JP2022514113A - 細胞に形質移入するための組成物及び方法 - Google Patents

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Abstract

本開示は、安全かつ無毒性の核酸形質移入剤として遺伝子治療用途で使用される分枝状ポリマー及びポリプレックスに関する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１０月１２日出願の米国仮出願第６２／７４４，９９４号及び２０１９年０３月２９日出願の米国仮出願第６２／８２６，４６１号の優先権の利益を主張するものであり、当該出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
本開示の分野
本開示の様々な実施形態は、安全かつ無毒性の核酸形質移入剤として、例えば、遺伝子治療用途で使用される、分枝状ポリマーに関する。
導入遺伝子発現を操作するために細胞（例えば、皮膚線維芽細胞）に機能的な遺伝子材料を送達することは、ナノ医療において非常に重要である。多数のポリマー遺伝子送達システムが開発されているにもかかわらず、高度に安全かつ効率的な遺伝子形質移入（例えば、線維芽細胞遺伝子形質移入）はまだ達成されていない。
ほぼ３０年にわたる開発の後、遺伝子治療は、健康状態を改善し遺伝子障害を補正するための急増するナノ医療設備の主要部分となっている。［１］ウイルス遺伝子送達ベクターを用いた複数の臨床試験が行われているが、免疫原性応答及び導入遺伝子挿入による変異誘発のトリガーとなるリスク、遺伝子材料の大規模生産及び低い「カーゴ容量」に関連する制約、ならびにベクター移動性が予測不能である問題は、依然として対処されていない。［２、３］この観点から、非ウイルス遺伝子送達ベクターは、最小限の免疫原性、非腫瘍形成性、費用効果の高い製造、高ペイロードの核酸及び局在化遺伝子発現の可能性があるため、より有望と考えられる。２０１０年以降、非ウイルス遺伝子ベクターを用いた遺伝子治療の臨床試験の件数は著しく増加しており、プラスミドＤＮＡ及び低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、遺伝子補正、治療用タンパク質発現、及び抗原ワクチン接種のために少なくとも４０種のナノ粒子ベース遺伝子治療で製剤化され、２７件の臨床試験で１２種の主要なリポソームシステムが研究され、１３件の臨床試験で７種のポリマーベースシステムが研究されている。［３］ポリマーベース遺伝子治療の臨床試験の中では、市販のカチオン性ポリマーポリエチレンイミン（ＰＥＩ）がいくつかの有望性を示している。しかし、ＰＥＩは非分解性であり、その安全性に関する懸念が深刻な妨げとなっている。［４］よって、ポリマーベース遺伝子治療を臨床応用に近づけるために、ポリマー遺伝子ベクターの遺伝子形質移入効率及び安全性を改善するための多大な努力が払われている。
ポリマー遺伝子送達ベクターの中で、ポリ（β－アミノエステル）（ＰＡＥ）は最も有望な候補の１つのタイプである。ＰＡＥは、最初にＬａｎｇｅｒ及び共同研究者によって設計及び合成され、１ステップのマイケル付加プロセスを通じたアミンとジアクリレートとの共重合によって行われた。［５］骨格上の３級アミン及び末端の１級アミンはカチオン単位として機能して、静電相互作用によってＤＮＡを凝縮してナノ粒子にし、また「プロトンスポンジ効果」を介してエンド／リソソームからのポリプレックス脱出を容易にする。骨格上のエステル結合は、水性条件下で加水分解的に分解して、ポリプレックスを解離し、ＤＮＡを放出し、さらに遺伝子形質移入後の細胞毒性を低減することができる。［６、７］徹底的な構造／特性の最適化後、［８－１０］ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方で好ましい安全性プロファイル及び高い形質移入効率を伴ったＤＮＡ形質移入向けにいくつかのＰＡＥが同定されている。［６、１１、１２］しかし、２０１５年までは、ＰＡＥを用いたほぼ全ての研究において直鎖状構造のポリマーに焦点が当てられていた。分枝状ポリマーは、その３次元（３Ｄ）構造及び複数の末端官能基が、さらなる利点をポリマー遺伝子ベクターにもたらすため、遺伝子形質移入の可能性がより大きいと考えられる。本発明者らは、容易なワンポット「Ａ２＋Ｂ３＋Ｃ２」マイケル付加戦略を介し、高度に分岐したポリ（β－アミノエステル）（ＨＰＡＥ）を開発することに成功した。［１３－１６］広範囲の細胞タイプにわたり、ＨＰＡＥは、対応する直鎖状カウンターパートよりもはるかに高い遺伝子形質移入能力を示し、遺伝子送達におけるより大きな可能性を実証した。ＨＰＡＥの高い遺伝子形質移入能力は、さらに、劣性栄養障害型表皮水疱症（ＲＤＥＢ）皮膚疾患モデルを用いてｉｎ ｖｉｖｏで実証された。ＲＤＥＢは、ＶＩＩ型コラーゲン（Ｃ７）（表皮－皮膚の接着を固定するように機能する係留線維（ＡＦ）の重要な構成要素である）をコードするＣＯＬ７Ａ１遺伝子の変異によって引き起こされる、希少で破壊的な遺伝性機械的水疱症である。［１７］ Ｃ７の欠乏は、皮膚の脆弱性、広範な水疱、及びびらんにつながり、これらは過剰な瘢痕及び稗粒腫形成を伴って治癒する特徴がある［１８］。ＲＤＥＢノックアウトマウスモデル及び移植マウスモデルのいずれにおいても、ＨＰＡＥは、高レベルのＣ７発現及び最大１０週間のＣ７発現回復を媒介しており［１３、１５、１９］、臨床的皮膚遺伝子送達の大きな可能性が強調されている。ＨＰＡＥは、米国特許公開第２０１７／０２１６４５５号でさらに説明されている（あらゆる目的において参照によりその全体が本明細書に援用される）。
線維芽細胞は、皮膚組織の完全性及び皮膚の生物学的機能の維持、細胞微小環境の制御において中心的な役割を果たしており、肥厚性瘢痕、老化／光老化、糖尿病性創傷治癒、がん、及び肥厚性皮膚骨膜症などの複数の皮膚疾患に関連する。線維芽細胞内で遺伝子発現を操作する能力は、機能的ゲノミクス、経路解析、及び生物医学的応用にとって基本的なものである。例えば、初代ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＰＤＦ）は、表現型的にも核型的にも正常なヒト皮膚細胞のアクセス可能な供給源であり、不死化細胞株に比べて、生物学的にｉｎ ｖｉｖｏ適用により適切である。［２０］過去には、ＨＰＤＦは、ＲＤＥＢでのＣ７修復のために皮膚に直接注入された。それでも、ＨＰＤＦの直接皮内注射により、ＲＤＥＢ患者においてＡＦの異常な形態［２１］及び一過性のタンパク質置換［２２］が示されている。これに対し、形質移入による遺伝子操作の後は、線維芽細胞は多様に適応し、より臨床遺伝子治療に適したものになることが想定され得る。ＨＰＤＦのＣ７強化により、再構成されたＡＦの強度及び安定性の改善、投与スケジュールの最適化、ならびにＲＤＥＢの投与頻度の低減に顕著な効果があると考えられる。しかし、線維芽細胞の非ウイルス遺伝子形質移入は常に困難なものであった。最も一般的な方法としては、高費用のエレクトロポレーション、マグネトフェクション、及び比較的効率が低く毒性の化学製剤が挙げられる。［２０、２３、２４］例えば、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）送達効率は、異なるエレクトロポレーションシステムにより、ヒト皮膚線維芽細胞［２５］では２７％、ヒト初代線維芽細胞［２６］では４４％が検出されるにとどまった。有力な陽イオン性脂質試薬ＴｒａｎｓＦｅｃｔｉｎ、リポフェクタミンＬＴＸ、及びエレクトロポレーションにおいて、マウス胎児線維芽細胞における最大形質移入効率は、それぞれ１５．７％、１１．８％、及び４８．１％であった［２４］。
そのため、高い効率及び安全性で線維芽細胞に形質移入するための信頼できる非ウイルス遺伝子送達システムの開発は必須であり、非常に重要である。
いくつかの実施形態において、本開示は、遺伝子形質移入療法に有用なポリプレックスを形成するのに適した分枝状ポリマーであって、以下のプロセス：
（ａ）式（Ａ）の化合物
Figure 2022514113000002
 を、式Ｒ１－ＮＨ２またはＲ１－Ｎ（Ｈ）－Ｚ’－Ｎ（Ｈ）－Ｒ１を有する第１のアミンと反応させることと、
（ｂ）ステップ（ａ）の生成物を、式Ｒ２－ＮＨ２またはＲ２－Ｎ（Ｈ）－Ｚ’’－Ｎ（Ｈ）－Ｒ２を有する第２のアミンと反応させることと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の生成物を式（Ｂ）の化合物と反応させることとによって作製され、
Figure 2022514113000003
 式中、
各Ｊが、独立的に、－Ｏ－または－ＮＨ－であり、
Ｚ、Ｚ’、及びＺ’’が結合部分であり、
Ａが、１～３０個の炭素原子の直鎖状もしくは分枝状炭素鎖、２～３０個の原子の直鎖状もしくは分枝状ヘテロ原子含有炭素鎖、３～３０個の炭素原子を含む炭素環、または３～３０個の原子を含む複素環であり、
Ａが、任意選択で、１つ以上のハロゲン、ヒドロキシル、アミノ基、スルホニル基、スルホンアミド基、チオール、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ、Ｃ１－Ｃ６エーテル、Ｃ１－Ｃ６チオエーテル、Ｃ１－Ｃ６スルホン、Ｃ１－Ｃ６スルホキシド、Ｃ１－Ｃ６１級アミド、Ｃ１－Ｃ６２級アミド、ハロＣ１－Ｃ６アルキル、カルボキシル基、シアノ基、ニトロ基、ニトロソ基、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ３－Ｃ６シクロアルキル、Ｃ３－Ｃ６ヘテロシクリル、Ｃ２－Ｃ５ヘテロアリール、またはＣ６－Ｃ１０アリールで置換され（式中、各Ｒ’は、独立的に、水素及びＣ１－Ｃ６アルキルからなる群より選択される）、
Ｇが、－Ｃ－、－Ｓ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｐ（ＯＲ１）－、または－Ｐ（ＯＨ）－であり、
各Ｑが、Ｃ１－Ｃ１０直鎖状もしくは分枝状アルキル基であり、
各Ｅ１が、独立的に、共有結合、－Ｎ－、－Ｏ－、－Ｓ－、アルキレン、ヘテロアルキレン、アルケニル、ヘテロアルケニレン、アルキニル、ヘテロアルキニレンからなる群より選択され；
Ｒ１及びＲ２が、各々独立的に、Ｃ１－Ｃ４０アルキル、Ｃ１－Ｃ４０ヘテロアルキル、Ｃ２－Ｃ４０アルケニル、Ｃ２－Ｃ４０ヘテロアルケニレン、Ｃ４－Ｃ８シクロアルケニル、Ｃ２－Ｃ４０アルキニル、Ｃ２－Ｃ４０ヘテロアルキニレン、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリールであり、このとき、当該ヘテロシクリル及びヘテロアリールが、Ｎ、Ｓ、Ｐ、及びＯからなる群より選択される１～５個のヘテロ原子を含み、当該Ｃ１－Ｃ４０アルキル、Ｃ２－Ｃ４０アルケニル、Ｃ４－Ｃ８シクロアルケニル、Ｃ２－Ｃ４０アルキニル、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、及びヘテロアリールが、任意選択で、Ｄ、ハロゲン、Ｃ１－Ｃ６アルキル、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、または－Ｎ（Ｃ１－Ｃ６アルキル）２で置換され、Ｒ１は、非置換であるか、またはハロゲン、ヒドロキシル、アミノ基、スルホニル基、スルホンアミド基、チオール、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ、Ｃ１－Ｃ６エーテル、Ｃ１－Ｃ６チオエーテル、Ｃ１－Ｃ６スルホン、Ｃ１－Ｃ６スルホキシド、Ｃ１－Ｃ６１級アミド、Ｃ１－Ｃ６２級アミド、ハロＣ１－Ｃ６アルキル、カルボキシル基、シアノ基、ニトロ基、ニトロソ基、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ３－Ｃ６シクロアルキル、Ｃ３－Ｃ６ヘテロシクリル、Ｃ２－Ｃ５ヘテロアリール、及びＣ６－Ｃ１０）アリールのうちの１つ以上で置換され（式中、各Ｒ’は、独立的に、水素及びＣ１－Ｃ６アルキルからなる群より選択される）、
各ｎが少なくとも１である、分枝状ポリマーを提供する。
いくつかの実施形態において、本開示は、ポリマーを作製する方法であって、
（ａ）式（Ａ）の化合物
Figure 2022514113000004
 を、式Ｒ１－ＮＨ２またはＲ１－Ｎ（Ｈ）－Ｚ’－Ｎ（Ｈ）－Ｒ１を有する第１のアミンと反応させることと、
（ｂ）（ａ）の生成物を、式Ｒ２－ＮＨ２またはＲ１－Ｎ（Ｈ）－Ｚ’’－Ｎ（Ｈ）－Ｒ２を有する第２のアミンと反応させることと、
（ｃ）（ｂ）の生成物を式（Ｂ）の化合物と反応させることとを含み、
Figure 2022514113000005
 式中、
各Ｊが、独立的に、－Ｏ－または－ＮＨ－であり、
Ｚ、Ｚ’、及びＺ’’が結合部分であり、
Ａが、１～３０個の炭素原子の直鎖状もしくは分枝状炭素鎖、２～３０個の原子の直鎖状もしくは分枝状ヘテロ原子含有炭素鎖、３～３０個の炭素原子を含む炭素環、または３～３０個の原子を含む複素環であり、
Ａが、任意選択で、１つ以上のハロゲン、ヒドロキシル、アミノ基、スルホニル基、スルホンアミド基、チオール、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ、Ｃ１－Ｃ６エーテル、Ｃ１－Ｃ６チオエーテル、Ｃ１－Ｃ６スルホン、Ｃ１－Ｃ６スルホキシド、Ｃ１－Ｃ６１級アミド、Ｃ１－Ｃ６２級アミド、ハロＣ１－Ｃ６アルキル、カルボキシル基、シアノ基、ニトロ基、ニトロソ基、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ３－Ｃ６シクロアルキル、Ｃ３－Ｃ６ヘテロシクリル、Ｃ２－Ｃ５ヘテロアリール、またはＣ６－Ｃ１０アリールで置換され（式中、各Ｒ’は、独立的に、水素及びＣ１－Ｃ６アルキルからなる群より選択される）、
Ｇが、－Ｃ－、－Ｓ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｐ（ＯＲ１）－、または－Ｐ（ＯＨ）－であり、
各Ｑが、ＨまたはＣ１－Ｃ１０直鎖状もしくは分枝状アルキル基であり、
各Ｅ１が、独立的に、共有結合、－Ｎ－、－Ｏ－、－Ｓ－、アルキレン、ヘテロアルキレン、アルケニル、ヘテロアルケニレン、アルキニル、ヘテロアルキニレンからなる群より選択され；
Ｒ１及びＲ２が、各々独立的に、Ｃ１－Ｃ４０アルキル、Ｃ１－Ｃ４０ヘテロアルキル、Ｃ２－Ｃ４０アルケニル、Ｃ２－Ｃ４０ヘテロアルケニレン、Ｃ４－Ｃ８シクロアルケニル、Ｃ２－Ｃ４０アルキニル、Ｃ２－Ｃ４０ヘテロアルキニレン、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリールであり、このとき、当該ヘテロシクリル及びヘテロアリールが、Ｎ、Ｓ、Ｐ、及びＯからなる群より選択される１～５個のヘテロ原子を含み、当該Ｃ１－Ｃ４０アルキル、Ｃ２－Ｃ４０アルケニル、Ｃ４－Ｃ８シクロアルケニル、Ｃ２－Ｃ４０アルキニル、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、及びヘテロアリールが、任意選択で、Ｄ、ハロゲン、Ｃ１－Ｃ６アルキル、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、または－Ｎ（Ｃ１－Ｃ６アルキル）２で置換され、Ｒ１は、非置換であるか、またはハロゲン、ヒドロキシル、アミノ基、スルホニル基、スルホンアミド基、チオール、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ、Ｃ１－Ｃ６エーテル、Ｃ１－Ｃ６チオエーテル、Ｃ１－Ｃ６スルホン、Ｃ１－Ｃ６スルホキシド、Ｃ１－Ｃ６１級アミド、Ｃ１－Ｃ６２級アミド、ハロＣ１－Ｃ６アルキル、カルボキシル基、シアノ基、ニトロ基、ニトロソ基、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ３－Ｃ６シクロアルキル、Ｃ３－Ｃ６ヘテロシクリル、Ｃ２－Ｃ５ヘテロアリール、及びＣ６－Ｃ１０）アリールのうちの１つ以上で置換され（式中、各Ｒ’は、独立的に、水素及びＣ１－Ｃ６アルキルからなる群より選択される）、
各ｎが少なくとも１である、方法を提供する。
いくつかの実施形態において、本開示は、核酸成分と、本明細書で説明される方法によって調製されたポリマー、または式（Ｉ）
Figure 2022514113000006
 を含むポリマーとを含む、ポリプレックスであって、式中、
各Ａが、独立的に、１～３０個の炭素原子の直鎖状もしくは分枝状炭素鎖、１～３０個の原子の直鎖状もしくは分枝状ヘテロ原子含有炭素鎖、３～３０個の炭素原子を含む炭素環、または３～３０個の原子を含む複素環であり、
Ａが、任意選択で、１つ以上のハロゲン、ヒドロキシル、アミノ基、スルホニル基、スルホンアミド基、チオール、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ、Ｃ１－Ｃ６エーテル、Ｃ１－Ｃ６チオエーテル、Ｃ１－Ｃ６スルホン、Ｃ１－Ｃ６スルホキシド、Ｃ１－Ｃ６１級アミド、Ｃ１－Ｃ６２級アミド、ハロＣ１－Ｃ６アルキル、カルボキシル基、シアノ基、ニトロ基、ニトロソ基、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ３－Ｃ６シクロアルキル、Ｃ３－Ｃ６ヘテロシクリル、Ｃ２－Ｃ５ヘテロアリール、またはＣ６－Ｃ１０アリールで置換され（式中、各Ｒ’は、独立的に、水素及びＣ１－Ｃ６アルキルからなる群より選択される）、
各Ｂが、独立的に、第１の結合部分であり、
各Ｘが、独立的に、
Figure 2022514113000007
 であり、
各Ｙが、独立的に、
Figure 2022514113000008
 であり、
各Ｌが、独立的に、第２の結合部分であり、
各Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３が、各出現において独立的に、Ｈ、Ｃ１－Ｃ４０アルキル、Ｃ１－Ｃ４０ヘテロアルキル、Ｃ２－Ｃ４０アルケニル、Ｃ２－Ｃ４０ヘテロアルケニレン、Ｃ４－Ｃ８シクロアルケニル、Ｃ２－Ｃ４０アルキニル、Ｃ２－Ｃ４０ヘテロアルキニレン、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、もしくはヘテロアリールであり、当該ヘテロシクリル及びヘテロアリールが、Ｎ、Ｓ、Ｐ、及びＯからなる群より選択される１～５個のヘテロ原子を含み、当該Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ８アルケニル、Ｃ４－Ｃ８シクロアルケニル、Ｃ２－Ｃ６アルキニル、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、及びヘテロアリールが、任意選択で、Ｄ、ハロゲン、Ｃ１－Ｃ６アルキル、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、もしくは－Ｎ（Ｃ１－Ｃ６アルキル）２で置換され、または
Ｒ２及びＲ３が、それらが結合する原子と一緒になって、Ｎ、Ｓ、Ｐ、及びＯからなる群より選択される１～３個のヘテロ原子を含むヘテロシクリルまたはヘテロアリールを形成してもよく、
ａが１～１０００であり、
ｂが１～４であり、
ｃが１～３であり、
ｚが１～１００であり、
ただし、Ｒ２及びＲ３の少なくとも一方がＨではないことを前提とする、ポリプレックスを提供する。
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示のある特定の実施形態に従うポリプレックスの有効量と、医薬的に許容される担体との組合せを含む、医薬組成物を提供する。
いくつかの実施形態において、本開示は、細胞形質移入の方法であって、標的細胞に１つ以上のポリプレックスを形質移入するのに適した条件下で、１つ以上の標的細胞を、本開示のある特定の実施形態に従う少なくとも１つのポリプレックスを含む医薬組成物に接触させることを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態において、本開示は、疾患の治療を必要とする患者における当該疾患を治療する方法であって、患者の細胞のうちの１つ以上にポリプレックス核酸成分が形質移入されるように、本開示のある特定の実施形態に従う少なくとも１つのポリプレックスを含む医薬組成物の治療有効量を投与することを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態において、本開示は、疾患の治療を必要とする患者における当該疾患を治療する方法であって、本開示のある特定の実施形態に従う少なくとも１つのポリプレックスを含む医薬組成物の治療有効量を投与することを含み、当該組成物の投与が、対象における標的遺伝子の不完全な翻訳を補正する、方法を提供する。
形質移入効率及び細胞生存率の評価を示している。ａは、一連のｗ／ｗ比におけるＬＢＰＡＥ／ＤＮＡ、ＰＥＩ／ＤＮＡ、及びＳｕｐｅｒＦｅｃｔ／ＤＮＡポリプレックスによる形質移入から４８時間後のＨＰＤＦのＧｌｕｃ活性及び細胞生存率を示している。ｂは、３Ｔ３のＧｌｕｃ活性及び細胞生存率を示している。Ｇｌｕｃ活性における＊ＰＥＩ及び＃ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ群からの有意差（ｐ＜０．０５、スチューデントの両側ｔ検定）。 ＨＰＤＦ及び３Ｔ３におけるＬＢＰＡＥ／ＤＮＡポリプレックス及びＳｕｐｅｒＦｅｃｔ／ＤＮＡポリプレックスのＬＣ５０評価を示している。ａは、未処置細胞または５５５μｇ／ｍＬ－１の濃度のＬＢＰＡＥ／ＤＮＡポリプレックスまたは３５μｇ／ｍＬ－１の濃度のＳｕｐｅｒＦｅｃｔ／ＤＮＡポリプレックスにより形質移入した細胞の代表的な生／死画像を示している。スケールバーは５０μｍである。ｂは、アラマーブルーアッセイによって測定されたＬＢＰＡＥ／ＤＮＡポリプレックス濃度依存的な細胞生存率を示している。ｃは、アラマーブルーアッセイによって測定されたＳｕｐｅｒＦｅｃｔ／ＤＮＡポリプレックス濃度依存的な細胞生存率を示している。 異なる遺伝子送達系によって媒介されるＧＦＰ発現及びＭＦＩの比較を示している。ａは、ＬＢＰＡＥ／ＤＮＡ、ＰＥＩ／ＤＮＡ、及びＳｕｐｅｒＦｅｃｔ／ＤＮＡポリプレックスで処理した後のＨＰＤＦ細胞のＧＦＰ画像を示している。未処置（ＵＴ）細胞を陰性対照として使用した。スケールバーは２００μｍ。ｂは、異なるポリプレックスを形質移入した後のＨＰＤＦ集団のヒストグラム分布を示している。ｃは、形質移入後の細胞のＧＦＰ陽性ＨＰＤＦのパーセンテージ及びＭＦＩを示している。ｄは、３Ｔ３のＧＦＰ画像を示している。スケールバーは２００μｍ。ｅは、異なるポリプレックスを形質移入した後の３Ｔ３集団のヒストグラム分布を示している。ｆは、形質移入後のＧＦＰ陽性３Ｔ３のパーセンテージ及び細胞のＭＦＩを示している。ＧＦＰ陽性細胞の＊パーセンテージ及び＃ＭＦＩにおける市販試薬群との有意差（ｐ＜０．０５、スチューデントの両側ｔ検定）。 ＬＢＰＡＥ／ポリプレックスの物理化学的特性を示している。ａは、アガロースゲル電気泳動によるＤＮＡ凝縮能力定量を示している。ｂは、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイによるＤＮＡ結合親和性測定値を示している。ｃは、ポリプレックスサイズ及びゼータ電位測定値を示している。ｄは、ＴＥＭによるポリプレックス形態観測を示している。スケールバーは２００ｎＭ。 多様なポリプレックスの細胞取込みを示している。ａは、異なるポリプレックスによる形質移入から４時間後の細胞の蛍光画像を示している。核はＤＡＰＩ（青）で染色し、ＤＮＡはＣｙ３（赤）で標識した。スケールバーは２０μｍ。ｂは、フローサイトメトリーで定量化されたＨＰＤＦにおけるポリプレックス取込み効率を示している。ｃは、フローサイトメトリーで定量化された３Ｔ３におけるポリプレックス取込み効率を示している。ｄは、Ｃｙ３陽性ＨＰＤＦのパーセンテージ及び細胞の正規化ＭＦＩを示している。ｅは、Ｃｙ３陽性３Ｔ３のパーセンテージ及び細胞の正規化ＭＦＩを示している。＊ＭＦＩ定量におけるＳｕｐｅｒＦｅｃｔとの有意差（ｐ＜０．０５、スチューデントの両側ｔ検定）。 ＬＢＰＡＥのプロトン緩衝能、分解、及びＤＮＡ放出評価を示している。ａは、酸－塩基滴定によって定量されるプロトン緩衝能を示している。ｂは、ＧＰＣを用いて定量された分解プロファイルを示している。ｃは、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイで評価したポリプレックスからのＤＮＡ放出の評価を示している。 ＨＰＤＦにおけるＣ７発現の免疫蛍光染色を示している。ａは、ＬＢＰＡＥ／ＭＣＣ７ポリプレックスによる形質移入から４日後のＨＰＤＦの蛍光画像を示している。核をＤＡＰＩ（青）で染色し、Ｃ７をモノクローナル抗コラーゲンＶＩＩ一次抗体と共にインキュベートし、Ａｌｅｘａ－５６８ヤギ抗マウス二次抗体（赤）で染色した。スケールバーは２０μｍ。ｂは、ＨＰＤＦのＣ７発現のフローサイトメトリー定量化を示している。ｃは、ＬＢＰＡＥ／ＭＣＣ７及びＳｕｐｅｒＦｅｃｔ／ＤＮＡポリプレックスによる形質移入後におけるＣ７発現の上方制御の程度及びＨＰＤＦのＭＦＩを示している。Ｃ７上方制御の＊パーセンテージ及び＃ＭＦＩにおけるＳｕｐｅｒＦｅｃｔとの有意差（ｐ＜０．０５、スチューデントの両側ｔ検定）。 直鎖状オリゴマーの組合せ戦略を通じたＬＢＰＡＥの合成の概略図である。ステップ１では、Ａ２型アミンは、Ｃ２型ジアクリレートと反応して、直鎖状Ａ２－Ｃ２塩基オリゴマーを形成し、これはさらに、第２のアミンによってエンドキャップされて、直鎖状Ａ２－Ｃ２オリゴマーを生成する。ステップ２では、直鎖状Ａ２－Ｃ２オリゴマーを分岐によってＢ３型トリアクリレートと合わせてＬＢＰＡＥを得る。四角の枠は、本作業でＬＢＰＡＥの合成に使用したモノマー及びエンドキャップ剤を示している。 直鎖状オリゴマー及びＬＢＰＡＥのＧＰＣ結果を示している。 ＭＨアルファ曲線及びＬＢＰＡＥの値を示している。 １Ｈ ＮＭＲによるＬＢＰＡＥの化学組成解析を示している。 ＭＣＣ７及びｐｃＤＮＡ３．１ＣＯＬ７Ａ１のアガロースゲル結果を示している。 ａは、「Ａ２＋Ｂ３＋Ｃ２」マイケル付加戦略を介したＨＰＡＥ合成を示している。ｂは、本開示のＨＰＡＥのＧＰＣ曲線及びＭｗ計算値を示している。ｃは、本開示のＨＰＡＥのＭＨアルファ曲線及び計算値を示している。（図１３及び１６～１９は、「ＨＣ３２－１２２」を使用して本開示のＨＰＡＥポリマーを定義している。ＨＣ３２－１２２は、実施例で使用するＨＣ３２－ＤＡＴＯＵに相当する。） １０：１、３０：１、及び５０：１（重量％／重量％）のＨＰＡＥ／ＤＮＡ比を用いて、１１ｋＤａ、２１ｋＤａ、３４ｋＤａ、及び４１ｋＤａのＭＷを有するＨＰＡＥを含むポリプレックスを用いたＲＤＥＢケラチノサイトの形質移入を示している。 １０：１、３０：１、及び５０：１（重量％／重量％）のポリマー／ＤＮＡ比を用いて、１１ｋＤａ、２１ｋＤａ、３４ｋＤａ、及び４１ｋＤａのＭＷを有するＨＰＡＥを含むポリプレックスを用いたＲＤＥＢケラチノサイトの遺伝子形質移入後の細胞ＤＮＡを示している。 ＨＰＡＥ／ＤＮＡポリプレックスを用いたＲＤＥＢＫ細胞におけるレポーター遺伝子形質移入試験を示している。ａは、ＨＰＡＥ／ＤＮＡ及びＰＥＩ／ＤＮＡポリプレックスによる形質移入から４８時間後のＲＤＥＢＫ細胞の相対的Ｇｌｕｃ活性を示している。データは、ＨＰＡＥ／ＤＮＡポリプレックス（３０：１ｗｔ％／ｗｔ％）を形質移入したＲＤＥＢＫ細胞のＧｌｕｃ活性を基準に正規化したパーセンテージとして提示する。＊ＨＰＡＥ群（ｗ／ｗ＝３０：１）との有意差（ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定）。ｂは、ＨＰＡＥ／ＤＮＡ及びＰＥＩ／ＤＮＡポリプレックスによる形質移入後のＲＤＥＢＫ細胞の生存率を示しており、ｃは、未処置（ＵＴ）細胞、ＨＰＡＥ／ＤＮＡ（ｗ／ｗ＝３０：１）またはＰＥＩ／ＤＮＡ（ｗ／ｗ＝１：１）ポリプレックスで処置した細胞のＧＦＰ画像を示している。スケールバーは２００μｍ。ｄは、ＵＴ及び形質移入した細胞集団の代表的なヒストグラム分布を示しており、ｅは、フローサイトメトリーで定量したＧＦＰ陽性ＲＤＥＢＫ細胞及びＭＦＩのパーセンテージを示している。ＧＦＰ陽性細胞の＊パーセンテージ及び＃細胞ＭＦＩにおけるＰＥＩとの有意差（ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定）。 ＨＰＡＥ／ＭＣＣ７ポリプレックスのＭＣＣ７生合成及び細胞取込みを示している。ａは、ｐｈｉＣ３１及び１－ｓｃｅｌ消化システムを用いたＭＣＣ７生合成を示している。ｂは、ＥｃｏＲ１消化後の３つのＣＯＬ７Ａ１コードプラスミドＤＮＡのアガロースゲル電気泳動を示している。ｐｃＤＮＡ３．１ＣＯＬ７Ａ１の通常のプラスミド（ＲＰ）、ＭＮ５１１Ａ－１－ＣＯＬ７Ａ１の親プラスミド（ＰＰ）、及びＭＣＣ７の骨格長は、それぞれ５ｋｂ、８ｋｂ、及び３ｋｂである。ｃは、異なるポリプレックスによる形質移入後のＲＤＥＢＫ細胞の蛍光画像を示している。核はＤＡＰＩ（青）で染色し、ＤＮＡはＣｙ３（赤）で標識した。スケールバーは２０μｍ。ｄは、フローサイトメトリーで定量化したポリプレックス細胞取込み効率を示しており、ｅは、Ｃｙ３陽性細胞及びＭＦＩのパーセンテージを示している。＊細胞ＭＦＩにおけるＰＥＩ／ＭＣＣ７群との有意差（ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定）。 ＨＰＡＥ／ＭＣＣ７ポリプレックスによる形質移入後のＣＯＬ７Ａ１ｍ ＲＮＡ及び組換え型Ｃ７発現を示している。ａは、ＲＴ－ｑＰＣＲによって得られた内在性対照ＧＡＰＤＨの増幅プロットを示している。ｂは、ＲＴ－ｑＰＣＲによって得られた形質移入後のＲＤＥＢＫ細胞のＣＯＬ７Ａ１ ｍＲＮＡの増幅プロットを示している。ｃは、ＣＯＬ７Ａ１ ｍＲＮＡの定量化を示している。＊ＰＥＩ群との有意差（ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定）。ｄは、Ｃ７染色（赤色蛍光）の細胞免疫蛍光画像を示している（スケールバーは２０μｍ）。ｅは、Ｃ７発現のウェスタンブロッティング結果を示している。４２ｋＤａ β－アクチンを負荷対照として使用した。 ＨＰＡＥ／ＤＮＡのｗｔ％／ｗｔ％比が３０：１であるＨＰＡＥ／ＭＣＣ７ポリプレックスの物理化学的特性を示している。ａは、ＨＰＡＥ／ＭＣＣ７ポリプレックス形成を示している。ｂは、ポリプレックス調製から２時間後のＤＮＡ凝縮及びヘパリン競合アッセイのアガロースゲル結果を示している。ｃは、ポリプレックス調製から２時間後のＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイによるヘパリンの存在下または非存在下でのＤＮＡ結合能力試験を示している。ｄは、ＮＴＡによって測定されたＨＰＡＥ／ＭＣＣ７ポリプレックスのサイズを示している。ｅは、ＨＰＡＥ／ＭＣＣ７ポリプレックスのゼータ電位分布を示している。ｆは、ＨＰＡＥ／ＭＣＣ７ポリプレックスのＴＥＭ画像を示している。スケールバーは５００ｎＭ。 本開示のＨＰＡＥポリプレックスを含む製剤の遺伝子形質移入性能を示している。ａは、ＲＤＥＢＫ細胞におけるポリプレックス凍結乾燥及びさらなる形質移入試験を示している。ｂは、異なる保存方法及び凍結乾燥条件からのポリプレックスを用いた形質移入後の細胞のＧＦＰ画像を示している。ＦＺ：凍結乾燥；Ｓｕｃ：スクロース。スケールバーは２００μｍ。ｃは、ＵＴ及び形質移入細胞集団の代表的なヒストグラム分布を示している。ｄは、フローサイトメトリーによって定量化された形質移入後の細胞のＧＦＰ発現効率を示している。＊新鮮に調製したポリプレックス群との有意差（ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定）。（ｅ）フローサイトメトリーによって定量化した標準化ＭＦＩ。＊新鮮に調製したポリプレックス群との有意差（ｐ＜０．０５、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。 長期保存後のＲＤＥＢＫ細胞への本開示のＨＰＡＥポリプレックスの形質移入を示している。
上記で使用されているように、また本開示全体において、以下の用語は、別段の指示がない限り、以下の意味を有するように理解されるものとする。用語がない場合は、当業者に知られている従来の用語が優先される。
本明細書で使用する場合、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、オープンな非限定的な意味で使用される。
冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、本開示では、その冠詞の文法的目的語の１つまたは２つ以上（すなわち、少なくとも１つ）を意味するために使用される。例として、「要素（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素または２つ以上の要素を意味する。
「及び／または」という用語は、別段の指示がない限り、本開示では「及び」あるいは「または」のいずれかを意味するために使用される。
より簡潔に説明するために、本明細書で示される定量的表現のいくつかは、「約」という用語で修飾されない。「約」という用語が明示的に使用されているかどうかにかかわらず、本明細書で示される全ての量は実際の所与の値を意味するように意図されており、また、このような所与の値に対する実験及び／または測定条件による同等の値及び近似値を含めて、当技術分野の通常の技量に基づいて合理的に推論されるこのような所与の値への近似も意味するように意図されていることを理解されたい。収率がパーセンテージとして示される場合は常に、このような収率は、特定の化学量論的条件下で得られ得る同じ実体の最大量に関して収率が示される実体の質量を意味する。別段の指示がない限り、パーセンテージで示される濃度は質量比を意味する。
