰＥＧ－４およびＰＥＧ－６ホスホラミダイト［異性体的に純粋］（３５ａ）の合成
１－Ｏ－ＴＢＤＰＳ－３－Ｏ－ＤＭＴｒ－プロパン－１，２，３－トリオール９（実施例２から）を無水ＴＨＦに溶解した。水素化ナトリウムを添加してアルコキシドを生成した。バブリングが終了したら、トシラート（カタログ番号ＢＰ－２１６５７、Ｂｒｏａｄｐｈａｒｍのトシル化を介して調製）を少しずつ添加した。反応物を撹拌しながら４８時間インキュベートした。過剰のＮａＨを水でクエンチし、次いで、溶液を分液漏斗に移し、酢酸エチルで抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、フィルタにかけ、減圧下で濃縮した。残渣をトルエンに再懸濁し、残りの塩から分離し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、３２を得た。
ペンダントＰＥＧ－２、ＰＥＧ－４およびＰＥＧ－６ホスホラミダイト［異性体的に純粋］（３５ａ）の合成
１－Ｏ－ＴＢＤＰＳ－３－Ｏ－ＤＭＴｒ－プロパン－１，２，３－トリオール９（実施例２から）を無水ＴＨＦに溶解した。水素化ナトリウムを添加してアルコキシドを生成した。バブリングが終了したら、トシラート（カタログ番号ＢＰ－２１６５７、Ｂｒｏａｄｐｈａｒｍのトシル化を介して調製）を少しずつ添加した。反応物を撹拌しながら４８時間インキュベートした。過剰のＮａＨを水でクエンチし、次いで、溶液を分液漏斗に移し、酢酸エチルで抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、フィルタにかけ、減圧下で濃縮した。残渣をトルエンに再懸濁し、残りの塩から分離し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、３２を得た。
アルキン３２ａをＴＨＦに再懸濁し、ＴＢＡＦを添加した。反応物を減圧下で濃縮し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、３３を得た。
ＤＭＳＯ中のアルキン３３ａの溶液に、酢酸２－アジドエチルを添加した。個別のバイアル中で、アスコルビン酸ナトリウムを水に溶解し、ＤＭＳＯ、引き続いて１Ｍ ＣｕＳＯ４を添加して触媒混合物を調製する。触媒混合物をアルキン／アジドの溶液に１０分かけて滴加する。完了したら、０．５Ｍ ＥＤＴＡでクエンチし、１５分間撹拌する。水で希釈し、酢酸エチルで３回抽出する。合わせた有機抽出物をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させる。残渣をトルエンに再懸濁し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、３４ ａを得る。
ＤＭＳＯ中のアルキン３３ａの溶液に、酢酸２－アジドエチルを添加した。個別のバイアル中で、アスコルビン酸ナトリウムを水に溶解し、ＤＭＳＯ、引き続いて１Ｍ ＣｕＳＯ４を添加して触媒混合物を調製する。触媒混合物をアルキン／アジドの溶液に１０分かけて滴加する。完了したら、０．５Ｍ ＥＤＴＡでクエンチし、１５分間撹拌する。水で希釈し、酢酸エチルで３回抽出する。合わせた有機抽出物をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させる。残渣をトルエンに再懸濁し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、３４ ａを得る。
トリアゾール３４ａをＤＣＭおよびＴＥＡに溶解した。ＰＰＡ－Ｃｌを添加し、反応物を１５分間インキュベートした。反応物を減圧下で乾燥させ、１％ ＴＥＡを含むトルエンに再懸濁し、次いで、フラッシュクロマトグラフィーによって精製した。ホスホラミダイト３５を単離し、１Ｈおよび３１Ｐ ＮＭＲによって確認した。
実施例９
ＰＥＧベースのレポーターコード（３７ｂ）の合成
生成物３３のＤＭＳＯ溶液に、２－（アセトキシメチル）－２－（アジドメチル）プロパン－１，３－ジイルジアセテート（２－（ブロモメチル）－２－（ヒドロキシメチル）－１，３－プロパンジオールをＤＭＦに溶解し、続いてＮａＮ３を添加することによって調製）を添加した。反応物を１１０℃でインキュベーションし、濃縮し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製した。生成物を単離する際に、残渣を無水酢酸と反応させ、精製した。別個のバイアル中で、アスコルビン酸ナトリウムを水に溶解し、ＤＭＳＯ、引き続いて１Ｍ ＣｕＳＯ４を添加し、触媒混合物を調製する。触媒混合物をアルキン／アジドの溶液に１０分かけて滴加する。完了したら、０．５Ｍ ＥＤＴＡでクエンチし、１５分間撹拌する。水で希釈し、酢酸エチルで３回抽出する。合わせた有機抽出物をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させる。残渣をトルエンに再懸濁し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、３６を得られた。
ＰＥＧベースのレポーターコード（３７ｂ）の合成
生成物３３のＤＭＳＯ溶液に、２－（アセトキシメチル）－２－（アジドメチル）プロパン－１，３－ジイルジアセテート（２－（ブロモメチル）－２－（ヒドロキシメチル）－１，３－プロパンジオールをＤＭＦに溶解し、続いてＮａＮ３を添加することによって調製）を添加した。反応物を１１０℃でインキュベーションし、濃縮し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製した。生成物を単離する際に、残渣を無水酢酸と反応させ、精製した。別個のバイアル中で、アスコルビン酸ナトリウムを水に溶解し、ＤＭＳＯ、引き続いて１Ｍ ＣｕＳＯ４を添加し、触媒混合物を調製する。触媒混合物をアルキン／アジドの溶液に１０分かけて滴加する。完了したら、０．５Ｍ ＥＤＴＡでクエンチし、１５分間撹拌する。水で希釈し、酢酸エチルで３回抽出する。合わせた有機抽出物をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させる。残渣をトルエンに再懸濁し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、３６を得られた。
第一級アルコール３６ｂをＤＣＭおよびＴＥＡに溶解した。ＰＰＡ－Ｃｌを添加し、反応物を１５分間インキュベートした。反応物を減圧下で乾燥させ、１％ ＴＥＡを含むトルエンに再懸濁し、次いで、フラッシュクロマトグラフィーによって精製した。ホスホラミダイト３７を単離し、１Ｈおよび３１Ｐ ＮＭＲによって確認した。
実施例１０
ＰＥＧベースのレポーターコード（４０）の合成
１－Ｏ－ＴＢＤＰＳ－３－Ｏ－ＤＭＴｒ－プロパン－１，２，３－トリオール９（実施例２から）を無水ＴＨＦに溶解した。水素化ナトリウムを添加してアルコキシドを生成した。バブリングが終了したら、トシラート（カタログ番号ＢＰ－２１０３６、Ｂｒｏａｄｐｈａｒｍの逐次トシル化およびシリル保護によって調製）をＴＨＦに溶解し、少しずつ添加した。反応物を撹拌しながら一晩インキュベーションした。水で反応をクエンチし、ＤＣＭで抽出した。合わせた有機層を減圧下で乾燥させた。残渣をトルエンに再懸濁し、残りの塩から分離し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、３８を得た。
ＰＥＧベースのレポーターコード（４０）の合成
１－Ｏ－ＴＢＤＰＳ－３－Ｏ－ＤＭＴｒ－プロパン－１，２，３－トリオール９（実施例２から）を無水ＴＨＦに溶解した。水素化ナトリウムを添加してアルコキシドを生成した。バブリングが終了したら、トシラート（カタログ番号ＢＰ－２１０３６、Ｂｒｏａｄｐｈａｒｍの逐次トシル化およびシリル保護によって調製）をＴＨＦに溶解し、少しずつ添加した。反応物を撹拌しながら一晩インキュベーションした。水で反応をクエンチし、ＤＣＭで抽出した。合わせた有機層を減圧下で乾燥させた。残渣をトルエンに再懸濁し、残りの塩から分離し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、３８を得た。
ビスシリルエーテル３８をＴＨＦに再懸濁し、ＴＢＡＦを添加した。反応物を減圧下で濃縮し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製した。精製した物質をＤＣＭに再懸濁し、ＴＥＡを添加した。ＢｚＣｌを滴加した。反応物を完了まで室温で撹拌した。反応物を減圧下で濃縮し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、アルコール３９を得た。
アルコール３９をＤＣＭおよびＴＥＡに溶解した。ＰＰＡ－Ｃｌを添加し、反応物を１５分間インキュベーションした。反応物を減圧下で乾燥させ、１％ ＴＥＡを含むトルエンに再懸濁し、次いで、フラッシュクロマトグラフィーによって精製した。ホスホラミダイト４０を単離し、１Ｈおよび３１Ｐ ＮＭＲによって確認した。
実施例１１
ビス－ＰＥＧベースのレポーターコード（４５ａ～ｄおよび４７ｅ～ｉ）の合成
Ｏ，Ｏ’－ベンジリデンペンタエリスリトール（４１、カタログ番号Ｂ２６８２、ＴＣＩ）を無水ＴＨＦに溶解した。水素化ナトリウムを添加してアルコキシドを生成した。バブリングが終了したら、トシラート（カタログ番号ＢＰ－２１３９７、Ｂｒｏａｄｐｈａｒｍまたはカタログ番号ＢＰ－２１６５７、Ｂｒｏａｄｐｈａｒｍのトシル化を介して調製）をＴＨＦに溶解し、少しずつ添加した。反応物を撹拌しながら一晩インキュベーションした。過剰のＮａＨを水でクエンチし、ＤＣＭで抽出した。合わせた有機層を減圧下で乾燥させた。残渣をトルエンに再懸濁し、残りの塩から分離し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、４２ａ～ｈを得た。
ビス－ＰＥＧベースのレポーターコード（４５ａ～ｄおよび４７ｅ～ｉ）の合成
Ｏ，Ｏ’－ベンジリデンペンタエリスリトール（４１、カタログ番号Ｂ２６８２、ＴＣＩ）を無水ＴＨＦに溶解した。水素化ナトリウムを添加してアルコキシドを生成した。バブリングが終了したら、トシラート（カタログ番号ＢＰ－２１３９７、Ｂｒｏａｄｐｈａｒｍまたはカタログ番号ＢＰ－２１６５７、Ｂｒｏａｄｐｈａｒｍのトシル化を介して調製）をＴＨＦに溶解し、少しずつ添加した。反応物を撹拌しながら一晩インキュベーションした。過剰のＮａＨを水でクエンチし、ＤＣＭで抽出した。合わせた有機層を減圧下で乾燥させた。残渣をトルエンに再懸濁し、残りの塩から分離し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、４２ａ～ｈを得た。
生成物４２ａ～ｈをＭｅＯＨに溶解し、ＨＣｌを添加した。反応物を室温で一晩インキュベートし、次いで、重炭酸ナトリウムで中和した。これを減圧下で濃縮し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製して４３ａ－ｈを得た。
生成物４３ａ～ｈをＤＣＭおよびＴＥＡに溶解した。ＤＣＭ中のＤＭＴ－Ｃｌの溶液を少しずつ添加した。反応物を減圧下で乾燥させた。残渣をトルエンに再懸濁し、塩から分離し、次いで、フラッシュクロマトグラフィーによって精製して４４ ａ－ｈを得た。
生成物４４ａ～ｄをＤＣＭおよびＴＥＡに溶解した。ＰＰＡ－Ｃｌを添加し、反応物を１５分間インキュベートした。反応物を減圧下で乾燥させ、１％ ＴＥＡを含むトルエンに再懸濁し、次いで、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、ホスホラミダイト４５ａ～ｄを得た。
生成物４４（ｅ－ｈ）のＤＭＳＯ溶液に、酢酸２－アジドエチルを添加した。別個のバイアル中で、アスコルビン酸ナトリウムを水に溶解し、ＤＭＳＯ、次いで１Ｍ ＣｕＳＯ４を添加して触媒混合物を調製する。触媒混合物をアルキン／アジドの溶液に１０分かけて滴加する。完了したら、０．５Ｍ ＥＤＴＡでクエンチし、１５分間撹拌する。水で希釈し、酢酸エチルで３回抽出する。合わせた有機抽出物をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させる。残渣をトルエンに再懸濁し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、４６ｅ－ｈを得た。
生成物４６ｅ～ｈをＤＣＭおよびＴＥＡに溶解した。ＰＰＡ－Ｃｌを添加し、反応物を１５分間インキュベーションした。反応物を減圧下で乾燥させ、１％ ＴＥＡを含むトルエンに再懸濁し、次いで、フラッシュクロマトグラフィーによって精製して、ホスホラミダイト４７ｅ～ｈを得た。
実施例１２
ＰＥＧベースのレポーターコード（５２）の合成および試験
２，２－ビス（ブロモメチル）－１，３－プロパンジオール（４８、カタログ番号Ｄ１８０８、ＴＣＩ）をＤＭＦに溶解し、ＮａＮ３を添加した。反応物を１１０℃でインキュベーションして、濃縮し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、生成物４９を得た。
ＰＥＧベースのレポーターコード（５２）の合成および試験
２，２－ビス（ブロモメチル）－１，３－プロパンジオール（４８、カタログ番号Ｄ１８０８、ＴＣＩ）をＤＭＦに溶解し、ＮａＮ３を添加した。反応物を１１０℃でインキュベーションして、濃縮し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、生成物４９を得た。
ＤＭＳＯ中の４９の溶液に、安息香酸２－（２－（プロパ－２－イン－１－イルオキシ）エトキシ）エチル（市販のアルコール前駆体のベンゾイル化によって調製）を添加した。別個のバイアル中で、アスコルビン酸ナトリウムを水に溶解し、ＤＭＳＯ、次いで１Ｍ ＣｕＳＯ４を添加して触媒混合物を調製する。触媒混合物をアルキン／アジドの溶液に１０分かけて滴加する。完了したら、０．５ Ｍ ＥＤＴＡでクエンチし、１５分間撹拌する。水で希釈し、酢酸エチルで３回抽出する。合わせた有機抽出物をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させる。残渣をトルエンに再懸濁し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、５０を得た。
生成物５０をＤＣＭおよびＴＥＡに溶解した。ＤＣＭ中のＤＭＴ－Ｃｌの溶液を少しずつ添加した。反応物を減圧下で乾燥させた。残渣をトルエンに再懸濁し、塩から分離し、次いで、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、５１を得た。
生成物５１をＤＣＭおよびＴＥＡに溶解した。ＰＰＡ－Ｃｌを添加し、反応物を１５分間インキュベートした。反応物を減圧下で乾燥させ、１％ ＴＥＡを含むトルエンに再懸濁し、次いで、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、ホスホラミダイト５２を得た。
実施例１３
ＰＥＧベースのレポーターコード（６２）の合成および試験
２－（ブロモメチル）－２－（ヒドロキシメチル）－１，３－プロパンジオール（５３、カタログ。番号Ｂ４０５７、ＴＣＩ）をＤＭＦに溶解し、ＮａＮ３を添加した。反応物を１１０℃でインキュベーションして、濃縮し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、生成物５４を得た。
ＰＥＧベースのレポーターコード（６２）の合成および試験
２－（ブロモメチル）－２－（ヒドロキシメチル）－１，３－プロパンジオール（５３、カタログ。番号Ｂ４０５７、ＴＣＩ）をＤＭＦに溶解し、ＮａＮ３を添加した。反応物を１１０℃でインキュベーションして、濃縮し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、生成物５４を得た。
