JP2022533358A - 終末糖化産物受容体ｒｎａのモジュレーター及び調節 - Google Patents

Abstract

終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ）におけるプレｍＲＮＡスプライシングを修飾し、ＲＡＧＥ遺伝子転写物又はその一部のスプライシングを調節するための単離又は精製されたＡＯＮに関する。

Description

本発明は、終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ）又はその一部をコードするプレｍＲＮＡの選択的スプライシングを調節し、スプライススイッチングアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮｓ）を用いて、ＲＡＧＥアイソフォームの発現及び／又は活性を修飾するための方法、並びに前記モジュレーターを用いてＲＡＧＥ関連障害を治療する方法に関する。

終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ）は、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーに属する多価Ｉ型膜貫通糖タンパク質である。ヒトＲＡＧＥ（Ａｇｅｒ）遺伝子は、染色体６上の主要組織適合複合体クラスＩＩＩ領域内に位置する。それは、１１のエクソン及び１０のイントロン、並びにその転写を制御する５’隣接領域を含む。転写されたＲＡＧＥ ｍＲＮＡは、約１．４ｋｂであり、短い３’ＵＴＲを有する。

５０～５５ｋＤａの糖化ＲＡＧＥタンパク質は、限られた範囲の細胞（例えば、血管内皮、Ｉ型肺細胞、白血球）内で構成的に発現されるが、ＲＡＧＥ発現は、大部分の細胞型及び組織内で損傷、ストレス、低酸素又は炎症に続いて誘導され、炎症促進性及び増殖促進性シグナル伝達における導管がもたらされることがある。結果として、ＲＡＧＥ発現は、限定はされないが、ＲＡＧＥが発現及び進行にも関与する、神経変性疾患、がん、心血管疾患、糖尿病、自己免疫及び虚血障害を含む、炎症性及び代謝性障害において上方制御される。

ＲＡＧＥは、アルツハイマー病；筋萎縮性側索硬化症；ハンチントン病；クロイツフェルト・ヤコブ病；糖尿病性神経障害、家族性アミロイド多発ニューロパチー、シャルコー神経障害性関節症及び血管炎性ニューロパチーなどの神経変性状態；神経障害性疼痛；神経膠腫の発現及び進行；虚血性脳傷害／脳卒中、及び多発性硬化症を含む種々の脳障害に関与している。

ＲＡＧＥは、腫瘍細胞の増殖、遊走及び浸潤を含む、腫瘍生物学の多くの側面に関与している。多くのがんは、より高レベルのＲＡＧＥを発現する（実例として、乳がん、結腸がん、腎がん及び胃がんが挙げられる）。例外が、肺細胞が分化し、より悪性化するとＲＡＧＥが失われることで、ＲＡＧＥ発現が低減される場合の肺がんである。

Ｃ６グリオーマ細胞では、腫瘍体積は、ＲＡＧＥが遮断された細胞からなる腫瘍内で著しく減少する。それに対し、野生型ＲＡＧＥを過剰発現する腫瘍は、急速に増殖し、周囲組織に非常に効率的に浸潤した。神経膠腫／髄芽腫多形；膵がん；メラノーマ；前立腺がん；乳がん；肝がん／肝腫瘍；及び結腸がんなどの多くの一般的ながんに対するがん治療として、ＲＡＧＥシグナル伝達を遮断するための治療剤を有するのであれば、望ましいことになる。

健康状態下で、肺のＲＡＧＥの発現は、全組織で最高である。しかし、肺におけるＲＡＧＥ発現は通常、Ｉ型肺細胞内に限って認められる。肺における他の細胞内及び他の部位でのＲＡＧＥシグナル伝達の上方制御は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）／肺気腫；喘息；タバコ喫煙／汚染に起因する損傷；急性肺損傷／急性呼吸促迫症候群；及び肺線維症を含む種々の肺障害に関与している。

ＲＡＧＥは、決定的に、炎症性関節炎；変形性関節症；網膜疾患；粥状動脈硬化；血管石灰化；虚血性心疾患／心臓リモデリング／線維症；心不全；糖尿病性及び非糖尿病性腎疾患；炎症性腸疾患；子癇前症；多発性嚢胞卵巣症候群；脂肪肝、線維症、虚血性及び非虚血性肝損傷；筋ジストロフィー；脊髄損傷；皮膚炎症及び加齢；並びに角膜炎などのいくつかの炎症性状態にも関与する。

ヒトＲＡＧＥは、免疫グロブリン様エクトドメイン、単一膜貫通ドメイン及び短い（４２アミノ酸）細胞質テールから構成される。ＲＡＧＥのエクトドメイン（細胞外ドメインとしても公知）は、３つの免疫グロブリン様領域：Ｎ末端Ｖ型ドメインとそれに続く２つのＣ型ドメイン（Ｃ及びＣ’又は代替的にＣ１及びＣ２と称される）を含む。

終末糖化産物（ＡＧＥｓ）及び非ＡＧＥリガンドのＲＡＧＥのエクトドメインへの結合により、炎症、損傷並びに細胞増殖及び分化に関与する細胞内シグナル伝達カスケードが活性化される。ＲＡＧＥの活性化はまた、ＲＡＧＥリガンド－受容体相互作用がＮＦκＢ活性化を介してＲＡＧＥの発現を増強し、それにより後続するＲＡＧＥ誘導細胞活性化を増強するような正のフィードバックループを誘導する。事実、発明者がＲＡＧＥ発現を強力に下方制御することを認識している唯一の手段は、ＲＡＧＥの活性化を低減することである。この状況は、リガンドのレベル上昇が受容体の発現を低減するような他の受容体とは対照的である。

ヒトにおいて、ＲＡＧＥの細胞質テールは、４３アミノ酸長（残基３６２～残基４０４）である。この細胞質テールは、リガンド結合と異なり、ＲＡＧＥ依存性細胞活性化にとって決定的であるモチーフを有する。ＲＡＧＥの細胞質テールは、同じ経路の活性化をもたらす、（ＲＡＧＥのリガンド非依存性活性化としても知られる）ＲＡＧＥエクトドメインへの非ＡＧＥリガンドのＡＧＥの結合のない、共局在化したＧタンパク質共役受容体のそれらの同族リガンドによる活性化に続いてトランス活性化されることがある（Ｐｉｃｋｅｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２０１９；１２９：４０６－４２１）。特定の共局在化された活性化Ｇタンパク質共役受容体によるＲＡＧＥ細胞質テールのＲＡＧＥリガンド非依存性活性化は、ＲＡＧＥがインビボで活性化される場合の重要な経路であると思われる。

ＲＡＧＥのリガンド依存性活性化とＲＡＧＥのリガンド非依存性活性化の双方において、細胞内シグナル伝達は、種々のシグナル伝達パートナーと相互作用する、ＲＡＧＥの細胞質ドメインによって媒介される。

ＲＡＧＥの選択的スプライシングは、リガンド依存性及びリガンド非依存性シグナル伝達経路によって活性化されるような改変された能力を有するＲＡＧＥアイソフォームの生成を通じてのＲＡＧＥ活性の調節にとっても重要である。ＲＡＧＥの選択的スプライシングは、悪性腫瘍、糖尿病及びアルツハイマー病を含む病態において改変される。しかし、選択的スプライシングがＲＡＧＥの調節／調節不全にとって重要であるように思われる一方で、この機構を特異的に標的にするような方法は認められていない。

それは、この背景において、細胞保護的ＲＡＧＥアイソフォームの全長ＲＡＧＥにわたる好ましい生成に向けてＲＡＧＥスプライシングを調節するための、スプライススイッチングＡＯＮを用いる本方法が記述されることに反する。

背景技術の上記開示は、あくまで本発明の理解を容易にすることが意図される。その考察は、参照される材料のいずれかが本願の優先日時点での共通の一般的知見の一部であるか又は一部であったことの認識又は承認ではない。

広範には、本発明の一形態によると、終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ）をコードするプレｍＲＮＡ遺伝子転写物又はその一部の選択的スプライシングを調節するために使用される単離又は精製されたＡＯＮが提供される。

本発明の一態様では、ＲＡＧＥプレｍＲＮＡのイントロンの近傍又は内部の領域に相補的な標的化配列を含む１０～５０ヌクレオチドのＡＯＮが提供される。

本発明の一態様では、ＲＡＧＥプレｍＲＮＡのスプライス部位に相補的な又は隣接した標的化配列を含む１０～５０ヌクレオチドのＡＯＮが提供される。

ＲＮＡ二次構造などの要素、ＡＯＮとＳＲタンパク質との間の競合、異種核リボ核タンパク質（ｈｎＲＮＰ）、及び／又はスプライコフォームを形成する他の要素がＡＯＮの作用に影響し得ることから、決定的なアクセプター又はドナースプライス部位に誘導されたＡＯＮは、スプライシングを常に改変するわけではない。結果的に、本発明の一態様では、スプライソソームのエレメント（例えば、タンパク質スプライシング因子、ｕＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ）によって結合されるとき、近傍のエクソンのスプライシングを調節する、エンハンサー又はサイレンサーとして作用するＲＡＧＥのプレｍＲＮＡ中のシス作用性ＲＮＡエレメントに相補的な又は隣接した標的化配列を含む１０～５０ヌクレオチドのＡＯＮが提供される。

本発明の一態様では、スプライス部位選択に影響を及ぼすように前記ｍＲＮＡの二次構造を調節する、ＲＡＧＥプレｍＲＮＡに相補的な標的化配列を含む１０～５０ヌクレオチドのＡＯＮが提供される。

本発明の一形態では、ＲＡＧＥ遺伝子転写物又はその一部における１つ以上のエクソン配列の除去（スキッピングとしても公知）を誘導するための単離又は精製されたＡＯＮが提供される。

本発明の一形態では、ＲＡＧＥ遺伝子転写物又はその一部におけるイントロン配列の保持を誘導するための単離又は精製されたＡＯＮが提供される。

本発明の一形態では、ＡＯＮは、プレｍＲＮＡ－ＡＯＮ複合体の分解を阻止するように化学修飾され、限定はされないが、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）、２’Ｏ‐メチルホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（２ＯＭｅ）、及び２’－Ｏ－メトキシエチルホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（２ＯＭｅ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）修飾ＡＯＮｓ、熱安定性ツイストインターカレート核酸（ｔｗｉｓｔｅｄ ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）（ＴＩＮＡ）及びペプチド核酸（ＰＮＡｓ）を含む。

本発明の一形態では、ＡＯＮｓは、限定はされないが、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰｓ）、ｖｉｖｏモルホリノ（ＶＭＯ）又はペプチドホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＰＭＯ）を含む、それらの送達を増強するための部分にコンジュゲートされる。

好ましくは、ＡＯＮは、表３ａ～３ｄのいずれかに示される配列を含む群から選択される。好ましくは、ＡＯＮは、配列番号１～３１を含むリストから選択される。より好ましくは、ＡＯＮは、配列番号１１、１８、１９、又は２０である。

本発明のＡＯＮは、選択された標的部位に結合する能力があるＡＯＮであるように選択されてもよく、ここで標的部位は、スプライスドナー部位、スプライスアクセプター部位、スプライスエンハンサー配列 スプライスサイレンサー配列又はプレｍＲＮＡの二次構造を調節する部位から選択される推定上のｍＲＮＡスプライシング部位である。標的部位はまた、ドナー又はアクセプタースプライス部位が標的にされるとき、いくつかの隣接するイントロン配列を含んでもよい。

より具体的には、ＡＯＮは、配列番号１～３１の任意の１つ以上及び／又は表３ａ～３ｄのいずれかに示される配列、及びそれらの組み合わせ又はカクテルからなる群から選択されてもよい。より好ましくは、ＡＯＮは、配列番号１１、１８、１９、又は２０である。ＡＯＮの組み合わせは、好ましくは、配列番号１１及び１０、又は配列番号１１及び１３の組み合わせである。これは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でかかる配列にハイブリダイズし得る配列、それらに相補的な配列、修飾塩基、修飾骨格、及びそれらの機能的切断部又は伸長部を有する配列（ＲＡＧＥ遺伝子転写物におけるプレｍＲＮＡプロセシング活性を保有又は調節する）を含む。

特定の実施形態では、ＡＯＮｓは、標的配列に１００％相補的であってもよく、又は例えばバリアントに対応させるため、オリゴヌクレオチドと標的配列との間で形成されるヘテロ二本鎖がインビボで生じることがある細胞ヌクレアーゼの作用及び他の分解様式に抗するのに十分に安定である限り、ミスマッチを含んでもよい。それ故、特定のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドと標的配列との間で、概数で又は少なくとも約７０％の配列相補性、例えば、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列相補性を有してもよい。

本発明は、ＲＡＧＥプレｍＲＮＡの選択的スプライシングを調節するため、選択された標的に結合する能力がある２つ以上のＡＯＮｓの組み合わせ、例えば２つ以上のかかるＡＯＮを含む構築物にも拡張される。構築物は、組み合わされたＡＯＮに基づく治療法を意図して、一緒に使用されてもよい。ＡＯＮｓの組み合わせは、好ましくは、配列番号１１及び１０、又は配列番号１１及び１３の組み合わせである。

本発明は、そのさらなる態様に従い、本発明のＡＯＮ配列のｃＤＮＡ又はクローン化コピー、及び本発明のＡＯＮ配列を有するベクターに拡張される。本発明は、かかる配列及び／又はベクターを有する細胞にもさらに拡張される。

ＲＡＧＥ遺伝子転写物のスプライシングを操作するための方法であって、
ａ）本明細書に記載のようなＡＯＮｓの１つ以上を提供し、且つオリゴマーが標的核酸部位に結合することを可能にするステップ
を含む、方法も提供される。

患者におけるＲＡＧＥ発現に関連する疾患の作用を治療し、予防し、又は寛解させるための医薬、予防、又は治療組成物であって、
ａ）本明細書に記載のような１つ以上のＡＯＮｓ；並びに
ｂ）１つ以上の薬学的に許容できる担体及び／又は希釈剤
を含む、組成物も提供される。

組成物は、本発明の所望されるＡＯＮの各々を約１ｎＭ～１０００ｎＭで含んでもよい。好ましくは、組成物は、本発明のＡＯＮの各々を約１０ｎＭ～５００ｎＭ、最も好ましくは１ｎＭ～１０ｎＭの間で含んでもよい。

ＲＡＧＥ発現に関連する疾患の作用を治療し、予防し、又は寛解させるための方法であって、
ａ）本明細書に記載のような１つ以上のＡＯＮｓ又は１つ以上のＡＯＮｓを含む医薬組成物を有効量で患者に投与するステップ
を含む、方法も提供される。

ＲＡＧＥ発現及び／又は活性に関連する疾患の作用を治療し、予防し、又は寛解させるための薬剤の製造における、本明細書に記載のような精製及び単離されたＡＯＮｓの使用も提供される。

患者におけるＲＡＧＥ発現に関連する疾患の作用を治療し、予防し、又は寛解させるためのキットであって、好適な容器内にその使用説明書と一緒に包装された、少なくとも本明細書に記載のようなＡＯＮ及びその組み合わせ又はカクテルを含む、キットも提供される。

好ましくは、患者におけるＲＡＧＥ発現に関連する疾患は、神経変性疾患、がん、肺障害、又は炎症性疾患である。

ＲＡＧＥ発現に関連する疾患を有する対象は、ヒトを含む哺乳動物であってもよい。

本発明のさらなる態様は、ここで付随する非限定例及び図面を参照して説明されることになる。

本発明のさらなる特徴は、そのいくつかの非限定的実施形態の以下の説明においてより十分に説明される。この説明は、あくまで本発明を例示することを意図して含められる。それは、上で示されるような発明の大まかな要約、開示又は説明に対する限定として理解されるべきではない。説明は、以下の付随する図面を参照してなされることになる。

