JP2022521230A - 化学的スカルペル - Google Patents
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Abstract
Description
本発明の文脈では、「ダブルノックアウト」マウスは、それらの遺伝子が不活性化されるように遺伝子工学によって改変されたマウスであり、そのため標的遺伝子の発現又は活性化が遮断されると理解される。
まず、本発明は、癌性腹膜炎を治療する目的でコラゲナーゼ酵素溶液を用いて腹膜洗浄を行うことからなる新たな治療方法論を説明し、該腹膜洗浄は、化学療法の腹腔内適用の前に、好ましくはアクセス可能な固形腫瘍の外科的摘出(細胞切除)後に行われなければならない。この意味で、本特許明細書の実施例(実施例1を参照されたい)に示されている実験に基づいて、好ましくは、3000cc~5000cc(立方センチメートル)の溶液、37U/mL(1ミリリットル当たりの単位)~148U/mLの濃度、5分~45分の時間間隔、及び36.5℃~39℃の平均温度のコラゲナーゼ溶液を用いて癌性腹膜炎に冒されたヒト被験体において腹膜洗浄を行うことは、腹膜表面からの中皮細胞、及び手術中に行われる細胞切除の後に残る可能性のある微視的腫瘍インプラントの完全な剥離を可能にすると結論付けることができる。これにより、全ての腫瘍細胞が腹腔内化学療法の作用に曝露される。さらに、この形態の前処理は、腹膜癒着に作用して、「細胞シェルター」空間にアクセスできるようにするという該前処理の追加の利点を有する。
材料及び方法
in vitro研究
Fundacion Jimenez Diazの医薬品研究委員会から承認(PIC75/2016_FJD)を得た後、同意書に署名した癌性腹膜炎の患者に由来する組織を収集した。組織片をマルチウェルプレートに入れ、35U/mLのコラゲナーゼで30分間又は24時間処理した後、培養物を洗浄し、酵素処理から得られた細胞を分析した。着想は、中皮細胞が単独で得られたのか、腫瘍細胞も得られたのかを様々な時間に確認することであった(図1)。
アジュバントとしてのコラゲナーゼによる用量/容量/時間の調整に関する研究:
微調整:
マウスに対するコラゲナーゼによる腹膜洗浄の第1の試験:
リポカリン-2遺伝子(好中球動員に影響を与える)及びApoE遺伝子(マウスがアテローム性動脈硬化症を発症する可能性を高める)が除去された5週齢のダブルノックアウト雌性マウス(LIPDKO)6匹を使用した。コラゲナーゼの濃度が異なる3本のチューブ:滅菌PBS(緩衝液)中、350U/mL、87.5U/mL、及び35U/mLを調製した。各濃度を、体重に応じて2匹のマウスに注射した。
腔の容積及び最適な治療時間を微調整して、腔内の器官が損傷を受けないようにする目的で、体重250グラムの6週齢のWistarラットを20匹使用し、臨床使用のための35U/mLのコラゲナーゼ及び37U/mLのコラゲナーゼの種々の濃度で試験した。これまでは全ての研究を実験用途のコラゲナーゼを用いて行ってきたが、製造業者から要求された効力当量計算を考慮して、ここからは臨床使用が許可されたコラゲナーゼを使用することを選択した。次いで、コラゲナーゼによる2分~30分の種々の治療時間(30分、20分、15分、10分、5分、及び2分)を使用して研究を実施し、4つの中間時間でn=2を使用した。
本発明の方法論を微調整するため、種々のコラゲナーゼ酵素用量(350U/mL、175U/mL、87.5U/mL、70U/mL、35U/mL、17.5U/mL、8.75U/mL、3.5U/mL、及び0%)を、10分間の腹膜洗浄によってLIPDKOマウスで試験した。培養皿で増殖させた洗浄から得られた細胞、及び種々の濃度で洗浄した後の腹膜組織の形態を分析した。最も適切な用量は35U/mLのコラゲナーゼであると決定した。
