JP2022516073A - 抗ｐｄ－１結合タンパク質およびその使用方法 - Google Patents

抗ｐｄ－１結合タンパク質およびその使用方法 Download PDF

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Abstract

ＰＤ－１と選択的に結合する抗原結合タンパク質（ＡＢＰ）ならびにそのアイソフォームおよびホモログ、ならびにＡＢＰを含む組成物が、本明細書で提供される。ＡＢＰを使用する方法、例えば、治療方法および診断方法も提供される。ＰＤ－１に対する結合特異性を有する抗原結合タンパク質（ＡＢＰ）、ならびに医薬組成物、診断組成物、およびキットを含めた、そのようなＡＢＰを含む組成物が、本明細書で提供される。ＰＤ－１ ＡＢＰを作製する方法、ならびに例えば治療目的、診断目的および研究目的で、ＰＤ－１ ＡＢＰを使用する方法も、提供される。

Description

１．関連出願の相互参照
本出願は、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる、２０１８年１２月２７日に出願した米国仮特許出願第６２／７８５，６６０号の優先権および利益を主張する。
２．配列表
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂ経由で提出した１２２２１の配列に関する配列表を含み、この配列表は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０１９年１２月２０日に作成した前記ＡＳＣＩＩコピーは、ＧＧＮ－０１１ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔという名であり、サイズは２，０１８，８９９バイトである。
３．分野
ＰＤ－１に対する結合特異性を有する抗原結合タンパク質（ＡＢＰ）、ならびに医薬組成物、診断組成物、およびキットを含めた、そのようなＡＢＰを含む組成物が、本明細書で提供される。ＰＤ－１ ＡＢＰを作製する方法、ならびに例えば治療目的、診断目的および研究目的で、ＰＤ－１ ＡＢＰを使用する方法も、提供される。
４．背景
プログラム細胞死タンパク質１およびＣＤ２７９（表面抗原分類２７９）としても公知である、ＰＤ－１は、Ｔ細胞炎症活性を抑制する細胞表面受容体である。ＰＤ－１は、Ｔ細胞、Ｂ細胞およびマクロファージを含む免疫細胞により発現される。免疫細胞によっても発現されるＰＤ－Ｌ１は、ＰＤ－１の主要リガンドである。ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との相互作用は、Ｔ細胞炎症活性を抑制することによる免疫応答の下方調節および自己免疫寛容の促進に極めて重要である。この活性は、免疫系ががん細胞を死滅させるのを防止するばかりでなく、自己免疫疾患も防止する。
腫瘍細胞は、ＰＤ－Ｌ１を上方調節することによりＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路を乗っ取り、ひいては抗腫瘍免疫応答を抑制する。最近、ＰＤ－１阻害剤は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１結合に拮抗し、それによって免疫系を活性化して腫瘍を攻撃することが示された。したがって、ＰＤ－１阻害剤は、いくつかの種類のがんを処置するために使用されているが、効果はまちまちである。
ＰＤ－１活性の抑制は、動物において脳アミロイドβ斑（cerebral amyloid-β plagues）を低減させ、認知能力を向上させることも判明している。ＰＤ－１活性の遮断は、単球由来のマクロファージを脳に動員するＩＦＮ－γ依存性免疫応答であって、その結果、これらのマクロファージが組織からアミロイドβ斑を一掃することができるＩＦＮ－γ依存性免疫応答を惹起することが実証された。したがって、抗ＰＤ－１抗体は、アルツハイマー病を処置するための治療薬としても提案されている。
したがって、がんおよびアルツハイマー病を含む様々な疾患の処置、診断および研究に使用することができるＰＤ－１ ＡＢＰを開発する必要がある。
５．概要
ＰＤ－１に対する結合特異性を有する新規ＡＢＰ、およびそのようなＡＢＰを使用する方法が、本明細書で提供される。ＰＤ－１は、ヒトＰＤ－１（配列番号７００１）またはヒトＰＤ－１の断片である。
ＡＢＰは、抗体を含むことができる。一部の実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。一部の実施形態では、抗体は、キメラ抗体である。一部の実施形態では、抗体は、ヒト化抗体である。一部の実施形態では、抗体は、ヒト抗体である。一部の実施形態では、ＡＢＰは、抗体断片を含む。一部の実施形態では、ＡＢＰは、代替足場を含む。一部の実施形態では、ＡＢＰは、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む。
本明細書で提供されるＡＢＰは、ＰＤ－１の阻害に関連する様々な生物学的効果を誘導することができる。一部の実施形態では、本明細書で提供されるＡＢＰは、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との結合を防止する。一部の実施形態では、本明細書で提供されるＡＢＰは、エフェクターＴ細胞の阻害を防止する。一部の実施形態では、ＡＢＰは、エフェクターＴ細胞を共刺激する。一部の実施形態では、ＡＢＰは、調節性Ｔ細胞によるエフェクターＴ細胞の抑制を阻害する。一部の実施形態では、ＡＢＰは、組織内のまたは体循環におけるエフェクターＴ細胞の数を増加させる。一部の実施形態では、組織は、腫瘍である。一部の実施形態では、組織は、ウイルスに感染している組織である。
ＡＢＰを含む医薬組成物の１つまたは複数と医薬組成物の使用のための指示とを含むキットも提供される。
本明細書で提供されるＡＢＰをコードする単離されたポリヌクレオチドおよびそれらの部分も提供される。
そのようなポリヌクレオチドを含むベクターも提供される。
そのようなポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞、およびそのようなベクターを含む組換え宿主細胞も、提供される。
本明細書で提供されるポリヌクレオチド、ベクターまたは宿主細胞を使用してＡＢＰを産生する方法も提供される。
ＡＢＰと薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物も提供される。
より具体的には、本開示は、ヒトプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）に特異的に結合する単離された抗原結合タンパク質（ＡＢＰ）であって、（ａ）配列番号３００１～３０２８から選択される配列を有するＣＤＲ３－Ｌ、および配列番号６００１～６０２８から選択される配列を有するＣＤＲ３－Ｈ；または（ｂ）配列番号１００９２～１０６１４から選択される配列を有するＣＤＲ３－Ｌ、および配列番号１１６６１～１２１８３から選択される配列を有するＣＤＲ３－Ｈ；または（ｃ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２５５０９の下で寄託されたライブラリー内のクローンのいずれか１つのＣＤ３－Ｌの配列を有するＣＤＲ３－Ｌ、およびＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２５５０９の下で寄託されたライブラリー内のクローンのいずれか１つのＣＤ３－Ｌの配列を有するＣＤＲ３－Ｌを含む、単離された抗原結合タンパク質（ＡＢＰ）を提供する。一部の実施形態では、ＣＤＲ３－ＬおよびＣＤＲ３－Ｈは、同族対である。
一部の実施形態では、ＡＢＰは、（ａ）配列番号１００１～１０２８から選択される配列を有するＣＤＲ１－Ｌ、および配列番号２００１～２０２８から選択される配列を有するＣＤＲ２－Ｌ；および配列番号４００１～４０２８から選択される配列を有するＣＤＲ１－Ｈ；および配列番号５００１～５０２８から選択される配列を有するＣＤＲ２－Ｈ；または（ｂ）配列番号９０４６～９５６８から選択される配列を有するＣＤＲ１－Ｌ；および配列番号９５６９～１００９１から選択される配列を有するＣＤＲ２－Ｌ、および配列番号１０６１５～１１１３７から選択される配列を有するＣＤＲ１－Ｈ；および配列番号１１１３８～１１６６０から選択される配列を有するＣＤＲ２－Ｈ；または（ｃ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２５５０９の下で寄託されたライブラリー内のクローンのいずれか１つのＣＤＲ１－Ｌから選択される配列を有するＣＤＲ１－Ｌ；およびＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２５５０９の下で寄託されたライブラリー内のクローンのいずれか１つのＣＤＲ２－Ｌから選択される配列を有するＣＤＲ２－Ｌ；およびＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２５５０９の下で寄託されたライブラリー内のクローンのいずれか１つのＣＤＲ１－Ｈから選択される配列を有するＣＤＲ１－Ｈ；およびＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２５５０９の下で寄託されたライブラリー内のクローンのいずれか１つのＣＤＲ２－Ｈから選択される配列を有するＣＤＲ２－Ｈを含む。
一部の実施形態では、ＡＢＰは、ＣＤＲ１－Ｌ、ＣＤＲ２－Ｌ、ＣＤＲ３－Ｌ、ＣＤＲ１－Ｈ、ＣＤＲ２－ＨおよびＣＤＲ３－Ｈを含み、ＣＤＲ１－Ｌは、配列番号１００１からなり、ＣＤＲ２－Ｌは、配列番号２００１からなり、ＣＤＲ３－Ｌは、配列番号３００１からなり、ＣＤＲ１－Ｈは、配列番号４００１からなり、ＣＤＲ２－Ｈは、配列番号５００１からなり、ＣＤＲ３－Ｈは、配列番号６００１からなるか；またはＣＤＲ１－Ｌは、配列番号１００２からなり、ＣＤＲ２－Ｌは、配列番号２００２からなり、ＣＤＲ３－Ｌは、配列番号３００２からなり、ＣＤＲ１－Ｈは、配列番号４００２からなり、ＣＤＲ２－Ｈは、配列番号５００２からなり、ＣＤＲ３－Ｈは、配列番号６００２からなるか；またはＣＤＲ１－Ｌは、配列番号１００３からなり、ＣＤＲ２－Ｌは、配列番号２００３からなり、ＣＤＲ３－Ｌは、配列番号３００３からなり、ＣＤＲ１－Ｈは、配列番号４００３からなり、ＣＤＲ２－Ｈは、配列番号５００３からなり、ＣＤＲ３－Ｈは、配列番号６００３からなるか；またはＣＤＲ１－Ｌは、配列番号１００４からなり、ＣＤＲ２－Ｌは、配列番号２００４からなり、ＣＤＲ３－Ｌは、配列番号３００４からなり、ＣＤＲ１－Ｈは、配列番号４００４からなり、ＣＤＲ２－Ｈは、配列番号５００４からなり、ＣＤＲ３－Ｈは、配列番号６００４からなるか；またはＣＤＲ１－Ｌは、配列番号１００５からなり、ＣＤＲ２－Ｌは、配列番号２００５からなり、ＣＤＲ３－Ｌは、配列番号３００５からなり、ＣＤＲ１－Ｈは、配列番号４００５からなり、ＣＤＲ２－Ｈは、配列番号５００５からなり、ＣＤＲ３－Ｈは、配列番号６００５からなるか；またはＣＤＲ１－Ｌは、配列番号１００６からなり、ＣＤＲ２－Ｌは、配列番号２００６からなり、ＣＤＲ３－Ｌは、配列番号３００６からなり、ＣＤＲ１－Ｈは、配列番号４００６からなり、ＣＤＲ２－Ｈは、配列番号５００６からなり、ＣＤＲ３－Ｈは、配列番号６００６からなるか；またはＣＤＲ１－Ｌは、配列番号１００７からなり、ＣＤＲ２－Ｌは、配列番号２００７からなり、ＣＤＲ３－Ｌは、配列番号３００７からなり、ＣＤＲ１－Ｈは、配列番号４００７からなり、ＣＤＲ２－Ｈは、配列番号５００７からなり、ＣＤＲ３－Ｈは、配列番号６００７からなるか；またはＣＤＲ１－Ｌは、配列番号１００８からなり、ＣＤＲ２－Ｌは、配列番号２００８からなり、ＣＤＲ３－Ｌは、配列番号３００８からなり、ＣＤＲ１－Ｈは、配列番号４００８からなり、ＣＤＲ２－Ｈは、配列番号５００８からなり、ＣＤＲ３－Ｈは、配列番号６００８からなるか；またはＣＤＲ１－Ｌは、配列番号１００９からなり、ＣＤＲ２－Ｌは、配列番号２００９からなり、ＣＤＲ３－Ｌは、配列番号３００９からなり、ＣＤＲ１－Ｈは、配列番号４００９からなり、ＣＤＲ２－Ｈは、配列番号５００９からなり、ＣＤＲ３－Ｈは、配列番号６００９からなるか；またはＣＤＲ１－Ｌは、配列番号１０１０からなり、ＣＤＲ２－Ｌは、配列番号２０１０からなり、ＣＤＲ３－Ｌは、配列番号３０１０からなり、ＣＤＲ１－Ｈは、配列番号４０１０からなり、ＣＤＲ２－Ｈは、配列番号５０１０からなり、ＣＤＲ３－Ｈは、配列番号６０１０からなるか；またはＣＤＲ１－Ｌは、配列番号１０１１からなり、ＣＤＲ２－Ｌは、配列番号２０１１からなり、ＣＤＲ３－Ｌは、配列番号３０１１からなり、ＣＤＲ１－Ｈは、配列番号４０１１からなり、ＣＤＲ２－Ｈは、配列番号５０１１からなり、ＣＤＲ３－Ｈは、配列番号６０１１からなるか；またはＣＤＲ１－Ｌは、配列番号１０１２からなり、ＣＤＲ２－Ｌは、配列番号２０１２からなり、ＣＤＲ３－Ｌは、配列番号３０１２からなり、ＣＤＲ１－Ｈは、配列番号４０１２からなり、ＣＤＲ２－Ｈは、配列番号５０１２からなり、ＣＤＲ３－Ｈは、配列番号６０１２からなるか；またはＣＤＲ１－Ｌは、配列番号１０１３からなり、ＣＤＲ２－Ｌは、配列番号２０１３からなり、ＣＤＲ３－Ｌは、配列番号３０１３からなり、ＣＤＲ１－Ｈは、配列番号４０１３からなり、ＣＤＲ２－Ｈは、配列番号５０１３からなり、ＣＤＲ３－Ｈは、配列番号６０１３からなるか；またはＣＤＲ１－Ｌは、配列番号１０１４からなり、ＣＤＲ２－Ｌは、配列番号２０１４からなり、ＣＤＲ３－Ｌは、配列番号３０１４からなり、ＣＤＲ１－Ｈは、配列番号４０１４からなり、ＣＤＲ２－Ｈは、配列番号５０１４からなり、ＣＤＲ３－Ｈは、配列番号６０１４からなるか；またはＣＤＲ１－Ｌは、配列番号１０１５からなり、ＣＤＲ２－Ｌは、配列番号２０１５からなり、ＣＤＲ３－Ｌは、配列番号３０１５からなり、ＣＤＲ１－Ｈは、配列番号４０１５からなり、ＣＤＲ２－Ｈは、配列番号５０１５からなり、ＣＤＲ３－Ｈは、配列番号６０１５からなるか；またはＣＤＲ１－Ｌは、配列番号１０１６からなり、ＣＤＲ２－Ｌは、配列番号２０１６からなり、ＣＤＲ３－Ｌは、配列番号３０１６からなり、ＣＤＲ１－Ｈは、配列番号４０１６からなり、ＣＤＲ２－Ｈは、配列番号５０１６からなり、ＣＤＲ３－Ｈは、配列番号６０１６からなるか；またはＣＤＲ１－Ｌは、配列番号１０１７からなり、ＣＤＲ２－Ｌは、配列番号２０１７からなり、ＣＤＲ３－Ｌは、配列番号３０１７からなり、ＣＤＲ１－Ｈは、配列番号４０１７からなり、ＣＤＲ２－Ｈは、配列番号５０１７からなり、ＣＤＲ３－Ｈは、配列番号６０１７からなるか；またはＣＤＲ１－Ｌは、配列番号１０１８からなり、ＣＤＲ２－Ｌは、配列番号２０１８からなり、ＣＤＲ３－Ｌは、配列番号３０１８からなり、ＣＤＲ１－Ｈは、配列番号４０１８からなり、ＣＤＲ２－Ｈは、配列番号５０１８からなり、ＣＤＲ３－Ｈは、配列番号６０１８からなるか；またはＣＤＲ１－Ｌは、配列番号１０１９からなり、ＣＤＲ２－Ｌは、配列番号２０１９からなり、ＣＤＲ３－Ｌは、配列番号３０１９からなり、ＣＤＲ１－Ｈは、配列番号４０１９からなり、ＣＤＲ２－Ｈは、配列番号５０１９からなり、ＣＤＲ３－Ｈは、配列番号６０１９からなるか；またはＣＤＲ１－Ｌは、配列番号１０２０からなり、ＣＤＲ２－Ｌは、配列番号２０２０からなり、ＣＤＲ３－Ｌは、配列番号３０２０からなり、ＣＤＲ１－Ｈは、配列番号４０２０からなり、ＣＤＲ２－Ｈは、配列番号５０２０からなり、ＣＤＲ３－Ｈは、配列番号６０２０からなるか；またはＣＤＲ１－Ｌは、配列番号１０２１からなり、ＣＤＲ２－Ｌは、配列番号２０２１からなり、ＣＤＲ３－Ｌは、配列番号３０２１からなり、ＣＤＲ１－Ｈは、配列番号４０２１からなり、ＣＤＲ２－Ｈは、配列番号５０２１からなり、ＣＤＲ３－Ｈは、配列番号６０２１からなるか；またはＣＤＲ１－Ｌは、配列番号１０２２からなり、ＣＤＲ２－Ｌは、配列番号２０２２からなり、ＣＤＲ３－Ｌは、配列番号３０２２からなり、ＣＤＲ１－Ｈは、配列番号４０２２からなり、ＣＤＲ２－Ｈは、配列番号５０２２からなり、ＣＤＲ３－Ｈは、配列番号６０２２からなるか；またはＣＤＲ１－Ｌは、配列番号１０２３からなり、ＣＤＲ２－Ｌは、配列番号２０２３からなり、ＣＤＲ３－Ｌは、配列番号３０２３からなり、ＣＤＲ１－Ｈは、配列番号４０２３からなり、ＣＤＲ２－Ｈは、配列番号５０２３からなり、ＣＤＲ３－Ｈは、配列番号６０２３からなるか；またはＣＤＲ１－Ｌは、配列番号１０２４からなり、ＣＤＲ２－Ｌは、配列番号２０２４からなり、ＣＤＲ３－Ｌは、配列番号３０２４からなり、ＣＤＲ１－Ｈは、配列番号４０２４からなり、ＣＤＲ２－Ｈは、配列番号５０２４からなり、ＣＤＲ３－Ｈは、配列番号６０２４からなるか；またはＣＤＲ１－Ｌは、配列番号１０２５からなり、ＣＤＲ２－Ｌは、配列番号２０２５からなり、ＣＤＲ３－Ｌは、配列番号３０２５からなり、ＣＤＲ１－Ｈは、配列番号４０２５からなり、ＣＤＲ２－Ｈは、配列番号５０２５からなり、ＣＤＲ３－Ｈは、配列番号６０２５からなるか；またはＣＤＲ１－Ｌは、配列番号１０２６からなり、ＣＤＲ２－Ｌは、配列番号２０２６からなり、ＣＤＲ３－Ｌは、配列番号３０２６からなり、ＣＤＲ１－Ｈは、配列番号４０２６からなり、ＣＤＲ２－Ｈは、配列番号５０２６からなり、ＣＤＲ３－Ｈは、配列番号６０２６からなるか；またはＣＤＲ１－Ｌは、配列番号１０２７からなり、ＣＤＲ２－Ｌは、配列番号２０２７からなり、ＣＤＲ３－Ｌは、配列番号３０２７からなり、ＣＤＲ１－Ｈは、配列番号４０２７からなり、ＣＤＲ２－Ｈは、配列番号５０２７からなり、ＣＤＲ３－Ｈは、配列番号６０２７からなるか；またはＣＤＲ１－Ｌは、配列番号１０２８からなり、ＣＤＲ２－Ｌは、配列番号２０２８からなり、ＣＤＲ３－Ｌは、配列番号３０２８からなり、ＣＤＲ１－Ｈは、配列番号４０２８からなり、ＣＤＲ２－Ｈは、配列番号５０２８からなり、ＣＤＲ３－Ｈは、配列番号６０２８からなる。
一部の実施形態では、ＡＢＰは、配列番号１～２８から選択される配列と少なくとも９７％同一の配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）、および配列番号１０１～１２８から選択される配列と少なくとも９７％同一の配列を含む可変重鎖（ＶＨ）；または配列番号８０００～８５２２から選択される配列と少なくとも９７％同一の配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）、および配列番号８５２３～９０４５から選択される配列と少なくとも９７％同一の配列を含む可変重鎖（ＶＨ）；またはＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２５５０９の下で寄託されたライブラリー内のクローンのいずれか１つのＶＬ配列と少なくとも９７％同一の配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）、およびＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２５５０９の下で寄託されたライブラリー内のクローンのいずれか１つのＶＨ配列と少なくとも９７％同一の配列を含む可変重鎖（ＶＨ）を含む。一部の実施形態では、ＶＬおよびＶＨは、同族対である。
一部の実施形態では、ＡＢＰは、配列番号１～２８から選択される配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）、および配列番号１０１～１２８から選択される配列を含む可変重鎖（ＶＨ）、または配列番号８０００～８５２２から選択される配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）、および配列番号８５２３～９０４５から選択される配列を含む可変重鎖（ＶＨ）；またはＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２５５０９の下で寄託されたライブラリー内のクローンのいずれか１つのＶＬ配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）、およびＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２５５０９の下で寄託されたライブラリー内のクローンのいずれか１つのＶＨ配列を含む可変重鎖（ＶＨ）を含む。一部の実施形態では、ＶＬおよびＶＨは、同族対である。
一部の実施形態では、ＡＢＰは、ｓｃＦｖまたは全長モノクローナル抗体を含む。一部の実施形態では、ＡＢＰは、免疫グロブリン定常領域を含む。
一部の実施形態では、ＡＢＰは、バイオレイヤー干渉法または表面プラズモン共鳴により測定して、５００ｎＭ未満のＫＤでヒトＰＤ－１に結合する。一部の実施形態では、ＡＢＰは、バイオレイヤー干渉法または表面プラズモン共鳴により測定して、２００ｎＭ未満のＫＤでヒトＰＤ－１に結合する。一部の実施形態では、ＡＢＰは、バイオレイヤー干渉法または表面プラズモン共鳴により測定して、２５ｎＭ未満のＫＤでヒトＰＤ－１に結合する。一部の実施形態では、ＡＢＰは、２５ｎＭ未満のＫＤで細胞表面上のヒトＰＤ－１と結合する。
本開示の別の態様は、本開示のＡＢＰのいずれか１つと賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。
本開示の別の態様は、疾患を処置する方法であって、それを必要とする対象に、本明細書で開示されるＡＢＰのまたは本明細書で開示される医薬組成物の有効量を投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、疾患は、がん、ＡＩＤＳ、アルツハイマー病およびウイルスまたは細菌感染症からなる群から選択される。一部の実施形態では、方法は、１つまたは複数の追加の治療剤を対象に投与するステップをさらに含む。一部の実施形態では、追加の治療剤は、ＣＴＬＡ－４阻害剤、ＴＩＧＩＴ阻害剤、化学療法剤、免疫刺激剤、放射線、サイトカイン、サイトカインをコードするポリヌクレオチド、およびこれらの組合せから選択される。
６．図面の簡単な説明
図１は、完全ヒトマウスから単離されたＢ細胞からｓｃＦｖライブラリーを生成し、抗原に対して高い親和性を有する抗体を発現するＢ細胞を選択する方法を要約した。図１は、配列番号１２１９４～１２２２１を出現順にそれぞれ開示する。
図２は、ｓｃＦｖ増幅手順を例示する。第一に、ＩｇＫ Ｃ領域、ＩｇＧ Ｃ領域、および全てのＶ領域を対象とするプライマーの混合物を使用して、ＩｇＫとＩｇＨを別々に増幅させる。第二に、Ｖ－ＨおよびＣ－Ｋプライマーは、ＩｇＫとＩｇＨとの融合生成物であるオーバーラップ伸長アンプリコンの形成をもたらす相補性領域を含有する。相補性領域は、Ｇｌｙ－ＳｅｒリッチｓｃＦｖリンカー配列をコードするＤＮＡ配列を含む。第三に、セミネステッドＰＣＲは、Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシングまたは酵母ディスプレイのためのアダプターを付加するために実施される。
図３は、示されているモノクローナル抗体およびペムブロリズマブのエピトープビニングを示すエピトープマップを含む。
７．詳細な説明
７．１．定義
本明細書中で別段の定義がない限り、本開示に関連して使用される科学および専門用語は、当業者により一般に理解されている意味を有するものとする。さらに、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、単数形の用語は、複数形のものを含むものとし、複数形の用語は、単数形のものを含むものとする。一般に、本明細書に記載の細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学ならびにタンパク質および核酸化学およびハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法、ならびに本明細書に記載の細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学ならびにタンパク質および核酸化学およびハイブリダイゼーションの技術は、当技術分野において周知の、一般に使用されているものである。本開示の方法および技術は、別段の指示がない限り、一般に、当技術分野において周知の従来の方法に従って、ならびに本明細書の至る所で言及され、論じられる様々な一般およびより特異的な参考文献に記載されているように、行われる。例えば、Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)およびAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992)、およびHarlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990)を参照されたく、これらの参考文献は、参照により本明細書に組み込まれる。酵素反応および精製技術は、当技術分野において一般に遂行されているように、または本明細書に記載されるように、製造業者の仕様に従って行われる。本明細書に記載の分析化学、合成有機化学、医化学および薬化学に関連して使用される用語法、ならびに本明細書に記載の分析化学、合成有機化学、医化学および薬化学の実験手順および技術は、当技術分野において周知の、一般に使用されているものである。化学合成、化学分析、薬学的調製、製剤および送達、ならびに患者の処置には、標準的な技術を使用することができる。
下記の用語は、別段の指示がない限り、下記の意味を有すると解されるものとする：
用語「ＰＤ－１」、「ＰＤ－１タンパク質」、および「ＰＤ－１抗原」は、ヒトＰＤ－１、または細胞により天然に発現される、もしくはｐｄｃｄ１遺伝子をトランスフェクトした細胞により発現される、ヒトＰＤ－１の任意のバリアント（例えば、スプライスバリアントおよび対立遺伝子バリアント）、アイソフォームおよび種ホモログを指すために、本明細書では同義的に使用される。一部の態様では、ＰＤ－１タンパク質は、霊長類（例えば、サルまたはヒト）、げっ歯類（例えば、マウスまたはラット）、イヌ、ラクダ、ネコ、ウシ、ヤギ、ウマまたはヒツジにより天然に発現されるＰＤ－１タンパク質である。一部の態様では、ＰＤ－１タンパク質は、ヒトＰＤ－１（ｈＰＤ－１；配列番号７００１）である。
用語「免疫グロブリン」は、１対の軽（Ｌ）鎖および１対の重（Ｈ）鎖である、２対のポリペプチド鎖を一般に含む、構造的に関連しているタンパク質のクラスを指す。「無傷免疫グロブリン」では、これらの４本の鎖全てがジスルフィド結合により相互接続されている。免疫グロブリンの構造は、十分に特徴付けられている。例えば、Paul, Fundamental Immunology 7th ed., Ch. 5 (2013) Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PAを参照されたい。手短に述べると、各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域（ＣＨ）を概して含む。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３と略記される、３つのドメインを概して含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域を概して含む。軽鎖定常領域は、ＣＬと略記される、１つのドメインを概して含む。
用語「抗原結合タンパク質」（ＡＢＰ）は、抗原またはエピトープと特異的に結合する１つまたは複数の抗原結合ドメインを含むタンパク質を指す。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、天然に存在する抗体のものと同様の特異性および親和性で抗原またはエピトープに結合する。一部の実施形態では、ＡＢＰは、抗体を含む。一部の実施形態では、ＡＢＰは、抗体からなる。一部の実施形態では、ＡＢＰは、抗体から本質的になる。一部の実施形態では、ＡＢＰは、代替足場を含む。一部の実施形態では、ＡＢＰは、代替足場からなる。一部の実施形態では、ＡＢＰは、代替足場から本質的になる。一部の実施形態では、ＡＢＰは、抗体断片を含む。一部の実施形態では、ＡＢＰは、抗体断片からなる。一部の実施形態では、ＡＢＰは、抗体断片から本質的になる。「ＰＤ－１ ＡＢＰ」、「抗ＰＤ－１ ＡＢＰ」、または「ＰＤ－１特異的ＡＢＰ」は、抗原ＰＤ－１と特異的に結合する、本明細書で提供されるような、ＡＢＰである。一部の実施形態では、ＡＢＰは、ＰＤ－１の細胞外ドメインに結合する。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるＰＤ－１ ＡＢＰは、異なる種からのＰＤ－１タンパク質間またはそれらの間で保存される、ＰＤ－１のエピトープと結合する。
用語「抗体」は、本明細書ではその最も広い意味で使用され、抗原またはエピトープと特異的に結合する１つまたは複数の抗原結合ドメインを含むある特定のタイプの免疫グロブリン分子を含む。抗体は、具体的には、無傷抗体（例えば、無傷免疫グロブリン）、抗体断片、および多重特異性抗体を含む。抗原結合ドメインの一例は、ＶＨ－ＶＬ二量体により形成される抗原結合ドメインである。抗体は、１つのタイプのＡＢＰである。
用語「代替足場」は、抗原またはエピトープと特異的に結合する１つまたは複数の抗原結合ドメインを生成するように１つまたは複数の領域を多様化することができる分子を指す。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、天然に存在する抗体のものと同様の特異性および親和性で、抗原またはエピトープに結合する。例示的な代替足場としては、フィブロネクチンに由来するもの（例えば、Ａｄｎｅｃｔｉｎｓ（商標））、β－サンドイッチに由来するもの（例えば、ｉＭａｂ）、リポカリンに由来するもの（例えば、Ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ（登録商標））、ＥＥＴＩ－ＩＩ／ＡＧＲＰに由来するもの、ＢＰＴＩ／ＬＡＣＩ－Ｄ１／ＩＴＩ－Ｄ２に由来するもの（例えば、クニッツドメイン）、チオレドキシンペプチドアプタマーに由来するもの、プロテインＡに由来するもの（例えば、Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標））、アンキリンリピートに由来するもの（例えば、ＤＡＲＰｉｎ）、ガンマ－Ｂ－クリスタリン／ユビキチンに由来するもの（例えば、アフィリン）、ＣＴＬＤ３に由来するもの（例えば、テトラネクチン）、フィノマーに由来するもの、および（ＬＤＬＲ－Ａ分子）に由来するもの（例えば、アビマー）が挙げられる。代替足場のさらなる情報は、Binz et al., Nat. Biotechnol., 2005 23:1257-1268；Skerra, Current Opin. in Biotech., 2007 18:295-304；およびSilacci et al., J. Biol. Chem., 2014, 289:14392-14398において提供されており、これらの参考文献の各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。代替足場は、１つのタイプのＡＢＰである。
用語「抗原結合ドメイン」は、抗原またはエピトープと特異的に結合することができるＡＢＰの部分を意味する。
用語「全長抗体」、「無傷抗体」、および「全抗体」は、天然に存在する抗体構造と実質的に同様の構造を有する抗体であって、Ｆｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指すために、本明細書では同義的に使用される。
用語「Ｆｃ領域」は、天然に存在する抗体では、Ｆｃ受容体とおよび補体系のある特定のタンパク質と相互作用する、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を意味する。様々な免疫グロブリンのＦｃ領域およびそこに含有されているグリコシル化部位の構造は、当技術分野において公知である。その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Schroeder and Cavacini, J. Allergy Clin. Immunol., 2010, 125:S41-52を参照されたい。Ｆｃ領域は、天然に存在するＦｃ領域であってもよく、または本開示の他の箇所に記載されるように改変されたＦｃ領域であってもよい。
ＶＨおよびＶＬ領域は、より保存される領域が散在する、超可変性の領域（「相補性決定領域（ＣＤＲ）」とも呼ばれる「超可変領域（ＨＶＲ）」）にさらに細分することができる。より保存される領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。ＶＨおよびＶＬ各々は、３つのＣＤＲと４つのＦＲを一般に含み、これらは次の順序で配置されている（Ｎ末端からＣ末端へ）：ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４。ＣＤＲは、抗原結合に関与し、抗体の抗原特異性および結合親和性に影響を及ぼす。その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest 5th ed. (1991) Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MDを参照されたい。
いずれの脊椎動物種からの軽鎖も、その定常ドメインの配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる、２つのタイプの一方に指定され得る。
いずれの脊椎動物種からの重鎖も、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭという５つの異なるクラス（またはアイソタイプ）のうちの１つに指定され得る。これらのクラスは、それぞれ、α、δ、ε、γおよびμとも表記される。ＩｇＧおよびＩｇＡクラスは、配列および機能の違いに基づいてサブクラスにさらに分けられる。ヒトは、次のサブクラスを発現する：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２。
ＣＤＲのアミノ酸配列境界を、当業者は、多数の公知番号付けスキームのいずれかを使用して決定することができ、そのような番号付けスキームには、Kabat et al.、上掲（「Ｋａｂａｔ」番号付けスキーム）；Al-Lazikani et al., 1997, J. Mol. Biol., 273:927-948（「Ｃｈｏｔｈｉａ」番号付けスキーム）；MacCallum et al., 1996, J. Mol. Biol. 262:732-745（「Ｃｏｎｔａｃｔ」番号付けスキーム）；Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol., 2003, 27:55-77（「ＩＭＧＴ」番号付けスキーム）；およびHonegge and Plueckthun, J. Mol. Biol., 2001, 309:657-70（「ＡＨｏ」番号付けスキーム）により記載されたものが含まれ、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