生成物５４をＤＣＭおよびＴＥＡに溶解した。ベンゾイルクロリドを添加した。溶液を室温で一晩インキュベーションした。反応物をＤＣＭで水から抽出し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製して、生成物５５を得、このｂｉｓ－Ｂｚをモノまたはトリ保護種から分離し、分けた。
生成物５５の一部をＤＣＭおよびＴＥＡに溶解した。ＤＣＭ中のＤＭＴ－Ｃｌの溶液を少しずつ添加した。ＭｅＯＨを添加し、反応物を減圧下で乾燥させた。残渣をトルエンに再懸濁し、塩から分離し、次いで、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、トリチル化５６を得た。
４１を無水ＴＨＦに溶解した。水素化ナトリウムを添加してアルコキシドを生成した。バブリングが停止したら、プロパルギルブロミドをＴＨＦに溶解し、少しずつ添加した。過剰のＮａＨをＭｅＯＨ １ｍＬでクエンチし、次いで、水で希釈し、ＤＣＭで抽出した。合わせた有機層を減圧下で乾燥させた。残渣をトルエンに再懸濁し、残りの塩から分離し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、５７を得た。
生成物５７をＭｅＯＨに溶解し、ＨＣｌを添加した。反応物を室温で一晩インキュベーションし、次いで、重炭酸ナトリウムで中和した。これを減圧下で濃縮し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、５８を得た。
生成物５８をＤＣＭおよびＴＥＡに溶解した。ベンゾイルクロリドを添加し、反応物を６０分間インキュベーションした。反応物を水からＤＣＭで抽出し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、生成物５９を得た。
生成物５６および５９を９：１ ＤＭＳＯ：Ｈ２Ｏに溶解した。ＴＢＴＡ、アスコルビン酸ナトリウムおよび硫酸銅の溶液を添加し、反応物を６０分間インキュベーションした。反応物を水からＤＣＭで抽出し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、生成物６０を得た。
生成物６０および５５を９：１ ＤＭＳＯ：Ｈ２Ｏに溶解した。ＴＢＴＡ、アスコルビン酸ナトリウムおよび硫酸銅の溶液を添加し、反応物を６０分間インキュベーションした。反応物を水からＤＣＭで抽出し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、生成物６１を得た。
生成物６１をＤＣＭおよびＴＥＡに溶解した。ＰＰＡ－Ｃｌを添加し、反応物を１５分間インキュベートした。反応物を減圧下で乾燥させ、１％ ＴＥＡを含むトルエンに再懸濁し、次いで、フラッシュクロマトグラフィーによって精製した。ホスホラミダイト６２を単離し、１Ｈおよび３１Ｐ ＮＭＲによって確認した。
実施例１４
エナンチオマー（９Ｓ，１０Ｓ）－２，５，８，１１，１４，１７－ヘキサオキサオクタデカン－９，１０－ジオールのＤＭＴホスホラミダイト（ペンダントコードＣ２ビス－ＰＥＧ－２ホスホラミダイト［エナンチオマー］）（６７）の合成
（＋）－２，３－Ｏ－イソプロピリデン－Ｌ－トレイトール６３の無水ＤＭＦ中の溶液を、ＮａＨの無水ＤＭＦ中混合物にゆっくり添加した（注：Ｈ２ガスの激しい発生）。バブリングが終了したら、ｍＰＥＧ２－Ｔｏｓ（Ｂｒｏａｄｐｈａｒｍカタログ番号ＢＰ－２０９８３）をＤＭＦに溶解し、少しずつ添加し、周囲温度で一晩撹拌した。反応混合物を水に注ぎ入れ、酢酸エチルで抽出し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、６４を得た。
エナンチオマー（９Ｓ，１０Ｓ）－２，５，８，１１，１４，１７－ヘキサオキサオクタデカン－９，１０－ジオールのＤＭＴホスホラミダイト（ペンダントコードＣ２ビス－ＰＥＧ－２ホスホラミダイト［エナンチオマー］）（６７）の合成
（＋）－２，３－Ｏ－イソプロピリデン－Ｌ－トレイトール６３の無水ＤＭＦ中の溶液を、ＮａＨの無水ＤＭＦ中混合物にゆっくり添加した（注：Ｈ２ガスの激しい発生）。バブリングが終了したら、ｍＰＥＧ２－Ｔｏｓ（Ｂｒｏａｄｐｈａｒｍカタログ番号ＢＰ－２０９８３）をＤＭＦに溶解し、少しずつ添加し、周囲温度で一晩撹拌した。反応混合物を水に注ぎ入れ、酢酸エチルで抽出し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、６４を得た。
生成物６４をＭｅＯＨに溶解し、ＨＣｌを添加した。溶液を２０分間インキュベーションし、次いで、重炭酸ナトリウムで中和し、減圧下で乾燥させた。残渣を酢酸エチルに再懸濁し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、６５を得た。
生成物６５をＤＣＭおよびＴＥＡに溶解した。ＤＣＭ中のＤＭＴ－Ｃｌの溶液を少しずつ添加した。反応物を減圧下で乾燥させた。残渣をトルエンに再懸濁し、塩から分離し、次いで、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、６６を得た。
生成物６６をＤＣＭおよびＴＥＡに溶解した。ＰＰＡ－Ｃｌを添加し、反応物を１５分間インキュベートした。反応物を減圧下で乾燥させ、１％ ＴＥＡを含むトルエンに再懸濁し、次いで、フラッシュクロマトグラフィーによって精製した。ホスホラミダイト６７は、１Ｈおよび３１Ｐ ＮＭＲによって確認した。
実施例１５
１－Ｏ－ＤＭＴ－３－Ｏ－ＰＰＡ－２，２－ビス（Ｍｅ－Ｏ－ｍＰＥＧ４）－プロパン（７２）の合成
ペンタエリスリトール（６８、カタログ番号Ｐ００３９、ＴＣＩ）のＤＭＦ中の溶液に、ｐ－トルエンスルホン酸を添加した。反応物をトリエチルアミンで中和し、濃縮し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、６９を得た。
１－Ｏ－ＤＭＴ－３－Ｏ－ＰＰＡ－２，２－ビス（Ｍｅ－Ｏ－ｍＰＥＧ４）－プロパン（７２）の合成
ペンタエリスリトール（６８、カタログ番号Ｐ００３９、ＴＣＩ）のＤＭＦ中の溶液に、ｐ－トルエンスルホン酸を添加した。反応物をトリエチルアミンで中和し、濃縮し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、６９を得た。
生成物６９を、ＥＤＣ－ＨＣｌ、ＤＭＡＰおよびレブリン酸のＴＨＦ中の攪拌溶液に添加し、周囲温度で一晩攪拌した。溶液を濃縮し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、７０を得た。
生成物７０をＤＣＭおよびＴＥＡに溶解した。ＤＭＴ－ＣｌのＤＣＭ中の溶液を少しずつ添加した。反応物を減圧下で乾燥させた。残渣をトルエンに再懸濁し、塩から分離し、次いで、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、７１を得た。
生成物７１をＤＣＭおよびＴＥＡに溶解した。ＰＰＡ－Ｃｌを添加し、反応物を１５分間インキュベートした。反応物を減圧下で乾燥させ、１％ＴＥＡを含むトルエンに再懸濁し、次いで、フラッシュクロマトグラフィーによって精製した。ホスホラミダイト７２は、１Ｈおよび３１Ｐ ＮＭＲによって確認した。
実施例１６
ＰＥＧベースのレポーターコードの合成および試験
本実施例では、レポーターコードをＰＥＧベースのホスホラミダイトを用いて合成し、特に、これらのコードはヌクレオチドを含まない。４つの例示的なレポーターコードを表５に示す。
ＰＥＧベースのレポーターコードの合成および試験
本実施例では、レポーターコードをＰＥＧベースのホスホラミダイトを用いて合成し、特に、これらのコードはヌクレオチドを含まない。４つの例示的なレポーターコードを表５に示す。
各コードのレベル識別（すなわち、区別可能な電子シグナル）および移動時間を、４つのＸＮＴＰのそれぞれが表４に示される群からの固有のコードを含むＸＮＴＰを組み込むＨＩＶ－２ゲノムに由来する配列の１００ｍｅｒのＸｐａｎｄｏｍｅｒコピーを合成することによって評価した。Ｘｐａｎｄｏｍｅｒの合成、処理、およびナノポア配列解析は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる出願人のＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／６７７６３号に記載されているように行った。対照として、異なる公知のコードを組み込んだ同じＨＩＶ－２配列のＸｐａｎｄｏｍｅｒコピーを並行して配列決定した。各コードのレベル区別および移動時間を示す代表的なトレースを図１３Ａ（対照－古いコード）および１３Ｂ（試験－新しいＰＥＧベースの対照）に示す。
Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ配列情報の精度を評価するために、ＳＢＸ反応からの配列リードの集団のヒストグラム表示によって配列データを解析した。解析ソフトウェアは、各配列リードを鋳型の配列に整列し、正しい鋳型配列と整列しないリードの末端の配列の範囲をトリミングする。１００ｍｅｒの鋳型のＳＢＸ配列決定の代表的なヒストグラムを図１４Ａ（対照）および図１４Ｂ（新しいＰＥＧベースのコード）に示す。注目すべきことに、ヌクレオチドを含まないＰＥＧベースのコードを組み込んだＸｐａｎｄｏｍｅｒは、この鋳型の高度に正確な配列リードをもたらした。
実施例１７
ペンダントＰＥＧベースのＴＣＥによる移動制御－２コードレベル
本実施例において、ペンダントＰＥＧホスホラミダイトを組み込んだＴＣＥによる移動制御を、ＴＧジヌクレオチド反復からなる単純な６０ｍｅｒ鋳型を配列決定するためにＳＢＸプロトコルを使用することによって評価した。ＸＡＴＰ基質およびＸＣＴＰ基質の両方を、以下のＴＣＥを組み込むように設計した：Ｙ２２２２２２２２２２２２５５、式中、「Ｙ」は対称ホスホラミダイト分枝鎖を表し、「２」はペンダントＰＥＧ２を表し、「５」はベンゾフランを表す。ＸＡＴＰ基質は、以下のレポーターコードを組み込むように設計した、ＤＤＤＤＤＤＬＬＬＬ、式中、「Ｄ」はＰＥＧ６を表し、「Ｌ」はＣ２を表す。ＸＣＴＰ基質は、以下のレポーターコードを組み込むように設計された、ＤＤＤＤＸＸ４４ＸＸＤＬ、式中、「Ｘ」はＰＥＧ３を表し、「４」はペンダントＰＥＧ４を表す。
ペンダントＰＥＧベースのＴＣＥによる移動制御－２コードレベル
本実施例において、ペンダントＰＥＧホスホラミダイトを組み込んだＴＣＥによる移動制御を、ＴＧジヌクレオチド反復からなる単純な６０ｍｅｒ鋳型を配列決定するためにＳＢＸプロトコルを使用することによって評価した。ＸＡＴＰ基質およびＸＣＴＰ基質の両方を、以下のＴＣＥを組み込むように設計した：Ｙ２２２２２２２２２２２２５５、式中、「Ｙ」は対称ホスホラミダイト分枝鎖を表し、「２」はペンダントＰＥＧ２を表し、「５」はベンゾフランを表す。ＸＡＴＰ基質は、以下のレポーターコードを組み込むように設計した、ＤＤＤＤＤＤＬＬＬＬ、式中、「Ｄ」はＰＥＧ６を表し、「Ｌ」はＣ２を表す。ＸＣＴＰ基質は、以下のレポーターコードを組み込むように設計された、ＤＤＤＤＸＸ４４ＸＸＤＬ、式中、「Ｘ」はＰＥＧ３を表し、「４」はペンダントＰＥＧ４を表す。
６０ｍｅｒ鋳型のＸｐａｎｄｏｍｅｒコピーを作製するために、プライマー伸長反応を、伸長オリゴヌクレオチド４ｐｍおよび各ＸＮＴＰ ２５０ｐｍを使用して行った。伸長反応物１０μＬには以下の試薬が含まれていた：５０ｍＭ ＴｒｉｓＣｌ、ｐＨ ８．８４、２００ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ、２０％ ＰＥＧ８Ｋ、５％ ＮＭＳ、０．７５ｎｍｏｌポリホスフェートＰＰ－６０．２０、２μｇ ＳＳＢ、０．５ Ｍ尿素、５ｍＭ ＰＥＭ添加剤（適切なポリメラーゼ増強分子は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、出願人の係属中のＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／６７７６３号に開示されている）、および精製組換えＤＮＡポリメラーゼ１．２μｇ（ＤＰＯ４ポリメラーゼの適切に操作されたバリアントは、出願人のＰＣＴ特許出願番号、国際公開第２０１７／０８７２８１号、第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０３０９７２号および第ＰＣＴ／ＵＳ１８６４７９４号に開示されており、これらはその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。伸長反応を４２℃で３０分間実行した。
伸長反応のＸｐａｎｄｏｍｅｒ産物を次にＳＢＸプロトコルを用いて配列決定した。簡潔には、拘束されたＸｐａｎｄｏｍｅｒ生成物を切断して、線状化Ｘｐａｎｄｏｍｅｒを生成した。これは、最初に伸長反応をクエンチし、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒを２Ｍ無水コハク酸でアミン修飾することによって達成した。次いで、試料を１１．７ Ｍ ＤＣｌで２３℃で３０分間処理することによって、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒのホスホルアミデート結合を切断した。線状化Ｘｐａｎｄｏｍｅｒをエタノール沈殿によって精製し、３４％ ＡＣＮおよび１５％ ＤＭＦを補充した緩衝剤に再懸濁した。
配列決定のために、２．８ Ｍ ＮＨ ４Ｃｌ、１．２Ｍ ＧｕａｎＣｌ、２０ｍＭ ＮａＨｅｘ、１０％ ＤＭＦ、２ｍＭ ＥＤＴＡおよび２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．４の試料緩衝剤にＸｐａｎｄｏｍｅｒを添加した。タンパク質ナノポアは、２ Ｍ ＮＨ４Ｃｌおよび１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４ を含有する緩衝剤でα－溶血素をＤＰｈＰＥ／ヘキサデカン二重層メンバーに挿入することによって調製した。この試験では、検出システムのシスウェルに０．４Ｍ ＮＨ４Ｃｌ、６００ｍＭ ＧｕａｎＣｌ、および１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、トランスウェルに２Ｍ ＮＨ４Ｃｌおよび１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４の緩衝剤を使用した。Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ試料を７０℃に２分間加熱し、完全に冷却し、次いで、試料２μＬをシスウェルに添加した。実行したパラメータは、以下のとおりであった：６０ｍＶ／３００ｍＶ／１０μｓ／２ｍｓ（読み取り電圧／パルス電圧／パルス電圧持続時間／パルス周波数）。Ｌａｂｖｉｅｗ取得ソフトウェアを介してデータを取得した。この実行からの代表的なトレースを図１５に示す。
図１５のトレースの上に重ね合わされたレベル番号によって示されるように、全てのレポーターコードはこの試験において検出システムによって正しく読み取られ、１００％の精度を実証した。欠失または挿入エラーがないことは、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ移動の厳密な調節を可能にする構造としてのペンダントＰＥＧベースのＴＣＥの有効性を検証する。重要なことに、本試験で使用したペンダントＰＥＧベースのＴＣＥでは、単一の電圧パルス後に２つのコードレベル間の遷移が観察された。単一電圧パルスでＸｐａｎｄｏｍｅｒの連続的レポーターコード間を遷移する能力は、当技術分野における著しい進歩であり、はるかに高い配列決定スループットを可能にする。
実施例１８
ペンダントＰＥＧベースのＴＣＥを用いた拡張による配列決定－４コードレベル
