JP2022524537A - 脂質付加タンパク質性構造の調製のためのプロセス - Google Patents

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Abstract

本発明は、酵素カップリングを使用する、生体分子、酵素タグ、親水性スペーサー、リンカー、および親油性部分を含む抱合体の調製のためのプロセスに関する。

Description

本発明は、純粋な（neat）水性分散液に可溶でありながら、疎水性表面および膜との強い相互作用を示すペプチドおよびタンパク質－脂質抱合体の調製のためのプロセスに関する。かかるプロセスによって得られた抱合体は、疎水性ポリマー表面の表面工学、薬物送達システム、および細胞に使用可能である。
本発明は、酵素カップリングを使用する、生体分子、酵素タグ、親水性スペーサー、リンカー、および親油性部分を含む抱合体の調製のためのプロセスに関する。生体分子に抱合された親油性部分は、生体分子を、疎水性ポリマー表面、脂質ベースの薬物送達システム（リポソームなどのＤＤＳ）の表面、または生細胞全体のいずれかに固定するために利用される［１］。
薬物送達システムへの生体分子の固定は、細胞への標的薬物送達を達成する目的を有し、これは、担体にカプセル化された薬物がリガンド－標的相互作用を介して所望の細胞型に対して向けられることを意味する。この相互作用を使用して、薬物の薬物動態ならびに薬力学的特性が改善され得る。これは、特にがん細胞に対する毒性化合物の送達を含み得る。
細胞への生体分子の固定は、養子細胞移入を含む治療に特に関係がある。ここで、患者または別の個体に由来する幹細胞または免疫細胞などの細胞は、ex vivoで培養および改変され、次いで患者に戻される。典型的な治療用途は、がん免疫治療、自己免疫疾患、再生医療、および組織工学を含む。これらの治療領域は、関与する細胞の表面が超生理学的方法で改変されている場合、例として、サイトカインの固定による免疫治療中［２］、間葉系幹細胞の増加した走化性をもたらすリガンドの固定による再生治療中［３、４］、または細胞への抗原および酵素の固定による自己免疫疾患の処置中［５、６］、利益になり得る。
遺伝子工学は細胞膜工学に使用され得、それによってこれに続く娘細胞に遺伝的継承可能性を提供するか、または細胞外および細胞内の改変を同時に達成する可能性を提供する。しかしながら、遺伝子工学はいくつかの欠点に悩まされている。これらは、免疫原性反応、過剰活性化（構成的発現に起因する［７］）、またはde novo腫瘍発生［８、９］の原因となり得るウイルスベクターの使用を含む。遺伝子工学は、形質導入またはトランスフェクションの効率に強く依存し、これは予測が困難である。ゆえに、改変された細胞の治療的有効性は、一貫性のない治療的有効性を示し得る。また、改変はすべての細胞型（例として、ゆっくりと分裂する細胞［１］）で可能ではない。最終的に、遺伝子工学は永続的かつ不可逆的な固有の改変をもたらすが、これはすべての治療的な例で所望されるわけではない［１］。
非遺伝的方法は、細胞表面の遺伝子工学の重要な代替手段であり、細胞膜への構造の共有結合の抱合または疎水性挿入に基づく改変に分けることができる。共有結合の抱合は、細胞表面上に存在する反応性構造を利用して、所望の構造を結合させる［１］。これらの化学的方法の主な欠点は、カルボン酸、システイン、リジン、または炭水化物構造などの多数の可能な反応部位が生物活性結合剤および細胞表面の結合に関与するため、その結果得られる不均一な抱合産物である。したがって、タンパク質を細胞表面に抱合させるために、部位特異的クリックケミストリー［１０、１１］も用いられた。これらの部位特異的化学反応は、細胞表面上の好適なアクセサー（accessor）分子のいずれかの（遺伝的）導入を必要とするか、または潜在的に毒性のある触媒を必要とし得るか、または依然としていくつかの副産物をもたらし得る［１０］。
疎水性挿入は、細胞表面上の存在している構造の直接的な改変を回避するための選択肢である［１］。それは、単離された反応としての生物活性結合剤の脂質付加、およびこれに続く親和性をベースとした、脂質付加構造の膜の二重層への自発的な挿入を伴う。リポソーム薬物送達システムも二重層構造上に構築されているため、それらの膜は脂質付加生体分子で改変することもできる。このプロセスは一般的に「挿入後（post-insertion）」と呼ばれる［１２］。
疎水性挿入を介した細胞膜への化合物の固定は、非毒性であると記載されている。また、挿入された分子は細胞膜の動的な運動に関与し得る［１］。共有結合の結合と比較して、疎水性挿入は、反応有効性からの細胞改変の程度の依存性を回避する。また、細胞膜の可動性の低減または細胞表面上に存在する機能的構造の変更などの生理学的な変更が軽減される［１］。疎水性挿入は、ポリエチレングリコール［１３、１４］、グリカン［１５］、オリゴヌクレオチド［６］、およびペプチドまたはタンパク質［４、１６－１９］による細胞膜改変を達成するためにいくつかの報告で使用された。タンパク質の脂質付加および細胞挿入に関する上記の報告は、細胞膜工学の有望なプロセスおよび結果を示す。しかしながら、いくつかの主な不利な点が適切な使用（例として、ヒトの細胞治療中の細胞膜リモデリングのため）を妨げている。Martinらは、ステロール様脂質アンカーによるペプチドの脂質付加を報告した［１７］。このステップは固相で行われ、反応がＰｙＢＯＰ（ベンゾトリアゾール－１－イル－オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート）／ＨＯＢＴ（ヒドロキシベンゾトリアゾール）活性化ステップに基づいていたため、カルボン酸の保護基の広範な使用を含む厳しい反応条件を必要とした。また、ジメチルホルムアミドなどの有機溶媒を必要とした。したがって、この手順は、いくつかの反応部位を有し、アミノ酸側鎖の選択的保護が可能ではない大きなタンパク質には適用できない。さらにまた、かかる大きなタンパク質の脂質付加手順を使用することから、多種多様な副産物が期待され得る。
再生的な様式で心筋梗塞の処置を改善するために、Wonらは、組換えＣＸＣケモカイン受容体４（ＣＸＣＲ４）を２つの疎水性飽和ミリスチル鎖を有するＰＥＧ化脂質に抱合させ、疎水性挿入によって間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の表面を改変した［４］。これは、in vitroアッセイでそのように改変されたＭＳＣの遊走を改善し、よって心筋の虚血部位へのＭＳＣのホーミングを潜在的に増加させる［１］。ＣＸＣＲ４は、利用されているマレイミド改変脂質との反応にアクセス可能である８つのシステインを有するため、脂質改変後に脂質付加ＣＸＣＲ４または複数の抱合種の多様な構造異性体が期待され得る［４］。これらは種々の生物活性を有し得るか、または挿入された構造と細胞二重層との種々の相互作用をもたらし得る。これは、続いて、受容体の結合領域の種々の立体的アクセス可能性をもたらし得、最終的にそれぞれのリガンドの潜在的に低減された結合をもたらし得る。別の研究では、同じグループがジミリスチル化ＰＥＧ化脂質を市販製品のKadcyla（登録商標）と同様の抗体薬物複合体に抱合させた［２０］。脂質は、疎水性アンカーとしてのジミリスチルモチーフおよび記載されていない長さのポリエチレングリコールスペーサーから構成され、その末端のカルボン酸基は、カルボジイミド－ＮＨＳ化学を介して活性化された。この構造は、タンパク質のリジンの側鎖の第一級アミンに対して優先的に結合し、そのうち８８から７０までが、Kadcyla（登録商標）の抗体で反応性であると記載されている［１０］。避けられない不均一性は、治療、安全性、さらには規制／分析の視点から複数の懸念をもたらす。
かかる不均一性は、好適な部位選択的な抱合戦略によって軽減され得る。生体分子の脂質付加のためのソルターゼ媒介ペプチド転移は、上記の問題をカバーする有望なアプローチである。なぜならば、反応は著しい多用途性を有し、抱合は穏やかな反応条件で実行可能であり、定義されたアミノ酸タグ間の抱合に起因する固有の部位特異性を有するためである。ソルターゼの酵素ファミリーはトランスペプチダーゼに属し、本来はグラム陽性細菌のハウスキーピング酵素として発見され、ペプチドグリカン層上のタンパク質の固定を媒介する［２１］。Staphylococcus aureusに由来するソルターゼＡ変異体は、標的タンパク質のＣ末端ＬＰｘＴＧモチーフ（ロイシン－プロリン－任意のアミノ酸－スレオニン－グリシン）を認識し、酵素の触媒中心におけるスレオニンおよびシステインとチオアシル中間体を形成する［２１］。
式１：ソルターゼＡ媒介ペプチド転移の一般的なスキーム
Figure 2022524537000002
グリシンに対するアミド結合は切断され、続いてペプチド転移反応を介して、（例として、オリゴグリシン［２１］または他の第一級アミン［２２、２３］の）入ってくる求核性Ｎ末端と置き換わる。
疎水性挿入ベースの細胞膜工学へのかかるソルターゼＡベースの抱合戦略を実施する試みは、Antosらによって行われた［１６］。AntosらはトランスペプチダーゼソルターゼＡを使用して、１０～２２個の範囲に及ぶ炭素のトリグリシン改変アルキル鎖、ならびにトリグリシン改変コレステロール、およびアダマンタン誘導体をＬＰＥＴＧ改変ｅＧＦＰ（増強緑色蛍光タンパク質（モデルタンパク質））に結合させた。それらは、脂質アンカーとして使用されるコレステロールと同様に、脂質付加ｅＧＦＰと１４個の炭素原子以上のアルキル鎖長の細胞との効率的な会合を示した。しかしながら、アダマンタン脂質付加ｅＧＦＰと細胞二重層との会合は見られなかった。これらの有望な結果にもかかわらず、Antosらによって実証された研究はいくつかの不利な点を有する。最初に、単一の脂質鎖のみがタンパク質に結合したが、以前の報告は、膜におけるタンパク質性構造の信頼性が高く安定した固定のための２つの脂質鎖の要件を述べていた［２４、２５］。おそらく、Antosらは、単一の脂質鎖改変の利用により、タンパク質脂質付加中の主な課題である可溶性の問題を回避した。長鎖アンカーのこれらの可溶性の問題は、細胞相互作用の最も有望なアンカーであるＣ２２アルキル鎖によるｅＧＦＰの脂質付加中の界面活性剤品質（detergence）のｎ－ドデシルマルトシドの使用によってさらに軽減された。タンパク質の脂質付加中の界面活性剤の利用は、界面活性剤および脂質構造の両方が同様の極性（例としてクロマトグラフィーによる適切な精製を妨げ得るもの）を有するため、好ましくない。同様に、脂質付加産物からの界面活性剤の欠乏は、得られた産物の疎水性に起因して安定性の問題をもたらし得る。最終的に、界面活性剤は毒性があり、（例としてヒトの自家治療中）細胞での脂質付加産物の利用を妨げ得るか、または界面活性剤は変性を通じて脂質付加タンパク質の完全性に影響を与え得る。コレステロールまたはＣ２２アルキル鎖アンカーのいずれかで脂質付加されたｅＧＦＰは、５時間後に種々の細胞株で顕著な内在化を示したため、これらの脂質アンカーが細胞膜の外側を安定的に再構築するための好適なツールとして機能するかどうかも疑わしい。また、脂質アンカーとタンパク質との間にスペーサーが利用されていないため、細胞表面上に固定化された潜在的な結合剤がそれらの標的構造にアクセス可能であるかどうかは疑わしい場合がある［２６］。Antosらによって実証されたプロセスの別の欠点は、親和性ベースの精製方法である。ｅＧＦＰおよびソルターゼＡの両方がＨｉｓ６タグを有し、このＨｉｓ６タグは脂質との反応中にｅＧＦＰから切断されるため、１ＭのＮａＣｌおよび４０ｍＭのイミダゾールを含むＮｉ－ＮＴＡ樹脂を使用してすべてのＨｉｓ６タグ付きタンパク質を結合させ、続いて除去した。この戦略は、反応バルクにおいて存在する他の化合物、とりわけ非抱合脂質も除去する必要があることを無視している。したがって、Antosらによって提示されたプロセスは、（例としてin vivo研究または細胞治療中の）脂質付加産物の利用に好適ではない開示された形態である。
