JP2022523105A - 免疫応答をモジュレートするｅｎｐｐ１阻害剤および方法 - Google Patents

免疫応答をモジュレートするｅｎｐｐ１阻害剤および方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2022523105A
JP2022523105A JP2021544572A JP2021544572A JP2022523105A JP 2022523105 A JP2022523105 A JP 2022523105A JP 2021544572 A JP2021544572 A JP 2021544572A JP 2021544572 A JP2021544572 A JP 2021544572A JP 2022523105 A JP2022523105 A JP 2022523105A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
substituted
alkyl
compound
alkoxy
enpp1
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2021544572A
Other languages
English (en)
Other versions
JPWO2020160333A5 (ja
Inventor
リンイン リー，
マーク スミス，
ジャクリーン アン カロッザ，
ヴォルカー ボーナート，
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Leland Stanford Junior University
Original Assignee
Leland Stanford Junior University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Leland Stanford Junior University filed Critical Leland Stanford Junior University
Publication of JP2022523105A publication Critical patent/JP2022523105A/ja
Publication of JPWO2020160333A5 publication Critical patent/JPWO2020160333A5/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic System
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/645—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having two nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07F9/6509—Six-membered rings
    • C07F9/6512—Six-membered rings having the nitrogen atoms in positions 1 and 3
    • C07F9/65128—Six-membered rings having the nitrogen atoms in positions 1 and 3 condensed with carbocyclic rings or carbocyclic ring systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic System
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/28—Phosphorus compounds with one or more P—C bonds
    • C07F9/38—Phosphonic acids RP(=O)(OH)2; Thiophosphonic acids, i.e. RP(=X)(XH)2 (X = S, Se)
    • C07F9/3804—Phosphonic acids RP(=O)(OH)2; Thiophosphonic acids, i.e. RP(=X)(XH)2 (X = S, Se) not used, see subgroups
    • C07F9/3808—Acyclic saturated acids which can have further substituents on alkyl
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/01—Hydrocarbons
    • A61K31/015—Hydrocarbons carbocyclic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4706—4-Aminoquinolines; 8-Aminoquinolines, e.g. chloroquine, primaquine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/517—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with carbocyclic ring systems, e.g. quinazoline, perimidine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/66—Phosphorus compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/66—Phosphorus compounds
    • A61K31/662—Phosphorus acids or esters thereof having P—C bonds, e.g. foscarnet, trichlorfon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/66—Phosphorus compounds
    • A61K31/675—Phosphorus compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. pyridoxal phosphate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/69—Boron compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D201/00—Preparation, separation, purification or stabilisation of unsubstituted lactams
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D215/00—Heterocyclic compounds containing quinoline or hydrogenated quinoline ring systems
    • C07D215/02—Heterocyclic compounds containing quinoline or hydrogenated quinoline ring systems having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen atoms or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D215/16—Heterocyclic compounds containing quinoline or hydrogenated quinoline ring systems having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen atoms or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D215/38—Nitrogen atoms
    • C07D215/42—Nitrogen atoms attached in position 4
    • C07D215/46—Nitrogen atoms attached in position 4 with hydrocarbon radicals, substituted by nitrogen atoms, attached to said nitrogen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D215/00—Heterocyclic compounds containing quinoline or hydrogenated quinoline ring systems
    • C07D215/02—Heterocyclic compounds containing quinoline or hydrogenated quinoline ring systems having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen atoms or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D215/16—Heterocyclic compounds containing quinoline or hydrogenated quinoline ring systems having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen atoms or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D215/48—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen
    • C07D215/54—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen attached in position 3
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D239/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings
    • C07D239/70—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D239/72—Quinazolines; Hydrogenated quinazolines
    • C07D239/86—Quinazolines; Hydrogenated quinazolines with hetero atoms directly attached in position 4
    • C07D239/94—Nitrogen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings
    • C07D401/04—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings directly linked by a ring-member-to-ring-member bond
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F5/00—Compounds containing elements of Groups 3 or 13 of the Periodic System
    • C07F5/02—Boron compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F5/00—Compounds containing elements of Groups 3 or 13 of the Periodic System
    • C07F5/02—Boron compounds
    • C07F5/025—Boronic and borinic acid compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic System
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/28—Phosphorus compounds with one or more P—C bonds
    • C07F9/38—Phosphonic acids RP(=O)(OH)2; Thiophosphonic acids, i.e. RP(=X)(XH)2 (X = S, Se)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic System
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/553—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07F9/576—Six-membered rings
    • C07F9/60—Quinoline or hydrogenated quinoline ring systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic System
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/6558—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom containing at least two different or differently substituted hetero rings neither condensed among themselves nor condensed with a common carbocyclic ring or ring system
    • C07F9/65583—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom containing at least two different or differently substituted hetero rings neither condensed among themselves nor condensed with a common carbocyclic ring or ring system each of the hetero rings containing nitrogen as ring hetero atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic System
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/6561—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom containing systems of two or more relevant hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring or ring system, with or without other non-condensed hetero rings

Abstract

ＥＮＰＰ１を阻害するための化合物、組成物および方法が提供される。対象方法の態様は、試料にＥＮＰＰ１阻害剤化合物を接触させて、ＥＮＰＰ１のｃＧＡＭＰ加水分解活性を阻害するステップを含む。一部の場合、ＥＮＰＰ１阻害剤化合物は、細胞非透過性である。ＥＮＰＰ１阻害剤化合物は、細胞外で作用し、ｃＧＡＭＰの分解を遮断することができる。同様に、がんを処置する医薬組成物および方法が提供される。本方法の態様は、被験体に、治療有効量のＥＮＰＰ１阻害剤を投与して、被験体のがんを処置するステップを含む。ある特定の場合、がんは、固形腫瘍がんである。同様に、被験体にＥＮＰＰ１阻害剤を投与するステップに連携して、放射線療法を被験体に投与する方法が提供される。放射線療法は、対象方法において、被験体への放射線損傷を軽減するが、依然として免疫応答を引き起こす程度に有効な投与量および／または頻度で投与され得る。