ＲＡＧＥ及びＲＡＧＥ＿ｖ１を生成するＲＡＧＥの選択的スプライシングを示す。エクソンはボックスとして示される。コード配列は黒色であり、非コード配列は白色である。角線はスプライシング事象を表す。Ｓ＝未成熟終止コドン。 エクソン１０を標的化する選択されたＡＯＮｓによる処置後、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲによる検出として、Ａ５７９細胞内、又は対照（スクランブルＲＮＡ処置）細胞内での、任意のＲＡＧＥ ｍＲＮＡ（全ヒトＲＡＧＥ）スプライコフォーム（ｓｐｌｉｃｏｆｏｒｍｓ）及びヒトＲＡＧＥ ９ｂ配列を有するＲＡＧＥ ｍＲＮＡスプライコフォームの発現における倍数変化を示す。 エクソン１０を標的化する選択されたＡＯＮｓによるＡ５７９細胞の処置後、又は対照（スクランブルＲＮＡ処置）細胞での、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲによる検出としての、任意のＲＡＧＥ ｍＲＮＡ（全ヒトＲＡＧＥ）スプライコフォーム及びエクソン１０を有するヒトＲＡＧＥ ｍＲＮＡスプライコフォームのｍＲＮＡ発現における倍数変化を示す。 推定上のｈｎＲＮＰＦ結合部位に隣接したエクソン１０をさらに標的化する選択されたＡＯＮｓによるＡ５７９細胞の処置後、又は対照（スクランブルＲＮＡ処置）細胞での、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲによる検出としての、任意のＲＡＧＥ（全ヒトＲＡＧＥ）スプライコフォーム及びエクソン１０を有するヒトＲＡＧＥ ｍＲＮＡスプライコフォームのｍＲＮＡ発現における倍数変化を示す。 エクソン１０を標的化する特異的なＡＯＮｓによるＡ５７９細胞の処置後、又は対照（スクランブルＲＮＡ処置）細胞での、異なるＲＡＧＥ ｍＲＮＡスプライコフォームの相対的発現を意味する、異なるサイズのエクソン８～１１断片を有する構築物をコードするＲＡＧＥクローンの百分率を示す。例えば、３００バンドは、エクソン８、９、１０及び１１を有するスプライコフォーム（即ち、シグナル伝達能のあるスプライコフォーム）を表す一方で、２５０バンドは、ＲＡＧＥ ９ｂを有するスプライコフォームを表し、バンドなしは、エクソン８の欠失を伴うＲＡＧＥ ｍＲＮＡスプライコフォームを表す。 異なるスプライコフォームの存在を表す、異なるサイズのバンド又はバンドなし（矢印）による、エクソン８～１１にわたるＤＮＡ ＰＣＲ産物の代表的なゲル画像である。 ＡＯＮ３７７９によるＡ５７９細胞の処置後、デジタルＰＣＲによる測定として、対照（スクランブルＲＮＡ処置）細胞と比較した、エクソン１０を有するＲＡＧＥ ｍＲＮＡのコピー数を示す。 エクソン１０を標的化する選択されたＡＯＮｓによるＡ５７９細胞の処置後の、対照（スクランブルＲＮＡ処置）細胞と比較した、細胞培地中で検出された内因性可溶性ＲＡＧＥタンパク質の濃度を示す。 ＲＡＧＥ特異抗体を用いて検出されたウエスタンブロットによる、ＡＯＮ３７７９又はＡＯＮ８７又は対照（ＣＴＬ）ＲＮＡの存在下及び不在下での、ＣＨＯ細胞へのヒトＲＡＧＥのゲノム配列（ｇＲＡＧＥ）をコードするＤＮＡのトランスフェクション後の、細胞培地（左）及び細胞可溶化物（右）におけるＲＡＧＥタンパク質の発現を示す。レーンＭはマーカーであり、レーン２はベクター対照（内因性ＲＡＧＥが発現されない）であり、レーン３はｇＲＡＧＥ＋対照（スクランブル）ＲＮＡであり、レーン３はｇＲＡＧＥ＋ＡＯＮ３７７９であり、且つレーン４はｇＲＡＧＥ＋ＡＯＮ８７である。矢印は、細胞培地中のより小さい可溶性ＲＡＧＥのサイズ（赤）及び細胞可溶化物中のより大きい全長ＲＡＧＥのサイズ（白）を表す。 ＥＬＩＳＡによる測定として、エクソン１０を標的化するＡＯＮｓのトランスフェクションの存在下及び不在下での、ＣＨＯ細胞へのヒトＲＡＧＥのゲノム配列（ｇＲＡＧＥ）をコードするＤＮＡのトランスフェクション後の、培地中での可溶性ＲＡＧＥタンパク質の発現を示す。 ＥＬＩＳＡによる測定として、ＡＯＮ３７７９によってさらに標的化される部位に隣接又は重複するエクソン１０を標的化する選択されたＡＯＮｓの存在下及び不在下での、ＣＨＯ細胞へのヒトＲＡＧＥのゲノム配列（ｇＲＡＧＥ）をコードするＤＮＡのトランスフェクション後の、培地中での可溶性ＲＡＧＥタンパク質の発現を示す。 ＥＬＩＳＡによる測定として、ＡＯＮ３７７９の存在下及び不在下での、ＣＨＯ細胞へのヒトＲＡＧＥのゲノム配列をコードするＤＮＡのトランスフェクション後の、培地中での可溶性ＲＡＧＥの発現の用量依存性誘導を示す。点線は、スクランブルＲＮＡ（１０ｎＭ）がトランスフェクトされたＣＨＯ細胞内での可溶性ＲＡＧＥの発現を表す。 対照（スクランブルＲＮＡ処置）細胞と比較した、ＲＡＧＥリガンド、Ｓ１００Ａ８／９（０．６μｇ／ｍｌ）によるＡ５４９細胞の処置及びエクソン１０を標的化する選択されたＡＯＮｓのプレトランスフェクションによるその調節に続く、ＩＣＡＭ－１遺伝子発現の誘導を示す。 対照（スクランブルＲＮＡ処置）細胞と比較した、ＲＡＧＥリガンド、Ｓ１００Ａ８／９（０．６μｇ／ｍｌ）による一次ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）細胞の処置及びエクソン１０を標的化する選択されたＡＯＮｓのプレトランスフェクションによるその調節に続く、ＩＣＡＭ－１遺伝子発現の誘導を示す。 ＲＡＧＥのトランス活性化を誘導する能力がある、アンジオテンシンＩＩによるＡ５４９細胞の処置後の、ＩＣＡＭ－１遺伝子発現の誘導を示す。特に、ＩＣＡＭ－１遺伝子発現におけるこの誘導は、対照（スクランブルＲＮＡ処置）細胞と比較して、Ａ５７９細胞へのエクソン１０を標的化する選択されたＡＯＮｓのプレトランスフェクションによっても調節される。 対照（スクランブルＲＮＡ処置）細胞と比較した、アンジオテンシンＩＩ（１μＭ）による一次ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）の処置及びエクソン１０を標的化する選択されたＡＯＮｓのプレトランスフェクションによるその調節に続く、ＩＣＡＭ－１遺伝子発現の誘導を示す。 推定上のｈｎＲＮＰ－Ｆ／Ｈ１結合部位に隣接したエクソン１０を特異的に標的化するＡＯＮｓによるＨＭＥＣの処置後、又は対照（スクランブルＲＮＡ処置）細胞での、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲによる検出としての、任意のＲＡＧＥ ｍＲＮＡ（全ヒトＲＡＧＥ）スプライコフォーム及びエクソン１０を有するヒトＲＡＧＥ ｍＲＮＡスプライコフォームの発現における倍数変化を示す。 推定上のｈｎＲＮＰＦ結合部位に隣接したエクソン１０を標的化するＡＯＮｓによるＨＭＥＣの処置後、又は対照（スクランブルＲＮＡ処置）細胞での、ヒトＲＡＧＥ ９ｂ配列を有するＲＡＧＥ ｍＲＮＡスプライコフォームのｍＲＮＡ発現における倍数変化を示す。 エクソン９ｂを有するＲＡＧＥ ｍＲＮＡスプライコフォームの発現に対する、ＡＯＮ３７７９のｖｉｖｏモルホリノ製剤（０．１～１μＭ）による一次ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）の処置の、非標的モルホリノＡＯＮ対照と比較しての効果を示す。 培地中での可溶性ＲＡＧＥタンパク質の発現に対する、ＡＯＮ３７７９のｖｉｖｏモルホリノ製剤（０．１～１μＭ）による一次ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）の処置の、非標的モルホリノＡＯＮ対照と比較しての効果を示す。 培地中での可溶性ＲＡＧＥタンパク質の発現に対する、ＡＯＮ３７７９のｖｉｖｏモルホリノ製剤（１μＭ）によるゲノムヒトＲＡＧＥを発現するＣＨＯ細胞の処置の、非標的モルホリノＡＯＮ対照と比較しての効果を示す。 上記実験中で使用される異なるＡＯＮｓ及びそれらの相補的標的を表す、エクソン１０に限り含むヒトＲＡＧＥ ＤＮＡの配列を示す。紫ボックスは、ｈｎＲＮＰＦ結合の推定上のポリＧ標的を表す。 ＡＯＮ３７７９のトランスフェクションに応答して可溶性ＲＡＧＥで観察された増加に対する、発現されたヒトＲＡＧＥの選択的スプライシング時にｈｎＲＮＰの推定上のｐｏｌｙＧ標的の突然変異（突然変異体ｇＲＡＧＥ Ｍ３）後の効果の欠如を示す。 ＲＡＧＥプレｍＲＮＡに対する下で利用される異なるＡＯＮｓ及びそれらの相補的標的を表す、エクソン９に限り含むヒトＡＧＥＲの遺伝子配列を示す。 リアルタイムＲＴ－ＰＣＲによる検出として、エクソン９を標的化する選択されたＡＯＮｓによるＡ５７９細胞の処置後、又は対照（スクランブルＲＮＡ処置）細胞での、任意のＲＡＧＥ ｍＲＮＡ（全ヒトＲＡＧＥ）スプライコフォーム及びエクソン１０を有するヒトＲＡＧＥ ｍＲＮＡスプライコフォームの発現を示す。 異なるスプライコフォームの存在を表す、異なるサイズのバンド又はバンドなしによる、エクソン８～１１に及ぶＤＮＡ ＰＣＲ産物の代表的なゲル画像である。 エクソン１０を標的化する選択されたＡＯＮｓによるＡ５７９細胞の処置後、又はスクランブルＲＮＡ対照（ＣＴＬ）での、異なるスプライコフォームｍＲＮＡの相対的発現を意味する、異なるサイズのエクソン８～１１断片を有する構築物をコードするＲＡＧＥ ｍＲＮＡクローンの百分率を表す。例えば、３００バンドは、エクソン８、９、１０及び１１を有するＲＡＧＥ ｍＲＮＡスプライコフォーム（即ちシグナル伝達能のあるスプライコフォーム）を表す一方で、２５０バンドは、ＲＡＧＥ ９ｂを有するスプライコフォームを表し、バンドなしは、エクソン８の欠失を伴うＲＡＧＥ ｍＲＮＡスプライコフォームを表す。 ＥＬＩＳＡによる測定として、エクソン９を標的化する選択されたＡＯＮｓの存在下及び不在下で、ヒトＲＡＧＥのゲノム配列をコードするＤＮＡのＣＨＯ細胞へのトランスフェクション後、対照（スクランブルＲＮＡ処置）細胞での、培地中での可溶性ＲＡＧＥタンパク質の発現を示す。ＮＤ＝非検出。 ＲＡＧＥリガンド、Ｓ１００Ａ８／９（０．６μｇ／ｍＬ）による処置及びエクソン９を標的化する選択されたＡＯＮｓのトランスフェクションによるその調節に続く、対照（スクランブルＲＮＡ処置）細胞と比較してのＴＬＲ４遺伝子発現の誘導を示す。 ＲＡＧＥのトランス活性化を誘導する能力がある、アンジオテンシンＩＩ（１μＭ）による処置後の、ＩＣＡＭ－１遺伝子発現の誘導を示す。特に、ＩＣＡＭ－１遺伝子発現におけるこの誘導は、対照（スクランブルＲＮＡ処置）細胞と比較して、エクソン９を標的化する選択されたＡＯＮｓのＡ５７９細胞へのトランスフェクションに従って調節される。 リアルタイムＲＴ－ＰＣＲによる検出として、エクソン９を標的化する選択されたＡＯＮｓによるＨＭＥＣ１細胞の処置後、又は対照（スクランブルＲＮＡ）処置細胞での、任意のＲＡＧＥ ｍＲＮＡ（全ヒトＲＡＧＥ）スプライコフォーム及びエクソン１０を有するヒトＲＡＧＥ ｍＲＮＡスプライコフォームの発現における倍数変化を示す。 リアルタイムＲＴ－ＰＣＲによる検出として、イントロン９を標的化する選択されたＡＯＮｓ、（陽性対照としての）ＡＯＮ３７７９によるＡ５７９細胞の処置後、又は対照（スクランブルＲＮＡ処置）細胞での、任意のＲＡＧＥ ｍＲＮＡ（全ＲＡＧＥ）スプライコフォーム及びエクソン１０を有するヒトＲＡＧＥ ｍＲＮＡスプライコフォームの発現における倍数変化を示す。 リアルタイムＲＴ－ＰＣＲによる検出として、イントロン９を標的化する選択されたＡＯＮｓ、（陽性対照としての）ＡＯＮ３７７９によるＡ５４９細胞の処置後、又は対照（スクランブルＲＮＡ処置）細胞での、エクソン９ｂ配列を有するＲＡＧＥ ｍＲＮＡスプライコフォームの発現における倍数変化を示す。 リアルタイムＲＴ－ＰＣＲによる検出として、イントロン９を標的化する選択されたＡＯＮｓ、（陽性対照としての）ＡＯＮ３７７９によるＨＭＥＣ１細胞の処置後、又は対照（スクランブルＲＮＡ処置）細胞での、任意のＲＡＧＥ ｍＲＮＡ（全ヒトＲＡＧＥ）スプライコフォーム及びエクソン１０を有するヒトＲＡＧＥ ｍＲＮＡスプライコフォームの発現を示す。 リアルタイムＲＴ－ＰＣＲによる検出として、イントロン９を標的化する選択されたＡＯＮｓ、（陽性対照としての）ＡＯＮ３７７９によるＨＭＥＣ１細胞の処置後、又は対照（スクランブルＲＮＡ処置）細胞での、エクソン９ｂを有するＲＡＧＥ ｍＲＮＡスプライコフォームの発現における倍数変化を示す。 培地中でのＥＬＩＳＡによる検出として、イントロン９を標的化する特定のＡＯＮｓ、（陽性対照としての）ＡＯＮ３７７９によるゲノムヒトＲＡＧＥを発現するＡ５７９細胞の処置後、又は対照（スクランブルＲＮＡ処置）細胞での、可溶性ＲＡＧＥの濃度を示す。 ＡＯＮｓ及びそれらの相補的標的を表す、イントロン９に限り含むヒトＲＡＧＥ ＤＮＡの配列を示す。 培地中でのＥＬＩＳＡによる検出として、ＲＡＧＥプレｍＲＮＡを標的化するＡＯＮｓによるゲノムマウスＲＡＧＥを発現するＣＨＯ細胞の処置後、又は対照（スクランブルＲＮＡ処置）細胞での、可溶性ＲＡＧＥの濃度を示す。 リアルタイムＲＴ－ＰＣＲで、マウスＲＡＧＥのエクソン９を標的化する選択されたＡＯＮｓ（５０ｎＭ）によるＰＭＡＥＣの処置後、又は対照（スクランブルＲＮＡ処置）細胞での、任意のＲＡＧＥ ｍＲＮＡ（全マウスＲＡＧＥ）スプライコフォーム並びにエクソン１０及び１１を有するＲＡＧＥ ｍＲＮＡスプライコフォームの発現における倍数変化を示す。 マウスＲＡＧＥのエクソン９を標的化する選択されたＡＯＮｓ（１０ｎＭ）によるＰＭＡＥＣの処置後、又は対照（スクランブルＲＮＡ処置）細胞での、任意のｍＲＮＡ ＲＡＧＥ（全マウスＲＡＧＥ）並びにエクソン１０及び１１を有するＲＡＧＥ ｍＲＮＡスプライコフォームの発現における倍数変化を示す。 マウスＲＡＧＥのエクソン９を標的化する特定のＡＯＮｓ（１０ｎＭ）によるＰＭＡＥＣ細胞の処置後、又は対照（スクランブルＲＮＡ処置）細胞での、培地中の可溶性ＲＡＧＥタンパク質の濃度を示す。 リアルタイムＲＴ－ＰＣＲで、ＡＯＮ ｍ３７７９（１０ｎＭ）によるＰＭＡＥＣの処置後、又は対照（スクランブルＲＮＡ処置）細胞での、任意のＲＡＧＥ ｍＲＮＡ（全マウスＲＡＧＥ）スプライコフォーム並びにエクソン１０及び１１を有するＲＡＧＥ ｍＲＮＡスプライコフォームの発現における倍数変化を示す。 ＡＯＮ３７７９（１０ｎＭ）、ＡＯＮ ｍ３７７９によるゲノムマウスＲＡＧＥを発現するＣＨＯ細胞の処置後、又は対照（スクランブルＲＮＡ処置）細胞での、培地中の可溶性ＲＡＧＥタンパク質の濃度を示す。 ＡＯＮ３７７９（１０ｎＭ）、ＡＯＮ ｍ３７７９によるゲノムヒトＲＡＧＥを発現するＣＨＯ細胞の処置後、又は対照（スクランブルＲＮＡ処置）細胞での、培地中の可溶性ＲＡＧＥタンパク質の濃度を示す。 リアルタイムＲＴ－ＰＣＲで、ＡＯＮ ｍ３７７９又は非標的モルホリノＡＯＮによるマウスからの精密切断肺切片の４８時間処置後の、任意のＲＡＧＥ ｍＲＮＡ（全ＲＡＧＥ）スプライコフォーム並びにエクソン１０及び１１を有するＲＡＧＥ ｍＲＮＡスプライコフォームの発現を示す。 リアルタイムＲＴ－ＰＣＲで、ＡＯＮ ｍ３７７９又は媒体（生理食塩水）によるマウスからの精密切断肺切片の処置後の、任意のＲＡＧＥ ｍＲＮＡ（全ＲＡＧＥ）及びエクソン９ｂを有するＲＡＧＥ ｍＲＮＡスプライコフォームの時間依存性発現を示す。 リアルタイムＲＴ－ＰＣＲで、ＡＯＮ ｍ３７７９のＣ５７Ｂｌ６マウスへの毎日皮下注射から１週後の、任意のＲＡＧＥ ｍＲＮＡ（全マウスＲＡＧＥ）スプライコフォーム及びエクソン９ｂ又はエクソン１０を有するマウスＲＡＧＥ ｍＲＮＡスプライコフォームの肺発現における、非標的ＡＯＮ対照と比較しての倍数変化を示す。 リアルタイムＲＴ－ＰＣＲで、ＡＯＮ ｍ３７７９のモルホリノ製剤のＣ５７Ｂｌ６マウスへの気管内滴下から４８時間後の、任意のＲＡＧＥ ｍＲＮＡ（全マウスＲＡＧＥ）スプライコフォーム並びにエクソン１０及び１１を有するマウスＲＡＧＥ ｍＲＮＡスプライコフォームの肺発現における、非標的ＡＯＮ対照と比較しての倍数変化を示す。 リアルタイムＲＴ－ＰＣＲで、ＡＯＮ ｍ３７７９の２－０’Ｍｅ製剤のＣ５７Ｂｌ６マウスへの気管内滴下から４８時間の、任意のＲＡＧＥ ｍＲＮＡ（全マウスＲＡＧＥ）スプライコフォーム並びにエクソン１０及び１１を有するマウスＲＡＧＥ ｍＲＮＡスプライコフォームの肺発現における、媒体対照と比較しての倍数変化を示す。＊はｐ＝０．０１対ベースラインを表す。 ＡＯＮ ｍ３７７９、ＡＯＮ４１０５及び滅菌水対照のＣ５７Ｂｌ６マウスへの気管内注射から２日後の、循環する可溶性ＲＡＧＥにおける、ベースライン出血と比較しての倍数変化（％）を示す。 リアルタイムＲＴ－ＰＣＲによる測定として、異なる領域のエクソン１０を標的化する選択されたＡＯＮｓの組み合わせの存在下及び不在下で、ヒトＲＡＧＥのゲノム配列（ｇＲＡＧＥ）をコードするＤＮＡのＣＨＯ細胞へのトランスフェクション後、又は対照（スクランブルＲＮＡ処置）細胞での、エクソン９ｂを有するＲＡＧＥ ｍＲＮＡスプライコフォームの発現を示す。 ＥＬＩＳＡによる測定として、エクソン１０の５’スプライス部位を標的化する選択されたＡＯＮｓの組み合わせの存在下及び不在下で、ヒトＲＡＧＥのゲノム配列（ｇＲＡＧＥ）をコードするＤＮＡのＣＨＯ細胞へのトランスフェクション後、又は対照（スクランブルＲＮＡ処置）での、培地中での可溶性ＲＡＧＥタンパク質の発現を示す。 ＥＬＩＳＡによる測定として、エクソン１０の３’及び５’スプライス部位を標的化する選択されたＡＯＮｓの組み合わせの存在下及び不在下で、ヒトＲＡＧＥのゲノム配列（ｇＲＡＧＥ）をコードするＤＮＡのＣＨＯ細胞へのトランスフェクション後、又は対照ＲＮＡでの、培地中での可溶性ＲＡＧＥタンパク質の発現を示す。ボックスは、ＡＯＮ３７７９を含む処置を示す。 リアルタイムＲＴ－ＰＣＲによる測定として、エクソン１０の隣接領域を標的化する選択されたＡＯＮｓの組み合わせの存在下及び不在下で、ヒトＲＡＧＥのゲノム配列をコードするＤＮＡのＣＨＯ細胞へのトランスフェクション後、又は対照（スクランブルＲＮＡ）処置細胞での、エクソン９ｂを有するＲＡＧＥ ｍＲＮＡスプライコフォームの発現を示す。 ＥＬＩＳＡによる測定として、選択されたＡＯＮｓの組み合わせの存在下及び不在下で、マウスＲＡＧＥのマウスゲノム配列をコードするＤＮＡのＣＨＯ細胞へのトランスフェクション後、又は対照（スクランブルＲＮＡ）での、培地中での可溶性ＲＡＧＥタンパク質の発現を示す。

アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）は、ワトソン・クリック塩基対合を通じてプレＲＮＡ／ｍＲＮＡに選択的にハイブリダイズし、標的ＲＮＡの機能を選択的に調節することが可能なＤＮＡ又はＲＮＡの短い修飾された合成アンチセンス鎖である。

ｍＲＮＡの選択的スプライシングを調節するため、ＡＯＮｓが使用されるとき、それらはスプライススイッチングオリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）と称されることが多い。本発明では、ＡＯＮ及びＳＳＯという用語は、互換可能に用いられてもよい。ＳＳＯｓは、プレｍＲＮＡと塩基対合し、スプライシング機構の成分とプレｍＲＮＡとの間で生じるＲＮＡ－ＲＮＡ塩基対又はタンパク質－ＲＮＡ結合相互作用を遮断することにより、転写物の正常なスプライシングレパートリーを破壊する。ＳＳＯｓは、翻訳の産物を調節するため、選択されたエクソンの「スキッピング」及び／又はイントロン配列の保持を誘導し得る。これは、スプライス部位を直接的に標的化する、又は特定のタンパク質の結合を調節するか若しくはプレｍＲＮＡの二次構造を改変することによって、スプライシングの増強若しくはサイレンシングに関与するシス作用性配列を標的化することにより、達成可能である。

治療用ＳＳＯｓは、遺伝性障害を治療するために使用されて、不完全又は不整列な切片をスキップし、内部的に欠失されても、この段階で治療法として機能的なタンパク質の作製を可能にすることがある。

選択的スプライシングは、終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ）における転写後遺伝子調節の重要な層として認識されている。大部分のＲＡＧＥがその全長アイソフォームで発現されるが、いくつかの異なるコードアイソフォームが、選択的スプライシング（スプライコフォームとしても公知）、例えば、Ｎ末端切断、Ｃ末端切断を有するスプライコフォーム、及びイントロン配列を保持するスプライコフォームを通じて生成される。これらの異なるスプライコフォームは、競合的リガンド結合又は結合パートナーからの全長タンパク質の置換のいずれかによる、全長ＲＡＧＥ受容体の可能な調節因子として作用してもよい。肺、肝臓、腎臓、平滑筋、内皮細胞及び脳などの異なる組織内で、２０を超えるスプライコフォームが同定されている。

異なるＲＡＧＥ遺伝子スプライスバリアントが、ヒト遺伝子命名法委員会（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）に従い、ＲＡＧＥ、ＲＡＧＥ＿ｖ１～ＲＡＧＥ＿ｖ１９と名付けられている。例えば、イントロン９（エクソン９ｂ）の保持（ランオン）は、ヒト中で循環ＲＡＧＥの約５％を構成するＣ切断型可溶性スプライコフォーム（ＲＡＧＥ＿ｖ１、内因性分泌型ＲＡＧＥ又はｅｓＲＡＧＥ）を生成する膜貫通及び細胞質ドメインの未成熟な停止及び完全な欠損をもたらす。任意のシグナル伝達エレメント又は膜貫通ドメインが欠如すると、ｅｓＲＡＧＥは、リガンドに対して全長ＲＡＧＥと競合する、又はリガンドクリアランスを増強する、デコイ受容体として作用することが可能である。ｅｓＲＡＧＥのより高い循環レベルが改善された健康転帰及び長寿に関連する一方で、より低いｅｓＲＡＧＥは、限定はされないが、粥状動脈硬化、糖尿病、メタボリックシンドローム、心血管死亡率、貧血、自閉症及び様々な腫瘍化状態を含む、多くの病態に関連する。組換えｅｓＲＡＧＥによる糖尿病マウスの治療により、粥状動脈硬化、血管炎症、腎損傷及び網膜損傷が低減される。

ＲＡＧＥΔ（ＤＮ ＲＡＧＥ又はＲＡＧＥｖ２０としても公知）は、細胞内ドメインの１６のアミノ酸が欠如するが、リガンド結合及び膜貫通ドメインを保持することで、細胞表面ＲＡＧＥのドミナントネガティブ阻害剤として作用する。さらに、細胞外ドメインにおける変化をもたらすスプライシング事象は、ＲＡＧＥのＩｇ－Ｖドメインの一部又は全部の挿入、欠失、又は除去により、リガンド結合ドメインに影響することがある。例えば、Ｎ－ＲＡＧＥは、エクソン３中の選択的開始部位で開始することで、リガンド結合に必要とされるシグナルペプチド又はＶ－ドメインを有しない。

ＲＡＧＥの異常なスプライシング（ひいては機能障害性ＲＡＧＥシグナル伝達）が、糖尿病、一部のがん及びアルツハイマー病において報告されている。

ｅｓＲＡＧＥ型スプライシングにおけるエクソン１０のスキッピングは、高等真核生物におけるイントロン長の制限に起因する。約４５ヌクレオチドは、５’スプライス部位及び分枝点部位に分離する必要があり、分枝点部位と３’スプライス部位との間の最小距離は各々、約１８ヌクレオチドであるように思われる。したがって、７０ヌクレオチドより短いイントロンは、哺乳類において極めて希少であり、効率的にスプライスアウトされ得ない。イントロン９中のｅｓＲＡＧＥの５’スプライス部位が選択されるとき、この部位とエクソン１０と境を接する３’スプライス部位との間の距離は４６ヌクレオチドであり、それはイントロン長の下限よりも大幅に短い。したがって、下流の、イントロン９のｅｓＲＡＧＥの５’スプライス部位の使用及びエクソン１０の包含であれば、相互に排他的となる。分析される既知のスプライスバリアントの中で、下流のイントロン９中のｅｓＲＡＧＥの５’スプライス部位を使用するすべての変異体は、エクソン１０をスキップし；それに対し、上流のイントロン９中のＲＡＧＥ５’のスプライス部位を使用するすべての変異体は、エクソン１０を包含した。それ故、利用可能な証拠によると、イントロン９中の２つの選択的５’スプライス部位のいずれか一方の選択が、エクソン１０の包含又は除去と関連することが示される。このスプライシングの調節の手段又は調節するための外部的手段は、以前から知られていない。

本発明では、ＲＡＧＥプレｍＲＮＡの選択的スプライシングパターンを選択的に操作し、非機能的であるか、又は全長ＲＡＧＥのリガンド依存性活性化及びリガンド非依存性トランス活性化をアンタゴナイズするためのデコイ受容体として作用する、いずれかの天然ＲＡＧＥ ｍＲＮＡスプライコフォームの生成をもたらすため、ＳＳＯｓが使用される。

特に、これらのスプライス部位で共通するＲＡＧＥ多型は認められない。ＲＡＧＥ配列は、高度に保存される。したがって、パーソナル化又は個別化された配列修飾は、エクソンスキッピング技術による遺伝性障害の管理と異なり、必要とされない。

本発明は、ＲＡＧＥプレｍＲＮＡ又はその一部の選択的スプライシングを調節するＡＯＮｓを開発することによる、限定はされないが、神経変性疾患、がん、肺障害、又は炎症性疾患を含む、ＲＡＧＥが発現又は進行に関与する疾患の作用の治療、予防又は寛解のための代替的方法を提供する。

広範には、本発明の一態様によると、終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ）遺伝子転写物又はその一部におけるプレｍＲＮＡスプライシングを調節するための単離又は精製されたＡＯＮが提供される。好ましくは、ＲＡＧＥプレｍＲＮＡ又はその一部におけるエクソン除去及び／又はイントロン保持を誘導するための単離又は精製されたＡＯＮが提供される。

