JP2022534396A - ポリマーベースの細胞ラベリング、バーコーディングおよび集合体 - Google Patents

Abstract

既存の単一細胞分析技術は一般に高解像度であるが、可能な異なる実験条件の数に制限がある。本明細書に開示されるのは、核酸バーコードを細胞集団に送達するためのカチオン性ポリマーを使用する、細胞の不均一な集団の多重化バーコーディングのための組成物および方法である。【選択図】図１Ａ

Description

関連出願の相互参照
この出願は、２０１９年５月３１日に出願された米国仮特許出願第６２／８５５，４４８号の優先権の利益を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる。

配列表の参照
本出願は、電子形式の配列表とともに提出されている。配列表は、２０２０年５月２９日に作成され、最後に変更を加えられて、ＣＨＭＣ６３＿０２２ＷＯＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ．ＴＸＴ，というファイル名として提供され、このファイルは、１，３０５バイトのサイズである。電子配列表の情報は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

本開示の態様は、一般に、細胞バーコーディング技術に関するものである。これらの技術は、効率的かつ安価な多重化バーコーディングのためにカチオン性ポリマーおよび合成された核酸分子を利用する。

単一細胞ゲノム、トランスクリプトーム、およびプロテオーム解析は、定量生物学および応用医学に革命をもたらした。ハイスループットオリゴヌクレオチドシーケンシングの革新的な技術により、特定の細胞型の治療および分離、ならびにその後の下流分析における調査のための一連の革新的な戦略への道が開かれた。単一細胞用途では、現在の方法論は、分子バーコードとして機能する一意の分子識別子で細胞集団にタグを付ける抗体－オリゴヌクレオチドペアを使用した単一細胞ラベリングに依存している。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは特定の抗体の表面に共有結合しており、オリゴヌクレオチドは主に目的の細胞またはタンパク質を標的にして結合する生来の能力を持たないため、これらの抗体はラベリングメディエーターとして機能する。さらに、抗体とオリゴヌクレオチドとのペアリングの組み合わせごとに直接抱合が必要である。同じ細胞型の５つの集団を５つの異なるユニーク分子識別子でラベリングするには、５つの別々の抱合反応が必要になる。すべての細胞型に対して抗体－オリゴペアを作成するこの必要性は、面倒で、費用がかかり、時間がかかる可能性がある。したがって、細胞ラベリングのための改善された方法が現在必要とされている。

本開示のいくつかの態様は、キャップされたカチオン性ポリマーを合成する方法に関する。いくつかの実施形態では、方法は、マポリ（エチレングリコール）ジアクリレートモノマーおよび３－アミノ－１－プロパノールを接触させて、マイケル付加によって、ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート／３－アミノ－１－プロパノールカチオン性ポリマーを形成することであって、ポリ（エチレングリコール）ジアクリレートモノマーの３－アミノ－１－プロパノールに対するモル比が、１超であり、カチオン性ポリマーがアクリレート末端である、形成することと、カチオン性ポリマーの末端アクリレート基を、アミン基を含むキャッピング分子と接触させて、マイケル付加によってキャップされたカチオン性を形成することであって、キャップされたカチオン性ポリマーが、いずれのアクリレート基も含まない、形成することと、を含む。いくつかの実施形態では、工程（ａ）のポリ（エチレングリコール）ジアクリレートモノマーおよび３－アミノ－１－プロパノールは、ジ（トリメチロールプロパン）テトラアクリレートとさらに接触され、ジ（トリメチロールプロパン）テトラアクリレートの付加は、３つ以上の末端アクリレート基を含む分岐状ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート／ジ（トリメチロールプロパン）テトラアクリレート／３－アミノ－１－プロパノールカチオン性ポリマーの形成をもたらす。いくつかの実施形態では、キャッピング分子は、１，４－ビス（３－アミノプロピル）ピペラジン、スペルミン、ポリエチレンイミン、もしくは２，２－ジメチル－１，３－プロパンジアミンのうちの１つ以上、またはこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ポリ（エチレングリコール）ジアクリレートモノマーの３－アミノ－１－プロパノールに対するモル比は、１．０１：１、１．０２：１、１．０３：１、１．０４：１、１．０５：１、１．０６：１、１．０７：１、１．０８：１、１．０９：１、１．１：１、１．１１：１、１．１２：１、１．１３：１、１．１４：１、もしくは１．１５：１、または約１．０１：１、約１．０２：１、約１．０３：１、約１．０４：１、約１．０５：１、約１．０６：１、約１．０７：１、約１．０８：１、約１．０９：１、約１．１：１、約１．１１：１、約１．１２：１、約１．１３：１、約１．１４：１、もしくは約１．１５：１、もしくは前述の比のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の比、例えば１．０１：１～１．１５：１、１．０１：１～１．１：１、１．０５：１～１．１：１、または１．１：１～１．１５：１である。いくつかの実施形態では、カチオン性ポリマーとキャッピング分子との質量比は、１００：１、１００：２、１００：３、１００：４、１００：５、１００：６、１００：７、１００：８、１００：９、１００：１０、１００：１５、１００：２０、１００：２５、１００：３０、１００：３５、１００：４０、１００：４５、１００：５０、１００：５５、１００：６０、１００：６５、１００：７０、１００：７５、１００：８０、１００：８５、１００：９０、１００：９５、１００：１００、１００：１５０、１００：２００、１００：３００、１００：４００、もしくは１００：５００、または約１００：１、約１００：２、約１００：３、約１００：４、約１００：５、約１００：６、約１００：７、約１００：８、約１００：９、約１００：１０、約１００：１５、約１００：２０、約１００：２５、約１００：３０、約１００：３５、約１００：４０、約１００：４５、約１００：５０、約１００：５５、約１００：６０、約１００：６５、約１００：７０、約１００：７５、約１００：８０、約１００：８５、約１００：９０、約１００：９５、約１００：１００、約１００：１５０、約１００：２００、約１００：３００、約１００：４００、もしくは約１００：５００、または前述の比のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の比、例えば１００：１～１００：５００、１００：１～１００：２５、１００：１０～１００：１００、もしくは１００：１００～１００：５００である。いくつかの実施形態では、キャップされたカチオン性ポリマーは、ＰＯＬＹ１、ＰＯＬＹ２、ＰＯＬＹ３、ＰＯＬＹ４、ＰＯＬＹ５、ＰＯＬＹ６、ＰＯＬＹ７、もしくはＰＯＬＹ８、またはこれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、カチオン性ポリマーおよびキャップされたカチオン性ポリマーは、表２に示される比および成分に従って合成される。

本開示のいくつかの態様は、キャップされたカチオン性ポリマーに関する。いくつかの実施形態では、キャップされたカチオン性ポリマーは、本明細書に記載の方法のうちのいずれか１つによって合成されたキャップされたカチオン性ポリマーである。いくつかの実施形態では、キャップされたカチオン性ポリマーは、蛍光染料をさらに含む。いくつかの実施形態では、蛍光染料は、ＤｙＬｉｇｈｔ ４８８、ＤｙＬｉｇｈｔ ５５０、またはＤｙＬｉｇｈｔ ６５０である。

本開示のいくつかの態様は、細胞をラベリングすることに関する。いくつかの実施形態では、この方法は、細胞をカチオン性バーコードと接触させることを含み、カチオン性バーコードは、カチオン性ポリマーおよび核酸バーコードを含み、カチオン性ポリマーは、核酸バーコードが細胞の細胞質にアクセスすることを可能にする。いくつかの実施形態では、核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡである。いくつかの実施形態では、核酸は一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）である。いくつかの実施形態では、核酸は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、もしくは５０００ヌクレオチド長の長さ、または前述の長さのうちのいずれか２つによって定義される範囲内の長さ、例えば、１０～５０００ヌクレオチド、１００～１０００ヌクレオチド、２００～５００ヌクレオチド、１０～５００ヌクレオチド、もしくは４００～５０００ヌクレオチド長を有する。いくつかの実施形態では、カチオン性ポリマーは、本明細書に記載のカチオン性ポリマーのうちのいずれか１つである。いくつかの実施形態では、カチオン性ポリマーは、本明細書に記載の方法のうちのいずれか１つによって合成されたカチオン性ポリマーである。いくつかの実施形態では、細胞は、組織、オルガノイド、もしくはスフェロイドの一部、またはこれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号２～４の配列を有する。

本開示のいくつかの態様は、細胞集団の多重化バーコーディングの方法に関する。いくつかの実施形態では、方法は、細胞の集団を１つ以上のカチオン性バーコードと接触させることであって、カチオン性バーコードのそれぞれが、カチオン性ポリマーおよびユニークな配列の核酸バーコードを含む、接触させることと、１つ以上のカチオン性の核酸バーコードを、単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑによって配列決定して、これにより、個々の細胞の核酸バーコードの配列によって、個々の細胞がその細胞の集団に属するものとして特定することと、を含む。いくつかの実施形態では、カチオン性ポリマーは、本明細書に記載のカチオン性ポリマーのうちのいずれか１つである。いくつかの実施形態では、カチオン性ポリマーは、本明細書に記載の方法のうちのいずれか１つによって合成されたカチオン性ポリマーである。いくつかの実施形態では、核酸バーコードはｓｓＤＮＡバーコードであり、核酸バーコードの配列決定は、ｓｓＤＮＡバーコードを増幅することを含む。いくつかの実施形態では、核酸バーコードは、配列番号２～４の配列を有する。いくつかの実施形態では、細胞の集団は、組織、オルガノイド、またはスフェロイドの一部である。いくつかの実施形態では、細胞の集団は、肝臓オルガノイド、または前腸スフェロイドの一部である。いくつかの実施形態では、細胞の集団は、２つ以上の細胞の亜集団を含み、細胞の各亜集団は、ユニークな個体に由来し、細胞の集団は、２つ以上の細胞の亜集団を組み合わせることによって形成される。いくつかの実施形態では、細胞の集団を接触させることは、２つ以上の細胞の亜集団を組み合わせることによって細胞の集団が形成される前に、２つ以上の細胞の亜集団のそれぞれを、ユニークなカチオン性バーコードと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、配列決定することは、２つ以上の細胞の亜集団のそれぞれのユニークなカチオン性バーコードを配列決定し、それにより、個々の細胞の核酸バーコードの配列によって、個々の細胞を２つ以上の細胞の亜集団のうちの１つに属するものとして特定することを含む。

本明細書で提供される本開示の実施形態は、以下の番号が付けられた代替案によって説明される。
１．細胞をヌクレオチドを含むカチオン性ポリマーと接触させる工程を含む、細胞をラベリングするための方法。
２．細胞、組織、またはオルガノイド集合体を、ヌクレオチドを含む該ポリマーでラベリングすることをさらに含む、代替案１に記載の方法。
３．ヌクレオチドを含む該カチオン性ポリマーが、一級、二級、三級アミン、または四級アンモニウムカチオンで終端している、代替案１または２に記載の方法。
４．該ヌクレオチドが、一本鎖または二本鎖である、先行代替案のいずれか１つに記載の方法。
５．該ヌクレオチドが、一本鎖であり、ヌクレオチドを含む該ポリマーが、ＤＮＡバーコーディングまたはＦＩＳＨ実験に使用される、先行代替案のいずれか１つに記載の方法。
６．該ヌクレオチドが、約５０～約５０，０００塩基対の長さを有する、先行代替案のいずれか１つに記載の方法。
７．該ヌクレオチドが、一本鎖である、先行代替案のいずれか１つに記載の方法。
８．該ヌクレオチドが、一本鎖である、先行代替案のいずれか１つに記載の方法。
９．該カチオン性ポリマーが、細胞成分に組み込まれる、先行代替案のいずれか１つに記載の方法。
１０．該カチオン性ポリマーが、細胞内成分に組み込まれる、先行代替案のいずれか１つに記載の方法。
１１．ヌクレオチド結合を電気泳動によって評価することを含む、先行代替案のいずれか１つに記載の方法。
１２．該ヌクレオチドが、バーコードとして機能し、フローサイトメトリー、共焦点顕微鏡法、およびこれらの組み合わせによって、オルガノイド、細胞、またはスフェロイド内の該バーコードの時空間分布を定量化することを含む、先行代替案のいずれか１つに記載の方法。
１３．該ヌクレオチドが、バーコードとして機能し、該バーコードを増幅することを含み、該バーコードが、タグを含む、先行代替案のいずれか１つに記載の方法。
１４．該ヌクレオチドが、１つ以上の細胞型を特定するためのバーコードとして機能する、先行代替案のいずれか１つに記載の方法。
１５．該ヌクレオチドが、バーコードとして機能し、該バーコードを、細胞のドナーを特定するために使用することを含む、先行代替案のいずれか１つに記載の方法。
１６．該ヌクレオチドが、バーコードとして機能し、該バーコードを、細胞の１つ以上の特徴を定量化するために使用することを含む、先行代替案のいずれか１つに記載の方法。
１７．該方法が、抗体の使用を含まない、先行代替案のいずれか１つに記載の方法。
１８．少なくとも２つのアクリレート官能基と、末端の小さなアミン含有分子と、を含むアクリレートモノマーから合成されたカチオン性ポリマーを含む、細胞をラベリルするための組成物。
１９．該カチオン性ポリマーが、分岐状ポリマーである、代替案１８に記載の組成物。
２０．該組成物が、生物学的緩衝液、好ましくは１０ｍＭ～２５ｍＭの生物学的緩衝液を含み、好ましくは約７．４のｐＨを有するものを含む、代替案１８または１９に記載の組成物。
２１．該生物学的緩衝液が、ＨＥＰＥＳである、代替案２０に記載の組成物。
２２．該方法が、約７～約８のｐＨで実施される、代替案１～１７のいずれか１つに記載の方法。
２３．ポリマー－ヌクレオチドバーコードを作製するための方法であって、
ヌクレオチド（「ＤＮＡバーコード」）を緩衝液中で約１μｇ～約２５μＬの濃度に希釈してヌクレオチド溶液を形成することと、
該希釈ステムで使用するものと等量の緩衝液中に、先行代替案のいずれか１つに記載のポリマーを提供して、ポリマー溶液を形成することと、
該ヌクレオチド溶液を該ポリマー溶液と混合することと、を含む、方法。

上記の特徴に加えて、追加の特徴および変形例は、以下の図面および例示的な実施形態の説明から容易に明らかになるであろう。これらの図面は実施形態を描写しており、範囲を限定することを意図するものではないことを理解されたい。
合成およびバーコーディングの概略図の実施形態を示す。 ＰＯＬＹ－ｓｅｑシステムの作成に使用される試薬の実施形態を示す。アクリレート末端ポリマーを生成するために、ポリ（エチレングリコール）ジアクリレートＭ_ｎ＝２５０（Ｄ８）、ジ（トリメチロールプロパン）テトラアクリレート（Ｖ５）、および３－アミノ－１－プロパノール（Ｓ３）の３つの試薬を使用する。次に、ポリマーを４つの試薬（Ｃ１～Ｃ４）のうちの１つでキャップする。 アクリレート末端（ＰＯＬＹ－ａｃ）および破線のボックスで強調された末端アルケンからの共鳴を有するスペルミンキャップされたＰＯＬＹ２の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルの実施形態を示す。 対照ベクターリポフェクタミン３０００およびＭｉｒｕｓ ＴｒａｎｓＩＴに対する、７２．３ ｉＰＳＣとともに２４時間インキュベートした濃度０．１～１００μｇ／ｍＬでのＰＯＬＹ－ｓｅｑベクターの生存率スクリーニングの実施形態を示す。＊＊＊ ＝ｐ<０．００１、ｎ＝３。 ＥＳＨ１および１３８３Ｄ６ ｉＰＳＣを用いたＰＯＬＹ－ｓｅｑベクターの生存率スクリーニングの実施形態を示す。 示された質量比でＰＯＬＹ－ｓｅｑポリマーによって結合されたｓｓＤＮＡバーコードのゲル電気泳動の実施形態を示す。 シングレットおよび二重ラベリングを示すＤｙＬｉｇｈｔ ４８８またはＤｙＬｉｇｈｔ ６５０コンジュゲートＰＯＬＹ－ｓｅｑベクターで事前にタグ付けされた融合スフェロイドのＦＡＣＳの実施形態を示す。 ＦＡＣＳによる総ラベル付け細胞および二重ラベル付け細胞の定量化の実施形態を示す。 ＤｙＬｉｇｈｔコンジュゲートＰＯＬＹ２で個別にタグ付けされた混合ＨＬＯのＦＡＣＳ分析の実施形態を示す。 図２ＣのＦＡＣＳ分析による総ＨＬＯラベリングの定量化の実施形態を示す。 タグ付けの３時間後のＨＬＯ内のベクターの局在化を追跡するために使用されるリソソーム、ＰＯＬＹ－ｓｅｑベクター、ミトコンドリア、およびＦ－アクチンの共焦点免疫蛍光顕微鏡写真の実施形態を示す。ＨＬＯ全体がＰＯＬＹ－ｓｅｑ蛍光およびＦ－アクチン染色で示されている。スケールバー＝５０μｍ。挿入画像は、リソソームの共局在化を示している。スケールバー＝１０μｍ。 ＰＯＬＹ－ｓｅｑでラベルされた前方前腸（上部、より明るい）および後方前腸（下部、より暗い）の融合スフェロイドの共焦点イメージングの実施形態を示す。 個別にタグ付けされた３つのＨＬＯサンプルにおけるバーコード発現のＵＭＡＰ分析の実施形態を示す。 各サンプル内の３つのバーコードのそれぞれに整列された細胞のパーセンテージを、インセットターゲティング精度（９４％）で示すグラフの実施形態を示す。 （ｉ）すべてのクラスター化細胞、および（ｉｉ）ＰＯＬＹ－ｓｅｑタグ付けからのバーコード読み取りを含有するクラスター化細胞のみを示す高感度ＵＭＡＰクラスタリングの実施形態を示す。サンプルＥ２について、クラスターごとのターゲティングおよびすべてのクラスターにわたるカバレッジ率が示されている。（ｉ）すべての細胞および（ｉｉ）バーコードＥ３に関連付けられたすべての細胞（上）を示すサンプルＥ３ならびに（ｉ）すべての細胞および（ｉｉ）バーコードＥ４（下）に関連付けられたすべての細胞を示すサンプルＥ４のＵＭＡＰ分析およびクラスタリングの実施形態も示されている。 サンプルＥ２、Ｅ３、およびＥ４について、およびすべてのサンプルにわたる平均として、ダブレット、ネガティブ、およびシングレットラベル付け細胞を特定するためにＳｅｕｒａｔで実行されるハッシング分析の実施形態を示す。 細胞当たりのユニークな検出された遺伝子（ＵＭＩ）の数と総ＲＮＡ、および組み入れられたネガティブ細胞とシングレットラベル付け細胞との間の遺伝子発現の実施形態を示す。 肝細胞（ＨＮＦ４α、ＡＳＧＲ１、ＣＥＢＰＡ、ＲＢＰ４）、星状細胞（ＣＯＬ１Ａ２、ＳＰＡＲＣ、ＴＡＧＬＮ）、および胆管細胞（ＫＲＴ７、ＴＡＣＳＴＤ２、ＳＰＰ１）の遺伝子発現と各発現集団に含まれるそれぞれのバーコード集団によって特定されたＨＬＯ肝系統の実施形態を示す。 サンプルＥ２、Ｅ３、およびＥ４について、胆管、肝細胞、および星状集団内のバーコード発現の実施形態を示す。 両方の亜集団のクラスターにわたるバーコード表現を示す、ユニークに検出された遺伝子の数（高ＵＭＩ>１３５０）および（低ＵＭＩ<１３５０）によって分割されたシングレットバーコードされた亜集団のヒートマップおよびＵＭＡＰクラスタリングの実施形態を示す。