癌性腹膜炎モデルは、同系BDIXラットへのDHD細胞の腹腔内注射によって、2001年にGarcia Olmo博士らによって微調整された(The site of injection of tumor cells in rats does not influence the subsequent distribution of metastases. Garcia-Olmo DC, Garcia-Rivas M, Garcia-Olmo D, Ontanon J. Oncol Rep. 2003;10(4):903-7.;Orthotopic implantation of colon carcinoma cells provides an experimental model in the rat that replicates the regional spreading pattern of human colorectal cancer. Garcia-Olmo D, Garcia-Rivas M, Garcia-Olmo DC, Atienzar M Cancer Lett. 1998; 23;132(1-2):127-33)。本明細書の図2に見られるように、このモデルは、ヒト偽粘液腫(癌性腹膜炎の一種)を確実に再現する。
「in vivo」モデルの開発。癌性腹膜炎のラットでの第I相(微調整)
「in vivo」モデルの開発のため、6匹のBDIXラットで癌腫症を引き起こし、治療を4週間後に提案した。治療は腹膜洗浄によって異なる濃度(370U/mL、2×148U/mL、74U/mL、37U/mL、0)のコラゲナーゼを使用することからなり、3匹の動物に対して開放システムで灌流ポンプを使用し、他の3匹の動物にはいかなる灌流ポンプも使用せずに行った(図3)。コラゲナーゼの用量選択は、群の以前の研究によって決定された(微調整中のマウス及びラットでの第1の試験)。接種された6匹の動物のうち、4匹は非常に広範な癌腫症を示し、2匹は軽度の癌腫症を示し、1匹は皮下注射領域の腫瘍のみを示した。腹膜洗浄の方法は、動物に吸入麻酔を与えた後、腹腔を縦切開で露出させ、腹腔を上記の種々の濃度に希釈したコラゲナーゼで満たすことからなった。次いで、腹膜の連続洗浄(乳酸リンゲル溶液のみ)を行い、動物はそれぞれの場合に無作為に選択し、治療を全ての動物で10分間継続した。
化学療法剤のコアジュバントとしてのコラゲナーゼの用量の調整
参照される本発明の実施例に記載される実験を行う前に、本発明を実施するため、規定の時間及び用量でのコラゲナーゼによる治療の安全性を作業の第1段階で試験した。
群1:370U/mLのコラゲナーゼ。血性洗浄液、大網及び中胚葉の破壊。洗浄液中の腫瘍片。
群2:148U/mLのコラゲナーゼ。わずかに血性の洗浄液、容易に分離可能な大網及び中胚葉。洗浄液中に固形腫瘍片が観察される。
群3:74U/mLのコラゲナーゼ。非血性洗浄液、容易に分離可能な大網及び中胚葉。洗浄液にはインプラントはほとんど観察されないが、中胚葉及び大網の腫瘍インプラントのアクセス可能性は絶対的である。
群4:37U/mLのコラゲナーゼ。非血性洗浄液、容易に分離可能な大網及び中胚葉。洗浄液には腫瘍インプラントは観察されないが、中胚葉及び大網の両方で完全に露出しているように見える。
この段階の間、マイトマイシンC等の化学療法剤による腹膜腫瘍の治療におけるコラゲナーゼのコアジュバント又は増強の役割について学ぶために、様々な作業群及びサブグループで一連の生存実験を確立した。
これまで、以下の重大な結果が得られた。
「in vitro」の結果から、コラゲナーゼは、35U/mLの濃度で組織の端部を破壊し、中皮細胞を解放して、腫瘍の血管新生を制限すると推定された。より長い酵素時間は、より多くの細胞の解放及びより大きな組織損傷につながる。さらに、時間が45分を超えると組織が損傷し、取り出された細胞の生存率が阻害されることが観察された(図1)。