Nagamuneらは、トリグリシン脂質（疎水性部分とトリグリシンユニットとの間にポリエチレングリコールスペーサーを含む）の細胞への疎水性挿入と、これに続くソルターゼＡによって媒介されるＬＰＥＴＧ改変タンパク質の抱合とを組み合わせた［１９、２７］。したがって、このプロセスは、細胞膜工学のための疎水性挿入および共有結合の抱合戦略の組み合わせと見なされ得る。著者は、ｅＧＦＰががん細胞株のトリグリシン改変膜に成功裏に抱合され得ることを報告した。加えて、免疫グロブリンのＦｃフラグメントの抱合は、樹状細胞との共インキュベーションを介してがん細胞の増加した食作用をもたらした。疎水性挿入および共有結合の抱合の組み合わされた戦略は穏やかなアプローチであるが、いくつかの重要な不利な点がそれの適切な使用（例としてin vivo処置中）を妨げている。まず、ソルターゼＡは、ＬＰＥＴＧ改変タンパク質を細胞膜の表面［２８］または細胞周囲のマトリックス／流体に存在するＮ末端グリシンに非選択的に抱合させることが知られている。したがって、モデルタンパク質ｅＧＦＰまたはＦｃフラグメントのいずれかと細胞表面タンパク質との様々な抱合体が想定され得るため、ソルターゼＡの主な利点である高度に定義された反応産物の生成が失われる。さらにまた、細胞洗浄後のソルターゼＡの残余の決定は示されなかった。ソルターゼＡは細胞膜などの大きな表面に吸着し得るタンパク質であるため、細胞バルクからの徹底的な欠乏は極めて困難な作業になり得る。ソルターゼＡへの細胞の曝露は、非特異的な吸着をもたらし得［２９］、よって精製後でも細胞表面上に相当な残余をもたらし得る。それらは、細胞からの抱合構造の切断を意味する逆反応、またはより劇的に、細胞の投与時の重篤な免疫反応をもたらし得る。
また、薬物送達システムは、細胞膜工学のための疎水性挿入プロセスに類似したプロセスで改変される。このいわゆる挿入後プロセスは、純粋な（neat）ミセルまたは脂質付加リガンドおよびＰＥＧ化脂質から構成される混合ミセルのいずれかからの脂質付加リガンドの挿入を説明する［１２、３０－３２］。薬物送達システムの標的リガンド［３３］として典型的に用いられるタンパク質性構造の誘導体化は、主に非特異的な化学反応［３１］を介して生じる。今日まで、挿入後の免疫リポソーム調製物の部位選択的な戦略は開示されていないが、リポソーム表面へのリガンドの「in situ」抱合（または「誘導体化後」）のためのいくつかの部位選択的な抱合戦略が明らかにされている［３１］。これらの技術は、以前に利用された非選択的な抱合方法に比べて別個の改善を提供するが、それらは、様々な触媒の要件、使用されるリンカーおよび／または反応産物の未知の毒性、または相当量の副産物などの欠点に依然として悩まされている［１０］。酵素技術はこの問題を改善し得、いくつかの報告は、モデルタンパク質［３４－３６］または標的リガンド［２９、３７、３８］のリポソーム表面への成功した抱合について記載している。しかしながら、酵素は反応バルクから除去するのが難しい場合があり、よって免疫原性および薬物送達システムの安定性（逆反応に起因する）に起因して安全性に潜在的に影響を与え得るため、酵素とのオンサイト抱合は挑戦的である［２９］。
タンパク質性構造の脂質付加とこれに続く薬物送達システムまたは細胞膜の誘導体化について当該技術分野において知られている上に記載のプロセスは、いくつかの不利な点を有し、および／または均質性または純度に関して不十分な特性を有する化学的または細胞の産物のいずれかをもたらす。本発明の目的は、かかる不利な点を克服する好適なタンパク質－脂質抱合体の産生のためのプロセスを提供することであり、これは、それが反応プロセスに由来する残余のない部位選択的に脂質付加された産物、界面活性剤などの添加剤を必要とせずに溶解する産物を生産すべきであること、細胞膜などの複雑な表面に存在するとき、変化しない生物学的機能ならびに活性を提供すべきであることを意味する。
したがって、本発明の１つの目的は、抱合体の調製のためのプロセスに向けられ、ここで、抱合体は、生体分子、酵素タグ、親水性スペーサー、リンカー、および親油性部分を含み、かかるプロセスは、酵素タグ、親水性スペーサー、リンカー、および親油性部分を含む構成要素と、水性媒体における生体分子との酵素カップリング、および抱合体の精製を含む。有利なことに、かかるプロセスは、界面活性剤を使用せずに実行され得る。
本発明のさらなる目的は、これらの分子を、疎水性ポリマー表面、脂質ベースの薬物送達システム、または生細胞の膜などの疎水性環境に挿入することである。
図１は、化学構造式を示す。 図２は、化学反応式を示す。 図３は、実験データを示す。 図４は、実験データを示す。 図５は、実験データを示す。 図６は、実験データを示す。 図７は、実験データを示す。
図８は、実験データを示す。 図９は、実験データを示す。 図１０は、実験データを示す。 図１１は、実験データを示す。 図１２は、模式図を示す。 図１３は、実験データを示す。 図１４は、実験データを示す。
本明細書に使用されるとき、「酵素タグ、親水性スペーサー、リンカー、および親油性部分を含む構成要素」という用語は、「構成要素Ａ」とも呼ばれる。
好ましい態様に従って、生体分子と結合される構成要素Ａを構成する酵素タグ、親水性スペーサー、リンカー、および親油性部分は、それらが言及される順序で連結される（すなわち、酵素タグ－親水性スペーサー－リンカー－親油性部分）。
本明細書に使用されるとき、「a」または「an」は、１以上を意味するものとする。本明細書に使用されるとき、「含む」という語に関連して使用されるとき、「a」または「an」という語は１以上を意味する。本明細書に使用されるとき、「別の」は少なくとも２番目以上を意味する。さらにまた、文脈上別段の必要がない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含む。
本明細書に使用されるとき、「生体分子」という用語は、原則として、およそ３００より大きい分子量を有する天然または合成分子を指し、好ましくは、多糖類またはオリゴ糖類、オリゴペプチドまたはポリペプチド、タンパク質、ペプチド、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、ならびにそれらのグリコシル化脂質誘導体である。最も典型的には、生体分子は、免疫治療剤、抗体またはそのフラグメント、これらの抗体または融合タンパク質を含むフラグメントのいずれかの機能的誘導体である。
本明細書に使用されるとき、「酵素タグ」という用語は、酵素によって認識可能であり、かかる酵素によって触媒される反応の基質としてかかるタグに連結されている分子を識別する部分を指す。酵素と反応するとき、酵素タグは部分的または全体的に除去され得る。本発明において、酵素タグは、かかる酵素タグ、親水性スペーサー、リンカー、および親油性部分を含む構成要素の末端にあり、親水性スペーサーと直接的に連結されている。酵素タグは、かかる構成要素が酵素反応を介して生体分子に結合されることを可能にする。構成要素を生体分子とカップリングした後、酵素タグの部分のすべてまたは一部は、かかるカップリングから生じる抱合体に残る。
本明細書に使用されるとき、「親水性スペーサー」という用語は、親水性であり、それによってかかる抱合体または構成要素Ａにいくらかの親水性を提供する抱合体または構成要素Ａの特定の要素間に存在する部分を指す。本発明において、親水性スペーサーは、酵素タグとリンカーとの間に存在する。本発明で使用される親水性スペーサーは、それが構成要素または抱合体の水溶性を増加させる限り、いかなる限定も受けない。
本明細書に使用されるとき、「リンカー」という用語は、化学的な結合を通じて第１の分子を第２の分子に共有結合的に結合させる共有結合または原子の鎖を含む化学的部分を指す。本発明では、リンカーを使用して、親水性スペーサーを親油性部分と連結する。
本明細書に使用されるとき、「親油性部分」という用語は、脂肪、油、脂質、およびヘキサンまたはトルエンなどの親油性の非極性溶媒に可溶性または混和性である任意の疎水性基を指す。
本明細書に使用されるとき、「精製」という用語は、抱合体ではない、酵素反応を実施した後に培地において存在し得る副反応産物（例として、抱合中に不可避的に出現する酵素基質のフラグメント、酵素自体または反応について必要とされる補因子、または未反応の基質）などの外来要素の量を低減するプロセスステップを指す。精製は、クロマトグラフィー法などの当該技術分野において知られている種々の方法を伴い得、クロマトグラフィーのステップなどの１以上のステップを含み得る。
抱合体において存在する生体分子はポリペプチドである。結果的に、本発明は、生体分子がポリペプチドであるプロセスに向けられる。
本明細書に使用されるとき、「ポリペプチド」という用語は、典型的には、アミド連結によって隣接するアミノ酸のα－アミノ基とカルボキシル基との間のペプチド結合によって互いに接続されたアミノ酸、典型的にはＬ－アミノ酸のポリマーを指し、ここで、アミノ酸残基の数は、約５～約１００万の範囲に及び得る。好ましくは、ポリペプチドは、約１０～約２０００アミノ酸残基、さらにより好ましくは約２０～約５００アミノ酸残基を有する。よって、本明細書に使用されるとき、ポリペプチドは、当該技術分野でオリゴペプチド（５～１０アミノ酸残基）、ポリペプチド（１１～１００アミノ酸残基）、およびタンパク質（１００アミノ酸残基を超える）としばしば呼ばれるものを含む。
生体分子として存在し得る適切なポリペプチドは、抗原、インテグリンおよびカドヘリンを含む細胞接着タンパク質、ペプチドホルモン、特に成長因子、サイトカイン、特にインターロイキン、これらの分子のいずれかに関する受容体、酵素および天然または人工抗体およびそれらのフラグメントを含む。よって、本発明はさらに、「構成要素Ａ」に抱合された生体分子が、抗原、インテグリン、またはカドヘリンなどの細胞接着タンパク質、成長因子などのペプチドホルモン、インターロイキンなどのサイトカイン、これらの分子のいずれかに関する受容体、酵素、または天然または人工抗体またはそれらのフラグメントであるプロセスに向けられる。
本明細書に使用されるとき、「抗原」という用語は、抗体に結合し得る実体またはそのフラグメントを指す。抗原は、生物、特に動物、より特にはヒトを含む哺乳動物において免疫応答を誘導し得る。「抗原」という用語は、抗原の一部を指す抗原決定基またはエピトープとして知られる領域を含む（これは、接触するか、または抗原性または抗原決定基の原因となる抗原の接触残基を支持するのに重要な役割を果たす）。
本明細書に使用されるとき、「細胞接着タンパク質」という用語は、細胞認識部位として構造内に細胞外領域を有し、細胞～細胞相互作用の媒介に関与する細胞接着タンパク質の大きなファミリーを指す。「細胞接着タンパク質」という用語は、天然の供給源または組換え細胞培養からのタンパク質、および合成的に生成された小分子実体およびその薬学的に許容し得る誘導体および塩を含む、接着タンパク質のネイティブな配列の生物学的に活性な等価物を含む。
本明細書に使用されるとき、「インテグリン」という用語は、細胞が細胞外マトリックスに結合し、それに応答することの両方を可能にし、創傷治癒、細胞分化、腫瘍細胞のホーミング、およびアポトーシスなどの様々な細胞機能に関与する細胞接着タンパク質を指す。機能的インテグリンは、非共有結合的に結合しているアルファおよびベータと呼ばれる２つの膜貫通糖タンパク質サブユニットからなる。アルファサブユニットはすべて、ベータサブユニットと同様に、互いにいくつかの相同性を共有している。受容体は常に１つのアルファ鎖および１つのベータ鎖を含む。例は、アルファ６ベータ１、アルファ３ベータ１、アルファ７ベータ１、ＬＦＡ－１などを含む。本明細書に使用されるとき、「インテグリン」という用語。
本明細書に使用されるとき、「カドヘリン」という用語は、タンパク質のカドヘリンスーパーファミリーのメンバーである細胞接着タンパク質を指す。カドヘリンスーパーファミリーは、例えば、古典的なカドヘリンのサブファミリー（その特定の例は、Ｅ－カドヘリン、Ｎ－カドヘリン、およびＰ－カドヘリンを含む）およびデスモソームタンパク質のサブファミリー（その特定の例は、デスモグレイン１、２、および３、およびデスモコリン３を含む）を含む。カドヘリンの天然の供給源は、ヒト、家畜、スポーツ動物、霊長類、齧歯類、およびペット、例えば、ニワトリ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ウシ、ウサギ、マウス、およびラットを含む脊椎動物に見出され得る。
本明細書に使用されるとき、「ペプチドホルモン」という用語は、内分泌機能を有するタンパク質、例えば、インスリン、プロインスリン、副甲状腺ホルモン、リラキシン、プロリラキシン、インスリン、グルカゴン、カルシトニン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、および黄体形成ホルモン（ＬＨ）などの糖タンパク質ホルモンを指す。
