CN116982599A - 一种小鼠自发性肝癌模型的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种自发性肝癌动物模型的构建方法，包括胆管结扎和利用硫代乙酰胺的化学诱导步骤。通过所述构建方法获得的新型小鼠自发性肝癌成瘤模型较同种或异种移植瘤模型有更贴近临床患者的肿瘤免疫微环境。可用于研究肝细胞癌发生发展过程中的组织病理，分子特征以及肿瘤微环境改变；同时也可作为临床前动物模型用于新型抗肿瘤药物开发、肝细胞癌实验性治疗及诊断研究的验证。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种小鼠自发性肝癌模型及其构建方法和应用。
背景技术
肝细胞癌是一种高度异质性的癌症，通常经由“肝炎-肝硬化-肝癌”三部曲演变而来，同时伴有潜在的慢性肝病和合并症。目前常用的小鼠肝癌模型包括：1)基因工程小鼠模型；2)化学诱导小鼠模型；3)同种或异种移植瘤模型。其中基因工程小鼠前期建模周期长，成本昂贵，此外基于基因工程构建的小鼠模型更适用于研究具体特定基因在肝癌发生发展过程的作用，传统的建模方式主要是通过重组基因敲入或目的基因敲除构建，现有的转基因肝癌小鼠模型多采用cMYC联合其他基因共转染后过表达构建，该方法的造模成本高、成瘤不均一、不稳定，同时由于肝癌有明显的异质性，导致该模型不易用于评价除特定基因外的其他基因在肝癌发生发展过程中的作用，因此对于自发性肿瘤的研究有一定局限性。单纯化学诱导的小鼠肝癌模型包括使用遗传毒性和非遗传毒性的致癌物来诱导小鼠肿瘤发生，但这一模型也不能完全模拟肝癌在体内的发生过程，尤其是不能重现部分病人早期肝内胆汁淤积的病理生理过程，导致该方法构建的模型也有一定缺陷。同种或异种移植瘤模型是目前最常用的肝癌原发性模型，主要通过皮下或肝脏原位等途径注射肿瘤单细胞悬液或种植瘤块形成原发性肝癌模型，然而该模型不能完全模拟患者体内肿瘤生长微环境，瘤内免疫细胞数量也较自发性肿瘤明显减少，因此在免疫治疗相关研究中也不能作为较为理想的模型。
为了解决上述问题，本发明提供了一种新型小鼠自发性肝癌成瘤模型及其构建方法和应用。
本发明第一方面提供了一种自发性肝癌动物模型的构建方法，包括胆管结扎和化学诱导步骤。
在某些实施方式中，所述化学诱导的试剂选自DEN，CCl4，AFB，硫代乙酰胺(TAA)。
在某些实施方式中，所述化学诱导的试剂为硫代乙酰胺(TAA)。
在某些实施方式中，所述胆管结扎一周到两周后拆线再进行硫代乙酰胺(TAA)饮水诱导。
在某些实施方式中，所述硫代乙酰胺(TAA)饮水中TAA浓度为0.05％。
在某些实施方式中，所述动物选自小鼠、大鼠或兔。
在某些实施方式中，所述方法进一步包括胆管结扎前的动物准备、动物麻醉和术前消毒步骤。
在某些实施方式中，所述方法进一步包括硫代乙酰胺(TAA)饮水诱导后的模型功能验证步骤。
在某些实施方式中，所述功能验证包括组织形态学检查、HE染色及肝癌相关标志物免疫组织化学检测。
本发明第二方面提供了根据本发明第一方面所述的方法获得的动物模型在研究肝细胞癌发生发展过程中的组织病理，分子特征以及肿瘤微环境改变中的应用。
本发明第三方面提供了根据本发明第一方面所述的方法获得的动物模型作为临床前动物模型用于新型抗肿瘤药物开发、肝细胞癌实验性治疗及诊断研究的验证中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1)本发明提供了一种新型小鼠自发性肝癌成瘤模型，较目前常用的致肝癌模型(如单纯的化学诱导)，更加贴近临床肝癌发生发展的病理生理过程。临床部分肝癌患者在发生发展过程中会存在胆汁淤积的病理生理过程，本发明通过结扎胆道模拟肝癌发生早期胆汁淤积、胆管渐进性破坏和肝内持续性炎症,进而引起胆管细胞和肝细胞损伤,并逐步进展为肝纤维化。1-2周后将胆道结扎线放开，继而予以小鼠硫代乙酰胺(TAA)饮水，TAA在肝中代谢为硫氧化物,进而产生自由基和活性氧,破坏细胞膜的通透性,诱导肝细胞增殖,通过进一步维持肝纤维化导致持续性肝损伤，并逐步发展为肝硬化，最终引起肝癌发生。硫代乙酰胺诱导的肝纤维化模型在形态和功能上均与人肝纤维化相似，成功率高且不易逆转，能够维持持续的肝损伤；由硫代乙酰胺诱导的肝纤维化、肝硬化模型类似于人类发生肝纤维化、肝硬化时出现的病理生理改变，更具有临床前模型的应用意义。
2)本发明的新型小鼠自发性肝癌成瘤模型较基因工程小鼠简单易行，材料采购容易，成瘤率高且较均一。
3)本发明的新型小鼠自发性肝癌成瘤模型较同种或异种移植瘤模型有更贴近临床患者的肿瘤免疫微环境。
4)通过所述方法构建获得的肝癌动物模型可用于研究肝细胞癌发生发展过程中的组织病理，分子特征以及肿瘤微环境改变；同时也可作为临床前动物模型用于新型抗肿瘤药物开发、肝细胞癌实验性治疗及诊断研究的验证。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更显著：
图1显示本发明的自发性肝癌模型的构建方法流程。
图2显示模型小鼠肝脏组织形态学特征。
图3显示模型小鼠脏组织HE染色结果。其中，Mock1，Mock2为对照组，肝组织结构清晰正常，无显著病理性改变；TAA-1，TAA-2为含有TAA水喂养胆道结扎后的小鼠的肝组织，可发现明显肝纤维化以及肿瘤发生。
图4显示模型小鼠肝脏组织肝癌相关标志物AFP表达情况。其中，Mock为正常对照组，AFP染色结果为阴性；TAA-1，TAA-2为含有TAA水喂养胆道结扎后的小鼠的肝组织，AFP染色明显，表达呈阳性，提示有肝癌发生。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例的附图，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
