JP2022534119A - 組換えヘルペスウイルスベクター - Google Patents

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Abstract

本明細書において記載される本発明は、ヘルペスウイルス目に由来する組換え複製欠損ウイルスを提供し、ウイルスは、ＩＣＰ２７をコードする遺伝子、またはその機能的等価遺伝子の完全な欠失を特徴とする。本発明はまた、そのような組換え複製欠損ウイルスのための産生細胞株も提供し、細胞株はＩＣＰ２７またはその機能的等価物のコード配列を有し、コード配列は、ＩＣＰ２７をコードする遺伝子の完全な欠失を特徴とするウイルスとの配列重複がないか、または最小限の配列重複を有する。そのような組換え複製欠損ウイルスおよび産生細胞株を使用する方法も提供される。

Description

関連出願の参照
本出願は、２０１９年５月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／８５４，６３７号、および２０１９年７月１１日に出願された第６２／８７３，０９４号の出願日の利益を主張するものであり、上記出願の各々の内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
組換え単純ヘルペスウイルス１型（ｒＨＳＶ）ベクターとの同時感染を使用する組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター産生は、大量のｒＡＡＶ粒子を生成する極めて効率の良い方法である（Ｃｏｎｗａｙら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：９８６～９９３頁、１９９９；Ｂｏｏｔｈら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １１：８２９～８３７頁、２００４；Ａｄａｍｓｏｎ－Ｓｍａｌｌら、Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ． Ｍｅｄ． Ｃｌｉｎ． Ｄｅｖ． ３：１６０３１頁、２０１６）。産生方法は、許容細胞において複製するためのヘルパーウイルスとしてＡＡＶ生活環の中でＨＳＶが果たす役割に依存する。したがって、ｒＨＳＶウイルスは、ヘルパーとしても、ならびにＡＡＶゲノム複製および産生細胞へのパッケージングを支持する必要なＡＡＶ機能を送達するためのシャトルとしても機能することができる。
この系のいくつかのｒＨＳＶベクターは、ウイルス感染細胞タンパク質（Ｉｎｆｅｃｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ）２７、すなわちＩＣＰ２７をコードする遺伝子に１．６ｋｂの欠失を有するＨＳＶ１型ウイルスｄ２７－１の複製欠損バリアントから改変される（ＲｉｃｅおよびＫｎｉｐｅ、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６４：１７０４～１７１５頁、１９９０）。ＩＣＰ２７は、最初期（Ｉｍｍｅｄｉａｔｅ Ｅａｒｌｙ）６３（ＩＥ６３）もしくはウイルス分子量（Ｖｉｒａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ）６３（Ｖｍｗ６３）タンパク質のようにその分子量に基づく名前によって、またはＵｎｉｑｕｅ Ｌｏｎｇ ５４（ＵＬ５４）遺伝子のようにＨＳＶ－１ゲノム上のその位置によっても知られる、５１２個のアミノ酸のタンパク質である。ＩＣＰ２７は、ＨＳＶ－１に感染した細胞で発現される最初のタンパク質の１つであり、細胞培養でのウイルス複製に必要不可欠である。ＩＣＰ２７の非存在下では、ＵＬ５４遺伝子およびＵＬ５５遺伝子の一部を含有する２．４ｋｂ ＢａｍＨＩ－ＨｐａＩ断片で安定に形質転換されてＩＣＰ２７を発現するＶｅｒｏ細胞誘導体である、例えばＶ２７細胞によってＩＣＰ２７がトランスで提供されない限り、ｒＨＳＶゲノムは複製することができない（ＲｉｃｅおよびＫｎｉｐｅ、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６４：１７０４～１７１５頁、１９９０）。他の報告されているＩＣＰ２７補完細胞株は、同じくＵＬ５４遺伝子およびＵＬ５５遺伝子の一部も含有する２．４ｋｂ ＢａｍＨＩ－ＳｓｔＩ断片でいずれも安定に形質転換された、Ｖｅｒｏ由来２－２細胞およびＢＨＫ２１由来Ｂ１３０細胞であった（Ｓｍｉｔｈら Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８６：７４～８６頁、１９９２；Ｈｏｗａｒｄら Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：１１３７～１１４７頁、１９９８）。
Ｖ２７は、ｒＡＡＶ産生に使用されるｒＨＳＶストックの大規模製造のために現在使用されている唯一の細胞株である（Ｐｅｎａｕｄ－Ｂｕｄｌｏｏら、Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ．：Ｍｅｄ． ＆ Ｃｌｉｎ． Ｄｅｖ． ８：１６６～１８０頁、２０１８）。ｒＨＳＶストックは、Ｖ２７細胞の単層をフラスコ中で、またはマイクロキャリアを使用して懸濁液中で、感染させることによって調製される。得られたｒＨＳＶストックは３～４日後に回収され、濃縮される（ＫｎｏｐおよびＨａｒｅｌｌ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｐｒｏｇ． ２３：７１５～７２１頁、２００７；Ａｄａｍｓｏｎ－Ｓｍａｌｌら、Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ． Ｍｅｄ． Ｃｌｉｎ． Ｄｅｖ． ３：１６０３１頁、２０１６）。
しかし、複製欠損ウイルスベクターがヘルパー細胞株で増殖されるときは常に、ウイルスゲノムと、細胞ゲノムに存在する組み込まれたウイルス遺伝子の間の相同組換え（ＨＲ）（アデノウイルス（Ａｄ）ベクターの産生中にも観察される）のプロセスを通じて複製能力を獲得したウイルスの亜集団を最終ストックが含有する可能性が高くなり、２９３細胞におけるＥ１遺伝子欠失Ａｄベクターゲノムと組み込まれたＥ１配列の間の相同組換えは、Ｅ１ベクターのストックを汚染する複製コンピテントＡｄ（ＲＣＡ）を高い頻度でもたらした（Ｈｅｈｉｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ． ７０：８４５９～８４６７頁、１９９６）。現在のｄ２７－１組換えＨＳＶ（ｒＨＳＶ）ベクターをＶ２７細胞で使用する製造プロセスは、ｒＨＳＶロットの「野生型様」の複製コンピテントＨＳＶ（ｒｃＨＳＶ）汚染の生成ももたらし得ることは例外ではない。
詳細には、複製コンピテントＨＳＶ（ｒｃＨＳＶ）、またはＩＣＰ２７復帰変異体は、相同組換えによりＶ２７でのｒＨＳＶの増幅中に起こり得る（Ｙｅら、Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． Ｃｌｉｎ． Ｄｅｖ． ２５：２１２～２１７頁、２０１４）。３×１０８ ｒＨＳＶ ＰＦＵあたり１ＰＦＵ未満と報告された低レベルのｒｃＨＳＶがｒＨＳＶストックで示されている（Ｐｅｎａｕｄ－Ｂｕｄｌｏｏら、Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ．：Ｍｅｄ． ＆ Ｃｌｉｎ． Ｄｅｖ． ８：１６６～１８０頁、２０１８）。
しかし、ＨＳＶ－１は、ウイルス複製が制御されない可能性があり、脳にウイルスが拡散した結果、深刻な形態の脳炎を引き起こす可能性があるため、表現型的に野生型ウイルスとして振る舞ういずれのｒｃＨＳＶウイルスも、複製欠損ストックの治療的使用に重大な問題をもたらすことになる（Ａｓｅｎｂａｕｅｒら、Ｎｅｕｒｏｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ ２９：１２０～１２３頁、１９９８；Ｇｕｒｓｅｓら、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｐａｅｄｉａｔｒｉｃｓ． １６：１７３～１７５頁、１９９６；Ｙａｍａｄａら Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ ＆ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ７４：２６２～２６４頁、２００３）。
故に、ｄ２７－１ ｒＨＳＶベクターを利用する既存のｒＨＳＶ産生プロセスを改善する必要がある。
本明細書において記載されるベクターは、既存のｄ２７－１ ＩＣＰ２７欠失と比べて、より大きな比較的完全なＩＣＰ２７遺伝子欠失をその骨格に有する新規ｒＨＳＶベクターを提供し、ｒＨＳＶ産生細胞株でｄ２７－１ベースの補完系を使用するｒＨＳＶの産生中に生成されるｒｃＨＳＶの汚染を回避する。実際に、ヘルペスウイルス目に由来する他のウイルスでの類似のウイルスベクターも本発明の一部である。
本明細書において記載される本発明はまた、適切なウイルスベクター（例えば、ｒＨＳＶ）産生細胞株に導入することができる組換えベクターも提供し、組換えベクターは、本発明のウイルス（例えば、ｒＨＳＶ）ベクターを宿主細胞で増殖させるために必要なＩＣＰ２７コード配列を提供する。ある特定の態様では、組換えベクター（ウイルス産生細胞株のゲノムに組み込まれ得る）、およびより大きな比較的完全なＩＣＰ２７欠失を有する対象ウイルス（例えば、ｒＨＳＶ）ベクター中のＩＣＰ２７コード配列に重複がほとんどないか、または重複がない。
本発明はさらに、そのような組換えベクターを含む宿主細胞を提供する。
本発明はさらに、対象ウイルスベクター（例えば、ｒＨＳＶベクター）を増殖／増幅／産生する方法を提供する。
本発明はさらに、対象ウイルスベクター（ｒＨＳＶなど）を使用して組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を産生する方法を提供する。
故に、本発明の１つの側面は、ヘルペスウイルス目に由来する組換え複製欠損ウイルスであって、ウイルスが、ＩＣＰ２７をコードする遺伝子、またはその機能的等価遺伝子中の欠失によって特徴づけられ、欠失が少なくとも１，２００ｂｐ長であり、ＩＣＰ２７をコードする遺伝子（例えば、配列番号１１）、またはその機能的等価遺伝子の最も３’末端の３００ｂｐ、２５０ｂｐ、２００ｂｐ、１５０ｂｐ、１００ｂｐ、５０ｂｐ、３０ｂｐ、２０ｂｐ、１０ｂｐ、９ｂｐ、８ｂｐ、７ｂｐ、６ｂｐ、５ｂｐ、４ｂｐ、３ｂｐ、２ｂｐ、１ｂｐまたは０ｂｐ以下を残す前記ウイルスを提供する。
ある特定の態様では、組換え複製欠損ウイルスは、ヘルペスウイルス目からの非臨床または実験室ウイルスに由来する。
ある特定の態様では、欠失は、ＩＣＰ２７をコードする遺伝子またはその機能的等価遺伝子のコード配列（またはＯＲＦ）全体を含む、から本質的になる、またはからなる。
ある特定の態様では、欠失は、ＩＣＰ２７をコードする遺伝子もしくその機能的等価遺伝子のプロモーター領域全体、またはプロモーター領域の一部（例えば、最も３’側の約４００ヌクレオチド）をさらに含む。
ある特定の態様では、ＩＣＰ２７をコードする遺伝子は、配列番号１１のポリヌクレオチド配列を有する。
ある特定の態様では、ウイルスは、アロヘルペスウイルス科またはマラコヘルペスウイルス科に由来する。
ある特定の態様では、ウイルスは、ヘルペスウイルス科に由来する。
ある特定の態様では、ウイルスは、アルファヘルペスウイルス亜科、ベータヘルペスウイルス亜科、またはガンマヘルペスウイルス亜科に由来する
ある特定の態様では、ウイルスは、ＨＨＶ－１（単純ヘルペスウイルス－１またはＨＳＶ－１）、ＨＨＶ－２（単純ヘルペスウイルス－２またはＨＳＶ－２）、ＨＨＶ－３（水痘帯状疱疹ウイルスまたはＶＺＶ）、ＨＨＶ－４（エプスタインバーウイルスまたはＥＢＶ）、ＨＨＶ－５（サイトメガロウイルスまたはＣＭＶ）、ＨＨＶ－６Ａ／ＨＨＶ－６Ｂ（ロゼオロウイルス、ヘルペスリンパ球向性ウイルス）、ＨＨＶ－７、またはＨＨＶ－８（カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスまたはＫＳＨＶ）に由来する。
ある特定の態様では、ウイルスは、オナガザルヘルペスウイルス－１（ＣｅＨＶ－１）またはネズミヘルペスウイルス６８（ＭＨＶ－６８またはＭｕＨＶ－４）に由来する。
ある特定の態様では、ウイルスは、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）を含むブタアルファ－ヘルペスウイルスに由来する。
ある特定の態様では、ウイルスは、クモザルヘルペスウイルス１（Ａｔｅｌｉｎｅ ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ Ｉ）、クモザルヘルペスウイルス（ｓｐｉｄｅｒ ｍｏｎｋｅｙ ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ）、ブタヘルペスウイルス、ウシヘルペスウイルス２、オナガザルヘルペスウイルス１（ヘルペスＢウイルス）、オオコウモリアルファヘルペスウイルス１、ウサギヘルペスウイルス４、マカクヘルペスウイルス１、カンガルーヘルペスウイルス２、およびヒヒヘルペスウイルス２などのシンプレックスウイルス属に由来する。
ある特定の態様では、ウイルスは、ウシヘルペスウイルス１、ウシヘルペスウイルス５、スイギュウヘルペスウイルス１、ヤギヘルペスウイルス１、イヌヘルペスウイルス１、オナガザルヘルペスウイルス９、シカヘルペスウイルス１、シカヘルペスウイルス２、ヘラジカヘルペスウイルス１、ウマヘルペスウイルス１、ウマヘルペスウイルス３、ウマヘルペスウイルス４、ウマヘルペスウイルス８、ウマヘルペスウイルス９、ネコヘルペスウイルス１、およびブタヘルペスウイルス１などのバリセロウイルス属に由来する。
ある特定の態様では、ウイルスは、カモヘルペスウイルス１、ハトヘルペスウイルス１、トリヘルペスウイルス２、トリヘルペスウイルス３（ＧａＨＶ－３またはＭＤＶ－２）、シチメンチョウヘルペスウイルス１（ＨＶＴ）、およびクジャクヘルペスウイルス１などのマルディウイルス属に由来する。
ある特定の態様では、ウイルスは、トリヘルペスウイルス１、およびオウムヘルペスウイルス１などのイルトウイルス（Ｌｉｔｏｖｉｒｕｓ）属に由来する。
ある特定の態様では、ウイルスは、アカウミガメヘルペスウイルス（Ｃａｒｅｔｔａ ｃａｒｅｔｔａ ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ）、ウミガメヘルペスウイルス１、ウミガメヘルペスウイルス２、ウミガメヘルペスウイルス３、ウミガメヘルペスウイルス４、アオウミガメヘルペスウイルス、クーバーヘルペスウイルス（Ｃｏｏｂｅｒ ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ）、ヌマガメヘルペスウイルス１、ヌマガメヘルペスウイルス２、線維乳頭腫関連ヘルペスウイルス、カタトカゲヘルペスウイルス１、カタトカゲヘルペスウイルス２、カタトカゲヘルペスウイルス３、モリイシガメ（Ｇｌｙｐｔｅｍｉｓ）ヘルペスウイルス１、モリイシガメヘルペスウイルス２、イグアナヘルペスウイルス１、イグアナヘルペスウイルス２、アカウミガメ口腔皮膚ヘルペスウイルス（Ｌｏｇｇｅｒｈｅａｄ ｏｒｏｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ）、肺－眼－気管関連ヘルペスウイルス、ヨコクビガメヘルペスウイルス１、ミシシッピアカミミガメヘルペスウイルス、アメリカハコガメヘルペスウイルス１、アメリカハコガメヘルペスウイルス２、リクガメヘルペスウイルス１、リクガメヘルペスウイルス２、リクガメヘルペスウイルス３、リクガメヘルペスウイルス４、およびオオトカゲヘルペスウイルス１などの爬虫類アルファヘルペスウイルスに由来する。
ある特定の態様では、ウイルスは、アルセラフィンヘルペスウイルス１、アルセラフィンヘルペスウイルス２、クモザルヘルペスウイルス２、ウシヘルペスウイルス４、オナガザルヘルペスウイルス１７、ウマヘルペスウイルス２、ウマヘルペスウイルス５、ウマヘルペスウイルス ７、ニホンザルラディノウイルス、ウサギヘルペスウイルス１、およびネズミヘルペスウイルス４（マウスガンマヘルペスウイルス６８またはＭＨＶ－６８）などのラディノウイルス属に由来する。
ある特定の態様では、ウイルスは、ＫＯＳ、ＫＯＳ１．１、ＫＯＳ１．１Ａ、ＫＯＳ６３、ＫＯＳ７９、ＭｃＫｒａｅ、Ｓｔａｉｎ １７、Ｆ１７、ＭｃＩｎｔｙｒｅなどのＨＳＶ－１の実験室株である。
ある特定の態様では、その機能的等価遺伝子は、ＫＳＨＶのＯＲＦ５７、ＥＢＶのＭｔａ／ＳＭ／ＥＢ２、ヒトＣＭＶのＵＬ６９、またはヘルペスウイルス目からの任意のウイルス中の他の等価遺伝子である。
ある特定の態様では、本発明の組換え複製欠損ウイルスは、ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質のコード配列、ならびに／またはＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接する目的の遺伝子（ＧＯＩ）をさらに含む。
ある特定の態様では、ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質のコード配列、ならびに／またはＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接する目的の遺伝子（ＧＯＩ）は、ウイルスの非必須遺伝子（例えば、ウイルス複製に必要とされず、ウイルスパッケージングに必要とされない）に組み込まれる、またはウイルスの非必須遺伝子を置換する。
本発明の別の側面は、ＩＣＰ２７またはその機能的等価物を宿主細胞で発現させることができる組換えベクターであって、（１）宿主細胞においてコード配列の転写を指示することができるプロモーターに作動可能に連結された、ＩＣＰ２７またはその機能的等価物のコード配列と；（２）コード配列の３’側のポリアデニル化部位と；（３）場合により、１つまたは複数のマルチクローニング部位とを含み；本発明のウイルスのいずれか１つの３００ｂｐ、２５０ｂｐ、２００ｂｐ、１５０ｂｐ、１００ｂｐ、５０ｂｐ、３０ｂｐ、２０ｂｐ、１０ｂｐ、９ｂｐ、８ｂｐ、７ｂｐ、または６ｂｐ以下の連続ヌクレオチドを含有する前記ベクターを提供する。
ある特定の態様では、ＩＣＰ２７は、配列番号１０のアミノ酸配列を有する、または配列番号１０と少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．２％、９９．４％、９９．６％、もしくは９９．８％同一である。
ある特定の態様では、プロモーターは少なくとも４００ポリヌクレオチドを含む。
ある特定の態様では、プロモーターは、配列番号１１のヌクレオチド１～５３８、配列番号１１のヌクレオチド１２７～５３８、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＴ８８７２２４のヌクレオチド１１３，１３９～１１３，５５０、またはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＴ８８７２２４のヌクレオチド１１３，０１３～１１３，５５０を含む。
ある特定の態様では、コード配列は、哺乳動物宿主細胞での発現のために部分的または完全にコドン最適化されている。
ある特定の態様では、コード配列の最も３’側の３００～３５０ヌクレオチドは、哺乳動物宿主細胞での発現のためにコドン最適化されている。
ある特定の態様では、ポリアデニル化部位は、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化部位である。
ある特定の態様では、ＩＣＰ２７のコード配列は、宿主細胞ｐｒｅ－ｍＲＮＡスプライシングの阻害を低減する一方で、ＨＳＶ後期遺伝子発現を可能にする変異を含む。
ある特定の態様では、変異は、ｖＢＳ３．３二重変異、ｖＢＳ４．３二重変異、またはｖＢＳ５．３二重変異である。
本発明の別の側面は、ＩＣＰ２７またはその機能的等価物を発現させることができる、本発明の組換えベクターを含む宿主細胞を提供する。
関連する側面では、本発明は、機能性ＩＣＰ２７タンパク質を発現する（例えば、恒常的または誘導的に発現する）ウイルス産生／パッケージング細胞株を提供し、機能性ＩＣＰ２７タンパク質のコード配列は、完全なＩＣＰ２７遺伝子欠失を有する対象ｒＨＳＶベクターとの配列重複がほとんどない（例えば、最大１０、５、３、２、１ｂｐの重複）か、または配列重複がない。
ある特定の態様では、機能性ＩＣＰ２７タンパク質のコード配列は、同じ領域での野生型ＩＣＰ２７コード配列との配列相同性を最小化するために、コード配列の３’末端にコドン最適化領域を有する。例えば、野生状態で使用されるｄ２７－１ ＨＳＶ－１ベクターは、欠失の３’末端に非欠失ＩＣＰ２７遺伝子の一部を含有し、非欠失ＩＣＰ２７遺伝子配列は、対象宿主細胞／ウイルスパッケージング細胞株／ウイルス産生細胞株中のＩＣＰ２７コード配列と重複する可能性がある。冗長な遺伝暗号を利用することにより、この重複領域の対象機能性ＩＣＰ２７のコード配列がコドン最適化されてコードされたアミノ酸配列を保存することができるが、それにもかかわらずこの領域の配列相同性を核酸レベルで６６％以下に低減して組換えを妨げることができる。
ある特定の態様では、組換えベクターは宿主細胞ゲノムに安定に組み込まれる。
ある特定の態様では、宿主細胞は、ヒト、サル、ウシ、ブタ、ウマおよび他のウマ類、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、マウス、ラット、ウサギ、ミンク、オポッサム、ラクダおよび他のラクダ科動物、ニワトリおよび他の鳥類、アルマジロ、カエル、爬虫類などの脊椎動物に由来する、または昆虫細胞に由来する。（代表的な細胞には、ＢＨＫ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＨＥＫ２９３細胞および他が挙げられる。）
本発明の別の側面は、本発明の組換え複製欠損ウイルスを増殖／増幅／産生する方法であって、本発明の宿主細胞を本発明の組換え複製欠損ウイルスに感染させるステップを含む前記方法を提供する。
ある特定の態様では、方法は、本発明の感染宿主細胞から本発明の組換え複製欠損ウイルスを回収するステップをさらに含む。
ある特定の態様では、本発明の組換え複製欠損ウイルスとＩＣＰ２７またはその機能的等価物のコード配列の間に、３００ｂｐ、２５０ｂｐ、２００ｂｐ、１５０ｂｐ、１００ｂｐ、５０ｂｐ、３０ｂｐ、２０ｂｐ、１０ｂｐ、９ｂｐ、８ｂｐ、７ｂｐ、６ｂｐ、５ｂｐ、４ｂｐ、３ｂｐ、または２ｂｐ以下の配列重複がある。
本発明の別の側面は、ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接する目的の遺伝子（ＧＯＩ）コード配列を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を産生する方法であって、ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質のコード配列を含む本発明の第１の組換え複製欠損ウイルス、ならびにＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接する目的の遺伝子（ＧＯＩ）を含む本発明の第２の組換え複製欠損ウイルスに産生宿主細胞を同時感染させるステップを含む前記方法を提供する。
本発明の別の側面は、ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接する目的の遺伝子（ＧＯＩ）のコード配列を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を産生する方法であって、ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質のコード配列を含む本発明の組換え複製欠損ウイルスに産生宿主細胞を感染させるステップを含み、産生宿主細胞が、（１）ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接するＧＯＩコード配列を有する組み込まれたＡＡＶプロウイルスを含み；（２）ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接するＧＯＩコード配列を有するベクター（例えば、プラスミド）によってトランスフェクトされ；または（３）ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接するＧＯＩコード配列を有するｒＡＡＶに同時感染される、前記方法を提供する。
ある特定の態様では、産生細胞株はＢＨＫ、Ｖｅｒｏ、またはＨＥＫ２９３である。
ある特定の態様では、ＧＯＩは、ジストロフィンの機能的等価物（例えば、機能性マイクロジストロフィンタンパク質をコードするジストロフィンミニ遺伝子）である。
ある特定の態様では、ＡＡＶの指向性は、血清型、例えばＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、好ましくはＡＡＶ９を含む。ある特定の態様では、ＡＡＶカプシドは遺伝子修飾されてもよく、またはカプシドは、特定の組織、例えば筋肉、骨格筋、心筋、平滑筋等へのＧＯＩの組織特異的または生理的コンパートメント送達を増強する合成デザイナーカプシドである。ある特定の態様では、形質導入効率および変更された指向性を改善するために、ＡＡＶの指向性は、シュードタイピング、または異なるウイルス血清型由来のカプシドおよびゲノムの混合により変更される。例示的なシュードタイプ化ＡＡＶには、筋芽細胞を標的にするＡＡＶ２／５、またはＡＡＶ２／６が挙げられる。ある特定の態様では、インシリコ由来配列がデノボ合成され、臨床応用と関係する生物学的特性について特徴づけられる。