本実施例において、ペンダントＰＥＧホスホラミダイトを組み込んだＴＣＥによる移動制御を、ＳＢＸプロトコルを使用して配列ＣＡＴＧの反復からなる６０ｍｅｒ鋳型を配列決定することによって評価した。全てのＸＮＴＰ基質を、以下のＴＣＥを組み込むように設計し、Ｙ４４４４４４４４４４４４４５５、式中、「Ｙ」は対称ホスホラミダイト分枝鎖を表し、「４」はペンダントＰＥＧ４を表し、「５」はベンゾフランを表す。ＸＡＴＰ基質を、以下のレポーターコードを組み込むように設計し、ＤＤＤＤＤＤＬＬＤＸ、ＸＣＴＰ基質は、以下のレポーターコードを組み込むように設計し、ＤＤＤＤＤＤＬＬＬＬ、ＸＴＴＰ基質は、以下のレポーターコードを組み込むように設計し、ＤＤＤＤＤＤ４４ＬＸＸＸ、ＸＧＴＰ基質は、以下のレポーターコードを組み込むように設計し、ＤＤＤＤＸＸＬ４４４４４４ＸＬＬＬＬ、式中、「Ｄ」はＰＥＧ６を表し、「Ｌ」はＣ２を表し、「Ｘ」はＰＥＧ３を表し、「４」はペンダントＰＥＧ４を表す。
ペンダントＰＥＧベースのＴＣＥを用いた拡張による配列決定－４コードレベル
本実施例において、ペンダントＰＥＧホスホラミダイトを組み込んだＴＣＥによる移動制御を、ＳＢＸプロトコルを使用して配列ＣＡＴＧの反復からなる６０ｍｅｒ鋳型を配列決定することによって評価した。全てのＸＮＴＰ基質を、以下のＴＣＥを組み込むように設計し、Ｙ４４４４４４４４４４４４４５５、式中、「Ｙ」は対称ホスホラミダイト分枝鎖を表し、「４」はペンダントＰＥＧ４を表し、「５」はベンゾフランを表す。ＸＡＴＰ基質を、以下のレポーターコードを組み込むように設計し、ＤＤＤＤＤＤＬＬＤＸ、ＸＣＴＰ基質は、以下のレポーターコードを組み込むように設計し、ＤＤＤＤＤＤＬＬＬＬ、ＸＴＴＰ基質は、以下のレポーターコードを組み込むように設計し、ＤＤＤＤＤＤ４４ＬＸＸＸ、ＸＧＴＰ基質は、以下のレポーターコードを組み込むように設計し、ＤＤＤＤＸＸＬ４４４４４４ＸＬＬＬＬ、式中、「Ｄ」はＰＥＧ６を表し、「Ｌ」はＣ２を表し、「Ｘ」はＰＥＧ３を表し、「４」はペンダントＰＥＧ４を表す。
６０ｍｅｒ鋳型のＸｐａｎｄｏｍｅｒコピーを作製するために、プライマー伸長反応を、伸長オリゴヌクレオチド４ｐｍおよび各ＸＮＴＰの１０００ｐｍを使用して行った。伸長反応物１０μＬには以下の試薬が含まれていた、５０ｍＭ ＴｒｉｓＣｌ、ｐＨ８．８４、２００ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ、２０％ ＰＥＧ８Ｋ、１０％ ＮＭＰ、３ｎｍｏｌポリホスフェートＰＰ－６０．２０、２μｇ ＳＳＢ、１ Ｍ尿素、１０ ｍＭ ＰＥＭ添加剤および１．８μｇ精製組換えＤＮＡポリメラーゼ。伸長反応を３７℃で３０分間行った。
伸長反応のＸｐａｎｄｏｍｅｒ産物を次にＳＢＸプロトコルを用いて配列決定した。簡潔には、拘束されたＸｐａｎｄｏｍｅｒ産物を切断して、線状化Ｘｐａｎｄｏｍｅｒを生成した。これは、最初に伸長反応をクエンチし、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒを２Ｍ無水コハク酸でアミン修飾することによって達成した。次いで、試料を１１．７ Ｍ ＤＣｌで２３℃で３０分間処理することによって、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒのホスホルアミデート結合を切断した。線状化Ｘｐａｎｄｏｍｅｒをエタノール沈殿によって精製し、３４％ ＡＣＮおよび１５％ ＤＭＦを補充した緩衝剤に再懸濁した。
配列決定のために、０．８Ｍ ＮＨ４Ｃｌ、１．２Ｍ ＧｕａｎＣｌおよび２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ ７．４の試料緩衝剤にＸｐａｎｄｏｍｅｒを添加した。タンパク質ナノポアは、２Ｍ ＮＨ４Ｃｌおよび１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ ７．４ を含有する緩衝剤中でα－溶血素をＤＰｈＰＥ／ヘキサデカン二重層メンバーに挿入することに
よって調製した。本試験では、シスウェルにおいて、０．４ Ｍ ＮＨ４Ｃｌ、６００ｍＭ ＧｕａｎＣｌ、および１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ ７．４の緩衝剤、トランスウェルにおいて２Ｍ ＮＨ４Ｃｌおよび１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４の緩衝剤を使用した。Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ試料を７０℃に２分間加熱し、完全に冷却し、次いで、試料２μＬをシスウェルに添加した。実行したパラメータは、以下のとおりであった：７０ｍＶ／６５０ｍＶ／６μｓ／１．５ｍｓ（読み取り電圧／パルス電圧／パルス電圧持続時間／パルス周波数）。Ｌａｂｖｉｅｗ取得ソフトウェアを介してデータを取得した。この実行からの代表的なトレースを図１６に示す。
よって調製した。本試験では、シスウェルにおいて、０．４ Ｍ ＮＨ４Ｃｌ、６００ｍＭ ＧｕａｎＣｌ、および１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ ７．４の緩衝剤、トランスウェルにおいて２Ｍ ＮＨ４Ｃｌおよび１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４の緩衝剤を使用した。Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ試料を７０℃に２分間加熱し、完全に冷却し、次いで、試料２μＬをシスウェルに添加した。実行したパラメータは、以下のとおりであった：７０ｍＶ／６５０ｍＶ／６μｓ／１．５ｍｓ（読み取り電圧／パルス電圧／パルス電圧持続時間／パルス周波数）。Ｌａｂｖｉｅｗ取得ソフトウェアを介してデータを取得した。この実行からの代表的なトレースを図１６に示す。
図１６のトレースの上に重ねられるレベル番号は、ＸＣＴＰコード（Ｌ１）、ＸＴＴＰコード（Ｌ２）、ＸＡＴＰコード（Ｌ３）およびＸＧＴＰコード（Ｌ４）によって生成されるシグナルに対応する。本試験では、全てのレポーターコードが検出システムによって正確に読み取られ、１００％の精度を実証した。欠失および挿入エラーがないことは、「読み取り電圧」の間に正確なシグナル読み取りを生成し、「パルス電圧」の間に移動の再開を可能にするために、ポアチャネル内のレポーターコードを一時的に休止する際のペンダントＰＥＧベースのＴＣＥの有効性を強調する。この場合も、本試験で使用したペンダントＰＥＧベースのＴＣＥを用いて、連続的なレポーターコード間の移行を単一電圧パルスで達成した。注目すべきことに、以下の電圧パラメータを使用して、同じＸｐａｎｄｏｍｅｒ試料のアリコートの別々の実行において、同じレベルの精度が観察された：６５／７００／６／１．５；６５／６５０／６／１．５；６０／６５０／６／１．５および６０／６００／６／１．５。コードリードのスループットは様々な電圧パラメータによって影響され得ることがさらに観察された。
実施例１９
ペンダントＰＥＧベースのＴＣＥを用いた複合体鋳型の拡張による配列決定
本実施例では、ペンダントＰＥＧホスホラミダイトを組み込んだＴＣＥによる移動制御を、ＳＢＸプロトコルを使用して複合体１００ｍｅｒ鋳型を配列決定することによって評価した。各ＸＮＴＰ基質を以下のＴＣＥを用いて合成した：Ｙ２２２２２２２２２２２２５５、式中、「Ｙ」は対称ホスホラミダイト分枝鎖を表し、「２」はペンダントＰＥＧ２を表し、「５」はベンゾフランを表す。以下のレポーターコードを用いてＸＮＴＰ基質を合成した：（ＸＣ）ＤＤＤＤＤＤＬＬＬＬ、式中、「Ｄ」はＰＥＧ６を表し、「Ｌ」はＣ２を表す、（ＸＴ）ＤＤＤＤＤＤ４４ＬＤＸ、式中、「Ｘ」はＰＥＧ３を表し、「４」はペンダントＰＥＧ４を表す、（ＸＡ）ＤＤＤＤＸＸ４４ＸＸＤＬ；および（ＸＧ）ＤＤＤＤＸＸＬ。
ペンダントＰＥＧベースのＴＣＥを用いた複合体鋳型の拡張による配列決定
本実施例では、ペンダントＰＥＧホスホラミダイトを組み込んだＴＣＥによる移動制御を、ＳＢＸプロトコルを使用して複合体１００ｍｅｒ鋳型を配列決定することによって評価した。各ＸＮＴＰ基質を以下のＴＣＥを用いて合成した：Ｙ２２２２２２２２２２２２５５、式中、「Ｙ」は対称ホスホラミダイト分枝鎖を表し、「２」はペンダントＰＥＧ２を表し、「５」はベンゾフランを表す。以下のレポーターコードを用いてＸＮＴＰ基質を合成した：（ＸＣ）ＤＤＤＤＤＤＬＬＬＬ、式中、「Ｄ」はＰＥＧ６を表し、「Ｌ」はＣ２を表す、（ＸＴ）ＤＤＤＤＤＤ４４ＬＤＸ、式中、「Ｘ」はＰＥＧ３を表し、「４」はペンダントＰＥＧ４を表す、（ＸＡ）ＤＤＤＤＸＸ４４ＸＸＤＬ；および（ＸＧ）ＤＤＤＤＸＸＬ。
１００ｍｅｒ鋳型固体プライマー伸長反応のＸｐａｎｄｏｍｅｒコピーを生成するために、１ｐｍｏｌのＸＡＴＰおよびＸＣＴＰならびに１．５ ｐｍｏｌのＸＧＴＰおよびＸＴＴＰ（延長オリゴがチップ基板に共有結合している固体状態のＸｐａｎｄｏｍｅｒ合成は、出願人の仮特許出願第６２／８２６，８０５号に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を使用して行った。伸長反応物５０μ＋には以下の試薬が含まれていた。５０ｍＭ ＴｒｉｓＣｌ、ｐＨ８．８４、２００ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ、２０％ ＰＥＧ８Ｋ、１０％ ＮＭＰ、１５ ｐｍｏｌポリホスフェートＰＰ－６０．２０、１０μｇ ＳＳＢ、１Ｍ尿素、１０ｍＭ ＰＥＭ添加剤および９μｇ精製組換えＤＮＡポリメラーゼ。伸長反応を３７℃で３０分間実行した。
次に、ＳＢＸプロトコルを使用してＸｐａｎｄｏｍｅｒ産物を配列決定した。簡潔には、拘束されたＸｐａｎｄｏｍｅｒ産物を切断して、線状化Ｘｐａｎｄｏｍｅｒを生成した。これは、最初に伸長反応をクエンチし、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒを無水コハク酸でアミン修飾することによって達成した。次いで、試料を７．５Ｍ ＤＣｌで２３℃で３０分間処理することによって、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒのホスホルアミデート結合を切断した。線状化Ｘｐａｎｄｏｍｅｒを、伸長オリゴヌクレオチドの光切断によってチップ基板から放出させ、１５％ ＡＣＮおよび５％ ＤＭＳＯ（２０％最終溶媒）を補充した溶出緩衝剤中に回収した。
配列決定のために、０．８Ｍ ＮＨ４Ｃｌ、１．２Ｍ ＧｕＣｌ、２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４の試料緩衝剤にＸｐａｎｄｏｍｅｒを添加した。タンパク質ナノポアは、α－溶血素を２Ｍ ＮＨ４Ｃｌおよび１００ｍＭ ＨＥＰＥＳの緩衝剤、ｐＨ７．４中のＤＰｈＰＥ／ヘキサデカン二重層メンバーに挿入することによって調製した。シスウェルを、０．４Ｍ ＮＨ４Ｃｌ、６００ｍＭ ＧｕａｎＣｌ、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４を含有する緩衝剤で灌流し、トランスウェルを、２Ｍ ＮＨ４Ｃｌ、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４を含有する緩衝剤で灌流した。Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ試料を７０℃に２分間加熱し、完全に冷却し、次いで、試料２μＬをシスウェルに添加した。電圧パラメータを以下のように実行した：６０ｍＶ／６００ｍＶ／６μｓ／１．５ｍｓ（読み取り電圧／パルス電圧／パルス電圧持続時間／パルス周波数）。Ｌａｂｖｉｅｗ取得ソフトウェアを介してデータを取得した。この実行からの代表的なトレースを図１７に示す。
図１７に示されるように、全てのレポーターコードの配列は、本試験における検出システムによって正確に読み取られ、１００％の精度を実証した。欠失または挿入エラーがないことは、ポリマー鋳型の信頼性の高い配列読み取りを可能にする構造としてのペンダントＰＥＧベースのＴＣＥの有効性を再び検証する。重要なことに、ホモポリマーの連続をこれらの条件下で正確に配列決定し（例えば、図１４に示されるトレースの開始付近の４×Ｌ１コードの配列を参照のこと）、それによりペンダントＰＥＧベースのＴＣＥを用いたＳＢＸの精度を強調した。
実施例２０
ペンダントＰＥＧベースのＴＣＥを用いた複合体２２２ｍｅｒ鋳型の拡張による配列決定
本実施例では、複合体２２２ｍｅｒ鋳型を配列決定するためにＳＢＸプロトコルを使用することによって、ペンダントＰＥＧベースのＴＣＥによる移動制御を評価した。以下のＴＣＥを含むように各ＸＮＴＰ基質を合成した：Ｙ４４４４４４４４４４４４５５、式中、「Ｙ」は対称ホスホラミダイト分枝鎖を表し、「４」はペンダントＰＥＧ－４を表し、「５」はベンゾフランを表す。以下のレポーターコードを用いてＸＮＴＰ基質を合成した：ＸＣ）ＤＤＤＤＤＤＬＬＬＤＸ、（ＸＴ）ＤＤＤＤＤＤ４４ＬＸＸＸ、（ＸＡ）ＤＤＤＤＤＤ４４４ＬＬＤＸ、および（ＸＧ）ＤＤＤＤＸＸＬ４４４４４４ＸＬＬＬＬ、式中、「Ｄ」はＰＥＧ－６を表し、「Ｌ」はＣ２を表し、「Ｘ」はＰＥＧ－３を表し、「４」はペンダントＰＥＧ－４を表す。
ペンダントＰＥＧベースのＴＣＥを用いた複合体２２２ｍｅｒ鋳型の拡張による配列決定
本実施例では、複合体２２２ｍｅｒ鋳型を配列決定するためにＳＢＸプロトコルを使用することによって、ペンダントＰＥＧベースのＴＣＥによる移動制御を評価した。以下のＴＣＥを含むように各ＸＮＴＰ基質を合成した：Ｙ４４４４４４４４４４４４５５、式中、「Ｙ」は対称ホスホラミダイト分枝鎖を表し、「４」はペンダントＰＥＧ－４を表し、「５」はベンゾフランを表す。以下のレポーターコードを用いてＸＮＴＰ基質を合成した：ＸＣ）ＤＤＤＤＤＤＬＬＬＤＸ、（ＸＴ）ＤＤＤＤＤＤ４４ＬＸＸＸ、（ＸＡ）ＤＤＤＤＤＤ４４４ＬＬＤＸ、および（ＸＧ）ＤＤＤＤＸＸＬ４４４４４４ＸＬＬＬＬ、式中、「Ｄ」はＰＥＧ－６を表し、「Ｌ」はＣ２を表し、「Ｘ」はＰＥＧ－３を表し、「４」はペンダントＰＥＧ－４を表す。
２２２ｍｅｒ鋳型のＸｐａｎｄｏｍｅｒコピーを作製するために、固体プライマー伸長反応を、１．２５ｐｍｏｌの各ＸＮＴＰ、１０ｐｍｏｌの鋳型および２０ｐｍｏｌのＥ－オリゴプライマー（伸長オリゴがチップ基板に共有結合している固体のＸｐａｎｄｏｍｅｒ合成は、出願人の仮特許出願第６２／８２６，８０５号に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を使用して行った。伸長反応物５０μＬには以下の試薬が含まれていた：５０ｍＭ ＴｒｉｓＣｌ、ｐＨ８．８４、２００ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ、２０％ ＰＥＧ８Ｋ、８％ ＮＭＰ、１５ｎｍｏｌのポリホスフェートＰＰ－６０．２０、１０μｇ ＳＳＢ、１Ｍ尿素、５ｍＭ ＰＥＭ添加剤および９μｇ精製組換えＤＮＡポリメラーゼ。伸長反応を３７℃で３０分間実行した。
次に、ＳＢＸプロトコルを使用してＸｐａｎｄｏｍｅｒ産物を配列決定した。簡潔には、拘束されたＸｐａｎｄｏｍｅｒ生成物を緩衝剤Ｂ．００１（１％ Ｔｗｅｅｎ－２０／３％ ＳＤＳ／５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０／１００ｍＭ ＮａＰＯ４／１５％ ＤＭＦ）中で洗浄し、２００μｌの緩衝剤Ｃ．００１（７．５Ｍ ＤＣｌ）を添加し、２３℃で３０分間インキュベーションすることによって切断して線状化Ｘｐａｎｄｏｍｅｒを生成した。次いで、試料を１０００μｌの緩衝剤Ｂ．００１を添加することによって中和した。次いで、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ試料を、６６６μｍｏｌの無水コハク酸を添加し、２３℃で５分間インキュベーションすることによってアミン修飾に供した。次いで、試料を緩衝剤Ｄ．０９４（５０％ ＡＣＮ）中で洗浄し、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒを光切断によって基質から放出させ、緩衝剤ＡＧ４９７（０．８Ｍ ＮＨ４Ｃｌ／１．２Ｍ ＧｕａｎＣｌ／２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）中で保存した。