コラゲナーゼ87.5U/mLの用量を用いたマウス:皮膚から完全に剥がれ、触れると自然に破裂する、血液性で実質的に透明な腹壁。腹膜洗浄はPSS(生理食塩水、0.9%塩化ナトリウム)で行い、洗浄した生成物をDMEM+10%FBS+1%P/Sが入ったペトリ皿(P100)に播種する。6時間後に顕微鏡下で皿を観察すると、細胞が皿に付着しているのが見られ、大量の赤血球も見られる。全ての腹部器官を摘除する。器官をつなぐ全ての構造が弱くなったか、又は存在しなかったかのように、摘除の際に器官は非常に簡単に互いに分離することがわかる。
コラゲナーゼ35U/mLの用量を用いたマウス:自然に破裂する非常に薄い血性腹壁。非常に容易な器官の摘除。
17.5U/mL及び8.75U/mLの用量を用いたマウス:マウスの1匹は、菲薄化が最も少ない、幾分血性の腹壁を示す。腸腫瘤全体が固定されており、切除するのにより多くの労力が必要である。もう一方のマウスは、正常な外観及び色の腹壁を持つ。腸腫瘤はしっかりと固定されている。摘除した全ての器官(腹膜、膀胱、子宮、大腸、小腸、胃、脾臓、肝臓、腎臓、及び大血管)を、その後の解剖病理学研究のためにホルムアルデヒド中に保管する。
ラットでの「in vivo」微調整試験の当初の結果から、35U/mLのコラゲナーゼの濃度が提案された目的に理想的であり、最良の治療時間は10分~15分であると推定され、その後、腸及び大網を覆う中皮細胞の除去が観察されるが、腸管を含むいかなる器官も関与していない。上記の濃度及び時間での組織学的研究は、中間層又は内層の関与なしに腸管を覆う中皮層の菲薄化を実証し、これは、いかなる器官の関与もなしに腫瘍組織を露出することと同等であると理解される。腹腔と相互作用した残りの器官は影響を受けず、腹腔壁の菲薄化は1つの研究でのみ観察されたが、動物を損なうことなくその後の生存率が確認された(図4)。
ラット1。菲薄化は外筋壁で観察され、幾つかの局所的な最小の損傷が或る特定の領域で観察される。腸を取り巻く脂肪細胞は確かに破壊されている。
ラット2。腸壁は幾分薄いが、損傷は見らない。
ラット4。正常に見える。
ラット5。最も損傷を受けたラット。外筋層には、損傷及び糜爛の幾つかの病巣ポイントがある。
癌性腹膜炎モデルを微調整するための研究において、同系BDIXラットにDHD細胞を注射した後の癌性腹膜炎の発生は、全ての場合で80%成功した。
濃度及び癌腫症モデルを生成したら、上記の表1に列挙された群に従って、コラゲナーゼによる治療とマイトマイシンCによる治療とを関連付けることにより安全性研究を実施した。文献では同等性は5mg/動物のマイトマイシンCの用量を推奨しているが、本著者らによって行われた最初の試験が、エンドポイント基準に達し、適切な鎮痛プロトコルにもかかわらず屠殺しなければならなかった動物の数が多かったことを指摘することは重要である。この理由で、群Dでは用量を0.5mg/動物及び0.1mg/動物に下げた。このようにして、適切な鎮痛プロトコルを用いると、動物は場合によっては2週間まで生存することができた。
群A(コラゲナーゼ):5匹中4匹が生存し、1匹は内臓摘出のために手術後に死亡した。
群B(種々の用量のマイトマイシン)。大量の連続鎮痛(トラマドールSC/12時間で2日間、ブプレクス+ミダゾラムSC/12時間で1週間)にもかかわらず、動物は高用量(5mg/動物)では2週間を超えて生存することができず、動物は常に無気力であり、ほとんど活動を示さない。低用量(0.1mg/動物)では、高用量の動物と比較するために1週目に1匹の動物を屠殺するが、残りは試験が終了するまで生存する。この低用量群の1週目に大量の鎮痛剤が必要であることを指摘しなければならない。