本明細書に使用されるとき、成長因子という用語は、細胞成長を刺激することができるタンパク質またはポリペプチドを指す。それらは、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ヒト成長ホルモン（ＨＧＦ）、ＮＧＦβなどの神経成長因子、Ｎ－メチオニルヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、肝成長因子、血小板成長因子；ＴＧＦαおよびＴＧＦβなどの形質転換成長因子（ＴＧＦ）；線維芽細胞成長因子エフリン（Ｅｐｈ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、グリア細胞刺激因子（ＧＳＦ）；マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、および顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）を含むコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；幹細胞成長因子（ＳＣＧＦ）（造血幹細胞因子とも呼ばれる）；間質細胞由来因子（ＳＤＦ）、その有効なフラグメント、およびそれらの組み合わせ；および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を含むが、これらに限定されない。他の成長因子は、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、アンジオポエチン－１、アンジオポエチン－２、ｂ－ＦＧＦ、およびＦＬＴ－３リガンド、およびそれらの有効なフラグメントを含み得る。
本明細書に使用されるとき、「サイトカイン」という用語は、細胞間メディエーターとして別の細胞に作用する、ある細胞集団によって放出されるタンパク質を指す。かかるサイトカインの例は、リンホカインおよびモノカインである。サイトカインに含まれるものは、インターロイキン；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＩＦＮα、ＩＦＮβ、およびＩＦＮγなどのインターフェロン；およびＴＮＦαまたはＴＮＦβである。
本明細書に使用されるとき、「インターロイキン」という用語は、免疫系機能の範囲を制御する免疫細胞によって分泌される様々なサイトカインのいずれかを指す。当業者は、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－１９、ＩＬ－２０、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、ＩＬ－２３、ＩＬ－２４を含むが、これらに限定されない１以上のインターロイキンの存在またはレベルを理解するであろう。
本明細書における「抗体」または「免疫グロブリン」という用語は、最も広い意味で使用され、無傷のモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの無傷の抗体から形成される多重特異性抗体（例として、二重特異性抗体）、および抗体フラグメント（それらが所望の生物活性を示す限り）を具体的にカバーする。用語は、一般に、一緒に連結された異なる結合特異性の２つ以上の抗体またはそのフラグメントから構成されるヘテロ抗体を含む。
それらの定常領域のアミノ酸配列に応じて、無傷の抗体は種々の「抗体（免疫グロブリン）クラス」に割り当てられ得る。無傷の抗体の５つの主なクラス（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ）があり、これらのいくつかは、さらに「サブクラス」（アイソタイプ）（例として、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、およびＩｇＡ２）に分類され得る。種々のクラスの抗体に対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。生体分子として使用される抗体の好ましい主なクラスは、ＩｇＧ、より詳細にはＩｇＧ１およびＩｇＧ２である。
抗体は通常、約１５０，０００の分子量を有する糖タンパク質であり、２つの同一の軽（Ｌ）鎖および２つの同一の重（Ｈ）鎖から構成されている。各軽鎖は、１つの共有結合のジスルフィド結合によって重鎖に連結されているが、ジスルフィド連結の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で変化する。各重鎖および軽鎖は、規則的に間隔を置いた鎖内ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は、一方の端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、これに続きいくつかの定常ドメインが続く。各軽鎖は、一方の端に可変ドメインを有し（ＶＬ）、もう一方の端に定常ドメインを有する。軽鎖の定常ドメインは、重鎖の最初の定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列する。特定のアミノ酸残基は、軽鎖のの可変ドメインと重鎖の可変ドメインとの間の界面を形成すると考えられている。任意の脊椎動物種からの抗体の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる２つの明確に別個のタイプの１つに割り当てられ得る。
「抗体フラグメント」は、無傷の抗体の一部を含み、好ましくはその抗原結合または可変領域を含む。抗体フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｖおよびＦｃフラグメント、二重特異性抗体、線状抗体、単鎖抗体分子；および抗体フラグメント（単数または複数）から形成された多重特異性抗体を含む。「無傷の」抗体は、抗原結合可変領域、ならびに軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）および重鎖定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含むものである。好ましくは、無傷の抗体は、１以上のエフェクター機能を有する。
本明細書に使用されるとき、「人工」という用語は、人間によって設計または調製された、天然には存在しない組成物およびシステムを指す。例えば、人工ポリペプチド（例として、抗体または抗体フラグメント）は、非天然配列（例として、天然に存在するタンパク質またはそのフラグメントと１００パーセントの同一性を有さないポリペプチド）を含むものである。
本明細書に使用されるとき、上の「人工」の定義と一致する「人工抗体」という用語は、天然抗体に見られるものとは別個のアミノ酸配列または化学的構成を有する抗体を指す。人工抗体は、野生型（すなわち、最も豊富）またはその変異体バージョンのいずれかである、天然に存在するタンパク質の部分配列ではない。本明細書に使用されるとき、「人工抗体」は、任意の好適な方法（例として、組換え発現、化学合成、酵素合成、動物全体からの精製など）によって生成または合成され得る。
本発明の好ましい態様に従って、生体分子として使用される抗体は、モノクローナル抗体またはそのフラグメント（単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、可変フラグメント（Ｆｖ）、またはフラグメント抗原結合（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、またはＦ（ａｂ’）２）、ラクダ類または軟骨魚由来の重鎖のみの抗体またはそのフラグメント（ＶＨＨまたはｖＮＡＲなど）など）であり、またはここで、人工ポリペプチドは、ＤＡＲＰｉｎ、アドネクチン、アンチカリン、またはアフィボディである。
本明細書に使用されるとき、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、集団を含む個々の抗体は、少量で存在し得る可能性のある天然に存在する変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に対して向けられている。さらにまた、種々の決定基（エピトープ）に対して向けられた種々の抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して向けられている。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、それらが他の抗体によって汚染されずに合成され得るという点で有利である。モノクローナル抗体を作製するための方法は、Kohler and Milstein (1975, Nature 256, 495)によって、および“Monoclonal Antibody Technology, The Production and Characterization of Rodent and Human Hybridomas” (1985, Burdon et al., Eds, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Volume 13, Elsevier Science Publishers, Amsterdam)において記載されたハイブリドーマ方法を含み、または周知の組換えＤＮＡ方法（例として、US 4,816,567を参照）によって作製され得る。モノクローナル抗体はまた、例えば、Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)およびMarks et al., J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991)に記載された技術を使用してファージ抗体ライブラリーから単離され得る。
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる２つの同一の抗原結合フラグメントを生成し、各々は、単一の抗原結合部位およびＣＬおよびＣＨ１領域、および残余の「Ｆｃ」フラグメントを含み、その名称は容易に結晶化するその能力を反映している。
抗体の「Ｆｃ」領域は、原則として、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＩｇＧ１またはＩｇＧ２抗体の主なクラスのヒンジ領域を含む。ヒンジ領域は、ＣＨ１領域をＣＨ２－ＣＨ３領域と組み合わせた約１５アミノ酸残基の群である。
ペプシン処理は、２つの抗原結合部位を有し、依然として抗原を架橋できる「Ｆ（ａｂ’）２」フラグメントをもたらす。トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、β－メルカプトエチルアミン、またはジチオスレイトールなどの好適な還元剤によるさらなる処理は、Ｆａｂのフラグメントをもたらす。「Ｆｖ」は、完全な抗原認識および抗原結合部位を含む最小の抗体フラグメントである。この領域は、緊密な非共有結合の会合における１つの重鎖および１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。この立体配置において、各可変ドメインの３つの超可変領域（ＣＤＲ）が相互作用して、ＶＨ－ＶＬ二量体の表面に抗原結合部位を定義する。集合的に、６つの超可変領域は抗体に抗原結合特異性を与える。しかしながら、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つの超可変領域のみを含むＦｖの半分）でさえ、結合部位全体よりも親和性は低いものの、抗原を認識して結合する能力を有する。Ｆａｂフラグメントは、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）も含む。「Ｆａｂ’」フラグメントは、抗体ヒンジ領域からの１以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端におけるいくつかの残基の追加によってＦａｂフラグメントとは異なる。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、本来はヒンジシステインをそれらの間に有するＦａｂ’フラグメントのペアとして生成された。