本明細書に開示されるのは、標準的なハッシングオリゴヌクレオチド（「オリゴ」）に１０分で結合することができる低コストの市販の試薬で合成されたポリマーベースの分子バーコードラベリングシステム（「ＰＯＬＹ－ｓｅｑ」と呼ばれる）の実施形態である。ＰＯＬＹ－ｓｅｑシステムは、細胞集団内の細胞を成功裏にラベリングする。いくつかの実施形態では、細胞集団は、前方前腸スフェロイド集団、後方前腸スフェロイド集団、またはヒト肝臓オルガノイド集団である。このシステムは、標準のハッシングオリゴを使用して１時間以内に機能的なバーコーディングを実現し、いくつかの実施形態では、１０×Ｇｅｎｏｍｉｃｓ単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑプラットフォームで調製されたヒト肝臓オルガノイドに由来する細胞の９０％でバーコードラベルの正しい特定を可能にし、迅速で費用効果の高い方法でプールされた異種サンプル多重化のための機会を提供する。

次世代シーケンシング（ＮＧＳ）は、トランスクリプトームおよびゲノムプロファイルへの比類のない綿密な調査のための強力なツールを提供する。単一細胞技術は、異種サンプルの高解像度分解析の能力を提供する。しかしながら、ライブラリの調製ごとに１つの実験条件しかないという注意があり、複数のライブラリの調製が必要になるため、複数のサンプルを実行するためのコストが高くなる。例えば、単一細胞ＲＮＡシーケンシング（ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ）は、単一細胞用に捕捉されたすべてのＲＮＡ鎖が、それらの独自の細胞特異的バーコードを受け取りながら、シーケンシング用に捕捉されたあらゆるＲＮＡ鎖がその独自の鎖特異的バーコードを受け取るように、デュアルバーコードスキームを使用する。より大型のシーケンサーは、適切なシーケンシング深度で複数の単一細胞実験を並行して実行する能力を備えているため、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑの調製では、一般に、複数の実験をプールして並行して実行できるように、３番目の実験に特定なインデックスバーコードを添付する。この多重化により、処理能力が向上し、読み取り数当たりのコストが削減される。しかしながら、インデックスの添付はライブラリ調製の最終工程で実行されるため、サンプルは個別に調製して個別のインデックスを受け取る必要があり、適切な読み深度で個別のサンプルを一緒にプールできる場合は、コストが高くなる可能性がある。単一細胞処理の前のこのサンプルプーリングには、ＮＧＳプラットフォームで読み取り可能なバーコードでサンプルに異種タグを付けることができる方法論が必要である。

細胞ラベリングの一般的な手法の１つは、バーコード抱合抗体を使用する。この方法は、抗体によって提供される特異的ラベリングを利用して、標的を区別するだけでなく、発現の定量化も可能にする。複数のサンプルの特異的ラベリングから誘導された生来のバーコーディングの不均一性を通して、これによりサンプルの多重化とスーパーローディングがさらに可能になる。相補的技術は、細胞膜への非選択的な組み入れのために、脂肪酸の修飾を採用している。この方法は、抗体ラベリングと並置された特異性を犠牲にして、標的化の遍在性を高めることを目指している。抗体ベースのバーコーディング法は細胞表面タンパク質発現または特定の亜集団のタグ付けの定量化を可能にし、脂質法はより普遍的なバーコード組み入れを可能にするが、カスタムライブラリの作成ではそれらの調製に費用または時間がかかる場合がある。バーコードはラベリングメディエーターに直接的に共有的に抱合しているため、特にカスタムサンプルバーコードが多重化用途のための異種集団のラベリングに役立つ場合は柔軟性が低下する。他の技術は、遺伝的多様性に依存して、バイオインフォマティクス処理またはウイルスライブラリの作成および生成からのバーコード配列の発現を通じて逆多重化を推進する。ウイルス法は長期の系統追跡に便利であるが、多重化用途で十分なバーコード表現を行うための高い形質導入効率を備えたウイルスライブラリの生成および適用は、短期ラベリングを制限する場合がある。したがって、最小限の調製でカスタムバーコードプールを作成し、処理能力を大幅に向上させ、実験ごとに１サンプルの現行の一般的なサンプル調製戦略と多重化させることでシーケンシングコストを削減できる、高速で、効率的な偏在するサンプル特異的バーコーディングツールを開発する機会がある。

ポリマーベースのトランスフェクション技術は、選択した配列をコードする一連の機能的ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを送達する能力、またはタンパク質発現の改変について以前に調査されている。イオン相互作用の一般原理に基づいて動作する電荷ベースの方法論を採用するポリマーベクターは、ポリマーのカチオン電荷に依存して、核酸の骨格に存在するアニオン電荷との相互作用を通じてＤＮＡ／ＲＮＡに結合し、細胞表面と相互作用する。インビボでの情報の送達および分布の追跡に焦点を合わせた以前の用途で、トランスフェクションメディエーターからバーコーディングベクターへのポリマーの直接翻訳を可能にするのはこの原理に基づいている。しかしながら、効率的な単一細胞多重化用途の定式化の最適化はまだ完全に検討されていない。サンプルの多重化に適用できるバーコード用システムの２つの明確な特徴は、サンプルの不均一性に関係ない普遍的な結合であり、重要なことに、結合の忠実度である。サンプルの多重化を利用する場合、トランスクリプトームまたはゲノムがどれほど明確に配列決定されていても、特定の細胞は、下流のバイオインフォマティクス処理で識別可能な、定義されたサンプル特異的なバーコードを持っている必要がある。異種サンプルでは、普遍的ラベリングは、サンプルをプールできる偏りのない方法を提供するのに役立つ。結合の忠実度により、細胞がサンプルに特異的なバーコードでタグ付けされると、バーコーディングベクトルは多重化中に元々の細胞に結合されたままになり、配列決定された細胞が特定のサンプルに割り当てられる信頼性をそうでなければ低下させる他の細胞には移動しない。これらの２つのパラメーターを、本明細書に記載されるＰＯＬＹ－ｓｅｑベクトルの開発中に定量化メトリックとして使用した。

以下の詳細な説明では、その一部を形成する添付の図面を参照する。図面では、文脈上別段の指示がない限り、通常、類似の記号は類似の構成要素を特定する。詳細な説明、図面、および特許請求の範囲に記載された例示的な実施形態は、限定することを意味するものではない。本明細書に提示される主題の精神または範囲から逸脱することなく、他の実施形態を利用することができ、他の変更を行うことができる。本明細書に一般的に記載され、図に示される本開示の態様は、多種多様な異なる構成で配置、置換、結合、分離、および設計することができ、それらはすべて、本明細書に明示的に企図されることが容易に理解されよう。

別段の定めがない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、本開示が属する当業者による本開示に照らして読まれたときに一般に理解されるのと同じ意味を有する。本開示の目的のために、次の用語を以下に説明する。

本明細書の開示は、多くの実施形態を説明するために肯定的な言葉を使用している。本開示はまた、物質または材料、方法の工程および条件、プロトコル、または手順などの主題が完全にもしくは部分的に除外される実施形態を含む。

冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書では、冠詞の文法的目的語の１つまたは２つ以上（例えば、少なくとも１つ）を指すために使用される。例として、「ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ（要素）」は、１つの要素または２つ以上の要素を意味する。

「約」は、参照する量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）、レベル、値、数、頻度、割合、寸法、サイズ、量（ａｍｏｕｎｔ）、重量または長さに対し１０％と同程度に変動する量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）、レベル、値、数、頻度、割合、寸法、サイズ、量（ａｍｏｕｎｔ）、重量または長さを意味する。

この明細書全体を通して、文脈上別段の必要がない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という言葉は、記載された工程もしくは要素または工程もしくは要素のグループを包含することを意味するが、いかなる他の工程もしくは要素または工程もしくは要素のグループも排除しないことを意味することが離解されよう。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、語句「からなる」が続くすべてを含むことを意味する。そのため、語句「からなる」は、列挙された要素が必要であり（ｒｅｑｕｉｒｅｄ）、または必須（ｍａｎｄａｔｏｒｙ）であり、その他の要素が存在し得ないことを示す。「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」とは、この語句の前に列挙されたあらゆる要素の包含を意味しており、他の要素は、この列挙された要素に関して本開示で明示される活性もしくは作用を妨げないまたはこの活性もしくは作用に寄与しないものに限定される。したがって、「本質的にからなる」という句は、列挙された要素が必要であり（ｒｅｑｕｉｒｅｄ）、または必須（ｍａｎｄａｔｏｒｙ）であるが、その他の要素は任意選択的であり、列挙された要素の活性もしくは作用に実質的な影響を及ぼすか否かに応じて存在してもよいし存在しなくてもよいことを示す。

本明細書で使用される「個体」、「対象」、または「患者」という用語は、本明細書に照らして理解されるそれらの一般的かつ通常の意味を有し、ヒトまたは非ヒト哺乳動物、例えば、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、非ヒト霊長類、または鳥、例えば、ニワトリ、ならびに他の脊椎動物または無脊椎動物を意味する。「哺乳動物」という用語は、通常の生物学的意味で使用される。したがって、これには、具体的には、サル（チンパンジー、類人猿、サル）およびヒトを含む霊長類、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコ、げっ歯類、ラット、マウス、モルモットなどが挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される「有効量」または「有効用量」という用語は、明細書に照らして理解されるそれらの一般的かつ通常の意味を有し、観察可能な効果をもたらす記載された組成物または化合物のその量を指す。現在開示されている主題の活性組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、特定の対象および／または用途に対して所望の応答を達成するのに有効な量の活性組成物または化合物を投与するように変えることができる。選択される投薬量レベルは、組成物の活性、配合物、投与経路、他の薬物または治療との組み合わせ、治療される状態の重症度、および治療される対象の身体的状態ならびに病歴が挙げられるが、これらに限定されない様々な因子に依存するであろう。いくつかの実施形態では、最小用量が投与され、用量制限毒性がない場合、用量は最小有効量に増量される。本明細書では、有効用量の決定および調整、ならびにそのような調整をいつどのように行うかの評価が企図されている。

本明細書で使用される「機能」および「機能的」という用語は、本明細書に照らして理解されるような明白で通常の意味を有し、生物学的、酵素的、または治療的機能を指す。

本明細書で使用される「阻害する」という用語は、本明細書に照らして理解されるようなその一般的かつ通常の意味を有し、生物学的活性の減少または防止を指すことができる。減少は、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは１００％であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、または約それら以下である割合、あるいは前述の値のうちのいずれか２つによって定義される範囲内にある量によるものであり得る。本明細書で使用される場合、「遅延」という用語は、明細書に照らして理解されるような一般的かつ通常の意味を有し、生物学的事象の、そうでない場合に予想されるよりも遅い時間への遅れ、延期、または延期を指す。遅延は、約０％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、もしくは約それら以下である割合、または前述の値のうちのいずれか２つによって定義される範囲内にある量の遅延であり得る。阻害および遅延という用語は、必ずしも１００％の阻害または遅延を示すとは限らない。部分的な阻害または遅延が実現され得る。

本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、明細書に照らして理解されるような一般的かつ通常の意味を有し、（１）最初に産生されたとき（自然界および／または実験環境で）に、それが関連付けられた構成成分の少なくともいくつかから分離された、および／または（２）人間の手によって産生、調製、および／または製造されたときにそれが関連付けられた成分の少なくともいくつかから分離された、物質および／または実体を指す。単離された物質および／または実体は、最初に関連付けられた他の構成成分の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、実質的に１００％、もしくは１００％に等しいか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、それら以下であるか、または約それら以下であるものから分離され得る（または前述の値を含むおよび／もしくはまたがる範囲で分離され得る）。いくつかの実施形態では、単離された薬剤は、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、実質的に１００％、または１００％純粋であるか、少なくともそれらほど純粋であるか、それら以下で純粋であるか、または約それら以下で純粋である（もしくは前述の値を含むおよび／またはまたがる範囲で純粋である）。本明細書で使用される場合、「単離された」物質は、「純粋」であり得る（例えば、他の成分を実質的に含まない）。本明細書で使用される場合、「単離された細胞」という用語は、多細胞生物または組織に含まれない細胞を指してもよい。

本明細書で使用される場合、「インビボ」は、本明細書に照らして理解されるその一般的かつ通常の意味を与えられ、組織抽出物または死んだ生物とは対照的に、生きている生物、通常は動物、ヒトを含む哺乳動物、および植物内での方法の実施を指す。

本明細書で使用される場合、「エクスビボ」は、明細書に照らして理解されるその一般的かつ通常の意味を与えられ、自然条件のほとんど変化のない生体外での方法の実行を指す。

本明細書で使用される場合、「インビトロ」は、明細書に照らして理解されるその一般的かつ通常の意味を与えられ、生物学的条件の外、例えばペトリ皿または試験管内での方法の実施を指す。

本明細書で使用される「核酸」または「核酸分子」という用語は、本明細書に照らして理解されるそれらの一般的かつ通常の意味を有し、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）などのポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、自然に細胞内に現れるもの、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって生成されたフラグメント、およびライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼ作用、およびエキソヌクレアーゼ作用によって生成されたフラグメントを指す。核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡなど）であるモノマー、または天然に存在するヌクレオチドの類似体（例えば、天然に存在するヌクレオチドのエナンチオマー形態）、または両方の組み合わせから構成され得る。修飾ヌクレオチドは、糖部分および／またはピリミジンもしくはプリン塩基部分に変化を有することができる。糖修飾には、例えば、１つ以上のヒドロキシル基のハロゲン、アルキル基、アミン、およびアジド基による置換が含まれるか、または糖をエーテルもしくはエステルとして官能化することができる。さらに、糖部分全体を、アザ糖および炭素環式糖類似体などの立体的ならびに電子的に類似した構造に置き換えることができる。塩基部分の修飾の例としては、アルキル化プリンおよびピリミジン、アシル化プリンもしくはピリミジン、または他の周知の複素環式置換基が挙げられる。核酸モノマーは、ホスホジエステル結合またはそのような結合の類似体によって結合することができる。ホスホジエステル結合の類似体としては、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホルアニリデート、またはホスホルアミデートが挙げられる。「核酸分子」という用語はまた、いわゆる「ペプチド核酸」を含み、これは、ポリアミド骨格に結合した天然に存在するまたは修飾された核酸塩基を含む。核酸は一本鎖または二本鎖のいずれかであり得る。「オリゴヌクレオチド」は、核酸と互換的に使用することができ、二本鎖もしくは一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかを指すことができる。核酸（単数または複数）は、様々な生物学的システムにおける核酸（単数または複数）の増幅および／もしくは発現に使用することができる核酸ベクターまたは核酸構築物（例えば、プラスミド、ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、バクテリオファージ、コスミド、フォスミド、ファージミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、またはヒト人工染色体（ＨＡＣ））中に含まれ得る。典型的には、ベクターまたは構築物はまた、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、インデューサー、リボソーム結合部位、翻訳開始部位、開始コドン、終止コドン、ポリアデニル化シグナル、複製起点、クローニング部位、多重クローニング部位、制限酵素部位、エピトープ、レポーター遺伝子、選択マーカー、抗生物質選択マーカー、標的化配列、ペプチド精製タグ、もしくはアクセサリー遺伝子、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されないエレメントも含有するであろう。

核酸または核酸分子は、異なるペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする１つ以上の配列を含むことができる。これらの１つ以上の配列は、同じ核酸もしくは核酸分子内で隣接して、あるいは、例えばリンカー、リピートもしくは制限酵素部位間の余分な核酸、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、もしくは３００の塩基長、または前述の長さのうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の長さであるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、または約それら以下である、任意の他の配列と結合することができる。本明細書で使用される核酸に関する「下流」という用語は、明細書に照らして理解されるその一般的かつ通常の意味を有し、核酸が二本鎖である場合、コード化配列（センス鎖）を含有する鎖上の前の配列の３’末端の後ろにある配列を指す。本明細書で使用される核酸に関する「上流」という用語は、明細書に照らして理解されるその一般的かつ通常の意味を有し、核酸が二本鎖である場合、コード化配列（センス鎖）を含有する鎖上の後続の配列の５’末端の前にある配列を指す。本明細書で使用される核酸に関する「グループ化」という用語は、本明細書に照らして理解されるその一般的かつ通常の意味を有し、直接もしくは、例えばリンカー、リピートもしくは制限酵素部位間の余分な核酸、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、もしくは３００の塩基長、または、前述の長さのうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の長さであるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、または約それら以下である、任意の他の配列と近接して生じるが、一般に、機能的もしくは触媒的ポリペプチド、タンパク質、またはタンパク質ドメインをコードする配列間とは生じない２つ以上の配列を指す。

本明細書に記載の核酸は、核酸塩基を含む。一次、標準、天然、または未修飾の塩基は、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、およびウラシルである。他の核酸塩基としては、プリン、ピリミジン、修飾核酸塩基、５－メチルシトシン、シュードウリジン、ジヒドロウリジン、イノシン、７－メチルグアノシン、ヒポキサンチン、キサンチン、５，６－ジヒドロウラシル、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－ブロモウラシル、イソグアニン、イソシトシン、アミノアリル塩基、色素ラベル付け塩基、蛍光塩基、またはビオチンラベル付け塩基が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書に照らして理解されるそれらの一般的かつ通常の意味を有し、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸から構成される高分子を指す。ペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質の多くの機能は当技術分野において既知であり、酵素、構造、輸送、防御、ホルモン、またはシグナル伝達が挙げられるが、これらに限定されない。ペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質は、常にではないが、多くの場合、核酸テンプレートを使用してリボソーム複合体によって生物学的に生成されるが、化学合成も利用できる。核酸テンプレートを操作することにより、２つ以上のペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質の置換、欠失、短縮、付加、複製、または融合などのペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質変異を実行することができる。これらの２つ以上のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の融合は、同じ分子内で隣接して、あるいは、例えばリンカー、リピート、エピトープ、もしくはタグ間の余分なアミノ酸、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、もしくは３００の塩基長、または、前述の長さのうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の長さであるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、または約それら以下である、任意の他の配列と結合することができる。本明細書で使用されるポリペプチドに関する「下流」という用語は、明細書に照らして理解されるその一般的かつ通常の意味を有し、前の配列のＣ末端の後ろにある配列を指す。本明細書で使用されるポリペプチドに関する「上流」という用語は、明細書に照らして理解されるその一般的かつ通常の意味を有し、後続の配列のＮ末端の前にある配列を指す。