ある特定の態様では、目的の遺伝子（ＧＯＩ）には、ＬＧＭＤ２Ｅ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｅ型）、ＬＧＭＤ２Ｄ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｄ型）、ＬＧＭＤ２Ｃ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｃ型）、ＬＧＭＤ２Ｂ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ型）、ＬＧＭＤ２Ｌ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｌ型）、ＬＧＭＤ２Ｉ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｉ型）の原因遺伝子／欠損遺伝子、またはＮＡＧＬＵ（α－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ、サンフィリポ症候群またはムコ多糖症ＩＩＩＢ型（ＭＰＳ ＩＩＩＢ）に関する）、スルファミダーゼもしくはＳＧＳＨ（ムコ多糖症ＩＩＩＡ型またはＭＰＳ ＩＩＩＡに関する）、第ＩＸ因子、第ＶＩＩＩ因子、ミオチューブラリン１（ＭＴＭ１）、生存運動ニューロン（ＳＭＮ、脊髄性筋萎縮症またはＳＭＡに関する）、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼＧＡＬＧＴ２、カルパイン－３（ＣＡＰＮ－３）、酸性アルファグルコシダーゼ（ＧＡＡ、ポンペ病に関する）、アルファ－ガラクトシダーゼＡもしくはＧＬＡ（ファブリー病に関する）、グルコセレブロシダーゼ、ジストロフィンもしくはマイクロジストロフィンの遺伝子もしくはコード配列が挙げられる。
ある特定の態様では、ＧＯＩはマイクロジストロフィン遺伝子である。
ある特定の態様では、マイクロジストロフィン遺伝子は、ＵＳ７，９０６，１１１；ＵＳ７，００１，７６１；ＵＳ７，５１０，８６７；ＵＳ６，８６９，７７７；ＵＳ８，５０１，９２０；ＵＳ７，８９２，８２４；ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１３７３３；またはＵＳ１０，１６６，２７２に記載されているものである。
ある特定の態様では、マイクロジストロフィン遺伝子は、完全長ジストロフィンタンパク質のＲ１６およびＲ１７スペクトリン様リピートのコード配列を含む（ＵＳ７，８９２，８２４に記載されているものなど）。
ある特定の態様では、マイクロジストロフィン遺伝子は、完全長ジストロフィンタンパク質のＲ１、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ２３、およびＲ２４スペクトリン様リピートのコード配列を含む（ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１３７３３に記載されているマイクロジストロフィン遺伝子など）。
本発明の別の側面は、筋ジストロフィーの処置を必要とする対象における筋ジストロフィーを処置する方法であって、マイクロジストロフィン遺伝子をコードする組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターの治療有効量を対象に投与するステップを含み、ｒＡＡＶが本発明の方法によって産生される、前記方法を提供する。
ある特定の態様では、方法は、対象にｒＡＡＶを投与するステップの前に、本発明の方法によってｒＡＡＶを産生するステップをさらに含む。
本発明の別の側面は、ウイルスが、ＩＣＰ２７をコードする遺伝子またはその機能的等価遺伝子の中の欠失によって特徴づけられ、欠失が少なくとも１，２００ｂｐ長であり、ＩＣＰ２７をコードする遺伝子（例えば、配列番号１１）、またはその機能的等価遺伝子の最も３’末端の３００ｂｐ、２５０ｂｐ、２００ｂｐ、１５０ｂｐ、１００ｂｐ、５０ｂｐ、３０ｂｐ、２０ｂｐ、１０ｂｐ、９ｂｐ、８ｂｐ、７ｂｐ、６ｂｐ、５ｂｐ、４ｂｐ、３ｂｐ、２ｂｐ、１ｂｐまたは０ｂｐ以下を残す、ヘルペスウイルス目に由来する組換え複製欠損ウイルスを製造する方法であって、ＩＣＰ２７をコードする遺伝子またはその機能的等価遺伝子の欠失を、適切な宿主細胞での相同組換えによって作製するステップを含む前記方法を提供する。
ある特定の態様では、相同組換えは、ＩＣＰ２７をコードする遺伝子またはその機能的等価遺伝子を有する、ヘルペスウイルス目に由来するウイルスのゲノム（例えば、ＨＳＶゲノム）を含む細菌人工染色体（ＢＡＣ）を使用して実行される。
ある特定の態様では、宿主細胞は、大腸菌、または真核細胞、例えば酵母、昆虫細胞（例えば、ＳＦ９）、もしくは哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞は、Ｖｅｒｏ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ヒト肺線維芽細胞ＭＲＣ－５、ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）、ヒト胚性肺線維芽細胞（ＨＥＬＦ）、メイディン－ダービーイヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、メイディン－ダービーウシ腎臓細胞（ＭＤＢＫ）などであってもよい。
本発明の別の側面は、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ発現カセットか、またはＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接する目的の遺伝子（ＧＯＩ、例えばジストロフィンミニ遺伝子）のいずれかをＨＳＶベクターのＴＫ遺伝子座に含む、ＩＣＰ２７欠失ＨＳＶベクターを生成する方法であって、（ａ）ｇａｌＫ選択マーカーを、ドナーＤＮＡにおいて相同組換えによりＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ発現カセットかまたはＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接するＧＯＩのいずれかに挿入して、ｇａｌＫ標識ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ発現カセットまたはｇａｌＫ標識ＧＯＩをそれぞれ生成するステップと；（２）相同組換えおよびｇａｌＫポジティブ選択により、ｇａｌＫ標識ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ発現カセットまたはｇａｌＫ標識ＧＯＩを、それぞれＩＣＰ２７欠失ＨＳＶベクターのＴＫ遺伝子座に挿入するステップと；（３）相同組換えおよびｇａｌＫネガティブ選択により、ｇａｌＫ標識ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ発現カセットまたはｇａｌＫ標識ＧＯＩ中のｇａｌＫ選択マーカーを、それぞれＩＣＰ２７欠失ＨＳＶベクターから除去するステップとを含む前記方法を提供する。
実施例、特許請求の範囲、またはサブセクションの１つに記載されているのみのものを含む本発明の任意の１つの態様は、不適切にまたは明示的に否認されない限り、任意の他の１つまたは複数の態様と組み合わされ得ることが理解されるべきである。
ＢＨＫ２１細胞を、ＭＯＩ ０．１でｄ２７－１ ｒＨＳＶベクターに感染させ、次いで配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５か、または関係がないＧＦＰプラスミド対照配列のいずれかのポリヌクレオチド配列を保有する２．５μｇの対応するプラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクション２４時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、新たな培地を各ウェルに添加した。感染７２時間後、細胞上清を各ウェルから回収し、ｒＨＳＶ力価をＶ２７細胞単層でプラークアッセイによって決定した。ＬｏＤ－検出限界。 ＢＨＫ－２７クローンを、ＭＯＩ ０．１でｄ２７－１ ｒＨＳＶベクターに感染させた。感染７２時間後、細胞上清を各ウェルから回収し、ｒＨＳＶ力価をＶ２７細胞単層でプラークアッセイによって決定した。ＬｏＤ－検出限界。 図３は、実施例１および実施例８に記載されるプラークアッセイに基づく、ｒｃＨＳＶ汚染のないＩＣＰ２７（ＵＬ５４）遺伝子の完全な２．１ｋｂ（２，０７７ｂｐ）欠失を有するｒＨＳＶウイルスのロバストな産生を示す図である。Ｖｅｒｏ細胞におけるプラークの非存在によって明らかなように、基本的にｒｃＨＳＶを汚染することなく、ＩＣＰ２７遺伝子の完全な欠失を有する対象ｒＨＳＶベクター（図３のクローン３）が、Ｖ２７細胞における多数のプラークによって明らかなように高力価ｒＨＳＶを産生したことは明白である。 図４は、実施例１および実施例８に記載されるプラークアッセイに基づく、ｒｃＨＳＶ汚染のないＩＣＰ２７（ＵＬ５４）遺伝子の完全な２．１ｋｂ（２，０７７ｂｐ）欠失を有するｒＨＳＶウイルスのロバストな産生を示す図である。Ｖｅｒｏ細胞におけるプラークの非存在によって明らかなように、基本的にｒｃＨＳＶを汚染することなく、ＩＣＰ２７遺伝子の完全な欠失を有する対象ｒＨＳＶベクター（図４のクローン４）が、Ｖ２７細胞における多数のプラークによって明らかなように高力価ｒＨＳＶを産生したことは明白である。 Δ２７ＨＳＶウイルスＤＤＰＣＲ力価に関するＶｅｒｏ ＭＷ７５サブクローンの上位を示す図である。 Ｖ７５サブクローン＃４、＃２０および＃２４のΔ２７ＨＳＶウイルスプラーク力価（ｐｆｕ／ｍＬ）を示す図である。 対象Ｖ７５．４細胞で増殖させた場合の、不完全なＩＣＰ２７欠失（Δ２７ＨＳＶ）を有する対照ＨＳＶベクターと比べて完全なＩＣＰ２７欠失（ＳＬＢ２７）を有する対象ＨＳＶベクターのより高い力価を示す図である。 合胞体プラーク形成は、部分的なＩＣＰ２７欠失を有する伝統的ＨＳＶベクターｄ２７－１では観察されなかった一方、完全なＩＣＰ２７欠失を有する対象ＨＳＶベクターに感染したほとんど全てのテストＶ７５．４培養物のＰ６における予想外の合胞体プラーク形成を示す図である。 ＢＨＫ産生細胞において、対照ＨＳＶベクター（Δ２７ＨＳＶ）と比べて対象ベクター（ＳＬＢ２７）がより高いＡＡＶ９－Ｄｙｓ力価を有することを示す図である。
１．概要
現在のｄ２７－１ ｒＨＳＶ－Ｖ２７ベースのベクター宿主細胞系は、ｄ２７－１ウイルスの配列と補完Ｖ２７細胞に組み込まれたＨＳＶ－１配列の間に８１５ヌクレオチドの重複を有する。類似のまたはより大きいサイズの重複は、他のＩＣＰ２７欠失ウイルスおよび類似の補完細胞、すなわち、２－２細胞またはＢ１３０細胞内にも存在する。この８１５ヌクレオチド以上の重複は、ＩＣＰ２７欠失ウイルスの配列とＩＣＰ２７補完細胞に組み込まれたＨＳＶ－１配列の間の相同組換えを可能にし、ＩＣＰ２７欠失ウイルスストックに野生型様の複製コンピテントな汚染ウイルスの出現をもたらす。これらのストックは、次いで、ＩＣＰ２７欠失ウイルスの増殖が制限されるはずの非補完細胞でも増殖する。これは、ウイルスストック細胞毒性の増加および非補完細胞におけるウイルスプラークの生成によって観察される。これらの望ましくない影響は、これらの重複を生み出す領域を除去することにより、本発明のｒＨＳＶベクターおよび方法によって軽減することができる。
出願人は、ＨＳＶ－１ ＩＣＰ２７欠失ウイルス変異体の成長および増殖に有用な新規ＩＣＰ２７補完細胞株を生成するために、ＩＣＰ２７発現カセットをコードする複数のＤＮＡコード配列を設計した。そのような発現カセットは、接着性Ｖｅｒｏ細胞、接着性ＢＨＫ細胞、および無血清懸濁液適合ＢＨＫ細胞株、またはＨＳＶの複製を支持する任意の他の細胞株で使用することができる。これらの産生細胞をｒＨＳＶ産生に使用する場合、現在使用されているｄ２７－１ ｒＨＳＶ－Ｖ２７ベースのベクター宿主細胞系でのｒＨＳＶの増殖と比べて、複製コンピテントなｒｃＨＳＶを生成する可能性は著しく低いであろう（ゼロではないにしても）。いかなる特定の理論にも束縛されることを望むものではないが、本発明は、ウイルスゲノムと、新規接着性Ｖｅｒｏ細胞株または無血清懸濁液適合ＢＨＫ細胞株などのＩＣＰ２７補完細胞株の細胞ゲノムに存在する組み込まれたＩＣＰ２７遺伝子の間のより小さな（または無）配列相同領域または重複に一部基づくと考えられる。
配列番号１、２、３、５、６、７、８、または９などの配列を有するＩＣＰ２７カセット保有プラスミドによって安定にトランスフェクトされたＢＨＫ細胞は、図２に示されたＢＨＫ１５３などの単離クローンによって名付けられた。
ある特定の態様では、本発明のｒＨＳＶベクターは、ｄ２７－１ベクターで現在使用されているＩＣＰ２７欠失（約１．６ｋｂの欠失）と比べて、最大のＩＣＰ２７欠失（約２ｋｂの欠失）を有する。全ての分析されたＩＣＰ２７発現構築物は、ｒＨＳＶの複製を同様の効率で支持することができた。故に、ＩＣＰ２７遺伝子に約２ｋｂの欠失を有する対象ｒＨＳＶベクターは、複製コンピテントなＨＳＶ（ｒｃＨＳＶ）を含まないｒＨＳＶを産生するのに使用することができる新規ｒＨＳＶ産生系となる。
特に、出願者らは、２，０７７ｂｐ ＵＬ５４遺伝子全体が欠失しているｒＨＳＶ－１ゲノムを生成するためのＤＮＡ配列を設計した。これは、現在、ＩＣＰ２７コードＵＬ５４遺伝子の最大および完全な欠失である。そのようなより大きなＩＣＰ２７欠失を包含する新規複製欠損ウイルス（例えば、複製欠損ｒＨＳＶ－１）は、複製コンピテントなｒｃＨＳＶを生成する可能性がより低いであろう。その理由は、一部には、新規ウイルスゲノムと、現在のＩＣＰ２７補完細胞株（例えば、Ｖ２７、２－２、Ｂ１３０細胞など）の細胞ゲノムに存在する任意の組み込まれたＩＣＰ２７遺伝子の間の配列重複がより小さいためである。
新規接着性Ｖｅｒｏ細胞または無血清懸濁液適合ＢＨＫ細胞株における、そのようなより大きなＩＣＰ２７欠失（例えば、ＩＣＰ２７コードＵＬ５４遺伝子の完全な欠失）を有する新規複製欠損ウイルス（例えば、ｒＨＳＶ－１）の増殖は、それらの細胞ゲノムに組み込まれたそれらのＩＣＰ２７遺伝子と、完全なＵＬ５４遺伝子欠失を有するｒＨＳＶのウイルスゲノムの間に重複がないことになり、複製コンピテントなｒｃＨＳＶウイルスを含まないｒＨＳＶストックの産生を可能にするであろう。そのようなｒｃＨＳＶフリーｒＨＳＶストックは、ｒＡＡＶの大規模産生に極めて有用となり得、次にｒＡＡＶは、治療用タンパク質（ペプチド、酵素、抗体など）、オリゴヌクレオチド（すなわち、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、ならびに遺伝子編集およびサイレンシングツール（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ、ＴＡＬＥＮ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ他）などの発現のために、遺伝子治療において使用され得る。
本明細書に記載された本発明の一般原理に従って、以下のセクションは、本発明の様々な側面のさらに詳細な説明を提供する。本発明の任意の態様は、本出願の異なるセクションに記載されているそれらの態様、および実施例、図面、または特許請求の範囲にのみ記載されているものを含む、本発明の任意の１つまたは複数の追加の態様と組み合わされ得ることが理解されるべきである。
２．組換え複製欠損ウイルス
１つの側面では、本明細書において記載される本発明は、ヘルペスウイルス目に由来する組換え複製欠損ウイルスであって、ウイルスが、ＩＣＰ２７をコードする遺伝子、またはその機能的等価遺伝子中の欠失によって特徴づけられ、前記欠失が少なくとも１，２００ｂｐ長であり、前記ＩＣＰ２７をコードする遺伝子（例えば、配列番号１１）、またはその機能的等価遺伝子の最も３’末端の３００ｂｐ、２５０ｂｐ、２００ｂｐ、１５０ｂｐ、１００ｂｐ、５０ｂｐ、３０ｂｐ、２０ｂｐ、１０ｂｐ、９ｂｐ、８ｂｐ、７ｂｐ、６ｂｐ、５ｂｐ、４ｂｐ、３ｂｐ、２ｂｐ、１ｂｐまたは０ｂｐ以下を残す、前記ウイルスを提供する。
ある特定の態様では、組換え複製欠損ウイルス（例えば、ＨＳＶ）は、ＨＳＶの臨床株／非実験室株ではない。
ある特定の態様では、組換え複製欠損ウイルス（例えば、ＨＳＶ）は、ＫＯＳ、ＫＯＳ１．１、ＫＯＳ１．１Ａ、ＫＯＳ６３、ＫＯＳ７９、ＭｃＫｒａｅ、Ｓｔａｉｎ １７、Ｆ１７、およびＭｃＩｎｔｙｒｅなどのＨＳＶの実験室株である。
本明細書で使用される場合、「臨床株」および「非実験室株」は本明細書で互換的に使用されて、ヒトまたは非ヒト動物から比較的最近単離された、または単離されたばかりのウイルス株を指す。実験室株と非実験室株との１つの主な違いは、実験室株が、培養または連続継代で長期間（例えば、場合によっては数年）維持されている点である（凍結後の貯蔵に費やされる時間を除く）。培養下で連続継代の多くの世代を経た実験室株は、培養での迅速な複製および増殖に有利に働く変異を蓄積している可能性があるが、実用化に有用な特定の特性、例えば軸索に沿って移動する能力の維持を喪失している可能性もある。
ある特定の態様では、本発明のウイルスベクター（例えば、ＨＳＶベクター）は、その宿主からその修飾されていない臨床前駆体株が単離されて以来、培養下で３年以上経ているウイルス株に由来する。培養下の時間は、凍結後の貯蔵時間を除く、培養に実際に費やされた時間である。
ある特定の態様では、本発明のウイルスベクター（例えば、ＨＳＶベクター）は、その宿主からその修飾されていない臨床前駆体株が単離されて以来、１，０００サイクルを超える連続継代を経ているウイルス株に由来する。
欠失のため、本発明の組換え複製欠損ウイルスは、宿主細胞によってトランスで提供されるＩＣＰ２７タンパク質または機能的等価物の非存在下で複製欠損である。
ヒトヘルペスウイルス１（ＨＨＶ－１）（ヒト単純ヘルペスウイルス１）中のＩＣＰ２７（感染細胞タンパク質 ２７）遺伝子は、５１２アミノ酸タンパク質（参照により本明細書に組み込まれるＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ３ＭＵ８８（Ｑ３ＭＵ８８＿ＨＨＶ１））をコードする。これは、ｍＲＮＡ輸送因子、前初期タンパク質ＩＥ６３、ＶＭＷ６３、およびＵＬ５４としても知られる。ＩＣＰ２７遺伝子の配列は、ＨＳＶ－１由来の天然のプロモーター配列を含む配列番号１１に示される。
対象組換え複製欠損ウイルスは、ＨＳＶ－１由来のＩＣＰ２７の機能的等価遺伝子を担持し得る、ヘルペスウイルス目の任意のウイルスに由来してもよい。ＩＣＰ２７遺伝子またはその機能的等価物の欠失は少なくとも１，２００ｂｐ長であり、前記ＩＣＰ２７をコードする遺伝子（例えば、配列番号１１）、またはその機能的等価遺伝子の最も３’末端の３００ｂｐ、２５０ｂｐ、２００ｂｐ、１５０ｂｐ、１００ｂｐ、５０ｂｐ、３０ｂｐ、２０ｂｐ、１０ｂｐ、９ｂｐ、８ｂｐ、７ｂｐ、６ｂｐ、５ｂｐ、４ｂｐ、３ｂｐ、２ｂｐ、１ｂｐまたは０ｂｐ（すなわち、何も残さない）以下を残す。
ヘルペスウイルス属は、１９７１年に国際ウイルス分類委員会（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｔａｘｏｎｏｍｙ ｏｆＶｉｒｕｓｅｓ（ＩＣＴＶ））の最初の報告書において確立された。この属は、２３種類のウイルスおよび４つのウイルス群からなった。１９７６年の第２回ＩＣＴＶ報告書において、この属は科レベル－ヘルペトウイルス科に格上げされた。爬虫類に由来するウイルスと混同する可能性があるため、この名前は１９７９年に第３回報告書においてヘルペスウイルス科に変更された。この報告書では、ヘルペスウイルス科は３つの亜科（アルファヘルペスウイルス亜科（Ａｌｐｈａｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｎａｅ）、ベータヘルペスウイルス亜科（Ｂｅｔａｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｎａｅ）およびガンマヘルペスウイルス亜科（Ｇａｍｍａｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｎａｅ））、および５つの無名の属に分類され、２１種類のウイルスがリストされた。２００９年には、ヘルペスウイルス科はヘルペスウイルス目に格上げされた。この格上げは、魚類および軟体動物のヘルペスウイルスが鳥類および哺乳動物のヘルペスウイルスとは遠縁にすぎなかったという発見に伴うものであった。２つの新たな科－硬骨魚およびカエルウイルスを組み入れるアロヘルペスウイルス科、ならびに軟体動物のヘルペスウイルスを含有するマラコヘルペスウイルス科が作られた。
様々な名称の科、亜科、属および種からのものを含む、ヘルペスウイルス目の既知のウイルス由来の機能的等価遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏ、ＥＭＢＬなどの公開または専用データベースから、ヒトＨＳＶ－１ ＩＣＰ２７ポリヌクレオチド配列（配列番号１１など）をクエリとして使用して容易に入手することができる。故に、これらの配列は本明細書に記載されないが、さもなければ参照により本明細書に組み込まれる。
ある特定の態様では、ＩＣＰ２７遺伝子またはその機能的等価遺伝子の最も３’末端は、それぞれのウイルスゲノムにおける次の遺伝子のすぐ５’側のヌクレオチド（例えば、ＩＣＰ２７遺伝子または等価物の３’側の「次の」遺伝子のプロモーターの第１のヌクレオチド）によって定義される。
ある特定の態様では、ＩＣＰ２７遺伝子またはその機能的等価遺伝子最も３’末端は、終止コドン自体を含むＩＣＰ２７またはその機能的等価遺伝子の終止コドンによって定義される。
ある特定の態様では、ＩＣＰ２７をコードする遺伝子は、配列番号１１のポリヌクレオチド配列を有する。
ある特定の態様では、欠失は、少なくとも１，３００ｂｐ、１，４００ｂｐ、１，５００ｂｐ、１，６００ｂｐ、１，７００ｂｐ、１，８００ｂｐ、１，９００ｂｐ、２，０００ｂｐ、２，１００ｂｐまたはそれ以上である。
ある特定の態様では、欠失は、ＩＣＰ２７をコードする遺伝子またはその機能的等価遺伝子のコード配列（またはＯＲＦ）全体を含む、から本質的になる、またはからなる。
ある特定の態様では、欠失は、ＩＣＰ２７をコードする遺伝子もしくはその機能的等価遺伝子のプロモーター領域全体、またはプロモーター領域の一部（例えば、最も３’側の約４００ヌクレオチド）をさらに含む。
ある特定の態様では、ウイルスは、アロヘルペスウイルス科またはマラコヘルペスウイルス科に由来する。
ある特定の態様では、ウイルスは、アルファヘルペスウイルス亜科、ベータヘルペスウイルス亜科、またはガンマヘルペスウイルス亜科などのヘルペスウイルス科に由来する。
ある特定の態様では、ウイルスは、ＨＨＶ－１（単純ヘルペスウイルス－１またはＨＳＶ－１）、ＨＨＶ－２（単純ヘルペスウイルス－２またはＨＳＶ－２）、ＨＨＶ－３（水痘帯状疱疹ウイルスまたはＶＺＶ）、ＨＨＶ－４（エプスタインバーウイルスまたはＥＢＶ）、ＨＨＶ－５（サイトメガロウイルスまたはＣＭＶ）、ＨＨＶ－６Ａ／ＨＨＶ－６Ｂ（ロゼオロウイルス、ヘルペスリンパ球向性ウイルス）、ＨＨＶ－７、またはＨＨＶ－８（カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスまたはＫＳＨＶ）に由来する。
ある特定の態様では、ウイルスは、オナガザルヘルペスウイルス－１（ＣｅＨＶ－１）またはネズミヘルペスウイルス６８（ＭＨＶ－６８またはＭｕＨＶ－４）に由来する。
ある特定の態様では、ウイルスは、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）を含むブタアルファ－ヘルペスウイルスに由来する。
ある特定の態様では、ウイルスは、クモザルヘルペスウイルス１、クモザルヘルペスウイルス、ブタヘルペスウイルス、ウシヘルペスウイルス２、オナガザルヘルペスウイルス１（ヘルペスＢウイルス）、オオコウモリアルファヘルペスウイルス１、ウサギヘルペスウイルス４、マカクヘルペスウイルス１、カンガルーヘルペスウイルス２、およびヒヒヘルペスウイルス２などのシンプレックスウイルス属に由来する。
ある特定の態様では、ウイルスは、ウシヘルペスウイルス１、ウシヘルペスウイルス５、スイギュウヘルペスウイルス１、ヤギヘルペスウイルス１、イヌヘルペスウイルス１、オナガザルヘルペスウイルス９、シカヘルペスウイルス１、シカヘルペスウイルス２、ヘラジカヘルペスウイルス１、ウマヘルペスウイルス１、ウマヘルペスウイルス３、ウマヘルペスウイルス４、ウマヘルペスウイルス８、ウマヘルペスウイルス９、ネコヘルペスウイルス１、およびブタヘルペスウイルス１などのバリセロウイルス属に由来する。
ある特定の態様では、ウイルスは、カモヘルペスウイルス１、ハトヘルペスウイルス１、トリヘルペスウイルス２、トリヘルペスウイルス３（ＧａＨＶ－３またはＭＤＶ－２）、シチメンチョウヘルペスウイルス１（ＨＶＴ）、およびクジャクヘルペスウイルス１などのマルディウイルス属に由来する。
ある特定の態様では、ウイルスは、トリヘルペスウイルス１、およびオウムヘルペスウイルス１などのイルトウイルス（Ｌｉｔｏｖｉｒｕｓ）属に由来する。
ある特定の態様では、ウイルスは、アカウミガメヘルペスウイルス（Ｃａｒｅｔｔａ ｃａｒｅｔｔａ ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ）、ウミガメヘルペスウイルス１、ウミガメヘルペスウイルス２、ウミガメヘルペスウイルス３、ウミガメヘルペスウイルス４、アオウミガメヘルペスウイルス、クーバーヘルペスウイルス、ヌマガメヘルペスウイルス１、ヌマガメヘルペスウイルス２、線維乳頭腫関連ヘルペスウイルス、カタトカゲヘルペスウイルス１、カタトカゲヘルペスウイルス２、カタトカゲヘルペスウイルス３、モリイシガメヘルペスウイルス１、モリイシガメヘルペスウイルス２、イグアナヘルペスウイルス１、イグアナヘルペスウイルス２、アカウミガメ口腔皮膚ヘルペスウイルス、肺－眼－気管関連ヘルペスウイルス、ヨコクビガメヘルペスウイルス１、ミシシッピアカミミガメヘルペスウイルス、アメリカハコガメヘルペスウイルス１、アメリカハコガメヘルペスウイルス２、リクガメヘルペスウイルス１、リクガメヘルペスウイルス２、リクガメヘルペスウイルス３、リクガメヘルペスウイルス４、およびオオトカゲヘルペスウイルス１などの爬虫類アルファヘルペスウイルスに由来する。
