JP2022518292A - ホスホジエステラーゼ４（ｐｄｅ４）阻害によるてんかんの治療方法 - Google Patents

Abstract

てんかんを治療する方法が提供される。本方法は、てんかんを有する個体に、治療有効量のホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤を投与することを含む。抗てんかん剤を同定する方法も提供される。かかる方法は、ＰＤＥ４活性アッセイにおいてＰＤＥ４ポリペプチドを候補薬剤と接触させることを含み、候補薬剤によるＰＤＥ４ポリペプチドの活性の阻害により、候補薬剤が抗てんかん剤として同定される。【選択図】図９Ｂ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／７９６，００２号の利益を主張し、この出願はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

導入
何千万人もの人々がてんかんに罹患している。８０年近くの研究および多くの新薬の出現にもかかわらず、発作緩和の有効率は大きく変化していない。てんかんの主な治療法は薬物であるが、てんかん患者の根強い３０～４０％は現在の投薬に抵抗性であり、絶え間ない再発性発作およびそれに伴う生涯にわたる健康問題を抱えている。例として、ドラベ症候群（ＤＳ）は小児てんかんであり、通常、健康な赤ん坊の生後１年目に、５分より長く（多くの場合３０分より長く）続く熱性けいれんとして現れる。ＤＳのほとんどの症例は、脳の電位依存性Ｉ型ナトリウムチャネル、Ｎａ_Ｖ１．１をコードするＳｃｎ１ａ遺伝子における機能喪失変異によるものである。その遺伝学が理解されているにもかかわらず、ＤＳは依然として非常に薬剤耐性があり、何千人もの子供たちが多くの効果のない治療法のなか苦しんでいる。

ＤＳ診断に続いて、臨床医が病気を理解し治療戦略を評価しようとするあいだ、家族はクリニックおよびＥＲを転々と出入りし、子供たちはＥＥＧ、ＣＴ、ＭＲＩ、および脊椎穿刺を繰り返し受ける。これは、幼い子供（およびその家族）が、効果的な戦略を見つけることを期待して、主に成人向けの様々な抗けいれん療法を単独でまたは組み合わせて（ｎ＝８薬物および／または手術および／またはケトン食療法）試すという厳しい試練に直面することを意味する。１つの戦略をテストするのに８～１０週間かかる可能性があることを考えると、１年に５～６つの組み合わせしかテストできず、治療戦略を特定するために複数年が必要になることがよくあり、その間中、子供たちは制御できない発作および緊急治療室への訪問を続ける。

２０１８年６月に、ＦＤＡはＤＳの最初の抗けいれん薬としてカンナビジオール（ＣＢＤ、Ｅｐｉｄｉｏｌｅｘ）を承認した。重要な前進であるが、ＣＢＤは患者の４３％で発作の頻度を減らすだけであり、完全な発作消失（最終的な目標）を達成したのは５％未満である。したがって、効果的な抗てんかん剤に対する重要な満たされていないニーズが残っている。

てんかんを治療する方法が提供される。本方法は、てんかんを有する個体に、治療有効量のホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤を投与することを含む。抗てんかん剤を同定する方法も提供される。かかる方法は、ＰＤＥ４活性アッセイにおいてＰＤＥ４ポリペプチドを候補薬剤と接触させることを含み、候補薬剤によるＰＤＥ４ポリペプチドの活性の阻害により、候補薬剤が抗てんかん剤として同定される。

代表的なＰＤＥ４遺伝子構造の概要。 本開示の実施形態に従って阻害され得るヒトＰＤＥ４Ａポリペプチドのアミノ酸配列アラインメント。 本開示の実施形態に従って阻害され得るヒトＰＤＥ４Ｂポリペプチドのアミノ酸配列アラインメント。 本開示の実施形態に従って阻害され得るヒトＰＤＥ４Ｃポリペプチドのアミノ酸配列アラインメント。 本開示の実施形態に従って阻害され得るヒトＰＤＥ４Ｄポリペプチドのアミノ酸配列アラインメント。 パネルＡ：ＰＤＥ４阻害剤（ＡＮ２７２８）の例がｓｃｎ１ｌａｂ変異ゼブラフィッシュにおいて用量依存的に生体エネルギー（bioenergetics）をベースラインレベルに回復させることを示すデータ。パネルＢ：様々なＰＤＥ４阻害剤（この例では、ロリプラム、シロミラスト、ロフルミラスト、イブジラスト、テオフィリン、ドロタベリン、およびイルソグラジン）がｓｃｎ１ｌａｂ変異ゼブラフィッシュにおいて生体エネルギーをベースラインレベルに回復させるのに効果的であることを示すデータ。 ＰＤＥ４Ｂ－、４Ｃ－および４Ｄ－モルフォリノがｓｃｎ１ｌａｂ変異ゼブラフィッシュにおいて生体エネルギーをベースラインレベルに回復させるのに効果的であることを示すデータ。 ＰＤＥ４阻害剤の２つの例（ロフルミラストおよびテオフィリン）が全般性（generalizable）てんかんのｋｃｎａ１モデルで生体エネルギーを回復させることを示すデータ。 パネルＡおよびＢ：ＰＤＥ４阻害剤（ＡＮ２７２８）の例が、発作頻度およびピーク振幅の減少を含め、ｓｃｎ１ｌａｂゼブラフィッシュにおける発作様過興奮をベースラインレベルへと遮断することを示すデータ。 パネルＡおよびＢ：ＰＤＥ４Ｂモルフォリノがｓｃｎ１ｌａｂゼブラフィッシュにおける発作様過興奮をベースラインレベルへと遮断するのに効果的であることを示すデータ。 ＰＤＥ４阻害剤（ＡＮ２７２８）の例がマウスＳｃｎ１ａ変異脳のエクスビボスライスの過興奮を減少させることを示すデータ。 ＰＤＥ４阻害剤（ＡＮ２７２８）の例が６Ｈｚ誘発マウスモデルにおいて発作の誘発から保護することを示すデータ。 ＰＤＥ４阻害剤（ＡＮ２７２８）の例がＳｃｎ１ａ変異マウスにおいて高体温（hyperthermia）による発作を予防することを示すデータ。 ２重選択的ＰＤＥ４Ｂ阻害剤（ロリプラム）がＳｃｎ１ａ変異マウスの高体温誘発性発作からの保護に有効であることを示すデータ。 ＰＤＥ４阻害剤の３つの例（ＡＮ２７２８、ロリプラム、ロフルミラスト）がＳｃｎ１ａ変異マウスの発作を部分的または完全に遮断することを示すデータ。

てんかんを治療する方法が提供される。本方法は、てんかんを有する個体に、治療有効量のホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤を投与することを含む。抗てんかん剤を同定する方法も提供される。かかる方法は、ＰＤＥ４活性アッセイにおいてＰＤＥ４ポリペプチドを候補薬剤と接触させることを含み、候補薬剤によるＰＤＥ４ポリペプチドの活性の阻害により、候補薬剤が抗てんかん剤として同定される。

本開示の方法をより詳細に記載する前に、本方法は、記載される特定の実施形態に限定されず、当然のことながら変更され得ることが理解されるべきである。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、本方法の範囲は添付の特許請求の範囲のみによって限定されるため、限定的であることを意図していないこともまた理解されたい。

値の範囲が提供される場合、その範囲の上限値と下限値との間の、文脈上そうではないと明確に指示されない限りは下限値の単位の１０分の１までの各介在値、およびその記載される範囲内の任意の他の記載値または介在値が、本発明に包含されることを理解されたい。これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立して、より小さな範囲に含めることができ、本方法の範囲内にさらに包含され、記載された範囲内で任意の具体的に除外された制限の対象となる。記載された範囲が限界の一方または両方を含む場合、限界を含んだ範囲のいずれか一方または両方を除外する範囲もまた、本方法に含まれる。

特定の範囲は、数値の前に用語「約」が付された状態で本明細書に提示される。「約」という用語は、それが先行する正確な数字、およびその用語が先行する数字に近接または近似する数字に逐語的支持を提供するために本明細書において使用される。ある数が特定の列挙された数に近接または近似するかどうかを決定するにあたり、近接または近似するが列挙されていない数とは、それが提示されている文脈において具体的に列挙された数と実質的に等価な数であり得る。

別段定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、本方法が属する当該技術分野における当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または同等の任意の方法もまた、本発明の実施または試験においても使用することができるが、代表的で例示的な方法および材料をここで説明する。

本明細書に引用されるすべての刊行物および特許は、各個々の刊行物または特許が参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示されているかのように参照により本明細書に組み込まれ、刊行物が引用される関連する方法および／または材料を開示かつ記載するために、参照により本明細書に組み込まれる。任意の刊行物の引用は、出願日前のその開示のためであり、提供される刊行日は独立して確認する必要があり得る実際の刊行日とは異なる可能性があるため、本方法がこのような刊行物に先行する権利がないと認めるものと解釈されるべきではない。

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。特許請求の範囲はいかなる任意選択的な要素も排除するように起草されてもよいことにさらに留意されたい。したがって、この記述は、特許請求の要素の列挙に関連して「専ら」、「のみ」などのような排他的な用語の使用または「負の」限定の使用のための文言的根拠としての役割を果たすことを意図している。

明瞭さのために別々の実施形態の文脈中で記載された本方法の特定の特徴はまた、単一の実施形態中で組み合わせても提供され得ることが認識される。逆に、簡潔にするために、単一の実施形態の文脈で説明される本方法の様々な特徴はまた、別々にまたは任意の適切な部分的組み合わせで提供されてもよい。実施形態のすべての組み合わせは、本開示によって具体的に包含され、本明細書において、このような組み合わせが実施可能なプロセスおよび／または組成物を内包する程度まで、まさに各々およびすべての組み合わせが個別にかつ明示的に開示されているかのように開示される。加えて、こうした変形を記載する実施形態において列挙されるすべての部分的組み合わせも、本方法によって具体的に包含され、本明細書において、まさに各々およびすべてのこのような部分的組み合わせが本明細書に個別かつ明示的に開示されているかのように開示される。

本開示を読むと当業者には明らかであるように、本明細書に説明され例証された個々の実施形態のそれぞれは、本方法の範囲または趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離され得る、または組み合わせられ得る個別の要素および特徴を有する。任意の記載された方法は、列挙された事象の順序で、または論理的に可能な他の順序で実施することができる。

治療の方法
上に要約したように、本開示はてんかんを治療する方法を提供する。てんかんを治療する方法は、てんかんを有する個体に治療有効量のホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤を投与することを含む。本方法は、ＰＤＥ４阻害が、ゼブラフィッシュおよびマウスてんかんモデルの両方において、生体エネルギー（bioenergetics）および過興奮性ニューロン表現型を遮断し、てんかんのマウスモデルにおいて高体温誘発性発作から保護し、ならびにＮＩＨが支援するＥｐｉｌｅｐｓｙ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｐｒｏｇｒａｍのエントリーポイントモデルである６Ｈｚテストを使用した発作を遮断する、との本明細書に記載されている予想外の発見に部分的に基づいている。

環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）は、環状ヌクレオチドのセカンドメッセンジャーである環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）および環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）の加水分解を触媒する。ＰＤＥ４ファミリーは、３つのｃＡＭＰ特異的ＰＤＥファミリーのうちの１つである。ＰＤＥ４は、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）を介したタンパク質リン酸化、ｃＡＭＰ応答エレメントを介した遺伝子転写、サイクリックヌクレオチド感受性イオンチャネルなど、いくつかの細胞生理学的プロセスを調節することが示されている。これらのプロセスは、認知機能、うつ病、統合失調症、高血圧、および心筋細胞の収縮性に関連付けられてきた。

