JP2022524864A - 遺伝子サイレンシングを介した有害生物防除のための植物細胞内におけるｄｓＲＮＡの生成 - Google Patents

遺伝子サイレンシングを介した有害生物防除のための植物細胞内におけるｄｓＲＮＡの生成 Download PDF

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Abstract

有害生物遺伝子をサイレンシングすることができる長鎖ｄｓＲＮＡ分子を植物細胞内で生成する方法であって、（ａ）標的として植物遺伝子を有するサイレンシング分子であって、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）を動員することができるサイレンシング分子をコードしている核酸配列を植物のゲノムにおいて選択することと；（ｂ）有害生物遺伝子に対するサイレンシング特異性を付与するために当該植物遺伝子の核酸配列を改変し、その結果、当該サイレンシング特異性を有する当該植物遺伝子の転写物が、当該ＲｄＲｐを動員することができる当該サイレンシング分子と塩基相補を形成して、当該有害生物遺伝子をサイレンシングすることができる長鎖ｄｓＲＮＡ分子を生成し、それによって、当該有害生物遺伝子をサイレンシングすることができる長鎖ｄｓＲＮＡ分子を当該植物細胞内で生成することと、を含む方法が提供される。【選択図】なし

Description

関連出願
本願は、２０１９年３月１４日出願の英国特許出願第１９０３５２１．１号に対する優先権の利益を主張し、その内容全体を参照により本明細書に援用する。
配列表に関する記述
本願の出願と同時に提出された、２０２０年３月１２日に作成された７３，７２８バイトの８１３２１ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔと題されたＡＳＣＩＩファイルは、参照により本明細書に援用される。
発明の分野及び背景技術
本発明は、その幾つかの実施形態において、有害生物の標的遺伝子をサイレンシングするための、宿主細胞におけるｄｓＲＮＡ分子の生成及び増幅に関する。
近年のゲノム編集技術の進歩により、生存細胞のゲノム中の数十億個のヌクレオチドのうちのわずか数個を編集することによって、生存細胞におけるＤＮＡ配列を変化させることが可能になった。過去１０年間で、ヒトの体細胞及び多能性細胞等においてゲノム編集を使用するためのツール及び専門的技術が増加し、現在ではこのアプローチがヒトの疾患を治療するための戦略として広く展開されるまでになっている。その基本的なプロセスは、ゲノム中に部位特異的なＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を作り出し、次いで、細胞の内因性ＤＳＢ修復機構にその切断を修復させることに依る（例えば、非相同末端接合（ＮＨＥＪ）又は相同組換え（ＨＲ）等による、後者では、外因的に提供されたドナーテンプレートを用いてＤＮＡ配列に対して正確に１つ以上のヌクレオチドを変化させることができる（非特許文献１）。
例えば、有力な治療法については、３つの主要なアプローチで細胞の変異原性ゲノム編集（ＮＨＥＪ）が使用される：（ａ）空間的に正確な挿入又は欠失を引き起こすことにより、機能性遺伝要素をノックアウトする、（ｂ）原因であるフレームシフト変異を補う挿入又は欠失を作り出して、部分的に機能性又は非機能性の遺伝子を再活性化させる、及び（ｃ）規定の遺伝子欠失を作り出す。幾つかの異なる用途でＮＨＥＪによる編集が使用されるが、編集の最も広い用途は、恐らく相同組換え（ＨＲ）によるゲノム編集を利用する。ＨＲは稀な事象であるが、外因的に与えられたテンプレートに依存して修復プロセス中に正確な配列をコピーするので精度が高い。
現在、ＨＲが媒介するゲノム編集の４種の主な用途は、（ａ）遺伝子の修正（すなわち、単一遺伝子における点変異によって引き起こされる疾患の修正）、（ｂ）機能性遺伝子の修正（すなわち、遺伝子全体に点在する変異によって引き起こされる疾患の修正）、（ｃ）セーフハーバー遺伝子の付加（すなわち、正確な調節が必要ない場合又は上記非生理的レベルのトランスジーンが望ましい場合）、及び（ｄ）標的となるトランスジーンの付加（すなわち、正確な調節が必要な場合）（非特許文献１，前喝）である。
様々な真核生物（例えば、マウス、ヒト、エビ、植物）におけるＲＮＡ分子のゲノム編集に関するこれまでの研究は、例えば、ｍｉＲＮＡ遺伝子の活性をノックアウトしたり、標的ＲＮＡにおける結合部位を変化させたりすることに重点的に取り組んでいた。
ヒト細胞におけるゲノム編集に関しては、非特許文献２は、ＨｅＬａ細胞でヒトｍｉＲ－９３の５’領域を標的とすることによってクラスターからヒトｍｉＲ－９３を欠失させるためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用した。ドローシャプロセシング部位（すなわち、二本鎖ＲＮＡ特異的ＲＮａｓｅＩＩＩ酵素であるドローシャが、宿主細胞の核内で一次ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）に結合し、切断し、それによって、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡにプロセシングする位置）及びシード配列（すなわち、ｍｉＲＮＡのｍＲＮＡへの結合に不可欠な保存された７塩基（ｈｅｐｔａｍｅｔｒｉｃａｌ）の配列、典型的にはｍｉＲＮＡの５’末端から２～７番目に位置する）を含む標的となる領域において、様々な小さなが誘導された。非特許文献２によれば、１ヌクレオチドの欠失であっても、標的ｍｉＲＮＡが高い特異性で完全にノックアウトされた。
マウス種におけるゲノム編集に関しては、非特許文献３が、マウス細胞においてＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを使用するｍｉＲＮＡ阻害戦略を提供した。非特許文献３は、特別に設計したｓｇＲＮＡを用いて、Ｃａｓ９ヌクレアーゼによってｍｉＲＮＡ遺伝子を単一部位で切断し、その結果、これら細胞でｍｉＲＮＡがノックアウトされた。
植物のゲノム編集に関しては、非特許文献４が、植物におけるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９技術の使用について、ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮと比較して論じており、非特許文献５は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９技術が、シロイヌナズナ及びタバコ等のモデル植物、並びにコムギ、トウモロコシ、及びイネを含む作物において、タンパク質をコードしている遺伝子のノックダウンに応用されていることを教示している。
ｍｉＲＮＡ活性又は標的結合部位の破壊に加えて、人工ｍｉＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ）を介した内因性及び外因性の標的遺伝子の遺伝子サイレンシングを使用する遺伝子サイレンシングが実現されている（非特許文献６）。ｍｉＲＮＡと同様に、ａｍｉＲＮＡは一本鎖であり、約２１ヌクレオチド（ｎｔ）長であり、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ内の二重鎖の成熟ｍｉＲＮＡ配列を置換することによって設計される（前喝非特許文献６）。これらａｍｉＲＮＡは、人工発現カセット（プロモーター、ターミネーター等を含む）内にトランスジーンとして導入され（非特許文献７）、低分子ＲＮＡのバイオジェネシス及びサイレンシング機構を介してプロセシングされ、標的の発現をダウンレギュレートする。非特許文献８によれば、ａｍｉＲＮＡは、組織特異的又は誘導性プロモーターの下で発現したときに活性を有し、特に、幾つかの関連するが同一ではない標的遺伝子をダウンレギュレートする必要があるときに、植物における特異的遺伝子サイレンシングに使用することができる。
非特許文献９は、内因性ｍｉＲＮＡ遺伝子座へのプロモーターレス抗ウイルスＲＮＡｉヘアピンの導入を開示している。具体的には、非特許文献９は、Ｃａｓ９又はＴＡＬＥＮヌクレアーゼ等の配列特異的ヌクレアーゼによって誘導される相同性依存性ＤＮＡ組み換えによって、天然に存在するｍｉＲＮＡ遺伝子（例えば、ｍｉＲ１２２）に隣接するａｍｉＲＮＡ前駆体トランスジーン（ヘアピン型ｐｒｉ－ａｍｉＲＮＡ）を挿入する。このアプローチでは、天然のｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ１２２）を発現する転写的に活性のあるＤＮＡ遺伝子座を利用することによってプロモーター及びターミネーターのないａｍｉＲＮＡを使用する、すなわち、内因性のプロモーター及びターミネーターが、挿入されたａｍｉＲＮＡトランスジーンの転写を駆動し、調節した。
ＤＮＡを使わずにＲＮＡ及び／又はタンパク質を細胞内に導入する様々な方法が、既に報告されている。例えば、エレクトロポレーション及びリポフェクションを用いたＲＮＡトランスフェクションが、特許文献１に記載されている。非特許文献１０によって、Ｃａｓ９タンパク質及びｓｇＲＮＡ複合体のマイクロインジェクションによるＣａｓ９／ｓｇＲＮＡリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体の細胞への直接送達が記載されている。非特許文献１１によって、エレクトロポレーションを介したＣａｓ９タンパク質／ｓｇＲＮＡ複合体の送達が記載されている。非特許文献１２によって、リポソームを介したＣａｓ９タンパク質関連ｓｇＲＮＡ複合体の送達が報告されている。
米国特許出願公開第２０１６０２８９６７５号
Ｐｏｒｔｅｕｓ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｏｘｉｃｏｌ．（２０１６）５６：１６３－９０ Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１４）１１（１０）：１２４３－９ Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ（２０１４）４：３９４３ Ｂｏｒｔｅｓｉ ａｎｄ Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｄｖａｎｃｅｓ（２０１５）３３：４１－５２ Ｂａｓａｋ ａｎｄ Ｎｉｔｈｉｎ，Ｆｒｏｎｔ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．（２０１５）６：１００１ Ｔｉｗａｒｉ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（２０１４）８６：１ Ｃａｒｂｏｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ（２０１４）ｐｐ．１１３．２３４９８９ Ｓｃｈｗａｂ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ（２００６）Ｖｏｌ．１８，１１２１－１１３３ Ｓｅｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１７）Ｖｏｌ．４５（１）：ｅ３ Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，"Ｈｅｒｉｔａｂｌｅ ｇｅｎｅ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｉｎ Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ ｂｙ ｄｉｒｅｃｔ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｓ９－ｓｇＲＮＡ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎｓ，"Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０１３）１９５：１１７７－１１８０ Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，"Ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ ｖｉａ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｃａｓ９ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎｓ"Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．（２０１４）２４：１０１２－１０１９ Ｚｕｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，"Ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｉｄ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｅｎａｂｌｅｓ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｂａｓｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ"Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１４）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３０８１
本発明の幾つかの実施形態の態様によれば、有害生物遺伝子をサイレンシングすることができる長鎖ｄｓＲＮＡ分子を植物細胞内で生成する方法であって、（ａ）標的として植物遺伝子を有するサイレンシング分子であって、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）を動員することができるサイレンシング分子をコードしている核酸配列を植物のゲノムにおいて選択することと；（ｂ）有害生物遺伝子に対するサイレンシング特異性を付与するために当該植物遺伝子の核酸配列を改変し、その結果、当該サイレンシング特異性を有する当該植物遺伝子の転写物が、当該ＲｄＲｐを動員することができるサイレンシング分子と塩基相補を形成して、当該有害生物遺伝子をサイレンシングすることができる長鎖ｄｓＲＮＡ分子を生成し、それによって、当該有害生物遺伝子をサイレンシングすることができる長鎖ｄｓＲＮＡ分子を当該植物細胞内で生成することと、を含む方法が提供される。
本発明の幾つかの実施形態の態様によれば、植物細胞内で有害生物遺伝子をサイレンシングすることができる長鎖ｄｓＲＮＡ分子を植物細胞内で生成する方法であって、（ａ）標的として植物遺伝子を有するサイレンシング分子であって、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）を動員することができるサイレンシング分子をコードしている核酸配列を植物のゲノムにおいて選択することと；（ｂ）有害生物遺伝子に対するサイレンシング特異性を付与するために当該植物遺伝子の核酸配列を改変し、その結果、当該サイレンシング特異性を有する当該植物遺伝子の転写物が、当該ＲｄＲｐを動員することができるサイレンシング分子と塩基相補を形成して、当該有害生物遺伝子をサイレンシングすることができる長鎖ｄｓＲＮＡ分子を生成し、それによって、当該植物細胞内で当該有害生物遺伝子をサイレンシングすることができる長鎖ｄｓＲＮＡ分子を当該植物細胞内で生成することと、を含む方法が提供される。
本発明の幾つかの実施形態の態様によれば、有害生物遺伝子をサイレンシングすることができる長鎖ｄｓＲＮＡ分子を植物細胞内で生成する方法であって、（ａ）有害生物遺伝子の核酸配列に対して所定の配列相同性を示す植物遺伝子の核酸配列を選択することと；（ｂ）当該植物遺伝子に対するサイレンシング特異性を付与するために、ＲＮＡ分子をコードしている植物の内因性核酸配列を改変し、その結果、当該ＲＮＡ分子からプロセシングされたＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）を動員することができる低分子ＲＮＡ分子が、当該植物遺伝子の転写物と塩基相補を形成して、当該有害生物遺伝子をサイレンシングすることができる長鎖ｄｓＲＮＡ分子を生成し、それによって、当該有害生物遺伝子をサイレンシングすることができる長鎖ｄｓＲＮＡ分子を当該植物細胞内で生成することと、を含む方法が提供される。
本発明の幾つかの実施形態の態様によれば、有害生物耐性又は抵抗性植物を作製する方法であって、本発明の幾つかの実施形態に従って有害生物遺伝子をサイレンシングすることができる長鎖ｄｓＲＮＡ分子を植物細胞内で生成することを含む方法が提供される。
本発明の幾つかの実施形態の態様によれば、本発明の幾つかの実施形態の方法に従って作製された植物が提供される。
本発明の幾つかの実施形態の態様によれば、本発明の幾つかの実施形態の植物の細胞が提供される。
本発明の幾つかの実施形態の態様によれば、本発明の幾つかの実施形態の植物の種子が提供される。
本発明の幾つかの実施形態の態様によれば、有害生物耐性又は抵抗性植物を生成する方法であって、（ａ）本発明の幾つかの実施形態の植物を育種することと；（ｂ）有害生物遺伝子を抑制することができる長鎖ｄｓＲＮＡ分子を発現し、かつＤＮＡ編集剤を含まない後代植物を選択し、それによって、有害生物耐性又は抵抗性植物を生成することと、
を含む方法が提供される。
本発明の幾つかの実施形態の態様によれば、繁殖を可能にする条件下で植物又は植物細胞を成長させることを含む、本発明の幾つかの実施形態の植物又は植物細胞を生成する方法が提供される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＲｄＲｐを動員することができるサイレンシング分子は、２１～２４ヌクレオチドを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＲｄＲｐを動員することができるサイレンシング分子は、２１ヌクレオチドを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＲｄＲｐを動員することができるサイレンシング分子は、２２ヌクレオチドを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＲｄＲｐを動員することができるサイレンシング分子は、２３ヌクレオチドを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＲｄＲｐを動員することができるサイレンシング分子は、２４ヌクレオチドを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＲｄＲｐを動員することができるサイレンシング分子は、２１ヌクレオチドからなる。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＲｄＲｐを動員することができるサイレンシング分子は、２２ヌクレオチドからなる。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＲｄＲｐを動員することができるサイレンシング分子は、２３ヌクレオチドからなる。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＲｄＲｐを動員することができるサイレンシング分子は、２４ヌクレオチドからなる。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＲｄＲｐを動員することができるサイレンシング分子は、トランス作用性ｓｉＲＮＡ（ｔａｓｉＲＮＡ）、フェーズド低分子干渉ＲＮＡ（ｐｈａｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ結合ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、低分子核内ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、低分子核小体ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、細胞外ＲＮＡ（ｅｘＲＮＡ）、リピート由来のＲＮＡ、自律性及び非自律性の転位性ＲＮＡからなる群から選択される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ｍｉＲＮＡは、２２ヌクレオチドの成熟低分子ＲＮＡを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ－１５６ａ、ｍｉＲ－１５６ｃ、ｍｉＲ－１６２ａ、ｍｉＲ－１６２ｂ、ｍｉＲ－１６７ｄ、ｍｉＲ－１６９ｂ、ｍｉＲ－１７３、ｍｉＲ－３９３ａ、ｍｉＲ－３９３ｂ、ｍｉＲ－４０２、ｍｉＲ－４０３、ｍｉＲ－４４７ａ、ｍｉＲ－４４７ｂ、ｍｉＲ－４４７ｃ、ｍｉＲ－４７２、ｍｉＲ－７７１、ｍｉＲ－７７７、ｍｉＲ－８２８、ｍｉＲ－８３０、ｍｉＲ－８３１、ｍｉＲ－８３１、ｍｉＲ－８３３ａ、ｍｉＲ－８３３ａ、ｍｉＲ－８４０、ｍｉＲ－８４５ｂ、ｍｉＲ－８４８、ｍｉＲ－８５０、ｍｉＲ－８５３、ｍｉＲ－８５５、ｍｉＲ－８５６、ｍｉＲ－８６４、ｍｉＲ－２９３３ａ、ｍｉＲ－２９３３ｂ、ｍｉＲ－２９３６、ｍｉＲ－４２２１、ｍｉＲ－５０２４、ｍｉＲ－５６２９、ｍｉＲ－５６４８、ｍｉＲ－５９９６、ｍｉＲ－８１６６、ｍｉＲ－８１６７ａ、ｍｉＲ－８１６７ｂ、ｍｉＲ－８１６７ｃ、ｍｉＲ－８１６７ｄ、ｍｉＲ－８１６７ｅ、ｍｉＲ－８１６７ｆ、ｍｉＲ－８１７７、及びｍｉＲ－８１８２からなる群から選択される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、植物遺伝子は、非タンパク質コード遺伝子である。
本発明の幾つかの実施形態によれば、植物遺伝子は、コード遺伝子である。
本発明の幾つかの実施形態によれば、植物遺伝子は、内在性のサイレンシング活性を有する分子をコードしていない。
本発明の幾つかの実施形態によれば、方法は、有害生物遺伝子に対する植物遺伝子のサイレンシング特異性を付与するＤＮＡ編集剤を植物細胞に導入することを更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、工程（ｂ）の改変は、有害生物遺伝子に対する植物遺伝子のサイレンシング特異性を付与するＤＮＡ編集剤を植物細胞に導入することを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、植物遺伝子は、ネイティブの植物遺伝子に対する内在性のサイレンシング活性を有する分子をコードしている。
本発明の幾つかの実施形態によれば、方法は、植物遺伝子のサイレンシング特異性を、ネイティブの植物遺伝子とは異なる有害生物遺伝子に向けてリダイレクトするＤＮＡ編集剤を植物細胞に導入することを更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、方法は、植物遺伝子のサイレンシング特異性を、ネイティブの植物遺伝子とは異なる有害生物遺伝子に向けてリダイレクトするＤＮＡ編集剤を植物細胞に導入することを更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、工程（ｂ）の改変は、植物遺伝子のサイレンシング特異性を、ネイティブの植物遺伝子とは異なる有害生物遺伝子に向けてリダイレクトするＤＮＡ編集剤を植物細胞に導入することを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、内在性のサイレンシング活性を有する植物遺伝子は、トランス作用性ｓｉＲＮＡ（ｔａｓｉＲＮＡ）、フェーズド低分子干渉ＲＮＡ（ｐｈａｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ結合ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、低分子核内ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、低分子核小体ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、細胞外ＲＮＡ（ｅｘＲＮＡ）、自律性及び非自律性の転位性ＲＮＡからなる群から選択される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、内在性のサイレンシング活性を有する植物遺伝子は、フェーズド二次ｓｉＲＮＡ生成分子をコードしている。
本発明の幾つかの実施形態によれば、内在性のサイレンシング活性を有する植物遺伝子は、トランス作用性ｓｉＲＮＡ生成（ＴＡＳ）分子である。
本発明の幾つかの実施形態によれば、植物遺伝子のサイレンシング特異性は、有害生物遺伝子の転写物レベルを測定することによって判定される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、植物遺伝子のサイレンシング特異性は、表現型的に判定される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、表現型的な判定は、植物の有害生物抵抗性の判定によって行われる。
本発明の幾つかの実施形態によれば、植物遺伝子のサイレンシング特異性は、遺伝子型的に判定される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、植物の表現型は、植物の遺伝子型の前に判定される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、植物の遺伝子型は、植物の表現型の前に判定される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、植物遺伝子のサイレンシング特異性は、有害生物遺伝子の転写物レベルを測定することによって判定される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、表現型的な判定は、植物の有害生物抵抗性の判定によって行われる。
本発明の幾つかの実施形態によれば、所定の配列相同性は、７５～１００％の同一性を含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＲｄＲｐを動員することができる低分子ＲＮＡ分子は、２１～２４ヌクレオチドを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＲｄＲｐを動員することができる低分子ＲＮＡ分子は、２１ヌクレオチドを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＲｄＲｐを動員することができる低分子ＲＮＡ分子は、２２ヌクレオチドを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＲｄＲｐを動員することができる低分子ＲＮＡ分子は、２３ヌクレオチドを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＲｄＲｐを動員することができる低分子ＲＮＡ分子は、２４ヌクレオチドを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＲｄＲｐを動員することができる低分子ＲＮＡ分子は、２１ヌクレオチドからなる。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＲｄＲｐを動員することができる低分子ＲＮＡ分子は、２２ヌクレオチドからなる。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＲｄＲｐを動員することができる低分子ＲＮＡ分子は、２３ヌクレオチドからなる。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＲｄＲｐを動員することができる低分子ＲＮＡ分子は、２４ヌクレオチドからなる。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＲｄＲｐを動員することができる低分子ＲＮＡ分子は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ結合ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、トランス作用性ｓｉＲＮＡ（ｔａｓｉＲＮＡ）、フェーズド低分子干渉ＲＮＡ（ｐｈａｓｉＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、低分子核内ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、低分子核小体ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、細胞外ＲＮＡ（ｅｘＲＮＡ）、リピート由来のＲＮＡ、自律性及び非自律性の転位性ＲＮＡからなる群から選択される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＲＮＡ分子は、内在性のサイレンシング活性を有しない。
本発明の幾つかの実施形態によれば、方法は、植物遺伝子に対するＲＮＡ分子のサイレンシング特異性を付与するＤＮＡ編集剤を植物細胞に導入することを更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＲＮＡ分子は、ネイティブの植物遺伝子に対する内在性のサイレンシング活性を有する。
本発明の幾つかの実施形態によれば、方法は、ＲＮＡ分子のサイレンシング特異性を、ネイティブの植物遺伝子とは異なる植物遺伝子に向けてリダイレクトするＤＮＡ編集剤を植物細胞に導入することを更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、工程（ｂ）の改変は、ＲＮＡ分子のサイレンシング特異性を、ネイティブの植物遺伝子とは異なる植物遺伝子に向けてリダイレクトするＤＮＡ編集剤を植物細胞に導入することを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、有害生物遺伝子の核酸配列に対して所定の配列相同性を示す植物遺伝子は、サイレンシング分子をコードしていない。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＲＮＡ分子のサイレンシング特異性は、植物遺伝子又は有害生物遺伝子の転写物レベルを測定することによって判定される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＲＮＡ分子のサイレンシング特異性は、表現型的に判定される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、表現型的な判定は、植物の有害生物抵抗性の判定によって行われる。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＲＮＡ分子のサイレンシング特異性は、遺伝子型的に判定される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、植物の表現型は、植物の遺伝子型の前に判定される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、植物の遺伝子型は、植物の表現型の前に判定される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、少なくとも１つのｓｇＲＮＡを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、植物で発現可能なプロモータに動作可能に連結された少なくとも１つのｓｇＲＮＡを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、エンドヌクレアーゼを含まない。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、エンドヌクレアーゼを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、ｄＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、及びホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択されるＤＮＡ編集系のものである。
本発明の幾つかの実施形態によれば、エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９を含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＲＮＰとして細胞に適用される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、植物細胞内での発現をモニタリングするためにレポーターに連結される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、レポーターは、蛍光タンパク質である。
本発明の幾つかの実施形態によれば、植物細胞は、プロトプラストである。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ｄｓＲＮＡ分子は、細胞内ＲＮＡｉプロセシング機構によってプロセシング可能である。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ｄｓＲＮＡ分子は、二次低分子ＲＮＡにプロセシングされる。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ｄｓＲＮＡ及び／又は二次低分子ＲＮＡは、有害生物遺伝子に対するサイレンシング特異性を有する。
本発明の幾つかの実施形態によれば、有害生物は、無脊椎動物である。
本発明の幾つかの実施形態によれば、有害生物は、ウイルス、アリ、シロアリ、ミツバチ、スズメバチ、芋虫、コオロギ、トノサマバッタ、カブトムシ、カタツムリ、ナメクジ、線形動物、ゴキブリ（ｂｕｇ）、ハエ、ショウジョウバエ、コナジラミ、カ、バッタ、ウンカ、ハサミムシ、アブラムシ、カイガラムシ、ツリガネムシ、クモ、ダニ、キジラミ、マダニ、ガ、毛虫、サソリ、及び真菌からなる群から選択される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、植物は、作物、花卉、雑草、及び樹木からなる群から選択される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、植物は、非トランスジェニックである。
本発明の幾つかの実施形態によれば、植物は、トランスジェニック植物である。
本発明の幾つかの実施形態によれば、植物は、遺伝的に改変されていない（非ＧＭＯ）。
本発明の幾つかの実施形態によれば、植物は、遺伝的に改変されている（ＧＭＯ）。
特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び／又は科学用語は、本発明が関連する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載するものと類似又は等価な方法及び材料を本発明の実施態様の実施又は試験で用いることができるが、例示的な方法及び／又は材料について以下に記載する。矛盾する場合、定義を含む特許明細書が優先される。更に、材料、方法、及び実施例は、単なる例示であり、そして、必ずしも限定を意図するものではない。
本発明の幾つかの実施形態について、添付の図面を参照して、単なる例示として本明細書で説明する。次に図面を詳細に具体的に参照するが、示されている特徴は、一例であり、本発明の実施形態について例示的に論じることを目的とするものであることを強調する。これに関連して、図面に付随する説明は、本発明の実施形態がどのように実施され得るかを当業者に明らかにするものである。
図中、
図１は、遺伝子編集誘導遺伝子サイレンシング（ＧＥｉＧＳ）による標的遺伝子増幅について最初に提案するモデル（モデル１と称される）を説明する写真である。このモデルに従って（図中の対応する数字を参照）： １． 有害生物遺伝子「Ｘ」が標的遺伝子である（サイレンシングされたとき、有害生物が防除される） ２． 相同性検索により宿主関連遺伝子Ｘが同定される（植物遺伝子「Ｘ」） ３． アンプリファイア低分子ＲＮＡ（例えば、２２ｎｔ ｍｉＲＮＡ）のサイレンシング特異性を植物遺伝子「Ｘ」に対してリダイレクトするために、ＧＥｉＧＳを行う。 ４． アンプリファイア低分子ＧＥｉＧＳ ＲＮＡが、ＲｄＲｐ（増幅酵素）と結合するＲＩＳＣ複合体を形成する。 ５． ＲｄＲｐが、植物遺伝子「Ｘ」の転写物に対して相補的なアンチセンスＲＮＡ鎖を合成し、ｄｓＲＮＡを形成する。 ６． 植物遺伝子「Ｘ」のｄｓＲＮＡが、ダイサー（複数可）又はダイサー様タンパク質によって二次ｓＲＮＡにプロセシングされる。 ７． 植物遺伝子「Ｘ」のｄｓＲＮＡが、有害生物によって取り込まれる。有害生物内で、植物ｄｓＲＮＡ－Ｘが、ＲＮＡｉを介して対応する相同な有害生物遺伝子「Ｘ」をダウンレギュレートする低分子ＲＮＡにプロセシングされる。 ８． 場合によっては、二次ｓＲＮＡが有害生物によって取り込まれ、標的遺伝子「Ｘ」をサイレンシングする。 図２は、ＧＥｉＧＳによる標的遺伝子増幅について２番目に提案するモデル（モデル２と称される）を説明する写真である。このモデルに従って（図中の対応する数字を参照）： １． 有害生物遺伝子「Ｘ」が標的遺伝子である（サイレンシングされたとき、有害生物が防除される） ２． 天然に存在する増幅されたＲＮＡｉ前駆体のサイレンシング特異性を有害生物遺伝子「Ｘ」（例えば、ＴＡＳ；増幅され、ｔａｓｉＲＮＡにプロセシングされる）に対してリダイレクトするために、ＧＥｉＧＳを行う。 ３． 野生型アンプリファイアｓＲＮＡが、ＲｄＲｐ（増幅酵素）と結合するＲＩＳＣ複合体を形成する。 ４． ＲｄＲｐが、増幅されたＧＥｉＧＳ前駆体の転写物に対して相補的なアンチセンスＲＮＡ鎖を合成し、ｄｓＲＮＡを形成する ５． 増幅されたＧＥｉＧＳ ｄｓＲＮＡが、ダイサー（複数可）によって二次ｓＲＮＡにプロセシングされる。 ６． ＧＥｉＧＳのｄｓＲＮＡが有害生物によって取り込まれる。有害生物内で、植物のＧＥｉＧＳ－ｄｓＲＮＡが、ＲＮＡｉを介して対応する相同な有害生物遺伝子「Ｘ」をダウンレギュレートする低分子ＲＮＡにプロセシングされる ７． 場合によっては、ＧＥｉＧＳ－ｄｓＲＮＡに由来する二次ｓＲＮＡ（例えば、ＴＡＳ前駆体の場合はｔａｓｉＲＮＡ）も同様に有害生物によって取り込まれ、標的遺伝子「Ｘ」をサイレンシングする。 図３Ａは、（モデル１に従った）有害生物配列と相同な領域を有する植物における内因性遺伝子の同定を示す。具体的には、ＮＭ＿００１０３７０７１．１（シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）、配列番号２）の植物遺伝子に対するＡＦ５０２３９１．１（ダイズシスト線虫（Ｈ．ｇｌｙｃｉｎｅｓ）、配列番号１）の有害生物のｂｌａｓｔアラインメント。 図３Ｂは、（図３Ａに記載の）植物における相同性領域の下流の領域を標的とするｓｉＲＮＡ配列を保有する、設計されたｍｉＲＮＡベースのＧＥｉＧＳオリゴを示す。上：ＧＥｉＧＳオリゴ、配列番号３（赤はｓｉＲＮＡ）。下：有害生物に対して相同性を有する植物標的遺伝子（配列番号４）。緑は相同な有害生物配列（配列番号１）。ＧＥｉＧＳ－ｓｉＲＮＡによって標的とされると予測される配列を赤で示す。 図４Ａは、（モデル１に従った）有害生物の配列と相同な領域を有する植物における内因性遺伝子の同定を示す。具体的には、ＮＭ＿１１６３５１．７（シロイヌナズナ、配列番号６）の植物遺伝子に対するＡＦ５０００２４．１（ダイズシスト線虫、配列番号５）の有害生物のｂｌａｓｔアラインメント。 図４Ｂは、（図４Ａに記載の）植物における相同性領域の下流の領域を標的とするｓｉＲＮＡ配列を保有する、設計されたｍｉＲＮＡベースのＧＥｉＧＳオリゴを示す。上：ＧＥｉＧＳオリゴ、配列番号７（赤はｓｉＲＮＡ）。下：有害生物に対して相同性を有する標的遺伝子（配列番号８）。緑は相同な有害生物配列（配列番号５）。ＧＥｉＧＳ－ｓｉＲＮＡによって標的とされると予測される配列を赤で示す。 図５Ａは、（モデル１に従った）有害生物の配列と相同な領域を有する植物における内因性遺伝子の同定を示す。具体的には、ＮＭ＿００１２０３７５２．２（シロイヌナズナ、配列番号１０）の植物遺伝子に対するＡＦ４６９０６０．１（ダイズシスト線虫、配列番号９）の有害生物のｂｌａｓｔアラインメント。 図５Ｂは、（図５Ａに記載の）植物における相同性領域の下流の領域を標的とするｓｉＲＮＡ配列を保有する、設計されたｍｉＲＮＡベースのＧＥｉＧＳオリゴを示す。上：ＧＥｉＧＳオリゴ、配列番号１１（赤はｓｉＲＮＡ）。下：有害生物に対して相同性を有する標的遺伝子（配列番号１２）。緑は相同な有害生物配列（配列番号９）。ＧＥｉＧＳ－ｓｉＲＮＡによって標的とされると予測される配列を赤で示す。 図６は、ＧＥｉＧＳテンプレートを作製するための計算パイプラインの実施形態のフローチャートである。計算ＧｅｉＧＳパイプラインは、生物学的メタデータを適用し、内因性非コードＲＮＡ遺伝子（例えば、ｍｉＲＮＡ遺伝子）を最小限しか編集せずに新たに機能を獲得させる、すなわち、関心遺伝子発現を標的とするようにそのサイレンシング能力をリダイレクトするために使用されるＧｅｉＧＳ ＤＮＡドナーテンプレートを自動的に作製することを可能にする。 図７は、内因性ｍｉＲＮＡを、ＰＤＳ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡに置き換え、それによって、内因性ＰＤＳ遺伝子の遺伝子サイレンシングを誘導する、ゲノム編集誘導遺伝子サイレンシング（ＧＥｉＧＳ）の実施形態のフローチャートである。改変を導入するために、２成分系を使用している。第１に、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９系は、ＧＦＰ含有ベクターにおいて、設計された特定のガイドＲＮＡを通して、選択された遺伝子座において切断を行って、その部位における相同ＤＮＡ修復（ＨＤＲ）を促進する。第２に、新たに割り当てられた遺伝子を標的とするためにｍｉＲＮＡの配列を所望の通り改変したＤＯＮＯＲ配列を、ＨＤＲのテンプレートとして導入する。この系は、プロトプラストの形質転換に使用され、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９ベクターのＧＦＰシグナルに起因してＦＡＣＳによって濃縮され、回収され、植物に再生される。 図８Ａ～Ｃは、ＰＤＳ遺伝子のサイレンシングが光退色を引き起こすことを示す写真である。タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）（図８Ａ～Ｂ）及びシロイヌナズナ（図８Ｃ）の植物におけるＰＤＳ遺伝子をサイレンシングすると、ベンサミアナタバコ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）（図８Ｂ）及びシロイヌナズナ（図８Ｃ、右側）で光退色が引き起こされる。ＰＤＳのサイレンシングの３週間半後に写真を撮影した。 図９Ａは、Ｃｏｌ－０細胞におけるＨＤＲが媒介するゲノム交換の例、並びにこのような交換のＰＣＲ及びジェノタイピングに使用されるプライマーの模式図を示す。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９及びｓｇＲＮＡが交換領域を標的として、ｄｓＤＮＡの切断を生じさせた。ＤＯＮＯＲテンプレートは、相同ＤＮＡ修復（ＨＤＲ）によってそのゲノム遺伝子座（ＡｔＴＡＳ１ｂ又はＡｔＴＡＳ３ａ）に挿入し、所望の交換を導入するための相同性アームを保有していた。交換領域：線形動物の遺伝子を標的とするように改変された配列。短い矢印は、ゲノムの交換を実証するためのＰＣＲに使用した、全ての反応に共通の交換特異的又はｗｔ特異的なフォワードプライマー及び非特異的リバースプライマーを表す。リバースプライマーは、ＤＯＮＯＲテンプレートの増幅を避けるために、組換え部位の更に下流でアニーリングするように設計した。交換特異的フォワードプライマーは、交換が発生した場合にこれだけが増幅を可能にするように設計した。野生型（ＷＴ）の配列のみでＰＣＲ増幅を制御するために、追加のフォワードプライマーを設計した。点線は、ＰＣＲ産物を表す。楕円は、サンガーシーケンシング反応に使用したリバースプライマーを示す。 図９Ｂ～Ｃは、ＷＴプライマーを用いて生成されたＰＣＲ産物の電気泳動の顕微鏡写真を示す。実施例３に記載の全ての処理から抽出したＤＮＡに対するＰＣＲのために、非特異的リバースプライマー及びＷＴ特異的プライマーを用いた。ＰＣＲ産物を１．６％アガロースゲルで泳動した。小さな矢印及び数字は、予測されるＰＣＲ産物のバンド及びサイズを示す。（図９Ｂ）は、ＡｔＴＡＳ１ｂ遺伝子座のＰＣＲ反応を表し、（図９Ｃ）は、ＡｔＴＡＳ３ａ遺伝子座の反応を表す。Ｙ２５：Ｙ２５、ＣＯＰＩ複合体のβサブユニット；スプライシング：スプライシング因子；Ｒｉｂｏ３ａ：リボソームタンパク質３ａ；Ｓｐｌｉｃｅｏ：スプライセオソームＳＲタンパク質；ＷＴ：野生型。Ｈ２Ｏ：テンプレートなし、水のＰＣＲ陰性対照。ＭＷ：１ｋｂ＋分子量ラダー（ＮＥＢ）。 図９Ｄ～Ｅは、交換特異性プライマーを用いて生成されたＰＣＲ産物の電気泳動の顕微鏡写真を示す。実施例３における全ての交換処理から抽出したＤＮＡに対するＰＣＲのために、非特異的リバースプライマー及び交換特異的フォワードプライマーを用いた。反応の特異性についての対照として、ＷＴ ＤＮＡもテンプレートとして使用した。ＰＣＲ産物を１．６％アガロースゲルで泳動した。小さな矢印及び数字は、予測されるＰＣＲ産物のバンド及びサイズを示す。（図９Ｄ）は、ＡｔＴＡＳ１ｂ（Ｔａｓ１ｂ）遺伝子座における交換についてのＰＣＲ反応を表し、（図９Ｅ）はＡｔＴＡＳ３ａ（Ｔａｓ３ａ）遺伝子座における交換についての反応を表す。Ｙ２５：Ｙ２５、ＣＯＰＩ複合体のβサブユニット；スプライシング：スプライシング因子；Ｒｉｂｏ３ａ：リボソームタンパク質３ａ；Ｓｐｌｉｃｅｏ：スプライセオソームＳＲタンパク質；ＷＴ：野生型。Ｈ２Ｏ：テンプレートなし、水のＰＣＲ陰性対照。ＭＷ：１ｋｂ＋分子量ラダー（ＮＥＢ）。 図９Ｆ～Ｇは、ＰＣＲ産物のサンガーシーケンシング反応のスキームを示す。各ＰＣＲ産物のサンガーシーケンシングのために、図９Ａの非特異的リバースプライマーを用いた。矢印は、ＰＣＲ増幅に使用した特異的フォワードプライマーを表す。ＨＤＲ事象の後に導入された追加のヌクレオチド変化（反応に使用したプライマーに由来するものではない）をハイライト表示し、灰色で塗りつぶしている。クロマトグラムは、予測配列（上線）に対してアライメントしたＰＣＲ産物の配列を示す。（図９Ｆ）は、ＡｔＴＡＳ１ｂ（Ｔａｓ１ｂ）遺伝子座における交換についてのシーケンシング反応を表し、（図９Ｇ）はＡｔＴＡＳ３ａ（Ｔａｓ３ａ）遺伝子座における交換についての反応を表す。Ｙ２５：Ｙ２５、ＣＯＰＩ複合体のβサブユニット；スプライシング：スプライシング因子；Ｒｉｂｏ３ａ：リボソームタンパク質３ａ；Ｓｐｌｉｃｅｏ：スプライセオソームＳＲタンパク質；ＷＴ：野生型。 図１０Ａ～Ｂは、Ｃｏｌ－０細胞においてＨＤＲが媒介するゲノム交換を通して作製されたｄｓＲＮＡのセンス鎖（図１０Ａ）及びアンチセンス鎖（図１０Ｂ）の模式図である。交換領域：線形動物の遺伝子を標的とするように改変された配列。短い矢印は、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）及びｃＤＮＡの作製に使用した非特異的プライマーを表す。追加の短い矢印は、交換の発現を証明するためにｃＤＮＡに対するＰＣＲ（ＰＣＲ）に使用した、全ての反応に共通する交換特異的プライマー及び非特異的プライマーを表す。ＰＣＲ反応は、全てのＰＣＲ産物の長さが２００ヌクレオチド未満になるように設計した。特異的プライマーは、交換が発生した場合にこれだけが増幅を可能にするように設計した。点線は、予測されるＰＣＲ産物を表す。楕円は、サンガーシーケンシング反応に使用したプライマーを示す。方向は、転写物の５’→３’を示す。 図１０Ｃ～Ｄは、ＡｔＴＡＳ１ｂのセンス及びアンチセンスＲＮＡ鎖の発現を調べて、交換を含むｄｓＲＮＡを検出するための、ＰＣＲ産物の電気泳動の顕微鏡写真を示す。ＲＴ－ＰＣＲ反応を行ってｃＤＮＡを作製し、続いて、図１０Ａ～Ｂに記載のプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ産物を１．６％アガロースゲルで泳動した。小さな矢印及び数字は、予測されるＰＣＲ産物のバンド及びサイズを示す。（図１０Ｃ）は、ＡｔＴＡＳ１ｂセンスＲＮＡ転写物のＰＣＲ反応を表し、（図１０Ｄ）は、ＡｔＴＡＳ１ｂアンチセンスＲＮＡ転写物のＰＣＲ反応を表す。Ｙ２５：Ｙ２５、ＣＯＰＩ複合体のβサブユニット；ＷＴ：野生型；Ｈ２Ｏ：テンプレートなし、水のＰＣＲ陰性対照；ＭＷ：１ｋｂ＋分子量ラダー（ＮＥＢ）。＋ＲＴ：逆転写酵素によって増幅されたｃＤＮＡをテンプレートとして使用したＰＣＲ反応。－ＲＴ：逆転写対照－逆転写酵素を使用せず、ｃＤＮＡが作製されなかった。 図１０Ｅ～Ｆは、ＡｔＴＡＳ３ａのセンス及びアンチセンスＲＮＡ鎖の発現を調べて、交換を含むｄｓＲＮＡを検出するための、ＰＣＲ産物の電気泳動の顕微鏡写真を示す。ＲＴ－ＰＣＲ反応を行ってｃＤＮＡを作製し、続いて、図１０Ａ－Ｂに記載のプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ産物を１．６％アガロースゲルで泳動した。小さな矢印及び数字は、予測されるＰＣＲ産物のバンド及びサイズを示す。（図１０Ｅ）は、ＡｔＴＡＳ３ａセンスＲＮＡ転写物のＰＣＲ反応を表し、（図１０Ｆ）は、ＡｔＴＡＳ３ａアンチセンスＲＮＡ転写物のＰＣＲ反応を表す。Ｒｉｂｏ３ａ：リボソームタンパク質３ａ；ＷＴ：野生型。Ｈ２Ｏ：テンプレートなし、水のＰＣＲ陰性対照。ＭＷ：１ｋｂ＋分子量ラダー（ＮＥＢ）。＋ＲＴ：逆転写酵素によって増幅されたｃＤＮＡをテンプレートとして使用したＰＣＲ反応。－ＲＴ：逆転写対照－逆転写酵素を使用せず、ｃＤＮＡが作製されなかった。 図１０Ｇは、交換が導入されたＲＮＡのセンス鎖を増幅したＰＣＲ産物のサンガーシーケンシング反応のスキームを示す。各ＰＣＲ産物のサンガーシーケンシングには、図１０Ａの非特異的フォワードプライマーを用いた。矢印は、ＰＣＲ増幅に使用した特異的リバースプライマーを示す。ＤＯＮＯＲテンプレートによって導入された追加のヌクレオチド変更をハイライト表示し、灰色で塗りつぶしている。クロマトグラムは、予測配列に対してアライメントしたＰＣＲ産物の配列を示す。上のパネルは、ＡｔＴＡＳ１ｂ（Ｔａｓ１ｂ）遺伝子座における交換の発現を証明するためのシーケンシング反応を表し、下のパネルは、ＡｔＴＡＳ３ａ（Ｔａｓ３ａ）遺伝子座における交換の発現を証明するための反応を表す。Ｙ２５：Ｙ２５、ＣＯＰＩ複合体のβサブユニット；Ｒｉｂｏ３ａ：リボソームタンパク質３ａ；ＷＴ：野生型。 図１０Ｈは、交換が導入されたＲＮＡのアンチセンス鎖を増幅したＰＣＲ産物のサンガーシーケンシング反応のスキームを示す。各ＰＣＲ産物のサンガーシーケンシングには、図１０Ｂの非特異的リバースプライマーを用いた。矢印は、ＰＣＲ増幅に使用した特異的フォワードプライマーを表す。ＤＯＮＯＲテンプレートによって導入された追加のヌクレオチド変更をハイライト表示し、灰色で塗りつぶしている。クロマトグラムは、予測配列に対してアライメントしたＰＣＲ産物の配列を示す。上段は、ＡｔＴＡＳ１ｂ（Ｔａｓ１ｂ）遺伝子座における交換の発現を証明するためのシーケンシング反応を表し、下段は、ＡｔＴＡＳ３ａ（Ｔａｓ３ａ）遺伝子座における交換の発現を証明するための反応を表す。Ｙ２５：Ｙ２５、ＣＯＰＩ複合体のβサブユニット；Ｒｉｂｏ３ａ：リボソームタンパク質３ａ；ＷＴ：野生型。 図１０Ｉは、Ｔａｓ１ｂ及びＴａｓ３ａから転写された野生型ＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖を増幅したＰＣＲ産物のサンガーシーケンシング反応のスキームを示す。センス転写物については、各ＰＣＲ産物のサンガーシーケンシングのために図１０Ａの非特異的フォワードプライマーを用いた。アンチセンス転写物については、センス各ＰＣＲ産物のサンガーシーケンシングのために図１０Ｂの非特異的リバースプライマーを用いた。矢印は、ＰＣＲ増幅に使用したフォワードプライマーを表す。クロマトグラムは、アノテーションされたＷＴ配列に対してアライメントしたＰＣＲ産物の配列を示す。 図１１Ａは、下のパネルにおいて、ＴｕＭＶ転写レベルの定量及びＧＦＰの可視化を通して相対発現を測定することによって表した、様々な処理と共に接種した後のベンサミアナタバコの葉におけるＴｕＭＶ感染レベルを示す棒グラフを提供する。対照及び処理を、同じ葉の上に並べて浸透させた。左から右へ－（１）ＴｕＭＶベクターを含有するアグロバクテリウム（ｎ＝３；葉の左側）又は任意のベクターを含有しないアグロバクテリウム（ｎ＝３；葉の右側）を葉に浸透させた。（２）ｍｉＲ１７３を過剰発現するベクターを含有するアグロバクテリウム（ｎ＝３；左側）又はベクターを含有しないアグロバクテリウム（ｎ＝３；右側）を葉に浸透させた。（３）ＧＥｉＧＳ－ダミー（ｎ＝３；左側）又はＧＥｉＧＳ－ＴｕＭＶ（ｎ＝３；右側）を過剰発現するベクターを葉に浸透させた。（４）ＧＥｉＧＳ－ダミーを過剰発現するベクターを含有するアグロバクテリウム（ｎ＝３、左側）又はＧＥｉＧＳ－ＴｕＭＶをコードしている（ｅｎｄｏｃｉｎｇ）ベクターを含有するアグロバクテリウム（ｎ＝２、右側）を、いずれもｍｉＲ１７３を過剰発現するベクターを含有するアグロバクテリウムと同時に葉に浸透させた。上のパネルの顕微鏡写真は、分析したサンプルの代表的な写真である。ＴｕＭＶは、ＵＶ光下で可視化されたＧＦＰシグナルによってモニタリングした。棒グラフは平均値を示し；エラーバーは標準誤差を表し；一元配置分散分析及び事後チューキーＨＳＤ検定に従って＊－ｐ値＜０．０５；＊＊－ｐ値＜０．０１。 図１１Ｂは、ＧＥｉＧＳ－ダミー及びｍｉＲ１７３を過剰発現するベクター（中央）、又はＧＥｉＧＳ－ＴｕＭＶ及びｍｉＲ１７３を過剰発現するベクター（右）を含有するアグロバクテリウムをベンサミアナタバコの葉全体に同時に浸透させた写真を示す。対照の葉には、ベクターを含有しないアグロバクテリウムを浸透させた（左）。ＴｕＭＶは、ＵＶ光下で可視化されたＧＦＰシグナルによってモニタリングした。 図１２Ａは、ｍｉＲ３９０及びリボソームタンパク質３ａを標的とするように改変されたＴＡＳ３ａを過剰発現するベクターを同時に浸透させたベンサミアナタバコの葉から抽出した全ＲＮＡを給餌した線形動物におけるリボソームタンパク質３ａの相対発現を提供する棒グラフである。ＴＡＳ３ａ ｗｔバックボーン及びｍｉＲ３９０アンプリファイアを過剰発現する外植片由来のＲＮＡを給餌した線形動物を対照として使用した。内因性のノーマライザー遺伝子としてアクチンを用いたｑＲＴ－ＰＣＲにより、ＲＮＡ抽出物を３日間給餌した線形動物に対して分析を行った。（エラーバーは、標準誤差を表し；＊＊＊－ｐ値＜０．００１）。 図１２Ｂは、ｍｉＲ３９０及びスプライセオソームＳＲタンパク質を標的とするように改変されたＴＡＳ３ａを過剰発現するベクターを同時に浸透させたベンサミアナタバコの葉から抽出した全ＲＮＡを給餌した線形動物におけるスプライセオソームＳＲタンパク質の相対発現を提供する棒グラフである。ＴＡＳ３ａ ｗｔバックボーン及びｍｉＲ３９０アンプリファイアを過剰発現する外植片由来のＲＮＡを給餌した線形動物を対照として使用した。内因性のノーマライザー遺伝子としてアクチンを用いたｑＲＴ－ＰＣＲにより、ＲＮＡ抽出物を３日間給餌した線形動物に対して分析を行った。（エラーバーは、標準誤差を表し；＊＊－ｐ値＜０．０１）。 図１３Ａ～Ｄは、浸透の４８～７２時間後の、ＧＥｉＧＳ設計に対してアラインメントされた、リボソームタンパク質３ａ（図１３Ａ及び１３Ｂ）及びスプライセオソームＳＲタンパク質（図１３Ｃ及び１３Ｄ）に対するＧＥｉＧＳ設計並びにｍｉＲ３９０を発現するベクターを浸透させたベンサミアナタバコの葉のＲＮＡ－ｓｅｑ解析（図１３Ａ及び１３Ｃ）及びｓｍａｌｌ ＲＮＡ－ｓｅｑ解析（図１３Ｂ及び１３Ｄ）を示す。各プロットにおける薄い灰色の矩形は、転写物におけるｍｉＲ３９０結合領域を示す。各プロットにおける黒色の四角は、線形動物における遺伝子を標的とする二次ｓｉＲＮＡを生じさせる標的遺伝子に対する相同領域を示す。各プロットにおける上側のクロマトグラムはセンス鎖を示し、一方、下側のクロマトグラムはアンチセンスを示す。