群C(DHD):文献のデータによる通常の動物の進行があり、動物を適切な時期に屠殺する。
群D(DHD+コラゲナーゼ+マイトマイシン):2つの濃度(0.5mg/動物及び0.1mg/動物)のマイトマイシンを使用し、最初の動物を1週間後の適切な時間に屠殺し、残りを2週間後に屠殺する。これらの屠殺時間は、動物の状態が悪化しているためではなく、腸の構造を群Bの動物と比較する必要があるために選択される。
群E(DHD+マイトマイシン5mg/動物)。この群は生成された最初の動物群であり、追跡期間全体を通して大量の鎮痛剤が使用されたにもかかわらず、エンドポイント基準のために全ての動物を屠殺しなければならなかった。動物の半数は、おそらく5mgの用量での腹腔内マイトマイシンの影響のために、手術後の最初の夜に死んでいるのが発見された。
群F(DHD+コラゲナーゼ):異なる動物を1ヶ月後及び2ヶ月後に屠殺する(動物モニタリングプロトコルによると痛みの兆候は観察されない)。
設計された方法は、実行可能で、安全で、再現性がある。
生成された製品は、化学的/酵素的なスカルペル(手術用ナイフ)として示される。
研究で開発された最適な濃度及び時間では、組織学的に器官又は組織の障害は観察されない。
治療後に生き残った唯一の動物は、障害も疼痛も示さなかった。
癒着の除去におけるコラゲナーゼの有効性
このアッセイの目的は、後で使用するためにラットの腹膜癒着のモデルを設計することであった。そのため、いずれも雄性のWistarラットで2つの異なる可能性を試験した。4匹の対照(手術されていないラット)を使用した。
低密度ポリプロピレンメッシュの小片の適用
最初の群(群1)に属する合計10匹のラットのうち5匹の6週齢のWistarラットの介入。フォーレンによる事前の吸入麻酔、動物の剃毛、及び無菌対策を実施し、皮膚及び腹壁に最小限の開口部を作り、正中線の両側に5つずつ、ポリプロピレンメッシュの小片を10個移植する。ポリプロピレンメッシュは、事前にpss(生理食塩水(0.9%NaCl))で湿らせた0.5cm2の小片に切断されている。
腹腔内プロテーゼの適用から4ヶ月後、実験の最終段階のため動物を再び手術する。その前に採血する。まず、群1に属するラットで実験を行う。研究をペア及び単盲検(研究者)で無作為化する。検査技師は使用された溶液を知っているが、それが何であるかについては述べない。次に、手術したラットのそれぞれで得られた結果を収集する:
未知の溶液(PBS)を37℃で20分間投与。
ディクテーション:「腹腔を四分円で体系的に確認し、そこに触診によって判断したメッシュ片を含む脂肪凝集体が見つかる。アクセス可能なメッシュが見つからず、内臓損傷のリスクがあるため、試料を取り出さない。」
未知の溶液(PBS)を37℃で20分間投与する。
ディクテーション:「メッシュは、損傷を与えることなく穏やかに引っ張ると解放できないことが認められるため、試料を収集しない。」
20mlの未知の溶液(PBS中の0.05%コラゲナーゼ)を20分間加える。
ディクテーション:季肋部ループの球の1つをわずかに引っ張ると壊れて、メッシュ(3)の幾つかの断片が解放され、これをホルマリンに導入する。
20mlの未知の溶液(PBS中の0.05%コラゲナーゼ)を20分間加える。
ディクテーション:「洗浄後、大網に見られるメッシュはわずかに引っ張るとすぐに解放される。恥骨上脂肪の別のメッシュは、脂肪凝集体を損傷することなく切り離され(dissected and released)、6片のメッシュがデジタル解剖で出血することなく解放される。」
20mlの未知の溶液(PBS)を20分間加える。