「患者」とは、哺乳類、例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、または非ヒト霊長類、例えば、サル、チンパンジー、ヒヒ、もしくはアカゲザルである。「患者」には、ヒト及び動物の両方が含まれる。
化合物に関連して使用される場合、「有効量」または「治療有効量」という用語は、所望の生物学的結果を提供するのに十分な量の化合物を意味する。その結果とは、疾患の徴候、症状、もしくは原因の低減及び／または軽減、あるいは生物学的システムの他の任意の望ましい変化であり得る。例えば、治療使用のための「有効量」とは、臨床的に有意な疾患の減少をもたらすのに必要とされる、本明細書に開示されるような化合物を含む組成物の量である。個々の場合における適切な「有効量」は、通常の実験を用いて当業者が決定することができる。したがって、「有効量」という表現は、概して、活性物質が治療効果を有する量を意味する。
本明細書で使用する場合、「治療する」または「治療」という用語は、「予防する」という用語と同義であり、疾患の発症の延期、疾患の発症の予防、及び／または発症するまたは発症が予想されるこのような症状の重症度の低減を示すように意図されている。したがって、これらの用語は、既存の疾患症状を改善すること、追加の症状を予防すること、症状の根本的な原因を改善もしくは予防すること、障害もしくは疾患を阻害すること、例えば、障害もしくは疾患の発症を阻止すること、障害もしくは疾患を緩和すること、障害もしくは疾患の退行を引き起こすこと、疾患もしくは疾患によって引き起こされた状態を緩和すること、または疾患もしくは疾患の症状を停止もしくは軽減することを含む。ある特定の実施形態において、「治療する」または「治療」とは、健康な皮膚表現型を促進することを意味する。
「障害」という用語は、別段の指示がない限り、本開示では疾患、状態、または病気という用語を意味するために使用され、これらの用語と互換的に使用される。
「医薬的に許容される」または「薬理学的に許容される」という用語を使用することにより、生物学的に、または別の形で、望ましくない物質であることを意味するように意図されており、このような物質は、実質的に望ましくない生物学的作用を引き起こすことなく、またはそれが含まれる組成物の任意の成分と有害な方式で相互作用することなく、個体に投与することができる。
本開示で使用する場合、「担体」という用語は、担体、賦形剤、及び希釈剤を包含し、対象の臓器または身体の一部から別の臓器または身体の一部への医薬剤の運搬または輸送に関与する材料、組成物、またはビヒクル、例えば、液体もしくは固体充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、または封入材料を意味する。賦形剤は、所望の剤形の適合性及び放出プロファイルに基づいて選択すべきである。例示的な担体材料としては、例えば、結合剤、懸濁化剤、崩壊剤、充填剤、界面活性剤、可溶化剤、安定剤、滑沢剤、湿潤剤、希釈剤、噴霧乾燥分散液などが挙げられる。
「医薬的に適合する担体材料」という用語は、例えば、アラビアゴム、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、グリセロリン酸カルシウム、乳酸カルシウム、マルトデキストリン、グリセリン、ケイ酸マグネシウム、カゼインナトリウム、ダイズレシチン、塩化ナトリウム、リン酸三カルシウム、リン酸二カリウム、ステアロイル乳酸ナトリウム、カラギーナン、モノグリセリド、ジグリセリド、アルファ化デンプンなどを含み得る。例えば、Ｈｏｏｖｅｒ，Ｊｏｈｎ Ｅ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．１９７５を参照
本明細書で使用する場合、「対象」という用語は哺乳類及び非哺乳類を包含する。哺乳類の例としては、限定されるものではないが、哺乳類クラスの任意のメンバー：ヒト、非ヒト霊長類、例えば、チンパンジー、ならびに他の類人猿及びサル種；家畜、例えば、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ；飼育動物、例えば、ウサギ、イヌ、ネコ；げっ歯類を含む実験動物、例えば、ラット、マウス及びモルモットなどが挙げられる。非哺乳類の例としては、限定されるものではないが、鳥類、魚類などが挙げられる。本開示の１つの実施形態において、哺乳類はヒトである。
本開示において使用する場合、「投与される」、「投与」、または「投与する」という用語は、開示される化合物もしくは開示される化合物の医薬的に許容される塩または組成物を対象に直接投与すること、あるいは、治療を必要とする対象（動物を含む）の体内で、このような個体をこのような化合物に接触させるまたは別の方法で曝露することにより、活性化合物の同等量を形成することができる、開示される化合物もしくは開示される化合物の医薬的に許容される塩または組成物のプロドラッグ誘導体またはアナログを対象に投与することを意味する。
本明細書で使用する場合、「アルキル」とは、１～４０個の炭素原子を有する直鎖状または分枝状飽和鎖を意味する。代表的な飽和アルキル基としては、限定されるものではないが、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、２－メチル－１－プロピル、２－メチル－２－プロピル、２－メチル－１－ブチル、３－メチル－１－ブチル、２－メチル－３－ブチル、２，２－ジメチル－１－プロピル、２－メチル－１－ペンチル、３－メチル－１－ペンチル、４－メチル－１－ペンチル、２－メチル－２－ペンチル、３－メチル－２－ペンチル、４－メチル－２－ペンチル、２，２－ジメチル－１－ブチル、３，３－ジメチル－１－ブチル、２－エチル－１－ブチル、ブチル、イソブチル、ｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ－ヘキシルなど、ならびにより長いアルキル基（例えば、ヘプチル、及びオクチルなど）が挙げられる。アルキル基は、非置換の場合も置換されている場合もある。３個以上の炭素原子を含むアルキル基は、直鎖状の場合も分枝状の場合もある。本明細書で使用する場合、「低級アルキル」とは、１～１０個の炭素原子を有するアルキルを意味する。
本明細書で使用する場合、「アルケニル」には、２～４０個の炭素原子を含む非分枝状または分枝状炭化水素鎖が含まれる。「アルケニル」基は、少なくとも１つの二重結合を含む。アルケニル基の二重結合は、別の不飽和基に結合しない場合も結合する場合もある。アルケニル基の例としては、限定されるものではないが、エチレニル、ビニル、アリル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、ブタジエニル、ペンタジエニル、ヘキサジエニル、２－エチルヘキセニル、２－プロピル－２－ブテニル、４－（２－メチル－３－ブテン）－ペンテニルなどが挙げられる。アルケニル基は、非置換の場合も置換されている場合もある。また、本明細書で定義する場合、アルケニルは、分枝状の場合も直鎖状の場合もある。
本明細書で使用する場合、「アルキニル」には、２～４０個の炭素原子を含む非分枝状または分枝状不飽和炭化水素鎖が含まれる。「アルキニル」基は、少なくとも１つの三重結合を含む。アルキニル基の三重結合は、別の不飽和基に結合しない場合も結合する場合もある。アルキニル基の例としては、限定されるものではないが、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、メチルプロピニル、４－メチル－１－ブチニル、４－プロピル－２－ペンチニル、４－ブチル－２－ヘキシニルなどが挙げられる。アルキニル基は、非置換の場合も置換されている場合もある。
また、本明細書中の本文、スキーム、実施例、及び表にある満たされていない原子価を有する任意の炭素及びヘテロ原子は、原子価を満たすのに十分な数の水素原子（複数可）を有すると仮定されることにも留意されたい。
本明細書で使用する場合、水素への言及は、所望される場合重水素置換も意味し得る。本明細書で使用する場合、「重水素」という用語は、奇数の陽子及び中性子を有する水素の安定同位体を意味する。
「ハロ」または「ハロゲン」という用語は、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素を意味する。
本明細書で使用する場合、「ハロアルキル」という用語は、１つ以上のハロゲンで置換された本明細書で定義されるアルキル基を意味する。ハロアルキル基の例としては、限定されるものではないが、トリフルオロメチル、ジフルオロメチル、ペンタフルオロエチル、トリクロロメチル等が挙げられる。
別段の指定がない限り、「アリール」という用語は、フェニル、ビフェニル、またはナフチルなどの単環式または２環式基を含めた１～３つの芳香環を有する環式芳香族炭化水素基を意味する。２つの芳香環（２環式など）を含む場合、アリール基の芳香環は、単一の点で連結され得る（例えば、ビフェニル）、または縮合され得る（例えば、ナフチル）。アリール基は、任意選択で、１つ以上の置換基（例えば、１～５つの置換基）により、任意の結合点で置換されてもよい。置換基は、それ自体が任意選択で置換されてもよい。さらに、２つの縮合環を含む場合、本明細書で定義されるアリール基は、完全飽和環と縮合した不飽和または部分飽和環を有し得る。このようなアリール基の例示的な環系としては、限定されるものではないが、フェニル、ビフェニル、ナフチル、アントラセニル、フェナレニル、フェナントレニル、インダニル、インデニル、テトラヒドロナフタレニル、テトラヒドロベンゾアヌレニルなどが挙げられる。
別段の指定がない限り、「ヘテロアリール」とは、Ｎ、Ｏ、またはＳから選択される１個以上の環ヘテロ原子を含み、残りの環原子がＣである５～１８個の環原子の１価の単環式芳香族ラジカルまたは多環式芳香族ラジカルを意味する。本明細書で定義されるヘテロアリールは、ヘテロ原子がＮ、Ｏ、またはＳから選択される２環式ヘテロ芳香族基も意味する。芳香族ラジカルは、本明細書で説明される１つ以上の置換基で任意選択で独立的に置換される。置換基は、それ自体が任意選択で置換されてもよい。例としては、限定されるものではないが、ベンゾチオフェン、フリル、チエニル、ピロリル、ピリジル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリミジニル、イミダゾリル、イソキサゾリル、オキサゾリル、オキサジアゾリル、ピラジニル、インドリル、チオフェン－２－イル、キノリル、ベンゾピラニル、イソチアゾリル、チアゾリル、チアジアゾリル、チエノ［３，２－ｂ］チオフェン、トリアゾリル、トリアジニル、イミダゾ［１，２－ｂ］ピラゾリル、フロ［２，３－ｃ］ピリジニル、イミダゾ［１，２－ａ］ピリジニル、インダゾリル、ピロロ［２，３－ｃ］ピリジニル、ピロロ［３，２－ｃ］ピリジニル、ピラゾロ［３，４－ｃ］ピリジニル、ベンゾイミダゾリル、チエノ［３，２－ｃ］ピリジニル、チエノ［２，３－ｃ］ピリジニル、チエノ［２，３－ｂ］ピリジニル、ベンゾチアゾリル、インドリル、インドリニル、インドリノニル、ジヒドロベンゾチオフェニル、ジヒドロベンゾフラニル、ベンゾフラン、クロマニル、チオクロマニル、テトラヒドロキノリニル、ジヒドロベンゾチアジン、ジヒドロベンゾオキサニル、キノリニル、イソキノリニル、１，６－ナフチリジニル、ベンゾ［ｄｅ］イソキノリニル、ピリド［４，３－ｂ］［１，６］ナフチリジニル、チエノ［２，３－ｂ］ピラジニル、キナゾリニル、テトラゾロ［１，５－ａ］ピリジニル、［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］ピリジニル、イソインドリル、ピロロ［２，３－ｂ］ピリジニル、ピロロ［３，４－ｂ］ピリジニル、ピロロ［３，２－ｂ］ピリジニル、イミダゾ［５，４－ｂ］ピリジニル、ピロロ［１，２－ａ］ピリミジニル、テトラヒドロピロロ［１，２－ａ］ピリミジニル、３，４－ジヒドロ－２Ｈ－１λ２－ピロロ［２，１－ｂ］ピリミジン、ジベンゾ［ｂ，ｄ］チオフェン、ピリジン－２－オン、フロ［３，２－ｃ］ピリジニル、フロ［２，３－ｃ］ピリジニル、１Ｈ－ピリド［３，４－ｂ］［１，４］チアジニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾイソキサゾリル、フロ［２，３－ｂ］ピリジニル、ベンゾチオフェニル、１，５－ナフチリジニル、フロ［３，２－ｂ］ピリジン、［１，２，４］トリアゾロ［１，５－ａ］ピリジニル、ベンゾ［１，２，３］トリアゾリル、イミダゾ［１，２－ａ］ピリミジニル、［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ｂ］ピリダジニル、ベンゾ［ｃ］［１，２，５］チアジアゾリル、ベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール、１，３－ジヒドロ－２Ｈ－ベンゾ［ｄ］イミダゾール－２－オン、３，４－ジヒドロ－２Ｈ－ピラゾロ［１，５－ｂ］［１，２］オキサジニル、４，５，６，７－テトラヒドロピラゾロ［１，５－ａ］ピリジニル、チアゾロ［５，４－ｄ］チアゾリル、イミダゾ［２，１－ｂ］［１，３，４］チアジアゾリル、チエノ［２，３－ｂ］ピロリル、３Ｈ－インドリル、及びその誘導体が挙げられる。さらに、２つの縮合環を含む場合、本明細書で定義されるヘテロアリール基は、完全飽和環と縮合した不飽和または部分飽和環を有し得る。
本明細書で使用する場合、「シクロアルキル」という用語は、環当たり３～１８個の炭素原子を有する、飽和または部分飽和であり単環式の縮合またはスピロ多環式炭素環を意味する。シクロアルキル環または炭素環は、任意選択で、１つ以上の置換基（例えば、１～５つの置換基）により、任意の結合点で置換されてもよい。置換基は、それ自体が任意選択で置換されてもよい。シクロアルキル基の例としては、限定されるものではないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプタニル、シクロオクタニル、ノルボラニル、ノルボレニル、ビシクロ［２．２．２］オクタニル、ビシクロ［２．２．２］オクテニル、デカヒドロナフタレニル、オクタヒドロ－１Ｈ－インデニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘキサ－１，４－ジエニル、シクロヘキサ－１，３－ジエニル、１，２，３，４－テトラヒドロナフタレニル、オクタヒドロペンタレニル、３ａ，４，５，６，７，７ａ－ヘキサヒドロ－１Ｈ－インデニル、１，２，３，３ａ－テトラヒドロペンタレニル、ビシクロ［３．１．０］ヘキサニル、ビシクロ［２．１．０］ペンタニル、スピロ［３．３］ヘプタニル、ビシクロ［２．２．１］ヘプタニル、ビシクロ［２．２．１］ヘプタ－２－エニル、ビシクロ［２．２．２］オクタニル、６－メチルビシクロ［３．１．１］ヘプタニル、２，６，６－トリメチルビシクロ［３．１．１］ヘプタニル、及びその誘導体が挙げられる。
本明細書で使用する場合、「シクロアルケニル」という用語は、環当たり３～１８個の炭素原子を有し、少なくとも１つの二重結合を有する、部分飽和、単環式の縮合またはスピロ多環式炭素環を意味する。シクロアルケニル環は、任意選択で、１つ以上の置換基（例えば、１～５つの置換基）により、任意の結合点で置換されてもよい。置換基は、それ自体が任意選択で置換されてもよい。
本明細書で使用する場合、「ヘテロシクロアルキル」または「ヘテロシクリル」いう用語は、炭素原子、及び酸素、窒素、または硫黄から得られるヘテロ原子を含む４～１８個の原子の飽和もしくは部分不飽和及び非芳香族の単環式、または縮合もしくはスピロ多環式環構造を意味し、環炭素またはヘテロ原子の間で共有される非局在化π電子（芳香族性）は存在しない。ヘテロシクロアルキルまたはヘテロシクリル環構造は、１つ以上の置換基によって置換されてもよい。置換基は、それ自体が任意選択で置換されてもよい。ヘテロシクロアルキルまたはヘテロシクリル環の例としては、限定されるものではないが、オキセタニル、アゼチジニル、テトラヒドロフラニル、ピロリジニル、オキサゾリニル、オキサゾリジニル、チアゾリニル、チアゾリジニル、ピラニル、チオピラニル、テトラヒドロピラニル、ジオキサリニル、ピペリジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、チオモルホリニルＳ－オキシド、チオモルホリニルＳ－ジオキシド、ピペラジニル、アゼピニル、オキセピニル、ジアゼピニル、トロパニル、ホモトロパニル、ジヒドロチオフェン－２（３Ｈ）－オニル、テトラヒドロチオフェン１，１－ジオキシド、２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロリル、イミダゾリジン－２－オン、ピロリジン－２－オン、ジヒドロフラン－２（３Ｈ）－オン、１，３－ジオキソラン－２－オン、イソチアゾリジン１，１－ジオキシド、４，５－ジヒドロ－１Ｈ－イミダゾリル、４，５－ジヒドロオキサゾリル、オキシラニル、ピラゾリジニル、４Ｈ－１，４－チアジニル、チオモルホリニル、１，２，３，４－テトラヒドロピリジニル、１，２，３，４－テトラヒドロピラジニル、１，３－オキサジナン－２－オン、テトラヒドロ－２Ｈ－チオピラン１，１－ジオキシド、７－オキサビシクロ［２．２．１］ヘプタニル、１，２－チアゼパン１，１－ジオキシド、オクタヒドロ－２Ｈ－キノリジニル、１，３－ジアザビシクロ［２．２．２］オクタニル、２，３－ジヒドロベンゾ［ｂ］［１，４］ジオキシン、３－アザビシクロ［３．２．１］オクタニル、８－アザスピロ［４．５］デカン、８－オキサ－３－アザビシクロ［３．２．１］オクタニル、２－アザビシクロ［２．２．１］ヘプタン、２，８－ジアザスピロ［５．５］ウンデカニル、２－アザスピロ［５．５］ウンデカニル、３－アザスピロ［５．５］ウンデカニル、デカヒドロイソキノリニル、１－オキサ－８－アザスピロ［４．５］デカニル、８－アザビシクロ［３．２．１］オクタニル、１，４’－ビピペリジニル、アゼパニル、８－オキサ－３－アザビシクロ［３．２．１］オクタニル、３，４－ジヒドロ－２Ｈ－ベンゾ［ｂ］［１，４］オキサジニル、５，６，７，８－テトラヒドロイミダゾ［１，２－ａ］ピリジニル、１，４－ジアゼパニル、フェノキサチイニル、ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソリル、２，３－ジヒドロベンゾフラニル、２，３－ジヒドロベンゾ［ｂ］［１，４］ジオキシニル、４－（ピペリジン－４－イル）モルホリニル、３－アザスピロ［５．５］ウンデカニル、デカヒドロキノリニル、ピペラジン－２－オン、１－（ピロリジン－２－イルメチル）ピロリジニル、１，３’－ビピロリジニル、及び６，７，８，９－テトラヒドロ－１Ｈ，５Ｈ－ピラゾロ［１，２－ａ］［１，２］ジアゼピニルが挙げられる。
本明細書で使用する場合、数値範囲は、別段の記載がない限り、連続的な整数を含むように意図されている。例えば、「０から５まで」と表現される範囲は、０、１、２、３、４及び５を含むと考えられる。
本明細書で使用する場合、「置換された」という用語は、指定された基または部分が、１つ以上の位置でその指定された基または部分に接続し得る１つ以上の好適な置換基を有することを意味する。例えば、シクロアルキルで置換されたアリールは、シクロアルキルが、結合により、またはアリールと融合し２個以上の共通の原子を共有することにより、アリールの１個の原子に接続することを示し得る。
本明細書で使用する場合、「非置換」という用語は、指定された基が置換基を有しないことを意味する。
「任意選択で置換された」という用語は、所与の化学部分（例えば、アルキル基）が、（必須ではないが）他の置換基（例えば、ヘテロ原子）に結合し得ることを意味するものと理解されたい。例えば、任意選択で置換されたアルキル基は、完全飽和アルキル鎖（すなわち、純粋な炭化水素）であり得る。代替的に、同じ任意選択で置換されたアルキル基が、水素とは異なる置換基を有してもよい。例えば、アルキル基は、鎖に沿った任意の点で、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、または本明細書で説明される他の任意の置換基に結合することができる。したがって、「任意選択で置換された」という用語は、所与の化学部分が他の官能基を含む可能性があるが、必ずしも任意のさらなる官能基を有するわけではないことを意味する。別段の指定がない場合、説明された基の任意選択の置換で使用される好適な置換基としては、限定されるものではないが、オキソ、－ハロゲン、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ、Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１－Ｃ６ハロアルコキシ、－ＯＣ１－Ｃ６アルケニル、－ＯＣ１－Ｃ６アルキニル、－Ｃ１－Ｃ６アルケニル、－Ｃ１－Ｃ６アルキニル、－ＯＨ、ＣＮ（シアノ）、－ＣＨ２ＣＮ、－ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＨ、－ＯＣ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ６アルキル、－Ｃ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ６アルキル、－Ｃ（Ｏ）－Ｃ０－Ｃ６アルキレニル－シクロアルキル、－Ｃ（Ｏ）－Ｃ０－Ｃ６アルキレニル－ヘテロシクロアルキル、－Ｃ（Ｏ）－Ｃ０－Ｃ６アルキレニル－アリール、－Ｃ（Ｏ）－Ｃ０－Ｃ６アルキレニル－ヘテロアリール、－ＯＣ（Ｏ）ＯＣ１－Ｃ６アルキル、ＮＨ２、ＮＨ（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、Ｎ（Ｃ１－Ｃ６アルキル）２、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｃ１－Ｃ６アルキル）２、－Ｃ（Ｏ）ＮＨシクロアルキル、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｃ１－Ｃ６アルキル）シクロアルキル、－Ｃ（Ｏ）ＮＨヘテロシクロアルキル、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｃ１－Ｃ６アルキル）ヘテロシクロアルキル、－Ｃ（Ｏ）ＮＨアリール、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｃ１－Ｃ６アルキル）アリール、－Ｃ（Ｏ）ＮＨヘテロアリール、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｃ１－Ｃ６アルキル）ヘテロアリール、－Ｓ（Ｏ）２－Ｃ１－Ｃ６アルキル、－Ｓ（Ｏ）２－Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル、－Ｓ（Ｏ）２－シクロアルキル、－Ｓ（Ｏ）２－ヘテロシクロアルキル、－Ｓ（Ｏ）２－アリール、－Ｓ（Ｏ）２－ヘテロアリール－Ｃ０－Ｃ６アルキレニル－Ｓ（Ｏ）２ＮＨ２、－Ｓ（Ｏ）２ＮＨＣ１－Ｃ６アルキル、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｃ１－Ｃ６アルキル）２、－Ｓ（Ｏ）２ＮＨシクロアルキル、－Ｓ（Ｏ）２ＮＨヘテロシクロアルキル、－Ｓ（Ｏ）２ＮＨアリール、－Ｓ（Ｏ）２ＮＨヘテロアリール、－ＮＨＳ（Ｏ）２Ｃ１－Ｃ６アルキル、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ６アルキル）Ｓ（Ｏ）２（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、－ＮＨＳ（Ｏ）２アリール、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ６アルキル）Ｓ（Ｏ）２アリール、－ＮＨＳ（Ｏ）２ヘテロアリール、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ６アルキル）Ｓ（Ｏ）２ヘテロアリール、－ＮＨＳ（Ｏ）２シクロアルキル、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ６アルキル）Ｓ（Ｏ）２シクロアルキル、－ＮＨＳ（Ｏ）２ヘテロシクロアルキル、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ６アルキル）Ｓ（Ｏ）２ヘテロシクロアルキル、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ６アルキル）Ｓ（Ｏ）２アリール，－Ｃ０－Ｃ６アルキレニル－アリール、－Ｃ０－Ｃ６アルキレニル－ヘテロアリール、－Ｃ０－Ｃ６アルキレニル－シクロアルキル、－Ｃ０－Ｃ６アルキレニル－ヘテロシクロアルキル、－Ｏ－アリール、－ＮＨ－アリール、及びＮ（Ｃ１－Ｃ６アルキル）アリールが挙げられる。置換基は、それ自体が任意選択で置換されてもよい。多官能部分が示されている場合、コアへの結合点が線で示される。例えば、（シクロアルキルオキシ）アルキル－は、アルキルがコアへの結合点であり、一方シクロアルキルがオキシ基を介してアルキルに結合していることを意味する。また、「任意選択で置換された」は、「置換された」または「非置換」も意味し、これらの意味は上記で説明されている。
本明細書で使用する場合、「リンカー」または「結合部分」という用語は、２つの基を接続し、０から１００個の間の原子の骨格を有する基を意味する。リンカーまたは結合は、２つの基または長さが１から１００個の間の原子、例えば、長さが約１、２、３、４、５、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、または１００個の炭素原子の鎖を接続する共有結合（すなわち、０個の原子の骨格）とすることができ、このときリンカーは、直鎖状、分枝状、環状、または単一の原子とすることができる。ある特定の場合において、リンカー骨格の１つ以上の炭素原子は、任意選択で、硫黄、窒素、または酸素ヘテロ原子で置換される場合がある。骨格原子間の結合は、飽和の場合も不飽和の場合もある。リンカーは、１つ以上の置換基、例えばアルキル、アリール、またはアルケニル基を含むことができる。リンカーとしては、限定されるものではないが、オリゴ（エチレングリコール）、エーテル、チオエーテル、３級アミン、直鎖状または分枝状であり得るアルキル、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、１－メチルエチル（イソ－プロピル）、ｎ－ブチル、ｎ－ペンチル、１，１－ジメチルエチル（ｔ－ブチル）などを挙げることができる。リンカー骨格としては、環状基、例えば、アリール、複素環、またはシクロアルキル基を挙げることができ、このとき、骨格には環状基の２個以上の原子、例えば、２個、３個または４個の原子が含まれる。リンカーは、切断可能な場合も切断不可能な場合もある。
別段の明記がない限り、分子量という用語は、量平均分子量（ＭＷ）を意味する。
「ヘテロアルキレン」という用語は、硫黄、酸素、またはＮＲｄ（式中、Ｒｄは水素またはアルキルである）で置き換えられた１個以上の炭素原子を有する２価アルキレンを意味する。ヘテロアルキレンは、直鎖状、分枝状、環状、またはこれらの組合せとすることができる。
「ヘテロアルケニレン」という用語は、その骨格内に少なくとも１つの炭素間二重結合と、１個以上のヘテロ原子（例えば、Ｎ、Ｓ、またはＯ）とを有する、２価の直鎖状または分枝状鎖ヒドロカルビル基を意味する。
「ヘテロアルキニレン」という用語は、その骨格内に少なくとも１つの炭素間三重結合と、１個以上のヘテロ原子（例えば、Ｎ、Ｓ、またはＯ）とを有する、２価の直鎖状または分枝状鎖ヒドロカルビル基を意味する。
本明細書で使用する場合、「ポリプレックス」という用語は、核酸とポリマーとの間の複合体を意味する。核酸は、非共有結合、詳細には静電結合を介し、ポリマーと結合する。
「プラスミド」という用語は、細胞の中心代謝の一部ではない遺伝子をしばしば有する染色体外エレメントを意味し、通常は環状２本鎖ＤＮＡ分子の形態をとる。このようなエレメントは、任意の供給源に由来する１本鎖または２本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの、線状、環状、またはスーパーコイル状の、自己複製配列、ゲノム組込配列、ファージまたはヌクレオチド配列とすることができ、このような配列においては、複数のヌクレオチド配列が連結または再合成されて、選択された遺伝子産物のプロモーターフラグメント及びＤＮＡ配列を適切な３’非翻訳配列と共に細胞に導入可能なユニークな構造となっている。本明細書で使用する場合、「プラスミド」という用語は、遺伝子材料（すなわち、核酸）から構成されたコンストラクトを意味する。典型的には、プラスミドは、細菌宿主細胞（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）内で機能的である複製起点と、プラスミドを含む細菌宿主細胞を検出するための選択マーカーとを含む。
「ナノプラスミド」という用語は、より小さなプラスミドに所望の遺伝子挿入物を提供する、細菌配列が低減された環状ＤＮＡ配列を意味する。例えば、抗生物質を含まないＲＮＡ－ＯＵＴ選択システムによって生成されたナノプラスミド及びその作製方法は、米国特許第９，１０９，０１２号（Ｎａｔｕｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによって特許されている）で説明されており、当該文献はその全体が参照により本明細書に援用される。
「核酸」という用語は、ヌクレオチド塩基の生物学的ポリマーを意味し、限定されるものではないが、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、及びペプチド核酸（ＰＮＡ）を挙げることができる。
「ミニサークル」という用語は、細菌の複製配列を除去するために分子内組換えによって親プラスミドから誘導された小型の最小サイズの環状ＤＮＡを意味する。
「遺伝子編集システム」という用語は、多くのＤＮＡ修復経路の１つによって標的核酸を改変可能なシステムを意味する。
本開示は、直鎖状オリゴマーの組合せ戦略によって合成されたポリマーを含めた分枝状ポリマーの新規のクラスを対象とする。いくつかの実施形態において、直鎖状ポリ（β－アミノエステル）オリゴマーは、分岐単位によって接続されて、多官能性直鎖状－分枝状ハイブリッドポリ（β－アミノエステル）（ＬＢＰＡＥ）を形成する。本開示のポリマーは、限定されるものではないが、高性能線維芽細胞遺伝子形質移入を含めた様々な用途のために設計及び調製される。ヒト初代皮膚線維芽細胞（ＨＰＤＦ）及びマウス胚線維芽細胞（３Ｔ３）において、超高度な導入遺伝子発現がＬＢＰＡＥにより達成され、Ｇルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）発現の３２９２倍の強化及びほぼ１００％の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現が検出された。詳細な機構的試験により、ＬＢＰＡＥは、線維芽細胞遺伝子形質移入に関与する複数の細胞外及び細胞内バリアを通り抜けできることが明らかになった。さらに重要なことに、ＬＢＰＡＥは、様々な遺伝子（例えば、ＣＯＬ７Ａ１）を有効に送達して、所望の発現（例えば、ＨＰＤＦにおけるＶＩＩ型コラーゲンタンパク質（Ｃ７））を実質的に上方制御し、疾患（例えば、劣性栄養障害型表皮水疱症（ＲＤＥＢ）などのＣ７欠損遺伝性皮膚症）の治療において大きな可能性を示し得る。
ポリマー
いくつかの実施形態において、本開示は、以下のプロセス：
（ａ）式（Ａ）の化合物
Figure 2022514113000009
 を、式Ｒ１－ＮＨ２またはＲ１－Ｎ（Ｈ）－Ｚ’－Ｎ（Ｈ）－Ｒ１を有する第１のアミンと反応させることと、
（ｂ）ステップ（ａ）の生成物を、式Ｒ２－ＮＨ２またはＲ２－Ｎ（Ｈ）－Ｚ’’－Ｎ（Ｈ）－Ｒ２を有する第２のアミンと反応させることと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の生成物を式（Ｂ）の化合物と反応させることとによって作製され、
Figure 2022514113000010
 によって作製されるポリマーであって、式中、
各Ｊが、独立的に、－Ｏ－または－ＮＨ－であり、
Ｚ、Ｚ’、及びＺ’’が結合部分であり、
Ａが、１～３０個の炭素原子の直鎖状もしくは分枝状炭素鎖、２～３０個の原子の直鎖状もしくは分枝状ヘテロ原子含有炭素鎖、３～３０個の炭素原子を含む炭素環、または３～３０個の原子を含む複素環であり、
Ａが、任意選択で、１つ以上のハロゲン、ヒドロキシル、アミノ基、スルホニル基、スルホンアミド基、チオール、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ、Ｃ１－Ｃ６エーテル、Ｃ１－Ｃ６チオエーテル、Ｃ１－Ｃ６スルホン、Ｃ１－Ｃ６スルホキシド、Ｃ１－Ｃ６１級アミド、Ｃ１－Ｃ６２級アミド、ハロＣ１－Ｃ６アルキル、カルボキシル基、シアノ基、ニトロ基、ニトロソ基、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ３－Ｃ６シクロアルキル、Ｃ３－Ｃ６ヘテロシクリル、Ｃ２－Ｃ５ヘテロアリール、またはＣ６－Ｃ１０アリールで置換され（式中、各Ｒ’は、独立的に、水素及びＣ１－Ｃ６アルキルからなる群より選択される）、
Ｇが、－Ｃ－、－Ｓ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｐ（ＯＲ１）－、または－Ｐ（ＯＨ）－であり、
各Ｑが、ＨまたはＣ１－Ｃ１０直鎖状もしくは分枝状アルキル基であり、