本発明は、その幾つかの実施形態において、有害生物の標的遺伝子をサイレンシングするための宿主細胞におけるｄｓＲＮＡ分子の生成及び増幅に関する。
図面及び付随する説明を参照することで、本発明の原理及び操作をより深く理解することができる。
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において、以下の明細書に記載されるか又は実施例によって例示される詳細に必ずしも限定されるものではないことを理解されたい。本発明は、他の実施形態が可能であるか、又は様々な方法及び異なる生物において実施若しくは実行することができる。また、本明細書で使用される語句及び用語は説明目的のためのものであり、限定するものであるとみなされるべきではないことを理解されたい。
様々な生物（例えば、マウス、ヒト、植物）におけるＲＮＡ分子のゲノム編集に関するこれまでの研究は、遺伝子導入を使用してｍｉＲＮＡの活性又は標的結合部位を破壊することに重点的に取り組んでいた。植物におけるゲノム編集は、モデル植物の遺伝子又は挿入をノックダウンするために、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９技術、ＺＦＮ、及びＴＡＬＥＮ等のヌクレアーゼを用いることに集中していた。更に、人工ｍｉＲＮＡトランスジーンを用いて内因性及び外因性の標的遺伝子をサイレンシングする、植物における遺伝子サイレンシングも報告されている［Ｍｏｌｎａｒ Ａ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｊ．（２００９）５８（１）：１６５－７４．ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．１３６５－３１３Ｘ．２００８．０３７６７．ｘ．Ｅｐｕｂ ２００９ Ｊａｎ １９；Ｂｏｒｇｅｓ ａｎｄ Ｍａｒｔｉｅｎｓｓｅｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｜ ＡＯＰ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ４ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２０１５；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｍ４０８５］。人工ｍｉＲＮＡトランスジーンは、人工発現カセット（プロモーター、ターミネーター、選択マーカー等を含む）内で植物細胞に導入され、標的の発現をダウンレギュレートする。
近年のゲノム編集技術の進歩により、ゲノムの所望の位置において部位特異的二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導した後に、ゲノム編集（ＮＨＥＪ及びＨＲ）等によってヒト患者の細胞で１個以上の数個のヌクレオチドを編集することによって、生存細胞のＤＮＡ配列を変化させることも可能となっている。ＮＨＥＪが、それのみではないが主にノックアウトを目的として使用されるのに対し、ＨＲは、点変異等の特定の部位の正確な編集を導入したり、天然に存在する又は遺伝的に受け継がれた有害な変異を修正したりするために使用される。
成熟低分子ＲＮＡ（すなわち、ダイサー生成物及び非ダイサー生成物）及びｄｓＲＮＡ（すなわち、ダイサー基質、例えば、低分子ＲＮＡ前駆体）は、効率的な細胞内遺伝子ノックダウンを媒介することができる。ｍｉＲＮＡのバイオジェネシスは、ｄｓＲＮＡ構造（例えば、ヘアピン型前駆体）の存在を必要とする。しかし、ヘアピン型ＲＮＡは、有害生物に効率よく取り込まれない可能性があり、その理由は、（ｉ）不安定であるため量が少ない（例えば、ダイサーによってプロセシングされる）及び（ｉｉ）ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）によるＲＮＡ－ＲＮＡ増幅段階がないためである。そのため、有害生物は摂取した低分子ＲＮＡ前駆体（例えば、ｄｓＲＮＡ）の影響をより受けやすくなる。
本発明を実用化するにあたり、本発明者らは、有害生物遺伝子を標的とするために植物の細胞及び組織内で長鎖ｄｓＲＮＡ分子を生成させることを目的とした遺伝子編集技術を考案した。このようなｄｓＲＮＡ分子は、可動性であり、細胞及び組織間で移動可能であるので、細胞内で生成されたら、細胞外に現れる場合もある。更に、このようなｄｓＲＮＡ分子は、ｄｓＲＮＡを発現している宿主（例えば、植物の葉及び茎）に由来する物質を摂取することを通して生物間を移動することもできる。具体的には、本発明者らは、２つのモデルのうちの１つを含むＧＥｉＧＳシステムを開発した。
下記のモデルは、その全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９／０５８２５５号に記載されているように、遺伝子編集誘導遺伝子サイレンシング（ＧＥｉＧＳ）技術に一部基づいている。本明細書で使用するとき、語句「ＧＥｉＧＳが行われる」は、サイレンシングＲＮＡをコードしている核酸配列を、コードされているサイレンシングＲＮＡが選択した標的を標的とするように改変することを本質的に含む、サイレンシングＲＮＡのサイレンシング特異性をリダイレクトするためにＧＥｉＧＳ技術を使用することに関する。幾つかの実施形態によれば、ＧＥｉＧＳは、（例えば、Ｃａｓ９等であるがこれに限定されないエンドヌクレアーゼを発現させるか又は細胞内に導入することによって）細胞内のサイレンシングＲＮＡをコードしている核酸配列において二本鎖切断を誘導し、サイレンシングＲＮＡをコードしている核酸配列に所望のヌクレオチド変化を含む核酸テンプレートを提供することによって行われる。このような実施形態によれば、ヌクレオチド変化は、次いで、核酸テンプレートの関連部分が導入される際に、相同性依存性組み換え（ＨＤＲ）を介してサイレンシングＲＮＡをコードしている核酸配列に導入される。幾つかの実施形態によれば、核酸テンプレートは、サイレンシングＲＮＡが選択した標的配列を標的とするように、サイレンシングＲＮＡをコードしている核酸配列にヌクレオチドの変化を導入する。ｍｉＲＮＡ又はｔａｓｉＲＮＡをコードしている核酸配列においてヌクレオチドを変化させるためにＧＥｉＧＳを使用する例は、本明細書において以下の実施例１Ｂ及び３に例示される。
第１のモデルでは、有害生物標的遺伝子と相同な植物遺伝子を同定する。低分子ＲＮＡ分子のサイレンシング特異性を植物遺伝子（有害生物標的遺伝子と相同）に対してリダイレクトするためにＧＥｉＧＳを実施する。この低分子ＲＮＡ分子（アンプリファイア又はプライマー低分子ＲＮＡとも称される）は、ＲｄＲｐと複合体を形成し、ＲｄＲｐは、植物遺伝子の転写物に対して相補的なアンチセンスＲＮＡ鎖を合成してｄｓＲＮＡを形成する。次いで、ｄｓＲＮＡは、二次低分子ＲＮＡ（ｓＲＮＡ）に更にプロセシングされる。重要なことに、一次低分子ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、及び二次低分子ＲＮＡ分子（すなわち、例えばＤｉｃｅｒ様により新たに生成されたｄｓＲＮＡのＲＮＡｉプロセシングの産物）は、有害生物に取り込まれ、有害生物の遺伝子サイレンシングを媒介することができる。本質的に、ＧＥｉＧＳを用いてアンプリファイア低分子ＲＮＡ分子のターゲティング特異性をリダイレクトすることにより、第１のモデルは、これまで長鎖ｄｓＲＮＡを形成していなかった配列から新たな長鎖ｄｓＲＮＡを形成することを可能にし、その結果、フェーズドＲＮＡ生成遺伝子座が生じる。この遺伝子座は、有害生物遺伝子に対する天然の類似性を保有しているので、得られる長鎖ｄｓＲＮＡは、有害生物内の対応する遺伝子をサイレンシングする能力を保有する。
第２のモデルでは、天然に二本鎖ＲＮＡ形態に変換された植物遺伝子（長鎖ｄｓＲＮＡ及びフェーズドＲＮＡを生成する天然に増幅された遺伝子座、例えば、天然に存在するＴＡＳ）に対してＧＥｉＧＳを実施して、サイレンシング特異性を有害生物標的遺伝子に向けてリダイレクトする。最初に、標的として植物遺伝子を有し、ＲｄＲｐと複合体を形成することができるネイティブのサイレンシングＲＮＡ分子（本明細書では、アンプリファイア又はプライマー低分子ＲＮＡとも称される；例えば、ｍｉＲ－１７３等の２２ｎｔ ｍｉＲＮＡ）を選択する。ＲｄＲｐは、植物遺伝子の転写物に対して相補的なアンチセンスＲＮＡ鎖を合成して、長鎖ｄｓＲＮＡを形成する。次いで、長鎖ｄｓＲＮＡは、二次ｓＲＮＡ（すなわち、例えばＤｉｃｅｒ様によって新たに生成されたｄｓＲＮＡのＲＮＡｉプロセシングの産物）に更にプロセシングされる。このモデルによれば、長鎖ｄｓＲＮＡ及び二次低分子ＲＮＡ分子は有害生物に取り込まれ、有害生物遺伝子のサイレンシングを媒介することができる。
このように、本発明は、より多くの量及びより大きな低分子ＲＮＡ集団を与え、従って、はるかに高いサイレンシング有効性を有する、植物の細胞及び組織において増幅可能なｄｓＲＮＡ分子の形成を提供する。更に、ｄｓＲＮＡ分子から作製される複数の二次低分子ＲＮＡは、効率的な標的のノックダウンの機会を増加させる。本方法によって生成されたｄｓＲＮＡ分子は、有害生物に効率的に取り込まれるため、植物に害を与えることなく、効率的に遺伝子をサイレンシングし、有害生物遺伝子を安全に制御することが可能になる。更に、本明細書に記載の遺伝子編集技術は、プロモーター、ターミネーター、選択マーカーを有する発現カセットを含む古典的な分子遺伝学的及びトランスジェニックツールを実行しない。
従って、本発明の一態様によれば、有害生物遺伝子をサイレンシングすることができる長鎖ｄｓＲＮＡ分子を植物細胞内で生成する方法であって、
（ａ）有害生物遺伝子の核酸配列に対して所定の配列相同性を示す植物遺伝子の核酸配列を選択することと；
（ｂ）当該植物遺伝子に対するサイレンシング特異性を付与するために、ＲＮＡ分子をコードしている植物の内因性核酸配列を改変し、その結果、当該ＲＮＡ分子からプロセシングされたＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）を動員することができる低分子ＲＮＡ分子が、当該植物遺伝子の転写物と塩基相補を形成して、当該有害生物遺伝子をサイレンシングすることができる長鎖ｄｓＲＮＡ分子を生成し、
それによって、当該有害生物遺伝子をサイレンシングすることができる長鎖ｄｓＲＮＡ分子を当該植物細胞内で生成することと、
を含む方法が提供される。
用語「長鎖ｄｓＲＮＡ分子」は、本明細書で使用するとき、第１の鎖（センス鎖）及び第１の鎖の逆相補体である第２の鎖（アンチセンス鎖）を有するポリリボ核酸の二本鎖配列を指し、当該ポリリボ核酸は、塩基対合（例えば、塩基対合の領域において互いの逆相補体である２つの配列）によって結合し、当該二本鎖のポリリボ核酸は、ダイサーファミリー由来の酵素の基質となり得、典型的には、当該長鎖ｄｓＲＮＡ分子は、少なくとも２６ｂｐ以上である。２本の鎖は同じ長さであってもよく、異なる長さであってもよいが、ただし、２本の鎖の間には、全長にわたって少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の相補性を有する安定な二本鎖構造が形成されるのに十分な配列相同性が存在する。
用語「相補」、「相補性」、又は「相補的」の使用は、ＲＮＡ分子（又はプロセシングされた低分子ＲＮＡの形態で存在するその少なくとも一部、又は二本鎖ポリヌクレオチドの少なくとも一本の鎖若しくはその一部、又は一本鎖ポリヌクレオチドの一部）が生理学的条件下で標的ＲＮＡ（例えば、植物遺伝子の転写物）又はその断片にハイブリダイズして、標的遺伝子のＲｄＲｐが媒介する合成を調節する又は機能を発揮させることを意味する。例えば、幾つかの実施形態では、ＲＮＡ分子（例えば、低分子ＲＮＡ分子）は、標的ＲＮＡ（又は所与の標的遺伝子のファミリーメンバー）における１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００個、又はそれ以上の連続するヌクレオチドの配列と比較して、１００％の配列同一性、又は少なくとも約３０、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％の配列同一性を有する。
本明細書で使用するとき、ＲＮＡ分子又はそのプロセシングされた低分子ＲＮＡの形態態（以下で更に詳細に論じる）は、５’→３’に読んだ配列の一方の全てのヌクレオチドが、３’→５’に読んだときの他方の配列の全てのヌクレオチドに対して相補的である場合、「完全な相補性」を示すと言われる。参照ヌクレオチド配列に対して完全に相補的なヌクレオチド配列は、参照ヌクレオチド配列の逆相補的配列と同一の配列を示す。
配列の相補性を判定する方法は、当技術分野において周知であり、当技術分野において周知のバイオインフォマティクスツール（例えば、ＢＬＡＳＴ、多重配列アラインメント）が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態によれば、長鎖ｄｓＲＮＡ分子は、２０ｂｐよりも長い。
一実施形態によれば、長鎖ｄｓＲＮＡ分子は、２１ｂｐよりも長い。
一実施形態によれば、長鎖ｄｓＲＮＡ分子は、２２ｂｐよりも長い。
一実施形態によれば、長鎖ｄｓＲＮＡ分子は、２３ｂｐよりも長い。
一実施形態によれば、長鎖ｄｓＲＮＡ分子は、２４ｂｐよりも長い。
一実施形態によれば、長鎖ｄｓＲＮＡ分子は、２０～１００，０００ｂｐを含む。
一実施形態によれば、長鎖ｄｓＲＮＡ分子は、２０～１０，０００ｂｐを含む。
一実施形態によれば、長鎖ｄｓＲＮＡ分子は、２０～１，０００ｂｐを含む。
一実施形態によれば、長鎖ｄｓＲＮＡ分子は、２０～５００ｂｐを含む。
一実施形態によれば、長鎖ｄｓＲＮＡ分子は、２０～５０ｂｐを含む。
一実施形態によれば、長鎖ｄｓＲＮＡ分子は、２００～５０００ｂｐを含む。
一実施形態によれば、長鎖ｄｓＲＮＡ分子は、２００～１０００ｂｐを含む。
一実施形態によれば、長鎖ｄｓＲＮＡ分子は、２００～５００ｂｐを含む。
一実施形態によれば、長鎖ｄｓＲＮＡ分子は、２０００～１００，０００ｂｐを含む。
一実施形態によれば、長鎖ｄｓＲＮＡ分子は、２０００～１０，０００ｂｐを含む。
一実施形態によれば、長鎖ｄｓＲＮＡ分子は、２０００～５０００ｂｐを含む。
一実施形態によれば、長鎖ｄｓＲＮＡ分子は、１０，０００～１００，０００ｂｐを含む。
一実施形態によれば、長鎖ｄｓＲＮＡ分子は、１，０００～１０，０００ｂｐを含む。
一実施形態によれば、長鎖ｄｓＲＮＡ分子は、１００～１０，０００ｂｐを含む。
一実施形態によれば、長鎖ｄｓＲＮＡ分子は、１００～１，０００ｂｐを含む。
一実施形態によれば、長鎖ｄｓＲＮＡ分子は、１０～１，０００ｂｐを含む。
一実施形態によれば、長鎖ｄｓＲＮＡ分子は、１０～１００ｂｐを含む。
一実施形態によれば、長鎖ｄｓＲＮＡ分子は、オーバーハング、すなわち、ｄｓＲＮＡ分子の非二本鎖領域（すなわち、一本鎖ＲＮＡ）を含む。
一実施形態によれば、長鎖ｄｓＲＮＡ分子は、オーバーハングを含まない。
一実施形態によれば、本発明の長鎖ｄｓＲＮＡ分子は、ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と会合することができる低分子ＲＮＡ分子にプロセシングされ得る。従って、本発明の長鎖ｄｓＲＮＡ分子は、細胞内ＲＮＡｉプロセシング機構の基質として機能し得（すなわち、前駆体ＲＮＡ分子であり得）、以下で詳細に論じる通り、ＤＩＣＥＲタンパク質ファミリー（例えば、ＤＣＲ１及びＤＣＲ２）、ＤＩＣＥＲ－ＬＩＫＥタンパク質ファミリー（例えば、ＤＣＬ１、ＤＣＬ２、ＤＣＬ３、ＤＣＬ４）、ＡＲＧＯＮＡＵＴＥタンパク質ファミリー（例えば、ＡＧＯ１、ＡＧＯ２、ＡＧＯ３、ＡＧＯ４）、ｔＲＮＡ切断酵素（例えば、ＲＮＹ１、ＡＮＧＩＯＧＥＮＩＮ、ＲＮａｓｅ Ｐ、ＲＮａｓｅ Ｐ様、ＳＬＦＮ３、ＥＬＡＣ１、及びＥＬＡＣ２）、及びＰｉｗｉ結合ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）関連タンパク質（例えば、ＡＧＯ３、ＡＵＢＥＲＧＩＮＥ、ＨＩＷＩ、ＨＩＷＩ２、ＨＩＷＩ３、ＰＩＷＩ、ＡＬＧ１、及びＡＬＧ２）が挙げられるがこれらに限定されないリボヌクレアーゼによって、低分子ＲＮＡ分子にプロセシングされ得る。
用語「植物」は、本明細書で使用するとき、植物全体、接ぎ木された植物、植物の祖先及び子孫、並びに種子、シュート、茎、根（塊茎を含む）、台木、若枝、並びに植物の細胞、組織、及び器官を含む植物の一部を包含する。植物は、懸濁培養物、胚、分裂組織領域、カルス組織、葉、配偶体、胞子体、花粉、及び小胞子を含む任意の形態であってよい。本発明の方法において有用であり得る植物としては、緑色植物上科に属する全ての植物、具体的には、以下を含むリストから選択される飼料又は飼い葉植物、観賞植物、食用作物、樹木、又は低木を含む単子葉及び双子葉の植物が挙げられる：アカシア属（Ａｃａｃｉａ）の種、カエデ属（Ａｃｅｒ）の種、マタタビ属（Ａｃｔｉｎｉｄｉａ）の種、トチノキ属（Ａｅｓｃｕｌｕｓ）の種、アガティス・オーストラリス（Ａｇａｔｈｉｓ ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、アルビジア・アマラ（Ａｌｂｉｚｉａ ａｍａｒａ）、アルソフィラ・トリカラー（Ａｌｓｏｐｈｉｌａ ｔｒｉｃｏｌｏｒ）、ウシクサ属（Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎ）の種、ラッカセイ属（Ａｒａｃｈｉｓ）の種、ビンロウジュ（Ａｓｅｃａ ｃａｔｅｃｈｕ）、アステリア・フラグランス（Ａｓｔｅｌｉａ ｆｒａｇｒａｎｓ）、アストラガルス・シサー（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｃｉｃｅｒ）、バイキアエア・プルリジュガ（Ｂａｉｋｉａｅａ ｐｌｕｒｉｊｕｇａ）、カバノキ属（Ｂｅｔｕｉｌａ）の種、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の種、オヒルギ（Ｂｒｕｇｕｉｅｒａ ｇｙｍｎｏｒｒｈｉｚａ）、ブルケア・アフリカーナ（Ｂｕｒｋｅａ ａｆｒｉｃａｎａ）、ハナモツヤクノキ（Ｂｕｔｅａ ｆｒｏｎｄｏｓａ）、カダバ・ファリノーサ（Ｃａｄａｂａ ｆａｒｉｎｏｓａ）、ベニゴウカン属（Ｃａｌｌｉａｎｄｒａ）の種、チャノキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、アサ科（Ｃａｎｎａｂａｃｅａｅ）、ダンドク（Ｃａｎｎａ ｉｎｄｉｃａ）、アサ属（Ｃａｎｎａｂｉｓ）の種、アサ（Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ）、大麻、工業用大麻、トウガラシ属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）の種、カシア属（Ｃａｓｓｉａ）の種、セントロエマ・プベスケンス（Ｃｅｎｔｒｏｅｍａ ｐｕｂｅｓｃｅｎｓ）、ボケ属（Ｃｈａｃｏｏｍｅｌｅｓ）の種、シナニッケイ（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ ｃａｓｓｉａ）、アラビカコーヒーノキ（Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ）、コロフォスペルムム・モパネ（Ｃｏｌｏｐｈｏｓｐｅｒｍｕｍ ｍｏｐａｎｅ）、タマザキクサフジ（Ｃｏｒｏｎｉｌｌｉａ ｖａｒｉａ）、コトネアスター・セロティナ（Ｃｏｔｏｎｅａｓｔｅｒ ｓｅｒｏｔｉｎａ）、サンザシ属（Ｃｒａｔａｅｇｕｓ）の種、キュウリ属（Ｃｕｃｕｍｉｓ）の種、イトスギ属（Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ）、シルバー・ファーン（Ｃｙａｔｈｅａ ｄｅａｌｂａｔａ）、マルメロ（Ｃｙｄｏｎｉａ ｏｂｌｏｎｇａ）、スギ（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）、オガルカヤ属（Ｃｙｍｂｏｐｏｇｏｎ）の種、シンシア・ディアルバータ（Ｃｙｎｔｈｅａ ｄｅａｌｂａｔａ）、マルメロ、ヴェロニカ（Ｄａｌｂｅｒｇｉａ ｍｏｎｅｔａｒｉａ）、ダバリア・ディバリカータ（Ｄａｖａｌｌｉａ ｄｉｖａｒｉｃａｔａ）、ヌスビトハギ属（Ｄｅｓｍｏｄｉｕｍ）の種、ディクソニア・スクアローサ（Ｄｉｃｋｓｏｎｉａ ｓｑｕａｒｏｓａ）、ジベテロポゴン・アンプレクテンス（Ｄｉｂｅｔｅｒｏｐｏｇｏｎ ａｍｐｌｅｃｔｅｎｓ）、ジオクレア属（Ｄｉｏｃｌｅａ）の種、フジマメ属（Ｄｏｌｉｃｈｏｓ）の種、ドリクニウム・レクタム（Ｄｏｒｙｃｎｉｕｍ ｒｅｃｔｕｍ）、エチノクロア・ピラミダリス（Ｅｃｈｉｎｏｃｈｌｏａ ｐｙｒａｍｉｄａｌｉｓ）、エーラフィア属（Ｅｈｒａｆｆｉａ）の種、シコクビエ（Ｅｌｅｕｓｉｎｅ ｃｏｒａｃａｎａ）、スズメガヤ属（Ｅｒａｇｒｅｓｔｉｓ）の種、デイゴ属（Ｅｒｙｔｈｒｉｎａ）の種、ユーカリ属（Ｅｕｃａｌｙｐｆｕｓ）の種、ユークレア・シンペリー（Ｅｕｃｌｅａ ｓｃｈｉｍｐｅｒｉ）、ユーラリア・ビロサ（Ｅｕｌａｌｉａ ｖｉ／ｌｏｓａ）、ヅパ属（Ｐａｇｏｐｙｒｕｍ）の種、フェイジョア・セロウィアナ（Ｆｅｉｊｏａ ｓｅｌｌｏｗｌａｎａ）、オランダイチゴ属（Ｆｒａｇａｒｉａ）の種、フレミンジア（Ｆｌｅｍｉｎｇｉａ）の種、フレイシネチア・バンクシイ（Ｆｒｅｙｃｉｎｅｔｉａ ｂａｎｋｓｌｉ）、ゲンノショウコ（Ｇｅｒａｎｉｕｍ ｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉ）、イチョウ（ＧｉｎＡｇｏ ｂｉｌｏｂａ）、グリシン・ジャバニカ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｊａｖａｎｉｃａ）、グリリシディア属（Ｇｌｉｒｉｃｉｄｉａ）の種、アプランドワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、グレビレア属（Ｇｒｅｖｉｌｌｅａ）の種、グイボウルティア・コレオスペルマ（Ｇｕｉｂｏｕｒｔｉａ ｃｏｌｅｏｓｐｅｒｍａ）、イワオウギ属（Ｈｅｄｙｓａｒｕｍ）の種、ヘマルチア・アルティッシマ（Ｈｅｍａｆｆｈｉａ ａｌｔｉｓｓｉｍａ）、ヘテロポゴン・コントルツス（Ｈｅｔｅｒｏｐｏｇｏｎ ｃｏｎｔｏｆｆｕｓ）、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）、ヒパーレニア・ルファ（Ｈｙｐａｒｒｈｅｎｉａ ｒｕｆａ）、オトギリソウ（Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ ｅｒｅｃｔｕｍ）、ヒペフェリア・ジソルテ（Ｈｙｐｅｆｆｈｅｌｉａ ｄｉｓｓｏｌｕｔｅ）、インジゴ・インカマタ（Ｉｎｄｉｇｏ ｉｎｃａｍａｔａ）、アヤメ属（Ｉｒｉｓ）の種、レプタルレナ・ピロリフォリア（Ｌｅｐｔａｒｒｈｅｎａ ｐｙｒｏｌｉｆｏｌｉａ）、レスペディザ属（Ｌｅｓｐｅｄｉｚａ）の種、レチュカ属（Ｌｅｔｔｕｃａ）の種、ギンネム（Ｌｅｕｃａｅｎａ ｌｅｕｃｏｃｅｐｈａｌａ）、ロウデチア・シンプレクス（Ｌｏｕｄｅｔｉａ ｓｉｍｐｌｅｘ）、ロトヌス・バイネスリ（Ｌｏｔｏｎｕｓ ｂａｉｎｅｓｌｉ）、ミヤコグサ属（Ｌｏｔｕｓ）の種、マクロチローマ・アキシラレ（Ｍａｃｒｏｔｙｌｏｍａ ａｘｉｌｌａｒｅ）、リンゴ属（Ｍａｌｕｓ）の種、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、ムラサキウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｌｉｖａ）、メタセコイア（Ｍｅｔａｓｅｑｕｏｉａ ｇｌｙｐｔｏｓｔｒｏｂｏｉｄｅｓ）、ムサ・サピエンツム（Ｍｕｓａ ｓａｐｉｅｎｔｕｍ）、バナナ、ニコチアヌム属（Ｎｉｃｏｔｉａｎｕｍ）の種、オノブリョチス属（Ｏｎｏｂｒｙｃｈｉｓ）の種、オルニソプス属（Ｏｒｎｉｔｈｏｐｕｓ）の種、イネ属（Ｏｒｙｚａ）の種、ペルトフォルム・アフリカヌム（Ｐｅｌｔｏｐｈｏｒｕｍ ａｆｒｉｃａｎｕｍ）、チカラシバ属（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ）の種、アボカド（Ｐｅｒｓｅａ ｇｒａｔｉｓｓｉｍａ）、ペチュニア属（Ｐｅｔｕｎｉａ）の種、インゲンマメ属（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ）の種、カナリーヤシ（Ｐｈｏｅｎｉｘ ｃａｎａｒｉｅｎｓｉｓ）、フォルミウム・クッキアヌム（Ｐｈｏｒｍｉｕｍ ｃｏｏｋｉａｎｕｍ）、カナメモチ属（Ｐｈｏｔｉｎｉａ）種、ピセア・グラウカ（Ｐｉｃｅａ ｇｌａｕｃａ）、マツ属（Ｐｉｎｕｓ）種、エンドウ（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖａｍ）、ポドカルプス・トタラ（Ｐｏｄｏｃａｒｐｕｓ ｔｏｔａｒａ）、ポゴナルスリア・フレッキイ（Ｐｏｇｏｎａｒｔｈｒｉａ ｆｌｅｃｋｉｉ）、ポゴナルスリア・セクアルローサ（Ｐｏｇｏｎａｆｆｈｒｉａ ｓｑｕａｒｒｏｓａ）、ポプラ属（Ｐｏｐｕｌｕｓ）の種、プロソピス・シネラリア（Ｐｒｏｓｏｐｉｓ ｃｉｎｅｒａｒｉａ）、ベイマツ（Ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａ ｍｅｎｚｉｅｓｉｉ）、プテロロビウム・ステラツム（Ｐｔｅｒｏｌｏｂｉｕｍ ｓｔｅｌｌａｔｕｍ）、セイヨウナシ（Ｐｙｒｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、カシ属（Ｑｕｅｒｃｕｓ）の種、シャリンバイ（Ｒｈａｐｈｉｏｌｅｐｓｉｓ ｕｍｂｅｌｌａｔａ）、ロパロスチリス・サピダ（Ｒｈｏｐａｌｏｓｔｙｌｉｓ ｓａｐｉｄａ）、ルス・ナタレンシス（Ｒｈｕｓ ｎａｔａｌｅｎｓｉｓ）、セイヨウスグリ（Ｒｉｂｅｓ ｇｒｏｓｓｕｌａｒｉａ）、スグリ属（Ｒｉｂｅｓ）の種、ニセアカシア（Ｒｏｂｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏａｃａｃｉａ）、バラ属（Ｒｏｓａ）の種、キイチゴ属（Ｒｕｂｕｓ）種、ヤナギ属（Ｓａｌｉｘ）の種、スキザクリウム・サングイネウム（Ｓｃｈｙｚａｃｈｙｒｉｕｍ ｓａｎｇｕｉｎｅｕｍ）、シアドピチス・ベフィシラタ（Ｓｃｉａｄｏｐｉｔｙｓ ｖｅｆｆｉｃｉｌｌａｔａ）、セコイア（Ｓｅｑｕｏｉａ ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ）、セコイアデンドロン（Ｓｅｑｕｏｉａｄｅｎｄｒｏｎ ｇｉｇａｎｔｅｕｍ）、ソルガム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）、ホウレンソウ属（Ｓｐｉｎａｃｉａ）の種、スポロボルス・フィムブリアツス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｕｓ ｆｉｍｂｒｉａｔｕｓ）、スチブルス・アロペクロイデス（Ｓｔｉｂｕｒｕｓ ａｌｏｐｅｃｕｒｏｉｄｅｓ）、スチロサントス・フミリス（Ｓｔｙｌｏｓａｎｔｈｏｓ ｈｕｍｉｌｉｓ）、タデハギ属（Ｔａｄｅｈａｇｉ）の種、ラクウショウ（Ｔａｘｏｄｉｕｍ ｄｉｓｔｉｃｈｕｍ）、テメダ・トリアンドラ（Ｔｈｅｍｅｄａ ｔｒｉａｎｄｒａ）、ジャジクソウ属（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ）の種、コムギ属（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）の種、アメリカツガ（Ｔｓｕｇａ ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ）、スノキ属（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ）種、ソラマメ属（Ｖｉｃｉａ）の種、ヨーロッパブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）、ワトソニア・ピラミダタ（Ｗａｔｓｏｎｉａ ｐｙｒａｍｉｄａｔａ）、オランダカイウ（Ｚａｎｔｅｄｅｓｃｈｉａ ａｅｔｈｉｏｐｉｃａ）、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、アマランサス、アーティチョーク、アスパラガス、ブロッコリー、芽キャベツ（Ｂｒｕｓｓｅｌｓ ｓｐｒｏｕｔｓ）、キャベツ、キャノーラ、ニンジン、カリフラワー、セロリ、コラードの葉（ｃｏｌｌａｒｄ ｇｒｅｅｎｓ）、亜麻、ケール、レンズマメ、アブラナ、オクラ、タマネギ、ジャガイモ、イネ、ダイズ、イチゴ、サトウダイコン、サトウキビ、ヒマワリ、トマト、カボチャ、チャノキ。あるいは、藻類及び他の非緑色植物を本発明の幾つかの実施形態の方法に使用することもできる。
特定の実施形態によれば、植物は、作物、花卉、雑草、又は樹木である。
特定の実施形態によれば、植物は、木本植物種、例えば、オニマタタビ（Ａｃｔｉｎｉｄｉａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）（マタタビ科（Ａｃｔｉｎｉｄｉａｃｅａｅ））、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔｅｓｃｕｌｅｎｔａ）（トウダイグサ科（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｃｅａｅ））、ユリノキ（Ｆｉｒｉｏｄｅｎｄｒｏｎ ｔｕｌｉｐｅｒａ）（モクレン科（Ｍａｇｎｏｌｉａｃｅａｅ））、ポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ）（ヤナギ科（Ｓａｌｉｃａｃｅａｅ））、ビャクダン（Ｓａｎｔａｌｕｍ ａｌｂｕｍ）（ビャクダン科（Ｓａｎｔａｌａｃｅａｅ））、ニレ（Ｕｌｍｕｓ）（ニレ科（Ｕｌｍａｃｅａｅ））、並びにバラ科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）（リンゴ属（Ｍａｌｕｓ）、サクラ属（Ｐｒｕｎｕｓ）、ナシ属（Ｐｙｒｕｓ））及びミカン科（Ｒｕｔａｃｅａｅ）（柑橘属（Ｃｉｔｒｕｓ）、ミカン属（Ｍｉｃｒｏｃｉｔｒｕｓ））の異なる種、裸子植物、例えば、カナダトウヒ（Ｐｉｃｅａ ｇｌａｕｃａ）及びテーダマツ（Ｐｉｎｕｓ ｔａｅｄａ）、森林樹（例えば、カバノキ科（Ｂｅｔｕｌａｃｅａｅ）、ブナ科（Ｆａｇａｃｅａｅ）、裸子植物、及び熱帯樹種）、果樹、低木又は草本、例えば、（バナナ、ココア、ココヤシ、コーヒー、ナツメヤシ、ブドウ、及びチャ）、並びにアブラヤシである。
特定の実施形態によれば、植物は、熱帯作物のもの、例えば、コーヒー、マカダミア、バナナ、パイナップル、タロ、パパイヤ、マンゴー、オオムギ、豆類、キャッサバ、ヒヨコマメ、カカオ（チョコレート）、ササゲ、トウモロコシ（コーン）、キビ、イネ、ソルガム、サトウキビ、サツマイモ、タバコ、タロ、チャ、ヤムである。
「子実」、「種子」、又は「豆」は、別の顕花植物に成長することができる顕花植物の生殖単位を指す。本明細書で使用するとき、これらの用語は同義的かつ互換的に使用される。
特定の実施形態によれば、植物は、植物細胞、例えば、胚細胞懸濁液中の植物細胞である。
特定の実施形態によれば、植物細胞は、プロトプラストである。
プロトプラストは、任意の植物組織、例えば、果実、花、根、葉、胚、胚細胞懸濁液、カルス、又は実生組織に由来する。
特定の実施形態によれば、植物細胞は、胚形成細胞である。
特定の実施形態によれば、植物細胞は、体細胞胚形成細胞である。
用語「植物遺伝子」とは、本明細書で使用するとき、有害生物遺伝子に対するサイレンシングの特異性を付与するように改変され得る、例えば、内因性の、植物における任意の遺伝子を指す。
一実施形態によれば、植物遺伝子は、非コード遺伝子（例えば、非タンパク質コード遺伝子）である。
一実施形態によれば、植物遺伝子は、コード遺伝子（例えばタンパク質コード遺伝子）である。
一実施形態によれば、植物遺伝子（すなわち、有害生物遺伝子の核酸配列に対して上記所定の配列相同性を示す）は、サイレンシング分子をコードしていない。
一実施形態によれば、植物遺伝子は、内在性のサイレンシング活性を有する分子（例えば、以下に詳細に論じるようなＲＮＡ分子、例えば、非コードＲＮＡ分子）をコードしていない。
一実施形態によれば、植物遺伝子は、内在性のサイレンシング活性を有する分子（例えば、以下に詳細に論じるようなＲＮＡ分子、例えば、非コードＲＮＡ分子）をコードしている。
本明細書で使用するとき、用語「有害生物」とは、直接的又は間接的に植物に害を与える生物を指す。直接的な影響としては、例えば、植物の葉を食べることが挙げられる。間接的な影響としては、例えば、病因物質（例えば、ウイルス、細菌等）を植物に伝播することが挙げられる。後者の場合、有害生物は、病原体伝播のベクターとして機能する。
幾つかの実施形態によれば、有害生物は、摂取及び／又は浸漬等であるがこれに限定されない方法を介して長鎖ｄｓＲＮＡに対して感受性である無脊椎動物の有害生物を含む、無脊椎動物の有害生物である。各可能性は、本発明の別個の実施態様を表す。幾つかの実施形態によれば、長鎖ｄｓＲＮＡに対して感受性である無脊椎動物の有害生物は、２６ｂｐ以上、場合によっては約２６～５０ｂｐの長鎖ｄｓＲＮＡに対して感受性である。各可能性は、本発明の別個の実施態様を表す。
一実施形態によれば、有害生物は、無脊椎動物の生物である。
例示的な有害生物としては、昆虫、線形動物、カタツムリ、ナメクジ、クモ、イモムシ、サソリ、ダニ、マダニ、真菌等が挙げられるが、これらに限定されない。
昆虫の有害生物としては、甲虫目（例えば、カブトムシ）、ハエ目（例えば、ハエ、カ）、ハチ目（例えば、ハバチ、スズメバチ、ミツバチ、及びアリ）、チョウ目（例えば、チョウ及びガ）、ハジラミ目（例えば、シラミ、例えば、ハジラミ（ｃｈｅｗｉｎｇ ｌｉｃｅ、ｂｉｔｉｎｇ ｌｉｃｅ、及びｂｉｒｄ ｌｉｃｅ）、カメムシ目（例えば、カメムシ）、腹吻亜目（例えば、アブラムシ、コナジラミ、及びカイガラムシ）、頚吻亜目（例えば、セミ、ヨコバイ、ツノゼミ、ウンカ、及びアワフキムシ）、及び鞘吻亜目（例えば、コケムシ（ｍｏｓｓ ｂｕｇｓ）及びカブトムシ（ｂｅｅｔｌｅ ｂｕｇｓ））を含む同翅目、バッタ目（例えば、バッタ、トノサマバッタ、並びにキリギリス及びウェタを含むコオロギ）、アザミウマ目（例えば、アザミウマ）、ハサミムシ目（例えば、ハサミムシ）、シロアリ目（例えば、シロアリ）、シラミ目（例えば、シラミ）、ノミ目（例えば、ノミ）、トビケラ目（例えば、トビケラ）等から選択される昆虫が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の昆虫の有害生物としては、トウモロコシ：ヨーロッパアワノメイガ（Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）；タマナヤガ（Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ）；アメリカタバコガ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ）；ツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）；南西部アワノメイガ（Ｄｉａｔｒａｅａ ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ）；モロコシマダラメイガ（Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ）；サトウキビメイガ（Ｄｉａｔｒａｅａ ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ）；ウエスタンコーンルートワーム（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ、ｗｅｓｔｅｒｎ ｃｏｒｎ ｒｏｏｔｗｏｒｍ）；ノーザンコーンルートワーム（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｌｏｎｇｉｃｏｒｎｉｓ ｂａｒｂｅｒｉ、ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｃｏｒｎ ｒｏｏｔｗｏｒｍ）；ジュウイチホシウリハムシ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ ｈｏｗａｒｄｉ）；クシコメツキ属（Ｍｅｌａｎｏｔｕｓ）種、コメツキムシの幼虫（ｗｉｒｅｗｏｒｍｓ）；ノーザンマスクドコガネムシ（Ｃｙｃｌｏｃｅｐｈａｌａ ｂｏｒｅａｌｉｓ、ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｍａｓｋｅｄ ｃｈａｆｅｒ）（地虫）；インマクラタスジコガネモドキ（Ｃｙｃｌｏｃｅｐｈａｌａ ｉｍｍａｃｕｌａｔａ）（地虫）；マメコガネ（Ｐｏｐｉｌｌｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）；ミノハムシ（Ｃｈａｅｔｏｃｎｅｍａ ｐｕｌｉｃａｒｉａ）；トウモロコシゾウムシ（Ｓｐｈｅｎｏｐｈｏｒｕｓ ｍａｉｄｉｓ）；トウモロコシアブラムシ（Ｒｈｏｐａｌｏｓｉｐｈｕｍ ｍａｉｄｉｓ）；コーンルートアフィド（Ａｎｕｒａｐｈｉｓ ｍａｉｄｉｒａｄｉｃｉｓ、ｃｏｒｎ ｒｏｏｔ ａｐｈｉｄ）；アメリカコバネナガカメムシ（Ｂｌｉｓｓｕｓ ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ）；アカアシトビバッタ（Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｆｅｍｕｒｒｕｂｒｕｍ）；ミグラトリーグラスホッパー（Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｓａｎｇｕｉｎｉｐｅｓ、ｍｉｇｒａｔｏｒｙ ｇｒａｓｓｈｏｐｐｅｒ）；タネバエ（Ｈｙｌｅｍｙａ ｐｌａｔｕｒａ）；コーンブロットリーフマイナー（Ａｇｒｏｍｙｚａ ｐａｒｖｉｃｏｒｎｉｓ、ｃｏｒｎ ｂｌｏｔ ｌｅａｆｍｉｎｅｒ）；クサキイロアザミウマ（Ａｎａｐｈｏｔｈｒｉｐｓ ｏｂｓｃｒｕｒｕｓ）；シーフアント（Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ ｍｉｌｅｓｔａ、ｔｈｉｅｆ ａｎｔ）；ナミハダニ（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ ｕｒｔｉｃａｅ）；ソルガム：ソルガムボーラー（Ｃｈｉｌｏ ｐａｒｔｅｌｌｕｓ、ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｏｒｅｒ）；ツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）；アメリカタバコガ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ）；モロコシマダラメイガ（Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ）；グラニュレートカットワーム（Ｆｅｌｔｉａ ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａ、ｇｒａｎｕｌａｔｅ ｃｕｔｗｏｒｍ）；フィロファガ・クリニタ（Ｐｈｙｌｌｏｐｈａｇａ ｃｒｉｎｉｔａ）；エレオデス（Ｅｌｅｏｄｅｓ）属、コノデルス（Ｃｏｎｏｄｅｒｕｓ）属、及びアエオルス（Ａｅｏｌｕｓ）属の種、コメツキムシの幼虫；クビアカクビホソハムシ（Ｏｕｌｅｍａ ｍｅｌａｎｏｐｕｓ）；ミノハムシ；トウモロコシゾウムシ；トウモロコシアブラムシ；イエローシュガーケーンアフィド（Ｓｉｐｈａ ｆｌａｖａ、ｙｅｌｌｏｗ ｓｕｇａｒｃａｎｅ ａｐｈｉｄ）；アメリカコバネナガカメムシ；ソルガムタマバエ（Ｃｏｎｔａｒｉｎｉａ ｓｏｒｇｈｉｃｏｌａ）；ニセナミハダニ（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ）；ナミハダニ；コムギ：ヨトウムシ（Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ ｕｎｉｐｕｎｃｔａｔａ）；ツマジロクサヨトウ；モロコシマダラメイガ；ウエスタンカットワーム（Ａｇｒｏｔｉｓ ｏｒｔｈｏｇｏｎｉａ、ｗｅｓｔｅｒｎ ｃｕｔｗｏｒｍ）；モロコシマダラメイガ；クビアカクビホソハムシ；オオタコゾウムシ（Ｈｙｐｅｒａ ｐｕｎｃｔａｔａ）；ジュウイチホシウリハムシ；ロシアコムギアブラムシ（Ｒｕｓｓｉａｎ ｗｈｅａｔ ａｐｈｉｄ）；ムギミドリアブラムシ（Ｓｃｈｉｚａｐｈｉｓ ｇｒａｍｉｎｕｍ）；ムギヒゲナガアブラムシ（Ｍａｃｒｏｓｉｐｈｕｍ ａｖｅｎａｅ）；アカアシトビバッタ；ディファレンシャルグラスホッパー（Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｉｓ、ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｇｒａｓｓｈｏｐｐｅｒ）；ミグラトリーグラスホッパー；ヘシアンバエ（Ｍａｙｅｔｉｏｌａ ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ）；ムギアカタマバエ（Ｓｉｔｏｄｉｐｌｏｓｉｓ ｍｏｓｅｌｌａｎａ）；ムギキモグリバエ（Ｍｅｒｏｍｙｚａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）；コムギスイセンハナアブ（Ｈｙｌｅｍｙａ ｃｏａｒｃｔａｔａ）；ウスグロアザミウマ（Ｆｒａｎｋｌｉｎｉｅｌｌａ ｆｕｓｃａ）；コムギクキバチ（Ｃｅｐｈｕｓ ｃｉｎｃｔｕｓ、ｗｈｅａｔ ｓｔｅｍ ｓａｗｆｌｙ）；チューリップサビダニ（Ａｃｅｒｉａ ｔｕｌｉｐａｅ）；ヒマワリ：ヒマワリハマキガ（Ｓｕｌｅｉｍａ ｈｅｌｉａｎｔｈａｎａ）；サンフラワーモス（Ｈｏｍｏｅｏｓｏｍａ ｅｌｅｃｔｅｌｌｕｍ、ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ ｍｏｔｈ）；サンフラワービートル（ｚｙｇｏｇｒａｍｍａ ｅｘｃｌａｍａｔｉｏｎｉｓ、ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ ｂｅｅｔｌｅ）；キャロットビートル（Ｂｏｔｈｙｒｕｓ ｇｉｂｂｏｓｕｓ、ｃａｒｒｏｔ ｂｅｅｔｌｅ）；サンフラワーシードミッジ（Ｎｅｏｌａｓｉｏｐｔｅｒａ ｍｕｒｔｆｅｌｄｔｉａｎａ、ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ ｓｅｅｄ ｍｉｄｇｅ）；ワタ：ニセアメリカタバコガ（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）；アメリカタバコガ；シロイチモジヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ）；ワタアカミムシ（Ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ）；メキシコワタミゾウムシ（Ａｎｔｈｏｎｏｍｕｓ ｇｒａｎｄｉｓ）；ワタアブラムシ（Ａｐｈｉｓ ｇｏｓｓｙｐｉｉ）；ワタノミハムシ（Ｐｓｅｕｄａｔｏｍｏｓｃｅｌｉｓ ｓｅｒｉａｔｕｓ）；オンシツコナジラミ（Ｔｒｉａｌｅｕｒｏｄｅｓ ａｂｕｔｉｌｏｎｅａ）；ミドリメクラカメムシ（Ｌｙｇｕｓ ｌｉｎｅｏｌａｒｉｓ）；アカアシトビバッタ；ディファレンシャルグラスホッパー；ネギアザミウマ（Ｔｈｒｉｐｓ ｔａｂａｃｉ）；ウスグロアザミウマ（Ｆｒａｎｋｌｉｎｋｉｅｌｌａ ｆｕｓｃａ）；ニセナミハダニ；ナミハダニ；イネ：サトウキビメイガ（Ｄｉａｔｒａｅａ ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ）；ツマジロクサヨトウ；アメリカタバコガ；グレープコラスピス（Ｃｏｌａｓｐｉｓ ｂｒｕｎｎｅａ、ｇｒａｐｅ ｃｏｌａｓｐｉｓ）；イネミズゾウムシ（Ｌｉｓｓｏｒｈｏｐｔｒｕｓ ｏｒｙｚｏｐｈｉｌｕｓ）；ココクゾウムシ（Ｓｉｔｏｐｈｉｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）；クロスジツマグロヨコバイ（Ｎｅｐｈｏｔｅｔｔｉｘ ｎｉｇｒｏｐｉｃｔｕｓ）；アメリカコバネナガカメムシ；アオクサカメムシ；ダイズ：ダイズシャクトリムシ（Ｐｓｅｕｄｏｐｌｕｓｉａ ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ）；ビロードマメケムシ（Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ）；グリーンクローバーワーム（Ｐｌａｔｈｙｐｅｎａ ｓｃａｂｒａ、ｇｒｅｅｎ ｃｌｏｖｅｒｗｏｒｍ）；ヨーロッパアワノメイガ；タマナヤガ；シロイチモジヨトウ；ニセアメリカタバコガ；アメリカタバコガ；インゲンテントウ（Ｅｐｉｌａｃｈｎａ ｖａｒｉｖｅｓｔｉｓ）；モモアカアブラムシ（Ｍｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅ）；ジャガイモヒメヨコバイ（Ｅｍｐｏａｓｃａ ｆａｂａｅ）；アオクサカメムシ；アカアシトビバッタ；ディファレンシャルグラスホッパー；タネバエ；ダイズアザミウマ（Ｓｅｒｉｃｏｔｈｒｉｐｓ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）；ネギアザミウマ；イチゴハダニ（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉ、ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ ｓｐｉｄｅｒ ｍｉｔｅ）；ナミハダニ；オオムギ：ヨーロッパアワノメイガ；タマナヤガ；ムギミドリアブラムシ、アメリカコバネナガカメムシ；アオクサカメムシ；チャイロカメムシ（Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ ｓｅｒｖｕｓ、ｂｒｏｗｎ ｓｔｉｎｋ ｂｕｇ）；タネバエ（Ｄｅｌｉａ ｐｌａｔｕｒａ）；ヘシアンバエ；ホモノハダニ（Ｐｅｔｒｏｂｉａ ｌａｔｅｎｓ）；ナタネ：ダイコンアブラムシ（Ｂｒｅｖｉｃｏｒｙｎｅ ｂｒａｓｓｉｃａｅ）；フリービートル（Ｐｈｙｌｌｏｔｒｅｔａ ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ、Ｆｌｅａ ｂｅｅｔｌｅ）；ベルタアワヨトウ（Ｍａｍｅｓｔｒａ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔａ）；コナガ（Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）；デリア（Ｄｅｌｉａ）属の種、根食い虫が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態によれば、病原体は線形動物である。
例示的な線形動物としては、ネモグリセンチュウ（Ｒａｄｏｐｈｏｌｕｓ ｓｉｍｉｌｉｓ）、線虫、ラドホルス・アラボコフェアエ（Ｒａｄｏｐｈｏｌｕｓ ａｒａｂｏｃｏｆｆｅａｅ）、ミナミネグサレセンチュウ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｃｏｆｆｅａｅ）、ネコブセンチュウ（メロイドギン属（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ）の種）、シストセンチュウ（ヘテロデラ属（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ）及びグロボデラ属（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ）の種）、ネグサレセンチュウ（プラチレンクス属（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）の種）、クキセンチュウ（Ｄｉｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｄｉｐｓａｃｉ）、マツノザイセンチュウ（Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓ ｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ）、ニセフクロセンチュウ（Ｒｏｔｙｌｅｎｃｈｕｌｕｓ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、ブドウオオハリセンチュウ（Ｘｉｐｈｉｎｅｍａ ｉｎｄｅｘ）、ナコブス・アベルランス（Ｎａｃｏｂｂｕｓ ａｂｅｒｒａｎｓ）、及びアフェレンコイデス・ベッセイ（Ａｐｈｅｌｅｎｃｈｏｉｄｅｓ ｂｅｓｓｅｙｉ）が挙げられるが、これらに限定されない。
例示的な真菌としては、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、レプトスファエリア・マキュランス（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ ｍａｃｕｌａｎｓ）（キャベツ根朽病菌（Ｐｈｏｍａ ｌｉｎｇａｍ））、菌核病菌（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）、イネいもち病菌（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ ｇｒｉｓｅａ）、イネ馬鹿苗病菌（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）（フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ））、イネいもち病菌（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｏｒｙｚａｅ）、ボトリティス・シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａｌ）、プッチニア属（Ｐｕｃｃｉｎｉａ）の種、フザリウム・グラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、ブルメリア・グラミニス（Ｂｌｕｍｅｒｉａ ｇｒａｍｉｎｉｓ）、ミコスファエレラ・グラミニコラ（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）、コレトトリカム属（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）の種、ウスティラゴ・メイディス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓ）、メラムプソラ・リニ（Ｍｅｌａｍｐｓｏｒａ ｌｉｎｉ）、ファコプソラ・パチリジ（Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ ｐａｃｈｙｒｈｉｚｉ）、及びリゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態によれば、有害生物は、アリ、シロアリ、ミツバチ、スズメバチ、芋虫、コオロギ、トノサマバッタ、カブトムシ、カタツムリ、ナメクジ、線形動物、ゴキブリ、ハエ、ショウジョウバエ、コナジラミ、カ、バッタ、ウンカ、ハサミムシ、アブラムシ、カイガラムシ、ツリガネムシ、クモ、ダニ、キジラミ、マダニ、ガ、毛虫、及びサソリであり、その生活環の異なる段階における、アリ、ミツバチ、スズメバチ、芋虫、カブトムシ、カタツムリ、ナメクジ、線形動物、ゴキブリ、ハエ、コナジラミ、カ、バッタ、ハサミムシ、アブラムシ、カイガラムシ、ツリガネムシ、クモ、ダニ、キジラミ、及びサソリである。
