JP2022517122A - 固相ペプチド合成のための方法および装置 - Google Patents

Abstract

本発明は、固相ペプチド合成を実行するための方法、自動並行固相ペプチド合成、およびそのような方法を実行するために設計された装置に関する。本発明によると、２５ｋＨｚより大きい周波数の超音波が、固相ペプチド合成が行われる反応媒体に方法の間に少なくとも断続的に作用する。

Description

本発明は、固相ペプチド合成を実行するための方法、自動並行固相ペプチド合成、およびそのような方法を実行するために適応された装置に関する。

固相ペプチド合成（ＳＰＰＳまたはさらにメリフィールド合成）は、１９６２年にノーベル賞受賞者ロバート・ブルース・メリフィールドによって導入された、不溶性ポリマー担体を使用するペプチド合成方法である。配列特異的な一時的に保護されたアミノ酸を、合成樹脂担体に共有結合されている、成長するポリペプチド鎖のＣ末端に段階的に付着させることにより、直鎖ペプチドを構築する。反応が制御され、副反応が回避されることを確実にするために、アミノ酸の反応性官能性側鎖は、好適な保護基によってブロックされなければならない。接続されるアミノ酸のα－アミノ基は実際のカップリング反応の間のみ保護されればよいが、永久側鎖保護基は、合成の完了後に初めてペプチドから切断される。リボソームタンパク質生合成とは対照的に、ペプチド鎖の延長はＣ末端からＮ末端へと生じる。ポリスチレンと１～２％の１，４－ジビニルベンゼンのコポリマーが好適なポリマー担体であることが明らかになっている。ビーズ重合によって得られる、直径２０～１００μｍの樹脂ビーズは、合成に使用される溶媒中で膨張し、それにより試薬に透過性になる。ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）およびフルオレニル－９－メトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基は、主に中間α－アミノ保護基として使用される。Ｂｏｃ基は、接触水素化およびアルカリ加水分解に対して安定であり、例えば５０％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）による穏やかな酸分解によって切断することができる。個々のカップリング工程後に、酸による脱ブロック反応を継続的に繰り返すことにより、側鎖保護基の部分的な脱ブロック、およびポリマー担体へのアンカー結合のわずかな加水分解がもたらされる。Ｆｍｏｃ基は、モルホリン、２－アミノエタノールまたはピペリジンなどの好適な塩基による処理によって切断可能であるという利点を有する。ポリマー担体へのアンカー基として、かつ対応するアミノ酸構成単位の第三の官能基を保護するために酸不安定性の塩基耐性基を使用すると、有利には中間保護基と永久保護基を互いに独立して切断することができる。

カップリング反応（縮合またはペプチド伸長とも称される）は、合成に極めて重要な工程であり、これは最終生成物の均質性には、完全な変換が基本的な必要条件であるためである。原則的に、試薬は過剰量で使用され、好ましくは無水物、活性エステルまたはいわゆるｉｎ－ｓｉｔｕ活性化剤であり、ここで中間活性化エステル誘導体が形成される。α－アミノ保護基の切断および次のＮα－保護アミノ酸の付着（カップリング反応、縮合）の反応工程を継続的に繰り返すことにより、合成工程の広範な自動化、およびそのほとんどがフロースルー原則に従って作用するペプチド合成装置の構築が可能になった。ここで樹脂は、試薬および溶媒が自動的にフィードされ、担体材料と混合され、その後抽出されるように、フリットを備えたカラムの底部に置かれる。工程は、構築されるペプチドの所望の長さに到達するまで繰り返される。最後に、合成されたペプチドをポリマー担体から離脱する。樹脂マトリックスからの離脱は試薬を用いて達成され、試薬は、選択される保護基のスキームに応じてＣ末端アミノ酸と担体の間のアンカー結合を選択的に切断するか、または合成されたペプチドの部分的もしくは完全な脱ブロックを同期的に生じさせる。複数のペプチド合成が固相ペプチド合成から開発されている（非特許文献１、非特許文献２）。

自動ペプチド合成の主な課題は、クロスコンタミネーションを回避することであり、これは公知の手順および自動機器では、試薬が同じ管系およびカニューレを通るためである。クロスコンタミネーションを防止するために、公知の装置構成では、システム全体が大量のリンス剤でリンスされる。

ここで、特許文献１は、クロスコンタミネーションを排除することができる自動同時複数並行合成を可能にする装置に着手し提供している。これは、合成時間の顕著な短縮をもたらす。

ペプチド合成の合成時間を短縮するための別のアプローチは、合成中に試薬をマイクロ波放射に曝露することである。これにより、合成時間を１０分の１に短縮することができる。しかし、マイクロ波補助反応は、特別な保護空間で実行されなければならない。このため、この方法は比較的小さい反応器、およびしたがって低いスループット分量に制限される。さらに、一般的な保護基のすべてがマイクロ波放射に対して安定であるわけではないため、収率が低減し、より多くの不純物が生じる可能性があることが見出された。

１９７７年、超音波を用いて合成を補助する試みが特許文献２で公開された。しかし、後年において、この方法は、少なくとも示された形態で所望の結果をもたらさなかったことが明白になった。一般的な方法では、合成時間の再現可能な加速は観察できなかった。

ＤＥ１０１３１０８８Ｂ４ ＣＡ１０１９３２４

E. Atherton and R.C. Sheppard Solid-Phase Synthesis - A Practical Approach, Oxford University Press, 1989 H.-D. Jakubke Peptides: Chemistry and Biology, published by Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg, 1996

ここで、本発明の目的は、収率および純度を維持または改善しながら固相ペプチド合成の合成時間をさらに加速させることである。その方法は特に自動並行方法に適用されることが望まれる。

この目的は、自動並行固相ペプチド合成を実行するための方法、および独立請求項の特色を有する、前記方法を実行するための装置によって達成される。

したがって、本発明の第１の態様は、固相ペプチド合成（以下合成またはペプチド合成とも称する）を実行するための方法に関する。本発明による方法は、
ａ）保護基によってＮ末端が保護されたアミノ酸を、アミノ酸のＣ末端を介して固体担体材料に結合させる工程、
ｂ）保護基を切断する工程、
ｃ）少なくとも１回のペプチド伸長を実施する工程、および
ｄ）ペプチドを担体材料から切断することによって反応を停止する工程を含み、
工程ａ）～ｄ）は液体反応媒体中で行われ、少なくとも工程の１つの間に、＞２５～２０００ｋＨｚの範囲の周波数の超音波が反応媒体に少なくとも断続的に作用する。

超音波は、固相ペプチド合成の問題の反応に対する加速効果を、４０ｋＨｚより大きい周波数からのみ有することが見出された。これにより、本発明による方法は、固相ペプチド合成の合成時間を、少なくともマイクロ波補助ペプチド合成の合成時間の領域内になるように再現可能に短縮することができる。しかし、有利には、特別な安全対策がとられる必要がない。さらに、必要な装置は調達および維持するのに比較的安価である。これは、方法がほぼすべての合成設備、特に並行および／または自動化可能合成設備に使用可能であることを意味する。

工程ａ）は、官能基を好適な担体材料、例えば固相ペプチド合成のためのプレロードもしくは非プレロード樹脂またはアミド樹脂に直接または間接的に結合させることを意味すると本明細書で理解される。この官能基は、特にＦｍｏｃ保護基を用いて保護されてもよい。ここで、プレロードまたは非プレロードとは、少なくとも第１のおよび任意選択で少なくとも１つの後続のアミノ酸、すなわち合成されるアミノ酸配列の最初のアミノ酸が担体材料に既に結合されているという事実を指す。

４０ｋＨｚより大きい、好ましくは５０ｋＨｚより大きい、特に７５ｋＨｚより大きい、特に好ましくは１００ｋＨｚより大きい周波数が特に好適であることが明らかになっており、これはより高い周波数でより顕著な合成時間の短縮を達成できるためである。ペプチド合成に対する肯定的な効果、特に品質の向上のために、キャビティの形成が重要であることが見出された。関連するキャビテーションは、４０ｋＨｚの周波数から開始して周波数の増加とともに強度を増す。２０～４０ｋＨｚの周波数範囲では、振動励起のみが行われる。

好ましくは、本発明による方法の超音波周波数は、２ＭＨｚ、特に１ＭＨｚを超えない。好ましい周波数のさらなる説明が以下に続く。

本明細書に記載される超音波補助固相ペプチド合成（ＵＳＰＳ）は、化学合成においてソノケミストリーのカテゴリーに属する。

一般的な周波数は、簡素な回転運動であっても励起するには数桁低すぎるため、超音波の化学的効果は、音場の直接効果であることはない。

肯定的な効果は、超音波および結果として発生する圧力パルスによって誘発されるキャビテーションに直接関連すると推測される。キャビテーションは、４０ｋＨｚ～２ＭＨｚの周波数範囲で生じる。