ある特定の態様では、ウイルスは、アルセラフィンヘルペスウイルス１、アルセラフィンヘルペスウイルス２、クモザルヘルペスウイルス２、ウシヘルペスウイルス４、オナガザルヘルペスウイルス１７、ウマヘルペスウイルス２、ウマヘルペスウイルス５、ウマヘルペスウイルス７、ニホンザルラディノウイルス、ウサギヘルペスウイルス１、およびネズミヘルペスウイルス４（マウスガンマヘルペスウイルス－６８またはＭＨＶ－６８）などのラディノウイルス属に由来する。
ある特定の態様では、ウイルスは、ＫＯＳ、ＫＯＳ１．１、ＫＯＳ１．１Ａ、ＫＯＳ６３、ＫＯＳ７９、ＭｃＫｒａｅ、Ｓｔａｉｎ １７、Ｆ１７、ＭｃＩｎｔｙｒｅなどのＨＳＶ－１の株である。
ある特定の態様では、その機能的等価遺伝子は、ＫＳＨＶのＯＲＦ５７、ＥＢＶのＭｔａ／ＳＭ／ＥＢ２、ヒトＣＭＶのＵＬ６９、またはヘルペスウイルス目からの任意のウイルス中の他の等価遺伝子である。
ある特定の態様では、ウイルスは、ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質のコード配列、ならびに／またはＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接する目的の遺伝子（ＧＯＩ）をさらに含む。
ある特定の態様では、ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質のコード配列、ならびに／またはＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接する目的の遺伝子（ＧＯＩ）は、ウイルスの非必須遺伝子（例えば、ウイルス複製に必要とされず、ウイルスパッケージングに必要とされない）に組み込まれる、またはウイルスの非必須遺伝子を置換する。例示的なそのような非必須遺伝子にはＴＫ遺伝子が挙げられ、非必須遺伝子はウイルスゲノムの他の約５０％の大部分を含む。
本発明の別の側面は、本発明の組換え複製欠損ウイルスを増殖／増幅／産生する方法であって、相補的／機能性ＩＣＰ２７遺伝子またはその機能的等価物を発現する対象宿主細胞（下記参照）を、対象組換え複製欠損ウイルスに感染させるステップを含む前記方法を提供する。
ある特定の態様では、方法は、感染宿主細胞から組換え複製欠損ウイルスを回収するステップをさらに含む。
ある特定の態様では、対象組換え複製欠損ウイルスと、宿主細胞ゲノムに組み込まれ得るＩＣＰ２７またはその機能的等価物のコード配列の間に、３００ｂｐ、２５０ｂｐ、２００ｂｐ、１５０ｂｐ、１００ｂｐ、５０ｂｐ、３０ｂｐ、２０ｂｐ、１０ｂｐ、９ｂｐ、８ｂｐ、７ｂｐ、６ｂｐ、５ｂｐ、４ｂｐ、３ｂｐ、または２ｂｐ以下の配列重複がある。
ヘルペスウイルス目に由来する対象組換え複製欠損ウイルスは、相同組換えなどの従来の分子生物学手法を使用して製造または構築することができる。例えば、ＨＳＶの野生型株由来の天然ＩＣＰ２７遺伝子またはコード配列（またはヘルペスウイルス目のウイルス由来の機能的等価遺伝子）を欠失させるために、野生型ウイルスのゲノムが、細菌人工染色体（ＢＡＣ）または酵母人工染色体（ＹＡＣ）などの適切なベクターに挿入されてもよい。相同組換えが、次いで、大腸菌、酵母、昆虫細胞（例えば、ＳＦ９）、または哺乳動物細胞などの適切な宿主細胞で実行されて、標的遺伝子（すなわち、ＩＣＰ２７遺伝子またはその機能的等価物）を欠失させてもよい。これは、例えば、標的遺伝子（すなわち、ＩＣＰ２７またはその機能的等価物）と隣接する相同領域を担持する線状化プラスミドを同じ宿主細胞に導入することによって行うことができる。
適切な哺乳動物宿主細胞には、Ｖｅｒｏ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ヒト肺線維芽細胞ＭＲＣ－５、ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）、ヒト胚性肺線維芽細胞（ＨＥＬＦ）、メイディン－ダービーイヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、メイディン－ダービーウシ腎臓細胞（ＭＤＢＫ）、または任意の他の適切な哺乳動物細胞が挙げられる。
故に、本発明の別の側面は、ウイルスがＩＣＰ２７をコードする遺伝子、またはその機能的等価遺伝子中の欠失によって特徴づけられ、欠失が少なくとも１，２００ｂｐ長であり、ＩＣＰ２７をコードする遺伝子（例えば、配列番号１１）、またはその機能的等価物の最も３’末端の３００ｂｐ、２５０ｂｐ、２００ｂｐ、１５０ｂｐ、１００ｂｐ、５０ｂｐ、３０ｂｐ、２０ｂｐ、１０ｂｐ、９ｂｐ、８ｂｐ、７ｂｐ、６ｂｐ、５ｂｐ、４ｂｐ、３ｂｐ、２ｂｐ、１ｂｐまたは０ｂｐ以下を残す、ヘルペスウイルス目に由来する組換え複製欠損ウイルスを製造する方法であって、ＩＣＰ２７をコードする遺伝子またはその機能的等価物の欠失を、適切な宿主細胞での相同組換えによって作成するステップを含む前記方法を提供する。
ある特定の態様では、相同組換えは、ＩＣＰ２７をコードする遺伝子またはその機能的等価物を有する、ヘルペスウイルス目に由来するウイルスのゲノム（例えば、ＨＳＶゲノム）を含む細菌人工染色体（ＢＡＣ）を使用して実行される。
ある特定の態様では、対象ｒＨＳＶ ＤＮＡの増幅のための細胞は、大きな細胞タイプ群、例えば大腸菌、または真核細胞、例えば酵母、昆虫細胞（例えば、ＳＦ９）、もしくは哺乳動物細胞から選択することができる。ｒＨＳＶウイルスの増殖は、哺乳動物細胞、例えば、Ｖｅｒｏ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ヒト肺線維芽細胞ＭＲＣ－５、ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）、ヒト胚性肺線維芽細胞（ＨＥＬＦ）、メイディン－ダービーイヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、メイディン－ダービーウシ腎臓細胞（ＭＤＢＫ）などで行うことができる。
３．ｒＡＡＶ中の目的の遺伝子（ＧＯＩ）および処置可能な疾患
本発明の組換え複製欠損ウイルス、例えば本発明のｒＨＳＶベクターは、目的の遺伝子（ＧＯＩ）を担持する組換えＡＡＶベクターの大規模産生に使用することができる。ＧＯＩは、ＡＡＶのパッケージング能力、例えば、約４～５ｋｂ、またはＩＴＲ配列を含む約４．７ｋｂ、またはＩＴＲ配列を占めない約４．４ｋｂ内の任意の遺伝子またはコード配列であってもよい。
ある特定の態様では、ＧＯＩを担持するｒＡＡＶは、宿主の内因性遺伝子の機能の欠如、例えばＧＯＩの欠損バージョンに起因する疾患または状態を処置するために遺伝子治療において使用することができる。
本明細書で使用される場合、「目的の遺伝子」またはＧＯＩは、一般に核酸またはポリヌクレオチド配列、例えば遺伝子、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、またはタンパク質もしくはｓｉＲＮＡなどのＲＮＡのコード配列を指す。しかし、ある特定の状況または文脈では、用語ＧＯＩは、タンパク質（ＧＯＩによってコードされた）、またはＧＯＩによって治療され得る疾患もしくは徴候、またはＧＯＩの機能の喪失に起因し得る（ただし、必ずしもではない）疾患もしくは徴候も大まかに指す。
例えば、遺伝子ＧＡＬＧＴ２は、複雑な糖分子を、ジストログリカンを含むいくつかの特定のタンパク質に移動させる酵素である、タンパク質ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ（β－１，４－Ｎ－アセチルガラクトサミンガラクトシルトランスフェラーゼ）をコードする。通常の状況下では、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼは神経筋接合部（ＮＭＪ）でのみ見出される。ＮＭＪでは、ジストログリカン結合タンパク質複合体のいくつかの成分が筋肉内の他の場所とは異なる。重要なことには、ＮＭＪにはジストロフィンの代わりにユートロフィンが存在する。筋ジストロフィーのｍｄｘマウスモデルにおいて、ＧＡＬＧＴ２のウイルス遺伝子導入は、ＮＭＪの通常の発現ドメインだけではなく筋肉膜全体にわたるＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼの発現、および筋線維全体にわたるユートロフィンの上方制御をもたらす。ｍｄｘマウスにおいて、この発現は、マイクロジストロフィン遺伝子発現と同程度に筋肉の機能欠損を是正することができる。さらに、ＧＡＬＧＴ２の過剰発現は、ＬＧＭＤ２Ａおよび先天性筋ジストロフィー（ＭＤＣ１Ａ）を含む他の筋ジストロフィーのマウスモデルにおいて筋病理を是正する。故に、処置を必要する患者においてＧＡＬＧＴ２それ自体は必ずしも欠損していないとしても、ＧＡＬＧＴ２はＤＭＤ、ＢＭＤ、ＬＧＭＤ２ＡおよびＭＤＣ１Ａなどの筋ジストロフィーを処置するためのＧＯＩである。
別の例では、サルコリピン（ＳＬＮ）は、サルコ／小胞体（ＳＲ）Ｃａ２＋ ＡＴＰａｓｅ（ＳＥＲＣＡ）を阻害し、ＤＭＤ患者およびＤＭＤのｍｄｘマウスモデルなどの動物モデルの筋肉中で異常に上昇する。ＡＡＶ９媒介ＲＮＡ干渉によるＳＬＮレベルの低下は、ＤＭＤの重度のジストロフィン／ユートロフィン二重変異体（ｍｄｘ：ｕｔｒ－／－）マウスモデルにおいて、筋病理の減弱、ならびに横隔膜、骨格筋および心機能の改善を含むジストロフィーの病理を改善する。故にＳＬＮ ＲＮＡｉのコード配列は、ＤＭＤを治療するＧＯＩである。
故にＧＯＩは、発現されると、変異した、損傷したもしくは不活性な遺伝子またはタンパク質を置換する遺伝子（またはタンパク質）となり得る。ＧＯＩは、発現されると、疾患、障害、または機能不全における治療の修正を必要とする、すでに機能しているプロセスを助ける遺伝子（またはタンパク質）となり得る。ＧＯＩは、発現されると、疾患、障害、または機能不全における治療の修正を必要とする、機能しないプロセスを助ける遺伝子（またはタンパク質）となり得る。ＧＯＩ核酸配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または合成核酸分子であってもよい。ＧＯＩは、タンパク質、酵素、構造タンパク質、機能性タンパク質、または細胞機能に基づき適応可能なタンパク質であってもよい。ＧＯＩは、疾患、障害、または機能不全に治療的有用性または治療法をもたらすことができる。
ある特定の態様では、ＧＯＩは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９、Ｃａｓ １３、ＴＡＬＥＮ、またはそれらの意図された活性のために細胞内送達に必要とされる他の遺伝子ベースの遺伝子編集タンパク質であってもよい。
いかなるＧＯＩも本明細書で使用される場合、発現および活性の増強のために公知のコンピュータベースのアルゴリズムによるコドン最適化を必要とし得る。
故に、対象ウイルスベクター（例えば、ｒＨＳＶベクター）および補完細胞（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｃｅｌｌ）（ＩＣＰ２７遺伝子産物をトランスで供給する）を使用して産生される得るｒＡＡＶは、例えば、疾患または状態を処置する遺伝子治療に有用な目的の遺伝子（ＧＯＩ）をコードしてもよい。代表的な（非限定的な）目的の遺伝子（ＧＯＩ）には、ＬＧＭＤ２Ｅ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｅ型）、ＬＧＭＤ２Ｄ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｄ型）、ＬＧＭＤ２Ｃ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｃ型）、ＬＧＭＤ２Ｂ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ型）、ＬＧＭＤ２Ｌ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｌ型）、ＬＧＭＤ２Ｉ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｉ型）の原因／欠損遺伝子、またはＮＡＧＬＵ（α－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ、サンフィリポ症候群またはムコ多糖症ＩＩＩＢ型（ＭＰＳ ＩＩＩＢ）に関する）、スルファミダーゼもしくはＳＧＳＨ（ムコ多糖症ＩＩＩＡ型またはＭＰＳ ＩＩＩＡに関する）、第ＩＸ因子、第ＶＩＩＩ因子、ミオチューブラリン１（ＭＴＭ１）、生存運動ニューロン（ＳＭＮ、脊髄性筋萎縮症またはＳＭＡに関する）、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼＧＡＬＧＴ２、カルパイン－３（ＣＡＰＮ－３）、酸性アルファグルコシダーゼ（ＧＡＡ、ポンペ病に関する）、アルファ－ガラクトシダーゼＡもしくはＧＬＡ（ファブリー病に関する）、グルコセレブロシダーゼ、ジストロフィンもしくはマイクロジストロフィンの遺伝子もしくはコード配列が挙げられ得る。
ある特定の態様では、ＧＯＩはマイクロジストロフィン遺伝子である。
ある特定の態様では、マイクロジストロフィン遺伝子は、以下の特許に記載されているいずれか１つである：ＵＳ７，９０６，１１１；ＵＳ７，００１，７６１；ＵＳ７，５１０，８６７；ＵＳ６，８６９，７７７；ＵＳ８，５０１，９２０；ＵＳ７，８９２，８２４；ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１３７３３；ＵＳ１０，１６６，２７２（全て参照により本明細書に組み込まれる）。ある特定の態様では、マイクロジストロフィン遺伝子は、ｒＡＡＶビリオン、例えば、わずか約４．７ｋｂのサイズにパッケージングされることができる。
ある特定の態様では、マイクロジストロフィン遺伝子は、そのコード配列内に、一酸化窒素シンターゼ（ｎＮＯＳ）活性を筋鞘に取り戻すことができるスペクトリン様リピートＲ１６およびＲ１７を含有する（ＵＳ７，８９２，８２４に記載されているものなど）。
ある特定の態様では、マイクロジストロフィン遺伝子は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１３７３３（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているものなど、完全長ジストロフィンタンパク質のＲ１、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ２３、およびＲ２４スペクトリン様リピート（すなわち、それぞれＳＲ１、ＳＲ１６、ＳＲ１７、ＳＲ２３、およびＳＲ２４）のコード配列を含む。ある特定の態様では、マイクロジストロフィン遺伝子は、ＳＲ１、ＳＲ１６、ＳＲ１７、ＳＲ２３、およびＳＲ２４以外の完全長ジストロフィンタンパク質のいかなる他のスペクトリンリピートもコードしない。
ｒＨＳＶベースの系によって産生されるｒＡＡＶから恩恵を受ける可能性がある疾患または状態には、ハンチントン病、Ｘ連鎖性ミオチュブラーミオパチー（ＸＬＭＴＭ）、酸マルターゼ欠損症（例えば、ポンペ病）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、重症筋無力症（ＭＧ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、フリードライヒ運動失調症、ミトコンドリア筋症、筋ジストロフィー（デュシェンヌ型筋ジストロフィー、筋緊張性ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨ）、先天性筋ジストロフィー（ＣＤＭ）、眼咽頭型筋ジストロフィー（ＯＰＭＤ）、遠位型筋ジストロフィー、エメリー－ドレイフス型筋ジストロフィー（ＥＤＭＤ）、ムコ多糖症（ＭＰＳ）、異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）、バッテン病、レット症候群、クラッベ病、カナバン病、Ｘ連鎖性網膜分離症、色覚異常（ＣＮＧＢ３およびＣＮＧＡ３）、Ｘ連鎖性網膜色素変性症、加齢性黄斑変性症、血管新生黄斑変性症、ポンペ病、ファブリー病、ＭＰＳ Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩＡ、ＩＩＩＢ、ゴーシェ病、ダノン病、Ａ１Ａｔ欠損症、フリードライヒ運動失調症、ウィルソン病、バッテン病（ＣＬＮ１、ＣＬＮ３、ＣＬＮ６、ＣＬＮ８）、ウォルマン病、テイ－サックス病、ニーマン－ピック病Ｃ型（Ｎｉｅｍａｎｎ－Ｌｉｃｋタイプ Ｃ）、ＣＤＫＬ５欠乏症、Ｂサラセミア、鎌状赤血球症が挙げられる。
ある特定の態様では、ｒＨＳＶベースの系によって産生されるｒＡＡＶから恩恵を受ける可能性がある疾患または状態には、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、先天性筋ジストロフィー（ＣＭＤ）、ベスレム型ＣＭＤ、福山型ＣＭＤ、筋眼脳病（ＭＥＢｓ）、脊椎硬直症候群、ウルリッヒ型ＣＭＤ、ウォーカー－ワールブルク症候群（ＷＷＳ）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、エメリー－ドレイフス型筋ジストロフィー（ＥＤＭＤ）、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）、肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）、筋緊張性ジストロフィー（ＤＭ）、眼咽頭型筋ジストロフィー（ＯＰＭＤ）、ＡＬＳ（筋萎縮性側索硬化症）を含む運動ニューロン疾患、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）が挙げられ得る。
ある特定の態様では、ｒＨＳＶベースの系によって産生されるｒＡＡＶから恩恵を受ける可能性がある疾患または状態には、典型的には筋力低下、筋緊張の消失、または一時的な筋麻痺を特徴とするイオンチャネル病が挙げられ得る。それらには、アンダーセン症候群、高カリウム性周期性四肢麻痺、低カリウム性周期性四肢麻痺、先天性筋緊張、ベッカー筋緊張、トムセン筋緊張、先天性パラミオトニー、カリウム惹起性ミオトニーが挙げられる。
ある特定の態様では、ｒＨＳＶベースの系によって産生されるｒＡＡＶから恩恵を受ける可能性がある疾患または状態には、細胞のエネルギーを生み出す構造が機能障害の場合に生じるミトコンドリア病が挙げられ得る。そのような疾患には、フリードライヒ運動失調症（ＦＡ）、ミトコンドリア筋症、カーンズ－セイヤー症候群（ＫＳＳ）、リー症候群（亜急性壊死性脳筋症（ｓｕｂａｃｕｔｅ ｎｅｃｒｏｔｉｚｉｎｇ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｐａｔｈｙ））、ミトコンドリアＤＮＡ枯渇症候群、ミトコンドリア脳筋症、乳酸アシドーシスおよび脳卒中様発作（ＭＥＬＡＳ）、ミトコンドリア神経胃腸脳筋症（ＭＮＧＩＥ）、赤色ぼろ線維を伴うミオクローヌス（ＭＥＲＲＦ）、ニューロパチー、運動失調および網膜色素変性症（ＮＡＲＰ）、ピアソン症候群、進行性外眼筋麻痺（ＰＥＯ）が挙げられる。
ある特定の態様では、ｒＨＳＶベースの系によって産生されるｒＡＡＶから恩恵を受ける可能性がある疾患または状態には、筋線維が正常に機能せず、筋力低下をもたらす筋肉の疾患であるミオパチーが挙げられ得る。ミオパチーには、キャップミオパチー、中心核ミオパチー、先天性筋線維不均等症、コアミオパチー、セントラルコア病、マルチミニコアミオパチー、ミオシンストレージミオパチー（Ｍｙｏｓｉｎ ｓｔｏｒａｇｅ ｍｙｏｐａｔｈｙ）、筋細管ミオパチー、ネマリンミオパチー、遠位型ミオパチー、ＧＮＥミオパチー／野中ミオパチー／遺伝性封入体ミオパチー（ＨＩＢＭ）、レイン遠位型ミオパチー（Ｌａｉｎｇ ｄｉｓｔａｌ ｍｙｏｐａｔｈｙ）、マルケスベルグ－グリッグス遅発性遠位型ミオパチー（Ｍａｒｋｅｓｂｅｒｇ－Ｇｒｉｇｇｓ ｌａｔｅ－ｏｎｓｅｔ ｄｉｓｔａｌ ｍｙｏｐａｔｈｙ）、三好型ミオパチー、Ｕｄｄ型ミオパチー／脛骨筋ジストロフィー、声帯および咽頭遠位型ミオパチー、ウェランダー遠位型ミオパチー（Ｗｅｌａｎｄｅｒ ｄｉｓｔａｌ ｍｙｏｐａｔｈｙ）、内分泌性ミオパチー、甲状腺機能亢進性ミオパチー、甲状腺機能低下性ミオパチー、炎症性ミオパチー、皮膚筋炎、封入体筋炎、多発性筋炎、代謝性ミオパチー、酸マルターゼ欠損症（ＡＭＤ、ポンペ病）、カルニチン欠損症、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ欠損症、脱分枝酵素欠損症（コーリ病、フォーブス病）、乳酸脱水素酵素欠損症、ミオアデニル酸デアミナーゼ欠損症、ホスホフルクトキナーゼ欠損症（垂井病）、ホスホグリセリン酸キナーゼ欠損症、ホスホグリセリン酸ムターゼ欠損症、ホスホリラーゼ欠損症（マッカードル病）、筋原線維ミオパチー（ＭＦＭ）、肩甲腓骨ミオパチーが挙げられる。
ある特定の態様では、ｒＨＳＶベースの系によって産生されるｒＡＡＶから恩恵を受ける可能性がある疾患または状態には、筋肉と神経の間のシグナル伝達に関与する１つまたは複数の重要なタンパク質の破壊、機能障害または欠如から生じる神経筋接合部疾患が挙げられ得る。そのような疾患には、先天性筋無力症候群（ＣＭＳ）、ランバート－イートン筋無力症症候群（ＬＥＭＳ）、重症筋無力症（ＭＧ）が挙げられる。
ある特定の態様では、ｒＨＳＶベースの系によって産生されるｒＡＡＶから恩恵を受ける可能性がある疾患または状態には、脳および脊髄を身体の残りの部分につなげる運動神経および感覚神経が冒され、感覚、運動または他の機能が損なわれる末梢神経疾患が挙げられ得る。そのような疾患には、シャルコー－マリー－トゥース病（ＣＭＴ）、巨大軸索ニューロパチー（ＧＡＮ）、悪液質および加齢における筋消耗が挙げられる。
４．相補的組換えベクター
本発明のウイルスベクター、例えば本発明の組換えＨＳＶベクターは、対象ウイルスベクターから欠失されたＩＣＰ２７機能を提供する適切な宿主細胞で増殖され得る。そのようなＩＣＰ２７機能は、ＩＣＰ２７をコードする対象相補的組換えベクター（または略して「組換えベクター」）によって提供することができる。本発明の相補的組換えベクターは、宿主細胞のゲノムに組み込まれ得る。ＩＣＰ２７コード配列は、ＩＣＰ２７遺伝子が由来するヘルペスウイルスゲノム中の天然のプロモーターから転写され得る。
故に、本発明の別の側面は、ＩＣＰ２７またはその機能的等価物を宿主細胞で発現させることができる（相補的）組換えベクターであって、（１）宿主細胞においてコード配列の転写を指示することができるプロモーターに作動可能に連結された、ＩＣＰ２７またはその機能的等価物のコード配列と；（２）コード配列の３’側のポリアデニル化部位と；（３）場合により、１つまたは複数のマルチクローニング部位とを含み；対象組換え複製欠損ウイルス（例えば、ｒＨＳＶ）のいずれかの３００ｂｐ、２５０ｂｐ、２００ｂｐ、１５０ｂｐ、１００ｂｐ、５０ｂｐ、３０ｂｐ、２０ｂｐ、１０ｂｐ、９ｂｐ、８ｂｐ、７ｂｐ、または６ｂｐ以下の連続ヌクレオチドを含有する前記ベクターを提供する。
トランスで提供されるＩＣＰ２７タンパク質は、野生型ＩＣＰ２７ほど１００％活性である必要はないため、ある特定の態様では、ＩＣＰ２７は、配列番号１０のアミノ酸配列を有する、または配列番号１０と少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．２％、９９．４％、９９．６％、または９９．８％同一である。
同様に、ＩＣＰ２７コード配列のプロモーターは、ＩＣＰ２７が由来するウイルス中の天然のプロモーターである必要はないが、いくつかの態様では、プロモーターは天然のプロモーターである。
ある特定の態様では、プロモーターは、少なくとも約４００ポリヌクレオチド、４５０ポリヌクレオチド、５００ポリヌクレオチド、または約５５０ポリヌクレオチドを含む。
ある特定の態様では、プロモーターは、配列番号１１のヌクレオチド１～５３８、または配列番号１１のヌクレオチド１２７～５３８、またはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＴ８８７２２４のヌクレオチド１１３，１３９～１１３，５５０、またはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＴ８８７２２４のヌクレオチド１１３，０１３～１１３，５５０（配列全体が参照により本明細書に組み込まれる）を含む。
ある特定の態様では、本発明の相補的組換えベクター上のＩＣＰ２７コード配列と、対象ウイルスベクター由来の欠失ＩＣＰ２７コード配列の間に配列の重複はない。
ある特定の態様では、宿主細胞における相補的ＤＮＡとしてのＩＣＰ２７コード配列（ＩＣＰ２７コード配列を欠く対象ウイルス（例えば、ｒＨＳＶ）ベクターの増殖に有用な）は、真核生物または哺乳動物細胞株、例えばＢＨＫ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、またはＨＥＫ２９３細胞での翻訳のために部分的または完全にコドン最適化される。例えば、ある特定の態様では、コード配列の最も３’側の３００～３５０ヌクレオチドが、哺乳動物宿主細胞での発現のためにコドン最適化される。
ある特定の態様では、ポリアデニル化部位は、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化部位である。
ある特定の態様では、ポリアデニル化部位またはポリ（Ａ）シグナル配列は、他の適切な供給源、例えば、合成配列または他の真核生物の遺伝子もしくはウイルス由来の配列由来である。
