JP2022522803A - 結腸直腸癌及び／又はその前癌段階の診断用タンパク質シグネチャー - Google Patents
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Abstract
本発明は、結腸直腸癌及び／又はその前癌段階を診断するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法に関する。【選択図】図１
Description
本発明を医療分野に含めることができる。特に、本発明は、結腸直腸癌及び／又はその前癌段階を診断するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法に関する。
結腸直腸癌（ＣＲＣ：colorectal cancer）（結腸癌、直腸癌、又は腸癌としても知られる）は、結腸又は直腸（大腸の一部）での癌の発症である。結腸直腸癌の大部分は腺癌である。これは、結腸の組織内に多数の腺があるためである。これらの腺は、遺伝子レベルで多くの変化を起こすと、良性から浸潤性の悪性結腸癌に移行するものとして予測可能に進行する。結腸の腺腫、特に進行性結腸直腸腺腫（ＡＡ：advanced colorectal adenoma）は、悪性腺癌の良性バージョンであるが、除去しないと悪性になる可能性がある（通常、悪性になり結腸癌につながる傾向があるため、除去される）。
スクリーニングは結腸直腸癌を予防し、それによる死亡を減少させるための効果的な方法であり、５０歳～７５歳で始めることを勧められる。結腸直腸癌の最もよく知られていて最も頻繁に使用されるスクリーニング検査は、糞便免疫化学検査（ＦＩＴ）と呼ばれる。ＦＩＴは、前癌又は癌の兆候である可能性がある便試料中の血液を検出する。異常な結果が得られた場合は、通常、結腸内視鏡検査が推奨され、これにより、医師は結腸及び直腸の内部を見て診断を下すことができる。結腸内視鏡検査中に、小さなポリープが見つかった場合は取り除くことができる。大きなポリープ又は腫瘍が見つかった場合は、生検を行って癌性かどうかを確認することができる。消化器病専門医は、結腸内視鏡検査を使用してこれらの腺腫及びポリープを見つけて除去し、浸潤性腺癌につながる遺伝的変化を獲得し続けるのを防ぐ。
上で説明したように、ＦＩＴは現在結腸直腸癌のスクリーニングに使用されているが、ＦＩＴはＡＡに対する感度が低い（文献によっては約２０％～３０％）ことに留意することが重要であり、この種の患者のほとんどが誤って疾患がないと分類される可能性があることを意味する。その結果、ＦＩＴは感度が低いために腺腫を特定することができない。さらに、ＦＩＴは糞便試料を使用するため、コンプライアンスが低くなる。一方、結腸内視鏡検査は侵襲的技術であり、最も重篤な合併症は一般に胃腸穿孔である。他方、結腸内視鏡検査は、今日、麻酔を伴う手技であり、結腸内視鏡検査のための腸の準備中に通常投与される下剤は幾つかの消化器系の問題と関連する。
ＣＲＣ又はＡＡに罹患するリスクのある一般集団をスクリーニングするために今日使用されている方法は、高率の偽陽性に関連していることに留意することが重要である。その結果、今日では大量の不必要なフォローアップ結腸内視鏡検査が行われている。
本発明は、血液、血清、又は血漿等の低侵襲試料から分離されたタンパク質バイオマーカーの濃度レベルから逸脱した、結腸直腸癌又は結腸直腸腺腫（特に進行性結腸直腸腺腫）に罹患するリスクのあるヒト被験体を特定又はスクリーニングするｉｎ ｖｉｔｒｏ方法に焦点を合わせることで、上で言及される課題に対する明確な解決策を提供する。本発明の方法は、血液、血清又は血漿の試料に基づくため、結腸直腸癌スクリーニングへのコンプライアンスを改善することが期待される。さらに、本発明の方法は、高い感度及び特異度をもたらし、これは、結腸直腸癌及び結腸直腸腺腫の両方の検出のための強力で費用効果の高い方法であることを意味する。
本発明は、血液、血清、又は血漿等の低侵襲性試料から単離されたタンパク質バイオマーカーの濃度レベルから逸脱した、結腸直腸癌及び／又は進行性結腸直腸腺腫に罹患するリスクのあるヒト被験体を診断、特定又はスクリーニングするｉｎ ｖｉｔｒｏ方法に関する。本発明の方法は、高い感度及び特異度をもたらし、これは、結腸直腸癌及び結腸直腸腺腫の両方の検出のための強力で費用効果の高い方法であることを意味する。
本発明の方法は、ＣＲＣ又はＡＡに罹患するリスクのある一般集団をスクリーニングするために今日使用されている方法（ＦＩＴ）と比較してより高い感度及び特異度を有することから、より低いパーセンテージの偽陽性と関連する。結果として、本発明に記載される方法は、フォローアップ結腸内視鏡検査の数を減らすのに明らかに役立ち、したがって、今日の患者のスクリーニング又は診断方法が改善される。本発明の方法が実施された後、患者が結腸直腸癌及び／又は前癌段階に罹患している可能性があると判断された場合、結果は結腸内視鏡検査によって確認される。しかしながら、患者が結腸直腸癌及び／又は前癌段階に罹患している可能性があると判断されない場合、結腸内視鏡検査を実施する必要はなく、以下に規定される本発明の方法によるルーチン検査が推奨される。