表１は、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａスキームにより同定されたＣＤＲ１－Ｌ（ＶＬのＣＤＲ１）、ＣＤＲ２－Ｌ（ＶＬのＣＤＲ２）、ＣＤＲ３－Ｌ（ＶＬのＣＤＲ３）、ＣＤＲ１－Ｈ（ＶＨのＣＤＲ１）、ＣＤＲ２－Ｈ（ＶＨのＣＤＲ２）およびＣＤＲ３－Ｈ（ＶＨのＣＤＲ３）の位置を提供するものである。ＣＤＲ１－Ｈについては、Ｋａｂａｔ番号付けスキームとＣｈｏｔｈｉａ番号付けスキームの両方を使用して残基番号付けが提供されている。
ＣＤＲは、例えば、www.bioinf.org.uk/abs/abnum/で入手可能であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Abhinandan and Martin, Immunology, 2008, 45:3832-3839に記載されている、Ａｂｎｕｍなどの、抗体番号付けソフトウェアを使用して指定され得る。
Figure 2022516073000002
「ＥＵ番号付けスキーム」は、一般に、抗体重鎖定常領域中の残基（例えば、Kabat et al.、上掲で報告されているような）に言及する際に使用される。
「抗体断片」は、無傷抗体の一部分、例えば、無傷抗体の抗原結合領域または可変領域を含む。抗体断片は、例えば、Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片、ｓｃＦｖ（ｓＦｖ）断片、およびｓｃＦｖ－Ｆｃ断片を含む。
「Ｆｖ」断片は、１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインの非共有結合で連結された二量体を含む。
「Ｆａｂ」断片は、重鎖および軽鎖可変ドメインに加えて、軽鎖の定常ドメイン、および重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ断片は、例えば、組換え法により、または全長抗体のパパイン消化により、調製することができる。
「Ｆ（ａｂ’）２」断片は、ジスルフィド結合により連結された、ヒンジ領域付近にある、２つのＦａｂ’断片を含有する。Ｆ（ａｂ’）２断片は、例えば、組換え法により、または無傷抗体のペプシン消化により、調製することができる。Ｆ（ａｂ’）断片は、例えばβ－メルカプトエタノールでの処置により、解離させることができる。
「単鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は、単一ポリペプチド鎖内にＶＨドメインおよびＶＬドメインを含む。ＶＨおよびＶＬは、一般に、ペプチドリンカーにより連結されている。Plueckthun A. (1994)を参照されたい。一部の実施形態では、リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１２１９０）である。一部の実施形態では、ｎ＝１、２、３、４、５または６。その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Antibodies from Escherichia coli. In Rosenberg M. & Moore G.P. (Eds.), The Pharmacology of Monoclonal Antibodies vol. 113 (pp. 269-315). Springer-Verlag, New Yorkを参照されたい。
「ｓｃＦｖ－Ｆｃ」断片は、Ｆｃドメインに結合しているｓｃＦｖを含む。例えば、Ｆｃドメインは、ｓｃＦｖのＣ末端に結合していることがある。ｓｃＦｖ内の可変ドメインの配向に依存するＶＨまたはＶＬ（すなわち、ＶＨ－ＶＬまたはＶＬ－ＶＨ）の後に、Ｆｃドメインが続くことがある。当技術分野において公知のまたは本明細書に記載の任意の好適なＦｃドメインを使用することができる。一部の場合には、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインを含む。
用語「単一ドメイン抗体」は、抗体の１つの可変ドメインが、他の可変ドメインが存在しない抗原と特異的に結合する、分子を指す。単一ドメイン抗体およびその断片は、Arabi Ghahroudi et al., FEBS Letters, 1998, 414:521-526およびMuyldermans et al., Trends in Biochem.Sci., 2001, 26:230-245に記載されており、これらの参考文献の各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
「単一特異性ＡＢＰ」は、単一のエピトープと特異的に結合する結合部位を含むＡＢＰである。単一特異性ＡＢＰの例は、二価だが、各抗原結合ドメインにおける同じエピトープを認識する、天然に存在するＩｇＧ分子である。結合特性は、あらゆる好適な結合価で存在し得る。
用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団からの抗体を指す。実質的に均一な抗体の集団は、モノクローナル抗体の産生中に通常生じ得るバリアントを除いて、実質的に同様であるおよび同じエピトープに結合する抗体を含む。そのようなバリアントは、一般に、ほんの少量でのみ存在する。モノクローナル抗体は、概して、複数の抗体からの単一の抗体の選択を含むプロセスにより得られる。例えば、選択プロセスは、ハイブリドーマクローン、ファージクローン、酵母クローン、細菌クローンまたは他の組換えＤＮＡクローンのプールなどの、複数のクローンからのユニーククローンの選択であり得る。選択された抗体をさらに改造して、例えば、標的に対する親和性を向上させること（「親和性成熟」）、抗体をヒト化すること、細胞培養におけるその産生を改善すること、および／または対象におけるその免疫原性を低下させることができる。
用語「キメラ抗体」は、重鎖および／または軽鎖の一部分が特定の供給源または種に由来するが、その重鎖および／または軽鎖の残部が異なる供給源または種に由来する、抗体を指す。
非ヒト抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト抗体に由来する最小配列を含有するキメラ抗体である。一般に、ヒト化抗体は、１つまたは複数のＣＤＲからの残基が非ヒト抗体（ドナー抗体）の１つまたは複数のＣＤＲからの残基により置換されている、ヒト抗体（レシピエント抗体）である。ドナー抗体は、所望の特異性、親和性または生物学的効果を有するマウス、ラット、ウサギ、ニワトリまたは非ヒト霊長類抗体などの、任意の好適な非ヒト抗体であり得る。一部の事例では、レシピエント抗体の選択されたフレームワーク領域残基は、ドナー抗体からの対応するフレームワーク領域残基により置換されている。ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見られない残基も含み得る。そのような改変は、抗体機能をさらに洗練するために行われ得る。さらなる詳細については、Jones et al., Nature, 1986, 321:522-525；Riechmann et al., Nature, 1988, 332:323-329；およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol., 1992, 2:593-596を参照されたく、これらの参考文献の各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
「ヒト抗体」は、ヒトもしくはヒト細胞により産生される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列、またはヒト抗体レパートリーもしくはヒト抗体をコードしている配列（例えば、ヒト供給源から得られたもしくは新規に設計された）を利用する非ヒト供給源に由来するアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する、抗体である。ヒト抗体は、具体的にはヒト化抗体を含まない。一部の実施形態では、げっ歯動物は、それらのげっ歯動物抗体配列をヒト抗体で置き換えるように遺伝子操作される。
「単離されたＡＢＰ」または「単離された核酸」は、その天然環境の成分から分離および／または回収された、ＡＢＰまたは核酸である。天然環境の成分は、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性物質を含み得る。一部の実施形態では、単離されたＡＢＰは、例えばスピニングカップシークエネーターの使用により、Ｎ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るために十分な程度に精製される。一部の実施形態では、単離されたＡＢＰは、クーマシーブルーまたは銀染色剤による検出を用いる還元または非還元条件下でのゲル電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）により、均一になるまで精製される。単離されたＡＢＰは、ＡＢＰの天然環境の少なくとも１つの成分が存在しないので、組換え細胞内の元位置の（in situ）ＡＢＰを含む。一部の態様では、単離されたＡＢＰまたは単離された核酸は、少なくとも１つの精製ステップにより調製される。一部の実施形態では、単離されたＡＢＰまたは単離された核酸は、少なくとも８０重量％、８５重量％、９０重量％、９５重量％または９９重量％に精製される。一部の実施形態では、単離されたＡＢＰまたは単離された核酸は、少なくとも８０体積％、８５体積％、９０体積％、９５体積％または９９体積％に精製される。一部の実施形態では、単離されたＡＢＰまたは単離された核酸は、少なくとも８５重量％、９０重量％、９５重量％、９８重量％、９９重量％～１００重量％ＡＢＰまたは核酸を含む溶液として提供される。一部の実施形態では、単離されたＡＢＰまたは単離された核酸は、少なくとも８５体積％、９０体積％、９５体積％、９８体積％、９９体積％～１００体積％ＡＢＰまたは核酸を含む溶液として提供される。
「親和性」は、分子（例えば、ＡＢＰ）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原またはエピトープ）との非共有結合性相互作用の総計の強度を指す。別段の指示がない限り、本明細書で使用される場合、「親和性」は、結合対のメンバー（例えば、ＡＢＰおよび抗原またはエピトープ）間の１：１相互作用を表す、固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性を、解離平衡定数（ＫＤ）により表すことができる。解離平衡定数に寄与する動態成分は、より詳細に下記で説明される。親和性は、本明細書に記載のものを含む、当技術分野で公知の一般的な方法により測定することができる。例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標））またはバイオレイヤー干渉法（例えば、ＦＯＲＴＥＢＩＯ（登録商標））を使用して、親和性を決定することができる。
標的分子とのＡＢＰの結合に関して、特定の抗原（例えば、ポリペプチド標的）または特定の抗原上のエピトープ「に結合する」、「に特異的に結合すること」、「と特異的に結合する」、「に対して特異的」、「に選択的に結合する」、および「に対して選択的」という用語は、非特異的または非選択的相互作用（例えば、非標的分子との）とは明らかに異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、標的分子との結合を測定し、それを非標的分子との結合と比較することにより、測定することができる。特異的結合は、標的分子上の認識されるエピトープを模倣する対照分子との競合により決定することもできる。その場合、特異的結合は、ＡＢＰの標的分子との結合が対照分子により競合的に阻害される場合に示される。一部の態様では、ＰＤ－１ ＡＢＰの非標的分子に対する親和性は、ＰＤ－１に対する親和性の約５０％未満である。一部の態様では、ＰＤ－１ ＡＢＰの非標的分子に対する親和性は、ＰＤ－１に対する親和性の約４０％未満である。一部の態様では、ＰＤ－１ ＡＢＰの非標的分子に対する親和性は、ＰＤ－１に対する親和性の約３０％未満である。一部の態様では、ＰＤ－１ ＡＢＰの非標的分子に対する親和性は、ＰＤ－１に対する親和性の約２０％未満である。一部の態様では、ＰＤ－１ ＡＢＰの非標的分子に対する親和性は、ＰＤ－１に対する親和性の約１０％未満である。一部の態様では、ＰＤ－１ ＡＢＰの非標的分子に対する親和性は、ＰＤ－１に対する親和性の約１％未満である。一部の態様では、ＰＤ－１ ＡＢＰの非標的分子に対する親和性は、ＰＤ－１に対する親和性の約０．１％未満である。
用語「ｋｄ」（秒－１）は、本明細書で使用される場合、特定のＡＢＰ－抗原相互作用の解離速度定数を指す。この値は、ｋｏｆｆ値とも呼ばれる。
用語「ｋａ」（Ｍ－１×秒－１）は、本明細書で使用される場合、特定のＡＢＰ－抗原相互作用の会合速度定数を指す。この値は、ｋｏｎ値とも呼ばれる。
用語「ＫＤ」（Ｍ）は、本明細書で使用される場合、特定のＡＢＰ－抗原相互作用の解離平衡定数を指す。ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ。
用語「ＫＡ」（Ｍ－１）は、本明細書で使用される場合、特定のＡＢＰ－抗原相互作用の会合平衡定数を指す。ＫＡ＝ｋａ／ｋｄ。
「親和性成熟した」ＡＢＰは、変更（複数可）を有さない親ＡＢＰと比較して、ＡＢＰのその抗原に対する親和性の改善をもたらす、１つまたは複数の変更（例えば、１つまたは複数のＣＤＲまたはＦＲにおける）を有するＡＢＰである。一実施形態では、親和性成熟したＡＢＰは、標的抗原に対してナノモル濃度またはピコモル濃度の親和性を有する。親和性成熟したＡＢＰは、当技術分野において公知の様々な方法を使用して産生され得る。例えば、Marks et al.（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Bio/Technology, 1992, 10:779-783）は、ＶＨドメインとＶＬドメインのシャフリングによる親和性成熟を記載している。ＣＤＲおよび／またはフレームワーク残基のランダム変異誘発は、例えば、Barbas et al. (Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 1994, 91:3809-3813)、Schier et al., Gene, 1995, 169:147-155；Yelton et al., J. Immunol., 1995, 155:1994-2004、Jackson et al., J. Immunol., 1995, 154:3310-33199、およびHawkins et al, J. Mol. Biol., 1992, 226:889-896により記載されており、これらの参考文献の各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
「イムノコンジュゲート」は、１つまたは複数の異種分子とコンジュゲートしているＡＢＰである。
「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域により媒介される生物活性を指し、これらの活性は、抗体アイソタイプによって異なり得る。抗体エフェクター機能の例としては、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を活性化するためのＣ１ｑ結合、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および抗体依存性細胞ファゴサイトーシス（ＡＤＣＰ）を活性化するためのＦｃ受容体結合が挙げられる。
２つまたはそれより多くのＡＢＰに関連して本明細書で使用される場合、「と競合する」または「と交差競合する」という用語は、２つまたはそれより多くのＡＢＰが、抗原（例えば、ＰＤ－１）との結合について競合することを示す。１つの例示的アッセイでは、ＰＤ－１で表面を被覆し、それを第１のＰＤ－１ ＡＢＰと接触させ、その後、第２のＰＤ－１ ＡＢＰを添加する。別の例示的アッセイでは、第１のＰＤ－１ ＡＢＰで表面を被覆し、それをＰＤ－１と接触させ、次いで、第２のＰＤ－１ ＡＢＰを添加する。第１のＰＤ－１ ＡＢＰの存在が、どちらかのアッセイにおいて第２のＰＤ－１ ＡＢＰの結合を低減させる場合には、これらのＡＢＰは競合する。「と競合する」という用語は、１つのＡＢＰが別のＡＢＰの結合を低減させるが、逆の順序でＡＢＰが添加されたときには競合が観察されない、ＡＢＰの組合せも含む。しかし、一部の実施形態では、第１および第２のＡＢＰは、それらが添加される順序に関係なく、互いの結合を阻害する。一部の実施形態では、１つのＡＢＰは、別のＡＢＰのその抗原への結合を少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％低減させる。当業者は、競合アッセイで使用される抗体の濃度をＰＤ－１に対するＡＢＰの親和性およびＡＢＰの結合価に基づいて選択することができる。この定義に記載のアッセイは、説明のためのものであり、当業者は、任意の好適なアッセイを利用して、抗体が互いに競合するかどうかを決定することができる。好適なアッセイは、Cox et al., "Immunoassay Methods," in Assay Guidance Manual [Internet], Updated December 24, 2014 (www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK92434/; accessed September 29, 2015); Silman et al., Cytometry, 2001, 44:30-37;およびFinco et al., J. Pharm. Biomed. Anal., 2011, 54:351-358に記載されており、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
用語「エピトープ」は、ＡＢＰと特異的に結合する抗原の部分を意味する。エピトープは、多くの場合、表面露出アミノ酸残基および／または糖側鎖からなり、特異的三次元構造特性はもちろん特異的電荷特性も有し得る。立体構造エピトープと非立体構造エピトープとは、前者の立体構造エピトープとの結合は変性溶媒の存在下で失われることがあるが、後者の非立体構造エピトープとの結合はそうではないことで、区別される。エピトープは、結合に直接関与するアミノ酸残基と、結合に直接関与しない他のアミノ酸残基とを含み得る。ＡＢＰが結合するエピトープは、例えば、異なる点変異を有するＰＤ－１バリアントとのまたはキメラＰＤ－１バリアントとのＡＢＰ結合の試験などの、公知のエピトープ決定技術を使用して、決定することができる。
ポリペプチド配列と参照配列との「同一性」パーセントは、配列をアラインさせ、最大配列同一性パーセントを達成するために必要に応じてギャップを導入した後、参照配列中のアミノ酸残基と同一であるポリペプチド配列中のアミノ酸残基のパーセンテージと定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアラインメントは、当技術分野における技能の範囲内である様々な方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、ＭＥＧＡＬＩＧＮ（ＤＮＡＳＴＡＲ）、ＣＬＵＳＴＡＬＷ、ＣＬＵＳＴＡＬ ＯＭＥＧＡまたはＭＵＳＣＬＥソフトウェアなどの公開されているコンピュータソフトウェアを使用して、達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列をアラインさせるための適切なパラメーターを決定することができる。
「保存的置換」または「保存的アミノ酸置換」は、あるアミノ酸の化学的にまたは機能的に類似したアミノ酸での置換を指す。類似したアミノ酸をもたらす保存的置換表は、当技術分野において周知である。例として、表２～４で提供されるアミノ酸の群は、一部の実施形態では、互いに保存的置換とみなされる。
Figure 2022516073000003
Figure 2022516073000004
Figure 2022516073000005
追加の保存的置換は、例えば、Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties 2nd ed. (1993) W. H. Freeman & Co., New York, NYにおいて見出すことができる。親ＡＢＰ中のアミノ酸残基の１つまたは複数の保存的置換を行うことにより生成されるＡＢＰは、「保存的に改変されたバリアント」と呼ばれる。
用語「処置すること」（およびその変形形態、例えば「処置する」または「処置」）は、それを必要とする対象における疾患または状態の自然な経過を変更する目的での臨床的介入を指す。処置は、発病予防のために行われることもあり、臨床病理学的検査の過程で行われることもある。処置の望ましい効果としては、疾患の発生もしくは再発を防止すること、症状を軽減すること、疾患の任意の直接的もしくは間接的病理学的帰結を和らげること、転移を防止すること、疾患進行速度を低下させること、病状を改善または緩和すること、および寛解、または予後改善が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「治療有効量」または「有効量」という用語は、対象に投与されたときに疾患または障害を処置するのに有効である、本明細書で提供されるＡＢＰまたは医薬組成物の量を指す。
本明細書で使用される場合、用語「対象」は、哺乳動物対象を意味する。例示的な対象としては、ヒト、サル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ラクダ、ヤギ、ウサギおよびヒツジが挙げられる。ある特定の実施形態では、対象は、ヒトである。一部の実施形態では、対象は、本明細書で提供されるＡＢＰで処置することができる疾患または状態を有する。一部の態様では、疾患または状態は、がんである。一部の態様では、疾患または状態は、ウイルス感染症である。
用語「添付文書」は、治療用または診断用製品（例えば、キット）の市販のパッケージ内に通例含まれている指示であって、そのような治療用または診断用製品の使用に関する適応症、使用法、投与量、投与、併用療法、禁忌および／または警告についての情報を含む指示を指すために使用される。
用語「細胞傷害剤」は、本明細書で使用される場合、細胞の機能を阻害もしくは防止するおよび／または細胞死もしくは破壊を引き起こす物質を指す。
「化学療法剤」は、がんの処置に有用な化学化合物を指す。化学療法剤は、がんの成長を促進することができるホルモンの効果を調節、低下、遮断または阻害するように作用する、「抗ホルモン剤」または「内分泌療法薬」を含む。
用語「細胞増殖抑制剤」は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのどちらかで細胞の成長を抑止する、化合物または組成物を指す。一部の実施形態では、細胞増殖抑制剤は、Ｓ期の細胞のパーセンテージを低下させる薬剤である。一部の実施形態では、細胞増殖抑制剤は、Ｓ期の細胞のパーセンテージを少なくとも約２０％、少なくとも約４０％、少なくとも約６０％、または少なくとも約８０％低下させる。
用語「腫瘍」は、あらゆる新生物細胞成長および増殖を悪性であるか良性であるかを問わずに指し、ならびにあらゆる前がん性およびがん性細胞および組織を指す。用語「がん」、「がん性の」、「細胞増殖性障害」、「増殖性障害」、および「腫瘍」は、本明細書で言及される場合、相互排他的ではない。用語「細胞増殖性障害」および「増殖性障害」は、ある程度の異常細胞増殖を伴う障害を指す。一部の実施形態では、細胞増殖性障害は、がんである。
用語「医薬組成物」は、含有する活性成分の生物活性が対象の処置に有効であることを可能にするような形態である調製物であって、対象にとって許容できないほど毒性である追加の成分を含有しない調製物を指す。
用語「モジュレートする」および「モジュレーション」は、述べられている可変要素（recited variable）を低減させることもしくは阻害することまたは、代替的に、活性化することもしくは増加させることを指す。
用語「増加させる」および「活性化する」は、述べられている可変要素の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍またはそれより大きな増加を指す。
用語「低下させる」および「阻害する」は、述べられている可変要素の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％の、２分の１、３分の１、４分の１、５分の１、１０分の１、２０分の１、５０分の１、１００分の１への、またはそれより大きな減少を指す。
用語「刺激する（agonize）」は、受容体の活性化に関連する生物学的応答を誘導するための受容体シグナル伝達の活性化を指す。「アゴニスト」は、受容体と結合してそれを刺激する実体である。
用語「拮抗する」は、受容体の活性化に関連する生物学的応答を阻害するための受容体シグナル伝達の阻害を指す。「アンタゴニスト」は、受容体と結合してそれに拮抗する実体である。
用語「エフェクターＴ細胞」は、ヘルパーＴ（すなわち、ＣＤ４＋）細胞、および細胞傷害性（すなわち、ＣＤ８＋）Ｔ細胞を含む。ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞は、Ｂ細胞の形質細胞およびメモリーＢ細胞への成熟、ならびに細胞傷害性Ｔ細胞およびマクロファージの活性化を含む、いくつかの免疫学的プロセスの進展に寄与する。ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞は、ウイスル感染細胞および腫瘍細胞を破壊する。エフェクターＴ細胞に関するさらなる情報については、その全体が参照により本明細書に組み込まれるSeder and Ahmed, Nature Immunol., 2003, 4:835-842を参照されたい。
用語「調節性Ｔ細胞」は、例えばエフェクターＴ細胞を抑制することにより、免疫学的寛容を調節する細胞を含む。一部の態様では、調節性Ｔ細胞は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋表現型を有する。一部の態様では、調節性Ｔ細胞は、ＣＤ８＋ＣＤ２５＋表現型を有する。調節性Ｔ細胞に関するさらなる情報については、その全体が参照により本明細書に組み込まれるNocentini et al., Br. J. Pharmacol., 2012, 165:2089-2099を参照されたい。
用語「樹状細胞」は、ナイーブＴ細胞を活性化することができ、Ｂ細胞の成長および分化を刺激することができる、プロフェッショナル抗原提示細胞を指す。
ポリペプチド（例えば、抗体）の「バリアント」は、天然ポリペプチド配列と比べて１つまたは複数のアミノ酸残基がアミノ酸配列に挿入されている、アミノ酸配列から欠失している、および／またはアミノ酸配列に置換されている、アミノ酸配列を含み、天然ポリペプチドと本質的に同じ生物活性を保持する。ポリペプチドの生物活性は、当技術分野における標準的技術を使用して測定することができる（例えば、バリアントが抗体である場合、その活性を本明細書に記載の結合アッセイにより試験することができる）。本開示のバリアントは、断片、アナログ、組換えポリペプチド、合成ポリペプチド、および／または融合タンパク質を含む。
ポリペプチドの「誘導体」は、例えば、別の化学的部分、例えばポリエチレングリコール、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）など、とのコンジュゲーション、リン酸化、およびグリコシル化によって、化学的に改変されているポリペプチド（例えば、抗体）である。別段の指示がない限り、用語「抗体」は、２本の全長重鎖と２本の全長軽鎖とを含む抗体に加えて、その誘導体、バリアント、断片およびムテインを含み、これらの例は、下に記載される。
ヌクレオチド配列は、調節配列がヌクレオチド配列の発現（例えば、発現のレベル、タイミングまたは位置）に影響を与える場合、調節配列に「作動可能に連結」されている。「調節配列」は、それが作動可能に連結されている核酸の発現（例えば、発現のレベル、タイミングまたは位置）に影響を与える、核酸である。調節配列は、例えば、調節される核酸に直接その効果を発揮することができ、または１つもしくは複数の分子（例えば、調節配列および／もしくは核酸と結合するポリペプチド）の作用によってその効果を発揮することができる。調節配列の例としては、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）が挙げられる。調節配列のさらなる例は、例えば、Goeddel, 1990, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CAおよびBaron et al., 1995, Nucleic Acids Res. 23:3605-06に記載されている。
「宿主細胞」は、核酸、例えば本開示の核酸を発現させるために使用することができる細胞である。宿主細胞は、原核生物、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉであってもよく、または真核生物、例えば、単細胞真核生物（例えば、酵母もしくは他の真菌）、植物細胞（例えば、タバコもしくはトマト植物細胞）、動物細胞（例えば、ヒト細胞、サル細胞、ハムスター細胞、ラット細胞、マウス細胞、もしくは昆虫細胞）もしくはハイブリドーマであってもよい。宿主細胞の例としては、ＣＳ－９細胞、サル腎細胞のＣＯＳ－７系（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）（Gluzman et al., 1981, Cell 23:175を参照されたい）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞もしくはそれらの誘導株、例えば、無血清培地で成長するＶｅｇｇｉｅ ＣＨＯおよび関連細胞系（Rasmussen et al., 1998, Cytotechnology 28:31を参照されたい）、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０）細胞系、アフリカミドリザル腎細胞系ＣＶ１に由来するＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞系（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）（McMahan et al., 1991, EMBO J. 10:2821を参照されたい）、ヒト胎児由来腎細胞、例えば、２９３、２９３ ＥＢＮＡもしくはＭＳＲ ２９３、ヒト上皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、他の形質転換霊長類細胞系、正常二倍体細胞、初代組織、初代外植片のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養から得られる細胞株、ＨＬ－６０、Ｕ９３７、ＨａｋまたはＪｕｒｋａｔ細胞が挙げられる。典型的には、宿主細胞は、ポリペプチドをコードする核酸で形質転換することができるまたはそのような核酸をトランスフェクトすることができる培養細胞であり、したがって、そのような核酸は、宿主細胞において発現され得る。
句「組換え宿主細胞」は、発現させるべき核酸で形質転換されたまたはそのような核酸がトランスフェクトされた宿主細胞を示すために使用され得る。宿主細胞は、核酸を含むが、調節配列が宿主細胞に導入され、その結果、調節配列が核酸と作動可能に連結されない限り、その核酸を所望のレベルで発現しない細胞でもあり得る。用語宿主細胞が特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫または潜在的な子孫も指すことは、理解されよう。例えば変異または環境の影響によって、ある特定の改変が後の世代で生じる可能性があるため、そのような子孫は、実際には親細胞と同一でない可能性があるが、それでもやはり、本明細書で使用されるこの用語の範囲内に含まれる。
７．２．他の解釈規定
本明細書で述べられている範囲は、述べられているエンドポイントを含む、範囲内の値の全てについての簡略表記であると解される。例えば、１～５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９および５０からなる群からの任意の数、数の組合せまたは部分的範囲を含むと解される。
別段の指示がない限り、１つまたは複数の立体中心を有する化合物への言及は、その化合物の各々の立体異性体、およびその化合物の立体異性体の全ての組合せを意図している。
７．３．核酸
一態様において、本開示は、単離された核酸分子を提供する。核酸は、例えば、抗原結合タンパク質の全てまたは一部、例えば、本開示の抗体の一方もしくは両方の鎖、またはその断片、誘導体、ムテインもしくはバリアントをコードするポリヌクレオチド；ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを同定、分析、変異または増幅するためのハイブリダイゼーションプローブ、ＰＣＲプライマーまたはシークエンシングプライマーとしての使用に十分なポリヌクレオチド；ポリヌクレオチドの発現を阻害するためのアンチセンス核酸；および前述のものの相補配列を含む。核酸は、いずれの長さであってもよい。核酸は、例えば、長さ５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、７５０、１，０００、１，５００、３，０００、５，０００ヌクレオチドもしくはそれを超える長さであってもよく、および／または１つもしくは複数の追加の配列、例えば調節配列を含むこともあり、および／またはより大きい核酸、例えばベクター、の一部であってもよい。核酸は、一本鎖状または二本鎖状であり得、ＲＮＡおよび／もしくはＤＮＡヌクレオチド、ならびにそれらの人工バリアント（例えば、ペプチド核酸）を含むこともある。
抗体ポリペプチド（例えば、重鎖または軽鎖、可変ドメインのみ、または全長）をコードする核酸は、ＰＤ－１で免疫されたマウスのＢ細胞から単離することができる。核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの従来の手順により単離することができる。
重鎖および軽鎖可変領域の可変領域をコードする核酸配列が本明細書で示される。遺伝コードの縮重に起因して、本明細書で開示されるポリペプチド配列の各々が、多数の他の核酸配列によりコードされることは、当業者には理解される。本開示は、本開示の各々の抗原結合タンパク質をコードする各々の縮重ヌクレオチド配列を提供する。
