JP2022527247A - 標的分子を修飾するための組成物及び方法 - Google Patents

標的分子を修飾するための組成物及び方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、標的分子を化学選択的に修飾する方法を提供する。本主題の方法は、チオール部分を含む標的分子を、反応性部分を含む生体分子と接触させる工程を含み、当該反応性部分は、フェノール部分またはカテコールを含む生体分子と、フェノールまたはカテコール部分を酸化することができる酵素との反応によって生成される。当該接触は、当該標的分子を当該生体分子と複合体化させるのに十分な条件下で実施され、それにより、修飾された標的分子が生成される。本開示は、チオール部分を含む本主題の標的分子と、フェノール部分またはカテコール部分を含む生体分子とを含む組成物を提供する。本開示は、本主題の方法を実施するためのキットを提供する。本開示はまた、修飾された標的分子及びその使用方法を提供する。

Description

相互参照
本出願は、２０１９年３月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／８２２，６１６号及び２０１９年１０月４日に出願された米国仮特許出願第６２／９１０，８３６号の利益を主張し、これらの出願は、その全体が参照により本明細書に援用される。
テキストファイルとして提供される配列表の参照による援用
２０２０年３月１７日に作成されたサイズ８，０５６ＫＢのテキストファイル「ＢＥＲＫ－４０５ＷＯ＿ＳＥＱ＿ＬＩＳＴＩＮＧ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」として、配列表を提供する。テキストファイルの内容は、その全体が参照により本明細書に援用される。
連邦政府支援の研究に関する声明文
本発明は、国立科学財団によって授与された助成金番号１０５９０８３及び１８０８１８９の下で政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
序文
生体分子と標的分子の機能を維持しつつ、生体分子と標的分子を結合させて複合体を生成することは、長い間、化学生物学及びバイオ医薬品研究の目標であった。複合体の例として、ワクチン開発用のタンパク質－ペプチド複合体、抗体医薬品、及び免疫療法用の抗体－タンパク質複合体が挙げられる。
適度なサイズの分子をタンパク質に結合させるために多くの技術が開発されてきたが、タンパク質または生体分子を部位特異的にタンパク質の表面の任意の位置に結合させることができるシンプルな生体分子修飾手順を開発することは困難であった。
シンプルでありながら部位特異的な様式で標的分子を修飾することができる、改良された標的分子修飾手順が必要とされている。
概要
本開示は、標的分子を化学選択的に修飾する方法を提供する。本主題の方法は、チオール部分を含む標的分子を、反応性部分を含む生体分子と接触させることを含み、反応性部分は、フェノール部分またはカテコールを含む生体分子と、フェノールまたはカテコール部分を酸化することができる酵素との反応によって生成される。接触は、標的分子を生体分子と複合体化させるのに十分な条件下で実施され、それにより、修飾された標的分子が生成される。本開示は、チオール部分を含む本主題の標的分子、及びフェノール部分またはカテコール部分を含む生体分子を含む組成物を提供する。本開示は、本主題の方法を実施するためのキットを提供する。本開示はまた、修飾された標的分子及びその使用方法を提供する。
本発明は、以下の詳細な説明を添付の図とあわせて読むことにより、最もよく理解される。一般的な慣例に従い、図の様々な特徴が縮尺通りではないことを強調する。反対に、様々な特徴の寸法を、明確化のために場合により拡大または縮小させる。図面には、以下の図が含まれる。以下に記載する図は、例示を目的としたものに過ぎないことを理解されたい。図は、本教示の範囲をいかようにも限定することを意図するものではない。
図１Ａは、キノン中間体を提供するためのチロシナーゼ酵素によるフェノール及びカテコール部分の活性化、ならびにその後のキノン中間体と潜在的な求核試薬との反応を示す。 図１Ｂは、溶媒に曝露されたチオールを有する標的タンパク質（Ａ）と、チロシン／フェノールを有するカップリングパートナー（Ｂ）から、共有結合した複合体生成物（Ｃ）を生じさせる、例示的な本主題の化学選択的修飾反応を示す。 図２、パネルＡは、α－エンドルフィンペプチドで修飾されたＭＳ２ Ｎ８７Ｃを示すＥＳＩ－ＴＯＦデータ、及びマレイミド遮断実験を示しており、タンパク質のマレイミドを介してチオールをキャッピングすると、チロシナーゼ触媒反応を介した付加が遮断され、チロシナーゼ処理を最初に実行する場合もまた、これによりマレイミドの反応が遮断されることを示している。この図は、表面のシステインが、修飾されている残基であることを示している。 図２、パネルＢは、様々な条件下でのタンパク質－ペプチド複合体の安定性試験結果を示す。すべての試料は、５０ｍＭリン酸緩衝液中に記載の条件で保存した。 図３は、本主題の方法において適合性のあるフェノール部分を含む生体分子の例示的な例を示す。 図３－１の続きを示す。 図４は、ＭＳ２ウイルスキャプシドのシステイン含有変異体への様々なペプチドのカップリングを示すＥＳＩ－ＴＯＦデータを示す。ペプチドは、アシル化されたＮ末端を有する以下の配列からなっていた：２ＮＬＳ：Ａｃ－ＹＧＰＫＫＫＲＫＶＧＧＳＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号９４３）；ＩＬ１３：Ａｃ－ＧＹＡＣＧＥＭＧＷＶＲＣＧＧＳＫ（配列番号９４４）；Ｒ８：Ａｃ－ＹＧＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号９４５）；及びＨＩＶ－Ｔａｔ：Ａｃ－ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号９４６）。 図５、パネルＡは、Ｃａｓ９（Ｃ８０，Ｃ５７４）がエンドルフィンによって２回修飾されていることを示すＥＳＩ－ＴＯＦデータを示す。図５、パネルＢは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＤＮＡ切断アッセイを示しており、これは、ペプチド（Ｅｎｄ）で修飾されたＣａｓ９（ＲＮＰ）が、ガイドＲＮＡ（ａｐｏ）に付加する前に修飾された場合でも切断活性を保持することを示している。各処理について、ＲＮＰを濃度勾配全体に加えて、標的ＤＮＡ鎖に対する活性を測定した。 図５、パネルＣは、成功したＣａｓ９－ＧＦＰ複合体を示すＥＳＩ－ＴＯＦデータを示す。配列を、以下のように記載する：ＧＹＧＧＳ（配列番号１０２１）、ＭＹＧＧＳ（配列番号１０２２）。図５、パネルＤは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断アッセイを示しており、ＧＦＰで修飾されたＣａｓ９が、対照と比較して活性を保持していることを示している。配列を、以下のように記載する：ＭＹＧＧＳ（配列番号１０２２）、ＳＧＧＧＧＹ（配列番号１０４０）。 図６は、ＳＶ４０核局在化配列の２つのコピーを含むペプチドによって修飾されたＣａｓ９が、神経前駆細胞に進入し、編集することができ、編集効率を２０倍に高めることができたことを示す。 図７は、フェノール含有タンパク質の小分子チオールによる修飾を示すＥＳＩ－ＴＯＦデータを示す。 図８は、キノコのチロシナーゼのアミノ酸配列を示す。配列を、配列番号９７１に記載する。 図９は、キノコのチロシナーゼのアミノ酸配列を示す。配列を、配列番号９７２に記載する。 図１０Ａ～１０Ｚ及び１０ＡＡ～１０ＶＶは、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）のチロシナーゼのアミノ酸配列を示す。図１０Ａ～１０Ｚの配列を、配列番号９７３～９９８に記載する。図１０ＡＡ～１０ＶＶの配列を、配列番号９９９～１０２０に記載する。 図１０－１の続きを示す。 図１０－２の続きを示す。 図１０－３の続きを示す。 図１０－４の続きを示す。 図１０－５の続きを示す。 図１０－６の続きを示す。 図１０－７の続きを示す。 図１０－８の続きを示す。 図１０－９の続きを示す。 図１０－１０の続きを示す。 図１０－１１の続きを示す。 図１１は、ａｂＴＹＲ－ペプチド電荷スクリーニングを示す：５－Ｍｅｒチロシン含有ペプチドを、ａｂＴＹＲを使用してＹ１８２Ｃ ＧＦＰ及びｐＡＦ ＭＳ２にカップリングした。得られた反応混合物を、Ｑ－ＴＯＦ質量分析を使用して分析した。反応条件：５０Ｍ μＭ ＧＦＰ、２５０μＭペプチド、０．１６７μＭチロシナーゼ、１０ｍＭ緩衝液ｐＨ６．５、室温３０分、すべての反応を１０ｍＭトロポロンでクエンチした。配列は以下の通りである：ＧＧＧＧＹ（配列番号１０２４）、ＲＧＧＧＹ（配列番号１０２５）、ＲＧＲＧＹ（配列番号１０２６）、ＲＲＲＧＹ（配列番号１０２７）、ＲＲＲＲＹ（配列番号１０２８）、ＥＧＧＧＹ（配列番号１０２９）、ＥＧＥＧＹ（配列番号１０３０）、ＥＥＥＧＹ（配列番号１０３１）、ＥＥＥＥＹ（配列番号１０３２）、ＧＧＧＷＹ（配列番号１０３３）、ＧＧＷＧＹ（配列番号１０３４）、ＲＲＲＷＹ（配列番号１０３５）、ＲＲＷＲＹ（配列番号１０３６）、ＥＥＥＷＹ（配列番号１０３７）、ＥＥＷＥＹ（配列番号１０３８）。 図１１－１の続きを示す。 図１２Ａ～１２Ｂは、ａｂＴＹＲ及びｂｍＴＹＲモデルを示す：ａｂＴＹＲ（ａ）は、グルタミン酸及びアスパラギン酸残基が豊富にあるため、活性部位の周囲に全体的に負の電荷（赤い残基）を有する。対照的に、ｂｍＴＹＲ（ｂ）は、その活性部位の周りにわずかな正電荷（青い残基）を有する。 図１３は、ｂｍＴＹＲ電荷スクリーニングを示す。５－Ｍｅｒチロシン含有ペプチドを、ｂｍＴＹＲを使用してＹ１８２ＣＧＦＰにカップリングさせた。得られた反応混合物を、Ｑ－ＴＯＦ質量分析を使用して分析したところ、ｂｍＴＹＲが負に荷電した基質を好むことが示された。反応条件：５０Ｍ μＭ ＧＦＰ、２５０μＭペプチド、０．２μＭチロシナーゼ、１０ｍＭ緩衝液ｐＨ６．５、３７℃で３０分、すべての反応を１０ｍＭトロポロンでクエンチした。配列は以下の通りである：ＧＧＧＧＹ（配列番号１０２４）、ＧＧＧＷＹ（配列番号１０３３）、ＥＥＥＧＹ（配列番号１０３１）、ＲＲＲＧＹ（配列番号１０２７）。 図１３－１の続きを示す。 図１４は、ＥＧＧＧＹ（配列番号１０２９）及びＥＥＥＥＹ（配列番号１０３２）ペプチドに関するａｂＴＹＲとｂｍＴＹＲとの間の比較を示す。反応条件（ａｂＴＹＲ）：５０Ｍ μＭ ＧＦＰ、２５０μＭペプチド、０．１６７μＭチロシナーゼ、１０ｍＭ緩衝液ｐＨ６．５、室温３０分。反応条件（ｂｍＴＹＲ）：１０Ｍ μＭ ＧＦＰ、５０μＭペプチド、０．８μＭチロシナーゼ、１０ｍＭ緩衝液ｐＨ６．５、室温１時間、すべての反応を１０ｍＭトロポロンでクエンチした。 図１４－１の続きを示す。 図１５Ａ～１５Ｃは、タンパク質修飾のための酸化的カップリング戦略を示す。ａ）Ｎ末端プロリン残基及びアミノフェニル基にカップリングさせるために、ｏ－キノン及びｏ－イミノキノンにアクセスする化学的及び物理的方法。ｂ）Ｎ末端プロリン残基にカップリングさせるためのフェノールのチロシナーゼ媒介酸化。ｃ）タンパク質のＮ末端またはＣ末端でのｏ－キノンの選択的チロシナーゼ媒介生成と、それに続く外来性アミン求核試薬とのカップリングのためのチロシンタグタンパク質。 図１６Ａ～１６Ｂは、ｐ－アミノフェニルアラニン含有ＭＳ２（ｐＡＦ－ＭＳ２）へのＴｙｒ含有ペプチドの結合を示す。Ｎ－Ａｃ－α－エンドルフィンは、そのＮ末端にアクセス可能なチロシン残基を有する。この部位は、チロシナーゼによって酸化され、Ｓｃｈｕｌｔｚアンバーコドンサプレッション法を使用して導入されたアニリン基を含むｐＡＦ－ＭＳ２キャプシドにカップリングされ得る。配列は以下のように記載されている：ＧＧＦＭＴＳＥＫＳＱＴＰＬＶＴ（配列番号１０３９）（ｂ）１８０残基目のアニリン基の位置を完全なウイルスキャプシド（ＰＤＢ ＩＤ：２ＭＳ２）上にピンク色で示す。ＥＳＩ－ＴＯＦ ＭＳ分析により、予測される生成物へ実質的に完全に変換されたことが示された（予測値：１５５８９Ｄａ）。過剰な修飾は観察されなかった。 図１７Ａ～１７Ｅは、Ａ．ビスポラス（Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ）チロシナーゼを介したアミン求核試薬とのカップリングを示す。ａ）Ｃ末端－ＧＧＹタグ付きトラスツズマブのｓｃＦｖを、モデルカップリングパートナーとして使用した。 ｂ）ｓｃＦｖを構成するトラスツズマブの重鎖及び軽鎖可変ドメインの結晶構造。 ｃ）１５０μＭアニリンとのカップリング前後の開始ｓｃＦｖ－ＧＧＹの代表的な質量スペクトル。 ｄ）４－アミノフェニル由来の求核試薬を２５μＭ～７５０μＭの濃度でスクリーニングした。ｅ）ピロリジン及びピペラジン由来の求核試薬を１００μＭ～５０００μＭの濃度でスクリーニングした。変換は、ＴＯＦ－ＬＣＭＳの統合によって概算した。代表的なスペクトルについては、補足図Ｘを参照されたい。 図１７Ｄの説明を参照。 図１８は、Ａ．ビスポラス（Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ）チロシナーゼを使用して首尾よくカップリングしたチロシンタグ付きタンパク質基質を示す。Ｃ末端を赤で強調表示し、内部チロシン残基をオレンジで強調表示する。反応は、ｐＨ６．５のリン酸緩衝液中のチロシナーゼ、及びアニリンを用いて行った。ａ）Ｎ末端にタグ付けされたユビキチン。ｂ）Ｃ末端－（ＧＧＧＧＳ）２ＧＧＹタグ付きｓｆＧＦＰ。（配列番号９４７）ｃ）Ｃ末端－ＧＧＹタグ付きトラスツズマブｓｃＦｖ。配列は以下に記載するとおりである：ＳＧＧＧＧＹ（配列番号１０４０）。 図１８－１の続きを示す。 図１９Ａ～１９Ｃは、ＳＫＢＲ３（ＨＥＲ２＋）細胞に結合したフルオロフォア結合トラスツズマブｓｃＦｖのフローサイトメトリー試験を示す。ａ）ＧＧＹタグ付きｓｃＦｖと、１２Ｕ／ＬのＡ．ビスポラス（Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ）チロシナーゼ及び５０μＭのアニリン－Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ４８８との酸化的カップリング。ｂ）ＥＳＩ ＴＯＦ－ＭＳは、ｓｃＦｖ－ＧＧＹが８５％の変換率でカップリングしたことを示している。タグ付けされていないバージョンのｓｃＦｖは修飾されなかった。 図１９Ａの説明を参照。 図１９Ａの説明を参照。 図２０Ａ～２０Ｂは、Ｃ末端リンカーの探索及びＢ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）チロシナーゼの有用性を示す。ａ）ドメイン４及び５の天然のドメイン間リンカー配列を利用した２種を含む、様々なタイプ及び長さのリンカーをプロテインＬのＣ末端に付加した。プロテインＬバリアントを、Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）チロシナーゼを用いた標準的なカップリング反応に供した。配列を、配列番号１０４１に記載する。 ｂ）Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）チロシナーゼで処理した後にＴＯＦ－ＬＣＭＳによって観察した変換。いずれのバリアントも、Ａ．ビスポラス（Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ）チロシナーゼによって修飾することができなかった。配列を、以下のように記載する：（Ｇ４Ｓ）２ＧＧＹ（配列番号９４７）、（Ｇ４Ｓ）３ＧＧＹ（配列番号１０４２）、Ａ（ＥＡＡＡＫ）２ＡＧＧＹ（配列番号１０４３）、（ＡＰ）３ＧＧＹ（配列番号１０４４）、ＡＮ２０ＧＧＹ（配列番号１０４５）、ＥＩＫＲＴＧＧＹ（配列番号１０４６）、Ｇ４ＳＧＧＹ（配列番号９６８）。 図２１Ａ～２１Ｃは、Ｃ末端チロシンタグ付きＭＢＰのＢ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）媒介酸化的カップリングを示す。ａ）Ｃ末端を赤で強調表示したＭＢＰの結晶構造。チロシン残基をオレンジ色で示す。結合マルトースを黄色で示す。 ｂ）ＭＢＰ－ＳＳＧＧＧＧＹ（配列番号９４８）のデータ。 ｃ）ＭＢＰ－ＧＧＹを使用したデータ。 図２２Ａ～２２Ｄは、プロテインＬ－Ｏ．Ｇ．４８８複合体「二次」親和性試薬を使用したＨＥＲ２＋細胞の検出を示す。ａ）検出スキーム：非チロシンタグ付きトラスツズマブｓｃＦｖは、ＨＥＲ２＋ＳＫ－ＢＲ－３細胞に結合し、Ｏ．Ｇ．４８８修飾プロテインＬによって認識される。 ｂ）二次親和性試薬は、２５μＭのＯ．Ｇ．４８８－アニリンとＢ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）チロシナーゼを使用して、－ＡＮ２０ＧＧＹ末端プロテインＬバリアントから作成された。 ｃ）修飾前後のプロテインＬ－ＡＮ２０ＧＧＹの質量スペクトル。 ｄ）上記のスキームに従って処理したＳＫ－ＢＲ－３細胞及び陰性対照のフローサイトメトリー蛍光データ。ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞をＨＥＲ２対照として使用した。配列は以下に記載するとおりである：ＡＮ２０ＧＧＹ（配列番号１０４５）。 図２３は、酸化的カップリング条件（１２Ｕ／ｍＬ ａｂＴＹＲ、１５０μＭアニリン、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．５、１時間）に供したＣ末端－ＧＧＹチロシンタグ付き及びタグなしトラスツズマブｓｃＦｖを示す。 図２４Ａ～２４Ｄは、－ＧＧＹタグ付きトラスツズマブｓｃＦｖの変換におけるａｂＴｙｒ及びアニリン濃度の変化を示す。ａ）反応スキーム。 ｂ）代表的な質量スペクトル：様々なａｂＴＹＲ濃度での１０００Ｍアニリン。 図２４Ｂ－１の続きを示す。 ｃ）トラスツズマブ（「Ｔｒａｓ．」）ｓｃＦｖ－ＧＧＹからアニリンカップリング生成物への変換率の表。 ｄ）Ｔｒａｓ．ｓｃＦｖ－ＧＧＹからアニリンカップリング生成物への変換のグラフ表示。 図２５は、アレート求核試薬添加実験を示す。チロシナーゼ酵素の５、１０、２０、４０、または６０分後に、ａｂＴＹＲを介した酸化的カップリングにアニリンを添加した。 図２５－１の続きを示す。 図２６は、４－アミノフェニル由来の求核試薬との酸化的カップリング反応の代表的なスペクトルを示す。ａ）ｏ－トルイジン、ｂ）２，６－ジメチルアニリン、ｃ）４－アミノフェニル－Ｎ－メチルアミド。 図２６－１の続きを示す。 図２６－１の続きを示す。 図２７は、酸化的カップリング反応の代表的なスペクトルを示す。 図２７－１の続きを示す。 図２７－１の続きを示す。 図２８は、プロテインＬバリアントの酸化的カップリング反応を示す。配列は以下に記載するとおりである：（Ｇ４Ｓ）２ＧＧＹ（配列番号９４７）；（Ｇ４Ｓ）３ＧＧＹ（配列番号１０４２）、Ａ（ＥＡＡＡＫ）２ＡＧＧＹ（配列番号１０４３）、（ＡＰ）３ＧＧＹ（配列番号１０４４）。 図２８－１の続きを示す。 図２８－１の続きを示す。 図２８－１の続きを示す。 図２８－１の続きを示す。 図２９Ａ～２９Ｂは、４℃で保存した、タンパク質保存緩衝液（２０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５％グリセロール、ｐＨ７．４）＋１０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）中のトラスツズマブｓｃＦｖ－ＧＧＹの安定性試験を示す。各列のＴＯＦ－ＬＣＭＳスペクトルは、示された時点でサンプリングしたタンパク質の同じアリコート由来のスペクトルであった。非カップリングタンパク質とカップリングタンパク質のジスルフィド還元ｓｃＦｖ－ＧＧＹは、質量の予測値がそれぞれ２６，３３７．２Ｄａ及び２６，４４２．２Ｄａである。アニリンカップリング＋還元＋ＤＴＴ＝２６，５９４．４５Ｄａ ａ）ａｂＴＹＲを介したアニリンとの酸化的カップリングに供する。ｂ）酸化的カップリング反応に供さない。 図２９Ａ－１の続きを示す。 図２９Ａ－１の説明を参照。 図３０Ａ～３０Ｂは、４℃で保存した、タンパク質保存緩衝液（２０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５％グリセロール、ｐＨ７．４）中のトラスツズマブｓｃＦｖ－ＧＧＹの安定性試験を示す。各列のＴＯＦ－ＬＣＭＳスペクトルは、示された時点でサンプリングしたタンパク質の同じアリコート由来のスペクトルであった。非カップリングタンパク質とカップリングタンパク質のジスルフィド還元ｓｃＦｖ－ＧＧＹは、質量の予測値がそれぞれ２６，３３７．２Ｄａ及び２６，４４２．２Ｄａである。ａ）ａｂＴＹＲを介したアニリンとの酸化的カップリングに供し、タンパク質保存緩衝液にバッファー交換する。ｂ）酸化的カップリング反応に供さない。 図３０Ａ－１の続きを示す。 図３０Ａ－１の説明を参照。 図３１Ａ～３１Ｂは、４℃で保存した、タンパク質保存緩衝液（２０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５％グリセロール、ｐＨ７．４）＋１０ｍＭグルタチオン中のトラスツズマブｓｃＦｖ－ＧＧＹの安定性試験を示す。各列のＴＯＦ－ＬＣＭＳスペクトルは、示された時点でサンプリングしたタンパク質の同じアリコート由来のスペクトルであった。非カップリングタンパク質とカップリングタンパク質のジスルフィド還元ｓｃＦｖ－ＧＧＹは、質量の予測値がそれぞれ２６，３３７．２Ｄａ及び２６，４４２．２Ｄａである。アニリンカップリング＋還元＋１×グルタチオン＝２６，７４７．５８Ｄａ；アニリンカップリング＋還元＋２×グルタチオン＝２７，０５２．８９Ｄａ ａ）ａｂＴＹＲを介したアニリンとの酸化的カップリングに供する。ｂ）酸化的カップリング反応に供さない。 図３１Ａ－１の続きを示す。 図３１Ａ－１の説明を参照。 図３２は、酸化的カップリング反応生成物におけるチオール交換の試験を示す。トラスツズマブｓｃＦｖ－ＧＧＹを、タンパク質保存緩衝液（２０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５％グリセロール、ｐＨ７．４）＋１０ｍＭグルタチオンにバッファー交換し、４℃で保存した。２４時間後、試料の一部をＴＯＦ－ＬＣＭＳ分析に供し、残りをタンパク質保存緩衝液＋１０ｍＭ ＤＴＴにバッファー交換し、４℃でさらに２４時間保存した。次いで、第２の試料をＴＯＦ－ＬＣＭＳ分析に供した。 図３２－１の続きを示す。 図３３は、タンパク質構築物の平均質量を示す。配列は以下に記載するとおりである：ＧＧＧＧＳＧＧＹ（配列番号９６８）；（ＧＧＧＧＳ）２ＧＧＹ（配列番号９４７）；（ＡＰ）４ＧＧＹ（配列番号１０６１）；ＡＮ２０ＧＧＹ（配列番号１０４５）、ＳＳＧＧＧＧＹ（配列番号９４８）、（ＧＧＧＧＳ）３ＧＧＹ（配列番号１０４２）、ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＧＧＹ（配列番号１０４３）、（ＡＰ）３ＧＧＹ（配列番号番号１０４４）、ＥＩＫＲＴＧＧＹ（配列番号１０４６）、ＧＧＧＧＳＧＧＹ（配列番号９６８）。 図３４Ａ～３４Ｅは、タンパク質構築物のアミノ酸配列を示す。図３４Ａ～３４Ｅの配列は、配列番号１０４９～１０５３に記載されている。 図３４Ａの説明を参照。 図３４Ａの説明を参照。 図３４Ａの説明を参照。 図３４Ａの説明を参照。 図３５は、フェノール標識核酸をシステイン含有タンパク質にカップリングするためのバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）チロシナーゼ（ｂｍＴＹＲ）のＤ５５Ｋ変異体の使用を示す。 図３６Ａ～３６Ｃは、本開示の方法を使用した、核酸のポリペプチドへのカップリングを示す。 図３７Ａ～３７Ｃは、荷電基質に対するその選好に対するｂｍＴＹＲへの様々な変異の影響を示す。 図３８は、負に荷電した基質の活性化に対するａｂＴＹＲの活性の欠如を示す。 図３９Ａ～３９Ｇは、本開示の方法を使用したタンパク質の連結を概略的に示す。 図３９Ａの説明を参照。 図３９Ａの説明を参照。 図３９Ａの説明を参照。 図３９Ａの説明を参照。 図３９Ａの説明を参照。 図３９Ａの説明を参照。 図４０Ａ～４０Ｃは、ヒト血清中の標的分子－生体分子複合体の安定性を示す。 図４０Ａの説明を参照。 図４０Ａの説明を参照。 図４１は、本開示の方法を使用した、Ｃａｓ９の：ｉ）Ｉｇ Ｆｃポリペプチド；ｉｉ）及びナノボディへのカップリングを示す。 図４２は、Ｃａｓ９－ナノボディ複合体の飛行時間型質量分析データを示す。 図４３Ａ～４３Ｂは、本開示の方法を使用した、ｉ）哺乳類の生細胞表面の直接標識方法（図４３Ａ）；及びｉｉ）細胞表面へのポリペプチドのカップリングを示す。 図４４Ａ～４４Ｂは、標的分子が２つのチオール部分を含む反応を示す。
定義
本発明をさらに説明する前に、本発明が、記載する特定の実施形態に限定されるものではなく、したがって、言うまでもなく、変化し得ることを理解されたい。本明細書中で使用する用語法は、特定の実施形態を記載するためのものに過ぎず、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、限定するものとしては意図されないことも理解されたい。
値の範囲が提供される場合、文脈が別途明確に指示しない限り、下限値の単位の１０分の１までの、その範囲の上限値と下限値との間の各介在値、ならびにその表示範囲の任意の他の表示値または介在値が、本発明に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限値及び下限値は、独立して、そのより小さい範囲内に含まれてもよく、また、表示範囲内の任意の具体的な除外限度に従って、本発明に包含される。表示範囲がそれらの限界値のうちの一方または両方を含む場合、それらの包含される限界値のうちのいずれかまたは両方を除外する範囲もまた、本発明に包含される。
別段の定義がない限り、本明細書中で使用するすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されている方法及び材料と同様もしくは同等の任意の方法及び材料を、本発明の実践または試験においても使用してもよいが、好ましい方法及び材料を本明細書に記載する。本明細書で言及されるすべての刊行物は、それらの刊行物の引用に関連した方法及び／または材料を開示及び記載するために、参照により本明細書に援用される。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、文脈が別途明らかに規定しない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば、「チオール基」への言及は、複数のそのようなチオール基への言及を含み、「チオール基」への言及は、当業者に公知の１つ以上のチオール基及びその等価体などへの言及を含む。特許請求の範囲はあらゆる任意の要素を除外するように作成され得ることにさらに留意されたい。したがって、この記述は、特許請求の範囲の要素の記載に関連する「単に」、「のみ」などの排他的用語の使用、または「否定的な」制限の使用のための先行する基準として機能することが意図される。
明確化のために別個の実施形態の文脈において記載されている本発明の特定の特徴を単一の実施形態において組み合わせて提供してもよいことが理解される。逆に、簡潔にするために単一の実施形態の文脈において説明される本発明の様々な特徴を、別々に、または任意の好適な副組み合わせで提供してもよい。本発明に関連する実施形態のすべての組み合わせは、本発明によって明確に包含され、ありとあらゆる組み合わせが個別にかつ明示的に開示されたかのように、本明細書に開示される。さらに、様々な実施形態及びそれらの要素のすべての副組み合わせも本発明によって明確に包含され、ありとあらゆるそのような副組み合わせが個別にかつ明示的に本明細書に開示されたかのように、本明細書に開示される。
本明細書中で論じる刊行物は、本出願の出願日以前のそれらの開示についてのみ提供される。本明細書におけるいずれの内容も、本発明が先行発明によるそのような刊行物に先行する資格がないことを認めるものと解釈されるべきではない。さらに、提供される刊行物の日付は、実際の刊行日とは異なる場合があり、別々に確認される必要があり得る。
本明細書中で使用する場合、用語「親和性タグ」とは、特定の結合対、すなわち、化学的または物理的手段を介して分子の一方が他方の分子に特異的に結合する２つの分子のメンバーを指す。親和性タグの相補的メンバーを固定化して（例えば、クロマトグラフィー支持体、ビーズまたは平面表面に）親和性タグに特異的に結合するアフィニティークロマトグラフィー支持体を生成してもよい。目的の化合物に親和性タグを付けると、その化合物を、例えば、アフィニティークロマトグラフィーを使用してアフィニティーによって、タグなしの化合物の混合物から分離することができる。特異的結合対の例として、ビオチン及びストレプトアビジン（またはアビジン）、ならびに抗原及び抗体が挙げられるが、結合対、例えば、核酸ハイブリッド、ポリヒスチジン及びニッケル、ならびにアジド及びアルキニル（例えば、シクロオクチニル）またはホスフィノ基も想定される。特異的結合対には、元の特異的結合メンバーの類似体、誘導体、及び断片が含まれ得る。
本明細書中で使用する場合、用語「ビオチン部分」とは、ビオチンまたはビオチン類似体、例えば、デスチオビオチン、オキシビオチン、２’－イミノビオチン、ジアミノビオチン、ビオチンスルホキシド、ビオシチンなどを含む親和性タグを指す。ビオチン部分は、ストレプトアビジンに少なくとも１０－８Ｍの親和性で結合する。ビオチン部分にはまた、リンカー、例えば、－ＬＣビオチン、－ＬＣ－ＬＣ－ビオチン、－ＳＬＣビオチンまたは－ＰＥＧｎ １－ビオチンが含まれ得、式中、ｎ１は３～１２である。
「連結基」、「リンカー部分」などにおける「連結」または「リンカー」とは、共有結合を介して２つの基を接続する連結部分を意味する。リンカーは、直鎖状、分岐、環状または単一の原子であってもよい。そのような連結基の例として、アルキル、アルケニレン、アルキニレン、アリーレン、アルカリレン、アラルキレン、及び限定されないが、アミド（－ＮＨ－ＣＯ－）、ウレイレン（－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－）、イミド（－ＣＯ－ＮＨ－ＣＯ－）、エポキシ（－Ｏ－）、エピチオ（－Ｓ－）、エピジオキシ（－Ｏ－Ｏ－）、エピジチオ（－Ｓ－Ｓ－）、カルボニルジオキシ（－Ｏ－ＣＯ－Ｏ－）、アルキルジオキシ（－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ－Ｏ－）、エポキシイミノ（－Ｏ－ＮＨ－）、エピミノ（－ＮＨ－）、カルボニル（－ＣＯ－）などを含む官能基を含む連結部分が挙げられる。特定の場合では、リンカー骨格の、１、２、３、４、５個、またはそれ以上の炭素原子を、任意選択で、硫黄、窒素または酸素のヘテロ原子に置換してもよい。主鎖原子間の結合は飽和または不飽和であってもよく、多くの場合、リンカー主鎖に、１つ、２つ、または３つ以下の不飽和結合が存在するであろう。リンカーは、１つ以上の置換基、例えば、アルキル、アリールまたはアルケニル基を含み得る。リンカーには、限定されないが、ポリ（エチレングリコール）ユニット（複数可）（例えば、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）－）；エーテル、チオエーテル、アミン、直鎖または分岐であり得るアルキル（例えば、（Ｃ１－Ｃ１２）アルキル）、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、１－メチルエチル（イソプロピル）、ｎ－ブチル、ｎ－ペンチル、１，１－ジメチルエチル（ｔ－ブチル）などが含まれ得る。リンカー主鎖には、環状基、例えば、アリール、複素環またはシクロアルキル基が含まれ得、主鎖には、環状基の２つ以上の原子、例えば、２、３または４個の原子が含まれる。リンカーは、切断可能であっても切断不可能であってもよい。連結基へのリンカーの任意の便利な配向及び／または接続を使用してもよい。
「アルキル」とは、１～１０個の炭素原子、例えば、１～６個の炭素原子を有する一価飽和脂肪族ヒドロカルビル基を指す。本用語には、例として、直鎖及び分枝鎖ヒドロカルビル基、例えば、メチル（ＣＨ３－）、エチル（ＣＨ３ＣＨ２－）、ｎ－プロピル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２－）、イソプロピル（（ＣＨ３）２ＣＨ－）、ｎ－ブチル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－）、イソブチル（（ＣＨ３）２ＣＨＣＨ２－）、ｓｅｃ－ブチル（（ＣＨ３）（ＣＨ３ＣＨ２）ＣＨ－）、ｔ－ブチル（（ＣＨ３）３Ｃ－）、ｎ－ペンチル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－）、及びネオペンチル（（ＣＨ３）３ＣＣＨ２－）などが含まれる。
用語「置換アルキル」とは、本明細書中に定義するアルキル基を指し、アルキル鎖中の１個以上の炭素原子（Ｃ１炭素原子を除く）が、場合により、－Ｏ－、－Ｎ－、－Ｓ－、－Ｓ（Ｏ）ｎ ２－（式中、ｎ２は０～２）、－ＮＲ－（式中、Ｒは水素またはアルキル）などのヘテロ原子で置換されるとともに、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、アミノアシル、アミノアシルオキシ、オキシアミノアシル、アジド、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシル、オキソ、チオケト、カルボキシル、カルボキシアルキル、チオアリールオキシ、チオヘテロアリールオキシ、チオヘテロシクロオキシ、チオール、チオアルコキシ、置換チオアルコキシ、アリール、アリールオキシ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリル、ヘテロシクロオキシ、ヒドロキシアミノ、アルコキシアミノ、ニトロ、－ＳＯ－アルキル、－ＳＯ－アリール、－ＳＯ－ヘテロアリール、－ＳＯ２－アルキル、－ＳＯ２－アリール、－ＳＯ２－ヘテロアリール、及び－ＮＲａＲｂからなる群から選択される１～５個の置換基を有し、式中、Ｒ’及びＲ”は同じでも異なっていてもよく、また、水素、任意置換のアルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール及び複素環から選択される。
「アリール」または「Ａｒ」とは、単一環（フェニル基中に存在するような）を有する６～１８個の炭素原子の一価芳香族炭素環式基または複数の縮合環を有する環系（そのような芳香環系の例として、ナフチル、アントリル及びインダニルが挙げられる）を指し、結合点が芳香環の原子を介してさえいれば、縮合環は芳香族であってもなくてもよい。本用語には、例えば、フェニル及びナフチルが含まれる。アリール置換基についての定義によって特段の制限を受けない限り、そのようなアリール基を、任意選択で、アシルオキシ、ヒドロキシ、チオール、アシル、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、置換アルキル、置換アルコキシ、置換アルケニル、置換アルキニル、置換シクロアルキル、置換シクロアルケニル、アミノ、置換アミノ、アミノアシル、アシルアミノ、アルカリール、アリール、アリールオキシ、アジド、カルボキシル、カルボキシアルキル、シアノ、ハロゲン、ニトロ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリル、ヘテロシクロオキシ、アミノアシルオキシ、オキシアシルアミノ、チオアルコキシ、置換チオアルコキシ、チオアリールオキシ、チオヘテロアリールオキシ、－ＳＯ－アルキル、－ＳＯ－置換アルキル、－ＳＯ－アリール、－ＳＯ－ヘテロアリール、－ＳＯ２－アルキル、－ＳＯ２－置換アルキル、－ＳＯ２－アリール、－ＳＯ２－ヘテロアリール及びトリハロメチルから選択される１～５個の置換基、または１～３個の置換基で置換することができる。
「アミノ」とは、－ＮＨ２基を指す。
用語「置換アミノ」とは、－ＮＲＲ基を指し、式中、各Ｒは、独立して、水素、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、ヘテロアリール、及びヘテロシクリルからなる群から選択されるが、ただし、少なくとも１つのＲは水素ではない。
本明細書における開示に加えて、用語「置換」は、特定の基またはラジカルを修飾するために使用する場合、特定の基またはラジカルの１つ以上の水素原子を、それぞれ互いに独立して、以下に定義するような同一または異なる置換基で置換することも意味し得る。
本明細書中の個々の用語に関して開示する基に加えて、特定の基またはラジカル中の飽和炭素原子上の１つ以上の水素を置換するための置換基（単一炭素上の任意の２個の水素を、＝Ｏ、＝ＮＲ７０、＝Ｎ－ＯＲ７０、＝Ｎ２または＝Ｓで置換することができる）は、特に明記しない限り、－Ｒ６０、ハロ、＝Ｏ、－ＯＲ７０、－ＳＲ７０、－ＮＲ８０Ｒ８０、トリハロメチル、－ＣＮ、－ＯＣＮ、－ＳＣＮ、－ＮＯ、－ＮＯ２、＝Ｎ２、－Ｎ３、－ＳＯ２Ｒ７０、－ＳＯ２Ｏ－Ｍ＋、－ＳＯ２ＯＲ７０、－ＯＳＯ２Ｒ７０、－ＯＳＯ２Ｏ－Ｍ＋、－ＯＳＯ２ＯＲ７０、－Ｐ（Ｏ）（Ｏ－）２（Ｍ＋）２、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ７０）Ｏ－Ｍ＋、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ７０）２、－Ｃ（Ｏ）Ｒ７０、－Ｃ（Ｓ）Ｒ７０、－Ｃ（ＮＲ７０）Ｒ７０、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｍ＋、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ７０、－Ｃ（Ｓ）ＯＲ７０、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ８０Ｒ８０、－Ｃ（ＮＲ７０）ＮＲ８０Ｒ８０、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ７０、－ＯＣ（Ｓ）Ｒ７０、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－Ｍ＋、－ＯＣ（Ｏ）ＯＲ７０、－ＯＣ（Ｓ）ＯＲ７０、－ＮＲ７０Ｃ（Ｏ）Ｒ７０、－ＮＲ７０Ｃ（Ｓ）Ｒ７０、－ＮＲ７０ＣＯ２ －Ｍ＋、－ＮＲ７０ＣＯ２Ｒ７０、－ＮＲ７０Ｃ（Ｓ）ＯＲ７０、－ＮＲ７０Ｃ（Ｏ）ＮＲ８０Ｒ８０、－ＮＲ７０Ｃ（ＮＲ７０）Ｒ７０及び－ＮＲ７０Ｃ（ＮＲ７０）ＮＲ８０Ｒ８０であり、式中、Ｒ６０は、任意置換のアルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキルアルキル、シクロアルキルアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール及びヘテロアリールアルキルからなる群から選択され、各Ｒ７０は、独立して、水素またはＲ６０であり；各Ｒ８０は、独立してＲ７０であるか、あるいは２つのＲ８０が、それらが結合している窒素原子と一緒になって５、６または７員ヘテロシクロアルキルを形成し、それは、任意選択で、Ｏ、Ｎ及びＳからなる群（そのうちのＮは、－ＨまたはＣ１－Ｃ３アルキル置換を有していてもよい）から選択される１～４個の同一または異なる追加のヘテロ原子を有していてもよく；各Ｍ＋は、正味の単一の正電荷を有する対イオンである。各Ｍ＋は、独立して、例えば、Ｋ＋、Ｎａ＋、Ｌｉ＋などのアルカリイオン；例えば＋Ｎ（Ｒ６０）４などのアンモニウムイオン；または、［Ｃａ２＋］０．５、［Ｍｇ２＋］０．５、または［Ｂａ２＋］０．５などのアルカリ土類イオンであってもよい（「下付き文字０．５」は、そのような二価アルカリ土類イオンの対イオンの一方を本発明の化合物のイオン化形態、もう一方を塩化物などの典型的な対イオンとすることができるか、または本明細書に開示する２つのイオン化化合物が、そのような二価アルカリ土類イオンに対する対イオンとして作用することができるか、または本発明の二重イオン化化合物が、そのような二価アルカリ土類イオンに対する対イオンとして作用することができることを意味する）。具体例として、－ＮＲ８０Ｒ８０は、－ＮＨ２、－ＮＨ－アルキル、Ｎ－ピロリジニル、Ｎ－ピペラジニル、４Ｎ－メチル－ピペラジン－１－イル及びＮ－モルホリニルが挙げられる。
本明細書における開示に加えて、「置換」アルケン、アルキン、アリール及びヘテロアリール基における不飽和炭素原子上の水素の置換基は、特に明記しない限り、－Ｒ６０、ハロ、－Ｏ－Ｍ＋、－ＯＲ７０、－ＳＲ７０、－Ｓ－Ｍ＋、－ＮＲ８０Ｒ８０、トリハロメチル、－ＣＦ３、－ＣＮ、－ＯＣＮ、－ＳＣＮ、－ＮＯ、－ＮＯ２、－Ｎ３、－ＳＯ２Ｒ７０、－ＳＯ３ －Ｍ＋、－ＳＯ３Ｒ７０、－ＯＳＯ２Ｒ７０、－ＯＳＯ３ －Ｍ＋、－ＯＳＯ３Ｒ７０、－ＰＯ３ －２（Ｍ＋）２、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ７０）Ｏ－Ｍ＋、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ７０）２、－Ｃ（Ｏ）Ｒ７０、－Ｃ（Ｓ）Ｒ７０、－Ｃ（ＮＲ７０）Ｒ７０、－ＣＯ２ －Ｍ＋、－ＣＯ２Ｒ７０、－Ｃ（Ｓ）ＯＲ７０、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ８０Ｒ８０、－Ｃ（ＮＲ７０）ＮＲ８０Ｒ８０、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ７０、－ＯＣ（Ｓ）Ｒ７０、－ＯＣＯ２ －Ｍ＋、－ＯＣＯ２Ｒ７０、－ＯＣ（Ｓ）ＯＲ７０、－ＮＲ７０Ｃ（Ｏ）Ｒ７０、－ＮＲ７０Ｃ（Ｓ）Ｒ７０、－ＮＲ７０ＣＯ２ －Ｍ＋、－ＮＲ７０ＣＯ２Ｒ７０、－ＮＲ７０Ｃ（Ｓ）ＯＲ７０、－ＮＲ７０Ｃ（Ｏ）ＮＲ８０Ｒ８０、－ＮＲ７０Ｃ（ＮＲ７０）Ｒ７０及び－ＮＲ７０Ｃ（ＮＲ７０）ＮＲ８０Ｒ８０であり、式中、Ｒ６０、Ｒ７０、Ｒ８０及びＭ＋は、以前に定義したとおりであり、ただし、置換アルケンまたはアルキンの場合、置換基は、－Ｏ－Ｍ＋、－ＯＲ７０、－ＳＲ７０、または－Ｓ－Ｍ＋ではない。
本明細書中の個々の用語に関して開示する基に加えて、「置換」ヘテロアルキル及びシクロヘテロアルキル基中の窒素原子上の水素の置換基は、特に明記しない限り、－Ｒ６０、－Ｏ－Ｍ＋、－ＯＲ７０、－ＳＲ７０、－Ｓ－Ｍ＋、－ＮＲ８０Ｒ８０、トリハロメチル、－ＣＦ３、－ＣＮ、－ＮＯ、－ＮＯ２、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ７０、－Ｓ（Ｏ）２Ｏ－Ｍ＋、－Ｓ（Ｏ）２ＯＲ７０、－ＯＳ（Ｏ）２Ｒ７０、－ＯＳ（Ｏ）２Ｏ－Ｍ＋、－ＯＳ（Ｏ）２ＯＲ７０、－Ｐ（Ｏ）（Ｏ－）２（Ｍ＋）２、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ７０）Ｏ－Ｍ＋、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ７０）（ＯＲ７０）、－Ｃ（Ｏ）Ｒ７０、－Ｃ（Ｓ）Ｒ７０、－Ｃ（ＮＲ７０）Ｒ７０、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ７０、－Ｃ（Ｓ）ＯＲ７０、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ８０Ｒ８０、－Ｃ（ＮＲ７０）ＮＲ８０Ｒ８０、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ７０、－ＯＣ（Ｓ）Ｒ７０、－ＯＣ（Ｏ）ＯＲ７０、－ＯＣ（Ｓ）ＯＲ７０、－ＮＲ７０Ｃ（Ｏ）Ｒ７０、－ＮＲ７０Ｃ（Ｓ）Ｒ７０、－ＮＲ７０Ｃ（Ｏ）ＯＲ７０、－ＮＲ７０Ｃ（Ｓ）ＯＲ７０、－ＮＲ７０Ｃ（Ｏ）ＮＲ８０Ｒ８０、－ＮＲ７０Ｃ（ＮＲ７０）Ｒ７０及び－ＮＲ７０Ｃ（ＮＲ７０）ＮＲ８０Ｒ８０であり、式中、Ｒ６０、Ｒ７０、Ｒ８０及びＭ＋は、以前に定義したとおりである。
本明細書における開示に加えて、特定の実施形態では、置換される基は、１、２、３、もしくは４個の置換基、１、２、もしくは３個の置換基、１もしくは２個の置換基、または１個の置換基を有する。
上記で定義したすべての置換基において、置換基を、それ自体に対するさらなる置換基（例えば、それ自体が置換アリール基で置換され、さらに置換アリール基などで置換される、置換アリール基を置換基として有する置換アリール）で定義することによって到達したポリマーは、本明細書に包含されることを意図しないことを理解されたい。そのような場合、そのような置換の最大数は３である。例えば、本明細書で具体的に企図される置換アリール基の連続置換は、置換アリール－（置換アリール）－置換アリールに限定される。
１つ以上の置換基を含む本明細書に開示する基のいずれに関しても、当然のことながら、そのような基は立体的に非現実的及び／または合成的に実行不可能ないかなる置換または置換パターンも含まないことが理解される。さらに、本発明の化合物は、これらの化合物の置換から生じるすべての立体化学異性体を含む。
特定の実施形態では、置換基は、化合物の光学異性及び／または立体異性に寄与し得る。化合物の塩、溶媒和物、水和物、及びプロドラッグ形態もまた、対象とする。そのような形態のすべてが本開示に含まれる。したがって、本明細書に記載の化合物には、それらの薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、プロドラッグ及び異性体を含む、それらの塩、溶媒和物、水和物、プロドラッグ及び異性体形態が含まれる。特定の実施形態では、化合物は、薬学的に活性な誘導体に代謝され得る。
特に明記されていない限り、原子への言及には、その原子の同位体が含まれることが意図される。例えば、Ｈへの言及には、１Ｈ、２Ｈ（すなわち、Ｄ）及び３Ｈ（すなわち、Ｔ）が含まれることが意図され、Ｃへの言及には、１２Ｃ及び炭素のすべての同位体（１３Ｃなど）が含まれることが意図される。
本明細書中で使用する場合、用語「切断可能なリンカー」または「切断可能に連結された」とは、結合の接続部分がインタクトなままとなっており、刺激（例えば、物理的、化学的または酵素的刺激）を使用して選択的に開裂可能なリンカーまたは結合を指す。いくつかの切断可能な結合が文献に記載されている（例えば、Ｂｒｏｗｎ（１９９７）Ｃｏｎｔｅｍｐｏｒａｒｙ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ４（３）；２１６－２３７）。及びＧｕｉｌｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ（Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２０００ １０００：２０９１－２１５７）。ジスルフィド結合（ＤＤＴによって切断され得る）及び光切断可能なリンカーは、切断可能な結合の例である。
用語「フルオロフォア」とは、第１の波長のエネルギーを吸収し、異なる第２の波長でエネルギーを再放出することができる任意の分子実体を指す。特定の実施形態では、対象の生体分子は、生体分子の一端または中央位置に結合したフルオロフォアを含む。いくつかの実施形態では、フルオロフォアを、生体分子の一端に結合させてもよい。生体分子に結合したフルオロフォアは、単一の分子である必要はないが、複数の分子を含み得る。
当業者に公知のように、フルオロフォアは、本質的に合成または生物学的であり得る。より一般的には、カップリング条件下で安定であり、クエンチャーに近接している場合に十分に抑制することができる任意のフルオロフォアを使用することができ、それにより、プローブへの標的の特異的結合に応答してフルオロフォアの蛍光強度の有意な変化を検出することができる。適切なフルオロフォアの例として、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ４８８色素、ローダミン及びローダミン誘導体、フルオレセインイソチオシアネート、フルオレセイン、６－カルボキシフルオレセイン（６－ＦＡＭ）、クマリン及びクマリン誘導体、シアニン及びシアニン誘導体、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ、ＤｙＬｉｇｈｔ Ｆｌｕｏｒなどが挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、生体分子は、金属キレート剤を含む。金属とキレート配位子との間の錯体に関して本明細書中で使用する「キレート」は、複素環構造を形成するように１つ以上の配位子に結合した金属イオンの組み合わせを指す。金属イオンの正電荷（複数可）の中和によるキレート形成は、イオン性、共有結合、または配位共有結合の形成によるものであり得る。特定の実施形態では、金属キレート剤は、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸（ＤＯＴＡ、またはテトラキセタンとも呼ばれる）を含むが、これに限定されない。
本明細書中で同じ意味で使用される用語「ポリヌクレオチド」及び「核酸」とは、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかである、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。したがって、この用語は、一本鎖、二本鎖、もしくは多重鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、あるいはプリン及びピリミジン塩基または他の天然の、化学的もしくは生化学的に修飾された、非天然の、または誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーを含むが、これらに限定されない。
本明細書中で同じ意味で使用される用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」とは、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指し、これは、コードされた、及び非コードのアミノ酸、化学的もしくは生化学的に修飾された、または誘導体化されたアミノ酸、ならびに修飾されたペプチド主鎖を有するポリペプチドを含み得る。用語「融合タンパク質」またはその文法的等価物は、通常、それらの天然状態では結合していないが、一般的にはペプチド結合を介してそれぞれのアミノ末端及びカルボキシル末端に結合して、単一の連続ポリペプチドを形成する複数のポリペプチド成分からなるタンパク質を含むことを意味する。融合タンパク質は、２つ、３つ、または４つ以上の異なるタンパク質の組み合わせであり得る。
一般的に、ポリペプチドは、任意の長さ、例えば、２残基以上のアミノ酸、４残基超のアミノ酸、約１０残基超のアミノ酸、約２０残基超のアミノ酸、約５０残基超のアミノ酸、約１００残基超のアミノ酸、約３００残基超のアミノ酸、多くの場合、最大約５００または１０００以上のアミノ酸であり得る。「ペプチド」は、一般的に、長さが２残基以上のアミノ酸であり、例えば、４残基超のアミノ酸、約１０残基超のアミノ酸、約２０残基超のアミノ酸、多くの場合、最大約５０残基超のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、ペプチドは、長さが２～３０アミノ酸である。
本明細書中で使用する場合、用語「標的タンパク質」とは、標的ファミリーのすべてのメンバー、ならびにその断片及びエナンチオマー、ならびにそのタンパク質模倣物を指す。本明細書に記載の目的の標的タンパク質は、特に明記しない限り、標的ファミリーのすべてのメンバー、ならびにその断片及びエナンチオマー、ならびにそのタンパク質模倣物を含むことを意図している。標的タンパク質は、ホルモン、成長因子、受容体、酵素、サイトカイン、骨誘導因子、コロニー刺激因子及び免疫グロブリンを含むがこれらに限定されない、治療または診断標的などの目的の任意のタンパク質であり得る。用語「標的タンパク質」とは、任意の便利な組換え発現方法または任意の便利な合成方法を使用して調製することができるか、または市販で購入することができる組換え分子及び合成分子、ならびに標的分子を含む融合タンパク質を含むことを意図している。
用語「生理学的条件」とは、生細胞に適合する条件、例えば、生細胞に適合する温度、ｐＨ、塩分などの主に水性の条件を指す。
「固体支持体」、「支持体」、及び「固相支持体」は同じ意味で用いられ、剛性または半剛性の表面を有する物質または物質群を指す。多くの実施形態では、固体支持体の少なくとも１つの表面は実質的に平坦であるが、いくつかの実施形態では、例えば、ウェル、隆起領域、ピン、エッチングされたトレンチなどにより、異なる化合物の合成領域を物理的に分離することが望ましい場合がある。他の実施形態によれば、固体支持体（複数可）は、ビーズ、樹脂、ゲル、ミクロスフェア、または他の幾何学的構成の形態をとるであろう。
用語「抗体」及び「免疫グロブリン」には、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、及びＦｄフラグメント、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体（ｓｃＡｂ）、単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）、単一ドメイン重鎖抗体、単一ドメイン軽鎖抗体、ナノボディ、二重特異性抗体、多重特異性抗体、ならびに抗体の抗原結合（ａｎｔｉｇｅｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ）（本明細書中では抗原結合（ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ）とも呼ばれる）部分及び非抗体タンパク質などの融合タンパク質を含むがこれらに限定されない、抗原への特異的結合を保持する任意のアイソタイプの抗体または免疫グロブリン、抗体の断片が含まれる。抗体は、例えば、放射性同位元素、検出可能な生成物を生成する酵素、蛍光タンパク質などで検出可能に標識することができる。抗体を、特異的結合対のメンバー、例えば、ビオチン（ビオチン－アビジン特異的結合対のメンバー）などの他の部分にさらに複合体化することができる。抗体はまた、ポリスチレンプレートまたはビーズなどを含むがこれらに限定されない固体支持体に結合されることができる。この用語には、Ｆａｂ’、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）２、及び／または抗原への特異的結合を保持する他の抗体断片、及びモノクローナル抗体も含まれる。本明細書中で使用する場合、モノクローナル抗体は、同一の細胞群（そのすべてが単一の細胞から反復的な細胞複製によって産生された）によって産生される抗体である。すなわち、細胞のクローンは単一の抗体種のみを産生する。モノクローナル抗体はハイブリドーマ産生技術を使用して産生することができるが、当業者に公知の他の産生方法も使用することができる（例えば、抗体ファージディスプレイライブラリーに由来する抗体）。抗体は一価または二価であり得る。抗体は、Ｉｇモノマーとすることができ、これは、２つの重鎖と２つの軽鎖がジスルフィド結合で接続された、４つのポリペプチド鎖からなる「Ｙ字型」分子である。
本明細書中で使用する用語「ヒト化免疫グロブリン」とは、異なる起源の免疫グロブリンの部分を含む免疫グロブリンを指し、少なくとも１つの部分は、ヒト起源のアミノ酸配列を含む。例えば、ヒト化抗体は、従来技術（例えば、合成）によって化学的に結合するか、または遺伝子工学技術を使用して連続的なポリペプチドとして調製した、必要な特異性を有するマウスなどの非ヒト起源の免疫グロブリンに由来する部分、及びヒト起源の免疫グロブリン配列に由来する部分（例えば、キメラ免疫グロブリン）を含み得る（例えば、キメラ抗体のタンパク質部分をコードするＤＮＡを発現させて、連続的なポリペプチド鎖を産生することができる）。ヒト化免疫グロブリンの別の例は、非ヒト由来抗体に由来する相補性決定領域（ＣＤＲ）及びヒト起源の軽鎖及び／または重鎖に由来するフレームワーク領域を含む１つ以上の免疫グロブリン鎖を含む免疫グロブリンである（例えば、フレームワークの変化を伴うか、または伴わないＣＤＲ移植抗体）。キメラまたはＣＤＲ移植単鎖抗体もヒト化免疫グロブリンという用語に包含される。例えば、Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，８１６，５６７号；Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，欧州特許第０，１２５，０２３Ｂ１号；Ｂｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，８１６，３９７号；Ｂｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，欧州特許第０，１２０，６９４Ｂ１号；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，ＭＳ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ８６／０１５３３；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，欧州特許第０，１９４，２７６Ｂ１号；Ｗｉｎｔｅｒ，米国特許第５，２２５，５３９号；Ｗｉｎｔｅｒ，欧州特許第０，２３９，４００Ｂ１号；Ｐａｄｌａｎ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，欧州特許出願第０，５１９，５９６Ａ１号を参照のこと。単鎖抗体に関しては、Ｌａｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，９４６，７７８号；Ｈｕｓｔｏｎ，米国特許第５，４７６，７８６号；及びＢｉｒｄ，Ｒ．Ｅ． ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：４２３－４２６（１９８８））も参照のこと。