ＰＤＥ４遺伝子ファミリーは、ＰＤＥ４Ａ、ＰＤＥ４Ｂ、ＰＤＥ４Ｃ、およびＰＤＥ４Ｄの４つの遺伝子アイソフォームで構成されている。アイソフォームは、スポンジおよび真正後生動物が分離する前に、真核生物の共通祖先で遺伝子重複イベントを介して発生した。４つすべてのＰＤＥ４遺伝子アイソフォームからの転写産物が哺乳類種で検出されている。代表的なＰＤＥ４遺伝子構造の概要を図１に示す。ＰＤＥ４遺伝子は、破線（条件的（facultative）エクソン）または実線（構成的エクソン）のいずれかで接続された複数のエクソンで構成されている。エクソン（１）を指定するＰＤＥ４の長形態のアミノ末端は、遺伝子の上流領域に位置し、それぞれが異なるプロモーター制御下にある。上流の保存領域－１（ＵＣＲ１）は、３つのエクソン（ＵＣＲ１ａ、ＵＣＲ１ｂ、およびＵＣＲ１ｃ）で構成されている。エクソン（１ａ）を指定するＰＤＥ４の短形態のアミノ末端は、リンカー領域１（ＬＲ１）のエクソンの下流に位置している。上流の保存領域２（ＵＣＲ２）は、３つのエクソン（ＵＣＲ２ａ、ＵＣＲ２ｂ、およびＵＣＲ２ｃ）で構成されており、エクソン（１ｂ）を指定する超短形態のアミノ末端によって中断されている。切断された超短ＰＤＥ４スプライス変異体のアミノ末端は、ＵＣＲ２ｂエクソン（１ｃ）内に見られる。ＰＤＥ４の酵素コアは、遺伝子の最も下流の領域に位置するいくつかの構成的エクソン（すべてのアイソフォームに見られる）によってコードされている。ＰＤＥ４アイソフォームの遺伝子構造およびスプライス変異体に関するさらなる詳細は、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）ＢＭＣ Ｅｖｏｌ Ｂｉｏｌ．１０：２４７に見出され、その開示は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、本開示の方法に従って阻害されるＰＤＥ４ポリペプチドは、Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）ＢＭＣ Ｅｖｏｌ Ｂｉｏｌ．１０：２４７の図Ｓ１に提供されるＰＤＥ４ポリペプチドである。

本開示の方法に従って（単独でまたは任意の組み合わせで）阻害され得るＰＤＥ４ポリペプチドの非限定的な例を表１に提供する。

本明細書で使用される場合、「ＰＤＥ４阻害剤」または「ＰＤＥ４の阻害剤」は、その薬剤の非存在下での１つ以上のＰＤＥ４アイソフォームのホスホジエステラーゼ活性と比較して、１つ以上のＰＤＥ４アイソフォームのホスホジエステラーゼ活性を阻害する（例えば、減少または無効にする）薬剤である。特定の実施形態において、阻害剤は、阻害剤の非存在下での１つ以上のＰＤＥ４アイソフォームのうちの少なくとも１つのホスホジエステラーゼ活性と比較して、１つ以上のＰＤＥ４アイソフォームのうちの少なくとも１つのホスホジエステラーゼ活性を、８０％以下、７５％以下、７０％以下、６５％以下、６０％以下、５５％以下、５０％以下、４５％以下、４０％以下、３５％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、または１％以下にする。

ＰＤＥ４Ａは、皮質、海馬、および小脳などの中枢神経系（ＣＮＳ）で発現される。ＰＤＥ４Ｂは、線条体、扁桃体、視床、および海馬を含むＣＮＳで広く発現される。ＰＤＥ４ＣはＣＮＳで広く発現していないが、嗅球で発現が観察されており、皮質での発現は限られている。ＰＤＥ４Ｄは、海馬およびその他の場所を含むＣＮＳで発現される。

いくつかの実施形態において、本方法は、ＰＤＥ４Ａ、ＰＤＥ４Ｂ、ＰＤＥ４Ｃ、およびＰＤＥ４Ｄのうちの１つ以上を阻害するＰＤＥ４阻害剤を投与することを含む。特定の実施形態において、ＰＤＥ４阻害剤は、ＰＤＥ４Ａ、ＰＤＥ４Ｂ、ＰＤＥ４Ｃ、およびＰＤＥ４Ｄのうちの２つ、３つ、またはそれぞれを阻害する。本方法は、ＰＤＥ４Ａ、ＰＤＥ４Ｂ、ＰＤＥ４Ｃ、およびＰＤＥ４Ｄの間で選択性を示すＰＤＥ４阻害剤を投与することを含み得る。「選択性」とは、ＰＤＥ４阻害剤が、ＰＤＥ４Ａ、ＰＤＥ４Ｂ、ＰＤＥ４Ｃ、もしくはＰＤＥ４Ｄを排他的に阻害するか、または、ＰＤＥ４Ａ、ＰＤＥ４Ｂ、ＰＤＥ４Ｃ、およびＰＤＥ４Ｄのうちの２つ以上を阻害するか、のいずれかであり、その２つ以上のＰＤＥ４アイソフォームの少なくとも１つの阻害が、阻害剤によって阻害される２つ以上のＰＤＥ４アイソフォーム間の別のアイソフォームの阻害よりも大きい、ことを意味する。いくつかの実施形態において、ＰＤＥ４阻害剤は、ＰＤＥ４アイソフォームに対して選択的である。本明細書で使用される場合、ＰＤＥ４阻害剤は、阻害剤が、そのＰＤＥ４アイソフォーム（ＰＤＥ４Ａ、ＰＤＥ４Ｂ、ＰＤＥ４Ｃ、もしくはＰＤＥ４Ｄ）のみを阻害するか、または、そのＰＤＥ４アイソフォームを、少なくとも１つの他のＰＤＥ４アイソフォームよりも大きな程度で阻害するかのいずれかの場合に、ＰＤＥ４アイソフォームに対して「選択的」である。例えば、特定の実施形態において、ＰＤＥ４阻害剤は、ＰＤＥ４Ｂに対して選択的であり、従ってＰＤＥ４Ｂの阻害が第２のＰＤＥ４アイソフォームの阻害よりも大きく、例えば、ＰＤＥ４Ｄの阻害よりも大きい。

いくつかの実施形態において、ＰＤＥ４阻害剤は、ＰＤＥ４Ａ、ＰＤＥ４Ｂ、ＰＤＥ４Ｃ、およびＰＤＥ４Ｄのうちの１つ、２つ、または３つを阻害しない（または実質的に阻害しない）。本明細書で使用される場合、阻害剤の非存在下でのアイソフォームの活性と比較して、ＰＤＥ４アイソフォームを阻害剤と接触させたときに、阻害剤がアイソフォームの活性を２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、または１％を超えて阻害しない場合、ＰＤＥ４アイソフォームの活性を「実質的に阻害」しない。特定の実施形態において、本方法は、ＰＤＥ４Ｄを阻害しない（または実質的に阻害しない）ＰＤＥ４Ｂ阻害剤を投与することを含む。

いくつかの実施形態において、ＰＤＥ４阻害剤は、ＰＤＥ４の触媒ドメイン（例えば、活性部位）に結合することによって作用する。他の実施形態において、ＰＤＥ４阻害剤は、ＰＤＥ４活性をアロステリックに阻害することによって作用する。１１個のＰＤＥスーパーファミリーメンバー（ＰＤＥ１～１１）はすべて、触媒ドメイン全体で高度な配列保存を示し、代わりに、固有の調節ドメインをコードするモチーフによってＰＤＥファミリーを区別する。ＰＤＥを標的とする従来の戦略は、触媒ドメインに結合するリガンドに主に焦点を当てており、それにより、ｃＡＭＰ加水分解の完全な阻害およびそれに関連する毒性、ならびに非選択的結合による治療範囲の狭さにつながってきた。ＰＤＥ４Ａ、ＰＤＥ４Ｂ、ＰＤＥ４Ｃ、およびＰＤＥ４Ｄにはそれぞれ、３つのシグネチャー調節ドメイン、すなわち、調節モジュールを形成する上流の保存領域１（ＵＣＲ１）および２（ＵＣＲ２）、ならびにＣ末端の制御領域（ＣＲ３）ドメインが含まれている。ＰＤＥ４ＢおよびＰＤＥ４Ｄの結晶構造は、ホスホジエステラーゼ活性が触媒活性部位のＵＣＲ２アロステリック制御によって調節されていることを示している。したがって、ＰＤＥ４のアロステリック調節は、ＰＤＥ４活性を選択的に妨害するための過小評価されているアプローチである。実際、小分子ＰＤＥ４Ｄアロステリックモジュレーターは、細胞およびインビボアッセイで強力である。さらに、ＰＤＥ４ＢのＵＣＲ２は、触媒ドメインの活性部位とトランスで密接に相互作用することが示されている。いくつかの実施形態において、本方法は、例えば、ＵＣＲ２が活性部位を閉じ込める態様でＰＤＥ４Ｂに結合することにより、ＰＤＥ４Ｂを選択的に（例えば、ＰＤＥ４Ｄと対比して）阻害する阻害剤を投与することを含み、それにより、ｃＡＭＰによるアクセスを抑制する。

いくつかの実施形態において、ＰＤＥ４阻害剤は、ｃＡＭＰによるアクセスを閉じるコンフォメーションにおける活性部位を横切るＣ末端調節ヘリックス（ＣＲ３）の捕捉によって、ＰＤＥ４Ａ、ＰＤＥ４Ｂ、および／またはＰＤＥ４Ｃを選択的に（例えば、ＰＤＥ４Ｄと対比して）阻害するアロステリックモジュレーターである。例えば、小分子はＣＲ３ヘリックスに沿って異なる残基と相互作用し、複数の「閉じた」コンフォメーションをもたらし得る。Ｆｏｘ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌ．２６（３）：６５７－６３。ＣＲ３ヘリックスは、活性部位上でわずかに異なる方向をとることができ、それぞれに固有のヘリックスレジストリがある。ＰＤＥ４Ｄと対比されるＰＤＥ４Ｂについての選択性を示し、本開示の方法に従って投与され得るアロステリック阻害剤の例は既知であり、２－アリールピリミジン誘導体化合物Ａ－３３（Ｈａｇａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ．２４（１６）：４０３１－４、およびＦｏｘ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌ．２６（３）：６５７－６３））、およびＨａｇａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ．２４（１６）：４０３１－４に記載のトリアジン化合物を含む。