特定の実施形態によれば、有害生物は、その生涯の任意の生活環段階にある。
一実施形態によれば、有害生物は、ウイルスである。
語句「有害生物遺伝子をサイレンシングする」とは、設計された本発明の長鎖ｄｓＲＮＡ分子によって標的とされていない有害生物遺伝子と比較して、ポリヌクレオチド又はそれによってコードされているポリペプチドの発現レベルを少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％低下させることを指す。
ポリヌクレオチド又はそれによってコードされているポリペプチドの発現レベルを測定するためのアッセイとしては、ＲＴ－ＰＣＲ、ウェスタンブロット、免疫組織化学的検査及び／若しくはフローサイトメトリー、シーケンシング、又は（以下で更に論じる）任意の他の検出方法が挙げられるが、これらに限定されない。
好ましくは、有害生物の遺伝子をサイレンシングした結果、有害生物が抑制、制御、及び／又は殺傷され、その結果、有害生物が植物に与える損傷が制限される。有害生物の制御としては、有害生物を殺傷する、有害生物の発育を阻害する、有害生物が植物に与える損傷が少なくなるように有害生物の繁殖力若しくは成長を変化させる、生成される子孫の数を減少させる、あまり適合しない有害生物を生成する、捕食者の攻撃をより受けやすい有害生物を生成する、又は有害生物が植物を食べるのを阻止することが挙げられるが、これらに限定されない。
用語「有害生物遺伝子」とは、本明細書で使用するとき、成長、発生、生殖、又は感染力に必須である有害生物における任意の遺伝子を指す。この遺伝子は、有害生物の任意の組織で発現し得るが、特定の実施形態では、有害生物において抑制のために標的とされる遺伝子は、有害生物の腸組織の細胞、有害生物の中腸の細胞、腸管内腔又は中腸を覆っている細胞、有害生物の腸内細菌叢の細胞、及び有害生物の免疫系の細胞で発現する。このような標的遺伝子は、例えば、腸細胞の代謝、成長、分化、及び免疫系に関与している可能性がある。
本方法によって標的とし得る例示的な有害生物遺伝子としては、以下の表１Ａ～Ｂに列挙する遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態によれば、線形動物遺伝子は、バナナネモグリセンチュウ（Ｒａｄｏｐｈｏｌｕｓ ｓｉｍｉｌｉｓ）の遺伝子であるカルレチキュリン１３（ＣＲＴ）又はコラーゲン５（ｃｏｌ－５）を含む。
特定の実施形態によれば、真菌遺伝子は、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）の遺伝子であるＦＯＷ２、ＦＲＰ１、及びＯＰＲを含む。
一実施形態によれば、有害生物遺伝子をサイレンシングすることにより、有害生物によって害され、設計された本発明の長鎖ｄｓＲＮＡ分子に供されていない植物と比較して、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％、植物における疾患の症状が減少するか又は（有害生物に起因する）植物へのダメージが減少する。
有害生物の制御を測定するアッセイは、当技術分野において一般的に知られており、例えば、参照により本明細書に援用される米国特許第第５，６１４，３９５号を参照。このような技術としては、平均病変径、病原体のバイオマス、及び腐敗した植物組織の全体的な割合を経時的に測定することが挙げられる。例えば、参照により本明細書に援用されるＴｈｏｍｍａ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ９５：１５１０７－１５１１１を参照。また、植物全体の給餌アッセイ及びトウモロコシの根の給餌アッセイの両方を提供するＢａｕｍ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １１：１３２２－１３２６及び国際公開第２００７／０３５６５０号も参照。
一実施形態によれば、方法は、有害生物遺伝子の核酸配列に対して所定の配列相同性を示す植物遺伝子の核酸配列を選択することを含む。
一実施形態によれば、植物遺伝子の核酸配列と有害生物遺伝子の核酸配列との間の配列相同性は、６０％～１００％、７０％～８０％、７０％～９０％、７０％～１００％、７５％～１００％、８０％～９０％、８０％～１００％、８５％～１００％、９０％～１００％、又は９５％～１００％の同一性を含む。
特定の実施形態によれば、配列相同性は、植物遺伝子の核酸配列と有害生物遺伝子の核酸配列との間の７５％～１００％の同一性を含む。
特定の実施形態によれば、配列相同性は、植物遺伝子の核酸配列と有害生物遺伝子の核酸配列との間の８５％～１００％の同一性を含む。
特定の実施形態によれば、配列相同性は、植物遺伝子の核酸配列と有害生物遺伝子の核酸配列との間の７５％～１００％の同一性を含む。
一実施形態によれば、配列相同性は、植物遺伝子の核酸配列と有害生物遺伝子の核酸配列との間の少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を含む。
相同性（例えば、相同性パーセント、配列同一性＋配列類似性）は、ペアワイズ配列アラインメントを計算する任意の相同性比較ソフトウェアを用いて求めることができる。
本明細書で使用するとき、２つの核酸又はポリペプチド配列の文脈における「配列同一性」又は「同一性」は、アライメントしたときに同じである、２つの配列中の残基に対する言及を含む。タンパク質に関して配列同一性パーセントを用いる場合、同一ではない残基の位置は、多くの場合、アミノ酸残基が類似の化学的特性（例えば、電荷又は疎水性）を有する他のアミノ酸残基に置換されるので分子の機能的特性が変化しない保存的アミノ酸置換によって異なることが認識される。保守的置換で配列が異なる場合、置換の保存的な性質を補正するために、配列同一性パーセントを上方調整してもよい。このような保存的置換によって異なる配列は、「配列類似性」又は「類似性」を有するとみなされる。この調整を行うための手段は、当業者に周知である。典型的には、保守的置換を完全なミスマッチではなく部分的なミスマッチとしてスコアリングして、配列同一性パーセントを高めることを含む。従って、例えば、同一アミノ酸にスコア１を与え、非保存的置換にスコア０を与える場合、保存的置換には０と１との間のスコアを与える。保守的置換のスコアリングは、例えば、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ Ｓ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ ＪＧのアルゴリズム［Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｒｏｍ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｌｏｃｋｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９２，８９（２２）：１０９１５－９］に従って計算される。
同一性（例えば、相同性パーセント）は、例えば、デフォルトパラメータを使用すること等によって、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のＢｌａｓｔＮソフトウェアを含む任意の相同性比較ソフトウェアを用いて求めることができる。
本発明の幾つかの実施形態によれば、同一性は、グローバル同一性、すなわち、本発明のアミノ酸又は核酸の配列全体にわたる同一性であり、その一部にわたる同一性ではない。
本発明の幾つかの実施形態によれば、用語「相同性」又は「相同」とは、２つ以上の核酸配列の同一性；又は２つ以上のアミノ酸配列の同一性；又は１つ以上の核酸配列に対するアミノ酸配列の同一性を指す。
本発明の幾つかの実施形態によれば、相同性は、グローバル相同性、すなわち、本発明のアミノ酸又は核酸の配列全体にわたる相同性であり、その一部にわたる相同性ではない。
２つ以上の配列間の相同性又は同一性の程度は、様々な公知の配列比較ツールを用いて求めることができる。以下は、本発明の幾つかの実施形態と共に使用することができる、このようなツールの非限定的な説明である。
ポリヌクレオチド配列で出発して、他のポリヌクレオチド配列と比較する場合、ＥＭＢＯＳＳ－６．０．１ Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（ｅｍｂｏｓｓ（ｄｏｔ）ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ（ｄｏｔ）ｎｅｔ／ａｐｐｓ／ｃｖｓ／ｅｍｂｏｓｓ／ａｐｐｓ／ｎｅｅｄｌｅ（ｄｏｔ）ｈｔｍｌから入手可能）を以下のデフォルトパラメータで使用することができる：（ＥＭＢＯＳＳ－６．０．１）ｇａｐｏｐｅｎ＝１０；ｇａｐｅｘｔｅｎｄ＝０．５；ｄａｔａｆｉｌｅ＝ＥＤＮＡＦＵＬＬ；ｂｒｉｅｆ＝ＹＥＳ。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＥＭＢＯＳＳ－６．０．１ Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムで使用されるパラメータは、ｇａｐｏｐｅｎ＝１０；ｇａｐｅｘｔｅｎｄ＝０．２；ｄａｔａｆｉｌｅ＝ＥＤＮＡＦＵＬＬ；ｂｒｉｅｆ＝ＹＥＳである。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ポリヌクレオチドとポリヌクレオチドとを比較するためのＥＭＢＯＳＳ－６．０．１ Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用して相同性を求めるために使用される閾値は、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である。
幾つかの実施形態によれば、相同性の程度を求めるには、更に、（タンパク質－タンパク質比較又はヌクレオチド－ヌクレオチド比較用の）Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用する必要がある。
ＧｅｎＣｏｒｅ６．０ Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムのデフォルトパラメータは以下を含む：ｍｏｄｅｌ＝ｓｗ．ｍｏｄｅｌ。
本発明の幾つかの実施形態によれば、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用して相同性を求めるために使用される閾値は、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である。
本発明の幾つかの実施形態によれば、関心ポリペプチド又はポリヌクレオチドに対するグローバル相同性を実施する前に（例えば、配列全体に対して８０％のグローバル相同性）、関心ポリペプチド又はポリヌクレオチドに対するローカル相同性（例えば、配列長の６０％にわたって６０％の同一性）によって事前に選択された配列に対して、グローバル相同性を実施する。例えば、第１の段階ではＢｌａｓｔｐ及びｔＢｌａｓｔｎアルゴリズムをフィルタとするＢＬＡＳＴソフトウェアを用いて相同配列を選択し、第２の段階ではｎｅｅｄｌｅ（ＥＭＢＯＳＳパッケージ）又はＦｒａｍｅ＋アルゴリズムによるアライメントを行う。ローカル同一性（Ｂｌａｓｔアラインメント）は、グローバルアライメント段階のためのフィルタとしてのみ使用されるので、非常に許容的なカットオフ－配列長の６０％の範囲に対して６０％の同一性で定義される。この特定の実施形態（ローカル同一性を使用する場合）では、Ｂｌａｓｔパッケージのデフォルトフィルタリングを利用しない（パラメータ「－Ｆ Ｆ」を設定することにより）。
第２の段階では、コア遺伝子のポリペプチド配列に対して少なくとも８０％のグローバル同一性に基づいてホモログを定義する。幾つかの実施形態によれば、相同性は、ローカル相同性又はローカル同一性である。
ローカルアラインメントツールとしては、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のＢｌａｓｔＰ、ＢｌａｓｔＮ、ＢｌａｓｔＸ、又はＴＢＬＡＳＴＮソフトウェア、ＦＡＳＴＡ、及びＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムが挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態によれば、以下のパラメータでＢｌａｓｔＮを用いて相同性を求める：ｍａｘ ｔａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ＝１０００、ｅｘｐｅｃｔ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＝１０、ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ＝１１、ｍａｔｃｈ ｓｃｏｒｅ＝２、ｍｉｓｍａｔｃｈ ｓｃｏｒｅ＝－３、ｇａｐ ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ ｃｏｓｔ＝５、ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｃｏｓｔ＝２。
特定の実施形態によれば、有害生物遺伝子の核酸配列に対して所定の配列相同性を示す植物遺伝子の核酸配列を選択することは、有害生物の転写物に対して「相同性ストレッチ」を有する植物の転写物を同定することによって行われる。特定の実施形態によれば、相同性ストレッチは、植物の転写物全体にわたって２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、又はそれ以上のヌクレオチド（例えば、２０～５０ヌクレオチド、２０～２５ヌクレオチド、例えば、２１ヌクレオチド）である。２０～５０ヌクレオチド（例えば、２１ヌクレオチド）の範囲内で、植物の転写物の有害生物の転写物に対する相同性は、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又は１００％である。
特定の実施形態によれば、有害生物が線形動物（ダイズシスト線虫（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ｇｌｙｃｉｎｅｓ））である場合、有害生物遺伝子は、アクセッション番号ＡＦ４６９０６０．１（ダイズシスト線虫ユビキチン伸長タンパク質）に記載の通りであり、植物遺伝子は、ＮＭ＿００１２０３７５２．２（シロイヌナズナユビキチン１１（ＵＢＱ１１））に記載の通りである。
特定の実施形態によれば、有害生物が線形動物（ダイズシスト線虫）である場合、有害生物遺伝子は、アクセッション番号ＡＦ５０００２４．１（ダイズシスト線虫推定腺タンパク質Ｇ８Ｈ０７）に記載の通りであり、植物遺伝子は、ＮＭ＿１１６３５１．７（シロイヌナズナグリコシルトランスフェラーゼファミリー１タンパク質（ＡＴ４Ｇ０１２１０））に記載の通りである。
特定の実施形態によれば、有害生物が線形動物（ダイズシスト線虫）である場合、有害生物遺伝子は、アクセッション番号ＡＦ５０２３９１．１（ダイズシスト線虫推定腺タンパク質Ｇ１０Ａ０６）に記載の通りであり、植物遺伝子は、ＮＭ＿００１０３７０７１．１（シロイヌナズナｂＺＩＰ転写因子ファミリー１タンパク質（ＴＧＡ１））に記載の通りである。
一実施形態によれば、方法は、植物遺伝子に対するサイレンシング特異性を付与するために、ＲＮＡ分子をコードしている植物の内因性核酸配列を改変し、その結果、当該ＲＮＡ分子からプロセシングされたＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）を動員することができる低分子ＲＮＡ分子が、当該植物遺伝子の転写物と塩基相補を形成して、当該有害生物遺伝子をサイレンシングすることができる長鎖ｄｓＲＮＡ分子を生成することを含む。
一実施形態によれば、ＲＮＡ分子は、非コードＲＮＡ分子である。
本明細書で使用するとき、用語「非コードＲＮＡ分子」とは、アミノ酸配列に翻訳されず、タンパク質をコードしていないＲＮＡ配列を指す。
一実施形態によれば、ＲＮＡ分子をコードしている核酸配列は、非コード遺伝子（例えば、非タンパク質コード遺伝子）に位置する。ゲノムの例示的な非コード部分としては、イントロン、非コードＲＮＡの遺伝子、ＤＮＡメチル化領域、エンハンサー及び遺伝子座制御領域、インスレーター、Ｓ／ＭＡＲ配列、非タンパク質コード偽遺伝子、トランスポゾン、非自律性転位因子（例えば、Ａｌｕ、ＳＩＮＥＳ、並びに変異した非コードトランスポゾン及びレトロトランスポゾン）、並びに染色体のセントロメア及びテロメア領域の単純反復が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態によれば、ＲＮＡ分子をコードしている核酸配列は、遍在的に発現する非コード遺伝子に位置する。
一実施形態によれば、ＲＮＡ分子をコードしている核酸配列は、組織特異的に（例えば、葉、果実、又は花で）発現する非コード遺伝子に位置する。
一実施形態によれば、ＲＮＡ分子をコードしている核酸配列は、誘導的に発現する非コード遺伝子に位置する。
一実施形態によれば、ＲＮＡ分子をコードしている核酸配列は、発生的に調節される非コード遺伝子に位置する。
一実施形態によれば、ＲＮＡ分子をコードしている核酸配列は、遺伝子と遺伝子との間、すなわち、遺伝子間領域に位置する。
一実施形態によれば、ＲＮＡ分子をコードしている核酸配列は、非コード遺伝子のイントロン内に位置する。
一実施形態によれば、ＲＮＡ分子をコードしている核酸配列は、コード遺伝子（例えば、タンパク質コード遺伝子）に位置する。
一実施形態によれば、ＲＮＡ分子をコードしている核酸配列は、コード遺伝子（例えば、タンパク質コード遺伝子）のエキソン内に位置する。
一実施形態によれば、ＲＮＡ分子をコードしている核酸配列は、コード遺伝子（例えば、タンパク質をコードしている遺伝子）の非翻訳領域（ＵＴＲ）をコードしているエキソン内に位置する。
一実施形態によれば、ＲＮＡ分子をコードしている核酸配列は、コード遺伝子（例えば、タンパク質コード遺伝子）の翻訳されたエキソン内に位置する。
一実施形態によれば、ＲＮＡ分子をコードしている核酸配列は、コード遺伝子（例えば、タンパク質コード遺伝子）のイントロン内に位置する。
一実施形態によれば、ＲＮＡ分子をコードしている核酸配列は、遍在的に発現するコード遺伝子内に位置する。
一実施形態によれば、ＲＮＡ分子をコードしている核酸配列は、組織特異的に（例えば、葉、果実、又は花で）発現するコード遺伝子内に位置する。
一実施形態によれば、ＲＮＡ分子をコードしている核酸配列は、誘導的に発現するコード遺伝子内に位置する。
一実施形態によれば、ＲＮＡ分子をコードしている核酸配列は、発生的に調節されるコード遺伝子に位置する。
一実施形態によれば、ＲＮＡ分子（例えば、非コードＲＮＡ分子）は、典型的には、ＲＮＡサイレンシングプロセシング機構又は活性の対象となる。しかし、本明細書では、ＲｄＲＰの動員、ＲＮＡ干渉、又は翻訳阻害をもたらすプロセシング機序を惹起し得るヌクレオチドの数個の変化（例えば、ｍｉＲＮＡでは最大２４ヌクレオチド）も想定される。
特定の実施形態によれば、ＲＮＡ分子は、植物細胞に対して内因性（天然に存在、例えば、ネイティブ）である。また、ＲＮＡ分子は、細胞に対して外因性（すなわち、外部から添加され、植物細胞内で天然には存在しない）であってもよいことが理解されるであろう。
幾つかの実施形態によれば、ＲＮＡ分子（例えば、非コードＲＮＡ分子）は、内在性の翻訳阻害活性を有する。
幾つかの実施形態によれば、ＲＮＡ分子（例えば、非コードＲＮＡ分子）は、内在性のＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）活性を有する。
幾つかの実施形態によれば、ＲＮＡ分子（例えば、非コードＲＮＡ分子）は、内在性の翻訳阻害活性も内在性のＲＮＡｉ活性も含まない（すなわち、非コードＲＮＡ分子は、ＲＮＡサイレンシング活性を有しない）。
本発明の実施形態によれば、ＲＮＡ分子（例えば、非コードＲＮＡ分子）は、ネイティブの植物ＲＮＡ（例えば、天然の植物ＲＮＡ）に特異的であり、（後述の通り）そうするように設計されていない限り、関心有害生物ＲＮＡ又は植物ＲＮＡ（すなわち、植物遺伝子の転写物）を相互阻害することもサイレンシングすることもなく、ＲＴ－ＰＣＲ、ウェスタンブロット、免疫組織化学的検査、及び／又はフローサイトメトリー、シーケンシング、又は任意の他の検出方法によってＲＮＡ又はタンパク質のレベルで求めたときに、標的遺伝子に対して１００％以下のグローバル相同性、例えば、標的遺伝子に対して９９％未満、９８％未満、９７％未満、９６％未満、９５％未満、９４％未満、９３％未満、９２％未満、９１％未満、９０％未満、８９％未満、８８％未満、８７％未満、８６％未満、８５％未満、８４％未満、８３％未満、８２％未満、８１％未満のグローバル相同性を示す。
一実施形態によれば、ＲＮＡ分子（例えば、非コードＲＮＡ分子）は、ＲＮＡサイレンシング又はＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）分子（「サイレンシング分子」とも称される）である。
用語「ＲＮＡサイレンシング」又は「ＲＮＡｉ」とは、非コードＲＮＡ分子（「ＲＮＡサイレンシング分子」、「サイレンシング分子」、又は「ＲＮＡｉ分子」）が、配列特異的に、遺伝子の発現又は翻訳の転写同時又は転写後の阻害を媒介する細胞調節機序を指す。
本明細書で使用するとき、「ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）を動員することができるサイレンシング分子」とは、ＲｄＲｐをその標的転写物との相互作用部位に会合させることができ、それによって、テンプレートとして別のＲＮＡ分子に基づく長鎖ｄｓＲＮＡを形成することを可能にするサイレンシング分子を指す。非限定的な例では、ＲｄＲｐを動員することができるサイレンシング分子は、２２ｎｔ長のｍｉＲＮＡ等であるがこれに限定されないｍｉＲＮＡであり、ＴＡＳ転写物は、ｍｉＲＮＡ／ＲＩＳＣ／ＲｄＲｐ複合体のテンプレートとして機能し、その結果、ＴＡＳ転写物に基づく長鎖ｄｓＲＮＡが得られる。
一実施形態によれば、ＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）は、転写中にＲＮＡの抑制を媒介することができる（転写同時遺伝子サイレンシング）。
特定の実施形態によれば、転写同時遺伝子サイレンシングは、エピジェネティックサイレンシング（例えば、機能性遺伝子発現を妨げる染色体の状態）を含む。
一実施形態によれば、ＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）は、転写後のＲＮＡ抑制（転写後遺伝子サイレンシング）を媒介することができる。
転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）とは、典型的には、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子の分解又は切断の（典型的には、細胞の細胞質内で生じる）プロセスを指し、これは、翻訳を妨げることによってその活性を低下させる。例えば、以下に詳述する通り、ＲＮＡサイレンシング分子のガイド鎖は、ｍＲＮＡ分子における相補的な配列と対合し、例えば、アルゴノート２（Ａｇｏ２）による切断を誘導する。
転写同時遺伝子サイレンシングは、典型的には、遺伝子活性の不活性化（すなわち、転写抑制）を指し、典型的には細胞核内で起こる。このような遺伝子活性の抑制は、標的ＤＮＡ及びヒストンをメチル化するメチル基転移酵素等のエピジェネティック関連因子によって媒介される。このように、転写同時遺伝子サイレンシングでは、低分子ＲＮＡと標的ＲＮＡとの結合（低分子ＲＮＡ－転写物相互作用）により、標的新生転写物が不安定化し、遺伝子の活性及び転写を抑制する構造へのクロマチンのリモデリングを誘導する、ＤＮＡ及びヒストンを修飾する酵素（すなわち、エピジェネティック因子）を動員する。また、転写同時遺伝子サイレンシングでは、クロマチンに結合した長鎖非コードＲＮＡスカフォールドが、低分子ＲＮＡとは独立してクロマチン修飾複合体を動員し得る。これら転写同時サイレンシング機序は、不適切な転写事象を検出し、サイレンシングするＲＮＡ監視システムを形成し、自己強化型エピジェネティックループを介してこれら事象の記憶を提供する［Ｄ．Ｈｏｃｈ ａｎｄ Ｄ．Ｍｏａｚｅｄ，ＲＮＡ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ．（２０１５）１６（２）：７１－８４に記載の通り］。
本発明の実施形態によれば、ＲＮＡｉバイオジェネシス／プロセシング機構によって、ＲＮＡサイレンシング分子が作製される。
本発明の実施形態によれば、ＲＮＡｉバイオジェネシス／プロセシング機構によって、ＲＮＡサイレンシング分子が作製されるが、具体的な標的は同定されていない。
一実施形態によれば、ＲＮＡ分子（例えば、非コードＲＮＡ分子）は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を誘導することができる。
一実施形態によれば、ＲＮＡ分子（例えば、非コードＲＮＡ分子又はＲＮＡサイレンシング分子）は、前駆体からプロセシングされる。
一実施形態によれば、ＲＮＡ分子（例えば、非コードＲＮＡ分子又はＲＮＡサイレンシング分子）は、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）前駆体からプロセシングされる。
一実施形態によれば、ＲＮＡ分子（例えば、非コードＲＮＡ分子又はＲＮＡサイレンシング分子）は、二重鎖構造の一本鎖ＲＮＡ前駆体からプロセシングされる。
一実施形態によれば、ＲＮＡ分子（例えば、非コードＲＮＡ分子又はＲＮＡサイレンシング分子）は、ｄｓＲＮＡ前駆体（例えば、完全及び不完全な塩基対合を含む）からプロセシングされる。
一実施形態によれば、ＲＮＡ分子（例えば、非コードＲＮＡ分子又はＲＮＡサイレンシング分子）は、非構造化ＲＮＡ前駆体からプロセシングされる。
一実施形態によれば、ＲＮＡ分子（例えば、非コードＲＮＡ分子又はＲＮＡサイレンシング分子）は、タンパク質コードＲＮＡ前駆体からプロセシングされる。
一実施形態によれば、ＲＮＡ分子（例えば、非コードＲＮＡ分子又はＲＮＡサイレンシング分子）は、ＲＮＡ前駆体からプロセシングされる。
一実施形態によれば、ＲＮＡ分子（例えば、非コードＲＮＡ分子又はＲＮＡサイレンシング分子）は、プロセシングされ、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と会合する。
一実施形態によれば、ＲＮＡ分子（例えば、非コードＲＮＡ分子又はＲＮＡサイレンシング分子）は、プロセシングされ、ＲＮＡｉプロセシング機構、例えば、ダイサー、Ａｇｏ２、ＤＩＣＥＲタンパク質ファミリー（例えば、ＤＣＲ１及びＤＣＲ２）、ＤＩＣＥＲ－ＬＩＫＥタンパク質ファミリー（例えば、ＤＣＬ１、ＤＣＬ２、ＤＣＬ３、ＤＣＬ４）、ＡＲＧＯＮＡＵＴＥタンパク質ファミリー（例えば、ＡＧＯ１、ＡＧＯ２、ＡＧＯ３、ＡＧＯ４）、ｔＲＮＡ切断酵素（例えば、ＲＮＹ１、ＡＮＧＩＯＧＥＮＩＮ、ＲＮａｓｅ Ｐ、ＲＮａｓｅ Ｐ様、ＳＬＦＮ３、ＥＬＡＣ１、及びＥＬＡＣ２）、及びＰｉｗｉ結合ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）関連タンパク質（例えば、ＡＧＯ３、ＡＵＢＥＲＧＩＮＥ、ＨＩＷＩ、ＨＩＷＩ２、ＨＩＷＩ３、ＰＩＷＩ、ＡＬＧ１、及びＡＬＧ２）（以下で更に論じる）が挙げられるがこれらに限定されないリボヌクレアーゼと会合する。
一実施形態によれば、ｄｓＲＮＡは、２つの異なる相補的なＲＮＡに由来していてもよく、又はｄｓＲＮＡを形成するためにそれ自体に折り重ねられる単一のＲＮＡに由来していてもよい。
以下は、本発明の特定の実施形態に従って使用することができる、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と会合し、内在性のＲＮＡｉ活性を有する（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子である）ＲＮＡサイレンシング分子（例えば、非コードＲＮＡ分子）についての詳細な説明である。
完全及び不完全ベースの対合したＲＮＡ（すなわち、二本鎖ＲＮＡ；ｄｓＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡ－細胞内に長鎖ｄｓＲＮＡが存在すると、ダイサーと称されるリボヌクレアーゼＩＩＩ酵素の活性が刺激される。ダイサー（エンドリボヌクレアーゼダイサー又はＲＮａｓｅモチーフを有するヘリカーゼとしても知られている）は、植物では典型的にはダイサー様（ＤＣＬ）タンパク質と称される酵素である。植物によってＤＣＬ遺伝子の数は異なるので、例えば、シロイヌナズナゲノムは、典型的には、４つのＤＣＬ遺伝子を有し、イネは、８つのＤＣＬ遺伝子を有し、トウモロコシゲノムは、５つのＤＣＬ遺伝子を有する。ダイサーは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として知られているｄｓＲＮＡの短い片へのｄｓＲＮＡのプロセシングに関与する。ダイサー活性に由来するｓｉＲＮＡは、典型的には、約２１～約２３ヌクレオチド長であり、２つの３’ヌクレオチドのオーバーハングを有する約１９塩基対の二重鎖を含む。
一実施形態によれば、２１ｂｐよりも長いｄｓＲＮＡ前駆体が使用される。様々な研究により、長鎖ｄｓＲＮＡを用いて、ストレス応答を誘導することも著しいオフターゲット作用を引き起こすこともなく、遺伝子発現をサイレンシングできることが実証されている－例えば、［Ｓｔｒａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００６，Ｖｏｌ．３４，Ｎｏ．１３ ３８０３－３８１０；Ｂｈａｒｇａｖａ Ａ ｅｔ ａｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｐｒｏｔｏｃ．２００４；１３：１１５－１２５；Ｄｉａｌｌｏ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．２００３；１３：３８１－３９２；Ｐａｄｄｉｓｏｎ Ｐ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００２；９９：１４４３－１４４８；Ｔｒａｎ Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２００４；５７３：１２７－１３４］を参照。
用語「ｓｉＲＮＡ」とは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路を誘導する低分子阻害性ＲＮＡ二重鎖（一般的には１８～３０塩基対）を指す。典型的には、ｓｉＲＮＡは、中央に１９ｂｐの二重鎖領域を有し、末端に対称的な２塩基の３’オーバーハングを有する２１ｍｅｒとして化学的に合成されるが、最近、２５～３０塩基長の化学的に合成されたＲＮＡ二重鎖が、同じ位置にある２１ｍｅｒと比較して効力が１００倍も増加し得ることが報告されている。ＲＮＡｉの誘発においてより長いＲＮＡを用いて得られる効力の増大が観察されたことは、ダイサーに生成物（２１ｍｅｒ）ではなく基質（２７ｍｅｒ）を与えたことに起因しており、これがｓｉＲＮＡ二重鎖のＲＩＳＣへの侵入の速度又は効率を改善することが示唆される。
３’オーバーハングの組成ではなく位置がｓｉＲＮＡの効力に影響を与え、アンチセンス鎖に３’オーバーハングを有する非対称的な二重鎖は、一般的に、センス鎖に３’オーバーハングを有するものよりも効力が高いことが判明している（Ｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，２００５）。
二本鎖干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）の鎖は、接続してヘアピン又はステムループの構造（例えば、ｓｈＲＮＡ）を形成することができる。従って、前述のように、本発明の幾つかの実施形態のＲＮＡサイレンシング分子は、短鎖ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であってもよい。
短鎖ヘアピン型ＲＮＡ、「ｓｈＲＮＡ」という用語は、本明細書で使用するとき、ステムループ構造を有し、相補的配列の第１及び第２の領域を含み、当該領域の相補性の程度及び配向が当該領域間で塩基対合が生じるのに十分であり、当該第１及び第２の領域がループ領域によって接合され、当該ループがループ領域内のヌクレオチド（又はヌクレオチドアナログ）間の塩基対合の欠如から生じる、ＲＮＡ分子を指す。ループにおけるヌクレオチド数は、３以上２３以下、又は５以上１５以下、又は７以上１３以下、又は４以上９以下、又は９以上１１以下の数である。ループにおけるヌクレオチドの一部は、ループにおける他のヌクレオチドとの塩基対相互作用に関与し得る。ループを形成するために使用することができるオリゴヌクレオチド配列の例としては、５’－ＣＡＡＧＡＧＡ－３’及び５’－ＵＵＡＣＡＡ－３’（国際公開第２０１３１２６９６３号及び同第２０１４１０７７６３号）が挙げられる。得られた一本鎖オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡｉ機構と相互作用することができる二本鎖領域を含むステムループ又はヘアピンの構造を形成することを、当業者であれば認識するであろう。
本発明の幾つかの実施形態のＲＮＡサイレンシング分子は、ＲＮＡのみを含有する分子に限定される必要はなく、化学的に修飾されたヌクレオチド及び非ヌクレオチドを更に包含する。
トランス作用型ｓｉＲＮＡ（ＴａｓｉＲＮＡ）、リピート関連ｓｉＲＮＡ（Ｒａ－ｓｉＲＮＡ）、及び天然アンチセンス転写物由来のｓｉＲＮＡ（Ｎａｔ－ｓｉＲＮＡ）を含む、様々な種類のｓｉＲＮＡが本発明によって企図される。
特定の実施形態によれば、ＲＮＡ分子（例えば、非コードＲＮＡ分子）は、フェーズド低分子干渉ＲＮＡ（ｐｈａｓｉＲＮＡ）である。「ＰｈａｓｉＲＮＡ」は、シロイヌナズナのトランス作用性ｓｉＲＮＡ（ｔａｓｉＲＮＡ）の分類によって例示される、ＲＤＲ６によってｄｓＲＮＡに変換され、ＤＣＬ４によってプロセシングされたｍＲＮＡに由来するものである（Ｖａｚｑｕｅｚ ｅｔ ａｌ．，２００４）。例外的な場合、草本の生殖組織では、ｐｈａｓｉＲＮＡがＤＣＬ５（以前はＤＣＬ３ｂとして知られていた）の２４ヌクレオチドの産物である場合もある（Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ，２０１２）。幾つかのｐｈａｓｉＲＮＡのトランス作用性の名称（ｔａｓｉＲＮＡ）は、相同性依存的にｍｉＲＮＡのように機能し、起源ｍＲＮＡ以外の遺伝子からのｍＲＮＡのＡＧＯ１依存的スライシングを指示することに由来する（下記参照）。
特定の実施形態によれば、ＲＮＡ分子（例えば、非コードＲＮＡ分子）は、ｔａｓｉＲＮＡである。「ＴａｓｉＲＮＡ」は、フェーズドパターンでｍｉＲＮＡトリガーによって非コードＴＡＳ転写物から生成される二次ｓｉＲＮＡのクラスである（Ｐｅｒａｇｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｖａｚｑｕｅｚ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｙｏｓｈｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，２００５）。用語「フェーズド」とは、単に、特定のヌクレオチドで出発して、低分子ＲＮＡがヘッド・ツー・テイル配置で正確に作製されることを示し；この配置は、ｍｉＲＮＡに惹起されて始まり、続いて、ＤＣＬ４に触媒される切断が生じることに起因する。ｔａｓｉＲＮＡのバイオジェネシスに関与する主要なタンパク質としては、ＲＤＲ６、ＳＵＰＰＲＥＳＳＯＲ ＯＦ ＧＥＮＥ ＳＩＬＥＮＣＩＮＧ３（ＳＧＳ３）、ＤＣＬ４、ＡＧＯ１、ＡＧＯ７、及びＤＯＵＢＬＥ－ＳＴＲＡＮＤＥＤ ＲＮＡ ＢＩＮＤＩＮＧ ＦＡＣＴＯＲ４が挙げられるが、これらに限定されない（Ｐｅｒａｇｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｖａｚｑｕｅｚ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ａｄｅｎｏｔ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ ｅｔ ａｌ．，２００８ａ；Ｆｕｋｕｄｏｍｅ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。最も重要なことに、「１ヒット」又は「２ヒット」経路として知られている、２１ヌクレオチドのｔａｓｉＲＮＡが生成される２つの機序が存在する。１ヒット機序では、単一のｍｉＲＮＡが、標的部位の断片３９（又は下流）においてｐｈａｓｉＲＮＡの生成を惹起するｍＲＮＡ標的の切断を指示する（Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００５）。１ヒットｍｉＲＮＡトリガーは、典型的には、２２ヌクレオチド長である（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｃｕｐｅｒｕｓ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。２ヒットモデルでは、２１ヌクレオチドのｍｉＲＮＡ標的部位の対を使用し、そのうち３９標的部位でのみ切断が生じ、標的部位のｐｈａｓｉＲＮＡ断片（又は上流）が生成される（Ａｘｔｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００６）。
一実施形態によれば、サイレンシングＲＮＡは、約２６及び３１ヌクレオチド長のＰｉｗｉ結合ＲＮＡのクラスである「ｐｉＲＮＡ」を含む。ｐｉＲＮＡは、典型的には、Ｐｉｗｉタンパク質との相互作用を通じてＲＮＡ－タンパク質複合体を形成する、すなわち、アンチセンスｐｉＲＮＡは、典型的には、Ｐｉｗｉタンパク質（例えば、Ｐｉｗｉ、Ａｇｏ３、及びＡｕｂｅｒｇｉｎｅ（Ａｕｂ））にロードされる。
ｍｉＲＮＡ－別の実施形態によれば、ＲＮＡサイレンシング分子はｍｉＲＮＡであってもよい。
用語「ｍｉｃｒｏＲＮＡ」、「ｍｉＲＮＡ」、及び「ｍｉＲ」は同義であり、遺伝子発現を調節する約１９～２４ヌクレオチド長の非コード一本鎖ＲＮＡ分子の集合体を指す。ｍｉＲＮＡは、広範な生物（例えば、昆虫、哺乳類、植物、線形動物）にみられ、発生、恒常性、及び疾患の病因において役割を果たすことが示されている。
ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、最初、長い不完全な二本鎖のステムループＲＮＡとして存在し、ダイサーによって、成熟ガイド鎖（ｍｉＲＮＡ）及びパッセンジャー鎖として知られている同様のサイズの断片（ｍｉＲＮＡ＊）を含むｓｉＲＮＡ様二重鎖に更にプロセシングされる。ｍｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ＊は、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ及びｐｒｅ－ｍｉＲＮＡの対向するアームに由来し得る。ｍｉＲＮＡ＊配列は、クローニングされたｍｉＲＮＡのライブラリーにみられることもあるが、典型的には、ｍｉＲＮＡよりも低頻度であり、その理由は、ほとんどの場合、細胞内で機能せず、分解されるためである。
最初はｍｉＲＮＡ＊と共に二本鎖種として存在するが、ｍｉＲＮＡは、最終的には、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）として知られているリボ核タンパク質複合体に一本鎖ＲＮＡとして組み込まれる。様々なタンパク質がＲＩＳＣを形成することができ、これによって、ｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ＊二重鎖に対する特異性、標的遺伝子の結合部位、ｍｉＲＮＡの活性（抑制又は活性化）、及びｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ＊二重鎖のどちらの鎖がＲＩＳＣにロードされるかが変化し得る。
ｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ＊二重鎖のｍｉＲＮＡ鎖がＲＩＳＣにロードされたとき、ｍｉＲＮＡ＊は除去され、分解される。ＲＩＳＣにロードされるｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ＊二重鎖の鎖は、５’末端がそれほど緊密に対合していない方の鎖である。ｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ＊の両端がほぼ等価な５’対合を有する場合、ｍｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ＊の両方が遺伝子サイレンシング活性を有し得る。
ＲＩＳＣは、ｍｉＲＮＡとｍＲＮＡとの間の高いレベルの相補性に基づいて、特にｍｉＲＮＡの２～８番目のヌクレオチド（「シード配列」と称される）によって標的核酸を特定する。
翻訳を効率的に阻害するためのｍｉＲＮＡとそのｍＲＮＡ標的との間の塩基対合要件については、多くの研究によって調べられている（Ｂａｒｔｅｌ ２００４，Ｃｅｌｌ １１６－２８１により概説）。ゲノム全体におけるｍｉＲＮＡの結合を解析した計算機による研究では、ｍｉＲＮＡの５’側の２～８番目の塩基（「シード配列」とも称される）が標的との結合において特別な役割を果たすことが示唆されているが、通常「Ａ」であることが判明している最初のヌクレオチドの役割も認識されている（Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．２００５ Ｃｅｌｌ １２０－１５）。同様に、Ｋｒｅｋら（２００５，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ３７－４９５）は、１～７番目又は２～８番目のヌクレオチドを用いて標的を同定し、検証した。ｍＲＮＡにおける標的部位は、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、又はコード領域に存在し得る。興味深いことに、複数のｍｉＲＮＡが、同じ部位又は複数の部位を認識することによって同じｍＲＮＡ標的を調節することがある。ほとんどの遺伝的に同定された標的に複数のｍｉＲＮＡ結合部位が存在することは、複数のＲＩＳＣの協同作用が最も効率的な翻訳阻害をもたらすことを示している可能性がある。
ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡの切断又は翻訳抑制という２つの機序のいずれかによって遺伝子発現をダウンレギュレートするようにＲＩＳＣに指示することができる。ｍＲＮＡがｍｉＲＮＡに対してある程度の相補性を有している場合、ｍｉＲＮＡはｍＲＮＡの切断を指定することができる。ｍｉＲＮＡが切断を誘導する場合、典型的には、ｍｉＲＮＡの１０及び１１番目の残基に対するヌクレオチド対合間で切断される。あるいは、ｍｉＲＮＡがｍｉＲＮＡに対して必要な程度の相補性を有しない場合、ｍｉＲＮＡは翻訳を抑制することができる。動物ではｍｉＲＮＡと結合部位との間の相補性の程度が低い場合があるので、翻訳抑制は、動物においてより広く存在している可能性がある。
ｍｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ＊の任意の対の５’末端及び３’末端にはばらつきがある場合があることに留意すべきである。このばらつきは、切断部位に対するドローシャ及びダイサーの酵素的プロセシングのばらつきに起因している可能性がある。ｍｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ＊の５’末端及び３’末端におけるばらつきは、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ及びｐｒｅ－ｍｉＲＮＡのステム構造におけるミスマッチに起因している可能性もある。ステム鎖のミスマッチは、異なるヘアピン構造の集団につながる可能性がある。ステム構造におけるばらつきは、ドローシャ及びダイサーによる切断の生成物のばらつきにもつながる可能性がある。
一実施形態によれば、ｍｉＲＮＡは、ダイサーとは独立して、例えばアルゴノート２によってプロセシングされ得る。
ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ配列は、４５～９０、６０～８０、又は６０～７０ヌクレオチドを含み得、一方、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ配列は、４５～３０，０００、５０～２５，０００、１００～２０，０００、１，０００～１，５００、又は８０～１００ヌクレオチドを含み得ることが理解されるであろう。
アンチセンス－アンチセンスは、ある遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズすることによってその遺伝子の発現を阻止又は阻害するように設計された一本鎖ＲＮＡである。標的ＲＮＡをコードしているｍＲＮＡ転写物と特異的にハイブリダイズすることができるアンチセンスポリヌクレオチドを用いて、標的ＲＮＡのダウンレギュレーションを行うことができる。
転位因子ＲＮＡ
転位性遺伝要素（ＴＥ）は、膨大なＤＮＡ配列を含み、その全てが、カットアンドペースト機序によって直接（トランスポゾン）又はＲＮＡ中間体を介して間接的に（レトロトランスポゾン）ゲノム中の新たな部位に移動する能力を有している。ＴＥは、転位に必要なタンパク質をコードしているＯＲＦを有しているかどうかに応じて、自律性クラスと非自律性クラスに分けられる。ＲＮＡが媒介する遺伝子サイレンシングは、ゲノムがＴＥ活性、並びにゲノムの遺伝的な及びエピジェネティックな不安定性に由来する有害な影響を制御する機序のうちの１つである。
上述の通り、ＲＮＡ分子（例えば、非コードＲＮＡ分子）は、標準的な（内在性の）ＲＮＡｉ活性を有しない場合がある（例えば、標準的なＲＮＡサイレンシング分子ではない又はその標的が同定されていない）。このようなＲＮＡサイレンシング分子としては、以下が挙げられる。
一実施形態によれば、ＲＮＡ分子（例えば、非コードＲＮＡ分子）は、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）である。用語「ｔＲＮＡ」とは、核酸のヌクレオチド配列とタンパク質のアミノ酸配列とを物理的に連結させる役割を果たすＲＮＡ分子を指し、以前は可溶性ＲＮＡ又はｓＲＮＡと称されていた。ｔＲＮＡは、典型的には、約７６～９０ヌクレオチド長である。
一実施形態によれば、ＲＮＡ分子（例えば、非コードＲＮＡ分子）は、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）である。用語「ｒＲＮＡ」とは、リボソーム、すなわち、リボソーム小サブユニット又はリボソーム大サブユニットのいずれかのＲＮＡ構成要素を指す。
一実施形態によれば、ＲＮＡ分子（例えば、非コードＲＮＡ分子）は、低分子核内ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ又はＵ－ＲＮＡ）である。用語「ｓＲＮＡ」又は「Ｕ－ＲＮＡ」は、真核細胞における細胞核のスプライシングスペックル及びカハール体内にみられる低分子ＲＮＡ分子を指す。ｓｎＲＮＡは、典型的には、約１５０ヌクレオチド長である。
一実施形態によれば、ＲＮＡ分子（例えば、非コードＲＮＡ分子）は、低分子核小体ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）である。用語「ｓｎｏＲＮＡ」とは、他のＲＮＡ、例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、及びｓｎＲＮＡの化学修飾を主に誘導する低分子ＲＮＡ分子のクラスを指す。ｓｎｏＲＮＡは、典型的には、２つのクラスのうちの１つに分類される：Ｃ／ＤボックスｓｎｏＲＮＡは、典型的には、約７０～１２０ヌクレオチド長であり、メチル化に関連しており、Ｈ／ＡＣＡボックスｎｏＲＮＡは、典型的には約１００～２００ヌクレオチド長であり、プソイドウリジン化に関連している。
ＲＮＡ成熟においてｓｎｏＲＮＡと同様の役割を果たすｓｃａＲＮＡ（すなわち、低分子カハール体ＲＮＡ遺伝子）はｓｎｏＲＮＡに類似しているが、その標的はスプライセオソームｓｎＲＮＡであり、（核のカハール体において）スプライセオソームｓｎＲＮＡ前駆体の部位特異的な修飾を行う。
一実施形態によれば、ＲＮＡ分子（例えば、非コードＲＮＡ分子）は、細胞外ＲＮＡ（ｅｘＲＮＡ）である。用語「ｅｘＲＮＡ」は、それが転写された細胞の外に存在するＲＮＡ種を指す（例えば、エキソソームＲＮＡ）。
一実施形態によれば、ＲＮＡ分子（例えば、非コードＲＮＡ分子）は、リピート由来のＲＮＡである。用語「リピート由来のＲＮＡ」とは、逆方向ゲノム反復に由来するＤＮＡ（例えば、ＤＮＡ組み換え、ゲノム遺伝子座の重複、転位事象等によって生成されたＤＮＡ等であるが、これらに限定されない）によってコードされているＲＮＡを指す。
一実施形態によれば、ＲＮＡ分子（例えば、非コードＲＮＡ分子）は、鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）である。用語「ｌｎｃＲＮＡ」又は「長鎖ｎｃＲＮＡ」とは、典型的には２００ヌクレオチドよりも長い非タンパク質コード転写物を指す。
特定の実施形態によれば、ＲＩＳＣと会合するＲＮＡ分子（例えば、非コードＲＮＡ分子）の非限定的な例としては、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ結合ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、フェーズド低分子干渉ＲＮＡ（ｐｈａｓｉＲＮＡ）、トランス作用性ｓｉＲＮＡ（ｔａｓｉＲＮＡ）、低分子核内ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ又はＵＲＮＡ）、転位因子ＲＮＡ（例えば、自律性及び非自律性の転位性ＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、低分子核小体ＲＮＡ分子（ｓｎｏＲＮＡ）、低分子カハール体ＲＮＡ（ｓｃａＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、細胞外ＲＮＡ（ｅｘＲＮＡ）、リピート由来のＲＮＡ、及び長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態によれば、ＲＩＳＣと会合するＲＮＡｉ分子の非限定的な例としては、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ結合ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、フェーズド低分子干渉ＲＮＡ（ｐｈａｓｉＲＮＡ）、及びトランス作用性ｓｉＲＮＡ（ｔａｓｉＲＮＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態によれば、本発明の幾つかの実施形態のＲＮＡ分子（例えば、非コードＲＮＡ分子）からプロセシングされた低分子ＲＮＡ分子は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）を動員することができる。
用語「プロセシングされた」とは、ＲＮＡ分子が、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と会合可能な低分子ＲＮＡ形態に切断されるバイオジェネシスを指す。例えば、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、例えばダイサーによって成熟ｍｉＲＮＡにプロセシングされる。
本明細書で使用するとき、用語「低分子ＲＮＡ形態」又は「低分子ＲＮＡ」又は「低分子ＲＮＡ分子」とは、成熟低分子ＲＮＡが標的ＲＮＡ、例えば、植物遺伝子の転写物（又はその断片）とハイブリダイズできることを指す。
一実施形態によれば、低分子ＲＮＡは、２５０ヌクレオチド以下の長さを有し、例えば、２０～２５０個、２０～２００個、２０～１５０個、２０～１００個、２０～５０個、２０～４０個、２０～３０個、２０～２５個、２０～２６個、３０～１００個、３０～８０個、３０～６０個、３０～５０個、３０～４０個、５０～１５０個、５０～１００個、５０～８０個、５０～７０個、１００～２５０個、１００～２００個、１００～１５０個、１５０～２５０個、１５０～２００個のヌクレオチドを含む。
特定の実施形態によれば、低分子ＲＮＡ分子は、２０～５０ヌクレオチドを含む。
特定の実施形態によれば、低分子ＲＮＡ分子は、２０～３０ヌクレオチドを含む。
特定の実施形態によれば、低分子ＲＮＡ分子は、２１～２９ヌクレオチドを含む。
特定の実施形態によれば、低分子ＲＮＡ分子は、２１～２４ヌクレオチドを含む。
特定の実施形態によれば、低分子ＲＮＡ分子は、２１ヌクレオチドを含む。
特定の実施形態によれば、低分子ＲＮＡ分子は、２２ヌクレオチドを含む。
特定の実施形態によれば、低分子ＲＮＡ分子は、２３ヌクレオチドを含む。
特定の実施形態によれば、低分子ＲＮＡ分子は、２４ヌクレオチドを含む。
特定の実施形態によれば、低分子ＲＮＡ分子は、２０～５０ヌクレオチドからなる。
特定の実施形態によれば、低分子ＲＮＡ分子は、２０～３０ヌクレオチドからなる。
特定の実施形態によれば、低分子ＲＮＡ分子は、２１～２９ヌクレオチドからなる。
特定の実施形態によれば、低分子ＲＮＡ分子は、２１～２４ヌクレオチドからなる。
特定の実施形態によれば、低分子ＲＮＡ分子は、２１ヌクレオチドからなる。
特定の実施形態によれば、低分子ＲＮＡ分子は、２２ヌクレオチドからなる。
特定の実施形態によれば、低分子ＲＮＡ分子は、２３ヌクレオチドからなる。
特定の実施形態によれば、低分子ＲＮＡ分子は、２４ヌクレオチドからなる。