本発明は、終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ）遺伝子転写物上の選択された標的に結合し、ＲＡＧＥ遺伝子転写物又はその一部におけるプレｍＲＮＡスプライシングを調節する能力があるＡＯＮを提供する。

例えば、本発明の一態様では、ｍＲＮＡの選択的スプライシングの調節に関与するタンパク質の結合に関連するＲＡＧＥプレｍＲＮＡ又はその一部の領域に相補的な標的化配列を含む１０～５０ヌクレオチドのＡＯＮが提供される。

他のＡＯＮに基づく治療法と異なり、本発明は、リボヌクレアーゼＨの動員を介するＲＮＡの分解の増強を誘導せず、ここでリボヌクレアーゼＨは、ＲＡＧＥ遺伝子のＤＮＡに二本鎖で結合されたＲＮＡに優先的に結合し、それを分解した。複製、転写、転座及び翻訳などの正常機能に干渉することにより生成されたＲＡＧＥタンパク質の量を調節することは、ＡＯＮのＲＡＧＥゲノムＤＮＡへのハイブリダイゼーションにもＡＯＮｓのｍＲＮＡへの結合にも依存しない。むしろ、ＡＯＮｓは、ＲＡＧＥ遺伝子転写物又はその一部におけるプレｍＲＮＡスプライシングを調節し、エクソン「スキッピング」又はイントロン配列の保持（ランオン）を誘導するために使用される。該方法は、好ましくは、ＲＡＧＥ依存性シグナル伝達を媒介する能力があるＲＡＧＥ ｍＲＮＡスプライコフォームの発現を低減し、且つ／又はＲＡＧＥ依存性シグナル伝達を媒介する能力がある機能ドメインが欠如したＲＡＧＥ ｍＲＮＡスプライコフォームの生成を増強する。

本発明の第１の態様によると、ＲＡＧＥ遺伝子転写物上の選択された標的に結合し、ＲＡＧＥ遺伝子転写物又はその一部におけるプレｍＲＮＡスプライシングを調節する能力があるＡＯＮｓが提供される。広範には、ＲＡＧＥ遺伝子転写物又はその一部におけるエクソン除去／イントロン保持の標的化を誘導するための単離又は精製されたＡＯＮが提供される。

「単離された」は、通常は天然状態で付随する成分から実質的又は本質的に遊離された材料を意味する。例えば、「単離されたポリヌクレオチド」又は「単離されたオリゴヌクレオチド」は、本明細書で用いられるとき、天然に存在する状態でそれに隣接する配列から精製又は除去されているポリヌクレオチド、例えばゲノム内のＤＮＡ断片に隣接した配列から除去されたＤＮＡ断片を指してもよい。用語「単離する」は、それが細胞に関するとき、細胞（例えば、線維芽細胞、リンパ芽球）の供給源対象（例えば、ポリヌクレオチド反復疾患を有する対象）からの精製を指す。ＤＮＡ、ｍＲＮＡ又はタンパク質との関連での「単離する」は、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ又はタンパク質の供給源、例えば細胞からの回収を指す。

ＡＯＮは、それがハイブリダイズする相手の標的配列に「誘導される」又は「対して標的化される」と述べることができる。特定の実施形態では、標的配列は、プレプロセシングされたｍＲＮＡの３’若しくは５’スプライス部位、分枝点部位、又はスプライシングの調節に関与する他の配列、例えばスプライスエンハンサー及びスプライスサイレンサー並びにスプライシングに影響を及ぼすＲＮＡの二次構造を決定する部位を含む領域を含む。標的配列は、エクソン内部又はイントロン内部に存在してもよく、又はイントロン／エクソン接合部に及んでもよい。

特定の実施形態では、ＡＯＮは、有効な様式で標的ＲＮＡ（例えばプレｍＲＮＡ）の領域を遮断するため、標的ＲＮＡ（即ち、スプライス部位選択が調節される場合のＲＮＡ）に対して十分な配列相補性を有する。例示的な実施形態では、ＲＡＧＥプレｍＲＮＡのかかる遮断は、他の場合であればスプライシングを調節することになるスプライソソームタンパク質に対する結合部位をマスクすることにより、且つ／又は標的化ＲＮＡの構造を改変することにより、スプライシングを調節するように機能する。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、標的プレｍＲＮＡ（例えばＲＡＧＥ遺伝子プレｍＲＮＡ）である。

標的ＲＮＡのスプライシングを調節するため、標的ＲＮＡ配列に対して十分な配列相補性を有するＡＯＮは、ＡＯＮが、他の場合であればスプライシングを調節することになる天然タンパク質に対する結合部位のマスキングを誘発するのに十分な配列を有し、且つ／又は標的化ＲＮＡの三次元構造を改変することを意味する。

選択されたＡＯＮｓは、短縮化され得る、例えば、約１２塩基、又はそれ以上、例えば約５０塩基であり得て、標的配列へのハイブリダイゼーション時にスプライス調節をもたらすのに該配列が十分に相補的であり、且つ任意選択的にはＲＮＡと４５℃以上のＴｍを有するヘテロ二本鎖を形成する限り、少数のミスマッチを含む。

好ましくは、ＡＯＮは、配列番号１～３１及び／又は表３ａ～３ｄのいずれかで示される配列を含む群から選択される。より好ましくは、ＡＯＮは、配列番号１１、１８、１９、又は２０である。

特定の実施形態では、標的配列とＡＯＮとの間の相補性の程度は、安定な二本鎖を形成するのに十分である。ＡＯＮｓと標的ＲＮＡ配列との相補性の領域は、８～１１塩基程度に短くてもよいが、１２～１５塩基又はそれ以上、例えば、１０～５０塩基、１０～４０塩基、１２～３０塩基、１２～２５塩基、１５～２５塩基、１２～２０塩基、又は１５～２０塩基（これらの範囲間におけるすべての整数を含む）であり得る。約１６～１７塩基のＡＯＮは、一般に固有の相補的配列を有するのに十分に長い。特定の実施形態では、相補的塩基の最小長さは、本明細書で考察される通り、必要な結合Ｔｍを達成することが求められてもよい。

特定の実施形態では、５０塩基程度に長いオリゴヌクレオチドは、少なくとも最小数の塩基、例えば１０～１２塩基が標的配列に相補的である場合、好適なことがある。しかし、一般に、細胞における促進的又は能動的取り込みは、約３０塩基未満のオリゴヌクレオチド長で最適化される。本明細書でさらに記載されるホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）ＡＯＮｓの場合、結合安定性及び取り込みの最適な平衡は、一般に１８～２５塩基長で生じる。概数で１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０塩基からなるＡＯＮｓ（例えば、ＰＭＯｓ、ＰＭＯ－Ｘ、ＰＮＡｓ、ＬＮＡｓ、ＴＩＮＡ、２’－ＯＭｅ）が含まれる。

特定の実施形態では、ＡＯＮｓは、標的配列に１００％相補的であってもよく、又は例えばバリアントに対応させるため、オリゴヌクレオチドと標的配列との間で形成されるヘテロ二本鎖がインビボで生じることがある細胞ヌクレアーゼの作用及び他の分解様式に抗するのに十分に安定である限り、ミスマッチを含んでもよい。それ故、特定のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドと標的配列との間で、概数で又は少なくとも約７０％の配列相補性、例えば、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列相補性を有してもよい。

ミスマッチは、存在する場合、典型的には、ハイブリッド二本鎖の末端領域に向けて中間よりも不安定化するものではない。許容されるミスマッチの数は、二本鎖安定性の十分に理解されている原理に応じて、オリゴヌクレオチドの長さ、二本鎖内のＧ：Ｃ塩基対の百分率、及び二本鎖内のミスマッチの位置に依存することになる。かかるＡＯＮは、標的配列に対して必ずしも１００％相補的でないが、標的配列に安定的且つ特異的に結合することに有効であることで、標的プレＲＮＡのスプライシングが調節される。

ＡＯＮと標的配列との間で形成される二本鎖の安定性は、細胞酵素切断に対する二本鎖の結合Ｔｍ及び感受性の関数である。相補性配列ＲＮＡに対するオリゴヌクレオチドのＴｍは、通常の方法、例えば、Ｈａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８５，ｐｐ．１０７－１０８に記載、又はＭｉｙａｄａ Ｃ．Ｇ．ａｎｄ Ｗａｌｌａｃｅ Ｒ．Ｂ．，１９８７，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｖｏｌ．１５４ ｐｐ．９４－１０７に記載のような方法により測定されてもよい。特定の実施形態では、ＡＯＮｓは、体温を超える、好ましくは約４５℃又は約５０℃を超える、相補性配列ＲＮＡに対する結合Ｔｍを有してもよい。６０～８０℃又はそれ以上の範囲内のＴｍの場合も含まれる。

変異体のさらなる例として、配列番号１～３１のいずれか及び／又は表３ａ～３ｄのいずれかで示される配列の全長にわたる、概数で又は少なくとも約７０％の配列同一性又は相同性、例えば、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性又は相同性を有するＡＯＮｓが挙げられる。より好ましくは、ＡＯＮは、配列番号１１、１８、１９、又は２０である。

より具体的には、選択された標的部位に結合し、ＲＡＧＥ遺伝子転写物又はその一部におけるプレｍＲＮＡスプライシングを修飾する能力があるＡＯＮが提供される。ＡＯＮは、好ましくは配列番号１～３１及び／又は表３ａ～３ｄのいずれかで示される配列から選択される。より好ましくは、ＡＯＮは、配列番号１１、１８、１９、又は２０である。

プレｍＲＮＡスプライシングの修飾により、好ましくは、１つ以上のエクソンの「スキッピング」若しくは除去又はｍＲＮＡのイントロンの保持が誘導される。得られるタンパク質は、好ましくは、内部切断又は未成熟終結のいずれかに起因して、親全長ＲＡＧＥタンパク質と比較してより短い長さである。これらの切断されたＲＡＧＥタンパク質は、全長ＲＡＧＥタンパク質のスプライコフォームと称されてもよい。

作製されたｍＲＮＡの残存するエクソンは、インフレームであり、元の３’及び５’末端間の領域内に内部切断を有することを除き、親全長タンパク質の配列に類似した配列を有するより短いタンパク質を生成することがある。別の可能性では、エクソンスキッピングは、タンパク質の最初の部分が親全長タンパク質に対して実質的に同一であるが、タンパク質の第２の部分がフレームシフトに起因して異なる配列（例えばナンセンス配列）を有するようなタンパク質をもたらすフレームシフトを誘導することがある。或いは、エクソンスキッピングは、リーディングフレームの破壊及び翻訳の未成熟終結の存在に起因し、未成熟終結タンパク質（ｐｒｅｍａｔｕｒｅｌｙ ｔｅｒｍｉｎａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）の生成を誘導することがある。未成熟終結タンパク質は、未成熟に終結されたｍＲＮＡ（例えば、エクソン１０及び／又は１１のスキッピング）の結果であってもよく、又はイントロン（例えばＲＡＧＥ ９ｂ）へのランオン若しくはミスセンススキップ（エクソン１０及び／又は１１ ｍＲＮＡを有するｍＲＮＡを提供するが、これらのエクソンによってコードされるタンパク質の発現を提供しない）の結果であってもよい。

エクソン１～９の各エクソンのスキッピングは、好ましくはＲＡＧＥ転写物のリーディングフレームを破壊することになる。これは、ナンセンス媒介性崩壊を通じたＲＮＡの分解増強をもたらすことになる。

エクソン１～１１の各エクソンのスキッピングは、好ましくはリーディングフレームをインタクトに保持することになる。これは、好ましくは内部切断されたタンパク質への翻訳をもたらすことになる。切断されたタンパク質又はＲＡＧＥ ｍＲＮＡスプライコフォームは、完全に失われた機能を有してもよく、低下した機能を有するか又はデコイ受容体として作用してもよい。

好ましくは、これらの切断されたナンセンス又は未成熟終結タンパク質は、ＲＡＧＥリガンドによる細胞内シグナル伝達経路の誘導又は配置されたＧＰＣＲｓによるＲＡＧＥの非リガンド依存性トランス活性化に関与する１つ以上の機能ドメインが欠如している。例えば、エクソン１０は膜貫通ドメインをコードし、このエクソンを除去すると、潜在的にはＲＡＧＥを介したリガンド誘導シグナル伝達の可溶性デコイ又は競合アンタゴニストとして作用し得る、可溶性ＲＡＧＥタンパク質が生成されることがある。切断されたナンセンス又は未成熟終結タンパク質は、他の因子に対する付着又は結合部位がさらに欠如することがあり、その除去は、ＲＡＧＥタンパク質と関連するシグナル伝達経路との相互作用の低下を引き起こすことがある。

或いは、１つ以上のエクソンの除去は、ＲＡＧＥタンパク質のミスフォールディング及びタンパク質が膜を通して巧みに輸送される能力における低下を引き起こすことがある。

内部切断されたタンパク質（即ち、１つ以上のエクソンによってコードされるアミノ酸が欠如したタンパク質）の存在は好ましい。ＲＡＧＥタンパク質が阻害される場合、身体がＲＡＧＥタンパク質の総量減少を補償しようとすることから、ＲＡＧＥ転写の亢進を伴う問題が生じることがある。それに対し、（好ましくは完全ＲＡＧＥタンパク質の特徴の１つ以上が欠如している）内部切断されたタンパク質の存在は、転写亢進を阻止しても、機能的ＲＡＧＥタンパク質の総量減少に起因して治療的利点をもたらすのに十分である必要がある。

本発明のＡＯＮ誘導性エクソンスキッピングは、ＲＡＧＥタンパク質の機能を完全ではない代わりに実質的に失わせる必要がある。好ましくは、エクソンスキッピングプロセスを介する選択的スプライシングの調節は、ＲＡＧＥタンパク質の機能性の低下又は喪失をもたらす。

異なるスキッピング方法を用いて生成されるＲＡＧＥの異なるアイソフォームであれば、好ましくは、ＲＡＧＥ活性に関連する異なる疾患、例えば、神経変性疾患、がん、肺障害、又は炎症性疾患を治療又は予防するために使用可能である、シグナル伝達活性が喪失又は低下したタンパク質をもたらし得る。選択的スプライシング方法により、好ましくはＲＡＧＥ発現及び活性に関連する疾患の具体的な側面、形態若しくは進行に対する治療として使用可能である、切断されたタンパク質又は機能が低下したタンパク質が形成されることがある。

ＡＯＮｓを使用する本発明のスキッピングプロセスは、各エクソンを除去（スキップ）してもよく、又は２つ以上のエクソンの同時スキッピングをもたらしてもよい。

ＡＯＮｓを使用する本発明のスキッピングプロセスは、１つ以上のエクソンの直接的スキッピングの存在下又は不在下でのイントロン配列の保持を含んでもよい。

本発明のＡＯＮｓは、選択された標的に結合し、ＲＡＧＥ遺伝子転写物中のエクソン除去を誘導する能力がある２つ以上のＡＯＮｓの組み合わせであってもよい。組み合わせは、２つ以上のＡＯＮｓのカクテル、及び／又は一緒に連結された２つ以上のＡＯＮｓを含む構築物であってもよい。

本発明は、ＲＡＧＥ遺伝子転写物における選択的スプライシングを調節するための方法であって、
本明細書に記載のようなＡＯＮｓの１つ以上を提供し、且つオリゴマーが標的核酸部位に結合することを可能にするステップ
を含む、方法をさらに提供する。

本発明のさらなる別の態様によると、ＲＡＧＥプレｍＲＮＡの選択的スプライシングを調節するための核酸配列標的であって、配列番号１～３１及び／又は表３ａ～３ｄのいずれかで示される配列からなる群から選択される核酸配列のＤＮＡ等価物、及びそれらに相補的な配列を含む、核酸配列標的が提供される。より好ましくは、ＡＯＮは、配列番号１１、１８、１９、又は２０である。ＡＯＮは、ＡＯＮｓの組み合わせ、好ましくは配列番号１１及び１０、又は配列番号１１及び１３の組み合わせであってもよい。

コンセンサススプライス部位を完全にマスクするようにＡＯＮｓを設計することで、必ずしも標的化エクソンのスプライシングにおける変化をもたらさなくてもよい。さらに、発明者は、ＡＯＮｓを設計するとき、ＡＯＮ自体のサイズ又は長さが常に主要な要素でないことを発見している。いくつかの標的を用いて、２０塩基程度に短いＡＯＮｓは、特定の場合、同じエクソンに特異的な他のより長い（例えば２５塩基）オリゴマーよりも効率的に、一部のエクソン包含を誘導することができた。

発明者は、スプライシングを再指示するための、ＡＯＮｓによって遮断又はマスク可能である任意の標準モチーフが存在するように思われないことも発見している。ＡＯＮｓが各遺伝子標的に対して設計され、それら個別の有効性が経験的に評価される必要があることは見出されている。

より具体的には、ＡＯＮは、表３ａ～３ｄのいずれかで示されるものから選択されてもよい。配列は、好ましくは、配列番号１～３１の任意の１つ以上、及びそれらの組み合わせ又はカクテルからなる群から選択される。より好ましくは、ＡＯＮは、配列番号１１、１８、１９、又は２０である。ＡＯＮｓの組み合わせは、好ましくは配列番号１１及び１０、又は配列番号１１及び１３の組み合わせである。これは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でかかる配列にハイブリダイズし得る配列、それらに相補的な配列、修飾塩基、修飾骨格、及びそれらの機能的切断部又は伸長部を有する配列（ＲＡＧＥ遺伝子転写物におけるプレｍＲＮＡプロセシング活性を有する又は調節する）を含む。

オリゴマー及びＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はＲＮＡは、各分子中の十分な数の対応する位置が互いに水素結合し得るヌクレオチドによって占有されるとき、互いに相補的である。それ故、「特異的にハイブリダイズ可能」及び「相補的」は、オリゴマーとＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はＲＮＡ標的との間で安定的且つ特異的な結合が生じるような十分な程度の相補性又は対合を示すために使用される用語である。当該技術分野では、ＡＯＮの配列が、特異的にハイブリダイズ可能であるべきその標的配列の配列に１００％相補的である必要がないことは理解されている。ＡＯＮは、化合物の標的ＤＮＡ又はＲＮＡ分子への結合が標的ＤＮＡ又はＲＮＡ産物の正常機能に干渉するとき、特異的にハイブリダイズ可能であり、且つ、特異的結合が所望される条件下、即ち、インビボアッセイ又は治療的処置の場合、及びインビトロアッセイの場合の生理的状態下、アッセイが実施される条件下で、ＡＯＮの非標的配列への非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性がある。

選択的ハイブリダイゼーションは、低、中又は高ストリンジェンシー条件下であってもよいが、好ましくは高ストリンジェンシー下である。当業者は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーが、基礎組成、相補鎖の長さ及びハイブリダイズする核酸間のヌクレオチド塩基ミスマッチの数に加えて、塩濃度、温度、又は有機溶媒などの条件による影響を受けることを理解するであろう。ストリンジェントな温度条件は、一般に、３０℃超、典型的には３７℃超、及び好ましくは４５℃超、好ましくは少なくとも５０℃、及び典型的には６０℃～８０℃又はそれ以上の温度を含むことになる。ストリンジェントな塩条件は、通常、１０００ｍＭ未満、典型的には５００ｍＭ未満、及び好ましくは２００ｍＭ未満となる。しかし、パラメータの組み合わせは、任意の単一パラメータの尺度よりもはるかに重要である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例が、６５℃及び０．１×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）である。それ故、本発明のＡＯＮｓは、表３ａ～３ｄ、又は配列番号１～３１のいずれかで提供される配列に選択的にハイブリダイズするオリゴマーを含んでもよい。より好ましくは、ＡＯＮは、配列番号１１、１８、１９、又は２０である。

構造タンパク質におけるエクソンの末端のコドン配列がコドンの末端で常に破壊することではなく、結果的に、ｍＲＮＡのインフレームリーディングを保証するため、プレｍＲＮＡから２つ以上のエクソンを欠失させる必要性があるかもしれないことは理解されるであろう。かかる環境では、本発明の方法により複数のＡＯＮｓが選択される必要があるかもしれず、ここで各々は、所望されるエクソン及び／又はイントロンの包含を誘導することに関与する異なる領域に特異的である。Ｔｍは、所与のイオン強度及びｐＨで、標的配列の５０％が相補的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする温度である。かかるハイブリダイゼーションは、ＡＯＮの標的配列に対する「近似的」又は「実質的」相補性、及び正確な相補性で生じてもよい。

典型的には、ＡＯＮのヌクレオチドと、少なくとも約１４ヌクレオチドのストレッチにわたり、少なくとも約５５％の同一性、好ましくは少なくとも約６５％、より好ましくは少なくとも約７５％及び最も好ましくは少なくとも約９０％、９５％、９８％又は９９％の同一性がある場合、選択的ハイブリダイゼーションが生じることになる。上記の通り、相同性比較の長さは、より長いストレッチに及んでもよく、特定の実施形態では、少なくとも約９ヌクレオチド、通常的には少なくとも約１２ヌクレオチド、より通常的には少なくとも約２０ヌクレオチド、多くは少なくとも約２１、２２、２３若しくは２４ヌクレオチド、少なくとも約２５、２６、２７若しくは２８ヌクレオチド、少なくとも約２９、３０、３１若しくは３２ヌクレオチド、少なくとも約３６又はそれ以上のヌクレオチドのストレッチに及ぶことが多くなる。

それ故、本発明のＡＯＮ配列は、好ましくは、本明細書中の配列表に示される配列に対して、少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％又は９０％の相同性を有する。より好ましくは、少なくとも９１％、９２％、９３％ ９４％、又は９５％、より好ましくは、少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％の相同性がある。一般に、ＡＯＮの長さが短縮されると、選択的ハイブリダイゼーションを得るのに要求される相同性が拡大する。結果的に、本発明のＡＯＮが約３０未満のヌクレオチドからなる場合、同一性百分率が、本明細書中の配列表に示されるＡＯＮｓと比べて、７５％を超える、好ましくは８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％を超えることが好ましい。ヌクレオチド相同性比較は、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム又はＧＡＰなどの配列比較プログラムによって実施されてもよい（Ｄｅｖｅｒａｕｘ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２，３８７－３９５）。この方法では、本明細書中で引用される場合と類似する又は実質的に異なる長さの配列であれば、ギャップのアラインメントへの挿入により比較可能であり、かかるギャップは、例えばＧＡＰによって使用される比較アルゴリズムにより決定可能である。