Description

本出願は、それらのそれぞれの全体が参照により組み込まれている、２０１９年２月１日出願の米国仮特許出願第６２／８００，２８３号、および２０１９年３月６日出願の米国仮特許出願第６２／８１４，７４５号への優先権および利益を主張する。
政府の権利
本発明は、米国国立衛生研究所によって助成された契約ＣＡ１９０８９６およびＣＡ２２８０４４、ならびに国防総省によって助成された契約Ｗ８１ＸＷＨ－１８－１－００４１に基づく政府支援により行われた。政府は、本発明において、ある程度の権利を有する。
導入部
環状グアノシン一リン酸－アデノシン一リン酸（ｃＧＡＭＰ）は、重要な抗がん自然免疫経路である、インターフェロン遺伝子の刺激因子（ＳＴＩＮＧ）の経路を活性化する。ｃＧＡＳ－ｃＧＡＭＰ－ＳＴＩＮＧ経路は、微生物感染、またはがんおよび自然免疫障害を含めた病態生理学的状態のどちらか一方に起因して、細胞質ＤＮＡの存在下で活性化を受ける。環状ＧＭＰ－ＡＭＰシンターゼ（ｃＧＡＳ）は、ヌクレオチジルトランスフェラーゼファミリーに属し、サイトゾルｄｓＤＮＡに結合すると活性化されて、シグナル伝達分子（２’－５’、３’－５’）環状ＧＭＰ－ＡＭＰ（または２’，３’－ｃＧＡＭＰ、または環状グアノシン一リン酸－アデノシン一リン酸であるｃＧＡＭＰ）を産生する万能ＤＮＡセンサーである。２’，３’－ｃＧＡＭＰは、微生物感染の間の第２のメッセンジャーとして作用すると、ＳＴＩＮＧに結合してこれを活性化し、免疫応答の引き金となるＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）および他の共刺激性分子の産生をもたらす。ＳＴＩＮＧ経路は、感染症におけるその役割の他に、がん免疫療法および自己免疫疾患に対する標的として浮上している。
エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ１（ＥＮＰＰ１）は、ｃＧＡＭＰを分解することができるｃＧＡＭＰの主要なヒドロラーゼである。ＥＮＰＰ１は、エクト－ヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ（ＥＮＰＰ）ファミリーのメンバーであり、２つの同一ジスルフィド結合サブユニットを含む、ＩＩ型膜貫通糖タンパク質である。ＥＮＰＰ１は、ヌクレオチドおよびヌクレオチド糖のホスホジエステル結合、ならびにヌクレオチドおよびヌクレオチド糖のピロホスフェート結合を含めた様々な基質を切断する幅広い特異性を有する。ＥＮＰＰ１は、ヌクレオシド５’三リン酸をその対応する一リン酸に加水分解する機能を有することができ、二アデノシンポリリン酸も加水分解することができる。
ＥＮＰＰ１を阻害するための化合物、組成物および方法が提供される。対象方法の態様は、試料にＥＮＰＰ１阻害剤化合物を接触させて、ＥＮＰＰ１のｃＧＡＭＰ加水分解活性を阻害するステップを含む。一部の場合、ＥＮＰＰ１阻害剤化合物は、細胞非透過性である。ＥＮＰＰ１阻害剤化合物は、細胞外で作用し、ｃＧＡＭＰの分解を遮断することができる。同様に、がんを処置する医薬組成物および方法が提供される。本方法の態様は、被験体に、治療有効量のＥＮＰＰ１阻害剤を投与して、被験体のがんを処置するステップを含む。ある特定の場合、がんは、固形腫瘍がんである。同様に、被験体にＥＮＰＰ１阻害剤を投与するステップに連携して、放射線療法を被験体に投与する方法が提供される。放射線療法は、対象方法において、被験体への放射線損傷を軽減するが、依然として免疫応答を引き起こす程度に有効な投与量および／または頻度で投与され得る。
本開示のこれらおよび他の利点および特徴が、本組成物および使用方法の詳細な説明を一読すると当業者に明白となり、この詳細な説明は、以下に一層十分に記載されている。
本発明は、添付の図面と関連させて一読すると、以下の詳細な説明から最良に理解される。本特許または出願書類は、カラーで作製された少なくとも１つの図面を含む。一般的な実務に従い、図面の様々な特徴は、縮尺通りでないことが強調される。これとは反対に、様々な特徴の寸法は、明瞭にするため任意に拡大されているか、または縮小されている。以下の図が図面に含まれる。以下に記載されている図面は、例示目的に過ぎないことが理解される。図は、本教示の範囲を決して限定することを意図するものではない。
図１のパネルＡ～Ｊは、ｃＧＡＭＰが、可溶性因子として２９３Ｔ ｃＧＡＳ ＥＮＰＰ１－／－細胞から排出されることを実証する実験結果を示す。 図１のパネルＡ～Ｊは、ｃＧＡＭＰが、可溶性因子として２９３Ｔ ｃＧＡＳ ＥＮＰＰ１－／－細胞から排出されることを実証する実験結果を示す。 図１のパネルＡ～Ｊは、ｃＧＡＭＰが、可溶性因子として２９３Ｔ ｃＧＡＳ ＥＮＰＰ１－／－細胞から排出されることを実証する実験結果を示す。
図２のパネルＡ～Ｃは、ＥＮＰＰ１が細胞外ｃＧＡＭＰを調節することができることを実証する実験結果を示す。
図３のパネルＡ～Ｆは、例示的なＥＮＰＰ１阻害剤（化合物１）の構造および様々な細胞アッセイにおける活性を例示する。
図４のパネルＡ～Ｅは、がん細胞が、培養物中でｃＧＡＳを発現して、ｃＧＡＭＰを連続的に排出することを示す実験結果を示す。
図５のパネルＡ～Ｉは、細胞外ｃＧＡＭＰの隔離により、腫瘍関連樹状細胞が、腫瘍ｃＧＡＳおよび宿主ＳＴＩＮＧ依存的に低下することを示す実験結果を示す。 図５のパネルＡ～Ｉは、細胞外ｃＧＡＭＰの隔離により、腫瘍関連樹状細胞が、腫瘍ｃＧＡＳおよび宿主ＳＴＩＮＧ依存的に低下することを示す実験結果を示す。 図５のパネルＡ～Ｉは、細胞外ｃＧＡＭＰの隔離により、腫瘍関連樹状細胞が、腫瘍ｃＧＡＳおよび宿主ＳＴＩＮＧ依存的に低下することを示す実験結果を示す。
図６のパネルＡ～Ｄは、ＥＮＰＰ１－／－腫瘍動員自然免疫浸潤は侵襲性が低く、ＩＲおよび抗ＣＴＬＡ－４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４）治療法に一層感受性が高いことを示す実験結果を示す。 図６のパネルＡ～Ｄは、ＥＮＰＰ１－／－腫瘍動員自然免疫浸潤は侵襲性が低く、ＩＲおよび抗ＣＴＬＡ－４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４）治療法に一層感受性が高いことを示す実験結果を示す。 図６のパネルＡ～Ｄは、ＥＮＰＰ１－／－腫瘍動員自然免疫浸潤は侵襲性が低く、ＩＲおよび抗ＣＴＬＡ－４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４）治療法に一層感受性が高いことを示す実験結果を示す。
図７のパネルＡ～Ｃは、ＥＮＰＰ１阻害は、ＩＲ処置および抗ＣＴＬＡ－４と相乗作用して、抗腫瘍作用を発揮することを示す実験結果を示す。
図８のパネルＡ～Ｄは、ＥＮＰＰ１加水分解活性およびｃＧＡＭＰレベルを評価するＬＣ－ＭＳ／ＭＳ法および２９３Ｔ ｃＧＡＳ ＥＮＰＰ１ｌｏｗおよび２９３Ｔ ｃＧＡＳ ＥＮＰＰ１－／－細胞系の使用を例示する。 図８のパネルＡ～Ｄは、ＥＮＰＰ１加水分解活性およびｃＧＡＭＰレベルを評価するＬＣ－ＭＳ／ＭＳ法および２９３Ｔ ｃＧＡＳ ＥＮＰＰ１ｌｏｗおよび２９３Ｔ ｃＧＡＳ ＥＮＰＰ１－／－細胞系の使用を例示する。
図９のパネルＡ～Ｂは、ＣＤ１４＋一次ヒト末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）が細胞外ｃＧＡＭＰに応答することを例示する実験概略図および結果を示す。
図１０のパネルＡ～Ｂは、化合物１および化合物ＱＳ１のＥＮＰＰ１阻害活性を比較し、細胞アッセイにおけるＱＳ１の活性を示す実験結果を示す。
図１１のパネルＡ～Ｆは、例示的なＥＮＰＰ１阻害剤化合物１（ＳＴＦ－１０８４）は、細胞非透過性であり、ＥＮＰＰ１に特異的で、かつ非毒性であることを示す実験結果を示す。 図１１のパネルＡ～Ｆは、例示的なＥＮＰＰ１阻害剤化合物１（ＳＴＦ－１０８４）は、細胞非透過性であり、ＥＮＰＰ１に特異的で、かつ非毒性であることを示す実験結果を示す。
図１２のパネルＡ～Ｅは、がん細胞が、培養物中でｃＧＡＭＰを連続的に排出することを示す実験結果を示す。
図１３のパネルＡ～Ｄは、細胞外ｃＧＡＭＰの隔離により、腫瘍関連樹状細胞が、腫瘍ｃＧＡＳおよび宿主ＳＴＩＮＧ依存的に低下することを示す実験結果を示す。
図１４のパネルＡ～Ｆは、確立されたＥＮＰＰ１－／－腫瘍は、腫瘍関連樹状細胞の増加をもたらすこと、侵襲性が低いこと、ならびにＩＲおよび抗ＣＴＬＡ－４治療法に一層感受性が高いことを示す実験結果を示す。 図１４のパネルＡ～Ｆは、確立されたＥＮＰＰ１－／－腫瘍は、腫瘍関連樹状細胞の増加をもたらすこと、侵襲性が低いこと、ならびにＩＲおよび抗ＣＴＬＡ－４治療法に一層感受性が高いことを示す実験結果を示す。
図１５は、ＥＮＰＰ１阻害（例えば、化合物１；ＳＴＦ－１０８４の使用）はＩＲ処置と相乗作用し、腫瘍関連樹状細胞を増加させることを実証するデータのグラフを示す。
図１６は、合成細胞から標的細胞へのｃＧＡＭＰ移行の様々な様式を例示する概略図を示す。
図１７は、ｃＧＡＭＰは、ｉｎ ｖｉｖｏでがん細胞によって分泌されるがん危険シグナルであることを例示する概略図を示す。
図１８Ａ～図１８Ｃは、例示的なＥＮＰＰ１阻害剤（化合物１）により、細胞系に存在する細胞外ｃＧＡＭＰの量が増加し得ることを例示するデータを示す。
図１９Ａ～図１９Ｂは、例示的なＥＮＰＰ１阻害剤（化合物１）により、ｃＧＡＭＰにより刺激されるインターフェロン転写が増大し得ることを例示する実験概略図および結果を示す。
図２０Ａ～図２０Ｂは、例示的なＥＮＰＰ１阻害剤（化合物１）により、マウス腫瘍モデルにおける、腫瘍関連樹状細胞の数が増加し得ることを例示するデータを示す。
図２１Ａ～図２１Ｃは、ＥＮＰＰ１阻害は、ＩＲ処置および抗ＣＴＬＡ－４と相乗作用して、抗腫瘍作用を発揮することを例示する実験結果を示す。 図２１Ａ～図２１Ｃは、ＥＮＰＰ１阻害は、ＩＲ処置および抗ＣＴＬＡ－４と相乗作用して、抗腫瘍作用を発揮することを例示する実験結果を示す。
図２２は、ＥＮＰＰ１が、免疫伝達物質であるｃＧＡＭＰを調節する自然免疫チェックポイントであることを例示する概略図を示す。
定義
本開示の実施形態をさらに記載する前に、本開示は、記載されている特定の実施形態に限定されず、したがって、当然ながら様々になり得ることを理解すべきである。本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によってしか限定されないので、本明細書において使用される用語は、特定の実施形態を記載することを目的としているに過ぎず、限定的であることを意図するものではないことをやはり理解すべきである。
特に定義されない限り、本明細書において使用される技術用語および科学用語はすべて、本開示が属する分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似または等価な任意の方法および物質もまた、本開示の実施形態の実施または試験に使用され得る。
本明細書において、および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎｄ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が特に明白に示さない限り、複数の指示物を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば、「化合物（ａ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」と言う場合、単一の化合物だけではなく、２つまたはそれより多くの化合物の組合せ物も含み、「置換基（ａ ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔ）」と言う場合、単一の置換基と、２つまたはそれより多くの置換基とを含み、他も同様である。
本発明を記載および主張するに際し、ある特定の用語が、以下に説明される定義に従って使用される。本明細書において提供される定義は、相互に排他的であることは意図されていないことが理解される。したがって、ある化学部分は、１つより多い用語の定義に収まることがある。
語句「例えば（ｆｏｒ ｅｘａｍｐｌｅ）」、「例えば（ｆｏｒ ｉｎｓｔａｎｃｅ）」、「など（ｓｕｃｈ ａｓ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、一層一般的な主題をさらに明確にする例を組み込むことを意図する。これらの例は、本開示を理解する一助としてのみに提示されており、限定を決して意図するものではない。
本明細書において議論されている刊行物は、本出願の出願日以前にそれらが開示されていることを単に提示しているに過ぎない。本発明が、先行発明によってこのような刊行物により先行される権利がないことを承認するものとして解釈されるべきものは、本明細書において何ら存在しない。さらに、提示されている刊行物の日付けは、実際の公開日とは異なることがあり、この日付けは、独立して確認する必要があることがある。
用語「活性剤」、「アンタゴニスト」、「阻害剤」、「薬物」および「薬理学的活性剤」は、本明細書において互換的に使用されて、生物（ヒトまたは動物）に投与されると、局所作用および／または全身作用による所望の薬理学的作用および／または生理学的作用を誘発する、化学物質または化合物を指す。
用語「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」などは、腫瘍負荷の低下などの、所望の薬理学的作用および／または生理学的作用を得ることを指す。この作用は、疾患もしくはそれらの症状を完全にもしくは部分的に予防する点で予防的とすることができ、かつ／あるいは疾患および／または疾患に起因し得る有害作用に対する部分的もしくは完全な治癒という点で治療的とすることができる。「処置」は、哺乳動物における、特にヒトにおける疾患の任意の処置を包含することが意図されており、以下：（ａ）疾患に罹り易い可能性があるが、疾患を有するとまだ診断されていない被験体に疾患または疾患の症状（例えば、一次疾患に関連し得るまたは一次疾患によって引き起こされる恐れのある疾患（慢性ＨＣＶ感染の状況においてもたらされる恐れのある肝線維症におけるような）を含む）が起こることを予防すること、（ｂ）疾患を阻害すること、すなわちその発症を停止させること、および（ｃ）疾患を軽減すること、すなわち疾患の後退（例えば、腫瘍負荷の低下）を引き起こすことを含む。
用語「薬学的に許容される塩」は、哺乳動物などの患者への投与に許容される塩（所与の投与量レジメンにとって許容される哺乳動物への安全性を有する対イオンとの塩）を意味する。このような塩は、薬学的に許容される無機塩基または有機塩基から、および薬学的に許容される無機酸または有機酸から誘導することができる。「薬学的に許容される塩」とは、化合物の薬学的に許容される塩を指し、この塩は、当分野で周知の様々な有機対イオンおよび無機対イオンから誘導され、単なる例として、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウム、テトラアルキルアンモニウムなど、および分子が塩基性官能基を含有する場合、塩酸塩、臭化水素酸塩、ギ酸塩、酒石酸塩、ベシル酸塩、メシル酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、シュウ酸塩などの有機酸または無機酸の塩を含む。
用語「個体」、「宿主」、「被験体」および「患者」は、本明細書において互換的に使用され、以下に限定されないが、サル類およびヒトを含めたヒトおよび非ヒト霊長類；ラットおよびマウスを含むげっ歯類；ウシ類；ウマ類；ヒツジ類；ネコ類；イヌ類などを含めた動物を指す。「哺乳動物」は、任意の哺乳動物種のメンバー（単数または複数）を意味し、例として、イヌ類；ネコ類；ウマ類；ウシ類；ヒツジ類；げっ歯目など、および霊長類、例えば、非ヒト霊長類およびヒトを含む。非ヒト動物モデル、例えば、哺乳動物、例えば非ヒト霊長類、ネズミ科、ウサギ目などを実験検討に使用することができる。
用語「決定する」、「測定する」、「評価する」および「アッセイする」は、互換的に使用され、定量的決定および定性的決定の両方を含む。
本明細書において互換的に使用される用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指し、このポリマー形態には、コードされたアミノ酸およびコードされないアミノ酸、化学的または生化学的に改変または誘導されたアミノ酸、ならびに改変されたペプチド骨格を有するポリペプチドを含むことができる。この用語は、以下に限定されないが、Ｎ末端メチオニン残基を有するもしくは有さない、異種配列および天然リーダー配列を有する融合物である非相同性アミノ酸配列を有する融合タンパク質；免疫学的にタグ付けされたタンパク質；検出可能な融合パートナーを有する融合タンパク質、例えば、融合パートナーとして、蛍光タンパク質、β－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼなどを含む融合タンパク質などを含めた、融合タンパク質を含む。
用語「核酸分子」および「ポリヌクレオチド」は、互換的に使用され、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはそれらのアナログのいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有することがあり、既知または不明の任意の機能を発揮し得る。ポリヌクレオチドの非限定例には、遺伝子、遺伝子断片、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、調節領域、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマーが含まれる。核酸分子は、直鎖状であってもよく、または環状であってもよい。
「治療有効量」または「有効量」は、疾患、状態または障害を処置するため、哺乳動物または他の被験体に投与されると、疾患、状態または障害に対するこのような処置を行うのに十分な化合物の量を意味する。「治療有効量」は、化合物、疾患およびその重症度、ならびに処置される被験体の年齢、体重などに応じて様々となろう。
用語「単位剤形」とは、本明細書で使用される場合、ヒトおよび動物被験体のための単位投与量として好適な物理的に離散性の単位を指し、各単位は、薬学的に許容される希釈剤、担体またはビヒクルと連携して、所望の効果を生じるのに十分な量で計算される所定量の化合物（例えば、本明細書に記載されているアミノピリミジン化合物）を含有する。単位剤形に関する規格は、使用される特定の化合物、および実現されるべき効果、および宿主における各化合物に関連する薬力学に依存する。
用語「薬学的に許容される賦形剤」、「薬学的に許容される希釈剤」、「薬学的に許容される担体」および「薬学的に許容されるアジュバント」は、医薬組成物を調製する際に有用な、一般に安全で非毒性の、生物学的にもその他の点でも望ましくもないことがない、賦形剤、希釈剤、担体またはアジュバントを指し、獣医学的使用およびヒト医薬品使用に許容される賦形剤、希釈剤、担体およびアジュバントを含む。本明細書および特許請求の範囲において使用される「薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、担体およびアジュバント」は、このような賦形剤、希釈剤、担体およびアジュバントを１種および１種より多くの両方を含む。
用語「医薬組成物」は、哺乳動物、とりわけヒトなどの、被験体への投与に好適な組成物を包含することが意図される。一般に、「医薬組成物」は、滅菌であり、被験体の内部で望ましくない応答を誘発することが可能な夾雑物を好ましくは含まない（例えば、医薬組成物中の化合物（単数または複数）は、医薬品グレードである）。医薬組成物は、経口、口内、直腸、非経口、腹腔内、皮内、気管内、筋肉内、皮下などを含めたいくつかの異なる投与経路を介して、それを必要とする被験体または患者に投与するよう設計され得る。
語句「式を有する」または「構造を有する」は、限定を意図するものではなく、用語「含む」が一般に使用されるのと同じように使用される。用語「から独立して選択される」は、本明細書において、記載されている要素、例えばＲ基などが、同一とすることができるか、または異なることができることを示すよう使用される。
用語「してもよい（ｍａｙ）」、「必要に応じた（ｏｐｔｉｏｎａｌ）」、「必要に応じて（ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）」または「必要に応じて、～してもよい」は、その後に記載されている状況が起こることがあるか、または起こらないことがあることを意味し、その結果、この記載は、その状況が起こる例およびその状況が起こらない例を含む。例えば、語句「必要に応じて置換されている」は、非水素置換基は、所与の原子上に存在してもよく、または存在しなくてもよいことを意味し、したがって、この記載は、非水素置換基が存在する構造、および非水素置換基が存在しない構造を含む。
「アシル」とは、基Ｈ－Ｃ（Ｏ）－、アルキル－Ｃ（Ｏ）－、置換アルキル－Ｃ（Ｏ）－、アルケニル－Ｃ（Ｏ）－、置換アルケニル－Ｃ（Ｏ）－、アルキニル－Ｃ（Ｏ）－、置換アルキニル－Ｃ（Ｏ）－、シクロアルキル－Ｃ（Ｏ）－、置換シクロアルキル－Ｃ（Ｏ）－、シクロアルケニル－Ｃ（Ｏ）－、置換シクロアルケニル－Ｃ（Ｏ）－、アリール－Ｃ（Ｏ）－、置換アリール－Ｃ（Ｏ）－、ヘテロアリール－Ｃ（Ｏ）－、置換ヘテロアリール－Ｃ（Ｏ）－、ヘテロシクリル－Ｃ（Ｏ）－および置換ヘテロシクリル－Ｃ（Ｏ）－を指し、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式および置換複素環式は、本明細書で定義されている通りである。例えば、アシルは、「アセチル」基ＣＨ３Ｃ（Ｏ）－を含む。
用語「アルキル」とは、必ずしもではないが通常、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｔ－ブチル、オクチル、デシルなど、およびシクロペンチル、シクロヘキシルなどのシクロアルキル基などの、１～約２４個の炭素原子を含有する、分岐状または非分岐状飽和炭化水素基（すなわち、モノラジカル）を指す。一般に、必ずしもではないが、アルキル基は、本明細書において、１～約１８個の炭素原子を含有することができ、このような基は、１～約１２個の炭素原子を含有することができる。用語「低級アルキル」は、１～６個の炭素原子からなるアルキル基を意図する。「置換アルキル」は、１つまたは複数の置換基により置換されているアルキルを指し、これは、カルボニル基中などの、アルキル置換基中の同一炭素原子からの２個の水素原子が置き換えられている例を含む（すなわち、置換アルキル基は、－Ｃ（＝Ｏ）－部分を含むことができる）。用語「ヘテロ原子含有アルキル」および「ヘテロアルキル」とは、以下にさらに詳述されている通り、少なくとも１個の炭素原子がヘテロ原子により置き換えられているアルキル置換基を指す。用語「アルキル」および「低級アルキル」は、特に示されていない場合、それぞれ、直鎖状、分岐状、環式、非置換の、置換されているおよび／もしくはヘテロ原子を含有するアルキルまたは低級アルキルを含む。
用語「置換アルキル」は、本明細書で定義されているアルキル基であって、アルキル鎖中の１個または複数の炭素原子が、－Ｏ－、－Ｎ－、－Ｓ－、－Ｓ（Ｏ）ｎ－（ｎは、０～２である）、－ＮＲ－（Ｒは、水素またはアルキルである）などのヘテロ原子により必要に応じて置き換えられており、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、アミノアシル、アミノアシルオキシ、オキシアミノアシル、アジド、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシル、オキソ、チオケト、カルボキシル、カルボキシルアルキル、チオアリールオキシ、チオヘテロアリールオキシ、チオヘテロシクロオキシ、チオール、チオアルコキシ、置換チオアルコキシ、アリール、アリールオキシ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリル、ヘテロシクロオキシ、ヒドロキシアミノ、アルコキシアミノ、ニトロ、－ＳＯ－アルキル、－ＳＯ－アリール、－ＳＯ－ヘテロアリール、－ＳＯ２－アルキル、－ＳＯ２－アリール、－ＳＯ２－ヘテロアリールおよび－ＮＲａＲｂ（Ｒ’およびＲ”は、同一であってもよくまたは異なっていてもよく、水素、必要に応じて置換されているアルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリールおよび複素環式から選択される）からなる群から選択される１～５つの置換基を有する、アルキル基を含むことが意図されている。
用語「アルケニル」とは、エテニル、ｎ－プロペニル、イソプロペニル、ｎ－ブテニル、イソブテニル、オクテニル、デセニル、テトラデセニル、ヘキサデセニル、エイコセニル、テトラコセニルなどの、少なくとも１つの二重結合を含有する、２～約２４個の炭素原子からなる直鎖状、分岐状または環式炭化水素基を指す。一般に、やはり必ずしもではないが、アルケニル基は、本明細書において、２～約１８個の炭素原子を含有することができ、例えば、２～１２個の炭素原子を含有することができる。用語「低級アルケニル」は、２～６個の炭素原子からなるアルケニル基を意図する。用語「置換アルケニル」とは、１つまたは複数の置換基により置換されているアルケニルを指し、用語「ヘテロ原子含有アルケニル」および「ヘテロアルケニル」とは、少なくとも１個の炭素原子がヘテロ原子により置き換えられているアルケニルを指す。用語「アルケニル」および「低級アルケニル」は、特に示されていない場合、それぞれ、直鎖状、分岐状、環式、非置換の、置換されているおよび／またはヘテロ原子を含有するアルケニルならびに低級アルケニルを含む。
用語「アルキニル」とは、エチニル、ｎ－プロピニルなどの、少なくとも１つの三重結合を含有する２～２４個の炭素原子からなる直鎖状または分岐状炭化水素基を指す。一般に、やはり必ずしもではないが、アルキニル基は、本明細書において、２～約１８個の炭素原子を含有することができ、このような基は、２～１２個の炭素原子をさらに含有することができる。用語「低級アルキニル」は、２～６個の炭素原子からなるアルキニル基を意図する。用語「置換アルキニル」とは、１つまたは複数の置換基により置換されているアルキニルを指し、用語「ヘテロ原子含有アルキニル」および「ヘテロアルキニル」とは、少なくとも１個の炭素原子がヘテロ原子により置き換えられているアルキニルを指す。用語「アルキニル」および「低級アルキニル」は、特に示されていない場合、それぞれ、直鎖状、分岐状、非置換の、置換されているおよび／またはヘテロ原子を含有するアルキニルおよび低級アルキニルを含む。
用語「アルコキシ」とは、単一の末端エーテル連結基を介して結合しているアルキル基を指す。すなわち、「アルコキシ」基は、－Ｏ－アルキルと表されることができ、アルキルは、上で定義されている通りである。「低級アルコキシ」基は、１～６個の炭素原子を含有するアルコキシ基を指し、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ－プロポキシ、イソプロポキシ、ｔ－ブチルオキシなどを含む。「Ｃ１～Ｃ６アルコキシ」または「低級アルコキシ」として特定される置換基は、本明細書において、例えば、１～３個の炭素原子を含有してもよく、さらなる例として、このような置換基は、１個または２個の炭素原子を含有してもよい（すなわち、メトキシおよびエトキシ）。表示「－ＯＭｅ」および「ＭｅＯ－」は、メトキシ基を指す。
用語「置換アルコキシ」とは、置換アルキル－Ｏ－、置換アルケニル－Ｏ－、置換シクロアルキル－Ｏ－、置換シクロアルケニル－Ｏ－および置換アルキニル－Ｏ－という基を指し、置換アルキル、置換アルケニル、置換シクロアルキル、置換シクロアルケニルおよび置換アルキニルは、本明細書で定義されている通りである。
用語「アリール」とは、別段の指定がない限り、一般に、必ずしもではないが、５～３０個の炭素原子を含有し、かつ単一の芳香環、または一緒に縮合している、直接連結されている、もしくは間接的に連結されている複数の芳香環（こうして、異なる芳香環が、メチレン部分またはエチレン部分などの共通の基に結合している）を含有する芳香族置換基を指す。アリール基は、例えば、５～２０個の炭素原子を含有することができ、さらなる例として、アリール基は、５～１２個の炭素原子を含有することができる。例えば、アリール基は、１つの芳香環、あるいは２つもしくはそれより多い縮合芳香環または連結した芳香環（すなわち、ビアリール、アリール置換アリールなど）を含有することができる。例には、フェニル、ナフチル、ビフェニル、ジフェニルエーテル、ジフェニルアミン、ベンゾフェノンなどが含まれる。「置換アリール」とは、１つまたは複数の置換基により置換されているアリール部分を指し、用語「ヘテロ原子含有アリール」および「ヘテロアリール」とは、以下にさらに詳細に記載されている通り、少なくとも１個の炭素原子がヘテロ原子により置き換えられているアリール置換基を指す。アリールは、以下に限定されないが、フェニル、ビフェニル、ナフチル、ピリジル、フリル、チオフェニル、イミダゾイル、ピリミジニルおよびオキサゾイルによって例示される、安定な環式、複素環式、多環式および複素多環式不飽和Ｃ３～Ｃ１４部分を含むことが意図されており、これらは、ヒドロキシ、Ｃ１～Ｃ８アルコキシ、分岐状または直鎖状Ｃ１～Ｃ８アルキル、アシルオキシ、カルバモイル、アミノ、Ｎ－アシルアミノ、ニトロ、ハロゲン、トリフルオロメチル、シアノおよびカルボキシルからなる群から選択される１～５つのメンバーによってさらに置換されていてもよい（例えば、Katritzky, Handbook of Heterocyclic Chemistryを参照されたい）。特に示されていない場合、用語「アリール」は、非置換、置換および／またはヘテロ原子含有芳香族置換基を含む。
用語「アラルキル」とは、アリール置換基を有するアルキル基を指し、用語「アルカリール」とは、アルキル置換基を有するアリール基を指し、「アルキル」および「アリール」は、上で定義されている通りである。一般に、アラルキル基およびアルカリール基は、本明細書において、６～３０個の炭素原子を含有する。アラルキル基およびアルカリール基は、例えば、６～２０個の炭素原子を含有することができ、さらなる例として、このような基は、６～１２個の炭素原子を含有することができる。
用語「アルキレン」とは、ジラジカルのアルキル基を指す。特に示さない限り、このような基は、１～２４個の炭素原子を含有する飽和炭化水素鎖を含み、これは、置換されていてもよく、または非置換であってもよく、１つまたは複数の脂環式基を含有してもよく、ヘテロ原子を含有していてもよい。「低級アルキレン」は、１～６個の炭素原子を含有するアルキレン連結基を指す。例には、メチレン（－－ＣＨ２－－）、エチレン（－－ＣＨ２ＣＨ２－－）、プロピレン（－－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－－）、２－メチルプロピレン（－－ＣＨ２－－ＣＨ（ＣＨ３）－－ＣＨ２－－）、ヘキシレン（－－（ＣＨ２）６－－）などが含まれる。
同様に、用語「アルケニレン」、「アルキニレン」、「アリーレン」、「アラルキレン」および「アルカリーレン」とは、それぞれ、ジラジカルのアルケニル基、アルキニル基、アリール基、アラルキル基およびアルカリール基を指す。
用語「アミノ」とは、－ＮＲＲ’基を指し、ＲおよびＲ’は独立して、水素または非水素置換基であり、非水素置換基は、例えば、アルキル、アリール、アルケニル、アラルキル、ならびにそれらの置換されている変形体および／またはヘテロ原子含有変形体を含む。
用語「ハロ」および「ハロゲン」は、慣用的な意味で使用され、クロロ、ブロモ、フルオロまたはヨード置換基を指す。
「カルボキシル」、「カルボキシ」または「カルボキシレート」とは、－ＣＯ２Ｈまたはその塩を指す。
「シクロアルキル」とは、縮合環系、架橋環系およびスピロ環系を含めた、単環式環または多環式環を有する、３～１０個の炭素原子からなる環式アルキル基を指す。好適なシクロアルキル基の例には、例えば、アダマンチル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロオクチルなどが含まれる。このようなシクロアルキル基には、例として、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロオクチルなどの単環構造、またはアダマンタニルなどの多環構造などが含まれる。
用語「置換シクロアルキル」とは、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノアシル、アミノアシルオキシ、オキシアミノアシル、アジド、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシル、オキソ、チオケト、カルボキシル、カルボキシルアルキル、チオアリールオキシ、チオヘテロアリールオキシ、チオヘテロシクロオキシ、チオール、チオアルコキシ、置換チオアルコキシ、アリール、アリールオキシ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリル、ヘテロシクロオキシ、ヒドロキシアミノ、アルコキシアミノ、ニトロ、－ＳＯ－アルキル、－ＳＯ－置換アルキル、－ＳＯ－アリール、－ＳＯ－ヘテロアリール、－ＳＯ２－アルキル、－ＳＯ２－置換アルキル、－ＳＯ２－アリールおよび－ＳＯ２－ヘテロアリールから選択される１～５つの置換基または１～３つの置換基を有するシクロアルキル基を指す。
「ヘテロ原子含有アルキル基」（「ヘテロアルキル」基とも呼ばれる）または「ヘテロ原子含有アリール基」（「ヘテロアリール」基とも呼ばれる）におけるような「ヘテロ原子含有」という用語は、１個または複数の炭素原子が、炭素以外の原子、例えば、窒素、酸素、硫黄、リンまたはケイ素、通常、窒素、酸素または硫黄により置き換えられている分子、連結基または置換基を指す。同様に、用語「ヘテロアルキル」とは、ヘテロ原子を含有するアルキル置換基を指し、用語「ヘテロシクロアルキル」とは、ヘテロ原子を含有するシクロアルキル置換基を指し、用語「複素環式」または「複素環」とは、ヘテロ原子を含有する環式置換基を指し、用語「ヘテロアリール」および「複素芳香族」とは、それぞれ、ヘテロ原子を含有する「アリール」および「芳香族」置換基を指す、などである。ヘテロアルキル基の例には、アルコキシアリール、アルキルスルファニル－置換アルキル、Ｎ－アルキル化アミノアルキルなどが含まれる。ヘテロアリール置換基の例には、ピロリル、ピロリジニル、ピリジニル、キノリニル、インドリル、フリル、ピリミジニル、イミダゾリル、１，２，４－トリアゾリル、テトラゾリルなどが含まれ、ヘテロ含有脂環式基の例は、ピロリジノ、モルホリノ、ピペラジノ、ピペリジノ、テトラヒドロフラニルなどである。
「ヘテロアリール」とは、環内に１～１０個の炭素原子などの１～１５個の炭素原子、ならびに酸素、窒素および硫黄からなる群から選択される１～１０個のヘテロ原子からなる芳香族基を指す。このようなヘテロアリール基は、単環（ピリジニル、イミダゾリルまたはフリルなど）、または環系における縮合多環（例えば、インドリジニル、キノリニル、ベンゾフラン、ベンゾイミダゾリルまたはベンゾチエニルなどの基におけるような）を有することができ、この場合、環系内の少なくとも１つの環は芳香族であり、但し、結合点は芳香環の原子を介することを条件とする。ある特定の実施形態では、ヘテロアリール基の窒素および／または硫黄環原子（単数または複数）は、必要に応じて酸化されて、Ｎ－オキシド（Ｎ→Ｏ）、スルフィニルまたはスルホニル部分をもたらす。この用語は、例として、ピリジニル、ピロリル、インドリル、チオフェニルおよびフラニルを含む。ヘテロアリール置換基に関して定義することによって特に制約されない限り、このようなヘテロアリール基は、アシルオキシ、ヒドロキシ、チオール、アシル、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、置換アルキル、置換アルコキシ、置換アルケニル、置換アルキニル、置換シクロアルキル、置換シクロアルケニル、アミノ、置換アミノ、アミノアシル、アシルアミノ、アルカリール、アリール、アリールオキシ、アジド、カルボキシル、カルボキシルアルキル、シアノ、ハロゲン、ニトロ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリル、ヘテロシクロオキシ、アミノアシルオキシ、オキシアシルアミノ、チオアルコキシ、置換チオアルコキシ、チオアリールオキシ、チオヘテロアリールオキシ、－ＳＯ－アルキル、－ＳＯ－置換アルキル、－ＳＯ－アリール、－ＳＯ－ヘテロアリール、－ＳＯ２－アルキル、－ＳＯ２－置換アルキル、－ＳＯ２－アリールおよび－ＳＯ２－ヘテロアリールおよびトリハロメチルから選択される１～５つの置換基または１～３つの置換基により必要に応じて置換され得る。
用語「複素環」、「複素環式」および「ヘテロシクリル」とは、単環、または、縮合環系、架橋環系およびスピロ環系を含む縮合多環を有し、そして１～４個のヘテロ原子を含めた３～１５個の環原子を有する、飽和基または不飽和基を指す。これらの環ヘテロ原子は、窒素、硫黄および酸素から選択され、この場合、縮合環系において、環のうちの１つまたは複数が、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールとすることができ、但し、結合点は、非芳香環を介することを条件とする。ある特定の実施形態では、複素環式基の窒素原子（単数もしくは複数）および／または硫黄原子（単数もしくは複数）は、必要に応じて酸化され、Ｎ－オキシド、－Ｓ（Ｏ）－または－ＳＯ２－部分をもたらす。
複素環およびヘテロアリールの例には、以下に限定されないが、アゼチジン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インドリジン、イソインドール、インドール、ジヒドロインドール、インダゾール、プリン、キノリジン、イソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチルピリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、プテリジン、カルバゾール、カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、フェナントロリン、イソチアゾール、フェナジン、イソオキサゾール、フェノキサジン、フェノチアジン、イミダゾリジン、イミダゾリン、ピペリジン、ピペラジン、インドリン、フタルイミド、１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン、４，５，６，７－テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン、チアゾール、チアゾリジン、チオフェン、ベンゾ［ｂ］チオフェン、モルホリニル、チオモルホリニル（チアモルホリニルとも称される）、１，１－ジオキソチオモルホリニル、ピペリジニル、ピロリジン、テトラヒドロフラニルなどが含まれる。
複素環式置換基に関する定義によって特に制約されない限り、このような複素環式基は、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノアシル、アミノアシルオキシ、オキシアミノアシル、アジド、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシル、オキソ、チオケト、カルボキシル、カルボキシルアルキル、チオアリールオキシ、チオヘテロアリールオキシ、チオヘテロシクロオキシ、チオール、チオアルコキシ、置換チオアルコキシ、アリール、アリールオキシ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリル、ヘテロシクロオキシ、ヒドロキシアミノ、アルコキシアミノ、ニトロ、－ＳＯ－アルキル、－ＳＯ－置換アルキル、－ＳＯ－アリール、－ＳＯ－ヘテロアリール、－ＳＯ２－アルキル、－ＳＯ２－置換アルキル、－ＳＯ２－アリール、－ＳＯ２－ヘテロアリールおよび縮合複素環から選択される１～５つの置換基または１～３つの置換基により必要に応じて置換され得る。
「ヒドロカルビル」とは、アルキル基、アルケニル基、アリール基などの、１～約２４個の炭素原子を含む、さらには１～約１８個の炭素原子を含む、およびさらには約１～１２個の炭素原子を含む、１～約３０個の炭素原子を含有し、直鎖状、分岐状、環式、飽和および不飽和種を含む、一価のヒドロカルビルラジカルを指す。ヒドロカルビルは、１つまたは複数の置換基により置換されていてもよい。用語「ヘテロ原子含有ヒドロカルビル」とは、少なくとも１個の炭素原子がヘテロ原子により置き換えられているヒドロカルビルを指す。特に示さない限り、用語「ヒドロカルビル」は、置換されているおよび／またはヘテロ原子を含有するヒドロカルビル部分を含むものとして解釈されるべきである。
「置換ヒドロカルビル」、「置換アルキル」、「置換アリール」などにおけるような「置換されている」とは、上述の定義の一部において暗示されている通り、ヒドロカルビル、アルキル、アリールまたは他の部分において、炭素（または他の）原子に結合している少なくとも１個の水素原子が、１つまたは複数の非水素置換基により置き換えられていることが意図される。このような置換基の例には、非限定的に、官能基、およびヒドロカルビル部分Ｃ１～Ｃ２４アルキル（Ｃ１～Ｃ１８アルキルを含み、さらにはＣ１～Ｃ１２アルキルを含み、さらにはＣ１～Ｃ６アルキルを含む）、Ｃ２～Ｃ２４アルケニル（Ｃ２～Ｃ１８アルケニルを含み、さらにはＣ２～Ｃ１２アルケニルを含み、さらにはＣ２～Ｃ６アルケニルを含む）、Ｃ２～Ｃ２４アルキニル（Ｃ２～Ｃ１８アルキニルを含み、さらにはＣ２～Ｃ１２アルキニルを含み、さらにはＣ２～Ｃ６アルキニルを含む）、Ｃ５～Ｃ３０アリール（Ｃ５～Ｃ２０アリールを含み、さらにはＣ５～Ｃ１２アリールを含む）およびＣ６～Ｃ３０アラルキル（Ｃ６～Ｃ２０アラルキルを含み、さらにはＣ６～Ｃ１２アラルキルを含む）が含まれる。上述のヒドロカルビル部分は、具体的に記載されているものなどの、１つもしくは複数の官能基、または追加のヒドロカルビル部分によりさらに置換されていてもよい。特に示さない限り、本明細書に記載されている基のいずれも、非置換基に加えて、置換部分および／またはヘテロ原子含有部分を含むものと解釈されるべきである。
「スルホニル」とは、基ＳＯ２－アルキル、ＳＯ２－置換アルキル、ＳＯ２－アルケニル、ＳＯ２－置換アルケニル、ＳＯ２－シクロアルキル、ＳＯ２－置換シクロアルキル（cylcoalkyl）、ＳＯ２－シクロアルケニル、ＳＯ２－置換シクロアルケニル（cylcoalkenyl）、ＳＯ２－アリール、ＳＯ２－置換アリール、ＳＯ２－ヘテロアリール、ＳＯ２－置換ヘテロアリール、ＳＯ２－複素環式およびＳＯ２－置換複素環式を指し、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式および置換複素環式は、本明細書で定義されている通りである。スルホニルには、例として、メチル－ＳＯ２－、フェニル－ＳＯ２－および４－メチルフェニル－ＳＯ２－が含まれる。
用語「官能基」とは、ハロ、ヒドロキシル、スルフヒドリル、Ｃ１～Ｃ２４アルコキシ、Ｃ２～Ｃ２４アルケニルオキシ、Ｃ２～Ｃ２４アルキニルオキシ、Ｃ５～Ｃ２０アリールオキシ、アシル（Ｃ２～Ｃ２４アルキルカルボニル（－ＣＯ－アルキル）およびＣ６～Ｃ２０アリールカルボニル（－ＣＯ－アリール）を含む）、アシルオキシ（－Ｏ－アシル）、Ｃ２～Ｃ２４アルコキシカルボニル（－（ＣＯ）－Ｏ－アルキル）、Ｃ６～Ｃ２０アリールオキシカルボニル（－（ＣＯ）－Ｏ－アリール）、ハロカルボニル（－ＣＯ）－Ｘ（Ｘは、ハロである）、Ｃ２～Ｃ２４アルキルカーボナト（－Ｏ－（ＣＯ）－Ｏ－アルキル）、Ｃ６～Ｃ２０アリールカーボナト（－Ｏ－（ＣＯ）－Ｏ－アリール）、カルボキシ（－ＣＯＯＨ）、カルボキシラト（－ＣＯＯ－）、カルバモイル（－（ＣＯ）－ＮＨ２）、一置換Ｃ１～Ｃ２４アルキルカルバモイル（－（ＣＯ）－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ２４アルキル））、二置換アルキルカルバモイル（－（ＣＯ）－Ｎ（Ｃ１～Ｃ２４アルキル）２）、一置換アリールカルバモイル（－（ＣＯ）－ＮＨ－アリール）、チオカルバモイル（－（ＣＳ）－ＮＨ２）、カルバミド（－ＮＨ－（ＣＯ）－ＮＨ２）、シアノ（－Ｃ≡Ｎ）、イソシアノ（－Ｎ＋≡Ｃ－）、シアナト（－Ｏ－Ｃ≡Ｎ）、イソシアナト（－Ｏ－Ｎ＋≡Ｃ－）、イソチオシアナト（－Ｓ－Ｃ≡Ｎ）、アジド（－Ｎ＝Ｎ＋＝Ｎ－）、ホルミル（－（ＣＯ）－Ｈ）、チオホルミル（－（ＣＳ）－Ｈ）、アミノ（－ＮＨ２）、モノ－およびジ－（Ｃ１～Ｃ２４アルキル）－置換アミノ、モノ－およびジ－（Ｃ５～Ｃ２０アリール）－置換アミノ、Ｃ２～Ｃ２４アルキルアミド（－ＮＨ－（ＣＯ）－アルキル）、Ｃ５～Ｃ２０アリールアミド（－ＮＨ－（ＣＯ）－アリール）、イミノ（－ＣＲ＝ＮＨ（Ｒ＝水素、Ｃ１～Ｃ２４アルキル、Ｃ５～Ｃ２０アリール、Ｃ６～Ｃ２０アルカリール、Ｃ６～Ｃ２０アラルキルなど））、アルキルイミノ（－ＣＲ＝Ｎ（アルキル）（Ｒ＝水素、アルキル、アリール、アルカリールなど））、アリールイミノ（－ＣＲ＝Ｎ（アリール）（Ｒ＝水素、アルキル、アリール、アルカリールなど））、ニトロ（－ＮＯ２）、ニトロソ（－ＮＯ）、スルホ（－ＳＯ２－ＯＨ）、スルホナト（－ＳＯ２－Ｏ－）、Ｃ１～Ｃ２４アルキルスルファニル（－Ｓ－アルキル；「アルキルチオ」とも呼ばれる）、アリールスルファニル（－Ｓ－アリール；「アリールチオ」とも呼ばれる）、Ｃ１～Ｃ２４アルキルスルフィニル（－（ＳＯ）－アルキル）、Ｃ５～Ｃ２０アリールスルフィニル（－（ＳＯ）－アリール）、Ｃ１～Ｃ２４アルキルスルホニル（－ＳＯ２－アルキル）、Ｃ５～Ｃ２０アリールスルホニル（－ＳＯ２－アリール）、ホスホノ（－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２）、ホスホナト（－Ｐ（Ｏ）（Ｏ－）２）、ホスフィナト（－Ｐ（Ｏ）（Ｏ－））、ホスホ（－ＰＯ２）およびホスフィノ（－ＰＨ２）、モノ－およびジ－（Ｃ１～Ｃ２４アルキル）－置換ホスフィノ、モノ－およびジ－（Ｃ５～Ｃ２０アリール）－置換ホスフィンなどの化学基が意図される。さらに、上述の官能基は、具体的な基が許容する場合、上で具体的に記載されているものなどの、１つもしくは複数の追加の官能基、または１つもしくは複数のヒドロカルビル部分によりさらに置換されていてもよい。
「連結基」、「リンカー部分」などにおけるものなどの「連結する」または「リンカー」とは、共有結合により、２つの基を連結する連結部分であることが意図される。リンカーは、直鎖状、分岐状、環式または単一原子とすることができる。このような連結基の例には、アルキル、アルケニレン、アルキニレン、アリーレン、アルカリーレン、アラルキレン、および非限定的に、アミド（－ＮＨ－ＣＯ－）、ウレイレン（－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－）、イミド（－ＣＯ－ＮＨ－ＣＯ－）、エポキシ（－Ｏ－）、エピチオ（－Ｓ－）、エピジオキシ（－Ｏ－Ｏ－）、カルボニルジオキシ（－Ｏ－ＣＯ－Ｏ－）、アルキルジオキシ（－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ－Ｏ－）、エポキシイミノ（－Ｏ－ＮＨ－）、エピイミノ（－ＮＨ－）、カルボニル（－ＣＯ－）などを含めた、官能基を含有する連結部分が含まれる。ある特定の場合、リンカー主鎖の１個、２個、３個、４個もしくは５個、またはそれより多くの炭素原子は、硫黄、窒素または酸素ヘテロ原子により必要に応じて置換されていてもよい。主鎖原子の間の結合は、飽和または不飽和であってもよく、通常、１つ、２つまたは３つ以下の不飽和結合が、リンカー主鎖に存在する。リンカーは、例えば、アルキル基、アリール基またはアルケニル基を有する１つまたは複数の置換基を含んでもよい。リンカーは、非限定的に、ポリ（エチレングリコール）単位（単数または複数）（例えば、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）－）；エーテル、チオエーテル、アミン、アルキル（例えば、（Ｃ１～Ｃ１２）アルキル）を含むことができ、これらは、直鎖状または分岐状、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、１－メチルエチル（イソ－プロピル）、ｎ－ブチル、ｎ－ペンチル、１，１－ジメチルエチル（ｔ－ブチル）などであってもよい。リンカー主鎖は、環式基、例えば、アリール、複素環またはシクロアルキル基を含むことができ、この場合、環式基の２個またはそれより多い原子、例えば、２個、３個または４個の原子が主鎖に含まれる。リンカーは、切断性であってもよく、または非切断性であってもよい。連結された基へのリンカーの都合のよい方向および／または連結が使用されてもよい。
用語「置換されている」が、可能な置換されている基の一覧表示の前に現れる場合、この用語は、その群のメンバーのそれぞれに適用されることが意図されている。例えば、語句「置換アルキルおよびアリール」は、「置換アルキルおよび置換アリール」として解釈されるべきである。
本明細書における開示に加えて、用語「置換されている」は、指定した基またはラジカルを修飾するために使用されている場合、指定した基またはラジカルの１個または複数の水素原子が、それぞれ、互いに独立して、以下に定義されている同一または異なる置換基により置きかえられていることも意味することができる。
本明細書における個々の用語に関して開示されている基に加えて、指定した基またはラジカルにおける飽和炭素原子上の１個または複数の水素（単一炭素上の任意の２個の水素は、＝Ｏ、＝ＮＲ７０、＝Ｎ－ＯＲ７０、＝Ｎ２または＝Ｓにより置き換えられることができる）の代わりに置き換わる置換基は、別段の指定がない限り、－Ｒ６０、ハロ、＝Ｏ、－ＯＲ７０、－ＳＲ７０、－ＮＲ８０Ｒ８０、トリハロメチル、－ＣＮ、－ＯＣＮ、－ＳＣＮ、－ＮＯ、－ＮＯ２、＝Ｎ２、－Ｎ３、－ＳＯ２Ｒ７０、－ＳＯ２Ｏ－Ｍ＋、－ＳＯ２ＯＲ７０、－ＯＳＯ２Ｒ７０、－ＯＳＯ２Ｏ－Ｍ＋、－ＯＳＯ２ＯＲ７０、－Ｐ（Ｏ）（Ｏ－）２（Ｍ＋）２、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ７０）Ｏ－Ｍ＋、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ７０）２、－Ｃ（Ｏ）Ｒ７０、－Ｃ（Ｓ）Ｒ７０、－Ｃ（ＮＲ７０）Ｒ７０、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｍ＋、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ７０、－Ｃ（Ｓ）ＯＲ７０、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ８０Ｒ８０、－Ｃ（ＮＲ７０）ＮＲ８０Ｒ８０、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ７０、－ＯＣ（Ｓ）Ｒ７０、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－Ｍ＋、－ＯＣ（Ｏ）ＯＲ７０、－ＯＣ（Ｓ）ＯＲ７０、－ＮＲ７０Ｃ（Ｏ）Ｒ７０、－ＮＲ７０Ｃ（Ｓ）Ｒ７０、－ＮＲ７０ＣＯ２ －Ｍ＋、－ＮＲ７０ＣＯ２Ｒ７０、－ＮＲ７０Ｃ（Ｓ）ＯＲ７０、－ＮＲ７０Ｃ（Ｏ）ＮＲ８０Ｒ８０、－ＮＲ７０Ｃ（ＮＲ７０）Ｒ７０および－ＮＲ７０Ｃ（ＮＲ７０）ＮＲ８０Ｒ８０であり、Ｒ６０は、必要に応じて置換されているアルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキルアルキル、シクロアルキルアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールおよびヘテロアリールアルキルからなる群から選択され、Ｒ７０はそれぞれ、独立して、水素またはＲ６０であり、Ｒ８０はそれぞれ、独立して、Ｒ７０であるか、または代替的に、２つのＲ８０は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、５員、６員または７員のヘテロシクロアルキルを形成し、これは、Ｏ、ＮおよびＳからなる群から選択される同一のまたは異なる追加のヘテロ原子のうちの１～４個を必要に応じて含んでもよく、ヘテロ原子のうちのＮは、－ＨまたはＣ１～Ｃ３アルキル置換を有していてもよく、Ｍ＋はそれぞれ、正味の単一正電荷を有する対イオンである。Ｍ＋はそれぞれ、独立して、例えば、Ｋ＋、Ｎａ＋、Ｌｉ＋などのアルカリイオン；＋Ｎ（Ｒ６０）４などのアンモニウムイオン；または［Ｃａ２＋］０．５、［Ｍｇ２＋］０．５または［Ｂａ２＋］０．５（下付数字０．５は、このような二価のアルカリ土類イオンに対する対イオンのうちの１つが、本発明の化合物のイオン化形態とすることができること、および塩化物イオンまたは本明細書に開示されている２つのイオン化合物などの他の典型的な対イオンが、このような二価のアルカリ土類イオンに対する対イオンとして働くことができること、または本発明の二重イオン化化合物が、このような二価のアルカリ土類イオンに対する対イオンとして働くことができることを意味する）などのアルカリ土類イオンとすることができる。具体例として、－ＮＲ８０Ｒ８０は、－ＮＨ２、－ＮＨ－アルキル、Ｎ－ピロリジニル、Ｎ－ピペラジニル、４Ｎ－メチル－ピペラジン－１－イルおよびＮ－モルホリニルを含むことが意図されている。
本明細書における開示に加え、「置換されている」アルケン、アルキン、アリールおよびヘテロアリール基における不飽和炭素原子上の水素に対する置換基は、別段の指定がない限り、－Ｒ６０、ハロ、－Ｏ－Ｍ＋、－ＯＲ７０、－ＳＲ７０、－Ｓ－Ｍ＋、－ＮＲ８０Ｒ８０、トリハロメチル、－ＣＦ３、－ＣＮ、－ＯＣＮ、－ＳＣＮ、－ＮＯ、－ＮＯ２、－Ｎ３、－ＳＯ２Ｒ７０、－ＳＯ３ －Ｍ＋、－ＳＯ３Ｒ７０、－ＯＳＯ２Ｒ７０、－ＯＳＯ３ －Ｍ＋、－ＯＳＯ３Ｒ７０、－ＰＯ３ －２（Ｍ＋）２、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ７０）Ｏ－Ｍ＋、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ７０）２、－Ｃ（Ｏ）Ｒ７０、－Ｃ（Ｓ）Ｒ７０、－Ｃ（ＮＲ７０）Ｒ７０、－ＣＯ２ －Ｍ＋、－ＣＯ２Ｒ７０、－Ｃ（Ｓ）ＯＲ７０、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ８０Ｒ８０、－Ｃ（ＮＲ７０）ＮＲ８０Ｒ８０、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ７０、－ＯＣ（Ｓ）Ｒ７０、－ＯＣＯ２ －Ｍ＋、－ＯＣＯ２Ｒ７０、－ＯＣ（Ｓ）ＯＲ７０、－ＮＲ７０Ｃ（Ｏ）Ｒ７０、－ＮＲ７０Ｃ（Ｓ）Ｒ７０、－ＮＲ７０ＣＯ２ －Ｍ＋、－ＮＲ７０ＣＯ２Ｒ７０、－ＮＲ７０Ｃ（Ｓ）ＯＲ７０、－ＮＲ７０Ｃ（Ｏ）ＮＲ８０Ｒ８０、－ＮＲ７０Ｃ（ＮＲ７０）Ｒ７０および－ＮＲ７０Ｃ（ＮＲ７０）ＮＲ８０Ｒ８０であり、Ｒ６０、Ｒ７０、Ｒ８０およびＭ＋は、以前に定義されている通りであり、但し、置換アルケンまたはアルキンの場合、置換基は、－Ｏ－Ｍ＋、－ＯＲ７０、－ＳＲ７０または－Ｓ－Ｍ＋でないことを条件とする。
本明細書における個々の用語に関して開示されている基に加え、「置換されている」ヘテロアルキルおよびシクロヘテロアルキル基における窒素原子上の水素に対する置換基は、別段の指定がない限り、－Ｒ６０、－Ｏ－Ｍ＋、－ＯＲ７０、－ＳＲ７０、－Ｓ－Ｍ＋、－ＮＲ８０Ｒ８０、トリハロメチル、－ＣＦ３、－ＣＮ、－ＮＯ、－ＮＯ２、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ７０、－Ｓ（Ｏ）２Ｏ－Ｍ＋、－Ｓ（Ｏ）２ＯＲ７０、－ＯＳ（Ｏ）２Ｒ７０、－ＯＳ（Ｏ）２Ｏ－Ｍ＋、－ＯＳ（Ｏ）２ＯＲ７０、－Ｐ（Ｏ）（Ｏ－）２（Ｍ＋）２、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ７０）Ｏ－Ｍ＋、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ７０）（ＯＲ７０）、－Ｃ（Ｏ）Ｒ７０、－Ｃ（Ｓ）Ｒ７０、－Ｃ（ＮＲ７０）Ｒ７０、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ７０、－Ｃ（Ｓ）ＯＲ７０、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ８０Ｒ８０、－Ｃ（ＮＲ７０）ＮＲ８０Ｒ８０、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ７０、－ＯＣ（Ｓ）Ｒ７０、－ＯＣ（Ｏ）ＯＲ７０、－ＯＣ（Ｓ）ＯＲ７０、－ＮＲ７０Ｃ（Ｏ）Ｒ７０、－ＮＲ７０Ｃ（Ｓ）Ｒ７０、－ＮＲ７０Ｃ（Ｏ）ＯＲ７０、－ＮＲ７０Ｃ（Ｓ）ＯＲ７０、－ＮＲ７０Ｃ（Ｏ）ＮＲ８０Ｒ８０、－ＮＲ７０Ｃ（ＮＲ７０）Ｒ７０および－ＮＲ７０Ｃ（ＮＲ７０）ＮＲ８０Ｒ８０であり、Ｒ６０、Ｒ７０、Ｒ８０およびＭ＋は、既に定義されている通りである。
本明細書おける開示に加え、ある特定の実施形態では、置換されている基は、１つ、２つ、３つもしくは４つの置換基、１つ、２つもしくは３つの置換基、１つもしくは２つの置換基、または１つの置換基を有する。
特に示さない限り、本明細書において明示的に定義されていない置換基の命名は、その官能基の末端部分、次いで隣接官能基に、結合点に向かう方向で名前を付けることにより達成される。例えば、置換基「アリールアルキルオキシカルボニル」とは、（アリール）－（アルキル）－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－基を指す。
１つまたは複数の置換基を含有する本明細書において開示されている基のいずれかに関すると、当然ながら、このような基は、立体的に実現困難である、かつ／または合成的に現実可能ではない置換または置換パターンのいずれも含まないことが理解される。さらに、対象化合物は、これらの化合物の置換から生じる立体化学異性体のすべてを含む。
ある特定の実施形態では、置換基は、化合物の光学異性および／または立体異性に寄与することがある。化合物の塩、溶媒和物、水和物およびプロドラッグ形態もまた、関心がもたれる。このような形態のすべてが、本開示により包含される。したがって、本明細書において記載されている化合物は、薬学的に許容されるその塩、溶媒和物、水和物、プロドラッグおよび異性体を含めた、その塩、溶媒和物、水和物、プロドラッグおよび異性形態を含む。ある特定の実施形態では、化合物は、薬学的に活性な誘導体に代謝され得る。
別段の指定がない限り、原子を言う場合、その原子の同位体を含むことが意図されている。例えば、Ｈを言う場合、１Ｈ、２Ｈ（すなわち、Ｄ）および３Ｈ（すなわち、Ｔ）を含むことが意図されており、Ｃを言う場合、１２Ｃおよび炭素のすべての同位体（１３Ｃなど）を含むことが意図されている。
本開示を一読すれば、当業者に明白な通り、本明細書において記載および例示されている個々の実施形態はそれぞれ、本発明の範囲または趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴とは容易に分けることができる、またはこれらの特徴と容易に組み合わせることができる、個別の構成要素および特徴を有する。記載されている方法のいずれも、記載されている事象の順序で、または理論的に可能な任意の他の順序で行うことができる。
装置および方法は、機能的な説明を伴う文法的流動性を目的として説明されたか、または説明されるが、米国特許法第１１２条の下で明示的に筋道を立てて述べられていない限り、特許請求の範囲は、「手段」または「工程」の限定を構成することによって必然的に限定されると決して解釈されるものではなく、司法上の均等論の元で特許請求の範囲によって提示される定義の意味および均等物の全範囲と一致すること、および特許請求の範囲が米国特許法第１１２条の下で明示的に筋道を立てて述べられている場合、米国特許法第１１２条の下で完全な法的等価物に一致することが明確に理解されるべきである。
他の用語および概念の定義が、詳細な説明の全体にわたり現れる。
詳細な説明
上に要約されている通り、本開示の態様は、ＥＮＰＰ１を阻害するための化合物、組成物および方法を含む。本方法の態様は、試料にＥＮＰＰ１阻害剤化合物を接触させて、ＥＮＰＰ１のｃＧＡＭＰ加水分解活性を阻害するステップを含む。これらの化合物、組成物および方法は、ＥＮＰＰ１の阻害が望ましい様々な用途での使用が見出される。
同様に、対象とするＥＮＰＰ１阻害剤化合物を使用する、がんを処置する医薬組成物および方法が提供される。本方法の態様は、被験体に、治療有効量のＥＮＰＰ１阻害剤化合物を投与して、ｃＧＡＭＰの加水分解を阻害し、被験体のがんを処置するステップを含む。
ＥＮＰＰ１阻害剤化合物
対象となるＥＮＰＰ１阻害剤化合物は、親水性頭部基に連結されている、アリール環系またはヘテロアリール環系、例えば、キナゾリン基またはキノリン基に基づくコア構造を含むことができる。アリール環系またはヘテロアリール環系と親水性頭部基との間のリンカーは、単環式アリール、ヘテロアリール、炭素環または複素環、および１つまたは複数の非環式連結部分を含むことができる。キナゾリンまたはキノリンコア構造は、４位においてリンカーにより置換され得る。アリール環系またはヘテロアリール環系は、必要に応じてさらに置換されている。本開示は、４位においてリンカーにより、および３位においてシアノ基により置換されているキノリンコア構造を有する化合物を含む。一部の場合、リンカーは、フェニルまたは置換フェニルなどの６員の１，４－二置換アリール環式基またはヘテロアリール環式基を含む。ある特定の場合、リンカーは、Ｎ１，４－二置換ピペリジン環またはＮ１，Ｎ４－二置換ピペラジン環などの、６員の１，４－二置換飽和複素環または炭素環を含む。対象とするＥＮＰＰ１阻害剤化合物のさらなる態様は、以下において、およびその開示の全体が参照により本明細書に組み込まれている、２０１８年９月７日に出願のＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５００１８においてＬｉらにより記載されている。
用語「親水性頭部基」とは、親水性であり、かつ水性環境、例えば生理的条件において、十分に溶媒和されており、細胞膜に対する透過性が低いコアアリール環系またはヘテロアリール環系に連結されている基を指す。一部の場合、細胞膜への透過性が低いとは、膜（例えば、結腸直腸Ｃａｃｏ－２または腎ＭＤＣＫ細胞系などの細胞単層）を通過する単離された親水性頭部基に対する受動拡散の任意の好都合な方法により測定すると、透過係数が、１０－５ｃｍ／ｓもしくはそれ未満、１０－６ｃｍ／ｓもしくはそれ未満、１０－７ｃｍ／ｓもしくはそれ未満、１０－８ｃｍ／ｓもしくはそれ未満、１０－９ｃｍ／ｓもしくはそれ未満、または一層低いなどの１０－４ｃｍ／ｓもしくはそれ未満になることが意図される。例えば、Yang and Hinner, Methods Mol Biol. 2015; 1266: 29-53を参照されたい。親水性頭部基は、親水性頭部基が結合されている分子に、水溶解度の改善、および細胞透過性の低下をもたらすことができる。親水性頭部基は、水性環境において十分に溶媒和されており、膜への透過性が低い、任意の好都合な親水性基とすることができる。ある特定の例では、親水性基は、離散性の官能基（例えば、本明細書に記載されている）、またはその置換型である。一般に、荷電基、またはより大きな非荷電の極性基は、透過性が低い。一部の場合、親水性頭部基は荷電しており、例えば、正または負に荷電している。一部の実施形態では、親水性頭部基は、それ自体、細胞透過性ではなく、対象化合物に対して細胞不透過性をもたらす。親水性頭部基またはそのプロドラッグ形態は、対象化合物の所望の細胞透過性をもたらすように選択することができることが理解される。ある特定の場合、親水性頭部基は、中性の親水性基である。一部の場合、親水性頭部基は、プロドラッグ形態で含まれ、したがって、ｉｎ ｖｉｖｏで除去され得るプロ部分を含む。ある特定の例では、対象化合物は、細胞透過性である。
親水性頭部基は、亜鉛イオンに結合するか、またはこれとキレートを形成することができる任意の好都合な基、またはそのプロドラッグ形態とすることができる。ある特定の場合、親水性頭部基は、リン含有基である。対象とするＥＮＰＰ１阻害剤において利用され得る目的のリン含有基は、以下に限定されないが、ホスホン酸またはホスホネート、ホスホン酸エステル、ホスフェート、リン酸エステル、チオホスフェート、チオリン酸エステル、ホスホロアミデートおよびチオホスホロアミデートもしくはそれらの塩、またはそれらのプロドラッグ形態（例えば、本明細書に記載されている）を含む。
キナゾリン環系およびイソキノリン環系を含む、目的の例示的なＥＮＰＰ１阻害剤化合物は、式（Ｉ）～（ＸＶｂ）および表１～２の化合物構造に説明されている。
一部の場合、対象とするＥＮＰＰ１阻害剤化合物は、式（Ｉ）：
Figure 2022523105000002
 （式中、
Ｘ１は、親水性頭部基（例えば、本明細書に記載されている）であり、
Ａは、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、複素環および置換複素環から選択される環系であり、
Ｌ１およびＬ２は、独立して、共有結合またはリンカーであり、
Ｚ３は、存在しないか、またはＮＲ２２、ＯおよびＳから選択され、
Ｚ２は、ＣＲ１２またはＮであり、
Ｚ１は、ＣＲ１１またはＮであり、
Ｒ１は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキルアリール、置換アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、置換アルキルヘテロアリール、アルケニルアリール（例えば、エテニルアリール）、置換アルケニルアリール、アルケニルヘテロアリール（例えば、エテニルヘテロアリール）、置換アルケニルヘテロアリール、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環および置換複素環から選択され、
Ｒ１１およびＲ１２は、Ｈ、シアノ、トリフルオロメチル、ハロゲン、アルキルおよび置換アルキルから独立して選択され、
Ｒ２２は、Ｈ、アルキルおよび置換アルキルから選択され、
Ｒ２～Ｒ５は、Ｈ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、－ＯＣＦ３、ハロゲン、シアノ、アミン、置換アミン、アミド、複素環および置換複素環から独立して選択されるか、またはＲ２とＲ３、Ｒ３とＲ４もしくはＲ４とＲ５は、それらが結合している炭素原子と一緒になって、複素環、置換複素環、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリールおよび置換アリールから選択される縮合環（例えば、５員または６員の単環式環）をもたらす）
またはそのプロドラッグ、薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物である。
式（Ｉ）のある特定の実施形態では、Ｚ３は、存在しない。式（Ｉ）のある特定の実施形態では、Ｚ３は、ＮＲ２２であり、Ｒ２２は、Ｈ、Ｃ（１～６）アルキルおよび置換Ｃ（１～６）アルキルから選択される。ある特定の場合、Ｚ３はＮＨである。ある特定の場合、Ｚ３はＮＲ２２であり、Ｒ２２は、Ｃ（１～６）アルキル、例えば、メチル、エチル、プロピル、ペンチルまたはヘキシルである。ある特定の場合、Ｚ３は、ＮＲ２２であり、Ｒ２２は、置換Ｃ（１～６）アルキルである。式（Ｉ）のある特定の場合、Ｚ３は、Ｏである。式（Ｉ）のある特定の場合、Ｚ３は、Ｓである。
式（Ｉ）の一部の例では、Ｚ１は、ＣＲ１１であり、Ｒ１１は、水素、シアノ、トリフルオロメチル、ハロゲン、アルキルおよび置換アルキル水素から選択される。一部の場合、アルキルまたは置換アルキル（alky）は、Ｃ１～５アルキルである。式（Ｉ）の一部の例では、Ｚ１はＣＲ１１であり、Ｒ１１は水素である。一部の場合、Ｒ１１は、シアノである。一部の場合、Ｒ１１は、トリフルオロメチルである。一部の場合、Ｒ１１は、ハロゲン、例えば、Ｂｒ、Ｉ、ＣｌまたはＦである。一部の場合、Ｒ１１は、アルキル、例えば、Ｃ１～５アルキルである。一部の場合、Ｒ１１は、置換アルキル、例えば、置換Ｃ１～５アルキルである。
式（Ｉ）の一部の例では、Ｚ２は、ＣＲ１２であり、Ｒ１２は、水素、シアノ、トリフルオロメチル、ハロゲン、アルキルおよび置換アルキル水素から選択される。一部の場合、アルキルまたは置換アルキルは、Ｃ１～５アルキルである。式（Ｉ）の一部の例では、Ｚ２はＣＲ１２であり、Ｒ１２は水素である。一部の場合、Ｒ１２は、シアノである。一部の場合、Ｒ１２は、トリフルオロメチルである。一部の場合、Ｒ１２は、ハロゲン、例えば、Ｂｒ、Ｉ、ＣｌまたはＦである。一部の場合、Ｒ１２は、アルキル、例えば、Ｃ１～５アルキルである。一部の場合、Ｒ１２は、置換アルキル、例えば、置換Ｃ１～５アルキルである。
式（Ｉ）のある特定の実施形態では、Ｚ１およびＺ２のうちの少なくとも１つはＮである。式（Ｉ）のある特定の実施形態では、Ｚ１は、ＣＲ１１であり、Ｚ２は、Ｎである。式（Ｉ）のある特定の場合、Ｚ１は、Ｎであり、Ｚ２は、ＣＲ１２である。式（Ｉ）のある特定の例では、Ｚ１は、ＣＲ１１であり、Ｚ２は、ＣＲ１２である。式（Ｉ）のある特定の場合、Ｚ１は、Ｎであり、Ｚ２は、Ｎである。
式（Ｉ）のある特定の実施形態では、Ｌ１およびＬ２は、それぞれ共有結合である。ある特定の場合、Ｌ１およびＬ２はそれぞれ、リンカーである。ある特定の場合、Ｌ１は、共有結合であり、Ｌ２は、リンカーである。ある特定の場合、Ｌ１は、リンカーであり、Ｌ２は、共有結合である。任意の好都合なリンカーを利用して、ＡをＸに、および／またはＡをＺ３に連結することができる（例えば、本明細書に記載されている）。一部の場合、Ａは、共有結合によってＸに連結されている。ある特定の場合、Ａは、長さが１～１０個、１～８個または１～６個の原子、例えば、長さが１個、２個、３個、４個、５個または６個の原子などの、長さが１～１２個の原子からなる直鎖状リンカーを介して、Ｘに連結されている。リンカーＬ２は、（Ｃ１～６）アルキルリンカー、あるいはエステル（－ＣＯ２－）、アミド（ＣＯＮＨ）、カルバメート（ＯＣＯＮＨ）、エーテル（－Ｏ－）、チオエーテル（－Ｓ－）および／もしくはアミノ基（－ＮＲ－であり、Ｒは、Ｈまたはアルキルである）などの、ヘテロ原子または連結官能基により必要に応じて置換されている、置換（Ｃ１～６）アルキルリンカーとすることができる。一部の場合、Ａは、共有結合によりＺ３に連結されている。ある特定の場合、Ａは、長さが１～１０個、１～８個または１～６個の原子、例えば、長さが１個、２個、３個、４個、５個または６個の原子などの、長さが１～１２個の原子からなる直鎖状リンカーを介して、Ｚ３に連結されている。リンカーＬ１は、（Ｃ１～６）アルキルリンカー、あるいはケト（ＣＯ）、エステル（－ＣＯ２－）、アミド（ＣＯＮＨ）、カルバメート（ＯＣＯＮＨ）、エーテル（－Ｏ－）、チオエーテル（－Ｓ－）および／もしくはアミノ基（－ＮＲ－であり、Ｒは、Ｈまたはアルキルである）などの、ヘテロ原子または連結官能基により必要に応じて置換されている、置換（Ｃ１～６）アルキルリンカーとすることができる。Ｚ３がＮＲ２２である場合、リンカーＬ１は、Ｚ３と一緒になって、アミド基（ＮＲ２２ＣＯ）連結基をもたらす、末端ケト（Ｃ＝Ｏ）基を含むことができる。Ｚ３１がＯまたはＳである場合、リンカーＬ１は、Ｚ３１と一緒になって、エステルまたはチオエステル基連結基をもたらす、末端ケト（Ｃ＝Ｏ）基を含むことができる。
式（Ｉ）のある特定の実施形態では、Ｚ３は、亜鉛イオンに結合することが可能なリン含有基またはそのプロドラッグ形態である。
式（Ｉ）のある特定の例では、Ｚ３は、ＮＲ２２、ＯおよびＳから選択される。したがって、対象となる式（Ｉ）のＥＮＰＰ１阻害剤化合物は、式（ＩＩ）：
Figure 2022523105000003
 （式中、Ｚ３１は、ＮＲ２２、ＯおよびＳから選択される）
によって記載することができる。
式（ＩＩ）のある特定の実施形態では、Ｚ３１は、ＮＲ２２であり、Ｒ２２は、Ｈ、Ｃ（１～６）アルキルおよび置換Ｃ（１～６）アルキルから選択される。ある特定の場合、Ｚ３１はＮＨである。ある特定の場合、Ｚ３１はＮＲ２２であり、Ｒ２２は、Ｃ（１～６）アルキル、例えば、メチル、エチル、プロピル、ペンチルまたはヘキシルである。ある特定の場合、Ｚ３１はＮＲ２２であり、Ｒ２２は置換Ｃ（１～６）アルキルである。式（Ｉ）のある特定の場合、Ｚ３１は、Ｏである。式（Ｉ）のある特定の場合、Ｚ３１は、Ｓである。
式（ＩＩ）の一部の例では、Ｚ１は、ＣＲ１１であり、Ｒ１１は、水素、シアノ、トリフルオロメチル、ハロゲン、アルキルおよび置換アルキル水素から選択される。一部の場合、アルキルまたは置換アルキルは、Ｃ１～５アルキルである。式（ＩＩ）の一部の例では、Ｚ１はＣＲ１１であり、Ｒ１１は水素である。一部の場合、Ｒ１１は、シアノである。一部の場合、Ｒ１１は、トリフルオロメチルである。一部の場合、Ｒ１１は、ハロゲン、例えば、Ｂｒ、Ｉ、ＣｌまたはＦである。一部の場合、Ｒ１１は、アルキル、例えば、Ｃ１～５アルキルである。一部の場合、Ｒ１１は、置換アルキル、例えば、置換Ｃ１～５アルキルである。
式（ＩＩ）の一部の例では、Ｚ２は、ＣＲ１２であり、Ｒ１２は、水素、シアノ、トリフルオロメチル、ハロゲン、アルキルおよび置換アルキル水素から選択される。一部の場合、アルキルまたは置換アルキルは、Ｃ１～５アルキルである。式（ＩＩ）の一部の例では、Ｚ２はＣＲ１２であり、Ｒ１２は水素である。一部の場合、Ｒ１２は、シアノである。一部の場合、Ｒ１２は、トリフルオロメチルである。一部の場合、Ｒ１２は、ハロゲン、例えば、Ｂｒ、Ｉ、ＣｌまたはＦである。一部の場合、Ｒ１２は、アルキル、例えば、Ｃ１～５アルキルである。一部の場合、Ｒ１２は、置換アルキル、例えば、置換Ｃ１～５アルキルである。
式（ＩＩ）のある特定の実施形態では、Ｚ１およびＺ２のうちの少なくとも１つはＮである。式（Ｉ）のある特定の実施形態では、Ｚ１は、ＣＲ１１であり、Ｚ２は、Ｎである。式（Ｉ）のある特定の場合、Ｚ１は、Ｎであり、Ｚ２は、ＣＲ１２である。式（Ｉ）のある特定の例では、Ｚ１は、ＣＲ１１であり、Ｚ２は、ＣＲ１２である。式（Ｉ）のある特定の場合、Ｚ１は、Ｎであり、Ｚ２は、Ｎである。
式（ＩＩ）のある特定の実施形態では、Ｌ１およびＬ２は、それぞれ共有結合である。ある特定の場合、Ｌ１およびＬ２はそれぞれ、リンカーである。ある特定の場合、Ｌ１は、共有結合であり、Ｌ２は、リンカーである。ある特定の場合、Ｌ１は、リンカーであり、Ｌ２は、共有結合である。任意の好都合なリンカーを利用して、ＡをＸに、および／またはＡをＺ３に連結することができる（例えば、本明細書に記載されている）。一部の場合、Ａは、共有結合によってＸに連結されている。ある特定の場合、Ａは、長さが１～１０個、１～８個または１～６個の原子、例えば、長さが１個、２個、３個、４個、５個または６個の原子などの、長さが１～１２個の原子からなる直鎖状リンカーを介して、Ｘに連結されている。リンカーＬ２は、（Ｃ１～６）アルキルリンカー、あるいはケト（ＣＯ）、エステル（－ＣＯ２－）、アミド（ＣＯＮＨ）、カルバメート（ＯＣＯＮＨ）、エーテル（－Ｏ－）、チオエーテル（－Ｓ－）および／もしくはアミノ基（－ＮＲ－であり、Ｒは、Ｈまたはアルキルである）などの、ヘテロ原子または連結官能基により必要に応じて置換されている、置換（Ｃ１～６）アルキルリンカーとすることができる。一部の場合、Ａは、共有結合によりＺ３に連結されている。ある特定の場合、Ａは、長さが１～１０個、１～８個または１～６個の原子、例えば、長さが１個、２個、３個、４個、５個または６個の原子などの、長さが１～１２個の原子からなる直鎖状リンカーを介して、Ｚ３に連結されている。リンカーＬ１は、（Ｃ１～６）アルキルリンカー、あるいはケト（Ｃ＝Ｏ）、エステル（－ＣＯ２－）、アミド（ＣＯＮＨ）、カルバメート（ＯＣＯＮＨ）、エーテル（－Ｏ－）、チオエーテル（－Ｓ－）および／もしくはアミノ基（－ＮＲ－であり、Ｒは、Ｈまたはアルキルである）などの、ヘテロ原子または連結官能基により必要に応じて置換されている、置換（Ｃ１～６）アルキルリンカーとすることができる。Ｚ３１がＮＲ２２である場合、リンカーＬ１は、Ｚ３１と一緒になって、アミド基（ＮＲ２２ＣＯ）連結基をもたらす、末端ケト（Ｃ＝Ｏ）基を含むことができる。Ｚ３１がＯまたはＳである場合、リンカーＬ１は、Ｚ３１と一緒になって、エステルまたはチオエステル基連結基をもたらす、末端ケト（Ｃ＝Ｏ）基を含むことができる。
式（ＩＩ）の一部の場合、対象であるＥＮＰＰ１阻害剤化合物は、式（ＩＩＩ）：
Figure 2022523105000004
 （式中、
Ｒ３１～Ｒ３４はそれぞれ、Ｈ、ハロゲン、アルキルおよび置換アルキルから独立して選択されるか、またはＲ３１とＲ３２もしくはＲ３３とＲ３４は、環式連結しており、それらが結合している炭素原子と一緒になって、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクリルまたは置換ヘテロシクリル環をもたらし、
ｎおよびｍは、それぞれ独立して、０～６の整数（例えば、０～３）である）
のものである。
式（ＩＩＩ）のある特定の実施形態では、Ｚ３１は、ＮＲ２２であり、Ｒ２２は、Ｈ、Ｃ（１～６）アルキルおよび置換Ｃ（１～６）アルキルから選択される。ある特定の場合、Ｚ３１はＮＨである。ある特定の場合、Ｚ３１はＮＲ２２であり、Ｒ２２は、Ｃ（１～６）アルキル、例えば、メチル、エチル、プロピル、ペンチルまたはヘキシルである。ある特定の場合、Ｚ３１はＮＲ２２であり、Ｒ２２は置換Ｃ（１～６）アルキルである。式（ＩＩＩ）のある特定の場合、Ｚ３１は、Ｏである。式（ＩＩＩ）のある特定の場合、Ｚ３１は、Ｓである。
式（ＩＩ）では、Ｚ３１がＮＲ２２である場合、リンカーＬ１は、Ｚ３１と一緒になって、アミド基（ＮＲ２２ＣＯ）連結基をもたらす、末端ケト（Ｃ＝Ｏ）基を含むことができる。したがって、式（ＩＩ）の一部の場合、対象であるＥＮＰＰ１阻害剤化合物は、式（ＩＩＩａ）：
Figure 2022523105000005
 （式中、
Ｚ４１は、－ＮＲ２２Ｃ（＝Ｏ）－であり、
Ｒ３１～Ｒ３４はそれぞれ、Ｈ、ハロゲン、アルキルおよび置換アルキルから独立して選択されるか、またはＲ３１とＲ３２もしくはＲ３３とＲ３４は、環式連結しており、それらが結合している炭素原子と一緒になって、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクリルまたは置換ヘテロシクリル環をもたらし、
ｎおよびｍは、それぞれ独立して、０～６の整数（例えば、０～３）である）
のものである。
式（ＩＩＩ）～（ＩＩＩａ）の一部の例では、Ｚ１は、ＣＲ１１であり、Ｒ１１は、水素、シアノ、トリフルオロメチル、ハロゲン、アルキルおよび置換アルキル水素から選択される。一部の場合、アルキルまたは置換アルキルは、Ｃ１～５アルキルである。式（ＩＩＩ）～（ＩＩＩａ）の一部の例では、Ｚ１はＣＲ１１であり、Ｒ１１は水素である。一部の場合、Ｒ１１は、シアノである。一部の場合、Ｒ１１は、トリフルオロメチルである。一部の場合、Ｒ１１は、ハロゲン、例えば、Ｂｒ、Ｉ、ＣｌまたはＦである。一部の場合、Ｒ１１は、アルキル、例えば、Ｃ１～５アルキルである。一部の場合、Ｒ１１は、置換アルキル、例えば、置換Ｃ１～５アルキルである。
式（ＩＩＩ）～（ＩＩＩａ）の一部の例では、Ｚ２は、ＣＲ１２であり、Ｒ１２は、水素、シアノ、トリフルオロメチル、ハロゲン、アルキルおよび置換アルキル水素から選択される。一部の場合、アルキルまたは置換アルキルは、Ｃ１～５アルキルである。式（ＩＩＩ）～（ＩＩＩａ）の一部の例では、Ｚ２はＣＲ１２であり、Ｒ１２は水素である。一部の場合、Ｒ１２は、シアノである。一部の場合、Ｒ１２は、トリフルオロメチルである。一部の場合、Ｒ１２は、ハロゲン、例えば、Ｂｒ、Ｉ、ＣｌまたはＦである。一部の場合、Ｒ１２は、アルキル、例えば、Ｃ１～５アルキルである。一部の場合、Ｒ１２は、置換アルキル、例えば、置換Ｃ１～５アルキルである。
式（ＩＩＩ）～（ＩＩＩａ）のある特定の実施形態では、Ｚ１およびＺ２のうちの少なくとも１つはＮである。式（ＩＩＩ）～（ＩＩＩａ）のある特定の実施形態では、Ｚ１は、ＣＲ１１であり、Ｚ２は、Ｎである。式（ＩＩＩ）～（ＩＩＩａ）のある特定の場合、Ｚ１は、Ｎであり、Ｚ２は、ＣＲ１２である。式（ＩＩＩ）～（ＩＩＩａ）のある特定の例では、Ｚ１は、ＣＲ１１であり、Ｚ２は、ＣＲ１２である。式（ＩＩＩ）～（ＩＩＩａ）のある特定の場合、Ｚ１は、Ｎであり、Ｚ２は、Ｎである。
式（ＩＩＩ）～（ＩＩＩａ）のある特定の実施形態では、Ｒ３１～Ｒ３４はそれぞれ、水素である。ある特定の実施形態では、Ｒ３１～Ｒ３４のうちの少なくとも１つは、ハロゲンである。ある特定の実施形態では、Ｒ３１～Ｒ３４のうちの少なくとも１つは、アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ３１～Ｒ３４のうちの少なくとも１つは、置換アルキルである。ある特定の場合、Ｒ３１～Ｒ３４の１つは、ハロゲンであり、その残りは、水素、ハロゲン、アルキルおよび置換アルキルから選択される。ある特定の場合、Ｒ３１～Ｒ３４の１つは、アルキルであり、その残りは、水素、ハロゲン、アルキルおよび置換アルキルから選択される。ある特定の場合、１つのＲ３１～Ｒ３４は、置換アルキルであり、その残りは、水素、ハロゲン、アルキルおよび置換アルキルから選択される。ある特定の場合、Ｒ３１～Ｒ３４の１つは、ハロゲンであり、その残りは、水素である。ある特定の場合、Ｒ３１～Ｒ３４の１つは、アルキルであり、その残りは、水素である。ある特定の場合、１つのＲ３１～Ｒ３４は、置換アルキルであり、その残りは、水素である。
式（ＩＩＩ）～（ＩＩＩａ）のある特定の実施形態では、ｎは０～３の整数である。ある特定の場合、ｎは０である。ある特定の場合、ｎは１である。ある特定の場合、ｎは２である。ある特定の場合、ｎは３である。式（ＩＩＩ）～（ＩＩＩａ）のある特定の実施形態では、ｍは０～３の整数である。ある特定の場合、ｍは０である。ある特定の場合、ｍは１である。ある特定の場合、ｍは２である。ある特定の場合、ｍは３である。ある特定の場合、ｎは０であり、ｍは１である。ある特定の場合、ｎは０であり、ｍは２である。ある特定の場合、ｎは０であり、ｍは３である。ある特定の場合、ｎは１であり、ｍは０である。ある特定の場合、ｎは１であり、ｍは１である。ある特定の場合、ｎは１であり、ｍは２である。ある特定の場合、ｎは１であり、ｍは３である。ある特定の場合、ｎは２であり、ｍは０である。ある特定の場合、ｎは２であり、ｍは１である。ある特定の場合、ｎは２であり、ｍは２である。ある特定の場合、ｎは２であり、ｍは３である。ある特定の場合、ｎは３であり、ｍは０である。ある特定の場合、ｎは３であり、ｍは１である。ある特定の場合、ｎは３であり、ｍは２である。ある特定の場合、ｎは３であり、ｍは３である。ある特定の場合、ｎ＋ｍは、０～３の整数である。ある特定の場合、ｎ＋ｍは０である。ある特定の場合、ｎ＋ｍは１である。ある特定の場合、ｎ＋ｍは２である。ある特定の場合、ｎ＋ｍは３である。
式（Ｉ）～（ＩＩＩａ）のいずれかの一部の実施形態では、環系Ａは、フェニル、置換フェニル、ピリジル、置換ピリジル、ピリミジン、置換ピリミジン、ピペリジン、置換ピペリジン、ピペラジン、置換ピペラジン、ピリダジン、置換ピリダジン、シクロヘキシルおよび置換シクロヘキシルから選択される。ある特定の場合、環系Ａは、フェニルまたは置換フェニルである。一部の場合、環系Ａは、ピリジルまたは置換ピリジルである。一部の場合、環系Ａは、ピリミジンまたは置換ピリミジンである。一部の場合、環系Ａは、ピペリジンまたは置換ピペリジンである。一部の場合、環系Ａは、ピペラジンまたは置換ピペラジンである。一部の場合、環系Ａは、シクロヘキシルまたは置換シクロヘキシルである。
一部の実施形態では、環系Ａは、式（Ａ１）：
Figure 2022523105000006
 （式中、
Ｒ６はそれぞれ、水素、アルキル、置換アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、置換アルコキシ、トリフルオロメチル、ハロゲン、アシル、置換アシル、カルボキシ、カルボキシアミド、置換カルボキシアミド、スルホニル、置換スルホニル、スルホンアミドおよび置換スルホンアミドから選択され、
ｐは、０～４の整数である）
によって記載される。
ある特定の場合、Ａ１は、フェニレンである。ある特定の場合、Ａ１は、一置換フェニレンである。ある特定の場合、Ａ１は、二置換フェニレンである。ある特定の場合、Ａ１は、三置換フェニレンである。ある特定の場合、Ａ１は、四置換フェニレンである。ある特定の場合、フェニレンの置換基（substitutent）は、低級アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチルおよびヘキシル）およびハロゲン（例えば、Ｆ、Ｃｌ、ＩまたはＢｒ）から選択される。
一部の実施形態では、Ａ１環は、式（Ａ１ａ）：
Figure 2022523105000007
 によって記載される。
一部の実施形態では、環系Ａは、式（Ａ２）：
Figure 2022523105000008
 （式中、
Ｚ５は、ＮおよびＣＲ６から選択され、