各Ｅ１が、独立的に、共有結合、－Ｎ－、－Ｏ－、－Ｓ－、アルキレン、ヘテロアルキレン、アルケニル、ヘテロアルケニレン、アルキニル、ヘテロアルキニレンからなる群より選択され；
Ｒ１及びＲ２が、各々独立的に、Ｃ１－Ｃ４０アルキル、Ｃ１－Ｃ４０ヘテロアルキル、Ｃ２－Ｃ４０アルケニル、Ｃ２－Ｃ４０ヘテロアルケニレン、Ｃ４－Ｃ８シクロアルケニル、Ｃ２－Ｃ４０アルキニル、Ｃ２－Ｃ４０ヘテロアルキニレン、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリールであり、このとき、当該ヘテロシクリル及びヘテロアリールが、Ｎ、Ｓ、Ｐ、及びＯからなる群より選択される１～５個のヘテロ原子を含み、当該Ｃ１－Ｃ４０アルキル、Ｃ２－Ｃ４０アルケニル、Ｃ４－Ｃ８シクロアルケニル、Ｃ２－Ｃ４０アルキニル、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、及びヘテロアリールが、任意選択で、Ｄ、ハロゲン、Ｃ１－Ｃ６アルキル、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、または－Ｎ（Ｃ１－Ｃ６アルキル）２で置換され、Ｒ１は、非置換であるか、またはハロゲン、ヒドロキシル、アミノ基、スルホニル基、スルホンアミド基、チオール、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ、Ｃ１－Ｃ６エーテル、Ｃ１－Ｃ６チオエーテル、Ｃ１－Ｃ６スルホン、Ｃ１－Ｃ６スルホキシド、Ｃ１－Ｃ６１級アミド、Ｃ１－Ｃ６２級アミド、ハロＣ１－Ｃ６アルキル、カルボキシル基、シアノ基、ニトロ基、ニトロソ基、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ３－Ｃ６シクロアルキル、Ｃ３－Ｃ６ヘテロシクリル、Ｃ２－Ｃ５ヘテロアリール、及びＣ６－Ｃ１０）アリールのうちの１つ以上で置換され（式中、各Ｒ’は、独立的に、水素及びＣ１－Ｃ６アルキルからなる群より選択される）、
各ｎが少なくとも１である、ポリマーを提供する。
いくつかの実施形態において、本開示は、以下のプロセス：
（ａ）式（Ａ）の化合物
Figure 2022514113000011
 及び式（Ｂ）の化合物：
Figure 2022514113000012
 を、式Ｒ１－ＮＨ２またはＲ１－Ｎ（Ｈ）－Ｚ’－Ｎ（Ｈ）－Ｒ１を有する第１のアミンと反応させることと、
（ｂ）ステップ（ａ）の生成物を、式Ｒ２－ＮＨ２またはＲ２－Ｎ（Ｈ）－Ｚ’’－Ｎ（Ｈ）－Ｒ２を有する第２のアミンと反応させることと
によって作製されるポリマーであって、式中、
各Ｊが、独立的に、－Ｏ－または－ＮＨ－であり、
Ｚ、Ｚ’、及びＺ’’が結合部分であり、
Ａが、１～３０個の炭素原子の直鎖状もしくは分枝状炭素鎖、２～３０個の原子の直鎖状もしくは分枝状ヘテロ原子含有炭素鎖、３～３０個の炭素原子を含む炭素環、または３～３０個の原子を含む複素環であり、
Ａが、任意選択で、１つ以上のハロゲン、ヒドロキシル、アミノ基、スルホニル基、スルホンアミド基、チオール、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ、Ｃ１－Ｃ６エーテル、Ｃ１－Ｃ６チオエーテル、Ｃ１－Ｃ６スルホン、Ｃ１－Ｃ６スルホキシド、Ｃ１－Ｃ６１級アミド、Ｃ１－Ｃ６２級アミド、ハロＣ１－Ｃ６アルキル、カルボキシル基、シアノ基、ニトロ基、ニトロソ基、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ３－Ｃ６シクロアルキル、Ｃ３－Ｃ６ヘテロシクリル、Ｃ２－Ｃ５ヘテロアリール、またはＣ６－Ｃ１０アリールで置換され（式中、各Ｒ’は、独立的に、水素及びＣ１－Ｃ６アルキルからなる群より選択される）、
Ｇが、－Ｃ－、－Ｓ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｐ（ＯＲ１）－、または－Ｐ（ＯＨ）－であり、
各Ｑが、ＨまたはＣ１－Ｃ１０直鎖状もしくは分枝状アルキル基であり、
各Ｅ１が、独立的に、共有結合、－Ｎ－、－Ｏ－、－Ｓ－、アルキレン、ヘテロアルキレン、アルケニル、ヘテロアルケニレン、アルキニル、ヘテロアルキニレンからなる群より選択され；
Ｒ１及びＲ２が、各々独立的に、Ｃ１－Ｃ４０アルキル、Ｃ１－Ｃ４０ヘテロアルキル、Ｃ２－Ｃ４０アルケニル、Ｃ２－Ｃ４０ヘテロアルケニレン、Ｃ４－Ｃ８シクロアルケニル、Ｃ２－Ｃ４０アルキニル、Ｃ２－Ｃ４０ヘテロアルキニレン、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリールであり、このとき、当該ヘテロシクリル及びヘテロアリールが、Ｎ、Ｓ、Ｐ、及びＯからなる群より選択される１～５個のヘテロ原子を含み、当該Ｃ１－Ｃ４０アルキル、Ｃ２－Ｃ４０アルケニル、Ｃ４－Ｃ８シクロアルケニル、Ｃ２－Ｃ４０アルキニル、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、及びヘテロアリールが、任意選択で、Ｄ、ハロゲン、Ｃ１－Ｃ６アルキル、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、または－Ｎ（Ｃ１－Ｃ６アルキル）２で置換され、Ｒ１は、非置換であるか、またはハロゲン、ヒドロキシル、アミノ基、スルホニル基、スルホンアミド基、チオール、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ、Ｃ１－Ｃ６エーテル、Ｃ１－Ｃ６チオエーテル、Ｃ１－Ｃ６スルホン、Ｃ１－Ｃ６スルホキシド、Ｃ１－Ｃ６１級アミド、Ｃ１－Ｃ６２級アミド、ハロＣ１－Ｃ６アルキル、カルボキシル基、シアノ基、ニトロ基、ニトロソ基、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ３－Ｃ６シクロアルキル、Ｃ３－Ｃ６ヘテロシクリル、Ｃ２－Ｃ５ヘテロアリール、及びＣ６－Ｃ１０）アリールのうちの１つ以上で置換され（式中、各Ｒ’は、独立的に、水素及びＣ１－Ｃ６アルキルからなる群より選択される）、
各ｎが少なくとも１である、ポリマーを提供する。
いくつかの実施形態において、Ｚは、１～３０個の炭素原子の直鎖状もしくは分枝状炭素鎖、１～３０個の原子の直鎖状もしくは分枝状ヘテロ原子含有炭素鎖、３～３０個の炭素原子を含む炭素環、３～３０個の炭素原子を含むアルキレン－炭素環、３～３０個の原子を含む複素環、または３～３０個の原子を含むアルキレン－複素環である。Ｚは、非置換の場合もあれば、ハロゲン、ヒドロキシル、アミノ基、スルホニル基、スルホンアミド基、チオール、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ、Ｃ１－Ｃ６エーテル、Ｃ１－Ｃ６チオエーテル、Ｃ１－Ｃ６スルホン、Ｃ１－Ｃ６スルホキシド、Ｃ１－Ｃ６１級アミド、Ｃ１－Ｃ６２級アミド、ハロＣ１－Ｃ６アルキル、カルボキシル基、シアノ基、ニトロ基、ニトロソ基、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ３－Ｃ６シクロアルキル、Ｃ３－Ｃ６ヘテロシクリル、Ｃ２－Ｃ５ヘテロアリール、及びＣ６－Ｃ１０アリールのうちの少なくとも１つで置換される場合もある（式中、各Ｒ’は、独立的に、水素及びＣ１－Ｃ６アルキルからなる群より選択される）。いくつかの実施形態において、Ｚは、１～３０個の炭素原子の直鎖状炭素鎖である。例えば、Ｚは、限定されるものではないが、Ｃ１－Ｃ２４アルキレン、Ｃ１－Ｃ２０アルキレン、Ｃ１－Ｃ１６アルキレン、Ｃ１－Ｃ１２アルキレン、Ｃ１－Ｃ８アルキレン、Ｃ１－Ｃ６アルキレン、Ｃ１－Ｃ４アルキレン、Ｃ１－Ｃ３アルキレン、Ｃ１－Ｃ２アルキレン、Ｃ１アルキレンを含めたアルキレン基とすることができる。代表的なアルキレン基としては、限定されるものではないが、メチレン、エチレン、プロピレン、ｎ－ブチレン、エテニレン、プロペニレン、ｎ－ブテニレン、プロピニレン、ｎ－ブチニレンなどが挙げられるが。いくつかの実施形態において、Ｚは、１～３０個の炭素原子の直鎖状もしくは分枝状炭素鎖、または１～３０個の原子の直鎖状もしくは分枝状ヘテロ原子含有炭素鎖である。いくつかの実施形態において、Ｚは、１～１０個の炭素原子の直鎖状または分枝状炭素鎖である。例えば、いくつかの実施形態において、Ｚは
Figure 2022514113000013
 である。いくつかの実施形態において、Ｚは、１～３０個の炭素原子の分枝状炭素鎖である。いくつかの実施形態において、Ｚは、１～３０個の原子の直鎖状または分枝状ヘテロ原子含有炭素鎖である。例えば、Ｚは、ヘテロ原子（限定されるものではないが、Ｏ、Ｎ、Ｓ、またはＰを含む）で置換された１個以上の炭素原子を有する直鎖状または分枝状炭素鎖とすることができる。いくつかの実施形態において、Ｚは、３～３０個の炭素原子を含む炭素環である。いくつかの実施形態において、Ｚは、３～３０個の炭素原子を含むアルキレン－炭素環である。例えば、いくつかの実施形態において、Ｚは
Figure 2022514113000014
 であり、式中、ｘは１～１０００である。いくつかの実施形態において、Ｚは、３～３０個の原子を含む複素環である。いくつかの実施形態において、Ｚは、３～３０個の原子を含むアルキレン－複素環である。いくつかの実施形態において、Ｚは置換されていない。いくつかの実施形態において、Ｚは置換されている。いくつかの実施形態において、Ｚは、以下：
Figure 2022514113000015
 のうちの１つである。
いくつかの実施形態において、Ｚ’は、１～３０個の炭素原子の直鎖状もしくは分枝状炭素鎖、１～３０個の原子の直鎖状もしくは分枝状ヘテロ原子含有炭素鎖、３～３０個の炭素原子を含む炭素環、３～３０個の炭素原子を含むアルキレン－炭素環、３～３０個の原子を含む複素環、または３～３０個の原子を含むアルキレン－複素環である。Ｚ’は、非置換の場合もあれば、ハロゲン、ヒドロキシル、アミノ基、スルホニル基、スルホンアミド基、チオール、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ、Ｃ１－Ｃ６エーテル、Ｃ１－Ｃ６チオエーテル、Ｃ１－Ｃ６スルホン、Ｃ１－Ｃ６スルホキシド、Ｃ１－Ｃ６１級アミド、Ｃ１－Ｃ６２級アミド、ハロＣ１－Ｃ６アルキル、カルボキシル基、シアノ基、ニトロ基、ニトロソ基、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ３－Ｃ６シクロアルキル、Ｃ３－Ｃ６ヘテロシクリル、Ｃ２－Ｃ５ヘテロアリール、及びＣ６－Ｃ１０アリールのうちの少なくとも１つで置換される場合もある（式中、各Ｒ’は、独立的に、水素及びＣ１－Ｃ６アルキルからなる群より選択される）。いくつかの実施形態において、Ｚ’は、１～３０個の炭素原子の直鎖状炭素鎖である。例えば、Ｚ’は、限定されるものではないが、Ｃ１－Ｃ２４アルキレン、Ｃ１－Ｃ２０アルキレン、Ｃ１－Ｃ１６アルキレン、Ｃ１－Ｃ１２アルキレン、Ｃ１－Ｃ８アルキレン、Ｃ１－Ｃ６アルキレン、Ｃ１－Ｃ４アルキレン、Ｃ１－Ｃ３アルキレン、Ｃ１－Ｃ２アルキレン、Ｃ１アルキレンを含めたアルキレン基とすることができる。代表的なアルキレン基としては、限定されるものではないが、メチレン、エチレン、プロピレン、ｎ－ブチレン、エテニレン、プロペニレン、ｎ－ブテニレン、プロピニレン、ｎ－ブチニレンなどが挙げられるが。いくつかの実施形態において、Ｚ’は、１～３０個の炭素原子の直鎖状もしくは分枝状炭素鎖、または１～３０個の原子の直鎖状もしくは分枝状ヘテロ原子含有炭素鎖である。
いくつかの実施形態において、Ｚ’’は、１～３０個の炭素原子の直鎖状もしくは分枝状炭素鎖、１～３０個の原子の直鎖状もしくは分枝状ヘテロ原子含有炭素鎖、３～３０個の炭素原子を含む炭素環、３～３０個の炭素原子を含むアルキレン－炭素環、３～３０個の原子を含む複素環、または３～３０個の原子を含むアルキレン－複素環である。Ｚ’’は、非置換の場合もあれば、ハロゲン、ヒドロキシル、アミノ基、スルホニル基、スルホンアミド基、チオール、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ、Ｃ１－Ｃ６エーテル、Ｃ１－Ｃ６チオエーテル、Ｃ１－Ｃ６スルホン、Ｃ１－Ｃ６スルホキシド、Ｃ１－Ｃ６１級アミド、Ｃ１－Ｃ６２級アミド、ハロＣ１－Ｃ６アルキル、カルボキシル基、シアノ基、ニトロ基、ニトロソ基、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ３－Ｃ６シクロアルキル、Ｃ３－Ｃ６ヘテロシクリル、Ｃ２－Ｃ５ヘテロアリール、及びＣ６－Ｃ１０アリールのうちの少なくとも１つで置換される場合もある（式中、各Ｒ’は、独立的に、水素及びＣ１－Ｃ６アルキルからなる群より選択される）。いくつかの実施形態において、Ｚ’’は、１～３０個の炭素原子の直鎖状炭素鎖である。例えば、Ｚ’’は、限定されるものではないが、Ｃ１－Ｃ２４アルキレン、Ｃ１－Ｃ２０アルキレン、Ｃ１－Ｃ１６アルキレン、Ｃ１－Ｃ１２アルキレン、Ｃ１－Ｃ８アルキレン、Ｃ１－Ｃ６アルキレン、Ｃ１－Ｃ４アルキレン、Ｃ１－Ｃ３アルキレン、Ｃ１－Ｃ２アルキレン、Ｃ１アルキレンを含めたアルキレン基とすることができる。代表的なアルキレン基としては、限定されるものではないが、メチレン、エチレン、プロピレン、ｎ－ブチレン、エテニレン、プロペニレン、ｎ－ブテニレン、プロピニレン、ｎ－ブチニレンなどが挙げられるが。いくつかの実施形態において、Ｚ’’は、１～３０個の炭素原子の直鎖状もしくは分枝状炭素鎖、または１～３０個の原子の直鎖状もしくは分枝状ヘテロ原子含有炭素鎖である。
本開示のある特定の実施形態によれば、Ｇは、－Ｃ－、－Ｓ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｐ（ＯＲ１）－、または－Ｐ（ＯＨ）－であり、よってそれぞれ、カルボニル、スルホキシド、スルホン、及びホスホノ基を形成する。したがって、いくつかの実施形態において、Ｇは－Ｃ－である。いくつかの実施形態において、Ｇは－Ｓ－である。いくつかの実施形態において、Ｇは－Ｓ（Ｏ）－である。
いくつかの実施形態において、式（Ｂ）の化合物は、
Figure 2022514113000016
 であって、式中、
Ｒが、１～１０個の炭素原子の直鎖状もしくは分枝状炭素鎖、１～１０個の原子の直鎖状もしくは分枝状ヘテロ原子含有炭素鎖、３～１０個の炭素原子を含む炭素環、または３～１０個の原子を含む複素環であり、Ｒが、非置換であるか、またはハロゲン、ヒドロキシル、アミノ基、スルホニル基、スルホンアミド基、チオール、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ、Ｃ１－Ｃ６エーテル、Ｃ１－Ｃ６チオエーテル、Ｃ１－Ｃ６スルホン、Ｃ１－Ｃ６スルホキシド、Ｃ１－Ｃ６１級アミド、Ｃ１－Ｃ６２級アミド、ハロＣ１－Ｃ６アルキル、カルボキシル基、シアノ基、ニトロ基、ニトロソ基、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ３－Ｃ６シクロアルキル、Ｃ３－Ｃ６ヘテロシクリル、Ｃ２－Ｃ５ヘテロアリール、及びＣ６－Ｃ１０アリールのうちの少なくとも１つで置換されており（式中、各Ｒ’は、独立的に、水素及びＣ１－Ｃ６アルキルからなる群より選択される）、Ｒ’’が、非置換または置換された、１～１０個の炭素原子の直鎖状もしくは分枝状炭素鎖、１～１０個の原子の直鎖状もしくは分枝状ヘテロ原子含有炭素鎖、３～１０個の炭素原子を含む炭素環、または３～１０個の原子を含む複素環である。いくつかの実施形態において、Ｒは１個の炭素原子である。いくつかの実施形態において、Ｒ’’は、直鎖状または分枝状炭素鎖、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、２－メチル－１－プロピル、２－メチル－２－プロピル、２－メチル－１－ブチル、３－メチル－１－ブチル、２－メチル－３－ブチル、２，２－ジメチル－１－プロピル、２－メチル－１－ペンチル、３－メチル－１－ペンチル、４－メチル－１－ペンチル、２－メチル－２－ペンチル、３－メチル－２－ペンチル、４－メチル－２－ペンチル、２，２－ジメチル－１－ブチル、３，３－ジメチル－１－ブチル、２－エチル－１－ブチル、ブチル、イソブチル、ｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ－ヘキシルである。例えば、いくつかの実施形態において、式（Ｂ）の化合物は
Figure 2022514113000017
 である。いくつかの実施形態において、Ｒは、３～１０個の炭素原子を含む炭素環である。例えば、Ｒは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニル、シクロデシル、フェニル、またはナフチルとすることができる。いくつかの実施形態において、Ｒは、３～１０個の原子を含む複素環である。
ある特定の実施形態において、第１のアミンは、式Ｒ１－ＮＨ２またはＲ１－Ｎ（Ｈ）－Ｚ’－Ｎ（Ｈ）－Ｒ１を有する。いくつかの実施形態において、第１のアミンは、式Ｒ１－ＮＨ２を有する。いくつかの実施形態において、第１のアミンは、式Ｒ１－Ｎ（Ｈ）－Ｚ’－Ｎ（Ｈ）－Ｒ１を有する。いくつかの実施形態において、式Ｒ１－Ｎ（Ｈ）－Ｚ’－Ｎ（Ｈ）－Ｒ１を有する第１のアミンは、
Figure 2022514113000018
 である。いくつかの実施形態において、第１のアミンは、Ｒ１－Ｎ（Ｈ）－Ｚ’－Ｎ－（Ｒ１）２を有する。いくつかの実施形態において、式Ｒ１－Ｎ（Ｈ）－Ｚ’－Ｎ－（Ｒ１）２を有する第１のアミンは、
Figure 2022514113000019
 である。
ある特定の実施形態において、第２のアミンは、式Ｒ２－ＮＨ２またはＲ２－Ｎ（Ｈ）－Ｚ’’－Ｎ（Ｈ）－Ｒ２を有する。いくつかの実施形態において、第２のアミンは、式Ｒ２－ＮＨ２を有する。いくつかの実施形態において、第２のアミンは、式Ｒ２－Ｎ（Ｈ）－Ｚ’’－Ｎ（Ｈ）－Ｒ２を有する。いくつかの実施形態において、式Ｒ２－Ｎ（Ｈ）－Ｚ’’－Ｎ（Ｈ）－Ｒ２を有する第２のアミンは、
Figure 2022514113000020
 である。いくつかの実施形態において、第１のアミンは、Ｒ２－Ｎ（Ｈ）－Ｚ’’－Ｎ－（Ｒ２）２を有する。いくつかの実施形態において、式Ｒ２－Ｎ（Ｈ）－Ｚ’’－Ｎ－（Ｒ２）２を有する第１のアミンは、
Figure 2022514113000021
 である。
ある特定の実施形態において、Ｒ１は、Ｃ１－Ｃ４０アルキル、Ｃ１－Ｃ４０ヘテロアルキル、Ｃ２－Ｃ４０アルケニル、Ｃ２－Ｃ４０ヘテロアルケニレン、Ｃ４－Ｃ８シクロアルケニル、Ｃ２－Ｃ４０アルキニル、Ｃ２－Ｃ４０ヘテロアルキニレン、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、もしくはヘテロアリールであり、当該ヘテロシクリル及びヘテロアリールは、Ｎ、Ｓ、Ｐ、及びＯからなる群より選択される１～５個のヘテロ原子を含み、当該Ｃ１－Ｃ４０アルキル、Ｃ２－Ｃ４０アルケニル、Ｃ４－Ｃ８シクロアルケニル、Ｃ２－Ｃ４０アルキニル、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、及びヘテロアリールは、任意選択で、Ｄ、ハロゲン、Ｃ１－Ｃ６アルキル、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、もしくは－Ｎ（Ｃ１－Ｃ６アルキル）２で置換されている。Ｒ１は、非置換の場合もあれば、ハロゲン、ヒドロキシル、アミノ基、スルホニル基、スルホンアミド基、チオール、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ、Ｃ１－Ｃ６エーテル、Ｃ１－Ｃ６チオエーテル、Ｃ１－Ｃ６スルホン、Ｃ１－Ｃ６スルホキシド、Ｃ１－Ｃ６１級アミド、Ｃ１－Ｃ６２級アミド、ハロＣ１－Ｃ６アルキル、カルボキシル基、シアノ基、ニトロ基、ニトロソ基、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ３－Ｃ６シクロアルキル、Ｃ３－Ｃ６ヘテロシクリル、Ｃ２－Ｃ５ヘテロアリール、及びＣ６－Ｃ１０アリールのうちの少なくとも１つで置換される場合もある（式中、各Ｒ’は、独立的に、水素及びＣ１－Ｃ６アルキルからなる群より選択される）。いくつかの実施形態において、Ｒ１は、Ｃ１－Ｃ２０アルキルである。例えば、Ｒ１は、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、またはＣ２０アルキル基、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、２－メチル－１－プロピル、２－メチル－２－プロピル、２－メチル－１－ブチル、３－メチル－１－ブチル、２－メチル－３－ブチル、２，２－ジメチル－１－プロピル、２－メチル－１－ペンチル、３－メチル－１－ペンチル、４－メチル－１－ペンチル、２－メチル－２－ペンチル、３－メチル－２－ペンチル、４－メチル－２－ペンチル、２，２－ジメチル－１－ブチル、３，３－ジメチル－１－ブチル、２－エチル－１－ブチル、ブチル、イソブチル、ｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ－ヘキシル、ｎ－ヘプチル、ｎ－オクチル、ｎ－ノニル、ｎ－デシル、ｎ－ウンデシル、ｎ－ドデシル、ｎ－トリデシル、ｎ－テトラデシル、ｎ－ペンタデシル、ｎ－ヘキサデシル、ｎ－ヘプタデシル、ｎ－オクタデシル、ｎ－ノナデシル、またはｎ－イコシルとすることができる。いくつかの実施形態において、Ｒ１は置換されていない。いくつかの実施形態において、Ｒ１は置換されている。いくつかの実施形態において、Ｒ１は、
Figure 2022514113000022
 からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ１は、
Figure 2022514113000023
 である。いくつかの実施形態において、Ｒ１は、
Figure 2022514113000024
 である。
ある特定の実施形態において、Ｒ２は、Ｃ１－Ｃ４０アルキル、Ｃ１－Ｃ４０ヘテロアルキル、Ｃ２－Ｃ４０アルケニル、Ｃ２－Ｃ４０ヘテロアルケニレン、Ｃ４－Ｃ８シクロアルケニル、Ｃ２－Ｃ４０アルキニル、Ｃ２－Ｃ４０ヘテロアルキニレン、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、もしくはヘテロアリールであり、当該ヘテロシクリル及びヘテロアリールは、Ｎ、Ｓ、Ｐ、及びＯからなる群より選択される１～５個のヘテロ原子を含み、当該Ｃ１－Ｃ４０アルキル、Ｃ２－Ｃ４０アルケニル、Ｃ４－Ｃ８シクロアルケニル、Ｃ２－Ｃ４０アルキニル、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、及びヘテロアリールは、任意選択で、Ｄ、ハロゲン、Ｃ１－Ｃ６アルキル、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、もしくは－Ｎ（Ｃ１－Ｃ６アルキル）２で置換されている。Ｒ２は、非置換の場合もあれば、ハロゲン、ヒドロキシル、アミノ基、スルホニル基、スルホンアミド基、チオール、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ、Ｃ１－Ｃ６エーテル、Ｃ１－Ｃ６チオエーテル、Ｃ１－Ｃ６スルホン、Ｃ１－Ｃ６スルホキシド、Ｃ１－Ｃ６１級アミド、Ｃ１－Ｃ６２級アミド、ハロＣ１－Ｃ６アルキル、カルボキシル基、シアノ基、ニトロ基、ニトロソ基、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ３－Ｃ６シクロアルキル、Ｃ３－Ｃ６ヘテロシクリル、Ｃ２－Ｃ５ヘテロアリール、及びＣ６－Ｃ１０アリールのうちの少なくとも１つで置換される場合もある（式中、各Ｒ’は、独立的に、水素及びＣ１－Ｃ６アルキルからなる群より選択される）。いくつかの実施形態において、Ｒ２は、Ｃ１－Ｃ２０アルキルである。例えば、Ｒ２は、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、またはＣ２０アルキル基、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、２－メチル－１－プロピル、２－メチル－２－プロピル、２－メチル－１－ブチル、３－メチル－１－ブチル、２－メチル－３－ブチル、２，２－ジメチル－１－プロピル、２－メチル－１－ペンチル、３－メチル－１－ペンチル、４－メチル－１－ペンチル、２－メチル－２－ペンチル、３－メチル－２－ペンチル、４－メチル－２－ペンチル、２，２－ジメチル－１－ブチル、３，３－ジメチル－１－ブチル、２－エチル－１－ブチル、ブチル、イソブチル、ｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ－ヘキシル、ｎ－ヘプチル、ｎ－オクチル、ｎ－ノニル、ｎ－デシル、ｎ－ウンデシル、ｎ－ドデシル、ｎ－トリデシル、ｎ－テトラデシル、ｎ－ペンタデシル、ｎ－ヘキサデシル、ｎ－ヘプタデシル、ｎ－オクタデシル、ｎ－ノナデシル、またはｎ－イコシルとすることができる。いくつかの実施形態において、Ｒ２は置換されていない。いくつかの実施形態において、Ｒ２は置換されている。いくつかの実施形態において、Ｒ２は、
Figure 2022514113000025
 からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ２は、
Figure 2022514113000026
 である。いくつかの実施形態において、Ｒ２は、
Figure 2022514113000027
 である。
いくつかの実施形態において、各Ｑは、ＨまたはＣ１－Ｃ１０直鎖状もしくは分枝状アルキル基である。したがって、いくつかの実施形態において、各ＱはＨである。他の実施形態において、各ＱはＣ１－Ｃ１０直鎖状または分枝状アルキル基である。例えば、各Ｑは、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、２－メチル－１－プロピル、２－メチル－２－プロピル、２－メチル－１－ブチル、３－メチル－１－ブチル、２－メチル－３－ブチル、２，２－ジメチル－１－プロピル、２－メチル－１－ペンチル、３－メチル－１－ペンチル、４－メチル－１－ペンチル、２－メチル－２－ペンチル、３－メチル－２－ペンチル、４－メチル－２－ペンチル、２，２－ジメチル－１－ブチル、３，３－ジメチル－１－ブチル、２－エチル－１－ブチル、ブチル、イソブチル、ｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ－ヘキシル、ｎ－ヘプチル、ｎ－オクチル、ｎ－ノニル、またはｎ－デシルとすることができる。いくつかの実施形態において、各Ｑはメチルである。
いくつかの実施形態において、各Ｊは－Ｏ－である。いくつかの実施形態において、各Ｊは－ＮＨ－である。
いくつかの実施形態において、各Ｅ１は、独立的に、共有結合、－Ｎ－、－Ｏ－、－Ｓ－、アルキレン、ヘテロアルキレン、アルケニル、ヘテロアルケニレン、アルキニル、ヘテロアルキニレンからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、各Ｅ１はヘテロアルキレンである。いくつかの実施形態において、各Ｅ１は－ＣＨ２－Ｏ－である。様々な実施形態において、各ｎは、少なくとも１である。例えば、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり得る。いくつかの実施形態において、ｎは１である。
いくつかの実施形態において、Ａは、１～３０個の炭素原子の直鎖状もしくは分枝状炭素鎖、２～３０個の原子の直鎖状もしくは分枝状ヘテロ原子含有炭素鎖、３～３０個の炭素原子を含む炭素環、または３～３０個の原子を含む複素環である。例えば、いくつかの実施形態において、Ａは
Figure 2022514113000028
 である。
いくつかの実施形態において、本開示のポリマーは、一般構造
Figure 2022514113000029
 を有し、式中、波状の結合
Figure 2022514113000030
 は、ポリマーの残りに対する結合を表し、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ４は、本明細書で示されるいずれかの定義を有する。連続的な直鎖状オリゴマーの成長及び分岐が高度に制御されているため、得られるポリマーは、上記の構造に示されるように、より均一に直鎖状セグメント及び分岐単位が分布している。以降のセクション及び実施例で説明されるように、ポリマーは、強力なＤＮＡ結合親和性を有しており、ＤＮＡを凝縮してナノサイズのポリプレックスをほぼ１００％の細胞取込み効率で製剤化することができる。いくつかの実施形態において、本開示のポリマーは、
Figure 2022514113000031
 である（式中、Ｒ２基は本明細書で示されるいずれかの定義を有する）。
いくつかの実施形態において、本開示は、
Figure 2022514113000032
 を含むポリマーであって、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ａ、Ｅ１、Ｇ、Ｊ、Ｑ、Ｚ、Ｚ’’、及びｎが、本明細書で示されるいずれかの定義を有する、ポリマーを提供する。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約３ｋＤａ～約２００ｋＤａである。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約５ｋＤａ～約５０ｋＤａである。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約１０ｋＤａから５０ｋＤａの間である。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約５ｋＤａ～約１５ｋＤａである。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約１０ｋＤａである。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約２０ｋＤａである。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約３０ｋＤａである。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約４０ｋＤａである。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのマーク－フウィンクから定義されるアルファパラメーターは、約０．５未満である。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのマーク－フウィンクの式から定義されるアルファパラメーターは、約０．３～約０．５を範囲とする。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＰＤＩは約１．０～約８．０である。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＰＤＩは約２．５である。
いくつかの実施形態において、本開示は、
Figure 2022514113000033
 を含むポリマーであって、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ａ、Ｅ１、Ｇ、Ｊ、Ｑ、Ｚ、及びｎが、本明細書で示されるいずれかの定義を有する、ポリマーを提供する。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約３ｋＤａ～約２００ｋＤａである。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約５ｋＤａ～約５０ｋＤａである。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約１０ｋＤａから５０ｋＤａの間である。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約５ｋＤａ～約１５ｋＤａである。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約１０ｋＤａである。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約２０ｋＤａである。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約３０ｋＤａである。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約４０ｋＤａである。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのマーク－フウィンクから定義されるアルファパラメーターは、約０．５未満である。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのマーク－フウィンクの式から定義されるアルファパラメーターは、約０．３～約０．５を範囲とする。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＰＤＩは約１．０～約８．０である。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＰＤＩは約２．５である。
いくつかの実施形態において、本開示は、
Figure 2022514113000034
