JP2022516661A - 嚢胞性線維症を処置する方法 - Google Patents

嚢胞性線維症を処置する方法 Download PDF

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Abstract

カテーテルを使用して気管支動脈カテーテル法による送達によりウイルスベクターの集団を対象における複数の標的部位に投与する、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を使用して嚢胞性線維症（ＣＦ）を処置するための方法を含むがこれに限定されない、ベクターに関する方法および組成物が、本明細書に記載される。本明細書は、ＣＦ肺疾患の是正のためのいくつかの遺伝子治療戦略が研究されてきたが、安全で効率的なベクター系の開発はいまだ達成されていないという課題を解決する手段を提供する。

Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０１９年１月８日に出願した米国仮出願第６２／７８９，７９７号、２０１９年６月２４日に出願した米国仮出願第６２／８６５，７３１号、および２０１９年７月３日に出願した米国仮出願第６２／８７０，３５８号に基づく利益を合衆国法典第３５巻第１１９条（ｅ）項の下で主張しており、その各々の内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
技術分野
本発明は、嚢胞性線維症の処置のために治療用ベクター、例えば、これらに限定されないがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子、ビリオンおよびベクターなどを肺に投与するための、気管支動脈送達の使用に関する。
背景
遺伝子治療は、遺伝性障害を治癒させる可能性があることばかりでなく、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）などのウイスルを使用する後天性および変性疾患の長期非侵襲性処置を助長することも示されている。ＡＡＶ自体は、十分な複製のためにヘルパーウイルスを必要とする非病原体依存性パルボウイルスである。ＡＡＶは、その安全性および単純性のため、ウイルスベクターとして遺伝子治療に利用されている。ＡＡＶは、分裂細胞と非分裂細胞の両方に形質導入することができる幅広い宿主および細胞型指向性を有する。これまでに、１２のＡＡＶ血清型および１００を超えるバリアントが識別されている。異なるＡＡＶ血清型は、ｉｎ ｖｉｖｏにせよｉｎ ｖｉｔｒｏにせよ、異なる組織の細胞への異なる感染能力を有し得ること、ならびに感染力のこれらの差は、各ＡＡＶ血清型のカプシド表面に位置する特定の受容体および共受容体に関係している可能性が高いことまたは細胞内輸送経路自体に関係している可能性があることが、示されている。
それに基づいて、酵素療法の代替または補助として、疾患、例えば血友病を処置するための遺伝子治療法の実行可能性が調査されている（High K.A., et. al., (2016) Hum. Mol. Genet. Apr 15;25(R1):R36-41；Samelson-Jones B.J., et. al. (2018) Mol Ther Methods Clin Dev. 2018 Dec 31;12:184-201）。
嚢胞性線維症（ＣＦ）は、肺を徐々に破壊する気道の感染、炎症、リモデリングおよび閉塞を特徴とする疾患であり、最も多く見られる致死性遺伝性肺疾患である。ＣＦは、膵および肺機能不全に至る、水および電解質輸送の異常を特徴とする常染色体劣性障害である。ＣＦは、最も多く見られる重度の常染色体劣性障害のうちの１つであり、北米では５％保因頻度を有し、出生児２５００名中約１名が罹患する。
ＣＦは、ＡＴＰ加水分解およびリン酸化により制御されるアニオンチャネルをコードする嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）遺伝子の突然変異により引き起こされる劣性遺伝病である。ＣＦは、ヘテロ接合体が表現型的に正常であり、肺内の気道の内側を覆っている標的細胞をエアロゾル、局所的戦略または血管戦略によるベクター送達に利用できる可能性があるので、遺伝子治療の魅力的な候補である。
嚢胞性線維症は、治療方法が分かっていない。平均余命は、先進国世界では４２～５０歳の間である。肺の疾患は、嚢胞性線維症を有する人々の８０％における死因である。
以下のＣＦ疾患特異的治療には、以下のものが含まれる：経口用のＫＡＬＹＤＥＣＯ（登録商標）（イバカフトル）錠、最初の米国承認：２０１２年、上皮細胞表面でＣＦＴＲタンパク質を依然として産生する、より軽度の（およびより低頻度の）突然変異を対象にして；経口用のＯＲＫＡＭＢＩ（登録商標）（ルマカフトル／イバカフトル）錠、米国承認：２０１５年、最も多く見られる重度突然変異用を対象にしたＦ５０８ｄｅｌ突然変異の２つのコピー（Ｆ５０８ｄｅｌ／Ｆ５０８ｄｅｌ）を有するＣＦ患者の処置用；および経口用のＳＹＭＤＥＫＯ（商標）（テザカフトル／イバカフトル）錠、最初の米国承認：２０１８年、Ｋａｌｙｄｅｃｏによりカバーされない単一Ｆ５０８ｄｅｌヘテロ接合体および他の突然変異の処置を対象にして。
対症処置は、気道粘液の粘度を低減させるための噴霧用高張食塩水、ドルナーゼアルファおよびマンニトールドライパウダー；地域流行性Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ感染症を処置するための抗生物質（多くの場合、ネブライザー療法用）；気道開存性を向上させるための気管支拡張薬；分泌物を柔らかくするためのステロイド、毎日の胸部マッサージ、振動および連打を含む。
以上のことから、特に、最も多く見られる重度突然変異について、まだ対処されていない有意な医療ニーズがある。ＣＦの標的細胞集団への治療薬の送達には、いまだ大きな課題が残っている。したがって、当技術分野において、肺組織への野生型ＣＦＴＲ遺伝子の送達による、ＣＦ気道の塩基イオン輸送の欠陥を標的とする安全かつ効率的なベクター系の手法を使用する、ＣＦの処置のための方法が必要である。
High K.A., et. al., (2016) Hum. Mol. Genet. Apr 15;25(R1):R36-41 Samelson-Jones B.J., et. al. (2018) Mol Ther Methods Clin Dev. 2018 Dec 31;12:184-201
本明細書に記載される技術は、一般に、ＣＦの処置のために気管支動脈送達を使用してベクター、例えば、これらに限定されないがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子、ビリオンおよびベクターなどを投与する遺伝子治療法に関する。
したがって、例えば、逆方向末端反復（ＩＴＲ）、プロモーター、異種遺伝子、ポリＡテールを含有するヌクレオチド配列であって、嚢胞性線維症を処置するために使用するために他の制御因子エレメントを含有する可能性があるヌクレオチド配列を含む、ｒＡＡＶベクターを典型的な例として使用する、ウイルスベクターを投与するために使用されることになるカテーテルが、本明細書に記載される。
ＣＦは、肺を徐々に破壊する気道の感染、炎症、リモデリングおよび閉塞を特徴とする疾患である。肺の物理的および宿主免疫バリアは、気道への遺伝子移入成功への課題を提示する。ＣＦは、常染色体劣性遺伝する。ＣＦは、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）タンパク質の遺伝子の両方のコピーの突然変異の存在により引き起こされる。ＣＦＴＲは、ＣＦＴＲ遺伝子によりコードされる、脊椎動物における膜タンパク質およびクロライドチャネルである。ＣＦＴＲの単一の機能するコピーを有する者は、保因者であるが、他の点ではほぼ正常である。ＣＦＴＲは、汗、消化液および粘液の産生に関与する。ＣＦＴＲが機能性でない場合、通常は薄く、流動性である分泌物が、そうではなく、濃く、粘稠になる。この状態は、汗試験および遺伝子検査により診断される。世界の一部の地域では、出生時に乳児のスクリーニングが行われる。
ＣＦＴＲ遺伝子は、ヘテロ接合体が表現型的に正常であり、肺内の気道の内側を覆っている標的細胞がエアロゾルまたは他の局所的戦略によるベクター送達に利用できる可能性があるので、遺伝子治療の魅力的な候補である。ＣＦＴＲ遺伝子が１９８９年に最初にクローニングされて以来、ＣＦ肺疾患の是正のためのいくつかの遺伝子治療戦略が研究されてきた。しかし、安全で効率的なベクター系の開発は、いまだ大きな課題である。これは、一つには、外来粒子を排除するようにまたはその取込みを防止するように進化した複数の精巧な肺のバリアに起因する。ＣＦ肺における濃い分泌物ならびに慢性感染および炎症の二次的影響が、遺伝子移入に対するさらなるバリアとなる。
肺への嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）遺伝子の直接送達による、ＣＦを処置するための方法は、本明細書に記載の通りである。本発明の態様は、下記で説明される例示的利点を生じさせる、構築および使用におけるある特定の利益を教示する。
一部の実施形態では、標的化ウイルスベクターを含む医薬製剤が本明細書で開示され、例えば、治療用構築物は、（１）１２の天然に存在するＡＡＶカプシドのいずれか、それらの操作されたバリアントのいずれか、または任意の関連ディペンドウイルス、例えば、トリまたはイヌＡＡＶ、（２）ＣＦＴＲのｃＤＮＡ導入遺伝子またはそのバリアント、（３）最高発現に合わせたプロモーターおよびエンハンサーエレメント、ならびに（４）薬学的に許容される担体または賦形剤を含むことができる。
また、一部の実施形態では、本明細書で開示されるようなウイルスベクター、例えば、ｒＡＡＶベクター、ウイルスベクターゲノムをコードする核酸の嚢胞性線維症の処置における使用に関する。
本明細書に記載される技術の態様は、ここで概要が示され、ウイルスベクターは、５’から３’方向に、
５’ＩＴＲ、
プロモーター配列、
イントロン配列、
治療用導入遺伝子（例えば、野生型ＣＦＴＲ遺伝子）、
ポリＡ配列、および
３’ＩＴＲ
を含む。
したがって、一部の態様では、嚢胞性線維症（ＣＦ）を処置するための方法であって、対象における複数の標的部位にベクターの集団を投与するステップであって、ベクターが、治療用核酸を含有し、ベクターが、第１の細気管支群における第１の基底膜標的部位を標的とするために、カテーテルを第１の気管支動脈に留置し、ベクターの第１の用量をカテーテル内に投与すること、および第２の気管支動脈の範囲を定める細気管支群における基底膜細胞の第２のセットを標的とするために、同じまたは異なるカテーテルを第２の気管支動脈内に留置することを含む、気管支動脈カテーテル法による送達により投与される、ステップを含む方法が、本明細書で提供される。必要に応じて、全ての基底膜細胞への治療薬送達を達成するための第３または第４のバリアント気管支動脈内への第３またはさらには第４の注射を含む。
これらの方法および本明細書に記載される全てのそのような方法の一部の実施形態では、第１の用量は、第１の気管支動脈体積（血管枝を含む気管支血管血流量）に比例し、第２、第３または第４の用量は、総気管支動脈体積に比例する。これらの方法および本明細書に記載される全てのそのような方法の一部の実施形態では、ベクターの第１の用量は、第１の気管支動脈への送達により範囲を定められた細気管支の全てにおける基底／前駆細胞、クラブ細胞または繊毛細胞の基底膜標的部位を標的とするために、カテーテル内に投与される。
これらの方法および本明細書に記載される全てのそのような方法の一部の実施形態では、治療用核酸は、治療用嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）遺伝子である。
これらの方法および本明細書に記載される全てのそのような方法の一部の実施形態では、治療用核酸は、短縮型治療用嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）遺伝子である。
これらの方法および本明細書に記載される全てのそのような方法の一部の実施形態では、短縮型治療用嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）遺伝子は、ＣＦＴＲのＮテールプロセシング突然変異体である。
これらの方法および本明細書に記載される全てのそのような方法の一部の実施形態では、短縮型治療用嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）遺伝子は、ΔＦ５０８－ＣＦＴＲのプロセシングを特異的にレスキューすることができる。
これらの方法および本明細書に記載される全てのそのような方法の一部の実施形態では、ベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡ核酸ベクターである。
これらの方法および本明細書に記載される全てのそのような方法の一部の実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。
これらの方法および本明細書に記載される全てのそのような方法の一部の実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レンチウイルスベクター、または単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のいずれかから選択される。
これらの方法および本明細書に記載される全てのそのような方法の一部の実施形態では、ウイルスベクターは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）である。
これらの方法および本明細書に記載される全てのそのような方法の一部の実施形態では、治療用核酸は、遺伝子編集分子である。
これらの方法および本明細書に記載される全てのそのような方法の一部の実施形態では、遺伝子編集分子は、ヌクレアーゼ、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、ガイドＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、およびアクチベーターＲＮＡから選択される。
これらの方法および本明細書に記載される全てのそのような方法の一部の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子編集分子は、ｇＲＮＡまたはｇＤＮＡである。
これらの方法および本明細書に記載される全てのそのような方法の一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、病変を引き起こすＣＦＴＲ遺伝子を標的とすることになる。
これらの方法および本明細書に記載される全てのそのような方法の一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、表４から選択される。
これらの方法および本明細書に記載される全てのそのような方法の一部の実施形態では、配列特異的ヌクレアーゼは、核酸誘導型ヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはメガＴＡＬから選択される。
これらの方法および本明細書に記載される全てのそのような方法の一部の実施形態では、配列特異的ヌクレアーゼは、一塩基エディター、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼおよびＤＮＡ誘導型ヌクレアーゼから選択される、核酸誘導型ヌクレアーゼである。
これらの方法および本明細書に記載される全てのそのような方法の一部の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子編集分子は、アクチベーターＲＮＡである。
これらの方法および本明細書に記載される全てのそのような方法の一部の実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼである。
これらの方法および本明細書に記載される全てのそのような方法の一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、Ｃａｓヌクレアーゼである。
これらの方法および本明細書に記載される全てのそのような方法の一部の実施形態では、気管支動脈送達は、楔入圧測定値を得るために別個の肺動脈カテーテル法を伴う。
これらの方法および本明細書に記載される全てのそのような方法の一部の実施形態では、ウイルスベクターの集団は、１～５分にわたっての緩徐な注入により投与される。
これらの方法および本明細書に記載される全てのそのような方法の一部の実施形態では、圧力は、注入中に定期的な間隔または拍動間隔のどちらかで呼気流に印加される。
これらの方法および本明細書に記載される全てのそのような方法の一部の実施形態では、圧力は、最大１５秒間、２～５呼吸ごとに供給される。
これらの方法および本明細書に記載される全てのそのような方法の一部の実施形態では、圧力は、２～１５ｍｍＨｇである。
これらの方法および本明細書に記載される全てのそのような方法の一部の実施形態では、ベクターを運ぶ気管支動脈毛細血管と標的細胞とは、５～１０ミクロン近接している。
これらの方法および本明細書に記載される全てのそのような方法の一部の実施形態では、カプシドタンパク質およびＩＴＲのＡＡＶは、任意の天然もしくは人工血清型またはその改変体であり得る。タンパク質およびＩＴＲは、同じ血清型であっても、異なる血清型であってもよい。一実施形態では、カプシドタンパク質のＡＡＶの少なくとも１つは、ＡＡＶ血清型９である。
態様のいずれかについての別の実施形態では、全てのカプシドタンパク質は、ＡＡＶ９由来である。
これらの方法および本明細書に記載される全てのそのような方法の一部の実施形態では、透過処理剤の投与をさらに含む。
態様のいずれかについての一部の実施形態では、カプシドタンパク質の少なくとも１つは、ＡＡＶ血清型９である。
態様のいずれかについての一部の実施形態では、全てのカプシドタンパク質は、ＡＡＶ血清型９である。
態様のいずれかについての一部の実施形態では、他カプシドタンパク質の少なくとも１つは、異なる血清型由来である。
態様のいずれかについての一部の実施形態では、ＡＡＶ ＩＴＲは、少なくとも１つのカプシドタンパク質とは異なる血清型由来である。
態様のいずれかについての一部の実施形態では、ＡＡＶ ＩＴＲは、カプシドタンパク質と同じ血清型のうちの少なくとも１つ由来である。
本発明の態様の他の特徴および利点は、例として本発明の態様の原理を説明する、添付の図面と併用される、以下のより詳細な説明から明らかになる。
詳細な説明
治療用導入遺伝子を含有するウイルスベクターの集団を対象における複数の標的部位に投与するためにカテーテルを使用する、嚢胞性線維症（ＣＦ）を処置するための方法であって、第１の気管支動脈内の近位にカテーテルを留置し（標的部位は、前記気管支動脈により範囲を定められた細気管支群における基底／前駆細胞である）、次いで、カテーテルを第２の気管支動脈内に移動させて、第２の気管支動脈により範囲を定められた第２の細気管支群における基底／前駆細胞の第２の集団にウイルスベクターの第２の用量を送達する、気管支動脈カテーテル法による送達による方法が、本明細書に記載される。個体の解剖学的構造により、必要に応じて、第３もしくは第４の気管支動脈またはそれらの枝への第３または第４の注射によりベクター送達が達成される。
本明細書に記載される技術の一態様は、逆方向末端反復（ＩＴＲ）、プロモーター、異種遺伝子、ポリＡテールを含有するヌクレオチド配列であって、嚢胞性線維症を処置するために使用される他の制御因子エレメントを含有する可能性があるヌクレオチド配列を含む、ｒＡＡＶベクターに関する。核酸は、典型的にはＡＡＶカプシドに封入されている。一部の実施形態では、カプシドは、改変カプシドであり得る。カプシドタンパク質は、どちらのＩＴＲとも異なる任意のＡＡＶ血清型由来であり得る。本明細書に記載される技術は、一般に、ＣＦの処置のために気管支動脈送達を使用してベクター、例えば、これらに限定されないがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子、ビリオンおよびベクターなどを投与する、遺伝子治療法に関する。
したがって、例えば、逆方向末端反復（ＩＴＲ）、プロモーター、異種遺伝子、ポリＡテールを含有するヌクレオチド配列であって、嚢胞性線維症を処置するために使用するため他の制御因子エレメントを含有する可能性があるヌクレオチド配列を含む、ｒＡＡＶベクターを典型的な例として使用する、ウイルスベクターを投与するために使用されることになるカテーテルが、本明細書に記載される。
ＣＦは、肺を徐々に破壊する気道の感染、炎症、リモデリングおよび閉塞を特徴とする疾患である。肺の物理的および宿主免疫バリアは、気道への遺伝子移入成功への課題を提示する。ＣＦは、常染色体劣性遺伝する。ＣＦは、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）タンパク質の遺伝子の両方のコピーの突然変異の存在により引き起こされる。嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）は、ＣＦＴＲ遺伝子によりコードされる、脊椎動物における膜タンパク質およびクロライドチャネルである。ＣＦＴＲの単一の機能するコピーを有する者は、保因者であるが、他の点ではほぼ正常である。ＣＦＴＲは、汗、消化液および粘液の産生に関与する。ＣＦＴＲが機能性でない場合、通常は薄い分泌物が、そうではなく、濃くなる。この状態は、汗試験および遺伝子検査により診断される。世界の一部の地域では、出生時に乳児のスクリーニングが行われる。
ＣＦＴＲ遺伝子は、ヘテロ接合体が表現型的に正常であり、肺内の気道の内側を覆っている標的細胞がエアロゾルまたは他の局所的戦略によるベクター送達に利用できる可能性があるので、遺伝子治療の魅力的な候補である。ＣＦＴＲ遺伝子が１９８９年に最初にクローニングされて以来、ＣＦ肺疾患の是正のためのいくつかの遺伝子治療戦略が研究されてきた。しかし、安全で効率的なベクター系の開発は、いまだ大きな課題である。これは、一つには、外来粒子を排除するようにまたはその取込みを防止するように進化した複数の精巧な肺の気道バリアに起因する。ＣＦ肺における濃い分泌物と慢性感染および炎症の二次的影響とが、遺伝子移入に対するさらなるバリアとなる。
肺への嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）遺伝子の直接送達による、ＣＦを処置するための方法は、本明細書に記載の通りである。本発明の態様は、下記で説明される例示的利点を生じさせる、構築および使用におけるある特定の利益を教示する。
一部の実施形態では、本明細書で開示されるような標的化ウイルスベクター、例えば、ｒＡＡＶベクター、ｒＡＡＶをコードする核酸と薬学的に許容される担体とを含む医薬製剤が、本明細書で開示される。また、一部の実施形態では、本明細書で開示されるようなウイルスベクター、例えば、ｒＡＡＶベクター、ウイルスベクターゲノムをコードする核酸の、嚢胞性線維症の処置における使用に関する。
本明細書に記載される技術の態様は、ここで概要が示され、ｒＡＡＶゲノムは、５’から３’方向に、５’ＩＴＲ、プロモーター配列、イントロン配列、治療用導入遺伝子（例えば、野生型ＣＦＴＲ遺伝子）、ポリＡ配列、および３’ＩＴＲを含む。
ある実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ウイルスカプシドを含み、かつこのカプシド内にヌクレオチド配列を含有するカセットを含み、これが本明細書では「ｒＡＡＶベクター」と呼ばれる。ｒＡＡＶゲノムは、２つの逆方向末端反復（ＩＴＲ、例えば、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ）を含むがこれらに限定されない、複数のエレメントを含み、プロモーター、異種遺伝子およびポリＡテールを含む追加の要素が、ＩＴＲの間に位置する。さらなる実施形態では、ｍｉＲＮＡの結合のためのシード領域配列、またはｓｈＲＮＡ配列を含む、追加のエレメントが、ＩＴＲ間に存在することがある。パッケージングのためのｒＡＡＶベクターは、サイズ制限のため、ｒｅｐタンパク質などのゲノム内の酵素遺伝子も、ｖｐ１、２または３などの構造遺伝子も含まない。カプシドは、典型的にはトランスで調製される。同様に、適切なｒｅｐタンパク質がトランスで発現される。
Ｉ．定義
本明細書中で別段の定義がない限り、本出願に関連して使用される科学および専門用語は、本開示がする技術分野の当業者により一般に理解されている意味を有するものとする。本発明は、本明細書に記載され、それ自体が変わることもある、特定の方法論、プロトコールおよび試薬などに限定されないことを理解されたい。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明することを目的にしたものに過ぎず、特許請求の範囲によりもっぱら定義される本発明の範囲を限定することを意図したものではない。免疫学および分子生物学における一般用語の定義は、The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 20th Edition, published by Merck Sharp & Dohme Corp., 2018 (ISBN 0911910190, 978-0911910421)；Robert S. Porter et al.(eds.), The Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine, published by Blackwell Science Ltd., 1999-2012 (ISBN 9783527600908)；およびRobert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)；Immunology by werner Luttmann, published by Elsevier, 2006；Janeway's Immunobiology, Kenneth Murphy, Allan Mowat, Casey weaver (eds.), W. W. Norton & Company, 2016 (ISBN 0815345054, 978-0815345053)；Lewin's Genes XI, published by Jones & Bartlett Publishers, 2014 (ISBN-1449659055)；Michael Richard Green and Joseph Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (2012) (ISBN 1936113414)；Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (2012) (ISBN 044460149X)；Laboratory Methods in Enzymology: DNA, Jon Lorsch (ed.) Elsevier, 2013 (ISBN 0124199542)；Current Protocols in Molecular Biology (CPMB), Frederick M. Ausubel (ed.), John Wiley and Sons, 2014 (ISBN 047150338X, 9780471503385)、 Current Protocols in Protein Science (CPPS), John E. Coligan (ed.), John Wiley and Sons, Inc., 2005；およびCurrent Protocols in Immunology (CPI) (John E. Coligan, ADA M Kruisbeek, David H Margulies, Ethan M Shevach, Warren Strobe, (eds.)John Wiley and Sons, Inc., 2003 (ISBN 0471142735, 9780471142737)において見出すことができ、その内容は、全て、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。