ある特定の態様では、本発明の相補的組換えベクター上のＩＣＰ２７コード配列と、欠失ＩＣＰ２７コード配列／ＯＲＦがない対象組換え複製欠損ウイルスベクターの間のいかなる最小のまたは残存する重複も、２つの間の相同組換えを可能にするまたは支持するほど有意ではない。例えば、対象ウイルスベクターとＩＣＰ２７コード配列（プラス任意の天然のプロモーター配列）の間のいかなる配列の重複も相同組換えをもたらすには不十分であるように、（あるとしても）最小残留ＩＣＰ２７コード配列および／またはプロモーター配列が対象ウイルスベクター上にある。
ある特定の態様では、宿主細胞における相補的ＤＮＡとしてのＩＣＰ２７コード配列（ＩＣＰ２７コード配列を欠く対象（例えば、ｒＨＳＶ）ベクターの増殖に有用な）は、宿主プレｍＲＮＡスプライシングを阻害するＩＣＰ２７タンパク質の能力を低減する一方で、後期遺伝子発現の促進を依然として可能にする変異を含む。そのようなＩＣＰ２７変異は、少なくとも一部にはＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質の発現増加により、より大きな感染性ｒＡＡＶ収量をもたらす可能性がある。
例示的なそのような変異には、Ｓｏｌｉｍａｎら（Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７１：９１８８～９１９７頁、１９９７、参照により本明細書に組み込まれる）によって記載されているｖＢＳ３．３、ｖＢＳ４．３、およびｖＢＳ５．３変異が挙げられる。具体的には、Ｓｏｌｉｍａｎは、遺伝子内サプレッサーの遺伝学的スクリーニングにおいて３９．５℃の制限温度でＩＣＰ２７活性を喪失する、温度感受性ＩＣＰ２７アレル－ＬＧ４の使用を記載した。３つのそのような遺伝子内サプレッサー、すなわちｖＢＳ３．３、ｖＢＳ４．３、およびｖＢＳ５．３が同定された。ＬＧ４アレルは、野生型ＩＣＰ２７においてカルボキシ末端ジンクフィンガーのちょうどＮ末端に単一のＲ４８０Ｈ点変異を有する。ｖＢＳ３．３、ｖＢＳ４．３、およびｖＢＳ５．３遺伝子内サプレッサーアレルは、全て元のＲ４８０Ｈ点変異を保持していたが、それぞれ１つの追加の点変異のＶ４９６Ｉ、Ｓ３３４Ｌ、およびＶ４８７Ｉも含有する。故に、ｖＢＳ３．３は、Ｒ４８０ＨおよびＶ４９６Ｉの二重点変異である。ｖＢＳ４．３は、Ｒ４８０ＨおよびＳ３３４Ｌの二重点変異である。ｖＢＳ５．３は、Ｒ４８０ＨおよびＶ４８７Ｉの二重点変異である。
５．宿主細胞
多くの異なるタイプの真核生物宿主細胞は、そのような真核生物宿主細胞が、対象組換え複製欠損ウイルスベクターから欠失されたＩＣＰ２７を発現するように改変されることを条件に、対象組換え複製欠損ウイルスベクターを増殖させるのに使用され得る。
ある特定の態様では、対象宿主細胞は対象相補的組換えベクターを含み、対象ウイルスベクターの複製およびパッケージングを促進するようにＩＣＰ２７を発現させることができる。
ある特定の態様では、組換えベクターは宿主細胞ゲノムに安定に組み込まれる。
ある特定の態様では、宿主細胞は、ヒト、サル、ウシ、ブタ、ウマおよび他のウマ類、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、マウス、ラット、ウサギ、ミンク、オポッサム、ラクダおよび他のラクダ科動物、ニワトリおよび他の鳥類、アルマジロ、カエル、もしくは爬虫類などの脊椎動物に由来し、または昆虫細胞に由来する。ヒト細胞には、ＢＨＫ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＨＥＫ２９３細胞等が挙げられる。
ある特定の態様では、宿主細胞は、Ｌ－Ｇｌｎ、５～１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、および１％ペニシリン－ストレプトマイシンを補充されたＤＭＥＭなどの標準的な組織培養培地を使用して増殖され得るＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎臓）である。接着性ＨＥＫ２９３細胞の増殖に関して、動物由来成分による汚染を制限するために、ｒＡＡＶ生産中、ＦＢＳのパーセンテージは低減され得る。
ある特定の態様では、宿主細胞はＶｅｒｏ細胞である。そのような細胞は、組織培養プレート、皿、フラスコ、ボトル、および接着性Ｖｅｒｏ細胞を懸濁液様の状態で増殖できるようにするマイクロキャリアを含む固体支持体で増殖することができる。
ある特定の態様では、宿主細胞は、ＢＨＫ２１などのＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓細胞）細胞である。ある特定の態様では、ＢＨＫ細胞は、無血清懸濁液で増殖するように適合される。
ある特定の態様では、宿主細胞はＨＥＫ２９３細胞である。ある特定の態様では、ＨＥＫ２９３細胞は、無血清培地（Ｆ１７またはＥｘｐｉ２９３培地など）および懸濁液での増殖のために適合される。故にバイオリアクターでの大規模増殖に適している。例えば、Ｇｒｉｅｇｅｒら（Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ． ２４：２８７～２９７頁、２０１６、参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
ある特定の態様では、ＨＥＫ２９３細胞は、ＳＶ４０ Ｔ抗原（温度感受性アレルｔｓＡ１６０９）およびネオマイシン／ジェネティシン耐性遺伝子を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞である。
ある特定の態様では、対象ｒＨＳＶ ＤＮＡの増幅のための細胞は、大きな細胞タイプ群、例えば大腸菌、または真核細胞、例えば酵母、昆虫細胞（例えば、ＳＦ９）、もしくは哺乳動物細胞から選択することができる。ｒＨＳＶウイルスの増殖は、哺乳動物細胞、例えば、Ｖｅｒｏ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ヒト肺線維芽細胞ＭＲＣ－５、ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）、ヒト胚性肺線維芽細胞（ＨＥＬＦ）、メイディン－ダービーイヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、メイディン－ダービーウシ腎臓細胞（ＭＤＢＫ）などで行うことができる。
ある特定の態様では、そのようにして増殖されたウイルスベクターのストックは、複製コンピテントなウイルスベクターが存在しないことを確実にするためにチェックされ得る。例えば、実施例１で使用されるアッセイが、ｒＨＳＶの力価、およびｒｃＨＳＶの存在または非存在を決定するのに使用され得る。
ある特定の態様では、本発明のウイルスベクターは、遺伝子治療で使用することができる目的の遺伝子（ＧＯＩ）をコードする組換えＡＡＶベクターの産生において使用するために適合され得る。以下の「組換えＡＡＶ産生」と題されたセクションを参照のこと。そのような態様では、１つまたは複数のｒＡＡＶ産生細胞株は、ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質をコードするｒＨＳＶベクター、ならびに場合によりＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接するＧＯＩをコードするｒＨＳＶベクターなどの対象ウイルスベクターによって感染され得る。
ある特定の態様では、ｒＡＡＶ産生のためのそのようなプロデューサー細胞株は、ＡＡＶのｒｅｐ－ｃａｐ遺伝子の両方、および薬物選択マーカーと一緒にｒＡＡＶベクターゲノム（ＧＯＩを含む）を含有するプラスミドをトランスフェクトされたＨｅＬａまたはＡ５４９由来細胞株である。
ある特定の態様では、ｒＡＡＶ産生のためのそのようなプロデューサー細胞株は、Ｖｅｒｏ細胞である。
ある特定の態様では、ｒＡＡＶ産生のためのそのようなプロデューサー細胞株は、ＢＨＫ細胞である。
ある特定の態様では、ｒＡＡＶ産生のためのそのようなプロデューサー細胞株は、ＨＥＫ２９３細胞である。
ある特定の態様では、ｒＡＡＶ産生のためのそのようなプロデューサー細胞株は、ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接するＧＯＩをコードするｒＡＡＶプロウイルスを含み、ｒＡＡＶプロウイルスは、ｒＡＡＶ産生のためのプロデューサー細胞株のゲノムに組み込まれる。ＧＯＩは、ＵＳ７，９０６，１１１；ＵＳ７，００１，７６１；ＵＳ７，５１０，８６７；ＵＳ６，８６９，７７７；ＵＳ８，５０１，９２０；ＵＳ７，８９２，８２４；もしくはＵＳ１０，１６６，２７２、またはＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１３７３３（全て参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているジストロフィンミニ遺伝子またはマイクロジストロフィン遺伝子などの、遺伝子治療に有用な本明細書において記載されるＧＯＩのいずれか１つであってもよい。
例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１３７３３（ＷＯ２０１６／１１５５４３Ａ２）は、調節カセットに作動可能に連結されたマイクロジストロフィン遺伝子を提供しており、マイクロジストロフィン遺伝子は、アミノ末端アクチン結合ドメイン；β－ジストログリカン結合ドメイン；および少なくとも４つのスペクトリン様リピートを含むスペクトリン様リピートドメインを含むタンパク質をコードし、少なくとも４つのスペクトリン様リピートのうち２つは、神経一酸化窒素シンターゼ結合ドメインを含む。ある特定の態様では、少なくとも４つのスペクトリン様リピートには、スペクトリン様リピート１（ＳＲ１）、スペクトリン様リピート１６（ＳＲ１６）、スペクトリン様リピート１７（ＳＲ１７）、およびスペクトリン様リピート２４（ＳＲ２４）が挙げられる。ある特定の態様では、マイクロジストロフィン遺伝子によってコードされるタンパク質は、ヒンジドメインの少なくとも一部、例えば、ヒンジ１ドメイン、ヒンジ２ドメイン、ヒンジ３ドメイン、ヒンジ４ドメイン、およびヒンジ様ドメインの少なくとも１つをさらに含む。ある特定の態様では、マイクロジストロフィン遺伝子は、Ｎ末端からＣ末端の順に以下を含む：ヒンジ１ドメイン（Ｈ１）；スペクトリン様リピート１（ＳＲ１）；スペクトリン様リピート１６（ＳＲ１６）；スペクトリン様リピート１７（ＳＲ１７）；スペクトリン様リピート２４（ＳＲ２４）；およびヒンジ４ドメイン（Ｈ４）。ある特定の態様では、Ｈ１は、ＳＲ１に直接結合される。ある特定の態様では、ＳＲ１はＳＲ１６に直接結合される。ある特定の態様では、ＳＲ１６はＳＲ１７に直接結合される。ある特定の態様では、ＳＲ１７はＳＲ２４に直接結合される。ある特定の態様では、ＳＲ２４はＨ４に直接結合される。ある特定の態様では、マイクロジストロフィン遺伝子によってコードされるタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端の順に、スペクトリン様リピート２（ＳＲ２）およびスペクトリン様リピート３（ＳＲ３）をＳＲ１とＳＲ１６の間にさらに含む。ある特定の態様では、ＳＲ１はＳＲ２に直接結合され、ＳＲ２はＳＲ３にさらに結合される。ある特定の態様では、Ｈ１はＳＲ１に直接結合され、ＳＲ１はＳＲ１６に直接結合され、ＳＲ１６はＳＲ１７に直接結合され、ＳＲ１７は ＳＲ２３に直接結合され、ＳＲ２３はＳＲ２４に直接結合され、およびＳＲ２４はＨ４に直接結合される。
ある特定の態様では、調節カセットは、ＣＫ８プロモーターおよび心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）プロモーターからなる群から選択される。ある特定の態様では、マイクロジストロフィン遺伝子によってコードされるタンパク質は、５つのスペクトリン様リピートから８つのスペクトリン様リピートを有する。ある特定の態様では、マイクロジストロフィン遺伝子によってコードされるタンパク質は、ＷＯ２０１６／１１５５４３Ａ２（参照により本明細書に組み込まれる）の配列番号４または５のアミノ酸配列と少なくとも８０％または９０％の配列同一性を有する。
ある特定の態様では、そのようにして産生されたｒＡＡＶウイルスベクターは、ｒＨＳＶおよびｒｃＨＳＶウイルスベクターがｒＡＡＶウイルスストックに存在しないことを確実にするためにチェックされ得る。例えば、実施例１で使用されるアッセイが、ｒＨＳＶおよびｒｃＨＳＶの存在または非存在を決定するのに使用され得る。
６．組換えＡＡＶ産生
対象組換え複製欠損ウイルスベクター、特に対象組換えＨＳＶベクター、および産生細胞株は、遺伝子治療に有用な組換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶ）の大規模産生に使用することができるＨＳＶベースの補完系を一緒に形成する。
対象ウイルス（例えば、ｒＨＳＶ）ベクターおよび産生細胞株を用いて産生され得る組換えＡＡＶベクターは、典型的には、野生型ＡＡＶウイルスｒｅｐおよびｃａｐオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の代わりに、目的の遺伝子（ＧＯＩ）および発現調節因子（ＧＯＩのプロモーターなど）を含む。ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ ＯＲＦ、場合によりそれらの天然のプロモーターｐ５、ｐ１９、およびｐ４０は、対象組換えＨＳＶベクターおよび／または産生細胞株によって代わりに供給される。ｒｅｐ ＯＲＦは、ＡＡＶウイルス生活環に関与する４つの非構造Ｒｅｐタンパク質をコードし、ｃａｐ ＯＲＦは、正二十面体のＡＡＶカプシドを形成する３つの構造タンパク質（すなわち、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３）をコードする。典型的には、ｒＡＡＶベクターゲノム中に保持されるＡＡＶウイルス配列のみが、逆方向末端反復（ＩＴＲ）－ＡＡＶ ＤＮＡ複製およびパッケージングに必要とされる最小のシスエレメントである。
目的の遺伝子（ＧＯＩ）は、ある特定の疾患または状態の処置における遺伝子治療に有用な遺伝子を含み得る。代表的な（非限定的な）ＧＯＩには、ＬＧＭＤ２Ｅ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｅ型）、ＬＧＭＤ２Ｄ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｄ型）、ＬＧＭＤ２Ｃ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｃ型）、ＬＧＭＤ２Ｂ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ型）、ＬＧＭＤ２Ｌ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｌ型）、ＬＧＭＤ２Ｉ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｉ型）の原因／欠損遺伝子、またはＮＡＧＬＵ（α－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ、サンフィリポ症候群またはムコ多糖症ＩＩＩＢ型（ＭＰＳ ＩＩＩＢ）に関する）、スルファミダーゼもしくはＳＧＳＨ（ムコ多糖症ＩＩＩＡ型またはＭＰＳ ＩＩＩＡに関する）、第ＩＸ因子、第ＶＩＩＩ因子、ミオチューブラリン１（ＭＴＭ１）、生存運動ニューロン（ＳＭＮ、脊髄性筋萎縮症またはＳＭＡに関する）、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼＧＡＬＧＴ２、カルパイン－３（ＣＡＰＮ－３）、酸性アルファグルコシダーゼ（ＧＡＡ、ポンペ病に関する）、アルファ－ガラクトシダーゼＡもしくはＧＬＡ（ファブリー病に関する）、グルコセレブロシダーゼ、ジストロフィンもしくはマイクロジストロフィンの遺伝子もしくはコード配列が挙げられ得る。
適切なマイクロジストロフィン遺伝子は、以下の特許に記載されている：ＵＳ７，９０６，１１１；ＵＳ７，００１，７６１；ＵＳ７，５１０，８６７；ＵＳ６，８６９，７７７；ＵＳ８，５０１，９２０；ＵＳ７，８９２，８２４；ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１３７３３；ＵＳ１０，１６６，２７２（全て参照により本明細書に組み込まれる）。
対象ｒＨＳＶベースの系によって産生されるｒＡＡＶから恩恵を受ける可能性がある疾患または状態には、ハンチントン病、Ｘ連鎖性ミオチュブラーミオパチー（ＸＬＭＴＭ）、酸マルターゼ欠損症（例えば、ポンペ病）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、重症筋無力症（ＭＧ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、フリードライヒ運動失調症、ミトコンドリア筋症、筋ジストロフィー（デュシェンヌ型筋ジストロフィー、筋緊張性ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨ）、先天性筋ジストロフィー（ＣＤＭ）、眼咽頭型筋ジストロフィー（ＯＰＭＤ）、遠位型筋ジストロフィー、エメリー－ドレイフス型筋ジストロフィー（ＥＤＭＤ）、ムコ多糖症（ＭＰＳ）、異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）、バッテン病、レット症候群、クラッベ病、カナバン病、Ｘ連鎖性網膜分離症、色覚異常（ＣＮＧＢ３およびＣＮＧＡ３）、Ｘ連鎖性網膜色素変性症、加齢性黄斑変性症、血管新生黄斑変性症、ポンペ病、ファブリー病、ＭＰＳ Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩＡ、ＩＩＩＢ、ゴーシェ病、ダノン病、Ａ１Ａｔ欠損症、フリードライヒ運動失調症、ウィルソン病、バッテン病（ＣＬＮ１、ＣＬＮ３、ＣＬＮ６、ＣＬＮ８）、ウォルマン病、テイ－サックス病、ニーマン－ピック病Ｃ型（Ｎｉｅｍａｎｎ－Ｌｉｃｋタイプ Ｃ）、ＣＤＫＬ５欠乏症、Ｂサラセミア、鎌状赤血球症等が挙げられる。
天然には複製欠損ヒトパルボウイルスであるため、野生型ＡＡＶは、その複製のためのヘルパーの援助なしで宿主細胞の染色体内にそのゲノムを部位特異的に組み込み、ヘルパーウイルスによる細胞感染により救出されない限り、宿主細胞の染色体内でいつまでも持続する。宿主細胞へのヘルパーウイルスの導入は、ＡＡＶ複製、および子孫ビリオンの生成の引き金を引く。遺伝子治療に有用なｒＡＡＶビリオンの場合、適切な宿主細胞へのヘルパーウイルス機能の導入は、必要なｒｅｐおよびｃａｐコード配列も同じ系に供給されるならばｒＡＡＶビリオンへのＧＯＩのパッケージングの引き金を引く。
換言すれば、組換えＡＡＶの産生は、（１）ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐコード配列の存在、ならびに（２）ヘルパーウイルス機能に全面的に依存している。対象組換え（ＨＳＶ）ベクターおよび産生細胞株は、ｒＡＡＶ産生に必要とされる両方の機能性を提供することができる。
ＨＳＶなどのヘルペスウイルス科のウイルスは、ＡＡＶ複製に必須のトランス機能を提供することが示されている（ＨａｎｄａおよびＣａｒｔｅｒ、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５４：６６０３～６６１０頁、１９７９；Ｂｕｌｌｅｒら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ４０：２４１～２４７頁、１９８１）。簡単にするために、本明細書における説明は、ＡＡＶ複製に必須のトランス機能を提供することができるヘルペスウイルス科由来のウイルスの具体例としてＨＳＶを引き合いに出し、該説明は、ヘルペスウイルス科などのヘルペスウイルス目由来の他のウイルスに概ね当てはまることが理解されるべきである。
ヘルペスウイルス科などのヘルペスウイルス目のウイルス（例えば、ＨＳＶ）由来の複製タンパク質は、効率の良いゲノム複製およびパッケージングのためにＡＡＶによって直接使用され得る。
ある特定の態様では、対象ｒＨＳＶは、ＧＯＩを含むｒＡＡＶを産生するのにＨＳＶアンプリコンベースの系と共に使用され得る。この態様によれば、場合によりそれらの天然のプロモーター（ｐ５、ｐ１９、およびｐ４０）を含むＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐコード配列は、ＨＳＶ複製起点およびパッケージングシグナル（例えば、ＨＳＶアンプリコン）を担持するいわゆるｐＨＳＶ－ＲＣプラスミドによって提供される。ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を担持するＨＳＶ粒子は、ｐＨＳＶ－ＲＣプラスミドをＶｅｒｏ細胞などの適切な宿主細胞にトランスフェクトし、ＩＣＰ２７欠失を有する対象ｒＨＳＶベクターに該宿主細胞を感染させることによって生成される。この系では、ＩＣＰ２７欠失を有する対象ｒＨＳＶベクターがヘルパーウイルスとして使用されて、ＨＳＶアンプリコンＤＮＡ複製およびＨＳＶ粒子へのパッケージングに必要とされる欠損しているトランス因子を供給した。そのようにして生成されたＨＳＶ粒子は、適切な宿主細胞（Ｖｅｒｏ細胞など）を、ＨＳＶ粒子およびＩＣＰ２７欠失を有する対象ｒＨＳＶベクターに感染させることによる連続感染継代を通じてさらに増幅され得る。ある特定の態様では、所望のＧＯＩを含む組換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を有するそのようなＨＳＶ粒子にプロウイルス細胞株を感染させ、プロウイルス細胞株が、プロウイルス細胞株のゲノムに組み込まれたＧＯＩを含むｒＡＡＶを含有することによって産生される。ある特定の態様では、所望のＧＯＩを含む組換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を有するそのようなＨＳＶ粒子に細胞を感染させ、細胞が、ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接するＧＯＩを有するｒＡＡＶプラスミドをトランスフェクトされることによって産生される。ある特定の態様では、所望のＧＯＩを含む組換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を有するそのようなＨＳＶ粒子に細胞を感染させ、ＧＯＩを有するｒＡＡＶに細胞が感染されることによって産生される。
ある特定の態様では、対象ｒＨＳＶは、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐコード配列を対象ｒＨＳＶベクターに組み込むことによって、ＧＯＩを含むｒＡＡＶを産生するのに直接使用することができる。この態様によれば、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は、ＩＣＰ２７欠失を有する対象複製欠損ｒＨＳＶベクターの非必須遺伝子（チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子座など）に、例えば、相同組換えによって挿入されてもよい（置換ありまたはなしで）。得られたｒＨＳＶは、対象ＩＣＰ２７欠失ｒＨＳＶと重複しない（または最小限に重複する）ＩＣＰ２７コード配列を含有する本発明のＶ２７様細胞（Ｖｅｒｏ細胞に由来するものなど）で増殖され得る。得られたｒＨＳＶ粒子は、使用されると必要なＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質を産生して、適切なＡＡＶ産生細胞株（ＢＨＫ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、またはＨＥＫ２９３細胞など）を感染させることができる。ある特定の態様では、所望のＧＯＩを含む組換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を有するそのようなｒＨＳＶ粒子にプロウイルス細胞株を感染させ、プロウイルス細胞株が、プロウイルス細胞株のゲノムに組み込まれたＧＯＩを含むｒＡＡＶを含有することによって産生される。ある特定の態様では、所望のＧＯＩを含む組換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を有するそのようなｒＨＳＶ粒子に細胞を感染させ、細胞が、ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接するＧＯＩを有するｒＡＡＶプラスミドもトランスフェクトされることによって産生される。ある特定の態様では、所望のＧＯＩを含む組換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を有するそのようなｒＨＳＶ粒子に細胞を感染させ、細胞が、ＧＯＩを有するｒＡＡＶにも感染されることによって産生される。