本開示の方法を実施する場合、任意の適切なタイプのＰＤＥ４阻害剤を使用することができる。いくつかの実施形態において、ＰＤＥ４阻害剤は小分子である。「小分子」とは、１０００原子質量単位（ａｍｕ）以下の分子量を有する化合物を意味する。いくつかの実施形態において、小分子は７５０ａｍｕ以下、５００ａｍｕ以下、４００ａｍｕ以下、３００ａｍｕ以下、または２００ａｍｕ以下である。特定の実施形態において、小分子はポリマー中に存在するような反復分子単位から作られていない。本開示の方法に従って投与し得るＰＤＥ４活性の小分子アロステリックモジュレーターは既知であり、Ｇｕｒｎｅｙ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｈａｎｄｂ Ｅｘｐ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０４：１６７－９２、Ｂｕｒｇｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２８（１）：６３－７０、Ｆｏｘ ｅｔ ａｌ．（前掲）、Ｈａｇａｎ ｅｔ ａｌ．（前掲）、および他のところに記載されているものを含む。いくつかの実施形態において、ＰＤＥ４阻害剤が小分子である場合、ＰＤＥ４阻害剤は、ＡＮ２７２８（５－（４－シアノフェノキシ）－２，３－ジヒドロ－１－ヒドロキシ－２，１－ベンゾオキサボロール）、ドロタベリン、イブジラスト、イルソグラジン、ピクラミラスト、ロフルミラスト、ロリプラム、テオフィリン、アプレミラスト、化合物Ａ－３３（Ｈａｇａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ．２４（１６）：４０３１－４、およびＦｏｘ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌ．２６（３）：６５７－６３に記載されている）、Ｈａｇａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ．２４（１６）：４０３１－４に記載されているトリアジン化合物、およびそれらの任意の組み合わせから選択される。特定の実施形態において、ＰＤＥ４阻害剤が小分子である場合、ＰＤＥ４阻害剤はＡＮ２７２８である。いくつかの実施形態によれば、ＰＤＥ４阻害剤はロリプラムではない。特定の実施形態において、ＰＤＥ４阻害剤はロリプラムではなく、ロリプラムの選択性とは異なる、ＰＤＥ４Ａ、ＰＤＥ４Ｂ、ＰＤＥ４Ｃ、およびＰＤＥ４Ｄの間の選択性を示す。いくつかの実施形態において、本方法は、ロリプラムよりもＰＤＥ４Ｄのより少ない阻害を示すＰＤＥ４阻害剤を使用する。

いくつかの実施形態によれば、ＰＤＥ４阻害剤は、ＰＤＥ４の発現を阻害する。例えば、ＰＤＥ４阻害剤は、ＰＤＥ４Ａ、ＰＤＥ４Ｂ、ＰＤＥ４Ｃ、およびＰＤＥ４Ｄのうちの１つ、２つ、３つ、またはそれぞれの発現を阻害し得る。特定の実施形態において、ＰＤＥ４阻害剤がＰＤＥ４の発現を阻害する場合、ＰＤＥ４阻害剤は、核酸ベースの阻害剤である。「核酸ベースの阻害剤」とは、２つ以上の連結されたヌクレオチドのポリマーを意味し、当該ポリマーは、天然に存在するヌクレオチド、天然に存在しないヌクレオチド（例えば、ＬＮＡ、ＦＡＮＡ、２’－Ｏ－Ｍｅ ＲＮＡ、２’－フルオロＲＮＡなどのヌクレオチド類似体）、またはそれらの組み合わせを含み得る。

いくつかの実施形態において、核酸ベースのＰＤＥ４阻害剤は、ＰＤＥ４ＡをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＰＤＥ４ＢをコードするｍＲＮＡ、ＰＤＥ４ＣをコードするｍＲＮＡ、ＰＤＥ４ＤをコードするｍＲＮＡ、またはそれらの任意の組み合わせの一部に相補的な領域を含む。本明細書で使用される「相補的」という用語は、標的核酸のすべてまたは領域への非共有結合によって塩基対を形成するヌクレオチド配列を指す。標準的なワトソン－クリック型塩基対において、グアニン（Ｇ）がＤＮＡにおいてシトシン（Ｃ）と塩基対を形成するように、アデニン（Ａ）は、チミン（Ｔ）と塩基対を形成する。ＲＮＡでは、チミンは、ウラシル（Ｕ）で置き換えられる。したがって、ＡはＴに相補的であり、ＧはＣに相補的である。ＲＮＡでは、ＡはＵ相補的であり、逆もまた同様である。典型的には、「相補的」または「相補性」とは、少なくとも部分的に相補的なヌクレオチド配列を指す。これらの用語はまた、一方の鎖のすべてのヌクレオチドが対応する位置の他方の鎖のすべてのヌクレオチドに相補的であるように完全に相補的な二本鎖も含み得る。場合によっては、ヌクレオチド配列は、標的に部分的に相補的であり得、その場合、すべての対応する位置において、すべてのヌクレオチドが標的核酸中のすべてのヌクレオチドに相補的であるとは限らない。例えば、プライマーは、標的核酸に対して完全に（すなわち、１００％）相補的であり得るか、またはプライマーおよび標的核酸は、完全ではないある程度（例えば、７０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９９％）の相補性を共有し得る。２つのヌクレオチド配列の同一性パーセントは、最適な比較目的のために配列を整列させることによって決定することができる（例えば、最適な整列のために第１の配列の配列にギャップを導入することができる）。次いで、対応する位置のヌクレオチドを比較し、２つの配列間の同一性パーセントは、その配列によって共有される同一位置の数の関数である（すなわち、同一性％＝同一位置の数／位置の総数×１００）。一方の配列中の位置が他方の配列中の対応する位置と同じヌクレオチドによって占められているとき、その分子は、その位置で同一である。そのような数学的アルゴリズムの非限定的な例は、Ｋａｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－５８７７（１９９３）に記載されている。そのようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３８９－３４０２（１９９７）に記載されているように、ＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用するとき、それぞれのプログラム（例えば、ＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用することができる。一態様において、配列比較のためのパラメータは、スコア＝１００、ワード長＝１２に設定することができ、または変更することができる（例えば、ワード長＝５またはワード長＝２０）。

いくつかの実施形態によれば、核酸ベースのＰＤＥ４阻害剤のヌクレオチド配列は、核酸ベースのＰＤＥ４阻害剤がＰＤＥ４アイソフォームに対して選択的であるように選択／設計される。例えば、核酸ベースのＰＤＥ４阻害剤のヌクレオチド配列は、阻害剤がＰＤＥ４Ａ、ＰＤＥ４Ｂ、および／またはＰＤＥ４Ｃの発現を選択的に（例えば、ＰＤＥ４Ｄと対比して）阻害するように選択／設計され得る。いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列は、阻害剤がＰＤＥ４Ｂ発現を選択的に阻害するように、例えば、ＰＤＥ４Ｄ発現と対比してＰＤＥ４Ｂ発現を選択的に阻害するように選択／設計される。

本開示の方法を実施する際に使用し得る核酸ベースの阻害剤の非限定的な例には、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、モルフォリノなどが含まれる。ＰＤＥ４Ａ（ヒトＰＤＥ４ＡについてＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：５１４１）、ＰＤＥ４Ｂ（ヒトＰＤＥ４ＢについてＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：５１４２）、ＰＤＥ４Ｃ（ヒトＰＤＥ４ＣについてＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：５１４３）、およびＰＤＥ４Ｄ（ヒトＰＤＥ４ＣについてＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：５１４４）、ならびに対応する転写産物の利用可能な配列情報に基づいて、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、モルフォリノなどの核酸ベースの阻害剤は、利用可能なツール、例えば、ＩｎｖｉｖｏｇｅｎのｓｉＲＮＡ Ｗｉｚａｒｄ、ＤｈａｒｍａｃｏｎのｓｉＤＥＳＩＧＮ Ｃｅｎｔｅｒ、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＢＬＯＣＫ－ｉＴ（商標）ＲＮＡｉ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ、ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｏｓｕｍｃ．ｅｄｕ／ｍｉｒ－ｓｙｎｔｈで入手可能なｍｉＲ－Ｓｙｎｔｈ、ＷＭＤ３－Ｗｅｂ ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ、Ｇｅｎｅ Ｔｏｏｌｓが提供するモルフォリノ設計ツールなどを使用して設計され得る。ターゲティング用のｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、モルフォリノなどを設計および提供するためのアプローチは既知であり、例えばＣｈａｋｒａｂｏｒｔｙ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ８：１３２－１４３、Ａｈｍａｄｚａｄａ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｖ．１０（１）：６９－８６、Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３６（５）：５６２－５７５、Ｍｏｈａｎｔｙ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｄｅｓ．２１（３１）：４６０６－１３、Ｇｏｍｅｓ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ａｇｅｉｎｇ Ｒｅｓ Ｒｅｖ．２１：４３－５４、Ｇｕｓｔｉｎｃｉｃｈ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｐｒｏｇ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．１５５：１９４－２１１、Ｍｏｎｓｏｏｒｉ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ａｄｖ Ｐｈａｒｍ Ｂｕｌｌ．４（４）：３１３－３２１、およびＸｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ １６：１３４に記載されている。

上に要約したように、本開示の態様は、てんかんを有する個体（例えば、てんかんを有すると診断された個体）に治療有効量のＰＤＥ４阻害剤を投与することによるてんかん（「発作障害」と呼ばれることもある）の治療を含む。いくつかの実施形態において、ＰＤＥ４阻害剤は、本開示の抗てんかん剤を同定する方法を使用して同定された任意のＰＤＥ４阻害剤を含め、本明細書の他の場所に記載された任意のＰＤＥ４阻害剤である。古くから確立されている抗てんかん薬（ＡＥＤ）であるフェニトイン、カルバマゼピン、クロナゼパム、エトスクシミド、バルプロ酸、およびバルビツール酸塩は広く処方されているが、ある範囲の副作用がある。さらに、現在利用可能な治療剤に耐性のある患者のかなりのグループ（３０～４０％）がある。フェルバメート、ガバペンチン、ラモトリジン、オクスカルバゼピン、チアガビン、トピラマート、ビガバルトリン、ゾニサミド、およびレベチラセタムを含め、最近いくつかの薬が発売された。そのような最近の薬のいくつかは改善された有効性および副作用プロファイルを示しているが、てんかん患者の約３０％は未治療のままである。

ＰＤＥ４阻害は、てんかんのゼブラフィッシュモデルおよびマウスモデルの両方で生体エネルギーおよび過興奮性ニューロン表現型を遮断し、てんかんのマウスモデルで高体温誘発性発作から保護し、６Ｈｚテストを使用した発作をブロックするという本明細書に記載の予期しない発見を考慮して、本方法は、多種多様なてんかんの治療に使用できることを理解されたい。特定の実施形態において、個体は、良性ローランドてんかん、前頭葉てんかん、乳児けいれん、若年性ミオクロニーてんかん（ＪＭＥ）、若年性欠伸てんかん、小児欠伸てんかん、ピクノレプシー、熱性発作、ラフォラ病の進行性ミオクローヌスてんかん、レノックス・ガストー症候群、ランドウ・クレフナー症候群、ドラベ症候群（ＤＳ）、熱性発作を伴う全般てんかん（ＧＥＦＳ＋）、乳児重症ミオクロニーてんかん（ＳＭＥＩ）、良性家族性新生児ひきつけ（ＢＦＮＣ）、ウエスト症候群、大田原症候群、早期ミオクロニー脳症、遊走性部分てんかん、乳児てんかん性脳症、結節性硬化症（ＴＳＣ）、限局性皮質異形成、Ｉ型滑脳症、ミラー・ディカー症候群、アンジェルマン症候群、脆弱Ｘ症候群、自閉症スペクトラム障害におけるてんかん、皮質下帯状異所性灰白質、ウォーカー・ワールブルグ症候群、アルツハイマー病てんかん、外傷後てんかん、進行性ミオクローヌスてんかん、反射てんかん、ラスムッセン症候群、側頭葉てんかん、辺縁系てんかん、てんかん重積状態、腹部てんかん、巨大両側性ミオクローヌス、月経随伴性てんかん、ジャクソン発作障害、ウンフェルリヒト・ルンドボルグ病、および光感受性てんかんから選択されるてんかんを有する。いくつかの実施形態によれば、個体はドラベ症候群（ＤＳ）を有する。特定の実施形態において、個体は、遺伝的突然変異によって引き起こされるてんかんを有する。いくつかの実施形態において、個体は、非遺伝的病因を有するてんかんを有し、その非限定的な例には、脳震盪、脳損傷などによって引き起こされるてんかんが含まれる。いくつかの実施形態によれば、個体は、その個体が２つ以上の誘発されていない発作を起こしたことに基づいて、てんかんを有すると診断されている。個体のてんかんには、全般発作または部分発作（例えば、限局性）発作が含まれ得る。