本開示は、特定のハイブリダイゼーション条件下で他の核酸（例えば、ＰＤＣＤ１遺伝子のいずれかのヌクレオチド配列を含む核酸）とハイブリダイズする核酸をさらに提供する。核酸をハイブリダイズさせる方法は、当技術分野において周知である。例えば、Curr. Prot. in Mol. Biol., John Wiley & Sons, N.Y.(1989), 6.3.1-6.3.6を参照されたい。本明細書で定義される場合、中等度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、５×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を含有する、予洗溶液；約５０％ホルムアミド、６×ＳＳＣのハイブリダイゼーションバッファー、および５５℃のハイブリダイゼーション温度（または他の同様のハイブリダイゼーション溶液、例えば約５０％ホルムアミドを含有するもの、と４２℃のハイブリダイゼーション温度）；および０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、６０℃の洗浄条件を使用する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、６×ＳＳＣ中、４５℃でハイブリダイズし、その後、０．１×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ中、６８℃で１回または複数回洗浄する。さらに、当業者は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを増加または減少させるように、その結果、互いと少なくとも６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８または９９％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸が、概して、互いにハイブリダイズした状態を維持するように、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件を操作することができる。ハイブリダイゼーション条件の選択に影響を与える基本パラメーター、および好適な条件を考案するためのガイダンスは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ、およびＭａｎｉａｔｉｓ（1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., chapters 9 and 11；およびCurr.Prot. in Mol.Biol.1995, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., sections 2.10 and 6.3-6.4）により示されており、これらのことを、当業者は、例えばＤＮＡの長さおよび／または塩基組成に基づいて容易に決定することができる。
変異により核酸に変化を導入し、それによって、核酸がコードするポリペプチド（例えば、抗原結合タンパク質）のアミノ酸配列の変化をもたらすことができる。当技術分野において公知の任意の技術を使用して変異を導入することができる。一実施形態では、例えば部位特異的変異誘発プロトコールを使用して、１つまたは複数の特定のアミノ酸残基を変化させる。別の実施形態では、例えばランダム変異誘発プロトコールを使用して、１つまたは複数のランダムに選択された残基を変化させる。どのように行ったとしても、変異体ポリペプチドを発現させ、所望の特性（例えば、ＰＤ－１との結合）についてスクリーニングすることができる。
変異を、核酸に、核酸がコードするポリペプチドの生物活性を有意に変えることなく導入することができる。例えば、非必須アミノ酸残基に対するアミノ酸置換をもたらすヌクレオチド置換を行うことができる。一実施形態では、ＰＤ－１またはその所望の断片、バリアントもしくは誘導体について本明細書で提供されるヌクレオチド配列は、２つまたはそれより多く配列が異なる残基になるようなＰＤ－１について本明細書で示されるアミノ酸残基の１つまたは複数の欠失または置換を含むアミノ酸配列をコードするように、変異させられる。あるいは、核酸がコードするポリペプチドの生物活性（例えば、ＰＤ－１の結合）を選択的に変化させる１つまたは複数の変異を、核酸に導入することができる。例えば、変異は、生物活性を量的にまたは質的に変化させることができる。量的変化の例としては、活性の増加、低減または消失が挙げられる。質的変化の例としては、抗原結合タンパク質の抗原特異性の変化が挙げられる。
別の態様では、本開示は、本開示の核酸配列の検出のためのプライマーまたはハイブリダイゼーションプローブとしての使用に好適である核酸分子を提供する。本開示の核酸分子は、本開示の全長ポリペプチドをコードする核酸配列の一部分、例えば、プローブもしくはプライマーとして使用することができる断片、または本開示のポリペプチドの活性部分（例えば、ＰＤ－１結合部分）をコードする断片のみを含むこともある。
本開示の核酸の配列に基づくプローブを使用して、本開示のポリペプチドをコードする核酸または類似の核酸、例えば転写物を検出することができる。プローブは、標識基、例えば、放射性同位体、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子を含むことができる。そのようなプローブを使用して、ポリペプチドを発現する細胞を同定することができる。
７．４．発現ベクター
本開示は、本開示のポリペプチドまたはその一部分をコードする核酸を含むベクターを提供する。ベクターの例としては、プラスミド、ウイルスベクター、非エピソーム哺乳動物ベクター、および発現ベクター、例えば組換え発現ベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
本開示の別の態様では、本開示の核酸分子およびポリヌクレオチドを含有する発現ベクターも提供され、そのようなベクターで形質転換された宿主細胞、およびポリペプチドを産生する方法も提供される。用語「発現ベクター」は、ポリヌクレオチド配列からポリペプチドを発現させるためのプラスミド、ファージ、ウイルスまたはベクターを指す。ポリペプチドの発現のためのベクターは、ベクター伝播（vector propagation）のためにおよびクローニングされた挿入断片の発現のために必要な配列を最小限で含有する。発現ベクターは、（１）遺伝子発現において調節的役割を果たす遺伝子エレメント（単数または複数）、例えば、プロモーターまたはエンハンサーと、（２）ｍＲＮＡに転写され、タンパク質に翻訳される、ポリペプチドおよびタンパク質をコードする配列と、（３）適切な転写開始および終結配列との集合体を含む、転写単位を含む。これらの配列は、選択マーカーをさらに含むこともある。宿主細胞における発現に好適なベクターは、容易に入手可能であり、核酸分子は、標準的な組換えＤＮＡ技術を使用してベクターに挿入される。そのようなベクターは、特定の組織において機能するプロモーター、および標的ヒトまたは動物細胞におけるポリペプチドの発現のためのウイルスベクターを含むことができる。
本開示の組換え発現ベクターは、本開示の核酸を、宿主細胞における核酸の発現に好適な形態で含むことができる。組換え発現ベクターは、発現に使用される宿主細胞に基づいて選択される１つまたは複数の調節配列であって、発現される核酸配列に作動可能に連結されている配列を含む。調節配列は、多くのタイプの宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を指令するもの（例えば、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー、ラウス肉腫ウイルスプロモーターおよびサイトメガロウイルスプロモーター）、ある特定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を指令するもの（例えば、組織特異的調節配列、Voss et al., 1986, Trends Biochem. Sci. 11:287、Maniatis et al., 1987, Science 236:1237を参照されたく、これらの参考文献は、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる）、および特定の処置または状態に応答してヌクレオチド配列の誘導性発現を指令するもの（例えば、哺乳動物細胞におけるメタロチオネイン（metallothionin）プロモーター、ならびに真核細胞系と原核細胞系の両方におけるｔｅｔ応答性および／もしくはストレプトマイシン応答性プロモーター（同文献を参照されたい）を含む。発現ベクターの設計が、形質転換すべき宿主細胞の選択、所望されるタンパク質の発現レベルなどのような因子に依存し得ることは、当業者には理解される。本開示の発現ベクターを宿主細胞に導入して、それによって、本明細書に記載の核酸によりコードされるタンパク質またはペプチド、例えば融合タンパク質またはペプチドなど、を産生することができる。
一部の実施形態では、発現ベクターは、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２５５０９の下で寄託されたＰＤ－１結合クローンのライブラリーのクローンのうちの１つから精製された発現ベクターである。一部の実施形態では、発現ベクターは、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２５５０９の下で寄託されたＰＤ－１結合クローンのライブラリーから精製されたクローンのうちの１つにおける発現ベクターの１つの遺伝子改変により生成される。一部の実施形態では、発現ベクターは、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２５５０９の下で寄託されたＰＤ－１結合クローンのライブラリーのクローンのうちの１つの重鎖および軽鎖の可変領域配列を使用することにより生成される。
本開示は、ポリペプチドを作製する方法をさらに提供する。様々な他の発現／宿主系を利用することができる。ベクターＤＮＡを従来の形質転換またはトランスフェクション技術によって原核細胞または真核細胞系に導入することができる。これらの系としては、組換えバクテリオファージ、プラスミドもしくはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）などの微生物；酵母発現ベクターで形質転換された酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）がトランスフェクトされたもしくは細菌発現ベクター（ＴｉもしくはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換された植物細胞系；または動物細胞系が挙げられるが、これらに限定されない。組換えタンパク質産生に有用な哺乳動物細胞としては、ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系、もしくはそれらの派生株、例えば、Ｖｅｇｇｉｅ ＣＨＯ、および無血清培地で成長する関連細胞系（Rasmussen et al., 1998, Cytotechnology 28:31を参照されたい）またはＤＨＦＲが欠損しているＣＨＯ株ＤＸ－Ｂ１１（Urlaub et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-20を参照されたい）、ＣＯＳ細胞、例えばサル腎細胞のＣＯＳ－７系（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）（Gluzman et al., 1981, Cell 23:175を参照されたい）、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＨｅｐＧ２、３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １６３）、ＲＩＮ、ＭＤＣＫ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０）細胞系、アフリカミドリザル腎細胞系ＣＶ１に由来するＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞系（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）（McMahan et al., 1991, EMBO J. 10:2821を参照されたい）、ヒト胎児由来腎細胞、例えば、２９３、２９３ ＥＢＮＡもしくはＭＳＲ ２９３、ヒト上皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、他の形質転換霊長類細胞系、正常二倍体細胞、初代組織、初代外植片のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養から得られる細胞株、ＨＬ－６０、Ｕ９３７、ＨａｋまたはＪｕｒｋａｔ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。哺乳動物発現は、分泌または可溶性ポリペプチドの産生を可能にし、これらのポリペプチドを成長培地から回収することができる。
哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションのために、使用される発現ベクターおよびトランスフェクション技術次第で、ほんの一部の細胞のみが、外来ＤＮＡをそれらのゲノムに取り入れることができることは、公知である。これらの組込み体を同定および選択するために、選択可能なマーカー（例えば、抗生物質に対する耐性について）をコードする遺伝子が、一般に、目的の遺伝子とともに宿主細胞に導入される。所望の発現カセットばかりでなく選択可能なマーカーも含有するベクターでそのような細胞を形質転換すると、これらの細胞を、強化培地において、例えば、強化培地を選択培地に切り替える前に、成長させることができる。選択可能なマーカーは、導入された配列を首尾よく発現する細胞の成長および回収を可能にするように設計される。安定に形質転換された細胞の耐性凝集塊（resistant clump）を、利用する細胞系に適している組織培養技術を使用して増殖させることができる。組換えタンパク質の発現についての概要は、Methods of Enzymology, v. 185, Goeddell, D.V., ed., Academic Press (1990)において見出すことができる。好ましい選択可能なマーカーとしては、Ｇ４１８、ハイグロマイシンおよびメトトレキサートなどの、薬物に対する耐性を付与するものが挙げられる。導入された核酸が安定にトランスフェクトされた細胞は、数ある中でも特に、薬物選択（例えば、選択可能なマーカー遺伝子が組み込まれた細胞は生き残るが、他の細胞は死滅する）により同定することができる。
形質転換細胞を、ポリペプチドの発現を促進する条件下で培養し、ポリペプチドを従来のタンパク質精製手順（上記で定義した通り）により回収することができる。１つのそのような精製手順は、例えば、ＰＤ－１の全てまたは一部分（例えば、細胞外ドメイン）が結合したマトリックスを用いる、親和性クロマトグラフィーの使用を含む。本明細書における使用が企図されるポリペプチドは、内因性夾雑物質が実質的にない、実質的に均一な組換え哺乳動物抗ＰＤ－１抗体ポリペプチドを含む。
一部の場合、例えば、原核細胞系を使用する発現の場合には、本開示の発現されるポリペプチドを、生物活性になるように、「再び折り畳み」、酸化して適切な三次元構造にし、ジスルフィド結合を生成する必要があり得る。再折り畳みは、当技術分野において周知の多数の手順を使用して果たすことができる。そのような方法は、例えば、可溶化されたポリペプチドを、カオトロピック剤の存在下で、通常は７より高いｐＨに曝露することを含む。カオトロープの選択は、封入体可溶化に使用される選択と同様であるが、カオトロープは、より低い濃度で概して使用される。例示的なカオトロピック剤は、グアニジンおよび尿素である。ほとんどの場合、再折り畳み／酸化溶液は、システイン架橋の形成のためにジスルフィドシャフリングが起こることを可能にする特定のレドックス電位を生じさせるために、還元剤とその酸化形態も特定の比率で含有する。一般に使用される一部のレドックス対としては、システイン／シスタミン、グルタチオン／ジチオビスＧＳＨ、塩化第二銅、ジチオトレイトールＤＴＴ／ジチアンＤＴＴ、および２－メルカプトエタノール（ｂＭＥ）／ジチオ－ｂＭＥが挙げられる。多くの事例では、再折り畳みの効率を上昇させるために共溶媒が使用され得る。一般に使用される共溶媒としては、グリセロール、様々な分子量のポリエチレングリコール、およびアルギニンが挙げられる。
加えて、従来の技術に従って溶液中または固体支持体上でポリペプチドを合成することができる。様々な自動合成装置が市販されており、公知のプロトコールに従ってそれらを使用することができる。例えば、Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2d.Ed., Pierce Chemical Co. (1984)；Tam et al., J Am Chem Soc, 105:6442, (1983)；Merrifield, Science 232:341-347 (1986)；Barany and Merrifield, The Peptides, Gross and Meienhofer, eds, Academic Press, New York, 1-284；Barany et al., Int J Pep Protein Res, 30:705-739 (1987)を参照されたい。
本開示のポリペプチドおよびタンパク質は、当業者に周知のタンパク質生成技術に従って精製することができる。これらの技術は、あるレベルでの、タンパク質性および非タンパク質性画分の粗分画を含む。ペプチドポリペプチドを他のタンパク質から分離した後、クロマトグラフィーおよび電気泳動技術を使用して目的のペプチドまたはポリペプチドをさらに精製して、部分的精製または完全精製（または均一に至る精製）を達成することができる。用語「精製されたポリペプチド」は、本明細書で使用される場合、他の成分から単離可能な組成物であって、ポリペプチドがその天然に得ることができる状態と比較して任意の程度に精製されている組成物を指すように意図されている。したがって、精製されたポリペプチドは、それが天然に存在する環境から分離されているポリペプチドも指す。一般に、「精製された」は、分画に供されて様々な他の成分が除去されたポリペプチド組成物であって、その発現された生物活性を実質的に保持する組成物を指す。用語「実質的に精製された」が使用される場合、この表記は、ポリペプチドまたはペプチドが、組成物の主要成分を形成する、例えば、組成物中のタンパク質の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％またはそれより多くを構成する、ペプチドまたはポリペプチド組成物を指す。
精製における使用に好適な様々な技術が当業者には周知である。これらの技術は、例えば、硫酸アンモニウム、ＰＥＧ、抗体（免疫沈降法）などでのまたは熱変性による沈殿、その後の遠心分離；クロマトグラフィー、例えば、親和性クロマトグラフィー（プロテインＡカラム）、イオン交換、ゲル濾過、逆相、ヒドロキシルアパタイト、疎水性相互作用クロマトグラフィー、等電点電気泳動、ゲル電気泳動、ならびにこれらの技術の組合せを含む。当技術分野において一般に公知であるように、様々な精製ステップを行う順序を変えてもよく、またはある特定のステップを省いてもよく、それでもなお、実質的に精製されたポリペプチドの調製に好適な方法をもたらす可能性があると考えられる。例示的な精製ステップは、下記の実施例で提供される。
ポリペプチドの精製度を定量するための様々な方法は、本開示に鑑みれば当業者には公知である。これらの方法は、例えば、活性画分の比結合活性を決定すること、またはＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析により画分中のペプチドまたはポリペプチドの量を評価することを含む。ポリペプチド画分の純度の好ましい評価方法は、画分の結合活性を計算すること、それを最初の抽出物の結合活性と比較すること、およびひいては、本明細書では「精製倍数」により評価される精製度を計算することである。結合活性の量を表すために使用される実際の単位は、精製を追跡するために選択される特定のアッセイ技術、およびポリペプチドまたはペプチドが検出可能な結合活性を示すか否かに、もちろん、依存する。
７．５．抗体
ＰＤ－１抗体は、ヘパリンＨＰカラムを使用し、塩勾配を使用する、宿主細胞培養液の濾過された上清の溶出により、抗体をコードする遺伝子がトランスフェクトされた宿主細胞から精製することができる。
Ｆａｂ断片は、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインを有する、一価断片であり；Ｆ（ａｂ’）２断片は、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を有する二価断片であり；Ｆｄ断片は、ＶＨおよびＣＨ１ドメインを有し；Ｆｖ断片は、抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインを有し；ｄＡｂ断片は、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、またはＶＨまたはＶＬドメインの抗原結合性断片を有する（米国特許第６，８４６，６３４号、同第６，６９６，２４５号、米国特許出願公開第０５／０２０２５１２号、同第０４／０２０２９９５号、同第０４／００３８２９１号、同第０４／０００９５０７号、同第０３／００３９９５８号、Ward et al., Nature 341:544-546, 1989）。
特定の軽鎖および重鎖可変領域ドメインのポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、下記で説明される。軽鎖および重鎖を含む抗体は、軽鎖可変ドメインの名称と重鎖可変ドメインの名称を組み合わせることにより表記される。例えば、「Ｌ４Ｈ７」は、Ｌ４の軽鎖可変ドメイン（配列番号４の配列を含む）とＨ７の重鎖可変ドメイン（配列番号１０７の配列を含む）とを含む抗体を示す。軽鎖可変配列は、配列番号１～２８で提供され、重鎖可変配列は、配列番号１０１～１２８で提供される。
他の実施形態では、抗体は、特定の重鎖または軽鎖を含むことができるが、相補的軽鎖および重鎖可変ドメインは、不特定のままである。詳細には、本明細書におけるある特定の実施形態は、特定の軽鎖または重鎖によって特異的抗原（例えば、ＰＤ－１）に結合し、その結果、相補的重鎖または軽鎖が、無差別であっても、またはさらには無関係であってもよいが、例えばコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより、それらを決定することができる、抗体を含む。Portolano et al., J. Immunol. V. 150 (3), pp. 880-887 (1993)；Clackson et al., Nature v. 352 pp. 624-628 (1991)；Adler et al., A natively paired antibody library yields drug leads with higher sensitivity and specificity than a randomly paired antibody library, MAbs (2018))；Adler et al., Rare, high-affinity mouse anti-PD-1 antibodies that function in checkpoint blockade, discovered using microfluidics and molecular genomics, MAbs (2017)。
天然に存在する免疫グロブリン鎖は、相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる、３つの超可変領域によって結合された比較的保存されるフレームワーク領域（ＦＲ）の同じ一般構造を示す。軽鎖および重鎖両方が、Ｎ末端からＣ末端へ、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含む。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication no.91-3242, 1991におけるKabat et al.の定義に従う。
「完全ヒト抗体」とも呼ばれる、「ヒト抗体」という用語は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する１つまたは複数の可変および定常領域を有する全ての抗体を含む。一実施形態では、可変および定常ドメインの全ては、ヒト免疫グロブリン配列（完全ヒト抗体）に由来する。これらの抗体は、ヒト重鎖および／または軽鎖コード遺伝子に由来する抗体を発現するように遺伝子改変されるマウスの目的の抗原での免疫による方法を含む、様々な方法で調製することができ、これらの方法の例は、下に記載される。
ヒト化抗体は、１つまたは複数のアミノ酸置換、欠失および／または付加の点で非ヒト種に由来する抗体の配列とは異なる配列を有し、したがって、ヒト化抗体は、それがヒト対象に投与されたとき、非ヒト種抗体と比較して、免疫応答を誘導する可能性が低く、および／またはさほど激しくない免疫応答を誘導する。一実施形態では、非ヒト種抗体の重鎖および／または軽鎖のフレームワークおよび定常ドメイン内のある特定のアミノ酸を、ヒト化抗体を産生するように変異させる。別の実施形態では、ヒト抗体からの定常ドメイン（複数可）を非ヒト種の可変ドメイン（複数可）に融合させる。別の実施形態では、非ヒト抗体の１つまたは複数のＣＤＲ配列内の１つまたは複数のアミノ酸残基を、それがヒト対象に投与されたとき、非ヒト抗体の推定免疫原性を低下させるように変化させ、変化させるアミノ酸残基は、抗体のその抗原との免疫特異的結合にとって重要でないか、または加えられるアミノ酸配列に対する変化は、保存的変化であり、したがって、ヒト化抗体の抗原との結合は、非ヒト抗体の抗原との結合よりも有意に悪くはない。ヒト化抗体を作製する方法の例は、米国特許第６，０５４，２９７号、同第５，８８６，１５２号および同第５，８７７，２９３号において見出すことができる。
用語「キメラ抗体」は、１つの抗体からの１つまたは複数の領域と１つまたは複数の他の抗体からの１つまたは複数の領域とを含有する、抗体を指す。一実施形態では、ＣＤＲの１つまたは複数は、ヒト抗ＰＤ－１抗体に由来する。別の実施形態では、ＣＤＲの全てがヒト抗ＰＤ－１抗体に由来する。別の実施形態では、１つより多くのヒト抗ＰＤ－１抗体からのＣＤＲが、キメラ抗体では、混合されており、マッチしている。例えば、キメラ抗体は、第１のヒト抗ＰＤ－１抗体の軽鎖からのＣＤＲ１と、第２のヒト抗ＰＤ－１抗体の軽鎖からのＣＤＲ２およびＣＤＲ３と、第３の抗ＰＤ－１抗体からの重鎖からのＣＤＲとを含むことがある。さらに、フレームワーク領域は、同じ抗ＰＤ－１抗体のうちの１つに由来することもあり、ヒト抗体などの１つもしくは複数の異なる抗体に由来することもあり、またはヒト化抗体に由来することもある。キメラ抗体の一例では、重鎖および／または軽鎖の一部分は、特定の種からのまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体と同一であるか、相同であるか、またはそのような抗体に由来するが、鎖の残部は、別の種からのまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体と同一であるか、相同であるか、またはそのような抗体に由来する。所望の生物活性（すなわち、ＰＤ－１に特異的に結合する能力）を示すそのような抗体の断片も含まれる。
抗体の断片またはアナログを、当業者は、本明細書の教示に従って、および当技術分野において周知の技術を使用して、容易に調製することができる。断片またはアナログの好ましいアミノおよびカルボキシ末端は、機能的ドメインの境界付近に存在する。構造ドメインおよび機能的ドメインは、ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列データを公的または専有の配列データベースと比較することにより、同定することができる。コンピュータによる比較方法を使用して、構造および／または機能が分かっている他のタンパク質中に存在する配列モチーフまたは予測タンパク質立体構造ドメインを同定することができる。折り重なって公知の三次元構造になるタンパク質配列を同定する方法も公知である。例えば、Bowie et al., 1991, Science 253:164を参照されたい。
抗体に由来する抗原結合性断片は、例えば、抗体のタンパク質分解性加水分解、例えば、従来の方法による全抗体のペプシンまたはパパイン消化により、得ることができる。例として、Ｆ（ａｂ’）２と呼ばれる５Ｓ断片を得るためのペプシンでの抗体の酵素的切断により、抗体断片を生じさせることができる。チオール還元剤を使用してこの断片をさらに切断して、３．５Ｓ Ｆａｂ’一価断片を生じさせることができる。必要に応じて、ジスルフィド結合の切断の結果として生じるスルフヒドリル基に対してブロッキング基を使用して、切断反応を行うことができる。代替方法として、パパインを使用する酵素的消化は、２つの一価Ｆａｂ断片とＦｃ断片とを直接生じさせる。これらの方法は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇの米国特許第４，３３１，６４７号、Nisonoff et al., Arch. Biochem. Biophys. 89:230, 1960；Porter, Biochem. J. 73:119, 1959；Edelman et al., in Methods in Enzymology 1:422 (Academic Press 1967)により;およびAndrews, S.M. and Titus, J.A. in Current Protocols in Immunology (Coligan J.E., et al., eds), John Wiley & Sons, New York (2003), pages 2.8.1 2.8.10 and 2.10A.1 2.10A.5により記載されている。抗体を切断するための、例えば、重鎖を分離して一価軽重鎖断片（Ｆｄ）を形成し、さらに断片を切断するための、他の方法、または他の酵素的、化学的もしくは遺伝学的技術も、それらの断片が、無傷抗体により認識される抗原に結合する限り、使用することができる。
抗体断片は、いずれの合成タンパク質または遺伝子操作されたタンパク質であってもよい。例えば、抗体断片は、軽鎖可変領域からなる単離された断片；重鎖および軽鎖の可変領域からなる「Ｆｖ」断片；軽鎖および重鎖可変領域がペプチドリンカーにより接続されている、組換え単鎖ポリペプチド分子（ｓｃＦｖタンパク質）を含む。
抗体断片のもう１つの形態は、抗体の１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むペプチドである。ＣＤＲ（「最小認識単位」または「超可変領域」とも呼ばれる）を分子に共有結合であるいは非共有結合で組み込んで、その分子を抗原結合タンパク質にすることができる。ＣＤＲは、目的のＣＤＲをコードするポリヌクレオチドを構築することにより得ることができる。そのようなポリヌクレオチドは、例えば、抗体産生細胞のｍＲＮＡを鋳型として使用して、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して可変領域を合成することにより、調製される（例えば、Larrick et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106, 1991；Courtenay Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter et al. (eds.), page 166 (Cambridge University Press 1995)；およびWard et al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch et al., (eds.), page 137 (Wiley Liss, Inc. 1995)を参照されたい）。
したがって、一実施形態では、結合剤は、本明細書に記載の少なくとも１つのＣＤＲを含む。結合剤は、本明細書に記載の少なくとも２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのＣＤＲを含むこともある。結合剤は、本明細書に記載の抗体の少なくとも１つの可変領域ドメインをさらに含むことがある。可変領域ドメインは、いずれのサイズまたはアミノ酸組成のものであってもよく、本明細書に具体的に記載される、および１つまたは複数のフレームワーク配列と隣接しているまたはインフレームである、ヒトＰＤ－１との結合に関与する少なくとも１つのＣＤＲ配列、例えば、ＣＤＲ１－Ｈ、ＣＤＲ２－Ｈ、ＣＤＲ３－Ｈ、ＣＤＲ１－Ｌ、ＣＤＲ２－ＬおよびＣＤＲ３－Ｌを一般に含む。一般に、可変（Ｖ）領域ドメインは、免疫グロブリン重（ＶＨ）鎖および／または軽（ＶＬ）鎖可変ドメインのいずれの好適な配置であってもよい。したがって、例えば、Ｖ領域ドメインは、一価であることがあり、下記で説明されるように少なくとも１×１０７Ｍに等しいかまたはそれよりも低い親和性でヒトＰＤ－１に独立して結合することができる、ＶＨまたはＶＬドメインであることがある。あるいは、Ｖ領域ドメインは、二価であることがあり、ＶＨＶＨ、ＶＨＶＬ、またはＶＬＶＬ二量体を含有することがある。Ｖ領域二量体は、非共有結合で会合していることがある、少なくとも１本のＶＨおよび少なくとも１本のＶＬ鎖（本明細書では以降ＦＶと呼ばれる）を含む。必要に応じて、これらの鎖を、直接、例えば２つの可変ドメイン間のジスルフィド結合によって、あるいはリンカー、例えばペプチドリンカーを介して、共有結合でカップリングさせて、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦＶ）を形成することができる。
可変領域ドメインは、いずれの天然に存在する可変ドメインまたはその操作されたバージョンであってもよい。操作されたバージョンとは、組換えＤＮＡ操作技術を使用して作出された可変領域ドメインを意味する。そのような操作されたバージョンは、例えば、特異的抗体可変領域から、特異的抗体のアミノ酸配列におけるまたはそのようなアミノ酸配列への、挿入、欠失または変化により、作出されたものを含む。特定の例としては、第１の抗体からの少なくとも１つのＣＤＲおよび必要に応じて１つまたは複数のフレームワークアミノ酸と、第２の抗体からの可変領域ドメインの残部とを含有する、操作された可変領域ドメインを含む。