Ｒ６はそれぞれ、水素、アルキル、置換アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、置換アルコキシ、トリフルオロメチル、ハロゲン、アシル、置換アシル、カルボキシ、カルボキシアミド、置換カルボキシアミド、スルホニル、置換スルホニル、スルホンアミドおよび置換スルホンアミドから選択され、
ｑは、０～２の整数である）
によって記載される。
ある特定の場合、Ａ２は、ピリジルである。ある特定の場合、Ａ２は、置換ピリジルである。一部の場合、ピリジルは、一置換ピリジルである。他の場合、ピリジルは、二置換ピリジルである。他の場合、ピリジルは、三置換ピリジルである。ある特定の場合、Ｚ５はＮであり、こうしてＡ２はピリミジルとなる。一部の場合、Ａ２は、置換ピリミジルである。一部の場合、ピリミジルは一置換されている。一部の場合、ピリミジルは二置換されている。Ａ２のある特定の実施形態では、置換基は、低級アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチルおよびヘキシル）、トリフルオロメチルおよびハロゲン（例えば、Ｆ、Ｃｌ、ＩまたはＢｒ）から選択される。
一部の実施形態では、環系Ａは、式（Ａ３）：
Figure 2022523105000009
 （式中、
Ｚ５は、ＮおよびＣＲ６から選択され、
Ｒ６はそれぞれ、水素、アルキル、置換アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、置換アルコキシ、トリフルオロメチル、ハロゲン、アシル、置換アシル、カルボキシ、カルボキシアミド、置換カルボキシアミド、スルホニル、置換スルホニル、スルホンアミドおよび置換スルホンアミドから選択され、
ｑは、０～２の整数である）
によって記載される。
ある特定の場合、Ａ３は、ピリジルである。ある特定の場合、Ａ３は、置換ピリジルである。一部の場合、ピリジルは、一置換ピリジルである。他の場合、ピリジルは、二置換ピリジルである。他の場合、ピリジルは、三置換ピリジルである。ある特定の場合、Ｚ５はＮであり、こうしてＡ３はピリミジルとなる。一部の場合、Ａ３は、置換ピリミジルである。一部の場合、ピリミジルは一置換されている。一部の場合、ピリミジルは二置換されている。Ａ３のある特定の実施形態では、置換基は、低級アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチルおよびヘキシル）、トリフルオロメチルおよびハロゲン（例えば、Ｆ、Ｃｌ、ＩまたはＢｒ）から選択される。
一部の実施形態では、環系Ａは、式（Ａ４）：
Figure 2022523105000010
 （式中、
Ｚ５は、Ｎであり、
Ｒ６はそれぞれ、水素、アルキル、置換アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、置換アルコキシ、トリフルオロメチル、ハロゲン、アシル、置換アシル、カルボキシ、カルボキシアミド、置換カルボキシアミド、スルホニル、置換スルホニル、スルホンアミドおよび置換スルホンアミドから選択され、
ｑは、０～２の整数である）
によって記載される。
一部の場合、Ａ４は、置換ピリミジルである。一部の場合、ピリミジルは一置換されている。一部の場合、ピリミジルは二置換されている。Ａ４のある特定の実施形態では、置換基は、低級アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチルおよびヘキシル）、トリフルオロメチルおよびハロゲン（例えば、Ｆ、Ｃｌ、ＩまたはＢｒ）から選択される。
式（ＩＩＩ）～（ＩＩＩａ）の一部の場合、ＥＮＰＰ１阻害剤化合物は、式（ＩＶ）～（ＩＶａ）：
Figure 2022523105000011
 （式中、
Ｚ３１は、ＮＲ２２、ＯおよびＳから選択され、
Ｚ４１は、－ＮＲ２２Ｃ（＝Ｏ）－であり、
Ｚ１１およびＺ２１は、ＮおよびＣ（ＣＮ）から独立して選択され、
Ｒ３１～Ｒ３４はそれぞれ、Ｈ、ハロゲン、アルキルおよび置換アルキルから独立して選択されるか、またはＲ３１とＲ３２もしくはＲ３３とＲ３４は、環式連結しており、それらが結合している炭素原子と一緒になって、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクリルまたは置換ヘテロシクリル環をもたらし、
Ｒ６はそれぞれ、Ｈ、アルキル、置換アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、置換アルコキシ、トリフルオロメチルおよびハロゲンから独立して選択され、
ｐは、０～４の整数であり、
ｎおよびｍは、それぞれ独立して、０～６の整数（例えば、０～３）である）
のものである。
式（ＩＶ）～（ＩＶａ）のある特定の実施形態では、Ｚ３１は、ＮＲ２２であり、Ｒ２２は、Ｈ、Ｃ（１～６）アルキルおよび置換Ｃ（１～６）アルキルから選択される。ある特定の場合、Ｚ３１はＮＨである。ある特定の場合、Ｚ３１はＮＲ２２であり、Ｒ２２は、Ｃ（１～６）アルキル、例えば、メチル、エチル、プロピル、ペンチルまたはヘキシルである。ある特定の場合、Ｚ３１はＮＲ２２であり、Ｒ２２は置換Ｃ（１～６）アルキルである。式（ＩＶ）～（ＩＶａ）のある特定の場合、Ｚ３１は、Ｏである。式（ＩＶ）～（ＩＶａ）のある特定の場合、Ｚ３１は、Ｓである。
式（ＩＶ）～（ＩＶａ）のある特定の実施形態では、Ｚ１１およびＺ２１のうちの少なくとも１つはＮである。式（ＩＶ）～（ＩＶａ）のある特定の実施形態では、Ｚ１１は、Ｃ（ＣＮ）であり、Ｚ２１は、Ｎである。式（ＩＶ）～（ＩＶａ）のある特定の場合、Ｚ１１は、Ｎであり、Ｚ２１は、Ｃ（ＣＮ）である。式（ＩＶ）～（ＩＶａ）のある特定の例では、Ｚ１１は、Ｃ（ＣＮ）であり、Ｚ２１は、Ｃ（ＣＮ）である。式（ＩＶ）～（ＩＶａ）のある特定の場合、Ｚ１１は、Ｎであり、Ｚ２１は、Ｎである。
式（ＩＶ）～（ＩＶａ）のある特定の実施形態では、Ｒ３１～Ｒ３４はそれぞれ、水素である。ある特定の実施形態では、Ｒ３１～Ｒ３４のうちの少なくとも１つは、ハロゲンである。ある特定の実施形態では、Ｒ３１～Ｒ３４のうちの少なくとも１つは、アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ３１～Ｒ３４のうちの少なくとも１つは、置換アルキルである。ある特定の場合、Ｒ３１～Ｒ３４の１つは、ハロゲンであり、その残りは、水素、ハロゲン、アルキルおよび置換アルキルから選択される。ある特定の場合、Ｒ３１～Ｒ３４の１つは、アルキルであり、その残りは、水素、ハロゲン、アルキルおよび置換アルキルから選択される。ある特定の場合、Ｒ３１～Ｒ３４の１つは、置換アルキルであり、その残りは、水素、ハロゲン、アルキルおよび置換アルキルから選択される。ある特定の場合、Ｒ３１～Ｒ３４の１つは、ハロゲンであり、その残りは、水素である。ある特定の場合、Ｒ３１～Ｒ３４の１つは、アルキルであり、その残りは、水素である。ある特定の場合、Ｒ３１～Ｒ３４の１つは、置換アルキルであり、その残りは、水素である。
式（ＩＶ）～（ＩＶａ）のある特定の実施形態では、ｎは０～３の整数である。ある特定の場合、ｎは０である。ある特定の場合、ｎは１である。ある特定の場合、ｎは２である。ある特定の場合、ｎは３である。式（ＩＶ）～（ＩＶａ）のある特定の実施形態では、ｍは０～３の整数である。ある特定の場合、ｍは０である。ある特定の場合、ｍは１である。ある特定の場合、ｍは２である。ある特定の場合、ｍは３である。ある特定の場合、ｎは０であり、ｍは１である。ある特定の場合、ｎは０であり、ｍは２である。ある特定の場合、ｎは０であり、ｍは３である。ある特定の場合、ｎは１であり、ｍは０である。ある特定の場合、ｎは１であり、ｍは１である。ある特定の場合、ｎは１であり、ｍは２である。ある特定の場合、ｎは１であり、ｍは３である。ある特定の場合、ｎは２であり、ｍは０である。ある特定の場合、ｎは２であり、ｍは１である。ある特定の場合、ｎは２であり、ｍは２である。ある特定の場合、ｎは２であり、ｍは３である。ある特定の場合、ｎは３であり、ｍは０である。ある特定の場合、ｎは３であり、ｍは１である。ある特定の場合、ｎは３であり、ｍは２である。ある特定の場合、ｎは３であり、ｍは３である。ある特定の場合、ｎ＋ｍは、０～３の整数である。ある特定の場合、ｎ＋ｍは０である。ある特定の場合、ｎ＋ｍは１である。ある特定の場合、ｎ＋ｍは２である。ある特定の場合、ｎ＋ｍは３である。
式（ＩＶａ）の一部の場合、ｎは０であり、ｍは１または２などの、ｍは０～２である。
式（ＩＶ）～（ＩＶａ）の一部の場合、ＥＮＰＰ１阻害剤化合物は、式（Ｖ）～（Ｖａ）：
Figure 2022523105000012
 （式中、
Ｒ４１～Ｒ４４は、水素、アルキル、置換アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、置換アルコキシ、トリフルオロメチル、ハロゲン、アシル、置換アシル、カルボキシ、カルボキシアミド、置換カルボキシアミド、スルホニル、置換スルホニル、スルホンアミドおよび置換スルホンアミドから独立して選択される）
のものである。
式（Ｖ）～（Ｖａ）のある特定の実施形態では、Ｚ１１およびＺ２１のうちの少なくとも１つはＮである。式（Ｖ）～（Ｖａ）のある特定の実施形態では、Ｚ１１は、Ｃ（ＣＮ）であり、Ｚ２１は、Ｎである。式（Ｖ）～（Ｖａ）のある特定の場合、Ｚ１１は、Ｎであり、Ｚ２１は、Ｃ（ＣＮ）である。式（Ｖ）～（Ｖａ）のある特定の例では、Ｚ１１は、Ｃ（ＣＮ）であり、Ｚ２１は、Ｃ（ＣＮ）である。式（Ｖ）～（Ｖａ）のある特定の場合、Ｚ１１は、Ｎであり、Ｚ２１は、Ｎである。
式（Ｖ）～（Ｖａ）の一部の場合、対象であるＥＮＰＰ１阻害剤化合物は、式（ＶＩａ）～（ＶＩｄ）のうちの１つ：
Figure 2022523105000013
 のものである。
式（ＶＩａ）～（ＶＩｄ）のある特定の実施形態では、Ｒ４１～Ｒ４４はそれぞれ、水素である。ある特定の実施形態では、Ｒ４１～Ｒ４４のうちの少なくとも１つは、アルキルまたは置換アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ４１～Ｒ４４のうちの少なくとも１つは、ヒドロキシである。ある特定の実施形態では、Ｒ４１～Ｒ４４のうちの少なくとも１つは、アルコキシまたは置換アルコキシである。ある特定の場合、Ｒ４１～Ｒ４４のうちの少なくとも１つは、トリフルオロメチルである。ある特定の場合、Ｒ４１～Ｒ４４のうちの少なくとも１つは、ハロゲンである。ある特定の場合、Ｒ４１～Ｒ４４のうちの少なくとも１つは、アシルまたは置換アシルである。ある特定の場合、Ｒ４１～Ｒ４４のうちの少なくとも１つは、カルボキシである。ある特定の場合、Ｒ４１～Ｒ４４のうちの少なくとも１つは、カルボキシアミドまたは置換カルボキシアミドである。ある特定の場合、Ｒ４１～Ｒ４４のうちの少なくとも１つは、スルホニルまたは置換スルホニルである。ある特定の場合、Ｒ４１～Ｒ４４のうちの少なくとも１つは、スルホンアミドおよび置換スルホンアミドである。ある特定の場合、Ｒ３１～Ｒ３４の１つは水素であり、その残りは、水素、アルキル、置換アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、置換アルコキシ、トリフルオロメチル、ハロゲン、アシル、置換アシル、カルボキシ、カルボキシアミド、置換カルボキシアミド、スルホニル、置換スルホニル、スルホンアミドおよび置換スルホンアミドから選択される。ある特定の場合、Ｒ３１～Ｒ３４のうちの２つは水素であり、その残りは、水素、アルキル、置換アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、置換アルコキシ、トリフルオロメチル、ハロゲン、アシル、置換アシル、カルボキシ、カルボキシアミド、置換カルボキシアミド、スルホニル、置換スルホニル、スルホンアミドおよび置換スルホンアミドから選択される。ある特定の場合、Ｒ３１～Ｒ３４のうちの３つは水素であり、その残りは、水素、アルキル、置換アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、置換アルコキシ、トリフルオロメチル、ハロゲン、アシル、置換アシル、カルボキシ、カルボキシアミド、置換カルボキシアミド、スルホニル、置換スルホニル、スルホンアミドおよび置換スルホンアミドから選択される。
式（ＶＩａ）～（ＶＩｄ）のある特定の実施形態では、ｎは０～３の整数である。ある特定の場合、ｎは０である。ある特定の場合、ｎは１である。ある特定の場合、ｎは２である。ある特定の場合、ｎは３である。式（ＶＩａ）～（ＶＩｄ）のいずれかのある特定の実施形態では、ｍは０～３の整数である。ある特定の場合、ｍは０である。ある特定の場合、ｍは１である。ある特定の場合、ｍは２である。ある特定の場合、ｍは３である。ある特定の場合、ｎは０であり、ｍは１である。ある特定の場合、ｎは０であり、ｍは２である。ある特定の場合、ｎは０であり、ｍは３である。ある特定の場合、ｎは１であり、ｍは０である。ある特定の場合、ｎは１であり、ｍは１である。ある特定の場合、ｎは１であり、ｍは２である。ある特定の場合、ｎは１であり、ｍは３である。ある特定の場合、ｎは２であり、ｍは０である。ある特定の場合、ｎは２であり、ｍは１である。ある特定の場合、ｎは２であり、ｍは２である。ある特定の場合、ｎは２であり、ｍは３である。ある特定の場合、ｎは３であり、ｍは０である。ある特定の場合、ｎは３であり、ｍは１である。ある特定の場合、ｎは３であり、ｍは２である。ある特定の場合、ｎは３であり、ｍは３である。ある特定の場合、ｎ＋ｍは、０～３の整数である。ある特定の場合、ｎ＋ｍは０である。ある特定の場合、ｎ＋ｍは１である。ある特定の場合、ｎ＋ｍは２である。ある特定の場合、ｎ＋ｍは３である。
式（ＶＩａ）～（ＶＩｄ）のいずれかのある特定の実施形態では、Ｒ２２は水素である。ある特定の場合、Ｒ２２はアルキルである。ある特定の場合、Ｒ２２は置換アルキルである。ある特定の場合、アルキルまたは置換アルキルは、Ｃ（１～６）アルキルである。
式（Ｉ）～（ＶＩｄ）のいずれかのある特定の実施形態では、Ｒ１は、水素、アルキルアリール、置換アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、置換アルキルヘテロアリール、アルケニルアリール（例えば、エテニルアリール）、置換アルケニルアリール、アルケニルヘテロアリール（例えば、エテニルヘテロアリール）、置換アルケニルヘテロアリール、アリール、置換アリール、ヘテロアリールおよび置換ヘテロアリールから選択される。
式（Ｉ）～（ＶＩｄ）のある特定の場合、Ｒ１は水素である。ある特定の場合、Ｒ１は、アリールまたは置換アリールである。ある特定の場合、Ｒ１は、ヘテロアリールまたは置換ヘテロアリールである。ある特定の場合、Ｒ１は、アルキルアリールまたは置換アルキルアリールである。ある特定の場合、Ｒ１は、アルキルヘテロアリールまたは置換アルキルヘテロアリールである。ある特定の場合、Ｒ１は、アルケニルアリールまたは置換アルケニルアリールである。ある特定の場合、Ｒ１は、エテニルアリールである。ある特定の場合、Ｒ１は、置換エテニルアリールである。一部の場合、Ｒ１は、エテニルヘテロアリールである。ある特定の場合、Ｒ１は、アルケニルヘテロアリールまたは置換アルケニルヘテロアリールである。一部の場合、Ｒ１は、置換エテニルヘテロアリールである。
式（ＶＩａ）～（ＶＩｄ）の一部の場合、ＥＮＰＰ１阻害剤化合物は、式（ＶＩＩａ）～（ＶＩＩｂ）のうちの１つ：
Figure 2022523105000014
 のものである。
式（Ｉ）～（ＶＩＩｂ）のいずれかのある特定の実施形態では、Ｒ２～Ｒ５は、Ｈ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、－ＯＣＦ３、ハロゲン、シアノ、アミン、置換アミン、アミド、複素環および置換複素環から独立して選択される。
式（Ｉ）～（ＶＩＩｂ）のいずれかのある特定の実施形態では、Ｒ２～Ｒ５は、水素、ＯＨ、Ｃ（１～６）アルコキシ、－ＯＣＦ３、Ｃ（１～６）アルキルアミノ、ジ－Ｃ（１～６）アルキルアミノ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＣＮから独立して選択される。
ある特定の場合、Ｒ２～Ｒ５のうちの少なくとも１つは、水素である。ある特定の場合、Ｒ２～Ｒ５のうちの少なくとも２つは、水素である。ある特定の場合、Ｒ２～Ｒ５はそれぞれ、水素である。ある特定の場合、Ｒ２～Ｒ５のうちの少なくとも１つは、ヒドロキシである。ある特定の場合、Ｒ２～Ｒ５のうちの少なくとも１つは、アルキルまたは置換アルキルである。ある特定の場合、Ｒ２～Ｒ５のうちの少なくとも１つは、アルコキシまたは置換アルコキシである。ある特定の場合、アルコキシまたは置換アルコキシは、Ｃ（１～６）アルコキシ、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、ペントキシ、ヘキソキシである。ある特定の場合、Ｒ２～Ｒ５のうちの少なくとも１つは、メトキシである。ある特定の場合、Ｒ２～Ｒ５のうちの少なくとも１つは、－ＯＣＦ３である。ある特定の場合、Ｒ２～Ｒ５のうちの少なくとも１つは、ハロゲンである。ある特定の場合、ハロゲンは、フッ化物である。ある特定の場合、ハロゲンは、塩化物である。ある特定の場合、ハロゲンは、臭化物である。ある特定の場合、Ｒ２～Ｒ５のうちの少なくとも１つは、シアノである。ある特定の場合、Ｒ２～Ｒ５のうちの少なくとも１つは、アミンまたは置換アミンである。ある特定の場合、Ｒ２～Ｒ５のうちの少なくとも１つは、Ｃ（１～６）アルキルアミノである。ある特定の場合、Ｒ２～Ｒ５のうちの少なくとも１つは、ジ－Ｃ（１～６）アルキルアミノである。ある特定の場合、Ｒ２～Ｒ５のうちの少なくとも１つは、アミドである。ある特定の場合、Ｒ２～Ｒ５のうちの少なくとも１つは、複素環または置換複素環である。
式（Ｉ）～（ＶＩＩｂ）の一部の例では、Ｒ３およびＲ４は、独立して、アルコキシであり、Ｒ２およびＲ５はどちらも水素である。ある特定の場合、アルコキシは、メトキシである。一部の場合、Ｒ３は、アルコキシであり、Ｒ２、Ｒ４およびＲ５は、水素である。一部の場合、Ｒ４は、アルコキシであり、Ｒ２、Ｒ３およびＲ５それぞれ、水素である。ある特定の場合、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、水素であり、Ｒ５はアルコキシである。ある特定の場合、アルコキシは、Ｃ（１～６）アルコキシである。ある特定の場合、アルコキシは、メトキシである。ある特定の場合、アルコキシは、エトキシである。ある特定の場合、アルコキシは、プロポキシである。ある特定の場合、アルコキシは、ブトキシである。ある特定の場合、アルコキシは、ペントキシである。ある特定の場合、アルコキシは、ヘキシルオキシである。
式（ＶＩｃ）～（ＶＩｄ）の一部の場合、Ｒ４１～Ｒ４４は、それぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、Ｃ（１～６）アルキルまたはＣ（１～６）アルコキシである。式（ＶＩｃ）～（ＶＩｄ）の一部の場合、ｍは、１または２である。式（ＶＩｃ）～（ＶＩｄ）の一部の場合、Ｒ２は、Ｈであり、Ｒ３～Ｒ５は、水素、Ｃ（１～６）アルコキシ、Ｆ、ＣｌおよびＣ（１～６）アルキルから独立して選択される。
式（ＶＩＩａ）～（ＶＩＩｂ）の一部の場合、対象であるＥＮＰＰ１阻害剤化合物は、式（ＶＩＩｃ）～（ＶＩＩｌ）のうちの１つ：
Figure 2022523105000015
 のものである。
式（ＶＩａ）の一部の場合、ＥＮＰＰ１阻害剤化合物は、式（ＶＩＩｍ）：
Figure 2022523105000016
 のものである。
式（ＶＩＩｍ）のある特定の実施形態では、Ｒ２～Ｒ５は、Ｈ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、－ＯＣＦ３、ハロゲン、シアノ、アミン、置換アミン、アミド、複素環および置換複素環から独立して選択される。式（ＶＩＩｍ）のある特定の実施形態では、Ｒ２～Ｒ５は、水素、ＯＨ、Ｃ（１～６）アルコキシ、－ＯＣＦ３、Ｃ（１～６）アルキルアミノ、ジ－Ｃ（１～６）アルキルアミノ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＣＮから独立して選択される。式（ＶＩＩｍ）のある特定の実施形態では、ｎ＋ｍ＝１である。式（ＶＩＩｍ）のある特定の実施形態では、ｎ＋ｍ＝２である。式（ＶＩＩｍ）のある特定の実施形態では、ｎは１であり、ｍは０である。
式（ＶＩＩｍ）のある特定の場合、Ｒ３～Ｒ５のうちの少なくとも１つは、水素である。ある特定の場合、Ｒ３～Ｒ５のうちの少なくとも２つは、水素である。ある特定の場合、Ｒ３～Ｒ５はそれぞれ、水素である。ある特定の場合、Ｒ３～Ｒ５のうちの少なくとも１つは、ヒドロキシである。ある特定の場合、Ｒ３～Ｒ５のうちの少なくとも１つは、アルキルまたは置換アルキルである。ある特定の場合、Ｒ３～Ｒ５のうちの少なくとも１つは、アルコキシまたは置換アルコキシである。式（ＶＩＩｍ）のある特定の場合、アルコキシまたは置換アルコキシは、Ｃ（１～６）アルコキシ、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、ペントキシ、ヘキソキシである。ある特定の場合、Ｒ３～Ｒ５のうちの少なくとも１つは、メトキシである。式（ＶＩＩｍ）のある特定の場合、Ｒ３～Ｒ５のうちの少なくとも１つは、－ＯＣＦ３である。ある特定の場合、Ｒ３～Ｒ５のうちの少なくとも１つは、ハロゲンである。ある特定の場合、ハロゲンは、フッ化物である。ある特定の場合、ハロゲンは、塩化物である。ある特定の場合、ハロゲンは、臭化物である。ある特定の場合、Ｒ３～Ｒ５のうちの少なくとも１つは、シアノである。ある特定の場合、Ｒ３～Ｒ５のうちの少なくとも１つは、アミンまたは置換アミンである。ある特定の場合、Ｒ３～Ｒ５のうちの少なくとも１つは、Ｃ（１～６）アルキルアミノである。ある特定の場合、Ｒ３～Ｒ５のうちの少なくとも１つは、ジ－Ｃ（１～６）アルキルアミノである。式（ＶＩＩｍ）のある特定の場合、Ｒ３～Ｒ５のうちの少なくとも１つは、アミドである。ある特定の場合、Ｒ３～Ｒ５のうちの少なくとも１つは、複素環または置換複素環である。
式（ＶＩＩｍ）の一部の例では、Ｒ３およびＲ４は、独立してアルコキシであり、Ｒ２およびＲ５はどちらも水素である。ある特定の場合、アルコキシは、メトキシである。一部の場合、Ｒ３は、アルコキシであり、Ｒ２、Ｒ４およびＲ５は、水素である。一部の場合、Ｒ４は、アルコキシであり、Ｒ２、Ｒ３およびＲ５はそれぞれ、水素である。式（ＶＩＩｍ）のある特定の場合、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、水素であり、Ｒ５は、アルコキシである。ある特定の場合、アルコキシは、Ｃ（１～６）アルコキシである。ある特定の場合、アルコキシは、メトキシである。ある特定の場合、アルコキシは、エトキシである。ある特定の場合、アルコキシは、プロポキシである。ある特定の場合、アルコキシは、ブトキシである。ある特定の場合、アルコキシは、ペントキシである。ある特定の場合、アルコキシは、ヘキシルオキシである。
式（ＶＩＩｍ）のある特定の実施形態では、ｎは０～３であり、ｍは０～３である。式（ＶＩＩｍ）の一部の例では、ｍは０である。ある特定の場合、ｍは１である。ある特定の場合、ｍは２である。ある特定の場合、ｍは３である。ある特定の場合、ｎは０であり、ｍは１である。ある特定の場合、ｎは０であり、ｍは２である。ある特定の場合、ｎは０であり、ｍは３である。ある特定の場合、ｎは１であり、ｍは０である。ある特定の場合、ｎは１であり、ｍは１である。ある特定の場合、ｎは１であり、ｍは２である。ある特定の場合、ｎは１であり、ｍは３である。ある特定の場合、ｎは２であり、ｍは０である。ある特定の場合、ｎは２であり、ｍは１である。ある特定の場合、ｎは２であり、ｍは２である。ある特定の場合、ｎは２であり、ｍは３である。ある特定の場合、ｎは３であり、ｍは０である。ある特定の場合、ｎは３であり、ｍは１である。ある特定の場合、ｎは３であり、ｍは２である。ある特定の場合、ｎは３であり、ｍは３である。ある特定の場合、ｎ＋ｍは、０～３の整数である。ある特定の場合、ｎ＋ｍは０である。ある特定の場合、ｎ＋ｍは１である。ある特定の場合、ｎ＋ｍは２である。ある特定の場合、ｎ＋ｍは３である。
式（Ｉ）のＥＮＰＰ１阻害剤化合物のある特定の例では、Ｚ３は存在しない。式（Ｉ）のある特定の実施形態では、Ｚ３は存在せず、Ｚ２は、ＣＲ１２であり、Ｒ１２は、シアノであり、本化合物は、式（Ｘ）：
Figure 2022523105000017
 （式中、Ｌ１１およびＬ１２は、独立して、共有結合またはリンカーである）により記載される。式（Ｘ）の一部の例では、Ｌ１１は共有結合である。
式（Ｘ）の一部の実施形態では、環系Ａは、フェニル、置換フェニル、ピリジル、置換ピリジル、ピリミジン、置換ピリミジン、ピペリジン、置換ピペリジン、ピペラジン、置換ピペラジン、ピリダジン、置換ピリダジン、シクロヘキシルおよび置換シクロヘキシルから選択される。ある特定の場合、環系Ａは、フェニルまたは置換フェニルである。一部の場合、環系Ａは、ピリジルまたは置換ピリジルである。一部の場合、環系Ａは、ピリミジンまたは置換ピリミジンである。一部の場合、環系Ａは、ピペリジンまたは置換ピペリジンである。一部の場合、環系Ａは、ピペラジンまたは置換ピペラジンである。一部の場合、環系Ａは、シクロヘキシルまたは置換シクロヘキシルである。
一部の実施形態では、環系Ａは、式（Ａ１）～（Ａ４）のうちのいずれか１つ：
Figure 2022523105000018
 （式中、
Ｚ５は、ＮおよびＣＲ６から選択され、
Ｒ６はそれぞれ、水素、アルキル、置換アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、置換アルコキシ、トリフルオロメチル、ハロゲン、アシル、置換アシル、カルボキシ、カルボキシアミド、置換カルボキシアミド、スルホニル、置換スルホニル、スルホンアミドおよび置換スルホンアミドから選択され、
ｐは、０～４の整数であり、
ｑは、０～２の整数である）
により記載される（例えば、本明細書に記載されている）。
一部の実施形態では、Ａ環は、式（Ａ５）：
Figure 2022523105000019
 （式中、
Ｚ５はそれぞれ、ＮおよびＣＲ１６から独立して選択され、
Ｒ１６はそれぞれ、水素、アルキル、置換アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、置換アルコキシ、トリフルオロメチル、ハロゲン、アシル、置換アシル、カルボキシ、カルボキシアミド、置換カルボキシアミド、スルホニル、置換スルホニル、スルホンアミドおよび置換スルホンアミドから独立して選択され、
ｒは、０～８の整数である）
によって記載される。
ある特定の場合、Ａ５は、ピペリジンまたは置換ピペリジンである。ある特定の場合、Ａ５は、ピペラジンまたは置換ピペラジンである。ある特定の場合、Ａ５は、シクロヘキシルまたは置換シクロヘキシルである。Ａ５のある特定の実施形態では、ｒは、１、２、３、４、５、６、７または８など、０より大きい。一部の場合、Ａ５は、１つのＲ１６基を含む。一部の場合、Ａ５は、２つのＲ１６基を含む。一部の場合、Ａ５は、３つのＲ１６基を含む。一部の場合、Ａ５は、４つのＲ１６基を含む。ある特定の実施形態では、置換基は、低級アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチルおよびヘキシル）、トリフルオロメチルおよびハロゲン（例えば、Ｆ、Ｃｌ、ＩまたはＢｒ）から選択される。
ある特定の実施形態では、Ａ環は、式（Ａ５ａ）～（Ａ５ｃ）のうちのいずれか１つ：
Figure 2022523105000020
 を有する。
ある特定の実施形態では、Ａ環は、式（Ａ５ｄ）または（Ａ５ｅ）となる相対立体配置を有するシクロヘキシル：
Figure 2022523105000021
 である。
式（Ｘ）のある特定の場合、対象であるＥＮＰＰ１阻害剤化合物は、式（ＸＩ）：
Figure 2022523105000022
 （式中、
Ｚ５はそれぞれ、ＮおよびＣＲ１６から独立して選択され、
Ｒ１６はそれぞれ、水素、アルキル、置換アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、置換アルコキシ、トリフルオロメチル、ハロゲン、アシル、置換アシル、カルボキシ、カルボキシアミド、置換カルボキシアミド、スルホニル、置換スルホニル、スルホンアミドおよび置換スルホンアミドから独立して選択され、
ｒは、０～８の整数である）
のものである。
式（ＸＩ）のある特定の実施形態では、少なくとも１つのＺ５はＮである。式（ＸＩ）のある特定の実施形態では、Ｚ５の１つは、Ｎであり、もう一方のＺ５は、ＣＲ１６である。式（ＸＩ）のある特定の場合、Ｚ５基はどちらも、ＣＲ１６である。式（ＸＩ）のある特定の場合、Ｚ５基はどちらも、Ｎである。
式（Ｘ）～（ＸＩ）のいずれか１つの化合物のある特定の実施形態では、Ｌ１１およびＬ１２は、それぞれ共有結合である。ある特定の場合、Ｌ１１およびＬ１２はそれぞれ、リンカーである。ある特定の場合、Ｌ１１は、共有結合であり、Ｌ１２は、リンカーである。ある特定の場合、Ｌ１１は、リンカーであり、Ｌ１２は、共有結合である。任意の好都合なリンカーを、Ｌ１１およびＬ１２として利用することができる。一部の場合、Ｌ１１は、共有結合である。ある特定の場合、Ｌ１１は、長さが１～１０個、１～８個または１～６個の原子、例えば、長さが１個、２個、３個、４個、５個または６個の原子などの、長さが１～１２個の原子からなる直鎖状リンカーである。リンカーＬ１１は、（Ｃ１～６）アルキルリンカー、あるいはエステル（－ＣＯ２－）、アミド（ＣＯＮＨ）、カルバメート（ＯＣＯＮＨ）、エーテル（－Ｏ－）、チオエーテル（－Ｓ－）および／もしくはアミノ基（－ＮＲ－であり、Ｒは、Ｈまたはアルキルである）などの、ヘテロ原子または連結官能基により必要に応じて置換されている、置換（Ｃ１～６）アルキルリンカーとすることができる。一部の場合、Ｌ１２は、共有結合である。ある特定の場合、Ｌ１２は、長さが１～１０個、１～８個または１～６個の原子、例えば、長さが１個、２個、３個、４個、５個または６個の原子などの、長さが１～１２個の原子のリンカーである。リンカーＬ１２は、（Ｃ１～６）アルキルリンカー、あるいはエステル（－ＣＯ２－）、アミド（ＣＯＮＨ）、カルバメート（ＯＣＯＮＨ）、エーテル（－Ｏ－）、チオエーテル（－Ｓ－）および／もしくはアミノ基（－ＮＲ－であり、Ｒは、Ｈまたはアルキルである）などの、ヘテロ原子または連結官能基により必要に応じて置換されている、置換（Ｃ１～６）アルキルリンカーとすることができる。
式（ＸＩ）の一部の場合、対象であるＥＮＰＰ１阻害剤化合物は、式（ＸＩＩ）：
Figure 2022523105000023
 のものである。
式（ＸＩＩ）の化合物のある特定の実施形態では、Ｚ５は、ＣＲ１６であり、Ｒ１６はそれぞれ、水素、アルキル、置換アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、置換アルコキシ、トリフルオロメチル、ハロゲン、アシル、置換アシル、カルボキシ、カルボキシアミド、置換カルボキシアミド、スルホニル、置換スルホニル、スルホンアミドおよび置換スルホンアミドから選択される。式（ＸＩＩ）の化合物のある特定の場合、Ｚ５は、Ｎである。
式（ＸＩＩ）の化合物のある特定の実施形態では、Ｌ１２は共有結合である。ある特定の場合、Ｌ１２は、リンカーである。任意の好都合なリンカーを、Ｌ１２として利用することができる。ある特定の場合、Ｌ１２は、長さが１～１０個、１～８個または１～６個の原子、例えば、長さが１個、２個、３個、４個、５個または６個の原子などの、長さが１～１２個の原子からなる直鎖状リンカーである。リンカーＬ１２は、（Ｃ１～６）アルキルリンカー、あるいはエステル（－ＣＯ２－）、アミド（ＣＯＮＨ）、カルバメート（ＯＣＯＮＨ）、エーテル（－Ｏ－）、チオエーテル（－Ｓ－）および／もしくはアミノ基（－ＮＲ－であり、Ｒは、Ｈまたはアルキルである）などの、ヘテロ原子または連結官能基により必要に応じて置換されている、置換（Ｃ１～６）アルキルリンカーとすることができる。
式（ＸＩＩ）の一部の場合、対象であるＥＮＰＰ１阻害剤化合物は、式（ＸＩＩＩ）：
Figure 2022523105000024
 （式中、
Ｒ３５およびＲ３６はそれぞれ、Ｈ、ハロゲン、アルキルおよび置換アルキルから独立して選択されるか、またはＲ３５およびＲ３６は、環式連結しており、それらが結合している炭素原子と一緒になって、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクリルまたは置換ヘテロシクリル環をもたらし、
ｓは、０～６の整数（例えば、０～３）である）
のものである。
式（ＸＩＩＩ）のある特定の実施形態では、Ｒ３５およびＲ３６はそれぞれ、水素である。ある特定の実施形態では、Ｒ３５またはＲ３６のうちの少なくとも１つは、ハロゲンである。ある特定の実施形態では、Ｒ３５またはＲ３６のうちの少なくとも１つは、アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ３５またはＲ３６のうちの少なくとも１つは、置換アルキルである。ある特定の場合、Ｒ３５は、ハロゲンであり、Ｒ３６は、水素、ハロゲン、アルキルおよび置換アルキルから選択される。ある特定の場合、Ｒ３５は、アルキルであり、Ｒ３６は、水素、ハロゲン、アルキルおよび置換アルキルから選択される。ある特定の場合、Ｒ３５は、置換アルキルであり、Ｒ３６は、水素、ハロゲン、アルキルおよび置換アルキルから選択される。ある特定の場合、Ｒ３５は、ハロゲンであり、Ｒ３６は、水素である。ある特定の場合、Ｒ３５は、アルキルであり、Ｒ３６は、水素である。ある特定の場合、Ｒ３５は、置換アルキルであり、Ｒ３６は、水素である。
式（ＸＩＩＩ）のある特定の実施形態では、ｓは０～３の整数である。ある特定の場合、ｓは０である。ある特定の場合、ｓは１である。ある特定の場合、ｓは２である。ある特定の場合、ｓは３である。
式（ＸＩＩＩ）の一部の場合、対象であるＥＮＰＰ１阻害剤化合物は、式（ＸＩＶ）：
Figure 2022523105000025
 （式中、ｓは０～６の整数（例えば、０～３）である）
のものである。
式（ＸＩＩＩ）のある特定の実施形態では、ｓは０～３の整数である。ある特定の場合、ｓは０である。ある特定の場合、ｓは１である。ある特定の場合、ｓは２である。ある特定の場合、ｓは３である。
式（Ｘ）～（ＸＩＶ）のいずれかのある特定の実施形態では、Ｒ２～Ｒ５は、Ｈ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、－ＯＣＦ３、ハロゲン、シアノ、アミン、置換アミン、アミド、複素環および置換複素環から独立して選択される。
式（Ｘ）～（ＸＩＶ）のいずれかのある特定の実施形態では、Ｒ２～Ｒ５は、水素、ＯＨ、Ｃ（１～６）アルコキシ、－ＯＣＦ３、Ｃ（１～６）アルキルアミノ、ジ－Ｃ（１～６）アルキルアミノ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＣＮから独立して選択される。
式（Ｘ）～（ＸＩＶ）のいずれかのある特定の場合、Ｒ２～Ｒ５のうちの少なくとも１つは、水素である。ある特定の場合、Ｒ２～Ｒ５のうちの少なくとも２つは、水素である。ある特定の場合、Ｒ２～Ｒ５のうちの少なくとも３つは、水素である。ある特定の場合、Ｒ２～Ｒ５はそれぞれ、水素である。ある特定の場合、Ｒ２～Ｒ５のうちの少なくとも１つは、ヒドロキシである。ある特定の場合、Ｒ２～Ｒ５のうちの少なくとも１つは、アルキルまたは置換アルキルである。ある特定の場合、Ｒ２～Ｒ５のうちの少なくとも１つは、アルコキシまたは置換アルコキシである。ある特定の場合、アルコキシまたは置換アルコキシは、Ｃ（１～６）アルコキシ、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、ペントキシ、ヘキソキシである。ある特定の場合、Ｒ２～Ｒ５のうちの少なくとも１つは、メトキシである。ある特定の場合、Ｒ２～Ｒ５のうちの少なくとも１つは、－ＯＣＦ３である。ある特定の場合、Ｒ２～Ｒ５のうちの少なくとも１つは、ハロゲンである。ある特定の場合、ハロゲンは、フッ化物である。ある特定の場合、ハロゲンは、塩化物である。ある特定の場合、ハロゲンは、臭化物である。ある特定の場合、Ｒ２～Ｒ５のうちの少なくとも１つは、シアノである。ある特定の場合、Ｒ２～Ｒ５のうちの少なくとも１つは、アミンまたは置換アミンである。ある特定の場合、Ｒ２～Ｒ５のうちの少なくとも１つは、Ｃ（１～６）アルキルアミノである。ある特定の場合、Ｒ２～Ｒ５のうちの少なくとも１つは、ジ－Ｃ（１～６）アルキルアミノである。ある特定の場合、Ｒ２～Ｒ５のうちの少なくとも１つは、アミドである。ある特定の場合、Ｒ２～Ｒ５のうちの少なくとも１つは、複素環または置換複素環である。
式（Ｘ）～（ＸＩＶ）のいずれかの一部の例では、Ｒ３およびＲ４は、独立して、アルコキシであり、Ｒ２およびＲ５はどちらも水素である。一部の場合、Ｒ３は、アルコキシであり、Ｒ２、Ｒ４およびＲ５は、水素である。一部の場合、Ｒ４は、アルコキシであり、Ｒ２、Ｒ３およびＲ５それぞれ、水素である。ある特定の場合、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、水素であり、Ｒ５はアルコキシである。ある特定の場合、アルコキシは、Ｃ（１～６）アルコキシである。ある特定の場合、アルコキシは、メトキシである。ある特定の場合、アルコキシは、エトキシである。ある特定の場合、アルコキシは、プロポキシである。ある特定の場合、アルコキシは、ブトキシである。ある特定の場合、アルコキシは、ペントキシである。ある特定の場合、アルコキシは、ヘキシルオキシである。
式（ＸＩＶ）の一部の場合、対象であるＥＮＰＰ１阻害剤化合物は、式（ＸＩＶａ）～（ＸＩＶｅ）のうちの１つ：
Figure 2022523105000026
 （式中、ｓは０～６の整数（例えば、０～３）である）
のものである。
式（Ｉ）の一部の場合、対象であるＥＮＰＰ１阻害剤化合物は、式（ＸＶａ）または（ＸＶｂ）：
Figure 2022523105000027
 （式中、
ｓは、０～３であり、
Ｒ２１は、Ｃ（１～６）アルキルまたは置換Ｃ（１～６）アルキルであり、
Ｒ３およびＲ４は、ＣｌおよびＦから選択される）
のものである。
式（ＸＶａ）～（ＸＶｂ）の一部の場合、Ｒ２１は、メチル、エチル、ｎ－プロピルおよびイソプロピルから選択される。ある特定の場合、Ｒ２１はメチルである。式（ＸＶａ）～（ＸＶｂ）の一部の場合、Ｒ３およびＲ４は、Ｃｌである。ある特定の例では、Ｒ３およびＲ４はＦである。式（ＸＶａ）～（ＸＶｂ）の一部の場合、ｓは２である。ある特定の例では、ｓは１である。式（ＸＶａ）～（ＸＶｂ）の一部の実施形態では、ｓは２であり、Ｒ２１はメチルまたはイソプロピルであり、Ｒ３およびＲ４は、ＣｌおよびＦから選択される。
式（ＸＶａ）～（ＸＶｂ）の一部の例では、対象であるＥＮＰＰ１阻害剤化合物は、以下の構造のうちの１つ：
Figure 2022523105000028
 のもの、またはそのプロドラッグ（例えば、本明細書に記載されている）である。
上記の通り、Ｘ１は、親水性頭部基またはそのプロドラッグ型である。本明細書に記載されている親水性頭部基のいずれの実施形態も、本明細書に記載されている式（Ｉ）～（ＸＶｂ）の実施形態のいずれか１つに組み込むことができる。式（Ｉ）～（ＸＶｂ）の一部の実施形態では、Ｘ１は、亜鉛イオンに結合することが可能な荷電基を含む親水性頭部基またはそのプロドラッグ形態である。ある特定の場合、亜鉛イオンに結合することが可能な親水性頭部基は、リン含有官能基（例えば、本明細書に記載されている）である。
式（Ｉ）～（ＸＶｂ）の一部の実施形態では、親水性頭部基（Ｘ１）は、ホスホン酸またはホスホネート、ホスホン酸エステル、ホスフェート、リン酸エステル、チオホスフェート、チオリン酸エステル、ホスホロアミデート、チオホスホロアミデート、スルホネート、スルホン酸、スルフェート、ヒドロキサム酸、ケト酸、アミドおよびカルボン酸から選択される。式（Ｉ）～（ＸＶｂ）のいずれか１つの一部の実施形態では、親水性頭部基は、ホスホン酸、ホスホネートまたはそれらの塩である。式（Ｉ）～（ＸＶｂ）のいずれか１つの一部の実施形態では、親水性頭部基は、ホスフェートまたはその塩である。式（Ｉ）～（ＸＶｂ）のいずれか１つの一部の実施形態では、親水性頭部基は、ホスホン酸エステルまたはリン酸エステルである。式（Ｉ）～（ＸＶｂ）のいずれか１つの一部の実施形態では、親水性頭部基は、チオホスフェートである。式（Ｉ）～（ＸＶｂ）のいずれか１つの一部の実施形態では、親水性頭部基は、チオリン酸エステルである。式（Ｉ）～（ＸＶｂ）のいずれか１つの一部の実施形態では、親水性頭部基は、ホスホロアミデートである。式（Ｉ）～（ＸＶｂ）のいずれか１つの一部の実施形態では、親水性頭部基は、チオホスホロアミデートである。
本明細書に記載されている式（Ｉ）～（ＸＶｂ）の実施形態のいずれか１つに組み込まれ得る目的の親水性頭部基の具体的な例は、以下に限定されないが、ホスフェート（ＲＰＯ４Ｈ－）、ホスホネート（ＲＰＯ３Ｈ－）、ホウ酸（ＲＢＯ２Ｈ２）、カルボキシレート（ＲＣＯ２ －）、スルフェート（ＲＳＯ４ －）、スルホネート（ＲＳＯ３ －）、アミン（ＲＮＨ３ ＋）、グリセロール、ラクトースなどの糖もしくはヒアルロン酸から誘導される糖、極性アミノ酸、ポリ酸化エチレン、およびオリゴエチレングリコールから選択される第１の部分を含む頭部基であって、コリン、エタノールアミン、グリセロール、核酸、糖、イノシトール、アミノ酸またはアミノ酸エステル（例えば、セリン）および脂質（例えば、脂肪酸、またはＣ８～Ｃ３０飽和もしくは不飽和炭化水素などの炭化水素鎖）から選択される第２の部分の残基に必要に応じてコンジュゲートされている、頭部基を含む。頭部基は、様々な他の修飾部を含有してもよく、例えば、オリゴエチレングリコールおよびポリ酸化エチレン（ＰＥＧ）含有頭部基の場合、このようなＰＥＧ鎖は、メチル基により終端されていてもよく、さらなる修飾のための遠位官能基を有してもよい。親水性頭部基の例にはまた、以下に限定されないが、チオホスフェート、ホスホコリン、ホスホグリセロール、ホスホエタノールアミン、ホスホセリン、ホスホイノシトール、エチルホスホスホリルコリン（ethylphosphosphorylcholine）、ポリエチレングリコール、ポリグリセロール、メラミン、グルコサミン、トリメチルアミン、スペルミン、スペルミジンおよびコンジュゲートされているカルボキシレート、スルフェート、ホウ酸、スルホネート、スルフェートおよび炭水化物が含まれる。
式（Ｉ）～（ＸＶｂ）のいずれか１つの一部の例では、親水性頭部基Ｘ１は、式（ＸＶＩ）：
Figure 2022523105000029
 （式中、
Ｚ６は、存在しないか、またはＯおよびＣＨ２から選択され、
Ｚ７およびＺ９は、ＯおよびＮＲ１０からそれぞれ独立して選択され、Ｒ１０は、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルであり、
Ｚ８は、ＯおよびＳから選択され、
Ｒ８およびＲ９は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アシル、置換アシル、非芳香族複素環、置換非芳香族複素環、シクロアルキル、置換シクロアルキルおよびプロ部分からそれぞれ独立して選択される）
のものである。
式（ＸＶＩ）の一部の実施形態では、Ｚ６は、存在しない。他の場合、Ｚ６は、ＣＨ２である。他の場合、Ｚ６は、酸素である。式（ＸＶＩ）の一部の実施形態では、Ｚ７は、酸素であり、Ｚ９は、ＮＲ１０である。一部の場合、Ｚ７は、ＮＲ１０であり、Ｚ９は、酸素である。一部の場合、Ｚ７とＺ９はどちらも酸素である。他の場合、Ｚ７およびＺ９はどちらもＮＲ１０である。一部の場合、Ｚ８は、酸素である。他の場合、Ｚ８は、硫黄である。
式（ＸＶＩ）の一部の実施形態では、Ｚ７、Ｚ８およびＺ９はすべて酸素原子であり、Ｚ６は、存在しないか、またはＣＨ２である。他の場合、Ｚ８は硫黄原子であり、Ｚ７およびＺ９は、どちらも酸素原子であり、Ｚ６は、存在しないか、またはＣＨ２である。他の場合、Ｚ８は硫黄原子であり、Ｚ６、Ｚ７およびＺ９は、すべて酸素原子である。一部の場合、Ｚ８は、酸素原子であり、Ｚ７は、ＮＲ１０であり、Ｚ９は、酸素原子であり、Ｚ６は、存在しないか、またはＣＨ２である。他の場合、Ｚ８は酸素原子であり、Ｚ７は、ＮＲ１０であり、Ｚ６およびＺ９は、どちらも酸素原子である。他の場合、Ｚ８は酸素原子であり、Ｚ７およびＺ９は、それぞれ独立して、ＮＲ１０であり、Ｚ６は、酸素原子である。さらに他の場合、Ｚ８は酸素原子であり、Ｚ７およびＺ９は、それぞれ独立して、ＮＲ１０であり、Ｚ６は、存在しないか、またはＣＨ２である。一部の場合、Ｚ７およびＺ９は、それぞれ同じである。他の場合、Ｚ７およびＺ９は、異なる。式（ＸＶＩ）の基は、図示されている構造の１つまたは複数の互変異性体の形態を含むことがあること、ならびにすべてのこのような形態およびその塩が含まれることが意図されていることが理解される。
式（ＸＶＩ）の一部の実施形態では、Ｚ７およびＺ９のうちの少なくとも１つは、ＮＲ１０である。一部の場合、Ｒ１０は、水素である。一部の場合、Ｒ１０は、アルキルである。一部の他の場合、Ｒ１０は、置換アルキルである。一部の場合、Ｚ７とＺ９はどちらもＮＲ１０である。一部の場合、Ｚ７とＺ９はどちらも、ＮＲ１０であり、Ｒ１０、Ｒ８およびＲ９はそれぞれ、独立して水素である。一部の場合、Ｚ７とＺ９はどちらも、ＮＲ１０であり、Ｒ１０はそれぞれ、アルキル基であり、Ｒ８およびＲ９はそれぞれ、水素である。一部の場合、Ｚ７とＺ９はどちらも、ＮＲ１０であり、Ｒ１０はそれぞれ、置換アルキル基（例えば、エステル基またはカルボキシル基により置換されているアルキル基）であり、Ｒ８およびＲ９はそれぞれ、水素である。
式（ＸＶＩ）の一部の実施形態では、Ｒ８およびＲ９は、どちらも水素原子である。一部の場合、Ｒ８およびＲ９のうちの少なくとも１つは、水素以外の置換基である。他の場合、Ｒ８およびＲ９はどちらも、水素以外の置換基である。一部の場合、Ｒ８およびＲ９のうちの少なくとも１つは、アルキルまたは置換アルキルである。一部の場合、Ｒ８およびＲ９のうちの少なくとも１つは、アルケニルまたは置換アルケニルである。いくつかの他の場合、Ｒ８およびＲ９のうちの少なくとも１つは、アリールまたは置換アリールである。一部の場合、Ｒ８およびＲ９のうちの少なくとも１つは、アシルまたは置換アシルである。一部の場合、Ｒ８およびＲ９のうちの少なくとも１つは、ヘテロアリールまたは置換ヘテロアリールである。一部の場合、Ｒ８およびＲ９のうちの少なくとも１つは、シクロアルキルまたは置換シクロアルキルである。一部の場合、Ｒ８およびＲ９は、どちらもアルキル基（例えば、低級アルキル）である。一部の場合、Ｒ８およびＲ９は、どちらも置換アルキル基（例えば、アルコキシ、置換アルコキシ、エステルまたはカルボキシル基により置換されているＣ（１～６）アルキル）である。一部の場合、Ｒ８およびＲ９のうちの少なくとも１つは、プロ部分を含む。ある特定の場合、Ｒ８とＲ９はどちらも、フェニル基である。一部の場合、Ｒ８およびＲ９は、同じである。他の場合、Ｒ８およびＲ９は、異なる。
式（Ｉ）～（ＸＶｂ）のいずれか１つの一部の例では、親水性頭部基Ｘ１は、式（ＸＶＩａ）～（ＸＶＩｆ）のうちのいずれか１つ：
Figure 2022523105000030
 （式中、
Ｒ１０およびＲ１１は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アシル、置換アシル、カルボキシル、置換カルボキシルおよびプロ部分（例えば、本明細書に記載されている）からそれぞれ独立して選択される）
から選択される。
式（ＸＶＩａ）～（ＸＶＩｆ）の一部の実施形態では、Ｒ１０およびＲ１１は、どちらも水素原子である。一部の場合、Ｒ１０およびＲ１１のうちの少なくとも１つは、水素以外の置換基である。他の場合、Ｒ１０およびＲ１１はどちらも、水素以外の置換基である。一部の場合、Ｒ１０およびＲ１１は、同じである。他の場合、Ｒ１０およびＲ１１は、異なる。一部の場合、Ｒ１０およびＲ１１のうちの少なくとも１つは、アルキルまたは置換アルキルである。一部の場合、Ｒ１０およびＲ１１のうちの少なくとも１つは、アリールまたは置換アリールである。一部の場合、Ｒ１０およびＲ１１はどちらも、アルキルまたは置換アルキルである。一部の場合、Ｒ１０およびＲ１１のどちらも、アリールまたは置換アリールである。一部の場合、Ｒ１０およびＲ１１のどちらも、アシルまたは置換アシルである。一部の場合、Ｒ１０およびＲ１１は、どちらも低級アルキル基である。一部の場合、Ｒ１０およびＲ１１は、どちらも置換アルキル基（例えば、アルコキシ、置換アルコキシ、エステルまたはカルボキシル基により置換されているＣ（１～６）アルキル）である。一部の場合、Ｒ１０およびＲ１１のうちの少なくとも１つは、プロ部分を含む。ある特定の場合、Ｒ１０とＲ１１はどちらも、フェニル基である。
式（ＸＶＩａ）～（ＸＶＩｄ）のある特定の場合、Ｒ１０およびＲ１１のうちの少なくとも１つは、切断性基または自壊性プロ部分を含む。自壊性基は、ジスルフィド連結プロ部分、または自壊性エステル含有プロ部分とすることができる。一部の場合、Ｒ１０および／またはＲ１１は、以下の式であるジスルフィド連結プロ部分：－ＣＨ２ＣＨ２－ＳＳ－Ｒ１２（Ｒ１２は、アルキルまたは置換アルキルである）を含む。ある特定の例では、Ｒ１２は、Ｃ８～Ｃ３０飽和または不飽和炭化水素鎖である。一部の場合、Ｒ１０および／またはＲ１１は、以下の式であるプロ部分：－ＣＨ２ＯＣＯＲ１３（Ｒ１３は、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルである）を含む。一部の場合、Ｒ１０および／またはＲ１１は、以下の式であるプロ部分：－ＣＨ２Ｃ（Ｒ１４）２ＣＯ２Ｒ１４（Ｒ１４はそれぞれ、独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルである）を含む。
式（Ｉ）～（ＸＶｂ）のいずれか１つの一部の例では、親水性頭部基Ｘ１またはそのプロドラッグ形態は、以下：
Figure 2022523105000031
Figure 2022523105000032
 または薬学的に許容されるそれらの塩から選択される。
式（Ｉ）～（ＸＶｂ）のいずれか１つの一部の例では、親水性頭部基Ｘ１は、式（ＸＶＩ）：
Figure 2022523105000033
 （式中、
Ｒ８１およびＲ９１は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリール、置換アリール、アシル基、エステル、アミド、複素環、置換複素環 シクロアルキルおよび置換シクロアルキルからそれぞれ独立して選択されるか、またはＲ８１とＲ９１は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環および置換複素環から選択される基を形成する）
のものである。
式（ＸＶＩ）の一部の実施形態では、Ｒ８１およびＲ９１は、どちらも水素原子である。他の場合、Ｒ８１およびＲ９１はどちらも、水素以外の置換基である。
式（Ｉ）～（ＸＶｂ）のいずれか１つの一部の例では、親水性頭部基Ｘ１は、式（ＸＶＩＩ）：
Figure 2022523105000034
 のものである。
式（Ｉ）～（ＸＶｂ）のいずれか１つの一部の例では、親水性頭部基Ｘ１は、式（ＸＶＩＩＩ）：
Figure 2022523105000035
 （式中、
Ｚ６１は、存在しないか、またはＯおよびＣＨ２から選択される）
のものである。
式（ＸＶＩＩＩ）の一部の実施形態では、親水性頭部基は、以下の基のうちの１つ：
Figure 2022523105000036
 から選択される。
式（Ｉ）～（ＸＶｂ）のいずれか１つの一部の例では、親水性頭部基Ｘ１は、式（ＸＩＸ）：
Figure 2022523105000037
 のものである。
式（Ｉ）～（ＸＶｂ）のいずれか１つの一部の例では、親水性頭部基Ｘ１は、式（ＸＸ）：
Figure 2022523105000038
 （式中、
Ｒ９２は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリール、置換アリール、アシル基、エステル、アミド、複素環、置換複素環 シクロアルキルおよび置換シクロアルキルから選択される）
のものである。
式（ＸＸ）の一部の実施形態では、Ｒ９２は水素である。他の場合、Ｒ９２は、水素以外の置換基である。ある特定の実施形態では、Ｒ９２は、アルキルまたは置換アルキルである。式（ＸＸ）のある特定の実施形態では、親水性頭部基は、以下の構造：
Figure 2022523105000039
 のものである。
式（Ｉ）～（ＸＶｂ）のいずれか１つの一部の例では、親水性頭部基Ｘ１は、式（ＸＸＩ）：
Figure 2022523105000040
 のものである。
式（Ｉ）～（ＸＶｂ）のいずれかの基Ｘ１におけるヒドロキシル基およびアミン基のいずれも、任意の好都合な基、例えば、アルキル基、置換アルキル基、フェニル基、置換フェニル基、エステル基などにより必要に応じてさらに置換されていてもよいことが理解されよう。好都合な代替的な親水性基のいずれも、式（Ｉ）～（ＸＶｂ）のいずれかの化合物中の基Ｘ１として利用され得ることが理解されよう。
ある特定の実施形態では、ＥＮＰＰ１阻害剤化合物は、表１の構造のうちの１つもしくはそのプロドラッグ（例えば、本明細書に記載されている）、または薬学的に許容されるそれらの塩によって記載されている。
Figure 2022523105000041
Figure 2022523105000042
Figure 2022523105000043
Figure 2022523105000044
Figure 2022523105000045
Figure 2022523105000046
ある特定の実施形態では、ＥＮＰＰ１阻害剤化合物は、表２の構造のうちの１つもしくはそのプロドラッグ（例えば、本明細書に記載されている）、または薬学的に許容されるそれらの塩によって記載されている。
Figure 2022523105000047
Figure 2022523105000048
Figure 2022523105000049
Figure 2022523105000050
Figure 2022523105000051
ある特定の実施形態では、ＥＮＰＰ１阻害剤化合物は、表３の構造のうちの１つもしくはそのプロドラッグ（例えば、本明細書に記載されている）、または薬学的に許容されるそれらの塩によって記載されている。
Figure 2022523105000052
Figure 2022523105000053
 ある特定の実施形態では、本化合物は、表１～３の化合物の１つの構造によって記載されている（本明細書において、表１～３を言及する場合、表３ａを含む）。表１～３に示されている化合物のうちのいずれかは、塩形態で存在し得ることが理解される。一部の場合、本化合物の塩形態は、薬学的に許容される塩である。表１～３に示されている化合物のうちのいずれも、プロドラッグ形態で存在し得ることが理解される。
一部の実施形態では、本化合物は、表３ａの化合物のうちの１つの構造によって記載される。
Figure 2022523105000054
Figure 2022523105000055
Figure 2022523105000056
Figure 2022523105000057
Figure 2022523105000058
Figure 2022523105000059
Figure 2022523105000060
Figure 2022523105000061
Figure 2022523105000062
本開示の態様は、ＥＮＰＰ１阻害剤化合物（例えば、本明細書に記載されている）、その塩（例えば、薬学的に許容される塩）、ならびに／またはそれらの溶媒和物、水和物および／もしくはプロドラッグ形態を含む。さらに、１つまたは複数のキラル中心を有する本明細書に記載されている化合物のいずれにおいても、絶対立体化学が明示的に表示されていない場合、各中心は、独立して、Ｒ立体配置またはＳ立体配置またはそれらの混合物とすることができることが理解される。塩、溶媒和物、水和物、プロドラッグおよび立体異性体のすべての変形が、本開示によって包含されていることが意図されていることが認識されよう。
一部の実施形態では、対象であるＥＮＰＰ１阻害剤化合物またはそのプロドラッグ形態は、薬学的に許容される塩の形態で提供される。アミンまたは窒素含有ヘテロアリール基を含有する化合物は、性質は塩基性であり、したがって、様々な無機酸および有機酸と反応して、薬学的に許容される酸付加塩を形成することができる。このような塩を形成するために一般に使用される酸は、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸およびリン酸などの無機酸、ならびにパラ－トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、パラ－ブロモフェニルスルホン酸、炭酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸および酢酸などの有機酸、ならびに関連する無機酸および有機酸を含む。したがって、このような薬学的に許容される塩は、硫酸塩、ピロ硫酸塩、硫酸水素塩、亜硫酸塩、亜硫酸水素塩、リン酸塩、リン酸一水素塩、リン酸二水素塩、メタリン酸塩、ピロリン酸塩、塩化物塩、臭化物塩、ヨウ化物塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、デカン酸塩、カプリル酸塩、アクリル酸塩、ギ酸塩、イソ酪酸塩、カプリン酸塩、ヘプタン酸塩、プロピオール酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、スベリン酸塩、セバシン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、ブチン－１，４－ジオエート塩、ヘキシン－１，６－ジオエート塩、安息香酸塩、クロロ安息香酸塩、メチル安息香酸塩、ジニトロ安息香酸塩、ヒドロキシ安息香酸塩、メトキシ安息香酸塩、フタル酸塩、テレフタル酸塩、スルホン酸塩、キシレンスルホン酸塩、フェニル酢酸塩、フェニルプロピオン酸塩、フェニル酪酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、β－ヒドロキシ酪酸塩、グリコール酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、プロパンスルホン酸塩、ナフタレン－１－スルホン酸塩、ナフタレン－２－スルホン酸塩、マンデル酸塩、馬尿酸塩、グルコン酸塩、ラクトビオン酸塩、および同様の塩を含む。ある特定の実施形態では、薬学的に許容される酸付加塩は、塩酸および臭化水素酸などの無機酸と形成されるもの、ならびにフマル酸およびマレイン酸などの有機酸と形成されるものを含む。
一部の実施形態では、対象化合物は、プロドラッグ形態で提供される。「プロドラッグ」とは、身体内で活性剤を放出するために変換を必要とする、活性剤の誘導体を指す。ある特定の実施形態では、変換は、酵素変換である。プロドラッグは、多くの場合、活性剤に変換されるまで、薬理学的に不活性であることが多いが、必ずしもそうではない。「プロ部分」は、活性剤内の官能基をマスクするために使用すると、活性剤をプロドラッグに変換する保護基の形態を指す。一部の場合、プロ部分は、ｉｎ ｖｉｖｏで酵素的または非酵素的手段により切断される結合（単数または複数）を介して、薬物に結合されている。対象化合物の好都合なプロドラッグ形態のいずれも、例えば、Ｒａｕｔｉｏら（”Prodrugs: design and clinical applications”, Nature Reviews Drug Discovery 7, 255-270(February 2008)）によって記載されている戦略および方法に準拠して調製することができる。一部の場合、プロ部分は、対象化合物の親水性頭部基に結合されている。一部の場合、プロ部分は、対象化合物のヒドロキシ基またはカルボン酸基に結合されている。ある特定の場合、プロ部分は、アシル基または置換アシル基である。ある特定の場合、プロ部分は、例えば、対象化合物の親水性頭部基に結合されている場合、エステル官能基、例えばホスホン酸エステル、リン酸エステルなどを形成するアルキル基または置換アルキル基である。
一部の実施形態では、対象化合物は、ホスホン酸またはホスホネートまたはホスフェート頭部基を含む化合物に変換され得る、ホスホン酸エステルまたはリン酸エステルプロドラッグである。
一部の実施形態では、対象化合物、そのプロドラッグ、立体異性体または塩は、溶媒和物（例えば、水和物）の形態で提供される。用語「溶媒和物」とは、本明細書で使用される場合、１分子または複数分子の溶質、例えばプロドラッグまたは薬学的に許容されるその塩、および１分子または複数分子の溶媒によって形成される複合体または凝集物を指す。このような溶媒和物は、通常、溶質と溶媒の実質的に固定されたモル比を有する結晶性固体である。代表的な溶媒は、例として、水、メタノール、エタノール、イソプロパノール、酢酸などを含む。溶媒が水である場合、形成される溶媒和物は水和物である。
一部の実施形態では、対象化合物は、経口投与によって供給されて、血流に吸収される。一部の実施形態では、対象化合物の経口生体利用率は、３０％またはそれより高い。腸の内腔を通過する吸収量またはその生体利用率を増大させるために、好都合な任意の方法を使用して、対象化合物またはその製剤に改変が行われてもよい。
一部の実施形態では、対象化合物は、代謝的に安定である（例えば、化合物の半減期の間に、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、実質的に無傷のままである）。ある特定の実施形態では、本化合物は、１０分間もしくはそれより長い、１２分間もしくはそれより長い、１５分間もしくはそれより長い、２０分間もしくはそれより長い、３０分間もしくはそれより長い、６０分間もしくはそれより長い、２時間もしくはそれより長い、６時間もしくはそれより長い、１２時間もしくはそれより長い、２４時間もしくはそれより長い、またはさらに長いなどの、５分間またはそれより長い半減期（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期）を有する。
ＥＮＰＰ１を阻害する方法
上に要約されている通り、本開示の態様は、ＥＮＰＰ１阻害剤、およびこれを使用する阻害方法を含む。ＥＮＰＰ１は、エクト－ヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ（ＥＮＰＰ）ファミリーのメンバーである。したがって、対象方法の態様は、ｃＧＡＭＰに対するＥＮＰＰ１のヒドロラーゼ活性の阻害を含む。本発明者らは、ｃＧＡＭＰが、重要な細胞外生物学的機能を有することができ、これは、ｃＧＡＭＰの細胞外分解、例えばその分解酵素ＥＮＰＰ１による加水分解を遮断することによって増強され得ることを発見した。ある特定の例では、阻害のＥＮＰＰ１標的は細胞外にあり、対象となるＥＮＰＰ１を阻害する化合物は、細胞非透過性であり、したがって、細胞に拡散することができない。したがって、対象方法は、ＥＮＰＰ１のヒドロラーゼ活性の選択的な細胞外阻害を実現し、ｃＧＡＭＰの細胞外レベルを増大することができる。したがって、一部の場合、ＥＮＰＰ１阻害性化合物は、ＥＮＰＰ１の活性を細胞外で阻害する化合物である。本発明者により行われる実験は、ＥＮＰＰ１の活性を阻害すると、細胞外ｃＧＡＭＰを増大させて、その結果として、ＳＴＩＮＧ経路を促進することができることを示している。
ＥＮＰＰ１を阻害するとは、この酵素の活性を、２０％もしくはそれを超えて、３０％もしくはそれを超えて、４０％もしくはそれを超えて、５０％もしくはそれを超えて、６０％もしくはそれを超えて、７０％もしくはそれを超えて、８０％もしくはそれを超えて、９０％もしくはそれを超えて、９５％もしくはそれを超えて（例えば、任意の好都合なｉｎ ｖｉｔｒｏ阻害アッセイにおける対照との比較）などの１０％またはそれを超えて低下することが意図される。一部の場合、ＥＮＰＰ１の阻害は、その正常活性に比べて（例えば、任意の好都合なアッセイによって測定される対照との比較）、３分の１倍もしくはそれより低く、５分の１倍もしくはそれより低く、１０分の１倍もしくはそれより低く、１００分の１倍もしくはそれより低く、または１０００分の１倍もしくはそれより低くなどの、２分の１倍またはそれより低く、酵素の活性を低下させることを意味する。
一部の場合、本方法は、試料中のＥＮＰＰ１を阻害する方法である。用語「試料」は、本明細書で使用される場合、必ずしもではないが通常、目的の１つまたは複数の構成成分を含有する流体形態の物質または物質の混合物に関する。
一部の実施形態では、ＥＮＰＰ１を阻害する方法であって、試料に、細胞非透過性ＥＮＰＰ１阻害剤を接触させて、ＥＮＰＰ１のｃＧＡＭＰ加水分解活性を阻害させるステップを含む、方法が提供される。一部の場合、試料は、細胞試料である。一部の場合、試料は、ｃＧＡＭＰを含む。ある特定の場合、ｃＧＡＭＰレベルは、細胞試料中で向上している（例えば、阻害剤と接触させない対照試料との比較）。対象方法は、ｃＧＡＭＰのレベルの向上をもたらすことができる。「ｃＧＡＭＰレベルの向上」とは、対象化合物に接触させた細胞試料中のｃＧＡＭＰのレベルであって、試料中のｃＧＡＭＰレベルが、薬剤に接触されていない対照試料に比べて、２０％もしくはそれより高く、３０％もしくはそれより高く、４０％もしくはそれより高く、５０％もしくはそれより高く、６０％もしくはそれより高く、７０％もしくはそれより高く、８０％もしくはそれより高く、９０％もしくはそれより高く、１００％もしくはそれより高く、またはさらに高くなどの１０％またはそれより高く向上している、ｃＧＡＭＰレベルが意図される。
ある特定の実施形態では、本ＥＮＰＰ１阻害剤は、本明細書で定義されている阻害剤である。一部の実施形態では、本ＥＮＰＰ１阻害剤は、式（Ｉ）～（ＸＶｂ）（例えば、本明細書に記載されている）のいずれか１つによる阻害剤である。一部の場合、ＥＮＰＰ１阻害剤は、表１～３（例えば、本明細書に記載されている）の化合物のうちのいずれか１つである。一部の場合、ＥＮＰＰ１阻害剤は、細胞非透過性である。
一部の実施形態では、本ＥＮＰＰ１阻害剤は、細胞透過性となるように構成されている。一部の実施形態では、ＥＮＰＰ１を阻害する方法であって、試料に、細胞透過性ＥＮＰＰ１阻害剤を接触させて、ＥＮＰＰ１を阻害させるステップを含む、方法が提供される。
一部の実施形態では、対象化合物は、さらなる酵素に対する活性を反映するＥＮＰＰ１阻害プロファイルを有する。一部の実施形態では、対象化合物は、１種または複数種の他の酵素の望ましくない阻害なしに、ＥＮＰＰ１を特異的に阻害する。
一部の実施形態では、本開示の化合物は、ｃＧＡＭＰおよびＥＮＰＰ１の相互作用を妨害する。例えば、対象化合物は、ｃＧＡＭＰに対するＥＮＰＰ１のヒドロラーゼ活性を阻害することによって、細胞外ｃＧＡＭＰを増加させるよう働くことができる。いかなる特定の理論にも拘泥されないが、細胞外ｃＧＡＭＰの増加により、ＳＴＩＮＧ経路が活性化されると考えられる。
一部の実施形態では、対象化合物は、阻害アッセイによって、例えば、対照と比較した、対象化合物による処置後の細胞不含系または細胞のどちらか一方での酵素の活性レベルを決定するアッセイによって、ＩＣ５０またはＥＣ５０値をそれぞれ測定することによって求めると、ＥＮＰＰ１を阻害する。ある特定の実施形態では、対象化合物は、３μＭもしくはそれ未満、１μＭもしくはそれ未満、５００ｎＭもしくはそれ未満、３００ｎＭもしくはそれ未満、２００ｎＭもしくはそれ未満、１００ｎＭもしくはそれ未満、５０ｎＭもしくはそれ未満、３０ｎＭもしくはそれ未満、１０ｎＭもしくはそれ未満、５ｎＭもしくはそれ未満、３ｎＭもしくはそれ未満、１ｎＭもしくはそれ未満、またはさらに一層低いなどの１０μＭまたはそれ未満のＩＣ５０値（またはＥＣ５０値）を有する。
上で要約されるように、本開示の態様は、ＥＮＰＰ１を阻害する方法を含む。対象化合物（例えば、本明細書に記載されている）は、１０％～１００％の範囲で、例えば、１０％もしくはそれより高く、２０％もしくはそれより高く、３０％もしくはそれより高く、４０％もしくはそれより高く、５０％もしくはそれより高く、６０％もしくはそれより高く、７０％もしくはそれより高く、８０％もしくはそれより高く、または９０％もしくはそれより高く、ＥＮＰＰ１の活性を阻害することができる。ある特定のアッセイでは、対象化合物は、１×１０－６Ｍもしくはそれ未満（例えば、１×１０－６Ｍもしくはそれ未満、１×１０－７Ｍもしくはそれ未満、１×１０－８Ｍもしくはそれ未満、１×１０－９Ｍもしくはそれ未満、１×１０－１０Ｍもしくはそれ未満、または１×１０－１１Ｍもしくはそれ未満）のＩＣ５０でその標的を阻害することができる。
ＥＮＰＰ１活性を決定する際に使用することができるプロトコールは多数あり、以下に限定されないが、細胞不含アッセイ、例えば、結合アッセイ；精製酵素を使用するアッセイ、細胞表現型が測定される細胞アッセイ、例えば遺伝子発現アッセイ；および特定の動物を含むｉｎ ｖｉｖｏアッセイ（この動物は、ある特定の実施形態では、標的病原体に関連する状態の動物モデルであってもよい）を含む。
一部の実施形態では、対象方法は、試料に、ＥＮＰＰ１を特異的に阻害する対象化合物を接触させるステップを含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法である。ある特定の実施形態では、試料は、ＥＮＰＰ１を含有することが疑われており、対象方法は、本化合物がＥＮＰＰ１を阻害するかどうかを評価するステップをさらに含む。
ある特定の実施形態では、対象化合物は、標識、例えば蛍光標識を含む修飾化合物であり、対象方法は、例えば、光学的検出を使用して、試料中の標識を、存在する場合、検出するステップをさらに含む。
ある特定の実施形態では、本化合物は、支持体、または支持体に結合する親和性基（例えば、ビオチン）により修飾されて、本化合物に結合しないいかなる試料も除去され得る（例えば、洗浄による）。特異的に結合したＥＮＰＰ１は、存在する場合、次に、標識化された標的特異的プローブの結合を使用する、または蛍光タンパク質反応性試薬を使用するなどの、任意の慣用的な手段を使用して検出され得る。
対象方法の別の実施形態では、試料は、ＥＮＰＰ１を含有することが分かっている。
一部の実施形態では、本方法は、がん細胞の増殖を低減する方法であって、細胞に有効量の対象であるＥＮＰＰ１阻害剤化合物（例えば、本明細書に記載されている）を接触させて、がん細胞の増殖を低減するステップを含む方法である。ある特定の場合、対象であるＥＮＰＰ１阻害剤化合物は、細胞内で作用することができる。本方法は、化学療法剤（例えば、本明細書に記載されている）と組み合わせて行うことができる。がん細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏとなり得る。ある特定の例では、本方法は、細胞にＥＮＰＰ１阻害剤化合物（例えば、本明細書に記載されている）を接触させるステップ、および細胞に化学療法剤を接触させるステップを含む。任意の好都合ながん細胞を標的とすることができる。
処置の方法
本開示の態様は、ｃＧＡＭＰに対するＥＮＰＰ１のヒドロラーゼ活性を阻害して、ｃＧＡＭＰのレベルの向上、および／またはＳＴＩＮＧ経路の下流でのモジュレート（例えば、活性化）を実現する方法を含む。本発明者らは、ｃＧＡＭＰが細胞外空間に存在することができること、およびＥＮＰＰ１が、ｃＧＡＭＰの細胞外レベルを制御することができることを発見した。本発明者らは、ｃＧＡＭＰが、ｉｎ ｖｉｖｏで細胞外での重要な生物学的機能を有し得ることも発見した。本明細書において記載されて、実証されている結果は、対象方法によるＥＮＰＰ１阻害により、ｉｎ ｖｉｖｏでＳＴＩＮＧ活性がモジュレートされ得ること、したがって、例えば、がん免疫療法に対する標的として、様々な疾患の処置における使用が見出されることを示す。したがって、対象方法は、ＥＮＰＰ１活性（例えば、ｃＧＡＭＰのヒドロラーゼ活性）を選択的に細胞外阻害してｃＧＡＭＰの細胞外レベルを向上させて、インターフェロン遺伝子の刺激因子（ＳＴＩＮＧ）の経路の活性化を実現することができる。一部の例では、対象方法は、被験体におけるＳＴＩＮＧ媒介性応答を増大させる方法である。一部の例では、対象方法は、被験体における免疫応答をモジュレートする方法である。
「ＳＴＩＮＧ媒介性応答」とは、以下に限定されないが、例えば、細菌病原体、ウイルス病原体および真核生物病原体に対する免疫応答を含めた、ＳＴＩＮＧにより媒介されるあらゆる応答を指す。例えば、Ishikawa et al. Immunity 29: 538-550 (2008); Ishikawa et al. Nature 461: 788-792 (2009);およびSharma et al. Immunity 35: 194-207 (2011)を参照されたい。ＳＴＩＮＧはまた、自己ＤＮＡの不適切な認識により開始されるある特定の自己免疫疾患において（例えば、Gall et al. Immunity 36: 120-131 (2012)を参照されたい）、およびＤＮＡワクチンに応答する適応免疫を誘導する場合に機能する（例えば、Ishikawa et al. Nature 461: 788-792 (2009)を参照されたい）。被験体におけるＳＴＩＮＧ媒介性応答を増大させるとは、対照被験体（例えば、対象化合物の投与を受けていない被験体）に比べると、被験体におけるＳＴＩＮＧ媒介性応答が増大することが意図される。一部の場合、被験体はヒトであり、対象化合物および方法は、ヒトＳＴＩＮＧの活性化をもたらす。一部の場合、ＳＴＩＮＧ媒介性応答は、免疫応答のモジュレートを含む。一部の例では、対象方法は、被験体における免疫応答をモジュレートする方法である。
一部の場合、ＳＴＩＮＧ媒介性応答は、被験体における、インターフェロン（例えば、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）、ＩＩＩ型インターフェロン（ＩＦＮ））の生成量の増加を含む。インターフェロン（ＩＦＮ）は、様々な生物活性、例えば、抗ウイルス、免疫モジュレートおよび抗増殖性を有するタンパク質である。ＩＦＮは、ウイルス、ポリペプチド、分裂促進因子などの様々な誘発因子への曝露に応答して哺乳動物細胞によって産生される、比較的小さく、種に特異的な単鎖ポリペプチドである。インターフェロンは、ウイルスの攻撃から動物組織および細胞を保護し、重要な宿主防御機構である。インターフェロンは、Ｉ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型インターフェロンとして分類することができる。目的の哺乳動物のＩ型インターフェロンには、ＩＦＮ－α（アルファ）、ＩＦＮ－β（ベータ）、ＩＦＮ－κ（カッパ）、ＩＦＮ－δ（デルタ）、ＩＦＮ－ε（イプシロン）、ＩＦＮ－τ（タウ）、ＩＦＮ－ω（オメガ）およびＩＦＮ－ζ（ゼータ、リミチンとしても公知である）が含まれる。
インターフェロンは、これらの分子が、複数のレベルで作用する抗がん活性を有するので、様々ながんの処置における使用が見出されている。インターフェロンタンパク質は、ヒト腫瘍細胞の増殖を直接、阻害することができる。一部の場合、抗増殖性活性はまた、シスプラチン、５ＦＵおよびパクリタキセルなどの様々な承認されている化学療法剤と相乗性がある。インターフェロンタンパク質の免疫調節活性はまた、抗腫瘍免疫応答の誘発をもたらすことができる。この応答は、ＮＫ細胞の活性化、マクロファージ活性の刺激、およびＭＨＣクラスＩ表面発現の誘発を含み、抗腫瘍細胞傷害性Ｔリンパ球活性の誘発をもたらす。さらに、インターフェロンは、免疫系における抗原の交差提示においてある役割を果たす。さらに、一部の検討は、ＩＦＮ－βタンパク質は、抗血管新生活性を有することができることをさらに示す。新しい血管の形成である血管新生は、固形腫瘍の成長に重要である。ＩＦＮ－βは、ｂＦＧＦおよびＶＥＧＦなどの血管新生促進因子の発現を阻害することによって血管新生を阻害することができる。インターフェロンタンパク質はまた、組織リモデリングにおいて重要な、コラゲナーゼおよびエラスターゼなどの酵素の発現をモジュレートすることによって、腫瘍浸潤性を阻害することができる。
本方法の態様は、がんを有する被験体に、治療有効量のＥＮＰＰ１阻害剤を投与して、被験体のがんを処置するステップを含む。一部の例では、被験体は、がんと診断された、またはがんを有することが疑われるものである。任意の好都合なＥＮＰＰ１阻害剤が、がんを処置する対象方法に使用することができる。ある特定の場合、ＥＮＰＰ１阻害剤化合物は、本明細書に記載されている化合物である。ある特定の場合、ＥＮＰＰ１阻害剤は、細胞非透過性化合物である。ある特定の場合、ＥＮＰＰ１阻害剤は、細胞透過性化合物である。ある特定の場合、がんは、固形腫瘍がんである。ある特定の実施形態では、がんは、副腎、肝臓、腎臓、膀胱、乳房、結腸、胃、卵巣、子宮頸部、子宮、食道、結腸直腸、前立腺、膵臓、肺（小細胞と非小細胞の両方）、甲状腺、癌腫、肉腫、神経膠芽腫、黒色腫および様々な頭頸部腫瘍から選択される。一部の場合、がんは乳がんである。一部の実施形態では、がんはリンパ腫である。
本方法の態様は、被験体に、治療有効量の細胞非透過性ＥＮＰＰ１阻害剤を投与して、ｃＧＡＭＰの加水分解を阻害し、被験体のがんを処置するステップを含む。ある特定の場合、がんは、固形腫瘍がんである。ある特定の実施形態では、がんは、副腎、肝臓、腎臓、膀胱、乳房、結腸、胃、卵巣、子宮頸部、子宮、食道、結腸直腸、前立腺、膵臓、肺（小細胞と非小細胞の両方）、甲状腺、癌腫、肉腫、神経膠芽腫、黒色腫および様々な頭頸部腫瘍から選択される。ある特定の実施形態では、がんは乳がんである。一部の例では、がんはリンパ腫である。
本明細書において開示されている方法の一部の実施形態では、細胞非透過性ＥＮＰＰ１阻害剤は、式（Ｉ）～（ＸＶｂ）（例えば、本明細書に記載されている）のいずれか１つの阻害剤である。一部の場合、ＥＮＰＰ１阻害剤は、表１～３の化合物、またはそれらのプロドラッグ形態（例えば、本明細書に記載されている）である。
本明細書において開示されている方法の一部の実施形態では、ＥＮＰＰ１阻害剤は、細胞透過性である。
したがって、本方法の態様は、本化合物がＥＮＰＰ１を阻害する条件下で、試料に対象化合物（例えば、上記）を接触させるステップを含む。化合物に試料を接触させる任意の好都合なプロトコールを使用することができる。使用される特定のプロトコールは、例えば、試料がｉｎ ｖｉｔｒｏであるかｉｎ ｖｉｖｏであるかに応じて変わり得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏプロトコールの場合、試料への本化合物の接触は、任意の好都合なプロトコールを使用して実現することができる。一部の例では、試料は、好適な培養培地中で維持される細胞を含み、複合体が培養培地に導入される。ｉｎ ｖｉｖｏプロトコールの場合、任意の好都合な投与プロトコールが使用されてもよい。本化合物の効力、目的の細胞、投与方法、存在する細胞数に応じて、様々なプロトコールが使用されてもよい。
一部の実施形態では、対象方法は、被験体のがんを処置する方法である。一部の実施形態では、対象方法は、被験体に有効量の対象化合物（例えば、本明細書に記載されている）または薬学的に許容されるその塩を投与するステップを含む。対象化合物は、医薬組成物（例えば、本明細書に記載されている）の一部として投与されてもよい。本方法のある特定の例では、投与される化合物は、式（Ｉ）～（ＸＶｂ）（例えば、本明細書に記載されている）の１つの化合物である。本方法のある特定の例では、投与される化合物は、表１～３の化合物の１つによって記載される。
一部の実施形態では、「有効量」とは、個体に１つまたは複数の用量を単剤療法または併用療法で投与した場合、化合物による処置の非存在下での個体におけるＥＮＰＰ１活性に比べて、または代替として化合物による処置前もしくは処置後の個体におけるＥＮＰＰ１活性に比べて、約２０％（２０％阻害）、少なくとも約３０％（３０％阻害）、少なくとも約４０％（４０％阻害）、少なくとも約５０％（５０％阻害）、少なくとも約６０％（６０％阻害）、少なくとも約７０％（７０％阻害）、少なくとも約８０％（８０％阻害）、または少なくとも約９０％（９０％阻害）、ＥＮＰＰ１を阻害するのに有効な対象化合物の量のことである。
一部の実施形態では、「治療有効量」とは、個体に１つまたは複数の用量を単剤療法または併用療法で投与した場合、化合物による処置の非存在下での個体における腫瘍負荷に比べて、または代替として化合物による処置前もしくは処置後の被験体における腫瘍負荷に比べて、約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、被験体における腫瘍負荷を低下させるのに有効な対象化合物の量のことである。本明細書で使用される場合、用語「腫瘍負荷」は、がんを有する被験体が有する腫瘍組織の総質量を指す。
一部の実施形態では、「治療有効量」とは、個体に１つまたは複数の用量を単剤療法または併用療法で投与した場合、化合物による処置の非存在下で、個体における腫瘍縮小を観察するのに必要な放射線治療の用量に比べて、約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、被験体における腫瘍縮小を観察するのに必要な放射線治療の用量を低下させるのに有効な対象化合物の量のことである。
一部の実施形態では、化合物の「治療有効量」とは、がんを有する個体に１つまたは複数の用量で投与すると、１．５ｌｏｇ、２ｌｏｇ、２．５ｌｏｇ、３ｌｏｇ、３．５ｌｏｇ、４ｌｏｇ、４．５ｌｏｇまたは５ｌｏｇの腫瘍サイズの低下を実現するのに有効な量のことである。
一部の実施形態では、化合物の有効量は、約５０ｎｇ／ｍｌ～約５０μｇ／ｍｌ（例えば、約５０ｎｇ／ｍｌ～約４０μｇ／ｍｌ、約３０ｎｇ／ｍｌ～約２０μｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ～約１０μｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ～約１μｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ～約８００ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ～約７００ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ～約６００ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ～約５００ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ～約４００ｎｇ／ｍｌ、約６０ｎｇ／ｍｌ～約４００ｎｇ／ｍｌ、約７０ｎｇ／ｍｌ～約３００ｎｇ／ｍｌ、約６０ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌ、約６５ｎｇ／ｍｌ～約８５ｎｇ／ｍｌ、約７０ｎｇ／ｍｌ～約９０ｎｇ／ｍｌ、約２００ｎｇ／ｍｌ～約９００ｎｇ／ｍｌ、約２００ｎｇ／ｍｌ～約８００ｎｇ／ｍｌ、約２００ｎｇ／ｍｌ～約７００ｎｇ／ｍｌ、約２００ｎｇ／ｍｌ～約６００ｎｇ／ｍｌ、約２００ｎｇ／ｍｌ～約５００ｎｇ／ｍｌ、約２００ｎｇ／ｍｌ～約４００ｎｇ／ｍｌまたは約２００ｎｇ／ｍｌ～約３００ｎｇ／ｍｌ）の範囲となる量である。
一部の実施形態では、化合物の有効量は、約１０ｐｇ～約１００ｍｇ、例えば、約１０ｐｇ～約５０ｐｇ、約５０ｐｇ～約１５０ｐｇ、約１５０ｐｇ～約２５０ｐｇ、約２５０ｐｇ～約５００ｐｇ、約５００ｐｇ～約７５０ｐｇ、約７５０ｐｇ～約１ｎｇ、約１ｎｇ～約１０ｎｇ、約１０ｎｇ～約５０ｎｇ、約５０ｎｇ～約１５０ｎｇ、約１５０ｎｇ～約２５０ｎｇ、約２５０ｎｇ～約５００ｎｇ、約５００ｎｇ～約７５０ｎｇ、約７５０ｎｇ～約１μｇ、約１μｇ～約１０μｇ、約１０μｇ～約５０μｇ、約５０μｇ～約１５０μｇ、約１５０μｇ～約２５０μｇ、約２５０μｇ～約５００μｇ、約５００μｇ～約７５０μｇ、約７５０μｇ～約１ｍｇ、約１ｍｇ～約５０ｍｇ、約１ｍｇ～約１００ｍｇまたは約５０ｍｇ～約１００ｍｇの範囲となる量である。この量は、単回用量の量とすることができるか、または１日あたりの合計用量とすることができる。１日あたりの合計用量は、１０ｐｇ～１００ｍｇの範囲とすることができるか、または１００ｍｇ～約５００ｍｇの範囲とすることができるか、または５００ｍｇ～約１０００ｍｇの範囲とすることができる。
一部の実施形態では、化合物の単回用量が投与される。他の実施形態では、多回用量が投与される。本化合物は、多回用量がある期間にわたり投与される場合、ある期間にわたり、１日２回（ｑｉｄ）、毎日（ｑｄ）、１日おき（ｑｏｄ）、３日おき、１週間に３回（ｔｉｗ）または１週間に２回（ｂｉｗ）、投与され得る。例えば、化合物は、１日間～約２年間、またはそれより長い期間にわたり、ｑｉｄ、ｑｄ、ｑｏｄ、ｔｉｗまたはｂｉｗで投与される。例えば、化合物は、様々な因子に応じて、１週間、２週間、１か月、２か月、６か月、１年間または２年間、またはそれより長い間、上述の頻度のいずれかで投与される。
