JP2022523771A - ライブセルイメージング(live cell imaging)動的BH3プロファイリング - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、米国特許法第119条(e)項の下で、参照により本明細書にその全体が組み込まれている、2019年2月26日に出願した米国仮出願第62/810,928号に対する優先権を主張するものである。
いくつかの実施形態では、本開示の方法が、細胞(例えば、試験薬剤で前処理したがん細胞)をBH3ペプチドと接触させる工程を含む。該細胞をBH3ペプチドと接触させた後、該細胞内でBH3ペプチド誘導性ミトコンドリア外膜透過化(MOMP)を測定する。MOMPは、内因性アポトーシス経路を介するアポトーシスへの細胞運命決定における帰還不能点と見なされる。MOMPは、B細胞リンパ腫2(BCL-2)ファミリータンパク質によって制御され、DNA損傷、成長因子又は栄養不足、及び細胞傷害性薬剤での処理を含む、様々な細胞ストレッサーによって活性化され得る。ミトコンドリアアポトーシス経路の基礎状態は、細胞の最終的な運命を変え得る。なぜなら、異なる細胞は、MOMPを起こすためにプライムされる程度の点で異なり得るからである。
いくつかの実施形態では、BH3ペプチドが、アポトーシス促進性BCL-2ファミリータンパク質のBCL-2相同ドメイン3(BH3ドメイン)に相当するアミノ酸配列を含む。BH3ペプチドがそれに由来し得るアポトーシス促進性BCL-2ファミリータンパク質の非限定的な例は、BIM(細胞死のBCL-2相互作用メディエータ)、BID(BH3相互作用ドメイン死アゴニスト)、BAD(BCL-2関連死プロモータ)、Noxa、PUMA(アポトーシスのp53アップレギュレートモジュレータ)、BMF(BCL-2調節因子)、HRK(ハラキリ)、及びBIK(BCL-2相互作用キラー)を含む。いくつかの実施形態では、BH3ペプチドが、操作されたBH3ペプチドのアミノ酸配列を含む。操作されたBH3ペプチドは、特定抗アポトーシスBCL-2タンパク質をターゲティングするための所望の親和性及び特異性を示すように設計されている。操作されたBH3ペプチドの例は、MS1、MS2、MS3及びFS1を含む(例えば、Foight等、ACS Chem Biol.、2014年9月19日、9(9):1962~8頁を参照)。
本明細書に記載されるように、いくつかの態様では、本開示が、がん細胞中で試験薬剤を評価する方法を提供する。いくつかの実施形態では、試験薬剤が化合物を含む。いくつかの実施形態では、試験薬剤が、2つ以上の化合物を含む。いくつかの実施形態では、試験薬剤が、1,000、900、800、700、600、500、450、400、350、300、250、200又は150g/mol未満の分子量を有する。いくつかの実施形態では、試験薬剤が、約100g/mol以上約500g/mol以下の分子量を有する。いくつかの実施形態では、試験薬剤が、約200g/mol以上約800g/mol以下の分子量を有する。いくつかの実施形態では、試験薬剤が、約500g/mol以上約1,000g/mol以下の分子量を有する。例示的な試験薬剤は、小有機分子、小無機分子、ペプチド、タンパク質、タンパク質類似体、酵素、核酸、核酸類似体、抗体、抗原、ホルモン、脂質、多糖、成長因子、ウイルス、細胞、生物活性剤、医薬品、並びにそれらの組み合わせ及びプロドラッグを含むが、それらに限定されない。いくつかの実施形態では、試験薬剤が、抗がん剤、例えば、化学療法剤、標的がん治療剤、又は1つ又は複数の抗アポトーシスBCL-2タンパク質の阻害剤(例えば、BH3ミメティック)である。更なる例示的な試験薬剤は、ガス、微粒子、放射線、電磁放射線及びエアロゾルを含むが、それらに限定されない。
材料及び方法
LCI-DBP緩衝液
LCI-DBP初期染色液を、温めた培地4mL、核染色用のHoechst 33342(ビスベンズイミド)8μl、及びミトコンドリア染色用の1mM MitoTracker(登録商標)Green 8μlを混合して調製した。温めた1×DTEBバッファ20mL、10mg/mLオリゴマイシン40μL、及びミトコンドリア膜内外電位差の変化測定用の100μM TMRE 40μLを混合してLCI-DBP洗浄バッファを調製した。
