JP2022534770A - ハイブリッド配位子およびハイブリッド配位子を含む液体クロマトグラフィー固定相 - Google Patents

ハイブリッド配位子およびハイブリッド配位子を含む液体クロマトグラフィー固定相 Download PDF

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Abstract

組成物はハイブリッド配位子を含む。ハイブリッド配位子はアミン基、アミド基またはスルホンアミド基、およびヒドロキシル基を含む。第１の方法は、第１の極性分析種および第２の極性分析種を含有する溶液を用意するステップと、固定化ハイブリッド配位子を含む固定相に溶液を適用するステップと、第１の極性分析種および第２の極性分析種が異なる溶出時間で固定相を通過するように、固定相に溶離溶媒を適用するステップと、第１の溶出時間で第１の極性分析種を集めるステップ、および第１の溶出時間の後に第２の溶出時間で第２の極性分析種を集めるステップとを含む。充填カラム、カートリッジ、チューブ、ウェルプレート、膜または平らな薄層クロマトグラフィープレートのデバイスは、固体担体、および固体担体とカップリングされたハイブリッド配位子を含む。第２の方法は固定化ハイブリッド配位子を形成する。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
[0001]本出願は、２０１９年５月３０日に出願された米国特許仮出願第６２／８５４，４７３号の利益および優先権を主張し、その全体は参照によって本明細書に組み込まれる。
[0002]本開示は、一般に、配位子を対象とする。とりわけ、本開示は、アミン基、アミドまたはスルホンアミド基および多数のヒドロキシル基を有する部分を含むハイブリッド配位子、固体担体への配位子の生成および固定化の方法、固定化ハイブリッド配位子を含む液体クロマトグラフィー固定相、ならびに広範囲の極性分析種を分離するためのクロマトグラフィー固定相における固定化配位子の適用を対象とする。
[0003]極性分析種は、通常、Ｃ１８カラムなどの逆相カラムでは、保持が最小の保持を示すかまたは保持を全く示さない。他のタイプの固定相が、この保持の問題を解決するために開発されている。特に、親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）は好評を博している。従来のＨＩＬＩＣ固定相は、むき出しのシリカ、および様々な基の中でも、ジオール基、多数のヒドロキシル基、アミド基または双性イオン基を含有する配位子を含む。しかしながら、方法の開発および方法の頑丈さにまつわる困難は、ＨＩＬＩＣの採用に対する難問であった。一方、極性分析種は、陽イオン性基（例えば、プロトン化した塩基性アミン）、陰イオン性基（例えば、イオン化したカルボン酸またはスルホン酸）、中性基および／または混合した性質を有する基の存在に基づく様々な物理化学的性質を有し得る。これらの性質が、単一の固定相またはクロマトグラフィーカラムを用いて極性分析種をクロマトグラフィーで分離するのを困難にすることがある。
[0004]分離困難な極性分析種の例は、アミノ酸；極性の酸性除草剤、例えば、グリホセート、アミノメチルホスホン酸およびグルホシネート；中性グリコシル化化合物；水溶性ビタミン；有機酸；炭水化物；ペプチド；ならびにヌクレオシドおよびヌクレオチドを含む。
[0005]一実施形態において、組成物はハイブリッド配位子を含む。ハイブリッド配位子は、アミン基、アミド基またはスルホンアミド基、および複数のヒドロキシル基を含む。
[0006]別の実施形態において、極性分析種を分離する方法は、第１の極性分析種および第２の極性分析種を含有する溶液を用意するステップを含む。方法はまた、固定化ハイブリッド配位子を含む固定相に溶液を適用するステップを含む。固定化ハイブリッド配位子は、アミン基、アミド基またはスルホンアミド基、および複数のヒドロキシル基を含む。方法は、第１の極性分析種および第２の極性分析種が異なる溶出時間で固定相を通過するように、固定相に溶離溶媒を適用するステップをさらに含む。方法はまた、第１の溶出時間で固定相を出る第１の極性分析種を集めるステップ、および第１の溶出時間の後に第２の溶出時間で固定相を出る第２の極性分析種を集めるステップを含む。
[0007]別の実施形態において、デバイスは、固体担体および固定相として固体担体にカップリングされたハイブリッド配位子を含むクロマトグラフィーの材料を含む。ハイブリッド配位子は、アミン基、アミド基またはスルホンアミド基、および複数のヒドロキシル基を含む。ハイブリッド配位子は、式－Ｒ－（ＣＨ２）ｘ－Ｎ（Ｒ１）（Ｒ２）－（ＣＨ２）ｙ－ＮＨ－Ｒ３－（ＣＨＯＨ）ｚ－Ｒ４［式中、Ｒは、固体担体に結合した官能基を表し；ｘ、ｙおよびｚはそれぞれ独立に、２～１０の範囲の整数であり；Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立に、Ｈ、Ｃ１～Ｃ４アルキル基またはアリール基であり；Ｒ３はＣ（Ｏ）またはＳ（Ｏ）（Ｏ）であり；Ｒ４はＨ、ＣＨ３またはＣＯＯＨである］のものである。デバイスは、充填カラム、カートリッジ、チューブ、ウェルプレート、膜、または平らな薄層クロマトグラフィープレートであってもよい。
[0008]さらに別の実施形態において、固定化ハイブリッド配位子を形成する方法は、連結分子を用意するステップを含む。連結分子は、固体担体カップリング末端基を含む第１の末端；第一級アミン末端基または第二級アミン末端基を含む、第１の末端と反対の第２の末端；および固体担体カップリング末端基と、第一級アミン末端基または第二級アミン末端基との間の連結分子の骨格上にアミン基を含む。方法はまた、固体担体カップリング末端基を介して固体担体に第１の末端で連結分子を共有結合でカップリングさせるステップを含む。方法は、アミド結合およびスルホンアミド結合からなる群から選択される末端結合によって、末端分子に第２の末端で連結分子を共有結合でカップリングさせるステップをさらに含む。末端分子は複数のヒドロキシル基を含む。
[0009]本発明の他の特徴および利点は、例として、本発明の原理を例示する添付の図面と組み合わせて下記のより詳細な記載から明らかになるであろう。
[0010]本開示の固定化ハイブリッド配位子の固体１３Ｃ核磁気共鳴スペクトルを示す図である。 [0011]本開示のハイブリッド配位子の赤外スペクトルを示す図である。 [0012]本開示の固定化ハイブリッド配位子の７つの異なるロットの再現性を示す図である。 [0013]本開示の固定化ハイブリッド配位子を用いてアミノ酸のＬＣ／ＭＳ分離の結果を示す図である。 [0014]溶離パラメーターの第１の一組の下で本開示の固定化ハイブリッド配位子を用いた、極性の酸性除草剤のＬＣ／ＭＳ分離の結果を示す図である。 [0015]溶離パラメーターの第２の一組の下で本開示の固定化ハイブリッド配位子を用いた、極性の酸性除草剤のＬＣ／ＭＳ分離の結果を示す図である。 [0016]高アセトニトリル条件下で本開示の固定化ハイブリッド配位子を用いた、中性グリコシル化分析種のＨＩＬＩＣ分離の結果を示す図である。 [0017]本開示の固定化ハイブリッド配位子を用いた、水溶性ビタミンの陰イオン交換分離／静電気反発作用の結果を示す図である。 [0018]本開示の固定化ハイブリッド配位子を用いた、チアミンピロリン酸エステルのＬＣ／ＭＳ分離の結果を示す図である。 [0019]本開示の固定化ハイブリッド配位子を用いた、有機酸のＬＣ／ＭＳ分離の結果を示す図である。