本発明のＡＯＮは、標的配列との相同性が低下した領域、及び相同性が正確な領域を有してもよい。オリゴマーがその全長において正確な相同性を有することは必要ではない。例えば、オリゴマーは、標的配列に対して同一である少なくとも４又は５塩基の連続ストレッチ、好ましくは標的配列に対して同一である少なくとも６又は７塩基の連続ストレッチ、より好ましくは標的配列に対して同一である少なくとも８又は９塩基の連続ストレッチを有してもよい。オリゴマーは、標的配列に対して同一である少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５又は２６塩基のストレッチを有してもよい。オリゴマー配列の残りのストレッチは、標的配列と断続的に同一であってもよく；例えば、残りの配列は、同一塩基、それに続く非同一塩基、それに続く同一塩基を有してもよい。或いは（又は同様に）、オリゴマー配列は、完全に満たない相同性のストレッチが散在した、同一配列のいくつかのストレッチ（例えば、３、４、５又は６塩基）を有してもよい。かかる配列ミスマッチは、好ましくは、スプライススイッチング活性の低下を全く有しないか又は極わずかしか有しないことになる。

用語「調節する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）」又は「調節する（ｍｏｄｕｌａｔｅｓ）」は、１つ以上の定量化可能なパラメータを、任意選択的には定義され、且つ／又は統計学的に有意な量だけ「増加させる」又は「減少させる」ことを含む。用語「増加させる（ｉｎｃｒｅａｓｅ）」又は「増加させる（ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ）」、「増強する（ｅｎｈａｎｃｅ）」又は「増強する（ｅｎｈａｎｃｉｎｇ）」、又は「刺激する（ｓｔｉｍｕｌａｔｅ）」又は「刺激する（ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ）」は、一般に、ＡＯＮｓ又は組成物の１つが、細胞又は対象において、ＡＯＮなし又は対照化合物のいずれかによって引き起こされる応答と比較して、より大きい生理学的応答（即ち下流効果）をもたらす又は引き起こす能力を指す。用語「減少させる（ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ）」又は「減少させる（ｄｅｃｒｅａｓｅ）」は、一般に、ＡＯＮｓ又は組成物の１つが、細胞又は対象において、ＡＯＮなし又は対照化合物のいずれかによって引き起こされる応答と比較して、低下した生理学的応答（即ち下流効果）をもたらす又は引き起こす能力を指す。

関連の生理学的又は細胞応答（インビボ又はインビトロ）は、当業者にとって明らかであろうし、ＲＡＧＥをコードするプレｍＲＮＡにおける特定のエクソンの除去における増加、ＲＡＧＥをコードするプレｍＲＮＡの量における減少又はそれを必要とする細胞、組織、若しくは対象における機能的ＲＡＧＥタンパク質の発現における減少を含んでもよい。「増加した」又は「増強された」量は、典型的には統計学的に有意な量であり、且つ、ＡＯＮなし（薬剤の不在）又は対照化合物によって生成される量の、１．１倍、１．２倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍又はそれ以上の倍数（例えば、５００倍、１０００倍）（１を超えて２未満のすべての整数及び小数点、例えば、１．５、１．６、１．７、１．８を含む）の増加を含んでもよい。用語「低減する」又は「阻害する」は、一般に、診断技術における通常の技術に従う測定としての、１つ以上のＡＯＮｓ又は組成物が、関連する生理学的又は細胞応答、例えば本明細書に記載の疾患又は病態の症状を「減少させる」能力に関連してもよい。関連する生理学的又は細胞応答（インビボ又はインビトロ）は、当業者にとって明らかであろうし、がん、神経変性疾患、肺障害、及び他の炎症性疾患などの疾患の症状又は病理における低減を含んでもよい。応答における「減少」は、ＡＯＮなし又は対照組成物によってもたらされる応答と比較して、統計学的に有意であってもよく、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％（それらの間のすべての整数を含む）の減少を含んでもよい。

ＡＯＮの長さは、それがプレｍＲＮＡ分子内部の意図される位置に選択的に結合する能力がある限り、変化してもよい。かかる配列の長さは、本明細書に記載の選択手順に従って決定され得る。一般に、ＡＯＮは、約１０ヌクレオチド長から最大で約５０ヌクレオチド長になる。しかし、この範囲内のヌクレオチドの任意の長さが該方法において使用されてもよいことは理解されるであろう。好ましくは、ＡＯＮの長さは、１０～４０の間、１０～３５の間、１５～３０ヌクレオチド長又は２０～３０ヌクレオチド長、最も好ましくは約２５～３０ヌクレオチド長である。例えば、オリゴマーは、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチド長であってもよい。

本明細書で用いられるとき、「ＡＯＮ」は、核酸塩基がワトソン・クリック塩基対合によりＲＮＡ中の標的配列にハイブリダイズし、標的配列内でオリゴヌクレオチド：ＲＮＡヘテロ二本鎖を形成することを可能にする、ヌクレオチド、又はヌクレオチド類似体の直鎖状配列を指す。用語「ＡＯＮ」、「ＡＯＮ」、「オリゴマー」及び「アンチセンス化合物」は、オリゴヌクレオチドを指すように互換可能に用いられてもよい。環状サブユニットは、リボース又は別のペントース糖又は、特定の実施形態ではモルホリノ基（下のモルホリノオリゴヌクレオチドの説明を参照）に基づいてもよい。さらに、ペプチド核酸（ＰＮＡｓ）、ロックド核酸（ＬＮＡｓ）、及び２’－Ｏ－メチルオリゴヌクレオチドが、当該技術分野で公知の他のアンチセンス薬剤の中で企図される。

天然に存在しないＡＯＮｓ、又は「オリゴヌクレオチド類似体」、例えば、（ｉ）修飾骨格構造、例えばオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドに見られる標準的なホスホジエステル結合以外の骨格、及び／又は（ｉｉ）修飾糖部分、例えばリボース又はデオキシリボース部分ではなくてモルホリノ部分、を有するＡＯＮｓ又はオリゴヌクレオチドが含まれる。オリゴヌクレオチド類似体は、標準ポリヌクレオチド塩基とのワトソン・クリック塩基対合による水素結合能を有する塩基を支持し、ここで類似体骨格は、オリゴヌクレオチド類似体分子と標準ポリヌクレオチド（例えば、一本鎖ＲＮＡ又は一本鎖ＤＮＡ）中の塩基との間で配列特異的な形でかかる水素結合を許容するような塩基を呈する。好ましい類似体は、実質的に非荷電のリン含有骨格を有するものである。

ＡＯＮｓを生成するための１つの方法は、２’ヒドロキシリボース位置のメチル化であり、ホスホロチオエート骨格の組込みにより、ＲＮＡに外面的に類似するが、ヌクレアーゼ分解に対してはるかにより耐性がある分子が生成されるが、本発明の当業者は、本発明の対象において使用可能であるかもしれない好適な骨格の他の形態を理解するであろう。

ＡＯＮｓとの二本鎖形成中のプレｍＲＮＡの分解を回避するため、内因性リボヌクレアーゼＨによる切断を最小化又は阻止するように本方法で使用されるＡＯＮｓを適応させてもよい。この特性は、非メチル化オリゴマーによるＲＮＡの、細胞内又はリボヌクレアーゼＨを含有する粗抽出液中のいずれかでの処理により、プレｍＲＮＡ：ＡＯＮ二本鎖の分解が引き起こされることから高度に好ましい。本方法では、かかる分解をバイパスするか又は誘導しない能力がある修飾ＡＯＮｓの任意の形態が使用されてもよい。ヌクレアーゼ耐性は、本発明のＡＯＮｓを、部分不飽和の脂肪族炭化水素鎖、並びにカルボン酸基、エステル基、及びアルコール基を含む１つ以上の極性基又は荷電性基を含むように修飾することにより達成されてもよい。

ＲＮＡと二本鎖化されるとき、細胞リボヌクレアーゼＨによって切断されないＡＯＮｓの例が、２’－Ｏ－メチル誘導体である。かかる２’－Ｏ－メチル－オリゴリボヌクレオチドは、細胞環境内及び動物組織内で安定であり、それらのＲＮＡとの二本鎖は、それらのリボ又はデオキシリボ対応物よりも高いＴｍ値を有する。或いは、本発明のヌクレアーゼ耐性ＡＯＮｓは、フッ素添加された最終の３’末端ヌクレオチドの少なくとも１つを有してもよい。さらに代替的には、本発明のヌクレアーゼ耐性ＡＯＮｓは、最終の３末端ヌクレオチド塩基の少なくとも２つの間を連結するホスホロチオエート結合を有し、好ましくは最終の４つの３’末端ヌクレオチド塩基の間を連結するホスホロチオエート結合を有する。

スプライススイッチングの増強は、さらに代替的なオリゴヌクレオチド化学により達成されてもよい。例えば、ＡＯＮは、ホスホロアミデート又はホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）；ＰＭＯ－Ｘ；ＰＰＭＯ；ペプチド核酸（ＰＮＡ）；ロックド核酸（ＬＮＡ）及びα－Ｌ－ＬＮＡ、２’－アミノＬＮＡ、４’－メチルＬＮＡ及び４’－Ｏ－メチルＬＮＡを含む誘導体；エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）及びその誘導体；ホスホロチオエートオリゴマー；トリシクロＤＮＡオリゴマー（ｔｃＤＮＡ）；トリシクロホスホロチオエートオリゴマー；２’Ｏ－メチル修飾オリゴマー（２’－ＯＭｅ）；２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）；２’－フルオロ、２’－フルオロアラビノ（ＦＡＮＡ）；アンロックド核酸（ＵＮＡ）；熱安定性ねじれたインターカレーティング核酸（ＴＩＮＡ）、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）；シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）；２’－アミノ（２’－ＮＨ２）；２’－Ｏ－エチレンアミン、又はミックスマー若しくはギャップマーとしての前記の任意の組み合わせを含むリストから選択されてもよい。送達有効性をさらに改善するため、上記の修飾ヌクレオチドは、脂肪酸／脂質／コレステロール／アミノ酸／炭水化物／多糖／ナノ粒子などと糖又は核酸塩基部分にコンジュゲートされることが多い。これらのコンジュゲートヌクレオチド誘導体は、エクソンスキッピングＡＯＮｓを構築するためにも使用可能である。ヒトＲＡＧＥ遺伝子転写物のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導性スプライス修飾は、一般に、ホスホロチオエート骨格上でオリゴリボヌクレオチド、ＰＮＡｓ、２ＯＭｅ又はＭＯＥ修飾塩基のいずれかを使用している。オリゴ設計用に、カチオン性リポプレックスとして送達されるときのインビトロでのそれらの効率的取り込みが理由で２ＯＭｅＡＯｓが使用されるが、これらの化合物は、ヌクレアーゼ分解を受けやすく、インビボ又は臨床適用にとって理想的とは考えられない。本発明のＡＯＮｓを作製するため、代替化学が用いられるとき、本明細書に提供される配列のウラシル（Ｕ）は、チミン（Ｔ）で置換されてもよい。

天然に存在しないオリゴマー、又は「オリゴヌクレオチド類似体」、例えば、（ｉ）修飾骨格構造、例えば天然に存在するオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドに見られる標準的なホスホジエステル結合以外の骨格、及び／又は（ｉｉ）修飾糖部分、例えばリボース又はデオキシリボース部分ではなくてモルホリノ部分、を有するオリゴマーが、本発明のＡＯＮｓ中に含まれる。オリゴマー類似体は、標準ポリヌクレオチド塩基とのワトソン・クリック塩基対合による水素結合能を有する塩基を支持し、ここで類似体骨格は、オリゴマー類似体分子と標準ポリヌクレオチド（例えば、一本鎖ＲＮＡ又は一本鎖ＤＮＡ）中の塩基との間で配列特異的な形でかかる水素結合を許容するような塩基を呈する。好ましい類似体は、実質的に非荷電のリン含有骨格を有するものである。

リボヌクレアーゼＨを活性化しないアンチセンスオリゴヌクレオチドは、公知の技術に従って作製可能である（例えば、米国特許第５，１４９，７９７号明細書を参照）。かかるＡＯＮｓは、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド配列であってもよく、単に、リボヌクレアーゼＨの、１つのメンバーとしてオリゴマーを有する二本鎖分子への結合を立体的に妨害又は阻止する任意の構造的修飾であって、二本鎖形成を実質的に妨害又は破壊しない構造的修飾を有する。二本鎖形成に関与するオリゴマーの部分がリボヌクレアーゼＨのそれに対する結合に関与する部分と実質的に異なることから、リボヌクレアーゼＨを活性化しない極めて多数のＡＯＮｓが利用可能である。例えば、かかるＡＯＮｓは、ヌクレオチド間架橋リン酸残基の少なくとも１つ又は全部が、修飾リン酸塩、例えば、メチルホスホネート、メチルホスホロチオエート、ホスホロモルホリデート、ホスホロピペラジデート ボラノホスフェート、アミド結合及びホスホロアミド酸であるようなオリゴマーであってもよい。例えば、ヌクレオチド間架橋リン酸残基の他のすべてのものは、上記のように修飾されてもよい。別の非限定例では、かかるＡＯＮｓは、ヌクレオチドの少なくとも１つ又は全部が、２’低級アルキル部分（例えば、Ｃ_１～Ｃ_４、線状又は分岐状、飽和又は不飽和アルキル、例えば、メチル、エチル、エテニル、プロピル、１－プロペニル、２－プロペニル、及びイソプロピルなど）を有するような分子である。例えば、ヌクレオチドの他のすべてのものは、上記のように修飾されてもよい。

上記のＡＯＮｓが本発明のＡＯＮｓの好ましい形態である一方で、本発明は、限定はされないが、下記のようなオリゴマー模倣物を含む、他のオリゴマーアンチセンス分子を含む。

本発明において有用な好ましいＡＯＮｓの具体例として、修飾骨格又は非天然ヌクレオシド間結合を有するオリゴマーが挙げられる。本明細書で定義される通り、修飾骨格を有するオリゴマーは、骨格内にリン原子を保持するもの及び骨格内にリン原子を有しないものを含む。本明細書の目的として、また時として当該技術分野で参照される通り、修飾オリゴマーであって、それらのヌクレオシド間骨格内にリン原子を有しないものもＡＯＮｓであると考えることができる。

他の好ましいオリゴマー模倣物では、ヌクレオチド単位の糖及びヌクレオシド間結合の双方、即ち骨格は、新規な基で置換される。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションにおいて維持される。１つのかかるオリゴマー化合物として、優位なハイブリダイゼーション特性を有することが示されているオリゴマー模倣物は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡ化合物では、オリゴマーの糖骨格が、骨格、特にアミノエチルグリシン骨格を有するアミドで置換される。核酸塩基は、保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的又は間接的に結合される。

別の好ましい化学は、任意の公知のヌクレアーゼ又はプロテアーゼにより分解されない、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）のオリゴマー化合物である。これらの化合物は、非荷電であり、ＲＮＡ鎖に結合されるとき、リボヌクレアーゼＨ活性を活性化せず、インビボ投与後に持続的なスプライス調節を発揮することが示されている（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ ａｎｄ Ｗｅｌｌｅｒ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，７，１８７－１９７）。

修飾オリゴマーはまた、１つ以上の置換糖部分を含有してもよい。オリゴマーは、核酸塩基（当該技術分野では単に「塩基」と称されることが多い）の修飾又は置換をさらに含んでもよい。特定の核酸塩基は、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増強するために特に有用である。これらは、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジン、及びＮ－２、Ｎ－６及びＯ－６置換プリン、例えば、２－アミノプロピルアデニン、５－プロペニルウラシル及び５－プロピニルシトシンを含む。５－メチルシトシン置換は、さらにより詳細には２’－Ｏ－メトキシエチル糖修飾と組み合わされるとき、０．６～１．２℃により核酸の二本鎖安定性を増強することが示されている。

本発明のオリゴマーの別の修飾は、オリゴマーの活性、細胞分布又は細胞取り込みを増強する、オリゴマーの１つ以上の部分又はコンジュゲートに化学的に連結することを含む。かかる部分は、限定はされないが、脂質部分、例えば、コレステロール部分、コール酸、チオエーテル、例えば、ヘキシル－Ｓ－トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール若しくはウンデシル残基、リン脂質、例えば、ジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロール若しくはトリエチルアンモニウム１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－Ｈ－ホスホン酸、ポリアミン若しくはポリエチレングリコール鎖、又はアダマンタン酢酸、パルミチル部分、ミリスチル、又はオクタデシルアミン若しくはヘキシルアミノ－カルボニル－オキシステロール部分を含む。

細胞取り込み及び核局在化を増強するため、細胞透過性ペプチドがホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーに添加されている。Ｊｅａｒａｗｉｒｉｙａｐａｉｓａｒｎ ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１６ ９，１６２４－１６２９に示される通り、異なるペプチドタグが取り込みの効率及び標的組織特異性に影響を及ぼすことが示されている。

所与の化合物におけるすべての位置が均一に修飾されることは必要でなく、事実、上記修飾の２つ以上が、単一の化合物中又はさらにオリゴマー内部の単一のヌクレオシドに組み込まれてもよい。本発明は、キメラ化合物であるＡＯＮｓも含む。「キメラ」ＡＯＮｓ又は「キメラ」は、本発明との関連では、２つ以上の化学的に異なる領域を有するＡＯＮｓ、特にオリゴマーであり、各々は、少なくとも１つの単量体単位、即ちオリゴマー化合物の場合にはヌクレオチドで構成される。これらのオリゴマーは、典型的には少なくとも１つの領域を有し、ここでオリゴマーは、オリゴマー又はＡＯＮに対して、増強されたヌクレアーゼ分解に対する耐性、増強された細胞取り込み、及び標的核酸に対する結合親和性増強のための追加的領域を付与するように修飾される。

ＡＯＮｓ及びそれらの変異体の活性は、当該技術分野で通常の技術に従い、アッセイ可能である。例えば、調査されたＲＮＡｓ及びタンパク質のスプライス形態及び発現レベルは、転写された核酸又はタンパク質のスプライス形態及び／又は発現を検出するための多種多様な周知の方法のいずれかにより評価されてもよい。かかる方法の非限定例として、ＲＮＡのスプライス形態のＲＴ－ＰＣＲとそれに続くＰＣＲ産物のサイズ分離、核酸ハイブリダイゼーション方法、例えばノーザンブロット及び／又は核酸アレイの使用；核酸増幅方法；タンパク質の検出用の免疫学的方法；タンパク質精製方法；並びにタンパク質機能又は活性アッセイが挙げられる。

ＲＮＡ発現レベルは、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ（即ち、転写ポリヌクレオチド）を細胞、組織又は生物から調製することにより、そしてアッセイ対象の核酸の相補体、又はその断片である参照ポリヌクレオチドとｍＲＮＡ／ｃＤＮＡをハイブリダイズすることにより評価可能である。ｃＤＮＡは、任意選択的には、相補的ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの前に、種々のポリメラーゼ連鎖反応又はインビトロ転写方法のいずれかを用いて増幅可能であり；好ましくは、それは増幅されない。さらに、１つ以上の転写物の発現は、転写物の発現のレベルを評価するための定量ＰＣＲを使用して検出可能である。

本発明は、ＲＡＧＥスプライス操作を治療レベルまで誘導するため、ＲＡＧＥ遺伝子転写物のＡＯＮ誘導性スプライススイッチング、臨床的に重要なオリゴマー化学及び送達系を提供する。ＲＡＧＥ遺伝子転写からの全長ＲＡＧＥ ｍＲＮＡ、ひいてはＲＡＧＥタンパク質の量における実質的減少は、
ａ）（ｉ）イントロンエンハンサー標的モチーフ、（ｉｉ）ＡＯＮ長さ及びオリゴマーカクテルの開発、（ｉｉｉ）化学の選択、並びに（ｉｖ）オリゴマー送達を増強するための細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）の添加の実験的評価を通じた、線維芽細胞株を使用するインビトロでのオリゴマー精製；並びに
ｂ）１つ以上の欠損エクソンを伴うＲＡＧＥ転写物を作製するための新規な手法の詳細な評価
により達成される。

そのようなものとして、本明細書では、ＲＡＧＥプレｍＲＮＡの選択的スプライシングが特異的なＡＯＮｓにより調節可能であることが実証される。この方法で、全長（シグナル伝達能）ＲＡＧＥタンパク質の量における機能的に有意な減少を得ることができ、且つ／又は非シグナル伝達デコイ受容体ＲＡＧＥ ｍＲＮＡスプライコフォーム（ＲＡＧＥ＿ｖ１）又は他のデコイ受容体における増加は達成可能であり、それにより神経変性疾患、がん、肺障害、及び他の炎症性疾患などの疾患に関連する重度の病理が減少する。

本発明に従って使用されるＡＯＮｓは、便宜的には固相合成に関する周知の技術を通じて作製されてもよい。かかる合成のための機器は、例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）を含むいくつかのベンダーにより販売されている。修飾された固体支持体上でオリゴマーを合成するための一方法は、米国特許第４，４５８，０６６号明細書に記載されている。

当該技術分野で公知のかかる合成のための任意の他の手段が、追加的に又は代替的に利用されてもよい。ホスホロチオエート及びアルキル化誘導体などのオリゴマーを調製するための類似技術を使用することは周知である。１つのかかる自動化された実施形態では、ジエチルホスホラミダイトが出発物質として使用され、Ｂｅａｕｃａｇｅ，ｅｔ ａｌ．，（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２２：１８５９－１８６２に記載のように合成されてもよい。

本発明のＡＯＮｓは、インビトロで合成され、生物学的起源のアンチセンス組成物を含まない、又はＡＯＮｓのインビボ合成を誘導するように遺伝子ベクター構築物が設計される。本発明の分子は、他の分子、分子構造物又は化合物の混合物、例えば、取り込み、分布及び／又は吸収を補助するための、リポソーム、受容体標的化分子、経口、直腸、局所若しくは他の製剤などとも混合され、カプセル封入され、コンジュゲートされ、又はそうでなければ会合されてもよい。

本発明のＡＯＮｓは、疾患の治療を意図して利用されてもよい、予防薬又は治療薬としても使用可能である。したがって、一実施形態では、本発明は、薬学的に許容できる担体、希釈剤、又は賦形剤と混合された、治療有効量での、本明細書に記載のような効率的な一貫したエクソンスキッピングを誘導するためのＲＡＧＥプレｍＲＮＡにおける選択された標的に結合するＡＯＮｓを提供する。

したがって、本発明は、患者におけるＲＡＧＥ発現に関連する疾患の作用を治療し、予防し、又は寛解させるための医薬、予防、又は治療組成物であって、
ａ）本明細書に記載のような１つ以上のＡＯＮｓ、及び
ｂ）１つ以上の薬学的に許容できる担体及び／又は希釈剤
を含む、組成物を提供する。

好ましくは、ＲＡＧＥ発現に関連する疾患は、神経障害、がん；心血管障害；消化性障害；呼吸器障害、筋骨格、結合組織障害、腎障害、生殖器障害、皮膚障害、眼疾患及び内分泌障害を含むリストから選択される。