タンパク質ナノポアは、α－溶血素を２Ｍ ＮＨ４Ｃｌおよび１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４の緩衝剤中のＤＰｈＰＥ／ヘキサデカン二重層メンバーに挿入することによって調製した。シスウェルを、０．４Ｍ ＮＨ４Ｃｌ、６００ｍＭ ＧｕａｎＣｌ、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４を含有する緩衝剤で灌流し、トランスウェルを、２Ｍ ＮＨ４Ｃｌ、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４を含有する緩衝剤で灌流した。Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ試料を７０℃に２分間加熱し、完全に冷却し、次いで、試料２μＬをシスウェルに添加した。電圧パラメータを以下のように実行した：６０ｍＶ／６５０ｍＶ／６μｓ／１．０ｍｓ（読み取り電圧／パルス電圧／パルス電圧持続時間／パルス周波数）。Ｌａｂｖｉｅｗ取得ソフトウェアを介してデータを取得した。この実行からの代表的なトレースを図１８に示す。
図１８に示されるように、全てのレポーターコードの配列は、本試験における検出システムによって正確に読み取られ、１００％の精度を実証した。欠失または挿入エラーがないことは、ポリマー鋳型の信頼性の高い配列リードを可能にする構造としてのペンダントＰＥＧベースのＴＣＥの有効性を再び検証する。ここでも、ホモポリマーの連続をこれらの条件下で正確に配列決定し、これに良いペンダントＰＥＧベースのＴＣＥを用いたＳＢＸの精度を強調した。
実施例２１
ペンダントＰＥＧベースのＴＣＥおよびＤセルを用いた複合体２２２ｍｅｒ鋳型の拡張による配列決定
本実施例では、複合体２２２ｍｅｒ鋳型を配列決定するためにＳＢＸプロトコルを使用することによって、ペンダントＰＥＧベースのＴＣＥおよびＤセル特徴を用いた移動制御を評価した。以下のＴＣＥを含むように各ＸＮＴＰ基質を合成した：Ｙ（３２）（３２）（３２）（３２）（３２）（３２）（６１）（６１）（６１）（６１）（６１）（６１）、式中、「Ｙ」は対称ホスホラミダイト分枝鎖を表し、「３２」はペンダントｍＰＥＧ４（ＰＰＡ０３２）を表し、６１」はペンダントＰＥＧ（ＰＰＡ０６１）を表す。各ＸＮＴＰはまた、以下のＤセル特徴を含んでいた：Ｄ（６３）Ｄ（６３）Ｄ（６３）ＤＤ、式中、「Ｄ」はＰＥＧ６を表し、「６３」はペンダントＰＥＧ（ＰＰＡ０６３）を表す。以下のレポーターコードを用いてＸＮＴＰ基質を合成した：（ＸＣ）ＤＤＬＬＬＸ、（ＸＴ）ＬＸＸＸ、（ＸＡ）ＤＤ（３２）（３２）（３２）ＬＬＬＬＬＬＬおよび（ＸＧ）ＸＸＬ（３２）（３２）（３２）（３２）（３２）（３２）ＬＬＬＬＬＬＬ、式中、「Ｄ」はＰＥＧ－６を表し、「Ｌ」はＣ２を表し、「Ｘ」はＰＥＧ－３を表し、「３２」はペンダントｍＰＥＧ－４（ＰＰＡ０３２）を表す。
ペンダントＰＥＧベースのＴＣＥおよびＤセルを用いた複合体２２２ｍｅｒ鋳型の拡張による配列決定
本実施例では、複合体２２２ｍｅｒ鋳型を配列決定するためにＳＢＸプロトコルを使用することによって、ペンダントＰＥＧベースのＴＣＥおよびＤセル特徴を用いた移動制御を評価した。以下のＴＣＥを含むように各ＸＮＴＰ基質を合成した：Ｙ（３２）（３２）（３２）（３２）（３２）（３２）（６１）（６１）（６１）（６１）（６１）（６１）、式中、「Ｙ」は対称ホスホラミダイト分枝鎖を表し、「３２」はペンダントｍＰＥＧ４（ＰＰＡ０３２）を表し、６１」はペンダントＰＥＧ（ＰＰＡ０６１）を表す。各ＸＮＴＰはまた、以下のＤセル特徴を含んでいた：Ｄ（６３）Ｄ（６３）Ｄ（６３）ＤＤ、式中、「Ｄ」はＰＥＧ６を表し、「６３」はペンダントＰＥＧ（ＰＰＡ０６３）を表す。以下のレポーターコードを用いてＸＮＴＰ基質を合成した：（ＸＣ）ＤＤＬＬＬＸ、（ＸＴ）ＬＸＸＸ、（ＸＡ）ＤＤ（３２）（３２）（３２）ＬＬＬＬＬＬＬおよび（ＸＧ）ＸＸＬ（３２）（３２）（３２）（３２）（３２）（３２）ＬＬＬＬＬＬＬ、式中、「Ｄ」はＰＥＧ－６を表し、「Ｌ」はＣ２を表し、「Ｘ」はＰＥＧ－３を表し、「３２」はペンダントｍＰＥＧ－４（ＰＰＡ０３２）を表す。
２２２ｍｅｒ鋳型のＸｐａｎｄｏｍｅｒコピーを作製するために、固体プライマー伸長反応を、５０００ｐｍｏｌの各ＸＮＴＰ、４ｐｍｏｌの鋳型および２０ｐｍｏｌのＥ－オリゴプライマー（伸長オリゴがチップ基板に共有結合している固体状態のＸｐａｎｄｏｍｅｒ合成は、出願人の仮特許出願第６２／８２６，８０５号に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を使用して行った。伸長反応物５０μＬには以下の試薬が含まれていた：５０ｍＭ ＴｒｉｓＣｌ、ｐＨ８．８４、２００ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ、５０ｍＭ ＧｕＣｌ ２０％ＰＥＧ８Ｋ、１０％ ＮＭＰ、１５ｎｍｏｌポリホスフェートＰＰ－６０．２３、２．５μｇ Ｋｏｄ ＳＳＢ、０．１Ｍ尿素、１５ｍＭ ＰＥＭ添加剤および１３μｇの精製組換えＤＮＡポリメラーゼ（ＤＰＯ４ポリメラーゼのバリアント）。伸長反応を３７℃で６０分間行った。
次に、ＳＢＸプロトコルを使用してＸｐａｎｄｏｍｅｒ産物を配列決定した。簡潔には、拘束したＸｐａｎｄｏｍｅｒ産物を緩衝剤Ｂ．０６４（１％ Ｔｗｅｅｎ－２０／３％ ＳＤＳ／５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０／１００ｍＭ ＮａＰＯ４／１５％ ＤＭＦ）中で洗浄し、２００μｌの緩衝剤Ｃ．００１（７．５Ｍ ＤＣｌ）を添加し、２３℃で３０分間インキュベーションすることによって切断して線状化Ｘｐａｎｄｏｍｅｒを生成した。次いで、試料を２０００μｌの緩衝剤Ｂ．０６４を添加し、室温で２分間インキュベーションすることによって中和した。次いで、緩衝剤Ｂ．０６５中に５００μｍｏｌの無水コハク酸を添加し、２３℃で５分間インキュベーションすることによって、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ試料をアミン修飾に供した。次いで、試料を緩衝剤Ｄ．１０２（５０％ ＡＣＮ）で洗浄し、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒを光切断によって基質から放出させ、６０μｌの溶出緩衝剤に溶出した。
タンパク質ナノポアは、α－溶血素を２Ｍ ＮＨ４Ｃｌおよび１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４の緩衝剤中のＤＰｈＰＥ／ヘキサデカン二重層メンバーに挿入することによって調製した。シスウェルを、０．４Ｍ ＮＨ４Ｃｌ、６００ｍＭ ＧｕａｎＣｌ、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ ７．４、および５％グリセロールを含有する緩衝剤ＡＧ２４２で灌流し、トランスウェルを、０．４Ｍ ＮＨ４Ｃｌ、６００ｍＭ ＧｕａｎＣｌ、５％酢酸エチル、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４を含有する緩衝剤ＡＢ０８０で灌流した。Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ試料を７０℃に２分間加熱し、完全に冷却し、次いで、試料２μＬをシスウェルに添加した。電圧パラメータを以下のように実行した：７０ｍＶ／６２５ｍＶ／６μｓ／１．０ｍｓ（読み取り電圧／パルス電圧／パルス電圧持続時間／パルス周波数）。Ｌａｂｖｉｅｗ取得ソフトウェアを介してデータを取得した。
Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ配列情報の精度を評価するために、ＳＢＸ反応からの配列リードの集団のヒストグラム表示によって配列データを分析した。解析ソフトウェアは、各配列リードを鋳型の配列に整列し、正しい鋳型配列と整列しないリードの末端の配列の範囲をトリミングする。２２２ｍｅｒ鋳型のＳＢＸ配列決定の代表的なヒストグラムを図１９に示す。図から分かるように、ＳＢＸ試験は、２２２ｍｅｒ鋳型の非常に正確なリードを生成した。特に、本試験のスループットは顕著であった。これらの結果は、ペンダントＰＥＧベースのＴＣＥおよびＤセルの特徴を組み込んだＳＳＲＴが、ナノポアを通過したＸｐａｎｄｏｍｅｒ移動の高度に正確かつ効率的な制御を提供することを示している。
実施例２２
ラチェット
ラチェットの本実施例では、単一の溶血素ナノポアが、トランス側に前庭部を有し、０．４Ｍ ＮＨ４Ｃｌ、６００ｍＭ ＧｕａｎＣｌ、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４から構成される試薬混合物をシスリザーバ中に、２Ｍ ＮＨ４Ｃｌ、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４から構成される試薬混合物をトランスリザーバ中に有する脂質二重層中で調製される。各リザーバ内に配置されたＡｇ／ＡｇＣｌ電極間を通過する電流は、Ａｘｏｐａｔｃｈ ２００Ｂ増幅器によって測定され、１００ｋ試料／秒でデジタル化される。ナノポアを通る電流を駆動するために、＋７０ｍＶ～－５０ｍＶの間で交互になっている５０％のデューティサイクルを有する方形波を、正電圧から負電圧への遷移の間に印加される＋６００ｍＶの６μｓパルスと共にトランスリザーバに印加する（全ての電圧はシスリザーバ電位を基準とする）。この適用されたパルストレインでは、欠失または挿入のない理想的な移動を想定しており、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒに組み込まれた各ＸＮＴＰの両方のレポーターが測定され、一方は＋７０ｍＶ、他方は－５０ｍＶである。各塩基に対して２つの測定値を有することは、一致した結果においてより高い信頼性を提供することができ、非ホモポリマー配列における欠失および挿入を同定するのにも役立つことができる冗長性を提供する。図２０Ａは、＋７０ｍＶ／６００ｍＶパルス／－５０ｍＶのサイクルがナノポアを通過するＸｐａｎｄｏｍｅｒ移動にどのように影響し、Ｃコードについての２回の測定、続いてＡコードについての２回の測定（およびＧコードについての１回の最初の測定）をもたらすかを示す。パターンコードは、この非ホモポリマー配列において、各塩基に対する２つのレポーター測定値をどのように使用して挿入および欠失を同定することができるかを示す。Ｘｐａｎｄｏｍｅｒが、それぞれ（ナノポア内の）次のレポーターに進行しないか、または次のレポーターをスキップする場合、挿入および欠失が引き起こされる。
ラチェット
ラチェットの本実施例では、単一の溶血素ナノポアが、トランス側に前庭部を有し、０．４Ｍ ＮＨ４Ｃｌ、６００ｍＭ ＧｕａｎＣｌ、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４から構成される試薬混合物をシスリザーバ中に、２Ｍ ＮＨ４Ｃｌ、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４から構成される試薬混合物をトランスリザーバ中に有する脂質二重層中で調製される。各リザーバ内に配置されたＡｇ／ＡｇＣｌ電極間を通過する電流は、Ａｘｏｐａｔｃｈ ２００Ｂ増幅器によって測定され、１００ｋ試料／秒でデジタル化される。ナノポアを通る電流を駆動するために、＋７０ｍＶ～－５０ｍＶの間で交互になっている５０％のデューティサイクルを有する方形波を、正電圧から負電圧への遷移の間に印加される＋６００ｍＶの６μｓパルスと共にトランスリザーバに印加する（全ての電圧はシスリザーバ電位を基準とする）。この適用されたパルストレインでは、欠失または挿入のない理想的な移動を想定しており、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒに組み込まれた各ＸＮＴＰの両方のレポーターが測定され、一方は＋７０ｍＶ、他方は－５０ｍＶである。各塩基に対して２つの測定値を有することは、一致した結果においてより高い信頼性を提供することができ、非ホモポリマー配列における欠失および挿入を同定するのにも役立つことができる冗長性を提供する。図２０Ａは、＋７０ｍＶ／６００ｍＶパルス／－５０ｍＶのサイクルがナノポアを通過するＸｐａｎｄｏｍｅｒ移動にどのように影響し、Ｃコードについての２回の測定、続いてＡコードについての２回の測定（およびＧコードについての１回の最初の測定）をもたらすかを示す。パターンコードは、この非ホモポリマー配列において、各塩基に対する２つのレポーター測定値をどのように使用して挿入および欠失を同定することができるかを示す。Ｘｐａｎｄｏｍｅｒが、それぞれ（ナノポア内の）次のレポーターに進行しないか、または次のレポーターをスキップする場合、挿入および欠失が引き起こされる。
ＳＢＸ合成および精製プロトコルを使用して、公知の配列の合成ＤＮＡ鋳型から生成したＸｐａｎｄｏｍｅｒ試料をシスリザーバに導入し、測定を進めた。移動性Ｘｐａｎｄｏｍｅｒの電流測定の一例を図２０Ｂに示す。グラフは、＋７０ｍＶ測定値からの４つのレポーター電流レベル（１４、２０、２７および３５ｐＡ）および－５０ｍＶ測定値からの４つのレポーター電流レベル（－１２、－２０、－２５および－２９ｐＡ）が水平な破線によって示されるようにスケーリングされる。データは、予期されるＤＮＡ鋳型配列に整列され、グラフ上の数値配列によって示される。４つの数字のそれぞれは、塩基を指す。青色の配列番号は、鋳型との確認された塩基一致を示す。矢印は誤差を示している。番号１で指定された矢印は、ベースコールにより認識され得る、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒが前進しなかったことを示す非ホモポリマー挿入である。番号２で指定された矢印は、ベースコールが全て同じレベルであるために認識されないホモポリマー挿入を示す。
実施例２４
フルオロアラビノシルＸＮＴＰエピマーの合成
本実施例は、各ＸＮＴＰの２’フルオロ（Ｆ）エピマー（２’ＦＡＮＡ ＸＮＴＰ）の合成を記載する。これらのエピマーは、「フルオロアラビノシル核酸」（ＦＡＮＡ）と呼ばれるフッ素化ヌクレオシドに基づく。２’Ｆエピマーは、酸処理中に安定性の増加を示すと予測され、これは、線状化Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ生成物を生成する合成経路における重要なステップである。以下は、各２’ＦＡＮＡ ＸＮＴＰを生成するための合成スキームである。
フルオロアラビノシルＸＮＴＰエピマーの合成
本実施例は、各ＸＮＴＰの２’フルオロ（Ｆ）エピマー（２’ＦＡＮＡ ＸＮＴＰ）の合成を記載する。これらのエピマーは、「フルオロアラビノシル核酸」（ＦＡＮＡ）と呼ばれるフッ素化ヌクレオシドに基づく。２’Ｆエピマーは、酸処理中に安定性の増加を示すと予測され、これは、線状化Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ生成物を生成する合成経路における重要なステップである。以下は、各２’ＦＡＮＡ ＸＮＴＰを生成するための合成スキームである。
第１のステップでは、フィアルリジン（化合物１、ＴＣＩ Ａｍｅｒｉｃａから入手可能）を薗頭反応（例えば、Ｂａｇ，Ｓ．、Ｊａｎａ，Ｓ．ａｎｄ Ｋａｓｕｌａ，Ｍ．（２０１８）Ｓｏｎｏｇａｓｈｉｒａ Ｃｒｏｓｓ－Ｃｏｕｐｌｉｎｇ：Ａｌｋｙｎｅ－Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｉｎ Ｐａｌｌａｄｉｕｍ－Ｃａｔａｌｙｚｅｄ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，ａｎｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ（ｐｐ．７５－１４６）．Ｅｌｓｅｖｉｅｒを参照）を介して１－８オクタジインにカップリングさせる。第２のステップでは、化合物２をピリジン中の約１当量のＤＭＴｒＣＬで処理して、化合物３を生成する。第３のステップでは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、「Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ ｅｓｔｅｒｓ ａｎｄ ｕｓｅ ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｔｈｅｒｅｏｆ」と題されたＫｏｋｏｒｉｓ ｅｔ ａｌの米国特許第１０，３０１，３４５号に記載されたプロトコルにしたがって、化合物３をアミデートトリホスフェートに変換する。