本明細書で使用される任意の所与の物質、化合物、または材料の「純度」という用語は、仕様に照らして理解されるその一般的かつ通常の意味を有し、予想される存在量に対する物質、化合物、または材料の実際の存在量を指す。例えば、物質、化合物、または材料は、少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％純粋であり、その間のすべての小数を含む。純度は、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、アミノ酸、脂質、細胞膜、細胞破片、小分子、分解産物、溶媒、担体、ビヒクル、もしくは汚染物質、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない不必要な不純物の影響を受ける場合がある。いくつかの実施形態では、物質、化合物、または材料は、宿主細胞タンパク質、宿主細胞核酸、プラスミドＤＮＡ、汚染ウイルス、プロテアソーム、宿主細胞培養成分、プロセス関連成分、マイコプラズマ、発熱物質、細菌内毒素、および外来性感染性因子を実質的に含まない。純度は、電気泳動、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、キャピラリー電気泳動、ＰＣＲ、ｒｔＰＣＲ、ｑＰＣＲ、クロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、分光法、ＵＶ－可視分光法、赤外線分光法、質量分析法、核磁気共鳴、重量測定、もしくは滴定、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない技法を使用して測定することができる。

本明細書で使用される任意の所与の物質、化合物、または材料の「収率」という用語は、仕様に照らして理解されるその一般的かつ通常の意味を有し、予想される存在量に対する物質、化合物、または材料の実際の総量を指す。例えば、物質、化合物、または材料の収率は、予想される総量の８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは１００％であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、または約それら以下であり、その間のすべての小数を含む。収率は、反応またはプロセスの効率、望ましくない副反応、分解、投入物質、化合物、もしくは材料の品質、または製造の任意の工程での所望の物質、化合物、もしくは材料の損失によって影響を受ける場合がある。

本明細書で使用される「ｗ／ｗ％」または「重量／重量％」という用語は、本明細書に照らして理解されるその一般的かつ通常の意味を有し、１００を掛けた組成物の全重量に対する成分または薬剤の重量に関して表された割合を指す。本明細書で使用される「ｖ／ｖ％」または「体積／体積％」という用語は、本明細書に照らして理解されるその一般的かつ通常の意味を有し、組成物の全液体体積に対する化合物、物質、成分または薬剤の液体体積に関して表された割合に１００を掛けたものを指す。

カチオン性ポリマーおよびその製造方法
本明細書で使用される「カチオン性ポリマー」という用語は、本明細書に照らして理解されるその一般的かつ通常の意味を有し、その表面に正（カチオン性）電荷を示す高分子量ポリマー化合物を指す。いくつかの実施形態では、正電荷は、カチオン性ポリマー上のアミン基によるものである。カチオン性ポリマーは、線状ポリマー、分岐状ポリマー、ランダム分岐状ポリマー、デンドリマー、ブロックポリマー、またはグラフトポリマーであり得る。いくつかの実施形態では、これらの異なるポリマー構造は、カチオン性ポリマーの特性を変化させる。細胞への送達の目的で、カチオン性ポリマーは、核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）の負に帯電したリン酸骨格に結合して、ポリマー／核酸複合体を形成することができる。カチオン性ポリマーはまた、核酸の三次元構造を変化させることができ、例えば、核酸を圧縮するか、またはヌクレアーゼにアクセスしにくくする。カチオン性ポリマーはまた、カチオン性電荷もしくは領域の数または密度、安全性、毒性、生分解性、使いやすさ、合成の容易さ、核酸複合体形成の効率、核酸送達の効率、凝集傾向、官能基による追加の修飾のための能力、もしくはコスト、またはこれらの任意の組み合わせなどの品質に従って選択される。まだ完全には理解されていないが、カチオン性ポリマーは、電荷相互作用、エンドサイトーシスによる細胞への内在化、および細胞質への核酸の放出を介して細胞の原形質膜と相互作用することによって、複合核酸を細胞に送達する。遺伝子発現を意図した核酸ペイロードの場合、これらの核酸は、リボソームによって直接翻訳されるか（ＲＮＡの場合のように）、核に移行してエピソームとして（ＤＮＡとして）転写されるかのいずれかであり得る。バーコーディング用途の場合、このプロセスの任意の工程で、シーケンシングによるなど、核酸ペイロードを分析することができる。当技術分野において既知のカチオン性ポリマーの例としては、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリ－Ｌ－リジン（ＰＬＬ）、キトサン、ＤＥＡＥ－デキストラン、またはポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）が挙げられる、これらに限定されない。一部のカチオン性ポリマーは、脂質ベースのトランスフェクション試薬と組み合わせて、細胞への送達を強化することができる。カチオン性ポリマーを含んでも、または含まなくてもよい市販のトランスフェクション試薬の例とは、リポフェクタミン、ＴｒａｎｓＩＴ、またはＦｕｇｅｎｅが挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書に記載されているのは、カチオン性ポリマーを合成する方法である。いくつかの実施形態では、方法は、ジアクリレートモノマーおよびアルカノールアミンを使用することを含む。いくつかの実施形態では、ジアクリレートモノマーのアクリレート官能基およびアルカノールアミンのアミン官能基は、マイケル付加反応に従って反応して、アクリレート－アミノ付加物を形成する。いくつかの実施形態では、マイケル付加は、アザ－マイケル付加である。いくつかの実施形態では、方法は、複数のジアクリレートモノマーと、複数のアルカノールアミンとを反応させて、ジアクリレート／アルカノールアミンポリマーをもたらすことを含む。いくつかの実施形態では、ジアクリレートモノマーは、ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート（「Ｄ８」）モノマーもしくはジ（トリメチロールプロパン）テトラアクリレート（「Ｖ５」）モノマー、またはその両方である。いくつかの実施形態では、ジアクリレートモノマーは、線状ジアクリレートモノマーである。いくつかの実施形態では、ジアクリレートモノマーは、下記の構造を有する。

いくつかの実施形態では、ジアクリレートモノマーは、分岐状ジアクリレートモノマーである。いくつかの実施形態では、ジアクリレートモノマーは、下記の構造を有する。

いくつかの実施形態では、ポリ（エチレングリコール）ジアクリレートは、ポリ（エチレングリコール）ジアクリレートＭ_ｎ＝２５０である。いくつかの実施形態では、アルカノールアミンは、３－アミノ－１－プロパノール（「Ｓ３」）である。いくつかの実施形態では、アルカノールアミンは、下記の構造を有する

いくつかの実施形態では、方法は、Ｄ８モノマーをＳ３モノマーと反応させて、Ｄ８／Ｓ３ポリマーをもたらすことを含む。いくつかの実施形態では、方法は、Ｄ８をＳ３と反応させて、Ｄ８／Ｓ３ポリマーをもたらすことを含む。いくつかの実施形態では、Ｄ８およびＳ３は、マイケル付加によって反応される。いくつかの実施形態では、Ｄ８／Ｓ３ポリマーは、Ｄ８とＳ３とを接触することによってマイケル付加により生成される。いくつかの実施形態では、Ｄ８／Ｓ３ポリマーは線状ポリマーである。いくつかの実施形態では、Ｄ８／Ｓ３ポリマーは、１つまたは２つのアクリレート基を含む。いくつかの実施形態では、Ｄ８／Ｓ３ポリマーはカチオン性ポリマーである。いくつかの実施形態では、Ｄ８の量はＳ３の量よりも多い。いくつかの実施形態では、Ｄ８はＳ３よりも豊富である。いくつかの実施形態では、Ｄ８は過剰にある。いくつかの実施形態では、Ｄ８対Ｓ３のモル比は、１より大きい。いくつかの実施形態では、Ｄ８対Ｓ３のモル比は、１．０１：１、１．０２：１、１．０３：１、１．０４：１、１．０５：１、１．０６：１、１．０７：１、１．０８：１、１．０９：１、１．１：１、１．１１：１、１．１２：１、１．１３：１、１．１４：１、もしくは１．１５：１、または前述の比のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の比、例えば、１．０１：１～１．１５：１、１．０１：１～１．１：１、１．０５：１～１．１：１、もしくは１．１：１～１．１５：１であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、あるいは約それら以下である。いくつかの実施形態では、Ｄ８対Ｓ３のモル比は、１．０５：１であるか、約１．０５：１であるか、少なくとも１．０５：１であるか、少なくとも約１．０５：１であるか、１．０５：１以下であるか、または約１．０５：１以下である。いくつかの実施形態では、Ｄ８対Ｓ３のモル比は、１．１：１であるか、約１．１：１であるか、少なくとも１．１：１であるか、少なくとも約１．１：１であるか、１．１：１以下であるか、または約１．１：１以下である。いくつかの実施形態では、方法は、Ｄ８モノマーとＶ５モノマーとの混合物をＳ３モノマーと反応させて、Ｄ８／Ｖ５／Ｓ３ポリマーをもたらすことを含む。いくつかの実施形態では、方法は、Ｄ８とＶ５とＳ３とを接触させて、Ｄ８／Ｖ５／Ｓ３ポリマーをもたらすことを含む。いくつかの実施形態では、Ｄ８／Ｖ５／Ｓ３ポリマーはカチオン性ポリマーである。いくつかの実施形態では、Ｄ８／Ｖ５／Ｓ３ポリマーは分岐状ポリマーである。いくつかの実施形態では、Ｄ８／Ｖ５／Ｓ３ポリマーは、３つ以上の末端アクリレート基を含む。いくつかの実施形態では、Ｄ８およびＶ５の量は、Ｓ３の量よりも多い。いくつかの実施形態では、Ｄ８およびＶ５は、Ｓ３よりも豊富である。いくつかの実施形態では、Ｄ８およびＶ５は過剰にある。いくつかの実施形態では、Ｄ８対Ｓ３のモル比は、１より大きい。いくつかの実施形態では、Ｄ８対Ｓ３のモル比は、１．０１：１、１．０２：１、１．０３：１、１．０４：１、１．０５：１、１．０６：１、１．０７：１、１．０８：１、１．０９：１、１．１：１、１．１１：１、１．１２：１、１．１３：１、１．１４：１、もしくは１．１５：１、または前述の比のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の比、例えば、１．０１：１～１．１５：１、１．０１：１～１．１：１、１．０５：１～１．１：１、もしくは１．１：１～１．１５：１であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、あるいは約それら以下である。いくつかの実施形態では、Ｄ８対Ｓ３のモル比は、１．０５：１であるか、約１．０５：１であるか、少なくとも１．０５：１であるか、少なくとも約１．０５：１であるか、１．０５：１以下であるか、または約１．０５：１以下である。いくつかの実施形態では、Ｄ８対Ｓ３のモル比は、１．１：１であるか、約１．１：１であるか、少なくとも１．１：１であるか、少なくとも約１．１：１であるか、１．１：１以下であるか、または約１．１：１以下である。いくつかの実施形態では、Ｖ５対Ｓ３のモル比は、１より小さい。いくつかの実施形態では、Ｖ５対Ｓ３のモル比は、０．１：１、０．２：１、０．３：１、０．４：１、０．５：１、０．６：１、０．７：１、０．８：１、０．９：１、もしくは１：１、または前述の比のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の比、例えば、０．１：１～１：１、０．５：１～０．８：１、０．１：１～０．５：１、もしくは０．５：１～１：１であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、あるいは約それら以下である。いくつかの実施形態では、Ｄ８対Ｖ５のモル比は、１より大きい。いくつかの実施形態では、Ｄ８対Ｖ５のモル比は、１．１：１、１．２：１、１．３：１、１．４：１、１．５：１、１．６：１、１．７：１、１．８：１、１．９：１、もしくは２．０：１、または前述の比のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の比、例えば、１．１：１～２．０：１、１．３：１～１．８：１、１．１：１～１．５：１、もしくは１．５：１～２．０：１であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、あるいは約それら以下である。いくつかの実施形態では、Ｄ８、Ｖ５、およびＳ３のモル比が表２に提供されている。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法のうちのいずれか１つによって合成されたカチオン性ポリマーは、アクリレート末端であり、カチオン性ポリマーは、１つ以上のアクリレート官能基を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のアクリレート官能基は、さらに反応される。いくつかの実施形態では、カチオン性ポリマーは、１つ以上のキャッピング分子と反応して、キャップされたカチオン性ポリマーを形成する。いくつかの実施形態では、カチオン性ポリマーを、１つ以上のキャッピング分子と接触させて、キャップされたカチオン性ポリマーを形成する。いくつかの実施形態では、１つ以上のキャッピング分子は、アミン基を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のキャッピング分子のアミン基は、マイケル付加によって１つ以上のアクリレート官能基と反応する。いくつかの実施形態では、マイケル付加は、アザ－マイケル付加である。いくつかの実施形態では、１，４－ビス（３－アミノプロピル）ピペラジン（「Ｃ１」）、スペルミン（「Ｃ２」）、ポリエチレンイミン（「Ｃ３」）、もしくは２，２－ジメチル－１，３－プロパンジアミン（「Ｃ４」）のうちの１つ以上（例えば、少なくとも１、２、３、４個）、またはこれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、キャッピング分子は、下記の構造を有する

いくつかの実施形態では、カチオン性ポリマーとキャッピング分子とを、特定の質量比で接触させる。いくつかの実施形態では、カチオン性ポリマーとキャッピング分子とを、１より大きい質量比で接触させる。いくつかの実施形態では、カチオン性ポリマーとキャッピング分子とを、１より小さい質量比で接触させる。いくつかの実施形態では、カチオン性ポリマーとキャッピング分子とを、１００：１、１００：２、１００：３、１００：４、１００：５、１００：６、１００：７、１００：８、１００：９、１００：１０、１００：１５、１００：２０、１００：２５、１００：３０、１００：３５、１００：４０、１００：４５、１００：５０、１００：５５、１００：６０、１００：６５、１００：７０、１００：７５、１００：８０、１００：８５、１００：９０、１００：９５、１００：１００、１００：１５０、１００：２００、１００：３００、１００：４００、もしくは１００：５００、または前述の比のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の比、例えば、１００：１～１００：５００、１００：１～１００：２５、１００：１～１００：１００、１００：１０～１００：１００、もしくは１００：１００～１００：５００であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、あるいは約それら以下である質量比で接触させる。いくつかの実施形態では、カチオン性ポリマーとキャッピング分子とを、表２に提供される質量比で接触させる。いくつかの実施形態では、キャップされたカチオン性ポリマーは、いかなるアクリレート基も含まない。いくつかの実施形態では、キャップされたカチオン性ポリマーは、ベクターＰＯＬＹ１、ＰＯＬＹ２、ＰＯＬＹ３、ＰＯＬＹ４、ＰＯＬＹ５、ＰＯＬＹ６、ＰＯＬＹ７、もしくはＰＯＬＹ８のうちの１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８つ）、またはこれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、キャップされたカチオン性ポリマーは、ベクターＰＯＬＹ１である。いくつかの実施形態では、キャップされたカチオン性ポリマーは、ベクターＰＯＬＹ２である。いくつかの実施形態では、キャップされたカチオン性ポリマーは、ベクターＰＯＬＹ３である。いくつかの実施形態では、キャップされたカチオン性ポリマーは、ベクターＰＯＬＹ４である。いくつかの実施形態では、キャップされたカチオン性ポリマーは、そのベクターＰＯＬＹ５である。いくつかの実施形態では、キャップされたカチオン性ポリマーは、ベクターＰＯＬＹ６である。いくつかの実施形態では、キャップされたカチオン性ポリマーは、ベクターＰＯＬＹ７である。いくつかの実施形態では、キャップされたカチオン性ポリマーは、ベクターＰＯＬＹ８である。いくつかの実施形態では、キャップされたカチオン性ポリマーは、表２に提供されるキャップされたカチオン性ポリマーのうちのいずれか１つである。いくつかの実施形態では、キャップされたカチオン性ポリマーは、表２に提供されるモル比または質量比に従って合成されたキャップされたカチオン性ポリマーである。

いくつかの実施形態では、カチオン性ポリマーは、本明細書に開示されるジアクリレートモノマーと本明細書に開示されるアミノアルコール（アルカノールアミン）とを混合して、キャップされていないアクリレート末端カチオン性ポリマーを形成することによって合成される。いくつかの実施形態では、ジアクリレートモノマーとアミノアルコールとを、１０℃、２０℃、３０℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃、８５℃、８６℃、８７℃、８８℃、８９℃、９０℃、９１℃、９２℃、９３℃、９４℃、９５℃、９６℃、９７℃、９８℃、９９℃、もしくは１００℃、または前述の温度のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の温度、例えば、１０℃～１００℃、６０℃～９５℃、８５℃～９９℃、１０℃～９０℃、もしくは８５℃～１００℃であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、あるいは約それら以下である温度で反応させる。いくつかの実施形態では、ジアクリレートモノマーとアミノアルコールとを、９０℃であるか、約９０℃であるか、少なくとも９０℃であるか、少なくとも約９０℃であるか、９０℃以下であるか、または約９０℃以下である温度で反応させる。いくつかの実施形態では、ジアクリレートモノマーとアミノアルコールとを、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、もしくは４８時間、または前述の時間数のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の時間数、例えば、１～４８時間、１０～３０時間、２０～２５時間、１～２４時間、もしくは２４～４８時間であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、あるいは約それら以下である時間数の間反応させる。いくつかの実施形態では、ジアクリレートモノマーとアミノアルコールとを、２４時間であるか、約２４時間であるか、少なくとも２４時間であるか、少なくとも約２４時間であるか、２４時間以下であるか、または約２４時間以下である温度で反応させる。

いくつかの実施形態では、キャップされていないアクリレート末端カチオン性ポリマーは、キャッピング分子の付加によってキャップされ、キャップされたカチオン性ポリマーを形成し、ここで、キャッピング分子は、一級または二級アミンを含む分子である。いくつかの実施形態では、キャップされていないアクリレート末端カチオン性ポリマーを、キャッピング分子と、１０℃、２０℃、３０℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃、８５℃、８６℃、８７℃、８８℃、８９℃、９０℃、９１℃、９２℃、９３℃、９４℃、９５℃、９６℃、９７℃、９８℃、９９℃、もしくは１００℃、または前述の温度のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の温度、例えば、１０℃～１００℃、６０℃～９５℃、８５℃～９９℃、１０℃～９０℃、もしくは８５℃～１００℃であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、または約それら以下である温度で反応させる。いくつかの実施形態では、キャップされていないアクリレート末端カチオン性ポリマーを、キャッピング分子と、５０℃であるか、約５０℃であるか、少なくとも５０℃であるか、少なくとも約５０℃であるか、５０℃以下であるか、または約５０℃以下である温度で反応させる。いくつかの実施形態では、キャップされていないアクリレート末端カチオン性ポリマーを、キャッピング分子と、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、もしくは４８時間、または前述の時間数のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の時間数、例えば、１～４８時間、１０～３０時間、２０～２５時間、１～２４時間、もしくは２４～４８時間であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、あるいは約それら以下である温度で反応させる。いくつかの実施形態では、キャップされていないアクリレート末端カチオン性ポリマーを、キャッピング分子と、２４時間であるか、約２４時間であるか、少なくとも２４時間であるか、少なくとも約２４時間であるか、２４時間以下であるか、または約２４時間以下である温度で反応させる。いくつかの実施形態では、キャップされたカチオン性ポリマーは、－２０℃であるか、約－２０℃であるか、少なくとも－２０℃であるか、少なくとも約－２０℃であるか、－２０℃以下であるか、または約－２０℃以下である温度で保存される。