特に、本発明の第１の実施の形態において、結腸直腸癌及び／又はその前癌段階を診断するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法（以降、「本発明の方法」）であって、ａ）被験体から得られた生物学的試料において少なくともＦｌｔ３Ｌの濃度レベルを測定することを含み、ｂ）健康な対照被験体において測定された基準濃度レベルと比較して、少なくともＦｌｔ３Ｌの濃度レベルの偏差又は変動が特定される場合、これは被験体が結腸直腸癌及び／又は前癌段階に罹患していることを示す、ｉｎ ｖｉｔｒｏ方法に関する。
特に好ましい実施の形態において、本発明の方法は、被験体から得られた生物学的試料中の少なくとも組合せ［Ｆｌｔ３Ｌ及びＣＹＦＲＡ２１－１］の濃度レベルを測定することを含む。
これに関して、本発明で特許請求される全ての最も信頼できるシグネチャーは、Ｆｌｔ３Ｌ、好ましくは［Ｆｌｔ３Ｌ及びＣＹＦＲＡ２１－１］を含み、したがって、Ｆｌｔ３Ｌ、好ましくは［Ｆｌｔ３Ｌ及びＣＹＦＲＡ２１－１］、例えば［Ｆｌｔ３Ｌ及びＣＹＦＲＡ２１－１及びＡＲＥＧ］、［Ｆｌｔ３Ｌ及びＣＹＦＲＡ２１－１及びＡＲＥＧ及びＥｒｂＢ４］、又は［Ｆｌｔ３Ｌ及びＣＹＦＲＡ２１－１及びＡＲＥＧ及びＣＬＥＣ２Ｃ］を含む様々なバイオマーカーシグネチャーは、ＣＲＣの検出ではおよそ０．９の曲線下面積（ＡＵＣ）にて、またＡＡの検出でも良好なパフォーマンスを伴って取得されることを考慮することが重要である（表１２を参照されたい）。本発明によれば、Ｆｌｔ３Ｌ、好ましくは［Ｆｌｔ３Ｌ及びＣＹＦＲＡ２１－１］を含むシグネチャーのいずれかを効率的に使用することができるが、Ｆｌｔ３Ｌ、好ましくは［Ｆｌｔ３Ｌ及びＣＹＦＲＡ２１－１］を含む以下のシグネチャー：［Ｆｌｔ３Ｌ及びＣＹＦＲＡ２１－１及びＡＲＥＧ及びＥｒｂＢ４］（ＣＲＣのＡＵＣ＝０．９３１）又は［Ｆｌｔ３Ｌ及びＣＹＦＲＡ２１－１及びＡＲＥＧ及びＣＬＥＣ２Ｃ］（ＣＲＣのＡＵＣ＝０．９１５）（表１２を参照されたい）は、それらがＣＲＣの検出で０．９を超えるＡＵＣ値及びＡＡの検出に良好なパフォーマンスを提供することから特に好ましい。
本発明の第２の実施の形態は、上で言及されるシグネチャーのいずれかの濃度レベルを決定するための試薬を含むキット（kit of parts）に関する。好ましい実施の形態において、本発明は、結腸直腸癌及び／又はその前癌段階の診断のための、Ｆｌｔ３Ｌ、又は組合せ［Ｆｌｔ３Ｌ及びＣＹＦＲＡ２１－１］、好ましくは［Ｆｌｔ３Ｌ及びＣＹＦＲＡ２１－１及びＡＲＥＧ］、［Ｆｌｔ３Ｌ及びＣＹＦＲＡ２１－１及びＡＲＥＧ及びＥｒｂＢ４］又は［Ｆｌｔ３Ｌ及びＣＹＦＲＡ２１－１及びＡＲＥＧ及びＣＬＥＣ２Ｃ］の濃度レベルを決定するための試薬を含むキットのｉｎ ｖｉｔｒｏ使用に関する。
本発明の方法によれば、上で言及されるバイオマーカーの組合せのいずれかの濃度レベルを測定した後、シグネチャーについてスコア値を取得し、このスコア値を、診断規則を規定する閾値と比較する。このスコア値が閾値よりも高い場合、対応する試料は陽性試料として分類され、これは、患者が結腸直腸癌及び／又はその前癌段階に罹患している可能性があることを示す。感度及び特異度の値を最適化するために、閾値が規定される。その結果、好ましい実施の形態において、本発明の方法は、ａ）被験体から得られた生物学的試料において、上で言及されるバイオマーカーの組合せのいずれかの濃度レベルを測定することと、ｂ）リスクスコアを取得するため、濃度値を処理することとを含み、ｃ）基準値と比較して、上で言及されるバイオマーカーの組合せのいずれかについて取得されたリスクスコア値の偏差又は変動が特定される場合、これは、被験体が結腸直腸癌及び／又は前癌状態に罹患していることを示す。
本発明の第３の実施の形態は、結腸直腸癌及び／又はその前癌段階の診断のための上で言及されるバイオマーカー又はシグネチャーのいずれかのｉｎ ｖｉｔｒｏ使用に関する。
好ましい実施の形態において、結腸直腸癌の前癌段階は、進行性結腸直腸腺腫である。
好ましい実施の形態において、結腸直腸癌及び／又はその前癌段階の診断は、画像技術、好ましくは結腸内視鏡検査によって確認される。
好ましい実施の形態において、本発明は、結腸直腸癌及び／又はその前癌段階を検出するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、該方法は、ａ）ヒト患者から血漿試料を得ることと、ｂ）血漿試料を上で言及されるタンパク質バイオマーカー又はシグネチャーに対する抗体と接触させ、タンパク質と抗体との間の結合を検出することにより、上記タンパク質バイオマーカー又はシグネチャーのいずれかが血漿試料中に存在するかどうかを検出することとを含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏ方法に関する。