ディクテーション:「右季肋部では、露出したメッシュは見られない。メッシュは、ループを損傷することなく、わずかに引っ張ると脱離する。以前に見られた脂肪凝集体が見つかり、弱く引っ張って分離しようとしたが、メッシュは見られなかった。出血の開始に応じて、左季肋部に切り替えた。盲腸に隣接する前述のメッシュは、実際には完全に解放されることなく、強く引っ張ると幾らかは脱離する。より大きな力で引っ張ることにより、メッシュを取り出した。腸のループに折り返されたメッシュを弱く引っ張って解放しようとする。脂肪が壊れてメッシュが解放される。3つ目のメッシュは盲腸及び回腸末端の凝集体から解放される。下腹部に、強く引っ張ると外れる1つ目のメッシュを確認した。2つ目のメッシュがその領域に見られ、これも解放されるが、多くの力を加えなくてはならない。」
20mlの未知の溶液(PBS)を20分間加える。
ディクテーション:「大網に依存するメッシュは、わずかに引っ張ると解放される。下腹部のメッシュは、わずかに中程度の強さで引っ張っても解放されない。下腹部の球は、わずかに引っ張っても解放されない。球の2番目のメッシュを中程度の強さで引っ張って脱離しようとしたが、成功しなかった。」
20mlの未知の溶液(PBS中の0.05%コラゲナーゼ)を20分間加える。
ディクテーション:「洗浄後、脾臓大網のメッシュは自己限定的な出血の兆候を示す。メッシュは完全に上皮化され、高度に血管新生されている。中程度に繰り返し引っ張ると、脂肪はその構造を失うが、メッシュは強制的に取り出さない。回腸末端の球に含まれるメッシュの1つは、わずかに引っ張ると完全に分離する。メッシュを取り除いた後、組織は幾分壊れやすい。中程度の強さの引っ張りで解放される堅い恥骨上脂肪(tense suprapubic fat)のメッシュへの回腸末端の癒着がある。恥骨上脂肪組織からメッシュを解放する試みがなされ、強く引っ張ったが成功しなかった。デジタル鈍的切開を試みたがメッシュの取り出しは成功しなかった。2回目の試みでは、メッシュが脾臓の大網から解放され、隣接する組織が壊れやすくなる。ループの集合体からメッシュを解放しようとしたが、成功しなかった。腹腔内出血のため、腹腔内洗浄を閉じる前に行う。」
20mlの未知の溶液(PBS中の0.05%コラゲナーゼ)を20分間加える。
ディクテーション:「盲腸は同じ外観で、慢性炎症の兆候がある。同じ位置に屈曲があり、それらは容易に分離されない。デジタルプル(digital pulling)ではメッシュでは感じられない。肝臓では、これまで見られなかったメッシュが観察され、強く引っ張っても分離せず、出血のリスクがあるため手技を停止する。メッシュはわずかに引っ張ると肝大網から分離する(メッシュは2つあり、そのうちの1つは簡単に分離することができない)。下腹部では、壁と接触しているメッシュの1つが分離され、2つ目のより深いメッシュは分離されない。腹腔内出血のためpssによる洗浄を行う。」
20mlの未知の溶液(PBS中の0.05%コラゲナーゼ)を20分間加える。
ディクテーション:「腸間膜のメッシュは、わずかに引っ張るとすぐに解放される。肝大網のメッシュは完全に上皮化されているが、容易に解放される。また脾臓大網のメッシュも完全に上皮化されており、これも容易に解放される。壁への下腹部脂肪への癒着は容易に解放される。3つのメッシュがいかなる合併症及び出血もなしに恥骨上脂肪から解放される。」
20mlの未知の溶液(PBS)を20分間加える。
ディクテーション:「腸ループに癒着した大網メッシュは、操作すると壊れやすいことが示される。出血を伴う脂肪からの部分的な分離があり、停止する必要があった。脾臓の大網に癒着したメッシュは、中程度の強さの引っ張りでは解放されず、自己制限的な出血がある。同じ群で、別のメッシュを強く引っ張ると解放することができ、2つ目のメッシュを強く引っ張ると解放される。メッシュは、強く引っ張っても恥骨上脂肪から解放されない。」
大きなメッシュが左の壁に癒着し、別のメッシュが右の大網に癒着しているのが見られる。