がんを有する個体に治療有効量の対象化合物を投与すると、以下：１）腫瘍負荷の低下、２）腫瘍縮小を行うのに必要な放射線治療の用量の低下、３）個体における１つの細胞から別の細胞へのがんの蔓延の低減、４）臨床的転帰における罹患率または致死率の低下、５）他の抗がん剤と組み合わせた場合に、処置の全期間の短縮、および６）疾患応答の指標の改善（例えば、がんの１つまたは複数の症状の低下）のうちの１つまたは複数をもたらすことができる。様々な方法のいずれも、処置法が有効であるかどうかを判定するために使用することができる。例えば、対象方法により処置された個体から得られた生体試料をアッセイすることができる。
明細書において記載されている化合物のいずれも、処置の対象方法に利用することができる。ある特定の例では、本化合物は、式（Ｉ）～（ＸＶｂ）（例えば、本明細書に記載されている）の１つである。ある特定の場合、本化合物は、表１～３の化合物の１つ、またはそのプロドラッグ形態である。一部の場合、対象方法に利用される化合物は、細胞浸透性ではない。一部の場合、対象方法に利用される化合物は、細胞浸透性に乏しい。
一部の実施形態では、本化合物はＥＮＰＰ１を特異的に阻害する。一部の実施形態では、本化合物は、ｃＧＡＭＰの活性をモジュレートする。一部の実施形態では、本化合物は、ＥＮＰＰ１とｃＧＡＭＰとの相互作用を妨害する。一部の実施形態では、本化合物は、ＳＴＩＮＧ経路の活性化をもたらす。
一部の実施形態では、被験体は哺乳動物である。ある特定の例では、被験体はヒトである。他の被験体は、家庭用ペット（例えば、イヌおよびネコ）、家禽（例えば、ウシ、ブタ、ヤギ、ウマなど）、げっ歯類（例えば、疾患の動物モデルにおけるような、例えば、マウス、モルモットおよびラット）、および非ヒト霊長類（例えば、チンパンジーおよびサル）を含むことができる。被験体は、がんの処置を必要とすることがある。一部の例では、対象方法は、本明細書に記載されているがんのいずれか１つを含む、がんを診断するステップを含む。一部の実施形態では、本化合物は、医薬調製物として投与される。
ある特定の実施形態では、ＥＮＰＰ１阻害剤化合物は、標識を含む修飾化合物であり、本方法は、被験体における標識を検出するステップをさらに含む。標識の選択は、検出手段に依る。任意の好都合な標識化および検出システムを対象方法に使用することができる。例えば、Baker, ”The whole picture,” Nature, 463, 2010, p977-980を参照されたい。ある特定の実施形態では、本化合物は、光学的検出に好適な蛍光標識を含む。ある特定の実施形態では、本化合物は、ポジトロン放出断層法（ＰＥＴ）または単一光子放射断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）を使用する検出のための放射標識を含む。一部の場合、本化合物は、トモグラフィー検出に好適な常磁性標識を含む。対象化合物は、上記の通り標識化されていてもよいが、一部の方法では、本化合物は、標識されておらず、二次標識剤をイメージングに使用する。
併用療法
対象化合物は、被験体に単独でまたは追加の、すなわち第２の活性剤と組み合わせて投与され得る。対象であるＥＮＰＰ１阻害剤化合物が第２の活性剤、または追加治療法、例えば放射線療法と組み合わせて使用され得る併用治療方法。用語「薬剤」、「化合物」および「薬物」は、本明細書において互換的に使用される。例えば、ＥＮＰＰ１阻害剤化合物は、単独で、または以下に限定されないが、免疫調節性疾患および状態、ならびにがんを含めた、目的の疾患の処置に使用される薬物などの１つもしくは複数の他の薬物と連携して投与され得る。一部の実施形態では、対象方法は、第２の薬剤、例えば低分子、化学療法剤、抗体、抗体断片、抗体－薬物コンジュゲート、アプタマー、タンパク質またはチェックポイント阻害剤を同時に、または順番に同時投与するステップをさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、被験体に放射線療法を行うステップをさらに含む。
用語「共投与」および「と組み合わせて」とは、具体的な時間限定なしに、２種またはそれより多い治療剤の同時、一斉または逐次投与のいずれかを含む。一実施形態では、薬剤は細胞または被験体の身体に同時に存在するか、または同時にその生物学的効果もしくは治療効果を発揮する。一実施形態では、治療剤は、同じ組成物または単位剤形に存在する。他の実施形態では、治療剤は、個別の組成物または単位剤形に存在する。ある特定の実施形態では、第１の薬剤は、第２の治療剤の投与前（例えば、分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間または１２週間前）に、第２の治療剤と同時にまたはその後（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間または１２週間後）に投与することができる。
本開示の医薬組成物との公知の治療薬または追加治療法の「同時投与」は、本化合物および第２の薬剤または追加治療法を、公知薬物および本発明の組成物の両方が治療効果を有するような時間に投与することを意味する。このような同時投与は、対象化合物の投与に関して、薬物の同時（すなわち、同じ時間に）投与、事前投与または後続投与を含むことができる。２種の薬剤の投与経路は、様々となり得、この場合、代表的な投与経路は、以下に一層詳細に記載されている。当業者が、特定の薬物または治療法、および本開示の化合物にとっての投与の適切な時機、順序および投与量を決定することは困難ではない。
一部の実施形態では、本化合物（例えば、対象化合物および少なくとも１つの追加化合物または治療法）は、互いに１２時間以内、互いに６時間以内、互いに３時間以内、または互いに１時間以内などの互いに２４時間以内に被験体に投与される。ある特定の実施形態では、本化合物は、互いに１時間以内に投与される。ある特定の実施形態では、本化合物は、実質的に同時に投与される。実質的に同時に投与されるとは、本化合物が、互いに５分間もしくはそれ未満、または１分間もしくはそれ未満などの、互いに約１０分間またはそれ未満以内に被験体に投与されることが意図される。
同様に、対象化合物および第２の活性剤の医薬調製物が提供される。医薬剤形では、本化合物は、その薬学的に許容される塩の形態で投与されてもよく、またはそれらは、単独でもしくは適切に連携させて、および他の薬学的活性化合物と組み合わせて使用されてもよい。
対象方法のいずれかに連携して、本ＥＮＰＰ１阻害剤化合物（例えば、本明細書に記載されている）（または、このような化合物を含む医薬組成物）は、感染症を軽減または予防するよう、慢性炎症または線維症を処置または予防するよう、あるいはがんを処置するよう設計されている別の薬物と組み合わせて投与することができる。各場合において、本ＥＮＰＰ１阻害剤化合物は、他の薬物の投与前に、それと同時に、またはその後に投与され得る。ある特定の場合、がんは、副腎、肝臓、腎臓、膀胱、乳房、結腸、胃、卵巣、子宮頸部、子宮、食道、結腸直腸、前立腺、膵臓、肺（小細胞と非小細胞の両方）、甲状腺、癌腫、肉腫、神経膠腫、神経膠芽腫、黒色腫および様々な頭頸部腫瘍から選択される。
がんの処置に関すると、本ＥＮＰＰ１阻害剤化合物は、アルキル化剤、ニトロソ尿素、代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生物質、植物（ビンカ）アルカロイド、ステロイドホルモン、タキサン、ヌクレオシドアナログ、ステロイド、アントラサイクリン、甲状腺ホルモン置き換え薬物、チミジレート標的薬物、キメラ抗原受容体／Ｔ細胞治療法、キメラ抗原受容体／ＮＫ細胞治療法、アポトーシス調節因子阻害剤（例えば、Ｂ細胞ＣＬＬ／リンパ腫２（ＢＣＬ－２）ＢＣＬ－２様１（ＢＣＬ－ＸＬ）阻害剤）、ＣＡＲＰ－１／ＣＣＡＲ１（細胞分裂周期およびアポトーシス調節因子１）阻害剤、コロニー刺激因子１受容体（ＣＳＦ１Ｒ）阻害剤、ＣＤ４７阻害剤、がんワクチン（例えば、Ｔｈ１７誘導性樹状細胞ワクチンまたは遺伝子改変されたチロシナーゼ（Ｏｎｃｅｐｔ（登録商標）など））および他の細胞治療法からなる群から選択される化学療法剤と組み合わせて投与され得る。
目的の具体的な化学療法剤には、以下に限定されないが、ゲムシタビン、ドセタキセル、ブレオマイシン、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、イマチニブ、ダサチニブ、ニロチニブ、ボスチニブ、クリゾチニブ、セリチニブ、トラメチニブ、ベバシズマブ、スニチニブ、ソラフェニブ、トラスツズマブ、アド－トラスツズマブエムタンシン、リツキシマブ、イピリムマブ、ラパマイシン、テムシロリムス、エベロリムス、メトトレキセート、ドキソルビシン、アブラキサン、フォルフィリノックス、シスプラチン、カルボプラチン、５－フルオロウラシル、テイスモ（Ｔｅｙｓｕｍｏ）、パクリタキセル、プレドニゾン、レボチロキシン、ペメトレキセド、ナビトクラックスおよびＡＢＴ－１９９が含まれる。ペプチド化合物もまた使用され得る。目的のがん化学治療剤には、以下に限定されないが、ドラスタチンならびにそれらの活性アナログおよび誘導体；ならびにオーリスタチンならびにそれらの活性アナログおよび誘導体（例えば、モノメチルオーリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）など）が含まれる。例えば、ＷＯ９６／３３２１２、ＷＯ９６／１４８５６およびＵ．Ｓ．６，３２３，３１５を参照されたい。好適ながん化学療法剤はまた、メイタンシノイドならびにそれらの活性アナログおよび誘導体（例えば、ＥＰ１３９１２１３；およびLiu et al (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623を参照されたい）；デュオカルマイシンならびにそれらの活性アナログおよび誘導体（例えば、合成アナログ、ＫＷ－２１８９およびＣＢ １－ＴＭ１を含む）；ならびにベンゾジアゼピンならびにそれらの活性アナログおよび誘導体（例えば、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ））を含む。
一部の実施形態では、本ＥＮＰＰ１阻害剤化合物は、がんを処置するための化学療法剤と組み合わせて投与され得る。ある特定の場合、化学療法剤はゲムシタビンである。一部の場合、化学療法剤はドセタキセルである。一部の場合、化学療法剤はアブラキサンである。
がん（例えば、固形腫瘍がん）の処置に関すると、本ＥＮＰＰ１阻害剤化合物は、免疫治療剤と組み合わせて投与することができる。免疫治療剤は、免疫応答を誘発する、増強するまたは抑制することによって疾患の処置に使用することが見出されている任意の好都合な薬剤である。一部の場合、免疫治療剤は、免疫チェックポイント阻害剤である。例えば、図２１Ａ～４Ｃは、マウスモデルにおいて、例示的なＥＮＰＰ１阻害剤が免疫チェックポイント阻害剤と相乗的に作用することができることを例示している。以下に限定されないが、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ－４）阻害剤、プログラム死１（ＰＤ－１）阻害剤およびＰＤ－Ｌ１阻害剤を含めた、任意の好都合なチェックポイント阻害剤を利用することができる。ある特定の例では、チェックポイント阻害剤は、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ－４）阻害剤、プログラム死１（ＰＤ－１）阻害剤およびＰＤ－Ｌ１阻害剤から選択される。目的の例示的なチェックポイント阻害剤には、以下に限定されないが、イピリムマブ、ペムブロリズマブおよびニボルマブが含まれる。ある特定の実施形態では、がんおよび／または炎症性疾患を処置する場合、免疫調節性ポリペプチド（単数または複数）は、コロニー刺激因子１受容体（ＣＳＦ１Ｒ）阻害剤と組み合わせて投与することができる。目的のＣＳＦ１Ｒ阻害剤には、以下に限定されないが、エマクツズマブが含まれる。
任意の好都合ながんワクチン治療法および薬剤が、対象とするＥＮＰＰ１阻害剤化合物、組成物および方法と組み合わせて使用することができる。がん、例えば卵巣がんの処置の場合、本ＥＮＰＰ１阻害剤化合物は、ワクチン接種治療法、例えばＴｈ１／Ｔｈ１７免疫を促進する樹状細胞（ＤＣ）ワクチン接種剤と組み合わせて投与することができる。Ｔｈ１７細胞浸潤は、卵巣がん患者の中で全生存期間の顕著な延びと関連している。一部の場合、本ＥＮＰＰ１阻害剤化合物は、Ｔｈ１７誘導ワクチン接種と組み合わせたアジュバント療法としての使用が見出されている。
同様に、以下に限定されないが、Rishi et al., Journal of Biomedical Nanotechnology, Volume 11, Number 9, September 2015, pp. 1608-1627(20)により記載されているものを含むＣＡＲＰ－１／ＣＣＡＲ１（細胞分裂周期およびアポトーシス調節因子１）阻害剤、および以下に限定されないが、Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４などの抗ＣＤ４７抗体剤を含めたＣＤ４７阻害剤である、薬剤が興味深い。
ある特定の例では、組合せ物は、いずれかの構成成分単独に比べると、効果の増強をもたらす。一部の場合、組合せ物は、構成成分の組合せ効果または相加効果に比べると、相加以上の効果または相乗効果を実現する。対象化合物および化学療法剤の様々な組合せ物が使用されてもよく、逐次にまたは同時にのどちらか一方で使用される。多回投与量の場合、例えば、２種の薬剤を、直接、順に交互にしてもよく、または１つの薬剤の２回もしくはそれより多い用量を単回用量の他の薬剤と順に交互にしてもよい。両方の薬剤の同時投与もまた、順に交互にしてもよく、または他の方法で、個々の薬剤の投与量を分散してもよい。一部の場合、投与量同士の間の時間は、処置の開始後、約１～６時間から、約６～１２時間まで、約１２～２４時間まで、約１～２日間まで、約１～２週間まで、またはそれより長い期間までとすることができる。
ｃＧＡＭＰ誘導化学療法剤との組合せ
本開示の態様は、がんを処置する方法であって、本ＥＮＰＰ１阻害剤化合物（または、このような化合物を含む医薬組成物）を、ｃＧＡＭＰの生成をｉｎ ｖｉｖｏで誘導することが可能な化学療法剤と組み合わせて投与することができる、方法を含む。被験体を有効量の特定の化学療法剤に曝露させると、被験体において、２’３’－ｃＧＡＭＰの生成が誘導され得る。対象であるＥＮＰＰ１阻害剤化合物が共投与されて、ｃＧＡＭＰの分解を防止すると、ｃＧＡＭＰの誘導されるレベルが維持および／または増強され得、例えば、どちらか一方の薬剤を単独で用いて実現されるレベルと比較すると増強され得る。圧倒的な修復機構または分解機構による細胞の死滅によって、アルキル化剤、核酸アナログおよび挿入剤などの、ＤＮＡ損傷をもたらすことができ、ｃＧＡＭＰ生成を誘導することができる任意の好都合な化学療法剤を、対象併用治療法に使用することができる。一部の場合、ｃＧＡＭＰ誘導化学療法剤は、抗有糸分裂剤である。抗有糸分裂剤は、ＤＮＡを損傷することによって、または微小管に結合することによって作用する薬剤である。一部の場合、ｃＧＡＭＰ誘導化学療法剤は、抗腫瘍剤である。
対象とする併用療法を使用して処置され得る目的のがんは、以下に限定されないが、副腎、肝臓、腎臓、膀胱、乳房、結腸、胃、卵巣、子宮頸部、子宮、食道、結腸直腸、前立腺、膵臓、肺（小細胞と非小細胞の両方）、甲状腺、癌腫、肉腫、神経膠腫、神経膠芽腫、黒色腫および様々な頭頸部腫瘍を含む。一部の場合、がんは乳がんである。ある特定の例では、がんは神経膠腫または神経膠芽腫である。
目的の化学療法剤には、以下に限定されないが、ウラシルアナログ、フルオロウラシルプロドラッグ、チミジル酸シンターゼ阻害剤、デオキシシチジンアナログ、ＤＮＡ合成阻害剤（例えば、Ｓ期アポトーシスをもたらす）、葉酸アナログ、デヒドロフォレートレダクターゼ阻害剤、アントラサイクリン、挿入剤（例えば、二本鎖の破壊をもたらす）、トポイソメラーゼＩＩａ阻害剤、タキサン、微小管分解阻害剤（例えば、Ｇ２／Ｍ期停止／アポトーシスをもたらす）、微小管集合阻害剤、微小管機能安定化剤（例えば、Ｇ２／Ｍ期アポトーシスをもたらす）、チューブリン重合促進剤、チューブリン結合剤（例えば、Ｍ期停止によるアポトーシスをもたらす）、エポチロンＢアナログ、ビンカアルカロイド、ナイトロジェンマスタード、ニトロソ尿素、ＤＮＡアルキル化剤（例えば、鎖間架橋、ｐ５３によるアポトーシスをもたらす）、ＶＥＧＦ阻害剤、抗血管新生抗体、ＨＥＲ２阻害剤、キナゾリンＨＥＲ２阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、シロリムスアナログ、ｍＴＯＲＣ１阻害剤（例えば、乳がんにおいて、エキセメスタン＝エストロゲン生成を阻害するアロマターゼ（Aromastase）阻害剤との組合せ物）、トリアゼン、ダカルバジンプロドラッグ、メチルヒドラジンが含まれる。
例示的な目的の乳がん化学治療剤には、以下に限定されないが、カペシタビン、カルモフール、フルオロウラシル、テガフール、ゲムシタビン、メトトレキセート、ドキソルビシン、エピルビシン、ドセタキセル、イキサベピロン、ビンデシン、ビノレルビン、シクロホスファミド、ベバシクマブ（Bevacicumab）、ペルツズマブ、トラスツズマブ、ラパチニブおよびエベロリムスが含まれる。例示的な神経膠腫／神経膠芽腫に関連する抗新生物薬物には、以下に限定されないが、カルムスチン、ロムスチン、テモゾロミド、プロカルバジン、ビンクリスチンおよびベバシクマブが含まれる。例示的な目的のＤＮＡ損傷化学療法剤には、以下に限定されないが、メルファラン、シスプラチンおよびエトポシド、フルオロウラシル、ゲムシタビンが含まれる。
併用放射線療法
代替的に、がんを処置する方法の場合、本ＥＮＰＰ１阻害剤化合物（または、このような化合物を含む医薬組成物）は、放射線療法と組み合わせて投与することができる。ある特定の実施形態では、本方法は、被験体に放射線療法を行うステップを含む。やはり、本ＥＮＰＰ１阻害剤化合物は、放射線療法の実施前またはその後に投与され得る。したがって、対象方法は、被験体に放射線療法を投与するステップをさらに含むことができる。放射線療法と対象化合物の投与とを組み合わせると、相乗的治療効果を実現することができる。被験体が、放射線療法（ＲＴ）の間に、好適な投与量および／または頻度の放射線照射に曝露されると、被験体において、２’３’－ｃＧＡＭＰの生成が誘導され得る。対象となるＥＮＰＰ１阻害剤化合物が共投与されて、ｃＧＡＭＰの分解を防止すると、ｃＧＡＭＰのこのようなレベルの誘導が維持および／または増強され得、例えば、ＲＴを単独で用いて実現されるレベルと比べて増強され得る。例えば、図２１Ａは、マウスモデルにおいて、例示的なＥＮＰＰ１阻害剤が、放射線療法（ＲＴ）と相乗的に作用して腫瘍負荷を低下させることができることを例示している。したがって、対象方法の態様は、放射線照射処置単独の治療的に有効な投与量および／または頻度／レジメンに比べると、放射線照射処置の投与量および／または頻度／レジメンの減少した投与を含む。一部の場合、放射線療法は、被験体に放射線損傷のリスク、例えば放射線照射処置単独の治療的に有効な投与量および／または頻度／レジメンのもとで起こることが予期される放射線損傷を軽減するのに有効な投与量および／または頻度で、対象化合物と組み合わせて投与される。
一部の場合、本方法は、放射線療法の前に被験体にＥＮＰＰ１阻害剤を投与するステップを含む。一部の場合、本方法は、放射線療法に被験体を曝露した後に、被験体にＥＮＰＰ１阻害剤を投与するステップを含む。ある特定の場合、本方法は、それを必要とする被験体に放射線療法、次いで、ＥＮＰＰ１阻害剤、次いでチェックポイント阻害剤を逐次投与することを含む。
有用性
例えば、本明細書に記載されている本発明の化合物および方法は、様々な用途における使用が見出されている。目的の用途には、以下に限定されないが、研究用途および治療用途が含まれる。本発明の方法は、ＥＮＰＰ１の阻害が望ましい、任意の好都合な用途を含めた、様々な異なる用途における使用が見出される。
対象化合物および方法は、様々な研究用途における使用が見出されている。対象化合物および方法は、化合物の生体利用率および代謝安定性の最適化に使用することができる。
対象化合物および方法は、様々な治療用途における使用が見出されている。目的の治療用途は、がん処置における用途を含む。したがって、対象化合物は、宿主におけるがんの阻害および／または処置が望ましい、様々な異なる状態の処置における使用が見出されている。例えば、対象化合物および方法は、固形腫瘍がん（例えば、本明細書に記載されている）の処置における使用が見出され得る。
医薬組成物
本明細書において議論されている化合物は、任意の好都合な賦形剤、試薬および方法を使用して製剤化することができる。組成物は、薬学的に許容される賦形剤（単数または複数）を含む製剤で提供される。幅広い様々な薬学的に許容される賦形剤が当分野で公知であり、本明細書において詳細に議論される必要はない。薬学的に許容される賦形剤は、例えば、A. Gennaro (2000) ”Remington: The Science and Practice of Pharmacy,” 20th edition, Lippincott, Williams, & Wilkins; Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (1999) H.C. Ansel et al., eds., 7th ed., Lippincott, Williams, & Wilkins;およびHandbook of Pharmaceutical Excipients (2000) A.H. Kibbe et al., eds., 3rd ed. Amer. Pharmaceutical Assocを含む、様々な出版物に十分に記載されている。
ビヒクル、アジュバント、担体または希釈剤などの薬学的に許容される賦形剤が、公的に容易に入手可能である。さらに、ｐＨ調整剤および緩衝化剤、等張化剤、安定剤、湿潤剤などの薬学的に許容される補助物質が、公的に容易に入手可能である。
一部の実施形態では、対象化合物は、水性緩衝液中で製剤化される。好適な水性緩衝液には、以下に限定されないが、強度が５ｍＭ～１００ｍＭで変わる、酢酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩およびリン酸塩の緩衝液が含まれる。一部の実施形態では、水性緩衝液は、等張性溶液をもたらす試薬を含む。このような試薬には、以下に限定されないが、塩化ナトリウム；および糖、例えば、マンニトール、デキストロース、スクロースなどが含まれる。一部の実施形態では、水性緩衝液は、ポリソルベート２０または８０などの非イオン性界面活性剤をさらに含む。必要に応じて、製剤は、保存剤をさらに含んでもよい。好適な保存剤には、以下に限定されないが、ベンジルアルコール、フェノール、クロロブタノール、塩化ベンザルコニウムなどが含まれる。多くの場合では、製剤は、約４℃で保管される。製剤はまた凍結乾燥されていてもよく、この場合、それらの製剤は、一般に、スクロース、トレハロース、ラクトース、マルトース、マンニトールなどの凍結保護物質を含む。凍結乾燥製剤は、周囲温度でさえも、長期間にわたり保管することができる。一部の実施形態では、対象化合物は、持続放出向けに製剤化される。
一部の実施形態では、対象化合物および第２の活性剤（例えば、本明細書に記載されている）、例えば、低分子、化学療法剤、抗体、抗体断片、抗体－薬物コンジュゲート、アプタマーまたはタンパク質などが、薬学的に許容される賦形剤（単数または複数）を含む製剤中（例えば、同一製剤または個別の製剤）で個体に投与される。一部の実施形態では、第２の活性剤は、チェックポイント阻害剤、例えば細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ－４）阻害剤、プログラム死１（ＰＤ－１）阻害剤またはＰＤ－Ｌ１阻害剤である。
本発明の別の態様では、本発明の化合物、または薬学的に許容されるその塩、異性体、互変異性体もしくはプロドラッグを含むまたはこれらから本質的になる、医薬組成物であって、１つまたは複数の追加の目的の活性剤をさらに含む、医薬組成物が提供される。任意の好都合な活性剤は、対象化合物と連携して、対象方法に利用することができる。一部の例では、追加剤は、チェックポイント阻害剤である。併用療法のための、対象化合物およびチェックポイント阻害剤、ならびに本明細書に記載されている追加的な治療剤は、経口、皮下、筋肉内、経鼻、非経口または他の経路により投与され得る。対象化合物および第２の活性剤（存在する場合）は、同一投与経路によって、または異なる投与経路によって投与されてもよい。治療剤は、以下に限定されないが、例えば、経口、直腸、鼻腔、局所（経皮、エアゾール、口内および舌下を含む）、膣、非経口（皮下、筋肉内、静脈内および皮内を含む）、膀胱内、または罹患臓器への注射を含めた、任意の好適な手段により投与することができる。ある特定の場合、治療剤は経鼻により投与することができる。一部の場合、治療剤は、腫瘍内投与することができる。
一部の実施形態では、対象化合物および化学療法剤は、薬学的に許容される賦形剤（単数または複数）を含む製剤（例えば、同一製剤または個別の製剤）で個体に投与される。化学療法剤には、以下に限定されないが、アルキル化剤、ニトロソ尿素、代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生物質、植物（ビンカ）アルカロイドおよびステロイドホルモンが含まれる。ペプチド化合物もまた使用され得る。好適ながん化学療法剤には、ドラスタチンならびにそれらの活性アナログおよび誘導体；ならびにオーリスタチンならびにそれらの活性アナログおよび誘導体（例えば、モノメチルオーリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）など）が含まれる。例えば、ＷＯ９６／３３２１２、ＷＯ９６／１４８５６およびＵ．Ｓ．６，３２３，３１５を参照されたい。好適ながん化学療法剤はまた、メイタンシノイドならびにそれらの活性アナログおよび誘導体（例えば、ＥＰ１３９１２１３；およびLiu et al (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623を参照されたい）；デュオカルマイシンならびにそれらの活性アナログおよび誘導体（例えば、合成アナログ、ＫＷ－２１８９およびＣＢ １－ＴＭ１を含む）；ならびにベンゾジアゼピンならびにそれらの活性アナログおよび誘導体（例えば、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ））を含む。
併用療法のための、対象化合物および第２の化学療法剤、ならびに本明細書に記載されている追加治療剤は、経口、皮下、筋肉内、非経口または他の経路により投与され得る。対象化合物および第２の化学療法剤は、同一投与経路によって、または異なる投与経路によって投与されてもよい。治療剤は、以下に限定されないが、例えば、経口、直腸、鼻腔、局所（経皮、エアゾール、口内および舌下を含む）、膣、非経口（皮下、筋肉内、静脈内および皮内を含む）、膀胱内、または罹患臓器への注射を含めた、任意の好適な手段により投与することができる。
対象化合物は、単位剤形で提供されてもよく、当分野で周知の任意の方法によって調製されてもよい。このような方法は、対象化合物と１つまたは複数の副成分を構成する薬学的に許容される担体または希釈剤とを組み合わせることを含む。薬学的に許容される担体は、選択された投与経路および標準医薬実務に基づいて選択される。担体はそれぞれ、製剤の他の成分と適合性がある、および被験体に有害でないという意味において、「薬学的に許容される」ものでなければならない。この担体は、固体または液体とすることができ、そのタイプは、使用される投与のタイプに基づいて一般に選択される。
好適な固体担体の例には、ラクトース、スクロース、ゼラチン、寒天およびバルク粉末が含まれる。好適な液体担体の例には、水、薬学的に許容される脂肪および油、アルコール、またはエステルを含めた他の有機溶媒、エマルション剤、シロップ剤もしくはエリキシル剤、懸濁液剤、溶液剤および／または懸濁液剤、ならびに非起泡性顆粒剤から再構成した溶液剤およびまたは懸濁液剤、ならびに起泡性顆粒剤から再構成した起泡性調製物が含まれる。このような液体担体は、例えば、好適な溶媒、保存剤、乳化剤、懸濁化剤、希釈剤、甘味剤、増粘剤および融解剤を含有することができる。好ましい担体は、食用油、例えばコーン油またはキャノーラ油である。ポリエチレングリコール、例えばＰＥＧもまた良好な担体である。
本開示の投与レジメンを実現する任意の薬物送達デバイスまたはシステムが使用され得る。幅広い送達デバイスおよびシステムが、当業者に公知である。
以下の実施例は、本開示の実施形態を行い使用する方法の完全な開示および説明を当業者に提供するように提示されており、発明者がその発明として見なすものの範囲を限定することを意図するものでもなく、以下の実験が実施された実験のすべてまたは唯一であることを示すことを意図するものでもない。使用される数字（例えば量、温度など）に関する正確性を確保する努力を行ってきたが、ある程度の実験誤差および偏差を考慮すべきである。特に示さない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏の度であり、圧力は、大気圧または大気圧付近である。
本発明は、その特定の実施形態を参照して記載されているが、本発明の真の趣旨および範囲から逸脱することなく、様々な変更がなされてもよいこと、および等価物が置き換えられてもよいことが当業者によって理解されるべきである。さらに、本開示の目的、趣旨および範囲に対して、特定の状況、物質、物質の組成、プロセス、プロセス工程（単数または複数）を適応させる多数の修正が行われてもよい。このような修正はすべて、添付されている特許請求の範囲内にあることが意図されている。
（実施例１）
化合物の合成
化合物は、任意の好都合な方法を使用して合成されてよい。本開示の化合物を調製する際に使用するために適応され得る方法は、実施例１ａ～１ｃに記載されている例示的な合成法、およびその開示の全体が参照により本明細書に組み込まれている、２０１８年９月７日出願のＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５００１８においてＬｉらによって記載されている方法を含む。開示化合物を合成するために有用な一般的に公知の化学的合成スキームおよび条件を提示する多数の一般的な参考文献もまた入手可能である（例えば、Smith and March, March’s Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, Fifth Edition, Wiley-Interscience, 2001; or Vogel, A Textbook of Practical Organic Chemistry, Including Qualitative Organic Analysis, Fourth Edition, New York: Longman, 1978を参照されたい）。反応は、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、ＬＣ／ＭＳによってモニタリングすることができ、反応生成物は、ＬＣ／ＭＳおよび１Ｈ ＮＭＲによって特徴付けられ得る。中間体および最終生成物は、シリカゲルクロマトグラフィーによって、またはＨＰＬＣによって精製することができる。
（実施例１ａ）
例示的な合成スキーム 化合物１
この開示の化合物の調製に使用するのに適合し得る化合物１の合成を以下に説明する；
Figure 2022523105000063
ジメチル（２－（ピペリジン－４－イル）エチル）ホスホネートの調製
Figure 2022523105000064
トルエン（１００ｍＬ）中のビス（ジメトキシホスホリル）メタン（１１．４２ｇ、４９．１９ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、室温で水素化ナトリウム（２．１６ｇ、５４．１１ｍｍｏｌ）を注意深く加えた。次に、この反応混合物を窒素雰囲気下に置き、温度を４０℃未満に維持しながら、１－ベンジルピペリジン－４－カルバルデヒド（１０ｇ、４９．１９ｍｍｏｌ）のトルエン（５０ｍＬ）溶液をゆっくりと加えた。得られた混合物を室温で１６時間、撹拌し、次に、飽和塩化アンモニウム水溶液を添加することによってクエンチした。有機相を分離し、ブラインにより洗浄して乾燥（ＭｇＳＯ４）し、蒸発乾固した。クロマトグラフィー（１２０ｇ ＳｉＯ２；ヘキサン中の５～１００％のＥｔＯＡｃのグラジエント）により、ジメチル（Ｅ）－（２－（１－ベンジルピペリジン－４－イル）ビニル）ホスホネート（６．２ｇ、１６％）が無色油状物として得られた。
エタノール（４０ｍＬ）中のジメチル（Ｅ）－（２－（１－ベンジルピペリジン－４－イル）ビニル）ホスホネート（３．７ｇ、１２．０ｍｍｏｌ）の混合物にＰｄ／Ｃ（１．１ｇ、１０．３ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を水素雰囲気下に置き、室温で１２時間、撹拌してろ過し、減圧下で蒸発乾固すると、ジメチル（２－（ピペリジン－４イル）エチル）ホスホネート（２．７ｇ、１００％）が無色油状物として得られた。
ジメチル（２－（１－（６，７－ジメトキシキナゾリン－４－イル）ピペリジン－４－イル）エチル）ホスホネートの調製
Figure 2022523105000065
イソプロピルアルコール（２０ｍＬ）中のジメチル（２－（ピペリジン－４－イル）エチル）ホスホネート（１．１ｇ、４．９ｍｍｏｌ）および４－クロロ－６，７－ジメトキシキナゾリン（１．０ｇ、４．５ｍｍｏｌ）の混合物に、ジイソプロピルエチルアミン（０．６ｇ、８．９ｍｍｏｌ）を加えた。９０℃で３時間、撹拌した後、この反応混合物を冷却して、蒸発乾固させた。シリカゲル（ジクロロメタン中の５％ＭｅＯＨ）の精製により、ジメチル（２－（１－（６，７－ジメトキシキナゾリン－４－イル）ピペリジン－４－イル）エチル）ホスホネート（７５５ｍｇ、３７％）が油状物として得られた。
ＬＣ－ＭＳ：ｍ／ｚ＝４１０．２５［Ｍ＋Ｈ］＋
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.65 (s, 1H), 7.23 (s, 1H), 7.09 (s, 1H), 4.19 (dq, J = 14.0,2.9, 2.4 Hz, 2H), 4.02 (s, 3H), 3.99 (s, 3H), 3.77 (s, 3H), 3.75 (s, 3H), 3.05 (td, J = 12.8,2.3 Hz, 2H), 1.93 - 1.77 (m, 4H), 1.67 (ddd, J = 14.1, 9.5, 5.9 Hz, 3H), 1.46 (qd, J =12.2, 3.7 Hz, 2H).
ジメチル（２－（１－（６，７－ジメトキシキナゾリン－４－イル）ピペリジン－４イル）エチル）ホスホン酸（化合物１）の調製
Figure 2022523105000066
氷浴によって冷却した、クロロホルム（６０ｍＬ）中のジメチル（２－（１－（６，７－ジメトキシキナゾリン－４－イル）ピペリジン－４－イル）エチル）ホスホネート（３．２５ｇ、７．９４ｍｍｏｌ）の冷却溶液にブロモトリメチルシラン（３．６７ｇ、２４ｍｍｏｌ）を加えた。この反応混合物を室温まで温め、９０分後にメタノール（２０ｍＬ）を添加することによってクエンチした。この混合物を減圧下で蒸発乾固し、次に、メタノール（１００ｍＬ）中で溶媒和させた。この反応混合物を濃縮して体積を半分にし、ろ過して沈殿物を除去し、次に蒸発乾固した。この残留物をジクロロメタンにより結晶化し、ろ過して真空下で乾燥すると、ジメチル（２－（１－（６，７－ジメトキシキナゾリン－４－イル）ピペリジン－４－イル）エチル）ホスホン酸（２．１ｇ、６９％）が得られた。
ＬＣ－ＭＳ：ｍ／ｚ＝３８１．８［Ｍ＋Ｈ］＋
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.77 (s, 1H), 7.34 (s, 1H), 7.23 (s, 1H), 4.71 (d, J =13.1 Hz, 2H), 3.99 (s, 3H), 3.97 (s, 3H), 3.48 (t, J = 12.7 Hz, 2H), 3.18 (s, 1H), 1.97-1.90 (m, 2H), 1.62-1.43 (m, 4H), 1.40-1.27 (m, 2H).
（実施例１ｂ）
化合物５（表１）の合成
以下に説明されている合成スキームを使用して化合物５を調製する：
Figure 2022523105000067
（実施例１ｃ）
化合物６（表１）の合成
以下に説明されている合成スキームを使用して化合物６を調製する：
Figure 2022523105000068
化学合成：特に明記しない限り、周囲雰囲気下で反応を行った。定性的ＴＬＣ分析は、２５０ｍｍの厚さ、６０Å、ガラス背面、Ｆ２５４シリカ（Ｓｉｌｉｃｙｃｌｅ、Ｑｕｅｂｅｃ Ｃｉｔｙ、Ｃａｎａｄａ）で行った。可視化は、ＵＶ光およびｐ－アニスアルデヒドまたはＫＭｎＯ４染色溶液への曝露と、その後に加熱することによって行った。使用した溶媒はすべて、ＡＣＳグレードのＳｕｒｅ－Ｓｅａｌ品であり、他の試薬はすべて、特に明記しない限り、入手したまま使用した。市販されていない４－クロロキナゾリンおよび４－クロロ３－キノンリンニトリル（4-chloro3-quinonline nitrile）の合成は、アミン構築ブロックと一緒に補足情報に記載されている。フラッシュクロマトグラフィーを、シリカゲルフラッシュカートリッジ（ＳｉｌｉＣｙｃｌｅ（登録商標）、ＳｉｌｉａＳｅｐ（商標）４０～６３μｍ、６０Å）を使用するＴｅｌｅｄｙｎｅ Ｉｓｃｏ精製システムで行った。ＨＰＬＣは、Ａｇｉｌｅｎｔ ＰｒｅｐＨＴ Ｚｏｒｂａｘ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ－Ｃ１８逆相カラム（２１．２×２５０ｍｍ）を使用する、Ａｇｉｌｅｎｔ１２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ分取スケール精製システムで行った。構造決定は、Ｂｒｕｋｅｒ ＡＶ－５００分光計で記録した１Ｈスペクトル、およびＳｈｉｍａｄｚｕ２０－２０ ＥＳＩ ＬＣＭＳ機器で採集した低分解能質量スペクトル（ＥＳＩ－ＭＳ）を使用して行った。構造決定は、Ｂｒｕｋｅｒ ＡＶ－５００またはＡＶ－４００分光計のどちらか一方で記録した１Ｈスペクトル、およびＳｈｉｍａｄｚｕ ２０－２０ＥＳＩ ＬＣＭＳ機器で採集した低分解能質量スペクトル（ＥＳＩ－ＭＳ）を使用して行った。ＨＰＬＣ－ＭＳによって決定すると、最終化合物の純度は＞９５％であった。最終化合物の１Ｈスペクトルはすべて、期待した構造と一致した。
ウレア４および５の合成。
Figure 2022523105000069
１－（２－（１－（６，７－ジメトキシキナゾリン－４－イル）ピペリジン－４－イル）エチル）ウレア４（表３ａ中）の調製
１－（２－（ピペリジン－４－イル）エチル）ウレア６４（１７３ｍｇ、１．０１ｍｍｏｌ）のイソプロパノール（５ｍＬ）溶液に、窒素雰囲気下、４－クロロ－６，７－ジメトキシキナゾリン６３（１８１ｍｇ、０．８１ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（３９１ｍｇ、３．０３ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を室温で２時間、撹拌し、次に減圧下で蒸発乾固した。精製（分取ＨＰＬＣ）により、表題化合物４（１７２ｍｇ、４７％）が明黄色結晶として得られた。
ＬＣＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ３６０。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.49 (s, 1H), 7.17 (s, 1H), 7.07 (s, 1H), 5.92-5.90 (m, 1H), 5.36 (br s, 2H), 4.13-4.09 (m, 2H), 3.90 (s, 3H), 3.88 (s, 3H), 3.04-2.94 (m, 4H), 1.81-1.78 (m, 2H), 1.62-1.56 (m, 1H) and 1.38-1.33 (m, 4H).
１－（（１－（６，７－ジメトキシキナゾリン－４－イル）ピペリジン－４－イル）メチル）ウレア５（表３ａ中）の調製
１－（ピペリジン－４－イルメチル）ウレア６５（１５５ｍｇ、０．９７ｍｍｏｌ）のイソプロパノール（１０ｍＬ）溶液に、窒素雰囲気下、４－クロロ－６，７－ジメトキシキナゾリン６３（１７４ｍｇ、０．７８ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（３９４ｍｇ、２．９ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を１０℃で３時間、撹拌し、次に減圧下で蒸発乾固した。クロマトグラフィー（ＳｉＯ２：ジクロロメタン中０～６％ＭｅＯＨ）により所望の生成物５（１５０ｍｇ、４４％）が白色固体として得られた。
ＬＣＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ３４６．０ 1H NMR (400 MHz, メタノール-d4) δ 8.44 (s, 1H), 7.14 (s, 1H), 7.12 (s, 1H), 4.28-4.24 (m, 2H), 3.96 (s, 3H), 3.94 (s, 3H), 3.13-3.07 (m, 4H), 1.94-1.87 (m, 3H) and 1.50-1.41 (m, 2H).
３－（１－（６，７－ジメトキシキナゾリン－４－イル）ピペリジン－４－イル）プロパン酸６（表３ａ中）の調製
Figure 2022523105000070
４－クロロ－６，７－ジメトキシ－キナゾリン６３（３．１４ｇ、１３．９８ｍｍｏｌ）および３－（４－ピペリジル）プロパン酸（２．０ｇ、１２．７２ｍｍｏｌ）をイソプロパノール（１００ｍＬ）中に懸濁させて、３時間、９０℃で撹拌した。一旦冷却すると、この混合物を減圧下で蒸発乾固させた。次に、この残留物をＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）により摩砕すると、表題化合物６（１．８７ｇ、４２％）が白色固体として得られた。
1H NMR (400 MHz, メタノール-d4) δ
（２－（１－（６，７－ジメトキシキノリン－４－イル）ピペリジン－４－イル）エチル）ボロン酸７（表３ａ中）の調製
Figure 2022523105000071
溶媒中のｔｅｒｔ－ブチル４－エチニルピペリジン－１－カルボキシレート６６（２．９２ｇ、１３．９５ｍｍｏｌ）、ビス（シクロペンタジエニル）ジルコニウムクロリドヒドリド（１５０ｍｇ、０．５１８ｍｍｏｌ）および４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン６７（１．４９ｇ、１１．６３ｍｍｏｌ）の溶液を６０℃で１６時間、撹拌し、次に、エーテルにより希釈し、減圧下で蒸発乾固した。クロマトグラフィー（ＳｉＯ２；石油エーテル中の２～５％酢酸エチル）により６８（４．２ｇ、８９％）が得られた。ＭｅＯＨ（５００ｍＬ）中のｔｅｒｔ－ブチル（Ｅ）－４－（２－（４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン－２－イル）ビニル）ピペリジン－１－カルボキシレート６８（４．２ｇ、１２．４６ｍｍｏｌ）および炭素担持パラジウム（８４０ｍｇ、２０％ｗ／ｗ）の混合物を水素雰囲気下に置き、室温で１６時間、撹拌した。次に、この混合物をＣｅｌｉｔｅ（登録商標）のパッドでろ過し、次に、減圧下で蒸発乾固すると、６９（４．２ｇ、９２％）が得られた。１Ｍ ＨＣｌ水溶液（４ｍＬ）溶液を、冷却した（０℃）ＭｅＯＨ／ヘキサン（５ｍＬ／５ｍＬ）中の７３（４６０ｍｇ、１．３６ｍｍｏｌ）の混合物に加えた。この混合物を室温まで温め、３時間、撹拌し、次に減圧下で蒸発乾固させると、（２－（ピペリジン－４－イル）エチル）ボロン酸７０（１８０ｍｇ、６８％）が塩酸塩として得られた。７０（１４０ｍｇ、１．０４ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（５ｍＬ）溶液に、４－クロロ－６，７－ジメトキシキナゾリン６３（１８０ｍｇ、０．９３５ｍｍｏｌ）、次いでＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（３６０ｍｇ、１．８７ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を８０℃で１６時間、撹拌し、次に減圧下で蒸発乾固した。精製（分取ＨＰＬＣ）により表題化合物が明黄色固体（１０５ｍｇ；３７％）として得られた。
ＬＣＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ ３４６．３。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.67 (s, 1H), 7.26 (s, 1H), 7.25 (s, 1H), 4.62-4.59 (m, 2H), 3.92 (s, 3H), 3.90 (s, 3H), 3.42-3.36 (m, 4H), 2.46 (s, 1H), 1.88-1.86 (m, 2h), 1.29-1.14 (m, 3H) and 0.60-0.56 (m, 2H).
ヒドロキサム酸８および９の調製。
Figure 2022523105000072
２－（１－（６，７－ジメトキシキナゾリン－４－イル）ピペリジン－４－イル）－Ｎ－ヒドロキシアセトアミド８（表３ａ中）の調製
封管中、ｉ－ＰｒＯＨ（６ｍＬ）中の４－クロロ－６，７－ジメトキシキナゾリン６３（６００ｍｇ、２．６８ｍｍｏｌ）およびエチル２－（ピペリジン－４－イル）アセテート７１（５０４ｍｇ、２．９５ｍｍｏｌ）の混合物を１００℃で１６時間、撹拌した。次に、この反応混合物を減圧下で濃縮し、残留物をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製すると、エチル２－（１－（６，７－ジメトキシキナゾリン－４－イル）ピペリジン－４－イル）アセテート（７５０ｍｇ、７７％）が得られた。ＴＨＦ（１０ｍＬ）中のエチル２－（１－（６，７－ジメトキシキナゾリン－４－イル）ピペリジン－４－イル）アセテート（２５０ｍｇ、０．６９６ｍｍｏｌ）の混合物に、Ｈ２Ｏ中の２Ｍ ＮａＯＨ溶液（１ｍＬ）を加えた。この混合物を室温で１６時間、撹拌し、次に、１Ｍ ＨＣｌ溶液を添加することによってクエンチした。有機相を酢酸エチルにより抽出してブラインにより洗浄し、乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）し、減圧下で蒸発乾固させると、酸７２（２００ｍｇ、８６％）が白色固体として得られた。
ＴＨＦ（１０ｍＬ）中の酸７２（３００ｍｇ、０．９０６ｍｍｏｌ）の混合物に、ＮＨ２ＯＨ・ＨＣｌ（７６ｍｇ、１．０９ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（４６８ｍｇ、３．６３ｍｍｏｌ）および（ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）（４８１ｍｇ、１．０９ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を室温で１６時間、撹拌し、次に水により希釈して酢酸エチルにより抽出し、ブライン溶液で洗浄して、乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）し、減圧下で蒸発乾固した。クロマトグラフィー（ＳｉＯ２、溶媒）により表題生成物８（１８０ｍｇ、７７％）が白色固体として得られた。ＬＣＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ３４７．１０。1H NMR (400 MHz, D2O) δ 8.42 (s, 1H), 7.13 (s, 1H), 7.00 (s, 1H), 4.68-4.62 (m, 2H), 3.95 (s, 3H), 3.91 (s, 3H), 3.51-3.45 (m, 2H), 2.21-2.15 (m, 3H), 1.93-1.0 (m, 2H) and 1.45-1.36 (m, 2H).
１－（６，７－ジメトキシキナゾリン－４－イル）－Ｎ－ヒドロキシピペリジン－４－カルボキサミド９（表３ａ中）の調製
エチルピペリジン－４－カルボキシレート７３を使用した以外、８の手順に従い合成した。
ＬＣＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ ３３３．２５。1H NMR (400 MHz, D2O) δ 8.39 (s, 1H), 7.04 (s, 1H), 6.94 (s, 1H), 4.62-4.58 (m, 2H), 3.91 (s, 3H), 3.86 (s, 3H), 3.47-3.41 (m, 2H), 2.65-2.60 (m, 1H), 1.97-1.94 (m, 2H) and 1.82-1.77 (m, 2H).
化合物１０、１１、１２、１３および１６（表３ａ中）の一般手順。
Figure 2022523105000073
２－（１－（６，７－ジメトキシキノリン－４－イル）ピペリジン－４－イル）エタン－１－オール７７の調製
封管中、イソプロパノール（１０ｍＬ）中の４－クロロ－６，７－ジメトキシキナゾリン６３（１．０ｇ、４．４６ｍｍｏｌ）およびピペリジン－４－イルエタノール７９（６３３ｍｇ、４．９１ｍｍｏｌ）の混合物を１００℃で１６時間、撹拌した。冷却すると、この反応混合物を減圧下で濃縮し、残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（ＳｉＯ２；石油エーテル中のＥｔＯＡｃ）によって精製すると、２－（１－（６，７－ジメトキシキノリン－４－イル）ピペリジン－４－イル）エタン－１－オール７５（１．３ｇ、９１％）が得られた。
（１－（６，７－ジメトキシキノリン－４－イル）ピペリジン－４－イル）メタノール７８の調製
封管中、ｉ－ＰｒＯＨ（１０ｍＬ）中の４－クロロ－６，７－ジメトキシキナゾリン６３（９００ｍｇ、４．０２ｍｍｏｌ）およびピペリジン－４－イルメタノール（piperdin-4-ylmethanol）７６（５０８ｍｇ、４．４２ｍｍｏｌ）の混合物を１００℃で１６時間、撹拌した。冷却すると、この反応混合物を減圧下で蒸発乾固した。クロマトグラフィー（ＳｉＯ２；石油エーテル中、１０～８０％酢酸エチル）によって精製すると、（１－（６，７－ジメトキシキノリン－４－イル）ピペリジン－４－イル）メタノール７８（１ｇ、８２％）が得られた。
２－（１－（６，７－ジメトキシキナゾリン－４－イル）ピペリジン－４－イル）エチル二水素ホスフェート１０（表３ａ中）の調製
２－（１－（６，７－ジメトキシキナゾリン－４－イル）ピペリジン－４－イル）エタン－１－オール７７（３４０ｍｇ、１．０７ｍｍｏｌ）を１０ｍＬの乾燥ピリジンに溶解し、次に、それを－１５℃まで冷却し、１０分間、撹拌した。ＰＯＣｌ３（８２１ｍｇ、５．４ｍｍｏｌ）をＮ２雰囲気下で滴下して加えた。この反応温度を０℃までゆっくりと昇温し、次に、さらに３０分間、再度、撹拌した。この混合物を０℃で炭酸水素ナトリウム溶液（水２５０ｍＬ中の８００ｍｇ）に注ぎ入れた。所望の化合物をジクロロメタンにより抽出した。有機相を濃縮し、分取ＨＰＬＣを使用して精製すると、２－（１－（６，７－ジメトキシキナゾリン－４－イル）ピペリジン－４－イル）エチル二水素ホスフェート１０（５２ｍｇ、１２％）が白色固体として得られた。
ＬＣＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ ３９８。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.54 (s, 1H), 7.17 (s, 1H), 7.15 (s, 1H), 4.28-4.16 (m, 2H), 3.93 (s, 8H), 3.13-3.04 (m, 2H), 1.90-1.80 (m, 2H), 1.75 (s, 1H), 1.59 (d, J = 6.4 Hz, 2H) and 1.44-1.32 (m, 2H).
（１－（６，７－ジメトキシキノリン－４－イル）ピペリジン－４－イル）メチル二水素ホスフェート１１（表３ａ中）の調製
（１－（６，７－ジメトキシキノリン－４－イル）ピペリジン－４－イル）メタノール７８（１００ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）を乾燥ピリジン（３ｍＬ）に溶解し、次に、それを－１５℃まで冷却し、１０分間、撹拌した。ＰＯＣｌ３（２５３ｍｇ、１．６５ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下で滴下して加えた。この反応温度を０℃までゆっくりと昇温し、次に、さらに３０分間、撹拌した。この混合物を０℃でＮａＨＣＯ３水溶液（５０ｍＬの水中の１６０ｍｇ）に注ぎ入れた。所望の化合物をジクロロメタンにより抽出し、次に減圧下で蒸発乾固した。分取ＨＰＬＣによる精製によって（１－（６，７－ジメトキシキノリン－４－イル）ピペリジン－４－イル）メチル二水素ホスフェート１１（７０ｍｇ、５５％）が、凍結乾燥後、白色粉末として得られた。ＬＣＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ ３８４．２０。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.74 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 7.31 (s, 1H), 7.20 (s, 1H), 4.66 (d, J = 13.0 Hz, 1H), 3.97 (m, J = 12.6, 1.6 Hz, 8H), 3.76 (t, J = 6.6 Hz, 3H), 2.19-2.00 (m, 1H), 1.92 (d, J = 13.5 Hz, 2H), 1.45 (dd, J = 14.2, 10.7 Hz, 1H).
Ｏ－（２－（１－（６，７－ジメトキシキナゾリン－４－イル）ピペリジン－４－イル）エチル）Ｏ，Ｏ－二水素ホスホロチオエート１２（表３ａ中）の調製
２－（１－（６，７－ジメトキシキノリン－４－イル）ピペリジン－４－イル）エタン－１－オール７７（１５０ｍｇ、０．４７３ｍｍｏｌ）の乾燥ピリジン（５ｍＬ）溶液に、－１５℃でＰ（Ｓ）Ｃｌ３（４７７ｍｇ、２．８４ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を、０℃で０．５時間、撹拌した後、Ｈ２Ｏ（５０ｍＬ）中のＮａＨＣＯ３（２３８ｍｇ、２．８４ｍｍｏｌ）の溶液に注ぎ入れた。この混合物を、０℃で２時間、撹拌した。この反応混合物の進行をＬＣＭＳによってモニタリングした。次に、この混合物を減圧下で濃縮し、この残留物を分取ＨＰＬＣによって精製すると、化合物１２（１６ｍｇ、８％）が明黄色固体として得られた。ＬＣＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ ４１４．０５。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.62 (s, 1H), 7.19 (d, J = 7.7 Hz, 2H), 4.45 (d, J = 12.3 Hz, 2H), 3.91 (d, J = 11.3 Hz, 10H), 1.86 (d, J = 12.2 Hz, 3H), 1.56 (d, J = 6.4 Hz, 2H), 1.34 (d, J = 10.7 Hz, 2H).
Ｏ－（（１－（６，７－ジメトキシキナゾリン－４－イル）ピペリジン－４－イル）メチル）Ｏ，Ｏ－二水素ホスホロチオエート１３（表３ａ中）の調製
（１－（６，７－ジメトキシキノリン－４－イル）ピペリジン－４－イル）メタノール７８（１００ｍｇ、０．３３０ｍｍｏｌ）の乾燥ピリジン（５ｍＬ）溶液に、－１５℃でＰ（Ｓ）Ｃｌ３（２８０ｍｇ、１．９８ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を、０℃で０．５時間、撹拌した後、Ｈ２Ｏ（５０ｍＬ）中のＮａＨＣＯ３（１１６ｍｇ、１．９８ｍｍｏｌ）の溶液に注ぎ入れた。この混合物を、０℃で２時間、撹拌した。この混合物を減圧下で蒸発乾固し、この残留物を分取ＨＰＬＣによって精製すると、化合物１３（１０ｍｇ、７．６％）が黄色固体として得られた。ＬＣＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ ４００．１５。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.54 (s, 1H), 7.18 (s, 1H), 7.11 (s, 1H), 4.25 (d, J = 13.4 Hz, 2H), 3.89 (d, J = 9.1 Hz, 6H), 3.76 (s, 2H), 3.10 (d, J = 11.8 Hz, 3H), 1.94 (s, 1H), 1.81 (d, J = 12.7 Hz, 2H), 1.39 (d, J = 11.4 Hz, 1H).
（（１－（６，７－ジメトキシキナゾリン－４－イル）ピペリジン－４－イル）メチル）ホスホン酸１６の調製
無水ＣＨ２Ｃｌ２（４０ｍＬ）中のＰＰｈ３（３．３９ｇ、１５ｍｍｏｌ）およびイミダゾール（１．０２ｇ、１５ｍｍｏｌ）を０℃で１０分間、撹拌し、次に、Ｉ２（３．８ｇ、１５ｍｍｏｌ）を加えた。粗製反応混合物を窒素雰囲気下に置き、さらに１０分間、撹拌し、次に、（１－（６，７－ジメトキシキナゾリン－４－イル）ピペリジン－４－イル）メタノール７８（３．０３ｇ、１０ｍｍｏｌ）を加えた。この反応混合物を室温で一晩、撹拌した。水性Ｎａ２Ｓ２Ｏ３を添加することによって、この反応をクエンチした。粗製混合物をＣＨ２Ｃｌ２により抽出し、水、ブラインにより洗浄して乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）し、減圧下で蒸発乾固した。メタノールからの再結晶により、４－（４－（ヨードメチル）ピペリジン－１－イル）－６，７－ジメトキシキナゾリン（２．２８ｇ、５６％）が明黄色固体として得られた。ＬＣＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ ４１４．３。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.63 (d, J = 1.3 Hz, 1H), 7.28 (s, 1H), 7.07 (s, 1H), 4.23 (s, 2H), 4.00 (s, 6H), 3.19 (d, J = 6.5 Hz, 2H), 3.08 (s, 2H), 2.11-2.00 (m, 2H), 1.82 (s, 1H), 1.49 (s, 2H), 1.29-1.20 (m, 1H).無水ＭｅＣＮ（４０ｍＬ）中のビス（ベンジルオキシ）（オキソ）－λ４－ホスファン（９．５ｇ、３６．３ｍｍｏｌ）の冷却（０℃）溶液に、１，８－ジアザビシクロ（５．４．０）ウンデカ－７－エン（ＤＢＵ）（９．２ｇ、６０．５ｍｍｏｌ）を加えた。１０分後、４－（４－（ヨードメチル）ピペリジン－１－イル）－６，７－ジメトキシキナゾリン（５．０ｇ、１２．１ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を一晩、撹拌し、次に、減圧下で蒸発乾固した。残留物を酢酸エチルに溶解し、水、ブラインにより洗浄して乾燥（ＭｇＳＯ４）し、減圧下で蒸発乾固した。ＦＣＣ［ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ（５０：１）］による精製によって、ジベンジル（（１－（６，７－ジメトキシキナゾリン－４－イル）ピペリジン－４－イル）メチル）ホスホネート（１．１ｇ、１８％）が無色の粘稠な油状物として得られた。ＬＣＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ ５４８．２０。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.57 (s, 1H), 7.89 (s, 1H), 7.39-7.33 (m, 10H), 6.99 (s, 1H), 5.08 (m, 3H), 4.96 (m, 2H), 4.64 (d, J = 13.5 Hz, 2H), 4.09 (s, 3H), 3.93 (s, 3H), 3.27 (d, J = 12.9 Hz, 2H), 2.05 (d, J = 13.9 Hz, 5H), 1.76 (m, 4H), 1.42 (d, J = 12.5 Hz, 2H).
ＭｅＯＨ（２０ｍＬ）中のジベンジル（（１－（６，７－ジメトキシキナゾリン－４－イル）ピペリジン－４－イル）メチル）ホスホネート（６６０ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）およびＰｄ／Ｃ（１３２ｍｇ、２０％ｗ／ｗ）を含有する混合物をＨ２雰囲気下に置き、室温で撹拌した。４時間後、粗製混合物をＣｅｌｉｔｅ（登録商標）パッドによりろ過して、ろ液を減圧下で蒸発乾固した。分取ＨＰＬＣによる精製によって、（（１－（６，７－ジメトキシキナゾリン－４－イル）ピペリジン－４－イル）メチル）ホスホン酸１６（１２５ｍｇ、２８％）が、明黄色固体として得られた。ＬＣＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ ３６８．１０。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.72 (s, 1H), 7.29 (s, 2H), 4.60 (d, J = 12.8 Hz, 2H), 3.95 (d, J = 11.2 Hz, 6H), 3.46 (s, 2H), 2.09 (s, 3H), 1.61 (s, 2H), 1.42 (s, 2H).
（２－（１－（６，７－ジメトキシキナゾリン－４－イル）ピペリジン－４－イル）プロピル）ホスホン酸１４（表３ａ中）の調製
Figure 2022523105000074
ＰＰｈ３（１．４ｇ、５．３４ｍｍｏｌ）およびイミダゾール（０．３６ｇ、５．３４ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）溶液に、ヨウ素（１．３５ｇ、５．３４ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を室温で０．５時間、撹拌し、次に、７９（１．０ｇ、４．１１ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）溶液を滴下して加えた。この反応混合物を室温で４時間、撹拌し、次に、飽和Ｎａ２ＳＯ３溶液によりクエンチして、ＣＨ２Ｃｌ２により抽出した。有機相を水、ブラインにより洗浄して乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）し、減圧下で蒸発乾固した。クロマトグラフィー（ＳｉＯ２；石油エーテル中の５％ＥｔＯＡｃ）により、ｔｅｒｔ－ブチル４－（３－ヨードプロピル）ピペリジン－１－カルボキシレート（１．０ｇ、６８％収率）が明黄色油状物として得られた。
ＤＭＦ（５０ｍＬ）中のｔｅｒｔ－ブチル４－（３－ヨードプロピル）ピペリジン－１－カルボキシレート（１．０ｇ、２．８３ｍｍｏｌ）の混合物に、ジエチルホスホネート（０．５８ｇ、４．２４ｍｍｏｌ）およびＣｓ２ＣＯ３（１．８４ｇ、５．６６ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を窒素雰囲気下、室温で一晩、撹拌し、次に、水の添加（addition or water）によってクエンチした。有機相を水、ブラインにより洗浄して乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）し、減圧下で蒸発乾固した。クロマトグラフィー（ＳｉＯ２；石油エーテル中の２０％ＥｔＯＡｃ）により８０（０．７８ｇ、７６％）が明黄色油状物として得られた。ＬＣＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ ３６４．３０。
８０（０．７８ｇ、２．１４ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（８ｍＬ）溶液に、ＴＦＡ（１．５ｍＬ、２１．４ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を室温で４時間、撹拌し、次に減圧下で蒸発乾固すると粗製８１が油状物として得られ、これをさらに精製することなく、次の工程に使用した。ＬＣＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ ２６４．２５。
ジエチルホスホネート（５９７ｍｇ、２．６５ｍｍｏｌ）および粗製８１のＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）溶液に、ＤＩＰＥＡ（１．３７ｇ、１０．６３ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を室温で一晩、撹拌し、次に、飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液によりクエンチして、ＣＨ２Ｃｌ２により抽出した。有機相を水、ブラインにより洗浄して乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）し、減圧下で蒸発乾固した。クロマトグラフィー（ＳｉＯ２、ＣＨ２Ｃｌ２中の５％ＭｅＯＨ）によりジエチルホスホネート（０．５ｇ、３９％）中間体が黄色油状物として得られた。これをＭｅＣＮ（１０ｍＬ）中で溶媒和し、ＴＭＳＢｒ（１．４６ｍＬ、１１．０７ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を６０℃で６時間、撹拌し、次に、室温まで冷却して、減圧下で蒸発乾固した。クロマトグラフィー（chromatopgraphy）（分取ＨＰＬＣ）により、１４（２２０ｍｇ、５０％）を白色固体として得た。ＬＣＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ ３９６．２０。1H NMR (400 MHz, メタノール-d4) δ 8.51 (s, 1H), 7.33 (s, 1H), 7.14 (s, 1H), 4.02 (s, 3H), 3.97 (s, 3H), 3.49 (t, J = 12 Hz, 2H), 2.00-1.97 (m, 3H), 1.75-1.66 (m, 5H) and 1.45-1.37 (m, 5H).
（２－（１－（６，７－ジメトキシキナゾリン－４－イル）ピペリジン－４－イル）エチル）ホスホノチオＯ，Ｏ－酸１７の調製
Figure 2022523105000075
ＤＭＳＯ（１０ｍＬ）中のＯ，Ｏ－ジエチル（２－（ピペリジン－４－イル）エチル）ホスホノチオエート（４００ｍｇ、１．５１ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（９２７ｍｇ、７．１９ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、４－クロロ－６，７－ジメトキシ－キナゾリン６６（４０３ｍｇ、１．８０ｍｍｏｌ）を加えた。この反応混合物を窒素雰囲気下に置き、次に、８０℃で１６時間、撹拌した。この反応混合物を室温まで冷却し、水で希釈して酢酸エチルにより抽出した。有機相を乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）し、減圧下で蒸発乾固した。精製（ＳｉＯ２、ヘキサン中の０～１００％ＥｔＯＡｃ）すると、Ｏ，Ｏ－ジエチル（２－（１－（６，７－ジメトキシキナゾリン－４－イル）ピペリジン－４－イル）エチル）ホスホノチオエート（３８０ｍｇ、４６％）が得られた。ＴＭＳＩ（７ｍＬ）中のＯ，Ｏ－ジエチル（２－（１－（６，７－ジメトキシキナゾリン－４－イル）ピペリジン－４－イル）エチル）ホスホノチオエート（４５ｍｇ、０．０９９ｍｍｏｌ）の撹拌溶液を６０℃で１６時間、撹拌し、次に、室温まで冷却した。この混合物を水により希釈し、酢酸エチルにより抽出した。有機相を乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）し、次に、減圧下で蒸発乾固した。分取ＨＰＬＣによる精製によって、（２－（１－（６，７－ジメトキシキナゾリン－４－イル）ピペリジン－４－イル）エチル）ホスホノチオＯ，Ｏ－酸１７（１３ｍｇ、３２％）が白色固体として得られた。ＬＣＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ ３９６．２５。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.51 (s, 1H), 7.33 (s, 1H), 7.16 (s, 1H), 4.02 (s, 3H), 3.97 (s, 3H), 3.58 (d, J = 10.4 Hz, 3H), 3.48 (t, J = 12.0 Hz, 2H), 2.00 (d, J = 11.7 Hz, 2H), 1.81 (s, 1H), 1.64 (d, J = 17.9 Hz, 2H), 1.61-1.51 (m, 2H), 1.45-1.32 (m, 2H).
（２－（４－（６，７－ジメトキシキナゾリン－４－イル）ピペリジン－１－イル）エチル）ホスホン酸１８（表３ａ中）
Figure 2022523105000076
 ＬＣＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ ３８２．２５ 1H NMR (400 MHz, D2O) δ 8.65 (s, 1H), 6.93 (s, 1H), 6.76 (s, 1H), 3.86 (s, 3H), 3.84 (s, 3H), 3.30-3.22 (m, 1H), 3.18-3.15 (m, 2H), 2.73-2.66 (m, 2H), 2.37-2.32 (m, 2H) and 1.79-1.63 (m, 6H).
（２－（４－（６，７－ジメトキシキナゾリン－４－イル）ピペラジン－１－イル）エチル）ホスホン酸臭化水素塩１９（表３ａ中）。
Figure 2022523105000077
プロパン－２－オール中のピラジン８２および化合物６３を含有する混合物を３０分間、加熱して還流し、次に、室温まで冷却した。この反応混合物を水でクエンチし、クロロホルムに抽出した。有機相を分離して水、ブラインにより洗浄し、乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）して減圧下で蒸発乾固した。ジエチルエーテルからの結晶化により、８３（１．６５ｇ、８４％）が白色固体として得られた。ピペラジン８３（０．３１ｇ、１．１ｍｍｏｌ）を水（２０ｍＬ）に溶解し、ビニルホスホネート８４（０．１９ｇ、１．２ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を５０℃で１時間、加熱し、次に、室温まで冷却した。クロロホルムにより抽出して乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）し、減圧下で蒸発乾固した。クロマトグラフィー（ＳｉＯ２ １２ｇ；ＣＨ２Ｃｌ２中の１５％ＭｅＯＨ）、次いでジエチルエーテルから結晶化させると、エチルエステル８５（０．２３ｇ；４９％）が白色固体として得られた。ＬＣＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ ４１０．１０ 1H NMR (500 MHz, クロロホルム-d) δ 8.67 (s, 1H), 7.25 (s, 1H), 7.09 (s, 1H), 4.01 (d, J = 18.8 Hz, 6H), 3.77 (d, J = 10.9 Hz, 6H), 3.68 (t, J = 4.9 Hz, 4H), 3.49 (s, 2H), 2.81-2.66 (m, 6H), 2.11-2.00 (m, 2H).クロロホルム（２０ｍＬ）およびＤＭＦ（５ｍＬ）中の４－［４－（２－ジエトキシホスホリルエチル）ピペラジン－１－イル］－６，７－ジメトキシ－キナゾリン８５（６００ｍｇ、３．８ｍｍｏｌ）の溶液に、臭化トリメチルシリル（１９８ｍｇ、１．３ｍｍｏｌ）を加えた。得られた溶液を室温で３時間、撹拌し、次に、メタノールを添加することによってクエンチした。この混合物を減圧下で蒸発乾固し、メタノール－ジエチルエーテルから結晶化させると、所望の生成物１９（０．２３ｇ、８９％）がＨＢｒ塩として得られた。ＬＣＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ ３８２．８。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.97 (s, 1H), 7.96 (s, 1H), 7.42 (s, 1H), 7.35 (s, 1H), 4.02 (s, 3H), 4.00 (s, 3H), 3.34 (t, J = 8.6 Hz, 2H), 3.17 (s, 2H), 2.90 (s, 2H), 2.74 (s, 2H), 2.20-2.08 (m, 2H).
（４－（６，７－ジメトキシキナゾリン－４－イル）フェネチル）ホスホン酸２０（表３ａ中）の調製
Figure 2022523105000078
２－（４－ブロモフェニル）エタン－１－オール８６（５．０ｇ、２４．８ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（１００ｍＬ）溶液に、窒素雰囲気下、－７８℃で２．５Ｍのｎ－ブチルリチウム（２４ｍＬ）を加えた。１時間、撹拌した後、トリイソプロピルボレート（８．６ｍＬ）をこの混合物に加えた。この反応混合物を室温で１時間、撹拌し、次に、２Ｍ ＨＣｌ溶液（１００ｍＬ）を添加することによってクエンチし、１時間、撹拌した。この混合物をジクロロメタン（３×１００ｍＬ）により抽出して乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）し、減圧下で蒸発乾固した。クロマトグラフィー（ＳｉＯ２；ジクロロメタン：メタノール、１：０～２０：０）により、ボロン酸８７（１．３４ｇ、３３％）が明黄色固体として得られた。次に、この物質をＴＨＦ（３０ｍＬ）および水（１０ｍＬ）の溶液に溶解した。この溶液に、４－クロロ－６，７－ジメトキシキナゾリン６３（２．２４ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム（２．７６ｇ、２０．０ｍｍｏｌ）、次いでテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０．５ｇ、０．４３ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を６５℃で１６時間、撹拌し、次に、酢酸エチルにより希釈してブラインにより洗浄し、乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）して減圧下で蒸発乾固した。クロマトグラフィー（ＳｉＯ２：ジクロロメタン中のメタノール０～１０％）により、８８（１．４３ｇ、６０％）が明黄色固体として得られた。
トリフェニルホスフィン（２．３６ｇ、９．０ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（２４ｍＬ）溶液に、０℃でイミダゾール（７００ｍｇ、１０．２８ｍｍｏｌ）を加えた。１０分間、撹拌した後、Ｉ２（２．３ｇ、９．０ｍｍｏｌ）を加えた。さらに１０分間撹拌した後、ジクロロメタン（１２ｍＬ）中の化合物８９（１．５ｇ、４．８ｍｍｏｌ）。この混合物を室温まで温め、５時間、撹拌した。次に、この混合物をジクロロメタン（３６ｍＬ）により希釈し、ブラインにより洗浄して乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）し、減圧下で蒸発乾固した。クロマトグラフィー（ＳｉＯ２：石油エーテル：酢酸エチル１０：１）により８９（４．０ｇ）が無色油状物として得られた。
ＤＭＦ（２０ｍＬ）中の粗製８９（９３０ｍｇ、２．２ｍｍｏｌ）およびジベンジルホスホネート（８８４ｍｇ、３．３７ｍｍｏｌ）の混合物に、炭酸セシウム（１．４２６ｇ、４．４ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を窒素雰囲気下に置き、室温で３時間、撹拌した。一旦完了すると、この反応混合物をろ過して、減圧下で蒸発乾固した。クロマトグラフィー（Ｃ１８カラム：水：アセトニトリル、１：０～８０：１）、次いで凍結乾燥すると、ジベンジル中間体（７５０ｍｇ、７９％）がオフホワイト色の固体として得られた。ジベンジル（４－（６，７－ジメトキシキナゾリン－４－イル）フェネチル）ホスホネート（２３０ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（２０ｍＬ）に溶解した。Ｐｄ／Ｃ（４６ｍｇ、２０％ｗ／ｗ）を加え、この混合物を水素雰囲気下、室温で２４時間、撹拌し、次に、Ｃｅｌｉｔｅ（登録商標）によりろ過した。クロマトグラフィー（分取ＨＰＬＣ、酸性条件下）により、化合物２０（５５．４ｍｇ、３６％）が黄色固体として得られた。ＬＣＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ ３７５．０。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)): δ 9.09 (s, 1H), 7.75-7.73 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.45-7.43 (m, 2H), 7.41 (s, 1H), 7.32 (s, 1H), 4.08 (s, 1H), 3.98 (s, 3H), 3.91 (s, 1H), 3.81 (s, 3H), 2.89-2.87 (m, 3H) and 1.89 (m, 2H).
（４－（（６，７－ジメトキシキノリン－４－イル）アミノ）フェニル）ホスホン酸ナトリウム塩２１（表３ａ中）の合成
Figure 2022523105000079
ｉＰｒＯＨ（１０ｍＬ）中の４－クロロ－６，７－ジメトキシ－キナゾリン６７（０．６７ｇ、３．０ｍｍｏｌ）およびジエチル（４－アミノフェニル）ホスホネート（０．６９ｇ、３．０ｍｍｏｌ）の混合物を一晩、加熱して還流した。この固体沈殿物をろ過して、ＥｔＯＡｃにより洗浄して乾燥すると、ジエチル（４－（（６，７－ジメトキシキナゾリン－４－イル）アミノ）フェニル）ホスホネート（０．９２ｇ、７３％収率）が白色固体として得られた。この生成物をＭｅＣＮ（２０ｍＬ）に溶解し、ここに、臭化トリメチルシリル（２．８ｍＬ、２２ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を６０℃で６時間、撹拌し、冷却して、次に、減圧下で蒸発乾固した。粗製残留物を飽和水性ＮａＨＣＯ３の添加によってクエンチした（ｐＨ８に調節した）。得られた混合物を分取ＨＰＬＣ（中性条件下）により精製し、次に凍結乾燥すると、所望の生成物２１（３００ｍｇ、３５％収率）がオフホワイト色の固体として得られた。ＬＣＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ ３６２．１０。1H NMR (400 MHz, D2O) δ 7.73 (s, 1H), 7.53 (t, J = 9.8 Hz, 2H), 7.22 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 6.39 (s, 1H), 6.16 (s, 1H) and 3.39 (s, 6H).
（４－（（６，７－ジメトキシキノリン－４－イル）アミノ）ベンジル）ホスホン酸ナトリウム塩２２（表３ａ中）の合成
Figure 2022523105000080
ｉＰｒＯＨ（１０ｍＬ）中の４－クロロ－６，７－ジメトキシ－キナゾリン６７（０．３４ｇ、１．５ｍｍｏｌ）およびジエチル（４－アミノベンジル）ホスホネート（０．３６ｇ、３．０ｍｍｏｌ）の混合物を一晩、加熱して還流した。この沈殿物をろ過して、ＥｔＯＡｃにより洗浄し、減圧下で蒸発乾固し、次にアセトニトリル（２０ｍＬ）に溶解した。ここに、臭化トリメチルシリル（０．５８ｍＬ、４．６ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を、６０℃で６時間、撹拌した。濃縮後、溶液がｐＨ８に到達するまで、この残留物を飽和水性ＮａＨＣＯ３により処理した。この混合物を分取ＨＰＬＣ（中性）により精製すると、２２（１０４ｍｇ、５７％）がオフホワイト色の固体として得られた。ＬＣＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ ３７６．１０。1H NMR (400 MHz, D2O) δ 7.77 (s, 1H), 7.15 (s, 4H), 6.49 (s, 1H), 6.21 (s, 1H), 3.47 (s, 6H) and 2.70 (d, J = 19.5 Hz, 2H).
（４－（（（６，７－ジメトキシキノリン－４－イル）アミノ）メチル）フェニル）ホスホン酸ナトリウム塩２３（表１中で４とも称される）。
Figure 2022523105000081
ｉＰｒＯＨ（１０ｍＬ）中の４－クロロ－６，７－ジメトキシ－キナゾリン６３（０．９３ｇ、４．１４ｍｍｏｌ）および（４－ブロモフェニル）メタンアミン９０（０．７７ｇ、４．１４ｍｍｏｌ）の混合物を一晩、加熱して還流した。沈殿した固体をろ過して酢酸エチルにより洗浄し、減圧下で蒸発乾固すると、Ｎ－（４－ブロモベンジル）－６，７－ジメトキシキナゾリン－４－アミン塩酸塩９１（１．５ｇ、８８％）が白色固体として得られた。ＴＨＦ（１０ｍＬ）中のＫＯＡｃ（１１ｍｇ、０．１１２ｍｍｏｌ）、Ｐｄ（ＯＡｃ）２（５．５ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）、ｄｐｐｆ（２７ｍｇ、０．０４９ｍｍｏｌ）からなる混合物に、トリエチルアミン（０．３７ｍＬ、２．６８ｍｍｏｌ）を加え、窒素をパージした。トリエチルアミン（０．３７ｍＬ、２．６８ｍｍｏｌ）を加えた。７０℃で１５分間、撹拌した後、Ｎ－（４－ブロモベンジル）－６，７－ジメトキシキナゾリン－４－アミン塩酸塩（０．５ｇ、１．２２ｍｍｏｌ）およびジエチルホスホネート（０．１６ｇ、１．２２ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１０ｍＬ）溶液を加えた。この反応物を６時間、還流して撹拌し、次に、ＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ）と水（２０ｍＬ）との間に分配した。有機相を分離して水、ブラインにより洗浄し、乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）して減圧下で蒸発乾固した。カラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２；酢酸エチル中の５０％石油エーテル）によって精製すると、ジエチル（４－（（（６，７－ジメトキシキナゾリン－４－イル）アミノ）メチル）フェニル）ホスホネート（０．２ｇ、３８％）が黄色固体として得られた。
ジエチル（４－（（（６，７－ジメトキシキナゾリン－４－イル）アミノ）メチル）フェニル）ホスホネート（０．５ｇ、１．１６ｍｍｏｌ）のＭｅＣＮ（２０ｍＬ）溶液に、ＴＭＳＢｒ（１．４５ｍＬ、１１．５ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を６０℃で６時間、撹拌し、室温まで冷却して、次に、減圧下で蒸発させた。この残留物を飽和水性ＮａＨＣＯ３（ｐＨ９）によりクエンチし、得られた混合物を分取ＨＰＬＣ（中性）により精製すると、表題生成物２３（１０２ｍｇ、２２％）がオフホワイト色の固体として得られた。ＬＣＭＳ：［Ｍ－Ｈ］＋ ｍ／ｚ：３７４．００。1H NMR (400 MHz, D2O) δ 8.00 (s, 1H), 7.61 (s, 2H), 7.29 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 6.70 (s, 1H), 6.55 (s, 1H), 4.62 (s, 2H), 3.75 (d, J = 18.2 Hz, 6H).
ジメチル（２－（ピペリジン－４－イル）エチル）ホスホネート９２およびジエチル（２－（ピペリジン－４－イル）エチル）ホスホネート９３の一般手順合成（synthsis）
Figure 2022523105000082