以下の用語は、本明細書中での説明および添付の特許請求の範囲に使用される：
本発明を説明する文脈で（特に、後続の特許請求の範囲の文脈で）使用される用語「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」および同様の指示語は、本明細書中で別段の指示がない限り、または文脈による明確な否定がない限り、単数形と複数形の両方を網羅すると解釈されるものとする。さらに、識別される要素についての序数標識－例えば、「第１（の）」、「第２（の）」、「第３（の）」など－は、要素間を区別するために使用され、別段の具体的な記述がない限り、そのような要素の必要数も限定数も示さず、または含意せず、そのような要素の特定の位置も順序も示さない。本明細書に記載される全ての方法は、本明細書中で別段の指示がない限り、または文脈による別段の明確な否定がない限り、任意の適切な順序で行うことができる。本明細書で提供される任意のおよび全ての例、または例示的な言葉（例えば、「などの」）の使用は、本発明をよりよく説明することを目的とするものに過ぎず、別様に請求項に記載される本発明の範囲に制限を課さない。本発明の実施に不可欠ないずれかの請求項不記載要素を示すと解釈すべきいかなる言葉も本明細書には存在しない。
さらに、用語「約」は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の長さ、用量、時間、温度およびこれらに類するものの量などの、測定可能な値を指すときに本明細書で使用される場合、明記されている量の±２０％、±１０％、±５％、±１％、±０．５％、またはさらには±０．１％の変動量を包含するように意図されている。
また、本明細書で使用される場合、「および／または」は、関連する列挙されている項目の１つまたは複数についての任意のおよび全ての可能な組合せはもちろん、選択的に（「または」）解釈される場合には組合せの欠如も指し、それらを包含する。
本明細書で使用される場合、移行句「から本質的になること」は、請求項の範囲を、請求されている発明の、請求項に列挙される指定材料またはステップ、「ならびに基本的および新規特徴に実質的な影響を与えないもの」を包含するように解釈すべきであることを意味する。例えば、In re Herz, 537 F.2d 549, 551-52, 190 USPQ 461,463 (CCPA 1976)（強調は原文通り）を参照されたく、MPEP § 2111.03も参照されたい。したがって、用語「から本質的になること」は、本発明の請求項で使用される場合、「含むこと」と同意義であると解釈されるように意図されていない。文脈による別段の指示がない限り、本明細書に記載される本発明の様々な特徴を任意の組合せで使用することができることが、特に意図されている。
さらに、本発明は、本発明の一部の実施形態では、本明細書で示される任意の特徴および特徴の組合せを除外または割愛することができることも企図している。
さらに例を挙げて説明すると、例えば、本明細書が、特定のアミノ酸をＡ、Ｇ、Ｉ、Ｌおよび／またはＶから選択することができることを示す場合、この言葉は、アミノ酸を、これらのアミノ酸の任意のサブセット、例えば、Ａ、Ｇ、ＩまたはＬ；Ａ、Ｇ、ＩまたはＶ；ＡまたはＧ；Ｌのみなどから、このような部分的組合せ各々が本明細書で明確に示されている場合と同様に、選択することができることも示す。さらに、そのような言葉は、指定されたアミノ酸の１つまたは複数が（例えば、否定的条件により）権利放棄され得ることも示す。例えば、特定の実施形態では、可能性のあるそのような権利放棄各々が本明細書に明確に示されている場合と同様に、アミノ酸は、ＡでもＧでもＩでもない；Ａでない；ＧでもＶでもない；など。
用語「パルボウイルス」は、本明細書で使用される場合、自己複製パルボウイルスおよびディペンドウイルスを含む、ｆａｍｉｌｙ Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅを包含する。自律パルボウイルスは、ｇｅｎｅｒａ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ、Ｅｒｙｔｈｒｏｖｉｒｕｓ、Ｄｅｎｓｏｖｉｒｕｓ、ＩｔｅｒａｖｉｒｕｓおよびＣｏｎｔｒａｖｉｒｕｓのメンバーを含む。例示的な自律パルボウイルスとしては、マウス微小ウイルス、ウシパルボウイルス、イヌパルボウイルス、ニワトリパルボウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ネコパルボウイルス、ガチョウパルボウイルス、Ｈ１パルボウイルス、バリケンパルボウイルス、Ｂ１９ウイルス、および現在公知のまたは将来発見される任意の他の自律パルボウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。他の自律パルボウイルスは、当業者に公知である。例えば、BERNARD N. FIELDS et al., VIROLOGY, volume 2, chapter 69 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers)を参照されたい。
本明細書で使用される場合、用語「アデノ随伴ウイルス」（ＡＡＶ）は、ＡＡＶ １型、ＡＡＶ ２型、ＡＡＶ ３型（３Ａおよび３Ｂ型を含む）、ＡＡＶ ４型、ＡＡＶ ５型、ＡＡＶ ６型、ＡＡＶ ７型、ＡＡＶ ８型、ＡＡＶ ９型、ＡＡＶ １０型、ＡＡＶ １１型、ＡＡＶ １２型、ＡＡＶ １３型、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、および現在公知のまたは将来発見される任意の他のＡＡＶを含むが、これらに限定されない。例えば、BERNARD N. FIELDS et al., VIROLOGY, volume 2, chapter 69 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers)を参照されたい。いくつかの比較的新しいＡＡＶ血清型およびクレードが識別されている（例えば、Gao et al., (2004) J. Virology 78:6381-6388；Moris et al., (2004) Virology 33-:375- 383を参照されたい）。血清型の混合物を含む、キメラ、ハイブリッド、モザイクまたは合理的ハプロイドを使用することもできる。
ＡＡＶおよび自律パルボウイルスの様々な血清型のゲノム配列、ならびに天然逆方向末端反復（ＩＴＲ）、Ｒｅｐタンパク質およびカプシドサブユニットの配列は、当技術分野において公知である。そのような配列は、文献において、またはＧｅｎＢａｎｋなどの公開データベースにおいて見出すことができる。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００２０７７、ＮＣ＿００１４０１、ＮＣ＿００１７２９、ＮＣ＿００１８６３、ＮＣ＿００１８２９、ＮＣ＿００１８６２、ＮＣ＿０００８８３、ＮＣ＿００１７０１、ＮＣ＿００１５１０、ＮＣ＿００６１５２、ＮＣ＿００６２６１、ＡＦ０６３４９７、Ｕ８９７９０、ＡＦ０４３３０３、ＡＦ０２８７０５、ＡＦ０２８７０４、Ｊ０２２７５、Ｊ０１９０１、Ｊ０２２７５、Ｘ０１４５７、ＡＦ２８８０６１、ＡＨ００９９６２、ＡＹ０２８２２６、ＡＹ０２８２２３、ＮＣ＿００１３５８、ＮＣ＿００１５４０、ＡＦ５１３８５１、ＡＦ５１３８５２、ＡＹ５３０５７９を参照されたく、これらの開示は、パルボウイルスおよびＡＡＶの核酸およびアミノ酸配列の教示について参照により本明細書に組み込まれる。例えば、Srivistava et al., (1983) J Virology 45:555；Chiarini et al., (1998) J. Virology 71:6823；Chiarini et al., (1999) J. Virology 73:1309；Bantel-Schaal et al., (1999) J. Virology 73:939；Xiao et al., (1999) J. Virology 73:3994；Muramatsu et al., (1996) Virology 221:208；Shade et al., (1986) J. Viral.58:921；Gao et al., (2002) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99:11854；Morris et al., (2004) Virology 33-:375- 383；国際特許公開ＷＯ００／２８０６１、同ＷＯ９９／６１６０１、同ＷＯ９８／１１２４４；および米国特許第６，１５６，３０３号も参照されたく、これらの開示は、パルボウイルスおよびＡＡＶの核酸およびアミノ酸配列の教示について参照により本明細書に組み込まれる。
自律パルボウイルスおよびＡＡＶのカプシド構造は、より詳細にBERNARD N. FIELDS et al., VIROLOGY, volume 2, chapters 69 & 70 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers)に記載されている。ＡＡＶ２（Xie et al., (2002) Proc. Nat. Acad.Sci.99:10405-10）、ＡＡＶ４（Padron et al., (2005) J. Viral. 79: 5047-58）、ＡＡＶ５（Walters et al., (2004) J. Viral.78: 3361-71）およびＣＰＶ（Xie et al., (1996) J. Mal.Biol.6:497-520およびTsao et al., (1991) Science 251: 1456-64）の結晶構造の記載も参照されたい。
用語「指向性」は、本明細書で使用される場合、ある特定の細胞または組織へのウイルスの優先的侵入、必要に応じて、その後の、細胞内のウイルスゲノムにより保有される配列の発現（例えば、転写および必要に応じて翻訳）、例えば、組換えウイルスウイルスについて、目的の異種核酸の発現を指す。
本明細書で使用される場合、「全身指向性」および「全身形質導入」（および同等の用語）は、本発明のウイルスカプシドまたはウイルスベクターが、全身（例えば、脳、肺、骨格筋、心臓、肝臓、腎臓および／または膵臓）の組織に対する指向性を示すことおよび／またはそのような全身の組織に形質導入することを示す。本発明の実施形態では、中枢神経系（例えば、脳、神経細胞など）の全身形質導入が観察される。他の実施形態では、心筋組織の全身形質導入が達成される。
本明細書で使用される場合、「選択的指向性」または「特異的指向性」は、ある特定の標的細胞および／もしくはある特定の組織へのウイルスベクターの送達、ならびに／またはある特定の標的細胞および／もしくはある特定の組織に対する特異的形質導入を意味する。
本発明の一部の実施形態では、本発明のカプシドを含むＡＡＶ粒子は、ある特定の３０の組織および／または細胞に対する効率的形質導入ならびにある特定の組織／細胞への非常に低い形質導入レベル（例えば、形質導入低減）（この形質導入は望ましくない）という複数の表現型を実証することができる。
本明細書で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、別段の指示がない限り、ペプチドとタンパク質との両方を包含する。
本明細書で使用される場合、用語「気管支動脈送達」は、気管支動脈内へのカテーテルの挿入を指す。気管支動脈は、呼吸細気管支に至るまでの気道（および気道上皮）の唯一の血管供給である。
「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチド塩基の配列であり、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド配列（天然に存在するヌクレオチドと天然に存在しないヌクレオチドの両方を含む）であり得るが、代表的実施形態では、一本鎖または二本鎖どちらかのＤＮＡ配列である。
「キメラ核酸」は、融合ポリペプチドをコードするように共有結合で一緒に連結されている２つまたはそれより多くの核酸配列を含む。核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡであってもよく、またはそれらのハイブリッドであってもよい。
用語「融合ポリペプチド」は、典型的にはペプチド結合により、共有結合で一緒に連結されている２つまたはそれより多くのポリペプチドを含む。
本明細書で使用される場合、「単離された」ポリヌクレオチド（例えば、「単離されたＤＮＡ」または「単離されたＲＮＡ」）は、天然に存在する生物またはウイルスの他の成分、例えば、ポリヌクレオチドを伴って見出されることが多い細胞もしくはウイルス構造成分または他のポリペプチドもしくは核酸の少なくとも一部から少なくとも部分的に分離されたポリヌクレオチドを意味する。代表的実施形態では、「単離された」ヌクレオチドは、出発材料と比較して少なくとも約１０倍、１００倍、１０００倍、１０，０００倍またはそれより高度に濃縮されている。
同様に、「単離された」ポリペプチドは、天然に存在する生物またはウイルスの他の成分、例えば、ポリペプチドを伴って見出されることが多い細胞もしくはウイルス構造成分または他のポリペプチドもしくは核酸の少なくとも一部から少なくとも部分的に分離されているポリペプチドを意味する。代表的実施形態では、「単離された」ポリペプチドは、出発材料と比較して少なくとも約１０倍、１００倍、１０００倍、１０，０００倍またはそれより高度に濃縮されている。
「単離された細胞」は、その天然の状態で自体が通常は伴う他の成分から分離されている細胞を指す。例えば、単離された細胞は、培養培地中の細胞および／または本発明の薬学的に許容される担体中の細胞であり得る。したがって、単離された細胞を対象に送達および／または導入することができる。一部の実施形態では、単離された細胞は、対象から除去され、ｅｘ ｖｉｖｏで本明細書に記載されるように操作され、次いで対象に戻される細胞である。
本明細書で使用される場合、ウイルスベクターまたはウイルス粒子もしくはウイルス粒子の集団を「単離する」または「精製する」（または文法的等価表現）とは、ウイルスベクターまたはウイルス粒子もしくはウイルス粒子の集団が、出発材料中の他の成分の少なくとも一部から少なくとも部分的に分離されることを意味する。代表的実施形態では、「単離された」または「精製された」ウイルスベクターまたはウイルス粒子もしくはウイルス粒子の集団は、出発材料と比較して少なくとも約１０倍、１００倍、１０００倍、１０，０００倍またはそれより高度に濃縮されている。
別段の指示がない限り、「効率的形質導入」または「効率的指向性」または同様の用語は、適切な対照を参照することにより決定され得る（例えば、対照の形質導入または指向性の、それぞれ、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、５００％またはそれを超える）。特定の実施態様では、ウイルスベクターは、神経細胞および心筋細胞に効率的に形質導入するか、または神経細胞および心筋細胞に対する効率的指向性を有する。適切な対照は、所望の指向性および／または形質導入プロファイルを含む、様々な因子に依存することになる。
「治療用ポリペプチド」は、細胞または対象におけるタンパク質の非存在もしくは欠損に起因する症状を緩和すること、低減すること、予防すること、遅延させることおよび／もしくは安定させることができるポリペプチドであり、ならびに／または別様に対象に利益、例えば、疾患の症状を低減するもしくは消失させるための酵素置換、または移植片生着性の向上、または免疫応答の導入をもたらすポリペプチドである。
用語「処置する」、「処置すること」または「の処置」（およびこれらの文法的変化形）とは、対象の状態の重症度を低減させる、少なくとも部分的に改善するもしくは安定させること、および／または少なくとも１つの臨床症状のある程度の緩和、軽減、減少もしくは安定化が達成されること、および／または疾患もしくは障害の進行の遅延が生じることを意味する。
用語「予防する」、「予防すること」および「予防」（およびこれらの文法的変化形）は、本発明の方法の非存在下で起こることと比較して、対象における疾患、障害および／もしくは臨床症状の発症の予防および／もしくは遅延、ならびに／または疾患、障害および／もしくは臨床症状の発症の重症度の低減を指す。予防は、完全なもの、例えば、疾患、障害および／または臨床症状の完全非存在であることがある。予防は、対象における疾患、障害および／もしくは臨床症状の発生、ならびに／または発症の重症度が、本発明の非存在下で起こることより実質的に少なく／低くなるような、部分的なものであり得る。
「処置有効」量は、本明細書で使用される場合、対象に何らかの改善または利益をもたらすのに十分である量である。別の言い方をすれば、「処置有効」量は、対象における少なくとも１つの臨床症状のある程度の緩和、軽減、減少または安定化をもたらすことになる量である。何らかの利益が対象にもたらされるのであれば、治療効果が、完全である必要も治癒的である必要もないことは、当業者には理解されるであろう。
「予防有効」量は、本明細書で使用される場合、本発明の方法の非存在下で起こることと比較して、対象における疾患、障害および／もしくは臨床症状の発症を予防するおよび／もしくは遅延させるのにならびに／または対象における疾患、障害および／もしくは臨床症状の発症の重症度を低減させるおよび／もしくは遅延させるのに十分である量である。何らかの予防的利益が対象にもたらされるのであれば、予防のレベルが完全である必要がないことは、当業者には理解されるであろう。
用語「異種核酸配列」および「異種核酸分子」は、本明細書では同義的に使用され、ウイルスに天然に存在しない核酸配列を指す。一般に、異種核酸分子または異種核酸配列は、目的の（例えば、細胞および／または対象への送達のための）ポリペプチドおよび／または非翻訳ＲＮＡ、例えばＣＦＴＲをコードするオープンリーディングフレームを含む。
本明細書で使用される場合、用語「ウイルスベクター（virus vector）」、「ウイルス（の）ベクター（viral vector）」、「ベクター」または「遺伝子送達ベクター」は、ウイルスカプシド（例えば、ＡＡＶ）含む製造構築物であって、ウイルスカプシドが、核酸送達ビヒクルとして機能し、エフェクターＤＮＡの発現に必要なエレメント（例えば、数ある中でも特に、ＩＴＲ、プロモーター、イントロン、ｃＤＮＡ、ポリＡテール）のパッケージングされたカセットを含有し、ベクターを構成する製造構築物を指す。あるいは、一部の文脈では、用語「ベクター」は、単独のベクターゲノム／ｖＤＮＡを指すために使用されることもある。
「ｒＡＡＶベクターゲノム」または「ｒＡＡＶゲノム」は、１つまたは複数の異種核酸配列を含むＡＡＶゲノム（すなわち、ｖＤＮＡ）である。ｒＡＡＶベクターは、ウイルスを生成するためにシスでの逆方向末端反復（ＴＲ）のみを一般に必要とする。他の全てのウイルス配列は重要でないためトランスに供給され得る（Muzyczka, (1992) Curr. Topics Microbial. Immunol.158:97）。典型的に、ｒＡＡＶベクターゲノムは、ベクターによって効率的にパッケージングされ得る導入遺伝子のサイズを最大にするために１つまたは複数のＴＲ配列のみを保持することになる。構造および非構造タンパク質コード配列は、トランスに（例えば、プラスミドなどのベクターから、または配列をパッケージング細胞に安定に組み込むことにより）提供され得る。本発明の実施形態では、ｒＡＡＶベクターゲノムは、少なくとも１つのＩＴＲ配列（例えば、ＡＡＶ ＴＲ配列）、必要に応じて、２つのＩＴＲ（例えば、２つのＡＡＶ ＴＲ）を含み、これらのＩＴＲは、典型的には、ベクターゲノムの５’および３’末端にあり、異種核酸に隣接するであろうが、異種核酸と連続している必要はない。ＴＲは、互いに同じであってもよく、または異なっていてもよい。
用語「末端反復」または「ＴＲ」は、ヘアピン構造を形成する任意のウイルス末端反復または合成配列を含み、逆方向末端反復（すなわち、所望の機能、例えば、複製、ウイルスパッケージング、組込みおよび／またはプロウイルスレスキュー、ならびにこれらの類する機能を媒介する、ＩＴＲ）として機能する。ＴＲは、ＡＡＶ ＴＲであることもあり、または非ＡＡＶ ＴＲであることもある。例えば、非ＡＡＶ ＴＲ配列、例えば、他のパルボウイルス（例えば、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）、マウスパルボウイルス（ＭＶＭ）、ヒトパルボウイルスＢ－１９）のもの、または任意の他の適切なウイルス配列（例えば、ＳＶ４０複製基点としての役割を果たすＳＶ４０ヘアピン）を、ＴＲとして使用することができ、このＴＲを短縮化、置換、欠失、挿入および／または付加によりさらに改変することができる。さらに、ＴＲは、Ｓａｍｕｌｓｋｉらの米国特許第５，４７８，７４５号に記載されているような「二重Ｄ配列」などの、部分的または完全合成ＴＲであり得る。
「ＡＡＶ逆方向末端反復」または「ＡＡＶ ＩＴＲ」を含む「ＡＡＶ末端反復」または「ＡＡＶ ＴＲ」は、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２または現在公知のもしくは将来発見される任意の他のＡＡＶを含むが、それらに限定されないいずれのＡＡＶからのものであってもよい。２つのＩＴＲは、同じ血清型からのものであってもよく、または異なる血清型からのものであってもよい。ＡＡＶ末端反復は、末端反復が、所望の機能、例えば、複製、ウイルスパッケージング、組込みおよび／またはプロウイルスレスキュー、ならびにこれらに類する機能を媒介するのであれば、天然末端反復配列を有する必要がない（例えば、天然ＡＡＶ ＴＲまたはＡＡＶ ＩＴＲ配列が、挿入、欠失、短縮化および／またはミスセンス突然変異により変更されていてもよい）。
ＡＡＶタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３は、一緒に相互作用して正二十面体対称のＡＡＶカプシドを形成するカプシドタンパク質である。ＶＰ１．５は、米国特許出願公開第２０１４／００３７５８５号に記載されているＡＡＶタンパク質である。しかし、カプシドのタンパク質は、改変されていてもよく、いずれのＡＡＶ血清型からのものであってもよい。一実施形態では、カプシドタンパク質は、少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲと同じ血清型由来である。別の実施形態では、少なくとも１つのＩＴＲとカプシドタンパク質とは、異なる血清型からである。
本発明のウイルスベクターは、さらに、国際特許公開ＷＯ００／２８００４およびChao et al., (2000) Molecular Therapy 2:619に記載されているような「標的化された」ウイルスベクター（例えば、方向付けられた指向性を有する）および／または「ハイブリッド」プロウイルス（すなわち、ウイルスＴＲおよびウイルスカプシドが異なるパルボウイルス由来である）であることができる。
本発明のウイルスベクターは、さらに、国際特許公開ＷＯ０１／９２５５１（この開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているような二重鎖型パルボウイルス粒子であることができる。したがって、一部の実施形態では、二本鎖（二重鎖）ゲノムを本発明のウイルスカプシドにパッケージングすることができる。
さらに、ウイルスカプシドまたはゲノムエレメントは、挿入、欠失および／または置換を含む、他の改変を含有することができる。
「キメラ」カプシドタンパク質は、本明細書で使用される場合、野生型と比較してカプシドタンパク質のアミノ酸配列中の１つまたは複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０など）のアミノ酸残基の置換、ならびに野生型と比較してアミノ酸配列中の１つまたは複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０など）のアミノ酸残基の挿入および／または欠失により改変されている、ＡＡＶカプシドタンパク質を意味する。一部の実施形態では、１つのＡＡＶ血清型からの完全または部分的ドメイン、機能性領域、エピトープなどにより、異なるＡＡＶ血清型の対応する野生型ドメイン、機能性領域、エピトープなどを任意の組合せで置き換えて、本発明のキメラカプシドタンパク質を産生することができる。キメラカプシドタンパク質の産生は、当技術分野において周知のプロトコールに従って行うことができ、有意な数のキメラカプシドタンパク質が、本明細書ばかりでなく文献にも記載されており、それらを本発明のカプシドに含めることができる。
本明細書で使用される場合、用語「ハプロイドＡＡＶ」は、本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ１８／２２７２５に記載されているようなＡＡＶを意味するものとする。
用語「ハイブリッド」ＡＡＶベクターまたはパルボウイルスは、ウイルスＴＲまたはＩＴＲとウイルスカプシドとが異なるパルボウイルス由来である、ｒＡＡＶベクターを指す。ハイブリッドベクターは、国際特許公開ＷＯ００／２８００４およびChao et al., (2000) Molecular Therapy 2:619に記載されている。例えば、ハイブリッドＡＡＶベクターは、アデノウイルスの複製およびパッケージングに十分なアデノウイルス５’および３’シスＩＴＲ配列（すなわち、アデノウイルス末端反復およびＰＡＣ配列）を典型的に含む。
用語「ポリプロイドＡＡＶ」は、２つまたはそれより多くのＡＡＶ血清型からのカプシドで構成されているＡＡＶベクターであって、例えば、より高度の形質導入のために個々の血清型を活用することができるが、ある特定の実施形態では親からの指向性をなくすことができない、ＡＡＶベクターを指す。
本明細書で使用される場合、用語「アミノ酸」は、任意の天然に存在するアミノ酸、その改変形態、および合成アミノ酸を包含する。
発現されることになる目的の遺伝子を含むＤＮＡベクターを含むＡＡＶまたはＡＡＶの態様に関する、またはそのようなＡＡＶもしくはＡＡＶの態様を開示もしくは記載している、参照のために本明細書に組み込まれるさらなる特許は、米国特許第６，４９１，９０７号、同第７，２２９，８２３号、同第７，７９０，１５４号、同第７，２０１８９８号、同第７，０７１，１７２号、同第７，８９２，８０９号、同第７，８６７，４８４号、同第８，８８９，６４１号、同第９，１６９，４９４号、同第９，１６９，４９２号、同第９，４４１，２０６号、同第９，４０９，９５３号、および同第９，４４７，４３３号、同第９，５９２，２４７号、および同第９，７３７，６１８号である。
ＩＩ．ｒＡＡＶゲノムエレメント
本明細書で開示される通り、本技術の一態様は、カプシドを含むｒＡＡＶベクターであって、そのカプシド内に「ｒＡＡＶベクターゲノム」と呼ばれるヌクレオチド配列を含む、ｒＡＡＶベクターに関する。ｒＡＡＶベクターゲノム（「ｒＡＡＶゲノム」とも呼ばれる）は、２つの逆方向末端反復（ＩＴＲ、例えば、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ）を含むがこれらに限定されない、複数のエレメントを含み、プロモーター、異種遺伝子およびポリＡテールを含む、追加の要素がこれらのＩＴＲの間に位置する。
一部の実施形態では、本明細書で開示されるｒＡＡＶゲノムは、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列と、５’ＩＴＲと３’ＩＴＲとの間に位置するプロモーター、例えば肺特異的プロモーター配列とを含み、プロモーターは、治療用タンパク質をコードする異種核酸に動作可能に連結したものであり、異種核酸配列は、次のエレメントのうちの１つまたは複数をさらに含むことができる：イントロン配列、分泌シグナルペプチドをコードする核酸、およびポリＡ配列。