本発明の第４の実施の形態は、結腸直腸癌又はその前癌段階を診断及び治療する方法であって、ａ）ヒト患者から血漿試料を得ることと、ｂ）上で言及されるタンパク質バイオマーカー又はシグネチャーのいずれかが血漿試料に存在するかどうかを検出することと、ｃ）血漿試料中の上記タンパク質バイオマーカー又はシグネチャーの存在が検出された場合に、結腸直腸癌又はその前癌段階を有する患者を診断することと、患者に結腸内視鏡検査を行い、その後結腸直腸癌又はポリープを取り除くこととを含む、方法に関する。
代替的に、本発明の第５の実施の形態は、結腸直腸癌及び／又はその前癌段階を診断するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法（以降、「本発明の方法」）であって、ａ）被験体から得られた生物学的試料において少なくともＡＲＥＧの濃度レベルを測定することを含み、ｂ）健康な対照被験体において測定された基準濃度レベルと比較して、少なくともＡＲＥＧの濃度レベルの偏差又は変動が特定される場合、これは被験体が結腸直腸癌及び／又は前癌段階に罹患していることを示す、ｉｎ ｖｉｔｒｏ方法に関する。
特に好ましい実施の形態において、本発明の方法は、被験体から得られた生物学的試料中の少なくとも組合せ［ＡＲＥＧ及びＣＹＦＲＡ２１－１］の濃度レベルを測定することを含む。
これに関して、本発明で特許請求される全ての最も信頼できるシグネチャーは、ＡＲＥＧ、好ましくは［ＡＲＥＧ及びＣＹＦＲＡ２１－１］を含み、したがって、ＡＲＥＧを含む、好ましくは［ＡＲＥＧ及びＣＹＦＲＡ２１－１］を含む様々なバイオマーカーシグネチャーは、ＣＲＣの検出ではおよそ０．９の曲線下面積（ＡＵＣ）にて、またＡＡの検出でも良好なパフォーマンスを伴って取得されることを考慮することが重要である（表１２の２を参照されたい）。その結果、本発明によれば、ＡＲＥＧを含む、好ましくは［ＡＲＥＧ及びＣＹＦＲＡ２１－１］を含むシグネチャーのいずれかを効果的に使用することができるが、ＡＲＥＧを含む、好ましくは［ＡＲＥＧ及びＣＹＦＲＡ２１－１］を含む以下のシグネチャー：［ＡＲＥＧ及びＣＹＦＲＡ２１－１及びＦｌｔ３Ｌ及びＥｒｂＢ４］（ＣＲＣのＡＵＣ＝０．９３１）又は［ＡＲＥＧ及びＣＹＦＲＡ２１－１及びＦｌｔ３Ｌ及びＣＬＥＣ２Ｃ］（ＣＲＣのＡＵＣ＝０．９１５）（表１２の２を参照されたい）は、それらがＣＲＣの検出で０．９を超えるＡＵＣ値及びＡＡの検出に良好なパフォーマンスを提供することから特に好ましい。
したがって、特に好ましい実施の形態において、本発明の方法は、被験体から得られた生体試料において、少なくとも組合せ［ＡＲＥＧ及びＣＹＦＲＡ２１－１及びＦｌｔ３Ｌ］、又は組合せ［ＡＲＥＧ及びＣＹＦＲＡ２１－１及びＣＬＥＣ２Ｃ］、又は組合せ［ＡＲＥＧ及びＣＹＦＲＡ２１－１及びＥｒｂＢ４］、又は組合せ［ＡＲＥＧ及びＣＹＦＲＡ２１－１及びＦａｓＬ］、又は組合せ［ＡＲＥＧ及びＣＹＦＲＡ２１－１及びＣＤ１４７］、又は組合せ［ＡＲＥＧ及びＣＹＦＲＡ２１－１及びＨＧＦＲ］、又は組合せ［ＡＲＥＧ及びＣＹＦＲＡ２１－１及びＦｌｔ３Ｌ及びＥｒｂＢ４］、又は組合せ［ＡＲＥＧ及びＣＹＦＲＡ２１－１及びＦｌｔ３Ｌ及びＣＬＥＣ２Ｃ］、又は組合せ［ＡＲＥＧ及びＣＹＦＲＡ２１－１及びＨＧＦＲ及びＣＤ１４７］の濃度レベルを測定することを含む。
特に好ましい実施の形態において、本発明の方法は、被験体から得られた生物学的試料において、少なくとも組合せ［ＡＲＥＧ及びＣＤ１４７］、又は組合せ［ＡＲＥＧ及びＣＬＥＣ２Ｃ］、又は組合せ［ＡＲＥＧ及びＨＧＦＲ］、又は組合せ［ＡＲＥＧ及びＣＤ１４７及びＨＧＦＲ］の濃度レベルを測定することを含む。
本発明の第６の実施の形態は、結腸直腸癌及び／又はその前癌段階の診断のための上で言及されるシグネチャーのいずれかのｉｎ ｖｉｔｒｏ使用に関する。
本発明の方法によれば、上で言及されるバイオマーカーの組合せのいずれかの濃度レベルを測定した後、シグネチャーについてスコア値を取得し、このスコア値を、診断規則を規定する閾値と比較する。このスコア値が閾値よりも高い場合、対応する試料は陽性試料として分類され、これは、患者が結腸直腸癌及び／又はその前癌段階に罹患している可能性があることを示す。感度及び特異度の値を最適化するために、閾値が規定される。その結果、好ましい実施の形態において、本発明の方法は、ａ）被験体から得られた生物学的試料において、上で言及されるバイオマーカーの組合せのいずれかの濃度レベルを測定することと、ｂ）リスクスコアを取得するため、濃度値を処理することとを含み、ｃ）基準値と比較して、上で言及されるバイオマーカーの組合せのいずれかについて取得されたリスクスコア値の偏差又は変動が特定される場合、これは、被験体が結腸直腸癌及び／又は前癌状態に罹患していることを示す。