可変領域ドメインを、少なくとも１つの他の抗体またはその断片のＣ末端側のアミノ酸に共有結合させることができる。したがって、例えば、可変領域ドメインに存在するＶＨドメインを、免疫グロブリンＣＨ１ドメインまたはその断片に連結させることができる。同様に、ＶＬドメインをＣＫドメインまたはその断片に連結させることができる。このように、例えば、抗体は、抗原結合性ドメインが、会合ＶＨおよびＶＬドメインを含有し、これらのドメインのＣ末端がＣＨ１およびＣＫドメインにそれぞれ共有結合で連結されている、Ｆａｂ断片であり得る。ＣＨ１ドメインをさらなるアミノ酸で伸長させて、例えば、Ｆａｂ’断片に見られるようなヒンジ領域もしくはヒンジ領域ドメインの一部分を得ることができ、または抗体ＣＨ２およびＣＨ３ドメインなどのさらなるドメインを得ることができる。
本明細書中で説明されるように、抗体は、これらのＣＤＲの少なくとも１つを含む。例えば、１つまたは複数のＣＤＲを、既知抗体フレームワーク領域（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２など）に組み込むことができ、または好適なビヒクルとコンジュゲートさせてその半減期を延ばすことができる。好適なビヒクルとしては、Ｆｃ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アルブミン、トランスフェリンなどが挙げられるが、それらに限定されない。これらおよび他の好適なビヒクルは、当技術分野において公知である。そのようなコンジュゲートＣＤＲペプチドは、単量体形態、二量体形態、三量体形態または他の形態であり得る。一実施形態では、１つまたは複数の水溶性ポリマーが、結合剤の１カ所または複数ヶ所の特異的位置に、例えばアミノ末端に、結合される。
別の例では、抗体（すなわち、ＰＤ－１抗体）からの個々のＶＬまたはＶＨ鎖を使用して、同じ特異性を有する、抗原結合性断片（またはＦａｂ）を形成することができる他のＶＨまたはＶＬについて、検索することができる。したがって、ＶＨおよびＶＬ鎖Ｉｇ遺伝子のランダムな組合せをバクテリオファージライブラリー（例えば、ｆｄまたはラムダファージ）において抗原結合性断片として発現させることができる。例えば、抗原結合特異的ＶＬまたはＶＨ鎖ライブラリーとそれぞれ組み合わせた親ＶＬまたはＶＨ鎖ライブラリーを利用することにより、コンビナトリアルライブラリーを生成することができる。次いで、コンビナトリアルライブラリーを、従来の技術により、例えば、放射性標識されたプローブ（例えば、放射性標識されたＰＤ－１）を使用することにより、スクリーニングすることができる。例えば、Portolano et al., J. Immunol. V. 150 (3) pp. 880-887 (1993)を参照されたい。
ダイアボディは、２本のポリペプチド鎖を含む二価抗体であって、各ポリペプチド鎖が、リンカーにより結合されたＶＨおよびＶＬドメインを含み、このリンカーが、短すぎて同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を生じさせることができず、結果として、各ドメインによる別のポリペプチド鎖上の相補ドメインとの対合を可能にする、二価抗体である（例えば、Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-48、およびPoljak et al., 1994, Structure 2:1121-23を参照されたい）。ダイアボディの２本のポリペプチド鎖が同一である場合には、それらの鎖の対合の結果として生じるダイアボディは、２つの同一の抗原結合部位を有する。異なる配列を有するポリペプチド鎖を使用して、２つの異なる抗原結合部位を有するダイアボディを作製することができる。同様に、トリアボディおよびテトラボディは、３本および４本のポリペプチド鎖をそれぞれ含む抗体であって、同じであってもよく、または異なっていてもよい、３つまたは４つの抗原結合部位をそれぞれ形成する抗体である。
フィブロネクチンポリペプチドモノボディを含む、抗体ポリペプチドが、米国特許第６，７０３，１９９号においても開示されている。単鎖ポリペプチドである他の抗体ポリペプチドが、米国特許公開第２００５／０２３８６４６号において開示されている。
ある特定の実施形態では、抗体は、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレングリコール、またはポリプロピレングリコールを含むがこれらに限定されない、結合している１つまたは複数の水溶性ポリマーを含む。例えば、米国特許第４，６４０，８３５号、同第４，４９６，６８９号、同第４，３０１，１４４号、同第４，６７０，４１７号、同第４，７９１，１９２号および同第４，１７９，３３７号を参照されたい。ある特定の実施形態では、誘導結合剤（derivative binding agent）は、モノメトキシ－ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、もしくは他の炭水化物に基づくポリマー、ポリ－（Ｎ－ビニルピロリドン）－ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）およびポリビニルアルコールのうちの１つまたは複数、ならびにこのようなポリマーの混合物を含む。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の水溶性ポリマーは、１つまたは複数の側鎖にランダムに結合される。ある特定の実施形態では、ＰＥＧは、抗体などの結合剤の治療能を向上させるように作用することができる。ある特定のそのような方法は、例えば、あらゆる目的でこれにより参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，１３３，４２６号において論じられている。
７．６．抗原結合タンパク質
一態様では、本開示は、ＰＤ－１と結合する抗原結合タンパク質（例えば、抗体、抗体断片、抗体誘導体、抗体変異タンパク質、および抗体バリアント）を提供する。
抗原結合タンパク質は、例えば、天然に存在する免疫グロブリンの構造を有し得る。「免疫グロブリン」は、四量体分子である。天然に存在する免疫グロブリンでは、各四量体は、ポリペプチド鎖の２つの同一な対から構成され、それぞれの対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）と１つの「重」鎖（約５０～７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識を担う約１００から１１０またはそれより多いアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能を担う定常領域を定義する。ヒト軽鎖は、カッパ軽鎖とラムダ軽鎖として分類される。重鎖は、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファ、またはイプシロンとして分類され、抗体のアイソタイプをそれぞれ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥとして定義する。軽鎖および重鎖内では、可変領域および定常領域が約１２個またはそれより多いアミノ酸の「Ｊ」領域によって接合し、重鎖はさらに約１０個のアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。一般に、Fundamental Immunology Ch. 7(Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y.(1989)）（参照により全ての目的でその全体が組み込まれる）を参照されたい。各軽鎖／重鎖の対の可変領域は、無傷免疫グロブリンが２つの結合部位を有するように、抗体結合部位を形成する。
本開示による抗原結合タンパク質は、ＰＤ－１の生物活性を阻害する抗原結合タンパク質を含む。
異なる抗原結合タンパク質は、ＰＤ－１の異なるドメインと結合することもあり、または異なる作用機序により作用することもある。とりわけ本明細書で示される場合、ドメイン領域が表記され、例えば、別段の指示がない限り、群を含むドメイン領域が表記される。例えば、アミノ酸４～１２は、次の９つのアミノ酸を指す：４位および１２位のアミノ酸、ならびに配列内の介在する７つのアミノ酸。他の例は、ＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１との結合を阻害する抗原結合タンパク質を含む。抗原結合タンパク質は、本開示で使用されるためにＰＤ－１誘導活性を完全に阻害する必要がなく、もっと正確に言えば、ＰＤ－１の特定の活性を低減させる抗原結合タンパク質も使用に企図される。（特定の疾患を処置する際のＰＤ－１結合性抗原結合タンパク質についての特定の作用機序の本明細書での論述は、説明のためのものに過ぎず、本明細書で提示される方法は、そのような論述に縛られない）。
別の態様では、本開示は、Ａ１ＬＣ－Ａ２８ＬＣからなる群から選択される軽鎖可変領域またはＡ１ＨＣ－Ａ２８ＨＣからなる群から選択される重鎖可変領域、ならびにその断片、誘導体、ムテイン、およびバリアントを含む抗原結合タンパク質を提供する。このような抗原結合タンパク質は、名称「ＬｘＨｙ」（式中、これらが以下の配列において標識されているように、「ｘ」は軽鎖可変領域の数に相当し、「ｙ」は重鎖可変領域の数に相当する）を使用して示すことができる。すなわち、例えば、「Ａ１ＨＣ」は、配列番号１０１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を示し、「Ａ１ＬＣ」は、配列番号１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を示す、などである。より一般的に言えば、「Ｌ２Ｈ１」は、Ｌ２（配列番号２）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域およびＨ１（配列番号１０１）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む抗原結合タンパク質を指す。明確化のために、１つの群のうちの少なくとも２つのメンバーによって示される全ての範囲は、その範囲のメンバーの末端の間およびそれを含む群の全てのメンバーを含む。よって、範囲Ａ１～Ａ２８の群は、Ａ１からＡ２８の間の全てのメンバー、ならびにメンバーＡ１およびＡ２８自体を含む。範囲Ａ４～Ａ６の群は、メンバーＡ４、Ａ５、およびＡ６を含む、などである。
一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２５５０９の下で寄託されたＰＤ－１結合クローンのライブラリー内のクローンの１つと同一の重鎖配列および軽鎖配列両方の可変（Ｖ（Ｄ）Ｊ）領域を含む。一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２５５０９の下で寄託されたＰＤ－１結合クローンのライブラリー内のクローンの１つと同一の重鎖配列または軽鎖配列のどちらかの可変（Ｖ（Ｄ）Ｊ）領域を含む。一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２５５０９の下で寄託されたＰＤ－１結合クローンのライブラリー内のクローンのうちの１つにおいて発現ベクターから発現される。
抗原結合部位の一部を生じさせるＣＤＲの位置（下線付き）も下記に示され、さらに、フレームワーク領域（ＦＲ）がこれらの可変ドメイン配列の介在セグメントである。軽鎖可変領域と重鎖可変領域の両方に、３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１～３）および４つのＦＲ（ＦＲ１～４）が存在する。軽鎖および重鎖各々のＣＤＲ領域は、抗体型（Ａ１、Ａ２、Ａ３など）によっても分類される。本開示の抗原結合タンパク質は、例えば、Ｌ１Ｈ１（抗体Ａ１）、Ｌ２Ｈ２（抗体Ａ２）、Ｌ３Ｈ３（抗体Ａ３）、Ｌ４Ｈ４（抗体Ａ４）、Ｌ５Ｈ５（抗体Ａ５）、Ｌ６Ｈ６（抗体Ａ６）、Ｌ７Ｈ７（抗体Ａ７）、Ｌ８Ｈ８（抗体Ａ８）、Ｌ９Ｈ９（抗体Ａ９）、Ｌ１０Ｈ１０（抗体Ａ１０）、Ｌ１１Ｈ１１（抗体Ａ１１）、Ｌ１２Ｈ１２（抗体Ａ１２）、Ｌ１３Ｈ１３（抗体Ａ１３）、Ｌ１４Ｈ１４（抗体１４）、Ｌ１５Ｈ１５（抗体１５）、Ｌ１６Ｈ１６（抗体１６）、Ｌ１７Ｈ１７（抗体１７）、Ｌ１８Ｈ１８（抗体１８）、Ｌ１９Ｈ１９（抗体１９）、Ｌ２０Ｈ２０（抗体２０）、Ｌ２１Ｈ２１（抗体２１）、Ｌ２２Ｈ２２（抗体２２）、Ｌ２３Ｈ２３（抗体２３）、Ｌ２４Ｈ２４（抗体２４）、Ｌ２５Ｈ２５（抗体２５）、Ｌ２６Ｈ２６（抗体２６）、Ｌ２７Ｈ２７（抗体２７）およびＬ２８Ｈ２８（抗体２８）からなる群から選択される軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインの組合せを有する抗原結合タンパク質を含む。
一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２５５０９の下で寄託されたＰＤ－１結合クローンのライブラリー内のクローンの１つと同一の６つ全てのＣＤＲ配列（軽鎖の３つのＣＤＲおよび重鎖の３つのＣＤＲ）を含む。一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２５５０９の下で寄託されたＰＤ－１結合クローンのライブラリー内のクローンの１つと同一の６つＣＤＲ配列（軽鎖の３つのＣＤＲおよび重鎖の３つのＣＤＲ）のうちの３つを含む。一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２５５０９の下で寄託されたＰＤ－１結合クローンのライブラリー内のクローンの１つと同一の６つのＣＤＲ配列のうちの１つ、２つ、３つ、４つまたは５つを含む。
一実施形態では、本開示は、Ｌ１～Ｌ２８からなる群から選択される軽鎖可変ドメインの配列と１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１残基のみ異なるアミノ酸の配列を含む軽鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質であって、そのような配列差の各々が、独立して、１アミノ酸残基の欠失、挿入または置換のいずれかである、抗原結合タンパク質を提供する。別の実施形態では、軽鎖可変ドメインは、Ｌ１～Ｌ２８からなる群から選択される軽鎖可変ドメインの配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸の配列を含む。別の実施形態では、軽鎖可変ドメインは、Ｌ１～Ｌ２８からなる群（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７、Ｌ８、Ｌ９、Ｌ１０、Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ１３、Ｌ１４、Ｌ１５、Ｌ１６、Ｌ１７、Ｌ１８、Ｌ１９、Ｌ２０、Ｌ２１、Ｌ２２、Ｌ２３、Ｌ２４、Ｌ２５、Ｌ２６、Ｌ２７、および、Ｌ２８を含む）から選択される軽鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸の配列を含む。別の実施形態では、軽鎖可変ドメインは、Ｌ１～Ｌ２８からなる群から選択される軽鎖可変ドメインをコードするポリヌクレオチドの相補体と中等度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸の配列を含む。別の実施形態では、軽鎖可変ドメインは、Ｌ１～Ｌ２８からなる群から選択される軽鎖可変ドメインをコードするポリヌクレオチドの相補体と中等度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸の配列を含む。別の実施形態では、軽鎖可変ドメインは、Ｌ１～Ｌ２８の軽鎖ポリヌクレオチドの相補体と中等度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸の配列を含む。
一実施形態では、本開示は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２５５０９の下で寄託されたＰＤ－１結合クローンのライブラリーのクローンのうちの１つによりコードされる軽鎖可変ドメインの配列と１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１残基のみ異なるアミノ酸の配列を含む軽鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質であって、そのような配列差の各々が、独立して、１アミノ酸残基の欠失、挿入または置換のいずれかである、抗原結合タンパク質を提供する。別の実施形態では、軽鎖可変ドメインは、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２５５０９の下で寄託されたＰＤ－１結合クローンのライブラリーのクローンのうちの１つによりコードされる軽鎖可変ドメインの配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸の配列を含む。別の実施形態では、軽鎖可変ドメインは、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２５５０９の下で寄託されたＰＤ－１結合クローンのライブラリーのクローンのうちの１つのヌクレオチド配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸の配列を含む。
別の実施形態では、本開示は、Ｈ１～Ｈ２８からなる群から選択される重鎖可変ドメインの配列と、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１つの残基のみで異なるアミノ酸の配列を含む重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質であって、このような配列の差異のそれぞれが、独立して、１つのアミノ酸残基の欠失、挿入、または置換のいずれかである、抗原結合タンパク質を提供する。別の実施形態では、重鎖可変ドメインは、Ｈ１～Ｈ２８からなる群から選択される重鎖可変ドメインの配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸の配列を含む。別の実施形態では、重鎖可変ドメインは、Ｈ１～Ｈ２８からなる群から選択される重鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸の配列を含む。別の実施形態では、重鎖可変ドメインは、Ｈ１～Ｈ２８からなる群から選択される重鎖可変ドメインをコードするポリヌクレオチドの相補体に対して適度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸の配列を含む。別の実施形態では、重鎖可変ドメインは、Ｈ１～Ｈ２８からなる群から選択される重鎖可変ドメインをコードするポリヌクレオチドの相補体に対して適度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸の配列を含む。別の実施形態では、重鎖可変ドメインは、本明細書で開示される重鎖ポリヌクレオチドの相補体に対して適度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸の配列を含む。
一実施形態では、本開示は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２５５０９の下で寄託されたＰＤ－１結合クローンのライブラリーのクローンのうちの１つによりコードされる重鎖可変ドメインの配列と１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１残基のみ異なるアミノ酸の配列を含む重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質であって、そのような配列差の各々が、独立して、１アミノ酸残基の欠失、挿入または置換のいずれかである、抗原結合タンパク質を提供する。別の実施形態では、重鎖可変ドメインは、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２５５０９の下で寄託されたＰＤ－１結合クローンのライブラリーのクローンのうちの１つによりコードされる重鎖可変ドメインの配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸の配列を含む。別の実施形態では、重鎖可変ドメインは、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２５５０９の下で寄託されたＰＤ－１結合クローンのライブラリーのクローンのうちの１つのヌクレオチド配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸の配列を含む。
本開示の抗原結合タンパク質の特定の実施形態は、本明細書において参照されるＣＤＲおよび／またはＦＲのうちの１つまたは複数のアミノ酸配列に対して同一である１つまたは複数のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、抗原結合タンパク質は、上記に例示された軽鎖ＣＤＲ１配列を含む。別の実施形態では、抗原結合タンパク質は、上記に例示された軽鎖ＣＤＲ２配列を含む。別の実施形態では、抗原結合タンパク質は、上記に例示された軽鎖ＣＤＲ３配列を含む。別の実施形態では、抗原結合タンパク質は、上記に例示された重鎖ＣＤＲ１配列を含む。別の実施形態では、抗原結合タンパク質は、上記に例示された重鎖ＣＤＲ２配列を含む。別の実施形態では、抗原結合タンパク質は、上記に例示された重鎖ＣＤＲ３配列を含む。
一実施形態では、本開示は、上記に示されるＣＤＲ配列と、５、４、３、２、または１個以下のアミノ酸残基で異なる１つまたは複数のＣＤＲ配列を含む抗原結合タンパク質を提供する。
一部の実施形態では、抗原結合タンパク質のＣＤＲ１配列の少なくとも１つは、表５もしくは９に示されているようなＡ１～Ａ２８、ＣＤＲ１－Ｌ１～２８もしくはＣＤＲ１－Ｈ１～２８からのＣＤＲ１配列、または表７に示されているようなそれらのコンセンサス配列である。一部の実施形態では、抗原結合タンパク質のＣＤＲ２配列の少なくとも１つは、表５もしくは９に示されているようなＡ１～Ａ２８、ＣＤＲ２－Ｌ１～２８もしくはＣＤＲ２－Ｈ１～２８からのＣＤＲ２配列、または表７に示されているようなそれらのコンセンサス配列である。一部の実施形態では、抗原結合タンパク質のＣＤＲ３配列の少なくとも１つは、表５もしくは９に示されているようなＡ１～Ａ２８、ＣＤＲ３－Ｌ１～２８もしくはＣＤＲ３－Ｈ１～２８からのＣＤＲ３配列、または表７に示されているようなそれらのコンセンサス配列である。
別の実施形態では、抗原結合タンパク質の軽鎖ＣＤＲ３配列は、表５もしくは９に示されているようなＡ１～Ａ２８もしくはＣＤＲ３－Ｌ１～２８の軽鎖ＣＤＲ３配列、または表７に示されているようなそれらのコンセンサス配列であり、抗原結合タンパク質の重鎖ＣＤＲ３配列は、表５もしくは９に示されているようなＡ１～Ａ２８もしくはＣＤＲ－Ｈ１～２８の重鎖配列、または表７に示されているようなそれらのコンセンサス配列である。
別の実施形態では、抗原結合タンパク質は、各々独立して６つ、５つ、４つ、３つ、２つ、１つまたは０の単一アミノ酸付加、置換および／または欠失の点でＡ１～Ａ２８のＣＤＲ配列と異なる、１つ、２つ、３つ、４つまたは５つのＣＤＲ配列を含み、抗原結合タンパク質は、各々独立して６つ、５つ、４つ、３つ、２つ、１つまたは０の単一アミノ酸付加、置換および／または欠失の点でＣＤＲ配列と異なる、１つ、２つ、３つ、４つまたは５つのＣＤＲ配列をさらに含む。一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、Ａ１～Ａ２８のＣＤＲ配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を各々が有する１つ、２つ、３つ、４つまたは５つのＣＤＲ配列を含む。
Ａ１～Ａ２８のヌクレオチド配列、またはＡ１～Ａ２８のアミノ酸配列を、例えば、ランダム変異誘発によりまたは部位特異的変異誘発（例えば、オリゴヌクレオチド指定部位特異的変異誘発）により変更して、非変異ポリヌクレオチドと比較して１つまたは複数の特定のヌクレオチド置換、欠失または挿入を含む変更されたポリヌクレオチドを作出することができる。このような変更を加える技術の例は、Walder et al., 1986, Gene 42:133；Bauer et al.1985, Gene 37:73；Craik, BioTechniques, January 1985, 12-19；Smith et al., 1981, Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press；ならびに米国特許第４，５１８，５８４号および同第４，７３７，４６２号に記載されている。これらおよび他の方法を使用して、例えば、所望の特性を有する、例えば、非誘導体化抗体と比較してＰＤ－１に対する親和性、アビディティもしくは特異性が増加した、ｉｎ ｖｉｖｏもしくはｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性もしくは安定性が増加した、またはｉｎ ｖｉｖｏでの副作用が低減した、抗ＰＤ－１抗体の誘導体を作製することができる。
本開示の範囲内の抗ＰＤ－１抗体の他の誘導体は、抗ＰＤ－１抗体ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合させた異種ポリペプチドを含む組換え融合タンパク質の発現によるものなどの、抗ＰＤ－１抗体またはそれらの断片と他のタンパク質またはポリペプチドとの共有結合性または凝集性コンジュゲートを含む。例えば、コンジュゲートされるペプチドは、異種シグナル（またはリーダー）ポリペプチド、例えば、酵母アルファ因子リーダー、またはペプチド、例えばエピトープタグであり得る。抗原結合タンパク質含有融合タンパク質は、抗原結合タンパク質の精製または同定を助長するために付加されたペプチド（例えば、ポリＨｉｓ）を含むことができる。抗原結合タンパク質を、Hopp et al., Bio/Technology 6:1204, 1988および米国特許第５，０１１，９１２号に記載されているようなＦＬＡＧペプチドＡｓｐ－Ｔｙｒ－Ｌｙｓ－Ａｓｐ－Ａｓｐ－Ａｓｐ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）（配列番号１２１９１）に連結させることもできる。ＦＬＡＧペプチドは、高抗原性であり、特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）により可逆的に結合されるエピトープを提供し、発現させた組換えタンパク質の迅速なアッセイおよび容易な精製を可能にする。ＦＬＡＧペプチドが所与のポリペプチドに融合している融合タンパク質の調製に有用な試薬は、市販されている（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）。
１つの好適なＦｃポリペプチドは、ＰＣＴ出願ＷＯ９３／１０１５１（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されており、ヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ領域の未変性Ｃ末端に対するＮ末端ヒンジ領域から伸長する一本鎖ポリペプチドである。別の有用なＦｃポリペプチドは、米国特許第５，４５７，０３５号およびBaum et al., 1994, EMBO J. 13:3992-4001に記載されるＦｃムテインである。このムテインのアミノ酸配列は、アミノ酸１９がＬｅｕからＡｌａに変化し、アミノ酸２０がＬｅｕからＧｌｕに変化し、かつアミノ酸２２がＧｌｙからＡｌａに変化したことを除いて、ＷＯ９３／１０１５１において示された未変性Ｆｃ配列のものと同一である。ムテインは、Ｆｃ受容体に対する親和性の低下を示す。
他の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体の重鎖および／または軽鎖の可変部分は、抗体重鎖および／または軽鎖の可変部分の代わりに使用することができる。
１つまたは複数の抗原結合タンパク質を含有するオリゴマーをＰＤ－１アンタゴニストとして利用することができる。オリゴマーは、共有結合で連結されたまたは非共有結合で連結された二量体、三量体またはより高次のオリゴマーの形態であることもある。２つまたはそれより多くの抗原結合タンパク質を含むオリゴマーは使用が企図され、一例はホモ二量体である。他のオリゴマーとしては、ヘテロ二量体、ホモ三量体、ヘテロ三量体、ホモ四量体、ヘテロ四量体などが挙げられる。
一実施形態は、抗原結合タンパク質に融合したペプチド部分間の共有結合または非共有結合による相互作用を介して接合した複数の抗原結合タンパク質を含むオリゴマーを対象とする。このようなペプチドは、ペプチドリンカー（スペーサー）、またはオリゴマー化を促進する特性を有するペプチドであってもよい。ロイシンジッパーおよび抗体に由来するある特定のポリペプチドは、以下により詳細に記載されるように、それに結合した抗原結合タンパク質のオリゴマー化を促進することができるペプチドに含まれる。
特定の実施形態では、オリゴマーは、２つ～４つの抗原結合タンパク質を含む。オリゴマーの抗原結合タンパク質は、上記の形態のいずれか、例えばバリアントまたは断片などの、いずれの形態であってもよい。好ましくは、オリゴマーは、ＰＤ－１結合活性を有する抗原結合タンパク質を含む。
一実施形態では、オリゴマーは、免疫グロブリンに由来するポリペプチドを使用して調製される。抗体由来のポリペプチドの様々な部分（Ｆｃドメインを含む）に融合させたある特定の異種ポリペプチドを含む融合タンパク質の調製は、例えば、Ashkenazi et al., 1991, PNAS USA 88:10535；Byrn et al., 1990, Nature 344:677；およびHollenbaugh et al., 1992 Curr. Prot.s in Immunol., Suppl. 4, pages 10.19.1 - 10.19.11により記載されている。
本開示の一実施形態は、抗ＰＤ－１抗体のＰＤ－１結合性断片を抗体のＦｃ領域に融合させることにより作出される、２つの融合タンパク質を含む二量体に関する。この二量体は、例えば、融合タンパク質をコードする遺伝子融合体を適切な発現ベクターに挿入し、組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞に遺伝子融合体を発現させ、かつ発現した融合タンパク質を抗体分子のように組み立て、それから、二量体を生じるように鎖間ジスルフィド結合がＦｃ部分間に形成することによって、作製することができる、。
あるいは、オリゴマーは、ペプチドリンカー（スペーサーペプチド）を伴うまたは伴わない、複数抗原結合タンパク質を含む融合タンパク質である。好適なペプチドリンカーには、米国特許第４，７５１，１８０号および同第４，９３５，２３３号に記載されているものもある。
オリゴマー抗原結合タンパク質を調製するための別の方法は、ロイシンジッパーの使用を含む。ロイシンジッパードメインは、それらが見出されるタンパク質のオリゴマー化を促進するペプチドである。ロイシンジッパーは、元々はいくつかのＤＮＡ結合タンパク質において同定されたものであり（Landschulz et al., 1988, Science 240:1759）、それ以来、様々な異なるタンパク質において見つかっている。公知のロイシンジッパーの中には、二量体化または三量体化する天然に存在するペプチドおよびそれらの誘導体もある。可溶性オリゴマータンパク質の産生に好適なロイシンジッパードメインの例は、ＰＣＴ出願ＷＯ９４／１０３０８に記載されており、肺サーファクタントプロテインＤ（ＳＰＤ）に由来するロイシンジッパーは、Hoppe et al., 1994, FEBS Letters 344:191に記載されており、これらの参考文献は、参照により本明細書に組み込まれる。改変ロイシンジッパーに融合させた異種タンパク質の安定な三量体化を可能にする、改変ロイシンジッパーの使用は、Fanslow et al., 1994, Semin. Immunol. 6:267-78に記載されている。１つの手法では、ロイシンジッパーペプチドに融合させた抗ＰＤ－１抗体断片または誘導体を含む、組換え融合タンパク質が、好適な宿主細胞に発現され、形成する可溶性オリゴマー抗ＰＤ－１抗体断片または誘導体が、培養上清から回収される。
一態様では、本開示は、ＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１との結合に干渉する抗原結合タンパク質を提供する。そのような抗原結合タンパク質をＰＤ－１またはその断片、バリアントもしくは誘導体に対して生じさせ、従来のアッセイでＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１との結合に干渉する能力についてスクリーニングすることができる。好適なアッセイの例は、ＰＤ－１を発現する細胞とＰＤ－Ｌ１の結合を阻害する能力について抗原結合タンパク質を試験するアッセイ、または細胞表面ＰＤ－１とのＰＤ－Ｌ１の結合の結果として生じる生物学的または細胞応答を低減させる能力について抗原結合タンパク質を試験するアッセイである。例えば、抗体を、固定化抗体表面（ＰＤ－１）と結合するそれらの能力に従って、スクリーニングすることができる。ＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１との結合を遮断する抗原結合タンパク質を、悪液質を含むがこれに限定されない、任意のＰＤ－１関連状態の処置に利用することができる。ある実施形態では、トランスジェニックマウスの免疫を含む手順により生成されたヒト抗ＰＤ－１モノクローナル抗体が、そのような状態の処置に利用される。
本開示の抗原結合タンパク質の抗原結合性断片は、従来の技法によって産生することができる。このような断片の例としては、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片が挙げられるがこれらに限定されない。遺伝子操作技法によって産生される抗体断片および誘導体も企図される。