Ｆ．プロモーター
一部の実施形態では、治療用タンパク質の適切なレベルを達成するために、ｒＡＡＶ遺伝子型は、プロモーターを含む。適切なプロモーターは、当業者に公知のいくつかのプロモーターのいずれかから選択することができる。一部の実施形態では、プロモーターは、細胞型特異的プロモーターである。さらなる実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーターである。ある実施形態では、プロモーターは、５’の上流に位置し、異種核酸配列に動作可能に連結されている。一部の実施形態では、プロモーターは、肝臓細胞型特異的プロモーター、心筋細胞型特異的プロモーター、ニューロン細胞型特異的プロモーター、神経細胞型特異的プロモーター、筋肉細胞型特異的プロモーターもしくは肺特異的プロモーター、または別の細胞型特異的プロモーターである。
一部の実施形態では、構成的プロモーターは、異なる強度および組織特異性の構成的プロモーターの群から選択することができる。これらのプロモーターの一部の例が表６に示される。ウイルスベクター、例えばｒＡＡＶベクターゲノムは、１つまたは複数の構成的プロモーター、例えば、ウイスルプロモーター、または転写を促進することに一般に活性である哺乳動物遺伝子からのプロモーターを含み得る。構成的ウイルスプロモーターの例は、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ａｄ ＥＩＡプロモーターおよびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターである。構成的哺乳動物プロモーターの例としては、βアクチンプロモーターおよびニワトリベータアクチン（ＣＢ）プロモーターにより例示されるような、様々なハウスキーピング遺伝子プロモーターが挙げられ、ＣＢプロモーターは、ＣＦＴＲを発現させるために特に有用な構成的プロモーターであることが判明している。
ある実施形態では、プロモーターは、Degiulio JV et al. Gene Ther. 2010 Apr;17(4):541-549.IDに記載されているような強力かつ肺特異的な導入遺伝子発現を媒介する肺特異的ＳＰ－Ｃプロモーターを含む、プロモーター配列を含むがこれらに限定されない、肺特異的プロモーターなどの、組織特異的プロモーターである。
ある実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーターである。適切な誘導性プロモーターの例としては、例えば、チトクロムＰ４５０遺伝子、熱ショックタンパク質遺伝子、メタロチオネイン遺伝子、およびホルモン誘導性遺伝子などの遺伝子からのプロモーター、例えばエストロゲン遺伝子プロモーターなどが挙げられる。誘導性プロモーターの別の例は、テトラサイクリンに応答性であるｔｅｔＶＰ１６プロモーターである。
本明細書における開示によるｒＡＡＶゲノム内のプロモーターとしては、ニューロン特異的プロモーター、例えばシナプシン１（ＳＹＮ）プロモーター；筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター；およびデスミン（ＤＥＳ）プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、異種核酸（例えば、ヒトＣＦＴＲ）のＡＡＶ媒介発現を、ニューロンにおいてシナプシンプロモーターによって、または骨格筋においてＭＣＫプロモーターによって達成することができる。使用することができる他のプロモーターとしては、ＥＦ、Ｂ１９ｐ６、ＣＡＧ、ニューロン特異的エノラーゼ遺伝子プロモーター；ニワトリベータアクチン／ＣＭＶハイブリッドプロモーター；血小板由来成長因子遺伝子プロモーター；ｂＧＨ、ＥＦ１ａ、ＣａｍＫＩＩａ、ＧＦＡＰ、ＲＰＥ、ＡＬＢ、ＴＢＧ、ＭＢＰ、ＭＣＫ、ＴＮＴ、ａＭＨＣ、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＣＦＰおよびＹＦＰプロモーターが挙げられる。
Figure 2022516661000001
 Ｈ．ポリＡ
一部の実施形態では、ウイルスベクターゲノム、例えば、ｒＡＡＶベクターゲノムは、一実施形態ではＣＦＴＲ融合ポリペプチドをコードする異種核酸遺伝子の３’側かつ下流に位置する、少なくとも１つのポリＡテールを含む。一部の実施形態では、ポリＡシグナルは、本明細書で定義される通りの安定性配列またはＣＳ配列の３’にある。ｈＧＨポリＡ、ｓｙｎｐＡポリＡおよびこれらに類するものを含むがそれらに限定されない、任意のポリＡ配列を使用することができる。一部の実施形態では、ポリＡは、合成ポリＡ配列である。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターゲノムは、２つのポリＡテール、例えば、ｈＧＨポリＡ配列および別のポリＡ配列を含み、スペーサー配列がこれら２つのポリＡ配列間に位置する。一部の実施形態では、第１のポリＡ配列は、ｈＧＨポリＡ配列であり、第２のポリＡ配列は、合成配列であるか、またはその逆である－すなわち、代替的な実施形態では、第１のポリＡ配列は、合成ポリＡ配列であり、第２のポリＡ配列は、ｈＧＨポリＡ配列である。例示的なポリＡ配列は、例えば、ｈＧＨポリＡ配列であるか、またはｈＧＨポリＡ配列に対して配列、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％のヌクレオチド配列、同一性を少なくとも有するポリＡ核酸配列である。一部の実施形態では、使用のために包含されるｈＧＨポリ配列は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるAnderson et al. J. Biol. Chem 264(14); 8222-8229, 1989に記載されている（例えば、８２２３ページ、第２欄、第１段落を参照されたい）。
一部の実施形態では、異種遺伝子の転写物を含む、ｒＡＡＶベクターゲノムから転写されるＲＮＡ転写物を安定させるように、ポリＡテールを操作することができ、代替的な実施形態では、不安定にさせることになるエレメントを含むようにポリＡテールを操作することができる。
ある実施形態では、ポリＡテールの長さを変更することにより不安定化エレメントになるようにポリＡテールを操作することができる。ある実施形態では、ポリＡテールを延長または短縮することができる。さらなる実施形態では、異種遺伝子、一実施形態ではＣＦＴＲ遺伝子、とポリＡテールとの間に存する３’非翻訳領域を延長または短縮して、異種遺伝子の発現レベルを変更することまたは産生される最終ポリペプチドを変更することができる。一部の実施形態では、３’非翻訳領域は、ＧＡＡ ３’ＵＴＲを含む。
別の実施形態では、不安定化エレメントは、ＲＮＡ転写物をサイレンシングする（翻訳を抑制するおよび分解を促進する）能力があるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）であって、異種遺伝子をコードするものに結合するｍｉＲＮＡである。異種遺伝子、例えばＩＧＦ２（Ｖ４３Ｍ）－ＣＦＴＲ融合ポリペプチドの発現のモジュレーションは、ｍｉＲＮＡが結合するポリＡテール内のシード領域を改変、付加または欠失させることにより行うことができる。ある実施形態では、ポリＡテール内のシード領域の付加または欠失は、ｒＡＡＶベクターゲノム内の異種遺伝子によりコードされるタンパク質、例えばＩＧＦ２（Ｖ４３Ｍ）－ＣＦＴＲ融合ポリペプチドの発現を増加または減少させることができる。さらなる実施形態では、シード領域の付加または欠失の結果として起こる、発現のそのような増加または減少は、ｒＡＡＶベクターゲノムを含有するＡＡＶにより形質導入される細胞型に依存する。
別の実施形態では、シード領域を操作して、異種遺伝子とポリＡテールとの間に位置する３’非翻訳領域にすることもできる。さらなる実施形態では、不安定化剤は、ｓｉＲＮＡであり得る。ｓｉＲＮＡのコード領域は、ｒＡＡＶベクターゲノムに含まれることがあり、一般にはポリＡテールの下流、３’側に位置する。
Ｉ．末端反復
ここで開示されるようなｒＡＡＶゲノムは、望ましい特性を有し、かつＩＴＲを組み込むベクターの活性およびそのようなベクターに対する細胞応答をモジュレートするように設計され得るＡＡＶ ＩＴＲを含む。別の実施形態では、ＡＡＶ ＩＴＲは、望ましい特性を有し、かつ参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，４４７，４３３号に示されているようなものを含む、１つまたは２つの合成ＩＴＲを含むベクターの活性およびそのようなベクターに対する細胞応答を操作するように設計され得る合成ＡＡＶ ＩＴＲである。レンチウイルスは、パッケージングにも役立つ長い末端反復、ＬＴＲを有する。
ｒＡＡＶに使用されるＡＡＶ ＩＴＲ、およびＨＩＶなどのレンチウイルスとともに使用されるＬＴＲは、特定の応用に適する任意の血清型のものであり得る、本明細書で開示されるような導入遺伝子ゲノムに隣接する。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターゲノムは、ＡＡＶ ＩＴＲと隣接している。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターゲノムは、ＡＡＶ ＩＴＲと隣接しており、ＩＴＲは、完全長ＩＴＲ配列、ＣＰＧアイランドを含む配列が除去されたＩＴＲ、ＣＰＧ配列を含む配列が付加されたＩＴＲ、短縮型ＩＴＲ配列、ＩＴＲ内に１つもしくは複数の欠失を有するＩＴＲ配列、ＩＴＲ内に１つもしくは複数の付加を有するＩＴＲ配列、またはハイブリッドＩＴＲを形成するように一緒に連結さている前述のＩＴＲの任意の部分を含む組合せを含む。
長期発現を助長するために、ある実施形態では、ＧＡＡをコードするポリヌクレオチドは、ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）（例えば、第１のもしくは５’ＡＡＶと第２の３’ＡＡＶ ＩＴＲと）の間に挿入されるか、またはＬＴＲ、例えば、ＨＩＶ ＬＴＲである。ＡＡＶ ＩＴＲは、ＷＴ ｒＡＡＶベクターゲノムの両端に見られ、ＤＮＡ複製起点およびＤＮＡ複製のプライマーとしての機能を果たす。ＡＡＶ ＤＮＡ複製にはもちろん、原核生物プラスミドからのレスキューまたは切除にも、シスでのＩＴＲが必要とされる。ある実施形態では、ｒＡＡＶゲノムの核酸内に含有されるＡＡＶ ＩＴＲ配列は、いずれのＡＡＶ血清型（例えば、１、２、３、３ｂ、４、５、６、７、８、９および１０）に由来してもよく、または１つより多くの血清型に由来してもよく、これは、ＩＴＲを構築するための２つもしくはそれより多くのＡＡＶ血清型の部分を組み合わせることを含む。ある実施形態では、ｒＡＡＶベクターゲノムを含む、ｒＡＡＶベクターにおける使用のために、第１および第２のＩＴＲは、パッケージングおよび複製に必要とされる、ＷＴまたは操作されたＩＴＲの最小部分を少なくとも含むべきである。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターゲノムは、ＡＡＶ ＩＴＲと隣接している。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターゲノムは、少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲを含み、前記ＩＴＲは、（ａ）ＡＡＶ ｒｅｐ結合エレメント、（ｂ）ＡＡＶ末端分解配列、および（ｃ）ＡＡＶ ＲＢＥ（Ｒｅｐ結合エレメント）を含むか、これらから本質的になるか、またはこれらからなり、前記ＩＴＲは、いずれの他のＡＡＶ ＩＴＲ配列も含まない。別の実施形態では、エレメント（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は、ＡＡＶ９ ＩＴＲからのものであり、このＩＴＲは、いずれの他のＡＡＶ９ ＩＴＲ配列も含まない。さらなる実施形態では、エレメント（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９を含むがこれらに限定されない、任意のＡＡＶ ＩＴＲ由来である。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、２つの合成ＩＴＲを含み、これらの合成ＩＴＲは、同じであってもよく、または異なっていてもよい。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターゲノムを含む、ｒＡＡＶベクター内のポリヌクレオチドは、２つの合成ＩＴＲを含み、これらの合成ＩＴＲは、同じであってもよく、または異なっていてもよい。ＩＴＲ内の３つのエレメントは、ＩＴＲ機能に十分であるように決定されている。この最小機能性ＩＴＲをＡＡＶベクターの産生および形質導入の全ての態様に使用することができる。追加の欠失によって、よりいっそう小さい最小機能性ＩＴＲが規定されることもある。長さが短いほうが、より大きいトランスジェニックカセットのパッケージングおよび形質導入を可能にするのに有利である。
別の実施形態では、合成ＩＴＲ内に存在するエレメントの各々は、天然に存在するＡＡＶ ＩＴＲ内に存在するような、まさにその配列（ＷＴ配列）であってもよく、またはＡＡＶ ＩＴＲのエレメントの機能が、これらの同じエレメントの、それらが天然に存在するＡＡＶ ＩＴＲに存在する場合の、機能と実質的に異ならないような十分なレベルで機能し続けるのであれば、わずかに異なって（例えば、１、２、３、４、５もしくはそれより多くのヌクレオチドの付加、欠失および／もしくは置換で異なって）いてもよい。
さらなる実施形態では、ｒＡＡＶベクターゲノムを含む、ｒＡＡＶベクターは、ＩＴＲの間に、１つまたは複数の追加の非ＡＡＶシスエレメント、例えば、転写を開始させるエレメント、エンハンサー機能を媒介するエレメント、有糸分裂時に複製および対称分布を可能にするエレメント、または形質導入ゲノムの存続およびプロセシングを変更するエレメントを含むことができる。そのようなエレメントは、当技術分野において周知であり、限定せずにプロモーター、エンハンサー、クロマチン結合配列、テロメア配列、シス作用性マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、およびそれらの組合せを含む。
別の実施形態では、ＩＴＲは、天然に存在するＩＴＲ、例えばＡＡＶ９からのＩＴＲ９、と比較して改変された転写活性を示す。ＩＴＲ９配列がプロモーター活性を本質的に有することは公知である。ＩＴＲ９配列は、ポリ（Ａ）配列と同様の終結活性も本質的に有する。本発明の最小機能性ＩＴＲは、実施例で示されるような転写活性を示すが、ＩＴＲ２と比較して減少したレベルで示す。したがって、一部の実施形態では、ＩＴＲには、転写機能がある。他の実施形態では、ＩＴＲには、転写欠損がある。ある特定の実施形態では、ＩＴＲは、例えば、ベクターが宿主染色体に組み込まれたときにベクター内に存在するトランスジェニックカセットの転写を防止する、転写インスレーターとして作用することができる。
本発明の一態様は、少なくとも１つの合成ＡＡＶ ＩＴＲを含み、ＩＴＲ内の１つまたは複数の転写因子結合部位のヌクレオチド配列が、ＩＴＲ２などの天然に存在するＡＡＶ ＩＴＲの配列と比較して欠失および／または置換されている、ｒＡＡＶベクターゲノムに関する。一部の実施形態では、それは、１つまたは複数の転写因子結合部位が欠失および／または置換されている、最小機能性ＩＴＲである。一部の実施形態では、少なくとも１つの転写因子結合部位、例えば、少なくとも５つもしくはそれより多くの、または１０もしくはそれより多くの転写因子結合部位、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１の転写因子結合部位が、欠失および／または置換されている。
本明細書に記載のｒＡＡＶベクターゲノムを含む、ｒＡＡＶベクターである、別の実施形態は、少なくとも１つの合成ＡＡＶ ＩＴＲを含むポリヌクレオチドであって、ＩＴＲ内の転写開始部位にまたはその付近に通常は存在する１個または複数のＣｐＧアイランド（シトシン塩基のすぐ後にグアニン塩基が続くもの（ＣｐＧ）であり、このような配置のシトシンはメチル化される傾向がある）が欠失および／または置換されている、ポリヌクレオチドを含む。ある実施形態では、ＣｐＧアイランドの欠失、またはＣｐＧアイランドの数の低減は、ｒＡＡＶベクターの免疫原性を低減させることがある。これは、ＣｐＧアイランドで起こる、ｒＡＡＶベクターＤＮＡ配列とのＴＬＲ－９の結合の低減または完全阻害の結果として生じる。ＣｐＧモチーフのメチル化が転写サイレンシングをもたらすことも周知である。ＩＴＲ内のＣｐＧモチーフの除去は、ＴＬＲ－９認識の減少および／またはメチル化の減少およびしたがって導入遺伝子サイレンシングの減少をもたらすと予想される。一部の実施形態では、それは、１個または複数のＣｐＧアイランドが欠失および／または置換されている最小機能性ＩＴＲである。ある実施形態では、ＡＡＶ ＩＴＲ２が１６のＣｐＧアイランドを含有することは公知であり、これらのＣｐＧアイランドのうちの１個もしくは複数または１６個全てを欠失させることができる。
一部の実施形態では、少なくとも１個のＣｐＧモチーフ、例えば、少なくとも４個もしくはそれより多くの、または８個もしくはそれより多くのＣｐＧモチーフ、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５もしくは１６個のＣｐＧモチーフが、欠失および／または置換されている。句「欠失および／または置換される」は、本明細書で使用される場合、ＣｐＧモチーフ内の一方または両方のヌクレオチドが欠失され、異なるヌクレオチドで置換される、または欠失と置換との任意の組合せであることを意味する。
別の実施形態では、合成ＩＴＲは、下記に列挙されるヌクレオチド配列のうちの１つを含むか、１つから本質的になるか、または１つからなる。他の実施形態では、合成ＩＴＲは、下記に列挙されるヌクレオチド配列のうちの１つと少なくとも８０％同一である、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるヌクレオチド配列を含むか、そのようなヌクレオチド配列から本質的になるか、またはそのようなヌクレオチド配列からなる。
Figure 2022516661000002
Figure 2022516661000003
ある特定の実施形態では、本明細書に記載のｒＡＡＶベクターゲノムは、宿主細胞に形質導入することができるＡＡＶウイルス粒子を産生することができる合成ＩＴＲを含む。そのようなＩＴＲは、例えば異種核酸のウイルス送達に使用することができる。そのようなＩＴＲの例としては、上記に列挙されているＭＨ－２５７、ＭＨ－２５８、およびＭＨデルタ２５８が挙げられる。
他の実施形態では、合成ＩＴＲを含有する本明細書に記載のｒＡＡＶベクターゲノムは、ＡＡＶウイルス粒子を産生することができない。そのようなＩＴＲは、例えば異種核酸の非ウイルス移入に使用することができる。そのようなＩＴＲの例としては、上記に列挙されているＭＨテロメア－１、ＭＨテロメア－２、およびＭＨ Ｐｏｌ ＩＩ ２５８が挙げられる。
さらなる実施形態では、本発明の合成ＩＴＲを含む本明細書に記載のｒＡＡＶベクターゲノムは、第２のＩＴＲをさらに含み、このＩＴＲは、第１のＩＴＲと同じであってもよく、または異なっていてもよい。一実施形態では、ｒＡＡＶベクターゲノムは、異種核酸、例えばタンパク質または機能性ＲＮＡをコードする配列をさらに含む。追加の実施形態では、第２のＩＴＲは、Ｒｅｐタンパク質により分解され得ず、すなわち、二本鎖ウイルスＤＮＡを生じさせ得る。
ある実施形態では、ｒＡＡＶベクターゲノムは、本発明の合成ＩＴＲを含むポリヌクレオチドを含む。さらなる実施形態では、ウイルスベクターは、パルボウイルスベクター、例えばＡＡＶベクターであり得る。別の実施形態では、少なくとも１つの合成ＩＴＲを有するベクターゲノムを含有する組換えパルボウイルス粒子（例えば、組換えＡＡＶ粒子）であり得る。
本発明の別の実施形態は、ＡＡＶカプシドのトランスジェニックＤＮＡパッケージング能力を増大する方法であって、少なくとも１つの合成ＡＡＶ ＩＴＲを含むｒＡＡＶベクターゲノムを生成するステップを含み、前記ＩＴＲが、（ａ）ＡＡＶ ｒｅｐ結合エレメント、（ｂ）ＡＡＶ末端分解配列、および（ｃ）ＡＡＶ ＲＢＥエレメントを含み、前記ＩＴＲが、いずれの他のＡＡＶ ＩＴＲ配列も含まない方法に関する。
本発明のさらなる実施形態は、ｒＡＡＶベクターゲノムによる感染に対する細胞応答を変更する方法であって、少なくとも１つの合成ＩＴＲを含むｒＡＡＶベクターゲノムを生成するステップを含み、前記ＩＴＲ内の１つまたは複数の転写因子結合部位のヌクレオチド配列が、欠失および／または置換されており、さらに、ｒＡＡＶベクターゲノムが、感染に対する細胞応答の変更を生じさせる少なくとも１つの合成ＩＴＲを含む方法に関する。
本発明の追加の実施形態は、ｒＡＡＶベクターゲノムによる感染に対する細胞応答を変更する方法であって、少なくとも１つの合成ＩＴＲを含むｒＡＡＶベクターゲノムを生成するステップを含み、前記ＩＴＲ内の１つまたは複数のＣｐＧモチーフが、欠失および／または置換されており、少なくとも１つの合成ＩＴＲを含むベクターが、感染に対する細胞応答の変更を生じさせる方法に関する。
ＩＩＩ．ベクターおよびビリオン
標的化されるウイルスベクターは、例えば、レンチウイルス、アデノウイルス（Ａｄ）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ＨＳＶなどを含むがこれらに限定されない、遺伝子治療に有用ないずれのウイルスベクターであってもよい。
送達ベクターの選択は、標的宿主の年齢および種、ｉｎ ｖｉｔｒｏ対ｉｎ ｖｉｖｏ送達、所望される発現のレベルおよび持続性、意図された目的（例えば、治療またはポリペプチド産生のため）、標的細胞または臓器、送達経路、単離された核酸のサイズ、安全性の懸念、およびこれらに類することを含む、当技術分野において公知のいくつかの因子に基づいて行うことができる。
適切なベクターとしては、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、または単純ヘルペスウイルス）；脂質ベクター；ポリリシンベクター；プラスミドなどの核酸分子とともに使用される合成ポリアミノポリマーベクター；およびこれらに類するものが挙げられる。
当技術分野において公知である任意のウイルスベクターを本発明において使用することができる。そのようなウイルスベクターの例としては、Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ；Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ；Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ；Ｃａｐｉｌｌｏｖｉｒｕｓ群；Ｃａｒｌａｖｉｒｕｓ群；Ｃａｒｍｏｖｉｒｕｓウイルス群；Ｃａｕｌｉｍｏｖｉｒｕｓ群；Ｃｌｏｓｔｅｒｏｖｉｒｕｓ群；Ｃｏｍｍｅｌｉｎａ黄色斑紋ウイルス群；Ｃｏｍｏｖｉｒｕｓウイルス群；Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ；ＰＭ２ファージ群；Ｃｏｒｃｉｃｏｖｉｒｉｄａｅ；潜伏ウイルス群；クリプトウイルス群；Ｃｕｃｕｍｏｖｉｒｕｓウイルス群Ｆａｍｉｌｙ（［ＰＨｇｒ］６ファージ群；Ｃｙｓｉｏｖｉｒｉｄａｅ；カーネーション輪紋群；Ｄｉａｎｔｈｏｖｉｒｕｓウイルス群；ソラマメウイルト群；Ｆａｂａｖｉｒｕｓウイルス群；Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ；Ｆｕｒｏｖｉｒｕｓ群；Ｇｅｒｍｉｎｉｖｉｒｕｓ群；Ｇｉａｒｄｉａｖｉｒｕｓ群；Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ；Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ；Ｈｏｒｄｅｉｖｉｒｕｓウイルス群；Ｉｌｌａｒｖｉｒｕｓウイルス群；Ｉｎｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｉｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｌｅｖｉｖｉｒｉｄａｅ；Ｌｉｐｏｔｈｒｉｘｖｉｒｉｄａｅ；Ｌｕｔｅｏｖｉｒｕｓ群；Ｍａｒａｆｉｖｉｒｕｓウイルス群；トウモロコシ白化萎縮ウイルス群；ｉｃｒｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｎｅｃｒｏｖｉｒｕｓ群；Ｎｅｐｏｖｉｒｕｓウイルス群；Ｎｏｄａｖｉｒｉｄａｅ；Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ；Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ；パースニップイエローフレックウイルス群；Ｐａｒｔｉｔｉｖｉｒｉｄａｅ；Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ；エンドウひだ葉モザイクウイルス群；Ｐｈｙｃｏｄｎａｖｉｒｉｄａｅ；Ｐｉｃｏｍａｖｉｒｉｄａｅ；Ｐｌａｓｍａｖｉｒｉｄａｅ；Ｐｒｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｐｏｌｙｄｎａｖｉｒｉｄａｅ；Ｐｏｔｅｘｖｉｒｕｓ群；Ｐｏｔｙｖｉｒｕｓ；Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ；Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｒｈｉｚｉｄｉｏｖｉｒｕｓ群；Ｓｉｐｈｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｓｏｂｅｍｏｖｉｒｕｓ群；ＳＳＶ １型ファージ；Ｔｅｃｔｉｖｉｒｉｄａｅ；Ｔｅｎｕｉｖｉｒｕｓ；Ｔｅｔｒａｖｉｒｉｄａｅ；Ｔｏｂａｍｏｖｉｒｕｓ群；Ｔｏｂｒａｖｉｒｕｓ群；Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ；Ｔｏｍｂｕｓｖｉｒｕｓ群；Ｔｏｂｏｖｉｒｕｓ群；Ｔｏｔｉｖｉｒｉｄａｅ；Ｔｙｍｏｖｉｒｕｓ群；および植物ウイルスサテライトに由来するベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
組換えウイルスベクターを産生するためのプロトコール、および核酸送達にウイルスベクターを使用するためのプロトコールは、Bouard, D. et al, Br J. Pharmacol 2009 May, 157(2) 153-165 "Viral Vectors: from virology to transgene expression", Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. M. et al.(eds.) Greene Publishing Associates, (1989) および他の標準的な実験室マニュアル（例えば、Vectors for Gene Therapy. In: Current Protocols in Human Genetics. John Wiley and Sons, Inc.: 1997）において見出すことができる。
核酸を送達するためのウイルスベクターの特定の例としては、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶおよび他のパルボウイルス、ヘルペスウイルスならびにポックスウイルスベクターが挙げられる。レンチウイルスは、分裂細胞と非分裂細胞の両方に感染することができるタイプのレトロウイルスである。レンチウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）を含む。導入遺伝子は、同じであっても異なってもよい、合成であってもよい、キメラであってもよいなどのＬＴＲと隣接する。加えて、ｔａｔおよびｒｅｖのようなエレメントは、導入遺伝子の発現を増強することができる。