本発明の第７の実施の形態は、上で言及されるシグネチャーのいずれかの濃度レベルを決定するための試薬を含むキット（kit of parts）に関する。好ましい実施の形態において、本発明は、結腸直腸癌及び／又はその前癌段階の診断のためのバイオマーカーの上で言及される組合せのいずれかの濃度レベルを決定するための試薬を含むキットのｉｎ ｖｉｔｒｏ使用に関する。
好ましい実施の形態において、結腸直腸癌の前癌段階は、進行性結腸直腸腺腫である。
好ましい実施の形態において、結腸直腸癌及び／又はその前癌段階の診断は、画像技術、好ましくは結腸内視鏡検査によって確認される。
好ましい実施の形態において、本発明は、結腸直腸癌及び／又はその前癌段階を検出するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、該方法は、ａ）ヒト患者から血漿試料を得ることと、ｂ）血漿試料を上で言及されるタンパク質バイオマーカー又はシグネチャーに対する抗体と接触させ、タンパク質と抗体との間の結合を検出することにより、上記タンパク質バイオマーカー又はシグネチャーのいずれかが血漿試料中に存在するかどうかを検出することとを含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏ方法に関する。
本発明の最後の実施の形態は、結腸直腸癌又はその前癌段階を診断及び治療する方法であって、ａ）ヒト患者から血漿試料を得ることと、ｂ）上で言及されるタンパク質バイオマーカー又はシグネチャーのいずれかが血漿試料に存在するかどうかを検出することと、ｃ）血漿試料中の上記タンパク質バイオマーカー又はシグネチャーの存在が検出された場合に、結腸直腸癌又はその前癌段階を有する患者を診断することと、患者に結腸内視鏡検査を行い、その後結腸直腸癌又はポリープを取り除くこととを含む、方法に関する。
本発明の目的のため、以下の用語が定義される：
「結腸直腸癌」という用語は、小腸の下の腸管（すなわち、盲腸、上行結腸、横行結腸、下行結腸、Ｓ状結腸及び直腸を含む大腸（結腸））の細胞の癌を特徴とする医学的状態である。
「結腸直腸腺腫」という表現は、結腸直腸癌の良性で前癌性の段階であるが、それでも結腸直腸癌に進行するリスクが高い、腺腫性ポリープとも呼ばれる結腸の腺腫を指す。
「進行性結腸直腸腺腫」という表現は、少なくとも１０ｍｍのサイズの腺腫、又は組織学的に高度異形成若しくは絨毛成分が２０％を超える腺腫を指す。
「低侵襲性の生物学的試料」という表現は、患者の採血に使用する細い針以外に、有害な器具を使用することを必要とせず、その結果、患者にとって有害ではない、患者の体から採取した任意の試料を指す。具体的には、低侵襲性の生物学的試料は、本発明では、血液、血清、又は血漿試料を指す。
「健康な対照被験体において測定された基準濃度レベル」という表現は、タンパク質の濃度レベルの「基準値」を指す。タンパク質の濃度レベルの偏差が、上記「健康な対照被験体において測定された基準濃度レベル」に関して決定される場合、これは、結腸直腸癌又はその前癌段階の指標である。特に、本発明のバイオマーカー又はシグネチャーの濃度レベルが、上記「基準値」に関して有意に高い又は低い場合、これは、結腸直腸癌又はその前癌段階の指標である。
「リスクスコア」という表現は、１つ以上の濃度値を単一の値（又はリスク値）に処理した後に得られるリスク値を指し、個人の疾患の確率を表す。このリスク値を基準値と比較して、患者が結腸直腸癌及び／又はその前癌段階に罹患している可能性があるかどうかを評価する。
「基準値」は、閾値又はカットオフ値とすることができる。典型的には、「閾値」又は「カットオフ値」は、実験的、経験的、又は理論的に決定することができる。当業者によって認識されるように、閾値はまた、既存の実験条件及び／又は臨床条件に基づいて任意に選択され得る。試験の機能及びベネフィット／リスクバランス（偽陽性及び偽陰性の臨床結果）に応じて最適な感度及び特異度を得るには、閾値を決定しなければならない。好ましくは、当業者は、本発明の方法に従って得られたバイオマーカーレベル（又はスコア）を、規定された閾値と比較してもよい。典型的には、最適な感度及び特異度（したがって閾値）は、実験データに基づく受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を使用して決定され得る。例えば、基準群においてバイオマーカーのレベルを決定した後、試験対象の生物学的試料中のバイオマーカーの測定濃度の統計的処理にアルゴリズム分析を使用して、試料分類に有意性を有する分類基準を取得することができる。ＲＯＣ曲線の正式名称は、受信者動作特性曲線（receiver operation characteristic curve）ともしても知られる受信者操作特性（receiver operator characteristic curve）である。