[0020]同一の参照番号は、可能な限り、図面の全体にわたって同一の部分を表すために用いられる。
[0021]固体担体に固定化されたハイブリッド配位子は固定相を形成する。ハイブリッド配位子は多数の官能基を有し、固体担体に固定化される場合、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）、親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）、およびＡＥＸとＨＩＬＩＣの組み合わせを含む、多モードのクロマトグラフィーの保持および分離メカニズムを提供する。ハイブリッドＡＥＸ－ＨＩＬＩＣ ＨＰＬＣカラムは、様々な極性化合物を分離し溶離することができる。
[0022]幾つかの実施形態において、ハイブリッド固定相は、固体担体に固定化された多数の官能基を有する配位子を含み、固定相として極性分析種のカラム液体クロマトグラフィー分離のために使用される。固定相の官能基は、陰イオン交換部分、例えば、第二級、第三級または第四級アミン、アミドまたはスルホンアミド、および多数のヒドロキシル基などを含む。ハイブリッド固定相は、陰イオン交換相互作用、親水性相互作用クロマトグラフィー、およびこれら２つのモードの混合または組み合わせを含むが、これらに限定されない多数の分離メカニズムを提供する。好適な固体担体材料は、球状シリカ、無機／有機ハイブリッドシリカ粒子、ポリマー粒子、３Ｄ印刷シリカもしくはポリマー担体、およびシリカ系モノリスまたはポリマー系モノリスを含むことができるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、ハイブリッド固定相を含む修飾固体担体は、カラムフォーマットに詰められ、酸性除草剤、有機酸、アミノ酸、水溶性ビタミン、糖、ヌクレオシド、ヌクレオチド、薬物代謝物、およびペプチドを含むが、これらに限定されない様々な極性分析種の液体クロマトグラフィー分離に適用可能である。
[0023]ハイブリッド配位子の化学構造は、好ましくはハイブリッドＡＥＸ、ＨＩＬＩＣ、および／またはＡＥＸとＨＩＬＩＣの組み合わせによる少なくとも１種の通常の極性官能基を有する多数の極性分析種のクロマトグラフィー分離を可能にするために選択される。幾つかの実施形態において、ハイブリッド配位子は、アミン、アミドまたはスルホンアミド、および多数のヒドロキシル基を含む。
[0024]例示的な実施形態において、アミン窒素およびアミド窒素および炭素、またはスルホンアミド窒素および硫黄は、配位子の骨格の一部である。アミンはイオン交換部分として役立つ。ヒドロキシル基は、好ましくは配位子の骨格炭素から離れて、直接延在するペンダント基である。例示的な実施形態において、アミン窒素は、固体担体に最も近接し、アミドまたはスルホンアミド基は中間にあり、ヒドロキシル基は固体担体から最も遠いが、他の順序付けも同様に用いられてもよい。例示的な実施形態において、ハイブリッド配位子は、アミン、アミドまたはスルホンアミド、ヒドロキシル基、およびハイブリッド配位子を固体担体にカップリングさせる官能基を除く他の官能基を含まない。
[0025]幾つかの実施形態において、ハイブリッド配位子は下記式：
Ｒ－（ＣＨ２）ｘ－Ｎ（Ｒ１）（Ｒ２）－（ＣＨ２）ｙ－ＮＨ－Ｒ３－（ＣＨＯＨ）ｚ－Ｒ４ （１）
［式中、Ｒは、固体担体に結合することができる官能基または固体担体に結合した官能基を表し；ｘ、ｙおよびｚはそれぞれ独立に、２～１０、例えば、２～４、２～６、２～８、３～６、３～８、３～１０、４～６、４～８、４～１０などの範囲の、２、３、４、５、６、７、８、９または１０などの整数であり；Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立に、Ｈ、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３またはＣ４アルキル基、アリール基、または非結合電子対であり；Ｒ３はＣ（Ｏ）またはＳ（Ｏ）（Ｏ）であり；Ｒ４はＨ、ＣＨ３またはＣＯＯＨである］
を有する。幾つかの実施形態において、ｘ、ｙ、ｚ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の１つまたは複数は、特定の分析種の分離を高めるためのハイブリッド配位子をカスタマイズするために選択される。
[0026]幾つかの実施形態において、ｘ、ｙ、ｚ、Ｒ１およびＲ２の１つまたは複数は、ハイブリッド配位子の疎水性を減少または低下させるために選択される。幾つかのそのような実施形態において、ｘおよびｙはそれぞれ独立に、２～３の範囲の整数である。幾つかのそのような実施形態において、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立に、ＨまたはＣＨ３である。
[0027]幾つかの実施形態において、固体担体はシリカである。幾つかの実施形態において、配位子はシラノール基を介してシリカ表面に連結される。幾つかの実施形態において、上記式（１）中でＲによって表されるシリカに結合することができる官能基は、下記式：
Ｒ５－Ｏ－Ｓｉ（Ｒ６）（Ｒ７）－ （２）
［式中、Ｒ５はメチル基またはエチル基であり、Ｒ６およびＲ７はそれぞれ独立にＣ１～Ｃ４アルキル基またはアルコキシ基である］
を有する。
[0028]例示的な実施形態において、固定化ハイブリッド配位子を形成する方法は、連結分子を用意するステップを含む。連結分子は、固体担体カップリング末端基を含む第１の末端、第一級アミン末端基を有する第１の末端と反対の第２の末端、および固体担体カップリング末端基と第一級アミン末端基との間の連結分子の骨格上のアミン基を含む。方法はまた、固体担体カップリング末端基を介して第１の末端で固体担体に連結分子を共有結合でカップリングさせるステップを含む。方法は、アミド結合またはスルホンアミド結合である末端結合によって末端分子に第２の末端で連結分子を共有結合でカップリングさせるステップをさらに含む。末端分子は、多数のヒドロキシル基を含む。
[0029]幾つかの実施形態において、式（１）のハイブリッド配位子の合成は、１種または複数の極性溶媒中でジアミンシラン連結分子の、ラクトン末端分子との反応によって達成されて、２つの反応体間のアミド結合連結を形成する。ラクトンは、２個以上のヒドロキシル基を含む。好適なラクトンは、アラビノ－１，４－ラクトン、フコノ－１，４－ラクトン、ガラクトノ－１，４－ラクトン、グルコノラクトン、ラムノノ－１，４－ラクトン、リボノ－１，４－ラクトンおよびトレオノ－１，４－ラクトンを含んでもよいが、これらに限定されない。ジアミンシランは、第一級アミン、第二級、第三級または第四級アミンを含む。好適なジアミンシランは、下記式：
Ｒ－（ＣＨ２）ｘ－Ｎ（Ｒ１）（Ｒ２）－（ＣＨ２）ｙ－ＮＨ２ （３）
［式中、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、ｘおよびｙは式（１）に関しての記載と同じである］
を有することができる。