本発明の一形態では、ＲＡＧＥ関連障害は、粥状動脈硬化、虚血性心疾患、心筋炎、心内膜炎、心筋症、急性リウマチ熱、慢性リウマチ性（ｒｈｅｍａｔｉｃ）心疾患、脳血管疾患／脳卒中、心不全、血管石灰化、末梢血管疾患、及びリンパ管炎の群から選択される心血管障害である。

本発明の一形態では、ＲＡＧＥ関連障害は、歯周炎、食道炎、胃炎、胃・十二指腸潰瘍化、クローン病、潰瘍性大腸炎、虚血性大腸炎、腸炎及び全腸炎、腹膜炎、アルコール性肝疾患、肝炎、中毒性肝疾患、胆汁性肝硬変、肝線維症／肝硬変、非アルコール性脂肪性肝疾患／非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨ）、肝損傷、外傷又は手術からの肝外傷及び回復の群から選択される消化器系障害である。

本発明の一形態では、ＲＡＧＥ関連障害は、唇、口腔及び咽頭の悪性新生物、消化器の悪性新生物、呼吸器及び胸腔内臓器の悪性新生物、骨及び関節軟骨の悪性新生物、皮膚のメラノーマ及び他の悪性新生物、中皮及び軟部組織の悪性新生物、乳房の悪性新生物、女性生殖器の悪性新生物、男性生殖器の悪性新生物、尿路の悪性新生物、眼、脳及び中枢神経系の他の部分の悪性新生物、甲状腺及び他の内分泌腺の悪性新生物、リンパ、造血及び関連組織の悪性新生物、明確に定義されていない二次及び／又は不特定部位の悪性新生物の群から選択されるがんである。

本発明の一形態では、ＲＡＧＥ関連障害は、神経障害であり、中枢神経系の炎症性疾患、主に中枢神経系を冒す全身性萎縮、錐体外路及び運動障害、パーキンソン病、中枢神経系の脱髄性疾患、アルツハイマー病、限局性脳萎縮、レビー小体病、てんかん、片頭痛、神経障害性疼痛、糖尿病性神経障害、多発ニューロパチー、神経膠腫の発現及び進行、脊髄外傷、及び虚血性脳傷害／脳卒中、脳損傷、外傷又は手術からの脳外傷及び回復の群から選択される。

本発明の一形態では、ＲＡＧＥ関連障害は、筋骨格（ｍｕｓｃｌｕｌｏｓｋｅｌｅｔａｌ）障害であり、筋ジストロフィー、先天性及び蓄積性ミオパチー、多発性筋炎、重症筋無力症、皮膚筋炎、封入体筋炎、筋萎縮及び筋損傷の群から選択される。

本発明の一形態では、ＲＡＧＥ関連障害は、精神障害であり、認知症、アルツハイマー病、血管性認知症、嗜癖、統合失調症、大感情障害、抑うつ、躁病、双極性障害、及び不安症の群から選択される。

本発明の一形態では、ＲＡＧＥ関連障害は、呼吸器（肺）障害であり、急性上気道感染、鼻炎、上咽頭炎、副鼻腔炎、喉頭炎、インフルエンザ及び肺炎、急性気管支炎、急性細気管支炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、気管支拡張症、肺気腫、外用剤に起因する慢性肺疾患、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、肺好酸球増多症、及び胸膜炎、肺損傷、外傷又は手術からの肺外傷及び回復の群から選択される。

本発明の一形態では、ＲＡＧＥ関連障害は、結合組織障害であり、変形性関節症、感染性関節炎、関節リウマチ、乾癖性及び腸炎性関節症、若年性関節炎、痛風及び他の結晶関節症、糖尿病性関節症、結節性多発動脈炎、チャーグ・ストラウス、皮膚粘膜リンパ節症候群［川崎］、過敏性血管炎、グッドパスチャー症候群、血栓性微小血管症、ウェゲナー肉芽腫症、大動脈弓症候群［高安］、巨細胞性動脈炎、リウマチ性多発筋痛症、顕微鏡的多発血管炎、低補体血症性（ｈｙｐｏｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｅｍｉｃ）血管炎、全身性エリテマトーデス、皮膚多発性筋炎、多発性筋炎、全身性硬化症、クレスト症候群、乾燥症候群［シェーグレン］、混合性結合組織病、ベーチェット病、外傷性筋肉損傷、捻挫、筋挫傷、及び骨折の群から選択される。

本発明の一形態では、ＲＡＧＥ関連障害は、腎障害であり、糸球体腎炎、腎炎、糖尿病性腎疾患、間質性腎炎、閉塞性及び逆流性腎症、急性腎不全、及び慢性腎疾患の群から選択される。

本発明の一形態では、ＲＡＧＥ関連障害は、生殖器障害であり、前立腺炎、前立腺肥大、前立腺異形成、卵管炎、卵巣炎、骨盤内炎症性疾患（ＰＩＤ）、多嚢胞性卵巣症候群、子宮頸管炎、子宮頸部異形成、腟炎、外陰炎の群から選択される。

本発明の一形態では、ＲＡＧＥ関連障害は、皮膚炎、湿疹、天疱瘡／類天疱瘡（ｐｅｍｐｈｙｇｏｉｄ）、乾癬、ばら色粃糠疹、扁平苔癬、蕁麻疹、多形紅斑（ｅｒｙｔｈｒｅｍａ ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ）、結節性紅斑（ｅｒｙｔｈｅｍａ ｎｏｒｄｏｓｕｍ）、日焼け、角化症、光老化皮膚潰瘍、表面皮膚損傷、及び開放創の群から選択される皮膚障害である。

本発明の一形態では、ＲＡＧＥ関連障害は、角膜炎、結膜炎、網膜炎、緑内障、強膜炎、上強膜炎、脈絡網膜性炎症、糖尿病性網膜症、黄斑浮腫、未熟児の網膜症、及び視神経炎、眼損傷、外傷又は手術からの眼外傷及び回復の群から選択される眼疾患である。

本発明の一形態では、ＲＡＧＥ関連障害は、糖尿病、インスリン抵抗性、障害性耐糖能及び甲状腺炎の群から選択される内分泌障害である。

組成物は、本発明の所望されるＡＯＮの各々を約１ｎＭ～１０００ｎＭで含んでもよい。好ましくは、組成物は、本発明のＡＯＮの各々を、概数で１ｎＭ～５００ｎＭ、１０ｎＭ～５００ｎＭ、５０ｎＭ～７５０ｎＭ、１０ｎＭ～５００ｎＭ、１ｎＭ～１００ｎＭ、１ｎＭ～５０ｎＭ、１ｎＭ～４０ｎＭ、１ｎＭ～３０ｎＭ、１ｎＭ～２０ｎＭ、最も好ましくは１ｎＭ～１０ｎＭの間で含んでもよい。

組成物は、本発明の所望されるＡＯＮの各々を、約１ｎｍ、約２ｎｍ、約３ｎｍ、約４ｎｍ、約５ｎｍ、約６ｎｍ、約７ｎｍ、約８ｎｍ、約９ｎｍ、約１０ｎｍ、約２０ｎｍ、約５０ｎｍ、約７５ｎｍ、約１００ｎｍ、約１５０ｎｍ、約２００ｎｍ、約２５０ｎｍ、約３００ｎｍ、約３５０ｎｍ、約４００ｎｍ、約４５０ｎｍ、約５００ｎｍ、約５５０ｎｍ、約６００ｎｍ、約６５０ｎｍ、約７００ｎｍ、約７５０ｎｍ、約８００ｎｍ、約８５０ｎｍ、約９００ｎｍ、約９５０ｎｍ又は約１０００ｎｍで含んでもよい。

本発明は、患者への送達に適した形態での、ＲＡＧＥ発現関連疾患又は病理などの疾患の症状の予防的若しくは治療的処置、予防又は寛解に寄与するように適応した１つ以上のＡＯＮｓをさらに提供する。

語句「薬学的に許容できる」は、生理学的に許容でき、典型的には、患者に投与されるとき、アレルギー反応又は同様に有害な反応、例えば異常亢進などもたらさない分子実体及び組成物を指す。用語「担体」は、化合物が一緒に投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤、又は媒体を指す。かかる薬学的担体は、滅菌液体、例えば水及び油、例えば、石油、動物、植物又は合成起源のもの、例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などであり得る。水又は生理食塩水並びに水性デキストロース及びグリセロール溶液は、好ましくは、担体、特に注射用液剤として利用される。好適な薬学的担体については、Ｍａｒｔｉｎ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，（１９９０）に記載されている。

本発明のより具体的な形態では、治療有効量の本発明の１つ以上のＡＯＮｓを、薬学的に許容できる希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント、及び／又は担体と一緒に含む医薬組成物が提供される。かかる組成物は、様々な緩衝液内容物の希釈剤（例えば、トリス－ＨＣＩ、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨ及びイオン強度及び添加剤、例えば、浄化剤及び可溶化剤（例えば、ツイーン８０、ポリソルベート８０）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、保存剤（例えば、Ｔｈｉｍｅｒｓｏｌ、ベンジルアルコール）及び充填物質（例えば、ラクトース、マンニトール）を含む。材料は、ポリ乳酸、ポリグリコール酸などの高分子化合物の粒子製剤中、又はリポソーム中に組み込まれてもよい。ハイラウロン酸（Ｈｙｌａｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）も使用されてもよい。かかる組成物は、本タンパク質及び誘導体の物理的状態、安定性、インビボ放出の速度、及びインビボクリアランスの速度に影響を及ぼしてもよい。例えば、参照により本明細書中に援用される、Ｍａｒｔｉｎ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．（１９９０，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ１８０４２）ｐａｇｅｓ １４３５－１７１２を参照されたし。組成物は、液体形態で調製されてもよく、又は乾燥粉末、例えば凍結乾燥形態であってもよい。

本発明に従って提供される医薬組成物が当該技術分野で公知の任意の手段により投与されてもよいことは理解されるであろう。好ましくは、投与が意図される医薬組成物は、経口的、局所的注射により、又は肺若しくは経鼻経路により投与される。適切な経路は、治療中の対象の病態にとって適切であるように、当業者により決定されてもよい。

特定の実施形態では、本開示のＡＯＮｓは、肺又は経鼻経路により送達され得る（例えば、噴霧される生理食塩水を介してＡＯＮｓを組み込む）。健常ヒト組織内でのＲＡＧＥ ｍＲＮＡの最も高度な内因性発現は、肺内で見出され、気道を介してアクセス可能である。吸入されるオリゴヌクレオチドは、呼吸器疾患において現れつつある治療的様式である。気道は、主に双性イオン脂質からなる肺界面活性剤で専ら覆われる。これらの界面活性剤脂質は、気道のｐＨでカチオン性特性を有する。アニオン性オリゴヌクレオチドが吸入されるとき、それらは界面活性剤により吸着される傾向があり、気管支及び肺胞上皮細胞により肺細胞に効率的に取り込まれることが仮定されている再配合された（ｒｅｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ）粒子をもたらす。注目すべきは、ＡＯＮｓは、噴霧プロセスに抗し得ることが示されている。

特定の実施形態では、ＡＯＮｓは、より好ましくは、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内又は皮下投与経路により送達される。血管又は血管外循環、血液又はリンパ系、及び脳脊髄液は、ＡＯＮが導入されてもよい一部の非限定的な部位である。

特定の実施形態では、直接的ＣＮＳ送達が利用されてもよく、例えば、脳室（ｖｅｎｔｒｉｂｕｌａｒ）又はくも膜下腔内投与が投与経路として使用されてもよい。

局所投与用製剤は、本開示のオリゴマーが、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート剤及び界面活性剤などの局所送達剤と混合される場合を含む。脂質及びリポソームは、中性（例えば、ジオレオイルホスファチジルＤＯＰＥエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンＤＭＰＣ、ジステアロイルホスファチジル（ｄｉｓｔｅａｒｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ）コリン） 陰性（例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロール ＤＭＰＧ）、及びカチオン性（例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピルＤＯＴＡＰ及びジオレオイルホスファチジルエタノールアミンＤＯＴＭＡ）を含む。局所又は他の投与の場合、本開示のオリゴマーは、リポソーム内にカプセル封入されてもよく、又はそれと、特にカチオン性リポソームと複合体を形成してもよい。或いは、オリゴマーは、脂質、特にカチオン性脂質と複合体を形成してもよい。脂肪酸及びエステル、それらの薬学的に許容できる塩、及びそれらの使用は、米国特許第６，２８７，８６０号明細書及び／又は米国特許出願第０９／３１５，２９８号明細書（１９９９年５月２０日に出願）にさらに記載されている。

特定の実施形態では、本開示のＡＯＮｓは、経皮的方法により（例えば、ＡＯＮｓの、任意選択的にリポソーム中にパッケージングされたかかるＡＯＮｓを有する、例えばエマルジョンへの組込みを介して）送達され得る。かかる経皮及びエマルジョン／リポソーム媒介性の送達方法は、例えば米国特許第６，９６５，０２５号明細書中に、当該技術分野におけるＡＯＮｓの送達について記載されている。

本明細書に記載のＡＯＮｓはまた、移植可能な装置を介して送達されてもよい。かかる装置の設計は、例えば米国特許第６，９６９，４００号明細書中に記載の、例えば合成インプラント設計による、当該技術分野で承認されているプロセスである。

経口投与用の組成物及び製剤は、散剤又は顆粒剤、微粒子、ナノ微粒子、水又は非水性媒体中の懸濁剤又は溶液剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、サシェ剤、タブレット又はミニタブレットを含む。増粘剤、香味料、希釈剤、乳化剤、分散助剤又は結合剤が望ましいことがある。経口製剤は、本開示のオリゴマーが１つ以上の透過増強剤 界面活性剤及びキレート剤と併せて投与されるものである。界面活性剤は、脂肪酸及び／又はそのエステル若しくは塩、胆汁酸及び／又はその塩を含む。胆汁酸／塩及び脂肪酸並びにそれらの使用については、米国特許第６，２８７，８６０号明細書中にさらに記載されている。いくつかの実施形態では、本開示は、透過増強剤の組み合わせ、例えば、脂肪酸／塩と胆汁酸／塩との組み合わせを提供する。例示的な組み合わせは、ラウリン酸、カプリン酸及びＵＤＣＡのナトリウム塩である。さらなる透過増強剤は、ポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン－２０－セチルエーテルを含む。本開示のオリゴマーは、噴霧乾燥粒子を含む顆粒状形態で経口的に送達されてもよく、又は複合体化されて微粒子又はナノ粒子を形成してもよい。オリゴマー複合体化剤及びその使用については、米国特許第６，２８７，８６０号明細書にさらに記載されている。オリゴマーにおける経口製剤及びその調製については、米国特許第６，８８７，９０６号明細書、米国特許出願第０９／３１５，２９８号明細書（１９９９年５月２０日出願）、及び／又は米国特許出願公開第２００３００２７７８０号明細書に詳述されている。

非経口、くも膜下腔内又は脳室内投与における組成物及び製剤は、滅菌水溶液を含んでもよく、それはまた、緩衝剤、希釈剤及び他の好適な添加剤、例えば限定はされないが、透過増強剤、担体化合物及び他の薬学的に許容できる担体又は賦形剤を含有してもよい。

治療的に有用な量のＡＯＮｓの送達は、先に公表された方法により達成されてもよい。例えば、ＡＯＮの細胞内送達は、ＡＯＮと有効量のブロック共重合体との混合物を含む組成物を介してもよい。この方法の例が、米国特許出願公開第２００４０２４８８３３号明細書に記載されている。ＡＯＮｓを核に送達する他の方法が、Ｍａｎｎ ＣＪ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，９８（１）４２－４７、及びＧｅｂｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２（１５）：１８０１－１８１１に記載されている。ネイキッドＤＮＡ又は脂質担体への複合体化のいずれかとして発現ベクターを用いて核酸分子を細胞に導入するための方法については、米国特許第６，８０６，０８４号明細書に記載されている。

コロイド分散系中のＡＯＮを送達することが望ましいことがある。コロイド分散系は、高分子複合体、ナノカプセル、微粒子、ビーズ、及び脂質に基づく系、例えば、水中油エマルジョン、ミセル、混合ミセル、及びリポソーム又はリポソーム製剤を含む。これらのコロイド分散系は、治療用医薬組成物の製造において使用可能である。

リポソームは、インビトロ及びインビボでの送達媒体として有用な人工膜小胞である。これらの製剤は、正味のカチオン性、アニオン性、又は中性電荷の特徴を有し、インビトロ、インビボ及びエクスビボ送達方法における有用な特徴を有してもよい。大きい単層リポソームが、大きい高分子を含有する水性緩衝液を実質的百分率でカプセル封入し得ることが示されている。ＲＮＡ及びＤＮＡは、水性内部中にカプセル封入され得て、生物活性形態で細胞に送達され得る（Ｆｒａｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．６：７７，１９８１）。

リポソームが効率的な遺伝子導入媒体であるため、以下の特徴が提示される必要がある：（１）目的のＡＯＮの高効率であるがその生物学的活性を損なわないカプセル封入；（２）非標的細胞と比較して、標的細胞への優先的且つ実質的な結合；（３）小胞の水性内容物の標的細胞細胞質への高効率での送達；及び（４）遺伝子情報の正確且つ有効な発現（Ｍａｎｎｉｎｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，６：６８２，１９８８）。リポソームの組成物は通常、リン脂質、特に高い相転移温度のリン脂質の組み合わせであって、通常はステロイド、特にコレステロールとの組み合わせである。さらに、他のリン脂質又は他の脂質が使用されてもよい。リポソームの物理的特徴は、ｐＨ、イオン強度、及び２価カチオンの存在に依存する。カチオン性リポソームは、陰性荷電ＤＮＡ分子と相互作用し、安定な複合体を形成すると考えられる陽性荷電リポソームである。ｐＨ感受性があるか又は負に帯電したリポソームは、ＤＮＡを封入するが、それとの複合体を形成しないと考えられる。ＤＮＡを細胞に送達するため、カチオン性及び非カチオン性リポソームの双方が使用されている。

リポソームは、本明細書で用いられるとき、１つ以上の特殊化された脂質であって、リポソーム中に組み込まれるとき、かかる特殊化された脂質が欠如しているリポソームと比較して循環寿命の増加をもたらすものを含むリポソームを指す用語の「立体的に安定化された」リポソームも含む。立体的に安定化されたリポソームの例が、リポソームの小胞形成脂質部分の一部が１つ以上の糖脂質を含むか、又は１つ以上の親水性ポリマーとの誘導体、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分であるものである。リポソーム及びその使用については、米国特許第６，２８７，８６０号明細書にさらに記載されている。

さらに、本明細書に記載のＡＯＮｓは、移植可能な装置を介して送達されてもよい。かかる装置の設計は、例えば米国特許第６，９６９，４００号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書中に援用される）中に記載の、例えば合成インプラント設計での、当該技術分野で承認されているプロセスである。

アンチセンスオリゴヌクレオチドは、当該技術分野で承認されている技術（例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、融合、リポソーム、コロイド状高分子粒子、並びにウイルス及び非ウイルスベクター、並びに当該技術分野で公知の他の手段）を用いて細胞内に導入可能である。選択される送達方法は、少なくとも治療対象の細胞及び細胞の位置に依存することになり、当業者にとって明らかであろう。例えば、局所化は、リポソームを誘導するための表面上に特定のマーカーを有するリポソーム、標的細胞を含有する組織内への直接注入、特異的受容体媒介性取り込みなどにより達成され得る。

当該技術分野で公知の通り、ＡＯＮｓは、例えば、リポソーム媒介性取り込み、脂質コンジュゲート、ポリリジン媒介性取り込み、ナノ粒子媒介性取り込み、及び受容体媒介性エンドサイトーシス、並びにさらなる送達の非エンドサイトーシスモード、例えばマイクロインジェクション、透過処理（例えば、ストレプトリシン－Ｏ透過処理、アニオン性ペプチド透過処理）、エレクトロポレーションを伴う含む方法、並びに当該技術分野で公知の送達の様々な非侵襲的非エンドサイトーシス方法を用いて送達されてもよい（Ｄｏｋｋａ ａｎｄ Ｒｏｊａｎａｓａｋｕｌ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ４４，３５－４９（その全体が参照により援用される）を参照）。

さらに、ＡＯＮは、医薬組成物を作製するため、他の薬学的に許容できる担体又は希釈剤と組み合わされてもよい。好適な担体及び希釈剤は、等張食塩水溶液、例えばリン酸緩衝食塩水を含む。組成物は、非経口、筋肉内、静脈内、皮下、眼内、経口、又は経皮投与用に製剤化されてもよい。

記載される投与経路は、当業者が任意の特定の動物及び病態に対して最適な投与経路及び任意の用量を容易に決定できることから、単なる指針として意図されている。

機能的な新しい遺伝子材料をインビトロ及びインビボの双方で細胞内に導入するための複数の手法が試みられている（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１２７５－１２８０）。これらの手法は、発現されるべき遺伝子の修飾レトロウイルスへの組込み（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ （１９８９）上記；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（１９９１）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５１（１８），ｓｕｐｐｌ．：５０７４Ｓ－５０７９Ｓ）；非レトロウイルスベクターへの組込み（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｃｅｌｌ，６８：１４３－１５５；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２：４３１－４３４）；又はリポソームを介する異種プロモーターエンハンサーエレメントに連結された導入遺伝子の送達（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ（１９８９），上記；Ｂｒｉｇｈａｍ，ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．，２９８：２７８－３１１；Ｎａｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：１２８５－１２８８；Ｈａｚｉｎｓｋｉ，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，４：２０６－２０９；及びＷａｎｇ ａｎｄ Ｈｕａｎｇ（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８４：７８５１－７８５５）；リガンドに特異的なカチオンに基づく輸送糸との共役（Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３：１４６２１－１４６２４）又はネイキッドＤＮＡ、発現ベクターの使用（Ｎａｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０），上記）；Ｗｏｌｆｆ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７：１４６５－１４６８）を含む。組織への導入遺伝子の直接的注射は局在化発現のみをもたらす（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ（１９９２）上記）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（１９９１）上記；Ｂｒｉｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．（１９８９）上記；Ｎａｂｅｌ（１９９０）上記；及びＨａｚｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９９１）上記）。Ｂｒｉｇｈａｍらのグループ（Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．（１９８９）２９８：２７８－３１１及びＣｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９１）３９（ａｂｓｔｒａｃｔ））は、ＤＮＡリポソーム複合体の静脈内又は気管内いずれかの投与後のマウスの肺に限るインビボトランスフェクションについて報告している。ヒト遺伝子療法手順に関するレビュー論文の例として、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２）２５６：８０８－８１３；Ｂａｒｔｅａｕ ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ；８（５）：３１３－２３；Ｍｕｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００８）．Ｃｌｉｎ Ｒｅｖ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ；３５（３）：１６４－７８；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１３（１８）：１３１３－９；Ｓｉｍｏｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ；２（２）：２３７－５４が挙げられる。