ある特定の態様では、対象ｒＨＳＶは、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐコード配列を第１の対象ｒＨＳＶベクターに組み込み、ＡＡＶ ＩＴＲ隣接ＧＯＩを第２の対象ｒＨＳＶベクターに組み込むことによって、ＧＯＩを含むｒＡＡＶを産生するのに直接使用することができる。ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐコード配列、およびＡＡＶ ＩＴＲ隣接ＧＯＩは、対象ｒＨＳＶの同じ（または異なる）非必須遺伝子座、例えば、ＩＣＰ２７欠失を有する対象複製欠損ｒＨＳＶベクターのチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子座に、例えば、相同組換えによって挿入されてもよい。得られたｒＨＳＶｓは、対象ＩＣＰ２７欠失ｒＨＳＶと重複しない（または最小限に重複する）ＩＣＰ２７コード配列を含有する本発明のＶ２７様細胞（Ｖｅｒｏ細胞に由来するものなど）で増殖され得る。得られたｒＨＳＶ粒子－ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐコード配列を担持するｒＨＳＶ粒子の第１の集団、ならびにＡＡＶ ＩＴＲ隣接ＧＯＩを担持するｒＨＶＳ粒子の第２の集団を使用し、ＢＨＫ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、またはＨＥＫ２９３細胞などのＡＡＶ産生細胞株を同時感染させて、ＧＯＩを担持するｒＡＡＶビリオンを産生することができる。これは、ＨＳＶ感染だけに基づくｒＡＡＶ製造系である。ＧＯＩを担持するｒＡＡＶ粒子は、適切なｒＨＳＶ産生細胞株（Ｖｅｒｏ細胞またはＢＨＫ細胞など）を、ｒＨＳＶストックを産生するのに必要な補完系（対象ｒＨＳＶと重複しないＩＣＰ２７コード配列など）に最初に同時感染させることによって産生することができる。ｒＨＳＶベクターを回収し、高力価に濃縮後、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐコード配列を担持するｒＨＳＶベクター、ならびにＡＡＶ ＩＴＲ隣接ＧＯＩを担持するｒＨＳＶベクターは、ＨＥＫ２９３またはＢＨＫ細胞などの適切なＡＡＶ産生細胞株を同時感染させて、ＧＯＩを担持するｒＡＡＶベクターを産生するのに使用される。
故に別の側面では、本発明は、ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接する目的の遺伝子（ＧＯＩ）のコード配列を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を産生する方法であって、ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質のコード配列を含む第１の組換え複製欠損ウイルス、ならびにＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接する目的の遺伝子（ＧＯＩ）を含む第２の組換え複製欠損ウイルスに産生宿主細胞を同時感染させるステップを含む前記方法を提供する。
関連する側面では、本発明は、ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接する目的の遺伝子（ＧＯＩ）コード配列を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を産生する方法であって、ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質のコード配列を含む組換え複製欠損ウイルスに産生宿主細胞を感染させるステップを含み、産生宿主細胞が、（１）ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接するＧＯＩコード配列を有する組み込まれたＡＡＶプロウイルスを含み；（２）ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接するＧＯＩコード配列を有するベクター（例えば、プラスミド）によってトランスフェクトされ；または（３）ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接するＧＯＩコード配列を有するｒＡＡＶに同時感染される、前記方法を提供する。
ある特定の態様では、産生細胞株はＢＨＫ、Ｖｅｒｏ、またはＨＥＫ２９３である。
ある特定の態様では、ＡＡＶの指向性は、血清型、例えばＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、好ましくはＡＡＶ９を含む。ある特定の態様では、ＡＡＶカプシドは遺伝子修飾されてもよく、またはカプシドは、記載されているように、特定の組織、例えば筋肉、骨格筋、心筋、平滑筋などへの ＧＯＩの組織特異的または生理的コンパートメント送達を増強する合成デザイナーカプシドであってもよい（例えば、いずれも参照により本明細書に組み込まれる、ＺｉｎｎおよびＧｒｉｍｍ、Ｈｉｇｈ－Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＡＡＶ－Ｈｏｓｔ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ： Ｔｈｅ Ｆａｓｔ ａｎｄ ｔｈｅ Ｃｕｒｉｏｕｓ、ＪＭＢ ４３０（１７）：２６２６～２６４０頁、２０１８；ＫｏｔｔｅｒｍａｎおよびＳｃｈａｆｆｅｒ、Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ ｆｏｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ． Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０１４）４４４５～４４５１頁を参照のこと）。シュードタイピング、または異なるウイルス血清型由来のカプシドおよびゲノムの混合によるＡＡＶの指向性も使用され得る。これらの血清型はスラッシュを使用して表されるため、ＡＡＶ２／５は、血清型５由来のカプシドにパッケージングされた血清型２のゲノムを含有するウイルスを示す。これらのシュードタイプ化されたウイルスの使用は、形質導入効率を改善し、ならびに指向性を変更することができる。例えば、シュードタイプ化ＡＡＶ２／５は筋芽細胞を標的にする（Ｄｕａｎら、Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｍｕｓｃｌｅ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｗｉｔｈ ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ５ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｍｙｏｂｌａｓｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７５（１６）：７６６２～７６７１頁、２００１）。他のシュードタイプ化 ＡＡＶには、ＡＡＶ２／６が挙げられる。ある特定の態様では、インシリコ生成配列がデノボ合成され、臨床応用と関係する生物学的特性について特徴づけられた。この研究は、９つの機能性推定祖先ＡＡＶの生成、ならびに肝臓、筋肉、および網膜を標的にするための極めて強力なｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子治療ベクターとして、広く研究されているＡＡＶ血清型１、２、８、および９の予想祖先である、Ａｎｃ８０の同定につながった（Ｚｉｎｎら、Ｉｎ Ｓｉｌｉｃｏ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｖｉｒｕｓ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｌｉｎｅａｇｅ Ｙｉｅｌｄｓ ａ Ｐｏｔｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｖｅｃｔｏｒ， Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １２（６）：１０５６～１０６８頁、２０１５）；Ｂｕｎｉｎｇら、Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｔｈｅ ＡＡＶｃａｐｓｉｄ ｔｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｖｅｃｔｏｒ－ｈｏｓｔ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、２４：９４～１０４頁、２０１５）。
ある特定の態様では、ＡＡＶの指向性は骨格筋を含む（ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９、好ましくはＡＡＶ９）。
ある特定の態様では、目的の遺伝子（ＧＯＩ）には、ＬＧＭＤ２Ｅ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｅ型）、ＬＧＭＤ２Ｄ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｄ型）、ＬＧＭＤ２Ｃ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｃ型）、ＬＧＭＤ２Ｂ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ型）、ＬＧＭＤ２Ｌ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｌ型）、ＬＧＭＤ２Ｉ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｉ型）の原因／欠損遺伝子、またはＮＡＧＬＵ（α－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ、サンフィリポ症候群またはムコ多糖症ＩＩＩＢ型（ＭＰＳ ＩＩＩＢ）に関する）、スルファミダーゼもしくはＳＧＳＨ（ムコ多糖症ＩＩＩＡ型またはＭＰＳ ＩＩＩＡに関する）、第ＩＸ因子、第ＶＩＩＩ因子、ミオチューブラリン１（ＭＴＭ１）、生存運動ニューロン（ＳＭＮ、脊髄性筋萎縮症またはＳＭＡに関する）、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼＧＡＬＧＴ２、カルパイン－３（ＣＡＰＮ－３）、酸性アルファグルコシダーゼ（ＧＡＡ、ポンペ病に関する）、アルファ－ガラクトシダーゼＡもしくはＧＬＡ（ファブリー病に関する）、グルコセレブロシダーゼ、ジストロフィンもしくはマイクロジストロフィンの遺伝子もしくはコード配列が挙げられる。
ある特定の態様では、ＧＯＩは、ジストロフィンの機能的等価物（例えば、機能性マイクロジストロフィンタンパク質をコードするジストロフィンミニ遺伝子）である。
ある特定の態様では、ＧＯＩはマイクロジストロフィン遺伝子である。
ある特定の態様では、マイクロジストロフィン遺伝子は、ＵＳ７，９０６，１１１；ＵＳ７，００１，７６１；ＵＳ７，５１０，８６７；ＵＳ６，８６９，７７７；ＵＳ８，５０１，９２０；ＵＳ７，８９２，８２４；ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１３７３３；またはＵＳ１０，１６６，２７２に記載されているものである。
ある特定の態様では、マイクロジストロフィン遺伝子は、完全長ジストロフィンタンパク質のＲ１６およびＲ１７スペクトリン様リピートのコード配列を含む（ＵＳ７，８９２，８２４に記載されているものなど）。
ある特定の態様では、マイクロジストロフィン遺伝子は、完全長ジストロフィンタンパク質のＲ１、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ２３、およびＲ２４スペクトリン様リピートのコード配列を含む（ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１３７３３に記載されているマイクロジストロフィン遺伝子など）。
ある特定の態様では、マイクロジストロフィン遺伝子は、ＳＲ１、ＳＲ１６、ＳＲ１７、ＳＲ２３、およびＳＲ２４リピート（例えば、その順番の）以外の完全長ジストロフィンタンパク質のスペクトリンリピートのコード配列を含まない。
ある特定の態様では、対象ｒＨＳＶは、ＨＳＶコア複製機構－ＨＳＶヘリカーゼ－プライマーゼ複合体（ＵＬ５、ＵＬ８、およびＵＬ５２によってコードされた）、およびＵＬ２９によってコードされた一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質－を含む、ＡＡＶ産生に必要とされるＨＳＶ遺伝子、ならびにＨＳＶポリメラーゼＵＬ３０、ポリメラーゼアクセサリー因子ＵＬ４２、および起点結合タンパク質ＵＬ９を含む他のＨＳＶ遺伝子の最小セットを提供する。
ある特定の態様では、対象組換えＨＳＶベクターは、本明細書において記載されるＩＣＰ２７欠失に加えて、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、および／またはＩＣＰ４７などの感染細胞タンパク質（ＩＣＰ）をコードする、１つまたは複数のさらなる前初期（ＩＥ）遺伝子の欠失を有する。対象複製不能ｒＨＳＶベクターの産生は、ｒＨＳＶの欠損している複製およびパッケージング機能をトランスで提供する適当な補完細胞株を必要とする。
ある特定の態様では、ＩＣＰ２７欠失に加えて、対象ｒＨＳＶは、ＨＳＶ糖タンパク質Ｈ（ｇＨ）をコードする遺伝子をさらに欠く。感染性粒子は、補完ｇＨ発現細胞株のみに由来するそのようなｒＨＳＶから生成され得、故にさらなるレベルの安全性を付与し得る。
本明細書において記載されるＩＣＰ２７欠失に関連する本質的な特徴以外、対象ｒＨＳＶベクターは、野生型ＨＳＶゲノムの大部分を保持してもよく、またはウイルス増幅を危うくすることなく欠失される非必須遺伝子産物をコードする野生型ＨＳＶゲノムの５０％超を有してもよい。対象ｒＨＳＶベクターは、ＨＳＶ複製およびパッケージングに必要とされる２つのシスエレメント－複製起点（ｏｒｉＳ）、およびパッケージングシグナル（配列ａまたはｐａｃ）も含んでもよい。
ある特定の態様では、対象ｒＨＳＶおよび／またはｒＡＡＶベクターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養条件、例えばバイオリアクター（例えば、０．５Ｌ、１Ｌ、２Ｌ、３Ｌ、５Ｌ、１０Ｌ、２０Ｌ、５０Ｌ、１００Ｌ、２５０Ｌ、５００Ｌ、または１，０００Ｌワーキングボリュームバイオリアクター）、例えば感染後３日間のフェドバッチベクター産生のためのＣｅｌｌｉＧｅｎ Ｐｌｕｓ充填床バイオリアクター（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で産生される。
ある特定の態様では、対象ｒＨＳＶベクターは、固体支持体に依存するＶｅｒｏおよびＶｅｒｏ由来細胞株などの接着依存性細胞株でｉｎ ｖｉｔｒｏ培養物として産生される。ある特定の態様では、固体支持体は、組織培養皿、プレート、ボトル、フラスコ、細胞ファクトリーなどの組織培養表面である。ある特定の態様では、固体支持体は、Ｃｙｔｏｄｅｘ １（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ピスカタウェイ、ＮＪ）などのマイクロキャリア；ＦｉｂｒａＣｅｌ（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、エジソン、ＮＪ）などのマクロキャリア、または培地灌流を可能にするＣｅｌｌＣｕｂｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ローエル、ＭＡ）などの多層培養容器である。
ある特定の態様では、対象ｒＨＳＶおよび／またはｒＡＡＶベクターは、懸濁液中で増殖するように適合された真核生物細胞におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ培養物、例えばＢＨＫ細胞株の懸濁液培養物として産生される。
ある特定の態様では、培養上清は、１×１０１０プラーク形成単位（ＰＦＵ）を超えるｒＨＳＶ、１×１０１１プラーク形成単位（ＰＦＵ）を超えるｒＨＳＶ、１×１０１２プラーク形成単位（ＰＦＵ）を超えるｒＨＳＶ、１×１０１３プラーク形成単位（ＰＦＵ）を超えるｒＨＳＶ、１×１０１４プラーク形成単位（ＰＦＵ）を超えるｒＨＳＶをもたらす。
ある特定の態様では、ヒトを含む動物に投与するのに十分な純度を有するベクターストックを得るために、ベクターストックは１つまたは複数の後処理ステップ、例えば、濾過および／または濃縮（例えば、深層濾過、全量濾過、接線流濾過（ＴＦＦ）、および透析濾過）、マルチカラムクロマトグラフィー精製、最終濃縮／緩衝液交換などによって産生される。ある特定の態様では、精製プロセスおよび精製ベクターストックは、ＧＭＰ基準を満たす。
ある特定の態様では、ｒＨＳＶおよび／またはｒＡＡＶベクターストックの力価は、約１～２×１０７ＰＦＵ／ｍｌ、約１～２×１０８ＰＦＵ／ｍｌ、約１～２×１０９ＰＦＵ／ｍｌ、約１～２×１０１０ＰＦＵ／ｍｌ、約１～２×１０１１ＰＦＵ／ｍｌ、または約１～２×１０１２ＰＦＵ／ｍｌである。
ある特定の態様では、ｒＡＡＶベクターストックの全収量は、約１～２５×１０１４総ＶＧの精製ｒＡＡＶ、約１～１０×１０１４総ＶＧの精製ｒＡＡＶ、約１～５×１０１４総ＶＧの精製ｒＡＡＶ、または約２～４×１０１４総ＶＧの精製ｒＡＡＶである。
ある特定の態様では、そのようにして産生されたｒＨＳＶおよび／またはｒＡＡＶベクターは、高い最終産物純度を確実にするために、イオン交換クロマトグラフィーおよび／またはイオジキサノール密度勾配遠心分離によって粗細胞溶解物からさらに精製される。ある特定の態様では、そのようにして産生されたｒＡＡＶベクターは、臨床グレードのベクターバッチとして適格となる。
ある特定の態様では、本発明のＡＡＶ産生方法は、そのようにして産生されたｒＡＡＶベクターの力価、純度、および／または効力を決定するステップをさらに含む。これは、純度を決定するためのタンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分離の銀染色、感染性粒子に対するｒＡＡＶ完全カプシドの比（ＴＣＩＤ５０）を決定するためのｑＰＣＲ、残存ＨＳＶタンパク質を決定するためのＥＬＩＳＡ、および残存ＨＳＶ ＤＮＡを決定するためのｑＰＣＲのうち１つまたは複数を使用して、精製ｒＡＡＶストックを特徴づけるステップを含んでもよい。
７．ｒＨＳＶによって産生されるＡＡＶを使用した筋ジストロフィーの処置
対象ｒＨＳＶベースの系は、ｒＡＡＶの大規模産生に使用することができ、次にｒＡＡＶは、様々な形態の筋ジストロフィー、例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、筋緊張性ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨ）、先天性筋ジストロフィー（ＣＤＭ）、眼咽頭型筋ジストロフィー（ＯＰＭＤ）、遠位型筋ジストロフィー、エメリー－ドレイフス型筋ジストロフィー（ＥＤＭＤ）などを処置するための遺伝子治療において使用され得る。ある特定の態様では、筋ジストロフィーはＤＭＤまたはＢＭＤである。
故に、本発明の別の側面は、筋ジストロフィーの処置を必要とする対象における筋ジストロフィー（ＤＭＤおよびＢＭＤなど）を処置する方法であって、マイクロジストロフィン遺伝子などの筋ジストロフィーにおける欠損遺伝子の機能性バージョンをコードする組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターの治療有効量を対象に投与するステップを含み、ｒＡＡＶが対象ｒＨＳＶベクターおよび相補系を使用する本発明の方法によって産生される、前記方法を提供する。
ある特定の態様では、マイクロジストロフィン遺伝子は、ＵＳ７，９０６，１１１；ＵＳ７，００１，７６１；ＵＳ７，５１０，８６７；ＵＳ６，８６９，７７７；ＵＳ８，５０１，９２０；ＵＳ７，８９２，８２４；ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１３７３３；またはＵＳ１０，１６６，２７２（全て参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているものである。
ある特定の態様では、マイクロジストロフィン遺伝子は、完全長ジストロフィンタンパク質のＲ１、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ２３、およびＲ２４スペクトリン様リピートのコード配列を含む（ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１３７３３に記載されているものなど）。
ある特定の態様では、方法は、そのようにして産生されたｒＡＡＶを対象に投与するステップの前に、対象ｒＨＳＶベクターおよび相補系を使用する本発明の方法によってｒＡＡＶを産生するステップをさらに含む。
実施例１
ｒＨＳＶおよびｒｃＨＳＶの検出
本明細書において記載されるのは、ＨＳＶストック、および最終的にはＡＡＶストック中のｒＨＳＶおよびｒｃＨＳＶの存在を決定するのに利用することができる２つのアッセイである。
１つのアッセイでは、ＩＣＰ２７を産生するＶ２７細胞でＨＳＶストックをアッセイして、ｒＨＳＶ（その複製はトランスで供給されるＩＣＰ２７に依存する）のプラーク形成単位（ＰＦＵ）力価を決定する。並行して、同じＨＳＶストックを、ＩＣＰ２７を産生しないＶｅｒｏ細胞でもアッセイして、任意のｒｃＨＳＶ（その複製はトランスで供給されるＩＣＰ２７に依存しない）の存在を評価する。
このアッセイは、細胞核で複製すると、ｒＨＳＶまたはｒｃＨＳＶは細胞変性効果（ＣＰＥ）を誘導し、感染細胞にプラークを形成させるという事実に基づく（Ｙｅら、２０１４；Ａｄａｍｓｏｎ－Ｓｍａｌｌら、２０１６）。
残存ＨＳＶの検出は、最低検出限界を確実に可能にするように確立されている。現在、１０～２０ＰＦＵ／ｍＬという低い検出限界が記載されている（Ｋａｎｇら、２００９；Ｙｅら、２０１１）。
あるいは、またはさらに、ＩＣＰ２７に関する第２のＰＣＲベースのアッセイを、ｒＨＳＶおよび／またはｒｃＨＳＶの検出に利用する。このアッセイの１つの主な限界は、ウイルス粒子が感染性であるかどうかを示さないことである。しかし、連続継代は、検出されるシグナルが経時的に増幅されるかどうかを明らかにすることができ、粒子が複製コンピテントおよび／または感染性であるかどうかを決定するのに役立つ。
実施例２
新規ＩＣＰ２７発現カセット設計
本明細書において記載されるのは、新規接着性Ｖｅｒｏ、無血清懸濁液適合ＢＨＫ細胞株、またはヘルペス感染を許容し、故にその増殖を支持する任意の他の細胞の生成に有用な、ＩＣＰ２７発現カセットをコードするいくつかのＤＮＡ配列である。
そのような新規ＩＣＰ２７補完細胞は、ＩＣＰ２７コードＵＬ５４遺伝子の完全な欠失を有する新規複製欠損ｒＨＳＶ－１ウイルス／ベクターの増殖に使用される場合、複製コンピテントなｒｃＨＳＶを生成する可能性が（あるとしても）極めて低いであろう。新規ＩＣＰ２７補完細胞は、ウイルスゲノムと、新規接着性Ｖｅｒｏまたは無血清懸濁液適合ＢＨＫ細胞株の細胞ゲノムに存在する組み込まれたＩＣＰ２７遺伝子の間の配列重複がより小さいため、現在使用されているｄ２７－１ ｒＨＳＶベースのベクターを増殖させるのにも使用することができる。
対象新規接着性Ｖｅｒｏまたは無血清懸濁液適合ＢＨＫ細胞株における、ＩＣＰ２７コードＵＬ５４遺伝子の完全な欠失を有する新規複製欠損ｒＨＳＶ－１ウイルス／ベクターの増殖は、細胞ゲノムに組み込まれたＩＣＰ２７遺伝子と、完全なＵＬ５４遺伝子欠失を有する ｒＨＳＶのウイルスゲノムの間の重複がないであろう。これは、いかなる複製コンピテントなｒｃＨＳＶウイルスも含まない、または実質的に含まないｒＨＳＶストックの産生を可能にする。
より小さなＩＣＰ２７発現カセット（すなわち、Ｖ２７、２－２またはＢ１３０細胞中の約２．４ｋｂ ＩＣＰ２７発現カセットより小さい）をコードするＤＮＡ配列を、以下により詳細に記載する。
配列番号１（２，１８８ｎｔｓ）は、ＵＬ５４プロモーターの４１２ｎｔｓ；ＩＣＰ２７ ＨＳＶ－１株ＫＯＳ１．１ ＩＣＰ２７ペプチド（配列番号１０；ＧｅｎＰｅｐｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＡＡＦ４３１４７）をコードする、ＨＳＶ－１ ＫＯＳ１．１と同一のＩＣＰ２７ ＯＲＦ配列の１，５３９ｎｔｓを含む、ＵＬ５４遺伝子の１９５１ｎｔｓ ＨＳＶ－１（ＫＯＳ１．１）ＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＫＴ８８７２２４；ｎｔｓ：１１３，１３９～１１５，０８９）；ならびに多重制限部位リンカーおよびウシ成長ホルモンポリアデニル化（ｂＧＨポリ（Ａ））シグナル配列の２３７ｎｔｓを含有するポリヌクレオチド配列である。類似の配列は、他の適切な供給源由来の任意のポリ（Ａ）シグナル配列、例えば、合成配列または他の真核生物遺伝子もしくはウイルス由来の配列による、ｂＧＨポリ（Ａ）シグナル配列の置換を含んでもよい。
配列番号２（２，１８８ｎｔｓ）は、ＵＬ５４プロモーターの４１２ｎｔｓと；ＨＳＶ－１ ＫＯＳ１．１と同一のＩＣＰ２７ ＯＲＦ配列の最初の１２１７ｎｔｓを含む、ＵＬ５４遺伝子の１，６２９ｎｔｓ ＨＳＶ－１（ＫＯＳ１．１）ＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＫＴ８８７２２４；ｎｔｓ：１１３、１３９～１１４、７６７）、ならびにＩＣＰ２７ ＨＳＶ－１株ＫＯＳ１．１ ＩＣＰ２７ペプチド（配列番号１０；ＧｅｎＰｅｐｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＡＡＦ４３１４７）をコードするＩＣＰ２７コドン最適化配列の残存３２２ｎｔｓ；ならびに多重制限部位リンカーおよびｂＧＨポリ（Ａ））シグナル配列の２３７ｎｔｓを含有するポリヌクレオチド配列である。類似の配列は、他の適切な供給源由来の任意のポリ（Ａ）シグナル配列、例えば、合成配列または他の真核生物遺伝子もしくはウイルス由来の配列による、ｂＧＨポリ（Ａ）シグナル配列の置換を含んでもよい。