本明細書中で使用する場合、用語「ナノボディ」（Ｎｂ）とは、天然の重鎖抗体に由来する最小抗原結合断片または単一可変ドメイン（ＶＨＨ）を指し、これは当業者には公知である。これらはラクダに見出される重鎖のみ抗体に由来する（Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６３：４４６；Ｄｅｓｍｙｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ３：８０３）。「ラクダ科」ファミリーでは、軽鎖ポリペプチドを欠損した免疫グロブリンが見出される。「ラクダ科」には、旧世界ラクダ科動物（Ｃａｍｅｌｕｓ ｂａｃｔｒｉａｎｕｓ及びＣａｍｅｌｕｓ ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ）及び新世界ラクダ科動物（例えば、Ｌｌａｍａ ｐａｃｃｏｓ、Ｌｌａｍａ ｇｌａｍａ、Ｌｌａｍａ ｇｕａｎｉｃｏｅ、及びＬｌａｍａ ｖｉｃｕｇｎａ）が含まれる。単一可変ドメイン重鎖抗体は、本明細書中ではナノボディまたはＶＨＨ抗体と呼ばれる。
「抗体断片」は、インタクトな抗体の部分、例えば、インタクトな抗体の抗原結合領域または可変領域を含む。抗体断片の例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖフラグメント；ダイアボディ；線状抗体（Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７－１０６２（１９９５））；ドメイン抗体（ｄＡｂ；Ｈｏｌｔ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：４８４）；一本鎖抗体分子；ならびに抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。抗体のパパイン消化により、「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる、各々が単一の抗原結合部位を有する２つの同一の抗原結合断片と、容易に結晶化する能力を反映して命名された残りの「Ｆｃ」フラグメントが生成される。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有し、なお抗原を架橋することができるＦ（ａｂ’）２フラグメントが生成する。
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識部位及び結合部位を含む最小の抗体断片である。この領域は、１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインの緊密な非共有結合による二量体からなる。各可変ドメインの３つのＣＤＲがＶＨ－ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位を規定するように相互作用するのは、この配置においてである。総合すると、６つのＣＤＲが抗原結合特異性を抗体に付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（すなわち抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半体）でさえ、結合部位全体よりも低い親和性ではあるが、抗原を認識し、結合する能力を有する。
Ｆａｂ断片はまた、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）も含有する。Ｆａｂ断片は、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端に、抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含む数個の残基が付加されている点で、Ｆａｂ’断片とは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨとは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を有するＦａｂ’の本明細書における呼称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、元来、ヒンジシステインを間に有するＦａｂ’断片のペアとして産生された。抗体断片の他の化学的カップリングも既知である。
任意の脊椎動物種由来の抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、κ及びλと呼ばれる２つの明らかに異なる種類のうちの１つに割り当てられ得る。それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを異なる種類に割り当てることができる。免疫グロブリンには５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらのクラスうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、及びＩｇＡ２にさらに分類され得る。サブクラスは、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂなどのタイプにさらに分類され得る。
「単鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖内に存在する。いくつかの実施形態では、Ｆｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、これにより、ｓＦｖは抗原結合のための所望の構造を形成することができる。ｓＦｖの概説については、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）を参照のこと。
用語「ダイアボディ」とは、同一ポリペプチド鎖内の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片（ＶＨ－ＶＬ）を指す。同一鎖内の２つのドメイン間で対形成するには短すぎるリンカーを使用することにより、ドメインはもう一方の鎖の相補的ドメインと対形成し、２つの抗原結合部位が作出される。ダイアボディは、例えば、欧州特許第４０４，０９７号；ＷＯ９３／１１１６１；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０：６４４４－６４４８にさらに詳述されている。
本明細書中で使用する場合、用語「親和性」とは、２つの作用物質（例えば、抗体及び抗原）の可逆的結合の平衡定数を指し、解離定数（ＫＤ）として表される。親和性は、無関係なアミノ酸配列に対する抗体の親和性に比べて、少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、少なくとも１００倍、もしくは少なくとも１，０００倍、またはそれ以上であり得る。標的タンパク質に対する抗体の親和性は、例えば、約１００ナノモル濃度（ｎＭ）～約０．１ｎＭ、約１００ｎＭ～約１ピコモル濃度（ｐＭ）、もしくは約１００ｎＭ～約１フェムトモル濃度（ｆＭ）、またはそれ以上であり得る。本明細書中で使用する場合、用語「結合活性」とは、希釈後の解離に対する２つ以上の作用物質の複合体の抵抗性を指す。抗体及び／または抗原結合断片に関すして、用語「免疫反応性」及び「優先的に結合する」は、本明細書中で同じ意味で使用される。
用語「結合」とは、例えば、共有結合、静電結合、疎水性結合、及びイオン結合及び／または塩橋及び水橋などの相互作用を含む水素結合相互作用による２つの分子間の直接会合を指す。「特異的結合」とは、親和性が少なくとも約１０－７Ｍ以上、例えば、親和性が５×１０－７Ｍ、１０－８Ｍ、５×１０－８Ｍ、及びそれ以上の結合を指す。「非特異的結合」とは、親和性が約１０－７Ｍ未満の結合、例えば、親和性が１０－６Ｍ、１０－５Ｍ、１０－４Ｍなどの結合を指す。
「単離された」ポリペプチドとは、その天然の環境の成分から、同定され、分離され、及び／または回収されたポリペプチドである。その天然の環境の混入成分は、ポリペプチドの診断的または治療的使用を妨げる物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含み得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドを、（１）ローリー法によって決定されるタンパク質の９０重量％超、９５重量％超、もしくは９８重量％超、例えば、９９重量％超まで、（２）スピニングカップシークエネーターを使用してＮ末端もしくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５個の残基を得るのに十分な程度まで、または（３）クマシーブルーもしくは銀染色を使用して還元もしくは非還元条件下でドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）により均質になるまで精製する。単離されたポリペプチドには、組換え細胞内のｉｎ ｓｉｔｕのポリペプチドが含まれるが、これは、ポリペプチドの天然の環境の少なくとも１つの成分が存在しないためである。いくつかの例では、単離されたポリペプチドは、少なくとも１つの精製ステップにより調製される。
本開示を通読すれば当業者には明らかであるように、本明細書に記載し例示する個々の実施形態のそれぞれは、本発明の範囲または趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のうちのいずれかの特徴から容易に切り離し、または組み合わせ得る別個の成分及び特徴を有する。記載する方法はいずれも、記載されている事象の順序で、または論理的に可能な任意の他の順序で実施することができる。
値の範囲が提供される場合、文脈が別途明確に指示しない限り、下限値の単位の１０分の１までの、その範囲の上限値から下限値の間の各介在値、ならびにその表示範囲の任意の他の表示値または介在値が、本発明に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限値及び下限値は、独立して、そのより小さい範囲内に含まれてもよく、また、表示範囲内の任意の具体的な除外限度に従って、本発明に包含される。表示範囲がそれらの限界値のうちの一方または両方を含む場合、それらの包含される限界値のうちのいずれかまたは両方を除外する範囲もまた、本発明に包含される。
別段の定義がない限り、本明細書中で使用するすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されている方法及び材料と同様もしくは同等の任意の方法及び材料を、本発明の実践または試験においても使用してもよいが、好ましい方法及び材料を本明細書に記載する。本明細書で言及されるすべての刊行物は、それらの刊行物の引用に関連した方法及び／または材料を開示及び記載するために、参照により本明細書に援用される。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、文脈が別途明らかに規定しない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば、「標的分子」への言及は、複数のそのような標的分子を含み、「生体分子」への言及は、１つ以上の生体分子及び当業者に公知のそれらの等価体などへの言及を含む。特許請求の範囲はあらゆる任意の要素を除外するように作成され得ることにさらに留意されたい。したがって、この記述は、特許請求の範囲の要素の記載に関連する「単に」、「のみ」などの排他的用語の使用、または「否定的な」制限の使用のための先行する基準として機能することが意図される。
明確化のために別個の実施形態の文脈において記載されている本発明の特定の特徴を単一の実施形態において組み合わせて提供してもよいことが理解される。逆に、簡潔にするために単一の実施形態の文脈において説明される本発明の様々な特徴を、別々に、または任意の好適な副組み合わせで提供してもよい。本発明に関連する実施形態のすべての組み合わせは、本発明によって明確に包含され、ありとあらゆる組み合わせが個別にかつ明示的に開示されたかのように、本明細書に開示される。さらに、様々な実施形態及びそれらの要素のすべての副組み合わせも本発明によって明確に包含され、ありとあらゆるそのような副組み合わせが個別にかつ明示的に本明細書に開示されたかのように、本明細書に開示される。
本明細書中で論じる刊行物は、本出願の出願日以前のそれらの開示についてのみ提供される。本明細書におけるいずれの内容も、本発明が先行発明によるそのような刊行物に先行する資格がないことを認めるものと解釈されるべきではない。さらに、提供される刊行物の日付は、実際の刊行日とは異なる場合があり、別々に確認される必要があり得る。
詳細な説明
本開示は、標的分子を化学選択的に修飾する方法を提供する。本開示は、チオール部分を含む本主題の標的分子、及びフェノール部分またはカテコール部分を含む生体分子を含む組成物を提供する。本開示は、本主題の組成物を含む第１の容器、及びフェノール部分またはカテコール部分を酸化することができる酵素を含む第２の容器を提供するキットを提供する。本開示はまた、遺伝子治療、抗体複合体を介した新規免疫療法、生体材料構築及びワクチン開発のための生体分子の送達に用途を見出し得る改変された標的分子を提供する。
方法
上記で要約したように、本開示の態様は、標的分子を化学選択的に修飾する方法を含む。本主題の方法は、チオール部分を含む標的分子を、反応性部分を含む生体分子と接触させることを含み、反応性部分は、フェノール部分またはカテコール部分を含む生体分子と、フェノール部分またはカテコール部分を酸化することができる酵素との反応によって生成される。接触は、標的分子を生体分子と複合体化させるのに十分な条件下で実施され、それにより、修飾された標的分子が生成される。
いくつかの場合では、標的分子の化学選択的修飾のための本主題の方法は、ｉ）チオール部分を含む標的分子；ｉｉ）フェノール部分またはカテコール部分を含む生体分子；及びｉｉｉ）フェノールまたはカテコール部分を酸化することができる酵素に接触させることを含み；酵素は、生体分子のフェノールまたはカテコール部分を酸化して反応性部分を生成し、それによって反応性部分を含む生体分子を生成し、反応性部分は、チオール部分と反応し、それによって標的分子と生体分子を互いに結合させ、それにより、修飾された標的分子が生成される。いくつかの場合では、標的分子は、単一のチオール部分を含む。いくつかの場合では、標的分子は、２つのチオール部分を含む。
標的分子は、様々な分子（例えば、ポリペプチド；核酸；小分子など）のいずれかであり得る。同様に、生体分子は、様々な分子（例えば、ポリペプチド；核酸；小分子など）のいずれかであり得る。いくつかの場合では、標的分子はポリペプチドであり；生体分子は核酸である。いくつかの場合では、標的分子は核酸であり；生体分子はポリペプチドである。いくつかの場合では、標的分子はポリペプチドであり；生体分子は小分子である（例えば、がん化学療法剤）。いくつかの場合では、標的分子は第１のポリペプチドであり；生体分子は第２のポリペプチドであり、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドは同じであっても異なっていてもよい。
本主題の方法は、目的の生体分子を部位特異的な方法で標的分子の表面上の任意の位置に結合させ、それにより、目的の修飾された標的分子を生成させることができる、シンプルなカップリング手順を提供する。いくつかの実施形態では、標的分子は、第２の生体分子である（例えば、本明細書に記載するように）。いくつかの実施形態では、第２の生体分子はポリペプチドである。
対象となる生体分子として、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、脂質、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、その誘導体、構造類似体、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。特定の例では、目的の生体分子は抗体である。いくつかの場合では、目的の生体分子は、抗体断片またはその結合誘導体である。いくつかの場合では、抗体断片またはその結合誘導体は、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、ナノボディ、及びトリアボディからなる群から選択される。好適な生体分子として、例えば、小分子（例えば、がん化学療法剤など）、サイトカイン、ホルモン、免疫調節ポリペプチドなどが挙げられる。いくつかの場合では、生体分子は核酸であり；標的分子は抗体（例えば、ｓｃＦｖ；ナノボディなど）である。いくつかの場合では、生体分子は小分子（例えば、がん化学療法剤）であり；標的分子は抗体（例えば、ｓｃＦｖ；ナノボディなど）である。いくつかの場合では、例えば、標的分子が抗体である場合、生体分子を、標的分子のＦｃ部分に結合させる。いくつかの場合では、標的分子は免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｆｃポリペプチドである。
特定の実施形態では、フェノールまたはカテコール部分を含む生体分子は、フルオロフォア、活性小分子、親和性タグ、及び金属キレート剤（例えば、本明細書に記載の）から選択される１つ以上の部分をさらに含む。特定の例では、目的の生体分子は蛍光タンパク質である。特定の場合では、蛍光タンパク質は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である。特定の場合では、生体分子は酵素である。特定の場合では、生体分子は受容体のリガンドである。特定の場合では、生体分子は受容体である。
いくつかの実施形態では、フェノール部分またはカテコール部分を酸化することができる酵素は、フェノールオキシダーゼまたはカテコールオキシダーゼである。特定の場合では、酵素はチロシナーゼである。
用語「チロシナーゼ」は、本明細書では、フェノール（チロシンなど）の酸化を触媒する酵素であるモノフェノールモノオキシゲナーゼ（ＥＣ１．１４．１８．１；ＣＡＳ番号：９００２－１０－２）を指すために使用される。これは、植物や動物の組織に存在する銅含有酵素であり、酸化によるチロシンからのメラニンやその他の色素の生成を触媒する。すべてのチロシナーゼは、共通して、それらの活性部位内に二核のタイプ３銅中心を有する。そこでは、２つの銅原子がそれぞれ３つのヒスチジン残基と配位している。Ｍａｔｏｂａ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｄｉｎｕｃｌｅａｒ ｃｏｐｐｅｒ ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ ｉｓ ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｄｕｒｉｎｇ ｃａｔａｌｙｓｉｓ，” Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００６ Ｍａｒ ３１；２８１（１３）：８９８１－９０． Ｅｐｕｂ ２００６ Ｊａｎ ２５は、チロシナーゼ触媒中心の３次元モデルを開示している。
特定の実施形態では、本主題の酵素は、固体支持体系、例えば、ビーズ、樹脂、ゲル、ミクロスフェア、または他の幾何学的構成に固定されている。特定の場合では、固体支持体はガラスビーズである。いくつかの場合では、固体支持体は樹脂ビーズである。固体支持系に付着させた酵素を使用することにより、本主題の酵素の複数回の使用が可能になり、反応混合物から酵素を容易に除去可能とすることにより、本主題の標的分子の精製を容易にすることができる。特定の実施形態では、固体支持体系に付着させた本主題の酵素は、本主題の方法を連続フロー系で実施することを可能にすることができる。特定の実施形態では、固体支持体系に付着させた本主題の酵素は、本主題の方法の大規模なバッチ処理を容易にすることができる。
特定の場合では、本主題のフェノール部分は、チロシン残基に存在する。特定の場合では、チロシン残基は、目的の生体分子の一部である。特定の場合では、チロシン残基を、目的の生体分子内に合成的に導入する。他のいくつかの場合では、チロシン残基を、リンカーを介して目的の生体分子に連結させる（例えば、本明細書に記載のように）。チロシン残基は、標準的な組換え技術を使用して、例えば、チロシン残基がポリペプチド生体分子に導入されるようにポリペプチド生体分子をコードするヌクレオチド配列を改変することによって導入することができる。
いくつかの場合では、フェノールまたはカテコール部分は、目的の生体分子に導入する非天然（遺伝的にコードされていない）アミノ酸の一部である。例えば、アンバーコドン（ＴＡＧ）サプレッションを使用して、フェノール部分またはカテコール部分を含む遺伝的にコードされていないアミノ酸残基を組み込むことができる。例えば、Ｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：９０２６；Ｃｈｉｎ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ（２００２）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３：１１３５；Ｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：１１０２０；Ｕ．Ｓ．２０１５／０２４０２４９；及びＵＳ２０１８／０１７１３２１を参照のこと。別の例として、直交ＲＮＡシンテターゼ及び／または直交ｔＲＮＡは、遺伝的にコードされていないアミノ酸を生体分子に導入するために使用することができ、遺伝的にコードされていないアミノ酸は、フェノール部分またはカテコール部分を含む。
本主題の方法のいくつかの実施形態では、標的分子に存在するチオール部分は、システイン残基の一部である。特定の場合では、システイン残基は、天然のシステイン残基である。特定の場合では、システイン残基は、標的分子に合成的に導入される残基である。
特定の実施形態では、反応性部分は、オルトキノンもしくはセミキノンラジカル、またはそれらの組み合わせである。特定の実施形態では、本主題の方法は、以下のスキーム１に示すように、オルトキノン反応性中間体とチオール部分との間の反応を提供する。
Figure 2022527247000001
スキーム１
式中、Ｙ１は、活性小分子、切断可能なプローブ、フルオロフォア、及び金属キレート剤から選択される１つ以上の部分を任意選択で含む任意の簡便な生体分子であり；Ｌは、任意選択のリンカーであり（例えば、本明細書に記載のように）；Ｘ１は、水素及びヒドロキシルから選択され；Ｙ２は、任意の簡便な生体分子であり；ｎは、１～３の整数である。
スキーム１に示すように、特定の実施形態では、フェノールまたはカテコール部分を含む生体分子（例えば、式（Ｉ）の）は、フェノールまたはカテコール部分を酸化することができる酵素で活性化を受ける。いくつかの場合では、活性化は、酸素の存在下でチロシナーゼ酵素を用いて達成され、反応性部分を含む中間体（例えば、式（ＩＩ）のオルトキノン及び／または式（ＩＩＡ）のセミキノンラジカル）を生成し、前記反応性部分は、チオール系求核試薬（例えば、式（ＩＩＩ）の）を含む標的分子と反応して、標的分子と生体分子の複合体化をもたらし、それにより、修飾された標的分子（例えば、式（ｇｅｎＩＶ）の）が生成される。特定の実施形態では、式（ＩＩＩ）の標的分子は、例えば、本明細書に記載のような任意の簡便な生体分子を含み得る。特定の場合では、式（ＩＩＩ）中のＹ２はポリペプチドである。特定の場合では、修飾された分子は、式（ＩＶ）で表される。いくつかの場合では、修飾された標的分子は、式（ＩＶＡ）で表される。特定の場合では、修飾された標的分子は、本明細書に記載のように、式（ＩＶ）～（ＩＶＬ）のいずれか１つによって記述される。
特定の実施形態では、本主題の方法は、以下のスキーム２：
Figure 2022527247000002
に示すように、オルトキノン反応性中間体とチオール部分との間の反応を提供する。
スキーム２に示すように、特定の実施形態では、フェノール部分（例えば、式（ＩＢ）の）を含む生体分子は、酸素の存在下でチロシナーゼ酵素による活性化を受けて、反応性部分（例えば、式（ＩＩ）のオルトキノン）を含む中間体を生成し、前記反応性部分は、チオール系求核試薬（例えば、式（ＩＩＩ）の）を含む標的分子と反応して、標的分子と生体分子の複合体化をもたらし、それにより、修飾された標的分子（例えば、式（ＩＶＭ）の）が生成される。特定の実施形態では、式（ＩＩＩ）の標的分子は、例えば、本明細書に記載のような任意の簡便な生体分子を含み得る。特定の場合では、式（ＩＩＩ）中のＹ２はポリペプチドである。式（ＩＶＭ）の修飾された分子の特定の場合では、チオール基は、カテコール環の３位に存在する。式（ＩＶＭ）の修飾された分子の特定の場合では、チオール基は、カテコール環の５位に存在する。式（ＩＶＭ）の修飾された分子の特定の場合では、チオール基は、カテコール環の６位に存在する。
特定の実施形態では、式（Ｉ）の生体分子は、例えば、本明細書に記載し、以下でより詳細に論じるように、式（ＩＡ）～（ＩＤｂ）のいずれか１つであり得る。特定の実施形態では、修飾された標的分子は、例えば、本明細書に記載し、以下により詳細に論じるように、式（ＩＶ）～（ＩＶＬ）のいずれか１つであり得る。特定の実施形態では、修飾された標的分子は、例えば、式（ＩＶ１）～（ＩＶ３）、（ＩＶＡ１）～（ＩＶＡ３）、（ＩＶＢ１）～（ＩＶＢ３）、（ＩＶＣ１）～（ＩＶＣ３）、（ＩＶＤ１）～（ＩＶＤ３）、（ＩＶＥ１）～（ＩＶＥ３）、（ＩＶＦ１）～（ＩＶＦ３）、（ＩＶＧ１）～（ＩＶＧ３）、（ＩＶＨ１）～（ＩＶＨ３）及び（ＩＶＪ１）～（ＩＶＪ３）に示すように、単一の複合体化の産物である。特定の場合では、修飾された標的分子は、例えば、式（ＩＶ４）～（ＩＶ５）、（ＩＶＡ４）～（ＩＶＡ５）、（ＩＶＢ４）～（ＩＶＢ５）、（ＩＶＣ４）～（ＩＶＣ５）、（ＩＶＤ４）～（ＩＶＤ５）、（ＩＶＥ４）～（ＩＶＥ５）、（ＩＶＦ４）～（ＩＶＦ５）、（ＩＶＧ４）～（ＩＶＧ５）、（ＩＶＨ４）～（ＩＶＨ５）及び（ＩＶＪ４）～（ＩＶＪ５）に示すように、二重の複合体化の産物である。
特定の実施形態では、本主題の方法を、ｐＨ４～９、例えば、４．２、４．５、４．８、５．０、５．２、５．５、５．８、６．０、６．２、６．５、６．８、７．０、７．２、７．５、７．８、８．０、８．２、８．５、８．８または９で実施する。特定の実施形態では、本主題の方法を、ｐＨ５～８、例えば、５．２、５．５、５．８、６．０、６．２、６．５、６．８、７．０、７．２、７．５、７．８または８．０で実施する。特定の場合では、本主題の方法を、ｐＨ６～７．５、例えば、６．０、６．３、６．４、６．５、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４、または７．５で実施する。特定の実施形態では、本主題の方法を、中性ｐＨで実施する。本明細書中で使用する場合、表現「中性ｐＨ」とは、ｐＨ約７．０～約７．４を意味する。表現「中性ｐＨ」は、約７．０、７．０５、７．１、７．１５、７．２、７．２５、７．３、７．３５、及び７．４のｐＨ値を含む。
特定の実施形態では、本主題の方法を、生理学的条件下で実施してもよい。いくつかの実施形態では、方法を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで生細胞に対して実施する。他の実施形態では、方法を、ｅｘ ｖｉｖｏで生細胞に対して実施する。
特定の実施形態では、本主題の方法を、１つ以上の緩衝液の存在下で、水性媒体中で実施してもよい。対象となる緩衝液として、リン酸緩衝液、２－アミノ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－１，３－ジオール（ＴＲＩＳ）、４－［４－（２－ヒドロキシエチル）ピペルジン－１－イル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）などが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、本主題の方法を、有機溶媒中で実施してもよい。特定の場合では、有機溶媒は水混和性溶媒である。特定の場合では、有機溶媒は双極性非プロトン性溶媒である。特定の場合では、有機溶媒は、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、メタノール、及びアセトンから選択される。特定の場合では、有機溶媒を、水に対して１～２０％、例えば、２％、５％、１０％、１５％、または２０％の量で存在させる。いくつかの場合では、本主題の方法を、１％～２０％、例えば、５％、１０％、１５％、または２０％のアセトニトリルで実施する。いくつかの場合では、本主題の方法を、１％～２０％、例えば、５％、１０％、１５％、または２０％のジメチルホルムアミドで実施する。いくつかの場合では、本主題の方法を、１％～２０％、例えば、５％、１０％、１５％、または２０％のメタノールで実施する。いくつかの場合では、本主題の方法を、１％～２０％、例えば、５％、１０％、１５％、または２０％のアセトンで実施する。
本主題の方法の特定の実施形態では、修飾された標的分子は、二重または三重の複合体化の産物である（例えば、ｎが２または３である場合、式（ＩＶ）を参照のこと（本明細書ではまとめて「複数の複合体化産物」と呼ぶ））。本主題の方法の特定の実施形態では、複数の複合体化産物を、単一の複合体化産物（例えば、ｎが１の場合、式（ＩＶ）を参照のこと）に比べて、重量部で、１０分の１未満、例えば、２０分の１未満、２５分の１未満、５０分の１未満、７５分の１未満、１００分の１未満、またはそれ未満で存在させる。本主題の方法の特定の実施形態では、複数の複合体化産物は観察されない。
方法の特定の実施形態では、修飾された標的分子は、ある範囲のｐＨ及び温度値において、ならびにいくつかの追加の分子の存在下で安定である。いくつかの場合では、修飾された標的分子は、０℃～５０℃、例えば、４℃～４０℃、例えば、４℃～３７℃で安定である。特定の場合では、修飾された標的分子は、ｐＨ範囲４～９、例えば、ｐＨ ４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、または９にわたって安定である。特定の場合では、修飾された標的分子は、生物学的に関連する分子の存在下で安定である。特定の場合では、修飾された標的分子は、アルギニン残基のグアニジニウム基、リジン残基の第一級アミン、及びアニリン部分などの分子の存在下で安定である。いくつかの場合では、修飾された標的分子は生理学的条件で安定であり；例えば、いくつかの場合では、修飾された標的分子は、ヒト血清中で安定である。いくつかの場合では、修飾された標的分子（本明細書中では「標的分子－生体分子複合体」とも呼ばれる）は、３７℃で、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも１０日間、または少なくとも１４日間の一定期間、ヒト血清中で安定である。いくつかの場合では、修飾された標的分子（本明細書中では「標的分子－生体分子複合体」とも呼ばれる）は、３７℃で、約２日間～約７日間、約７日間～約１０日間、または約１０日間～約１４日間の期間、ヒト血清中で安定である。
上記のように、いくつかの場合では、標的分子は、単一のチオール部分を含む。他の例では、標的分子は、２つのチオール部分を含む。最初の酸化的カップリング反応に適格であることに加えて、新たに形成されるカテコールの近くに第２のチオールを有する求核試薬は、再酸化の場合に再度付加し得る。第２の付加の分子内の性質は、生物学的環境においてグルタチオンまたは遊離チオールを有する他の分子による第２の付加を防止または最小化し得る。ジチオール求核試薬（ジチオール標的分子）の使用例を図４４Ａに模式的に示す。
この戦略の別の実施形態は、２つのシステイン残基を有するタンパク質カップリングパートナーであり得る。システイン残基は、タンパク質のアミノ酸配列におけるそれらの位置によって互いに近接させることができ、またはタンパク質の三次元構造におけるそれらの位置によって近接させることができる。ポリペプチドには、ジチオールを含ませることができ、ポリペプチドは、例えば、ＣＣ、ＣＧＣ、ＣＧＧＣ（配列番号１０５５）、またはＣＧＧＧＣ（配列番号１０５６）配列を含む。例えば、ポリペプチドは、一般式：Ｘｎ１Ｃ（Ｘ）ｎ２ＣＸｎ３（配列番号１０５７）のアミノ酸配列を含み得、Ｘは、任意の天然（コード）または非天然（非コード）アミノ酸であり、ｎ１及びｎ３は、それぞれ独立してゼロまたは１～５０００（または５０００超）の整数であり、ｎ２は、ゼロまたは１～約１０の整数である。そのようなジチオール標的分子の使用例を、図４４Ｂに模式的に示す。
チロシナーゼポリペプチド
反応性部分（例えば、オルトキノン）の生成に使用するのに適したチロシナーゼポリペプチドには、図８、図９、図１０Ａ～１０Ｚ、及び図１０ＡＡ～１０ＶＶに示すチロシナーゼのアミノ酸配列のいずれか１つに対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するチロシナーゼポリペプチドが含まれる。いくつかの場合では、チロシナーゼポリペプチドは、アガリクス・ビスポラス（Ａｇｒｉｃｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓ）チロシナーゼポリペプチドである。いくつかの場合では、チロシナーゼポリペプチドは、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）チロシナーゼポリペプチドである。いくつかの場合では、チロシナーゼポリペプチドは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｓｔａｎｅｏｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓチロシナーゼポリペプチドである。いくつかの場合では、チロシナーゼポリペプチドは、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉチロシナーゼポリペプチドである。いくつかの場合では、チロシナーゼポリペプチドは、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓチロシナーゼポリペプチドである。いくつかの場合では、チロシナーゼポリペプチドは、Ｍａｌｕｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃａチロシナーゼポリペプチドである。いくつかの場合では、チロシナーゼポリペプチドは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅチロシナーゼポリペプチドである。いくつかの場合では、チロシナーゼポリペプチドは、Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍチロシナーゼポリペプチドである。いくつかの場合では、チロシナーゼポリペプチドは、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓチロシナーゼポリペプチドである。いくつかの場合では、チロシナーゼポリペプチドは、Ｊｕｇｌａｎｓ ｒｅｇｉａチロシナーゼポリペプチドである。例えば、Ｐｒｅｔｚｌｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．２０１７，７（１），１８１０；Ｒｅｎ ｅｔ ａｌ． ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３，１３，１８；Ｆａｃｃｉｏ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１２，４７（１２），１７４９－１７６０；Ｆａｉｒｈｅａｄ ｅｔ ａｌ． ＦＥＢＳ Ｊ．２０１０，２７７（９），２０８３－２０９５；Ｄｏ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．２０１７，７（１），１７２６７；Ｅｌｓａｙｅｄ ａｎｄ Ｄａｎｉａｌ Ｊ．Ａｐｐｌ． Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．２０１８，８（０９），９３－１０１；Ｌｏｐｅｚ－Ｔｅｊｅｄｏｒ ａｎｄ Ｐａｌｏｍｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ． Ｐｕｒｉｆ．２０１８，１４５，６４－７０；及びＦａｉｒｈｅａｄ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１２，２９（２），１８３－１９１を参照のこと。
いくつかの場合では、チロシナーゼポリペプチドは、フェノール部分（例えば、チロシン）またはカテコール部分を含む基質（生体分子）に選択的に作用し（例えば、オルトキノンなどの反応性部分を生成する）、基質は、フェノールまたはカテコール部分の５０Å以内（例えば、５０Å以内、４０Å以内、３０Å以内、または２０Å以内）において、中性であるかまたは正に荷電している。図８または図９に示されているチロシナーゼのアミノ酸配列のいずれか１つに対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するチロシナーゼは、基質上のフェノールまたはカテコール部分を選択的に修飾することができ、基質は、フェノールまたはカテコール部分の５０Å以内（例えば、５０Å以内、４０Å以内、３０Å以内、または２０Å以内）において、中性であるかまたは正に荷電している。例えば、生体分子がポリペプチドである場合、いくつかの場合では、生体分子は、フェノール部分（例えば、チロシン）またはカテコール部分の１０アミノ酸以内に少なくとも２つの中性または正に荷電したアミノ酸を含む。例えば、生体分子がポリペプチドである場合、いくつかの場合では、生体分子は、フェノール部分（例えば、チロシン）またはカテコール部分の１０アミノ酸以内に２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の中性または正に荷電したアミノ酸を含む。例えば、生体分子がポリペプチドである場合、いくつかの場合では、生体分子は、アミノ酸配列ＲＲＲＹ（配列番号９４９）、ＹＲＲＲ（配列番号９５０）、ＲＲＲＲＹ（配列番号９５１）、またはＹＲＲＲＲ（配列番号９５２）を含む。
いくつかの場合では、チロシナーゼポリペプチドは、フェノール部分（例えば、チロシン）またはカテコール部分を含む基質（生体分子）に選択的に作用し（例えば、オルトキノンなどの反応性部分を生成する）、基質は、フェノールまたはカテコール部分の５０Å以内（例えば、５０Å以内、４０Å以内、３０Å以内、または２０Å以内）において、負に荷電している。図１０Ａ～１０Ｚ及び１０ＡＡ～１０ＶＶに示すチロシナーゼのアミノ酸配列のいずれか１つに対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するチロシナーゼは、基質上のフェノールまたはカテコール部分を選択的に修飾することができ、基質は、フェノールまたはカテコール部分の５０Å以内（例えば、５０Å以内、４０Å以内、３０Å以内、または２０Å以内）において、負に荷電している。例えば、生体分子がポリペプチドである場合、いくつかの場合では、生体分子は、フェノール部分（例えば、チロシン）またはカテコール部分の１０アミノ酸以内に少なくとも２つの負に荷電したアミノ酸を含む。例えば、生体分子がポリペプチドである場合、いくつかの場合では、生体分子は、フェノール部分（例えば、チロシン）またはカテコール部分の１０アミノ酸以内に２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の負に荷電したアミノ酸を含む。例えば、生体分子がポリペプチドである場合、いくつかの場合では、生体分子は、アミノ酸配列ＥＥＥＹ（配列番号９５３）、ＹＥＥＥ（配列番号９５４）、ＥＥＥＥＹ（配列番号９５５）、またはＹＥＥＥＥ（配列番号９５６）を含む。
いくつかの場合では、チロシナーゼポリペプチドは、図１０Ｍに示すチロシナーゼのアミノ酸配列に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、チロシナーゼポリペプチドは、Ｄ５５のアミノ酸置換を含み、例えば、Ｄ５５は、Ｌｙｓに置換されている。そのようなチロシナーゼポリペプチドは、生体分子が正味の負電荷を有し、及び／またはフェノールまたはカテコール部分を取り囲む領域が正味の負電荷を有する（例えば、フェノール基がＴｙｒである場合、Ｔｙｒは、ＥＥＥＥＹ（配列番号９５５）またはＥＥＥＹ（配列番号９５３）ペプチドに存在し得る）場合に特に有用である。そのようなチロシナーゼポリペプチドは、生体分子が核酸である場合に特に有用である。
いくつかの場合では、チロシナーゼポリペプチドは、図１０Ｃに示すチロシナーゼのアミノ酸配列に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有し、チロシナーゼポリペプチドは、Ｒ２０９のアミノ酸置換を含み、例えば、Ｒ２０９は、Ｈｉｓに置換されている。そのようなチロシナーゼポリペプチドは、生体分子が正味の正電荷を有し、及び／またはフェノールまたはカテコール部分を取り囲む領域が正味の正電荷を有する（例えば、フェノール基がＴｙｒである場合、Ｔｙｒは、ＲＲＲＹ（配列番号９４９）またはＲＲＲＲＹ（配列番号９５１）ペプチドに存在し得る）場合に特に有用である。
細胞表面の修飾
いくつかの実施形態では、本主題の方法を使用して、細胞の表面を修飾する。したがって、一態様では、本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞の表面を修飾する方法を特徴とする。この方法は、一般的に、標的分子のチオール基を、反応性部分を含む生体分子と反応させて、細胞表面での化学選択的複合体化を提供することを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、細胞表面上の標的分子をチオール部分で修飾し；標的分子のチオール部分を、反応性部分（例えば、オルトキノン部分）を含む生体分子と反応させることを含む。他の実施形態では、この方法は、細胞表面上にフェノール部分を含む生体分子を活性化して、反応性部分を含む生体分子を生成し；生体分子の反応性部分を、チオール部分を含む標的分子と反応させることを含む。
検出可能な標識、薬物、及び他の分子による標的分子の修飾
いくつかの実施形態では、本開示は、チオール部分を含む標的分子への目的の生体分子の結合を提供する。この方法は、一般的に、チオール含有標的分子を、反応性部分（例えば、オルトキノン部分）を含む本主題の生体分子と反応させることを含む。対象となる標的分子及び生体分子として、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体などが挙げられるが、これらに限定されない。
関心対象の生体分子の支持体への結合
反応性部分を含む生体分子はまた、（例えば、アッセイを容易にするために）固体基層への結合を提供する部分、または容易な分離を提供する部分（例えば、磁気ビーズに結合した抗体によって認識されるハプテン）に複合体化した１つ以上の炭化水素リンカー（例えば、アルキル基またはその誘導体、例えば、アルキルエステルまたはＰＥＧ）を含み得る。一実施形態では、本発明の方法を使用して、定義された配向でのチップへのタンパク質（またはチオールを含むか、もしくはチオールを含むように修飾可能な他の分子）の結合を提供する。例えば、本開示の方法及び組成物を使用して、タグまたは他の部分（例えば、本明細書に記載の）を、標的分子のチオール、例えば、選択された部位（例えば、Ｎ末端またはその近位）にチオール部分を有するポリペプチドに送達することができる。タグまたは他の部分は、次いで、支持体（例えば、固体または半固体支持体、例えば、ハイスループットアッセイにおけるマイクロチップとしての使用に適した支持体）に分子を固定するための結合部位として使用することができる。
標的部位に送達するための生体分子の結合
反応性部分を含む生体分子は、いくつかの実施形態では、細胞に送達するための小分子薬、毒素、または他の分子を含む。小分子薬、毒素、または他の分子は、いくつかの実施形態では、薬理学的活性を提供する。小分子薬、毒素、または他の分子は、いくつかの実施形態では、他の分子の送達の標的として機能する。
小分子薬は、分子量が５０ダルトンより大きく、約２５００ダルトン未満の小型の有機または無機化合物であり得る。小分子薬は、タンパク質との構造的相互作用、特に水素結合に必要な官能基を含み得、少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基を含み得、そして少なくとも２つの官能化学基を含み得る。この薬物は、上記の官能基のうちの１つ以上と置換される環式炭素または複素環式構造及び／または芳香族または多環芳香族構造を含む。小分子薬はまた、ペプチド類、糖類、脂肪酸類、ステロイド類、プリン類、ピリミジン類、誘導体類、構造類似体類またはそれらの組み合わせを含む、生体分子間に見出される。
別の実施形態では、反応性部分を含む本主題の生体分子は、一対の結合パートナー（例えば、リガンド；受容体のリガンド結合部分；抗体；抗体の抗原結合断片；抗原；ハプテン；レクチン；レクチン結合炭水化物など）を含む。例えば、生体分子は、ウイルス受容体として機能し、ウイルスエンベロープタンパク質またはウイルスキャプシドタンパク質と結合すると、生体分子が提示される細胞表面へのウイルスの結合を促進するポリペプチドを含み得る。あるいは、生体分子は、抗体（例えば、モノクローナル抗体）と特異的に結合して、細胞表面に抗原を提示する宿主細胞の検出及び／または分離を容易にする抗原を含む。別の例では、生体分子は、受容体のリガンド結合部分、またはリガンドの受容体結合部分を含む。
化合物
フェノール部分またはカテコール部分を含む生体分子
本主題の方法の特定の実施形態では、フェノール部分またはカテコール部分を含む生体分子を、式（Ｉ）：
Figure 2022527247000003
によって記述され、式中、Ｙ１は生体分子であり、任意選択で、活性小分子、親和性タグ、フルオロフォア、及び金属キレート剤から選択される１つ以上の部分を含み；Ｘ１は、水素及びヒドロキシルから選択され；Ｌは任意選択のリンカーである。
式（Ｉ）の特定の実施形態では、Ｘ１は水素であり、その結果、生体分子はフェノール部分を含む。式（Ｉ）の他の実施形態では、Ｘ１はヒドロキシルであり、その結果、生体分子はカテコール部分を含む。
式（Ｉ）のいくつかの実施形態では、フェノール部分は、チロシン残基に存在する。特定の場合では、式（Ｉ）のフェノール部分を含む生体分子は、式（ＩＢ）または（ＩＣ）：
Figure 2022527247000004
の生体分子であり、式中、Ｒ２ はアルキル、及び置換アルキルから選択され；Ｒ３は、水素、アルキル、置換アルキル、ペプチド、及びポリペプチドから選択される。
本主題の方法の特定の実施形態では、フェノール部分またはカテコール（例えば、式（Ｉ）の）を含む生体分子は、リンカー（例えば、本明細書に記載の）を含む。好適なリンカーとして、カルボン酸、アルキルエステル、アリールエステル、置換アリールエステル、アルデヒド、アミド、アリールアミド、ハロゲン化アルキル、チオエステル、スルホニルエステル、アルキルケトン、アリールケトン、置換アリールケトン、ハロスルホニル、ニトリル、ニトロ、ＰＥＧ、及びペプチドリンカーが挙げられるが、これらに限定されない。
フェノール部分を目的の本主題の生体分子に連結する際に使用するための例示的なリンカーは、いくつかの実施形態では、ＰＥＧリンカーを含む。本明細書中で使用する場合、用語「ＰＥＧ」とは、ポリエチレングリコールまたは修飾ポリエチレングリコールを指す。修飾ポリエチレングリコールポリマーには、メトキシポリエチレングリコール、及び非置換であるか、または一端がアルキル、置換アルキル、または官能基で置換されているポリマーが含まれる（例えば、本明細書に記載のように）。任意の簡便な連結基をＰＥＧの末端で利用して、この基を、アルキル、アリール、ヒドロキシル、アミノ、アシル、アシルオキシ、カルボキシルエステル及びアミド末端及び／または置換基を含むがこれらに限定されない目的の部分に接続することができる。特定の例では、リンカーは、１つより多くのＰＥＧユニット、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のＰＥＧユニットを含む。特定の例では、リンカーは、１０未満のＰＥＧユニット、例えば、９、８、７、６、５、４、３、２または１個のＰＥＧユニットを含む。特定の場合では、リンカーは、４つ以下のＰＥＧユニットからなる。
特定の場合では、フェノール部分を含む生体分子は、式（ＩＡ）：
Figure 2022527247000005
によって記述され、式中：
Ｙ１は、任意選択で、活性小分子、親和性タグ、フルオロフォア、及び金属キレート剤から選択される１つ以上の基を含む生体分子である。
各Ｒ１は、独立して、水素、アシル、置換アシル、アルキル、及び置換アルキルから選択され；
Ｘ１は、水素及びヒドロキシルから選択され；かつ
Ｌ１は、直鎖または分岐アルキル、直鎖または分枝置換アルキル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、置換ＰＥＧ、及び１つ以上のペプチドから選択されるリンカーである。
特定の実施形態では、Ｘ１は水素であり、その結果、式（ＩＡ）の化合物は、式（ＩＡａ）：
Figure 2022527247000006
の化合物である。
上記の式（ＩＡ）～（ＩＡａ）のいずれかの特定の実施形態では、少なくとも１つのＲ１は水素である。特定の場合では、両方のＲ１基は水素である。特定の場合では、一方のＲ１基は水素であり、他方のＲ１基は、アルキル、置換アルキル、アシル、及び置換アシルから選択される。特定の場合では、一方のＲ１基は水素であり、他方のＲ１基はアルキルである。いくつかの場合では、一方のＲ１基は水素であり、他方のＲ１基は置換アルキルである。特定の場合では、一方のＲ１基は水素であり、他方のＲ１基はアシルである。特定の場合では、一方のＲ１基は水素であり、他方のＲ１基は置換アシルである。いくつかの場合では、アシル基は、式－Ｃ（Ｏ）Ｒ４であり、Ｒ４は低級アルキル基、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、またはヘキシルである。いくつかの場合では、置換アシル基は式－Ｃ（Ｏ）Ｒ４ＮＨ２であり、Ｒ４は低級アルキル基、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチルまたはヘキシルである。いくつかの場合では、置換アシル基は式－Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＮＨ２である。
式（ＩＡ）～（ＩＡａ）のいずれかの特定の実施形態では、Ｌ１は、直鎖または分岐アルキルである。特定の場合では、Ｌ１は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、またはヘキシルなどの低級アルキル基である。特定の場合では、Ｌ１は置換アルキル基である。特定の場合では、Ｌ１は置換低級アルキル基である。特定の場合では、Ｌ１はＰＥＧまたは置換ＰＥＧである（例えば、本明細書に記載のように）。他の特定の場合では、Ｌ１はペプチドである。他の特定の場合では、Ｌ１はポリペプチドである。特定の場合では、Ｌ１は、長さが１～１２原子、例えば、長さが１～１０、１～８、または１～６原子、例えば、長さが１、２、３、４、５または６原子の直鎖リンカーである。リンカーＬ１は、（Ｃ１－６）アルキルリンカーまたは置換（Ｃ１－６）アルキルリンカーであり得、任意選択で、エステル（－ＣＯ２－）、アミド（ＣＯＮＨ）、カルバメート（ＯＣＯＮＨ）、エーテル（－Ｏ－）、チオエーテル（－Ｓ－）及び／またはアミノ基（－ＮＲ－、式中、Ｒは、Ｈまたはアルキルである）などのヘテロ原子または連結官能基で置換されている。特定の場合では、リンカーＬ１は、ケト（Ｃ＝Ｏ）基を含み得る。特定の場合では、ケト基は、リンカー鎖のアミノ、チオール、またはエーテル基と一緒になって、アミド、エステル、またはチオエステル基の結合を提供することができる。
特定の実施形態では、連結基ＬまたはＬ１は、例えば、本明細書に記載のように、切断可能なリンカーである。
特定の実施形態では、フェノールまたはカテコール部分を含む生体分子を、式（ＩＤ）：
Figure 2022527247000007
によって記述され、式中、Ｙ１は生体分子であり、任意選択で、活性小分子、親和性タグ、フルオロフォア、及び金属キレート剤から選択される１つ以上の基を含み；Ｘ１は、水素及びヒドロキシルから選択され；ｎは、０～２０の整数である。特定の場合では、ｎは１０以下、例えば、９、８、７、６、５、４、３、２、１または０である。特定の場合では、ｎは５である。特定の場合では、ｎは４である。特定の場合では、ｎは３である。特定の場合では、ｎは２である。特定の場合では、ｎは１である。特定の場合では、ｎは０である。
特定の実施形態では、ｎは１であり、その結果、式（ＩＤ）の化合物は式（ＩＤａ）：
Figure 2022527247000008
の化合物である。
式（ＩＤ）または（ＩＤａ）の特定の実施形態では、Ｘ１は水素であり、その結果、生体分子はフェノール部分を含む。式（ＩＤ）または（ＩＤａ）の他の実施形態では、Ｘ１はヒドロキシルであり、その結果、生体分子はカテコール部分を含む。
特定の場合では、式（ＩＤａ）の化合物は、式（ＩＤｂ）：
Figure 2022527247000009
の化合物である。
式（ＩＤ）～（ＩＤｂ）のいずれかの化合物は、チラミン、または対応するフェノールもしくはカテコール含有アミンを、適切な溶媒中でＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルまたはマレイミド基を含む生体分子と反応させることによって調製してもよい。例えば、式（ＩＤｂ）の化合物は、以下のスキーム３に示すように、ＮＨＳ－エステル（Ｙ１－ＮＨＳ）を乾燥ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中でチラミンと反応させて、化合物（ＩＤｂ）を提供することによって調製してもよい。
Figure 2022527247000010
スキーム３
フェノール部分またはカテコール部分（例えば、式（Ｉ）～（ＩＤｂ）のいずれか）を含む生体分子は、任意の簡便な方法によって調製され得ることが理解されよう。本主題のフェノール及びカテコール含有部分を合成するのに有用な一般的に知られている化学合成スキーム及び条件を提供する多くの一般的な参考文献が利用可能である（例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｍａｒｃｈ，Ｍａｒｃｈ’ｓ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，２００１；またはＶｏｇｅｌ，Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｌｏｎｇｍａｎ，１９７８を参照のこと）。本明細書に開示するように、特定の場合では、本主題のフェノール部分は、チロシン残基に存在する。チロシン残基は、目的の生体分子の一部であり得る。他の場合では、チロシン部分は、目的の生体分子に合成的に導入してもよい。例えば、生体分子がペプチドまたはポリペプチドである場合、チロシン残基を、標準的な固相Ｆｍｏｃペプチド化学（Ｆｉｅｌｄｓ ＧＢ，Ｎｏｂｌｅ ＲＬ． Ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ９－ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ． Ｉｎｔ Ｊ Ｐｅｐｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ ３５：１６１－２１４，１９９０）によって導入してもよい。いくつかの場合では、フェノールまたはカテコール部分は、目的の生体分子に導入する非天然（遺伝的にコードされていない）アミノ酸の一部である。例えば、アンバーコドン（ＴＡＧ）サプレッションを使用して、フェノール部分またはカテコール部分を含む遺伝的にコードされていないアミノ酸残基を組み込むことができる。例えば、Ｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：９０２６；Ｃｈｉｎ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ（２００２）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３：１１３５；Ｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：１１０２０；Ｕ．Ｓ．２０１５／０２４０２４９；及びＵＳ２０１８／０１７１３２１を参照のこと。別の例として、直交ＲＮＡシンテターゼ及び／または直交ｔＲＮＡは、遺伝的にコードされていないアミノ酸を生体分子に導入するために使用することができ、遺伝的にコードされていないアミノ酸は、フェノール部分またはカテコール部分を含む。
