CN113710266A - 化学手术刀 - Google Patents

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CN113710266A CN202080029961.9A CN202080029961A CN113710266A CN 113710266 A CN113710266 A CN 113710266A CN 202080029961 A CN202080029961 A CN 202080029961A CN 113710266 A CN113710266 A CN 113710266A
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埃克托·瓜达拉哈拉·拉巴霍
马里亚诺·加西亚·阿兰茨
达米安·加西亚·奥尔莫
哈维尔·赫苏斯·巴兰比奥·布恩迪亚
迪莉娅·科尔特斯·吉拉尔
苏珊娜·奥尔梅迪拉斯·卢佩斯
M·卢兹·维加·克莱门特
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Himenez Diaz Health Research Foundation Institute
Universidad Autonoma de Madrid
Instituto de Investigacion Sanitaria Fundacion Jimenez Diaz
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Himenez Diaz Health Research Foundation Institute
Universidad Autonoma de Madrid
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Abstract

本发明涉及一种液体胶原酶溶液，该胶原酶溶液将通过用预定浓度的所述溶液洗涤预定时间来产生对覆盖腹膜肿瘤的组织的预调理，用作治疗腹膜实体瘤的细胞毒性药物增强或辅助治疗。在整个本发明中，所述溶液将用于以一定的浓度和时间直接施用于肿瘤或灌洗肿瘤，以使得引起覆盖肠道的间皮层变薄，而不累及中间层或内层。

Description

化学手术刀
技术领域
本发明涉及医学领域，特别涉及一种在溶液中包含胶原酶的组合物，该组合物用作实体瘤治疗中的细胞毒性药物增强或辅助治疗。
背景技术
本发明主要用于改善腹膜癌病(peritoneal carcinomatosis)治疗的临床结果。腹膜内化疗是治疗大多数晚期癌症的最佳方法。为了在无病间隔期和生存期方面获得良好的结果，必须通过复杂的外科手术实现完全的细胞减灭术(切除所有癌性肿块)。然而，外科医生可能无法检测到手术后可能形成的微小肿瘤植入物。有时，微小肿瘤植入物位于非常难以接近和检测的位置。此外，这些微小植入物通常会被腹膜间皮细胞层覆盖，这可能会使无法有效到达肿瘤块的化疗无效。
本发明通过提出一种在溶液中包含胶原酶的组合物来解决该问题，该组合物用作实体瘤治疗中的细胞毒性药物增强或辅助治疗。
附图说明
图1.从源自患者活组织检查的肿瘤组织中获得的细胞在体外培养并在96小时时用胶原酶处理。A)在培养皿上的植入物样本；B)当组织消化30分钟时胶原酶释放的间皮细胞的示例；C)当组织用胶原酶消化24小时时释放的细胞的示例，观察到具有肿瘤形态的细胞和高折射率的间皮细胞的释放(细胞从培养皿上脱离并可能死亡的迹象)；
图2.腹膜癌病动物模型(大鼠)的示例。在动物的腹腔中观察到各种肿瘤结节；
图3.在腹膜癌病动物模型中用胶原酶处理的总图。使动物处于麻醉后，将含有播散性肿瘤块的腹膜腔暴露出来，用胶原酶进行洗涤直到腔充满，然后以受控的速率和温度使含有胶原酶的溶液再循环，最后除去溶液，用林格氏(Ringer’s)乳酸盐溶液洗涤腹膜，对腹膜进行分析，然后再次关闭动物腹部进行随访；
图4.在对腹膜癌病动物模型中腹膜洗涤中的胶原酶浓度和暴露时间进行微调的测试期间，通过苏木精和伊红染色进行组织学样本分析。从图中可以看出，仅在大鼠3和大鼠5(分别为35U/mL和87.5U/mL)的情况下观察到肠切片中脱落细胞的增加；然而，肠道的内层(粘膜下层、粘膜和上皮)完全不受影响，尽管87.5U/mL的浓度确实会局部破坏粘膜下层而不影响隐窝；在来自第2组和第4组(8.75U/mL和林格氏乳酸盐溶液)的大鼠的情况下，在低酶浓度下的与腹膜洗涤相关的外部肌肉层脱落几乎不存在，表明在这些浓度和选定的时间下没有造成不良影响；
图5.在腹膜癌病动物模型中测试时不同处理组的尸体剖检：
5.A.来自丝裂霉素5mg处理组的健康大鼠在1周随访后的尸体剖检的示例。作为主要发现，观察到所有腹部器官处于放松和收缩状态(肾脏出现坏死以及肝脏出现塌陷)，网膜一接触就会破裂，并且大肠梗阻；
5.B.来自丝裂霉素0.1mg处理组的健康大鼠在2个月随访后的尸体剖检的示例。作为主要发现，观察到肠和网膜带血；
5.C.用74U/mL胶原酶处理并在2个月后处死的健康大鼠的尸体剖检的示例。没有累及腹部器官和网膜可被视为主要发现；
5.D.来自胶原酶37U/mL+丝裂霉素0.5mg处理组的腹膜癌大鼠在1周随访后的尸体剖检的示例。作为主要发现，可以观察到器官保存完好，并且网膜看起来正常；
5.E.来自DHD处理组的腹膜癌大鼠在1个月随访后的尸体剖检的示例。在腹水肠(ascitic intestine)中可以看到与网膜和腹壁相关的若干肿瘤块；
5F.腹膜癌加胶原酶的示例。F组在进行微调时进行分析，结果与E组相似(参见表3)。
图6.代表通过数字PCR检测突变和非突变KRAS致癌基因的图。A)阳性对照的示例，来自患有腹膜癌(皮下DHD)的大鼠的血浆；B)来自用丝裂霉素C以每只动物5mg处理的腹膜癌(皮下DHD)大鼠的血浆，这是唯一一种在血浆中产生阳性突变KRAS值的血浆。突变KRAS(i)；突变KRAS+非突变KRAS(ii)；阴性对照(iii)；非突变KRAS(iv)。
具体实施方式
定义
在本发明的上下文中，“双敲除”小鼠被理解为通过基因工程修饰，从而使其基因失活，以阻断靶基因的表达或激活的小鼠。
在本发明的上下文中，液体胶原酶溶液是指将通过用预定浓度的所述溶液洗涤预定时间来产生覆盖腹膜肿瘤的组织的预调理的溶液。在整个本发明中，所述溶液将用于以一定的浓度和时间直接施用于肿瘤或灌洗肿瘤，以使得引起覆盖肠道的间皮层变薄，而不累及中间层或内层。必须指出，在本发明的上下文中，所述胶原酶溶液限定在特定浓度范围内，优选是在盐水溶液中稀释的。
在本发明的上下文中，“DHD细胞”应理解为具有上皮形态的大鼠结肠癌细胞系，其用于研究大鼠结肠转移和用于产生假粘液瘤(以存在粘液性腹膜内肿瘤为特征的腹膜癌)。