このプロトコル用の材料が含むもの:10%FBSを含む温めた培地(AD. DMEM/F12で開始)、バッファC中の10,000U/mL DNAseI(メーカ説明書による)、POBS中の10,000U/mLヒアルロニダーゼ(滅菌ろ過)、PBS中の100mg/mLコラゲナーゼIV(約16,000U/mL)(滅菌ろ過)、50mLコニカルチューブ、60cmペトリディッシュ、96ウェルプレート、カミソリ刃及び安全手袋、200μLピペットチップ(組織片をピペットできるようにカミソリでカット)、100ミクロンフィルタ、氷冷HBSS(任意)。
コラーゲン溶液を、以下のプロトコルに従って酢酸中で調製した。酢酸溶液(0.1M)は、水50mLをコニカルチューブに入れて氷酢酸288μLを加えることにより調製した。0.1M酢酸にコラーゲンI(Sigma社C7661)を加えて、1mg/mLコラーゲン溶液を得た。該コラーゲン溶液は、溶解するまで1~3時間にわたり室温で撹拌した。
i)プレート×ウェル/プレート×10μL=総溶液(μL)
ii)20μg/cm2×0.0319cm2/ウェル×ウェル/プレート=μg/プレート
iii)μg/プレート×プレート=総コラーゲン(μg)
iv)総溶液-コラーゲン必要量=PBS必要量
細胞を含むプレートを、ウェル当たり10μLのLCI染色液により、3307 Steri-Cultインキュベータ、クラス100HEP中、37℃で20分間染色した。次いで、EL406(商標)コンビネーションマイクロプレートウォッシャーディスペンサを使用して、ウェル内の容積を10μLまで吸引した。EL406(商標)コンビネーションマイクロプレートウォッシャーディスペンサを使用して、細胞を含むプレートを、LCI洗浄バッファで3回洗浄し、ウェルごとの最終残量を10μLとした。次いで、プレートを、必要とされるセッティングのImageXpress(登録商標)Micro 4ハイコンテントスクリーニングシステム上に配置し、2分ごとに画像を撮影した。2画像後に、選択したLCI-DBP BIMペプチドバッファ10μLを、ウェルに加えた。次いでプレートを、最高で2時間撮像した。
膵臓8902細胞株を用いたLCI-DBP
異なる薬物処理に対する細胞の感受性を評価するために、膵臓8902(Panc8902)細胞株を用いてLCI-DBPを行った(図2A~図2F)。Panc8902細胞を、384ウェルプレート中にウェル当たり2,000細胞で播いた。細胞を、DMSO(溶媒)又はA1331852(Bcl-XL阻害剤)のいずれか一方で処理した。DMSOで処理した細胞を含有するウェルは、薬物非添加の対照基準として利用した。播いた細胞を一晩処理後、細胞を、LCI-DBP初期染色液で染色してから、LCI-DBP洗浄バッファで洗浄した。細胞をジギトニンで透過処理して、LCI-DBP BIMバッファ(100μM)の添加により、BIM BH3ペプチド(各ウェル中で最終濃度10μM)で処理した。
MMTV乳がんPDXモデルを用いたLCI-DBP
異なる薬物処理に対する細胞の感受性を評価するために、MMTV乳がんPDXモデルを用いてLCI-DBPを行った(図3A~図3G)。MMTV-PyMT-T1細胞を、384ウェルコラーゲンコートプレート中にウェル当たり4,000細胞で播いた。細胞を、DMSO(溶媒)又は17-DMAG(Hsp90阻害剤)のいずれか一方で処理した。DMSOで処理した細胞を含有するウェルは、薬物非添加の対照基準として利用した。播いた細胞を一晩処理後、細胞を、LCI-DBP初期染色液で染色してから、LCI-DBP洗浄バッファで洗浄した。細胞をジギトニンで透過処理して、LCI-DBP BIMバッファ(100μM)の添加により、BIM BH3ペプチド(各ウェル中で最終濃度10μM)で処理した。
ライブセルイメージングによるコア生検中でのBH3ペプチド応答
肝転移由来のヒト結腸直腸コア生検を用いたBH3ペプチド特異的なミトコンドリア電位の損失を、ライブセルイメージングにより評価した(図4)。コア生検試料の細胞をDMSOで処理し、処理細胞を、10μMのBIM BH3ペプチドの不在下(上図)又は存在下(下図)、ライブセルイメージングにより撮像した。ペプチド処理ウェルへのBIM BH3ペプチドの添加に続く異なる時点に、両方のペプチド処理条件の画像を取り込んだ。ミトコンドリア膜内外電位差の変化を、TMRE発光の経時的な低下の追跡により測定した。図示するように、BH3ペプチドを欠くウェルと比べてペプチド処理ウェル中ではTMRE発光の著しい損失が存在した。