いくつかの実施形態では、カチオン性ポリマーまたはキャップされたカチオン性ポリマーは、蛍光タグと結合される。いくつかの実施形態では、カチオン性ポリマーまたはキャップされたカチオン性ポリマーは、アミン反応性結合体を使用して蛍光タグと結合される。いくつかの実施形態では、カチオン性ポリマーまたはキャップされたカチオン性ポリマーは、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル抱合体を使用して結合される。いくつかの実施形態では、蛍光タグは、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル官能基を含む。いくつかの実施形態では、蛍光タグは、ＤｙＬｉｇｈｔ ４８８、ＤｙＬｉｇｈｔ ５５０、またはＤｙＬｉｇｈｔ ６５０である。

本明細書に記載されているのは、カチオン性ポリマー、キャップされたカチオン性ポリマー、もしくはその両方、またはそれらの組成物である。いくつかの実施形態では、カチオン性ポリマーは、本明細書に記載の方法のうちのいずれか１つによって生成されたカチオン性ポリマーである。いくつかの実施形態では、キャップされたカチオン性ポリマーは、本明細書に記載の方法のうちのいずれか１つによって生成されたキャップされたカチオン性ポリマーである。いくつかの実施形態では、キャップされたカチオン性ポリマーは、ベクターＰＯＬＹ１、ＰＯＬＹ２、ＰＯＬＹ３、ＰＯＬＹ４、ＰＯＬＹ５、ＰＯＬＹ６、ＰＯＬＹ７、もしくはＰＯＬＹ８のうちの１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８つ）、またはこれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、キャップされたカチオン性ポリマーは、ベクターＰＯＬＹ１である。いくつかの実施形態では、キャップされたカチオン性ポリマーは、ベクターＰＯＬＹ２である。いくつかの実施形態では、キャップされたカチオン性ポリマーは、ベクターＰＯＬＹ３である。いくつかの実施形態では、キャップされたカチオン性ポリマーは、ベクターＰＯＬＹ４である。いくつかの実施形態では、キャップされたカチオン性ポリマーは、そのベクターＰＯＬＹ５である。いくつかの実施形態では、キャップされたカチオン性ポリマーは、ベクターＰＯＬＹ６である。いくつかの実施形態では、キャップされたカチオン性ポリマーは、ベクターＰＯＬＹ７である。いくつかの実施形態では、キャップされたカチオン性ポリマーは、ベクターＰＯＬＹ８である。いくつかの実施形態では、キャップされたカチオン性ポリマーは、表２に提供されるキャップされたカチオン性ポリマーのうちのいずれか１つである。いくつかの実施形態では、キャップされたカチオン性ポリマーは、表２に提供されるモル比または質量比に従って合成されたキャップされたカチオン性ポリマーである。いくつかの実施形態では、カチオン性ポリマーもしくはキャップされたカチオン性ポリマー、またはその両方は、蛍光染料をさらに含む。いくつかの実施形態では、蛍光染料は、ＤｙＬｉｇｈｔ ４８８、ＤｙＬｉｇｈｔ ５５０、もしくはＤｙＬｉｇｈｔ ６５０、またはこれらの任意の組み合わせである。

「バーコード」および「バーコーディング」という用語は、本明細書に照らして理解されるように、それらの一般的かつ通常の意味を有し、細胞または細胞の成分（例えば、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド）をラベルし、シーケンシングによって細胞または細胞の成分を特定するために、既知の配列を有する短い核酸を使用することを指す。いくつかの実施形態では、核酸は、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、または一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）である。核酸は、ユニークなバーコード配列、ならびに異なる核酸バーコード間で同じである１つ以上の一定のアダプター配列を含む。典型的には、１つ以上の一定のアダプター配列は、核酸鎖の両端（すなわち、５’および３’末端）にあり、ユニークなバーコード配列に隣接している。これらの１つ以上の定数アダプター配列はプライマーアニーリング領域として使用されるため、同じプライマーを異なるバーコードのセット全体に使用することができる。プライマーを使用してバーコードを増幅すると、ユニークなバーコード配列の増幅をもたらし、これは、現在の方法を使用してユニークなバーコード配列を検出できるようにするために必要である。核酸バーコードは、細胞の異なる成分に結合できるように、抗体などの何らかの方法で修飾または結合することができる。細胞バーコーディング用途の場合、細胞のそれぞれのユニークなバーコードの増幅された配列に基づいて、細胞の集団または混合物内の別の細胞から１つの細胞を区別することができる。本明細書で使用される場合、カチオン性ポリマーは、細胞集団内の細胞に核酸バーコードを送達するために使用される。細胞がこれらのバーコードを有している間に、単一細胞ＲＮＡシーケンシング（ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ）などの単一細胞シーケンシング技術による細胞集団の分析により、個々の細胞およびその構成要素であるトランスクリプトームプロファイルの特定が可能となる。いくつかの実施形態では、細胞の集団は、細胞の２つ以上の亜集団からなる。細胞の２つ以上の亜集団のそれぞれに異なり、ユニークなバーコードを送達することにより、バーコードを配列決定することにより、２つ以上の亜集団がサンプル内で混合されている場合であっても、細胞の２つ以上の亜集団の１つに属するものとして細胞を特定することが可能となる。

いくつかの実施形態では、カチオン性ポリマーおよび核酸バーコードは、溶液中で組み合わされて、カチオン性バーコードを形成する。いくつかの実施形態では、カチオン性ポリマーと核酸バーコードとは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０ｗ／ｗ比のカチオン性ポリマー：核酸バーコード、または前述のｗ／ｗ比のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意のｗ／ｗ比、例えば、１～８０、１０～６０、２０～５０、１～６０、もしくは１０～８０ｗ／ｗ比であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、あるいは約それら以下であるｗ／ｗ比で組み合わされる。いくつかの実施形態では、カチオン性ポリマーと核酸バーコードとは、２ｗ／ｗ比で組み合わされる。いくつかの実施形態では、カチオン性ポリマーと核酸バーコードとは、５ｗ／ｗ比で組み合わされる。いくつかの実施形態では、カチオン性ポリマーと核酸バーコードとは、１０ｗ／ｗ比で組み合わされる。いくつかの実施形態では、カチオン性ポリマーと核酸バーコードとは、２０ｗ／ｗ比で組み合わされる。いくつかの実施形態では、カチオン性ポリマーと核酸バーコードとは、４０ｗ／ｗ比で組み合わされる。いくつかの実施形態では、カチオン性ポリマーと核酸バーコードとは、６０ｗ／ｗ比で組み合わされる。いくつかの実施形態では、カチオン性ポリマーと核酸バーコードとは、水溶液中で組み合わされる。いくつかの実施形態では、カチオン性ポリマーと核酸バーコードとは、増殖培地中で組み合わされる。いくつかの実施形態では、カチオン性ポリマーと核酸バーコードとは、ｍＴｅＳＲ培地中で組み合わされる。

本明細書に記載されているのは、細胞をラベリングまたはバーコーディングする方法である。いくつかの実施形態、いくつかの実施形態では、方法は、細胞をカチオン性バーコードと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、カチオン性バーコードは、カチオン性ポリマーおよび核酸バーコードを含む。いくつかの実施形態では、カチオン性ポリマーは、核酸バーコードが細胞の細胞質にアクセスすることを可能にする。いくつかの実施形態では、核酸バーコードは、本明細書および他の場所に記載されている核酸バーコードである。いくつかの実施形態では、核酸は、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはそれらの両方である。いくつかの実施形態では、核酸は、ｓｓＤＮＡである。いくつかの実施形態では、核酸は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、もしくは５０００ヌクレオチド長、または前述の長さのうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の長さ、例えば、１０～５０００ヌクレオチド、１００～１０００ヌクレオチド、２００～５００ヌクレオチド、１０～５００ヌクレオチド、または４００～５０００ヌクレオチド長であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、あるいは約それら以下である長さを有する。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号２～４の配列を有する。いくつかの実施形態では、カチオン性ポリマーは、本明細書に記載の方法のうちのいずれか１つによって生成されたカチオン性ポリマーである。いくつかの実施形態では、カチオン性ポリマーは、本明細書に記載の方法のうちのいずれか１つによって生成されたキャップされたカチオン性ポリマーである。いくつかの実施形態では、細胞は、細胞の集団内にある。いくつかの実施形態では、細胞は、組織、オルガノイド、もしくはスフェロイドの一部、またはこれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、細胞は、肝臓オルガノイド、または前腸スフェロイドの一部である。いくつかの実施形態では、細胞は、肝臓オルガノイドの一部である。いくつかの実施形態では、細胞をカチオン性バーコードと、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、もしくは４８時間、または前述の温度のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の時間数、例えば、１～４８時間、１０～３０時間、２０～２５時間、１～２４時間、もしくは２４～４８時間であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、あるいは約それら以下である時間数の間接触させる。いくつかの実施形態では、方法は、カチオン性バーコードを配列決定することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、単一細胞シーケンシングによってカチオン性バーコードを配列決定することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑによって、カチオン性バーコードを配列決定することを含む。

本明細書に開示されるのは、細胞集団の多重化バーコーディングの方法である。本明細書および他の場所で説明されているように、データ収集の処理能力を向上させるために（例えば、配列決定の各実行内で、複数のサンプルを実行する）、バーコードを使用して配列決定技術を多重化させることが有利である。いくつかの実施形態では、方法は、細胞の集団を１つ以上のカチオン性バーコードと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のカチオン性バーコードはそれぞれ、カチオン性ポリマーおよびユニークな配列の核酸バーコードを含む。いくつかの実施形態では、カチオン性ポリマーは、本明細書に記載の任意のカチオン性ポリマー、または本明細書に記載の方法のうちのいずれか１つによって合成されたカチオン性ポリマーである。いくつかの実施形態では、カチオン性ポリマーは、本明細書に記載の任意のキャップされたカチオン性ポリマー、または本明細書に記載の方法のうちのいずれか１つによって合成されたキャップされたカチオン性ポリマーである。いくつかの実施形態では、キャップされたカチオン性ポリマーは、本明細書に開示されるように、ベクターＰＯＬＹ１、ＰＯＬＹ２、ＰＯＬＹ３、ＰＯＬＹ４、ＰＯＬＹ５、ＰＯＬＹ６、ＰＯＬＹ７、もしくはＰＯＬＹ８のうちの１つ以上（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８つ）、またはこれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、核酸バーコードは、ＤＮＡまたはＲＮＡ鎖である。いくつかの実施形態では、核酸バーコードは、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）である。いくつかの実施形態では、核酸バーコードは、ｓｓＤＮＡバーコードである。いくつかの実施形態では、核酸バーコードは、当技術分野において既知のバーコードアレイの一部である。いくつかの実施形態では、核酸バーコードは、ＣＩＴＥ－ｓｅｑハッシングオリゴマーアレイに基づいている。いくつかの実施形態では、核酸バーコードは、配列番号２～４の配列を有する。いくつかの実施形態では、核酸バーコードは、化学的に合成される。いくつかの実施形態では、核酸バーコードは、本明細書に記載されるような１つ以上の核酸修飾を含む。いくつかの実施形態では、細胞の集団を１つ以上のカチオン性バーコードと接触させた後、方法は、１つ以上のカチオン性バーコードの核酸バーコードを配列決定することを含む。いくつかの実施形態では、核酸バーコードの配列決定は、単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑ（ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ）による。いくつかの実施形態では、核酸バーコードの配列決定は、個々の細胞を細胞の集団に属するものとして特定する。いくつかの実施形態では、個々の細胞は、個々の細胞の核酸バーコードの配列によって、細胞の集団に属するものとして特定される。いくつかの実施形態では、核酸バーコードの配列決定は、核酸バーコードを増幅することを含む。核酸バーコードがｓｓＤＮＡであるいくつかの実施形態では、核酸バーコードの配列決定は、ｓｓＤＮＡバーコードを増幅することを含む。

いくつかの実施形態では、キャップされたカチオン性ポリマーと核酸バーコードとは、１／１、２／１、３／１、４／１、５／１、６／１、７／１、８／１、９／１、１０／１、１１／１、１２／１、１３／１、１４／１、１５／１、１６／１、１７／１、１８／１、１９／１、２０／１、２１／１、２２／１、２３／１、２４／１、２５／１、２６／１、２７／１、２８／１、２９／１、もしくは３０／１μｇ／μｇ、または前述の比のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の比、例えば、１／１～３０／１、１０／１～２５／１、１５／１～２０／１、１／１～２０／１、もしくは１５／１～３０／１のキャップされたカチオン性ポリマー：核酸バーコードのｗ／ｗ比であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、あるいは約それら以下であるキャップされたカチオン性ポリマー：核酸バーコードのｗ／ｗ比で組み合わされる。いくつかの実施形態では、細胞の集団について、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、もしくは５０μｇのキャップされたカチオン性ポリマーが使用されるか、または前述の質量のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の質量、例えば、１～５０μｇ、１０～４０μｇ、２０～３０μｇ、１～３０μｇ、もしくは２０～５０μｇのキャップされたカチオン性ポリマーが使用されるいくつかの実施形態では、キャップされたカチオン性ポリマーと核酸バーコードとは、増殖培地中で組み合わされる。いくつかの実施形態では、増殖培地はＨＣＭである。いくつかの実施形態では、キャップされたカチオン性ポリマーと核酸バーコードとは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、もしくは３０分、または前述の温度のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の時間、例えば、１～３０分、１０～２５分、１５～２０分、１～２０分、もしくは１０～３０分であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、あるいは約それら以下である時間量にわたって複合体化される。いくつかの実施形態では、複合体化キャップされたカチオン性ポリマーおよび核酸バーコードを、細胞の集団と接触させる。いくつかの実施形態では、細胞の集団は肝臓オルガノイドである。いくつかの実施形態では、複合体化キャップされたカチオン性ポリマーおよび核酸バーコードを、細胞の集団と、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、もしくは１２０時間、または前述の時間のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の時間、例えば、１０～１２０時間、３０～１００時間、２０～５０時間、１０～３０時間、もしくは５０～１２０時間であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、あるいは約それら以下である時間量の間反応させる。いくつかの実施形態では、複合体化キャップされたカチオン性ポリマーおよび拡散バーコードの細胞会合は、接触後に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２時間、または前述の温度のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の時間量、例えば、１～１２時間、２～１０時間、２～４時間、もしくは１～５時間であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、あるいは約それら以下である時間量の前に発生する。いくつかの実施形態では、複合体化キャップされたカチオン性ポリマーおよび核酸バーコードを、細胞リソソームと共局在化する。いくつかの実施形態では、細胞の集団は、単一の細胞懸濁液に解離される。いくつかの実施形態では、単一細胞懸濁液は、単一細胞配列決定によって配列決定される。いくつかの実施形態では、単一細胞懸濁液は、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑによって配列決定される。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のキャップされたカチオン性ポリマーで細胞集団をバーコーディングすることが、細胞の５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％のラベリング、または前述の割合のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の割合、例えば、５０％～１００％、８０～９５％、８５％～９４％、５０％～９０％、もしくは８０％～１００％であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、あるいは約それら以下であるラベリングをもたらす。いくつかの実施形態では、配列決定が、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％、または前述の割合のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の割合、例えば、５０％～１００％、８０～９５％、８５％～９４％、５０％～９０％、もしくは８０％～１００％正確であるか、約それらで正確であるか、少なくともそれらで正確であるか、少なくとも約それらで正確であるか、それら以下で正確であるか、あるいは約それら以下で正確である。

いくつかの実施形態では、細胞の集団は、２つ以上の個体から調製、取得、または由来する。いくつかの実施形態では、この細胞集団は「プールされた集団」である。いくつかの実施形態では、細胞の集団は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、もしくは１０００個の個体、または前述の数のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の個体数、例えば、１～１０００個の個体、１０～５００個の個体、５０～１００個の個体、１～２００個の個体、もしくは５０～１０００個の個体であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、あるいは約それら以下である個体数から調製、取得、あるいは由来する。いくつかの実施形態では、細胞の集団は、２つ以上の個体からのｉＰＳＣに由来する。いくつかの実施形態では、細胞の集団は、２つ以上の個体に由来するｉＰＳＣを同調条件で同調させて、同調ｉＰＳＣを得ることによって、ｉＰＳＣに由来する。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、同調後に分化される。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、同調後に、胚体内胚葉、前腸スフェロイド、オルガノイド、もしくは肝臓オルガノイド、またはこれらの任意の組み合わせに分化される。いくつかの実施形態では、細胞の集団は、組織、オルガノイド、もしくはスフェロイド、またはこれらの任意の組み合わせの一部である。いくつかの実施形態では、細胞の集団は、組織、オルガノイド、もしくはスフェロイド、またはこれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、細胞の集団は、肝臓オルガノイドまたは前腸スフェロイド、もしくはその両方の一部である。いくつかの実施形態では、細胞の集団は、オルガノイドもしくは前腸スフェロイド、またはその両方である。いくつかの実施形態では、細胞の集団は、肝臓オルガノイドの一部であるか、または肝臓オルガノイドである。

いくつかの実施形態では、２つ以上の個体からの細胞の集団は、オルガノイド（「プールされたオルガノイド」）である。いくつかの実施形態では、プールされたオルガノイドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、もしくは１０００個の個体、または前述の数のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の個体数、例えば、１～１０００個の個体、１０～５００個の個体、５０～１００個の個体、１～２００個の個体、もしくは５０～１０００個の個体であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、あるいは約それら以下である個体数からから調製、取得、あるいは由来する。いくつかの実施形態では、２つ以上の個体からの細胞の集団は、２つ以上の個体からのｉＰＳＣに由来するオルガノイドである。いくつかの実施形態では、オルガノイドは、２つ以上の個体に由来するｉＰＳＣを同調条件で同調させて、同調オルガノイドを得ることによって、ｉＰＳＣに由来する。いくつかの実施形態では、オルガノイドは、肝臓オルガノイド、胃オルガノイド、腸オルガノイド、脳オルガノイド、肺オルガノイド、食道オルガノイド、骨オルガノイド、軟骨オルガノイド、膀胱オルガノイド、血管オルガノイド、内分泌オルガノイド、もしくは感覚オルガノイド、またはこれらの任意の組み合わせである。プールされたオルガノイドならびにその作製および使用方法は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開第ＷＯ２０１８／１９１６７３号で検討されている。

いくつかの実施形態では、細胞の集団は、細胞の２つ以上の亜集団を含む。いくつかの実施形態では、細胞の２つ以上の亜集団のそれぞれは、ユニークな個体に由来する。いくつかの実施形態では、細胞の集団は、細胞の２つ以上の亜集団を組み合わせることによって形成される。いくつかの実施形態では、２つ以上の亜集団は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、もしくは１０００個の亜集団、または前述の数のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の亜集団数、例えば、１～１０００個の亜集団、１０～５００個の亜集団、５０～１００個の亜集団、１～２００個の亜集団、もしくは５０～１０００個の亜集団であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、あるいは約それら以下である亜集団数を含む。いくつかの実施形態では、２つ以上の亜集団は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、もしくは１０００個の個体、または前述の数のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の個体数、例えば、１～１０００個の個体、１０～５００個の個体、５０～１００個の個体、１～２００個の個体、もしくは５０～１０００個の個体であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、あるいは約それら以下である個体数に由来する。いくつかの実施形態では、細胞の集団を１つ以上のカチオン性バーコードと接触させることは、細胞の集団を２つ以上のカチオン性バーコードと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、細胞の集団を１つ以上のカチオン性バーコードと接触させることは、細胞の集団を存在する亜集団の数と同じ数のカチオン性バーコードと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、細胞の集団を、存在する亜集団の数よりも少なくとも１つ多い数のカチオン性バーコードと接触させる。いくつかの実施形態では、細胞の集団を、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、もしくは１０００個のカチオン性バーコード、または前述の数のカチオン性バーコードのうちのいずれか２つによって定義される範囲内の数のカチオン性バーコード、例えば、２～１０００個のカチオン性バーコード、１０～５００個のカチオン性バーコード、５０～１００個のカチオン性バーコード、１～２００個のカチオン性バーコード、もしくは５０～１０００個のカチオン性バーコードであるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、あるいは約それら以下であるカチオン性バーコードの数と接触させる。いくつかの実施形態では、細胞の集団を、存在する亜集団の数よりも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０個多いカチオン性バーコード、または存在する亜集団の数よりも多い任意の数のカチオン性バーコード、例えば、細胞の集団中に存在する亜集団よりも１～２０個多い、５～１５個多い、１０～１２個多い、１～１０個多い、もしくは１０～２０個多いカチオン性バーコードであるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、あるいは約それら以下であると接触させる。