「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、ここで、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖において存在する。好ましくは、ｓｃＦｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にする、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含む。単鎖Ｆｖ抗体は、例えば、Plueckthun (The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)), WO93/16185; US 5,571,894; US 5,587,458; Huston et al. (1988, Proc.Natl. Acad. Sci. 85, 5879)または Skerra and Plueckthun (1988, Science 240, 1038)から知られている。
本明細書に使用されるとき、「重鎖のみの抗体」または「ＨＣＡｂ」という用語は、重鎖を含むが、抗体に通常見られる軽鎖を欠く機能的抗体を指す。ラクダ類動物（ラクダ、ラマ、またはアルパカなど）または軟骨魚（サメ、エイ、またはガンギエイなど）はＨＣＡｂを生成することが知られている。ラクダ類および軟骨魚の抗体は重鎖を含むが、軽鎖を欠いている。ラクダ類動物または軟骨魚に由来するＨＣＡｂは、それぞれ「ラクダ類由来の重鎖のみの抗体」および「軟骨魚由来の重鎖のみの抗体」と呼ばれる。
本明細書に使用されるとき、「ＶＨＨ」という用語は、ラクダ類抗体の重鎖の可変領域を指す。そのため、かかるラクダ類抗体からのＶＨＨ領域は、これらの種の目的の抗原に特異的に結合するために必要とされる最小限の構造要素を表す。ラクダ類ＶＨＨドメインは、高い親和性で抗原に結合し（Desmyter et al. (2001), J. Biol. Chem. 276:26285-90）、溶液において高い安定性を有する（Ewert et al. (2002), Biochemistry 41:3628-36）ことが見出されている。
本明細書に使用されるとき、「ｖＮＡＲ」という用語は、単一の可変の新しい抗原受容体（ＮＡＲ）ドメイン抗体フラグメントを指す。ｖＮＡＲフラグメントは、サメ免疫グロブリンの新しい抗原受容体抗体（ＩｇＮＡＲ）などの重鎖抗体に由来する単一ドメイン抗体フラグメントである。
「設計されたアンキリンリピートタンパク質」または「ＤＡＲＰｉｎ」という用語は、遺伝子工学を介して調製された、標的タンパク質に対して高い特異性および高い結合親和性を有する人工ポリペプチドを指す。ＤＡＲＰｉｎは、天然のアンキリンタンパク質に由来し、少なくとも２つまたは少なくとも３つのアンキリンリピートモチーフ、例えば、３つ、４つ、または５つのアンキリンリピートモチーフが繰り返される構造を有する。例えば、３つ、４つ、または５つのアンキリンリピートモチーフを含むＤＡＲＰｉｎは、それぞれ、約１０ｋＤａ、約１４ｋＤａ、および約１８ｋＤａの分子量を有し得る。ＤＡＲＰｉｎは、構造機能を実施するコア部分、および標的に結合するコアの外側の標的結合部分を含む。コア部分は保存されたアミノ酸配列を含み、標的結合部分は標的に応じて異なるアミノ酸配列を含む。
本明細書に使用されるとき、「アドネクチン」という用語は、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（ＦＮ３）を使用して構築される人工抗体であるモノボディを指す。
本明細書に使用されるとき、「アンチカリン」という用語は、ＧＰＤ１に特異的に結合し、ＧＰＤ１活性を阻害するリポカリンに由来する人工抗体に関する。アンチカリンは、ループおよび結合されたα－ヘリックスによってペアで接続された８つの逆平行ベータストランドによって形成され、天然に存在するリポカリンと共有するバレル構造を有する。
本明細書に使用されるとき、「アフィボディ」という用語は、抗原（例として、ＨＥＲ２のような特定の腫瘍マーカー）との選択的な相互作用の原因となるドメインを含む、１つのポリペプチド鎖から構成される組換えタンパク質を指す（例として、C. Steffen, M. Wikman, V. Tolmachev, G.P. Adams, F.Y. Nilsson, S. Stahl, J. Carlsson: In vitro characterization of a bivalent anti-HER-2 affibody with potential for radionuclide-based diagnostics, CancerBiother. Radiopharm., 20 (2005), pp. 239-248）。これは、別のポリペプチドと結合し得、抗原との結合のためのより良い特性、より高い安定性、および追加の機能（例として、別の物質または固体表面と制御可能に結合する可能性）を保証する。その質量は通常、数キロダルトンから数十キロダルトンの範囲内にある。
好ましい態様に従って、本発明のプロセスにおいて使用される構成要素において存在する生体分子は、ラクダ類の重鎖のみの抗体（ＶＨＨ）の可変ドメインに由来する単一ドメイン抗体である。
生体分子と構成要素Ａとの酵素カップリングは、ソルターゼなどのトランスペプチダーゼの使用によって達成され得る。本発明のプロセスにおいて使用される好ましいトランスペプチダーゼは、ソルターゼＡである。
生体分子と構成要素Ａとのカップリングを可能にするために、生体分子はトランスペプチダーゼの認識シグナルとしてＣ末端モチーフを有する。よって、本発明のプロセスの適切な態様において、生体分子は、酵素タグ、親水性スペーサー、リンカー、および親油性の構成要素部分（構成要素Ａ）を含む構成要素とのそのカップリングの前に、トランスペプチダーゼ、好ましくはソルターゼＡによる酵素抱合にためのＣ末端モチーフを有する。
好適な態様に従って、生体分子は、Ｃ末端モチーフとして、「ロイシン－プロリン－Ｘ－スレオニン－グリシン」（ＬＰＸＴＧ）からなるアミノ酸配列を有する。かかるＣ末端モチーフにおいて、「Ｘ」は、システインおよびトリプトファンを除く任意のタンパク質原性アミノ酸であり得る。したがって、本発明は、構成要素にカップリングする前の生体分子が、アミノ酸配列「ロイシン－プロリン－Ｘ－スレオニン－グリシン」（ＬＰＸＴＧ）からなるＣ末端モチーフを含むプロセスにも向けられ、ここで、「Ｘ」は任意のタンパク質原性アミノ酸であり得る。
本明細書に使用されるとき、「タンパク質原性アミノ酸」という用語は、システインおよびトリプトファンを除く真核生物の遺伝暗号によってタンパク質合成のために直接コードされる２１個のアミノ酸のうちの１つを指す。結果的に、Ｃ末端モチーフにおいて存在するタンパク質原性アミノ酸Ｘは、アミノ酸グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、およびヒスチジンのうちの１つであり、ここで、グルタミン酸が好ましい。よって、本発明はさらに、ＬＰＸＴＧモチーフにおいて存在するタンパク質原性アミノ酸が、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、またはヒスチジンであり、好ましくはグルタミン酸であるプロセスに向けられる。
酵素タグはＮ末端アミノ官能基を含む。適切な態様に従って、かかるＮ末端アミノ官能基は、脂肪族アミン、単一のグリシン、またはＣ末端で親水性スペーサーに連結されている１以上のＮ末端グリシン、好ましくはペンタグリシンを含むポリペプチド配列によって提供される。したがって、本発明はまた、酵素タグが脂肪族アミン、単一のグリシン、またはＣ末端で親水性スペーサーに連結されている１以上のＮ末端グリシン、好ましくはペンタグリシンを含むポリペプチド配列であるプロセスに向けられる。
アミノ酸またはポリペプチド鎖に関連する「Ｎ末端」は、アミノ酸上の遊離アミン基、またはポリペプチド鎖の第１のアミノ酸残基上の遊離アミン基を指す。同様に、アミノ酸またはポリペプチド鎖に関連する「Ｃ末端」は、アミノ酸上の遊離カルボキシ基、またはポリペプチド鎖の最終アミノ酸残基上の遊離カルボキシ基を指す。
上で説明したように、親水性スペーサーは、構成要素または抱合体の水溶性を増加させる。本発明のプロセスにおいて使用される構成要素Ａにおいて存在し得る好適な親水性スペーサーは、親水性重合ラジカル（水溶液に対して増加した親和性を有する）、すなわち、それらのアルキレン骨格において１以上の親水性（または極性）基を含む繰り返し構造ユニットを含むポリマーを含む。使用可能な親水性ポリマーラジカルの例は、ポリオキシ（Ｃ２－Ｃ３）アルキレン（例として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ））、多糖類（例として、デキストラン、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸）、およびポリエチレンイミンを含み、ここで、ポリエチレングリコールが好ましい。したがって、本発明の適切な態様は、酵素タグ、親水性スペーサー、リンカー、およびかかるプロセスにおいて使用される生体分子を有する親油性部分を含む構成要素が、ポリオキシ（Ｃ２－Ｃ３）アルキレン（例として、ポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコール）、多糖類（例として、デキストラン、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸）、ポリシアル酸、ポリエチレンイミン、好ましくはポリエチレングリコールであるプロセスにさらに向けられる。
好ましい親水性スペーサーは、「ＰＥＧ」または「ポリエチレングリコール」であり、これは、任意の水溶性ポリ（エチレンオキシド）を包含する。典型的には、「ＰＥＧ」は、－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－であるサブユニットの大多数（例として＞５０％）を含むポリマーを意味する。異なる形態のＰＥＧは、分子量、構造、または形状が異なり得る（例として、分枝状、線状、分岐ＰＥＧ、多機能など）。本発明のプロセスにおいて使用される構成要素Ａにおいて存在し得るＰＥＧは、「－ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－」であり得るが、１つの末端「－Ｏ－」基が「－ＮＨ－」基で置換されている形態も含み、これは、式「－ＮＨＣＨ２ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－」をもたらす。かかるｍは、１０～３００、好ましくは１５～１００、より好ましくは２０～７０、さらにより好ましくは２５～５０、特に好ましくは３０～４０、最も好ましくは３５である。
リンカーは、Ｃ－Ｃ、Ｃ－Ｏ、Ｃ－Ｎ、およびＣ－Ｓなどの共有結合によって親水性スペーサーを親油性部分に接続する。親水性スペーサーおよび親油性部分とのカップリング、ならびにリンカーと親水性スペーサーおよび親油性部分とのカップリングに使用可能なリンカーは、当該技術分野において知られており、例えば、EP 2825156 B1に記載されている。原則として、二官能性薬剤（すなわち、２つの官能（末端）基を有する薬剤）、好ましくはヘテロ二官能性薬剤（すなわち、２つの異なる官能（末端）基を有する薬剤）が反応し、それによって、親水性スペーサーおよび親油性部分を含む構成要素と結合する。典型的な官能基は、スクシンイミジルエステル、マレイミド、およびピリジルジスルフィドなどの基を含むが、これらに限定されない。いくつかの態様において、二官能性薬剤は、例として、カルボジイミド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル－４－アジドサリチル酸（ＮＨＳ－ＡＳＡ）、ジメチルピメリミダート二塩酸塩（ＤＭＰ）、ジメチルスベリミダート（ＤＭＳ）、３，３’－ジチオビスプロピオンイミダート（ＤＴＢＰ）、Ｎ－スクシンイミジル３－［２－ピリジルジチオ］－プロピオンアミド（ＳＰＤＰ）、スクシミジルα－メチルブタノアート、ビオチンアミドヘキサノイル－６－アミノ－ヘキサン酸Ｎ－ヒドロキシ－スクシンイミドエステル（ＳＭＣＣ）、スクシンイミジル［（Ｎ－マレイミドプロピオンアミド）－ドデカエチレングリコール］エステル（ＮＨ ＳＰＥＯ１２）、Ｎ－スクシンイミジル（４－ヨードアセチル）アミノベンゾアート（ＳＩＡＢ）、Ｎ－スクシンイミジルＳ－アセチルチオアセタート（ＳＡＴＡ）、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）およびＮ－ｈ－マレイミドブチリルオキシ－スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）、スクシンミジルジカルボニルペンタン、またはジスクシンイミジルスベラートから選択されるが、これらに限定されない。