ＲＯＣ曲線は、主に臨床生化学的診断検査に使用され、真陽性率（感度）及び偽陽性率（１－特異度）の連続変数を反映する包括的な指標である。ＲＯＣ曲線は、画像合成法によって感度と特異度との関係を明らかにする。一連の異なるカットオフ値（閾値又は臨界値、診断検査の正常な結果と異常な結果との間の境界値）は、一連の感度及び特異度の値を計算するための連続変数として設定される。次いで、感度を垂直座標として使用し、特異度を水平座標として使用して曲線を描く。曲線下面積（ＡＵＣ）が大きいほど、診断の精度が高くなる。ＲＯＣ曲線では、座標図の左上端に最も近い点が、高感度及び高特異度の両方の値を持つ臨界点である。ＲＯＣ曲線のＡＵＣ値は１．０～０．５である。ＡＵＣが０．５超である場合、ＡＵＣが１に近づくにつれて、診断結果はますます良くなる。ＡＵＣが０．５～０．７の場合、精度は低くなる。ＡＵＣが０．７～０．９の場合、精度は良好である。ＡＵＣが０．９より大きい場合、精度は非常に高くなる。このアルゴリズム的方法は、好ましくはコンピュータを用いて行われる。ＭｅｄＣａｌｃ ９．２．０．１医療統計ソフトウェア、ＳＰＳＳ９．０等の当該技術分野の既存のソフトウェア又はシステムをＲＯＣ曲線の描画に使用することができる。
「含む」とは、「含む」という言葉の前にある（follows）ものを包含するがこれに限定されないことを意味する。したがって、「含む」という用語の使用は、列挙された要素が要求される又は必須であるが、他の要素は任意であり、存在してもしなくてもよいことを示す。
「のみからなる」とは、「のみからなる」という句の前にあるものを「包含し、限定する」という意味である。したがって、「のみからなる」という句は、列挙された要素が要求される又は必須であり、他の要素が存在し得ないことを示す。
「結腸直腸癌」という用語は、小腸の下の腸管（すなわち、盲腸、上行結腸、横行結腸、下行結腸、Ｓ状結腸及び直腸を含む大腸（結腸））の細胞の癌を特徴とする医学的状態である。
「結腸直腸腺腫」という表現は、結腸直腸癌の良性で前癌性の段階であるが、それでも結腸直腸癌に進行するリスクが高い、腺腫性ポリープとも呼ばれる結腸の腺腫を指す。
「進行性結腸直腸腺腫」という表現は、少なくとも１０ｍｍのサイズの腺腫、又は組織学的に高度異形成若しくは絨毛成分が２０％を超える腺腫を指す。
「低侵襲性の生物学的試料」という表現は、患者の採血に使用する細い針以外に、有害な器具を使用することを必要とせず、その結果、患者にとって有害ではない、患者の体から採取した任意の試料を指す。具体的には、低侵襲性の生物学的試料は、本発明では、血液、血清、又は血漿試料を指す。
「健康な対照被験体において測定された基準濃度レベル」という表現は、タンパク質の濃度レベルの「基準値」を指す。タンパク質の濃度レベルの偏差が、上記「健康な対照被験体において測定された基準濃度レベル」に関して決定される場合、これは、結腸直腸癌又はその前癌段階の指標である。特に、本発明のバイオマーカー又はシグネチャーの濃度レベルが、上記「基準値」に関して有意に高い又は低い場合、これは、結腸直腸癌又はその前癌段階の指標である。
「リスクスコア」という表現は、１つ以上の濃度値を単一の値（又はリスク値）に処理した後に得られるリスク値を指し、個人の疾患の確率を表す。このリスク値を基準値と比較して、患者が結腸直腸癌及び／又はその前癌段階に罹患している可能性があるかどうかを評価する。
「基準値」は、閾値又はカットオフ値とすることができる。典型的には、「閾値」又は「カットオフ値」は、実験的、経験的、又は理論的に決定することができる。当業者によって認識されるように、閾値はまた、既存の実験条件及び／又は臨床条件に基づいて任意に選択され得る。試験の機能及びベネフィット／リスクバランス（偽陽性及び偽陰性の臨床結果）に応じて最適な感度及び特異度を得るには、閾値を決定しなければならない。好ましくは、当業者は、本発明の方法に従って得られたバイオマーカーレベル（又はスコア）を、規定された閾値と比較してもよい。典型的には、最適な感度及び特異度（したがって閾値）は、実験データに基づく受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を使用して決定され得る。例えば、基準群においてバイオマーカーのレベルを決定した後、試験対象の生物学的試料中のバイオマーカーの測定濃度の統計的処理にアルゴリズム分析を使用して、試料分類に有意性を有する分類基準を取得することができる。ＲＯＣ曲線の正式名称は、受信者動作特性曲線（receiver operation characteristic curve）ともしても知られる受信者操作特性（receiver operator characteristic curve）である。