いくつかの実施形態では、細胞の集団は、細胞の２つ以上（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、５０、１００、５００、１０００個）の細胞の亜集団を組み合わせることによって形成される。いくつかの実施形態では、細胞の集団は、２つ以上の細胞の亜集団が、単一細胞懸濁液中にある場合、２つ以上の細胞の亜集団を組み合わせることによって形成される。いくつかの実施形態では、組み合わされる２つ以上の細胞の亜集団は、単一細胞懸濁液である。いくつかの実施形態では、組み合わされる２つ以上の細胞の亜集団は、ｉＰＳＣである。いくつかの実施形態では、組み合わされる２つ以上の細胞の亜集団は、前腸スフェロイドである。いくつかの実施形態では、組み合わされる２つ以上の細胞の亜集団は、解離される前腸スフェロイドである。いくつかの実施形態では、組み合わされる２つ以上の細胞の亜集団は、肝臓オルガノイドである。いくつかの実施形態では、組み合わされる２つ以上の細胞の亜集団は、解離される肝臓オルガノイドである。いくつかの実施形態では、２つ以上の細胞の亜集団は、互いに同調される細胞である。いくつかの実施形態では、２つ以上の細胞の亜集団のそれぞれを、１つ以上（例えば、少なくとも１、２、３、４、５個）のカチオン性バーコードと接触させる。いくつかの実施形態では、１つ以上のカチオン性バーコードのそれぞれは、細胞の同じ亜集団に接触するカチオン性バーコードの中で、および異なる亜集団に接触するカチオン性バーコードの中の両方でユニークである。いくつかの実施形態では、２つ以上の細胞の亜集団のそれぞれを、それらが組み合わされて細胞の集団を形成する前に、１つ以上のカチオン性バーコードと接触させる。いくつかの実施形態では、細胞の集団を形成するためにそれらが組み合わされる前に、２つ以上の細胞の亜集団のそれぞれに接触させると、ユニークな配列を有する１つ以上のカチオン性バーコードの異なるセットを有する細胞の各亜集団がもたらされる。いくつかの実施形態では、２つ以上の細胞の亜集団を、１つ以上のユニークなカチオン性バーコードと接触させた後に、細胞の集団を形成するために、２つ以上の細胞の亜集団が組み合わされる。いくつかの実施形態では、細胞の集団の２つ以上の細胞の亜集団のそれぞれのユニークな１つ以上のカチオン性バーコードが、配列決定される。いくつかの実施形態では、２つ以上の細胞の亜集団のそれぞれのユニークな１つ以上のカチオン性バーコードを配列決定することが、細胞の集団中の２つ以上の細胞の亜集団のうちの１つの細胞亜集団に属するものとして個々の細胞を特定する。いくつかの実施形態では、個々の細胞が、個々の細胞の核酸バーコードの配列によって、２つ以上の細胞の亜集団の中の１つの細胞の亜集団に属するものとして特定される。

いくつかの実施形態では、２つ以上（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、５０、１００、５００、１０００個）の細胞の亜集団を含む細胞の集団は、オルガノイドである。いくつかの実施形態では、オルガノイドは肝臓オルガノイドである。いくつかの実施形態では、２つ以上（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、５０、１００、５００、１０００個）の細胞の亜集団を含む細胞の集団は、肝臓オルガノイドである。いくつかの実施形態では、オルガノイドは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、もしくは１０００個の個体、または前述の数のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の個体数、例えば、１～１０００個の個体、１０～５００個の個体、５０～１００個の個体、１～２００個の個体、もしくは５０～１０００個の個体であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、あるいは約それら以下である個体数に由来する細胞から形成される。いくつかの実施形態では、オルガノイドは、ｉＰＳＣ、胚体内胚葉、もしくは前腸スフェロイド、またはこれらの任意の組み合わせから形成される。いくつかの実施形態では、オルガノイドは、２つ以上の個体に由来する細胞からのｉＰＳＣ、胚体内胚葉、または前腸スフェロイドから形成される。いくつかの実施形態では、オルガノイドは、２つ以上の細胞の亜集団から形成され、細胞の亜集団は、ｉＰＳＣ、胚体内胚葉、または前腸スフェロイドである。いくつかの実施形態では、細胞の亜集団は同調されている。いくつかの実施形態では、細胞の亜集団のそれぞれを、オルガノイドをプールして形成する前に、１つ以上（例えば、少なくとも１、２、３、４、５個）のカチオン性バーコードと接触させる。いくつかの実施形態では、オルガノイドは、異なるカチオン性バーコードを含む２つ以上の亜集団を含む。いくつかの実施形態では、オルガノイドのカチオン性バーコードを配列決定することにより、オルガノイドの個々の細胞が、２つ以上の細胞の亜集団のうちの１つに属するものとして特定される。オルガノイドが肝臓オルガノイドであるいくつかの実施形態では、個々の細胞は、肝細胞、星細胞、もしくは胆管細胞、またはこれらの任意の組み合わせとしてさらに特定される。いくつかの実施形態では、個々の細胞は、ＨＮＦ４α、ＡＳＧＲ１、ＣＥＢＰＡ、ＲＢＰ４、ＣＯＬ１Ａ２、ＳＰＡＲＣ、ＴＡＧＬＮ、ＫＲＴ７、ＴＡＣＳＴＤ２、もしくはＳＰＰＩのうちの１つ以上（例えば、少なくとも１、２、３、４、５個）、またはこれらの組み合わせの発現に基づいて特定される。

幹細胞
本明細書で使用される場合、「全能性（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞」（全能性（ｏｍｎｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞としても知られる）という用語は、胚性および胚外細胞型に分化することができる幹細胞である。そのような細胞は、完全で生存可能な生物を構築することができる。これらの細胞は、卵子および精子細胞の融合から生産される。受精卵の最初の数分割によって生産される細胞も全能性である。

本明細書で使用される場合、「胚性幹細胞（ＥＳＣ）」という用語は、一般にＥＳ細胞とも略され、本明細書に照らして理解されるように、その一般的かつ通常の意味を有し、多能性であり、初期胚である胚盤胞の内部細胞塊に由来する細胞を指す。本開示の目的のために、「ＥＳＣ」という用語は、胚性生殖細胞を包含するために広義で使用される場合がある。

本明細書で使用される場合、「多能性幹細胞（ＰＳＣ）」という用語は、本明細書に照らして理解されるように、その一般的かつ通常の意味を有し、体のほぼすべての細胞型、すなわち、内胚葉（胃内壁、消化管、肺）、中胚葉（筋肉、骨、血液、泌尿生殖器）、および外胚葉（表皮組織および神経系）を含む３つの胚葉（胚上皮）のうちのいずれかに由来する細胞に分化することができる任意の細胞を包含する。ＰＳＣは、着床前胚盤胞の内部細胞塊細胞の子孫であり得るか、または特定の遺伝子の発現を強制することによって、非多能性幹細胞、例えば成体体細胞の誘導によって得られてもよい。多能性幹細胞は、任意の適切な供給源に由来し得る。多能性幹細胞の供給源の例は、ヒト、げっ歯類、ブタ、およびウシを含む哺乳動物の供給源を含む。

本明細書で使用される「人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）」という用語は、一般にｉＰＳ細胞とも省略され、本明細書に照らして理解されるように、その一般的かつ通常の意味を有し、特定の遺伝子の「強制」発現を誘導することによって、通常、非多能性幹細胞、例えば成体体細胞から人工的に得られた一種の多能性幹細胞を指す。ｈｉＰＳＣは、ヒトｉＰＳＣを指す。当該技術分野において既知のいくつかの方法において、ｉＰＳＣは、ある特定の幹細胞関連遺伝子の成体の線維芽細胞等の非多能性細胞へのトランスフェクションによって得られ得る。トランスフェクションは、レトロウイルスまたはレンチウイルスなどのウイルスを使用したウイルス形質導入によって達成され得る。トランスフェクトされた遺伝子は、マスター転写調節因子Ｏｃｔ－３／４（ＰＯＵ５Ｆ１）およびＳｏｘ２を含み得るが、他の遺伝子も誘導の効率を向上させる。３～４週間後、少数のトランスフェクトされた細胞は、形態学的および生化学的に多能性幹細胞と同様になり始め、通常、形態学的選択、倍加時間、またはレポーター遺伝子および抗生物質性選択によって単離される。本明細書で使用されるとき、ｉＰＳＣは、第一世代ｉＰＳＣ、マウスにおける第二世代ｉＰＳＣ、およびヒト誘導多能性幹細胞を含む。いくつかの方法において、４つの極めて重要な遺伝子であるＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ－Ｍｙｃを用いて多能性幹細胞にヒト線維芽細胞を形質転換するためにレトロウイルス系が使用される。他の方法において、体細胞をＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、およびＬＩＮ２８で形質転換するためにレンチウイルス系が使用される。ｉＰＳＣで発現が誘導される遺伝子としては、Ｏｃｔ－３／４（ＰＯＵ５Ｆ１）、Ｓｏｘ遺伝子ファミリーのある特定のメンバー（例えば、Ｓｏｘｌ、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、およびＳｏｘ１５）；Ｋｌｆファミリーのある特定のメンバー（例えば、Ｋｌｆｌ、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４、およびＫｌｆ５）、Ｍｙｃファミリーのある特定のメンバー（例えば、Ｃ－ｍｙｃ、Ｌ－ｍｙｃ、およびＮ－ｍｙｃ）；、Ｎａｎｏｇ、ＬＩＮ２８、Ｔｅｒｔ、Ｆｂｘ１５、ＥＲａｓ、ＥＣＡＴ１５－１、ＥＣＡＴ１５－２、Ｔｃｌ１、β－カテニン、ＥＣＡＴ１、Ｅｓｇ１、Ｄｎｍｔ３Ｌ、ＥＣＡＴ８、Ｇｄｆ３、Ｆｔｈ１１７、Ｓａｌ１４、Ｒｅｘ１、ＵＴＦ１、Ｓｔｅｌｌａ、Ｓｔａｔ３、Ｇｒｂ２、Ｐｒｄｍ１４、Ｎｒ５ａ１、Ｎｒ５ａ２、Ｅ－カドヘリン、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される場合、「前駆細胞」という用語は、本明細書に照らして理解されるように、その一般的かつ通常の意味を有し、本明細書に記載の方法で使用することができる任意の細胞を包含し、それを通じて、１つ以上の前駆細胞は、それ自体を再生するか、１つ以上の専門化された細胞型に分化する能力を獲得する。いくつかの実施形態において、前駆細胞は、多能性であるか、または多能性になる能力を有する。いくつかの実施形態において、前駆細胞は、多能性を獲得するために外部因子（例えば、増殖因子）の処理に供される。いくつかの実施形態において、前駆細胞は、全能性（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ）（または全能性（ｏｍｎｉｐｏｔｅｎｔ））幹細胞、多能性幹細胞（誘導性または非誘導性）、複能性幹細胞、寡能性幹細胞、および単能性幹細胞であり得る。いくつかの実施形態において、前駆細胞は、胚、乳児、小児、または成人由来であり得る。いくつかの実施形態において、前駆細胞は、遺伝子操作またはタンパク質／ペプチド処理を介して多能性が付与されるような処理に供される体細胞であり得る。前駆細胞には、胚幹細胞（ＥＳＣ）、胚性癌腫細胞（ＥＣ）、および胚盤葉上層幹細胞（ＥｐｉＳＣ）が含まれる。

いくつかの実施形態では、１つのステップは、多能性であるかまたは多能性になるように誘導され得る幹細胞を得ることである。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞は胚性幹細胞に由来し、また、この胚性幹細胞は哺乳動物初期胚の全能性細胞に由来し、インビトロで無限の未分化増殖が可能である。胚性幹細胞は、初期段階の胚である胚盤胞の内部細胞塊に由来する多能性幹細胞である。胚盤胞から胚性幹細胞を誘導するための方法は、当技術分野でよく知られている。ヒト胚性幹細胞Ｈ９（Ｈ９－ｈＥＳＣ）は、本出願に記載の例示的な実施形態で使用されるが、本明細書に記載の方法および系は、任意の幹細胞に適用可能であることが当業者によって理解される。

本開示による実施形態で使用することができる追加の幹細胞には、限定されないが、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ（ＮＳＣＢ）、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ（ＵＣＳＦ）のＨｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｗｉ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＷＩＳＣ ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｃｅｎｔｅｒ（ＵＷ－ＳＣＲＭＣ）、Ｎｏｖｏｃｅｌｌ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆ）、Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ ＡＢ（Ｇｏｔｅｂｏｒｇ， Ｓｗｅｄｅｎ）、ＥＳ Ｃｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｔｅ Ｌｔｄ（Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）、Ｉｓｒａｅｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｈａｉｆａ， Ｉｓｒａｅｌ）のＴｅｃｈｎｉｏｎ、およびＰｒｉｎｃｅｔｏｎ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙおよびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａによって主宰されるＳｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｄａｔａｂａｓｅによって主宰されるデータベースによって得られる、データベースに記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。本開示による実施形態で使用することができる例示的な胚性幹細胞には、ＳＡ０１（ＳＡ００１）、ＳＡ０２（ＳＡ００２）、ＥＳ０１（ＨＥＳ－１）、ＥＳ０２（ＨＥＳ－２）、ＥＳ０３（ＨＥＳ－３）、ＥＳ０４（ＨＥＳ－４）、ＥＳ０５（ＨＥＳ－５）、ＥＳ０６（ＨＥＳ－６）、ＢＧ０１（ＢＧＮ－０１）、ＢＧ０２（ＢＧＮ－０２）、ＢＧ０３（ＢＧＮ－０３）、ＴＥ０３（１３）、ＴＥ０４（１４）、ＴＥ０６（１６）、ＵＣ０１（ＨＳＦ１）、ＵＣ０６（ＨＳＦ６）、ＷＡ０１（ＨＩ）、ＷＡ０７（Ｈ７）、ＷＡ０９（Ｈ９）、ＷＡ１３（Ｈ１３）、ＷＡ１４（Ｈ１４）が挙げられるが、これらに限定されない。例示的なヒト多能性細胞株としてはＴｋＤＡ３－４、１２３１Ａ３、３１７－Ｄ６、３１７－Ａ４、ＣＤＨ１、５－Ｔ－３、３－３４－１、ＮＡＦＬＤ２７、ＮＡＦＬＤ７７、ＮＡＦＬＤ１５０、ＷＤ９０、ＷＤ９１、ＷＤ９２、Ｌ２００１２、Ｃ２１３、１３８３Ｄ６、ＦＦ、ＥＳＨ１、７２．３、または３１７－１２細胞が挙げられるが、これらに限定されない。

発生生物学では、細胞分化は、より専門化されていない細胞がより専門化された細胞型になるプロセスである。本明細書で使用される場合、「有向分化」という用語は、より専門化されていない細胞が特定の専門化された標的細胞型になるプロセスを記載する。専門化された標的細胞型の特殊性を、最初の細胞の運命を定義または変更するために使用することができる任意の適用可能な方法によって決定することができる。例示的な方法には、遺伝子操作、化学処理、タンパク質処理、および核酸処理が含まれるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態において、アデノウイルスを使用して、必要な４つの遺伝子を輸送し、胚性幹細胞実質的に同一のｉＰＳＣをもたらすことができる。アデノウイルスは、それ自身の遺伝子を標的の宿主と組み合わせないため、腫瘍を創出する危険性が排除される。いくつかの実施形態において、ｉＰＳＣを生成するために非ウイルスベースの技術が用いられる。いくつかの実施形態において、非常に低い効率ではあるが、いずれのウイルストランスフェクション系も全く使用せずに、プラスミドを介して再プログラミングを達成することができる。他の実施形態において、タンパク質の直接送達を用いてｉＰＳＣを生成し、そのようにしてウイルスまたは遺伝子修飾の必要性を排除する。いくつかの実施形態において、マウスｉＰＳＣの生成は、同様の方法論を使用して可能である。ポリアルギニンアンカーを介して細胞に運ばれる特定のタンパク質による細胞の反復処理は、多能性を誘導するのに十分であった。いくつかの実施形態において、低酸素条件下で体細胞をＦＧＦ２で処理することによって多能性誘導遺伝子の発現を増加させることもできる。

本明細書で使用される「フィーダー細胞」という用語は、本明細書に照らして理解されるようなその一般的かつ通常の意味を有し、増殖因子を培地に分泌するか、または細胞表面に表示することなどによって、多能性幹細胞の増殖をサポートする細胞を指す。フィーダー細胞は一般に付着細胞であり、増殖が停止する場合もある。例えば、フィーダー細胞は、照射（例えば、ガンマ線）、マイトマイシン－Ｃ処理、電気パルス、または穏やかな化学固定（例えば、ホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒド）によって増殖が停止される。ただし、フィーダー細胞は必ずしも増殖を停止するとは限らない。フィーダー細胞は、増殖因子の分泌、細胞表面への増殖因子の表示、培地の無害化、または細胞外マトリックスタンパク質の合成などの目的に役立ち得る。いくつかの実施形態では、フィーダー細胞は、支持された標的幹細胞に対して同種または異種であり、これは、下流の用途に影響を及ぼし得る。いくつかの実施形態では、フィーダー細胞はマウス細胞である。いくつかの実施形態では、フィーダー細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、フィーダー細胞は、マウス線維芽細胞、マウス胚性線維芽細胞、マウスＳＴＯ細胞、マウス３Ｔ３細胞、マウスＳＮＬ ７６／７細胞、ヒト線維芽細胞、ヒト前皮線維芽細胞、ヒト皮膚線維芽細胞、ヒト脂肪間葉細胞、ヒト骨髄間葉細胞、ヒト羊膜間葉細胞、ヒト羊膜上皮細胞、ヒト臍帯間葉細胞、ヒト胎児筋細胞、ヒト胎児線維芽細胞、またはヒト成人ファロピウス管上皮細胞である。いくつかの実施形態では、フィーダー細胞から調製された馴化培地は、フィーダー細胞共培養の代わりに、またはフィーダー細胞共培養と組み合わせて使用される。いくつかの実施形態では、フィーダー細胞は、標的幹細胞の増殖中には使用されない。