３種のソノケミストリー反応が仮定される。
１．均一系におけるラジカルまたはラジカルイオン性中間体による反応。キャビテーション気泡内で極端な圧力および高温により、水性相中で例えばＯＨ^・およびＨ^・ラジカルが生成され、それにより気泡内でとりわけＨ_２Ｏ_２の形成がもたらされる。
２．不均一系におけるイオン性反応による反応。これらは、溶媒中のキャビテーションの機械的効果によって主に補助される。非対称の気泡が固体粒子上に形成される。粒子上の非対称の気泡の破裂により、一方向に破裂していく気泡に向かって射出する液体ジェットが生じる。これにより、溶媒および溶解した物質の多孔質材料への吸収が補助される。他方で他の液相では、相の混合が行われる。
３．不均一系におけるラジカル反応も行われる反応。ラジカル経路が、Ｋｏｒｎｂｌｕｍ－Ｒｕｓｓｅｌｌ反応などにおけるイオン経路と比べて異なる生成物を生成する可能性がある。

キャビテーション気泡は、より低い周波数範囲で形成される可能性が高く、その後さらに大きく非対称になる。これにより、より強力であるがより不均等な混合がもたらされる。他方でより高い周波数では、より多数のより小さな対称の気泡が生成され、キャビテーション気泡と環境との間により多くのラジカル交換が生じる。

キャビテーションは、「液体中の気泡の形成、成長および内破崩壊である。キャビテーション崩壊は局部的に高い温度（約５０００Ｋ）、高い圧力（約１０００ａｔｍ）、非常に大きい加熱および冷却速度（＞１０９Ｋ／秒）」および液体ジェット（約４００ｋｍ／時間）を生じる。キャビテーション気泡は、真空気泡である（Ｓｕｓｌｉｃｋ １９９８）。真空は、高速で移動する表面および不活性の液体によってもたらされる。生じる圧力差は、液体内の凝集力および接着力を克服する。

１１０ｋＨｚより大きい周波数から、特に１２５ｋＨｚから、好ましくは１３０ｋＨｚより大きい周波数において、反応プロセスの加速およびそれに伴う反応時間の短縮ならびに収率の改善を観察することができる。標準的なシステムに比べ、４０倍の過剰量のアミノ酸を用いて作業する必要がなく、４倍の過剰量で既に同じ結果を達成できることが見出された。これにより、ひいては反応物の分量が著しく低減し、したがって相当なコスト削減につながる。さらに、１１０～５００ｋＨｚの範囲の周波数でラセミ化が観察されなかったため、収率が増加する。

本発明による方法の好ましい実施形態では、超音波は外部の液体浴を介して反応媒体に伝導されると仮定される。これは、超音波を直接または固体伝導手段のみを介して反応媒体に伝導する手段とは明らかに異なる。少なくとも１つの液体媒体を介した伝導は、より一貫性のある、再現可能で穏やかな合成結果をもたらすことが見出された。必要とされる合成時間は、液体を含む伝導媒体を使用した場合、例えば反応媒体中に浸漬されたプローブを使用する場合の合成時間より少ないばらつきを示した。さらに、試験設備は、プローブを使用する場合よりはるかに簡素である。プローブの浸漬は、不可避的にプローブのコンタミネーションにつながり、プローブの定期的な清掃を必要とし、これは合成時間の利得に等しいまたは少なくとも著しく低減させる。

キャビテーションに変換されるエネルギー量は、キャビテーション発生装置から液体へと伝達される運動を表す複数の要因に依存する。加速の強度は、エネルギーのキャビテーションへの効率的な変換に影響を及ぼす最も重要な要因の１つである。加速が大きいほど、より大きな圧力差が生じる。これにより、液体中に波ではなく真空気泡が生成される可能性が高くなる。これは、加速が大きいほどキャビテーションに変換されるエネルギーの割合が大きいことを意味する。（超）音波トランスデューサーの場合、加速の強度は振動の振幅によって決定される。超音波の強度に加え、乱流、摩擦および波の発生による損失が可能な限り低くなるような様態で液体が加速されることも重要である。これには移動の単方向の進路が最適である。

したがって、伝導媒体の選択がペプチド合成の効果に非常に重要である。状態の選択に加え、伝導媒体の物質も最適化されなければならない。伝導媒体として水に加え、有機溶媒、特にエタノール、プロパノールおよびブタノールなどの低級および中級アルコールも伝導媒体として好ましく使用される。

異なる伝導媒体を組み合わせて選択することが有利である。試験設備は、浴中浴と理解されるべきである。言い換えると、反応は、（反応）容器内に配置された反応媒体中で行われる。この反応容器は、ひいては第１の伝導媒体を含む容器内に配置され、この容器は、ひいてはさらなる伝導媒体内に配置される。したがって、超音波は、さらなる伝導媒体を介して第１の伝導媒体へと、さらにそこから反応媒体へと伝導される。

特に有利には、第１の伝導媒体は、特に上述の種類の低級および中級アルコールによって構成され、および／またはさらなる伝導媒体は水によって構成される。

高い超音波周波数では、液体浴中の温度は予想通り上昇する。しかし、最大５００ｋＨｚの周波数では、この効果を非常に良好に制御することができ、これは生じる温度の上昇が、継続的なクーラー（クライオスタット）またはペルチェ素子を用いた水浴の冷却などの冷却装置によって容易に補償することができ、そのためここで潜在的に同様に生じるラセミ化によって収率が損なわれないためである。

５００ｋＨｚより顕著に大きく、最大１０００ｋＨｚより大きい周波数を使用する場合、品質を保証するために、例えば浴を冷却することにより温度上昇に対抗することが合理的であることが明らかになった。

超音波浴は、好ましくは温度制御に、より詳細には２０～１００℃、好ましくは２０～７０℃、特に好ましくは４０～５０℃の温度範囲に供される。

本発明のさらに好ましい実施形態では、アミノ酸は、塩基不安定性、特に第二級アミンを用いて切断することができる一時的（最初の）保護基、特にフルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）によってＮ末端が保護されると仮定される。ｂｏｃ方法で使用される保護基と比較して、これらの保護基は、本発明による周波数の超音波に特に安定であることが示されており、したがって特に高い収率とともに高い純度が達成される可能性がある。脱保護は、好ましくは上述または試験結果にあるように、好適な塩基を使用して実行される。好ましくは、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）中２０％ピペリジンが使用される。

これまで、超音波補助ペプチド合成の利点は、ＢｏｃＯＣ合成に対してのみ確認されていた。超音波補助は、使用される樹脂が超音波下で粉砕されるため、Ｆｍｏｃベースの合成には適応されないことが今までに見出されている。使用される様々な反応媒体および側鎖の保護基のために、樹脂へのカップリングのみが超音波によって補助されうると推測されてきた。しかし、驚くべきことに、反応時間および収率の点での利点は、超音波補助によるＦｍｏｃベースのペプチド合成に対しても、記載される周波数範囲内での本発明の方法による個々の合成工程の間に示される可能性がある。

本発明による方法を用いて合成されるペプチドの反応性側鎖は、好ましくは（第２の）保護基によっても保護される。保護される官能基に依存して、特にＳ－２，４，６－トリメトキシベンジル（Ｔｍｏｂ）、トリフェニルメチル（Ｔｒｔ）、ｔｅｒｔ－ブチル（ｔＢｕ）、ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、２，２，４，６，７－ペンタメチルジヒドロベンゾフラン－５－スルホニル（Ｐｂｆ）からなる群から選択される酸安定性保護基が、言及される周波数範囲内の超音波を用いた本発明によるペプチド合成において特に安定性であることが示された。

本発明による方法を参照すると、例えば、アミノ酸が一文字コードまたは三文字コードで列挙される、Ｆｍｏｃ－Ａ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｃ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｄ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｅ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｆ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｈ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｉ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｋ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｍ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｎ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｑ－Ｔｒｔ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｒ－Ｐｂｆ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｓ－ｔＢｕ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔ－ｔＢｕ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｖ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｗ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｙ－（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ（Ｔｍｏｂ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｎ（Ｔｍｏｂ）－ＯＨの群から選択されるＦｍｏｃアミノ酸が、ペプチド伸長に特に好適である。これは、アミノ酸のＬ体とＤ体の両方を指す。

