JP2022531602A - 肺の炎症および炎症性リモデリングの予防および治療用R-エナンチオマーβ2アゴニストの、有害作用を軽減するための使用 - Google Patents
肺の炎症および炎症性リモデリングの予防および治療用R-エナンチオマーβ2アゴニストの、有害作用を軽減するための使用 Download PDFInfo
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Abstract
本発明は、気管支-肺炎症症状または炎症性線維症リモデリングを治療するための免疫調節剤としてのR-エナンチオマーテルブタリンおよび他のR-エナンチオマーβ2アゴニストの新たな使用を開示した。本発明はまた、気道過敏性および気道線維症を含む、ラセミまたはS-エナンチオマーβ2アゴニストに関連する有害作用を減少させるための、R-テルブタリンおよびR-β2アゴニストの新たな使用を開示した。
Description
関連出願の相互参照
本出願は、2019年5月7日に出願された米国仮出願第62844398号の利益を主張する。
本出願は、2018年9月9日に出願された米国特許出願第62728800号の続きである、2019年9月7日に出願された国際出願PCT/US19/50120号の一部継続出願でもある。
本発明は、気管支-肺炎症症状および/または炎症性リモデリングを、有害作用を低減して治療するための免疫調節剤としてのR-エナンチオマーテルブタリンおよび他のR-エナンチオマーβ2アゴニストの新しい使用を開示した。有害作用は、ラセミβ2アゴニストの頻繁な使用に関係する。
β2アゴニストであるテルブタリンは、主に喘息の治療において30年余り使用されており、いくつかの国では早期分娩のための子宮収縮抑制療法としても使用されている。テルブタリン分子は、R-およびSエナンチオマーの両方からなる。現在、錠剤、エアロゾル、または注射用製剤中のAPIとして市販されているテルブタリンは、SおよびRエナンチオマーテルブタリンを50%含有するラセミ体である。RまたはS β2アゴニスト、例えばサルブタモールは、生物学的効果において大きく異なり得ることが報告されている。Rエナンチオマーは、理論的に有効なウテマー(utemor)であり、一方、Sエナンチオマーは、β2受容体および毒性物質をも活性化しないディステマー(distemor)である。したがって、キラルスイッチは、必要としている患者にとって有益であり得る。しかしながら、先行技術においてS-テルブタリンの有害作用についての研究はほとんどない。むしろ、S-テルブタリンは治療的に不活性であるが、毒性はないと一般的に考えられており、したがって、ラセミテルブタリンの代わりにR-テルブタリンを使用することは、必要としている患者にとって有益ではない。このため、吸入剤または他の製剤としてRエナンチオマーテルブタリンを開発することは、研究開発の高コストが患者への臨床的利益の理由にならないため、必要なかったと考えられる。今日、市販されているほとんどのβ2アゴニストは、少量、例えばレボサルブタモールやアルフォルモテロールなどを除き、ラセミ形態のままである。主要な臨床試験において、吸入剤β2アゴニストの使用に、ラセミ体を上回る有意な利益がないことが実証された。(Mansfield etal.,Single-enantiomer drugs:elegant science,disappointing effects,Clinical Pharmacokinetics 43(5):287-90・2004年2月)
一方、気道過敏性による、β2アゴニストの長期使用の安全性への懸念が高まっている。肺の劣化および長期生存率の低下は、β2アゴニストの長期使用に関係する。場合によっては、長時間作用型βアゴニスト(LAB As)は、生命を脅かす喘息発作および急性呼吸窮迫症候群、ARDSに関連している(Bassford et al.The rise and fall of β-agonists in the treatment of ARDS,Critical Care 2012,16:208)。最近、β2アゴニストの代わりに、β2遮断剤が喘息患者に有益であり得ることが示唆された。(Albouaini.K et al.,Beta-blockers use in patients with chronic obstructive pulmonary disease and concomitant cardiovascular conditions,Int J Chron Obstruct Pulmon Dis.2007 Dec;2(4):535-540)
この議論は、喘息-COPDまたはARDSの臨床管理における問題を引き起こす。本発明において、本発明者らは、喘息-COPD、呼吸不全および生命を脅かす他の状態の治療における有効性および毒性に関して、R対SテルブタリンおよびR-サルブタモールなどの他のβ2アゴニストの大きな違いがあることを開示した。ラセミβ2アゴニストの有害作用は、β2アゴニストのS-エナンチオマーにのみ関連している可能性がある。したがって、ラセミテルブタリンの代わりにR-テルブタリンを使用すると、必要とする患者に大きな利益をもたらす可能性がある。他のR-エナンチオマーβ2アゴニスト(サルブタモール、バンブテロール、ビランテロール、サルメテロール、クレンテロール、ホルモテロール、トランチンテロール、インダカテロールなど)の使用にも同じことが当てはまる。
β2アゴニストを使用するための他の重要な態様は、β2アゴニストが細気管支平滑筋の弛緩によって気管支痙攣を緩和するためにのみ使用されるという、医療行為における長期的な共通の理解があるということである。コルチコステロイドは、時にはβ2アゴニストと組み合わせて、炎症性肺症状の治療において抗炎症剤として一般的に使用される一方、β2アゴニスト単体では、喘息/COPDに関連する、または関連しない炎症性肺疾患または症状の治療には使用されていない。サルブタモールの、動物または細胞研究においていくつかのサイトカインを阻害する効果が先行技術で報告されたが、β2アゴニストは、平滑筋弛緩の他に、免疫炎症または気管支線維症リモデリングに対する治療効果を有するとは、当業者に考えられなかった。
これらに基づいて、潜在的な抗炎症薬としてのb2-ARアゴニストの評価が強く保証される。しかしながら、喘息において気管支拡張剤として使用されるb2-ARアゴニストの、これらの薬物の全体的な治療効果に対する最終的な免疫調節活性への相対的な寄与は、まだ確立されていない。
さらに、RおよびSエナンチオマーβ2アゴニスト間で起こりうる相反する効果は、臨床では十分に実証されなかった。ラセミβ2アゴニストが使用された場合、R-エナンチオマーの可能性ある治療効果は、そのS-エナンチオマーの相反する作用によって低減または減少され得る。
病原体関連分子パターン(PAMP)に応答して繰り返されるアレルギー反応は、多くの場合、症例ごとに重症度および変化の割合が変動し得る「リモデリング」プロセスにつながる。これらの変化の主なものは、異常な気道壁を形成する気管支脈管系および神経のあまり明確に定義されない変化に加えて、気道線維症、平滑筋量の増加、粘液化生、および腺肥大である。
本発明は、アレルギー反応、敗血症のサイトカインストームまたはアセチルコリンストームの場合の病原体関連分子パターン(PAMP)によって誘発される肺の炎症および悪化した慢性細気管支炎、上腕肺線維症リモデリング、気腫、ならびに過剰な粘液生成を予防または治療するための抗免疫炎症薬としてのR-エナンチオマーβ2アゴニストの、新しい使用を開示した。さらに、本発明は、慢性細気管支炎、慢性閉塞性肺疾患、肺線維症および肺高血圧症を含む、ラセミβ2アゴニスト(50およびS-エナンチオマーからなる)の長期使用に関連する有害作用を低減するための、R-エナンチオマーβ2アゴニストの新しい使用を開示した。
発明の詳細
本発明では、臨床アレルギー反応を模倣するために、OVA感作/OVAチャレンジマウスを使用して、R、Sまたはラセミβ2アゴニストの効果を研究した。動物には、気道抵抗の増加、免疫炎症反応、サイトカイン放出、ROS産生、および肺組織の病理組織学的変化を含む、重度のアレルギー性炎症症状が現れた。OVA免疫化およびチャレンジによってアレルギー性喘息モデルを確立した後、動物を上記の薬物のエアロゾルの吸入によって7日間繰り返し前処理した。同じ動物において、メタコリンの吸入によって喘息発作を引き起こし、肺機能を研究した。BALFおよび組織サンプルを分析のために収集した。これらのプロトコルは、喘息患者が薬物で繰り返し治療された臨床治療に類似している。ベースライン条件は、従来技術で使用された正常な動物と比較して非常に大きく異なっていた。既存の喘息状態の動物におけるβ2アゴニストに対する応答は、正常な動物、または従来技術で使用される培養細胞株で見られる応答とは根本的に異なることが一般に知られている。本発明によって開示された喘息動物に基づく結果は、正常な動物または従来技術の培養細胞からの結果に従って当業者が予測することはできない。