未知の溶液による治療:37℃のPBSで20分間。
閉塞を解消するための機械的癒着剥離。縫合糸を設置して引張(mmHg単位の圧力(P))を実施する:
左上大網の引裂きP:243
左壁の引裂きP:286
左下部の引裂きP:298
右下部の引裂きP:269
未知の溶液による治療:PBS(mmHg単位の圧力(P)):
右季肋部の引裂きP:275
左季肋部の引裂きP:320
左上側腹部の引裂きP:288
左下側腹部の引裂きP:380
右腸骨窩の引裂きP:340
左腸骨窩の引裂きP:380
*引裂きP=引裂き圧力
未知の溶液による治療:PBS(mmHg単位の圧力(P)):
右季肋部の引裂きP:268
左季肋部の引裂きP:315
左季肋部2の引裂きP:344
左側腹部の引裂きP:393
左側腹部2の引裂きP:378
下腹部の引裂きP 360
右側腹部の引裂きP:401
治療:0.05%コラゲナーゼ(mmHg単位の圧力(P)):
右腰部(hyp)の引裂きP:320
右腰部の引裂きP:262
左腰部の引裂きP:276
左腰部2の引裂きP:198
左腰部3の引裂きP:253
左腰部4の引裂きP:168
左腰部の引裂きP:340
治療:0.05%コラゲナーゼ(mmHg単位の圧力(P)):
右腰部の引裂きP:170
右腰部2の引裂きP:291
右腸骨窩の引裂きP:140
胃間膜の引裂きP:120
下腹部の引裂きP:180
左腸骨窩の引裂きP:184
左側腹部の引裂きP:181
左大網の引裂きP:145
左大網2の引裂きP:201
治療:0.05%コラゲナーゼ(mmHg単位の圧力(P)):
肝臓の引裂きP:130
下部肝臓の引裂きP:230
右上季肋部の引裂きP:270
下部肝臓2の引裂きP:123
左側腹部の引裂きP:129
左側腹部2の引裂きP:144
盲腸の引裂きP:126
胃間膜の引裂きP:79
胃間膜2の引裂きP:91
右側腹部の引裂きP:172
右側腹部2の引裂きP:160
生化学及びサイトカインのために心臓内穿刺によって全てのラットから採血した。
R11、355g
心臓内穿刺による採血の合併症。壁、横隔膜、腸間膜を含む小腸の試料を採取してホルマリンに導入した。
巨視的:中間領域のループの球。メッシュも癒着も見られない。
生化学及びサイトカインのため心臓内穿刺によって採血する。組織をサンプリングする。
巨視的:壁への癒着、ループ間の癒着、目に見えるメッシュはない。
採血し、組織の試料を問題なく採取する。
巨視的:非常に肥大した盲腸は、ループの球と共に骨盤脂肪に付着している。
採血し、組織の試料を問題なく採取する。
巨視的:恥骨上脂肪及び胃大網への癒着、メッシュが含まれ、完全に脂肪で覆われている。
採血し、組織の試料を問題なく採取する。
巨視的:壁への癒着又はループ間の癒着はない。メッシュなし。
採血し、組織の試料を問題なく採取する。
巨視的:強く結合した小腸の腸ループの球、及び恥骨上脂肪へのループの癒着。メッシュを見ることはできない。
採血し、組織の試料を問題なく採取する。
巨視的:ループの球が恥骨上脂肪に癒着し、その中にメッシュが含まれている。盲腸にも癒着している。
採血し、組織の試料を問題なく採取する。
巨視的:肥大した盲腸。肝大網内のメッシュ。腸ループ及び肉芽腫への堅い癒着。これを取り出し、後で分析するために印を付ける。
採血し、組織の試料を問題なく採取する。
巨視的:ねじれた側面を有する、互いに癒着した腸ループ。左側壁脂肪(left parietal fat)への癒着。肥大した盲腸。
R2、328g(対照)
採血し、組織の試料を問題なく採取する。
巨視的:対照ラット。病理学的所見なし。
採血し、組織の試料を問題なく採取する。
巨視的:対照ラット。病理学的所見なし。
採血し、組織の試料を問題なく採取する。
巨視的:対照ラット。病理学的所見なし。
採血し、組織の試料を問題なく採取する。