本発明のＡＯＮｓは、任意の薬学的に許容できる塩、エステル、又はかかるエステルの塩、又は任意の他の化合物（ヒトを含む動物への投与時、生物活性代謝産物又はその残留物を（直接的又は間接的に）提供する能力がある）を包含する。したがって、例として、本開示は、本発明の化合物のプロドラッグ及び薬学的に許容できる塩、かかるプロドラッグの薬学的に許容できる塩、及び他の生物学的同等物についても注目する。

用語「薬学的に許容できる塩」は、本発明の化合物の生理的学的及び薬学的に許容できる塩：即ち、親化合物の所望される生物学的活性を保持し、それに対する望まれない毒性学的効果を付与しない塩を指す。オリゴマーの場合、薬学的に許容できる塩の好ましい例として、限定はされないが、（ａ）カチオン、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウム、ポリアミン、例えばスペルミン及びスペルミジンなどと形成される塩；（ｂ）例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸などの無機酸と形成される塩酸付加塩；（ｃ）例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロ酸などの有機酸と形成される塩；及び（ｄ）塩素、臭素、及びヨウ素などのアニオン元素から形成される塩が挙げられる。本発明の医薬組成物は、局所又は全身治療が所望されるか否かに加え、治療対象領域に応じて、いくつかの方法で投与されてもよい。投与は、局所（眼及び粘膜、並びに直腸送達を含む）、例えば粉末又はエアロゾルの吸入又はガス注入による（例えば、噴霧器、気管内、鼻腔内、上皮及び経皮による）肺、経口又は非経口であってもよい。非経口投与は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内若しくは筋肉内の注射若しくは注入；又は頭蓋内、例えばくも膜下腔内若しくは脳室内の投与を含む。少なくとも１つの２’－Ｏ－メトキシエチル修飾を伴うオリゴマーは、特に経口投与にとって有用であると考えられる。好ましくは、ＡＯＮは、皮下又は静脈内経路を介して送達される。

便宜的に単位剤形で提示されてもよい本発明の医薬製剤は、製薬業界で周知である通常の技術に従って調製されてもよい。かかる技術は、有効成分を薬学的担体又は賦形剤と会合させるステップを含む。一般に、製剤は、有効成分を液体担体若しくは微粉化固体担体又は両方と均一且つ緊密に会合させ、そこで必要な場合には産物を形成することにより調製される。

一実施形態では、ＡＯＮは、少なくとも２００～４００ｎＭ ＡＯＮのピーク血液濃度をもたらすのに有効な量及び様式で投与される。典型的には、１回以上の用量のＡＯＮが、一般に規則的間隔で約１～２週間、投与される。経口投与にとって好ましい用量は、約１ｍｇ～１０００ｍｇのオリゴマー／７０ｋｇである。いくつかの場合、患者あたり１０００ｍｇを超える用量のオリゴマーが必要なことがある。静脈内投与の場合、好ましい用量は、約０．５ｍｇ～１０００ｍｇのオリゴマー／７０ｋｇである。静脈内又は皮下投与の場合、ＡＯＮは、毎日又は毎週、約１２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与されてもよい。

ＡＯＮは、規則的間隔で短期間、例えば毎日で２週間以内、投与されてもよい。しかし、場合によっては、オリゴマーは、断続的により長期にわたり投与される。投与は、抗生物質の投与又は他の治療的処置が後続してもよく、又はそれと同時であってもよい。治療計画は、治療中の対象の免疫測定、他の生化学的検査及び生理学的検査の結果に基づき、指示通りに調節されてもよい（用量、頻度、経路など）。

投与は、数日から数か月かけて持続する治療経過とともに、又は治癒がもたらされるか若しくは病態の減少が達成されるまで、治療対象の病態の重症度及び応答性に依存する。最適な投与スケジュールは、患者の体内での薬剤蓄積の測定から計算可能である。当業者は、最適な用量、投与方法及び反復速度を容易に決定することができる。最適な用量は、各オリゴマーの相対的効力に応じて変化してもよく、一般にインビトロ及びインビボ動物モデルにおいて有効であることが見出されたＥＣ５０に基づいて評価され得る。一般に、用量は、０．０１μｇ～１００ｇ／ｋｇ体重であり、毎日、毎週、毎月若しくは毎年１回以上、又は２～２０年ごとにさらに１回投与されてもよい。当業者は、測定された体液又は組織中の薬剤の滞留時間及び濃度に基づき、投与における反復速度を容易に推定することができる。治療成功後、病態の再発を予防するため、患者に維持療法を受けさせるのが望ましいことがあり、ここでオリゴマーは、０．０１μｇ～１００ｇ／ｋｇ体重の範囲の維持用量で、毎日１回以上から２０年ごとに１回にかけて投与される。

本発明のＡＯＮｓを使用する有効なインビボ治療計画は、持続期間、用量、頻度及び投与経路、並びに治療中の対象の状態に応じて変化してもよい（即ち、予防的投与と局所又は全身感染に応じた投与）。したがって、かかるインビボ療法は、最適な治療成績を達成するため、治療中の特定タイプの障害に適した検査、及び用量又は治療計画に対応する調節による監視を必要とすることが多くなる。

治療は、例えば当該技術分野で公知の疾患の一般的指標により監視されてもよい。本発明のインビボ投与されたＡＯＮｓの有効性は、ＡＯＮの投与の前、間及び後に対象から採取された生体サンプル（組織、血液、尿など）から決定されてもよい。かかるサンプルのアッセイは、（１）当業者に公知の手順、例えば電気泳動ゲル移動度アッセイを用いて、標的及び非標的配列とのヘテロ二本鎖形成の存在又は不在を監視すること；（２）ＲＴ－ＰＣＲ、ノーザンブロッティング、ＥＬＩＳＡ又はウエスタンブロッティングなどの標準的技法による測定として、参照正常ｍＲＮＡ又はタンパク質に対する突然変異体ｍＲＮＡの量を監視すること、を含む。

核内オリゴマー送達は、ＡＯＮｓにとっての主要な課題である。異なる細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）は、ＰＭＯｓを異なる条件及び細胞株において様々な程度に局所化し、新規なＣＰＰｓが、ＰＭＯｓを標的細胞に送達するその能力について発明者により評価されている。ＣＰＰ又は「細胞取り込みを増強するペプチド部分」という用語は、互換可能に用いられ、「輸送ペプチド」、「担体ペプチド」、又は「ペプチド形質導入ドメイン」とも称される、カチオン性細胞透過性ペプチドを指す。該ペプチドは、本明細書中で示される通り、所与の細胞培養集団の細胞の概数又は少なくとも概数で３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％以内の細胞透過性を誘導する能力を有し、全身投与時、インビボで複数の組織内での高分子転位を可能にする。ＣＰＰｓは、当該技術分野で周知であり、例えば米国特許出願公開第２０１０／００１６２１５号明細書（その全体が参照により援用される）に開示されている。

したがって、本発明は、治療用医薬組成物を作製するための、細胞透過性ペプチドと組み合わせた本発明のＡＯＮｓを提供する。

本発明のさらなる態様によると、ＡＯＮに基づく治療法における使用が意図された、本明細書に記載のような１つ以上のＡＯＮｓが提供される。好ましくは、該治療法は、ＲＡＧＥ発現に関連する病態を対象とする。より好ましくは、ＲＡＧＥ発現に関連する病態に対する治療法は、がん、神経変性疾患、肺障害、及び炎症性疾患から選択される疾患に対する治療法である。

より具体的には、ＡＯＮは、表３ａ～３ｄ及び／又は配列番号１～３１のいずれかに列記されるＡＯＮｓの任意の１つ以上、及びそれらの組み合わせ又はカクテルからなる群から選択されてもよい。より好ましくは、ＡＯＮは、配列番号１１、１８、１９、又は２０である。これは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でかかる配列にハイブリダイズし得る配列、それらに相補的な配列、修飾塩基、修飾骨格、及びそれらの機能的切断部又は伸長部を有する配列（ＲＡＧＥ遺伝子転写物におけるプレｍＲＮＡプロセシング活性を保有又は調節する）を含む。

本発明は、ＲＡＧＥ遺伝子転写物におけるエクソン除去を誘導するため、選択された標的に結合する能力がある２つ以上のＡＯＮｓの組み合わせにも拡張される。組み合わせは、ＡＯＮに基づく治療法における使用が意図された、２つ以上のＡＯＮｓのカクテル、２つ以上のＡＯＮｓを含む構築物又は一緒に連結された２つ以上のＡＯＮｓであってもよい。ＡＯＮｓの組み合わせは、好ましくは配列番号１１及び１０、又は配列番号１１及び１３の組み合わせである。

本発明は、ＲＡＧＥ発現に関連する疾患の作用を治療し、予防し、又は寛解させるための方法であって、
ａ）本明細書に記載のような１つ以上のＡＯＮｓ又は１つ以上のＡＯＮｓを含む医薬組成物を有効量で患者に投与するステップ
を含む、方法を提供する。

さらに、本発明は、がん、神経変性疾患、肺障害、及び炎症性疾患の作用を治療し、予防し、又は寛解させるための方法であって、
ａ）本明細書に記載のような１つ以上のＡＯＮｓ又は１つ以上のＡＯＮｓを含む医薬組成物を有効量で患者に投与するステップ
を含む、方法を提供する。

好ましくは、該治療法は、エクソンスキッピング方法を介して機能的ＲＡＧＥタンパク質のレベルを低下させるため、使用される。ＲＡＧＥのレベル低下は、好ましくは、ＲＡＧＥ遺伝子転写物又はその一部におけるプレｍＲＮＡスプライシングを修飾することを通じて転写物レベルを低下させることにより達成される。

ＲＡＧＥにおける低下は、好ましくは、ＲＡＧＥ関連病態又は病理、例えば、神経変性疾患、がん、肺障害、及び炎症性疾患の症状の量、持続期間又は重症度における減少をもたらすことになる。

本明細書で用いられるとき、対象（例えば哺乳動物、例えばヒト）又は細胞の「治療」は、個体又は細胞の自然経過を変化させることを試みて用いられる介入の任意のタイプである。治療は、限定はされないが、医薬組成物の投与を含み、予防的に、又は病原体による病理学的事象若しくは接触の開始に続いて実施されてもよい。さらに、治療中の疾患又は病態の進行速度を減少させ、疾患又は病態の発症を遅らせ、又はその発症の重症度を減少させることに向けて誘導可能な「予防的」治療が含まれる。「治療」又は「予防」は、疾患又は病態、又はその関連症状の完全な根絶、治癒、又は予防を必ずしも示さない。

本発明の別の態様によると、ＲＡＧＥ発現に関連する疾患を調節又は制御するための薬剤の製造における、本明細書に記載のような１つ以上のＡＯＮｓの使用が提供される。

本発明は、ＲＡＧＥ発現に関連する疾患を治療するための薬剤の製造における、本明細書に記載のような精製及び単離されたＡＯＮｓの使用も提供する。

ＲＡＧＥ発現に関連する疾患の作用を治療し、予防し、又は寛解させるための薬剤の製造における、本明細書に記載のような精製及び単離されたＡＯＮｓの使用が提供される。

好ましくは、ＲＡＧＥ関連病理又は疾患は、神経変性疾患、がん、肺障害、又は炎症性疾患である。

本発明は、そのさらなる態様によると、本発明のＡＯＮ配列のｃＤＮＡ又はクローン化コピー、並びに本発明のＡＯＮ配列を有するベクターに拡張される。本発明は、かかる配列及び／又はベクターを有する細胞にもさらに拡張される。

本発明のＡＯＮは、別の治療用分子と同時投与されてもよい。例えば、ＡＯＮは、ＲＡＧＥ細胞質テールを調節可能である化合物、例えばペプチドである第２の治療剤とともに投与されてもよい。かかる化合物は、ＩＱＧＡＰ－１、ｄｉａｐｈａｎｏｕｓ－１、タンパク質キナーゼＣゼータ（ＰＫＣζ）、Ｄｏｃｋ７、ＭｙＤ８８、ＴＩＲＡＰ、ＥＲＫ１／２、嗅覚受容体２Ｔ２、ＡＤＰ／ＡＴＰトランスロカーゼ２、タンパク質ホスファターゼ１Ｇ、ＩＲＡＫ４、タンパク質ＤＪ－１（ＰＡＲＫ７）、カルポニン３、ドレブリン、フィラミンＢ、Ｒａｓ関連タンパク質Ｒａｂ－１３、ラディキシン／エズリン／モエシン、プロテオリピドタンパク質２、コロニン、Ｓ１００Ａ１１、スクシニル－ＣｏＡリガーゼ［ＧＤＰ形成］サブユニットα、Ｈｓｃ７０相互作用タンパク質、アポトーシス阻害剤５、ニューロピリン、切断刺激因子、成長因子受容体結合タンパク質２、ｓｅｃ６１ベータサブユニット、又はＮｃｋ１を含む。

本発明は、患者におけるＲＡＧＥ発現に関連する疾患又は病態を治療し、予防し、又は寛解させるためのキットであって、好適な容器内にその使用説明書と一緒に包装された、ＲＡＧＥ遺伝子転写物又はその一部におけるプレｍＲＮＡスプライシングを修飾するための少なくとも単離又は精製されたＡＯＮを含むキットも提供する。

好ましい実施形態では、キットは、本明細書に記載の通り、本明細書に記載のような少なくとも１つのＡＯＮ、配列番号１～３１の任意の１つ以上及び／若しくは表３ａ～３ｄのいずれかで示される配列、又はＡＯＮｓのカクテルを有することになる。キットは、緩衝液、安定剤などの周辺試薬をさらに有してもよい。より好ましくは、ＡＯＮは、配列番号１１、１８、１９、又は２０である。

したがって、患者におけるＲＡＧＥ発現に関連する疾患又は病態を治療し、予防し、又は寛解させるためのキットであって、好適な容器内にその使用説明書と一緒に包装された、本明細書に記載の少なくとも１つのＡＯＮ、配列番号１～３１の任意の１つ以上及び／又は表３ａ～３ｄのいずれかで示される配列、並びにそれらの組み合わせ又はカクテルを含むキットが提供される。より好ましくは、ＡＯＮは、配列番号１１、１８、１９、又は２０である。ＡＯＮｓの組み合わせは、好ましくは配列番号１１及び１０、又は配列番号１１及び１３の組み合わせである。

好ましくは、疾患又は病態は、がん、神経変性疾患、肺障害、又は炎症性疾患を含むリストから選択される。

キットの内容物は、凍結乾燥可能であり、キットは、凍結乾燥成分の再構成に適した溶媒をさらに含有し得る。キットの各成分は、別々の容器内に包装されることになり、かかる容器に関連して、医薬品又は生物製品の製造、使用又は販売を規制する政府機関によって規定された形態の通知であり得て、通知は、ヒト投与用の製造、使用又は販売の同機関による承認を反映している。

キットの成分が１つ以上の溶液で提供されるとき、溶液は、水溶液、例えば滅菌水溶液であり得る。インビボ使用の場合、発現構築物は、薬学的に許容できる注射可能な組成物に製剤化されてもよい。この場合、容器手段自体は、吸入薬、注射器、ピペット、アイドロッパー、又は他の装置類であってもよく、それからの製剤は、動物の患部、例えば肺に適用され、動物に注射され、又はさらにキットの他の成分に適用され、それらと混合されてもよい。

キットの成分は、さらに乾燥又は凍結乾燥形態で提供されてもよい。試薬又は成分が乾燥形態で提供されるとき、一般に好適な溶媒の添加により再構成がなされる。溶媒がさらに別の容器手段で提供されてもよいことが想定される。容器の数又はタイプと無関係に、本発明のキットは、最終複合組成物の動物体内への注射／投与又は配置を補助するための機器を含むか、又はそれが包装されてもよい。かかる機器は、吸入薬、注射器、ピペット、ピンセット、計量スプーン、アイドロッパー又は任意のかかる医学的に承認された送達媒体であってもよい。

当業者は、上記方法の適用が、多くの他の疾患の治療における使用に適したＡＯＮｓを同定するための広範な適用を有することを理解する必要がある。

本発明のＡＯＮｓは、代替療法、例えば薬物療法とさらに併用されてもよい。

したがって、本発明は、ＲＡＧＥ発現に関連する疾患又は病態の作用を治療し、予防し、又は寛解させる方法を提供し、ここで本発明のＡＯＮｓは、ＲＡＧＥ発現に関連する疾患又は病態の作用を治療し、予防し、又は寛解させることに関連する別の代替療法と経時的に又は同時に投与される。好ましくは、疾患又は病態は、神経変性疾患、がん、肺障害、又は炎症性疾患を含むリストから選択される。

概要
当業者は、本明細書に記載の発明が、詳述されたこと以外のバリエーション及び修飾を受けやすいことを理解するであろう。本発明が、すべてのかかるバリエーション及び修飾を含むことは理解されるべきである。本発明は、個別に又は集合的に本明細書で参照又は指示されるステップ、特徴、組成物及び化合物のすべて、並びにステップ又は特徴のありとあらゆる組み合わせ又は任意の２つ以上をさらに含む。

本発明は、あくまで例証目的が意図される、本明細書に記載の具体的な実施形態による範囲内に限定されるべきでない。機能的に等価な製品、組成物及び方法は、本明細書に記載のような発明の範囲内に明示される。

本明細書で引用される（特許、特許出願、雑誌論文、実験マニュアル、書籍、又は他の文書を含む）すべての刊行物の全開示内容は、参照により本明細書中に援用される。参考文献のいずれもが、先行技術を構成する、又は本発明が関係する分野での研究内容に共通した一般的知見の一部であることは承認がなされない。

本文中で引用される各文書、参考文献、特許出願又は特許は、その全体が本明細書中に参照により明示的に援用され、本文の一部として読者により読解及び考慮される必要があることをそれは意味する。単なる簡潔性のため、本文中で引用される文書、参考文献、特許出願又は特許が本文中で反復されない。

本明細書中で言及される任意の製品の、又は参照により本明細書中に援用される任意の文書中の任意の製造業者の使用説明書、説明書、製品仕様、及び製品シートは、ここで参照により本明細書中に援用され、本発明の実施において利用されてもよい。

本明細書で用いられるとき、用語「由来の」及び「～に由来の」は、特定の整数が特定の供給源から、その供給源から必ずしも直接的でなくても得られてもよいことを示すように解釈されるものとする。

本明細書で用いられるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈上そうでないとする明確な指示がない限り、複数の参照対象を含む。

本明細書全体を通じて、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」若しくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、述べられた整数又は整数のグループの包含を意味するが、任意の他の整数又は整数のグループの除外を意味しないことが理解されるであろう。

機能例における以外、又は特段の指定がある場合、本明細書及び請求項の中で使用される成分の量、反応条件などを表すすべての数は、すべての場合に用語「約」で修飾されているものとして理解されるべきである。したがって、それとは反対の指示がない限り、本明細書及び請求項の中で示される数値パラメータは、本発明によって得られるように追及された所望される特性に応じて変動してもよい近似値である。それ故、「約８０％」は、「約８０％」に加えて「８０％」を意味する。少なくとも、各数値パラメータは、有効数字の数及び通常の丸め手法に照らして解釈される必要がある。

本発明の広い範囲を明示する数値範囲及びパラメータが近似値であるにもかかわらず、具体例で示される数値は、可能な限り精密に報告される。しかし、任意の数値は、必然的にそれら各々の試験測定で見出される標準偏差から生じる特定の誤差を本質的に含む。

本明細書で用いられる選択された用語における他の定義は、発明の詳細な説明の中で見出され、全体を通じて適用されてもよい。特段の定義がされていない限り、本明細書で用いられるすべての他の科学技術用語は、本発明が属する当業者に共通に理解されている意味と同じ意味を有する。

本明細書中に含まれるヌクレオチド及びアミノ酸配列情報を有する配列同一性番号（「配列番号」）は、説明の最後にまとめられており、プログラムＰａｔｅｎｔｌｎバージョン３．０を用いて作成されている。各ヌクレオチド又はアミノ酸配列は、配列表中で数値指標＜２１０＞とそれに続く配列識別子（例えば、＜２１０＞１、＜２１０＞２など）により同定されている。配列の長さ、タイプ及び各ヌクレオチド又はアミノ酸配列における供給源生物は、数値指標フィールド＜２１１＞、＜２１２＞及び＜２１３＞で提供される各々の情報によって示される。

アンチセンスオリゴマー命名法体系が、異なるアンチセンスオリゴマー間を識別するため、提案及び公開された（Ｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｊ Ｇｅｎ Ｍｅｄ ４，６４４－６５４を参照）。この命名法は、下に示される通り、すべてが同じ標的領域を対象とした、いくつかのやや異なるアンチセンスオリゴマーを試験するとき、特に重要になった：
Ｈ＃Ａ／Ｄ（ｘ：ｙ）
最初の文字は種を示す（例えば、Ｈ：ヒト、Ｍ：マウス）
「＃」は標的エクソン番号を示す
「Ａ／Ｄ」は各々、エクソンの開始／末端のアクセプター又はドナースプライス部位を示す
（ｘ ｙ）は、「－」又は「＋」が各々、イントロン又はエクソン配列を示す場合、アニーリング座標を表す。例として、Ａ（－６＋１８）であれば、標的エクソンに先行するイントロンの最終の６塩基と標的エクソンの最初の１８塩基を示す。最も近いスプライス部位であれば、これらの座標が「Ａ」で先行されるようなアクセプターとなる。ドナースプライス部位のアニーリング座標を記述すると、最終の２つのエクソン塩基と最初の１８のイントロン塩基がアンチセンスオリゴマーのアニーリング部位に対応する場合、Ｄ（＋２－１８）であり得る。全体として、Ａ（＋６５＋８５）によって表示されるエクソンアニーリング座標であれば、そのエクソンの開始から（開始を含む）６５番目ヌクレオチドと８５番目ヌクレオチドとの間の部位である。

以下の例は、上記発明を使用する様式をより十分に説明するとともに、本発明の様々な態様を実施するためのベストモードを明示する。これらの方法は、本発明の範囲を限定せず、むしろ例示目的で提示されると理解される。

以下の実施例の各々において、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、以下の一般的材料及び方法が適用される。

ヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ１）をＭＣＤＢ１３１培地（１０ｍＭグルタミン、ＥＧＦ及びヒドロコルチゾンを有する１０％ＦＣＳ）中で培養した。ヒト肺上皮細胞（Ａ５４９）（がん）をＦ－１２Ｋ培地（２ｍＭグルタミンを有する１０％ＦＢＳ）中で培養した。一次大動脈内皮細胞（ＰＭＡＥＣ）を（野生型）Ｃ５７ｂｌ６マウス及びＡＧＥＲ ＫＯマウスの大動脈から単離し、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）／Ｆ１２内皮細胞増殖添加物（ＥＣＧＳ）を添加した培地中で培養した。