本発明では、臨床アレルギー反応を模倣するために、OVA感作/OVAチャレンジマウスを使用して、R、Sまたはラセミβ2アゴニストの効果を研究した。動物には、気道抵抗の増加、免疫炎症反応、サイトカイン放出、ROS産生、および肺組織の病理組織学的変化を含む、重度のアレルギー性炎症症状が現れた。OVA免疫化およびチャレンジによってアレルギー性喘息モデルを確立した後、動物を上記の薬物のエアロゾルの吸入によって7日間繰り返し前処理した。同じ動物において、メタコリンの吸入によって喘息発作を引き起こし、肺機能を研究した。BALFおよび組織サンプルを分析のために収集した。これらのプロトコルは、喘息患者が薬物で繰り返し治療された臨床治療に類似している。ベースライン条件は、従来技術で使用された正常な動物と比較して非常に大きく異なっていた。既存の喘息状態の動物におけるβ2アゴニストに対する応答は、正常な動物、または従来技術で使用される培養細胞株で見られる応答とは根本的に異なることが一般に知られている。本発明によって開示された喘息動物に基づく結果は、正常な動物または従来技術の培養細胞からの結果に従って当業者が予測することはできない。
本発明は、S-エナンチオマーがOVA感作/OVAチャレンジマウスの喘息において、気道抵抗および応答性を増強することを開示した。オボアルブミン(OVA)誘発喘息マウスでは、S-テルブタリンの治療により、ベースライン気道抵抗が有意に増強され、肺コンプライアンスが低下した。喘息マウスをムスカリン受容体アゴニストであるメタコリンでチャレンジした場合、喘息反応は、S-エナンチオマーで前処置したマウスでは、R-エナンチオマーまたは生理食塩水(対照)のいずれかで前処置したマウスよりもはるかに重症であった。プレチスモグラフィーによって測定された気道抵抗の増加は、生理食塩水またはR-エナンチオマーテルブタリンのいずれかで前処置したマウスと比較して、S-エナンチオマーで前処置したマウスで有意に高かった。S-テルブタリンで処置された喘息マウスの肺組織切片において、細気管支の重度の狭窄が顕微鏡下で観察され得る。一方、R-エナンチオマーテルブタリンは、抗喘息および炎症性病変に対してRSテルブタリンよりも有意に効果が高い。サルブタモール、バンブテロール、ビランテロール、クレンブテロール、サルメテロール、ホルモテロール、トランチンテロール、およびインダカテロールのRまたはS-エナンチオマーにも同じことが当てはまる。
これは、S-エナンチオマーが治療的に不活性であるだけでなく、薬物誘発気道過敏性の原因であることを明確に実証した。本発明は、S-エナンチオマーが、ラセミβ2アゴニスト治療を受けている患者の生命を脅かす喘息発作に関連していることを開示した。したがって、RS-ラセミの代わりにR-エナンチオマーを使用すると、望ましくない有害作用を減らすことができる。
本発明は、S-エナンチオマーβ2アゴニストによって、気管支肺胞洗浄液で測定した場合に、好酸球の血液および肺中の浸潤が増加することを開示した。喘息マウスにおいて、好酸球は、重度の炎症反応をもたらし得る喘息反応の重要なマーカーである。しかしながら、先行技術では、OVA感作/OVAチャレンジマウスにおいて、R-サルブタモールは好酸球を有意に減少させないことが報告された。他の先行技術では、サルブタモールの(R)-、および(S)-エナンチオマーの両方によって、喘息のマウスモデルにおける気道好酸球輸送および粘液過剰分泌が減少することが報告された。(Henderson etal.Journal of Allergy and Clinical Immunology 116(2):332-40・2005年9月)。本発明では、S-テルブタリンおよび他のS-エナンチオマーβ2アゴニストは、臨床治療を模倣するために、OVA感作/OVAチャレンジ喘息後のマウスにおいて7日間毎日吸入され、曝露された。一方、先行技術では、S-サルブタモールは、埋め込み型浸透圧ポンプによって非経口的に与えられた。議論は、薬物投与の経路が異なることに起因し得る。
本発明は、S-テルブタリンの繰り返し吸入後、OVA誘発喘息マウスの血液またはBALFのいずれかの好酸球の数が有意に増加することを開示した。ラセミテルブタリンの吸入は、S-テルブタリンと、程度は低いが同様の効果を有する一方、R-テルブタリンの繰り返し吸入は、Sまたはラセミテルブタリンと比較して反対の効果を有し、血液およびBALの両方の好酸球の数は、喘息マウスにおいて有意に減少した。同様のことが、サルブタモール、バンブテロール、ビランテロール、クレンテロール、サルメテロール、ホルモテロール、トランチンテロールおよびインダカテロールおよび他のβ2アゴニストのラセミ、RまたはS-エナンチオマーにも見られた。
本発明による本開示は、R-テルブタリンおよび他のβ2エナンチオマーアゴニストが好酸球媒介喘息反応を低減するために使用され得る一方で、S-テルブタリンおよび他のS-エナンチオマーβ2アゴニストは、必要とする患者によって吸入された場合、好酸球媒介喘息反応を悪化させ得ることを実証する。同じ理由で、50%のS-エナンチオマーを含有するラセミβ2アゴニストの吸入は、患者の喘息治療に有害であり得る。これは、先行技術によって開示されたことはなく、実際、先行技術は反対のことを開示した。したがって、本発明の開示は、新規かつ進歩的であると見なされるべきである。
本発明は、S-エナンチオマーβ2アゴニストが、気管支肺胞洗浄液(BALF)においてサイトカインおよびILC媒介炎症を増強することを開示した。OVA誘発喘息マウスのBALFでは、自然リンパ球(ILC)および2型炎症が活性化され、IL4およびIL13の放出が増加した。本発明は、S-テルブタリンおよび他のS-エナンチオマーβ2アゴニストを長期間繰り返し吸入した後、OVA感作/OVAチャレンジ喘息マウスにおいて、BALF中のIL4およびIL13を含むサイトカインならびに血液中のIgEがさらに増加したことを開示した。これらのサイトカインの増加は、肺の自然リンパ球(ILC)の活性化を示す。一方、R-テルブタリンおよび他のR-エナンチオマーβ2アゴニストの繰り返し吸入は、OVA感作/OVAチャレンジマウスのOVA感作/OVAチャレンジ喘息マウスにおけるBALFで、IL5の放出を有意に阻害した。同様の結果が、サルブタモール、バンブテロール、ビランテロール、クレンテロール、サルメテロール、ホルモテロール、トランチンテロールおよびインダカテロールおよび他のβ2アゴニストのラセミ、RまたはS-エナンチオマーにも見られた。ラセミβ2アゴニストであるサルブタモールおよびクレンテロールが、肺におけるILCの活性化を阻害し得ることが先行技術で報告されている。本発明は、S-エナンチオマーβ2アゴニストが、実際、肺において2型炎症およびILCを活性化することを開示した。本発明で開示された、SおよびRエナンチオマーサルブタモールおよびクレンテロール間で逆の2型炎症への効果は、先行技術では報告されていなかった。本発明は、この場合にラセミ体の代わりにR-エナンチオマーを使用すると、必要とする患者に肺炎症の管理における予想外の有意な利益をもたらすであろうことを開示した。本発明におけるこの開示は、新規かつ進歩的であると見なされるべきである。
持続性の気管支-肺炎症は、炎症性リモデリングにつながるであろう。本発明は、S-エナンチオマーβ2アゴニストの繰り返し吸入が、OVA感作/ovaチャレンジマウスにおいて、細気管支平滑筋および肺線維芽細胞の肥大および増殖、ならびに細胞外マトリックスでのコラーゲンの沈着をさらに増強し得ることを開示した。OVA感作/ovaチャレンジ喘息マウスは、重度の炎症、粘膜浮腫、上皮病変、好中球、リンパ球および好酸球の間質浸潤を発症した。平滑筋および線維芽細胞の肥大および増殖によって、細気管支平滑筋層の厚さが増し、コラーゲンが沈着した。S-テルブタリンを数日間繰り返し吸入すると、粘液の過剰産生で満たされた細気管支の内腔の重度の狭窄を伴って、上記の組織病理学的変化がさらに悪化する。したがって、炎症性リモデリングはS-テルブタリンによって増強されたが、R-テルブタリンによって減少した。
肺組織の肺胞隔壁の厚さも、さらに増加した。これらによって、OVA感作/ovaチャレンジ喘息マウスにおいて肺機能が低下し、ガス血液関門を介した酸素交換が減少するであろう。