さらに、側鎖が保護された特別な翻訳後修飾アミノ酸、例えば、
Ｓｅｒ／Ｔｈｒのリン酸化に関して
Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ＰＯ（ＯＢｚｌ）ＯＨ）、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ＰＯ（ＯＢｚｌ）ＯＨ）、Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ（ＰＯ（ＯＭｅ）_２）、Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ（ＰＯ（ＯＢｚｌ）ＯＨ）、Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ（ＰＯ（ＯＢｚｌ）_２）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ（ＰＯ_３Ｈ_２）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ（ＰＯ（ＮＭｅ_２）_２）、Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ（ＰＯ（ＮＭｅ_２）_２）、Ｆｍｏｃ－Ｐｐａ（Ｂｚｌ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｍｐ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｆ_２Ｐｍｐ－ＯＨ、
Ｔｙｒの硫酸化に関して
Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ（ＳＯ_３ｎＰ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ（ＳＯ_３ＤＣＶ）－ＯＨ、
Ａｒｇのメチル化に関して
Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｍｅ，Ｐｂｆ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－ＡＤＭＡ（Ｐｂｆ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－ＳＤＭＡ（Ｂｏｃ_２）－ＯＮａ、
Ｌｙｓのメチル化に関して
Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｍｅ，Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｍｅ_２）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｍｅ_３Ｃｌ）－ＯＨ、
シトルリン化に関して
Ｆｍｏｃ－シトルリン－ＯＨ、
Ａｓｎのグリコシル化に関して
Ｆｍｏｃ－Ａｓｎ（β－ＤＧｌｃＮＡｃ（Ａｃ）_３）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｎ（β－ＤＧｌｃＮＡｃ（Ａｃ）_３－（１－４）－β－ＤＧｌｃＮＡｃ（Ａｃ）_２）－ＯＨ、
Ｓｅｒ／Ｔｈｒのグリコシル化に関して
Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（α－ＤＧｌｎＮＡｃ（Ａｃ）_３）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（β－ＤＧａｌ（Ａｃ）_４－（１－３）α－ＤＧｌｎＮＡｃ（Ａｃ）_２）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（ｓｉａｌｙｌＯＭｅ（Ａｃ）_４－（１－６）－α－Ｄ－ＧｌｎＮＡｃ（Ａｃ）_２）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（シアリルＯＭｅ（Ａｃ）_４－（１－３）－β－Ｄ－Ｇａｌ（Ａｃ）_３－（１－３）α－ＤＧｌｎＮＡｃ（Ａｃ）_２）－ＯＨも使用できる。

同様に、複雑なペプチド配列の合成のために開発された合成構成単位、例えばＦｍｏｃシュードプロリンジペプチド、いわゆるＤｍｂ構成単位、例えばＦｍｏｃ－（Ｄｍｂ）Ｇｌｙ－ＯＨ、またはジペプチドＦｍｏｃＸａａＤｍｂＧｌｙとしてＨｍｂ構成単位であるＦｍｏｃＨｍｂＸａａならびにＨｍｓｂ構成単位、Ｈｎｂ構成単位、Ｍｍｓｂ構成単位、非天然アミノ酸、例えば
ナフチルアラニン、Ｆｍｏｃ－Ｌ－２Ｎａｌ－ＯＨ
オルニチン、Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｏｒｎ（Ａｌｏｃ）－ＯＨおよびメチル化変異体、
ポリエチレングリコール、Ｆｍｏｃ－Ｏ１Ｐｅｎ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－ＡＥＥＰ、Ｆｍｏｃ－ＴＴＤＳ－ＯＨおよびすべての他のＦｍｏｃ保護されたアミノポリエチレングリコール酸、
特に誘導体化アミノ酸、例えば
Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（ビオチン）－ＯＨ、ＦＭＯＣ－Ｌｙｓ（Ｃｙ５）－ＯＨを使用することができる。

一般的に、一時的に保護されたアミン官能基、好ましくはＦｍｏｃ保護されたもの、および活性エステルまたはアミン反応性基に変換可能なカルボン酸官能基を有するすべての構成単位をＵＳＰＳに使用することができる。

有利には、超音波は１つの工程のみで、特に工程ｃ）で反応媒体に作用する。代替的にまたはさらに、超音波は少なくとも１つのさらなる工程で、好ましくは工程ａ）、ｂ）および／または工程ｄ）で反応媒体に作用する。本発明による超音波の反応加速特性は、言及される工程のそれぞれで観察することができる。

ここで、超音波の作用は、中断によって収率が低減する可能性があるため、個々の工程間または個々の工程中に中断されないことが特に好ましい。

合成時間の最大の短縮と高い収率は、現在まで、超音波が合成全体にわたって、すなわち洗浄、脱保護、縮合およびカップリングの間も反応媒体に適用された場合に達成されていた。一方で、超音波は予備工程としての予備膨張においても、最終洗浄においても必ずしも有利であるわけではない。

固相ペプチド合成は、互いと区別することができる複数の洗浄工程を含む。個々の種類の洗浄工程は、それらのそれぞれの上流反応によって区別されてもよい。したがって、第１のアミノ酸の樹脂へのカップリング後の少なくとも１回の洗浄（初期洗浄）、工程ｂ）の保護基の脱カップリング後の洗浄（以下工程Ｗ_ｂ）、ペプチド鎖を延長するためのアミノ酸のカップリング後の洗浄（以下工程Ｗ_ｃ）、および工程ｄ）の、完成したペプチドの最後の一時的保護基の担体材料からの切断後の最終洗浄（以下工程Ｗ_ｄ）を挙げることができる。

個々の洗浄工程の間、超音波はまた、好ましくは反応に影響を及ぼし、必要なリンス剤およびリンス時間を顕著に短縮させる。したがって、超音波での１回のみのリンス工程による洗浄で、標準的な合成で通常４回リンスする場合と同じ結果が既に達成される。洗浄工程Ｗ_ｃ、すなわち工程ｃ）後の洗浄は、収率および品質の向上に特に重要である。研究により、洗浄工程Ｗ_ｂは完全に省略することもできることが示された。しかし、好ましくは、本発明による方法ではすべての洗浄工程が実行される。

特にこの洗浄工程では、１００～５００ｋＨｚの範囲、好ましくは１００～２００ｋＨｚの範囲、特に１２０～１４０ｋＨｚの範囲の超音波周波数が好ましい。これらの範囲では、いずれも洗浄工程の個々のリンスサイクル内で洗浄またはリンスに必要とされる溶媒、例えばＤＭＦの量は、洗浄工程Ｗ_ｂにつき１回のみのリンス工程が必要になるような様態で低減されてもよい。

特に有利には、超音波は、特に全く中断することなく、洗浄工程Ｗ_ｂ、Ｗ_ｃおよびＷ_ｄを含むペプチド合成のすべての工程ａ）～ｄ）において前述の周波数範囲内で反応媒体に作用すると仮定される。

合成されるペプチドに依存して、品質の向上および反応時間の短縮に関して、個々の工程ａ）～ｄ）、特に工程Ｗ_ｂ、_ｃおよび_ｄに対して異なる周波数が最適である、すなわち周波数がより有益な効果を示すことが見出された。したがって、超音波は、個々の工程において異なる周波数で反応媒体に作用することが好ましい。特に、周波数が工程間で変化するおよび／または異なる周波数の超音波が互いに重ね合わされることが好ましい。

担体材料は、ペプチド合成のために当業者に基本的に公知の材料である。これらは人工樹脂／合成樹脂であり、
Ｋｎｏｒｒ Ａｍｉｄ樹脂 ＬＳ １％ＤＶＢ、Ｗａｎｇ樹脂、クロロトリチル樹脂、ＰＲＧ樹脂、Ｔｅｎｔａｇｅｌ樹脂、Ｃｈｅｍｍａｔｒｉｘ樹脂、
一般的に、固相合成用のプレロードもしくは非プレロードおよび／または官能化樹脂の群からの樹脂が特に有利である。

常磁性ではない合成樹脂が好ましく、これは合成されたペプチドの磁気による分離が濾過による分離より顕著に複雑であり、かつ常磁性樹脂が、低周波数（最大４０ｋＨｚ）の超音波で非常に微細な粒子を形成するまで破砕され、このプロセスの間にフィルター材料を詰まらせることが示されたためである。

本発明の文脈では、好ましく使用される溶媒は、ＤＭＦ（Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド）、ＮＭＰ（Ｎ－メチル－２－ピロリドン）またはＤＭＡ（Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド）である。

縮合反応を触媒するために使用される塩基は、好ましくはＮＭＰ、４－メチルモルホリンまたはＤＩＰＥＡ、ＤＭＦまたは別の溶媒中のジイソプロピルエチルアミンである。

一時的Ｆｍｏｃ保護基を切断するための溶液は、好ましくはＤＭＦ中２０％ピペリジンである。他の切断方法は、原則的に当業者に公知である。

使用されるカップリング試薬は、好適には、ＨＢＴＵ（２－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）、ＨＣＴＵ（２－（６－クロロ－１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルアミニウムヘキサフルオロホスフェート）、ＰｙＢＯＰ（ベンゾトリアゾール－１－イル－オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）、ＤＣＣ、ジシクロヘキシルカルボジイミド、ＤＩＣ、ジイソプロピルカルボジイミドまたはＥＤＣ、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドである。