第１のステップでは、（上記のように）薗頭反応を介して、フィアルシタビン（化合物５、ＴＲＣ Ｃａｎａｄａから入手可能）を１－８オクタジインにカップリングさせて、化合物６を生成する。第２のステップでは、化合物６をピリジン中の約１当量のＤＭＴｒＣＬで処理して、化合物７を生成する。第３のステップでは、化合物７の環外アミンがアセチル基（例えば、Ｆａｎ，Ｙ．，Ｇａｆｆｎｅｙ，Ｂ．，ａｎｄ Ｊｏｎｅｓ，Ｒ．（２００４）．Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ Ｓｉｌｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｕａｎｏｓｉｎｅ Ｏ６ ａｎｄ ｔｈｅ Ａｍｉｎｏ Ｇｒｏｕｐｓ Ｆａｃｉｌｔａｔｅｓ Ｎ－Ａｃｙｌａｔｉｏｎ．Ｏｒｇａｎｉｃ Ｌｅｔｔｅｒｓ，６，１５，２５５５－２５５７を参照）によって保護され、続いてＫｏｋｏｒｉｓ ｅｔ ａｌ．の米国特許第１０，３０１，３４５号に記載されているように、アミデートトリホスフェート８に変換される。
第１のステップでは、７－デアザ－７－ヨードグアノシン（Ｇｒａｎｌｅｎから入手可能な化合物９；ＣＡＳ：４４４０２０－７１－７）を１当量の１，３－ジクロロ－１，１，３，３－テトラメチルジシロキサンで処理して化合物１０を得る（例えば、Ｍａｒｋｉｅｗｉｃｚ，Ｗ．Ｔ．ａｎｄ Ｗｉｅｗｉｏｒｏｗｓｋｉ，Ｍ．（１９７８）Ａ ｎｅｗ ｔｙｐｅ ｏｆ ｓｉｌｙｌ ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．５，ｓ１８５－ｓｓ１９０）．を参照）。第２のステップでは、フッ素化剤ＤＡＳＴ（例えば、Ｐａｎｋｉｅｗｉｃｚ，Ｋ．，Ｋｒｅｍｉｎｓｋｉ，Ｊ．，Ｃｉｓｚｅｗｓｋｉ，Ｌ．，Ｒｅｎ，Ｗ．，ａｎｄ Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｋ．（１９９２）．Ａ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ９－（２－ｄｅｏｘｙ－２－ｆｌｕｏｒｏ－β－Ｄ－ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｙｌ）ａｄｅｎｉｎｅ ａｎｄ－ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ．Ａｎ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｃ３’－ｅｎｄｏ ｔｏ Ｃ２’－ｅｎｄｏ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｓｈｉｆｔ ｏｎ ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｃｏｕｒｓｅ ｏｆ ２’－ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｇｒｏｕｐ ｗｉｔｈ ＤＡＳＴ．Ｊ．ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍ．５７，２，５５３－５５９を参照）を用いて、化合物１０を化合物１１に変換する。第３のステップにおいて、化合物１１中の環外アミンを上記のようにフェノキシアセチル基で保護する。第４のステップにおいて、得られた化合物１２を上記の薗頭反応によって１－８オクタジインにカップリングさせて、化合物１３を得る。第５のステップにおいて、上記のシロキサン基の脱保護により、化合物１４が得られる。第６のステップにおいて、化合物１４をピリジン中の１当量のＤＭＴｒＣｌで処理し、化合物１５が生成する。第７のステップにおいて、Ｋｏｋｏｒｉｓ ｅｔ ａｌの米国特許第１０，３０１，３４５号に記載されているように、化合物１５をグアノシンアミデートトリホスフェート１６に変換する。
この同じスキームを使用して、以下のトリホスホルアミデート類似体を合成することができる。
出発化合物７－デアザ－７－ヨードアデノシン（Ｇｒａｎｌｅｎから入手可能、ＣＡＳ：２４３８６－９３－４）から。
２０１９年５月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／８５２，２６２号、２０１９年７月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／８７７，１８３号、および２０１９年８月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／８８５，７４６号を含むがこれらに限定されない、本明細書で言及されたおよび／または出願データシートに列挙された米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許公報は全て、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。そのような文献は、例えば、本明細書に記載された発明に関連して使用され得る刊行物に記載された材料および方法論を説明および開示する目的で、参照により組み込まれ得る。上記および本文全体で説明されている刊行物は、本出願の出願日より前の開示のためにのみ提供されている。本明細書中のいかなるものも、本開示が先行発明によってそのような刊行物に先行する権利がないことの承認として解釈されるべきではない。
２０１９年５月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／８５２，２６２号、２０１９年７月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／８７７，１８３号、および２０１９年８月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／８８５，７４６号を含むがこれらに限定されない、本明細書で言及されたおよび／または出願データシートに列挙された米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許公報は全て、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。そのような文献は、例えば、本明細書に記載された発明に関連して使用され得る刊行物に記載された材料および方法論を説明および開示する目的で、参照により組み込まれ得る。上記および本文全体で説明されている刊行物は、本出願の出願日より前の開示のためにのみ提供されている。本明細書中のいかなるものも、本開示が先行発明によってそのような刊行物に先行する権利がないことの承認として解釈されるべきではない。
Claims (58)
- 以下の構造を有する化合物であって、
ＲはＯＨまたはＨであり、
核酸塩基は、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシルまたは核酸塩基類似体であり、
レポーター構築物は、第１の末端および第２の末端を有し、前記第１の末端から前記第２の末端に向かって連続的に、第１のレポーターコード、移動制御エレメントを保有する対称化学分枝鎖、および第２のレポーターコードを含むポリマーであり、
リンカーＡは、アルファホスホルアミデートの酸素原子を前記レポーター構築物の前記第１の末端に連結させ、
リンカーＢは、前記核酸塩基を前記レポーター構築物の前記第２の末端に連結させ、
ここで、
前記移動制御エレメントは、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２Ｓ－Ｏ－ｍＰＥＧ４－プロパン（化合物１２ｂ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２－（４－Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ３）－１－（Ｅｔ－Ｏ－Ａｃ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ｂ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２ｓ－Ｏ－ｍＰＥＧ６－プロパン（化合物１２ｃ）、１，２－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－３－Ｏ－ｍＰＥＧ２－プロパン（化合物１６）、２，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－１－（５－ベンゾフラン）－プロパン（化合物２０ｉ）、１，２－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－３－（４－メチルピペラジン－１－イル）－プロパン（化合物２０ｊ）、２，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－１－（Ｎ１－（２－Ｍｅ－５－ニトロインドール）－プロパン（化合物２０ｇ）、１，８－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－Ｎ，Ｎ－ジエチルピペラジン（化合物２６ｈ）、１，２－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－３－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ３－Ｏ－Ｂｚ））－１－（１，２，３－トリアゾール））－プロパン（化合物３１ｄ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２ｓ－Ｏ－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ２）－１－（Ｅｔ－ＯＢｚ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ａ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ５）－１－（Ｅｔ－Ｏ－Ａｃ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ｃ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２ｓ－Ｏ－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ７）－１－（Ｅｔ－ＯＢｚ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ｄ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２ｓ－Ｏ－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ３）－１－（Ｍｅ－アセテート）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ｅ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２ｓ－Ｏ－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ３）－１－（Ｅｔ－２，２，２－トリス－（Ｍｅ－Ｏ－Ｂｚ））－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３７ａ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ５）－１－（Ｅｔ－２，２，２－トリス－（Ｍｅ－Ｏ－Ａｃ））－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３７ｂ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２Ｓ－Ｏ－（ＰＥＧ４－Ｏ－Ｂｚ）－プロパン（化合物３８ｂ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２，２－ビス（Ｍｅ－Ｏ－ｍＰＥＧ２）－プロパン（化合物４５ｂ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２，２－ビス（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ２－Ｏ－Ｍｅ）－１－（Ｅｔ－Ｏ－Ｂｚ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物４７ｆ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２，２－ビス（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ３－Ｏ－Ｍｅ）－１－（Ｅｔ－Ｏ－Ｂｚ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物４７ｇ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２，２－ビス（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ３－Ｏ－Ｍｅ）－１－（Ｅｔ－２，２，２－トリス－（Ｍｅ）－Ｏ－Ｂｚ））－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物４７ｉ）、または１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２，２－ビス（１－Ｍｅ－４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ２－Ｏ－Ｂｚ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物５２）から選択される２つ以上の反復単位を含むポリマーである、化合物。 - ＲがＯＨである、請求項１に記載の化合物。
- ＲがＨである、請求項１に記載の化合物。
- 核酸塩基がアデニンである、請求項１から３のいずれか一項に記載の化合物。
- 核酸塩基がシトシンである、請求項１から３のいずれか一項に記載の化合物。
- 核酸塩基がグアニンである、請求項１から３のいずれか一項に記載の化合物。
- 核酸塩基がチミンである、請求項１から３のいずれか一項に記載の化合物。
- 核酸塩基がウラシルである、請求項１から３のいずれか一項に記載の化合物。
- 核酸塩基が核酸塩基類似体である、請求項１から３のいずれか一項に記載の化合物。
- 前記対称化学分枝鎖が、１，２，３－Ｏ－トリス－（ホスホジエステル）－プロパン、１，３－ビス－（５－Ｏ－ホスホジエステル－ペンチルアミド）－２－Ｏ－ホスホジエステル－プロパン、および１，４，７－Ｏ－トリス－（ホスホジエステル）－ヘプタンから選択される、請求項１から９のいずれか一項に記載の化合物。
- 前記対称化学分枝鎖が１，２，３－Ｏ－トリス－（ホスホジエステル）－プロパンである、請求項１から９のいずれか一項に記載の化合物。
- 前記移動制御エレメントが、表１Ａから選択される２つ以上の反復単位を含むポリマーである、請求項１から１１のいずれか一項に記載の化合物。
- 前記移動制御エレメントが、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２Ｓ－Ｏ－ｍＰＥＧ４－プロパン（化合物１２ｂ）および１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２－（４－Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ３）－１－（Ｅｔ－Ｏ－Ａｃ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ｂ）から選択される２つ以上の反復単位を含むポリマーである、請求項１から１１のいずれか一項に記載の化合物。