一実施形態によれば、低分子ＲＮＡ分子は、サイレンシング活性を有する（すなわち、サイレンシング分子である）。
前述のように、本発明の幾つかの実施形態のサイレンシング分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）を動員することができる。
用語「ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ」又は「ＲｄＲｐ」とは、ＲＮＡテンプレートからのＲＮＡの複製を触媒する酵素を指す。
一実施形態によれば、低分子ＲＮＡ分子は、ＲｄＲｐに対するアンプリファイア又はプライマー活性を有する。
特定の実施形態によれば、ＲｄＲｐを動員することができるサイレンシング分子は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ結合ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、トランス作用性ｓｉＲＮＡ（ｔａｓｉＲＮＡ）、フェーズド低分子干渉ＲＮＡ（ｐｈａｓｉＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、低分子核内ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、低分子核小体ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、細胞外ＲＮＡ（ｅｘＲＮＡ）、リピート由来のＲＮＡ、自律性及び非自律性の転位性ＲＮＡから選択される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＲｄＲｐを動員することができるサイレンシング分子は、２１～２４ヌクレオチドを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＲｄＲｐを動員することができるサイレンシング分子は、２１ヌクレオチドを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＲｄＲｐを動員することができるサイレンシング分子は、２２ヌクレオチドを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＲｄＲｐを動員することができるサイレンシング分子は、２３ヌクレオチドを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＲｄＲｐを動員することができるサイレンシング分子は、２４ヌクレオチドを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＲｄＲｐを動員することができるサイレンシング分子は、２１ヌクレオチドからなる。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＲｄＲｐを動員することができるサイレンシング分子は、２２ヌクレオチドからなる。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＲｄＲｐを動員することができるサイレンシング分子は、２３ヌクレオチドからなる。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＲｄＲｐを動員することができるサイレンシング分子は、２４ヌクレオチドからなる。
特定の実施形態によれば、ＲｄＲｐを動員することができるサイレンシング分子は、ｍｉＲＮＡである。
特定の実施形態によれば、ｍｉＲＮＡは、２１～２５ヌクレオチドの成熟低分子ＲＮＡを含む。
特定の実施形態によれば、ｍｉＲＮＡは、２１ヌクレオチドの成熟低分子ＲＮＡを含む。
特定の実施形態によれば、ｍｉＲＮＡは、２２ヌクレオチドの成熟低分子ＲＮＡを含む。
特定の実施形態によれば、ｍｉＲＮＡは、２３ヌクレオチドの成熟低分子ＲＮＡを含む。
特定の実施形態によれば、ｍｉＲＮＡは、２４ヌクレオチドの成熟低分子ＲＮＡを含む。
特定の実施形態によれば、ｍｉＲＮＡは、２５ヌクレオチドの成熟低分子ＲＮＡを含む。
特定の実施形態によれば、ｍｉＲＮＡは、２１～２５ヌクレオチドの成熟低分子ＲＮＡである。
特定の実施形態によれば、ｍｉＲＮＡは、２１ヌクレオチドの成熟低分子ＲＮＡである。
特定の実施形態によれば、ｍｉＲＮＡは、２２ヌクレオチドの成熟低分子ＲＮＡを含む。
特定の実施形態によれば、ｍｉＲＮＡは、２３ヌクレオチドの成熟低分子ＲＮＡである。
特定の実施形態によれば、ｍｉＲＮＡは、２４ヌクレオチドの成熟低分子ＲＮＡである。
特定の実施形態によれば、ｍｉＲＮＡは、２５ヌクレオチドの成熟低分子ＲＮＡである。
例示的なｍｉＲＮＡとしては、ｍｉＲ－１５６ａ、ｍｉＲ－１５６ｃ、ｍｉＲ－１６２ａ、ｍｉＲ－１６２ｂ、ｍｉＲ－１６７ｄ、ｍｉＲ－１６９ｂ、ｍｉＲ－１７３、ｍｉＲ－３９３ａ、ｍｉＲ－３９３ｂ、ｍｉＲ－４０２、ｍｉＲ－４０３、ｍｉＲ－４４７ａ、ｍｉＲ－４４７ｂ、ｍｉＲ－４４７ｃ、ｍｉＲ－４７２、ｍｉＲ－７７１、ｍｉＲ－７７７、ｍｉＲ－８２８、ｍｉＲ－８３０、ｍｉＲ－８３１、ｍｉＲ－８３１、ｍｉＲ－８３３ａ、ｍｉＲ－８３３ａ、ｍｉＲ－８４０、ｍｉＲ－８４５ｂ、ｍｉＲ－８４８、ｍｉＲ－８５０、ｍｉＲ－８５３、ｍｉＲ－８５５、ｍｉＲ－８５６、ｍｉＲ－８６４、ｍｉＲ－２９３３ａ、ｍｉＲ－２９３３ｂ、ｍｉＲ－２９３６、ｍｉＲ－４２２１、ｍｉＲ－５０２４、ｍｉＲ－５６２９、ｍｉＲ－５６４８、ｍｉＲ－５９９６、ｍｉＲ－８１６６、ｍｉＲ－８１６７ａ、ｍｉＲ－８１６７ｂ、ｍｉＲ－８１６７ｃ、ｍｉＲ－８１６７ｄ、ｍｉＲ－８１６７ｅ、ｍｉＲ－８１６７ｆ、ｍｉＲ－８１７７、及びｍｉＲ－８１８２が挙げられるが、これらに限定されない。
上述したように、本発明の幾つかの実施形態の方法は、植物遺伝子に対するサイレンシング特異性を付与するために、ＲＮＡ分子をコードしている植物の内因性核酸配列を改変することを含む。
一実施形態によれば、ＲＮＡ分子が内在性のサイレンシング活性を有しない場合、方法は、植物遺伝子に対するＲＮＡ分子のサイレンシング特異性を付与するＤＮＡ編集剤を植物細胞に導入することを更に含む。
一実施形態によれば、ＲＮＡ分子がネイティブの植物遺伝子に対して内在性のサイレンシング活性を有する場合、方法は、ＲＮＡ分子のサイレンシング特異性を、ネイティブの植物遺伝子とは異なる植物遺伝子に向けてリダイレクトするＤＮＡ編集剤を植物細胞に導入することを更に含む。
核酸配列を変更する方法については、以下で詳細に論じる。
幾つかの実施形態、例えば、本明細書に記載の第２のモデルによれば、有害生物遺伝子に対するサイレンシング特異性を付与する長鎖ｄｓＲＮＡ分子をコードするように、植物遺伝子の核酸配列が改変される。幾つかの実施形態によれば、この核酸配列は、ネイティブの植物遺伝子に対して内在性のサイレンシング活性を有するＲＮＡ分子をコードしており、その結果、この改変により、内在性のサイレンシング活性に加えて又はその代わりに、（例えば、有害生物遺伝子に対する）新規のサイレンシング活性を有するサイレンシングＲＮＡが得られる。各可能性は、本発明の別個の実施態様を表す。
従って、本発明の別の態様によれば、有害生物遺伝子をサイレンシングすることができる長鎖ｄｓＲＮＡ分子を植物細胞内で生成する方法であって、
（ａ）標的として植物遺伝子を有するサイレンシング分子であって、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）を動員することができるサイレンシング分子をコードしている核酸配列を植物のゲノムにおいて選択することと；
（ｂ）有害生物遺伝子に対するサイレンシング特異性を付与するために当該植物遺伝子の核酸配列を改変し、その結果、当該サイレンシング特異性を有する当該植物遺伝子の転写物が、当該ＲｄＲｐを動員することができるサイレンシング分子と塩基相補を形成して、当該有害生物遺伝子をサイレンシングすることができる長鎖ｄｓＲＮＡ分子を生成し、
それによって、当該有害生物遺伝子をサイレンシングすることができる長鎖ｄｓＲＮＡ分子を当該植物細胞内で生成することと、
を含む方法が提供される。
一実施形態によれば、植物遺伝子は、内在性のサイレンシング活性を有する分子をコードしていない。
一実施形態によれば、植物遺伝子が内在性のサイレンシング活性を有する分子をコードしていない場合、方法は、有害生物遺伝子に対する植物遺伝子のサイレンシング特異性を付与するＤＮＡ編集剤を植物細胞に導入することを更に含む。
一実施形態によれば、植物遺伝子は、ネイティブの植物遺伝子に対する内在性のサイレンシング活性を有する分子をコードしている。
一実施形態によれば、内在性のサイレンシング活性を有する植物遺伝子は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ結合ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、トランス作用性ｓｉＲＮＡ（ｔａｓｉＲＮＡ）、フェーズド低分子干渉ＲＮＡ（ｐｈａｓｉＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、低分子核内ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、低分子核小体ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、細胞外ＲＮＡ（ｅｘＲＮＡ）、リピート由来のＲＮＡ、自律性及び非自律性の転位性ＲＮＡから選択される。
幾つかの実施形態によれば、内在性のサイレンシング活性を有するＲＮＡをコードしている植物遺伝子は、フェーズド二次ｓｉＲＮＡ生成分子をコードしている。
本明細書で使用するとき、語句「フェーズド二次ｓｉＲＮＡ生成分子」とは、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）を動員する一次サイレンシング分子（例えば、ｍｉＲＮＡ）と塩基相補を形成することができ、それによって、長鎖ｄｓＲＮＡ分子に転写され、次に、二次サイレンシングＲＮＡ分子（すなわち、フェーズドＲＮＡ）にプロセシングされるＲＮＡ転写物を指す。幾つかの実施形態によれば、フェーズド二次ｓｉＲＮＡ生成分子は、ｔａｓｉＲＮＡ及びｐｈａｓｉＲＮＡからなる群から選択される。
幾つかの実施形態によれば、フェーズド二次ｓｉＲＮＡ生成分子は、複数の二次サイレンシングＲＮＡ分子、すなわち、少なくとも２つの二次サイレンシングＲＮＡ分子にプロセシングすることが可能である。幾つかの実施形態によれば、フェーズド二次ｓｉＲＮＡ生成分子をコードしている遺伝子を改変することは、このフェーズド二次ｓｉＲＮＡ生成分子のプロセシングによって形成される二次サイレンシングＲＮＡ分子の一部のみを改変することを含む。特定の実施形態によれば、フェーズド二次ｓｉＲＮＡ生成分子をコードしている遺伝子を改変することは、このフェーズド二次ｓｉＲＮＡ生成分子のプロセシングによって形成される二次サイレンシングＲＮＡ分子を１つだけ改変することを含む。幾つかの実施形態によれば、フェーズド二次ｓｉＲＮＡ生成分子をコードしている遺伝子を改変することは、このフェーズド二次ｓｉＲＮＡ生成分子のプロセシングによって形成される二次サイレンシングＲＮＡ分子を少なくとも１つ改変することを含む。他の実施形態によれば、フェーズド二次ｓｉＲＮＡ生成分子をコードしている遺伝子を改変することは、このフェーズド二次ｓｉＲＮＡ生成分子のプロセシングによって形成される二次サイレンシングＲＮＡ分子を全て改変することを含む。理論にも機序にも縛られるものではないが、フェーズド二次ｓｉＲＮＡ生成分子をコードしている遺伝子を、二次サイレンシングＲＮＡ分子のうち１つだけのサイレンシング特異性を新たな標的（例えば、有害生物のＲＮＡ）に向けて誘導するように改変することで、この新たな標的の少なくとも部分的なサイレンシングを誘導するのに十分である。
幾つかの実施形態によれば、改変される二次サイレンシングＲＮＡ分子の配列の長さは、標的の有害生物内の二次サイレンシング分子の長さである（例えば、２４ｎｔの二次ｓＲＮＡが形成されるように有害生物内でｔａｓｉＲＮＡがプロセシングされる場合、植物細胞内のフェーズド二次ｓｉＲＮＡ生成分子をコードしている遺伝子の配列は、少なくとも１つの２４ｎｔ配列が選択した有害生物のＲＮＡを標的とするように改変される）。幾つかの実施形態によれば、有害生物遺伝子に対するサイレンシング特異性を付与するために植物遺伝子（例えば、フェーズド二次ｓｉＲＮＡ生成分子をコードしている植物遺伝子）の核酸配列を改変することは、コードされている配列が有害生物遺伝子によってコードされているＲＮＡに対して実質的に相補的であるように、植物遺伝子における２１～３０ｎｔ、任意で２４ｎｔ、場合によっては３０ｎｔの配列を改変することを含む。各可能性は、本発明の別個の実施態様を表す。理論にも機序にも縛られるものではないが、フェーズド二次ｓｉＲＮＡ生成分子をコードしている遺伝子を、コードされている配列の３０ｎｔが有害生物の遺伝子に対して相補的になるように改変することで、長鎖ｄｓＲＮＡのプロセシング（植物遺伝子内のプロセシングとは異なる場合がある）により、有害生物において機能性のサイレンシング活性を有する二次ＲＮＡ分子が確実に得られるようになる。
特定の実施形態によれば、内在性のサイレンシング活性を有する植物遺伝子は、トランス作用性ｓｉＲＮＡ生成（ＴＡＳ）分子である。
特定の実施形態によれば、植物遺伝子は、サイレンシング分子の結合部位を含む。
特定の実施形態によれば、植物遺伝子は、ｍｉＲＮＡ分子の結合部位を含む。
特定の実施形態によれば、ｍｉＲＮＡとしては、ｍｉＲ－１５６ａ、ｍｉＲ－１５６ｃ、ｍｉＲ－１６２ａ、ｍｉＲ－１６２ｂ、ｍｉＲ－１６７ｄ、ｍｉＲ－１６９ｂ、ｍｉＲ－１７３、ｍｉＲ－３９３ａ、ｍｉＲ－３９３ｂ、ｍｉＲ－４０２、ｍｉＲ－４０３、ｍｉＲ－４４７ａ、ｍｉＲ－４４７ｂ、ｍｉＲ－４４７ｃ、ｍｉＲ－４７２、ｍｉＲ－７７１、ｍｉＲ－７７７、ｍｉＲ－８２８、ｍｉＲ－８３０、ｍｉＲ－８３１、ｍｉＲ－８３１、ｍｉＲ－８３３ａ、ｍｉＲ－８３３ａ、ｍｉＲ－８４０、ｍｉＲ－８４５ｂ、ｍｉＲ－８４８、ｍｉＲ－８５０、ｍｉＲ－８５３、ｍｉＲ－８５５、ｍｉＲ－８５６、ｍｉＲ－８６４、ｍｉＲ－２９３３ａ、ｍｉＲ－２９３３ｂ、ｍｉＲ－２９３６、ｍｉＲ－４２２１、ｍｉＲ－５０２４、ｍｉＲ－５６２９、ｍｉＲ－５６４８、ｍｉＲ－５９９６、ｍｉＲ－８１６６、ｍｉＲ－８１６７ａ、ｍｉＲ－８１６７ｂ、ｍｉＲ－８１６７ｃ、ｍｉＲ－８１６７ｄ、ｍｉＲ－８１６７ｅ、ｍｉＲ－８１６７ｆ、ｍｉＲ－８１７７、及びｍｉＲ－８１８２が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態によれば、植物遺伝子が内在性のサイレンシング活性を有する分子をコードしている場合、方法は、植物遺伝子のサイレンシング特異性を、ネイティブの植物遺伝子とは異なる有害生物遺伝子に向けてリダイレクトするＤＮＡ編集剤を植物細胞に導入することを更に含む。
本明細書で使用するとき、用語「サイレンシング特異性をリダイレクトする」とは、ＲＮＡ分子又は植物遺伝子の転写物の元々の特異性を、ＲＮＡ分子又は植物遺伝子の転写物の非天然の標的に向けて再プログラムすることを指す。従って、ＲＮＡ分子又は植物の転写物の元々の特異性が破壊され（すなわち、機能喪失）、新たな特異性は天然の標的とは異なる標的（すなわち、それぞれ植物又は有害生物のＲＮＡ）に対するものとなる、すなわち機能獲得である。ＲＮＡ分子又は植物遺伝子の転写物が内在性のサイレンシング活性を有しない場合、機能獲得のみが生じることが理解されるであろう。
本明細書で使用するとき、用語「ネイティブの標的ＲＮＡ」とは、ＲＮＡ分子（例えば、非コードＲＮＡ分子、例えば、サイレンシング分子）が天然で結合するＲＮＡ配列を指す。従って、ネイティブの植物ＲＮＡ（すなわち、ネイティブの植物遺伝子の転写物）は、当業者によって、ＲＮＡ分子（例えば、非コードＲＮＡ、例えば、サイレンシング分子）の天然の基質（すなわち、標的）であるとみなされる。
本明細書で使用するとき、用語「植物ＲＮＡ」又は「植物標的ＲＮＡ」とは、ＲＮＡ分子（例えば、非コードＲＮＡ、例えば、サイレンシング分子）に天然では結合しないＲＮＡ配列（コード又は非コード）を指す。従って、植物ＲＮＡ（すなわち、植物遺伝子の転写物）は、ＲＮＡ分子（例えば、非コードＲＮＡ、例えば、サイレンシング分子）の天然の基質（すなわち、標的）ではない。
本明細書で使用するとき、用語「有害生物ＲＮＡ」又は「有害生物標的ＲＮＡ」とは、設計された植物ＲＮＡによって並びに／又は作製されたｄｓＲＮＡ分子及び二次低分子ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡのプロセシングによって作製）によってサイレンシングされるＲＮＡ配列を指す。従って、有害生物ＲＮＡ（すなわち、有害生物遺伝子の転写物）は、植物ＲＮＡ又はｄｓＲＮＡ又は二次低分子の天然の基質（すなわち標的）ではない。
本明細書で使用するとき、語句「遺伝子をサイレンシングする」とは、（例えば、転写同時及び／又は転写後遺伝子サイレンシングによって）標的遺伝子からのｍＲＮＡ及び／又はタンパク質産物が存在しないか又は観察可能にレベルが低下することを指す。従って、本発明の設計されたＲＮＡ分子によって標的とはされない遺伝子と比較して、標的遺伝子は、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％サイレンシングされ得る。
サイレンシングの結果は、（本明細書において更に論じる通り）植物から設計されたＲＮＡを取り込む植物細胞若しくは植物全体若しくは他の生物（例えば、有害生物）の外見上の特性を調べることによって、又は生化学的技術によって確認することができる。
本発明の幾つかの実施形態の設計されたＲＮＡ分子は、農業的に価値のある形質（例えば、植物のバイオマス、収量、成長等）に影響を与えない限り、幾つかのオフターゲット特異性作用（複数可）を有し得ることが理解されるであろう。
ＲＮＡ分子（例えば、サイレンシング分子）と標的ＲＮＡとの特異的な結合は、計算アルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴ）によって決定し、例えば、ノーザンブロット、インサイチュハイブリダイゼーション、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ Ｐｌｅｘ Ａｓｓａｙ等を含む方法によって検証することができる。
一実施形態によれば、ＲＮＡ分子がｓｉＲＮＡであるか又はｓｉＲＮＡにプロセシングされる場合、相補性は、その標的配列に対して９０～１００％（例えば、１００％）の範囲である。
一実施形態によれば、ＲＮＡ分子がｍｉＲＮＡ若しくはｐｉＲＮＡであるか又はｍｉＲＮＡ若しくはｐｉＲＮＡにプロセシングされる場合、相補性は、その標的配列に対して３３～１００％の範囲である。
一実施形態によれば、ＲＮＡ分子がｍｉＲＮＡである場合、シード配列（すなわち、５’から２～８番目のヌクレオチド）の相補性は、その標的配列に対して８５～１００％（例えば、１００％）の範囲である。
一実施形態によれば、標的配列に対する相補性は、プロセシングされた低分子ＲＮＡ形態の少なくとも約３３％（例えば、２１～２８ｎｔの３３％）である。従って、例えば、ＲＮＡ分子がｍｉＲＮＡである場合、成熟ｍｉＲＮＡ配列（例えば、２１ｎｔ）の３３％が、シード相補性（例えば、２１ｎｔのうち７ｎｔ）を含む。
一実施形態によれば、標的配列に対する相補性は、プロセシングされた低分子ＲＮＡ形態の少なくとも約４５％（例えば、２１～２８ｎｔの４５％）である。従って、例えば、ＲＮＡ分子がｍｉＲＮＡである場合、成熟ｍｉＲＮＡ配列（例えば、２１ｎｔ）の４５％が、シード相補性（例えば、２１ｎｔのうち９～１０ｎｔ）を含む。
一実施形態によれば、ＲＮＡ分子又は植物ＲＮＡ（すなわち、改変前）は、典型的には、それぞれ植物ＲＮＡ又は有害生物ＲＮＡの配列に対して約１０％、２０％、３０％、３３％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以下の相補性を有するものとして選択される。
特定の実施形態によれば、ＲＮＡ分子又は植物ＲＮＡ（すなわち、改変前）は、典型的には、それぞれ植物ＲＮＡ又は有害生物ＲＮＡの配列に対して９９％以下の相補性を有するものとして選択される。
特定の実施形態によれば、ＲＮＡ分子又は植物ＲＮＡ（すなわち、改変前）は、典型的には、それぞれ植物ＲＮＡ又は有害生物ＲＮＡの配列に対して９８％以下の相補性を有するものとして選択される。
特定の実施形態によれば、ＲＮＡ分子又は植物ＲＮＡ（すなわち、改変前）は、典型的には、それぞれ植物ＲＮＡ又は有害生物ＲＮＡの配列に対して９７％以下の相補性を有するものとして選択される。
特定の実施形態によれば、ＲＮＡ分子又は植物ＲＮＡ（すなわち、改変前）は、典型的には、それぞれ植物ＲＮＡ又は有害生物ＲＮＡの配列に対して９６％以下の相補性を有するものとして選択される。
特定の実施形態によれば、ＲＮＡ分子又は植物ＲＮＡ（すなわち、改変前）は、典型的には、それぞれ植物ＲＮＡ又は有害生物ＲＮＡの配列に対して９５％以下の相補性を有するものとして選択される。
特定の実施形態によれば、ＲＮＡ分子又は植物ＲＮＡ（すなわち、改変前）は、典型的には、それぞれ植物ＲＮＡ又は有害生物ＲＮＡの配列に対して９４％以下の相補性を有するものとして選択される。
特定の実施形態によれば、ＲＮＡ分子又は植物ＲＮＡ（すなわち、改変前）は、典型的には、それぞれ植物ＲＮＡ又は有害生物ＲＮＡの配列に対して９３％以下の相補性を有するものとして選択される。
特定の実施形態によれば、ＲＮＡ分子又は植物ＲＮＡ（すなわち、改変前）は、典型的には、それぞれ植物ＲＮＡ又は有害生物ＲＮＡの配列に対して９２％以下の相補性を有するものとして選択される。
特定の実施形態によれば、ＲＮＡ分子又は植物ＲＮＡ（すなわち、改変前）は、典型的には、それぞれ植物ＲＮＡ又は有害生物ＲＮＡの配列に対して９１％以下の相補性を有するものとして選択される。
特定の実施形態によれば、ＲＮＡ分子又は植物ＲＮＡ（すなわち、改変前）は、典型的には、それぞれ植物ＲＮＡ又は有害生物ＲＮＡの配列に対して９０％以下の相補性を有するものとして選択される。
特定の実施形態によれば、ＲＮＡ分子又は植物ＲＮＡ（すなわち、改変前）は、典型的には、それぞれ植物ＲＮＡ又は有害生物ＲＮＡの配列に対して８５％以下の相補性を有するものとして選択される。
特定の実施形態によれば、ＲＮＡ分子又は植物ＲＮＡ（すなわち、改変前）は、典型的には、それぞれ植物ＲＮＡ又は有害生物ＲＮＡの配列に対して５０％以下の相補性を有するものとして選択される。
特定の実施形態によれば、ＲＮＡ分子又は植物ＲＮＡ（すなわち、改変前）は、典型的には、それぞれ植物ＲＮＡ又は有害生物ＲＮＡの配列に対して３３％以下の相補性を有するものとして選択される。
一実施形態によれば、ＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）又は植物ＲＮＡは、それぞれ植物ＲＮＡ又は有害生物ＲＮＡの配列に対して少なくとも約３３％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は更には１００％の相補性を有するように設計される。
特定の実施形態によれば、ＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）又は植物ＲＮＡは、それぞれ植物ＲＮＡ又は有害生物ＲＮＡに対して最低３３％の相補性を有するように設計される（例えば、８５～１００％のシードマッチ）。
特定の実施形態によれば、ＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）又は植物ＲＮＡは、それぞれ植物ＲＮＡ又は有害生物ＲＮＡに対して最低４０％の相補性を有するように設計される。
特定の実施形態によれば、ＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）又は植物ＲＮＡは、それぞれ植物ＲＮＡ又は有害生物ＲＮＡに対して最低４５％の相補性を有するように設計される。
特定の実施形態によれば、ＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）又は植物ＲＮＡは、それぞれ植物ＲＮＡ又は有害生物ＲＮＡに対して最低５０％の相補性を有するように設計される。
特定の実施形態によれば、ＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）又は植物ＲＮＡは、それぞれ植物ＲＮＡ又は有害生物ＲＮＡに対して最低５５％の相補性を有するように設計される。
特定の実施形態によれば、ＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）又は植物ＲＮＡは、それぞれ植物ＲＮＡ又は有害生物ＲＮＡに対して最低６０％の相補性を有するように設計される。
特定の実施形態によれば、ＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）又は植物ＲＮＡは、それぞれ植物ＲＮＡ又は有害生物ＲＮＡに対して最低７０％の相補性を有するように設計される。
特定の実施形態によれば、ＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）又は植物ＲＮＡは、それぞれ植物ＲＮＡ又は有害生物ＲＮＡに対して最低８０％の相補性を有するように設計される。
特定の実施形態によれば、ＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）又は植物ＲＮＡは、それぞれ植物ＲＮＡ又は有害生物ＲＮＡに対して最低８５％の相補性を有するように設計される。
特定の実施形態によれば、ＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）又は植物ＲＮＡは、それぞれ植物ＲＮＡ又は有害生物ＲＮＡに対して最低９０％の相補性を有するように設計される。
特定の実施形態によれば、ＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）又は植物ＲＮＡは、それぞれ植物ＲＮＡ又は有害生物ＲＮＡに対して最低９１％の相補性を有するように設計される。
特定の実施形態によれば、ＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）又は植物ＲＮＡは、それぞれ植物ＲＮＡ又は有害生物ＲＮＡに対して最低９２％の相補性を有するように設計される。
特定の実施形態によれば、ＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）又は植物ＲＮＡは、それぞれ植物ＲＮＡ又は有害生物ＲＮＡに対して最低９３％の相補性を有するように設計される。
特定の実施形態によれば、ＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）又は植物ＲＮＡは、それぞれ植物ＲＮＡ又は有害生物ＲＮＡに対して最低９４％の相補性を有するように設計される。
特定の実施形態によれば、ＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）又は植物ＲＮＡは、それぞれ植物ＲＮＡ又は有害生物ＲＮＡに対して最低９５％の相補性を有するように設計される。
特定の実施形態によれば、ＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）又は植物ＲＮＡは、それぞれ植物ＲＮＡ又は有害生物ＲＮＡに対して最低９６％の相補性を有するように設計される。
特定の実施形態によれば、ＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）又は植物ＲＮＡは、それぞれ植物ＲＮＡ又は有害生物ＲＮＡに対して最低９７％の相補性を有するように設計される。
特定の実施形態によれば、ＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）又は植物ＲＮＡは、それぞれ植物ＲＮＡ又は有害生物ＲＮＡに対して最低９８％の相補性を有するように設計される。
特定の実施形態によれば、ＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）又は植物ＲＮＡは、それぞれ植物ＲＮＡ又は有害生物ＲＮＡに対して最低９９％の相補性を有するように設計される。
特定の実施形態によれば、ＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）又は植物ＲＮＡは、それぞれ植物ＲＮＡ又は有害生物ＲＮＡに対して１００％の相補性を有するように設計される。
特定の実施形態によれば、ＲＮＡ分子又は植物ＲＮＡのアンチセンス鎖（例えば、ＲｄＲｐによって合成される生成物）は、有害生物ＲＮＡの配列に対して少なくとも約３３％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は更には１００％の相補性を有するように設計される。
特定の実施形態によれば、ＲＮＡ分子又は植物ＲＮＡのアンチセンス鎖（例えば、ＲｄＲｐによって合成される生成物）は、有害生物ＲＮＡの配列に対して最低３３％の相補性を有するように設計される（例えば、８５～１００％のシードマッチ）。
特定の実施形態によれば、ＲＮＡ分子又は植物ＲＮＡのアンチセンス鎖（例えば、ＲｄＲｐによって合成される生成物）は、有害生物ＲＮＡの配列に対して最低４０％の相補性を有するように設計される。
特定の実施形態によれば、ＲＮＡ分子又は植物ＲＮＡのアンチセンス鎖（例えば、ＲｄＲｐによって合成される生成物）は、有害生物ＲＮＡの配列に対して最低４５％の相補性を有するように設計される。
特定の実施形態によれば、ＲＮＡ分子又は植物ＲＮＡのアンチセンス鎖（例えば、ＲｄＲｐによって合成される生成物）は、有害生物ＲＮＡの配列に対して最低５０％の相補性を有するように設計される。
特定の実施形態によれば、ＲＮＡ分子又は植物ＲＮＡのアンチセンス鎖（例えば、ＲｄＲｐによって合成される生成物）は、有害生物ＲＮＡの配列に対して最低５５％の相補性を有するように設計される。
特定の実施形態によれば、ＲＮＡ分子又は植物ＲＮＡのアンチセンス鎖（例えば、ＲｄＲｐによって合成される生成物）は、有害生物ＲＮＡの配列に対して最低６０％の相補性を有するように設計される。
特定の実施形態によれば、ＲＮＡ分子又は植物ＲＮＡのアンチセンス鎖（例えば、ＲｄＲｐによって合成される生成物）は、有害生物ＲＮＡの配列に対して最低７０％の相補性を有するように設計される。
特定の実施形態によれば、ＲＮＡ分子又は植物ＲＮＡのアンチセンス鎖（例えば、ＲｄＲｐによって合成される生成物）は、有害生物ＲＮＡの配列に対して最低８０％の相補性を有するように設計される。
特定の実施形態によれば、ＲＮＡ分子又は植物ＲＮＡのアンチセンス鎖（例えば、ＲｄＲｐによって合成される生成物）は、有害生物ＲＮＡの配列に対して最低８５％の相補性を有するように設計される。
特定の実施形態によれば、ＲＮＡ分子又は植物ＲＮＡのアンチセンス鎖（例えば、ＲｄＲｐによって合成される生成物）は、有害生物ＲＮＡの配列に対して最低９０％の相補性を有するように設計される。
特定の実施形態によれば、ＲＮＡ分子又は植物ＲＮＡのアンチセンス鎖（例えば、ＲｄＲｐによって合成される生成物）は、有害生物ＲＮＡの配列に対して最低９１％の相補性を有するように設計される。
特定の実施形態によれば、ＲＮＡ分子又は植物ＲＮＡのアンチセンス鎖（例えば、ＲｄＲｐによって合成される生成物）は、有害生物ＲＮＡの配列に対して最低９２％の相補性を有するように設計される。
特定の実施形態によれば、ＲＮＡ分子又は植物ＲＮＡのアンチセンス鎖（例えば、ＲｄＲｐによって合成される生成物）は、有害生物ＲＮＡの配列に対して最低９３％の相補性を有するように設計される。
特定の実施形態によれば、ＲＮＡ分子又は植物ＲＮＡのアンチセンス鎖（例えば、ＲｄＲｐによって合成される生成物）は、有害生物ＲＮＡの配列に対して最低９４％の相補性を有するように設計される。
特定の実施形態によれば、ＲＮＡ分子又は植物ＲＮＡのアンチセンス鎖（例えば、ＲｄＲｐによって合成される生成物）は、有害生物ＲＮＡの配列に対して最低９５％の相補性を有するように設計される。
特定の実施形態によれば、ＲＮＡ分子又は植物ＲＮＡのアンチセンス鎖（例えば、ＲｄＲｐによって合成される生成物）は、有害生物ＲＮＡの配列に対して最低９６％の相補性を有するように設計される。
特定の実施形態によれば、ＲＮＡ分子又は植物ＲＮＡのアンチセンス鎖（例えば、ＲｄＲｐによって合成される生成物）は、有害生物ＲＮＡの配列に対して最低９７％の相補性を有するように設計される。
特定の実施形態によれば、ＲＮＡ分子又は植物ＲＮＡのアンチセンス鎖（例えば、ＲｄＲｐによって合成される生成物）は、有害生物ＲＮＡの配列に対して最低９８％の相補性を有するように設計される。
特定の実施形態によれば、ＲＮＡ分子又は植物ＲＮＡのアンチセンス鎖（例えば、ＲｄＲｐによって合成される生成物）は、有害生物ＲＮＡの配列に対して最低９９％の相補性を有するように設計される。
特定の実施形態によれば、ＲＮＡ分子又は植物ＲＮＡのアンチセンス鎖（例えば、ＲｄＲｐによって合成される生成物）は、有害生物ＲＮＡの配列に対して１００％の相補性を有するように設計される。
ＲＮＡ分子若しくは植物ＲＮＡのサイレンシング活性及び／若しくは特異性を誘導するため、又はＲＮＡ分子若しくは植物ＲＮＡ（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）のサイレンシング活性及び／若しくは特異性を植物ＲＮＡ若しくは有害生物ＲＮＡに向けてリダイレクトするために、ＤＮＡ編集剤を用いてＲＮＡ分子又は植物ＲＮＡ（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）をコードしている遺伝子を改変する。
以下は、遺伝子に核酸の変化を導入するために使用される方法及びＤＮＡ編集剤、並びに本開示の特定の実施形態に従って使用することができるそれを実行するための剤の様々な非限定的な例の説明である。
遺伝子操作されたエンドヌクレアーゼを用いたゲノム編集－このアプローチは、人工的に遺伝子操作された又は改変された天然に存在するヌクレアーゼを用いて、典型的には、ゲノム中の所望の位置（複数可）で切断し、特定の二本鎖切断（ＤＳＢ）を作り出し、次いで、相同組換え（ＨＲ）又は非相同末端接合（ＮＨＥＪ）等の細胞の内因性プロセスによって修復する逆遺伝学的方法を指す。ＮＨＥＪは、二本鎖切断（ＤＳＢ）のＤＮＡ末端を最小限の末端トリミングを用いて又は用いずに直接接合させるが、ＨＲは、切断部位における欠損したＤＮＡ配列を再生／コピーするためのテンプレート（すなわち、Ｓ期に形成される姉妹染色分体）として相同なドナー配列を利用する。ゲノムＤＮＡに特定のヌクレオチド改変を導入するためには、所望の配列を含有するドナーＤＮＡ修復テンプレート（外因的に提供される一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ）が、ＨＲの間存在していなければならない。
従来の制限エンドヌクレアーゼを用いてゲノム編集を実施することはできないが、その理由は、ほとんどの制限酵素がＤＮＡ上の数個の塩基対を標的として認識し、これらの配列はゲノム全体にわたって多くの箇所にみられることが多いため、所望の箇所に限定されない複数の切断が生じるためである。この課題を克服し、部位特異的な一本鎖又は二本鎖の切断（ＤＳＢ）を作り出すために、これまでに幾つかの異なるクラスのヌクレアーゼが発見され、バイオエンジニアリングされてきた。これらは、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを含む。
メガヌクレアーゼ－メガヌクレアーゼ（ホーミングヌクレアーゼとしても知られている）は、一般的に、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー、ＧＩＹ－ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ－Ｃｙｓ Ｂｏｘファミリー、並びにＥＤｘＨＤ酵素に関連し、一部には別のファミリーとみなされているＨＮＨファミリー及びＰＤ－（Ｄ／Ｅ）ｘＫの少なくとも５つの４つのファミリーに分類される。これらファミリーは、触媒活性及び認識配列に影響を与える構造モチーフによって特徴付けられる。例えば、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーのメンバーは、保存されたＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフを１又は２コピー有していることを特徴とする。メガヌクレアーゼの４つのファミリーは、保存された構造エレメント、ひいては、ＤＮＡ認識配列の特異性及び触媒活性に関して、互いに大きく異なっている。メガヌクレアーゼは、微生物種に一般的にみられ、非常に長い認識配列（＞１４ｂｐ）を有するという固有の特性を有しているため、天然で所望の箇所における切断についての特異性が非常に高くなる。
これを利用して、ゲノム編集において部位特異的な二本鎖切断（ＤＳＢ）を作製することができる。当業者であれば、これら天然に存在するメガヌクレアーゼを使用することができるが、このような天然に存在するメガヌクレアーゼの数は限られている。この課題を克服するために、突然変異誘発及びハイスループットスクリーニング法を用いて、固有の配列を認識するメガヌクレアーゼのバリアントが生み出されている。例えば、様々なメガヌクレアーゼを融合させて、新たな配列を認識するハイブリッド酵素が生み出されている。
あるいは、メガヌクレアーゼのＤＮＡ相互作用アミノ酸を変化させて、配列特異的なメガヌクレアーゼを設計することもできる（例えば、米国特許第８，０２１，８６７号を参照）。メガヌクレアーゼは、例えば、それぞれの内容全体が参照により本明細書に援用される、Ｃｅｒｔｏ，ＭＴ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０１２）９：０７３－９７５、米国特許第８，３０４，２２２号、同第８，０２１，８６７号、同第８，１１９，３８１号、同第８，１２４，３６９号、同第８，１２９，１３４号、同第８，１３３，６９７号、同第８，１４３，０１５号、同第８，１４３，０１６号、同第８，１４８，０９８号、又は同第８，１６３，５１４号に記載の方法を用いて設計することができる。あるいは、市販されている技術、例えば、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＤｉｒｅｃｔｅｄ Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｅｄｉｔｏｒ（商標）ゲノム編集技術を用いて、部位特異的な切断特性を有するメガヌクレアーゼを得ることもできる。
ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮ－ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）及び転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）という２つの異なるクラスの遺伝子操作されたヌクレアーゼは、いずれも標的となる二本鎖切断（ＤＳＢ）を作製するのに有効であることが証明されている（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｍａｈｆｏｕｚ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。
基本的に、ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮの制限エンドヌクレアーゼ技術は、特定のＤＮＡ結合ドメイン（それぞれ、一連のジンクフィンガードメイン又はＴＡＬＥリピートのいずれか）に連結する非特異的ＤＮＡ切断酵素を利用する。典型的には、そのＤＮＡ認識部位と切断部位とが互いに分離している制限酵素が選択される。切断部分が分離され、次いで、ＤＮＡ結合ドメインに連結し、それによって、所望の配列に対して非常に高い特異性を有するエンドヌクレアーゼが得られる。このような特性を有する例示的な制限酵素は、Ｆｏｋｌである。更に、Ｆｏｋｌには、ヌクレアーゼ活性を有するために二量体化を必要とするという利点があり、これは、各ヌクレアーゼパートナーが固有のＤＮＡ配列を認識したときに特異性が劇的に高まることを意味する。この効果を強化するために、Ｆｏｋｌヌクレアーゼは、ヘテロ二量体としてのみ機能し、高い触媒活性を有することができるように遺伝子操作されている。ヘテロ二量体で機能するヌクレアーゼは、不要なホモ二量体活性の可能性を回避するので、二本鎖切断（ＤＳＢ）の特異性を高める。
従って、例えば、特定の部位を標的とするために、ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮはヌクレアーゼ対として構築され、当該対の各メンバーは標的となる部位で隣接する配列に結合するように設計される。細胞内で一過的に発現すると、ヌクレアーゼはその標的部位に結合し、ＦｏｋＩドメインはヘテロ二量体化して二本鎖切断（ＤＳＢ）を作り出す。非相同末端接合（ＮＨＥＪ）経路を通してこれら二本鎖切断（ＤＳＢ）を修復すると、多くの場合、小さな欠失又は小さな配列挿入（インデル）が生じる。ＮＨＥＪによって行われる各修復は固有のものであるので、単一のヌクレアーゼ対を使用して、標的部位に様々な異なる挿入又は欠失を有する対立遺伝子群を作り出すことができる。
一般的に、ＮＨＥＪは比較的正確である（ヒト細胞におけるＤＳＢの約８５％が、検出から約３０分以内にＮＨＥＪによって修復される）。遺伝子編集では、修復が正確である場合、修復産物が変異原性になり、認識／切断部位／ＰＡＭモチーフが消失／変異するまで又は一過的に導入されたヌクレアーゼがもはや存在しなくなるまでヌクレアーゼが切断を続けるので、誤ったＮＨＥＪに頼ることになる。
典型的には、欠失の長さは、数塩基対から数百塩基対のいずれかの範囲であるが、２対のヌクレアーゼを同時に使用することによって、細胞培養下でより大きな欠失を生じさせることに成功している（Ｃａｒｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。更に、標的領域と相同なＤＮＡ断片をヌクレアーゼ対と併せて導入すると、相同組換え（ＨＲ）を介して二本鎖切断（ＤＳＢ）を修復して、特定の改変を生じさせることができる（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｕｒｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，２００５）。
ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮの両方のヌクレアーゼ部分は類似の特性を有するが、これら遺伝子操作されたヌクレアーゼ間の違いは、そのＤＮＡ認識ペプチドにある。ＺＦＮはＣｙｓ２－Ｈｉｓ２ジンクフィンガーに、そして、ＴＡＬＥＮはＴＡＬＥに依拠している。これらＤＮＡ認識ペプチドドメインはいずれも、天然ではそのタンパク質において組み合わせでみられるという特徴を有する。Ｃｙｓ２－Ｈｉｓ２ジンクフィンガーは、典型的には、３ｂｐ離れたリピートでみられ、様々な核酸相互作用タンパク質に多様な組み合わせでみられる。他方、ＴＡＬＥは、アミノ酸と認識されるヌクレオチド対との間の認識比が１対１であるリピートでみられる。ジンクフィンガー及びＴＡＬＥはいずれも反復パターンで生じるので、多様な配列特異性を生み出すために様々な組み合わせを試すことができる。部位特異的ジンクフィンガーエンドヌクレアーゼを作製するためのアプローチとしては、例えば、モジュラーアセンブリ（トリプレット配列と相関したジンクフィンガーを、必要な配列をカバーするように並べて結合させる）、ＯＰＥＮ（ペプチドドメイン対トリプレットヌクレオチドを低ストリンジェントに選択し、続いて、細菌系においてペプチドの組み合わせ対最終標的を高ストリンジェントに選択する）、及びとりわけ、ジンクフィンガーライブラリの細菌ワンハイブリッドスクリーニングが挙げられる。ＺＦＮは、例えばＳａｎｇａｍｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（商標）（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）で設計され、商業的に入手することもできる。
ＴＡＬＥＮを設計及び入手する方法は、例えば、Ｒｅｙｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１２ Ｍａｙ；３０（５）：４６０－５；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１１）２９：１４３－１４８；Ｃｅｒｍａｋ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１１）３９（１２）：ｅ８２、及びＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１１）２９（２）：１４９－５３に記載されている。ゲノム編集用途のためのＴＡＬ及びＴＡＬＥＮコンストラクトを設計するために、Ｍｏｊｏ Ｈａｎｄと命名された最近開発されたウェブベースのプログラムがＭａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃによって導入された（ｗｗｗ（ｄｏｔ）ｔａｌｅｎｄｅｓｉｇｎ（ｄｏｔ）ｏｒｇを通してアクセスすることができる）。ＴＡＬＥＮは、例えば、Ｓａｎｇａｍｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（商標）（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）で設計され、商業的に入手することもできる。
Ｔ－ＧＥＥシステム（標的遺伝子のゲノム編集エンジン）－標的細胞内においてインビボで集合し、所定の標的核酸配列と相互作用することができる、ポリペプチド部分及び特異性付与核酸（ＳＣＮＡ）を含有するプログラム可能な核タンパク質分子複合体が提供される。プログラム可能な核タンパク質分子複合体は、標的核酸配列内の標的部位を特異的に改変及び／若しくは編集する、並びに／又は標的核酸配列の機能を改変することができる。核タンパク質組成物は、（ａ）キメラポリペプチドをコードしており、（ｉ）標的部位を改変することができる機能性ドメイン及び（ｉｉ）特異性付与核酸と相互作用することができる連結ドメインを含むポリヌクレオチド分子と、（ｂ）（ｉ）標的部位に隣接する標的核酸の領域に相補的なヌクレオチド配列及び（ｉｉ）ポリペプチドの連結ドメインに特異的に結合することができる認識領域を含む特異性付与核酸（ＳＣＮＡ）とを含む。組成物は、特異性付与核酸及び標的核酸の塩基対合を通して、高い特異性及び分子複合体の標的核酸への結合能力を有するように、所定の核酸配列標的を正確に、確実に、かつコスト効率よく改変することを可能にする。組成物は、遺伝毒性が低く、モジュール式に集合し、カスタマイズすることなく単一のプラットフォームを利用し、専門のコア施設外で独立して使用するのに実用的であり、開発期間が短く、かつコストが低い。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム及びその全てのバリアント（本明細書では「ＣＲＩＳＰＲ」とも称される）－多くの細菌及び古細菌は、侵入してきたファージ及びプラスミドの核酸を分解することができる内因性ＲＮＡベースの適応免疫系を含む。これら系は、ＲＮＡ構成要素を生成するクラスター化された規則的な間隔の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）ヌクレオチド配列と、タンパク質構成要素をコードしているＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子とからなる。ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）は、特定のウイルス及びプラスミドのＤＮＡに相同な短いストレッチを含み、対応する病原体の相補的核酸を分解するようにＣａｓヌクレアーゼに指示するためのガイドとして作用する。化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの研究では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、標的配列に相同な２０塩基対を含有するｃｒＲＮＡ、及びトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の３つの構成要素がＲＮＡ／タンパク質複合体を形成し、合わせると配列特異的なヌクレアーゼ活性に十分になることが示されている（Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１２）３３７：８１６－８２１）。
更に、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの融合体で構成される合成キメラガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、インビトロにおいてｃｒＲＮＡに相補的なＤＮＡ標的を切断するようにＣａｓ９に指示することができることが実証された。また、Ｃａｓ９を合成ｇＲＮＡと併せて一過的に発現させることを用いて、様々な異なる種において標的となる二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成できることも実証された（Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３；ＤｉＣａｒｌｏ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３ａ，ｂ；Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。
ゲノム編集のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ｓｇＲＮＡ及びエンドヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９という２つの異なる構成要素を含有する。
ｇＲＮＡ（本明細書では短鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）とも称される）は、典型的には、単一のキメラ転写物において標的相同配列（ｃｒＲＮＡ）とｃｒＲＮＡをＣａｓ９ヌクレアーゼに連結させる内因性細菌ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との組み合わせをコードしている２０ヌクレオチドの配列である。ｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体は、ｓｇＲＮＡ配列と相補的なゲノムＤＮＡとの間の塩基対合によって標的配列に動員される。Ｃａｓ９の結合を成功させるためには、ゲノム上の標的配列が、標的配列の直後に正しいプロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列も含有していなければならない。ｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体の結合により、Ｃａｓ９がＤＮＡの両鎖を切断して二重鎖切断（ＤＳＢ）を生じさせることができるように、Ｃａｓ９がゲノム上の標的配列に局在する。ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮと同様に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓによって生じる二本鎖切断（ＤＳＢ）は、相同組換え又はＮＨＥＪを受けることができ、ＤＮＡ修復中に特異的配列改変を受けやすい。
Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、それぞれが異なるＤＮＡ鎖を切断する２つの機能性ドメインＲｕｖＣ及びＨＮＨを有する。これらドメインの両方が活性である場合、Ｃａｓ９はゲノムＤＮＡにおいて二本鎖切断（ＤＳＢ）を引き起こす。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの大きな利点は、このシステムが、高い効率性と、合成ｇＲＮＡを容易に作製できる能力とを兼ね備えている点である。このことから、異なるゲノム部位での改変を標的とする及び／又は同じ部位での異なる改変を標的とするように容易に変更可能なシステムが得られる。更に、複数の遺伝子を同時に標的とすることができるプロトコールも確立されている。変異を保有する細胞の大部分は、標的となる遺伝子に二対立遺伝子変異が存在する。
しかし、ｓｇＲＮＡ配列とゲノムＤＮＡの標的配列との間の塩基対合相互作用における見かけの柔軟性によって、標的配列との一致が不完全でもＣａｓ９によって切断することが可能になる。
ＲｕｖＣ－又はＨＮＨ－のいずれかの単一の不活性触媒ドメインを含有するＣａｓ９酵素の改変バージョンは、「ニッカーゼ」と呼ばれる。活性ヌクレアーゼドメインを１つだけしか有しないので、Ｃａｓ９ニッカーゼは、標的ＤＮＡの一方の鎖だけを切断し、一本鎖切断又は「ニック」を作り出す。一本鎖切断又はニックは、ほとんどの場合、ＰＡＲＰ（センサー）及びＸＲＣＣ１／ＬＩＧ ＩＩＩ複合体（ライゲーション）等であるがこれらだけではないタンパク質が関与する一本鎖切断修復機序によって修復される。トポイソメラーゼＩの毒又は天然に存在するＳＳＢにおいてＰＡＲＰ１を捕捉する薬物によって一本鎖切断（ＳＳＢ）が生成された場合、これらは存続し得、細胞がＳ期に入り、複製フォークがこのようなＳＳＢに遭遇したときに、ＨＲによってのみ修復可能な片端ＤＳＢとなる。しかし、Ｃａｓ９ニッカーゼによって導入された２つの近接する逆鎖のニックは二本鎖切断として扱われ、多くの場合「ダブルニック」ＣＲＩＳＰＲシステムと称される。ダブルニックは基本的に非平行ＤＳＢであり、他のＤＳＢと同様に、遺伝子標的に対する所望の効果及びドナー配列の存在及び細胞周期のステージに応じて、ＨＲ又はＮＨＥＪによって修復され得る（ＨＲは、はるかに存在量が少なく、細胞周期のＳ及びＧ２期でしか生じ得ない）。従って、オフターゲット作用の減少及び特異性が重要である場合、ごく近接して、ゲノムＤＮＡの逆鎖に標的配列を有する２つのｓｇＲＮＡを設計することによってダブルニックを作製するためにＣａｓ９ニッカーゼを使用すると、いずれかのｓｇＲＮＡだけではゲノムＤＮＡを変化させる可能性のないニックが生じるので、これら事象が不可能ではないとしても、オフターゲット作用は減少するであろう。