在本发明的上下文中，“同基因BDIX大鼠”应理解为由H.Druckrey博士(DruckreyH.,Landschutz C.,and Ivankovic S.(1970)Transplacentare Erzeugnung malignerTumoren des Nervensystems.II.Athyl-nitrosoharnstoff an 10genetischdefinierten Ratten-stammen.Z.Krebsforsch.73,371-386)于1937年从具有相同基因和组织的兄妹大鼠BDI和BDVIII之间杂交而创造的大鼠品系，并且从那以后一直维持兄妹大鼠之间的同系交配。由上述研究团队开发的这种模型允许了解在将要用于在大鼠中再现人腹膜癌病或假粘液瘤而注射的细胞的进展时间和浓度，特别是在解剖病理学水平上。
在本发明的上下文中，“包含液体胶原酶溶液的组合物以一定的浓度和时间直接施用于肿瘤或灌洗肿瘤，以使得引起肿瘤组织的暴露而不累及任何器官”应理解为意味着在受控的条件和浓度下用胶原酶洗涤腹膜以分解肿瘤块周围的间皮组织并允许通过局部施用的化学治疗剂进行后续治疗。为了分析不累及邻近器官，在建议的治疗后，分析了证明组织学上不累及器官及其正常功能活动的解剖功能数据。
在本发明的上下文中，“所述以一定的浓度和时间直接施用于肿瘤或灌洗肿瘤，以使得引起覆盖肠道的间皮层变薄，而不累及中间层或内层，”应理解为意味着肠道没有经历任何解剖功能损伤，将功能性定义为正常的器官活动。
在本发明的上下文中，“实体瘤”应理解为通常不包含具有囊肿或液体的区域的异常组织块。实体瘤可以是良性的(非癌性)或恶性的(癌性)。不同类型实体瘤的名称来自形成它们的细胞类型。肉瘤、癌和淋巴瘤是实体瘤的例子。
在本发明的上下文中，关于胶原酶溶液的“在化疗治疗之前施用”应理解为意味着通过胶原酶以受控方式洗涤含有实体瘤或微肿瘤的腹膜区域，以达到调理肿瘤块周围的组织并促进其后施用的细胞抑制产品的接近的目的。必须注意的是，优选地并且在施用细胞毒性药物或化疗之前，抑制胶原酶溶液。
在本发明的上下文中，“实体瘤治疗中的细胞毒性药物增强或辅助治疗”应理解为意味着通过将细胞毒性药物的作用集中在肿瘤组织上，使细胞毒性药物能够更好地接近肿瘤和邻近组织的治疗。
在本发明的上下文中，点用于将整数部分与小数部分分开。
在本发明的上下文中，酶单位(符号U)定义为在最佳酶条件下每分钟转化1μmol底物的催化活性。它也与其他单位(U/mg蛋白质或U/mL)结合使用，以分别表示比酶活性或酶活性浓度。
在本发明的上下文中，溶液是两种或更多种物质的均匀混合物。溶解的物质称为溶质，以及溶解有溶质的物质称为溶剂。
在本发明的上下文中，悬浮液是由分散在液体介质(分散相(dispersed phase))中的粉末状固体或小的不溶性颗粒(分散介质相(dispersing phase))形成的非均质混合物。
细胞毒性药物增强或辅助治疗应理解为意味着在用细胞毒性药物治疗之前用胶原酶进行的预处理允许改善病程，通过将肿瘤细胞暴露于腹腔化疗的作用并提供针对化疗本身显示的毒性的保护作用来增强实际的化疗效果。
发明内容
首先，本发明描述了一种新型治疗方法，该方法由以下组成：用胶原酶溶液进行腹膜洗涤以治疗腹膜癌病，其中所述腹膜洗涤必须在腹膜内应用化疗之前并且优选在手术切除可接近的实体瘤(细胞减灭术)之后进行。从这个意义上说，基于本专利说明书的实施例中所示的实验(参见实施例1)，可以得出结论，用胶原酶溶液、优选3000cc至5000cc(立方厘米)的溶液并且以37U/mL(单位/毫升)至148U/mL的浓度对受腹膜癌病影响的人对象进行腹膜洗涤，时段为5分钟至45分钟，平均温度为36.5℃至39℃，使得在手术过程中进行细胞减灭术后可能会残留的来自腹膜表面的间皮细胞和微小肿瘤植入物完全脱落。从而使所有肿瘤细胞暴露在腹膜内化疗的作用下。此外，这种形式的预处理具有额外的优势，即所述预处理能够作用于腹膜粘连，使“细胞庇护处(cell shelter)”空间可接近。
这种方法被称为“化学腹膜切除术(chemical peritonectomy)”，并且本发明提出将该方法用作所有形式的腹膜内化疗的预调理，包括腹膜内热灌注化疗(Hyperthermicintraperitoneal chemotherapy，HIPEC)或加压腹膜内气溶胶化疗(Pressurizedintraperitoneal aerosol chemotherapy，PIPAC)(HIPEC、PIPAC等)。
在从治疗腹膜癌病的实验中获得的结果中，注意到使用胶原酶作为化疗治疗的预调理(参见实施例的表3中的D组)不仅增强了细胞毒作用并由此增强了腹腔内化疗的治疗效果，还提供了针对化疗治疗本身所显示的毒性(在这种情况下，即针对丝裂霉素C所显示的高毒性)的保护作用。这一点很重要，这是考虑到，正如从表3中B2组(仅用0.1mg丝裂霉素C处理的对照组)的处理中所得出的，观察到器官的壁变薄并且带血的以及有许多粘连。此外，在B1组(仅用5mg丝裂霉素处理的对照组)的尸体剖检中，观察到许多刺激性和带血的粘连，以及薄的器官壁和血管。另外，可以看出E组的所有动物都死亡了。换句话说，高浓度的丝裂霉素C会杀死动物，甚至约0.1mg的丝裂霉素C的低浓度丝裂霉素C也会导致变薄且带血的壁，以及有许多粘连。与该数据形成鲜明对比的是，在用0.5mg或0.1mg丝裂霉素C处理之前用胶原酶进行预调理的D组的尸体剖检显示出，所有动物都存活并且没有粘连，尽管观察到主要在肠道中高度定位的癌病也会影响肌肉和肾脏。换句话说，如果比较表3中B组、E组和D组的数据，可以观察到用胶原酶预调理动物不仅可以改善病程，还增强了实际的化疗效果，因此，胶原酶主要以治疗腹膜癌病为目的，充当辅助治疗或增强化疗治疗(如丝裂霉素C，主要用于治疗腹膜癌病)的治疗，并充当针对化疗治疗本身(在这种情况下，即针对丝裂霉素C)所显示的毒性的保护剂。
基于这些结果，本发明的第一方面涉及一种在溶液或悬浮液中包含胶原酶的组合物，可选地作为使包含冻干胶原酶的组合物再水合的结果而包含在悬浮液或溶液中，该组合物用作治疗腹膜实体瘤的细胞毒性药物增强或辅助治疗，其中所述包含胶原酶的组合物在细胞毒性治疗之前施用，所述包含胶原酶的溶液或悬浮液直接施用于肿瘤或灌洗肿瘤。优选地，将所述细胞毒性药物直接施用于肿瘤或灌洗肿瘤，并且在细胞毒性治疗之前施用所述包含胶原酶的组合物。
在本发明第一方面的优选实施方式中，实体瘤优选选自腹膜肿瘤，更优选选自由胃腺癌或腹膜癌病组成的列表。
在本发明第一方面的另一个优选实施方式或其任何优选实施方式中，所述细胞毒性药物选自由以下组成的列表：抗生素，例如丝裂霉素或丝裂霉素C、蒽环类、博来霉素、或光神霉素；烷化剂；抗代谢物，例如5-氟尿嘧啶；铂衍生物，如顺铂或卡铂；激素，如雄激素、抗雄激素和雌激素；多柔比星、或紫杉醇；干扰素；白细胞介素；和单克隆抗体。优选地，细胞毒性药物是丝裂霉素，更优选是丝裂霉素C。
必须注意的是，“直接施用于肿瘤或灌洗肿瘤”应理解为洗涤生物体的肿瘤所在的区域或腔。
在本发明第一方面的另一个优选实施方式或其任何优选实施方式中，所述组合物以一定的浓度和时间直接施用于肿瘤或灌洗肿瘤，以使得引起肿瘤组织的暴露而不累及任何器官。必须注意的是，所述以一定的浓度和时间直接施用于肿瘤或灌洗肿瘤以使得引起肿瘤组织的暴露而不累及任何器官优选使用37U/mL至148U/mL、优选37U/mL至74U/mL的、可选地体积为1000cc至10000cc、优选为3000cc至5000cc的胶原酶溶液进行，使所述溶液作用2分钟至45分钟的时间，优选地7分钟至12分钟，然后使用胶原酶抑制剂(例如胶原蛋白)，然后施用细胞毒性药物。