肝臓は、外因性化合物の解毒および凝固、ならびに脂質、タンパク質、アンモニウム、および胆汁の生成など、生命に不可欠な多くの代謝機能を提供する重要な器官である。初代肝細胞は、高度に極性のある代謝細胞型であり、微絨毛線チャネルを有する毛細胆管構造を形成し、末梢循環を胆汁酸分泌経路から分離する。患者の肝臓のインビトロ再構成は、再生療法、創薬および薬物毒性研究を含む用途を提供し得る。初代肝細胞を用いた既存の方法論は、必須の解剖学的構造の欠如に主に起因しているが、非常に貧弱な機能性を示し、それは製薬産業におけるそれらの実際的使用を制限している。内在化した微絨毛および間葉細胞を伴う管腔構造を含み、ならびに肝細胞、星状細胞、クッパー細胞、および肝内皮細胞などの肝細胞タイプを示す肝オルガノイドの形成、およびそれらの作成および使用の方法は、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１８／０８５６１５号、同第ＷＯ２０１８／０８５６２２号、同第ＷＯ２０１８／０８５６２３号、および同第ＷＯ２０１８／２２６２６７号に以前に記載されており、それらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に明示的に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、ＥＳＣ、生殖細胞、またはｉＰＳＣは、幹細胞の増殖をサポートする増殖培地で培養される。いくつかの実施形態では、ＥＳＣ、生殖細胞、またはｉＰＳＣは、幹細胞増殖培地で培養される。いくつかの実施形態では、幹細胞増殖培地は、ＲＰＭＩ １６４０、ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ、肝細胞培養培地（ＨＣＭ）、ＳｔｅｍＦｉｔ、ｍＴｅＳＲ１、またはｍＴｅＳＲ Ｐｌｕｓ培地である。いくつかの実施形態では、幹細胞増殖培地は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む。いくつかの実施形態では、幹細胞増殖培地は、０％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、もしくは２０％、または、前述の濃度のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の割合、例えば、０％～２０％、０．２％～１０％、２％～５％、０％～５％、もしくは２％～２０％であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、あるいは約それら以下である濃度でＦＢＳを含む。いくつかの実施形態では、幹細胞増殖培地は、異種成分を含有しない。いくつかの実施形態では、増殖培地は、１つ以上の小分子化合物、活性化因子、阻害剤、または増殖因子を含む。いくつかの実施形態では、幹細胞は、フィーダー細胞基質上で増殖される。いくつかの実施形態では、幹細胞は、フィーダー細胞基質上では増殖されない。いくつかの実施形態では、幹細胞は、ラミニンでコーティングされたプレート上で増殖される。いくつかの実施形態では、幹細胞は、ＦＧＦ２またはＲＯＣＫ阻害剤（例えば、Ｙ－２７６３２）、もしくはその両方を補充して増殖される。

いくつかの実施形態では、ＰＳＣは、フィーダー細胞を含まない条件で培養される。いくつかの実施形態では、ＰＳＣは、ｍＴｅＳＲ培地で培養される。いくつかの実施形態では、ＰＳＣは、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは１００％であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、または約それら以下である培養密度に達したときに継代される。いくつかの実施形態では、ＰＳＣは、ＲＯＣＫ阻害剤およびＬａｍｉｎｉｎ－５１１とともに培養される。

多能性細胞（例えば、ｉＰＳＣまたはＥＳＣ）から胚体内胚葉（ＤＥ）を生成するための任意の方法が、本明細書に記載の方法に適用可能である。例示的な方法は、例えば、米国特許第９，７１９，０６８号に開示されている。いくつかの実施形態において、ｉＰＳＣ細胞を使用して胚体内胚葉を生成する。

いくつかの態様では、１つ以上の増殖因子が、多能性幹細胞からＤＥ細胞への分化プロセスにおいて使用される。いくつかの実施形態では、分化プロセスで使用される１つ以上の増殖因子は、ＴＧＦ－ベータスーパーファミリーからの増殖因子を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の増殖因子は、増殖因子のＴＧＦ－ベータスーパーファミリーのＮｏｄａｌ／アクチビンおよび／またはＢＭＰサブグループを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の増殖因子は、Ｎｏｄａｌ、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＢＭＰ４、またはこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＰＳＣを、１つ以上の増殖因子と、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、もしくは２４０時間、または前述の日数のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の時間数、例えば、１～２４０時間、２０～１２０時間、３０～５０時間、１～１００時間、もしくは５０～２４０時間であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、あるいは約それら以下である日数の間接触させる。いくつかの実施形態では、ＰＳＣを、１つ以上の増殖因子と、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、もしくは１０００ｎｇ／ｍＬ、または前述の濃度のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度、例えば、１０～１０００ｎｇ／ｍＬ、５０～８００ｎｇ／ｍＬ、１００～５００ｎｇ／ｍＬ、１０～２００ｎｇ／ｍＬ、もしくは１００～１０００ｎｇ／ｍＬであるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、あるいは約それら以下である濃度で接触させる。いくつかの実施形態では、１つ以上の増殖因子の濃度は、接触の期間全体を通して一定レベルで維持される。いくつかの実施形態では、１つ以上の増殖因子の濃度は、接触の期間で変化する。いくつかの実施形態では、１つ以上の増殖因子は、増殖培地に溶解される。いくつかの実施形態、胚体内胚葉細胞が豊富である細胞の集団が使用される。いくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞は、単離されるか、または実質的に精製される。いくつかの実施形態では、単離されたまたは実質的に精製された胚体内胚葉細胞は、１つ以上（例えば、少なくとも１つ、３つ）のＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、またはＣＸＲＣ４マーカーを、１つ以上（例えば、少なくとも１つ、３つ、５つ）のＯＣＴ４、ＡＦＰ、ＴＭ、ＳＰＡＲＣ、またはＳＯＸ７マーカーよりも多く発現する。

いくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞を、本明細書に記載されるシグナル伝達経路の１つ以上のモジュレーターと接触させる。いくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞は、シグナル伝達経路の１つ以上のモジュレーターで、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８時間、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７。１８、１９、もしくは２０日、あるいは前述の日数または時間数のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の時間数または日数、例えば、１時間～２０日、２０時間～１０日、１時間～４８時間、１日～２０日、１時間～５日、または２４時間～２０日であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、あるいは約それら以下である日数の間処理される。いくつかの実施形態では、シグナル伝達経路の１つ以上の増殖因子の濃度は、接触の期間全体を通して一定レベルで維持される。いくつかの実施形態では、シグナル伝達経路の１つ以上のモジュレーターの濃度は、接触の期間中に変化する。

いくつかの実施形態では、胚体内胚葉を前腸スフェロイドに分化させるために、胚体内胚葉細胞を、ＦＧＦ経路およびＷｎｔ経路の１つ以上のモジュレーターと接触させる。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔおよび／またはＦＧＦシグナル伝達経路に関連する細胞成分、例えば、経路の天然の阻害剤、アンタゴニスト、活性剤、またはアゴニストを使用して、Ｗｎｔおよび／またはＦＧＦシグナル伝達経路の阻害もしくは活性化をもたらすことができる。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔおよび／またはＦＧＦシグナル伝達経路に関連する細胞成分を標的にするｓｉＲＮＡおよび／またはｓｈＲＮＡを使用して、これらの経路を阻害もしくは活性化し得る。

線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）は、血管新生、創傷治癒、および胚発生に関与する増殖因子のファミリーである。ＦＧＦはヘパリン結合タンパク質であり、細胞表面関連ヘパラン硫酸プロテオグリカンとの相互作用がＦＧＦシグナル伝達に不可欠であることが示されている。ＦＧＦは、多種多様な細胞および組織の増殖ならびに分化の過程で重要な役割を果たす。ヒトでは、ＦＧＦファミリーの２２のメンバーが同定されており、そのすべてが構造的に関連するシグナル伝達分子である。メンバーＦＧＦ１～ＦＧＦ１０はすべて、線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）に結合する。ＦＧＦ１は酸性としても知られており、ＦＧＦ２は塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）としても知られている。ＦＧＦ相同因子１～４（ＦＨＦ１～ＦＨＦ４）としても既知であるメンバーＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３、およびＦＧＦ１４は、ＦＧＦと比較して明確な機能的差異を有することが示されている。これらの因子は著しく類似した配列相同性を有しているが、それらはＦＧＦＲに結合せず、ＦＧＦとは無関係の細胞内プロセスに関与する。このグループは「ｉＦＧＦ」としても既知である。メンバーＦＧＦ１５～ＦＧＦ２３はより新しく、あまり特徴付けられていない。ＦＧＦ１５は、ヒトＦＧＦ１９のマウスオルソログである（したがって、ヒトＦＧＦ１５はない）。ヒトＦＧＦ２０は、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）ＦＧＦ－２０（ＸＦＧＦ－２０）との相同性に基づいて同定された。他のＦＧＦの局所活性とは対照的に、ＦＧＦ１５／ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２１およびＦＧＦ２３は、より全身的な効果を有する。いくつかの実施形態では、使用されるＦＧＦは、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１５（ＦＧＦ１９、ＦＧＦ１５／ＦＧＦ１９）、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２、ＦＧＦ２３のうちの１つ以上（例えば、少なくとも１つ、３つ、５つ）である。いくつかの実施形態では、使用されるＦＧＦはＦＧＦ４である。いくつかの実施形態では、胚体内胚葉を、ＦＧＦと、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、もしくは２０００ｎｇ／ｍＬ、または前述の濃度のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度、例えば、１０～２０００ｎｇ／ｍＬ、５０～１５００ｎｇ／ｍＬ、５００～１００ｎｇ／ｍＬ、１０～１０００ｎｇ／ｍＬ、もしくは５００～２０００ｎｇ／ｍＬであるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、あるいは約それら以下である濃度で接触させる。

いくつかの実施形態では、胚体内胚葉を前腸スフェロイドに分化させるために、胚体内胚葉を、Ｗｎｔタンパク質または活性剤と接触させる。いくつかの実施形態では、胚体内胚葉を、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤と接触させる。ＧＳＫ３阻害剤は、Ｗｎｔ経路を活性化するように作用する。いくつかの実施形態では、胚体内胚葉を、ＧＳＫ３阻害剤のＣｈｉｒｏｎ（ＣＨＩＲ９９０２１）と接触させる。いくつかの実施形態では、胚体内胚葉を、ＣＨＩＲ９９０２１と、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０μＭのＣＨＩＲ９９０２１、または前述の濃度のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度、例えば、０．１～１０μＭ、０．４～６μＭ、１～５μＭ、０．１～１μＭ、もしくは０．５～１０μＭのＣＨＩＲ９９０２１であるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、あるいは約それら以下である濃度で接触させる。

いくつかの実施形態では、前腸スフェロイドは肝臓オルガノイドに分化される。いくつかの実施形態では、前腸スフェロイドは、前腸スフェロイドをレチノイン酸（ＲＡ）と接触させることによって肝臓オルガノイドに分化される。いくつかの実施形態では、前腸スフェロイドを、ＲＡと、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０μＭのＲＡ、または前述の濃度のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度、例えば、０．１～１０μＭ、０．４～６μＭ、１～５μＭ、０．１～１μＭ、もしくは０．５～１０μＭのＲＡであるか、約それらであるか、少なくともそれらであるか、少なくとも約それらであるか、それら以下であるか、あるいは約それら以下である濃度で接触させる。

いくつかの実施形態では、人工多能性幹細胞、胚体内胚葉、前腸スフェロイド、もしくは肝臓オルガノイドのうちの１つ以上、またはこれらの任意の組み合わせは、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１８／０８５６１５号、同第ＷＯ２０１８／１９１６７３号、同第ＷＯ２０１８／２２６２６７号、同第ＷＯ２０１９／１２６６２６号、同第ＷＯ２０２０／０２３２４５号、同第ＷＯ２０２０／０５６１５８号、および同第ＷＯ２０２０／０６９２８５号に記載の方法に従って調製され、それらのそれぞれは、参照によりその全体が、かつ人工多能性幹細胞、胚体内胚葉、前腸スフェロイド、肝臓オルガノイド、またはそれらの任意の組み合わせを産生する目的で明示的に組み込まれる。

上述の実施形態のいくつかの態様は、以下の実施例でさらに詳細に開示されており、これらは、本開示の範囲を限定することを決して意図するものではない。当業者は、本明細書の上記および特許請求の範囲に記載されているように、他の多くの実施形態も本開示の範囲内にあることを理解するであろう。

実施例１．ＰＯＬＹ－ｓｅｑポリマーの合成および特性評価
市販の試薬を使用してポリマーのセットを作成し、細胞に一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）バーコードをユ遍在的にタグ付けして、単一細胞ＮＧＳ技術の迅速で費用効果の高い多重化を可能にした。

ＰＯＬＹ－ｓｅｑベクターの合成および適用スキームを図１Ａに詳述する。アミノアルコールと混合されたアクリレートモノマーを、加熱して、キャップされていないアクリレート末端ベクターを形成する。ベクターは、小分子を含む一級または二級アミンの付加によりキャップされ、それにより、ＰＯＬＹ－ｓｅｑベクターがｓｓＤＮＡバーコードに結合する能力を付与し、細胞型に依存しない方法で細胞に接着する（ラベル付け細胞）。次に、ラベル付け細胞は、標準的な単一細胞技術を使用して処理され得る。それぞれの試薬はすべて市販される（図１Ｂ）。^１Ｈ ＮＭＲは、アクリレート末端生成物の生成後に末端アクリレート基の存在を確認し、これらの基の共鳴ピークはδ６．２－５．６で観測され、キャッピング試薬との結合が成功裏に行われると消失した（図１Ｃ）。細胞生存率への影響は、ＥＳＨ１、７２．３、１３８３Ｄ６ ｉＰＳＣを使用して評価した。５０μｇ／ｍＬ、ｐ<０．００１、ｎ＝３で始まるＣＴＧルミネセンスの有意な減少の開始は、キャッピング基Ｃ２およびＣ３（それぞれＰＯＬＹ２およびＰＯＬＹ３）を有する分枝状Ｖ５モノマーを含むポリマーで見出された（図１Ｄ）。結果を、ＥＳＨ１および１３８３Ｄ６ ｉＰＳＣで要約した（図１Ｅ）。キャップされたベクターがｓｓＤＮＡバーコードに結合して保持する能力をテストするために、ベクターとバーコードとを最初に混合し、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４中で１０分間結合させた。結合後、ベクターを２．５％のアガロースゲルに装填し、１５０Ｖで泳動させた。細胞ハッシング実験で使用した一本鎖ＤＮＡバーコードに結合する能力は、キャッピング試薬および骨格構造に依存することが分かった（図１Ｆ）。分子Ｃ２およびＣ３でキャップされたベクターは、Ｃ１またはＣ４でキャップされたベクターよりもゲル電気泳動中にｓｓＤＮＡバーコードを保持しやすいことが分かった。さらに、分枝アクリレートＶ５を含めると、完全なバーコード保持が観察される質量比（ｗ／ｗ）が大幅に減少した（ＰＯＬＹ２対ＰＯＬＹ６、ＰＯＬＹ３対ＰＯＬＹ７）。

実施例２．ＰＯＬＹ－ｓｅｑベクターは、細胞を特異的に標的化する
ｓｓＤＮＡバーコードを迅速に結合して保持する機能は重要な機能であるが、ベクターは細胞を標的化する機能も備えている必要がある。この目的のために、ベクターＰＯＬＹ１～ＰＯＬＹ４を細胞標的化の定量化のために選択した。ＰＯＬＹ－ｓｅｑベクターの標的化傾向を、最初に、ラベルした前腸および後腸スフェロイドのＦＡＣＳ分析を使用して試験した。４日目の単離された単一細胞のゲーティング分析を、図２Ａに示す。総ラベリングならびに二重ラベリングの程度の変動は、ベクター配合物に依存することが観察された（図２Ｂ）。総標的化率の有意な減少は１４日目に観察されたが、共培養の最初の７日以内に有意差は見られず、ラベリング忠実度の長寿を示している。ｌベクターＰＯＬＹ３は、最大の程度の二重ラベリングを提供し、最初の時点から開始してＰＯＬＹ１、ＰＯＬＹ２、およびＰＯＬＹ４よりも有意に高かった（ｐ<０．０１、ｎ＝３）（図２Ｂ）。ラベリング忠実度は、共焦点イメージングによって要約される。ＰＯＬＹ２でのラベリング後に融合したスフェロイドは、目に見える境界で明確なラベリングを示している（図２Ｆ）。ヒト肝臓オルガノイドの結合におけるベクターＰＯＬＹ２の有用性を、混合培養から単離された単一細胞のＦＡＣＳ分析を使用してさらに調査した（図２Ｃ）。ベクターＰＯＬＹ２は、バーコード結合と細胞標的化の性能に基づいて選択した。ベクターＰＯＬＹ２の総ラベリング率は、ＨＬＯ培養物から分離された細胞の９８．２±０．８％であった（図２Ｄ）。ＦＡＣＳ分析によるこの混合培養内の二重ラベル付け細胞はごくわずかであった。細胞に結合されたＰＯＬＹ－ｓｅｑベクターの空間分布を調べるために、ＤｙＬｉｇｈｔ ４８８結合ベクターを、ＨＬＯ培養物とインキュベートした。共焦点分析により、ＰＯＬＹ２およびＰＯＬＹ３のリソソームとの強い共局在性が明らかになったが、ＰＯＬＹ４は３つのｈｏｕｓｅで比較的低い内在化を示し、フローサイトメトリーで見つかった弱いラベリングを反映している（図２Ｅ）。これらの結果は、バーコードに結合し、細胞と相互作用する各ベクターの能力間の相関関係を示唆している。

実施例３．ＰＯＬＹ－ｓｅｑベクトルは、増幅可能なバーコードを送達する
ＰＯＬＹ－ｓｅｑベクターが、標準の１０×Ｃｈｒｏｍｉｕｍワークフローにより増幅され、一般的な次世代配シーケンサーにより読み取られるバーコードを送達するための能力を試験するために、３つのＨＬＯサンプルを、１０×Ｃｈｒｏｍｉｕｍプラットフォームで実行する１時間前に、ベクターＰＯＬＹ２を使用して３つの異なるバーコードを個別にタグ付けした。配列化されたすべてのバーコードを含むバーコードＨＬＯの単一セル分析では、最初のＦＡＣＳ分析中に観察された標的化率を反映する、９０％近いラベリングの全体の程度を有する３つの集団全体で高度なラベリングを明らかにした（図３Ａ～Ｂ）。３つのバーコードすべての配列決定精度は、９４％であった。重要なことに、複数のクラスターにわたるラベリングの均一性は、偏りのないラベリングを示す、高いクラスタリング感度を使用したＵＭＡＰ分析によって検証された。サンプルＥ２のすべての細胞は、１３個のクラスターにグループ化され、正しいバーコード読み取りのみを含む細胞と並置した（図３Ｃ）。サンプルＥ３とＥ４の分析も同様に実行した（図３Ｃ）。クラスター間のバーコードの均一性は、３つのサンプルすべてで確認され、サンプルＥ２、Ｅ３、およびＥ４のクラスター当たりの平均ラベリングは、それぞれ８９±３．４％、８６±４．８％、および８１±５．９％であることが分かった（図３Ｄ）。フロー分析と比較した単一細胞シーケンシングによるラベリング率のこの減少は、単一細胞調製中に使用されるラベリング時間の短縮（１時間対２４時間）に起因し、ＤＥＳｅｑ２によって測定された遺伝子発現に対するＰＯＬＹ２ラベリングの潜在的な影響を直接評価する機会を提供する。ラベリングにより測定された転写への摂動は、シングレットおよびネガティブラベル付け細胞を使用して調べられ、両方の集団は、一連の遺伝子、ハウスキーピング（ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤＨ、ＰＧＫ１）、オートファジーおよびアポトーシスに関連する細胞の健康（ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ９、ＭＡＰＫ８、ＴＰ５３）、細胞周期サイクリン（ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＥ１、ＣＣＮＢ１、ＣＣＮＡ２）、ミトコンドリア（ＭＴ－ＡＴＰ８、ＭＴ－ＮＤ１、ＭＴ－ＣＹＢ、ＭＴ－ＣＯ１）、およびヒト肝臓オルガノイド（ＡＬＢ、ＲＢＰ４、ＣＤＨ１、ＡＳＧＲ１）を使用して比較した。ラベリングは、これらの集団間のトランスクリプトーム発現を変化させないことが分かった（図３Ｅ、表１）。