 を含むポリマーであって、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ａ、Ｅ１、Ｇ、Ｊ、Ｑ、Ｚ、Ｚ’’、及びｎが、本明細書で示されるいずれかの定義を有する、ポリマーを提供する。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約３ｋＤａ～約２００ｋＤａである。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約５ｋＤａ～約５０ｋＤａである。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約１０ｋＤａから５０ｋＤａの間である。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約５ｋＤａ～約１５ｋＤａである。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約１０ｋＤａである。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約２０ｋＤａである。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約３０ｋＤａである。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約４０ｋＤａである。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのマーク－フウィンクから定義されるアルファパラメーターは、約０．５未満である。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのマーク－フウィンクの式から定義されるアルファパラメーターは、約０．３～約０．５を範囲とする。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＰＤＩは約１．０～約８．０である。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＰＤＩは約２．５である。
いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーは、
Figure 2022514113000035
 を含む。
いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーは、
Figure 2022514113000036
 を含み、式中、
ＪはＯであり、Ｚは
Figure 2022514113000037
 であり、式中、ｘは１～１０００である。
いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーは、
Figure 2022514113000038
 を含む。
いくつかのさらなる実施形態において、Ｒ１は
Figure 2022514113000039
 から選択される。
いくつかのさらなる実施形態において、Ｒ１は、
Figure 2022514113000040
 である。
いくつかのさらなる実施形態において、Ｒ１は、
Figure 2022514113000041
 である。
いくつかのさらなる実施形態において、Ｒ２は
Figure 2022514113000042
 から選択される。
いくつかのさらなる実施形態において、Ｒ２は、
Figure 2022514113000043
 である。
いくつかのさらなる実施形態において、Ｒ２は、
Figure 2022514113000044
 である。
いくつかのさらなる実施形態において、Ｒ１は
Figure 2022514113000045
 であり、Ｒ２は
Figure 2022514113000046
 である。
いくつかのさらなる実施形態において、Ｒ１は
Figure 2022514113000047
 であり、Ｒ２は
Figure 2022514113000048
 である。
いくつかの実施形態において、ポリマーは、
Figure 2022514113000049
 を含み、式中、
Ｒ１は
Figure 2022514113000050
 であり、
Ｒ２は
Figure 2022514113000051
 から選択される。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約３ｋＤａ～約２００ｋＤａである。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約５ｋＤａ～約５０ｋＤａである。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約１０ｋＤａから５０ｋＤａの間である。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約５ｋＤａ～約１５ｋＤａである。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約１０ｋＤａである。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約２０ｋＤａである。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約３０ｋＤａである。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約４０ｋＤａである。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのマーク－フウィンクから定義されるアルファパラメーターは、約０．５未満である。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのマーク－フウィンクの式から定義されるアルファパラメーターは、約０．３～約０．５を範囲とする。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＰＤＩは約１．０～約８．０である。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＰＤＩは約２．５である。
いくつかの実施形態において、ポリマーは、
Figure 2022514113000052
 を含み、式中、
ＪはＯであり、Ｚは
Figure 2022514113000053
 であり、式中、ｘは１～１０００であり、
Ｒ１は
Figure 2022514113000054
 であり、
Ｒ２は
Figure 2022514113000055
 である。
いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約３ｋＤａ～約２００ｋＤａである。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約５ｋＤａ～約５０ｋＤａである。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約１０ｋＤａから５０ｋＤａの間である。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約５ｋＤａ～約１５ｋＤａである。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約１０ｋＤａである。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約２０ｋＤａである。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約３０ｋＤａである。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約４０ｋＤａである。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのマーク－フウィンクから定義されるアルファパラメーターは、約０．５未満である。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのマーク－フウィンクの式から定義されるアルファパラメーターは、約０．３～約０．５を範囲とする。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＰＤＩは約１．０～約８．０である。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＰＤＩは約２．５である。
いくつかの実施形態において、本開示のある特定のポリマーは、式（Ａ）の化合物と式Ｒ１－ＮＨ２またはＲ１－Ｎ（Ｈ）－Ｚ’－Ｎ（Ｈ）－Ｒ１（本明細書で説明の通り）を有する第１のアミンとの直鎖状ポリマー（オリゴマー）が式（Ｂ）の化合物（本明細書で説明の通り）と架橋したものとして説明することができる。式（Ａ）の化合物が式Ｒ１－ＮＨ２またはＲ１－Ｎ（Ｈ）－Ｚ’－Ｎ（Ｈ）－Ｒ１を有する第１のアミンよりもモル過剰で存在する条件下で直鎖状オリゴマーが調製される場合、得られるオリゴマー種は、マイケルアクセプター基（例えば、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、または他のこのような基）で終結し、また、続いて適切な条件下で、式Ｒ２－ＮＨ２またはＲ２－Ｎ（Ｈ）－Ｚ’’－Ｎ（Ｈ）－Ｒ２（本明細書で説明の通り）を有する第２のアミンでエンドキャップしてもよい。次いで、得られたエンドキャップオリゴマーを、式（Ｂ）の三官能性マイケルアクセプター化合物（本明細書で説明の通り）と反応させて分枝状構造を得ることができる。代替的に、このような架橋ポリマーは、オリゴマーセグメントの分子量分布（例えば、本明細書で開示されるような約３～約２００の範囲のＭｗ値）及び式（Ｂ）のマイケルアクセプター化合物の取込みから誘導される架橋のモルまたは重量パーセンテージによって定義することができる。
いくつかの実施形態において、モル過剰の式（Ａ）の化合物を第１のアミンと反応させる。例えば、式（Ａ）の化合物：第１のアミンの化学量論比は、約１．１：１～約１０：１を範囲とすることができ、これには約１．１：１、約１．２：１、約１．３：１、約１．４：１、約１．５：１、約１．６：１、約１．７：１、約１．８：１、約１．９：１、約２：１、約３：１、約４：１、約５：１、約６：１、約７：１、約８：１、約９：１、または約１０：１（これらの間の全ての範囲を含む）が含まれる。
いくつかの実施形態において、式（Ａ）の化合物：第１のアミンの化学量論比は、約１．１：１、約１．２：１、約１．３：１、約１．４：１、約１．５：１、約１．６：１、約１．７：１、約１．８：１、約１．９：１、約２：１、約３：１、約４：１、約５：１、約６：１、約７：１、約８：１、約９：１、または約１０：１である。いくつかの実施形態において、式（Ａ）の化合物：第１のアミンの化学量論比は、約１．１：１～約２：１を範囲とすることができる。いくつかの実施形態において、式（Ａ）の化合物：第１のアミンの化学量論比は、約１．２：１である。いくつかの実施形態において、式（Ａ）の化合物は、モル等価（すなわち、約１：１）で第１のアミンと反応させる。
いくつかの実施形態において、ステップ（ａ）は、有機溶媒中で実施される。多種多様な有機溶媒を本開示の文脈で使用することができ、このような有機溶媒には、限定されるものではないが、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ－メチルピロリドン（ＮＭＰ）など；ケトン、例えば、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトンなど；エーテル、例えば、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジエチルエーテル、メチル３級ブチルエーテルなど；炭化水素、例えば、トルエン、キシレン、シクロヘキサンなどが含まれる。いくつかの実施形態において、ステップ（ａ）はＤＭＳＯ中で実施される。
いくつかの実施形態において、ステップ（ａ）は、約４０℃から約１２０℃の範囲の温度で実施され、これには約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、約５０、約５１、約５２、約５３、約５４、約５５、約５６、約５７、約５８、約５９、約６０、約６１、約６２、約６３、約６４、約６５、約６６、約６７、約６８、約６９、約７０、約７１、約７２、約７３、約７４、約７５、約７６、約７７、約７８、約７９、約８０、約８１、約８２、約８３、約８４、約８５、約８６、約８７、約８８、約８９、約９０、約９１、約９２、約９３、約９４、約９５、約９６、約９７、約９８、約９９、約１００、約１０１、約１０２、約１０３、約１０４、約１０５、約１０６、約１０７、約１０８、約１０９、約１１０、約１１１、約１１２、約１１３、約１１４、約１１５、約１１６、約１１７、約１１８、約１１９、または１２０℃（これらの間の全ての範囲を含む）が含まれる。
いくつかの実施形態において、ステップ（ａ）は、４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、約５０、約５１、約５２、約５３、約５４、約５５、約５６、約５７、約５８、約５９、約６０、約６１、約６２、約６３、約６４、約６５、約６６、約６７、約６８、約６９、約７０、約７１、約７２、約７３、約７４、約７５、約７６、約７７、約７８、約７９、約８０、約８１、約８２、約８３、約８４、約８５、約８６、約８７、約８８、約８９、約９０、約９１、約９２、約９３、約９４、約９５、約９６、約９７、約９８、約９９、約１００、約１０１、約１０２、約１０３、約１０４、約１０５、約１０６、約１０７、約１０８、約１０９、約１１０、約１１１、約１１２、約１１３、約１１４、約１１５、約１１６、約１１７、約１１８、約１１９、または１２０℃で実施される。いくつかの実施形態において、ステップ（ａ）は約９０℃で実施される。
いくつかの実施形態において、ステップ（ａ）の生成物は、ステップ（ｂ）の前に精製されない。他の実施形態において、ステップ（ａ）の生成物は、ステップ（ｂ）の前に精製される。ステップ（ａ）の生成物は、当業者にとって明らかな様々な方法及び技法によって精製することができる。
いくつかの実施形態において、モル過剰の第２のアミンをステップ（ａ）の生成物に添加する。例えば、第２のアミン：ステップ（ａ）の生成物の化学量論比は、約１．１：１～約１０：１を範囲とすることができ、これには約１．１：１、約１．２：１、約１．３：１、約１．４：１、約１．５：１、約１．６：１、約１．７：１、約１．８：１、約１．９：１、約２：１、約３：１、約４：１、約５：１、約６：１、約７：１、約８：１、約９：１、または約１０：１（これらの間の全ての範囲を含む）が含まれる。
いくつかの実施形態において、第２のアミン：ステップ（ａ）の生成物の化学量論比は、約１．１：１、約１．２：１、約１．３：１、約１．４：１、約１．５：１、約１．６：１、約１．７：１、約１．８：１、約１．９：１、約２：１、約３：１、約４：１、約５：１、約６：１、約７：１、約８：１、約９：１、または約１０：１である。いくつかの実施形態において、第２のアミン：ステップ（ａ）の化学量論比は約５：１である。いくつかの実施形態において、第２のアミンは、モル等価（すなわち、約１：１）でステップ（ａ）の生成物と反応させる。
いくつかの実施形態において、ステップ（ｂ）は、約１６℃～約４０℃の範囲の温度で実施される。例えば、ステップ（ｂ）は、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９～約４０℃の範囲の温度（これらの間の全ての範囲を含む）で実施される。
いくつかの実施形態において、ステップ（ｂ）は、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、または約４０℃の温度で実施される。
いくつかの実施形態において、ステップ（ｂ）の生成物は、ステップ（ｃ）の前に精製されない。他の実施形態において、ステップ（ｂ）の生成物は、ステップ（ｃ）の前に精製される。ステップ（ｂ）の生成物は、当業者にとって明らかな様々な方法及び技法によって精製することができる。例えば、ステップ（ｂ）の生成物は、透析によって精製することができる。
いくつかの実施形態において、ステップ（ｃ）は、ステップ（ｂ）より高い温度で実施される。例えば、ステップ（ｃ）は、約２１℃～約２００℃の範囲の温度で実施される。例えば、ステップ（ｃ）は、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、約５０、約５１、約５２、約５３、約５４、約５５、約５６、約５７、約５８、約５９、約６０、約６１、約６２、約６３、約６４、約６５、約６６、約６７、約６８、約６９、約７０、約７１、約７２、約７３、約７４、約７５、約７６、約７７、約７８、約７９、約８０、約８１、約８２、約８３、約８４、約８５、約８６、約８７、約８８、約８９、約９０、約９１、約９２、約９３、約９４、約９５、約９６、約９７、約９８、約９９、約１００、約１０１、約１０２、約１０３、約１０４、約１０５、約１０６、約１０７、約１０８、約１０９、約１１０、約１１１、約１１２、約１１３、約１１４、約１１５、約１１６、約１１７、約１１８、約１１９、約１２０、約１２１、約１２２、約１２３、約１２４、約１２５、約１２６、約１２７、約１２８、約１２９、約１３０、約１３１、約１３２、約１３３、約１３４、約１３５、約１３６、約１３７、約１３８、約１３９、約１４０、約１４１、約１４２、約１４３、約１４４、約１４５、約１４６、約１４７、約１４８、約１４９、約１５０、約１５１、約１５２、約１５３、約１５４、約１５５、約１５６、約１５７、約１５８、約１５９、約１６０、約１６１、約１６２、約１６３、約１６４、約１６５、約１６６、約１６７、約１６８、約１６９、約１７０、約１７１、約１７２、約１７３、約１７４、約１７５、約１７６、約１７７、約１７８、約１７９、約１８０、約１８１、約１８２、約１８３、約１８４、約１８５、約１８６、約１８７、約１８８、約１８９、約１９０、約１９１、約１９２、約１９３、約１９４、約１９５、約１９６、約１９７、約１９８、約１９９～約２００℃の範囲の温度（これらの間の全ての範囲を含む）で実施される。
いくつかの実施形態において、ステップ（ｃ）は、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、約５０、約５１、約５２、約５３、約５４、約５５、約５６、約５７、約５８、約５９、約６０、約６１、約６２、約６３、約６４、約６５、約６６、約６７、約６８、約６９、約７０、約７１、約７２、約７３、約７４、約７５、約７６、約７７、約７８、約７９、約８０、約８１、約８２、約８３、約８４、約８５、約８６、約８７、約８８、約８９、約９０、約９１、約９２、約９３、約９４、約９５、約９６、約９７、約９８、約９９、約１００、約１０１、約１０２、約１０３、約１０４、約１０５、約１０６、約１０７、約１０８、約１０９、約１１０、約１１１、約１１２、約１１３、約１１４、約１１５、約１１６、約１１７、約１１８、約１１９、約１２０、約１２１、約１２２、約１２３、約１２４、約１２５、約１２６、約１２７、約１２８、約１２９、約１３０、約１３１、約１３２、約１３３、約１３４、約１３５、約１３６、約１３７、約１３８、約１３９、約１４０、約１４１、約１４２、約１４３、約１４４、約１４５、約１４６、約１４７、約１４８、約１４９、約１５０、約１５１、約１５２、約１５３、約１５４、約１５５、約１５６、約１５７、約１５８、約１５９、約１６０、約１６１、約１６２、約１６３、約１６４、約１６５、約１６６、約１６７、約１６８、約１６９、約１７０、約１７１、約１７２、約１７３、約１７４、約１７５、約１７６、約１７７、約１７８、約１７９、約１８０、約１８１、約１８２、約１８３、約１８４、約１８５、約１８６、約１８７、約１８８、約１８９、約１９０、約１９１、約１９２、約１９３、約１９４、約１９５、約１９６、約１９７、約１９８、約１９９～約２００℃で実施される。いくつかの実施形態において、ステップ（ｃ）は約９０℃で実施される。
いくつかの実施形態において、本開示は、式（Ｉ）のポリマー：
Figure 2022514113000056
 （Ｉ）
であって、式中、
各Ａが、独立的に、１～３０個の炭素原子の直鎖状もしくは分枝状炭素鎖、１～３０個の原子の直鎖状もしくは分枝状ヘテロ原子含有炭素鎖、３～３０個の炭素原子を含む炭素環、または３～３０個の原子を含む複素環であり、
Ａが、任意選択で、１つ以上のハロゲン、ヒドロキシル、アミノ基、スルホニル基、スルホンアミド基、チオール、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ、Ｃ１－Ｃ６エーテル、Ｃ１－Ｃ６チオエーテル、Ｃ１－Ｃ６スルホン、Ｃ１－Ｃ６スルホキシド、Ｃ１－Ｃ６１級アミド、Ｃ１－Ｃ６２級アミド、ハロＣ１－Ｃ６アルキル、カルボキシル基、シアノ基、ニトロ基、ニトロソ基、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ３－Ｃ６シクロアルキル、Ｃ３－Ｃ６ヘテロシクリル、Ｃ２－Ｃ５ヘテロアリール、またはＣ６－Ｃ１０アリールで置換され（式中、各Ｒ’は、独立的に、水素及びＣ１－Ｃ６アルキルからなる群より選択される）、
各Ｂが、独立的に、
Figure 2022514113000057
 であり、
Ｇが、－Ｃ－、－Ｓ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｐ（ＯＲ１）－、または－Ｐ（ＯＨ）－であり、ｎが少なくとも１であり、
各Ｅ１が、共有結合、－Ｎ－、－Ｏ－、－Ｓ－、アルキレン、ヘテロアルキレン、アルケニル、ヘテロアルケニレン、アルキニル、ヘテロアルキニレンからなる群より選択され；
各Ｅ２が、共有結合、－Ｎ－、－Ｏ－、－Ｓ－、アルキレン、ヘテロアルキレン、アルケニル、ヘテロアルケニレン、アルキニル、ヘテロアルキニレンからなる群より選択され、
各Ｘが、独立的に、
Figure 2022514113000058
 であり、
各Ｙが、独立的に、
Figure 2022514113000059
 であり、
各Ｌが、独立的に、第２の結合部分であり、
各Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３が、各出現において独立的に、Ｈ、Ｃ１－Ｃ４０アルキル、Ｃ１－Ｃ４０ヘテロアルキル、Ｃ２－Ｃ４０アルケニル、Ｃ２－Ｃ４０ヘテロアルケニレン、Ｃ４－Ｃ８シクロアルケニル、Ｃ２－Ｃ４０アルキニル、Ｃ２－Ｃ４０ヘテロアルキニレン、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、もしくはヘテロアリールであり、当該ヘテロシクリル及びヘテロアリールが、Ｎ、Ｓ、Ｐ、及びＯからなる群より選択される１～５個のヘテロ原子を含み、当該Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ８アルケニル、Ｃ４－Ｃ８シクロアルケニル、Ｃ２－Ｃ６アルキニル、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、及びヘテロアリールが、任意選択で、Ｄ、ハロゲン、Ｃ１－Ｃ６アルキル、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、もしくは－Ｎ（Ｃ１－Ｃ６アルキル）２で置換され、または
Ｒ２及びＲ３が、それらが結合する原子と一緒になって、Ｎ、Ｓ、Ｐ、及びＯからなる群より選択される１～３個のヘテロ原子を含むヘテロシクリルまたはヘテロアリールを形成してもよく、
ａが１～１０００であり、
ｂが３または４であり、
ｃが１～３であり、
ｚが１～１００であり、
ただし、Ｒ２及びＲ３の少なくとも一方がＨではなく、ＧがＣの場合、Ｅ１が－ＣＨ２－Ｏ－ではないことを前提とする、ポリマーを提供する。
ある特定の実施形態において、本開示は、式（ＩＩ）のポリマー：
Figure 2022514113000060
 であって、式中、
各Ｅ１が、共有結合、－Ｎ－、－Ｏ－、－Ｓ－、アルキレン、ヘテロアルキレン、アルケニル、ヘテロアルケニレン、アルキニル、ヘテロアルキニレンからなる群より選択され；
各Ｅ２が、共有結合、－Ｎ－、－Ｏ－、－Ｓ－、アルキレン、ヘテロアルキレン、アルケニル、ヘテロアルケニレン、アルキニル、ヘテロアルキニレンからなる群より選択され；
Ｇが、－Ｃ－、－Ｓ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｐ（ＯＲ１）－、または－Ｐ（ＯＨ）－であり、
ｎが少なくとも１であり、
ただし、ＧがＣである場合、Ｅ１が－ＣＨ２－Ｏ－ではないことを前提とする、ポリマーを提供する。
いくつかの実施形態において、各Ｅ１及びＥ２は、独立的に、共有結合、－Ｎ－、－Ｓ－、アルキレン、ヘテロアルキレン、アルケニル、ヘテロアルケニレン、アルキニル、ヘテロアルキニレンからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、各Ｅ１はヘテロアルキレンである。いくつかの実施形態において、各Ｅ１は－ＣＨ２－Ｎ－である。いくつかの実施形態において、各Ｅ２はアルキレンである。いくつかの実施形態において、各Ｅ２は、
Figure 2022514113000061
 である。いくつかの実施形態において、各Ｅ２は、
Figure 2022514113000062
 である。いくつかの実施形態において、各ｎは少なくとも１である。例えば、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０とすることができる。いくつかの実施形態において、ｎは１である。いくつかの実施形態において、Ｇは－Ｃ－である。いくつかの実施形態において、各Ｂは、
Figure 2022514113000063
 ある。
いくつかの実施形態において、各Ｌは
Figure 2022514113000064
 であり、式中、ｘは１～１０００である。いくつかの実施形態において、ａは少なくとも２であり、ｂは３であり、各Ｘは、
Figure 2022514113000065
 である。いくつかの実施形態において、各Ａは、
Figure 2022514113000066
 である。いくつかの実施形態において、各Ｌは、
Figure 2022514113000067
 である。
いくつかの実施形態において、各Ｒ２及び／またはＲ３は
Figure 2022514113000068
 である。
いくつかの実施形態において、各Ｒ１は
Figure 2022514113000069
 である。
いくつかの実施形態において、本開示は、式（ＩＩＩ）～（ＶＩＩｅ）のポリマー：
Figure 2022514113000070
Figure 2022514113000071
Figure 2022514113000072
 であって、式中、各Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７が、各出現において独立的に、Ｈ、Ｃ１－Ｃ４０アルキル、Ｃ１－Ｃ４０ヘテロアルキル、Ｃ２－Ｃ４０アルケニル、Ｃ２－Ｃ４０ヘテロアルケニレン、Ｃ４－Ｃ８シクロアルケニル、Ｃ２－Ｃ４０アルキニル、Ｃ２－Ｃ４０ヘテロアルキニレン、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、もしくはヘテロアリールであり、当該ヘテロシクリル及びヘテロアリールが、Ｎ、Ｓ、Ｐ、及びＯからなる群より選択される１～５個のヘテロ原子を含み、当該Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ８アルケニル、Ｃ４－Ｃ８シクロアルケニル、Ｃ２－Ｃ６アルキニル、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、及びヘテロアリールが、任意選択で、Ｄ、ハロゲン、Ｃ１－Ｃ６アルキル、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、もしくは－Ｎ（Ｃ１－Ｃ６アルキル）２で置換され、残りの変数が上記で定義されている通りである、ポリマーを提供する。
いくつかの実施形態において、ｚは、１、２、または３である。いくつかの実施形態において、ｚは１である。
マーク－フウィンクの式から定義されるアルファパラメーターは、マーク－フウィンクプロットを意味する。マーク－フウィンクプロットは、高感度で構造－分子量の関係を明らかにするため、溶液中のポリマー構造を調べるための強力なツールである。このプロットは、固有粘度（ＩＶ）に対する分子量（ＭＷ）を対数－対数グラフ上にプロットすることによって生成される。分子量は、当然ながらポリマー鎖の長さ（または重合度）を示すが、それ自体は何ら構造を示すことはできない。固有粘度（ｄＬ／ｇで表される）は、溶液中のポリマー鎖の分子密度の測定値である。溶液中で鎖のフォールディングまたはコイルが緊密になるほど、密度は高くなり、固有粘度は低くなる。この測定値は分子量に依存しないため、同じ分子量を有する２つの異なる構造は異なる固有粘度を有する場合があり、例えば、同じ分子量の直鎖状（非分枝状）ポリマー及び分枝状ポリマーは、異なる固有粘度を有する。さらに、ポリマーがその分子量分布にわたって構造を変化させる（例えば、より多く置換される）場合、固有粘度の変化は容易に検出される。このため、マーク－フウィンクプロットが非常に有用かつ強力なものとなる。マーク－フウィンクプロットの生データは、光散乱検出器からの分子量と粘度検出器からの固有粘度とを組み合わせることによって、高品質の多重検出ＧＰＣ／ＳＥＣデータから好都合かつ簡便に得られる。両方のデータセットは、試料の溶出プロファイルにまたがった各点で測定される。得られたプロットは、単に２つの構造がどの程度近いかの評価からポリマー分岐の複雑な定量的測定の実施に至るまで、多くの方法で使用することができる。概して、α＜０．５：コンパクト／球状鎖、０．５＜α＜０．８：ランダムコイル／フレキシブル鎖、０．５＜α＜０．８：剛性のロッド／硬い鎖である。
いくつかの実施形態において、本開示のポリマーのマーク－フウィンクの式から定義されるアルファパラメーターは、約０．５未満である。例えば、本開示のポリマーのマーク－フウィンクの式から定義されるアルファパラメーターは、約０．０１～約０．４９を範囲とする。例えば、本開示のポリマーのマーク－フウィンクの式から定義されるアルファパラメーターは、約０．０１、約０．０２、約０．０３、約０．０４、約０．０５、約０．０６、約０．０７、約０．０８、約０．０９、約０．１０、約０．１１、約０．１２、約０．１３、約０．１４、約０．１５、約０．１６、約０．１７、約０．１８、約０．１９、約０．２０、約０．２１、約０．２２、約０．２３、約０．２４、約０．２５、約０．２６、約０．２７、約０．２８、約０．２９、約０．３０、約０．３１、約０．３２、約０．３３、約０．３４、約０．３５、約０．３６、約０．３７、約０．３８、約０．３９、約０．４０、約０．４１、約０．４２、約０．４３、約０．４４、約０．４５、約０．４６、約０．４７、約０．４８～約０．４９を範囲とする。いくつかの実施形態において、本開示のポリマーのマーク－フウィンクの式から定義されるアルファパラメーターは、約０．２～約０．５である。
いくつかの実施形態において、本開示のポリマーのマーク－フウィンクの式から定義されるアルファパラメーターは、約０．０１、約０．０２、約０．０３、約０．０４、約０．０５、約０．０６、約０．０７、約０．０８、約０．０９、約０．１０、約０．１１、約０．１２、約０．１３、約０．１４、約０．１５、約０．１６、約０．１７、約０．１８、約０．１９、約０．２０、約０．２１、約０．２２、約０．２３、約０．２４、約０．２５、約０．２６、約０．２７、約０．２８、約０．２９、約０．３０、約０．３１、約０．３２、約０．３３、約０．３４、約０．３５、約０．３６、約０．３７、約０．３８、約０．３９、約０．４０、約０．４１、約０．４２、約０．４３、約０．４４、約０．４５、約０．４６、約０．４７、約０．４８、または約０．４９である。
「多分散性指数」（ＰＤＩ）という用語は、所与のポリマー試料中の分子量分布の尺度を意味する。多分散性指数は、重量平均分子量（Ｍｗ）を数平均分子量（Ｍｎ）で割ることによって計算される。本明細書で使用する場合、「重量平均分子量」という用語は、概して、そのサイズに応じたポリマー分子の寄与に依存する分子量測定値を意味する。本明細書で使用する場合、「数平均分子量」という用語は、概して、試料中の全てのポリマー分子の総重量を試料中のポリマー分子の総数で割ることによって計算される分子量測定値を意味する。これらの用語は当業者に周知されている。
いくつかの実施形態において、本開示のポリマーのＰＤＩは約１．０１～約８．０である。例えば、ＰＤＩは、約１．０１、約１．０２、約１．０３、約１．０４、約１．０５、約１．０６、約１．０７、約１．０８、約１．０９、約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９、約２．０、約２．１、約２．２、約２．３、約２．４、約２．５、約２．６、約２．７、約２．８、約２．９、約３．０、約３．１、約３．２、約３．３、約３．４、約３．５、約３．６、約３．７、約３．８、約３．９、約４．０、約４．１、約４．２、約４．３、約４．４、約４．５、約４．６、約４．７、約４．８、約４．９、約５．０、約５．１、約５．２、約５．３、約５．４、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、約６．０、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、約７．０、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、約７．６、約７．７、約７．８、約７．９～約８．０（これらの間の全ての範囲を含む）を範囲とすることができる。