膵臓8902細胞株を用いたLCI-DBP
薬物処理に対する細胞の感受性を評価するために、膵臓8902(Panc8902)細胞株を用いてLCI-DBPを行った(図5A~図5C)。Panc8902細胞を、384ウェルプレート中にウェル当たり2,000細胞で播いた。細胞を、DMSO(溶媒)又はナビトクラックス(Bcl-2及びBcl-XLの阻害剤)(1μM)のいずれか一方で処理した。DMSOで処理した細胞は、ナビトクラックス薬物処理に対する薬物非添加の対照基準として利用した。播いた細胞を一晩処理後、細胞を、LCI-DBP初期染色液で染色してから、LCI-DBP洗浄バッファで洗浄した。細胞をジギトニンで透過処理して、LCI-DBP BIMバッファ(100μM)の添加により、BIM BH3ペプチド(各ウェル中で最終濃度1μM)で処理した。
特許請求の範囲における冠詞、例えば、「a」、「an」及び「the」は、反する指定がないか、又は文脈から特に明白でない限り、1つ又は2つ以上を意味し得る。一群の1つ又は複数の一員の間での「or」を含む特許請求の範囲又は明細書は、反する指定がないか、又は文脈から特に明白でない限り、該群の一員のうちの1つ、2つ以上、又はすべてが、任意の製品若しくは方法中に存在する、任意の製品若しくは方法中で使用される、又は別のやり方で任意の製品若しくは方法に関連する場合に、満たされると見なす。本発明は、該群のまさに一員が、任意の製品若しくは方法中に存在する、任意の製品若しくは方法中で使用される、又は別のやり方で任意の製品若しくは方法に関連する実施形態を含む。本発明は、該群の2つ以上の一員又は全員が、任意の製品若しくは方法中に存在する、任意の製品若しくは方法中で使用される、又は別のやり方で任意の製品若しくは方法に関連する実施形態を含む。
Claims (48)
- がんを治療するための推定上の治療剤を同定する方法であって、
a. 原発がん細胞を含む細胞集団の、試験薬剤と接触させた被験細胞部分を用意する工程、
b. 前記被験細胞部分をBH3ペプチドと接触させる工程、
c. 前記被験細胞部分の一連の画像を、ライブセルイメージングによりある期間にわたって取り込む工程、
d. 前記被験細胞部分において、取り込んだ画像に基づき前記期間の異なる時点にBH3ペプチド誘導性ミトコンドリア外膜透過化(MOMP)を測定する工程、
e. 前記被験細胞部分において測定したBH3ペプチド誘導性MOMPを、前記試験薬剤と接触させなかった、前記細胞集団の対照細胞部分におけるBH3ペプチド誘導性MOMPと比較する工程
を含み、前記対照細胞部分におけるBH3ペプチド誘導性MOMPと比べた、前記被験細胞部分におけるBH3ペプチド誘導性MOMPの上昇が、前記試験薬剤が前記細胞集団のがん細胞を治療するための推定上の治療剤であることを示す、方法。 - 前記比較する工程が、デルタプライミングの値を決定する工程を含み、デルタプライミングは、前記被験細胞部分におけるBH3ペプチド誘導性MOMPと前記対照細胞部分におけるBH3ペプチド誘導性MOMPとの差異である、請求項1に記載の方法。
- 前記デルタプライミングの値を複数の異なる時点で決定する、請求項2に記載の方法。
- 前記デルタプライミングの値が、前記期間にわたって生じるMOMPの最大差に相当するピーク値である、請求項2に記載の方法。
- 前記デルタプライミングの値が、前記期間の一部にわたって生じるMOMPの最大変化に相当するピーク値である、請求項2に記載の方法。
- 更に、前記期間にわたって生じるMOMPの全体的な変化に相当するデルタプライミングの集計値を決定する工程を含む、請求項2に記載の方法。
- 更に、
i)前記試験薬剤と接触させなかった、前記細胞集団の前記対照細胞部分を用意する工程、
ii)前記対照細胞部分を前記BH3ペプチドと接触させる工程、
iii)前記対照細胞部分の一連の画像を、ライブセルイメージングにより前記期間にわたって取り込む工程、
iv)前記対照細胞部分において、取り込んだ画像に基づき異なる時点にBH3ペプチド誘導性MOMPを測定する工程