２つの不活性触媒ドメインを含有するＣａｓ９酵素の改変バージョン（ｄｅａｄ Ｃａｓ９又はｄＣａｓ９）はヌクレアーゼ活性を有しないが、ｓｇＲＮＡの特異性に基づいて依然としてＤＮＡに結合することはできる。ｄＣａｓ９は、不活性酵素を既知の調節ドメインに融合させることによって遺伝子発現を活性化又は抑制するためのＤＮＡ転写調節因子のプラットフォームとして利用することができる。例えば、ゲノムＤＮＡ中の標的配列にｄＣａｓ９が単独で結合すると、遺伝子の転写に干渉することができる。
本発明の幾つかの実施形態によって使用することができるＣａｓ９の追加のバリアントとしては、ＣａｓＸ及びＣｐｆ１が挙げられるが、これらに限定されない。ＣａｓＸ酵素は、Ｃａｓ９に比べてサイズが小さく、細菌でみられる（典型的には、ヒトではみられない）ＲＮＡ誘導型のゲノムエディターの特徴的なファミリーを含むので、ヒトにおける免疫系／応答を惹起する可能性が低い。また、ＣａｓＸは、Ｃａｓ９と比べて異なるＰＡＭモチーフを利用するので、Ｃａｓ９のＰＡＭモチーフがみられない配列を標的とするために使用することができる［Ｌｉｕ ＪＪ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．（２０１９）５６６（７７４３）：２１８－２２３．を参照］。Ｃａｓ１２ａとも称されるＣｐｆ１は、Ｃａｓ９のＰＡＭ（ＮＧＧ）の存在量がはるかに少ないＡＴリッチ領域の編集に特に有利である［Ｌｉ Ｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ａｄｖ．（２０１９）３７（１）：２１－２７；Ｍｕｒｕｇａｎ Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．（２０１７）６８（１）：１５－２５を参照］。
別の実施形態によれば、ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＤＮＡ切断ドメイン等の様々なエフェクタードメインと融合させてもよい。ＤＮＡ切断ドメインは、任意のエンドヌクレアーゼ又はエキソヌクレアーゼから得ることができる。ＤＮＡ切断ドメインが由来し得るエンドヌクレアーゼの非限定的な例としては、制限エンドヌクレアーゼ及びホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられるが、これらに限定されない（例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｃａｔａｌｏｇ ｏｒ Ｂｅｌｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．を参照）。例示的な実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムの切断ドメインは、Ｆｏｋｌエンドヌクレアーゼドメイン又は改変Ｆｏｋｌエンドヌクレアーゼドメインである。更に、ホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）を使用することも別の選択肢である。ＨＥは、細菌、古細菌、及び単細胞真核生物でみられる小さなタンパク質（＜３００アミノ酸）である。ＨＥの際立った特徴は、制限酵素等の他の部位特異的エンドヌクレアーゼ（４～８ｂｐ）に比べて比較的長い配列（１４～４０ｂｐ）を認識することである。ＨＥは、歴史的に、小さな保存アミノ酸モチーフによって分類されてきた。少なくとも５つのこのようなファミリー：ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ；ＧＩＹ－ＹＩＧ；ＨＮＨ；ＥＤｘＨＤ酵素に関連しており、一部には別のファミリーとみなされているＨｉｓ－Ｃｙｓ Ｂｏｘ及びＰＤ－（Ｄ／Ｅ）ｘＫが同定されている。構造レベルでは、ＰＤ－（Ｄ／Ｅ）ｘＫ及びＥＤｘＨＤ酵素と同様に、ＨＮＨ及びＨｉｓ－Ｃｙｓ Ｂｏｘは共通のフォールド（ββα－メタルと命名）を共有している。各ファミリーの触媒及びＤＮＡ認識戦略は様々であり、様々な用途のための遺伝子操作に様々な程度適している。例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．（２０１４）１１２３：１－２６を参照。本発明の幾つかの実施形態に従って使用することができる例示的なホーミングエンドヌクレアーゼとしては、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＴｅｖＩ、Ｉ－ＨｍｕＩ、Ｉ－ＰｐｏＩ、及びＩ－Ｓｓｐ６８０３１が挙げられるが、これらに限定されない。
ＣＲＩＳＰＲの改変バージョン、例えば、ｄｅａｄ ＣＲＩＳＰＲ（ｄＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ）は、ＣＲＩＳＰＲ転写阻害（ＣＲＩＳＰＲｉ）又はＣＲＩＳＰＲ転写活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）にも利用することができる。例えば、Ｋａｍｐｍａｎｎ Ｍ．，ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．（２０１８）１３（２）：４０６－４１６；Ｌａ Ｒｕｓｓａ ＭＦ ａｎｄ Ｑｉ ＬＳ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．（２０１５）３５（２２）：３８００－９を参照］。
本発明の幾つかの実施形態に従って使用することができるＣＲＩＳＰＲの他のバージョンとしては、ＣＲＩＳＰＲシステムの構成要素を他の酵素と共に使用して、細胞のＤＮＡ又はＲＮＡに直接点変異を入れるゲノム編集が挙げられる。
従って、一実施形態によれば、編集剤は、ＤＮＡ又はＲＮＡ編集剤である。
一実施形態によれば、ＤＮＡ又はＲＮＡ編集剤は、塩基編集を惹起する。
用語「塩基編集」とは、本明細書で使用するとき、二本鎖又は一本鎖のＤＮＡ切断を作製することなく、細胞のＤＮＡ又はＲＮＡに点変異を入れることを指す。
塩基編集において、ＤＮＡ塩基エディターは、典型的には、触媒作用が損なわれたＣａｓヌクレアーゼと一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）に作用する塩基修飾酵素との融合を含む。その標的ＤＮＡ遺伝子座に結合すると、ｇＲＮＡと標的ＤＮＡ鎖とが塩基対合して、「Ｒループ」における一本鎖ＤＮＡの小さなセグメントが置換される。このｓｓＤＮＡバブル内のＤＮＡ塩基は、塩基編集酵素（例えば、デアミナーゼ酵素）によって改変される。真核細胞における効率を改善するために、触媒作用を失ったヌクレアーゼは、編集されていないＤＮＡ鎖にもニックを生成し、編集された鎖をテンプレートとして用いて編集されていない鎖を修復するように細胞を誘導する。
Ｃ－Ｇ塩基対をＴ－Ａ塩基対に変換するシトシン塩基エディター（ＣＢＥ）及びＡ－Ｔ塩基対をＧ－Ｃ塩基対に変換するアデニン塩基エディター（ＡＢＥ）の２つのクラスのＤＮＡ塩基エディターが報告されている。まとめると、ＣＢＥ及びＡＢＥは、４つの可能な対変異（Ｃ→Ｔ、Ａ→Ｇ、Ｔ→Ｃ、及びＧ→Ａ）を全て媒介することができる。ＲＮＡにおいても同様に、標的とするアデノシンからイノシンへの変換は、アンチセンス及びＣａｓ１３誘導型ＲＮＡ標的法の両方を利用する。
一実施形態によれば、ＤＮＡ又はＲＮＡ編集剤は、触媒的に不活性なエンドヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－ｄＣａｓ）を含む。
一実施形態によれば、触媒的に不活性なエンドヌクレアーゼは、不活性Ｃａｓ９（例えば、ｄＣａｓ９）である。
一実施形態によれば、触媒的に不活性なエンドヌクレアーゼは、不活性Ｃａｓ１３（例えば、ｄＣａｓ１３）である。
一実施形態によれば、ＤＮＡ又はＲＮＡ編集剤は、エピジェネティックな編集（すなわち、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はヒストンタンパク質に化学的変化を与える）が可能な酵素を含む。
例示的な酵素としては、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、メチラーゼ、アセチルトランスフェラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。より具体的には、例示的な酵素としては、例えば、ＤＮＡ（シトシン－５）メチルトランスフェラーゼ３Ａ（ＤＮＭＴ３ａ）、ヒストンアセチルトランスフェラーゼｐ３００、１０－１１転座メチルシトシンジオキシゲナーゼ１（ＴＥＴ１）、リジン（Ｋ）特異的デメチラーゼ１Ａ（ＬＳＤ１）、並びにカルシウム及びインテグリン結合タンパク質１（ＣＩＢ１）が挙げられる。
触媒作用を失ったヌクレアーゼに加えて、本発明のＤＮＡ又はＲＮＡ編集剤は、核酸塩基デアミナーゼ酵素及び／又はＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤を含んでいてもよい。
特定の実施形態によれば、ＤＮＡ又はＲＮＡ編集剤は、ｓｇＲＮＡと共に、ＢＥ１（ＡＰＯＢＥＣ１－ＸＴＥＮ－ｄＣａｓ９）、ＢＥ２（ＡＰＯＢＥＣ１－ＸＴＥＮ－ｄＣａｓ９－ＵＧＩ）、又はＢＥ３（ＡＰＯＢＥＣ－ＸＴＥＮ－ｄＣａｓ９（Ａ８４０Ｈ）－ＵＧＩ）を含む。ＡＰＯＢＥＣ１は、デアミナーゼの完全長又は触媒的に活性のある断片であり、ＸＴＥＮは、タンパク質リンカーであり、ＵＧＩは、後でＵ：Ｇミスマッチが修復されてＣ：Ｇ塩基対に戻るのを防ぐためのウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤であり、ｄＣａｓ９（Ａ８４０Ｈ）は、編集されていない鎖のみにニックを入れてＨＮＨドメインの触媒活性を回復させ、新たに合成されるＤＮＡを刺激し、所望のＵ：Ａ生成物を生じさせるためにｄＣａｓ９を元の状態に戻したニッカーゼである。
本発明の幾つかの実施形態に係る塩基編集に使用することができる追加の酵素は、その全体が参照により本明細書に援用されるＲｅｅｓ ａｎｄ Ｌｉｕ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０１８）１９：７７０－７８８に明記されている。
標的配列の選択及び／又は設計に役立てるのに利用可能なツールに加えて、バイオインフォマティクスに基づいて決定された異なる種における異なる遺伝子に固有のｓｇＲＮＡのリストが多数公的に利用可能であり、例えば、Ｆｅｎｇ Ｚｈａｎｇ研究室のＴａｒｇｅｔ Ｆｉｎｄｅｒ、Ｍｉｃｈａｅｌ Ｂｏｕｔｒｏｓ研究室のＴａｒｇｅｔ Ｆｉｎｄｅｒ（Ｅ－ＣＲＩＳＰ）、ＲＧＥＮ Ｔｏｏｌｓ：Ｃａｓ－ＯＦＦｉｎｄｅｒ、ＣａｓＦｉｎｄｅｒ：ゲノム中の特定のＣａｓ９標的を同定するためのＦｌｅｘｉｂｌｅアルゴリズム、及びＣＲＩＳＰＲ Ｏｐｔｉｍａｌ Ｔａｒｇｅｔ Ｆｉｎｄｅｒ等であるが、これらに限定されない。
ＣＲＩＳＰＲシステムを使用するためには、ｓｇＲＮＡ及びＣａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）の両方が標的細胞において（例えば、リボ核タンパク質複合体として）発現又は存在していなければならない。挿入ベクターが１つのプラスミド上に両方のカセットを含有していてもよく、又はカセットは２つの別々のプラスミドから発現する。ＣＲＩＳＰＲプラスミドは、Ａｄｄｇｅｎｅ（７５ Ｓｉｄｎｅｙ Ｓｔ，Ｓｕｉｔｅ ５５０Ａ・Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ ０２１３９）製のｐｘ３３０プラスミドのように市販されている。植物ゲノムを改変するためのクラスター化された規則的な間隔の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）ガイドＲＮＡ技術及びＣａｓエンドヌクレアーゼの使用は、少なくとも、その全体が参照により本明細書に具体的に援用されるＳｖｉｔａｓｈｅｖ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１６９（２）：９３１－９４５；Ｋｕｍａｒ ａｎｄ Ｊａｉｎ，２０１５，Ｊ Ｅｘｐ Ｂｏｔ ６６：４７－５７；及び米国特許出願公開第２０１５００８２４７８号にも開示されている。ｓｇＲＮＡと共にＤＮＡ編集を行うために使用することができるＣａｓエンドヌクレアーゼとしては、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１（Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｃｅｌｌ．１６３（３）：７５９－７１）、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、及びＣ２ｃ３（Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．２０１５ Ｎｏｖ ５；６０（３）：３８５－９７）が挙げられるが、これらに限定されない。
「ヒット・アンド・ラン」又は「イン・アウト」－２段階の組み換え手順を含む。最初の工程では、二重陽性／陰性選択可能マーカーカセットを含む挿入型ベクターを使用して、所望の配列変化を導入する。挿入ベクターは、標的となる遺伝子座に相同な単一の連続領域を含有し、関心変異を有するように改変される。このターゲティングコンストラクトを、相同な領域内の１つの部位で制限酵素を用いて線状化し、細胞内に導入し、陽性選択を行って相同組換えが媒介する事象を単離する。相同配列を有するＤＮＡは、プラスミド、一本鎖又は二本鎖のオリゴとして提供され得る。これら相同組換え体は、選択カセットを含む介在ベクター配列によって分離されている局所的重複を含有する。第２の工程では、標的とするクローンを陰性選択に供して、重複する配列間の染色体内組換えを介して選択カセットが失なわれた細胞を同定する。局所的な組み換え事象によって重複が取り除かれ、組み換えの部位に応じて、対立遺伝子は導入された変異を保持するか又は野生型に戻る。最終的には、任意の外因性配列を保持することなく、所望の改変が導入される。
「二重置換」又は「タグ及び交換」戦略－ヒット・アンド・ランアプローチに類似する２段階の選択手順を含むが、２つの異なるターゲティングコンストラクトを使用する必要がある。最初の工程では、３’及び５’に相同性アームを有する標準的なターゲティングベクターを使用して、変異を導入したい箇所の近傍に二重陽性／陰性選択可能カセットを挿入する。システムの構成要素を細胞に導入し、陽性選択を適用した後、ＨＲが媒介する事象を同定することができる。次に、所望の変異と相同な領域を含む第２のターゲティングベクターを標的となるクローンに導入し、陰性選択を適用して選択カセットを除去し、変異を導入する。最終的な対立遺伝子は、所望の変異を含有するが、不要な外因性配列は排除されている。
特定の実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、ＤＮＡターゲティングモジュール（例えば、ｓｇＲＮＡ）を含む。
特定の実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、エンドヌクレアーゼを含まない。
特定の実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、ヌクレアーゼ（例えば、エンドヌクレアーゼ）及びＤＮＡターゲティングモジュール（例えば、ｓｇＲＮＡ）を含む。
特定の実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、例えば、ｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９である。
特定の実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、ＴＡＬＥＮである。
特定の実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、ＺＦＮである。
特定の実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、メガヌクレアーゼである。
特定の実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼと、植物遺伝子の切断を誘導するｓｇＲＮＡとを含む。
特定の実施形態によれば、相同性依存性組み換え（ＨＤＲ）のテンプレートとして機能するオリゴヌクレオチドをＤＮＡ編集剤と一緒に細胞に導入し、当該オリゴヌクレオチドは、有害生物遺伝子に対するサイレンシング特異性を付与するために植物遺伝子の核酸配列を改変することを可能にするヌクレオチド変化を有する植物遺伝子の配列を含む。
一実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、植物細胞内での発現をモニタリングするためにレポーターに連結される。
一実施形態によれば、レポーターは、蛍光レポータータンパク質である。
用語「蛍光タンパク質」とは、蛍光を発するポリペプチドを指し、典型的には、フローサイトメトリー、顕微鏡、又は任意の蛍光イメージングシステムによって検出可能であり、従って、このようなタンパク質を発現している細胞の選択の基礎として使用することができる。
レポーターとして使用することができる蛍光タンパク質の例は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、及び赤色蛍光タンパク質（例えば、ｄｓＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＲＦＰ）であるが、これらに限定されない。蛍光又は他のレポーターの非限定的なリストとしては、発光（例えば、ルシフェラーゼ）又は比色アッセイ（例えば、ＧＵＳ）によって検出可能なタンパク質が挙げられる。特定の実施形態によれば、蛍光レポーターは、赤色蛍光タンパク質（例えば、ｄｓＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＲＦＰ）又はＧＦＰである。
新たなクラスの蛍光タンパク質及び用途についての概説は、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ［Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｅｒｉｋ Ａ．；Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｒｏｂｅｒｔ Ｅ．；Ｌｉｎ，Ｊｏｈｎ Ｙ．；Ｌｉｎ，Ｍｉｃｈａｅｌ Ｚ．；Ｍｉｙａｗａｋｉ，Ａｔｓｕｓｈｉ；Ｐａｌｍｅｒ，Ａｍｙ Ｅ．；Ｓｈｕ，Ｘｉａｏｋｕｎ；Ｚｈａｎｇ，Ｊｉｎ；Ｔｓｉｅｎ，Ｒｏｇｅｒ Ｙ．“Ｔｈｅ Ｇｒｏｗｉｎｇ ａｎｄ Ｇｌｏｗｉｎｇ Ｔｏｏｌｂｏｘ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ａｎｄ Ｐｈｏｔｏａｃｔｉｖｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｔｉｂｓ．２０１６．０９．０１０］に見出すことができる。
別の実施形態によれば、レポーターは、植物の内因性遺伝子である。例示的なレポーターは、カロテノイド生合成経路における重要な酵素のうちの１つをコードしているフィトエン不飽和化酵素遺伝子（ＰＤＳ３）である。そのサイレンシングにより、アルビノ／白化表現型が生じる。従って、ＰＤＳ３の発現が低下した植物は、完全なアルビノ及び矮性に至るまでクロロフィルレベルが低下する。本教示に従って使用することができる追加の遺伝子としては、作物保護に関与する遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
別の実施形態によれば、レポーターは、抗生物質選択マーカーである。レポーターとして使用することができる抗生物質選択マーカーの例は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔＩＩ）及びハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｔ）であるが、これらに限定されない。本教示に従って使用することができる追加のマーカー遺伝子としては、ゲンタマイシンアセチルトランスフェラーゼ（ａｃｃＣ３）抵抗性並びにブレオマイシン及びフレオマイシン抵抗性遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
酵素ＮＰＴＩＩは、カナマイシン、ネオマイシン、ゲネチン（又はＧ４１８）、及びパロモマイシン等の多数のアミノグリコシド抗生物質をリン酸化によって不活性化することが理解されるであろう。これらのうち、カナマイシン、ネオマイシン、及びパロマイシンは、多様な植物種で使用されている。
別の実施形態によれば、レポーターは、毒性選択マーカーである。レポーターとして使用することができる例示的な毒性選択マーカーは、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ１）遺伝子を用いたアリルアルコール選択であるが、これに限定されない。アルコールとアルデヒド又はケトンとの間の相互変換を触媒し、同時にＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋を還元するデヒドロゲナーゼ酵素群を含むＡＤＨ１は、組織内のアルコール性毒性物質を分解する。ＡＤＨ１の発現が低下した植物は、アリルアルコールに対する耐性の増大を示す。従って、ＡＤＨ１が低下した植物は、アリルアルコールの毒性作用に対して抵抗性である。
使用するＤＮＡ編集剤にかかわらず、本発明の方法は、ＲＮＡ分子又は植物遺伝子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）をコードしている遺伝子が、欠失、挿入、又は点変異のうちの少なくとも１つによって改変されるように使用される。
一実施形態によれば、非コードＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）の構造化領域が改変される。
一実施形態によれば、非コードＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）のステム領域が改変される。
一実施形態によれば、非コードＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）のループ領域が改変される。
一実施形態によれば、非コードＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）のステム領域及びループ領域が改変される。
一実施形態によれば、非コードＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）の非構造化領域が改変される。
一実施形態によれば、非コードＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）のステム領域及びループ領域、並びに非構造化領域が改変される。
特定の実施形態によれば、改変は、（ネイティブの植物ＲＮＡ又はネイティブのＲＮＡ分子、例えば、ＲＮＡサイレンシング分子と比較して）約１０～２５０ヌクレオチド、約１０～２００ヌクレオチド、約１０～１５０ヌクレオチド、約１０～１００ヌクレオチド、約１０～５０ヌクレオチド、約１～５０ヌクレオチド、約１～１０ヌクレオチド、約５０～１５０ヌクレオチド、約５０～１００ヌクレオチド、又は約１００～２００ヌクレオチドの改変を含む。
一実施形態によれば、改変は、（ネイティブの植物ＲＮＡ又はネイティブのＲＮＡ分子、例えば、ＲＮＡサイレンシング分子と比較して）最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、又は最大で２５０ヌクレオチドの改変を含む。
一実施形態によれば、連続核酸配列（例えば、少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００塩基）が改変され得る。
一実施形態によれば、例えば、２０、５０、１００、１５０、２００、５００、１０００個の核酸の配列全体にわたって非連続的に改変され得る。
特定の実施形態によれば、改変は、最大で２００ヌクレオチドの改変を含む。
特定の実施形態によれば、改変は、最大で１５０ヌクレオチドの改変を含む。
特定の実施形態によれば、改変は、最大で１００ヌクレオチドの改変を含む。
特定の実施形態によれば、改変は、最大で５０ヌクレオチドの改変を含む。
特定の実施形態によれば、改変は、最大で２５ヌクレオチドの改変を含む。
特定の実施形態によれば、改変は、最大で２０ヌクレオチドの改変を含む。
特定の実施形態によれば、改変は、最大で１５ヌクレオチドの改変を含む。
特定の実施形態によれば、改変は、最大で１０ヌクレオチドの改変を含む。
特定の実施形態によれば、改変は、最大で５ヌクレオチドの改変を含む。
一実施形態によれば、改変は、ＲＮＡ分子（例えば、サイレンシング分子）の構造に依存する。
従って、ＲＮＡ分子が非必須構造（すなわち、その適切なバイオジェネシス及び／又は機能において役割を果たさないＲＮＡサイレンシング分子の二次構造）を含有する場合、又は純粋にｄｓＲＮＡ（すなわち、完全又はほぼ完全なｄｓＲＮＡを有するＲＮＡサイレンシング分子）である場合、ＲＮＡ分子のサイレンシング特異性をリダイレクトするために、幾つかの改変（例えば、２０～３０ヌクレオチド、例えば、１～１０ヌクレオチド、例えば、５ヌクレオチド）が導入される。
別の実施形態によれば、ＲＮＡ分子が必須構造を有する（すなわち、ＲＮＡサイレンシング分子の適切なバイオジェネシス及び／又は活性がその二次構造に依存する）場合、ＲＮＡ分子のサイレンシング特異性をリダイレクトするために、より大きな改変（例えば、１００～２００ヌクレオチド、例えば、５０～１５０ヌクレオチド、例えば、３０ヌクレオチド超かつ２００ヌクレオチド以下、３０～２００ヌクレオチド、３５～２００ヌクレオチド、３５～１５０ヌクレオチド、３５～１００ヌクレオチド）が導入される。
一実施形態によれば、改変は、ＲＮＡサイレンシング分子の認識／切断部位／ＰＡＭモチーフが、元のＰＡＭ認識部位を消失させるように改変されるように行われる。
特定の実施形態によれば、ＰＡＭモチーフにおける少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上の核酸が改変される。
一実施形態によれば、改変は、挿入を含む。
特定の実施形態によれば、挿入は、（ネイティブの植物ＲＮＡ又はネイティブのＲＮＡ分子、例えば、ＲＮＡサイレンシング分子と比較して）約１０～２５０ヌクレオチド、約１０～２００ヌクレオチド、約１０～１５０ヌクレオチド、約１０～１００ヌクレオチド、約１０～５０ヌクレオチド、約１～５０ヌクレオチド、約１～１０ヌクレオチド、約５０～１５０ヌクレオチド、約５０～１００ヌクレオチド、又は約１００～２００ヌクレオチドの挿入を含む。
一実施形態によれば、挿入は、（ネイティブの植物ＲＮＡ又はネイティブのＲＮＡ分子、例えば、ＲＮＡサイレンシング分子と比較して）最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、又は最大で２５０ヌクレオチドの挿入を含む。
特定の実施形態によれば、挿入は、最大で２００ヌクレオチドの挿入を含む。
特定の実施形態によれば、挿入は、最大で１５０ヌクレオチドの挿入を含む。
特定の実施形態によれば、挿入は、最大で１００ヌクレオチドの挿入を含む。
特定の実施形態によれば、挿入は、最大で５０ヌクレオチドの挿入を含む。
特定の実施形態によれば、挿入は、最大で２５ヌクレオチドの挿入を含む。
特定の実施形態によれば、挿入は、最大で２０ヌクレオチドの挿入を含む。
特定の実施形態によれば、挿入は、最大で１５ヌクレオチドの挿入を含む。
特定の実施形態によれば、挿入は、最大で１０ヌクレオチドの挿入を含む。
特定の実施形態によれば、挿入は、最大で５ヌクレオチドの挿入を含む。
一実施形態によれば、改変は、欠失を含む。
特定の実施形態によれば、欠失は、（ネイティブの植物ＲＮＡ又はネイティブのＲＮＡ分子、例えば、ＲＮＡサイレンシング分子と比較して）約１０～２５０ヌクレオチド、約１０～２００ヌクレオチド、約１０～１５０ヌクレオチド、約１０～１００ヌクレオチド、約１０～５０ヌクレオチド、約１～５０ヌクレオチド、約１～１０ヌクレオチド、約５０～１５０ヌクレオチド、約５０～１００ヌクレオチド、又は約１００～２００ヌクレオチドの欠失を含む。
一実施形態によれば、欠失は、（ネイティブの植物ＲＮＡ又はネイティブのＲＮＡ分子、例えば、ＲＮＡサイレンシング分子と比較して）最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、又は最大で２５０ヌクレオチドの欠失を含む。
特定の実施形態によれば、欠失は、最大で２００ヌクレオチドの欠失を含む。
特定の実施形態によれば、欠失は、最大で１５０ヌクレオチドの欠失を含む。
特定の実施形態によれば、欠失は、最大で１００ヌクレオチドの欠失を含む。
特定の実施形態によれば、欠失は、最大で５０ヌクレオチドの欠失を含む。
特定の実施形態によれば、欠失は、最大で２５ヌクレオチドの欠失を含む。
特定の実施形態によれば、欠失は、最大で２０ヌクレオチドの欠失を含む。
特定の実施形態によれば、欠失は、最大で１５ヌクレオチドの欠失を含む。
特定の実施形態によれば、欠失は、最大で１０ヌクレオチドの欠失を含む。
特定の実施形態によれば、欠失は、最大で５ヌクレオチドの欠失を含む。
一実施形態によれば、改変は、点変異を含む。
特定の実施形態によれば、点変異は、（ネイティブの植物ＲＮＡ又はネイティブのＲＮＡ分子、例えば、ＲＮＡサイレンシング分子と比較して）約１０～２５０ヌクレオチド、約１０～２００ヌクレオチド、約１０～１５０ヌクレオチド、約１０～１００ヌクレオチド、約１０～５０ヌクレオチド、約１～５０ヌクレオチド、約１～１０ヌクレオチド、約５０～１５０ヌクレオチド、約５０～１００ヌクレオチド、又は約１００～２００ヌクレオチドの点変異を含む。
一実施形態によれば、点変異は、（ネイティブの植物ＲＮＡ又はネイティブのＲＮＡ分子、例えば、ＲＮＡサイレンシング分子と比較して）最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、又は最大で２５０ヌクレオチドにおける点変異を含む。
特定の実施形態によれば、点変異は、最大で２００ヌクレオチドにおける点変異を含む。
特定の実施形態によれば、点変異は、最大で１５０ヌクレオチドにおける点変異を含む。
特定の実施形態によれば、点変異は、最大で１００ヌクレオチドにおける点変異を含む。
特定の実施形態によれば、点変異は、最大で５０ヌクレオチドにおける点変異を含む。
特定の実施形態によれば、点変異は、最大で２５ヌクレオチドにおける点変異を含む。
特定の実施形態によれば、点変異は、最大で２０ヌクレオチドにおける点変異を含む。
特定の実施形態によれば、点変異は、最大で１５ヌクレオチドにおける点変異を含む。
特定の実施形態によれば、点変異は、最大で１０ヌクレオチドにおける点変異を含む。
特定の実施形態によれば、点変異は、最大で５ヌクレオチドにおける点変異を含む。
一実施形態によれば、改変は、欠失、挿入、及び／又は点変異のいずれかの組み合わせを含む。
一実施形態によれば、改変は、ヌクレオチド置換（例えば、ヌクレオチド交換）を含む。
特定の実施形態によれば、交換は、（ネイティブの植物ＲＮＡ又はネイティブのＲＮＡ分子、例えば、ＲＮＡサイレンシング分子と比較して）約１０～２５０ヌクレオチド、約１０～２００ヌクレオチド、約１０～１５０ヌクレオチド、約１０～１００ヌクレオチド、約１０～５０ヌクレオチド、約１～５０ヌクレオチド、約１～１０ヌクレオチド、約５０～１５０ヌクレオチド、約５０～１００ヌクレオチド、又は約１００～２００ヌクレオチドの交換を含む。
一実施形態によれば、ヌクレオチド交換は、（ネイティブの植物ＲＮＡ又はネイティブのＲＮＡ分子、例えば、ＲＮＡサイレンシング分子と比較して）最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、又は最大で２５０ヌクレオチドにおけるヌクレオチド置換を含む。
特定の実施形態によれば、ヌクレオチド交換は、最大で２００ヌクレオチドにおけるヌクレオチド置換を含む。
特定の実施形態によれば、ヌクレオチド交換は、最大で１５０ヌクレオチドにおけるヌクレオチド置換を含む。
特定の実施形態によれば、ヌクレオチド交換は、最大で１００ヌクレオチドにおけるヌクレオチド置換を含む。
特定の実施形態によれば、ヌクレオチド交換は、最大で５０ヌクレオチドにおけるヌクレオチド置換を含む。
特定の実施形態によれば、ヌクレオチド交換は、最大で２５ヌクレオチドにおけるヌクレオチド置換を含む。
特定の実施形態によれば、ヌクレオチド交換は、最大で２０ヌクレオチドにおけるヌクレオチド置換を含む。
特定の実施形態によれば、ヌクレオチド交換は、最大で１５ヌクレオチドにおけるヌクレオチド置換を含む。
特定の実施形態によれば、ヌクレオチド交換は、最大で１０ヌクレオチドにおけるヌクレオチド置換を含む。
特定の実施形態によれば、ヌクレオチド交換は、最大で５ヌクレオチドにおけるヌクレオチド置換を含む。
一実施形態によれば、植物ＲＮＡ又はＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）をコードしている遺伝子は、内因性ＲＮＡサイレンシング分子（例えば、ｍｉＲＮＡ）の配列を、選択したＲＮＡサイレンシング配列（例えば、ｓｉＲＮＡ）と交換することによって改変される。
一実施形態によれば、ｍｉＲＮＡ前駆体（ｐｒｉ／ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）又はｓｉＲＮＡ前駆体（ｄｓＲＮＡ））等のＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）のガイド鎖は、構造のオリジナリティを保持し、同じ塩基対合プロファイルを維持するように改変される。
一実施形態によれば、ｍｉＲＮＡ前駆体（ｐｒｉ／ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）又はｓｉＲＮＡ前駆体（ｄｓＲＮＡ））等のＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）のパッセンジャー鎖は、構造のオリジナリティを保持し、同じ塩基対合プロファイルを維持するように改変される。
本明細書で使用するとき、用語「構造のオリジナリティ」とは、二次ＲＮＡ構造（すなわち、塩基対合プロファイル）を指す。構造のオリジナリティを維持することは、純粋に配列に依存するのではなく構造に依存する、非コードＲＮＡ分子（例えば、ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ等のＲＮＡサイレンシング分子）の正確かつ効率的なバイオジェネシス／プロセシングに重要である。
一実施形態によれば、ＲＮＡ（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）は、ガイド鎖（サイレンシング鎖）において、標的ＲＮＡ（上述の通り）に対して約５０～１００％の相補性を有するように改変され、一方、パッセンジャー鎖は、元の（改変されていない）ＲＮＡ（例えば、非コードＲＮＡ）の構造を保持するように改変される。
一実施形態によれば、ＲＮＡ配列（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）は、シード配列（例えば、５’末端から２～８番目のｍｉＲＮＡヌクレオチドの場合）が標的配列と相補的になるように改変される。
特定の実施形態によれば、ＲＮＡサイレンシング分子（すなわち、ＲＮＡｉ分子）は、構造のオリジナリティを保持し、細胞のＲＮＡｉプロセシング及び実行因子によって認識されるようにＲＮＡｉ分子の配列が改変されるように設計される。
特定の実施形態によれば、ＲＮＡ分子、例えば、非コードＲＮＡ分子（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ等）は、細胞のＲＮＡｉプロセシング及び実行因子によって認識されるようにＲＮＡｉ分子の配列が改変されるように設計される。
追加の編集事象によって追加の変異を導入できる（すなわち、同時又は逐次）ことが理解されるであろう。
本発明のＤＮＡ編集剤は、（例えば、発現ベクターによる）ＤＮＡ送達法を用いて又はＤＮＡフリーの方法を用いて、植物細胞に導入してもよい。
一実施形態によれば、ｓｇＲＮＡ（又は使用されるＤＮＡ編集システムに応じて、使用される任意の他のＤＮＡ認識モジュール）をＲＮＡとして細胞に提供してもよい。
従って、本技術は、ＲＮＡトランスフェクション（例えば、ｍＲＮＡ＋ｓｇＲＮＡトランスフェクション）又はリボ核タンパク質（ＲＮＰ）トランスフェクション（例えば、タンパク質－ＲＮＡ複合体トランスフェクション、例えば、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体トランスフェクション）等の一過的なＤＮＡ又はＤＮＡフリーの方法を用いてＤＮＡ編集剤を導入することに関することが理解されるであろう。
例えば、Ｃａｓ９は、ＤＮＡ発現プラスミド、インビトロ転写物（すなわち、ＲＮＡ）として、又はリボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）におけるＲＮＡ部分に結合した組換えタンパク質として導入することができる。ｓｇＲＮＡは、例えば、ＤＮＡプラスミドとして又はインビトロ転写物（すなわち、ＲＮＡ）として送達することができる。
例えば、マイクロインジェクション［参照により本明細書に援用されるＣｈｏ ｅｔ ａｌ．，“Ｈｅｒｉｔａｂｌｅ ｇｅｎｅ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｉｎ Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ ｂｙ ｄｉｒｅｃｔ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｓ９－ｓｇＲＮＡ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０１３）１９５：１１７７－１１８０に記載］、エレクトロポレーション［参照により本明細書に援用されるＫｉｍ ｅｔ ａｌ．，“Ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ ｖｉａ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｃａｓ９ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎｓ”Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．（２０１４）２４：１０１２－１０１９に記載］、又は例えばリポソームを用いた脂質媒介トランスフェクション［参照により本明細書に援用されるＺｕｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｉｄ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｅｎａｂｌｅｓ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｂａｓｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ”Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１４）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３０８１に記載］等であるがこれらに限定されない、ＲＮＡ又はＲＮＰトランスフェクションのための当技術分野において公知の任意の方法を、本教示に従って使用することができる。ＲＮＡトランスフェクションの更なる方法は、その全体が参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１６０２８９６７５号に記載されている。
本発明のＲＮＡトランスフェクション方法の１つの利点は、ＲＮＡトランスフェクションが本質的に一過性であり、かつベクターフリーである点である。ＲＮＡトランスジーンは、任意の追加の配列（例えば、ウイルス配列）を必要とすることなく、最小限の発現カセットとして細胞に送達され、そこで発現することができる。
一実施形態によれば、本発明のＤＮＡ編集剤は、発現ベクターを用いて植物細胞に導入される。
本発明の幾つかの実施形態の「発現ベクター」（本明細書では「核酸コンストラクト」、「ベクター」、又は「コンストラクト」とも称される）は、このベクターを原核生物、真核生物、又は好ましくは両方における複製に適したものにする追加の配列を含む（例えば、シャトルベクター）。
本発明の幾つかの実施形態に係る方法において有用なコンストラクトは、当業者に周知の組換えＤＮＡ技術を用いて構築することができる。核酸配列は、植物への形質転換に好適であり、かつ形質転換された細胞において関心遺伝子を一過的に発現させるのに好適である、市販されている場合もあるベクターに挿入してよい。遺伝子コンストラクトは、核酸配列が植物細胞内での発現を可能にする１つ以上の調節配列に動作可能に連結された発現ベクターであってよい。
一実施形態によれば、機能性ＤＮＡ編集剤を発現させるために、切断モジュール（ヌクレアーゼ）がＤＮＡ認識ユニットの一体部分ではない場合、発現ベクターは、切断モジュール及びＤＮＡ認識ユニット（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの場合はｓｇＲＮＡ）をコードしていてよい。
あるいは、切断モジュール（ヌクレアーゼ）及びＤＮＡ認識ユニット（例えば、ｓｇＲＮＡ）を別々の発現ベクターにクローニングしてもよい。このような場合、少なくとも２つの異なる発現ベクターを同じ植物細胞に形質転換しなければならない。
あるいは、ヌクレアーゼを利用しない場合（すなわち、細胞に対して外因性源から投与しない場合）、単一の発現ベクターを使用してＤＮＡ認識ユニット（例えば、ｓｇＲＮＡ）をクローニングし、発現させてもよい。
典型的な発現ベクターは、転写及び翻訳開始配列、転写及び翻訳ターミネーター、並びに任意でポリアデニル化シグナルを含有していてもよい。
一実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、植物細胞において活性を有するシス作用性調節エレメント（例えば、プロモーター）に動作可能に連結された少なくとも１つのＤＮＡ認識ユニット（例えば、ｓｇＲＮＡ）をコードしている核酸剤を含む。
一実施形態によれば、ヌクレアーゼ（例えば、エンドヌクレアーゼ）及びＤＮＡ認識ユニット（例えば、ｓｇＲＮＡ）は、同じ発現ベクターからコードされている。このようなベクターは、ヌクレアーゼ及びＤＮＡ認識ユニットの両方を発現させるために、植物細胞において活性を有する単一のシス作用性調節エレメント（例えば、プロモーター）を含んでいてよい。あるいは、ヌクレアーゼ及びＤＮＡ認識ユニットはそれぞれ、植物細胞において活性を有するシス作用性調節エレメント（例えば、プロモーター）に動作可能に連結されていてもよい。
一実施形態によれば、ヌクレアーゼ（例えば、エンドヌクレアーゼ）及びＤＮＡ認識ユニット（例えば、ｓｇＲＮＡ）は、それぞれが植物細胞において活性を有するシス作用性調節エレメント（例えば、プロモーター）に動作可能に連結されている異なる発現ベクターからコードされている。
本明細書で使用するとき、語句「植物で発現可能」又は「植物細胞において活性を有する」とは、植物の細胞、組織、又は器官、好ましくは単子葉又は双子葉の植物の細胞、組織、又は器官で発現を少なくとも誘導、付与、活性化、又は強化することができる、プロモーター配列（それに付加された又はその中に含まれる任意の追加の調節エレメントを含む）を指す。
使用する植物プロモーターは、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、誘導性プロモーター、キメラプロモーター、又は発生的に調節されるプロモーターであってよい。
本発明の幾つかの実施形態の方法に有用な好ましいプロモーターの例を、表Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、及びＩＶに提示する。
Figure 2022524864000001
Figure 2022524864000002
Figure 2022524864000003
Figure 2022524864000004
Figure 2022524864000005
誘導性プロモーターは、特定の植物組織において、発生段階によって、又は例えば光、温度、化学物質、乾燥、高塩分、浸透圧ショック、酸化剤条件を含むストレス条件若しくは病原性の場合等の特定の刺激によって誘導されるプロモーターであり、エンドウｒｂｃＳ遺伝子に由来する光誘導性プロモーター、アルファルファｒｂｃＳ遺伝子由来のプロモーター、乾燥時に活性を有するプロモーターＤＲＥ、ＭＹＣ、及びＭＹＢ、高塩分及び浸透圧ストレスにおいて活性を有するプロモーターＩＮＴ、ＩＮＰＳ、ｐｒｘＥａ、Ｈａ ｈｓｐ１７．７Ｇ４、及びＲＤ２１、並びに病原性ストレスにおいて活性を有するプロモーターｈｓｒ２０３Ｊ及びｓｔｒ２４６Ｃが挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態によれば、プロモーターは、病原体誘導性プロモーターである。これらプロモーターは、細菌、真菌、ウイルス、線形動物、及び昆虫等の病原体に感染した後に、植物において遺伝子の発現を指示する。このようなプロモーターとしては、病原体の感染後に誘導される病原性関連タンパク質（ＰＲタンパク質）由来のもの；例えば、ＰＲタンパク質、ＳＡＲタンパク質、β－１，３－グルカナーゼ、キチナーゼ等が挙げられる。例えば、Ｒｅｄｏｌｆｉ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｎｅｔｈ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌ ８９：２４５－２５４；Ｕｋｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ４：６４５－６５６；及びＶａｎ Ｌｏｏｎ（１９８５）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｖｉｒｏｌ．４：１１１－１１６を参照。
一実施形態によれば、発現ベクターにおいて１つを超えるプロモーターが使用される場合、プロモーターは同一である（例えば、全て同一である、少なくとも２つが同一である）。
一実施形態によれば、発現ベクターにおいて１つを超えるプロモーターが使用される場合、プロモーターは異なっている（例えば、少なくとも２つが異なっている、全てが異なっている）。
一実施形態によれば、発現ベクターにおけるプロモーターとしては、ＣａＭＶ ３５Ｓ、２ｘ ＣａＭＶ ３５Ｓ、ＣａＭＶ １９Ｓ、ユビキチン、ＡｔＵ６２６、又はＴａＵ６が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態によれば、発現ベクターのプロモーターは、３５Ｓプロモーターを含む。
特定の実施形態によれば、発現ベクターのプロモーターは、Ｕ６プロモーターを含む。
発現ベクターは、転写及び翻訳開始配列、転写及び翻訳ターミネーター配列、並びに任意でポリアデニル化シグナルを含有していてもよい。
特定の実施形態によれば、発現ベクターは、Ｇ７終結配列、ＡｔｕＮｏｓ終結配列、又はＣａＭＶ－３５Ｓ終結配列等の終結配列等であるがこれらに限定されない終結配列を含む。
植物細胞は、本発明の幾つかの実施形態の核酸コンストラクトで安定的又は一過的に形質転換され得る。安定的な形質転換では、本発明の幾つかの実施形態の核酸分子は、植物のゲノムに組み込まれるので、安定的かつ遺伝性の形質を表す。一過的な形質転換では、核酸分子は、形質転換された細胞で発現するが、ゲノムには組み込まれないので、一過的な形質を表す。
単子葉植物及び双子葉植物の両方に外来遺伝子を導入する様々な方法が存在する（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ，Ｉ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，Ｐｌａｎｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９１）４２：２０５－２２５；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３３８：２７４－２７６）。
外因性ＤＮＡを植物のゲノムＤＮＡに安定的に組み込むための基本的な方法は、２つの主なアプローチを含む：
（ｉ）アグロバクテリウムが媒介する遺伝子移入：Ｋｌｅｅ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３８：４６７－４８６；Ｋｌｅｅ ａｎｄ Ｒｏｇｅｒｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ，Ｖｏｌ．６，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｇｅｎｅｓ，ｅｄｓ．Ｓｃｈｅｌｌ，Ｊ．，ａｎｄ Ｖａｓｉｌ，Ｌ．Ｋ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９８９）ｐ．２－２５；Ｇａｔｅｎｂｙ，ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ｋｕｎｇ，Ｓ．ａｎｄ Ａｒｎｔｚｅｎ，Ｃ．Ｊ．，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．（１９８９）ｐ．９３－１１２。
（ｉｉ）以下を含む、ＤＮＡの直接取り込み：Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ，Ｖｏｌ．６，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｇｅｎｅｓ ｅｄｓ．Ｓｃｈｅｌｌ，Ｊ．，ａｎｄ Ｖａｓｉｌ，Ｌ．Ｋ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９８９）ｐ．５２－６８；ＤＮＡをプロトプラストに直接取り込む方法、Ｔｏｒｉｙａｍａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１０７２－１０７４．植物細胞に短時間電気ショックを与えることによって誘導されるＤＮＡ取り込み：Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．（１９８８）７：３７９－３８４．Ｆｒｏｍｍ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）３１９：７９１－７９３．微粒子銃による植物の細胞又は組織へのＤＮＡ注入、Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８８）６：５５９－５６３；ＭｃＣａｂｅ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８８）６：９２３－９２６；Ｓａｎｆｏｒｄ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．（１９９０）７９：２０６－２０９；マイクロピペットシステムの使用による：Ｎｅｕｈａｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８７）７５：３０－３６；Ｎｅｕｈａｕｓ ａｎｄ Ｓｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．（１９９０）７９：２１３－２１７；細胞培養物、胚、又はカルス組織のガラス繊維又は炭化ケイ素ウイスカー形質転換、米国特許第５，４６４，７６５号、又はＤＮＡを出芽花粉と共に直接インキュベーションすることによる、ＤｅＷｅｔ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｖｕｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ，ｅｄｓ．Ｃｈａｐｍａｎ，Ｇ．Ｐ．ａｎｄ Ｍａｎｔｅｌｌ，Ｓ．Ｈ．ａｎｄ Ｄａｎｉｅｌｓ，Ｗ．Ｌｏｎｇｍａｎ，Ｌｏｎｄｏｎ，（１９８５）ｐ．１９７－２０９；及びＯｈｔａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８６）８３：７１５－７１９。
アグロバクテリウム系は、植物のゲノムＤＮＡに組み込まれる規定のＤＮＡセグメントを含有するプラスミドベクターを使用することを含む。植物組織への接種方法は、植物種及びアグロバクテリウム送達系によって異なる。広く使用されているアプローチは、植物全体の分化を開始させるのに優れた資源を提供する任意の組織外植片を用いて行うことができるリーフディスク手順である。Ｈｏｒｓｃｈ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ Ａ５，Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ（１９８８）ｐ．１－９。補助的なアプローチでは、真空浸透と組み合わせてアグロバクテリウム送達系を使用する。アグロバクテリウム系は、特にトランスジェニック双子葉植物の創出において実行可能である。