本発明のプロセスにおいて使用される酵素タグ、親水性スペーサー、リンカー、および親油性部分を含む構成要素は、かかるリンカーのいずれかによって調製され得る。好ましい態様に従って、かかる構成要素の調製に使用されるリンカーは、３－アミノ－１，２－プロパンジオールと連結されたδ位アミド上、および親水性スペーサーに連結されたα－スタンディング（standing）アミン官能基上のイソグルタミンである。酵素タグ、親水性スペーサー、リンカー、および親油性部分を含む構成要素内で、リンカー部分は以下の式（Ｉ）を有する：
Figure 2022524537000003
かかる式において、垂直の点線
Figure 2022524537000004
は、親油性部分への原子結合を示し、垂直の点線
Figure 2022524537000005
は、親水性スペーサーへの結合を示す。
本発明の適切な態様に従って、プロセスにおいて使用される構成要素Ａは、親油性部分として、１以上の、互いに独立して、飽和または不飽和の、直鎖状または分枝状の炭化水素鎖（６～３０個の炭素原子の鎖長を有する脂肪アルコールまたは脂肪酸など）、またはステロール（コレステロールなど）を含む。よって、本発明はまた、構成要素Ａにおいて存在する親油性部分が、互いに独立して、６～３０個の炭素原子の鎖長を有する脂肪アルコールまたは脂肪酸、またはコレステロールなどのステロールなどの飽和または不飽和の直鎖状または分枝状の炭化水素鎖の１以上であるプロセスに向けられる。好ましくは、親油性部分は、飽和の直鎖状の炭化水素鎖である。
本明細書に使用されるとき、「脂肪アルコール」という用語は、６～３０個の炭素原子を含み、少なくとも１つのヒドロキシル基ＯＨを含む長鎖脂肪族アルコールを指す。好ましくは、脂肪アルコールは、１以上のヒドロキシル基で任意に置換されていてもよく、６～３０個、なおより良好には１０～３０個、またはさらには１０～２２個、およびさらになおより良好には１４～１８個の炭素原子を含む、線状アルキル基を示すＲを有する構造Ｒ－ＯＨを有する。使用され得る脂肪アルコールは、ラウリルアルコール（１－ドデカノール）、ミリスチルアルコール（１－テトラデカノール）、セチルアルコール（１－ヘキサデカノール）、ステアリールアルコール（１－オクタデカノール）、アラキジルアルコール（１－エイコサノール）、ベヘニルアルコール（１－ドコサノール）、リグノセリルアルコール（１－テトラコサノール）、セリルアルコール（１－ヘキサコサノール）、モンタニルアルコール（１－オクタコサノール）、およびミリシルアルコール（１－トリアコンタノール）から単独で混合物として選択され得る。化合物Ａにおいて、脂肪アルコールおよびリンカーは、好ましくは、エーテル連結Ｒ１－Ｏ－Ｒ２によって互いに接続されており、ここでＲ１はリンカーであり、Ｒ２は脂肪アルコールのアルキル基である。
本明細書に使用されるとき、「脂肪酸」という用語は、少なくとも６個の炭素原子を含み、１つまたは２つ、好ましくは１つのカルボン酸基を含む長鎖の脂肪族酸を指す。好ましくは、脂肪酸は、６～３０個、なおより良好には１０～３０個、またはさらには１０～２２個、およびさらになお良好には１４～１８個の炭素原子を含む線状アルキル基を示すＲを有する構造Ｒ－ＣＯＯＨを有する。好適な脂肪酸は、例えば、ｎ－デカノアート（Ｃ１０、カプラート）、ｎ－ドデカノアート（Ｃ１２、ラウラート）、ｎ－テトラデカノアート（Ｃ１４、ミリスタート）、ｎ－オクタデカノアート（Ｃ１８、ステアラート）、ｎ－エイコサノアート（Ｃ２０、アラキダート）、ｎ－ドコサノアート（Ｃ２２、べへナート）、シス－６ ９－オクタデカノアート（Ｃ１８、オレアート）、すべてのシス－６ ５，８，１１，１４－エイコサテトラエノアート（Ｃ２０、アラキドナート）等を含む。化合物Ａにおいて、脂肪酸は、好ましくは、ヒドロキシル基を有するリンカーと接続され、ここで、脂肪酸のカルボン酸基は、好ましくは、エステル連結を介してリンカーのヒドロキシル基に連結されている。
本明細書に使用されるとき、「ステロール」という用語は、少なくとも１つのヒドロキシル基を含むステロイドを指す。ステロイドは、縮合した四環系ゴナン環系の存在によって特徴付けられる。ステロールは、コレステロール（すなわち、２，１５－ジメチル－１４－（１，５－ジメチルヘキシル）テトラシクロ［８．７．０．０２，７．０１１，１５］へプタコス－７－エン－５－オール）を含むが、これらに限定されない。化合物Ａにおいて、ステロールおよびリンカーは、好ましくは、エーテル連結Ｒ１－Ｏ－Ｒ２’によって互いに接続され、ここで、Ｒ１はリンカーであり、Ｒ２’はステロールの環系である。
本発明の特に好ましい態様に従って、プロセスにおいて使用される構成要素Ａは、リンカーの３－アミノ－１，２－プロパンジオールのジオール基に各エーテルが連結した２つのミリスチルアルコールを含む。よって、本発明はまた、親油性の構成要素の部分が、３－アミノ－１，２－プロパンジオールのジオール基に各エーテルが連結した２つのミリスチルアルコールを含むプロセスに向けられる。
本発明の適切な態様に従って、プロセスは、以下のステップを含む：（ａ）酵素タグ、親水性スペーサー、リンカー、および親油性部分を含む構成要素の水性分散液を調製すること；（ｂ）酵素および生体分子を加えること；（ｃ）ステップ（ｂ）において得られた混合物をインキュベートして抱合体を生成すること；（ｄ）ステップ（ｃ）において得られた抱合体を精製すること。したがって、本発明はまた、以下のステップを含むプロセスに向けられる：
（ａ）酵素タグ、親水性スペーサー、リンカー、および親油性部分を含む構成要素の水性分散液を調製すること；
（ｂ）酵素および生体分子を加えること；
（ｃ）ステップ（ｂ）において得られた混合物をインキュベートして抱合体を生成すること；
（ｄ）ステップ（ｃ）において得られた抱合体を精製すること。
本発明の適切な態様に従って、プロセスは酵素としてリガーゼを使用する。本明細書に使用されるとき、「リガーゼ」という用語は、通常、より大きな分子の１つの上の小さいペンダント化学基の加水分解を伴う、新しい化学結合を形成することによって２つの大きな分子の結合を触媒し得る酵素、または２つの化合物の一緒の連結を触媒する酵素（例として、Ｃ－Ｏ、Ｃ－Ｓ、Ｃ－Ｎなどの結合を触媒する酵素）を指す。一般に、リガーゼは以下の反応を触媒する：Ａｂ＋Ｃ→Ａ－Ｃ＋ｂ。本発明において、リガーゼを使用して、親水性スペーサーを生体分子で触媒する。
本発明において使用可能なリガーゼは、ソルターゼ、ブテラーゼ、トリプシリガーゼ、サブチリガーゼ、ペプチリガーゼ、およびオムニリガーゼを含み、ここで、ソルターゼＡが好ましい。よって、本発明は、ステップ（ｂ）における酵素が、ソルターゼ、ブテラーゼ、トリプシリガーゼ、サブチリガーゼ、ペプチリガーゼ、およびオムニリガーゼを含むリガーゼであり、好ましくはソルターゼＡであるプロセスにさらに向けられる。
本発明において使用される酵素は、例えば、M Schmidt et al: Enzyme-mediated ligation technologies for peptides and proteins, Current Opinion in Chemical Biology (2017) 38, pp 1-7によって記載されている。より具体的に言うと、ソルターゼは、例えば、TT Hung et al: Purification and characterization of sortase, the transpeptidase that cleaves surface proteins of Staphylococcus aureus at the LPXTG motif, PNAS, 1999, 96 (22) 12424-12429によって記載され；ブテラーゼは、GKT Nguyen et al.: Butelase1 is an Asx-specific ligase enabling peptide macrocyclization and synthesis. Nat Chem Biol 2014, 10:732-738によって記載され；トリプシリガーゼは、S Liebscher et al.: N‐Terminal Protein Modification by Substrate‐Activated Reverse Proteolysis, Angewandte Chemie International Edition, 53-11, 1433-7851によって記載され；サブチリガーゼは、AC Braisted et al.: Synthesis of proteins by subtiligase. Methods Enzymol 1997, 289:298-313によって記載され；オムニリガーゼおよびペプチリガーゼは、T Nuijens T et al.: Engineering of a diverse ligase toolbox for peptide segment condensation. Adv Synth Catal 2016, 358:4041-4048およびT Nuijens et al.: Omniligase and selective Peptiligases, efficient biocatalysts for assembling linear and cyclic peptides and protein conjugates, Chem. Today 2016, 34:16-19によって記載されている。
本発明の好ましい態様に従って、プロセスにおいて使用される構成要素Ａは、式ＩＩを有する：
Figure 2022524537000006
ここで、
ｍは、１５～６０、好ましくは２５～４５、より好ましくは３０～４０の任意の整数であり、最も好ましくは３６である；
ｎは、３～２７、好ましくは７～１９、より好ましくは１１～１５の任意の整数であり、最も好ましくは１１である；
ｐは、０～９、好ましくは２～７、より好ましくは３～５の任意の整数であり、最も好ましくは４である。
したがって、本発明はまた、酵素タグ、親水性スペーサー、リンカー、および親油性部分を含む構成要素が式ＩＩを有するプロセスに向けられ、
ここで
ｍは、１５～６０を示す；
ｎは、２～２７を示す；
ｐは、０～９を示す。
特に好ましい態様において、本発明のプロセスは、化合物Ａとして、式Ｉによる化合物を使用し、ここで、ｎは１１であり、ｍは３６であり、ｐは４である。
本発明のプロセスによって得られた抱合体は、固体脂質ナノ粒子、ナノエマルジョン、ミセル、またはリポソームなど（好ましくはリポソーム）の脂質ベースの薬物送達システムの改変のために十分に好適である。したがって、本発明はまた、固体脂質ナノ粒子、ナノエマルジョン、ミセル、またはリポソームなど（好ましくはリポソーム）の脂質ベースの薬物送達システムの改変のためのプロセスによって得られた抱合体の使用に向けられる。
本明細書に使用されるとき、「ナノ粒子」という用語は、１μｍ未満の平均サイズを有する粒子を指す。ナノ粒子は、好ましくは球などの規則的な形状を有するが、不規則な形状も有し得る。
「ナノエマルジョン」という用語は、コロイド分散液、典型的には水中の油の二相システムを指す。コロイド分散液は、１０～５００ｎｍ、好ましくは２０～２００ｎｍの平均サイズを有する液滴を含む。「平均（average）サイズ」または「平均（mean）サイズ」という用語は、本明細書に使用されるとき、液滴の平均直径に関する。
これらのシステムの平均サイズは、動的光散乱などの当業者によって知られている標準的なプロセスによって測定され得る。
本明細書に使用されるとき、「ミセル」という用語は、疎水性の内部および親水性の外部を有する粒子を形成するように組み立てられた脂質などの両親媒性分子の凝集体を指す。ミセルは、一般に、１００ｎｍ未満の直径を有する球状の集合体であるが、ミセルの直径の範囲および様々なミセルの形状（円板状ミセルなど）が当該該技術分野において知られている。
本明細書に使用されるとき、「リポソーム」という用語は、１以上の脂質、リン脂質、および／または界面活性剤から構成されるベシクルを指し、これは、哺乳動物への薬物（化学治療剤など）の送達に有用である。リポソームの構成要素は、生体膜の脂質配置と同様に二重層を形成する。