追加の実施形態としては、キメラ抗体、例えば、非ヒト（例えば、マウス）モノクローナル抗体のヒト化バージョンが挙げられる。このようなヒト化抗体は、公知の技法によって調製することができ、抗体がヒトに投与された場合に、免疫原性の低下という利点をもたらす。一実施形態では、ヒト化モノクローナル抗体は、マウス抗体の可変ドメイン（またはその抗原結合部位の全てもしくは一部）およびヒト抗体に由来する定常ドメインを含む。あるいは、ヒト化抗体断片は、マウスモノクローナル抗体の抗原結合部位およびヒト抗体に由来する可変ドメイン断片（抗原結合部位を欠如する）を含んでもよい。キメラおよびさらに操作されたモノクローナル抗体の産生のための手順は、Riechmann et al., 1988, Nature 332:323、Liu et al., 1987, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 84:3439、Larrick et al., 1989, Bio/Technology 7:934、およびWinter et al., 1993, TIPS 14:139に記載されたものを含む。一実施形態では、キメラ抗体は、ＣＤＲ移植抗体である。抗体をヒト化するための技法は、例えば、米国特許第５，８６９，６１９号、同第５，２２５，５３９号、同第５，８２１，３３７号、同第５，８５９，２０５号、同第６，８８１，５５７号、Padlan et al., 1995, FASEB J. 9:133-39、およびTamura et al., 2000, J. Immunol. 164:1432-41において議論されている。
非ヒト動物においてヒトまたは部分ヒト抗体を生成するための手順が開発されている。例えば、１つまたは複数の内在性免疫グロブリン遺伝子が様々な手段により不活性化されたマウスが作製されている。不活性化されたマウス遺伝子を置き換えるために、ヒト免疫グロブリン遺伝子がマウスに導入されている。この動物において産生される抗体は、この動物に導入されたヒト遺伝物質によりコードされるヒト免疫グロブリンポリペプチド鎖を含む。一実施形態では、トランスジェニックマウスなどの非ヒト動物がＰＤ－１ポリペプチドで免疫され、その結果、ＰＤ－１ポリペプチドに対する抗体が、その動物において生成される。
好適な免疫原の一例は、次の配列：配列番号７００１を有するタンパク質の細胞外ドメインを含むかまたはこのタンパク質の他の免疫原性断片を含むポリペプチドなどの、可溶性ヒトＰＤ－１である。ヒトまたは部分ヒト抗体の産生のためのおよび産生のためにトランスジェニック動物を使用するための技術の例は、米国特許第５，８１４，３１８号、同第５，５６９，８２５号および同第５，５４５，８０６号、Davis et al., 2003, Production of human antibodies from transgenic mice in Lo, ed. Antibody Engineering: Methods and Protocols, Humana Press, NJ:191-200、Kellermann et al., 2002, Curr Opin Biotechnol.13:593-97、Russel et al., 2000, Infect Immun.68:1820-26、Gallo et al., 2000, Eur J Immun.30:534-40、Davis et al., 1999, Cancer Metastasis Rev. 18:421-25、Green, 1999, J Immunol Methods.231:11-23、Jakobovits, 1998, Advanced Drug Delivery Reviews 31:33-42、Green et al., 1998, J Exp Med.188:483-95、Jakobovits A, 1998, Exp. Opin. Invest. Drugs. 7:607-14、Tsuda et al., 1997, Genomics.42:413-21、Mendez et al., 1997, Nat Genet.15:146-56、Jakobovits, 1994, Curr Biol.4:761-63、Arbones et al., 1994, Immunity.1:247-60、Green et al., 1994, Nat Genet.7:13-21、Jakobovits et al., 1993, Nature.362:255-58、Jakobovits et al., 1993, Proc Natl Acad Sci U S A. 90:2551-55. Chen, J., M. Trounstine, F. W. Alt, F. Young, C. Kurahara, J. Loring, D. Huszar. Inter'l Immunol. 5 (1993): 647-656、Choi et al., 1993, Nature Genetics 4: 117-23、Fishwild et al., 1996, Nature Biotech. 14: 845-51、Harding et al., 1995, Annals of the New York Academy of Sciences、Lonberg et al., 1994, Nature 368: 856-59、Lonberg, 1994, Transgenic Approaches to Human Monoclonal Antibodies in Handbook of Experimental Pharmacology 113: 49-101、Lonberg et al., 1995, Internal Review of Immunology 13: 65-93、Neuberger, 1996, Nature Biotechnology 14: 826、Taylor et al., 1992, Nucleic Acids Res.20: 6287-95、Taylor et al., 1994, Inter'l Immunol.6: 579-91、Tomizuka et al., 1997, Nature Genetics 16: 133-43、Tomizuka et al., 2000, Pro. Nat'l Acad. Sci. USA 97: 722-27、Tuaillon et al., 1993, Pro. Nat'l Acad. Sci. USA 90: 3720-24、およびTuaillon et al., 1994, J.Immunol.152: 2912-20に記載されている。
本開示の抗原結合タンパク質（例えば、抗体、抗体断片、および抗体誘導体）は、当技術分野で公知のいずれかの定常領域を含んでもよい。軽鎖定常領域は、例えば、カッパまたはラムダ型軽鎖定常領域、例えば、ヒトカッパまたはラムダ型軽鎖定常領域であってもよい。重鎖定常領域は、例えば、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、またはミュー型重鎖定常領域、例えば、ヒトアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、またはミュー型重鎖定常領域であってもよい。一実施形態では、軽鎖または重鎖定常領域は、天然に存在する定常領域の断片、誘導体、バリアント、またはムテインである。
目的の抗体からの様々なサブクラスまたはアイソタイプの抗体を誘導するための技法、すなわちサブクラススイッチングが公知である。よって、ＩｇＧ抗体は、例えば、ＩｇＭ抗体に由来してもよく、逆もまた同様である。このような技法は、所与の抗体（親抗体）の抗原結合特性を有する新たな抗体の調製を可能にするが、親抗体のものと異なる抗体のアイソタイプまたはサブクラスと関連する生物学的特性も示す。組換えＤＮＡ技法が用いられてもよい。特定の抗体ポリペプチドをコードするクローニングされたＤＮＡ、例えば、所望のアイソタイプの抗体の定常ドメインをコードするＤＮＡは、このような手順で用いることができる。Lantto et al., 2002, Methods Mol. Biol. 178:303-16も参照されたい。
一実施形態では、本開示の抗原結合タンパク質は、Ａ１～Ａ２８のいずれかのＩｇＧ１重鎖ドメイン（Ｈ１～Ｈ２８）またはＡ１～Ａ２８のいずれかのＩｇＧ１重鎖ドメイン（Ｈ１～Ｈ２８）の断片を含む。別の実施形態では、本開示の抗原結合タンパク質は、Ａ１～Ａ２８のカッパ軽鎖定常鎖領域（Ｌ１～Ｌ２８）、またはＡ１～Ａ２８のカッパ軽鎖定常領域（Ｌ１～Ｌ２８）の断片を含む。別の実施形態では、本開示の抗原結合タンパク質は、Ａ１～Ａ２８のＩｇＧ１重鎖ドメイン（Ｌ１～Ｌ２８）、またはその断片およびＡ１～Ａ２８のカッパ軽鎖ドメイン（Ｌ１～Ｌ２８）、またはその断片を含む。
したがって、本開示の抗原結合タンパク質は、例えば、所望のアイソタイプ（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＥおよびＩｇＤ）ならびにそのＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２断片を有する、可変ドメインの組合せＬ１Ｈ１、Ｌ２Ｈ２、Ｌ３Ｈ３、Ｌ４Ｈ４、Ｌ５Ｈ５、Ｌ６Ｈ６、Ｌ７Ｈ７、Ｌ８Ｈ８、Ｌ９Ｈ９、Ｌ１０Ｈ１０、Ｌ１１Ｈ１１、Ｌ１２Ｈ１２、Ｌ１３Ｈ１３、Ｌ１４Ｈ１４、Ｌ１５Ｈ１５、Ｌ１６Ｈ１６、Ｌ１７Ｈ１７、Ｌ１８Ｈ１８、Ｌ１９Ｈ１９、Ｌ２０Ｈ２０、Ｌ２１Ｈ２１、Ｌ２２Ｈ２２、Ｌ２３Ｈ２３、Ｌ２４Ｈ２４、Ｌ２５Ｈ２５、Ｌ２６Ｈ２６、Ｌ２７Ｈ２７、Ｌ２８Ｈ２８を含むものを含む。さらに、ＩｇＧ４が所望される場合、ＩｇＧ４抗体の不均一性をもたらし得るＨ鎖内ジスルフィド結合を形成する傾向を軽減するために、参照により本明細書に組み込まれるBloom et al., 1997, Protein Science 6:407に記載されているように、ヒンジ領域に点変異（ＣＰＳＣＰ（配列番号１２１９２）－＞ＣＰＰＣＰ（配列番号１２１９３））を導入することが望ましいこともある。
一実施形態では、抗原結合タンパク質は、１×１０－４ｓ－１またはそれ未満のＫｏｆｆを有する。別の実施形態では、Ｋｏｆｆは、５×１０－５ｓ－１またはそれ未満である。別の実施形態では、Ｋｏｆｆは、Ｌ１Ｈ１、Ｌ２Ｈ２、Ｌ３Ｈ３、Ｌ４Ｈ４、Ｌ５Ｈ５、Ｌ６Ｈ６、・・・およびＬ２８Ｈ２８からなる組合せの群から選択される軽鎖可変ドメイン配列と重鎖可変ドメイン配列の組合せを有する抗体と実質的に同じである。別の実施形態では、抗原結合タンパク質は、Ｌ１Ｈ１、Ｌ２Ｈ２、Ｌ３Ｈ３、Ｌ４Ｈ４、Ｌ５Ｈ５、Ｌ６Ｈ６、・・・およびＬ２８Ｈ２８からなる組合せの群から選択される軽鎖可変ドメイン配列と重鎖可変ドメイン配列の組合せを有する抗体からの１つまたは複数のＣＤＲを含む抗体と実質的に同じＫｏｆｆでＰＤ－１と結合する。別の実施形態では、抗原結合タンパク質は、上記で説明されたアミノ酸配列のうちの１つを含む抗体と実質的に同じＫｏｆｆでＰＤ－１と結合する。別の実施形態では、抗原結合タンパク質は、上記で説明されたアミノ酸配列のうちの１つを含む抗体からの１つまたは複数のＣＤＲを含む抗体と実質的に同じＫｏｆｆでＰＤ－１と結合する。
一態様では、本開示は、本開示の抗ＰＤ－１抗体の抗原結合性断片を提供する。そのような断片は、抗体由来の配列の全体からなることもあり、または追加の配列を含むこともある。抗原結合性断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、単鎖抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、およびドメイン抗体が挙げられる。他の例は、Lunde et al., 2002, Biochem. Soc. Trans. 30:500-06において提供されている。
単鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、重鎖および軽鎖可変ドメイン（Ｆｖ領域）断片をアミノ酸架橋（短いペプチドリンカー、例えば、アミノ酸残基の合成配列）によって連結し、単一のポリペプチド鎖をもたらすことによって形成することができる。このような単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、２つの可変ドメインポリペプチド（ＶＬおよびＶＨ）をコードするＤＮＡ間に、ペプチドリンカーをコードするＤＮＡを融合させることによって調製されている。得られたポリペプチドは、２つの可変ドメイン間のフレキシブルリンカーの長さに応じて、それら自体において折り返し、抗原結合モノマーを形成することができるか、または多量体（例えば、二量体、三量体、または四量体）を形成することができる（Kortt et al., 1997, Prot. Eng. 10:423；Kortt et al., 2001, Biomol. Eng. 18:95-108、Bird et al., 1988, Science 242:423-26およびHuston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-83）。様々なＶＬおよびＶＨを含むポリペプチドを組み合わせることによって、様々なエピトープと結合する多量体ｓｃＦｖを形成することができる（Kriangkum et al., 2001, Biomol. Eng. 18:31-40）。単鎖抗体の産生のために開発された技法としては、米国特許第４，９４６，７７８号、Bird, 1988, Science 242:423；Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879；Ward et al., 1989, Nature 334:544；de Graaf et al., 2002, Methods Mol Biol. 178:379-87に記載のものが挙げられる。可変ドメインの組合せＬ１Ｈ１、Ｌ２Ｈ２、Ｌ３Ｈ３、Ｌ４Ｈ４、Ｌ５Ｈ５、Ｌ６Ｈ６、・・・、およびＬ２８Ｈ２８を含むｓｃＦｖは、本開示に包含される。
７．７．モノクローナル抗体
別の態様では、本開示は、ＰＤ－１と結合するモノクローナル抗体を提供する。本開示のモノクローナル抗体は、様々な公知の技術を使用して生成することができる。一般に、特異的抗原と結合するモノクローナル抗体は、当業者に公知の方法により得ることができる（例えば、Kohler et al., Nature 256:495, 1975；Coligan et al.(eds.), Current Protocols in Immunology, 1:2.5.12.6.7 (John Wiley & Sons 1991)；米国特許再発行第３２，０１１号、米国特許第４，９０２，６１４号、同第４，５４３，４３９号および同第４，４１１，９９３号；Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Kennett, McKearn, and Bechtol (eds.) (1980)；ならびにAntibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988)；Picksley et al., "Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. coli," in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds.), page 93 (Oxford University Press 1995)を参照されたい）。抗体断片を、そのようなモノクローナル抗体から、タンパク分解などの任意の好適な標準的技術を使用して、または必要に応じて、タンパク分解（例えば、パパインもしくはペプシンを使用する）、続いて、ジスルフィド結合の軽度の還元、およびアルキル化により、誘導することができる。あるいは、そのような断片を本明細書に記載の組換え遺伝子操作技法により生成することもできる。
モノクローナル抗体は、当技術分野において公知のおよび本明細書に記載の方法に従って、ヒトＰＤ－１［配列番号７００１］またはその断片を含む免疫原を動物、例えば、ラット、ハムスター、ウサギ、または好ましくはマウス、例えば、当技術分野において公知のトランスジェニック体もしくはノックアウト体などに注射することにより、得ることができる。初回注射後および／またはブースター注射後、血清試料を得、ヒトＰＤ－１またはペプチドと結合する抗体の存在を当技術分野において公知のおよび本明細書に記載のいくつかの免疫検出法のいずれか１つを使用して検出することにより、特異的抗体産生の存在をモニターすることができる。所望の抗体を産生する動物から、リンパ系細胞が、最も一般的には、脾臓またはリンパ節からの細胞が、Ｂリンパ球を得るために取り出される。次いで、不死真核細胞系であるハイブリドーマを生じさせるために、Ｂリンパ球を、薬物感作骨髄腫細胞融合パートナー、好ましくは、免疫動物と同系であるもの、および他の望ましい特性（例えば、内在性Ｉｇ遺伝子産物の発現不能、例えば、Ｐ３Ｘ６３－Ａｇ ８．６５３（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ １５８０）：ＮＳＯ、ＳＰ２０）を必要に応じて有するものと、融合させる。
リンパ系（例えば、脾臓）細胞および黒色腫細胞を、数分間、膜融合促進剤、例えば、ポリエチレングリコールまたは非イオン性界面活性剤と組み合わせ、次いで、ハイブリドーマ細胞の成長を支持するが未融合黒色腫細胞を支持しない選択培地に、低密度で蒔くことができる。好ましい選択培地は、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）である。十分な時間の後、通常は約１～２週間後に、細胞のコロニーが観察される。単一コロニーを単離し、当技術分野において公知のおよび本明細書に記載の様々なイムノアッセイのいずれか１つを使用して、細胞により産生された抗体をヒトＰＤ－１に対する結合活性について試験することができる。ハイブリドーマが（例えば、限界希釈クローニングにより、または軟寒天プラーク単離により）クローニングされ、ＰＤ－１に特異的な抗体を産生する陽性クローンが選択され、培養される。ハイブリドーマ培養物からのモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養物の上清から単離することができる。
マウスモノクローナル抗体の産生のための代替方法は、ハイブリドーマ細胞を、同一遺伝子のマウス、例えば、モノクローナル抗体を含有する腹水液の形成を促進するように処置された（例えば、プリスタンでプライミングされた）マウスの腹膜腔に注射することである。モノクローナル抗体は、種々の十分に確立された技法によって、単離および精製することができる。このような単離技法としては、プロテインＡセファロースによる親和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーが挙げられる（例えば、Coligan at pages 2.7.1-2.7.12 and pages 2.9.1-2.9.3；Baines et al., "Purification of Immunoglobulin G(IgG)," in Methods in Molecular Biology, Vol. 10, pages 79-104(The Humana Press, Inc. 1992)を参照されたい）。モノクローナル抗体は、抗体の特定の特性（例えば、重鎖または軽鎖アイソタイプ、結合特異性など）に基づいて選択された適切なリガンドを使用する親和性クロマトグラフィーによって精製することができる。固体支持体上に固定された好適なリガンドの例としては、プロテインＡ、プロテインＧ、抗定常領域（軽鎖または重鎖）抗体、抗イディオタイプ抗体、およびＴＧＦ－ベータ結合タンパク質、またはその断片もしくはバリアントが挙げられる。
モノクローナル抗体は、当技術分野において公知の任意の技術を使用して、例えば、免疫スケジュールの完了後にトランスジェニック動物から採取した脾臓細胞を不死化することにより、産生することができる。脾臓細胞は、当技術分野において公知の任意の技術を使用して、例えば、それらを骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを生じさせることにより、不死化することができる。ＰＤ－１ポリペプチドに結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞系が同定される。そのようなハイブリドーマ細胞系、およびそれらにより産生される抗ＰＤ－１モノクローナル抗体は、本開示に包含される。ハイブリドーマ産生融合手順に使用するための骨髄腫細胞は、好ましくは、非抗体産生性であり、高い融合効率、および酵素欠損を有し、この欠損のため、これらの細胞は、所望の融合細胞（ハイブリドーマ）のみの成長を支持するある特定の選択培地では成長することができない。マウス融合における使用に好適な細胞系の例としては、Ｓｐ－２０、Ｐ３－Ｘ６３／Ａｇ８、Ｐ３－Ｘ６３－Ａｇ８．６５３、ＮＳ１／１．Ａｇ ４ １、Ｓｐ２１０－Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ－１１、ＭＰＣ１１－Ｘ４５－ＧＴＧ １．７およびＳ１９４／５ＸＸ０ Ｂｕｌが挙げられ、ラット融合に使用される細胞系の例としては、Ｒ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３－Ａｇ １．２．３、ＩＲ９８３Ｆおよび４Ｂ２１０が挙げられる。細胞融合に有用な他の細胞系は、Ｕ－２６６、ＧＭ１５００－ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ－ＬＯＮ－ＨＭｙ２およびＵＣ７２９－６である。ハイブリドーマまたはｍＡｂをさらにスクリーニングして、ＰＤ－１誘導活性を遮断する能力などの特定の特性を有するｍＡｂを同定することができる。
本開示の抗体は、完全ヒトモノクローナル抗体でもあり得る。ＰＤ－１と特異的に結合する単離された完全ヒト抗体であって、抗原結合タンパク質がヒト抗ＰＤ－１抗体の少なくとも１つのｉｎ ｖｉｖｏ生物活性を有する完全ヒト抗体が、提供される。
７．８．抗体を生成する方法
完全ヒトモノクローナル抗体は、当業者が精通している任意の数の技法により生成することができる。そのような方法には、ヒト末梢血細胞（例えば、Ｂリンパ球を含有する）のエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）形質転換、ヒトＢ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫、挿入されたヒト免疫グロブリン遺伝子を保有する免疫トランスジェニックマウスからの脾臓細胞の融合、ヒト免疫グロブリンＶ領域ファージライブラリーからの単離、または当技術分野において公知のおよび本明細書での開示に基づく他の手順が含まれるが、これらに限定されない。例えば、完全ヒトモノクローナル抗体は、抗原チャレンジに応答して特異的ヒト抗体を産生するように操作されたトランスジェニックマウスから得ることができる。トランスジェニックマウスから完全ヒト抗体を得るための方法は、例えば、Green et al., Nature Genet.7:13, 1994；Lonberg et al., Nature 368:856, 1994；Taylor et al., Int. Immun.6:579, 1994；米国特許第５，８７７，３９７号；Bruggemann et al., 1997 Curr.Opin.Biotechnol.8:455-58；Jakobovits et al., 1995 Ann. N. Y. Acad. Sci.764:525-35により記載されている。この技法では、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子座のエレメントが、内在性重鎖および軽鎖遺伝子座の標的破壊を含有する胚性幹細胞系に由来するマウスの株に導入される（Bruggemann et al., Curr.Opin.Biotechnol.8:455-58 (1997)も参照されたい）。例えば、ヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、ミニ遺伝子構築物であってもよく、またはマウスリンパ系組織においてＢ細胞特異的ＤＮＡ再構成および高頻度変異を起こす、酵母人工染色体上の導入遺伝子座であってもよい。完全ヒトモノクローナル抗体は、トランスジェニックマウスの免疫により得ることができ、これらのマウスが次いでＰＤ－１に対して特異的なヒト抗体を産生することができる。本明細書に記載の方法に従って、免疫トランスジェニックマウスのリンパ系細胞を使用してヒト抗体分泌ハイブリドーマを生じさせることができる。完全ヒト抗体を含有するポリクローナル血清も、免疫動物の血液から得ることができる。
本開示のヒト抗体を生成するための別の方法は、ＥＢＶ形質転換によるヒト末梢血細胞の不死化を含む。例えば、米国特許第４，４６４，４５６号を参照されたい。ＰＤ－１と特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するそのような不死化Ｂ細胞系（またはリンパ芽球様細胞系）を、本明細書で提供されるような免疫検出方法、例えばＥＬＩＳＡにより同定し、次いで標準的なクローニング技術により単離することができる。抗ＰＤ－１抗体を産生するリンパ芽球様細胞系の安定性は、当技術分野において公知の方法（例えば、Glasky et al., Hybridoma 8:377-89 (1989)を参照されたい）に従って形質転換細胞系をマウス黒色腫と融合させてマウス－ヒトハイブリッド細胞系を生じさせることにより、向上させることができる。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのさらに別の方法は、ヒト脾臓Ｂ細胞をヒトＰＤ－１で初回刺激し、その後、初回刺激されたＢ細胞をヘテロハイブリッド融合パートナーと融合させることを含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫である。例えば、Boerner et al., 1991 J. Immunol.147:86-95を参照されたい。
ある特定の実施形態では、当技術分野において公知の（ＷＯ９２／０２５５１；米国特許第５，６２７，０５２号；Babcook et al., Proc. Natl.Acad.Sci.USA 93:7843-48 (1996)）および本明細書に記載の分子生物学技術に従って、抗ヒトＰＤ－１抗体を産生するＢ細胞が選択され、軽鎖および重鎖可変領域がＢ細胞からクローニングされる。免疫動物からのＢ細胞は、ＰＤ－１と特異的に結合する抗体を産生する細胞を選択することにより脾臓、リンパ節または末梢血試料から単離することができる。Ｂ細胞をヒトから、例えば、末梢血試料から単離することもできる。
所望の特異性を有する抗体を産生する単一のＢ細胞を検出するための方法は、当技術分野において周知であり、例えば、プラーク形成、蛍光活性化細胞選別、ｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激に続いての特異的抗体の検出などによる。特異的抗体産生Ｂ細胞の選択方法は、例えば、ヒトＰＤ－１を含有する軟寒天中でＢ細胞の単一細胞懸濁液を調製することを含む。Ｂ細胞により産生される特異的抗体が抗原と結合すると複合体が形成され、この複合体は、免疫沈降物として目視可能であり得る。
一部の実施形態では、特異的抗体を産生するＢ細胞は、自然に対合した抗体の同定を可能にする方法を使用することによって選択される。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Adler et al., A natively paired antibody library yields drug leads with higher sensitivity and specificity than a randomly paired antibody library, MAbs(2018)に記載された方法を用いることができる。本方法は、Adler et al.から採用された、図１にまとめられたマイクロ流体技術、分子ゲノミクス、酵母単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）ディスプレイ、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）およびディープシークエンシングを組み合わせる。要するに、Ｂ細胞は、免疫した動物から単離され、次いでプールされ得る。Ｂ細胞は、オリゴｄＴビーズおよび溶解溶液を用いて液滴に被包され、ｍＲＮＡが結合したビーズが液滴から精製され、次いで、重鎖および軽鎖Ｉｇが自然に対合したｓｃＦｖをコードするＤＮＡアンプリコンを生成するＯＥ－ＲＴ－ＰＣＲ増幅ミックスを含む第２のエマルション中に注入される。次いで、自然に対合したアンプリコンのライブラリーを、ｓｃＦｖディスプレイのために酵母中に電気穿孔させる。ＦＡＣＳを使用して、高親和性ｓｃＦｖを同定する。最後に、抗体のディープシークエンシングを使用して、選別前後のｓｃＦｖライブラリーにおける全てのクローンを同定することができる。
所望の抗体を産生するＢ細胞を選択した後で、当技術分野で公知であり、本明細書に記載の方法に従って、ＤＮＡまたはｍＲＮＡを単離および増幅することによって、特異的抗体遺伝子がクローニングされてもよい。
本開示の抗体を得るための方法は、当技術分野において公知の様々なファージディスプレイ技術も採用することができる。例えば、Winter et al., 1994 Annu. Rev. Immunol. 12:433-55；Burton et al., 1994 Adv.Immunol.57:191-280を参照されたい。ヒトまたはマウス免疫グロブリン可変領域遺伝子コンビナトリアルライブラリーをファージベクター内に生成してもよく、これらをスクリーニングして、ＰＤ－１結合タンパク質またはそのバリアントもしくは断片と特異的に結合するＩｇ断片（Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖ、またはこれらの多量体）を選択することができる。例えば、米国特許第５，２２３，４０９号；Huse et al., 1989 Science 246:1275-81；Sastry et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5728-32 (1989)；Alting-Mees et al., Strategies in Molecular Biology 3:1-9 (1990)；Kang et al., 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4363-66；Hoogenboom et al., 1992 J. Molec.Biol.227:381-388；Schlebusch et al., 1997 Hybridoma 16:47-52およびこれらに引用されている参考文献を参照されたい。例えば、Ｉｇ可変領域断片をコードする複数のポリヌクレオチド配列を含有するライブラリーを、ファージコートタンパク質をコードする配列とインフレームで、糸状バクテリオファージ、例えばＭ１３またはそのバリアント、のゲノムに挿入することができる。融合タンパク質は、コートタンパク質と軽鎖可変領域ドメインとのおよび／または重鎖可変領域ドメインとの融合体であり得る。ある特定の実施形態によれば、免疫グロブリンＦａｂ断片をファージ粒子上に提示させることもできる（例えば、米国特許第５，６９８，４２６号を参照されたい）。
微量コートタンパク質などの、別のタンパク質に融合させた抗体断片を使用して、ファージが抗原を多く含むようにすることもできる。その場合、抗原（例えば、ＰＤ－１）に対するマウス免疫からの再構成重（ＶＨ）および軽（ＶＬ）鎖のランダムコンビナトリアルライブラリーを使用して、抗体断片の多様なライブラリーがファージの表面に提示される。これらのライブラリーを相補的可変ドメインについてスクリーニングし、例えば親和性カラムにより、ドメインを精製することができる。Clackson et al., Nature, V. 352 pp. 624-628 (1991)を参照されたい。
重鎖および軽鎖免疫グロブリンｃＤＮＡ発現ライブラリーは、例えば、λｌｍｍｕｎｏＺａｐ（商標）（Ｈ）およびλＩｍｍｕｎｏＺａｐ（商標）（Ｌ）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して、ラムダファージにおいて調製されてもよい。簡潔には、ｍＲＮＡは、Ｂ細胞集団から単離され、λＩｍｍｕｎｏＺａｐ（Ｈ）およびλＩｍｍｕｎｏＺａｐ（Ｌ）ベクターにおける重鎖および軽鎖免疫グロブリンｃＤＮＡ発現ライブラリーを作出するために使用される。これらのベクターは、個々にスクリーニングされても、またはＦａｂ断片もしくは抗体を形成するために共発現されてもよい（Huse et al.、上掲を参照されたい；Sastry et al.、上掲も参照されたい）。次に、陽性プラークは、非溶解性プラスミドに変換されて、Ｅ．ｃｏｌｉからのモノクローナル抗体断片の高レベルでの発現を可能にする。
一実施形態では、ハイブリドーマにおいて、目的のモノクローナル抗体を発現する遺伝子の可変領域は、ヌクレオチドプライマーを使用して増幅される。これらのプライマーは、当業者によって合成されてもよく、または市販の供給源から購入されてもよい。（例えば、とりわけ、ＶＨａ、ＶＨｂ、ＶＨｃ、ＶＨｄ、ＣＨ１、ＶＬおよびＣＬ領域に対するプライマーを含むマウスおよびヒトの可変領域に対するプライマーを販売するＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を参照されたい）。これらのプライマーを使用して、重鎖または軽鎖可変領域を増幅させ、次いで、それぞれ、ＩｍｍｕｎｏＺＡＰ（商標）ＨまたはＩｍｍｕｎｏＺＡＰ（商標）Ｌ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などのベクター中に挿入されてもよい。次いで、これらのベクターは、発現のために、Ｅ．ｃｏｌｉ、酵母、または哺乳動物ベースの系に、導入されてもよい。ＶＨおよびＶＬドメインの融合体を含有する多量の単鎖タンパク質は、これらの方法（Bird et al., Science 242:423-426, 1988を参照されたい）を使用して産生されてもよい。
本開示による抗体を産生する細胞が、上記の免疫および他の技術のいずれかを使用して得られたら、本明細書に記載の標準手順に従ってそれらからＤＮＡまたはｍＲＮＡを単離し、増幅することにより、特異的抗体遺伝子をクローニングすることができる。それらから産生された抗体をシークエンシングし、ＣＤＲを同定することができ、ＣＤＲをコードするＤＮＡを前に説明したように操作して本開示による他の抗体を生成することができる。
本開示のＰＤ－１結合剤は、好ましくは、本明細書に記載の細胞に基づくアッセイおよび／もしくは本明細書に記載のｉｎ ｖｉｖｏアッセイにおいてＰＤ－１機能をモジュレートし、ならびに／または本明細書に記載のドメインのうちの１つもしくは複数と結合し、ならびに／または本出願に記載の抗体のうちの１つの結合を交差遮断し、ならびに／または本出願に記載の抗体のうちの１つによってＰＤ－１への結合が交差遮断される。したがって、このような結合剤を、本明細書に記載のアッセイを使用して同定することができる。