[0030]幾つかの実施形態において、シリカのシラノール基を介するシリカへの合成ハイブリッド配位子（シラン）の結合は、合成に関して同一の極性溶媒中でシリカを用いて合成されたシランを加熱することによって達成される。合成および結合のための好適な極性溶媒は、メタノール、エタノール、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）およびその組み合わせを含む。
[0031]幾つかの実施形態において、固体担体はシリカ粒子である。シリカ粒子は球状であっても、非球状であってもよい。幾つかの実施形態において、球状シリカ粒子は、１０ｎｍ～１００μｍ、代替として１０ｎｍ～１μｍ、代替として１０ｎｍ～１００ｎｍ、代替として１００ｎｍ～１μｍ、代替として１００ｎｍ～１０μｍ、代替として１μｍ～１００μｍ、代替として１μｍ～１０μｍ、代替として１０μｍ～１００μｍの範囲、またはその間の任意の値、その間の範囲もしくは部分範囲の直径を有する。幾つかの実施形態において、非球状シリカ粒子は、１０ｎｍ～１００μｍ、代替として１０ｎｍ～１μｍ、代替として１０ｎｍ～１００ｎｍ、代替として１００ｎｍ～１μｍ、代替として１００ｎｍ～１０μｍ、代替として１μｍ～１００μｍ、代替として１μｍ～１０μｍ、代替として１０μｍ～１００μｍの範囲、またはその間の任意の値、その間の範囲もしくは部分範囲の最大寸法を有する。シリカ粒子は、多孔性であっても非多孔性であってもよい。多孔性のシリカ粒子は完全に多孔性であっても、または表面が多孔性であってもよい。幾つかの実施形態において、多孔性のシリカ粒子の孔の孔径は、１０Å～１０００Å、代替として１０Å～１００Å、代替として１００Å～１０００Åの範囲、またはその間の任意の値、その間の範囲もしくは部分範囲にある。
[0032]幾つかの実施形態において、固体担体は無機／有機ハイブリッド粒子である。無機／有機ハイブリッド粒子は球状であっても非球状であってもよい。幾つかの実施形態において、球状のハイブリッド粒子は、１０ｎｍ～１００μｍ、代替として１０ｎｍ～１μｍ、代替として１０ｎｍ～１００ｎｍ、代替として１００ｎｍ～１μｍ、代替として１００ｎｍ～１０μｍ、代替として１μｍ～１００μｍ、代替として１μｍ～１０μｍ、代替として１０μｍ～１００μｍの範囲、またはその間の任意の値、その間の範囲もしくは部分範囲の直径を有する。幾つかの実施形態において、非球状のハイブリッド粒子は、１０ｎｍ～１００μｍ、代替として１０ｎｍ～１μｍ、代替として１０ｎｍ～１００ｎｍ、代替として１００ｎｍ～１μｍ、代替として１００ｎｍ～１０μｍ、代替として１μｍ～１００μｍ、代替として１μｍ～１０μｍ、代替として１０μｍ～１００μｍの範囲、またはその間の任意の値、その間の範囲もしくは部分範囲の最大寸法を有する。ハイブリッド粒子は多孔性であっても非多孔性であってもよい。多孔性のハイブリッド粒子は、完全に多孔性であっても、または表面が多孔性であってもよい。幾つかの実施形態において、多孔性のハイブリッド粒子の孔の孔径は、１０Å～１０００Å、代替として１０Å～１００Å、代替として１００Å～１０００Åの範囲、またはその間の任意の値、その間の範囲もしくは部分範囲にある。
[0033]幾つかの実施形態において、固体担体はポリマー粒子である。固体担体のポリマー粒子として好適な材料は、ポリスチレンジビニルベンゼン（ＰＳＤＶＢ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、およびポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）を含むことができるが、これらに限定されない。
[0034]幾つかの実施形態において、固体担体は、シリカ系モノリス、ハイブリッド無機／有機モノリス、またはポリマー系モノリスである。モノリスは多孔性であっても非多孔性であってもよい。幾つかの実施形態において、多孔性のモノリスの孔の孔径は、１０Å～１０００Å、代替として１０Å～１００Å、代替として１００Å～１０００Åの範囲、またはその間の任意の値、その間の範囲もしくは部分範囲にある。
[0035]幾つかの実施形態において、固定相は充填カラム用の充填材料である。幾つかの実施形態において、カラムは、０．５ｃｍ～５０ｃｍ、代替として０．５ｃｍ～５ｃｍ、代替として５ｃｍ～５０ｃｍの範囲、またはその間の任意の値、その間の範囲もしくは部分範囲の長さを有し、５０μｍ～５０ｃｍ、代替として５０μｍ～５ｍｍ、代替として５００μｍ～５ｃｍ、代替として５０μｍ～５００μｍ、代替として５００μｍ～５ｍｍ、代替として５ｍｍ～５０ｃｍ、代替として５ｍｍ～５ｃｍ、代替として５ｃｍ～５０ｃｍの範囲、またはその間の任意の値、その間の範囲もしくは部分範囲の内径を有する。カラムとしての好適な材料は、ステンレス鋼、ガラス、溶融シリカおよびポリマーを含むことができるが、これらに限定されない。
[0036]幾つかの実施形態において、固定相は、カートリッジ中、チューブ中またはウェルプレートに含まれる。
[0037]ハイブリッド配位子を含むクロマトグラフィーカラムは、溶離される極性分析種およびカラムに適用される溶媒または溶媒のグラジエントに応じて、ＡＥＸ ＨＩＬＩＣカラムまたはその組み合わせとして役立つことができる。ハイブリッド配位子が異なるクロマトグラフィーの保持および分離メカニズムをもたらす異なる官能基を含むので、多モードのクロマトグラフィー分離は単一のハイブリッド配位子に基づいた固定相を用いて達成することができる。
[0038]幾つかの実施形態において、極性分析種を分離する方法は、第１の極性分析種および第２の極性分析種を含有する溶液を用意するステップを含む。方法はまた、固定化ハイブリッド配位子を含む固定相に溶液を適用するステップを含む。固定化ハイブリッド配位子は、アミン基、アミド基またはスルホンアミド基、および多数のヒドロキシル基を含む。方法は、第１の極性分析種および第２の極性分析種が異なる溶出時間で固定相を通過するように、固定相に溶離溶媒を適用するステップをさらに含む。方法はその上、第１の溶出時間に固定相を出る第１の極性分析種を集めるステップ、および第１の溶出時間の後に第２の溶出時間に固定相を出る第２の極性分析種を集めるステップをさらに含む。方法は、第１の溶出時間に固定相を出る第１の極性分析種を検出するステップ、および第１の溶出時間の後第２の溶出時間に固定相を出る第２の極性分析種を検出するステップをさらに含んでもよい。
[0039]配位子のアミン基は、陰イオン交換官能性を与え、ハイブリッド配位子は総じてＨＩＬＩＣ官能性を与える。混合モードは、アミノ酸などの酸性基と塩基性基の両方を含む分離分析種において殊に有益である。
[0040]本発明は、限定ではなく例示として提示される、以下の実施例の文脈においてさらに記載される。
実施例１
[0041]３－（２－アミノエチルアミノ）プロピルジメトキシメチルシランのＤ－（＋）－グルコン酸δ－ラクトンとの反応によって、無水ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、エタノール、メタノールまたはその混合物中、不活性アルゴン雰囲気下で終夜ハイブリッド配位子を合成した。同一の合成溶媒中で、多孔性または非多孔性のシリカゲル粒子に、合成したハイブリッド配位子を、６０℃で合成粗製物をシリカと終夜加熱することによって結合して、式（４）：