巨視的:対照ラット。病理学的所見なし。
R1、250g
採血し、組織の試料を問題なく採取する。
巨視的:小腸を犠牲にして閉塞を伴う腸閉塞の注目すべき兆候。腹腔を開く前に閉塞の兆候が認められる。骨盤内のゲージの変化。骨盤、左壁、及び脾臓下大網に癒着したメッシュ。
1mlの採血の合併症(生化学)
巨視的:恥骨上脂肪で覆われた骨盤内のメッシュ、及びそれに癒着して部分的に覆われたループの球内のメッシュが認められる。
採血し、組織の試料を問題なく採取する。
巨視的:肥大した盲腸。回腸中央部のレベルでの小腸のループのゲージの違い、閉塞の原因は認められない。小腸のループ間の癒着。子宮に癒着した左壁のメッシュ。左季肋部において別のメッシュが、胃及び大網脂肪及び卵巣に癒着していた。
採血し、組織の試料を問題なく採取する。
巨視的:肥大した盲腸。回腸の終末部-中間部のループの球。ループの球に付着した胃肝大網にあるメッシュの癒着。左腸骨窩のメッシュ。
採血し、組織の試料を問題なく採取する。
巨視的:メッシュを犠牲にした盲腸の癒着。小腸、恥骨上脂肪、及び右壁に癒着した骨盤内の2つのメッシュ。
採血し、組織の試料を問題なく採取する。
巨視的:回腸末端レベル及び左壁に癒着した腸ループ。
0.05%の濃度のコラゲナーゼは、関連する死亡率がなく、マウスモデルでの腹腔内適用に安全である。コラゲナーゼを37℃(コラゲナーゼの作用温度)で20分間激しく洗浄することにより適用した。
組織学的研究は、メッシュを配置する前又はメッシュを除去する際のいずれかにおいてコラゲナーゼで治療した場合(腹膜洗浄により)、腹膜に小さなメッシュ又は側腹部に大きなメッシュを有する動物の組織は影響を受けないことを実証する。逆に、生理食塩水で洗浄すると、メッシュに関連する多数の癒着が発生し、メッシュの取り出しが困難になる。
対照の介入直後及び介入後の種々の時点の両方において使用したモデルで連続試験を行ったところ、対照群との有意差を見つけることができず、又は生化学的パラメーター若しくは血液学的パラメーターとの関連もなかった。アミラーゼは、おそらくモデルの解剖学的特徴に起因して、両方の研究群で増加する(ラットでは、膵臓は非常に可動性がある)。
両方の群(群1及び群2)のサイトカインは、特定の試験として両方の群で研究されており、治療したマウスの血漿中を循環するサイトカインから得られた結果は次のとおりである。
抗炎症性サイトカイン:コラゲナーゼで治療したマウスにおいて、PBSで治療したマウスと比較してIL4及びIL10のわずかな増加
炎症性サイトカイン。コラゲナーゼで洗浄した動物におけるTNF-α及びIL12-p70の有意な増加(p<0.01)。INF-γに違いはない。
調節性サイトカイン:コラゲナーゼで治療した群では、IL2及びIL18の有意な増加(p<0.05)が観察される。IL1a、IL1b、IL5、IL6、IL7、IL13、及びIL17aのレベルに両群間で違いはない。
ケモカイン:コラゲナーゼで治療した群では、VEGF及びMCP1のレベルの有意な増加が観察され、分析された残りのケモカインは、群間で違いを示さない(M-MCF、MIP3a、GM-CSF、G-CSF、RANTRES、KC、及びMIP1a)。
提案モデル(ポリプロピレンメッシュ)による癒着の発生は、ヒトにおける場合と同等である。このモデルは、堅い癒着と緩い癒着との両方を発生させ、それらが発生する期間(4ヶ月)の間に、8%~10%閉塞及び偽腸閉塞の症例が観察され、これらは薬物の適用後に改善が見られた。
ペアで無作為化された群1の盲検研究では、10個の小片を有するモデルにおいて薬物を適用すると、メッシュを取り出すことの有効性の結果42%を提供するのに対し、希釈剤(PBS)を使用する対照症例では8%である。