在本发明第一方面的另一个优选实施方式或其任何优选实施方式中，所述实体瘤是腹膜肿瘤，以及所述组合物以一定的浓度和时间直接施用于肿瘤或灌洗肿瘤，以使得引起覆盖肠道的间皮层变薄，而不累及中间层或内层。
必须再次注意的是，所述以一定的浓度和时间直接施用于肿瘤或灌洗肿瘤以使得引起覆盖肠道的间皮层变薄而不累及中间层或内层优选使用37U/mL至148U/mL、优选37U/mL至74U/mL的、可选地体积为1000cc至10000cc、优选为3000cc至5000cc的胶原酶溶液进行，使所述溶液作用2分钟至45分钟的时间，优选地7分钟至12分钟，然后使用胶原酶抑制剂(例如胶原蛋白)或基于溶液如林格氏乳酸盐溶液进行抑制，然后施用细胞毒性药物。
本发明的第二方面涉及一种装置，该装置适用于将1000cc至10000cc、优选3000cc至5000cc的胶原酶溶液在36.5℃至39℃的平均温度下灌注到人对象的腹膜腔中，其特征还在于，所述装置适用于使溶液再循环，优选以1L/min的速率再循环。
第三方面涉及包括根据本发明第二方面的装置的试剂盒，其中所述试剂盒还包含一定浓度的可选的冻干胶原酶组合物，以使得当所述胶原酶组合物以1000cc至10000cc、优选3000cc至5000cc的体积直接灌洗人对象的腹膜腔中的肿瘤2分钟至45分钟时，引起肿瘤组织的暴露而不累及任何器官。优选地，所述再水合胶原酶组合物或在溶液或悬浮液中的胶原酶组合物为37U/mL至148U/mL，优选为37U/mL至74U/mL，体积为1000cc至10000cc，优选为3000cc至5000cc。
在本发明的第四方面，本发明的第二或第三方面的装置的特征在于，所述装置预先装载有一定浓度的胶原酶溶液，以使得当所述胶原酶组合物以1000cc至10000cc、优选3000cc至5000cc的体积直接灌洗人对象的腹膜腔中的肿瘤2分钟至45分钟时，引起肿瘤组织的暴露而不累及任何器官。优选地，所述胶原酶溶液包含浓度为37U/mL至148U/mL、优选37U/mL至74U/mL的3000cc至5000cc的胶原酶溶液。
本发明的第五方面涉及根据任一前述方面的装置或试剂盒，其中所述装置用于本发明第一方面或其任何优选实施方式中指定的治疗方法。
除了前面详述的方面之外，实施例2示出了用于设计大鼠腹膜粘连模型以供以后使用的试验。为此，在Wistar大鼠(全部为雄性)中测试了两种不同的可能性，并使用了四个对照(未手术的大鼠)。在上述两种情况下，考虑了通过应用在常规临床实践中已被证明会导致粘连的外来物(例如低密度聚丙烯网状物)来产生粘连的可能性。在热毯中，使用浓度为0.05％的胶原酶的PBS溶液，应用时间为20分钟，体积为20ml，温度为37℃，预先对药物调温。
根据所述测定的结果，确定使用胶原酶有利于粘连的释放；此外，还实现了无害地提取已知能够紧密粘附在腹膜组织上的外来成分，例如聚丙烯网状物。
因此，本发明的第六方面涉及一种在溶液或悬浮液中包含胶原酶的组合物，该组合物用作治疗以促进粘连的释放，优选腹粘连、腹膜粘连或肠粘连或组织之间的任何类型的手术后粘连。本发明第六方面的一个替代实施方式涉及一种在溶液或悬浮液中包含胶原酶的组合物，该组合物用作治疗以促进从动物或人体中提取具有紧密粘附于动物或人体组织的能力的外来成分，例如网状物，特别是聚丙烯网状物。更特别地，用于提取和治疗由手术中使用的材料引起的并随后留在组织之间的所有那些粘连，所述材料例如网状物、缝合线、假体、导管、心脏瓣膜、起搏器等。
在本发明第六方面的一个具体实施方式中，胶原酶的浓度为0.01％至0.1％，更优选为0.04％至0.06％，甚至更优选为约0.05％。在本发明第六方面的一个具体实施方式中，将所述包含胶原酶的组合物直接施用于粘连或灌洗粘连。在本发明第六方面的另一个具体实施方式中，所述包含胶原酶的组合物通过装置来施用或灌洗，该装置适用于将1000立方厘米至10000立方厘米的胶原酶溶液在36.5℃至39℃的平均温度下灌注到人对象的腹膜腔中，其特征还在于，所述装置适用于使溶液再循环，优选以1L/min的速率再循环。
在以下实施例中说明本发明。需要注意的是，所述实施例并不限制本发明。
实施例1
材料和方法
体外研究
在获得Fundación Jiménez Díaz医药产品研究委员会(PIC 75/2016_FJD)的授权后，收集了来自签署了同意书的腹膜癌病患者的组织。将组织片段收纳在多孔板中并用35U/mL胶原酶处理30分钟或24小时，然后洗涤培养物并分析从酶处理获得的细胞。这个想法是为了在不同的时间检查是单独获得间皮细胞还是还同时获得肿瘤细胞。图1。
体内研究
胶原酶作为佐剂调整剂量/体积/时间的研究：
微调：
用胶原酶对小鼠进行腹膜洗涤的第一测试：
使用六只5周龄的双敲除雌性小鼠(LIPDKO)，其中lipocalin-2基因(影响嗜中性粒细胞募集)和ApoE基因(使小鼠更可能发展动脉粥样硬化)已被消除。制备了具有三个不同浓度的胶原酶的试管：350U/mL、87.5U/mL和35U/mL的无菌PBS溶液(缓冲溶液)。根据小鼠体重将每个浓度注射给2只小鼠。
用胶原酶对大鼠进行腹膜洗涤的第一测试：
为了微调腔的体积和最佳的治疗时间，以使腔内的器官不会受到任何损伤，使用了20只6周龄的重250克的Wistar大鼠，并以用于临床应用的不同浓度的35U/mL胶原酶和37U/mL胶原酶对它们进行测试。到目前为止，所有研究都是使用实验用胶原酶进行，然而，考虑到制造商要求的效力等效性计算，从现在开始选择使用授权用于临床用途的胶原酶。然后使用从2分钟到30分钟的不同时间(30分钟、20分钟、15分钟、10分钟、5分钟和2分钟)对用胶原酶处理进行研究，在其中4个中间时间中n＝2。
微调测试的简要总结：
为了微调本发明的方法，通过10分钟腹膜洗涤用不同的胶原酶剂量(350U/mL、175U/mL、87.5U/mL、70U/mL、35U/mL、17.5U/mL、8.75U/mL、3.5U/mL和0％)对LIPDKO小鼠进行测试。分析洗涤后在培养皿中生长的细胞以及以不同浓度洗涤后腹膜组织的形态。确定最合适的剂量是35U/mL的胶原酶。
一旦选择了酶剂量，就以相同的方式并在相同的模型上通过40分钟、30分钟、20分钟、10分钟和5分钟的测试来确定作用时间。在整个微调方法中，收集洗涤液并在完全培养基中培养以分析获得的细胞；还同时采集动物的不同器官以检查在任何时间(浓度/时间)的任何器官损伤的存在以及检查腹膜组织的状况。
最后，对连续外部可及(开放式洗涤)的腹膜洗涤或使用类似于手术室中使用的灌注泵和温度控制的封闭系统进行了比较研究。对该封闭系统的洗涤液灌注率和收集系统进行了不同的测试。
腹膜癌变模型