いくつかの実施形態において、本開示のポリマーのマーク－フウィンクの式から定義されるＰＤＩは、約１．０１、約１．０２、約１．０３、約１．０４、約１．０５、約１．０６、約１．０７、約１．０８、約１．０９、約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９、約２．０、約２．１、約２．２、約２．３、約２．４、約２．５、約２．６、約２．７、約２．８、約２．９、約３．０、約３．１、約３．２、約３．３、約３．４、約３．５、約３．６、約３．７、約３．８、約３．９、約４．０、約４．１、約４．２、約４．３、約４．４、約４．５、約４．６、約４．７、約４．８、約４．９、約５．０、約５．１、約５．２、約５．３、約５．４、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、約６．０、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、約７．０、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、約７．６、約７．７、約７．８、約７．９、または約８．０である。いくつかの実施形態において、本開示のポリマーのＰＤＩは約２．５である。
いくつかの実施形態において、本開示のポリマーのＭＷは少なくとも３ｋＤａである。いくつかの実施形態において、本開示のポリマーのＭＷは約３ｋＤａ～約２００ｋＤａである。したがって、本開示のポリマーのＭＷは、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、約５０、約５１、約５２、約５３、約５４、約５５、約５６、約５７、約５８、約５９、約６０、約６１、約６２、約６３、約６４、約６５、約６６、約６７、約６８、約６９、約７０、約７１、約７２、約７３、約７４、約７５、約７６、約７７、約７８、約７９、約８０、約８１、約８２、約８３、約８４、約８５、約８６、約８７、約８８、約８９、約９０、約９１、約９２、約９３、約９４、約９５、約９６、約９７、約９８、約９９、約１００、約１０１、約１０２、約１０３、約１０４、約１０５、約１０６、約１０７、約１０８、約１０９、約１１０、約１１１、約１１２、約１１３、約１１４、約１１５、約１１６、約１１７、約１１８、約１１９、約１２０、約１２１、約１２２、約１２３、約１２４、約１２５、約１２６、約１２７、約１２８、約１２９、約１３０、約１３１、約１３２、約１３３、約１３４、約１３５、約１３６、約１３７、約１３８、約１３９、約１４０、約１４１、約１４２、約１４３、約１４４、約１４５、約１４６、約１４７、約１４８、約１４９、約１５０、約１５１、約１５２、約１５３、約１５４、約１５５、約１５６、約１５７、約１５８、約１５９、約１６０、約１６１、約１６２、約１６３、約１６４、約１６５、約１６６、約１６７、約１６８、約１６９、約１７０、約１７１、約１７２、約１７３、約１７４、約１７５、約１７６、約１７７、約１７８、約１７９、約１８０、約１８１、約１８２、約１８３、約１８４、約１８５、約１８６、約１８７、約１８８、約１８９、約１９０、約１９１、約１９２、約１９３、約１９４、約１９５、約１９６、約１９７、約１９８、約１９９～約２００ｋＤａ（これらの間の全ての範囲を含む）を範囲とする。いくつかの実施形態において、ポリマーのＭＷは約５ｋＤａから５０ｋＤａの間である。いくつかの実施形態において、ポリマーのＭＷは約１０ｋＤａから５０ｋＤａの間である。
いくつかの実施形態において、本開示のポリマーのＭＷは、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、約５０、約５１、約５２、約５３、約５４、約５５、約５６、約５７、約５８、約５９、約６０、約６１、約６２、約６３、約６４、約６５、約６６、約６７、約６８、約６９、約７０、約７１、約７２、約７３、約７４、約７５、約７６、約７７、約７８、約７９、約８０、約８１、約８２、約８３、約８４、約８５、約８６、約８７、約８８、約８９、約９０、約９１、約９２、約９３、約９４、約９５、約９６、約９７、約９８、約９９、約１００、約１０１、約１０２、約１０３、約１０４、約１０５、約１０６、約１０７、約１０８、約１０９、約１１０、約１１１、約１１２、約１１３、約１１４、約１１５、約１１６、約１１７、約１１８、約１１９、約１２０、約１２１、約１２２、約１２３、約１２４、約１２５、約１２６、約１２７、約１２８、約１２９、約１３０、約１３１、約１３２、約１３３、約１３４、約１３５、約１３６、約１３７、約１３８、約１３９、約１４０、約１４１、約１４２、約１４３、約１４４、約１４５、約１４６、約１４７、約１４８、約１４９、約１５０、約１５１、約１５２、約１５３、約１５４、約１５５、約１５６、約１５７、約１５８、約１５９、約１６０、約１６１、約１６２、約１６３、約１６４、約１６５、約１６６、約１６７、約１６８、約１６９、約１７０、約１７１、約１７２、約１７３、約１７４、約１７５、約１７６、約１７７、約１７８、約１７９、約１８０、約１８１、約１８２、約１８３、約１８４、約１８５、約１８６、約１８７、約１８８、約１８９、約１９０、約１９１、約１９２、約１９３、約１９４、約１９５、約１９６、約１９７、約１９８、約１９９～約２００ｋＤａである。いくつかの実施形態において、ポリマーのＭＷは約５ｋＤａから５０ｋＤａの間である。いくつかの実施形態において、ポリマーのＭＷは約１０ｋＤａから５０ｋＤａの間である。いくつかの実施形態において、ポリマーのＭＷは約１０ｋＤａである。いくつかの実施形態において、ポリマーのＭＷは約２０ｋＤａである。いくつかの実施形態において、ポリマーのＭＷは約３０ｋＤａである。いくつかの実施形態において、ポリマーのＭＷは約４０ｋＤａである。
いくつかの実施形態において、ステップ（ｂ）の後の生成物のＭＷは約３ｋＤａである。いくつかの実施形態において、ステップ（ｂ）の後の生成物のＭＷは約１０ｋＤａである。いくつかの実施形態において、ステップ（ｂ）の後の生成物のＭＷは約２０ｋＤａである。いくつかの実施形態において、ステップ（ｂ）の後の生成物のＭＷは約３０ｋＤａである。いくつかの実施形態において、ステップ（ｂ）の後の生成物のＭＷは約４０ｋＤａである。
作製方法
いくつかの実施形態において、本開示は、ポリマーを作製する方法であって、
（ａ）式（Ａ）の化合物
Figure 2022514113000073
 （Ａ）
を、式Ｒ１－ＮＨ２またはＲ１－Ｎ（Ｈ）－Ｚ’－Ｎ（Ｈ）－Ｒ１を有する第１のアミンと反応させることと、
（ｂ）ステップ（ａ）の生成物を、式Ｒ２－ＮＨ２またはＲ２－Ｎ（Ｈ）－Ｚ’’－Ｎ（Ｈ）－Ｒ２を有する第２のアミンと反応させることと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の生成物を式（Ｂ）の化合物と反応させることと
Figure 2022514113000074
 を含み、式中、
各Ｊが、独立的に、－Ｏ－または－ＮＨ－であり、
Ｚ、Ｚ’、及びＺ’’が結合部分であり、
Ａが、１～３０個の炭素原子の直鎖状もしくは分枝状炭素鎖、２～３０個の原子の直鎖状もしくは分枝状ヘテロ原子含有炭素鎖、３～３０個の炭素原子を含む炭素環、または３～３０個の原子を含む複素環であり、
Ａが、任意選択で、１つ以上のハロゲン、ヒドロキシル、アミノ基、スルホニル基、スルホンアミド基、チオール、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ、Ｃ１－Ｃ６エーテル、Ｃ１－Ｃ６チオエーテル、Ｃ１－Ｃ６スルホン、Ｃ１－Ｃ６スルホキシド、Ｃ１－Ｃ６１級アミド、Ｃ１－Ｃ６２級アミド、ハロＣ１－Ｃ６アルキル、カルボキシル基、シアノ基、ニトロ基、ニトロソ基、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ３－Ｃ６シクロアルキル、Ｃ３－Ｃ６ヘテロシクリル、Ｃ２－Ｃ５ヘテロアリール、またはＣ６－Ｃ１０アリールで置換され（式中、各Ｒ’は、独立的に、水素及びＣ１－Ｃ６アルキルからなる群より選択される）、
Ｇが、－Ｃ－、－Ｓ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｐ（ＯＲ１）－、または－Ｐ（ＯＨ）－であり、
各Ｑが、ＨまたはＣ１－Ｃ１０直鎖状もしくは分枝状アルキル基であり、
各Ｅ１が、独立的に、共有結合、－Ｎ－、－Ｏ－、－Ｓ－、アルキレン、ヘテロアルキレン、アルケニル、ヘテロアルケニレン、アルキニル、ヘテロアルキニレンからなる群より選択され；
Ｒ１及びＲ２が、各々独立的に、Ｃ１－Ｃ４０アルキル、Ｃ１－Ｃ４０ヘテロアルキル、Ｃ２－Ｃ４０アルケニル、Ｃ２－Ｃ４０ヘテロアルケニレン、Ｃ４－Ｃ８シクロアルケニル、Ｃ２－Ｃ４０アルキニル、Ｃ２－Ｃ４０ヘテロアルキニレン、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリールであり、このとき、当該ヘテロシクリル及びヘテロアリールが、Ｎ、Ｓ、Ｐ、及びＯからなる群より選択される１～５個のヘテロ原子を含み、当該Ｃ１－Ｃ４０アルキル、Ｃ２－Ｃ４０アルケニル、Ｃ４－Ｃ８シクロアルケニル、Ｃ２－Ｃ４０アルキニル、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、及びヘテロアリールが、任意選択で、Ｄ、ハロゲン、Ｃ１－Ｃ６アルキル、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、または－Ｎ（Ｃ１－Ｃ６アルキル）２で置換され、Ｒ１は、非置換であるか、またはハロゲン、ヒドロキシル、アミノ基、スルホニル基、スルホンアミド基、チオール、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ、Ｃ１－Ｃ６エーテル、Ｃ１－Ｃ６チオエーテル、Ｃ１－Ｃ６スルホン、Ｃ１－Ｃ６スルホキシド、Ｃ１－Ｃ６１級アミド、Ｃ１－Ｃ６２級アミド、ハロＣ１－Ｃ６アルキル、カルボキシル基、シアノ基、ニトロ基、ニトロソ基、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ３－Ｃ６シクロアルキル、Ｃ３－Ｃ６ヘテロシクリル、Ｃ２－Ｃ５ヘテロアリール、及びＣ６－Ｃ１０）アリールのうちの１つ以上で置換され（式中、各Ｒ’は、独立的に、水素及びＣ１－Ｃ６アルキルからなる群より選択される）、
各ｎが少なくとも１である、方法を提供する。
いくつかの実施形態において、本開示は、ポリマーを作製する方法であって、
（ａ）式（Ａ）の化合物
Figure 2022514113000075
 及び式（Ｂ）の化合物：
Figure 2022514113000076
 を、式Ｒ１－ＮＨ２またはＲ１－Ｎ（Ｈ）－Ｚ’－Ｎ（Ｈ）－Ｒ１を有する第１のアミンと反応させることと、
（ｂ）ステップ（ａ）の生成物を、式Ｒ２－ＮＨ２またはＲ２－Ｎ（Ｈ）－Ｚ’’－Ｎ（Ｈ）－Ｒ２を有する第２のアミンと反応させることと
を含み、式中、
各Ｊが、独立的に、－Ｏ－または－ＮＨ－であり、
Ｚ、Ｚ’、及びＺ’’が結合部分であり、
Ａが、１～３０個の炭素原子の直鎖状もしくは分枝状炭素鎖、２～３０個の原子の直鎖状もしくは分枝状ヘテロ原子含有炭素鎖、３～３０個の炭素原子を含む炭素環、または３～３０個の原子を含む複素環であり、
Ａが、任意選択で、１つ以上のハロゲン、ヒドロキシル、アミノ基、スルホニル基、スルホンアミド基、チオール、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ、Ｃ１－Ｃ６エーテル、Ｃ１－Ｃ６チオエーテル、Ｃ１－Ｃ６スルホン、Ｃ１－Ｃ６スルホキシド、Ｃ１－Ｃ６１級アミド、Ｃ１－Ｃ６２級アミド、ハロＣ１－Ｃ６アルキル、カルボキシル基、シアノ基、ニトロ基、ニトロソ基、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ３－Ｃ６シクロアルキル、Ｃ３－Ｃ６ヘテロシクリル、Ｃ２－Ｃ５ヘテロアリール、またはＣ６－Ｃ１０アリールで置換され（式中、各Ｒ’は、独立的に、水素及びＣ１－Ｃ６アルキルからなる群より選択される）、
Ｇが、－Ｃ－、－Ｓ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｐ（ＯＲ１）－、または－Ｐ（ＯＨ）－であり、
各Ｑが、ＨまたはＣ１－Ｃ１０直鎖状もしくは分枝状アルキル基であり、
各Ｅ１が、独立的に、共有結合、－Ｎ－、－Ｏ－、－Ｓ－、アルキレン、ヘテロアルキレン、アルケニル、ヘテロアルケニレン、アルキニル、ヘテロアルキニレンからなる群より選択され；
Ｒ１及びＲ２が、各々独立的に、Ｃ１－Ｃ４０アルキル、Ｃ１－Ｃ４０ヘテロアルキル、Ｃ２－Ｃ４０アルケニル、Ｃ２－Ｃ４０ヘテロアルケニレン、Ｃ４－Ｃ８シクロアルケニル、Ｃ２－Ｃ４０アルキニル、Ｃ２－Ｃ４０ヘテロアルキニレン、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリールであり、このとき、当該ヘテロシクリル及びヘテロアリールが、Ｎ、Ｓ、Ｐ、及びＯからなる群より選択される１～５個のヘテロ原子を含み、当該Ｃ１－Ｃ４０アルキル、Ｃ２－Ｃ４０アルケニル、Ｃ４－Ｃ８シクロアルケニル、Ｃ２－Ｃ４０アルキニル、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、及びヘテロアリールが、任意選択で、Ｄ、ハロゲン、Ｃ１－Ｃ６アルキル、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、または－Ｎ（Ｃ１－Ｃ６アルキル）２で置換され、Ｒ１は、非置換であるか、またはハロゲン、ヒドロキシル、アミノ基、スルホニル基、スルホンアミド基、チオール、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ、Ｃ１－Ｃ６エーテル、Ｃ１－Ｃ６チオエーテル、Ｃ１－Ｃ６スルホン、Ｃ１－Ｃ６スルホキシド、Ｃ１－Ｃ６１級アミド、Ｃ１－Ｃ６２級アミド、ハロＣ１－Ｃ６アルキル、カルボキシル基、シアノ基、ニトロ基、ニトロソ基、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ３－Ｃ６シクロアルキル、Ｃ３－Ｃ６ヘテロシクリル、Ｃ２－Ｃ５ヘテロアリール、及びＣ６－Ｃ１０）アリールのうちの１つ以上で置換され（式中、各Ｒ’は、独立的に、水素及びＣ１－Ｃ６アルキルからなる群より選択される）、
各ｎが少なくとも１である、方法を提供する。
いくつかの実施形態において、Ｚは、１～３０個の炭素原子の直鎖状もしくは分枝状炭素鎖、１～３０個の原子の直鎖状もしくは分枝状ヘテロ原子含有炭素鎖、３～３０個の炭素原子を含む炭素環、３～３０個の炭素原子を含むアルキレン－炭素環、３～３０個の原子を含む複素環、または３～３０個の原子を含むアルキレン－複素環である。Ｚは、非置換の場合もあれば、ハロゲン、ヒドロキシル、アミノ基、スルホニル基、スルホンアミド基、チオール、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ、Ｃ１－Ｃ６エーテル、Ｃ１－Ｃ６チオエーテル、Ｃ１－Ｃ６スルホン、Ｃ１－Ｃ６スルホキシド、Ｃ１－Ｃ６１級アミド、Ｃ１－Ｃ６２級アミド、ハロＣ１－Ｃ６アルキル、カルボキシル基、シアノ基、ニトロ基、ニトロソ基、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ３－Ｃ６シクロアルキル、Ｃ３－Ｃ６ヘテロシクリル、Ｃ２－Ｃ５ヘテロアリール、及びＣ６－Ｃ１０アリールのうちの少なくとも１つで置換される場合もある（式中、各Ｒ’は、独立的に、水素及びＣ１－Ｃ６アルキルからなる群より選択される）。いくつかの実施形態において、Ｚは、１～３０個の炭素原子の直鎖状炭素鎖である。例えば、Ｚは、限定されるものではないが、Ｃ１－Ｃ２４アルキレン、Ｃ１－Ｃ２０アルキレン、Ｃ１－Ｃ１６アルキレン、Ｃ１－Ｃ１２アルキレン、Ｃ１－Ｃ８アルキレン、Ｃ１－Ｃ６アルキレン、Ｃ１－Ｃ４アルキレン、Ｃ１－Ｃ３アルキレン、Ｃ１－Ｃ２アルキレン、Ｃ１アルキレンを含めたアルキレン基とすることができる。代表的なアルキレン基としては、限定されるものではないが、メチレン、エチレン、プロピレン、ｎ－ブチレン、エテニレン、プロペニレン、ｎ－ブテニレン、プロピニレン、ｎ－ブチニレンなどが挙げられるが。いくつかの実施形態において、Ｚは、１～３０個の炭素原子の直鎖状もしくは分枝状炭素鎖、または１～３０個の原子の直鎖状もしくは分枝状ヘテロ原子含有炭素鎖である。いくつかの実施形態において、Ｚは、１～１０個の炭素原子の直鎖状または分枝状炭素鎖である。例えば、いくつかの実施形態において、Ｚは
Figure 2022514113000077
 である。いくつかの実施形態において、Ｚは、１～３０個の炭素原子の分枝状炭素鎖である。いくつかの実施形態において、Ｚは、１～３０個の原子の直鎖状または分枝状ヘテロ原子含有炭素鎖である。例えば、Ｚは、ヘテロ原子（限定されるものではないが、Ｏ、Ｎ、Ｓ、またはＰを含む）で置換された１個以上の炭素原子を有する直鎖状または分枝状炭素鎖とすることができる。いくつかの実施形態において、Ｚは、３～３０個の炭素原子を含む炭素環である。いくつかの実施形態において、Ｚは、３～３０個の炭素原子を含むアルキレン－炭素環である。例えば、いくつかの実施形態において、Ｚは
Figure 2022514113000078
 であり、式中、ｘは１～１０００である。いくつかの実施形態において、Ｚは、３～３０個の原子を含む複素環である。いくつかの実施形態において、Ｚは、３～３０個の原子を含むアルキレン－複素環である。いくつかの実施形態において、Ｚは置換されていない。いくつかの実施形態において、Ｚは置換されている。いくつかの実施形態において、Ｚは、以下：
Figure 2022514113000079
 のうちの１つである。
いくつかの実施形態において、Ｚ’は、１～３０個の炭素原子の直鎖状もしくは分枝状炭素鎖、１～３０個の原子の直鎖状もしくは分枝状ヘテロ原子含有炭素鎖、３～３０個の炭素原子を含む炭素環、３～３０個の炭素原子を含むアルキレン－炭素環、３～３０個の原子を含む複素環、または３～３０個の原子を含むアルキレン－複素環である。Ｚ’は、非置換の場合もあれば、ハロゲン、ヒドロキシル、アミノ基、スルホニル基、スルホンアミド基、チオール、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ、Ｃ１－Ｃ６エーテル、Ｃ１－Ｃ６チオエーテル、Ｃ１－Ｃ６スルホン、Ｃ１－Ｃ６スルホキシド、Ｃ１－Ｃ６１級アミド、Ｃ１－Ｃ６２級アミド、ハロＣ１－Ｃ６アルキル、カルボキシル基、シアノ基、ニトロ基、ニトロソ基、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ３－Ｃ６シクロアルキル、Ｃ３－Ｃ６ヘテロシクリル、Ｃ２－Ｃ５ヘテロアリール、及びＣ６－Ｃ１０アリールのうちの少なくとも１つで置換される場合もある（式中、各Ｒ’は、独立的に、水素及びＣ１－Ｃ６アルキルからなる群より選択される）。いくつかの実施形態において、Ｚ’は、１～３０個の炭素原子の直鎖状炭素鎖である。例えば、Ｚ’は、限定されるものではないが、Ｃ１－Ｃ２４アルキレン、Ｃ１－Ｃ２０アルキレン、Ｃ１－Ｃ１６アルキレン、Ｃ１－Ｃ１２アルキレン、Ｃ１－Ｃ８アルキレン、Ｃ１－Ｃ６アルキレン、Ｃ１－Ｃ４アルキレン、Ｃ１－Ｃ３アルキレン、Ｃ１－Ｃ２アルキレン、Ｃ１アルキレンを含めたアルキレン基とすることができる。代表的なアルキレン基としては、限定されるものではないが、メチレン、エチレン、プロピレン、ｎ－ブチレン、エテニレン、プロペニレン、ｎ－ブテニレン、プロピニレン、ｎ－ブチニレンなどが挙げられるが。いくつかの実施形態において、Ｚ’は、１～３０個の炭素原子の直鎖状もしくは分枝状炭素鎖、または１～３０個の原子の直鎖状もしくは分枝状ヘテロ原子含有炭素鎖である。
いくつかの実施形態において、Ｚ’’は、１～３０個の炭素原子の直鎖状もしくは分枝状炭素鎖、１～３０個の原子の直鎖状もしくは分枝状ヘテロ原子含有炭素鎖、３～３０個の炭素原子を含む炭素環、３～３０個の炭素原子を含むアルキレン－炭素環、３～３０個の原子を含む複素環、または３～３０個の原子を含むアルキレン－複素環である。Ｚ’’は、非置換の場合もあれば、ハロゲン、ヒドロキシル、アミノ基、スルホニル基、スルホンアミド基、チオール、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ、Ｃ１－Ｃ６エーテル、Ｃ１－Ｃ６チオエーテル、Ｃ１－Ｃ６スルホン、Ｃ１－Ｃ６スルホキシド、Ｃ１－Ｃ６１級アミド、Ｃ１－Ｃ６２級アミド、ハロＣ１－Ｃ６アルキル、カルボキシル基、シアノ基、ニトロ基、ニトロソ基、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ３－Ｃ６シクロアルキル、Ｃ３－Ｃ６ヘテロシクリル、Ｃ２－Ｃ５ヘテロアリール、及びＣ６－Ｃ１０アリールのうちの少なくとも１つで置換される場合もある（式中、各Ｒ’は、独立的に、水素及びＣ１－Ｃ６アルキルからなる群より選択される）。いくつかの実施形態において、Ｚ’’は、１～３０個の炭素原子の直鎖状炭素鎖である。例えば、Ｚ’’は、限定されるものではないが、Ｃ１－Ｃ２４アルキレン、Ｃ１－Ｃ２０アルキレン、Ｃ１－Ｃ１６アルキレン、Ｃ１－Ｃ１２アルキレン、Ｃ１－Ｃ８アルキレン、Ｃ１－Ｃ６アルキレン、Ｃ１－Ｃ４アルキレン、Ｃ１－Ｃ３アルキレン、Ｃ１－Ｃ２アルキレン、Ｃ１アルキレンを含めたアルキレン基とすることができる。代表的なアルキレン基としては、限定されるものではないが、メチレン、エチレン、プロピレン、ｎ－ブチレン、エテニレン、プロペニレン、ｎ－ブテニレン、プロピニレン、ｎ－ブチニレンなどが挙げられるが。いくつかの実施形態において、Ｚ’’は、１～３０個の炭素原子の直鎖状もしくは分枝状炭素鎖、または１～３０個の原子の直鎖状もしくは分枝状ヘテロ原子含有炭素鎖である。
本開示のある特定の実施形態によれば、Ｇは、－Ｃ－、－Ｓ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｐ（ＯＲ１）－、または－Ｐ（ＯＨ）－とすることができ、よってそれぞれ、カルボニル、スルホキシド、スルホン、及びホスホノ基を形成する。したがって、いくつかの実施形態において、Ｇは－Ｃ－である。いくつかの実施形態において、Ｇは－Ｓ－である。いくつかの実施形態において、Ｇは－Ｓ（Ｏ）－である。
いくつかの実施形態において、式（Ｂ）の化合物は、
Figure 2022514113000080
 であり、式中、
Ｒが、１～１０個の炭素原子の直鎖状もしくは分枝状炭素鎖、１～１０個の原子の直鎖状もしくは分枝状ヘテロ原子含有炭素鎖、３～１０個の炭素原子を含む炭素環、または３～１０個の原子を含む複素環であり、Ｒが、非置換であるか、またはハロゲン、ヒドロキシル、アミノ基、スルホニル基、スルホンアミド基、チオール、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ、Ｃ１－Ｃ６エーテル、Ｃ１－Ｃ６チオエーテル、Ｃ１－Ｃ６スルホン、Ｃ１－Ｃ６スルホキシド、Ｃ１－Ｃ６１級アミド、Ｃ１－Ｃ６２級アミド、ハロＣ１－Ｃ６アルキル、カルボキシル基、シアノ基、ニトロ基、ニトロソ基、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ３－Ｃ６シクロアルキル、Ｃ３－Ｃ６ヘテロシクリル、Ｃ２－Ｃ５ヘテロアリール、及びＣ６－Ｃ１０アリールのうちの少なくとも１つで置換されており（式中、各Ｒ’は、独立的に、水素及びＣ１－Ｃ６アルキルからなる群より選択される）、Ｒ’’が、非置換または置換された、１～１０個の炭素原子の直鎖状もしくは分枝状炭素鎖、１～１０個の原子の直鎖状もしくは分枝状ヘテロ原子含有炭素鎖、３～１０個の炭素原子を含む炭素環、または３～１０個の原子を含む複素環である。いくつかの実施形態において、Ｒは１個の炭素原子である。いくつかの実施形態において、Ｒ’’は、直鎖状または分枝状炭素鎖、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、２－メチル－１－プロピル、２－メチル－２－プロピル、２－メチル－１－ブチル、３－メチル－１－ブチル、２－メチル－３－ブチル、２，２－ジメチル－１－プロピル、２－メチル－１－ペンチル、３－メチル－１－ペンチル、４－メチル－１－ペンチル、２－メチル－２－ペンチル、３－メチル－２－ペンチル、４－メチル－２－ペンチル、２，２－ジメチル－１－ブチル、３，３－ジメチル－１－ブチル、２－エチル－１－ブチル、ブチル、イソブチル、ｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ－ヘキシルである。例えば、いくつかの実施形態において、式（Ｂ）の化合物は
Figure 2022514113000081
 である。いくつかの実施形態において、Ｒは、３～１０個の炭素原子を含む炭素環である。例えば、Ｒは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニル、シクロデシル、フェニル、またはナフチルとすることができる。いくつかの実施形態において、Ｒは、３～１０個の原子を含む複素環である。
ある特定の実施形態において、第１のアミンは、式Ｒ１－ＮＨ２またはＲ１－Ｎ（Ｈ）－Ｚ’－Ｎ（Ｈ）－Ｒ１を有する。いくつかの実施形態において、第１のアミンは、式Ｒ１－ＮＨ２を有する。いくつかの実施形態において、第１のアミンは、式Ｒ１－Ｎ（Ｈ）－Ｚ’－Ｎ（Ｈ）－Ｒ１を有する。いくつかの実施形態において、式Ｒ１－Ｎ（Ｈ）－Ｚ’－Ｎ（Ｈ）－Ｒ１を有する第１のアミンは、
Figure 2022514113000082
 である。いくつかの実施形態において、第１のアミンは、Ｒ１－Ｎ（Ｈ）－Ｚ’－Ｎ－（Ｒ１）２を有する。いくつかの実施形態において、式Ｒ１－Ｎ（Ｈ）－Ｚ’－Ｎ－（Ｒ１）２を有する第１のアミンは、
Figure 2022514113000083
 である。
ある特定の実施形態において、第２のアミンは、式Ｒ２－ＮＨ２またはＲ２－Ｎ（Ｈ）－Ｚ’’－Ｎ（Ｈ）－Ｒ２を有する。いくつかの実施形態において、第２のアミンは、式Ｒ２－ＮＨ２を有する。いくつかの実施形態において、第２のアミンは、式Ｒ２－Ｎ（Ｈ）－Ｚ’’－Ｎ（Ｈ）－Ｒ２を有する。いくつかの実施形態において、式Ｒ２－Ｎ（Ｈ）－Ｚ’’－Ｎ（Ｈ）－Ｒ２を有する第２のアミンは、
Figure 2022514113000084
 である。いくつかの実施形態において、第１のアミンは、Ｒ２－Ｎ（Ｈ）－Ｚ’’－Ｎ－（Ｒ２）２を有する。いくつかの実施形態において、式Ｒ２－Ｎ（Ｈ）－Ｚ’’－Ｎ－（Ｒ２）２を有する第１のアミンは、
Figure 2022514113000085
 である。
ある特定の実施形態において、Ｒ１は、Ｃ１－Ｃ４０アルキル、Ｃ１－Ｃ４０ヘテロアルキル、Ｃ２－Ｃ４０アルケニル、Ｃ２－Ｃ４０ヘテロアルケニレン、Ｃ４－Ｃ８シクロアルケニル、Ｃ２－Ｃ４０アルキニル、Ｃ２－Ｃ４０ヘテロアルキニレン、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、もしくはヘテロアリールであり、当該ヘテロシクリル及びヘテロアリールは、Ｎ、Ｓ、Ｐ、及びＯからなる群より選択される１～５個のヘテロ原子を含み、当該Ｃ１－Ｃ４０アルキル、Ｃ２－Ｃ４０アルケニル、Ｃ４－Ｃ８シクロアルケニル、Ｃ２－Ｃ４０アルキニル、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、及びヘテロアリールは、任意選択で、Ｄ、ハロゲン、Ｃ１－Ｃ６アルキル、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、もしくは－Ｎ（Ｃ１－Ｃ６アルキル）２で置換されている。Ｒ１は、非置換の場合もあれば、ハロゲン、ヒドロキシル、アミノ基、スルホニル基、スルホンアミド基、チオール、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ、Ｃ１－Ｃ６エーテル、Ｃ１－Ｃ６チオエーテル、Ｃ１－Ｃ６スルホン、Ｃ１－Ｃ６スルホキシド、Ｃ１－Ｃ６１級アミド、Ｃ１－Ｃ６２級アミド、ハロＣ１－Ｃ６アルキル、カルボキシル基、シアノ基、ニトロ基、ニトロソ基、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ３－Ｃ６シクロアルキル、Ｃ３－Ｃ６ヘテロシクリル、Ｃ２－Ｃ５ヘテロアリール、及びＣ６－Ｃ１０アリールのうちの少なくとも１つで置換される場合もある（式中、各Ｒ’は、独立的に、水素及びＣ１－Ｃ６アルキルからなる群より選択される）。いくつかの実施形態において、Ｒ１は、Ｃ１－Ｃ２０アルキルである。例えば、Ｒ１は、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、またはＣ２０アルキル基、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、２－メチル－１－プロピル、２－メチル－２－プロピル、２－メチル－１－ブチル、３－メチル－１－ブチル、２－メチル－３－ブチル、２，２－ジメチル－１－プロピル、２－メチル－１－ペンチル、３－メチル－１－ペンチル、４－メチル－１－ペンチル、２－メチル－２－ペンチル、３－メチル－２－ペンチル、４－メチル－２－ペンチル、２，２－ジメチル－１－ブチル、３，３－ジメチル－１－ブチル、２－エチル－１－ブチル、ブチル、イソブチル、ｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ－ヘキシル、ｎ－ヘプチル、ｎ－オクチル、ｎ－ノニル、ｎ－デシル、ｎ－ウンデシル、ｎ－ドデシル、ｎ－トリデシル、ｎ－テトラデシル、ｎ－ペンタデシル、ｎ－ヘキサデシル、ｎ－ヘプタデシル、ｎ－オクタデシル、ｎ－ノナデシル、またはｎ－イコシルとすることができる。いくつかの実施形態において、Ｒ１は置換されていない。いくつかの実施形態において、Ｒ１は置換されている。いくつかの実施形態において、Ｒ１は、
Figure 2022514113000086
 からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ１は、
Figure 2022514113000087
 である。いくつかの実施形態において、Ｒ１は、
Figure 2022514113000088
 である。
ある特定の実施形態において、Ｒ２は、Ｃ１－Ｃ４０アルキル、Ｃ１－Ｃ４０ヘテロアルキル、Ｃ２－Ｃ４０アルケニル、Ｃ２－Ｃ４０ヘテロアルケニレン、Ｃ４－Ｃ８シクロアルケニル、Ｃ２－Ｃ４０アルキニル、Ｃ２－Ｃ４０ヘテロアルキニレン、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、もしくはヘテロアリールであり、当該ヘテロシクリル及びヘテロアリールは、Ｎ、Ｓ、Ｐ、及びＯからなる群より選択される１～５個のヘテロ原子を含み、当該Ｃ１－Ｃ４０アルキル、Ｃ２－Ｃ４０アルケニル、Ｃ４－Ｃ８シクロアルケニル、Ｃ２－Ｃ４０アルキニル、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、及びヘテロアリールは、任意選択で、Ｄ、ハロゲン、Ｃ１－Ｃ６アルキル、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、もしくは－Ｎ（Ｃ１－Ｃ６アルキル）２で置換されている。Ｒ２は、非置換の場合もあれば、ハロゲン、ヒドロキシル、アミノ基、スルホニル基、スルホンアミド基、チオール、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ、Ｃ１－Ｃ６エーテル、Ｃ１－Ｃ６チオエーテル、Ｃ１－Ｃ６スルホン、Ｃ１－Ｃ６スルホキシド、Ｃ１－Ｃ６１級アミド、Ｃ１－Ｃ６２級アミド、ハロＣ１－Ｃ６アルキル、カルボキシル基、シアノ基、ニトロ基、ニトロソ基、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ３－Ｃ６シクロアルキル、Ｃ３－Ｃ６ヘテロシクリル、Ｃ２－Ｃ５ヘテロアリール、及びＣ６－Ｃ１０アリールのうちの少なくとも１つで置換される場合もある（式中、各Ｒ’は、独立的に、水素及びＣ１－Ｃ６アルキルからなる群より選択される）。いくつかの実施形態において、Ｒ２は、Ｃ１－Ｃ２０アルキルである。例えば、Ｒ２は、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、またはＣ２０アルキル基、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、２－メチル－１－プロピル、２－メチル－２－プロピル、２－メチル－１－ブチル、３－メチル－１－ブチル、２－メチル－３－ブチル、２，２－ジメチル－１－プロピル、２－メチル－１－ペンチル、３－メチル－１－ペンチル、４－メチル－１－ペンチル、２－メチル－２－ペンチル、３－メチル－２－ペンチル、４－メチル－２－ペンチル、２，２－ジメチル－１－ブチル、３，３－ジメチル－１－ブチル、２－エチル－１－ブチル、ブチル、イソブチル、ｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ－ヘキシル、ｎ－ヘプチル、ｎ－オクチル、ｎ－ノニル、ｎ－デシル、ｎ－ウンデシル、ｎ－ドデシル、ｎ－トリデシル、ｎ－テトラデシル、ｎ－ペンタデシル、ｎ－ヘキサデシル、ｎ－ヘプタデシル、ｎ－オクタデシル、ｎ－ノナデシル、またはｎ－イコシルとすることができる。いくつかの実施形態において、Ｒ２は置換されていない。いくつかの実施形態において、Ｒ２は置換されている。いくつかの実施形態において、Ｒ２は、
Figure 2022514113000089
 からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ２は、