一実施形態によれば、アグロバクテリウムフリーの発現方法を用いて、植物細胞に外来遺伝子を導入する。一実施形態によれば、アグロバクテリウムフリーの発現方法は、一過的である。特定の実施形態によれば、ボンバードメント法を用いて、植物細胞に外来遺伝子を導入する。別の特定の実施形態によれば、植物の根へのボンバードメントを用いて、植物細胞に外来遺伝子を導入する。本発明の幾つかの実施形態に従って使用することができる例示的なボンバードメント法については、以下の実施例の項で論じる。
更に、本発明の幾つかの実施形態の教示に従って、様々なクローニングキット又は遺伝子合成を使用することができる。
一実施形態によれば、核酸コンストラクトは、バイナリーベクターである。バイナリーベクターの例は、ｐＢＩＮ１９、ｐＢＩ１０１、ｐＢｉｎＡＲ、ｐＧＰＴＶ、ｐＣＡＭＢＩＡ、ｐＢＩＢ－ＨＹＧ、ｐＢｅｃｋｓ、ｐＧｒｅｅｎ、又はｐＰＺＰである（Ｈａｊｕｋｉｅｗｉｃｚ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５，９８９（１９９４）及びＨｅｌｌｅｎｓ ｅｔ ａｌ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ ５，４４６（２０００））。
ＤＮＡを送達する他の方法（例えば、以下で論じるようなトランスフェクション、エレクトロポレーション、ボンバードメント、ウイルス接種等）において使用される他のベクターの例は、ｐＧＥ－ｓｇＲＮＡ（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｓ．２０１６ ７：１２６９７）、ｐＪＩＴ１６３－Ｕｂｉ－Ｃａｓ９（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００４ ３２，９４７－９５１）、ｐＩＣＨ４７７４２：：２ｘ３５Ｓ－５’ＵＴＲ－ｈＣａｓ９（ＳＴＯＰ）－ＮＯＳＴ（Ｂｅｌｈａｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１３ １１；９（１）：３９）、ｐＡＨＣ２５（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ａ．Ｈ．＆ Ｐ．Ｈ．Ｑｕａｉｌ，１９９６．Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒ－ｂａｓｅｄ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈ－ｌｅｖｅｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ ａｎｄ／ｏｒ ｓｃｒｅｅｎａｂｌｅ ｍａｒｋｅｒ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｍｏｎｏｃｏｔｙｌｅｄｏｎｏｕｓ ｐｌａｎｔｓ．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５：２１３－２１８）、ｐＨＢＴ－ｓＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）－ＮＯＳ（Ｓｈｅｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｌｉｇｈｔ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍａｉｚｅ，ＥＭＢＯ Ｊ．１２（９），３４９７－３５０５（１９９３）である。
一実施形態によれば、本発明の幾つかの実施形態の方法は、植物細胞にドナーオリゴヌクレオチドを導入することを更に含む。
一実施形態によれば、改変が挿入である場合、方法は、植物細胞にドナーオリゴヌクレオチドを導入することを更に含む。
一実施形態によれば、改変が欠失である場合、方法は、植物細胞にドナーオリゴヌクレオチドを導入することを更に含む。
一実施形態によれば、改変が欠失及び挿入（例えば、交換）である場合、方法は、植物細胞にドナーオリゴヌクレオチドを導入することを更に含む。
一実施形態によれば、改変が点変異である場合、方法は、植物細胞にドナーオリゴヌクレオチドを導入することを更に含む。
本明細書で使用するとき、用語「ドナーオリゴヌクレオチド」又は「ドナーオリゴ」とは、外因性ヌクレオチド、すなわちゲノムに正確な変化を生じさせるために植物細胞に外部から導入されるヌクレオチドを指す。一実施形態によれば、ドナーオリゴヌクレオチドは、合成である。
一実施形態によれば、ドナーオリゴは、ＲＮＡオリゴである。
一実施形態によれば、ドナーオリゴは、ＤＮＡオリゴである。
一実施形態によれば、ドナーオリゴは、合成オリゴである。
一実施形態によれば、ドナーオリゴヌクレオチドは、一本鎖ドナーオリゴヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）を含む。
一実施形態によれば、ドナーオリゴヌクレオチドは、二本鎖ドナーオリゴヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）を含む。
一実施形態によれば、ドナーオリゴヌクレオチドは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を含む。
一実施形態によれば、ドナーオリゴヌクレオチドは、二本鎖ＤＮＡ－ＲＮＡ二重鎖（ＤＮＡ－ＲＮＡ二重鎖）を含む。
一実施形態によれば、ドナーオリゴヌクレオチドは、二本鎖ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドを含む。
一実施形態によれば、ドナーオリゴヌクレオチドは、一本鎖ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドを含む。
一実施形態によれば、ドナーオリゴヌクレオチドは、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を含む。
一実施形態によれば、ドナーオリゴヌクレオチドは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含む。
一実施形態によれば、ドナーオリゴヌクレオチドは、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）を含む。
一実施形態によれば、ドナーオリゴヌクレオチドは、（上述の通り）交換のためのＤＮＡ又はＲＮＡ配列を含む。
一実施形態によれば、ドナーオリゴヌクレオチドは、非発現ベクターフォーマット又はオリゴで提供される。
一実施形態によれば、ドナーオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡドナープラスミド（例えば、環状又は線状化されたプラスミド）を含む。
一実施形態によれば、ドナーオリゴヌクレオチドは、約５０～５０００、約１００～５０００、約２５０～５０００、約５００～５０００、約７５０～５０００、約１０００～５０００、約１５００～５０００、約２０００～５０００、約２５００～５０００、約３０００～５０００、約４０００～５０００、約５０～４０００、約１００～４０００、約２５０～４０００、約５００～４０００、約７５０～４０００、約１０００～４０００、約１５００～４０００、約２０００～４０００、約２５００～４０００、約３０００～４０００、約５０～３０００、約１００～３０００、約２５０～３０００、約５００～３０００、約７５０～３０００、約１０００～３０００、約１５００～３０００、約２０００～３０００、約５０～２０００、約１００～２０００、約２５０～２０００、約５００～２０００、約７５０～２０００、約１０００～２０００、約１５００～２０００、約５０～１０００、約１００～１０００、約２５０～１０００、約５００～１０００、約７５０～１０００、約５０～７５０、約１５０～７５０、約２５０～７５０、約５００～７５０、約５０～５００、約１５０～５００、約２００～５００、約２５０～５００、約３５０～５００、約５０～２５０、約１５０～２５０、又は約２００～２５０ヌクレオチドを含む。
特定の実施形態によれば、ｓｓＯＤＮ（例えば、ｓｓＤＮＡ又はｓｓＲＮＡ）を含むドナーオリゴヌクレオチドは、約２００～５００ヌクレオチドを含む。
特定の実施形態によれば、ｄｓＯＤＮ（例えば、ｄｓＤＮＡ又はｄｓＲＮＡ）を含むドナーオリゴヌクレオチドは、約２５０～５０００ヌクレオチドを含む。
一実施形態によれば、内因性ＲＮＡサイレンシング分子（例えば、ｍｉＲＮＡ）を選択したＲＮＡサイレンシング配列（例えば、ｓｉＲＮＡ）に遺伝子交換するために、発現ベクター、ｓｓＯＤＮ（例えば、ｓｓＤＮＡ又はｓｓＲＮＡ）、又はｄｓＯＤＮ（例えば、ｄｓＤＮＡ又はｄｓＲＮＡ）が植物細胞内で発現する必要はなく、非発現テンプレートとして機能することができる。特定の実施形態によれば、このような場合、ＤＮＡ形態で提供された場合には、ＤＮＡ編集剤（例えば、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡモジュール）のみが発現すればよい。
幾つかの実施形態によれば、ヌクレアーゼを使用することなく内因性ＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）を遺伝子編集するために、ＤＮＡ編集剤（例えば、ｇＲＮＡ）を（例えば、本明細書で論じられるオリゴヌクレオチドドナーＤＮＡ又はＲＮＡ）を使用して又は使用せずに（ｗｉｔｈ ｏｒｏｕｒ ｗｉｔｈｏｕｔ）真核細胞に導入してよい。
一実施形態によれば、ドナーオリゴヌクレオチドの植物細胞への導入は、上述の方法のいずれかを用いて（例えば、発現ベクター又はＲＮＰトランスフェクションを用いて）行われる。
一実施形態によれば、ｓｇＲＮＡ及びＤＮＡドナーオリゴヌクレオチドを（例えば、ボンバードメントを介して）植物細胞に同時導入する。任意の追加の因子（例えば、ヌクレアーゼ）をそれと同時に導入してもよいことが理解されるであろう。
一実施形態によれば、ｓｇＲＮＡを、ＤＮＡドナーオリゴヌクレオチドの前に（例えば、数分又は数時間以内に）植物細胞に導入する。任意の追加因子（例えば、ヌクレアーゼ）をｓｇＲＮＡ又はＤＮＡドナーオリゴヌクレオチドの前に、同時に、又は後に導入してもよいことが理解されるであろう。
一実施形態によれば、ｓｇＲＮＡを、ＤＮＡドナーオリゴヌクレオチドの後に（例えば、数分又は数時間以内に）植物細胞に導入する。任意の追加因子（例えば、ヌクレアーゼ）をｓｇＲＮＡ又はＤＮＡドナーオリゴヌクレオチドの前に、同時に、又は後に導入してもよいことが理解されるであろう。
一実施形態によれば、ゲノム編集のための、少なくとも１つのｓｇＲＮＡ及びＤＮＡドナーオリゴヌクレオチドを含む組成物が提供される。
一実施形態によれば、ゲノム編集のための、少なくとも１つのｓｇＲＮＡ、ヌクレアーゼ（例えば、エンドヌクレアーゼ）、及びＤＮＡドナーオリゴヌクレオチドを含む組成物が提供される。
植物細胞に直接ＤＮＡを導入する様々な方法が存在し、当業者は、どの方法を選択すべきかを理解するであろう。エレクトロポレーションでは、プロトプラストを短時間、強電界に曝露する。マイクロインジェクションでは、非常に小さなマイクロピペットを使用して、ＤＮＡを細胞内に機械的に直接注入する。微粒子銃では、硫酸マグネシウム結晶又は金若しくはタングステンの粒子等のマイクロプロジェクタイルにＤＮＡを吸着させ、マイクロプロジェクタイルをプロトプラスト、細胞、又は植物組織に向かって物理的に加速させる。
従って、核酸の送達は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、及び／若しくはタンパク質、又は核酸とペプチドとの組み合わせを植物細胞に送達する方法において、例えば、プロトプラストの形質転換による（例えば、米国特許第５，５０８，１８４号を参照）；乾燥／阻害が媒介するＤＮＡの取り込みによる（例えば、Ｐｏｔｒｙｋｕｓ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９９：１８３－８）；エレクトロポレーションによる（例えば、米国特許第５，３８４，２５３号を参照）；炭化ケイ素繊維と共に撹拌することによる（例えば、米国特許第５，３０２，５２３号及び同第５，４６４，７６５号を参照）；アグロバクテリウムが媒介する形質転換による（例えば、米国特許第５，５６３，０５５号、同第５，５９１，６１６号、第５，６９３，５１２号、同第５，８２４，８７７号、同第５，９８１，８４０号、及び同第６，３８４，３０１号を参照）；ＤＮＡでコーティングされた粒子の加速による（例えば、米国特許第５，０１５，５８０号、同第５，５５０，３１８号、同第５，５３８，８８０号、同第６，１６０，２０８号、同第６，３９９，８６１号、及び同第６，４０３，８６５号を参照）、並びにナノ粒子、ナノキャリア、及び細胞透過性ペプチドによる（国際公開第２０１１２６６４４Ａ２号、同第２００９０４６３８４Ａ１号、同第２００８１４８２２３Ａ１号）ものが挙げられるがこれらに限定されない当業者に公知の任意の方法によって、本発明の実施形態における植物細胞に導入してよい。
トランスフェクションの他の方法としては、トランスフェクション試薬（例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、デンドリマー（Ｋｕｋｏｗｓｋａ－Ｌａｔａｌｌｏ，Ｊ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３，４８９７－９０２）、細胞透過性ペプチド（Ｍaｅ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ－ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎｔｏ ｔｏｂａｃｃｏ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １６６９（２）：１０１－７）、又はポリアミン（Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｖｉｎｏｇｒａｄｏｖ，２０１０，Ｓｈｏｒｔ ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ｐｏｌｙａｍｉｎｅｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｒａｉｎ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ，Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ，１４３（３）：３５９－３６６）の使用が挙げられる。
特定の実施形態によれば、植物細胞（例えば、プロトプラスト）にＤＮＡを導入するために、方法は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が媒介するＤＮＡの取り込みを含む。更なる詳細については、Ｋａｒｅｓｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．９：５７５－５７８；Ｍａｔｈｕｒ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１４：２２１－２２６；Ｎｅｇｒｕｔｉｕ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８：３６３－３７３を参照。次いで、細胞壁を成長させ、カルスを形成するために分裂を開始させ、シュート及び根を発生させ、植物全体を再生させる条件下で、植物細胞（例えば、プロトプラスト等）を培養する。
安定的な形質転換後に、植物の繁殖を行う。植物の繁殖の最も一般的な方法は、種子によるものである。しかし、種子繁殖による再生では、メンデルの法則に支配される遺伝的分散に従って植物が種子を生成するので、ヘテロ接合性により作物の均一性が失われるという問題点がある。基本的に、それぞれの種子は遺伝子的に異なっており、それぞれが固有の形質を持って成長する。従って、形質転換された植物は、再生された植物が親トランスジェニック植物と同一の形質及び特徴を有するように生成されることが好ましい。従って、形質転換された植物は、遺伝的に同一の形質転換された植物を迅速に一貫して再生させる微細繁殖によって再生されることが好ましい。
微細繁殖とは、選択した親植物又は品種から切り取った単一の組織片から新しい世代の植物を成長させるプロセスである。このプロセスにより、所望の形質を有する植物を大量に再生させることが可能になる。新たに生成された植物は、元の植物と遺伝子的に同一であり、元の植物の特徴を全て有している。微細繁殖（又はクローン化）は、短期間で高品質の植物材料を大量に生産することができ、元のトランスジェニック又は形質転換植物の特徴を保持しつつ、選択した品種を迅速に増殖させられる。クローン植物の利点は、植物の増殖速度並びに生成される植物の品質及び均一性である。
微細繁殖は、段階間で培養培地又は生育条件を変更する必要がある多段階手順である。従って、微細繁殖プロセスは４つの基本的な段階を含む：段階１、初期組織培養；段階２、組織培養増殖；段階３、分化及び植物形成；並びに段階４、温室栽培及びハードニング。段階１の初期組織培養中に、組織培養を確立し、汚染物質のないことを証明する。段階２中に、生産目標を達成するのに十分な数の組織サンプルが生成されるまで、初期組織培養物を増殖させる。段階３中に、段階２で成長させた組織サンプルを分割し、個々の小植物に成長させる。段階４では、形質転換された小植物をハードニングのために温室に移し、そこで、自然環境で成長することができるように、光に対する植物の耐性を徐々に高める。
現在は安定的な形質転換が好ましいが、本発明の幾つかの実施形態によって、葉の細胞、分裂組織細胞、又は植物全体の一過的な形質転換も想定される。
一過的な形質転換は、上述の直接ＤＮＡ移入法のいずれか又は改変植物ウイルスを用いたウイルス感染によって行うことができる。
植物宿主の形質転換に有用であることが示されているウイルスとしては、ＣａＭＶ、ＴＭＶ、ＴＲＶ、及びＢＶが挙げられる。植物ウイルスを用いた植物の形質転換については、米国特許第４，８５５，２３７号（ＢＧＶ）、欧州特許第６７，５５３号（ＴＭＶ）、特開昭第６３－１４６９３号（ＴＭＶ）、欧州特許第１９４，８０９号（ＢＶ）、欧州特許第２７８，６６７号（ＢＶ）；及びＧｌｕｚｍａｎ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１７２－１８９（１９８８）に記載されている。植物を含む多くの宿主における外来ＤＮＡの発現において使用するための偽ウイルス粒子は、国際公開第８７／０６２６１号に記載されている。
植物において非ウイルス性外因性核酸配列を導入し、発現させるための植物ＲＮＡウイルスの構築は、上記参照文献に加えて、Ｄａｗｓｏｎ，Ｗ．Ｏ．ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８９）１７２：２８５－２９２；Ｔａｋａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．ＥＭＢＯ Ｊ．（１９８７）６：３０７－３１１；Ｆｒｅｎｃｈ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８６）２３１：１２９４－１２９７；及びＴａｋａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９９０）２６９：７３－７６によっても示されている。
ウイルスがＤＮＡウイルスである場合、ウイルス自体に好適な改変を行ってよい。あるいは、外来ＤＮＡを有する所望のウイルスベクターを構築することを容易にするために、ウイルスをまず細菌プラスミドにクローニングしてよい。次いで、ウイルスをプラスミドから切り離してよい。ウイルスがＤＮＡウイルスである場合、ウイルスＤＮＡに細菌の複製起点を結合させ、次いで、細菌によって複製させてもよい。このＤＮＡの転写及び翻訳により、ウイルスＤＮＡをキャプシドで包むコートタンパク質が生成される。ウイルスがＲＮＡウイルスである場合、一般的にはウイルスをｃＤＮＡとしてクローニングし、プラスミドに挿入する。次いで、プラスミドを使用して、全ての構築を行う。次いで、プラスミドのウイルス配列が転写され、ウイルス遺伝子が翻訳されて、ウイルスＲＮＡをキャプシドで包むコートタンパク質（複数可）が生成されることによって、ＲＮＡウイルスが生成される。
本発明の幾つかの実施形態のコンストラクトに含まれるもの等の非ウイルス性外因性核酸配列を植物に導入し、発現させるための植物ＲＮＡウイルスの構築は、上記参照文献に加えて、米国特許第５，３１６，９３１号によって示されている。
一実施形態では、ネイティブのコートタンパク質のコード配列がウイルス核酸から欠失しており、植物宿主において発現し、組換え植物ウイルス核酸をパッケージングし、宿主に確実に組換え植物ウイルス核酸を全身感染させることができる非ネイティブの植物ウイルスコートタンパク質のコード配列及び非ネイティブのプロモーター、好ましくは、非ネイティブのコートタンパク質のコード配列のサブゲノムプロモーターが挿入されている、植物ウイルス核酸が提供される。あるいは、タンパク質が生成されるように、その中に非ネイティブの核酸配列を挿入することによってコートタンパク質遺伝子を不活性化してもよい。組換え植物ウイルス核酸は、１つ以上の追加の非ネイティブのサブゲノムプロモーターを含んでいてもよい。各非ネイティブのサブゲノムプロモーターは、植物宿主において隣接する遺伝子又は核酸配列を転写又は発現させることが可能であり、互いに、そして、ネイティブのサブゲノムプロモーターと組換えすることはできない。１つを超える核酸配列が含まれる場合、ネイティブの植物ウイルスサブゲノムプロモーター又はネイティブ及び非ネイティブの植物ウイルスサブゲノムプロモーターに隣接して、非ネイティブの（外来）核酸配列を挿入してよい。非ネイティブの核酸配列は、サブゲノムプロモーターの制御下で宿主植物において転写されて又は発現して所望の生成物を生成する。
第２の実施形態では、非ネイティブのコートタンパク質のコード配列の代わりに、非ネイティブのコートタンパク質のサブゲノムプロモーターのうちの１つに隣接してネイティブのコートタンパク質のコード配列が配置されることを除いて、第１の実施形態と同様に組換え植物ウイルス核酸が提供される。
第３の実施形態では、ネイティブのコートタンパク質遺伝子がそのサブゲノムプロモーターに隣接しており、１つ以上の非ネイティブのサブゲノムプロモーターがウイルス核酸に挿入されている、組換え植物ウイルス核酸が提供される。挿入された非ネイティブのサブゲノムプロモーターは、植物宿主において隣接する遺伝子を転写又は発現させることが可能であり、互いに、そして、ネイティブのサブゲノムプロモーターと組換えすることはできない。その配列がサブゲノムプロモーターの制御下で宿主植物内において転写されて又は発現して所望の生成物を生成するように、非ネイティブのサブゲノム植物ウイルスプロモーターに隣接して非ネイティブの核酸配列を挿入してよい。
第４の実施形態では、ネイティブのコートタンパク質のコード配列が非ネイティブのコートタンパク質のコード配列に置換されていることを除いて、第３の実施形態と同様に組換え植物ウイルス核酸が提供される。
ウイルスベクターは、組換え植物ウイルス核酸によってコードされているコートタンパク質によってキャプシドで包まれて、組換え植物ウイルスが生成される。組換え植物ウイルス核酸又は組換え植物ウイルスを用いて、適切な宿主植物に感染させる。組換え植物ウイルス核酸は、所望のタンパク質を生成させるために、宿主において複製され、宿主において全身に拡散し、宿主において外来遺伝子（複数可）（単離された核酸）を転写又は発現させることが可能である。
上記に加えて、本発明の幾つかの実施形態の核酸分子を葉緑体ゲノムに導入し、それによって、葉緑体発現を可能にすることもできる。
葉緑体のゲノムに外因性の核酸配列を導入する技術は、公知である。この技術は、以下の手順を含む。まず、１細胞あたりの葉緑体数が約１個に減少するように、植物細胞を化学的に処理する。次いで、葉緑体に少なくとも１つの外因性核酸分子を導入することを目的として、微粒子銃を介して細胞内に外因性核酸を導入する。外因性核酸は、葉緑体に固有の酵素によって容易に行われる相同組換えを介して葉緑体のゲノムに組み込み可能であるように選択される。この目的のために、外因性核酸は、関心遺伝子に加えて、葉緑体のゲノムに由来する少なくとも１つの核酸ストレッチを含む。更に、外因性核酸は、逐次選択後の葉緑体ゲノムのコピーの全て又は実質的に全てが外因性核酸を含むことを確認するためのこのような選択手順によって役立つ選択可能なマーカーを含む。この技術に関する更なる詳細については、参照により本明細書に援用される米国特許第４，９４５，０５０号及び同第５，６９３，５０７号にみられる。このようにして、葉緑体のタンパク質発現系によってポリペプチドを生成し、葉緑体の内膜に組み込むことができる。
使用する形質転換／感染方法にかかわらず、本教示は、ゲノム編集事象を含む形質転換細胞を更に選択する。
特定の実施形態によれば、特定の遺伝子座において正確な改変（例えば、交換、挿入、欠失、点変異）に成功した細胞のみが選択されるように、選択を実行する。従って、意図しない遺伝子座に改変（例えば、挿入、欠失、点変異）を含む任意の事象を含む細胞は選択されない。
一実施形態によれば、改変された細胞の選択は、表現型レベルで、分子事象の検出によって、蛍光レポーターの検出によって、又は選択（例えば、抗生物質）の存在下における成長によって行うことができる。
一実施形態によれば、改変された細胞の選択は、新たに生成されたｄｓＲＮＡ分子のバイオジェネシス及び出現を分析することによって行われる。
一実施形態によれば、改変された細胞の選択は、二次低分子ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡの更なるプロセシングによって作製される）のバイオジェネシス及び出現を分析することによって行われる。
一実施形態によれば、改変された細胞の選択は、新たに編集されたＲＮＡ分子のバイオジェネシス及び出現（例えば、新たなｍｉＲＮＡバージョンの存在、新たに編集されたｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｔａｓｉＲＮＡ等の存在）を分析することによって行われる。
一実施形態によれば、改変された細胞の選択は、新たに編集された植物ＲＮＡ転写物（すなわち、改変された植物遺伝子の）のバイオジェネシス及び出現を分析することによって行われる。
一実施形態によれば、改変された細胞の選択は、改変されたＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）若しくは改変された植物ＲＮＡのそれぞれ植物ＲＮＡ若しくは有害生物ＲＮＡに対するサイレンシング活性及び／若しくは特異性、又はｄｓＲＮＡ分子若しくはそれからプロセシングされた二次低分子ＲＮＡの有害生物ＲＮＡに対するサイレンシング活性及び／若しくは特異性を分析することによって、植物（例えば、植物の葉の発色、例えば、葉及び他の器官におけるクロロフィルの部分的又は完全な消失（白化）、壊死パターンの有無、花の発色、果実の形質（例えば、保存期間、硬さ、及び香り）、成長速度、植物サイズ（例えば、矮性）、作物収量、生物的ストレス抵抗性）、又は有害生物（例えば、線形動物の死亡率、甲虫の産卵率、又は細菌、ウイルス、真菌、寄生虫、昆虫、雑草、及び栽培植物若しくは在来植物のいずれかに関連する他の抵抗性表現型）における少なくとも１つの表現型を検証することによって行われる。
一実施形態によれば、ＲＮＡ分子、植物ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、又はそれからプロセシングされる二次低分子ＲＮＡのサイレンシング特異性は、遺伝子型的に、例えば、遺伝子の発現又は発現の欠如によって判定される。
一実施形態によれば、ＲＮＡ分子、植物ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、又はそれからプロセシングされる二次低分子ＲＮＡのサイレンシング特異性は、表現型的に判定される。
一実施形態によれば、植物の表現型は、遺伝子型の前に判定される。
一実施形態によれば、植物の遺伝子型は、表現型の前に決定される。
一実施形態によれば、改変された細胞の選択は、植物ＲＮＡ又は有害生物ＲＮＡのＲＮＡレベルを測定することにより、植物ＲＮＡ又は有害生物ＲＮＡに対するＲＮＡ分子（例えばＲＮＡサイレンシング分子）、植物ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、又はそれからプロセシングされる二次低分子ＲＮＡのサイレンシング活性及び／又は特異性を分析することにより行われる。これは、例えば、ノーザンブロッティング、ヌクレアーゼプロテクションアッセイ、インサイチュハイブリダイゼーション、又は定量ＲＴ－ＰＣＲ等、当技術分野で公知の任意の方法を用いて行うことができる。
一実施形態によれば、改変された細胞の選択は、求められる編集の種類、例えば、挿入、欠失、挿入－欠失（インデル）、逆位、置換、及びこれらの組み合わせに応じて、本明細書において「変異」又は「編集」とも称されるＤＮＡ編集事象を含む植物細胞又はクローンを分析することによって行われる。
配列変化を検出する方法は、当技術分野において周知であり、ＤＮＡ及びＲＮＡのシーケンシング（例えば、次世代シーケンシング）、電気泳動、酵素ベースのミスマッチ検出アッセイ、並びにＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ、ＲＮａｓｅ保護、インサイチュハイブリダイゼーション、プライマーエクステンション、サザンブロット、ノーザンブロット、及びドットブロット分析等のハイブリダイゼーションアッセイが挙げられるが、これらに限定されない。また、一塩基多型（ＳＮＰ）を検出するために使用される様々な方法、例えば、ＰＣＲベースのＴ７エンドヌクレアーゼ、ヘテロ二重鎖、及びサンガーシーケンシング、又はＰＣＲに続いで制限酵素で消化して固有の制限部位（複数可）の出現若しくは消失を検出する等を用いてもよい。
インデル等のＤＮＡ編集事象の存在を検証する別の方法は、ミスマッチのあるＤＮＡを認識し、切断する構造選択的酵素（例えば、エンドヌクレアーゼ）を利用するミスマッチ切断アッセイを含む。
一実施形態によれば、形質転換細胞の選択は、蛍光レポーターが発する蛍光を示す形質転換細胞をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）で選択することによって行われる。ＦＡＣＳ選別の後、蛍光マーカーを提示する形質転換植物細胞の陽性選択されたプールを収集し、上述のようにＤＮＡ編集事象を試験するためにアリコートを使用することができる。
抗生物質選択マーカーを使用した場合、形質転換後に、コロニー、すなわちクローン及びマイクロカルスに発生するまで、選択（例えば、抗生物質）の存在下で植物細胞クローンを培養する。次いで、カルスの細胞の一部を、上述のように、ＤＮＡ編集事象について分析（検証）する。
従って、本発明の一実施形態によれば、方法は、植物ＲＮＡ又は有害生物ＲＮＡに対するＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）、植物ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、又はそれからプロセシングされる二次低分子ＲＮＡの相補性を形質転換細胞において検証することを更に含む。
上述のように、改変後、ＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）、植物ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ（例えば、そのセンス又はアンチセンス鎖）、又はそれからプロセシングされる二次低分子ＲＮＡは、植物ＲＮＡ又は有害生物ＲＮＡの標的配列に対して、少なくとも約３０％、３３％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は更には１００％の相補性を有する。
設計されたＲＮＡ分子と標的植物ＲＮＡ又は有害生物ＲＮＡとの特異的結合は、当技術分野において公知の任意の方法、例えば、計算アルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴ）によって判定し、例えば、ノーザンブロット、インサイチュハイブリダイゼーション、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ Ｐｌｅｘ Ａｓｓａｙ等を含む方法によって検証することができる。
陽性クローンは、ＤＮＡ編集事象についてホモ接合性又はヘテロ接合性であり得ることが理解されるであろう。ヘテロ接合性細胞の場合、その細胞（例えば、二倍体の場合）は、改変遺伝子のコピー及び非改変遺伝子のコピーを含み得る。当業者であれば、意図する用途に応じて、更なる培養／再生のためのクローンを選択するであろう。
一実施形態によれば、一過的な方法が望ましい場合、必要に応じてＤＮＡ編集事象の存在を示すクローンを更に分析し、ＤＮＡ編集剤の非存在、すなわち、ＤＮＡ編集剤をコードしているＤＮＡ配列の消失について選択する。これは、例えばＧＦＰの蛍光検出又はｑ－ＰＣＲ、ＨＰＬＣ等により、（例えば、ｍＲＮＡ、タンパク質レベルでの）ＤＮＡ編集剤の発現の消失を分析することによって行うことができる。
一実施形態によれば、一過的な方法が望ましい場合、細胞を、本明細書に記載の核酸コンストラクト又はその一部、例えば、ＤＮＡ編集剤をコードしている核酸配列の非存在について分析してもよい。これは、蛍光顕微鏡、ｑ－ＰＣＲ、ＦＡＣＳ、及び又はサザンブロット、ＰＣＲ、シーケンシング、ＨＰＬＣ）等の任意の他の方法によって確認することができる）。
一実施形態によれば、後述するように、ＤＮＡ編集剤（例えば、エンドヌクレアーゼ）を含まない植物を得るために、植物を交配させる。
陽性クローンは、保存することができる（例えば、凍結保存）。
あるいは、植物組織培養法を用いて、まず植物細胞の群に成長させ、カルスに発生させ、次いで、カルスからシュートを再生させる（カルス発生（ｃａｌｌｏｇｅｎｅｓｉｓ））ことによって、植物細胞（例えば、プロトプラスト）を植物全体に再生させることができる。プロトプラストをカルスに成長させ、シュートを再生させるには、組織培養培地に植物成長調節物質を適切なバランスで配合する必要があり、これは、各植物種ごとにカスタマイズしなければならない。
また、プロトプラストフュージョンと呼ばれる技術を用いて、プロトプラストを植物の育種に使用することもできる。電界又はポリエチレングリコールの溶液を用いることによって、異なる種由来のプロトプラストの融合を誘導する。この技術は、組織培養で体細胞ハイブリッドを生成するために使用することができる。
プロトプラストを再生させる方法は、当技術分野において周知である。幾つかの要因、すなわち、遺伝子型、ドナー組織及びその前処理、プロトプラストを単離するための酵素処理、プロトプラストの培養方法、培養、培養培地、並びに物理的環境が、プロトプラストの分離、培養、及び再生に影響を与える。完全な概説については、Ｍａｈｅｓｈｗａｒｉ ｅｔ ａｌ．１９８６ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ａｎｄ ｏｆ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌｓ：３－３６．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎを参照。
再生した植物は、当業者が適切であると考えるように、更なる育種及び選択に供することができる。
従って、本発明の実施形態は、更に、本教示に係る有害生物ＲＮＡをサイレンシングすることができるｄｓＲＮＡ分子を含む植物、植物細胞、及び植物のプロセシング産物に関する。
本発明の一態様によれば、有害生物耐性又は抵抗性植物を作製する方法であって、本発明の幾つかの実施形態の方法に従って植物細胞内で有害生物遺伝子をサイレンシングすることができる長鎖ｄｓＲＮＡ分子を生成することを含む方法が提供される。
本発明の一態様によれば、有害生物耐性又は抵抗性植物を生成する方法であって、
（ａ）本発明の幾つかの実施形態の植物を育種することと；
（ｂ）有害生物遺伝子を抑制することができる長鎖ｄｓＲＮＡ分子を発現し、かつＤＮＡ編集剤を含まない後代植物を選択し、
それによって、有害生物耐性又は抵抗性植物を生成することと、
を含む方法が提供される。
本発明の一態様によれば、繁殖を可能にする条件下で植物又は植物細胞を成長させることを含む、本発明の幾つかの実施形態の植物又は植物細胞を生成する方法が提供される。
一実施形態によれば、育種は、交配又は自殖を含む。
用語「交配」とは、本明細書で使用するとき、雄性植物（又は配偶子）による雌性植物（又は配偶子）の受精を指す。用語「配偶子」とは、配偶体から有糸分裂によって植物で生成され、異性の２つの配偶子が融合して二倍体の接合体を形成する有性生殖に関与する、半数体生殖細胞（卵又は精子）を指す。この用語は、一般的に、花粉（精細胞を含む）及び胚珠（卵細胞を含む）への言及を含む。従って、「交配」とは、一般的に、ある個体の胚珠と別の個体からの花粉との受精を指し、一方、「自殖」とは、ある個体の胚珠と同じ個体からの花粉との受精を指す。交配は、植物の育種において広く用いられており、母親からの１本の染色体と父親からの１本の染色体とが交配して、２つの植物の間でゲノム情報の混合が生じる。これにより、新しい組み合わせの遺伝的に受け継がれる形質が生じる。
上述したように、望ましくない因子、例えば、ＤＮＡ編集剤（例えば、エンドヌクレアーゼ）を含まない植物を得るために、植物を交配してもよい。
本発明の幾つかの実施形態によれば、植物は、非トランスジェニックである。
本発明の幾つかの実施形態によれば、植物は、トランスジェニック植物である。
一実施形態によれば、植物は、遺伝的に改変されていない（ｎｏｎ－ＧＭＯ）。
一実施形態によれば、植物は、遺伝的に改変されている（ＧＭＯ）。
本発明の一態様によれば、本発明の幾つかの実施形態の植物の細胞が提供される。
本発明の一態様によれば、本発明の幾つかの実施形態の植物の種子が提供される。
一実施形態によれば、本方法によって生成された植物は、本方法によって生成されていない植物と比較して（すなわち、野生型の植物と比較して）、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％、有害生物に対してより抵抗性又は耐性が高い。
植物の有害生物に対する耐性又は抵抗性を評価するための当技術分野において公知の任意の方法を、本発明に従って使用することができる。例示的な方法としては、Ｒａｍiｒｅｚ Ｖ１，Ｇａｒｃiａ－Ａｎｄｒａｄｅ Ｊ，Ｖｅｒａ Ｐ．，Ｐｌａｎｔ Ｓｉｇｎａｌ Ｂｅｈａｖ．２０１１ Ｊｕｎ；６（６）：９１１－３．Ｅｐｕｂ ２０１１ Ｊｕｎ １に記載の通り、灰色かび病菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）に対する抵抗性を高めるシロイヌナズナにおけるＭＹＢ４６発現を低下させる；又はＧａｌｌｅｇｏ－Ｇｉｒａｌｄｏ Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｎｅｗ Ｐｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔ（２０１１）１９０：６２７－６３９ ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．１４６９－８１３７．２０１０．０３６２１．ｘ）に記載の通り、植物における防御応答の活性化を促進するアルファルファにおけるＨＣＴをダウンレギュレーションすることが挙げられるが、これらに限定されず、これらはいずれも参照により本明細書に援用される。
更なる実施形態によれば、関心標的遺伝子をサイレンシングすることができる長鎖ｄｓＲＮＡの分子を植物細胞内で生成する方法であって、（ａ）関心標的遺伝子の核酸配列に対して所定の配列相同性を示す植物遺伝子の第１の核酸配列を選択することと；（ｂ）当該第１の植物遺伝子に対するサイレンシング特異性を付与するために、ＲＮＡ分子をコードしている第２の植物の内因性核酸配列を改変し、その結果、当該ＲＮＡ分子からプロセシングされたＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）を動員することができる低分子ＲＮＡが、当該第１の植物遺伝子の転写物と塩基相補を形成して、当該関心標的遺伝子をサイレンシングすることができる長鎖ｄｓＲＮＡ分子を生成することと、を含む方法が提供される。
幾つかの実施形態によれば、第１の核酸配列は、上記方法の使用前にはサイレンシングＲＮＡをコードしていない。幾つかの実施形態によれば、長鎖ｄｓＲＮＡは、上記方法の使用前に第１の核酸配列から天然には生成されない。理論にも機序にも縛られるものではないが、上記方法における第１の核酸配列は、必ずしも天然に長鎖ｄｓＲＮＡ（又は任意のサイレンシングＲＮＡ）を生成するわけではないが、第２の植物内因性核酸配列の改変の結果、アンプリファイアとして作用しかつＲｄＲｐと会合するＲＮＡ分子（例えば、ｍｉＲＮＡ）が生成されて、第１の核酸配列のＲＮＡ転写物から長鎖ｄｓＲＮＡが作製される。従って、事実上、幾つかの実施形態によれば、上記方法は、これまで長鎖ｄｓＲＮＡを生成していなかった遺伝子から長鎖ｄｓＲＮＡを作製することができる。
幾つかの実施形態によれば、関心標的遺伝子は、植物細胞の内因性遺伝子である。他の実施形態によれば、関心標的遺伝子は、植物細胞に対して外因性の遺伝子（例えば、有害生物、例えば無脊椎動物の有害生物の遺伝子）である。
幾つかの実施形態によれば、第２の植物内因性核酸配列によってコードされているＲＮＡ分子は、ｍｉＲＮＡである。
幾つかの実施形態によれば、関心標的遺伝子の核酸配列に対する所定の配列相同性は、それぞれが関心標的遺伝子の配列に対して少なくとも９０％の相同性を有する、それぞれ少なくとも２８ｎｔの少なくとも２つのストレッチの相同性を含む。
幾つかの実施形態によれば、核酸配列を改変することは、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）等であるがこれらに限定されないＤＮＡ編集剤を使用することを含む。幾つかの実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、ＣＲＩＰＳＲエンドヌクレアーゼと、関心核酸配列（例えば、第２の植物内因性核酸の配列）の切断を指示するガイドＲＮＡとを含む。幾つかの実施形態によれば、関心核酸配列を改変することは、ＤＮＡ編集剤（場合によっては、関心核酸の切断を指示するガイドＲＮＡを含む）を使用することを含み、更に、改変される核酸配列と類似しているが、所望のヌクレオチド変化を含む追加の核酸配列を植物細胞に導入することを含む。理論にも機序にも縛られるものではないが、ＤＮＡ編集剤が関心核酸配列を切断し、追加の核酸配列（所望のヌクレオチドの変化を含む）の一部が、相同性依存性組み換え（ＨＤＲ）を介して関心核酸配列に導入される。
本明細書で使用するとき、用語「約」は、±１０％を指す。
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、及びこれらの同根語は、「含むが、これらに限定されない」を意味する。
用語「からなる」とは、「含み、これらに限定される」を意味する。
用語「から本質的になる」とは、追加の成分、工程、及び／又は部品が、請求される組成物、方法、又は構造の基本的かつ新規の特徴を実質的に変化させない場合に限り、組成物、方法、又は構造が追加の成分、工程、及び／又は部品を含んでいてもよいことを意味する。
本明細書で使用するとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上特に明確に指示していない限り、複数の指示対象を含む。例えば、用語「化合物」又は「少なくとも１つの化合物」は、その混合物を含む複数の化合物を含み得る。
この出願全体を通して、本発明の様々な実施形態を範囲形式で提示する場合がある。範囲形式での記載は、単に便宜のため及び簡略化のためのものであり、そして、本発明の範囲に対する確固たる限定であると解釈されるべきではないことを理解すべきである。従って、範囲の記載は、その範囲内の具体的に開示された全ての可能な部分範囲及び個々の数値を含むとみなされるべきである。例えば、１～６等の範囲の記載は、例えば、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６等の具体的に開示された部分範囲、並びに例えば１、２、３、４、５、及び６等のその範囲内の個々の数字を含むとみなされるべきである。これは、範囲の幅に関係なく適用される。
本明細書で数値範囲が指定されている場合は常に、指定範囲内の任意の引用されている数字（分数又は整数）を含むことを意味する。第１の指定の数と第２の指定の数との「間の範囲である」及び第１の指定の数「から」第２の指定の数「までの範囲である」という語句は、本明細書では互換的に使用され、第１及び第２の指定の数とその間の全ての分数及び整数を含むことを意味する。
本明細書で使用するとき、用語「方法」とは、与えられた課題を達成するための作法、手段、技術、及び手順を指し、化学、薬学、生物学、生化学、及び医学の分野の専門家に知られているか、又は既知の作法、手段、技術、及び手順から容易に開発される作法、手段、技術、及び手順を含むが、これらに限定されない。
本明細書で使用するとき、用語「治療する」とは、病態の進行を止める、実質的に阻害する、減速させる、若しくは逆行させる、病態の臨床的若しくは外観的な症状を実質的に寛解させる、又は病態の臨床的若しくは外観的な症状の出現を実質的に防ぐことを含む。
明確にするために、別々の実施形態の文脈で説明される本発明の特定の特徴が、単一の実施形態において組み合わせて提供される場合もあることが理解される。逆に、簡潔にするために単一の実施形態の文脈で説明される本発明の様々な特徴が、別個に、又は任意の好適なサブコンビネーションで、又は本発明の任意の他の説明された実施形態において好適に提供される場合もある。様々な実施形態の文脈で説明される特定の特徴は、その要素なしでは実施形態が機能的に無効になる場合を除いて、その実施形態の必須の特徴であるとはみなされるべきではない。
上に描写し、以下の特許請求の範囲で請求する本発明の様々な実施形態及び態様は、以下の実施例において実験的に裏付けられる。
本願で開示される任意の配列識別番号（配列番号）は、その配列番号がＤＮＡ配列形式又はＲＮＡ配列形式でのみ表現されている場合であっても、その配列番号が言及される文脈に応じて、ＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列のいずれを参照することもできることが理解される。例えば、配列番号１は、ＤＮＡ配列形式で表されているが（例えば、チミンのＴが記載されている）、それは、核酸配列に対応するＤＮＡ配列又はＲＮＡ分子の核酸配列のＲＮＡ配列のいずれを参照することもできる。同様に、一部の配列はＲＮＡ配列形式で表されているが（例えば、ウラシルのＵが記載されている）、記載されている分子の実際の種類に応じて、ｄｓＲＮＡを構成するＲＮＡ分子の配列又は示されているＲＮＡ配列に対応するＤＮＡ分子の配列のいずれを参照することもできる。いずれにしても、任意の置換を有する開示されている配列を有するＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子の両方が想定される。
次に以下の実施例を参照し、上記の説明と合わせて、本発明を非限定的に説明する。
一般に、本明細書で使用される命名法及び本発明で利用される実験手順には、分子、生化学、微生物学、顕微鏡、及び組換えＤＮＡの技術が含まれる。このような技術は、文献において十分に説明されている。例えば、以下を参照されたい：“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＩＩ Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．，ｅｄ．（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ，“Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ”，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｂｉｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ）“Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ”，Ｖｏｌｓ．１－４，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９８）；米国特許第４，６６６，８２８号、同第４，６８３，２０２号、同第４，８０１，５３１号、同第５，１９２，６５９号、及び同第５，２７２，０５７号に記載の方法論；“Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ”，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＩＩ Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＩＩ Ｃｏｌｉｇａｎ Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ），“Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９４）；Ｍｉｓｈｅｌｌ ａｎｄ Ｓｈｉｉｇｉ（ｅｄｓ），“Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）；利用可能なイムノアッセイは、特許及び科学文献において広く説明されており、例えば、以下を参照されたい：米国特許第３，７９１，９３２号、同第３，８３９，１５３号、同第３，８５０，７５２号、同第３，８５０，５７８号、同第３，８５３，９８７号、同第３，８６７，５１７号、同第３，８７９，２６２号、同第３，９０１，６５４号、同第３，９３５，０７４号、同第３，９８４，５３３号、同第３，９９６，３４５号、同第４，０３４，０７４号、同第４，０９８，８７６号、同第４，８７９，２１９号、同第５，０１１，７７１号、及び同第５，２８１，５２１号；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．，ｅｄ．（１９８４）；“Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．，ｅｄｓ．（１９８５）；“Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ”Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．，Ｅｄｓ．（１９８４）；“Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ”Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．，ｅｄ．（１９８６）；“Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ”ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）；“Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．，（１９８４）ａｎｄ “Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌ．１－３１７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；“ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ － Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ”ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；これらは全て、本明細書に完全に記載されているかのように、参照により援用される。他の一般的な参考資料は、この文書全体を通して記載されている。その中の手順は、当技術分野において周知であると考えられ、読者の便宜のために提供されている。そこに含まれる情報は全て、参照することにより本明細書に援用される。
一般的な材料及び実験手順
ＧＥｉＧＳテンプレートを作製するための計算パイプライン
計算ＧＥｉＧＳパイプラインは、生物学的メタデータを適用し、非コードＲＮＡ遺伝子（例えば、ｍｉＲＮＡ遺伝子）を最小限編集して、新たに機能を獲得させる、すなわち、関心配列を標的とするようにそのサイレンシング能力をリダイレクトさせるために使用されるＧＥｉＧＳ ＤＮＡテンプレートを自動生成することを可能にする。
図６に示すように、パイプラインは、ａ）ＧＥｉＧＳによってサイレンシングされる標的配列、ｂ）遺伝子編集され、ＧＥｉＧＳを発現する宿主生物、ｃ）ＧＥｉＧＳを遍在的に発現させるかどうかを選択できる、という入力項目を記入し、送信することから始まる。特定のＧＥｉＧＳの発現が必要な場合、幾つかの選択肢（特定の組織、発生段階、ストレス、熱／寒冷ショック等に特異的な発現）から選択することができる。