様々な個体が本方法に従って治療可能である。一般に、かかる個体は、肉食動物（例えば、イヌおよびネコ）、げっ歯類（例えば、マウス、モルモットおよびラット）、ならびに霊長類（例えば、ヒト、チンパンジー、およびサル）を含む哺乳動物のクラス内にある生物を記述するために広く使用される「哺乳動物」または「哺乳類」である。いくつかの実施形態において、個体はヒトである。

「治療する」または「治療」とは、個体を苦しめている病理学的状態に関連する症状の少なくとも緩和を意味し、緩和とは、ＰＤＥ４活性に関連した疾患または障害（例えば、てんかん）であって個体のＰＤＥ４活性を阻害することが有益となる疾患または障害などの、治療されている病理学的状態に関連するパラメータ、例えば症状の程度の少なくとも減少を意味するために広い意味で使用される。したがって、治療はまた、個体が病理学的状態、または少なくともその病理学的状態を特徴付ける症状にそれ以上苦しむことがないように、病理学的状態（例えば、てんかん）または少なくともそれに関連する症状が完全に阻害され、例えば、発生するのを抑制され、または停止され、例えば、中止されている状況も含む。いくつかの実施形態において、ＰＤＥ４阻害剤の１回以上の投与がない場合に個体が経験する発作の頻度および／または重症度と比べて、ＰＤＥ４阻害剤の１回以上の投与が、個体が経験する発作の頻度および／または重症度を９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または１％以下とする場合に、てんかんを有する個体は本方法によって治療されている。

投薬は、治療される疾患状態の重症度および応答性に依存する。最適な投薬スケジュールは、個体の体内におけるＰＤＥ４阻害剤の蓄積の測定値から計算することができる。投与する医師は、最適な投与量、投与方法および反復率を決定することができる。最適投与量は、ＰＤＥ４阻害剤の相対効力に応じて変動し得、一般にインビトロおよびインビボの動物モデルなどにおいて有効であることが見出されたＥＣ_５０に基づいて推定され得る。一般に、投与量は体重１ｋｇあたりの０．０１μｇ～１００ｇであり、日、週、月、または年１回以上投与することができる。治療する医師は、体液または組織中のＰＤＥ４阻害剤の、測定された滞留時間および濃度に基づいて、投与の繰り返し率を推定することができる。治療が成功した後、疾患状態の再発を防止するために対象に維持療法を受けさせることが望ましい場合もあり、１日１回以上、数ヶ月に１回、６ヶ月に１回、年に１回、または他の任意の適切な頻度の維持用量で、ＰＤＥ４阻害剤が投与される。

本開示の治療方法は、単一のタイプのＰＤＥ４阻害剤を個体に投与することを含み得るか、または２つ以上のタイプのＰＤＥ４阻害剤、例えば、異なるＰＤＥ４阻害剤のカクテルを個体に投与することを含み得る。

特定の態様において、ＰＤＥ４阻害剤は、併用療法の一部として第２の治療剤と組み合わせて個体に投与される。例えば、本開示の方法は、てんかんを有する個体に、第２の抗てんかん薬と組み合わせて治療有効量のＰＤＥ４阻害剤を投与することを含み得る。ＰＤＥ４阻害剤と組み合わせて使用できる第２の抗てんかん薬の非限定的な例には、アセタゾラミド、ジアゼパム、ベンゾジアゼピン、カンナバジオール、カルバマゼピン、クロバザム、クロナゼパム、酢酸エスリカルバゼピン、エトスクシミド、エトトイン、フェルバメート、フェンフルラミン、フォスフェニトイン、ガバペンチン、ガナキソロン、フペルジンＡ、ラコサミド、ラモトリジン、レベチラセタム、ロラゼパム、ニトラゼパム、オキシカルバゼピン、ペランパネル、ピラセタム、フェノバルビタール、フェニトイン、臭化カリウム、プレガバリン、プリミドン、レチガビン、ルフィナミド、バルプロ酸ナトリウム、スチリペントール、チアガビン、トピラマート、バルプロ酸、ビガバトリン、またはゾニサミドが含まれる。ＰＤＥ４阻害剤および第２の治療剤が組み合わせて投与される実施形態によれば、ＰＤＥ４阻害剤および第２の治療剤は、同時にまたは連続して投与され得る。

ＰＤＥ４阻害剤は、インビボおよびエクスビボでの方法、および全身および局所的な投与経路を含む、薬物送達に好適な任意の利用可能な方法および経路を使用して、個体に投与されてもよい。従来のおよび医薬的に許容される投与経路としては、鼻腔内、筋肉内、気管内、皮下、皮内、局所適用、眼内、静脈内、動脈内、経鼻、経口、および他の経腸および非経口投与経路が含まれる。投与経路は、ＰＤＥ４阻害剤および／または所望の効果に応じて、組み合わせることができ、または必要に応じて調節することができる。ＰＤＥ４阻害剤は、単回投与または複数回投与で投与され得る。いくつかの実施形態において、ＰＤＥ４阻害剤は、経口、非経口、鼻腔内、髄腔内、頭蓋内、または経皮投与によって投与される。いくつかの実施形態において、ＰＤＥ４阻害剤は経口投与される。いくつかの実施形態において、ＰＤＥ４阻害剤は局所的に投与される。いくつかの実施形態において、ＰＤＥ４阻害剤は眼に投与される。いくつかの実施形態において、ＰＤＥ４阻害剤は頭蓋内に投与される。いくつかの実施形態において、ＰＤＥ４阻害剤は静脈内投与される。いくつかの実施形態において、ＰＤＥ４阻害剤は、例えば、全身送達のための注射（例えば、静脈内注入）によって、または局所部位に投与される。いくつかの実施形態において、ＰＤＥ４阻害剤は吸入経路を介して投与される。いくつかの実施形態において、ＰＤＥ４阻害剤は鼻腔内に投与される。いくつかの実施形態において、ＰＤＥ４阻害剤は、血液脳関門（ＢＢＢ）を容易に通過せず、ＰＤＥ４阻害剤は、ＢＢＢを迂回するために鼻腔内に投与される。鼻腔内投与によるＢＢＢのバイパスに関するさらなる詳細は、例えば、Ｍｏｈａｎｔｙ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｄｅｓ．２１（３１）：４６０６－１３、および他の場所に記載されている。

抗てんかん剤を同定する方法
上に要約したように、本開示の態様は、抗てんかん剤を同定する方法を含む。抗てんかん剤を同定する方法は、ＰＤＥ４活性アッセイにおいてＰＤＥ４ポリペプチドを候補薬剤と接触させることを含み、ＰＤＥ４ポリペプチドの活性の阻害により、候補薬剤が抗てんかん剤として同定される。

候補薬剤と接触されるＰＤＥ４ポリペプチドは、目的の任意のＰＤＥ４ポリペプチドであり得る。いくつかの実施形態において、ＰＤＥ４ポリペプチドは、ＰＤＥ４Ａ、ＰＤＥ４Ｂ、ＰＤＥ４Ｃ、またはＰＤＥ４Ｄであり、上記の図２～５または表１で提供される任意のＰＤＥ４ポリペプチド、またはホスホジエステラーゼ活性を有するその機能的変異体を含む。「機能的変異体」とは、対応する野生型ＰＤＥ４ポリペプチドと比較して、１つ以上のアミノ酸置換、欠失、挿入、またはそれらの組み合わせを含む、ホスホジエステラーゼ活性を有するＰＤＥ４ポリペプチドを意味する。例えば、ＰＤＥ４Ｂの機能的変異体は、野生型ＰＤＥ４Ｂと比較して、１つ以上のアミノ酸置換、欠失、挿入、またはそれらの組み合わせを含むＰＤＥ４Ｂポリペプチドであり得る。機能的変異体は、対応する野生型ＰＤＥ４ポリペプチドの長さの４０％、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上にわたり、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、もしくは９９％以上のアミノ酸配列の相同性または同一性を含み得る。ＰＤＥ４ポリペプチドまたはその機能的変異体は、異種ドメインに融合され得る。異種ドメインの非限定的な例には、リンカードメイン（例えば、グリシン－セリンリンカー、または他の適切なリンカードメイン）、ＰＤＥ４ポリペプチドの検出に使用されるドメイン（例えば、ルシフェラーゼドメイン、または他の適切な検出可能なドメイン）、ＰＤＥ４ポリペプチドの精製に使用されるドメイン（例えば、ＨＩＳタグ、または他の適切な精製タグ）などが含まれる。

ＰＤＥ４活性アッセイは、ホスホジエステラーゼ活性をアッセイするための任意の適切な試薬（例えば、ＰＤＥ４基質など）およびフォーマットを使用して実施することができる。いくつかの実施形態において、ＰＤＥ４活性アッセイは、ＰＤＥ４ポリペプチドによるｃＡＭＰまたはｃＧＭＰの切断を検出することを含む。ＰＤＥ４ホスホジエステラーゼ活性の検出は、比色ベース、発光ベース、蛍光ベース、放射能ベースなどであり得る。いくつかの実施形態において、アッセイは、シングルチューブ、シングルウェル、マルチチューブ、マルチウェル（例えば、２４ウェル、４８ウェル、９６ウェル、３８４ウェル、または他のウェルフォーマット）、または他の適切なフォーマットにおいて実施される。ＰＤＥ４活性アッセイは、多数の候補薬剤（例えば、小分子ライブラリーの小分子）が、例えば別個のウェルで並行して、ＰＤＥ４ポリペプチドと容易に接触され得るようなハイスループットフォーマットに適している。

いくつかの実施形態において、抗てんかん剤を同定する方法において、接触は、無細胞ＰＤＥ４活性アッセイにおいて、ＰＤＥ４ポリペプチドおよび候補薬剤を組み合わせることを含む。本開示の方法を実施する際に使用され得るホスホジエステラーゼ活性およびその阻害を評価するための無細胞アッセイ試薬およびキットは既知であり、Ａｂｃａｍから入手可能なＰＤＥ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（９６ウェル比色分析）、Ｐｒｏｍｅｇａから入手可能なＰＤＥ－Ｇｌｏ（商標）Ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（１チューブから１５３６ウェル発光）、ＦａｂＧｅｎｎｉｘから入手可能なＰＤＥａｓｅ Ｋｉｔ、Ｍｅｄｉｏｍｉｃｓから入手可能なＢｒｉｄｇｅ－Ｉｔ（登録商標）ｃＡＭＰ－Ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔなどを含む。無細胞フォーマットでホスホジエステラーゼ活性およびその阻害を評価するための追加のアプローチは、例えば、Ｒｙｂａｌｋｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１０２０：５１－６２に記載されている。