ある特定の実施形態では、抗体は、本明細書で提供されるドメインのうちの１つもしくは複数と結合する、ならびに／または本明細書に記載の細胞に基づくアッセイおよび／もしくはｉｎ ｖｉｖｏアッセイで中和する、ならびに／または本出願に記載の抗体を交差遮断する、ならびに／または本出願に記載の抗体のうちの１つによるＰＤ－１への結合が交差遮断される抗体を、先ず同定することにより生成される。次いで、これらの抗体からのＣＤＲ領域が、適切な生体適合性フレームワークへの挿入に使用されて、ＰＤ－１結合剤が生成される。結合剤の非ＣＤＲ部分は、アミノ酸で構成されていてもよく、または非タンパク質分子で構成されていてもよい。本明細書に記載のアッセイは、結合剤の特徴付けを可能にする。好ましくは、本開示の結合剤は、本明細書で定義される通りの抗体である。
本開示による他の抗体は、本明細書に記載のおよび当技術分野において公知の従来の免疫および細胞融合手順により得ることができる。
抗体結合部位の中央の相補性決定領域（ＣＤＲ）の分子進化も、親和性が増加した抗体、例えば、Schier et al., 1996, J. Mol. Biol. 263:551により記載されているような、ｃ－ｅｒｂＢ－２に対する親和性が増加した抗体を単離するために、使用されている。したがって、このような技術は、ＰＤ－１に対する抗体の調製に有用である。ＰＤ－１に対する抗原結合タンパク質を、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏどちらかの、ＰＤ－１ポリペプチドの存在を検出するためのアッセイにおいて、使用することができる。抗原結合タンパク質を、免疫親和性クロマトグラフィーによるＰＤ－１タンパク質の精製に利用することもできる。
ヒト、部分ヒト、またはヒト化抗体は、多くの応用、特に、ヒト対象への抗体の投与を含む多くの応用に好適であるが、ある特定の応用には他のタイプの抗原結合タンパク質が好適である。非ヒト抗体は、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ロバ、または非ヒト霊長類（例えば、サル（例えば、カニクイザルまたはアカゲザル）または類人猿（例えば、チンパンジー））などの、いずれの抗体産生動物に由来してもよい。特定の種からの抗体は、例えば、その種の動物を、所望の免疫原（例えばＰＤ－１ポリペプチド）で免疫すること、もしくはその種の抗体を生成するための人工系（例えば、特定の種の抗体を生成するための細菌もしくはファージディスプレイに基づく系）を使用して免疫することにより作製することができるか、またはある種からの抗体を、別の種からの抗体に、例えば、抗体の定常領域を他の種からの定常領域で置き換えることによって、もしくは抗体の１つもしくは複数のアミノ酸残基を、それが他の種からの抗体の配列にさらに酷似するように置き換えることによって、変換することにより作製することができる。一実施形態では、抗体は、２つまたはそれより多くの異なる種からの抗体に由来するアミノ酸配列を含むキメラ抗体である。
いくつかの従来の技術のいずれによって、抗原結合タンパク質を調製し、所望の特性についてスクリーニングしてもよい。これらの技術のいくつかは、目的の抗原結合タンパク質（例えば、抗ＰＤ－１抗体）のポリペプチド鎖（またはその一部分）をコードする核酸を単離すること、およびその核酸を組換えＤＮＡ技術により操作することを含む。核酸を目的の別の核酸に融合させることができるか、または例えば、１つまたは複数のアミノ酸残基が付加、欠失もしくは置換されるように（例えば、変異誘発または他の従来の技術により）変更することができる。さらに、当技術分野において公知の任意の技術を使用して、抗原結合タンパク質を、それらを天然に発現する細胞から精製することができ（例えば、抗体を、それを産生するハイブリドーマから精製することができ）、または組換え発現系において産生させることができる。例えば、Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Kennet et al. (eds.), Plenum Press, New York (1980)；およびAntibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Land (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1988)を参照されたい。
当技術分野で公知のいずれかの発現系を使用して、本開示の組換えポリペプチドを作製することができる。発現系は、上記で包括的に詳述されている。一般に、宿主細胞は、所望のポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組換え発現ベクターで形質転換される。用いられてもよい宿主細胞の中には、原核生物、酵母またはより高等な真核生物の細胞がある。原核生物としては、グラム陰性またはグラム陽性生物、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＢａｃｉｌｌｉが挙げられる。より高等な真核細胞としては、昆虫細胞および哺乳類起源の確立された細胞系が挙げられる。好適な哺乳類宿主細胞系の例としては、サル腎臓細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）（Gluzman et al., 1981, Cell 23:175）のＣＯＳ－７系、Ｌ細胞、２９３細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０）細胞系、およびMcMahan et al., 1991, EMBO J. 10: 2821に記載されるアフリカミドリザルの腎臓細胞系ＣＶＩ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）由来のＣＶＩ／ＥＢＮＡ細胞系が挙げられる。細菌、真菌、酵母、および哺乳類細胞宿主に関して使用するための適切なクローニングベクターおよび発現ベクターは、Pouwels et al.(Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, 1985)に記載されている。
本開示の抗体に、この抗体が結合特異性を保持するのであれば、少なくとも１つのアミノ酸置換があってもよいことは理解される。したがって、抗体構造に対する改変は、本開示の範囲内に包含される。これらの改変は、抗体のＰＤ－１結合能力を壊さない、保存的でもよくまたは非保存的でもよいアミノ酸置換を含み得る。保存的アミノ酸置換は、生物システムにおける合成によるのではなく化学的ペプチド合成により概して組み込まれる、天然に存在しないアミノ酸残基を包含し得る。これらは、アミノ酸部分のペプチド模倣物および他の反転または逆方向形態を含む。保存的アミノ酸置換は、その位置のアミノ酸残基の極性または電荷に影響をほとんどまたは全く与えないような、規範的残基での天然アミノ酸残基の置換も含み得る。
非保存的置換は、１つのクラスのアミノ酸またはアミノ酸模倣体のメンバーの、異なる物理特性（例えば、サイズ、極性、疎水性、荷電）を有する別のクラスに由来するメンバーへの交換にも関与してもよい。このような置換された残基は、非ヒト抗体と相同であるヒト抗体の領域、または分子の非相同領域へと導入されてもよい。
さらに、当業者は、各所望のアミノ酸残基において、単一のアミノ酸置換を含有する試験バリアントを生成することができる。次いで、当業者に公知の活性アッセイを使用して、バリアントをスクリーニングすることができる。このようなバリアントを使用して、好適なバリアントの情報を収集することができる。例えば、特定のアミノ酸残基への変化が、破壊されたか、不必要に低下したか、または好適ではない活性をもたらすことが発見された場合、このような変化を有するバリアントは避けられてもよい。言い換えれば、このような日常的実験から収集された情報に基づき、当業者は、さらなる置換が、単独でまたは他の変異と組み合わせて回避されるべきアミノ酸を容易に決定することができる。
当業者は、周知の技法を使用して、本明細書に示されるポリペプチドの好適なバリアントを決定することができる。ある特定の実施形態では、当業者は、活性に対して重要であると考えられていない領域を標的とすることによって、活性を破壊することなく変化させることができる分子の好適なエリアを同定することができる。ある特定の実施形態では、類似するポリペプチド間で保存される分子の残基および部分を同定することができる。ある特定の実施形態では、生物活性または構造にとって重要であり得るエリアさえも、生物活性を破壊することなく、またはポリペプチド構造に有害な影響を及ぼすことなく、保存的アミノ酸置換に供されてもよい。
さらに、当業者は、活性または構造にとって重要である、類似するポリペプチドにおける残基を同定するための構造－機能研究を精査することができる。このような比較に鑑みて、類似するタンパク質の活性または構造にとって重要であるアミノ酸残基に対応するタンパク質のアミノ酸残基の重要性を予測することができる。当業者は、このような予測される重要なアミノ酸残基に対して化学的に類似するアミノ酸置換を選択してもよい。
当業者は、類似するポリペプチドの三次元構造に関連するその構造およびアミノ酸配列を解析することもできる。このような情報に鑑みて、当業者は、その三次元構造に関して、抗体のアミノ酸残基のアラインメントを予測することができる。ある特定の実施形態では、タンパク質の表面上に存在すると予測されるアミノ酸残基は他の分子との重要な相互作用に関与し得るので、当業者は、このような残基に対して急激な変化が起こらないように選択することができる。
いくつかの科学論文が、二次構造の予測に貢献している。Moult J., Curr. Op. in Biotech., 7(4):422-427(1996)、Chou et al., Biochem., 13(2):222-245(1974)；Chou et al., Biochem., 113(2):211-222(1974)；Chou et al., Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47:45-148(1978)；Chou et al., Ann. Rev. Biochem., 47:251-276およびChou et al., Biophys. J., 26:367-384(1979)を参照されたい。さらに、二次構造の予測を助長するために、コンピュータープログラムが現在利用可能である。二次構造を予測する１つの方法は、相同性モデリングに基づく。例えば、３０％を超える配列同一性、または４０％を超える類似性を有する２つのポリペプチドまたはタンパク質は、類似する構造トポロジーを有することが多い。ポリペプチドまたはタンパク質の構造内での潜在的な数の折り畳みを含む、タンパク質構造データベース（ＰＤＢ）の最近の発展は、二次構造の増強された予測性をもたらしている。Holm et al., Nucl. Acid. Res., 27(1):244-247(1999)を参照されたい。所与のポリペプチドまたはタンパク質には制限された数の折り畳みが存在し、臨界数の構造が一旦解明されると、構造の予測は、劇的により正確になることが示唆されている（Brenner et al., Curr. Op. Struct. Biol., 7(3):369-376(1997)）。
二次構造を予測する追加の方法としては、「スレッディング（ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）」（Jones, D., Curr. Opin. Struct. Biol., 7(3):377-87(1997)；Sippl et al., Structure, 4(1):15-19(1996)）、「プロファイル解析」（Bowie et al., Science, 253:164-170(1991)；Gribskov et al., Meth. Enzym., 183:146-159(1990)；Gribskov et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 84(13):4355-4358(1987)）、および「進化的連結」（Holm、上掲（１９９９）、およびBrenner、上掲（１９９７）を参照）が挙げられる。
ある特定の実施形態では、抗体のバリアントは、グリコシル化部位の数および／または種類が、親ポリペプチドのアミノ酸配列と比較して、変更されているグリコシル化バリアントを含む。ある特定の実施形態では、バリアントは、天然のタンパク質よりも多いかまたは少ない数のＮ連結グリコシル化部位を含む。Ｎ連結グリコシル化部位は、配列：Ａｓｎ－Ｘ－ＳｅｒまたはＡｓｎ－Ｘ－Ｔｈｒによって特徴付けられ、ここで、Ｘとして示されたアミノ酸残基は、プロリン以外の任意のアミノ酸残基であってもよい。この配列を作出するアミノ酸残基の置換によって、Ｎ連結炭水化物鎖の付加のための新たな可能な部位がもたらされる。あるいは、この配列を取り除く置換は、既存のＮ連結炭水化物鎖を除去する。１つまたは複数のＮ連結グリコシル化部位（典型的には、天然に存在するもの）が除外され、１つまたは複数の新たなＮ連結部位が作出されるＮ連結炭水化物鎖の再配列ももたらされる。追加の好ましい抗体バリアントは、１つまたは複数のシステイン残基が、親アミノ酸配列と比較して、欠失しているかまたは別のアミノ酸（例えば、セリン）に置換されているシステインバリアントを含む。システインバリアントは、例えば不溶性封入体の単離後に、抗体が生物学的に活性な立体構造へと再度折り畳まれなければならない場合に有用となり得る。システインバリアントは、一般に、天然のタンパク質よりも少ないシステイン残基を有し、典型的には、対合していないシステインから生じる相互作用を最小化するために偶数を有する。
所望のアミノ酸置換は（保存的であろうと、非保存的であろうと）、当業者によりそのような置換が所望される時点で決定され得る。ある特定の実施形態では、アミノ酸置換は、ＰＤ－１に対する抗体の重要な残基を同定するために使用されることもあり、または本明細書に記載のＰＤ－１に対する抗体の親和性を増加もしくは減少させるために使用されることもある。
ある特定の実施形態によれば、好ましいアミノ酸置換は、（１）タンパク質分解に対する感受性を低下させる、（２）酸化に対する感受性を低下させる、（３）タンパク質複合体を形成するための結合親和性を変更する、（４）結合親和性を変更する、および／または（４）このようなポリペプチドに関する他の生理化学または機能特性を付与もしくは改変するものである。ある特定の実施形態によれば、単一または複数のアミノ酸置換（ある特定の実施形態では、保存的アミノ酸置換）は、天然に存在する配列においてなされてもよい（ある特定の実施形態では、分子間接触を形成するドメイン（複数可）の外側のポリペプチドの部分）。ある特定の実施形態では、保存的アミノ酸置換は、典型的には、親配列の構造的特徴を実質的に変化させなくてもよい（例えば、アミノ酸の置き換えは、親配列に存在するヘリックスを切断するか、または親配列を特徴付ける他のタイプの二次構造を破壊する傾向にあるべきではない）。当技術分野で認識されるポリペプチドの二次および三次構造の例は、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、Proteins, Structures and Molecular Principles(Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York(1984))；Introduction to Protein Structure(C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y.(1991))；およびThornton et al. Nature 354:105(1991)に記載されている。
ある特定の実施形態では、本開示の抗体は、ポリマー、脂質、または他の部分と化学的に結合していてもよい。
結合剤は、生体適合性フレームワーク構造中に組み込まれる、本明細書に記載のＣＤＲの少なくとも１つを含んでもよい。一例では、生体適合性フレームワーク構造は、局在化した表面領域において、抗原（例えば、ＣＤＲ、可変領域など）と結合するアミノ酸のうちの１つまたは複数の配列をディスプレイすることができる、立体構造として安定な構造支持体、またはフレームワーク、または足場を形成するのに十分であるポリペプチドまたはその部分を含む。このような構造は、天然に存在するポリペプチドもしくはポリペプチド「折り畳み」（構造モチーフ）であってもよく、または天然に存在するポリペプチドもしくは折り畳みに対して、アミノ酸の付加、欠失もしくは置換などの１つもしくは複数の改変を有してもよい。これらの足場は、ヒト、他の哺乳動物、他の脊椎動物、無脊椎動物、植物、細菌またはウイルスなどのいずれかの種の（または２種以上の種の）ポリペプチドに由来し得る。
典型的には、生体適合性フレームワーク構造は、免疫グロブリンドメイン以外のタンパク質足場または骨格に基づく。例えば、フィブロネクチン、アンキリン、リポカリン、ネオカルジノスタチン（neocarzinostain）、チトクロムｂ、ＣＰ１ジンクフィンガー、ＰＳＴ１、コイルドコイル、ＬＡＣＩ－Ｄ１、Ｚドメインおよびテンダミスタットドメインに基づくものを使用することができる（例えば、Nygren and Uhlen, 1997, Curr. Opin. In Struct. Biol., 7, 463-469を参照されたい）。
本明細書に記載されるものなどのヒト化抗体は、当業者に公知の技術を使用して産生することができる（Zhang, W., et al., Molecular Immunology.42(12):1445-1451, 2005；Hwang W. et al., Methods. 36(1):35-42, 2005；Dall'Acqua WF, et al., Methods 36(1):43-60, 2005；およびClark, M., Immunology Today. 21(8):397-402, 2000）。
加えて、好適な結合剤が、これらの抗体の部分、例えば、本明細書で具体的に開示されるような、配列番号１００１～１０１１を有するＣＤＲ１－Ｌ１～１１；配列番号２００１～２０１１を有するＣＤＲ２－Ｌ１～１１；配列番号３００１～３０１１を有するＣＤＲ３－Ｌ１～１１；配列番号４００１～４０１１を有するＣＤＲ１－Ｈ１～１１；配列番号５００１～５０１１を有するＣＤＲ２－Ｈ１～１１；および配列番号６００１～６０１１を有するＣＤＲ３－Ｈ１～１１、のうちの１つまたは複数を含むことは、当業者であれば分かる。抗体が非置換ＣＤＲの結合特異性を保持するのであれば、ＣＤＲ領域のうちの領域の少なくとも１つに、ここで提供される配列から少なくとも１つのアミノ酸置換があってもよい。結合剤が、本明細書で開示される抗体のＰＤ－１との結合を交差遮断する、および／またはＰＤ－１を中和する、抗体の非ＣＤＲ部分は、非タンパク質分子であり得る。抗体が、競合結合アッセイにおいて抗体Ａ１～Ａ２８のうちの少なくとも１つにより示される結合パターンと同様のヒトＰＤ－１ペプチドとの結合パターンを示す、および／またはＰＤ－１を中和する、抗体の非ＣＤＲ部分は、非タンパク質分子であり得る。抗体が、組換え結合タンパク質または合成ペプチドであり、組換え結合タンパク質が、本明細書で開示される抗体のＰＤ－１との結合を交差遮断する、および／またはＰＤ－１を中和する、抗体の非ＣＤＲ部分は、アミノ酸で構成され得る。抗体が、組換え抗体であり、組換え抗体が、ヒトＰＤ－１ペプチドエピトープ競合結合アッセイ（下文で説明される）において抗体Ａ１～Ａ２８のうちの少なくとも１つにより示される結合パターンと同様のヒトＰＤ－１ペプチドとの結合パターンを示す、および／またはＰＤ－１を中和する、抗体の非ＣＤＲ部分は、アミノ酸で構成され得る。
抗体は、上記のＣＤＲ１ーＨ、ＣＤＲ２－Ｈ、ＣＤＲ３－Ｈ、ＣＤＲ１－Ｌ、ＣＤＲ２－ＬおよびＣＤＲ３－Ｌのうちの１つまたは複数を含み、抗体は、これらの配列をコードするＤＮＡを含有する宿主細胞からの発現によって得られてもよい。各ＣＤＲ配列をコードするＤＮＡは、ＣＤＲのアミノ酸配列に基づいて決定され、オリゴヌクレオチド合成技法、部位特異的変異誘発およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法を適宜使用して、任意の所望の抗体可変領域フレームワークおよび定常領域ＤＮＡ配列と一緒に合成されてもよい。可変領域フレームワークおよび定常領域をコードするＤＮＡは、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）などの遺伝子配列データベースから、当業者に広く利用可能である。
一旦合成されると、本開示の抗体をコードするＤＮＡまたはその断片は、核酸の切除、ライゲーション、形質転換、およびいくつもの公知の発現ベクターを使用するトランスフェクションのための種々の周知の手順のいずれかに従って、増幅および発現され得る。よって、ある特定の実施形態では、抗体断片の発現は、原核生物宿主、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおいて好ましい場合がある（例えば、Plueckthun et al., 1989 Methods Enzymol. 178:497-515を参照されたい）。ある特定の他の実施形態では、抗体またはその断片の発現は、酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、およびＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）を含む真核生物宿主細胞、動物細胞（哺乳類細胞を含む）または植物細胞において好ましい場合がある。好適な動物細胞の例としては、以下に限定されないが、骨髄腫細胞（マウスＮＳＯ系など）、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、またはハイブリドーマ細胞が挙げられる。植物細胞の例としては、タバコ、トウモロコシ、ダイズ、およびコメの細胞が挙げられる。
抗体の可変および／または定常領域をコードするＤＮＡを含有する１つまたは複数の複製可能な発現ベクターが調製され、適切な細胞系、例えば、非産生骨髄腫細胞系、例えば、抗体の産生が生じるマウスＮＳＯ系または細菌、例えばＥ．ｃｏｌｉを形質転換するために使用され得る。効率的な転写および翻訳を得るために、各ベクターにおけるＤＮＡ配列は、適切な調節配列、特にプロモーターおよび可変ドメイン配列に作動可能に連結されるリーダー配列を含むべきである。このように抗体を産生するための特定の方法は、一般的に周知であり、日常的に使用される。例えば、基礎分子生物学の手順は、Maniatis et al.(Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989；Maniatis et al, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York,(2001)も参照されたい）に記載されている。ＤＮＡ配列決定は、Sanger et al.(PNAS 74:5463,(1977))およびAmersham International plc sequencing handbookに記載されているように実施することができ、部位特異的変異誘発は、当技術分野で公知の方法に従って行うことができる（Kramer et al., Nucleic Acids Res. 12:9441,(1984)；Kunkel Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-92(1985)；Kunkel et al., Methods in Enzymol. 154:367-82(1987）；the Anglian Biotechnology Ltd. handbook）。さらに、多数の刊行物には、ＤＮＡの操作、発現ベクターの作出、ならびに適切な細胞の形質転換および培養による抗体の調製に好適な技法が記載される（Mountain A and Adair, J R in Biotechnology and Genetic Engineering Reviews(ed. Tombs, M P, 10, Chapter 1, 1992, Intercept, Andover, UK)；"Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F.M. Ausubel(ed.), Wiley Interscience, New York）。
本開示による抗体の親和性を改善することが望ましい場合、上述のＣＤＲのうちの１つまたは複数を含有することは、ＣＤＲを維持すること（Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995）、チェーンシャッフリング（Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992）、Ｅ． ｃｏｌｉ．の変異株の使用（Low et al., J. Mol. Biol., 250, 350-368, 1996）、ＤＮＡシャッフリング（Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997）、ファージディスプレイ（Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 7-88, 1996）およびセクシャルＰＣＲ（Crameri, et al., Nature, 391, 288-291, 1998）を含むいくつかの親和性成熟プロトコールによって得ることができる。親和性成熟のこれらの方法の全ては、Vaughan et al.(Nature Biotech., 16, 535-539, 1998)によって議論されている。
抗体などの一部のタンパク質は、種々の翻訳後修飾を受ける場合があることは当業者によって理解される。これらの修飾の種類および程度は、タンパク質を発現するために使用される宿主細胞系および培養条件に応じて変わることが多い。このような修飾は、グリコシル化、メチオニン酸化、ジケトピペリジン形成、アスパラギン酸異性化およびアスパラギンの脱アミド化の変化を含み得る。頻度の高い修飾は、カルボキシペプチダーゼの作用によるカルボキシ末端の塩基性残基（例えば、リシンまたはアルギニン）の損失である（Harris, R.J. Journal of Chromatography 705:129-134, 1995に記載されているように）。
７．９．配列
抗体Ａ１～Ａ２８は、重鎖および軽鎖Ｖ（Ｊ）Ｄポリヌクレオチド（本明細書ではそれぞれＬ１～Ｌ２８およびＨ１～Ｈ２８とも呼ばれる）を含む。抗体Ａ１～Ａ２８は、表５に収載される配列を含む。例えば、抗体Ａ１は、軽鎖Ｌ１（配列番号１）および重鎖Ｈ１（配列番号１０１）を含む。軽鎖（Ｌ１～Ｌ２８）および重鎖（Ｈ１～Ｈ２８）中のＣＤＲ配列も、特異的配列番号とともに提供される。例えば、Ｌ１の３つのＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）は、それぞれ、ＣＤＲ１－Ｌ１（配列番号１００１）、ＣＤＲ２－Ｌ１（配列番号２００１）およびＣＤＲ３－Ｌ１（配列番号３００１）であり、Ｈ１の３つのＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）は、ＣＤＲ１－Ｈ１（配列番号４００１）、ＣＤＲ２－Ｈ１（配列番号５００１）およびＣＤＲ３－Ｈ１（配列番号６００１）である。
Figure 2022516073000006
Figure 2022516073000007
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 ７．１０．医薬組成物
本開示のタンパク質およびポリペプチドを含有する医薬組成物も提供される。このような組成物は、薬学的に許容される材料、および生理学的に許容される製剤材料を含む混合物中に、治療または予防有効量のポリペプチドまたはタンパク質を含む。
医薬組成物は、例えば、組成物のｐＨ、容量オスモル濃度、粘度、透明度、色、等張性、匂い、無菌性、安定性、溶解もしくは放出速度、吸着または浸透を修正、維持または保存するための製剤材料を含有してもよい。
好適な製剤材料としては、以下に限定されないが、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリシンなど）；抗菌剤；酸化防止剤（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素ナトリウムなど）；バッファー（ホウ酸塩、重炭酸塩、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩、他の有機酸など）；増量剤（マンニトールまたはグリシンなど）、キレート剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など）；錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ－シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル－ベータ－シクロデキストリンなど）；充填剤；単糖類；二糖類および他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンなど）；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなど）；着色剤；着香剤および希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）；低分子量ポリペプチド；塩形成対イオン（ナトリウムなど）；防腐剤（塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸または過酸化水素など）；溶媒（グリセリン、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなど）；糖アルコール（マンニトールまたはソルビトールなど）；懸濁化剤；界面活性剤または湿潤剤（プルロニック（登録商標）、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０などのポリソルベート、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサパール（tyloxapal）など）；安定性強化剤（スクロースまたはソルビトール）；等張性強化剤（アルカリ金属ハロゲン化物、好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、マンニトール、ソルビトール）；送達ビヒクル；希釈剤；賦形剤および／または薬学的アジュバントが挙げられる。中性の緩衝食塩水または同種の血清アルブミンと混合した食塩水は、適切な希釈剤の例である。適切な工業標準に従って、ベンジルアルコールなどの防腐剤も添加してもよい。組成物は、希釈剤として適切な賦形剤溶液（例えば、スクロース）を使用して、凍結乾燥物として製剤化されてもよい。好適な構成成分は、用いられる投与量および濃度で、レシピエントに対して非毒性である。医薬製剤において用いることができる構成成分のさらなる例は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Ed.(1980)and 20th Ed.(2000), Mack Publishing Company, Easton, PAに示されている。
必要に応じて、組成物は、１つまたは複数の生理活性薬剤、例えば、抗血管新生物質、化学療法物質（例えば、カペシタビン、５－フルオロウラシル、またはドキソルビシン）、鎮痛物質などをさらに含み、これらの非限定的な例は、本明細書で提供される。様々な特定の実施形態では、組成物は、ＰＤ－１結合タンパク質に加えて、１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つの生理活性薬剤を含む。
本開示の別の実施形態では、本明細書に開示される組成物は、中性または塩の形態で製剤化されてもよい。例示的な薬学的に許容される塩としては、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基により形成される）が挙げられ、これは、例えば、塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などのような有機酸と共に形成される。遊離カルボキシル基と共に形成される塩は、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基に由来してもよい。製剤化されると、液剤は、投与製剤と適合する方式で、治療上有効な量で投与される。
担体は、ありとあらゆる溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、バッファー、担体溶液、懸濁液、コロイドなどをさらに含んでもよい。薬学的に活性な物質に対するこのような媒体および剤の使用は、当技術分野で周知である。いずれかの従来の媒体または剤が有効成分と不適合である場合を除いて、治療組成物におけるその使用が企図される。補足的な有効成分が組成物中に導入されてもよい。語句「薬学的に許容される」は、ヒトに投与された場合に、アレルギー反応や同様の有害反応を生じない分子実体および組成物を指す。
最適な医薬組成物は、例えば、意図される投与経路、送達形式、および所望の投与量に応じて、当業者によって決定される。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences、上掲を参照されたい。このような組成物は、ポリペプチドの物理的状態、安定性、ｉｎ ｖｉｖｏ放出量、およびｉｎ ｖｉｖｏクリアランス量に影響を及ぼし得る。例えば、好適な組成物は、注射用水、非経口投与用の生理学的食塩水溶液であってもよい。
７．１０．１．薬学的有効成分の含量
典型的な実施形態では、有効成分（すなわち、本開示のタンパク質およびポリペプチド）は、少なくとも０．０１ｍｇ／ｍｌ、少なくとも０．１ｍｇ／ｍｌ、少なくとも０．５ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも１ｍｇ／ｍｌの濃度で、医薬組成物中に存在する。ある特定の実施形態では、有効成分は、少なくとも１ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、または２５ｍｇ／ｍｌの濃度で、医薬組成物中に存在する。ある特定の実施形態では、有効成分は、少なくとも３０ｍｇ／ｍｌ、３５ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌ、４５ｍｇ／ｍｌまたは５０ｍｇ／ｍｌの濃度で、医薬組成物中に存在する。