必要な入力項目が全て送信されると、計算プロセスは、ｍｉＲＮＡのデータセット（例えば、低分子ＲＮＡシーケンシング、マイクロアレイ等）を検索し、入力条件に一致する関連ｍｉＲＮＡのみをフィルタリングすることを始める。次に、選択した成熟ｍｉＲＮＡの配列を標的配列に対してアラインメントし、相補性レベルの最も高いｍｉＲＮＡをフィルタリングする。次いで、これら天然に標的相補的な成熟ｍｉＲＮＡの配列を、標的の配列と完全に一致するように改変する。次いで、改変された成熟ｍｉＲＮＡ配列を、ｓｉＲＮＡの効力を予測するアルゴリズムにかけ、サイレンシングスコアが最も高い上位２０個をフィルタリングする。次いで、これら最終的な改変されたｍｉＲＮＡ遺伝子を使用して、以下の通り、２００～５００ｎｔのｓｓＤＮＡ又は２５０～５０００ｎｔのｄｓＤＮＡの配列を生成する：
改変されたｍｉＲＮＡに隣接するゲノムＤＮＡ配列に基づいて、２００～５００ｎｔのｓｓＤＮＡオリゴ及び２５０～５０００ｎｔのｄｓＤＮＡ断片を設計する。ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ配列が、オリゴの中央に位置する。改変されたｍｉＲＮＡのガイド鎖（サイレンシング）配列は、標的に対して１００％相補的である。しかし、改変されたパッセンジャーｍｉＲＮＡ鎖の配列は、同じ塩基対合プロファイルを維持するために、元の（改変されていない）ｍｉＲＮＡの構造を保持するように更に改変される。
次に、改変された交換バージョンではなく、改変されていない元のｍｉＲＮＡ遺伝子を特異的に標的とするように、差分（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）ｓｇＲＮＡを設計する。最後に、改変されたｍｉＲＮＡ遺伝子と元のｍｉＲＮＡ遺伝子との間で比較制限酵素部位分析を行い、差分の制限部位をまとめる。
従って、パイプラインの出力は、以下を含む：
ａ）最小限しか改変されていないｍｉＲＮＡを有する２００～５００ｎｔのｓｓＤＮＡオリゴ又は２５０～５０００ｎｔのｄｓＤＮＡ断片配列
ｂ）元のｍｉＲＮＡ遺伝子を特異的に標的とし、改変されたｍｉＲＮＡは標的としない２～３個の差分ｓｇＲＮＡ
ｃ）改変されたｍｉＲＮＡ遺伝子と元のｍｉＲＮＡ遺伝子との間の差分制限酵素部位のリスト。
ＧＥｉＧＳによるｄｓＲＮＡの設計
モデル１（数字は図１中の数字に対応）：
１． 有害生物遺伝子「Ｘ」が標的遺伝子である（サイレンシングされたとき、有害生物が防除される）
２． 有害生物遺伝子「Ｘ」（植物遺伝子「Ｘ」）に対する相同性検索により宿主関連遺伝子Ｘが同定される。幾つかの実施形態によれば、植物遺伝子Ｘは、それぞれが有害生物遺伝子Ｘの配列に対して少なくとも９０％の相同性を有する、少なくとも２８ｎｔの少なくとも２つのストレッチを含む場合、モデル１に従って同定される。
３． 低分子ＲＮＡ（例えば、２２ｎｔのｍｉＲＮＡ）のサイレンシング特異性を宿主関連遺伝子Ｘに向けてリダイレクトするために、植物細胞内でＧＥｉＧＳを行い、それによって、低分子ＲＮＡが植物遺伝子「Ｘ」の転写物についてのＲｄＲｐが媒介する転写のアンプリファイアとして作用するようにする。
４． ＧＥｉＧＳを用いてサイレンシングの特異性がリダイレクトされたアンプリファイア低分子ＲＮＡ（本明細書では「低分子ＧＥｉＧＳＲＮＡ」とも称される）が、ＲｄＲｐ（増幅酵素）と結合したＲＩＳＣ複合体を形成する。
５． ＲｄＲｐが、植物遺伝子「Ｘ」の転写物に対して相補的なアンチセンスＲＮＡ鎖を合成し、長鎖ｄｓＲＮＡを形成する。
６． 次いで、植物細胞内のダイサー（複数可）又は他のヌクレアーゼによって、長鎖ｄｓＲＮＡが少なくとも部分的に二次ｓＲＮＡにプロセシングされる。これら二次ｓＲＮＡのうち、二次ｓＲＮＡの一部のサイレンシング特異性が有害生物遺伝子Ｘに対するものである。
７． また、ｄｓＲＮＡは少なくとも部分的に有害生物に取り込まれ、場合によっては、上述のように有害生物においてｓＲＮＡにプロセシングされる。
８． 場合によっては、植物細胞からの二次ｓＲＮＡも有害生物に取り込まれ、例えば作製された長鎖ｄｓＲＮＡに加えて、標的遺伝子「Ｘ」もサイレンシングする。
モデル２（数字は図２中の数字に対応）：
１． 有害生物遺伝子「Ｘ」が標的遺伝子である（サイレンシングされたとき、有害生物が防除される）
２． 野生型の形態で増幅される（すなわち、長鎖ｄｓＲＮＡを生成する）ことが知られている天然に存在するＲＮＡｉ前駆体のサイレンシング特異性を、有害生物遺伝子「Ｘ」（例えば、ＴＡＳ遺伝子；野生型の形態で長鎖ｄｓＲＮＡに増幅され、ｔａｓｉＲＮＡにプロセシングされる）に向けてリダイレクトするために、植物細胞内でＧＥｉＧＳを行う。この転写物は、図２中「増幅ＧＥｉＧＳ前駆体」とマークされている。幾つかの実施形態によれば、モデル２と共に使用することができるＲＮＡｉ前駆体は、例えば、トランス作用性ｓｉＲＮＡ（ｔａｓｉＲＮＡ）又はフェーズド低分子干渉ＲＮＡ（ｐｈａｓｉＲＮＡ）にプロセシングされる前駆体が挙げられるがこれらに限定されない、長鎖ｄｓＲＮＡを形成し、二次低分子ＲＮＡにプロセシングされるＲＮＡｉ前駆体である。エンドヌクレアーゼ（ＣＡＳ９等）を用いて遺伝子において二本鎖切断を誘導し、相同性依存性組換え（ＨＤＲ）の使用を通して特異性のリダイレクションに必要なヌクレオチド変化を遺伝子に導入するＤＮＡ「ＧＥｉＧＳオリゴヌクレオチド」を提供することによって、ＲＮＡｉ前駆体をコードしている遺伝子に対して遺伝子編集誘導遺伝子サイレンシング（ＧＥｉＧＳ）を行う。このように、使用する「ＧＥｉＧＳオリゴヌクレオチド」に応じて、ＲＮＡｉ前駆体の一部（例えば、ｔＴＡＳ）の特異性は、有害生物遺伝子Ｘを標的とするように変化する。リダイレクトされたＲＮＡｉ前駆体は、細胞のダイサーによって、有害生物遺伝子Ｘにもマッチする二次低分子ＲＮＡ（例えば、ｔａｓｉＲＮＡ）にプロセシングされる。図２に示す例では、ｔａｓｉＲＮＡの１つだけが変化し、その結果、野生型及び変化したｔａｓｉＲＮＡの両方にプロセシングされるＴＡＳが生じる。
３． 野生型のアンプリファイア低分子ＲＮＡは、ＲｄＲｐ（増幅酵素）と結合したＲＩＳＣ複合体を形成する。
４． ＲｄＲｐは、増幅されたＧＥｉＧＳ前駆体の転写物に相補的なアンチセンスＲＮＡ鎖を合成し、長鎖ｄｓＲＮＡを形成する。
５． 増幅されたＧＥｉＧＳ ｄｓＲＮＡは、ダイサー（複数可）又は他のヌクレアーゼによって、植物細胞内で少なくとも部分的に二次ｓＲＮＡにプロセシングされる。これら二次ｓＲＮＡのうち、ＧＥｉＧＳが行われた箇所に対応する二次低分子ＲＮＡのサイレンシング特異性は、有害生物遺伝子Ｘに対するものである。
６． プロセシングされないＧＥｉＧＳ長鎖ｄｓＲＮＡの少なくとも一部が有害生物に取り込まれ、場合によっては、上述のように有害生物において低分子ＲＮＡにプロセシングされる。
７． 場合によっては、植物細胞内で以前に作製されていた二次ｓＲＮＡ（例えば、ＴＡＳ前駆体の場合はｔａｓｉＲＮＡ）も同様に有害生物に取り込まれ、標的遺伝子「Ｘ」をサイレンシングする。
以下の表１Ａ及び１Ｂは、本方法、特にモデル１が標的とすることができる例示的な有害生物遺伝子を提供する。以下の表２は、本方法、特にモデル２が標的とすることができる例示的な有害生物遺伝子を提供する。また、表２は、ＴＡＳ ＲＮＡ前駆体等の、ＧＥｉＧＳが標的とする、提案されたＲＮＡｉ前駆体（「バックボーン」と表記）も提供する。表２は、ＧＥｉＧＳを用いて提案されたバックボーンに導入可能であり、それにより、有害生物においてバックボーンがこれらｓｉＲＮＡにプロセシングされるようになり、標的遺伝子がサイレンシングされる、提案された低分子干渉ＲＮＡ（「所望のｓｉＲＮＡ」と表記）を示す。
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Figure 2022524864000007
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Figure 2022524864000012
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シロイヌナズナ及びトマトのボンバードメント及び植物再生
シロイヌナズナの根の調製
塩素ガスで滅菌したシロイヌナズナ（ｃｖ．Ｃｏｌ－０）の種子をＭＳマイナススクロースプレートに播種し、４℃において暗所で３日間春化処理した後、恒明下において２５℃で垂直に発芽させた。２週間後、根を１ｃｍの根の断片に切り取り、カルス誘導培地（ＣＩＭ：Ｂ５ビタミンを含む１／２ＭＳ、２％グルコース、ｐＨ５．７、０．８％寒天、２ｍｇ／Ｌ ＩＡＡ、０．５ｍｇ／Ｌ ２，４－Ｄ、０．０５ｍｇ／Ｌカイネチン）プレート上に置いた。２５℃において暗所で６日間インキュベートした後、根の断片を濾紙ディスクに移し、ボンバードメントの準備において、ＣＩＭＭプレート（ビタミンを含まない１／２ＭＳ、２％グルコース、０．４Ｍマンニトール、ｐＨ５．７、及び０．８％寒天）上に４～６時間置いた。
トマトの外植片調製：
トマト種子を、市販の漂白剤で２０分間表面殺菌した後、無菌条件下において滅菌水で３回洗浄する。種子を発芽培地（ＭＳ＋ビタミン、０．６％アガロース、ｐＨ＝５．８）上で培養し、１６／８時間の明暗サイクルで２５℃に置いておく。
８日齢のトマト植物から子葉を約１ｃｍ２に切り取り、ボンバードメント前培養物（ＭＳ＋ビタミン、３％スクロース、０．６％アガロース、ｐＨ＝５．８、１ｍｇ／Ｌ ＢＡＰ、０．２ｍｇ／Ｌ ＩＡＡ）上に２５℃において暗所で２日間置く。次いで、標的プレート（ＭＳ＋ビタミン、３％マンニトール、０．６％アガロース、ｐＨ＝５．８を含有）の中央に４時間かけて移す。
ボンバードメント
ＰＤＳ－１０００／Ｈｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ；ＰＤＳ－１０００／Ｈｅ Ｓｙｓｔｅｍ ＃１６５２２５７）を介してプラスミドコンストラクトを根の組織に導入するが、この手順を実行するためには、以下に概説する幾つかの予備段階が必要である。
金ストックの調製
０．６μｍの金（Ｂｉｏ－Ｒａｄ；Ｃａｔ：１６５２２６２）４０ｍｇを１００％エタノール１ｍＬと混合し、パルス遠心分離してペレット化し、エタノールを除去する。この洗浄手順を更に２回繰り返す。
洗浄後、ペレットを１ｍＬの滅菌蒸留水に再懸濁させ、５０μＬのアリコート作業量で１．５ｍＬチューブに分注する。
ビーズの調製
簡潔に述べると、以下の通り実施する：
典型的には、２枚のプレートのシロイヌナズナの根に衝撃を与えるには１本のチューブの金で十分であるので（プレート１枚あたり２ショット）、各チューブを４枚の（１，１００ｐｓｉ）Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ Ｒｕｐｔｕｒｅディスク（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）に分配する。
同一サンプルの複数枚のプレートを必要とするボンバードメントでは、サンプルの一貫性を維持し、全体的な調製を最小限にするために、チューブを合わせ、ＤＮＡ及びＣａＣｌ２／スペルミジン混合物の体積を適宜調整する。
以下のプロトコールは、金のチューブ１本を調製するプロセスを要約したものであり、これらは、使用する金のチューブの数に応じて調整しなければならない。
この後のプロセスは全て、エッペンドルフ製のサーモミキサーにおいて４℃で行う。
プラスミドＤＮＡサンプルを調製し、１１μｇのＤＮＡを含む各チューブに１０００ｎｇ／μＬの濃度で添加する。
１）４９３μＬのｄｄＨ２Ｏを１アリコート（７μＬ）のスペルミジン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）に添加し、最終濃度を０．１Ｍスペルミジンとする。１２５０μＬの２．５Ｍ ＣａＣｌ２をスペルミジン混合物に添加し、ボルテックスし、氷上に置く。
２）予め調製しておいた金のチューブをサーモミキサーに入れ、１４００ｒｐｍの速度で回転させる。
３）１１μＬのＤＮＡをチューブに添加し、ボルテックスし、回転しているサーモミキサーに戻す。
４）ＤＮＡ／金粒子を結合させるために、７０μＬのスペルミジンＣａＣｌ２混合物を（サーモミキサー内の）各チューブに添加する。
５）チューブを１５～３０秒間激しくボルテックスし、約７０～８０秒間氷上に置く。
６）混合物を７０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清を除去し、氷上に置く。
７）５００μＬの１００％エタノールを各チューブに添加し、ピペッティングによってペレットを再懸濁させ、ボルテックスする。
８）チューブを７０００ｒｐｍで１分間遠心分離する。
９）上清を除去し、ペレットを５０μＬの１００％エタノールに再懸濁させ、氷上で保存する。
マクロキャリアの調製
以下は、層流キャビネット内で行う：
１）マクロキャリア（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）、ストッピングスクリーン（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）、及びマクロキャリアディスクホルダーを滅菌し、乾燥させる。
２）マクロキャリアを、マクロキャリアディスクホルダーに平らに入れる。
３）ＤＮＡでコーティングした金の混合物をボルテックスし、各Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ Ｒｕｐｔｕｒｅディスクの中央に広げる（５μＬ）。
エタノールを蒸発させる。
ＰＤＳ－１０００（ヘリウム粒子送達系）
簡潔に述べると、以下を実施する：
ヘリウムボトルの制御弁を、少なくとも１３００ｐｓｉの入力圧力に調整する。ｖａｃ／ｖｅｎｔ／ｈｏｌｄスイッチを押し、ｆｉｒｅスイッチを３秒間押し続けることによって、真空を作り出す。これにより、ヘリウムが配管内に確実に流れ出るようになった。
１１００ｐｓｉのラプチャーディスクをイソプロパノールに入れ、混合して、静電気を除去する。
１）ラプチャーディスク１枚をディスク保持キャップに入れる。
２）マイクロキャリアローンチアセンブリを構築する（ストッピングスクリーン及び金を含有するマイクロキャリアを用いて）。
３）ペトリ皿のシロイヌナズナの根のカルスをローンチアセンブリの６ｃｍ下方に置く。
４）真空圧を２７インチＨｇ（水銀）に設定し、ヘリウム弁を開く（約１１００ｐｓｉ）。
５）真空を解除し、マイクロキャリアローンチアセンブリ及びラプチャーディスク保持キャップを取り外す。
６）同じ組織に対してボンバードメントを行う（すなわち、各プレートに２回ボンバードメントを行う）。
７）その後、ボンバーメントされた根を、２５℃において暗所で更に２４時間ＣＩＭプレート上に置く。
同時ボンバードメント
ＧＥｉＧＳプラスミドの組み合わせをボンバードメントする場合、５μｇ（１０００ｎｇ／μＬ）のｓｇＲＮＡプラスミドを８．５μｇ（１０００ｎｇ／μＬ）の交換プラスミド（例えば、ＤＯＮＯＲ）と混合し、この混合物１１μＬをサンプルに添加する。より多くのＧＥｉＧＳプラスミドを同時にボンバードメントする場合は、使用するｓｇＲＮＡプラスミドの交換プラスミド（例えば、ＤＯＮＯＲ）に対する濃度比を１：１．７とし、この混合物１１μｇ（１０００ｎｇ／μＬ）をサンプルに添加する。ＧＥｉＧＳ交換に関連しないプラスミドと同時ボンバードメントする場合は、等比で混合し、その混合物のうちの１１μｇ（１０００ｎｇ／μＬ）を各サンプルに添加する。
Ｃｏｌ－０プロトプラストのトランスフェクション
シロイヌナズナ（Ｃｏｌ－０）のプロトプラストに、Ｃｒｉｓｐｒ／Ｃａｓ９をコードしているベクター及びＨＤＲが媒介する交換を実現するためのドナーテンプレートをトランスフェクトした。Ｔａｓ１ｂ（ＡｔＴＡＳ１ｂ＿ＡＴ１Ｇ５００５５）又はＴａｓ３ａ（ＡｔＴＡＳ３ａ＿ＡＴ３Ｇ１７１８５）遺伝子の配列を交換して、上記線形動物の標的遺伝子における３０ｂｐの配列を標的とするｓＲＮＡを作製するように、実験を設計した。理論にも機序にも縛られるものではないが、線形動物における３０ｂｐの配列を標的とする長鎖ｄｓＲＮＡの作製の理論的根拠は、線形動物で形成される二次サイレンシングＲＮＡの長さが植物で形成される長さと異なっていたとしても、ｄｓＲＮＡが線形動物において二次サイレンシングＲＮＡにプロセシングされる際に、機能性サイレンシングＲＮＡ分子を確実に生成することである。
ＴＡＳ１ｂ遺伝子座において２つの交換を、そして、ＴＡＳ３ａ遺伝子座において２つの交換を設計した。交換は、お互いに独立している。ＤＯＮＯＲテンプレート（１ｋｂ）をプラスミドに合成した（Ｔｗｉｓｔ，ＵＳＡによって合成）。
プロトプラスト濃度は血球計を用いて、生存率はトリパンブルー（およそ３０μＬのプロトプラスト、６５μＬのｍｍｇ、５μＬのトリパンブルー）を用いて求めた。プロトプラストを希釈又は濃縮して、プロトプラストの最終密度を２×１０６細胞／ｍＬにした。
ＰＥＧトランスフェクションでは、ｓｇＲＮＡベクター（Ｃｒｉｓｐｒ／Ｃａｓ９、ｓｇＲＮＡ、ｍＣＨＥＲＲＹ）：ＤＯＮＯＲベクターのモル比は１：２０であり、これは、トランスポゾン１回あたりｓｇＲＮＡベクター３．９μｇ及びＤＯＮＯＲベクター約２１．６１μｇとなる。１ｍＬのプロトプラストに、１ｍＬのＰＥＧ溶液をゆっくりと添加した。ＰＥＧ溶液を新しくした（５ｍＬあたり２ｇのＰＥＧ ４０００（Ｓｉｇｍａ）、０．２Ｍマンニトール、０．５ｍＬの１Ｍ ＣａＣｌ２）。チューブを室温において暗所で２０分間インキュベートし、次いで、４ｍＬのＷ５を添加し、チューブを反転させることによって混合した。次いで、プロトプラストを遠心分離したペレットを５ｍＬのＰＣＡ（プロトプラスト再生培地）に再懸濁させて、細胞を分裂させ、ＨＤＲを実現した。
細胞分析
プラスミド送達の２４～７２時間後に細胞を回収し、Ｄ－ＰＢＳ培地に再懸濁させる。溶液の半分をルシフェラーゼ活性の分析に用い、もう半分を低分子ＲＮＡシーケンシングについて分析する。製造業者の指示書に従ってＤｕａｌ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）を用いて、二重ルシフェラーゼアッセイの分析を実施する。製造業者の指示書に従ってＴｏｔａｌ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｎｏｒｇｅｎｅ Ｂｉｏｔｅｋ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｎａｄａ）を用いて、全ＲＮＡを抽出する。これらサンプル中の所望の成熟低分子ＲＮＡを同定するために、低分子ＲＮＡシーケンシングを行う。
シロイヌナズナ植物の再生
シュートの再生には、Ｖａｌｖｅｋｅｎｓら［Ｖａｌｖｅｋｅｎｓ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ（１９８８）８５（１５）：５５３６－５５４０］のプロトコールの修正版を実行する。ボンバードメントした根を、ビタミンＢ５を含む１／２ＭＳ、２％グルコース、ｐＨ５．７、０．８％寒天、５ｍｇ／Ｌ ２ｉＰ、０．１５ｍｇ／Ｌ ＩＡＡを含むシュート誘導培地（ＳＩＭ）プレート上に置く。２５℃で１６時間明－２３℃で８時間暗のサイクルでプレートを放置する。１０日後、プレートを３％スクロース、０．８％寒天を含むＭＳプレートに１週間移し、次いで、新たな同様のプレートに移す。植物が再生したら、根から切り離し、分析するまで、３％スクロース、０．８％寒天を含むＭＳプレート上に置く。
トマトのボンバードメント後培養及び植物の再生
ボンバードメントされた外植片を、ＭＳ培地（ＭＳ＋ビタミン、３％スクロース、０．４％寒天ゲル、ｐＨ＝５．８、１ｍｇ／Ｌ ＢＡＰ、０．２ｍｇ／Ｌ ＩＡＡ）上に２５℃で暗所に２日間置く。外植片を１６／８明暗サイクルに移し、２週間ごとに継代する。再生しているシュートを根誘導培地（ＭＳ＋ビタミン、３％スクロース、２．２５％ゲルライト、ｐＨ＝５．８、２ｍｇ／Ｌ ＩＢＡ）に移す。
発根している植物を水で洗浄して、寒天の残りを全て取り除き、土壌に入れて覆う。１週間の順化の後、徐々に蓋を外して、植物をハードニングする。
ジェノタイピング
組織サンプルを処理し、Ｐｈｉｒｅ Ｐｌａｎｔ Ｄｉｒｅｃｔ ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて製造業者の推奨に従ってアンプリコンを増幅する。これら増幅に使用されるオリゴは、ＤＮＡの組み込みと区別するために、ＧＥｉＧＳシステムの改変配列における領域からＨＤＲテンプレートとして使用される領域の外側まで及ぶゲノム領域を増幅するように設計される。改変された遺伝子座における異なる改変は、特別に選択された制限酵素によって与えられるアンプリコンの異なる消化パターンを通して同定される。
ゲノムＰＣＲ反応
細胞サンプル（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、以下の実施例３で論じる）を、製造者の指示書に従ってＲＮＡ／ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｎｏｒｇｅｎ）を用いてゲノムＤＮＡ用に処理した。サンプルをＱｕｂｉｔによって定量し、ＤＮＡを－２０℃で保存した。
Ｔａｓ１ｂ（ＡｔＴＡＳ１ｂ＿ＡＴ１Ｇ５００５５）及びＴａｓ３ａ（ＡｔＴＡＳ３ａ＿ＡＴ３Ｇ１７１８５）の配列には、交換領域に隣接する非特異的なプライマーを用いた。陰性対照として、野生型（ＷＴ）のＤＮＡをテンプレートとして用いて同じ交換特異的反応を実施した。陽性ＰＣＲ対照として、ＷＴ ＤＮＡについての特異的ＰＣＲを全てのサンプルに対して実施した。ＰＣＲ増幅にはＱ５（登録商標）Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２Ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを使用した。
５μＬの各ＰＣＲ反応物を０．８％アガロースゲルで泳動した。分子量マーカー（ＭＷ）：１ｋｂ Ｐｌｕｓ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ（ＮＥＢ）と比較してバンドサイズを推定した。
交換を確認するために、ネステッドＰＣＲ反応を実施した。最初のゲノムＰＣＲは、ＨＤＲ領域に隣接する非特異的なフォワードプライマー及びリバースプライマーを含んでいた。ＰＣＲ産物をｍｉｌｉ－ｑ超純水で１／１００希釈し、次いで、前述の特異的交換ＰＣＲを実施した。ネステッドアプローチにおいて最初のＰＣＲに使用した非特異的プライマーは、ネステッドプライマーのアニーリング部位に隣接するアニーリング部位を有する。
使用したプライマー：
Ｔａｓ１ｂについての非特異的プライマー：
－ Ｔａｓ１ｂ＿ＷＴ＿Ｎｅｓｔｅｄ＿Ｎｏｎ＿Ｓｐｅｃｉｆｉｃ＿ＤＮＡ＿Ｒ：５’－ａｃｃａａｔｔｔｇａｃｃｃａａａａａｇｇｃ－３’（配列番号６３）
Ｔａｓ１ｂについての交換特異的プライマー：
－ Ｔａｓ１ｂ＿Ｓｐｌｉｃｉｎｇ３０＿Ｎｅｓｔｅｄ＿ＤＮＡ＿Ｆ：５’－ＧＣＡＧＣＡＧＡＴＣＡＡＴＧＡＡＡＴＴＣＡＡＣＧ－３’（配列番号６４）
－ Ｔａｓ１ｂ＿Ｙ２５３０＿Ｎｅｓｔｅｄ＿ＤＮＡ＿Ｆ：５’－ａｇＣＣＧＣＴＣＴＧＴＧＧＡＴＴＣＴＴＧ－３’（配列番号６５）
Ｔａｓ３ａについての非特異的プライマー：
－ Ｔａｓ３ａ＿ＷＴ＿Ｎｅｓｔｅｄ＿Ｎｏｎ＿Ｓｐｅｃｉｆｉｃ＿ＤＮＡ＿Ｒ： ５’－ａａａｃｔｃｃｔｃｇｃｃｔｃｔｔｇｇｔｇ－３’（配列番号６６）
Ｔａｓ３ａについての交換特異的プライマー：
－ Ｔａｓ３ａ＿Ｒｉｂｏ３ａ３０＿Ｎｅｓｔｅｄ＿ＤＮＡ＿Ｆ：５’－ＴＣＴＴＣＡＧＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＴＴＡＣＧ－３’（配列番号６７）
－ Ｔａｓ３ａ＿Ｓｐｌｉｃｅｏ３０＿Ｎｅｓｔｅｄ＿ＤＮＡ＿Ｆ：５’－ＴＣＣＴＴＴＴＴＧＡＣＣＡＡＣＡＴＴＴＧＴＴＴＧＴ－３’（配列番号６８）
陽性対照反応
ＷＴ Ｔａｓ１ｂ特異的：
－ Ｔａｓ１ｂ＿ＷＴ＿Ｎｅｓｔｅｄ＿Ｎｏｎ＿Ｓｐｅｃｉｆｉｃ＿ＤＮＡ＿Ｒ：５’－ａｃｃａａｔｔｔｇａｃｃｃａａａａａｇｇｃ－３’（配列番号６９）
－ Ｔａｓ１ｂ＿ＷＴ＿Ｎｅｓｔｅｄ＿ＤＮＡ＿Ｆ：５’－ｔｇｇａｃｔｔａｇａａｔａｔｇｃｔａｔｇｔｔｇｇａｃ－３’（配列番号７０）
ＷＴ Ｔａｓ３ａ特異的：
－ Ｔａｓ３ａ＿ＷＴ＿Ｎｅｓｔｅｄ＿Ｎｏｎ＿Ｓｐｅｃｉｆｉｃ＿ＤＮＡ＿Ｒ ５’－ａａａｃｔｃｃｔｃｇｃｃｔｃｔｔｇｇｔｇ－３’（配列番号７１）
－ Ｔａｓ３ａ＿ＷＴ＿Ｎｅｓｔｅｄ＿ＤＮＡ＿Ｆ ５’－ｔｃｔａｔｃｔｃｔａｃｃｔｃｔａａｔｔｃｇｔｔｃｇａｇ－３’（配列番号７２）
ＤＮＡ及びＲＮＡの単離
サンプルを液体窒素に収集し、加工するまで－８０℃で保存する。ドライアイスに入れたチューブの中で、プラスチック製のＴｉｓｓｕｅ Ｇｒｉｎｄｅｒ Ｐｅｓｔｌｅｓ（Ａｘｙｇｅｎ，ＵＳ）を使用して、組織を粉砕する。ＲＮＡ／ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｎｏｒｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｋ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｎａｄａ）を使用して、製造業者の指示書に従って、粉砕した組織からＤＮＡ及び全ＲＮＡを単離する。ＲＮＡ画分の２６０／２３０比が低い（＜１．６）場合、単離したＲＮＡを、１μＬのグリコーゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳ）１０％Ｖ／Ｖ酢酸ナトリウム、３Ｍ ｐＨ５．５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳ）、及び３倍の体積のエタノールを用いて－２０℃で一晩かけて沈殿させる。この溶液を４℃で３０分間、最高速度で遠心分離する。続いて、これを７０％エタノールで２回洗浄し、１５分間風乾し、Ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳ）に再懸濁させる。
ＲＮＡの抽出
細胞サンプル（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、以下の実施例３で論じる）を、製造者の指示書に従ってＲＮＡ／ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｎｏｒｇｅｎ）を用いてＲＮＡ精製のために処理した。サンプルをＱｕｂｉｔによって定量した。ＲＮＡを－８０℃で保存した。
ＲＮＡサンプルのＤＮＡｓｅ処理
線形動物の標的遺伝子を標的とすることができるｄｓＲＮＡのバイオジェネシスを証明するために、ＲＴ－ＰＣＲ反応に続いてＰＣＲを使用して、交換を含む低分子ｄｓＲＮＡ断片（＜２００ｂｐ）を特異的に探した。そうするために、製造業者の指示書に従ってＴｕｒｂｏ ＤＮＡ－Ｆｒｅｅ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。更にＤＮＡｓｅ処理を行い、サンプルの濃度を正規化した。
逆転写（ＲＴ）及び定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）
１マイクログラムの単離された全ＲＮＡを、製造業者のマニュアルに従ってＤＮａｓｅ Ｉで処理する（ＡＭＰＤ１；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳ）。Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳ）の指導者のマニュアルに従って、サンプルを逆転写する。
遺伝子発現については、製造業者のプロトコールに従って、ＣＦＸ９６ Ｔｏｕｃｈ（商標）Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ，ＵＳ）及びＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ ＪｕｍｐＳｔａｒｔ（商標）Ｔａｑ ＲｅａｄｙＭｉｘ（商標）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳ）において、定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）分析を行い、Ｂｉｏ－ＲａｄＣＦＸマネージャープログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ ３．１）で分析する。
Ｃｏｌ－０細胞におけるＴａｓ１ｂ及びＴａｓ３ａの交換についての発現解析のためのＲＮＡサンプルのＲＴ－ＰＣＲ
ＲＴ－ＰＣＲについては、ｑＳｃｒｉｐｔ Ｆｌｅｘ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｑｕａｎｔａ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）によって、Ｔａｓ１ｂ及びＴａｓ３ａの非特異的プライマーを用いてｃＤＮＡを生成した。あるｃＤＮＡ反応は、Ｔａｓ１ｂ及びＴａｓ３ａのそれぞれのセンス鎖について行い、別の反応はアンチセンス鎖について行った。処理するサンプルは、１６５ｎｇ／μＬのＲＮＡを含んでいた。
全てのＲＴ－ＰＣＲ反応に、逆転写酵素を含まない陰性対照（－ＲＴ対照）を使用した（逆転写酵素の代わりにＨ２Ｏを使用したことを除いて同じ処理）。これは、下流のＰＣＲ反応でＤＮＡの持ち越しによる増幅が起こっていないことを確認するためであった。各ＰＣＲ反応について、水の陰性対照を行った。各処理について＋ＲＴ／－ＲＴのためにＲＮＡを用いてマスターミックスを作製した。全てのサンプルについて、（ｉ）逆転写酵素及びバッファ（＋ＲＴ）並びに（ｉｉ）水及びバッファ（－ＲＴ）を用いて追加のマスターミックスを作製した。最終的なプライマー濃度：１μＭ
プライマー：
Ｔａｓ１ｂ
－ Ｔａｓ１ｂセンス：
Ｔａｓ１ｂ＿ＲＴ＿Ａ＿Ｒ：５’－ＴＡＡＣＡＴＡＡＡＡＡＴＡＴＴＡＣＡＡＡＴＡＴＣＡＴＴＣＣＧ－３’（配列番号９３）
－ Ｔａｓ１ｂアンチセンス：
Ｔａｓ１ｂ＿ＲＴ＿Ｂ＿Ｆ：５’－ＴＣＡＧＡＧＴＡＧＴＴＡＴＧＡＴＴＧＡＴＡＧＧＡＴＧＧ－３’（配列番号９４）
これらプライマーは、処理Ａ、Ｂ、及びＥに使用した。
Ｔａｓ３ａ
－ Ｔａｓ３ａセンス：
Ｔａｓ３ａ＿ＲＴ＿Ａ＿Ｒ：５’－ＧＣＴＣＡＧＧＡＧＧＧＡＴＡＧＡＣＡＡＧＧ－３’（配列番号９５）
－ Ｔａｓ３ａアンチセンス：
Ｔａｓ３ａ＿ＲＴ＿Ｂ＿Ｆ：５’－ＣＴＣＧＴＴＴＴＡＣＡＧＡＴＴＣＴＡＴＴＣＴＡＴＣＴＣ－３’（配列番号９６）
これらプライマーは、処理Ｃ、Ｄ、及びＥに使用した。
線形動物標的に向けてリダイレクトされたＴａｓ１ｂ及びＴａｓ３ａの発現を検出するためのｃＤＮＡに対するＰＣＲ
線形動物遺伝子を標的とするようにリダイレクトされたＴａｓ１ｂ又はＴａｓ３ａ遺伝子から転写されたｄｓＲＮＡを検出するために、Ｔａｓ３ａ又はＴａｓ１ｂについてのある非特異的プライマーと、交換特異的な（すなわち、ＧＥｉＧＳが媒介するリダイレクション後にヌクレオチドが交換された関連Ｔａｓ配列のみに結合する）別のプライマーとを用いて、ｃＤＮＡをテンプレートとして用いてＰＣＲ反応を行った。非特異的プライマーのアニーリング部位は、ｃＤＮＡの作製に使用した配列のやや下流に位置していた。特異的プライマーのアニーリング部位は、非特異的プライマーのアニーリング部位から２００ｂｐ未満下流に位置していた。ｄｓＲＮＡの両鎖：センス及びアンチセンスの発現の分析について、アプローチは同じであった。また、ＤＮＡｓｅ処理後のサンプルに残ったＤＮＡから増幅が起こらなかったことを確認するために、－ＲＴ ｃＤＮＡ反応についても反応を行った。陰性対照として、増幅が交換特異的であることを証明するために、各反応をＷＴのＤＮＡに対しても実施した。各ＰＣＲ反応に、Ｈ２Ｏ陰性対照を含めた。各ｃＤＮＡ ＰＣＲ反応物５μＬをテンプレートとして使用した。
プライマー：
Ｔａｓ３ａセンス鎖特異的反応：
－ リボソームタンパク質３ａ特異的：
Ｔａｓ３ａ＿ＲＮＡ＿Ｎｏｎ＿Ｓｐｅｃｉｆｉｃ＿Ａ＿Ｆ：５’－ＴＧＡＣＣＴＴＧＴＡＡＧＡＣＣＣＣＡＴＣＴＣ－３’（配列番号９７）
Ｔａｓ３ａ＿ＲＮＡ＿Ｒｉｂｏ３ａ３０＿Ｓｐｅｃｉｆｉｃ＿Ａ＿Ｒ：５’－ＡｇｇａｇａａａＡＴＴＣＧＴＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧ－３’（配列番号９８）
－ ＷＴ特異的：
Ｔａｓ３ａ＿ＲＮＡ＿Ｎｏｎ＿Ｓｐｅｃｉｆｉｃ＿Ａ＿Ｆ：５’－ＴＧＡＣＣＴＴＧＴＡＡＧＡＣＣＣＣＡＴＣＴＣ－３’（配列番号９９）
Ｔａｓ３ａ＿ＲＮＡ＿ＷＴ＿Ｓｐｅｃｉｆｉｃ＿Ａ＿Ｒ：５’－ＧＧＴＡＧＧＡＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＣＧＡＡＣＧ－３’（配列番号１００）
Ｔａｓ３ａアンチセンス鎖特異的反応：
－ リボソームタンパク質３ａ特異的：
Ｔａｓ３ａ＿ＲＮＡ＿Ｎｏｎ＿Ｓｐｅｃｉｆｉｃ＿Ｂ＿Ｒ：５’－ＣＡＡＣＣＡＴＡＣＡＴＣＡＡＴＡＡＣＡＡＡＣＡＡＡＡＧ－３’（配列番号１０１）
Ｔａｓ３ａ＿ＲＮＡ＿Ｒｉｂｏ３ａ３０＿Ｓｐｅｃｉｆｉｃ＿Ｂ＿Ｆ：５’－ＡＴＡＴＡＧＡＡＴＡＧＡＴａｔＣＧＧＣＴＴＣＴＴＣＡＧ－３’（配列番号１０２）
－ ＷＴ特異的：
Ｔａｓ３ａ＿ＲＮＡ＿Ｎｏｎ＿Ｓｐｅｃｉｆｉｃ＿Ｂ＿Ｒ：５’－ＣＡＡＣＣＡＴＡＣＡＴＣＡＡＴＡＡＣＡＡＡＣＡＡＡＡＧ－３’（配列番号１０３）
Ｔａｓ３ａ＿ＲＮＡ＿Ｓｐｌｉｃｅｏ３０＿Ｓｐｅｃｉｆｉｃ＿Ｂ＿Ｆ：５’－ＴＣＣＴＴＴＴＴＧＡＣＣＡＡＣＡＴＴＴＧＴＴＴＧＴ－３’（配列番号１０４）
Ｔａｓ１ｂセンス鎖特異的反応：
－ Ｙ２５、ＣＯＰＩ複合体のβサブユニット特異的：
Ｔａｓ１ｂ＿ＲＮＡ＿Ｎｏｎ＿Ｓｐｅｃｉｆｉｃ＿Ａ＿Ｆ：５’－ＧＡＧＴＣＡＴＴＣＡＴＣＧＧＴＡＴＣＴＡＡＣＣ－３’（配列番号１０５）
Ｔａｓ１ｂ＿ＲＮＡ＿Ｙ２５３０＿Ｓｐｅｃｉｆｉｃ＿Ａ＿Ｒ：５’－ａｇＣＣＧＣＴＣＴＧＴＧＧＡＴＴＣＴＴＧ－３’（配列番号１０６）
－ ＷＴ特異的：
Ｔａｓ１ｂ＿ＲＮＡ＿Ｎｏｎ＿Ｓｐｅｃｉｆｉｃ＿Ａ＿Ｆ：５’－ＧＡＧＴＣＡＴＴＣＡＴＣＧＧＴＡＴＣＴＡＡＣＣ－３’（配列番号１０７）
Ｔａｓ１ｂ＿ＲＮＡ＿ＷＴ＿Ｓｐｅｃｉｆｉｃ＿Ａ＿Ｒ：５’－ＴＧＧＡＣＴＴＡＧＡＡＴＡＴＧＣＴＡＴＧＴＴＧＧＡＣ－３’（配列番号１０８）
Ｔａｓ１ｂアンチセンス鎖特異的反応：
－ Ｙ２５、ＣＯＰＩ複合体のβサブユニット特異的：
Ｔａｓ１ｂ＿ＲＮＡ＿Ｎｏｎ＿Ｓｐｅｃｉｆｉｃ＿Ｂ＿Ｒ：５’－ＧＣＡＴＡＴＣＣＴＡＡＡＡＴＡＴＧＴＴＴＣＧＴＴＡＡＣ－３’（配列番号１０９）
Ｔａｓ１ｂ＿ＲＮＡ＿Ｙ２５３０＿Ｓｐｅｃｉｆｉｃ＿Ｂ＿Ｆ：５’－ＴＣＧＣＣＡＡＧＡＡＴＣＣＡＣＡＧＡＧＣ－３’（配列番号１１０）
－ ＷＴ特異的：
Ｔａｓ１ｂ＿ＲＮＡ＿Ｎｏｎ＿Ｓｐｅｃｉｆｉｃ＿Ｂ＿Ｒ：５’－ＧＣＡＴＡＴＣＣＴＡＡＡＡＴＡＴＧＴＴＴＣＧＴＴＡＡＣ－３’（配列番号１１１）
Ｔａｓ１ｂ＿ＲＮＡ＿ＷＴ＿Ｓｐｅｃｉｆｉｃ＿Ｂ＿Ｆ：５’－ＴＡＡＧＴＣＣＡＡＣＡＴＡＧＣＡＴＡＴＴＣＴＡＡＧＴＣ－３’（配列番号１１２）
ＴｕＭＶに対するベンサミアナタバコにおける長鎖ｄｓＲＮＡのサイレンシング活性の研究
植物材料
ベンサミアナタバコを、２１℃の長日条件（１６時間明、８時間暗）で処理するまで４週間、土壌で成長させた。
ＴｕＭＶ－ＧＦＰベクターのクローニング
ＴｕＭＶ－ＧＦＰ ｃＤＮＡカセットを、Ｔｏｕｒｉnｏ，Ａ．ら（Ｔｏｕｒｉnｏ，Ａ．，Ｓaｎｃｈｅｚ，Ｆ．，Ｆｅｒｅｒｅｓ，Ａ．ａｎｄ Ｐｏｎｚ，Ｆ．（２００８）．Ｈｉｇｈ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｆｏｒｅｉｇｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ａ ｂｉｏｓａｆｅ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ Ｔｕｒｎｉｐ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ．Ｓｐａｎｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６（Ｓ１），ｐ．４８）に記載のベクターから増幅させた。プライマーセット５’－ＡＴＧＴＴＴＧＡＡＣＧＡＴＣＧＧＧＣＣＣａａｇｇｇａｃｇａａｇｔｇａｔｃｃｇ－３’（配列番号１１３）及び５’－ＣＴＣＣＡＣＣＡＴＧＴＴＣＣＣＧＧＧｇｇｃａｃａｇｔｇｔｔｃａａｃｃｃｃ－３’（配列番号１１４）を用いて増幅を行った。このアンプリコンを、製造業者のプロトコールに従って、インフュージョン反応を通してＴ－ＤＮＡ領域にＮＰＴＩＩ耐性遺伝子を保有するバイナリーベクターにクローニングした。その後、アグロバクテリウムの浸透を目的として、ベクターをアグロバクテリウム株ＧＶ３１０１に形質転換した。
アグロインダクション及び葉の浸透
１． アグロバクテリウムの液体培養は、ＬＢ中で成長させた。
２． 細胞をスピンダウンし、ＭＭＡ培地（１０ｍＭ ＭＥＳ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、及び２００μＭ アセトシリンゴン、ｐＨ＝５．６）で１回洗浄した。
３． 細胞をスピンダウンし、上清を廃棄した。ペレットをＭＭＡ培地にＯＤ６００＝０．５になるように再懸濁させた。
４． 培養液を暗所で６時間穏やかに振盪した。
５． 必要に応じて培養物を合わせた（異なるベクターを含有する細菌間で１：１の比、各アグロバクテリウムは単一の遺伝子を発現するベクターを含有する）。最終的なアグロバクテリウムの総密度－ＯＤ６００＝０．５。ＴｕＭＶ－ＧＦＰベクターをＯＤ６００＝０．０００１の最終密度になるように添加した。
６． 無針注射器を使用して、４週齢のベンサミアナタバコ植物の葉に、誘導された培養物を浸透させた。
ＧＥｉＧＳ－ｄｓＲＮＡのサイレンシングに使用した遺伝子配列
－ ＡｔＴＡＳ１Ｂ（Ａｔ１ｇ５００５５）－配列番号１１５
－ ＧＥｉＧＳ－ＴｕＭＶ－配列番号１１６
－ ＧＥｉＧＳ－ＴｕＭＶ－成熟ｓｉＲＮＡ－配列番号１１７
－ ＧＥｉＧＳ－ダミー－配列番号１１８
－ ＧＥｉＧＳ－ダミー－成熟ｓｉＲＮＡ－配列番号１１９
－ ｍｉＲ１７３＿ＡＴ３Ｇ２３１２５－配列番号１２０
－ ｍｉＲ１７３－成熟ｍｉＲＮＡ－配列番号１２１
ＴｕＭＶ感染及び疾患からのシロイヌナズナの保護の研究
植物材料
所望のＧＥｉＧＳ配列を保有する植物から採取したシロイヌナズナの種子を塩素ガスで滅菌し、ＭＳ－Ｓ寒天培地プレートに１粒／ウェルで播種する。２週齢の実生を土壌に移す。１６時間明／８時間暗サイクルで２４℃において植物を成長させる。対照として、野生型の非改変（植物）を並行して成長させ、処理する。
植物への接種及び分析
ＴｕＭＶベクターの植物への接種及び分析の手順は、当技術分野において十分に確立されており、既に記載されている［Ｓａｒｄａｒｕ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ（２０１８），１９：１９８４－１９９４］。４週齢のシロイヌナズナの実生に、ウイルスベクターを発現しているＴｕＭＶを既に記載されている通り［Ｓaｎｃｈｅｚ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．（１９９８） Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５５（２）：２０７－２１９］又はＴｕＭＶ－ＧＦＰを既に記載されている通り［Ｔｏｕｒｉnｏ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２００８） Ｓｐａｎｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６（Ｓ１），ｐ．４８］接種する。ＴｕＭＶの場合、接種の１０～２８日後に症状のスコアリングを行う。ＴｕＭＶ－ＧＦＰの場合、接種の７～１４日後にＧＦＰシグナルの分析を行う。
更に、接種の１４日後に、接種部位の上方に成長している新葉を採取し、製造業者の指示書に従ってＴｏｔａｌ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｎｏｒｇｅｎｅ Ｂｉｏｔｅｋ Ｃｏｒｐ，Ｃａｎａｄａ）を用いて全ＲＮＡを抽出する。これらサンプルについて、遺伝子発現及び低分子ＲＮＡ発現をプロファイリングするために、Ｓｍａｌｌ ＲＮＡ解析及びＲＮＡ－ｓｅｑを実施する。
コナジラミのトマトへの感染に関する研究
植物材料
所望のＧＥｉＧＳ配列を保有する植物から採取した種子から、１ポットあたり１株を１６時間明／８時間暗サイクル下で２２℃においてトマト植物を成長させる。対照として、野生型の非改変（植物）を並行して成長させ、処理する。
コナジラミの接種
４週齢のトマト植物に５匹の雌のコナジラミを導入する。一枚の葉を保持しているクリップケージにコナジラミを入れる。５日後、死亡したコナジラミ及び生存しているコナジラミ、並びに卵を数える。
更に、接種の５日後に感染した葉を収集し、全ＲＮＡを抽出する。死亡したコナジラミ及び生存しているコナジラミを別々に回収し、それらからも全ＲＮＡを抽出する。これらサンプルについて、遺伝子発現及び低分子ＲＮＡ発現をプロファイリングするために、Ｓｍａｌｌ ＲＮＡ解析及びＲＮＡ－ｓｅｑを実施する。
線形動物遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡの研究
線形動物
植物に寄生するシスト線虫であるジャガイモシスト線虫（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ ｒｏｓｔｏｃｈｉｅｎｓｉｓ）（病原型Ｒｏ１、Ｊａｍｅｓ Ｈｕｔｔｏｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅコレクションから入手）を、ＤＥＦＲＡライセンス１２５０３４／３５９１４９／３の下ケンブリッジ大学で維持した。線形動物は、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）の品種Ｄeｓｉｒeｅで維持した。５０匹のシストを、直径７インチのポットにおいて砂：ロームの５０：５０混合物と合わせた。１ポットあたり１個の塊茎を植え、２０℃で３ヶ月間定期的に水を与えた。植物を１ヶ月間乾燥させ、浮選に続いて組ふるいを用いて土壌からシストを回収した。トマトの根の透析液を接種し、最長１４日間２～３日ごとに交換することによって、シストから幼虫を孵化させた。孵化した幼虫を、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ－２０を含有する水中において４℃で最長１週間保存した後、その後のアッセイで使用した。
使用した配列
－ ＡｔＴＡＳ３ａ＿ＡＴ３Ｇ１７１８５－配列番号１２２
－ ＧＥｉＧＳ－リボソームタンパク質３ａ－転写物－配列番号１２３
－ ＧＥｉＧＳ－リボソームタンパク質３ａ－転写物－配列番号１２４－線形動物でｓｉＲＮＡを作製するためにＧＥｉＧＳ設計を通して作製された、標的遺伝子に対して相同な領域を示す（すなわち、予測されるプロセシングされたｓｉＲＮＡ）。
－ ＧＥｉＧＳ－スプライセオソームＳＲタンパク質－転写物－配列番号１２５
－ ＧＥｉＧＳ－スプライセオソームＳＲタンパク質－転写物－配列番号１２６－線形動物でｓｉＲＮＡを作製するためにＧＥｉＧＳ設計を通して作製された、標的遺伝子に対して相同な領域を示す（すなわち、予測されるプロセシングされたｓｉＲＮＡ）。
－ ｍｉＲ１７３＿ＡＴ２Ｇ３８３２５－配列番号１２７
給餌のためのＲＮＡ調製
浸透させたベンサミアナタバコの葉から、Ｔｒｉ－Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）を用いて全ＲＮＡを抽出し、２回クロロホルムで洗浄し、イソプロパノールで一晩沈殿させた。回収したＲＮＡを、標準的な酢酸ナトリウム沈殿で更にクリーニングした。
回収した全てのＲＮＡを、製造業者の指示書に従ってＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ ０．５ｍＬ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒｓ ３ＫＤ ｃｕｔ－ｏｆｆ（Ｍｅｒｃｋ，ＵＳＡ）を用いてクリーニングし、ＤＤＷで３回洗浄した。ｎａｎｏｄｒｏｐを用いてＲＮＡを定量した。
線形動物給餌プロトコール
ＲＮＡを１×Ｍ９及び５０ｍＭオクトパミンで１．７６μｇ／μＬに希釈した。リピートごとに３５００Ｊ２を約５μＬの体積になるように１．５ｍＬのエッペンドルフにおいてペレット化した。２５μＬのＲＮＡ溶液を線形動物に添加し、ヒートブロックにおいて３００ｒｐｍで回転させながら２０℃でインキュベートした（最終ＲＮＡ濃度は１．４７μｇ／μＬであった）。７２時間後、線形動物をスピンダウンし（１０ｋ ｇ １分）、上清を除去することによって洗浄を行った。５００μＬのＲＮＡｓｅフリー水で３回洗浄を繰り返した。ペレットを液体窒素で急速冷凍し、処理するまで－８０℃で保存した。
線形動物のＲＮＡ抽出及び精製
製造業者の推奨に従って、Ｄｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ：Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈカタログ番号Ｒ２０５２を用いてＲＮＡの分離を行った。
マイクロチューブ乳棒を用いて、凍結（液体窒素又はドライアイス）させた組織サンプル（≦２５ｍｇ）をエッペンドルフ内で粉状になるまで粉砕し、６００μＬのＴＲＩ試薬をサンプルに添加し、完全にホモジナイズされるまで粉砕を続けた。次いで、特に指定のない限り、以下の工程は室温で実施し、遠心分離は１０，０００～１６，０００×ｇで３０秒間行った：
１． ＴＲＩ試薬又はｓｉｍｉｌａｒ１で溶解したサンプルに、同体積のエタノール（９５～１００％）を添加し、十分に混合した。
２． 混合物をコレクションチューブ内のＺｙｍｏ－Ｓｐｉｎ（商標）ＩＩＣＲ Ｃｏｌｕｍｎ２に移し、遠心分離した。カラムを新たなコレクションチューブに移し、フロースルーを廃棄した。
３． カラムにおいてＤＮａｓｅＩ処理を行った
（３ａ）４００μＬのＲＮＡ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒをカラムに添加し、遠心分離した。
（３ｂ）ＲＮａｓｅフリーチューブに、５μＬのＤＮａｓｅ Ｉ（６Ｕ／μＬ）及び７５μＬのＤＮＡ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒを添加し、混合した。ミックスをカラムマトリックスに直接添加した。
（３ｃ）室温（２０～３０℃）で１５分間インキュベートした。
４． ４００μＬのＤｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ（商標）ＲＮＡ ＰｒｅＷａｓｈをカラムに添加し、遠心分離した。フロースルーを廃棄し、工程を繰り返した。
５． ７００μＬのＲＮＡ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒをカラムに添加し、２分間遠心分離して、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒを確実に完全に除去した。カラムをＲＮａｓｅフリーチューブに慎重に移した。
６． ＲＮＡを溶出させるために、３０μＬのＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒをカラムマトリックスに直接添加し、遠心分離した。
７． ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計／蛍光光度計又はＱｕｂｉｔ蛍光光度計を用いてＲＮＡを定量し、ＲＮＡを直ちに使用した、又は≦－７０℃で冷凍保存した。
ｑＲＴ ｃＤＮＡライブラリーの調製
（Ｑｕａｎｔａ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ：ｑＳｃｒｉｐｔ Ｆｌｅｘ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ）
１． 全ての成分（酵素を除く）を解凍し、十分に混合し、遠心分離し（使用前）、氷上に置いた（使用前）。
２． 氷上に置いた０．２ｍＬの薄肉ＰＣＲチューブ又は９６ウェルＰＣＲ反応プレートに以下を添加した：
３． 成分 体積
ＲＮＡ（１μｇ～１０ｐｇ 全ＲＮＡ） 可変
ヌクレアーゼフリー水 可変
オリゴｄＴ ２μＬ
最終体積 １５．０μＬ
（注記：混合プライマー戦略では、２μＬのＯｌｉｇｏ ｄＴを使用した。多重第１鎖反応では、反応ミックスを用いてＲＴでマスターミックスを調製し、各チューブに５μＬずつ分注した）。
４． 穏やかなボルテックスによって成分を混合し、次いで、１０秒間遠心分離して、内容物を回収した。
５． ６５℃で５分間インキュベートし、次いで、氷中で急速冷却した。
６． 以下をプライミングされたＲＮＡテンプレート混合物に添加した：
成分 体積
ｑＳｃｒｉｐｔ Ｆｌｅｘ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｉｘ（５×） ４μＬ
ｑＳｃｒｉｐｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ １μＬ
最終体積 ２０．０μＬ
（注記：多重第１鎖反応では、反応ミックスを用いてＲＴでマスターミックスを調製し、各チューブに５μＬずつ分注した）。
７． 穏やかなボルテックスによって成分を混合し、次いで、以下の通りインキュベートした：
４２℃で６０分
８５℃で５分
４℃で保持
８． ｃＤＮＡ合成が完了した後、ｄＨ２Ｏ又はＴＥバッファ［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）を更に３０μＬ添加し、２０μＬのｑＲＴＰＣＲ反応に対して２～３μＬを使用した。ｃＤＮＡは－２０℃で保存することができた。
ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｊｕｍｐ Ｓｔａｒｔ Ｔａｑ Ｒｅａｄｙ反応のプロトコール
１． 全ての成分（酵素を除く）を解凍し、十分に混合し、使用前に遠心分離した。使用前は氷上で維持する。
２． 氷上に置いた０．２ｍＬの薄肉ＰＣＲチューブ又は９６ウェルＰＣＲ反応プレートに以下を添加した：
成分 体積
２×ＳＹＢＲマスターミックス １０μＬ
特異的フォワードプライマー（１０ｕＭ） １μＬ
特異的リバースプライマー（１０ｕＭ） １μＬ
ｃＤＮＡテンプレート ２～３μＬ
ヌクレアーゼフリーｄＨ２Ｏ 可変
最終体積 ２０μＬ
３． サンプルを以下の通りインキュベートした：
９４℃ ２分
９４℃ １５秒
５５～６０℃ ６０秒。３５～４０サイクル ＳＹＢＲシグナルを読む
融解曲線：
９５℃→６５℃、２０℃／サイクル、連続的にシグナルを収集
６５℃→９５℃／０．２秒
反応は、関心遺伝子及び内因性の較正物質の両方について、技術的にトリプリケートで行った。
プライマー配列
－ スプライセオソームＳＲタンパク質：
ｑＲＴＳｐＳＲ＿ＦＷＤ ＧＣＴＣＡＡＣＴＧＡＣＡＡＡＧＡＡＴＣＴＣＴＣＡＣ－配列番号１２８
ｑＲＴＳｐＳＲ＿ＲＥＶ ＴＴＧＡＡＡＡＴＴＧＧＧＴＣＡＡＡＧＡＡＡＴＧＣＧ－配列番号１２９
－ リボソームタンパク質３ａ
ｑＲＴＲｉｂ３ａ＿ＦＷＤ ＧＡＡＣＧＧＴＣＧＣＴＡＣＧＡＴＴＡＣＧＡ－配列番号１３０
ｑＲＴＲｉｂ３ａ＿ＲＥＶ ＣＡＡＡＣＧＣＴＣＴＧＴＴＧＡＡＣＡＧＧＣ－配列番号１３１
－ 正規化のための内因性遺伝子：
ＮＥＭＡＡＣＴＩＮ＿０９２５１＿Ｆ ＴＴＣＣＡＧＣＡＧＡＴＧＴＧＧＡＴＣＡＧ－配列番号１３２
ＮＥＭＡＡＣＴＩＮ＿０９２５１＿Ｒ ＣＧＧＣＣＴＴＡＴＴＣＴＴＣＡＡＧＣＡＣ－配列番号１３３
バイオインフォマティクス解析のための資料－
ＦＡＳＴＱフォーマットのＳｍａｌｌ－ＲＮＡ生データを、ｃｕｔａｄａｐｔ ２．８を用いて、パラメータ「－ｍ１８－ｕ４－ａ ＮＮＮＮＴＧＧＡＡＴＴＣＧＧＧＴＧＣＣＡＡＧＧ」（配列番号１３８）で加工して、シーケンシングスアダプターをトリミングし、ランダムアダプターを取り除き、１８ｎｔよりも長いリードだけを残した。ＦＡＳＴＱフォーマットのＲＮＡ－ｓｅｑ生データを，ｃｕｔａｄａｐｔ ２．８を用いて，パラメータ「－ｍ１８－ａ ＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＧＴＣＴＧＡＡＣＴＣＣＡＧＴＣＡ －Ａ ＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＣＧＴＣＧＴＡＧＧＧＡＡＡＧＡＧＴＧＴ」（配列番号１３９）で加工して、シーケンシングアダプターを除去し、１８ｎｔよりも長いリードを残した。
小さな擬似ゲノムに対応するためにＳＴＡＲバージョン２．７．１ａを用いてパラメータ「－－ｇｅｎｏｍｅＳＡｉｎｄｅｘＮｂａｓｅｓ ３」で、標的配列によって構成された擬似ゲノムに対してアラインメントインデックスを作成した。
ＳＴＡＲ ２．７．１ａを用いてパラメータ「－－ｏｕｔＳＡＭｔｙｐｅ ＢＡＭ Ｕｎｓｏｒｔｅｄ－－ｏｕｔＦｉｌｔｅｒＭｉｓｍａｔｃｈＮｍａｘ ０－－ａｌｉｇｎＩｎｔｒｏｎＭａｘ １－－ａｌｉｇｎＥｎｄｓＴｙｐｅ ＥｎｄＴｏＥｎｄ－－ｓｃｏｒｅＤｅｌＯｐｅｎ－１００００－－ｓｃｏｒｅＩｎｓＯｐｅｎ －１００００」で、Ｓｍａｌｌ－ＲＮＡアダプターがトリミングされたリードを疑似ゲノムに対してアラインメントした。ＲＮＡ－ｓｅｑアダプターがトリミングされたリードは、同じリソースを用いてパラメータ「－－ｏｕｔＳＡＭｔｙｐｅ ＢＡＭ Ｕｎｓｏｒｔｅｄ－－ａｌｉｇｎＥｎｄｓＴｙｐｅ ＥｎｄＴｏＥｎｄ－－ａｌｉｇｎＩｎｔｒｏｎＭａｘ ５００」でアラインメントした。
カスタムｐｙｔｈｏｎスクリプトを使用して、アラインメントされたｓｍａｌｌ－ＲＮＡのリードを２０～２４ヌクレオチドの長さに、ＲＮＡ－ｓｅｑのリードを５０ヌクレオチド超の長さにフィルタリングした。
標的配列に対するリードカバレッジは、ｂｅｄｔｏｏｌｓ ２．２９．２を用いてパラメータ「ｇｅｎｏｍｅｃｏｖ－ｂｇ－ｓｃａｌｅ｛ｆａｃｔｏｒ｝」で算出した。ここでは、リードカウントを１００万あたりのリード数（ＲＰＭ）に対して正規化するための係数を算出した。
ＲのＳｕｓｈｉパッケージ（バージョン１．２５．０）を用いて、カバレッジプロットを作成した。
実施例１Ａ
ゲノム編集誘導遺伝子サイレンシング（ＧＥｉＧＳ）
ＧＥｉＧＳオリゴを設計するために、プロセシングされ、誘導体低分子サイレンシングＲＮＡ分子（成熟）を生じさせる、テンプレート非コードＲＮＡ分子（前駆体）が必要になる。ＧＥｉＧＳオリゴを作製するために、２つの前駆体源及びそれに対応する成熟配列を用いた。ｍｉＲＮＡについては、ｍｉＲＢａｓｅデータベースから配列を取得した［Ｋｏｚｏｍａｒａ，Ａ．ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ－Ｊｏｎｅｓ，Ｓ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（２０１４）４２：Ｄ６８，AiＤ７３］。ｔａｓｉＲＮＡの前駆体及び成熟配列は、ｔａｓｉＲＮＡｄｂデータベースから取得した［Ｚｈａｎｇ，Ｃ．ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（２０１４）３０：１０４５，Ai１０４６］。