いくつかの実施形態において、抗てんかん剤を同定する方法において、接触は、細胞ベースのＰＤＥ４活性アッセイにおいて、ＰＤＥ４ポリペプチドと候補薬剤とを組み合わせることを含む。「細胞ベース」とは、ＰＤＥ４ポリペプチドおよび候補薬剤が細胞内で接触していることを意味する。いくつかの実施形態において、ＰＤＥ４ポリペプチドは、接触が起こる細胞によって発現される。本開示の方法を実施する際に使用され得るホスホジエステラーゼ活性およびその阻害を評価するための細胞ベースのアッセイ試薬およびキットは既知であり、ｅＥｎｚｙｍｅから入手可能なＡＣＴＯｎｅ ＰＤＥ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ、ＳＢ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙから入手可能なＣｅｌｌ－Ｂａｓｅｄ ＰＤＥ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ、Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎから入手可能なＫ９２７－Ｔｏｔａｌ Ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔなどを含む。無細胞フォーマットでホスホジエステラーゼ活性およびその阻害を評価するための追加のアプローチは、例えば、Ｔｉｔｕｓ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｊ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｃｒｅｅｎ．１３（７）：６０９－６１８（１５３６ウェルプレート中で、ｃＡＭＰ産生の推進力として構成的に活性なＧＰＣＲ、およびバイオセンサーとしてサイクリックヌクレオチド感受性（ＣＮＧ）カチオンチャネルが関わる、ハイスループットスクリーニング用の１５３６ウェルプレートフォーマットでの細胞ベースのＰＤＥ４アッセイを記載）、Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５７（１２）：１３７５－８２、およびＱｉｕ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４７２（１－２）：７３－８０に記載されている。

いくつかの実施形態において、ＰＤＥ４活性アッセイは、ＰＤＥ４ポリペプチドを、ＰＤＥ４活性を阻害することが知られている陽性コントロール剤と接触させることをさらに含む。使用できる陽性コントール剤の非限定的な例には、ＡＮ２７２８、ドロタベリン、イブジラスト、イルソグラジン、ピクラミラスト、ロフルミラスト、ロリプラム、テオフィリン、アプレミラスト、およびそれらの任意の組み合わせが含まれる。

候補薬剤は、関心のある任意のタイプの候補薬剤であり得る。いくつかの実施形態において、候補薬剤は小分子である。いくつかの実施形態において、小分子は、ＰＤＥ４阻害剤のインシリコスクリーニングに基づいて候補薬剤として選択された。インシリコスクリーンは、ＰＤＥ４Ａ、ＰＤＥ４Ｂ、ＰＤＥ４Ｃ、およびＰＤＥ４Ｄの間で選択的なＰＤＥ４阻害剤のスクリーンであり得た。例えば、インシリコスクリーンは、ＰＤＥ４Ａ、ＰＤＥ４Ｂ、および／またはＰＤＥ４Ｃを選択的に（例えば、ＰＤＥ４Ｄと対比して）阻害するＰＤＥ４阻害剤のインシリコスクリーンであり得た。いくつかの実施形態において、小分子は、ＰＤＥ４Ｂ対ＰＤＥ４Ｄに対して選択的である阻害剤のインシリコスクリーニングに基づいて候補薬剤として選択された。したがって、いくつかの実施形態において、本方法は、候補薬剤がＰＥＤ４ポリペプチドの活性を阻害すると決定される場合、候補薬剤がＰＤＥ４Ａ、ＰＤＥ４Ｂ、ＰＤＥ４Ｃ、およびＰＤＥ４Ｄの間で選択的阻害を示すかどうかを決定することをさらに含み得る。

いくつかの実施形態において、候補薬剤が小分子である場合、小分子は、小分子候補薬剤のライブラリーの一部である。いくつかの実施形態において、本方法は、小分子候補薬剤のライブラリーを、ハイスループットフォーマット、例えば、９６ウェル、３８４ウェル、１５３６ウェル、または他のハイスループットフォーマットでＰＤＥ４ポリペプチドと接触させることを含む。

組成物
本開示の態様は、組成物を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、例えば、本開示の方法を実施する際に用途を見出す。

いくつかの実施形態において、本開示の組成物は、本開示の抗てんかん剤を同定する方法によって同定された任意の抗てんかん剤を含め、本明細書の他の場所に記載されたＰＤＥ４阻害剤のいずれかを含む。

特定の態様において、本開示の組成物は、液体媒体中に存在するＰＤＥ４阻害剤（および任意選択で、第２の抗てんかん剤）を含む。液体媒体は、水、緩衝溶液などの水性液体媒体である得る。１つ以上の添加剤、例えば、塩（例えば、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ_４）、緩衝剤（トリス緩衝液、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－Ｎ’－（２－エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）、２－（Ｎ－モルフォリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２－（Ｎ－モルフォリノ）エタンスルホン酸ナトリウム塩（ＭＥＳ）、３－（Ｎ－モルフォリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ－トリス［ヒドロキシメチル］メチル－３－アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）など）、溶解剤、洗浄剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ－２０などの非イオン性洗浄剤）、ヌクレアーゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、グリセロール、キレート剤などは、このような組成物に存在してもよい。

医薬組成物もまた提供される。本開示の医薬組成物は、ＰＤＥ４阻害剤および薬学的に許容される担体を含む。本開示の任意の医薬組成物は、ＰＤＥ４阻害剤に加えて、第２の抗てんかん剤を含み得る。例えば、ＰＤＥ４阻害剤および第２の抗てんかん剤を含む医薬組成物が提供される。本開示の医薬組成物において提供され得る第２の抗てんかん剤の非限定的な例には、アセタゾラミド、ジアゼパム、ベンゾジアゼピン、カンナバジオール、カルバマゼピン、クロバザム、クロナゼパム、酢酸エスリカルバゼピン、エトスクシミド、エトトイン、フェルバメート、フェンフルラミン、フォスフェニトイン、ガバペンチン、ガナキソロン、フペルジンＡ、ラコサミド、ラモトリジン、レベチラセタム、ロラゼパム、ニトラゼパム、オキシカルバゼピン、ペランパネル、ピラセタム、フェノバルビタール、フェニトイン、臭化カリウム、プレガバリン、プリミドン、レチガビン、ルフィナミド、バルプロ酸ナトリウム、スチリペントール、チアガビン、トピラマート、バルプロ酸、ビガバトリン、またはゾニサミドが含まれる。

ＰＤＥ４阻害剤（および場合により第２の抗てんかん剤）は、個体に投与するための様々な製剤に組み込むことができる。より具体的には、ＰＤＥ４阻害剤は、適切な薬学的に許容される賦形剤または希釈剤との組み合わせによって、医薬組成物に製剤化することができ、錠剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、軟膏、液剤、注射剤、吸入剤、およびエアロゾルなどの固体、半固体、液体またはガス状形態の製剤に製剤化することができる。

個体への投与に好適な（例えば、ヒト投与に好適な）本開示のＰＤＥ４阻害剤の製剤は、一般に無菌であり、選択される投与経路に従って個体に投与するには禁忌である検出可能な発熱物質または他の混入物質をさらに含まない状態であり得る。

医薬剤形において、ＰＤＥ４阻害剤は、単独で、または、薬学的に活性な化合物、例えば、第２の抗てんかん剤と適切に結合されて、あるいは組み合わせられて、投与され得る。以下の方法および担体／賦形剤は単なる例であり、決して限定するものではない。

経口製剤の場合、ＰＤＥ４阻害剤は、例えば、ラクトース、マンニトール、コーンスターチまたはジャガイモデンプンなどの従来の添加剤、結晶セルロース、セルロース誘導体、アラビアゴム、コーンスターチまたはゼラチンなどの結合剤、コーンスターチ、ジャガイモデンプンまたはカルボキシメチルセルロースナトリウムなどの崩壊剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの滑剤、所望により、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、防腐剤および香味剤を用いて、錠剤、粉剤、顆粒剤またはカプセル剤を製造するために、単独でまたは適切な添加剤と組み合わせて使用することができる。

ＰＤＥ４阻害剤は、非経口（例えば、静脈内、動脈内、骨内、筋肉内、大脳内、脳室内、頭蓋内、髄腔内、皮下など）投与用に製剤化することができる。いくつかの実施形態において、ＰＤＥ４阻害剤は、経口、非経口、鼻腔内、髄腔内、頭蓋内、脳内、脳室内、または経皮投与用に処方される。いくつかの実施形態において、ＰＤＥ４阻害剤は、植物油もしくは他の類似の油、合成脂肪族グリセリド、高級脂肪酸のエステル、またはプロピレングリコール等の水性溶媒または非水性溶媒にＰＤＥ４阻害剤を溶解、懸濁または乳化することによって、また必要であれば、可溶化剤、等張剤、懸濁化剤、乳化剤、安定剤および防腐剤等の通常の添加剤を用いて、注射用に製剤化することができる。

ＰＤＥ４阻害剤を含む医薬組成物は、所望の純度を有するＰＤＥ４阻害剤を任意の生理学的に許容される担体、賦形剤、安定剤、界面活性剤、緩衝剤および／または等張化剤と混合することによって調製され得る。許容される担体、賦形剤および／または安定剤は、使用される投与量および濃度ではレシピエントに無毒であり、緩衝剤、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸；アスコルビン酸、グルタチオン、システイン、メチオニンおよびクエン酸を含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、エタノール、ベンジルアルコール、フェノール、ｍ－クレゾール、ｐ－クロロ－ｍ－クレゾール、メチルまたはプロピルパラベン、塩化ベンザルコニウム、またはそれらの組み合わせ）；アルギニン、グリシン、オルニチン、リジンン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、イソロイシン、ロイシン、アラニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、セリン、プロリン、およびそれらの組み合わせなどのアミノ酸；単糖、二糖、および他の糖類；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；ゼラチンまたは血清アルブミンなどのタンパク質；ＥＤＴＡなどのキレート剤；トレハロース、ショ糖、ラクトース、グルコース、マンノース、マルトース、ガラクトース、フラクトース、ソルボース、ラフィノース、グルコサミン、Ｎ－メチルグルコサミン、ガラクトサミン、およびノイラミン酸などの糖；ならびに／または、Ｔｗｅｅｎ、Ｂｒｉｊ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。

医薬組成物は、液体形態、凍結乾燥形態、または凍結乾燥形態から再構成された液体形態であり得、凍結乾燥調製物は投与前に滅菌溶液で再構成されることになる。凍結乾燥組成物を再構成するための標準的な手順は、一定量の純水（典型的には、凍結乾燥中に除去された体積と等量である）を加え戻すことであるが、非経口投与用の医薬組成物の製造のために抗菌剤を含む溶液が使用されてもよい。

ＰＤＥ４阻害剤の水性製剤は、例えば、約４．０～約７．０、または約５．０～約６．０の範囲、またはあるいは、約５．５のｐＨで、ｐＨ緩衝溶液中で調製され得る。この範囲内のｐＨに好適である緩衝剤の例には、リン酸緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤、クエン酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、および他の有機酸緩衝剤が含まれる。緩衝剤の濃度は、例えば、緩衝剤および製剤の所望の張性に応じて、約１ｍＭ～約１００ｍＭ、または約５ｍＭ～約５０ｍＭであり得る。

製剤の張性を調節するために、等張化剤を製剤に含めることができる。例示的な等張化剤としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、およびアミノ酸、糖の群からの任意の成分、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態において、水性製剤は等張性であるが、高張または低張溶液も適し得る。「等張性」という用語は、生理的食塩水または血清など、それが比較されるいくつかの他の溶液と同じ張性を有する溶液を意味する。等張化剤は、約５ｍＭ～約３５０ｍＭの量で、例えば、１００ｍＭ～３５０ｍＭの量で使用され得る。