本発明のプロセスによって得られた抱合体は、生細胞（好ましくはＴ細胞）の膜の改変にさらに十分に好適である。よって、本発明はさらに、生細胞（好ましくはＴ細胞）の膜の改変のためのプロセスによって得られた抱合体の使用に向けられる。
本明細書に使用されるとき、「Ｔ細胞」という用語は、胸腺において成熟するリンパ球のタイプを指す。Ｔ細胞は、細胞媒介免疫において重要な役割を果たし、細胞表面上のＴ細胞受容体の存在によって、Ｂ細胞などの他のリンパ球と区別される。Ｔ細胞は、（動物由来の脾臓またはヒトの献血から）単離するか、または市販の供給源から得ることができる。「Ｔ細胞」は、Ｔヘルパー細胞（ＣＤ４＋細胞）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋細胞）、ナチュラルキラーＴ細胞、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、およびガンマデルタＴ細胞を含む、ＣＤ３を発現するすべてのタイプの免疫細胞を含む。「細胞傷害性細胞」は、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、および好中球を含み、これらの細胞は細胞傷害性応答を媒介することができる。
本発明のプロセスによって得られた抱合体は、疎水性ポリスチレンなどの疎水性物質に対して親和性を有する表面の改変にさらに十分に好適である。結果的に、本発明はさらに、疎水性ポリスチレンなどの疎水性物質に対して親和性を有する表面の改変のためのプロセスによって得られた抱合体の使用に向けられる。
本明細書に使用されるとき、「疎水性」という用語は、物質が水と有する親和性の程度を指す。疎水性物質は、水に対する親和性を実質的に欠き、水をはじいて吸収しない傾向があり、水に溶解したり、または水と混合したり、または水で濡れたりしない傾向がある。
同様に、本発明のプロセスによって得られた抱合体は、エキソソームの膜の改変にさらに十分に好適であり、その結果、本発明はまた、エキソソームの膜の改変のためのプロセスによって得られた抱合体の使用に向けられる。
本明細書に使用されるとき、「エキソソーム」という用語は、細胞由来の小さい（直径２０～３００ｎｍの間、より好ましくは直径４０～２００ｎｍの間）ベシクルを指し、これは内部空間を取り囲み、直接的な原形質膜の出芽（budding）によって、または後期エンドソームと原形質膜との融合によって前記細胞から生成される膜を含む。エキソソームは、脂質または脂肪酸およびポリペプチドを含み、任意に、ペイロード（例として、治療剤）、レシーバ（例として、標的成分）、ポリヌクレオチド（例として、核酸、ＲＮＡ、またはＤＮＡ）、糖（例として、単純な糖、多糖類、またはグリカン）、または他の分子を含む。エキソソームは、プロデューサー細胞に由来し得、そのサイズ、密度、生化学的パラメータ、またはそれらの組み合わせに基づいてプロデューサー細胞から単離され得る。エキソソームは細胞外ベシクルの一種である。
Figure 2022524537000007
Figure 2022524537000008
Figure 2022524537000009
Figure 2022524537000010
Figure 2022524537000011
例は、本発明を限定することなく本発明を説明する。
方法
タンパク質の発現については、Bachran et al.によって記載された方法を使用した（Bachran, M. et al.: The activity of myeloid cell-specific VHH immunotoxins is target-, epitope-, subset- and organ dependent, Scientific Reports 7(1) (2017) 17916）。
このＶＨＨについて、組換えＳｒｔＡ２８を大腸菌株ＷＫ６（ＶＨＨ）およびＢＬ２１（ＤＥ３）において発現させた（ＳｒｔＡ発現）。好適な抗生物質の存在下での素晴らしい（terrific）ブロス（１２ｇ／Ｌのトリプトン、２４ｇ／Ｌの酵母エキス、５ｇ／Ｌのグリセロール、２．３ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１２．５ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４）における発現培養物を０．８のＯＤ６００ｎｍまで３７℃で増殖させた。イソプロピルβ－Ｄ－チオガラクトピラノシド（BioChemica, #A1008, 0025）を１ｍＭの最終濃度まで加え、培養物を３７℃でさらに３時間インキュベートした。遠心分離（１５分、４０００×ｇ、４℃）によって細胞を回収し、ペレットを、２０ｍＬのＰＢＳ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、８．３ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１．７ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４）／４００ｍＬの培養物において再懸濁した。再懸濁した試料を超音波処理（２×１分の超音波処理、１００％強度、５０％デューティサイクル、Sonicator HD2070, Sonotrode KE76, Bandelin）によって溶解し、遠心分離（３０分、３８０００×ｇ、４℃）し、上清をニッケル－ニトリロ三酢酸アガロース（Protino Ni-NTA, Macherey-Nagel）カラムにアプライした。すべての発現したタンパク質は６×Ｈｉｓタグを含み、金属キレートクロマトグラフィーによるタンパク質の精製を可能にする。続いて、カラムをＰＢＳ、ＰＢＳ＋２０ｍＭイミダゾール、およびＰＢＳ＋５０ｍＭイミダゾールによって洗浄した。タンパク質をＰＢＳ＋２５０ｍＭイミダゾールによって溶出した。溶出したタンパク質を、３ｋＤａカットオフ（ＶＨＨの場合）および１０ｋＤａカットオフ（ＳｒｔＡの場合）のAmicon遠心フィルターデバイス（Millipore）で濃縮した。濃縮したタンパク質をＰＢＳに対して終夜透析した。透析したタンパク質の濃度を２８０ｎｍでの吸光度測定によって決定した。精製したタンパク質の純度を、還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（１２％ゲル）およびクーマシー染色によって分析した。最終的な材料を＞９０％の純度であると決定した。
吸収係数は一次タンパク質配列に基づいており、オンラインソフトウェアExPASy ProtParam, SIB, Lausanne, Switzerlandから計算した。
利用されたタンパク質の配列（Nomenclature and symbolism for amino acids and peptides (Recommendations 1983), Pure and Applied Chemistry, 1984, p. 595による１文字コード）。
ソルターゼＡ（ＳｒｔＡ７ｍ）［配列番号１］
ＭＧＨＨＨＨＨＨＳＳＧＬＶＰＲＧＳＧＭＫＥＴＡＡＡＫＦＥＲＱＨＭＤＳＰＤＬＧＴＱＡＫＰＱＩＰＫＤＫＳＫＶＡＧＹＩＥＩＰＤＡＤＩＫＥＰＶＹＰＧＰＡＴＲＥＱＬＮＲＧＶＳＦＡＫＥＮＡＳＬＤＤＱＮＩＳＩＡＧＨＴＦＩＤＲＰＮＹＱＦＴＮＬＫＡＡＫＫＧＳＭＶＹＦＫＶＧＮＥＴＲＫＹＫＭＴＳＩＲＮＶＫＰＴＡＶＥＶＬＤＥＱＫＧＫＤＫＱＬＴＬＩＴＣＤＤＹＮＥＥＴＧＶＷＥＴＲＫＩＦＶＡＴＥＶＫ
ＶＨＨ ＤＣ１３［配列番号２］
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＨＮＬＳＣＴＡＳＧＩＴＦＳＳＬＡＭＧＷＦＲＱＴＰＧＫＥＲＥＦＶＡＮＩＭＲＳＧＳＳＶＦＹＡＤＳＶＲＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＡＨＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＦＣＡＡＴＲＧＡＷＰＡＥＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＧＧＬＰＥＴＧＧＨＨＨＨＨＨ
ＶＨＨ ＥＮＨ［配列番号３］
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＡＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＰＶＮＲＹＳＭＲＷＹＲＱＡＰＧＫＥＲＥＷＶＡＧＭＳＳＡＧＤＲＳＳＹＥＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＡＲＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＮＶＮＶＧＦＥＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＧＧＬＰＥＴＧＧＨＨＨＨＨＨ
ｅＧＦＰ（増強緑色蛍光タンパク質）［配列番号４］
ＭＶＳＫＧＥＥＬＦＴＧＶＶＰＩＬＶＥＬＤＧＤＶＮＧＨＫＦＳＶＳＧＥＧＥＧＤＡＴＹＧＫＬＴＬＫＦＩＣＴＴＧＫＬＰＶＰＷＰＴＬＶＴＴＬＴＹＧＶＱＣＦＳＲＹＰＤＨＭＫＱＨＤＦＦＫＳＡＭＰＥＧＹＶＱＥＲＴＩＦＦＫＤＤＧＮＹＫＴＲＡＥＶＫＦＥＧＤＴＬＶＮＲＩＥＬＫＧＩＤＦＫＥＤＧＮＩＬＧＨＫＬＥＹＮＹＮＳＨＮＶＹＩＭＡＤＫＱＫＮＧＩＫＶＮＦＫＩＲＨＮＩＥＤＧＳＶＱＬＡＤＨＹＱＱＮＴＰＩＧＤＧＰＶＬＬＰＤＮＨＹＬＳＴＱＳＡＬＳＫＤＰＮＥＫＲＤＨＭＶＬＬＥＦＶＴＡＡＧＩＴＬＧＭＤＥＬＹＫＨＨＨＨＨＨ
ＤＭＡ－ＰＥＧ－Ｇ５
ＤＭＡ－ＰＥＧ－Ｇ５は、図１において示された式を有する物質である。
例１
ＤＭＡ－ＰＥＧ－Ｇ５（クロロホルム中２５ｍｇ／ｍＬ）とここでさらに呼ばれる図１における構造２のストックをＨＰＬＣバイアルに分注した。クロロホルムを穏やかな窒素流下で蒸発させて薄い脂質膜を作製し、これをミセル水性脂質分散液（２ｍＭ）としてＤＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水、Sigma Aldrich, #D1408）ｐＨ７．４で水和した。代替的に、超音波を使用して、ＤＭＡ－ＰＥＧ－Ｇ５をＤＰＢＳ（ｐＨ７．４）（５～１０ｍｇ／ｍＬ）に溶解した。逆相ＨＰＬＣ（ｒｐ－ＨＰＬＣ）を使用して抱合体が単離されるまで、４００μＬの５０μＭのＶＨＨ、２５μＭのソルターゼＡ、および１ｍＭのＤＭＡ－ＰＥＧ－Ｇ５（３２０μｇの標的産物質量に対応する）を４℃で４時間インキュベートした。Aeris Widepore Ｃ４カラム（粒子サイズ３．６μｍ、長さ１００ｍｍ、直径２．１ｍｍ、Waters Corporation, Milford, Massachusetts, USA）およびバイナリ勾配パターンを利用して、反応バルクおよび産物を分離した（表）。
表２：反応バルクおよび産物の分離のｒｐ－ＨＰＬＣ勾配パターン（Ａ：０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ ｖ／ｖを有する水；Ｂ：０．０５％のＴＦＡ ｖ／ｖを有するアセトニトリル）
Figure 2022524537000012
溶離液Ａは０．１％のＴＦＡを有する水であり、溶離液Ｂは０．０５％のＴＦＡを有するアセトニトリルであった。分析は、デガッサ、バイナリポンプ、温度制御オートサンプラー、カラムオーブン、ダイオードアレイ検出器（ＤＡＤ）、および分析画分コレクター（ＡＦＣ）を備えたAgilent 1110 ＨＰＬＣシステムで行い、EZChrom Elite Software（Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA）によって制御した。カラム温度は３０℃、オートサンプラー温度は４℃に設定した。標準的な分析または単離注射体積は、それぞれ５μＬまたは２５～１００μＬであった。流速は０．５ｍＬ／分であった。データを２１４および２８０ｎｍでＤＡＤを使用して記録した。
抱合体ピークは、手動または自動画分コレクターを使用して収集した。真空遠心分離機（RVC 2-33 IR, Martin Christ, Osterode am Harz, Germany；速度：１５００ｒｐｍ；温度：４０℃；１００ｍｂａｒで１０分間、これに続き２０ｍｂａｒで２０分間、さらに２ｍｂａｒで蒸発）を使用して溶離液混合物が除去されるまで、単一の注射の収集物を氷上に保存した。その結果得られたペレットを水で水和し、タンパク質濃度を、ExPASy ProtParamウェブアプリケーション（https://web.expasy.org/protparam, SIB, Lausanne, Switzerland）によって計算された吸光係数を使用したＵＶ分光法（NP80, Implen, Westlake Village, CA, USA）によって決定した。収率は、回収したタンパク質溶液の質量および濃度、および標的産物の質量に基づいて計算した。純度は、２１４ｎｍでのｒｐ－ＨＰＬＣ分析により、２～１５分の間の自動ピーク検出および水ブランクのバックグラウンドノイズから得た閾値レベルによって決定した。