レトロウイルスは、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）などのγ－レトロウイルスベクター（γ-retroviral vectors）も含み、この導入遺伝子もまた両側がＬＴＲと隣接している。
用語「パルボウイルス」は、本明細書で使用される場合、自己複製パルボウイルスおよびディペンドウイルスを含む、ｆａｍｉｌｙ Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅを包含する。自律パルボウイルスは、ｇｅｎｅｒａ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ、Ｅｒｙｔｈｒｏｖｉｒｕｓ、Ｄｅｎｓｏｖｉｒｕｓ、ＩｔｅｒａｖｉｒｕｓおよびＣｏｎｔｒａｖｉｒｕｓのメンバーを含む。例示的な自律パルボウイルスとしては、マウス微小ウイルス、ウシパルボウイルス、イヌパルボウイルス、ニワトリパルボウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ネコパルボウイルス、ガチョウパルボウイルス、Ｈ１パルボウイルス、バリケンパルボウイルス、およびＢ１９ウイルス、ならびに国際ウイルス分類委員会（International Committee on Taxonomy of Viruses）（ＩＣＴＶ）によりパルボウイルスとして分類されている任意の他のウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
他の自律パルボウイルスは、当業者に公知である。例えば、BERNARD N. FIELDS et al., VIROLOGY, volume 2, chapter 69 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers)を参照されたい。
Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ属は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、例えば、これらに限定されないが、ＡＡＶ １型、ＡＡＶ ２型、ＡＡＶ ３型、ＡＡＶ ４型、ＡＡＶ ５型、ＡＡＶ ６型、ＡＡＶ ７型、ＡＡＶ ８型、ＡＡＶ ９型、ＡＡＶ １０型、ＡＡＶ １１型、ＡＡＶ １２型、ＡＡＶ １３型、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、およびヒツジＡＡＶ、ならびに国際ウイルス分類委員会（ＩＣＴＶ）によりディペンドウイルス（例えば、ＡＡＶ）として分類されている任意の他のウイルスなどを含む。例えば、BERNARD N. FIELDS et al., VIROLOGY, volume 2, chapter 69 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers)を参照されたい。
特定の実施形態では、送達ベクターは、ＡＡＶ １型、ＡＡＶ ２型、ＡＡＶ ３型、ＡＡＶ ４型、ＡＡＶ ５型、ＡＡＶ ６型、ＡＡＶ ７型、またはＡＡＶ ８型、ＡＡＶ ９型、ＡＡＶ １０型、ＡＡＶ １１型、ＡＡＶ １２型、ＡＡＶ １３型からのカプシドを含むがこれらに限定されない、ＡＡＶカプシドを含む。カプシドタンパク質は、同じ血清型からのものであってもよく、または異なる血清型からのものであってもよい。
表２は、例示的なＡＡＶ血清型、および例示的な公開されている対応するカプシド配列であって、本明細書に記載されるｒＡＡＶベクターにおいてＡＡＶカプシドとして使用することができ、あるいは現在公知のまたは将来識別される野生型カプシドタンパク質および／または他のキメラもしくはバリアントカプシドタンパク質との任意の組合せで使用することができ、各々が本明細書に組み込まれる、カプシド配列を記載する。
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ＡＡＶおよび自律パルボウイルスの様々な血清型のゲノム配列、ならびに末端反復（ＴＲ）、Ｒｅｐタンパク質およびカプシドサブユニットの配列は、当技術分野において公知である。そのような配列は、文献において、またはＧｅｎＢａｎｋなどの公開データベースにおいて見出すことができる。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ ００２０７７、ＮＣ ００１４０１、ＮＣ ００１７２９、ＮＣ ００１８６３、ＮＣ ００１８２９、ＮＣ ００１８６２、ＮＣ ０００８８３、ＮＣ ００１７０１、ＮＣ ００１５１０、ＡＦ０６３４９７、Ｕ８９７９０、ＡＦ０４３３０３、ＡＦ０２８７０５、ＡＦ０２８７０４、Ｊ０２２７５、Ｊ０１９０１、Ｊ０２２７５、Ｘ０１４５７、ＡＦ２８８０６１、ＡＨ００９９６２、ＡＹ０２８２２６、ＡＹ０２８２２３、ＮＣ ００１３５８、ＮＣ ００１５４０、ＡＦ５１３８５１、ＡＦ５１３８５２を参照されたく、これらの開示は、それら全体が本明細書に組み込まれる。例えば、Srivistava et al., (1983) J. Virology 45:555；Chiorini et al., (1998) J. Virology 71:6823；Chiorini et al., (1999) J. Virology 73:1309；Bantel-Schaal et al., (1999) J. Virology 73:939；Xiao et al., (1999) J. Virology 73:3994；Muramatsu et al., (1996) Virology 221:208；Shade et al., (1986) J. Virol.58:921；Gao et al., (2002) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99:11854；国際特許公開ＷＯ００／２８０６１、同ＷＯ９９／６１６０１、同ＷＯ９８／１１２４４：米国特許第６，１５６，３０３号も参照されたく、これらの開示は、それら全体が本明細書に組み込まれる。ＡＡＶ１、ＡＡＶ２およびＡＡＶ３末端反復配列の初期の説明は、Xiao, X., (1996), "Characterization of Adeno-associated virus (AAV) DNA replication and integration," Ph.D. Dissertation, University of Pittsburgh, Pittsburgh, Pa.（その全体が本明細書に組み込まれる）により提供されている。
本発明のパルボウイルスＡＡＶ粒子は、ウイルス末端反復およびウイルスカプシドが、それぞれ、異なるパルボウイルスまたはＡＡＶ由来である、「ハイブリッド」パルボウイルスまたはＡＡＶ粒子であり得る。ハイブリッドパルボウイルスは、より詳細に、国際特許公開ＷＯ００／２８００４；Chao et al., (2000) Molecular Therapy 2:619;およびChao et al., (2001) Mol.Ther.4:217（これらの開示は、それら全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。代表的な実施形態では、ウイルス末端反復およびカプシドはＡＡＶの異なる血清型由来である（すなわち、「ハイブリッドＡＡＶ粒子」）。
パルボウイルスまたはＡＡＶカプシドは、さらに、国際特許公開ＷＯ００／２８００４に記載されているような「キメラ」カプシド（例えば、異なるパルボウイルス、好ましくは異なるＡＡＶ血清型からの配列を含有する）または「標的化された」カプシド（例えば、方向付けられた指向性を有する）であり得る。
さらに、パルボウイルスまたはＡＡＶベクターは、国際特許公開ＷＯ０１／９２５５１に記載されているような二重鎖型パルボウイルス粒子または二重鎖型ＡＡＶ粒子であり得る。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、核酸送達ベクターとして用いられている。総説については、Muzyczka et al. Curr. Topics in Micro. and Immunol. (1992) 158:97-129を参照されたい。ＡＡＶは、パルボウイルスであり、直径１８～２６ナノメートルの小さい正二十面体ビリオンを有し、サイズ４～５キロベースの一本鎖ゲノムＤＮＡ分子を含有する。これらのウイルスは、ＤＮＡ分子のセンス鎖またはアンチセンス鎖のどちらかを含有し、どちらかの鎖がビリオンに組み込まれている。２つのオープンリーディングフレームが、一連のＲｅｐおよびＣａｐポリペプチドをコードする。Ｒｅｐポリペプチド（Ｒｅｐ５０、Ｒｅｐ５２、Ｒｅｐ６８およびＲｅｐ７８）は、ＡＡＶゲノムの複製、レスキューおよび組込みに関与するが、４つＲｅｐポリペプチド全ての非存在下で有意な活性が観察される。Ｃａｐタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３）は、ビリオンカプシドを形成する。ゲノムの５’および３’末端でｒｅｐおよびｃａｐオープンリーディングフレームに１４５塩基対の逆方向末端反復（ＩＴＲ）が隣接しており、このうちの最初の１２５塩基対がＹ型またはＴ型二重鎖構造を形成し得る。これらのＩＴＲは、ＡＡＶゲノムの複製、レスキュー、パッケージングおよび組込みに必要な最小シス配列に相当することが示されている。他の全てのウイルス配列は重要でないためトランスに供給されることもある（Muzyczka, (1992) Curr. Topics Microbiol. Immunol.158:97）。
ＡＡＶは、それらのＤＮＡを非分裂細胞に組み込むことができる数少ないウイルスのちの１つであり、ヒト第１９染色体への安定した組込みの高い頻度を示す（例えば、Flotte et al. (1992) Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 7:349-356；Samulski et al., (1989) J Virol.63:3822-3828；およびMcLaughlin et al., (1989) J. Virol.62:1963-1973を参照されたい）。様々な核酸が、ＡＡＶベクターを使用して異なる細胞型に導入されている（例えば、Hermonat et al., (1984) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 81:6466-6470；Tratschin et al., (1985) Mol.Cell.Biol.4:2072-2081；Wondisford et al., (1988) Mol. Endocrinol. 2:32-39；Tratschin et al., (1984) J. Virol.51:611-619；およびFlotte et al., (1993) J. Biol.Chem.268:3781-3790を参照されたい）。
一般に、ｒＡＡＶベクターゲノムは、ベクターによって効率的にパッケージングされ得る導入遺伝子のサイズを最大にするために末端反復（ＴＲ）配列のみを保持することになる。構造および非構造タンパク質コード配列は、トランスに（例えば、プラスミドなどのベクターから、または配列をパッケージング細胞に安定に組み込むことにより）提供され得る。典型的に、ｒＡＡＶベクターゲノムは、少なくとも１つのＡＡＶ末端反復を含み、より典型的には２つのＡＡＶ末端反復を含み、これらの末端反復は、一般に、異種ヌクレオチド配列の５’および３’末端に存在することになる。
表３は、本明細書に記載されるｒＡＡＶベクターにおいてＡＡＶカプシドとして使用することができ、あるいは現在公知のまたは将来識別される野生型カプシドタンパク質および／または他のキメラもしくはバリアントカプシドタンパク質との任意の組合せで使用することができ、各々が本明細書に組み込まれる、例示的なキメラまたはバリアントカプシドタンパク質を記載する。一部の実施形態では、使用のために包含されるｒＡＡＶベクターは、例えば、９，０１２，２２４およびＵＳ７，８９２，８０９において開示されているようなキメラベクターであり、これらの参考特許文献は、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＰＣＴ／ＵＳ１８／２２７２５において開示されているようなハプロイドｒＡＡＶベクターであるか、または例えば、２０１８年７月３１日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０４４６３２においておよび米国出願第１６／１５１，１１０号において開示されているようなポリプロイドｒＡＡＶベクターであり、これらの参考特許文献の各々は、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、９，０１２，２２４およびＷＯ２０１７／１０６２３６において開示されているようなｒＡＡＶ３ベクターであり、これらの参考特許文献の各々は、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。
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一実施形態では、本明細書で開示されるようなｒＡＡＶベクターは、現在公知のまたは将来識別される野生型カプシドタンパク質および／または他のキメラもしくはバリアントカプシドタンパク質との任意の組合せで本発明のＡＡＶカプシドに組み込むことができるキメラまたはバリアントカプシドタンパク質を記載している、ＵＳＰＴＯ発行特許および公開出願のファイルラッパーに収載されている以下の生物学的配列のいずれかに関連するカプシドタンパク質を含む（説明を目的として、１１４８６２５４は、米国特許出願第１１／４８６，２５４号に対応し、他の生物学的配列ファイルは、同様に解釈されたい）：１１４８６２５４．ｒａｗ、１１９３２０１７．ｒａｗ、１２１７２１２１．ｒａｗ、１２３０２２０６．ｒａｗ、１２３０８９５９．ｒａｗ、１２６７９１４４．ｒａｗ、１３０３６３４３．ｒａｗ、１３１２１５３２．ｒａｗ、１３１７２９１５．ｒａｗ、１３５８３９２０．ｒａｗ、１３６６８１２０．ｒａｗ、１３６７３３５１．ｒａｗ、１３６７９６８４．ｒａｗ、１４００６９５４．ｒａｗ、１４１４９９５３．ｒａｗ、１４１９２１０１．ｒａｗ、１４１９４５３８．ｒａｗ、１４２２５８２１．ｒａｗ、１４４６８１０８．ｒａｗ、１４５１６５４４．ｒａｗ、１４６０３４６９．ｒａｗ、１４６８０８３６．ｒａｗ、１４６９５６４４．ｒａｗ、１４８７８７０３．ｒａｗ、１４９５６９３４．ｒａｗ、１５１９１３５７．ｒａｗ、１５２８４１６４．ｒａｗ、１５３６８５７０．ｒａｗ、１５３７１１８８．ｒａｗ、１５４９３７４４．ｒａｗ、１５５０３１２０．ｒａｗ、１５６６０９０６．ｒａｗ、および１５６７５６７７．ｒａｗ。ある実施形態では、本発明のＡＡＶカプシドタンパク質およびウイルスカプシドは、例えば、参照により組み込まれる国際特許公開ＷＯ００／２８００４に記載されているように、それらが、別のウイルス、必要に応じて別のパルボウイルスまたはＡＡＶ、からのカプシドの全てまたは一部分を含み得ることから、キメラであり得る。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターゲノムは、本明細書に組み込まれる米国特許第８，７８４，７９９号に記載されているような一本鎖または単量体二重鎖である。
さらなる実施形態として、本発明のＡＡＶカプシドタンパク質およびウイルスカプシドは、参照により組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ１８／２２７２５に記載されているように、それらが、単一のＡＡＶカプシド内にＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３ ＡＡＶ血清型の異なる組合せを含み得ることから、ポリプロイド（ハプロイドとも呼ばれる）であり得る。
ある実施形態では、本明細書で開示されるようなＣＦの処置に有用なｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ３ｂカプシドである。使用のために包含されるＡＡＶ３ｂカプシドは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる２０１７／１０６２３６、ならびに９，０１２，２２４および７，８９２，８０９に記載されている。
ある実施形態では、ＣＦの処置に使用することができるＡＡＶカプシドは、示されているＡＡＶカプシドに全体がまたは一部が由来する改変ＡＡＶカプシドであり得る。一部の実施形態では、ＡＡＶ３ｂカプシドからのアミノ酸は、異なるＡＡＶ血清型の別のカプシドからのアミノ酸であり得、またはそのようなアミノ酸で置換されており、置換および／または挿入されるアミノ酸は、任意のＡＡＶ血清型からのものであり得、天然に存在するアミノ酸または部分的にもしくは完全に合成のアミノ酸のいずれかを含み得る。
処置の方法
嚢胞性線維症（ＣＦ）
この疾患は、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）遺伝子の突然変異によって引き起こされ、これらの突然変異は、ＣＦＴＲタンパク質欠損を生じさせることになり、それによって塩素輸送が妨げられ、その結果、様々な上皮層を横断する水の流動が著しく減じられることになる。これは、肺、消化管および他の臓器の分泌腺を閉塞させる「粘着性の」粘液性分泌物をもたらす。
嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）遺伝子。
一部の実施形態では、治療用導入遺伝子は、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）遺伝子である。
本明細書で使用される場合、「嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子」または「ＣＦＴＲ」は、塩および流体の恒常性を制御するクロライドおよび重炭酸イオンチャネルを指す。ＣＦＴＲ核酸およびポリペプチドの配列は、いくつかの種について公知であり、例えば、ヒトＣＦＴＲ（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：１０８０）、ｍＲＮＡ（例えば、ＮＣＢＩ参照配列：１．ＮＭ＿０００４９２．３）およびポリペプチド（例えば、ＮＰ＿０００４８３．３）を含む。ＣＦＴＲ糖タンパク質は、膜に組み込まれた複数のサブユニットを有し、これらのサブユニットが、２つの膜貫通ドメイン（ＭＳＤ）と、２つの細胞内ヌクレオチド結合ドメイン（ＮＢＤ）と、リン酸化部位として作用する制御（Ｒ）ドメインとを形成する。ＭＳＤ１およびＭＳＤ２は、チャネル細孔壁を形成する。細孔の開口および閉鎖は、ＭＳＤ１およびＭＳＤ２の立体構造変化を招く、細胞質ＮＢＤドメインとＡＴＰの相互作用によって起こる。ゲート開閉およびコンダクタンスは、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）でのＲドメインリン酸化によって制御される。ＣＦＴＲの複雑な領域は、正確なフォールディングを可能にするためにプロセシングおよび成熟を必要とする。ＣＦＴＲ構造は、小胞体から排出され、その後、細胞表面に輸送されるために、厳密な品質基準を満たさなければならない。これらの基準を満たすことができないＣＦＴＲは、小胞体関連タンパク質分解（ＥＲＡＤ）を被るように運命付けられている。そのような複雑な品質管理システムは、たとえ野生型であってもＣＦＴＲの排出発生を同様のファミリー細胞輸送体の３３％に減少させる効率の損失時に、動作する。嚢胞性線維症は、これらのドメインのＣＦＴＲを変更する突然変異またはこれらのドメインが互いに相互作用する方法を変更する突然変異の結果である。
Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓについてのＣＦＴＲ遺伝子産物の配列は、以下（ＮＰ＿０００４８３．３）の通りである：
Figure 2022516661000018
一部の実施形態では、治療用導入遺伝子は、例えば、Cebotaru L et al. (2013) J Biol Chem. Apr 12;288(15):10505-12に記載されているような、ヒトＣＦＴＲのＮテールプロセシング突然変異体（例えば、Ｅ６０Ａ、Ａ２６４またはＡ２７－２６４）（ＮＰ＿０００４８３．３）を含むがこれに限定されない、短縮型嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）遺伝子である。本明細書に記載される短縮型ＣＦＴＲ突然変異体は、ΔＦ５０８－ＣＦＴＲのプロセシングを特異的にレスキューすることができ、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞表面に機能性ＣＦＴＲクロライドチャネルを生じさせる。
本明細書で使用される場合、ＣＦＴＲ遺伝子の突然変異は、主として気道、膵臓、および肝臓の胆管系において、分泌性上皮細胞（secretary epithelial cells）中のＣＦＴＲタンパク質レベルの低減または非存在を生じさせる結果となる。ＣＦＴＲ遺伝子の１９００を超える異なる突然変異が報告されている。ＡＦ５０８ ＣＦＴＲおよびＧ５５１Ｄ ＣＦＴＲを含むがこれらに限定されない、制御因子作用が可能な突然変異（ＣＦＴＲ突然変異については、例えば、http://www.gen-et.sickkids.on.ca/cfniを参照されたい）。
Figure 2022516661000019
ＣＦＴＲの機能障害は、上皮細胞から覆っている粘液層へと逃避するクロライドイオン（Ｃｌ－）のレベルを低減させる。粘液へのＣｌ－イオンの分泌の低減は、Ｎａ＋：Ｃｌ－不均衡を生じさせる結果となり、次いで、この不均衡が、粘液層に吸収される水の量を低減させる。結果として、粘液は、濃くなり、粘着性になり、粘膜線毛エレベーターにより移動しにくくなる。肺に保持されている粘液は、ＣＦ患者の＞９５％において反復肺炎、肺損傷および最終的には肺不全を助長する、細菌感染、特にＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの好適な媒体になる。膵臓の他の管系、腸管、および肝臓胆管系に保持されている粘液は、閉塞、臓器機能不全および一部の場合には臓器不全の原因となる。
遺伝子編集分子
一部の実施形態では、治療用核酸は、遺伝子編集分子である。
本明細書に記載される技術の態様は、本明細書で概要が示され、ｒＡＡＶゲノムは、５’から３’方向に、
５’ＩＴＲ、
プロモーター配列、
イントロン配列、
治療用核酸（例えば、遺伝子編集分子）、
ポリＡ配列、および
３’ＩＴＲ
を含む。
本明細書に記載の治療用核酸分子は、ベクター、発現ベクター、阻害性核酸、アプタマー、鋳型分子もしくはカセット（例えば、遺伝子編集のための）、または標的化分子（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ技術のための）、または細胞に送達したい任意の他の核酸分子であり得る。核酸分子は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはそれらの合成もしくは可変バージョンであり得る。
本明細書で提供される全ての態様では、遺伝子編集核酸配列は、配列特異的ヌクレアーゼ、１つもしくは複数のガイドＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）、またはＣＲＩＳＰＲｉもしくはＣＲＩＳＰＲａ系の不活性化ＣＡＳ、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択される、遺伝子編集分子をコードする。
一部の実施形態では、遺伝子編集分子は、ヌクレアーゼ、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、ガイドＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、およびアクチベーターＲＮＡから選択される。
一般に、ガイド配列は、標的ポリヌクレオチド配列との、標的配列とハイブリダイズするのに十分な、およびＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ複合体の配列特異的標的化を選択されたゲノム標的配列に方向付けるのに十分な相補性を有する、任意のポリヌクレオチド配列である。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡが結合し、例えば、Ｃａｓタンパク質が、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を形成し得る。
一部の実施形態では、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）配列は、ゲノム内の所望の部位にｇＲＮＡ配列を方向付ける標的化配列であって、ガイド配列とＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼの会合を可能にするｃｒＲＮＡおよび／またはｔｒａｃｒＲＮＡ配列に融合されている標的化配列を含む。一部の実施形態では、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性度は、適切なアラインメントアルゴリズムを使用して最適にアラインされた場合、少なくとも５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％であるか、またはそれより高い。最適なアラインメントは、配列のアラインメントを行うための任意の適切なアルゴリズム、例えば、Ｓｍｉｔｈ・Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ・Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ）、ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）、ＳＯＡＰおよびＭａｑに基づくアルゴリズムを使用して、決定することができる。一部の実施形態では、ガイド配列は、５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５ヌクレオチドであるか、またはそれを超えるヌクレオチド長である。ガイドＲＮＡの標的化配列と、標的核酸分子上の標的配列とは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のミスマッチを含み得ることが、本明細書では企図される。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡ配列は、パリンドローム配列を含み、例えば、自己標的化配列は、パリンドロームを含む。ガイドＲＮＡの標的化配列は、典型的には１９～２１塩基対長であり、ガイドＲＮＡの標的化配列のすぐ前に、全ガイドＲＮＡ（標的化配列＋ヘアピン）をＣａｓ９などのＣａｓに結合させるヘアピンがある。パリンドローム配列がガイドＲＮＡの自己標的化配列として用いられる場合、逆方向反復エレメントは、例えば、９、１０、１１、１２ヌクレオチド、またはそれを超えるヌクレオチド長であり得る。ガイドＲＮＡの標的化配列が、１９～２１ｂｐであることが多い場合、９または１０ヌクレオチドのパリンドローム逆方向反復エレメントは、望ましい長さの標的化配列を提供する。したがって、Ｃａｓ９－ガイドＲＮＡヘアピン複合体は、任意のヌクレオチド配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ）、例えば、１９～２１塩基対配列とマッチし、かつ「ＰＡＭ」配列、例えばＮＧＧもしくはＮＧＡ、または他のＰＡＭが後に続くＤＮＡ配列を、認識し、切断することができる。
ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ複合体の配列特異的結合を標的配列に方向付けるガイド配列の能力を、任意の好適なアッセイにより評定することができる。例えば、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ複合体を形成するのに十分なＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ系の成分を、対応する標的配列を有する宿主細胞に、例えば、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ配列の成分をコードするベクターでのトランスフェクションによって提供することができ、その後、標的配列内の優先的切断について、例えば、サーベイヤーアッセイ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ（商標）、Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ、ＣＴ）により、評定することができる。同様に、試験管の中で、標的配列と、試験されることになるガイド配列を含むＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ複合体の成分と、試験ガイド配列とは異なる対照ガイド配列とを供給し、標的配列への結合または標的配列における切断率を試験ガイド配列反応と対照ガイド配列反応との間で比較することにより、標的ポリヌクレオチド配列の切断を評価することができる。ｇＲＮＡ配列を試験するために他のアッセイも使用することができることは、当業者には理解されるであろう。
ガイド配列を選択して任意の標的配列を標的とすることができる。一部の実施形態では、標的配列は、細胞のゲノム内の配列である。一部の実施形態では、標的配列は、本明細書に記載の、自己クローニングプラスミド内の第１のガイドＲＮＡをコードする配列である。典型的に、ゲノム内の標的配列は、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼの結合のためにプロトスペーサー隣接（ＰＡＭ）配列を含むことになる。エンドヌクレアーゼと標的化配列の適切な会合を可能にするためにＰＡＭ配列およびＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを同じ（細菌）種から選択すべきであることは、当業者には理解されるであろう。例えば、ＣＡＳ９のＰＡＭ配列は、ｃｐＦ１のＰＡＭ配列とは異なる。設計は、適切なＰＡＭ配列に基づく。ガイドＲＮＡの分解を防止するために、ガイドＲＮＡの配列は、ＰＡＭ配列を含有すべきではない。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡ内の標的化配列の長さは、１２ヌクレオチドであり、他の実施形態では、ガイドＲＮＡ内の標的化配列の長さは、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５または４０ヌクレオチドである。ガイドＲＮＡは、標的ＤＮＡ配列のどちらかの鎖に相補的であり得る。一部の実施形態では、挿入または欠失を含むようにゲノムを改変すると、ｇＲＮＡを、タンパク質コード領域のＮ末端のより近くに標的化することができる。
ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼによる標的切断のために、ゲノム内にユニークである標的配列が、ゲノム内に１回より多く出現する標的配列より好ましいことは、当業者には理解されるであろう。バイオインフォマティクスソフトウェアを使用して、ガイドＲＮＡのオフターゲット効果を予測することおよび最小化することができる（例えば、数ある中でも特に、Naito et al. "CRISPRdirect: software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites" Bioinformatics (2014), epub；Heigwer, F., et al. "E-CRISP: fast CRISPR target site identification" Nat. Methods 11, 122-123 (2014)；Bae et al. "Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases" Bioinformatics 30(10):1473-1475 (2014)；Aach et al. "CasFinder: Flexible algorithm for identifying specific Cas9 targets in genomes" BioRxiv (2014)を参照されたい）。
Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９の場合、ゲノム内のユニーク標的配列は、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧ Ｎ（配列番号３０９）（＿は、Ａ、Ｇ、ＴまたはＣであり、Ｘは、任意のヌクレオチドであり得る）がゲノム内に１回だけ出現する、形態ＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧ（配列番号３０８）のＣａｓ９標的部位を含み得る。ゲノム内のユニーク標的配列は、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧ（配列番号３１１）（Ｎは、Ａ、Ｇ、ＴまたはＣであり、Ｘは、任意のヌクレオチドであり得る）がゲノム内に１回だけ出現する、形態ＭＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧ（配列番号３１０）のＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９標的部位を含み得る。Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＣＲＩＳＰＲ１ Ｃａｓ９の場合、ゲノム内のユニーク標的配列は、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＸＡＧＡＡＷ（配列番号３１３）（Ｎは、Ａ、Ｇ、ＴまたはＣであり、Ｘは、任意のヌクレオチドであり得、Ｗは、ＡまたはＴである）がゲノム内に１回だけ出現する、形態ＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＸＡＧＡＡＷ（配列番号３１２）のＣａｓ９標的部位を含み得る。ゲノム内のユニーク標的配列は、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＸＡＧＡＡＷ（配列番号３１５）（Ｎは、Ａ、Ｇ、ＴまたはＣであり、Ｘは、任意のヌクレオチドであり得、Ｗは、ＡまたはＴである）がゲノム内に１回だけ出現する、形態ＭＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＸＡＧＡＡＷ（配列番号３１４）のＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＣＲＩＳＰＲ １ Ｃａｓ９標的部位を含み得る。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９の場合、ゲノム内のユニーク標的配列は、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧＸＧ（配列番号３１７）（Ｎは、Ａ、Ｇ、ＴまたはＣであり、Ｘは、任意のヌクレオチドであり得る）がゲノム内に１回だけ出現する、形態ＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧＸＧ（配列番号３１６）のＣａｓ９標的部位を含み得る。ゲノム内のユニーク標的配列は、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧＸＧ（配列番号３１９）（Ｎは、Ａ、Ｇ、ＴまたはＣであり、Ｘは、任意のヌクレオチドであり得る）がゲノム内に１回だけ出現する、形態ＭＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧＸＧ（配列番号３１８）のＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９標的部位を含み得る。これらの配列の各々において、「Ｍ」は、Ａ、Ｇ、ＴまたはＣであり、配列をユニークと特定する際に「Ｍ」を考慮する必要がない。
一般に、「ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ融合配列」は、この用語が本明細書で使用される場合、ユニーク標的化配列に融合されている核酸配列であって、ガイドＲＮＡとＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼとを含む複合体の形成を可能にするように機能する核酸配列を指す。そのような配列は、（ｉ）本明細書に記載の標的配列に対応する「プロトスペーサー」と呼ばれる可変配列と（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ反復とを含む原核生物におけるＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）配列に倣って作ることができる。同様に、融合体のｔｒａｃｒＲＮＡ（「トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」）部分を、エンドヌクレアーゼ複合体の形成を可能にするために、原核生物におけるｔｒａｃｒＲＮＡ配列と同様の二次構造（例えば、ヘアピン）を含むように設計することができる。一部の実施形態では、融合体は、（１）対応するｔｒａｃｒ配列を含有する細胞においてｔｒａｃｒＲＮＡ配列と隣接しているガイド配列の切除、および（２）ｔｒａｃｒＲＮＡ配列とハイブリダイズしたｃｒＲＮＡ配列を含むエンドヌクレアーゼ複合体の標的配列における形成のうちの１つまたは複数を促進するのに十分なｔｒａｃｒＲＮＡ配列との相補性を有する。一般に、相補性度は、ｃｒＲＮＡ配列とｔｒａｃｒＲＮＡ配列とのこれら２配列の短い方の長さに沿っての最適なアラインメントに準拠している。最適なアラインメントを任意の適切なアラインメントアルゴリズムにより決定することができ、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列内またはｃｒＲＮＡ配列内のどちらかでの自己相補性などの二次構造がさらに説明され得る。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列とｃｒＲＮＡ配列との間のこれら２配列の短い方の長さに沿っての相補性度は、最適にアラインされた場合、約次の値であるか、または約次の値より大きい：２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７．５％、９９％、またはそれより高い。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００であるか、またはそれを超えるヌクレオチド長（例えば、長さ７０～８０、７０～７５、７５～８０ヌクレオチド）である。一実施形態では、ｃｒＲＮＡは、６０ヌクレオチド未満、５０ヌクレオチド未満、４０ヌクレオチド未満、３０ヌクレオチド未満、または２０ヌクレオチド長未満である。他の実施形態では、ｃｒＲＮＡは、３０～５０ヌクレオチド長であり、他の実施形態では、ｃｒＲＮＡは、３０～５０、３５～５０、４０～５０、４０～４５、４５～５０または５０～５５ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列およびｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、これら２配列間のハイブリダイゼーションが、ヘアピンなどの二次構造を有する転写物を生じさせるために単一の転写物に含有される。一部の実施形態では、ヘアピン構造に使用されるループ形成配列は、４ヌクレオチド長、例えば、配列ＧＡＡＡである。しかし、より長いまたはより短い配列を使用することができ、代替配列を使用することもできる。配列は、好ましくは、ヌクレオチドトリプレット（例えば、ＡＡＡ）、および追加のヌクレオチド（例えば、ＣまたはＧ）を含む。ループ形成配列の例としては、ＣＡＡＡおよびＡＡＡＧが挙げられる。一実施形態では、転写物または転写ｇＲＮＡ配列は、少なくとも１つのヘアピンを含む。一実施形態では、転写物または転写ポリヌクレオチド配列は、少なくとも２つまたはそれより多くのヘアピンを有する。他の実施形態では、転写物は、２つ、３つ、４つまたは５つのヘアピンを有する。さらなる実施形態では、転写物は、多くても５つのヘアピンしか有さない。一部の実施形態では、単一の転写物は、転写終結配列、例えば、ポリＴ配列、例えば６つのＴヌクレオチドをさらに含む。ガイド配列と、ｃｒＲＮＡ配列と、ｔｒａｃｒ配列とを含む、単一のポリヌクレオチドの非限定的な例は、以下の通りであり（５’から３’へと列挙されている）、ここで、「Ｎ」は、ガイド配列の塩基を表し、小文字の第１のブロックは、ｃｒＲＮＡ配列を表し、小文字の第２のブロックは、ｔｒａｃｒ配列を表し、最後のポリＴ配列は、転写ターミネーターを表す：（ｉ）ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮｇｔｔｔｔｔｇｔａｃｔｃｔｃａａｇａｔｔｔａＧＡＡＡｔａａａｔｃｔｔｇｃａｇａａｇｃｔａｃａａａｇａｔａａｇｇｃｔｔｃａｔｇｃｃｇａａａｔｃａａｃａｃｃｃｔｇｔｃａｔｔｔｔａｔｇｇｃａｇｇｇｔｇｔｔｔｔｃｇｔｔａｔｔｔａａＴＴＴＴＴＴ（配列番号３２０）；（ｉｉ）ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮｇｔｔｔｔｔｇｔａｃｔｃｔｃａＧＡＡＡｔｈｃａｇａａｇｃｔａｃａａａｇａｔａａｇｇｃｔｔｃａｔｇｃｃｇａａａｔｃａａｃａｃｃｃｔｇｔｃａｔｔｔｔａｔｇｇｃａｇｇｇｔｇｔｔｔｔｃｇｔｔａｔｔｔａａＴＴＴＴＴＴ（配列番号３２１）；（ｉｉｉ）ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮｇｔｔｔｔｔｇｔａｃｔｃｔｃａＧＡＡＡｔｇｃａｇａａｇｃｔａｃａａａｇａｔａａｇｇｃｔｔｃａｔｇｃｃｇａａａｔｃａａｃａｃｃｃｔｇｔｃａｔｔｔｔａｔｇｇｃａｇｇｇｔｇｔＴＴＴＴＴＴ（配列番号３２２）；（ｉｖ）ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａＧＡＡＡｔａｇｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａａｃｔｔｇａａａａａｇｔｇｇｃａｃｃｇａｇｔｃｇｇｔｇｃＴＴＴＴＴＴ（配列番号３２３）；（ｖ）ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａＧＡＡＡＴＡＧｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａａｃｔｔｇａａａａａｇｔＴＴＴＴＴＴＴ（配列番号３２４）；および（ｖｉ）ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａｇＡＡＡＴＡＧｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａＴＴＴＴＴＴＴＴ（配列番号３２５）。一部の実施形態では、配列（ｉ）～（ｉｉｉ）は、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＣＲＩＳＰＲ１からのＣａｓ９と組み合わせて使用される。一部の実施形態では、配列（ｉｖ）～（ｖｉ）は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓからのＣａｓ９と組み合わせて使用される。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、ｃｒＲＮＡ配列を含む転写物とは別個の転写物である。
一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、２つのＲＮＡ分子を含むことができ、本明細書では「デュアルガイドＲＮＡ」または「ｄｇＲＮＡ」と呼ばれる。一部の実施形態では、ｄｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡを含む第１のＲＮＡ分子、およびｔｒａｃｒＲＮＡを含む第２のＲＮＡ分子を含み得る。第１および第２のＲＮＡ分子は、ｃｒＲＮＡ上の旗竿とｔｒａｃｒＲＮＡ上の旗竿との間の塩基対合によってＲＮＡ二重鎖を形成し得る。ｄｇＲＮＡを使用する場合、旗竿に長さに関する上限を設ける必要がない。
他の実施形態では、ガイドＲＮＡは、単一のＲＮＡ分子を含むことができ、本明細書では「シングルガイドＲＮＡ」または「ｓｇＲＮＡ」と呼ばれる。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡに共有結合で連結されているｃｒＲＮＡを含むことができる。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとをリンカーを介して共有結合で連結させることができる。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ上の旗竿とｔｒａｃｒＲＮＡ上の旗竿との間の塩基対合によるステム－ループ構造を含むことができる。一部の実施形態では、シングルガイドＲＮＡは、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０ヌクレオチド長であるか、それを超えるヌクレオチド長（例えば、長さ７５～１２０、７５～１１０、７５～１００、７５～９０、７５～８０、８０～１２０、８０～１１０、８０～１００、８０～９０、８５～１２０、８５～１１０、８５～１００、８５～９０、９０～１２０、９０～１１０、９０～１００、１００～１２０、１００～１２０ヌクレオチド長）である。一部の実施形態では、ベクターまたはその組成物は、少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする核酸を含む。例えば、第２のポリヌクレオチド配列は、少なくとも１個のｇＲＮＡ、少なくとも２個のｇＲＮＡ、少なくとも３個のｇＲＮＡ、少なくとも４個のｇＲＮＡ、少なくとも５個のｇＲＮＡ、少なくとも６個のｇＲＮＡ、少なくとも７個のｇＲＮＡ、少なくとも８個のｇＲＮＡ、少なくとも９個のｇＲＮＡ、少なくとも１０個のｇＲＮＡ、少なくとも１１個のｇＲＮＡ、少なくとも１２個のｇＲＮＡ、少なくとも１３個のｇＲＮＡ、少なくとも１４個のｇＲＮＡ、少なくとも１５個のｇＲＮＡ、少なくとも１６個のｇＲＮＡ、少なくとも１７個のｇＲＮＡ、少なくとも１８個のｇＲＮＡ、少なくとも１９個のｇＲＮＡ、少なくとも２０個のｇＲＮＡ、少なくとも２５個のｇＲＮＡ、少なくとも３０個のｇＲＮＡ、少なくとも３５個のｇＲＮＡ、少なくとも４０個のｇＲＮＡ、少なくとも４５個のｇＲＮＡ、または少なくとも５０個のｇＲＮＡをコードし得る。第２のポリヌクレオチド配列は、ｇＲＮＡ１個～ｇＲＮＡ５０個の間、ｇＲＮＡ１個～ｇＲＮＡ４５個の間、ｇＲＮＡ１個～ｇＲＮＡ４０個の間、ｇＲＮＡ１個～ｇＲＮＡ３５個の間、ｇＲＮＡ１個～ｇＲＮＡ３０個の間、ｇＲＮＡ１個～異なるｇＲＮＡ２５個の間、ｇＲＮＡ１個～ｇＲＮＡ２０個の間、ｇＲＮＡ１個～ｇＲＮＡ１６個の間、ｇＲＮＡ１個～異なるｇＲＮＡ８個の間、異なるｇＲＮＡ４個～異なるｇＲＮＡ５０個の間、異なるｇＲＮＡ４個～異なるｇＲＮＡ４５個の間、異なるｇＲＮＡ４個～異なるｇＲＮＡ４０個の間、異なるｇＲＮＡ４個～異なるｇＲＮＡ３５個の間、異なるｇＲＮＡ４個～異なるｇＲＮＡ３０個の間、異なるｇＲＮＡ４個～異なるｇＲＮＡ２５個の間、異なるｇＲＮＡ４個～異なるｇＲＮＡ２０個の間、異なるｇＲＮＡ４個～異なるｇＲＮＡ１６個の間、異なるｇＲＮＡ４個～異なるｇＲＮＡ８個の間、異なるｇＲＮＡ８個～異なるｇＲＮＡ５０個の間、異なるｇＲＮＡ８個～異なるｇＲＮＡ４５個の間、異なるｇＲＮＡ８個～異なるｇＲＮＡ４０個の間、異なるｇＲＮＡ８個～異なるｇＲＮＡ３５個の間、異なるｇＲＮＡ８個～異なるｇＲＮＡ３０個の間、異なるｇＲＮＡ８個～異なるｇＲＮＡ２５個の間、異なるｇＲＮＡ８個～異なるｇＲＮＡ２０個の間、異なるｇＲＮＡ８個～異なるｇＲＮＡ１６個の間、異なるｇＲＮＡ１６個～異なるｇＲＮＡ５０個の間、異なるｇＲＮＡ１６個～異なるｇＲＮＡ４５個の間、異なるｇＲＮＡ１６個～異なるｇＲＮＡ４０個の間、異なるｇＲＮＡ１６個～異なるｇＲＮＡ３５個の間、異なるｇＲＮＡ１６個～異なるｇＲＮＡ３０個の間、異なるｇＲＮＡ１６個～異なるｇＲＮＡ２５個の間、または異なるｇＲＮＡ１６個～異なるｇＲＮＡ２０個の間をコードし得る。異なるｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列の各々は、プロモーターに作動可能に連結され得る。異なるｇＲＮＡに作動可能に連結されているプロモーターは、同じプロモーターであってもよい。異なるｇＲＮＡに作動可能に連結されているプロモーターは、異なるプロモーターであってもよい。プロモーターは、構成的モータプロモーター、誘導性プロモーター、抑制性プロモーター、または制御性プロモーターであってもよい。
一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ノックインが、またはノックアウト欠損が、または欠陥遺伝子の修正がうまくいく、ＣＦＴＲ配列標的領域を標的とすることになる。既知のＣＦＴＲ標的領域に結合する複数のｇＲＮＡ配列が設計されている。ＣＦＴＲを標的とするｇＲＮＡ配列の非限定的な例は、表３に収載されている。
一部の実施形態では、治療用核酸は、ＣＦＴＲを標的とする遺伝子編集分子である。
一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、ミスフォールディング、小胞体保留、およびＣＦＴＲタンパク質の早期分解を引き起こす最も多く見られるＣＦＴＲ突然変異、第１１エクソンの５０８位におけるフェニルアラニンの欠失（ＣＦＴＲ Ｆ５０８ ｄｅｌ）、を標的とする。
一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、ＣＦＴＲを標的とし、野生型ＣＦＴＲ配列をコードするドナープラスミドと一緒にＣＦＴＲ第１１エクソンまたは第１１イントロンを標的とするｇＲＮＡを含むが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、ＣＦＴＲ突然変異を標的とし、ＣＦＴＲ第１１エクソンまたは第１１イントロンを標的とするｇＲＮＡを含むが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、ＣＦＴＲを標的とし、野生型ＣＦＴＲ配列をコードするドナープラスミドと一緒にＣＦＴＲ第１１エクソンまたは第１１イントロンを標的とするｇＲＮＡを含むが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、ＣＦＴＲ突然変異を標的とし、野生型ＣＦＴＲ配列をコードするドナープラスミドと一緒にＣＦＴＲ第１１エクソンまたは第１１イントロンを標的とするｇＲＮＡを含むが、これらに限定されない。
表４に収載されているｇＲＮＡ配列は、ヒトゲノム内のＣＦＴＲ遺伝子を一意的に標的とする。これらのｇＲＮＡ配列は、ゲノム編集のためにＤＳＢを導入するために、ＷＴ ＳｐＣａｓ９とともに使用するためのものであるか、ＷＴ ＳｐＣａｓ９タンパク質とともに使用されるｃｒＲＮＡとして使用するためのものである。これらのｓｇＲＮＡ配列は、Sanjana N.E., Shalem O., Zhang F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nat Methods. 2014 Aug;11(8):783-4において検証された。
Figure 2022516661000020
一部の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子編集分子は、ｇＲＮＡまたはｇＤＮＡである。
一部の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子編集分子は、ＳＡＭでの転写活性化のためのｇＲＮＡである。
一部の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子編集分子は、アクチベーターＲＮＡである。
表５に収載されている以下のｇＲＮＡ配列は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９相乗的活性化メディエーター（ＳＡＭ）複合体とともに使用された場合、ヒトゲノム内の内在性ＣＦＴＲ遺伝子の転写をユニークかつ頑強に活性化する。これらのｇＲＮＡは、転写開始部位（ＴＳＳ）の上流の最初の２００ｂｐを特異的に標的とする。これらの有効なｓｇＲＮＡ配列は、Konermann S et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature, 2015 Jan 29;517(7536):583-8において発表された。
Figure 2022516661000021
一部の実施形態では、配列特異的ヌクレアーゼは、核酸誘導型ヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはメガＴＡＬから選択される。
一部の実施形態では、配列特異的ヌクレアーゼは、一塩基エディター、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、およびＤＮＡ誘導型ヌクレアーゼから選択される、核酸誘導型ヌクレアーゼである。
本明細書に記載されるヌクレアーゼを、配列特異的ヌクレアーゼを設計するために、変更、例えば操作することができる（例えば、米国特許第８，０２１，８６７号を参照されたい）。ヌクレアーゼは、例えば、Certo, MT et al. Nature Methods (2012) 9:073-975；米国特許第８，３０４，２２２号、同第８，０２１，８６７号、同第８，１１９，３８１号、同第８，１２４，３６９号、同第８，１２９，１３４号、同第８，１３３，６９７号、同第８，１４３，０１５号、同第８，１４３，０１６号、同第８，１４８，０９８号、または同第８，１６３，５１４号（各々の内容は、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている方法を使用して設計することができる。あるいは、部位特異的切断特性を有するヌクレアーゼを、市販の技術、例えば、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓのＤｉｒｅｃｔｅｄ Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｅｄｉｔｏｒ（商標）ゲノム編集技術を使用して得ることができる。
ある特定の実施形態では、ベクター構築物は、相同組換え修復鋳型、ガイドＲＮＡおよび／もしくはＣａｓ酵素、または任意の他のヌクレアーゼを含み、これらは、例えば、ｉ）ガイドＲＮＡをコードする核酸、ｉｉ）または所望のヌクレアーゼ、例えばＣａｓ酵素もしくは他のヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを投与することにより、ｉｉｉ）あるいはＣａｓ酵素とガイドＲＮＡとを含むリボヌクレオチドタンパク質（ＲＮＰ）複合体を投与すること、またはｉｖ）例えば、ベクター、例えばウイルス、プラスミドもしくは別のベクターによる組換えヌクレアーゼタンパク質の送達により、トランスに送達される。