式（Ｉ）～（ＩＤｂ）のいずれか１つのいくつかの実施形態では、目的の生体分子は、活性小分子、親和性タグ、フルオロフォア、及び金属キレート剤から選択される１つ以上の基を含む。特定の場合では、フルオロフォアはローダミン色素である。特定の場合では、フルオロフォアはキサンテン色素である。特定の場合では、フルオロフォアはＯｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ４８８である。特定の場合では、金属キレート剤は、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸（ＤＯＴＡ、またはテトラキセタンとも呼ばれる）である。特定の場合では、親和性タグはビオチン部分である（例えば、本明細書に記載のように）。
特定の場合では、フェノール部分を含む生体分子は、図３に示すような構造によって記述される。
チオール部分を含む標的分子
チオール部分を含み、本主題の方法での使用に適した分子、及び本主題の方法での使用に適したチオール含有分子を生成する方法は、当技術分野で周知である。
標的分子は、天然か、または合成的または組換え的に産生され得、そして単離されるか、実質的に精製されるか、またはチオール含有標的分子が基づく、未修飾分子の天然環境内（例えば、宿主動物、例えば、哺乳類、例えば、ネズミ宿主（例えば、ラット、マウス）、ハムスター、イヌ、ネコ、ウシ、ブタなどを含む、細胞表面または細胞内）に存在し得る。いくつかの実施形態では、標的分子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで無細胞反応物中に存在する。他の実施形態では、標的分子は、細胞内に存在し、及び／または細胞表面に提示される。目的の多くの実施形態では、標的分子は、生細胞内；生細胞の表面；生物、例えば、生きている多細胞生物内にある。好適な生細胞には、生きている多細胞生物の一部である細胞；多細胞生物から分離された細胞；不死化細胞株などが含まれる。
標的分子は、Ｄ－アミノ酸、Ｌ－アミノ酸、またはその両方からなっていてもよく、他の部分を含むように、天然、合成、または組換えのいずれかでさらに修飾されていてもよい。例えば、標的分子は、リポタンパク質、糖タンパク質、または他のそのような修飾タンパク質であってもよい。
一般的に、標的分子は、本発明による反応性部分を含む生体分子との反応のための少なくとも１つのチオール部分を含むが、２つ以上、３つ以上、５つ以上、１０つ以上のチオール部分を含んでいてもよい。標的分子に存在し得るチオール部分の数は、本明細書に開示する方法を実施する際に、反応の修飾された標的分子の意図された用途、標的分子自体の性質、及び当業者に容易に明らかである他の考慮事項に応じて様々に異なる。
標的分子は、反応性部分を含む生体分子への結合が望まれる部位でチオール部分を含むように修飾することができる。例えば、標的分子がペプチドまたはポリペプチドである場合、標的分子基質を、Ｎ末端チオール部分を含むように修飾し、それにより、チオール部分を含む本主題の標的ペプチドまたはポリペプチドを生成してもよい。ペプチドまたはポリペプチド基質上の任意の好都合な位置を、チオール部分を含むように修飾し、それにより、本主題の方法で使用するための標的ペプチドまたはポリペプチドを生成してもよいことが理解される。
特定の実施形態では、チオール部分を含む標的分子は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドである。
特定の場合では、チオール部分は、システイン残基に存在する。特定の場合では、システイン残基は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドに固有のものである。他の場合、システイン残基を、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドに導入する。例えば、システイン残基を、標準的な固相Ｆｍｏｃペプチド化学（Ｆｉｅｌｄｓ ＧＢ，Ｎｏｂｌｅ ＲＬ Ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ９－ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ． Ｉｎｔ Ｊ Ｐｅｐｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ ３５：１６１－２１４，１９９０）によって導入してもよい。
修飾された標的分子
本主題の方法の特定の実施形態では、生成される修飾された標的分子は、式（ＩＶ）もしくは（ＩＶＡ）、またはそれらの組み合わせの分子である。したがって、本開示の態様は、式（ＩＶ）または（ＩＶＡ）：
Figure 2022527247000011
の化合物を含み、式中、Ｙ１は生体分子であり、任意選択で、活性小分子、親和性タグ、フルオロフォア、及び金属キレート剤から選択される１つ以上の部分を含み；Ｌは、任意選択のリンカーであり；Ｙ２は、第２の生体分子であり；ｎは、１～３の整数である。
式（ＩＶ）または（ＩＶＡ）の特定の実施形態では、ｎは３未満、例えば２または１である。特定の場合では、ｎは２である。特定の場合では、ｎは１である。特定の場合では、本主題の修飾された標的分子は、式（ＩＶ）の化合物である。特定の場合では、本主題の修飾された標的分子は、式（ＩＶＡ）の化合物である。
いくつかの実施形態では、式（ＩＶ）の修飾された標的分子のｎは１であり、化合物は、式（ＩＶ１）～（ＩＶ３）：
Figure 2022527247000012
のいずれかによって記述される。
いくつかの実施形態では、式（ＩＶ）の修飾された標的分子のｎは２であり、化合物は、式（ＩＶ４）～（ＩＶ５）：
Figure 2022527247000013
のいずれかによって記述される。
いくつかの実施形態では、式（ＩＶＡ）の修飾された標的分子のｎは１であり、化合物は、式（ＩＶ１）～（ＩＶ３）：
Figure 2022527247000014
のいずれかによって記述される。
いくつかの実施形態では、式（ＩＶＡ）の修飾された標的分子のｎは２であり、化合物は、式（ＩＶ４）～（ＩＶ５）：
Figure 2022527247000015
のいずれかによって記述される。
特定の実施形態では、修飾された標的分子は、リンカーを含む（例えば、本明細書に記載のように）。好適なリンカーとして、カルボン酸、アルキルエステル、アリールエステル、置換アリールエステル、アルデヒド、アミド、アリールアミド、ハロゲン化アルキル、チオエステル、スルホニルエステル、アルキルケトン、アリールケトン、置換アリールケトン、ハロスルホニル、ニトリル、ニトロ、及びペプチドリンカーが挙げられるが、これらに限定されない。
生体分子へのオルトキノンの連結に使用するための例示的なリンカー（Ｙ１）は、いくつかの実施形態では、－（ＣＲ１ ２）ｍＮＨＣ（Ｏ）－などのアミドを含み、式中、Ｒ１は、水素、または置換基（例えば、本明細書に記載のような）から選択され、ｍは、１～２０の整数である。例示的なリンカーはまた、例えば、本明細書に記載のように、ＰＥＧまたは置換ＰＥＧリンカーを含み得る。
特定の実施形態では、リンカーは、例えば、本明細書に記載のように、切断可能なリンカーである。
特定の実施形態では、修飾された標的分子は、式（ＩＶＢ）または（ＩＶＣ）：
Figure 2022527247000016
によって記述され、式中、Ｙ１は、任意選択で、活性小分子、親和性タグ、フルオロフォア、及び金属キレート剤から選択される１つ以上の基を含む生体分子であり；各Ｒ１は、独立して、水素、アシル、置換アシル、アルキル、及び置換アルキルから選択され；Ｙ２は第２の生体分子であり；Ｌ１は、直鎖または分岐アルキル、直鎖または分岐置換アルキル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、置換ＰＥＧ、及び１つ以上のペプチドから選択されるリンカーであり；ｎは、１～３の整数である。
式（ＩＶＢ）または（ＩＶＣ）の特定の実施形態では、ｎは３未満、例えば２または１である。特定の場合では、ｎは２である。特定の場合では、ｎは１である。特定の場合では、本主題の修飾された標的分子は、式（ＩＶＢ）の化合物である。特定の場合では、本主題の修飾された標的分子は、式（ＩＶＣ）の化合物である。
いくつかの実施形態では、式（ＩＶＢ）の修飾された標的分子のｎは１であり、化合物は、式（ＩＶＢ１）～（ＩＶＢ３）：
Figure 2022527247000017
のいずれかによって記述される。
いくつかの実施形態では、式（ＩＶＢ）の修飾された標的分子のｎは２であり、化合物は、式（ＩＶＢ４）～（ＩＶＢ５）：
Figure 2022527247000018
のいずれかによって記述される。
いくつかの実施形態では、式（ＩＶＣ）の修飾された標的分子のｎは１であり、化合物は、式（ＩＶＣ１）～（ＩＶＣ３）：
Figure 2022527247000019
のいずれかによって記述される。
いくつかの実施形態では、式（ＩＶＣ）の修飾された標的分子のｎは２であり、化合物は、式（ＩＶＣ４）～（ＩＶＣ５）：
Figure 2022527247000020
のいずれかによって記述される。
上記の式（ＩＶＢ）～（ＩＶＣ５）のいずれかの特定の実施形態では、少なくとも１つのＲ１は水素である。特定の場合では、両方のＲ１基は水素である。特定の場合では、一方のＲ１基は水素であり、もう一方のＲ１基は、アルキル、置換アルキル、アシル、及び置換アシルから選択される。特定の場合では、一方のＲ１基は水素であり、他方のＲ１基はアルキルである。いくつかの場合では、一方のＲ１基は水素であり、他方のＲ１基は置換アルキルである。特定の場合では、一方のＲ１基は水素であり、他方のＲ１基はアシルである。特定の場合では、一方のＲ１基は水素であり、他方のＲ１基は置換アシルである。いくつかの場合では、アシル基は、式－Ｃ（Ｏ）Ｒ４であり、Ｒ４は低級アルキル基、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、またはヘキシルである。いくつかの場合では、置換アシル基は式－Ｃ（Ｏ）Ｒ４ＮＨ２であり、Ｒ４は低級アルキル基、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチルまたはヘキシルである。いくつかの場合では、置換アシル基は式－Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＮＨ２である。
式（ＩＶＢ）～（ＩＶＣ５）のいずれかの特定の実施形態では、Ｌ１は、直鎖または分岐アルキルである。特定の場合では、Ｌ１は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、またはヘキシルなどの低級アルキル基である。特定の場合では、Ｌ１は置換アルキル基である。特定の場合では、Ｌ１は置換低級アルキル基である。特定の場合では、Ｌ１はＰＥＧまたは置換ＰＥＧである（例えば、本明細書に記載のように）。他の特定の場合では、Ｌ１はペプチドである。他の特定の場合では、Ｌ１はポリペプチドである。特定の場合では、Ｌ１は、長さが１～１２原子、例えば、長さが１～１０、１～８、または１～６原子、例えば、長さが１、２、３、４、５または６原子の直鎖リンカーである。リンカーＬ１は、（Ｃ１－６）アルキルリンカーまたは置換（Ｃ１－６）アルキルリンカーであり得、任意選択で、エステル（－ＣＯ２－）、アミド（ＣＯＮＨ）、カルバメート（ＯＣＯＮＨ）、エーテル（－Ｏ－）、チオエーテル（－Ｓ－）及び／またはアミノ基（－ＮＲ－、式中、Ｒは、Ｈまたはアルキルである）などのヘテロ原子または連結官能基で置換されている。特定の場合では、リンカーＬ１は、ケト（Ｃ＝Ｏ）基を含み得る。特定の場合では、ケト基は、リンカー鎖のアミノ、チオール、またはエーテル基と一緒になって、アミド、エステル、またはチオエステル基の結合を提供することができる。
特定の実施形態では、連結基Ｌ１は、例えば、本明細書に記載のように、切断可能なリンカーである。
特定の実施形態では、修飾された標的分子は、式（ＩＶＤ）～（ＩＶＧ）：
Figure 2022527247000021
のいずれかによって記述され、式中、Ｒ２ はアルキル、及び置換アルキルから選択され；Ｒ３は、水素、アルキル、置換アルキル、ペプチド、及びポリペプチドから選択され；ｎは、１～３の整数である。
式（ＩＶＤ）～（ＩＶＧ）のいずれかの特定の実施形態では、ｎは３未満、例えば２または１である。特定の場合では、ｎは２である。特定の場合では、ｎは１である。特定の場合では、本主題の修飾された標的分子は、式（ＩＶＤ）の化合物である。特定の場合では、本主題の修飾された標的分子は、式（ＩＶＥ）の化合物である。特定の場合では、本主題の修飾された標的分子は、式（ＩＶＦ）の化合物である。特定の場合では、本主題の修飾された標的分子は、式（ＩＶＧ）の化合物である。
特定の実施形態では、式（ＩＶＤ）～（ＩＶＧ）のいずれかは、以下の構造：
Figure 2022527247000022
に示すような相対的な立体化学構造を有し得る。
いくつかの実施形態では、式（ＩＶＤ）の修飾された標的分子のｎは１であり、化合物は、式（ＩＶＤ１）～（ＩＶＤ３）：
Figure 2022527247000023
のいずれかによって記述される。
いくつかの実施形態では、式（ＩＶＤ）の修飾された標的分子のｎは２であり、化合物は、式（ＩＶＤ４）～（ＩＶＤ５）：
Figure 2022527247000024
のいずれかによって記述される。
いくつかの実施形態では、式（ＩＶＥ）の修飾された標的分子のｎは１であり、化合物は、式（ＩＶＥ１）～（ＩＶＥ３）：
Figure 2022527247000025
のいずれかによって記述される。
いくつかの実施形態では、式（ＩＶＥ）の修飾された標的分子のｎは２であり、化合物は、式（ＩＶＥ４）～（ＩＶＥ５）：
Figure 2022527247000026
のいずれかによって記述される。
いくつかの実施形態では、式（ＩＶＦ）の修飾された標的分子のｎは１であり、化合物は、式（ＩＶＦ１）～（ＩＶＦ３）：
Figure 2022527247000027
のいずれかによって記述される。
いくつかの実施形態では、式（ＩＶＦ）の修飾された標的分子のｎは２であり、化合物は、式（ＩＶＦ４）～（ＩＶＦ５）：
Figure 2022527247000028
のいずれかによって記述される。
いくつかの実施形態では、式（ＩＶＧ）の修飾された標的分子のｎは１であり、化合物は、式（ＩＶＧ１）～（ＩＶＧ３）：
Figure 2022527247000029
のいずれかによって記述される。
いくつかの実施形態では、式（ＩＶＧ）の修飾された標的分子のｎは２であり、化合物は、式（ＩＶＧ４）～（ＩＶＧ５）：
Figure 2022527247000030
のいずれかによって記述される。
本明細書に記載の標的分子の特定の実施形態では、Ｒ２はアルキル基である。特定の場合では、Ｌ２は置換アルキル基である。特定の場合では、アルキル基は、低級アルキル基、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチルまたはヘキシルである。
本明細書に記載の標的分子の特定の実施形態では、Ｒ３は水素である。特定の場合では、Ｒ３はアルキル基である。特定の場合では、Ｒ３は置換アルキル基である。特定の場合では、アルキル基は、低級アルキル基、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチルまたはヘキシルである。特定の場合では、Ｒ３はペプチドである。特定の場合では、Ｒ３はポリペプチドである。
特定の実施形態では、修飾された標的分子は、式（ＩＶＨ）または（ＩＶＪ）：
Figure 2022527247000031
によって記述され、式中、Ｙ１は生体分子であり、任意選択で、活性小分子、親和性タグ、フルオロフォア、及び金属キレート剤から選択される１つ以上の基を含み；Ｙ２は、第２の生体分子であり；ｎは、１～３の整数であり；ｍは、０～２０の整数である。特定の場合では、ｍは１０以下、例えば、９、８、７、６、５、４、３、２、１または０である。特定の場合では、ｍは５である。特定の場合では、ｍは４である。特定の場合では、ｍは３である。特定の場合では、ｍは２である。特定の場合では、ｍは１である。特定の場合では、ｍは０である。
本主題の方法の特定の実施形態では、修飾された標的分子は、式（ＩＶＫ）または（ＩＶＬ）：
Figure 2022527247000032
によって記述される。
式（ＩＶＨ）～（ＩＶＪ）のいずれかの特定の実施形態では、ｎは３未満、例えば２または１である。特定の場合では、ｎは２である。特定の場合では、ｎは１である。
いくつかの実施形態では、式（ＩＶＨ）の修飾された標的分子のｎは１であり、化合物は、式（ＩＶＨ１）～（ＩＶＨ３）：
Figure 2022527247000033
のいずれかによって記述される。
いくつかの実施形態では、式（ＩＶＨ）の修飾された標的分子のｎは２であり、化合物は、式（ＩＶＨ４）～（ＩＶＨ５）：
Figure 2022527247000034
のいずれかによって記述される。
いくつかの実施形態では、式（ＩＶＪ）の修飾された標的分子のｎは１であり、化合物は、式（ＩＶＪ１）～（ＩＶＪ３）：
Figure 2022527247000035
のいずれかによって記述される。
いくつかの実施形態では、式（ＩＶＪ）の修飾された標的分子のｎは２であり、化合物は、式（ＩＶＪ４）～（ＩＶＪ５）：
Figure 2022527247000036
のいずれかによって記述される。
特定の実施形態では、チオール基を含む標的分子は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドである（例えば、本明細書に記載のように）。
式（ＩＶ）～（ＩＶＪ５）のいずれか１つの特定の実施形態では、Ｙ１はポリペプチドである。特定の場合では、Ｙ１ポリペプチドは、蛍光タンパク質、抗体、及び酵素から選択される。特定の場合では、蛍光タンパク質は緑色蛍光タンパク質である。他の適切なポリペプチドは、本明細書の他の場所に記載されている。
切断可能なリンカー
目的の本主題の分子に使用してもよい切断可能なリンカーには、求電子的に切断可能なリンカー、求核的に切断可能なリンカー、光切断可能なリンカー、金属切断可能なリンカー、電解切断可能、及び還元的及び酸化的条件下で切断可能なリンカーが含まれる。特定の場合では、切断可能なリンカーは、酸性条件下で切断される。特定の場合では、切断可能なリンカーは、酵素によって切断される。特定の場合では、切断可能なリンカーは、還元条件下で切断されるリンカーである。特定の場合では、切断可能なリンカーは、グルタチオン還元によって急速に切断される。特定の場合では、切断可能なリンカーは、ジスルフィド結合を含む。特定の場合では、切断可能なリンカーは、物理的刺激によって切断される。特定の場合では、切断可能なリンカーは、光切断可能である。
特定の場合では、ＬまたはＬ１は、酸に不安定なリンカーである。特定の場合では、リンカーは、ｐＨ６以下、例えば、６．０、５．９５、５．９、５．８５、５．８、５．７５、５．７、５．６５、５．６、５．５５、５．５、５．４５、５．４、５．３５、５．３、５．２５、５．２、５．１５、５．１、５．０５、５．０、４．９、４．８５、４．８０、４．７５、４．７、４．６５、４．６、４．５５、４．５またはそれ未満で切断する。
特定の場合では、ＬまたはＬ１は、光切断可能なリンカーである。好適な光切断可能なリンカーとして、Ｇｕｉｌｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２０００ １０００：２０９１－２１５７）に記載されているように、オルト－ニトロベンジル系リンカー、フェナシルリンカー、アルコキシベンゾインリンカー、クロムアレーン錯体リンカー、ＮｐＳＳＭｐａｃｔリンカー及びピバロイルグリコールリンカーが挙げられる。
いくつかの場合では、ＬまたはＬ１は、タンパク質分解的に切断可能なリンカーである。
タンパク質分解的に切断可能なリンカーとして、アラニンカルボキシペプチダーゼ、Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ ｍｅｌｌｅａアスタシン、細菌ロイシルアミノペプチダーゼ、がん凝固促進剤、カテプシンＢ、クロストリパイン、サイトゾルアラニルアミノペプチダーゼ、エラスターゼ、エンドプロテイナーゼＡｒｇ－Ｃ、エンテロキナーゼ、ガストリシン、ゲラチナーゼ、Ｇｌｙ－Ｘカルボキシペプチダーゼ、グリシルエンドペプチダーゼ、ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ、ヒポデルミンＣ、ＩｇＡ特異的セリンエンドペプチダーゼ、ロイシルアミノペプチダーゼ、ロイシルエンドペプチダーゼ、ｌｙｓＣ、リソソームプロＸカルボキシペプチダーゼ、リシルアミノペプチダーゼ、メチオニルアミノペプチダーゼ、ミクソバクター（ｍｙｘｏｂａｃｔｅｒ）、ナルディライジン、膵臓エンドペプチダーゼＥ、ピコルナイン２Ａ、ピコルナイン３Ｃ、プロエンドペプチダーゼ、プロリルアミノペプチダーゼ、プロタンパク質転換酵素Ｉ、プロタンパク質転換酵素ＩＩ、ルスセリリシン、サッカロペプシン、セメノゲラーゼ、Ｔ－プラスミノーゲン活性化因子、トロンビン、組織カリクレイン、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）、トガビリン、トリプトファニルアミノペプチダーゼ、Ｕ－プラスミノーゲンアクチベーター、Ｖ８、ベノムビンＡ、ベノムビンＡＢ、及びＸａａ－ｐｒｏアミノペプチダーゼからなる群から選択されるプロテアーゼによって認識されるプロテアーゼ認識配列を含み得る。
例えば、タンパク質分解的に切断可能なリンカーは、マトリックスメタロプロテイナーゼ切断部位、例えば、コラゲナーゼ－１、－２、及び－３（ＭＭＰ－１、－８、及び－１３）、ゲラチナーゼＡ及びＢ（ＭＭＰ－２及び－９）、ストロメリシン１、２、及び３（ＭＭＰ－３、－１０、及び－１１）、マトリライシン（ＭＭＰ－７）、及び膜メタロプロテイナーゼ（ＭＴ１－ＭＭＰ及びＭＴ２－ＭＭＰ）から選択されるＭＭＰの切断部位を含み得る。例えば、ＭＭＰ－９の切断配列は、Ｐｒｏ－Ｘ－Ｘ－Ｈｙ（配列番号１０５４）（式中、Ｘは任意の残基を表す；Ｈｙ、疎水性残基）、例えば、Ｐｒｏ－Ｘ－Ｘ－Ｈｙ－（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）（配列番号８４７）、例えば、Ｐｒｏ－Ｌｅｕ／Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－Ｍｅｔ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ（配列番号８４８）またはＰｒｏ－Ｌｅｕ／Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－Ｍｅｔ－Ｔｈｒ（配列番号８４９）である。プロテアーゼ切断部位の別の例は、プラスミノーゲン活性化因子切断部位、例えば、ｕＰＡまたは組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）切断部位である。いくつかの場合では、切断部位はフューリン切断部位である。ｕＰＡ及びｔＰＡの切断配列の特定の例として、Ｖａｌ－Ｇｌｙ－Ａｒｇを含む配列が挙げられる。タンパク質分解的に切断可能なリンカーに含まれ得るプロテアーゼ切断部位の別の例は、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ切断部位、例えば、プロテアーゼがグルタミンとセリンとの間で切断するＥＮＬＹＴＱＳ（配列番号８５０）である。ＴＥＶプロテアーゼは、一般式ＥＸ１Ｘ２ＹＸ３Ｑ（Ｇ／Ｓ）の直鎖アミノ酸配列（配列番号）を認識し、式中、Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３のそれぞれは、任意のアミノ酸であり、切断は、ＱとＧまたはＱとＳの間で生じる。ＴＥＶプロテアーゼ切断可能なリンカーとして、ＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号９５７）；ＥＮＬＹＴＱＳ（配列番号９５８）；ＥＮＬＹＦＱＧＧＹ（配列番号９５９）；ＥＮＬＹＦＱＳ（配列番号９６０）などが挙げられ得る。タンパク質分解的に切断可能なリンカーに含まれ得るプロテアーゼ切断部位の別の例は、エンテロキナーゼ切断部位、例えば、ＤＤＤＤＫ（配列番号８５１）であり、切断は、リジン残基の後で生じる。タンパク質分解的に切断可能なリンカーに含まれ得るプロテアーゼ切断部位の別の例は、トロンビン切断部位、例えば、ＬＶＰＲ（配列番号８５２）である。プロテアーゼ切断部位を含むさらなる好適なリンカーとして、以下のアミノ酸配列のうち１つ以上を含むリンカーが挙げられる：ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼによって切断されるＬＥＶＬＦＱＧＰ （配列番号８５３）（ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ及びグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼを含む融合タンパク質；Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６０１）；トロンビン切断部位、例えば、ＣＧＬＶＰＡＧＳＧＰ（配列番号８５４）；カテプシンＢによって切断されるＳＬＬＫＳＲＭＶＰＮＦＮ（配列番号８５５）またはＳＬＬＩＡＲＲＭＰＮＦＮ（配列番号８５６）；エプスタインバーウイルスプロテアーゼによって切断されるＳＫＬＶＱＡＳＡＳＧＶＮ（配列番号８５７）またはＳＳＹＬＫＡＳＤＡＰＤＮ（配列番号８５８）；ＭＭＰ－３（ストロメリシン）によって切断されるＲＰＫＰＱＱＦＦＧＬＭＮ（配列番号８５９）；ＭＭＰ－７（マトリライシン）によって切断されるＳＬＲＰＬＡＬＷＲＳＦＮ（配列番号８６０）；ＭＭＰ－９によって切断されるＳＰＱＧＩＡＧＱＲＮＦＮ（配列番号８６１）；サーモリシン様ＭＭＰによって切断されるＤＶＤＥＲＤＶＲＧＦＡＳＦＬ（配列番号８６２）；マトリックスメタロプロテイナーゼ２（ＭＭＰ－２）によって切断されるＳＬＰＬＧＬＷＡＰＮＦＮ（配列番号８６３）；カテプシンＬによって切断されるＳＬＬＩＦＲＳＷＡＮＦＮ（配列番号８６４）；カテプシンＤによって切断されるＳＧＶＶＩＡＴＶＩＶＩＴ（配列番号８６５）；マトリックスメタロプロテイナーゼ１（ＭＭＰ－１）によって切断されるＳＬＧＰＱＧＩＷＧＱＦＮ（配列番号８６６）；ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子によって切断されるＫＫＳＰＧＲＶＶＧＧＳＶ（配列番号８６７）；膜型マトリックスメタロプロテイナーゼ１（ＭＴ－ＭＭＰ）によって切断されるＰＱＧＬＬＧＡＰＧＩＬＧ（配列番号８６８）；ストロメリシン３（またはＭＭＰ－１１）、サーモリシン、線維芽細胞コラゲナーゼ及びストロメリシン－１によって切断されるＨＧＰＥＧＬＲＶＧＦＹＥＳＤＶＭＧＲＧＨＡＲＬＶＨＶＥＥＰＨＴ（配列番号８６９）；マトリックスメタロプロテイナーゼ１３（コラゲナーゼ－３）によって切断されるＧＰＱＧＬＡＧＱＲＧＩＶ（配列番号８７０）；組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）によって切断されるＧＧＳＧＱＲＧＲＫＡＬＥ（配列番号８７１）；ヒト前立腺特異抗原によって切断されるＳＬＳＡＬＬＳＳＤＩＦＮ（配列番号８７２）；カリクレイン（ｈＫ３）によって切断されるＳＬＰＲＦＫＩＩＧＧＦＮ（配列番号８７３）；好中球エラスターゼによって切断されるＳＬＬＧＩＡＶＰＧＮＦＮ（配列番号８７４）；及びカルパイン（カルシウム活性化中性プロテアーゼ）によって切断されるＦＦＫＮＩＶＴＰＲＴＰＰ（配列番号８７５）。
いくつかの場合では、リンカーはジスルフィド結合を含み、例えば、β－メルカプトエタノール、システイン－ＨＣｌ、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩、または別の還元剤を使用して、還元条件下で切断可能である。
いくつかの場合では、リンカーは、バリン－シトルリンジペプチドまたはバリン－リジンジペプチドなどのジペプチドを含む。
生体分子
本開示の方法または複合体での使用に適した生体分子として、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、脂質、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、その構造類似体、及びそれらの組み合わせが挙げられる。
好適な生体分子として、ポリペプチド、核酸、糖タンパク質、小分子、炭水化物、脂質、糖脂質、リポタンパク質、リポ多糖、糖、アミノ酸、有機染料、合成ポリマーなどが挙げられるが、これらに限定されない。
好適な脂質として、例えば、３－Ｎ－［（メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル］－１，２－ジミリスチルオキシ－プロピルアミン（ＰＥＧ－Ｃ－ＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、ジパルミトイルホスファチジルコリン、３－Ｎ－［（ｗ－メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル］－１，２－ジミレスチルオキシプロピルアミン、１，２－ジリノレイルオキシ－３－Ｎ，Ｎジメチルアミノプロパン、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、ＰＥＧ－ｃＤＭＡ、１，２－ジリノレイルオキシ－３－（Ｎ；Ｎ－ジメチル）アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）などが挙げられる。
好適な生体分子は、親和性部分を含む。好適な親和性部分として、Ｈｉｓ５（ＨＨＨＨＨ）（配列番号８７６）；ＨｉｓＸ６（ＨＨＨＨＨＨ）（配列番号８７７）；ｃ－ｍｙｃ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）（配列番号８７８）；Ｆｌａｇ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）（配列番号８７９）；Ｓｔｒｅｐタグ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ）（配列番号８８０）；ヘマグルチニン、例えば、ＨＡタグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）（配列番号８８１）；グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）；チオレドキシン；セルロース結合ドメイン、ＲＹＩＲＳ（配列番号８８２）；Ｐｈｅ－Ｈｉｓ－Ｈｉｓ－Ｔｈｒ（配列番号８８３）；キチン結合ドメイン；Ｓ－ペプチド；Ｔ７ペプチド；ＳＨ２ドメイン；Ｃ末端ＲＮＡタグ、ＷＥＡＡＡＲＥＡＣＣＲＥＣＣＡＲＡ（配列番号８８４）；金属結合ドメイン、例えば、亜鉛結合ドメインまたはカルシウム結合タンパク質由来などのカルシウム結合ドメイン、例えば、カルモジュリン、トロポニンＣ、カルシニューリンＢ、ミオシン軽鎖、リカバリン、Ｓ－モジュリン、ビシニン、ＶＩＬＩＰ、ニューロカルシン、ヒポカルシン、フレケニン、カルトラクチン、カルパインラージサブユニット．Ｓ１００タンパク質。パルブアルブミン、カルビンジンＤ９Ｋ、カルビンジンＤ２８Ｋ、及びカルレチニン；ビオチン；ストレプトアビジン；ＭｙｏＤ；ロイシンジッパーポリペプチド；及びマルトース結合タンパク質が挙げられる。いくつかの場合では、好適な生体分子はビオチンである。
いくつかの場合では、標的ポリペプチドと複合体化するのに適した生体分子は二量体化ドメインである。好適な二量体化ドメインの非限定的な例として、以下の二量体化ペアのポリペプチドが挙げられる：
ａ）ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）及びＦＫＢＰ；
ｂ）ＦＫＢＰ及びカルシニューリン触媒サブユニットＡ（ＣｎＡ）；
ｃ）ＦＫＢＰ及びシクロフィリン；
ｄ）ＦＫＢＰ及びＦＫＢＰ－ラパマイシン関連タンパク質（ＦＲＢ）；
ｅ）ジャイレースＢ（ＧｙｒＢ）及びＧｙｒＢ；
ｆ）ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）及びＤＨＦＲ；
ｇ）ＤｍｒＢ及びＤｍｒＢ；
ｈ）ＰＹＬ及びＡＢＩ；
ｉ）Ｃｒｙ２及びＣＩＢ１；ならびに
ｊ）ＧＡＩ及びＧＩＤ１。
例えば、いくつかの場合では、生体分子は、以下のアミノ酸ＦＫＢＰアミノ酸配列に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドである：ＭＧＶＱＶＥＴＩＳＰＧＤＧＲＴＦＰＫＲＧＱＴＣＶＶＨＹＴＧＭＬＥＤＧＫＫＦＤＳＳＲＤＲＮＫＰＦＫＦＭＬＧＫＱＥＶＩＲＧＷＥＥＧＶＡＱＭＳＶＧＱＲＡＫＬＴＩＳＰＤＹＡＹＧＡＴＧＨＰＧＩＩＰＰＨＡＴＬＶＦＤＶＥＬＬＫＬＥ（配列番号８８５）。
いくつかの場合では、標的ポリペプチドと複合体化するのに適した生体分子は、特異的結合対のメンバーである。特異的結合対には、例えば、ｉ）抗体－抗原；ｉｉ）細胞接着分子－細胞外マトリックス；ｉｉｉ）リガンド－受容体；ｉｖ）ビオチン－アビジンなどが含まれる。
好適な合成ポリマーとして、ポリアルキレン、例えば、ポリエチレン及びポリプロピレン及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；ポリクロロプレン；ポリビニルエーテル、例えば、ポリ（酢酸ビニル）；ポリビニルハロゲン化物、例えば、ポリ（塩化ビニル）；ポリシロキサン；ポリスチレン；ポリウレタン；ポリアクリレート、例えば、ポリ（メチル（メタ）アクリレート）、ポリ（エチル（メタ）アクリレート）、ポリ（ｎ－ブチル（メタ）アクリレート）、ポリ（イソブチル（メタ）アクリレート）、ポリ（ｔｅｒｔ－ブチル（メタ）アクリレート）、ポリ（ヘキシル（メタ）アクリレート）、ポリ（イソデシル（メタ）アクリレート）、ポリ（ラウリル（メタ）アクリレート）、ポリ（フェニル（メタ）アクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（アクリル酸イソブチル）、及びポリ（アクリル酸オクタデシル）；ポリアクリルアミド、例えば、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（メタクリルアミド）、ポリ（エチルアクリルアミド）、ポリ（エチルメタクリルアミド）、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（ｎ、イソ、及びｔｅｒｔ－ブチルアクリルアミド）；ならびにその共重合体及び混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの場合では、標的ポリペプチドに複合体化する生体分子はポリペプチドである。好適なポリペプチドとして、例えば、蛍光タンパク質；受容体；酵素；構造タンパク質；親和性タグなどが挙げられる。
好適な蛍光タンパク質として、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはそのバリアント、ＧＦＰの青色蛍光バリアント（ＢＦＰ）、ＧＦＰのシアン蛍光バリアント（ＣＦＰ）、ＧＦＰの黄色蛍光バリアント（ＹＦＰ）、強化ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）、強化ＣＦＰ（ＥＣＦＰ）、強化ＹＦＰ（ＥＹＦＰ）、ＧＦＰＳ６５Ｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ｔｏｐａｚ（ＴＹＦＰ）、Ｖｅｎｕｓ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、ＧＦＰｕｖ、不安定化ＥＧＦＰ（ｄＥＧＦＰ）、不安定化ＥＣＦＰ（ｄＥＣＦＰ）、不安定化ＥＹＦＰ（ｄＥＹＦＰ）、ｍＣＦＰｍ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、Ｔ－Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ＣｙＰｅｔ、ＹＰｅｔ、ｍＫＯ、ＨｃＲｅｄ、ｔ－ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ－単量体、Ｊ－Ｒｅｄ、ｄｉｍｅｒ２、ｔ－ｄｉｍｅｒ２（１２）、ｍＲＦＰ１、ｐｏｃｉｌｌｏｐｏｒｉｎ、Ｒｅｎｉｌｌａ ＧＦＰ、Ｍｏｎｓｔｅｒ ＧＦＰ、ｐａＧＦＰ、Ｋａｅｄｅ ｐｒｏｔｅｉｎ及びｋｉｎｄｌｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ、フィコビリンタンパク質、ならびにＢ－フィコエリトリン、Ｒ－フィコエリトリン、及びアロフィコシアニンを含むフィコビリンタンパク質複合体が挙げられるが、これらに限定されない。蛍光タンパク質の他の例として、ｍＨｏｎｅｙｄｅｗ、ｍＢａｎａｎａ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｄＴｏｍａｔｏ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＧｒａｐｅ１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＧｒａｐｅ２、ｍＰｌｕｍ（Ｓｈａｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２：９０５－９０９）などが挙げられる。例えば、Ｍａｔｚ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：９６９－９７３に記載されているような、花虫類種由来の様々な蛍光及び染色タンパク質のうちのいずれかが使用に好適である。
いくつかの場合では、生体分子は抗体である。好適な抗体は、本明細書の他の場所に記載されている。抗体は、任意の抗原結合抗体に基づくポリペプチドであり得、多種多様な抗体が当技術分野で公知である。いくつかの例では、抗体は単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である。他の抗体ベースの抗原結合ドメイン（ｃＡｂ ＶＨＨ（ラクダ抗体可変ドメイン）及びヒト化バージョン、ＩｇＮＡＲ ＶＨ（サメ抗体可変ドメイン）及びヒト化バージョン、ｓｄＡｂ ＶＨ（単一ドメイン抗体可変ドメイン）及び「ラクダ化」抗体可変ドメインが使用に適している。いくつかの例では、単鎖ＴＣＲ（ｓｃＴｖ、ＶαＶβを含む単鎖２ドメインＴＣＲ）などのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ベースの認識ドメインも使用に適している。
抗体は、抗原、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＣＤ３０、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥＲＢＢ２、ＣＡ１２５、ＭＵＣ－１、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＣＤ４４表面接着分子、メソセリン、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、血管内皮成長因子受容体－２（ＶＥＧＦＲ２）、高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷ－ＭＡＡ）、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＩＬ－１３Ｒ－ａ２、ＧＤ２などに特異的であり得る。いくつかの場合では、抗体は、サイトカインに特異的である。いくつかの場合では、抗体は、サイトカイン受容体に特異的である。いくつかの場合では、抗体は、成長因子に特異的である。いくつかの場合では、抗体は、成長因子受容体に特異的である。いくつかの場合では、抗体は、細胞表面受容体に特異的である。いくつかの場合では、抗体は、抗ＣＤ３抗体である。
いくつかの場合では、標的分子と生体分子の両方が抗体である。いくつかの場合では、標的分子は第１の抗原に特異的な第１の抗体であり、生体分子は第２の抗原に特異的な第２の抗体である。第１の抗原と第２の抗原は、完全に別個の分子であり得る。例えば、第１の抗原は第１のポリペプチドであり得、第２の抗原は第２のポリペプチドであり得る。第１の抗原は、抗原によって提示される第１のエピトープであり得、第２の抗原は、同じ抗原によって提示される第２のエピトープであり得る。得られる複合体は、二重特異性抗体であり得る。
いくつかの場合では、生体分子は、標的生体分子に以下のような特性を与える：ｉ）血清半減期の増加；ｉｉ）免疫原性の増加；ｉｉｉ）強化された薬物動態特性；ｉｖ）血液脳関門を通過する輸送の増加など。例えば、いくつかの場合では、血清半減期を延長する生体分子はヒト血清アルブミンである。いくつかの場合では、血清半減期を延長する生体分子はアルブミン結合ドメインである。いくつかの場合では、血清半減期を延長する生体分子はトランスサイレチンである。いくつかの場合では、血清半減期を延長する生体分子はサイロキシン結合タンパク質である。いくつかの場合では、生体分子は免疫グロブリンＦｃポリペプチドである。いくつかの場合では、血液脳関門を通過する輸送を促進する生体分子は、トランスフェリン受容体（ＴＲ）、インスリン受容体（ＨＩＲ）、インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦＲ）、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１及び２（ＬＰＲ－１及び２）、ジフテリア毒素受容体、ラマ単一ドメイン抗体、タンパク質伝達ドメイン、ＴＡＴ、ペネトラチン、またはポリアルギニンペプチドである。
好適な生体分子には、がん化学療法剤などの小分子が含まれる。好適ながん化学療法剤として、例えば、アルキル化剤、例えば、ナイトロジェンマスタード（例えば、クロラムブシル、クロルメチン、シクロホスファミド、イホスファミド、及びメルファラン）；ニトロソウレア（例えば、カルムスチン、フォテムスチン、ロムスチン、及びストレプトゾシン）；白金化合物（例えば、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、及びＢＢＲ３４６４）；ブスルファン；ダカルバジン；メクロレタミン；プロカルバジン；テモゾロミド；チオテパ；ウラムスチン；代謝拮抗薬、例えば、葉酸（例えば、メトトレキサート、ペメトレキセド、及びラルチトレキサート）；プリン（例えば、クラドリビン、クロファラビン、フルダラビン、メルカプトプリン、及びチオグアニン）；ピリミジン（例えば、カペシタビン）；シタラビン；フルオロウラシル；ゲムシタビン；植物アルカロイド、例えば、ポドフィラム（例えば、エトポシド、及びテニポシド）、タキサン（例えば、ドセタキセル及びパクリタキセル）、ビンカ（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、及びビノレルビン）；細胞傷害性／抗腫瘍性抗生物質、例えば、アントラサイクリンファミリーメンバー（例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、及びバルビシン）、ブレオマイシン、リファンピシン、ヒドロキシ尿素、及びマイトマイシン；トポイソメラーゼ阻害剤、例えば、トポテカン及びイリノテカン；光増感剤、例えば、アミノレブリン酸、アミノレブリン酸メチル、ポルフィマーナトリウム、及びベルテポルフィン；ならびに他の薬剤、例えば、アリトレチノイン、アルトレタミン、アムサクリン、アナグレリド、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、アキシチニブ、ベキサロテン、ベバシズマブ、ボルテゾミブ、セレコキシブ、デニロイキンジフチトックス、エルロチニブ、エストラムスチン、ゲフィチニブ、ヒドロキシカルバミド、イマチニブ、ラパチニブ、パゾパニブ、ペントスタチン、マソプロコール、ミトタン、ペグアスパラガーゼ、タモキシフェン、ソラフェニブ、スニチニブ、ベムラフェニブ、バンデタニブ、及びトレチノインが挙げられる。例えば、いくつかの場合では、標的分子は抗体であり；生体分子は、がんの化学療法剤である。
好適な生体分子には、サイトカイン、ケモカイン、ペプチドホルモンなどが含まれる。好適な生体分子として、例えば、インターフェロン（例えば、ＩＦＮ－γ）；インターロイキン（例えば、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２ｐ４０、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７など）；ＩＰ－１０、ＫＣ、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１α、ＭＩＰ－１β、Ｍ－ＣＳＦ ＭＩＰ－２、ＭＩＧ；αケモカイン（例えば、ＣＸＣケモカイン；例えば、ＣＸＣ－１～ＣＸＣ－１７）；βケモカイン（ＣＣケモカイン）、例えば、ＲＡＮＴＥＳまたはＣＣＬ２０（ＭＩＰ－３αとしても知られる）；腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）；エオタキシン；顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）；顆粒球－マクロファージ－コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）；エリスロポエチン；インスリン；Ｇｒｏ－α；Ｇｒｏβ；Ｇｒｏ－γ；間質由来因子；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）；インスリン様成長因子（ＩＧＦ）；線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）；表皮成長因子（ＥＧＦ）；白血病抑制因子（ＬＩＦ）；肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）；トロンボポエチンなどが挙げられる。
好適な生体分子には、核酸が含まれる。いくつかの場合では、核酸は、ＤＮＡ分子である。いくつかの場合では、核酸は、ＲＮＡ分子である。いくつかの場合では、核酸は、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドの両方を含む。いくつかの場合では、核酸は、一本鎖ＤＮＡ分子である。いくつかの場合では、核酸は、二本鎖ＤＮＡ分子である。いくつかの場合では、核酸は、一本鎖ＲＮＡ分子である。好適な核酸には、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイムなどが含まれる。好適な核酸として、ｓｉＲＮＡまたは他のＲＮＡ干渉試薬（ＲＮＡｉ剤またはｉＲＮＡ剤）であるかまたはそれらとして作用する核酸、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、自己切断ＲＮＡ、リボザイム、その断片及び／またはバリアント（例えば、ペプチジルトランスフェラーゼ２３Ｓ ｒＲＮＡ、ＲＮａｓｅ Ｐ、グループＩ及びグループＩＩイントロン、ＧＩＲ１分岐リボザイム、リードザイム、ヘアピンリボザイム、ハンマーヘッドリボザイム、ＨＤＶリボザイム、哺乳類ＣＰＥＢ３リボザイム、ＶＳリボザイム、ｇｌｍＳリボザイム、ＣｏＴＣリボザイムなど）、マイクロＲＮＡ、マイクロＲＮＡ模倣物、スーパーｍｉｒ、アプタマー、アンチｍｉｒ、アンタゴｍｉｒ、Ｕｌアダプター、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、ＲＮＡ活性化因子、長い非コードＲＮＡ、短い非コードＲＮＡ（例えば、ｐｉＲＮＡ）、免疫調節オリゴヌクレオチド（例えば、免疫刺激オリゴヌクレオチド、免疫抑制性オリゴヌクレオチド）、ＧＮＡ、ＬＮＡ、ＥＮＡ、ＰＮＡ、ＴＮＡ、ＨＮＡ、ＴＮＡ、ＸＮＡ、ＨｅＮＡ、ＣｅＮＡ、モルホリノ、Ｇ－四重鎖（ＲＮＡ及びＤＮＡ）、抗ウイルスオリゴヌクレオチド、及びデコイオリゴヌクレオチドが挙げられる。核酸は、任意の長さであり得、修飾リボヌクレオチド塩基、修飾デオキシリボヌクレオチド塩基、修飾デオキシリボース、修飾リボース、及び修飾主鎖結合（例えば、ホスホロチオエート結合）のうちの１つ以上を含み得る。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドと複合体化するための生体分子
いくつかの場合では、標的ポリペプチドと複合体化させる生体分子は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドへの複合体化に適した生体分子である。
いくつかの場合では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドへの複合体化に適した生体分子は、標的ＤＮＡの転写を調節する（例えば、転写を阻害する、転写を増加させる）ことができる生体分子である。例えば、いくつかの場合では、生体分子は、転写を阻害するタンパク質（またはタンパク質由来ドメイン）（例えば、転写抑制因子、すなわち、転写阻害タンパク質の動員、メチル化などの標的ＤＮＡの修飾、ＤＮＡ修飾因子の動員、標的ＤＮＡと会合したヒストンの調節、ヒストン修飾因子、例えば、ヒストンのアセチル化及び／またはメチル化を修飾する因子の動員などを介して機能するタンパク質）である。いくつかの場合では、生体分子は、転写を増加させるタンパク質（またはタンパク質由来ドメイン）（例えば、転写活性化因子、すなわち、転写活性化タンパク質の動員、脱メチル化などの標的ＤＮＡの修飾、ＤＮＡ修飾因子の動員、標的ＤＮＡと会合したヒストンの調節、ヒストンのアセチル化及び／またはメチル化を修飾する因子などのヒストン修飾因子の動員などを介して機能するタンパク質）である。
いくつかの場合では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドへの結合に適した生体分子は、標的核酸を修飾する酵素活性（例えば、ＦｏｋＩヌクレアーゼ活性などのヌクレアーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、脱アミノ化活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン化活性、酸化活性、ピリミジン二量体形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性またはグリコシラーゼ活性）を有するポリペプチドである。
いくつかの場合では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドへの複合体化に適した生体分子は、標的核酸と会合したポリペプチド（例えば、ヒストン）を修飾する酵素活性（例えば、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性または脱ミリストイル化活性）を有するポリペプチドである。
転写の増加に使用することができ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドへの複合体化のための生体分子として適しているタンパク質（またはその断片）の例として、ＶＰ１６、ＶＰ６４、ＶＰ４８、ＶＰ１６０、ｐ６５サブドメイン（例えば、ＮＦｋＢ由来）、ならびにＥＤＬＬの活性化ドメイン、及び／またはＴＡＬ活性化ドメイン（例えば、植物における活性のための）などの転写活性化因子；ＳＥＴ１Ａ、ＳＥＴ１Ｂ、ＭＬＬ１～５、ＡＳＨ１、ＳＹＭＤ２、ＮＳＤ１などのヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ；ＪＨＤＭ２ａ／ｂ、ＵＴＸ、ＪＭＪＤ３などのヒストンリジンデメチラーゼ；ＧＣＮ５、ＰＣＡＦ、ＣＢＰ、ｐ３００、ＴＡＦ１、ＴＩＰ６０／ＰＬＩＰ、ＭＯＺ／ＭＹＳＴ３、ＭＯＲＦ／ＭＹＳＴ４、ＳＲＣ１、ＡＣＴＲ、Ｐ１６０、ＣＬＯＣＫなどのヒストンアセチルトランスフェラーゼ；ならびにＴｅｎ－Ｅｌｅｖｅｎ Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ（ＴＥＴ）ジオキシゲナーゼ１（ＴＥＴ１ＣＤ）、ＴＥＴ１、ＤＭＥ、ＤＭＬ１、ＤＭＬ２、ＲＯＳ１などのＤＮＡデメチラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
転写の減少に使用することができ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドへの複合体化のための生体分子として適しているタンパク質（またはその断片）の例として、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢまたはＳＫＤ）などの転写抑制因子；ＫＯＸ１抑制ドメイン；Ｍａｄ ｍＳＩＮ３相互作用ドメイン（ＳＩＤ）；ＥＲＦ抑制ドメイン（ＥＲＤ）、ＳＲＤＸ抑制ドメイン（例えば、植物における抑制のための）など；Ｐｒ－ＳＥＴ７／８、ＳＵＶ４－２０Ｈ１、ＲＩＺ１などのヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ；ＪＭＪＤ２Ａ／ＪＨＤＭ３Ａ、ＪＭＪＤ２Ｂ、ＪＭＪＤ２Ｃ／ＧＡＳＣ１、ＪＭＪＤ２Ｄ、ＪＡＲＩＤ１Ａ／ＲＢＰ２、ＪＡＲＩＤ１Ｂ／ＰＬＵ－１、ＪＡＲＩＤ１Ｃ／ＳＭＣＸ、ＪＡＲＩＤ１Ｄ／ＳＭＣＹなどのヒストンリジンデメチラーゼ；ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ９、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＨＤＡＣ１１などのヒストンリジンデアセチラーゼ；ＨｈａＩ ＤＮＡ ｍ５ｃ－メチルトランスフェラーゼ（Ｍ．ＨｈａＩ）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１（ＤＮＭＴ１）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３ａ（ＤＮＭＴ３ａ）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３ｂ（ＤＮＭＴ３ｂ）、ＭＥＴＩ、ＤＲＭ３（植物）、ＺＭＥＴ２、ＣＭＴ１、ＣＭＴ２（植物）などのＤＮＡメチラーゼ；及びＬａｍｉｎ Ａ、Ｌａｍｉｎ Ｂなどの末梢動員エレメントが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの場合では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドに複合体化させる生体分子は、標的核酸（例えば、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ）を修飾する酵素活性を有する。生体分子によって提供され得る酵素活性の例として、制限酵素（例えば、ＦｏｋＩヌクレアーゼ）によって提供されるものなどのヌクレアーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ（例えば、ＨｈａＩ ＤＮＡ ｍ５ｃ－メチルトランスフェラーゼ（Ｍ．ＨｈａＩ）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１（ＤＮＭＴ１）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３ａ（ＤＮＭＴ３ａ）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３ｂ（ＤＮＭＴ３ｂ）、ＭＥＴＩ、ＤＲＭ３（植物）、ＺＭＥＴ２、ＣＭＴ１、ＣＭＴ２（植物）など）によって提供されるものなどのメチルトランスフェラーゼ活性；デメチラーゼ（例えば、Ｔｅｎ－Ｅｌｅｖｅｎ Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ（ＴＥＴ）ジオキシゲナーゼ１（ＴＥＴ１ＣＤ）、ＴＥＴ１、ＤＭＥ、ＤＭＬ１、ＤＭＬ２、ＲＯＳ１など）によって提供されるものなどのデメチラーゼ活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、デアミナーゼ（例えば、ラットＡＰＯＢＥＣ１などのシトシンデアミナーゼ酵素）によって提供されるものなどの脱アミン化活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン化活性、酸化活性、ピリミジン二量体形成活性、インテグラーゼ及び／またはレゾルバーゼ（例えば、Ｇｉｎインベルターゼの超活性変異体、ＧｉｎＨ１０６ＹなどのＧｉｎインベルターゼ；ヒト免疫不全ウイルス１型インテグラーゼ（ＩＮ）；Ｔｎ３レゾルバーゼなど）によって提供されるものなどのインテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、レコンビナーゼ（例えば、Ｇｉｎレコンビナーゼの触媒ドメイン）によって提供されるものなどのレコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性、及びグリコシラーゼ活性）が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの場合では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドに複合体化させる生体分子は、標的核酸（例えば、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ）と会合したタンパク質（例えば、ヒストン、ＲＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ結合タンパク質など）を修飾する酵素活性を有する。生体分子によって提供され得る（標的核酸と会合したタンパク質を修飾する）酵素活性の例として、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）（例えば、ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ ｖａｒｉｅｇａｔｉｏｎ３～９ホモログ１（ＳＵＶ３９Ｈ１、ＫＭＴ１Ａとしても知られる）、真性染色質ヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ２（Ｇ９Ａ、ＫＭＴ１Ｃ及びＥＨＭＴ２としても知られる）、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＥＳＥＴ／ＳＥＴＤＢ１など、ＳＥＴ１Ａ、ＳＥＴ１Ｂ、ＭＬＬ１～５、ＡＳＨ１、ＳＹＭＤ２、ＮＳＤ１、ＤＯＴ１Ｌ、Ｐｒ－ＳＥＴ７／８、ＳＵＶ４－２０Ｈ１、ＥＺＨ２、ＲＩＺ１）によって提供されるものなどのメチルトランスフェラーゼ活性、ヒストンデメチラーゼ（例えば、リジンデメチラーゼ１Ａ（ＫＤＭ１Ａ、ＬＳＤ１としても知られる）、ＪＨＤＭ２ａ／ｂ、ＪＭＪＤ２Ａ／ＪＨＤＭ３Ａ、ＪＭＪＤ２Ｂ、ＪＭＪＤ２Ｃ／ＧＡＳＣ１、ＪＭＪＤ２Ｄ、ＪＡＲＩＤ１Ａ／ＲＢＰ２、ＪＡＲＩＤ１Ｂ／ＰＬＵ－１、ＪＡＲＩＤ１Ｃ／ＳＭＣＸ、ＪＡＲＩＤ１Ｄ／ＳＭＣＹ、ＵＴＸ、ＪＭＪＤ３など）によって提供されるものなどのデメチラーゼ活性、ヒストンアセチラーゼトランスフェラーゼ（例えば、ヒトアセチルトランスフェラーゼｐ３００、ＧＣＮ５、ＰＣＡＦ、ＣＢＰ、ＴＡＦ１、ＴＩＰ６０／ＰＬＩＰ、ＭＯＺ／ＭＹＳＴ３、ＭＯＲＦ／ＭＹＳＴ４、ＨＢＯ１／ＭＹＳＴ２、ＨＭＯＦ／ＭＹＳＴ１、ＳＲＣ１、ＡＣＴＲ、Ｐ１６０、ＣＬＯＣＫなどの触媒コア／断片）によって提供されるものなどのアセチルトランスフェラーゼ活性、ヒストンデアセチラーゼ（例えば、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ９、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＨＤＡＣ１１などによって提供されるものなどのデアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、及び脱ミリストイル化活性が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの場合では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドに複合体化させる生体分子は、触媒的に活性なエンドヌクレアーゼである。例えば、いくつかの場合では、標的ポリペプチドは、触媒的に不活性であり（例えば、エンドヌクレアーゼ活性を示さない）、標的核酸結合活性を保持する（ガイドＲＮＡと複合体を形成した場合）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドであり；ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドに複合体化させる生体分子は、触媒的に活性なエンドヌクレアーゼである。例えば、いくつかの場合では、触媒的に活性なエンドヌクレアーゼはＦｏｋＩポリペプチドである。非限定的な一例として、いくつかの場合では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドに複合体化させる生体分子は、以下に示すＦｏｋＩアミノ酸配列に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＦｏｋＩヌクレアーゼであり；ＦｏｋＩヌクレアーゼの長さは、約１９５アミノ酸～約２００アミノ酸である。