Figure 2022534770000001
［式中、式（４）中のシリカに結合した酸素は、シリカのシリコン原子に結合している］
の固定化ハイブリッド配位子を形成した。
実施例２
[0042]ワンポット法は、混合２：１ ＤＭＦ：エタノール（ｖ／ｖ）または２：１ ＤＭＦ：メタノール（ｖ／ｖ）溶媒中で、式（４）のハイブリッド配位子を生成し、それを５．５ｇの表面が多孔性のシリカ粒子に固定化した。
[0043]このワンポット法において、同一のフラスコおよび溶媒中で配位子の生成およびシリカへの固定化を同時に遂行した。最初に５．５ｇの量の表面が多孔性のシリカ粒子（２．７μｍ、～９０Å、～１２０ｍ２／ｇ）を加熱し、２５０ｍＬの三首フラスコ中で終夜真空乾燥して、６０℃に冷ました。フラスコに栓をし、オーブンから取り出し、換気フードへ移した。換気フード内では、制御器を備えた加熱マントルにフラスコを置き、栓の１つを取り除きそれを２４／４０のフリットガス入口に置き換えることによって、その中身を直ちに乾燥アルゴン圧力下で保護した。次いで、別の栓を取り外し、長さ２０～２５ｃｍの、先に乾燥しておいた２４／４０の還流凝縮器に取り替えた。不活性媒体を含有する２４／４０ガスバブラーを凝縮器の頂部に配置し、大気の侵入を防止するためにバブラーを通して漏れるガスによって監視しながらフラスコ内の最小限の陽圧を維持するようにガス流動を調整した。添加漏斗へ１２０ｍＬの量の無水ＤＭＦおよび６０ｍＬの量の無水エタノール（またはメタノール）をカニューレで挿入し、撹拌しながらシリカと混合した。シリカが分散したら、フラスコへＤ－（＋）－グルコン酸δ－ラクトン１．１ｇ、次いで３－（２－アミノエチルアミノ）プロピルジメトキシメチルシラン１．２ｍＬを添加した。フラスコは栓を用いて蓋をし、アルゴン下で維持した。気泡が３～５秒ごとに出て来るように、アルゴン比率を調節した。反応物（フラスコ中の混合物）を撹拌しながら３５℃に加熱し、終夜維持した。
[0044]反応の後、１ｍｍ厚、１μｍ孔径のポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）フィルターディスクを装備した開放型濾過フラスコに混合物を移した。母液は除去し、次いで、第２、第３の洗浄に真空を適用する前に、初めの洗浄溶媒中スパチュラで毎回撹拌することによって粒子を再懸濁するように注意して、結果として得られた結合したシリカ粒子の塊をメタノール１００ｍＬで３回洗浄した。同一の再懸濁液技法を組み込んで、次に、水中８０％メタノール（ｖ／ｖ）１００ｍＬを用いて３回、次いで最終的にアセトニトリル１００ｍＬを用いて３回シリカを洗浄した。最終溶媒洗浄の後、設備をなお真空下においたままおよそ２０分間濾過ケーキを空気乾燥して、さらさらした粉末を生成し、これを乾燥皿に移して真空オーブン内６０℃で少なくとも２０時間乾燥した。
[0045]ＣＨＮ分析は下記の結果であった：それぞれ溶媒として２：１ ＤＭＦ：エタノール（ｖ／ｖ）を用いて、２．８２３％の炭素（Ｃ）、０．４７８％の水素（Ｈ）、および０．５９０％の窒素（Ｎ）、ならびに２：１ ＤＭＦ：メタノール（ｖ／ｖ）を用いて３．００３％のＣ、０．５６２％のＨ、および０．６３１％のＮ。
実施例３
[0046]ツーポット法は、式（４）のハイブリッド配位子を形成し、それを、メタノールまたは混合２：１ ＤＭＳＯ：メタノール（ｖ／ｖ）溶媒中で、５．５ｇの表面が多孔性のシリカ粒子に固定化した。
[0047]この方法において、２つの別個のフラスコで、しかし同一の溶媒中で、配位子の生成およびシリカへの固定化を実施した。無水メタノール５０ｍＬ、または混合２：１ ＤＭＳＯ：メタノール（ｖ／ｖ）中、乾燥した２５０ｍＬの圧力フラスコ中で、Ｄ－（＋）－グルコン酸δ－ラクトン１．２ｇおよび３－（２－アミノエチルアミノ）プロピルジメトキシメチルシラン１．２ｍＬの反応によって配位子を合成した。圧力容器を密封し、室温または６０℃で終夜撹拌した。終夜反応の後、結果として得られた溶液を、５．５ｇの表面が多孔性の乾燥したシリカ粒子（２．７μｍ、８３．７Å、１２３．１ｍ２／ｇ）に２４／４０の継手を備えた２５０ｍＬの三首フラスコ中で注いだ。三首フラスコに撹拌棒、２つのガラス栓、およびガラスフリットガス入口アダプターを取り付けた。換気フードに三首フラスコを移し、熱制御器に接続した加熱マントル中で保護した。アルゴンラインにガス入口を接続し、ガスバブラーと１つの栓を置き換えた。６．３５ｍｍ（１／４インチ）のＪ型テフロン（登録商標）被覆の熱電対を取り付けた２４／４０アダプターと他の栓を置き換えた。気泡が３～５秒ごとに出て来るように、アルゴン比率を調節した。
[0048]合成した配位子を２０時間６０℃で加熱および撹拌しながら反応を維持することにより、シリカに固定化した。４５℃に反応を冷却した後、１ｍｍ厚、１μｍ孔径のＰＴＦＥフィルターディスクを取り付けた、制御した乾燥雰囲気のＲｕｓｅｋ漏斗へ混合物をカニューレで挿入し、アルゴンを用いて連続的にパージした。母液を濾別し、次いで、第２、第３の洗浄に真空を適用し洗浄溶媒を除去する前に、スパチュラで毎回撹拌することによって洗浄溶媒中で粒子を再懸濁するように注意して、結果として得られた結合したシリカ粒子の塊を無水の２：１ＤＭＳＯ：メタノール（ｖ／ｖ）１００ｍＬを用いて３回洗浄した。同一の再懸濁液技法を組み込んで、次に、水中２０％アセトニトリル（ｖ／ｖ）１００ｍＬを用いて３回、次いで最終的にアセトニトリル１００ｍＬを用いてシリカを３回洗浄した。最初のＤＭＳＯ／メタノール洗浄の後にアルゴンは使用しなかった。最終溶媒洗浄の後、設備をなお真空下においたまま約２０分間濾過ケーキを空気乾燥し、塊を乾燥皿に移し真空オーブン中６０℃で少なくとも２０時間乾燥した。
[0049]ＣＨＮ分析は下記の結果であった：それぞれ溶媒としてメタノールを用いて、３．６３％のＣ、０．６８％のＨ、０．６８％のＮ、ならびに２：１ ＤＭＳＯ：メタノール（ｖ／ｖ）を用いて３．１６％のＣ、０．５５％のＨ、０．６０％のＮ。
実施例４
[0050]ツーポット法によって、式（４）のハイブリッド配位子を生成し、それを、混合２：１ ＤＭＳＯ：メタノール（ｖ／ｖ）溶媒中で、５．５ｇのより大きい孔（１６０Å）のシリカ粒子に固定化した。
[0051]この方法において、２つの別個のフラスコで、しかし同一の溶媒中で、配位子の生成および１６０Å孔シリカへの固定化を実施した。２５０ｍＬの圧力フラスコ中で、無水の混合２：１ ＤＭＳＯ：メタノール（ｖ／ｖ）１８０ｍＬ中のＤ－（＋）－グルコン酸δ－ラクトン０．８６ｇと３－（２－アミノエチルアミノ）プロピルジメトキシメチルシラン０．８１ｍＬの反応によって、配位子を合成した。圧力容器を密封し撹拌しながら３０℃に終夜加熱した。終夜の反応後に、２４／４０の継手を備えた２５０ｍＬの三首フラスコ中で、結果として得られた溶液を、５．５ｇの表面が多孔性の乾燥したシリカ粒子（２．７μｍ、～１６０Å、８２．２ｍ２／ｇ）に注いだ。三首フラスコには、撹拌棒、２つのガラス栓、およびガラスフリットガス入口アダプターを取り付けた。三首フラスコを換気フードに移動し、熱制御器に接続した加熱マントル中で保護した。アルゴンラインにガス入口を接続し、１つの栓をガスバブラーと置き換えた。他の栓を、６．３５ｍｍ（１／４インチ）のＪ型テフロン被覆の熱電対を取り付けた２４／４０アダプターと置き換えた。気泡が３～５秒ごとに出て来るように、アルゴン比率を調節した。