S-テルブタリンを繰り返し吸入すると、OVA感作/OVAチャレンジマウスにおいて杯細胞の過形成および過剰な粘液産生が増加した。PASおよびマッソン染色は、気道杯細胞の過形成およびコラーゲン沈着、および上皮下マトリックス糖タンパク質の増加を示した。これらは、気管支-肺炎症、肺線維症、肺炎および肺気腫、COPDまたは無気肺の悪化につながり得る。
一方、阻害されるR-テルブタリンの吸入は、そのS-エナンチオマーとは逆の効果を示した。R-テルブタリンは、喘息マウスの細気管支平滑筋細胞の増殖、線維芽細胞およびコラーゲン沈着、杯細胞の過形成、および粘液産生を有意に阻害した。ラセミテルブタリンの吸入の効果は、R-テルブタリンと比較すると、はるかに少ないか、またはなかった。
同様の効果または結果が、サルブタモール、バンブテロール、ビランテロール、クレンテロール、サルメテロール、ホルモテロール、トランチンテロールおよびインダカテロールおよび他のβ2アゴニストを含む、ラセミ、RまたはS-エナンチオマーβ2アゴニストにも見られた。
S-サルブタモールは、正常な細胞培養調製物において細気管支平滑筋および線維芽細胞の増殖を増加させ得ることが報告された。これは、細胞を直接計数するのではなく、培養皿中の総タンパク質を測定することにのみ基づいた(Basil O Ibe、et.al、Int Arch Allergy Immunol 2008;146:321-333による)。どのタイプの細胞が増殖するのか教示されず、測定されたタンパク質が個々の細胞の分泌活性の増加に起因するのか、または細胞数の増加に起因するのかも教示されていなかった。一方、本発明は、S-テルブタリンまたはS-サルブタモールの、インビボ、すなわちOVA感作/チャレンジによって正常ではなく炎症状態下にある動物モデルでの疾患への効果を開示し、薬物を肺内への吸入によって試験した。さらに、本発明は、S-テルブタリンまたはS-サルブタモールまたは他のβ2アゴニストの繰り返し前処置による、OVA感作/チャレンジ誘発炎症の変性を開示した。したがって、先行技術は、本発明の開示を明白にするべきではない。
血管の変化は、肺の炎症性リモデリングの重要な部分である。本発明は、S-エナンチオマーβ2アゴニストの吸入によって、OVA感作/ovaチャレンジマウスの血管の中間層がさらに増加することを開示した。OVA感作/ovaチャレンジマウスの肺では、血管平滑筋細胞および線維芽細胞のサイズおよび数の増大、過剰なコラーゲン沈着、ならびに血管間質マトリックスにおける炎症性浸潤があった。内皮細胞は増殖し、形が歪んでいる。血管壁の厚さが増した。S-テルブタリンの繰り返し吸入後、内皮細胞、平滑筋細胞および線維芽細胞の増殖がさらに増強され、血管の中間層にコラーゲンがさらに沈着し、これにより血管の壁厚がさらに増加した。さらに、肺胞の間質層における線維芽細胞の増殖およびコラーゲン沈着があり、肺胞の隔壁の厚さが増した。これらの変化は、酸素交換の減少、血管抵抗の増加につながり、肺高血圧症をもたらし得る。したがって、本発明は、OVA感作/ovaチャレンジに示される炎症性リモデリングプロセスがS-テルブタリンの繰り返し吸入後にさらに増強されたが、これらのプロセスはR-テルブタリンの吸入後に有意に減少したことを開示した。本発明の開示は、当業者によって予想され得ない。それは新規かつ進歩的であると見なされるべきである。
血管の変化は、肺の炎症性リモデリングの重要な部分である。本発明は、S-エナンチオマーβ2アゴニストの吸入によって、OVA感作/ovaチャレンジマウスの血管の中間層がさらに増加することを開示した。OVA感作/ovaチャレンジマウスの肺では、血管平滑筋細胞および線維芽細胞のサイズおよび数の増大、過剰なコラーゲン沈着、ならびに血管間質マトリックスにおける炎症性浸潤があった。内皮細胞は増殖し、形が歪んでいる。血管壁の厚さが増した。S-テルブタリンの繰り返し吸入後、内皮細胞、平滑筋細胞および線維芽細胞の増殖がさらに増強され、血管の中間層にコラーゲンがさらに沈着し、これにより血管の壁厚がさらに増加した。さらに、肺胞の間質層における線維芽細胞の増殖およびコラーゲン沈着があり、肺胞の隔壁の厚さが増した。これらの変化は、酸素交換の減少、血管抵抗の増加につながり、肺高血圧症をもたらし得る。したがって、本発明は、OVA感作/ovaチャレンジに示される炎症性リモデリングプロセスがS-テルブタリンの繰り返し吸入後にさらに増強されたが、これらのプロセスはR-テルブタリンの吸入後に有意に減少したことを開示した。本発明の開示は、当業者によって予想され得ない。それは新規かつ進歩的であると見なされるべきである。
本発明はまた、サルブタモール、バンブテロール、ビランテロール、クレンテロール、サルメテロール、ホルモテロール、トランチンテロールおよびインダカテロールおよび他のβ2アゴニストを含む、ラセミ、RまたはS-エナンチオマーβ2アゴニストの使用についての同様の効果または結果を開示した。
急性呼吸窮迫症状などの呼吸不全は、敗血症によって誘発され得る。それは、ウイルス、細菌、またはPAMP、例えばPLSに応答した、サイトカイン、ケモカインの急速かつ過剰な放出、および免疫機能不全を特徴とした。マクロファージ活性化が敗血症における決定的かつ重要な段階であることは、十分に認められている。本発明は、S-アルブテロール(サルブタモール)がマクロファージ極性化を促進し、PLSによる炎症チャレンジ中にサイトカインの放出および活性酸素種(ROS)の産生を増加させた一方で、R-サルブタモールがマクロファージの極性化を有意に阻害したことを開示した。(R)-サルブタモールは、TNF-α、IL-1β、IL-4、5、6、13およびMCP-1を含む、LPS誘導M1マクロファージにおけるサイトカインの放出および発現を阻害した。これらの阻害効果は、特異的β2アゴニスト遮断剤であるICI-118551によって遮断され得る。S-サルブタモールは、逆の効果を有した。マクロファージは、重度のアレルギー反応の開始、および敗血症によって誘発されるサイトカインストーム、呼吸窮迫または不全において重要な役割を果たす。M1マクロファージ極性化は、炎症性疾患を促進する。この研究では、β2受容体アゴニストである(R)-サルブタモールがマクロファージの細胞代謝を阻害し、再プログラムすることを発見した。(R)-サルブタモールは、フローサイトメトリー分析によって決定されるように、LPS誘発M1マクロファージの極性化を有意に阻害した。(R)-サルブタモールは、腫瘍壊死因子a(TNF-α)、インターロイキン-1β(IL-1β)、および単球走化性タンパク質-1(MCP-1)など、典型的なM1マクロファージサイトカインのタンパク質およびmRNAの両方の発現をダウンレギュレートし、(R)-サルブタモールがM1マクロファージで通常発現されるサイトカインを転写的に抑制できることを示唆している。
さらに、(R)-サルブタモールは、還元型グルタチオン(GSH)/酸化型グルタチオン(GSSG)の比率を増加させ、誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS)を阻害し、一酸化窒素(NO)および活性酸素種(ROS)の産生を大幅に減少させた。対照的に、(S)-サルブタモールはNOおよびROSの産生を増加させた。生体エネルギー学プロファイルは、(R)-サルブタモールが好気的解糖を有意に減少させ、ミトコンドリア呼吸を弱めることを示した。さらに、非標的メタボロミクス分析は、(R)-サルブタモールが代謝経路を調節することを実証した。フェニルアラニン代謝、ペントースリン酸経路、およびグリセロリン脂質代謝が、(R)-サルブタモールによって最も顕著に影響を受けた経路であった。(R)-サルブタモールのM1極性化への効果は、特異的β2受容体拮抗薬であるICI-118551によって遮断された。本発明は、(R)-サルブタモールが、好気的解糖およびグリセロリン脂質代謝をダウンレギュレートすることにより、LPS誘導マクロファージのM1表現型を阻害することを開示した。本発明によるこの開示は、新規かつ進歩的である。
マクロファージの活性化および増殖は、敗血症の開始および発症の重要な段階であると考えられた。一実施形態では、LPS(細菌由来のPAMP)は、腹膜液からのマクロファージの増殖および極性化を誘導した。これらのマクロファージの数は、(R)-サルブタモールで処理されると、正常レベルに向かって有意に減少した。極性化M1マクロファージまたはM2マクロファージも、敗血症状態と比較して有意に減少した。これらの阻害効果は、特異的β2受容体遮断剤の使用によって遮断され得る。一方、(S)-サルメテロールによる敗血症の治療で、M1およびM2マクロファージの両方が、敗血症の状態と比較してさらに増加した。