ＦｏｋＩヌクレアーゼアミノ酸配列：
ＱＬＶＫＳＥＬＥＥＫＫＳＥＬＲＨＫＬＫＹＶＰＨＥＹＩＥＬＩＥＩＡＲＮＳＴＱＤＲＩＬＥＭＫＶＭＥＦＦＭＫＶＹＧＹＲＧＫＨＬＧＧＳＲＫＰＤＧＡＩＹＴＶＧＳＰＩＤＹＧＶＩＶＤＴＫＡＹＳＧＧＹＮＬＰＩＧＱＡＤＥＭＱＲＹＶＥＥＮＱＴＲＮＫＨＩＮＰＮＥＷＷＫＶＹＰＳＳＶＴＥＦＫＦＬＦＶＳＧＨＦＫＧＮＹＫＡＱＬＴＲＬＮＨＩＴＮＣＮＧＡＶＬＳＶＥＥＬＬＩＧＧＥＭＩＫＡＧＴＬＴＬＥＥＶＲＲＫＦＮＮＧＥＩＮＦ（配列番号８８６）。
いくつかの場合では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドに複合体化させる生体分子はデアミナーゼである。いくつかの場合では、標的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドは、触媒的に不活性である。好適なデアミナーゼとして、シチジンデアミナーゼ及びアデノシンデアミナーゼが挙げられる。
好適なアデノシンデアミナーゼは、ＤＮＡ中のアデノシンを脱アミノ化することができる任意の酵素である。いくつかの場合では、デアミナーゼは、ＴａｄＡデアミナーゼである。
いくつかの場合では、好適なアデノシンデアミナーゼは、以下のアミノ酸配列：
ＭＳＥＶＥＦＳＨＥＹＷＭＲＨＡＬＴＬＡＫＲＡＷＤＥＲＥＶＰＶＧＡＶＬＶＨＮＮＲＶＩＧＥＧＷＮＲＰＩＧＲＨＤＰＴＡＨＡＥＩＭＡＬＲＱＧＧＬＶＭＱＮＹＲＬＩＤＡＴＬＹＶＴＬＥＰＣＶＭＣＡＧＡＭＩＨＳＲＩＧＲＶＶＦＧＡＲＤＡＫＴＧＡＡＧＳＬＭＤＶＬＨＨＰＧＭＮＨＲＶＥＩＴＥＧＩＬＡＤＥＣＡＡＬＬＳＤＦＦＲＭＲＲＱＥＩＫＡＱＫＫＡＱＳＳＴＤ（配列番号８８７）
に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの場合では、好適なアデノシンデアミナーゼは、以下のアミノ酸配列：
ＭＲＲＡＦＩＴＧＶＦＦＬＳＥＶＥＦＳＨＥＹＷＭＲＨＡＬＴＬＡＫＲＡＷＤＥＲＥＶＰＶＧＡＶＬＶＨＮＮＲＶＩＧＥＧＷＮＲＰＩＧＲＨＤＰＴＡＨＡＥＩＭＡＬＲＱＧＧＬＶＭＱＮＹＲＬＩＤＡＴＬＹＶＴＬＥＰＣＶＭＣＡＧＡＭＩＨＳＲＩＧＲＶＶＦＧＡＲＤＡＫＴＧＡＡＧＳＬＭＤＶＬＨＨＰＧＭＮＨＲＶＥＩＴＥＧＩＬＡＤＥＣＡＡＬＬＳＤＦＦＲＭＲＲＱＥＩＫＡＱＫＫＡＱＳＳＴＤ（配列番号８８８）
に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの場合では、好適なアデノシンデアミナーゼは、以下の黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）ＴａｄＡアミノ酸配列：
ＭＧＳＨＭＴＮＤＩＹＦＭＴＬＡＩＥＥＡＫＫＡＡＱＬＧＥＶＰＩＧＡＩＩＴＫＤＤＥＶＩＡＲＡＨＮＬＲＥＴＬＱＱＰＴＡＨＡＥＨＩＡＩＥＲＡＡＫＶＬＧＳＷＲＬＥＧＣＴＬＹＶＴＬＥＰＣＶＭＣＡＧＴＩＶＭＳＲＩＰＲＶＶＹＧＡＤＤＰＫＧＧＣＳＧＳＬＭＮＬＬＱＱＳＮＦＮＨＲＡＩＶＤＫＧＶＬＫＥＡＣＳＴＬＬＴＴＦＦＫ ＮＬＲＡＮＫＫＳＴＮ：（配列番号８８９）
に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの場合では、好適なアデノシンデアミナーゼは、以下の枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＴａｄＡアミノ酸配列：
ＭＴＱＤＥＬＹＭＫＥＡＩＫＥＡＫＫＡＥＥＫＧＥＶＰＩＧＡＶＬＶＩＮＧＥＩＩＡＲＡＨＮＬＲＥＴＥＱＲＳＩＡＨＡＥＭＬＶＩＤＥＡＣＫＡＬＧＴＷＲＬＥＧＡＴＬＹＶＴＬＥＰＣＰＭＣＡＧＡＶＶＬＳＲＶＥＫＶＶＦＧＡＦＤＰＫＧＧＣＳＧＴＬＭＮＬＬＱＥＥＲＦＮＨＱＡＥＶＶＳＧＶＬＥＥＥＣＧＧＭＬＳＡＦＦＲＥＬＲＫＫＫＫＡＡＲＫＮＬＳＥ（配列番号８９０）
に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの場合では、好適なアデノシンデアミナーゼは、以下のサルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＴａｄＡアミノ酸配列：
ＭＰＰＡＦＩＴＧＶＴＳＬＳＤＶＥＬＤＨＥＹＷＭＲＨＡＬＴＬＡＫＲＡＷＤＥＲＥＶＰＶＧＡＶＬＶＨＮＨＲＶＩＧＥＧＷＮＲＰＩＧＲＨＤＰＴＡＨＡＥＩＭＡＬＲＱＧＧＬＶＬＱＮＹＲＬＬＤＴＴＬＹＶＴＬＥＰＣＶＭＣＡＧＡＭＶＨＳＲＩＧＲＶＶＦＧＡＲＤＡＫＴＧＡＡＧＳＬＩＤＶＬＨＨＰＧＭＮＨＲＶＥＩＩＥＧＶＬＲＤＥＣＡＴＬＬＳＤＦＦＲＭＲＲＱＥＩＫＡＬＫＫＡＤＲＡＥＧＡＧＰＡＶ（配列番号８９１）
に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの場合では、好適なアデノシンデアミナーゼは、以下のシェワネラ・プトレファシエンス（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ）ＴａｄＡアミノ酸配列：
ＭＤＥＹＷＭＱＶＡＭＱＭＡＥＫＡＥＡＡＧＥＶＰＶＧＡＶＬＶＫＤＧＱＱＩＡＴＧＹＮＬＳＩＳＱＨＤＰＴＡＨＡＥＩＬＣＬＲＳＡＧＫＫＬＥＮＹＲＬＬＤＡＴＬＹＩＴＬＥＰＣＡＭＣＡＧＡＭＶＨＳＲＩＡＲＶＶＹＧＡＲＤＥＫＴＧＡＡＧＴＶＶＮＬＬＱＨＰＡＦＮＨＱＶＥＶＴＳＧＶＬＡＥＡＣＳＡＱＬＳＲＦＦＫＲＲＲＤＥＫＫＡＬＫＬＡＱＲＡＱＱＧＩＥ（配列番号８９２）
に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの場合では、好適なアデノシンデアミナーゼは、以下のインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）Ｆ３０３１ ＴａｄＡアミノ酸配列：
ＭＤＡＡＫＶＲＳＥＦＤＥＫＭＭＲＹＡＬＥＬＡＤＫＡＥＡＬＧＥＩＰＶＧＡＶＬＶＤＤＡＲＮＩＩＧＥＧＷＮＬＳＩＶＱＳＤＰＴＡＨＡＥＩＩＡＬＲＮＧＡＫＮＩＱＮＹＲＬＬＮＳＴＬＹＶＴＬＥＰＣＴＭＣＡＧＡＩＬＨＳＲＩＫＲＬＶＦＧＡＳＤＹＫＴＧＡＩＧＳＲＦＨＦＦＤＤＹＫＭＮＨＴＬＥＩＴＳＧＶＬＡＥＥＣＳＱＫＬＳ ＴＦＦＱＫＲＲＥＥＫＫＩＥＫＡＬＬＫＳＬＳＤＫ（配列番号８９３）
に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの場合では、好適なアデノシンデアミナーゼは、以下のカウロバクター・クレセンタス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）ＴａｄＡアミノ酸配列：
ＭＲＴＤＥＳＥＤＱＤＨＲＭＭＲＬＡＬＤＡＡＲＡＡＡＥＡＧＥＴＰＶＧＡＶＩＬＤＰＳＴＧＥＶＩＡＴＡＧＮＧＰＩＡＡＨＤＰＴＡＨＡＥＩＡＡＭＲＡＡＡＡＫＬＧＮＹＲＬＴＤＬＴＬＶＶＴＬＥＰＣＡＭＣＡＧＡＩＳＨＡＲＩＧＲＶＶＦＧＡＤＤＰＫＧＧＡＶＶＨＧＰＫＦＦＡＱＰＴＣＨＷＲＰＥＶＴＧＧＶＬＡＤＥＳＡＤＬＬＲＧＦＦＲＡＲＲＫＡＫＩ（配列番号８９４）
に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの場合では、好適なアデノシンデアミナーゼは、以下のゲオバクター・スルフレデュセンス（Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｌｆｕｒｒｅｄｕｃｅｎｓ）ＴａｄＡアミノ酸配列：
ＭＳＳＬＫＫＴＰＩＲＤＤＡＹＷＭＧＫＡＩＲＥＡＡＫＡＡＡＲＤＥＶＰＩＧＡＶＩＶＲＤＧＡＶＩＧＲＧＨＮＬＲＥＧＳＮＤＰＳＡＨＡＥＭＩＡＩＲＱＡＡＲＲＳＡＮＷＲＬＴＧＡＴＬＹＶＴＬＥＰＣＬＭＣＭＧＡＩＩＬＡＲＬＥＲＶＶＦＧＣＹＤＰＫＧＧＡＡＧＳＬＹＤＬＳＡＤＰＲＬＮＨＱＶＲＬＳＰＧＶＣＱＥＥＣＧＴＭＬＳＤＦＦＲＤＬＲＲＲＫＫＡＫＡＴＰＡＬＦＩＤＥＲＫＶＰＰＥＰ（配列番号８９５）
に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドに複合体化させる生体分子として好適なシチジンデアミナーゼには、ＤＮＡ中のシチジンを脱アミノ化することができる任意の酵素が含まれる。
いくつかの場合では、シチジンデアミナーゼは、デアミナーゼのアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集複合体（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリー由来のデアミナーゼである。いくつかの場合では、ＡＰＯＢＥＣファミリーデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ１デアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ２デアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ａデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇデアミナーゼ、及びＡＰＯＢＥＣ３Ｈデアミナーゼからなる群から選択される。いくつかの場合では、シチジンデアミナーゼは、活性化誘導デアミナーゼ（ＡＩＤ）である。
いくつかの場合では、好適なシチジンデアミナーゼは、以下のアミノ酸配列：
ＭＤＳＬＬＭＮＲＲＫＦＬＹＱＦＫＮＶＲＷＡＫＧＲＲＥＴＹＬＣＹＶＶＫＲＲＤＳＡＴＳＦＳＬＤＦＧＹＬＲＮＫＮＧＣＨＶＥＬＬＦＬＲＹＩＳＤＷＤＬＤＰＧＲＣＹＲＶＴＷＦＴＳＷＳＰＣＹＤＣＡＲＨＶＡＤＦＬＲＧＮＰＮＬＳＬＲＩＦＴＡＲＬＹＦＣＥＤＲＫＡＥＰＥＧＬＲＲＬＨＲＡＧＶＱＩＡＩＭＴＦＫＤＹＦＹＣＷＮＴＦＶＥＮＨＥＲＴＦＫＡＷＥＧＬＨＥＮＳＶＲＬＳＲＱＬＲＲＩＬＬＰＬＹＥＶＤＤＬＲＤＡＦＲＴＬＧＬ（配列番号８９６）
に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの場合では、好適なシチジンデアミナーゼはＡＩＤであり、以下のアミノ酸配列：
ＭＤＳＬＬＭＮＲＲＫ ＦＬＹＱＦＫＮＶＲＷ ＡＫＧＲＲＥＴＹＬＣ ＹＶＶＫＲＲＤＳＡＴ ＳＦＳＬＤＦＧＹＬＲ ＮＫＮＧＣＨＶＥＬＬ ＦＬＲＹＩＳＤＷＤＬ ＤＰＧＲＣＹＲＶＴＷ ＦＴＳＷＳＰＣＹＤＣ ＡＲＨＶＡＤＦＬＲＧ ＮＰＮＬＳＬＲＩＦＴ ＡＲＬＹＦＣＥＤＲＫ ＡＥＰＥＧＬＲＲＬＨ ＲＡＧＶＱＩＡＩＭＴ ＦＫＥＮＨＥＲＴＦＫ ＡＷＥＧＬＨＥＮＳＶ ＲＬＳＲＱＬＲＲＩＬ ＬＰＬＹＥＶＤＤＬＲＤＡＦＲＴＬＧＬ（配列番号８９７）
に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの場合では、好適なシチジンデアミナーゼはＡＩＤであり、以下のアミノ酸配列：
ＭＤＳＬＬＭＮＲＲＫ ＦＬＹＱＦＫＮＶＲＷ ＡＫＧＲＲＥＴＹＬＣ ＹＶＶＫＲＲＤＳＡＴ ＳＦＳＬＤＦＧＹＬＲ ＮＫＮＧＣＨＶＥＬＬ ＦＬＲＹＩＳＤＷＤＬ ＤＰＧＲＣＹＲＶＴＷ ＦＴＳＷＳＰＣＹＤＣ ＡＲＨＶＡＤＦＬＲＧ ＮＰＮＬＳＬＲＩＦＴ ＡＲＬＹＦＣＥＤＲＫ ＡＥＰＥＧＬＲＲＬＨ ＲＡＧＶＱＩＡＩＭＴ ＦＫＤＹＦＹＣＷＮＴ ＦＶＥＮＨＥＲＴＦＫ ＡＷＥＧＬＨＥＮＳＶ ＲＬＳＲＱＬＲＲＩＬ ＬＰＬＹＥＶＤＤＬＲ ＤＡＦＲＴＬＧＬ（配列番号８９８）
に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの場合では、生体分子をＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドに複合体化させるための本開示の方法を、トレハロースの存在下で実施する。トレハロースの濃度は、２５ｍＭ～約１００ｍＭ（例えば、２５ｍＭ～５０ｍＭ、５０ｍＭ～１００ｍＭ）であり得る。例えば、いくつかの場合では、生体分子をＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドに複合体化させるための本開示の方法を、以下の条件下で実施する：２０ｍＭのトリスＨＣｌ、３００ｍＭのＫＣｌ、５０ｍＭのトレハロースｐＨ７．０、４℃ 、１時間；１０μＭ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチド。
標的分子
修飾に適した標的分子には、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、脂質、糖脂質、糖ポリペプチドなどが含まれるが、これらに限定されない。本開示の方法に従って修飾される標的分子は、フェノール部分またはカテコール部分を含むか、または含むように修飾される。
いくつかの場合では、標的分子はポリペプチド（「標的ポリペプチド」）である。
本開示の方法を使用して修飾することができる標的ポリペプチドには、酵素、抗体、構造ポリペプチド、受容体のリガンド、受容体などが含まれるが、これらに限定されない。標的ポリペプチドには、構造タンパク質；受容体；酵素；細胞表面タンパク質；細胞の機能に不可欠なタンパク質；触媒活性に関与するタンパク質；運動活動に関与するタンパク質；ヘリカーゼ活性に関与するタンパク質；代謝過程（同化作用及び異化作用）に関与するタンパク質；抗酸化活性に関与するタンパク質；タンパク質分解に関与するタンパク質；生合成に関与するタンパク質；キナーゼ活性を有するタンパク質；オキシドレダクターゼ活性を有するタンパク質；トランスフェラーゼ活性を有するタンパク質；加水分解酵素活性を有するタンパク質；リアーゼ活性を有するタンパク質；イソメラーゼ活性を有するタンパク質；リガーゼ活性を有するタンパク質；酵素調節活性を有するタンパク質；シグナル伝達活性を有するタンパク質；構造ポリペプチド；結合活性を有するポリペプチド；受容体ポリペプチド；細胞運動に関与するタンパク質；膜融合に関与するタンパク質；細胞コミュニケーションに関与するタンパク質；生物学的プロセスの調節に関与するタンパク質；開発に関与するタンパク質；細胞分化に関与するタンパク質；刺激への応答に関与するタンパク質；行動タンパク質；細胞接着タンパク質；細胞死に関与するタンパク質；輸送に関与するタンパク質（タンパク質輸送体活性、核輸送、イオン輸送体活性、チャネル輸送体活性などを含む）；分泌活性に関与するタンパク質；電子輸送体活性に関与するタンパク質；病因に関与するタンパク質；シャペロン調節活性に関与するタンパク質；核酸結合活性を有するタンパク質；転写調節活性を有するタンパク質；細胞外組織に関与するタンパク質；生合成に関与するタンパク質；翻訳調節に関与するタンパク質などが含まれ得る。
いくつかの場合では、標的ポリペプチドは抗体である。抗体は、任意の抗原結合抗体に基づくポリペプチドであり得、多種多様な抗体が当技術分野で公知である。いくつかの例では、抗体は単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である。他の抗体ベースの抗原結合ドメイン（ｃＡｂ ＶＨＨ（ラクダ抗体可変ドメイン）及びヒト化バージョン、ＩｇＮＡＲ ＶＨ（サメ抗体可変ドメイン）及びヒト化バージョン、ｓｄＡｂ ＶＨ（単一ドメイン抗体可変ドメイン）及び「ラクダ化」抗体可変ドメインが使用に適している。いくつかの例では、単鎖ＴＣＲ（ｓｃＴｖ、ＶαＶβを含む単鎖２ドメインＴＣＲ）などのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ベースの認識ドメインも使用に適している。
抗体は、抗原、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＣＤ３０、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥＲＢＢ２、ＣＡ１２５、ＭＵＣ－１、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＣＤ４４表面接着分子、メソセリン、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、血管内皮成長因子受容体－２（ＶＥＧＦＲ２）、高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷ－ＭＡＡ）、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＩＬ－１３Ｒ－ａ２、ＧＤ２などに特異的であり得る。いくつかの場合では、抗体は、サイトカインに特異的である。いくつかの場合では、抗体は、サイトカイン受容体に特異的である。いくつかの場合では、抗体は、成長因子に特異的である。いくつかの場合では、抗体は、成長因子受容体に特異的である。いくつかの場合では、抗体は、細胞表面受容体に特異的である。いくつかの場合では、抗体は、抗ＣＤ３抗体である。
いくつかの場合では、抗体は：８０６、９Ｅ１０、３Ｆ８、８１Ｃ６、８Ｈ９、アバゴボマブ、アバタセプト、アブシキシマブ、アビツズマブ、アブリルマブ、アクトクスマブ、アダリムマブ、アデカツズマブ、アドゥカヌマブ、アフェリモマブ、アフツズマブ、アラシズマブ ペゴル、ＡＬＤ５１８、アレファセプト、アレムツズマブ、アリロクマブ、アルトゥモマブ ペンテテート、アマツキシマブ、ＡＭＧ１０２、アナツモマブ マフェナトックス、アネツマブ ラブタンシン、アニフロルマブ、アンルキンズマブ、アポリズマブ、アルシツモマブ、アスクリンバクマブ、アセリズマブ、アタシセプト、アテゾリズマブ、アチヌマブ、アトリズマブ／トシリズマブ、アトロリムマブ、ＡＶＥ１６４２、バピネウズマブ、バシリキシマブ、バビツキシマブ、ベクツモマブ、ベゲロマブ、ベリムマブ、ベンラリズマブ、ベルチリムマブ、ベシレソマブ、ベバシズマブ、ベズロトクスマブ、ビシロマブ、ビマグルマブ、ビメキズマブ、ビバツズマブ メルタンシン、ブリナツモマブ、ブロソズマブ、ＢＭＳ－９３６５５９、ボコシズマブ、ブレンツキシマブ ベドチン、ブリアキヌマブ、ブロダルマブ、ブロルシズマブ、ブロンチクツズマブ、カナキヌマブ、カンツズマブ メルタンシン、カンツズマブ ラブタンシン、カプラシズマブ、カプロマブ ペンデチド、カルルマブ、カツマキソマブ、ｃＢＲ９６－ドキソルビシン免疫複合体、ＣＣ４９、ＣＤＰ７９１、セデリズマブ、セルトリズマブ ペゴル、セツキシマブ、ｃＧ２５０、Ｃｈ．１４．１８、シタツズマブ ボガトックス、シクスツムマブ、クラザキズマブ、クレノリキシマブ、クリバツズマブ テトラキセタン、コドリツズマブ、コルツキシマブ ラブタンシン、コナツムマブ、コンシズマブ、ＣＰ７５１８７１、ＣＲ６２６１、クレネズマブ、ＣＳ－１００８、ダセツズマブ、ダクリズマブ、ダロツズマブ、ダピロリズマブ ペゴル、ダラツムマブ、デクトレクマブ、デムシズマブ、デニンツズマブ マフォドチン、デノスマブ、デルロツキシマブ ビオチン、デツモマブ、ジヌツキシマブ、ディリダブマブ、ドルリモマブ アリトクス、ドロチツマブ、デュリゴツマブ、デュピルマブ、デュルバルマブ、デュシギツマブ、エクロメキシマブ、エクリズマブ、エドバコマブ、エドレコロマブ、エファリズマブ、エファリズマブ、エルデルマブ、エルゲムツマブ、エロツズマブ、エルシリモマブ、エマクツズマブ、エミベツズマブ、エナバツズマブ、エンフォルツマブ ベドチン、エンリモマブ ペゴル、エノブリツズマブ、エノキズマブ、エノチクマブ、エンシツキシマブ、エピツモマブ シツキセタン、エプラツズマブ、エルリズマブ、エルツマキソマブ、エタネルセプト、エタラシズマブ、エトロリズマブ、エビナクマブ、エボロクマブ、エクスビビルマブ、Ｆ１９、ファノレソマブ、ファラリモマブ、ファレツズマブ、ファシヌマブ、ＦＢＴＡ０５、フェルビズマブ、フェザキヌマブ、フィクラツズマブ、フィギツムマブ、フィリブマブ、フランボツマブ、フレチクマブ、フォントリズマブ、フォラルマブ、フォラビルマブ、フレソリムマブ、フラヌマブ、フツキシマブ、ガリキシマブ、ガニツマブ、ガンテネルマブ、ガビリモマブ、ゲムツズマブ オゾガマイシン、ゲボキズマブ、ギレンツキシマブ、グレムバツムマブ ベドチン、ゴリムマブ、ゴミリキシマブ、グセルクマブ、ＨＧＳ－ＥＴＲ２、ｈｕ３Ｓ１９３、ｈｕＡ３３、イバリズマブ、イブリツモマブ チウキセタン、イクルクマブ、イダルシズマブ、ＩＧＮ１０１、ＩｇＮ３１１、イゴボマブ、ＩＩＩＡ４、ＩＭ－２Ｃ６、ＩＭＡＢ３６２、イマルマブ、ＩＭＣ－Ａ１２、イムシロマブ、イムガツズマブ、インクラクマブ、インダツキシマブ ラブタンシン、インデュサツマブ ベドチン、インフリキシマブ、イノリモマブ、イノツズマブ オゾガマイシン、インテツムマブ、イピリムマブ、イラツムマブ、イサツキシマブ、イトリズマブ、イキセキズマブ、Ｊ５９１、ＫＢ００４、ケリキシマブ、ＫＷ－２８７１、ラベツズマブ、ランブロリズマブ、ランパリズマブ、レブリキズマブ、レマレソマブ、レンジルマブ、レルデリムマブ、レクサツムマブ、リビビルマブ、リファスツズマブ ベドチン、リゲリズマブ、リロトマブ サテトラキセタン、リンツズマブ、リリルマブ、ロデルシズマブ、ロキベトマブ、ロルボツズマブ メルタンシン、ルカツムマブ、ルリズマブ ペゴル、ルミリキシマブ、ルムレツズマブ、マパツムマブ、マルゲツキシマブ、マスリモマブ、マツズマブ、マブリリムマブ、ＭＥＤＩ４７３６、メポリズマブ、メテリムマブ、ＭＥＴＭＡＢ、ミラツズマブ、ミンレツモマブ、ミルベツキシマブ ソラブタンシン、ミツモマブ、ＭＫ－０６４６、ＭＫ－３４７５、ＭＭ－１２１、モガムリズマブ、ＭＯＲＡｂ－００３、モロリムマブ、モタビズマブ、ＭＯｖ１８、モクセツモマブ パスドトックス、ＭＰＤＬ３３２８０Ａ、ムロモナブ－ＣＤ３、ナコロマブ タフェナトックス、ナミルマブ、ナプツモマブ エスタフェナトックス、ナルナツマブ、ナタリズマブ、ネバクマブ、ネシツムマブ、ネモリズマブ、ネレリモマブ、ネスバクマブ、ニモツズマブ、ニボルマブ、ノフェツモマブ メルペンタン、オビルトキサキシマブ、オビヌツズマブ、オカラツズマブ、オクレリズマブ、オズリモマブ、オファツムマブ、オララツマブ、オロキズマブ、オマリズマブ、オナルツズマブ、オンツキシズマブ、オピシヌマブ、オポルツズマブ モナトックス、オレゴボマブ、オルチクマブ、オテリキシズマブ、オトレルツズマブ、オクセルマブ、オザネズマブ、オゾラリズマブ、パギバキシマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、パンコマブ、パノバクマブ、パルサツズマブ、パスコリズマブ、パソツキシズマブ、パテクリズマブ、パトリツマブ、ペンブロリズマブ、ペムツモマブ、ペラキズマブ、ペルツズマブ、ペクセリズマブ、ピジリズマブ、ピナツズマブ ベドチン、ピンツモマブ、プラクルマブ、ポラツズマブ ベドチン、ポネズマブ、プリリキシマブ、プリトキサキシマブ、プリツムマブ、ＰＲＯ１４０、キリズマブ、Ｒ１５０７、ラコツモマブ、ラドレツマブ、ラフィビルマブ、ラルパンシズマブ、ラムシルマブ、ラニビズマブ、ラキシバクマブ、レファネズマブ、レガビルマブ、レスリズマブ、リロツムマブ、リヌクマブ、リツキシマブ、ロバツムマブ、ロレヅマブ、ロモソズマブ、ロンタリズマブ、ロベリズマブ、ルプリズマブ、サシツズマブ ゴビテカン、サマリズマブ、サリルマブ、サツモマブ ペンデチド、ＳＣＨ９００１０５、セクキヌマブ、セリバンツマブ、セトキサキシマブ、セビルマブ、ＳＧＮ－ＣＤ１９Ａ、ＳＧＮ－ＣＤ３３Ａ、シブロツズマブ、シファリムマブ、シルツキシマブ、シムツズマブ、シプリズマブ、シルクマブ、ソフィツズマブ ベドチン、ソラネズマブ、ソリトマブ、ソネプシズマブ、ソンツズマブ、スタムルマブ、スレソマブ、スビズマブ、タバルマブ、タカツズマブ テトラキセタン、タドシズマブ、タリズマブ、タネズマブ、タプリツマブ パプトックス、タレクツマブ、テフィバズマブ、テリモマブ アリトックス、テナツモマブ、テネリキシマブ、テプリズマブ、テプロツムマブ、テシドルマブ、テツロマブ、ＴＧＮ１４１２、チシリムマブ／トレメリムマブ、チガツズマブ、チルドラキズマブ、ＴＮＸ－６５０、トシリズマブ、トラリズマブ、トサトクスマブ、トシツモマブ、トベツマブ、トラロキヌマブ、トラスツズマブ、ＴＲＢＳ０７、トレガリズマブ、トレメリムマブ、トレボグルマブ、ツコツズマブ セルモロイキン、ツビルマブ、ウブリツキシマブ、ウロクプルマブ、ウレルマブ、ウステキヌマブ、ウステキヌマブ、ヴァンドルツズマブ ベドチン、バンチクツマブ、バヌシズマブ、バパリキシマブ、バルリルマブ、バテリズマブ、ベドリズマブ、ベルツズマブ、ベパリモマブ、ベセンクマブ、ビシリズマブ、ボロシキシマブ、ボルセツズマブ マフォドチン、ボツムマブ、ザルツムマブ、ザノリムマブ、ザツキシマブ、ジラリムマブ及びゾリモマブ アリトックスから選択される。
いくつかの場合では、標的ポリペプチドはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドである。好適なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドは、クラス２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、例えば、ＩＩ型、Ｖ型、またはＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドである。いくつかの場合では、好適なＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼは、クラス２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼである。いくつかの場合では、好適なＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼは、クラス２のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）である。いくつかの場合では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓガイドエフェクターポリペプチドは、クラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチド（例えば、Ｃｐｆ１タンパク質、Ｃ２ｃ１タンパク質、またはＣ２ｃ３タンパク質）である。いくつかの場合では、好適なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドは、クラス２のＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチド（例えば、Ｃ２ｃ２タンパク質；「Ｃａｓ１３ａ」タンパク質とも呼ばれる）である。ＣａｓＸタンパク質もまた、好適である。ＣａｓＹタンパク質もまた、好適である。
いくつかの場合では、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓエフェクターポリペプチドはＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドである。いくつかの場合では、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓエフェクターポリペプチドはＣａｓ９ポリペプチドである。Ｃａｓ９タンパク質は、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメントとの会合によって、標的核酸配列（例えば、染色体配列または染色体外配列、例えば、エピソーム配列、ミニサークル配列、ミトコンドリア配列、緑葉体配列など）内の標的部位に誘導される（例えば、標的部位において安定化される）。いくつかの場合では、Ｃａｓ９ポリペプチドは、配列番号７５３に記載のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９に対して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または９９％超のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合では、Ｃａｓ９ポリペプチドは、配列番号５～８１６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む。いくつかの場合では、Ｃａｓ９ポリペプチドは、配列番号５～８１６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または９９％超のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの場合では、Ｃａｓ９ポリペプチドは、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９（ｓａＣａｓ９）ポリペプチドである。いくつかの場合では、ｓａＣａｓ９ポリペプチドは、配列番号２４９に記載のｓａＣａｓ９アミノ酸配列に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの場合では、Ｃａｓ９ポリペプチドは、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ Ｃａｓ９（ＣｊＣａｓ９）ポリペプチドである。ＣｊＣａｓ９は、５’－ＮＮＮＶＲＹＭ－３’をプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）として認識する。ＣｊＣａｓ９のアミノ酸配列を配列番号５５に記載する。いくつかの場合では、好適なＣａｓ９ポリペプチドは、配列番号５５に記載のＣｊＣａｓ９アミノ酸配列に対して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または９９％超のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの場合では、好適なＣａｓ９ポリペプチドは、高忠実度（ＨＦ）Ｃａｓ９ポリペプチドである。Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎａｔｕｒｅ ５２９：４９０． 例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９アミノ酸配列（例えば、配列番号５） のアミノ酸Ｎ４９７、Ｒ６６１、Ｑ６９５、及びＱ９２６が、例えば、アラニンで置換されている。例えば、ＨＦ Ｃａｓ９ポリペプチドは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（例えば、配列番号５）に対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％超のアミノ酸配列同一性を有し得、アミノ酸Ｎ４９７、Ｒ６６１、Ｑ６９５、及びＱ９２６が、例えば、アラニンで置換されている。いくつかの場合では、好適なＣａｓ９ポリペプチドは、改変されたＰＡＭ特異性を示す。例えば、Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ ５２３：４８１を参照のこと。
いくつかの場合では、好適なＣａｓ９ポリペプチドは、以下のＣａｓ９－ＨＦ１配列：
ＤＫＫＹＳＩＧＬＡＩＧＴＮＳＶＧＷＡＶＩＴＤＥＹＫＶＰＳＫＫＦＫＶＬＧＮＴＤＲＨＳＩＫＫＮＬＩＧＡＬＬＦＤＳＧＥＴＡＥＡＴＲＬＫＲＴＡＲＲＲＹＴＲＲＫＮＲＩＣＹＬＱＥＩＦＳＮＥＭＡＫＶＤＤＳＦＦＨＲＬＥＥＳＦＬＶＥＥＤＫＫＨＥＲＨＰＩＦＧＮＩＶＤＥＶＡＹＨＥＫＹＰＴＩＹＨＬＲＫＫＬＶＤＳＴＤＫＡＤＬＲＬＩＹＬＡＬＡＨＭＩＫＦＲＧＨＦＬＩＥＧＤＬＮＰＤＮＳＤＶＤＫＬＦＩＱＬＶＱＴＹＮＱＬＦＥＥＮＰＩＮＡＳＧＶＤＡＫＡＩＬＳＡＲＬＳＫＳＲＲＬＥＮＬＩＡＱＬＰＧＥＫＫＮＧＬＦＧＮＬＩＡＬＳＬＧＬＴＰＮＦＫＳＮＦＤＬＡＥＤＡＫＬＱＬＳＫＤＴＹＤＤＤＬＤＮＬＬＡＱＩＧＤＱＹＡＤＬＦＬＡＡＫＮＬＳＤＡＩＬＬＳＤＩＬＲＶＮＴＥＩＴＫＡＰＬＳＡＳＭＩＫＲＹＤＥＨＨＱＤＬＴＬＬＫＡＬＶＲＱＱＬＰＥＫＹＫＥＩＦＦＤＱＳＫＮＧＹＡＧＹＩＤＧＧＡＳＱＥＥＦＹＫＦＩＫＰＩＬＥＫＭＤＧＴＥＥＬＬＶＫＬＮＲＥＤＬＬＲＫＱＲＴＦＤＮＧＳＩＰＨＱＩＨＬＧＥＬＨＡＩＬＲＲＱＥＤＦＹＰＦＬＫＤＮＲＥＫＩＥＫＩＬＴＦＲＩＰＹＹＶＧＰＬＡＲＧＮＳＲＦＡＷＭＴＲＫＳＥＥＴＩＴＰＷＮＦＥＥＶＶＤＫＧＡＳＡＱＳＦＩＥＲＭＴＡＦＤＫＮＬＰＮＥＫＶＬＰＫＨＳＬＬＹＥＹＦＴＶＹＮＥＬＴＫＶＫＹＶＴＥＧＭＲＫＰＡＦＬＳＧＥＱＫＫＡＩＶＤＬＬＦＫＴＮＲＫＶＴＶＫＱＬＫＥＤＹＦＫＫＩＥＣＦＤＳＶＥＩＳＧＶＥＤＲＦＮＡＳＬＧＴＹＨＤＬＬＫＩＩＫＤＫＤＦＬＤＮＥＥＮＥＤＩＬＥＤＩＶＬＴＬＴＬＦＥＤＲＥＭＩＥＥＲＬＫＴＹＡＨＬＦＤＤＫＶＭＫＱＬＫＲＲＲＹＴＧＷＧＡＬＳＲＫＬＩＮＧＩＲＤＫＱＳＧＫＴＩＬＤＦＬＫＳＤＧＦＡＮＲＮＦＭＡＬＩＨＤＤＳＬＴＦＫＥＤＩＱＫＡＱＶＳＧＱＧＤＳＬＨＥＨＩＡＮＬＡＧＳＰＡＩＫＫＧＩＬＱＴＶＫＶＶＤＥＬＶＫＶＭＧＲＨＫＰＥＮＩＶＩＥＭＡＲＥＮＱＴＴＱＫＧＱＫＮＳＲＥＲＭＫＲＩＥＥＧＩＫＥＬＧＳＱＩＬＫＥＨＰＶＥＮＴＱＬＱＮＥＫＬＹＬＹＹＬＱＮＧＲＤＭＹＶＤＱＥＬＤＩＮＲＬＳＤＹＤＶＤＨＩＶＰＱＳＦＬＫＤＤＳＩＤＮＫＶＬＴＲＳＤＫＮＲＧＫＳＤＮＶＰＳＥＥＶＶＫＫＭＫＮＹＷＲＱＬＬＮＡＫＬＩＴＱＲＫＦＤＮＬＴＫＡＥＲＧＧＬＳＥＬＤＫＡＧＦＩＫＲＱＬＶＥＴＲＡＩＴＫＨＶＡＱＩＬＤＳＲＭＮＴＫＹＤＥＮＤＫＬＩＲＥＶＫＶＩＴＬＫＳＫＬＶＳＤＦＲＫＤＦＱＦＹＫＶＲＥＩＮＮＹＨＨＡＨＤＡＹＬＮＡＶＶＧＴＡＬＩＫＫＹＰＫＬＥＳＥＦＶＹＧＤＹＫＶＹＤＶＲＫＭＩＡＫＳＥＱＥＩＧＫＡＴＡＫＹＦＦＹＳＮＩＭＮＦＦＫＴＥＩＴＬＡＮＧＥＩＲＫＲＰＬＩＥＴＮＧＥＴＧＥＩＶＷＤＫＧＲＤＦＡＴＶＲＫＶＬＳＭＰＱＶＮＩＶＫＫＴＥＶＱＴＧＧＦＳＫＥＳＩＬＰＫＲＮＳＤＫＬＩＡＲＫＫＤＷＤＰＫＫＹＧＧＦＤＳＰＴＶＡＹＳＶＬＶＶＡＫＶＥＫＧＫＳＫＫＬＫＳＶＫＥＬＬＧＩＴＩＭＥＲＳＳＦＥＫＮＰＩＤＦＬＥＡＫＧＹＫＥＶＫＫＤＬＩＩＫＬＰＫＹＳＬＦＥＬＥＮＧＲＫＲＭＬＡＳＡＧＥＬＱＫＧＮＥＬＡＬＰＳＫＹＶＮＦＬＹＬＡＳＨＹＥＫＬＫＧＳＰＥＤＮＥＱＫＱＬＦＶＥＱＨＫＨＹＬＤＥＩＩＥＱＩＳＥＦＳＫＲＶＩＬＡＤＡＮＬＤＫＶＬＳＡＹＮＫＨＲＤＫＰＩＲＥＱＡＥＮＩＩＨＬＦＴＬＴＮＬＧＡＰＡＡＦＫＹＦＤＴＴＩＤＲＫＲＹＴＳＴＫＥＶＬＤＡＴＬＩＨＱＳＩＴＧＬＹＥＴＲＩＤＬＳＱＬＧＧＤ（配列番号８９９）
に対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの場合では、好適なＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓエフェクターポリペプチドはＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドである。いくつかの場合では、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓエフェクターポリペプチドはＣｐｆ１タンパク質である。いくつかの場合では、Ｃｐｆ１タンパク質は、配列番号８１８～８２２のいずれか１つに記載のＣｐｆ１アミノ酸配列に対して、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの場合では、好適なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドは、ＣａｓＸまたはＣａｓＹポリペプチドである。ＣａｓＸ及びＣａｓＹポリペプチドは、Ｂｕｒｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｎａｔｕｒｅ ５４２：２３７に記載されている。
いくつかの場合では、好適なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドは、異種ポリペプチド（「融合パートナー」とも呼ばれる）に融合させたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドを含む融合タンパク質である。いくつかの場合では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドを、細胞内局在化を提供するアミノ酸配列（融合パートナー）に融合させ、すなわち、融合パートナーは、細胞内局在化配列（例えば、核を標的とするための１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）、２つ以上のＮＬＳ、３つ以上のＮＬＳなど）である。
クラス２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９タンパク質；Ｖ型またはＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質；Ｃｐｆ１タンパク質など）に結合し、複合体を標的核酸内の特定の位置にターゲティングする核酸は、本明細書中では「ガイドＲＮＡ」または「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓガイド核酸」または「ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ」と呼ばれる。ガイドＲＮＡは、標的核酸配列に相補的なヌクレオチド配列であるガイド配列（本明細書ではターゲティング配列とも呼ばれる）を含むターゲティングセグメントを含むことにより、複合体（ＲＮＰ複合体）に標的特異性を提供する。
いくつかの場合では、ガイドＲＮＡは、２つの別個の核酸分子：「活性化因子」及び「ターゲッター（Ｔｅｒｇｅｔｅｒ）」を含み、本明細書では、「デュアルガイドＲＮＡ」、「二重分子ガイドＲＮＡ」、「２分子ガイドＲＮＡ」または「ｄｇＲＮＡ」」と呼ばれる。いくつかの場合では、ガイドＲＮＡは、１つの分子（例えば、いくつかのクラス２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質の場合、対応するガイドＲＮＡは単一の分子であり；いくつかの場合では、活性化因子及びターゲッターは、例えば、介在するヌクレオチドを介して互いに共有結合する）であり、ガイドＲＮＡは、「単一ガイドＲＮＡ」、「単一分子ガイドＲＮＡ」、「１分子ガイドＲＮＡ」、または単に「ｓｇＲＮＡ」と呼ばれる。
クラス２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチド
クラス２のＣＲＩＳＰＲ系では、エフェクター複合体の機能（例えば、標的ＤＮＡの切断）を、単一のエンドヌクレアーゼによって行う（例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ．２０１５ Ｏｃｔ ２２；１６３（３）：７５９－７１；Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１５ Ｎｏｖ；１３（１１）：７２２－３６；Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．２０１５ Ｎｏｖ ５；６０（３）：３８５－９７）；及びＳｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １５：１６９を参照のこと。そのため、用語「クラス２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質」は、本明細書では、クラス２のＣＲＩＳＰＲ系由来のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチド（例えば、標的核酸切断タンパク質）を包含するように使用される。したがって、本明細書中で使用する用語「クラス２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチド」は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９）；Ｖ－Ａ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチド（例えば、Ｃｐｆ１（「Ｃａｓ１２ａ」とも呼ばれる））；Ｖ－Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチド（例えば、Ｃ２ｃ１（「Ｃａｓ１２ｂ」とも呼ばれる））；Ｖ－Ｃ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチド（例えば、Ｃ２ｃ３（「Ｃａｓ１２ｃ」とも呼ばれる））；Ｖ－Ｕ１型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチド（例えば、Ｃ２ｃ４）；Ｖ－Ｕ２型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチド（例えば、Ｃ２ｃ８）；Ｖ－Ｕ５型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチド（例えば、Ｃ２ｃ５）；Ｖ－Ｕ４型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃ２ｃ９）；Ｖ－Ｕ３型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチド（例えば、Ｃ２ｃ１０）；ＶＩ－Ａ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチド（例えば、Ｃ２ｃ２（「Ｃａｓ１３ａ」としても知られる））；ＶＩ－Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチド（例えば、Ｃａｓ１３ｂ（Ｃ２ｃ４としても知られる））；及びＶＩ－Ｃ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチド（例えば、Ｃａｓ１３ｃ（Ｃ２ｃ７としても知られる））を包含する。現在までに、ＩＩ型、Ｖ型、及びＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドが、クラス２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドに包含されているが、この用語はまた、対応するガイドＲＮＡに結合してＲＮＰ複合体を形成するのに適した任意のクラス２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドを包含することをも意味している。
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）
天然のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系では、Ｃａｓ９は、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼとして機能し、ｃｒＲＮＡとトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を備えたデュアルガイドＲＮＡを使用して、Ｃａｓ９の２つのヌクレアーゼ活性部位が一緒になって二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）を生成するか、または一本鎖ＤＮＡ切断（ＳＳＢ）を個別に生成するメカニズムによって、標的を認識し、切断する。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼＣａｓ９及び改変されたデュアルガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）またはシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、所望のＤＮＡ配列をターゲティングすることができるリボヌクレオプロテイン（ＲＮＰ）複合体を形成する。デュアルＲＮＡ複合体またはキメラシングルガイドＲＮＡによって誘導されて、Ｃａｓ９は、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）標的核酸内に部位特異的ＤＳＢまたはＳＳＢを生成し、これは、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同組換え（ＨＤＲ）のいずれかによって修復される。
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドは、クラス２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼの一種である。いくつかの場合では、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９タンパク質である。Ｃａｓ９タンパク質は、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡと複合体を形成する。ガイドＲＮＡは、標的核酸の配列（標的部位）に相補的なヌクレオチド配列（ガイド配列）を有することにより、Ｃａｓ９－ガイドＲＮＡ複合体に標的特異性を提供する（本明細書の他の場所に記載されているように）。複合体のＣａｓ９タンパク質は、部位特異的な活性を提供する。言い換えれば、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメントとの会合によって、標的核酸配列（例えば、染色体配列または染色体外配列、例えば、エピソーム配列、ミニサークル配列、ミトコンドリア配列、緑葉体配列など）内の標的部位に誘導される（例えば、標的部位において安定化される）。
Ｃａｓ９タンパク質は、標的核酸及び／または標的核酸に関連するポリペプチドに結合し、及び／または修飾する（例えば、切断、ニック、メチル化、脱メチル化など）ことができる（例えば、ヒストンテールのメチル化またはアセチル化）（例えば、Ｃａｓ９タンパク質が、活性を有する融合パートナーを含む場合）。いくつかの場合では、Ｃａｓ９タンパク質は、天然型（例えば、細菌細胞及び／または古細菌細胞において天然に生じる）タンパク質である。他の場合では、Ｃａｓ９タンパク質は、天然型ポリペプチドではない（例えば、Ｃａｓ９タンパク質は、バリアントＣａｓ９タンパク質、キメラタンパク質などである）。
好適なＣａｓ９タンパク質の例として、配列番号５～８１６に記載のタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。天然のＣａｓ９タンパク質は、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡに結合し、それによって標的核酸（標的部位）内の特定の配列に向けられ、標的核酸を切断する（例えば、ｄｓＤＮＡを切断して二本鎖切断を生成する、ｓｓＤＮＡを切断する、ｓｓＲＮＡを切断するなど）。キメラＣａｓ９タンパク質は、異種タンパク質（融合パートナーと呼ばれる）と融合したＣａｓ９ポリペプチドを含む融合タンパク質であり、異種タンパク質は、活性（例えば、Ｃａｓ９タンパク質によって提供されない活性）を提供する。融合パートナーは、例えば、酵素活性（例えば、ヌクレアーゼ活性、ＤＮＡ及び／またはＲＮＡメチル化活性、ＤＮＡ及び／またはＲＮＡ切断活性、ヒストンアセチル化活性、ヒストンメチル化活性、ＲＮＡ修飾活性、ＲＮＡ結合活性、ＲＮＡスプライシング活性など）を提供することができる。いくつかの場合では、Ｃａｓ９タンパク質の一部（例えば、ＲｕｖＣドメイン及び／またはＨＮＨドメイン）は、野生型Ｃａｓ９タンパク質の対応する部分と比較して、ヌクレアーゼ活性の低下を示す（例えば、いくつかの場合では、Ｃａｓ９タンパク質はニッカーゼである）。いくつかの場合では、Ｃａｓ９タンパク質は、野生型Ｃａｓ９タンパク質に比べて（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９に比べて）酵素的に不活性であるか、または酵素活性が低下している。
いくつかの場合では、融合タンパク質は：ａ）触媒的に不活性なＣａｓ９タンパク質（または他の触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲエフェクターポリペプチド）；及びｂ）触媒的に活性なエンドヌクレアーゼを含む。例えば、いくつかの場合では、触媒的に活性なエンドヌクレアーゼはＦｏｋＩポリペプチドである。非限定的な一例として、いくつかの場合では、融合タンパク質は：ａ）触媒的に不活性なＣａｓ９タンパク質（または他の触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲエフェクターポリペプチド）を含み；及びｂ）以下に示すＦｏｋＩアミノ酸配列に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＦｏｋＩヌクレアーゼであり；ＦｏｋＩヌクレアーゼの長さは、約１９５アミノ酸～約２００アミノ酸である。
ＦｏｋＩヌクレアーゼアミノ酸配列：
ＱＬＶＫＳＥＬＥＥＫＫＳＥＬＲＨＫＬＫＹＶＰＨＥＹＩＥＬＩＥＩＡＲＮＳＴＱＤＲＩＬＥＭＫＶＭＥＦＦＭＫＶＹＧＹＲＧＫＨＬＧＧＳＲＫＰＤＧＡＩＹＴＶＧＳＰＩＤＹＧＶＩＶＤＴＫＡＹＳＧＧＹＮＬＰＩＧＱＡＤＥＭＱＲＹＶＥＥＮＱＴＲＮＫＨＩＮＰＮＥＷＷＫＶＹＰＳＳＶＴＥＦＫＦＬＦＶＳＧＨＦＫＧＮＹＫＡＱＬＴＲＬＮＨＩＴＮＣＮＧＡＶＬＳＶＥＥＬＬＩＧＧＥＭＩＫＡＧＴＬＴＬＥＥＶＲＲＫＦＮＮＧＥＩＮＦ（配列番号９００）。
所与のタンパク質がＣａｓ９ガイドＲＮＡと相互作用するかどうかを判定するためのアッセイは、タンパク質と核酸との間の結合を試験する任意の簡便な結合アッセイであり得る。好適な結合アッセイ（例えば、ゲルシフトアッセイ）は当業者には公知であろう（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ及びタンパク質を標的核酸に付加することを含むアッセイ）。
タンパク質が活性を有するかどうかを判定するための（例えば、タンパク質が標的核酸を切断するヌクレアーゼ活性及び／またはいくつかの異種活性を有するかどうかを判定するための）アッセイは、任意の簡便なアッセイ（例えば、核酸切断を試験する任意の簡便な核酸切断アッセイ）であり得る。好適なアッセイ（例えば、切断アッセイ）は当業者には公知であり、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ及びタンパク質を標的核酸に付加することを含み得る。
いくつかの場合では、好適なＣａｓ９タンパク質は、配列番号５に記載のＣａｓ９アミノ酸配列のアミノ酸７～１６６または７３１～１００３に対して、または配列番号６～８１６に記載のアミノ酸配列のいずれかの対応する部分に対して、６０％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９９％以上または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