除非另作定义，此处使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。
实施例1自发性肝癌模型的构建方法
1)动物准备：一般选择4-8周龄雄性C57小鼠(对麻醉和手术的耐受性较好)。术前禁食12小时。
2)动物麻醉：5％水合氯醛腹腔注射(按0.01ml麻药/g体重)，待小鼠麻醉成功后进行备皮，备皮范围：上至胸骨柄，下至会阴，左右分别至腋前线或腋中线，并用湿纱布擦去小鼠体毛，防止其进入腹腔引起异物反应。
3)术前消毒：用胶带将小鼠固定于操作台上，如果操作台面为泡沫板等较为疏松的材料，也可以采用大头针固定四肢，但因使用大头针固定时对小鼠有一定的创伤，可能会影响麻醉效果。小鼠固定完成后以无菌棉球蘸取碘伏，轻柔地消毒手术区域3次。
4)胆管结扎：在腹正中线、会阴上约1cm处，以眼科剪逐层剪开皮肤及肌肉等组织，向上开口至剑突上约0.5～1cm，以能暴露肝脏组织为宜。取2支无菌棉签，以生理盐水稍润湿后探入腹腔内，将肝叶、胃及部分肠管轻轻向右拨开，可观察到自肝门部位发出的与门脉伴行的透明胆管，继续向下可见胆管常附着于一小段肠管之上。以眼科镊轻柔钝性游离一小段胆管(约0.5cm)，埋置2条6-0可吸收缝线(PDS-II)手术缝线并分别打手术结。线头留取长度不宜过短，约0.5cm即可。一般此时即可观察到胆管较结扎前轻微增粗。确认腹腔内无脏器损伤或出血后，以棉签轻轻复位肝叶、胃及肠管，用5-0手术缝线逐层关腹，留取线头长度以0.3cm为宜。皮肤缝合完毕后以碘伏棉球消毒切口1-2次，注意擦净切口处血渍，并用配置好的0.05％庆大霉素溶液于小鼠后肢肌内注射50ul。一周到两周后依据动物状态确定拆线时机。
4)硫代乙酰胺(TAA)饮水：8周龄C57小鼠随机分为造模组及正常对照组，对照组只给予饮用水，造模组在饮用水中加入0.05％ TAA，整个肝癌造模过程持续30周，期间所有小鼠自由饮水、自由摄取标准鼠粮。
图1显示本发明的自发性肝癌模型的构建方法流程。
实施例2肝癌模型的验证
TAA饮水15周后每两周取样一次看肝的情况。0.5％的肝素钠润洗1.5ml EP管内壁，于实验后第48h，72h眼眶采血200ul，并加入20ul 0.5％的肝素钠。充分混合后，12000g离心10min，收取血浆置于-80℃冰箱中用于后续研究。采血完成后，用颈椎脱颈法处死小鼠后取样。摘取肝脏组织做组织形态学检查，并进行HE染色及肝癌相关标志物AFP的免疫组织化学检测。
由图2可见，含有TAA的水可导致肝癌发生，对照组(Mock)无肝癌发生。
由图3可见，含有TAA的水喂养小鼠可致明显肝纤维化以及肿瘤发生。具体表现为肝组织结构紊乱，部分区域内胶原沉积。细胞弥漫性生长，排列紧密，形态不规则，呈多样性，胞核异型性明显，部分出现空泡样改变，符合肿瘤样改变。对照(Mock)组无明显改变。
由图4可见，含有TAA的水喂养胆道结扎后的小鼠肝组织明显AFP表达阳性，对照(Mock)组小鼠的肝组织AFP表达阴性。
另外，在实施过程中，发明人发现较目前常用的致肝癌模型(如单纯的化学诱导)，更加贴近临床肝癌发生发展的病理生理过程。小鼠出现与临床患者较为相似的症状，如胆汁淤积导致的皮肤发黄，尿色加深，食欲减退，体重下降等。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这中叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (10)
1.一种自发性肝癌动物模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括胆管结扎和化学诱导步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述化学诱导的试剂选自DEN，CCl4，AFB，硫代乙酰胺(TAA)。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述化学诱导的试剂为硫代乙酰胺(TAA)。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述胆管结扎一周到两周后拆线再进行硫代乙酰胺(TAA)饮水诱导。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述硫代乙酰胺(TAA)饮水中TAA浓度为0.05％。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述动物选自小鼠、大鼠或兔。
7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括胆管结扎前的动物准备、动物麻醉和术前消毒步骤；可选地，所述方法进一步包括硫代乙酰胺(TAA)饮水诱导后的模型功能验证步骤。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述功能验证包括组织形态学检查、HE染色及肝癌相关标志物免疫组织化学检测。
9.根据权利要求1-8任一项所述的方法获得的动物模型在研究肝细胞癌发生发展过程中的组织病理，分子特征以及肿瘤微环境改变中的应用。
10.根据权利要求1-8任一项所述的方法获得的动物模型作为临床前动物模型用于新型抗肿瘤药物开发、肝细胞癌实验性治疗及诊断研究的验证中的应用。
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