García Olmo博士等人在2001年通过将DHD细胞腹腔内注射到同基因BDIX大鼠中而对腹膜癌病模型进行了微调(The site of injection of tumor cells in rats doesnot influence thesubsequent distribution of metastases.García-Olmo DC,García-Rivas M,García-Olmo D,
Figure BDA0003311338610000061
J.Oncol Rep.2003；10(4):903-7.；Orthotopicimplantation of colon carcinoma cells provides an experimental model in therat that replicates the regional spreading pattern of human colorectalcancer.García-Olmo D,García-Rivas M,García-Olmo DC,Atiénzar M CancerLett.1998；23；132(1-2):127-33)。正如在本文的图2中所观察到的，该模型可靠地再现了人假粘液瘤(一种腹膜癌病)。
对癌病大鼠的胶原酶安全性/有效性测试
开发“体内”模型。腹膜癌病大鼠的I期(微调)
为了开发“体内”模型，在6只BDIX大鼠中引起癌病，建议在4周后进行处理。处理由以下组成：通过腹膜洗涤使用不同浓度(370U/mL、2×148U/mL、74U/mL、37U/mL、0)的胶原酶，并且在开放系统中对3只动物使用灌注泵进行，而对其他3只动物不使用任何灌注泵(图3)。胶原酶剂量选择由该组的先前研究确定(微调期间在小鼠和大鼠中的第一测试)。在6只接种动物中，4只表现出非常广泛的癌病，2只表现出轻度癌病，其中1仅表现出皮下注射区的肿瘤。腹膜洗涤的方法由以下组成：在给予动物吸入麻醉后，以纵向切口暴露腹腔，并用稀释至上述不同浓度的胶原酶填充腹腔。然后连续洗涤腹膜(仅用林格氏乳酸盐)；随机在每种情况下选择动物，所有动物的处理持续10分钟。
在所有情况下收集洗涤的组织样本和器官用于组织学研究(图4)。
胶原酶+化疗药物对癌病大鼠的安全性测试
调整作为化疗剂辅助佐剂的胶原酶的剂量
在进行所参考的本发明实施例中描述的实验之前，在工作的第一阶段测试了在规定时间和剂量下用胶原酶处理的安全性，以实施本发明。
随后，在确定胶原酶溶液的剂量、浓度和时间的情况下，测试作为使用丝裂霉素C(主要用于治疗腹膜癌病)化疗治疗的辅助佐剂或增强剂的治疗的安全性。如今，在术中化疗期间使用不同的细胞毒剂进行腹膜洗涤；尽管如此，有证据证明丝裂霉素C是最常用的细胞毒性药物，并显示出最高的疗效。
从这个意义上说，在所有动物中接种DHD细胞并因此诱导腹膜中的实体瘤(腹膜癌病)后，不同工作组中，就其作为使用丝裂霉素C的化疗治疗的辅助佐剂或增强剂的安全性方面，确定了胶原酶的最佳剂量：
-对照组：仅用林格氏乳酸盐洗涤。中胚层很容易分离，并且洗涤是不带血的。紧密的网膜。
-1组：370U/mL胶原酶。洗涤液带血，网膜和中胚层破坏。洗涤液中有肿瘤碎片。
-2组：148U/mL胶原酶。洗涤液略带血，网膜和中胚层易分离。在洗涤液中观察到实体瘤碎片。
-3组：74U/mL胶原酶。洗涤液不带血，网膜和中胚层易分离。在洗涤液中观察到的植入物很少，但肿瘤植入物在中胚层和网膜中的可及性是绝对的。
-4组：37U/mL胶原酶。洗涤液不带血，网膜和中胚层易分离。在洗涤液中未观察到肿瘤植入物，但可以看到它们在中胚层和网膜中完全暴露。
这一阶段的外科手术由以下组成：第一方法：腹膜癌诱导，其中将DHD细胞注射到腹膜中，经过6周至8周，直到通过腹部触诊检查腹膜中存在肿瘤块；第二方法：处理，其中在给予动物吸入麻醉后，通过腹部纵向切口暴露腹腔，使腹腔充满不同浓度的胶原酶溶液在37℃下进行测试(取决于每只动物对应的组)，不断手洗腹膜，轻轻连续摇晃10分钟。在每种情况下随机选择动物。
不同处理的癌病大鼠存活率的分析
在此阶段，对各个工作组和子组建立了一系列存活实验，以了解胶原酶在使用例如丝裂霉素C的化疗药物治疗腹膜肿瘤中的辅助或增强作用：
表1
Figure BDA0003311338610000081
该阶段的外科手术由以下组成：在给予动物吸入麻醉后，用纵向切口暴露腹腔，在37℃下用37U/mL的用林格氏乳酸盐溶液稀释的胶原酶溶液或丝裂霉素C溶液(取决于每只动物对应的组别)填充腹腔，并不断手洗腹膜，轻轻连续摇晃；在每种情况下随机选择动物，所有动物的处理都持续10分钟。
在TCQ组中进行2次该程序，第一次用胶原酶，用不同待测浓度的丝裂霉素C重复洗涤腹膜2分钟后，重复测试。在所有情况下都收集洗涤的组织样本和器官用于组织学研究。在处死动物之前，还从所有动物身上采集血液，在提取后的一个小时内对血液进行处理以获得血浆，一方面分析是否存在突变的KRAS致癌基因(由DHD细胞表达的外显子1的密码子12中的突变)，另一方面分析腹膜洗涤后血液中胶原酶痕迹的存在或残留物。数字PCR用于KRAS癌基因定位研究。对于胶原酶痕量研究，匿名样本被送到Lyposmol实验室进行特异性抗MMP-1和抗MMP-2ELISAS的性能测试。
每组最初由6只大鼠(2×3)组成。在最初的设计中，3只动物在15天后被处死，其余的放置直到动物的状况为需要处死它们(皮下肿瘤生长直径＞0.5cm)或最多2个月。进行的测试由以下组成：根据数据收集表进行日常动物控制；处死后抽血获得血浆，并对腹壁、小肠、大肠(升肠、横肠、降肠)、肝、脾、肾和大网膜进行组织学研究。然而，不幸的是，并非所有注射了DHD的动物都产生了癌病，也不是所有的动物都能在计划的时间里存活下来，因此不可能所有组都遵循最初的设计。
结果
迄今为止，已经取得了以下显著的结果：
用胶原酶对小鼠进行腹膜洗涤的第一测试：
从“体外”结果推断，浓度为35U/mL的胶原酶破坏组织边缘，释放间皮细胞并限制肿瘤血管化。更长的酶时间导致更多细胞的释放和更大的组织损伤。此外，已经观察到，在超过45分钟时，组织会受损并且提取的细胞的活力受到抑制。图1。
经过若干次“体外”测试得出的主要结论是：胶原酶的最佳浓度为35U/mL，最佳时间为30分钟。时间或浓度的显著增加会对高百分比的“体外”细胞造成损害。
从小鼠的I期(微调)的“体内”结果可以看出，如下表所示，施用不同剂量胶原酶后半小时，小鼠5和6(接受最高剂量)无精打采，表现出疼痛的迹象并且对抓握的反应非常低。肉眼也可以看到腹壁已经脱落。此外，其中一只接受35U/mL胶原酶的小鼠对抓握反应良好，但表现出疼痛迹象。使用胶原酶剂量最高的小鼠在一小时内死亡。其余的动物在镇痛状态下放置24小时。
表2
Figure BDA0003311338610000091
*PCI：癌病指数，其中，＞10＝显著累及腹膜的癌病
微调阶段的尸体剖检的结果总结如下：
-使用87.5U/mL的胶原酶剂量的小鼠：腹壁带血、几乎透明，完全脱离皮肤并在接触时自行破裂。用PSS(生理盐水溶液，0.9％氯化钠)进行腹膜洗涤，将洗涤后的产物接种在具有DMEM+10％FBS+1％P/S的培养皿(P100)上。6小时后在显微镜下观察培养皿，可见细胞贴附于培养皿上，也可见大量红细胞。切除所有腹部器官。可以看出，这些器官在移除时很容易彼此分离，就好像将它们连接在一起的所有结构都已减弱或不存在一样。