[0052]２３時間撹拌しながら反応物を６０℃に加熱することにより、合成した配位子をシリカに固定化した。室温に反応物を冷却した後、１ｍｍ厚、１μｍ孔径のＰＴＦＥフィルターディスクを取り付けた真空漏斗へ移した。母液を除去し、次いで、濾過の開始前に毎回スパチュラを用いて撹拌することにより、以下の洗浄溶媒中で粒子を再懸濁するように注意して、結果として得られた結合したシリカ粒子の塊を洗浄した：無水の２：１ＤＭＳＯ：メタノール（ｖ／ｖ）１００ｍＬを用いて１回、水中５０％アセトニトリル（ｖ／ｖ）１００ｍＬを用いて１回、水中２０％アセトニトリル１００ｍＬ（ｖ／ｖ）を用いて３回、水中５０％アセトニトリル（ｖ／ｖ）１００ｍＬを用いて１回、および、最終的にアセトニトリル１００ｍＬを用いて３回。最終の溶媒洗浄の後、設備をなお真空下においたまま約２０分間濾過ケーキを空気乾燥し、塊を乾燥皿に移し真空オーブン中６０℃で少なくとも２０時間乾燥した。
[0053]ＣＨＮ分析は下記の結果であった：１．８４９％のＣ、０．４５０％のＨおよび０．４０６％のＮ。
実施例５
[0054]二段階法は、式（４）のハイブリッド配位子を生成し、それを、５．５ｇの表面が多孔性のシリカ粒子に固定化した。この方法において、シリカ表面はまずアミンシランで修飾され、次いで、シリカに固定化されたアミン基はラクトン試薬と反応して式（４）の固定化ハイブリッド配位子を形成した。
[0055]第１の段階の間、アミンシラン、３－（２－アミノエチルアミノ）プロピルジメトキシメチルシランを、表面が多孔性のシリカ粒子（２．７μｍ、～９０Å、１２５ｍ２／ｇ）に固定化した。２５０ｍＬの三首フラスコ中で最初に５．５ｇの量のシリカを加熱し、終夜真空乾燥して、６０℃に冷ました。フラスコに栓をし、オーブンから取り出し、換気フードへ移した。換気フード内では、制御器を備えた加熱マントルにフラスコを置き、栓の１つを取り除きそれを２４／４０のフリットガス入口に置き換えることによって、その中身を直ちに乾燥アルゴン圧力下で保護した。次いで、別の栓を取り外し、長さ２０～２５ｃｍの、先に乾燥しておいた２４／４０の還流凝縮器に取り替えた。不活性媒体を含有する２４／４０ガスバブラーを凝縮器の頂部に配置し、大気の侵入を防止するためにバブラーを通して漏れるガスによって監視しながらフラスコ内の最小限の陽圧を維持するようにガス流動を調整した。添加漏斗へ１８０ｍＬの量の無水トルエンをカニューレで挿入し、撹拌しながらシリカと混合した。シリカが分散したら、次に３－（２－アミノエチルアミノ）プロピルジメトキシメチルシラン１．１７ｍＬを添加し、フラスコは熱プローブおよびアダプターを用いて栓をした。
[0056]次いで、熱をかけて１１０℃に温度を上げて１６時間温和な還流を起こした。反応が完結した後、５０℃に温度を下げ、１ｍｍ厚、１μｍ孔径のＰＴＦＥフィルターディスクを装備した開放型濾過フラスコに混合物を移した。母液を除去し、次いで、濾過の開始前に毎回スパチュラを用いて撹拌することにより、以下の洗浄溶媒中で粒子を再懸濁するように注意して、結果として得られた結合したシリカ粒子の塊を洗浄した：メタノール１００ｍＬを用いて１回、トルエン１００ｍＬを用いて１回、メタノール１００ｍＬを用いて１回、トルエン１００ｍＬを用いて１回およびメタノール１００ｍＬを用いて最終的に１回。最終溶媒洗浄の後、設備をなお真空下においたまま約２０分間濾過ケーキを空気乾燥した。次いで塊を乾燥皿に移し真空オーブン中６０℃で少なくとも２０時間乾燥した。
[0057]ＣＨＮ分析は下記の結果であった：２．４０％のＣ、０．７１％のＨ、および０．９３％のＮ。
[0058]方法の第２の段階では、固定化アミンを含む調製したシリカを、式（４）の固定化ハイブリッド配位子に変換した。反応の前に、先立って３－（２－アミノエチルアミノ）プロピルジメトキシメチルシランと結合しておいたシリカ１．５０ｇをＰＴＦＥ被覆した磁気撹拌棒を有する２５０ｍＬの三首フラスコ中、６０℃で終夜真空乾燥した。換気フードへフラスコを移し、制御器を備えた加熱マントルに置いた。混合２：１水：エタノール溶媒（ｖ／ｖ）６０ｍＬを、撹拌しながらフラスコに添加してシリカを懸濁した。シリカ懸濁液を３５℃の温度に加熱した。Ｄ－（＋）－グルコン酸δ－ラクトン０．１１ｇの溶液を、混合２：１水：エタノール（ｖ／ｖ）溶媒６０ｍＬ中で調製し、８時間にわたってフラスコへ滴下した。３５℃でさらに１６時間反応を継続させた。
[0059]反応後、１ｍｍ厚、１μｍ孔径のＰＴＦＥフィルターディスクを装備した開放型濾過フラスコに混合物を移した。母液を除去し、次いで、濾過の開始前に毎回スパチュラを用いて撹拌することにより、以下の洗浄溶媒中で粒子を再懸濁するように注意して、結果として得られた結合したシリカ粒子の塊を洗浄した：メタノール１００ｍＬを用いて１回、水中８０％メタノール（ｖ／ｖ）を用いて３回、および、最終的に、アセトニトリル１００ｍＬを用いて３回。最終溶媒洗浄の後、設備をなお真空下においたまま約２０分間濾過ケーキを空気乾燥した。次いで塊を乾燥皿に移し真空オーブン中６０℃で少なくとも２０時間乾燥した。
[0060]ＣＨＮ分析は下記の結果であった：１．１０４％のＣ、０．２４９％のＨ、および０．３３５％のＮ。
実施例６
[0061]図１は、表面が多孔性のシリカ（２．７μｍ、～９０Å、１２５ｍ２／ｇ）に固定化した式（４）のハイブリッド配位子の代表的な１３Ｃ核磁気共鳴（Ｃ－１３ ＮＭＲ）スペクトルを、－４．２２ｐｐｍ；１３．１９ｐｐｍ；２１．９２ｐｐｍ；３８．９ｐｐｍ；５０．４５ｐｐｍ；６４．３７ｐｐｍ；７２．０８ｐｐｍ；および１７６．８５ｐｐｍに標識付けしたピークを用いて示す。１７６．８５ｐｐｍのピークは、合成した配位子のカルボニル基炭素に対応し、７２．０８および６４．３７ｐｐｍのピークはＣ－ＯＨ基の炭素に対応し、５４．４５および３８．９のピークは第二級アミン（－ＮＨ－）に連結した炭素に対応する。これらのピークの存在は、式（４）のハイブリッド配位子の合成および固定化が成功したことを示す。
実施例７
[0062]実施例１の固定化ハイブリッド配位子に赤外分光法を実施した。図２は結果として得られたスペクトルを示す。ピークは、３３６６、２９４９、１８７３、１６６６、１５３８、１０７４および８１０ｃｍ－１に観察された。３３６６の幅の広いピークはＯ－Ｈ伸縮、１８３７はＯ－Ｈ変角にそれぞれ関係があり得る。１６６６および１５３８の二重のピークは、アミド結合の存在を示す。これらの結果は、１つのアミド基および多数のヒドロキシル基を含む式（４）のハイブリッド配位子の化学構造と矛盾しない。
実施例８
[0063]式（４）の固定化ハイブリッド配位子の異なる７つの試料を形成し、ロット間の再現性を評価するために試験した。１つは、１２４．６ｍ２／ｇの表面積を有するシリカのロットを使用し、５つは、１２３．１ｍ２／ｇの表面積を有するシリカのロットを使用し、１つは、１２３．７ｍ２／ｇの表面積を有するシリカのロットを使用した。異なる２人の作業者が、約３か月の期間にわたって異なる時間にこれらの試料を製造した。ＨＰＬＣカラムに各試料を詰め、３種の水溶性ビタミン：チアミン（Ｂ１）、ニコチン酸（Ｂ３）および葉酸（Ｂ９）を用いてクロマトグラフィーで評価した。カラムは２．７μｍの表面が多孔性の粒子（ＳＰＰ）を有する２．１ｍｍ×５０ｍｍであった。