反応産物を検証するために、方法をエレクトロスプレーイオン化質量分析計（ESI-MS, amaZon SL, Bruker Corporation, Billerica, Massachusetts, USA）を備えた同様のＨＰＬＣシステムに移した。イオン供給源タイプは正極性のＥＳＩに設定した。キャピラリー出口は１４０Ｖであり、トラップドライブは「９４」に設定した。質量範囲モードは、１００～２２００ｍ／ｚのスキャン範囲で増強された分解能に設定した。ランごとに５つのスペクトルを平均化した。質量は、生のスペクトルの逆重畳積分を使用して計算した。
例２
例１からの単離されたＶＨＨ ＥＮＨ抱合体またはネイティブＶＨＨ ＥＮＨ（１００ｎＭ）を１００ｎＭのｅＧＦＰにスパイクした。ＶＨＨ ＥＮＨは、結合時にｅＧＦＰの固有の蛍光を増加させるその能力で知られている。唯一のｅＧＦＰと比較した蛍光強度の増加は、励起および発光をそれぞれ４８５ｎｍおよび５３５ｎｍに設定したSpark Plate Reader（Tecan Group, Maennedorf, Switzerland）を利用して、黒色９６ウェルプレート（Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA）で測定した。
例３
ＦＩＴＣデキストラン（フルオレセインイソチオシアナート）標識リポソームは、他の場所で記載されているように調製した［４］。手短に、ＤＰＰＣ（１，２－ジパルミトイルホスファチジルコリン）コレステロール、ＤＰＰＧ（１，２－ジパルミトイルホスファチジルグリセロール）、およびＤＭＡ－ＰＥＧ－Ｇ５（５９．４：３４．６：５．０：１．０、モル分率）の混合物をメタノールにおいて３２ｍＭに溶解し、コンピューター制御のバイナリポンプシステムを介して、２７Ｇ針を備えたカスタマイズされたＴピース（T-piece）を利用して、ＤＰＢＳ（ｐＨ７．４）における１０ｍｇ／ｍＬのＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアナート）デキストラン溶液に注射した。分散液をタンジェント流濾過により精製および濃縮した。脂質濃度は、他の場所で記載されている蒸発光散乱検出を有するｒｐ－ＨＰＬＣ方法によって決定した［５］。免疫リポソームを調製するために、脂質付加ＶＨＨ ＥＮＨまたはＶＨＨ ＤＣ１３をリポソーム分散液に加えて、リン脂質（ＰＬ）１μＭあたり０．２５～２ｎＭのＶＨＨにした。混合物を徹底的にボルテックスし、５０℃で３０分間インキュベートした。
マウス骨髄由来のサプレッサーＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ－１＋細胞（ＭＤＳＣ）は、骨髄由来のＮＵＰ前駆細胞に由来した［６］。ＭＤＳＣは、１０％の熱不活性化ウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン（Life Technologies, #15140122）、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Life Technologies, #15140122）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Life Technologies, #11360070)、５０μＭの２－メルカプトエタノール（Life Technologies, #31350-010）、および１×非必須アミノ酸（Life Technologies, #11140-035）が追加され、２０ｎｇ／ｍＬのインターロイキン－６および２０ｎｇ／ｍＬの顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（Biolegend, #576304, San Diego, USA）が追加された完全ＲＰＭＩ（RPMI 1640培地、Life Technologies, #21875-034, Carlsbad, CA, USA）において４日間分化させた。ＶＨＨ改変リポソームの結合を調べるために、ＭＤＳＣを５００μＭのリポソーム（総脂質含量に基づく）とともに４℃で４時間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳバッファー（１×ＰＢＳ＋２％の熱不活性化ウシ胎仔血清）で洗浄し、ＦＡＣＳバッファーにおいてＦｃ受容体ブロック（TruStain FcX, BioLegend, #422302）の存在下で細胞の抗体染色を行った。死細胞の排除のためにSytoxBlue（Thermo Fisher Scientific, S34857）を使用した。リポソームは、カプセル化されたＦＩＴＣ－デキストランを介して検出した。
例４
Ｔ細胞は、ハイデルベルク大学の動物施設で特定病原体除去条件下で維持されたＣ５７ＢＬ／６ｊマウスの脾臓から単離し、登録されたプロトコルＴ４７／１６の下で安楽死させた。脾臓を粉砕し、マウスＣＤ８ａ＋Ｔ細胞単離キット（#130-104-075, Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Germany）を使用して赤血球を溶解し（ACK lysing buffer, #A1049201, Thermo Fisher Scientific）、製造業者の指示に従って磁気細胞単離（LS columns, #130-042-401, Miltenyi Biotec）を使用した後、ＣＤ８＋細胞を単離した。精製したＣＤ８＋Ｔ細胞を１ｎＭのCell Tracer Far Red（#C34564, Thermo Fisher Scientific）によって３５℃で５分間染色し、ＦＡＣＳバッファーで洗浄した。染色したＴ細胞（１．６５×１０８細胞／ｍＬ）を６５０ｎＭのネイティブまたは脂質付加ＶＨＨ ＤＣ１３およびＶＨＨ ＥＮＨとともに４℃で１時間インキュベートした。Ｔ細胞への脂質付加ＶＨＨ結合は、ＦＩＴＣ－抗ラマ抗体によって検出した。
マウス骨髄由来のサプレッサーＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ－１＋細胞（ＭＤＳＣ）は骨髄由来のＮＵＰ前駆細胞に由来した［６］。ＭＤＳＣをは、１０％の熱不活性化ウシ胎仔血清、１００Ｕ/ｍＬのペニシリン（Life Technologies, #15140122）、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Life Technologies, #15140122)、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Life Technologies, #11360070）、５０μＭの２－メルカプトエタノール（Life Technologies, #31350-010）、および１×非必須アミノ酸（Life Technologies, #11140-035）が追加され、２０ｎｇ／ｍＬのインターロイキン－６および２０ｎｇ／ｍＬの顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（Biolegend, #576304, San Diego, USA）が追加された完全ＲＰＭＩ（RPMI 1640培地, Life Technologies, #21875-034, Carlsbad, CA, USA）において４日間分化させた。脂質付加ＶＨＨの膜挿入を調べるために、ＭＤＳＣ（１０７細胞／ｍＬ）を５００ｎＭのネイティブまたは脂質付加ＶＨＨ ＥＮＨまたはＶＨＨ ＤＣ１３とともに４℃で３０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳバッファー（１×ＰＢＳ＋２％の熱不活性化ウシ胎仔血清）で洗浄し、ＦＡＣＳ（蛍光支援セルソーティング）バッファーにおいてＦｃ受容体ブロック（TruStain FcX, BioLegend, #422302）の存在下で細胞の抗体染色を行った。死細胞の排除のためにSytoxBlue（Thermo Fisher Scientific, S34857）を使用した。細胞膜に挿入された脂質付加ＶＨＨをＦＩＴＣ－抗ラマ抗体（Invitrogen, #A16061）によって検出した。細胞のすべての分析をフローサイトメトリーによって行った。フローサイトメトリーはFACSAria II（Beckton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA）で行い、結果をFlowJo（Tree Star, V.10.0.8）によって分析した。
例５
例４からのＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ－１＋細胞を１００μｇ／ｍＬのｅＧＦＰとともに４℃で３０分間インキュベートして、細胞膜に挿入されている脂質付加ＶＨＨ ＥＮＨへのｅＧＦＰの結合を検出した。フローサイトメトリーはｅＧＦＰの蛍光についてFACSAria II（Beckton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA）で行い、結果をFlowJo（Tree Star、V.10.0.8）によって分析した。
例６
細胞－細胞相互作用実験について、ハイデルベルク大学の動物施設で特定病原体除去条件下で維持されたＣ５７ＢＬ／６ｊマウスの脾臓からＴ細胞を単離し、登録されたプロトコルＴ４７／１６の下で安楽死させた。脾臓を粉砕し、マウスＣＤ８ａ＋Ｔ細胞単離キット（#130-104-075, Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Germany）を使用して赤血球を溶解し（ACK lysing buffer, #A1049201, Thermo Fisher Scientific）、製造業者の指示に従って磁気細胞単離（LS columns, #130-042-401, Miltenyi Biotec）を使用した後、ＣＤ８＋細胞を単離した。精製したＣＤ８＋Ｔ細胞を１ｎＭのCell Tracer Far Red（#C34564, Thermo Fisher Scientific）によって３５℃で５分間染色し、ＦＡＣＳバッファーで洗浄した。染色したＴ細胞（１．６５×１０８細胞／ｍＬ）を６５０ｎＭのネイティブまたは脂質付加ＶＨＨ ＤＣ１３およびＶＨＨ ＥＮＨとともに４℃で１時間インキュベートした。ＶＨＨ標識Ｔ細胞をＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、３×１０７個のＴ細胞を１．１×１０７個のＭＤＳＣ（例４において記載したように取得）とともに４℃で１時間インキュベートした。ＣＤ８＋Ｔ細胞の磁気ビーズ単離およびＴ細胞に結合したＭＤＳＣの同時精製のために、Ｔ細胞およびＭＤＳＣをＬＳカラムにロードした。溶出した細胞を抗ＣＤ１１ｂ－ブリリアントバイオレット６０５および抗Ｇｒ－１－ＦＩＴＣ（#101237および#108405, Biolegend）によって染色し、上に記載のとおりフローサイトメトリーによって分析した。
例７
ネイティブまたは脂質付加ＶＨＨ ＥＮＨ（例１のバッチ＃３）を、ThermoFisher Polysorp ９６ウェルプレート（# Nunc 475094）の種々のバリエーションで、ＤＰＢＳ（ｐＨ７．４）（１ｘ、Sigma, #D1408）においてｅＧＦＰと混合した。バリエーションは以下を含む：ＰＢＳ、ｅＧＦＰ（５０ｎＭ）を有するＰＢＳ、ｅＧＦＰ（５０ｎＭ）を有するＰＢＳ＋ネイティブＶＨＨ ＥＮＨ（５０ｎＭ）、ｅＧＦＰ（５０ｎＭ）を有するＰＢＳ＋脂質付加ＶＨＨ ＥＮＨ（５～５０ｎＭ）。プレートをオービタルシェーカーにおいて６０ｒｐｍ、３７℃で１．５時間インキュベートした。その後、プレートを３００ｇで１分間遠心分離し、ウェルの底にすべての液体を集めた。次いで、プレートをTecanReader Spark（ThermoFischer）を使用して、４８５ｎｍの励起および５２５ｎｍの発光で測定した。その後、ウェルにおける液体を５回交換した。１、２、３、および５の各交換ステップの後、蛍光を測定した。