- 前記移動制御エレメントが、以下の配列：［（１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２Ｓ－Ｏ－ｍＰＥＧ４－プロパン（化合物１２ｂ））］ｎ１［（１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２－（４－Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ３）－１－（Ｅｔ－Ｏ－Ａｃ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ｂ）］ｎ２を含むポリマーであり、式中、ｎ１が０～６であり、ｎ２が６～１０である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の化合物。
- 前記第１のレポーターコードおよび前記第２のレポーターコードが同一である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の化合物。
- 前記第１のレポーターコードおよび前記第２のレポーターコードが、ヘキサエチレングリコール（Ｄ）、エタン（Ｌ）、トリアエチレングリコール（Ｘ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２Ｓ－Ｏ－ｍＰＥＧ４－プロパン（化合物１２ｂ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２－（４－Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ３）－１－（Ｅｔ－Ｏ－Ａｃ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ｂ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２，２－ビス（Ｍｅ－Ｏ－ｍＰＥＧ２）－プロパン（化合物４５ｂ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２Ｓ－Ｏ－（ＰＥＧ４－Ｏ－Ｂｚ）－プロパン（化合物３８ｂ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２ｓ－Ｏ－ｍＰＥＧ６－プロパン（化合物１２ｃ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２ｓ－Ｏ－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ３）－１－（Ｅｔ－２，２，２－トリス－（Ｍｅ－Ｏ－Ｂｚ））－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３７ａ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２ｓ－Ｏ－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ３）－１－（Ｍｅ－アセテート）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ｅ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２ｓ－Ｏ－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ２）－１－（Ｅｔ－ＯＢｚ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ａ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２－（４－Ｅｔ－１－（Ｅｔ－Ｏ－ｍＰＥＧ１）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３１ａ）、２，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－１－（１ージメトキシキナゾリンジオン）－プロパン（化合物２０ｃ）、２，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－１－（Ｎ９－（３，６－ジメトキシカルバゾール）－プロパン（化合物２０ｅ）、１，１’－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２，２’－（スルホニルビス（ベンズ－４－イル））－ジエタノール（化合物２６ｄ）、１，１’－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２，２’－ビピリジン－４，４’－イル）－ジメタノール（化合物２６ａ）、２，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－１－（Ｎ１－（４，６－ジメトキシ－３－Ｍｅ－インドール）－プロパン（化合物２０ｂ）、３－（１，２－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－プロピル）－８，８－ジメチルヘキサヒドロ－３Ｈ－３ａ、６－メタノベンゾ［ｃ］イソチアゾール２，２－ジオキシド（化合物２０ｄ）、２，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－１－（Ｎ１－（６－アザチミン））－プロパン（化合物２０ｆ）、１，５－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－ヘキサヒドロフロ［２，６］フラン（化合物２３）、１，１’－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－オクタヒドロ－２，６－ジメチル－３，８：４，７－ジメタノ－２，６－ナフチリジン－４，８－ジイル）－ジメタノール（化合物２６ｅ）、２，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－１－（Ｎ１－（２－Ｍｅ－５－ニトロインドール）－プロパン（化合物２０ｈ）、２，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－１－（Ｎ１－（２－Ｍｅ－５－ニトロインドール）－プロパン（化合物２０ｇ）、２，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－１－（５－ベンゾフラン）－プロパン（化合物２０ｉ）、１，２－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－３－Ｏ－ｍＰＥＧ２－プロパン（化合物５ｂ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２－（４－Ｅｔ－１－（Ｅｔ－Ｏ－ｍＰＥＧ３）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３１ｂ）、および１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－３－Ｏ－ｍＰＥＧ４－プロパン（化合物５ａ）から選択される２つ以上の反復単位を含むポリマーである、請求項１から１４のいずれか一項に記載の化合物。
- 前記第１のレポーターコードおよび前記第２のレポーターコードが、ヘキサエチレングリコール、エタン、トリアエチレングリコール、および表１Ａに示される任意の化合物から選択される２つ以上の反復単位を含むポリマーである、請求項１から１４のいずれか一項に記載の化合物。
- 前記第１のレポーターコードおよび前記第２のレポーターコードが、ヘキサエチレングリコール、エタン、トリアエチレングリコールおよび１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２Ｓ－Ｏ－ｍＰＥＧ４－プロパン（化合物１２ｂ）から選択される２つ以上の反復単位を含むポリマーである、請求項１から１４のいずれか一項に記載のレポーターコード。
- 前記第１のレポーターコードおよび前記第２のレポーターコードが、（ｉ）［（ヘキサエチレングリコール）２（エタン）３（ヘキサエチレングリコール）（トリアエチレングリコール）］、（ｉｉ）［（ヘキサエチレングリコール）２（１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２Ｓ－Ｏ－ｍＰＥＧ４－プロパン（化合物１２ｂ））２（エタン）（トリアエチレングリコール）３］、（ｉｉｉ）［（ヘキサエチレングリコール）２（１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２Ｓ－Ｏ－ｍＰＥＧ４－プロパン（化合物１２ｂ））３（エタン）２（ヘキサエチレングリコール）（トリアエチレングリコール）］、および（ｉｖ）［（トリアエチレングリコール）２（エタン）（１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２Ｓ－Ｏ－ｍＰＥＧ４－プロパン（化合物１２ｂ））６（エタン）７］から選択される配列を含むポリマーである、請求項１から１４のいずれか一項に記載の化合物。
- リンカーＡおよびリンカーＢが、スペルミン（Ｑ）、ヘキサエチレングリコール（Ｄ）、２－（（４－（（３－（３－（ベンゾイルオキシ）－２－（（（１－（３－（ベンゾイルオキシ）－２－（（ベンゾイルオキシ）メチル）－２－（（ホスホジエステル－オキシ）メチル）プロピル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－イル）メトキシ）メチル）－２－（（ベンゾイルオキシ）メチル）プロポキシ）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）メチル）－２－Ｏ－ホスホジエステル－プロパン－１，３－ジイルジベンゾエート（化合物６２）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２，２－ビス（１－Ｍｅ－４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ２－Ｏ－Ｂｚ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物５２）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ５）－１－（Ｅｔ－Ｏ－Ａｃ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ｃ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２ｓ－Ｏ－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ７）－１－（Ｅｔ－ＯＢｚ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ｄ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２ｓ－Ｏ－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ３）－１－（Ｅｔ－２，２，２－トリス－（Ｍｅ－Ｏ－Ｂｚ））－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３７ａ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ５）－１－（Ｅｔ－２，２，２－トリス－（Ｍｅ－Ｏ－Ａｃ））－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３７ｂ）、１，２－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－３－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ３－Ｏ－Ｂｚ）－１－（１，２，３－トリアゾール））－プロパン（化合物３１ｄ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２，２－ビス（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ２－）Ｏ－Ｍｅ）－１－（Ｅｔ－Ｏ－Ｂｚ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物４７ｆ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２，２－ビス（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ３－Ｏ－Ｍｅ）－１－（Ｅｔ－２，２，２－トリス－（Ｍｅ－Ｏ－Ｂｚ））－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物４７ｉ）、１，２－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－３－（４－メチルピペラジン－１－イル）－プロパン（化合物２０ｊ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２，２－ビス（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ３）－Ｏ－Ｍｅ）－１－（Ｅｔ－Ｏ－Ｂｚ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物４７ｇ）、および１，１’－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－Ｎ（ｐ－トリル）－ジエタノールアミン（化合物２６ｂ）から選択される２つ以上の反復単位を含むポリマーである、請求項１から１９のいずれか一項に記載の化合物。
- リンカーＡおよびリンカーＢが、スペルミンおよび表１Ａに示される任意の化合物から選択される２つ以上の反復単位を含むポリマーである、請求項１から１９のいずれか一項に記載の化合物。
- リンカーＡおよびリンカーＢが、スペルミンの２つの反復単位を含むポリメラーゼ増強領域を含む、請求項１から１９のいずれか一項に記載の化合物。
- リンカーＡおよびリンカーＢが、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ５）－１－（Ｅｔ－Ｏ－Ａｃ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ｃ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２ｓ－Ｏ－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ７）－１－（Ｅｔ－ＯＢｚ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ｄ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２ｓ－Ｏ－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ３）－１－（Ｅｔ－２，２，２－トリス－（Ｍｅ－Ｏ－Ｂｚ））－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３７ａ）、および１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ５）－１－（Ｅｔ－２，２，２－トリス－（Ｍｅ－Ｏ－Ａｃ））－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３７ｂ）から選択される２つ以上の反復単位を含む移動減速領域を含む、請求項１から２２のいずれか一項に記載の化合物。