すべてのアミノ酸／試薬は使用される溶媒に溶解され、それにより反応媒体／反応物媒体／試薬溶液が得られる。試薬が方法および装置の文脈で言及される場合、試薬の溶液を含むとも理解される。

使用されるアミノ酸の濃度は、合成の規模およびＤＭＦ、ＮＭＰまたはＤＭＡなどの使用される溶媒へのその溶解度に常に依存する。

良好な合成結果を得るために、カップリングされるアミノ酸（ＡＡ）および活性エステルを形成するための試薬（活性剤）は、好ましくはそれぞれ合成の規模に対して少なくとも等モルで使用される。しかし、等モル量のＡＡおよび活性剤を一緒に使用し、それらを両方とも合成の規模に対して過剰量で使用することが一般的である。過剰量は、４倍～１００倍の範囲である。先行技術の固相ペプチド合成を用いて本発明の方法に匹敵する品質を達成するためには、ペプチド配列に応じて少なくとも４０倍の過剰量が必要である。この理由は、反応物の高い過剰量は、生成物、すなわち延長されたペプチド鎖の形成に好都合であるためである。ここで、アミノ酸の濃度は、使用される溶媒への保護されるＡＡの溶解度に主に依存し、好ましくは０．２Ｍ～０．６Ｍの間である。

本出願に記載される実験では、アミノ酸は０．４Ｍの濃度で使用された。

ここでも、超音波は連続（超音波補助）工程ａ）～ｄ）間で全く中断することなく、周波数のみが変化することが有利である。有利には、方法は、半自動／自動および／または並行して実行されることが想定される。並行自動方法と本発明による超音波補助の組合せでは、固有のペプチド、すなわち特定の個体に合わせて調整されたペプチドを、ネオアンチゲンを用いる特定の形態のがん治療が多数の患者に利用可能になる規模およびスループットで生成することができる。ネオアンチゲンは、腫瘍細胞のタンパク質における突然変異誘導性変化である。これらは、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）の技術によって同定可能である。通常、様々なネオアンチゲンの数は、１００～２００の間の範囲である。対応する数の合成ペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでこれらのネオアンチゲンを模倣することができ、患者の腫瘍特異的免疫化に使用することができる。ネオアンチゲンの数、組成およびアミノ酸配列は、各患者に固有である。したがって、対応するペプチドの複製も個体によって適応されなければならず、言い換えると個別化されなければならない。この有望な治療を完全に医学的に使用可能にするために、同じ条件下で多数の患者に対して妥当な期間内で試験を行うことができなければならない。これは、極めて短時間で多数の個別化された抗原が入手可能になることを必要とする。したがって、記載される形態の個別化されたがん治療は、ペプチドの合成に対して速度、並行性および品質を強く要求する。本発明による方法は、これらの必要条件に適合する可能性がある。

本発明による方法は、大規模用途に特に好適である。「大規模用途」という用語は、１ｌ～５０ｌ、特に１００～５００ｌのバッチサイズの規模を意味する。

したがって、本発明のさらなる態様は、記載される実施形態の１つにおける本発明による方法を含む自動並行固相ペプチド合成である。

本発明による方法は、特に有利には、室温または適度な温度上昇において実行される。２０～１００℃の範囲、好ましくは２０～７０℃の範囲、特に４０～６０℃の範囲の反応温度が特に好ましい。温度制御は、好ましくは少なくとも工程ａ）、ｂ）および／またはｄ）で行われる。

本発明による方法は、とりわけ特に生成物が１００ｇを超える規模の、リトラグルチド（ｌｉｔｒａｇｌｕｔｉｄｅ）およびセマグルチドの大規模生成に特に好適であることが見出された。

本発明のさらなる態様は、記載される実施形態の１つにおける本発明による方法を実行するために設計された、固相ペプチド合成を実行するための装置に関する。この目的のために、本発明による装置は、好ましくは２５ｋＨｚ～２ＭＨｚ、特に４０ｋＨｚ～１ＭＨｚの範囲、好ましくは１００～５００ｋＨｚの範囲の周波数の超音波を、液体伝導媒体を介して反応媒体に伝導する超音波トランスデューサーを含む。

前記装置は、好ましくは反応物媒体を充填するための少なくとも１つの開口部を備えた１つまたは複数の合成容器、特に９６、３８４、１５３６または３４５６個の反応チャンバを有するマイクロタイタープレート形式の合成プレート、合成シリンダーまたは合成フラスコまたは合成反応器を受容するための手段、および伝導液を含む超音波浴を有し、合成容器は、合成容器が超音波浴の伝導液で最低限の高さまで湿潤されるように超音波浴内に配置されてもよい。

有利には、最低限の高さは、超音波装置の超音波トランスデューサーから反応媒体への超音波の伝導が、音波がほぼ液体伝導媒体によってのみ生じるような様態で保証される高さを意味すると理解される。この目的のために、合成容器の外面の伝導媒体の表面の高さは、合成容器中の反応媒体のメニスカスの少なくとも半分の高さ、好ましくは半分から全高、好ましくは４分の３から全高の範囲の高さに相当する。

合成容器は、好ましくは合成プレートとして、例えばマイクロタイタープレートとして、特に例えばビーカーまたはシリンジの形態の並列および並設合成シリンダー、または合成フラスコ、例えば丸底フラスコもしくは反応器（例えばＨｏｃｈｓｔまたはＳｙｒｉｎｇｅによる）として設計される。特に、丸底フラスコまたは反応器としての合成容器の設計は、大規模の半自動／自動固相ペプチド合成に使用するために好ましく、これはフラスコ中１～５０ｌまたは反応器中１００～５００ｌの規模を取り扱うことができるためである。

一方で、マイクロタイタープレートまたは並列合成シリンダーの使用は、並行および自動固相ペプチド合成のために特に好ましいが、リトラグルチドおよびセマグルチドなどの個々のペプチドの大規模用途には、前述のものがより一般的に使用される。本発明は、希釈装置ならびに合成構成単位の供給および計量送達用の管系を一切有することなく動作する装置を提案する。別個の合成ペンが個々の合成構成単位に提供され、合成用の合成装置のホルダーに設けられており、装置のグリッパアームによって把持され、このホルダーから取り出され、計量分量の構成単位を合成容器、特に合成プレートの反応チャンバ内に位置する担体材料へと送達する。

したがって、試薬リザーバおよび投与装置が自己完結型ユニットを形成する。これにより、リンスプロセスがすべて排除され、合成構成単位の変更および試薬の配給の際に以前に必要とされた、それに伴う欠点が排除される。

並行合成のためにエリアが画定される（図２）。作業領域は、グリッパアームによって動かされる合成ペンが、作業領域のすべての点に接することができるような寸法である。好ましくは、最大１０個の合成ステーションが、特に対称的にこの作業領域に配置される。合成ステーションの寸法は、好ましくは標準的なマイクロタイタープレートに基づく。合成ステーションはモジュール設計のものであってもよく、溶媒の抽出のための連結部を備えた基部および合成プレートを保持するための露出されたフレームを含んでもよい。使用される合成プレートの区画に依存して、例えば６、１２、２４、４８、９６、３８４、１５３６または３４５６の個別の合成が１つの合成プレートで並行して実施されてもよい。より大きな合成規模では、合成シリンダーまたはシリンジ体が特別な受容器中で使用されてもよい。

本発明のさらなる特色によると、合成プレートの反応チャンバは、開放側が透過性材料、例えばフリットで閉じられてもよい。切断反応後に溶解されたペプチドを受容するための試料プレートがフレームの下に配置されてもよい。固相合成のために提案された装置を用いると、合成および担体材料である合成樹脂からの得られた化合物の切断の両方が、手作業による介入を伴うことなく可能である。

試料プレートは個々の保持チャンバを備えており、保持チャンバはそれらの配置および設計が合成プレートの反応チャンバのグリッドに対応している。このようにして、特定の化合物の担体材料または合成樹脂からのその切断後の、誤差のない容易な割り当てが保証される。したがって、反応生成物のハイスループットスクリーニングラインへの直接の移動が容易に可能である。