界面活性剤もまた、凝集を減少させるために、および／または製剤中の微粒子の形成を最小限にするために、および／または吸着を低減するために、製剤に添加されてもよい。界面活性剤の例としては、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（Ｂｒｉｊ）、アルキルフェニルポリオキシエチレンエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ）、ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンコポリマー（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）およびドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が挙げられる。適切なポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルの例は、ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ ２０（商標）の商標で販売）、およびポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ ８０（商標）の商標で販売）である。適切なポリエチレン－ポリプロピレンコポリマーの例は、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８またはＰｏｌｏｘａｍｅｒ １８８（商標）の名称で販売されているものである。適切なポリオキシエチレンアルキルエーテルの例は、Ｂｒｉｊ（商標）の商標で販売されているものである。界面活性剤の濃度の例は、約０．００１％～約１％ｗ／ｖの範囲であり得る。

凍結乾燥プロセス中の不安定化条件からＰＤＥ４阻害剤を保護するために、凍結乾燥保護剤を添加してもよい。例えば、既知の凍結乾燥保護剤には、糖（グルコースおよびスクロースを含む）、ポリオール（マンニトール、ソルビトールおよびグリセロールを含む）、ならびにアミノ酸（アラニン、グリシンおよびグルタミン酸を含む）が挙げられる。凍結乾燥保護剤は、約１０ｍＭ～５００ｎＭの量で含まれ得る。

いくつかの実施形態において、医薬組成物は、ＰＤＥ４阻害剤、および上記の薬剤（例えば、界面活性剤、緩衝剤、安定剤、等張化剤）のうちの１つ以上を含み、エタノール、ベンジルアルコール、フェノール、ｍ－クレゾール、ｐ－クロロ－ｍ－クレゾール、メチルまたはプロピルパラベン、塩化ベンザルコニウム、およびこれらの組み合わせ等の、１つ以上の防腐剤を本質的に含まない。他の実施形態において、防腐剤が、製剤中に、例えば約０．００１～約２％（ｗ／ｖ）の範囲の濃度で含まれる。

キット
キットもまた、本開示によって提供される。いくつかの実施形態において、キットは、例えば、本開示の方法を実施する際に用途を見出す。

いくつかの実施形態において、本開示のキットは、本開示の抗てんかん剤を同定する方法によって同定された任意の抗てんかん剤を含め、本明細書の他の場所に記載されたＰＤＥ４阻害剤のいずれかを含む。

いくつかの実施形態において、本開示のキットは、ＰＤＥ４阻害剤および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を含む。例えば、上記の組成物のセクションに記載された医薬組成物のいずれかを含め、本開示の医薬組成物のいずれかを含むキットが提供される。いくつかの実施形態において、本開示のキットは、ＰＤＥ４阻害剤に加えて第２の抗てんかん剤をさらに含む医薬組成物を含む。例えば、てんかんを治療する方法での使用を見出すキットは、ＰＤＥ４阻害剤および第２の抗てんかん剤を含む医薬組成物を含み得る。いくつかの実施形態において、本開示のキットは、ＰＤＥ４阻害剤を含む医薬組成物とは別の医薬組成物で提供される第２の抗てんかん剤をさらに含む。（ＰＤＥ４阻害剤と同じまたは異なる医薬組成物において）本開示のキットで提供され得る第２の抗てんかん剤の非限定的な例には、アセタゾラミド、ジアゼパム、ベンゾジアゼピン、カンナバジオール、カルバマゼピン、クロバザム、クロナゼパム、酢酸エスリカルバゼピン、エトスクシミド、エトトイン、フェルバメート、フェンフルラミン、フォスフェニトイン、ガバペンチン、ガナキソロン、フペルジンＡ、ラコサミド、ラモトリジン、レベチラセタム、ロラゼパム、ニトラゼパム、オキシカルバゼピン、ペランパネル、ピラセタム、フェノバルビタール、フェニトイン、臭化カリウム、プレガバリン、プリミドン、レチガビン、ルフィナミド、バルプロ酸ナトリウム、スチリペントール、チアガビン、トピラマート、バルプロ酸、ビガバトリン、またはゾニサミドが含まれる。

本方法を実施するためのキットは、単位投与量の形式、例えば、アンプル、または複数投与量の形式で存在する、ある量のＰＤＥ４阻害剤（および任意選択で第２の抗てんかん剤）を含み得る。したがって、特定の実施形態において、キットは、ＰＤＥ４阻害剤（および任意選択で第２の抗てんかん剤）を含む医薬組成物の１つ以上（例えば、２つ以上）の単位投与量（例えば、アンプル）、ならびに／または、第２の抗てんかん剤を含む医薬組成物の１つ以上（例えば、２つ以上）の単位投与量（例えば、アンプル）を含み得る。

「単位投与量」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒトおよび動物対象のための単一の投与量として適切な物理的に別個の単位を指し、各単位は、所望の効果をもたらすのに十分な量で計算された所定量の組成物を含有する。単位投与量の量は、使用される特定のＰＤＥ４阻害剤、達成されるべき効果、および個体におけるＰＤＥ４阻害剤に関連する薬力学などの様々な要因に依存する。さらに他の実施形態において、キットは、ＰＤＥ４阻害剤（および任意選択で第２の抗てんかん剤）を含む組成物の単一の複数投与量を含み得る。

キットの成分は、別々の容器内に存在してよく、または複数の成分が単一の容器内に存在してもよい。例えば、ＰＤＥ４阻害剤および第２の抗てんかん剤の両方を含むキットにおいて、ＰＤＥ４阻害剤および第２の抗てんかん剤は、同じ組成物（例えば、１つ以上の容器中）で提供され得るか、または別々の容器で別々の組成物で提供され得る。適切な容器には、個々のチューブ（例えば、バイアル）、アンプルなどが含まれる。

本開示のキットは、説明書をさらに含み得る。例えば、ＰＤＥ４阻害剤を含むキットは、必要とする個体にＰＤＥ４阻害剤を投与するための説明書を含み得る。いくつかの実施形態において、説明書は、本明細書の他の場所に記載されているいずれかのタイプのてんかんのうちの１つ以上を含む、てんかんを有する個体にＰＤＥ４阻害剤を投与するための説明書を含む。

説明書は、適切な記録媒体に記録することができる。例えば、説明書は、紙またはプラスチックなどの基材上に印刷することができる。そのようなものとして、説明書は、添付文書としてキット内に、キットの容器またはその構成要素のラベル（すなわち、包装または副包装に付随して）などに存在し得る。他の実施形態において、説明書は、ポータブルフラッシュドライブ、ＤＶＤ、ＣＤ－ＲＯＭ、ディスケットなどの適切なコンピュータ可読記憶媒体上に存在する、電子記憶データファイルとして存在する。さらに他の実施形態において、実際の説明書は、キットには存在しないが、例えばインターネットを介してリモートソースから指示を取得するための手段が提供される。この実施形態の一例は、説明書を閲覧することができ、かつ／または説明書をダウンロードできるウェブアドレスを含むキットである。説明書と同様に、説明書を得るための手段は、好適な基材上に記録される。

添付の特許請求の範囲にかかわらず、本開示は、以下の実施形態によっても定義される。
１．てんかんを治療する方法であって、てんかんを有する個体に治療有効量のホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤を投与することを含む、方法。
２．ＰＤＥ４阻害剤が小分子である、実施形態１に記載の方法。
３．ＰＤＥ４阻害剤が、ＡＮ２７２８、ドロタベリン、イブジラスト、イルソグラジン、ピクラミラスト、ロフルミラスト、ロリプラム、テオフィリン、アプレミラスト、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、実施形態２に記載の方法。
４．ＰＤＥ４阻害剤がＡＮ２７２８である、実施形態２に記載の方法。
５．ＰＤＥ４阻害剤が、ＰＤＥ４Ａ、ＰＤＥ４Ｂ、ＰＤＥ４Ｃ、またはＰＤＥ４Ｄのうちの１つ以上を阻害する、実施形態１に記載の方法。
６．ＰＤＥ４阻害剤が、ＰＤＥ４Ａ、ＰＤＥ４Ｂ、ＰＤＥ４Ｃ、およびＰＤＥ４Ｄの間で選択性を示す、実施形態１に記載の方法。
７．ＰＤＥ４阻害剤がＰＤＥ４Ｂについて選択的である、実施形態６に記載の方法。
８．投与が、経口、非経口、鼻腔内、髄腔内、頭蓋内、または経皮投与による、実施形態１～７のいずれか１つに記載の方法。
９．ＰＤＥ４阻害剤がＰＤＥ４の発現を阻害する、実施形態１に記載の方法。
１０．ＰＤＥ４阻害剤が、ＰＤＥ４ＡをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＰＤＥ４ＢをコードするｍＲＮＡ、ＰＤＥ４ＣをコードするｍＲＮＡ、ＰＤＥ４ＤをコードするｍＲＮＡ、またはそれらの任意の組み合わせの一部に相補的な領域を含む核酸ベースの阻害剤である、実施形態９に記載の方法。
１１．核酸ベースの阻害剤が、ＰＤＥ４Ａ、ＰＤＥ４Ｂ、ＰＤＥ４Ｃ、またはＰＤＥ４ＤをコードするｍＲＮＡに選択的にハイブリダイズする、実施形態１０に記載の方法。
１２．核酸ベースの阻害剤が、ＰＤＥ４ＢをコードするｍＲＮＡに選択的にハイブリダイズする、実施形態１１に記載の方法。
１３．核酸ベースの阻害剤が、モルフォリノ、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である、実施形態１０～１２のいずれか１つに記載の方法。
１４．個体が、良性ローランドてんかん、前頭葉てんかん、乳児けいれん、若年性ミオクロニーてんかん（ＪＭＥ）、若年性欠伸てんかん、小児欠伸てんかん、ピクノレプシー、熱性発作、ラフォラ病の進行性ミオクローヌスてんかん、レノックス・ガストー症候群、ランドウ・クレフナー症候群、ドラベ症候群（ＤＳ）、熱性発作を伴う全般てんかん（ＧＥＦＳ＋）、乳児重症ミオクロニーてんかん（ＳＭＥＩ）、良性家族性新生児ひきつけ（ＢＦＮＣ）、ウエスト症候群、大田原症候群、早期ミオクロニー脳症、遊走性部分てんかん、乳児てんかん性脳症、結節性硬化症（ＴＳＣ）、限局性皮質異形成、Ｉ型滑脳症、ミラー・ディカー症候群、アンジェルマン症候群、脆弱Ｘ症候群、自閉症スペクトラム障害におけるてんかん、皮質下帯状異所性灰白質、ウォーカー・ワールブルグ症候群、アルツハイマー病てんかん、外傷後てんかん、進行性ミオクローヌスてんかん、反射てんかん、ラスムッセン症候群、側頭葉てんかん、辺縁系てんかん、てんかん重積状態、腹部てんかん、巨大両側性ミオクローヌス、月経随伴性てんかん、ジャクソン発作障害、ウンフェルリヒト・ルンドボルグ病、および光感受性てんかんからなる群から選択されるてんかんを有する、実施形態１～１３のいずれか１つに記載の方法。
１５．個体が遺伝的変異によって引き起こされるてんかんを有する、実施形態１～１３のいずれか１つに記載の方法。
１６．抗てんかん剤を同定する方法であって、ホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）活性アッセイにおいてＰＤＥ４ポリペプチドを候補薬剤と接触させることを含み、候補薬剤によるＰＤＥ４ポリペプチドの活性の阻害により、候補薬剤が抗てんかん剤として同定される、方法。
１７．接触が、無細胞ＰＤＥ４活性アッセイにおいてＰＤＥ４ポリペプチドと候補薬剤とを組み合わせることを含む、実施形態１６に記載の方法。
１８．接触が、細胞ベースのＰＤＥ４活性アッセイにおいてＰＤＥ４ポリペプチドと候補薬剤とを組み合わせることを含む、実施形態１６に記載の方法。
１９．ＰＤＥ４活性アッセイが、ＰＤＥ４ポリペプチドを、ＰＤＥ４活性を阻害することが知られている陽性対照薬剤と接触させることをさらに含む、実施形態１６～１８のいずれか１つに記載の方法。
２０．陽性対照薬剤が、ＡＮ２７２８、ドロタベリン、イブジラスト、イルソグラジン、ピクラミラスト、ロフルミラスト、ロリプラム、テオフィリン、アプレミラスト、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、実施形態１９に記載の方法。
２１．候補薬剤が小分子である、実施形態１６～２０のいずれか１つに記載の方法。
２２．ＰＤＥ４ポリペプチドが、ＰＤＥ４Ａ、ＰＤＥ４Ｂ、ＰＤＥ４Ｃ、またはＰＤＥ４Ｄである、実施形態１６～２１のいずれか１つに記載の方法。
２３．ＰＤＥ４ポリペプチドがＰＤＥ４Ｂである、実施形態２２に記載の方法。
２４．候補薬剤が、ＰＥＤ４ポリペプチドの活性を阻害すると決定される場合、候補薬剤が、ＰＤＥ４Ａ、ＰＤＥ４Ｂ、ＰＤＥ４Ｃ、およびＰＤＥ４Ｄの間で選択的阻害を示すかどうかを決定することをさらに含む、実施形態１６～２３のいずれか１つに記載の方法。
２５．実施形態１６～２４のいずれか１つによる方法によって同定された抗てんかん剤を含む医薬組成物。
２６．てんかんを有する個体に、実施形態１６～２４のいずれか１つに記載の方法によって同定された治療有効量の抗てんかん剤を投与することを含む方法。