実施例４．ＰＯＬＹ－ｓｅｑバーコードは、ＨＬＯ内の複数の集団系統を特定する
多細胞性がＨＬＯ培養システムで実証されているため、異種バーコードの可能性を、ＨＬＯ系統の同定を通じてさらに実証した。肝細胞核因子４アルファ（ＨＮＦ４α）、アシアロ糖タンパク質受容体１（ＡＳＧＲ１）、ＣＣＡＡＴエンハンサー結合タンパク質アルファ（ＣＥＢＰＡ）、およびレチノール結合タンパク質４（ＲＢＰ４）によって同定される肝細胞；コラーゲンタイプ１、アルファ２（ＣＯＬ１Ａ２）、分泌タンパク質酸性およびシステインリッチ（ＳＰＡＲＣ）、ならびにトランスゲリン（ＴＡＧＬＮ）によって同定される星状細胞；および、ケラチン７（ＫＲＴ７）、上皮糖タンパク質－１（ＴＡＣＳＴＤ２）、および分泌型リン酸化タンパク質１（ＳＰＰ１）によって同定される胆管細胞は、バーコード付きの集団の中でかなりの程度の表現を有していた（図４Ａ）。バーコード表現を調べたところ、これらの集団内で均一に発現していることが分かった（図４Ｂ）。最後に、ＰＯＬＹ－ｓｅｑが広範囲の発現されたユニークな遺伝子を通して細胞を成功裏にバーコード化するための能力について、単一ラベル付け細胞を、以前の分析と同様に１３５０のカットオフで高および低ＵＭＩ画分に分割した（図４Ｃ）。Ｓｅｕｒａｔクラスタリングは、両方の画分間で集団を明確に特定した。高ＵＭＩ画分と低ＵＭＩ画分は、ＰＯＬＹ－ｓｅｑバーコードによって高度に表され、それぞれ、平均８３±４．７％および８８±４．６％で集団が単一ラベル付け細胞として特定され、脂質ベースの方法を使用した以前のバーコーディング性能を反映した。

実施例５．ＰＯＬＹ－ｓｅｑ手法の観察
本明細書に開示されるように、カチオン性ポリマーを、送達のために核酸に結合することができるベクターとして調製した。ポリマーは、市販のアクリレート末端モノマーとアルカノールアミンを使用して、マイケル付加によって合成した。ベクターＰＯＬＹ２およびＰＯＬＹ３は、２４時間の時間にわたって５０μｇ／ｍＬの濃度で始まるＣＴＧ発光における有意な減少（ｐ<０．００１）を示したが、ＰＯＬＹ１もＰＯＬＹ４も、試験された濃度にわたって生存率に対するいかなる感知可能な摂動も示さず（図１Ｄ、Ｅ）、長期ラベリングからの潜在的な毒性を理解するための参照点として機能した。核酸を細胞に成功裏に送達するには、ベクターは少なくとも２つの特性を備えている必要があり、結合したＤＮＡ／ＲＮＡを保持する能力と結合する能力であり、かなりの時間細胞に結合したままでなければならない。ゲル電気泳動を使用して、ＰＯＬＹ－ｓｅｑベクターがＣＩＴＥ－ｓｅｑハッシングｓｓＤＮＡバーコードなどの核酸に迅速に結合するための能力、およびそれを保持するための能力を調査した。分枝アクリレートモノマー（Ｖ５）を有し、高密度の一級および二級アミン（Ｃ２、Ｃ３）を含有するモノマーでキャップされたベクターは、生理学的ｐＨ下でｓｓＤＮＡバーコードに最も容易に結合し、およびそれを保持した。ＤＮＡ移動の反転によって示されるように、ベクターＰＯＬＹ２およびＰＯＬＹ３についての完全な結合の開始は、それぞれ、ｗ／ｗ＝１０および５で観察された。逆に、ジアクリレートモノマーＤ８とアルカノールアミンＳ３（ＰＯＬＹ５～ＰＯＬＹ８）のみで作成されたベクターは、結合活性における劇的な減少を示した（図１Ｆ）。したがって、ｓｓＤＮＡ結合の成功は、分枝アーキテクチャとキャップタイプとの組み合わせである。分枝アクリレート（ＰＯＬＹ１～ＰＯＬＹ４）で作成されたベクターは、ｓｓＤＮＡに結合するより大きな傾向を示したため、これらのバリアントを細胞標的化についてのさらなる調査のために選択した。

細胞標的化の定量化は、フローサイトメトリーを使用して、モデルの前腸／後腸境界部融合系において蛍光ラベル付けベクターを追跡することで達成された。ベクターＰＯＬＹ１～ＰＯＬＹ３間の細胞ラベリングの割合は、最初の７日間で有意差はなく、結合の忠実度を示唆していた。ベクターＰＯＬＹ３は最高の総ラベリングを提供したが、すべての時点で他の３つのベクターと並置されたかなりの程度の二重ラベリングを示した。興味深いことに、ベクターＰＯＬＹ４は、電気泳動を行ったときにｓｓＤＮＡバーコードを保持できなかったが、細胞と結合する能力を示した。ｓｓＤＮＡ結合効率および細胞標的化性能に基づいて、ＰＯＬＹ２はヒト肝臓オルガノイド（ＨＬＯ）培養物の単一細胞バーコーディング用途の主な候補とみなされた。ＦＡＣＳ分析は、ＨＬＯサンプルからのほぼすべての細胞がＰＯＬＹ２でタグ付けされ、個別にタグ付けされた培養物を混合してから２４時間後に感知できるほどの二重ラベリングがないことを明らかにした。蛍光共役ＰＯＬＹ－ｓｅｑの共焦点分析により、培養システムとのインキュベーションから３時間後のリソソーム内での配合物依存性の共局在性が明らかになった。リソソーム隔離は一般に、クラスリン依存性、ダイナミン依存性エンドサイトーシスまたはマイクロピノサイトーシスから輸送された初期エンドソームからの後期エンドソームの成熟または融合に関連しているため、ベクターＰＯＬＹ２とＰＯＬＹ３の細胞会合がこの時点より前に容易に発生することを示唆している。内在化のメカニズムは分子的には不明であるが、この選択的な関連付けは、時間依存のエンドソーム／リソソームオルガネラのトラフィッキングへの調査の機会を提供する。

バーコードおよびタグ付け細胞を結合して能力を有していることとは別に、いくつかのシステムによるｓｓＤＮＡバーコードの機能的送達は、最終的には、システムが有用であるとみなされるために、単一細胞調製技術によって正しく捕捉および増幅された読み取り可能でユニークな配列に依存する。本明細書に記載のポリマーベクターは、バーコード結合、細胞ラベリングおよび保持に効率的な品質を有し、非常に均一な方法でインサイチューで１時間ラベリングした後、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ中に特定できる読み取り可能なバーコードを送達した。バーコードのない細胞（ネガティブ）と単一ラベル付け細胞（シングレット）を並置すると、細胞当たりのユニークな遺伝子（ＵＭＩ）または総ＲＮＡの数の分布、および一般的なトランスクリプトーム発現に違いは見られなかった。これは、ＰＯＬＹ－ｓｅｑバーコードが単一細胞ライブラリの調製および分析を妨害せず、転写レベルで細胞生理学を混乱させないことを示唆している。さらに、ＰＯＬＹ－ｓｅｑは、不均一な集団を均一に標識付けし、ラベル付けの割合およびバーコード表現の両方として定量化した。ベクターＰＯＬＹ２を合成するためのコスト見積もりは３腺と／ｍｇである。ＨＬＯサンプル当たり１０μｇを使用した。特定の細胞内小胞隔離、蛍光ラベリングするための、および共有結合抱合体を必要することなくｓｓＤＮＡバーコードを細胞に迅速に結合して送達するための能力により、ＰＯＬＹ－ｓｅｑシステムは、多重化用途のためのカスタムバーコード付けプールを安価に生成する機会を提供し、かなりの時間および配列決定費用を節約する。

実施例６．材料および方法
合成材料：
以下の材料はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、さらに精製することなく使用した：ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート、Ｍ_ｎ＝２５０；≧９２％、ジ（トリメチロールプロパン）テトラアクリレート；３－アミノ－１－プロパノール、≧９９％、１，４－ビス（３－アミノプロピル）ピペラジン、≧９９％；スペルミン、≧９９％；ポリエチレンイミン、Ｍ_ｎ＝６００；２，２－ジメチル－１，３－プロパンジアミン、≧９９％；ＤＭＳＯ、≧９９％；０．０３％（ｖ／ｖ）ＴＭＳを含有する、ＤＭＳＯ－ｄ_６９９．９％原子％Ｄ。

ポリマー合成：
ＰＯＬＹ－ｓｅｑベクターは、マイケル付加を介して、ここに記載されている試薬を使用した２段階のプロセスで合成した。アクリレート末端モノマー、アルカノールアミンモノマー、およびキャッピング剤は、最初に２００ｍｇ／ｍＬの無水ＤＭＳＯに溶解された。試薬を１２×７５ｍｍのガラス製培養チューブ内で定義された比率で均一に混合し、９０℃で２０時間反応させて、アクリレート終端生成物（ＰＯＬＹ－ａｃ）を形成した。シリコーンオイルバスを使用して温度を一定に保った。末端アクリレート基のアミン抱合は、キャッピング剤の付加により第２段階で達成した。末端アクリレート抱合体を５０℃で２４時間継続し、最終的なＰＯＬＹ－ｓｅｑポリマーベクターを生成した（表２）。最終製品のアリコートは、長期保存のために－２０℃で維持した。適用検査用のポリマーの溶解は、濃縮ＤＭＳＯストックを２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に１および１０ｍｇ／ｍＬの最終濃度での直接的な希釈によって達成した。すべてのＤｙＬｉｇｈｔ試薬をＤＭＳＯに溶解して最終濃度を１０ｍｇ／ｍＬにした。ＤｙＬｉｇｈｔ抱合体は、ＮＨＳで活性化されたＤｙＬｉｇｈｔ蛍光分子を１０ｍｇ／ｍＬのＰＯＬＹ－ｓｅｑベクターとボルテックス下でポリマー１ｍｇ当たり４０μｇ ＤｙＬｉｇｈｔの最終濃度まで混合することを通して達成した。

アクリレート、アミンモノマー、およびキャッピング分子のリスト：
アクリレートモノマー：ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート、Ｍ_ｎ＝２５０（「Ｄ８」）；ジ（トリメチロールプロパン）テトラアクリレート（「Ｖ５」）。

アルカノールアミン：３－アミノ－１－プロパノール（「Ｓ３」）
キャッピング分子：１，４－ビス（３－アミノプロピル）ピペラジン（「Ｃ１」）、スペルミン（「Ｃ２」）、ポリエチレンイミン、Ｍ_ｎ＝６００（「Ｃ３」）、２，２－ジメチル－１，３－プロパンジアミン（「Ｃ４」）。

ＮＭＲ：
ＮＭＲは、Ｂｒｕｋｅｒ Ａｓｃｅｎｄ ６００ＭＨｚ分光計で実行した。アクリレート末端またはキャップされたベクターの５ｍｇのアリコートを、サンプル取得のために重水素化ＤＭＳＯ－ｄ６に直接溶解した。自由誘導減衰ファイルを、Ｍｎｏｖａで処理した。

細胞培養／毒性：
ヒト胚性幹細胞クローンＨ１は、ＷｉＣｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから提供された。ｉＰＳＣクローン１３８３Ｄ６はＫｙｏｔｏ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから寄贈された。ｉＰＳＣクローン７２．３は、ＣＣＨＭＣ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｉｌｉｔｙから提供された。幹細胞は、わずかな変更を加えて当技術分野において既知のプロトコルに従って、または本明細書に記載されているように維持した。すべての幹細胞は、５％のＣＯ_２中、３７℃でｍＴｅＳＲ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、フィーダー細胞を含まない条件で維持した。Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）分離により７０％の培養密度に達した時点で細胞を継代し、１０μｇ／ｍＬのＹ－２７６３２（ＲＯＣＫ阻害剤）および５μｇ／ｍＬのラミニン－５１１を補填した６ウェルＦａｌｃｏｎ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）プレートに一晩播種した。Ｙ－２７６３２／ラミニン－５１１を補充したｍＴｅＳＲ培地を、一晩の付着後にｍＴｅＳＲに交換し、毎日新鮮なｍＴｅＳＲ培地と交換した。

毒性スクリーニングは、白色９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）で実施した。Ａｃｃｕｔａｓｅを使用して、継代プレートからの単一細胞懸濁液を単離した。細胞を、Ｙ－２７６３２およびラミニン－５１１を補充したｍＴｅＳＲ中の個々のウェルに、２０，０００個の細胞／ウェルの初期濃度で維持しながらプレーティングし、８０～９０％の集密度に達するまでｍＴｅＳＲ中で維持した。ＰＯＬＹ－ｓｅｑポリマーをｍＴｅＳＲで希釈し、細胞に２４時間適用した。生存率は、ＡＴＰベースのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（ＣＴＧ）３Ｄ生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって決定した。

フローサイトメトリー
前腸および後腸培養物を、当技術分野で知られている方法に従って、または本明細書に記載されているように増殖させた。系統の確立に続いて、培養物を、次いで、ＤｙＬｉｇｈｔコンジュゲートＰＯＬＹ－ｓｅｑベクターによって２０μｇ／ｍＬの濃度で一晩タグ付けし、前腸および後腸培養物は、それぞれ異なるＤｙＬｉｇｈｔ色（前腸については４８８ｎｍ、後腸については６５０ｎｍ）を受容した。タグ付け後、細胞をＤＭＥＭ／Ｆ－１２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で２回洗浄し、結合していないＰＯＬＹ－ｓｅｑベクターを除去した。単一細胞懸濁液を単離し、Ｙ－２７６３２およびラミニン－５１１を補充したｍＴｅＳＲでウェル当たり２０，０００個の細胞の量で超低付着性Ｕ底９６ウェルプレートに播種した。プレートを１６０×ｇで２分間、短時間遠心分離し、細胞をペレット化した。スフェロイドを一晩形成させた。形成後、ＰＯＬＹ－ｓｅｑ－ＤｙＬｉｇｈｔ ４８８でタグ付けされた単一のスフェロイドに、ＰＯＬＹ－ｓｅｑ－ＤｙＬｉｇｈｔ ６５０でタグ付けされた単一のスフェロイドをプレーティングし、一晩融合させた。融合スフェロイドを、前述のように維持した。融合後１、４、７、および１４日目に、０．９×Ａｃｃｕｔａｓｅ＋１．０×ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓの混合物を使用して、３７℃で穏やかにピペッティングしながらスフェロイドを消化した。総ラベリングおよび二重ラベリングの程度を、フローサイトメトリーを使用して定量化した。

ＨＬＯ培養
ヒト肝臓オルガノイド（ＨＬＯ）は、わずかな変更を加えて当技術分野で既知の方法に従って、または本明細書に記載されるように生成した。内胚葉を確立するために、ｉＰＳＣをＹ－２７６３２およびラミニン－５１１を補充したｍＴｅＳＲの６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種した。翌日、培地をｍＴｅＳＲのみに変更した。２日目に培地を１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）および５０ｎｇ．ｍＬの骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４；Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含有するＲＰＭＩ－１６４０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に切り替えた。これは、分化の１日目（Ｄ１）を構成する。２日目（Ｄ２）に培地をＲＰＭＩ－１６４０ ＋ １００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ＋０．２％のノックアウト血清交換（ＫＯＳＲ； Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に切り替えた。３日目（Ｄ３）に培地をＲＰＭＩ－１６４０ ＋ １００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ＋ ２．０％のＫＯＳＲに切り替えました。４～６日の間（Ｄ４～６）に培地をＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋Ｂ２７（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）＋Ｎ２（Ｇｉｂｃｏ）＋５００ｎｇ／ｍＬの線維芽細胞増殖因子４（ＦＧＦ－４；Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）および３μＭのＣＨＩＲ９９０２１（Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）に切り替えて、毎日交換した。Ａｃｃｕｔａｓｅを使用してＤ７で単一細胞懸濁液を分離した。細胞を洗浄し、５０，０００細胞／５０μＬのマトリゲルで増殖因子マトリゲルに再懸濁した。６ウェルプレート（ＶＷＲ）に５０μＬの液滴を播種した。Ｄ７～１０では、培地を濃縮培地（ＥＰ）：Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ）＋２％のＢ－２７（Ｇｉｂｃｏ）＋１％のＮ２（Ｇｉｂｃｏ）＋１％ＨＥＰＥＳ（１Ｍ、Ｇｉｂｃｏ）＋１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）＋１％のＬ－グルタミン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）＋３μＭのＣＨＩＲ９９０２１（Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）＋５ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２（Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）＋１０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）＋２０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ（Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）＋０．５μＭのＡ８３－０１（Ｔｏｃｒｉｓ）＋５０μｇ／ｍＬのアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ）に切り替えて、Ｄ７およびＤ９に交換した。Ｄ１１～１４では、培地をＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋２％のＢ－２７＋１％のＮ２＋１％のＨＥＰＥＳ（１Ｍ）＋１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ＋１％のＬ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ＋２μＭのレチノイン酸（Ｓｉｇｍａ）に切り替えて、Ｄ１１およびＤ１３に交換した。培地を肝細胞培養培地（ＨＣＭ；Ｌｏｎｚａ）＋１０ｎｇ／ｍＬの肝細胞増殖因子（ＨＧＦ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）＋Ｏｎｃｏｓｔａｔｉｎ Ｍに切り替えて、１日おきに交換した。ＨＬＯはＤ２１～Ｄ２４の間で使用された。ＨＬＯは、ＨＣＭ中で一晩ＤｙＬｉｇｈｔ ４８８、５５０、または６５０のいずれかで抱合されたＰＯＬＹ－ｓｅｑベクターで個別にタグ付けし、２回洗浄して、フロー分析の前に２４時間混合した。混合培養物を、０．９×Ａｃｃｕｔａｓｅ＋１．０×ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓの混合物を使用して、３７℃で穏やかにピペッティングして消化した。総ラベリングおよび二重ラベリングの程度を、フローサイトメトリーを使用して定量化した。