合成ペン（図３および図４）は、スクリュー閉鎖部によって閉鎖されてもよい中空円筒状本体（試薬リザーバ）および合成プレートの反応チャンバの自由開口部に適応され、出口開口部を備えるマウスピースを下端に有する。出口開口部は、弁ニードルと停止弁によって閉鎖されており、これらはピストンロッドおよび本体のピストンによって導かれ、それらの閉位置でピストンに作用する圧縮ばねによって解放可能に固定される。ピストンの下のシリンダー空間は、単一の合成構成単位および不活性ガスを保持するために使用され、試薬の計量送達は、マウスピースを反応チャンバの開放側を覆う透過性材料に単純に置くことによってもたらされる。それと同時に、弁ニードルを押し込むことによって弁座から停止弁が解放され、出口開口部が解放される。分配される試薬の量は、マウスピースが透過性材料に置かれる時間の長さによって決定される。マウスピースが持ち上げられるとき、出口開口部は再び自動的に閉じる。

合成ペンのさらなる設計では（図６）、試薬リザーバのスクリュー閉鎖部が、バヨネット閉鎖部を備えた移動可能蓋によって置き換えられる。特に押し込まれた蓋の中心に配置されることが好ましいピストンロッドは、合成ペン全体を通って投与シリンダー内に導かれる。投与シリンダーは、底部が例えば逆流防止弁で閉鎖される。蓋を押すことにより、規定量の試薬がピストンによって分配される。合成ペンに設置された戻し手段、例えばばねがピストンを戻す。それと同時にまたはその後、投与シリンダーが再び充填される。下端側のマウスピース内の好適な作動装置、例えば逆流防止弁により、溶液が能動送達によってのみ分配されうることが保証される。合成ペンのこの設計は、反応チャンバへの非接触分配を可能にする。閉鎖された試薬リザーバを有する合成ペンの閉鎖された設計により、高い試薬安定性が保証される。

有利には、本発明による装置の超音波浴は昇降可能である。これにより、反応容器を好ましくは所定の高さまで複数の工程で、または継続的に超音波浴に降下させることが可能になる。

さらに、超音波浴は様々な試験設備、特に様々な合成容器に使用可能である。

超音波浴はまた、有利には温度制御可能であり、特に２０～１００℃の制御された温度範囲、好ましくは２０～７０℃の範囲、特に４０～６０℃の範囲を達成するように設計される。特に、装置は、例えば高い超音波周波数による加熱による浴の温度を低下させるための冷却システムを有する。これは、５００ｋＨｚから、特に１０００ｋＨｚからの周波数を使用する場合に特に有利である。

さらに、本発明による装置の超音波浴またはその超音波発生器は、変動する周波数、特に少なくとも低周波数範囲（４０～７５ｋＨｚ）内の１つ、および高周波数範囲（１００～２０００ｋＨｚ、好ましくは１００～５００ｋＨｚ）内の１つを発生し、それらを液体浴に伝導するように設計される。この目的のために、様々な周波数が互いに交互に、または付加的に切り替え可能であると有利である。

好ましい実施形態では、超音波浴、またはむしろ超音波浴の超音波発生器は、公称電力が４０～１００Ｗの範囲、特に５０～７０Ｗの範囲内の必要な電力を備え、１００～３００Ｗの範囲、好ましくは１７０～２８０Ｗの範囲、大規模用途に対して２５０Ｗ～７００Ｗの範囲、特に５００～６００Ｗの範囲内のピークが達成される。

各合成構成単位に別個の合成ペンを使用し、合成プレートの反応チャンバの開放側を覆うことにより、コンタミネーションの危険性が顕著に低減され、クロスコンタミネーションが実質的に排除される。不十分なリンスプロセスによってしばしば生じる合成構成単位のキャリーオーバーは、もはや生じる可能性がない。

リンスプロセスの排除により、有機溶媒の消費が相当に低減するだけでなく、合成もまた何倍も加速される。

記載される実施形態は、個々の場合で別様に記載されない限り、有利には互いに組み合わせることができる。そうでなければ、本発明の実施形態は方法および装置に平等に適用される。

以下では、ほんの例示目的で機能する実用例および結果を用いて本発明を詳細に説明する。添付の図面は以下を示す。

ペプチドの合成のための本発明による装置の概略図である。 図１による装置の作業領域の平面図である。 本発明の好ましい実施形態における別個のフィード、投与および試薬貯蔵のための合成ペンの概略図である。 図３による合成ペンの縦断面である。 本発明によって形成された反応チャンバを有する合成プレートの図２のＡ－Ａ断面である。 本発明のさらなる好ましい実施形態における合成ペンの縦断面の概略図である。 本発明の好ましい実施形態による固相ペプチド合成のための方法のシーケンスの概略図である。 エンドモルフィンの合成に基づく、本発明による方法を用いたトリプトファンの安定性を表すグラフである。 本発明による方法を用いた、アシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）の安定性を表すグラフである。 先行技術の比較方法を使用した、アシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）の安定性を表すグラフである。 合成戦略を考慮に入れた、ＡＣＰペプチドの平均的な合成品質の比較を表すグラフである。 図１１による合成の品質を表すグラフである。 様々な可溶化継続時間のアミノ酸に対するストック溶液の試験を表すグラフである。 シングルカップリングとダブルカップリングの比較を表すグラフである。 シングルカップリングとダブルカップリング、さらにアミノ酸の過剰量の比較を表すグラフである。 様々な超音波周波数を使用したペプチドの平均的な合成品質の比較を表すグラフである。

図１に概略的に示される合成装置１は、実験室ピペットロボットに基づくものであり、ｘ、ｙおよびｚ軸に移動できるグリッパアーム２を有する。作業領域３には、合成容器、特に反応チャンバ９のグリッドおよび配置に関してそれ自体公知のマイクロタイタープレートに由来し、６、１２、２４、４８、９６、３８４、１５３６または３４５６グリッドの反応チャンバ９を有する合成プレート５が存在し、これにより合成の高度の並行化が達成される。合成プレート５は弁ブロック６に置かれ、使用される試薬およびリンス液を、吸引ポンプに連結された弁ブロック６によって反応チャンバ９から吸引して廃棄するための多孔質材料の膜２８を底部側に有する。

合成プレート５は、超音波浴５０、特に高さが調整可能であり、制御可能にオンオフを切り替えることができる浴内に、弁ブロック６および試料プレート２７と一緒に配置される。超音波浴５０は、その中に合成容器５が配置される液体伝導媒体を含む容器を有する。超音波浴５０の位置に依存して、反応媒体の合成容器５のメニスカスは、超音波浴５の伝導媒体の充填レベルの少なくとも半分まで、好ましくは少なくとも最大４分の３まで、特に完全に下にある。超音波浴５０は、伝導媒体を介して少なくとも２５ｋＨｚ～２ＭＨｚの範囲の周波数の超音波を伝導するように設計される。

合成装置１は、リンス剤供給ライン１０を介して対応するリンス剤リザーバに連結される、１つまたは複数のリンスコーム８をさらに備える。反応時間が経過し使用済み反応溶液が抜き出された後、合成構成単位がカップリングされた反応チャンバ９に位置する試料をリンスするために、必要とされるリンス剤を含むリンスコーム８がグリッパアーム２によって取り出され、合成プレート５の反応チャンバ９の上方に移動し、リンス液の計量送達を行う。リンス後、別のリンスコーム８が使用され、カップリングされた合成構成単位の一時的保護基を上述のように切断するために必要とされる溶液を供給する。インキュベーション時間の経過後、切断溶液が弁ブロック６を介して吸引ポンプ７を利用して抜き出され、試料が洗浄される。洗浄後、別の合成構成単位がカップリングされる新たな合成サイクルが開始する。

本発明によると、各合成構成単位に対して別個の合成ペン１１が提供され、ペンの中には閉鎖された空間内に試薬２０が置かれ、不活性ガス２１によって封止されてもよい。対応する合成構成単位を有する個々の合成ペン１１は、合成装置１のホルダー４に設けられ、グリッパアームホルダー３０で合成ペン１１を把持するグリッパアーム２によって合成プレート５の反応チャンバ９へと運ばれ、試薬の計量送達を行う。

本発明によって使用される合成ペン１１は、下端のマウスピース１４およびシリンダー空間を密閉するスクリュー閉鎖部１３を備えた中空円筒状本体１２からなる。マウスピース１４内には、閉位置でシール２９上に静置する弁ニードル１５および停止弁１６によって閉鎖された出口開口部が存在する。弁ニードル１５および停止弁１６は、ピストンロッド１７を介してピストン１８によって導かれる。停止弁１６に要求される閉鎖圧は、ピストン１８上に静置し、スクリュー閉鎖部１３の内部端面に対して支持される圧縮ばね１９によって発生される。ピストン１８の下の自由空間は、有利には不活性ガス２１で封止された適切な合成構成単位２０を提供するために使用される。このようにして、高度に反応性の試薬を不活性ガス雰囲気下で長期間にわたって安定に保つことができ、これにより合成生成物の品質が著しく改善する。