-使用35U/mL的胶原酶剂量的小鼠：腹壁非常薄、带血，会自行破裂。移除器官非常容易。
-剂量为17.5U/mL和8.75U/mL的小鼠：其中一只小鼠的腹壁略带血，但减薄最少。整个肠道肿块是牢固的，需要更多的努力来切除它。另一只小鼠的腹壁具有正常的外观和颜色。肠道质量得到很好的保护。将所有移除的器官(腹膜、膀胱、子宫、大肠、小肠、胃、脾、肝、肾和大血管)都保存在甲醛中，用于随后的解剖病理学研究。
用胶原酶对大鼠进行腹膜洗涤的首次测试：
从对大鼠“体内”微调测试的初步结果推断，对于提出的目标，35U/mL的胶原酶浓度是理想的，最佳处理时间为10分钟至15分钟；在那之后，观察到覆盖肠道和网膜的间皮细胞被清除，但没有累及包括肠道在内的任何器官。在所述浓度和时间下的组织学研究表明，覆盖肠道的间皮层变薄，而不累及中间层或内层；这理解为相当于在不累及任何器官的情况下暴露肿瘤组织。与腹腔相互作用的其余器官不受影响，仅在一项研究中观察到腹腔壁变薄，但随后证实动物的生存能力没有减弱(图4)。
样本解剖病理报告：
-大鼠1.观察到外肌壁变薄，并且在某些区域观察到一些局部最小损伤。肠道周围的脂肪细胞确实被破坏了。
-大鼠2.肠壁稍薄，但未观察到损伤。
-大鼠4.表现正常。
-大鼠5.受到最大损伤的老鼠。外肌层有若干个损伤和侵蚀的中心。
从图2中可以观察到，仅在大鼠3和大鼠5(分别为70U/mL和87.5U/mL)的情况下观察到肠切片中脱落细胞的增加；然而，肠道的内层(粘膜下层、粘膜和上皮)完全不受影响，尽管87.5U/mL的浓度确实会局部破坏粘膜下层而不影响隐窝；在来自第2组和第4组(8.75U/mL和林格氏乳酸溶液)的大鼠的情况下，外部肌肉层脱落几乎不存在，表明在这些浓度和选定的时间下没有造成不良影响。
这种微调方法对大鼠的第二个可评估结果是，考虑到在解剖病理学研究和动物及其腹膜器官的宏观研究中获得的相同结果，根据制造商的指示，计算并验证了实验用胶原酶和临床用胶原酶之间的等效性。
用于生成腹膜癌病的模型：
在对腹膜癌病模型进行微调的研究中，在所有情况下，同基因BDIX大鼠注射DHD细胞后产生腹膜癌病的成功率为80％。
不同处理的癌病大鼠存活率的分析
一旦产生浓度和癌病模型，根据上表1中列出的组，通过将胶原酶处理与丝裂霉素C处理相关联来进行安全性研究。需要指出的是，尽管文献中的等效推荐剂量为每只动物5mg丝裂霉素C，但本作者进行的初步试验表明，大量动物达到了终点标准，而不得不被处死，尽管有合适的镇痛方案。出于这个原因，D组的剂量降低到每只动物0.5mg和每只动物0.1mg。以这种方式并采用合适的镇痛方案，在某些情况下，动物能够存活长达2周。
与不同处理相关的宏观和存活结果如表3所示。
表3
Figure BDA0003311338610000111
以下可以认为是表3中列出的结果的总结：
-A组(胶原酶)：5只动物中有4只存活，1只在手术后因取出内脏而死亡。
-B组(不同剂量的丝裂霉素)。尽管大量持续镇痛(曲马多(Tramadol)SC/12h持续2天；Buprex+Midazolan SC/12h持续1周)，但动物在高剂量(5mg/每只动物)下仍无法存活超过2周；这些动物总是无精打采，很少活动。在低剂量(0.1mg/每只动物)下，第1周处死1只动物并与高剂量动物进行比较，但其余动物存活至测试结束。必须指出，该低剂量组在第一周需要大量镇痛。
-C组(DHD)：根据文献数据的正常动物进展，在适当的时间处死动物。
-D组(DHD+胶原酶+丝裂霉素)：使用2种浓度(每只动物0.5mg和每只动物0.1mg)的丝裂霉素，1周后在适当的时间处死第一只动物，2周后处死其余动物。选择这些处死时间不是因为动物的状况恶化，而是因为需要将它们的肠道结构与B组的动物进行比较。
-E组(DHD+每只动物丝裂霉素5mg)。该组是产生的第一组动物，尽管在整个随访期间使用了大量镇痛，但由于终点标准，所有动物都必须被处死。在手术后的第一个晚上，发现一半的动物死亡，这可能是由于5mg剂量的腹腔内丝裂霉素的影响。
-F组(DHD+胶原酶)：1个月和2个月后处死不同的动物(根据动物监测方案未观察到疼痛迹象)。
基于这些数据，注意到使用胶原酶作为化疗治疗(D组)的预调理是如何使所用化疗剂(在这种情况下是丝裂霉素C)的浓度显著降低，而获得类似的解剖病理结果的。这一点很重要，因为从表3中可以看到，关于B2组用0.1mg丝裂霉素进行处理，观察到器官的壁变薄并且带血以及有许多粘连。此外，在用5mg丝裂霉素处理的B1组的尸体剖检中，观察到许多刺激性和带血的粘连，以及薄的器官壁和血管。另外，可以看出E组的动物全部死亡。换句话说，高浓度的丝裂霉素会杀死动物，而0.1mg浓度的丝裂霉素C导致壁变薄且带血，以及有许多粘连。与该数据形成鲜明对比的是，在用0.5mg丝裂霉素处理之前用胶原酶进行预调理的D组的尸体剖检显示，所有动物都存活并且没有粘连，尽管观察到主要在肠道中高度定位的癌病也会影响肌肉和肾脏。换句话说，如果比较表3中B和D的数据，可以观察到用胶原酶预调理动物不仅允许改善病程，还增强了实际的化疗效果，因此，胶原酶充当化疗治疗(如丝裂霉素C，主要用于治疗腹膜癌病)的辅助治疗，并充当针对化疗治疗本身(在这种情况下，即针对丝裂霉素C)所显示的毒性的保护剂。
此外，分析了从不同组的动物获得的血浆样本。
收集的血浆及其条件如表4所述。
表4
Figure BDA0003311338610000121
Figure BDA0003311338610000131
为了通过数字PCR分析不同组血液中突变KRAS的存在，根据制造商的数据，使用QIAamp循环核酸试剂盒从至少2ml血浆/组中提取DNA，结果为表4中列出的那些。图6示出了对C组(阳性对照)和E组获得的图，E组是在不同的处理中唯一可认为血浆具有阳性突变KRAS的组。
表4
组 突变KRAS事件数量 健康KRAS事件数量
A 0 2426
B 0 1253
C 13094 7424
D-1 7 8677
D-2 2 3774
E 524 5228
F 1 2198
检查处理后和随访期间动物血液中是否有胶原酶残留的ELISA结果为，MMP-1和MMP-2均为阴性。
结论：
-设计的方法可行、安全且可重复。
-显示产生的产品为化学/酶促手术刀。
-在研究中制定的最佳浓度和时间下，没有观察到组织学上的器官或组织损伤。
-唯一的在处理后保留存活的动物没有出现任何损伤或疼痛。
实施例2
胶原酶去除粘连的功效
该试验的目的是设计大鼠腹膜粘连模型以供以后使用。为此，在Wistar大鼠(全部为雄性)中测试了两种不同的可能性。使用了四个对照(未手术的大鼠)。
在上述两种情况下，考虑了通过应用在常规临床实践中已被证明会导致粘连的外来物(例如低密度聚丙烯网状物)来产生粘连的可能性。在热毯中，使用浓度为0.05％的胶原酶的PBS溶液，应用时间为20分钟，体积为20ml，温度为37℃，并预先对药物调温。
通过这些数据，可以看出胶原酶伴随轻微拉动而释放粘连的功效。另一个相关发现是应用处理时出现的胰反应。
实验的第一阶段
应用小块低密度聚丙烯网状物