Figure 2022514113000090
 である。いくつかの実施形態において、Ｒ２は、
Figure 2022514113000091
 である。
いくつかの実施形態において、各Ｑは、ＨまたはＣ１－Ｃ１０直鎖状もしくは分枝状アルキル基である。したがって、いくつかの実施形態において、各ＱはＨである。他の実施形態において、各ＱはＣ１－Ｃ１０直鎖状または分枝状アルキル基である。例えば、各Ｑは、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、２－メチル－１－プロピル、２－メチル－２－プロピル、２－メチル－１－ブチル、３－メチル－１－ブチル、２－メチル－３－ブチル、２，２－ジメチル－１－プロピル、２－メチル－１－ペンチル、３－メチル－１－ペンチル、４－メチル－１－ペンチル、２－メチル－２－ペンチル、３－メチル－２－ペンチル、４－メチル－２－ペンチル、２，２－ジメチル－１－ブチル、３，３－ジメチル－１－ブチル、２－エチル－１－ブチル、ブチル、イソブチル、ｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ－ヘキシル、ｎ－ヘプチル、ｎ－オクチル、ｎ－ノニル、またはｎ－デシルとすることができる。いくつかの実施形態において、各Ｑはメチルである。
いくつかの実施形態において、各Ｊは－Ｏ－である。いくつかの実施形態において、各Ｊは－ＮＨ－である。
いくつかの実施形態において、各Ｅ１は、独立的に、共有結合、－Ｎ－、－Ｏ－、－Ｓ－、アルキレン、ヘテロアルキレン、アルケニル、ヘテロアルケニレン、アルキニル、ヘテロアルキニレンからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、各Ｅ１はヘテロアルキレンである。いくつかの実施形態において、各Ｅ１は－ＣＨ２－Ｏ－である。いくつかの実施形態において、各ｎは少なくとも１である。例えば、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０とすることができる。いくつかの実施形態において、ｎは１である。
いくつかの実施形態において、Ａは、１～３０個の炭素原子の直鎖状もしくは分枝状炭素鎖、２～３０個の原子の直鎖状もしくは分枝状ヘテロ原子含有炭素鎖、３～３０個の炭素原子を含む炭素環、または３～３０個の原子を含む複素環である。例えば、いくつかの実施形態において、Ａは
Figure 2022514113000092
 である。
いくつかの実施形態において、本開示のポリマーは、一般構造
Figure 2022514113000093
 を有し、式中、波状の結合は、ポリマーの残りに対する結合を表す。連続的な直鎖状オリゴマーの成長及び分岐が高度に制御されているため、得られるポリマーは、上記の構造に示されるように、より均一に直鎖状セグメント及び分岐単位が分布している。以降のセクション及び実施例で説明されるように、ポリマーは、強力なＤＮＡ結合親和性を有しており、ＤＮＡを凝縮してナノサイズのポリプレックスをほぼ１００％の細胞取込み効率で製剤化することができる。いくつかの実施形態において、本開示のポリマーは、
Figure 2022514113000094
 である。
いくつかの実施形態において、モル過剰の式（Ａ）の化合物を第１のアミンと反応させる。例えば、式（Ａ）の化合物：第１のアミンの化学量論比は、約１．１：１～約１０：１を範囲とすることができ、これには約１．１：１、約１．２：１、約１．３：１、約１．４：１、約１．５：１、約１．６：１、約１．７：１、約１．８：１、約１．９：１、約２：１、約３：１、約４：１、約５：１、約６：１、約７：１、約８：１、約９：１、または約１０：１（これらの間の全ての範囲を含む）が含まれる。
いくつかの実施形態において、式（Ａ）の化合物：第１のアミンの化学量論比は、約１．１：１、約１．２：１、約１．３：１、約１．４：１、約１．５：１、約１．６：１、約１．７：１、約１．８：１、約１．９：１、約２：１、約３：１、約４：１、約５：１、約６：１、約７：１、約８：１、約９：１、または約１０：１である。いくつかの実施形態において、式（Ａ）の化合物：第１のアミンの化学量論比は約１．１：１～約２：１を範囲とすることができる。いくつかの実施形態において、式（Ａ）の化合物：第１のアミンの化学量論比は約１．２：１である。いくつかの実施形態において、式（Ａ）の化合物は、モル等価（すなわち、約１：１）で第１のアミンと反応させる。
いくつかの実施形態において、ステップ（ａ）は、有機溶媒中で実施される。多種多様な有機溶媒を本開示の文脈で使用することができ、このような有機溶媒には、限定されるものではないが、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ－メチルピロリドン（ＮＭＰ）など；ケトン、例えば、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトンなど；エーテル、例えば、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジエチルエーテル、メチル３級ブチルエーテルなど；炭化水素、例えば、トルエン、キシレン、シクロヘキサンなどが含まれる。いくつかの実施形態において、ステップ（ａ）はＤＭＳＯ中で実施される。
いくつかの実施形態において、ステップ（ａ）は、約４０℃から約１２０℃の範囲の温度で実施され、これには約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、約５０、約５１、約５２、約５３、約５４、約５５、約５６、約５７、約５８、約５９、約６０、約６１、約６２、約６３、約６４、約６５、約６６、約６７、約６８、約６９、約７０、約７１、約７２、約７３、約７４、約７５、約７６、約７７、約７８、約７９、約８０、約８１、約８２、約８３、約８４、約８５、約８６、約８７、約８８、約８９、約９０、約９１、約９２、約９３、約９４、約９５、約９６、約９７、約９８、約９９、約１００、約１０１、約１０２、約１０３、約１０４、約１０５、約１０６、約１０７、約１０８、約１０９、約１１０、約１１１、約１１２、約１１３、約１１４、約１１５、約１１６、約１１７、約１１８、約１１９、または１２０℃（これらの間の全ての範囲を含む）が含まれる。
いくつかの実施形態において、ステップ（ａ）は、４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、約５０、約５１、約５２、約５３、約５４、約５５、約５６、約５７、約５８、約５９、約６０、約６１、約６２、約６３、約６４、約６５、約６６、約６７、約６８、約６９、約７０、約７１、約７２、約７３、約７４、約７５、約７６、約７７、約７８、約７９、約８０、約８１、約８２、約８３、約８４、約８５、約８６、約８７、約８８、約８９、約９０、約９１、約９２、約９３、約９４、約９５、約９６、約９７、約９８、約９９、約１００、約１０１、約１０２、約１０３、約１０４、約１０５、約１０６、約１０７、約１０８、約１０９、約１１０、約１１１、約１１２、約１１３、約１１４、約１１５、約１１６、約１１７、約１１８、約１１９、または１２０℃で実施される。いくつかの実施形態において、ステップ（ａ）は約９０℃で実施される。
いくつかの実施形態において、ステップ（ａ）の生成物は、ステップ（ｂ）の前に精製されない。他の実施形態において、ステップ（ａ）の生成物は、ステップ（ｂ）の前に精製される。ステップ（ａ）の生成物は、当業者にとって明らかな様々な方法及び技法によって精製することができる。
いくつかの実施形態において、モル過剰の第２のアミンをステップ（ａ）の生成物に添加する。例えば、第２のアミン：ステップ（ａ）の生成物の化学量論比は、約１．１：１～約１０：１を範囲とすることができ、これには約１．１：１、約１．２：１、約１．３：１、約１．４：１、約１．５：１、約１．６：１、約１．７：１、約１．８：１、約１．９：１、約２：１、約３：１、約４：１、約５：１、約６：１、約７：１、約８：１、約９：１、または約１０：１（これらの間の全ての範囲を含む）が含まれる。
いくつかの実施形態において、第２のアミン：ステップ（ａ）の生成物の化学量論比は、約１．１：１、約１．２：１、約１．３：１、約１．４：１、約１．５：１、約１．６：１、約１．７：１、約１．８：１、約１．９：１、約２：１、約３：１、約４：１、約５：１、約６：１、約７：１、約８：１、約９：１、または約１０：１である。いくつかの実施形態において、第２のアミン：ステップ（ａ）の生成物の化学量論比は約５：１である。いくつかの実施形態において、第２のアミンは、モル等価（すなわち、約１：１）でステップ（ａ）の生成物と反応させる。
いくつかの実施形態において、ステップ（ｂ）は、約１６℃～約４０℃の範囲の温度で実施される。例えば、ステップ（ｂ）は、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９～約４０℃の範囲の温度（これらの間の全ての範囲を含む）で実施される。
いくつかの実施形態において、ステップ（ｂ）は、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、または約４０℃の温度で実施される。
いくつかの実施形態において、ステップ（ｂ）の生成物は、ステップ（ｃ）の前に精製されない。他の実施形態において、ステップ（ｂ）の生成物は、ステップ（ｃ）の前に精製される。ステップ（ｂ）の生成物は、当業者にとって明らかな様々な方法及び技法によって精製することができる。例えば、ステップ（ｂ）の生成物は、透析によって精製することができる。
いくつかの実施形態において、ステップ（ｃ）は、ステップ（ｂ）より高い温度で実施される。例えば、ステップ（ｃ）は、約２１℃～約２００℃の範囲の温度で実施される。例えば、ステップ（ｃ）は、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、約５０、約５１、約５２、約５３、約５４、約５５、約５６、約５７、約５８、約５９、約６０、約６１、約６２、約６３、約６４、約６５、約６６、約６７、約６８、約６９、約７０、約７１、約７２、約７３、約７４、約７５、約７６、約７７、約７８、約７９、約８０、約８１、約８２、約８３、約８４、約８５、約８６、約８７、約８８、約８９、約９０、約９１、約９２、約９３、約９４、約９５、約９６、約９７、約９８、約９９、約１００、約１０１、約１０２、約１０３、約１０４、約１０５、約１０６、約１０７、約１０８、約１０９、約１１０、約１１１、約１１２、約１１３、約１１４、約１１５、約１１６、約１１７、約１１８、約１１９、約１２０、約１２１、約１２２、約１２３、約１２４、約１２５、約１２６、約１２７、約１２８、約１２９、約１３０、約１３１、約１３２、約１３３、約１３４、約１３５、約１３６、約１３７、約１３８、約１３９、約１４０、約１４１、約１４２、約１４３、約１４４、約１４５、約１４６、約１４７、約１４８、約１４９、約１５０、約１５１、約１５２、約１５３、約１５４、約１５５、約１５６、約１５７、約１５８、約１５９、約１６０、約１６１、約１６２、約１６３、約１６４、約１６５、約１６６、約１６７、約１６８、約１６９、約１７０、約１７１、約１７２、約１７３、約１７４、約１７５、約１７６、約１７７、約１７８、約１７９、約１８０、約１８１、約１８２、約１８３、約１８４、約１８５、約１８６、約１８７、約１８８、約１８９、約１９０、約１９１、約１９２、約１９３、約１９４、約１９５、約１９６、約１９７、約１９８、約１９９～約２００℃の範囲の温度（これらの間の全ての範囲を含む）で実施される。
いくつかの実施形態において、ステップ（ｃ）は、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、約５０、約５１、約５２、約５３、約５４、約５５、約５６、約５７、約５８、約５９、約６０、約６１、約６２、約６３、約６４、約６５、約６６、約６７、約６８、約６９、約７０、約７１、約７２、約７３、約７４、約７５、約７６、約７７、約７８、約７９、約８０、約８１、約８２、約８３、約８４、約８５、約８６、約８７、約８８、約８９、約９０、約９１、約９２、約９３、約９４、約９５、約９６、約９７、約９８、約９９、約１００、約１０１、約１０２、約１０３、約１０４、約１０５、約１０６、約１０７、約１０８、約１０９、約１１０、約１１１、約１１２、約１１３、約１１４、約１１５、約１１６、約１１７、約１１８、約１１９、約１２０、約１２１、約１２２、約１２３、約１２４、約１２５、約１２６、約１２７、約１２８、約１２９、約１３０、約１３１、約１３２、約１３３、約１３４、約１３５、約１３６、約１３７、約１３８、約１３９、約１４０、約１４１、約１４２、約１４３、約１４４、約１４５、約１４６、約１４７、約１４８、約１４９、約１５０、約１５１、約１５２、約１５３、約１５４、約１５５、約１５６、約１５７、約１５８、約１５９、約１６０、約１６１、約１６２、約１６３、約１６４、約１６５、約１６６、約１６７、約１６８、約１６９、約１７０、約１７１、約１７２、約１７３、約１７４、約１７５、約１７６、約１７７、約１７８、約１７９、約１８０、約１８１、約１８２、約１８３、約１８４、約１８５、約１８６、約１８７、約１８８、約１８９、約１９０、約１９１、約１９２、約１９３、約１９４、約１９５、約１９６、約１９７、約１９８、約１９９～約２００℃で実施される。いくつかの実施形態において、ステップ（ｃ）は約９０℃で実施される。
いくつかの実施形態において、本開示の方法によって作製されるポリマーのマーク－フウィンクの式から定義されるアルファパラメーターは、約０．５未満である。例えば、本開示のポリマーのマーク－フウィンクの式から定義されるアルファパラメーターは、約０．０１、約０．０２、約０．０３、約０．０４、約０．０５、約０．０６、約０．０７、約０．０８、約０．０９、約０．１０、約０．１１、約０．１２、約０．１３、約０．１４、約０．１５、約０．１６、約０．１７、約０．１８、約０．１９、約０．２０、約０．２１、約０．２２、約０．２３、約０．２４、約０．２５、約０．２６、約０．２７、約０．２８、約０．２９、約０．３０、約０．３１、約０．３２、約０．３３、約０．３４、約０．３５、約０．３６、約０．３７、約０．３８、約０．３９、約０．４０、約０．４１、約０．４２、約０．４３、約０．４４、約０．４５、約０．４６、約０．４７、約０．４８～約０．４９を範囲とする。いくつかの実施形態において、本開示の方法によって作製されるポリマーのマーク－フウィンクの式から定義されるアルファパラメーターは、約０．２～約０．５である。
いくつかの実施形態において、本開示の方法によって作製されるポリマーのマーク－フウィンクの式から定義されるアルファパラメーターは、約０．０１、約０．０２、約０．０３、約０．０４、約０．０５、約０．０６、約０．０７、約０．０８、約０．０９、約０．１０、約０．１１、約０．１２、約０．１３、約０．１４、約０．１５、約０．１６、約０．１７、約０．１８、約０．１９、約０．２０、約０．２１、約０．２２、約０．２３、約０．２４、約０．２５、約０．２６、約０．２７、約０．２８、約０．２９、約０．３０、約０．３１、約０．３２、約０．３３、約０．３４、約０．３５、約０．３６、約０．３７、約０．３８、約０．３９、約０．４０、約０．４１、約０．４２、約０．４３、約０．４４、約０．４５、約０．４６、約０．４７、約０．４８、または約０．４９である。
いくつかの実施形態において、本開示の方法によって作製されるポリマーのＰＤＩは、約１．０１～約８．０である。例えば、ＰＤＩは、約１．０１、約１．０２、約１．０３、約１．０４、約１．０５、約１．０６、約１．０７、約１．０８、約１．０９、約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９、約２．０、約２．１、約２．２、約２．３、約２．４、約２．５、約２．６、約２．７、約２．８、約２．９、約３．０、約３．１、約３．２、約３．３、約３．４、約３．５、約３．６、約３．７、約３．８、約３．９、約４．０、約４．１、約４．２、約４．３、約４．４、約４．５、約４．６、約４．７、約４．８、約４．９、約５．０、約５．１、約５．２、約５．３、約５．４、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、約６．０、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、約７．０、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、約７．６、約７．７、約７．８、約７．９～約８．０（これらの間の全ての範囲を含む）を範囲とすることができる。
いくつかの実施形態において、本開示の方法によって作製されるポリマーのマーク－フウィンクの式から定義されるＰＤＩは、約１．０１、約１．０２、約１．０３、約１．０４、約１．０５、約１．０６、約１．０７、約１．０８、約１．０９、約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９、約２．０、約２．１、約２．２、約２．３、約２．４、約２．５、約２．６、約２．７、約２．８、約２．９、約３．０、約３．１、約３．２、約３．３、約３．４、約３．５、約３．６、約３．７、約３．８、約３．９、約４．０、約４．１、約４．２、約４．３、約４．４、約４．５、約４．６、約４．７、約４．８、約４．９、約５．０、約５．１、約５．２、約５．３、約５．４、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、約６．０、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、約７．０、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、約７．６、約７．７、約７．８、約７．９、または約８．０である。いくつかの実施形態において、本開示のポリマーのＰＤＩは約２．５である。いくつかの実施形態において、本開示のポリマーのＰＤＩは約３．５である。いくつかの実施形態において、本開示のポリマーのＰＤＩは約６．５である。いくつかの実施形態において、本開示のポリマーのＰＤＩは約８．５である。
いくつかの実施形態において、本開示の方法によって作製されるポリマーのＭＷは、少なくとも３ｋＤａである。いくつかの実施形態において、本開示の方法によって作製されるポリマーのＭＷは、約３ｋＤａ～約２００ｋＤａである。したがって、本開示のポリマーのＭＷは、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、約５０、約５１、約５２、約５３、約５４、約５５、約５６、約５７、約５８、約５９、約６０、約６１、約６２、約６３、約６４、約６５、約６６、約６７、約６８、約６９、約７０、約７１、約７２、約７３、約７４、約７５、約７６、約７７、約７８、約７９、約８０、約８１、約８２、約８３、約８４、約８５、約８６、約８７、約８８、約８９、約９０、約９１、約９２、約９３、約９４、約９５、約９６、約９７、約９８、約９９、約１００、約１０１、約１０２、約１０３、約１０４、約１０５、約１０６、約１０７、約１０８、約１０９、約１１０、約１１１、約１１２、約１１３、約１１４、約１１５、約１１６、約１１７、約１１８、約１１９、約１２０、約１２１、約１２２、約１２３、約１２４、約１２５、約１２６、約１２７、約１２８、約１２９、約１３０、約１３１、約１３２、約１３３、約１３４、約１３５、約１３６、約１３７、約１３８、約１３９、約１４０、約１４１、約１４２、約１４３、約１４４、約１４５、約１４６、約１４７、約１４８、約１４９、約１５０、約１５１、約１５２、約１５３、約１５４、約１５５、約１５６、約１５７、約１５８、約１５９、約１６０、約１６１、約１６２、約１６３、約１６４、約１６５、約１６６、約１６７、約１６８、約１６９、約１７０、約１７１、約１７２、約１７３、約１７４、約１７５、約１７６、約１７７、約１７８、約１７９、約１８０、約１８１、約１８２、約１８３、約１８４、約１８５、約１８６、約１８７、約１８８、約１８９、約１９０、約１９１、約１９２、約１９３、約１９４、約１９５、約１９６、約１９７、約１９８、約１９９～約２００ｋＤａを範囲とする。いくつかの実施形態において、ポリマーのＭＷは約５ｋＤａから５０ｋＤａの間である。いくつかの実施形態において、ポリマーのＭＷは約１０ｋＤａから５０ｋＤａの間である。
いくつかの実施形態において、本開示の方法によって作製されるポリマーのＭＷは、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、約５０、約５１、約５２、約５３、約５４、約５５、約５６、約５７、約５８、約５９、約６０、約６１、約６２、約６３、約６４、約６５、約６６、約６７、約６８、約６９、約７０、約７１、約７２、約７３、約７４、約７５、約７６、約７７、約７８、約７９、約８０、約８１、約８２、約８３、約８４、約８５、約８６、約８７、約８８、約８９、約９０、約９１、約９２、約９３、約９４、約９５、約９６、約９７、約９８、約９９、約１００、約１０１、約１０２、約１０３、約１０４、約１０５、約１０６、約１０７、約１０８、約１０９、約１１０、約１１１、約１１２、約１１３、約１１４、約１１５、約１１６、約１１７、約１１８、約１１９、約１２０、約１２１、約１２２、約１２３、約１２４、約１２５、約１２６、約１２７、約１２８、約１２９、約１３０、約１３１、約１３２、約１３３、約１３４、約１３５、約１３６、約１３７、約１３８、約１３９、約１４０、約１４１、約１４２、約１４３、約１４４、約１４５、約１４６、約１４７、約１４８、約１４９、約１５０、約１５１、約１５２、約１５３、約１５４、約１５５、約１５６、約１５７、約１５８、約１５９、約１６０、約１６１、約１６２、約１６３、約１６４、約１６５、約１６６、約１６７、約１６８、約１６９、約１７０、約１７１、約１７２、約１７３、約１７４、約１７５、約１７６、約１７７、約１７８、約１７９、約１８０、約１８１、約１８２、約１８３、約１８４、約１８５、約１８６、約１８７、約１８８、約１８９、約１９０、約１９１、約１９２、約１９３、約１９４、約１９５、約１９６、約１９７、約１９８、約１９９～約２００ｋＤａである。いくつかの実施形態において、本開示の方法によって作製されるポリマーのＭＷは、約５ｋＤａから５０ｋＤａの間である。いくつかの実施形態において、本開示の方法によって作製されるポリマーのＭＷは、約１０ｋＤａである。いくつかの実施形態において、本開示の方法によって作製されるポリマーのＭＷは、約２０ｋＤａである。いくつかの実施形態において、本開示の方法によって作製されるポリマーのＭＷは、約３０ｋＤａである。いくつかの実施形態において、本開示の方法によって作製されるポリマーのＭＷは、約４０ｋＤａである。
いくつかの実施形態において、ステップ（ｂ）の後の生成物のＭＷは約３ｋＤａである。
ポリプレックス
いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書で説明される核酸成分と、本明細書で開示される分枝状ポリマーのいずれか、例えば、本明細書で説明されるプロセスによって作製されたポリマー、または式（Ｉ）のポリマー：
Figure 2022514113000095
 とを含むポリプレックスであって、式中、
各Ａが、独立的に、１～３０個の炭素原子の直鎖状もしくは分枝状炭素鎖、１～３０個の原子の直鎖状もしくは分枝状ヘテロ原子含有炭素鎖、３～３０個の炭素原子を含む炭素環、または３～３０個の原子を含む複素環であり、
Ａが、任意選択で、１つ以上のハロゲン、ヒドロキシル、アミノ基、スルホニル基、スルホンアミド基、チオール、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ、Ｃ１－Ｃ６エーテル、Ｃ１－Ｃ６チオエーテル、Ｃ１－Ｃ６スルホン、Ｃ１－Ｃ６スルホキシド、Ｃ１－Ｃ６１級アミド、Ｃ１－Ｃ６２級アミド、ハロＣ１－Ｃ６アルキル、カルボキシル基、シアノ基、ニトロ基、ニトロソ基、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ３－Ｃ６シクロアルキル、Ｃ３－Ｃ６ヘテロシクリル、Ｃ２－Ｃ５ヘテロアリール、またはＣ６－Ｃ１０アリールで置換され（式中、各Ｒ’は、独立的に、水素及びＣ１－Ｃ６アルキルからなる群より選択される）、
各Ｂが、独立的に、第１の結合部分であり、
各Ｘが、独立的に、
Figure 2022514113000096
 であり、
各Ｙが、独立的に、
Figure 2022514113000097
 であり、
各Ｌが、独立的に、第２の結合部分であり、
各Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３が、各出現において独立的に、Ｈ、Ｃ１－Ｃ４０アルキル、Ｃ１－Ｃ４０ヘテロアルキル、Ｃ２－Ｃ４０アルケニル、Ｃ２－Ｃ４０ヘテロアルケニレン、Ｃ４－Ｃ８シクロアルケニル、Ｃ２－Ｃ４０アルキニル、Ｃ２－Ｃ４０ヘテロアルキニレン、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、もしくはヘテロアリールであり、当該ヘテロシクリル及びヘテロアリールが、Ｎ、Ｓ、Ｐ、及びＯからなる群より選択される１～５個のヘテロ原子を含み、当該Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ８アルケニル、Ｃ４－Ｃ８シクロアルケニル、Ｃ２－Ｃ６アルキニル、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、及びヘテロアリールが、任意選択で、Ｄ、ハロゲン、Ｃ１－Ｃ６アルキル、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、もしくは－Ｎ（Ｃ１－Ｃ６アルキル）２で置換され、または
Ｒ２及びＲ３が、それらが結合する原子と一緒になって、Ｎ、Ｓ、Ｐ、及びＯからなる群より選択される１～３個のヘテロ原子を含むヘテロシクリルまたはヘテロアリールを形成してもよく、
ａが１～１０００であり、
ｂが１～４であり、
ｃが１～３であり、
ｚが１～１００であり、
ただし、Ｒ２及びＲ３の少なくとも一方がＨではないことを前提とする、ポリプレックスを提供する。
ある特定の実施形態において、ポリプレックスは、核酸成分と、式（ＩＩ）のポリマー：
Figure 2022514113000098
 とを含み、式中、
各Ｅ１が、共有結合、－Ｎ－、－Ｏ－、－Ｓ－、アルキレン、ヘテロアルキレン、アルケニル、ヘテロアルケニレン、アルキニル、ヘテロアルキニレンからなる群より選択され；
各Ｅ２が、共有結合、－Ｎ－、－Ｏ－、－Ｓ－、アルキレン、ヘテロアルキレン、アルケニル、ヘテロアルケニレン、アルキニル、ヘテロアルキニレンからなる群より選択され；
Ｇが、－Ｃ－、－Ｓ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｐ（ＯＲ１）－、または－Ｐ（ＯＨ）－であり、
ｎが少なくとも１である。
いくつかの実施形態において、各Ｂは、独立的に、
Figure 2022514113000099
 ある。いくつかの実施形態において、各Ｅ１及びＥ２は、独立的に、共有結合、－Ｎ－、－Ｏ－、－Ｓ－、アルキレン、ヘテロアルキレン、アルケニル、ヘテロアルケニレン、アルキニル、ヘテロアルキニレンからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、各Ｅ１はヘテロアルキレンである。いくつかの実施形態において、各Ｅ１は－ＣＨ２－Ｏ－である。いくつかの実施形態において、各Ｅ２はアルキレンである。いくつかの実施形態において、各Ｅ２は、
Figure 2022514113000100
 である。いくつかの実施形態において、各Ｅ２は、
Figure 2022514113000101
 である。いくつかの実施形態において、各ｎは少なくとも１である。例えば、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０とすることができる。いくつかの実施形態において、ｎは１である。いくつかの実施形態において、Ｇは－Ｃ－である。いくつかの実施形態において、各Ｂは、
Figure 2022514113000102
 である。
いくつかの実施形態において、Ｂ及びＡは化合して、
Figure 2022514113000103
 を形成する。
いくつかの実施形態において、各Ｌは
Figure 2022514113000104
 であり、式中、ｘは１～１０００である。いくつかの実施形態において、ａは少なくとも２であり、ｂは３であり、各Ｘは、
Figure 2022514113000105
 である。いくつかの実施形態において、各Ａは、
Figure 2022514113000106
 である。いくつかの実施形態において、各Ｌは、
Figure 2022514113000107
 である。
いくつかの実施形態において、Ｙは、
Figure 2022514113000108
 である。
いくつかの実施形態において、各Ｒ２及び／またはＲ３は
Figure 2022514113000109
 である。
いくつかの実施形態において、各Ｒ１は
Figure 2022514113000110
 である。
いくつかの実施形態において、ポリプレックスは、核酸成分と、式（ＩＩＩ）～（ＶＩＩｅ）のポリマー：
Figure 2022514113000111
Figure 2022514113000112
Figure 2022514113000113
 とを含み、式中、各Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７は、各出現において独立的に、Ｈ、Ｃ１－Ｃ４０アルキル、Ｃ１－Ｃ４０ヘテロアルキル、Ｃ２－Ｃ４０アルケニル、Ｃ２－Ｃ４０ヘテロアルケニレン、Ｃ４－Ｃ８シクロアルケニル、Ｃ２－Ｃ４０アルキニル、Ｃ２－Ｃ４０ヘテロアルキニレン、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、もしくはヘテロアリールであり、当該ヘテロシクリル及びヘテロアリールは、Ｎ、Ｓ、Ｐ、及びＯからなる群より選択される１～５個のヘテロ原子を含み、当該Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ８アルケニル、Ｃ４－Ｃ８シクロアルケニル、Ｃ２－Ｃ６アルキニル、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、及びヘテロアリールは、任意選択で、Ｄ、ハロゲン、Ｃ１－Ｃ６アルキル、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、もしくは－Ｎ（Ｃ１－Ｃ６アルキル）２で置換され、残りの変数は上記で定義されている通りである。
いくつかの実施形態において、ｚは、１、２、または３である。いくつかの実施形態において、ｚは１である。
いくつかの実施形態において、ポリプレックスは、核酸成分と、
Figure 2022514113000114
を含むポリマーとを含み、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ａ、Ｅ１、Ｇ、Ｊ、Ｑ、Ｚ、Ｚ’’、及びｎは、本明細書で示されるいずれかの定義を有する。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約３ｋＤａ～約２００ｋＤａである。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約５ｋＤａ～約５０ｋＤａである。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約１０ｋＤａから５０ｋＤａの間である。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約５ｋＤａ～約１５ｋＤａである。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約１０ｋＤａである。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約２０ｋＤａである。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約３０ｋＤａである。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約４０ｋＤａである。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのマーク－フウィンクから定義されるアルファパラメーターは、約０．５未満である。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのマーク－フウィンクの式から定義されるアルファパラメーターは、約０．３～約０．５を範囲とする。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＰＤＩは約１．０～約８．０である。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＰＤＩは約２．５である。
いくつかの実施形態において、ポリプレックスは、核酸成分と、
Figure 2022514113000115