ＲＯＣ曲線は、主に臨床生化学的診断検査に使用され、真陽性率（感度）及び偽陽性率（１－特異度）の連続変数を反映する包括的な指標である。ＲＯＣ曲線は、画像合成法によって感度と特異度との関係を明らかにする。一連の異なるカットオフ値（閾値又は臨界値、診断検査の正常な結果と異常な結果との間の境界値）は、一連の感度及び特異度の値を計算するための連続変数として設定される。次いで、感度を垂直座標として使用し、特異度を水平座標として使用して曲線を描く。曲線下面積（ＡＵＣ）が大きいほど、診断の精度が高くなる。ＲＯＣ曲線では、座標図の左上端に最も近い点が、高感度及び高特異度の両方の値を持つ臨界点である。ＲＯＣ曲線のＡＵＣ値は１．０～０．５である。ＡＵＣが０．５超である場合、ＡＵＣが１に近づくにつれて、診断結果はますます良くなる。ＡＵＣが０．５～０．７の場合、精度は低くなる。ＡＵＣが０．７～０．９の場合、精度は良好である。ＡＵＣが０．９より大きい場合、精度は非常に高くなる。このアルゴリズム的方法は、好ましくはコンピュータを用いて行われる。ＭｅｄＣａｌｃ ９．２．０．１医療統計ソフトウェア、ＳＰＳＳ９．０等の当該技術分野の既存のソフトウェア又はシステムをＲＯＣ曲線の描画に使用することができる。
「含む」とは、「含む」という言葉の前にある（follows）ものを包含するがこれに限定されないことを意味する。したがって、「含む」という用語の使用は、列挙された要素が要求される又は必須であるが、他の要素は任意であり、存在してもしなくてもよいことを示す。
「のみからなる」とは、「のみからなる」という句の前にあるものを「包含し、限定する」という意味である。したがって、「のみからなる」という句は、列挙された要素が要求される又は必須であり、他の要素が存在し得ないことを示す。
本発明の目的のために、以下のタンパク質が、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースに従って同定される：
実施例１．材料及び方法
実施例１．１．研究集団
スペインの８つの病院（ブルゴス病院、ビーゴ病院、ドノスティ病院、オウレンセ病院、ビエルゾ病院、ベルトヴィグテ病院、及びサラゴサ病院）の合計９６人の被験体、すなわち散発性結腸直腸腫瘍と新たに診断された６４人の患者（ＣＲＣを有する３２人及びＡＡを有する３２人）及びいかなる癌の個人歴もなく、最近の結腸内視鏡検査で結腸直腸腫瘍性病変がないことを確認した３２人の健康な個人がこの研究に前向きに含まれた。ＡＡを有する患者は、少なくとも１０ｍｍのサイズの腺腫、又は組織学的に高度の異形成若しくは２０％超の絨毛成分を有する患者であった。参加者の特徴を表１に示す。血液試料を、全ての個人の内視鏡検査又は手術の前に収集した。
実施例１．１．研究集団
スペインの８つの病院（ブルゴス病院、ビーゴ病院、ドノスティ病院、オウレンセ病院、ビエルゾ病院、ベルトヴィグテ病院、及びサラゴサ病院）の合計９６人の被験体、すなわち散発性結腸直腸腫瘍と新たに診断された６４人の患者（ＣＲＣを有する３２人及びＡＡを有する３２人）及びいかなる癌の個人歴もなく、最近の結腸内視鏡検査で結腸直腸腫瘍性病変がないことを確認した３２人の健康な個人がこの研究に前向きに含まれた。ＡＡを有する患者は、少なくとも１０ｍｍのサイズの腺腫、又は組織学的に高度の異形成若しくは２０％超の絨毛成分を有する患者であった。参加者の特徴を表１に示す。血液試料を、全ての個人の内視鏡検査又は手術の前に収集した。
研究は各病院の組織倫理委員会によって承認され、ヘルシンキ宣言に従って全ての参加者から書面によるインフォームドコンセントを得た。
実施例１．２．試料の調製
各参加者からの全血１０ｍＬを、ＥＤＴＡ Ｋ２を含むチューブに収集した。血漿が分離するまで、血液試料を４℃に置いた。試料を１６００×ｇで１０分間、４℃で遠心分離して血球を遠沈し、血漿を新たなチューブに移した後、１６０００×ｇで１０分間、４℃で更に遠心分離して細胞成分を完全に除去した。
各参加者からの全血１０ｍＬを、ＥＤＴＡ Ｋ２を含むチューブに収集した。血漿が分離するまで、血液試料を４℃に置いた。試料を１６００×ｇで１０分間、４℃で遠心分離して血球を遠沈し、血漿を新たなチューブに移した後、１６０００×ｇで１０分間、４℃で更に遠心分離して細胞成分を完全に除去した。
実施例１．３．分子分析
血漿試料中のバイオマーカーの濃度を、市販のＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）及びＣＬＩＡ（化学発光免疫測定法）試験を使用し、対応する取扱説明書に従って確立した。ＨＧＦＲ及びＥｒｂＢ４を、Cloud clone Corp.製のＥＬＩＳＡキットで分析した。ＣＤ１４７、ＣＬＥＣ２Ｃ、Ｆｌｔ３Ｌ、及びＦａｓＬのレベルを、Elabscience製のＥＬＩＳＡキットを使用して測定した。ＩＦＮガンマの場合、Abcam製のＥＬＩＳＡキットを使用した。ＣＬＩＡ試験に関連して、ＣＹＦＲＡ２１－１及びＡＲＥＧをCloud Clone Corp.製のＣＬＩＡ試験で分析した。