LPSは、TLRなどの病原体認識受容体と相互作用し、NF-κBおよびMARK経路も活性化し、それによりサイトカインの過剰産生をさらにもたらす。本発明は、(R)-テルブタリンが、敗血症においてLPSによって活性化されるNF-κBおよびMARK経路の両方を、それらの発現またはリン酸化を減少させることにより有意に阻害することを開示した。しかしながら、逆に、(S)-テルブタリンは敗血症においてNF-κBおよびMARK経路の両方をさらに増強した。敗血症における「サイトカインストーム」は、INF、IL-1B、IL-2、4、6、10、12、TNFaおよびMCPなどの過剰放出を伴う。本発明は、(R)-テルブタリンならびに(R)-サルブタモールが「サイトカインストーム」を効果的に予防または改善することができ、これらのサイトカインの産生または放出を有意に減少させたことを開示した。
敗血症では、ROSなどのケモカインも過剰に産生される。本発明は、(R)-テルブタリンおよび(R)-サルブタモールが、誘導型NO(iNO)、およびLPS敗血症によって誘導される別のROSの過剰産生を有意に防止および阻害できることを開示した。本発明は、サルブタモール、バンブテロール、ビランテロール、クレンテロール、サルメテロール、ホルモテロール、トランチンテロールおよびインダカテロールおよび他のβ2アゴニストを含む、他のRS-ラセミ、S-エナンチオマーまたはR-エナンチオマーβ2アゴニストの同様の効果を開示した。
敗血症は、比較的高い死亡率を有する。それは主に、PAMPに対する不均衡な宿主免疫応答、ならびに呼吸窮迫または多臓器不全を伴う肺の炎症につながる、サイトカインおよびケモカインの過剰産生に起因する。マクロファージの活性化は、敗血症の発症における最も重要な段階の1つである。本発明は、敗血症の死亡率が、(R)-テルブタリンおよび(R)-サルブタモールによって大幅に減少するか、またはさらに減少することを開示した。それはおそらく、マクロファージの活性化および増殖を阻害することによるものであった。マクロファージの活性化に対する(R)-テルブタリンおよび(R)-サルブタモールの治療効果、様々なサイトカインおよびケモカインの阻害、ならびに敗血症の緩和は、先行技術から予想することはできない。
本発明はまた、サルブタモール、バンブテロール、ビランテロール、クレンテロール、サルメテロール、ホルモテロール、トランチンテロールおよびインダカテロールを含む、他の短時間または長時間作用型(R)-エナンチオマーβ2アゴニストの同様の効果を開示した。
併用療法は、気管支-肺炎症症状の臨床管理において一般的に使用される。本発明は、ムスカリン受容体アゴニストを、そのラセミまたはS-エナンチオマーの代わりにR-エナンチオマーβ2アゴニストと組み合わせる有益な効果を開示した。ova感作/ovaチャレンジマウスでは、S-サルブタモールの吸入によって、上記のように、より重度の炎症および組織リモデリング反応が発生する。ムスカリン受容体拮抗薬であるイプラトロピウムをS-サルブタモールと組み合わせた場合、喘息マウスにおいて改善は観察できなかった。しかしながら、S-エナンチオマーの代わりにR-サルブタモールを使用した場合、上記の喘息状態は有意に改善された。特に、杯細胞の増殖および粘液の過剰産生が有意に減少し、細気管支の内層の上皮細胞が回復した。さらに、メタコリンによって誘発される気道抵抗は、生理食塩水(対照)で治療された喘息マウスと比較して、S-サルブタモールで治療された喘息マウスではるかに大きい。同様のことが、テルブタリン、バンブテロール、ビランテロール、クレンテロール、サルメテロール、ホルモテロール、トランチンテロールおよびインダカテロールおよび他のβ2アゴニストのラセミ、RまたはS-エナンチオマーにも見られた。したがって、本発明は、β2アゴニストとイプラトロピウムまたは他のムスカリン受容体拮抗薬との併用療法において、ラセミの代わりにR-エナンチオマーを使用すると、効果が有意に向上し、有害作用が大幅に低減することを開示した。
本発明は、ムスカリン受容体拮抗薬の代わりにブデソニドまたはフルチカゾンプロピオナートなどのコルチコステロイドが使用された場合にも、同様の有益な効果が見られることを開示した。
併用療法におけるR-エナンチオマー-β2アゴニストの、この有益な効果は、先行技術に開示されていない。それは、新規かつ進歩的であると考えられるべきである。
さらに、本発明は、ムスカリン拮抗薬(イプラトロピウム)、コルチコステロイド(ブデソニドまたはフルチカゾン)プロピオナート、およびR-エナンチオマーβ2アゴニスト(R-テルブタリンまたはR-サルブタモールまたはR-サルメテロール)を組み合わせて使用する、トリプル併用療法を開示した。トリプル併用では、R-エナンチオマーβ2アゴニストは、喘息発作、免疫炎症、および組織リモデリングに対して、そのラセミ体よりも優れていた。
本発明によるムスカリン受容体拮抗薬は、チオトロピウム、グリコピロニウム、アクリジニウムおよびウメクリジニウムを含む。
本発明によるコルチコステロイドには、シクレソニド、ベクロメタゾン、モメタゾン、デキサメタゾン、プレドニゾロン、フルニソリド、トリアムシノロンアセトニド、および本発明による他の薬学的に使用されるコルチコステロイドまたはそれらの生理学的に許容される塩および/またはそれらの溶媒和物が含まれる。
β2アゴニストは細気管支平滑筋の弛緩による抗気管支痙攣にのみ使用されることが、医療行為における一般的に理解である。それは、炎症性肺疾患または症状を治療するための免疫調節剤としては使用されていない。
BALFまたは培養細胞における、R-サルブタモールによるいくつかのサイトカインの阻害が報告されているが、従来技術では、β2アゴニストは気管支拡張薬としての使用以外に、抗気管支肺炎症薬として使用することは推奨されていない。
本発明は、R-エナンチオマーβ2アゴニストの、気管支-肺炎症および炎症性リモデリングを予防または治療するための抗免疫炎症薬としての新しい使用を開示した。本発明は、R-エナンチオマーβ2アゴニストを使用して、肺免疫炎症状態も治療できることを開示した。肺免疫炎症状態は、IBD(炎症性腸疾患)、HIV感染症、結核、特発性肺炎、間質性肺疾患(ILD)、特発性肺線維症(IPF)、外因性アレルギー性肺胞炎(EAA)、肺癌または敗血症性ショックおよび全身感染などの他の疾患に関連する。
さらに、本発明は、持続性および悪化した慢性細気管支炎、悪化した慢性閉塞性肺疾患、肺線維症および肺高血圧症を含む、ラセミβ2アゴニストの長期使用に関連する有害作用を低減するための、R-エナンチオマーβ2アゴニストの新しい使用を開示した。
本発明は、短時間作用型β2アゴニスト:ビトルテロール、フェノテロール、イソプレナリン、オルシプレナリンまたはメタプロテレノール、ピルブテロール、プロカテロール、リトドリン;および長時間作用型β2アゴニスト、:バンブテロール、アルフォルモテロール、ホルモテロール、Perforomist;および超長時間作用型β2アゴニスト:アベジテロール、カルモテロール、インダカテロール、オロダテロール、ビランテロール、イソクスプリン、マブテロールおよびジルパテロールのRまたはR’R’エナンチオマーを含む、他のR-エナンチオマーβ2アゴニストの同様の有益な効果を開示した。
本発明は、短時間作用型β2アゴニスト:ビトルテロール、フェノテロール、イソプレナリン、オルシプレナリンまたはメタプロテレノール、ピルブテロール、プロカテロール、リトドリン;および長時間作用型β2アゴニスト、:バンブテロール、アルフォルモテロール、ホルモテロール、Perforomist;および超長時間作用型β2アゴニスト:アベジテロール、カルモテロール、インダカテロール、オロダテロール、ビランテロール、イソクスプリン、マブテロールおよびジルパテロールのRまたはR’R’エナンチオマーを含む、他のR-エナンチオマーβ2アゴニストの同様の有益な効果を開示した。
本発明によるR-テルブタリンおよび上に列挙された他のR-エナンチオマーβ2アゴニストの医薬品は、経口使用のための固形剤形;ゲル、直腸または膣用の坐剤、点眼薬、注射用の液体または凍結乾燥粉末;局所使用のための軟膏またはパッチ、ならびに肺および鼻への吸入用のエアロゾルまたは乾燥粉末を含む。
本発明によるR-テルブタリンおよび上に列挙された他のR-エナンチオマーβ2アゴニストの薬学的に許容される塩には、従来の薬学的に許容される無機または有機酸、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、二水素リン酸塩、メタンスルホン酸塩、臭化物、硫酸メチル、酢酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、2-ナフタレンスルホン酸塩、グリコネート(glyconate)、グルコン酸塩、クエン酸塩、酒石酸、乳酸、ピルビン酸イセチオン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩またはパラトルエンスルホン酸塩で形成されるものが含まれる。