 を含むポリマーとを含み、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ａ、Ｅ１、Ｇ、Ｊ、Ｑ、Ｚ、及びｎは、本明細書で示されるいずれかの定義を有する。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約３ｋＤａ～約２００ｋＤａである。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約５ｋＤａ～約５０ｋＤａである。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約１０ｋＤａから５０ｋＤａの間である。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約５ｋＤａ～約１５ｋＤａである。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約１０ｋＤａである。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約２０ｋＤａである。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約３０ｋＤａである。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約４０ｋＤａである。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのマーク－フウィンクから定義されるアルファパラメーターは、約０．５未満である。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのマーク－フウィンクの式から定義されるアルファパラメーターは、約０．３～約０．５を範囲とする。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＰＤＩは約１．０～約８．０である。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＰＤＩは約２．５である。
いくつかの実施形態において、ポリプレックスは、核酸成分と、
Figure 2022514113000116
 を含むポリマーとを含み、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ａ、Ｅ１、Ｇ、Ｊ、Ｑ、Ｚ、Ｚ’’、及びｎは、本明細書で示されるいずれかの定義を有する。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約３ｋＤａ～約２００ｋＤａである。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約５ｋＤａ～約５０ｋＤａである。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約１０ｋＤａから５０ｋＤａの間である。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約５ｋＤａ～約１５ｋＤａである。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約１０ｋＤａである。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約２０ｋＤａである。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約３０ｋＤａである。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約４０ｋＤａである。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのマーク－フウィンクから定義されるアルファパラメーターは、約０．５未満である。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのマーク－フウィンクの式から定義されるアルファパラメーターは、約０．３～約０．５を範囲とする。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＰＤＩは約１．０～約８．０である。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＰＤＩは約２．５である。
いくつかのさらなる実施形態において、ポリプレックスは、核酸成分と、
Figure 2022514113000117
 を含むポリマーとを含む。
いくつかのさらなる実施形態において、ポリプレックスは、核酸成分と、
Figure 2022514113000118
 を含むポリマーと含み、式中、
ＪはＯであり、Ｚは
Figure 2022514113000119
 であり、式中、ｘは１～１０００である。
いくつかのさらなる実施形態において、ポリプレックスは、核酸成分と、
Figure 2022514113000120
 を含むポリマーとを含む。
いくつかのさらなる実施形態において、ポリプレックスは、核酸成分と、Ｒ１が
Figure 2022514113000121
 及び
Figure 2022514113000122
 から選択されるポリマーとを含む。
いくつかのさらなる実施形態において、ポリプレックスは、核酸成分と、Ｒ１が
Figure 2022514113000123
 であるポリマーとを含む。
いくつかのさらなる実施形態において、ポリプレックスは、核酸成分と、Ｒ１が
Figure 2022514113000124
 であるポリマーとを含む。
いくつかのさらなる実施形態において、ポリプレックスは、核酸成分と、Ｒ２が
Figure 2022514113000125
 及び
Figure 2022514113000126
 から選択されるポリマーとを含む。
いくつかのさらなる実施形態において、ポリプレックスは、核酸成分と、Ｒ２が
Figure 2022514113000127
 であるポリマーとを含む。
いくつかのさらなる実施形態において、ポリプレックスは、核酸成分と、Ｒ２が
Figure 2022514113000128
 であるポリマーとを含む。
いくつかのさらなる実施形態において、ポリプレックスは、核酸成分と、Ｒ１が
Figure 2022514113000129
 であり、Ｒ２が
Figure 2022514113000130
 であるポリマーとを含む。
いくつかのさらなる実施形態において、ポリプレックスは、核酸成分と、Ｒ１が
Figure 2022514113000131
 であり、Ｒ２が
Figure 2022514113000132
 であるポリマーとを含む。
いくつかの実施形態において、ポリプレックスは、核酸成分と、
Figure 2022514113000133
 を含むポリマーと含み、式中、
Ｒ１は
Figure 2022514113000134
 であり、
Ｒ２は
Figure 2022514113000135
 から選択される。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約３ｋＤａ～約２００ｋＤａである。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約５ｋＤａ～約５０ｋＤａである。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約１０ｋＤａから５０ｋＤａの間である。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約５ｋＤａ～約１５ｋＤａである。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約１０ｋＤａである。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約２０ｋＤａである。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約３０ｋＤａである。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約４０ｋＤａである。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのマーク－フウィンクから定義されるアルファパラメーターは、約０．５未満である。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのマーク－フウィンクの式から定義されるアルファパラメーターは、約０．３～約０．５を範囲とする。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＰＤＩは約１．０～約８．０である。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＰＤＩは約２．５である。
いくつかの実施形態において、ポリプレックスは、核酸成分と、
Figure 2022514113000136
 を含むポリマーとを含み、式中、
ＪはＯであり、Ｚは
Figure 2022514113000137
 であり、式中、ｘは１～１０００であり、
Ｒ１は
Figure 2022514113000138
 であり、
Ｒ２は
Figure 2022514113000139
 である。
いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約３ｋＤａ～約２００ｋＤａである。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約５ｋＤａ～約５０ｋＤａである。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約１０ｋＤａから５０ｋＤａの間である。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約５ｋＤａ～約１５ｋＤａである。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約１０ｋＤａである。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約２０ｋＤａである。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約３０ｋＤａである。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＭＷは約４０ｋＤａである。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのマーク－フウィンクから定義されるアルファパラメーターは、約０．５未満である。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのマーク－フウィンクの式から定義されるアルファパラメーターは、約０．３～約０．５を範囲とする。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＰＤＩは約１．０～約８．０である。いくつかのさらなる実施形態において、ポリマーのＰＤＩは約２．５である。
いくつかの実施形態において、ポリマー及び核酸成分は、約０．１：１～約２００：１（ｗ／ｗ）の比で存在する。例えば、ポリマー及び核酸成分は、約０．１：１、約０．２：１、約０．３：１、約０．４：１、約０．５：１、約０．６：１、約０．７：１、約０．８：１、約０．９：１、約１：１、約２：１、約３：１、約４：１、約５：１、約６：１、約７：１、約８：１、約９：１、約１０：１、約１１：１、約１２：１、約１３：１、約１４：１、約１５：１、約１６：１、約１７：１、約１８：１、約１９：１、約２０：１、約２１：１、約２２：１、約２３：１、約２４：１、約２５：１、約２６：１、約２７：１、約２８：１、約２９：１、約３０：１、約３１：１、約３２：１、約３３：１、約３４：１、約３５：１、約３６：１、約３７：１、約３８：１、約３９：１、約４０：１、約４１：１、約４２：１、約４３：１、約４４：１、約４５：１、約４６：１、約４７：１、約４８：１、約４９：１、約５０：１、約５１：１、約５２：１、約５３：１、約５４：１、約５５：１、約５６：１、約５７：１、約５８：１、約５９：１、約６０：１、約６１：１、約６２：１、約６３：１、約６４：１、約６５：１、約６６：１、約６７：１、約６８：１、約６９：１、約７０：１、約７１：１、約７２：１、約７３：１、約７４：１、約７５：１、約７６：１、約７７：１、約７８：１、約７９：１、約８０：１、約８１：１、約８２：１、約８３：１、約８４：１、約８５：１、約８６：１、約８７：１、約８８：１、約８９：１、約９０：１、約９１：１、約９２：１、約９３：１、約９４：１、約９５：１、約９６：１、約９７：１、約９８：１、約９９：１、約１００：１、約１０１：１、約１０２：１、約１０３：１、約１０４：１、約１０５：１、約１０６：１、約１０７：１、約１０８：１、約１０９：１、約１１０：１、約１１１：１、約１１２：１、約１１３：１、約１１４：１、約１１５：１、約１１６：１、約１１７：１、約１１８：１、約１１９：１、約１２０：１、約１２１：１、約１２２：１、約１２３：１、約１２４：１、約１２５：１、約１２６：１、約１２７：１、約１２８：１、約１２９：１、約１３０：１、約１３１：１、約１３２：１、約１３３：１、約１３４：１、約１３５：１、約１３６：１、約１３７：１、約１３８：１、約１３９：１、約１４０：１、約１４１：１、約１４２：１、約１４３：１、約１４４：１、約１４５：１、約１４６：１、約１４７：１、約１４８：１、約１４９：１、約１５０：１、約１５１：１、約１５２：１、約１５３：１、約１５４：１、約１５５：１、約１５６：１、約１５７：１、約１５８：１、約１５９：１、約１６０：１、約１６１：１、約１６２：１、約１６３：１、約１６４：１、約１６５：１、約１６６：１、約１６７：１、約１６８：１、約１６９：１、約１７０：１、約１７１：１、約１７２：１、約１７３：１、約１７４：１、約１７５：１、約１７６：１、約１７７：１、約１７８：１、約１７９：１、約１８０：１、約１８１：１、約１８２：１、約１８３：１、約１８４：１、約１８５：１、約１８６：１、約１８７：１、約１８８：１、約１８９：１、約１９０：１、約１９１：１、約１９２：１、約１９３：１、約１９４：１、約１９５：１、約１９６：１、約１９７：１、約１９８：１、約１９９：１～約２００：１（これらの間の全ての範囲を含む）を範囲とする比で存在する。いくつかの実施形態において、ポリマー及び核酸成分は、約２０：１～約８０：１（ｗ／ｗ）の比で存在する。
いくつかの実施形態において、ポリマー及び核酸成分は、約０．１：１、約０．２：１、約０．３：１、約０．４：１、約０．５：１、約０．６：１、約０．７：１、約０．８：１、約０．９：１、約１：１、約２：１、約３：１、約４：１、約５：１、約６：１、約７：１、約８：１、約９：１、約１０：１、約１１：１、約１２：１、約１３：１、約１４：１、約１５：１、約１６：１、約１７：１、約１８：１、約１９：１、約２０：１、約２１：１、約２２：１、約２３：１、約２４：１、約２５：１、約２６：１、約２７：１、約２８：１、約２９：１、約３０：１、約３１：１、約３２：１、約３３：１、約３４：１、約３５：１、約３６：１、約３７：１、約３８：１、約３９：１、約４０：１、約４１：１、約４２：１、約４３：１、約４４：１、約４５：１、約４６：１、約４７：１、約４８：１、約４９：１、約５０：１、約５１：１、約５２：１、約５３：１、約５４：１、約５５：１、約５６：１、約５７：１、約５８：１、約５９：１、約６０：１、約６１：１、約６２：１、約６３：１、約６４：１、約６５：１、約６６：１、約６７：１、約６８：１、約６９：１、約７０：１、約７１：１、約７２：１、約７３：１、約７４：１、約７５：１、約７６：１、約７７：１、約７８：１、約７９：１、約８０：１、約８１：１、約８２：１、約８３：１、約８４：１、約８５：１、約８６：１、約８７：１、約８８：１、約８９：１、約９０：１、約９１：１、約９２：１、約９３：１、約９４：１、約９５：１、約９６：１、約９７：１、約９８：１、約９９：１、約１００：１、約１０１：１、約１０２：１、約１０３：１、約１０４：１、約１０５：１、約１０６：１、約１０７：１、約１０８：１、約１０９：１、約１１０：１、約１１１：１、約１１２：１、約１１３：１、約１１４：１、約１１５：１、約１１６：１、約１１７：１、約１１８：１、約１１９：１、約１２０：１、約１２１：１、約１２２：１、約１２３：１、約１２４：１、約１２５：１、約１２６：１、約１２７：１、約１２８：１、約１２９：１、約１３０：１、約１３１：１、約１３２：１、約１３３：１、約１３４：１、約１３５：１、約１３６：１、約１３７：１、約１３８：１、約１３９：１、約１４０：１、約１４１：１、約１４２：１、約１４３：１、約１４４：１、約１４５：１、約１４６：１、約１４７：１、約１４８：１、約１４９：１、約１５０：１、約１５１：１、約１５２：１、約１５３：１、約１５４：１、約１５５：１、約１５６：１、約１５７：１、約１５８：１、約１５９：１、約１６０：１、約１６１：１、約１６２：１、約１６３：１、約１６４：１、約１６５：１、約１６６：１、約１６７：１、約１６８：１、約１６９：１、約１７０：１、約１７１：１、約１７２：１、約１７３：１、約１７４：１、約１７５：１、約１７６：１、約１７７：１、約１７８：１、約１７９：１、約１８０：１、約１８１：１、約１８２：１、約１８３：１、約１８４：１、約１８５：１、約１８６：１、約１８７：１、約１８８：１、約１８９：１、約１９０：１、約１９１：１、約１９２：１、約１９３：１、約１９４：１、約１９５：１、約１９６：１、約１９７：１、約１９８：１、約１９９：１、または約２００：１の比で存在する。いくつかの実施形態において、ポリマー及び核酸成分は、約３０：１（ｗ／ｗ）の比で存在する。
いくつかの実施形態において、粒子サイズは２μｍ未満である。いくつかの実施形態において、ポリプレックスの粒子サイズは、約３００ｎｍ未満である。例えば、ポリプレックスの粒子サイズは、約５０、５１、約５２、約５３、約５４、約５５、約５６、約５７、約５８、約５９、約６０、約６１、約６２、約６３、約６４、約６５、約６６、約６７、約６８、約６９、約７０、約７１、約７２、約７３、約７４、約７５、約７６、約７７、約７８、約７９、約８０、約８１、約８２、約８３、約８４、約８５、約８６、約８７、約８８、約８９、約９０、約９１、約９２、約９３、約９４、約９５、約９６、約９７、約９８、約９９、約１００、約１０１、約１０２、約１０３、約１０４、約１０５、約１０６、約１０７、約１０８、約１０９、約１１０、約１１１、約１１２、約１１３、約１１４、約１１５、約１１６、約１１７、約１１８、約１１９、約１２０、約１２１、約１２２、約１２３、約１２４、約１２５、約１２６、約１２７、約１２８、約１２９、約１３０、約１３１、約１３２、約１３３、約１３４、約１３５、約１３６、約１３７、約１３８、約１３９、約１４０、約１４１、約１４２、約１４３、約１４４、約１４５、約１４６、約１４７、約１４８、約１４９、約１５０、約１５１、約１５２、約１５３、約１５４、約１５５、約１５６、約１５７、約１５８、約１５９、約１６０、約１６１、約１６２、約１６３、約１６４、約１６５、約１６６、約１６７、約１６８、約１６９、約１７０、約１７１、約１７２、約１７３、約１７４、約１７５、約１７６、約１７７、約１７８、約１７９、約１８０、約１８１、約１８２、約１８３、約１８４、約１８５、約１８６、約１８７、約１８８、約１８９、約１９０、約１９１、約１９２、約１９３、約１９４、約１９５、約１９６、約１９７、約１９８、約１９９、約２００、約２０１、約２０２、約２０３、約２０４、約２０５、約２０６、約２０７、約２０８、約２０９、約２１０、約２１１、約２１２、約２１３、約２１４、約２１５、約２１６、約２１７、約２１８、約２１９、約２２０、約２２１、約２２２、約２２３、約２２４、約２２５、約２２６、約２２７、約２２８、約２２９、約２３０、約２３１、約２３２、約２３３、約２３４、約２３５、約２３６、約２３７、約２３８、約２３９、約２４０、約２４１、約２４２、約２４３、約２４４、約２４５、約２４６、約２４７、約２４８、約２４９、約２５０、約２５１、約２５２、約２５３、約２５４、約２５５、約２５６、約２５７、約２５８、約２５９、約２６０、約２６１、約２６２、約２６３、約２６４、約２６５、約２６６、約２６７、約２６８、約２６９、約２７０、約２７１、約２７２、約２７３、約２７４、約２７５、約２７６、約２７７、約２７８、約２７９、約２８０、約２８１、約２８２、約２８３、約２８４、約２８５、約２８６、約２８７、約２８８、約２８９、約２９０、約２９１、約２９２、約２９３、約２９４、約２９５、約２９６、約２９７、約２９８、約２９９、または約３００ｎｍとすることができる。いくつかの実施形態において、本開示のポリプレックスの粒子サイズは約６０ｎｍ～約２５０ｎｍである。いくつかの実施形態において、本開示のポリプレックスの粒子サイズは約１７５ｎｍ～約２５０ｎｍである。
いくつかの実施形態において、本開示のポリプレックスのゼータ電位は約０ｍＶ～約１００ｍＶである。例えば、本開示のポリプレックスは、約０、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、約５０、約５１、約５２、約５３、約５４、約５５、約５６、約５７、約５８、約５９、約６０、約６１、約６２、約６３、約６４、約６５、約６６、約６７、約６８、約６９、約７０、約７１、約７２、約７３、約７４、約７５、約７６、約７７、約７８、約７８、約７９、約８０、約８１、約８２、約８３、約８４、約８５、約８６、約８７、約８８、約８９、約９０、約９１、約９２、約９３、約９４、約９５、約９６、約９７、約９８、約９９～約１００ｍＶを範囲とすることができる。いくつかの実施形態において、ゼータ電位は約３０ｍＶ～約３４ｍＶである。
いくつかの実施形態において、本開示のポリプレックスのゼータ電位は、約０、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、約５０、約５１、約５２、約５３、約５４、約５５、約５６、約５７、約５８、約５９、約６０、約６１、約６２、約６３、約６４、約６５、約６６、約６７、約６８、約６９、約７０、約７１、約７２、約７３、約７４、約７５、約７６、約７７、約７８、約７８、約７９、約８０、約８１、約８２、約８３、約８４、約８５、約８６、約８７、約８８、約８９、約９０、約９１、約９２、約９３、約９４、約９５、約９６、約９７、約９８、約９９、または約１００ｍＶである。
いくつかの実施形態において、ポリプレックスの核酸成分は、プラスミド、ナノプラスミド、核酸、ミニサークル、または遺伝子編集システムである。いくつかの実施形態において、ポリプレックスの核酸成分はプラスミドである。いくつかの実施形態において、ポリプレックスの核酸成分はナノプラスミドである。いくつかの実施形態において、ナノプラスミドは、真核導入遺伝子及び０．５ｋｂ未満のサイズの細菌骨格を含む。いくつかの実施形態において、プラスミドまたはナノプラスミドは、抗生物質耐性マーカーなしのプラスミドまたは抗生物質耐性マーカーなしのナノプラスミドである。いくつかの実施形態において、プラスミドまたはナノプラスミドは、スクロース選択マーカーまたはナンセンスサプレッサーマーカーを含む。
いくつかの実施形態において、ポリプレックスの核酸成分は遺伝子編集システムである。いくつかの実施形態において、遺伝子編集システムは、（ｉ）クラスター化等間隔短回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）システム、（ｉｉ）転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）システム、または（ｉｉｉ）ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）システムである。
いくつかの実施形態において、核酸はＲＮＡｉ誘導分子である。ＲＮＡｉ誘導分子は、ｓｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びマイクロＲＮＡからなる群より選択され得る。
いくつかの実施形態において、核酸成分は組織特異的プロモーターを含む。
いくつかの実施形態において、核酸成分は、遺伝子疾患または障害に関連する遺伝子を含む。遺伝子疾患または障害は、タンパク質発現の低下、不在、または機能不全をもたらす１つ以上の遺伝子の変異によって引き起こされ得る。遺伝子は、ＣＯＬ７Ａ１、ＬＡＭＢ３、ＡＤＡ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＣＦＴＲ、ＨＴＴ、ＮＦ１、ＰＨＡ、ＨＢＳ、ＦＥＲＭＴ１、ＫＲＴ１４、ＤＳＰ、ＳＰＩＮＫ５、及びＦＬＧからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、遺伝子はＣＯＬ７Ａ１であり、遺伝子疾患または障害は表皮水疱症の形態である。表皮水疱症には、栄養障害型表皮水疱症（常染色体劣性）、栄養障害型表皮水疱症（限局型バリアント）、痒疹型表皮水疱症、表皮水疱症（前脛骨型）、単純型表皮水疱症（Ｄｏｗｌｉｎｇ－Ｍｅａｒａ型）、単純型表皮水疱症（Ｋｏｅｂｎｅｒ型）、単純型表皮水疱症（劣性１）、単純型表皮水疱症（Ｗｅｂｅｒ－Ｃｏｃｋａｙｎｅ型）、表皮水疱症（致死性棘融解型症）が含まれる。いくつかの実施形態において、遺伝子障害または遺伝子疾患は、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損症、アルファ－１アンチトリプシン欠損症、嚢胞性線維症、ハンチントン病、１型神経線維腫症、フェニルケトン尿症、鎌状赤血球症、孤発性封入体筋炎、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、キンドラー症候群、接合部型表皮水疱症、網状色素性皮膚症、Ｎａｅｇｅｌｉ－Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｅｔｔｉ－Ｊａｄａｓｓｏｈｎ症候群、ネザートン症候群、尋常性魚鱗癬、アトピー性皮膚炎、アッシャー症候群、Ｅｈｌｅｒｓ－Ｄａｎｌｏｓ症候群、ホモ接合性家族性高コレステロール血症（ＨｏＦＨ）、またはクローン病である。
いくつかの実施形態において、遺伝子の配列は、ポリプレックスを細胞に送達した際にタンパク質発現が最大限になるように最適化されている。
医薬組成物
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示のある特定の実施形態に従う１つ以上のポリプレックスの有効量と、医薬的に許容される担体との組合せを含む、医薬組成物を提供する。
いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書で説明される１つ以上のポリプレックスの有効量と、医薬的に許容される賦形剤との組合せを含む、医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態において、医薬的に許容される賦形剤は、１つ以上の増量剤、緩衝剤、張性剤、及び凍結保護物質からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、増量剤は、ヒドロキシエチルデンプン、トレハロース、マンニトール、ラクトース、及びグリシンからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、緩衝剤は、リン酸バッファー、トリスＨＣｌバッファー、クエン酸バッファー、及びヒスチジンからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、張性剤は、マンニトール、スクロース、グリシン、グリセロール、及び塩化ナトリウムからなる群より選択される。
いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書で説明される１つ以上のポリプレックスの有効量と、凍結保護物質との組合せを含む、医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態において、凍結保護物質は、グルコース、スクロース、トレハロース、ラクトース、マンニトール、ソルビトール、アエロジル（コロイド状二酸化ケイ素）、マルトース、ポリ（ビニルピロリドン）、フルクトース、デキストラン、グリセロール、ポリ（ビニルアルコール）、グリシン、ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン、及びゼラチンからなる群より選択される。ある特定の実施形態において、凍結保護物質は、トレハロース、スクロース、グルコース、及びマンニトールからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、凍結保護物質はスクロースである。
いくつかの実施形態において、医薬的に許容される担体は、経口、非経口、吸入、局所、皮下、筋肉内、静脈内、眼内、または皮内の投与に適している。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、非水性ローション、油中水型ローション、及び水中油型ローションからなる群より選択されるローションとして製剤化される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、将来使用するために凍結乾燥される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は水溶液中で凍結される。
いくつかの実施形態において、医薬組成物は凍結乾燥物質である。いくつかの実施形態において、凍結乾燥物質は、本明細書で説明される１つ以上のポリプレックスの有効量と、医薬的に許容される賦形剤との組合せを含む。ある特定の実施形態において、医薬的に許容される賦形剤は、凍結保護物質を含む。ある特定の実施形態において、凍結保護物質は、トレハロース、スクロース、グルコース、及びマンニトールからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、凍結保護物質はスクロースである。
いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書で説明される１つ以上のポリプレックスの有効量と、医薬的に許容される担体との組合せを含む、医薬組成物を作製する方法を提供する。いくつかの実施形態において、当該方法は、本明細書で説明される１つ以上のポリプレックスを好適な溶媒と組み合わせることを含む。いくつかの実施形態において、好適な溶媒は、水、ジメチルスルホキシド、及びこれらの混合物からなる群から選択される。ある特定の実施形態において、好適な溶媒は水を含む。
いくつかの実施形態において、当該方法は、
（ａ）本明細書で説明される１つ以上のポリプレックスを好適な溶媒と組み合わせることと、
（ｂ）１つ以上の医薬的に許容される賦形剤をステップ（ａ）の混合物に添加することと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の混合物を凍結乾燥して、凍結乾燥物を得ることとを含む。
いくつかの実施形態において、ステップ（ｂ）の１つ以上の医薬的に許容される賦形剤は、凍結保護物質を含む。ある特定の実施形態において、凍結保護物質の濃度は、ステップ（ｂ）の混合物の約１重量％～約２０重量％であり、これには約２重量％、約３重量％、約４重量％、約５重量％、約６重量％、約７重量％、約８重量％、約９重量％、約１０重量％、約１１重量％、約１２重量％、約１３重量％、約１４重量％、約１５重量％、約１６重量％、約１７重量％、約１８重量％、及び約１９重量％（これらの間の全ての範囲を含む）が含まれる。ある特定の実施形態において、凍結保護物質の濃度は、ステップ（ｂ）の混合物の約１重量％、約２重量％、約３重量％、約４重量％、約５重量％、約６重量％、約７重量％、約８重量％、約９重量％、約１０重量％、約１１重量％、約１２重量％、約１３重量％、約１４重量％、約１５重量％、約１６重量％、約１７重量％、約１８重量％、約１９重量％、または約２０重量％である。特定の実施形態において、凍結保護物質の濃度は、ステップ（ｂ）の混合物の約１重量％である。特定の実施形態において、凍結保護物質の濃度は、ステップ（ｂ）の混合物の約３重量％である。特定の実施形態において、凍結保護物質の濃度は、ステップ（ｂ）の混合物の約５重量％である。
いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書で説明される方法に従って調製される医薬組成物を提供する。
いくつかの実施形態において、本開示は、下記：
（ａ）本明細書で説明される１つ以上のポリプレックスを好適な溶媒と組み合わせることと、
（ｂ）１つ以上の医薬的に許容される賦形剤をステップ（ａ）の混合物に添加することと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の混合物を凍結乾燥して、凍結乾燥物を得ることとを含む方法によって調製される、医薬組成物を提供する。
いくつかの実施形態において、ステップ（ｂ）の１つ以上の医薬的に許容される賦形剤は、凍結保護物質を含む。ある特定の実施形態において、凍結保護物質の濃度は、ステップ（ｂ）の混合物の約１重量％～約２０重量％であり、これには約２重量％、約３重量％、約４重量％、約５重量％、約６重量％、約７重量％、約８重量％、約９重量％、約１０重量％、約１１重量％、約１２重量％、約１３重量％、約１４重量％、約１５重量％、約１６重量％、約１７重量％、約１８重量％、及び約１９重量％（これらの間の全ての範囲を含む）が含まれる。ある特定の実施形態において、凍結保護物質の濃度は、ステップ（ｂ）の混合物の約１重量％、約２重量％、約３重量％、約４重量％、約５重量％、約６重量％、約７重量％、約８重量％、約９重量％、約１０重量％、約１１重量％、約１２重量％、約１３重量％、約１４重量％、約１５重量％、約１６重量％、約１７重量％、約１８重量％、約１９重量％、または約２０重量％である。特定の実施形態において、凍結保護物質の濃度は、ステップ（ｂ）の混合物の約１重量％である。特定の実施形態において、凍結保護物質の濃度は、ステップ（ｂ）の混合物の約３重量％である。特定の実施形態において、凍結保護物質の濃度は、ステップ（ｂ）の混合物の約５重量％である。