様々なＣａｓ９タンパク質（及びＣａｓ９ドメイン構造）及びＣａｓ９ガイドＲＮＡの例（及び標的核酸に存在するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に関連する要件に関する情報）は、当技術分野において見出すことができ、例えば、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１２ Ａｕｇ １７；３３７（６０９６）：８１６－２１；Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ Ｂｉｏｌ．２０１３ Ｍａｙ；１０（５）：７２６－３７、Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ Ｉｎｔ．２０１３；２０１３：２７０８０５、Ｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１３ Ｓｅｐ ２４；１１０（３９）：１５６４４－９；Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｅｌｉｆｅ．２０１３；２：ｅ００４７１、Ｐａｔｔａｎａｙａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３ Ｓｅｐ；３１（９）：８３９－４３、Ｑｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１３ Ｆｅｂ ２８；１５２（５）：１１７３－８３；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１３ Ｍａｙ ９；１５３（４）：９１０－８、Ａｕｅｒ ｅｔ．ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２０１３ Ｏｃｔ ３１、Ｃｈｅｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１３ Ｎｏｖ １；４１（２０）：ｅ１９、Ｃｈｅｎｇ ｅｔ．ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２０１３ Ｏｃｔ；２３（１０）：１１６３－７１、Ｃｈｏ ｅｔ．ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２０１３ Ｎｏｖ；１９５（３）：１１７７－８０、ＤｉＣａｒｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１３ Ａｐｒ；４１（７）：４３３６－４３、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３ Ｏｃｔ；１０（１０）：１０２８－３４、Ｅｂｉｎａ ｅｔ．ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１３；３：２５１０、Ｆｕｊｉｉ ｅｔ．ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１３ Ｎｏｖ １；４１（２０）：ｅ１８７、Ｈｕ ｅｔ．ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２０１３ Ｎｏｖ；２３（１１）：１３２２－５、Ｊｉａｎｇ ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１３ Ｎｏｖ １；４１（２０）：ｅ１８８、Ｌａｒｓｏｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２０１３ Ｎｏｖ；８（１１）：２１８０－９６、Ｍａｌｉ ｅｔ．ａｔ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３ Ｏｃｔ；１０（１０）：９５７－６３、Ｎａｋａｙａｍａ ｅｔ．ａｌ．，Ｇｅｎｅｓｉｓ．２０１３ Ｄｅｃ；５１（１２）：８３５－４３、Ｒａｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２０１３ Ｎｏｖ；８（１１）：２２８１－３０８、Ｒａｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１３ Ｓｅｐ １２；１５４（６）：１３８０－９、Ｕｐａｄｈｙａｙ ｅｔ．ａｌ．，Ｇ３（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）．２０１３ Ｄｅｃ ９；３（１２）：２２３３－８、Ｗａｌｓｈ ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１３ Ｓｅｐ ２４；１１０（３９）：１５５１４－５、Ｘｉｅ ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌ Ｐｌａｎｔ．２０１３ Ｏｃｔ ９、Ｙａｎｇ ｅｔ．ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１３ Ｓｅｐ １２；１５４（６）：１３７０－９、Ｂｒｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．２０１４ Ｏｃｔ ２３；５６（２）：３３３－９；Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１７ Ｍａｒ；１５（３）：１６９－１８２、ならびに米国特許及び特許出願第８，９０６，６１６号、第８，８９５，３０８号、第８，８８９，４１８号、第８，８８９，３５６号、第８，８７１，４４５号、第８，８６５，４０６号、第８，７９５，９６５号、第８，７７１，９４５号、第８，６９７，３５９号、第２０１４００６８７９７号、第２０１４０１７０７５３号、第２０１４０１７９００６号、第２０１４０１７９７７０号、第２０１４０１８６８４３号、第２０１４０１８６９１９号、第２０１４０１８６９５８号、第２０１４０１８９８９６号、第２０１４０２２７７８７号、第２０１４０２３４９７２号、第２０１４０２４２６６４号、第２０１４０２４２６９９号、第２０１４０２４２７００号、第２０１４０２４２７０２号、第２０１４０２４８７０２号、第２０１４０２５６０４６号、第２０１４０２７３０３７号、第２０１４０２７３２２６号、第２０１４０２７３２３０号、第２０１４０２７３２３１号、第２０１４０２７３２３２号、第２０１４０２７３２３３号、第２０１４０２７３２３４号、第２０１４０２７３２３５号、第２０１４０２８７９３８号、第２０１４０２９５５５６号、第２０１４０２９５５５７号、第２０１４０２９８５４７号、第２０１４０３０４８５３号、第２０１４０３０９４８７号、第２０１４０３１０８２８号、第２０１４０３１０８３０号、第２０１４０３１５９８５号、第２０１４０３３５０６３号、第２０１４０３３５６２０号、第２０１４０３４２４５６号、第２０１４０３４２４５７号、第２０１４０３４２４５８号、第２０１４０３４９４００号、第２０１４０３４９４０５号、第２０１４０３５６８６７号、第２０１４０３５６９５６号、第２０１４０３５６９５８号、第２０１４０３５６９５９号、第２０１４０３５７５２３号、第２０１４０３５７５３０号、第２０１４０３６４３３３号、及び第２０１４０３７７８６８号を参照されたい；これらの各々は、その全体が参照により本明細書に援用される。
バリアントＣａｓ９タンパク質－ニッカーゼ及びｄＣａｓ９
いくつかの場合では、Ｃａｓ９タンパク質は、バリアントＣａｓ９タンパク質である。バリアントＣａｓ９タンパク質は、対応する野生型Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列と比較した場合、少なくとも１つのアミノ酸が異なる（例えば、欠失、挿入、置換、融合を有する）アミノ酸配列を有する。いくつかの場合では、バリアントＣａｓ９タンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質のヌクレアーゼ活性を低下させるアミノ酸変化（例えば、欠失、挿入、または置換）を有する。例えば、いくつかの場合では、バリアントＣａｓ９タンパク質は、対応する野生型Ｃａｓ９タンパク質の５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または１％以下のヌクレアーゼ活性を有する。いくつかの場合では、バリアントＣａｓ９タンパク質は、実質的なヌクレアーゼ活性を有さない。Ｃａｓ９タンパク質が実質的なヌクレアーゼ活性を有さないバリアントＣａｓ９タンパク質である場合、そのＣａｓ９タンパク質はヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９タンパク質または「死んだ（ｄｅａｄ）」Ｃａｓ９の名をとって「ｄＣａｓ９」と呼ばれ得る。二本鎖標的核酸の一方の鎖を切断するが、もう一方は切断しないタンパク質（例えば、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９タンパク質）は、本明細書では「ニッカーゼ」（例えば、「ニッカーゼＣａｓ９」）と称される。
いくつかの場合では、バリアントＣａｓ９タンパク質は、標的核酸の相補鎖（当技術分野では標的鎖と呼ばれることもある）を切断することができるが、標的核酸の非相補鎖（当技術分野では非標的鎖と呼ばれることもある）を切断する能力が低下している。例えば、バリアントＣａｓ９タンパク質は、ＲｕｖＣドメインの機能を低下させる変異（アミノ酸置換）を有し得る。したがって、Ｃａｓ９タンパク質は、相補鎖を切断するが、非相補鎖は切断しないニッカーゼであり得る。非限定的な例として、いくつかの実施形態では、バリアントＣａｓ９タンパク質は、配列番号５の残基Ｄ１０（例えば、Ｄ１０Ａ、アスパラギン酸からアラニン）に対応するアミノ酸位置（または配列番号６～２６１及び２６４～８１６に記載のタンパク質の任意の対応する位置）に変異を有し、したがって、二本鎖標的核酸の相補鎖を切断することができるが、二本鎖標的核酸の非相補鎖を切断する能力は低下している（したがって、バリアントＣａｓ９タンパク質が二本鎖標的核酸を切断する場合、二本鎖切断（ＤＳＢ）の代わりに一本鎖切断（ＳＳＢ）を生じさせる）（例えば、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１２ Ａｕｇ １７；３３７（６０９６）：８１６－２１を参照のこと）。例えば、配列番号２６２を参照のこと。
いくつかの場合では、バリアントＣａｓ９タンパク質は、標的核酸の非相補鎖を切断することができるが、標的核酸の相補鎖を切断する能力が低下している。例えば、バリアントＣａｓ９タンパク質は、ＨＮＨドメインの機能を低下させる変異（アミノ酸置換）を有し得る。したがって、Ｃａｓ９タンパク質は、非相補鎖を切断するが、相補鎖は切断しないニッカーゼであり得る。非限定的な例として、いくつかの実施形態では、バリアントＣａｓ９タンパク質は、配列番号５の残基Ｈ８４０（例えば、Ｈ８４０Ａ変異、ヒスチジンからアラニン）に対応するアミノ酸位置（または配列番号６～２６１及び２６４～８１６として示すタンパク質のいずれかの対応する位置）に変異を有し、したがって、標的核酸の非相補的鎖を切断することができるが、標的核酸の相補的鎖を切断する能力が低下している（例えば、切断しない）。そのようなＣａｓ９タンパク質は、標的核酸（例えば、一本鎖標的核酸）を切断する能力が低下しているが、標的核酸（例えば、一本鎖標的核酸）に結合する能力を保持している。例えば、配列番号２６３を参照のこと。
いくつかの場合では、バリアントＣａｓ９タンパク質は、二本鎖標的核酸の相補鎖と非相補鎖の両方を切断する能力が低下している。非限定的な例として、いくつかの場合では、バリアントＣａｓ９タンパク質は、配列番号５の残基Ｄ１０及びＨ８４０に対応するアミノ酸位置（または配列番号６～２６１及び２６４～８１６に示すタンパク質のいずれかの対応する残基）に変異を有し（例えば、Ｄ１０Ａ及びＨ８４０Ａ）、それにより、ポリペプチドは、標的核酸の相補鎖及び非相補鎖の両方を切断する能力が低下している（例えば、切断しない）。そのようなＣａｓ９タンパク質は、標的核酸（例えば、一本鎖または二本鎖標的核酸）を切断する能力が低下しているが、標的核酸に結合する能力を保持している。標的核酸を切断することができない（例えば、ＲｕｖＣ及びＨＮＨドメインの触媒ドメインにおける１つ以上の変異に起因して）Ｃａｓ９タンパク質は、「死んだ」Ｃａｓ９または単に「ｄＣａｓ９」と呼ばれる。例えば、配列番号２６４を参照のこと。
Ｖ型及びＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ
いくつかの場合では、好適なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドは、Ｖ型またはＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼである（すなわち、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドは、Ｖ型またはＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼである）（例えば、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３）。Ｖ型及びＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、クラス２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼの一種である。Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼの例として、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、及びＣ２ｃ３が挙げられるが、これらに限定されない。ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドの一例はＣ２ｃ２である。いくつかの場合では、好適なＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓエフェクターポリペプチドはＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼである（例えば、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ３）。いくつかの場合では、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓエフェクターポリペプチドはＣｐｆ１タンパク質である。いくつかの場合では、好適なＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓエフェクターポリペプチドはＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼである（例えば、Ｃａｓ１３ａ）。
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼのように、Ｖ型及びＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、対応するガイドＲＮＡと複合体を形成する。ガイドＲＮＡは、標的核酸の配列（標的部位）に相補的なヌクレオチド配列（ガイド配列）を有することにより、エンドヌクレアーゼ－ガイドＲＮＡ ＲＮＰ複合体に標的特異性を提供する（本明細書の他の場所に記載されているように）。複合体のエンドヌクレアーゼは、部位特異的な活性を提供する。言い換えれば、エンドヌクレアーゼは、ガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメントとの会合によって、標的核酸配列（例えば、染色体配列または染色体外配列、例えば、エピソーム配列、ミニサークル配列、ミトコンドリア配列、緑葉体配列など）内の標的部位に誘導される（例えば、標的部位において安定化される）。
Ｖ型及びＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質に関連する例及びガイダンス（例えば、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、及びＣ２ｃ３ガイドＲＮＡ）は、当技術分野において見出すことができ、例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１５ Ｏｃｔ ２２；１６３（３）：７５９－７１；Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１５ Ｎｏｖ；１３（１１）：７２２－３６；Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．２０１５ Ｎｏｖ ５；６０（３）：３８５－９７；及びＳｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １５：１６９を参照されたい。
いくつかの場合では、Ｖ型またはＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３）は、酵素的に活性であり、例えば、Ｖ型またはＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓポリペプチドは、ガイドＲＮＡに結合すると、標的核酸を切断する。いくつかの場合では、Ｖ型またはＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３）は、対応する野生型のＶ型またはＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３）と比較して、低い酵素活性を示し、ＤＮＡ結合活性を保持している。
いくつかの場合では、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓエンドヌクレアーゼはＣｐｆ１タンパク質である。いくつかの場合では、Ｃｐｆ１タンパク質は、配列番号８１８～８２２のいずれかに記載のＣｐｆ１アミノ酸配列に対して、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合では、Ｃｐｆ１タンパク質は、配列番号８１８～８２２のいずれかに記載のＣｐｆ１アミノ酸配列の１００アミノ酸～２００アミノ酸（ａａ）、２００ａａ～４００ａａ、４００ａａ～６００ａａ、６００ａａ～８００ａａ、８００ａａ～１０００ａａ、１０００ａａ～１１００ａａ、１１００ａａ～１２００ａａ、または１２００ａａ～１３００ａａの連続したストレッチに対して、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、また １００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの場合では、Ｃｐｆ１タンパク質は、配列番号８１８～８２２のいずれかに記載のＣｐｆ１アミノ酸配列のＲｕｖＣＩドメインに対して、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合では、Ｃｐｆ１タンパク質は、配列番号８１８～８２２のいずれかに記載のＣｐｆ１アミノ酸配列のＲｕｖＣＩＩドメインに対して、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合では、Ｃｐｆ１タンパク質は、配列番号８１８～８２２のいずれかに記載のＣｐｆ１アミノ酸配列のＲｕｖＣＩＩＩドメインに対して、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合では、Ｃｐｆ１タンパク質は、配列番号８１８～８２２のいずれかに記載のＣｐｆ１アミノ酸配列のＲｕｖＣＩ、ＲｕｖＣＩＩ、及びＲｕｖＣＩＩＩドメインに対して、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの場合では、Ｃｐｆ１タンパク質は、野生型Ｃｐｆ１タンパク質と比較して（例えば、配列番号８１８～８２２のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むＣｐｆ１タンパク質と比較して）低い酵素活性を示し、ＤＮＡ結合活性を保持している。いくつかの場合では、Ｃｐｆ１タンパク質は、配列番号８１８～８２２のいずれかに記載のＣｐｆ１アミノ酸配列に対して、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；配列番号８１８に記載のＣｐｆ１アミノ酸配列のアミノ酸９１７に対応するアミノ酸残基に、アミノ酸置換（例えば、Ｄ→Ａ置換）を含む。いくつかの場合では、Ｃｐｆ１タンパク質は、配列番号８１８～８２２のいずれかに記載のＣｐｆ１アミノ酸配列に対して、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；配列番号８１８に記載のＣｐｆ１アミノ酸配列のアミノ酸１００６に対応するアミノ酸残基に、アミノ酸置換（例えば、Ｅ→Ａ置換）を含む。いくつかの場合では、Ｃｐｆ１タンパク質は、配列番号８１８～８２２のいずれかに記載のＣｐｆ１アミノ酸配列に対して、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；配列番号８１８に記載のＣｐｆ１アミノ酸配列のアミノ酸１２５５に対応するアミノ酸残基に、アミノ酸置換（例えば、Ｄ→Ａ置換）を含む。
いくつかの場合では、好適なＣｐｆ１タンパク質は、配列番号８１８～８２２のいずれかに記載のＣｐｆ１アミノ酸配列に対して、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの場合では、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓエンドヌクレアーゼはＣ２ｃ１タンパク質である（例として、配列番号８２３～８３０に記載するものが挙げられる）。いくつかの場合では、Ｃ２ｃ１タンパク質は、配列番号８２３～８３０のいずれかに記載のＣ２ｃ１アミノ酸配列に対して、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合では、Ｃ２ｃ１タンパク質は、配列番号８２３～８３０のいずれかに記載のＣ２ｃ１アミノ酸配列の１００アミノ酸～２００アミノ酸（ａａ）、２００ａａ～４００ａａ、４００ａａ～６００ａａ、６００ａａ～８００ａａ、８００ａａ～１０００ａａ、１０００ａａ～１１００ａａ、１１００ａａ～１２００ａａ、または１２００ａａ～１３００ａａの連続したストレッチに対して、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの場合では、Ｃ２ｃ１タンパク質は、配列番号８２３～８３０のいずれかに記載のＣ２ｃ１アミノ酸配列のＲｕｖＣＩドメインに対して、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合では、Ｃ２ｃ１タンパク質は、配列番号８２３～８３０のいずれかに記載のＣ２ｃ１アミノ酸配列のＲｕｖＣＩＩドメインに対して、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合では、Ｃ２ｃ１タンパク質は、配列番号８２３～８３０のいずれかに記載のＣ２ｃ１アミノ酸配列のＲｕｖＣＩＩＩドメインに対して、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合では、Ｃ２ｃ１タンパク質は、配列番号８２３～８３０のいずれかに記載のＣ２ｃ１アミノ酸配列のＲｕｖＣＩ、ＲｕｖＣＩＩ、及びＲｕｖＣＩＩＩドメインに対して、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの場合では、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓエンドヌクレアーゼはＣ２ｃ３タンパク質である（例として、配列番号８３１～８３４に記載するものが挙げられる）。いくつかの場合では、Ｃ２ｃ３タンパク質は、配列番号８３１～８３４のいずれかに記載のＣ２ｃ３アミノ酸配列に対して、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合では、Ｃ２ｃ３タンパク質は、配列番号８３１～８３４のいずれかに記載のＣ２ｃ３アミノ酸配列の１００アミノ酸～２００アミノ酸（ａａ）、２００ａａ～４００ａａ、４００ａａ～６００ａａ、６００ａａ～８００ａａ、８００ａａ～１０００ａａ、１０００ａａ～１１００ａａ、１１００ａａ～１２００ａａ、または１２００ａａ～１３００ａａの連続したストレッチに対して、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの場合では、Ｃ２ｃ３タンパク質は、配列番号８３１～８３４のいずれかに記載のＣ２ｃ３アミノ酸配列のＲｕｖＣＩドメインに対して、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合では、Ｃ２ｃ３タンパク質は、配列番号８３１～８３４のいずれかに記載のＣ２ｃ３アミノ酸配列のＲｕｖＣＩＩドメインに対して、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合では、Ｃ２ｃ３タンパク質は、配列番号８３１～８３４のいずれかに記載のＣ２ｃ３アミノ酸配列のＲｕｖＣＩＩＩドメインに対して、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合では、Ｃ２ｃ３タンパク質は、配列番号８３１～８３４のいずれかに記載のＣ２ｃ３アミノ酸配列のＲｕｖＣＩ、ＲｕｖＣＩＩ、及びＲｕｖＣＩＩＩドメインに対して、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの場合では、Ｃ２ｃ３タンパク質は、野生型Ｃ２ｃ３タンパク質と比較して（例えば、配列番号８３１～８３４のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むＣ２ｃ３タンパク質と比較して）低い酵素活性を示し、ＤＮＡ結合活性を保持している。いくつかの場合では、好適なＣ２ｃ３タンパク質は、配列番号８３１～８３４のいずれかに記載のＣ２ｃ３アミノ酸配列に対して、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの場合では、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓエンドヌクレアーゼはＣ２ｃ２タンパク質である（例として、配列番号８３５～８４６に記載するものが挙げられる）。いくつかの場合では、Ｃ２ｃ２タンパク質は、配列番号８３５～８４６のいずれかに記載のＣ２ｃ２アミノ酸配列に対して、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合では、Ｃ２ｃ２タンパク質は、配列番号８３５～８４６のいずれかに記載のＣ２ｃ２アミノ酸配列の１００アミノ酸～２００アミノ酸（ａａ）、２００ａａ～４００ａａ、４００ａａ～６００ａａ、６００ａａ～８００ａａ、８００ａａ～１０００ａａ、１０００ａａ～１１００ａａ、１１００ａａ～１２００ａａ、または１２００ａａ～１３００ａａの連続したストレッチに対して、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの場合では、Ｃ２ｃ２タンパク質は、配列番号８３５～８４６のいずれかに記載のＣ２ｃ２アミノ酸配列のＲｕｖＣＩドメインに対して、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合では、Ｃ２ｃ２タンパク質は、配列番号８３５～８４６のいずれかに記載のＣ２ｃ２アミノ酸配列のＲｕｖＣＩＩドメインに対して、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合では、Ｃ２ｃ２タンパク質は、配列番号８３５～８４６のいずれかに記載のＣ２ｃ２アミノ酸配列のＲｕｖＣＩＩＩドメインに対して、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合では、Ｃ２ｃ２タンパク質は、配列番号８３５～８４６のいずれかに記載のＣ２ｃ２アミノ酸配列のＲｕｖＣＩ、ＲｕｖＣＩＩ、及びＲｕｖＣＩＩＩドメインに対して、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの場合では、Ｃ２ｃ２タンパク質は、野生型Ｃ２ｃ２タンパク質と比較して（例えば、配列番号８３５～８４６のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むＣ２ｃ２タンパク質と比較して）低い酵素活性を示し、ＤＮＡ結合活性を保持している。いくつかの場合では、好適なＣ２ｃ２タンパク質は、配列番号８３５～８４６のいずれかに記載のＣ２ｃ２アミノ酸配列に対して、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
Ｖ型またはＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（ドメイン構造を含む）及びガイドＲＮＡに関連する例及びガイダンス（ならびに標的核酸に存在するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に関連する要件に関する情報）は、当技術分野において見出すことができ、例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１５ Ｏｃｔ ２２；１６３（３）：７５９－７１；Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１５ Ｎｏｖ；１３（１１）：７２２－３６；Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．２０１５ Ｎｏｖ ５；６０（３）：３８５－９７；及びＳｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１７ Ｍａｒ；１５（３）：１６９－１８２；ならびに米国特許及び特許出願：９，５８０，７０１；２０１７００７３６９５，２０１７００５８２７２，２０１６０３６２６６８，２０１６０３６２６６７，２０１６０２９８０７８，２０１６０２８９６３７，２０１６０２１５３００，２０１６０２０８２４３，及び２０１６０２０８２４１を参照されたい（これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に援用される）。
ＣａｓＸ及びＣａｓＹタンパク質
好適なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドとして、ＣａｓＸ及びＣａｓＹポリペプチドが挙げられる。例えば、Ｂｕｒｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｎａｔｕｒｅ ５４２：２３７を参照されたい。好適なＣａｓＸポリペプチドとして、ＷＯ２０１８／０６４３７１に記載されているものが含まれる。好適なＣａｓＹポリペプチドとして、ＷＯ２０１８／０６４３５２に記載されているものが含まれる。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクター融合ポリペプチド
いくつかの場合では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドは：ｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチド；及びｉｉ）異種融合パートナーを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクター融合ポリペプチドである。
いくつかの場合では、融合パートナーは、標的ＤＮＡの転写を調節する（例えば、転写を阻害する、転写を増加する）ことができる。例えば、いくつかの場合では、融合パートナーは、転写を阻害するタンパク質（例えば、転写抑制因子、転写阻害タンパク質の動員、メチル化などの標的ＤＮＡの修飾、ＤＮＡ修飾因子の動員、標的ＤＮＡと会合したヒストンの調節、ヒストン修飾因子、例えば、ヒストンのアセチル化及び／またはメチル化を修飾する因子の動員などを介して機能するタンパク質）（またはタンパク質由来ドメイン）である。いくつかの場合では、融合パートナーは、転写を増加させるタンパク質（例えば、転写活性化因子、転写活性化タンパク質の動員、脱メチル化などの標的ＤＮＡの修飾、ＤＮＡ修飾因子の動員、標的ＤＮＡに会合したヒストンの調節、ヒストン修飾因子、例えば、ヒストンのアセチル化及び／またはメチル化を修飾する因子の動員などを介して機能するタンパク質）（またはタンパク質由来ドメイン）である。
いくつかの場合では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクター融合ポリペプチドは、標的核酸を修飾する酵素活性（例えば、ＦｏｋＩヌクレアーゼ活性などのヌクレアーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、脱アミノ化活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン化活性、酸化活性、ピリミジン二量体形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性、またはグリコシラーゼ活性）を有する異種ポリペプチドを含む。
いくつかの場合では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクター融合ポリペプチドは、標的核酸と会合したポリペプチド（例えば、ヒストン）を修飾する酵素活性（例えば、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、または脱ミリストイル化活性）を有する異種ポリペプチドを含む。
転写の増加に使用することができ、異種融合パートナーとして好適なタンパク質（またはその断片）の例として、ＶＰ１６、ＶＰ６４、ＶＰ４８、ＶＰ１６０、ｐ６５サブドメイン（例えば、ＮＦｋＢ由来）、ならびにＥＤＬＬの活性化ドメイン及び／またはＴＡＬ活性化ドメイン（例えば、植物における活性のための）などの転写活性化因子；ＳＥＴ１Ａ、ＳＥＴ１Ｂ、ＭＬＬ１～５、ＡＳＨ１、ＳＹＭＤ２、ＮＳＤ１などのヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ；ＪＨＤＭ２ａ／ｂ、ＵＴＸ、ＪＭＪＤ３などのヒストンリジンデメチラーゼ；ＧＣＮ５、ＰＣＡＦ、ＣＢＰ、ｐ３００、ＴＡＦ１、ＴＩＰ６０／ＰＬＩＰ、ＭＯＺ／ＭＹＳＴ３、ＭＯＲＦ／ＭＹＳＴ４、ＳＲＣ１、ＡＣＴＲ、Ｐ１６０、ＣＬＯＣＫなどのヒストンアセチルトランスフェラーゼ；ならびにＴｅｎ－Ｅｌｅｖｅｎ Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ（ＴＥＴ）ジオキシゲナーゼ１（ＴＥＴ１ＣＤ）、ＴＥＴ１、ＤＭＥ、ＤＭＬ１、ＤＭＬ２、ＲＯＳ１などのＤＮＡデメチラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
転写の減少に使用することができ、異種融合パートナーとして好適なタンパク質（またはその断片）の例として、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢまたはＳＫＤ）などの転写抑制因子；ＫＯＸ１抑制ドメイン；Ｍａｄ ｍＳＩＮ３相互作用ドメイン（ＳＩＤ）；ＥＲＦ抑制ドメイン（ＥＲＤ）、ＳＲＤＸ抑制ドメイン（例えば、植物における抑制のための）など；Ｐｒ－ＳＥＴ７／８、ＳＵＶ４－２０Ｈ１、ＲＩＺ１などのヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ；ＪＭＪＤ２Ａ／ＪＨＤＭ３Ａ、ＪＭＪＤ２Ｂ、ＪＭＪＤ２Ｃ／ＧＡＳＣ１、ＪＭＪＤ２Ｄ、ＪＡＲＩＤ１Ａ／ＲＢＰ２、ＪＡＲＩＤ１Ｂ／ＰＬＵ－１、ＪＡＲＩＤ１Ｃ／ＳＭＣＸ、ＪＡＲＩＤ１Ｄ／ＳＭＣＹなどのヒストンリジンデメチラーゼ；ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ９、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＨＤＡＣ１１などのヒストンリジンデアセチラーゼ；ＨｈａＩ ＤＮＡ ｍ５ｃ－メチルトランスフェラーゼ（Ｍ．ＨｈａＩ）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１（ＤＮＭＴ１）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３ａ（ＤＮＭＴ３ａ）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３ｂ（ＤＮＭＴ３ｂ）、ＭＥＴＩ、ＤＲＭ３（植物）、ＺＭＥＴ２、ＣＭＴ１、ＣＭＴ２（植物）などのＤＮＡメチラーゼ；及びＬａｍｉｎ Ａ、Ｌａｍｉｎ Ｂなどの末梢動員エレメントが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの場合では、融合パートナーは、標的核酸（例えば、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ）を修飾する酵素活性を有する。融合パートナーによって提供され得る酵素活性の例として：制限酵素（例えば、ＦｏｋＩヌクレアーゼ）によって提供されるものなどのヌクレアーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ（例えば、ＨｈａＩ ＤＮＡ ｍ５ｃ－メチルトランスフェラーゼ（Ｍ．ＨｈａＩ）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１（ＤＮＭＴ１）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３ａ（ＤＮＭＴ３ａ）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３ｂ（ＤＮＭＴ３ｂ）、ＭＥＴＩ、ＤＲＭ３（植物）、ＺＭＥＴ２、ＣＭＴ１、ＣＭＴ２（植物）など）によって提供されるものなどのメチルトランスフェラーゼ活性；デメチラーゼ（例えば、Ｔｅｎ－Ｅｌｅｖｅｎ Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ（ＴＥＴ）ジオキシゲナーゼ１（ＴＥＴ１ＣＤ）、ＴＥＴ１、ＤＭＥ、ＤＭＬ１、ＤＭＬ２、ＲＯＳ１など）によって提供されるものなどのデメチラーゼ活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、デアミナーゼ（例えば、ラットＡＰＯＢＥＣ１などのシトシンデアミナーゼ酵素）によって提供されるものなどの脱アミン化活性、ジムスターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン化活性、酸化活性、ピリミジン二量体形成活性、インテグラーゼ及び／またはレゾルバーゼ（例えば、Ｇｉｎインベルターゼの超活性変異体、ＧｉｎＨ１０６ＹなどのＧｉｎインベルターゼ；ヒト免疫不全ウイルス１型インテグラーゼ（ＩＮ）；Ｔｎ３レゾルバーゼなど）によってもたらされるものなどのインテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、レコンビナーゼ（例えば、Ｇｉｎレコンビナーゼの触媒ドメイン）によって提供されるものなどのレコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性、及びグリコシラーゼ活性）が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの場合では、融合パートナーは、標的核酸（例えば、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ）と会合したタンパク質（例えば、ヒストン、ＲＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ結合タンパク質など）を修飾する酵素活性を有する。融合パートナーによって提供され得る（標的核酸と会合したタンパク質を修飾する）酵素活性の例として、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）（例えば、ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ ｖａｒｉｅｇａｔｉｏｎ３～９ホモログ１（ＳＵＶ３９Ｈ１、ＫＭＴ１Ａとしても知られる）、真性染色質ヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ２（Ｇ９Ａ、ＫＭＴ１Ｃ及びＥＨＭＴ２としても知られる）、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＥＳＥＴ／ＳＥＴＤＢ１など、ＳＥＴ１Ａ、ＳＥＴ１Ｂ、ＭＬＬ１～５、ＡＳＨ１、ＳＹＭＤ２、ＮＳＤ１、ＤＯＴ１Ｌ、Ｐｒ－ＳＥＴ７／８、ＳＵＶ４－２０Ｈ１、ＥＺＨ２、ＲＩＺ１）によって提供されるものなどのメチルトランスフェラーゼ活性、ヒストンデメチラーゼ（例えば、リジンデメチラーゼ１Ａ（ＫＤＭ１Ａ、ＬＳＤ１としても知られる）、ＪＨＤＭ２ａ／ｂ、ＪＭＪＤ２Ａ／ＪＨＤＭ３Ａ、ＪＭＪＤ２Ｂ、ＪＭＪＤ２Ｃ／ＧＡＳＣ１、ＪＭＪＤ２Ｄ、ＪＡＲＩＤ１Ａ／ＲＢＰ２、ＪＡＲＩＤ１Ｂ／ＰＬＵ－１、ＪＡＲＩＤ１Ｃ／ＳＭＣＸ、ＪＡＲＩＤ１Ｄ／ＳＭＣＹ、ＵＴＸ、ＪＭＪＤ３など）によって提供されるものなどのデメチラーゼ活性、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（例えば、ヒトアセチルトランスフェラーゼｐ３００、ＧＣＮ５、ＰＣＡＦ、ＣＢＰ、ＴＡＦ１、ＴＩＰ６０／ＰＬＩＰ、ＭＯＺ／ＭＹＳＴ３、ＭＯＲＦ／ＭＹＳＴ４、ＨＢＯ１／ＭＹＳＴ２、ＨＭＯＦ／ＭＹＳＴ１、ＳＲＣ１、ＡＣＴＲ、Ｐ１６０、ＣＬＯＣＫなどの触媒コア／断片）によって提供されるものなどのアセチルトランスフェラーゼ活性、ヒストンデアセチラーゼ（例えば、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ９、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＨＤＡＣ１１などによって提供されるものなどのデアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、及び脱ミリストイル化活性が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの場合では、融合タンパク質は：ａ）触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチド（例えば、触媒的に不活性なＣａｓ９ポリペプチド）；及びｂ）触媒的に活性なエンドヌクレアーゼを含む。例えば、いくつかの場合では、触媒的に活性なエンドヌクレアーゼはＦｏｋＩポリペプチドである。非限定的な一例として、いくつかの場合では、融合タンパク質は：ａ）触媒的に不活性なＣａｓ９タンパク質（または他の触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲエフェクターポリペプチド）を含み；及びｂ）以下に示すＦｏｋＩアミノ酸配列に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＦｏｋＩヌクレアーゼであり；ＦｏｋＩヌクレアーゼの長さは、約１９５アミノ酸～約２００アミノ酸である。
ＦｏｋＩヌクレアーゼアミノ酸配列：
ＱＬＶＫＳＥＬＥＥＫＫＳＥＬＲＨＫＬＫＹＶＰＨＥＹＩＥＬＩＥＩＡＲＮＳＴＱＤＲＩＬＥＭＫＶＭＥＦＦＭＫＶＹＧＹＲＧＫＨＬＧＧＳＲＫＰＤＧＡＩＹＴＶＧＳＰＩＤＹＧＶＩＶＤＴＫＡＹＳＧＧＹＮＬＰＩＧＱＡＤＥＭＱＲＹＶＥＥＮＱＴＲＮＫＨＩＮＰＮＥＷＷＫＶＹＰＳＳＶＴＥＦＫＦＬＦＶＳＧＨＦＫＧＮＹＫＡＱＬＴＲＬＮＨＩＴＮＣＮＧＡＶＬＳＶＥＥＬＬＩＧＧＥＭＩＫＡＧＴＬＴＬＥＥＶＲＲＫＦＮＮＧＥＩＮＦ（配列番号９０１）
いくつかの場合では、融合パートナーは、デアミナーゼである。したがって、いくつかの場合では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチド融合ポリペプチドは：ａ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチド；及びｂ）デアミナーゼを含む。いくつかの場合では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドは、触媒的に不活性である。好適なデアミナーゼとして、シチジンデアミナーゼ及びアデノシンデアミナーゼが挙げられる。
好適なアデノシンデアミナーゼは、ＤＮＡ中のアデノシンを脱アミノ化することができる任意の酵素である。いくつかの場合では、デアミナーゼは、ＴａｄＡデアミナーゼである。
いくつかの場合では、好適なアデノシンデアミナーゼは、以下のアミノ酸配列：
ＭＳＥＶＥＦＳＨＥＹＷＭＲＨＡＬＴＬＡＫＲＡＷＤＥＲＥＶＰＶＧＡＶＬＶＨＮＮＲＶＩＧＥＧＷＮＲＰＩＧＲＨＤＰＴＡＨＡＥＩＭＡＬＲＱＧＧＬＶＭＱＮＹＲＬＩＤＡＴＬＹＶＴＬＥＰＣＶＭＣＡＧＡＭＩＨＳＲＩＧＲＶＶＦＧＡＲＤＡＫＴＧＡＡＧＳＬＭＤＶＬＨＨＰＧＭＮＨＲＶＥＩＴＥＧＩＬＡＤＥＣＡＡＬＬＳＤＦＦＲＭＲＲＱＥＩＫＡＱＫＫＡＱＳＳＴＤ（配列番号９０２）
に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの場合では、好適なアデノシンデアミナーゼは、以下のアミノ酸配列：
ＭＲＲＡＦＩＴＧＶＦＦＬＳＥＶＥＦＳＨＥＹＷＭＲＨＡＬＴＬＡＫＲＡＷＤＥＲＥＶＰＶＧＡＶＬＶＨＮＮＲＶＩＧＥＧＷＮＲＰＩＧＲＨＤＰＴＡＨＡＥＩＭＡＬＲＱＧＧＬＶＭＱＮＹＲＬＩＤＡＴＬＹＶＴＬＥＰＣＶＭＣＡＧＡＭＩＨＳＲＩＧＲＶＶＦＧＡＲＤＡＫＴＧＡＡＧＳＬＭＤＶＬＨＨＰＧＭＮＨＲＶＥＩＴＥＧＩＬＡＤＥＣＡＡＬＬＳＤＦＦＲＭＲＲＱＥＩＫＡＱＫＫＡＱＳＳＴＤ（配列番号９０３）
に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの場合では、好適なアデノシンデアミナーゼは、以下のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＴａｄＡアミノ酸配列：
ＭＧＳＨＭＴＮＤＩＹＦＭＴＬＡＩＥＥＡＫＫＡＡＱＬＧＥＶＰＩＧＡＩＩＴＫＤＤＥＶＩＡＲＡＨＮＬＲＥＴＬＱＱＰＴＡＨＡＥＨＩＡＩＥＲＡＡＫＶＬＧＳＷＲＬＥＧＣＴＬＹＶＴＬＥＰＣＶＭＣＡＧＴＩＶＭＳＲＩＰＲＶＶＹＧＡＤＤＰＫＧＧＣＳＧＳＬＭＮＬＬＱＱＳＮＦＮＨＲＡＩＶＤＫＧＶＬＫＥＡＣＳＴＬＬＴＴＦＦＫ ＮＬＲＡＮＫＫＳＴＮ：（配列番号９０４）
に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの場合では、好適なアデノシンデアミナーゼは、以下の枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＴａｄＡアミノ酸配列：
ＭＴＱＤＥＬＹＭＫＥＡＩＫＥＡＫＫＡＥＥＫＧＥＶＰＩＧＡＶＬＶＩＮＧＥＩＩＡＲＡＨＮＬＲＥＴＥＱＲＳＩＡＨＡＥＭＬＶＩＤＥＡＣＫＡＬＧＴＷＲＬＥＧＡＴＬＹＶＴＬＥＰＣＰＭＣＡＧＡＶＶＬＳＲＶＥＫＶＶＦＧＡＦＤＰＫＧＧＣＳＧＴＬＭＮＬＬＱＥＥＲＦＮＨＱＡＥＶＶＳＧＶＬＥＥＥＣＧＧＭＬＳＡＦＦＲＥＬＲＫＫＫＫＡＡＲＫＮＬＳＥ（配列番号９０５）
に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの場合では、好適なアデノシンデアミナーゼは、以下のサルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＴａｄＡアミノ酸配列：
ＭＰＰＡＦＩＴＧＶＴＳＬＳＤＶＥＬＤＨＥＹＷＭＲＨＡＬＴＬＡＫＲＡＷＤＥＲＥＶＰＶＧＡＶＬＶＨＮＨＲＶＩＧＥＧＷＮＲＰＩＧＲＨＤＰＴＡＨＡＥＩＭＡＬＲＱＧＧＬＶＬＱＮＹＲＬＬＤＴＴＬＹＶＴＬＥＰＣＶＭＣＡＧＡＭＶＨＳＲＩＧＲＶＶＦＧＡＲＤＡＫＴＧＡＡＧＳＬＩＤＶＬＨＨＰＧＭＮＨＲＶＥＩＩＥＧＶＬＲＤＥＣＡＴＬＬＳＤＦＦＲＭＲＲＱＥＩＫＡＬＫＫＡＤＲＡＥＧＡＧＰＡＶ（配列番号９０６）
に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの場合では、好適なアデノシンデアミナーゼは、以下のシェワネラ・プトレファシエンス（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ）ＴａｄＡアミノ酸配列：
ＭＤＥＹＷＭＱＶＡＭＱＭＡＥＫＡＥＡＡＧＥＶＰＶＧＡＶＬＶＫＤＧＱＱＩＡＴＧＹＮＬＳＩＳＱＨＤＰＴＡＨＡＥＩＬＣＬＲＳＡＧＫＫＬＥＮＹＲＬＬＤＡＴＬＹＩＴＬＥＰＣＡＭＣＡＧＡＭＶＨＳＲＩＡＲＶＶＹＧＡＲＤＥＫＴＧＡＡＧＴＶＶＮＬＬＱＨＰＡＦＮＨＱＶＥＶＴＳＧＶＬＡＥＡＣＳＡＱＬＳＲＦＦＫＲＲＲＤＥＫＫＡＬＫＬＡＱＲＡＱＱＧＩＥ（配列番号９０７）
に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの場合では、好適なアデノシンデアミナーゼは、以下のインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）Ｆ３０３１ ＴａｄＡアミノ酸配列：
ＭＤＡＡＫＶＲＳＥＦＤＥＫＭＭＲＹＡＬＥＬＡＤＫＡＥＡＬＧＥＩＰＶＧＡＶＬＶＤＤＡＲＮＩＩＧＥＧＷＮＬＳＩＶＱＳＤＰＴＡＨＡＥＩＩＡＬＲＮＧＡＫＮＩＱＮＹＲＬＬＮＳＴＬＹＶＴＬＥＰＣＴＭＣＡＧＡＩＬＨＳＲＩＫＲＬＶＦＧＡＳＤＹＫＴＧＡＩＧＳＲＦＨＦＦＤＤＹＫＭＮＨＴＬＥＩＴＳＧＶＬＡＥＥＣＳＱＫＬＳ ＴＦＦＱＫＲＲＥＥＫＫＩＥＫＡＬＬＫＳＬＳＤＫ（配列番号９０８）
に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの場合では、好適なアデノシンデアミナーゼは、以下のカウロバクター・クレセンタス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）ＴａｄＡアミノ酸配列：
ＭＲＴＤＥＳＥＤＱＤＨＲＭＭＲＬＡＬＤＡＡＲＡＡＡＥＡＧＥＴＰＶＧＡＶＩＬＤＰＳＴＧＥＶＩＡＴＡＧＮＧＰＩＡＡＨＤＰＴＡＨＡＥＩＡＡＭＲＡＡＡＡＫＬＧＮＹＲＬＴＤＬＴＬＶＶＴＬＥＰＣＡＭＣＡＧＡＩＳＨＡＲＩＧＲＶＶＦＧＡＤＤＰＫＧＧＡＶＶＨＧＰＫＦＦＡＱＰＴＣＨＷＲＰＥＶＴＧＧＶＬＡＤＥＳＡＤＬＬＲＧＦＦＲＡＲＲＫＡＫＩ（配列番号９０９）
に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの場合では、好適なアデノシンデアミナーゼは、以下のゲオバクター・スルフレデュセンス（Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｌｆｕｒｒｅｄｕｃｅｎｓ）ＴａｄＡアミノ酸配列：
ＭＳＳＬＫＫＴＰＩＲＤＤＡＹＷＭＧＫＡＩＲＥＡＡＫＡＡＡＲＤＥＶＰＩＧＡＶＩＶＲＤＧＡＶＩＧＲＧＨＮＬＲＥＧＳＮＤＰＳＡＨＡＥＭＩＡＩＲＱＡＡＲＲＳＡＮＷＲＬＴＧＡＴＬＹＶＴＬＥＰＣＬＭＣＭＧＡＩＩＬＡＲＬＥＲＶＶＦＧＣＹＤＰＫＧＧＡＡＧＳＬＹＤＬＳＡＤＰＲＬＮＨＱＶＲＬＳＰＧＶＣＱＥＥＣＧＴＭＬＳＤＦＦＲＤＬＲＲＲＫＫＡＫＡＴＰＡＬＦＩＤＥＲＫＶＰＰＥＰ（配列番号９１０）
に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチド融合ポリペプチドに含めるのに好適なシチジンデアミナーゼには、ＤＮＡ中のシチジンを脱アミノ化することができる任意の酵素が含まれる。
いくつかの場合では、シチジンデアミナーゼは、デアミナーゼのアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集複合体（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリー由来のデアミナーゼである。いくつかの場合では、ＡＰＯＢＥＣファミリーデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ１デアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ２デアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ａデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇデアミナーゼ、及びＡＰＯＢＥＣ３Ｈデアミナーゼからなる群から選択される。いくつかの場合では、シチジンデアミナーゼは、活性化誘導デアミナーゼ（ＡＩＤ）である。
いくつかの場合では、好適なシチジンデアミナーゼは、以下のアミノ酸配列：
ＭＤＳＬＬＭＮＲＲＫＦＬＹＱＦＫＮＶＲＷＡＫＧＲＲＥＴＹＬＣＹＶＶＫＲＲＤＳＡＴＳＦＳＬＤＦＧＹＬＲＮＫＮＧＣＨＶＥＬＬＦＬＲＹＩＳＤＷＤＬＤＰＧＲＣＹＲＶＴＷＦＴＳＷＳＰＣＹＤＣＡＲＨＶＡＤＦＬＲＧＮＰＮＬＳＬＲＩＦＴＡＲＬＹＦＣＥＤＲＫＡＥＰＥＧＬＲＲＬＨＲＡＧＶＱＩＡＩＭＴＦＫＤＹＦＹＣＷＮＴＦＶＥＮＨＥＲＴＦＫＡＷＥＧＬＨＥＮＳＶＲＬＳＲＱＬＲＲＩＬＬＰＬＹＥＶＤＤＬＲＤＡＦＲＴＬＧＬ（配列番号９１１）
に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの場合では、好適なシチジンデアミナーゼはＡＩＤであり、以下のアミノ酸配列：
ＭＤＳＬＬＭＮＲＲＫ ＦＬＹＱＦＫＮＶＲＷ ＡＫＧＲＲＥＴＹＬＣ ＹＶＶＫＲＲＤＳＡＴ ＳＦＳＬＤＦＧＹＬＲ ＮＫＮＧＣＨＶＥＬＬ ＦＬＲＹＩＳＤＷＤＬ ＤＰＧＲＣＹＲＶＴＷ ＦＴＳＷＳＰＣＹＤＣ ＡＲＨＶＡＤＦＬＲＧ ＮＰＮＬＳＬＲＩＦＴ ＡＲＬＹＦＣＥＤＲＫ ＡＥＰＥＧＬＲＲＬＨ ＲＡＧＶＱＩＡＩＭＴ ＦＫＥＮＨＥＲＴＦＫ ＡＷＥＧＬＨＥＮＳＶ ＲＬＳＲＱＬＲＲＩＬ ＬＰＬＹＥＶＤＤＬＲＤＡＦＲＴＬＧＬ（配列番号９１２）
に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの場合では、好適なシチジンデアミナーゼはＡＩＤであり、以下のアミノ酸配列：
ＭＤＳＬＬＭＮＲＲＫ ＦＬＹＱＦＫＮＶＲＷ ＡＫＧＲＲＥＴＹＬＣ ＹＶＶＫＲＲＤＳＡＴ ＳＦＳＬＤＦＧＹＬＲ ＮＫＮＧＣＨＶＥＬＬ ＦＬＲＹＩＳＤＷＤＬ ＤＰＧＲＣＹＲＶＴＷ ＦＴＳＷＳＰＣＹＤＣ ＡＲＨＶＡＤＦＬＲＧ ＮＰＮＬＳＬＲＩＦＴ ＡＲＬＹＦＣＥＤＲＫ ＡＥＰＥＧＬＲＲＬＨ ＲＡＧＶＱＩＡＩＭＴ ＦＫＤＹＦＹＣＷＮＴ ＦＶＥＮＨＥＲＴＦＫ ＡＷＥＧＬＨＥＮＳＶ ＲＬＳＲＱＬＲＲＩＬ ＬＰＬＹＥＶＤＤＬＲ ＤＡＦＲＴＬＧＬ（配列番号９１３）
に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの場合では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチド融合ポリペプチドは、ニッカーゼ活性を示すＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドを含む。好適なニッカーゼは、本明細書の他の場所に記載されている。
いくつかの場合では、融合ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドは、１つ以上の局在化シグナルペプチドを含む。好適な局在化シグナル（「細胞内局在化シグナル」）として、例えば、核を標的とするための核局在化シグナル（ＮＬＳ）；融合タンパク質を核から遠ざけるための配列、例えば、核外輸送配列（ＮＥＳ）；融合タンパク質を細胞質に保持するための配列；ミトコンドリアを標的とするためのミトコンドリア局在化シグナル；葉緑体を標的とするための葉緑体局在化シグナル；小胞体（ＥＲ）保持シグナル；及びＥＲ搬出シグナルなどが挙げられる。いくつかの場合では、融合ポリペプチドはＮＬＳを含まないため、タンパク質は核に対してターゲティングされない（これは、例えば、標的核酸が、サイトゾル中に存在するＲＮＡである場合に、有利であり得る）。
いくつかの場合では、融合ポリペプチドは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）（例えば、いくつかの場合では、２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つ以上のＮＬＳ）を含む（融合させる）。したがって、いくつかの場合では、融合ポリペプチドは、１つ以上のＮＬＳ（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つ以上のＮＬＳ）を含む。いくつかの場合では、１つ以上のＮＬＳ（２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つ以上のＮＬＳ）を、Ｎ末端及び／またはＣ末端に、またはその近位（例えば、それらの５０アミノ酸以内）に配置する。いくつかの場合では、１つ以上のＮＬＳ（２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つ以上のＮＬＳ）を、Ｎ末端またはその近位（例えば、その５０アミノ酸以内）に配置する。いくつかの場合では、１つ以上のＮＬＳ（２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つ以上のＮＬＳ）を、Ｃ末端またはその近位（例えば、その５０アミノ酸以内）に配置する。いくつかの場合では、１つ以上のＮＬＳ（３つ以上、４つ以上、または５つ以上のＮＬＳ）を、Ｎ末端及びＣ末端の両方またはその近位（例えば、それらの５０アミノ酸以内）に配置する。いくつかの場合では、１つのＮＬＳをＮ末端に配置し、１つのＮＬＳをＣ末端に配置する。
いくつかの場合では、融合ポリペプチドは、１～１０個のＮＬＳ（例えば、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、２～１０、２～９、２～８、２～７、２～６、または２～５個のＮＬＳ）を含む（融合させる）。いくつかの場合では、融合ポリペプチドは、２～５個のＮＬＳ（例えば、２～４個、または２～３個のＮＬＳ）を含む（融合させる）。
ＮＬＳの非限定な例として：アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号９１４）を有するＳＶ４０ウイルスラージＴ抗原のＮＬＳ；ヌクレオプラスミン由来のＮＬＳ（例えば、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号９１５）を有するヌクレオプラスミン二連ＮＬＳ）；アミノ酸配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号９１６）またはＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰ（配列番号９１７）を有するｃ－ｍｙｃ ＮＬＳ；配列ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（配列番号９１８）を有するｈＲＮＰＡ１ Ｍ９ ＮＬＳ；インポーチン－アルファ由来のＩＢＢドメインの配列ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ（配列番号９１９）；筋腫Ｔタンパク質の配列ＶＳＲＫＲＰＲＰ（配列番号９２０）及びＰＰＫＫＡＲＥＤ（配列番号９２１）；ヒトｐ５３の配列ＰＱＰＫＫＫＰＬ（配列番号９２２）；マウスｃ－ａｂｌ ＩＶの配列ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ（配列番号９２３）；インフルエンザウイルスＮＳ１の配列ＤＲＬＲＲ（配列番号９２４）及びＰＫＱＫＫＲＫ（配列番号９２５）；肝炎ウイルスデルタ抗原の配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ（配列番号９２６）；マウスＭｘ１タンパク質の配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（配列番号９２７）；ヒトポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼの配列ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ（配列番号９２８）；ならびにステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイドの配列ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ（配列番号９２９）に由来するＮＬＳ配列が挙げられる。いくつかの場合では、ＮＬＳは、アミノ酸配列 ＭＤＳＬＬＭＮＲＲＫＦＬＹＱＦＫＮＶＲＷＡＫＧＲＲＥＴＹＬＣ（配列番号９３０）を含む。一般的に、ＮＬＳ（または複数のＮＬＳ）は、真核細胞の核中で検出可能な量の融合ポリペプチドの蓄積を駆動するのに十分な強度である。核中の蓄積の検出は、任意の好適な技法によって実施され得る。例えば、検出可能なマーカーを、融合ポリペプチドに融合させてもよく、それにより細胞内の位置を可視化してもよい。また、細胞核を細胞から単離してもよく、次いで、その内容物を、タンパク質を検出するための任意の好適なプロセス、例えば、免疫組織化学、ウェスタンブロット、または酵素活性アッセイによって分析してもよい。核中の蓄積はまた、間接的に測定してもよい。