実施例
OVA感作/チャレンジ喘息モデルマウスを、オボアルブミン(OVA)または生理食塩水で感作し、チャレンジした。手短に言うと、10μgのOVA抗原を含む0.2mLの2%水酸化アルミニウム(ALUM)ゲルを0日目および14日目に腹腔内(i.p.)注射することによって、マウスを感作した。21、22、および23日目に、生理食塩水(0.01g/mL)中の1%OVAで、ネブライザー(PARI Turbo boy)によって20分間マウスをチャレンジした。26日目に、生理食塩水(0.05g/mL)中の5%OVAを用いて、20分間の霧状OVAチャレンジを実施した。対照群には、0日目および14日目に2%ALUMを含む0.2mLの生理食塩水を腹腔内投与した後、21、22、23、および26日目に20分間、OVAを含まない霧状生理食塩水を投与した。
方法:
メタコリンに対する気道反応性の測定
メタコリン(Mch)に対するインビボ気道反応性は、意識があり、自由に動き、自発呼吸しているマウスにおいて、全身プレチスモグラフィー(Buxco Electronics Inc.)によって28日目に評価した。マウスを、エアロゾル化した生理食塩水、または超音波ネブライザーによって投与される増加する濃度のMch(2、10、20mg/mL)で2分間チャレンジした。Mchチャレンジの前に、テルブタリンの短時間作用型気管支拡張効果のために、20μLの薬物エアロゾルまたは生理食塩水をマウスに与えた。
気管支収縮の程度は、エンハンスドポーズ(enhanced pause、Penh)、すなわち、気道抵抗、インピーダンス、および胸膜腔内圧の測定値と相関する、計算された無次元値として表した。Penh値を記録し、それぞれの霧化チャレンジ後4分間で平均した。
サンプル採取および全血分析
メタコリンチャレンジ後、マウスに麻酔をかけ、血液学的分析のために血液を採取した。採取した血液の一部をヘパリン化したエッペンドルフチューブに移し、穏やかに混合し、4°Cの845×g下で10分間遠心分離して、さらなる分析のために血漿検体を分離した。0.3mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を使用して、気管支肺胞洗浄(BAL)を右肺で4回行った。生理食塩水を肺に注入し、30秒間平衡化させた後に回収し、遠心分離後の上清をさらなるサイトカイン分析のために-80°Cで保存する一方、細胞ペレットを0.5ml PBSに懸濁し、ライト染色を使用して好酸球の計数を実施した。次に、すべての臓器(肝臓、右肺葉、脾臓、腎臓、心臓、脳)を外科的に切除し、氷冷PBSで完全に洗浄して血液を除去し、次いで濾紙で吸い取って乾燥させた。次に、これらの組織標本を正確に秤量し、LC-MS/MSで薬物分布を検出するために-80°Cで保存した。白血球(WBC)数およびWBC分画を、採血後4時間内にProCyte Dx Hematology Analyzer(IDEXX Laboratories)を使用して分析した。
OVA-sIgEの測定
酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)キットを製造業者の仕様書に従って使用して、血漿中のOVA-sIgEを測定した。
BAL液中のサイトカインレベルの分析
市販のELISAキットを製造業者の説明書(R&D Systems、Minneapolis,Minn)に従って使用して、マウスIL-4およびIL-5の濃度についてBAL液サンプルを分析した。IL-13を、マウスIL-13イムノアッセイキット(Abeam、Cambridge、英国)を製造業者のプロトコルに従って使用して、BAL液中でアッセイした。
肺組織病理学
組織病理学のために左肺組織を採取し、10%ホルマリン中に24時間固定した後、パラフィン包埋し、次いでヘマトキシリンおよびエオシン(H&E、Solarbio、Beijing、中国)で、もしくは過ヨウ素酸シッフ(PAS、Solarbio、Beijing、中国)で慣例的に染色するために4μmで切片化するか、またはマッソンの三色染色(Baso、Zhuhai、中国)に供した。染色された肺切片の画像をAxisplus画像取込システム(Zeiss、ドイツ)によって得た後、グループ分けに盲検化された病理学者が画像解析コンピュータシステム(IPP)を使用して、マウス一匹あたり最低3つの気管支(管腔直径、150-500μm)を様々なパラメータについて解析した。組織学的スコア、気道平滑筋厚、PASスコア(杯細胞過形成)、およびコラーゲン沈着を、半定量的スコアリング法によって評価した。
肺におけるNF-κBのmRNAのレベルは、定量的リアルタイムPCR分析によって分析した。全RNAを、RNaEXTM Total RNA Isolation Kit(Generay Biotech)を使用して肺組織から抽出した。RNAサンプルの質および量を、NanoDrop ND-2000c分光光度計(Thermo Fisher Scientific,Inc.、Wilmington,DE)によって評価した。全RNA(1μg)は、cDNA逆転写キット(Vazyme Biotech、Nanjing、中国)を製造業者の説明書に従って使用して、cDNAに逆転写した。リアルタイムPCR反応は、AceQ qPCR SYBR Green Master Mix(Vazyme Biotech、Nanjing、中国)を備えた7500リアルタイムPCRシステム(Applied Biosystems、Foster City、California、米国)を使用して実施した。マウス用に設定されたプライマーは、Sangon Biotech(Shanghai、中国)によって合成された。
ウエスタンブロット分析
肺組織からの全タンパク質を製造業者(Beyotime、中国)のガイドラインに従って抽出し、濃度をBCAアッセイ(Pierce)によって決定した。標準としてのp38 MAPK(CST#8690)、p-p38 MAPK(Thr180/Tyr182、CST#4511)、NF-κB p65(GeneTex#GTX 102090)、p-NF-κB p65(S536、CST#3033)、およびGAPDH(Affinity#AF7021)に対する一次抗体を購入し、使用した。
結果:OVA誘発気道過敏性に対するR-、S-およびrac(RS)-テルブタリンの効果
OVA誘発マウスモデルを確立し、エアロゾル化されたMchに応答する気道反応性を、非侵襲的インビボプレチスモグラフィーによって評価した。下の図に示すように、対照群と比較して、OVA群のベースライン値は、生理食塩水に曝露すると有意に増大し(OVA群の0.80±0.12に対して対照群の0.55±0.08)、Rテルブタリンおよび2倍モル量のrac-テルブタリン治療は、ベースラインPenh値を有意に低下させることができた。
しかしながら、S-テルブタリン治療後のベースライン気道反応性は、対照群と比較して有意に増加した(0.70±0.13)。さらに、S-テルブタリン治療群は、Mchの投与量の増加に応答して気道活動亢進のさらなる悪化を示した。R-テルブタリンの治療は、Mchに対する気道気管支収縮を有意に減弱し、効果的な気管支痙攣保護を示した。一方、RS-テルブタリン(rac-ter)(R-terの2倍の投与量)投与は、R-ter/OVA群と比較して、はるかに小さいMchに対する効果を示した。
全血分析およびBAL液中の好酸球数
血液中の総WBCおよびWBC分画(好中球、リンパ球、単球、好酸球および好塩基球)、ならびにBAL液中の好酸球数を検出した。血液中の総WBCは、有意差なく類似していた。血液中のWBC分画のパーセンテージは、好酸球数のパーセンテージ以外は、すべての群内で有意差がないことが分かった。血液中およびBALF中の好酸球数のパーセントは、対照群と比較して、OVA、S-テルブタリンおよびRS(rac)-テルブタリン治療群で有意に高かった。好酸球数は、S-テルブタリン群で最も高かった。R-テルブタリンによる治療は、BALFへの好酸球の流入を有意に阻害した。
肺組織の組織病理学的評価