- リンカーＡおよびリンカーＢが、（ｉ）［（（ヘキサエチレングリコール）（１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ５）－１－（Ｅｔ－Ｏ－Ａｃ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ｃ））３（ヘキサエチレングリコール）２］、（ｉｉ）［（（ヘキサチレングリコール）（１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ５）－１－（Ｅｔ－Ｏ－Ａｃ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ｃ））４（ヘキサエチレングリコール）２］、（ｉｉｉ）［（（ヘキサチレングリコール）（１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２ｓ－Ｏ－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ７）－１－（Ｅｔ－ＯＢｚ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ｄ））４（ヘキサエチレングリコール）２］、および（ｉｖ）［（（ヘキサチレングリコール）（１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ５）－１－（Ｅｔ－２，２，２－トリス－（Ｍｅ－Ｏ－Ａｃ））－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３７ｂ））４（ヘキサエチレングリコール）２］から選択されるポリマーを含む移動減速領域を含む、請求項１から２２のいずれか一項に記載の化合物。
- リンカーＡが、トリアゾールを含む連結によって前記アルファホスホルアミデートの前記酸素原子に連結している、請求項１から２４のいずれか一項に記載の化合物。
- リンカーＢが、トリアゾールを含む連結によって前記核酸塩基に連結している、請求項１から２４のいずれか一項に記載の化合物。
- 第１の末端および第２の末端を有し、前記第１の末端から前記第２の末端に向かって連続的に、第１のレポーターコード、移動制御エレメントを保有する対称化学分枝鎖、および第２のレポーターコードを含むポリマーを含むレポーター構築物であって、前記移動制御エレメントが、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２Ｓ－Ｏ－ｍＰＥＧ４－プロパン（化合物１２ｂ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２－（４－Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ３）－１－（Ｅｔ－Ｏ－Ａｃ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ｂ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２ｓ－Ｏ－ｍＰＥＧ６－プロパン（化合物１２ｃ）、１，２－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－３－Ｏ－ｍＰＥＧ２－プロパン（化合物１６）、２，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－１－（５－ベンゾフラン）－プロパン（化合物２０ｉ）、１，２－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－３－（４－メチルピペラジン－１－イル）－プロパン（化合物２０ｊ）、２，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－１－（Ｎ１－（２－Ｍｅ－５－ニトロインドール）－プロパン（化合物２０ｇ）、１，８－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－Ｎ，Ｎ－ジエチルピペラジン（化合物２６ｈ）、１，２－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－３－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ３－Ｏ－Ｂｚ））－１－（１，２，３－トリアゾール））－プロパン（化合物３１ｄ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２ｓ－Ｏ－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ２）－１－（Ｅｔ－ＯＢｚ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ａ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ５）－１－（Ｅｔ－Ｏ－Ａｃ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ｃ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２ｓ－Ｏ－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ７）－１－（Ｅｔ－ＯＢｚ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ｄ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２ｓ－Ｏ－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ３）－１－（Ｍｅ－アセテート）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ｅ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２ｓ－Ｏ－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ３）－１－（Ｅｔ－２，２，２－トリス－（Ｍｅ－Ｏ－Ｂｚ））－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３７ａ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ５）－１－（Ｅｔ－２，２，２－トリス－（Ｍｅ－Ｏ－Ａｃ））－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３７ｂ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２Ｓ－Ｏ－（ＰＥＧ４－Ｏ－Ｂｚ）－プロパン（化合物３８ｂ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２，２－ビス（Ｍｅ－Ｏ－ｍＰＥＧ２）－プロパン（化合物４５ｂ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２，２－ビス（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ２－Ｏ－Ｍｅ）－１－（Ｅｔ－Ｏ－Ｂｚ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物４７ｆ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２，２－ビス（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ３－Ｏ－Ｍｅ）－１－（Ｅｔ－Ｏ－Ｂｚ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物４７ｇ、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２，２－ビス（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ３－Ｏ－Ｍｅ）－１－（Ｅｔ－２，２，２－トリス－（Ｍｅ－Ｏ－Ｂｚ））－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物４７ｉ）、または１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２，２－ビス（１－Ｍｅ－４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ２）－Ｏ－Ｂｚ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物５２）から選択される２つ以上の反復単位を含むポリマーである、レポーター構築物。
- 前記対称化学分枝鎖が、１，２，３－Ｏ－トリス－（ホスホジエステル）－プロパン、１，３－ビス－（５－Ｏ－ホスホジエステル－ペンチルアミド）－２－Ｏ－ホスホジエステル－プロパン、および１，４，７－Ｏ－トリス－（ホスホジエステル）－ヘプタンから選択される、請求項２７に記載のレポーター構築物。
- 前記対称化学分枝鎖が１，２，３－Ｏ－トリス－（ホスホジエステル）－プロパンである、請求項２７に記載のレポーター構築物。
- 前記移動制御エレメントが、表１Ａから選択される２つ以上の反復単位を含むポリマーである、請求項２７から２９のいずれか一項記載のレポーター構築物。
- 前記移動制御エレメントが、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２Ｓ－Ｏ－ｍＰＥＧ４－プロパン（化合物１２ｂ）および１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２－（４－Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ３）－１－（Ｅｔ－Ｏ－Ａｃ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ｂ）から選択される２つ以上の反復単位を含むポリマーである、請求項２７から２９のいずれか一項に記載のレポーター構築物。
- 前記移動制御エレメントが、以下の配列：［（１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２Ｓ－Ｏ－ｍＰＥＧ４－プロパン（化合物１２ｂ））］ｎ１［（１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２－（４－Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ３）－１－（Ｅｔ－Ｏ－Ａｃ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ｂ）］ｎ２を含むポリマーであり、式中、ｎ１が０～６であり、ｎ２が６～１０である、請求項２７から２９のいずれか一項に記載のレポーター構築物。
- 前記第１のレポーターコードおよび前記第２のレポーターコードが同一である、請求項２７から３２のいずれか一項に記載のレポーター構築物。
- 前記第１のレポーターコードおよび前記第２のレポーターコードが、ヘキサエチレングリコール（Ｄ）、エタン（Ｌ）、トリアエチレングリコール（Ｘ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２Ｓ－Ｏ－ｍＰＥＧ４－プロパン（化合物１２ｂ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２－（４－Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ３）－１－（Ｅｔ－Ｏ－Ａｃ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ｂ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２，２－ビス（Ｍｅ－Ｏ－ｍＰＥＧ２）－プロパン（化合物４５ｂ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２Ｓ－Ｏ－（ＰＥＧ４－Ｏ－Ｂｚ）－プロパン（化合物３８ｂ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２ｓ－Ｏ－ｍＰＥＧ６－プロパン（化合物１２ｃ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２ｓ－Ｏ－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ３）－１－（Ｅｔ－２，２，２－トリス－（Ｍｅ－Ｏ－Ｂｚ））－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３７ａ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２ｓ－Ｏ－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ３）－１－（Ｍｅ－アセテート）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ｅ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２ｓ－Ｏ－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ２）－１－（Ｅｔ－ＯＢｚ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ａ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２－（４－Ｅｔ－１－（Ｅｔ－Ｏ－ｍＰＥＧ１）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３１ａ）、２，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－１－（１ージメトキシキナゾリンジオン）－プロパン（化合物２０ｃ）、２，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－１－（Ｎ９－（３，６－ジメトキシカルバゾール）－プロパン（化合物２０ｅ）、１，１’－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２，２’－（スルホニルビス（ベンズ－４－イル））－ジエタノール（化合物２６ｄ）、１，１’－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２，２’－ビピリジン－４，４’－イル）－ジメタノール（化合物２６ａ）、２，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－１－（Ｎ１－（４，６－ジメトキシ－３－Ｍｅ－インドール）－プロパン（化合物２０ｂ）、３－（１，２－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－プロピル）－８，８－ジメチルヘキサヒドロ－３Ｈ－３ａ、６－メタノベンゾ［ｃ］イソチアゾール２，２－ジオキシド（化合物２０ｄ）、２，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－１－（Ｎ１－（６－アザチミン））－プロパン（化合物２０ｆ）、１，５－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－ヘキサヒドロフロ［２，６］フラン（化合物２３）、１，１’－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－オクタヒドロ－２，６－ジメチル－３，８：４，７－ジメタノ－２，６－ナフチリジン－４，８－ジイル）－ジメタノール（化合物２６ｅ）、２，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－１－（Ｎ１－（２－Ｍｅ－５－ニトロインドール）－プロパン（化合物２０ｈ）、２，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－１－（Ｎ１－（２－Ｍｅ－５－ニトロインドール）－プロパン（化合物２０ｇ）、２，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－１－（５－ベンゾフラン）－プロパン（化合物２０ｉ）、１，２－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－３－Ｏ－ｍＰＥＧ２－プロパン（化合物５ｂ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２－（４－Ｅｔ－１－（Ｅｔ－Ｏ－ｍＰＥＧ３）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３１ｂ）、および１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－３－Ｏ－ｍＰＥＧ４－プロパン（化合物５ａ）から選択される２つ以上の反復単位を含むポリマーである、請求項２７から３２のいずれか一項に記載のレポーター構築物。