以下の実施例は、限定ではなく例示として提供される。

実験
実施例１－ＰＤＥ４阻害は、ｓｃｎ１ｌａｂおよびｋｃｎａ１変異ゼブラフィッシュにおいて生体エネルギーをベースラインレベルに回復させる
図６（パネルＡ）に示されているのは、ＰＤＥ４阻害剤（ＡＮ２７２８）の例がｓｃｎ１ｌａｂ変異ゼブラフィッシュにおいて用量依存的に生体エネルギーをベースラインレベルに回復させることを示すデータである（図６～８では、「Ｓｃｎ１ａ」変異ゼブラフィッシュはｓｃｎ１ｌａｂ変異ゼブラフィッシュである）。この実験のセクションで採用されたｓｃｎ１ｌａｂ変異ゼブラフィッシュは、ホモ接合性の機能喪失型変異体である。全体の生体エネルギーを測定するために、生きているゼブラフィッシュ（さらなる詳細はＩｂｈａｚｅｈｉｅｂｏ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｂｒａｉｎ １４１（３）：７４４－７６１に記載されている）、ゼブラフィッシュの幼生（受精後（ｄｐｆ）５日）を２４ウェル膵島捕捉マイクロプレート（Ａｇｉｌｅｎｔ）に播種し、アッセイ開始前の２０分間にビヒクルまたは薬物に事前に曝露した。酸素消費率（ＯＣＲ）は、Ｓｅａｈｏｒｓｅ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して測定した。この実施例では、ｓｃｎ１ｌａｂ変異ゼブラフィッシュの幼生は野生型（ＷＴ）コントロールと比較して低下したＯＣＲを示し、このことは、ミトコンドリア呼吸がｓｃｎ１ｌａｂ変異体バックグラウンドで減少していることを示している。ＡＮ２７２８の存在下では、生体エネルギーの用量依存的な回復が観察され、１μＭおよび１０μＭは、ＯＣＲ応答をＷＴレベルまで完全に回復させた（図６、パネルＡ）。１ｎＭ～１００ｎＭの投与量は効果がなく、１００μＭの投与量は毒性があった。これは、ＯＣＲ応答が変異体レベルの応答を下回った場合の低下によって示されている。

図６（パネルＢ）に示されているのは、様々なＰＤＥ４阻害剤（この実施例では、ロリプラム、シロミラスト、ロフルミラスト、イブジラスト、テオフィリン、ドロタベリン、およびイルソグラジン）がｓｃｎ１ｌａｂ変異ゼブラフィッシュにおいてベースラインレベルに生体エネルギーを回復するのに効果的であることを示すデータである。上記と同様のアッセイでは、ｓｃｎ１ｌａｂ変異体を４０μＭの投与量のある範囲のＰＤＥ４阻害剤に曝露する。ロリプラム、シロミラスト、ロフルミラスト、イブジラストはすべて、ＷＴ幼生で観察されたベースラインレベルにＯＣＲ応答を回復させた。これは、これらの薬剤によるＰＤＥ４の阻害が、ビヒクルに曝露された場合のｓｃｎ１ｌａｂ変異ゼブラフィッシュで示される生体エネルギーの減少を逆転させたことを示している。

図７に示されているのは、ＰＤＥ４Ｂ－、４Ｃ－、および４Ｄ－モルフォリノがｓｃｎ１ｌａｂ変異ゼブラフィッシュにおいてベースラインレベルに生体エネルギーを回復するのに効果的であることを示すデータである。てんかん性ゼブラフィッシュの遺伝的バックグラウンドで特定のＰＤＥ４アイソフォームをノックダウンするように設計されたＡＴＧ遮断および／またはスプライス遮断モルフォリノ（Ｇｅｎｅ－Ｔｏｏｌｓ，Ｐｈｉｌｏｍａｔｈ，ＯＲ）を用いて一細胞段階におけるｓｃｎ１ｌａｂ変異ゼブラフィッシュ胚に注射した。ゼブラフィッシュのゲノムにおける遺伝子重複のため、ヒトで単一のオルソログを有する多くの遺伝子は、ゼブラフィッシュでは２つのアイソフォームを有する。モルフォリノは、各ゼブラフィッシュアイソフォーム単独を遮断するように設計された。モルフォリノを注入したｓｃｎ１ｌａｂ変異ゼブラフィッシュを２４ｈｐｆで選別し、生存可能な胚を５ｄｐｆでの生体エネルギーアッセイ（Ｓｅａｈｏｒｓｅ ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ）のために膵島マイクロプレートに播種した。ＰＤＥ４Ｂａ、ＰＤＥ４Ｂｂ、ＰＤＥ４Ｃｂ、およびＰＤＥ４Ｄを標的とするモルフォリノは、てんかんのバックグラウンドでＯＣＲ応答をＷＴベースラインレベルに回復させ、このことは、ＰＤＥ４シグナル伝達のノックダウンが、ｓｃｎ１ｌａｂ変異体で観察されたミトコンドリア機能の低下を軽減することを示している。

図８に示されているのは、２つの例示的なＰＤＥ４阻害剤（ロフルミラストおよびテオフィリン）が、ｋｃｎａ１変異ゼブラフィッシュの生体エネルギーを野生型魚で観察されるベースラインレベルにまで戻して回復させることを示すデータである。ｋｃｎａ１変異体は、全般性てんかんおよびてんかんにおける予期せぬ突然死（ＳＵＤＥＰ：sudden unexpected death in epilepsy）のモデルであり、このことは、ＰＤＥ４を阻害すると、より広くてんかんの状態全体にわたり効果的な抗てんかん特性を誘発する可能性が高いことを示している。

実施例２－ＰＤＥ４阻害は、ｓｃｎ１ｌａｂゼブラフィッシュにおいて発作様の過興奮をベースラインレベルにまで遮断する
図９に示されているのは、例示的なＰＤＥ４阻害剤（ＡＮ２７２８）が、ｓｃｎ１ｌａｂゼブラフィッシュにおいて発作様の過興奮をベースラインレベルにまで遮断することを実証するデータである。簡単に説明すると、６ｄｐｆゼブラフィッシュ（ＷＴおよびｓｃｎ１ｌａｂ変異体）を麻痺させ（α－ブンガロトキシン、１ｍｇ／ｍｌ、Ｔｏｃｒｉｓ）、アガロースに埋め込んだ。ゼブラフィッシュの背側をアガロースゲル表面にさらし、ガラス微小電極をゼブラフィッシュの視蓋に配置し、電気生理学的測定値を記録した。２０分間のベースライン記録後、薬物（最終濃度２０μＭ）を胚培地に直接添加し、同じゼブラフィッシュで継続的な記録を次の２０分間にわたって取得した。少しでもピペットを乱したり魚を動かしたりしないように注意した。発作様活動は、他の文献で定義されているように、高頻度の大振幅スパイクによって定義した（Ｂａｒａｂａｎ ｅｔ ａｌ，２０１３）。ＥＥＧトレースのセクションを拡大すると、発作後（持続時間＞１０００ｍｓ）および発作間（持続時間＜３００ｍｓ）の両方の活動が観察され（データ非表示）、てんかん様イベントと一致した。ＰＤＥ阻害剤（ＡＮ２７２８、４０μＭ）への曝露は、この発作様活動をベースラインレベルまで遮断した。複数のｓｃｎ１ｌａｂ変異ゼブラフィッシュ（ｎ＝６～１０）にわたるこれらの過興奮イベントの定量化（図９、パネルＢ）は、ＡＮ２７２８による処置後の変異体における発作頻度およびピーク振幅の減少を示している。

図１０に示されているのは、ＰＤＥ４Ｂモルフォリノが、ｓｃｎ１ｌａｂゼブラフィッシュにおいて発作様の過興奮をベースラインレベルにまで阻止するのに有効であることを実証するデータである。上記のように、ＰＤＥ４ＢａおよびＰＤＥ４Ｂｂを標的とするＰＤＥ４アイソフォーム特異的モルフォリノの注射は、ｓｃｎ１ｌａｂ変異体で観察された過興奮表現型を遮断した。ＰＤＥ４Ｃａ－、ＰＤＥ４Ｃｂ－、およびＰＤＥ４Ｄ－モルフォリノはすべて、この発作様活動を部分的にブロックしたが、ＰＤＥ４Ａ－モルフォリノは効果がなく、おそらく過興奮の表現型を悪化すらさせた。ＰＤＥ４アイソフォームを標的とするモルフォリノを注射したｓｃｎ１ｌａｂ変異ゼブラフィッシュ（ｎ＝６～１０）におけるこれらの過興奮イベントの定量化は、図９のパネルＢに示されているｓｃｎ１ｌａｂレベルと比較した場合、ＰＤＥ４Ｂ－、ＰＤＥ４Ｃ－、およびＰＤＥ４Ｄ－モルフォリノについての発作頻度および振幅の減少を示している。