一部の実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼである。
一実施形態では、ベクターは、誘導性プロモーターにより転写段階で制御されるエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）を含み得る。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、別個のベクター上にあり、これを、相同アームおよびドナー配列を含み、必要に応じてガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）も含み得る、ベクターを用いて対象に投与することができる。
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、Ｃａｓヌクレアーゼである。
一実施形態では、ベクターのカクテルを投与することができる。例えば、異なる遺伝子編集分子の組合せ。
別の実施形態では、遺伝子編集分子と、短縮型ＣＦＴＲ遺伝子などの治療用ＣＦＴＲ遺伝子を含有する第２のベクターとを投与することができる。
免疫バリア
自然および適応免疫応答は、遺伝子移入成功の大きな障壁である。肺は、宿主を病原体から保護する多層の精巧な防御機構を有する。この応答における重要なプレーヤーは、マクロファージ、樹状細胞、好中球およびリンパ球を含む。病原体認識受容体は、病原体関連分子パターンの検出によって急性および一過性自然免疫応答を誘発する。気道上皮において発現される病原体認識受容体には、Ｔｏｌｌ様受容体、抗ウイルス性細胞質ヘリカーゼ（ＲＩＧ－ＩおよびＭＤＡ５）、およびヌクレオチドオリゴマー化ドメイン様受容体がある。病原体分子の認識はもちろん、一部の遺伝子移入ベクターも、炎症性サイトカインの分泌および抗原提示細胞の成熟をもたらす。
物理的バリア
ＣＦＴＲ遺伝子が１９８９年に最初にクローニングされて以来、ＣＦ肺疾患の是正のためのいくつかの遺伝子治療戦略が研究されてきた。しかし、ベクター系の送達は、困難であった。これは、濃い分泌物を含むがこれらに限定されない、外来粒子を排除するようにまたはそれらの取込みを防止するように進化した複数の精巧な肺気道バリアに、一部は、起因し、ＣＦ肺における慢性感染および炎症の二次的影響が、遺伝子移入に対するさらなるバリアとなる。
肺は、外来粒子および病原体が気道細胞に接近するのを防止するために複数のバリアを進化させてきた。誘導気道表面は、内側が線毛上皮により覆われている。線毛は、線毛間液層に浸かっている。別の重要な物理的バリアである粘液層が、線毛間液層を覆っている。表面気道杯細胞および粘膜下腺により分泌されるムチンが、粘液の主成分である。粘液層は、吸入された粒子を捕捉し、それらを粘液線毛クリアランスにより除去する。炭水化物、糖タンパク質および多糖類で構成されている、頂端表面グリコカリックスが、別のバリアである。このグリコカリックスは、吸入された粒子に結合し、それらの粒子が細胞表面受容体に到達するのを防止する。
嚢胞性線維症（ＣＦ）を処置するための方法であって、カプシド内に治療用導入遺伝子を含有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであるウイルスベクターを、気管支動脈カテーテル法による送達により対象に投与するステップを含む方法が、本明細書に記載される。
用語「モジュレートすること」は、本明細書で使用される場合、例えば活性を、測定可能な量で増加または減少させることを意味する。ＣＦＴＲアニオンチャネルの活性を増加させることによりＣＦＴＲ活性をモジュレートする化合物は、アゴニストと呼ばれる。ＣＦＴＲアニオンチャネルの活性を減少させることによりＣＦＴＲ活性をモジュレートする化物は、アンタゴニストと呼ばれる。
句「ＣＦＴＲ媒介疾患を処置することまたはその重症度を低減させること」は、ＣＦＴＲ活性によって直接引き起こされる疾患の処置と、ＣＦＴＲアニオンチャネル活性によって直接引き起こされない疾患の症状の緩和との両方を指す。症状がＣＦＴＲ活性による影響を受ける可能性がある疾患の例としては、嚢胞性線維症、遺伝性肺気腫、遺伝性ヘモクロマトーシス、凝固－線溶不全、例えばプロテインＣ欠乏症、１型遺伝性血管性浮腫、脂質プロセシング不全、例えば家族性高コレステロール血症、１型カイロミクロン血症、無ベータリポタンパク血症、リソソーム蓄積症、例えばＩ細胞病／偽ハーラー、ムコ多糖症、サンドホフ／テイ・サックス、クリグラー・ナジャーＩＩ型多腺性内分泌障害／高インスリン血症、糖尿病、ラロン型低身長症、ミエロペルオキシダーゼ（Myleoperoxidase）欠損症、原発性副甲状腺機能低下症、黒色腫、グリカノーシスＣＤＧ１型、遺伝性肺気腫、先天性甲状腺機能亢進症、骨形成不全症、遺伝性低フィブリノゲン血症、ＡＣＴ欠損症、尿崩症（ＤＩ）、神経鎖錐体性（Neurophyseal）ＤＩ、腎性（Neprogenic）ＤＩ、シャルコー・マリー・トゥース症候群、ペリツェウス・メルツバッハー病、神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、進行性核上性麻痺、ピック病、いくつかのポリグルタミン神経障害、例えば、ハンチントン、脊髄小脳失調症（Spinocerebullar ataxia）Ｉ型、球脊髄性筋萎縮症、歯状核赤核淡蒼球ルイ体型（Dentatorubal pallidoluysian）、および筋強直性ジストロフィー、ならびに海綿状脳症、例えば遺伝性クロイツフェルト・ヤコブ病、ファブリー病、ストロイスラー・シャインカー症候群、ＣＯＰＤ、ドライアイ疾患、ならびにシェーグレン病が挙げられる。
ＣＦ疾患特異的治療
下記の疾患特異的治療には、以下のものが含まれる：経口用のＫＡＬＹＤＥＣＯ（登録商標）（イバカフトル）錠、最初の米国承認：２０１２年、上皮細胞表面でＣＦＴＲタンパク質を依然として産生する、より軽度の（およびより低頻度の）突然変異を対象にして；経口用のＯＲＫＡＭＢＩ（登録商標）（ルマカフトル／イバカフトル）錠、米国承認：２０１５年、最も多く見られる重度突然変異を対象にしたＦ５０８ｄｅｌ突然変異の２つのコピー（Ｆ５０８ｄｅｌ／Ｆ５０８ｄｅｌ）を有するＣＦ患者の処置用；および経口用のＳＹＭＤＥＫＯ（商標）（テザカフトル／イバカフトル）錠、最初の米国承認：２０１８年、単一Ｆ５０８ｄｅｌヘテロ接合体およびＫａｌｙｄｅｃｏによりカバーされない一部の他の突然変異の処置を対象にして。
対症処置
対症処置は、気道粘液の粘度を低減させるための噴霧用高張食塩水、ドルナーゼアルファおよびマンニトールドライパウダー；地域流行性Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ感染症を処置するための抗生物質（多くの場合、ネブライザー投与用）；気道開存性を向上させるための気管支拡張薬；分泌物を柔らかくするためのステロイド、毎日の胸部マッサージ、振動および連打を含む。
したがって、特に、最も多く見られる重度突然変異について、まだ対処されていない有意な医療ニーズがある。
ＣＦＴＲ遺伝子の静脈内送達
非気道研究を考えると、静脈内ベクター送達は、マウスで研究されてきたが、大部分が肺胞遺伝子移入、および気管支樹の上皮へのほんの低レベルの遺伝子送達という結果になっている。
気管支動脈経由のＣＦＴＲ遺伝子の送達
本明細書に記載の全身の動脈経路を標的とするＡＡＶベクターの気管支動脈経由での粘液産生性気管支気道への送達は、遺伝子治療ベクターの現在の制限を克服することになる。
嚢胞性線維症（ＣＦ）を処置するための方法であって、カプシド内に治療用導入遺伝子を含有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであるウイルスベクターを気管支動脈カテーテル法による送達により、対象に投与するステップを含む方法は、本明細書に記載される通りである。
気管支動脈は、動脈血を肺に供給し、最も一般的には下行大動脈から分岐するが、いくつかの異常起源が記載されている。気管支動脈は、小枝が毛細血管網を構造気道、粘膜、気道平滑筋および外膜に供給している気管支血管鞘内に気道と平行して走行している。気管支動脈の最大径は、気道の外膜に見られ得る。これらの枝から分岐している粘膜下毛細血管は、ほとんど知覚できない。静脈側では、気管支毛細血管は、肺静脈毛細血管および細静脈、奇静脈、ならびに近位気道において気管支静脈の限られた複合体と、複雑な吻合パターンを形成する－全てではないがほとんどの静脈血は、肺静脈を辿って左心房に戻る。
可能な動物モデルのうち、ヒツジは、ヒトの解剖学的構造および生理機能に最も近い肺を有し、気管支循環生理機能の研究に広く使用されており、経験豊富な人が担当している血管研究によく耐える。ヒツジの場合、気管支動脈は、両方の肺への体血流の８０％を供給する単一の気管分岐部大血管として生じる。この動脈の入口部の直径は、１～６ｍｍまで様々であり、ベクター送達のための５フレンチガイディングカテーテルを許容するであろう。動脈は、肺へ下降し、粘液分泌腺を包囲している粘膜下層における呼吸上皮の直ぐ下にある細い血管（直径５～２０ｕｍ）の豊富な気管支周囲毛細血管叢を提供する遠位終末細気管支まで、枝経由で主および副気管支に血液を供給する。顕微鏡レベルで、気管支動脈枝は、それらが明確に定義される外弾性板を有さない点で、それらの肺動脈対応物とは組織学的に明確に異なる。これらの細動脈から分岐している毛細血管の内皮は、有窓型のものであり、気管支粘膜への流体の通過を増進し、かつ内皮細胞間結合により能動輸送によって好中球の毛細血管通過を増進する。これらの解剖学的要因は、気管支動脈によって送達されるＡＡＶベクターが、全ての気管支の粘膜下層に、したがって全ての標的細胞に到達する可能性が高いはずである理由を強調する。
ヒトにおける気管支動脈手法
本明細書で使用される場合、用語「気管支動脈」は、栄養と酸素を豊富に含んだ血液とを肺の構造要素に供給する動脈を指す。ヒトにおける気管支動脈供給は、多少可変的である。通常は、左肺へ走行する２本の気管支動脈、および右肺への１本がある。左気管支動脈（上および下）は、胸部大動脈から直接分岐している。単一の右気管支動脈は、通常は、次のうちの１つから分岐している：１）胸部大動脈の右第３後肋間動脈との共通幹、２）上気管支動脈の左側、３）任意の数の右肋間動脈、主として３番目の右後肋間動脈。気管支動脈は、肺の気管支および結合組織に血液を供給する。気管支動脈は、気管支とともに走行し、気管支で分枝し、一般に呼吸細気管支レベルで終わる。栄養素および酸素を気管支および細気管支に供給した後、気管支毛細血管は、肺細静脈の枝と吻合することによって肺静脈循環に戻る。気管支血管は、肺の臓側胸膜にも供給する。気管支動脈により供給される血液の多くは、肺静脈によって戻ってくるので、右側循環にではなく左心に戻ってくる血液は、肺毛細血管床レベルで見られる血液より酸素含有量がわずかに少ない。
気管支動脈カテーテル法
ヒトにおける経皮的手法による気管支動脈カテーテル法は、最初は気管支悪性病変の直接化学療法処置のために、その後は重度喀血患者の塞栓療法のために、３３年にわたって実施されている。気管支動脈カテーテル法は、血管インターベンショニスト間で定評のある技法である。気管支動脈カテーテル法は、喀血のエピソードを経験する嚢胞性線維症患者に対して定期的に実施されており、特に気管支動脈がかなり拡張されるので、治療薬送達に適しているであろう（Burke TC. and Mauro MA. (2004) Bronchial artery embolization. Semin Intervent Radiol. 2004 Mar;21(1):43-8）。
一実施形態では、本発明は、治療剤がカテーテルを通って移動して標的部位に到達しなければならない距離を効果的に短縮するために薬物送達ユニットをその遠位端に有するカテーテルを提供する。
気管支動脈系
本明細書で使用される場合、「細気管支（ｂｒｏｎｃｈｉｏｌｅｓ）」または「細気管支（ｂｒｏｎｃｈｉｏｌｅ）」は、空気が、鼻または口を通って、枝が粘膜下層にもはや軟骨も腺も含有しない肺の肺胞（空気嚢）に進む、通路を指す。細気管支は、気管支の枝であり、呼吸器系の導管部の一部である。細気管支は、まだ導管部内にある、より小さい終末細気管支へとさらに分岐し、次いで、これらの終末細気管支がより小さい呼吸細気管支へと分岐し、これらの呼吸細気管支が呼吸部の始まりを示す。
本明細書に記載される場合の「細気管支」は、終末細気管支および呼吸細気管支を含む。
左および右気管支である、各肺における、一次気管支は、二次気管支を生じさせる。次に、これらの二次気管支が三次気管支を生じさせる。これらの三次気管支が細気管支へとさらに分岐する。これらの細気管支は、それらの壁が硝子軟骨を有さない点、およびそれらがそれらの上皮内層にクラブ細胞を有する点で、三次気管支とは組織学的に明確に異なる。上皮は、単層線毛円柱上皮として始まり、細気管支のサイズが減少するにつれて単層線毛立方上皮に変化する。細気管支の直径は、多くの場合、１ｍｍ未満と言われているが、この値には、５ｍｍから０．３ｍｍまで幅があり得る。上述の通り、これらの細気管支は、それらの開存性を維持するために硝子軟骨を有さない。その代わりに、それらの細気管支は、支持のために周囲の肺組織に付着された弾性線維に依存する。これらの細気管支の内層（粘膜固有層）は、薄く、腺が存在せず、平滑筋の層に包囲されている。細気管支は、どんどん細くなって、終末細気管支へと分岐する。これらの細気管支は、気道の第１分岐から第１６分岐までに及ぶ導管部の終わりを示す。肺胞は、導管部が気道の第１６から第２３分岐までの呼吸部へと変化して初めて存在することになる。
終末細気管支
終末細気管支は、導管部の最も遠位の区域である。終末気管支は、小さい細気管支から枝分かれする。終末細気管支の各々が分岐して、少数の肺胞を含有する呼吸細気管支を形成する。終末細気管支は、クラブ細胞を含有する単層立方上皮で内側が覆われている。終末細気管支は、限られた数の線毛細胞を含有し、杯細胞を含有しない。クラブ細胞は、非線毛性、円形タンパク質分泌細胞である。それらの分泌物は、最小の細気管支内の気道を維持するために、非粘着性のタンパク質様化合物である。サーファクタントと呼ばれるこの分泌物は、表面張力を低減させ、その結果、細気管支が吸気中に拡張すること、および細気管支が呼気中に虚脱するのを防ぐことを可能にする。呼吸器系の幹細胞であるクラブ細胞は、気道分泌物に溶解している物質を無毒化する酵素を産生する。
呼吸細気管支
呼吸細気管支は、直径が５０分の１インチである、肺の最も狭い気道である。この気管支は、何度も分岐した後、細気管支へと進展。細気管支は、空気を肺の交換面に送達する。これらの細気管支は、壁の薄い膨出部である肺胞により遮られる。肺胞管は、呼吸細気管支の遠位に続くものである。
肺
肺は、ヒトにおけるならびに少数の魚類および一部の巻き貝を含む多くの他の動物における呼吸器系の主要臓器である。哺乳動物および大部分の他の脊椎動物では、２つの肺が心臓の両側の背骨付近に位置する。呼吸器系におけるそれらの機能は、ガス交換プロセスで、大気から酸素を抽出し、それを血流に移送すること、および二酸化炭素を血流から大気に放出することである。呼吸は、異なる種では異なる筋肉系により駆動される。哺乳動物、爬虫類および鳥類は、それらの異なる筋肉を使用して、呼吸を支援し、助長する。初期四肢動物では、空気は、咽頭筋により頬側ポンピングによって肺に送り込まれており、これは、両生類にいまだに見られる機構である。ヒトの場合、呼吸を駆動する主な呼吸筋は、横隔膜である。肺は、ヒトの発話を含む声帯音を可能にする空気の流れももたらす。
肺は、胸部の胸郭内の心臓の両側に位置する。肺は、円錐形の形状であり、頂部に狭く丸い尖部があり、広い凹状の基部が横隔膜の凸面に存在する。肺の尖部は、首の付け根に伸び、第１肋骨の胸骨端レベルのすぐ上に達する。肺は、胸郭内の背骨付近から胸部前面に及び、気管の下方部分から下方へ横隔膜に及ぶ。左肺は、心臓と空間を共有し、これに適応するために、左肺の心切痕と呼ばれる圧痕をその縁に有する。肺の前および外側は、肋骨に面しており、このことから肺の表面に軽度の圧痕が生じる。肺の内側面は、胸部の中央に面しており、心臓、大血管、および気管が２本の主気管支に分岐する気管分岐部に対して位置する。心圧痕は、肺が心臓にもたれてかかっている肺表面に形成される圧痕である。
両方の肺には、肺根に門と呼ばれる中央のくぼみがあり、ここから血管および気道が肺に入る。気管支肺リンパ節も門にある。
肺は、肺胸膜に包囲されている。これらの胸膜は、２つの漿膜であり、外側の壁側胸膜は、胸郭の内壁を覆っており、内側の臓側胸膜は、肺の表面の内側を直接覆っている。胸膜の間に、潤滑胸膜液の薄層を含有する胸膜腔と呼ばれる潜在空隙がある。各肺は、葉間裂としての胸膜の陥入により葉に分けられる。葉間裂は、肺を分割し、肺の拡張を助ける、胸膜の二重ひだである。
主または一次気管支は、門から肺に入り、最初に、肺の各葉に空気を供給する葉気管支としても公知の二次気管支に枝分かれする。葉気管支は、区域気管支としても公知の三次気管支に枝分かれし、これらの三次気管支は、気管支肺区域として公知の葉のさらなる区画に空気を供給する。各気管支肺区域には、それ自体の（区域）気管支をおよび動脈供給がある。左および右肺の区域は、表に示されている。区域解剖は、肺における疾患の過程の局在定位に臨床的に有用である。区域は、周囲組織に深刻な影響を与えることなく外科的に摘出することができる別個の単位である。
肺は、下気道の一部であり、気管支気道を、それらが気管から枝分かれしたときに受け入れる。肺は、肺胞で終わる気管支気道、間にある肺組織、ならびに静脈、動脈、神経およびリンパ管を含む。気管および気管支は、それらの粘膜および粘膜下層内に毛細リンパ管叢を有する。より小さい気管支は単一の層を有し、それらは肺胞には非存在である。
気管、気管支および細気管支を含む下気道の全ては、内側が呼吸上皮で覆われている。この呼吸上皮は、粘液を産生する杯細胞と、マクロファージと同様の作用を有するクラブ細胞とが散在している、線毛上皮である。気管における軟骨の不完全な輪、および気管支におけるより小さい軟骨板が、これらの気道の開口を維持する。細気管支は、狭すぎて軟骨を支持することができず、細気管支の壁は、平滑筋からなり、平滑筋は、主に上皮のみからなる、より狭い呼吸細気管支には非存在であること多い。気道は、小葉で終わる。各小葉は、呼吸細気管支からなり、呼吸細気管支は、肺胞管および肺胞嚢に枝分かれし、そしてまた、肺胞嚢が肺胞に分岐する。
気道全体の上皮細胞が上皮被覆液（ＥＬＦ）を分泌し、その組成は厳重に制御され、その組成によって粘液線毛クリアランスがどの程度機能するのかが決まる。肺胞は、２つの肺胞細胞型と肺胞マクロファージとからなる。これら２つの細胞型は、Ｉ型およびＩＩ型肺胞細胞（肺細胞としても公知）として公知である。ＩおよびＩＩ型は、壁および肺胞中隔を構成する。Ｉ型細胞は、各肺胞の表面積の９５％を提供し、平坦（「扁平」）であり、ＩＩ型細胞は、一般に、肺胞の隅にクラスターを形成し、立方体状の形状を有する。
Ｉ型は、肺胞の壁構造を構成する扁平上皮細胞である。それらは、容易なガス交換を可能にする極めて薄い壁を有する。これらのＩ型細胞は、各肺胞を分離する肺胞中隔も構成する。これらの中隔は、上皮内層および関連基底膜からなる。Ｉ型細胞は、分裂することができず、それ故、ＩＩ型細胞からの分化に頼る。ＩＩ型のほうが大きく、ＩＩ型は、肺胞の内側を覆っており、上皮被覆液および肺サーファクタントを産生および分泌する。ＩＩ型細胞は、分裂することができ、Ｉ型細胞に分化することができる。
肺胞マクロファージには、重要な免疫学的役割がある。それらは、血管から押し出された、解放された赤血球を含む、肺胞内に蓄積する物質を除去する。肺は、肺実質に付着している疎性結合組織の下位層を有する、臓側胸膜の漿膜に包囲されている。
下気道は、呼吸器系の一部であり、気管と、肺を含む気管より下の構造とからなる。気管は、咽頭から空気を受け取り、下方へ、気管が右気管支と左気管支に分かれる場所（気管分岐部）に至るまで走行する。これらの気管支は、空気を右および左肺に供給し、それらが呼吸細気管支になるまで漸進的に肺葉の二次および三次気管支へそして益々小さい細気管支へと分かれる。次に、これらの呼吸細気管支は、肺胞管経由で肺胞に空気を供給し、肺胞でガス交換が行われる。吸い込まれた酸素は、肺胞壁を通って覆っている毛細血管へ、そして循環へと拡散し、二酸化炭素は、血液から肺に拡散して吐き出される。
導管部の気管支は、気道の開口を保持するために硝子軟骨で強化されている。細気管支は、軟骨を有さず、その代わりに平滑筋によって包囲されている。空気は、導管部によって３７℃（９９°Ｆ）に加温され、加湿され、浄化され、空気から粒子は粘液層上に捕捉されることになり、その後、通路の内側を覆っている呼吸上皮上の線毛により除去される。
気道の平滑筋中の肺伸展受容器は、強い吸気中の肺の過膨張を防止する、ヘーリング・ブロイウェル反射として公知の反射を開始する。
気管支および肺循環
肺には、気管支および肺循環により提供される二重の血液供給がある。気管支循環は、大動脈が起源である気管支動脈によって、酸素を豊富に含んだ血液を肺の構造要素および気道に供給する。通常は３本の動脈、左肺への２本および右肺への１本があり、これらが気管支および細気管支と並行して枝分かれする。肺循環は、脱酸素化された血液を心臓から肺に運び、酸素を豊富に含んだ血液を心臓に戻して体の他の部位に供給する。肺の血液量は、平均約４５０ミリリットルであり、これは、全循環系の総血液量の約９パーセントである。この量は、正常な血液量の２分の１～２倍の間で容易に変動し得る。
気管支動脈
肺は、次の二重の血管系によって支配されている：（１）低圧肺系（１５～３０ｍｍＨｇ）は、右心室から分岐し、脱酸素化された血液（心拍出量の１００％）をガス交換のために肺胞に運び、その後、酸素を豊富に含んだ血液を左心室による全身送達のために左心房に戻す、肺動脈を含む。（２）気管支動脈系は、胸部大動脈の動脈枝から分岐する高圧左（全身）循環（１１０～１４０ｍｍＨｇ）の一部である。通常の人々の心拍出量のわずか約０．５％に相当する、気管支動脈が、気管から呼吸細気管支までの気管支と気管上皮とを含む気道構造（気道の１～２３枝）に対する唯一の栄養供給である。
気管支動脈は、典型的にはＴ３～Ｔ８レベルで胸部大動脈から分岐し、気管支、迷走神経、縦隔後部および食道にも供給する。動脈の８０パーセントがＴ５～Ｔ６レベルから分岐する。気管支動脈の解剖学的構造の多くの変形形態が記載されている。より多く見られる組合せとしては、単一の右肋間気管支（ＩＣＢ）幹と単一の左気管支動脈、共通の幹から分岐している単一の右ＩＣＢ幹および単一の左気管支動脈、ならびに単一の右ＩＣＢ幹と２本の左気管支動脈が挙げられる。左ＩＣＢ幹は、識別されていなが、右気管支動脈は、肋間動脈と起点を共有することが多い。気管支動脈の２０％もが、大動脈以外の異例の起点を有する。異常な起点としては、鎖骨下、甲状頸、内胸、腕頭、心膜横隔、最上肋間、腹部大動脈、および下横隔動脈が挙げられる。気管支肺動脈吻合は、慢性炎症または肺高血圧症患者ではかなり顕著であり得る。肺実質は、肋間、乳、横隔、甲状頸、腋窩および鎖骨下動脈経由で胸膜間全身側副循環から気管支循環への動脈血供給を受け得る。
本明細書に記載の気管支系の毛細血管床は、この細胞層の拡散性栄養素の主供給源を代表する、気道の偽円柱上皮の基底膜の直下、約５～１５μｍの距離に存在する。
気管支動脈系の重要な特徴は、心臓に血液を戻すための対応する気管支静脈がないことである。その代わりに、気管支毛細血管は、一連の複雑なシャント血管によって、左心房に戻る全身肺静脈系の小静脈と－一部は奇静脈へ枝とも－融合している。これは、注入手順中に麻酔薬リザーバーバッグを過膨張させることにより肺（肺胞）毛細血管を圧縮することによって気管支動脈毛細血管床内の流れを妨げる（およびベクター拡散を増加させる）機会を治療薬送達中にもたらす。
気道上皮は、偽円柱状であるので、全ての細胞は、基底上皮細胞であろうと、推定的前駆細胞であろうと、クララ細胞（粘液産生性）であろうと、線毛上皮細胞であろうと、または希少細胞型、例えばイオノサイト（推定的Ｃｌ－イオン発現細胞）であろうと、全て、下層気管支毛細血管に同等に接近して基底膜に直接付着する。
様々な上皮細胞の代謝回転率は、特に、ＣＦなどの疾患状態に関して、ほとんど理解されていない。さらに、どの細胞型が、上皮表面に分泌されるＣｌ－イオンの大部分を提供するのかは、依然として不明である。最近の研究は、新たに発見されたイオノサイトが、少なくとも上気道では、主要供給源であり得ることを示唆している。
ＣＦの動物モデル
ＣＦモデルは、様々な種（例えば、マウス、ラット、フェレット、ヒツジおよびブタ）において生成されている。
ＣＦブタモデル
最近、新しいＣＦ動物モデルが開発された。Ｒｏｇｅｒｓおよび同僚は、ＣＦＴＲヌルおよびＣＦＴＲ－ΔＦ５０８ヘテロ接合体ブタを生じさせ、その後、ＣＦＴＲ－ΔＦ５０８ホモ接合動物を生じさせた。ＣＦモデルとしてのブタの利点は、ヒトにより類似している肺の解剖学的構造、生理機能、組織構造および生化学的性質を含む。
加えて、ブタは、遺伝子的にヒトとの相同性がより高く、より大きい体サイズおよびより長い寿命を有する。ＣＦブタは、ＣＦを有するヒトに存在するいくつかの表現型を明示する。ブタにおけるＣＦＴＲ機能の喪失は、膵外分泌破壊、膵機能不全、限局性胆汁性肝硬変、および微小胆嚢をもたらす。胎便性イレウスの浸透率は、ＣＦブタでは１００％である。この型の腸閉塞は、ＣＦを有するヒト新生児の約１５％に観察される。ＣＦブタ肺は、出生時には炎症を示さないが、興味深いことにそれらの肺組織は、野生型同腹子と比較して無菌である頻度が低い。
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓによる気管内チャレンジを行った際に、ＣＦブタは、野生型と比較して除菌低減を示す。動物は、細菌感染、炎症、気道傷害およびリモデリングを特徴とする肺疾患を生後１カ月以内に自発的に発症する。肺疾患所見は、不均一であり、重症度は、軽度から重度まで様々である。
フェレットモデル
別の新しいＣＦ動物モデルは、フェレットである。ＣＦＴＲ－／－フェレットは、浸透率７５％の胎便性イレウス、膵疾患、肝疾患を発症し、それらの肺には、生後４週間以内に、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓをはじめとする細菌が自然にコロニーを形成することが多い。肺疾患の漸進的発症、および細菌排除の欠陥も、細菌チャレンジを受けたＣＦフェレット新生仔において観察されている。
ヒツジモデル
可能な動物モデルのうち、ヒツジは、ヒトの解剖学的構造および生理機能に最も近い肺を有し、気管支循環生理機能の研究に広く使用されており、経験豊富な人が担当している血管研究によく耐える。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集および体細胞核移植（ＳＣＮＴ）技法を使用するＣＦのヒツジモデルが生成されている。ＣＦＴＲノックアウトヒツジは、ヒトにおけるＣＦ病態と一致する重度疾患を発症する。膵線維症、腸閉塞、および精管非存在は、特に関連性があった。また、かなりの肝および胆嚢疾患が、ヒトにおいて顕著に見られるＣＦ肝疾患を示し得る。
ヒツジの場合、気管支動脈は、両方の肺への体血流の８０％を供給する単一の気管分岐部大血管として生じる。この動脈の入口部の直径は、１～６ｍｍまで様々であり、ベクター送達のための５フレンチガイディングカテーテルを許容するであろう。動脈は、肺へ下降し、細い血管の豊富な気管支周囲毛細血管叢（粘液分泌腺を包囲している粘膜下層における呼吸上皮の直ぐ下にある）を提供する遠位終末細気管支まで、枝経由で主および副気管支に血液を供給する。顕微鏡レベルで、気管支動脈枝は、それらが明確に定義される外弾性板を有さない点で、それらの肺動脈対応物とは組織学的に明確に異なる。これらの毛細血管の内皮は、有窓型のものであり、研究者らによって、気管支粘膜への流体の通過、および内皮細胞間結合による能動輸送による好中球の毛細血管通過が実証されている。したがって、ヒツジは、ヒトにおけるＣＦをモデル化するために特に適切な動物モデルであり、その理由は、これら２つの種における肺の解剖学的構造および発達の類似性である。