トルエン中のビス（ジメトキシホスホリル）メタン９２またはビス（ジエトキシホスホリル）メタン９３（１ｍｏｌ．当量）の撹拌溶液に、室温で水素化ナトリウム（１．１ｍｏｌ．当量）を注意深く加える。次に、この反応混合物を窒素雰囲気下に置き、温度を４０℃未満に維持しながら、１－ベンジルピペリジン－４－カルバルデヒド９４（１ｍｏｌ．当量）のトルエン溶液をゆっくりと加える。得られた混合物を室温で１６時間、撹拌し、次に、飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液を添加することによってクエンチする。有機相を分離し、ブラインにより洗浄して乾燥（ＭｇＳＯ４）し、蒸発乾固した。クロマトグラフィー（１２０ｇ ＳｉＯ２；ヘキサン中の５～１００％のＥｔＯＡｃのグラジエント）により、ジメチルまたはジエチル（Ｅ）－（２－（１－ベンジルピペリジン－４－イル）ビニル）ホスホネートが無色油状物として得られる。エタノール中のジメチルまたはジエチル（Ｅ）－（２－（１－ベンジルピペリジン－４－イル）ビニル）ホスホネート（１ｍｏｌ．当量）の混合物に触媒のＰｄ／Ｃを加える。この混合物を水素雰囲気下に置き、室温で１２時間、撹拌してろ過し、減圧下で蒸発乾固すると、ジメチルまたはジエチル（２－（ピペリジン－４－イル）エチル）ホスホネート９５および９６のいずれかが無色油状物として得られる。
ジベンジル（２－（ピペリジン－４－イル）エチル）ホスホネート１００の合成に関する一般手順
Figure 2022523105000083
ＰＰｈ３（１．５ｍｏｌ．当量）およびイミダゾール（１．５ｍｏｌ．当量）のＣＨ２Ｃｌ２溶液に、ヨウ素（１．５ｍｏｌ．当量）を加えた。１０分間、撹拌した後、９７（１．０ｍｏｌ．当量）のＣＨ２Ｃｌ２溶液を滴下して加える。この混合物を室温で２時間、撹拌し、Ｃｅｌｉｔｅ（登録商標）パッドによりろ過して、５％チオ硫酸ナトリウム溶液により処理する。この混合物を酢酸エチルにより抽出し、ブラインにより洗浄して乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）し、減圧下で蒸発乾固する。クロマトグラフィーにより９８が油状物として得られる。
化合物９８（３．０ｍｏｌ．当量）のＭｅＣＮ溶液に、４０℃でＤＢＵ（５．０ｍｏｌ．当量）を加えた。１０分間、撹拌した後、ジベンジルホスホネート（１．０ｍｏｌ当量）のＭｅＣＮ溶液を滴下して加えた。２時間、撹拌した後、この反応混合物を減圧下で蒸発乾固し、クロマトグラフィーによって精製すると、９９が得られる。
ＴＦＡ／ＤＣＭ中の化合物９９（１．０ｍｏｌ．当量）の溶液を室温で１時間、撹拌し、次に、減圧下で蒸発乾固すると、１００が油状物として得られる。
（２－（１－（キナゾリン－４－イル）ピペリジン－４－イル）エチル）ホスホン酸、（２－（１－（キノリン－４－イル）ピペリジン－４－イル）エチル）ホスホン酸および（２－（１－（イソキノリン－１－イル）ピペリジン－４－イル）エチル）ホスホン酸を合成する一般方法。
方法Ａ
イソプロピルアルコール中のジメチル（２－（ピペリジン－４－イル）エチル）ホスホネート９５またはジエチル（２－（ピペリジン－４－イル）エチル）ホスホネート９６（１．１ｍｏｌ．当量）および４－クロロキナゾリン、４－クロロキノリンまたは１－クロロイソキノリン（１ｍｏｌ．当量）のいずれかの混合物（０．１Ｍの反応濃度）に、ジイソプロピルエチルアミン（２ｍｏｌ．当量）を加えた。９０℃で３時間、撹拌した後、この反応混合物を冷却して、蒸発乾固させた。シリカゲル（ジクロロメタン中の５％ＭｅＯＨ）の精製により、ジメチルホスホネートまたはジエチルホスホネートが得られる。クロロホルムまたはジクロロメタン中のホスホネート（１ｍｏｌ．当量）の冷却した（０℃）溶液（０．５Ｍの反応濃度）に、臭化トリメチルシリル（３ｍｏｌ．当量）を加えた。この反応混合物を室温まで温め、９０分後にメタノールを添加することによってクエンチした。この混合物を減圧下で蒸発乾固し、次に、メタノール中で溶媒和させた。この反応混合物を濃縮して体積を半分にし、ろ過して沈殿物を除去し、次に蒸発乾固した。この残留物をジクロロメタンにより結晶化し、ろ過して減圧下で乾燥すると、所望のホスホン酸が臭化物塩として得られた。
方法Ｂ：
ジクロロメタン中のジメチル（２－（ピペリジン－４－イル）エチル）ホスホネート９５またはジエチル（２－（ピペリジン－４－イル）エチル）ホスホネート９６（１．１ｍｏｌ．当量）および４－クロロキナゾリン、４－クロロキノリンまたは１－クロロイソキノリン（１ｍｏｌ．当量）のいずれかの混合物（０．１Ｍの反応濃度）に、ジイソプロピルエチルアミン（３ｍｏｌ．当量）を加えた。室温で一晩、撹拌した後、この反応混合物を飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液の添加によってクエンチした。有機相を分離して水およびブラインにより洗浄し、乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）して減圧下で蒸発乾固した。シリカゲル（ジクロロメタン中の５％ＭｅＯＨ）の精製により、ジメチルホスホネートまたはジエチルホスホネートが得られる。アセトニトリル中のジメチルホスホネートまたはジエチルホスホネート（７ｍｏｌ．当量）の冷却した（０℃）溶液（０．１Ｍの反応濃度）に、臭化トリメチルシリル（３ｍｏｌ．当量）を加えた。この反応混合物を６０℃で６時間、撹拌し、冷却して減圧下で蒸発乾固し、粗製残留物を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液の添加によりクエンチした（ｐＨ８～９が観察されるまで）。この粗製残留物を分取ＨＰＬＣ（中性）により精製すると、ホスホン酸がナトリウム塩として得られた。
方法Ｃ：
ジクロロメタン中のジベンジル（２－（ピペリジン－４－イル）エチル）ホスホネート１００（１．１ｍｏｌ．当量）および４－クロロキナゾリン、４－クロロキノリンまたは１－クロロイソキノリン（１ｍｏｌ．当量）のいずれかの混合物（０．１Ｍの反応濃度）に、ジイソプロピルエチルアミン（３ｍｏｌ．当量）を加えた。室温で一晩、撹拌した後、この反応混合物を飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液の添加によってクエンチした。有機相を分離して水およびブラインにより洗浄し、乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）して減圧下で蒸発乾固した。シリカゲル（ジクロロメタン中の５％ＭｅＯＨ）の精製により、ジベンジルホスホネートが得られる。ＭｅＯＨ中のジベンジルホスホネート（１ｍｏｌ．当量）およびＰｄ／Ｃからなる混合物を水素雰囲気下に置き、室温で２時間、撹拌する。次に、この混合物をＣｅｌｉｔｅ（登録商標）によりろ過して、減圧下で蒸発乾固すると、ホスホン酸が得られる。
（２－（１－（６，７－ジメトキシキナゾリン－４－イル）ピペリジン－４－イル）エチル）ホスホン酸（または化合物１）の調製
Figure 2022523105000084
方法Ａに準拠して調製し、１５（２．１ｇ、６９％）をオフホワイト色の固体として得た。ＬＣＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ ３８１．８。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.77 (s, 1H), 7.34 (s, 1H), 7.23 (s, 1H), 4.71 (d, J = 13.1 Hz, 2H), 3.99 (s, 3H), 3.97 (s, 3H), 3.48 (t, J = 12.7 Hz, 2H), 3.18 (s, 1H), 1.97-1.90 (m, 2H), 1.62-1.43 (m, 4H), 1.40-1.27 (m, 2H).
（４－（（（６，７－ジメトキシキナゾリン－４－イル）アミノ）メチル）ベンジル）ホスホン酸２４（本明細書における表中で５とも称される）の調製
Figure 2022523105000085
方法Ｂに準拠して調製した。分取ＨＰＬＣによって、生成物をオフホワイト色の固体（９％収率）として単離した。ＬＣＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ ３９０．１５。1H NMR (400 MHz, D2O) δ 8.12 (s, 1H), 7.22 (s, 4H), 7.11 (s, 1H), 6.91 (s, 1H), 4.79 (s, 2H), 4.76 (s, 2H), 3.98 (s, 3H), 3.91 (s, 3H), 2.79 (s, 1H), 2.74 (s, 1H)
（２－（１－（６－メトキシキナゾリン－４－イル）ピペリジン－４－イル）エチル）ホスホン酸２５の調製
Figure 2022523105000086
方法Ａに準拠して調製し、２５（５０％収率）をオフホワイト色の固体として得た。ＬＣＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ ３５２．１０。1H NMR (400 MHz, メタノール-d4) δ 8.57 (s, 1H), 7.74-7.73 (m, 1H), 7.68-7.66 (m, 1H), 7.46 (d, 1H), 4.96 (br s, 2H), 3.98, (s, 3H), 3.57 (br s, 2H), 2.65 (s, 2H), 2.07-2.04 (m, 2H), 1.81 (m, 1H), 1.79-1.75 (m, 2H), 1.66-1.63 (m, 2H) and 1.46-1.44 (m, 2H).
（２－（１－（６－ヒドロキシキナゾリン－４－イル）ピペリジン－４－イル）エチル）ホスホン酸２６の調製
Figure 2022523105000087
方法Ｃに準拠して調製し、２６（７％収率）をオフホワイト色の固体として得た。ＬＣＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ ３３８．１５。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.48 (s, 1H), 7.65 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.32 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.18 (s, 1H), 4.21-4.17 (m, 2H), 2.99-2.95 (m, 2H), 1.82-1.79 (m, 2H), 1.53-1.49 (m, 5H) and 1.30-1.19 (m, 2H).
（２－（１－（７－メトキシキナゾリン－４－イル）ピペリジン－４－イル）エチル）ホスホン酸２７の調製
Figure 2022523105000088
方法Ａに準拠して調製し、２７（９５％収率）をオフホワイト色の固体として得た。ＬＣＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ ３５２．０ 1H NMR (500 MHz, メタノール-d4) δ 8.55 (s, 1H), 8.10 (d, J = 10 Hz, 1H), 7.30 (dd, J = 10 Hz and 5 Hz, 1H), 7.10 (d, J = 5 Hz, 1H), 4.01 (s, 3H), 3.57-3.48 (m, 2H), 2.65 (s, 1H), 2.05-2.02 (m, 2H), 1.94-1.90 (m, 1H), 1.80-1.74 (m, 2H), 1.65-1.60 (m, 2H) and 1.46-1.41 (m, 2H).
（２－（１－（７－エトキシキナゾリン－４－イル）ピペリジン－４－イル）エチル）ホスホン酸２８の調製。
Figure 2022523105000089
方法Ｂに準拠して調製し、２８をオフホワイト色の固体として得た。
（２－（１－（７－ヒドロキシキナゾリン－４－イル）ピペリジン－４－イル）エチル）ホスホン酸２９の調製
Figure 2022523105000090
方法Ｂに準拠して調製し、２９（４％収率）を淡黄色固体として得た。ＬＣＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ ３３８．２５。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.49 (s, 1H), 8.64 (s, 1H), 7.96 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 7.10 (dd, J = 9.2 and 2.2 Hz, 1H), 7.00 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 4.62 (br s, 2H), 3.38 (br s, 2H), 1.87 (d, J = 12.7 Hz, 2H), 1.72 (br s, 1H), 1.58-1.38 (m, 4H) and 1.28-1.22 (m, 2H).
（２－（１－（７－アミノキナゾリン－４－イル）ピペリジン－４－イル）エチル）ホスホン酸３０の調製
Figure 2022523105000091
方法Ｃに準拠して調製し、３０（３２％収率）を明黄色固体として得た。ＬＣＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ ３３７．１０。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.35 (s, 1H), 7.62 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.81 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.61 (br s, 1H), 6.30 (br s, 2H), 4.26-4.20 (m, 2H), 3.10-2.90 (m, 2H), 1.79-1.76 (m, 2H), 1.60-1.30 (m, 5H) and 1.25-1.20 (m, 2H).
（２－（１－（７－イソプロポキシキナゾリン－４－イル）ピペリジン－４－イル）エチル）ホスホン酸３１の調製
Figure 2022523105000092
方法Ｂに準拠して調製し、３１を明黄色固体として得た。ＬＣＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ ３３７．１０。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.35 (s, 1H), 7.62 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.81 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 6.66 (s, 1H), 6.30 (br s, 2H), 4.25-4.21 (m, 2H), 3.08-2.96 (m, 2H), 1.81-1.75 (m, 2H), 1.65-1.31 (m, 5H) and 1.27-1.18 (m, 2H).
（２－（１－（８－メトキシキナゾリン－４－イル）ピペリジン－４－イル）エチル）ホスホン酸３２の調製
Figure 2022523105000093
方法Ｂに準拠して調製し、３２（３２％収率）をオフホワイト色の固体として得た。ＬＣＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ ３５２．１５。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.92 (s, 1H), 6.92-6.88 (m, 1H), 6.80 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 6.71 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 3.76-3.70 (m, 2H), 3.71 (s, 3H), 2.72 (t, J = 12 Hz, 2H), 1.64 (d, J = 12 Hz, 2H), 1.51-1.28 (m, 5H) and 1.02-0.94 (m, 2H).
（２－（１－（８－エトキシキナゾリン－４－イル）ピペリジン－４－イル）エチル）ホスホン酸３３（本明細書における表中で２２６とも称される）の調製
Figure 2022523105000094
方法Ｂに準拠して調製し、３３を白色固体として得た。ＬＣＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ ３６６．２０。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 1H NMR (400 MHz, D2O) δ 8.17 (s, 1H), 7.21-7.09 (m, 2H), 4.13-3.98 (m, 4H), 2.97 (t, J = 12.4 Hz, 2H), 1.82 (d, J = 13.0 Hz, 2H), 1.56-1.35 (m, 8H), 1.26 (q, J = 11.4 Hz, 2H).
（２－（１－（８－イソプロポキシキナゾリン－４－イル）ピペリジン－４－イル）エチル）ホスホン酸３４（表３ａ中）の調製
Figure 2022523105000095
方法Ｂに準拠して調製し、３４（４３％収率）をオフホワイト色の固体として得た。ＬＣＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 1H NMR (400 MHz, D2O) δ 8.10 (s, 1H), 7.11 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.03 (d, J = 7.1 Hz, 1H), 3.94 (d, J = 13.0 Hz, 2H), 2.86 (t, J = 12.6 Hz, 2H), 1.67 (d, J = 13.1 Hz, 2H), 1.40-1.07 (m, 13H).
（２－（１－（８－ヒドロキシキナゾリン－４－イル）ピペリジン－４－イル）エチル）ホスホン酸３６（表３ａ中）の調製
Figure 2022523105000096
 方法Ｂに準拠して調製し、３５をオフホワイト色の固体として得た。
ＬＣＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 1H NMR (400 MHz, D2O)
（２－（１－（５，８－ジメトキシキナゾリン－４－イル）ピペリジン－４－イル）エチル）ホスホン酸３６の調製
Figure 2022523105000097
方法Ｂに準拠して調製し、３６をオフホワイト色の固体として得た。ＬＣＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ ３８２．１５。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ8.47 (s, 1H), 7.54 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 7.15 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 3.95 (d, J = 12.0 Hz, 8H), 1.82 (s, 2H), 1.67 (s, 1H), 1.59-1.30 (m, 6H), 1.21 (s, 2H).
（２－（１－（６，８－ジメトキシキナゾリン－４－イル）ピペリジン－４－イル）エチル）ホスホン酸３７の調製
Figure 2022523105000098
方法Ｃに準拠して調製し、３７（１５％収率）をオフホワイト色の固体として得た。ＬＣＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ ３８２．１５ 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ8.54 (s, 1H), 7.11 (s, 1H), 6.86-6.82 (m, 1H), 4.50 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 4.27 (m, 1 H), 3.85 (m, 6 H), 3.74 (m, 2 H), 3.27 (m, 2 H), 1.88-1.85 (m, 2 H), 1.66 (m, 1 H), 1.54-1.48 (m, 4 H) and 1.29 (m, 2 H).
（２－（１－（７，８－ジメトキシキナゾリン－４－イル）ピペリジン－４－イル）エチル）ホスホン酸３８の調製
Figure 2022523105000099
方法Ｃに準拠して調製し、３８（１６％収率）をオフホワイト色の固体として得た。ＬＣＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ ３８２．１５ 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ8.60 (s, 1H), 7.90 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 7.49 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 4.69 (m, 2H), 4.02 (s, 3H), 3.89 (s, 3H), 3.46 (m, 2H), 1.90 (d, J = 12.8 Hz, 2H), 1.75 (m, 1H), 1.53-1.49 (m, 4 H) and 1.31-1.28 (m, 2H).
（２－（１－（７，８－ジヒドロ－［１，４］ジオキシノ［２，３－ｇ］キナゾリン－４－イル）ピペリジン－４－イル）エチル）ホスホン酸３９（表３ａ中）の調製
Figure 2022523105000100
方法Ｃに準拠して調製し、３９（７％収率）をオフホワイト色の固体として得た。ＬＣＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ ３８０．１５。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ8.64 (s, 1H), 7.48 (s, 1H), 7.19 (s, 1H), 4.56 (d, J = 11.8 Hz, 2H), 4.45 (d, J = 3.0 Hz, 2H), 4.38 (d, J = 3.3 Hz, 2H), 3.39 (s, 1H), 3.33 (s, 1H), 1.87 (d, J = 12.2 Hz, 2H), 1.71 (s, 1H), 1.58-1.38 (m, 4H), 1.26 (d, J = 10.2 Hz, 2H).
（２－（１－（５－フルオロ－８－メトキシキナゾリン－４－イル）ピペリジン－４－イル）エチル）ホスホン酸４０（表３ａ中）の調製
Figure 2022523105000101
方法Ｃに準拠して調製し、４０（７％収率）を明黄色固体として得た。ＬＣＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ ３７０．１０。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ8.55 (s, 1H), 7.44-7.38 (m, 2H), 4.28-4.23 (m, 2H), 3.94 (s, 3H), 3.28-3.18 (m, 2H), 1.82-1.78 (m, 2H), 1.70-1.66 (m, 1H), 1.49-1.23 (m, 4H) and 1.26-1.09 (m, 2H).
（２－（１－（６－フルオロ－８－メトキシキナゾリン－４－イル）ピペリジン－４－イル）エチル）ホスホン酸４１（表３ａ中）の調製
Figure 2022523105000102
方法Ｂに準拠して調製し、４１（４４％収率）を白色固体として得た。ＬＣＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ ３６６．１５。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ8.02 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 7.21 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 7.04 (s, 1H), 3.93 (s, 3H), 2.49 (s, 3H), 1.91-1.88 (m, 2 H), 1.74(m, 1 H), 1.53-1.49(m, 5 H), and 1.29-1.27 (m, 3 H).
（２－（１－（６－クロロ－８－メトキシキナゾリン－４－イル）ピペリジン－４－イル）エチル）ホスホン酸４２（表３ａ中）の調製
Figure 2022523105000103
方法Ｂに準拠して調製し、４２（４２％収率）を明黄色固体として得た。ＬＣＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ ３８６．１０。1H NMR (400 MHz, D2O) δ8.03 (s, 1H), 6.91-6.88 (m, 2H), 3.92-3.89 (m, 2H), 3.77 (s, 3H), 2.93-2.87 (m, 2H), 1.70-1.67 (m, 2H) and 1.41-1.12 (m, 7H).
（２－（１－（７－クロロ－８－メトキシキナゾリン－４－イル）ピペリジン－４－イル）エチル）ホスホン酸４３（表３ａ中）の調製
Figure 2022523105000104
方法Ｂに準拠して調製し、４３（５０％収率）を白色固体として得た。ＬＣＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ ３８６．０５。1H NMR (400 MHz, D2O) δ8.07 (s, 1H), 7.10-7.06 (m, 2H), 3.95-3.91 (m, 2H), 3.71 (s, 3H), 2.96-2.90 (m, 2H), 1.71-1.68 (m, 2H) and 1.42-1.01 (m, 7H).
２－［１－［６，７－ジメトキシ－２－［（Ｅ）－２－（３－ピリジル）ビニル］キナゾリン－４－イル］－４－ピペリジル］エチル－ヒドロキシ－ホスフィネート４４の調製
Figure 2022523105000105
方法Ｂに準拠して調製し、４４（４９％収率）を明黄色固体として得た。ＬＣＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ ４８５．２５。1H NMR (400 MHz, D2O) δ8.09 (s, 1H), 7.94 (s, 1H), 7.36 (d, J = 8 Hz, 1H), 7.06 (s, 1H), 6.74 (d, J = 16.8 Hz 1H), 6.58 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 6.40 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 6.24 (d, J = 16.8 Hz, 1H), 3.94-3.91 (m, 2H), 3.84 (s, 3H), 3.67 (s, 3H), 2.96-2.90 (m, 2H), 1.96-1.93 (m, 2H) and 1.56-1.32 (m, 7H).
（Ｅ）－（２－（１－（８－メトキシ－２－（２－（ピリジン－３－イル）ビニル）キナゾリン－４－イル）ピペリジン－４－イル）エチル）ホスホン酸４５の調製
Figure 2022523105000106
方法Ｂに準拠して調製し、４５（７９％収率）を黄色固体として得た。ＬＣＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ ４５５．２０。1H NMR (400 MHz, メタノール-d4) δ9.07 (br s, 1H), 8.70 (br s, 1H), 8.62-8.60 (m, 1H), 8.31 (d, 1H), 7.89-7.88 (m, 1H), 7.70-7.54 (m, 4H), 5.20-5.00 (m, 2H) 4.13 (s, 3H), 3.58-3.50 (m, 2H), 2.07-2.02 (m, 2H), 1.88-1.82 (m, 1H), 1.78-1.64 (m, 4H) and 1.51-1.46 (m, 2H).
（２－（１－（６，７－ジメトキシキノリン－４－イル）ピペリジン－４－イル）エチル）ホスホン酸４６の調製
Figure 2022523105000107
方法Ｃに準拠して調製し、４６（２２％収率）を白色固体として得た。ＬＣＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ ３８１．３０。1H NMR (400 MHz, メタノール-d4) δ8.35 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 7.29-7.27 (m, 2H), 7.11 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 4.27-4.23 (m, 2H), 4.03 (s, 3H), 4.02 (s, 3H), 3.40-3.32 (m, 2H), 2.06-2.03 (m, 4H) 1.82-1.79 (m, 3H) and 1.62-1.48 (m, 2H).
（２－（１－（３－シアノ－６，７－ジメトキシキノリン－４－イル）ピペリジン－４－イル）エチル）ホスホン酸４７（表２中で４２とも称される）の調製
Figure 2022523105000108
方法Ｂに準拠して調製し、４７（４７％収率）をオフホワイト色の固体として得た。ＬＣＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ ４０６．２０。1H NMR (400 MHz, D2O) δ8.00 (s, 1H), 6.62 (s, 1H), 6.40 (s, 1H), 3.75 (s, 3H), 3.66 (s, 3H), 3.18 (d, J = 12.3 Hz, 2H), 2.94 (t, J = 12.2 Hz, 2H), 1.72 (d, J = 12.7 Hz, 2H), 1.43-1.30 (m, 6H), 1.17-1.04 (m, 2H).
（２－（１－（３－シアノ－６－メトキシキノリン－４－イル）ピペリジン－４－イル）エチル）ホスホン酸４８（表２中で４４とも称される）の調製
Figure 2022523105000109
方法Ｂに準拠して調製し、４８（１６％収率）をオフホワイト色の固体として得た。ＬＣＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ ３７６．２０。1H NMR (400 MHz, D2O) δ8.15 (s, 1H), 7.51 (s, 1H), 7.18 (s, 1H), 6.88 (s, 1H), 3.71 (s, 3H), 3.60-3.51 (m, 2H), 3.15-3.08 (m, 2H), 1.81-1.74 (m, 2H) and 1.41-1.15 (m, 7H).
（２－（１－（３－シアノ－７－メトキシキノリン－４－イル）ピペリジン－４－イル）エチル）ホスホン酸４９（表２中で４３とも称される）の調製
Figure 2022523105000110
方法Ｂに準拠して調製し、４９（２３％収率）をオフホワイト色の固体として得た。ＬＣＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ ３７６．２０。1H NMR (400 MHz, D2O) δ7.94 (s, 1H), 7.39 (d, J = 9.4 Hz, 1H), 6.84-6.64 (m, 2H), 3.90 (s, 3H), 3.59 (d, J = 12.4 Hz, 2H), 3.22 (t, J = 12 Hz, 2H), 1.89 (d, J = 12.8 Hz, 2H), 1.62-1.45 (m, 5H) and 1.33-1.25 (m, 2H).
（２－（１－（３－シアノ－８－メトキシキノリン－４－イル）ピペリジン－４－イル）エチル）ホスホン酸５０（表１中で４５とも称される）の調製
Figure 2022523105000111
方法Ｂに準拠して調製し、５０をオフホワイト色の固体として得た。ＬＣＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ ３７６．２０。1H NMR (400 MHz, D2O) δ8.03 (s, 1H), 7.27-7.23 (m, 1H), 7.11-7.09 (m, 1H), 7.04-7.02 (m, 1H), 3.90 (s, 3H), 3.43 (br d, J = 12.4 Hz, 2H), 3.06 (br t, J = 12 Hz, 2H), 1.80 (br d, J = 12.8 Hz, 2H), 1.50-1.47 (m, 5H) and 1.31-1.24 (m, 2H).
（２－（１－（６，７－ジメトキシイソキノリン－１－イル）ピペリジン－４－イル）エチル）ホスホン酸５１の調製
Figure 2022523105000112
方法Ｂに準拠して調製し、５１（３０％収率）をオフホワイト色の固体として得た。ＬＣＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ ３８１．１０。1H NMR (400 MHz, D2O) δ 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 7.79 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 7.51-7.44 (m, 2H), 7.31 (s, 1H), 3.96 (d, J = 4.8 Hz, 6H), 3.23 (m, 4H), 1.88 (m, 2H), 1.55 (m, 2H), 1.48 (m, 1H) and 1.45 (m, 4 H).
（２－（１－（４－シアノ－６，７－ジメトキシイソキノリン－１－イル）ピペリジン－４－イル）エチル）ホスホン酸５２（表３ａ中）の調製
Figure 2022523105000113
方法Ｂに準拠して調製し、５２（５０％収率）をオフホワイト色の固体として得た。ＬＣＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ 1H NMR (400 MHz, D2O) δ
Ｏ－（（１－（８－メトキシキナゾリン－４－イル）ピペリジン－４－イル）メチル）Ｏ，Ｏ－二水素ホスホロチオエート５３（表３ａ中）の調製
Figure 2022523105000114
（１－（８－メトキシキナゾリン－４－イル）ピペリジン－４－イル）メタノール（化合物８０と同じ方法を使用して調製）（５００ｍｇ、１．８３ｍｍｏｌ）のピリジン（５ｍＬ）溶液に、－１５℃で三塩化ホスホロチオイル（１．６ｇ、９．４５ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。この反応混合物を０℃で１時間、撹拌した後、炭酸水素ナトリウム（９２３ｍｇ、１０．９８ｍｍｏｌ）水溶液（２０ｍＬ）に０℃で加えた。得られた混合物を０℃で２時間、撹拌した。次に、減圧下で蒸発乾固した。精製（分取ＨＰＬＣ）により、５３（８３ｍｇ、１２％）が白色固体として得られた。ＬＣＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ ３５４．１０ 1H NMR (400 MHz, , DMSO-d6) δ8.59 (s, 1H), 7.59-7.50 (m, 2H), 7.45 (dd, J = 6.5, 2.4 Hz, 1H), 4.53 (d, J = 12.7 Hz, 2H), 3.97 (s, 3H), 3.80-3.74 (m, 4H), 2.03 (s, 1H), 1.86 (d, J = 13.5 Hz, 2H), 1.41 (q, J = 11.8 Hz, 2H).
（（（１－（８－メトキシキナゾリン－４－イル）ピペリジン－４－イル）オキシ）メチル）ホスホン酸５４（表３ａ中）の調製
Figure 2022523105000115
化合物１０および１１と同じ方法を使用して調製した。この混合物を精製すると（分取ＨＰＬＣ、０．１％ＴＦＡ）、５４がオフホワイト色の固体として得られた。
ＬＣＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ ３５３．３。1H NMR (400 MHz, D2O) δ 8.40 (s, 1H), 7.54 (s, 2H), 7.40 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 4.37 (s, 3H), 4.01-3.88 (m, 9H), 3.71 (d, J = 9.3 Hz, 4H), 3.63 (s, 1H), 2.11 (s, 2H), 1.81 (s, 2H).
（４－（８－メトキシキナゾリン－４－イル）フェネチル）ホスホン酸５５（表３ａ中）の調製
Figure 2022523105000116
化合物２０と同じ方法を使用し、白色固体として調製した。
ＬＣＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ ３４５．１０。1H NMR (400 MHz, D2O) δ
（４－（（（８－メトキシキナゾリン－４－イル）アミノ）メチル）フェニル）ホスホン酸５６の調製
Figure 2022523105000117
化合物２３と同じ方法に準拠して調製した。ＬＣＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ ３４６．１０。1H NMR (400 MHz, D2O) δ8.20 (s, 1H), 7.62-7.57 (m, 2H), 7.43-7.41 (m, 2H), 7.31-7.28 (m, 2H), 7.23-7.21 (m, 1H) and 2.93 (s, 3H).
（４－（（（３－シアノ－８－メトキシキノリン－４－イル）アミノ）メチル）フェニル）ホスホン酸５７（表１中で５２とも称される）の調製
Figure 2022523105000118
化合物２３と同じ方法に準拠して調製し、５７をオフホワイト色の固体として得た。ＬＣＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ ３７０．１０。1H NMR (400 MHz, D2O) δ8.02 (s, 1H), 7.48-7.43 (m, 2H, 7.36-7.30 (m, 2H), 7.15-7.09 (m, 3H), 4.77 (s, 2H) and 3.81 (s, 3H).
（４－（（（３－シアノ－８－メトキシキノリン－４－イル）アミノ）メチル）ベンジル）ホスホン酸５８（表２中で２１１とも称される）の調製
Figure 2022523105000119
化合物２３と同じ方法に準拠して調製し、５８を白色固体として得た。ＬＣＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ ３８４．１５。1H NMR (400 MHz, メタノール-d4) δ8.32 (s, 1H), 7.77 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.50 (t, J = 8.4 Hz, 1H), 7.35-7.33 (m, 2H), 7.26 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.20 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 5.02 (s, 2H), 3.99 (s, 3H) and 2.85 (d, J = 20 Hz, 2H).
（３－（１－（３－シアノ－８－メトキシキノリン－４－イル）ピペリジン－４－イル）プロピル）ホスホン酸５９（表２中で２１０とも称される）の調製
Figure 2022523105000120
化合物１４と同じ方法に準拠して調製し、５９を白色固体として得た。ＬＣＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ ３９０．２０。1H NMR (400 MHz, D2O) δ8.30 (s, 1H), 7.39 (br s, 2H), 7.19 (br s, 1H), 3.98 (s, 3H), 3.73-3.70 (m, 2H), 3.30 (t, J = 12 Hz, 2H), 1.92-1.88 (m, 2H), 1.70-1.45 (m, 3H) and 1.40-1.27 (m, 6H).
（４－（（（３－シアノ－８－メトキシキノリン－４－イル）アミノ）メチル）フェニル）ボロン酸６０（表２中で２１４とも称される）の調製
Figure 2022523105000121
化合物１０１（０．９７ｇ、５．０ｍｍｏｌ）の２－メトキシエタノール（１０ｍＬ）溶液に、（４－ブロモフェニル）メタンアミン９０（１．７４ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）およびＥｔ３Ｎ（１．５１ｇ、１５ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を１００℃で一晩、加熱し、室温まで冷却して、次に減圧下で蒸発乾固した。クロマトグラフィー（石油エーテル中の３５％ＥｔｏＡｃ）により１０２（１．５ｇ、８８％）が白色固体として得られた。化合物１０２（６９ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）のＤＭＳＯ（３ｍＬ）溶液に、ビス（ピナコラト）ジボロン（６１．０ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）、酢酸カリウム（５８．８ｍｇ、３．０ｍｍｏｌ）、Ｐｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２（７．４ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）を加えた。この反応物に窒素をパージすることにより脱気し、次に、８０℃で４８時間、加熱した。この混合物を室温まで冷却して酢酸エチルにより希釈し、次に、Ｃｅｌｉｔｅ（登録商標）パッドによりろ過した。ろ液を減圧下で蒸発乾固した。この残留物をＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）に溶解し、ＥｔＯＡｃ中のＨＣｌ（４Ｍ、０．２ｍＬ、４．０ｍｍｏｌ）溶液を加えた。この混合物を室温で一晩、撹拌し、次に減圧下で蒸発乾固した。クロマトグラフィー［分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ）］により、６０（４０．５ｍｇ、２工程通算で６５％）が白色固体として得られた。ＬＣＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ ３３４．１５。1H NMR (400 MHz, メタノール-d4) δ 8.69 (s, 1H), 7.90 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.73 (t, J = 8.3 Hz, 2H), 7.61 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.41 (dd, J = 17.3, 7.8 Hz, 2H), 5.05 (s, 2H), 4.13 (s, 3H).
（２－（１－（３－シアノ－８－メトキシキノリン－４－イル）ピペリジン－４－イル）エチル）ボロン酸６１（表２中の２１６とも称する）の調製
Figure 2022523105000122
化合物７と同じ手順に従い調製した。化合物６１を黄色固体として単離した。
ＬＣＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ ３４０．２０。1H NMR (400 MHz, メタノール-d4) δ8.81 (s, 1H), 7.83 (d, J = 12 Hz, 1H), 7.72 (t, J = 8 Hz, 1H), 7.60 (d, J = 8 Hz, 1H), 4.51 (d, J = 12 Hz, 2H), 3.81 (t, J = 12 Hz, 2H), 3.31 (s, 3H), 2.66 (s, 1H). 2.05 (br d, J = 12 Hz, 2H), 1.72-1.30 (m, 4H) and 0.91-0.85 (m, 2H).
４－（（（３－シアノ－８－メトキシキノリン－４－イル）アミノ）メチル）－Ｎ－ヒドロキシベンズアミド６２（表２中で２２０とも称される）の調製
Figure 2022523105000123
１０１（２．０ｇ、８．９ｍｍｏｌ）および１０３（１．５ｇ、８．９ｍｍｏｌ）の２－メトキシエタノール（４０ｍＬ）溶液を一晩、加熱して還流し、次に、室温まで冷却した。この反応混合物を減圧下で蒸発乾固し、次に、ＥｔＯＡｃにより摩砕して、ろ過して乾燥すると、粗製化合物１０４（１．７ｇ）が明黄色固体として得られた。
化合物１０４（０．５ｇ、１．５５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２０ｍＬ）溶液に、ＮａＯＨ（０．１７ｇ、４．６５ｍｍｏｌ、水２ｍＬに溶解）を加えた。この混合物を一晩、４５℃まで加熱した。冷却した溶液を減圧下で濃縮し、ｐＨ５．５が実現するまで、残留物を水性ＨＣｌ（２Ｎ）により処理した。得られた沈殿物をろ過して乾燥すると、粗製酸中間体（０．３ｇ、６２％収率）が明黄色固体として得られた。粗製酸をＤＭＦ（１０ｍＬ）に溶解し、次に、０℃まで冷却して、窒素下に置いた。ＢＯＰ（０．４８ｇ、１．０６ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（０．５０ｇ、３．８８ｍｍｏｌ）、次いでＨＯＮＨ２－ＨＣｌ（０．０９ｇ、１．２６ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を室温で一晩、撹拌し、水（５０ｍＬ）によりクエンチし、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機相を水およびブラインにより洗浄し、乾燥（Ｎａ２ＳＯ３）して、減圧下で蒸発乾固した。クロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２中の５％ＭｅＯＨ）、次に分取ＨＰＬＣ（Ｈ＋、０．１％ＴＦＡ）により、６２（３４ｍｇ、１０％）がオフホワイト色の固体として得られた。ＬＣＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋ 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.19 (s, 1H), 9.06 (s, 1H), 8.55 (s, 1H), 8.45 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.72 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 7.39 (dd, J = 4.6, 2.9 Hz, 2H), 7.29 (dd, J = 12.3, 5.0 Hz, 2H), 5.11 (s, 2H), 3.93 (s, 3H).
（実施例２）
化合物活性の評価
表１～３の選択化合物および他の誘導体を調製し、基質として、チミジン一リン酸パラニトロフェノール（ＴＭＰ－ｐＮＰ）を使用するＥＮＰＰ１活性アッセイで評価する。１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、２００μＭ ＺｎＣｌ２（ｐＨ７．５）中、室温でＴＭＰ－ｐＮＰ（２μＭ）、ＥＮＰＰ１阻害剤の５倍希釈液および精製されている組換えマウスＥＮＰＰ１（０．５ｎＭ）を用いて酵素反応を用意する。反応の進行は、この反応により生成するパラニトロフェノレートの吸光度を４００ｎｍにおいて２０分間、測定することによりモニタリングする。生成物形成の傾きを抽出して、プロットし、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ７．０３を用いてあてはめを行い、ＩＣ５０値を得ることができる。
化合物をまた、基質としてｃＧＡＭＰを使用するＥＮＰＰ１酵素活性アッセイでも評価する。対象化合物を評価するために使用することができる方法は、２０１８年９月７日に出願のＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５００１８においてＬｉらにより記載されているものを含む。例示的な方法を以下に説明する。
物質：
マウスＥＮＰＰ１：Kato et al. PNAS (2012) 109(42):16876-8に従い発現させて精製した。ｃＧＡＭＰ：Li et al. Nat. Chem. Biol. (2014) 10:1043-8に従い合成して精製した。ポリホスフェート：ＡＭＰホスホトランスフェラーゼ（ＰＡＰ）：ＰＡＰ遺伝子（ジーンバンク：ＡＢ０９２９８３．１）を合成（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）し、Ｈｉｓ－ＳＵＭＯ Ｃ末端タグを有するｐＴＢ１４６ベクターにクローニングした。プラスミドを用いて形質転換したＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を成長させて、１６℃で一晩、０．７５ｍＭ ＩＰＴＧによりＯＤ６００＝１で誘導した。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、４００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ イミダゾール、２ｍＭ ＤＴＴ、プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を含有する緩衝液中に細胞を再懸濁させて、２回の凍結－解凍サイクルおよび超音波処理により溶解した。すべての後工程は、４℃で行った。溶解物を４０，０００ｒｃｆで１時間、遠心分離することによって濁りをとり、上清をＨｉｓＰｕｒコバルト樹脂（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と共に２時間、インキュベートした。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する３０ｍＬの緩衝液を用いて２回、樹脂を洗浄し、タンパク質を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、６００ｍＭ イミダゾールを用いて溶出した。陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰ）を行った。ミオキナーゼ（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）
ＥＮＰＰ１酵素活性アッセイに関する例示的な手順：
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６）、２５０ｎＭ ＮａＣｌ、５００ｕＭ ＣａＣｌ２および１ｕＭ ＺｎＣｌ２（全反応体積＝１０μＬ）を含有する緩衝液中、５ｕＭのｃＧＡＭＰおよび化合物の５倍連続希釈液と共に、室温で３時間、３ｎＭのマウスＥＮＰＰ１をインキュベートし、この後に、この反応物を９５℃で１０分間、熱不活性化した。ＡＭＰ分解生成物は、ＡＴＰに変換され、これを、ルシフェラーゼを使用して検出した。これを達成するため、ポリホスフェート：ＡＭＰホスホトランスフェラーゼ（ＰＡＰ）およびミオキナーゼからなる酵素混合物をＧｏｕｅｌｉらのＥＰ２７７１４８０に準拠して調製した。手短に述べると、ＰＡＰを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．１％ ＮＰ－４０を含有する緩衝液中、２ｍｇ／ｍＬに希釈した。３．２ｍＭ 硫酸アンモニウム（ｐＨ６．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび４ｍＭポリホスフェートを含有する緩衝液中にミオキナーゼを２ＫＵ／ｍＬに希釈した。４０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．０５ｍｇ／ｍＬ Ｐｒｉｏｎｅｘ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０μＭポリホスフェートおよび０．１５ｇ／Ｌフェノールレッド（ピペット操作を容易にするため）を含有する緩衝液中、熱不活性化したＥＮＰＰ１反応物をＰＡＰ（０．０１μｇ／μＬ）およびミオキナーゼ（０．００７５Ｕ／μＬ）と共に、３時間インキュベートした（全反応体積＝２０μＬ）。製造業者のプロトコールに準拠して、この反応物にＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（２０ｕＬ）を加え、発光量を測定した。データを１００％酵素活性（化合物なし）および０％酵素活性（酵素なし）に正規化した後、関数１００／（１＋（［化合物］／ＩＣ５０））にあてはめた。
ＩＣ５０値は、文字Ａ～Ｃにより表示される範囲内に収まり、ここで、Ａは、ＩＣ５０値が５０ｎＭ未満であることを表し、Ｂは、ＩＣ５０値が５０ｎＭ～１００ｎＭの間であることを表し、Ｃは、ＩＣ５０値が１００ｎＭより高いことを表す。
Figure 2022523105000124
Figure 2022523105000125
Figure 2022523105000126
Figure 2022523105000127
Figure 2022523105000128
Figure 2022523105000129
Figure 2022523105000130
Figure 2022523105000131
Figure 2022523105000132
Figure 2022523105000133
Figure 2022523105000134
（実施例３）
細胞外ＥＮＰＰ１、および細胞外ＥＮＰＰ１の阻害の実証
図１８Ａ～１８Ｃを参照すると、ＥＮＰＰ１は、ｃＧＡＭＰの細胞外レベルを制御すること、およびｃＧＡＭＰレベルは、ＥＮＰＰ１阻害剤（例えば、化合物１）により細胞を処置することによって回復され得ることが観察された。
２９３Ｔ ｃＧＡＳ ＥＮＰＰ１－／－細胞にヒトＥＮＰＰ１発現プラスミドをトランスフェクトし、全細胞溶解物にｃＧＡＭＰヒドロラーゼ活性があることが確認された（図１８Ａ）。２９３Ｔ細胞は、ＡＴＣＣから購入し、ウイルスをトランスフェクトして、マウスｃＧＡＳを安定的に発現させた。２９３Ｔ ｍｃＧＡＳ ＥＮＰＰ１－／－を、ＣＲＩＳＰＲ ｓｇＲＮＡ標的ヒトＥＮＰＰ１（５’ＣＡＣＣＧＣＴＧＧＴＴＣＴＡＴＧＣＡＣＧＴＣＴＣＣ－３’）（配列番号１）のウイルストランスフェクトによって生成した。１０％ ＦＢＳ（Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）（ｖ／ｖ）および１００Ｕ／ｍＬペニシリン－ストレプトマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を補給したＤＭＥＭ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｅｌｌｇｒｏ）中で、ＰｕｒＣｏｌ（Ａｄｖａｎｃｅｄ ＢｉｏＭａｔｒｉｘ）によりコーティングした、組織培養物処理済みプレートにおいて、２９３Ｔ ｍｃＧＡＳ ＥＮＰＰ１－／－細胞をプレート培養した。プレート培養して１２～２４時間後、製造業者の指示書に準拠し、表示濃度のｐｃＤＮＡ３プラスミドＤＮＡ（空の、またはヒトＥＮＰＰ１を含む）を加えて、細胞にＦｕｇｅｎｅ６（Ｐｒｏｍｅｇａ）をトランスフェクトした。トランスフェクトして２４時間後に、ウエスタンブロット法（抗体ウサギ抗ＥＮＰＰ１（Ｌ５２０、１：１０００）およびマウス抗チューブリン（ＤＭ１Ａ、１：２，０００）、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓを使用）によりＥＮＰＰ１発現の分析を行うために細胞を溶解した。全細胞溶解物は、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１％ ＮＰ－４０（ｐＨ９．０）中、１×１０６個の細胞を溶解することによって生成した。３２Ｐ－ｃＧＡＭＰ（５μＭ）を全細胞溶解物と共にインキュベートし、分解を上の実施例２に記載されている通りモニタリングした（図１８Ａ）。
無傷細胞では、ＥＮＰＰ１発現は、細胞外ｃＧＡＭＰを枯渇させるが、細胞内ｃＧＡＭＰ濃度に影響を及ぼさない（図１８Ｂ）。２９３Ｔ ｍｃＧＡＳ ＥＮＰＰ１－／－にｐｃＤＮＡ３（空の、またはヒトＥＮＰＰ１を含む）をトランスフェクトして２４時間後に、培地を取り除き、１％ インスリン－トランスフェリン－セレン－ピルビン酸ナトリウム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）および１００Ｕ／ｍＬペニシリン－ストレプトマイシンを補給した血清不含ＤＭＥＭにより置き換えた。培地を交換して１２～２４時間後、培地を取り除き、冷ＰＢＳを用いてプレートから細胞を洗い流した。培地と細胞の両方を１０００ｒｃｆにおいて、４℃で１０分間、遠心分離し、液体クロマトグラフィー－タンデム型質量分析法（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）によって、ｃＧＡＭＰの濃度測定の準備を行った。内部標準として５００ｎＭの環状ＧＭＰ－１３Ｃ１０，１５Ｎ５－ＡＭＰを補給した５０：５０のアセトニトリル：水３０～１００μＬに、細胞を溶解し、１５，０００ｒｃｆにおいて、４℃で２０分間、遠心分離にかけて、不溶性フラクションを除去した。培地を除去して、内部標準として５００ｎＭの環状ＧＭＰ－１３Ｃ１０，１５Ｎ５－ＡＭＰおよび２０％ギ酸を補給した。試料のｃＧＡＭＰ、ＡＴＰおよびＧＴＰ含有量を、４℃に設定したオートサンプラーを備えており、ＡＢ Ｓｃｉｅｘ４０００ ＱＴＲＡＰ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）に接続したＳｈｉｍａｄｚｕ ＨＰＬＣ（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）で分析した。１０μＬの分量をＢｉｏｂａｓｉｃ ＡＸ ＬＣカラム、５μｍ、５０×３ｍｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に注入した。移動相は、１００ｍＭの炭酸アンモニウム（Ａ）およびアセトニトリル中の０．１％ギ酸（Ｂ）からなった。初期条件はＢ９０％とし、０．５分間、維持した。この移動相を、０．５分から２．０分までＡ３０％に向上させ、Ａ３０％を２．０分から３．５分まで維持し、３．５分から３．６分までＢ９０％に上昇させ、Ｂ９０％を３．６分から５分まで維持した。流速は０．６ｍＬ／分に設定した。質量分析計は、ソース温度を５００℃に設定してエレクトロスプレー陽イオンモード（electrode spray positive ion mode）で操作した。デクラスタリングおよび衝突誘起解離は、窒素ガスを使用して実施した。デクラスタリング電位および衝突エネルギーは、標準品の直接注入によって最適化した。各分子に関して、ＭＲＭ遷移（ｍ／ｚ）、ＤＰ（Ｖ）およびＣＥ（Ｖ）は以下の通りである：ＡＴＰ（５０８＞１３６、３４１、５５）、ＧＴＰ（５２４＞１５２、２３６、４３）、ｃＧＡＭＰ（６７５＞１３６、１２１、９７；６７５＞３１２、１２１、５９；６７５＞１５２、１２１、７３）、内部標準の環状ＧＭＰ－１３Ｃ１０，１５Ｎ５－ＡＭＰ（６９０＞１４６、１１１、１０１；６９０＞１５２、１１１、４５；６９０＞３２７、１１１、４７）、抽出標準の環状１３Ｃ１０，１５Ｎ５－ＧＭＰ－１３Ｃ１０，１５Ｎ５－ＡＭＰ（７０５＞１５６、６６、９３；７０５＞１６２、６６、７３）。
ＥＮＰＰ１の阻害により、細胞外ｃＧＡＭＰの分解が遮断される（図１８Ｃ）。同一実験を上記の通り行い、この回は、培地を変更した際に５０μＭのＥＮＰＰ１阻害剤（化合物１）も含んだ。阻害剤を用いた場合、培地中の細胞外ｃＧＡＭＰ濃度は以前のレベルに戻った。
図１８Ａは、空のベクター、およびヒトＥＮＰＰ１を含有するベクターをトランスフェクトした２９３Ｔ ｃＧＡＳ ＥＮＰＰ１－／－細胞であって、ウエスタンブロットを使用して、ＥＮＰＰ１タンパク質発現について２４時間後に分析した２９３Ｔ ｃＧＡＳ ＥＮＰＰ１－／－細胞（上）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を使用したＥＮＰＰ１ ３２Ｐ－ｃＧＡＭＰ加水分解活性（下）を示している。図１８Ｂは、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用した、細胞内および細胞外ｃＧＡＭＰ濃度を示す。ＢＱＬ＝定量限界値未満。平均値±標準誤差（ｎ＝２）。＊＊Ｐ＝０．００５（スチューデントのｔ検定）。図１８Ｃは、５０μＭの化合物１の存在下または非存在下での、空のベクターまたはヒトＥＮＰＰ１を含有するベクターをトランスフェクトした２９３Ｔ ｃＧＡＳ ＥＮＰＰ１－／－細胞に関する細胞内および細胞外ｃＧＡＭＰ濃度を示している。ＢＱＬ＝定量限界値未満。平均値±標準誤差（ｎ＝２）。＊＊Ｐ＝０．００１３（スチューデントのｔ検定）。
（実施例４）
ＥＮＰＰ１の阻害により、一次ＣＤ１４＋単球のｃＧＡＭＰ活性化が向上する
ＥＮＰＰ１阻害剤（化合物１）を使用して、２９３Ｔ ｃＧＡＳ ＥＮＰＰ１ｌｏｗ細胞系によって排出されたｃＧＡＭＰが、ヒトＣＤ１４＋単球などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって検出され得るかどうかを試験した（図１９Ａ）。２９３Ｔ ｃＧＡＳ ＥＮＰＰ１ｌｏｗ細胞にｐｃＤＮＡ（空の、またはヒトＥＮＰＰ１を含有する）をトランスフェクトした。全血からの濃縮バフィーコートにＰｅｒｃｏｌｌ密度勾配を施すことによって一次ヒト末梢血液単核球細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。ＣＤ１４＋単球は、ＣＤ１４＋マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して単離した。２％ ヒト血清および１００Ｕ／ｍＬペニシリン－ストレプトマイシンを補給したＲＭＰＩ中でＣＤ１４＋単核球を培養した。２９３Ｔ ｃＧＡＳ ＥＮＰＰ１ｌｏｗ細胞をトランスフェクトして８時間後、培地を、例示的なＥＮＰＰ１阻害剤化合物１を含むまたは含まない、２％ヒト血清および１００Ｕ／ｍＬペニシリン－ストレプトマイシンを補給したＲＭＰＩに変更した。培地を変更して２４時間後、２９３Ｔ ｃＧＡＳ ＥＮＰＰ１ｌｏｗ細胞に由来する上清をＣＤ１４＋単球に移した（図１９Ａ）。上清を移送して２４～２６時間後、全ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して抽出し、Ｍａｘｉｍａ Ｈ Ｍｉｎｕｓ逆転写酵素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて逆転写した。７９００ＨＴ高速リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で、ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ ２Ｘ Ｇｒｅｅｎｓｔａｒ ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｂｉｏｎｅｅｒ）を用いて、二連でリアルタイムＲＴ－ＰＣＲを行った。データを各試料に関してＣＤ１４発現量に正規化した。誘導倍率は、ΔΔＣｔを使用して計算した。ヒトＩＦＮＢ１に対するプライマー：フォワード（５’－ＡＡＡＣＴＣＡＴＧＡＧＣＡＧＴＣＴＧＣＡ－３’）（配列番号２）、リバース（５’－ＡＧＧＡＧＡＴＣＴＴＣＡＧＴＴＴＣＧＧＡＧＧ－３’）（配列番号３）；ヒトＣＤ１４：フォワード（５’－ＧＣＣＴＴＣＣＧＴＧＴＣＣＣＣＡＣＴＧＣ－３’）（配列番号４）、リバース（５’－ＴＧＡＧＧＧＧＧＣＣＣＴＣＧＡＣＧ－３’）（配列番号５）。
ｃＧＡＳを発現する２９３Ｔ ｃＧＡＳ ＥＮＰＰ１ｌｏｗ細胞に由来する上清は、ＣＤ１４＋ ＩＦＮＢ１発現を誘発したが、ｃＧＡＳヌル２９３Ｔ細胞に由来する上清は誘発しなかった。このことは、がん細胞により排出される細胞外ｃＧＡＭＰが、シグナル伝達因子として、ＣＤ１４＋細胞によって検出され得ることを示唆する（図１９Ｂ）。２９３Ｔ ｃＧＡＳ ＥＮＰＰ１ｌｏｗ細胞表面のＥＮＰＰ１の一過性過剰発現は、細胞外ｃＧＡＭＰの分解およびＣＤ１４＋ ＩＦＮＢ１発現量の低下を引き起こしたが、化合物１の添加により、細胞外ｃＧＡＭＰレベルがレスキューされて、ＣＤ１４＋ ＩＦＮＢ１発現を誘発した（図１９Ｂ）。
図１９Ａを参照すると、上清の移送実験の概略図を示す。図１９Ｂは、ＤＮＡをトランスフェクトして、化合物１の存在下または非存在下でインキュベートしたｃＧＡＳヌル２９３Ｔ細胞または２９３Ｔ ｃＧＡＳ ＥＮＰＰ１ｌｏｗ細胞を示している。これらの細胞からの上清を一次ＣＤ１４＋ヒトＰＢＭＣに移送した。ＩＦＮＢ１ ｍＲＮＡレベルをＣＤ１４に正規化し、誘導倍率を未処置ＣＤ１４＋細胞と比較して計算した。平均値±標準誤差（ｎ＝２）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１（一元配置ＡＮＯＶＡ）。
（実施例５）
ＥＮＰＰ１阻害は、電離放射線（ＩＲ）処置と相乗作用し、腫瘍関連樹状細胞を増大させる。
がん細胞系はｃＧＡＭＰを排出するかどうか、および電離放射線（ＩＲ）が、生成される細胞外ｃＧＡＭＰのレベルに影響を及ぼすかどうかを試験した。電離放射線（ＩＲ）は、腫瘍細胞において、サイトゾルＤＮＡを増加させて、ｃＧＡＳ依存的ＩＦＮ－β生成を活性化することが示されている（Bakhoum et al. Nat. Commun. (2015) 6:1-10;およびVanpouille Nat. Commun. (2017) 8:15618）。プレート培養して２４時間後、セシウム源を使用して４Ｔ１細胞を２０Ｇｙ ＩＲにより処置し、ＥＮＰＰ１阻害剤（化合物１）５０ｕＭを補給した培地に変更して、細胞培養物中に存在するＥＮＰＰ１を阻害した。培地を表示時間に採集し、１０００×ｇで遠心分離し、残留細胞を除去し、０．５％酢酸で酸性にして、抽出標準としての環状－１３Ｃ１０，１５ ５－ＧＭＰ－１３Ｃ１０，１５Ｎ５－ＡＭＰを補給した（１００μＬ中で最終濃度２μＭにするために適量）。以前に記載された通り、ＨｙｐｅｒＳｅｐアミノプロピルＳＰＥカラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に培地を適用して、ｃＧＡＭＰを富化させた（Gao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2015) 112:E5699-705）。溶離液を蒸発乾固させて、５００ｎＭの内部標準を補給した５０：５０アセトニトリル：水に再構成した。培地をｃＧＡＭＰの質量分析法による定量に供した。
連続的なｃＧＡＭＰ排出が、４Ｔ１細胞において４８時間にわたり検出された。４８時間時には、ＩＲにより処置した細胞は、未処置よりも細胞外ｃＧＡＭＰレベルがかなり高かった。
次に、マウス４Ｔ１腫瘍モデルにおける、腫瘍関連樹状細胞数に及ぼす、例示的なＥＮＰＰ１阻害剤化合物１と組み合わせたＩＲの効果を検討した（図２０Ｂ）。７～９週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の乳腺脂肪体に、５０μＬのＰＢＳ中に懸濁させた１×１０６個の４Ｔ１－ルシフェラーゼ腫瘍細胞を接種した。注射して２日後に、０．５ｍｍ Ｃｕのフィルター付き２２５ｋＶｐキャビネット式Ｘ線照射装置（ＩＣ２５０、Ｋｉｍｔｒｏｎ Ｉｎｃ．、ＣＴ）を使用して、腫瘍に２０Ｇｙの放射線照射を行った。麻酔をかけた動物を、腫瘍が存在するところに１５×２０ｍｍの隙間を有する３．２ｍｍの鉛製シールドを用いて遮蔽した。ＰＢＳ中の１ｍＭの化合物１を１００μＬ、またはＰＢＳ単独で、マウスに腫瘍内に注射した。その翌日に、腫瘍を抽出し、２０μｇ／ｍＬ ＤＮアーゼＩ ＩＶ型（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、およびクロストリジウムヒストリチクム（Clostridium histolyticum）に由来する１ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ中、３７℃で３０分間、インキュベートした。腫瘍を１００μｍセルストレーナー（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）に通し、赤血球溶解緩衝液（１５５ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ、１２ｍＭ ＮａＨＣＯ３、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）を使用して赤血球を室温で５分間、溶解した。Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ固定近赤外死滅細胞染色キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて細胞を染色し、ＴｒｕＳｔａｉｎ ｆｃＸを使用して１０分間、Ｆｃ－ブロックし、続いて、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４５およびＩ－Ａ／Ｉ－Ｅ（すべて、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を用いて抗体染色した。ＳＨ８００Ｓセルソーター（Ｓｏｎｙ）またはＬＳＲ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して細胞を分析した。統計解析に関して、ＦｌｏｗＪｏ Ｖ１０ソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）およびＰｒｉｓｍ７．０４ソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ）を使用してデータを解析し、そして統計学的有意性を、ウェルチの補正を伴う対応のないｔ検定を使用して評価した。
ＰＢＳ対照と比べると、化合物１の腫瘍内注射により、腫瘍関連白血球の組成は変わらず（図２０Ｂ）、ＥＮＰＰ１は、この腫瘍モデルにおいて、基底レベルの細胞外ｃＧＡＭＰを一掃する際に大きな役割を果たさないことを示唆している。しかし、腫瘍をＩＲにより事前処置した場合、化合物１により腫瘍関連ＣＤ１１ｃ＋集団が増加したことが観察された（図２０Ｂ）。
これらの結果が、図２０Ａおよび図２０Ｂに例示されている。図２０Ａは、４８時間にわたり、４Ｔ１細胞により生成した細胞外ｃＧＡＭＰを示している。時間０時において、細胞を未処置のまま放置するか、または２０Ｇｙ ＩＲにより処置し、５０μＭの化合物１を補給した培地で新しくした。平均値±標準誤差（ｎ＝２）。＊＊Ｐ＝０．００４（スチューデントのｔ検定）。図２０Ｂは、０日目にＢＡＬＢ／ｃＪマウスに同所的に注射した４Ｔ１細胞（１×１０６）を示している。２日目に腫瘍を未処置のまま放置したか、または２０Ｇｙ ＩＲにより処置し、ＰＢＳ（ＩＲ（０Ｇｙ）の場合、ｎ＝５；ＩＲ（２０Ｇｙ）の場合、ｎ＝４）または化合物１（ｎ＝５）を腫瘍内注射した。３日目に、腫瘍を採取し、ＦＡＣＳにより分析した。＊Ｐ＝０．０４７（ウェルチのｔ検定）。
（実施例６）
ＥＮＰＰ１阻害は、ＩＲ処置および抗ＣＴＬＡ－４と相乗作用し、抗腫瘍作用を発揮する
腫瘍の免疫検出およびクリアランスが、電離放射線（ＩＲ）および例示的なＥＮＰＰ１阻害剤、例えば化合物１を使用して、細胞外ｃＧＡＭＰをｉｎ ｖｉｖｏでさらに増加させることによって、増大し得るかどうかを検討した。
７～９週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の乳腺脂肪体に、５０μＬのＰＢＳ中に懸濁させた５×１０４個の４Ｔ１－ルシフェラーゼ細胞を接種した。腫瘍体積（長さ２×幅／２で求める）が８０ｍｍ３～１２０ｍｍ３に到達すると、０．５ｍｍ Ｃｕのフィルター付き２２５ｋＶｐキャビネット式Ｘ線照射装置（ＩＣ２５０、Ｋｉｍｔｒｏｎ Ｉｎｃ．、ＣＴ）を使用して、腫瘍に２０Ｇｙの放射線照射を行った。麻酔をかけた動物を、腫瘍が存在するところに１５×２０ｍｍの隙間を有する３．２ｍｍの鉛製シールドを用いて遮蔽した。ＩＲ後の２、４および７日目に、１００μＬの１００μＭの化合物１、および／またはＰＢＳ中のｃＧＡＭＰ１０μｇまたはＰＢＳ単独を腫瘍内に注射した。あるいは、ＩＲ後、２日目、５日目および７日目に、ＰＢＳ中の１ｍＭ化合物１またはＰＢＳ単独を腫瘍内に注射し、２００μｇの抗ＣＴＬＡ－４抗体またはＳｙｒｉａｎハムスターＩｇＧ抗体（どちらもＢｉｏＸＣｅｌｌ）を腹腔内注射した。異なる処置群に由来するマウスを各ケージに共同収容し、ケージの影響をなくした。検討全体を通して実験者を盲検にした。１日おきに腫瘍体積を記録した。マウス内の相関関係を考慮するため、腫瘍体積を一般化推定式で分析した。各時間点における処置群の一対比較を、多重比較の場合のテューキーの調節を伴う事後検定を使用して行った。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ７．０３を使用して、動物の死亡をカプランマイヤー曲線にプロットし、統計学的有意性をログランクマンテル－コックス検定を使用して評価した。動物手順はすべて、実験室用動物の世話に関する管理委員会により承認を受けた。
化合物１の投与は、ＩＲ処置の腫瘍縮小効果を増強したが、有意ではなかった（図２１Ａ）。ｃＧＡＭＰの腫瘍内注射は、ＩＲ処置ほどの効果を有さなかったが、ｃＧＡＭＰに加えて、化合物１を注射すると、相乗的に腫瘍を退縮させて、生存が延び、１０％の治癒率を達成した（図２１Ａおよび図２１Ｂ）。
適応免疫チェックポイント遮断薬である抗ＣＴＬＡ－４との相乗効果も試験した。ＩＲのない場合、抗ＣＴＬＡ－４および化合物１による処置は、生存の延長に効果がなかった（図２１Ｃ）。しかし、ＩＲ事前処置と化合物１および抗ＣＴＬＡ－４とを組み合わせると、有意な相乗効果が発揮され、１０％の治癒率が達成された。まとめると、これらの結果は、ＩＲ処置とＥＮＰＰ１阻害とを組み合わせることによって細胞外ｃＧＡＭＰを増大すると、腫瘍免疫原性が増大されて、抗腫瘍作用を発揮することを実証する。
これらの結果は、図２１Ａに例示されており、これは、ＩＲと組み合わせた化合物１の腫瘍縮小効果を示している。確立された腫瘍（１００±２０ｍｍ３）を２０Ｇｙ ＩＲにより一旦、処置し、次いで、ＩＲ後の２日目、４日目および７日目に、ＰＢＳを３回腫瘍内注射または処置を行った（処置群あたり、ｎ＝９）。異なる処置群からのマウスを共同収容し、実験者を盲検にした。マウス内の相関関係を考慮するため、腫瘍体積を一般化推定式で分析した。各時間点における処置群の一対比較を、多重比較の場合のテューキーの調節を伴う事後検定を使用して行った。図２１Ｂは、図２１Ａの場合のカプランマイヤー曲線を示しており、Ｐ値はログランクマンテル－コックス検定によって求めた。図２１Ｃは、図２１Ｂにおける場合と同じ手順に加えて、ＩＲ後の２日目、５日目および７日目に腹腔内に注射した抗ＣＴＬＡ４またはＩｇＧアイソタイプ対照抗体を示している（ＩＲ（０）＋化合物１＋ＣＴＬＡ－４処置群の場合、ｎ＝８；他のすべての処置群の場合、ｎ＝１７～１９）。統計解析は、図２１Ｂの場合と同様に行った。
要約すると、これらの結果は、ｃＧＡＭＰは細胞外に存在し、対象となるＥＮＰＰ１阻害剤は、細胞外で作用することができることを示しており、したがって、ＥＮＰＰ１の細胞外阻害は、治療効果に十分であることを示している。ＥＮＰＰ１は、自然免疫チェックポイントとしてふさわしい。これらの実験は、ＥＮＰＰ１を細胞外で阻害することにより、ｃＧＡＭＰは抗がん免疫が賦活化され、治療法として既に利用可能な免疫チェックポイント遮断薬と相乗的に組み合わせることが可能であることを示している（図２２）。
（実施例７）
２’３’－ｃＧＡＭＰは、がん細胞により生成され、ＥＮＰＰ１によって調節される免疫伝達物質である
導入部
２’３’－環状ＧＭＰ－ＡＭＰ（ｃＧＡＭＰ）は、サイトゾルｄｓＤＮＡに応答して合成され、自然免疫ＳＴＩＮＧ経路を活性化する細胞内の第２のメッセンジャーとして特徴付けられる。その細胞外ヒドロラーゼＥＮＰＰ１は、細胞外ｃＧＡＭＰが存在することを暗示している。質量分析法を使用して、ｃＧＡＭＰが、操作された細胞系によって可溶性因子として連続的に排出されるが、次に、ＥＮＰＰ１によって効率的に一掃されることが検出された。強力で、特異的かつ細胞非透過性ＥＮＰＰ１阻害剤を開発することによって、ｃＧＡＭＰ排出は、マウスの腫瘍モデルに一般的に使用されるがん細胞系において検出された。腫瘍では、中和性タンパク質を使用する細胞外ｃＧＡＭＰの枯渇により、腫瘍関連樹状細胞が低下した。ＥＮＰＰ１の遺伝的ノックアウトおよび薬理学的阻害による細胞外ｃＧＡＭＰの増大により、腫瘍関連樹状細胞が増加して、腫瘍が縮小し、電離放射線および抗ＣＴＬＡ－４と相乗作用して、腫瘍を治癒する。結論として、ｃＧＡＭＰは、腫瘍により放出され、宿主の先天性免疫によって検出される抗がん免疫伝達物質である。
第２のメッセンジャー２’３’－環状ＧＭＰ－ＡＭＰ（ｃＧＡＭＰ）は、抗ウイルスおよび抗がん先天性免疫において極めて重要な役割を果たす。ｃＧＡＭＰは、サイトゾル中の二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に応答して、酵素である環状－ＧＭＰ－ＡＭＰシンターゼ（ｃＧＡＳ）によって合成され、これは、細胞内病原体、および損傷細胞またはがん性細胞に対する危険シグナルである。ｃＧＡＭＰは、その小胞体（ＥＲ）表面受容体であるインターフェロン遺伝子の刺激因子（ＳＴＩＮＧ）に結合して、これを活性化し、１型インターフェロン（ＩＦＮ）の生成を活性化する。これらの有力なサイトカインは、脅威を取り除くための下流での自然免疫応答および適応免疫応答を誘発する。
ｃＧＡＭＰは、その元の細胞内のＳＴＩＮＧを活性化することに加えて、上皮細胞におけるギャップ結合により、バイスタンダー細胞へと拡散することができる。この細胞間連絡機構は、損傷した細胞の隣接細胞に警告を与え、やはりまた、不運なことに、薬物誘発性肝臓毒性の拡散および脳転移の主原因となる恐れがある。さらに、サイトゾルｃＧＡＭＰは、感染の次の段階の間に、発芽ウイルス粒子に包み込まれて、伝達され得る。どちらの伝達モードでも、ｃＧＡＭＰは、細胞外空間には決して曝露されない。
唯一検出可能なｃＧＡＭＰヒドロラーゼ活性を担う酵素は、エクトヌクレオチドピロホスファターゼホスホジエステラーゼ１（ＥＮＰＰ１）である（例えば、Li, L. et al. Hydrolysis of 2’3’-cGAMP by ENPP1 and design of nonhydrolyzable analogs. Nat. Chem. Biol. 10, 1043-8 (2014)を参照されたい）。ＥＮＰＰ１は、一回膜貫通ドメインによって固定される膜結合形態と血清中の切断された可溶性タンパク質の両方として細胞外酵素として注釈が付けられるので、上記のことは驚くべきことである。２つの負電荷を有しており、恐らくは細胞膜を受動的に通過することができないｃＧＡＭＰは、細胞に侵入して、ＳＴＩＮＧを活性化することができ（例えば、Gao, P. et al. Structure-function analysis of STING activation by c[G(2’,5’) pA(3’,5’)p] and targeting by antiviral DMXAA. Cell 154, 748-762 (2013);およびCorrales, L. et al. Direct Activation of STING in the Tumor Microenvironment Leads to Potent and Systemic Tumor Regression and Immunity. Cell Rep. 11, 1018-1030 (2015)を参照されたい）、ｃＧＡＭＰのための輸送チャネルが存在することを示唆する。ｃＧＡＭＰは細胞に侵入することができるので、ｃＧＡＭＰアナログは、腫瘍内注射により、転移性固形腫瘍を処置するための臨床試験において現在、試験が行われている最中である。細胞外ｃＧＡＭＰが流入されて、抗がん作用を有すること、および主要ｃＧＡＭＰヒドロラーゼは細胞外にあることを認識して、ｃＧＡＭＰは細胞外空間に排出されて、他の細胞にシグナルを伝達し、細胞外分解によって調節されると仮定した。
がんによるｃＧＡＭＰ排出および抗がん免疫検出における細胞外ｃＧＡＭＰの役割が本明細書において実証されている。遺伝的ノックアウトおよび薬理学的阻害を使用して、細胞外ｃＧＡＭＰ濃度、免疫浸潤および腫瘍進行の制御におけるＥＮＰＰ１の役割も検討した。まとめると、ｃＧＡＭＰは、ＥＮＰＰ１によって調節される免疫伝達物質として特徴付けられた。
物質および方法
試薬、抗体および細胞系
［α－３２Ｐ］ＡＴＰ（８００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、１０ｍＣｉ／ｍＬ、２５０μＣｉ）および［３５Ｓ］ＡＴＰαＳ（１２５０Ｃｉ／ｍｍｏｌ、１２．５ｍＣｉ／ｍＬ、２５０μＣｉ）は、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒから購入した。アデノシン三リン酸、グアノシン三リン酸、アデノシン－１３Ｃ１０，１５Ｎ５、５’－三リン酸、グアノシン－１３Ｃ１０，１５Ｎ５－三リン酸、４－ニトロフェニルホスフェートおよびビス（４－ニトロフェニル）ホスフェートをＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、＞９８％原子的に純粋である。２’３’－ｃＧＡＭＰはＩｎｖｉｖｏｇｅｎから購入した。Ｃａｃｏ－２アッセイは、Ｃｙｐｒｏｔｅｘから購入した。キノームのスクリーニングは、Ｅｕｒｏｆｉｎｓによって行われた。ＰＡＭＰＡおよびＭＤＣＫ透過性アッセイは、Ｑｕｉｎｔａｒａ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙによって行われた。総タンパク質含有量は、ＢＣＡアッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して定量した。細胞生存率は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して定量した。完全長ヒトＥＮＰＰ１は、ｐｃＤＮＡ３ベクターにクローニングした。一連の４ＯＮ－ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ ＥＮＰＰ１ ｓｉＲＮＡ（ＬＱ－００３８０９－００－０００２）は、Ｄｈａｒｍａｃｏｎから購入した。ＱＳ１は、以前に記載された通りに合成した２５。以下のモノクローナル抗体をウエスタンブロット法に使用した：ウサギ抗ｃＧＡＳ（Ｄ１Ｄ３Ｇ Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、１：１，０００）ウサギ抗マウスｃＧＡＳ（Ｄ２Ｏ８Ｏ Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、１：１，０００）、マウス抗チューブリン（ＤＭ１Ａ Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、１：２，０００）およびウサギ抗ＳＴＩＮＧ（Ｄ２Ｐ２Ｆ Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、１：１，０００）、ＩＲＤｙｅ ８００ＣＷヤギ抗ウサギ（ＬＩ－ＣＯＲ、１：１５，０００）およびＩＲＤｙｅ ６８０ＲＤヤギ抗マウス（ＬＩ－ＣＯＲ、１：１５，０００）。