一部の実施形態では、医薬組成物は、本開示のタンパク質またはポリペプチドに加えて、１つまたは複数の追加の活性成分を含む。１つまたは複数の追加の活性成分は、異なるチェックポイント受容体を標的とする薬物、例えば、ＣＴＬＡ－４阻害剤（例えば、抗ＣＴＬＡ－４抗体）またはＴＩＧＩＴ阻害剤（例えば、抗ＴＩＧＩＴ抗体）であり得る。
７．１０．２．一般的な製剤化
医薬組成物は、液体、油、エマルション、ゲル、コロイド、エアロゾルまたは固体を含む、ヒトまたは動物用の薬に適切な任意の形態であってもよい。
医薬組成物は、経腸および非経口投与経路を含む、ヒトまたは動物用の薬に適切な任意の投与経路による投与のために製剤化され得る。
様々な実施形態では、医薬組成物は、吸入による投与のために製剤化される。ある特定のこれらの実施形態では、医薬組成物は、気化器による投与のために製剤化される。ある特定のこれらの実施形態では、医薬組成物は、ネブライザーによる投与のために製剤化される。ある特定のこれらの実施形態では、医薬組成物は、エアロゾライザーによる投与のために製剤化される。
様々な実施形態では、医薬組成物は、経口投与、頬側投与、または舌下投与のために製剤化される。
一部の実施形態では、医薬組成物は、静脈内、筋肉内、または皮下投与のために製剤化される。
一部の実施形態では、医薬組成物は、髄腔内または脳室内投与のために製剤化される。
一部の実施形態では、医薬組成物は、局所投与のために製剤化される。
７．１０．３．注射に適合される医薬組成物
静脈内、皮膚もしくは皮下注射、または病気の部位への注射のために有効成分は、パイロジェンフリーであり、好適なｐＨ、等張性および安定性を有する非経口的に許容される水性溶液の形態である。当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸加リンゲル注射液などの等張性ビヒクルを使用して、好適な液剤を十分に調製することができる。防腐剤、安定化剤、バッファー、酸化防止剤および／または他の添加剤が、必要な場合に含まれ得る。
様々な実施形態では、単位剤形は、バイアル、アンプル、ボトル、または予め充填されたシリンジである。一部の実施形態では、単位剤形は、０．０１ｍｇ、０．１ｍｇ、０．５ｍｇ、１ｍｇ、２．５ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、１２．５ｍｇ、２５ｍｇ、５０ｍｇ、７５ｍｇ、または１００ｍｇの医薬組成物を含有する。一部の実施形態では、単位剤形は、１２５ｍｇ、１５０ｍｇ、１７５ｍｇ、または２００ｍｇの医薬組成物を含有する。一部の実施形態では、単位剤形は、２５０ｍｇの医薬組成物を含有する。
典型的な実施形態では、単位剤形における医薬組成物は、液体形態である。様々な実施形態では、単位剤形は、０．１ｍＬから５０ｍｌの間の医薬組成物を含有する。一部の実施形態では、単位剤形は、１ｍｌ、２．５ｍｌ、５ｍｌ、７．５ｍｌ、１０ｍｌ、２５ｍｌ、または５０ｍｌの医薬組成物を含有する。
特定の実施形態では、単位剤形は、０．０１ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、または１ｍｇ／ｍｌの濃度の医薬組成物１ｍｌを含有するバイアルである。一部の実施形態では、単位剤形は、０．０１ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、または１ｍｇ／ｍｌの濃度の医薬組成物２ｍｌを含有するバイアルである。
一部の実施形態では、単位剤形における医薬組成物は、固体形態、例えば、可溶化に好適な凍結乾燥物である。
皮下、皮内、または筋肉内投与に好適な単位剤形の実施形態は、充填済シリンジ、オートインジェクター、および自動注射ペン（ａｕｔｏｉｎｊｅｃｔ ｐｅｎ）を含み、それぞれ、所定量の本明細書の上記に記載の医薬組成物を含有する。
様々な実施形態では、単位剤形は、シリンジおよび所定量の医薬組成物を含む充填済シリンジである。ある特定の充填済シリンジの実施形態では、シリンジは、皮下投与用に適合させる。ある特定の実施形態では、シリンジは、自己投与に好適である。特定の実施形態では、充填済シリンジは、単回使用シリンジである。
様々な実施形態では、充填済シリンジは、約０．１ｍＬから約０．５ｍＬの医薬組成物を含有する。ある特定の実施形態では、シリンジは、約０．５ｍＬの医薬組成物を含有する。具体的な実施形態では、シリンジは、約１．０ｍＬの医薬組成物を含有する。特定の実施形態では、シリンジは、約２．０ｍＬの医薬組成物を含有する。
ある特定の実施形態では、単位剤形は、自動注射ペンである。自動注射ペンは、本明細書に記載される医薬組成物を含有する自動注射ペンを含む。一部の実施形態では、自動注射ペンは、所定体積の医薬組成物を送達する。他の実施形態では、自動注射ペンは、使用者によってある体積の医薬組成物を送達するように構成される。
様々な実施形態では、自動注射ペンは、約０．１ｍＬから約５．０ｍＬの医薬組成物を含有する。具体的な実施形態では、自動注射ペンは、約０．５ｍＬの医薬組成物を含有する。特定の実施形態では、自動注射ペンは、約１．０ｍＬの医薬組成物を含有する。他の実施形態では、自動注射ペンは、約５．０ｍＬの医薬組成物を含有する。
７．１１．単位剤形
医薬組成物は、便宜的に、単位剤形中に存在してもよい。
単位剤形は、典型的には、医薬組成物の１つまたは複数の具体的な投与経路に対して適する。
様々な実施形態では、単位剤形は、吸入による投与に適する。ある特定のこれらの実施形態では、単位剤形は、気化器による投与に適する。ある特定のこれらの実施形態では、単位剤形は、ネブライザーによる投与に適する。ある特定のこれらの実施形態では、単位剤形は、エアロゾライザーによる投与に適する。
様々な実施形態では、単位剤形は、経口投与、頬側投与、または舌下投与に適する。
一部の実施形態では、単位剤形は、静脈内、筋肉内、または皮下投与に適する。
一部の実施形態では、単位剤形は、髄腔内または脳室内投与に適する。
一部の実施形態では、医薬組成物は、局所投与用に製剤化される。
単一の剤形を生成するために担体材料と組み合わせることができる有効成分の量は、一般的に、治療効果をもたらす化合物の量である。
７．１２．使用方法
無傷ＰＤ－１と特異的に結合する治療用抗体を使用することができる。
ｉｎ ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイは、最適な投与量の範囲を特定するのを助けるために必要に応じて用いることができる。製剤中で用いられる正確な用量は、投与経路、および状態の重篤性に応じても変わり、開業医の判断および各対象の状況に従って決定されるべきである。有効用量は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたは動物モデル試験系に由来する用量応答曲線から推定されてもよい。
オリゴペプチドまたはポリペプチドは、それが、本明細書で提供されるＣＤＲのうちの少なくとも１つと、ならびに／または抗体Ａ１～Ａ２８のうちの少なくとも１つのＰＤ－１との結合を交差遮断するおよび／もしくは抗体Ａ１～Ａ２８のうちの少なくとも１つによるＰＤ－１との結合が交差遮断されるＰＤ－１結合剤のＣＤＲと、ならびに／またはＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１との結合を遮断することができるＰＤ－１結合剤のＣＤＲと、少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有する場合、本開示の範囲内である。
ＰＤ－１結合剤ポリペプチドおよび抗体は、それらが、抗体Ａ１～Ａ２８のうちの少なくとも１つの可変領域と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一のアミノ酸配列を有し、抗体Ａ１～Ａ２８のうちの少なくとも１つのＰＤ－１との結合を交差遮断し、および／もしくは抗体Ａ１～Ａ２８のうちの少なくとも１つによるＰＤ－１との結合が交差遮断される場合、ならびに／またはＰＤ－Ｌ１に対するＰＤ－１の阻害効果を遮断することができる場合、本開示の範囲内である。
本開示による抗体は、ヒトＰＤ－１に対して５×１０－７Ｍ未満のもしくはそれに等しい、１×１０－７Ｍ未満のもしくはそれに等しい、０．５×１０－７Ｍ未満のもしくはそれに等しい、１×１０－８Ｍ未満のもしくはそれに等しい、１×１０－９Ｍ未満のもしくはそれに等しい、１×１０－１０Ｍ未満のもしくはそれに等しい、１×１０－１１Ｍ未満のもしくはそれに等しい、または１×１０－１２Ｍ未満のもしくはそれに等しい結合親和性を有し得る。
抗体または結合パートナーの親和性、および抗体が結合を阻害する程度は、従来の技法、例えば、Scatchard et al.(Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660-672(1949))に記載されるものを使用して、または表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ；ＢＩＡｃｏｒｅ、Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）によって、当業者によって決定され得る。表面プラズモン共鳴では、標的分子を固相に固定し、フローセルに沿って流れる移動相中のリガンドに曝露される。リガンドが、固定化された標的と結合する場合、局所的な屈折率が変化し、ＳＰＲ角度の変化をもたらし、反射光の強度における変化を検出することにより、ＳＰＲ角度の変化をリアルタイムでモニタリングすることができる。ＳＰＲシグナルの変化の速度を分析して、結合反応の会合および解離の相についての見かけの速度定数を得ることができる。これらの値の比率により、見かけの平衡定数（親和性）を得る（例えば、Wolff et al., Cancer Res. 53:2560-65(1993)を参照されたい）。
本開示による抗体は、いずれかの免疫グロブリンクラス、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、またはＩｇＡに属してもよい。本開示による抗体は、動物、例えば、家禽（例えば、ニワトリ）および哺乳動物（以下に限定されないが、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、または他のげっ歯類、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ヒト、または他の霊長類を含む）から得られるかまたはそれに由来する。抗体は、内在化抗体であってもよい。抗体の産生は、一般的に、米国特許出願公開第２００４／０１４６８８８Ａ１号に開示される。
新たなフレームワークおよび／または定常領域への特異的Ａ１～Ａ２８ ＣＤＲの操作を含む、本開示に従って抗体を生成するための上記の方法では、所望の抗体を選択するために適切なアッセイ（すなわち、ＰＤ－１に対する結合親和性を決定するアッセイ；交差遮断アッセイ；Ｂｉａｃｏｒｅに基づく競合結合アッセイ；ｉｎ ｖｉｖｏアッセイ）を利用できる。
７．１２．１．ＰＤ－１阻害剤に応答する疾患を処置する方法
別の態様では、ＰＤ－１阻害剤に応答する疾患を有する対象を処置するための方法が提示される。疾患は、がん、ＡＩＤＳ、アルツハイマー病またはウイルスもしくは細菌感染症であり得る。
用語「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」などは、一般的に、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを意味するために本明細書において使用される。この効果は、疾患、状態、もしくはその症状を完全にもしくは部分的に防止するという点で予防的であってもよい、ならびに／または疾患もしくは状態および／もしくは疾患もしくは状態に起因する、症状などの有害作用に対する部分的または完全な治癒という点で治療的であってもよい。「処置」は、本明細書で使用される場合、哺乳動物、特にヒトの疾患または状態の任意の処置を網羅し：（ａ）疾患もしくは状態に罹りやすい可能性があるが、疾患もしくは状態を有すると未だ診断されていない対象において、疾患もしくは状態が起こるのを防止すること；（ｂ）疾患もしくは状態を阻害すること（例えば、その発症を阻止すること）；または（ｃ）疾患もしくは状態を緩和すること（例えば、疾患または状態を退縮させること、１つまたは複数の症状の改善をもたらすこと）を含む。いずれかの状態の改善は、標準的方法および当技術分野で公知の技法に従って、容易に評価することができる。その疾患について、その方法によって処置される対象の集団は、望ましくない状態または疾患を患っている対象、および状態または疾患の発症のリスクを有する対象を含む。
用語「治療有効用量」または「有効量」によって、それが投与されるものに対して所望の効果をもたらす用量または量を意味する。正確な用量または量は、処置の目的次第であり、公知の技法を使用して、当業者によって確認される（例えば、Lloyd(1999)The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compoundingを参照されたい）。
用語「十分な量」は、所望の効果をもたらすのに十分な量を意味する。
用語「治療有効量」は、疾患の症状を改善するのに有効である量である。治療有効量は、予防を治療とみなすことができるため、「予防有効量」であってもよい。
用語「改善する」は、疾患状態、例えば神経変性疾患状態の処置（その予防、重症度または進行の緩和、寛解、または治癒を含む）におけるいずれかの治療上有益な帰結を指す。
投与される実際の量、ならびに投与速度および時間経過は、処置されるタンパク質凝集疾患の性質および重症度に応じて決まる。処置の処方、例えば、投与量などの決定は、一般開業医および他の医師の責任の範囲内にあり、典型的には、処置される障害、個々の患者の状態、送達部位、投与方法および開業医に公知の他の要因を考慮に入れる。上述の技法およびプロトコールの例は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A.(ed), 1980に見出される。
一部の実施形態では、医薬組成物は、吸入によって、経口的に、頬側投与によって、舌下投与によって、注射によって、または局所投与によって投与される。
一部の実施形態では、医薬組成物は、ニューロンの生存またはドーパミン放出をモジュレートするのに十分な量で投与される。一部の実施形態では、主要なカンナビノイドは、用量当たり１ｇ未満、５００ｍｇ未満、１００ｍｇ未満、１０ｍｇ未満の量で投与される。
一部の実施形態では、医薬組成物は、１日に１回、１日に２～４回、１週間に２～４回、１週間に１回、または２週間ごとに１回投与される。
組成物を単独で、または他の処置と組み合わせて、処置すべき状態に依存して同時にもしくは逐次的にどちらかで、投与することができる。例えば、医薬組成物は、異なるチェックポイント受容体を標的とする１つまたは複数の薬物、例えば、ＣＴＬＡ－４阻害剤（例えば、抗ＣＴＬＡ－４抗体）またはＴＩＧＩＴ阻害剤（例えば、抗ＴＩＧＩＴ抗体）と組み合わせて投与することができる。
８．実施例
以下は、本開示を実行するための特定の実施形態の例である。実施例は、例示目的のみのために提供され、本開示の範囲をいかなるようにも限定することを意図しない。使用される数値（例えば、量、温度など）に関して正確性を確保するための努力がなされているが、幾分かの実験誤差およびばらつきは、当然のことながら許容されるべきである。
本開示の実施は、別段の指示がない限り、当技術分野の技能の範囲内であるタンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技術および薬理学の従来の方法を利用する。そのような技術は、文献で十分に説明されている。例えば、T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993)；A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition)；Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989)；Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.)；Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990)；Carey and Sundberg Advanced Organic Chemistry 3rd Ed.(Plenum Press) Vols A and B(1992)を参照されたい。さらに、その全体が参照により本明細書に組み込まれるAdler et al., A natively paired antibody library yields drug leads with higher sensitivity and specificity than a randomly paired antibody library, MAbs (2018)、およびAdler et al., Rare, high-affinity mouse anti-PD-1 antibodies that function in checkpoint blockade, discovered using microfluidics and molecular genomics, MAbs (2017)で説明されている抗体を生成および選択する方法を、利用することができる。
（実施例１）
８．１．１．実施例１：抗原結合タンパク質の生成
抗原結合タンパク質の生成
マウス免疫および試料調製：
先ず、挿入されたヒト免疫グロブリン遺伝子を保有するトランスジェニックマウスを、ＴｉｔｅｒＭａｘをアジュバントとして使用して配列番号７００１の可溶性ＰＤ－１免疫原（すなわち、Ｈｉｓタグ付きＰＤ－１タンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ））で免疫した。１μｇの免疫原を各踵関節に注射し、３μｇの免疫原を１５日間、３日ごとに腹腔内投与した。１：２００希釈物で開始する各動物の血清の１：２希釈系列を用いて酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）により力価を評価した。採取の前に、２．５μｇ／踵関節の最終静脈内ブーストをアジュバントなしで各動物に投与した。リンパ節（膝窩、鼠径部、腋窩および腸間膜のもの）を屠殺後に外科的に摘出した。手作業で破壊し、その後、７０μｍフィルターに通すことにより、各動物の単一細胞懸濁物を作製した。次に、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）Ｍｏｕｓｅ Ｐａｎ－Ｂ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ネガティブ選択キットを使用して、各試料からＢ細胞を単離した。リンパ節Ｂ細胞集団をＣ－Ｃｈｉｐ血球計数器（Ｉｎｃｙｔｏ）での計数により定量し、トリパンブルーを使用して生存率を評価した。次いで、細胞を、１２％ＯｐｔｉＰｒｅｐ（商標）Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｉｇｍａ）を含有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中、５，０００～６，０００細胞／ｍＬに希釈した。この細胞混合物をマイクロ流体被包に使用した。動物６匹各々からのおおよそ１００万個のＢ細胞をエマルジョン液滴マイクロフルイディクスプラットフォームで泳動させた。
対合した重鎖および軽鎖のライブラリーの生成：
エマルション液滴マイクロフルイディクスのプラットフォームまたはボルテックスエマルションを使用して、天然の重鎖－軽鎖Ｉｇが無傷で対合した、単一細胞のＲＮＡ由来のｓｃＦｖをコードするＤＮＡライブラリーを生成した。ＤＮＡライブラリーを生成する方法を、１）ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡ捕捉、２）多重化オーバーラップ伸長逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＯＥ－ＲＴ－ＰＣＲ）、および３）人工産物を除去して、ディープシークエンシングまたは酵母ディスプレイライブラリーのためにアダプターを付加するためのネステッドＰＣＲに分割した。ｓｃＦｖライブラリーは、陽性ＥＬＩＳＡ力価に達した各動物由来のおよそ１００万個のＢ細胞から作成した。
ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡ捕捉のために、ガラス（Ｄｏｌｏｍｉｔｅ）から製作したカスタムデザインの並行流のエマルション液滴マイクロ流体チップを使用した。マイクロ流体チップは、フルオロカーボンオイル（Ｄｏｌｏｍｉｔｅ）のための２つのインプットチャネル、上記の細胞懸濁物ミックスのための１つのインプットチャネル、および細胞溶解バッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．５、０．５ＭのＮａＣｌ、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、０．５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）－２０、および２０ｍＭのジチオトレイトール）中１．２５ｍｇ／ｍｌのオリゴ－ｄＴビーズ（ＮＥＢ）のための１つのインプットチャネルを有する。インプットチャネルは、チップの長さのほとんどに対しては１５０μｍまで、液滴ジャンクションでは５５μｍまで狭く、５０μｍまでエッチングし、疎水性Ｐｉｃｏ－Ｇｌｉｄｅ（Ｄｏｌｏｍｉｔｅ）でコーティングした。３つのＭｉｔｏｓ Ｐ－Ｐｕｍｐ圧力ポンプ（Ｄｏｌｏｍｉｔｅ）を使用して、液体をチップを通してポンプで送った。液滴サイズは圧力に応じて変わるが、典型的には、約４５ｍｍの直径の液滴が最も安定している。エマルションを冷やした２ｍｌのマイクロ遠心管中に回収し、ｍＲＮＡ捕捉のために４０℃で１５分間インキュベートした。Ｐｉｃｏ－Ｂｒｅａｋ（Ｄｏｌｏｍｉｔｅ）を使用して、ビーズを液滴から抽出した。一部の実施形態では、ボルテックスを使用して、類似する単一細胞分配エマルションを作製した。
マルチプレックスＯＥ－ＲＴ－ＰＣＲには、ガラス製Ｔｅｌｏｓ液滴エマルジョンマイクロ流体チップ（Ｄｏｌｏｍｉｔｅ）を使用した。ｍＲＮＡ結合ビーズをＯＥ－ＲＴ－ＰＣＲミックスに再懸濁させ、鉱物油系界面活性剤ミックス（ＧｉｇａＧｅｎから市販されている）を用いて２７μｍの液滴を生じさせる圧力でマイクロ流体チップに注入した。ＯＥ－ＲＴ－ＰＣＲミックスは、２×ワンステップＲＴ－ＰＣＲバッファー、２．０ｍＭ ＭｇＳＯ４、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ逆転写酵素、およびＰｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、加えて、ＩｇＫ Ｃ領域、ＩｇＧ Ｃ領域および全Ｖ領域に対するプライマーの混合物を含有する（図２）。オーバーラップ領域は、Ｇｌｙ－ＳｅｒリッチｓｃＦｖリンカー配列をコードするＤＮＡ配列である。液滴破壊溶液（droplet breaking solution）（ＧｉｇａＧｅｎから市販されている）を使用して液滴からＤＮＡ断片を回収し、次いで、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製する。一部の実施形態では、ボルテックスを使用して同様のＯＥ－ＲＴ－ＰＣＲエマルジョンを作製した。
ネステッドＰＣＲ（図２）では、最初に、精製したＯＥ－ＲＴ－ＰＣＲ産物を１５０Ｖで８０分間１．７％のアガロースゲルにランした。連結した産物に対応する１２００～１５００塩基対（ｂｐ）のバンドを切り取り、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ）を使用して精製した。次いで、ＰＣＲを実施し、Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシングまたは酵母ディスプレイのためにアダプターを付加した；シークエンシングでは、７つのヌクレオチドのランダマーを付加して、次の次世代シークエンシングステップのベースコールの精度を増加させる。プライマーを含有するＩｌｌｕｍｉｎａアダプターまたは酵母発現ベクター中にクローニングするためのプライマーのいずれかを含む２×ＮＥＢＮｅｘｔ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ増幅ミックス（ＮＥＢ）を用いてネステッドＰＣＲを実施した。ネステッドＰＣＲ産物を１５０Ｖで５０分間１．２％のアガロースゲルにランした。８００～１１００ｂｐのバンドを切り出し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ）を使用して精製した。
一部の実施形態では、ｓｃＦｖライブラリーは自然に対合せず、例えばＢ細胞から単離されたＲＮＡから直接的にｓｃＦｖを増幅させることによってランダムに対合した。
（実施例２）
８．１．２．実施例２：酵母ディスプレイによるＰＤ－１バインダーの単離
ライブラリースクリーニング：
ヒトＩｇＧ１－Ｆｃ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびＰＤ－１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）タンパク質を、ＥＺ－Ｌｉｎｋ Ｍｉｃｒｏ Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ＬＣ－Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してビオチン化した。ビオチン化試薬を再懸濁させて９ｍＭにし、５０倍モル過剰でタンパク質に添加した。反応物を氷上で２時間インキュベートし、次いで、Ｚｅｂａ脱塩カラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してビオチン化試薬を除去した。最終タンパク質濃度をブラッドフォードアッセイで計算した。
次に、６つのＤＮＡライブラリーを酵母において表面ｓｃＦｖとして発現させた。ＧＡＬ１／１０プロモーター、Ａｇａ２細胞壁テザー、およびＣ末端ｃ－Ｍｙｃタグを含有する酵母表面ディスプレイベクター（ｐＹＤ）を構築した。ＧＡＬ１／１０プロモーターは、ガラクトースを含有する培地中でｓｃＦｖタンパク質の発現を誘導する。Ａｇａ２細胞壁テザーは、ｓｃＦｖを酵母細胞表面に往復させ、ｓｃＦｖを細胞外スペースに係留させるために必要とされた。流動選別の間にｃ－Ｍｙｃタグを使用して、インフレームｓｃＦｖタンパク質を発現する酵母細胞を染色した。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞（ＡＴＣＣ）をゲル精製したネステッドＰＣＲ産物と共に電気穿孔し（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＩＩ；０．５４ｋＶ、２５ｕＦ、抵抗を無限大に設定）、ｉｎ ｖｉｖｏでの相同組換えのためのｐＹＤベクターを線状化した。形質転換細胞を拡大させ、ガラクトースで誘導して、酵母ｓｃＦｖディスプレイライブラリーを生成した。
拡大ｓｃＦｖライブラリーからの２００万個の酵母細胞を、抗ｃ－Ｍｙｃ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａ２１２８１）およびＡＦ４８８コンジュゲート二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａ１１０３９）で染色した。ＰＤ－１と結合するｓｃＦｖ発現細胞を選択するために、ビオチン化ＰＤ－１抗原を、一次抗体インキュベーション中に酵母培養物に添加し（最終７ｎＭ）、次いでＰＥ－ストレプトアビジン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色した。酵母細胞を二重陽性細胞（ＡＦ４８８Ｃ／ＰＥＣ）についてＢＤ Ｉｎｆｌｕｘ（Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｓｈａｒｅｄ ＦＡＣＳ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）で流動選別し、次いで、回収したクローンを拡大のためにカナマイシン、ストレプトマイシンおよびペニシリン（Ｔｅｋｎｏｖａ）とともにＳＤ－ＣＡＡプレートに播種した。次いで、拡大された第１ラウンドＦＡＣＳクローンを、同じ容量モル濃度（最終７ｎＭ）の同じ抗原での第２のＦＡＣＳラウンドに供した。最終ＦＡＣＳ選別から回収した酵母からプラスミドミニプレップ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を調製した。テールドエンドＰＣＲを使用して、ディープシークエンシングのためにプラスミドライブラリーにＩｌｌｕｍｉｎａアダプターを付加させた。
典型的なＦＡＣＳドットプロットでは、四分円の右上は、抗原結合とｓｃＦｖ発現の両方について染色される（Ｃ末端ｃ－Ｍｙｃタグで同定される）酵母を含有する。四分円の左下は、抗原についてもｓｃＦｖ発現についても染色されない酵母を含有する。四分円の右下は、ｓｃＦｖを発現するが、抗原に結合しない酵母を含有する。各レパートリーにおけるバインダーの頻度は、抗原およびｓｃＦｖ発現について二重染色される酵母の数をｓｃＦｖを発現する酵母の数で割ることによって推定した。７ｎＭの最終抗原濃度で選別した場合、免疫したマウスから生成されたライブラリーによって、低いパーセンテージのｓｃＦｖバインダー（０．０８％～１．２８％の範囲）しか得られなかった。レパートリーにおけるバインダーの血清中力価と頻度の間に明確な関連はなかった。これらの選別された細胞の拡大後に、７ｎＭの最終抗原濃度で２回目のＦＡＣＳを使用して、スクリーニングの特異性を増加させた。２回目のＦＡＣＳにおけるバインダーの頻度は、通常、１回目のＦＡＣＳよりも実質的に高く、８．３９％～８４．４％の範囲であった。一般的に、１回目の選別でのより低い頻度のバインダーによって、２回目の選別のより頻度の低いバインダーがもたらされた。おそらく、これは、元のレパートリーにおいて、より少ない真のバインダーしか有さない試料に対する、より低いゲーティング特異性によるものである。
ディープレパートリーシークエンシング：
ＰＤ－１結合クローンをライブラリー（「ＰＤ－１結合クローンのライブラリー」）として回収し、ディープレパートリーシークエンシングに供した。ＰＤ－Ｌ１結合クローンのライブラリーは、ＡＴＣＣアカウント番号９７３６１（アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ ２０１１０ ＵＳＡ）の下、２０１８年１１月２０日にブタペスト条約に基づいてＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２５５０９の下で寄託された。ライブラリー内の各クローンは、単一細胞が起源である重鎖配列と軽鎖配列両方の対合可変（Ｖ（Ｄ）Ｊ）領域を含むｓｃＦｖを含有する。ディープレパートリーシークエンシングは、重鎖配列と軽鎖配列両方の全ての対合可変（Ｖ（Ｄ）Ｊ）領域の配列を決定する。酵母ｓｃＦｖライブラリーのシークエンシングから得た重鎖および軽鎖配列の一部を配列番号１～２８および配列番号１０１～１２８で提供する。酵母ｓｃＦｖライブラリーのシークエンシングから得た追加の配列を配列番号８００１～９０４５で提供する。具体的には、それらの可変軽鎖（ＶＬ）配列は、配列番号８００１～８５２２を含む。それらの可変重鎖（ＶＨ）配列は、配列番号８５２３～９０４５を含む。
ディープ抗体シークエンシングライブラリーを、定量的ＰＣＲ Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＫＡＰＡ）を使用して定量し、１７．５ｐＭまで希釈した。製造業者の指示に従って、５００サイクルのＭｉＳｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｖ２を使用して、ライブラリーをＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）でシークエンシングした。重鎖と軽鎖の連結を維持して、高品質の配列リードを得るために、２回の別々の実行でシークエンシングを行った。１回目の実行（「連結型の実行」）では、ｓｃＦｖライブラリーを直接シークエンシングして、軽鎖Ｖ遺伝子およびＣＤＲ３について３４０サイクルのフォワードリード、ならびに重鎖ＣＤＲ３および重鎖Ｖ遺伝子の一部を網羅する１６２サイクルのリバースリードを得た。２回目の実行（「非連結型の実行」）では、ｓｃＦｖライブラリーをＰＣＲに関する鋳型として最初に使用し、重鎖および軽鎖Ｖ遺伝子を別々に増幅させた。次いで、重鎖および軽鎖Ｉｇについて、３４０サイクルのフォワードリードと１６２サイクルのリバースリードを別々に得た。これにより、ＣＤＲ３とＶ遺伝子の一部でオーバーラップするフォワードリードとリバースリードが得られ、ヌクレオチドコールの信頼性が増加する。
ベースコールエラーを除去するために、リードのエラー（Ｅ）の予想数をそのＰｈｒｅｄスコアから計算した。デフォルトにより、Ｅ＞１であるリードを廃棄し、ベースコールエラーの最確数がゼロであるリードを残した。追加のクオリティフィルターとして、シングルトンヌクレオチドリードを廃棄したが、これは、２回またはそれより多い回数見出される配列は正しい確率が高いからである。最後に、連結型および非連結型の実行からのフィルタリング済み配列をマージすることにより、高品質、連結抗体配列を生成した。手短に述べると、非連結型の実行からのフォワードリードとリバースリードを最初にマージした一連のスクリプトをＰｙｔｈｏｎで書き込んだ。ミスマッチを有する一切のフォワード配列－リバース配列対を廃棄した。次に、連結型の実行からのヌクレオチド配列を使用して、非連結型の実行でのマージ配列に対してクエリを実行した。スクリプトから最終的に出力されるものは、Ｉｇ重鎖とＩｇ軽鎖とが自然に対合している、一連の全長、高品質可変（Ｖ（Ｄ）Ｊ）配列である。
リーディングフレームおよびＦＲ／ＣＤＲ接合部を同定するために、十分に精選された免疫グロブリン配列のデータベースを先ず処理して、各ＦＲ／ＣＤＲ接合部についての位置特異的配列行列（ＰＳＳＭ）を生成した。これらのＰＳＳＭを使用して、上記のプロセスを使用して生成したマージヌクレオチド配列の各々についてのＦＲ／ＣＤＲ接合部を同定した。これにより、ヌクレオチド配列の各々についてのタンパク質リーディングフレームを同定した。ＰＳＳＭに対する低い同一性スコアを有するＣＤＲ配列を感嘆符により示す。次いで、Ｐｙｔｈｏｎスクリプトを使用して配列を翻訳した。有効な予測ＣＤＲ３配列を有するリードが必要であったため、例えば、ＶセグメントとＪセグメントとの間のフレームシフトがあるリードを廃棄した。次に、ｓｃＦｖヌクレオチド配列をクエリとして、ならびにＩＭＧＴデータベースからのＶおよびＪ遺伝子配列を参照配列として使用して、ＵＢＬＡＳＴを実行した。最低Ｅ値でのＵＢＬＡＳＴアラインメントを使用して、ＶおよびＪ遺伝子ファミリーを指定し、生殖細胞系列に対する％ＩＤをコンピュータで計算した。