配列番号３（２，１８８ｎｔｓ）は、ＵＬ５４プロモーターの４１２ｎｔｓを含む、ＵＬ５４遺伝子の４１２ｎｔｓ ＨＳＶ－１（ＫＯＳ１．１）ＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＫＴ８８７２２４；ｎｔｓ：１１３，１３９～１１３，５５０）；ＩＣＰ２７ ＨＳＶ－１株ＫＯＳ１．１ ＩＣＰ２７ペプチド（配列番号１０；ＧｅｎＰｅｐｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＡＡＦ４３１４７）をコードするコドン最適化ＨＳＶ－１ ＩＣＰ２７ ＯＲＦ配列の完全１，５３９ｎｔｓ；ならびに多重制限部位リンカーおよびｂＧＨポリ（Ａ））シグナル配列の２３７ｎｔｓを含有するポリヌクレオチド配列である。類似の配列は、他の適切な供給源由来の任意のポリ（Ａ）シグナル配列、例えば、合成配列または他の真核生物遺伝子もしくはウイルス由来の配列による、ｂＧＨポリ（Ａ）シグナル配列の置換を含んでもよい。
配列番号４（２，４４７ｎｔｓ）は、ＵＬ５４プロモーターの４１２ｎｔｓ；ＩＣＰ２７ ＨＳＶ－１株ＫＯＳ１．１ ＩＣＰ２７ペプチド（配列番号１０；ＧｅｎＰｅｐｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＡＡＦ４３１４７）をコードするＨＳＶ－１ ＫＯＳ１．１と同一のＩＣＰ２７ ＯＲＦ配列の１，５３９ｎｔｓ；およびＨＳＶ－１ ＵＬ５５遺伝子配列の４９６ｎｔｓを含む、ＵＬ５４およびＵＬ５５遺伝子の２，４４７ｎｔｓ ＨＳＶ－１（ＫＯＳ１．１）ＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＫＴ８８７２２４；ｎｔｓ：１１３，１３９～１１５，５８５）からなる、Ｖ２７細胞中にあるのと同じＤＮＡ配列（ＲｉｃｅおよびＫｎｉｐｅ、１９９０）を含有するポリヌクレオチド配列である。
配列番号５（２，３１４ｎｔｓ）は、完全ＵＬ５４プロモーターの５３８ｎｔｓおよびＨＳＶ－１ ＫＯＳ１．１と同一のＩＣＰ２７ ＯＲＦ配列の最初の１２１５ｎｔｓを含む、ＵＬ５４遺伝子の１，７５３ｎｔｓ ＨＳＶ－１（ＫＯＳ１．１）ＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＫＴ８８７２２４；ｎｔｓ：１１３、０１３－１１４、７６５）；ならびにＩＣＰ２７ ＨＳＶ－１株ＫＯＳ１．１ ＩＣＰ２７ペプチド（配列番号１０；ＧｅｎＰｅｐｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＡＡＦ４３１４７）をコードするＩＣＰ２７コドン最適化配列の残存３２４ｎｔｓ；ならびに多重制限部位リンカーおよびｂＧＨポリ（Ａ））シグナル配列の２３７ｎｔｓを含有するポリヌクレオチド配列である。類似の配列は、他の適切な供給源由来の任意のポリ（Ａ）シグナル配列、例えば、合成配列または他の真核生物遺伝子もしくはウイルス由来の配列による、ｂＧＨポリ（Ａ）シグナル配列の置換を含んでもよい。
配列番号６は、ＵＬ５４プロモーターの４１２ｎｔｓ；ＩＣＰ２７ ＨＳＶ－１株ＫＯＳ１．１ ＩＣＰ２７ペプチド（配列番号１０；ＧｅｎＰｅｐｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＡＡＦ４３１４７）をコードするコドン最適化ＨＳＶ－１ ＩＣＰ２７ ＯＲＦ配列の完全１，５３９ｎｔｓを含む、ＵＬ５４遺伝子のＨＳＶ－１（ＫＯＳ１．１）ＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＫＴ８８７２２４；ｎｔｓ：１１３，１３９～１１３，５５０）；多重制限部位リンカーおよびｂＧＨポリ（Ａ））シグナル配列を含有するポリヌクレオチド配列である。類似の配列は、他の適切な供給源由来の任意のポリ（Ａ）シグナル配列、例えば、合成配列または他の真核生物遺伝子もしくはウイルス由来の配列による、ｂＧＨポリ（Ａ）シグナル配列の置換を含んでもよい。
配列番号７は、ＵＬ５４プロモーターの４１２ｎｔｓ；ＩＣＰ２７ ＨＳＶ－１株ＫＯＳ１．１ ＩＣＰ２７ペプチド（配列番号１０；ＧｅｎＰｅｐｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＡＡＦ４３１４７）をコードするコドン最適化ＨＳＶ－１ ＩＣＰ２７ ＯＲＦ配列の完全１，５３９ｎｔｓを含む、ＵＬ５４遺伝子のＨＳＶ－１（ＫＯＳ１．１）ＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＫＴ８８７２２４；ｎｔｓ：１１３，１３９～１１３，５５０）；ならびに多重制限部位リンカーおよびｂＧＨポリ（Ａ））シグナル配列の２３７ｎｔｓを含有するポリヌクレオチド配列である。類似の配列は、他の適切な供給源由来の任意のポリ（Ａ）シグナル配列、例えば、合成配列または他の真核生物遺伝子もしくはウイルス由来の配列による、ｂＧＨポリ（Ａ）シグナル配列の置換を含んでもよい。
配列番号８（２，３１４ｎｔｓ）は、完全ＵＬ５４プロモーターの５３８ｎｔｓ；ＩＣＰ２７ ＨＳＶ－１株ＫＯＳ１．１ ＩＣＰ２７ペプチド（配列番号１０；ＧｅｎＰｅｐｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＡＡＦ４３１４７）をコードするＨＳＶ－１ ＫＯＳ１．１と同一のＩＣＰ２７ ＯＲＦ配列の１，５３９ｎｔｓを含む、ＵＬ５４遺伝子の２，０７７ｎｔｓ ＨＳＶ－１（ＫＯＳ１．１）ＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＫＴ８８７２２４；ｎｔｓ：１１３，０１３－１１５，０８９）；ならびに２３７ｎｔｓ多重制限部位リンカーおよびウシ成長ホルモンポリアデニル化（ｂＧＨポリ（Ａ））シグナル配列を含有するポリヌクレオチド配列である。類似の配列は、他の適切な供給源由来の任意のポリ（Ａ）シグナル配列、例えば、合成配列または他の真核生物遺伝子もしくはウイルス由来の配列による、ｂＧＨポリ（Ａ）シグナル配列の置換を含んでもよい。
配列番号９（２，１８８ｎｔｓ）は、ＵＬ５４プロモーターの４１２ｎｔｓと；ＨＳＶ－１ ＫＯＳ１．１と同一のＩＣＰ２７ ＯＲＦ配列の最初の１２３２ｎｔｓを含む、ＵＬ５４遺伝子の１，６４４ｎｔｓ ＨＳＶ－１（ＫＯＳ１．１）ＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＫＴ８８７２２４；ｎｔｓ：１１３、１３９～１１４、７８２）、ならびにＩＣＰ２７ ＨＳＶ－１株ＫＯＳ１．１ ＩＣＰ２７ペプチド（配列番号１０；ＧｅｎＰｅｐｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＡＡＦ４３１４７）をコードするＩＣＰ２７コドン最適化配列の残存３０７ｎｔｓ；ならびに２３７ｎｔｓ多重制限部位リンカーおよびｂＧＨポリ（Ａ））シグナル配列を含有するポリヌクレオチド配列である。類似の配列は、他の適切な供給源由来の任意のポリ（Ａ）シグナル配列、例えば、合成配列または他の真核生物遺伝子もしくはウイルス由来の配列による、ｂＧＨポリ（Ａ）シグナル配列の置換を含んでもよい。
配列番号１０は、ＩＣＰ２７ ＨＳＶ－１株ＫＯＳ１．１ ＩＣＰ２７ペプチド（配列番号１０；ＧｅｎＰｅｐｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＡＡＦ４３１４７）のポリペプチド配列である。
実施例３
ＩＣＰ２７補完アッセイ
新規ＩＣＰ２７発現構築物の、ｒＨＳＶの複製を支持する能力をテストするために、一連の補完実験を行った。具体的には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５か、または関係がないＧＦＰプラスミド対照配列のいずれかのポリヌクレオチド配列を保有するプラスミドをトランスフェクトしたとき、ＢＨＫ２１細胞をＭＯＩ ０．１でｒＨＳＶに感染させた。トランスフェクション２４時間後、細胞をＰＢＳで洗浄してトランスフェクションミックスの残余物を除去した。新鮮な培地を次いで各ウェルに添加した。細胞上清試料を感染後７２時間時点で回収し、標準的なプラークアッセイを使用してＶ２７細胞単層で滴定した（実施例１を参照のこと）。補完実験からの結果を図１に示す。
結果は、全ての分析したＩＣＰ２７発現構築物が、ｒＨＳＶの複製を同様の効率で支持することができることを示した。
Figure 2022534119000001
実施例４
新規ＩＣＰ２７発現細胞株：ＢＨＫ－２７およびＶｅｒｏ－２７の生成
ＢＨＫ－２７およびＶｅｒｏ－２７細胞株および関連する細胞株は、ＢＨＫ－２１またはＶｅｒｏ細胞にＩＣＰ２７配列保有プラスミドをそれぞれトランスフェクトするか、または配列番号１、２、３、５、６、７、８、もしくは９によって定義されたＩＣＰ２７配列を保有する第３世代レンチウイルスベクターにこれらの細胞を感染させて生成した。安定なクローンをジェネティシン選択下で単離し、ウエスタンブロットによってＩＣＰ２７発現を、標準的なプラークアッセイによってｒＨＳＶ産生をテストした。
ＢＨＫ１５３と呼ばれるＢＨＫ－２７クローンの１つを、以下の実施例８で使用した。
実施例５
ＢＨＫ－２７およびＶｅｒｏ－２７におけるｒＨＳＶの産生
単離した安定なＢＨＫ－２７またはＶｅｒｏ－２７細胞クローンをＭＯＩ ０．１でｄ２７－１ ｒＨＳＶに感染させ、７２時間インキュベートした。細胞上清中のｒＨＳＶ力価を、標準的なプラークアッセイによって決定した。代表的な結果は、同定された陽性クローン（クローン＃１６、５０、６３、１１０、および１５３など）が高レベルのｒＨＳＶを産生したことを示している（図２）。
実施例６
ＢＨＫ－２７およびＶｅｒｏ－２７で産生されたｒＨＳＶからのＡＡＶベクターの産生
ｒＡＡＶベクターは、ＨＥＫ ２９３細胞かまたはＢＨＫ－２１細胞のいずれかを、ＧＯＩを含むｒＡＡＶゲノムか、またはＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ発現カセットのいずれかをコードする２つのｒＨＳＶベクターに両ｒＨＳＶともＭＯＩ ２で同時感染させて産生する。ｒＡＡＶベクターを感染後７２時間で回収する。
実施例７
ＵＬ５４遺伝子の完全な欠失を有するｒＨＳＶ－１ゲノム
ヘルペスウイルスで報告されているＩＣＰ２７遺伝子の最大の欠失は、ｄ２７－１ ｒＨＳＶウイルスにおけるＩＣＰ２７遺伝子の１，６２４ｂｐの欠失であり、ＢａｍＨＩ部位をクレノウＤＮＡポリメラーゼによって平滑化し、ＩＣＰ２７遺伝子中の１，６２４ｂｐの欠失を生成した後のＢａｍＨＩおよびＳｔｕＩ切断ならびにライゲーションによる環状化後に、ｐＰｓ２７ｐｄｌから構築されたｐＰｓｄ２７－１プラスミドの相同組換えによって生成された（ＲｉｃｅおよびＫｎｉｐｅ、１９９０）。
このウイルスは、ＩＣＰ２７を発現するＶｅｒｏ由来Ｖ２７細胞で増殖することもできる。Ｖ２７細胞は、ｐＢＨ２７プラスミドを用いたＶｅｒｏ細胞の安定な形質導入によって生成された。プラスミドは、ＩＣＰ２７遺伝子と共に２．４ｋｂ ＨＳＶ－１ ＫＯＳ１．１ ＢａｍＨＩ－ＨｐａＩ ＤＮＡ断片を含有する。ｄ２７－１ ｒＨＳＶ－１ウイルス／ベクターと、Ｖ２７細胞ゲノムに組み込まれているＩＣＰ２７コード配列の間には８１５ｂｐの大きな相同配列重複がある（ＲｉｃｅおよびＫｎｉｐｅ、１９８８；ＲｉｃｅおよびＫｎｉｐｅ、１９９０）。
同様に、他のＶｅｒｏまたはＢＨＫ－２１ベースのＩＣＰ２７発現細胞株、２－２またはＢ１３０は、両方ともプラスミド ｐＳＧ１３０ Ｂ／Ｓ由来の類似の２．４ｋｂ ＢａｍＨＩ－ＳｓｔＩ ＩＣＰ２７遺伝子断片を担持する（Ｓｅｋｕｌｏｖｉｃｈら、１９８８；Ｓｍｉｔｈら、１９９２；Ｈｏｗａｒｄら、１９９８）。
配列番号１１（２，０７７ｎｔｓ）は、対象新規複製欠損ＩＣＰ２７欠失ｒＨＳＶベクターを生成するためにＨＳＶ－１（ＫＯＳ１．１）ゲノムから欠失されたＵＬ５４遺伝子のＨＳＶ－１（ＫＯＳ１．１）ＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＫＴ８８７２２４；ｎｔｓ：１１３，０１３－１１５，０８９）の２，０７７ｂｐに相当するポリヌクレオチド配列である。そのような新規ｒＨＳＶベクターは、ＵＬ５４遺伝子のこれまでで最大および完全な２，０７７ｂｐ欠失を有する。これは、細胞ゲノムに組み込まれたＩＣＰ２７遺伝子と、ｒＨＳＶのウイルスゲノムの間に重複配列がない新規接着性Ｖｅｒｏまたは無血清懸濁液適合ＢＨＫ細胞株と併用される場合、いかなる複製コンピテントなｒｃＨＳＶウイルスも含まないｒＨＳＶストックの産生を可能にする。
ヘルペスウイルス目由来の他のウイルスにおける欠失は、ＵＬ５３遺伝子またはその類似体のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の終止コドンの後の第１のヌクレオチドから始まり、ＵＬ５４遺伝子またはその類似体のＯＲＦの終止コドンを含む、最後のヌクレオチドまでとなろう。
本ＩＣＰ２７欠失ベクター－ＳＬＤ２７－は、ｄ２７－１ウイルス（１，６２４ｎｔｓ；ＲｉｃｅおよびＫｎｉｐｅ、１９９０）より大きな４５３ｎｔｓの欠失をＩＣＰ２７遺伝子（２，０７７ｎｔｓ；配列番号１１）中に有する。故に、ＳＬＤ２７ゲノムと、配列番号１、２、３、５、６、７、８、および９のプラスミド（プラスミド配列番号４を除く）を使用して生成された補完細胞株中のＩＣＰ２７遺伝子の間にＤＮＡ配列重複はないことになる。
プラスミド配列番号４は、Ｖ２７補完細胞株中のＨＳＶ－１ ＤＮＡ配列に相当し、ｄ２７－１ウイルスとＶ２７細胞ゲノム配列の間に８１５ｎｔｓの重複を有する。
細胞ゲノムに組み込まれたＩＣＰ２７遺伝子と、完全なＵＬ５４遺伝子欠失を有するｒＨＳＶウイルスゲノムの間に配列重複がない新規接着性Ｖｅｒｏまたは無血清懸濁液適合ＢＨＫ細胞株における、ＩＣＰ２７コードＵＬ５４遺伝子の完全な欠失を有する新規複製欠損ｒＨＳＶ－１ウイルス／ベクターの増殖は、複製コンピテントなｒｃＨＳＶウイルスを含まないｒＨＳＶストックの産生を可能にする。
対象ｒＨＳＶベクター、および対象ｒＨＳＶベクターから欠失されたＩＣＰ２７コード配列を発現する補完細胞（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｃｅｌｌ）株は、遺伝子治療に有用なｒＡＡＶの大規模産生に使用することができる。例えば、Ｔｈｏｍａｓら（Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎａ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ Ｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ １ Ｃｏｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ－Ａｄａｐｔｅｄ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ． Ｈｕｍ Ｇｅｎ Ｔｈｅｒ ２０（８）：８６１～８７０頁、２００９、内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）；Ａｄａｍｓｏｎ－Ｓｍａｌｌら（Ａ ｓｃａｌａｂｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ－ｔｉｔｅｒ ａｎｄ ｈｉｇｈ－ｑｕａｌｉｔｙ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｔｙｐｅ ９ ｖｅｃｔｏｒｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＨＳＶ ｐｌａｔｆｏｒｍ． Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈ ２８（１）：１～１４頁、２０１７、内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）；およびＣｌｅｍｅｎｔら（Ｌａｒｇｅ－Ｓｃａｌｅ Ａｄｅｎａ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ－Ｂａｓｅｄ Ｓｙｓｔｅｍ Ｅｎａｂｌｅｓ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ． Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０：７９６～８０６頁、２００９、内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
実施例８
完全なＩＣＰ２７欠失を有するｒＨＳＶベクターの産生
この実験では、そのプロモーターおよびコード配列を含むＩＣＰ２７遺伝子（ＵＬ５４）を、細菌人工染色体（ＢＡＣ）ベクター（ＨＳＶ－１ ＫＯＳ１．１－ＢＡＣ）に組み込まれた野生型ＨＳＶ－１ ＫＯＳ１．１株ゲノムから、エレクトロコンピテント大腸菌における相同組換えを使用して完全に欠失させた。ＩＣＰ２７欠失ＨＳＶ－１ウイルスのロバストな産生が、基本的にｒｃＨＳＶ汚染がないこれらのＩＣＰ２７欠失ＨＳＶ－１－ＢＡＣクローンから達成され得ることを示すために、ＵＬ５４遺伝子中の２．１ｋｂ（２，０７７ｂｐ）の欠失を有する独立して単離されたＩＣＰ２７欠失ＨＳＶ－１－ＢＡＣクローンの４つを、実施例１に記載したＶ２７およびＶｅｒｏ細胞プラークアッセイを使用してテストした。４つのクローンのうち２つ、クローン＃３およびクローン＃４からの代表的な結果を、それぞれ図３および４に示した。
具体的には、ＩＣＰ２７遺伝子（ＵＬ５４）を、エレクトロコンピテント大腸菌における相同組換えを使用して、本発明により初めて完全に欠失させた。
エレクトロコンピテント大腸菌技術における相同組換えは、相同組換えおよび標的ＤＮＡ配列に隣接する両側の約５０ｂｐの相同領域に基づく。これは、ＢＡＣベクター上の野生型ＨＳＶゲノムなどの標的ＤＮＡ、特にＩＣＰ２７遺伝子を、標的ＤＮＡを欠失させて修飾することができる系である。
１つのそのようなエレクトロコンピテント大腸菌株は、ＤＨ１０Ｂ大腸菌株に由来するＤＹ３８０である。別のそのような株は、ＤＹ３８０に由来するＳＷ１０２である。ＳＷ１０２のガラクトースオペロンは、ガラクトキナーゼ遺伝子（ｇａｌＫ）が欠失されていることを除いて十分に機能するように修飾されているが、ｇａｌＫ機能をトランスで加えることができ、それにより炭素源としてガラクトースで増殖する能力を回復することができる。これは、ＳＷ１０２におけるｇａｌＫベースの選択の生物学的基盤を成す。
ｇａｌＫベースの選択は、ポジティブ選択およびネガティブ選択の両方を伴う２段階システムである。まず、ポジティブ選択ステップ中、ＢＡＣにおける特定の位置、例えばＩＣＰ２７遺伝子座に対する相同性（例えば、両側の少なくとも５０ｂｐ）を含有するｇａｌＫカセットを、相同組換えによってＢＡＣに挿入する。得られた組換え細菌は、次いで、唯一の炭素源としてガラクトースを含む最小培地で増殖することができる（陽性選択）。次に、ｇａｌＫカセットを、ＢＡＣベクター中のｇａｌＫカセットに隣接する相同性を用いてドナー配列によって置換する。成功した組換え体は、炭素源としてグリセロールを含む最小プレートで、２－デオキシ－ガラクトース（ＤＯＧ）に対する耐性に基づきｇａｌＫカセットに対して選択して同定することができる。ＤＯＧ自体は無害であるが、ｇａｌＫはＤＯＧをリン酸化して非代謝型の、したがって細菌宿主には毒性中間体である、２－デオキシ－ガラクトース－１－リン酸になる可能性がある。故に、ｇａｌＫカセットを失っている（例えば、組換えによって）細菌のみが生き残り、ＤＯＧ耐性コロニーになることになる（ネガティブ選択）。
この系を使用して、野生型ＨＳＶ－１ ＫＯＳ１．１株を担持するＢＡＣを、まず大腸菌ＳＷ１０２株にエレクトロポレーションによって導入した。次に、ＩＣＰ２７遺伝子に隣接するゲノム領域に対して相同な約５０ｂｐの配列によって両側で隣接されたｇａｌＫコード配列を含むｇａｌＫカセットを、ＰＣＲ増幅によって生成した。ここで、ＩＣＰ２７遺伝子に隣接する５０ｂｐ相同領域は、ＵＬ５４遺伝子のＨＳＶ－１ ＫＯＳ１．１ ＤＮＡ配列の２，０７７ｂｐ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＫＴ８８７２２４；ｎｔｓ：１１３，０１３～１１５，０８９）であるＩＣＰ２０遺伝子を完全に排除するように設計した。実施例７および配列番号１１を参照のこと。この欠失は、５３８ｂｐ ＵＬ５４プロモーター（配列番号１１のヌクレオチド１～５３８）、および１５３９ｂｐ ＩＣＰ２７コード配列（配列番号１１のヌクレオチド５３９～２０７７）を含む。
相同組換え後、ｇａｌＫポジティブ選択を行って、２，０７７ｂｐ ＩＣＰ２７遺伝子をｇａｌＫカセットと置換している組換え体を同定した。
次に、ｇａｌＫを、ＩＣＰ２７隣接配列を用いて（ＫＴ８８７２２４のヌクレオチド１１３，０１３の約５０ｂｐ上流を、ＫＴ８８７２２４のヌクレオチド１１５，０８９の約５０ｂｐ下流に連結して）相同組換えを使用してＢＡＣベクターから同様に排除した。このステップ後、ｇａｌＫネガティブ選択を行って、ｇａｌＫカセットを失っている組換え体を同定した。得られたＢＡＣクローンを、ＩＣＰ２７欠失ＨＳＶ－１－ＢＡＣクローンと名付けた。基本的に汚染ｒｃＨＳＶがないロバストなｒＨＳＶ産生を支持する能力を示すために、そのようなクローンのうち４つ、すなわちクローン１～４をさらなるテストに供した。
具体的には、ＢＨＫ１５３細胞（実施例４を参照のこと）を、個々のＩＣＰ２７欠失ＨＳＶ－１－ＢＡＣクローン（すなわち、クローン１～４）由来のＢＡＣ ＤＮＡによってトランスフェクトした。ＩＣＰ２７欠失ＨＳＶ－１－ＢＡＣクローン由来のＢＡＣ ＤＮＡ配列は、ｒＨＳＶ産生のためのＩＣＰ２７機能を提供できることが以前に確認されている（図２参照のこと）ＢＨＫ１５３細胞に安定に組み込まれたＩＣＰ２７遺伝子と相同領域を共有しない。トランスフェクトされたＢＨＫ１５３細胞の溶解物を、トランスフェクション約１２～１３日後に回収し、ｒＨＳＶを含有する上清を実施例１の方法を使用して６ウェルプレートでアッセイして、Ｖ２７細胞およびＶｅｒｏ細胞におけるｒＨＳＶウイルス力価を決定した。クローン３および４の感染２日後の結果を、図３および４にそれぞれ示す。
ＩＣＰ２７遺伝子の２，０７７ｂｐ欠失を有する本発明のｒＨＳＶベクターが、ロバストなｒＨＳＶ産生を十分支持できることは明白である。ＩＣＰ２７を発現するＶ２７細胞では、４つのＩＣＰ２７欠失ＨＳＶ－１－ＢＡＣクローン全てが、全ての段階希釈（１０－１、１０－２、．．．、および１０－６）でＶ２７細胞においてプラークを生成した。図３および４を参照のこと。１０－６希釈では約２～１０プラークがあり、細胞変性効果（ＣＰＥ）が１０－１および１０－２希釈で観察された。これは、それぞれ１００μＬおよび１０μＬの回収に相当する。
Ｖｅｒｏ細胞（ＩＣＰ２７欠失ＨＳＶ－１ウイルス増殖に必要とされるＩＣＰ２７機能を欠く）では、段階希釈１０－１および１０－２で４つのＩＣＰ２７欠失ＨＳＶ－１－ＢＡＣクローンのいずれからもプラークは観察されなかった。図３および４を参照のこと。
対照として、ＢＨＫ１５３細胞でのＨＳＶ－１ ＫＯＳ１．１－ＢＡＣ ＤＮＡのトランスフェクションによって前もって生成した野生型ＨＳＶ－１ ＫＯＳ１．１－ＢＡＣウイルスに感染後、段階希釈１０－１、１０－２、および１０－３でＣＰＥがＶｅｒｏ細胞において観察された（データ不図示）。
実施例９
完全なＩＣＰ２７欠失を有するｒＨＳＶベクターの生成、およびヒトジストロフィンミニ遺伝子かまたはＡＡＶ Ｒｅｐ／Ｃａｐコード配列のいずれかとのＴＫ遺伝子座の置換
この例では、ＨＳＶ－１チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子座（ＵＬ２３）を、ヒトジストロフィンミニ遺伝子（マイクロジストロフィン）などの目的の遺伝子（ＧＯＩ）か、またはｒＡＡＶ産生に必要とされる任意のＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ発現カセットかのいずれかと置換するために、実施例８のＩＣＰ２７欠失ＨＳＶ－１－ＢＡＣベクターを相同組換えによってさらに修飾した。２つのｒＨＳＶベクター（ｒＨＳＶ ＧＯＩ；およびｒＨＳＶｒｅｐ／ｃａｐ）による適切なプロデューサー細胞株の同時感染は、遺伝子治療のためのｒＡＡＶ遺伝子治療ベクターを生成するのに使用することができる。
これを達成する１つの方法は、上記したようにｇａｌＫ選択を使用した２段階プロセスを使用することによる。まず、エレクトロポレーションおよび組換えによりＴＫ遺伝子座（ＵＬ２３）をｇａｌＫカセットと置換する。２つのプライマーを使用するＰＣＲによってｇａｌＫカセットを増幅する。各プライマーはｇａｌＫカセットに隣接し、ＨＳＶ－１ ＴＫ遺伝子座配列（ＵＬ２３）内の挿入部位の両側の少なくとも５０ｂｐ配列の配列を増幅する。得られたＰＣＲ産物は、エレクトロポレーションおよび組換えのための２つの５０ｂｐ ＴＫ相同領域に隣接したｇａｌＫコード配列を有する。得られたＰＣＲ産物を、次いで、ＩＣＰ２７欠失ＨＳＶ－１－ＢＡＣクローンを有する大腸菌ＳＷ１０２に導入して（実施例８を参照のこと）、相同組換えを行う。陽性ｇａｌＫ選択は、完全なＩＣＰ２７欠失およびＨＳＶ ＴＫ遺伝子へのｇａｌＫ遺伝子挿入の両方を有する、修飾されたＩＣＰ２７欠失ＨＳＶ－１－ＢＡＣゲノムをもたらした（ＩＣＰ２７欠失ＨＳＶ－１－ＢＡＣ ＴＫｍｕｔ／ｇａｌＫ＋）。
次のステップでは、エレクトロポレーションおよび組換えにより、ｇａｌＫをＧＯＩかまたはｒｅｐ／ｃａｐ ＤＮＡカセットのいずれかと置換し、ｒＡＡＶ産生のための一対のｒＨＳＶベクター（ｒＨＳＶ ＧＯＩおよびｒＨＳＶｒｅｐ／ｃａｐ）をもたらす。
あるいは、異なるアプローチとして、ｇａｌＫ選択マーカーをＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ発現カセットかまたはＧＯＩのいずれかに最初に挿入して、ｇａｌＫ標識ｒｅｐ／ｃａｐ発現カセットまたはｇａｌＫ標識ＧＯＩを生成した後、ｇａｌＫ標識ｒｅｐ／ｃａｐ発現カセットまたはｇａｌＫ標識ＧＯＩを、ＩＣＰ２７欠失ＨＳＶ ＴＫ遺伝子座に相同組換えを使用して挿入した。データ不図示。
さらにあるいは、ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接するＧＯＩカセットが安定に組み込まれたプロデューサー細胞株（ＰＣＬ）を使用して、ＡＡＶの産生のための単一のｒＨＳＶ ｒｅｐ／ｃａｐベクターを構築してもよい。