マウスの肺におけるアレルギー性炎症性変化をさらに調査するために、次いでH&E染色を行った。図2Aに示すように、対照群では炎症、粘膜浮腫、上皮病変は観察されなかったが、OVA誘発喘息マウスは、間質浸潤ならびに多数のリンパ球および好酸球浸潤を含む重度の炎症、粘膜浮腫、上皮病変を発症した(図2Bモデル)。R-テルブタリンおよび2倍投与量のrac-テルブタリン治療により、炎症性細胞浸潤の程度がそれぞれ改善したことが、組織学的スコアによって確認された。一方、OVA治療マウスは、細気管支および血管の両方で平滑筋肥大を示し、気管支および血管の平滑筋層の厚さが増加し、これらはR-terによって抑制され、S-terによってさらに増強された(図2C)。同様に、PASおよびマッソン染色は、OVA群において上皮下マトリックス糖タンパク質の沈着、気道杯細胞の過形成およびコラーゲン沈着があり、これらの状態がS-ter治療後にさらに悪化したことを示した。一方、OVA群で見られた炎症状態、コラーゲン沈着、杯の過形成、ならびに平滑筋および線維芽細胞の増殖および肥大は、R-terの治療後に後退し、正常に向かって回復した。
OVA-sIgE(血清IgE)およびTh2サイトカインの測定
BAL液中の血漿OVA-sIgEおよび代表的なTh2サイトカイン(IL-4、IL-5、IL-13)を評価した。OVAで治療されたマウスは、OVA-sIgEレベルの有意な増加を示したが、R-terの投与によって著しく阻害された。同様に、Th2サイトカイン(IL-4、5、および13)は、OVA治療群で増強されることが分かり、R-ter治療は、BALF中のIL-5を有意に減少させた。しかしながら、S-ter治療は、OVA群と比較して、IL-4およびIL-13の放出をさらに増加させた(図3)。これは、S-テルブタリンがILCを活性化し、Th2型炎症を誘発し得ることを実証している。
(図3)
(図3)
R-テルブタリンは、肺におけるp38 MAPKリン酸化およびNF-κB発現を阻害した。OVAでチャレンジした後、炎症性NF-κBの発現は、対照群と比較してmRNA転写物において増加した(図4B)。これは、S-ter治療群においてさらに増強された。一方、R-ter治療は、NF-κB発現の増加を効果的に阻害した。NF-κBのp65サブユニットのリン酸化において、同様の結果が見られた(図4D)。MAPK、特にp38およびERK1/2は、気道炎症および炎症性メディエーターの調節、例えばNF-κBの活性化に関与している。したがって、本発明は、R-terによる炎症反応の阻害が、OVA誘発喘息マウスのMAPK経路を介してもたらされることを開示した。図4Cに示すように、OVA治療マウスは、著しくアップレギュレートされたp38 MAPKリン酸化を示し、S-ter治療は、OVA群と比較してp38 MAPK活性化をさらに増加させた。R-ter治療は、OVA群と比較してp38 MAPKの活性化を著しく抑制した。
肺組織のPAS染色に対するR-およびS-テルブタリンの効果
イプラトロピウムとRS-、R-およびS-サルブタモールとの併用療法の効果。上記と同様の方法を使用した。生理食塩水、メタコリン2mg/ml(低投与量)または10mg/ml(高投与量)の霧化エアロゾルを、吸入によってOVA誘発喘息マウスに投与した。
結果
1)肺機能:イプラトロピウム(Ipr)は、サルブタモール(Sa)と組み合わせたムスカリン受容体遮断薬であり、β2アゴニストは、抗喘息および抗炎症について改善された効果を示した。メタコリンに反応した気道抵抗の増加は、R-サルブタモールによって有意に減少し、イプラトロピウムと組み合わせると、効果がさらに改善された。併用療法としてのR-サルブタモールの効果は、RS-サルブタモールよりもはるかに効果的である。しかしながら、S-サルブタモール単体は、メタコリンに対する気道反応をさらに増強し得る。S-サルブタモールの有害作用は、わずかな割合のイプラトロピウムと組み合わせるだけで軽減され得る。
1)肺機能:イプラトロピウム(Ipr)は、サルブタモール(Sa)と組み合わせたムスカリン受容体遮断薬であり、β2アゴニストは、抗喘息および抗炎症について改善された効果を示した。メタコリンに反応した気道抵抗の増加は、R-サルブタモールによって有意に減少し、イプラトロピウムと組み合わせると、効果がさらに改善された。併用療法としてのR-サルブタモールの効果は、RS-サルブタモールよりもはるかに効果的である。しかしながら、S-サルブタモール単体は、メタコリンに対する気道反応をさらに増強し得る。S-サルブタモールの有害作用は、わずかな割合のイプラトロピウムと組み合わせるだけで軽減され得る。
5.1.(R)-サルブタモールは、LPS誘発M1マクロファージ極性化を有意に阻害し、(R)-サルブタモールは、典型的なM1マクロファージサイトカインの発現をダウンレギュレートした
方法
方法
マクロファージを、LPS刺激の前に(R)/(S)-サルブタモールを用いずに、または用いて1時間処理し、その後12時間インキュベートした。(R)-サルブタモール(>99%純度、99.85%ee)および(S)-サイブタモール(>99%純度、92.73%ee)。細胞内ROSレベルを、ROSインジケーター、DCFH-DA(Life Technologies-Thermo Fisher Scientific、MA、米国)を使用して調べた。酸化生成物(2’,7’-ジクロロフルオレセイン、DCF)の蛍光を、LSM 710レーザー走査型共焦点顕微鏡(Carl Zeiss、Jena、ドイツ)を使用して評価した。培養物上清中のNO濃度を、Griessアッセイ(Beyotime、Shanghai、中国)を製造業者の説明書に従って使用して、亜硝酸塩(安定したNO分解産物)の濃度をアッセイすることによって測定した。細胞内NOレベルを、NO感受性蛍光プローブDAF-FM DA(Sigma、St.Louis、MO、米国)を使用して検出した(24)。細胞をDAF-FM DA(10μM)で37℃で30分間標識し、PBSで3回穏やかに洗浄した。LSM710レーザー走査型共焦点顕微鏡(スケールバー、100μm)(Carl Zeiss、Jena、ドイツ)を使用して、蛍光を検出した。
Seahorse分析:(R)-サルブタモールを用いた、または用いない、LPSで誘導されたRAW264.7細胞の酸素消費速度(OCR)および細胞外酸性化速度(ECAR)を、Seahorse XF96細胞外フラックスアナライザー(Agilent、Santa Clara、CA、米国)を使用してリアルタイムで測定した。
結果
(R)-サルブタモールは、LPS誘導RAW264.7細胞におけるM1マクロファージの極性化を阻害した
(R)-サルブタモールは、LPS誘導RAW264.7細胞におけるM1マクロファージの極性化を阻害した
RAW2647細胞に対する(R)-サルブタモールの細胞毒性効果を決定するために、CCK-8アッセイを使用して細胞生存率を調べた。本発明者らのデータは、LPS(100ng/mL)の有無にかかわらず、(R)-サルブタモールの濃度が100μMに達した場合でも、細胞生存率の変化は示さなかった。様々な濃度(0.25μM、0.5μM、1μM、2μM、5μM、10μM、および100μM)の(R)-サルブタモールで前処置した後に生成されたNOおよびROSを、LPS誘導RAW264.7細胞において調べた。この研究では、10μMの(R)-サルブタモールの濃度を選択した。
マクロファージ極性化に対するβ2アドレナリン受容体活性化の効果を調査するために、マクロファージを(R)-サルブタモールで前処置し、続いて100ng/mLのLPSで誘導した。マクロファージM1(F4/80+/CD11c+/CD206-)およびM2(F4/80+/CD11c-/CD206+)極性化を、フローサイトメトリーを使用して分析した。フローサイトメトリー分析は、マクロファージの基礎レベルが24.7%であり、LPSで刺激すると、マクロファージの59.2%がM1表現型に極性化することを示し、LPSがM1極性化を誘発し得ることを示唆している。マクロファージをLPSで刺激する前に(R)-サルブタモールで前処置した場合、M1マクロファージの有病率は31.8%に減少し、(R)-サルブタモールがLPSに誘発されるM1マクロファージの極性化を緩和したことを示唆している。
細胞の総数に対するM1細胞の比率は、異なる治療群間で類似していた(図7)。M2マクロファージ極性化に対する(R)-サルブタモールの効果を決定するために、フローサイトメトリーを使用した。データは、LPSによる刺激および(R)-サルブタモールによる前処置で、M2マクロファージの基礎レベルが0.244%から0.239%および0.214%にそれぞれ減少することを示した。これらの結果は、(R)-サルブタモールがM2極性化に影響を及ぼさないことを示唆している。さらに、(R)-サルブタモールがβ2アドレナリン受容体を介してM1マクロファージ極性化に対してその効果をもたらすかどうかを調査するために、特異的β2アドレナリン受容体拮抗薬であるICI-118551をこの研究で使用した。本発明は、細胞をICI-118551とのインキュベーション後に(R)-サルブタモールで前処置した場合、M1マクロファージのパーセンテージが55.8%に増加したことを開示した(図7)。これは、β2アドレナリン受容体を介して、(R)-サルブタモールがM1マクロファージ極性化に対してその阻害効果を発揮したことを示唆した。