[0064]図３に溶離結果を示す。Ｂ１がまず空隙時間に溶離し、Ｂ３は２番目に溶離し、Ｂ９は３番目に溶離する。移動相として５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル／水中の０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸を用いて定組成条件下、流速０．４ｍＬ／分で３種の化合物を溶離した。第１のピーク（Ｂ１）の組および第２のピーク（Ｂ３）の組それぞれは、１％未満の相対標準偏差（ＲＳＤ）を有していた。第３のピーク（Ｂ９）の組は、保持係数が約２５であってもわずか２．４％のＲＳＤを有していた。試験の結果の低いＲＳＤは、配位子の調製およびシリカへの配位子の固定化のための手順が、高度に再現可能である固定化配位子をもたらすことを示す。
実施例９
[0065]普遍的遺伝コードによってコードされた２０のアミノ酸を含む２２のアミノ酸の混合物を、式（４）のハイブリッド配位子と結合したシリカを含有するカラムに適用した。これらのアミノ酸をそれらの側鎖に従って４つの群：無極性、極性、正に帯電、および負に帯電に分類することができる。
[0066]混合した陰イオン交換親水性相互作用クロマトグラフィー－液体クロマトグラフィー質量分析（ＡＥＸ／ＨＩＬＩＣ ＬＣ／ＭＳ）条件を、誘導体化されていないアミノ酸分析種を分離および検出するために選択した。カラムは、２．７μｍの表面が多孔性の粒子（ＳＰＰ）を有する２．１ｍｍ×１００ｍｍであった。
[0067]カラムの混合物に、水中０．５％（ｖ／ｖ）のギ酸の第１の溶媒（移動相Ａ）、および２０ｍＭギ酸アンモニウム（ｐＨ３．０）を含む、９０％（ｖ／ｖ）のアセトニトリルおよび１０％（ｖ／ｖ）の水の第２の溶媒（移動相Ｂ）を使用して溶媒のグラジエントを適用した。移動相グラジエントは、８８％（ｖ／ｖ）の移動相Ｂで３．５分間の持続から始め、次いで、４．５分にわたって３０％の移動相Ｂに下げた。誘導体化されていないアミノ酸を、陽イオンモード下のエレクトロスプレーイオン化質量分析によって検出した。
[0068]図４のクロマトグラムによって示すように、２２の誘導体化されていないアミノ酸はすべて、８分以内に長さ１０ｃｍのカラムによって分離され、溶離した。無極性のアミノ酸が最初に、続いて極性の正に帯電したアミノ酸（Ａｒｇ、ＨｉｓおよびＬｙｓ）、最後に、極性の負に帯電したアミノ酸（ＧｌｕおよびＡｓｐ）が溶離した。同重体のアミノ酸対、ＬｅｕとＩｌｅのベースライン分解は、殊に注目すべきである。
実施例１０
[0069]式（４）のハイブリッド配位子と結合したシリカを含有するカラムを、極性の酸性除草剤アミノメチルホスホン酸（ＡＭＰＡ）、グルホシネート、およびグリホセートの混合物のＬＣ／ＭＳ分析に適用した。陰イオン交換条件下で５％（ｖ／ｖ）のアセトニトリル、０．３％（ｖ／ｖ）のギ酸および３０ｍＭギ酸アンモニウムを含む移動相および０．３ｍＬ／分の流速を用いて、カラム（２．１ｍｍ×３０ｍｍ、２．７μｍのＳＰＰ粒子を含む）を作動させた。陽イオンモードで選択イオンモニタリングによる質量分析法によって分析種を検出した。
[0070]図５のクロマトグラムによって示すように、３分未満の短い運転時間で、３種の分析種の良好な分離を、移動相または試料中にエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含まず、運転の間にシステムを洗い流す必要がなく、達成した。その分離は、配位子と極性の酸性除草剤の陰イオン交換相互作用を実証する。ＡＭＰＡ（１）は、３０秒未満の保持時間でまず溶離し、グルホシネート（２）は、約１分の保持時間で２番目に溶離し、グリホセート（３）は２分より少し短い保持時間で３番目に溶離した。
実施例１１
[0071]式（４）のハイブリッド配位子と結合したシリカを含有するカラムを、極性の酸性除草剤ＡＭＰＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）、グルホシネート（１００ｎｇ／ｍＬ）およびグリホセート（１００ｎｇ／ｍＬ）の混合物のＬＣ／ＭＳ分析に適用した。カラム（２．１ｍｍ×３０ｍｍ、２．７μｍのＳＰＰ粒子を含む）を、０．６ｍＬ／分の流速で、緩衝塩を含まず水中０．５％（ｖ／ｖ）のギ酸を含む第１の移動相（Ａ）およびアセトニトリル中０．５％（ｖ／ｖ）のギ酸を含む第２の移動相（Ｂ）を用いて作動させた。グラジエント移動相は、６０％のＡ／４０％のＢから始め、１分で１００％のＡに移行し、３分間１００％のＡで保持した。４～４．０１分に、グラジエント移動相はもとの６０％のＡ／４０％のＢに移行した。陰イオンモードで多数の反応モニタリングによる質量分析法によって分析種を検出した。
[0072]図６のクロマトグラムによって示すように、３分の短い運転時間で、３種の分析種の良好な分離を、移動相または試料中にＥＤＴＡを含まず、運転の間にシステムを洗い流す必要がなく、達成した。その分離は、配位子と極性の酸性除草剤の陰イオン交換相互作用を実証する。ＡＭＰＡ（１）は１５秒の保持時間および１．３５のテーリング係数でまず溶離し、グルホシネート（２）は０．９分の保持時間および１．０４のテーリング係数で２番目に溶離し、グリホセートは１．９５分の保持時間および１．１５のテーリング係数で３番目に溶離した。３種の化合物がすべてクロマトグラフィーで保持し分離するのが悪評高いほどに難しいので、各化合物に対する鋭く対称的なピーク形状は注目すべきである。実施例１１での分離は、実施例１０での分離よりも少し良好な結果であり、異なる運転条件で実施例１０および１１は、同様の分離を達成することができるという点で固定化ハイブリッド配位子の多用性を実証する。
実施例１２
[0073]式（４）のハイブリッド配位子と結合したシリカを含有するカラムを、中性グリコシル化分析種、サリシン、ナリンギンおよびアミグダリンの混合物のＨＰＬＣ分離に適用した。サリシンのみ１つの糖単位を有するが、ナリンギンおよびアミグダリンは分子中に２つの糖単位を含んでいる。カラム（２．１ｍｍ×５０ｍｍ、２．７μｍのＳＰＰ粒子を含む）を、高いアセトニトリル含有量（９５％、ｖ／ｖ）、および０．１％（ｖ／ｖ）のギ酸を含む移動相を用い、０．４ｍＬ／分の流速および紫外線（ＵＶ）検出を用いるＨＩＬＩＣ条件下で作動させた。
[0074]図７のクロマトグラムによって示すように、カラムによって、極性の糖基へのハイブリッド固定相の良好な選択性の結果、３種の極性グリコシル化分析種を十分に分割した。サリシン（１）は、約１．２５分の保持時間でまず溶離し、ナリンギン（２）は約２．５分の保持時間で２番目に溶離し、アミグダリン（３）は約４．３分の保持時間で３番目に溶離した。それぞれサリシンについて５、ナリンギンについて１０、アミグダリンについて１６の保持係数（ｋ）を有する、これらの小さいグリコシル化分析種の高い保持が観察された。
実施例１３