ＡＯＮｓのトランスフェクションのため、上皮又は内皮細胞を４８ウェルプレートに２４又は４８時間播種し、次にリポフェクタミン３０００試薬（０．１５ｕｌ／ウェルのリポフェクタミン３０００；０．４ｕｌ／ウェルのＰ３０００／ウェル）を使用し、（ＨＭＥＣ１及びＡ５４９における）ヒトＡＧＥＲ及びマウスＰＭＡＥＣ細胞におけるマウスＡＧＥＲのエクソン９を標的化するＡＯＮｓ又は各対照のいずれかをトランスフェクトした（表３ａ～３ｄ）。細胞をＡＯＮ／カチオン性リポプレックスとともに３７℃で２４時間インキュベートし、それ以降の時点で、ＴＲＩＺＯＬ技術又はＣｅｌｌｓ ｔｏ ＣＴ ｍｅｔｈｏｄのいずれかを用いて、細胞を溶解し、ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを作製した。

ヒトＲＡＧＥプレｍＲＮＡの選択的スプライシングに対する効果を測定するため、すべてのＲＡＧＥ ｍＲＮＡスプライスバリアント中で保持される発現（ｍＲＮＡ）、エクソン９ｂの保持又は膜貫通細胞質テールをコードするＲＡＧＥｖ１アイソフォームの発現を各々意味する、ＲＡＧＥの１１番目のエクソン、エクソン９ｂ又はエクソン８～１０の範囲のいずれかにリアルタイムＲＴ－ＰＣＲプライマーを用いて、発現を測定した。細胞質テールのエクソン８～１０のＰＣＲシグナルにおけるエクソン１１と比較しての減少は、ＲＡＧＥ ｍＲＮＡスプライコフォームのエクソン１０をほとんど有さず、全長ＲＡＧＥタンパク質アイソフォーム（シグナル伝達能がある）が細胞によりあまり生成されないことを示す。マウス細胞及び組織において、エクソン１０を有するＲＡＧＥ ｍＲＮＡスプライコフォームの発現を表すため、マウスＲＡＧＥ ｍＲＮＡのエクソン１０～１１に及ぶプライマーを使用した。

培地も収集し、可溶性ＲＡＧＥのレベルをＥＬＩＳＡによって測定した。分子量カットオフフィルターを使用し、培地（６ｍｌ）を濃縮してから、ＥＬＩＳＡで試験した。

チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、組換えタンパク質を高レベルで発現することから、エンドポイントとしてタンパク質分泌が改変された、プレｍＲＮＡスプライシングの調節を検討するための理想系となる。細胞外可溶性ＲＡＧＥの発現及び分泌をもたらす、ＲＡＧＥのスプライシングに対するＡＯＮｓの効果をより十分に探索するためのモデル系として、（１０％ＦＢＳを添加した）Ｆ１２培地中で増殖させたＣＨＯ細胞に、リポフェクタミン２０００を使用し、ＡＯＮｓとともにヒトゲノムＡＧＥＲ（ｇＲＡＧＥ）配列（天然５’及び３’非翻訳領域を除く）をコードするプラスミドをトランスフェクトした。２日後、培地を収集し、分子量カットオフフィルターを使用して濃縮し、抗ｈＲＡＧＥ抗体（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてウエスタンブロットにより試験した。

ＡＯＮ投与後に検出したＲＡＧＥ変異体の正確な配列を決定するため、Ｔｒｉｚｏｌ法を用いてＲＮＡを抽出し、オリゴｄＴプライマーを用いてｃＤＮＡを作製してから、ＲＡＧＥの５’及び３’ＵＴＲ配列に対するＲＡＧＥに特異的なプライマーを用いてＰＣＲし、セミネステッドＰＣＲを行い、ＲＡＧＥ配列の混合物を増幅した。ゲル精製したＲＡＧＥバンドをＴＡクローニングベクターにクローニングしてから、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｏｐ１０細胞に形質転換した。５０を超えるコロニーを選択し、エクソン８～１１に及ぶプライマーを使用するＭｕｌｔｉＮＡ配列アナライザーを用いて特徴づけ、ＲＡＧＥインサートのサイズを決定した。各サイズの５つのクローンをサンガー配列決定用に送り、バンドサイズに対応したＲＡＧＥ配列スプライコフォームを確認した。

ＲＡＧＥのリガンド依存性及びリガンド非依存性活性化の介入の機能的影響を測定するため、ＡＴ１Ｒ同族リガンドのアンジオテンシンＩＩ（１μＭ）又はＲＡＧＥリガンドのＳ１００Ａ８／Ａ９（０．６ｕｇ／ｍＬ）に細胞を４時間曝露した。次に、細胞をｍＲＮＡの抽出まで凍結貯蔵し、抽出し、Ｃｅｌｌｓ ｔｏ Ｃｔ ｍｅｔｈｏｄを用いて、ｃＤＮＡを合成した。ＮＦκＢサブユニット、ｐ６５（ＲｅｌＡ）又はＮＦκＢ活性化標的遺伝子（例えばＩＣＡＭ－１）の遺伝子発現における変化を、蓄積された蛍光のリアルタイム検出に基づき、ＴａｑＭａｎシステムを用いて実施される、定量的リアルタイムＲＴ－ＰＣＲにより評価した（ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００，Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ Ｉｎｃ，ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）。遺伝子発現を１８Ｓ ｍＲＮＡに正規化し、１の任意の値を付与した、非処置対照マウス／細胞における発現のレベルと比較して、倍数変化として報告した。

実施例１．エクソン１０中のシス作用性ＲＮＡエレメントを標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用する、ヒト細胞内のＲＡＧＥの選択的スプライシングの調節
本実施例は、ＲＡＧＥプレｍＲＮＡのスプライシングが、ＲＡＧＥプレｍＲＮＡのエクソン１０中のシス作用性ＲＮＡエレメントを標的化するＡＯＮを使用して調節可能であることを示す。

ＲＡＧＥプレｍＲＮＡは、天然に選択的スプライシングを受け、種々のｍＲＮＡスプライコフォームを生成する。これらのＲＡＧＥスプライコフォームの大半は、ＲＡＧＥの膜貫通及び細胞質ドメインを各々コードする、エクソン１０及び１１と生成されるタンパク質アイソフォームの双方を有することから、ＲＡＧＥリガンドにより活性化され、且つ配置されたＧＰＣＲによりトランス活性化されることができ、炎症促進性及び増殖促進性シグナル伝達が誘導される。エクソン９における選択的５’スプライス部位選択は、エクソン９の８３ヌクレオチド伸長も導き得る（エクソン９Ｂ；図１ａ）。この選択的スプライス部位とエクソン１０の開始点の３’（アクセプター）スプライス部位との間の距離が、真核生物におけるイントロン長の下限よりはるかに短い４６ヌクレオチドに過ぎないことから、エクソン１０は結果的にスキップされ、エクソン１１の開始点の３’（アクセプター）部位が代わりに選択される。この選択的スプライシングはまた、未成熟終止コドンを導入するが、それが最終のエクソンエクソン接合部の直ぐ近傍（２９ｂｐ）にあることから、ナンセンス媒介性崩壊を受けない。それ故、この選択的スプライシングから得られた成熟ｍＲＮＡ（ＲＡＧＥ＿ｖ１、図１ａ）は、エクソン１０及び１１によってコードされる膜保持及び細胞質シグナル伝達の各々にとって必要とされるエレメントが欠如したタンパク質アイソフォームをコードすることで、循環中、気管支肺胞及び脳脊髄液中に分泌され、天然に見出される。このｅｓＲＡＧＥは、細胞表面の全長ＲＡＧＥとリガンドに対して競合する、又はリガンドクリアランスを増強する、デコイ受容体として作用し得る。さらに、エクソン９ｂによってコードされる新規な１７アミノ酸のＣ末端は、ＲＡＧＥシグナル伝達又は多量体化に対して非依存性作用を有することがある。

ヒト肺上皮細胞（Ａ５４９）へのエクソン１０を標的化する１０ｎＭ ＡＯＮｓのトランスフェクションにより、エクソン９ｂを有するＲＡＧＥ ｍＲＮＡスプライコフォームの発現における変化がもたらされた（図１ｂ）。一部のＡＯＮｓ、特にＡＯＮ３７７９は、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲによる測定として、エクソン９ｂを有するＲＡＧＥ ｍＲＮＡスプライコフォームの発現を、対照（スクランブルＲＮＡ処置）細胞と比較して増強した。エクソン１０も標的化する他のＡＯＮｓ、特にＡＯＮ３７７７及びＡＯＮ３７８１は、効果を有しなかった。

ヒト肺上皮細胞（Ａ５４９）へのエクソン１０を標的化する１０ｎＭ濃度のＡＯＮｓのトランスフェクションによっても、ＲＡＧＥ ｍＲＮＡスプライコフォームの発現における変化がもたらされたことで、一部のＡＯＮｓ、特にＡＯＮ３７７９、ＡＯＮ３７８０、ＡＯＮ３７８１、ＡＯＮ８２、ＡＯＮ８３及びＡＯＮ８７は、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲによる測定として、（即ち、細胞質テールのシグナル伝達エレメントをコードする）エクソン１０を有するＲＡＧＥ ｍＲＮＡスプライコフォームの発現を、対照（スクランブルＲＮＡ処置）細胞と比較すると、減少させた（図１ｃ及び１ｄ）。エクソン１０も標的化する他のＡＯＮｓ、特にＡＯＮ３７７７、ＡＯＮ８４及びＡＯＮ８５は、効果を有しなかった。

次に、エクソン１０を標的化する選択されたＡＯＮｓの存在下及び不在下でヒト肺上皮細胞（Ａ５４９）内で発現されるすべてのＲＡＧＥ ｍＲＮＡスプライコフォームを単離し、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）Ｔｏｐ１０細胞にクローニングした。エクソン８とエクソン１１との間に及ぶプライマーを使用し、各ＲＡＧＥインサートのサイズを決定した。エクソン１０を標的化する選択されたＡＯＮｓ、特にＡＯＮ３７７９及びＡＯＮ３７７８による処置により、サイズが２５０ｋＢの断片を有するＲＡＧＥ ｍＲＮＡスプライコフォームの発現増加がもたらされたが（図１ｅ）、それはエクソン９ｂの保持を意味する。

さらに、エクソン１０を標的化するすべてのＡＯＮｓにより、３００ｋＢのバンドを表すｍＲＮＡクローンの百分率の発現が減少したが、それはエクソン８～１０内に含まれるシグナル伝達能のあるエレメントの完全な発現を意味する。特に、ＡＯＮ３７７９により、サイズが３００ｋＢの断片を有するＲＡＧＥ ｍＲＮＡスプライコフォームにおける４９％の減少がもたらされた（図１ｆ）。

さらに、エクソン１０を標的化するすべてのＡＯＮｓにより、エクソン８が完全に欠失しているＲＡＧＥ ｍＲＮＡスプライコフォームの新規な発現が誘導された（サンガー配列決定によって確認され、ゲル上の矢印によって示されるＭｕｌｔｉＮＡアナライザー上の空のレーン；図１ｆ）及び「バンドなし」断片（図１ｅ）によって表される。

さらに、エクソン１０を標的化するＡＯＮｓ、特にＡＯＮ３７７７及びＡＯＮ３７７８のヒト肺上皮細胞（Ａ５４９）へのトランスフェクションにより、サイズが２７６ｋＢ及び４３０ｋＢの断片を有するＲＡＧＥ ｍＲＮＡスプライコフォームの新規な発現がもたらされたが（図１ｅ）、それは各々、エクソン９の非典型的な除去、及びエクソン９、エクソン９ｂ及びエクソン１０の保持を意味する。

さらに、エクソン１０を標的化する１０ｎＭ ＡＯＮｓ、特にＡＯＮ３７７９のヒト肺上皮細胞（Ａ５４９）へのトランスフェクションにより、デジタルＰＣＲでの測定として、対照（スクランブルＲＮＡ処置）細胞よりも、エクソン１０を有するＲＡＧＥ ｍＲＮＡスプライコフォームのコピーの数における変化がもたらされた（図１ｇ）。

さらに、エクソン１０を標的化する１０ｎＭ ＡＯＮｓ、特にＡＯＮ３７７９のヒト肺上皮細胞（Ａ５４９）へのトランスフェクションにより、内因性可溶性ＲＡＧＥの培地への放出が増強されたが（図１ｈ）、それはエクソン９ｂを有するＲＡＧＥ ｍＲＮＡスプライコフォームの発現増加に一致する。

ヒトＲＡＧＥのゲノム配列（ｇＤＮＡ）をコードするプラスミドのＣＨＯ細胞へのトランスフェクションにより、ウエスタンブロットによる検出として、細胞培地中に分泌された少量の内因性ＲＡＧＥ（赤矢印）を含む、遺伝子産物の選択的スプライシングがもたらされ、それはＲＡＧＥの正常なスプライシングパターンに一致した（図１ｉ）。培地中に分泌された内因性可溶性ＲＡＧＥ（ｅｓＲＡＧＥ）の量は、ゲノムヒトＲＡＧＥを発現するこれらのＣＨＯ細胞にＡＯＮ３７７９又はＡＯＮ８７を同時トランスフェクトしたとき、増加した（図１ｉ）。同時に、細胞内で発現及び保持された全長ＲＡＧＥ（白矢印）は、ゲノムヒトＲＡＧＥを発現するＣＨＯ細胞にＡＯＮ３７７９又はＡＯＮ８７を同時トランスフェクトしたとき、減少した。細胞はまた、細胞内に増加量のＣ切断型ＲＡＧＥを有した。

さらに、ゲノムヒトＲＡＧＥを発現するＣＨＯ細胞内で、ＥＬＩＳＡでの測定としての可溶性ＲＡＧＥの定量的量は、エクソン１０を標的化する選択されたＡＯＮｓ、例えば、ＡＯＮ３７７９、ＡＯＮ８２、ＡＯＮ８３、ＡＯＮ８４及びＡＯＮ８５のトランスフェクション後、増加した（図１ｊ）。これらの中で、ＡＯＮ３７７９は、最大の効果を有した。

さらに、ＥＬＩＳＡでの測定としての可溶性ＲＡＧＥの定量的量は、ＡＯＮ９０及び９３を含む、ＡＯＮ３７７９に類似した領域内のエクソン１０を標的化する一部の他のＡＯＮｓにより、ＡＯＮ３７７９と類似する量（１０ｎＭ）分増加した（図１ｋ）。ゲノムヒトＲＡＧＥを発現するＣＨＯ細胞内から放出された可溶性ＲＡＧＥの定量的量は、ＡＯＮ３７７９のトランスフェクション後、用量依存的様式で増加した（図１ｌ）。

さらに、エクソン１０を標的化する１０ｎＭ ＡＯＮｓ、特にＡＯＮ３７７９のヒト肺上皮細胞（Ａ５４９）へのトランスフェクションにより、ＩＣＡＭ－１発現の誘導を引き起こす、ＲＡＧＥリガンドＳ１００Ａ８／Ａ９（０．６μｇ／ｍＬ）によるＲＡＧＥの活性化後、炎症促進性シグナル伝達の誘導が調節された（図１ｍ）。

さらに、エクソン１０を標的化する１０ｎＭ ＡＯＮｓ、特に、ＡＯＮ３７７９、ＡＯＮ３７８０、ＡＯＮ８１、ＡＯＮ８２及びＡＯＮ８３のヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）へのトランスフェクションにより、ＲＡＧＥリガンドＳ１００Ａ８／Ａ９（０．６μｇ／ｍＬ；図１ｍ）への曝露後、ＩＣＡＭ－１発現の誘導が阻止された。

さらに、エクソン１０を標的化する１０ｎＭ ＡＯＮｓ、特にＡＯＮ３７７９のヒト肺上皮細胞（Ａ５４９）へのトランスフェクションにより、ＩＣＡＭ－１発現の誘導を引き起こす、アンジオテンシンＩＩ（１μＭ）によるＡＴ１受容体の活性化後のＲＡＧＥのトランス活性化後、炎症促進性シグナル伝達の誘導が調節された（図１ｏ）。

さらに、エクソン１０を標的化する１０ｎＭ ＡＯＮｓ、特に、ＡＯＮ３７７７、ＡＯＮ３７７９、ＡＯＮ３７８０、ＡＯＮ３７８０、ＡＯＮ３７８２及びＡＯＮ３７８３のヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）へのトランスフェクションにより、アンジオテンシンＩＩ（１μＭ；図１ｐ）によるＡＴ１受容体の活性化後のＲＡＧＥのリガンド非依存性トランス活性化後のＩＣＡＭ－１発現の誘導を含む、炎症促進性シグナル伝達の誘導が調節された。エクソン１０を標的化する他のＡＯＮｓ、特にＡＯＮ３７７８及びＡＯＮ８４は、効果を有しなかった。

エクソン１０を標的化する１０ｎＭ ＡＯＮｓ、特に、ＡＯＮ３７７９、ＡＯＮ３７８０、ＡＯＮ８２、ＡＯＮ８３及びＡＯＮ８７のヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ１）へのトランスフェクションにより、エクソン１０を有するＲＡＧＥ ｍＲＮＡスプライコフォームの発現における減少を含む、ＲＡＧＥ ｍＲＮＡスプライコフォームの発現における変化がもたらされた（図１ｑ）。さらに、エクソン１０を標的化する１０ｎＭ ＡＯＮｓ、特にＡＯＮ３７７９及びＡＯＮ８７のヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ１）へのトランスフェクションにより、エクソン９ｂを有するＲＡＧＥ ｍＲＮＡスプライコフォームの発現における増加が誘導された（図１ｒ）。

オクタグアニジンデンドリマー（ｖｉｖｏモルホリノとして公知）と共有結合的に連結されたモルホリノオリゴヌクレオチドが、トランスフェクション試薬を必要とせずにインビトロ及びインビボで使用可能である。ＡＯＮ３７７９のｖｉｖｏモルホリノ製剤（１μＭ）によるヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）の処置により、ＲＡＧＥ ｍＲＮＡスプライコフォームの発現における変化、例えば、ＲＴ－ＰＣＲによる測定として、エクソン９ｂを有するＲＡＧＥ ｍＲＮＡスプライコフォームの増加がもたらされた（図１ｓ）。さらに、細胞培地中でのｅｓＲＡＧＥの発現も、対照モルホリノＡＯＮで処置した細胞と比較して増強された（図１ｔ）。トランスフェクション試薬の不在下でのＡＯＮ７９の処置は、効果を有しなかった。トランスフェクション試薬によるＡＯＮ３７７９のトランスフェクションを陽性対照として示す。

さらに、ＡＯＮ３７７９のｖｉｖｏモルホリノ製剤（１μＭ）によるゲノムヒトＲＡＧＥを発現するＣＨＯ細胞の処置により、ＥＬＩＳＡでの測定として、可溶性ＲＡＧＥの発現が増強された（図１ｕ）。

ポリ（Ｇ）ストレッチ、特にＧＧＧＧモチーフが発現サイレンサーとして作用し得、且つそれらがｈｎＲＮＰ Ｈ及びＦによって結合されることが多いことが知られている（Ｓｏｈａｉｌ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２０１４）。ＲＡＧＥスプライシングが、上流ＲＡＧＥ５’スプライス部位の優先的利用にとって必要とされる、イントロン９／エクソン９ｂ内部のＧリッチシスエレメント及び異種核リボ核タンパク質Ｈにより部分的に調節されることが仮定されている。ポリ（Ｇ）ストレッチは、ｈｎＲＮＰ Ｈの結合に連続Ｇストレッチを必要とするとき、エクソンスキッピングを支持する。ＡＯＮｓは、一般にＧリッチ領域内に乏しい親和性及び低下した有効性を有する。エクソン１０は、３つのＧＧＧＧモチーフを有し、その１つは、ｈｎＲＮＰＦ結合標的として認識され、ＡＯＮ３７７９、ＡＯＮ３７８７及びＡＯＮ３７８２によって隣接される（図１ｖ）。しかし、この領域を突然変異させること（ＲＡＧＥ突然変異体Ｍ３）は、エクソンスプライシング又はＡＯＮ３７７９への応答に対する効果を有しなかったが（図１ｗ）、我々が、ＲＡＧＥのスプライシングを調節するため、これらの領域をＡＯＮｓにより標的化することによりＲＡＧＥスプライシングの新規なサイレンサーを調節していることが示唆され、それは先行技術から予測され得なかった。

実施例２．エクソン９中のシス作用性ＲＮＡエレメントを標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用する、ヒト細胞内でのＲＡＧＥの選択的スプライシングの調節
本実施例は、ＲＡＧＥプレｍＲＮＡの選択的スプライシングが、ＲＡＧＥのプレｍＲＮＡのエクソン９中のシス作用性ＲＮＡエレメントを標的化するＡＯＮｓを使用して調節可能であることを示す（図２ａ）。

エクソン９を標的化する１０ｎＭ濃度のいくつかのＡＯＮｓ、特に、ＡＯＮ３６６８、ＡＯＮ３６６９、ＡＯＮ３６７０、ＡＯＮ４１０３、ＡＯＮ４１０４、ＡＯＮ４１０５のヒト肺上皮細胞（Ａ５４９）へのトランスフェクションにより、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲによる測定として、対照（スクランブルＲＮＡ処置）細胞と比較して、エクソン１０を有するＲＡＧＥ ｍＲＮＡスプライコフォームの発現が減少した（図２ｂ）。エクソン９を標的化する別のＡＯＮｓ、特にＡＯＮ４１０６は、効果を有しなかった。しかし、エクソン９を標的化するすべてのＡＯＮｓによる処置後、ＲＡＧＥ ｍＲＮＡの発現全体は、やや増強された。

エクソン９を標的化する選択されたＡＯＮｓの存在下及び不在下のヒト肺上皮細胞（Ａ５４９）内で発現されたすべてのＲＡＧＥ ｍＲＮＡスプライコフォームを単離し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｏｐ１０細胞にクローニングした。エクソン８～１１に及ぶプライマーを使用し、各ＲＡＧＥインサートのサイズを決定した（図２ｃ）。エクソン９を標的化するすべてのＡＯＮｓにより、３００ｋＢバンドを表すｍＲＮＡクローンの百分率での発現が減少したが（図２ｄ）、それはエクソン１０及び１１中に含まれるシグナル伝達能のあるエレメントの十分な発現を意味する。特に、ＡＯＮ３６７０は、サイズが３００ｋＢの断片を有するＲＡＧＥ ｍＲＮＡスプライコフォームにおける減少をもたらした（図２ｄ）。

さらに、エクソン９を標的化するＡＯＮｓ、特にＡＯＮ３６６９、ＡＯＮ３６７０、ＡＯＮ４１０３のヒト肺上皮細胞（Ａ５４９）へのトランスフェクションにより、エクソン８がスキップされた（ｍｕｌｔｉＮＡアナライザーで空のレーンによって表される；図２ｃ）ＲＡＧＥ ｍＲＮＡスプライコフォームの新規な発現が誘導された。