いくつかの場合では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドは、「タンパク質形質導入ドメイン」すなわちＰＴＤ（ＣＰＰ－細胞透過性ペプチドとしても知られる）を含み、これはポリペプチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、または脂質二層、ミセル、細胞膜、細胞小器官膜、もしくは小胞膜の横断を促進する有機もしくは無機化合物を指す。小さな極性分子から大きな高分子の範囲であり得る別の分子及び／またはナノ粒子に結合させたＰＴＤは、例えば、細胞外空間から細胞内空間に、またはサイトゾルから細胞小器官内に移動する分子の膜横断を促進する。いくつかの実施形態では、ＰＴＤを、ポリペプチドのアミノ末端に共有結合させる。いくつかの実施形態では、ＰＴＤを、ポリペプチドのカルボキシ末端に共有結合させる。いくつかの場合では、ＰＴＤを、好適な挿入部位で融合ポリペプチドに内的に挿入する（すなわち、融合ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端においてではない）。いくつかの場合では、本主題の融合ポリペプチドは、１つ以上のＰＴＤ（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上のＰＴＤ）を含む（複合体化する、融合させる）。いくつかの場合では、ＰＴＤは、核局在シグナル（ＮＬＳ）（例えば、いくつかの場合では、２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つ以上のＮＬＳ）を含む。したがって、いくつかの場合では、融合ポリペプチドは、１つ以上のＮＬＳ（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つ以上のＮＬＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ＰＴＤを、核酸（例えば、ガイド核酸、ガイド核酸をコードするポリヌクレオチド、融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドなど）に共有結合させる。ＰＴＤの例として、最小ウンデカペプチドタンパク質形質導入ドメイン（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号９３１）を有するＨＩＶ－１ ＴＡＴの残基４７～５７に対応する）；細胞中への直接侵入に十分ないくつかのアルギニン（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０～５０残基のアルギニン）を含むポリアルギニン配列；ＶＰ２２ドメイン（Ｚｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９（６）：４８９－９６）；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａタンパク質形質導入ドメイン（Ｎｏｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５２（７）：１７３２－１７３７）；切断型ヒトカルシトニンペプチド（Ｔｒｅｈｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２１：１２４８－１２５６）；ポリリジン（Ｗｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：１３００３－１３００８）；ＲＲＱＲＲＴＳＫＬＭＫＲ（配列番号９３２）；トランスポータンＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号９３３）；ＫＡＬＡＷＥＡＫＬＡＫＡＬＡＫＡＬＡＫＨＬＡＫＡＬＡＫＡＬＫＣＥＡ（配列番号９３４）；及びＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号９３５）が挙げられるが、これらに限定されない。例示的なＰＴＤとして、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号９３６）、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号９３７）；３アルギニン残基～５０アルギニン残基のアルギニンホモポリマーが挙げられるが、これらに限定されない；例示的なＰＴＤドメインアミノ酸配列として、以下のうちのいずれかが挙げられるが、これらに限定されない：ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号９３８）、ＲＫＫＲＲＱＲＲ（配列番号９３９）、ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ（配列番号９４０）、ＴＨＲＬＰＲＲＲＲＲＲ（配列番号９４１）、及びＧＧＲＲＡＲＲＲＲＲＲ（配列番号９４２）。いくつかの実施形態では、ＰＴＤは、活性化可能なＣＰＰ（ＡＣＰＰ）である（Ａｇｕｉｌｅｒａ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｉｎｔｅｇｒ Ｂｉｏｌ （Ｃａｍｂ）Ｊｕｎｅ；１（５－６）：３７１－３８１）。ＡＣＰＰは、マッチするポリアニオン（例えば、Ｇｌｕ９すなわち「Ｅ９」）に切断可能なリンカーを介して接続されたポリカチオン性ＣＰＰ（例えば、Ａｒｇ９すなわち「Ｒ９」）を含み、これは正味電荷をほぼ０に低減し、それによって細胞への接着及び取り込みを阻害する。リンカーの切断時に、ポリアニオンが放出され、ポリアルギニン及びその本来の接着性を局所的にアンマスクし、したがってＡＣＰＰを「活性化して」膜を横断するようにする。
ガイドＲＮＡ
標的ポリペプチドがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドである場合、いくつかの場合では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドは、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓエフェクターポリペプチドガイドＲＮＡ（「ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓガイドＲＮＡ」とも呼ばれる）と複合体化する。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドタンパク質に結合し、複合体を標的核酸内の特定の位置にターゲティングする核酸分子は、本明細書では「ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓエフェクターポリペプチドガイドＲＮＡ」または単に「ガイドＲＮＡ」と呼ばれる。
ガイドＲＮＡは、第１のセグメント（本明細書では「ターゲティングセグメント」と呼ばれる）；及び第２のセグメント（本明細書では「タンパク質結合セグメント」と呼ばれる）の２つのセグメントを含むと言うことができる。「セグメント」とは、分子のセグメント／セクション／領域、例えば、核酸分子内のヌクレオチドの連続したストレッチを意味する。セグメントはまた、複合体の領域／セクションをも意味し得、その結果、セグメントには複数の分子の領域が含まれ得る。「ターゲティングセグメント」は、本明細書中では、ガイドＲＮＡの「可変領域」とも呼ばれる。「タンパク質結合セグメント」は、本明細書中では、ガイドＲＮＡの「定常領域」とも呼ばれる。いくつかの場合では、ガイドＲＮＡはＣａｓ９ガイドＲＮＡである。
ガイドＲＮＡの第１のセグメント（ターゲティングセグメント）は、標的核酸（例えば、標的ｓｓＲＮＡ、標的ｓｓＤＮＡ、二本鎖標的ＤＮＡの相補鎖など）内の特定の配列（標的部位）に相補的な（及び、したがってそれとハイブリダイズする）ヌクレオチド配列（ガイド配列）を含む。タンパク質結合セグメント（または「タンパク質結合配列」）は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドと相互作用する（結合する）。ガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、互いにハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡ二重鎖（ｄｓＲＮＡ二重鎖）を形成するヌクレオチドの２つの相補性ストレッチを含む。標的核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ）の部位特異的結合及び／または切断は、ガイドＲＮＡ（ガイドＲＮＡのガイド配列）と標的核酸との間の塩基対合相補性によって決定される位置（例えば、標的座位の標的配列）において生じ得る。
ガイドＲＮＡとＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドは、複合体を形成する（例えば、非共有結合相互作用を介して結合する）。ガイドＲＮＡは、ガイド配列（標的核酸の配列に対して相補的なヌクレオチド配列）を含む、ターゲティングセグメントを含むことによって、複合体に標的特異性を提供する。複合体のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドは、部位特異的活性（例えば、切断活性、またはＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓエフェクターポリペプチドがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチド融合ポリペプチドである、すなわち、融合パートナーを有する場合には、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドによって提供される活性）を提供する。言い換えれば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドは、ガイドＲＮＡとの会合により、標的核酸配列（例えば、染色体核酸中の標的配列、例えば、染色体；染色体外核酸中の標的配列、例えば、エピソーム核酸、ミニサークル、ｓｓＲＮＡ、ｓｓＤＮＡなど；ミトコンドリア核酸中の標的配列；葉緑体核酸中の標的配列；プラスミド中の標的配列；ウイルス核酸中の標的配列など）に誘導される。
ガイドＲＮＡの「ターゲティング配列」とも呼ばれる「ガイド配列」は、ガイドＲＮＡがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドを、任意の所望の標的核酸の任意の所望の配列にターゲティングすることができるように修飾され得るが、ただし、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列は考慮され得る。したがって、例えば、ガイドＲＮＡは、真核細胞中の核酸、例えば、ウイルス核酸、真核細胞核酸（例えば、真核細胞染色体、染色体配列、真核細胞ＲＮＡなど）において、配列に対する相補性を有する（例えば、ハイブリダイズすることができる）配列（ガイド配列）とともにターゲティングセグメントを有し得る。
いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、２つの別個の核酸分子：「活性化因子」及び「ターゲッター（Ｔｅｒｇｅｔｅｒ）」を含み、本明細書では、「デュアルガイドＲＮＡ」、「二重分子ガイドＲＮＡ」、または「２分子ガイドＲＮＡ」「デュアルガイドＲＮＡ」、または「ｄｇＲＮＡ」と呼ばれる。いくつかの実施形態では、活性化因子及びターゲッターは互いに共有結合しており（例えば、介在するヌクレオチドを介して）、ガイドＲＮＡは、「単一ガイドＲＮＡ」、「Ｃａｓ９単一ガイドＲＮＡ」、「単一分子Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ」、または「１分子Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ」、または単に「ｓｇＲＮＡ」と呼ばれる。
ガイドＲＮＡには、ｃｒＲＮＡ様（「ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」／「ターゲッター」／「ｃｒＲＮＡ」／「ｃｒＲＮＡリピート」）分子及び対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様（「トランス作用性ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」／「活性化因子」／「ｔｒａｃｒＲＮＡ」）分子が含まれる。ｃｒＲＮＡ様分子（ターゲッター）は、ガイドＲＮＡのターゲティングセグメント（一本鎖）と、ガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖の半分を形成するヌクレオチドのストレッチ（「二重鎖形成セグメント」）の両方を含む。対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様分子（活性化因子／ｔｒａｃｒＲＮＡ）は、ガイド核酸のタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖の残りの半分を形成するヌクレオチドのストレッチ（二重鎖形成セグメント）を含む。言い換えれば、ｃｒＲＮＡ様分子のヌクレオチドのストレッチは、ｔｒａｃｒＲＮＡ様分子のヌクレオチドのストレッチと相補的であり、ハイブリダイズして、ガイドＲＮＡのタンパク質結合ドメインのｄｓＲＮＡ二重鎖を形成する。したがって、各ターゲッター分子は、対応する活性化因子分子（ターゲッターとハイブリダイズする領域を有する）を有すると言及し得る。ターゲッター分子は、さらにターゲティングセグメントを提供する。したがって、ターゲッターと活性化因子分子（対応するペアとして）は、ハイブリダイズしてガイドＲＮＡを形成する。所与のｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡ分子の正確な配列は、そのＲＮＡ分子が見出される種に特有である。デュアルガイドＲＮＡは、対応する活性化因子とターゲッターのペアを含み得る。
用語「活性化因子」または「活性化ＲＮＡ」は、本明細書中では、デュアルガイドＲＮＡ（したがって、「活性化因子」と「ターゲッター」が、例えば介在ヌクレオチドによって互いに連結されている場合はシングルガイドＲＮＡ）のｔｒａｃｒＲＮＡ様分子（ｔｒａｃｒＲＮＡ：「トランス作用性ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」）を意味するために使用される。したがって、例えば、ガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ）は、活性化因子配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列）を含む。ｔｒａｃｒ分子（ｔｒａｃｒＲＮＡ）は、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ分子（ｃｒＲＮＡ）とハイブリダイズしてデュアルガイドＲＮＡを形成する天然の分子である。用語「活性化因子」は、本明細書中では、天然のｔｒａｃｒＲＮＡを包含するために用いられるが、修飾（例えば、トランケーション、配列変異、塩基修飾、骨格修飾、結合修飾など）を有するｔｒａｃｒＲＮＡで、活性化因子がｔｒａｃｒＲＮＡの少なくとも１つの機能を保持している（例えば、Ｃａｓ９タンパク質が結合するｄｓＲＮＡ二重鎖に寄与する）場合もまた、包含するために用いられる。いくつかの場合では、活性化因子は、Ｃａｓ９タンパク質と相互作用することができる１つ以上のステムループを提供する。活性化因子は、ｔｒａｃｒ配列（ｔｒａｃｒＲＮＡ配列）を有すると称することができ、いくつかの場合では活性化因子はｔｒａｃｒＲＮＡであるが、用語「活性化因子」は、天然のｔｒａｃｒＲＮＡに限定されない。
用語「ターゲッター」または「ターゲッターＲＮＡ」は、本明細書中では、デュアルガイドＲＮＡの（したがって、これに加えて、「活性化因子」と「ターゲッター」が、例えば、介在するヌクレオチドによって一緒に連結されている場合のシングルガイドＲＮＡの）ｃｒＲＮＡ様分子（ｃｒＲＮＡ：「ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」）を指すために使用される。したがって、例えば、ガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ）は、ターゲティングセグメント（標的核酸とハイブリダイズする（相補的である）ヌクレオチドを含む）、及び二重鎖形成セグメント（例えば、ｃｒＲＮＡの二重鎖形成セグメント、これはｃｒＲＮＡリピートとも呼ばれ得る）を含む。ターゲッターのターゲティングセグメント（標的核酸の標的配列とハイブリダイズするセグメント）の配列は、所望の標的核酸とハイブリダイズするようにユーザーによって改変されるため、ターゲッターの配列は、多くの場合、非天然の配列である。しかしながら、活性化因子の二重鎖形成セグメントとハイブリダイズするターゲッターの二重鎖形成セグメント（以下でより詳細に説明する）は、天然の配列を含み得る（例えば、天然のｃｒＲＮＡの二重鎖形成セグメント（ｃｒＲＮＡリピートとも呼ばれ得る）の配列を含み得る）。したがって、ターゲッターの一部（例えば、二重鎖形成セグメント）が、多くの場合にｃｒＲＮＡ由来の天然の配列を含むという事実にもかかわらず、ターゲッターという用語を、天然のｃｒＲＮＡと区別するために本明細書中で使用する。しかしながら、用語「ターゲッター」には、天然のｃｒＲＮＡが含まれる。
ガイドＲＮＡはまた、３つの部分：（ｉ）ターゲティング配列（標的核酸の配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列）；（ｉｉ）活性化因子配列（上記のとおり）（いくつかの場合では、ｔｒａｃｒ配列と呼ばれる）；及び（ｉｉｉ）活性化因子配列の少なくとも一部にハイブリダイズして二重鎖を形成する配列を含むと言及し得る。ターゲッターは（ｉ）と（ｉｉｉ）を有し；一方、活性化因子は（ｉｉ）を有する。
ガイドＲＮＡ（例えば、デュアルガイドＲＮＡまたはシングルガイドＲＮＡ）は、対応する活性化因子とターゲッターのペアから構成され得る。いくつかの場合では、二重鎖形成セグメントを活性化因子とターゲッターとの間で交換することができる。言い換えれば、いくつかの場合では、ターゲッターは、ｔｒａｃｒＲＮＡの二重鎖形成セグメント由来のヌクレオチド配列（この配列は、通常、活性化因子の一部であろう）を含み、一方、活性化因子は、ｃｒＲＮＡの二重鎖形成セグメント由来のヌクレオチド配列を含む（この配列は、通常、ターゲッターの一部であろう）。
上述のように、ターゲッターは、ガイドＲＮＡのターゲティングセグメント（一本鎖）と、ガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖の半分を形成するヌクレオチドのストレッチ（「二重鎖形成セグメント」）の両方を含む。対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様分子（活性化因子）は、ガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖の残りの半分を形成するヌクレオチドのストレッチ（二重鎖形成セグメント）を含む。言い換えれば、ターゲッターのヌクレオチドのストレッチは、活性化因子のヌクレオチドのストレッチに相補的であり、それとハイブリダイズして、ガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖を形成する。したがって、各ターゲッターは、対応する活性化因子（ターゲッターとハイブリダイズする領域を有する）を有すると言及し得る。ターゲッター分子は、さらにターゲティングセグメントを提供する。したがって、ターゲッターと活性化因子（対応するペアとして）は、ハイブリダイズしてガイドＲＮＡを形成する。所与の天然のｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡ分子の特定の配列は、そのＲＮＡ分子が見出される種に特有である。好適な活性化因子及びターゲッターの例は、当技術分野で周知である。
核酸の修飾
いくつかの場合では、ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓガイドＲＮＡは、核酸に新規または強化された特性（例えば、安定性の向上）を提供するための１つ以上の修飾、例えば、塩基修飾、主鎖修飾、糖修飾などを有する。
好適な核酸修飾として、２’Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’フルオロ修飾ヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）修飾ヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）修飾ヌクレオチド、ホスホロチオエート結合を有するヌクレオチド、及び５’キャップ（例えば、７－メチルグアニレートキャップ（ｍ７Ｇ））が挙げられるが、これらに限定されない。
リン酸原子を内部に含有する好適な修飾核酸主鎖として、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチル及び他のアルキルホスホネート（３’－アルキレンホスホネート、５’－アルキレンホスホネート、及びキラルホスホネートを含む）、ホスフィネート、ホスホルアミダート（３’－アミノホスホルアミダート及びアミノアルキルホスホルアミダートを含む）、ホスホロジアミダート、チオノホスホロアミダート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェート、及び通常の３’－５’結合を有するボラノホスフェート、それらの２’－５’結合類似体、ならびに１つ以上のヌクレオチド間結合が、３’－３’、５’－５’または２’－２’結合である、反転極性を有するものが挙げられる。反転極性を有する好適なオリゴヌクレオチドは、最も３’末端側のヌクレオチド間結合において単一の３’－３’結合を含む、すなわち、塩基性であり得る単一の反転ヌクレオシド残基（核酸塩基が欠失しているか、またはその代わりにヒドロキシル基を有する）を含む。様々な塩（例えば、カリウムまたはナトリウムなど）、混合塩、及び遊離酸形態もまた含まれる。
いくつかの場合では、ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓガイドＲＮＡは、ホスホロチオエート結合によって連結している１つ以上のヌクレオチドを有する（すなわち、本主題の核酸は、１つ以上のホスホロチオエート連結を有する）。ホスホロチオエート（ＰＳ）結合（すなわち、ホスホロチオエート連結）は、核酸（例えば、オリゴ）のリン酸骨格中の非架橋酸素を、硫黄原子で置き換える。この修飾は、ヌクレオチド間の連結に、ヌクレアーゼ変性に対する耐性を付与する。ホスホロチオエート結合をオリゴの５’または３’末端における最後の３－５ヌクレオチド間に導入して、エキソヌクレアーゼ変性を阻害することができる。ホスホロチオエート結合をオリゴ内に含めること（例えば、オリゴ全体を通して）は、エンドヌクレアーゼによる攻撃を低減することにも役立つ。
例えば米国特許第５，０３４，５０６号に記載されているような、モルホリノ骨格構造を有するＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓガイドＲＮＡもまた好適である。例えば、いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓガイドＲＮＡは、リボース環の代わりに６員モルホリノ環を含む。これらの実施形態のうちのいくつかでは、ホスホロジアミダートまたは他の非ホスホジエステルヌクレオシド間連結で、ホスホジエステル連結を置き換える。
ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓガイドＲＮＡにはまた、１つ以上の置換された糖部分も含めることができる。好適なポリヌクレオチドは：ＯＨ；Ｆ；Ｏ－、Ｓ－、もしくはＮ－アルキル；Ｏ－、Ｓ－、もしくはＮ－アルケニル；Ｏ－、Ｓ－、もしくはＮ－アルキニル；またはＯ－アルキル－Ｏ－アルキルから選択される糖置換基を含み、それらのアルキル、アルケニル、及びアルキニルは、置換または非置換のＣ１～Ｃ１０アルキルまたはＣ２～Ｃ１０アルケニル及びアルキニルであってもよい。Ｏ（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、及びＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ（（ＣＨ２）ｎＣＨ３）２が特に好適であり、ｎ及びｍは、１～約１０である。他の好適なポリヌクレオチドは、Ｃ１～Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、Ｏ－アルカリルもしくはＯ－アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬理学的特性を改善するための基、及び同様の特性を有する他の置換基から選択される糖置換基を含む。好適な修飾として、２’－メトキシエトキシ（２’－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）または２’－ＭＯＥとしても知られる）（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｌｖ． Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６－５０４）すなわち、アルコキシアルコキシ基が挙げられる。さらなる好適な修飾として、本明細書の下記の実施例に記載する、２’－ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基（２’－ＤＭＡＯＥとしても知られる）、及び２’－ジメチルアミノエトキシエトキシ（当技術分野では、２’－Ｏ－ジメチル－アミノ－エトキシ－エチルまたは２’－ＤＭＡＥＯＥとしても知られる）、すなわち、２’－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）２が挙げられる。
カップリングタンパク質を介して２つのタンパク質をカップリングする方法
本開示は、カップリングポリペプチドを介した第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドの化学選択的カップリング方法を提供する。化学選択的カップリングの生成物は、Ｎ末端からＣ末端の順に：ｉ）第１のポリペプチド；ｉｉ）カップリングポリペプチド；及びｉｉｉ）第２のポリペプチドを含み得る。この方法は、上記のように、チロシナーゼポリペプチドの基質選択性を利用する。
例えば、いくつかの場合では、本開示は、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドをカップリングポリペプチドへと化学選択的にカップリングさせる方法を提供し、方法は：ａ）第１のポリペプチドをカップリングポリペプチドと接触させて、第１のポリペプチド－カップリングポリペプチド複合体を生成させることを含み、第１のポリペプチドは、チオール部分（例えばＣｙｓ、Ｃｙｓは、第１のポリペプチド内の、任意の溶媒にアクセス可能な位置に存在し得る）を含み、カップリングポリペプチドは、第１のポリペプチドに存在するチオール部分と共有結合を形成するＮ末端反応性部分を含み、Ｎ末端反応性部分を含むカップリングポリペプチドは、Ｎ末端反応性部分を生成させるために、Ｎ末端フェノール部分またはカテコール部分及びＣ末端フェノールまたはカテコール部分を含むポリペプチドと、Ｎ末端フェノール部分またはカテコール部分を酸化することはできるがＣ末端フェノールまたはカテコール部分を酸化することはできない第１の酵素とを反応させることにより生成され（「カップリング前駆体ポリペプチド」）；カップリングポリペプチドは、Ｎ末端フェノールまたはカテコール部分の１０アミノ酸以内に２つ以上の正に荷電したまたは中性アミノ酸を含み、Ｃ末端フェノールまたはカテコール部分の１０アミノ酸以内に２つ以上の負に荷電したアミノ酸を含み；方法はまた、ｂ）第２のポリペプチドを、第１のポリペプチド－カップリングポリペプチド複合体と接触させることを含み、第２のポリペプチドはチオール部分（例えば、Ｃｙｓ、Ｃｙｓは、第２のポリペプチド内の任意の溶媒アクセス可能位置に存在し得る）を含み、第１のポリペプチド－カップリングポリペプチド複合体は、第２のポリペプチドに存在するチオール部分と共有結合を形成するＣ末端反応性部分を含み、Ｃ末端反応性部分を含む第１のポリペプチド－カップリングポリペプチド複合体は、第１のポリペプチド－カップリングポリペプチド複合体と、Ｃ末端フェノールまたはカテコール部分を酸化してＣ末端反応性部分を生成させることができる第２の酵素との反応によって生成され；前記接触が、第１のポリペプチド－カップリングポリペプチド－第２のポリペプチド複合体を生成する。いくつかの場合では、第１の酵素は、図８または図９に示されているａｂＴＹＲのアミノ酸配列に対して少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むチロシナーゼポリペプチドであり；第２の酵素は、図１０Ａ～１０Ｚ及び１０ＡＡ～１０ＶＶのいずれか１つに示されているアミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むチロシナーゼポリペプチドである。
別の例として、いくつかの場合では、本開示は、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドをカップリングポリペプチドへと化学選択的にカップリングさせる方法を提供し、方法は：ａ）第１のポリペプチドをカップリングポリペプチドと接触させて、第１のポリペプチド－カップリングポリペプチド複合体を生成させることを含み、第１のポリペプチドは、チオール部分を含み、カップリングポリペプチドは、第１のポリペプチドに存在するチオール部分と共有結合を形成するＮ末端反応性部分を含み、Ｎ末端反応性部分を含むカップリングポリペプチドは、Ｎ末端反応性部分を生成させるために、Ｎ末端フェノール部分またはカテコール部分及びＣ末端フェノールまたはカテコール部分を含むポリペプチドと、Ｎ末端フェノール部分またはカテコール部分を酸化することはできるがＣ末端フェノールまたはカテコール部分を酸化することはできない第１の酵素とを反応させることにより生成され；カップリングポリペプチドは、Ｎ末端フェノールまたはカテコール部分の１０アミノ酸以内に２つ以上の負に荷電したアミノ酸を含み、Ｃ末端フェノールまたはカテコール部分の１０アミノ酸以内に２つ以上の正に荷電したまたは中性アミノ酸を含み；方法はまた、ｂ）第２のポリペプチドを、第１のポリペプチド－カップリングポリペプチド複合体と接触させることを含み、第２のポリペプチドはチオール部分を含み、第１のポリペプチド－カップリングポリペプチド複合体は、第２のポリペプチドに存在するチオール部分と共有結合を形成するＣ末端反応性部分を含み、Ｃ末端反応性部分を含む第１のポリペプチド－カップリングポリペプチド複合体は、第１のポリペプチド－カップリングポリペプチド複合体と、Ｃ末端フェノールまたはカテコール部分を酸化してＣ末端反応性部分を生成させることができる第２の酵素との反応によって生成され；前記接触が、第１のポリペプチド－カップリングポリペプチド－第２のポリペプチド複合体を生成する。いくつかの場合では、第１の酵素は、図１０Ａ～１０Ｚ及び１０ＡＡ～１０ＶＶのいずれか１つに示されているアミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むチロシナーゼポリペプチドであり；第２の酵素は、図８または図９に示されているａｂＴＹＲのアミノ酸配列に対して少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むチロシナーゼポリペプチドである。
カップリングポリペプチドは、１０アミノ酸～１００アミノ酸、または１００超のアミノ酸の長さを有し得る。いくつかの場合では、カップリングポリペプチドは、１０アミノ酸～２５アミノ酸の長さを有する。いくつかの場合では、カップリングポリペプチドは、２５アミノ酸～５０アミノ酸の長さを有する。いくつかの場合では、カップリングポリペプチドは、５０アミノ酸～１００アミノ酸の長さを有する。いくつかの場合では、カップリングポリペプチドは、１００超のアミノ酸の長さを有し；例えば、いくつかの場合では、カップリングポリペプチドは、１００アミノ酸～２００アミノ酸、２００アミノ酸～５００アミノ酸、または５００超のアミノ酸（例えば、５００～１０００、１０００～２０００、または２０００超のアミノ酸）の長さを有する。いくつかの場合では、Ｎ末端フェノール部分とＣ末端フェノール部分の両方がチロシンであり、反応性部分を生成する酵素はチロシナーゼである。
上記のように、いくつかの場合では、カップリングポリペプチドは：ａ）Ｎ末端フェノール部分またはカテコール部分の１０アミノ酸以内に２つ以上の負に荷電したアミノ酸；またはｂ）Ｃ末端フェノール部分またはカテコール部分の１０アミノ酸以内に２つ以上の負に荷電したアミノ酸を含む。そのような場合、カップリングポリペプチドは：ａ）Ｎ末端フェノール部分またはカテコール部分の１０アミノ酸以内に２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の負に荷電したアミノ酸；またはｂ）Ｃ末端フェノール部分またはカテコール部分の１０アミノ酸以内に２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の負に荷電したアミノ酸を含み得る。非限定的な一例として、カップリングポリペプチドは、アミノ酸配列：ＹＥＥＥＥ（Ｘ）ｎＲＲＲＲＹ（配列番号９６１）を含み、式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｎは０～４０の整数である（例えば、式中、ｎは、０～５、５～１０、１０～１５、１５～２０、２０～２５、２５～３０、３０～３５、または３５～４０の整数である）。非限定的な別の例として、カップリングポリペプチドは、アミノ酸配列：ＹＤＤＤＤ（Ｘ）ｎＫＫＫＫＹ（配列番号９６２）を含み、式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｎは０～４０の整数である（例えば、式中、ｎは、０～５、５～１０、１０～１５、１５～２０、２０～２５、２５～３０、３０～３５、または３５～４０の整数である）。
上記のように、いくつかの場合では、カップリングポリペプチドは：ａ）Ｎ末端フェノール部分またはカテコール部分の１０アミノ酸以内に２つ以上の正に荷電したアミノ酸；またはｂ）Ｃ末端フェノール部分またはカテコール部分の１０アミノ酸以内に２つ以上の正に荷電したアミノ酸を含む。そのような場合、カップリングポリペプチドは：ａ）Ｎ末端フェノール部分またはカテコール部分の１０アミノ酸以内に２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の正に荷電したアミノ酸；またはｂ）Ｃ末端フェノール部分またはカテコール部分の１０アミノ酸以内に２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の正に荷電したアミノ酸を含み得る。非限定的な一例として、カップリングポリペプチドは、アミノ酸配列：ＹＫＫＫＫ（Ｘ）ｎＤＤＤＤＹ（配列番号９６３）を含み、式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｎは０～４０の整数である（例えば、式中、ｎは、０～５、５～１０、１０～１５、１５～２０、２０～２５、２５～３０、３０～３５、または３５～４０の整数である）。非限定的な別の例として、カップリングポリペプチドは、アミノ酸配列：ＹＲＲＲＲ（Ｘ）ｎＥＥＥＥＹ（配列番号９６４）を含み、式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｎは０～４０の整数である（例えば、式中、ｎは、０～５、５～１０、１０～１５、１５～２０、２０～２５、２５～３０、３０～３５、または３５～４０の整数である）。
本開示は、上記のように、カップリングポリペプチドを提供する。本開示は、本開示のカップリングポリペプチドを含む組成物を提供する。本開示は：ａ）本開示のカップリングポリペプチド；及びｂ）緩衝液を含む組成物を提供する。
好適な第１及び第２のポリペプチドは、上記のポリペプチドのいずれかを含む。例えば、いくつかの場合では、第１及び／または第２のポリペプチドは抗体（例えば、単鎖抗体）である。別の例として、いくつかの場合では、第１及び／または第２のポリペプチドはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドである。一例として、いくつかの場合では、第１のポリペプチドはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドであり；第２のポリペプチドはＩｇ Ｆｃポリペプチドである。別の例として、いくつかの場合では、第１のポリペプチドはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドであり；第２のポリペプチドはナノボディである。別の例として、いくつかの場合では、第１のポリペプチドはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドであり；第２のポリペプチドはｓｃ Ｆｖポリペプチドである。
２つ以上のポリペプチドを結合する方法
本開示は、２つ以上のポリペプチドを互いに連続的にカップリングする方法を提供する。この方法は、上記のように、チロシナーゼポリペプチドの基質選択性を利用する。この方法は、不溶性の基質、すなわちビーズなどの固定化された表面上で実行することができる。２つ以上のポリペプチドを互いに連続的にカップリングするための本開示の方法を、図３９Ａ～３９Ｇに概略的に示す。
したがって、本開示は、第１のポリペプチドを第２のポリペプチドに共有結合させる方法を提供し、方法は：ａ）第１のポリペプチドを固定化反応性部分と接触させることを含み、固定化反応性部分は、固定化フェノール部分またはカテコール部分と第１の酵素との反応によって生成され；第１の酵素は、固定化フェノール部分またはカテコール部分を酸化し、それにより固定化反応性部分を生成させることができ、第１のポリペプチドは：ｉ）チオール部分；及びｉｉ）フェノール部分またはカテコール部分を含み、第１のポリペプチドは、フェノール部分またはカテコール部分の１０アミノ酸以内に２つ以上の負に荷電したアミノ酸を含み、固定化反応性部分は、第１のポリペプチドに存在するチオール部分と共有結合を形成し、それにより固定化された第１のポリペプチドを生成し；方法はまた、ｂ）固定化された第１のポリペプチドを第２の酵素と接触させ、第２の酵素は、第１のポリペプチドに存在するフェノール部分またはカテコール部分を酸化して、反応性部分を含む固定化された第１のポリペプチドを生成させることができ；方法はまた、ｃ）反応性部分を含む固定化された第１のポリペプチドを第２のポリペプチドと接触させることを含み、第２のポリペプチドは：ｉ）チオール部分；及びｉｉ）フェノール部分またはカテコール部分を含み、第２のポリペプチドは、フェノール部分またはカテコール部分の１０アミノ酸以内に２つ以上の中性または正の荷電を有し、固定化された第１のポリペプチドに存在する反応性部分は、第２のポリペプチドに存在するチオール部分と共有結合を形成し、それにより、第２のポリペプチドに共有結合した第１のポリペプチドを含む固定化された複合体が生成される。いくつかの場合では、第１の酵素は、図８、図９、図１０Ａ～１０Ｚ、及び図１０ＡＡ～１０ＶＶのいずれか１つに示されているアミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むチロシナーゼポリペプチドである。いくつかの場合では、第１のポリペプチドに存在するチオール部分は、Ｃｙｓ（例えば、溶媒にアクセス可能なＣｙｓ；例えば、Ｎ末端Ｃｙｓ）に存在し、第１のポリペプチドに存在するフェノール部分は、Ｔｙｒ残基に存在する。いくつかの場合では、Ｔｙｒ残基は、ＥＥＥＹ（配列番号９５３）、ＥＥＥＥＹ（配列番号９５５）、ＤＤＤＤＹ（配列番号９６５）、またはＤＤＤＤＹ（配列番号９６５）を含むアミノ酸のストレッチに存在する。いくつかの場合では、第２の酵素は、図１０Ａ～１０Ｚ及び図１０ＡＡ～１０ＶＶのいずれか１つに示されているアミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むチロシナーゼポリペプチドである。いくつかの場合では、第２の酵素は、図１０Ｍに示されているアミノ酸配列に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸を含むチロシナーゼポリペプチドであり、チロシナーゼポリペプチドは、Ｄ５５の置換を含む（例えば、Ｄ５５Ｋ置換を含む）。
この方法は、任意の数のポリペプチドを連続的に連結するために使用することができる。例えば、いくつかの場合では、方法はさらに、ｃ）固定化された複合体を第３の酵素と接触させることを含み、第３の酵素は、第２のポリペプチドに存在するフェノール部分またはカテコール部分を酸化して、反応性部分を含む固定化された複合体を生成させることができ；方法はまた、ｄ）反応性部分を含む固定化された複合体を第３のポリペプチドと接触させることを含み、第３のポリペプチド：ｉ）チオール部分；及びｉｉ）フェノール部分またはカテコール部分を含み、第３のポリペプチドは、フェノール部分またはカテコール部分の１０アミノ酸以内に２つ以上の負の荷電を有し、固定化された複合体に存在する反応性部分は、第２のポリペプチドに存在するチオール部分と共有結合を形成し、それにより、第２のポリペプチドに共有結合した第３のポリペプチドを含む固定化された複合体が生成される。いくつかの場合では、第３の酵素は、図８または図９に示されているアミノ酸配列に対して少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むチロシナーゼポリペプチドである。
ａ）負に荷電した環境（例えば、ポリペプチドがＴｙｒ残基の１０アミノ酸以内に２つ以上の負の荷電を有する）に存在するＴｙｒ残基を優先的に修飾するチロシナーゼ酵素；及びｂ）中性または正に荷電した環境（例えば、ポリペプチドがＴｙｒ残基の１０アミノ酸以内に２つ以上の中性または正の荷電を有する）に存在するＴｙｒ残基を優先的に修飾するチロシナーゼ酵素を交互に使用することにより、ポリペプチド基質を、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上のポリペプチドを含む固定化された複合体に連続的に付加することができる。上記の方法は、例えば、第１のポリペプチドが：ｉ）チオール部分；及びｉｉ）フェノール部分またはカテコール部分を含むように改変することができ、第１のポリペプチドは、フェノール部分またはカテコール部分の１０アミノ酸以内に２つ以上の中性または正に荷電したアミノ酸を含み；そのような場合、第２のポリペプチドは：ｉ）チオール部分；及びｉｉ）フェノール部分またはカテコール部分を含み、第１のポリペプチドは、フェノール部分またはカテコール部分の１０アミノ酸以内に２つ以上の負に荷電したアミノ酸を含む。
いくつかの場合では、方法の任意の２つのステップの間で、チロシナーゼ酵素をさらに添加する前に、チロシナーゼ酵素を不活性化または除去する。例えば、いくつかの場合では、上記の方法の工程（ｂ）と工程（ｃ）との間で、第２の酵素を不活性化または除去する。いくつかの場合では、第２のポリペプチドに存在するチオール部分はＣｙｓに存在し、第２のポリペプチドに存在するフェノール部分はＴｙｒ残基に存在する。いくつかの場合では、Ｔｙｒ残基は、ＲＲＲＹ（配列番号９４９）、ＲＲＲＲＹ（配列番号９５１）、ＫＫＫＹ（配列番号９６６）、またはＫＫＫＫＹ（配列番号９６７）を含むアミノ酸のストレッチに存在する。
図３９Ａに概略的に示すように、ａｂＴＹＲを、ビオチン－フェノールと、チオール基及びＥＥＥＥＹ（配列番号９５５）配列を含む第１のポリペプチド（「タンパク質Ａ」）とを連結し、ビオチン－第１のポリペプチド複合体を生成するために使用する。ビオチン－第１のポリペプチド複合体をストレプトアビジンビーズと接触させて、ビオチン－第１のポリペプチド複合体を固定化することができる。チオール基及びＲＲＲＲＹ（配列番号９５１）を含む第２のポリペプチド（「タンパク質Ｂ」）配列を、ｂｍＴＹＲ（Ｄ５５Ｋ）（例えば、図１０Ｍに示すｂｍＴＹＲ（Ｄ５５Ｋ））の作用によって固定化したビオチン－第１のポリペプチド複合体の第１のポリペプチドに複合体化させて、固定化された第１のポリペプチド－第２のポリペプチド複合体を生成させることができる。いくつかの場合では、図３９Ａ、図３９Ｂ、及び図３９Ｃに示すように、２つの異なるポリペプチド（例えば、「タンパク質Ａ」及び「タンパク質Ｂ」）を、鎖状体に交互に付加する。あるいは、図３９Ｄ及び図３９Ｅに示すように、単一のポリペプチドの複数のコピーを鎖状化する。さらに別の可能性として、いくつかの場合では、鎖状化するポリペプチドのそれぞれは、図３９Ｆ及び図３９Ｇに示すように、他のポリペプチドと異なる（例えば、「タンパク質Ａ」、「タンパク質Ｂ」、及び「タンパク質Ｃ」）。
組成物
本開示の態様は、式（ＩＩＩ）のチオールを含む標的分子と、式（Ｉ）：
Figure 2022527247000037
のフェノール部分またはカテコール部分を含む生体分子とを含む、医薬組成物を含む組成物をさらに提供し、
式中、Ｙ１は生体分子であり、任意選択で、活性小分子、親和性タグ、フルオロフォア、及び金属キレート剤から選択される１つ以上の部分を含み；Ｌは、任意選択のリンカーであり；Ｘ１は、水素及びヒドロキシルから選択され；Ｙ２は、第２の生体分子である。
特定の実施形態では、式（ＩＩＩ）のチオールを含む標的分子の組成物、及び薬学的に許容される賦形剤を提供する。
特定の実施形態では、式（Ｉ）のフェノール部分またはカテコール部分を含む生体分子の組成物、及び薬学的に許容される賦形剤を提供する。
本主題の組成物の特定の実施形態では、Ｙ２は、例えば、本明細書に記載のように、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドである。
本主題の組成物の特定の実施形態では、式（Ｉ）は、本明細書に開示するように、式（ＩＡ）、（ＩＡａ）、（ＩＢ）、（ＩＣ）、（ＩＤ）、（ＩＤａ）及び（ＩＤｂ）のいずれかによって記述される。
本主題の組成物は、一般的に、式（ＩＩＩ）のチオールを含む本主題の標的分子；式（Ｉ）のフェノール部分またはカテコール部分を含む生体分子；及び少なくとも１つの追加の化合物を含む。好適な追加の化合物として：塩、例えば、マグネシウム塩、ナトリウム塩など：例えば、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４など；緩衝剤、例えば、トリス緩衝液、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－Ｎ’－（２－エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸ナトリウム塩（ＭＥＳ）、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ－トリス［ヒドロキシメチル］メチル－３－アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）など；可溶化剤；界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ－２０などの非イオン性界面活性剤；プロテアーゼ阻害剤などが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、本主題の組成物は、式（ＩＩＩ）のチオールを含む本主題の標的分子；式（Ｉ）のフェノール部分またはカテコール部分を含む生体分子；及び薬学的に許容される賦形剤を含む。多種多様な薬学的に許容される賦形剤が当技術分野で公知であり、本明細書中で詳細に説明する必要はない。薬学的に許容される賦形剤は、例えば、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，”２０ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（１９９９）Ｈ．Ｃ．Ａｎｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，７ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ；及びＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（２０００）Ａ．Ｈ．Ｋｉｂｂｅ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，３ｒｄ ｅｄ． Ａｍｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃを含む様々な刊行物に詳細に記載されている。
ビヒクル、アジュバント、担体または希釈剤などの薬学的に許容される賦形剤は、一般的に容易に入手可能である。さらに、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、等張剤、安定剤、湿潤剤などの薬学的に許容される補助剤は、一般的に容易に入手可能である。
キット
本明細書に記載の化合物及び組成物は、キットとしてパッケージ化することができ、キットは、様々な例示的な用途で化合物または組成物を使用するための説明書を任意選択で含み得る。非限定的な例として、例えば、粉末または凍結乾燥形態の化合物または組成物、及び本主題の方法で使用するための再構成、用量情報、及び保管情報を含む使用説明書を含むキットが挙げられる。キットは、任意選択で、即時使用が可能な液体形態、または投与のために溶液とさらに混合する必要がある化合物または組成物の容器を含み得る。
本開示の態様は、式（ＩＩＩ）のチオールを含む本主題の標的分子、及び式（Ｉ）のフェノール部分を含む生体分子を含む組成物を含む第１の容器；ならびにフェノール部分またはカテコール部分を酸化することができる酵素を含む第２の容器を含むキットを含む。特定の場合では、酵素はチロシナーゼ酵素である。
特定の実施形態では、本主題のキットは、式（ＩＩＩ）のチオールを含む本主題の標的分子を含む第１の容器；式（Ｉ）のフェノール部分またはカテコール部分を含む生体分子を含む第２の容器；及びフェノール部分またはカテコール部分を酸化することができる酵素を含む第３の容器を含む。特定の場合では、酵素はチロシナーゼ酵素である。
キットには、粉末形態を再構成するためのバイアルなど、本主題の方法を支援する任意選択の構成要素を含めることができる。キットは、無菌の完全性を維持しながら、皮下注射針によって単回または複数回の穿刺をすることに適したシール（例えば、圧着されたセプタムシールクロージャー）を備えた容器のいずれかで提供してもよい。キットの構成要素は、カートン、ブリスターパック、ボトル、チューブなどに組み立てられ得る。
上述の構成要素に加えて、本発明のキットは、本発明の方法を実施するための説明書をさらに含み得る。これらの説明書を、本主題のキット中に各種形式で存在させてよく、それらのうちの１つ以上をキット中に存在させてもよい。これらの説明書として存在させ得る１つの形式は、好適な媒体または物質に印刷された説明書であり、例えば、キットの包装、包装の挿入物などに入れられた、情報が印刷された１枚または複数の紙である。別の手段は、情報が記録され、保存されたコンピュータで読み取り可能な媒体、例えば、ＣＤ、ＤＶＤ、Ｂｌｕ－Ｒａｙ、コンピュータで読み取り可能なメモリなどであろう。存在し得るさらに別の手段は、例えば、機能性色素の検出に使用するための適切なスマートフォンアプリをダウンロードするためのウェブサイトへのリンクなどのウェブサイトアドレスであり、これは、インターネットを介して再移動したサイト上で情報にアクセスするために利用し得る。任意の好都合な手段をキット内に存在させてもよい。
有用性
本主題の化合物、組成物、キット、及び本主題の修飾方法は、研究用途及び診断用途を含む様々な用途において有用である。
対象となる研究用途には、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの生体分子（タンパク質など）の操作、タグ付け及び追跡を含む、標的分子、生体分子、細胞、粒子、表面の選択的操作が対象となるあらゆる用途が含まれる。
本主題の方法及び組成物はまた、治療用途にも利用可能であり、例えば、対象となる治療用途には、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）が利用可能な用途（例えば、新規免疫療法）、遺伝子治療のためのタンパク質の送達、ワクチン開発が含まれる。
チロシナーゼバリアントのスクリーニング方法
本開示は、特定の基質に対する選好性を有するチロシナーゼバリアントの同定方法を提供する。この方法は、負に荷電した環境、または正に荷電した環境において、特定の配列に存在するフェノールまたはカテコールに対する選好性を有するチロシナーゼバリアントの同定を提供することができる。方法は、一般的に：ａ）ペプチドを被験チロシナーゼ及びチオール修飾ビオチン（ビオチン－チオール）と接触させることを含み、ペプチドは、約４アミノ酸～約２５アミノ酸（例えば、約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５～２０、または２０～２５アミノ酸）の長さを有し、ペプチドがＣ末端のＴｙｒ残基を有する場合、ビオチン－ペプチド複合体が生成し；方法はまた、ｂ）ビオチン－ペプチド複合体をストレプトアビジン複合化ビーズ（例えば、磁気ビーズに複合体化したストレプトアビジン）と接触させて、ストレプトアビジン－ビオチン－ペプチド複合体を生成し；ｃ）ストレプトアビジン－ビオチン－ペプチド複合体のペプチドのアミノ酸配列を決定することを含む。いくつかの場合では、方法は、ストレプトアビジン－ビオチン－ペプチド複合体を洗浄して、非結合のペプチド（ビオチンに複合体化していないペプチド）を除去するステップをさらに含む。いくつかの場合では、方法は、ペプチドのアミノ酸配列を決定する前に、ストレプトアビジン－ビオチン－ペプチド複合体からペプチドを遊離させるステップをさらに含む。ストレプトアビジン－ビオチン－ペプチド複合体を、過剰量の遊離ビオチン、アセトニトリル、及びギ酸（例えば、８０％アセトニトリル、５％ギ酸、及び２ｍＭビオチン）を含む混合物中でインキュベートすることにより、ストレプトアビジン－ビオチン－ペプチド複合体からペプチドを遊離させる（溶出する）ことができる。ストレプトアビジン－ビオチン－ペプチド複合体に存在するペプチド（例えば、溶出ペプチド）のアミノ酸配列は、例えば、質量分析（ＭＳ）（例えば、タンデムＭＳ）を含む様々な周知の方法のいずれかを使用して決定することができる。ペプチドのライブラリーを使用して、被験チロシナーゼが、特定のアミノ酸配列、負に荷電した環境、または正に荷電した環境に対する選好性を有するかどうかを判定することができる。
本開示の非限定的な態様の例
態様Ａ
上述の本主題の実施形態を含む態様は、単独で、または１つ以上の他の態様または実施形態との組み合わせにおいて有効であり得る。上述の記載に制限されるものではないが、１～３９の番号が付された本開示の特定の非限定的な態様を以下に示す。本開示を読むことにより当業者には明らかであるように、個々の番号が付された態様のそれぞれは、先行または後続の個々の番号が付された態様のうちのいずれかと共に使用し得るか、または組み合わせ得る。これは、態様のすべてのそのような組み合わせに対する支持を提供することを意図するものであり、以下に明示的に提供する態様の組み合わせに限定するものではない。
態様１．標的分子を化学選択的に修飾する方法であって、前記方法は：チオール部分を含む標的分子を反応性部分を含む生体分子と接触させる工程を含み；前記反応性部分を含む前記生体分子が、フェノール部分またはカテコール部分を含む生体分子と、前記フェノールまたはカテコール部分を酸化することができる酵素との反応によって生成され；前記接触させる工程が、前記標的分子と前記生体分子との複合体化に十分な条件下で行われ、それにより、修飾された標的分子が生成される、前記方法。
態様２．前記標的分子がポリペプチドである、態様１に記載の方法。
態様３．前記酵素がチロシナーゼ酵素である、態様１または２に記載の方法。
態様４．前記酵素が、固体支持体に結合されている、態様１～３のいずれか一項に記載の方法。
態様５．前記フェノール部分が、チロシン残基に存在する、態様１～４のいずれか一項に記載の方法。