２９３Ｔ細胞はＡＴＣＣから購入し、ウイルスをトランスフェクトして、マウスｃＧＡＳを安定的に発現させた。２９３Ｔ ｃＧＡＳ ＥＮＰＰ１ｌｏｗ細胞は、ＣＲＩＳＰＲ ｓｇＲＮＡ標的ヒトＥＮＰＰ１（５’－ＣＡＣＣＧＣＴＧＧＴＴＣＴＡＴＧＣＡＣＧＴＣＴＣＣ－３’）のウイルストランスフェクトによって生成し、２９３Ｔ ｍｃＧＡＳ ＥＮＰＰ１－／－細胞は、このプールからの単一細胞クローニング後に選別した。４Ｔ１およびＥ０７７１ ｃＧＡＳ－／－細胞は、ＣＲＩＳＰＲ ｓｇＲＮＡ（ｌｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲｖ２－ｂｌａｓｔを使用、Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド、＃８３４８０）標的マウスＭｂ２１ｄ１（５’－ＣＡＣＣＧＧＡＡＧＧＧＧＣＧＣＧＣＧＣＴＣＣＡＣＣ－３’）のウイルストランスフェクトによって生成した。細胞は、単一細胞クローニング後に選別した。４Ｔ１－Ｌｕｃ ＥＮＰＰ１－／－細胞は、ＣＲＩＳＰＲ ｓｇＲＮＡ（ｌｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲｖ２－ｂｌａｓｔを使用）（Sanjana, N. E., Shalem, O. & Zhang, F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nat. Methods 11, 783-784 (2014)）標的マウスＥＮＰＰ１（５’－ＧＣＴＣＧＣＧＣＣＣＡＴＧＧＡＣＣＴ－３’および５’－ＡＴＡＴＧＡＣＴＧＴＡＣＣＣＴＡＣＧＧＧ－３’）またはスクランブル配列のウイルストランスフェクトによって生成した。４Ｔ１－Ｌｕｃ ｓｈｃＧＡＳ細胞は、プラスミドｐＧＨ１８８を使用するｓｈＲＮＡ（５’－ＣＡＧＧＡＴＴＧＡＧＣＴＡＣＡＡＧＡＡＴＡＴ－３’）のウイルストランスフェクトによって生成した。ｓｈＲＮＡを内包する細胞は、ブラストサイジンを用いて選別し、ＧＦＰ発現に関してソートし、実験用のプールとして使用した。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１は、ＡＴＣＣから購入し、Ｅ０７７１は、ＣＨ３ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓから購入し、４Ｔ１－ルシフェラーゼおよび分泌されたｍＥＮＰＰ１を発現するＨＥＫ２９３Ｓ ＧｎＴ１－細胞を得た。
細胞培養物
細胞系を、１０％ ＦＢＳ（Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）（ｖ／ｖ）および１００Ｕ／ｍＬペニシリン－ストレプトマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を補給したＤＭＥＭ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｅｌｌｇｒｏ）（２９３Ｔ、ＭＣ３８）またはＲＰＭＩ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｅｌｌｇｒｏ）（４Ｔ１－Ｌｕｃ、Ｅ０７７１、ＭＤＡ－ＭＤ－２３１）中で維持した。全血からの濃縮バフィーコートにＰｅｒｃｏｌｌ密度勾配を施すことによって一次ヒト末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。ＣＤ１４＋ ＰＢＭＣは、ＣＤ１４＋マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して単離した。２％ヒト血清および１００Ｕ／ｍＬペニシリン－ストレプトマイシンを補給したＲＭＰＩ中でＣＤ１４＋ＰＢＭＣを培養した。
組換えタンパク質の発現および精製
ｓｓｃＧＡＳ：プライマーペアフォワード：（５’－ＣＴＧＧＡＡＧＴＴＣＴＧＴＴＣＣＡＧＧＧＧＣＣＣＣＡＴＡＴＧＧＧＣＧＣＣＴＧＧＡＡＧＣＴＣＣＡＧＡＣ－３’）およびリバース：（５’－ＧＡＴＣＴＣＡＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＣＴＣＧＡＧＣＣＡＡＡＡＡＡＣＴＧＧＡＡＡＴＣＣＡＴＴＧＴ－３’）を使用して、ブタｃＤＮＡライブラリーからブタｃＧＡＳ（残基１３５～４９７）をコードするＤＮＡ配列を増幅した。ＰＣＲ生成物をギブソンアセンブリによりｐＤＢ－Ｈｉｓ－ＭＢＰに挿入し、Ｒｏｓｅｔｔａ細胞中で発現させた。カナマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含む２×ＹＴ培地中で細胞を成長させて、ＯＤ６００が１に到達すると、０．５ｍＭ ＩＰＴＧにより誘発させて、１６℃で一晩、成長させた。タンパク質および細胞溶解物を含む以下の手順のすべてを４℃で行った。細胞をペレット化し、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、４００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％ グリセロール、１０ｍＭイミダゾール、１ｍＭ ＤＴＴおよびプロテアーゼ阻害剤カクテル（ｃＯｍｐｌｅｔｅ ＥＤＴＡ不含錠剤、Ｒｏｃｈｅ）中に溶解した。細胞抽出物を５０，０００×ｇで１時間、超遠心分離することによって濁りを取り除いた。濁りのない上清をＨｉｓＰｕｒコバルト樹脂（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；細菌培養物１リットルあたり１ｍＬの樹脂）と共にインキュベートした。コバルト樹脂を、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１Ｍ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、１０ｍＭイミダゾール、１ｍＭ ＤＴＴにより洗浄した。タンパク質は、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１Ｍ ＮａＣｌ、１０％グリセロールおよび１ｍＭ ＤＴＴ中の３００ｍＭイミダゾールにより樹脂から溶出した。Ｈｉｓ－ＭＢＰ－ｓｓｃＧＡＳを含有するフラクションをプールして濃縮し、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、４００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴに対して透析した。タンパク質は、今後の使用のために一定分量で迅速に凍結した。
ＳＴＩＮＧ：マウスＳＴＩＮＧ（残基１３９～３７８）をｐＴＢ１４６ Ｈｉｓ－ＳＵＭＯベクターに挿入し、Ｒｏｓｅｔｔａ細胞中で発現させた。１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地中で細胞を成長させて、ＯＤ６００が１に到達すると、０．７５ｍＭ ＩＰＴＧにより１６℃で一晩、誘発させた。タンパク質および細胞溶解物を使用する以下の手順のすべてを４℃で実施した。細胞をペレット化し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、４００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、２ｍＭ ＤＴＴおよびプロテアーゼ阻害剤（ｃＯｍｐｌｅｔｅ、ＥＤＴＡ不含プロテアーゼ阻害剤カクテル、Ｒｏｃｈｅ）中に溶解した。細胞を超音波処理によって溶解し、溶解物を５０，０００ｒｃｆで１時間、超遠心分離することによって濁りをとった。濁りのない上清をＨｉｓＰｕｒコバルト樹脂（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；細菌培養物１Ｌあたり１ｍＬの樹脂）と共に３０分間、インキュベートした。樹脂結合タンパク質を、５０カラム体積分の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２％ ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１１４、５０ＣＶの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１Ｍ ＮａＣｌ（各洗浄は、１滴／２～３秒のドリップ速度に設定し、２～３時間かかった）および２０ＣＶの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌで洗浄した。タンパク質は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中の６００ｍＭイミダゾールにより樹脂から溶出した。Ｈｉｓ－ＳＵＭＯ－ＳＴＩＮＧを含有するフラクションをプールして濃縮し、ＳＵＭＯラーゼ酵素Ｈｉｓ－ＵＬＰ１と共にインキュベートしながら、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌに対して透析を行い、Ｈｉｓ－ＳＵＭＯタグを一晩、除去した。この溶液をＨｉｓＰｕｒコバルト樹脂と共に再度、インキュベートし、Ｈｉｓ－ＳＵＭＯタグを除去して、ＳＴＩＮＧを通過液から採取した。タンパク質を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）に対して透析し、Ａｅｋｔａ ＦＰＬＣ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してＨｉｔｒａｐＱ陰イオン交換カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードし、ＮａＣｌグラジエントにより溶出した。ＳＴＩＮＧを含有するフラクションをプールし、ＰＢＳに緩衝液交換し、使用するまで４℃で保管した。
ＥＮＰＰ１：ｍＥＮＰＰ１は、Kato, K. et al. (Expression, purification, crystallization and preliminary X-ray crystallographic analysis of Enpp1. Acta Crystallogr. Sect. F Struct. Biol. Cryst. Commun. 68, 778-782 (2012);およびCrystal structure of Enpp1, an extracellular glycoprotein involved in bone mineralization and insulin signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 16876-81 (2012))によって記載されている通りに生成した。
液体クロマトグラフィー－タンデム型質量分析法
環状ＧＭＰ－１３Ｃ１０，１５Ｎ５－ＡＭＰを内部標準として使用し、環状１３Ｃ１０，１５ ５－ＧＭＰ－１３Ｃ１０，１５Ｎ５－ＡＭＰを抽出標準として使用した。同位体標識ｃＧＡＭＰ標準は、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）中、１ｍＭ ＡＴＰ（同位体標識されている）、１ｍＭ ＧＴＰ（同位体標識されている）、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍｇ／ｍＬニシン精巣ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ）および２μＭ ｓｓｃＧＡＳを一晩、インキュベートすることによって合成した。反応物を９５℃で加熱し、３ｋＤａ遠心フィルターによりろ過した。水を回転式蒸発器で除去した。ｃＧＡＭＰは、ＵＶ－可視検出器（ＰｒｏＳｔａｒ；Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびフラクションコレクタ（４４０－ＬＣ；Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を接続した、分取ＨＰＬＣ（１２６０Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＬＣ ｓｙｓｔｅｍ；Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でのＰＬＲＰ－Ｓポリマー逆相分取カラム（１００Å、８μｍ、３００×２５ｍｍ；Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して粗製反応混合物から精製した。流速は２５ｍＬ／分に設定した。移動相は、水中の１０ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウムおよびアセトニトリルからなった。移動相は、最初の５分間、２％アセトニトリルとして開始した。次に、アセトニトリルを５～２０分に３０％に上昇させて、２０～２２分に９０％に上昇させて、２２～２５分に９０％で維持し、次に、２５～２８分に２％まで低下させた。ｃＧＡＭＰを含有するフラクションを凍結乾燥し、水に再懸濁させた。２８０ｎｍにおいて吸光度を測定することによって、濃度を求めた。試料のｃＧＡＭＰ、ＡＴＰおよびＧＴＰ含有量を、４℃に設定したオートサンプラーを備えており、ＡＢ Ｓｃｉｅｘ４０００ ＱＴＲＡＰ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）に接続したＳｈｉｍａｄｚｕ ＨＰＬＣ（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）で分析した。１０μＬの分量をＢｉｏｂａｓｉｃ ＡＸ ＬＣカラム、５μｍ、５０×３ｍｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に注入した。移動相は、１００ｍＭの炭酸アンモニウム（Ａ）およびアセトニトリル中の０．１％ギ酸（Ｂ）からなった。初期条件はＢ９０％とし、０．５分間、維持した。この移動相を、０．５分間～２．０分間でＡ３０％に上昇させ、Ａ３０％を２．０分から３．５分まで維持し、３．５分から３．６分までＢ９０％に上昇させ、Ｂ９０％を３．６分から５分まで維持した。流速は０．６ｍＬ／分に設定した。質量分析計は、ソース温度を５００℃に設定してエレクトロスプレー陽イオンモードで操作した。デクラスタリングおよび衝突誘起解離は、窒素ガスを使用して実施した。デクラスタリング電位および衝突エネルギーは、標準品の直接注入によって最適化した。各分子に関して、ＭＲＭ遷移（ｍ／ｚ）、ＤＰ（Ｖ）およびＣＥ（Ｖ）は以下の通りである：ＡＴＰ（５０８＞１３６、３４１、５５）、ＧＴＰ（５２４＞１５２、２３６、４３）、ｃＧＡＭＰ（６７５＞１３６、１２１、９７；６７５＞３１２、１２１、５９；６７５＞１５２、１２１、７３）、内部標準の環状ＧＭＰ－１３Ｃ１０，１５Ｎ５－ＡＭＰ（６９０＞１４６、１１１、１０１；６９０＞１５２、１１１、４５；６９０＞３２７、１１１、４７）、抽出標準の環状１３Ｃ１０，１５Ｎ５－ＧＭＰ－１３Ｃ１０，１５Ｎ５－ＡＭＰ（７０５＞１５６、６６、９３；７０５＞１６２、６６、７３）。
２９３Ｔ ｃＧＡＳ ＥＮＰＰ１－／－細胞における排出アッセイ
２９３Ｔ ｃＧＡＳ ＥＮＰＰ１－／－細胞は、ＰｕｒＣｏｌをコーティングした、組織培養物処理プレート（Ａｄｖａｎｃｅｄ ＢｉｏＭａｔｒｉｘ）でプレート培養した。２４時間後、培地を穏やかに取り除き、１％インスリン－トランスフェリン－セレン－ピルビン酸ナトリウム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）および１００Ｕ／ｍＬペニシリン－ストレプトマイシンを補給した血清不含ＤＭＥＭにより置き換えた。表示時間に、培地を取り除き、冷ＰＢＳを用いてプレートから細胞を洗い流した。培地と細胞の両方を１０００ｒｃｆにおいて、１０分間、４℃で遠心分離した。５００ｎＭの内部標準を補給した５０：５０のアセトニトリル：水３０～１００μＬに細胞を溶解し、１５，０００ｒｃｆにおいて、４℃で２０分間、遠心分離にかけて、不溶性フラクションを除去した。濃縮を必要としない場合、培地の一定分量を取り出し、５００ｎＭの内部標準および２０％ギ酸を補給した。濃縮が必要な場合、０．５％酢酸を用いて培地を酸性にし、抽出標準を補給した（１００μＬ中で２μＭの最終濃度にするために適量）。Gao, D. et al. (Activation of cyclic GMP-AMP synthase by self-DNA causes autoimmune diseases. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, E5699-705 (2015)）によって記載されている通り、培地をＨｙｐｅｒＳｅｐアミノプロピルＳＰＥカラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に適用してｃＧＡＭＰを富化させた。溶離液を蒸発乾固させて、５００ｎＭの内部標準を補給した５０：５０のアセトニトリル：水に再構成した。ｃＧＡＭＰ、ＡＴＰおよびＧＴＰの質量分析での定量に、培地および細胞抽出物を供した。
２９３Ｔ ｃＧＡＳ ＥＮＰＰ１－／－細胞のトランスフェクト刺激
製造業者の指示書に準拠し、表示濃度のｐｃＤＮＡ３プラスミドＤＮＡ（空の、またはヒトＥＮＰＰ１を含む）を加えて、２９３Ｔ ｃＧＡＳ ＥＮＰＰ１－／－細胞にＦｕｇｅｎｅ６（Ｐｒｏｍｅｇａ）をトランスフェクトした。トランスフェクトして２４時間後に、排出アッセイを上記の通り行った。
馴化培地の移送
２９３Ｔ ｃＧＡＳ ＥＮＰＰ１ｌｏｗ細胞をプレート培養し、上記の通り、プラスミドＤＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクトして２４時間後、培地をＲＰＭＩ＋２％ヒト血清＋１％ペニシリン－ストレプトマイシン、＋／－ ２μＭ ｃＧＡＭＰ、＋／－ ２０ｎＭ 組換えｍＥＮＰＰ１または＋／－ ５０ｕＭ化合物１に変更した。培地を変更して２４時間後に、２９３Ｔ ｃＧＡＳ ＥＮＰＰ１ｌｏｗ細胞から馴化培地を取り除き、新しく単離したＣＤ１４＋ ＰＢＭＣと共にインキュベートした。ＣＤ１４＋ ＰＢＭＣの遺伝子発現量を１４～１６時間後に分析した。
ＲＴ－ＰＣＲ分析
全ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して抽出し、Ｍａｘｉｍａ Ｈ Ｍｉｎｕｓ逆転写酵素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて逆転写した。７９００ＨＴ高速リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で、ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ ２Ｘ Ｇｒｅｅｎｓｔａｒ ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｂｉｏｎｅｅｒ）を用いて、二連でリアルタイムＲＴ－ＰＣＲを行った。データを各試料に関してＣＤ１４、ＡＣＴＢまたはＧＡＰＤＨ発現量に正規化した。誘導倍率は、ΔΔＣｔを使用して計算した。ヒトＩＦＮＢ１に対するプライマー：フォワード（５’－ＡＡＡＣＴＣＡＴＧＡＧＣＡＧＴＣＴＧＣＡ－３’）、リバース（５’－ＡＧＧＡＧＡＴＣＴＴＣＡＧＴＴＴＣＧＧＡＧＧ－３’）；ヒトＣＤ１４：フォワード（５’－ＧＣＣＴＴＣＣＧＴＧＴＣＣＣＣＡＣＴＧＣ－３’）、リバース（５’－ＴＧＡＧＧＧＧＧＣＣＣＴＣＧＡＣＧ－３’）；ヒトＡＣＴＢ：フォワード（５’－ＧＧＣＡＴＣＣＴＣＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＡ－３’）、リバース（５’－ＡＧＡＧＧＣＧＴＡＣＡＧＧＧＡＴＡＧＣＡ－３’）；ヒトＧＡＰＤＨ：フォワード（５’－ＣＣＡＡＧＧＴＣＡＴＣＣＡＴＧＡＣＡＡＣ－３’）；リバース（５’－ＣＡＧＴＧＡＧＣＴＴＣＣＣＧＴＴＣＡＧ－３’）。
３２Ｐ－ｃＧＡＭＰ分解ＴＬＣアッセイ
放射標識３２Ｐ ｃＧＡＭＰは、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００μｇ／ｍＬニシン精巣ＤＮＡ中、非標識ＡＴＰ（１ｍＭ）および２μＭの精製した組換えブタｃＧＡＳを含む３２Ｐ－ＡＴＰをドープしたＧＴＰ（１ｍＭ）を室温で一晩、インキュベートすることによって合成し、残りのヌクレオチド出発物質は、アルカリホスファターゼを用いて４時間、３７℃で分解した。細胞溶解物は、１００μＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１％ ＮＰ－４０（ｐＨ９．０）中、１×１０６細胞（２９３Ｔ）または１０×１０６細胞（４Ｔ１－Ｌｕｃ、Ｅ０７７１およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１）を砕き、溶解することによって生成した。４Ｔ１－Ｌｕｃ、Ｅ０７７１およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１の場合、溶解物の全タンパク質濃度をＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して測定し、試料を正規化し、その結果、各溶解物の反応に同量のタンパク質を使用した。１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、２００μＭ ＺｎＣｌ２（ｐＨ７．５またはｐＨ９．０）中、プローブ３２Ｐ－ｃＧＡＭＰ（５μＭ）を、表示時間量の間、ｍＥＮＰＰ１（２０ｎＭ）または全細胞溶解物と共にインキュベートした。阻害曲線を生成するために、ＥＮＰＰ１阻害剤の５倍希釈液をこの反応に含ませた。分解はＴＬＣによって評価した（例えば、Li, L. et al. Hydrolysis of 2’3’-cGAMP by ENPP1 and design of nonhydrolyzable analogs. Nat. Chem. Biol. 10, 1043-8 (2014)を参照されたい）。プレートを蛍光スクリーン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）に曝露させて、Ｔｙｐｈｏｏｎ９４００にイメージングし、３２ＰシグナルをＩｍａｇｅＪを使用して定量した。阻害曲線をあてはめ、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ７．０３を使用してＩＣ５０値を得た。ＩＣ５０値は、Ｃｈｅｎｇ－Ｐｒｕｓｏｆｆ式Ｋｉ，ａｐｐ＝ＩＣ５０／（１＋［Ｓ］／Ｋｍ）を使用して、Ｋｉ，ａｐｐ値に変換した。
ＡＬＰＬおよびＥＮＰＰ２阻害アッセイ
９６ウェルプレートフォーマット中、室温で反応構成成分をインキュベートし、プレートリーダー（Ｔｅｃａｎ）において、４００ｎＭでの吸光度を測定することによって、４－ニトロフェノレートの生成をモニタリングすることによって、他のエクトヌクレオチダーゼに関する阻害アッセイを行った。ＡＬＰＬ：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２０μＭ ＺｎＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有する緩衝液（ｐＨ９．０）中の、０．１ｎＭ ＡＬＰＬ、２μＭ ４－ニトロフェニルホスフェート、および様々な濃度の阻害剤を室温で。ＥＮＰＰ２：１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２００μＭ ＺｎＣｌ２、２ｍＭ ＣａＣｌ２を含有する緩衝液（ｐＨ９．０）中の、２ｎＭ ＥＮＰＰ２、５００μＭビス（４－ニトロフェニル）ホスフェート、および様々な濃度の阻害剤。
がん細胞系における排出アッセイ
４Ｔ１－Ｌｕｃ、Ｅ０７７１およびＭＣ３８細胞を、５０μＭの化合物１を補給した新しい培地に変更した。表示時間において、培地を採取した。細胞は、ＰＢＳを用いてプレートから剥がし、１０００ｒｃｆにおいてペレット化し、４ｍＬの５０：５０アセトニトリル：水に溶解し、１５，０００ｒｃｆで遠心分離した。ＨｙｐｅｒＳｅｐアミノプロピルＳＰＥカラムを使用して、上記の通り、ｃＧＡＭＰを培地および細胞の上清から富化して、質量分析による定量に供した。
４Ｔ１－Ｌｕｃ腫瘍マウスモデル
７～９週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の乳腺脂肪体に、５０μＬのＰＢＳ中に懸濁させた５×１０４個または５×１０５個の４Ｔ１－Ｌｕｃ－ルシフェラーゼ細胞を接種した。腫瘍体積（長さ２×幅／２で求める）が８０ｍｍ３～１２０ｍｍ３に到達すると、０．５ｍｍ Ｃｕのフィルター付き２２５ｋＶｐキャビネット式Ｘ線照射装置（ＩＣ２５０、Ｋｉｍｔｒｏｎ Ｉｎｃ．、ＣＴ）を使用して、腫瘍に２０Ｇｙの放射線照射を行った。麻酔をかけた動物を、腫瘍が存在するところに１５×２０ｍｍの隙間を有する３．２ｍｍの鉛製シールドを用いて遮蔽した。ＩＲ後の２日目、４日目および７日目に、１００μＬの１００μＭの化合物１、および／またはＰＢＳ中のｃＧＡＭＰ１０μｇまたはＰＢＳ単独を腫瘍内に注射した。あるいは、ＩＲ後、２日目、５日目および７日目に、ＰＢＳ中の１ｍＭ化合物１またはＰＢＳ単独を腫瘍内に注射し、２００μｇの抗ＣＴＬＡ－４ 抗体またはＳｙｒｉａｎハムスターＩｇＧ抗体（どちらもＢｉｏＸＣｅｌｌ）を腹腔内に注射した。異なる処置群に由来するマウスを各ケージに共同収容し、ケージの影響をなくした。検討全体を通して実験者を盲検にした。１日おきに腫瘍体積を記録した。マウス内の相関関係を考慮するため、腫瘍体積を一般化推定式で分析した。各時間点における処置群の一対比較を、多重比較の場合のテューキーの調節を伴う事後検定を使用して行った。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ７．０３を使用して、動物の死亡をカプランマイヤー曲線にプロットし、統計学的有意性をログランクマンテル－コックス検定を使用して評価した。マウスはすべて、Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの施設内動物管理委員会の規則を遵守してＳｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙにおいて維持し、手順はＳｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの実験室用動物の世話に関する管理委員会によって承認を受けた。
腫瘍のＦＡＣＳ解析
７～９週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃ ＷＴ（４Ｔ１－Ｌｕｃ腫瘍）またはＣ５７ＢＬ／６（Ｅ０７７１腫瘍）ＷＴ、ｃＧＡＳ－／－またはＳＴＩＮＧｇｔ／ｇｔ（ＳＴＩＮＧ－／－と称する）マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の乳腺脂肪体に、５０μＬのＰＢＳに懸濁させた１×１０６個の腫瘍細胞を接種した。注射をして２日後、腫瘍を記載されている通りに放射線照射し、ＰＢＳ中の１ｍＭ化合物１を１００μＬ、またはＰＢＳ単独を注射した。ＳＴＩＮＧおよびｍＥＮＰＰ１を使用する実験の場合、１００μＭの中和性ＳＴＩＮＧまたは非結合性ＳＴＩＮＧ（Ｒ２３７Ａ）１００μＬ、あるいは７００ｎＭ ｍＥＮＰＰ１またはＰＢＳを腫瘍内注射した。翌日に腫瘍を抽出し、２０μｇ／ｍＬ ＤＮアーゼＩ ＩＶ型（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、およびクロストリジウムヒストリチクム（Clostridium histolyticum）に由来する１ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むＲＰＭＩ＋１０％ ＦＢＳ中、３７℃で３０分間、インキュベートした。腫瘍を１００μｍセルストレーナー（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）に通し、赤血球溶解緩衝液（１５５ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ、１２ｍＭ ＮａＨＣＯ３、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）を使用して赤血球を室温で５分間、溶解した。Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ固定近赤外死滅細胞染色キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて細胞を染色し、ＴｒｕＳｔａｉｎ ｆｃＸを使用して１０分間、Ｆｃ－ブロックし、続いて、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４５およびＩ－Ａ／Ｉ－Ｅ（すべて、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を用いて抗体染色した。ＳＨ８００Ｓセルソーター（Ｓｏｎｙ）またはＬＳＲ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して細胞を分析した。統計解析に関して、ＦｌｏｗＪｏ Ｖ１０ソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）およびＰｒｉｓｍ ７．０４ソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ）を使用してデータを解析し、そして統計学的有意性を、ウェルチの補正を伴う対応のないｔ検定を使用して評価した。
ｉｎ ｖｉｖｏイメージング
２００μｌの水中の３ｍｇ ＸｅｎｏＬｉｇｈｔ Ｄ－ルシフェリン（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ）をマウスにｉｐ注射し、Ｌａｇｏ Ｘ ｉｎ ｖｉｖｏイメージングシステム（Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｍａｇｉｎｇ）を使用してイメージングした。対物高さを１．５ｃｍに、ビニングを４に、Ｆストップを１．２に設定し、曝露時間を１２０秒とした。画像は、ａｕｒａ２．０．１ソフトウェア（Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｍａｇｉｎｇ）を使用して解析した。
結果
ｃＧＡＭＰは、２９３Ｔ ｃＧＡＳ ＥＮＰＰ１－／－細胞から可溶性因子として排出される
ｃＧＡＭＰが細胞外に存在するという仮説を試験するため、本発明者らは、最初に、複雑な混合物からｃＧＡＭＰを検出する液体クロマトグラフィー－タンデム型質量分析法（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）法を開発した。本発明者らは、２つの同位体標識されているｃＧＡＭＰ標準（図１のパネルＡ）を使用して、基底細胞培養培地および血清含有培地の両方において、ｃＧＡＭＰ濃度を０．５ｎＭの低濃度まで定量することができ、本発明者らは、同じ実験において、細胞抽出物から細胞内ｃＧＡＭＰ濃度を定量することができる（図１のパネルＢ、ならびに図８のパネルＡおよびＢ）。本発明者らは、ｃＧＡＳもＳＴＩＮＧも発現しない２９３Ｔ細胞の使用を選択する。本発明者らは、マウスｃＧＡＳを安定的に発現し、ＣＲＩＳＰＲを使用してＥＮＰＰ１をノックアウトすることによって、２９３Ｔ ｃＧＡＳ ＥＮＰＰ１ｌｏｗ細胞系を生成した（図８のパネルＣ）。次に、本発明者らは、単一クローンを単離し、２９３Ｔ ｃＧＡＳ ＥＮＰＰ１－／－細胞系を生成した（図８のパネルＣ）。血清は、ＥＮＰＰ１のタンパク質分解により切断された可溶形態を含有するので、本発明者らは血清不含培地も使用した。本発明者らは、このＥＮＰＰ１不含細胞培養物系を使用して、いかなる刺激もなしに、２９３Ｔ ｃＧＡＳ ＥＮＰＰ１－／－細胞中で一定の低いマイクロモル濃度の基底細胞内ｃＧＡＭＰ濃度を検出した（図１のパネルＣ）。誤ったＤＮＡ分離の結果として、がん細胞においてサイトゾルｄｓＤＮＡが多量に存在するので、これは驚くべきことではない（例えば、Mackenzie, K. J. et al. cGAS surveillance of micronuclei links genome instability to innate immunity. Nature 548, 461-465 (2017); Harding, S. M. Mitotic progression following DNA damage enables pattern recognition within micronuclei. Nature 548, 466-470 (2017);およびBakhoum, S. F. et al. Chromosomal instability drives metastasis through a cytosolic DNA response. Nature 553, 467-472 (2018)を参照されたい）。本発明者らは、新しい培地を細胞に補充した後、３０時間後に、細胞外ｃＧＡＭＰ濃度の１００ｎＭまでの直線的な向上を測定した（図１のパネルＤ）。３０時間時に、細胞の外側のｃＧＡＭＰ分子の数は、内側の数に等しかった（図１のパネルＥ）。本発明者らは、細胞外ラクトースデヒドロゲネート（dehydrogenate）（ＬＤＨ）活性に基づいて無視できる程度の細胞死の量を検出し、培地中のｃＧＡＭＰは生細胞によって排出されることを示唆している（図１のパネルＥ）。本発明者らは、排出速度（ｖexport）が、２２０分子 細胞－１ｓ－１であると計算した（図１のパネルＦ）。最後に、培地中のｃＧＡＭＰは、１０ｋＤａのフィルターを何ら保持されることなく通過することができ、これは、細胞外ベシクルおよびタンパク質を保持しているはずであり、ｃＧＡＭＰは、自由に可溶性の分子として排出されることを示唆している（図１のパネルＨ）。
２９３Ｔ細胞によって分泌された細胞外ｃＧＡＭＰは、主に可溶形態にあるが、細胞外ベシクルには存在しないことをさらに確認するため、本発明者らは、レポーターとして、ＣＤ１４＋ヒト末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を使用した。これらの細胞は、可溶性ｃＧＡＭＰを吸収し、これにより、ＩＦＮ－β生成をもたらすことが以前に示されている１７。本発明者らは、ＣＤ１４＋ ＰＢＭＣは、ＩＦＮＢ１を上方調節することによって、可溶性ｃＧＡＭＰのマイクロモル濃度未満の濃度に応答することを観察した（図９）。ＤＮＡをトランスフェクトしたｃＧＡＳを発現する２９３Ｔ ｃＧＡＳ ＥＮＰＰ１ｌｏｗ細胞からの馴化培地は、ＣＤ１４＋細胞において、ＩＦＮＢ１発現を誘発したが、ＤＮＡをトランスフェクトしたｃＧＡＳヌル２９３Ｔ細胞からの馴化培地は、誘発しなかった。このことは、この活性が、２９３Ｔ細胞によって生成される細胞外ｃＧＡＭＰの結果であることを示唆している（図１のパネルＨおよびＩ）。精製済みの可溶性組換えマウスＥＮＰＰ１（ｍＥＮＰＰ１）の添加（図８のパネルＤ）により、馴化培地中で検出可能なｃＧＡＭＰが枯渇し、やはりまたこの活性が失われた（図１のパネルＨおよびＪ）。可溶性ＥＮＰＰ１（ＭＷ＝約１００ｋＤａ）は、膜に浸透することができず、したがって、可溶性細胞外ｃＧＡＭＰしか接近することができないので、本発明者らは、２９３Ｔ細胞が可溶性ｃＧＡＭＰを分泌すると結論付ける。まとめると、本発明者らのデータは、この人工的ながん細胞系は、細胞内ｃＧＡＭＰを細胞外培地に可溶性因子として排出することによって、その細胞内ｃＧＡＭＰを定常状態に維持することを実証している。
図１のパネルＡ～Ｊ：ｃＧＡＭＰは、２９３Ｔ ｃＧＡＳ ＥＮＰＰ１－／－細胞から、可溶性因子として排出される。ａ、ｃＧＡＭＰおよび単一同位体標識されているｃＧＡＭＰの化学構造、ｂ、ｃＧＡＭＰはＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより検出される。定量の下限値＝４ｎＭ。（左）０、４および１０ｎＭにおけるｃＧＡＭＰ、ならびに内部標準としての５００ｎＭでの単一同位体標識ｃＧＡＭＰ（１５Ｄａ重い）の液体クロマトグラフィートレース；（右）ｃＧＡＭＰの外部標準曲線、Ｒ２＝０．９９６。データは、１０より多い独立実験の代表である。ｃ～ｄ、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して測定される、外因性刺激のない２９３Ｔ ｃＧＡＳ ＥＮＰＰ１－／－細胞からの、ｃＧＡＭＰの細胞内および細胞外濃度。０時間時に、細胞に血清不含培地を補充した。可視化するには小さ過ぎる、いくつかのエラーバーを伴う平均値±標準誤差（ｎ＝２）。データは、３回の独立実験の代表である。ｅ、細胞外／合計ラクトースデヒドロゲネート（ＬＤＨ）活性の割合（右側のｙ軸）と比較した、（ｃ）および（ｄ）におけるデータから計算した、細胞外／全ｃＧＡＭＰ分子の割合（左側のｙ軸）。ｆ、（ｄ）におけるデータから計算した、経時的な細胞あたり排出されたｃＧＡＭＰの量。排出速度は、線形回帰を使用して見出した。ｇ、１０ｋＤａフィルターに培地を通す前および後に測定した、２９３Ｔ ｃＧＡＳ ＥＮＰＰ１－／－細胞によって生成される細胞内および細胞外ｃＧＡＭＰ濃度。平均値±標準誤差（ｎ＝２）。データは、２つの独立実験の代表である。ｈ、（ｉ）および（ｊ）に関する馴化培地移送実験の概略図。ｃＧＡＳヌル２９３Ｔまたは２９３Ｔ ｃＧＡＳ ＥＮＰＰ１ｌｏｗ細胞に、空のｐｃＤＮＡベクターをトランスフェクトし、＋／－ ２０ｎＭ組換えマウスＥＮＰＰ１（ｍＥＮＰＰ１）により処置した。これらの細胞からの馴化培地を一次ＣＤ１４＋ ヒトＰＢＭＣに移送した。ｉ、ＩＦＮＢ１ ｍＲＮＡレベルをＣＤ１４に正規化し、誘導倍率を未処置ＣＤ１４＋細胞と比較して計算した。平均値±標準誤差（ｎ＝４）。＊＊＊Ｐ＝０．０００３（一元配置ＡＮＯＶＡ）。ｃＧＡＭＰ濃度は馴化培地中で測定した。平均値±標準誤差（ｎ＝２）。＊＊＊Ｐ＝０．０００２（一元配置ＡＮＯＶＡ）。データは、２つの独立実験の代表である。ｊ、ＩＦＮＢ１ ｍＲＮＡレベルをＣＤ１４に正規化し、誘導倍率を未処置ＣＤ１４＋細胞と比較して計算した。平均値±標準誤差（ｎ＝２）。＊Ｐ＝０．０４（一元配置ＡＮＯＶＡ）。ｃＧＡＭＰ濃度は馴化培地中で測定した。平均値±標準誤差（ｎ＝２）。＊＊Ｐ＝０．００２（一元配置ＡＮＯＶＡ）。データは、２つの独立実験の代表である。
図８のパネルＡ～Ｄ：ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ法の開発、ならびに２９３Ｔ ｃＧＡＳ ＥＮＰＰ１ｌｏｗおよび２９３Ｔ ｃＧＡＳ ＥＮＰＰ１－／－細胞系の構築。ａ、０、２０および８０ｎＭにおけるｃＧＡＭＰ；５００ｎＭにおける単一同位体標識内部標準ｃＧＡＭＰ（１５Ｄａ重い）；ならびに２μＭの二重同位体標識抽出標準ｃＧＡＭＰ（３０Ｄａ重い）の液体クロマトグラフィーのトレース。すべての分析対象の化学構造。ｂ、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって測定されるＡＴＰ濃度に対する細胞数の較正。平均値±標準誤差（ｎ＝２）。ｃ、ウエスタンブロットによって分析した、２９３Ｔ、２９３Ｔ ｃＧＡＳ ＥＮＰＰ１－／－および２９３Ｔ ｃＧＡＳ ＥＮＰＰ１ｌｏｗ細胞系のｃＧＡＳ発現量（左）。ＴＬＣおよびオートラジオグラフィーによって測定される、２９３Ｔ ｃＧＡＳ、２９３Ｔ ｃＧＡＳ ＥＮＰＰ１－／－および２９３Ｔ ｃＧＡＳ ＥＮＰＰ１ｌｏｗ細胞の各々の１００万個からの全細胞溶解物中の３２Ｐ－ｃＧＡＭＰのＥＮＰＰ１加水分解活性（右）。溶解物データは、２回の独立実験の代表である。ｄ、培地から精製した組換えマウスＥＮＰＰ１のクーマシーゲル；溶出フラクションは、使用前にプールした（左）。ＴＬＣによって分析したマウスＥＮＰＰ１による３２Ｐ－ｃＧＡＭＰ分解（右）。
図９のパネルＡ：ＣＤ１４＋ ＰＢＭＣは、細胞外ｃＧＡＭＰに応答する。ａ、細胞外ｃＧＡＭＰによるＣＤ１４＋ ＰＢＭＣの刺激の概略図。ｂ、１６時間、細胞外ｃＧＡＭＰの濃度を向上させて刺激したヒトＣＤ１４＋ ＰＭＢＣに関するＲＴ－ｑＰＣＲによって測定したＩＦＮＢ１誘発。平均値±標準誤差（ｎ＝２、技術的ｑＰＣＲ反復）。
ＥＮＰＰ１は、細胞外ｃＧＡＭＰのみを調節する
本発明者らは、２９３Ｔ細胞に由来するＥＮＰＰ１をノックアウトして、この細胞をＥＮＰＰ１不含培地中で培養すると、細胞外ｃＧＡＭＰを最初に観察することができたので、本発明者らは、次に、細胞外ｃＧＡＭＰしかＥＮＰＰ１によって調節されないかどうかを検討した。ＥＮＰＰ１は、その細胞外注釈があるにも関わらず、酵素であるＣＤ３８の場合のように膜表面の配向を反転させることができること（例えば、Zhao, Y. J., Lam, C. M. C. & Lee, H. C. The membrane-bound enzyme CD38 exists in two opposing orientations. Sci. Signal. 5, ra67 (2012)を参照されたい）、またはＥＮＰＰ１は、ＥＲルーメンにおいて合成されると活性化され得ること、およびｃＧＡＭＰはＥＲ膜を通過することができることが考えられる（図２のパネルＡ）。ＥＮＰＰ１活性の局在化を検討するために、本発明者らは、２９３Ｔ ｃＧＡＳ ＥＮＰＰ１－／－細胞にヒトＥＮＰＰ１発現プラスミドをトランスフェクトし、全細胞溶解物におけるその活性を確認した（図２のパネルＢ）。無傷細胞では、ＥＮＰＰ１発現は、細胞外ｃＧＡＭＰを枯渇させるが、細胞内ｃＧＡＭＰ濃度に影響を及ぼさない（図２のパネルＣ）。したがって、これらの細胞では、細胞外ｃＧＡＭＰはＥＮＰＰ１によって調節されるが、細胞内ｃＧＡＭＰは調節されない。
図２のパネルＡ～Ｃ：ＥＮＰＰ１は細胞外ｃＧＡＭＰのみを調節する。ａ、ＥＮＰＰ１活性の３つの可能な細胞位置。ｂ、２９３Ｔ ｃＧＡＳ ＥＮＰＰ１－／－細胞に、空のベクターまたはヒトＥＮＰＰ１を含有するベクターをトランスフェクトし、２４時間後にウエスタンブロットを使用して、ＥＮＰＰ１タンパク質発現量について（上）、および薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を使用してＥＮＰＰ１ ３２Ｐ－ｃＧＡＭＰ加水分解活性について（下）分析した。データは、２つの独立実験の代表である。ｃ、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して測定した細胞内および細胞外ｃＧＡＭＰ濃度。ＢＱＬ＝定量限界値未満。平均値±標準誤差（ｎ＝２）。＊＊Ｐ＝０．００２（スチューデントのｔ検定）。データは、３回の独立実験の代表である。
細胞非透過性ＥＮＰＰ１阻害剤の開発
細胞外ｃＧＡＭＰの生理的関連性、およびｃＧＡＭＰが特異的ヒドロラーゼによって調節される必要がある理由を検討するため、本発明者らは、ＥＮＰＰ１を薬理学的に阻害することによって、その濃度を操作しようとした。本発明者らは、非特異的ＥＮＰＰ１阻害剤であるＱＳ１を最初に試験した（図１０のパネルＡ）（Patel, S. D. et al. Quinazolin-4-piperidin-4-methyl sulfamide PC-1 inhibitors: Alleviating hERG interactions through structure based design. Bioorganic Med. Chem. Lett. 19, 3339-3343 (2009); and Shayhidin, E. E. et al. Quinazoline-4-piperidine sulfamides are specific inhibitors of human NPP1 and prevent pathological mineralization of valve interstitial cells. Br. J. Pharmacol. 172, 4189-4199 (2015)）。ＱＳ１は、ＥＮＰＰ１を過剰発現する細胞では、細胞外ｃＧＡＭＰ分解を阻害することができるが、これは、ＥＮＰＰ１ノックアウト細胞では、ｃＧＡＭＰの排出を部分的に遮断もした（図１０のパネルＢ）。ＱＳ１処置細胞により、細胞内ｃＧＡＭＰが向上し、排出は、がん細胞においてｃＧＡＭＰホメオスタシスを維持するための重要な機構であることをやはり実証している。排出遮断活性のために、本発明者らの排出検討では、細胞外ｃＧＡＭＰを検討するための手段としてＱＳ１が除外される。ホスホネートアナログである化合物１は、ＥＮＰＰ１触媒部位において、Ｚｎ２＋とキレート形成するよう、および細胞透過性を最小化するよう、および細胞内オフターゲットを回避するよう設計した（図３のパネルＡ）。化合物１は、１１０±１０ｎＭとなるＫｉ，ａｐｐを有し（図３のパネルＢ）、これは、ＱＳ１よりも約６０倍、強力である（図１０のパネルＡ）。
本発明者らは、３つの独立した透過性アッセイ：並行した人工膜透過性アッセイ（ＰＡＭＰＡ）（図１１のパネルＡ）；腸細胞Ｃａｃｏ－２透過性アッセイ（図１１のパネルＢ）；および上皮細胞ＭＤＣＫ透過性アッセイ（図１１のパネルＣ）を行うことによって、化合物１が細胞非透過性であることを確認した。高い細胞透過性および低い細胞透過性を有する対照化合物に比べると、化合物１は、３つのすべてのアッセイにおいて、非透過性化合物の分類に入る。さらに、化合物１は、密接に関連しているエクトヌクレオチダーゼであるアルカリホスファターゼ（Ｋｉ，ａｐｐ＞１００μＭ）およびＥＮＰＰ２（Ｋｉ，ａｐｐ＝５．５μＭ）に対する活性は低い（図１１のパネルＤ）。本発明者らは、化合物１は、その低い細胞透過性のために細胞内オフターゲットを有すると予期していないが、本発明者らは、４６８種のキナーゼのパネルに対するその結合を試験して、その特異性をさらに決定した。ＡＭＰに対して構造的類似性があるにもかかわらず、化合物１は、１μＭで２種のキナーゼにしか結合しない（図１１のパネルＥ）。化合物１はまた、ヒトとマウスとの両方の肝臓ミクロソームにおいて、高い安定性（ｔ１／２＞１５９分間）を示す。まとめると、本発明者らは、化合物１が強力な、細胞非透過性の特異的かつ安定なＥＮＰＰ１阻害剤であることを実証した。
次に、本発明者らは、ＥＮＰＰ１を過剰発現する２９３Ｔ ｃＧＡＳ細胞の細胞外ｃＧＡＭＰ濃度を維持する際の化合物１の有効性を測定して、３４０±１６０ｎＭとなるＩＣ５０値を得て（図３のパネルＣ）、細胞外ｃＧＡＭＰ分解を完全に遮断するのに１０μＭで十分であった（図３のパネルＤ）。ＱＳ１と異なり、化合物１は、細胞内ｃＧＡＭＰに影響を及ぼさず、化合物１は、ｃＧＡＭＰの排出に影響を及ぼさないことを実証した（図３のパネルＤ）。したがって、化合物１は、細胞外ｃＧＡＭＰ濃度を特異的に増大する、優れたＥＮＰＰ１阻害剤の手段化合物である。
最後に、本発明者らは、ＣＤ１４＋ ＰＢＭＣに対して検出可能な細胞外ｃＧＡＭＰシグナルの増強における化合物１の有効性を試験した。本発明者らは、化合物１が、使用した濃度では、ＰＢＭＣに対して毒性がないことを最初に確認した（図１１のパネルＦ）。ＥＮＰＰ１を過剰発現する２９３Ｔ ｃＧＡＳ細胞に由来する馴化培地は、ＣＤ１４＋細胞において、ＩＦＮＢ１発現を誘発できなかった（図３のパネルＥおよびＦ）。しかし、化合物１は、培地中の細胞外ｃＧＡＭＰレベル、およびＣＤ１４＋細胞におけるＩＦＮＢ１発現の誘発をレスキューした（図３のパネルＦ）。これらの結果は、膜貫通タンパク質としての潜在的な足場効果のない、ＥＮＰＰ１の酵素活性は、ＣＤ１４＋ ＰＢＭＣによる細胞外ｃＧＡＭＰへの応答を抑制することを実証している。まとめると、本発明者らのデータは、細胞外ｃＧＡＭＰレベルは、ＥＮＰＰ１発現によって低下し得ること、およびＥＮＰＰ１阻害によって向上し得ることを示唆しており、これらのことは、ＣＤ１４＋ ＰＢＭＣのｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性化に影響を及ぼす。
図３のパネルＡ～Ｆ：細胞非透過性ＥＮＰＰ１阻害剤の活性。ａ、化合物１の化学構造。ｂ、ｐＨ７．５における、基質としての３２Ｐ－ｃＧＡＭＰを有する精製マウスＥＮＰＰ１に対する化合物１の阻害活性（Ｋｉ，ａｐｐ＝１１０±１０ｎＭ）。可視化するには小さ過ぎるいくつかのエラーバーを伴う平均値±標準誤差（ｎ＝３の独立実験）。ｃ、２９３Ｔ ｃＧＡＳ ＥＮＰＰ１－／－細胞において一過的に発現されるヒトＥＮＰＰ１に対する化合物１の阻害活性（ＩＣ５０＝３４０±１６０ｎＭ）。平均値±標準誤差（ｎ＝２）。ｄ、１０μＭの化合物１の存在下または非存在下で、空のｐｃＤＮＡベクターまたはヒトＥＮＰＰ１を含有するベクターをトランスフェクトした２９３Ｔ ｃＧＡＳ ＥＮＰＰ１－／－細胞に関する細胞内および細胞外ｃＧＡＭＰ濃度。ＢＱＬ＝定量限界値未満。平均値±標準誤差（ｎ＝３）。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１（一元配置ＡＮＯＶＡ）。データは、２つの独立実験の代表である。ｅ、馴化培地実験の概略図。２９３Ｔ ｃＧＡＳ ＥＮＰＰ１ｌｏｗ細胞に、ヒトＥＮＰＰ１を含有するベクターをトランスフェクトし、化合物１の存在下または非存在下でインキュベートした。これらの細胞からの馴化培地を一次ＣＤ１４＋ヒトＰＢＭＣに移送した。ｆ、ＩＦＮＢ１ ｍＲＮＡレベルをＣＤ１４に正規化し、誘導倍率を未処置ＣＤ１４＋細胞と比較して計算した。平均値±標準誤差（ｎ＝２）。＊＊Ｐ＝０．００７（一元配置ＡＮＯＶＡ）。ｃＧＡＭＰ濃度は馴化培地中で測定した。平均値±標準誤差（ｎ＝２）。＊＊Ｐ＝０．００６（一元配置ＡＮＯＶＡ）。データは、２つの独立実験の代表である。
図１０のパネルＡ～Ｂ：ＱＳ１に比べた化合物１の改善。
ａ、ＱＳ１の構造、およびｐＨ７．５における、基質として３２Ｐ－ｃＧＡＭＰを用いる精製マウスＥＮＰＰ１に対するその阻害活性（化合物１との比較）（ＱＳ１ Ｋｉ，ａｐｐ＝６．４±３．２μＭ）。平均値±標準誤差（ｎ＝２独立実験）。ｂ、ＱＳ１の存在下または非存在下で、空のベクターまたはヒトＥＮＰＰ１を含有するベクターをトランスフェクトした２９３Ｔ ｃＧＡＳ ＥＮＰＰ１－／－細胞に関する細胞内、細胞外および全ｃＧＡＭＰ。平均値±標準誤差（ｎ＝２）。＊Ｐ＜０．０５。＊＊Ｐ＜０．０１（一元配置ＡＮＯＶＡ）。
図１１のパネルＡ～Ｆ：化合物１は、細胞非透過性で、ＥＮＰＰ１に特異的かつ非毒性である。ａ、人工膜透過性アッセイ（ＰＡＭＰＡ）における化合物１の透過性。ｂ、腸細胞Ｃａｃｏ－２アッセイにおける化合物１の透過性。ＰＡ＝ピーク面積、ＩＳ＝内部標準。化合物１、アテノロール（低い受動性透過性ネガティブ対照）およびプロプラノロール（高い受動性透過性ポジティブ対照）を含む化合物を、２時間、Ｃａｃｏ－２単層の頂端側でインキュベートした。基底外側にある化合物の濃度をＬＣ－ＭＳ／ＭＳによってモニタリングした。見かけ透過速度（Ｐａｐｐ）は、傾きから計算した。データは、２つの独立実験の代表である。ｃ、上皮細胞ＭＤＣＫ透過性アッセイにおける化合物１の透過性。ｄ、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰＬ）およびＥＮＰＰ２に対する、化合物１の阻害活性。平均値±標準誤差（ｎ＝２）。ｅ、対照の百分率としての、キナーゼ阻害を図示する化合物１に関するキノーム相互作用マップ（試験した４６８種のキナーゼ）。ＴＲＥＥｓｐｏｔ（商標）ソフトウェアツールを使用して生成し、ＫＩＮＯＭＥｓｃａｎ（登録商標）、ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの１部門ＤｉｓｃｏｖｅＲＸから許可を得て転載した画像。ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ２０１０（著作権）。ｆ、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏによって測定した細胞生存率。全ＰＢＭＣおよびＣＤ１４＋ ＰＢＭＣを化合物１と共に１６時間、インキュベートし、次に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏを使用してＡＴＰレベルについてアッセイした。データを化合物１がない場合に正規化し、％細胞生存率を計算した。
がん細胞は、培養物中でｃＧＡＳを発現して、ｃＧＡＭＰを連続的に排出する
細胞外ｃＧＡＭＰが、ｉｎ ｖｉｖｏでがん細胞により分泌される危険シグナルとして機能し得るかどうかを判定するため、本発明者らは、最初に、ｃＧＡＭＰを排出する腫瘍モデルを特定しようとした。本発明者らは、培養物中で、１つのヒト（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）および３つのマウスがん細胞系（Ｅ０７７１、ＭＣ３８、およびｉｎ ｖｉｖｏでのイメージングのためのルシフェラーゼを発現する４Ｔ１細胞系である４Ｔ１－Ｌｕｃ）を試験し、これらはすべて、ｃＧＡＳを発現する（図４のパネルＡ）。これらの細胞における細胞内ｃＧＡＭＰ濃度を検出することは困難である。しかし、余分の濃度および精製工程を使用して、本発明者らは、４Ｔ１－Ｌｕｃ細胞において、５．８×１０－１０ｎｍｏｌ／細胞（約１５０ｎＭ）の細胞内ｃＧＡＭＰを検出することができた（図４のパネルＢ）。ｓｈＲＮＡを使用してｃＧＡＳをノックダウンすると、ｃＧＡＳタンパク質レベルの低下をもたらして、細胞内ｃＧＡＭＰレベルが低下し、ｃＧＡＳ発現は、４Ｔ１－Ｌｕｃ細胞に存在するｃＧＡＭＰの量を制御することを実証している（図１２のパネルＡおよびＢ）。細胞培養培地において、細胞表面および可溶性ＥＮＰＰ１を阻害する化合物１を使用して、本発明者らは、これらの細胞系のすべてにおいて、連続的なｃＧＡＭＰ排出を検出し、細胞外ｃＧＡＭＰレベルは、４８時間で約６×１０－９ｎｍｏｌ／細胞（培地に希釈すると、約１０ｎＭ）に到達した（図４のパネルＣおよびＤ、ならびに図１２のパネルＣおよびＤ）。驚くべきことに、これは、細胞内に存在するｃＧＡＭＰの約１０倍の量であり、がん細胞は、そのｃＧＡＭＰを排出によって効率的に一掃することを示唆している。電離放射線（ＩＲ）は、腫瘍細胞において、サイトゾルＤＮＡを増加させて、ｃＧＡＳ依存的ＩＦＮ－β生成を活性化することができる（例えばBakhoum, S. F. et al. Numerical chromosomal instability mediates susceptibility to radiation treatment. Nat. Commun. 6, 1-10 (2015);およびVanpouille-Box, C. et al. DNA exonuclease Trex1 regulates radiotherapy-induced tumour immunogenicity. Nat. Commun. 8, 15618 (2017)を参照されたい）。実際に、ＩＲ処置によっても、２日後に４Ｔ１－Ｌｕｃ細胞において、細胞外ｃＧＡＭＰ生成が増大した（図４のパネルＥおよび図１２のパネルＥ）。まとめると、本発明者らのデータは、これらのがん細胞系は、ｃＧＡＭＰを絶えず生成して、これを効率的に排出し、ＩＲによって刺激されて、一層多くの細胞外ｃＧＡＭＰを生成することができることを実証している。
図４のパネルＡ～Ｅ：がん細胞は、培養物中でｃＧＡＳを発現して、ｃＧＡＭＰを連続的に排出する。ａ、ウエスタンブロットにより分析した４Ｔ１－Ｌｕｃ、Ｅ０７７１、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１およびＭＣ３８のｃＧＡＳ発現。ｂ、外因性刺激のない場合の、４Ｔ１－Ｌｕｃ細胞における細胞内ｃＧＡＭＰの濃度の推定。平均値±標準誤差（ｎ＝２）。ｃ、４８時間にわたる、ＭＣ３８細胞により生成される細胞外ｃＧＡＭＰ。時間０時において、５０μＭの化合物１を補給した培地を用いて細胞を新しくした。平均値±標準誤差（ｎ＝２）。データは、２つの独立実験の代表である。ｄ、５０μＭの化合物１の存在下、４８時間後に測定した、４Ｔ１－Ｌｕｃ、Ｅ０７７１およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞により生成した細胞外ｃＧＡＭＰ。ＢＱＬ＝定量限界値未満。平均値±標準誤差（ｎ＝２）。ｅ、４８時間にわたる、４Ｔ１－Ｌｕｃ細胞により生成される細胞外ｃＧＡＭＰ。時間０時において、細胞を未処置のまま放置するか、または２０Ｇｙ ＩＲにより処置し、５０μＭの化合物１を補給した培地で新しくした。平均値±標準誤差（ｎ＝２）。＊Ｐ＝０．０４（スチューデントのｔ検定）。
図１２のパネルＡ～Ｅ：がん細胞は、培養物中で、ｃＧＡＭＰを連続的に排出する。ａ、ウエスタンブロットによって分析した４Ｔ１－Ｌｕｃ ＷＴおよび４Ｔ１－Ｌｕｃ ｓｈｃＧＡＳ細胞系のｃＧＡＳ発現量。ｂ、外因性刺激のない、４Ｔ１－Ｌｕｃ ＷＴおよび４Ｔ１－Ｌｕｃ ｓｈｃＧＡＳ細胞系の細胞内ｃＧＡＭＰ。平均値±標準誤差（ｎ＝２）。４Ｔ１－Ｌｕｃ ＷＴのデータは、比較のため、図４のパネルｂからの再提示である。ｃ、図４のパネルｃに示されている実験の細胞外ｃＧＡＭＰ（培地濃度単位で図示）。ｄ、図４のパネルｄに示されている実験の細胞外ｃＧＡＭＰ（培地濃度単位で図示）。ＢＱＬ＝定量限界値未満。平均値±標準誤差（ｎ＝２）。ｅ、図４のパネルｃに示されている実験の細胞外ｃＧＡＭＰ（培地濃度単位で図示）。平均値±標準誤差（ｎ＝２）。＊＊Ｐ＝０．００４（スチューデントのｔ検定）。
細胞外ｃＧＡＭＰの隔離により、腫瘍ｃＧＡＳおよび宿主ＳＴＩＮＧに依存して、腫瘍関連樹状細胞が低下する
腫瘍では、細胞外空間は、細胞内空間の体積の０．３～０．８倍と推定される２８。しかし、細胞培養物では、細胞外空間の体積は、細胞内空間の体積の約２５０～１０００倍である。本発明者らは、１×１０６個の細胞あたり、培養培地１ｍＬを使用し、細胞体積は約１～４ｐＬと推定して、この計算を行う。したがって、本発明者らの細胞培養物の系は、腫瘍微小環境中と比べて、３００～３０００倍細胞外空間を希釈する。この希釈係数、およびｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてがん細胞により排出される細胞外ｃＧＡＭＰはナノモル濃度であるという本発明者らの測定値を考慮すると、本発明者らは、腫瘍微小環境における細胞外ｃＧＡＭＰは、腫瘍細胞の自然免疫認識をもたらし得る、マイクロモル濃度の範囲に到達し得ると予想する。本発明者らのｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞実験の限界を認識したので、本発明者らは、ｉｎ ｖｉｖｏ実験に戻り、細胞外ｃＧＡＭＰの役割を検討した（図５のパネルＡ）。最初に、本発明者らは、腫瘍細胞におけるｃＧＡＳをノックアウトすることによって、腫瘍対宿主ｃＧＡＭＰの重要性を判定しようとし（図１３のパネルＡ）、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドにおいて、ｃＧＡＳ－／－およびＳＴＩＮＧ－／－マウスを利用した。本発明者らはまた、細胞外ｃＧＡＭＰを特異的に隔離するための手段として、中和剤も開発した（図５のパネルＡ）。本発明者らは、ＳＴＩＮＧの可溶性サイトゾルドメインを利用し（図５のパネルＢ）、これは、Ｋｄ７３±１４ｎＭでｃＧＡＭＰに結合する（図５のパネルＣ）。本発明者らは、非結合性ＳＴＩＮＧ対照として、Ｒ２３７Ａ変異体ＳＴＩＮＧ（例えば、Gao, P. et al., Cell 154, 748-762 (2013)を参照されたい）も生成した（図５のパネルＢ～Ｄ）。細胞培養物中のこれらのタンパク質の中和有効性を試験するため、本発明者らは、ＣＤ１４＋ ＰＢＭＣを使用した。野生型（ＷＴ）ＳＴＩＮＧ（中和性ＳＴＩＮＧ）は、予期される２：１の化学量論で細胞外ｃＧＡＭＰを中和することが可能である一方、非結合性ＳＴＩＮＧは、２００倍高い濃度の場合でさえも効果がなかった（図５のパネルＥ）。
本発明者らは、マウスにおけるＥ０７７１同所性腫瘍を確立し、次いで、中和性ＳＴＩＮＧを腫瘍内注射を行って細胞外ｃＧＡＭＰを枯渇させて、腫瘍関連白血球を染色するために腫瘍を切除した。ＷＴ Ｅ０７７１腫瘍では、中和性ＳＴＩＮＧにより、全ＣＤ４５＋／ＭＨＣ－ＩＩ＋腫瘍関連抗原提示細胞（ＡＰＣ）集団において、ＣＤ１１ｃ＋樹状細胞集団が顕著に低下し、細胞外ｃＧＡＭＰは、免疫系によって検出され得ることを示唆する（図５のパネルＦおよびＧ、ならびに図１３のパネルＢ）。細胞外ｃＧＡＭＰの枯渇はまた、腫瘍がｃＧＡＳ－／－マウスにおいて成長すると、ＣＤ１１ｃ＋集団を減少させ、宿主細胞は、細胞外ｃＧＡＭＰ生成に有意に寄与しないことを示唆している（図５のパネルＧ、および図１３のパネルＢ）。対照的に、細胞外ｃＧＡＭＰの枯渇は、ｃＧＡＳ－／－ Ｅ０７７１細胞（複数のクローンをプールして、完全なノックアウトを実現したが、クローン効果を最小限にした）またはＳＴＩＮＧ－／－マウスを使用した場合、ＣＤ１１ｃ＋集団に影響を及ぼさなかった。これは、宿主細胞ではなく腫瘍細胞が、細胞外ｃＧＡＭＰの主要生産体であり、次に、細胞外ｃＧＡＭＰは、宿主ＳＴＩＮＧによって感知されることを実証している（図５のパネルＧおよび図１３のパネルＢ）。本発明者らはまた、ＢＡＬＢ／ｃバックグラウンドにおいて、同所性４Ｔ１－Ｌｕｃ腫瘍モデルを試験した。ｃＧＡＳおよびＳＴＩＮＧノックアウト株は、このバックグラウンドにおいて確立されなかったが、本発明者らは、４Ｔ１－Ｌｕｃ腫瘍においてｃＧＡＳをノックアウトした。ＣＤ４５＋／ＭＨＣ ＩＩ＋集団において、中和性ＳＴＩＮＧの、ＷＴ ４Ｔ１－Ｌｕｃ腫瘍への腫瘍内注射により、腫瘍関連ＣＤ１１ｃ＋集団が顕著に低下した（図５のパネルＨ、および図１３のパネルＣ）。対照的に、細胞外ｃＧＡＭＰの枯渇は、ｃＧＡＳ－／－ ４Ｔ１－Ｌｕｃ腫瘍には影響を及ぼさなかった（図５のパネルＨ、および図１３のパネルＣ）。本発明者らはまた、ｍＥＮＰＰ１タンパク質の腫瘍内注射によって細胞外ｃＧＡＭＰを枯渇し（図８のパネルＤ）、ＣＤ４５＋／ＭＨＣ ＩＩ＋集団において、ＣＤ１１ｃ＋細胞が低下することが再度、観察された（図５のパネルＩ、および図１３のパネルＤ）。本発明者らのＥ０７７１および４Ｔ１－Ｌｕｃモデルの結果は一緒に、腫瘍細胞によって生成した細胞外ｃＧＡＭＰは、宿主ＳＴＩＮＧに依存的であるが、宿主ｃＧＡＳに無関係に、自然免疫応答を活性化することを実証している。まとめると、本発明者らのデータは、がん細胞によって生成する細胞外ｃＧＡＭＰは、自然免疫応答を誘発する危険シグナルであることを実証している。
図５のパネルＡ～Ｉ：細胞外ｃＧＡＭＰの隔離により、腫瘍ｃＧＡＳおよび宿主ＳＴＩＮＧに依存的に、腫瘍関連樹状細胞が低下する。ａ、ｉｎ ｖｉｖｏで、細胞外ｃＧＡＭＰの役割を評価するための実験の段取り。ｂ、組換えマウスＷＴ ＳＴＩＮＧおよびＲ２３７Ａ ＳＴＩＮＧのクーマシーゲル。ｃ、プローブとして、放射標識した３５Ｓ－ｃＧＡＭＰを使用する、膜結合アッセイによって求めた、マウスＷＴ ＳＴＩＮＧ（中和性）およびＲ２３７Ａ ＳＴＩＮＧ（非結合性）のサイトゾルドメインの結合曲線。平均値±標準誤差（２つの独立実験からｎ＝２）。ｄ、Ｒ２３７をピンク色で強調したｃＧＡＭＰを有する複合体におけるマウスＷＴ ＳＴＩＮＧの結晶構造（ＰＤＢ ＩＤ ４ＬＯＪ）。ｅ、中和性ＳＴＩＮＧまたは非結合性ＳＴＩＮＧ（２μＭ～１００μＭ、２．５倍希釈液）の存在下で、２μＭのｃＧＡＭＰにより処置したＣＤ１４＋ ＰＢＭＣにおける、ＩＦＮＢ１ ｍＲＮＡの誘導倍率。平均値±標準誤差（ｎ＝２、技術的ｑＰＣＲ反復）。ｆ、ＷＴまたはｃＧＡＳ－／－Ｅ０７７１細胞（１×１０６）を、０日目にＷＴ、ｃＧＡＳ－／－またはＳＴＩＮＧ－／－ Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに同所的に注射した。中和性（ＷＴマウスｎ＝５；ｃＧＡＳ－／－マウス、ｎ＝５；ＳＴＩＮＧ－／－マウス、ｎ＝４）または非結合性ＳＴＩＮＧ（ＷＴマウス、ｎ＝５；ｃＧＡＳ－／－マウス、ｎ＝４；ＳＴＩＮＧ－／－マウス、ｎ＝５）を２日目に、腫瘍内注射した。３日目に、腫瘍を取得し、ＦＡＣＳにより分析した。試料をＦＳＣ－Ａ／ＳＳＣ－Ａ、シングレット（ＦＳＣ－Ｗ）、生細胞、ＣＤ４５＋、ＭＨＣ ＩＩ＋、ＣＤ１１ｃ＋集団における細胞表面でゲートした。ｇ、全ＡＰＣのＣＤ１１ｃ＋細胞の百分率。平均値±標準偏差。＊Ｐ＝０．０１５。＊＊Ｐ＝０．００８（ウェルチのｔ検定）。ｈ、ＷＴ ＢＡＬＢ／ｃＪマウスにおいて、ＷＴ（中和性ＳＴＩＮＧ、ｎ＝３；非結合性ＳＴＩＮＧ、ｎ＝２）またはｃＧＡＳ－／－ ４Ｔ１－Ｌｕｃ細胞（ｎ＝５）を用いて、（ｆ）および（ｇ）においてと同じ手順を行った。平均値±標準偏差。＊Ｐ＝０．０１１。（ウェルチのｔ検定）。ｉ、０日目に、ＷＴ ＢＡＬＢ／ｃＪマウスに４Ｔ１－Ｌｕｃ細胞（１×１０６）を同所的に注射した。２日目に、ＰＢＳ（ｎ＝５）または組換えマウスＥＮＰＰ１（ｍＥＮＰＰ１）（ｎ＝６）を腫瘍内注射した。３日目に、腫瘍を取得し、ＦＡＣＳにより分析した。平均値±標準偏差。＊Ｐ＝０．０３３。（ウェルチのｔ検定）。
図１３のパネルＡ～Ｄ：細胞外ｃＧＡＭＰの隔離により、腫瘍ｃＧＡＳおよび宿主ＳＴＩＮＧに依存的に、腫瘍関連樹状細胞が低下する。ａ、ＣＲＩＳＰＲノックアウトプールからサブクローニングした、Ｅ０７７１（左）および４Ｔ１－Ｌｕｃ（右）ｃＧＡＳ－／－細胞。Ｅ０７７１ ｃＧＡＳ－／－のサブクローン１、２、４、６、８および９は、マウスへの注射前にプールした。４Ｔ１－Ｌｕｃ ｃＧＡＳ－／－のサブクローン４、７および８は、マウスへの注射前にプールした。ｂ、図５ｇに示されている実験の幾何平均。平均値±標準偏差。＊Ｐ＝０．０４９（ＷＴ腫瘍／ＷＴ宿主）。＊Ｐ＝０．０１５（ＷＴ腫瘍／ｃＧＡＳ－／－宿主）。（ウェルチのｔ検定）。ｃ、図５ｈに示されている実験の幾何平均。平均値±標準偏差。＊＊Ｐ＝０．００９（ウェルチのｔ検定）。ｄ、図５ｉに示されている実験の幾何平均。平均値±標準偏差。＊Ｐ＜０．０１５（ウェルチのｔ検定）。
ＥＮＰＰ１活性を低下させることにより細胞外ｃＧＡＭＰを向上させると、樹状細胞浸潤が増加し、乳房腫瘍はさらに処置可能になる。
ＥＮＰＰ１は、一部の乳がんにおいて高度に発現され、そのレベルは、予後不良と相関づけられている（例えば、Lau, W. M. et al. Enpp1: A Potential Facilitator of Breast Cancer Bone Metastasis. PLoS One 8, 1-5 (2013); Takahashi, R. U. et al. Loss of microRNA-27b contributes to breast cancer stem cell generation by activating ENPP1. Nat. Commun. 6, 1-15 (2015);およびUmar, A. et al. Identification of a Putative Protein Profile Associated with Tamoxifen Therapy Resistance in Breast Cancer. Mol. Cell. Proteomics 8, 1278-1294 (2009)を参照されたい）。高いＥＮＰＰ１発現量は、乳がんが細胞外ｃＧＡＭＰを枯渇させて、免疫検出を抑制するために利用する機構となり得る。本発明者らは、３種のトリプルネガティブ乳がん細胞である４Ｔ１－Ｌｕｃ、Ｅ０７７１およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１におけるＥＮＰＰ１活性を測定し、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１および４Ｔ１－Ｌｕｃは、高いＥＮＰＰ１活性を示した（図１４のパネルＡ）。したがって、本発明者らは、腫瘍免疫検出、成長および処置に対する応答に及ぼすＥＮＰＰ１の効果をプローブするため、トリプルネガティブ転移性および同所性４Ｔ１－Ｌｕｃマウスモデルを選択する。
本発明者らは、最初に、腫瘍浸潤樹状細胞に及ぼすＥＮＰＰ１の影響を試験した。本発明者らは、４Ｔ１－Ｌｕｃ細胞におけるＥＮＰＰ１をノックアウトして、その酵素活性が欠如していることによってクローンを検証し（市販のＥＮＰＰ１抗体は、ノックアウトを検証するほど十分な感度がない）、複数のクローンをプールして、クローン効果を最小化した（図１４のパネルＢ）。４Ｔ１－Ｌｕｃ埋め込み後に、本発明者らは、ｃＧＡＭＰ生成を誘導するため、２０Ｇｙ ＩＲの線量で腫瘍を処置し、２４時間後に腫瘍を切除して、その腫瘍関連白血球組成を分析した。ＥＮＰＰ１－／－腫瘍は、ＷＴ腫瘍よりも大きな腫瘍関連ＣＤ１１ｃ＋集団を有する（図６のパネルＡおよび図１４のパネルＣ）。次に、本発明者らは、４Ｔ１－Ｌｕｃ腫瘍の免疫拒絶に及ぼすＥＮＰＰ１の影響を試験した。これは、腫瘍を埋め込んで２週間以内に肺に通常、転移する侵襲性腫瘍モデルである（Pulaski, B. A. & Ostrand-Rosenberg, S. Reduction of Established Spontaneous Mammary Carcinoma Metastases following Immunotherapy with Major Histocompatibility Complex Class II and B7.1 Cell-based Tumor Vaccines. Cancer Res. 58, 1486-1493 (1998)）。ＥＮＰＰ１－／－腫瘍が１００ｍｍ３に到達する前のこの腫瘍の初期腫瘍成長速度は、ＷＴ腫瘍と同じであり、このことは、本発明者らが、ゆっくりと成長するクローンを選択しなかったことを示唆している（図１４のパネルＤ）。しかし、確立されたＥＮＰＰ１－／－腫瘍は、侵襲性が低く（図６のパネルＢ）、ＩＲに対して一層の応答が高い（図６のパネルＢ）。ＩＲがない場合、適応免疫チェックポイント遮断薬である抗ＣＴＬＡ－４は、腫瘍の収縮に際し、ＥＮＰＰ１－／－と相乗作用しない（図１４のパネルＥおよびＦ）。顕著なことに、本発明者らは、ＩＲをｃＧＡＭＰ生成の誘導に使用すると、抗ＣＴＬＡ－４は、ＥＮＰＰ１－／－ 腫瘍を４０％治癒したが、ＷＴ腫瘍を何ら治癒しなかった（図６のパネルＣ）。細胞外ｃＧＡＭＰの直接的な腫瘍内注射は、ＷＴ腫瘍よりもＥＮＰＰ１－／－腫瘍において効果的であり、抗ＣＴＬＡ－４の存在なしにＩＲと相乗作用して、マウスの３０％を治癒する（図６のパネルＤ）。まとめると、ＥＮＰＰ１は、４Ｔ１－Ｌｕｃ腫瘍の自然免疫検出である細胞外ｃＧＡＭＰを抑制し、ＩＲへのその応答、および適応免疫チェックポイント遮断に負に影響を及ぼす。
図６のパネルＡ～Ｄ：ＥＮＰＰ１－／－腫瘍は、自然免疫浸潤を動員し、侵襲性が低く、かつＩＲおよび抗ＣＴＬＡ－４治療法への感受性がより高い。ａ、０日目に、ＷＴ ＢＡＬＢ／ｃＪマウスにＷＴまたはＥＮＰＰ１－／－４Ｔ１－Ｌｕｃ細胞（１×１０６）を同所的に注射した（各群について、ｎ＝５）。２日目に腫瘍を２０ＧｙのＩＲにより処置した。３日目に、腫瘍を取得し、ＦＡＣＳにより分析した。複数のＥＮＰＰ１－／－ ４Ｔ１－Ｌｕｃ細胞クローンをプールした後、注射し、クローン効果を最小限にした。＊＊Ｐ＝０．００８（ウェルチのｔ検定）。ｂ、確立したＷＴまたはＥＮＰＰ１－／－ ４Ｔ１－Ｌｕｃ腫瘍（１００±２０ｍｍ３）を０Ｇｙまたは２０ＧｙのＩＲで１回、処置し、次いでＩＲ後の２日目、５日目および７日目にＩｇＧの３回の腹腔内注射を行った（ＷＴ ４Ｔ１－Ｌｕｃの場合、ｎ＝９、ＥＮＰＰ１－／－ ４Ｔ１－Ｌｕｃの場合、ｎ＝１０）。腫瘍体積およびカプランマイヤー曲線を示す。２０日目にテューキーの調節を用いる事後検定（腫瘍体積）、およびログランクマンテル－コックス検定（カプランマイヤー）を使用して、一対比較によりＰ値を求めた。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。ｃ、確立したＷＴまたはＥＮＰＰ１－／－ ４Ｔ１－Ｌｕｃ腫瘍（１００±２０ｍｍ３）を０Ｇｙまたは２０ＧｙのＩＲで１回、処置し、次いで、ＩＲ後の２日目、５日目および７日目に抗ＣＴＬＡ－４の３回の腹腔内注射を行った（すべての群に関して、ｎ＝１０）。腫瘍体積およびカプランマイヤー曲線を示す。２０日目にテューキーの調節を用いる事後検定（腫瘍体積）、およびログランクマンテル－コックス検定（カプランマイヤー）を使用して、一対比較によりＰ値を求めた。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。ＥＮＰＰ１－／－ ４Ｔ１－Ｌｕｃ＋ＩＲ（２０）＋抗ＣＴＬＡ－４処置群において、４／１０（４０％）のマウスは、生物発光イメージングによって検証した腫瘍不含生存者である。ｄ、スクランブルｓｇＲＮＡ配列を感染させて確立した４Ｔ１－Ｌｕｃ腫瘍、またはＥＮＰＰ１－／－ ４Ｔ１－Ｌｕｃ腫瘍（１００±２０ｍｍ３）を２０ＧｙのＩＲで１回、処置し、次いで、ＩＲ後の２日目、４日目および７日目に１０μｇのｃＧＡＭＰの３回の腹腔内注射を行った（両群に関して、ｎ＝１０）。腫瘍体積およびカプランマイヤー曲線を示す。２０日目にテューキーの調節を用いる事後検定（腫瘍体積）、およびログランクマンテル－コックス検定（カプランマイヤー）を使用して、一対比較によりＰ値を求めた。＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。ＥＮＰＰ１－／－ ４Ｔ１－Ｌｕｃ＋ＩＲ（２０）ｃＧＡＭＰ処置群では、３／１０（３０％）のマウスは、生物発光イメージングによって検証した腫瘍不含生存者である。ｂ～ｄにおける異なる処置群からのマウスを共同収容し、実験者を盲検にした。
図１４のパネルＡ～Ｆ：確立されたＥＮＰＰ１－／－腫瘍は、腫瘍関連樹状細胞の増加をもたらし、侵襲性が低く、かつＩＲおよび抗ＣＴＬＡ－４治療法に感受性がより高い。ａ、３２Ｐ－ｃＧＡＭＰ分解アッセイを使用する、４Ｔ１－Ｌｕｃ、Ｅ０７７１およびＭＤＡ－ＭＢ２３１細胞におけるＥＮＰＰ１活性。データは、３回の独立実験の代表である。ｂ、３２Ｐ－ｃＧＡＭＰ分解アッセイを使用する、ＥＮＰＰ１－／－ ４Ｔ１－Ｌｕｃクローンの検証。異なるクローンに由来する溶解物をタンパク質濃度によって正規化した。マウスへの注射前に、ＥＮＰＰ１－／－ ４Ｔ１－Ｌｕｃ クローン２～６および１３～１８をプールした。ｃ、図６ａに示されている実験の幾何平均。平均値±標準偏差。＊Ｐ＝０．０１２（ウェルチのｔ検定）。ｄ、（左）処置した当日における、ＷＴ（ｎ＝５５）対ＥＮＰＰ１－／－（ｎ＝５５）４Ｔ１－Ｌｕｃ細胞の腫瘍体積；（右）腫瘍体積／１００ｍｍ３±２０ｍｍ３のサイズに到達するために必要な日数として表される、初期腫瘍成長速度。平均値±標準偏差（ウェルチのｔ検定）。ｅ、腫瘍を有するマウスの生物発光画像。ｆ、ＩｇＧと抗ＣＴＬＡ－４処置群との間の比較を強調するための、図６ａ、ｂに示されているデータの再プロット。腫瘍が必要なサイズに到達した後の、２日目、５日目および７日目に、確立したＷＴまたはＥＮＰＰ１－／－ ４Ｔ１－Ｌｕｃ腫瘍（１００±２０ｍｍ３）に、ＩｇＧまたは抗ＣＴＬＡ－４の３回の腹腔内注射により処置した（ＷＴ ４Ｔ１－Ｌｕｃ＋ＩｇＧの場合、ｎ＝９、すべての他の群に関してｎ＝１０）。腫瘍体積およびカプランマイヤー曲線を示す。２０日目にテューキーの調節を用いる事後検定（腫瘍体積）、およびログランクマンテル－コックス検定（カプランマイヤー）を使用して、一対比較によりＰ値を求めた。
本発明者らの遺伝的結果は、ＥＮＰＰ１が薬理学的阻害に対する潜在的標的であることを示唆している。本発明者らが開発したＥＮＰＰ１阻害剤である化合物１は、腫瘍内に注射されると、迅速なクリアランスを示す。本発明者らは、医薬品会社が通常、薬物開発の後期段階で通常行う、投与経路の広範囲な検討、および対応する製剤の最適化なしに、化合物１がｉｎ ｖｉｖｏで効果を有するかどうかを求めた。本発明者らは、ＩＲ処置直後に化合物１を腫瘍に注射し、２４時間後に、腫瘍関連ＣＤ１１ｃ＋集団が増加したことを観察した（図７のパネルＡおよび図１５）。驚くべきことに、化合物１は、ＩＲおよび抗ＣＴＬＡ－４と相乗作用し、１０％治癒率を実現した（図７のパネルＢ）。最後に、化合物１は、ＩＲおよびｃＧＡＭＰと相乗作用して腫瘍を収縮し、生存を延長し、１０％治癒率を実現したことが観察された（図７のパネルＣ）。まとめると、これらの結果は、ＥＮＰＰ１が、薬理学的な標的の対象となり、がんの自然免疫認識が増強され得ることを実証している。
図７のパネルＡ～Ｃ：ＥＮＰＰ１阻害は、ＩＲ処置および抗ＣＴＬＡ－４と相乗作用し、抗腫瘍作用を発揮する。ａ、０日目に、ＷＴ ＢＡＬＢ／ｃＪマウスに４Ｔ１－Ｌｕｃ細胞（１×１０６）を同所的に注射した。２日目に、腫瘍を２０ＧｙのＩＲにより処置し、ＰＢＳ（ｎ＝４）または化合物１（ｎ＝５）を腫瘍内注射した。３日目に腫瘍を取得し、ＦＡＣＳにより分析した。＊Ｐ＝０．０４７（ウェルチのｔ検定）。ｂ、確立された４Ｔ１－Ｌｕｃ腫瘍（１００±２０ｍｍ３）を２０ＧｙのＩＲにより一旦、処置し、次いで、２日目、４日目および７日目に、ＰＢＳまたは化合物１を３回腫瘍内注射し、２日目、５日目および７日目に抗ＣＴＬＡ－４の腹腔内注射を行った（すべての処置群あたり、ｎ＝１７～１９）。腫瘍体積およびカプランマイヤー曲線を示す。４０日目にテューキーの調節を用いる事後検定（腫瘍体積）、およびログランクマンテル－コックス検定（カプランマイヤー）を使用して、一対比較によりＰ値を求めた。ｃ、確立された４Ｔ１－Ｌｕｃ腫瘍（１００±２０ｍｍ３）を２０ＧｙのＩＲにより一旦、処置し、次いで、ＩＲ後の２日目、４日目および７日目に、ｃＧＡＭＰを単独で、またはｃＧＡＭＰ＋化合物１の３回腫瘍内注射を行った（処置群あたり、ｎ＝９）。腫瘍体積およびカプランマイヤー曲線を示す。４０日目にテューキーの調節を用いる事後検定（腫瘍体積）、およびログランクマンテル－コックス検定（カプランマイヤー）を使用して、一対比較によりＰ値を求めた。
図１５は、ＥＮＰＰ１阻害がＩＲ処置と相乗作用して、腫瘍関連樹状細胞を増加させることを示している。図７のパネルａに示されている実験の幾何平均。平均値±標準偏差。＊Ｐ＜０．０５（ウェルチのｔ検定）。
図１６：合成細胞から標的細胞へのｃＧＡＭＰ移行の様々な様式。（１）ギャップ結合による拡散；（２）出芽ウイルス粒子に包み込まれて、感染の次の段階の間に伝達される；および（３）細胞外空間への排出。
図１７：ｃＧＡＭＰはがん危険シグナルである。ＡＰＣは、様々なｃＧＡＳ依存機構によって腫瘍細胞を感知することができる：（１）腫瘍誘導性ｄｓＤＮＡによるＡＰＣ ｃＧＡＳの活性化、（２）腫瘍細胞によって分泌されたＩ型ＩＦＮのＡＰＣ感知、および（３）腫瘍細胞によって構成的に生成されて排出されたｃＧＡＭＰのＡＰＣ感知。
考察
本開示の結果は、ｃＧＡＭＰ排出の証拠を提示する。細胞－細胞ｃＧＡＭＰ移行は、ギャップ結合およびウイルス粒子により起こり得る。本開示は、ｃＧＡＭＰは細胞外空間を移動することができるというｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの証拠を提示している（例えば、図１６を参照されたい）。本発明者らが試験した細胞系のすべてが、外部刺激なしにｃＧＡＭＰを合成して排出するので、ｃＧＡＭＰの排出は、がん細胞の顕著な特徴である。染色体の不安定性および異常なサイトゾルｄｓＤＮＡは、腫瘍の固有の特性であると考えられ、腫瘍細胞はｃＧＡＳをほとんど不活性化しないので（例えば、Bakhoum, S. F. et al. Chromosomal instability drives metastasis through a cytosolic DNA response. Nature 553, 467-472 (2018)を参照されたい）、本発明者らは、持続的なｃＧＡＭＰ生成および排出はやはり、腫瘍細胞に固有の特性となり得ると結論付ける。サイトゾルｃＧＡＭＰヒドロラーゼは特定されておらず、ＥＮＰＰ１は、細胞内ｃＧＡＭＰを分解することができないので、排出は、現在のところ、ｃＧＡＭＰがサイトゾルから除去される唯一の機構であり、ユビキチン媒介性ＳＴＩＮＧ分解の他に、細胞内ＳＴＩＮＧシグナル伝達を停止する別の方法となる（例えば、Konno, H., Konno, K. & Barber, G. N. Cyclic dinucleotides trigger ULK1 (ATG1) phosphorylation of STING to prevent sustained innate immune signaling. Cell 155, 688-698 (2013)を参照されたい）。しかし、このクリアランス機構により、がん細胞は免疫検出に晒される。
実際に、本発明者らの結果は、がん細胞による排出されたｃＧＡＭＰは、免疫系により検出される危険シグナルであることを実証している。がん細胞に由来するネオアンチゲンは、ＡＰＣにより提示されて、最終的にがん特異的死滅を発揮する、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞をクロスプライミングする。しかし、ＡＰＣが最初にどのようにがん細胞を検出するかはそれほど理解されていない。免疫原性腫瘍は、ＡＰＣの重要なタイプである、ＣＤ１１ｃ＋樹状細胞に対する危険シグナルとしてｄｓＤＮＡを放出する（例えば、Xu, M. M. et al. Dendritic Cells but Not Macrophages Sense Tumor Mitochondrial DNA for Cross-priming through Signal Regulatory Protein a Signaling. Immunity 47, 363-373 (2017)を参照されたい）。さらに、がん細胞は、放射線照射によって誘導されるがん細胞自体のサイトゾルｄｓＤＮＡに応答して、危険シグナルとしてＩＦＮを生成する（Vanpouille-Box, C. et al. DNA exonuclease Trex1 regulates radiotherapy-induced tumour immunogenicity. Nat. Commun. 8, 15618 (2017)）。腫瘍ｃＧＡＳの触媒活性は、Ｂ１６黒色腫モデルにおいて、宿主ＳＴＩＮＧ依存的に、腫瘍免疫と相関し（例えば、Marcus, A. et al. Tumor-Derived cGAMP Triggers a STING-Mediated Interferon Response in Non-tumor Cells to Activate the NK Cell Response. Immunity 49, 754-763.e4 (2018)を参照されたい）、ｃＧＡＭＰは、未知の機構で、腫瘍細胞から宿主細胞に移行され得ることを示唆している。ここで、本発明者らは、がん細胞は、危険シグナルとして可溶性細胞外ｃＧＡＭＰを生成し、これにより、腫瘍微小環境において、樹状細胞数の増加がもたらされるという直接的な証拠を提示する（図１７）。ｃＧＡＭＰ排出は、物理的に連絡されていないが、近接状態にある、細胞間のｃＧＡＭＰ連絡の重要な様式である。サイトカインとは異なり、ｃＧＡＭＰは、分解されることなく、および／またはその有効な濃度未満に希釈されることなく、細胞外空間において長い距離を移動することができない。この特性は神経伝達物質と共有され、ｃＧＡＭＰを最初に特定された免疫伝達物質と認定する。
したがって、細胞外空間へのｃＧＡＭＰの放出は、がんがｃＧＡＭＰを迅速に一掃することができない場合、がんの弱点となる。本発明者らは、ＥＮＰＰ１は、マウスにおいて、細胞外ｃＧＡＭＰシグナル伝達をｉｎ ｖｉｔｒｏで、およびその下流での抗がん免疫活性化を負に調節することを実証する。腫瘍由来の可溶性ｃＧＡＭＰは、自由に拡散可能であるため、１つの細胞表面におけるＥＮＰＰ１の過剰発現は、微小環境の近傍において確実にｃＧＡＭＰを一掃し、その近傍に適応する。ヒトでは、乳がんにおけるＥＮＰＰ１発現レベルは、薬物耐性（例えば、Umar, A. et al. Mol. Cell. Proteomics 8, 1278-1294 (2009)を参照されたい）、骨腫瘍転移（例えば、Lau, W. M. et al. PLoS One 8, 1-5 (2013)を参照されたい）および予後不良に相関づけられている（Takahashi, R. U. et al. Nat. Commun. 6, 1-15 (2015)）。ＥＮＰＰ１は、がん免疫療法での用途に対する自然免疫チェックポイントとして阻害の標的対象となり得る。
前述の発明は、理解を明確にするため、例示および実施例によって一部詳細に記載されているが、本発明の教示と照らし合わせると、添付の特許請求の範囲の趣旨または範囲から逸脱することなく、そのある種の変更および修正がなされ得ることが当業者には容易に明らかである。
したがって、前述のことは、単に、本発明の原理を例示しているに過ぎない。当業者は、本明細書において明確に記載または示されてはいないが、本発明の原理を具現化し、かつその趣旨および範囲内に含まれる様々な配置を考案することができることが理解されよう。さらに、本明細書において記載されているすべての例および条件付き語句は、読み手が本発明の原理および本発明者らによる当技術の促進に寄与される概念を理解する一助となることが主に意図されており、このような具体的に記載されている例および条件に限定されないものとして解釈されるべきである。さらに、本発明の原理、態様および実施形態、ならびにそれらの具体例を記載している本明細書におけるすべての記述は、それらの構造的等価物および機能的等価物の両方を包含することが意図されている。さらに、このような等価物は、現在公知の等価物および将来に開発される等価物の両方、すなわち、構成に関わりなく、同じ機能を発揮する開発された任意の要素を含むことが意図されている。したがって、本発明の範囲は、本明細書に示されて記載されている例示的な実施形態に限定されることを意図するものではない。むしろ、本発明の範囲および趣旨は、以下によって具現化される。
したがって、本発明の範囲は、本明細書に示されて記載されている例示的な実施形態に限定されることを意図するものではない。むしろ、本発明の範囲および趣旨は、添付の特許請求の範囲によって具現化されている。特許請求の範囲において、米国特許法第１１２条第（ｆ）項または米国特許法第１１２条第（６）項は、請求項における限定の始めに正確な語句「のための手段」または正確な語句「のステップ」が記載されている場合にのみ、請求項におけるこのような限定に対して想起されると明示的に定義されている。このような正確な語句が、請求項における限定に使用されない場合、米国特許法第１１２条第（ｆ）項または米国特許法第１１２条第（６）項は、発動されない。