对属于第一组(第1组)的总计10只大鼠中的5只6周龄Wistar大鼠进行干预。在使用Forane进行吸入麻醉之前，将动物剃毛，并实施无菌措施，在皮肤和腹壁上开一个最小的开口，以植入10小片聚丙烯网状物，中线两侧各5片。将它们事先用生理盐水溶液(physiological saline solution，pss)(0.9％ClNa)润湿，然后切成0.5cm2的小块。
手术前施用曲马多5mg/kg和头孢唑林(cefazolin)30mg/kg。需要进行稀释以施用合适的体积。
随访每日体重控制并皮下施用曲马多。
之后(第一次干预的两天后)，对第1组剩余的5只Wistar大鼠进行干预，并对体重和伤口进展进行相同的随访，并在接下来的72小时内施用镇痛。
大约一个月后，对属于第二组(第II组)的额外6只6周龄的Wistar大鼠进行干预。在用Forane吸入麻醉、将动物剃毛并实施无菌措施后，进行剖腹术，在腹腔中植入4个聚丙烯网状物，中线两侧各2片。在植入之前，网状物用pss润湿。
在接下来的几天内对大鼠进行随访，每24小时皮下施用曲马多，持续72小时。
实验的第二阶段
施加腹膜内假体四个月后，再次对动物进行手术以进行实验的最后阶段。手术之前抽血。首先，对属于第1组的大鼠进行实验。该研究是随机成对和单盲的(研究者)。实验室技术人员知道所使用的溶液，但没有记载是什么。接下来，收集在每只手术大鼠中获得的结果：
1.R13，295g：口述：“肉眼未见网状物。在盲肠的肠系膜和末端回肠有一折叠的区域，明显包含小片网状物。腹壁闭合处无粘连。非创伤性进入。”
在37℃施用未知溶液(PBS)20分钟。
口述：“系统地按象限检查腹腔，发现其中的脂肪团块，通过触诊确定，其中包含网状物片。由于没有发现可触及的网状物，并且由于存在内脏损伤的风险，因此不取出样本。”
2.R14，268g：口述：“观察到两片网状物粘附在脾脏腹膜上，以及网状物粘附在网膜和卵巢脂肪(左髂窝)上。末端回肠和结肠游离。小肠彼此之间和肝脏之间的粘连牢固，可能继发于网状物，但无法验证，因为由于肝脏出血的风险，无法将它们取出。在右髂窝，杂乱状的卵巢脂肪中具有网状物。卵巢脂肪通过另一网状物牢固粘连在壁上。”
在37℃施用未知溶液(PBS)20分钟。
口述：“观察到，在不造成损伤的情况下，不能通过轻轻拉动来释放网状物，因此没有收集样本”
3.R11，294g；口述：“非创伤性进入。与壁无粘连。在右季肋部有一团肠袢(intestinalloop)，网膜含有网状物碎片。在该区域至少观察到2团。盲肠被折叠并扩张。左季肋部是游离的。骨盆脂肪中含有网状物。”
添加20ml未知溶液(0.05％胶原酶的PBS溶液)20分钟。
口述：轻微拉动下，其中一团季肋部袢会破裂，并释放出几片网状物(3)，将其引入甲醛中。
4.R12，284g：口述：“非创伤性进入。与壁无粘连。在右季肋部有一受污染状的网状物碎片，在添加处理之前将其移除。在下腹观察到压缩的脂肪，由于其质地，该压缩的脂肪可能含有网状物。在腔的其余部分未观察到网状物碎片。”
添加20ml未知溶液(0.05％胶原酶的PBS溶液)20分钟。
口述：“洗涤后，轻轻拉动即可轻松释放在网膜中所见的网状物。在不损坏脂肪聚集体的情况下解剖并释放耻骨弓上的脂肪中的另一网状物，6片网状物通过数字解剖被释放并且没有出血。”
5.R15，309g：口述：“非创伤性进入。在右季肋部未见网状残留物。在卵巢和子宫内膜附近可见没有暴露的网状物的脂肪聚集体。在左季肋部，在盲肠和小肠附近有一脂肪聚集体。可见连接到网膜的两个部分暴露的网状物。下腹脂肪中可见一网状物，其包含在所述脂肪中，但没有暴露出来。”
添加20ml未知溶液(PBS)20分钟。
口述：“在右季肋部中未见暴露的网状物。轻轻拉动网状物即可分离，而不会损坏袢。找到了之前所见的脂肪聚集体，并尝试轻柔拉动将其分开，但没有找到网状物。为了应对出血发作，我们切换到左季肋部。先前描述的与盲肠相邻的网状物在强力拉动下有些分离，而没有真正完全释放。通过用更大的力拉动，网状物被提取出来。尝试微弱拉动以释放折叠在肠袢上的网状物。脂肪分解，释放网状物。第三个网状物从盲肠和末端回肠的团块中释放出来。在下腹中，我们找到了因强力拉动而脱落的第一个网状物。在该区域可以看到第二个网状物，该网状物也被释放，但需要施加很大的力。”
6.R16，257g：口述：“非创伤性进入。进入腹腔后，在脾方面可见包含在网膜中的网状物。在右季肋部未见网状残留物，也未见脂肪中可能含有它们。在左侧腹，观察到一团袢，其中至少包含一个可见的网状物。袢更深处可能有网状物。在下腹中，可以看到一团袢连同卵巢脂肪，并包含至少一个可见的网状物。在左髂窝内，有一脂肪聚集体，其中未见网状物。在下腹中，至少有两个网状物形成一团袢。”
添加20ml未知溶液(PBS)20分钟。
口述：“依赖于网膜的网状物通过轻微拉动而释放。轻微的中等强度拉动不会释放下腹中的网状物。轻微拉动不会释放下腹的团。尝试以中等强度拉动将团的第二个网状物分离，但没有成功。”
7.R17，249g：口述：“非创伤性进入。肠沿中线聚集成2个结实的团，它们一起移动。脾网膜内有网状物粘附在一团袢上。在右季肋部未见网状物。脂肪聚集在左季肋部，但无可见的网状物。在下腹，有一脂肪聚集体，里面有网状物。”
添加20ml未知溶液(0.05％胶原酶的PBS溶液)20分钟。
口述：“洗涤后，脾网膜的网状物表现出自限性出血迹象。网状物是完全上皮化和高度血管化的。通过重复中度拉动，脂肪会失去其结构，但没有强行提取网状物。末端回肠的团中包含的其中一个网状物在轻微拉动时完全分离。移除网状物后，组织有些脆弱。末端回肠粘连到张紧的耻骨弓上的脂肪上，通过中等强度的拉动释放。尝试通过强力拉动从耻骨弓上的脂肪组织中释放网状物，但没有成功。在没有成功提取网状物的情况下尝试了数字钝性解剖。在第二次尝试中，网状物从脾网膜上释放，相邻组织是脆弱的。尝试从袢的团块中释放网状物，但没有成功。在腹腔积血封闭之前进行腹膜洗涤。”
8.R18，256g：口述：“进入时有少量肌肉出血，肌肉出血没有进入腹腔。盲肠很大。末端回肠有褶皱：距盲肠几厘米处有两个弯曲，上面覆盖有白色的膜。其余的肠是游离的。在右侧腹，紧邻盲肠，有一团袢，其中含有无法提取、拉动时非常脆弱的脂肪。在肝周脂肪中至少有两个网状物。在下腹中，与2个网状物结合的脂肪与壁接触。”
添加20ml未知溶液(0.05％胶原酶的PBS溶液)20分钟。
口述：“盲肠具有相同的外观，有慢性炎症的迹象。在同一位置有弯曲，它们不容易分开。通过数字拉动无法感知网状物。在肝脏中，观察到先前未见的网状物，并且它不会因强力拉动而分离，由于出血风险而停止操作。网状物通过轻微拉动与肝网膜分离(有两个网状物，其中一个不易成功分离)。在下腹中，与壁接触的其中一个网状物分离；第二个更深的网状物没有分离。用pss洗涤以清洗腹腔积血。”
9.R19，330g：口述：“非创伤性进入。未见与壁的粘连。有小肠袢的团块，与盲肠相邻，肠系膜内有网状物。在右季肋部有一团袢，外观正常，未见任何网状物。在肝网膜中观察到网状物，包括在肝网膜中。在肝和脾网膜之间有另一个网状物。在耻骨弓上的脂肪中可以感知若干个网状物。”