態様６．前記チオール部分が、システイン残基に存在する、態様１～５のいずれか一項に記載の方法。
態様７．前記システイン残基が、天然のシステイン残基である、態様６に記載の方法。
態様８．前記生体分子が、フルオロフォア、活性小分子、親和性タグ、及び金属キレート剤から選択される１つ以上の部分を含む、態様１～７のいずれか一項に記載の方法。
態様９．前記反応性部分が、オルトキノンもしくはセミキノンラジカル、またはそれらの組み合わせである、態様１～８のいずれか一項に記載の方法。
態様１０．前記生体分子がポリペプチドである、態様１～９のいずれか一項に記載の方法。
態様１１．前記生体分子が、蛍光タンパク質、抗体、酵素、受容体のリガンド、及び受容体から選択されるポリペプチドである、態様１０に記載の方法。
態様１２．前記フェノール部分またはカテコール部分を含む生体分子が、式（Ｉ）の分子であり、前記反応性部分を含む生体分子が、式（ＩＩ）もしくは（ＩＩＡ）またはそれらの組み合わせの分子であり：
Figure 2022527247000038
式中：
Ｙ１が、活性小分子、親和性タグ、フルオロフォア、及び金属キレート剤から選択される１つまたは複数の部分を任意で含む、生体分子であり；
Ｘ１が、水素及びヒドロキシルから選択され；かつ
Ｌが、任意選択のリンカーである、態様１～１１のいずれか一項に記載の方法。
態様１３．前記チオール部分を含む標的分子が、式（ＩＩＩ）の分子であり、前記修飾された標的分子が、式（ＩＶ）もしくは（ＩＶＡ）またはそれらの組み合わせの分子であり：
Figure 2022527247000039
式中：
Ｙ１が生体分子であり、任意選択で、活性小分子、親和性タグ、フルオロフォア、及び金属キレート剤から選択される１つ以上の部分を含み；
Ｙ２が、第２の生体分子であり；
Ｌが、任意選択のリンカーであり；かつ
ｎが、１～３の整数である、態様１～１２のいずれか一項に記載の方法。
態様１４．前記式（ＩＶ）の修飾された標的分子が、式（ＩＶ１）～（ＩＶ３）：
Figure 2022527247000040
のいずれかの分子であり；
前記式（ＩＶＡ）の修飾された標的分子が、式（ＩＶＡ１）～（ＩＶＡ３）：
Figure 2022527247000041
のいずれかの分子である、態様１３に記載の方法。
態様１５．前記式（ＩＶ）の修飾された標的分子が、式（ＩＶ５）～（ＩＶ６）：
Figure 2022527247000042
のいずれかの分子であり；
前記式（ＩＶＡ）の修飾された標的分子が、式（ＩＶＡ４）～（ＩＶＡ５）：
Figure 2022527247000043
のいずれかの分子である、態様１３に記載の方法。
態様１６．前記フェノール部分またはカテコール部分を含む生体分子が、式（ＩＡ）：
Figure 2022527247000044
によって記述され、
式中：
Ｙ１が、活性小分子、親和性タグ、フルオロフォア、及び金属キレート剤から選択される１つまたは複数の基を任意で含む、生体分子であり；
各Ｒ１が、独立して、水素、アシル、置換アシル、アルキル、及び置換アルキルから選択され；
Ｘ１が、水素及びヒドロキシルから選択され；かつ
Ｌ１が、直鎖または分岐アルキル、直鎖または分枝置換アルキル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、置換ＰＥＧ、及び１つ以上のペプチドから選択されるリンカーである、
態様１～１５のいずれか一項に記載の方法。
態様１７．前記フルオロフォアが、ローダミン色素またはキサンテン色素である、態様１６に記載の方法。
態様１８．前記修飾された標的分子が、式（ＩＶＢ）もしくは（ＩＶＣ）：
Figure 2022527247000045
またはそれらの組み合わせによって記述され、
式中：
Ｙ１が、活性小分子、親和性タグ、フルオロフォア、及び金属キレート剤から選択される１つまたは複数の基を任意で含む、生体分子であり；
各Ｒ１が、独立して、水素、アシル、置換アシル、アルキル、及び置換アルキルから選択され；
Ｙ２が、第２の生体分子であり；
Ｌ１が、直鎖または分岐アルキル、直鎖または分枝置換アルキル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、置換ＰＥＧ、及び１つ以上のペプチドから選択されるリンカーであり；ならびに
ｎが、１～３の整数である、態様１～１７のいずれか一項に記載の方法。
態様１９．前記式（ＩＶＢ）の修飾された標的分子が、式（ＩＶＢ１）～（ＩＶＺＢ３）：
Figure 2022527247000046
のいずれかの分子であり；
前記式（ＩＶＣ）の修飾された標的分子が、式（ＩＶＣ１）～（ＩＶＣ３）：
Figure 2022527247000047
のいずれかの分子である、態様１８に記載の方法。
態様２０．前記式（ＩＶＢ）の修飾された標的分子が、式（ＩＶＢ５）～（ＩＶＢ６）：
Figure 2022527247000048
のいずれかの分子であり；
前記式（ＩＶＣ）の修飾された標的分子が、式（ＩＶＣ４）～（ＩＶＣ５）：
Figure 2022527247000049
のいずれかの分子である、態様１８に記載の方法。
態様２１．ｐＨ４～９で実施される、態様１～２０のいずれか一項に記載の方法。
態様２２．中性ｐＨで実施される、態様２１に記載の方法。
態様２３．前記チオール基を含む標的分子がＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドである、態様１～２２のいずれか一項に記載の方法。
態様２４．式（ＩＩＩ）：
Figure 2022527247000050
のチオールを含む標的分子と、
式（Ｉ）：
Figure 2022527247000051
のフェノール部分またはカテコール部分を含む生体分子と
を含む、組成物であって、
式中：
Ｙ１が、活性小分子、親和性タグ、フルオロフォア、及び金属キレート剤から選択される１つまたは複数の部分を任意で含む、生体分子であり；
Ｘ１が、水素及びヒドロキシルから選択され；
Ｌが、任意選択のリンカーであり；かつ
Ｙ２が、第２の生体分子である、
前記組成物。
態様２５．Ｙ２が、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドである、態様２４に記載の組成物。
態様２６．式（Ｉ）が、式（ＩＡ）：
Figure 2022527247000052
によって記述され、
式中：
Ｙ１が、活性小分子、親和性タグ、フルオロフォア、及び金属キレート剤から選択される１つまたは複数の基を任意で含む、生体分子であり；
各Ｒ１が、独立して、水素、アシル、置換アシル、アルキル、及び置換アルキルから選択され；
Ｘ１が、水素及びヒドロキシルから選択され；かつ
Ｌ１が、直鎖または分岐アルキル、直鎖または分枝置換アルキル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、置換ＰＥＧ、及び１つ以上のペプチドから選択されるリンカーである、
態様２４または２５に記載の組成物。
態様２７．態様２４～２６のいずれか一項に記載の組成物を含む第１の容器；及び
前記フェノールまたはカテコール部分を酸化することができる酵素を含む第２の容器
を含む、キット。
態様２８．前記酵素がチロシナーゼ酵素である、請求項２７に記載のキット。
態様２９．式（ＩＶ）または（ＩＶＡ）：
Figure 2022527247000053
の化合物であって、
式中：
Ｙ１が、活性小分子、親和性タグ、フルオロフォア、及び金属キレート剤から選択される１つまたは複数の部分を任意で含む、生体分子であり；
Ｌが、任意選択のリンカーであり；
Ｙ２が、第２の生体分子であり；かつ
ｎが、１～３の整数である、
前記化合物。
態様３０．前記式（ＩＶ）の修飾された標的分子が、式（ＩＶ１）～（ＩＶ５）：
Figure 2022527247000054
のいずれかの分子である、態様２９に記載の化合物。
態様３１．前記式（ＩＶＡ）の修飾された標的分子が、式（ＩＶＡ１）～（ＩＶＡ５）：
Figure 2022527247000055
のいずれかの分子である、態様２９に記載の化合物。
態様３２．Ｌが切断可能なリンカーである、態様２９～３１のいずれか一項に記載の化合物。
態様３３．Ｙ１がポリペプチドである、態様２９～３２のいずれか一項に記載の化合物。
態様３４．Ｙ１が、蛍光タンパク質、抗体、及び酵素から選択される、態様３３に記載の化合物。
態様３５．前記化合物が、式（ＩＶＢ）または（ＩＶＣ）：
Figure 2022527247000056
によって記述され、
式中：
Ｙ１が、活性小分子、親和性タグ、フルオロフォア、及び金属キレート剤から選択される１つまたは複数の基を任意で含む、生体分子であり；
各Ｒ１が、独立して、水素、アシル、置換アシル、アルキル、及び置換アルキルから選択され；
Ｙ２は、第２の生体分子であり；
Ｌ１が、直鎖または分岐アルキル、直鎖または分枝置換アルキル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、置換ＰＥＧ、及び１つ以上のペプチドから選択されるリンカーであり；かつ
ｎが、１～３の整数である、
態様２９～３４のいずれか一項に記載の化合物。
態様３６．前記式（ＩＶＢ）の修飾された標的分子が、式（ＩＶＢ１）～（ＩＶＺＢ５）：
Figure 2022527247000057
のいずれかの分子である、態様３５に記載の化合物。
態様３７．前記式（ＩＶ）の修飾された標的分子が、式（ＩＶＣ１）～（ＩＶＣ５）：
Figure 2022527247000058
のいずれか１つの分子である、態様３５に記載の化合物。
態様３８．前記化合物が、式（ＩＶＤ）～（ＩＶＧ）：
Figure 2022527247000059
のいずれかによって記述され、
式中：
Ｒ２が、アルキル及び置換アルキルから選択され；
Ｒ３が、水素、アルキル置換アルキル、ペプチド、及びポリペプチドから選択され；及び
ｎが、１～３の整数である、
態様２９～３７のいずれか一項に記載の化合物。
態様３９．Ｙ２が、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドである、態様２９～３８のいずれか一項に記載の化合物。
態様Ｂ
上述の本主題の実施形態を含む態様は、単独で、または１つ以上の他の態様または実施形態との組み合わせにおいて有効であり得る。上述の記載に制限されるものではないが、１～７１の番号が付された本開示の特定の非限定的な態様を以下に示す。本開示を読むことにより当業者には明らかであるように、個々の番号が付された態様のそれぞれは、先行または後続の個々の番号が付された態様のうちのいずれかと共に使用し得るか、または組み合わせ得る。これは、態様のすべてのそのような組み合わせに対する支持を提供することを意図するものであり、以下に明示的に提供する態様の組み合わせに限定するものではない。
態様１．標的分子を化学選択的に修飾する方法であって、前記方法は：チオール部分を含む標的分子を反応性部分を含む生体分子と接触させる工程を含み；前記反応性部分を含む前記生体分子が、フェノール部分またはカテコール部分を含む生体分子と、前記フェノール部分またはカテコール部分を酸化することができる酵素との反応によって生成され；前記接触させる工程が、前記標的分子を前記生体分子と複合体化させるのに十分な条件下で実施され、それにより、修飾された標的分子が生成される、前記方法。
態様２．前記標的分子が、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドである、態様１に記載の方法。
態様３．前記酵素がチロシナーゼポリペプチドである、態様１または態様２に記載の方法。
態様４．前記チロシナーゼポリペプチドが、アガリクス・ビスポラス（Ａｇｒｉｃｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓ）チロシナーゼ（ａｂＴＹＲ）ポリペプチドである、態様１～３のいずれか一項に記載の方法。
態様５．前記チロシナーゼポリペプチドが、図８または図９に示されているａｂＴＹＲのアミノ酸配列に対して少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、態様１～３のいずれか一項に記載の方法。
態様６．前記フェノール部分またはカテコール部分を含む生体分子が、前記フェノール部分またはカテコール部分の５０オングストローム（Å）以内で中性または正に荷電している、態様４または態様５に記載の方法。
態様７．前記チロシナーゼポリペプチドが、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）チロシナーゼ（ｂｍＴＹＲ）ポリペプチドである、態様１～３のいずれか一項に記載の方法。
態様８．前記チロシナーゼポリペプチドが、図１０Ａ～１０Ｚ及び１０ＡＡ～１０ＶＶのいずれか１つに示されているアミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、態様１～３のいずれか一項に記載の方法。
態様９．前記フェノール部分またはカテコール部分を含む生体分子が、前記フェノール部分またはカテコール部分の５０Å以内で負に荷電している、態様７または態様８に記載の方法。
態様１０．前記標的分子がポリヌクレオチドである、態様１～９のいずれか一項に記載の方法。
態様１１．前記標的分子がＤＮＡ分子である、態様１０に記載の方法。
態様１２．前記標的分子がＲＮＡ分子である、態様１０に記載の方法。
態様１３．前記生体分子がポリペプチドである、態様１０～１２のいずれか一項に記載の方法。
態様１４．前記酵素が、固体支持体に結合されている、態様１～１３のいずれか一項に記載の方法。
態様１５．前記フェノール部分が、チロシン残基に存在する、態様１～１４のいずれか一項に記載の方法。
態様１６．前記チオール部分が、システイン残基に存在する、態様１～１５のいずれか一項に記載の方法。
態様１７．前記システイン残基が、天然のシステイン残基である、態様１６に記載の方法。
態様１８．前記生体分子が、フルオロフォア、活性小分子、親和性タグ、及び金属キレート剤から選択される１つ以上の部分を含む、態様１～１７のいずれか一項に記載の方法。
態様１９．前記反応性部分が、オルトキノンもしくはセミキノンラジカル、またはそれらの組み合わせである、態様１～１８のいずれか一項に記載の方法。
態様２０．前記生体分子がポリペプチドである、態様１～１９のいずれか一項に記載の方法。
態様２１．前記生体分子が、蛍光タンパク質、抗体、酵素、受容体のリガンド、及び受容体から選択されるポリペプチドである、態様２０に記載の方法。
態様２２．前記フェノール部分またはカテコール部分を含む生体分子が、式（Ｉ）の分子であり、前記反応性部分を含む生体分子が、式（ＩＩ）もしくは（ＩＩＡ）またはそれらの組み合わせの分子であり：
Figure 2022527247000060
式中：
Ｙ１が、活性小分子、親和性タグ、フルオロフォア、及び金属キレート剤から選択される１つまたは複数の部分を任意で含む、生体分子であり；
Ｘ１が、水素及びヒドロキシルから選択され；かつ
Ｌが、任意選択のリンカーである、
態様１～２１のいずれか一項に記載の方法。
態様２３．前記チオール部分を含む標的分子が、式（ＩＩＩ）の分子であり、前記修飾された標的分子が、式（ＩＶ）もしくは（ＩＶＡ）またはそれらの組み合わせの分子であり：
Figure 2022527247000061
式中：
Ｙ１が、活性小分子、親和性タグ、フルオロフォア、及び金属キレート剤から選択される１つまたは複数の部分を任意で含む、生体分子であり；
Ｙ２が、第２の生体分子であり；
Ｌが、任意選択のリンカーであり；かつ
ｎが、１～３の整数である、
態様１～２２のいずれか一項に記載の方法。
態様２４．前記式（ＩＶ）の修飾された標的分子が、式（ＩＶ１）～（ＩＶ３）：
Figure 2022527247000062
のいずれかの分子であり；かつ
前記式（ＩＶＡ）の修飾された標的分子が、式（ＩＶＡ１）～（ＩＶＡ３）：
Figure 2022527247000063
のいずれかの分子である、態様２３に記載の方法。
態様２５．前記式（ＩＶ）の修飾された標的分子が、式（ＩＶ５）～（ＩＶ６）：
Figure 2022527247000064
のいずれかの分子であり；かつ
前記式（ＩＶＡ）の修飾された標的分子が、式（ＩＶＡ４）～（ＩＶＡ５）：
Figure 2022527247000065
のいずれかの分子である、態様２３に記載の方法。
態様２６．前記フェノール部分またはカテコール部分を含む生体分子が、式（ＩＡ）：
Figure 2022527247000066
によって記述され、
式中：
Ｙ１が、活性小分子、親和性タグ、フルオロフォア、及び金属キレート剤から選択される１つまたは複数の基を任意で含む、生体分子であり；
各Ｒ１が、独立して、水素、アシル、置換アシル、アルキル、及び置換アルキルから選択され；
Ｘ１が、水素及びヒドロキシルから選択され；かつ
Ｌ１が、直鎖または分岐アルキル、直鎖または分枝置換アルキル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、置換ＰＥＧ、及び１つ以上のペプチドから選択されるリンカーである、
態様１～２５のいずれか一項に記載の方法。
態様２７．前記フルオロフォアが、ローダミン色素またはキサンテン色素である、態様２６に記載の方法。
態様２８．前記修飾された標的分子が、式（ＩＶＢ）もしくは（ＩＶＣ）：
Figure 2022527247000067
またはそれらの組み合わせによって記述され、
式中：
Ｙ１が、活性小分子、親和性タグ、フルオロフォア、及び金属キレート剤から選択される１つまたは複数の基を任意で含む、生体分子であり；
各Ｒ１が、独立して、水素、アシル、置換アシル、アルキル、及び置換アルキルから選択され；
Ｙ２が、第２の生体分子であり；
Ｌ１が、直鎖または分岐アルキル、直鎖または分枝置換アルキル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、置換ＰＥＧ、及び１つ以上のペプチドから選択されるリンカーであり；かつ
ｎが、１～３の整数である、
態様１～２７のいずれか一項に記載の方法。
態様２９．前記式（ＩＶＢ）の修飾された標的分子が、式（ＩＶＢ１）～（ＩＶＺＢ３）：
Figure 2022527247000068
のいずれかの分子であり；かつ
前記式（ＩＶＣ）の修飾された標的分子が、式（ＩＶＣ１）～（ＩＶＣ３）：
Figure 2022527247000069
のいずれかの分子である、態様２８に記載の方法。
態様３０．前記式（ＩＶＢ）の修飾された標的分子が、式（ＩＶＢ５）～（ＩＶＢ６）：
Figure 2022527247000070
のいずれかの分子であり；かつ
前記式（ＩＶＣ）の修飾された標的分子が、式（ＩＶＣ４）～（ＩＶＣ５）：
Figure 2022527247000071
のいずれかの分子である、態様２８に記載の方法。
態様３１．ｐＨ４～９で実施される、態様１～３０のいずれか一項に記載の方法。
態様３２．中性ｐＨで実施される、態様３１に記載の方法。
態様３３．前記チオール基を含む標的分子がＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドである、態様１～３２のいずれか一項に記載の方法。
態様３４．式（ＩＩＩ）：
Figure 2022527247000072
のチオールを含む標的分子と、
式（Ｉ）：
Figure 2022527247000073
のフェノール部分またはカテコール部分を含む生体分子と
を含む組成物であって、
式中：
Ｙ１が、活性小分子、親和性タグ、フルオロフォア、及び金属キレート剤から選択される１つまたは複数の部分を任意で含む、生体分子であり；
Ｘ１が、水素及びヒドロキシルから選択され；
Ｌが、任意選択のリンカーであり；かつ
Ｙ２が、第２の生体分子である、
前記組成物。
態様３５．前記フェノール部分またはカテコール部分を含む生体分子が、前記フェノール部分またはカテコール部分の５０Å以内で中性または正に荷電している、態様３４に記載の組成物。
態様３６．前記フェノール部分またはカテコール部分を含む生体分子が、前記フェノール部分またはカテコール部分の５０Å以内で負に荷電している、態様３４に記載の組成物。
態様３７．前記Ｙ１がポリペプチドであり、かつＹ２がポリペプチドである、態様３４～３６のいずれか一項に記載の組成物。
態様３８．Ｙ１がポリヌクレオチドであり、かつＹ２がポリペプチドである、態様３４～３６のいずれか一項に記載の組成物。
態様３９．Ｙ２が、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドである、態様３４～３８のいずれか一項に記載の組成物。
態様４０．式（Ｉ）が式（ＩＡ）：
Figure 2022527247000074
によって記述され、
式中：
Ｙ１が、活性小分子、親和性タグ、フルオロフォア、及び金属キレート剤から選択される１つまたは複数の基を任意で含む、生体分子であり；
各Ｒ１が、独立して、水素、アシル、置換アシル、アルキル、及び置換アルキルから選択され；
Ｘ１が、水素及びヒドロキシルから選択され；かつ
Ｌ１が、直鎖または分岐アルキル、直鎖または分枝置換アルキル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、置換ＰＥＧ、及び１つ以上のペプチドから選択されるリンカーである、
態様３４～３９のいずれか一項に記載の組成物。
態様４１．態様３４～４０のいずれか一項に記載の組成物を含む第１の容器；及び
前記フェノールまたはカテコール部分を酸化することができる酵素を含む第２の容器
を含む、キット。
態様４２．前記酵素がチロシナーゼポリペプチドである、態様４１に記載のキット。
態様４３．前記チロシナーゼ酵素が、アガリクス・ビスポラス（Ａｇｒｉｃｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓ）チロシナーゼ酵素（ａｂＴＹＲ）である、態様４２に記載のキット。
態様４４．前記チロシナーゼポリペプチドが、図８または図９に示されているａｂＴＹＲのアミノ酸配列に対して少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、態様４２に記載のキット。
態様４５．前記チロシナーゼ酵素が、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）チロシナーゼ酵素（ｂｍＴＹＲ）である、態様４２に記載のキット。
態様４６．前記チロシナーゼポリペプチドが、図１０Ａ～１０Ｚ及び１０ＡＡ～１０ＶＶのいずれか１つに示されているアミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、態様４２に記載のキット。
態様４７．式（ＩＶ）または（ＩＶＡ）：
Figure 2022527247000075
の化合物であって、
式中：
Ｙ１が、活性小分子、親和性タグ、フルオロフォア、及び金属キレート剤から選択される１つまたは複数の部分を任意で含む、生体分子であり；
Ｌが、任意選択のリンカーであり；
Ｙ２が、第２の生体分子であり；かつ
ｎが、１～３の整数である、
前記化合物。
態様４８．前記式（ＩＶ）の修飾された標的分子が、式（ＩＶ１）～（ＩＶ５）：
Figure 2022527247000076
のいずれかの分子である、態様４７に記載の化合物。
態様４９．前記式（ＩＶＡ）の修飾された標的分子が、式（ＩＶＡ１）～（ＩＶＡ５）：
Figure 2022527247000077
のいずれかの分子である、態様４７に記載の化合物。
態様５０．Ｌが切断可能なリンカーである、態様４７～４９のいずれか一項に記載の化合物。
態様５１．Ｙ１がポリペプチドである、態様４７～５０のいずれか一項に記載の化合物。
態様５２．Ｙ１が、蛍光タンパク質、抗体、及び酵素から選択される、態様５１に記載の化合物。
態様５３．式（ＩＶＢ）または（ＩＶＣ）：
Figure 2022527247000078
によって記述され、
式中：
Ｙ１が、活性小分子、親和性タグ、フルオロフォア、及び金属キレート剤から選択される１つまたは複数の基を任意で含む、生体分子であり；
各Ｒ１が、独立して、水素、アシル、置換アシル、アルキル、及び置換アルキルから選択され；
Ｙ２が、第２の生体分子であり；
Ｌ１が、直鎖または分岐アルキル、直鎖または分枝置換アルキル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、置換ＰＥＧ、及び１つ以上のペプチドから選択されるリンカーであり；かつ
ｎが、１～３の整数である、
態様４７～５２のいずれか一項に記載の化合物。
態様５４．前記式（ＩＶＢ）の修飾された標的分子が、式（ＩＶＢ１）～（ＩＶＺＢ５）：
Figure 2022527247000079
のいずれかの分子である、態様５３に記載の化合物。
態様５５．前記式（ＩＶ）の修飾された標的分子が、式（ＩＶＣ１）～（ＩＶＣ５）：
Figure 2022527247000080
のいずれか１つの分子である、態様５３に記載の化合物。
態様５６．前記化合物が、式（ＩＶＤ）～（ＩＶＧ）：
Figure 2022527247000081
のいずれかによって記述され、
式中：
Ｒ２が、アルキル及び置換アルキルから選択され；
Ｒ３が、水素、アルキル置換アルキル、ペプチド、及びポリペプチドから選択され；及び
ｎが、１～３の整数である、
態様４７～５５のいずれか一項に記載の化合物。
態様５７．Ｙ２が、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドである、態様４７～５６のいずれか一項に記載の化合物。
態様５８．第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドをカップリングポリペプチドへと化学選択的にカップリングさせる方法であって、前記方法が：
ａ）前記第１のポリペプチドを前記カップリングポリペプチドと接触させて、第１のポリペプチド－カップリングポリペプチド複合体を生成させる工程であって、
前記第１のポリペプチドが、チオール部分を含み、
前記カップリングポリペプチドが、前記第１のポリペプチドに存在するチオール部分と共有結合を形成するＮ末端反応性部分を含み、
前記Ｎ末端反応性部分を含む前記カップリングポリペプチドが、前記Ｎ末端反応性部分を生成させるために、Ｎ末端フェノール部分またはカテコール部分及びＣ末端フェノール部分またはカテコール部分を含むポリペプチドと、前記Ｎ末端フェノール部分またはカテコール部分を酸化することはできるが前記Ｃ末端フェノール部分またはカテコール部分を酸化することはできない第１の酵素とを反応させることによって生成され；
前記カップリングポリペプチドが、前記Ｎ末端フェノール部分またはカテコール部分の１０アミノ酸以内の２つ以上の正に荷電したまたは中性のアミノ酸と、前記Ｃ末端フェノール部分またはカテコール部分の１０アミノ酸以内の２つ以上の負に荷電したアミノ酸とを含む、
前記工程；ならびに
ｂ）前記第２のポリペプチドを、前記第１のポリペプチド－カップリングポリペプチド複合体と接触させる工程であって、
前記２のポリペプチドが、チオール部分を含み、
前記第１のポリペプチド－カップリングポリペプチド複合体が、前記第２のポリペプチドに存在するチオール部分と共有結合を形成するＣ末端反応性部分を含み、
前記Ｃ末端反応性部分を含む前記第１のポリペプチド－カップリングポリペプチド複合体が、前記第１のポリペプチド－カップリングポリペプチド複合体と、前記Ｃ末端フェノール部分またはカテコール部分を酸化してＣ末端反応性部分を生成させることができる第２の酵素との反応によって生成され；
前記接触が、第１のポリペプチド－カップリングポリペプチド－第２のポリペプチド複合体を生成する、
前記工程
を含む、前記方法。
態様５９．
ａ）前記第１の酵素が、図８または図９に示されているａｂＴＹＲのアミノ酸配列に対して少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むチロシナーゼポリペプチドであり；かつ
ｂ）前記第２の酵素が、図１０Ａ～１０Ｚ及び図１０ＡＡ～１０ＶＶのいずれか１つに示されているアミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むチロシナーゼポリペプチドである、
態様５８に記載の方法。
態様６０．第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドをカップリングポリペプチドへと化学選択的にカップリングさせる方法であって、前記方法が：
ａ）前記第１のポリペプチドを前記カップリングポリペプチドと接触させて、第１のポリペプチド－カップリングポリペプチド複合体を生成させる工程であって、
前記第１のポリペプチドが、チオール部分を含み、
前記カップリングポリペプチドが、前記第１のポリペプチドに存在するチオール部分と共有結合を形成するＮ末端反応性部分を含み、
前記Ｎ末端反応性部分を含む前記カップリングポリペプチドが、前記Ｎ末端反応性部分を生成させるために、Ｎ末端フェノール部分またはカテコール部分及びＣ末端フェノール部分またはカテコール部分を含むポリペプチドと、前記Ｎ末端フェノール部分またはカテコール部分を酸化することはできるが前記Ｃ末端フェノール部分またはカテコール部分を酸化することはできない第１の酵素とを反応させることによって生成され；
前記カップリングポリペプチドが、前記Ｎ末端フェノール部分またはカテコール部分の１０アミノ酸以内の２つ以上の負に荷電したアミノ酸と、前記Ｃ末端フェノール部分またはカテコール部分の１０アミノ酸以内に２つ以上の正に荷電したまたは中性のアミノ酸とを含む、
前記工程；ならびに
ｂ）前記第２のポリペプチドを、前記第１のポリペプチド－カップリングポリペプチド複合体と接触させる工程であって、
前記２のポリペプチドが、チオール部分を含み、
前記第１のポリペプチド－カップリングポリペプチド複合体が、前記第２のポリペプチドに存在するチオール部分と共有結合を形成するＣ末端反応性部分を含み、
前記Ｃ末端反応性部分を含む前記第１のポリペプチド－カップリングポリペプチド複合体が、前記第１のポリペプチド－カップリングポリペプチド複合体と、前記Ｃ末端フェノール部分またはカテコール部分を酸化してＣ末端反応性部分を生成させることができる第２の酵素との反応によって生成され；
前記接触が、第１のポリペプチド－カップリングポリペプチド－第２のポリペプチド複合体を生成する、
前記工程
を含む、前記方法。
態様６１．
ａ）前記第１の酵素が、図１０Ａ～１０Ｚ及び図１０ＡＡ～１０ＶＶのいずれか１つに示されているアミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むチロシナーゼポリペプチドであり；かつ
ｂ）前記第２の酵素が、図８または図９に示されているａｂＴＹＲのアミノ酸配列に対して少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むチロシナーゼポリペプチドである、
態様６０に記載の方法。
態様６２．第１のポリペプチドを第２のポリペプチドへと共有結合させる方法であって、前記方法が：
ａ）前記第１のポリペプチドを、固定化された反応性部分と接触させる工程であって、
前記固定化された反応性部分が、固定化されたフェノール部分またはカテコール部分と第１の酵素との反応によって生成され、前記第１の酵素が、前記固定化されたフェノール部分またはカテコール部分を酸化することができ、それによって前記固定化された反応性部分が生成され、
前記第１のポリペプチドが：ｉ）チオール部分；及びｉｉ）フェノール部分またはカテコール部分を含み、前記第１のポリペプチドが、前記フェノール部分またはカテコール部分の１０アミノ酸以内に２つ以上の負に荷電したアミノ酸を含み、
前記固定化された反応性部分が、前記第１のポリペプチドに存在する前記チオール部分と共有結合を形成し、それにより、固定化された第１のポリペプチドが生成される、
前記工程；
ｂ）前記固定化された第１のポリペプチドを第２の酵素と接触させる工程であって、前記第２の酵素が、前記第１のポリペプチドに存在する前記フェノール部分またはカテコール部分を酸化して、反応性部分を含む固定化された第１のポリペプチドを生成させることができる、前記工程；ならびに
ｃ）前記反応性部分を含む固定化された第１のポリペプチドを、第２のポリペプチドと接触させる工程であって、
前記第２のポリペプチドが：ｉ）チオール部分；及びｉｉ）フェノール部分またはカテコール部分を含み、前記第２のポリペプチドが、前記フェノール部分またはカテコール部分の１０アミノ酸以内に２つ以上の中性または正の荷電を有し、
前記固定化された第１のポリペプチドに存在する前記反応性部分が、前記第２のポリペプチドに存在する前記チオール部分と共有結合を形成し、それにより、前記第２のポリペプチドに共有結合した前記第１のポリペプチドを含む固定化された複合体が生成される、
前記工程
を含む、前記方法。
態様６３．前記第１の酵素が、図８、図９、図１０Ａ～１０Ｚ、及び図１０ＡＡ～１０ＶＶのいずれか１つに示されているアミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むチロシナーゼポリペプチドである、態様６２に記載の方法。
態様６４．前記第１のポリペプチドに存在する前記チオール部分が、Ｃｙｓに存在し、前記第１のポリペプチドに存在する前記フェノール部分が、Ｔｙｒ残基に存在する、態様６２または態様６３に記載の方法。
態様６５．前記Ｔｙｒ残基が、ＥＥＥＹ（配列番号９５３）、ＥＥＥＥＹ（配列番号９５５）、ＤＤＤＤＹ（配列番号９６５）、またはＤＤＤＤＹ（配列番号９６５）を含むアミノ酸のストレッチに存在する、態様６４に記載の方法。
態様６６．前記第２の酵素が、図１０Ａ～１０Ｚ及び図１０ＡＡ～１０ＶＶのいずれか１つに示されているアミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むチロシナーゼポリペプチドである、態様６２～６５のいずれか一項に記載の方法。
態様６７．前記方法が、
ｃ）前記固定化された複合体を、第３の酵素と接触させる工程であって、前記第３の酵素が、前記第２のポリペプチドに存在する前記フェノール部分またはカテコール部分を酸化して、反応性部分を含む固定化された複合体を生成させることができる、工程；及び
ｃ）前記反応性部分を含む固定化された複合体を、第３のポリペプチドと接触させる工程であって、
前記第３のポリペプチドが：ｉ）チオール部分；及びｉｉ）フェノール部分またはカテコール部分を含み、前記第３のポリペプチドが、前記フェノール部分またはカテコール部分の１０アミノ酸以内に２つ以上の負の荷電を有し、
前記固定化された複合体に存在する前記反応性部分が、前記第２のポリペプチドに存在する前記チオール部分と共有結合を形成し、それにより、前記第２のポリペプチドに共有結合した前記第３のポリペプチドを含む固定化された複合体が生成される、
前記工程
をさらに含む、態様６２～６６のいずれか一項に記載の方法。
態様６８．前記第３の酵素が、図８または図９に示されているアミノ酸配列に対して少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むチロシナーゼポリペプチドである、態様６７に記載の方法。
態様６９．工程（ｂ）と工程（ｃ）との間に、前記第２の酵素を不活性化または除去する、態様６７または６８に記載の方法。
態様７０．前記第２のポリペプチドに存在する前記チオール部分が、Ｃｙｓに存在し、前記第２のポリペプチドに存在する前記フェノール部分が、Ｔｙｒ残基に存在する、態様６７～６９のいずれか一項に記載の方法。
態様７１．前記Ｔｙｒ残基が、ＲＲＲＹ（配列番号９４９）、ＲＲＲＲＹ（配列番号９５１）、ＫＫＫＹ（配列番号９６６）、またはＫＫＫＫＹ（配列番号９６７）を含むアミノ酸のストレッチに存在する、態様７０に記載の方法。
以下の実施例は、当業者に本発明の作成方法及び使用方法の完全な開示及び記載を提供するために提示するものであり、本発明者らが考えるそれらの発明の範囲を限定することを意図するものでもなく、また、以下の実験が実施したすべてまたは唯一の実験であることを表すことを意図するものでもない。使用される数値（例えば、量、温度など）に関して正確さを確保する努力がなされているが、いくつかの実験誤差及び偏差が考慮されるべきである。特に明記しない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧力は大気圧または大気圧に近い。標準的な略語、例えば、ｂｐ、塩基対（複数可）；ｋｂ、キロベース（複数可）；ｐｌ、ピコリットル（複数可）；ｓまたはｓｅｃ、秒（複数可）；ｍｉｎ、分（複数可）；ｈまたはｈｒ、時間（複数可）；ａａ、アミノ酸（複数可）；ｋｂ、キロベース（複数可）；ｂｐ、塩基対（複数可）；ｎｔ、ヌクレオチド（複数可）；ｉ．ｍ．、筋肉内（に）；ｉ．ｐ．、腹腔内（に）；ｓ．ｃ．、皮下（に）などが使用され得る。
例示的なフェノール及びカテコール含有中間体は、任意の簡便な方法を使用して合成され得る。本開示の例示的なフェノール及びカテコール含有中間体を調製する際の使用に適合させることができる方法として、Ｍａｚａらにより、”Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎ－Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｐｒｏｌｉｎｅ Ｒｅｓｉｄｕｅｓ Ｕｓｉｎｇ Ｐｈｅｎｏｌ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ”，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２０１９），１４１，３８８５－３８９２に記載された方法が挙げられ、その開示は、その全体が参照により本明細書に援用される。開示する化合物の合成に有用な一般的に知られている化学合成スキーム及び条件を提供する多くの一般的な参考文献もまた、利用可能である（例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｍａｒｃｈ，Ｍａｒｃｈ’ｓ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，２００１；またはＶｏｇｅｌ，Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｌｏｎｇｍａｎ，１９７８を参照のこと）。反応を、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、ＬＣ／ＭＳ、ならびにＬＣ／ＭＳ及び１Ｈ ＮＭＲで特性評価した反応生成物により、モニタリングしてもよい。
実施例１
特に明記しない限り、すべての化学物質はＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ペプチドは、Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔから購入した。ペプチド配列は、ＳＩに見出され得る。
チロシナーゼカップリング反応
ＭＳ２複合体化を、８７位のアスパラギン残基をシステインに置き換える（Ｎ８７Ｃ）キャプシドのシステイン変異体で実施した。カップリング条件は、２０ｍＭ ｐＨ６．５のリン酸、１０ｕＭ Ｎ８７Ｃ ＭＳ２、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入したチロシナーゼ（ＣＡＳ番号９００２－１０－２）に対し、５０ｍＭリン酸ｐＨ６．５を１：１０の比率で加えて希釈し、最終濃度０．１６μＭとした。特に明記しない限り、カップリング試薬を、最終濃度５０μＭまたは５×ＭＳ２モノマー濃度で添加した。超純水（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ、抵抗１８ｕΩ）を、最終容量２０μＬになるように添加した。反応を室温で３０分間行った後、２ｕＬの２０ｍＭトロポロンと２０ｍＭ ＴＣＥＰでクエンチし、それぞれの最終濃度を２ｍＭとした。
安定性の試験のために、ほぐれたチロシナーゼを、樹脂に結合させた酵素に置き換えた。反応は、過剰なチロシナーゼを除去するための０．２μｍフィルターによる濾過ステップの追加、ならびに１ｍＭトロポロン及びＴＣＥＰによるクエンチを用いて上記のように実施した。
Ｃａｓ９カップリングは、以下の条件下で生じた：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、３００ｍＭ ＫＣｌ、５０ｍＭトレハロースｐＨ７．０（緩衝液Ａ）、４℃１時間。１０μＭ Ｃａｓ９。上記のクエンチ溶液を使用してすべての試料をクエンチした後、１００，０００ｋＤａ ＭＷＣＯスピンコンセントレーターを使用して溶媒を緩衝液Ａに３回交換した。ペプチドカップリングでは、ペプチドを５倍の比率で添加し、５０ｕＭのペプチド濃度を得た。タンパク質同士のカップリングでは、Ｃａｓ９：標的タンパク質の比率１：１では、濾過後に単一修飾Ｃａｓ９へのほぼ定量的な変換が得られ、一方、Ｃａｓ９：標的の比率１：５では、二重修飾生成物への完全な変換が得られた。
図１は、タンパク質スケールでの反応のスキームを示す。
図２のパネルＡは、タンパク質上のマレイミドを介してチオールをキャッピングすると、チロシナーゼ触媒反応を介した付加が遮断され、逆にチロシナーゼを最初に作用させる場合もまた、マレイミドの反応が遮断されることを示している。
図２のパネルＢは、一連の安定性試験を示しており、複合体の連結が様々な緩衝条件で経時的に安定していることを示している。
図３は、本主題の方法で使用した基質の多様なアレイを示す。
図４は、本主題の方法を使用した様々なペプチドの付加をサポートするマススペクトルデータを示す。
図５のパネルＡは、本主題の方法を使用してＣａｓ９を修飾することができることを示している。
図５のパネルＢは、アポタンパク質、すなわちそのガイドＲＮＡのないＣａｓ９に対して反応を実施する場合であっても、修飾されたＣａｓ９が活性を保持することを示している。
図５のパネルＣは、Ｃａｓ９を、別のタンパク質、この場合はＮ末端にチロシンを有するＧＦＰで修飾することができることを示している。
図５のパネルＤは、ＧＦＰ－Ｃａｓ９複合体が活性を保持していることを示している。
図６は、ペプチド（２ＮＬＳ配列Ａｃ－ＹＧＰＫＫＫＲＫＶＧＧＳＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号９４３））で修飾されたＣａｓ９が、神経前駆細胞の編集が２０倍向上することを示している。
図７は、フェノール含有タンパク質の小分子チオールによる修飾を示すＥＳＩ－ＴＯＦデータを示す。
実施例２
細菌バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）由来の半直交チロシナーゼ（ｂｍＴＹＲ）を使用しながら、ａｂＴＹＲの電荷制限を利用する系（Ｇｏｌｄｆｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ－Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ １８３４：６２９；Ｋａｎｔｅｅｖ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｉｎｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．１８：８９５；Ｋａｎｔｅｅｖ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ ２４：１３６０；Ｓｅｎｄｏｖｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ． Ｓｅｃｔ． Ｆ Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． Ｃｒｙｓｔ． Ｃｏｍｍｕｎ．６６：１１０１；Ｓｈｕｓｔｅｒ Ｂｅｎ－Ｙｏｓｅｆ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ． Ｔｅｃｈｎｏｌ．４７：３７２；Ｓｈｕｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：１８８）が開発された。
基質電荷がａｂＴＹＲに及ぼす影響を調べるために、５ｍｅｒペプチドのライブラリー１５種を取得し、ペプチドライブラリーとＹ１８２Ｃ ＧＦＰ及びｐＡＦ ＭＳ２の両方とのカップリング反応の収率を比較してａｂＴＹＲの電荷スクリーニングを行った。Ｙ１８２Ｃ ＧＦＰの場合は単一のチオール、ｐＡＦ ＭＳ２の場合は単一のアニリン、及び正と負の両方に荷電したタンパク質基質を呈することから、これらの基質を選択した。データに基づくと、ａｂＴＹＲはチロシン残基周辺の電荷と立体障害の両方に感受性であり、負電荷は立体バルクよりもはるかに有害な要因であるようである。どちらの場合も、ペプチドに対するチロシナーゼ活性を完全に阻害するには、－４の電荷で十分であった（図１１）。
ａｂＴＹＲの電荷選好性の背後にある潜在的な理由を調べるために、タンパク質の結晶構造を調べたところ、グルタミン酸とアスパラギン酸の残基が豊富にあるため、ａｂＴＹＲの活性部位の周囲に全体的に大きな負電荷があることがわかった。これらの「ゲートキーパー」残基が、ａｂＴＹＲの電荷選好性を引き起こしているものであると仮定された（図１２Ａ）。
細菌で真核生物の酵素を発現させることは簡単なことではなく；さらに、ａｂＴＹＲはヘテロ四量体であり、それを発現させることはさらに複雑になる。公開されている結晶構造を有する単量体の細菌チロシナーゼが同定された。バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）由来チロシナーゼ（ｂｍＴＹＲ）（Ｇｏｌｄｆｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１３）上記；Ｋａｎｔｅｅｖ ｅｔ ａｌ．（２０１３）上記；Ｋａｎｔｅｅｖ ｅｔ ａｌ．（２０１５）上記；Ｓｅｎｄｏｖｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２０１０）上記；Ｓｈｕｓｔｅｒ Ｂｅｎ－Ｙｏｓｅｆ ｅｔ ａｌ．（２０１０）上記；Ｓｈｕｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００９）上記）を試験した。ｂｍＴＹＲは正に荷電した活性部位を有し、これは結晶構造によって確認された（図１２Ｂ）。ｂｍＴＹＲを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現させ、ペプチド電荷スクリーニングの最初の試験を実施した。データから、ｂｍＴＹＲが負に荷電した基質を受け入れることができることが示された（図１３、１４）。さらに、ｂｍＴＹＲは、ａｂＴＹＲと同様にトロポロンによって阻害される。触媒活性を高めるためにｂｍＴＹＲ変異体を発現させることができる。文献に基づくと、変異：Ｆ１９７Ａ、Ｒ２０９Ｈ、Ｖ２１８Ｇ、及びＶ２１８Ｆ（Ｋａｎｔｅｅｖ ｅｔ ａｌ．（２０１５）上記）；Ｓｅｎｄｏｖｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２０１０）上記；Ｓｈｕｓｔｅｒ Ｂｅｎ Ｙｏｓｅｆ ｅｔ ａｌ．（２０１０）上記；Ｓｈｕｓｔｅｒ Ｂｅｎ－Ｙｏｓｅｆ（２０１０）上記）は、銅分子の保持の向上、フェノール標的の選択性の向上、ならびに立体バルクに対する感度の増加及び減少など、様々な有利な特性をもたらす。さらに、変異Ｄ５５Ｋ及びＥ１４１Ｋを有するｂｍＴＹＲを使用することができ、これにより、負に荷電した基質にのみ作用するチロシナーゼが生成される。これらの残基、Ｄ５５及びＥ１４１は、活性部位に隣接して位置し、赤で強調表示されている（図１２Ｂ）。
実施例３
結果
フェノール官能化カーゴのａｂＴＹＲを介した酸化的カップリングに関する初期研究の過程で、α－エンドルフィンペプチド（図１６ａ）のＮ末端チロシン残基が、ａｂＴＹＲ活性部位に到達するのに十分な立体的アクセスが可能であるかどうかを調べた。ｐ－アミノフェニルアラニン（ｐＡＦ）ＭＳ２ウイルスキャプシドカップリングパートナーとの、この反応を試験した。機能化されたウイルスキャプシドへのクリーンでほぼ定量的な変換が観察された（図１６ｂ）。メラニン生合成中の遊離のＬ－チロシンアミノ酸の酸化の場合と同様に、遊離のＮ末端が近位のｏ－キノンを容易に攻撃するため、α－エンドルフィンのＮ末端をアセチル化することが反応の成功に不可欠であった（Ｒａｍｓｄｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２２：２３８８）。
チャレンジするタンパク質基質での反応を試験するために、トラスツズマブ抗体の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）に付加されるＧＧＹタグを選択した。トラスツズマブは、ＨＥＲ２＋乳癌の治療のためのＦＤＡ承認のモノクローナル抗体であり（Ｐｌｏｓｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｄｒｕｇｓ ６６：４４９）、バイオコンジュゲーション反応を試験するためのモデル構築物として広く使用されている（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｓｃｉ．ｒｅｐ．６：１；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．８：１２０；Ｂａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ． Ｃｈｅｍ．２４：５２０；Ｂｒｕｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ． Ｃｈｅｍ．２８：１１８９）。トラスツズマブは、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）形式でも一般的に使用され、これは、全長抗体と比較して組織及び腫瘍への浸透が向上しており（Ｙｏｋｏｔａ ｅｔ ａｌ．（１９９２）ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５２：３４０２；Ｂａｔｒａ ｅｔ ａｌ．（２００２）１３：６０３）、同様に、二重特異性抗体の構築に使用される可能性があることから（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１７）ＭＡｂｓ ９：１８２）、注目されている。確立された 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ペリプラズム発現プロトコルを選択して、Ｃ末端に－ＧＧＹタグが付いたトラスツズマブｓｃＦｖを生成した（Ｒｏｕｅｔ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．７：３６４）。この基質によって提示される１つの潜在的な課題は、その１５個のチロシン残基のうち８個が抗原結合部位に位置し、フェノール側鎖がバルク溶液に向けられていることである。内部チロシン残基のオフターゲット酸化の可能性にもかかわらず、ｓｃＦｖのＣ末端－ＧＧＹタグ付きバージョンがモデルアニリン求核試薬（図１６）にほぼ定量的にカップリングしているのに対し、タグなしバージョンは反応条件下では実質的に修飾されない（図２３）。
この基質が非常にクリーンに変換されることから、反応のいくつかのパラメーターを試験するためのモデルとしてこの基質を使用することとなった。これらの調査を実施している間、ａｂＴＹＲ濃度をＵ／ｍＬの単位で測定し、異なるバッチ、等しい質量でのａｂＴＹＲが、酵素活性において多少異なっていることがわかった（例えば、１ｍｇ／ｍＬチロシナーゼストック溶液は、通常、一般的な１２Ｕ／ｍＬの反応物中の酵素の１５０～２００ｎＭに対応する９００～１２００Ｕ／ｍＬの活性を示す）。アニリンの濃度を２５μＭ～７５０μＭに変化させると、１５０μＭの濃度で最大の変換が達成され（図１６ｂ）、少なくとも８Ｕ／ｍＬ ａｂＴＹＲであることが示された。しかしながら、より低いａｂＴＹＲ濃度では、これらの反応物中に残留する非酸化の出発物質によって証明されるように、より高い濃度のアニリンがチロシナーゼを阻害するようであった（図２４）。求核性カップリングパートナーによるａｂＴＹＲの阻害を低減するために、ｏ－トルイジン及び２，６－ジメチルアニリンで濃縮スクリーニングを繰り返し（図２６、図１７）、チロシナーゼ活性部位が容易に閉塞されないと仮定された。しかしながら、これらの求核試薬は、試験したすべての濃度でアニリンよりも低い変換率を示した。
ＴＯＦ－ＬＣＭＳでの少なくとも８Ｕ／ｍＬのチロシナーゼとの反応において、残余の非結合タンパク質が完全に酸化されたという事実は、カップリングパートナーが競合するプロセスによってクエンチされる前に、ｏ－キノン中間体を妨害する時間が限られていることを示唆している。チロシナーゼの５、１０、２０、４０、または６０分後に一連のｓｃＦｖ－ＧＧＹ ＯＣ反応物にアニリンを添加した後期求核付加実験では、すべての場合で開始タンパク質が完全に酸化される一方で、形成される生成物の量は、反応の開始後どれだけ早くカップリングパートナーが添加されるかに依存することが示された（図２５）。
求核試薬がｏ－キノン中間体と反応する速度の重要性を考慮して、４－アミノフェニル基とそのカーゴの間の最適なカップリングパートナーが何であり得るかを調べた。４－アミノフェニル－Ｎ－メチルアミド、ｐ－アニシジン、及びｐ－トルイジンをモデル化合物として使用して、４－アミノフェノールを他の基質に結合させる最良の手段を調べた。４－アミノフェニル－Ｎ－メチルアミドは最もクリーンな反応を示したが、ｐ－アニシジンとｐ－トルイジンは不十分な結果をもたらした。＊ｐ－アニシジン反応物はオレンジ色に変化し、求核試薬の酸化とタンパク質の二次修飾が示された。最後に、様々なピペラジンとラセミ体のＮ－メチルピロリジンのカップリング効率を評価した。良好な変換を達成するためにはるかに高いマイクロモル濃度及びミリモル濃度が必要とされたことから、これらが劣った求核試薬であることが示された（図１６ｃ；図２７）。プロリンＮ末端のモデルであるＮ－メチル－ピロリジンは、このカテゴリーの求核試薬で最良の変換を示した。
－ＧＧＹタグ付きトラスツズマブｓｃＦｖのａｂＴＹＲを介した修飾が、この構築物の結合活性を乱さなかったことを示すために、蛍光色素Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（ＯＧ）４８８をアニリン求核試薬で誘導体化し、ｓｃＦｖに酸化的にカップリングさせた。反応は、２５μＭのアニリン－ＯＧ４８８と１２Ｕ／ｍＬのａｂＴＹＲで最適に進行し、８５％の変換率でｓｃＦｖ－ＧＧＹ－Ａｎ－Ｏ．Ｇ．４８８構築物が得られた。フローサイトメトリーにより、この構築物が、ＨＥＲ２－ＭＤＡ－ＭＢ－４６８乳癌細胞よりもＨＥＲ２＋ＳＫ－ＢＲ－３乳癌細胞株を選択的に認識することができることが示された（図２２ｄ）。
過ヨウ素酸ナトリウム及びフェリシアン化カリウムを介したｐ－アミノフェニルアラニンとｏ－メトキシフェノール及びｏ－アミノフェノールの酸化的カップリング反応の生成物の構造（Ｏｂｅｒｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍｉｅ－Ｉｎｔ．Ｅｄ．５３：１０５７；Ｅｌｓｏｈｌｙ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３９：３７６７）は以前に特徴決定されており、チロシナーゼを介したカップリングで観察された生成物の質量は、予測された構造と一致している。それにもかかわらず、ＮＭＲによるカップリング生成物を特徴決定して、反応の同等性を確認した。ａｂＴＹＲを用いて、Ｄ２Ｏ中のＮ－アセチルＬ－チロシンとｐ－トルイジンとの間で小分子モデル反応を行った。Ｄ２Ｏで進行し、濃い紫色に変わるために、反応は、より多くのチロシナーゼと長い反応時間を必要とした。反応混合物の直接ＮＭＲ観察から、図に示すものと一致する単一の一次生成物が明らかとなった。
Ｔｙｒタグ付きｓｃＦｖに対するアニリン複合体の安定性を、１５％グリセロール（ｐＨ７．４）を含む標準的なリン酸及びＮａＣｌタンパク質保存緩衝液中で、４℃で７日間モニタリングし、連結が損なわれていないことを確認した（図３０）。１０ｍＭのジチオスレイトール（図２９）またはグルタチオン（図３１）の添加は、チオール付加物の形成をもたらした。グルタチオンの場合、このさらなる修飾が、２４時間以内に定量的に生じた。図３２は、グルタチオン、次いでＤＴＴによるアニリンカップリングｓｃＦｖの連続処理を示す。この追加の修飾にもかかわらず、どちらの場合もアニリンの連結は損なわれなかった。
Ｎ末端またはＣ末端にチロシンタグが付いたいくつかの全長タンパク質を発現させることにより、多様なタンパク質基質に対して、同様にこの方法論を試験した。
プロテインＬは、ヒトκ軽鎖の可変領域を認識するＩｇＧ結合タンパク質である。これは、病原性Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｇｎｕｓで発見され、５つの結合ドメインからなり（Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １１０：１７４５６）、短い９～１０アミノ酸リンカーによってタンデムに接続されている（Ｋａｓｔｅｒｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１２８２０）（図２０ａ）。これらの５つのドメインの相互作用を組み合わせた結合力により、このタンパク質はｐＨ８で１３０ｎＭのＫｄを達成することができる（Ｂｅｃｋｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．３４０：１９３）。組換え発現させる場合、野生型タンパク質の細胞壁アンカードメインは通常削除され、いくつかの短縮バージョンは、軽鎖結合ドメインを３つまたは４つのみ有する。プロテインＬは、ｓｃＦｖの精製に日常的に使用されており（Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ． Ｐｕｒｉｆ．１１６：９８）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する細胞のユニバーサルフローサイトメトリーマーカーとして使用され（Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｊ．Ｔｒａｎｓｌ． Ｍｅｄ．１０：１）、これは通常、ｓｃＦｖを利用して標的を認識する。プロテインＬは、抗原認識ループに干渉することなく可変軽鎖に結合するため、結合したｓｃＦｖ及びＩｇＧの「二次」検出試薬として使用することできる。