マウスピース１４が試料と直接接触する場合のクロスコンタミネーションを確実に回避するために、本発明によると、試料または固相２６、例えば合成樹脂が位置する反応チャンバ９は、開放側が透過性材料２５、例えばフリットで覆われる。合成構成単位２０を試料または合成樹脂にカップリングするために、合成ペン１１のマウスピース１４は反応チャンバを閉鎖している透過性材料２５の上に置かれ、それにより弁ニードル１５が圧縮ばね１９の閉鎖圧に抗して内向きに変位し、停止弁１６が解放される。この後、試薬溶液は自由に流出でき、流出する溶液の投与量は、マウスピース１４が材料２５上に置かれる期間によって決定される。

最後の一時的保護基が切断され試料が洗浄されると、固相２６にカップリングされた合成構成単位２０の切断が行われる。この目的のために、切断溶液がリンスコーム８によって試料に添加され、切断反応が開始される。インキュベーション時間の経過後、切断溶液に溶解された化合物が、本発明のさらなる特色によると弁ブロック６の下に配置され、抽出システムに連結される試料プレート２７の受容チャンバへと通るように弁ブロック６が切り替えられる。試料プレート２７は、それらの構築および設計に関して合成プレート５に一致する。溶解された化合物の固相２６から試料プレート２７への移動により、合成が終了する。

図６は、合成ペン１１のさらなる好ましい実施形態を示し、同じ参照符号は互いに一致する。試薬リザーバのスクリュー閉鎖部は、この設計ではバヨネット閉鎖部を備えた移動可能蓋１３ａによって置き換えられる。特に押し込まれた蓋の中心に配置されることが好ましいピストンロッド１７は、合成ペン全体を通って投与シリンダー３１へと導かれる。投与シリンダー３１は、例えば逆流防止弁３２によって下向きに閉鎖される。蓋１３ａを押すことにより、規定の分量の試薬がピストンによって分配される。合成ペン１１に設置された戻し手段、例えばばね３３、３３ａ、３３ｂによってピストンが戻される。それと同時または以後に、投与シリンダーが再充填３４される。下端側のマウスピース１４内の好適な調整手段、例えば逆流防止弁により、溶液が能動送達のみによって投与可能であることが保証される。合成ペン１１のこの設計は、反応チャンバへの非接触分配を可能にする。閉鎖された試薬リザーバを有する合成ペン１１の閉鎖された設計により、高い試薬安定性が保証される。

図７は、本発明による方法の概略図を示す。

本発明による方法は、本発明による装置によって実行されるまたは実行されてもよい固相ペプチド合成の一部である。この目的のために、アミノ酸のＮ末端は、保護基によって所望されない反応から保護される。このようにして保護されたアミノ酸は、そのＣ末端を介して固体担体材料に結合される（Ｉ）。次に、Ｎ末端が脱保護され（ＩＩ）、Ｎ末端が保護された別のアミノ酸が、ペプチド伸長によって先のアミノ酸のＮ末端に結合される（ＩＩＩ）。工程ＩＩ～ＩＩＩは、アミノ酸の所望の鎖長に到達するまで繰り返される。鎖長に到達すると、工程ＩＶでペプチドを担体材料から切断することによって反応が停止される。少なくとも最後に、ペプチドは好適な溶媒で洗浄される（工程Ｖ）。必要に応じて、固体担体材料、一般的には樹脂の予備膨張（工程Ｏ）が方法の最初に実行される。本発明によると、前記工程の少なくとも１つは、少なくとも一時的に超音波補助される（Ｘ）。これは、少なくとも一時的に、少なくとも２５ｋＨｚより大きい周波数の超音波（Ｘ）が、合成が行われる反応媒体に適用されることを意味すると理解される。容器を用いて反応媒体が導入される超音波浴は、伝導に特に良好に適合することが見出された。準備としてかつ合成時間に関して、超音波（Ｘ）が、好ましくは工程間でオフに切り替えられることなく複数の工程にわたって反応媒体に作用すると有利であることがさらに見出された。特に工程Ｉ～ＩＶに関して、本発明によって実行される超音波は、一桁の範囲の合成時間の短縮をもたらすことができる。

表１は、超音波作用無しの先行技術の方法と、５０～１５０ｋＨｚの範囲の超音波作用を用いる本発明による方法の、繰返し単位の個々の工程の合成時間の比較である。本発明による方法は、超音波無しの比較方法より１０倍速いことが明らかである。

ＮまたはＣ末端に結合した保護基に加え、アミノ酸は、反応性側鎖をブロックするためにさらなる保護基を有することができる。ここで、超音波および塩基または酸安定性などの、ペプチド合成中の化学的および物理的環境に関する必要条件に注意が払われなければならない。本発明による方法に使用するために好適な反応性側鎖のための保護基は、例えば酸不安性保護基、例えばＳ－２，４，６－トリメトキシベンジル（Ｔｍｏｂ）、トリフェニルメチル（Ｔｒｔ）、ｔｅｒｔ－ブチル（ｔＢｕ）、ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）および２，２，４，６，７－ペンタメチルジヒドロベンゾフラン－５－スルホニル（Ｐｂｆ）である。

本発明による方法を参照すると、例えば、アミノ酸が一文字コードとして示される、Ｆｍｏｃ－Ａ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｃ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｄ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｅ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｆ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｈ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｉ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｋ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｍ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｎ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｑ－Ｔｒｔ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｒ－Ｐｂｆ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｓ－ｔＢｕ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔ－ｔＢｕ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｖ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｗ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｙ－（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ（Ｔｍｏｂ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｎ（Ｔｍｏｂ）－ＯＨ（ＴＭＯＢ＝２，４，６－トリメトキシベンジル）の群から選択されるＦｍｏｃアミノ酸がペプチド伸長に特に好適である。

Ｆｍｏｃアミノ酸は、Ｌ体とＤ体の両方で存在してもよい。

これらを用いると、収率の損失を伴うことなく、合成時間を先行技術と比べて１０倍より高く短縮することができる。

表２は、エンドモルフィンの例を使用した、ピペットスキームに基づく好ましい実施形態における本発明による方法の合成の典型的な経過を示す。これは、基本的に上述の工程（Ｏ～Ｖ）を含むが、これらは以下の例でより詳細に、サブ工程とともに記載される。第１の工程は樹脂の予備膨張（Ｏ）であり、例えばＤＭＦ中２０％ピペリジンを用いた樹脂の脱保護、その後溶媒、例えばＤＭＦまたはＤＣＭによる洗浄、アミノ酸のカップリング（Ｉ）、再び溶媒、例えばＤＭＦまたはＤＣＭによる洗浄、アミノ酸の脱保護、および最後に溶媒、好ましくはＤＭＦまたはＤＣＭによる洗浄が続く。

ここで、サイクルのシーケンスは常に同じである。最後のアミノ酸（ＡＡ）がカップリングされると、脱保護され、洗浄され、溶媒、例えばＤＭＦまたはＤＣＭでリンスされる。個々のサイクル中、示される実施形態では、２５ｋＨｚ～２ＭＨｚの範囲の周波数の超音波が反応媒体に作用する。この例では、超音波（Ｘ）はまた、工程間で中断されない。代替的に、超音波は工程間または個々の工程中に中断されてもよい。しかし、４０ｋＨｚ～２ＭＨｚの範囲、特に５０ｋＨｚ～２００ｋＨｚの範囲の試験周波数では、継続的な超音波が特に有利であることが示された。

示される例では、予備膨張および溶媒、好ましくはジクロロメタン（ＤＣＭ）による最終リンスの工程は、超音波を用いずに実行される。しかし、これは単に好ましい実施形態であり、したがって超音波は実際すべての工程にわたって提供されてもよい。

本発明による方法は、いわゆる短期または長期合成として実行されてもよい。２つの違いを表３に例として示す。

短期合成は、基本的に脱保護の継続時間が半分であるという点で長期合成とは異なる。さらに、洗浄および脱保護工程の数が減少する。長期合成は、より長い合成時間を必要とするという事実にもかかわらず、先行技術と比較して１０分の１の短縮された合成時間も提供する。