様々な宿主生物においてサイレンシング標的を選択した（データは示さない）。ｓｉＲＮＡｒｕｌｅｓソフトウェアを用いて、これら標的に対するｓｉＲＮＡを設計した［Ｈｏｌｅｎ，Ｔ．，ＲＮＡ（２００６）１２：１６２０，Ai１６２５．］。これらｓｉＲＮＡ分子のそれぞれを使用して各前駆体中に存在する成熟配列を置き換え、「ナイーブ」なＧＥｉＧＳオリゴを作製した。これらナイーブな配列の構造を、ＶｉｅｎｎａＲＮＡ Ｐａｃｋａｇｅ ｖ２．６［Ｌｏｒｅｎｚ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，ＶｉｅｎｎａＲＮＡ Ｐａｃｋａｇｅ ２．０．Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ ｆｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１１）６：２６］を用いて可能な限り野生型前駆体の構造に近づくように調整した。構造を調整した後、配列数及び野生型オリゴと改変オリゴとの間の二次構造の変化を算出した。これら計算は、野生型に対して最小限の配列改変しか必要としない、潜在的に機能的なＧＥｉＧＳオリゴを同定するために必須である。
ＣａｓＯＴソフトウェア［Ｘｉａｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（２０１４）３０：１１８０，Ai１１８２］を用いて、野生型前駆体に対するＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ９低分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を作製した。ＧＥｉＧＳオリゴを作製するために適用された改変がｓｇＲＮＡのＰＡＭ領域に影響を与えて、それを改変オリゴに対して無効なものにするｓｇＲＮＡを選択した。
実施例１Ｂ
内因性植物遺伝子の遺伝子サイレンシング－ＰＤＳ
ゲノム編集誘導遺伝子サイレンシング（ＧＥｉＧＳ）を用いて内因性遺伝子のサイレンシングを定量的に評価するためのハイスループットスクリーニングを確立するために、本発明者らは、幾つかの有望な視覚的マーカーについて検討した。本発明者らは、色素蓄積に関与する遺伝子、例えば、フィトエン不飽和化酵素（ＰＤＳ）をコードしている遺伝子に注目することを選択した。ＰＤＳをサイレンシングすると光退色が引き起こされるため（図８Ｂ）、概念実証（ＰＯＣ）として遺伝子編集後にロバストな実生のスクリーニングとしてそれを用いることが可能になる。図８Ａ～Ｃは、ＰＤＳについてサイレンシングされたベンサミアナタバコ及びシロイヌナズナの植物を用いた代表的な実験を示す。植物は、カロテノイドの量が減少した植物でみられる特徴的な光退色表現型を示す。
ＰＯＣ実験では、以下の通りｓｉＲＮＡの選択を行った：
ＧＥｉＧＳアプリケーションを用いてＰＤＳ遺伝子に対するシロイヌナズナ又はベンサミアナタバコにおけるＲＮＡｉ機構を始動させるためには、ＰＤＳを標的とする有効な２１～２４ｂｐのｓｉＲＮＡを同定する必要がある。活性ｓｉＲＮＡの配列を見つけるために、２つのアプローチを使用する：１）文献をスクリーニング－ＰＤＳサイレンシングは多くの植物に置いて周知のアッセイであるので、本発明者らは、シロイヌナズナ又はベンサミアナタバコの遺伝子と１００％一致する可能性のある、異なる植物における十分に特徴付けられている短いｓｉＲＮＡ配列を同定する。２）所与の遺伝子に対する遺伝子サイレンシングの始動にどのｓｉＲＮＡが有効であるかを予測するために使用されているアルゴリズムが数多く公開されている。これらアルゴリズムの予測は１００％ではないので、本発明者らは、少なくとも２つの異なるアルゴリズムの成果である配列のみを使用している。
ＰＤＳ遺伝子をサイレンシングするｓｉＲＮＡ配列を使用するために、本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いて、それを既知の内因性非コードＲＮＡ遺伝子配列と交換している（例えば、ｍｉＲＮＡ配列の変更、長鎖ｄｓＲＮＡ配列の変更、アンチセンスＲＮＡの作製、ｔＲＮＡの変更等）。特徴付けられている非コードＲＮＡ、例えばｍｉＲＮＡのデータベースは数多く存在するが、本発明者らは、発現プロファイルの異なる（例えば、構成的な発現が少ない、高発現している、ストレスで誘導される等）既知のシロイヌナズナ又はベンサミアナタバコの内因性非コードＲＮＡ、例えばｍｉＲＮＡを幾つか選択している。例えば、内因性ｍｉＲＮＡ配列を、ＰＤＳ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡと交換するために、本発明者らは、ＨＲアプローチ（相同組み換え）を用いている。ＨＲを使用すると、２つの選択肢が想定される：例えば中央に改変ｍｉＲＮＡ配列を含む２５０～５００ｎｔ程度のドナーｓｓＤＮＡオリゴ配列を使用する、又はＰＤＳのｓｉＲＮＡに変更された２×２１ｂｐのｍｉＲＮＡ及び＊ｍｉＲＮＡ（図７に示すように、ｓｉＲＮＡの５００～２０００ｂｐ上流及び下流）を除いて植物ゲノム中のｍｉＲＮＡ周辺に対して最小限の変更しか含まない、１Ｋｂ～４Ｋｂのインサートを保有するプラスミドを使用する。トランスフェクションには、以下のコンストラクトが含まれる：陽性の形質転換細胞を追跡し、濃縮するためのＣＲＩＳＰＲ：Ｃａｓ９／ＧＦＰセンサー、挿入ベクター／オリゴに応じてＨＲにより修復される二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成するようＣａｓ９を誘導するｇＲＮＡ。挿入ベクター／オリゴは、置換される標的となる遺伝子座を取り囲む２つの連続する相同性領域を含有し（すなわちｍｉＲＮＡ）、関心変異を保有するように改変される（すなわちｓｉＲＮＡ）。プラスミドを使用する場合、ターゲティングコンストラクトは、制限酵素認識部位を含むか又は含まず、ｍｉＲＮＡを選択したｓｉＲＮＡで置き換えることで終了する相同組換えのテンプレートとして使用される。プロトプラストへのトランスフェクション後、ＦＡＣＳを用いてＣａｓ９／ｓｇＲＮＡがトランスフェクションされる事象を濃縮し、プロトプラストを植物に再生し、白化した実生をスクリーニングし、スコアリングする（図５を参照）。対照として、ランダムな非ＰＤＳターゲティング配列を保有するオリゴをプロトプラストにトランスフェクトする。陽性の編集された植物は、ＰＤＳを標的とするｓｉＲＮＡ配列を生成すると予測されるので、ＰＤＳ遺伝子がサイレンシングされ、ｇＲＮＡを持たない対照と比べて実生が白く見える。元の塩基対合プロファイルは維持されるので、編集されたｍｉＲＮＡは、交換後も依然としてｍｉＲＮＡとしてプロセシングされることに留意することが重要である。しかし、新たに編集されたプロセシングされるｍｉＲＮＡは、標的に対して高い相補性（例えば１００％）を有するため、実際には、新たに編集された低分子ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡとして作用する。
実施例１Ｃ
ＴｕＭＶウイルス感染に対するシロイヌナズナ植物の抵抗性の保有
機能不全非コードＲＮＡにサイレンシング特異性を導入して、カブモザイクウイルス（ＴｕＭＶ）を標的とするように、シロイヌナズナのゲノムにおける変化を設計する。これら配列は、ゲノム遺伝子座の状況において伸長された相同性アームと共に、ＤＯＮＯＲと命名されたＰＵＣ５７ベクターに導入される。所望の遺伝子座でＤＮＡの切断を生じさせるために、ガイドＲＮＡをＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９ベクターシステムに導入する。遺伝子ボンバードメントプロトコールを介してＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９ベクターシステムをＤＯＮＯＲベクターと同時に植物に導入して、ＨＤＲ（相同ＤＮＡ修復（ＨＤＲ）を通して所望の改変を導入する。
ゲノム中に所望の変化を有するシロイヌナズナの実生をジェノタイピングを通して同定し、ＴｕＭＶ又はＴｕＭＶ－ＧＦＰのいずれかを保有しているアグロバクテリウムを接種し、ウイルス応答についてスコアリングする。
実施例２
トマト植物のコナジラミ寄生に対する抵抗性の保有
ＧＥｉＧＳ２．０パイプライン（上記の「一般的な材料と実験手順」の項で説明）に従って非コードＲＮＡを生成し、コナジラミの必須遺伝子を標的とするように、トマトゲノムの変化を設計する。これら配列は、ゲノム遺伝子座の状況において伸長された相同性アームと共に、ＤＯＮＯＲと命名されたＰＵＣ５７ベクターに導入される。所望の遺伝子座でＤＮＡの切断を生じさせるために、ガイドＲＮＡをＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９ベクターシステムに導入する。遺伝子ボンバードメントプロトコールを介してＤＯＮＯＲベクターと同時にこれらを植物に導入して、相同ＤＮＡ修復（ＨＤＲ）を通して所望の改変を導入する。ジェノタイピングを通して所望のゲノム変化を保有すると同定されたトマト植物にコナジラミを導入し、応答についてスコアリングする。
実施例３
シロイヌナズナプロトプラストにおけるトランス作用性サイレンシングＲＮＡに対するＧＥｉＧＳの使用
ＧＥｉＧＳを用いてｔａｓｉＲＮＡのサイレンシング特異性をリダイレクトするときの植物細胞内における相同性依存性組み換え（ＨＤＲ）事象を実証するために、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９エンドヌクレアーゼ、ＤＮＡの切断を指示するｓｇＲＮＡ、及び「ドナー」配列（ＧＥｉＧＳドナーとも称される）を発現するベクターを用いて、シロイヌナズナのプロトプラストでトランスフェクションアッセイを行って、ＧＥｉＧＳを介して所望のヌクレオチドの変化を導入した（本明細書では「交換」とも称される）。ドナー配列には、ＨＤＲを容易にするために、相同性アーム（変化した配列の約５００塩基対上流及び下流）に隣接する、所望のヌクレオチド変化を有する標的配列に対応する配列が含まれていた。
ＧＥｉＧＳアプローチは、本質的に、上記及び国際公開第２０１９／０５８２５５号（参照により本明細書に援用される）に記載されている原理に従い、本明細書において以下に例示する通りであった。簡潔に述べると、ＧＥｉＧＳドナーを含むベクターを、Ｃａｓ９等のエンドヌクレアーゼ及び編集される遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡと一緒に細胞に導入すると、ＧＥｉＧＳ－オリゴ配列が細胞のゲノムに導入され（ＨＤＲによって媒介）、その結果、編集された遺伝子が所望の変化を含むようになる（例えば、そのサイレンシング活性が選択した標的に向けてリダイレクトされた長鎖ｄｓＲＮＡに転写され得るＴＡＳ遺伝子をコードする）。
この操作には、いずれもトランス作用性ｓｉＲＮＡ生成（ＴＡＳ）分子をコードしている２つの遺伝子ＴＡＳ１ｂ及びＴＡＳ３ａ（以下を参照）をバックボーンとして使用した。ＧＥｉＧＳを用いて導入される変化は、線形動物であるジャガイモシスト線虫における必須遺伝子を標的とし、サイレンシングする長鎖ｄｓＲＮＡ及び低分子二次ｔａｓｉＲＮＡを生じさせるように選択した。これら標的遺伝子は、ＲＮＡｉ技術を用いてこの遺伝子を標的とした場合の線形動物における悪影響について論じた過去の刊行物に基づいて選択した（以下の表３）。これら遺伝子は別の系統の線形動物で同定されたので、選択した遺伝子をクエリとして用いて、ジャガイモシスト線虫の公に利用可能なデータベース（ｗｗｗ（ｄｏｔ）ｐａｒａｓｉｔｅ（ｄｏｔ）ｗｏｒｍｂａｓｅ（ｄｏｔ）ｏｒｇ／Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ＿ｒｏｓｔｏｃｈｉｅｎｓｉｓ＿ｐｒｊｅｂ１３５０４／Ｉｎｆｏ／Ｉｎｄｅｘ／）におけるＢＬＡＳＴ検索を通して、そのホモログを同定した。
Figure 2022524864000014
遺伝子配列において選択されたＳｉＲＮＡ標的部位を以下の配列に記載する：
ＧＲＯＳ＿ｇ０５９６０：ＴＧＧＡＧＣＡＧＣＡＧＡＴＣＡＡＴＧＡＡＡＴＴＣＡＡＣＧＡＣ（配列番号５９）
ＧＲＯＳ＿ｇ０４４６２：ＡＴＴＣＧＴＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＣＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＧ（配列番号６０）
ＧＲＯＳ＿ｇ０４８６３：ＡＡＡＡＡＣＡＡＡＣＡＡＡＴＧＴＴＧＧＴＣＡＡＡＡＡＧＧＡＴ（配列番号６１）
ＧＲＯＳ＿ｇ００２６３：ＣＣＧＣＴＣＴＧＴＧＧＡＴＴＣＴＴＧＧＣＧＡＡＴＡＴＴＧＣＧ（配列番号６２）
Ｃｏｌ－０プロトプラストのトランスフェクション
上記の通り、シロイヌナズナ（Ｃｏｌ－０）のプロトプラストに、Ｃｒｉｓｐｒ／Ｃａｓ９及びｓｇＲＮＡをコードしているベクター及びＨＤＲが媒介する交換を実現するためのドナーテンプレートを含有するベクターをトランスフェクトした。Ｔａｓ１ｂ（ＡｔＴＡＳ１ｂ＿ＡＴ１Ｇ５００５５）又はＴａｓ３ａ（ＡｔＴＡＳ３ａ＿ＡＴ３Ｇ１７１８５）遺伝子の配列を交換して、上記線形動物の標的遺伝子における３０ｂｐの配列を標的とする長鎖ｄｓＲＮＡ及び低分子二次ＲＮＡを作製するように、実験を設計した。ＴＡＳ１ｂ遺伝子座において２つの交換を、そして、ＴＡＳ３ａ遺伝子座において２つの交換を設計した。交換は、互いに独立していた。
異なる実験条件で使用したベクターの様々な組み合わせを以下の表４に列挙する。ＴＡＳバックボーンとドナーオリゴとの様々な組み合わせを使用した。陰性対照のトランスフェクションは、ＤＮＡを用いずに行った（処理Ｅ）。
Figure 2022524864000015
Ｃｏｌ－０細胞におけるＴａｓ１ｂ及びＴａｓ３ａの交換のゲノム上の証拠
トランスフェクションされた細胞のうちのごく一部のみが、ＨＤＲドナーテンプレートによるＤＮＡ二本鎖切断の修復に成功し、交換が発生したと予測された。これは、当技術分野において公知であるように、ＨＤＲ事象の頻度が低いためである。従って、トランスフェクトされたサンプルであっても、交換が行われなかった細胞が相当数含まれると予測された。
プロセシングされたサンプルが全てＰＣＲ増幅に好適であることを実証するために、全ての処理（Ａ～Ｅ）から得られたゲノムＤＮＡに対してＷＴ特異的プライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。フォワードプライマーは、交換が起こることを意図した領域にアニーリングするように設計し、一方、リバースプライマーは、組み換え部位の更に下流にアニーリングするように設計した（図９Ａ、プライマーを矢印で示し、予測されるＰＣＴ産物を破線で示した）。ＷＴ Ｔａｓ１ｂについて１つのプライマーセットを設計し、ＷＴ Ｔａｓ３ａについては異なるプライマーセットを設計した。ＷＴ Ｔａｓ１ｂ、Ｙ２５、及びスプライシング因子の交換処理（ＷＴ＝処理Ｅ）については、予測されたＰＣＲ産物（５９４ｂｐ長）が得られた。同様に、ＷＴ Ｔａｓ３ａ、リボソームタンパク質３ａ、及びスプライセオソームＳＲタンパク質の交換処理についても、予測されたＰＣＲ産物（５７４ｂｐ長）が得られた。予想通り、陰性対照（水、テンプレートなし）では増幅が得られなかった（図９Ｂ～Ｃ）。
次いで、組換え部位の更に下流でアニーリングする同じ非特異的リバースプライマー（ＷＴ Ｔａｓ１ｂについては１つの非特異的プライマー、ＷＴ Ｔａｓ３ａについては異なるプライマー）及び交換特異的フォワードプライマーを用いて特異的ＰＣＲ反応を行った（図９Ａ）。ＰＣＲ反応の特異性の対照として、各プライマー対の陰性対照のためにＷＴ ＤＮＡを用いた（図９Ｅ～Ｆ）。Ｔａｓ１ｂではＹ２５（５８７ｂｐ長）及びスプライシング因子（５８４ｂｐ長）の交換処理について、予測された特異的ＰＣＲ産物が得られた。同様に、リボソームタンパク質３ａ（５６８ｂｐ長）及びスプライセオソームＳＲタンパク質（５７４ｂｐ長）の交換処理でも、予測された特異的ＰＣＲ産物が得られた（図９Ｄ～Ｅ）。全てのＰＣＲ反応について、テンプレートとしてＷＴ ＤＮＡを用いた場合は増幅が得られず、交換特異的プライマーの特異性が更に実証された。更に、予想通り、陰性対照（水、テンプレートなし）では増幅が得られなかった。
更に、非特異的リバースプライマーを用いて、粗ＰＣＲ産物をサンガーシーケンシング（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ）した。Ｓｎａｐｇｅｎｅソフトウェアを使用してシーケンシング結果を解析した。特定のプライマー結合部位の直前にＨＤＲ交換によって導入された（使用したプライマーによっては導入されたのではない）幾つかの変異が検出されることが予測された。シーケンシング反応により、このような変異の同一性及び位置が確認された。また、Ｔａｓ１ｂとＴａｓ３ａのいずれについてもＷＴ特異的産物をシーケンシングのために送り、同様のアプローチに従って、ＷＴ配列の同一性も確認することができた（図９Ｆ）。その結果、Ｔａｓ１ｂ及びＴａｓ３ａの両方の遺伝子座で、異なるドナーオリゴを使用した全ての処理において、ｓｇＲＮＡガイドが活性を有し、ＨＤＲ交換が行われたことが確認された。
また、非特異的ＰＣＲ反応を行った後にメインアプローチで使用したのと同じプライマーセットを用いてネステッド特異的ＰＣＲ反応を行うネステッドＰＣＲアプローチに従った場合も、同様の結果が得られた。
ゲノムＰＣＲ
細胞サンプル（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ）を、ＲＮＡ／ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いてゲノムＤＮＡ用に処理した（上述の通り）。
上述の通り、Ｔａｓ１ｂ（ＡｔＴＡＳ１ｂ＿ＡＴ１Ｇ５００５５）及びＴａｓ３ａ（ＡｔＴＡＳ３ａ＿ＡＴ３Ｇ１７１８５）の配列には、交換領域に隣接する非特異的プライマーを用いた。陰性対照として、野生型（ＷＴ）ＤＮＡをテンプレートとして用いて同じ交換特異的反応を実施した。増幅は予測されなかった。陽性ＰＣＲ対照として、ＷＴ ＤＮＡについての特異的ＰＣＲを全てのサンプルに対して実施した。
同様の代替アプローチに従って交換についても確認した。単一のＰＣＲ反応の代わりに、ネステッドＰＣＲ反応を行った。最初のゲノムＰＣＲは、ＨＤＲ領域に隣接する非特異的なフォワードプライマー及びリバースプライマーを含んでいた。ネステッドアプローチにおいて最初のＰＣＲに使用した非特異的プライマーは、ネステッドプライマーのアニーリング部位に隣接するアニーリング部位を有する。
遺伝子及び配列
以下の表５は、（ＴＡＳバックボーン及び線形動物の標的遺伝子の組み合わせごとに）意図した交換を含み、線形動物における遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを生じさせるＧＥｉＧＳドナー内のＧＥｉＧＳ－オリゴの領域を列挙する。野生型ＴＡＳのバックボーン、使用したｓｇＲＮＡ、及びＧＥｉＧＳドナー設計の配列を以下に列挙する。
ＧＥｉＧＳ設計における相同領域（ＴＡＳ長鎖ｄｓＲＮＡのサイレンシング活性及び特異性を標的遺伝子のサイレンシングに向けてリダイレクトするために、野生型領域と交換することを意図した領域）には下線を引いて示す。以下の配列では、ドナーベクターに挿入され、相同性アームを有する交換されたヌクレオチドを含有するドナー配列を、例えば、ＧＥｉＧＳ－スプライシング因子－ＤＯＮＯＲと称する。線形動物における遺伝子を標的とする交換事象後のＴＡＳ遺伝子の長鎖ｄｓＲＮＡ転写物は、例えばＧＥｉＧＳ－スプライシング因子－転写物と称される。
Figure 2022524864000016
表５の追加配列：
－ ＡｔＴＡＳ１ｂ＿ＡＴ１Ｇ５００５５－配列番号７３
－ ｓｇＲＮＡ＿ＡｔＴＡＳ１ｂ（ＰＡＭを含む）－配列番号７４
－ ＧＥｉＧＳ－スプライシング因子－転写物－配列番号７５
－ ＧＥｉＧＳのＧＥｉＧＳ設計における相同領域－スプライシング因子－転写物－配列番号７６
－ ＧＥｉＧＳ－スプライシング因子－ＤＯＮＯＲ－配列番号７７
－ ＧＥｉＧＳのＧＥｉＧＳ設計における相同領域－スプライシング因子－ＤＯＮＯＲ－配列番号７８
－ ＧＥｉＧＳ－Ｙ２５－転写物－配列番号７９
－ ＧＥｉＧＳのＧＥｉＧＳ設計における相同領域－Ｙ２５－転写物－配列番号８０
－ Ｙ２５－ＤＯＮＯＲ－配列番号８１
－ Ｙ２５のＧＥｉＧＳ設計における相同領域－ＤＯＮＯＲ－配列番号８２
－ ＡｔＴＡＳ３ａ＿ＡＴ３Ｇ１７１８５－配列番号８３
－ ｓｇＲＮＡ＿ＡｔＴＡＳ３ａ（ＰＡＭを含む）－配列番号８４
－ ＧＥｉＧＳ－リボソームタンパク質３ａ－転写物－配列番号８５
－ ＧＥｉＧＳのＧＥｉＧＳ設計における相同領域－リボソームタンパク質３ａ－転写物－配列番号８６
－ ＧＥｉＧＳ－リボソームタンパク質３ａ－ＤＯＮＯＲ－配列番号８７
－ ＧＥｉＧＳのＧＥｉＧＳ設計における相同領域－リボソームタンパク質３ａ－ＤＯＮＯＲ－配列番号８８
－ ＧＥｉＧＳ－スプライセオソームＳＲタンパク質－転写物－配列番号８９
－ ＧＥｉＧＳのＧＥｉＧＳ設計における相同領域－スプライセオソームＳＲタンパク質－転写物－配列番号９０
－ ＧＥｉＧＳ－スプライセオソームＳＲタンパク質－ＤＯＮＯＲ－配列番号９１
－ ＧＥｉＧＳのＧＥｉＧＳ設計における相同領域－スプライセオソームＳＲタンパク質－ＤＯＮＯＲ－配列番号９２
実施例４
ＧＥｉＧＳによって改変されたＴＡＳ遺伝子を発現する細胞における長鎖二本鎖ＲＮＡ
長鎖ｄｓＲＮＡをコードしている植物遺伝子の核酸配列を改変した結果、細胞内で改変ｄｓＲＮＡが生じることを実証するために、実施例３で分析したプロトプラストを起源とするＲＮＡを使用した。（交換されるように設計されていない領域における）標的である試験した遺伝子座に特異的なプライマーを用いてＲＮＡを逆転写した。次いで、交換領域に特異的なプライマー（交換された配列又はｗｔ配列を特異的に増幅する）を用いて、予測されるＲＮＡ転写物のセンス及びアンチセンスとしての長鎖ｄｓＲＮＡの存在について調べた。
全ての処理からＲＮＡを抽出し、ＤＮＡｓｅで処理して微量のＤＮＡを除去した。次いで、ＲＮＡサンプルを、非特異的プライマーを用いたＲＴ－ＰＣＲに供してｃＤＮＡを作製した。２つの異なる独立したＲＴ－ＰＣＲ（＋ＲＴ）反応を行って、それぞれＴａｓ ＤＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖からｃＤＮＡを作製した。Ｔａｓ１ｂ及びＴａｓ３ａの両方とも、このアプローチに従った。逆転写対照（－ＲＴ）は、全て同じ試薬を用いて実施したが、逆転写酵素の代わりに水を添加した。反応ミックスに逆転写酵素が含まれていない場合はｃＤＮＡが作製されないため、その後のＰＣＲ反応で得られる任意のＰＣＲ産物は、必ず、サンプルをＤＮＡｓｅ処理した後にインタクトなまま残った持ち越しＤＮＡから増幅されたものである。
（センスｃＤＮＡについては）非特異的フォワードプライマー及び交換特異的リバースプライマー（図１０Ａ）、又は（アンチセンスｃＤＮＡについては）非特異的リバースプライマー及び交換特異的フォワードプライマー（図１０Ｂ）を用いて、特異的ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、全てのＰＣＲ産物の長さが２００ヌクレオチド未満になるように設計した（図１０Ａ～Ｂ）。
Ｔａｓ１ｂ（図１０Ｃ～Ｄ、右パネル）及びＴａｓ３ａ配列（図１０Ｅ～Ｆ、右パネル）についてのＷＴ特異的ＰＣＲ反応は、処理されたサンプルからのＲＮＡがＰＣＲ増幅に好適であることを示した。処理したサンプルにおけるセンス鎖（Ｔａｓ１ｂについては１０５ｂｐ、Ｔａｓ３ａについては１３３ｂｐ）及びアンチセンス鎖（Ｔａｓ１ｂについては１４７ｂｐ、Ｔａｓ３ａについては１０１ｂｐ）の両方のｗｔ遺伝子座（Ｔａｓ１ｂ及びＴａｓ３ａ遺伝子）について、予測されたＰＣＲ産物が得られ、これは、これらが共存しており、従って、サンプル中にｄｓＲＮＡが存在していることを示す。クリーン－ＲＴ反応は、ＤＮＡｓｅ処理によってＲＮＡサンプルから微量のＤＮＡを除去するのに成功したことを示す。
処理したＲＮＡについて交換特異的ＲＴ－ＰＣＲ反応を行ったところ、Ｙ２５のセンス処理（９８ｂｐ）及びアンチセンス処理（１４９ｂｐ）で特異的に異なって増幅されたＰＣＲ産物が得られた（図１０Ｃ～Ｄ、左パネル）。同様に、リボソームタンパク質３ａのセンス処理（１３０ｂｐ）及びアンチセンス処理（１１８ｂｐ）でも、特異的に異なって増幅されたＰＣＲ産物が得られた（図１０Ｅ～Ｆ、左パネル）。水を用い、ＲＴテンプレートを用いなかった陰性対照では、増幅が得られなかった。各特異的ＰＣＲ反応の陰性対照として、非処理細胞からのＲＮＡをテンプレートとして用いたＰＣＲに同じマスターミックスを用いた（処理Ｅ）。予測したサイズの強いバンドが見られなかったことから、交換特異的プライマーに対する特異性が示され、交換された遺伝子座からＲＮＡが発現していることが実証された。
センスアプローチの場合は非特異的フォワードプライマーを用いて（図１０Ｇ）、アンチセンスアプローチの場合は非特異的リバースプライマーを用いて（図１０Ｈ）、粗ＰＣＲ産物をサンガーシーケンシングした。これは、特定のプライマー結合部位の直前にＨＤＲ交換によって導入された（使用したプライマーによっては導入されたのではない）幾つかの変異が検出されることが予測された。シークエンシング反応により、Ｔａｓ１ｂ Ｙ２５交換及びＴａｓ３ａリボソームタンパク質３ａ交換について、このような変異の同一性及び位置が確認された（図１０Ｇ～Ｈ）また、Ｔａｓ１ｂとＴａｓ３ａのいずれについてもＷＴ特異的産物をシーケンシングのために送り、同様のアプローチに従って、ＷＴ配列の同一性も確認することができた（図１０Ｉ）。
従って、実施例３の処理Ａ及びＣを用いて処理した細胞内で、交換を含有するｄｓＲＮＡ転写物が存在することの証明に成功した（すなわち、Ｙ２５標的遺伝子を標的とさせる交換を含有するＴａｓ１ｂのｄｓＲＮＡ及びリボソームタンパク質３ａ標的遺伝子を標的とさせる交換を含有するＴａｓ３ａのｄｓＲＮＡ）。
実施例５
ベンサミアナタバコにおけるターゲティング特異性が変化した長鎖ｄｓＲＮＡのサイレンシング活性
以下の実験では、（例えば、ＨＤＲが媒介してサイレンシング特異性をリダイレクトするＧＥｉＧＳアプローチを使用して）（それからプロセシングされた低分子ＲＮＡの）ターゲティング特異性が選択した遺伝子に向けてリダイレクトされたｄｓＲＮＡを使用したときの、選択した標的遺伝子に向けたサイレンシング活性を実証した。そうするために、（１）ＧＦＰマーカーを有するカブモザイクウイルス（ＴｕＭＶ）ベクター、及び（２）「ＧＥｉＧＳ設計」を過剰発現させるためのベクター－シロイヌナズナゲノムにおけるＴＡＳ１ｂ遺伝子バックボーンにヌクレオチド変化を導入するためにＧＥｉＧＳを用いることによって作製することができる、ＴｕＭＶを標的とするために必要なヌクレオチド変化を有するＴＡＳ１ｂに基づく転写物をコードしているＴＡＳ遺伝子（以下、「ＧＥｉＧＳ－ＴｕＭＶ」とも称される）をベンサミアナタバコの葉に浸透させることを通して一過的な発現系を使用した。浸透は、様々なベクターで形質転換されたＧＶ３１０１株のアグロバクテリウム細菌を葉に導入することによって行った。
シロイヌナズナについて上述した通りのＧＥｉＧＳアプローチを用いて「ＧＥｉＧＳ設計」を作製するために必要なオリゴヌクレオチド、特に－（１）ＴＡＳ１ｂを切断するために用いられるｓｇＲＮＡ、（２）（ＨＤＲが媒介する交換を用いてＧＥｉＧＳドナーによってＴＡＳ１ｂのバックボーンに導入される）ＴｕＭＶを標的とするｓｉＲＮＡ配列、（３）ＴＡＳ１ｂのバックボーンに対して所望の変化を含むＧＥｉＧＳドナーは、以下の通りである：
（１）ＴＡＳ１ｂを切断するために使用されたであろうｓｇＲＮＡ－配列番号１３４
（２）（ＨＤＲが媒介する交換を用いてＧＥｉＧＳドナーによってＴＡＳ１ｂバックボーンに導入されたであろう）ＴｕＭＶを標的とするｓｉＲＮＡ配列－配列番号１３５
（３）ＴＡＳ１ｂのバックボーンに対して所望の変化を含むＧＥｉＧＳドナー－配列番号１３６
（４）（（１）の成熟ｓｉＲＮＡ配列をＴＡＳ１ｂ配列に導入するように設計された）（３）のドナーを用いたＧＥｉＧＳの後にシロイヌナズナで発現したであろうＧＥｉＧＳオリゴ－配列番号１３７。
ＴｕＭＶの複製コンポーネントに蛍光ＧＦＰレポーター遺伝子を組み込むことで、葉におけるＴｕＭＶの成長及び拡散、ひいては、ＴｕＭＶ特異的サイレンシング分子のウイルスに対するサイレンシング有効性をモニタリングすることが可能になった。
ＴＡＳ１ｂのＲｄＲｐ依存性転写を生成するアンプリファイアはｍｉＲ１７３である。従って、ＴｕＭＶ－ＧＦＰベクターをｍｉＲ１７３アンプリファイアの有り／無しで同時に浸透させ、アンプリファイアが存在する場合にＴｕＭＶを標的とするｄｓＲＮＡのサイレンシング活性が見られると予測した。
陰性対照として、特定の既知の標的を有しない「ＧＥｉＧＳ設計」を過剰発現させるためのベクター（「ダミー」又は「ＧＥｉＧＳ－ダミー」とも称される）を葉に浸透させた（すなわち、「ＧＥｉＧＳ－ＴｕＭＶ」で変化した箇所に対応するが、ベンサミアナタバコにおける任意の既知の遺伝子には対応していない箇所にヌクレオチド変化を有するＴＡＳ１ｂに基づくｄｓＲＮＡ）。ダミー対照又は「ＧＥｉＧＳ－ＴｕＭＶ」ｄｓＲＮＡを発現するベクターの両方を、アンプリファイアの有り無しで葉に浸透させた。浸透した接種材料のレベルを処理間で一定に保つために、特定の成分を含まない処理では空のアグロバクテリウムを使用した（以下の表６を参照）。
Figure 2022524864000017
図１１Ａから分かるように、２つの異なる処理を並んだそれぞれの葉に浸透させ、葉の各面におけるＧＦＰレベル（ＴｕＭＶレベルに対応）を測定した（この観察結果をｑＲＴ－ＰＣＲ分析によって更に確認した）。各処理を少なくとも３回繰り返し、ＵＶ光下で観察し、写真撮影のために１枚を犠牲にした。
１枚の葉（葉１）では、発現しているベクター（＋ＴｕＭＶ）を浸透させ、ＴｕＭＶを浸透させなかった処理（－ＴｕＭＶ）とＧＦＰレベルを比較した。予想通り、ウイルスが存在しないときにバックグラウンドの蛍光は存在しなかった。２枚目の葉（葉２）では、ＴｕＭＶ－ＧＦＰウイルスをアンプリファイアであるｍｉＲ１７３の有り（＋ｍｉＲ１７３）又は無し（－ｍｉＲ１７３）で浸透させたところ、ｍｉＲ１７３単体ではウイルスの複製に影響を与えないことが実証された（ｑＲＴ－ＰＣＴによる相対発現の測定値に対して著しい影響を有していなかったため）。３枚目の葉（葉３）及び４枚目の葉（葉４）では、ＴｕＭＶウイルスを発現しているベクターを、既知の遺伝子を標的としないｄｓＲＮＡ（ＧＥｉＧＳ－ダミー）又はウイルスを標的とするように変化したｄｓＲＮＡ（ＧＥｉＧＳ－ＴｕＭＶ）のいずれかを発現しているコンストラクトと共に浸透させた。これは、アンプリファイア無し（葉３）又は有り（葉４）のいずれかで行った。
アンプリファイアの存在下（葉４）では、図１１Ａにおける相対発現によって示される通り、ダミー処理と比較して、ＴｕＭＶ転写物の明らかな有意な減少及び視覚的なＧＦＰシグナルの減少が観察された。ＧＥｉＧＳ－ＴｕＭＶコンストラクト（アンプリファイア無し）を浸透させたときに葉３で観察されたＧＦＰレベルのわずかな低下は、ｑＲＴ－ＰＣＲ分析により、ばらつきが大きすぎて有意とはみなされないと判定された。
ＴｕＭＶ－ＧＦＰ融合体を発現するベクター、アンプリファイア、及びｄｓＲＮＡコンストラクトを発現するベクター（ＴｕＭＶを標的とする「ＧＥｉＧＳ－ＴｕＭＶ」又は既知の遺伝子を標的としない「ＧＥｉＧＳ－ダミー」のいずれか、以下の表７を参照）を浸透させることによって、上述の系を用いて、葉全体に浸透させた（図１１Ｂ）。対照として、ベクター無しのアグロバクテリウムを浸透させた葉を使用した。ＧＥｉＧＳ－ＴｕＭＶ ｄｓＲＮＡを使用した場合、ＧＦＰレベルの明らかな低下が観察されたが、ＧＥｉＧＳ－ダミーでは観察されなかった。これにより、ＧＥｉＧＳ設計及びアンプリファイア遺伝子がＴｕＭＶの複製に及ぼす影響が強調された。
Figure 2022524864000018
これら結果から、アンプリファイア依存性ｔａｓｉＲＮＡ経路の許容されているモデルから予測される通り、ＴＡＳ遺伝子及びアンプリファイアのサイレンシングの誘導における役割が確認された。更に、これら結果から、（例えば、ｄｓＲＮＡをコードしている遺伝子に所望のヌクレオチド変化を導入し、それによって、選択した標的をサイレンシングするようにｄｓＲＮＡをリダイレクトすることによって）有害生物における選択した標的の遺伝子発現をサイレンシングするために、植物におけるＧＥｉＧＳを用いて変化させたｄｓＲＮＡの発現の実現可能性が更に確認された。
実施例６
植物内における線形動物の遺伝子を標的とする長鎖ｄｓＲＮＡの発現は、線形動物におけるその標的遺伝子のサイレンシングを誘導する
この実験は、植物で発現し、有害生物遺伝子（例えば、線形動物遺伝子）を標的とするようにリダイレクトされたサイレンシングｄｓＲＮＡ分子（例えば、ＴＡＳ遺伝子から発現した）が、有害生物（例えば、線形動物）においてその標的遺伝子のサイレンシングを誘導できることを実証することを意図していた。
そのようにするために、一過的な発現系を用いて、上述の通り、ベンサミアナタバコの葉で試験したｄｓＲＮＡ分子を発現させ、それを、アグロバクテリウムが媒介する葉への浸透によって葉に導入した。次いで、後述する通り、葉の抽出物を線形動物に給餌し、標的遺伝子の発現に対する影響を調べた。
線形動物であるジャガイモシスト線虫におけるリボソームタンパク質３ａ及びスプライセオソームＳＲタンパク質遺伝子を標的とすることを通じて分析を行った。具体的には、ヌクレオチド変化が導入されたＴＡＳ３ａ転写物を過剰発現するベクターを含むアグロバクテリウムを、ベンサミアナタバコの葉に浸透させた。このヌクレオチド変化によって、ＴＡＳ３ａ転写物のサイレンシング特異性がこれら線形動物遺伝子のうちの１つに向けて少なくとも部分的にリダイレクトされた。遺伝子におけるＤＮＡ切断を誘導し（例えば、Ｃａｓ９等のエンドヌクレアーゼ及び特定のｓｇＲＮＡを使用）、所望のヌクレオチド変化を含むＧＥｉＧＳドナーオリゴヌクレオチドとの相同性依存性組換え（ＨＤＲ）を介して遺伝子に変化を導入することによって、遺伝子編集誘導遺伝子サイレンシング（ＧＥｉＧＳ）を用いて、対応する変化を植物細胞内のＴＡＳ３ａ遺伝子に導入することができた。リボソームタンパク質３ａに対する特異性をＴＡＳ３ａ遺伝子に導入するために使用することができるＧＥｉＧＳオリゴ及びｓｇＲＮＡ配列の配列は、上記の実施例３に提供されている。
対照として、ＴＡＳ３ａの野生型転写物も葉に浸透させた。対照であるＴＡＳ３ａ及び線形動物の遺伝子を標的とするように改変されたＴＡＳ３ａを浸透させた葉の両方に、アンプリファイアであるｍｉＲ３９０を更に浸透させた。
４８時間後及び７２時間後に葉を回収し、全ＲＮＡを抽出し、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ ０．５ｍＬ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒｓ ３ＫＤ ｃｕｔ－ｏｆｆ（Ｍｅｒｃｋ，ＵＳＡ）でクリーニングした。ジャガイモシスト線虫である線形動物にこの全ＲＮＡを後述の通り７２時間給餌し、回収した。ＲＮＡを抽出し、内因性のノーマライザー遺伝子としてアクチンを用いて、ｑＲＴ－ＰＣＲによる遺伝子発現解析を行った。リボソームタンパク質３ａ（図１２Ａ）及びスプライセオソームＳＲタンパク質（図１２Ｂ）は、いずれも植物内給餌線形動物試験で発現レベルが著しく低下することが示された。リボソームタンパク質３ａの発現は７×１０－５のＴ検定有意性で減少し、スプライセオソームＳＲタンパク質の発現は１．７２×１０－３のＴ検定有意性で減少することが示され、これは、標的とされる遺伝子が有意にサイレンシングされたことを示し、次の世代で線形動物の成長の低下を示すはずである。
これら結果は、線形動物遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡの形成につながった、Ｔａｓ３ａに対して行った改変が、このようなｄｓＲＮＡに対して感受性である病原体を標的とすることができることを実証する。
また、線形動物の給餌に使用したＲＮＡ抽出物は、ＲＮＡ－ｓｅｑ及びｓｍａｌｌ ＲＮＡ－ｓｅｑ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ；図１３Ａ～Ｄ）でも分析した。分析は、方法に記載の通り行った。リボソームタンパク質３ａ（図１３Ａ及び１３Ｂ）及びスプライセオソームＳＲタンパク質（図１３Ｃ及び１３Ｄ）を標的とすることを目的としたＧＥｉＧＳ設計の配列に対して、シーケンスリードをアラインメントした。アライメントは、センス及びアンチセンスの両鎖に対して行った。分析によって、長いＲＮＡｓｅｑリード（図１３Ａ及び１３Ｃ）及び短いｓｍａｌｌ ＲＮＡｓｅｑリード（図１３Ｂ及び１３Ｄ）の解析を通して、長鎖二本鎖ＲＮＡを作製する能力を有する転写物の両鎖の存在が確認された。５０ヌクレオチドよりも長いリードを用いてＲＮＡ－ｓｅｑ解析を行ったため、この解析では長鎖二重鎖ＲＮＡが同定された。更に、２０～２４塩基の配列をフィルタリングすることを通して低分子ＲＮＡ解析を行ったところ、長鎖ｄｓＲＮＡのフェーズドプロセシングが実証され、二次ｓｉＲＮＡの形成が確認された（図１３Ｂ及び１３Ｄ）。
本発明をその具体的な実施形態と併せて説明してきたが、当業者には多くの代替例、改変例、及び変形例が明らかになることは明白である。従って、添付の特許請求の範囲の趣旨及び広義の範囲内の全てのこのような代替例、改変例、及び変形例を包含することが意図される。
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、それぞれの個々の刊行物、特許、又は特許出願が参照により本明細書に援用されることが具体的かつ個別に示されているかのように、その全体が本明細書に援用される。更に、本出願において任意の参考文献を引用又は特定することは、このような文献が本発明の先行技術として利用可能であることを認めると解釈されるものではない。章の見出しが使用されている限りにおいて、それは必ずしも限定的であると解釈されるべきではない。
また、本出願の任意の優先権書類（複数可）は、その全体が参照により本明細書に援用される。
参照文献
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Ｌｉ，Ｊ．，Ｔｏｄｄ，Ｔ．ａｎｄ Ｔｒｉｃｋ，Ｈ．（２００９）．Ｒａｐｉｄ ｉｎ ｐｌａｎｔａ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｏｏｔ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓ ｉｎ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｓｏｙｂｅａｎ ｐｌａｎｔｓ．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，２９（２），ｐｐ．１１３－１２３．

Claims (50)

  1. 有害生物遺伝子をサイレンシングすることができる長鎖ｄｓＲＮＡ分子を植物細胞内で生成する方法であって、
    （ａ）標的として植物遺伝子を有するサイレンシング分子であって、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）を動員することができるサイレンシング分子をコードしている核酸配列を植物のゲノムにおいて選択することと；
    （ｂ）前記有害生物遺伝子に対するサイレンシング特異性を付与するために前記植物遺伝子の核酸配列を改変し、その結果、前記サイレンシング特異性を有する前記植物遺伝子の転写物が、前記ＲｄＲｐを動員することができる前記サイレンシング分子と塩基相補を形成して、前記有害生物遺伝子をサイレンシングすることができる長鎖ｄｓＲＮＡ分子を生成し、
    それによって、前記有害生物遺伝子をサイレンシングすることができる長鎖ｄｓＲＮＡ分子を前記植物細胞内で生成することと、
    を含む方法。
  2. 前記ＲｄＲｐを動員することができる前記サイレンシング分子が、２１～２４ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ＲｄＲｐを動員することができる前記サイレンシング分子が、トランス作用性ｓｉＲＮＡ（ｔａｓｉＲＮＡ）、フェーズド低分子干渉ＲＮＡ（ｐｈａｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ結合ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、低分子核内ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、低分子核小体ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、細胞外ＲＮＡ（ｅｘＲＮＡ）、リピート由来のＲＮＡ、自律性及び非自律性の転位性ＲＮＡからなる群から選択される、請求項１～２のいずれか一項に記載の方法。
  4. 前記ｍｉＲＮＡが、２２ヌクレオチドの成熟低分子ＲＮＡを含む、請求項３に記載の方法。
  5. 前記ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ－１５６ａ、ｍｉＲ－１５６ｃ、ｍｉＲ－１６２ａ、ｍｉＲ－１６２ｂ、ｍｉＲ－１６７ｄ、ｍｉＲ－１６９ｂ、ｍｉＲ－１７３、ｍｉＲ－３９３ａ、ｍｉＲ－３９３ｂ、ｍｉＲ－４０２、ｍｉＲ－４０３、ｍｉＲ－４４７ａ、ｍｉＲ－４４７ｂ、ｍｉＲ－４４７ｃ、ｍｉＲ－４７２、ｍｉＲ－７７１、ｍｉＲ－７７７、ｍｉＲ－８２８、ｍｉＲ－８３０、ｍｉＲ－８３１、ｍｉＲ－８３１、ｍｉＲ－８３３ａ、ｍｉＲ－８３３ａ、ｍｉＲ－８４０、ｍｉＲ－８４５ｂ、ｍｉＲ－８４８、ｍｉＲ－８５０、ｍｉＲ－８５３、ｍｉＲ－８５５、ｍｉＲ－８５６、ｍｉＲ－８６４、ｍｉＲ－２９３３ａ、ｍｉＲ－２９３３ｂ、ｍｉＲ－２９３６、ｍｉＲ－４２２１、ｍｉＲ－５０２４、ｍｉＲ－５６２９、ｍｉＲ－５６４８、ｍｉＲ－５９９６、ｍｉＲ－８１６６、ｍｉＲ－８１６７ａ、ｍｉＲ－８１６７ｂ、ｍｉＲ－８１６７ｃ、ｍｉＲ－８１６７ｄ、ｍｉＲ－８１６７ｅ、ｍｉＲ－８１６７ｆ、ｍｉＲ－８１７７、及びｍｉＲ－８１８２からなる群から選択される、請求項３又は４に記載の方法。
  6. 前記植物遺伝子が、非タンパク質コード遺伝子である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記植物遺伝子が、ネイティブの植物遺伝子に対する内在性のサイレンシング活性を有する分子をコードしている、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記工程（ｂ）の改変が、前記植物遺伝子のサイレンシング特異性を、ネイティブの植物遺伝子とは異なる前記有害生物遺伝子に向けてリダイレクトするＤＮＡ編集剤を植物細胞に導入することを更に含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記内在性のサイレンシング活性を有する前記植物遺伝子が、トランス作用性ｓｉＲＮＡ（ｔａｓｉＲＮＡ）、フェーズド低分子干渉ＲＮＡ（ｐｈａｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ結合ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、低分子核内ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、低分子核小体ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、細胞外ＲＮＡ（ｅｘＲＮＡ）、自律性及び非自律性の転位性ＲＮＡからなる群から選択される、請求項７又は８に記載の方法。
  10. 前記内在性のサイレンシング活性を有する前記植物遺伝子が、フェーズド二次ｓｉＲＮＡ生成分子をコードしている、請求項７～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記内在性のサイレンシング活性を有する前記植物遺伝子が、トランス作用性ｓｉＲＮＡ生成（ＴＡＳ）分子である、請求項７～９のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記植物遺伝子のサイレンシング特異性が、前記有害生物遺伝子の転写物レベルを測定することによって判定される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記植物遺伝子の前記サイレンシング特異性が、表現型的に判定される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記表現型的な判定が、前記植物の有害生物抵抗性の判定によって行われる、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記植物遺伝子のサイレンシング特異性が、遺伝子型的に判定される、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 植物の表現型が、植物の遺伝子型の前に判定される、請求項１５に記載の方法。
  17. 植物の遺伝子型が、植物の表現型の前に判定される、請求項１５に記載の方法。
  18. 有害生物遺伝子をサイレンシングすることができる長鎖ｄｓＲＮＡ分子を植物細胞内で生成する方法であって、
    （ａ）前記有害生物遺伝子の核酸配列に対して所定の配列相同性を示す植物遺伝子の核酸配列を選択することと；
    （ｂ）前記植物遺伝子に対するサイレンシング特異性を付与するために、ＲＮＡ分子をコードしている植物の内因性核酸配列を改変し、その結果、前記ＲＮＡ分子からプロセシングされたＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）を動員することができる低分子ＲＮＡ分子が、前記植物遺伝子の転写物と塩基相補を形成して、前記有害生物遺伝子をサイレンシングすることができる長鎖ｄｓＲＮＡ分子を生成し、
    それによって、前記有害生物遺伝子をサイレンシングすることができる長鎖ｄｓＲＮＡ分子を前記植物細胞内で生成することと、
    を含む方法。
  19. 前記所定の配列相同性が、７５～１００％の同一性を含む、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記ＲｄＲｐを動員することができる前記低分子ＲＮＡ分子が、２１～２４ヌクレオチドを含む、請求項１８～１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記ＲｄＲｐを動員することができる前記低分子ＲＮＡ分子が、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ結合ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、トランス作用性ｓｉＲＮＡ（ｔａｓｉＲＮＡ）、フェーズド低分子干渉ＲＮＡ（ｐｈａｓｉＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、低分子核内ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、低分子核小体ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、細胞外ＲＮＡ（ｅｘＲＮＡ）、リピート由来のＲＮＡ、自律性及び非自律性の転位性ＲＮＡからなる群から選択される、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記ＲＮＡ分子が、ネイティブの植物遺伝子に対する内在性のサイレンシング活性を有する、請求項１８～２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記工程（ｂ）の改変が、前記ＲＮＡ分子のサイレンシング特異性を、ネイティブの植物遺伝子とは異なる前記植物遺伝子に向けてリダイレクトするＤＮＡ編集剤を前記植物細胞に導入することを含む、請求項１８～２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記有害生物遺伝子の核酸配列に対して前記所定の配列相同性を示す前記植物遺伝子が、サイレンシング分子をコードしていない、請求項１８～２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記ＲＮＡ分子の前記サイレンシング特異性が、前記植物遺伝子又は前記有害生物遺伝子の転写物レベルを測定することによって判定される、請求項１８～２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記ＲＮＡ分子のサイレンシング特異性が、表現型的に判定される、請求項１８～２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記表現型的な判定が、前記植物の有害生物抵抗性の判定によって行われる、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記ＲＮＡ分子のサイレンシング特異性が、遺伝子型的に判定される、請求項１８～２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 植物の表現型が、植物の遺伝子型の前に判定される、請求項２８に記載の方法。
  30. 植物の遺伝子型が、植物の表現型の前に判定される、請求項２８に記載の方法。
  31. 前記ＤＮＡ編集剤が、少なくとも１つのｓｇＲＮＡを含む、請求項８～１７又は２３～３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記ＤＮＡ編集剤が、エンドヌクレアーゼを含まない、請求項８～１７又は２３～３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記ＤＮＡ編集剤が、エンドヌクレアーゼを含む、請求項８～１７又は２３～３１のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記ＤＮＡ編集剤が、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、ｄＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、及びホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択されるＤＮＡ編集系のものである、請求項８～１７又は２３～３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９を含む、請求項３３又は３４に記載の方法。
  36. 前記ＤＮＡ編集剤が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＲＮＰとして細胞に適用される、請求項８～１７又は２３～３５のいずれか一項に記載の方法。
  37. 前記植物細胞が、プロトプラストである、請求項１～３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. ｄｓＲＮＡ分子が、細胞内ＲＮＡｉプロセシング機構によってプロセシング可能である、請求項１～３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. ｄｓＲＮＡ分子が、二次低分子ＲＮＡにプロセシングされる、請求項１～３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記ｄｓＲＮＡ及び／又は前記二次低分子ＲＮＡが、有害生物遺伝子に対するサイレンシング特異性を有する、請求項１～３９のいずれか一項に記載の方法。
  41. 有害生物耐性又は抵抗性植物を作製する方法であって、請求項１～４０のいずれか一項に従って有害生物遺伝子をサイレンシングすることができる長鎖ｄｓＲＮＡ分子を植物細胞内で生成することを含む方法。
  42. 前記有害生物が、無脊椎動物である、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記有害生物が、ウイルス、アリ、シロアリ、ミツバチ、スズメバチ、芋虫、コオロギ、トノサマバッタ、カブトムシ、カタツムリ、ナメクジ、線形動物、ゴキブリ（ｂｕｇ）ハエ、ショウジョウバエ、コナジラミ、カ、バッタ、ウンカ、ハサミムシ、アブラムシ、カイガラムシ、ツリガネムシ、クモ、ダニ、キジラミ、マダニ、ガ、毛虫、サソリ、及び真菌からなる群から選択される、請求項４１又は４２に記載の方法。
  44. 請求項１～４３のいずれか一項に記載の方法によって生成される植物。
  45. 作物、花卉、雑草、及び樹木からなる群から選択される、請求項４４に記載の植物。
  46. 非トランスジェニックである、請求項４４又は４５に記載の植物。
  47. 請求項４４～４６のいずれか一項に記載の植物の細胞。
  48. 請求項４４～４６のいずれか一項に記載の植物の種子。
  49. 有害生物耐性又は抵抗性植物を生成する方法であって、
    （ａ）請求項４４～４６のいずれか一項に記載の植物を育種することと；
    （ｂ）前記有害生物遺伝子を抑制することができる長鎖ｄｓＲＮＡ分子を発現し、かつ前記ＤＮＡ編集剤を含まない後代植物を選択し、
    それによって、前記有害生物耐性又は抵抗性植物を生成することと、
    を含む方法。
  50. 請求項４４～４７のいずれか一項に記載の植物又は植物細胞を生成する方法であって、繁殖を可能にする条件下で前記植物又は植物細胞を成長させることを含む方法。
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