を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。 - 前記被験細胞部分を、第1のペプチド濃度で前記BH3ペプチドと接触させ、前記方法が更に、前記第1のペプチド濃度でBH3ペプチド誘導性MOMPを測定した後、前記被験細胞部分を、第2の上昇したペプチド濃度で前記BH3ペプチドと接触させる工程を含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- (c)から(e)までを、前記第2の上昇したペプチド濃度で行う、請求項8に記載の方法。
- 前記第1のペプチド濃度が、少なくとも0.001μM且つ1μM以下、少なくとも0.001μM且つ0.1μM以下、少なくとも0.001μM且つ0.01μM以下、少なくとも0.005μM且つ0.1μM以下、又は少なくとも0.005μM且つ0.01μM以下である、請求項8に記載の方法。
- 前記被験細胞部分及び前記対照細胞部分が、がん細胞の検出マーカーを含み、BH3ペプチド誘導性MOMPを、前記検出マーカーを含む細胞においてのみ測定する、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記検出マーカーが、細胞内腫瘍マーカー、細胞外腫瘍マーカー又は細胞表面腫瘍マーカーである、請求項11に記載の方法。
- 更に、前記被験細胞部分及び前記対照細胞部分を、前記検出マーカーに対する抗体で染色する工程、並びに前記抗体の染色を検出してがん細胞を同定する工程を含む、請求項12に記載の方法。
- 前記検出マーカーが、上皮細胞接着分子(EpCam)、ケラチンタンパク質、平滑筋アクチンタンパク質、c-kitタンパク質、S100タンパク質又はビメンチンタンパク質からなる群から選択される、請求項12に記載の方法。
- 前記検出マーカーが、がん細胞を非がん細胞と区別する1つ又は複数の形態的特徴である、請求項11に記載の方法。
- 前記被験細胞部分及び前記対照細胞部分が、非がん細胞の検出マーカーを含み、前記検出マーカーを含む細胞をBH3ペプチド誘導性MOMPの測定から除外する、請求項1から15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記検出マーカーが、非がん細胞をがん細胞と区別する1つ又は複数の形態的特徴である、請求項1から16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記被験細胞部分及び前記対照細胞部分の細胞が固体表面に付着している、請求項1から17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記付着させた細胞がある濃度で存在し、前記細胞の95%が互いに接触していない、請求項18に記載の方法。
- 前記付着させた細胞が10,000細胞以下である、請求項19に記載の方法。
- 前記付着させた細胞が、少なくとも100細胞から10,000細胞まで、少なくとも100細胞且つ1,000細胞以下、少なくとも1,000細胞、少なくとも1,000細胞且つ5,000細胞以下、又は少なくとも5,000細胞で存在する、請求項20に記載の方法。
- 前記固体表面が1つ又は複数の接着促進剤で被覆されている、請求項18に記載の方法。
- 前記1つ又は複数の接着促進剤が、コラーゲン1、ラミニン、コラーゲン4及びフィブロネクチンからなる群から選択される細胞外マトリクスタンパク質を含む、請求項22に記載の方法。
- 前記細胞が接着細胞である、請求項18に記載の方法。
- 前記被験細胞部分及び前記対照細胞部分の細胞を、BH3ペプチドと接触させる前に透過処理する、請求項1から24のいずれか一項に記載の方法。
- BH3ペプチド誘導性MOMPを、電位差測定色素の発光の検出により測定する、請求項1から25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記電位差測定色素が、テトラメチルローダミンエチルエステル(TMRE)、テトラメチルローダミンメチルエステル(TMRM)、5,5',6,6'-テトラクロロ-1,1',3,3'-テトラエチルベンズイミダゾリルカルボシアニンヨージド(JC-1)及びジヒドロローダミン123からなる群から選択される、請求項26に記載の方法。
- 前記細胞集団が、コア生検試料、ヒト原発腫瘍試料、又は患者由来異種移植片(PDX)から得られる、請求項1から27のいずれか一項に記載の方法。
- 前記BH3ペプチドが、BIM、BID、BAD、Noxa A、Noxa B、PUMA、BMF、HRK及びBIKからなる群から選択されるポリペプチドのBH3ドメインに由来する、請求項1から28のいずれか一項に記載の方法。