超音波合成（単一の周波数）におけるダブルカップリングの合成スキーム

このサイクルは、配列全体が合成されるまで繰り返される（例としてＡＣＰ：Ｈ－ＶＱＡＡＩＤＹＩＮＧ－ＮＨ２→１０個のアミノ酸→１０サイクル）。

予備膨張および洗浄などの予備工程、ならびに最終洗浄工程はここに列挙されない。

超音波合成（単一の周波数）におけるシングルカップリングの合成スキーム

このサイクルは、配列全体が合成されるまで繰り返される（例としてＡＣＰ：Ｈ－ＶＱＡＡＩＤＹＩＮＧ－ＮＨ２→１０個のアミノ酸→１０サイクル）。

予備膨張および洗浄などの予備工程、ならびに最終洗浄工程はここに列挙されない。

超音波合成（複数の周波数、例えば１３２ｋＨｚおよび４７０ｋＨｚ）におけるシングルカップリングの合成スキーム

このサイクルは、配列全体が合成されるまで繰り返される（例：Ｈ－ＰＹＬＦＷＬＡＡＩ－ＮＨ２→９個のアミノ酸→９サイクル）。

予備膨張および洗浄などの予備工程、ならびに最終洗浄工程はここに列挙されない。

ＬＩＰＳ合成（トリプルカップリング）の合成スキーム

このサイクルは、配列全体が合成されるまで繰り返される（例：Ｈ－ＶＱＡＡＩＤＹＩＮＧ－ＮＨ２→１０個のアミノ酸→１０サイクル）。

ペンを配給するのに必要とされる時間は複数の要因に依存するため、ここでは概算値のみ示される。

キャッピング（アセチル化）無しのＡＢＩ合成（シングルカップリング）の合成スキーム

個々のモジュールは異なる長さを有する場合があり、長さはさらに合成される配列に依存するため、時間は概算値によってのみ示すことができる。加えて、内部センサーによって脱保護の間の脱保護されたＦｍｏｃ基の割合が測定される。

このサイクルは、配列全体が合成されるまで繰り返される（例：Ｈ－ＶＱＡＡＩＤＹＩＮＧ－ＮＨ２→１０個のアミノ酸→１０サイクル）。

モジュール内にはさらなる洗浄工程が含まれるため、これらは別個に示されない。

キャッピング（アセチル化）を用いたＡＢＩ合成（ダブルカップリング）の合成スキーム

個々のモジュールは異なる長さを有する場合があり、長さはさらに合成される配列に依存するため、時間は概算値によってのみ示すことができる。加えて、内部センサーによって脱保護の間の脱保護されたＦｍｏｃ基の割合が測定される。

このサイクルは、配列全体が合成されるまで繰り返される（例：Ｈ－ＶＱＡＡＩＤＹＩＮＧ－ＮＨ２→１０個のアミノ酸→１０サイクル）。

モジュール内にはさらなる洗浄工程が含まれる。これらは別個に示されない。

ＡＣＰ Ｈ－ＶＱＡＡＩＤＹＩＮＧ－ＮＨ２ Ｍ＝１０６３．２Ｄａ
合成規模：２５μｍｏｌ
合成樹脂：Ｋｎｏｒｒ Ａｍｉｄ樹脂ＬＳ １％ＤＶＢ
活性化剤：ＨＣＴＵ
塩基：ＤＩＰＥＡ
使用されるアミノ酸：

図１１は、合成戦略を考慮に入れたＡＣＰペプチドＨ－ＶＱＡＡＩＤＹＩＮＧ－ＮＨ_２の平均的な合成品質の比較である。
６６０－ＳＬ３ ＬＩＰＳ：マイクロタイタープレート（ＭＴＰ）中ＡＣＰ ＬＩＰＳロボット トリプルカップリング（標準プロトコール） 継続時間：２２．５時間
ＵＳＰＳ １３２ｋＨｚ ５０％出力：超音波中ＡＣＰ、１３２ｋＨｚ シングルカップリング（２バッチの平均） 継続時間：２．５時間
ＵＳＰＳ ４７０ｋＨｚ ５０％出力：超音波中ＡＣＰ、４７０ｋＨｚ シングルカップリング（２バッチの平均） 継続時間：２．５時間
ＵＳＰＳ １０００ｋＨｚ ６０％出力：超音波中ＡＣＰ、１０００ｋＨｚ シングルカップリング（２バッチの平均） 継続時間：２，５時間

周波数のレベルによって生成物の品質が向上することが分かる。

図１２は、図１１によるＨ－ＶＱＡＡＩＤＹＩＮＧ－ＮＨ_２の２５μｍｏｌの合成の品質を示すグラフである。

結果として、持続的な音波発生は生成物の品質を向上させ、周波数の増加もまた、生成物の品質を向上させると述べることができる。

図１３は、様々な可溶化継続時間のアミノ酸に対するストック溶液の試験を示す。

様々なストック溶液を用いて、１０００ｋＨｚの超音波を使用し、使用されるアミノ酸に対して様々な可溶化時間を用いてＡＣＰペプチドの合成を実行する。

使用されるアミノ酸の溶解時間が短いほど、生成物の品質が向上することが分かる。

図１４は、様々な周波数におけるカップリング数についてのＨ－ＶＱＡＡＩＤの収率および品質の比較を表すグラフである。

低周波数（１３２ｋＨｚ）では、ＬＣＭＳの品質はカップリング数の増加とともに向上することが分かる。

高周波数（４７０ｋＨｚ）では、ＬＣＭＳの品質に差はほとんどない。

しかし、周波数とは無関係に、収率はカップリング数の増加とともに増加する。

実験のために（図１５）、以前の試験とは異なるペプチドを選択する。配列はＰＹＬＦＷＬＡＡＩ－ＮＨ２である。

これもまた、合成するのが困難なペプチドである。

ＡＣＰ Ｈ－ＰＹＬＦＷＬＡＡＩ－ＮＨ２ Ｍ＝１０９２．６Ｄａ
合成規模：２５μｍｏｌ
合成樹脂：Ｋｎｏｒｒ Ａｍｉｄ樹脂ＬＳ １％ＤＶＢ
活性化剤：ＨＣＴＵ
塩基：ＤＩＰＥＡ
使用されるアミノ酸：

図１５は、シングルカップリングとダブルカップリングおよびこのペプチドに対するアミノ酸の過剰量の比較を示すグラフである。

同じ周波数では、合成品質に関して顕著な差はない。

しかし、カップリング数が増加すると、相対的な収率が明らかに増加する。

図１６は、様々な超音波周波数を使用したペプチドの平均的な合成品質の比較を表すグラフを示す。

様々な超音波周波数でシングルカップリングを使用して合成されたペプチドＰＹＬＦＷＬＡＡＩ－ＮＨ２の合成が示される。

超音波無し：
４０倍の過剰量のアミノ酸を用いた従来のＡＢＩ合成。
４倍の過剰量のアミノ酸を用いた従来のＡＢＩ合成。

従来のＡＢＩ合成では、アミノ酸の過剰量が少ないほどＬＣＭＳの品質が低くなる。

簡潔な超音波周波数 ４倍の過剰量のアミノ酸
周波数：４０ｋＨｚ、１３２ｋＨｚ、４７０ｋＨｚ

周波数の増加とともにＬＣＭＳの品質が向上する。

組み合わせた超音波周波数（脱保護、カップリング）、洗浄はより低い周波数のみ
組み合わせた周波数：４０ｋＨｚ＋４７０ｋＨｚおよび１３２ｋＨｚ＋４７０ｋＨｚ

周波数を切り替えることにより、合成品質が顕著に低下する。

超音波ｖｓ．従来のＡＢＩ合成
従来のＡＢＩ合成で良好～非常に良好なＬＣＭＳの品質を達成するためには、非常に高い過剰量のアミノ酸が必要である（４０倍）。

超音波を利用すると、４倍の過剰量のアミノ酸で十分である。ここで、使用される周波数が高いほど、ＬＣＭＳの品質は高くなる。

同等の結果は、
ＡＢＩ（４０Ｘ過剰量）および４７０ｋＨｚ（４Ｘの過剰量）
のパラメータを示した。

超音波合成を用いると、より短時間でより少ない溶媒およびアミノ酸の使用量で、少なくとも同等の、通常はより良好な結果を達成することができる。

図８～１０は、固相ペプチド合成によって合成されたペプチドの組成をそれぞれ示す。図８～９に示されるペプチドは、本発明による方法を用いて生成された一方、図１０はＴｅｔｒａｓを用いて先行技術によって合成されたペプチドに基づく。すべての方法は、本発明による装置を用いて実行した。

種々の方法から得られた生成物をＨＰＬＣによって分離し、個々のピークを質量分析およびＵＶ－ｖｉｓ分光分析によって割り当てた。
ＨＰＬＣ ＭＳシステム
ＤｉｏｎｅｘバイナリＨＰＬＣポンプ
泳動媒体Ａ：水と０．１％ギ酸
泳動媒体Ｂ：アセトニトリルと０．１％ギ酸
流量：０．５ｍｌ／分
最大４マイクロタイタープレート用のＧｉｌｓｏｎオートサンプラー
Ｄｉｏｎｅｘカラムオーブン
温度：３０℃
Ｄｉｏｎｅｘ ＵＶ検出器
２２０ｎｍで測定
Ｄｉｏｎｅｘ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｎｎｉｇａｎ Ｓｕｒｖｅｙｏｒ ＭＳＱシングル四重極質量分析計
イオン化モード：ＥＳＩ
試料温度：３５０℃
コーン電圧：５０Ｖ
ＨＰＬＣ分離カラム：Ｍｅｒｋ、クロモリスＷＰ３００、ＲＰ１８、１００－４．６ｍｍ
のパラメータを有する装置を使用した。