血漿試料中のバイオマーカーの濃度を、市販のＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）及びＣＬＩＡ（化学発光免疫測定法）試験を使用し、対応する取扱説明書に従って確立した。ＨＧＦＲ及びＥｒｂＢ４を、Cloud clone Corp.製のＥＬＩＳＡキットで分析した。ＣＤ１４７、ＣＬＥＣ２Ｃ、Ｆｌｔ３Ｌ、及びＦａｓＬのレベルを、Elabscience製のＥＬＩＳＡキットを使用して測定した。ＩＦＮガンマの場合、Abcam製のＥＬＩＳＡキットを使用した。ＣＬＩＡ試験に関連して、ＣＹＦＲＡ２１－１及びＡＲＥＧをCloud Clone Corp.製のＣＬＩＡ試験で分析した。
実施例１．４．データの定量化
タンパク質の定量工程では、試料を対応するキット（ＥＬＩＳＡ／ＣＬＩＡ）で処理し、実験プレートに分配した。各プレートは、検量線の構築に使用する対照データも含んだ。各実行から得られた蛍光データ（整数で表される）を、試料ごとにバックグラウンド補正し、２次多項式回帰モデルを使用して作成された検量線を使用して定量化する。
タンパク質の定量工程では、試料を対応するキット（ＥＬＩＳＡ／ＣＬＩＡ）で処理し、実験プレートに分配した。各プレートは、検量線の構築に使用する対照データも含んだ。各実行から得られた蛍光データ（整数で表される）を、試料ごとにバックグラウンド補正し、２次多項式回帰モデルを使用して作成された検量線を使用して定量化する。
実施例１．５．統計学的分析
ＣＲＣ（結腸直腸癌と診断された個人）、ＡＡ（進行性腺腫と診断された個人）及びＣＴＬ（疾患のない個人）の３つの群の個人をこの分析にて検討した。
ＣＲＣ（結腸直腸癌と診断された個人）、ＡＡ（進行性腺腫と診断された個人）及びＣＴＬ（疾患のない個人）の３つの群の個人をこの分析にて検討した。
生の定量化データは、平方根関数を適用し、次いでセンタリング及びスケーリングによって変換したため、変換後、各タンパク質測定値の平均は０、標準偏差は１である。定量値を表２及び表３に要約し、各タンパク質を、検討された種々の群の中央値と四分位間範囲として説明する。
データの非正規性はシャピロ－ウィルク検定によって確認され、その結果、ウィルコクソン順位和検定を使用して、ＣＲＣ症例又はＡＡ症例のいずれかをＣＴＬ個体と比較した。
個々のタンパク質及びそれらの組合せの幾つかの診断パフォーマンスは、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線、及びＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）によって評定される。さらに、種々の検定の感度、特異度、正の予測値及び負の予測値（ＰＰＶ及びＮＰＶ）を、最良のユーデン指数（Youden's Index）によって規定される最適なカットオフポイント（又は同じように、感度及び特異度の合計を最大化するＲＯＣのポイント）で計算した。
ＲＯＣ－ＡＵＣ及び残りのパフォーマンス値を導き出すために使用されるスコアを、個々のタンパク質の単変量ロジスティック回帰モデル、及び考慮されるタンパク質の種々の組合せの多変量ロジスティック回帰モデルを使用して取得した。ＡＵＣの９５％ＣＩは、個々のマーカーとそれらの組合せとの両方でＤｅＬｏｎｇ方法論を使用して取得した。
実施例２．結果
実施例２．１．個々のマーカーの結果
個々のタンパク質を評価するための様々な測定基準を決定し、ＣＲＣ／ＡＡ対ＣＴＬの以下の比較も行った。ＡＲＥＧ、ＣＹＦＲＡ２１－１、及びＦｌｔ３Ｌは、ＣＲＣ群とＣＴＬ群との間で有意に異なり、ＡＵＣは０．５とは有意に異なる（９５％信頼区間には０．５が含まれていないため）ことがわかる。ＡＡ群の場合、ＡＲＥＧもＣＴＬ群と比較した統計的差異を示す。
実施例２．１．個々のマーカーの結果
個々のタンパク質を評価するための様々な測定基準を決定し、ＣＲＣ／ＡＡ対ＣＴＬの以下の比較も行った。ＡＲＥＧ、ＣＹＦＲＡ２１－１、及びＦｌｔ３Ｌは、ＣＲＣ群とＣＴＬ群との間で有意に異なり、ＡＵＣは０．５とは有意に異なる（９５％信頼区間には０．５が含まれていないため）ことがわかる。ＡＡ群の場合、ＡＲＥＧもＣＴＬ群と比較した統計的差異を示す。
表２及び表３は、ウィルコクソン検定のｐ値（ｐ．Ｗｉｌｃ）、ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）、並びに感度（Ｓｅｎｓ．）、特異度（Ｓｐｅｃ．）、並びに最良のユーデン指数を用いてＲＯＣ曲線のカットオフポイントで計算した正の予測値（ＶＰＰ）及び負の予測値（ＶＰＮ）を含む個々のタンパク質の測定基準を示す。符号の列は、ｐ値が０．２５未満のバイオマーカーについて、高レベルのマーカーが疾患のリスクを増加させるか減少させるかを示す（それぞれ＋及び－）。