- 前記BH3ペプチドが、MS1、MS2、MS3及びFS1からなる群から選択される非天然BH3ペプチドである、請求項1から29のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ライブセルイメージングが、ライブシングルセルイメージングである、請求項1から30のいずれか一項に記載の方法。
- 更に、(a)に先立ち、前記被験細胞部分を前記試験薬剤と接触させる工程を含む、請求項1から31のいずれか一項に記載の方法。
- 前記原発がん細胞が、単離された原発がん細胞である、請求項1から32のいずれか一項に記載の方法。
- がん細胞中で試験薬剤を評価する方法であって、
a. 試験薬剤と接触させたがん細胞を含む、細胞の試料をBH3ペプチドと接触させる工程、
b. 前記試料中の個別細胞の一連の画像を、ライブセルイメージングによりある期間にわたって取り込む工程、
c. 複数の前記個別細胞において、取り込んだ画像に基づき前記期間の異なる時点にBH3ペプチド誘導性MOMPのレベルを測定する工程、
d. 前記複数の個別細胞を評価して、BH3ペプチド誘導性MOMPのレベルが前記期間の一時点においてプリセット値に達するかを決定する工程、
e. 前記複数の各個別細胞に対して、BH3ペプチド誘導性MOMPのレベルの前記プリセット値に達する前記時点を決定する工程
を含み、前記試験薬剤が、前記期間のより遅い時点で前記プリセット値に達する細胞と比べてより早い時点で前記プリセット値に達する細胞中ではより高い細胞傷害性を有し、前記プリセット値に達しない細胞は前記試験薬剤に対して耐性である、方法。 - 前記プリセット値が、一個別細胞でのBH3ペプチド誘導性MOMPのレベルの、対照レベルに対するプリセット変化である、請求項34に記載の方法。
- 前記対照レベルが、前記BH3ペプチドとの接触前に前記個別細胞中で測定したMOMPのレベルである、請求項35に記載の方法。
- 前記対照レベルが、前記BH3ペプチドとの接触後に前記個別細胞中で測定したMOMPのレベルである、請求項35に記載の方法。
- 前記対照レベルが、2つ以上の時点で測定した前記MOMPのレベルに基づく平均値である、請求項35から37のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プリセット値が、BH3ペプチド誘導性MOMPのレベルの、約20%から約80%の間の変化率である、請求項34から38のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プリセット値が、BH3ペプチド誘導性MOMPのレベルの、約40%から約60%の間の変化率である、請求項34から38のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プリセット値が、BH3ペプチド誘導性MOMPのレベルの、約50%の変化率である、請求項34から40のいずれか一項に記載の方法。
- 更に、前記プリセット値に達しない細胞を、MOMP以外の前記細胞の特性の更なる解析に付す工程を含む、請求項34から41のいずれか一項に記載の方法。
- 前記更なる解析が、ゲノム解析、トランスクリプトーム解析、プロテオーム解析及び形態学的解析の少なくとも1つを含む、請求項42に記載の方法。
- 前記更なる解析を行って、前記試験薬剤に対する耐性と相関する前記細胞の1つ又は複数の特性を評価する、請求項42又は43に記載の方法。
- BH3ペプチド誘導性MOMPのレベルを、
i) ミトコンドリア膜電位の測定、
ii) ミトコンドリアからのシトクロムcの放出の測定、及び
iii) ミトコンドリア内でのシトクロムcの保持の測定
のうちの1つ又は複数により決定する、請求項34から44のいずれか一項に記載の方法。 - 前記がん細胞が原発がん細胞である、請求項34から45のいずれか一項に記載の方法。
- 前記原発がん細胞が、単離された原発がん細胞である、請求項46に記載の方法。
- 更に、(a)に先立ち、前記細胞の試料を前記試験薬剤と接触させる工程を含む、請求項34から47のいずれか一項に記載の方法。
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