驚くべきことに、酵素タグ、親水性スペーサー、リンカー、および親油性部分から構成される化合物（図１における構造２）は、１０ｍｇ／ｍＬ（４ｍＭ）まで水性バッファーに溶解し得ることが見出された（例１）。
１ｍＭの構造２、２５μＭのトランスペプチダーゼソルターゼＡ、および５０μＭのＬＰＥＴＧ改変単一ドメイン抗体（例１）（構造１）の混合物を調製した後、逆相ＨＰＬＣによる分析から４時間後に構造１の効率的な脂質付加が観察された（図３、構造１として利用されたＶＨＨ ＥＮＨの例示のクロマトグラム）。
加えて、目視での検査を介して分析したところ、反応中に脂質付加産物の凝集または沈殿は観察されなかった（例１）。
質量分析により、２つの異なる単一ドメイン抗体（ＶＨＨ ＥＮＨ（図４）、ＶＨＨ ＤＣ１３（図５））の予想される分子量を確認した（例１）。
反応バルクは、ガラスバイアルにおける「脂質付加ＶＨＨ」ピークの記載された逆相ＨＰＬＣ方法のカラム流出物を収集することによって精製した。水、アセトニトリル、およびトリフルオロ酢酸から構成される溶離液混合物を真空遠心分離によって除去した。そのようにして得られたペレットは、約１ｍｇ／ｍＬのタンパク質含量まで水に溶解することができた（例１）。
そのようにして得られた脂質付加単一ドメイン抗体の純度を、２１４ｎｍでのＵＶ検出と組み合わせた逆相ＨＰＬＣを介して分析した。以下のバッチについて＞９５％の純度（ＵＶ面積に基づく）が明らかになった（図６、表１）（例１）。
表１
Figure 2022524537000013
収率は、回収されたタンパク質溶液の質量および濃度、および標的産物の質量（バッチあたり３２０μｇのタンパク質）に基づいて計算した。カラム流出物を冷却せずに調製されたＶＨＨ ＥＮＨロット＃３を除いて、＞５０％の良好な収率が得られた（例１）。
逆相ＨＰＬＣ精製された抱合体を介した生物活性は、結合時にｅＧＦＰの蛍光を増加させる脂質付加ＶＨＨ ＥＮＨの能力によって分析した（例２）［１］。
３つの異なるバッチをｅＧＦＰとともにインキュベートし、４８５ｎｍの励起および５３５ｎｍの発光での蛍光強度をネイティブＶＨＨ ＥＮＨのものと比較した。データは、ロット＃１およびロット＃２において結合の喪失がないことを明らかにした（図７）（例２）。ロット＃３は、カラム流出物を冷却せずに調製され、ｅＧＦＰの蛍光増強がわずかに減少したことを示した（例２）。
脂質付加および単離された単一ドメイン抗体ＶＨＨ ＥＮＨおよびＶＨＨ ＤＣ１３を、リン脂質に対するＶＨＨの異なる比率でＦＩＴＣ標識リポソーム薬物送達システム（例３）とともにインキュベートした。次いで、この挿入後プロセスを介して、改変リポソームを培養マウスＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ－１＋細胞とともにインキュベートした。ＶＨＨ ＤＣ１３は細胞表面受容体ＣＤ１１ｂに結合し、ＶＨＨ ＤＣ１３改変リポソームはフローサイトメトリー分析中にＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ－１＋細胞との明確な細胞の会合を示した（図８は２ｎＭ／μＭのリン脂質のリポソームのＶＨＨ ＤＣ１３表面密度のデータを示し、各ドットプロットのパーセンテージはマークされたゲートにおける陽性細胞の数を示す。ＦＳＣ：前方散乱）（例３）。
リポソームをリン脂質濃度に対する脂質付加ＶＨＨ ＤＣ１３の種々の比率でインキュベートしたとき、細胞への結合の最適を、１μＭのリン脂質あたり０．５ｎＭのＶＨＨ ＤＣ１３で観察した（図８）（例３）。
脂質付加ＶＨＨを細胞膜リモデリングに使用できるかどうかを評価するために、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ－１＋細胞またはＴ細胞を、脂質付加またはネイティブＶＨＨ ＥＮＨまたはＶＨＨ ＤＣ１３とともにインキュベートした（例４）。細胞の洗浄後、細胞をＦＩＴＣ－抗ラマ抗体で染色した後、フローサイトメトリーによって細胞表面上のＶＨＨの存在を確認した（例４、図１０）。脂質付加ＶＨＨは、フローサイトメトリーで細胞から得られる蛍光シグナルを明確に増加させる（例４）。ＶＨＨ ＤＣ１３をＣＤ１１ｂ＋細胞とともにインキュベートした場合、ＶＨＨ ＤＣ１３のＣＤ１１ｂへの直接的な結合が疎水性挿入効果を無効にするため、脂質付加型および非脂質付加型の違いは検出されなかった（例４）。
細胞表面上に存在する脂質付加ＶＨＨが可溶性抗原にもアクセス可能であるかどうかを評価するために、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ－１＋細胞を脂質付加またはネイティブＶＨＨ ＥＮＨまたはＶＨＨ ＤＣ１３とともにインキュベートした（例５）。細胞の洗浄の後、細胞をＶＨＨ ＥＮＨ対応抗原ｅＧＦＰとともにインキュベートした。フローサイトメトリーは、脂質付加ＶＨＨ ＥＮＨで処理した細胞によるｅＧＦＰの選択的な捕捉を明らかにした（例５、図１１）。
細胞表面上に存在する脂質付加ＶＨＨが細胞－細胞相互作用も促進できるかどうかを評価するために（例６）、単離したＣＤ８＋Ｔ細胞を脂質付加またはネイティブＶＨＨ ＥＮＨまたはＶＨＨ ＤＣ１３とともにインキュベートした。その後、そのように改変した細胞をＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ－１＋細胞とともにインキュベートした。この細胞混合物は、まず抗原ＣＤ８に特異的な磁気ビーズ支援セルソーティングによって分離した。その後、ＣＤ８＋残余分をＣＤ１１ｂおよびＧｒ－１について染色し、フローサイトメトリーによって分析した（図１４）（例６）。脂質付加ＶＨＨ ＤＣ１３とプレインキュベートした細胞集団は、ＣＤ８陽性カラム残余分でＭＤＳＣについてより高いシグナルを引き起こした。これは、ＶＨＨがＭＤＳＣとＴ細胞との間の細胞相互作用を促進したことを示す（図１３）（例６）。
脂質付加ＶＨＨを疎水性ポリスチレンなどの疎水性表面に固定化できるかどうかを評価するために、脂質付加またはネイティブＶＨＨ ＥＮＨを、Polysorp（登録商標）９６ウェルプレートで５０ｎＭのｅＧＦＰ（ＶＨＨ ＥＮＨの対応抗原）の存在下でインキュベートした（例７）。数回の洗浄ステップの後、２５ｎＭおよび５０ｎＭのコーティングのウェルで有意なコーティングおよび保持ｅＧＦＰを観察した（図１４）。データは、抗原または細胞の捕捉または細胞への固定化のための脂質付加ＶＨＨの有用性を示す（例７）。また、それはタンパク質の精製にも使用できる。

Claims (20)

  1. 抱合体の調製のためのプロセスであって、抱合体は、生体分子、酵素タグ、親水性スペーサー、リンカー、および親油性部分を含み、かかるプロセスは、酵素タグ、親水性スペーサー、リンカー、および親油性部分を含む構成要素と、水性媒体における生体分子との酵素カップリング、および抱合体の精製を含む、前記プロセス。
  2. 生体分子が、ポリペプチドである、請求項１に記載のプロセス。
  3. 生体分子が、抗原、インテグリン、またはカドヘリンなどの細胞接着タンパク質、成長因子などのペプチドホルモン、インターロイキンなどのサイトカイン、またはこれらの分子のいずれかに関する受容体、酵素、または天然または人工抗体またはそのフラグメントである、請求項２に記載のプロセス。
  4. 抗体が、モノクローナル抗体、または、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、可変フラグメント（Ｆｖ）、またはフラグメント抗原結合（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、またはＦ（ａｂ’）２）などのそのフラグメント；ＶＨＨまたはｖＮＡＲなどのラクダ類または軟骨魚由来の重鎖のみの抗体またはそのフラグメントであるか、または、人工抗体が、ＤＡＲＰｉｎ、アドネクチン、アンチカリン、またはアフィボディである、請求項３に記載のプロセス。
  5. 生体分子が、ラクダ類の重鎖のみの抗体（ＶＨＨ）の可変ドメインに由来する単一ドメイン抗体である、請求項３または４に記載のプロセス。
  6. 生体分子が、酵素タグ、親水性スペーサー、リンカー、および親油性部分を含む構成要素とのそのカップリングの前に、トランスペプチダーゼ、好ましくはソルターゼＡによる酵素抱合のためのＣ末端モチーフを有する、請求項１～５のいずれか一項に記載のプロセス。
  7. Ｃ末端モチーフが、アミノ酸配列「ロイシン－プロリン－Ｘ－スレオニングリシン」（ＬＰＸＴＧ）からなり、ここで、「Ｘ」は、任意のタンパク質原性アミノ酸であり得る、請求項６に記載のプロセス。
  8. ＬＰＸＴＧモチーフにおいて存在するタンパク質原性アミノ酸が、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、またはヒスチジンであり、好ましくはグルタミン酸である、請求項７に記載のプロセス。
  9. 酵素タグが、脂肪族アミン、単一のグリシン、親水性スペーサーにＣ末端で連結されている１以上のＮ末端グリシン、好ましくはペンタグリシンを有するペプチド配列である、請求項１～８のいずれか一項に記載のプロセス。
  10. 親水性スペーサーが、ポリオキシ（Ｃ２－Ｃ３）アルキレン（例として、ポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコール）、多糖類（例として、デキストラン、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸）、ポリシアル酸、ポリエチレンイミン、好ましくはポリエチレングリコールである、請求項１～９のいずれか一項に記載のプロセス。
  11. リンカーが、イソグルタミンであり、３－アミノ－１，２－プロパンジオールと連結されたδ－位のアミド上、および親水性スペーサーに連結されたα－スタンディング（standing）アミン官能基上にある、請求項１～１０のいずれか一項に記載のプロセス。
  12. 親油性部分が、１以上の、互いに独立して、飽和または不飽和の、直鎖状または分枝状の炭化水素鎖（６～３０個の炭素原子の鎖長を有する脂肪アルコールまたは脂肪酸など）、またはステロール（コレステロールなど）である、請求項１～１１のいずれか一項に記載のプロセス。
  13. 親油性部分が、各エーテルが３－アミノ－１，２－プロパンジオールのジオール基に連結された２つのミリスチルアルコールを含む、請求項１２に記載のプロセス。
  14. 酵素タグ、親水性スペーサー、リンカー、および親油性部分を含む構成要素（構成要素Ａ）が、ＤＭＡ－ＰＥＧ－Ｇ５である、請求項１～１３のいずれか一項に記載のプロセス。
  15. 以下のステップ：
    （ａ）酵素タグ、親水性スペーサー、リンカー、および親油性部分を含む構成要素の水性分散液を調製すること；
    （ｂ）酵素および生体分子を加えること；
    （ｃ）ステップ（ｂ）において得られた混合物をインキュベートして、抱合体を生成すること；
    （ｄ）ステップ（ｃ）において得られた抱合体を精製すること
    を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載のプロセス。
  16. ステップ（ｂ）における酵素が、ソルターゼ、ブテラーゼ、トリプシリガーゼ、サブチリガーゼ、ペプチリガーゼ、およびオムニリガーゼを含むリガーゼであり、好ましくはソルターゼＡである、請求項１５に記載のプロセス。
  17. 固体脂質ナノ粒子、ナノエマルジョン、ミセル、またはリポソーム、好ましくはリポソームなどの脂質ベースの薬物送達システムの改変のための、請求項１～１６のいずれか一項に記載のプロセスによって得られた抱合体の使用。
  18. 生細胞、好ましくはＴ細胞の膜の改変のための、請求項１～１６のいずれか一項に記載のプロセスによって得られた抱合体の使用。
  19. 疎水性ポリスチレンなどの疎水性物質に対して親和性を有する表面の改変のための、請求項１～１６のいずれか一項に記載のプロセスによって得られた抱合体の使用。
  20. エキソソームの膜の改変のための、請求項１～１５のいずれか一項に記載のプロセスによって得られた抱合体の使用。
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