群2の盲検研究では、4つの大きなメッシュ片を有するモデルに薬物を適用すると、188.26ミリバールの癒着引裂圧の結果を提供するのに対し、希釈剤(PBS)を使用する対照の場合は325.76ミリバールである。さらに、薬物で治療されたラットでは、薬物自体の癒着を解放する能力のため実施される引張の回数が多く、より大きな腹膜表面を露出させる。
薬物又はPBSを使用してから2ヶ月後の安楽死の際のモデルの分析では、有意差は見られなかったが、薬物で治療したモデルでは、主観的に癒着が少なくなった。
Claims (12)
- 溶液又は懸濁液中にコラゲナーゼを含む、固形腹膜腫瘍の治療における細胞傷害性薬物増強治療用又は補助治療用の組成物であって、コラゲナーゼを含む前記組成物が、細胞傷害性治療に先立って投与され、腫瘍に直接投与又は灌注され、前記細胞傷害性薬物がマイトマイシンである、組成物。
- 前記細胞傷害性薬物が前記腫瘍に直接投与又は灌注され、コラゲナーゼを含む前記組成物が細胞傷害性治療に先立って投与され、前記腫瘍に直接投与又は灌注される、請求項1に記載の組成物。
- 前記組成物が、いかなる器官の関与もなしに腫瘍組織の露出を引き起こすような濃度及び時間で、前記腫瘍に直接投与又は灌注される、請求項2に記載の組成物。
- 前記コラゲナーゼの作用が、前記細胞傷害性薬物の投与に先立って、前記腫瘍に直接投与又は灌注されるコラーゲン等のコラゲナーゼ阻害剤によって阻害される、請求項2又は3に記載の組成物。
- 腫瘍が腹膜腺癌又は腹膜癌腫からなる群より選択される、請求項1~4のいずれかに記載の組成物。
- 前記組成物が、中間層又は内層の関与なしに腸管を覆う中皮層の菲薄化を引き起こすような濃度及び時間で前記腫瘍に直接投与又は灌注される、請求項5に記載の組成物。
- 前記組成物が、37U/mL(1ミリリットル当たりの単位)~148U/mLのコラゲナーゼ溶液を含む、請求項1~6のいずれかに記載の組成物。
- 前記コラゲナーゼを、前記細胞傷害性薬物の投与に先立って、前記コラゲナーゼ阻害剤を使用する前に、腫瘍に直接投与又は灌注し、2分間~45分間作用させたままにする、請求項7に記載の組成物。
- 1000立方センチメートル~10000立方センチメートルのコラゲナーゼ溶液を平均温度36.5℃~39℃でヒト被験体の腹腔に注入するのに適した装置であって、さらに、該装置が前記溶液を、好ましくは1L/分の速度で再循環させるのに適していることを特徴とする、装置。
- 固形腹膜腫瘍の治療における細胞傷害性薬物増強治療用又は補助治療用のキットであって、
a.1000立方センチメートル~10000立方センチメートルのコラゲナーゼ溶液を平均温度36.5℃~39℃でヒト被験体の腹腔に注入するのに適した装置であって、さらに、前記装置が前記溶液を、好ましくは1L/分の速度で再循環させるのに適していることを特徴とする、装置を備え、
b.前記キットが、ヒト被験体の腹腔内の前記腫瘍を1000cc~10000ccの容量で2分間~45分間直接灌注するとき、いかなる器官の関与もなしに前記腫瘍組織の露出を引き起こすような濃度の任意に凍結乾燥されたコラゲナーゼ組成物を更に備え、
コラゲナーゼを含む前記組成物が、前記細胞傷害性治療に先立って投与され、前記腫瘍に直接投与又は灌注され、前記細胞傷害性薬物がマイトマイシンである、キット。 - 溶液中の前記再水和コラゲナーゼ組成物又はコラゲナーゼ組成物が、1000cc~10000ccの容量で37U/mL(1ミリリットル当たりの単位)~148U/mLの濃度である、請求項10に記載のキット。
- 前記装置に、37U/mL(1ミリリットル当たりの単位)~148U/mLの濃度で3000cc~5000ccのコラゲナーゼ溶液を含む組成物が事前に装填されていることを特徴とする、請求項10に記載のキット。
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