添加20ml未知溶液(0.05％胶原酶的PBS溶液)20分钟。
口述：“轻轻拉动即可轻松释放肠系膜网状物。肝网膜的网状物完全上皮化，但很容易释放。脾网膜的网状物也完全上皮化并且也很容易释放。粘附到壁的下腹脂肪很容被释放。从耻骨弓上的脂肪中释放出三个网状物，没有任何并发症，也没有出血。”
10.R20，264g：口述：“轻微的穿透伤，血液未进入腹腔。进入后，可以看到中线处有一团袢，影响小肠和盲肠。在两个点处可以观察到小肠的肠系膜中的几个网状物碎片，这两个点形成两个旋转区域。肝网膜牢固地粘附在两组网状物的其中一个上，右侧依赖于肠系膜。脾网膜在盲肠下方扭曲，另一组网状物在最远端。左侧耻骨弓上的脂肪中有网状物碎片，其粘结和粘附到壁上，包含至少2个也粘附在小肠上的网状物碎片。”
添加20ml未知溶液(PBS)20分钟。
口述：“粘附在肠袢上的网膜的网状物在操作时会变得脆弱。与脂肪部分地分离并伴随出血，使得必须停止。中度用力拉动不会释放粘附在脾网膜上的网状物，伴随自限性出血。在同一组中，另一网状物通过强力拉动成功释放，第二个网状物通过强力拉动成功释放。网状物不会通过用力拉动而从耻骨弓上的脂肪中释放。”
对第一组中的10只大鼠进行了新的血液测试。对于它们中的每只，在手术后15天采血。分析使用胶原酶之后的细胞因子。
其次，对属于第2组的大鼠进行实验。对这组大鼠进行手术，分为两组，每组3只大鼠，第一组接受0.05％胶原酶，另一组接受安慰剂(PBS)。之后，对它们进行粘附撕裂测试，测量最大压力和粘附撕裂时的曲线。为此，使用了由高精度数字压力表组成的粘附撕裂测量系统，该系统测量具有三个出口的封闭刚性系统的压力。一个是手动压力泵，另一个是具有线性移动性的活塞，该活塞上装有用于拉动的夹子，并从压力表中抽出压力。使用该系统测量导致胶原酶组与对照组中产生的粘附撕裂所需的压力。
记录该过程以便能够分析导致撕裂所需的压力曲线。
1.R1，245g：口述：“重要的肠袢扩张。结肠塌陷，其中有少量粪便。骨盆中有口径的变化，与粘附在小肠和壁上的网状物有关。肠梗阻。它的体重增加不如其他动物多，尾巴上的深褐色斑点表明脱水。”
可见一个大的网状物粘附在左壁上，另一个粘附在右侧网膜上。
用未知溶液处理：PBS在37℃下20分钟。
机械粘连松解术以解决梗阻。放置缝合线以进行拉动(压力(P)，单位为mm Hg)：
P撕裂左上网膜：243
P撕裂左壁：286
P撕裂左下：298
P撕裂右下：269
2.R6，298g：口述：“非创伤性进入。袢具有正常外观。其中存在带有盲肠的袢团(Ball of loops)，未见任何网状物。两个网状物粘附在胃肝网膜和耻骨弓上的脂肪上，一个在右侧，另一个在左侧。第三个网状物固定在左壁上。没有梗阻。”
用未知溶液处理：PBS(压力(P)，单位为mm Hg)：
P撕裂右季肋部：275
P撕裂左季肋部：320
P撕裂左上侧腹：288
P撕裂左下侧腹：380
P撕裂右髂窝：340
P撕裂左髂窝：380
*P撕裂＝撕裂压力
3.R7，273g：口述：非创伤性进入。粘附的袢中没有网状物。在右侧腹从肝网膜到耻骨弓上的脂肪可见网状物。另一个网状物牢固地粘附在脾脏、胃和左季肋壁上。左髂窝中和左侧腹的网状物粘附在子宫、耻骨弓上的脂肪和左壁上。骨盆中的网状物粘附在膀胱和耻骨弓上的脂肪上。
用未知溶液处理：PBS(压力(P)，单位为mm Hg)：
P撕裂右季肋部：268
P撕裂左季肋部：315
P撕裂左季肋部2：344
P撕裂左侧腹：393
P撕裂左侧腹2：378
P撕裂下腹：360
P撕裂右侧腹：401
4.R8，268g：“非创伤性进入。袢团中无网状物。左髂窝-左侧腹有3个网状物，与壁、子宫和耻骨弓上的脂肪粘连。第4个网状物位于右季肋部，粘附于壁、网膜和肝脏。”处理：0.05％胶原酶(压力(P)，单位为mm Hg)：
P撕裂右hyp：320
P撕裂右hyp：262
P撕裂左hyp：276
P撕裂左hyp2：198
P撕裂左hyp3：253
P撕裂左hyp4：168
P撕裂左hyp：340
5.R9，275g：口述：“非创伤性进入。具有正常分布的肠袢。右侧腹的网状物粘附在壁和腹膜后脂肪上。左上侧腹的网状物上皮化和血管化，牢固地粘附在壁和耻骨弓上的脂肪上。左髂窝的网状物牢固地粘附在壁上。”
处理：0.05％胶原酶(压力(P)，单位为mm Hg)：
P撕裂右hyp：170
P撕裂右hyp2：291
P撕裂右髂窝：140
P撕裂胃系膜：120
P撕裂下腹：180
P撕裂左髂窝：184
P撕裂左侧腹：181
P撕裂左网膜：145
P撕裂左网膜2：201
6.R10，260g：口述：“非创伤性进入。肠袢外观正常，盲肠扩大。在右髂窝，观察到部分粘附到下腹和后壁的网状物，浸入腹膜后脂肪中。在左侧腹，可以看到3个部分上皮化的网状物相互粘附。上面两个网状物在其中包含脾，下面一个网状物与卵巢紧密接触，外观黑而大。”
处理：0.05％胶原酶(压力(P)，单位为mm Hg)：
P撕裂肝脏：130
P撕裂下肝脏：230
P撕裂网状物右上季肋部：270
P撕裂下肝脏2：123
P撕裂左侧腹：129
P撕裂左侧腹2：144
P撕裂盲肠：126
P撕裂胃系膜：79
P撕裂胃系膜2：91
P撕裂右侧腹：172
P撕裂右侧腹2：160
2018年07月26日对第二组的6只大鼠和4只对照组进行了新的血液测试。分析使用胶原酶之后的细胞因子
两组均安乐死
通过心内穿刺从全部大鼠中抽血用于生物化学和细胞因子。
第1组(10只大鼠，提及了其中9只)
R11，355g
心内穿刺取血困难。取壁、隔膜和小肠及其肠系膜的样本，并引入甲醛中。
宏观：中间区域有袢团。未见网状物或粘连。
R12，310g
通过心内穿刺抽血用于生物化学和细胞因子。对组织进行取样。
宏观：与壁无粘连，袢之间无粘连，无可见的网状物。
R15，335g
抽血并取组织样本，未发生意外。
宏观：盲肠非常大，与一团袢一起粘附在骨盆脂肪上。
R13，313g
抽血并取组织样本，未发生意外。
宏观：粘附到耻骨弓上的脂肪和胃网膜，其中包含网状物，完全被脂肪覆盖。
R14，276g
抽血并取组织样本，未发生意外。
宏观：与壁或袢之间没有粘连。没有网状物。
R16，304g
抽血并取组织样本，未发生意外。
宏观：强力结合小肠肠袢团，袢粘附到耻骨弓上的脂肪上。未见网状物。
R17，265g
抽血并取组织样本，未发生意外。
宏观：袢团粘附在耻骨弓上的脂肪上，其中包含网状物。也粘附至盲肠。
R18，270g
抽血并取组织样本，未发生意外。
宏观：盲肠增大。肝网膜中有网状物。粘附到肠袢和粘附到具有硬度一致性的肉芽肿瘤。它被提取并标记以供以后分析。
R19，368g
抽血并取组织样本，未发生意外。
宏观：肠袢相互粘连，呈扭曲状。粘附至左腔壁的脂肪。盲肠增大。
对照组(4只大鼠)
R2，328g(对照)
抽血并取组织样本，未发生意外。
宏观：对照大鼠。无病理发现。
R3，288g(对照)
抽血并取组织样本，未发生意外。
宏观：对照大鼠。无病理发现。
R4，327g(对照)
抽血并取组织样本，未发生意外。
宏观：对照大鼠。无病理发现。
R5，298g
抽血并取组织样本，未发生意外。