(R)-サルブタモールは、LPS誘導マクロファージRAW264.7細胞におけるTNF-α、IL-1βおよびMCP-1の産生を減少させる。
LPSによる刺激後、M1極性化がM2極性化よりも優勢であることを確認するために、ELISAを使用して典型的なM1マクロファージサイトカイン(すなわち、TNF-α、IL-1β、およびMCP-1)のレベルを定量化した。これらのサイトカインは、主にマクロファージによって合成され、炎症性疾患において重要な役割を果たす(35,36)。本発明は、TNF-αがLPS刺激後に対照レベルの2.62倍から0.75倍に減少したことを開示した(図8A)。IL-1βは、ヒトにおいて多くの慢性炎症性疾患の特徴であり、報告によると、急性期反応に関連している(35,37)。ELISAを使用してIL-1βを定量し、本発明者らのデータは、LPS刺激後にIL-1βが対照レベルの2.24倍から1.12倍に減少したことを示した(図8B)。さらに、以前の研究では、MCP-1の阻害によって毛細血管-肺胞関門が損傷し、マクロファージの動員が減少することが示された(38-40)。この研究では、MCP-1の濃度がLPS誘導後に、1.588ng/niLから1.15ng/mLに減少した(図8C)。LPSでの刺激の前に細胞を(R)-サルブタモールで前処置すると、TNF-α、IL-1β、およびMCP-1のレベルが有意に低下した(図8A-図8C)。本発明者らは、LPSはM1極性化を引き起こしやすいが、M2極性化を引き起こしづらいと結論付ける。
TNF-α、IL-1βおよびMCP-1のmRNA発現を調べるために、定量的リアルタイムPCRを実施した。サイトカイン発現研究と一致して、TNF-αのmRNA発現は、LPS誘導群において対照群と比較して2.26倍増加した(図8D)。IL-1βおよびMCP-1のmRNA発現は、LPS誘導群において対照群と比較して、それぞれ12.74倍(図8E)および3.1倍増加した(図8F)。LPS刺激の前に細胞を(R)-サイブタモールで前処置すると、TNF-α、IL-1β、およびMCP-1のmRNAレベルが有意に低下した。TNF-α、IL-1βおよびMCP-1のmRNA発現は、ICI-118551治療細胞において対照群と比較して、それぞれ2.28倍、12.41倍、および3.36倍増加した。LPS誘導RAW264.7細胞と比較して、TNF-α、IL-1βおよびMCP-1のmRNA発現は、ICI-118551治療細胞において明白な変化を示さず(図8D-図8F)、(R)-サルブタモールがβ2アドレナリン受容体に作用し、これらのサイトカインの発現を減らすことを示唆している。これらの開示は、(R)-サイブタモールがβ2アドレナリン受容体を介して、転写レベルでTNF-α、IL-1βおよびMCP-1の発現を阻害し、それが次に、LPS誘発マクロファージにおけるTNF-α、IL-1βおよびMCP-1のタンパク質発現を減少させることを示唆した。
5.2.マクロファージRAW264.7細胞におけるNOおよびROSの産生に対する(R)-サルブタモールおよび(S)-サルブタモールの効果
(R)-サルブタモールは、誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS)を阻害し、一酸化窒素(NO)および活性酸素種(ROS)の産生を大幅に減少させた。対照的に、(S)-サルブタモールはNOおよびROSの産生を増加させた。
(R)-サルブタモールは、LPS誘発RAW264.7細胞におけるNOおよびROSの産生を減少させた。LPSは、NO産生の増加に通常関連する慢性炎症を引き起こした。M1マクロファージの極性化に対する(R)-サルブタモールの抗炎症効果を決定するために、細胞内NOレベルをNO感受性蛍光プローブ、DAF-FM DAを使用して決定した。代表的な画像は、DAFで染色された細胞の数が、対照細胞と比較してLPS誘導細胞で増加したのに対し、(R)-サルブタモールで前処置された細胞では、対照細胞と比較して染色された細胞の数が減少したことを示した(図9A)。DAF蛍光レベルは、LPS誘導群において対照群と比較して424%増加したが、細胞を(R)-サルブタモールで前処置した場合、DAF蛍光レベルは2.68倍減少した(図9B)。ICI-118551による治療でNOレベルが増加し、(R)-サルブタモールがβ2アドレナリン受容体機構を介してNO産生を阻害したことを示唆した。さらに、培養物上清中のNO濃度を、Griessアッセイを使用して亜硝酸塩(安定したNO分解産物)の濃度をアッセイすることによって測定した。対照条件と比較して、NO2の発現は、LPS刺激によって20.25倍増加し、NO2発現は、(R)-サルブタモール前処置によって2.28倍減少した(図9C)。M1マクロファージは、iNOSを活性化してL-アルギニンからNOを産生することが示されている。iNOSのレベルへの(R)-サルブタモールの役割を調査するために、iNOSのmRNAおよびタンパク質レベルを決定した。本発明は、マクロファージにおいて、LPS治療によってiNOSのmRNAレベルが増加したが、LPSに加えて(R)-サルブタモールで前処置した場合、それが減少したことを開示した(図9D)。mRNAと一致して、iNOSタンパク質レベルは、LPSでの治療およびLPS+(R)-サルブタモールでの治療後に同じ変化を示した(図9E)。(R)-サルブタモールの効果は、ICI-118551を追加することによって遮断された。
LPSは、ミトコンドリア機能不全を介して細胞アポトーシスを促進することができ、ミトコンドリアは、ROSの主な発生源である。この研究では、ROSをDCFH-DA色素で可視化した。染色された細胞の数は、(R)-サルブタモール前処置しない群と比較して、(R)-サルブタモール前処置群で減少した(図9A)。DCFのレベルは、LPS誘導RAW264.7細胞で7.30倍増加し、(R)-サルブタモールで前処置した細胞で3.38倍減少した(図9B)。本発明は、LPS誘導細胞におけるNOおよびROSのレベルを、(S)-サルブタモールでの前処置によって増加させ、(R)-サルブタモールでの前処置によって減少させるという対立する効果を開示した。さらに、本発明は、M1極性化がβ2アドレナリン受容体の活性化を必要とするのは、その効果が特異的β2遮断剤であるICI-118551によって減少したためである、という発見を開示した。
本発明は、(S)-エナンチオマーサルフタモールが、炎症反応におけるマクロファージの活性化に関して、その(R)-エナンチオマーとは異なる機構を有することを開示した。
5.3.(R)-サルブタモールは、LPS誘発マクロファージRAW264.7細胞におけるGSH/GSSGの比率を増加させる
5.3.(R)-サルブタモールは、LPS誘発マクロファージRAW264.7細胞におけるGSH/GSSGの比率を増加させる
GSSGに対するGSHの比率は、酸化ストレスのマーカーである。この比率は、LPS治療細胞では対照レベルから70,60%に減少し、(R)-サルブタモールで前処理した場合84,50%増加し、これはβ2アドレナリン受容体遮断薬であるICI-118551によって遮断された。
5.4.(R)-サルブタモールは、LPS誘導RAW264.7細胞においてミトコンドリア呼吸を救援し、好気的解糖を阻害する
5.4.(R)-サルブタモールは、LPS誘導RAW264.7細胞においてミトコンドリア呼吸を救援し、好気的解糖を阻害する
マクロファージの活性化は、様々な代謝プロファイルを誘発した。LPS誘発マクロファージは、解糖代謝プロファイルを利用した。本発明は、LPS治療マクロファージにおけるβ2アドレナリン受容体媒介ワールブルク代謝(好気的解糖)を開示した。OCRおよびECARを細胞外フラックスアナライザーを使用して測定し、LPSはOCR、すなわち酸素消費速度の測定値を59.29%減少させ、(R)-サルブタモールは、LPS治療細胞におけるOCRを69.59%増加させた。ECARは、細胞外酸性化速度の測定値であり、細胞の解糖速度の指標である。LPS治療は、ECAR、好気的解糖を対照条件と比較して有意にアップレギュレートしたが、(R)-サルブタモールは、好気的解糖を阻害した。本発明は、(R)-サルブタモールがLPS誘導細胞における代謝シフトを媒介する可能性があり、それがLPS誘導炎症から保護することを開示した。これはまた、ICI-118551治療によって遮断された。OCR/ECARの比率は、LPS治療細胞において減少したが、LPS治療細胞におけるOCR/ECARの比率は、(R)-サルブタモールで前処置した場合に増加した。
(図7)
(図8)
(図9)
(図7)