そのような対のｒＨＳＶベクターの１つは、ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接する目的の遺伝子（ＧＯＩ）を有する。具体的には、目的の遺伝子は、（ＷＯ／２０１６／１１５５４３として公開された、参照により本明細書に組み込まれる）ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１３７３３に記載されているジストロフィンミニ遺伝子であってもよい。１つのそのような特定のマイクロジストロフィン遺伝子は、ＣＫ８プロモーターの転写制御下で、完全長ジストロフィンタンパク質のＲ１、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ２３、およびＲ２４スペクトリン様リピートのコード配列を含み、本明細書では「ＣＫ８－ＨｕＤｙｓ５」と呼ばれる。ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接する目的の遺伝子は、エレクトロポレーションおよび組換えに必要とされる５０ｂｐ相同領域にさらに隣接する（例えば、ＴＫ－ＩＴＲ－ＣＫ８－ＨｕＤｙｓ５－ＩＴＲ－ＴＫ）。構築物全体はプラスミドに担持されてもよく（例えば、ｐＪ２３４ＴＫ－ＩＴＲ－ＣＫ８－ＨｕＤｙｓ５－ＩＴＲ－ＴＫ－Ｆｉｎａｌ）、プラスミドは、大腸菌（一例としてＳＷ１０２）におけるＩＣＰ２７欠失ＨＳＶ－１－ＢＡＣ ＴＫｍｕｔ／ｇａｌＫ＋での相同組換えの前にＮｒｕＩおよびＺｒａＩによって線状化することができる。ｇａｌＫネガティブ選択後、ｇａｌＫを除去し、ＴＫ位置に挿入されたＧＯＩカセットを有する成功した組換え体（ＩＣＰ２７欠失ＨＳＶ－１－ＢＡＣ ＴＫｍｕｔ／ＩＴＲ－ＧＯＩ－ＩＴＲ）について、クローンをスクリーニングする。これは、完全欠失ＩＣＰ２７（ＵＬ５４）遺伝子、ＴＫｍｕｔ遺伝子を含む、修飾されたｒＨＳＶ ＢＡＣベクターであり、後者の遺伝子は、ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接するＣＫ８プロモーターの制御下でヒトジストロフィンミニ遺伝子によって置換される。
さらに、ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接するＧＯＩカセットが安定に組み込まれたプロデューサー細胞株（ＰＣＬ）を使用して、ＡＡＶの産生のための単一のｒＨＳＶ ｒｅｐ／ｃａｐベクターを構築してもよい。
実質的に同じアプローチを使用して、任意のＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ発現カセットをＩＣＰ２７欠失ＨＳＶ－１－ＢＡＣ ＴＫｍｕｔ／ｇａｌＫ＋のＴＫ（ＵＬ２３）遺伝子座に挿入して、ｇａｌＫネガティブ選択によりＩＣＰ２７欠失ＨＳＶ－１－ＢＡＣ ＴＫｍｕｔ／ｇａｌＫ＋でエレクトロポレーションおよび組換えを行った後に、ＩＣＰ２７欠失ＨＳＶ－１－ＢＡＣ ＴＫｍｕｔ／ｒｅｐ／ｃａｐをもたらすことができる。ｒｅｐ／ｃａｐカセットは、ＴＫ遺伝子座に隣接する５０ｂｐ配列相同領域を含むプライマーを使用してＰＣＲ増幅によって生成することができる。
上記の構築物では、ＨＳＶゲノムはｐＢＡＣプラスミドに挿入され、その挿入配列はｌｏｘＰ配列に隣接した。ＢＡＣ配列は、ＩＣＰ２７欠失ＨＳＶ－１－ＢＡＣ ＴＫｍｕｔ／ＩＴＲ－ＧＯＩ－ＩＴＲ、およびＩＣＰ２７欠失ＨＳＶ－１－ＢＡＣ ＴＫｍｕｔ／ｒｅｐ／ｃａｐ骨格から、それぞれＢＡＣベクターおよびＣｒｅ発現（Ｃｒｅ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ）プラスミドをＩＣＰ２７発現ＢＨＫまたはＶｅｒｏ細胞へ同時トランスフェクトすることによって除去することができる。ＢＡＣ配列を欠く子孫ウイルスのプラーク精製は、ウイルスＩＣＰ２７欠失ＨＳＶ－１ ＴＫｍｕｔ／ＩＴＲ－ＧＯＩ－ＩＴＲ、およびＩＣＰ２７欠失ＨＳＶ－１ ＴＫｍｕｔ／ｒｅｐ－ｃａｐをもたらす。
例えば、ｒＡＡＶベクターは、実施例６に従って、これらの２つのｒＨＳＶベクターを使用して産生することができる。得られたｒＡＡＶベクターは、ＩＴＲ配列内に筋肉特異的ＣＫ８プロモーターの制御下のヒトジストロフィンミニ遺伝子ＨｕＤｙｓ５を有し、筋ジストロフィーを処置する遺伝子治療において容易に使用することができる。
上記のプロセスのわずかな変形は、相同組換えを使用して、任意のＧＯＩを任意の他のＧＯＩによって直接置換するステップを含んでもよい。例えば、ＩＣＰ２７欠失ＨＳＶ－１ ＴＫｍｕｔ／ＩＴＲ－ＧＯＩ－ＩＴＲクローンの生成後、ｇａｌＫ選択によりＧＯＩを別のＧＯによって直接置換してもよい。例えば、新旧のＧＯＩの プロモーターおよびポリＡ領域が同じならば、それらは、相同組換えのための５０ｂｐの最小相同領域として機能することができる。これらの配列が異なるならば、次いでスペーサー領域が使用され得る（それらが少なくとも５０ｂｐ長であるならば）。
具体的には、プロモーターおよびポリＡ領域が同一であるとして、ｇａｌＫカセットは、まず、ＧＯＩコード配列のプロモーターとポリＡ配列の間のＩＣＰ２７欠失ＨＳＶ－１ ＴＫｍｕｔ／ＩＴＲ－ＧＯＩ－ＩＴＲにエレクトロポレーションおよび組換えによって挿入され得る。ｇａｌＫポジティブ選択後、そのプロモーターとポリＡシグナル配列の間のＧＯＩのコード配列がｇａｌＫによって置換された、ＩＣＰ２７欠失ＨＳＶ－１ ＴＫｍｕｔ／ＩＴＲ－プロモーター－ｇａｌＫ－ポリＡ－ＩＴＲが得られる。次に、ＩＣＰ２７欠失ＨＳＶ－１ ＴＫｍｕｔ／ＩＴＲ－ｐｒｏｍ－ｇａｌＫ－ポリＡ－ＩＴＲ中の挿入されたｇａｌＫカセットが、エレクトロポレーションおよび組換えにより別のＧＯＩ由来のコード配列によって置換される。ＩＣＰ２７欠失ＨＳＶ－１ ＴＫｍｕｔ／ＩＴＲ－ＧＯＩ－ＩＴＲは、ｇａｌＫネガティブ選択後に得られる。
同様に、ＡＡＶ ｒｅｐ－ｃａｐＸ発現カセットを、ＩＣＰ２７欠失ＨＳＶ－１ ＴＫｍｕｔ／ｇａｌＫ＋の欠失されたＴＫ（ＵＬ２３）遺伝子座に挿入して、ｇａｌＫネガティブ選択によりＩＣＰ２７欠失ＨＳＶ－１ ＴＫｍｕｔ／ｇａｌＫ＋でエレクトロポレーションおよび組換えを行った後に、ＩＣＰ２７欠失ＨＳＶ－１ ＴＫｍｕｔ／ｒｅｐ－ｃａｐＸをもたらすことができる。
ＢＡＣ配列は、ＩＣＰ２７欠失ＨＳＶ－１－ＢＡＣ ＴＫｍｕｔ／ＩＴＲ－ＧＯＩ－ＩＴＲ、およびＩＣＰ２７欠失ＨＳＶ－１－ＢＡＣ ＴＫｍｕｔ／ｒｅｐ／ｃａｐＸ骨格から、それぞれＢＡＣベクターおよびＣｒｅ発現プラスミドをＩＣＰ２７発現ＢＨＫまたはＶｅｒｏ細胞へ同時トランスフェクトすることによって除去することができる。ＢＡＣ配列を欠く子孫ウイルスのプラーク精製は、ウイルスＩＣＰ２７欠失ＨＳＶ－１ ＴＫｍｕｔ／ＩＴＲ－ＧＯＩ－ＩＴＲ、およびＩＣＰ２７欠失ＨＳＶ－１ ＴＫｍｕｔ／ｒｅｐ－ｃａｐＸをもたらす。
実施例１０
完全なＩＣＰ２７欠失を有するｒＨＳＶベクターの生成、およびヒトジストロフィンミニ遺伝子かまたはＡＡＶ Ｒｅｐ／Ｃａｐコード配列－ＦＲＴ構築物のいずれかとのＴＫ遺伝子座の置換－ＦＲＴ構築物
この例では、および実施例９と同様に、実施例８のＩＣＰ２７欠失ＨＳＶ－１－ＢＡＣベクターを、ヒトジストロフィンミニ遺伝子などの目的の遺伝子か、またはｒＡＡＶ産生に必要とされるＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ発現カセットのいずれかをＨＳＶ－１ ＴＫ遺伝子座（ＵＬ２３）に挿入することによってさらに修飾する。この例と実施例９の違いは、中間体構築物中のｇａｌＫカセット、およびＧＯＩ（例えばジストロフィンミニ遺伝子）、およびｒｅｐ－ｃａｐ発現カセットが、全てｆｒｔＧおよびｆｒｔＨ配列に隣接して構築物のより容易な交換を促す点である。故に、大腸菌におけるエレクトロポレーションおよび組換えは、ｆｒｔＧおよびｆｒｔＨ部位に隣接するｇａｌＫカセットとＴＫ遺伝子座を置換するために最初に使用するのみであり、次いで、ＦＬＰ組換えによりＧＯＩかまたはｒｅｐ－ｃａｐ発現カセットのいずれかによってｇａｌＫを置換することができる。
これもやはり、上記したようにｇａｌＫ選択を使用して２段階プロセスで達成される。まず、エレクトロポレーションおよび組換えによりＴＫ遺伝子座（ＵＬ２３）をｆｒｔＧ－ｇａｌＫ－ｆｒｔＨカセットと置換する。２つのプライマーを用いるＰＣＲによってｆｒｔＧ－ｇａｌＫ－ｆｒｔＨカセットを増幅する。各プライマーは、ＨＳＶ－１ ＴＫ遺伝子座（ＵＬ２３）に隣接する配列と相同な５０ｂｐの配列を有する。得られたＰＣＲ産物は、ｆｒｔＧおよびｆｒｔＨに隣接するｇａｌＫコード配列を中央に有し、ｆｒｔＧおよびｆｒｔＨは次に、相同組換えのための２つの５０ｂｐ ＴＫ相同領域に隣接する。ＰＣＲ産物は、次いで相同組換えのために、ＩＣＰ２７欠失ＨＳＶ－１－ＢＡＣクローンを有する大腸菌（例えば、ＳＷ１０２）に導入する（実施例８を参照のこと）。陽性ｇａｌＫ選択は、完全なＩＣＰ２７欠失およびＴＫ欠失の両方を有し、ｇａｌＫがｆｒｔＧおよびｆｒｔＨ部位に隣接している、ＢＡＣベクター上の修飾されたｒＨＳＶをもたらす（ＩＣＰ２７欠失ＨＳＶ－１－ＢＡＣ ＴＫｍｕｔ／ｆｒｔＧ－ｇａｌＫ－ｆｒｔＨ）。このＢＡＣクローンを次いで、ＦＬＰ組換えにより、任意のＩＴＲ－ＧＯＩ－ＩＴＲカセット、および任意のｒｅｐ／ｃａｐカセットのアクセプターとしてその後使用する。
次のステップでは、ｇａｌＫを２つの構築物のどちらか１つとＦＬＰ組換えにより置換し、ｒＡＡＶ産生に有用な一対のｒＨＳＶベク２ターをもたらす。
そのようなｒＨＳＶベクターの１つは、ｆｒｔＧおよびｆｒｔＨ部位にさらに隣接する、ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接する目的の遺伝子（ＧＯＩ）を有する。具体的には、目的の遺伝子は、（ＷＯ／２０１６／１１５５４３として公開され、参照により本明細書に組み込まれる）ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１３７３３に記載されているジストロフィンミニ遺伝子であってもよい。１つのそのような特定のマイクロジストロフィン遺伝子は、ＣＫ８プロモーターの転写制御下で、完全長ジストロフィンタンパク質のＲ１、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ２３、およびＲ２４スペクトリン様リピートのコード配列を含み、本明細書では「ＣＫ８－ＨｕＤｙｓ５」と呼ばれる。あるいは、本明細書において上記したものなど、異なるジストロフィンミニ遺伝子のいずれかが挿入されてもよい。
ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接する目的の遺伝子は、ｆｒｔＧおよびｆｒｔＨ部位にさらに隣接する（ｆｒｔＧ－ＩＴＲ－ＧＯＩ－ＩＴＲ－ｆｒｔＨ）。構築物全体は、ＩＣＰ２７欠失ＨＳＶ－１－ＢＡＣ ＴＫｍｕｔ／ｆｒｔＧ－ｇａｌＫ－ｆｒｔＨでのＦＬＰ組換えのためにトランスファープラスミドに担持されてもよい。ｇａｌＫネガティブ選択後、ｇａｌＫを失っている成功した組換え体は、ＩＣＰ２７欠失ＨＳＶ－１－ＢＡＣ ＴＫｍｕｔ／ｆｒｔＧ－ＩＴＲ－ＧＯＩ－ＩＴＲ－ｆｒｔＨとして得ることができる。これは、完全欠失ＩＣＰ２７（ＵＬ５４）遺伝子およびＴＫ遺伝子（ＵＬ２３）を含み、後者の遺伝子がＡＡＶ ＩＴＲ配列およびｆｒｔＧ－ｆｒｔＨ部位に隣接するＧＯＩによって置換される、ＢＡＣベクター上の修飾されたｒＨＳＶベクターである。
実質的に同じアプローチを使用して、ＡＡＶ ｒｅｐ－ｃａｐＸ（任意の適切な／所望のＡＡＶカプシドのための）発現カセットをＩＣＰ２７欠失ＨＳＶ－１－ＢＡＣ ＴＫｍｕｔ／ｆｒｔＧ－ｇａｌＫ－ｆｒｔＨのＴＫ（ＵＬ２３）遺伝子座に挿入し、ＦＬＰ組換えと、その後のｇａｌＫネガティブ選択を行った後に、ＩＣＰ２７欠失ＨＳＶ－１－ＢＡＣ ＴＫｍｕｔ／ｆｒｔＧ－ｒｅｐ－ｃａｐＸ－ｆｒｔＨをもたらすことができる。
ＩＣＰ２７欠失ＨＳＶ－１－ＢＡＣ ＴＫｍｕｔ／ｆｒｔＧ－ＩＴＲ－ＧＯＩ－ＩＴＲ－ｆｒｔＨにおけるｌｏｘＰ隣接ＢＡＣ骨格、およびＩＣＰ２７欠失ＨＳＶ－１－ＢＡＣ ＴＫｍｕｔ／ｆｒｔＧ－ｒｅｐ－ｃａｐＸ－ｆｒｔＨにおけるｌｏｘＰ隣接ＢＡＣ骨格は、それぞれＢＡＣベクターおよびＣｒｅ発現プラスミドをＶｅｒｏ細胞へ同時トランスフェクトすることによって、両方とも排除することができる。ベータガラクトシダーゼを欠く子孫ウイルスのプラーク精製は、ウイルスＩＣＰ２７欠失ＨＳＶ－１－ＢＡＣ ＴＫｍｕｔ／ｆｒｔＧ－ＩＴＲ－ＧＯＩ－ＩＴＲ－ｆｒｔＨ、およびＩＣＰ２７欠失ＨＳＶ－１－ＢＡＣ ＴＫｍｕｔ／ｆｒｔＧ－ｒｅｐ－ｃａｐＸ－ｆｒｔＨをもたらす。
ｒＡＡＶベクターは、実施例６に従って、これらの２つのｒＨＳＶベクターを使用して産生することができる。得られたｒＡＡＶベクターは、ＩＴＲ配列内にヒトジストロフィンミニ遺伝子などの任意のＧＯＩを有し、筋ジストロフィーを処置する遺伝子治療において容易に使用することができる。
実施例１１
完全なＩＣＰ２７欠失を有するｒＨＳＶベクターの生成、およびＩＣＰ２７補完細胞における相同組換えによるＴＫ（ＵＬ２３）遺伝子座へのＡＡＶ Ｒｅｐ／Ｃａｐコード配列の挿入と、その後のＨＳＶクローンのアシクロビル選択
この例では、および実施例９と同様に、実施例８のＩＣＰ２７欠失ＨＳＶ－１－ＢＡＣベクターを、ｒＡＡＶ産生に必要とされるＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ発現カセットをＨＳＶ－１ ＴＫ遺伝子座（ＵＬ２３）に挿入することによってさらに修飾する。この例と実施例９の違いは、適切な大腸菌株におけるエレクトロポレーションの代わりに、真核生物ＩＣＰ２７補完細胞への同時トランスフェクション後に相同組換えが行われる点、ならびに中間体構築物におけるｇａｌＫカセットの選択および／または反対の選択の代わりに、ＨＳＶクローンの選択に使用される選択マーカーが、インタクトなＴＫ遺伝子を含むクローンに対するアシクロビル（ＡＣＶ）である点である。
同一ではないが類似したアプローチも、ヒトジストロフィンミニ遺伝子などの任意の目的の遺伝子をＴＫ遺伝子座に挿入するのに使用することができる。
具体的には、アシクロビルは、主に単純ヘルペスウイルス感染、水痘、帯状疱疹および他のヘルペスウイルスの処置に使用される、１９７４年に最初に開発された抗ウイルス薬である。アシクロビルは、実験室試薬としても利用することができる。アシクロビルは、ヘルペスＴＫ（チミジンキナーゼ）酵素によってアシクロビル一リン酸に変換され、次いで宿主細胞キナーゼによってアシクロビル三リン酸（ＡＣＶ－ＴＰ）に変換されるヌクレオシド類似体である。ＡＣＶ－ＴＰは、ヘルペス特異的ＤＮＡポリメラーゼを不活性化する競合的阻害剤であり、それ故に正常な細胞プロセスに影響を与えることなくさらなるウイルスＤＮＡ合成を防ぐ。
相同組換えを使用して、ＧＯＩ（ヒトジストロフィンミニ遺伝子など）またはこの場合ではＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ８発現カセットを、ＨＳＶ ＴＫ遺伝子座ＵＬ２３を取り囲む相同領域に隣接させることができ、ドナーＤＮＡとして使用してＨＳＶベクター中のＴＫ遺伝子を不活性化することができる。相同組換えによりＴＫ遺伝子機能を失っている（およびそれ故に同時にＧＯＩまたはｒｅｐ／ｃａｐカセットを獲得している）ＨＳＶのみが、アシクロビルの存在下で増殖しながら生き残ることができる。
このアプローチを使用することにより、発現カセットの両側で ＨＳＶ ＴＫ遺伝子座を取り囲む約５０ｂｐの相同領域に隣接するｒｅｐｃａｐ発現カセットを使用して、ＩＣＰ２７欠失ＨＳＶ－１－ＢＡＣベクター上のＴＫ遺伝子座（ＵＬ２３）を２２．５μｇ／ｍＬのアシクロビル選択に基づき不活性化した。具体的には、ＩＣＰ２７欠失ＨＳＶ－１－ＢＡＣベクターとの重複配列がない機能性ＩＣＰ－２７遺伝子を発現するＶ７５．４細胞、Ｖｅｒｏ由来細胞株に、ＩＣＰ２７欠失ＨＳＶ－１－ＢＡＣベクター（Ｃｒｅで前処置した）、およびＨＳＶ ＴＫ遺伝子座を取り囲む約５０ｂｐの相同領域に両側で隣接するｒｅｐｃａｐ８発現カセットを包含するドナーＤＮＡを含有するプラスミドを同時トランスフェクトした。Ｖ７５．４細胞を次いでアシクロビル約２２．５μｇ／ｍＬの存在下で培養して、相同組換えによりＨＳＶ ＴＫ遺伝子座をおそらく不活性化しているクローンを選択した。アシクロビル耐性クローンは、感染後３～７日（３～７ｄｐｉ）時点で観察され、ｒｅｐｃａｐ８発現カセットの存在をｑＰＣＲアッセイによって確認した。
この同じ選択スキームは、ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接するＧＯＩ、例えばＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接するミニジストロフィン発現カセットを含む本発明のＩＣＰ２７欠失ＨＳＶ－１－ＢＡＣベクターのＴＫ遺伝子座に挿入する場合にも使用することができる。
ｒＡＡＶベクターは、次いで、実施例６に従ってこれらの２つのｒＨＳＶベクターを使用して産生することができる。得られたｒＡＡＶベクターは、ＩＴＲ配列内にヒトジストロフィンミニ遺伝子などの任意のＧＯＩを有し、筋ジストロフィーを処置する遺伝子治療において容易に使用することができる。
実施例１２
Ｖ７５．４細胞株の生成
この例は、ＩＣＰ２７遺伝子を欠失したＨＳＶベクターを産生するためのパッケージング細胞株（Ｖ７５．４細胞株）の確立を示す。パッケージング細胞株は、ＩＣＰ２７遺伝子の完全な欠失を有する本発明のＨＳＶベクターとの配列重複がないように設計されたＩＣＰ２７コード配列を含有する。
Ｖ７５．４細胞株の生成に使用される親細胞株は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（マナッサス、ＶＡ）から入手したＶｅｒｏ細胞株ＣＣＬ－８１であった。Ｖｅｒｏ細胞株は、単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ－１）を含む様々なタイプのウイルスに極めて感染しやすいアフリカミドリザル（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ａｅｔｈｉｏｐｓ）腎臓細胞株である。ヌクレオチド配列ＵＬ５４－００２（プロモーターおよびコドン最適化 ＯＲＦ）配列番号１２を挿入して、レンチプロウイルスプラスミドから生成されたレンチウイルスベクターによって、Ｖｅｒｏ細胞を安定に形質導入した。Ｖ７５．４細胞に安定に組み込まれたＩＣＰ２７発現カセットは、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節因子エレメント（ＷＰＲＥ）配列、および配列番号１３に示されるような、３’側のＬＴＲレンチウイルス配列からのレンチウイルスポリアデニル化シグナルを含有する。
形質導入、クローニングおよび細胞株同定
５％ＣＯ２による加湿ＣＯ２制御インキュベーター中、ＤＭＥＭプラス５％ＦＢＳ、３７℃で維持したＶｅｒｏ細胞を、感染多重度（ＭＯＩ）＝１０でレンチウイルスベクターＰＲ－ＵＬ５４－００２により形質導入した。このプーからの細胞を、異なる密度で１５ｃｍ２プレートに播種してクローニングし、５％ＣＯ２による加湿ＣＯ２制御インキュベーター中、３７℃で選択なしにＤＭＥＭプラス１０％ＦＢＳで維持した。２～３週間後、単一コロニーマスターウェル（ＭＷ）をトリプシンによって剥離し、クローニングシリンダーを使用して回収した。マスターウェル（ＭＷ）からの細胞を２４ウェルプレートに播種し、同じ培地および条件で維持した。ウェルがコンフルエントに達したとき、トリプシンを使用してクローンを剥離し、２つの２４ウェルプレートに拡大した（１つはスクリーニングのための末端複製（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｌｉｃａ）用、１つは増殖用）。ＨＳＶ産生スクリーニングに予定されている培養物の一部を、ＭＯＩ＝０．１５でΔ２７ＨＳＶに感染させ、７２時間後に回収し、ＨＳＶ ＵＬ３６コピーのＤＤＰＣＲ力価および１ｍＬあたりのプラークについてテストした。
４つの優れたＭＷを同定し、表１に示す。
Figure 2022534119000002
最終的に、最も高いレベルの産生は、さらなるサブクローニングのために選択されたＭＷ ＬＶ－Ｖｅｒｏ００２ ＃７５（ＭＷ７５）で見出された。
ＭＷ７５からの細胞を、前述と同じ培地および条件で、９６ウェルプレートに０．３細胞／ウェルの密度で播種する限界希釈によってクローニングした。プレートを目視で点検して、単一細胞のみを播種されたウェルを同定した。１週間の増殖後、培地を交換し、コンフルエントに達したウェルで、トリプシンを使用してクローンを剥離し、２４ウェルプレートに拡大した。ウェルがコンフルエントに達したとき、トリプシンを使用してクローンを剥離し、２つの２４ウェルプレートに拡大した（１つはスクリーニングのための末端複製用、１つは増殖用）。ＨＳＶ産生スクリーニングに予定されている培養物の一部を、ＭＯＩ＝０．１５でΔ２７ＨＳＶに感染させ、７２時間後に回収し、ＨＳＶ ＵＬ３６コピーのＤＤＰＣＲ力価についてテストした。優れたＭＷ７５サブクローンを、図５に示すようにＵＬ３６ ＤＤＰＣＲによって選択した。
サブクローンをクローン＃４、＃２０および＃２４に絞り込み、生存率、結合時間、および継代Ｐ２６までの世代安定性について評価した。Δ２７ＨＳＶウイルスの安定性および収量はＭＷ７５クローン＃４（それ故にＶ７５．４細胞株）で最も良く（図６）、これを本発明のｒｃ－ＨＳＶフリー系でのさらなる使用のために選択した。
Ｖ７５．４を含むこれらの新たに確立されたパッケージング細胞株中のＩＣＰ－２７コード配列は、ＩＣＰ２７タンパク質のＣ末端をコードするコドン最適化領域を含有する。コドン最適化は、現在野生状態で使用されているｄ２７－１ ＨＳＶベクター中の残留ＩＣＰ２７コード配列と比べて、核酸レベルで配列相同性が最も少なくなるように設計した。ｄ２７－１ ＨＳＶベクター上の残留ＣＰ２７コード配列と、対象パッケージング細胞株中のＩＣＰ２７コード配列の間のいずれの配列重複もコドン縮重により６７％以下に低下するため、伝統的ｄ２７－１ ＨＳＶベクターを対象Ｖ７５．４型パッケージング細胞株にパッケージングする場合、ｒｃＨＳＶウイルス粒子を生成する機会を最小化するようにコドン最適化を設計した。
実際に、予備調査結果（データ不図示）は、伝統的ｄ２７－１ ＨＳＶベクターをＶ７５．４細胞株にパッケージングした場合、汚染ｒｃＨＳＶがｄ２７－１ ＨＳＶストックにない程度まで、ｒｃＨＳＶウイルス粒子は生成されないことを示した。
実施例１３
Ｖ７５．４細胞株で調製したＨＳＶ調製物における検出可能なｒｃＨＳＶの欠如
この例は、対象ＨＳＶベクターおよびパッケージング細胞株が、一緒に使用された場合、検出可能なｒｃＨＳＶ復帰変異体のないＨＳＶストックを産生することを示す。
具体的には、完全なＩＣＰ－２７欠失を有するいくつかの対象ＨＳＶベクター（本明細書における「ＳＬＢ２７」ベクター）、およびＨＳＶベクターのＴＫ遺伝子座に挿入したｒｅｐ／ｃａｐ発現カセット（ＳＬＢ２７－ＲＣ９ ＃１、＃２および＃３）またはＩＴＲ配列に隣接するＧＯＩ（ＳＬＢ２７－ｇｏｉ ＃１および＃２）のいずれかをテストした。これらのベクターを使用して対象Ｖ７５．４パッケージング細胞株を感染させて、これらのベクターの第１継代（Ｐ１）を増殖および産生した。Ｐ１ベクターを次いで使用して、Ｖ７５．４細胞を感染させてこれらのベクターの第２継代（Ｐ２）を産生した。Ｐ２継代ＨＳＶベクターを次いで、Ｖｅｒｏ細胞（機能性ＩＣＰ２７を持たない）またはＶ７５．４細胞（機能性ＩＣＰ２７を有する）のいずれかでテストし、ｄｄＰＣＲを次いで使用して、対象ＩＣＰ２７欠失ＨＳＶベクターと宿主細胞（Ｖ７５．４）中のＨＳＶ ＩＣＰ２７断片の間の望ましくない組換え事象後に生じた可能性がある任意のｒｃＨＳＶを検出した。
標準曲線を引く必要なしに、圧倒的な精度で、シグナル対ノイズ比が増加した、投入試料あたりの標的ＤＮＡコピーの絶対数をもたらすその能力のために、ここではｄｄＰＣＲを使用した。
データは、対象Ｖ７５．４細胞で増殖された任意のＳＬＢ２７調製物のＰ２において、またはＰ２をＶｅｒｏ細胞で増幅された場合、ｒｃＨＳＶは検出されない（ＢＬＱ、または「定量限界未満」）ことを示した。実際に、対象Ｖ７５．４細胞で増殖された任意のＳＬＢ２７調製物におけるＶｅｒｏプラークアッセイによって、ｒｃＨＳＶは継代Ｐ８まで検出されなかった。
対照として、部分的なＩＣＰ２７欠失およびＴＫ遺伝子座への類似のＧＯＩ挿入（Δ２７ＨＳＶｇｏｉ）を有する伝統的ＨＳＶベクターは、特にｒｃＨＳＶフリーと推定されるＨＳＶウイルスストックをＶｅｒｏ細胞でテストした場合、かなりの量のｒｃＨＳＶ復帰変異体を有する（以下の表を参照のこと）。
Figure 2022534119000003
Figure 2022534119000004
実施例１４
Ｖ７５．４細胞株で増殖された場合の不完全なＩＣＰ２７欠失と対比した、完全なＩＣＰ２７欠失を有するＨＳＶベクターのより高い力価
この例は、Ｖ７５．４などの対象パッケージング細胞株で増殖された場合、対象ＨＳＶベクターは、不完全なＩＣＰ２７欠失を有する伝統的ＨＳＶベクターより高い力価を有するＨＳＶストックを産生したことを示す。
対象ＨＳＶベクターは、同じ遺伝子座の部分的な欠失のみを有する伝統的ＨＳＶベクターと比べて、ＩＣＰ２７遺伝子座により大きなゲノム欠失を有するため、この結果は驚くべきことである。故に、対象ＨＳＶベクターは伝統的ＨＳＶベクターと比べてあまり「健康」でないと予想されていた。実際に、事前試験は、一般に使用されるｄ２７－１ ＨＳＶ株（ｄ２７－１株は、得られたＨＳＶベクター中のＩＣＰ２７のＣ末端領域コード配列の後ろに残った部分的なＩＣＰ２７欠失を有する）より大きなＨＳＶ中の欠失は、Ｖ２７パッケージング細胞株では十分に増殖せず、感染Ｖ２７細胞は成長するのに著しく長い時間がかかることを示した。より重要なことには、回収されたＨＳＶのウイルス力価は５～１０倍低かった（Ｂｕｎｎｅｌｌ、博士論文、アルバータ大学、２００１）。