- 前記第１のレポーターコードおよび前記第２のレポーターコードが、ヘキサエチレングリコール、エタン、トリアエチレングリコール、および表１Ａに示される任意の化合物から選択される２つ以上の反復単位を含むポリマーである、請求項２７から３２のいずれか一項に記載のレポーター構築物。
- 前記第１のレポーターコードおよび前記第２のレポーターコードが、ヘキサエチレングリコール、エタン、トリアエチレングリコール、および１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２Ｓ－Ｏ－ｍＰＥＧ４－プロパン（化合物１２ｂ）から選択される２つ以上の反復単位を含むポリマーである、請求項２７から３２のいずれか一項に記載のレポーター構築物。
- 前記第１のレポーターコードおよび前記第２のレポーターコードが、（ｉ）［（ヘキサエチレングリコール）２（エタン）３（ヘキサエチレングリコール）（トリアエチレングリコール）］、（ｉｉ）［（ヘキサエチレングリコール）２（１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２Ｓ－Ｏ－ｍＰＥＧ４－プロパン（化合物１２ｂ））２（エタン）（トリアエチレングリコール）３］、（ｉｉｉ）［（ヘキサエチレングリコール）２（１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２Ｓ－Ｏ－ｍＰＥＧ４－プロパン（化合物１２ｂ））３（エタン）２（ヘキサエチレングリコール）（トリアエチレングリコール）］、および（ｉｖ）［（トリアエチレングリコール）２（エタン）（１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－２Ｓ－Ｏ－ｍＰＥＧ４－プロパン（化合物１２ｂ））６（エタン）７］から選択される配列を含むポリマーである、請求項２７から３２のいずれか一項に記載のレポーター構築物。
- 対称的に合成されたレポーターテザー（ＳＳＲＴ）であって、前記対称的に合成されたレポーターテザーが、第１の末端および第２の末端を有し、前記第１の末端から前記第２の末端まで連続的に、第１のリンカー、請求項２７から３７のいずれか一項に記載のレポーター構築物、および第２のリンカーを含むポリマーであり、前記第１のリンカーおよび前記第２のリンカーが同一であり、スペルミン（Ｑ）、ヘキサエチレングリコール（Ｄ）、２－（（４－（（３－（ベンゾイルオキシ）－２－（（（１－（３－（ベンゾイルオキシ）－２－（（ベンゾイルオキシ）メチル）－２－（（ホスホジエステル－オキシ）メチル）プロピル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－イル）メトキシ）メチル）－２－（（ベンゾイルオキシ）メチル）プロポキシ）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）メチル）－２－Ｏ－ホスホジエステル－プロパン－１，３－ジイルジベンゾエート（化合物６２）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２，２－ビス（１－Ｍｅ－４）－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ２－Ｏ－Ｂｚ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物５２）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ５）－１－（Ｅｔ－Ｏ－Ａｃ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ｃ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２ｓ－Ｏ－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ７）－１－（Ｅｔ－ＯＢｚ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ｄ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２ｓ－Ｏ－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ３）－１－（Ｅｔ－２，２，２－トリス－（Ｍｅ－Ｏ－Ｂｚ））－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３７ａ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ５）－１－（Ｅｔ－２，２，２－トリス－（Ｍｅ－Ｏ－Ａｃ））－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３７ｂ）、１，２－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－３－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ３－Ｏ－Ｂｚ）－１－（１，２，３－トリアゾール））－プロパン（化合物３１ｄ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２，２－ビス（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ２－Ｏ－Ｍｅ）－１－（Ｅｔ－Ｏ－Ｂｚ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物４７ｆ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２，２－ビス（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ３－Ｏ－Ｍｅ）－１－（Ｅｔ－２，２，２－トリス－（Ｍｅ－Ｏ－Ｂｚ））－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物４７ｉ）、１，２－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－３－（４－メチルピペラジン－１－イル）－プロパン（化合物２０ｊ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２，２－ビス（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ３－Ｏ－Ｍｅ）－１－（Ｅｔ－Ｏ－Ｂｚ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物４７ｇ）、および１，１’－Ｏ－ビス（ホスホジエステル）－Ｎ（ｐ－トリル）－ジエタノールアミン（化合物２６ｂ）から選択される２つ以上の反復単位を含むポリマーである、レポーターテザー。
- 前記第１のリンカーおよび前記第２のリンカーが、スペルミンの二つの反復単位を含むポリメラーゼ増強領域を含む、請求項３８に記載の対称的に合成されたレポーターテザー（ＳＳＲＴ）。
- １，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ５）－１－（Ｅｔ－Ｏ－Ａｃ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ｃ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２ｓ－Ｏ－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ７）－１－（Ｅｔ－ＯＢｚ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ｄ）、１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２ｓ－Ｏ－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ３）－１－（Ｅｔ－２，２，２－トリス－（Ｍｅ－Ｏ－Ｂｚ））－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３７ａ）、および１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ５）－１－（Ｅｔ－２，２，２－トリス－（Ｍｅ－Ｏ－Ａｃ））－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３７ｂ）から選択される２つ以上の反復単位を含む移動減速領域を含む、請求項３８または３９に記載の対称的に合成されたレポーターテザー（ＳＳＲＴ）。
- （ｉ）［（（ヘキサエチレングリコール）（１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ５）－１－（Ｅｔ－Ｏ－Ａｃ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ｃ））３（ヘキサエチレングリコール）２］、（ｉｉ）［（（ヘキサチレングリコール）（１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ５）－１－（Ｅｔ－Ｏ－Ａｃ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ｃ））４（ヘキサエチレングリコール）２］、（ｉｉｉ）［（（ヘキサチレングリコール）（１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２ｓ－Ｏ－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ７）－１－（Ｅｔ－ＯＢｚ）－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３５ｄ））４（ヘキサエチレングリコール）２］、および（ｉｖ）［（（ヘキサチレングリコール）（１，３－Ｏ－ビス（ホスホジエステル－２－（４－（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ５）－１－（Ｅｔ－２，２，２－トリス－（Ｍｅ－Ｏ－Ａｃ））－１，２，３－トリアゾール）－プロパン（化合物３７ｂ））４（ヘキサエチレングリコール）２］から選択されるポリマーを含む移動減速領域を含む、請求項３８または３９に記載の対称的に合成されたレポーターテザー（ＳＳＲＴ）。
- 前記第１の末端および前記第２の末端が連結部分を含む、請求項３８から４１のいずれか一項に記載の対称的に合成されたレポーターテザー（ＳＳＲＴ）。
- 前記連結部分がアジド（－Ｎ３）基を含む、請求項４２に記載の対称的に合成されたレポーターテザー（ＳＳＲＴ）。
- 標的核酸を配列決定するための方法であって、ａ）鋳型指向性合成によって産生された娘鎖を提供し、前記娘鎖が、前記標的核酸の全部または一部の連続的なヌクレオチド配列に対応する配列でカップリングされた請求項１に記載の複数のＸＮＴＰサブユニットを含み、前記娘鎖の個々の前記ＸＮＴＰサブユニットが、レポーター構築物、核酸塩基残基、および選択的に切断可能な結合を含み、前記レポーター構築物が、前記選択的に切断可能な結合の切断時に、前記娘鎖の前記サブユニットの伸長を可能にすること、ｂ）前記選択的に切断可能な結合を切断して、前記複数の前記娘鎖の前記サブユニットよりも長い長さのＸｐａｎｄｏｍｅｒを生じさせ、前記Ｘｐａｎｄｏｍｅｒが、前記標的核酸の全部または一部の前記連続的なヌクレオチド配列に対応する配列中の遺伝情報を解析するための前記レポーター構築物を含むこと、およびｃ）前記Ｘｐａｎｄｏｍｅｒの前記レポーター構築物を検出することを含む、方法。
- 前記遺伝情報を解析するための前記レポーター構築物が、レポーターコードおよび移動制御エレメントを含み、前記移動制御エレメントが、立体障害による移動制御を提供し、ベースライン電圧に供されたナノポアを通過するときに前記Ｘｐａｎｄｏｍｅｒの移動を一時停止させ、前記移動制御エレメントが、前記ナノポアの開口部内で前記レポーターコードと係合し、前記レポーターコードが前記ナノポアによって感知される、請求項４４に記載の方法。
- 前記Ｘｐａｎｄｏｍｅｒがパルス電圧の印加によって前記ナノポアを通過する移動を再開し、前記パルス電圧が、前記移動制御エレメントの移動を可能にするのに十分である一方で、前記Ｘｐａｎｄｏｍｅｒの次のレポーター構築物が、前記ナノポアと自由に係合できるままである、請求項４４に記載の方法。
- 立体障害によって前記ナノポアと係合した前記レポーター構築物の前記移動制御エレメントが、前記パルス電圧の各パルス時に移動する、請求項４５に記載の方法。
- 標的構築物が、前記パルス電圧のパルス間の期間中に前記ナノポアによって感知される、請求項４５に記載の方法。
- 前記ベースライン電圧が約５５ｍＶ～約７５ｍＶである、請求項４４に記載の方法。
- 前記パルス電圧が約５５０ｍＶ～約７００ｍＶである、請求項４５に記載の方法。
- 前記パルス電圧が、約５μｓ～約１０μｓの持続期間を有する、請求項４５に記載の方法。
- 前記パルス電圧の周期性が約０．５ｍｓ～１．５ｍｓである、請求項４５に記載の方法。
- 前記ナノポアが交流（ＡＣ）に供される、請求項４４に記載の方法。
- 前記複数のＸＮＴＰサブユニットの１つ以上が、２’フルオロアラビノシルエピマーを含む、請求項４４から５３のいずれか一項に記載の方法。
- ＮＨ４Ｃｌ、ＭｇＣｌ２、ＬｉＣｌ、ＫＣｌ、ＣｓＣｌ、ＮａＣｌおよびＣａＣｌ２からなる群から選択される少なくとも１つの塩を含む、ナノポアを通過するポリマーの移動速度を制御するための緩衝剤。
- ３－メチル－２－オキサゾリジノン（ＭＯＡ）、ＤＭＦ、ＡＣＮ、ＤＭＳＯおよびＮＭＰからなる群から選択される少なくとも１つの溶媒をさらに含み、前記溶媒が約１％体積／体積～約３５％体積／体積の範囲で存在する、請求項５５に記載の緩衝剤。
- ヘキサン酸ナトリウム（ＮａＨｅｘ）、ＥＤＴＡ、レドックス試薬、ＰＥＧ、グリセロール、およびフィコール等からなる群から選択される少なくとも１つの添加剤をさらに含む、請求項５５に記載の緩衝剤。
- シス緩衝剤およびトランス緩衝剤を含むナノポア検出器を通過するポリマーの移動速度を制御するための緩衝システムであって、前記シス緩衝剤が第１の塩濃度を含み、前記トランス緩衝剤が第２の塩濃度を含み、前記第１の塩濃度が前記第２の塩濃度よりも低い、緩衝システム。
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