免疫蛍光：
ＨＬＯは、ライブイメージングの前に、ＨＣＭで希釈したＤｙＬｉｇｈｔ抱合ＰＯＬＹ－ｓｅｑベクターと、１～２４時間インキュベートした。Ｆ－アクチン染色は、ＳｉＲ－アクチン（Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ，Ｉｎｃ．）を２５０ｎＭの濃度で３時間、または５００ｎＭの濃度で１時間使用して達成した。ミトコンドリアは、テトラメチルローダミン、メチルエステル（ＴＭＲＭ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を１μＭの濃度で最低１時間使用して染色した。リソソームは、１μＭの濃度のＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ Ｂｌｕｅ ＤＮＤ－２２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で最低１時間染色した。

１０×ゲノミクス配列決定のための細胞タグ付け：
ＰＯＬＹ２は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって合成されたＣＩＴＥ－ｓｅｑ細胞ハッシングオリゴマー構造（表３）に基づく、１０×互換性のあるＤＮＡバーコード付けオリゴマーと、１０μｇのベクター／１μｇのオリゴの質量比で混合した。最初に、１０μｇのＰＯＬＹ２を５０μＬのＨＣＭで希釈し、１μｇのバーコード付けオリゴを別の５０μＬのアリコートで希釈した。バーコーディングオリゴは、希釈直後にＰＯＬＹ２にピペッティングすることによりすばやく混合し、１０分間静置されてすぐに使用できるＰＯＬＹ－ｓｅｑベクターを形成し、次いで、ベクターをＨＬＯアリコートに希釈して、１０μｇのベクター／５００μＬＨＣＭの最終濃度にした。ＨＬＯを、３７℃で１時間タグ付けした。ＨＬＯを２回洗浄して上清からバーコーディングベクターを除去し、Ａｃｃｕｔａｓｅ／ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｇｉｂｃｏ）の混合物によって単一細胞に継代させた。単一細胞懸濁液から４０μＭフィルターで破片を取り除き、ＨＣＭで最終濃度１０００細胞／μＬに調整してからＣｈｒｏｍｉｕｍチップに装填し、Ｃｈｒｏｍｉｕｍ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ ３’ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔｓ ｖ３に従って１０ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓで処理した。バーコードは、配列：５’－ＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣ＊Ｔ＊Ｃ－３’（配列番号１）の３’ホスホロチオエート安定化添加剤プライマーを使用して増幅された。ｃＤＮＡ増幅後、ＣＩＴＥ－ｓｅｑプロトコルに従ってバーコード配列を完全長ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡから分離し、ｉ７インデックスを含む標準のＰ５／Ｐ７アダプターを使用してＰＣＲ増幅した。調製したｓｃＲＮＡ－ｓｅｑライブラリを、ＮｏｖａＳｅｑ ６０００システムで実行した。分離されたバーコードライブラリは、ＮｅｘｔＳｅｑ ５５０システムで個別に実行した。Ｃｅｌｌｒａｎｇｅｒを使用して、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑリードをｈｇ１９ヒトゲノムにアラインし、バーコードリードを組み入れた。均一マニホルド近似および投影（ＵＭＡＰ）の作成、クラスター、およびバーコード表現は、１０ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓが提供するＬｏｕｐｅで実行した。シングレット／ダブレットの特定は、細胞をプレフィルタリングするＳｅｕｒａｔ ｖ３．１を使用して行い、>２５％のミトコンドリア数から構成されるトランスクリプトームを有する細胞を除外し、１００～１０，０００の個別に特定された遺伝子の数を有する細胞を含めた。トランスクリプトームの差次的発現を、ＤＥＳｅｑ２（Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ ｖ３．１１）を使用してＳｅｕｒａｔで、ｌｏｇ_２（１．１）変化倍率プレフィルターとサブサンプル当たり１０００個の細胞を使用して計算した。

前述の実施形態の少なくともいくつかでは、実施形態で使用される１つ以上の要素は、そのような置き換えが技術的に実現可能でない場合を除いて、別の実施形態で互換的に使用することができる。当業者は、特許請求される主題の範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の方法および構造に対して、他の様々な省略、付加、および改変を行うことができることを理解されよう。そのようなすべての改変および変更は、添付の特許請求の範囲によって規定されるように、主題の範囲内に含まれることが意図されている。

本明細書における実質的にすべての複数および／または単数の用語の使用に関して、当業者は、文脈および／または用途に適切であるように、複数から単数へと、および／または単数から複数へと言い換えることができる。明確にするために、様々な単数／複数の置き換えを本明細書において明確に説明することができる。

通常、本明細書および特に添付された特許請求の範囲（例えば、添付された特許請求の範囲の本文）で使用される用語は、通常は「オープンな」用語として意図されている（例えば、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は「含むがこれに限定されない」と解釈すべきであり、用語「有する」は「少なくとも有する」と解釈すべきであり、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」は「含むがこれに限定されない」と解釈すべきである等）ことを当業者は理解するであろう。導入される請求項の詳述の具体的な数が意図されている場合には、そのような意図は、この請求項で明示的に詳述され、そのような詳述が存在しない場合にはそのような意図は存在しないことを当業者はさらに理解するであろう。例えば、理解の補助として、下記の添付された特許請求の範囲は、請求項の詳述を導入するために、導入的語句「少なくとも１つ」および「１つ以上」の使用を含む場合がある。しかしながら、そのような語句の使用は、同じ請求項が導入的語句「１つ以上」または「少なくとも１つ」および「ａ」または「ａｎ」等の不定冠詞を含む場合であっても、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」による請求項の詳述の導入が、そのように導入される請求項の詳述を含む任意の特定の請求項を、ただ１つのそのような詳述を含む実施形態に限定することを意味すると解釈すべきではなく（例えば、「ａ」および／または「ａｎ」は「少なくとも１つ」または「１つ以上」を意味すると解釈すべきであり）、同じことが、請求項の詳述を導入するために使用される定冠詞の使用にも当てはまる。加えて、導入される請求項の詳述の具体的な数が明示的に詳述されている場合、そのような詳述は、少なくとも詳述された数を意味する（例えば、その他の修飾語句なしでの「２つの詳述」という単なる詳述は、少なくとも２つの詳述または２つ以上の詳述を意味する）と解釈すべきであることを当業者は認識するであろう。さらに、「Ａ、Ｂ、およびＣの少なくとも１つ等」に類似する慣習が使用される場合では、通常、そのような構文は、当業者がこの慣習を理解するであろう意味が意図されている（例えば、「Ａ、Ｂ、およびＣの少なくとも１つを有するシステム」には、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、ＡおよびＢを一緒に、ＡおよびＣを一緒に、ＢおよびＣを一緒に、ならびに／またはＡ、Ｂ、およびＣを一緒に有するシステム等が含まれるがこれらに限定されないであろう）。Ａ、Ｂ、またはＣの少なくとも１つ等」に類似する慣習が使用されている場合では、通常、そのような構文は、当業者がこの慣習を理解するであろう意味が意図されている（例えば、「Ａ、Ｂ、またはＣの少なくとも１つを有するシステム」には、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、ＡおよびＢを一緒に、ＡおよびＣを一緒に、ＢおよびＣを一緒に、ならびに／またはＡ、Ｂ、およびＣを一緒に有するシステム等が含まれるがこれらに限定されないであろう）。明細書、特許請求の範囲または図面のいずれにおいても、２つ以上の代替用語を提示する実質的にいかなる離接語および／または離接語句も、用語のうちの１つ、用語のいずれかまたは両方の用語を含む可能性を意図すると理解すべきであることを当業者はさらに理解するであろう。例えば、語句「ＡまたはＢ」は、「Ａ」または「Ｂ」または「ＡおよびＢ」の可能性を含むと理解されるであろう。

加えて、本開示の特徴または態様がマーカッシュグループによって説明されている場合、これにより、本開示は、マーカッシュグループの任意の個々のメンバーまたはメンバーのサブグループによっても説明されることを当業者は認識するであろう。

当業者に理解され得るように、文書として記述するという観点等のあらゆる目的のために、本明細書で開示されているすべての範囲は、あらゆる可能な部分範囲およびこれらの部分範囲の組み合せも包含する。列挙されているあらゆる範囲を、少なくとも２等分、３等分、４等分、５等分、１０等分等に分解される同じ範囲を十分に説明して可能にすると容易に認識することができる。非限定的な例として、本明細書で論じる各範囲を、下３分の１、中３分の１および上３分の１等に容易に分解することができる。当業者にも理解され得るように、「最大」、「少なくとも」、「超」、「未満」等のすべての言葉は、詳述される数を含み、上記で論じたように後に部分的範囲に分解され得る範囲を指す。最後に、当業者に理解され得るように、範囲は個々の各メンバーを含む。したがって、例えば、１～３個の物品を有する群は、１個、２個、または３個の物品を有する群を指す。同様に、１～５個の物品を有する群は、１個、２個、３個、４個、または５個等の物品を有する群を指し、以下同様である。

本明細書では様々な態様および実施形態が開示されているが、当業者にはその他の態様および実施形態が明らかであるだろう。本明細書で開示されている様々な態様および実施形態は説明を目的としており、限定していることを意図されておらず、真の範囲および趣旨は下記の特許請求の範囲で示される。

公開および未公開の出願、特許、および文献の参照を含むがこれらに限定されない、本明細書で引用されるすべての参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれ、本明細書の一部となる。参照により組み込まれる刊行物および特許または特許出願が明細書に含まれる開示と矛盾する範囲で、明細書は、そのような矛盾する資料に優先する、および／または優先することを意図している。

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ＭａｃＰａｒｌａｎｄ， Ｓ．Ａ．， Ｌｉｕ， Ｊ．Ｃ．， Ｍａ， Ｘ．， Ｉｎｎｅｓ， Ｂ．Ｔ．， Ｂａｒｔｃｚａｋ， Ａ．Ｍ．， Ｇａｇｅ， Ｂ．Ｋ．， Ｍａｎｕｅｌ， Ｊ．， Ｋｈｕｕ， Ｎ．， Ｅｃｈｅｖｅｒｒｉ， Ｊ．& Ｌｉｎａｒｅｓ， Ｉ．２０１８， "Ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｌｉｖｅｒ ｒｅｖｅａｌｓ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｉｎｔｒａｈｅｐａｔｉｃ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ"， Ｎａｔｕｒｅ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ， ｖｏｌ． ９， ｎｏ．１， ｐｐ．１－２１．
Ｌｕｚｉｏ， Ｊ．Ｐ．， Ｐｒｙｏｒ， Ｐ．Ｒ． & Ｂｒｉｇｈｔ， Ｎ．Ａ． ２００７， "Ｌｙｓｏｓｏｍｅｓ： ｆｕｓｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ"， Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ． ８， ｎｏ．８， ｐｐ．６２２－６３２．
Ｍａｙｏｒ， Ｓ．& Ｐａｇａｎｏ， Ｒ．Ｅ． ２００７， "Ｐａｔｈｗａｙｓ ｏｆ ｃｌａｔｈｒｉｎ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ"， Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ． ８， ｎｏ．８， ｐｐ．６０３．
ＭｃＭａｈｏｎ， Ｈ．Ｔ． & Ｂｏｕｃｒｏｔ， Ｅ．２０１１， "Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ａｎｄ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃｌａｔｈｒｉｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ"， Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ． １２， ｎｏ．８， ｐｐ．５１７．

Claims (27)

1. キャップされたカチオン性ポリマーを合成する方法であって、
   （ａ）ポリ（エチレングリコール）ジアクリレートモノマーおよび３－アミノ－１－プロパノールを接触させて、マイケル付加によって、ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート／３－アミノ－１－プロパノールカチオン性ポリマーを形成することであって、ポリ（エチレングリコール）ジアクリレートモノマー対３－アミノ－１－プロパノールのモル比が、１超であり、前記カチオン性ポリマーが、アクリレート末端である、形成することと、
   （ｂ）前記カチオン性ポリマーの末端アクリレート基をアミン基を含むキャッピング分子と接触させて、マイケル付加によって、前記キャップされたカチオン性ポリマーを形成することであって、前記キャップされたカチオン性ポリマーが、いずれのアクリレート基も含まない、形成することと、を含む、方法。
2. 工程（ａ）の前記ポリ（エチレングリコール）ジアクリレートモノマーおよび３－アミノ－１－プロパノールが、ジ（トリメチロールプロパン）テトラアクリレートとさらに接触され、ジ（トリメチロールプロパン）テトラアクリレートの前記付加が、３つ以上の末端アクリレート基を含む分岐状ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート／ジ（トリメチロールプロパン）テトラアクリレート／３－アミノ－１－プロパノールカチオン性ポリマーの形成をもたらす、請求項１に記載の方法。
3. 前記キャッピング分子が、１，４－ビス（３－アミノプロピル）ピペラジン、スペルミン、ポリエチレンイミン、もしくは２，２－ジメチル－１，３－プロパンジアミンのうちの１つ以上、またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項１または２に記載の方法。
4. ポリ（エチレングリコール）ジアクリレートモノマー対３－アミノ－１－プロパノールの前記モル比が、１．０１：１、１．０２：１、１．０３：１、１．０４：１、１．０５：１、１．０６：１、１．０７：１、１．０８：１、１．０９：１、１．１：１、１．１１：１、１．１２：１、１．１３：１、１．１４：１、もしくは１．１５：１、または約１．０１：１、約１．０２：１、約１．０３：１、約１．０４：１、約１．０５：１、約１．０６：１、約１．０７：１、約１．０８：１、約１．０９：１、約１．１：１、約１．１１：１、約１．１２：１、約１．１３：１、約１．１４：１、もしくは約１．１５：１、または前述の比のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の比、例えば１．０１：１～１．１５：１、１．０１：１～１．１：１、１．０５：１～１．１：１、もしくは１．１：１～１．１５：１である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記カチオン性ポリマーと前記キャッピング分子との質量比が、１００：１、１００：２、１００：３、１００：４、１００：５、１００：６、１００：７、１００：８、１００：９、１００：１０、１００：１５、１００：２０、１００：２５、１００：３０、１００：３５、１００：４０、１００：４５、１００：５０、１００：５５、１００：６０、１００：６５、１００：７０、１００：７５、１００：８０、１００：８５、１００：９０、１００：９５、１００：１００、１００：１５０、１００：２００、１００：３００、１００：４００、もしくは１００：５００、または約１００：１、約１００：２、約１００：３、約１００：４、約１００：５、約１００：６、約１００：７、約１００：８、約１００：９、約１００：１０、約１００：１５、約１００：２０、約１００：２５、約１００：３０、約１００：３５、約１００：４０、約１００：４５、約１００：５０、約１００：５５、約１００：６０、約１００：６５、約１００：７０、約１００：７５、約１００：８０、約１００：８５、約１００：９０、約１００：９５、約１００：１００、約１００：１５０、約１００：２００、約１００：３００、約１００：４００、もしくは約１００：５００、または前述の比のうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の比、例えば１００：１～１００：５００、１００：１～１００：２５、１００：１０～１００：１００、もしくは１００：１００～１００：５００である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記キャップされたカチオン性ポリマーが、ＰＯＬＹ１、ＰＯＬＹ２、ＰＯＬＹ３、ＰＯＬＹ４、ＰＯＬＹ５、ＰＯＬＹ６、ＰＯＬＹ７、もしくはＰＯＬＹ８、またはこれらの任意の組み合わせである、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記カチオン性ポリマーおよびキャップされたカチオン性ポリマーが、表２に示される比および成分に従って合成される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
8. 請求項１～３のいずれか一項に記載の方法により合成された、キャップされたカチオン性ポリマー。
9. 蛍光染料をさらに含む、先行請求項のいずれか一項に記載のキャップされたカチオン性ポリマー。
10. 前記蛍光染料が、ＤｙＬｉｇｈｔ ４８８、ＤｙＬｉｇｈｔ ５５０、またはＤｙＬｉｇｈｔ ６５０である、請求項９に記載のキャップされたカチオン性ポリマー。
11. 細胞をラベリングする方法であって、前記細胞をカチオン性バーコードと接触させることを含み、前記カチオン性バーコードが、カチオン性ポリマーおよび核酸バーコードを含み、前記カチオン性ポリマーが、前記核酸バーコードが前記細胞の細胞質にアクセスすることを可能にする、方法。
12. 前記核酸が、ＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１１に記載の方法。
13. 前記核酸が、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）である、請求項１１または１２に記載の方法。
14. 前記核酸が、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、もしくは５０００ヌクレオチド長の長さ、または前述の長さのうちのいずれか２つによって定義される範囲内の任意の長さ、例えば、１０～５０００ヌクレオチド、１００～１０００ヌクレオチド、２００～５００ヌクレオチド、１０～５００ヌクレオチド、もしくは４００～５０００ヌクレオチド長を有する、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記カチオン性ポリマーが、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法の前記キャップされたカチオン性ポリマーである、請求項１１～１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記細胞が、組織、オルガノイド、もしくはスフェロイドの一部、またはこれらの任意の組み合わせである、請求項１１～１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記細胞が、肝臓オルガノイド、または前腸スフェロイドの一部である、請求項１６に記載の方法。
18. 前記核酸が、配列番号２～４の配列を有する、請求項１１～１７のいずれか一項に記載の方法。
19. 細胞集団の多重化バーコーディングの方法であって、
    前記細胞の集団を、１つ以上のカチオン性バーコードと接触させることであって、前記カチオン性バーコードのそれぞれが、カチオン性ポリマーおよびユニークな配列の核酸バーコードを含む、接触させることと、
    単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑによって、前記１つ以上のカチオン性バーコードの前記核酸バーコードを配列決定し、それにより、個々の細胞を、前記個々の細胞の前記核酸バーコードの前記配列によって、前記細胞の集団に属するものとして特定することと、を含む、方法。
20. 前記カチオン性ポリマーが、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法の前記キャップされたカチオン性ポリマーである、請求項１９に記載の方法。
21. 前記核酸バーコードが、ｓｓＤＮＡバーコードであり、前記核酸バーコードを配列決定することが、前記ｓｓＤＮＡバーコードを増幅することを含む、請求項１９または２０に記載の方法。
22. 前記核酸バーコードが、配列番号２～４の配列を有する、請求項１９～２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 前記細胞の集団が、組織、オルガノイド、またはスフェロイドの一部である、請求項１９～２２のいずれか一項に記載の方法。
24. 前記細胞の集団が、肝臓オルガノイド、または前腸スフェロイドの一部である、請求項２３に記載の方法。
25. 前記細胞の集団が、２つ以上の細胞の亜集団を含み、細胞の各亜集団が、ユニークな個体に由来し、前記細胞の集団が、前記２つ以上の細胞の亜集団を組み合わせることによって形成される、請求項１９～２４のいずれか一項に記載の方法。
26. 前記細胞の集団を接触させることが、前記２つ以上の細胞の亜集団を組み合わせることによって前記細胞の集団が形成される前に、前記２つ以上の細胞の亜集団のそれぞれを、ユニークなカチオン性バーコードと接触させることを含む、請求項２５に記載の方法。
27. 配列決定することが、前記２つ以上の細胞の亜集団のそれぞれの前記ユニークなカチオン性バーコードを配列決定し、それにより、個々の細胞を、前記個々の細胞の前記核酸バーコードの前記配列によって、前記２つ以上の細胞の亜集団のうちの１つに属するものとして特定することを含む、請求項２６に記載の方法。

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