Claims (90)

  1. 式（Ｉ）の化合物：
    Figure 2022523105000135
     ［式中、
    Ｘ１は、親水性頭部基（例えば、亜鉛イオンと結合することが可能なリン含有基）であり、
    Ａは、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、複素環および置換複素環から選択される環系であり、
    Ｌ１およびＬ２は、独立して、共有結合またはリンカーであり、
    Ｚ３は、存在しないか、またはＮＲ２２、ＯおよびＳから選択され、
    Ｚ２は、ＣＲ１２またはＮであり、
    Ｚ１は、ＣＲ１１またはＮであり、
    Ｒ１は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキルアリール、置換アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、置換アルキルヘテロアリール、アルケニルアリール（例えば、エテニルアリール）、置換アルケニルアリール、アルケニルヘテロアリール（例えば、エテニルヘテロアリール）、置換アルケニルヘテロアリール、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環および置換複素環から選択され、
    Ｒ１１およびＲ１２は、Ｈ、シアノ、トリフルオロメチル、ハロゲン、アルキルおよび置換アルキルから独立して選択され、
    Ｒ２２は、Ｈ、アルキルおよび置換アルキルから選択され、
    Ｒ２～Ｒ５は、Ｈ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、－ＯＣＦ３、ハロゲン、シアノ、アミン、置換アミン、アミド、複素環および置換複素環から独立して選択されるか、またはＲ２とＲ３、Ｒ３とＲ４もしくはＲ４とＲ５は、それらが結合している炭素原子と一緒になって、複素環、置換複素環、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリールおよび置換アリールから選択される縮合環（例えば、５員または６員の単環式環）をもたらす］
    またはそのプロドラッグ、薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物。
  2. 前記化合物が、式（ＩＩ）：
    Figure 2022523105000136
     ［式中、Ｚ３１は、ＮＲ２２、ＯおよびＳから選択される］
    のものである、請求項１に記載の化合物。
  3. Ｚ３１が、ＮＲ２２であり、
    Ｒ２２が、Ｈ、Ｃ（１～６）アルキルおよび置換Ｃ（１～６）アルキルから選択される、
    請求項２に記載の化合物。
  4. 前記化合物が、式（ＩＩＩ）：
    Figure 2022523105000137
     ［式中、Ｒ３１～Ｒ３４はそれぞれ、Ｈ、ハロゲン、アルキルおよび置換アルキルから独立して選択されるか、またはＲ３１とＲ３２もしくはＲ３３とＲ３４は、環式連結しており、それらが結合している炭素原子と一緒になって、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクリルまたは置換ヘテロシクリル環をもたらし、
    ｎおよびｍは、それぞれ独立して、０～６の整数（例えば、０～３）である］
    のものである、請求項２または３に記載の化合物。
  5. ｎ＋ｍが０～３（例えば、０、１、２または３）である、請求項４に記載の化合物。
  6. 前記環系Ａが、フェニル、置換フェニル、ピリジル、置換ピリジル、ピリミジン、置換ピリミジン、ピペリジン、置換ピペリジン、ピペラジン、置換ピペラジン、ピリダジン、置換ピリダジン、シクロヘキシルおよび置換シクロヘキシルから選択される、請求項１から５のいずれか一項に記載の化合物。
  7. 前記環系Ａが、以下：
    Figure 2022523105000138
     ［式中、
    Ｚ５は、ＮおよびＣＲ６から選択され、
    Ｒ６はそれぞれ、水素、アルキル、置換アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、置換アルコキシ、トリフルオロメチル、ハロゲン、アシル、置換アシル、カルボキシ、カルボキシアミド、置換カルボキシアミド、スルホニル、置換スルホニル、スルホンアミドおよび置換スルホンアミドから選択され、
    ｐは、０～４の整数であり、
    ｑは、０～２の整数である］
    から選択される、請求項６に記載の化合物。
  8. 前記化合物が、式（ＩＶ）：
    Figure 2022523105000139
     ［式中、
    Ｚ１１およびＺ２１は、ＮおよびＣ（ＣＮ）から独立して選択され、
    Ｒ６はそれぞれ、Ｈ、アルキル、置換アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、置換アルコキシ、トリフルオロメチルおよびハロゲンから独立して選択され、
    ｐは、０～４の整数である］
    のものである、請求項４から７のいずれか一項に記載の化合物。
  9. 前記化合物が、式（Ｖ）：
    Figure 2022523105000140
     ［式中、
    Ｒ４１～Ｒ４４は、水素、アルキル、置換アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、置換アルコキシ、トリフルオロメチル、ハロゲン、アシル、置換アシル、カルボキシ、カルボキシアミド、置換カルボキシアミド、スルホニル、置換スルホニル、スルホンアミドおよび置換スルホンアミドから独立して選択される］
    のものである、請求項８に記載の化合物。
  10. 前記化合物が、式（ＶＩａ）～（ＶＩｂ）のうちの１つ：
    Figure 2022523105000141
     のものである、請求項９に記載の化合物。
  11. Ｒ１が、Ｈ、アルキルアリール、置換アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、置換アルキルヘテロアリール、アルケニルアリール（例えば、エテニルアリール）、置換アルケニルアリール、アルケニルヘテロアリール（例えば、エテニルヘテロアリール）、置換アルケニルヘテロアリール、アリール、置換アリール、ヘテロアリールおよび置換ヘテロアリールから選択される、請求項１から１０のいずれか一項に記載の化合物。
  12. Ｒ１が、Ｈ、エテニルアリール、置換エテニルアリール、エテニルヘテロアリールおよび置換エテニルヘテロアリールから選択される、請求項１１に記載の化合物。
  13. 前記化合物が、式（ＶＩＩａ）～（ＶＩＩｂ）のうちの１つ：
    Figure 2022523105000142
     のものである、請求項１０に記載の化合物。
  14. Ｒ２～Ｒ５が、Ｈ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、－ＯＣＦ３、ハロゲン、シアノ、アミン、置換アミン、アミド、複素環および置換複素環から独立して選択される、請求項１から１３のいずれか一項に記載の化合物。
  15. Ｒ２～Ｒ５が、Ｈ、ＯＨ、Ｃ（１～６）アルコキシ、－ＯＣＦ３、Ｃ（１～６）アルキルアミノ、ジ－Ｃ（１～６）アルキルアミノ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＣＮから独立して選択される、請求項１４に記載の化合物。
  16. Ｒ３およびＲ４が、独立して、アルコキシであり、
    Ｒ２およびＲ５が、水素である、
    請求項１４に記載の化合物。
  17. Ｒ３が、アルコキシであり、
    Ｒ２、Ｒ４およびＲ５が、水素である、
    請求項１４に記載の化合物。
  18. Ｒ４が、アルコキシであり、
    Ｒ２、Ｒ３およびＲ５が、水素である、
    請求項１４に記載の化合物。
  19. Ｒ２、Ｒ３およびＲ４が、Ｈであり、
    Ｒ５が、アルコキシである、
    請求項１４に記載の化合物。
  20. ｎが０であり、ｍが１である、請求項４から１９のいずれか一項に記載の化合物。
  21. ｎが１であり、ｍが０である、請求項４から１９のいずれか一項に記載の化合物。
  22. ｎおよびｍがどちらも１である、請求項４から１９のいずれか一項に記載の化合物。
  23. ｎおよびｍがどちらも０である、請求項４から１９のいずれか一項に記載の化合物。
  24. Ｚ３が存在せず、Ｚ２がＣＲ１２であり、Ｒ１２がシアノであり、前記化合物が、式（Ｘ）：
    Figure 2022523105000143
     ［式中、Ｌ１１およびＬ１２は、独立して、共有結合またはリンカーである］
    のものである、請求項１に記載の化合物。
  25. 前記環系Ａが、フェニル、置換フェニル、ピリジル、置換ピリジル、ピリミジン、置換ピリミジン、ピペリジン、置換ピペリジン、ピペラジン、置換ピペラジン、ピリダジン、置換ピリダジン、シクロヘキシルおよび置換シクロヘキシルから選択される、請求項２４に記載の化合物。
  26. 前記化合物が、式（ＸＩ）：
    Figure 2022523105000144
     ［式中、
    Ｚ５はそれぞれ、ＮおよびＣＲ１６から独立して選択され、
    Ｒ１６はそれぞれ、水素、アルキル、置換アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、置換アルコキシ、トリフルオロメチル、ハロゲン、アシル、置換アシル、カルボキシ、カルボキシアミド、置換カルボキシアミド、スルホニル、置換スルホニル、スルホンアミドおよび置換スルホンアミドから独立して選択され、
    ｒは、０～８の整数である］
    のものである、請求項２４または２５に記載の化合物。
  27. 前記化合物が、式（ＸＩＩ）：
    Figure 2022523105000145
     のものである、請求項２６に記載の化合物。
  28. Ｚ５がＮである、請求項２７に記載の化合物。
  29. 前記化合物が、式（ＸＩＩＩ）：
    Figure 2022523105000146
     ［式中、ｓは０～６の整数（例えば、０～３）である］
    のものである、請求項２８に記載の化合物。
  30. 前記化合物が、式（ＸＩＶ）：
    Figure 2022523105000147
     のものである、請求項２９に記載の化合物。
  31. Ｒ２～Ｒ５が、Ｈ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、－ＯＣＦ３、ハロゲン、シアノ、アミン、置換アミン、アミド、複素環および置換複素環から独立して選択される、請求項２４から３０のいずれか一項に記載の化合物。
  32. Ｒ２～Ｒ５が、Ｈ、ＯＨ、Ｃ（１～６）アルコキシ、－ＯＣＦ３、Ｃ（１～６）アルキルアミノ、ジ－Ｃ（１～６）アルキルアミノ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＣＮから独立して選択される、請求項３１に記載の化合物。
  33. Ｒ３およびＲ４が、独立して、アルコキシであり、
    Ｒ２およびＲ５が、水素である、
    請求項３１に記載の化合物。
  34. Ｒ３が、アルコキシであり、
    Ｒ２、Ｒ４およびＲ５が、水素である、
    請求項３１に記載の化合物。
  35. Ｒ４が、アルコキシであり、
    Ｒ２、Ｒ３およびＲ５が、水素である、
    請求項３１に記載の化合物。
  36. Ｒ２、Ｒ３およびＲ４が、Ｈであり、
    Ｒ５が、アルコキシである、
    請求項３１に記載の化合物。
  37. ｓが１である、請求項２９から３６のいずれか一項に記載の化合物。
  38. ｓが２である、請求項２９から３６のいずれか一項に記載の化合物。
  39. ｓが３である、請求項２９から３６のいずれか一項に記載の化合物。
  40. Ｘ１が、亜鉛イオンに結合することが可能な荷電リン含有基をマスクするプロ部分を含む、請求項１から３９のいずれか一項に記載の化合物。
  41. Ｘ１が、ホスホン酸、ホスホネート、ホスホン酸エステル、ホスフェート、リン酸エステル、チオホスフェート、チオリン酸エステル、ホスホロアミデートおよびチオホスホロアミデートから選択される、請求項４１から４０のいずれか一項に記載の化合物。
  42. Ｘ１が、式（ＸＶ）：
    Figure 2022523105000148
     ［式中、
    Ｚ６は、存在しないか、またはＯおよびＣＨ２から選択され、
    Ｚ７およびＺ９は、ＯおよびＮＲ１０からそれぞれ独立して選択され、Ｒ１０は、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルであり、
    Ｚ８は、ＯおよびＳから選択され、
    Ｒ８およびＲ９は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アシル、置換アシル、非芳香族複素環、置換非芳香族複素環、シクロアルキル、置換シクロアルキルおよびプロ部分からそれぞれ独立して選択される］
    のものである、請求項１から４１のいずれか一項に記載の化合物。
  43. Ｘ１が、式（ＸＶａ）～（ＸＶｆ）のいずれか１つ：
    Figure 2022523105000149
     ［式中、
    Ｒ１０およびＲ１１は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アシル、置換アシルおよびプロ部分からそれぞれ独立して選択される］
    から選択される、請求項４２に記載の化合物。
  44. Ｘ１が、以下：
    Figure 2022523105000150
     から選択される、請求項４３に記載の化合物、または薬学的に許容されるその塩。
  45. 前記化合物が、以下の構造：
    Figure 2022523105000151
     から選択される、請求項１３に記載の化合物。
  46. 前記化合物が、以下の構造：
    Figure 2022523105000152
    Figure 2022523105000153
     から選択される、請求項３０に記載の化合物。
  47. ＥＮＰＰ１機能を阻害する手段、および
    薬学的に許容される賦形剤
    を含む、医薬組成物。
  48. ＥＮＰＰ１機能を阻害する前記手段が、請求項１から４６のいずれか一項に記載のＥＮＰＰ１阻害剤である、請求項４７に記載の医薬組成物。
  49. がんの処置に使用するための医薬組成物であって、
    請求項１から４６のいずれか一項に記載のＥＮＰＰ１阻害剤、および
    薬学的に許容される賦形剤
    を含む、医薬組成物。
  50. ＥＮＰＰ１を阻害する方法であって、
    ＥＮＰＰ１を含む試料に、請求項１から４６のいずれか一項に記載のＥＮＰＰ１阻害剤を接触させて、前記ＥＮＰＰ１のｃＧＡＭＰ加水分解活性を阻害するステップ
    を含む、方法。
  51. 前記ＥＮＰＰ１阻害剤が、細胞非透過性である、請求項５０に記載の方法。
  52. 前記ＥＮＰＰ１阻害剤が、細胞透過性である、請求項５０に記載の方法。
  53. 前記試料が細胞試料である、請求項５０から５２のいずれか一項に記載の方法。
  54. 前記試料がｃＧＡＭＰを含む、請求項５３に記載の方法。
  55. ｃＧＡＭＰレベルが、前記細胞試料中で向上している（例えば、前記ＥＮＰＰ１阻害剤と接触していない対照試料との比較）、請求項５４に記載の方法。
  56. がんを処置する方法であって、
    がんを有する被験体に、治療有効量の請求項１から４６のいずれか一項に記載のＥＮＰＰ１阻害剤を投与して、前記被験体のがんを処置するステップ
    を含む、方法。
  57. がんを処置する方法であって、
    がんを有する被験体に、治療有効量のＥＮＰＰ１機能を阻害する手段を投与して、前記被験体のがんを処置するステップ
    を含む、方法。
  58. 前記がんが固形腫瘍がんである、請求項５６または５７に記載の方法。
  59. 前記がんが、副腎、肝臓、腎臓、膀胱、乳房、結腸、胃、卵巣、子宮頸部、子宮、食道、結腸直腸、前立腺、膵臓、肺（小細胞と非小細胞の両方）、甲状腺、癌腫、肉腫、神経膠芽腫、黒色腫および様々な頭頸部腫瘍から選択される、請求項５６から５８のいずれか一項に記載の方法。
  60. 前記がんが乳がんである、請求項５９に記載の方法。
  61. 前記がんがリンパ腫である、請求項５６または５７に記載の方法。
  62. 前記がんが神経膠芽腫である、請求項５９に記載の方法。
  63. 有効量の１種または複数種の追加の活性剤を前記被験体に投与するステップをさらに含む、請求項５６から６２のいずれか一項に記載の方法。
  64. 前記１種または複数種の追加の活性剤が、化学療法剤または免疫治療剤である、請求項６３に記載の方法。
  65. 前記１つまたは複数の追加の活性剤が、低分子、抗体、抗体断片、抗体－薬物コンジュゲート、アプタマーまたはタンパク質である、請求項６３または６４に記載の方法。
  66. 前記１つまたは複数の追加の活性剤が、チェックポイント阻害剤を含む、請求項６３から６５のいずれか一項に記載の方法。
  67. 前記チェックポイント阻害剤が、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ－４）阻害剤、プログラム死１（ＰＤ－１）阻害剤およびＰＤ－Ｌ１阻害剤から選択される、請求項６６に記載の方法。
  68. 前記１つまたは複数の追加の活性剤が、化学療法剤を含む、請求項６３から６５のいずれか一項に記載の方法。
  69. 前記化学療法剤が、ｃＧＡＭＰ誘導化学療法剤である、請求項６８に記載の方法。
  70. ｃＧＡＭＰ誘導化学療法剤が、前記被験体におけるｃＧＡＭＰの生成を誘導するのに有効な量で投与される抗有糸分裂剤または抗腫瘍剤である、請求項６９に記載の方法。
  71. 前記被験体に放射線療法を投与するステップをさらに含む、請求項５６から７０のいずれか一項に記載の方法。
  72. 前記阻害剤が放射線療法の前に前記被験体に投与される、請求項７１に記載の方法。
  73. 前記阻害剤が、放射線療法への前記被験体の曝露後に投与される、請求項７１に記載の方法。
  74. 前記放射線療法が前記被験体におけるｃＧＡＭＰの生成を誘導する、請求項７２または７３に記載の方法。
  75. 前記放射線療法が、前記被験体への放射線損傷を軽減するのに有効な程度の投与量および／または頻度で投与される、請求項７１から７４のいずれか一項に記載の方法。
  76. 前記ＥＮＰＰ１阻害剤が細胞非透過性である、請求項５６から７５のいずれか一項に記載の方法。
  77. 前記ＥＮＰＰ１阻害剤が細胞透過性である、請求項５６から７５のいずれか一項に記載の方法。
  78. がんを処置する際に使用するための、請求項１から４６のいずれか一項に記載のＥＮＰＰ１阻害剤。
  79. がんを処置するための医薬の製造における、請求項１から４６のいずれか一項に記載のＥＮＰＰ１阻害剤の使用。
  80. 被験体における、免疫応答をモジュレートする方法であって、
    治療有効量の請求項１から４６のいずれか一項に記載のＥＮＰＰ１阻害剤を被験体に投与して、前記被験体の炎症状態を処置するステップ
    を含む、方法。
  81. 被験体における、免疫応答をモジュレートする方法であって、
    被験体に治療有効量のＥＮＰＰ１機能を阻害するための手段を投与して、前記被験体の炎症状態を処置するステップ
    を含む、方法。
  82. Ｚ３が存在せず、Ｚ２がＣＲ１２であり、Ｒ１２がシアノ、ハロゲンまたはＮＨであり、前記化合物が、式（Ｘ）：
    Figure 2022523105000154
     ［式中、Ｌ１１およびＬ１２は、独立して、共有結合またはリンカーである］
    のものである、請求項１に記載の化合物。
  83. 前記環系Ａが、フェニル、置換フェニル、ピリジル、置換ピリジル、ピリミジン、置換ピリミジン、ピペリジン、置換ピペリジン、ピペラジン、置換ピペラジン、ピリダジン、置換ピリダジン、シクロヘキシルおよび置換シクロヘキシルから選択される、請求項８２に記載の化合物。
  84. 前記化合物が、式（ＸＩ）：
    Figure 2022523105000155
     ［式中、
    Ｚ５はそれぞれ、ＮおよびＣＲ１６から独立して選択され、
    Ｒ１６はそれぞれ、水素、アルキル、置換アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、置換アルコキシ、トリフルオロメチル、ハロゲン、アシル、置換アシル、カルボキシ、カルボキシアミド、置換カルボキシアミド、スルホニル、置換スルホニル、スルホンアミドおよび置換スルホンアミドから独立して選択され、
    ｒは、０～８の整数である］
    のものである、請求項８２または８３に記載の化合物。
  85. 前記化合物が、式（ＸＩＩ）：
    Figure 2022523105000156
     のものである、請求項８２に記載の化合物。
  86. Ｚ５がＮである、請求項８５に記載の化合物。
  87. 前記化合物が、式（ＸＩＩＩ）：
    Figure 2022523105000157
     ［式中、ｓは０～６の整数（例えば、０～３）である］
    のものである、請求項８４に記載の化合物。
  88. 前記化合物が、式（ＸＩＶ）：
    Figure 2022523105000158
     のものである、請求項８４に記載の化合物。
  89. Ｒ２～Ｒ５が、Ｈ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、－ＯＣＦ３、ハロゲン、シアノ、アミン、置換アミン、アミド、複素環および置換複素環から独立して選択される、請求項８２から８７のいずれか一項に記載の化合物。
  90. Ｒ２～Ｒ５が、Ｈ、ＯＨ、Ｃ（１～６）アルコキシ、－ＯＣＦ３、Ｃ（１～６）アルキルアミノ、ジ－Ｃ（１～６）アルキルアミノ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＣＮから独立して選択される、請求項８９に記載の化合物。