故に、伝統的ｄ２７－１ ＨＳＶ株（不完全なＩＣＰ２７欠失を有する）より大きな（完全な）欠失を有する対象ＨＳＶベクターの力価が、両方とも対象Ｖ７５．４パッケージング細胞株で増殖された場合、ｄ２７－１と比べてより高い力価を実際にもたらしことは驚きであった。図７に示すように、対象ＳＬＢ２７ベクターの最大２倍（１００％）高い力価（実施例１３を参照のこと）が、Ｖ７５．４細胞中のΔ２７ＨＳＶベクターと比べて観察された。力価軸のｌｏｇスケールに注目のこと。
完全なＩＣＰ２７欠失を有する対象ＳＬＢ２７ ＨＳＶベクターを使用した場合、ｄ２７－１ ＨＳＶベクターによって感染された同じ細胞と比べて、高い～極めて高いパーセンテージの合胞体プラーク表現型が感染パッケージング細胞（すなわち、この場合Ｖ７５．４細胞）で観察されたことも驚くべきことである。合胞体プラークは、感染細胞とその隣接（非感染）細胞との融合によって形成され、多核肥大細胞の形成をもたらし、おそらくより効率の良いＨＳＶ産生につながった。合胞体プラーク形成は、より高いゲノムコピー（ｄｄＰＣＲによって測定した場合）および感染（プラーク）力価／ｍＬとして示され得る。
実際に、図８に示すように、対象ＳＬＢ２７ ＨＳＶウイルスによって感染されたＶ７５．４細胞のほとんど全ての培養物は、継代６（Ｐ６）で合胞体プラーク表現型を生じた。クローンの１つ（ＳＬＢ２７－ＲＣ９ ＃２）は、感染Ｖ７５．４細胞で７４％の合胞体プラークを有し、別のクローン（ＳＬＢ２７－ｇｏｉ ＃１）は、感染Ｖ７５．４細胞で７５％の合胞体プラークを有した。対照的に、ｄ２７－１ ＨＳＶベクターによって感染された対応するＶ７５．４培養物は、同じ条件下で合胞体プラーク形成を示さなかった。
これらの驚くべき発見は、パッケージング細胞中の相補的ＩＣＰ２７コード配列と相まって、ＨＳＶベクターにおけるＩＣＰ２７の完全な欠失が、潜在的に合胞体プラーク形成の高いパーセンテージにより、ＨＳＶウイルスストックにおける有害なｒｃＨＳＶ生成を本質的に排除しただけでなく、意外にもより効率の良いＨＳＶウイルス産生ももたらしたことを示している。
実施例１５
ＢＨＫ細胞株で増殖された場合の不完全なＩＣＰ２７欠失と対比した、完全なＩＣＰ２７欠失を有するＨＳＶベクター使用して調製されたＡＡＶベクターのより高い力価
この例は、ＡＡＶ ｒｅｐ／Ｃａｐコード配列またはＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接するＧＯＩのいずれかを有する対象ＨＳＶベクターは、ＢＨＫなどの適切なＡＡＶ産生細胞株を同時感染させるのに使用された場合、不完全なＩＣＰ２７欠失を有する類似のＨＳＶベクターによって産生されるものより高いＡＡＶ力価を産生することができることを示す。
具体的には、完全なＩＣＰ２７欠失を有する本発明の２つのＨＳＶベクター（１つはＴＫ遺伝子座にＡＡＶ９ ｒｅｐ／Ｃａｐコード配列を含み、もう１つはＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接するジストロフィンミニ遺伝子を含む）を、対象Ｖ７５．４パッケージング細胞株で増殖させてＨＳＶストックを回収した。回収ＨＳＶストックを次いで使用して、ＡＡＶ産生細胞株ＢＨＫを感染させてＡＡＶ粒子を産生した。得られたＡＡＶ力価を決定し、不完全なＩＣＰ２７欠失を有する伝統的ＨＳＶベクター（ｄ２７ＨＳＶ）を使用して同様に産生されたＡＡＶと比較した。
同じウイルス量または感染多重度（ＭＯＩ＝２）、ならびに同じ細胞数を各実験で使用した（実験あたり１×１０６細胞；各群ｎ＝３）。
ＡＡＶ収量実験に使用したΔ２７ＨＳＶ－ｇｏｉ ＃３およびΔ２７ＨＳＶ－ＲＣ９ベクターの両方で、ｒｃＨＳＶおよびＩＣＰ２７が検出され、以前の発見と一致した。対照的に、対応するＳＬＢ２７－ＲＣ９ ＃２およびＳＬＢ２７－ｇｏｉ ＃２ ＨＳＶベクターストックでは、ｒｃＨＳＶ汚染およびＩＣＰ２７は検出されなかった。
Figure 2022534119000005
図９に示すように、ＡＡＶ力価は、約２．５×１０９のＡＡＶ力価と比べて平均で約５．５×１０９であった。ｒｃＨＳＶおよびＩＣＰ２７はＡＡＶ産生を阻害し得るため、対象ＨＳＶベクターおよびパッケージング細胞株の使用に関連したはるかに高いＡＡＶ力価は、ＢＨＫ産生細胞株を感染させるのに使用したＨＳＶストックにおけるｒｃＨＳＶまたはＩＣＰ２７の欠如によるものであった可能性がある。
Figure 2022534119000006
Figure 2022534119000007
ここで引用された全ての参考文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
ＤＮＡおよびペプチド配列
Figure 2022534119000008
Figure 2022534119000009
Figure 2022534119000010
Figure 2022534119000011
Figure 2022534119000012
Figure 2022534119000013
Figure 2022534119000014
Figure 2022534119000015
Figure 2022534119000016
Figure 2022534119000017
Figure 2022534119000018
Figure 2022534119000019

Claims (50)

  1. ヘルペスウイルス目に由来する組換え複製欠損ウイルスであって、前記ウイルスが、ＩＣＰ２７をコードする遺伝子、またはその機能的等価遺伝子中の欠失によって特徴づけられ、前記欠失が少なくとも１，２００ｂｐ長であり、前記ＩＣＰ２７をコードする遺伝子（配列番号１１）、またはその機能的等価遺伝子の最も３’末端の３００ｂｐ、２５０ｂｐ、２００ｂｐ、１５０ｂｐ、１００ｂｐ、５０ｂｐ、３０ｂｐ、２０ｂｐ、１０ｂｐ、９ｂｐ、８ｂｐ、７ｂｐ、６ｂｐ、５ｂｐ、４ｂｐ、３ｂｐ、２ｂｐ、１ｂｐまたは０ｂｐ以下を残す、前記ウイルス。
  2. 非臨床（または実験室）株ウイルスである、または非臨床（または実験室）株ウイルスに由来する、請求項１に記載の組換え複製欠損ウイルス。
  3. 前記欠失が、前記ＩＣＰ２７をコードする遺伝子または前記その機能的等価遺伝子のコード配列（またはＯＲＦ）全体を含む、請求項１または２に記載の組換え複製欠損ウイルス。
  4. 前記欠失が、前記ＩＣＰ２７をコードする遺伝子もしくは前記その機能的等価遺伝子のプロモーター領域全体、または前記プロモーター領域の一部（例えば、最も３’側の約４００ヌクレオチド）をさらに含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の組換え複製欠損ウイルス。
  5. 前記ＩＣＰ２７をコードする遺伝子が、配列番号１１のポリヌクレオチド配列を有する、請求項１～４のいずれか１項に記載の組換え複製欠損ウイルス。
  6. 前記ウイルスが、アロヘルペスウイルス科またはマラコヘルペスウイルス科に由来する、請求項１～５のいずれか１項に記載の組換え複製欠損ウイルス。
  7. 前記ウイルスが、ヘルペスウイルス科に由来する、請求項１～５のいずれか１項に記載の組換え複製欠損ウイルス。
  8. 前記ウイルスが、アルファヘルペスウイルス亜科、ベータヘルペスウイルス亜科、またはガンマヘルペスウイルス亜科に由来する、請求項７に記載の組換え複製欠損ウイルス。
  9. 前記ウイルスが、ＨＨＶ－１（単純ヘルペスウイルス－１またはＨＳＶ－１）、ＨＨＶ－２（単純ヘルペスウイルス－２またはＨＳＶ－２）、ＨＨＶ－３（水痘帯状疱疹ウイルスまたはＶＺＶ）、ＨＨＶ－４（エプスタインバーウイルスまたはＥＢＶ）、ＨＨＶ－５（サイトメガロウイルスまたはＣＭＶ）、ＨＨＶ－６Ａ／ＨＨＶ－６Ｂ（ロゼオロウイルス、ヘルペスリンパ球向性ウイルス）、ＨＨＶ－７、またはＨＨＶ－８（カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスまたはＫＳＨＶ）に由来する、請求項８に記載の組換え複製欠損ウイルス。
  10. 前記ウイルスが、オナガザルヘルペスウイルス－１（ＣｅＨＶ－１）またはネズミヘルペスウイルス６８（ＭＨＶ－６８またはＭｕＨＶ－４）に由来する、請求項８に記載の組換え複製欠損ウイルス。
  11. 前記ウイルスが、クモザルヘルペスウイルス１（Ａｔｅｌｉｎｅ ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ １）、クモザルヘルペスウイルス（ｓｐｉｄｅｒ ｍｏｎｋｅｙ ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ）、ブタヘルペスウイルス、ウシヘルペスウイルス２、オナガザルヘルペスウイルス１（ヘルペスＢウイルス）、オオコウモリアルファヘルペスウイルス１、ウサギヘルペスウイルス４、マカクヘルペスウイルス１、カンガルーヘルペスウイルス２、およびヒヒヘルペスウイルス２などのシンプレックスウイルス属に由来する、請求項８に記載の組換え複製欠損ウイルス。
  12. 前記ウイルスが、ウシヘルペスウイルス１、ウシヘルペスウイルス５、スイギュウヘルペスウイルス１、ヤギヘルペスウイルス１、イヌヘルペスウイルス１、オナガザルヘルペスウイルス９、シカヘルペスウイルス１、シカヘルペスウイルス２、ヘラジカヘルペスウイルス１、ウマヘルペスウイルス１、ウマヘルペスウイルス３、ウマヘルペスウイルス４、ウマヘルペスウイルス８、ウマヘルペスウイルス９、ネコヘルペスウイルス１、およびブタヘルペスウイルス１などのバリセロウイルス属に由来する、請求項８に記載の組換え複製欠損ウイルス。
  13. 前記ウイルスが、カモヘルペスウイルス１、ハトヘルペスウイルス１、トリヘルペスウイルス２、トリヘルペスウイルス３（ＧａＨＶ－３またはＭＤＶ－２）、シチメンチョウヘルペスウイルス１（ＨＶＴ）、およびクジャクヘルペスウイルス１などのマルディウイルス属に由来する、請求項８に記載の組換え複製欠損ウイルス。
  14. 前記ウイルスが、トリヘルペスウイルス１、およびオウムヘルペスウイルス１などのイルトウイルス（Ｌｉｔｏｖｉｒｕｓ）属に由来する、請求項８に記載の組換え複製欠損ウイルス。
  15. 前記ウイルスが、アカウミガメヘルペスウイルス（Ｃａｒｅｔｔａ ｃａｒｅｔｔａ ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ）、ウミガメヘルペスウイルス１、ウミガメヘルペスウイルス２、ウミガメヘルペスウイルス３、ウミガメヘルペスウイルス４、アオウミガメヘルペスウイルス、クーバーヘルペスウイルス（Ｃｏｏｂｅｒ ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ）、ヌマガメヘルペスウイルス１、ヌマガメヘルペスウイルス２、線維乳頭腫関連ヘルペスウイルス、カタトカゲヘルペスウイルス１、カタトカゲヘルペスウイルス２、カタトカゲヘルペスウイルス３、モリイシガメ（Ｇｌｙｐｔｅｍｉｓ）ヘルペスウイルス１、モリイシガメヘルペスウイルス２、イグアナヘルペスウイルス１、イグアナヘルペスウイルス２、アカウミガメ口腔皮膚ヘルペスウイルス（Ｌｏｇｇｅｒｈｅａｄ ｏｒｏｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ）、肺－眼－気管関連ヘルペスウイルス、ヨコクビガメヘルペスウイルス１、ミシシッピアカミミガメヘルペスウイルス、アメリカハコガメヘルペスウイルス１、アメリカハコガメヘルペスウイルス２、リクガメヘルペスウイルス１、リクガメヘルペスウイルス２、リクガメヘルペスウイルス３、リクガメヘルペスウイルス４、およびオオトカゲヘルペスウイルス１などの爬虫類アルファヘルペスウイルスに由来する、請求項８に記載の組換え複製欠損ウイルス。
  16. 前記ウイルスが、アルセラフィンヘルペスウイルス１、アルセラフィンヘルペスウイルス２、クモザルヘルペスウイルス２、ウシヘルペスウイルス４、オナガザルヘルペスウイルス１７、ウマヘルペスウイルス２、ウマヘルペスウイルス５、ウマヘルペスウイルス７、ニホンザルラディノウイルス、ウサギヘルペスウイルス１、およびネズミヘルペスウイルス４（マウスガンマヘルペスウイルス－６８またはＭＨＶ－６８）などのラディノウイルス属に由来する、請求項８に記載の組換え複製欠損ウイルス。
  17. 前記ウイルスが、ＫＯＳ、ＫＯＳ１．１、ＫＯＳ１．１Ａ、ＫＯＳ６３、ＫＯＳ７９、ＭｃＫｒａｅ、Ｓｔａｉｎ １７、Ｆ１７、またはＭｃＩｎｔｙｒｅなどのＨＳＶ－１の株である、請求項９に記載の組換え複製欠損ウイルス。
  18. 前記その機能的等価遺伝子が、ＫＳＨＶのＯＲＦ５７、ＥＢＶのＭｔａ／ＳＭ／ＥＢ２、またはヒトＣＭＶのＵＬ６９である、請求項１～１７のいずれか１項に記載の組換え複製欠損ウイルス。
  19. ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質のコード配列、ならびに／またはＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接する目的の遺伝子（ＧＯＩ）をさらに含む、請求項１～１８のいずれか１項に記載の組換え複製欠損ウイルス。
  20. 前記ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質の前記コード配列、ならびに／またはＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接する前記目的の遺伝子（ＧＯＩ）が、ウイルスの非必須遺伝子（例えば、ウイルス複製に必要とされず、ウイルスパッケージングに必要とされない）に組み込まれる、またはウイルスの非必須遺伝子を置換する、請求項１９の組換え複製欠損ウイルス。
  21. ＩＣＰ２７またはその機能的等価物を宿主細胞で発現させることができる組換えベクターであって、
    （１）宿主細胞において前記コード配列の転写を指示することができるプロモーターに作動可能に連結された、前記ＩＣＰ２７または前記その機能的等価物のコード配列と；
    （２）コード配列の３’側のポリアデニル化部位と；
    （３）場合により、１つまたは複数のマルチクローニング部位とを含み；
    請求項１～２０のいずれか１項に記載のウイルスの３００ｂｐ、２５０ｂｐ、２００ｂｐ、１５０ｂｐ、１００ｂｐ、５０ｂｐ、３０ｂｐ、２０ｂｐ、１０ｂｐ、９ｂｐ、８ｂｐ、７ｂｐ、または６ｂｐ以下の連続ヌクレオチドを含有する前記ベクター。
  22. 前記ＩＣＰ２７が、配列番号１０のアミノ酸配列を有する、または配列番号１０と少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．２％、９９．４％、９９．６％、もしくは９９．８％同一である、請求項２１に記載の組換えベクター。
  23. プロモーターが少なくとも４００ポリヌクレオチドを含む、請求項２１または２２に記載の組換えベクター。
  24. プロモーターが、配列番号１１のヌクレオチド１～５３８、配列番号１１のヌクレオチド１２７～５３８、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＴ８８７２２４のヌクレオチド１１３，１３９～１１３，５５０、またはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＴ８８７２２４のヌクレオチド１１３，０１３～１１３，５５０を含む、請求項２３に記載の組換えベクター。
  25. 前記コード配列が、哺乳動物宿主細胞での発現のために部分的または完全にコドン最適化されている、請求項２１～２４のいずれか１項に記載の組換えベクター。
  26. コード配列の最も３’側の３００～３５０ヌクレオチドが、哺乳動物宿主細胞での発現のためにコドン最適化されている、請求項２５に記載の組換えベクター。
  27. 前記ポリアデニル化部位が、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化部位である、請求項２１～２６のいずれか１項に記載の組換えベクター。
  28. 前記ＩＣＰ２７のコード配列が、宿主細胞ｐｒｅ－ｍＲＮＡスプライシングの阻害を低減する一方で、ＨＳＶ後期遺伝子発現を可能にする変異を含む、請求項２１～２７のいずれか１項に記載の組換えベクター。
  29. 変異が、ｖＢＳ３．３二重変異、ｖＢＳ４．３二重変異、またはｖＢＳ５．３二重変異である、請求項２８に記載の組換えベクター。
  30. 宿主細胞が、前記ＩＣＰ２７または前記その機能的等価物を発現することができる、請求項２１～２９のいずれか１項に記載の組換えベクターを含む宿主細胞。
  31. 組換えベクターが宿主細胞ゲノムに安定に組み込まれる、請求項３０に記載の宿主細胞。
  32. ＢＨＫ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、またはＨＥＫ２９３細胞である、請求項３０または３１に記載の宿主細胞。
  33. 請求項１～２０のいずれか１項に記載の組換え複製欠損ウイルスを増殖／増幅／産生する方法であって、請求項３０～３２のいずれか１項に記載の宿主細胞を、請求項１～２０のいずれか１項に記載の組換え複製欠損ウイルスに感染させるステップを含む前記方法。
  34. 請求項３０～３２のいずれか１項に記載の感染宿主細胞から、請求項１～２０のいずれか１項に記載の組換え複製欠損ウイルスを回収するステップをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
  35. 請求項１～２０のいずれか１項に記載の組換え複製欠損ウイルスと、前記ＩＣＰ２７または前記その機能的等価物のコード配列の間に、３００ｂｐ、２５０ｂｐ、２００ｂｐ、１５０ｂｐ、１００ｂｐ、５０ｂｐ、３０ｂｐ、２０ｂｐ、１０ｂｐ、９ｂｐ、８ｂｐ、７ｂｐ、６ｂｐ、５ｂｐ、４ｂｐ、３ｂｐ、または２ｂｐ以下の配列重複がある、請求項３３または３４に記載の方法。
  36. ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接する目的の遺伝子（ＧＯＩ）コード配列を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を産生する方法であって、ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質のコード配列を含む請求項１９または２０に記載の第１の組換え複製欠損ウイルス、ならびにＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接する目的の遺伝子（ＧＯＩ）を含む請求項１９または２０に記載の第２の組換え複製欠損ウイルスに産生宿主細胞を同時感染させるステップを含む前記方法。
  37. ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接する目的の遺伝子（ＧＯＩ）のコード配列を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を産生する方法であって、ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質のコード配列を含む請求項１９または２０に記載の組換え複製欠損ウイルスに産生宿主細胞を感染させるステップを含み、産生宿主細胞が、（１）ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接するＧＯＩコード配列を有する組み込まれたＡＡＶプロウイルスを含み；（２）ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接するＧＯＩコード配列を有するベクター（例えば、プラスミド）によってトランスフェクトされ；または（３）ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接するＧＯＩコード配列を有するｒＡＡＶに同時感染される、前記方法。
  38. 産生細胞株がＢＨＫ、Ｖｅｒｏ、またはＨＥＫ２９３である、請求項３６または３７に記載の方法。
  39. ＧＯＩが、ジストロフィンの機能的等価物（例えば、機能性マイクロジストロフィンタンパク質をコードするジストロフィンミニ遺伝子）である、請求項３６～３８のいずれか１項に記載の方法。
  40. ＡＡＶの指向性が骨格筋を含む（例えばＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９、好ましくはＡＡＶ９）、請求項３６～３９のいずれか１項に記載の方法。
  41. 目的の遺伝子（ＧＯＩ）には、ＬＧＭＤ２Ｅ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｅ型）、ＬＧＭＤ２Ｄ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｄ型）、ＬＧＭＤ２Ｃ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｃ型）、ＬＧＭＤ２Ｂ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ型）、ＬＧＭＤ２Ｌ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｌ型）、ＬＧＭＤ２Ｉ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｉ型）の原因遺伝子／欠損遺伝子、またはＮＡＧＬＵ（α－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ、サンフィリポ症候群またはムコ多糖症ＩＩＩＢ型（ＭＰＳ ＩＩＩＢ）に関する）、スルファミダーゼもしくはＳＧＳＨ（ムコ多糖症ＩＩＩＡ型またはＭＰＳ ＩＩＩＡに関する）、第ＩＸ因子、第ＶＩＩＩ因子、ミオチューブラリン１（ＭＴＭ１）、生存運動ニューロン（ＳＭＮ、脊髄性筋萎縮症またはＳＭＡに関する）、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼＧＡＬＧＴ２、カルパイン－３（ＣＡＰＮ－３）、酸性アルファグルコシダーゼ（ＧＡＡ、ポンペ病に関する）、アルファ－ガラクトシダーゼＡもしくはＧＬＡ（ファブリー病に関する）、グルコセレブロシダーゼ、ジストロフィンもしくはマイクロジストロフィンの遺伝子もしくはコード配列が挙げられる、請求項３６～４０のいずれか１項に記載の方法。
  42. ＧＯＩがマイクロジストロフィン遺伝子である、請求項４１に記載の方法。
  43. マイクロジストロフィン遺伝子が、ＵＳ７，９０６，１１１；ＵＳ７，００１，７６１；ＵＳ７，５１０，８６７；ＵＳ６，８６９，７７７；ＵＳ８，５０１，９２０；ＵＳ７，８９２，８２４；ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１３７３３；またはＵＳ１０，１６６，２７２に記載されているものである、請求項４２に記載の方法。
  44. マイクロジストロフィン遺伝子が、完全長ジストロフィンタンパク質のＲ１６およびＲ１７スペクトリン様リピートのコード配列を含む（ＵＳ７，８９２，８２４に記載されているものなど）、請求項４３に記載の方法。
  45. マイクロジストロフィン遺伝子が、完全長ジストロフィンタンパク質のＲ１、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ２３、およびＲ２４スペクトリン様リピートのコード配列を含む（ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１３７３３に記載されているマイクロジストロフィン遺伝子など）、請求項４４に記載の方法。
  46. 筋ジストロフィーの処置を必要とする対象における筋ジストロフィーを処置する方法であって、マイクロジストロフィン遺伝子（請求項４３～４５のいずれか１項に記載のものなど）をコードする組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターの治療有効量を対象に投与するステップを含み、前記ｒＡＡＶが、請求項３６～４０のいずれか１項に記載の方法によって産生される、前記方法。
  47. 対象にｒＡＡＶを投与するステップの前に、請求項３６～４０のいずれか１項に記載の方法によって前記ｒＡＡＶを産生するステップをさらに含む、請求項４６に記載の方法。
  48. ウイルスが、ＩＣＰ２７をコードする遺伝子またはその機能的等価遺伝子の中の欠失によって特徴づけられ、前記欠失が少なくとも１，２００ｂｐ長であり、前記ＩＣＰ２７をコードする遺伝子（例えば、配列番号１１）、またはその機能的等価遺伝子の最も３’末端の３００ｂｐ、２５０ｂｐ、２００ｂｐ、１５０ｂｐ、１００ｂｐ、５０ｂｐ、３０ｂｐ、２０ｂｐ、１０ｂｐ、９ｂｐ、８ｂｐ、７ｂｐ、６ｂｐ、５ｂｐ、４ｂｐ、３ｂｐ、２ｂｐ、１ｂｐまたは０ｂｐ以下を残す、ヘルペスウイルス目に由来する組換え複製欠損ウイルスを製造する方法であって、前記ＩＣＰ２７をコードする遺伝子または前記その機能的等価遺伝子の前記欠失を、宿主細胞での相同組換えによって作製するステップを含む前記方法。
  49. 相同組換えが、前記ＩＣＰ２７をコードする遺伝子または前記その機能的等価遺伝子を有する、ヘルペスウイルス目に由来する前記ウイルスのゲノム（例えば、ＨＳＶゲノム）を含む細菌人工染色体（ＢＡＣ）を使用して実行される、請求項４８に記載の方法。
  50. 宿主細胞が、大腸菌、または真核細胞、例えば酵母、昆虫細胞（例えば、ＳＦ９）、もしくは哺乳動物細胞（例えば、Ｖｅｒｏ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ヒト肺線維芽細胞ＭＲＣ－５、ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）、ヒト胚性肺線維芽細胞（ＨＥＬＦ）、メイディン－ダービーイヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、メイディン－ダービーウシ腎臓細胞（ＭＤＢＫ）など）である、請求項４８または４９に記載の方法。
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