図８は、反応性側鎖をブロックするための上述の保護基が、本発明による方法において安定であることを示す。この目的のために、本発明の方法によるペプチド合成の結果を、最も一般的な保護基の３種について示す。

図８は、長期合成手順に基づく本発明の方法によって実行された、エンドモルフィンの合成の分析結果を示す。理論的考察では、合成中に酸化に敏感なトリプトファンが超音波によって酸化される可能性があると当初示唆された。しかし、これは確認されなかった。むしろ、合成は８３％の純度で良好であった。わずかな副生成物のみが特定された。

メチオニン、トリチルおよびＴｍｏｂ保護基もまた、個々の試験において本発明による方法の間に安定であることが示された。

図９は、長期合成を用いて本発明の方法によって生成された、配列ＶＱＡＡＩＤＹＩＮＧ－ＯＨを有するアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）の合成を示す。

保護基Ｆｍｏｃ－Ｑ（Ｔｍｏｂ）－ＯＨおよびＦｍｏｃ－Ｎ（Ｔｍｏｂ）－ＯＨを使用した。合成されたペプチドは、その強力な疎水性特性のために調製するのが基本的に非常に困難である。それにもかかわらず、本発明による方法によって純度８２％のペプチドを生成することができた。７９％の純度しか達成できなかった、図１０に示される先行技術のＴｅｔｒａｓによる方法と同じペプチドの合成と比較すると、本発明による方法は、とりわけ収率の向上を達成できることが分かる。さらに、本発明による方法によって生成されたペプチドの合成時間は２．５時間で終了したのに対し、先行技術による比較方法は２５時間を必要とした。したがって、本発明による方法は１０倍短い。

本発明による方法および本発明による装置の使用により、有利にはマイクロ波の支援を伴うことなく、先行技術による方法の合成時間の最大１０分の１まで合成時間が短縮された。これは、収率の低減と一致することは決してないと示すことができ、むしろ標準的な方法との直接比較では、特に本発明による装置を使用した場合、本発明による方法は、より高純度の標的ペプチドを生成したと示すことができた。

参照符号のリスト
１ 合成装置
２ グリッパアーム
３ 作業領域
４ ホルダー
５ 合成プレート
６ 弁ブロック
７ 吸引ポンプ
８ リンスコーム
９ 反応チャンバ
１０ リンス剤供給ライン
１１ 合成ペン
１２ 本体、中空シリンダー
１３、１３ａ 閉鎖部、スクリュー閉鎖部、バヨネット閉鎖部を備えた移動可能蓋
１４ マウスピース
１５ 弁ニードル
１６ 停止弁
１７ ピストンロッド
１８ ピストン
１９ 圧縮ばね
２０ 合成構成単位
２１ 不活性ガス
２３ 出口開口部
２５ 透過性材料／フリット
２６ 固相
２７ 試料プレート
２８ 膜
２９ シール
３０ グリッパアーム受容器
３１ 投与シリンダー
３２ 出口弁
３３ 戻しばね
３３ａ 戻しばね用締結部
３３ｂ 戻しばね、スクリューグラブ締結部
３４ シリンダー充填用空隙
３５ ユニオンナット
３６ 投与カニューレガイド
３７ 投与カニューレ
５０ 超音波浴
Ｏ 予備膨張
Ｉ 保護基によってＮ末端が保護されたアミノ酸を、アミノ酸のＣ末端を介して固体担体材料に結合させる
ＩＩ 保護基を切断する
ＩＩＩ 少なくとも１回のペプチド伸長を実施する
ＩＶ ペプチドを担体材料から切断することによって反応を停止する
Ｖ 洗浄する
Ｘ 超音波作用

Claims (19)

1. 固相ペプチド合成を実行するための方法であって、
   ａ）保護基によってＮ末端が保護されたアミノ酸を、前記アミノ酸のＣ末端を介して固体担体材料に結合させる工程、
   ｂ）前記保護基を切断する工程、
   ｃ）少なくとも１回のペプチド伸長を実施する工程、および
   ｄ）前記ペプチドを前記担体材料から切断することによって反応を停止する工程
   を含み、
   工程ａ）～ｄ）が液体反応媒体中で行われ、前記工程の少なくとも１つの間に、２５～２０００ｋＨｚの範囲の周波数の超音波が前記反応媒体に少なくとも断続的に作用する、方法。
2. 前記超音波が、４０より大きい、特に７５より大きい、好ましくは１００ｋＨｚより大きい、特に好ましくは１１０ｋＨｚより大きい範囲の周波数で前記反応媒体に作用することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. 前記超音波が、１０００ｋＨｚ以下、好ましくは５００ｋＨｚ以下の範囲の周波数で前記反応媒体に作用することを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記超音波が、外部の液体浴を介して前記反応媒体に伝導されることを特徴とする、請求項１～３の何れか１項に記載の方法。
5. 前記工程ｂ）後に行われる洗浄工程Ｗ_ｂ）、前記工程ｃ）後に行われる洗浄工程Ｗ_ｃ）、および／または前記工程ｄ）後に行われる洗浄工程Ｗ_ｄ）をさらに含み、超音波がまたこれらの工程の少なくとも１つの間に前記反応媒体に作用する、請求項１～４の何れか１項に記載の方法。
6. 前記アミノ酸が、塩基不安定性保護基、特に第二級アミンを用いて切断することができる保護基、特にフルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）によってＮ末端が保護されることを特徴とする、請求項１～５の何れか１項に記載の方法。
7. 前記アミノ酸が、側鎖を保護するための保護基、特にＳ－２，４，６－トリメトキシベンジル（Ｔｍｏｂ）、トリフェニルメチル（Ｔｒｔ）、ｔｅｒｔ－ブチル（ｔＢｕ）、ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、２，２，４，６，７－ペンタメチルジヒドロベンゾフラン－５－スルホニル（Ｐｂｆ）を含むことを特徴とする、請求項１～６の何れか１項に記載の方法。
8. 超音波が前記工程の何れか１工程で、特に前記工程ｃ）で前記反応媒体に作用することを特徴とする、請求項１～７の何れか１項に記載の方法。
9. 超音波が作用するすべての工程ａ）～ｄ）および／またはＷ_ｂ）、Ｗ_ｃ）およびＷ_ｄ）の間、前記反応媒体が中断されずにかつ／または同じ周波数で作用されることを特徴とする、請求項１～８の何れか１項に記載の方法。
10. 超音波が複数の工程で前記反応媒体に作用する場合、前記超音波の周波数が前記工程間で、特に反応工程ａ）～ｄ）および洗浄工程Ｗ_ｂ～ｄ）の間で変動することを特徴とする、請求項１～９の何れか１項に記載の方法。
11. 前記洗浄工程の少なくとも１つの間の前記周波数が２５～２０００ｋＨｚの範囲、好ましくは４０より大きい、特に７５より大きい、好ましくは１００ｋＨｚより大きい、さらに好ましくは１１０ｋＨｚより大きい範囲であることを特徴とする、請求項１～１０の何れか１項に記載の方法。
12. 前記超音波浴が、２０～１００℃、好ましくは２０～７０℃、さらに好ましくは４０～６０℃の温度範囲に制御されることを特徴とする、請求項１～１１の何れか１項に記載の方法。
13. 半自動／自動および／または並行して実行されることを特徴とする、請求項１～１２の何れか１項に記載の方法。
14. 前記工程ｄ）が投与工程、洗浄工程および濾過工程を含み、半自動実施の場合、前記投与工程が手作業で実施され、さらなる工程が自動実施で実施される、請求項１～１３の何れか１項に記載の方法。
15. 請求項１～１４の何れか１項に記載の方法を含む、自動並行固相ペプチド合成。
16. 固相ペプチド合成を実行するための装置（１）であって、請求項１～１４の何れか１項に記載の方法を実行するために設計された、装置。
17. 反応物媒体を充填するための少なくとも１つの開口部を備えた合成容器（５）、特に合成プレート、複数の合成シリンダー、反応フラスコまたは反応器を受容するための手段（４）、および液体を含む超音波浴（５０）を含み、前記合成容器（５）は、前記合成容器（５）が前記超音波浴（５０）の前記液体で最低限の高さまで湿潤されるように前記超音波浴（５０）内に配置され得る、請求項１６に記載の装置。
18. 前記超音波浴が、高さおよび／または温度が調整可能であるように構成されていることを特徴とする、請求項１６または１７に記載の装置。
19. 請求項１～１４の何れか１項に記載の方法によって生成されたペプチド。
    

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