(図8)
(図9)
敗血症によって誘発される呼吸不全および死亡に対するR-アルブテロールおよびR-テルブタリンの予防効果
方法:生存率試験:BALB/cマウスを、生理食塩水対照(0.1mL/10g)、(R)-サルブタモール(0.1、0.25または0.5mg/kgの投与量)、(S)-サルブタモール(0.5mg/kg)、およびDex(デキサメタゾン)(5mg/kg)を含む、異なる治療群にランダムに割り当てた(n=11)。治療は3日間連続して腹腔内に投与した。3日目の治療の1時間後、LPS(15mg/kg)を腹腔内投与した。動物を監視した。その後、生存率を12時間毎に144時間記録した。
肺機能の測定
肺機能は、Buxcoシステム(Buxco Electronics、米国)を使用して測定した。チャンバーに短時間順応させた後、マウスに生理食塩水の最初のベースラインチャレンジを与えた。LPSの投与の6時間後に、1回換気量、および気道抵抗の指標であるPenhを含む測定を行った。
肺機能は、Buxcoシステム(Buxco Electronics、米国)を使用して測定した。チャンバーに短時間順応させた後、マウスに生理食塩水の最初のベースラインチャレンジを与えた。LPSの投与の6時間後に、1回換気量、および気道抵抗の指標であるPenhを含む測定を行った。
結果:LPS投与によって48時間以内にほとんどの動物が死亡し、死亡率は90.9%であった。しかながら、高投与量のR-サルブタモールで前処置されたすべての動物は、PLSチャレンジから生き残った。デキサメタゾン(5mg)で前処置された動物は、PLSチャレンジ後の死亡率が最も高かった。前処置なしのLPSチャレンジ群との比較において、S-サルブタモールで前処置された動物は、48時間での死亡率は同じであったが、LPSチャレンジ後36時間での死亡率は、より高かった(表6.1)。
Claims (31)
- 急性または慢性の気管支-肺炎症症状または炎症性リモデリングの予防または治療のための医薬品の製造において、有害作用を軽減するために、光学的に十分純粋なR-エナンチオマーβ2アゴニストおよびその薬学的に許容される塩を免疫調節剤として使用する
方法。 - 前記R-エナンチオマーβ2アゴニストが、50%~85%のエナンチオマー過剰率値を有する、
請求項1に記載の方法。 - 前記R-エナンチオマーβ2アゴニストが、85%~98%のエナンチオマー過剰率値を有する、
請求項1に記載の方法。 - 前記R-エナンチオマーβ2アゴニストが、98%~99.9%のエナンチオマー過剰率値を有する、
請求項1に記載の方法。 - 前記R-エナンチオマーβ2アゴニストが、テルブタリン、サルブタモール、バンブテロール、ビランテロール、クレンテロール、サルメテロール、ホルモテロール、トランチンテロールおよびインダカテロールである、
請求項1に記載の方法。 - 前記R-エナンチオマーβ2アゴニストが、短時間作用型β2アゴニスト:ビトルテロール、フェノテロール、イソプレナリン、オルシプレナリン、またはメタプロテレノール、ピルブテロール、プロカテロール、リトドリン;および長時間作用型β2アゴニスト、:バンブテロール、アルフォルモテロール、ホルモテロール、Perforomist;および超長時間作用型β2アゴニスト:アベジテロール、カルモテロール、インダカテロール、オロダテロール、ビランテロール、イソクスプリン、マブテロールおよびジルパテロールのRまたはR’R’エナンチオマーである、
請求項1に記載の方法。 - 前記炎症症状が、肺炎または気管支炎、細菌、ウイルスまたは他の病原体関連分子パターン(PAMP)に応答した急性呼吸窮迫症候群である、
請求項1に記載の方法。 - 前記慢性炎症症状が、気腫、または肺炎悪化を伴う持続性慢性気管支炎である、
請求項1に記載の方法。 - 前記炎症症状が、M1型マクロファージの活性化もしくは増殖、または肺もしくは血液中の好気的解糖の増強を特徴とする、
請求項1に記載の方法。 - 前記炎症症状が、肺および血液中の好酸球の増加を特徴とする、
請求項1に記載の方法。 - 前記炎症症状が、肺または血液中の単球走化性タンパク質-1(MCP-1)の増加を特徴とする、
請求項1に記載の方法。 - 前記炎症症状が、肺または血液中のTNF-α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6およびIL-13を含むサイトカインの増加を特徴とする、
請求項1に記載の方法。 - 前記炎症症状が、全p38MAPKに対するリン酸化p38MAPKの比率、および全p65NF-κBに対するリン酸化p65NF-κBの比率の増加を特徴とする、
請求項1に記載の方法。 - 前記炎症症状が、血清IgGの増加を特徴とする、
請求項1に記載の方法。 - 前記炎症症状が、肺および血液におけるROSおよびON産生の増加、または誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS)の発現の増加を特徴とする、
請求項1に記載の方法。 - 前記炎症性リモデリングが、気腫、粘液過剰分泌、炎症性喀痰産生および気道線維症である、
請求項1に記載の方法。 - 前記炎症性リモデリングが、上皮下線維症、筋線維芽細胞過形成、気道および血管平滑筋肥大、細気管支壁および血管の厚さの増加、粘液腺および杯細胞過形成、ならびに上皮破壊、ならびにコラーゲンの過剰な間質沈着、ならびに肺胞隔壁またはガス/血液関門の増加を特徴とする、
請求項1に記載の方法。 - 前記炎症性リモデリングが、肺細動脈抵抗の増加、肺細動脈または血管のリモデリング、および肺高血圧症を特徴とする、
請求項1に記載の方法。 - 前記有害作用が、S-エナンチオマーまたは(RS)-ラセミβ2アゴニストの頻繁な使用に関連する有害作用である、
請求項1に記載の方法。 - 前記有害作用が、(S)-エナンチオマーまたは(RS)-ラセミβ2アゴニストの頻繁な使用に起因する、アレルギー誘発性薬剤に対する気道過敏性を特徴とする、
請求項1に記載の方法。 - 前記(S)-エナンチオマー関連の有害作用が、細気管支平滑筋の増殖およびリモデリング、ならびに喘息-COPD状態の悪化をさらに増強することを特徴とする、
請求項18に記載の方法。 - 前記(S)エナンチオマー関連の有害作用が、線維芽細胞の増殖および間質コラーゲン沈着の増強、ならびに肺胞隔壁およびガス/血液関門の増加、喘息-COPDにおける血中酸素の減少、または(RS)-ラセミβ2アゴニストの頻繁な使用の結果としての肺機能の悪化による呼吸不全状態を特徴とする、
請求項19に記載の方法。 - 前記有害作用が、子宮収縮抑制療法または早期分娩のためのラセミテルブタリンまたはラセミサルブタモールの使用に関連する、
請求項1に記載の方法。 - 前記医薬品が、固体剤形、ゲル、坐剤、注射用の液体または凍結乾燥粉末、局所使用用の軟膏またはパッチ、および肺吸入または経鼻用のエアロゾルまたは乾燥粉末である、
請求項1に記載の方法。 - 前記治療が、肺または鼻を介した吸入による前記薬剤の投与を特徴とする、
請求項1に記載の方法。 - 前記治療が、前記薬剤の経口による、静脈内または皮下への注射による、および直腸または膣での坐剤としての投与を特徴とする、
請求項1に記載の方法。 - 前記治療が、イプラトロピウムまたは他のムスカリン受容体遮断薬と組み合わせた前記薬剤の投与を特徴とする、
請求項1に記載の方法。 - 前記治療が、イプラトロピウムまたは他のムスカリン受容体遮断薬およびコルチコステロイドと組み合わせた前記薬剤の投与を特徴とする、
請求項1に記載の方法。 - 前記ムスカリン受容体遮断薬が、チオトロピウム、グリコピロニウム、アクリジニウムおよびウメクリジニウムである、
請求項27に記載の方法。 - 前記コルチコステロイドが、ブデソニド、フルチカゾン、シクレソニド、ベクロメタゾン、モメタゾン、フルニソリド、プレドニゾロンおよびトリアムシノロンアセトニドである、
請求項28に記載の方法。 - 前記薬学的に許容される塩が、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、二水素リン酸塩、メタンスルホン酸塩、臭化物、硫酸メチル、酢酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、2-ナフタレンスルホン酸塩、グリコネート(glyconate)、グルコン酸塩、クエン酸塩、酒石酸、乳酸、ピルビン酸イセチオン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩またはパラトルエンスルホン酸塩である、
請求項1に記載の方法。
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