一部の実施形態では、ウイルスベクターの集団は、１～５分にわたっての緩徐な注入により投与される。
特定の実施形態では、１年にわたって、２年にわたって、３年にわたって、４年にわたって、５年にわたって、１０年にわたって最大１０の手順での反復特徴付けは、例えば、少なくとも１週間の間隔を空けることが必要となる（例えば、少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、少なくとも１０回などのまたはそれより多くの投与を用いて、様々な間隔期間にわたって、例えば、１時間に１回、１日に１回、週１回、月１回、年１回などで、所望の遺伝子発現レベルを達成することができる）。投薬は、単回投薬であることもあり、または累積性（連続投薬）であることもあり、当業者により容易に決定され得る。例えば、疾患または障害の処置は、本明細書で開示される医薬組成物ウイルスベクターの有効用量の１回の投与を含むことがある。あるいは、疾患または障害の処置は、例えば、１日１回、１日２回、１日３回、数日に１回または週１回などの、様々な期間にわたって行われる、ウイルスベクターの有効用量の複数回投与を含むこともある。
投与のタイミングは、個体の症状の重症度のような因子に依存して、個体によって異なり得る。例えば、本明細書で開示されるウイルスベクターの有効用量を、個体に、６カ月ごとに１回、無期限に、または個体がもはや治療を必要としなくなるまで、投与することができる。個体の状態を処置の全過程を通じてモニターすることができること、および投与される本明細書で開示されるウイルスベクターの有効量を、それに基づいて調整することができることは、当業者には認識されるであろう。
一部の実施形態では、本明細書で開示されるｒＡＡＶベクターおよび／またはｒＡＡＶゲノムを、本明細書で開示されるｒＡＡＶベクターを懸濁させるのに十分な量の溶媒、エマルジョンまたは他の希釈剤で製剤化することができる。この実施形態の他の態様では、本明細書で開示されるようなｒＡＡＶベクターおよび／またはｒＡＡＶゲノムを、溶媒、エマルジョンまたは希釈剤中、例えば、約９０％（ｖ／ｖ）未満、約８０％（ｖ／ｖ）未満、約７０％（ｖ／ｖ）未満、約６５％（ｖ／ｖ）未満、約６０％（ｖ／ｖ）未満、約５５％（ｖ／ｖ）未満、約５０％（ｖ／ｖ）未満、約４５％（ｖ／ｖ）未満、約４０％（ｖ／ｖ）未満、約３５％（ｖ／ｖ）未満、約３０％（ｖ／ｖ）未満、約２５％（ｖ／ｖ）未満、約２０％（ｖ／ｖ）未満、約１５％（ｖ／ｖ）未満、約１０％（ｖ／ｖ）未満、約５％（ｖ／ｖ）未満、または約１％（ｖ／ｖ）未満の量で、本明細書では製剤化することができる／製剤化することもある。他の態様では、本明細書で開示され得る、本明細書で開示されるような、ｒＡＡＶベクターおよび／またはｒＡＡＶゲノムは、例えば、約１％（ｖ／ｖ）～９０％（ｖ／ｖ）、約１％（ｖ／ｖ）～７０％（ｖ／ｖ）、約１％（ｖ／ｖ）～６０％（ｖ／ｖ）、約１％（ｖ／ｖ）～５０％（ｖ／ｖ）、約１％（ｖ／ｖ）～４０％（ｖ／ｖ）、約１％（ｖ／ｖ）～３０％（ｖ／ｖ）、約１％（ｖ／ｖ）～２０％（ｖ／ｖ）、約１％（ｖ／ｖ）～１０％（ｖ／ｖ）、約２％（ｖ／ｖ）～５０％（ｖ／ｖ）、約２％（ｖ／ｖ）～４０％（ｖ／ｖ）、約２％（ｖ／ｖ）～３０％（ｖ／ｖ）、約２％（ｖ／ｖ）～２０％（ｖ／ｖ）、約２％（ｖ／ｖ）～１０％（ｖ／ｖ）、約４％（ｖ／ｖ）～５０％（ｖ／ｖ）、約４％（ｖ／ｖ）～４０％（ｖ／ｖ）、約４％（ｖ／ｖ）～３０％（ｖ／ｖ）、約４％（ｖ／ｖ）～２０％（ｖ／ｖ）、約４％（ｖ／ｖ）～１０％（ｖ／ｖ）、約６％（ｖ／ｖ）～５０％（ｖ／ｖ）、約６％（ｖ／ｖ）～４０％（ｖ／ｖ）、約６％（ｖ／ｖ）～３０％（ｖ／ｖ）、約６％（ｖ／ｖ）～２０％（ｖ／ｖ）、約６％（ｖ／ｖ）～１０％（ｖ／ｖ）、約８％（ｖ／ｖ）～５０％（ｖ／ｖ）、約８％（ｖ／ｖ）～４０％（ｖ／ｖ）、約８％（ｖ／ｖ）～３０％（ｖ／ｖ）、約８％（ｖ／ｖ）～２０％（ｖ／ｖ）、約８％（ｖ／ｖ）～１５％（ｖ／ｖ）、または約８％（ｖ／ｖ）～１２％（ｖ／ｖ）の範囲の量で、溶媒、エマルジョンまたは他の希釈剤を含み得る。
一部の実施形態では、任意のＡＡＶ２、ＡＡＶ９カプシドにより封入されたものを含むがこれに限定されない任意の血清型の、本明細書で開示されるようなｒＡＡＶベクターおよび／またはｒＡＡＶゲノムは、治療用化合物を治療有効量で含む。ある実施形態では、本明細書で使用される場合、限定ではないが、用語「有効量」は、「治療有効量」、「有効用量」、または「治療有効用量」と同義語である。ある実施形態では、嚢胞性線維症を処置するための本明細書で開示される治療用化合物の有効性は、限定ではないが、ＣＦに関連する１つまたは複数の臨床症状および／または生理学的指標に基づいて個体の改善を観察することにより、判定することができる。
本明細書で開示されるようなｒＡＡＶベクターおよび／またはｒＡＡＶゲノムの送達を助長するために、そのようなｒＡＡＶベクターおよび／またはｒＡＡＶゲノムを担体または賦形剤と混合することができる。使用され得る担体および賦形剤としては、食塩水（特に、滅菌された、パイロジェンフリー食塩水）、食塩緩衝剤（例えば、クエン酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、および重炭酸緩衝剤）、アミノ酸、尿素、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質、タンパク質（例えば、血清アルブミン）、ＥＤＴＡ、塩化ナトリウム、リポソーム、マンニトール、ソルビトールおよびグリセロールが挙げられる。ＵＳＰグレードの担体および賦形剤は、ヒト対象へのビリオンの送達に特に有用である。
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される担体に溶解または分散された有効量の１つまたは複数の改変ウイルスベクター（例えば、ｒＡＡＶベクター）または追加の薬剤を含む。句「薬学的または薬理学的に許容される」は、例えばヒトなどの動物に必要に応じて投与されたときに有害反応、アレルギー反応、他の望ましくない反応、生物学的効果を生じさせない、分子実体および組成物を指す。
少なくとも１つの改変ｒＡＡＶベクターまたは追加の活性成分を含有する医薬組成物の調製は、参照により本明細書に組み込まれるRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Printing Company, 1990によって例示されるように、本開示に鑑みて当業者には公知であるであろう。さらに、動物（例えば、ヒト）への投与ために、調製物が、Ｕ．Ｓ．ＦＤＡ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓまたは該当する場合には他の諸国の同等の政府規制により要求されるような無菌性、発熱性、一般安全性および純度基準を満たすべきであることは、理解されるであろう。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、当業者には公知であろうような、任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、界面活性剤、抗酸化物質、保存剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、保存剤、薬物、薬物安定剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、着香剤、色素、およびこれらに類する材料ならびにそれらの組合せを含む（例えば、参照により本明細書に組み込まれるRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329を参照されたい）。任意の従来の担体が活性成分と非適合性である場合を除いて、治療用組成物または医薬組成物におけるその使用が企図される。
改変ベクターおよび／または薬剤を、遊離塩基、中性または塩形態の医薬組成物に製剤化することができる。薬学的に許容される塩は、酸付加塩、例えば、タンパク質性組成物の遊離アミノ基とで形成される酸付加塩、あるいは例えば塩酸もしくはリン酸などの無機酸とで、または酢酸、シュウ酸、酒石酸もしくはマンデル酸のような有機酸とで形成される酸付加塩を含む。遊離カルボキシル基とで形成される塩を、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムもしくは水酸化第二鉄などの無機塩基から誘導することもでき、またはイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジンもしくはプロカインのような有機塩基から誘導することもできる。
投与を担当する実施者が、通例の手順を使用して個々の対象のための医薬組成中の活性成分の濃度および適切な用量を決定することになる。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、例えば、少なくとも約０．１％の活性化合物（例えば、改変ウイルスベクター、例えばｒＡＡＶベクター、治療剤）を含み得る。他の実施形態では、活性化合物は、例えば、単位の重量の約２％～約７５％の間、または約２５％～約６０％の間、およびこれらの中の導出可能な任意の範囲を構成し得る。
本発明の方法の一態様では、異種核酸は、対象に改変細胞を、例えば組織の移植または植え込みによって、投与する目的で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで血管系または血管組織の細胞に送達される。ウイルス粒子を、適切な標準的な形質導入方法に従って、適切な感染多重度で細胞に導入することができる。投与するためのウイルスの力価は、標的細胞型および数、ならびに特定のウイルスベクターによって変わることがあり、当業者は、過度の実験なしにそのような力価を決定することができる。一実施形態では、１０２感染単位、または少なくとも約１０３感染単位、または少なくとも約１０５感染単位が、細胞に導入される。
「治療有効」量は、本明細書で使用される場合、対象に何らかの改善または利益をもたらすのに十分である量である。別の言い方をすれば、「治療有効」量は、対象における少なくとも１つの臨床症状のある程度の緩和、軽減または減少をもたらすことになる量である。何らかの利益が対象にもたらされるのであれば、治療効果が、完全である必要も治癒的である必要もないことは、当業者には理解されるであろう。ある特定の実施形態では、治療有効量は、治癒的でない。
それを必要とするヒト対象または動物への本発明によるウイルスベクターの投与は、当技術分野において公知の任意の手段により得る。好ましくは、ウイルスベクターは、薬学的に許容される担体中の治療有効用量で送達される。一実施形態では、ベクターは、改変された＼ベクターでコーティングされたステント、または改変された＼ベクターを含有するステントにより送達される。血管系へのベクターの送達のための送達用シースは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００４０１９３１３７号に記載されている。
対象に投与されるウイルスベクターの投薬量は、投与の様式、処置される疾患または状態、個々の対象の状態、送達される特定の治療用核酸に依存し、そのような投薬量を通例の方式で決定することができる。治療効果を達成するための例示的な用量は、少なくとも約１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５のまたはそれを超える形質導入単位、およびこれらの中の導出可能な任意の整数、およびこれらの中の導出可能な任意の範囲のウイルス力価の送達である。一実施形態では、投与のための用量は、約１０８～１０１３形質導入単位である。一実施形態では、投与のための用量は、約１０３～１０８形質導入単位である。
体重のキログラム当たりのベクターゲノムでの用量の単位（ｖｇ／ｋｇ）での、特定の治療効果を達成するために必要とされる改変ビリオンの用量は、改変ビリオンの投与経路、治療効果を達成するために必要とされる核酸（非翻訳ＲＮＡまたはタンパク質をコードする）発現のレベル、処置されることになる特異的疾患または障害、ビリオンに対する宿主免疫応答、発現産物に対する宿主免疫応答、および異種核酸産物の安定性を含むがこれらに限定されない、いくつかの因子に基づいて、変わるであろう。当業者は、前述の因子、および当技術分野において周知である他の因子に基づいて、特定の疾患または障害を有する患者を処置するための組換えビリオン用量範囲を容易に決定することができる。
特定の実施形態では、１回より多くの投与（例えば、２回、３回、４回またはそれより多くの投与）を週１回、月１回、年１回などを用いることができる。
注射剤は、従来の形態で、溶液もしくは懸濁液のどちらかとして、注射前に液体に溶解もしくは懸濁するのに好適な固体形態として、またはエマルジョンとして調製することができる。ベクターを局所または全身送達することができる。一実施形態では、ベクターは、デポーまたは徐放性製剤で投与される。さらに、ウイルスベクターを、外科的に植え込み可能なマトリックス（例えば、米国特許出願公開番号ＵＳ－２００４－００１３６４５－Ａ１に記載されているような）に付着させて送達することができる。
本明細書で開示される改変パルボウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクターまたは他のパルボウイルス）を、気管支動脈カテーテル法により投与することができる。例えば、米国特許第５，５８５，３６２号を参照されたい。
一実施形態では、気管支動脈送達は、左心房圧を決定するために肺楔入圧カテーテル法を伴う。
一部の実施形態では、ウイルスベクターの集団は、１～５分にわたっての緩徐な注入により投与される。
一実施形態では、圧力は、注入中に定期的なまたは拍動間隔で気道排気流に印加される。
一実施形態では、圧力は、最大１５秒間、２～５呼吸ごとに供給される。
一実施形態では、圧力は、２～１５ｍｍＨｇである。
一実施形態では、ベクターを運ぶ毛細血管と標的部位とは、５～１０ミクロン近接している。
一実施形態では、本発明の改変ベクターは、微多孔膜から形成されたインフレータブル・バルーンと流体連通し、かつ目的の遺伝子を含むベクターを含有する溶液を送達するカテーテルにより、投与される。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００３／０１００８８９号を参照されたい。
ある特定の実施形態では、本発明の改変組換えベクターの有効性を増加させるために、血管疾患または障害の処置に有効な別の薬剤または他の手順の投与と本発明の方法を組み合わせることが望ましいことがある。例えば、一部の実施形態では、薬理学的治療剤、外科手術またはこれらの組合せを含むがそれらに限定されない、従来の治療または薬剤を、ベクター投与と組み合わせることができると考えられる。非限定的な例では、治療利益は、血管組織における高血圧の低下、または医学的手技もしくは外科手術中に行われるものなどの血管もしくは心血管介入後の再狭窄の低減を含む。
このプロセスは、薬剤とベクターとを同じ時に（例えば、実質的に同時に）投与すること、または細胞、組織もしくは対象へのベクターおよび薬剤の別々の投与が所望の治療利益を生じさせる期間内に投与することを含み得る。投与は、改変ベクターと１つもしくは複数の薬剤との両方を含む単一の薬理学的製剤で行うことができ、または１つの製剤がベクターを含み、他のものが１つもしくは複数の薬剤を含む、２つもしくはそれより多くの別個の製剤を対象に投与することにより行うことができる。ある特定の実施形態では、薬剤は、免疫応答を低減させる薬剤、例えば、ＴＬＲ－９阻害剤、ｃＧＡＳ阻害剤、またはラパマイシンである。
改変ベクターの投与は、数分から数週間の範囲の間隔で、他の薬剤より前に行われる、他の薬剤と併用投与される、および／または、他の薬剤の後に行われることもある。ベクターおよび他の薬剤が細胞、組織または対象に別々に適用される実施形態では、一般に、各送達時間の間に有意な期間が経過してしまわないようにし、したがって、ベクターおよび薬剤は、細胞、組織または対象に対して有利な併用効果をなお発揮することができることになる。
薬理学的治療剤の投与および投与方法、投薬量ならびにこれらに類することは、当業者に周知であり（例えば、関連部分が参照により本明細書に組み込まれる、"Physicians Desk Reference"、Goodman & Gilman's "The Pharmacological Basis of Therapeutics"、"Remington's Pharmaceutical Sciences"、および"The Merck Index, Eleventh Edition"を参照されたい）、本明細書での開示に鑑みてそれらを本発明と組み合わせることができる。処置されることになる対象の状態に依存して、投薬量の多少の変動が必然的に起こることになる。いずれにせよ、投与の担当者が個々の対象のための適切な用量を決定することになり、そのような個々の決定は、当業者の技能の範囲内である。
投与
対象に投与される本明細書で開示されるようなウイルスベクター、例えば、ｒＨＩＶ、ｒＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶゲノムの投薬量は、投与様式、処置および／または予防される疾患または状態、個々の対象の状態、特定のウイルスベクターまたはカプシド、ならびに送達される核酸、ならびにこれらに類することに依存し、そのような投薬量を通例の方式で決定することができる。治療効果を達成するための例示的な用量は、少なくとも約１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５形質導入単位、必要に応じて約１０８～約１０１３形質導入単位の力価である。
さらなる実施形態では、本明細書で開示されるようなウイルスベクター、例えば、ｒＡＡＶもしくはｒＨＩＶベクターまたはｒＡＡＶゲノムの対象への投与は、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１週間、２週間、３週間、４週間、１カ月、２カ月、３カ月、４カ月のまたはそれより長い前記ベクターの循環半減期をもたらす。
ある実施形態では、本明細書で開示されるようなウイルスベクター、例えば、ｒＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶゲノムの対象への投与の期間は、１分～数時間の注入である。
さらなる実施形態では、遺伝子発現は、一時期停止される。例えば、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１２カ月、またはそれより長い間。
別の実施形態では、ＣＦの処置のための、本明細書で開示されるようなウイルスベクター、例えば、ｒＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶゲノムの投与は、体重の、例えば、少なくとも０．５ポンド、少なくとも１ポンド、少なくとも１．５ポンド、少なくとも２ポンド、少なくとも２．５ポンド、少なくとも３ポンド、少なくとも３．５ポンド、少なくとも４ポンド、少なくとも４．５ポンド、少なくとも５ポンド、少なくとも５．５ポンド、少なくとも６ポンド、少なくとも６．５ポンド、少なくとも７ポンド、少なくとも７．５ポンド、少なくとも８ポンド、少なくとも８．５ポンド、少なくとも９ポンド、少なくとも９．５ポンド、少なくとも１０ポンド、少なくとも１０．５ポンド、少なくとも１１ポンド、少なくとも１１．５ポンド、少なくとも１２ポンド、少なくとも１２．５ポンド、少なくとも１３ポンド、少なくとも１３．５ポンド、少なくとも１４ポンド、少なくとも１４．５ポンド、少なくとも１５ポンド、少なくとも２０ポンド、少なくとも２５ポンド、少なくとも３０ポンド、少なくとも５０ポンド増加をもたらす。別の実施形態では、ＣＦの処置のための、本明細書で開示されるような、任意の血清型のＡＡＶ ＣＦＴＲは、体重の、例えば、０．５ポンド～５０ポンド、０．５ポンド～３０ポンド、０．５ポンド～２５ポンド、０．５ポンド～２０ポンド、０．５ポンド～１５ポンド、０．５ポンド～１０ポンド、０．５ポンド～７．５ポンド、０．５ポンド～５ポンド、１ポンド～１５ポンド、１ポンド～１０ポンド、１ポンド～７．５ポンド、１ポンド～５ポンド、２ポンド～１０ポンド、２ポンド～７．５ポンド増加をもたらす。
最適化ｒＡＡＶベクターゲノム
ある実施形態では、最適化ウイルスベクター、例えばｒＡＡＶベクターゲノムは、ＩＴＲ、プロモーター、分泌ペプチド（secretary peptide）、受容体リガンド、短縮型導入遺伝子、マイクロＲＮＡ、ポリＡテール、異種遺伝子の発現を増加または減少させることができるエレメント、一実施形態では、免疫原性を低減させるための治療用遺伝子およびエレメントを含む、本明細書で開示されるエレメントのいずれかから、任意の組合せで作出される。ウイルスベクター、例えばｒＡＡＶベクターゲノムが導入され、発現されることになる、組織および細胞に対する指向性を有する任意のＡＡＶカプシドを有する、そのような最適化ウイルスベクター、例えばｒＡＡＶベクターゲノムを使用することができる。
以下の非限定的実施例は、今考えられる代表的実施形態のより完全な理解を容易にするために、単に説明を目的として提供される。これらの実施例は、ウイルスベクター、例えば、ＡＡＶベクターまたはビリオンおよびｒＡＡＶベクターを利用することができる全ての可能な状況の単なるサブセットであるように意図されている。したがって、これらの実施例を、ＡＡＶビリオンおよびｒＡＡＶベクターならびに／またはそれらの方法および使用に関するものを含む、本明細書に記載される実施形態のいずれかに限定されると解釈すべきでない。結局のところ、ＡＡＶビリオンおよびベクターを、遺伝子送達が所望される事実上あらゆる状況で利用することができる。
上述の説明および以下の実施例が例証に過ぎず、それらを本発明の範囲に対する制限と解釈すべきでないことは、理解されよう。当業者には明らかであろう様々な変更および修飾を、開示される実施形態に、本発明の趣旨および範囲を逸脱することなく加えることができる。さらに、特定される全ての特許、特許出願および公表文献は、例えば、本発明に関連して使用される可能性があるそのような公表文献に記載されている方法論を説明および開示することを目的として、参照により本明細書に明確に組み込まれる。これらの公表文献は、本出願の出願日より前のそれらの開示についてもっぱら提供される。このことに関して、過去の発明を理由にまたは任意の他の理由でそのような開示に先行する資格が本発明者らにないことを認めると解釈すべきものは何もない。これらの文献の日付についての記述または内容についての表記の全ては、本出願に利用可な情報に基づくものであり、これらの文献の日付または内容の正しさについてのいかなる承認にも相当しない。
特定される全ての特許および他の公表文献は、例えば、本発明に関連して使用される可能性があるそのような公表文献に記載されている方法論を説明および開示することを目的として、参照により本明細書に明確に組み込まれる。これらの公表文献は、本出願の出願日より前のそれらの開示についてもっぱら提供される。このことに関して、過去の発明を理由にまたは任意の他の理由でそのような開示に先行する資格が本発明者らにないことを認めると解釈すべきものは何もない。これらの文献の日付についての記述および内容についての表記の全ては、本出願に利用可な情報に基づくものであり、これらの文献の日付または内容の正しさについてのいかなる承認にも相当しない。
本明細書に記載される技術の一部の実施形態は、以下の番号付き段落のいずれかに従って定義され得る：
１．嚢胞性線維症（ＣＦ）を処置するための方法であって、
対象における複数の標的部位にベクターの集団を投与するステップであって、
前記ベクターが、治療用核酸を含有し、
前記ベクターが、
第１の気管支動脈により範囲を定められた細気管支群における基底膜標的部位を標的とするために、カテーテルを前記気管支動脈に留置し、ベクターの第１の用量を前記カテーテル内に投与すること、および
基底膜細胞の第２の集団を含有する第２の細気管支群を標的とするために、同じまたは異なるカテーテルを少なくとも第２の気管支動脈内に留置すること
を含む、気管支動脈カテーテル法による送達により投与される、ステップを含む方法。
２．必要に応じて、基底膜細胞の第３の集団を含有する第３の細気管支群を標的とするために前記同じまたは異なるカテーテルを第３の気管支動脈内に留置することをさらに含む、段落１に記載の方法。
３．必要に応じて、基底膜細胞の第４の集団を含有する第４の細気管支群を標的とするために前記同じまたは異なるカテーテルを第４の気管支動脈内に留置することをさらに含む、段落２に記載の方法。
４．必要に応じて、基底膜細胞の第５の集団を含有する第５の細気管支群を標的とするために前記同じまたは異なるカテーテルを第５の気管支動脈内に留置することをさらに含む、段落２に記載の方法。
５．前記第１の用量が、第１の気管支動脈体積（血管枝を含む気管支血管血流量）に比例し、第２の用量が、第２の気管支動脈体積に比例する、段落１に記載の方法。
６．ベクターの第１の用量が、細気管支の第１のセットにおける基底／前駆細胞、クラブ細胞または繊毛細胞の前記第１の基底膜標的部位を標的とするために、前記カテーテル内に投与される、段落１から５に記載の方法。
７．前記治療用核酸が、治療用嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）遺伝子である、段落１に記載の方法。
８．前記治療用核酸が、短縮型治療用嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）遺伝子である、段落１に記載の方法。
９．前記短縮型治療用嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）遺伝子が、ＣＦＴＲのＮテールプロセシング突然変異体である、段落８に記載の方法。
１０．前記短縮型治療用嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）遺伝子が、ΔＦ５０８－ＣＦＴＲのプロセシングを特異的にレスキューすることができる、段落８に記載の方法。
１１．前記ベクターが、ＤＮＡまたはＲＮＡ核酸ベクターである、段落１に記載の方法。
１２．前記ベクターが、ウイルスベクターである、段落１に記載の方法。
１３．ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レンチウイルスベクター、または単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のいずれかから選択される、段落９に記載の方法。
１４．ウイルスベクターが、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）である、段落９に記載の方法。
１５．前記治療用核酸が、遺伝子編集分子である、段落１に記載の方法。
１６．前記遺伝子編集分子が、ヌクレアーゼ、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、ガイドＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、およびアクチベーターＲＮＡから選択される、段落１５に記載の方法。
１７．少なくとも１つの遺伝子編集分子が、ｇＲＮＡまたはｇＤＮＡである、段落１５に記載の遺伝子編集分子。
１８．ガイドＲＮＡが、病変を引き起こすＣＦＴＲ突然変異を標的とする、段落１７に記載の方法。
１９．前記ガイドＲＮＡが、表４から選択される、段落１８に記載の方法。
２０．配列特異的ヌクレアーゼが、核酸誘導型ヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはメガＴＡＬから選択される、段落１５に記載の遺伝子編集分子。