[0075]式（４）のハイブリッド配位子と結合したシリカを含有するカラムを、３種の水溶性ビタミン：チアミン（ビタミンＢ１）、ニコチン酸（ビタミンＢ３）および葉酸（ビタミンＢ９）の混合物のＨＰＬＣ分離に適用した。ビタミンＢ１は恒久的に陽イオン帯電した分子であるが、ビタミンＢ３およびビタミンＢ９分子は、それぞれに１および２個のカルボン酸基を有する。カラム（２．７μｍのＳＰＰ粒子を含む２．１ｍｍ×５０ｍｍカラム）を。５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル／水中の０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸を含む移動相、０．４ｍＬ／分の流速、およびＵＶ検出を用いる、陰イオン交換クロマトグラフィー条件下で作動させた。
[0076]図８のクロマトグラムによって示すように、陰イオン交換クロマトグラフィー条件下のカラムによって３種のビタミン分析種を十分に分割した。陽イオンに帯電したビタミンＢ１（１）は、基本的に全く保持せず、０．３分未満で溶離し、１個のカルボン酸基を含むビタミンＢ３（２）は約１．３分の保持時間で２番目に溶離し、２個のカルボン酸基を含むビタミンＢ９（３）は約６．７分の保持時間で最後に溶離した。
[0077]代替の溶離（図示せず）において、ビタミンＢ１は、同一のカラム（２．１ｍｍ × ５０ｍｍ、２．７μｍのＳＰＰ粒子を含む）から、高有機含有量緩衝移動相を用いるＨＩＬＩＣ保持条件下、約２．３分で溶離した。移動相は、１０ｍＭギ酸アンモニウムを含む９０％（ｖ／ｖ）のアセトニトリル／１０％（ｖ／ｖ）の水であった。Ｔ０が０．２５６分である場合、ビタミンＢ１の保持係数は０．４ｍＬ／分の流速で約８であった。緩衝塩は静電気反発作用を減少させ、高い有機含有量は、ＨＩＬＩＣが相互作用を支配的にするように分配するＨＩＬＩＣを通り保持を増進した。
実施例１４
[0078]式（４）のハイブリッド配位子と結合したシリカを含有するカラムにチアミンピロリン酸エステルを適用した。カラム（２．１ｍｍ×５０ｍｍ、２．７μｍのＳＰＰ粒子を含む）を、水中５０ｍＭギ酸アンモニウムおよび０．１％（ｖ／ｖ）のギ酸を含む第１の移動相（Ａ）および９０／１０（ｖ／ｖ）アセトニトリル／水中、５０ｍＭギ酸アンモニウムおよび０．１％（ｖ／ｖ）のギ酸を含む第２の移動相（Ｂ）を用い、０．５ｍＬ／分の流速を用いるＨＩＬＩＣおよび次いで陰イオン交換条件下で作動させた。
[0079]グラジエント移動相を５％のＡ／９５％のＢから２分まで始め、次いで、１００％のＡに８分で移行し、次いで、溶離の終了まで１００％のＡのままとした。
[0080]図９のクロマトグラムによって示すように、チアミンピロリン酸エステルは、約８分の溶出時間で、良好な保持（約３１のｋ）および鋭い溶離ピークで溶離した。
[0081]水中、１０ｍＭギ酸アンモニウムおよび０．５％（ｖ／ｖ）のギ酸の移動相Ａ、ならびに９０／１０（ｖ／ｖ）アセトニトリル／水中、１０ｍＭギ酸アンモニウムおよび０．５％（ｖ／ｖ）のギ酸の移動相Ｂに、０．６ｍＬ／分の流速を用い、使用する移動相条件を変化させることによって、保持時間は鋭いピークを有する約３０秒に短縮した。
実施例１５
[0082]有機酸、キナ酸、リンゴ酸、フマル酸、クエン酸および酒石酸の混合物を式（４）のハイブリッド配位子と結合するシリカを含有するカラムに適用した。弱い陰イオン交換カラムとして、水中１０ｍＭギ酸アンモニウムおよび０．５％（ｖ／ｖ）のギ酸を含む第１の移動相（Ａ）、９０／１０（ｖ／ｖ）アセトニトリル／水中、１０ｍＭギ酸アンモニウムおよび０．５％（ｖ／ｖ）のギ酸を含む第２の移動相（Ｂ）を用い、０．５ｍＬ／分の流速を用いてカラムを作動させた。
[0083]グラジエント移動相を６５％のＡ／３５％のＢから１分まで始めて、次いで１００％のＡに２分で移行し、次いで、溶離の終了まで１００％のＡのままであった。陰イオンモードで選択イオンモニタリングを介する質量分析法によって有機酸分析種を検出した。とりわけ、有機酸のｍ／ｚのモニタリングは、キナ酸について１９１、リンゴ酸について１３３、フマル酸について１１５、クエン酸について１９１、および酒石酸について１４９であった。
[0084]図１０のクロマトグラムによって示すように、試験する有機酸の良好な分離が観察された。キナ酸（１）は約０．７分の保持時間で最初に溶離し、リンゴ酸（２）は約１．４分の保持時間で２番目に溶離し、フマル酸（３）は約３．９分の保持時間で３番目に溶離し、クエン酸（４）は約４．４分の保持時間で４番目に溶離し、酒石酸（５）は約６．７分の保持時間で５番目に溶離した。注目すべきことは、Ｃ１８のような逆相カラムでは達成するのが難しくなり得る同重体の分析種、キナ酸およびクエン酸の分離、および酒石酸からのキナ酸の分離であった。
[0085]前述の参照はすべて、本明細書の参照により本明細書に組み込まれる。
[0086]本発明を１個または複数の実施形態に関して説明したが、当業者には、本発明の範囲から逸脱することなく、様々な変更を為すことができ、且つ本発明の構成要素を等価物と置換することができることが理解されよう。さらに、本発明の本質的な範囲から逸脱することなく、特定の状況または材料を本発明の教示に適合させるように多数の修正を行うことができる。従って、本発明は、発明を実施するための熟慮された最良の形態として開示した特定の実施形態に制限されず、本発明は添付の特許請求の範囲内に入るすべての実施形態を含むことになることを意図する。さらに、詳細な記載において特定された数値はすべて、あたかも正確な値と近似値が両方とも明白に特定されるかのように解釈されるものとする。

Claims (21)

  1. ハイブリッド配位子を含む組成物であって、前記ハイブリッド配位子が、アミン基、アミド基またはスルホンアミド基および複数のヒドロキシル基を含む、前記組成物。
  2. 前記ハイブリッド配位子が、式：
    Ｒ－（ＣＨ２）ｘ－Ｎ（Ｒ１）（Ｒ２）－（ＣＨ２）ｙ－ＮＨ－Ｒ３－（ＣＨＯＨ）ｚ－Ｒ４
    ［式中、Ｒは、固体担体に結合することができる官能基、または固体担体に結合した官能基を表し；ｘ、ｙおよびｚはそれぞれ独立に、２～１０の範囲の整数であり；Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立に、Ｈ、Ｃ１～Ｃ４アルキル基またはアリール基であり；Ｒ３はＣ（Ｏ）またはＳ（Ｏ）（Ｏ）であり；Ｒ４は、Ｈ、ＣＨ３またはＣＯＯＨである］
    のものである、請求項１に記載の組成物。
  3. Ｒが、固体担体に結合することができる官能基を表し、式：
    Ｒ５－Ｏ－Ｓｉ（Ｒ６）（Ｒ７）
    ［式中、Ｒ５はメチル基またはエチル基であり、Ｒ６およびＲ７はそれぞれ独立に、Ｃ１～Ｃ４アルキル基またはアルコキシ基である］
    のものであり；
    前記固体担体が、シリカ、ハイブリッド無機／有機シリカおよびシリカモノリスからなる群から選択される材料である、
    請求項２に記載の組成物。
  4. Ｒが固体担体に結合した官能基を表し、式：
    シリカ－Ｏ－Ｓｉ（Ｒ５）（Ｒ６）
    ［式中、Ｒ５およびＲ６はそれぞれ独立に、Ｃ１～Ｃ４アルキル基またはアルコキシ基である］
    のものであり；
    前記固体担体が、シリカ粒子、ハイブリッド無機／有機シリカ粒子、シリカモノリス、およびハイブリッド無機／有機シリカモノリスからなる群から選択される材料である、
    請求項２に記載の組成物。