宏观：对照大鼠。无病理发现。
第II组(6只大鼠)
R1，250g
抽血并取组织样本，没有发生意外。
宏观：值得注意的迹象：以小肠为代价发生梗阻的肠梗阻。在打开腹腔之前就观察到梗阻的迹象。骨盆口径变化。网状物粘附在骨盆、左壁和脾下网膜。
R6，312g
抽取1ml血液困难(生物化学)
宏观：在骨盆中观察到一网状物，被耻骨弓上的脂肪覆盖，还有一网状物在一团袢中，粘附至该团袢并被部分覆盖。
R7，296g
抽血并取组织样本，未发生意外。
宏观：盲肠增大。在回肠中部水平的小肠袢的口径具有差异，没有观察到梗阻原因。小肠袢之间粘连。左壁的网状物粘附在子宫上。左季肋部的另一网状物粘附在胃、网膜脂肪和卵巢上。
R8，291g
抽血并取组织样本，未发生意外。
宏观：盲肠增大。中部末端回肠具有袢团。位于胃肝网膜中的网状物粘附在袢团上。左髂窝具有网状物。
R9，301g
抽血并取组织样本，未发生意外。
宏观：盲肠粘连以牺牲网状物为代价。骨盆中有两个网状物，粘附在小肠、耻骨弓上的脂肪和右壁上。
R10，258g
抽血并取组织样本，未发生意外。
宏观：肠袢粘附在末端回肠和左壁的水平。
所进行的实验的表格总结如下所示：
Figure BDA0003311338610000201
结论：
-浓度为0.05％的胶原酶对小鼠模型中的腹膜内应用是安全的，且无相关死亡。其通过在37℃(胶原酶的作用温度)下剧烈洗涤20分钟而应用。
-组织学研究表明，在放置网状物之前或移除网状物时用胶原酶处理(通过腹膜洗涤)时，腹膜中有小网状物或腹侧有大网状物的动物的组织不受影响。相反，当用盐水溶液洗涤时，会产生大量与网状物相关的粘连，使网状物难以提取。
-在干预后立即使用和在不同控制点使用的模型中进行了一系列测试，没有发现与对照组或生物化学或血液学参数相关的显著差异。两个研究组的淀粉酶均增加，这可能是由于模型的解剖学特征(在大鼠中，胰腺非常灵活)。
-两组(第1组和第2组)中的细胞因子均已作为特定测试在两组中进行了研究，其中从在处理的小鼠的血浆中循环的细胞因子获得的结果为：
-抗炎细胞因子：与用PBS处理的小鼠相比，用胶原酶处理的小鼠中IL4和IL10的增加不显著。
-促炎细胞因子：用胶原酶洗涤的动物中TNF-α和IL12-p70显著增加(p＜0.01)。
INF-γ没有差异。
-调节细胞因子：在用胶原酶处理的组中观察到IL2和IL18的显著增加(p＜0.05)。两组之间在IL1a、IL1b、IL5、IL6、IL7、IL13和IL17a的水平上没有差异。
-趋化因子：在用胶原酶处理的组中观察到VEGF和MCP1的水平显著增加，分析的其余趋化因子(M-MCF、MIP3a、GM-CSF、G-CSF、RANTRES、KC和MIP1a)显示出组之间没有差异。
在四个月时，两个组之间所有细胞因子和趋化因子的水平都接近于未进行腹部手术的对照大鼠的正常化水平。
-提出的模型(聚丙烯网状物)产生的粘连与人中的相似。该模型产生紧张和松散的粘连，并且在它们产生的时间(4个月)内，观察到8％至10％的梗阻和假性肠梗阻病例在应用药物后有所改善。
-在随机成对的第1组盲法研究中，在具有10小片的模型中应用药物，提供了42％提取网状物功效的结果，而使用稀释剂(PBS)的对照病例中为8％。
-在第2组的盲法研究中，在具有4个网状物大碎片的模型中应用药物，提供了188.26毫巴的粘附撕裂压力的结果，而在使用稀释剂(PBS)的对照病例中为325.76毫巴。此外，在那些用药物治疗的大鼠中，由于药物本身的释放粘连的能力，这会暴露更大的腹膜表面，因此进行的拉动次数更多。
-对使用药物或PBS 2个月后进行安乐死的模型的分析没有显示出任何显著差异，尽管主观上用药物治疗的模型中似乎出现较少的粘连。
最终结论：在37℃下使用浓度为37mg/Kg的胶原酶20分钟进行腹膜洗涤有利于与人类模型相当的鼠模型中粘连的释放。此外，还实现了无害地提取已知能够紧密粘附在腹膜组织上的外来成分，例如聚丙烯网状物。

Claims (12)

1.一种在溶液或悬浮液中包含胶原酶的组合物，所述组合物用作治疗腹膜实体瘤的细胞毒性药物增强或辅助治疗，其中所述包含胶原酶的组合物在细胞毒性治疗之前施用，所述组合物直接施用于肿瘤或灌洗所述肿瘤，并且其中所述细胞毒性药物是丝裂霉素。
2.根据权利要求1所述用途的组合物，其中，所述细胞毒性药物直接施用于所述肿瘤或灌洗所述肿瘤，并且其中所述包含胶原酶的组合物在细胞毒治疗之前施用，所述组合物直接施用于所述肿瘤或灌洗所述肿瘤。
3.根据权利要求2所述用途的组合物，其中，所述组合物以一定的浓度和时间直接施用于所述肿瘤或灌洗所述肿瘤，以使得引起肿瘤组织的暴露而不累及任何器官。
4.根据权利要求2或3所述用途的组合物，其中，在施用所述细胞毒性药物之前，通过例如胶原蛋白的胶原酶抑制剂来抑制所述胶原酶的作用，所述胶原酶抑制剂直接施用于所述肿瘤或灌洗所述肿瘤。
5.根据权利要求1至4中任一项所述用途的组合物，其中，所述肿瘤选自由腹膜腺癌或腹膜癌组成的列表。
6.根据权利要求5所述用途的组合物，其中，所述组合物以一定的浓度和时间直接施用于所述肿瘤或灌洗所述肿瘤，以使得引起覆盖肠道的间皮层变薄，而不累及中间层或内层。
7.根据权利要求1至6中任一项所述用途的组合物，其中，所述组合物包含37U/mL(单位/毫升)至148U/mL的胶原酶溶液。
8.根据权利要求7所述用途的组合物，其中，在施用所述细胞毒性药物之前，所述胶原酶直接施用于所述肿瘤或灌洗所述肿瘤，并在施用所述胶原酶抑制剂之前，使所述胶原酶作用2分钟至45分钟。
9.一种装置，所述装置适用于将1000立方厘米至10000立方厘米的胶原酶溶液在36.5℃至39℃的平均温度下灌注到人对象的腹膜腔中，其特征还在于，所述装置适用于使溶液再循环，优选以1L/min的速率再循环。
10.一种试剂盒，所述试剂盒用作治疗腹膜实体瘤的细胞毒性药物增强或辅助治疗，所述试剂盒包含：
a.装置，所述装置适用于将1000立方厘米至10000立方厘米的胶原酶溶液在36.5℃至39℃的平均温度下灌注到人对象的腹膜腔中，其特征还在于，所述装置适用于使循环溶液再循环，优选以1L/min的速率再循环，以及
b.其中所述试剂盒还包含一定浓度的可选的冻干胶原酶组合物，以使得当所述胶原酶组合物以1000cc至10000cc的体积直接灌洗人对象的所述腹膜腔中的肿瘤2分钟至45分钟时，引起肿瘤组织的暴露而不累及任何器官。
其中所述包含胶原酶的组合物在细胞毒性治疗之前施用，所述组合物直接施用于所述肿瘤或灌洗所述肿瘤，并且其中所述细胞毒性药物是丝裂霉素。
11.根据权利要求10所述用途的试剂盒，其中，所述再水合胶原酶组合物或在溶液中的胶原酶组合物的浓度为37U/mL(单位/毫升)至148U/mL，体积为1000cc至10000cc。
12.根据权利要求10所述用途的试剂盒，其特征在于，所述装置预先装载有组合物，所述组合物包含浓度为37U/mL(单位/毫升)至148U/mL的3000cc至5000cc的胶原酶溶液。
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