実施例２．２．バイオマーカーの最良の組合せ
個々の診断能力を向上させる目的で、タンパク質の組合せを次の手順で調査した。ＣＲＣ対ＣＴＬ（表３）又はＡＡ対ＣＴＬ（表４）のいずれかの比較でｐが０．２５未満のマーカーに基づいて、多変量ロジスティック回帰を使用して、これらのタンパク質の２つ、３つ、及び４つの可能な全ての組合せを同時に調査した。
個々の診断能力を向上させる目的で、タンパク質の組合せを次の手順で調査した。ＣＲＣ対ＣＴＬ（表３）又はＡＡ対ＣＴＬ（表４）のいずれかの比較でｐが０．２５未満のマーカーに基づいて、多変量ロジスティック回帰を使用して、これらのタンパク質の２つ、３つ、及び４つの可能な全ての組合せを同時に調査した。
表４、表５、表５の２、表６、及び表６の２は、ＣＲＣ対ＣＴＬを区別して、それぞれ２つ、３つ、及び４つのバイオマーカーの組合せで達成されたＡＵＣを示す。
表７、表８、及び表９は、ＡＡ対ＣＴＬを区別して、それぞれ２つ、３つ、及び４つのバイオマーカーの組合せで達成されたＡＵＣを示す。
それぞれのＡＵＣに基づいて、最良のモデルを選択した。表１０及び表１０の２は、ＣＲＣの最良の結果を示す。表１１及び表１１の２は、ＡＡの最良の結果を示す。ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）、感度（Ｓｅｎｓ．）、特異度（Ｓｐｅｃ．）、並びに最良のユーデン指数を用いてＲＯＣ曲線のカットオフポイントで計算した正の予測値（ＰＰＶ）及び負の予測値（ＮＰＶ）を含むタンパク質の最良の組合せの測定基準が包含される。
最後に、表１２及び表１２の２は、本発明で特許請求される最も重要なシグネチャーの重複を示すように設計される。全ての最良のシグネチャーが［Ｆｌｔ３Ｌ及びＣＹＦＲＡ２１－１］並びに［ＡＲＥＧ及びＣＹＦＲＡ２１－１］を含むことが明確に示される。
Claims (8)
- 結腸直腸癌及び／又はその前癌段階を診断するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、ａ）被験体から得られた生物学的試料において組合せ［Ｆｌｔ３Ｌ及びＣＹＦＲＡ２１－１］の濃度レベルを測定することを含み、ｂ）健康な対照被験体において測定された基準濃度レベルと比較して、少なくとも組合せ［Ｆｌｔ３Ｌ及びＣＹＦＲＡ２１－１］の濃度レベルの偏差又は変動が特定される場合、これは前記被験体が結腸直腸癌及び／又は前癌段階に罹患していることを示す、ｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
- ａ）前記被験体から得られた生物学的試料における、少なくとも組合せ［Ｆｌｔ３Ｌ及びＣＹＦＲＡ２１－１及びＡＲＥＧ］、又は組合せ［Ｆｌｔ３Ｌ及びＣＹＦＲＡ２１－１及びＡＲＥＧ及びＥｒｂＢ４］、又は組合せ［Ｆｌｔ３Ｌ及びＣＹＦＲＡ２１－１及びＡＲＥＧ及びＣＬＥＣ２Ｃ］の濃度レベルを測定することを含み、ｂ）健康な対照被験体において測定された基準濃度レベルと比較して、工程ａ）で言及される少なくとも１つの組合せの濃度レベルの偏差又は変動が特定される場合、これは前記被験体が結腸直腸癌及び／又は前癌段階に罹患していることを示す、請求項１に記載の結腸直腸癌及び／又はその前癌段階を診断するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
- 前記結腸直腸癌の前癌段階が進行性結腸直腸腺腫である、請求項１又は２に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
- 患者から得られた生物学的試料における、結腸直腸癌及び／又はその前癌段階の診断のための組合せ［Ｆｌｔ３Ｌ及びＣＹＦＲＡ２１－１］のｉｎ ｖｉｔｒｏ使用。
- 前記患者から得られた生物学的試料における、結腸直腸癌及び／又はその前癌段階の診断のための組合せ［Ｆｌｔ３Ｌ及びＣＹＦＲＡ２１－１及びＡＲＥＧ］、又は［Ｆｌｔ３Ｌ及びＣＹＦＲＡ２１－１及びＡＲＥＧ及びＥｒｂＢ４］、又は［Ｆｌｔ３Ｌ及びＣＹＦＲＡ２１－１及びＡＲＥＧ及びＣＬＥＣ２Ｃ］の請求項４に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ使用。
- 少なくとも［Ｆｌｔ３Ｌ及びＣＹＦＲＡ２１－１］、又は［Ｆｌｔ３Ｌ及びＣＹＦＲＡ２１－１及びＡＲＥＧ］、又は［Ｆｌｔ３Ｌ及びＣＹＦＲＡ２１－１及びＡＲＥＧ及びＥｒｂＢ４］、又は［Ｆｌｔ３Ｌ及びＣＹＦＲＡ２１－１及びＡＲＥＧ及びＣＬＥＣ２Ｃ］の一覧から選択されるシグネチャーの濃度レベルを決定するための試薬を含むキット。
- 結腸直腸癌及び／又はその前癌段階の診断のための請求項６に記載のキットの使用。
- 前記結腸直腸癌の前癌段階が進行性結腸直腸腺腫である、請求項７に記載のキットの使用。
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