各動物は、合計２８のユニークｓｃＦｖ候補バインダー（軽鎖については配列番号１～２８、重鎖については配列番号１０１～１２８）を含む、０．１％またはそれより高い頻度で存在する３８～５０のユニークｓｃＦｖ配列を、第２のＦＡＣＳ選択後に得た。配列番号［ｎ］の配列を有する軽鎖、および配列番号［１００＋ｎ］の配列を有する重鎖は、単一細胞からの同族対であり、単一のｓｃＦｖを形成する。例えば、配列番号１の軽鎖と配列番号１０１の重鎖とは同族対であり、配列番号１１の軽鎖と配列番号１１１の重鎖とは同族対である、など。
この方法で、２ラウンドのＦＡＣＳによりＰＤ－１結合ｓｃＦｖが富化された。加えて、多くのｓｃＦｖは、免疫マウスからのＢ細胞の最初の集団からのシークエンシングデータでは検出されず、選別前マウスレパートリーに存在したｓｃＦｖの大部分がＦＡＣＳ後には消失していた。したがって、この研究は、免疫マウスのレパートリーに存在する抗体の大部分が、免疫原に対する強力なバインダーでないこと、およびこの方法が、免疫マウスからのＢ細胞の最初の集団からの希少ｎＭ親和性バインダーを富化できることを示唆している。
（実施例３）
８．１．３．実施例３：抗原結合タンパク質の生物学的特性
次いで、選別前ライブラリーに低頻度で存在するが選別後ライブラリーでは高頻度になるｓｃＦｖ配列を、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において全長ｍＡｂとして合成した。これらのｍＡｂは、各動物についての第２ラウンドのＦＡＣＳにおいて２～３番目に存在量が多い配列を含む。加えて、ＳＪＬマウス株とＢａｌｂ／ｃマウス株との間の収束進化を示唆する抗体配列を選択した。
全長ｍＡｂを、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）および／または表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって結合動態について検証し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞アッセイによってチェックポイント阻害について検証した。
標的結合プロファイル：
ＰＤ－１に対する各全長抗体の結合特異性および親和性を、ＢＬＩおよび／またはＳＰＲを使用して決定した。抗ヒトＰＤ－１親和性は、Ａ１～Ａ１１に対してはＳＰＲおよびＡ１２～Ａ２８に対してはＢＬＩを使用した。抗カニクイザルＰＤ－１親和性は、ＢＬＩを使用して測定した。
ＢＬＩでは、Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ９６システム（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用して、Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ（ＡＨＣ）バイオセンサーに抗体をロードした。ロードしたバイオセンサーを、３００ｎＭで開始して１：３で６段階希釈した抗原希釈物に浸漬した。１：１の結合モデルおよびグローバルフィッティングを使用して動態解析を実施した。
ＳＰＲのために、中間密度（＞＞１，０００応答単位）の抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ試薬（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２０４７－０１）を、１００ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ５．５中の１３３ｍＭ ＥＤＣ（Ｓｉｇｍａ）および３３．３ｍＭ Ｓ－ＮＨＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で活性化したＸａｎｔｅｃ ＣＭＤ－５０Ｍチップ（５０ｎｍカルボキシメチルデキストラン、中密度の官能基）に、アミンカップリングさせた。次いで、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２０４７－０１）を、１０ｍＭ酢酸ナトリウム ｐＨ４．５（Ｃａｒｔｅｒｒａ Ｉｎｃ．）中、２５ｍｇ／ｍＬで１０分間、カップリングさせた。次いで、表面を１Ｍエタノールアミン ｐＨ８．５（Ｃａｒｔｅｒｒａ Ｉｎｃ．）で失活させた。ローン（lawn）固定化に使用した泳動用緩衝液は、ＨＢＳ－ＥＰＣ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０、ｐＨ７．４；Ｔｅｋｎｏｖａ）であった。
次いで、センサーチップをアレイ捕捉のための連続フローマイクロスポッター（ＣＦＭ；Ｃａｒｔｅｒｒａ Ｉｎｃ．）に移した。ｍＡｂ上清を１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含むＨＢＳ－ＥＰＣ中に５０倍希釈した（最終濃度３～１０ｍｇ／ｍＬ）。試料を、１回目と２回目のプリントにおいて、それぞれ、１５分と４分の捕捉ステップでそれぞれ２回捕捉し、６５ｍＬ／分の流速を使用して、複数密度を作り出した。ＣＦＭにおける泳動用緩衝液もＨＢＳ－ＥＰＣであった。
次に、動態解析のためにＳＰＲリーダー（ＭＸ－９６システム、Ｉｂｉｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にセンサーチップをロードした。泳動用緩衝液（１．０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含有するＨＢＳ－ＥＰＣ）中、１．９５、７．８、３１．２５、１２５および５００ｎＭの濃度である、４倍希釈系列での５つの漸増濃度で、ＰＤ－１を注入した。ＰＤ－１注入は、非再生動態系列において８ｍＬ／秒で５分であり、解離は１５分であった。この系列の終了時に７５ｍｇ／ｍＬのヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ捕捉抗体の注入を行って、各ｍＡｂの捕捉レベルを検証した。スポット間表面およびブランク注入を減算することにより結合データを二重参照し、Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ｔｏｏｌソフトウェア（Ｃａｒｔｅｒｒａ Ｉｎｃ．）を使用して、ｋａ（オンレート）、ｋｄ（オフレート）およびＫＤ（親和性）について解析した。
細胞表面結合研究のために、安定なＰＤ－１発現Ｆｌｐ－Ｉｎ ＣＨＯ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）細胞を生成し、５０：５０比で混合した。１００万個の細胞を、２００μｌのＭＡＣＳバッファー（０．５％ウシ血清アルブミンと２ｍＭ ＥＤＴＡとを含有するＤＰＢＳ）中の１μｇの抗ＰＤ－１組換え抗体で、３０分間、４℃で染色した。次いで、細胞を抗ヒトＣＤ１３４（ＯＸ４０）－ＡＰＣ［Ｂｅｒ－ＡＣＴ３５］（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ３５０００８）および抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ－ＰＥ［Ｍ１３１０Ｇ０５］（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ４１０７０）抗体で３０分間、４℃で共染色した。抗ヒトＣＤ２７９（ＰＤ－１）－ＦＩＴＣ［ＥＨ１２．２Ｈ７］（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ３２９９０３）抗体をこれらの混合実験の対照として使用し、細胞生存率をＤＡＰＩで評価した。フローサイトメトリー解析をＳｔａｎｆｏｒｄ Ｓｈａｒｅｄ ＦＡＣＳ ＦａｃｉｌｉｔｙにおいてＢＤ Ｉｎｆｌｕｘで行い、ＦｌｏｗＪｏを使用してデータを解析した。
１０～２８０ｎＭの範囲の親和性（ＫＤ）でＰＤ－１と特異的に結合する抗体を同定した。各抗体のＰＤ－１に対する親和性（ＫＤ）を表６に提供する。
非同族対合抗体（例えば、Adler et al., 2018）が、強い親和性および望ましい薬理学的特性を保持することが多いことは、当業者には十分理解され得る。一部の具現形態では、本開示は、表６の他の重鎖もしくは軽鎖配列と非同族対合している重鎖もしくは軽鎖配列、または任意の他の重鎖もしくは軽鎖配列と非同族対合している重鎖または軽鎖配列を表６に記載する。
Figure 2022516073000009
ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞アッセイ：
ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用を遮断する抗体の能力を解析するために、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ Ｂｌｏｃｋａｄｅ Ｂｉｏａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造業者の指示に従って使用した。アッセイの前日に、ＰＤ－Ｌ１ ａＡＰＣ／ＣＨＯ－Ｋ１細胞を９０％ハムＦ－１２／１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）に入れて解凍し、２つの９６ウェルプレートの内側の６０ウェルに蒔いた。細胞を一晩、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。アッセイ当日、抗体を９９％ＲＰＭＩ／１％ＦＢＳで希釈した。ＰＤ－Ｌ１ ａＡＰＣ／ＣＨＯ－Ｋ１細胞が入っているウェルに抗体希釈物を添加し、その後、ＰＤ－１エフェクター細胞（９９％ＲＰＭＩ／１％ＦＢＳに入れて解凍した）を添加した。細胞／抗体混合物を３７℃、５％ＣＯ２で６時間インキュベートし、その後、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ試薬を添加し、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ ｉ３ｘプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して発光を読み取った。［抗体に関するシグナル］／［無抗体に関するシグナル］の比を計算することにより誘導倍率をプロットし、これらのプロットを使用して、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用してＩＣ５０を計算した。社内産生ペムブロリズマブを陽性対照として使用し、無関係の抗原に結合する抗体を陰性対照として使用した。
ＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１との結合は、Ｔ細胞シグナル伝達の阻害をもたらす。したがって、ＰＤ－１に結合してＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用に拮抗する抗体は、この阻害を除去し、その結果、Ｔ細胞を活性化することを可能にする。ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１チェックポイント遮断を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞性の活性化Ｔ細胞核内因子（ＮＦＡＴ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験した。このアッセイでは、抗ＰＤ－１エピトープがＰＤ－Ｌ１結合ドメイン内に入る抗体は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用に拮抗し、その結果、ＮＦＡＴ－ルシフェラーゼレポーターが増加する。ＣＨＯ細胞に発現させたＰＤ－１に結合することができる全長ｍＡｂ候補をアッセイした。各ｍＡｂについてのＩＣ５０値を生成するために、いくつかの濃度に渡って測定を行った。一部の全長ｍＡｂ（ｔＰＤ１．１（Ａ１）、ｔＰＤ１．３（Ａ３）、ｔＰＤ１．４（Ａ４）、ｔＰＤ１．５（Ａ５）、ｔＰＤ１．６（Ａ６）、ｔＰＤ１．１６（Ａ９）、およびｔＰＤ１．１９（Ａ１０））は、表６に要約した通り、チェックポイント遮断において用量依存的に機能的である。７つの抗体のＣＤＲ配列は、下記の表７に要約する通り保存されるため、これらの配列をそれらのコンセンサス配列を使用して得ることができる。
本開示の一部の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、薬理学的には抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）により機能する。本開示の一部の実施形態では、ＡＤＣＣにおいて機能するがチェックポイント遮断において機能しない抗体を用いて、抗ＰＤ－１抗体療法に関する免疫関連毒性を消失させる。
Figure 2022516073000010
Figure 2022516073000011
ヒトＰＤ－１に対する各抗体の親和性を、Ｃａｒｔｅｒｒａ（Ａ１～Ａ１１）またはＦｏｒｔｅＢｉｏ（Ａ１２～Ａ２８）を使用して決定した。オンレート、オフレート、およびＫＤを決定し、表８に示す。
Figure 2022516073000012
Figure 2022516073000013
エピトープビニング：
改変された古典的サンドイッチアプローチにおいてハイスループットアレイＳＰＲを使用して、エピトープビニングを実施した。ＣＭＤ－２００Ｍチップ型を使用した（２００ｎｍのカルボキシメチルデキストラン、Ｘａｎｔｅｃ）以外は、Ｃａｒｔｅｒｒａ ＣＦＭおよびＳＰＲ親和性研究に類似する方法を使用して、センサーチップを官能化し、ｍＡｂを５０ｍｇ／ｍＬでカップリングさせて、より結合能の高い表面を作出した（固定された約３，０００個の反応性単位）。ｍＡｂ上清を、上清中のｍＡｂ濃度に応じて、泳動用緩衝液中で１：１または１：１０で希釈した。
センサーチップをＭＸ－９６機器中に配置し、捕捉したｍＡｂ（「リガンド」）を二価のアミン反応性リンカーであるビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳ３、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して表面に架橋させ、これを水中０．８７ｍＭで１０分間注入した。過剰に活性化したＢＳ３を１Ｍのエタノールアミン（ｐＨ８．５）で中和させた。各ビニングサイクルでは、２５０ｍｇ／ｍＬのヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ ００９－０００－００３）の７分間の注入を使用して、参照表面および標的スポットのいずれかの残存能を遮断した。
次に、２５０ｎＭ ＰＤ－１タンパク質をセンサーチップ上に注入し、その後、希釈ｍＡｂ上清（「分析物」）をまたは陰性対照としてのバッファーブランクを注入した。結果として、分析物ｍＡｂは、それがリガンドｍＡｂと競合しなかった場合にのみ抗原と結合した。各サイクルの終了時に、４部のＰｉｅｒｃｅ ＩｇＧ Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＃２１００４）、１部の５Ｍ ＮａＣｌ（最終０．８３Ｍ）および１．２５部の０．８５％Ｈ３ＰＯ４（最終０．１７％）の溶液を使用して、１分再生注入を行った。ｍＡｂのうちの１８のｍＡｂみが、複数回の再生を通してリガンドとしての活性を維持したため、ビニング解析は、１８×４６の競合行列を含んだ。
次いで、ＳＰＲエピトープデータ解析ソフトウェアパッケージ（Ｃａｒｔｅｒｒａ Ｉｎｃ．）においけるネットワークコミュニティプロットアルゴリズムを使用して、エピトープビンを決定した。クラスタリングアルゴリズムは、分析物データのみが入手可能なクラスターであるｍＡｂを、リガンドデータと分析物データの両方が入手可能であるｍＡｂとは別に分類することに留意されたい。この現象は、不完全競合行列のアーチファクトである。リガンドデータと分析物データの両方を有するｍＡｂは、より多くのｍＡｂ－ｍＡｂ測定値を有し、したがって、より多くのｍＡｂ－ｍＡｂの関連性をもたらし、このことにより、コミュニティプロットのより緊密な関係性が得られた。
エピトープビニングに供した抗体は、３つの異なる群に指定された（表６および図３のＡ、ＢおよびＣ）。
９．参照による組み込み
本出願において引用される全ての刊行物、特許、特許出願および他の文書は、それぞれ個々の刊行物、特許、特許出願または他の文書が全ての目的で参照により本明細書に組み込まれることを個々に示されているのと同程度に、全ての目的で参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
１０．均等物
様々な具体的な実施形態が例示および記載されているが、上記明細書は限定的ではない。本開示の趣旨および範囲を逸脱することなく、様々な変更がなされ得ることが認識される。多くの変更は、本明細書を鑑みて当業者にとって明らかになる。
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Claims (23)

  1. ヒトプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）に特異的に結合する単離された抗原結合タンパク質（ＡＢＰ）であって、
    （ａ）配列番号３００１～３０２８から選択される配列を有するＣＤＲ３－Ｌ、および配列番号６００１～６０２８から選択される配列を有するＣＤＲ３－Ｈ；または
    （ｂ）配列番号１００９２～１０６１４から選択される配列を有するＣＤＲ３－Ｌ、および配列番号１１６６１～１２１８３から選択される配列を有するＣＤＲ３－Ｈ；または
    （ｃ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２５５０９の下で寄託されたライブラリー内のクローンのいずれか１つのＣＤ３－Ｌの配列を有するＣＤＲ３－Ｌ、およびＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２５５０９の下で寄託されたライブラリー内のクローンのいずれか１つのＣＤ３－Ｌの配列を有するＣＤＲ３－Ｌ
    を含む、単離された抗原結合タンパク質（ＡＢＰ）。
  2. 前記ＣＤＲ３－Ｌおよび前記ＣＤＲ３－Ｈが、同族対である、請求項１に記載のＡＢＰ。
  3. （ａ）配列番号１００１～１０２８から選択される配列を有するＣＤＲ１－Ｌ、および配列番号２００１～２０２８から選択される配列を有するＣＤＲ２－Ｌ；および配列番号４００１～４０２８から選択される配列を有するＣＤＲ１－Ｈ；および配列番号５００１～５０２８から選択される配列を有するＣＤＲ２－Ｈ；または
    （ｂ）配列番号９０４６～９５６８から選択される配列を有するＣＤＲ１－Ｌ；および配列番号９５６９～１００９１から選択される配列を有するＣＤＲ２－Ｌ、および配列番号１０６１５～１１１３７から選択される配列を有するＣＤＲ１－Ｈ；および配列番号１１１３８～１１６６０から選択される配列を有するＣＤＲ２－Ｈ；または
    （ｃ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２５５０９の下で寄託されたライブラリー内のクローンのいずれか１つのＣＤＲ１－Ｌから選択される配列を有するＣＤＲ１－Ｌ；およびＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２５５０９の下で寄託されたライブラリー内のクローンのいずれか１つのＣＤＲ２－Ｌから選択される配列を有するＣＤＲ２－Ｌ；およびＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２５５０９の下で寄託されたライブラリー内のクローンのいずれか１つのＣＤＲ１－Ｈから選択される配列を有するＣＤＲ１－Ｈ；およびＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２５５０９の下で寄託されたライブラリー内のクローンのいずれか１つのＣＤＲ２－Ｈから選択される配列を有するＣＤＲ２－Ｈ
    を含む、請求項１に記載のＡＢＰ。
  4. ＣＤＲ１－Ｌ、ＣＤＲ２－Ｌ、ＣＤＲ３－Ｌ、ＣＤＲ１－Ｈ、ＣＤＲ２－ＨおよびＣＤＲ３－Ｈを含み、
    前記ＣＤＲ１－Ｌが、配列番号１００１からなり、前記ＣＤＲ２－Ｌが、配列番号２００１からなり、前記ＣＤＲ３－Ｌが、配列番号３００１からなり、前記ＣＤＲ１－Ｈが、配列番号４００１からなり、前記ＣＤＲ２－Ｈが、配列番号５００１からなり、前記ＣＤＲ３－Ｈが、配列番号６００１からなるか；または
    前記ＣＤＲ１－Ｌが、配列番号１００２からなり、ＣＤＲ２－Ｌが、配列番号２００２からなり、前記ＣＤＲ３－Ｌが、配列番号３００２からなり、前記ＣＤＲ１－Ｈが、配列番号４００２からなり、前記ＣＤＲ２－Ｈが、配列番号５００２からなり、前記ＣＤＲ３－Ｈが、配列番号６００２からなるか；または
    前記ＣＤＲ１－Ｌが、配列番号１００３からなり、前記ＣＤＲ２－Ｌが、配列番号２００３からなり、前記ＣＤＲ３－Ｌが、配列番号３００３からなり、前記ＣＤＲ１－Ｈが、配列番号４００３からなり、前記ＣＤＲ２－Ｈが、配列番号５００３からなり、前記ＣＤＲ３－Ｈが、配列番号６００３からなるか；または
    前記ＣＤＲ１－Ｌが、配列番号１００４からなり、前記ＣＤＲ２－Ｌが、配列番号２００４からなり、前記ＣＤＲ３－Ｌが、配列番号３００４からなり、前記ＣＤＲ１－Ｈが、配列番号４００４からなり、前記ＣＤＲ２－Ｈが、配列番号５００４からなり、前記ＣＤＲ３－Ｈが、配列番号６００４からなるか；または
    前記ＣＤＲ１－Ｌが、配列番号１００５からなり、前記ＣＤＲ２－Ｌが、配列番号２００５からなり、前記ＣＤＲ３－Ｌが、配列番号３００５からなり、前記ＣＤＲ１－Ｈが、配列番号４００５からなり、前記ＣＤＲ２－Ｈが、配列番号５００５からなり、前記ＣＤＲ３－Ｈが、配列番号６００５からなるか；または
    前記ＣＤＲ１－Ｌが、配列番号１００６からなり、前記ＣＤＲ２－Ｌが、配列番号２００６からなり、前記ＣＤＲ３－Ｌが、配列番号３００６からなり、前記ＣＤＲ１－Ｈが、配列番号４００６からなり、前記ＣＤＲ２－Ｈが、配列番号５００６からなり、前記ＣＤＲ３－Ｈが、配列番号６００６からなるか；または
    前記ＣＤＲ１－Ｌが、配列番号１００７からなり、前記ＣＤＲ２－Ｌが、配列番号２００７からなり、前記ＣＤＲ３－Ｌが、配列番号３００７からなり、前記ＣＤＲ１－Ｈが、配列番号４００７からなり、前記ＣＤＲ２－Ｈが、配列番号５００７からなり、前記ＣＤＲ３－Ｈが、配列番号６００７からなるか；または
    前記ＣＤＲ１－Ｌが、配列番号１００８からなり、前記ＣＤＲ２－Ｌが、配列番号２００８からなり、前記ＣＤＲ３－Ｌが、配列番号３００８からなり、前記ＣＤＲ１－Ｈが、配列番号４００８からなり、前記ＣＤＲ２－Ｈが、配列番号５００８からなり、前記ＣＤＲ３－Ｈが、配列番号６００８からなるか；または
    前記ＣＤＲ１－Ｌが、配列番号１００９からなり、前記ＣＤＲ２－Ｌが、配列番号２００９からなり、前記ＣＤＲ３－Ｌが、配列番号３００９からなり、前記ＣＤＲ１－Ｈが、配列番号４００９からなり、前記ＣＤＲ２－Ｈが、配列番号５００９からなり、前記ＣＤＲ３－Ｈが、配列番号６００９からなるか；または
    前記ＣＤＲ１－Ｌが、配列番号１０１０からなり、前記ＣＤＲ２－Ｌが、配列番号２０１０からなり、前記ＣＤＲ３－Ｌが、配列番号３０１０からなり、前記ＣＤＲ１－Ｈが、配列番号４０１０からなり、前記ＣＤＲ２－Ｈが、配列番号５０１０からなり、前記ＣＤＲ３－Ｈが、配列番号６０１０からなるか；または
    前記ＣＤＲ１－Ｌが、配列番号１０１１からなり、前記ＣＤＲ２－Ｌが、配列番号２０１１からなり、前記ＣＤＲ３－Ｌが、配列番号３０１１からなり、前記ＣＤＲ１－Ｈが、配列番号４０１１からなり、前記ＣＤＲ２－Ｈが、配列番号５０１１からなり、前記ＣＤＲ３－Ｈが、配列番号６０１１からなるか；または
    前記ＣＤＲ１－Ｌが、配列番号１０１２からなり、前記ＣＤＲ２－Ｌが、配列番号２０１２からなり、前記ＣＤＲ３－Ｌが、配列番号３０１２からなり、前記ＣＤＲ１－Ｈが、配列番号４０１２からなり、前記ＣＤＲ２－Ｈが、配列番号５０１２からなり、前記ＣＤＲ３－Ｈが、配列番号６０１２からなるか；または
    前記ＣＤＲ１－Ｌが、配列番号１０１３からなり、前記ＣＤＲ２－Ｌが、配列番号２０１３からなり、前記ＣＤＲ３－Ｌが、配列番号３０１３からなり、前記ＣＤＲ１－Ｈが、配列番号４０１３からなり、前記ＣＤＲ２－Ｈが、配列番号５０１３からなり、前記ＣＤＲ３－Ｈが、配列番号６０１３からなるか；または
    前記ＣＤＲ１－Ｌが、配列番号１０１４からなり、前記ＣＤＲ２－Ｌが、配列番号２０１４からなり、前記ＣＤＲ３－Ｌが、配列番号３０１４からなり、前記ＣＤＲ１－Ｈが、配列番号４０１４からなり、前記ＣＤＲ２－Ｈが、配列番号５０１４からなり、前記ＣＤＲ３－Ｈが、配列番号６０１４からなるか；または
    前記ＣＤＲ１－Ｌが、配列番号１０１５からなり、前記ＣＤＲ２－Ｌが、配列番号２０１５からなり、前記ＣＤＲ３－Ｌが、配列番号３０１５からなり、前記ＣＤＲ１－Ｈが、配列番号４０１５からなり、前記ＣＤＲ２－Ｈが、配列番号５０１５からなり、前記ＣＤＲ３－Ｈが、配列番号６０１５からなるか；または
    前記ＣＤＲ１－Ｌが、配列番号１０１６からなり、前記ＣＤＲ２－Ｌが、配列番号２０１６からなり、前記ＣＤＲ３－Ｌが、配列番号３０１６からなり、前記ＣＤＲ１－Ｈが、配列番号４０１６からなり、前記ＣＤＲ２－Ｈが、配列番号５０１６からなり、前記ＣＤＲ３－Ｈが、配列番号６０１６からなるか；または
    前記ＣＤＲ１－Ｌが、配列番号１０１７からなり、前記ＣＤＲ２－Ｌが、配列番号２０１７からなり、前記ＣＤＲ３－Ｌが、配列番号３０１７からなり、前記ＣＤＲ１－Ｈが、配列番号４０１７からなり、前記ＣＤＲ２－Ｈが、配列番号５０１７からなり、前記ＣＤＲ３－Ｈが、配列番号６０１７からなるか；または
    前記ＣＤＲ１－Ｌが、配列番号１０１８からなり、前記ＣＤＲ２－Ｌが、配列番号２０１８からなり、前記ＣＤＲ３－Ｌが、配列番号３０１８からなり、前記ＣＤＲ１－Ｈが、配列番号４０１８からなり、前記ＣＤＲ２－Ｈが、配列番号５０１８からなり、前記ＣＤＲ３－Ｈが、配列番号６０１８からなるか；または
    前記ＣＤＲ１－Ｌが、配列番号１０１９からなり、前記ＣＤＲ２－Ｌが、配列番号２０１９からなり、前記ＣＤＲ３－Ｌが、配列番号３０１９からなり、前記ＣＤＲ１－Ｈが、配列番号４０１９からなり、前記ＣＤＲ２－Ｈが、配列番号５０１９からなり、前記ＣＤＲ３－Ｈが、配列番号６０１９からなるか；または
    前記ＣＤＲ１－Ｌが、配列番号１０２０からなり、前記ＣＤＲ２－Ｌが、配列番号２０２０からなり、前記ＣＤＲ３－Ｌが、配列番号３０２０からなり、前記ＣＤＲ１－Ｈが、配列番号４０２０からなり、前記ＣＤＲ２－Ｈが、配列番号５０２０からなり、前記ＣＤＲ３－Ｈが、配列番号６０２０からなるか；または
    前記ＣＤＲ１－Ｌが、配列番号１０２１からなり、前記ＣＤＲ２－Ｌが、配列番号２０２１からなり、前記ＣＤＲ３－Ｌが、配列番号３０２１からなり、前記ＣＤＲ１－Ｈが、配列番号４０２１からなり、前記ＣＤＲ２－Ｈが、配列番号５０２１からなり、前記ＣＤＲ３－Ｈが、配列番号６０２１からなるか；または
    前記ＣＤＲ１－Ｌが、配列番号１０２２からなり、前記ＣＤＲ２－Ｌが、配列番号２０２２からなり、前記ＣＤＲ３－Ｌが、配列番号３０２２からなり、前記ＣＤＲ１－Ｈが、配列番号４０２２からなり、前記ＣＤＲ２－Ｈが、配列番号５０２２からなり、前記ＣＤＲ３－Ｈが、配列番号６０２２からなるか；または
    前記ＣＤＲ１－Ｌが、配列番号１０２３からなり、前記ＣＤＲ２－Ｌが、配列番号２０２３からなり、前記ＣＤＲ３－Ｌが、配列番号３０２３からなり、前記ＣＤＲ１－Ｈが、配列番号４０２３からなり、前記ＣＤＲ２－Ｈが、配列番号５０２３からなり、前記ＣＤＲ３－Ｈが、配列番号６０２３からなるか；または
    前記ＣＤＲ１－Ｌが、配列番号１０２４からなり、前記ＣＤＲ２－Ｌが、配列番号２０２４からなり、前記ＣＤＲ３－Ｌが、配列番号３０２４からなり、前記ＣＤＲ１－Ｈが、配列番号４０２４からなり、前記ＣＤＲ２－Ｈが、配列番号５０２４からなり、前記ＣＤＲ３－Ｈが、配列番号６０２４からなるか；または
    前記ＣＤＲ１－Ｌが、配列番号１０２５からなり、前記ＣＤＲ２－Ｌが、配列番号２０２５からなり、前記ＣＤＲ３－Ｌが、配列番号３０２５からなり、前記ＣＤＲ１－Ｈが、配列番号４０２５からなり、前記ＣＤＲ２－Ｈが、配列番号５０２５からなり、前記ＣＤＲ３－Ｈが、配列番号６０２５からなるか；または
    前記ＣＤＲ１－Ｌが、配列番号１０２６からなり、前記ＣＤＲ２－Ｌが、配列番号２０２６からなり、前記ＣＤＲ３－Ｌが、配列番号３０２６からなり、前記ＣＤＲ１－Ｈが、配列番号４０２６からなり、前記ＣＤＲ２－Ｈが、配列番号５０２６からなり、前記ＣＤＲ３－Ｈが、配列番号６０２６からなるか；または
    前記ＣＤＲ１－Ｌが、配列番号１０２７からなり、前記ＣＤＲ２－Ｌが、配列番号２０２７からなり、前記ＣＤＲ３－Ｌが、配列番号３０２７からなり、前記ＣＤＲ１－Ｈが、配列番号４０２７からなり、前記ＣＤＲ２－Ｈが、配列番号５０２７からなり、前記ＣＤＲ３－Ｈが、配列番号６０２７からなるか；または
    前記ＣＤＲ１－Ｌが、配列番号１０２８からなり、前記ＣＤＲ２－Ｌが、配列番号２０２８からなり、前記ＣＤＲ３－Ｌが、配列番号３０２８からなり、前記ＣＤＲ１－Ｈが、配列番号４０２８からなり、前記ＣＤＲ２－Ｈが、配列番号５０２８からなり、前記ＣＤＲ３－Ｈが、配列番号６０２８からなる、請求項１に記載のＡＢＰ。
  5. 配列番号１～２８から選択される配列と少なくとも９７％同一の配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）、および配列番号１０１～１２８から選択される配列と少なくとも９７％同一の配列を含む可変重鎖（ＶＨ）；または
    配列番号８０００～８５２２から選択される配列と少なくとも９７％同一の配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）、および配列番号８５２３～９０４５から選択される配列と少なくとも９７％同一の配列を含む可変重鎖（ＶＨ）；または
    ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２５５０９の下で寄託されたライブラリー内のクローンのいずれか１つのＶＬ配列と少なくとも９７％同一の配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）、およびＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２５５０９の下で寄託されたライブラリー内のクローンのいずれか１つのＶＨ配列と少なくとも９７％同一の配列を含む可変重鎖（ＶＨ）
    を含む、請求項１に記載のＡＢＰ。
  6. 前記ＶＬおよび前記ＶＨが、同族対である、請求項５に記載のＡＢＰ。
  7. 配列番号１～２８から選択される配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）、および配列番号１０１～１２８から選択される配列を含む可変重鎖（ＶＨ）；または
    配列番号８０００～８５２２から選択される配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）、および配列番号８５２３～９０４５から選択される配列を含む可変重鎖（ＶＨ）；または
    ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２５５０９の下で寄託されたライブラリー内のクローンのいずれか１つのＶＬ配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）、およびＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２５５０９の下で寄託されたライブラリー内のクローンのいずれか１つのＶＨ配列を含む可変重鎖（ＶＨ）
    を含む、請求項１に記載のＡＢＰ。
  8. 前記ＶＬおよび前記ＶＨが、同族対である、請求項７に記載のＡＢＰ。
  9. ｓｃＦｖまたは全長モノクローナル抗体を含む、請求項１から８のいずれかに記載のＡＢＰ。
  10. 免疫グロブリン定常領域を含む、請求項１から８のいずれかに記載のＡＢＰ。
  11. バイオレイヤー干渉法または表面プラズモン共鳴により測定して、５００ｎＭ未満のＫＤでヒトＰＤ－１に結合する、前記請求項のいずれかに記載のＡＢＰ。
  12. バイオレイヤー干渉法または表面プラズモン共鳴により測定して、２００ｎＭ未満のＫＤでヒトＰＤ－１に結合する、請求項１１に記載のＡＢＰ。
  13. バイオレイヤー干渉法または表面プラズモン共鳴により測定して、２５ｎＭ満のＫＤでヒトＰＤ－１に結合する、請求項１２に記載のＡＢＰ。
  14. ２５ｎＭ未満のＫＤで細胞表面上のヒトＰＤ－１と結合する、請求項１から１３のいずれかに記載のＡＢＰ。
  15. 請求項１から１４のいずれかに記載のＡＢＰと賦形剤とを含む、医薬組成物。
  16. 疾患を処置する方法であって、
    それを必要とする対象に、請求項１から１４のいずれかに記載のＡＢＰまたは請求項１５に記載の医薬組成物の有効量を投与するステップ
    を含む方法。
  17. 前記疾患が、がん、ＡＩＤＳ、アルツハイマー病およびウイルスまたは細菌感染症からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記対象に１つまたは複数の追加の治療剤を投与するステップをさらに含む、請求項１６から１７のいずれかに記載の方法。
  19. 前記追加の治療剤が、ＣＴＬＡ－４阻害剤、ＴＩＧＩＴ阻害剤、化学療法剤、免疫刺激剤、放射線、サイトカイン、サイトカインをコードするポリヌクレオチド、およびこれらの組合せから選択される、請求項１８に記載の方法。
  20. 請求項１から１０のいずれかに記載のＡＢＰをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
  21. 請求項２０に記載の単離されたポリヌクレオチドを含むベクター。
  22. 請求項２０に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは請求項２１に記載のベクターを含む宿主細胞。
  23. ヒトＰＤ－１に特異的に結合する単離された抗原結合タンパク質（ＡＢＰ）を産生する方法であって、
    請求項２２に記載の宿主細胞において前記ＡＢＰを発現させること、および前記ＡＢＰを単離すること
    を含む方法。
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