さらに、エクソン９を標的化するＡＯＮｓ、特に、ＡＯＮ３６６９、ＡＯＮ３６７０、ＡＯＮ４１０３及びＡＯＮ４１０５のヒト肺上皮細胞（Ａ５４９）へのトランスフェクションにより、２７６ｋＢ断片を有するＲＡＧＥ ｍＲＮＡスプライコフォームの新規な発現がもたらされたが、それはスプライコフォームからのエクソン９の除去を意味する（図２ｄ）。

ヒトＲＡＧＥのゲノム配列（ｇＲＡＧＥ）を有するプラスミドをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞において、培地中に分泌された可溶性ＲＡＧＥの量は、ＥＬＩＳＡでの測定として、対照（スクランブルＲＮＡ処置）細胞と比較すると、エクソン９中のＲＡＧＥスプライス部位を標的化するいくつかのＡＯＮｓ、具体的にはＡＯＮ３６６９及びＡＯＮ３６７１により適度に増加した（図２ｅ）。

さらに、ＴＬＲ４遺伝子発現の誘導を含む、ＲＡＧＥリガンドＳ１００Ａ８／Ａ９（０．６μｇ／ｍＬ）によるＲＡＧＥの活性化後、エクソン９を標的化する異なる濃度のＡＯＮｓ、特に、ＡＯＮ３６６９、ＡＯＮ３６７０及びＡＯＮ４１０３のヒト肺上皮細胞（Ａ５４９）へのトランスフェクションにより、炎症促進性シグナル伝達の誘導が阻害された（図２ｆ）。エクソン９を標的化する他のＡＯＮｓ、特にＡＯＮ３６６８及びＡＯＮ４１０４は、効果を有しなかった。

さらに、エクソン９を標的化する１０ｎＭ ＡＯＮｓ、特に、ＡＯＮ３６６９、ＡＯＮ３６７０、及びＡＯＮ４１０４のヒト肺上皮細胞（Ａ５４９）へのトランスフェクションにより、アンジオテンシンＩＩ（１μＭ；図２ｇ）によるＡＴ１受容体の活性化後のＲＡＧＥのリガンド非依存性トランス活性化を介して炎症誘発性シグナル伝達の誘導が調節された。エクソン９を標的化する他のＡＯＮｓ、特に、ＡＯＮ３６６８、ＡＯＮ３６７１及びＡＯＮ４１０３は、効果を有しなかった。

さらに、エクソン９を標的化する１０ｎＭ ＡＯＮｓ、特にＡＯＮ３６６９及びＡＯＮ３６７０のヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣｓ）へのトランスフェクションにより、エクソン１０を有する内因性ＲＡＧＥ ｍＲＮＡスプライコフォームの発現が減少した（図２ｈ）。

実施例３．エクソン９Ｂ中のシス作用性ＲＮＡエレメントを標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用する、ヒト細胞内でのＲＡＧＥの選択的スプライシングの調節
本実施例は、ＲＡＧＥの選択的スプライシングがＲＡＧＥのプレｍＲＮＡにおけるエクソン９ｂ内部のＲＮＡエレメントを標的化するＡＯＮｓを使用して調節可能であることを示す。

エクソン９ｂは、大部分のＲＡＧＥアイソフォームにおける選択的スプライシングにより除去される（図１ｅ）。この除去は、潜在的にはスプライソソームとエクソン９ｂ中のモチーフとの相互作用を必要とする。我々は、ＡＯＮｓを用いてこれらの結合因子を調節することで、ＲＡＧＥプレｍＲＮＡの選択的スプライシングも調節可能であると仮定した。

エクソン９ｂを標的化する１０ｎＭ濃度のＡＯＮｓのヒト肺上皮細胞（Ａ５４９）へのトランスフェクションにより、ＲＡＧＥ ｍＲＮＡスプライコフォームのｍＲＮＡ発現における変化がもたらされた。エクソン９ｂを標的化する両方のＡＯＮｓによる処置後、ＲＡＧＥの発現全体は、やや増強された（図３ａ）。さらに、エクソン１０を有するＲＡＧＥ ｍＲＮＡスプライコフォームの発現は、ＡＯＮ８８のトランスフェクション後、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲによる測定として、スクランブル対照処置細胞と比較して、適度に減少した（図３ａ）。さらに、エクソン９ｂを有するＲＡＧＥ ｍＲＮＡスプライコフォームの発現は、ＡＯＮ８８及びＡＯＮ８９により適度に増加した（図３ｂ）。エクソン１０を標的化するＡＯＮ３７７９のトランスフェクションを陽性対照として示す。

さらに、エクソン９ｂを標的化する１０ｎＭ濃度のＡＯＮｓのヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣｓ）へのトランスフェクションにより、エクソン１０を有するＲＡＧＥ ｍＲＮＡスプライコフォームの発現減少がもたらされ（図３ｃ）、エクソン９ｂを有するＲＡＧＥ ｍＲＮＡスプライコフォームの発現が増加した（図３ｄ）。さらに、ＲＡＧＥ ｍＲＮＡの発現全体は、エクソン９ｂを標的化する両方のＡＯＮｓによる処置後、やや増強された（図３ｃ）。エクソン１０を標的化するＡＯＮ３７７９のトランスフェクションを陽性対照として示す。

ヒトＲＡＧＥのゲノム配列（ｇＲＡＧＥ）を有するプラスミドをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞において、培地中に分泌された可溶性ＲＡＧＥの量は、ＥＬＩＳＡでの測定として、対照ＲＮＡと比較すると、エクソン９ｂを標的化するいくつかのＡＯＮｓ、具体的にはＡＯＮ８９により適度に増加した（図３ｅ）。エクソン１０を標的化するＡＯＮ３７７９のトランスフェクションを陽性対照として示す。

イントロン９のヒトＲＡＧＥ配列及びＡＯＮ８８及び８９に対する相補的標的を図３ｆに示す。

実施例４．ＲＡＧＥプレＭＲＮＡ中のシス作用性ＲＮＡエレメントを標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用する、マウスＲＡＧＥの選択的スプライシングの調節
本実施例は、ＲＡＧＥプレｍＲＮＡの選択的スプライシングがマウスＲＡＧＥのプレｍＲＮＡにおけるエクソン９、９Ｂ及び１０中のシス作用性ＲＮＡエレメントを標的化する特定のＡＯＮｓを使用しても調節可能であり、且つこの調節がインビトロ、エクスビボ及びインビボで実証可能であることを示す。

マウスＲＡＧＥの選択的スプライシングに対するＡＯＮｓの効果を試験するため、ＣＨＯ細胞にマウスＲＡＧＥのゲノム配列を有するプラスミドをトランスフェクトした。これは、少量のｅｓＲＡＧＥの分泌をもたらした。マウスＲＡＧＥを標的化するＡＯＮｓ、特にＡＯＮ ｍ３７７９（実施例１に詳述したヒトＲＡＧＥ配列におけるＡＯＮ３７７９によって標的化される同等配列内のマウスＲＡＧＥ配列のエクソン１０を標的化するように設計されたＡＯＮ）及びＡＯＮ ｍ１０１のトランスフェクションにより、細胞培地中へのｅｓＲＡＧＥの分泌が増加した（図４ａ）。

一次マウス大動脈内皮（ＰＭＡＥＣ）細胞に、ＲＡＧＥのエクソン９を標的化するＡＯＮｓ（５０ｍＭ）をトランスフェクトした（表３ｄ）。この処置により、それら各々の陰性対照と比較して、ＲＡＧＥ ｍＲＮＡスプライコフォームの発現における中程度の変化がもたらされた。特に、ＡＯＮ３６７４及びＡＯＮ３６７５は、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲによる測定として、エクソン１０を有するＲＡＧＥ ｍＲＮＡスプライコフォームの発現を低減することができた（図４ｂ）。

しかし、１０ｎＭで使用されるこれらのＡＯＮｓのＰＭＡＥＣへのトランスフェクションは、ＲＡＧＥ ｍＲＮＡスプライコフォームの発現に対して有意な効果を示さなかった（図４ｃ）。培地中に分泌された可溶性ＲＡＧＥのレベルは、５０ｎＭのＡＯＮ３６７４及びＡＯＮ３６７５の培養されたＰＭＡＥＣへのトランスフェクションの２４時間後、適度に増加した（図４ｄ）。

ｍ３７７９（１０ｎＭ）の、ゲノムマウスＲＡＧＥを発現するＣＨＯ細胞へのトランスフェクションにより、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲによる評価として、エクソン１０を有するＲＡＧＥ ｍＲＮＡスプライコフォームの発現が減少し；図４ｅ）、対照（スクランブルＲＮＡ処置）細胞と比較して、ｅｓＲＡＧＥの分泌が増加した（図４ｆ）。さらに、ヒトＲＡＧＥ配列を標的化するＡＯＮ３７７９により、ｅｓＲＡＧＥ分泌が増加したが、ＡＯＮ ｍ３７７９ほど多くはなかった。

ＲＡＧＥのマウス配列のエクソン１０を標的化するように設計したＡＯＮｓを、プラスミドからヒトＲＡＧＥのゲノム配列を発現するＣＨＯ細胞にトランスフェクトしたとき、（マウスＲＡＧＥエクソン１０を標的化するように設計した）ＡＯＮ ｍ３７７９は、細胞培地中での可溶性ヒトＲＡＧＥの増加も誘導した（図４ｇ）。しかし、（ヒトＲＡＧＥエクソン１０を特異的に標的化する）ＡＯＮ３７７９は、ゲノムヒトＲＡＧＥの調節においてＡＯＮ ｍ３７７９よりも有効であった。このデータは、エクソン１０中の特異的配列を標的化するＡＯＮｓが、非同一性の領域にもかかわらず、ＲＡＧＥスプライシングの調節において有効であり得ることを示す。

マウス組織内でのＲＡＧＥを標的化するＡＯＮの効果を試験するため、精密切断肺切片（ＰＣＬＳ）をマウスから得て、次にエクスビボで培養した。要するに、マウスを人道的に殺害し、それらの外植肺にアガロースを注入し、円柱状コアを採取し、次に組織スライサーで切断し、均一な直径及び厚みの肺切片を作製した。次に、ＰＣＬＳを組織培養条件下でマルチウェルプレート内の培地に浸した。２４時間後、次にＰＣＬＳにｖｉｖｏモルホリノＡＯＮ３７７９又は非標的対照を４８時間トランスフェクトした。ＡＯＮ３７７９による処置により、エクソン９ｂを有するＲＡＧＥ ｍＲＮＡの発現における有意な増加及びエクソン１０を有するＲＡＧｅ ｍＲＮＡスプライコフォームの発現減少がもたらされ（図４ｈ）、投与の７２時間後、エクソン９ｂに対する最大の効果が認められた（図４ｉ）。

ＲＡＧＥスプライシングを標的化するＡＯＮｓのインビボでの関連性を検証するため、雄Ｃ５７ｂｌ６マウスにＡＯＮ ｍ３７７９（１ｍｇ／ｋｇ／日）を７日間皮下注射した。エクソン９ｂを有するＲＡＧＥ ｍＲＮＡスプライコフォームの発現は、マウスの肺内で増加し、エクソン１０を有するスプライコフォームは、１週間のＡＯＮ ｍ３７７９による皮下処置後、減少した（図４ｊ）。

吸入治療剤としてのその可能性を検証するため、生存マウスを麻酔してから、３０μＬの１１μＭｖｉｖｏモルホリノＡＯＮ ｍ３７７９又は（陰性対照として）非標的ｖｉｖｏモルホリノ対照（リボヌクレアーゼ遊離水）を、カニューレ又は水単独を使用し、気管を介して肺に送達した。麻酔を逆転させ、４８時間後、マウスを殺害した。ｍ３７７９による気管内処置により、有意な効果を有しなかった水単独と比較して、エクソン１０を有するＲＡＧＥ ｍＲＮＡスプライコフォームの肺発現における有意な減少がもたらされた。さらに、エクソン９ｂを有するＲＡＧＥ ｍＲＮＡアイソフォームの発現が増加した（図４ｋ）。媒体（滅菌水）単独と比較すると、エクソン１０を有するＲＡＧＥ ｍＲＮＡスプライコフォームの発現における同様の減少が、３０ｕｌの１１ｕＭ ２－０’Ｍｅ－ホスホロチオエートＡＯＮ ｍ３７７９の気管内送達後、認められた（図４ｌ）。加えて、滅菌水又はヒトＲＡＧＥを標的化する無効なＡＯＮ４１０５と比較すると、循環する可溶性ＲＡＧＥにおける増加が、マウスのＡＯＮ ｍ３７７９による処置後、さらに認められた（図４ｍ）。

実施例５．ＲＡＧＥプレＭＲＮＡを標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチドの組み合わせを使用する、ＲＡＧＥの選択的スプライシングの調節
本実施例は、ＲＡＧＥの選択的スプライシングにより、ＲＡＧＥのプレｍＲＮＡにおける異なるシス作用性ＲＮＡエレメントを標的化するＡＯＮｓの組み合わせを使用して調節可能であることを示す。

エクソンの定義は、標的保持又は除去を促進する多成分「クロスエクソン」認識複合体のアセンブリによって調節されると考えられる。ＡＯＮ３７７９をＲＡＧＥのプレｍＲＮＡにおけるエクソン１０に結合し、ｅｓＲＡＧＥの生成を増強してから、限定はされないが、予測されたスプライス部位を含む、エクソン１０中の他の調節標的がより決定的となってもよいことが推測される。さらに、ＡＯＮ３７７９の存在下で、他のＡＯＮｓを用いて、ＲＡＧＥのプレｍＲＮＡにおけるエクソン１０中のこれらのシス作用性ＲＮＡエレメントを選択的に標的化することにより、エクソン除去からの何らかの回避が阻止され、好ましいｅｓＲＡＧＥの生成に向けてＲＡＧＥスプライシングがさらに調節されることになる。

ＲＡＧＥのエクソン１０の二次構造は、中心ヒンジ領域によって連結された２つのヘアピンループを有することが予測される。ＡＯＮ３７７９を用いて３’ヘアピンにおけるエクソンエンハンサー配列を標的化すると、エクソン１０中の上流５’スプライス部位を含む、代替の５’ヘアピンにおける標的の重要性が高まることが推測される。

この仮説を検証するため、ゲノムヒトＲＡＧＥをコードするプラスミドを有するＣＨＯ細胞に、エクソン１０中の予測された５’（アクセプター）スプライス部位を標的化する他のＡＯＮｓ（同様に１０ｎＭ）と組み合わせたＡＯＮ３７７９（１０ｎＭ）をトランスフェクトした。この組み合わせ処置により、ＲＡＧＥ ｍＲＮＡスプライコフォームの発現における変化がもたらされ、そこでは、いくつかの組み合わせ、特にＡＯＮ３７７９＋ＡＯＮ３７７７、ＡＯＮ３７７９＋ＡＯＮ３７７８により、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲによる測定として、ＡＯＮ３７７９単独又は対照スクランブルＲＮＡ処置細胞と比較すると、エクソン９ｂを有するＲＡＧＥ ｍＲＮＡアイソフォームの発現が有意に増加した（図５ａ）。さらに、この組み合わせにより、ＥＬＩＳＡによる培地中での測定として、ｅｓＲＡＧＥタンパク質の生成が増加した（図５ｂ）。さらに、ＡＯＮ３９９７及びＡＯＮ３７７８の組み合わせは、低用量（５ｎＭ＋５ｎＭ）でより有効であった。特に、ＡＯＮ３７７７及びＡＯＮ３７７８は、１０ｎＭでそれら自身に対する効果をほとんど又は全く有しなかった。

別の実験では、ゲノムヒトＲＡＧＥをコードするプラスミドを有するＣＨＯ細胞のトランスフェクションに、エクソン１０中の３’又は５’スプライス部位のいずれかを標的化する他のＡＯＮｓと組み合わせたＡＯＮ３７７９をトランスフェクトした。さらに、いくつかの組み合わせにより、ＲＡＧＥ ｍＲＮＡスプライコフォームの発現における変化がもたらされ、そこでは、いくつかの組み合わせ、特にＡＯＮ３７７９＋ＡＯＮ３７７８、ＡＯＮ３７７９＋ＡＯＮ３７８１及びＡＯＮ３７７９＋ＡＯＮ３７７８＋ＡＯＮ３７８１により、ＥＬＩＳＡによる測定として、ＡＯＮ３７７９単独又はスクランブル対照処置細胞と比較すると、可溶性ＲＡＧＥの発現が有意に増加した（図５ｃ）。この増加は、ＡＯＮ３７７９の代わりにＡＯＮ９３又はＡＯＮ８７を使用すると同様であったが、（ボックスで表した）ＡＯＮ３７７９との組み合わせは、全体的に最強であり、且つ最も一貫していた。

エクソン１０中の隣接領域を標的化するＡＯＮｓの他の組み合わせ、特にＡＯＮ３７７９＋ＡＯＮ３７８２、ＡＯＮ３７７９＋ＡＯＮ３７８４、ＡＯＮ３７７９＋ＡＯＮ３７８５のヒト肺上皮細胞（Ａ５４９）へのトランスフェクションは、ＡＯＮ３７７９単独を超える、エクソン９ｂを有するＲＡＧＥアイソフォームの発現に対する有意な効果を有しなかった（図５ｄ）。特に、これらのＡＯＮｓは、５’ヘアピン（ＡＯＮ３７７９と同様）及び／又は中心ヒンジ領域も標的化し、これは他の（３’）ヘアピン上のエクソンエンハンサーを標的化する、組み合わせで有効であったＡＯＮ３７７７又はＡＯＮ３７７８と異なる。

マウスＲＡＧＥのゲノム配列をコードするプラスミドを有するＣＨＯ細胞に、エクソン１０中の３’又は５’スプライス部位のいずれかを標的化するＡＯＮｓと組み合わせたＡＯＮ ｍ３７７９をトランスフェクトした。この組み合わせ処置により、ＲＡＧＥ ｍＲＮＡスプライコフォームの発現における変化がもたらされ、そこでは、いくつかの組み合わせ、特にＡＯＮ ｍ３７７９＋ＡＯＮ ｍ１０２により、ＥＬＩＳＡによる測定として、ＡＯＮ ｍ３７７９単独と比較すると、可溶性ＲＡＧＥの細胞培地への分泌が有意に増加した（図５ｅ）。

Claims (17)

1. 終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ）におけるプレｍＲＮＡスプライシングを修飾し、前記ＲＡＧＥ遺伝子転写物又はその一部のスプライシングを調節するための単離又は精製されたＡＯＮ。
2. ａ）配列番号１～３１；
   ｂ）表３ａ～３ｄ；及び／又は
   ｃ）配列番号１１、１８、１９、若しくは２０
   を含むリストから選択される、請求項１に記載のＡＯＮ。
3. （ｉ）修飾された糖部分；（ｉｉ）リボヌクレアーゼＨに対する耐性；及び／又は（ｉｉｉ）オリゴマー模倣化学を含むリストから選択される代替化学又は修飾を受ける１つ以上のヌクレオチド位置を有する、請求項１に記載のＡＯＮ。
4. （ｉ）ある部分への化学的コンジュゲーション；及び／又は（ｉｉ）細胞透過性ペプチドの標識によりさらに修飾される、請求項１に記載のアンチセンスオリゴマー。
5. ウラシルが前記ＡＯＮ中に存在する場合、前記ＡＯＮの前記ウラシル（Ｕ）がチミン（Ｔ）で置換される、請求項１に記載のＡＯＮ。
6. プレｍＲＮＡスプライシングの前記修飾が、前記ＲＡＧＥプレｍＲＮＡの１つ以上のエクソン配列のスキッピングをもたらす、請求項１に記載のＡＯＮ。
7. プレｍＲＮＡスプライシングの前記修飾が、前記ＲＡＧＥ ＲＮＡの１つ以上のイントロン配列の保持（ランオン）をもたらす、請求項１に記載のＡＯＮ。
8. 患者におけるＲＡＧＥ発現に関連する疾患の作用を治療し、予防し、又は寛解させるための医薬、予防、又は治療組成物であって、
   ａ）請求項１～８のいずれか一項に記載の１つ以上のＡＯＮｓ、及び
   ｂ）１つ以上の薬学的に許容できる担体及び／又は希釈剤
   を含む、組成物。
9. ＲＡＧＥ遺伝子転写物におけるスプライシングを操作するための方法であって、
   ａ）請求項１～７のいずれか一項に記載のＡＯＮｓの１つ以上を提供し、且つ前記オリゴマーが標的核酸部位に結合することを可能にするステップ
   を含む、方法。
10. ＲＡＧＥアイソフォームの発現、濃度又は活性を調節するための方法であって、
    （ａ）請求項１～７のいずれか一項に記載の１つ以上のＡＯＮｓ又は１つ以上のＡＯＮｓを含む医薬組成物を有効量で前記患者に投与するステップ
    を含む、方法。
11. ＲＡＧＥ発現に関連する疾患の作用を治療し、予防し、又は寛解させるための方法であって、
    ａ）請求項１～７のいずれか一項に記載の１つ以上のＡＯＮｓ又は１つ以上のＡＯＮｓを含む医薬組成物を有効量で前記患者に投与するステップ
    を含む、方法。
12. ＲＡＧＥ発現に関連する疾患の作用を治療し、予防し、又は寛解させるための薬剤の製造における、請求項１～７のいずれか一項に記載の精製及び単離されたＡＯＮｓの使用。
13. 患者におけるＲＡＧＥ発現に関連する疾患の作用を治療し、予防し、又は寛解させるためのキットであって、その使用説明書と一緒に、好適な容器内に包装された、少なくとも請求項１～７のいずれか一項に記載のＡＯＮ及びその組み合わせ又はカクテルを含む、キット。
14. 前記ＲＡＧＥ発現関連疾患が、神経変性疾患、がん、肺障害、及び炎症性疾患を含むリストから選択される、請求項８に記載の組成物、請求項９～１１のいずれか一項に記載の方法、請求項１２に記載の使用又は請求項１３に記載のキット。
15. 前記ＡＯＮが、可溶性ＲＡＧＥアイソフォーム、ＲＡＧＥ細胞質テールを調節することが可能な化合物を含むリストから選択される第２の治療剤と組み合わせて投与される、請求項８に記載の組成物、請求項９～１１のいずれか一項に記載の方法、請求項１２に記載の使用又は請求項１３に記載のキット。
16. 前記ＡＯＮが、ＡＯＮｓの組み合わせである、請求項８に記載の組成物、請求項９～１１のいずれか一項に記載の方法、請求項１２に記載の使用又は請求項１３に記載のキット。
17. ＡＯＮｓの前記組み合わせが、配列番号１１及び１０、又は配列番号１１及び１３の組み合わせから選択される、請求項１６に記載の組成物、方法、使用又はキット。

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