  5. 前記固体担体が、１０ｎｍ～１００μｍの範囲の直径および１０Å～１０００Åの範囲の孔径を有する球状シリカである、請求項２に記載の組成物。
  6. 前記固体担体が、ポリマー粒子、ポリマーモノリスおよび三次元印刷されたポリマー構造からなる群から選択されるポリマー材料であり、前記ハイブリッド配位子が前記ポリマー材料にカップリングされている、請求項２に記載の組成物。
  7. 前記ポリマー粒子が、ポリスチレンジビニルベンゼン、ポリ（ビニルアルコール）、およびポリメタクリル酸メチルからなる群から選択される、請求項６に記載の組成物。
  8. 前記ハイブリッド配位子が、式：
    Ｒ－（ＣＨ２）ｘ－ＮＨ－（ＣＨ２）ｙ－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨＯＨ）ｚ－Ｈ
    ［式中、Ｒは、固体担体に結合することができる官能基または固体担体に結合した官能基を表し、ｘ、ｙおよびｚはそれぞれ独立に、２～１０の範囲の整数である］
    のものである、請求項１に記載の組成物。
  9. 前記ハイブリッド配位子がシリカ固体担体に固定化され、固定化ハイブリッド配位子が、式：
    Figure 2022534770000002
     のものである、請求項１に記載の組成物。
  10. 極性分析種を分離する方法であって、
    第１の極性分析種および第２の極性分析種を含有する溶液を用意するステップと、
    固定化ハイブリッド配位子を含む固定相に前記溶液を適用するステップであり、前記固定化ハイブリッド配位子が、アミン基、アミド基またはスルホンアミド基および複数のヒドロキシル基を含む、ステップと、
    前記第１の極性分析種および前記第２の極性分析種が異なる溶出時間で前記固定相を通過するように、前記固定相に溶離溶媒を適用するステップと、
    第１の溶出時間で前記固定相を出る前記第１の極性分析種を集めるステップ、および前記第１の溶出時間の後に第２の溶出時間で前記固定相を出る前記第２の極性分析種を集めるステップと
    を含む、前記方法。
  11. 前記第１の極性分析種および前記第２の極性分析種が、酸性除草剤、有機酸、アミノ酸、水溶性ビタミン、糖、ヌクレオシド、ヌクレオチド、薬物代謝物およびペプチドからなる群からそれぞれ独立に選択される、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記ハイブリッド配位子が、式：
    Ｒ－（ＣＨ２）ｘ－Ｎ（Ｒ１）（Ｒ２）－（ＣＨ２）ｙ－ＮＨ－Ｒ３－（ＣＨＯＨ）ｚ－Ｒ４
    ［式中、Ｒは、固体担体に結合することができる官能基または固体担体に結合した官能基を表し；ｘ、ｙおよびｚはそれぞれ独立に、２～１０の範囲の整数であり；Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立に、Ｈ、Ｃ１～Ｃ４アルキル基またはアリール基であり；Ｒ３はＣ（Ｏ）またはＳ（Ｏ）（Ｏ）であり；Ｒ４はＨ、ＣＨ３またはＣＯＯＨである］
    のものである、請求項１０に記載の方法。
  13. デバイスであって
    固定相として固体担体および前記固体担体にカップリングされたハイブリッド配位子を含むクロマトグラフィー材料を含み、前記ハイブリッド配位子が、アミン基、アミド基またはスルホンアミド基および複数のヒドロキシル基を含み、前記ハイブリッド配位子が、式：
    －Ｒ－（ＣＨ２）ｘ－Ｎ（Ｒ１）（Ｒ２）－（ＣＨ２）ｙ－ＮＨ－Ｒ３－（ＣＨＯＨ）ｚ－Ｒ４
    ［式中、Ｒは、前記固体担体に結合した官能基を表し；ｘ、ｙおよびｚはそれぞれ独立に、２～１０の範囲の整数であり；Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立に、Ｈ、Ｃ１～Ｃ４アルキル基またはアリール基であり；Ｒ３はＣ（Ｏ）またはＳ（Ｏ）（Ｏ）であり；Ｒ４はＨ、ＣＨ３またはＣＯＯＨである］
    のものであり；
    前記デバイスが、充填カラム、カートリッジ、チューブ、ウェルプレート、膜および平らな薄層クロマトグラフィープレートからなる群から選択される、
    前記デバイス。
  14. Ｒが、式：
    Ｏ－Ｓｉ（Ｒ５）（Ｒ６）
    ［式中、Ｒ５およびＲ６はそれぞれ独立に、Ｃ１～Ｃ４アルキル基またはアルコキシ基である］
    のものであり；
    前記固体担体が、シリカ粒子、ハイブリッド無機／有機シリカ粒子、シリカモノリスおよびハイブリッド無機／有機シリカモノリスからなる群から選択される材料である、
    請求項１３に記載のデバイス。
  15. 前記固体担体が、１０ｎｍ～１００μｍの範囲の直径および１０Å～１０００Åの範囲の孔径を有する球状シリカである、請求項１３に記載のデバイス。
  16. 前記固体担体が、ポリマー粒子、ポリマーモノリスおよび三次元印刷されたポリマー構造からなる群から選択されるポリマー材料であり、前記ハイブリッド配位子が前記ポリマー材料にカップリングされている、請求項１３に記載のデバイス。
  17. 前記ポリマー粒子が、ポリスチレンジビニルベンゼン、ポリ（ビニルアルコール）およびポリメタクリル酸メチルからなる群から選択される、請求項１６に記載のデバイス。
  18. 前記ハイブリッド配位子が、式：
    Ｒ－（ＣＨ２）ｘ－ＮＨ－（ＣＨ２）ｙ－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨＯＨ）ｚ－Ｈ
    ［式中、Ｒは、固体担体に結合することができる官能基または固体担体に結合した官能基を表し、ｘ、ｙおよびｚはそれぞれ独立に、２～１０の範囲の整数である］
    のものである、請求項１３に記載のデバイス。
  19. 固定化ハイブリッド配位子を形成する方法であって、
    固体担体カップリング末端基を含む第１の末端；第一級アミン末端基または第二級アミン末端基を含む、前記第１の末端と反対の第２の末端；および前記固体担体カップリング末端基と前記第一級アミン末端基または前記第二級アミン末端基との間の連結分子の骨格上にアミン基を含む、連結分子を用意するステップと、
    前記固体担体カップリング末端基を介して固体担体に前記第１の末端で前記連結分子を共有結合でカップリングさせるステップと、
    アミド結合およびスルホンアミド結合からなる群から選択される末端結合によって複数のヒドロキシル基を含む末端分子に第２の末端で連結分子を共有結合でカップリングさせるステップと
    を含む、前記方法。
  20. 前記末端分子がラクトンであり、前記末端結合がアミド結合である、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記第１の末端で前記連結分子を共有結合でカップリングさせるステップ、および前記第２の末端で前記連結分子を共有結合でカップリングさせるステップが、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、エタノール、メタノールおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される通常の溶媒中で実施される、請求項１９に記載の方法。
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