JP2021544572A 2019-02-01 2020-01-30 免疫応答をモジュレートするｅｎｐｐ１阻害剤および方法 Pending JP2022523105A (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962800283P 2019-02-01 2019-02-01
US62/800,283 2019-02-01
US201962814745P 2019-03-06 2019-03-06
US62/814,745 2019-03-06
PCT/US2020/015968 WO2020160333A1 (en) 2019-02-01 2020-01-30 Enpp1 inhibitors and methods of modulating immune response

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2022523105A true JP2022523105A (ja) 2022-04-21
JPWO2020160333A5 JPWO2020160333A5 (ja) 2022-12-28

Family

ID=71842335

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2021544572A Pending JP2022523105A (ja) 2019-02-01 2020-01-30 免疫応答をモジュレートするｅｎｐｐ１阻害剤および方法

Country Status (17)

Country Link
US (1) US20220289775A1 (ja)
EP (1) EP3917536A4 (ja)
JP (1) JP2022523105A (ja)
KR (1) KR20210124265A (ja)
CN (1) CN113677350A (ja)
AU (1) AU2020214628A1 (ja)
BR (1) BR112021015098A2 (ja)
CA (1) CA3128044A1 (ja)
CL (1) CL2021002002A1 (ja)
CO (1) CO2021010186A2 (ja)
IL (1) IL284961A (ja)
MA (1) MA54879A (ja)
MX (1) MX2021009269A (ja)
PE (1) PE20212306A1 (ja)
SG (1) SG11202108288YA (ja)
TW (1) TW202214571A (ja)
WO (1) WO2020160333A1 (ja)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL302338A (en) 2017-09-08 2023-06-01 Univ Leland Stanford Junior ENPP1 inhibitors and their use for cancer treatment
WO2020140001A1 (en) * 2018-12-28 2020-07-02 Riboscience Llc Quinazoline derivatives as ectonucleotide pyrophosphatase phosphodiesterase 1 inhibitors
CN115151253A (zh) * 2019-09-23 2022-10-04 南京征祥医药有限公司 磷酸二酯酶抑制剂及用途
EP4146269A1 (en) * 2020-05-04 2023-03-15 Angarus Theraeutics, Inc. Enpp1 inhibitors and methods of modulating immune response
US11780849B2 (en) 2020-05-04 2023-10-10 Volastra Therapeutics, Inc. Imino sulfanone inhibitors of ENPP1
WO2022125614A1 (en) * 2020-12-09 2022-06-16 Stingray Therapeutics, Inc. Phosphonates as inhibitors of enpp1 and cdnp
JP2024500249A (ja) * 2020-12-09 2024-01-05 スティングレイ・セラピューティクス・インコーポレイテッド Ｅｎｐｐ１およびｃｄｎｐの阻害剤としてのホスホネート類
WO2022199635A1 (zh) * 2021-03-25 2022-09-29 南京明德新药研发有限公司 苄氨基喹唑啉类衍生物
CN115536696B (zh) * 2021-06-29 2023-07-14 上海齐鲁制药研究中心有限公司 Enpp1抑制剂
WO2023036289A1 (zh) * 2021-09-10 2023-03-16 上海海和药物研究开发股份有限公司 具有enpp1抑制活性的异羟基肟酸类化合物及其用途
KR20230040756A (ko) 2021-09-16 2023-03-23 삼성전자주식회사 위상 고정 루프의 모니터링 회로 및 이의 동작 방법
CA3235252A1 (en) 2021-10-26 2023-05-04 Duane GRANT Magnetostrictive piezoelectric nanoassembly as cancer chemotherapeutic
WO2023077083A1 (en) * 2021-10-29 2023-05-04 Angarus Therapeutics, Inc. Enpp1 inhibitors as inhibitors of metastasis
TW202329957A (zh) * 2022-01-21 2023-08-01 大陸商上海海和藥物研究開發股份有限公司 膦酸類化合物及其前藥、它們的製備方法及用途
WO2023197987A1 (zh) * 2022-04-11 2023-10-19 上海齐鲁制药研究中心有限公司 Enpp1抑制剂
WO2024028727A1 (en) * 2022-08-01 2024-02-08 Sravathi Ai Technology Private Limited Novel ectonucleotide pyrophosphatase / phosphodiesterase 1 (enpp-1) inhibitors and uses thereof

Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5136469A (ja) * 1974-07-25 1976-03-27 Pfizer
WO2003000188A2 (en) * 2001-06-21 2003-01-03 Ariad Pharmaceuticals, Inc. Novel quinazolines and uses thereof
WO2008113161A1 (en) * 2007-03-19 2008-09-25 Ulysses Pharmaceutical Products Inc. Phosphate prodrugs of quinazolinyl nitrofurans, methods of obtaining, and use of same
JP2009242240A (ja) * 2006-08-04 2009-10-22 Mebiopharm Co Ltd 含ホウ素キナゾリン誘導体
JP2010505955A (ja) * 2006-10-10 2010-02-25 インフィニティー ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 脂肪酸アミドヒドロラーゼのインヒビター
JP2013523894A (ja) * 2010-04-14 2013-06-17 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニー 新規グルコキナーゼアクチベーターおよびその使用方法
WO2013096680A1 (en) * 2011-12-22 2013-06-27 Alios Biopharma, Inc. Substituted phosphorothioate nucleotide analogs
WO2017147328A1 (en) * 2016-02-23 2017-08-31 Portola Pharmaceuticals, Inc. Compounds for binding proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (pcsk9)
JP2017530193A (ja) * 2014-09-22 2017-10-12 ユ−シェン チャオ 複素環式化合物及びその使用
JP2018513150A (ja) * 2015-04-07 2018-05-24 グアンドン・チョンシェン・ファーマスーティカル・カンパニー・リミテッド チロシンキナーゼ阻害剤およびそれを含む医薬組成物
WO2018229139A1 (en) * 2017-06-14 2018-12-20 Fundación Para La Investigación Médica Aplicada Novel compounds for use in cancer
WO2019023635A1 (en) * 2017-07-27 2019-01-31 Stingray Therapeutics, Inc. SUBSTITUTED 3 H-IMIDAZO (4,5-C) PYRIDINE AND 1H-PYRROLO (2,3-C) PYRIDINE SERIES OF A NOVEL ECTONUCLEOTIDE PYROPHOSPHATASE / PHOSPHODIESTERASE-1 (ENPP1) AND STIMULATOR FOR A GENE MODULATOR INTERFERON (STING) AS IMMUNOTHERAPEUTIC AGENTS AGAINST CANCER

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA228044A (en) 1923-01-16 Thomas Noble Boughton Die for forming bolts
CA190896A (en) 1919-02-24 1919-06-17 Josephat C. Bergeron Advertising device
DE3319795A1 (de) * 1983-06-01 1984-12-06 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Verfahren zur herstellung von phosphonsaeureestern
US10543207B2 (en) * 2008-12-31 2020-01-28 Ardelyx, Inc. Compounds and methods for inhibiting NHE-mediated antiport in the treatment of disorders associated with fluid retention or salt overload and gastrointestinal tract disorders
AR083199A1 (es) * 2010-09-29 2013-02-06 Intervet Internationale B V Compuestos de n-heteroarilo con unidad de puente ciclico
US10011600B2 (en) * 2014-09-25 2018-07-03 Araxes Pharma Llc Methods and compositions for inhibition of Ras
US10518257B2 (en) * 2017-05-04 2019-12-31 Exxonmobil Research And Engineering Company Metal organic frameworks, their synthesis and use

Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5136469A (ja) * 1974-07-25 1976-03-27 Pfizer
WO2003000188A2 (en) * 2001-06-21 2003-01-03 Ariad Pharmaceuticals, Inc. Novel quinazolines and uses thereof
JP2009242240A (ja) * 2006-08-04 2009-10-22 Mebiopharm Co Ltd 含ホウ素キナゾリン誘導体
JP2010505955A (ja) * 2006-10-10 2010-02-25 インフィニティー ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 脂肪酸アミドヒドロラーゼのインヒビター
WO2008113161A1 (en) * 2007-03-19 2008-09-25 Ulysses Pharmaceutical Products Inc. Phosphate prodrugs of quinazolinyl nitrofurans, methods of obtaining, and use of same
JP2013523894A (ja) * 2010-04-14 2013-06-17 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニー 新規グルコキナーゼアクチベーターおよびその使用方法
WO2013096680A1 (en) * 2011-12-22 2013-06-27 Alios Biopharma, Inc. Substituted phosphorothioate nucleotide analogs
JP2017530193A (ja) * 2014-09-22 2017-10-12 ユ−シェン チャオ 複素環式化合物及びその使用
JP2018513150A (ja) * 2015-04-07 2018-05-24 グアンドン・チョンシェン・ファーマスーティカル・カンパニー・リミテッド チロシンキナーゼ阻害剤およびそれを含む医薬組成物
WO2017147328A1 (en) * 2016-02-23 2017-08-31 Portola Pharmaceuticals, Inc. Compounds for binding proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (pcsk9)
WO2018229139A1 (en) * 2017-06-14 2018-12-20 Fundación Para La Investigación Médica Aplicada Novel compounds for use in cancer
WO2019023635A1 (en) * 2017-07-27 2019-01-31 Stingray Therapeutics, Inc. SUBSTITUTED 3 H-IMIDAZO (4,5-C) PYRIDINE AND 1H-PYRROLO (2,3-C) PYRIDINE SERIES OF A NOVEL ECTONUCLEOTIDE PYROPHOSPHATASE / PHOSPHODIESTERASE-1 (ENPP1) AND STIMULATOR FOR A GENE MODULATOR INTERFERON (STING) AS IMMUNOTHERAPEUTIC AGENTS AGAINST CANCER

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BORA, SURANJANA ET AL.: "Synthesis and antimalarial activity evaluation of some isoquine analogues", MEDICINAL CHEMISTRY RESEARCH, vol. 20, no. 9, JPN6023053338, 2011, pages 1632 - 1637, XP019971273, ISSN: 0005228687, DOI: 10.1007/s00044-010-9460-9 *
CHABRIER P. ET AL.: "Influence de la Phosphorylation sur les Proprietes Pharmacologiques des composes Biologiquement acti", ANNALES PHARMACEUTIQUES FRANCAISES, vol. 38, no. 1, JPN6023053335, 1980, pages 65 - 74, XP009011914, ISSN: 0005228690 *
HIEU, D. T. ET AL.: "Quinazoline-Based Hydroxamic Acids: Design, Synthesis, and Evaluation of Histone Deacetylase Inhibit", CHEMISTRY & BIODIVERSITY, vol. 15, no. 6, JPN6023053339, 2018, pages 1 - 13, ISSN: 0005228686 *
HIROI, KUNIO ET AL.: "New Chiral Sulfoxide Ligands Possessing a Phosphano or Phosphanoamino Functionality in Palladium-Cat", TETRAHEDRON, vol. 56, no. 27, JPN6023053337, 2000, pages 4701 - 4710, XP004206697, ISSN: 0005228688, DOI: 10.1016/S0040-4020(00)00393-8 *
WANG, S. ET AL.: "Highly Efficient Synthesis of a Class of Novel Chiral-Bridged Atropisomeric Monophosphine Ligands vi", ORGANIC LETTERS, vol. 14, no. 8, JPN6023053336, 2012, pages 1966 - 1969, XP055971330, ISSN: 0005228689, DOI: 10.1021/ol300721p *

Also Published As

Publication number Publication date
BR112021015098A2 (pt) 2022-01-11
WO2020160333A1 (en) 2020-08-06
EP3917536A1 (en) 2021-12-08
US20220289775A1 (en) 2022-09-15
CL2021002002A1 (es) 2022-03-11
CO2021010186A2 (es) 2021-10-29
MA54879A (fr) 2021-12-08
KR20210124265A (ko) 2021-10-14
IL284961A (en) 2021-09-30
MX2021009269A (es) 2021-08-24
PE20212306A1 (es) 2021-12-10
CN113677350A (zh) 2021-11-19
SG11202108288YA (en) 2021-08-30
AU2020214628A1 (en) 2021-08-12
TW202214571A (zh) 2022-04-16
CA3128044A1 (en) 2020-08-06
EP3917536A4 (en) 2022-11-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2022523105A (ja) 免疫応答をモジュレートするｅｎｐｐ１阻害剤および方法
JP7292740B2 (ja) Ｅｎｐｐ１阻害剤及びがんの治療のためのそれらの使用
AU2007321719B2 (en) Inhibitors of kinase activity
KR20210098960A (ko) Helios의 소분자 분해제 및 사용 방법
CN112771053A (zh) 基于生物标志物的治疗组合物
AU2017273857A1 (en) Compounds
EP3597186B1 (en) Myc g-quadruplex stabilizing small molecules and their use
RU2641693C2 (ru) Соединения 5-(пиридин-2-иламино)-пиразин-2-карбонитрила и их терапевтическое применение
TW201706272A (zh) 雙環化合物
RU2800798C2 (ru) Ингибиторы ENPP1 и способы модуляции иммунного ответа
WO2018065607A1 (en) Chemical substances which inhibit the enzymatic activity of human kallikrein related peptidase 6 (klk6)
WO2023035001A1 (en) Enpp1 inhibitors and immune cells expressing chimeric antigen receptors
WO2024089008A1 (en) Heterocyclic compounds capable of activating sting
CA3233398A1 (en) Small molecule inhibitors of oncogenic chd1l with preclinical activity against colorectal cancer

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20221220

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20221220

A977 Report on retrieval

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007

Effective date: 20231214

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20231227

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20240305