実施例３－ＰＤＥ４阻害は、マウスＳｃｎ１ａ変異脳のエクスビボスライスにおける過剰興奮性を低下させる
図１１は、例示的なＰＤＥ４阻害剤（ＡＮ２７２８）がマウスＳｃｎ１ａ変異脳のエクスビボスライスにおける過興奮性を低下させることを実証するＥＥＧデータを提供する。この実験セクションで使用されたマウスＳｃｎ１ａ変異体は、ヘテロ接合変異体であった（Ｓｃｎ１ａ－／－マウスは出生後早期に死亡する）。示されているように、エクスビボでのＳｃｎ１ａ変異マウスにおけるＥＥＧ記録は、ＡＮ２７２８が過興奮性表現型を減少させたことを示した（ｎ＝３）。このアッセイでは、成体Ｓｃｎ１ａ変異脳を迅速に取り出し、電気生理学的アッセイのために切片化した。ここでは、ＰＤＥ４阻害剤（ＡＮ２７２８、４０μＭ）を添加する前に、ベースラインの電気生理学的活性を測定するために細胞外フィールド記録を実施した。ＡＮ２７２８の存在下で、過興奮性の振幅および頻度の減少を測定した。

実施例４－ＰＤＥ４阻害は、６Ｈｚ誘発マウスモデルにおいて発作の誘発から保護する
図１２に提供されているのは、例示的なＰＤＥ４阻害剤（ＡＮ２７２８）が、６Ｈｚ誘発マウスモデルにおける発作の誘発から保護することを実証するデータである。発作に対するＰＤＥ４阻害の急性効果を調べるために、治療抵抗性の辺縁系発作を表す６Ｈｚ精神運動モデルを採用した（Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５；Ｂａｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００１）。簡単に説明すると、角膜電極を介して送達される低周波（６Ｈｚ）、長時間（３秒）の刺激によって誘発される精神運動発作を遮断する能力について化合物をスクリーニングした。これらの発作は、人間で観察される部分発作のモデルとなると考えられている。６Ｈｚ試験の３０分前に動物に投与した場合、１匹の動物だけが最高投与量（３００ｍｇ／ｋｇ）で応答した。しかし、６Ｈｚテストの２時間前にＡＮ２７２８で処置した場合、４匹中３匹が応答した。

実施例５－ＰＤＥ４阻害は、Ｓｃｎ１ａ変異マウスにおいて高体温誘発性発作から保護する
図１３（パネルＡおよびＢ）に示されるように、例示的なＰＤＥ４阻害剤（ＡＮ２７２８）は、Ｓｃｎ１ａ変異マウスにおける高体温誘発性発作から保護する。このモデルでは、外部熱源を使用してＳｃｎ１ａ変異動物のコア温度を上昇させ、その結果、脳の温度が上昇し、これが高体温発作につながる。これらの温熱性けいれんは、熱性けいれんを表すと考えられている。Ｓｃｎ１ａ変異体では、発作は約４１℃で始まるが、ＷＴでは、４３℃の高温でも発作が検出されることはめったにない。ＰＤＥ４阻害剤（ＡＮ２７２８）による処置後、Ｓｃｎ１ａ変異体は高体温による発作から保護され、一部の動物はまったく発作を経験せず（ｎ＝３）、残りの動物はより高い温度（例、４２℃）でのみ発作を経験する。図１２Ｂは、異なるグラフ化をした同じデータである。

図１４に示されているのは、２重選択的ＰＤＥ４Ｂ阻害剤（ロリプラム）が、Ｓｃｎ１ａ変異マウスにおいて温熱誘発性発作からの保護に有効であることを実証するデータである。上記の温熱誘発アッセイを使用して、異なるＰＤＥ４Ｂ阻害剤（ロリプラム、３ｍｇ／ｋｇ）によるＳｃｎ１ａ変異マウスの処置も、温熱誘発発作に対して神経保護的であり、発作を誘発するのに必要な温度を上昇させたのみならず（パネルＡ）、Ｒａｃｉｎｅスケールを使用して測定されるところの発作の重症度を、ほぼ４～５レベルである発作からレベル３にした（パネルＢ）。

図１５に示されているのは、上記のマウスＳｃｎ１ａ高体温モデルを使用して発作を遮断する際の３つの例示的なＰＤＥ４阻害剤（ＡＮ２７２８、ロリプラム、ロフルミラスト）の効果を比較するデータである。発作を誘発するのに必要な温度が野生型と統計的に異なる場合、発作の部分的な遮断が認められ、ＰＤＥ４阻害剤による前処理後に発作が誘発されない場合、発作の完全な遮断が起こる。

このように、上記は、単に本開示の原理を説明しているに過ぎない。当業者であれば、本明細書に明示的に記載または図示しないが、本発明の原理を具現化しその趣旨および範囲内に含まれる様々な構成を考案することができることが理解されよう。さらに、本明細書に列挙されたすべての例および条件的文言は、主として本発明の原理および発明者らにより当該技術分野の促進のために寄与された概念を理解する上で読者を助けることを意図しており、このような具体的に列挙された例および条件への限定ではないと解釈されるべきである。また、本発明の原理、態様、および実施形態、ならびにその具体的な例を列挙する本明細書におけるすべての記述は、その構造的および機能的等価物の両方を包含することを意図する。加えて、そのような等価物は、現在知られている等価物および将来開発される等価物の両方、すなわち、構造にかかわらず同じ機能を果たすあらゆる開発要素も含むことが意図される。したがって、本発明の範囲は、本明細書に図示および記載の例示的な実施形態に限定されることを意図しない。

Claims (26)

1. てんかんを治療する方法であって、てんかんを有する個体に治療有効量のホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤を投与することを含む、方法。
2. 前記ＰＤＥ４阻害剤が小分子である、請求項１に記載の方法。
3. 前記ＰＤＥ４阻害剤が、ＡＮ２７２８、ドロタベリン、イブジラスト、イルソグラジン、ピクラミラスト、ロフルミラスト、ロリプラム、テオフィリン、アプレミラスト、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
4. 前記ＰＤＥ４阻害剤がＡＮ２７２８である、請求項２に記載の方法。
5. 前記ＰＤＥ４阻害剤が、ＰＤＥ４Ａ、ＰＤＥ４Ｂ、ＰＤＥ４Ｃ、またはＰＤＥ４Ｄのうちの１つ以上を阻害する、請求項１に記載の方法。
6. 前記ＰＤＥ４阻害剤が、ＰＤＥ４Ａ、ＰＤＥ４Ｂ、ＰＤＥ４Ｃ、およびＰＤＥ４Ｄの間で選択性を示す、請求項１に記載の方法。
7. 前記ＰＤＥ４阻害剤がＰＤＥ４Ｂについて選択的である、請求項６に記載の方法。
8. 前記投与が、経口、非経口、鼻腔内、髄腔内、頭蓋内、または経皮投与による、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記ＰＤＥ４阻害剤がＰＤＥ４の発現を阻害する、請求項１に記載の方法。
10. 前記ＰＤＥ４阻害剤が、ＰＤＥ４ＡをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＰＤＥ４ＢをコードするｍＲＮＡ、ＰＤＥ４ＣをコードするｍＲＮＡ、ＰＤＥ４ＤをコードするｍＲＮＡ、またはそれらの任意の組み合わせの一部に相補的な領域を含む核酸ベースの阻害剤である、請求項９に記載の方法。
11. 前記核酸ベースの阻害剤が、ＰＤＥ４Ａ、ＰＤＥ４Ｂ、ＰＤＥ４Ｃ、またはＰＤＥ４ＤをコードするｍＲＮＡに選択的にハイブリダイズする、請求項１０に記載の方法。
12. 前記核酸ベースの阻害剤が、ＰＤＥ４ＢをコードするｍＲＮＡに選択的にハイブリダイズする、請求項１１に記載の方法。
13. 前記核酸ベースの阻害剤が、モルフォリノ、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である、請求項１０～１２のいずれか１項に記載の方法。
14. 前記個体が、良性ローランドてんかん、前頭葉てんかん、乳児けいれん、若年性ミオクロニーてんかん（ＪＭＥ）、若年性欠伸てんかん、小児欠伸てんかん、ピクノレプシー、熱性発作、ラフォラ病の進行性ミオクローヌスてんかん、レノックス・ガストー症候群、ランドウ・クレフナー症候群、ドラベ症候群（ＤＳ）、熱性発作を伴う全般てんかん（ＧＥＦＳ＋）、乳児重症ミオクロニーてんかん（ＳＭＥＩ）、良性家族性新生児ひきつけ（ＢＦＮＣ）、ウエスト症候群、大田原症候群、早期ミオクロニー脳症、遊走性部分てんかん、乳児てんかん性脳症、結節性硬化症（ＴＳＣ）、限局性皮質異形成、Ｉ型滑脳症、ミラー・ディカー症候群、アンジェルマン症候群、脆弱Ｘ症候群、自閉症スペクトラム障害におけるてんかん、皮質下帯状異所性灰白質、ウォーカー・ワールブルグ症候群、アルツハイマー病てんかん、外傷後てんかん、進行性ミオクローヌスてんかん、反射てんかん、ラスムッセン症候群、側頭葉てんかん、辺縁系てんかん、てんかん重積状態、腹部てんかん、巨大両側性ミオクローヌス、月経随伴性てんかん、ジャクソン発作障害、ウンフェルリヒト・ルンドボルグ病、および光感受性てんかんからなる群から選択されるてんかんを有する、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
15. 前記個体が遺伝的変異によって引き起こされるてんかんを有する、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
16. 抗てんかん剤を同定する方法であって、ホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）活性アッセイにおいてＰＤＥ４ポリペプチドを候補薬剤と接触させることを含み、前記候補薬剤による前記ＰＤＥ４ポリペプチドの活性の阻害により、前記候補薬剤が抗てんかん剤として同定される、方法。
17. 前記接触が、無細胞ＰＤＥ４活性アッセイにおいて前記ＰＤＥ４ポリペプチドと前記候補薬剤とを組み合わせることを含む、請求項１６に記載の方法。
18. 前記接触が、細胞ベースのＰＤＥ４活性アッセイにおいて前記ＰＤＥ４ポリペプチドと前記候補薬剤とを組み合わせることを含む、請求項１６に記載の方法。
19. 前記ＰＤＥ４活性アッセイが、前記ＰＤＥ４ポリペプチドを、ＰＤＥ４活性を阻害することが知られている陽性対照薬剤と接触させることをさらに含む、請求項１６～１８のいずれか１項に記載の方法。
20. 前記陽性対照薬剤が、ＡＮ２７２８、ドロタベリン、イブジラスト、イルソグラジン、ピクラミラスト、ロフルミラスト、ロリプラム、テオフィリン、アプレミラスト、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
21. 前記候補薬剤が小分子である、請求項１６～２０のいずれか１項に記載の方法。
22. 前記ＰＤＥ４ポリペプチドが、ＰＤＥ４Ａ、ＰＤＥ４Ｂ、ＰＤＥ４Ｃ、またはＰＤＥ４Ｄである、請求項１６～２１のいずれか１項に記載の方法。
23. 前記ＰＤＥ４ポリペプチドがＰＤＥ４Ｂである、請求項２２に記載の方法。
24. 前記候補薬剤が、前記ＰＥＤ４ポリペプチドの活性を阻害すると決定される場合、前記候補薬剤が、ＰＤＥ４Ａ、ＰＤＥ４Ｂ、ＰＤＥ４Ｃ、およびＰＤＥ４Ｄの間で選択的阻害を示すかどうかを決定することをさらに含む、請求項１６～２３のいずれか１項に記載の方法。
25. 請求項１６～２４のいずれか１項に記載の方法により同定された抗てんかん剤を含む医薬組成物。
26. てんかんを有する個体に、請求項１６～２４のいずれか１項に記載の方法によって同定された治療有効量の抗てんかん剤を投与することを含む方法。
    

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