アニリン官能化Ｏ．Ｇ．４８８によるａｂＴＹＲを介した修飾のために、プロテインＬを、ペンダント－ＧＧＹ及び－ＧＧＧＧＳＧＧＹ（配列番号９６８）タグを付けて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現させ、二次ｓｃＦｖ検出試薬を作成した。しかしながら、これらの構築物は、ａｂＴＹＲによる酸化に耐性を有し、これは、タンパク質構造の大部分から末端のチロシン残基が十分に離れていないため、立体的に閉塞したａｂＴＹＲ活性部位に到達できないためと考えられる。短い－ＧＧＹ及び－ＳＳＧＧＧＧＹ（配列番号９４８）タグを、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）のＣ末端に付加した場合にも同じ問題が発生した。この問題を回避するために、チロシンタグの前に様々なタイプ及び長さのＣ末端リンカーを有するプロテインＬバリアントのコレクションを生成した（図２０ｂ、図２８）。柔軟な（Ｇ４Ｓ）１－３ リンカーに加えて、プロテインＬを、αヘリックス（ＥＡＡＡＫ）２（配列番号９６９）リピート配列（Ａｒａｉ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１４：５２９）、非水素結合、強固な（ＡＰ）３リピート（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ． Ｒｅｖ．６５：１３５７）、ポリアスパラギン（Ｎ２０）配列、及び容易に修飾されるトラスツズマブｓｃＦｖ（ＥＩＫＲＴＧＧＹ）（配列番号９７０）のＣ末端配列で拡張した。さらに、Ｃ末端の第５の軽鎖結合ドメインを削除し、第４と第５の軽鎖結合ドメイン間のネイティブリンカーを、－ＧＧＹ及び－Ｇ４ＳＧＧＹ（配列番号９６８）タグで拡張した。残念ながら、これらのバリアントはいずれもａｂＴＹＲによって酸化することができなかった。
１２０ｋＤａチロシナーゼタンパク質の立体的バルクは、多くのタンパク質基質で活性部位へのアクセスを困難にする可能性が高いことが認識された。原則として、Ｃ末端リンカーを延長し続けることでａｂＴＹＲ酸化可能バリアントを生成できるはずであるが、リンカーが長いと、タグがタンパク質機能に干渉するリスクが高まり、ＰＣＲによるインストールが難しくなり、チロシンタグ付けアプローチの利便性が低下する。したがって、はるかに小さいバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）チロシナーゼ（ｂｍＴＹＲ）を発現させて試験する動機があった。この３５．５ｋＤａのタンパク質は、ＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において、最大２００ｍｇ／Ｌの収量でロバストに発現し、ａｂＴＹＲと比較してはるかに立体的に露出した活性部位を有する。喜ばしいことに、ｂｍＴＹＲに曝露させたすべてのチロシンタグ付きプロテインＬバリアントが定量的に酸化され、タグなしバリアントが修飾されない一方で、９０％以上の変換率で１５０μＭアニリンと反応した（図２０ｂ、図２８）。チロシンタグ付きＭＢＰバリアントもｂｍＴＹＲによって正常に酸化されたが、この場合、反応が高い変換率に達するまでに１時間以上を要した。
獲得したプロテインＬ修飾に対する解決策により、ｂｍＴＹＲを介したＯＣを、２５μＭのアニリン－Ｏ．Ｇ．４８８求核試薬を用いて、－ＡＮ２０ＧＧＹタグ付けプロテインＬバリアントに対して行った。所望の複合体が８７％の変換率で得られた（図２２ｃ）。次いで、この構築物を、非チロシンタグ付きトラスツズマブｓｃＦｖで前処理したＨＥＲ２＋（ＳＫ－ＢＲ－３）またはＨＥＲ２－（ＭＤＡ－ＭＢ－４６８）乳癌細胞に与えた。ｂｍＴＹＲ媒介ＯＣ条件下でアニリン－Ｏ．Ｇ．４８８で修飾されたプロテインＬ構築物のみが、ｓｃＦｖへの曝露後にＨＥＲ２＋細胞を標識することができた（図２２ｄ）。ＨＥＲ２を含まない細胞、またはカップリングとラベリングのワークフローから成分を省いた試料はタグ付けされなかった。
材料及び方法
試薬
すべての化学物質は、Ｓｉｇｍａ ＡｌｄｒｉｃｈまたはＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入し、特に明記しない限り、受け取ったままの状態で使用した。Ｍｉｌｌｉ－Ｑ Ｈ２Ｏを使用した。
アガリクス・ビスポラス（Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓ）チロシナーゼ（「キノコ由来チロシナーゼ」）は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから凍結乾燥粉末として入手し、受け取った時点で－２０℃で保存した。１ｍｇ／ｍＬストック溶液を、５０ｍＭリン酸緩衝液、１５％グリセロール水溶液、ｐＨ６．５で調製し、－８０℃で保存した。使用直前にアリコートを氷上で解凍し、各新しいストックの活性をアッセイした。安定性の試験では、この方法で保存したａｂＴＹＲアリコートの活性が、－８０℃での数か月の保存ではほとんど変化しないことが示されている。
タンパク質構築物
タンパク質遺伝子ブロックは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現用にコドン最適化されたものを、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。ｐＥＴ２８ｂゴールデンゲートエントリーベクターにクローニングするために、Ｂｓａ１切断部位を遺伝子配列の両端に存在させた。このベクターにより、遺伝子が挿入されたプラスミドで正常に形質転換されたコロニーを、緑色／白色スクリーニングすることができた。
その後のＴＯＦ－ＬＣＭＳ分析のための代表的なチロシナーゼ媒介酸化的カップリング反応
各ストック溶液の内容物をエッペンドルフチューブに加え、最後にチロシナーゼ酵素を加えた。得られた溶液を、２１ｍＭトロポロン水溶液５．０μＬを添加する前に６０分間室温で放置した。クエンチした反応物を、アニリンを除去するために、各サイクルの前に、１０ｋＤａ ＭＷＣＯ ５００μＬ ａｍｉｃｏｎ超遠心分離フィルター中で４サイクルのスピン脱塩に供し、４００μＬのＭｉｌｌｉ－Ｑ Ｈ２Ｏ、及びリン酸緩衝液で希釈した。得られた３５～５０μＬの液滴を、０．２２μＭセルロースアセテート遠心フィルターに通し、ＴＯＦ－ＬＣＭＳ分析に供した。
組換えタンパク質のサイトゾル発現－リットルスケール
５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含有するＴＢ培地中でのＢＬ２１（ＤＥ３）Ｓｔａｒ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の１０ｍＬ一晩培養物を、１Ｌの滅菌Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ培地及びカナマイシンを含む２．８Ｌ三又三角フラスコに接種した。培養物を、６００ｎｍでのＯＤが０．６～０．８に達するまで、２２０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で培養した。発現を誘導するために、ＩＰＴＧを１．０Ｍストックから最終濃度１．０ｍＭとなるように添加した。培養物を、上記の表に示す温度、時間、及び振盪速度でインキュベートした。培養物を、遠心分離（３，２００ｇ、１５分、４℃）でペレット化し、上清を捨てた。この時点からのすべてのステップは、冷（４℃）緩衝液と氷上で実施した。各ペレットを４５ｍＬのＤ．Ｉ．Ｈ２Ｏに再懸濁し、次いで５０ｍＬのｆａｌｃｏｎチューブにペレット化した（３，２００ｇ、１５分、４℃）。上澄みを注ぎ出し、ペレットを－８０℃で保存するか、または直ちに溶解した。
各細胞ペレット（０．５Ｌ培養物由来）を、２５ｍＬの溶解緩衝液（ＰＢＳ、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４、０．１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド、０．０５Ｕ／ｍＬベンジナーゼ、及び０．５ｍｇ／ｍＬ鶏卵白リゾチーム）に再懸濁した。細胞を氷上で少なくとも３０分間インキュベートし、次いで１０分間の超音波処理（６０％の振幅で２秒間オン、３秒間オフのパルス）によって溶解した。得られた懸濁液を遠心分離し（１４，０００ｇ、３０分、４℃）、上清を０．２μＭシリンジフィルターに通した。粗溶解物を、緩衝液Ａ（２０ｍＭイミダゾールを含むＰＢＳ、ｐＨ７．４）で平衡化したＧ．Ｅ．Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰ ５ｍＬアフィニティーカラムを使用してＮｉＮＴＡ精製に供した。２０カラム容量にわたって０～１００％の緩衝液Ｂ（４００ｍＭイミダゾールを含むＰＢＳ、ｐＨ７．４）のグラジエントを使用してタンパク質を溶出した。生成物を含む画分を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用して同定し、必要に応じてさらに精製した。精製したタンパク質を、１０ｋＤａ ＭＷＣＯ、１５ｍＬ ａｍｉｃｏｎ超遠心フィルターで４ラウンドのスピン濃縮を介してタンパク質保存緩衝液（１５％グリセロールを含むＰＢＳ）にバッファー交換し、各スピンの前に保存緩衝液で希釈した。
組換えタンパク質のサイトゾル発現－１０～５０ｍＬスケール
発現及び細胞ペレット処理を、上記のように実施した。
ペレットを１．０ｍＬの溶解緩衝液に再懸濁し、４５秒間超音波処理した（５０％の振幅で５秒間オン、５秒間オフのパルス）。溶解物を１６，１００ｇで１０分間遠心分離した。上清を保持し、固形物を廃棄した。各溶解物について、細胞培養物１ｍＬあたり１０μＬのＨｉｓＰｕｒ ＮｉＮＴＡ樹脂（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ 製品番号８８２２１；懸濁した樹脂１ｍＬあたり６０ｍｇのＨｉｓ６－タンパク質のキャパシティ）を結合緩衝液（ＰＢＳ、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）で平衡化した。次いで、樹脂を細胞溶解物に懸濁し、４℃で１時間インキュベートした。結合後、樹脂のアリコートを結合緩衝液で２回洗浄し、結合したタンパク質を溶出緩衝液（ＰＢＳ、８０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）で遊離させた。溶出したタンパク質の純度を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＴＯＦ－ＬＣＭＳで評価した。タンパク質を、１０ｋＤａ ＭＷＣＯ ５００μＬ ａｍｉｃｏｎ超スピン脱塩フィルター中での４サイクルの遠心分離（１４，０００ｇ、２０分、４℃）を介して、タンパク質保存緩衝液（１５％グリセロール中の２０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中にバッファー交換し、各サイクルの前にタンパク質保存緩衝液で５００μＬに希釈した。
マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）
ＮｉＮＴＡ精製後、ＭＢＰ含有画分を合わせ、１０ｋＤａ ＭＷＣＯ、１５ｍＬ ａｍｉｃｏｎ超遠心フィルター中で２０ｍＬに濃縮し、次いで陰イオン交換緩衝液Ａ（２５ｍＭ ＴＲＩＳ－ＨＣｌ、２０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．９）中に透析し、次いでＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰ ５ｍＬカラムに移し、２０カラム容量にわたって０～１００％の緩衝液Ｂ（２５ｍＭ ＴＲＩＳ－ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．９）の濃度勾配で溶出した。
トラスツズマブｓｃＦｖのペリプラズム発現及び精製
以下の手順は、Ｒｏｕｅｔ ｅｔ ａｌ．（２０１２），上記によるプロトコルから採用した。それぞれ５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含有する１Ｌの滅菌Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ培地を含む２つのフィンレス４Ｌ三角フラスコに、ＰｅｌＢ－トラスツズマブｓｃＦｖ－ＧＧＹまたは野生型Ｃ末端遺伝子構築物をｐＥＴ２８ｂ内に保持するＢＬ２１（ＤＥ３）ｓｔａｒ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞の１０ｍＬの一晩ＴＢ培地培養物を接種した。培養物を、６００ｎｍでのＯＤが０．６～０．８に達するまで、２２０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で培養した。発現を誘導するために、ＩＰＴＧを１．０Ｍストックから最終濃度０．４ｍＭとなるように添加した。次いで、培養物を、２００ｒｐｍで振盪しながら２８℃でインキュベートした。４時間後、各１Ｌの培養物を２つの遠心分離ボトルに分割し、遠心分離（３，２００ｇ、１５分、４℃）によってペレット化し、上清を廃棄した。この時点からのすべてのステップは、冷（４℃）緩衝液と氷上で実施した。各ペレット（０．５Ｌ培養物由来）を２５ｍＬのペリプラズム抽出緩衝液１（２０％ｗ／ｖ ショ糖、１００ｍＭ ＴＲＩＳ－ＨＣｌ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に再懸濁し、３０分間インキュベートした。固定角度ローターを使用した遠心分離（１０，０００ｇ、１０分、４℃）により細胞をペレット化し、上清を注ぎ出し、「ペリプラズム抽出物１」として保存した。ペレットをそれぞれ２５ｍＬのペリプラズム抽出緩衝液２（５．０ｍＭ ＭｇＣｌ２）に再懸濁し、氷上で３０分間インキュベートした。細胞を再び遠心分離（１０，０００ｇ、１０分、４℃）でペレット化し、上清を注ぎ出し、「ペリプラズム抽出物２」として保存した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより、ペリプラズム抽出物が両方ともｓｃＦｖを含むことがわかった。抽出物を合わせ、１０ｋＤａ ＭＷＣＯ ａｍｉｃｏｎ超遠心フィルター（４０００ｇ、２０分、４℃）で複数回遠心分離して５０ｍＬに濃縮し、次いで０．２２μｍのＰＥＳシリンジフィルターに通した。ペリプラズム抽出物を３５００Ｄａ ＭＷＣＯ透析カセットに移し、穏やかに撹拌しながら４ＬのＰＢＳ中で一晩インキュベートした。
５ｍＬ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃａｐｔｏ Ｌ（樹脂結合プロテインＬ）アフィニティーカラムを緩衝液Ａ（５０ｍＭクエン酸塩、４００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０）で平衡化した。透析したペリプラズム抽出物を再び０．２２μＭ ＰＥＳシリンジフィルターに通し、Ｃａｐｔｏ Ｌカラム上に移し、そして２２カラム体積にわたって０～１００％の緩衝液Ｂ（５０ｍＭクエン酸、ｐＨ２．５）の濃度勾配で溶出した。画分収集チューブには、ｐＨ８．０の１．０Ｍ ＴＲＩＳ ＨＣｌ緩衝液１．０ｍＬを事前に充填して、溶出緩衝液を中和した。ｓｃＦｖは、通常１００％の緩衝液Ｂで溶出され、ＴＯＦ－ＬＣＭＳで純粋であった。発現培地１リットルあたり０．８ｍｇ～１．２ｍｇが得られた。
合成
Figure 2022527247000082
５．０ｍｇ（９．８μモル）のＯｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（商標）４８８カルボン酸、スクシンイミジルエステル、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの５－異性体をＤＭＦ２００μｌに溶解した。ＤＭＦ中の４５μｇ／μＬの４－（２－アミノエチル）アニリン（１．３４ｍｇ、９．８μｍｏｌ）溶液２９．１μＬ及びＤＭＦ中の６０μｇ／μＬ ＴＥＡ（３．１７ｍｇ、３１．３μｍｏｌ）の溶液５２．８μＬを添加した。得られた明るい赤橙色の溶液を遮光し、室温で１８時間撹拌した。反応混合物を、溶媒Ａ（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ Ｈ２Ｏ）中の５０～６０％の溶媒Ｂ（ＡＣＮ）の濃度勾配を使用する半分取ＨＰＬＣを介して８分間にわたって精製した。生成物を含有する画分（緑色）を合わせ、回転蒸発によって部分的に濃縮してＡＣＮを除去し、－８０℃で凍結し、遮光しながら凍結乾燥した。２．４１８ｍｇ（４６％）のオレンジ色の粉末が得られた。生成物を、Ｈ２Ｏ中の２０％ＡＣＮに７５０μＭのストック濃度で溶解し、さらなる特性評価を行わずにカップリング反応に使用した。
ｓｃＦｖ結合のための細胞調製：
ＭＤＡ－ＭＢ－４６８（ＨＥＲ２－）細胞またはＳＫ－ＢＲ－３（ＨＥＲ２＋）細胞を含むＴ－２５フラスコを、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙから入手し、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター内で９０～１００％のコンフルエンシーまで増殖させた。分析の準備として、増殖培地を除去し、接着細胞をＤ－ＰＢＳですすいだ。細胞を、０．２５％トリプシンにより、３７℃で１０～１５分間処理することにより剥離させた。トリプシン消化は、細胞結合緩衝液（１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及び１．０％ｗ／ｖ ＮａＮ３を添加して細胞表面マーカーの内在化を防止したＤＰＢＳ）を１３～１５ｍＬの総体積になるまで添加することにより停止させた。細胞を１５ｍＬのｆａｌｃｏｎチューブに加え、２サイクルの遠心分離（３００ｇ、５分、室温）に供し、各サイクルの後に上清を除去し、第２のサイクルの前に１４ｍＬの結合緩衝液で希釈した。細胞を１．０ｍＬの細胞結合緩衝液に再懸濁し、ＢｉｏＲａｄ ＴＣ２０自動セルカウンターでカウントした。トリパンブルー染色で示されるように、生細胞数は＞９５％であった。細胞濃度を、追加の結合緩衝液により、２．０×１０６細胞／ｍＬに調整した。細胞懸濁液の１００μＬのアリコートをエッペンドルフチューブに移し、氷上に置いた。
ｓｃＦｖ－Ｏ．Ｇ．４８８複合体及び陰性対照の結合
各１００μＬの細胞のアリコートに、３１．３μＬの０．０４８μｇ／μＬトラスツズマブｓｃＦｖ構築物を加え（－ＧＧＹタグ付けするかまたはタグ付けせずに、Ｏ．Ｇ．－４８８またはａｂＴＹＲの存在下または非存在下で、ａｂＴＹＲを介したＯ．Ｃ．条件に供したもののいずれか）、それにより、１．５μｇのｓｃＦｖを各試料に添加した。試料を氷上で１時間、暗所でインキュベートした。次いで、試料を３サイクルの遠心分離（３００ｇ、３分）に供し、各サイクルの前に細胞を１０００μＬの細胞結合緩衝液に再懸濁し、各サイクルの後に上清を廃棄した。遠心分離後、細胞ペレットを０．５％パラホルムアルデヒドを含む１０００μＬのＤＰＢＳに再懸濁し、フローサイトメトリー分析の準備ができるまで氷上で１～３時間保持した。
トラスツズマブのｓｃＦｖ処理細胞へのプロテインＬ－ＡＮ２０ＧＧＹ－Ｏ．Ｇ．４８８複合体の結合
各１００μＬの細胞のアリコートに、２．０μＬの１．５μｇ／μＬのタグなしトラスツズマブｓｃＦｖを加えた。試料を氷上で１時間インキュベートし、光から保護した。次いで、試料を２サイクルの遠心分離（３００ｇ、３分）に供し、各サイクルの前に細胞を１０００μＬの細胞結合緩衝液に再懸濁し、各サイクルの後に上清を廃棄した。細胞ペレットを、１００μＬの細胞結合緩衝液中で再懸濁し、６０μＬの０．０４５μｇ／μＬのプロテインＬ－ＡＮ２０ＧＧＹ－Ｏ．Ｇ．４８８複合体または陰性対照構築物を添加し、試料あたり合計２．７μｇのプロテインＬ構築物とした。試料を、暗所、氷上で１時間インキュベートした。次いで、試料を３サイクルの遠心分離（３００ｇ、３分）に供し、各サイクルの前に細胞を１０００μＬの細胞結合緩衝液に再懸濁し、各サイクルの後に上清を廃棄した。遠心分離後、細胞ペレットを０．５％パラホルムアルデヒドを含む１０００μＬのＤＰＢＳに再懸濁し、フローサイトメトリー分析の準備ができるまで氷上で１～３時間保持した。
実施例４
本実施例では、ｂｍＴＹＲのＤ５５Ｋ変異体（図１０Ｍに示されているアミノ酸配列）が、フェノールで標識されたＤＮＡをシステイン含有タンパク質に効率的にカップリングすることができることを示す。この実験では、Ｃ６－アミンリンカー（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入）を有するオリゴヌクレオチドを、１０倍モル過剰のＮＨＳ－フェノールと共にｐＨ８．０、室温で２時間インキュベートすることにより、フェノールで修飾し、イオン交換によって精製した。反応条件は以下の通りであった：ｉ）５０μＭ ＧＦＰ；１５７ｎＭ ａｂＴＹＲ（または同等の活性のｂｍＴＹＲまたはＤ５５Ｋ ｂｍＴＹＲ）；ｉｉ）２５０μＭのＤＮＡ－フェノール；ｉｉｉ）１０ｍＭリン酸塩、ｐＨ６．５。反応を、室温（ＲＴ）で３０分間進行させた。ＧＦＰ：２７．５５０ｋＤａ；ＤＮＡ：約８ｋＤａ。
データを図３５に示す。ＧＦＰの上の大きな暗いバンドの出現は、ｂｍＴＹＲまたはＤ５５Ｋ ｂｍＴＹＲのいずれかを使用してＤＮＡカップリングが成功したが、ａｂＴＹＲは成功しなかったことを示している。
この反応は、反対の方向で、すなわち、Ｎ末端またはＣ末端のチロシンタグを有するタンパク質及びチオール修飾を有するオリゴヌクレオチドを組み合わせることによって実施することができ、それでもタンパク質－ヌクレオチド複合体が生じる。
実施例５
図３６Ａ～３６Ｃは、本開示の方法を使用した、核酸のポリペプチドへのカップリングを示す。
図３６Ａに示すように、ＮＨＳフェノールは、核酸のアミン末端ヌクレオチドにカップリングして、フェノール含有核酸（核酸－フェノール）を生成する。図３６Ｃに示すように、次いで、核酸－フェノールを、チオール含有タンパク質にカップリングし（例えば、Ｄ５５Ｋ置換を有するチロシナーゼ（例えば、図１０Ｍに示すようなＴＹＲポリペプチド）を使用して）、核酸－タンパク質複合体を生成する。図３６Ｂに示すように、ａｂＴＹＲ（図８；図９）は、反応を触媒しない。
制限エンドヌクレアーゼを核酸のヌクレオチド配列に含めることができ、核酸－タンパク質複合体のタンパク質から核酸を選択的に切断する能力を提供する。
実施例６：ＴＹＲ変異体の電荷選好性
これらの実験では、５０μＭのＹ１８２Ｃ ＧＦＰを、関連するチロシナーゼの２００ｎｍ ａｂＴＹＲと同等の活性を有する２００μＭのＥＥＥＥＹ（配列番号９５５）、ＲＲＲＲＹ（配列番号９５１）、またはその両方と組み合わせた。反応を、室温で３０分間進行させた後、トロポロンでクエンチし、ＥＳＩ－ＴＯＦ ＭＳで分析した。データを図３７Ａ～３７Ｃに示す。
図３７Ａ～３７Ｃは、荷電基質に対するその選好に対するｂｍＴＹＲへの様々な変異の影響を示す。図３７Ｃに示すように、野生型ｂｍＴＹＲ（図１０Ａに示されているアミノ酸配列）は、負に荷電した基質ＥＥＥＥＹ（配列番号９５５）（生成物質量２８２６０）に対してわずかに選好される。図３７Ｂに示すように、Ｒ２０９Ｈ変異体（図１０Ｃに示されているアミノ酸配列）は、カチオン性ＲＲＲＲＹ（配列番号９５１）基質（生成物質量２８３６９）に対してより高い活性を示す。図３７Ａに示すように、Ｄ５５Ｋ変異体（図１０Ｍに示されているアミノ酸配列）は、カチオン性ＲＲＲＲＹ（配列番号９５１）基質に対して実質的に活性を示さない。
図３８に示すように、ａｂＴＹＲは、負に荷電したＥＥＥＥＹ（配列番号９５５）基質（生成物の予測質量＝２８２６０）を活性化する能力を示さず、出発物質の質量＝２７５４８のみのままである。
実施例７：リンカー／マーカーとしてのビオチン
チロシン－チオール結合の安定性を分析するために、２００μＭのビオチン－ＰＥＧ４－フェノールを、室温で１時間、５０μＭ Ｙ１８２Ｃ ＧＦＰ及び２００ｎＭ ａｂＴＹＲと合わせた。比較反応では、５００μＭのビオチン－マレイミドを別個に５０μＭ Ｙ１８２Ｃ ＧＦＰと共に室温で２時間インキュベートした後、バッファー交換して過剰なマレイミドを除去した。これにより、チロシン－ＧＦＰ－ビオチンとマレイミド－ＧＦＰ－ビオチンを生成し、次いでこれらをヒト血清（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ製）または緩衝液中でインキュベートした。インキュベーション後、試料を２５μＬのストレプトアビジン磁気ビーズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ製）と室温で１時間混合した。３ラウンドの洗浄後、８０％アセトニトリル、５％ギ酸、及び２ｍＭビオチンの混合物と共に室温で１０分間インキュベートすることにより、ビーズから試料を溶出した。次いで、試料をＡｇｉｌｅｎｔ ６２２４ ＥＳＩ－ＴＯＦ質量分析計で分析し、相対質量を定量した。
データを図４０Ａ～４０Ｃに示す。チロシン－ＧＦＰ－ビオチン（ＢＴ）及びマレイミド－ＧＦＰ－ビオチン（ＢＭ）をヒト血清中で１日間（図４０Ａ）、２日間（図４０Ｂ）、または７日間（図４０Ｃ）のいずれかで、室温（ＲＴ）または３７℃（「３７」）でインキュベートした。図４０Ａ及び図４０Ｂに示すように、チロシン－ＧＦＰ－ビオチンとマレイミド－ＧＦＰ－ビオチンの両方が、いまだ存在していた。しかしながら、図４０Ｃに示すように、７日後、マレイミド－ＧＦＰ－ビオチン（ＢＭ）複合体はもはや検出されなかったが、一方、チロシン－ＧＦＰ－ビオチンレベルは、３７℃でのインキュベーションでも高いままであった。これらの結果は、チロシナーゼを使用して生成されたチオール－フェノールカップリングがヒト血清中で安定であり、マレイミドカップリングよりも安定していることを示している。
実施例８：Ｉｇ Ｆｃタンパク質またはナノボディのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドへのカップリング
免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｆｃ及びナノボディを、本開示の方法を使用して、Ｃａｓ９タンパク質に別個に複合体化した。１０μＭ Ｃａｓ９及び２０μＭ Ｆｃドメインを、２０ｍＭリン酸、２００ｍＭトレハロース、及び３００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ６．５）中、氷上で１時間、２００ｎＭ ａｂＴＹＲと組み合わせた。１０μＭ Ｃａｓ９をトレハロース緩衝液中で２０μＭナノボディと１時間混合した。複合体を、単独で、またはガイドＲＮＡと複合体を形成させて、ゲル上で分析した。データを図４１に示す。
レーン２、３、４、及び６は、それぞれ、非カップリングＩｇ Ｆｃ（ＮＮＮＹ（配列番号１０５９）配列を含む）、非カップリングＩｇ Ｆｃ（ＧＧＹＮＮＮ（配列番号１０６０）配列を含む）、ナノボディ、及びＣａｓ９である。レーン８及び９は、ガイドＲＮＡを含まない（レーン８）または含む（レーン９）Ｃａｓ９－Ｉｇ Ｆｃ複合体である。レーン１０及び１１は、ガイドＲＮＡを含まない（レーン１０）または含む（レーン１１）Ｃａｓ９－Ｉｇ Ｆｃ複合体である。レーン１２及び１３は、ガイドＲＮＡを含まない（レーン１２）または含む（レーン１３）ナノボディ－Ｃａｓ９複合体である。
ナノボディ－Ｃａｓ９複合体をＴＯＦ－ＭＳを使用して分析した。データを図４２に示す。
実施例９：哺乳類生細胞の表面の修飾
本明細書に記載の方法は、例えば、チロシナーゼ及びチロシンタグ付き抗原結合タンパク質を使用して、哺乳類生細胞表面の直接標識に使用することができる。モデル基質として、ＧＦＰ結合ナノボディをＪｕｒｋａｔ細胞に接着させ；細胞表面への接着後、ナノボディは抗原に結合する能力を保持している。この方法は、図４３Ａに概略的に示されている。
簡潔に述べると、Ｊｕｒｋａｔ細胞を、４００ｎＭのａｂＴＹＲと１０～２００μＭのＧＦＰ結合ナノボディを含む溶液に懸濁した。反応後、細胞を２５μＭ ＧＦＰでリンスした後、最終リンスとフローサイトメトリーによる分析を行った。データを図４３Ｂに示す。ナノボディ濃度に基づく緑色蛍光のレベルの増加は、ＧＦＰが、ナノボディ結合細胞に用量依存的に結合したことを示している。
本発明を、その特定の実施形態を参照して説明してきたが、当業者は、本発明の真の主旨及び範囲から逸脱することなく、様々な変更がなされてもよく、均等物に置き換えられてもよいことを理解されたい。さらに、特定の状況、材料、物質の組成、プロセス、プロセスの工程、またはプロセスの複数の工程を、本発明の目的、精神、及び範囲に適合させるために、多くの改変を加えてもよい。そのような改変はすべて、本明細書に添付の特許請求の範囲内にあることが意図されている。

Claims (71)

  1. 標的分子を化学選択的に修飾する方法であって、
    前記方法が、チオール部分を含む標的分子を、反応性部分を含む生体分子と接触させる工程を含み；
    前記反応性部分を含む前記生体分子が、フェノール部分またはカテコール部分を含む生体分子と、前記フェノール部分またはカテコール部分を酸化することができる酵素との反応によって生成され；
    前記接触させる工程が、前記標的分子を前記生体分子と複合体化させるのに十分な条件下で実施され、それにより、修飾された標的分子が生成される、
    前記方法。
  2. 前記標的分子が、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
  3. 前記酵素が、チロシナーゼポリペプチドである、請求項１または請求項２に記載の方法。
  4. 前記チロシナーゼポリペプチドが、アガリクス・ビスポラス（Ａｇｒｉｃｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓ）チロシナーゼ（ａｂＴＹＲ）ポリペプチドである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記チロシナーゼポリペプチドが、図８または図９に示されているａｂＴＹＲのアミノ酸配列に対して少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記フェノール部分またはカテコール部分を含む生体分子が、前記フェノール部分またはカテコール部分の５０オングストローム（Å）以内で中性または正に荷電している、請求項４または請求項５に記載の方法。
  7. 前記チロシナーゼポリペプチドが、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）チロシナーゼ（ｂｍＴＹＲ）ポリペプチドである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記チロシナーゼポリペプチドが、図１０Ａ～１０Ｚ及び１０ＡＡ～１０ＶＶのいずれか１つに示されているアミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記フェノール部分またはカテコール部分を含む生体分子が、前記フェノール部分またはカテコール部分の５０Å以内で負に荷電している、請求項７または請求項８に記載の方法。
  10. 前記標的分子がポリヌクレオチドである、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記標的分子がＤＮＡ分子である、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記標的分子がＲＮＡ分子である、請求項１０に記載の方法。
  13. 前記生体分子がポリペプチドである、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記酵素が、固体支持体に結合されている、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記フェノール部分が、チロシン残基に存在する、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記チオール部分が、システイン残基に存在する、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記システイン残基が、天然のシステイン残基である、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記生体分子が、フルオロフォア、活性小分子、親和性タグ、及び金属キレート剤から選択される１つ以上の部分を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記反応性部分が、オルトキノンもしくはセミキノンラジカル、またはそれらの組み合わせである、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記生体分子がポリペプチドである、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記生体分子が、蛍光タンパク質、抗体、酵素、受容体のリガンド、及び受容体から選択されるポリペプチドである、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記フェノール部分またはカテコール部分を含む生体分子が、式（Ｉ）の分子であり、前記反応性部分を含む生体分子が、式（ＩＩ）もしくは（ＩＩＡ）またはそれらの組み合わせの分子であり：
    Figure 2022527247000083
    式中：
    Ｙ１が、活性小分子、親和性タグ、フルオロフォア、及び金属キレート剤から選択される１つまたは複数の部分を任意で含む、生体分子であり；
    Ｘ１が、水素及びヒドロキシルから選択され；かつ
    Ｌが、任意選択のリンカーである、
    請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記チオール部分を含む標的分子が、式（ＩＩＩ）の分子であり、修飾された標的分子が、式（ＩＶ）もしくは（ＩＶＡ）またはそれらの組み合わせの分子であり：
    Figure 2022527247000084
    式中：
    Ｙ１が、活性小分子、親和性タグ、フルオロフォア、及び金属キレート剤から選択される１つまたは複数の部分を任意で含む、生体分子であり；
    Ｙ２が、第２の生体分子であり；
    Ｌが、任意選択のリンカーであり；かつ
    ｎが、１～３の整数である、
    請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記式（ＩＶ）の修飾された標的分子が、式（ＩＶ１）～（ＩＶ３）:
    Figure 2022527247000085
    のいずれかの分子であり；かつ
    前記式（ＩＶＡ）の修飾された標的分子が、式（ＩＶＡ１）～（ＩＶＡ３）：
    Figure 2022527247000086
    のいずれかの分子である、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記式（ＩＶ）の修飾された標的分子が、式（ＩＶ５）～（ＩＶ６）：
    Figure 2022527247000087
    のいずれかの分子であり；かつ
    前記式（ＩＶＡ）の修飾された標的分子が、式（ＩＶＡ４）～（ＩＶＡ５）：
    Figure 2022527247000088
    のいずれかの分子である、請求項２３に記載の方法。
  26. 前記フェノール部分またはカテコール部分を含む生体分子が、式（ＩＡ）：
    Figure 2022527247000089
    によって記述され、
    式中：
    Ｙ１が、活性小分子、親和性タグ、フルオロフォア、及び金属キレート剤から選択される１つまたは複数の基を任意で含む、生体分子であり；
    各Ｒ１が、独立して、水素、アシル、置換アシル、アルキル、及び置換アルキルから選択され；
    Ｘ１が、水素及びヒドロキシルから選択され；かつ
    Ｌ１が、直鎖または分岐アルキル、直鎖または分枝置換アルキル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、置換ＰＥＧ、及び１つ以上のペプチドから選択されるリンカーである、
    請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記フルオロフォアが、ローダミン色素またはキサンテン色素である、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記修飾された標的分子が、式（ＩＶＢ）もしくは（ＩＶＣ）：
    Figure 2022527247000090
    またはそれらの組み合わせによって記述され、
    式中：
    Ｙ１が、活性小分子、親和性タグ、フルオロフォア、及び金属キレート剤から選択される１つまたは複数の基を任意で含む、生体分子であり；
    各Ｒ１が、独立して、水素、アシル、置換アシル、アルキル、及び置換アルキルから選択され；
    Ｙ２が、第２の生体分子であり；
    Ｌ１が、直鎖または分岐アルキル、直鎖または分枝置換アルキル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、置換ＰＥＧ、及び１つ以上のペプチドから選択されるリンカーであり；かつ
    ｎが、１～３の整数である、
    請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記式（ＩＶＢ）の修飾された標的分子が、式（ＩＶＢ１）～（ＩＶＺＢ３）：
    Figure 2022527247000091
    のいずれかの分子であり；かつ
    前記式（ＩＶＣ）の修飾された標的分子が、式（ＩＶＣ１）～（ＩＶＣ３）：
    Figure 2022527247000092
    のいずれかの分子である、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記式（ＩＶＢ）の修飾された標的分子が、式（ＩＶＢ５）～（ＩＶＢ６）：
    Figure 2022527247000093
    のいずれかの分子であり；かつ
    前記式（ＩＶＣ）の修飾された標的分子が、式（ＩＶＣ４）～（ＩＶＣ５）：
    Figure 2022527247000094
    のいずれかの分子である、請求項２８に記載の方法。
  31. ｐＨ４～９で実施される、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 中性ｐＨで実施される、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記チオール基を含む標的分子がＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドである、請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. 式（ＩＩＩ）：
    Figure 2022527247000095
    のチオールを含む標的分子と、
    式（Ｉ）：
    Figure 2022527247000096
    のフェノール部分またはカテコール部分を含む生体分子と
    を含む組成物であって、
    式中：
    Ｙ１が、活性小分子、親和性タグ、フルオロフォア、及び金属キレート剤から選択される１つまたは複数の部分を任意で含む、生体分子であり；
    Ｘ１が、水素及びヒドロキシルから選択され；
    Ｌが、任意選択のリンカーであり；かつ
    Ｙ２が、第２の生体分子である、
    前記組成物。
  35. 前記フェノール部分またはカテコール部分を含む生体分子が、前記フェノール部分またはカテコール部分の５０Å以内で中性または正に荷電している、請求項３４に記載の組成物。
  36. 前記フェノール部分またはカテコール部分を含む生体分子が、前記フェノール部分またはカテコール部分の５０Å以内で負に荷電している、請求項３４に記載の組成物。
  37. Ｙ１がポリペプチドであり、かつＹ２がポリペプチドである、請求項３４～３６のいずれか一項に記載の組成物。
  38. Ｙ１がポリヌクレオチドであり、かつＹ２がポリペプチドである、請求項３４～３６のいずれか一項に記載の組成物。
  39. Ｙ２が、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドである、請求項３４～３８のいずれか一項に記載の組成物。
  40. 式（Ｉ）が、式（ＩＡ）：
    Figure 2022527247000097
    によって記述され、
    式中：
    Ｙ１が、活性小分子、親和性タグ、フルオロフォア、及び金属キレート剤から選択される１つまたは複数の基を任意で含む、生体分子であり；
    各Ｒ１が、独立して、水素、アシル、置換アシル、アルキル、及び置換アルキルから選択され；
    Ｘ１が、水素及びヒドロキシルから選択され；かつ
    Ｌ１が、直鎖または分岐アルキル、直鎖または分枝置換アルキル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、置換ＰＥＧ、及び１つ以上のペプチドから選択されるリンカーである、
    請求項３４～３９のいずれか一項に記載の組成物。
  41. 請求項３４～４０のいずれか一項に記載の組成物を含む第１の容器；及び
    前記フェノールまたはカテコール部分を酸化することができる酵素を含む第２の容器
    を含む、キット。
  42. 前記酵素がチロシナーゼポリペプチドである、請求項４１に記載のキット。
  43. 前記チロシナーゼ酵素が、アガリクス・ビスポラス（Ａｇｒｉｃｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓ）チロシナーゼ酵素（ａｂＴＹＲ）である、請求項４２に記載のキット。
  44. 前記チロシナーゼポリペプチドが、図８または図９に示されているａｂＴＹＲのアミノ酸配列に対して少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４２に記載のキット。
  45. 前記チロシナーゼ酵素が、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）チロシナーゼ酵素（ｂｍＴＹＲ）である、請求項４２に記載のキット。
  46. 前記チロシナーゼポリペプチドが、図１０Ａ～１０Ｚ及び１０ＡＡ～１０ＶＶのいずれか１つに示されているアミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４２に記載のキット。
  47. 式（ＩＶ）または（ＩＶＡ）：
    Figure 2022527247000098
    の化合物であって、
    式中：
    Ｙ１が、活性小分子、親和性タグ、フルオロフォア、及び金属キレート剤から選択される１つまたは複数の部分を任意で含む、生体分子であり；
    Ｌが、任意選択のリンカーであり；
    Ｙ２が、第２の生体分子であり；かつ
    ｎが、１～３の整数である、
    前記化合物。
  48. 前記式（ＩＶ）の修飾された標的分子が、式（ＩＶ１）～（ＩＶ５）：
    Figure 2022527247000099
    のいずれかの分子である、請求項４７に記載の化合物。
  49. 前記式（ＩＶＡ）の修飾された標的分子が、式（ＩＶＡ１）～（ＩＶＡ５）：
    Figure 2022527247000100
    のいずれかの分子である、請求項４７に記載の化合物。
  50. Ｌが切断可能なリンカーである、請求項４７～４９のいずれか一項に記載の化合物。
  51. Ｙ１がポリペプチドである、請求項４７～５０のいずれか一項に記載の化合物。
  52. Ｙ１が、蛍光タンパク質、抗体、及び酵素から選択される、請求項５１に記載の化合物。
  53. 前記化合物が、式（ＩＶＢ）または（ＩＶＣ）：
    Figure 2022527247000101
    によって記述され、
    式中：
    Ｙ１が、活性小分子、親和性タグ、フルオロフォア、及び金属キレート剤から選択される１つまたは複数の基を任意で含む、生体分子であり；
    各Ｒ１が、独立して、水素、アシル、置換アシル、アルキル、及び置換アルキルから選択され；
    Ｙ２が、第２の生体分子であり；
    Ｌ１が、直鎖または分岐アルキル、直鎖または分枝置換アルキル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、置換ＰＥＧ、及び１つ以上のペプチドから選択されるリンカーであり；かつ
    ｎが、１～３の整数である、
    請求項４７～５２のいずれか一項に記載の化合物。
  54. 前記式（ＩＶＢ）の修飾された標的分子が、式（ＩＶＢ１）～（ＩＶＺＢ５）：
    Figure 2022527247000102
    のいずれかの分子である、請求項５３に記載の化合物。
  55. 前記式（ＩＶ）の修飾された標的分子が、式（ＩＶＣ１）～（ＩＶＣ５）：
    Figure 2022527247000103
    のいずれか１つの分子である、請求項５３に記載の化合物。
  56. 前記化合物が、式（ＩＶＤ）～（ＩＶＧ）：
    Figure 2022527247000104
    のいずれかによって記述され、
    式中：
    Ｒ２が、アルキル及び置換アルキルから選択され；
    Ｒ３が、水素、アルキル置換アルキル、ペプチド、及びポリペプチドから選択され；及び
    ｎが、１～３の整数である、
    請求項４７～５５のいずれか一項に記載の化合物。
  57. Ｙ２が、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチドである、請求項４７～５６のいずれか一項に記載の化合物。
  58. 第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドをカップリングポリペプチドへと化学選択的にカップリングさせる方法であって、前記方法が、
    ａ）前記第１のポリペプチドを前記カップリングポリペプチドと接触させて、第１のポリペプチド－カップリングポリペプチド複合体を生成させる工程であって、
    前記第１のポリペプチドが、チオール部分を含み、
    前記カップリングポリペプチドが、前記第１のポリペプチドに存在するチオール部分と共有結合を形成するＮ末端反応性部分を含み、
    前記Ｎ末端反応性部分を含む前記カップリングポリペプチドが、前記Ｎ末端反応性部分を生成させるために、Ｎ末端フェノール部分またはカテコール部分及びＣ末端フェノール部分またはカテコール部分を含むポリペプチドと、前記Ｎ末端フェノール部分またはカテコール部分を酸化することはできるが前記Ｃ末端フェノール部分またはカテコール部分を酸化することはできない第１の酵素とを反応させることによって生成され、
    前記カップリングポリペプチドが、前記Ｎ末端フェノール部分またはカテコール部分の１０アミノ酸以内の２つ以上の正に荷電したまたは中性のアミノ酸と、前記Ｃ末端フェノール部分またはカテコール部分の１０アミノ酸以内の２つ以上の負に荷電したアミノ酸とを含む、
    前記工程；ならびに
    ｂ）前記第２のポリペプチドを、前記第１のポリペプチド－カップリングポリペプチド複合体と接触させる工程であって、
    前記２のポリペプチドが、チオール部分を含み、
    前記第１のポリペプチド－カップリングポリペプチド複合体が、前記第２のポリペプチドに存在するチオール部分と共有結合を形成するＣ末端反応性部分を含み、
    前記Ｃ末端反応性部分を含む前記第１のポリペプチド－カップリングポリペプチド複合体が、前記第１のポリペプチド－カップリングポリペプチド複合体と、前記Ｃ末端フェノール部分またはカテコール部分を酸化してＣ末端反応性部分を生成させることができる第２の酵素との反応によって生成され、
    前記接触が、第１のポリペプチド－カップリングポリペプチド－第２のポリペプチド複合体を生成する、
    前記工程
    を含む、前記方法。
  59. ａ）前記第１の酵素が、図８または図９に示されているａｂＴＹＲのアミノ酸配列に対して少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むチロシナーゼポリペプチドであり；かつ
    ｂ）前記第２の酵素が、図１０Ａ～１０Ｚ及び図１０ＡＡ～１０ＶＶのいずれか１つに示されているアミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むチロシナーゼポリペプチドである、
    請求項５８に記載の方法。
  60. 第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドをカップリングポリペプチドへと化学選択的にカップリングさせる方法であって、前記方法が：
    ａ）前記第１のポリペプチドを前記カップリングポリペプチドと接触させて、第１のポリペプチド－カップリングポリペプチド複合体を生成させる工程であって、
    前記第１のポリペプチドが、チオール部分を含み、
    前記カップリングポリペプチドが、前記第１のポリペプチドに存在するチオール部分と共有結合を形成するＮ末端反応性部分を含み、
    前記Ｎ末端反応性部分を含む前記カップリングポリペプチドが、前記Ｎ末端反応性部分を生成させるために、Ｎ末端フェノール部分またはカテコール部分及びＣ末端フェノール部分またはカテコール部分を含むポリペプチドと、前記Ｎ末端フェノール部分またはカテコール部分を酸化することはできるが前記Ｃ末端フェノール部分またはカテコール部分を酸化することはできない第１の酵素とを反応させることによって生成され、
    前記カップリングポリペプチドが、前記Ｎ末端フェノール部分またはカテコール部分の１０アミノ酸以内の２つ以上の負に荷電したアミノ酸と、前記Ｃ末端フェノール部分またはカテコール部分の１０アミノ酸以内に２つ以上の正に荷電したまたは中性のアミノ酸とを含む、
    前記工程；ならびに
    ｂ）前記第２のポリペプチドを、前記第１のポリペプチド－カップリングポリペプチド複合体と接触させる工程であって、
    前記２のポリペプチドが、チオール部分を含み、
    前記第１のポリペプチド－カップリングポリペプチド複合体が、前記第２のポリペプチドに存在するチオール部分と共有結合を形成するＣ末端反応性部分を含み、
    前記Ｃ末端反応性部分を含む前記第１のポリペプチド－カップリングポリペプチド複合体が、前記第１のポリペプチド－カップリングポリペプチド複合体と、前記Ｃ末端フェノール部分またはカテコール部分を酸化してＣ末端反応性部分を生成させることができる第２の酵素との反応によって生成され、
    前記接触が、第１のポリペプチド－カップリングポリペプチド－第２のポリペプチド複合体を生成する、
    前記工程
    を含む、前記方法。
  61. ａ）前記第１の酵素が、図１０Ａ～１０Ｚ及び図１０ＡＡ～１０ＶＶのいずれか１つに示されているアミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むチロシナーゼポリペプチドであり；かつ
    ｂ）前記第２の酵素が、図８または図９に示されているａｂＴＹＲのアミノ酸配列に対して少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むチロシナーゼポリペプチドである、
    請求項６０に記載の方法。
  62. 第１のポリペプチドを第２のポリペプチドへと共有結合させる方法であって、前記方法が：
    ａ）前記第１のポリペプチドを、固定化された反応性部分と接触させる工程であって、
    前記固定化された反応性部分が、固定化されたフェノール部分またはカテコール部分と第１の酵素との反応によって生成され、前記第１の酵素が、前記固定化されたフェノール部分またはカテコール部分を酸化することができ、それによって前記固定化された反応性部分が生成され、
    前記第１のポリペプチドが：ｉ）チオール部分；及びｉｉ）フェノール部分またはカテコール部分を含み、前記第１のポリペプチドが、前記フェノール部分またはカテコール部分の１０アミノ酸以内に２つ以上の負に荷電したアミノ酸を含み、
    前記固定化された反応性部分が、前記第１のポリペプチドに存在する前記チオール部分と共有結合を形成し、それにより、固定化された第１のポリペプチドが生成される、
    前記工程；
    ｂ）前記固定化された第１のポリペプチドを第２の酵素と接触させる工程であって、前記第２の酵素が、前記第１のポリペプチドに存在する前記フェノール部分またはカテコール部分を酸化して、反応性部分を含む固定化された第１のポリペプチドを生成させることができる、前記工程；ならびに
    ｃ）前記反応性部分を含む固定化された第１のポリペプチドを、第２のポリペプチドと接触させる工程であって、
    前記第２のポリペプチドが：ｉ）チオール部分；及びｉｉ）フェノール部分またはカテコール部分を含み、前記第２のポリペプチドが、前記フェノール部分またはカテコール部分の１０アミノ酸以内に２つ以上の中性または正の荷電を有し、
    前記固定化された第１のポリペプチドに存在する前記反応性部分が、前記第２のポリペプチドに存在する前記チオール部分と共有結合を形成し、それにより、前記第２のポリペプチドに共有結合した前記第１のポリペプチドを含む固定化された複合体が生成される、
    前記工程
    を含む、前記方法。
  63. 前記第１の酵素が、図８、図９、図１０Ａ～１０Ｚ、及び図１０ＡＡ～１０ＶＶのいずれか１つに示されているアミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むチロシナーゼポリペプチドである、請求項６２に記載の方法。
  64. 前記第１のポリペプチドに存在する前記チオール部分が、Ｃｙｓに存在し、前記第１のポリペプチドに存在する前記フェノール部分が、Ｔｙｒ残基に存在する、請求項６２または請求項６３に記載の方法。
  65. 前記Ｔｙｒ残基が、ＥＥＥＹ（配列番号９５３）、ＥＥＥＥＹ（配列番号９５５）、ＤＤＤＤＹ（配列番号９６５）、またはＤＤＤＤＹ（配列番号９６５）を含むアミノ酸のストレッチに存在する、請求項６４に記載の方法。
  66. 前記第２の酵素が、図１０Ａ～１０Ｚ及び図１０ＡＡ～１０ＶＶのいずれか１つに示されているアミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むチロシナーゼポリペプチドである、請求項６２～６５のいずれか一項に記載の方法。
  67. 前記方法が、
    ｃ）前記固定化された複合体を第３の酵素と接触させる工程であって、前記第３の酵素が、前記第２のポリペプチドに存在する前記フェノール部分またはカテコール部分を酸化して、反応性部分を含む固定化された複合体を生成させることができる、工程；及び
    ｃ）前記反応性部分を含む固定化された複合体を、第３のポリペプチドと接触させる工程であって、
    前記第３のポリペプチドが：ｉ）チオール部分；及びｉｉ）フェノール部分またはカテコール部分を含み、前記第３のポリペプチドが、前記フェノール部分またはカテコール部分の１０アミノ酸以内に２つ以上の負の荷電を有し、
    前記固定化された複合体に存在する前記反応性部分が、前記第２のポリペプチドに存在する前記チオール部分と共有結合を形成し、それにより、前記第２のポリペプチドに共有結合した前記第３のポリペプチドを含む固定化された複合体が生成される、
    前記工程
    をさらに含む、請求項６２～６６のいずれか一項に記載の方法。
  68. 前記第３の酵素が、図８または図９に示されているアミノ酸配列に対して少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むチロシナーゼポリペプチドである、請求項６７に記載の方法。
  69. 工程（ｂ）と工程（ｃ）との間に、前記第２の酵素を不活性化または除去する、請求項６７または６８に記載の方法。
  70. 前記第２のポリペプチドに存在する前記チオール部分が、Ｃｙｓに存在し、前記第２のポリペプチドに存在する前記フェノール部分が、Ｔｙｒ残基に存在する、請求項６７～６９のいずれか一項に記載の方法。
  71. 前記Ｔｙｒ残基が、ＲＲＲＹ（配列番号９４９）、ＲＲＲＲＹ（配列番号９５１）、ＫＫＫＹ（配列番号９６６）、またはＫＫＫＫＹ（配列番号９６７）を含むアミノ酸のストレッチに存在する、請求項７０に記載の方法。
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