２１．配列特異的ヌクレアーゼが、一塩基エディター、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、およびＤＮＡ誘導型ヌクレアーゼから選択される、核酸誘導型ヌクレアーゼである、段落１５に記載の遺伝子編集分子。
２２．少なくとも１つの遺伝子編集分子が、アクチベーターＲＮＡである、段落１５に記載の遺伝子編集分子。
２３．核酸誘導型ヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼである、段落１５に記載の遺伝子編集分子。
２４．ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、Ｃａｓヌクレアーゼである、段落１５に記載の遺伝子編集分子。
２５．気管支動脈送達が、肺楔入圧カテーテル法および測定を伴う、段落１から２４に記載の方法。
２６．ウイルスベクターの集団が、１～３０分にわたっての緩徐な注入により投与される、段落２５に記載の方法。
２７．圧力が、注入中に最大１５秒間、２～５呼吸ごとに定期的なまたは拍動間隔で呼吸リザーバーバッグに印加される、段落２５に記載の方法。
２８．前記圧力が、最大１５秒間、２～５呼吸ごとに供給される、段落２７に記載の方法。
２９．前記圧力が、２～１５ｍｍＨｇである、段落２７に記載の方法。
３０．前記標的部位と、５～１０ミクロン近接している、段落１から２９に記載の方法。
３１．前記ベクターが、プロモーターに作動可能に連結されたＣＦＴＫをコードするセグメントに隣接する少なくとも１対のＡＡＶ ＩＴＲを含有する核酸配列を含有するＡＡＶカプシドであり、少なくとも１つのカプシドタンパク質が、同じまたは異なるＡＡＶ血清型由来であるＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３からなる群から選択される、段落１から３０に記載の方法。
３２．透過処理剤の投与をさらに含む、段落１～３０の方法。
３３．カプシドタンパク質の少なくとも１つが、ＡＡＶ血清型９である、段落３１の方法。
３４．カプシドタンパク質の全てが、ＡＡＶ血清型９である、段落３１の方法。
３５．他のカプシドタンパク質の１つが、異なる血清型由来である、段落３１の方法。
３６．ＡＡＶ ＩＴＲが、少なくとも１つのカプシドタンパク質とは異なる血清型由来である、段落３１～３４の方法。
３７．ＡＡＶ ＩＴＲが、カプシドタンパク質と同じ血清型のうちの少なくとも１つ由来である、段落３１～３４の方法。
（実施例１）
気管支動脈カテーテル法による送達によるＣＦＴＲノックアウトブタへのＣＦＴＲ遺伝子を含有する組換えＡＡＶ９（ｒＡＡＶ９）ベクターの投与
ＣＦ肺は、ＣＦの際に最も深刻な影響を受ける臓器であるので、遺伝子治療の主要標的である。本明細書に記載のいずれかのＣＦＴＲ機能を欠いているＣＦブタモデルを使用することになる。ＣＦＴＲノックアウトブタモデルは、ヒトＣＦ患者が経験するものと同様の自発性肺感染症を発症する。
気管支動脈は、典型的にはＴ３～Ｔ８レベルで胸部大動脈から分岐し、気管支、迷走神経、縦隔後部および食道にも供給する。動脈の８０パーセントがＴ５～Ｔ６レベルから分岐する。気管支動脈の解剖学的構造の多くの変形形態が記載されている。より多く見られる組合せとしては、単一の右肋間気管支（ＩＣＢ）幹と単一の左気管支動脈、または共通の幹から分岐している単一の右ＩＣＢ幹および単一の左気管支動脈、または単一の右ＩＣＢ幹と２本の左気管支動脈が挙げられる。２本の気管支動脈が右側または左側のどちらかに見られ得る。左ＩＣＢ幹は、識別されていないが、右気管支動脈は、肋間動脈と起点を共有することが多い。
本明細書に記載の野生型ＣＦＴＲ遺伝子コピーを保有する組換えＡＡＶ９ウイルス（ｒＡＡＶ９－ｗｔＣＦＴＲ）を、ＣＦＴＲノックアウトブタの下側肺葉の単一区域に、Brinson GM et al. Am J Respir Crit Care Med. (1998) Am J Respir Crit Care Med. 1998 Jun;157(6 Pt 1):1951-8、およびBurke TC. and Mauro MA. (2004) Semin Intervent Radiol. 2004 Mar;21(1):43-8に記載されているような気管支動脈カテーテル法による送達を使用して送達することになる。加えて、高感度かつ特異的な組織化学的染色を使用して全肺における遺伝子発現の分布を評価することができるように、組換えＡＡＶ９－ｌａｃＺウイルス（ｒＡＡＶ９－ｌａｃＺ）を使用することになる。
組換えＡＡＶ９ウイルス投与および組織化学的評定。
動物に経口経路で９ｍｍカフ付き気管内チューブを挿管することになる。ベンゾカイン（２０％）を気管内チューブに噴霧することになる。Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＦ １Ｔ２０フレキシブルファイバー気管支鏡を気道に導入することになる。ｒＡＡＶ９－ｗｔＣＦＴＲの気管支動脈カテーテル法による送達のために、カテーテルを透視下で大動脈から第１気管支の動脈へ挿入することになる。前記第１気管支の動脈により範囲を定められた細気管支の第１のセットにおける基底膜細胞（基底／前駆細胞、クラブ細胞および線毛細胞など）を標的として、カテーテルによって、野生型ＣＦＴＲ遺伝子コピーを保有する組換えＡＡＶ９ウイルス（ｒＡＡＶ９－ｗｔＣＦＴＲ）の第１の用量を投与することになる。次いで、側底細胞の第２のセット（基底／前駆細胞、クラブ細胞、および線毛細胞）を標的とするウイルスベクターの第２の用量を用いて細気管支の第２のセットを標的とするために、同じまたは異なるカテーテルを第２の気管支血管に導入することになる。必要に応じて、この手順を完了するために第３のおよびことによると第４のカテーテル法を行うことになる。送達される全用量は、造影蛍光透視像から測定した血管直径に基づく各気管支動脈への推定流量に比例して分割されることになる。
カテーテルおよびスコープを除去し、動物をさらに１０分間、仰臥位に保つことになる。気管支動脈カテーテル法による送達によりｒＡＡＶ９－ｗｔＣＦＴＲおよびｒＡＡＶ９－ｌａｃＺに感染させたＣＦＴＲノックアウトブタの葉を６週間、週１回、胸部Ｘ腺により比較することになる。６週間で剖検を行うことになる。肺を固定し、Ｘｇａｌ染色を使用して染色することになる。組織切片は、主として誘導気道の細胞における組換え遺伝子発現を示すであろう。ＬａｃＺマーカーの生体内分布およびｗｔＣＦＴＲ処置への気道の応答をｌａｃ－Ｚベクター対照と比較することになる。
（実施例２）
気管支動脈カテーテル法による送達による野生型およびＣＦＴＲノックアウトヒツジへのカプシドにＣＦＴＲ遺伝子を含有する組換えＡＡＶ９（ｒＡＡＶ９）ベクターの投与。
ＣＦ肺は、ＣＦの際に最も深刻な影響を受ける臓器であるので、遺伝子治療の主要標的である。本明細書に記載のいずれかのＣＦＴＲ機能を欠いているＣＦヒツジモデルを、使用することになる。ＣＦＴＲノックアウトヒツジモデルは、ヒトＣＦ患者におけるものと同様の自発性肺感染症を発症する。
ヒツジは、一般に、Ｔ２～８レベルで大動脈から分岐する単一の気管支動脈を有する。この一次血管の枝は、気管支、迷走神経、縦隔後部および食道に供給する。
本明細書に記載の野生型ＣＦＴＲ遺伝子コピーを保有する組換えＡＡＶ９ウイルス（ｒＡＡＶ９－ｗｔＣＦＴＲ）、またはＡＡＶ９－ｌａｃＺマーカーを、個々のＣＦＴＲノックアウトヒツジにまたは組合せで、Brinson GM et al. Am J Respir Crit Care Med.(1998) Am J Respir Crit Care Med.1998 Jun;157(6 Pt 1):1951-8、およびBurke TC. and Mauro MA. (2004) Semin Intervent Radiol.2004 Mar;21(1):43-8に記載されているような気管支動脈カテーテル法による送達を使用して送達することになる。
組換えＡＡＶ９ウイルス投与および組織化学的評定。
動物に経口経路で９ｍｍカフ付き気管内チューブを挿管することになる。ベンゾカイン（２０％）を気管内チューブに噴霧することになる。Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＦ １Ｔ２０フレキシブルファイバー気管支鏡を気道に導入することになる。ベクターの気管支動脈カテーテル法による送達のために、カテーテルを大動脈から単一の気管支動脈へ挿入することになる。細気管支の全集団における基底膜標的部位（基底／前駆細胞、クラブ細胞および繊毛細胞など）を標的として、カテーテルによって、野生型ＣＦＴＲ遺伝子コピーを保有する組換えＡＡＶ９ウイルス（ｒＡＡＶ９－ｗｔＣＦＴＲ）および／またはｌａｃ－Ｚ遺伝子を保有する組換えＡＡＶ９ウイルスの全用量を投与することになる。
カテーテルおよびスコープを除去することになる。動物をさらに１０分間、仰臥位に保つことになる。気管支動脈カテーテル法による送達によりｒＡＡＶ９－ｗｔＣＦＴＲおよびｒＡＡＶ９－ｌａｃＺに感染させたＣＦＴＲノックアウトヒツジの葉を６週間、週１回、胸部Ｘ腺により評定することになる。
６週間で剖検を行うことになる。肺を固定し、Ｘｇａｌ染色を使用して染色することになる。組織切片は、主として誘導気道の肺胞細胞における組換え遺伝子発現を示すであろう。ＬａｃＺマーカーの生体内分布およびｗｔＣＦＴＲ処置への気道の応答をｌａｃ－Ｚベクター対照と比較することになる。
（実施例３）
気管支動脈カテーテル法による送達によるＣＦ患者へのＣＦＴＲ遺伝子を含有する組換えＡＡＶ９（ｒＡＡＶ９）ベクターの投与。
挿入された野生型ＣＦＴＲ遺伝子を含有する組換えＡＡＶ９ベクターを使用する遺伝子治療のためのヒト臨床試験についてプロトコールは、本明細書に記載する通りである。
患者選択。本発明のｒＡＡＶ９ベクターを使用する遺伝子治療についての嚢胞性線維症患者の評価に、様々な基準を使用することになる。臨床試験を受ける患者は、一般に、以下の基準を満たすべきである：
（１）嚢胞性線維症の確定診断。証拠は、ピロカルピンイオントフォレーシス法による６０ｍＥｑ／Ｉより上の汗ナトリウムもしくはクロライド、または嚢胞性線維症遺伝子型、および嚢胞性線維症の臨床所見、両方の証拠書類からなることになる。
（２）性別。男性または女性を使用することができる。スクリーニング期間およびＡＡＶ処置後６カ月間に生殖の機会がない患者のみを研究に参加させることになる。嚢胞性線維症を有する男性の９５％より多くは、精管の先天性萎縮を有し、結果として不妊である。女性は、彼女達が妊娠検査で陰性であり、認定された受胎調節法を研究中に使用する場合、適格となる。
（３）疾患の重症度。適格であるために、患者は、計画された手順、すなわち大動脈カテーテル法／気管支鏡検査、を安全に受けるため適切な臨床状態でなければならない。ふさわしい予定者は、推定２年生存率が５０％より高いような臨床状態を有すると定義する。患者は、以下のことを示す場合、臨床試験から除外されることになる：
（１）合併症のリスク。研究に参加することから彼らの合併症へのリスクを高める状態。これらの状態は、ａ）直近１２カ月以内の気胸；ｂ）インスリン依存性糖尿病；ｃ）直近２カ月以内のグルココルチコイド療法を必要とする喘息またはアレルギー性気管支肺アスペルギルス症；ｄ）患者に投与する可能性がある少なくとも２種類の抗生物質に対する感受性をｉｎ ｖｉｔｒｏで有さない、病原体を増殖させる喀痰培養物；ｅ）大喀血歴：過去１年間の２４時間以内の２５０ｍｌより多い血液の喀出；およびｆ）患者の合併症へのリスクを高めることになる、研究責任医師の意見による、任意の医学的状態または検査所見の異常を含む。
薬物療法。患者は、研究開始前２カ月以内に全身性グルココルチコイドでの処置を受けていた場合、除外されることになる。
プロトコールを遵守できないこと。患者は、研究責任医師の見解で、患者がプロトコールを遵守する可能性が低い特徴、例えば、薬物乱用、アルコール依存症、精神的不安定性、不適切な動機を有する場合、除外されることになる。
他の研究への参加。患者は、過去９０日以内に別の治験治療研究に参加していた場合、除外されることになる。
患者評価。以下の評価を、研究を通して様々な時点で行うことになる。
病歴および身体検査。嚢胞性線維症および無関係の疾患の両方の所見発現に関する病歴を聴取する。システム、薬の利用、および薬物アレルギー歴の総括を得る。
臨床検査室評価：ａ）血液：ヘモグロビン、ヘマトクリット、白血球数、白血球百分率、血小板数、ウェスターグレン沈降速度、血清電解質（ナトリウム、カリウム、クロライド、重炭酸塩）、ＢＵＮ、クレアチニン、グルコース、尿酸、総タンパク質、アルブミン、カルシウム、リン酸塩、総ビリルビン、抱合型ビリルビン、ＡＳＴ、ＡＬＴ、アルカリホスファターゼ、ＬＤＨ；ｂ）尿分析：定性的タンパク質、血液、グルコース、ケトン、ｐＨおよび顕微鏡検査。
肺機能検査。検査は、米国胸部学会（American Thoracic Society）により定められた基準（１９８７ａ、１９８７ｂ）を満たすことになる：ａ）Ｃｒａｐｏら(1981)の正常予測値を使用する肺活量測定；ｂ）絶対肺気量（総肺活量、胸腔内ガス容量、残気量）；およびｃ）拡散能、１回呼吸。室内の空気を吸っているときの動脈血液ガスおよびパルスオキシメトリー。（５）心電図（１２誘導）。後前方向および側面胸部Ｘ線。胸部の薄切りコンピュータ断層撮影。感受性になるまでの抗生物質を含む唾液の好気性菌培養。
Ｓｈｗａｃｈｍａｎ－Ｋｕｌｃｚｙｃｋｉスコア計算。男性の精子計数。文書化された結果を伴う精子計数を過去に受けたことがない場合、泌尿器科（Department of Urology）が精液分析を行うことになる。
気管支鏡検査。患者は、この手順の前６時間、絶食させられることになる。気管支鏡検査の３０分前に患者の静脈内に０．２ｍｇのグリコピロレートおよび５０ｍｇのメペリジンを患者に前投与することになる。心電図、脈拍数、およびパルスオキシメトリーを継続的にモニターすることになる。血圧を自動非侵襲システムにより５分ごとにモニターすることになる。粘性リドカイン２％（３０ｍｌ）でうがいさせ、吐き出させることになる。リドカイン４％を携帯用噴霧器により後咽頭および喉頭に噴霧することになる。鼻閉塞もポリープの証拠もない患者に鼻経由で気管支鏡を導入することになる。経鼻手法を使用することができない場合、気管支鏡を経口導入することになる。０．０５％を一方の鼻腔の粘膜に綿棒で局所的に塗布することになる。リドカインゼリー２％を同じ鼻腔内に注入することになる。口にカニューレにより６リットル／分で酸素補給を施すことになる。患者が、弛緩した状態だがそれでもなお言語刺激により目を覚ますことができる状態になるまで、ミダゾラムを１ｍｇボーラスで５分毎に１５秒にわたって静脈内投与することになる。追加のミダゾラムを１ｍｇボーラスで最大１５分毎に投与してこの鎮静レベルを維持することになる。フレキシブルファイバー気管支鏡を鼻孔内に導入することになる。必要に応じて、リドカイン２％を気管支鏡によって注入して咽頭および気道を麻酔することになる。
気管支肺胞洗浄。区域気管支に穏やかに押し込んだ気管支鏡によって生理食塩水の５０ｍｌアリコートを注入することになる。洗浄物を吸引トラップに吸引することになる。３つのアリコートを投与して回収し終えるまで、この手順を繰り返すことになる。
気管支動脈カテーテル法
気管支動脈カテーテル法の２週間前より、患者は、呼吸器感染症を低減し、全身の状態を最大限に高めるために、強化処置プロコールを開始することになる。２週間、患者に、彼らの培養生物が感受性である２つの抗緑膿菌性抗生物質を投与することになる。１日２回、体位ドレナージおよび打診を行うことになる。患者は、彼らの慢性処置レジメンの残りを続けることになる。この期を入院患者または外来患者として遂行することになる。その後の研究の間、患者は、彼らの以前に指示された医療計画を継続することになる。これは、任意の経口抗生物質、膵酵素、テオフィリン、およびビタミン補給剤の継続を含む。エアロゾル化気管支拡張薬および抗生物質も継続することになる。
胸部Ｘ線および薄切りＣＴスキャンを使用して、ａ）その患者についての平均的な疾患罹患度を有する、およびｂ）区域気管支が重力に依存するように気管支鏡検査で患者の位置を定めることができるような位置にある、解剖学的肺区域を選択することになる。
ｒＡＡＶ９－ｗｔＣＦＴＲの気管支動脈カテーテル法による送達のために、カテーテルを透視下で大腿動脈から下行大動脈へ前進させることになる。大動脈血管造影図からの気管支動脈分枝パターンを識別し、比例用量を推定した後、カテーテルを第１気管支の血管へと前進させ、第１気管支の動脈により範囲を定められた細気管支内の第１の基底膜標的部位（基底／前駆細胞、クラブ細胞、および繊毛細胞など）を標的として、野生型ＣＦＴＲ遺伝子コピーを保有する組換えＡＡＶ９ウイルス（ｒＡＡＶ９－ｗｔＣＦＴＲ）の第１の用量を投与することになる。次いで、同じまたは異なるカテーテルを、細気管支の第２のセットを標的として第２気管支の血管へと進行させ、その後、必要に応じて第３、第４または第５の送達を行うことになる。各気管支動脈に送達される用量は、血管造影から判断して各血管の推定血流量に比例するであろう。
ブタおよびヒツジでの以前の大型動物実験ならびにヒトＣＦ異種移植片での以前の経験（Englehardt et al., Nature Genetics 4:27-34 (1993)）から、ｒＡＡＶ－ｗｔＣＦＴＲの用量および濃度の情報を得ることになる。
気管支動脈カテーテル法の後
血圧、脈拍、体温および呼吸数を含むバイタルサインを、トランスフェクション後、最初の１時間は５分ごとに、次の２時間は１５分ごとに、次の６時間は１時間ごとに、次の１５時間は２時間ごとに、その週の残りの日は４時間ごとに測定し、記録することになる。最初の２４時間は連続心電図検査およびパルスオキシメトリーにより測定を行うことになる。上記に列挙されている臨床検査室血液検査、パルスオキシメトリー、ならびにＰＡおよび側面胸部Ｘ線を、第１週には毎日、第２週には週２回、およびその後６週間は毎週、行うことになる。薄切りＣＴスキャンを行うことになる。
ウイルスの投与後、十分な呼吸器の予防措置を講じて患者を隔離室に置くことになる。隔離室は、空気が濾過され、外部から送達される、陰圧室である。入室するいずれの者も、ガウン、マスク、保護めがねおよび手袋を着用することになる。患者は、治療開始後、少なくとも１０日間は隔離されることになる。病院内にいる間、患者は、当技術分野において公知のＰＣＲアッセイを使用するｒＡＡＶ９－野生型ＣＦＴＲ組換えウイルスの排出について彼のまたは彼女の痰、鼻腔スワブ、尿、便の分析を受けることになる。
次の試料および測定値をトランスフェクション後の気管支鏡検査中に得ることになる：ａ）トランスフェクト区域内および反対側の肺におけるその鏡像の区域気管支内の４箇所の部位での経上皮電位差；ｂ）トランスフェクト区域および反対側の肺におけるその鏡像の気管支肺胞洗浄；ｃ）トランスフェクト区域からの肺胞表面の６つの細胞学的擦過標本；およびｄ）トランスフェクト区域からの６つの経気管支生検材料。
治療の評価。
毒性、ＣＦＴＲタンパク質またはアデノウイルスタンパク質に対する免疫学的応答、ならびに遺伝子移入の効率および安定性について、患者を注意深くモニターすることになる。
参考文献
Brinson GM et al. Am J Respir Crit Care Med. (1998) Am J Respir Crit Care Med. 1998 Jun;157(6 Pt 1):1951-8.
Burke TC. and Mauro MA. (2004) Semin Intervent Radiol. 2004 Mar;21(1):43-8.
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Venkatesh VC et al. (1995) Am J Physiol. 1995 Apr;268(4 Pt 1):L674-82.

Claims (38)

  1. 嚢胞性線維症（ＣＦ）を処置するための方法であって、
    対象における複数の標的部位にベクターの集団を投与するステップであって、
    前記ベクターが、治療用核酸を含有し、
    前記ベクターが、
    第１の気管支動脈により範囲を定められた細気管支群における基底膜標的部位を標的とするために、カテーテルを前記気管支動脈に留置し、ベクターの第１の用量を前記カテーテル内に投与すること、および
    基底膜細胞の第２の集団を含有する第２の細気管支群を標的とするために、同じまたは異なるカテーテルを少なくとも第２の気管支動脈内に留置すること
    を含む、気管支動脈カテーテル法による送達により投与される、ステップを含む方法。
  2. 必要に応じて、基底膜細胞の第３の集団を含有する第３の細気管支群を標的とするために前記同じまたは異なるカテーテルを第３の気管支動脈内に留置することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  3. 必要に応じて、基底膜細胞の第４の集団を含有する第４の細気管支群を標的とするために前記同じまたは異なるカテーテルを第４の気管支動脈内に留置することをさらに含む、請求項２に記載の方法。
  4. 必要に応じて、基底膜細胞の第５の集団を含有する第５の細気管支群を標的とするために前記同じまたは異なるカテーテルを第５の気管支動脈内に留置することをさらに含む、請求項２に記載の方法。
  5. 前記第１の用量が、第１の気管支動脈体積（血管枝を含む気管支血管血流量）に比例し、第２の用量が、第２の気管支動脈体積に比例する、請求項１に記載の方法。
  6. ベクターの第１の用量が、細気管支の第１のセットにおける基底／前駆細胞、クラブ細胞または繊毛細胞の前記第１の基底膜標的部位を標的とするために、前記カテーテル内に投与される、請求項１から５に記載の方法。
  7. 前記治療用核酸が、治療用嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）遺伝子である、請求項１に記載の方法。
  8. 前記治療用核酸が、短縮型治療用嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）遺伝子である、請求項１に記載の方法。
  9. 前記短縮型治療用嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）遺伝子が、ＣＦＴＲのＮテールプロセシング突然変異体である、請求項８に記載の方法。
  10. 前記短縮型治療用嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）遺伝子が、ΔＦ５０８－ＣＦＴＲのプロセシングを特異的にレスキューすることができる、請求項８に記載の方法。
  11. 前記ベクターが、ＤＮＡまたはＲＮＡ核酸ベクターである、請求項１に記載の方法。
  12. 前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項１に記載の方法。
  13. ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レンチウイルスベクター、または単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のいずれかから選択される、請求項９に記載の方法。
  14. ウイルスベクターが、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）である、請求項９に記載の方法。
  15. 前記治療用核酸が、遺伝子編集分子である、請求項１に記載の方法。
  16. 前記遺伝子編集分子が、ヌクレアーゼ、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、ガイドＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、およびアクチベーターＲＮＡから選択される、請求項１５に記載の方法。
  17. 少なくとも１つの遺伝子編集分子が、ｇＲＮＡまたはｇＤＮＡである、請求項１５に記載の遺伝子編集分子。
  18. ガイドＲＮＡが、病変を引き起こすＣＦＴＲ突然変異を標的とする、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記ガイドＲＮＡが、表４から選択される、請求項１８に記載の方法。
  20. 配列特異的ヌクレアーゼが、核酸誘導型ヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはメガＴＡＬから選択される、請求項１５に記載の遺伝子編集分子。
  21. 配列特異的ヌクレアーゼが、一塩基エディター、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、およびＤＮＡ誘導型ヌクレアーゼから選択される、核酸誘導型ヌクレアーゼである、請求項１５に記載の遺伝子編集分子。
  22. 少なくとも１つの遺伝子編集分子が、アクチベーターＲＮＡである、請求項１５に記載の遺伝子編集分子。
  23. 核酸誘導型ヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼである、請求項１５に記載の遺伝子編集分子。
  24. ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、Ｃａｓヌクレアーゼである、請求項１５に記載の遺伝子編集分子。
  25. 気管支動脈送達が、肺楔入圧カテーテル法および測定を伴う、請求項１から２４に記載の方法。
  26. ウイルスベクターの集団が、１～３０分にわたっての緩徐な注入により投与される、請求項２５に記載の方法。
  27. 圧力が、注入中に最大１５秒間、２～５呼吸ごとに定期的なまたは拍動間隔で呼吸リザーバーバッグに印加される、請求項２５に記載の方法。
  28. 前記圧力が、最大１５秒間、２～５呼吸ごとに供給される、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記圧力が、２～１５ｍｍＨｇである、請求項２７に記載の方法。
  30. 前記標的部位と、５～１０ミクロン近接している、請求項１から２９に記載の方法。
  31. 前記ベクターが、プロモーターに作動可能に連結されたＣＦＴＫをコードするセグメントに隣接する少なくとも１対のＡＡＶ ＩＴＲを含有する核酸配列を含有するＡＡＶカプシドであり、少なくとも１つのカプシドタンパク質が、同じまたは異なるＡＡＶ血清型由来であるＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３からなる群から選択される、請求項１から３０に記載の方法。
  32. 前記ベクターが、ＡＡＶ血清型１、ＡＡＶ血清型２、ＡＡＶ血清型３、ＡＡＶ血清型３Ａ、ＡＡＶ血清型３Ｂ、ＡＡＶ血清型４、ＡＡＶ血清型５、ＡＡＶ血清型６、ＡＡＶ血清型７、ＡＡＶ血清型８、ＡＡＶ血清型９、ＡＡＶ血清型１０、ＡＡＶ血清型１１、ＡＡＶ血清型１２、ＡＡＶ血清型１３、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶおよび／またはヒツジＡＡＶからなる群から選択されるＡＡＶカプシドである、請求項１から３１に記載の方法。
  33. 透過処理剤の投与をさらに含む、請求項１から３２に記載の方法。
  34. カプシドタンパク質の少なくとも１つが、ＡＡＶ血清型９である、請求項３２に記載の方法。
  35. 前記カプシドタンパク質の全てが、ＡＡＶ血清型９である、請求項３４に記載の方法。
  36. 他のカプシドタンパク質の１つが、異なる血清型由来である、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記ＡＡＶ ＩＴＲが、少なくとも１つのカプシドタンパク質とは異なる血清型由来である、請求項３１から３６に記載の方法。
  38. 前記ＡＡＶ ＩＴＲが、前記カプシドタンパク質と同じ血清型のうちの少なくとも１つ由来である、請求項３１から３７に記載の方法。
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