細胞形質移入の方法
いくつかの実施形態において、本開示は、細胞形質移入の方法であって、標的細胞にポリプレックスを形質移入するのに適した条件下で、１つ以上の標的細胞を、本開示のある特定の実施形態に従う医薬組成物に接触させることを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、１つ以上の標的細胞は真核細胞である。いくつかの実施形態において、１つ以上の標的細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、血球、肺胞細胞、肺細胞、脳ニューロン、皮膚ニューロン、上皮細胞、ケラチノサイト、ｉＰＳ細胞、線維芽細胞、及び汗腺細胞のうちの１つ以上である。
治療方法
いくつかの実施形態において、本開示は、疾患の治療を必要とする患者における当該疾患を治療する方法であって、患者の細胞のうちの１つ以上にポリプレックス核酸成分が形質移入されるように、本開示のある特定の実施形態に従う医薬組成物の治療有効量を投与することを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態において、本開示は、疾患の治療を必要とする患者における当該疾患を治療する方法であって、本開示のある特定の実施形態に従う医薬組成物の治療有効量を投与することを含み、当該組成物の投与が、対象における標的遺伝子の不完全な翻訳を補正する、方法を提供する。
いくつかの実施形態において、遺伝子は、ＣＯＬ７Ａ１、ＬＡＭＢ３、ＡＤＡ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＣＦＴＲ、ＨＴＴ、ＮＦ１、ＰＨＡ、ＨＢＳ、ＦＥＲＭＴ１、ＫＲＴ１４、ＤＳＰ、ＳＰＩＮＫ５、及びＦＬＧからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、遺伝子はＣＯＬ７Ａ１であり、遺伝子疾患または障害は表皮水疱症の形態である。表皮水疱症には、栄養障害型表皮水疱症（常染色体劣性）、栄養障害型表皮水疱症（限局型バリアント）、痒疹型表皮水疱症、表皮水疱症（前脛骨型）、単純型表皮水疱症（Ｄｏｗｌｉｎｇ－Ｍｅａｒａ型）、単純型表皮水疱症（Ｋｏｅｂｎｅｒ型）、単純型表皮水疱症（劣性１）、単純型表皮水疱症（Ｗｅｂｅｒ－Ｃｏｃｋａｙｎｅ型）、表皮水疱症（致死性棘融解型症）が含まれる。いくつかの実施形態において、遺伝子障害または遺伝子疾患は、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損症、アルファ－１アンチトリプシン欠損症、嚢胞性線維症、ハンチントン病、１型神経線維腫症、フェニルケトン尿症、鎌状赤血球症、孤発性封入体筋炎、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、キンドラー症候群、接合部型表皮水疱症、網状色素性皮膚症、Ｎａｅｇｅｌｉ－Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｅｔｔｉ－Ｊａｄａｓｓｏｈｎ症候群、ネザートン症候群、尋常性魚鱗癬、アトピー性皮膚炎、アッシャー症候群、Ｅｈｌｅｒｓ－Ｄａｎｌｏｓ症候群、ホモ接合性家族性高コレステロール血症（ＨｏＦＨ）、またはクローン病である。
以下の実施例は、本開示を例示するために提供されるものであり、これらを限定するものとして解釈されるべきではない。これらの実施例において、別段の記載がない限り、全ての部及びパーセンテージは、重量によるものである。実施例中の略語を以下に示す。
実施例１：直鎖状オリゴマーの組合せによって調製するＬＢＰＡＥ
線維芽細胞遺伝子送達は、まだ治療用途向けに必要な効率を示していない。本明細書で説明されるように、この限界を克服するため、新規の直鎖状オリゴマー組合せ戦略により、本開示のある特定の実施形態に従う新規の多機能ＬＢＰＡＥ遺伝子送達材料を調製した。本開示のある特定の実施形態に従うＬＢＰＡＥは、形質移入困難な線維芽細胞ＨＰＤＦ及び一般的に使用されている３Ｔ３において優れた形質移入効率及び細胞毒性低減を達成し、市販の試薬の分枝状ＰＥＩ及びＳｕｐｅｒＦｅｃｔを実質的に上回る性能を示す。ＬＢＰＡＥポリプレックスの高いＬＣ５０値は、線維芽細胞形質移入における好ましい生体適合性を実証するものである。機序研究からは、十分な量の１級、２級、及び３級アミンを備えたＬＢＰＡＥが、均一な球状形態を有するナノサイズの粒子にＤＮＡを凝縮し、細胞取込みを促進し、効率的なエンドソーム脱出を満たすための強力な緩衝能力を媒介することができることが示されている。ＬＢＰＡＥ上のエステル結合を加水分解することで、ＤＮＡ放出が促進され、生体適合性が著しく高まり、ポリマー／ＤＮＡ ｗ／ｗ比の柔軟な設計及び調製が可能になる。レポーター遺伝子送達におけるＬＢＰＡＥの高い性能と共に、ＬＢＰＡＥは、ミニサークルＣＯＬ７Ａ１遺伝子をＨＰＤＦに効率的に送達し、皮膚の完全性を維持するために重要なＣ７の発現を顕著に改善することができる。これらの結果は、ＬＢＰＡＥが、線維芽細胞ベースの遺伝子送達において高性能の非ウイルスベクターであることを実証し、遺伝性皮膚疾患治療及び再生医療において非常に大きな可能性を秘めていることを強調するものである。
直鎖状オリゴマーが連続的に成長及び分岐することで、得られるＬＢＰＡＥの直鎖状セグメント及び分岐単位の分布がより均一なものになる。驚くべきことに、形質移入が困難なＨＰＤＦ及び一般的に使用されているマウス胚線維芽細胞（３Ｔ３）において、新規に開発されたＬＢＰＡＥは、ロバストな遺伝子形質移入能力を示し、Ｇルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）発現は、市販の遺伝子形質移入試薬ＰＥＩ及びＳｕｐｅｒＦｅｃｔを最大３桁上回り、明らかな細胞毒性を誘導することなくほぼ１００％の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現を達成した。線維芽細胞におけるＬＢＰＡＥの極めて強力な遺伝子形質移入能力の背後に考えられる機構を読み解くため、遺伝子形質移入プロセスに関連する複数の細胞外及び細胞内バリアについて検討した。結果からは、ＬＢＰＡＥが強力なＤＮＡ結合親和性を示し、ＤＮＡを凝縮してナノサイズのポリプレックスをほぼ１００％の細胞取込み効率で製剤化できることが示されている。ＬＢＰＡＥの強力なプロトン緩衝能及び生分解性は、ＬＢＰＡＥ／ＤＮＡポリプレックスのエンド／リソソーム脱出及び細胞質内のＤＮＡ放出も促進すると考えられる。さらに、ＬＢＰＡＥを使用して、ＣＯＬ７Ａ１遺伝子（ＭＣＣ７）をコードするミニサークルプラスミドをＨＰＤＦに送達し、Ｃ７発現の顕著な上方制御が検出された。これは、ＬＢＰＡＥがＣ７欠損性遺伝性皮膚疾患（例えば、破壊的で衰弱性の遺伝性皮膚障害ＲＤＥＢ）の治療向けに非常に有望であることを示すものである。
この実施例は、ＬＢＰＡＥを合成するための直鎖状オリゴマーの組合せ戦略を説明する。図８に示すように、この戦略は、２つの連続したステップ：直鎖状オリゴマーの形成及び分岐を伴う。第１のステップでは、Ａ２型アミンは、Ｃ２型ジアクリレートと反応してアクリレート末端塩基オリゴマーを形成し、直鎖状Ａ２－Ｃ２塩基オリゴマーを形成し、これがさらに、第２のアミンによってエンドキャップされる。精製して未反応モノマー及び過剰なエンドキャップ剤を除去した後、直鎖状Ａ２－Ｃ２オリゴマーが形成される。第２のステップでは、Ｂ３型トリアクリレートを導入して直鎖状Ａ２－Ｃ２オリゴマーを合わせ、ＬＢＰＡＥを得る。ＬＢＰＡＥの利点は２つあり、１）得られるＬＢＰＡＥの直線セグメントの長さを予め決めるため、容易に調整することができること、及び２）ＬＢＰＡＥの分岐単位は直線セグメント間でより均一に分布することである。
この仮説を検証するため、５－アミノ－１－ペンタノール（ＡＰ）、トリメチロールプロパントリアクリレート（ＴＭＰＴＡ）、１，４－ブタンジオールジアクリレート（ＢＤＡ）、及び１，１１－ジアミノ－３，６，９－トリオキサウンデカン（ＤＡＴＯＵ）を、それぞれＬＢＰＡＥ合成のＡ２、Ｂ３、Ｃ２型モノマー及びエンドキャップ剤として使用した。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で化学量論比１．２：１のＡＰ及びＢＤＡを９０℃で反応させ、重量平均分子量（Ｍｗ）をゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）で測定した。２４時間後、反応混合物のＭｗが３０００Ｄａに近づいたら、室温まで冷却することにより反応を停止し、ＤＭＳＯで希釈し、次いで過剰なＤＡＴＯＵを添加してアクリレート末端塩基オリゴマーを２５℃で４８時間エンドキャップした。アセトン中で未反応モノマー、エンドキャップ剤をＭｗ＜３０００Ｄａのオリゴマーと共に透析によって除去した後、およそ３５００ＤａのＭｗ及び多分散指数（ＰＤＩ）１．６９を有する直鎖状Ａ２－Ｃ２オリゴマーを得た（図１０）。ＬＢＰＡＥを生成するため、直鎖状Ａ２－Ｃ２オリゴマー及びＴＭＰＴＡをＤＭＳＯに溶解し（Ａ２－Ｃ２：ＴＭＰＴＡのモル比を３：１に設定）、９０℃で反応させた。Ｍｗがおよそ１０ｋＤａのときに反応を停止し、過剰なＤＡＴＯＵを組み込んで、全ての未反応のビニル基を消費した。次いで、ポリマーをジエチルエーテル中に沈殿させ、真空オーブン中で乾燥させて、最終ＬＢＰＡＥ生成物を得た。ＧＰＣ測定により、ＬＢＰＡＥがＭｗ ９．４ｋＤａ及びＰＤＩ ２．５を有することが示されている（図１９）。マーク－フウィンク（ＭＨ）プロットアルファ値０．３６は、高度に分岐した構造を確認するものである（図１０）。ＬＢＰＡＥの化学組成を１Ｈ－ＮＭＲによって確認した（図１１）。
実施例２：ＬＢＰＡＥは、線維芽細胞において強力な遺伝子形質移入効率及び優れた細胞生存率を達成する
有力な遺伝子送達ベクターは、高い遺伝子形質移入効率を達成するだけでなく、最小の細胞毒性も誘導することができる。それにもかかわらず、実際には、遺伝子ベクターの形質移入効率を改善すると、通常はその生体適合性が犠牲になり、その逆も生じる。合成したＬＢＰＡＥの遺伝子形質移入能力を評価し、線維芽細胞形質移入のための最も最適なパラメーターを同定するため、異なるｗ／ｗ比を有する一連のＬＢＰＡＥ／ＤＮＡポリプレックスを、最初にＨＰＤＦ及び３Ｔ３の形質移入に関して評価した。レポーター遺伝子としてＧｌｕｃ ＤＮＡを使用し、形質移入後のＧｌｕｃ活性測定値によって遺伝子形質移入効率を定量化した。アラマーブルーアッセイ及び致死濃度５０（ＬＣ５０）評価を使用して、形質移入後の線維芽細胞の細胞毒性及び毒性学的プロファイルを測定した。次いで、ＧＦＰ ＤＮＡをレポーター遺伝子として用いたフローサイトメトリーにより、ＬＢＰＡＥの形質移入効力をさらに検証した。
ＬＢＰＡＥによる形質移入後の線維芽細胞のＧｌｕｃ発現及び細胞生存率
カチオン性ポリマーベース遺伝子送達ベクターに関しては、ポリマー／ＤＮＡ重量比（ｗ／ｗ）は、形質移入効率及び細胞毒性の両方を定量するための有用なパラメーターである［５、１１］。そのため、本発明者らは、最初にｗ／ｗ比を系統的に最適化した。初代細胞（例えば、ＨＰＤＦ）が通常カチオンポリマーに対し脆弱であることを考慮して、ＨＰＤＦ形質移入に使用するＬＢＰＡＥ／ＤＮＡ ｗ／ｗ比を１０：１から５０：１まで徐々に増加させた。比較のための強力なベンチマークを設定するため、２つの市販の樹状遺伝子形質移入試薬ＰＥＩ及びＳｕｐｅｒＦｅｃｔに使用するｗ／ｗ比についても、製造業者のプロトコル及び以前の刊行物に従って最適化した［６、１３］。図１ａは、形質移入後のＨＰＤＦのＧｌｕｃ活性及び細胞生存率の概要を示したものである。ＰＥＩ及びＳｕｐｅｒＦｅｃｔ遺伝子形質移入の最適ｗ／ｗ比がそれぞれ１：１及び３：１であることが明確に示されている。ｗ／ｗ比をさらに増大させると、Ｇｌｕｃ活性が明らかに低下するだけでなく、細胞毒性も実質的に増大する。例えば、ｗ／ｗ比が３：１の場合と比較して、ｗ／ｗ比が９：１の場合、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ／ＤＮＡポリプレックスによる形質移入後のＨＰＤＦのＧｌｕｃ活性は３．４倍低く、細胞生存率は８９％超から４４％未満に減少した。これとは全く対照的に、ＬＢＰＡＥ／ＤＮＡポリプレックスによる形質移入後のＨＰＤＦのＧｌｕｃ発現は、試験したｗ／ｗ比の範囲において、ｗ／ｗ比が最も低い１０：１であっても、最適ｗ／ｗ比のＰＥＩ／ＤＮＡポリプレックス及びＳｕｐｅｒＦｅｃｔ／ＤＮＡポリプレックスによって媒介される発現よりも依然として強力である。特に、ｗ／ｗ比４０：１でＬＢＰＡＥ／ＤＮＡポリプレックスによって形質移入されたＨＰＤＦのＧｌｕｃ活性は、ＰＥＩ／ＤＮＡポリプレックスによって媒介されるものよりも最大１０３倍高い。重要なことには、ＬＢＰＡＥは明らかな細胞毒性を誘導しなかった。最も高いｗ／ｗ比５０：１であっても、９５％超の細胞生存率が依然として保持された。３Ｔ３では、ＰＥＩ／ＤＮＡポリプレックスは、ＨＰＤＦの場合と同様の傾向を遺伝子形質移入効率及び細胞毒性で示した。６：１及び９：１のｗ／ｗ比において、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ／ＤＮＡポリプレックスはより高い遺伝子形質移入効率を示すが、６２％及び４９％の細胞生存率を保持するに過ぎない（図１ｂ）。この場合も、全ての試験ｗ／ｗ比において、ＬＢＰＡＥ／ＤＮＡポリプレックスは、強力な遺伝子形質移入能力及び高い細胞生存率の両方を示している。ＬＢＰＡＥ／ＤＮＡポリプレックスによる形質移入後の３Ｔ３のＧｌｕｃ活性は、ＰＥＩ／ＤＮＡ及びＳｕｐｅｒＦｅｃｔ／ＤＮＡポリプレックスがその最適ｗ／ｗ比で媒介するものよりも桁違いに高い。驚くべきことに、ｗ／ｗ比７０：１において、ＬＢＰＡＥ／ＤＮＡポリプレックスは、ＰＥＩ／ＤＮＡポリプレックスに比べて最大３２９２倍高いＧｌｕｃ活性を媒介したが、依然として９０％超の細胞生存率を維持した。群間で同じ量のＤＮＡが使用されたことに留意されたい。ＬＢＰＡＥ／ＤＮＡポリプレックスに用いられた非常に高いｗ／ｗ比は、ＰＥＩまたはＳｕｐｅｒＦｅｃｔのいずれよりも顕著に多くのＬＢＰＡＥが使用されたことを意味する。このことはさらに、ＬＢＰＡＥの優れた生体適合性を実証するものである。
ＬＢＰＡＥの毒性学的プロファイル
遺伝子形質移入のために２５００超の候補が開発されスクリーニングされているが［２８］、これまでのところ、線維芽細胞においてはいずれのＰＡＥポリマーも毒性学的研究が行われていない。遺伝子形質移入におけるＬＢＰＡＥの生体適合性をさらに検証するため、ＬＢＰＡＥの毒性学的プロファイルを決定し、ＬＣ５０値を計算した。この目的のため、同じｗ／ｗ比４０：１を有するＢＰＡＥ／ＤＮＡポリプレックスを使用して、ポリプレックス濃度を３５５μｇ ｍＬ－１から７５５μｇ ｍＬ－１に増加させてＨＰＤＦ及び３Ｔ３に形質移入した。比較のため、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ／ＤＮＡポリプレックスを使用し、濃度を１５μｇ ｍＬ－１から５５μｇ ｍＬ－１まで増加させた。形質移入から２４時間後、細胞を緑色蛍光カルセイン－ＡＭ（Ｃ－ＡＭ、生細胞用）及び赤色蛍光エチジウムホモ２量体－１（ＥｔｈＤ－１、死細胞用）で同時に染色した。未処置細胞ならびに５５５μｇ／ｍＬ－１の濃度のＬＢＰＡＥ／ＤＮＡポリプレックス及び３５μｇ／ｍＬ－１の濃度のＳｕｐｅｒＦｅｃｔ／ＤＮＡポリプレックスで処置した細胞の代表的な蛍光画像を図２ａに示す。ＬＢＰＡＥ／ＤＮＡポリプレックスで処置したＨＰＤＦ及び３Ｔ３が、１桁高い濃度にもかかわらず、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ／ＤＮＡポリプレックスで処置したものと同様の細胞生存率を示したことが分かる。ポリプレックス濃度依存的細胞生存率をアラマーブルーアッセイで定量し、結果を図２ｂ及び図２ｃに示す。そこから、ＨＰＤＦ及び３Ｔ３におけるＳｕｐｅｒＦｅｃｔ／ＤＮＡポリプレックスのＬＣ５０値が、それぞれ３５．２μｇ ｍＬ－１及び３９．５μｇ ｍＬ－１と計算される。これに対し、ＬＢＰＡＥ／ＤＮＡポリプレックスのＬＣ５０値は５３８．４μｇ ｍＬ－１及び５５２．３μｇ ｍＬ－１であり、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ／ＤＮＡカウンターパートに比べて１４倍及び１３倍の増加に対応する。ＳｕｐｅｒＦｅｃｔは、突出した生物適合性のために遺伝子形質移入に広く使用されてきた。［２９、３０］非常に低い細胞殺傷作用を示すＬＢＰＡＥは、極めて高い生物適合性が実証されている。これは、特に、形質移入が困難な細胞型にとっては、形質移入効率を強化するのにかなり高用量のポリプレックスまたは複数の反復的な形質移入を使用することができるため、遺伝子形質移入において非常に重要なことである。
フローサイトメトリーで定量化したＧＦＰ発現
Ｇｌｕｃ ＤＮＡを使用して、ＬＢＰＡＥによって媒介される全体的な導入遺伝子発現レベルを定量化し、さらにＧＦＰ ＤＮＡを使用して、形質移入された細胞のパーセンテージを定量化した。ＨＰＤＦ及び３Ｔ３に、上記と同じｗ／ｗ比のＬＢＰＡＥ／ＤＮＡポリプレックスを形質移入した。図３ａに示す蛍光画像によって証明されるように、全てのｗ／ｗ比において、最適ｗ／ｗ比のＰＥＩ／ＤＮＡ及びＳｕｐｅｒＦｅｃｔ／ＤＮＡのカウンターパートによるものよりもはるかに多くのＨＰＤＦがＬＢＰＡＥ／ＤＮＡポリプレックスによって形質移入された。フローサイトメトリー測定値からは、ＰＥＩ／ＤＮＡ及びＳｕｐｅｒＦｅｃｔ／ＤＮＡポリプレックスによって達成されるＧＦＰ陽性ＨＰＤＦのパーセンテージが、それぞれ５０％及び４４％に過ぎないことが示されている。これに対し、ＬＢＰＡＥ／ＤＮＡポリプレックスは、ヒストグラム分布内のＧＦＰスペクトルチャネルに応答する細胞集団の離れたシフトによって反映されているように、はるかに高いレベルのＧＦＰ陽性集団を達成した（図３ｂ）。ＬＢＰＡＥ／ＤＮＡポリプレックスによって媒介される最も低いＧＦＰ陽性集団は、ｗ／ｗ比１０：１で６８％である。ｗ／ｗ比が４０：１を上回る場合、ＨＰＤＦの９３％超がＧＦＰ陽性である。さらに、ＬＢＰＡＥ／ＤＮＡポリプレックスによって形質移入されたＨＰＤＦの蛍光強度中央値（ＭＦＩ）は、ＰＥＩ／ＤＮＡ及びＳｕｐｅｒＦｅｃｔ／ＤＮＡカウンターパートによるものよりも最大１４０倍高い（図３ｃ）。３Ｔ３の場合には、ＬＢＰＡＥ／ＤＮＡポリプレックスによって達成されたＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージは、ｗ／ｗ比３０：１の３５％からｗ／ｗ比７０：１の９１％超まで増加し、ＰＥＩ／ＤＮＡ及びＳｕｐｅｒＦｅｃｔ／ＤＮＡポリプレックスによって達成されたそれぞれ５％及び１１％とは対照的であった（図３ｄ及び３ｅ）。加えて、ｗ／ｗ比が７０：１の場合、ＬＢＰＡＥ／ＤＮＡポリプレックスによって媒介される３Ｔ３のＭＦＩは、ＰＥＩ／ＤＮＡ及びＳｕｐｅｒＦｅｃｔ／ＤＮＡカウンターパートのＭＦＩよりも２７２倍及び２３０倍高かった（図３ｆ）。これらの結果は、ＬＢＰＡＥがより多くの細胞数を形質移入するだけでなく、個別に形質移入した細胞におけるタンパク質発現レベルを顕著に促進することが示すものである。初代線維芽細胞は形質移入が困難な細胞型であり、ＬＢＰＡＥが初代ＨＰＤＦで９０％超の遺伝子形質移入効率を媒介できるという事実は、ＬＢＰＡＥの極めて強力な遺伝子形質移入能力を実証するものである。ＬＢＰＡＥが優れた遺伝子形質移入能力で広範囲のｗ／ｗ比にわたって高い生体適合性を有することが証明されたことを考慮すれば、ＬＢＰＡＥが線維芽細胞遺伝子形質移入において広範な適用性を有することが想定され得る。
実施例３：極めて効力な遺伝子形質移入効率及び優れた生物適合性を達成するＬＢＰＡＥにおいて考えられる機序
線維芽細胞形質移入でＬＢＰＡＥが高性能であることの背後にあるであることの考えられる機序を読み解くため、ＤＮＡ凝縮及び結合親和性、ポリプレックスサイズ、ゼータ電位、形態、プロトン緩衝能、分解速度、ならびにポリプレックスからのＤＮＡ放出を含めた多数の細胞外及び細胞内遺伝子送達バリアに関し一連の検討を行った。
ＬＢＰＡＥのＤＮＡ凝縮及び結合親和性
有効なＤＮＡ凝縮は、エンドヌクレアーゼによるＤＮＡ分解からＤＮＡを保護するだけでなく、ポリプレックス細胞取込みにも好都合に働き、遺伝子形質移入を成功させるための前提条件である。［３０］カチオンポリマーについては、ＤＮＡ凝縮は主に静電相互作用によって駆動される。部分的または完全にプロトン化して正電荷を生成する様々なアミンが存在する。例えば、部分的または完全にプロトン化できるアミンは、エンドキャップ剤ＤＡＴＯＵから誘導される複数の末端１級アミン、またはＡＰから誘導される多数の骨格３級アミンである。ＬＢＰＡＥのＤＮＡ凝縮能力をアガロースゲル電気泳動で定量した。図４ａに示すように、全てのｗ／ｗ比においてＤＮＡシフトバンドは観察されなかった。このことは、負に荷電したＤＮＡが、正に荷電したＬＢＰＡＥによって効果的に遮蔽され、よって、移動なしでアガロースウェル内で保持されることを示す。市販の遺伝子形質移入試薬ＰＥＩ及びＳｕｐｅｒＦｅｃｔはいずれも、高いＤＮＡ凝縮能力を示しており、特にＳｕｐｅｒＦｅｃｔはＤＮＡを強く凝縮するため、ＤＮＡ染色色素がＤＮＡに接近することが困難であり、よってＤＮＡバンドの色が薄い。ＤＮＡとＬＢＰＡＥとの結合親和性をさらにＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイで定量化した。図４ｂに示すように、ＬＢＰＡＥは、全てのｗ／ｗ比において強力なＤＮＡ結合親和性を示す。概して、結合親和性はｗ／ｗ比と共に増加し、例えば、ｗ／ｗ比１０：１における８６％からｗ／ｗ比７０：１における９６％まで増加する。このことは、ＬＢＰＡＥが多いほどＬＢＰＡＥとＤＮＡとの間の静電相互作用が強力になることを実証するものである。比較すると、ＰＥＩ及びＳｕｐｅｒＦｅｃｔは、ＬＢＰＡＥにおけるほぼ１００％の結合親和性よりさらに強力な結合親和性を示し、ＰＥＩ及びＳｕｐｅｒＦｅｃｔはその凝縮能力と非常によく相関する。ただし、過度に強い相互作用はポリプレックスからのＤＮＡ放出を損なうため、適度なＤＮＡ結合親和性の方が遺伝子形質移入には好ましいことに留意されたい。［３１、３２］
ＬＢＰＡＥ／ＤＮＡポリプレックスのサイズ、ゼータ電位、及び形態
ナノメートルサイズ及び正の表面電荷は、エンドサイトーシス経路を介した粒子の細胞取込みを容易にし得る。［３３、３４］図４ｃに示すように、生理的溶液中で、全ての試験ｗ／ｗ比にわたり、動的光散乱法（ＤＬＳ）で測定したＬＢＰＡＥ／ＤＮＡポリプレックスの平均サイズは全て２５０ｎｍ未満である。１０：１～６０：１のｗ／ｗ比範囲において、ポリプレックスの粒子サイズは２２８ｎｍ～１８８ｎｍである。しかし、ｗ／ｗ比がさらに７０：１まで増加すると、ポリプレックスサイズは９７ｎｍに減少する。これに対応して、全てのポリプレックスは正のゼータ電位を示す。最も低いｗ／ｗ比１０：１において、ＬＢＰＡＥ／ＤＮＡポリプレックスは、６ｍＶという非常に低いゼータ電位を有する。ｗ／ｗ比が１０：１より高いと、ゼータ電位は顕著に増加して３０ｍＶ超となり、ｗ／ｗ比４０：１で最も高い３４ｍＶを達成した。同じ試験条件において、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ／ＤＮＡポリプレックスは、およそ９２ｎｍの非常に小さいサイズ及びおよそ３７ｍＶの高いゼータ電位を有する。これらの観察は、ポリマーのＤＮＡ縮合能力及び結合親和性と一致する。これに対し、ＰＥＩ／ＤＮＡポリプレックスは、高いＤＮＡ凝縮能力及び結合能力を有するが、５００ｎｍ超の実質的に大きなサイズを有する。透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）をさらに使用して、ポリプレックスのサイズ及び形態を観察した。図４ｄに示すように、全てのＬＢＰＡＥ／ＤＮＡ及びＳｕｐｅｒＦｅｃｔ／ＤＮＡポリプレックスは、ＤＬＳによって測定されたものと同様に、６０ｎｍから２５０ｎｍの間のサイズを有する均一な球状形態を示す。重要なことには、明らかなポリプレックス凝集が認められないことであり、これはポリプレックスの高い安定性を実証するものである。一方、ＰＥＩ／ＤＮＡポリプレックスは楕円体形態を示し、サイズは他のポリプレックスよりもはるかに大きい。２５０ｎｍ未満のサイズ及び適度に正の表面電荷を有するポリプレックスは、過剰な正電荷がもたらす潜在的細胞毒性の誘導を回避する一方で細胞取込みに対してより好ましいことが広く受け入れられている［７、９］。上記の遺伝子形質移入試験は、ＨＰＤＦ及び３Ｔ３形質移入における最良のｗ／ｗ比が、それぞれ４０：１及び７０：１であることを示した。このことは、有効な線維芽細胞遺伝子形質移入のための最も好ましいポリプレックスサイズ及び表面電荷が、細胞型に応じて実質的に変動し得ることを示すものである。これに関し、ＬＢＰＡＥ／ＤＮＡポリプレックスは、広い範囲のｗ／ｗ比において、常に２５０ｎｍ未満の平均サイズ及び中程度のゼータ電位を有しており、高性能を達成するための多様な細胞型への形質移入に広範に適用可能であることが示される。
実施例４：ＬＢＰＡＥ／ポリプレックスの細胞取込み
ポリプレックスの細胞取込みについてさらなる検討を行った。図５ａに示すように、全てのポリプレックスは、同じ細胞密度において、形質移入から４時間後、高い細胞取込み効率を示している。比較すると、ＰＥＩ／ＤＮＡ及びＳｕｐｅｒＦｅｃｔ／ＤＮＡポリプレックスと比較して、はるかに多くのＬＢＰＡＥ／ＤＮＡポリプレックスがＨＰＤＦ及び３Ｔ３に取り込まれており、これはＣｙ３標識ＤＮＡから観察されるはるかに強力な赤色蛍光によって裏付けられている。フローサイトメトリー定量化は、ＰＥＩ／ＤＮＡ及びＳｕｐｅｒＦｅｃｔ／ＤＮＡポリプレックスがＨＰＤＦの場合に９６．５％及び９８．４％の細胞取込み効率を達成することを明らかにしている（図５ｂ）。そうであるにしても、ＬＢＰＡＥ／ＤＮＡポリプレックスの取込み効率はなおわずかに高く、ほぼ１００％（９９．３％）である。３Ｔ３の場合にも同様の傾向が観察された（図５ｃ）。さらに、ＨＰＤＦにおいて、ＬＢＰＡＥ／ＤＮＡポリプレックスの正規化ＭＦＩは３．０５であり、ＰＥＩ／ＤＮＡ及びＳｕｐｅｒＦｅｃｔ／ＤＮＡカウンターパートにより達成されたものよりも１．３９倍高い（図５ｄ）。３Ｔ３の場合には、性能がそれぞれ１．９８倍及び１．６８倍上回っている（図５ｅ）。これらの全ての結果は、ＰＥＩ／ＤＮＡポリプレックスの細胞取込み効率が最も低い一方で、ＬＢＰＡＥ／ＤＮＡポリプレックスが、ＰＥＩ／ＤＮＡ及びＳｕｐｅｒＦｅｃｔ／ＤＮＡ両方のカウンターパートの性能を顕著に上回ることを示している。まとめると、これらの取込み結果は、上記の異なるポリプレックスのポリプレックスサイズ、ゼータ電位、及び遺伝子形質移入性能と非常によく相関する。
実施例５：プロトン緩衝能の測定
カチオン性ポリマーベースポリプレックスは、通常は、エンドサイトーシス経路を介して細胞に取り込まれ、ひとたび内在化すると、主にエンド／リソソームに捕捉される。ポリプレックスがエンド／リソソーム区画から時間内に脱出できない場合、ポリプレックス内に凝縮されたＤＮＡは、酸性区画内の消化酵素によって分解される。そのため、エンド／リソソーム脱出は、効率的な非ウイルス遺伝子送達のために克服すべきもう１つの主要なボトルネックである。「プロトンスポンジ効果」は、エンド／リソソームからポリプレックスが脱出するのを容易にするカチオンポリマーの主要な機序と広く考えられている。「プロトンスポンジ効果」の機序を考慮すれば、エンドソーム／リソソームｐＨに近いｐＫａを有する高含量のプロトン化可能な２級及び３級アミンを有するカチオン性ポリマーは、エンドソーム／リソソームからのポリプレックス脱出においてより好ましいものであり、ＰＥＩ及びＳｕｐｅｒＦｅｃｔが最も典型的な代表例である［２９］。ＬＢＰＡＥのプロトン緩衝能を検証するため、酸－塩基滴定を行った。図６ａに示すように、ＮａＣｌ溶液に溶解した所定量のポリマーにおいて、ＰＥＩが、ｐＨ７．４から５．１の間の酸－塩基滴定曲線における比較的平坦な勾配により最も強力なプロトン緩衝能を示すことは、驚くべきことではない。これは、ＰＥＩが非常に高い含量の１級、２級、及び３級アミンを有し、骨格内に３個の原子ごとに窒素を有するという事実によるものである。正規化後、ＰＥＩ、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ、及びＬＢＰＡＥのプロトン緩衝能は、それぞれ５．１ｍｍｏｌ Ｈ＋ｇ－１、４．６ｍｍｏｌ Ｈ＋ｇ－１、及び１．６ｍｍｏｌ Ｈ＋ｇ－１であることが分かる（表１）。実際に、ＬＢＰＡＥは、ＰＥＩ及びＳｕｐｅｒＦｅｃｔよりも低いプロトン緩衝能を示す。しかし、細胞毒性がはるかに低いことにより、ＬＢＰＡＥ／ＤＮＡポリプレックスのエンド／リソソーム脱出を効果的に促進するために、実際の適用ではｗ／ｗ比を顕著に増加させることができる。例えば、ＨＰＤＦ及び３Ｔ３遺伝子形質移入については、ＬＢＰＡＥ／ＤＮＡポリプレックスを、それぞれ４０：１及び７０：１のｗ／ｗ比で使用した。この条件において、使用した全体のＬＢＰＡＥのプロトン緩衝能は、ｗ／ｗ比１：１のＰＥＩの緩衝能よりも１２倍及び２１倍高く、ｗ／ｗ比３：１のＳｕｐｅｒＦｅｃｔよりも５倍及び８倍高い。「プロトンスポンジ効果」仮説に基づけば、ＬＢＰＡＥの高いプロトン緩衝能は浸透圧の増加を引き起こし、エンド／リソソームの膨潤及び破裂をもたらし、こうしてＬＢＰＡＥ／ＤＮＡポリプレックスを時間内にかつ効率的に細胞質内に放出する。
表１．ＬＢＰＡＥ及び市販試薬の緩衝能。
Figure 2022514113000140
実施例６：ＬＢＰＡＥの分解及びＤＮＡ放出評価
汎用性のある遺伝子送達ベクターは、ＤＮＡを有効に凝縮し、酵素による分解からそれを保護するだけでなく、核移入後にポリプレックスから凝縮されたＤＮＡを放出することもできる。カチオン性ポリマーについては、細胞質内のポリマー分解を促進し、よってＤＮＡ放出を促進し、遺伝子形質移入後の蓄積した細胞毒性を低減するための一連の戦略が提唱されている。しかし、効率的な遺伝子形質移入のためには、適度に長い半減期が遺伝子ベクターに必要である。というのも、短すぎる半減期は、不十分なＤＮＡ保護及び未成熟なＤＮＡの放出につながり、一方長すぎる半減期は、ポリプレックス解離及びＤＮＡ放出を困難にするためである。ＰＡＥの骨格上には複数のエステル結合が存在する。生理学的条件下では、エステル結合は加水分解によって分解して、生体適合性の小分子βアミノ酸及びジオールをもたらし得る。化学組成に応じて、ＬＰＡＥの半減期は水性環境下で１．５時間から６時間超にわたることが報告されている。［７］本開示のある特定の実施形態及び実施例に従うＬＢＰＡＥについては、３７℃での２時間のインキュベーション後に４３％の分解が観察された。分解は、６時間及び８時間のインキュベート後、それぞれ８１％及び８５％まで継続的に増加した（図６ｂ）。対応するポリプレックスからのＤＮＡ放出は、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイによって定量される。図６ｃに示すように、最も低いｗ／ｗ比１０：１において、ＬＢＰＡＥ／ＤＮＡポリプレックスはＤＮＡ放出速度が最も速く、２時間のインキュベート後、６０％超のＤＮＡが放出された。比較すると、４０：１の中程度及び７０：１の高いｗ／ｗ比では、より遅いが同様の速度で、縮合されたＤＮＡがポリプレックスから放出された。しかし、６時間後には６０％超のＤＮＡが放出された。ＤＮＡ放出プロファイルはＬＢＰＡＥ分解プロファイルと一致しており、ＬＢＰＡＥが、いかなる追加の外的誘因も必要とせずに、生理学的条件下では加水分解を介し自発的に凝縮ＤＮＡを放出し得ることが示されている。ＤＮＡ凝縮、結合親和性、ポリプレックスサイズ、ゼータ電位、細胞取込み、分解、及びＤＮＡ放出からの全ての結果は、ＬＢＰＡＥ／ＤＮＡポリプレックスの遺伝子形質移入効率及び生体適合性と非常によく相関しており、これは、線維芽細胞において高性能遺伝子形質移入に好ましいポリプレックス特性を達成するためのＬＢＰＡＥの組成、構造、及び機能性の操作を強調している。
実施例７：ＬＢＰＡＥは、ＨＰＤＦにおけるＣ７発現を操作するための機能的ＣＯＬ７Ａ１を送達する
本開示のある特定の実施形態及び実施例に従う多機能性ＬＢＰＡＥは、極めて高い効率性及び優れた生体適合性でＧｌｕｃ ＤＮＡ及びＧＦＰ ＤＮＡを送達してＨＰＤＦ及び３Ｔ３に形質移入可能であることが実証されている。しかし、多くの遺伝子送達ベクターは高レベルのレポーター遺伝子発現を示しており、機能性タンパク質の発現をもたらすためにこのような成功を移行させることは、はるかに困難である。したがって、ＨＰＤＦにおけるＣ７の発現を促進する機能的ＣＯＬ７Ａ１遺伝子を送達させることにより、ＬＢＰＡＥの有効性をさらに評価した。現在、ＲＤＥＢには、対症療法的ケア以外で有効な治療法が存在しない。ケラチノサイト及び皮膚線維芽細胞はいずれもＣ７の生成及び分泌が可能である［３５］が、後者は、遺伝性皮膚疾患の遺伝子治療における標的細胞型としては前者よりもロバストである。［２１、３６］ミニサークル（ＭＣ）ＤＮＡカセットは、標準的プラスミドの細菌骨格からの免疫原性応答のリスクなしに、標準的プラスミドよりも１０～１０００倍高く安定した非統合的導入遺伝子発現を示している。［３７、３８］ＣＯＬ７Ａ１遺伝子が約９ｋｂのｃＤＮＡ／ｍＲＮＡ転写物を伴って非常に大きいことを考慮して、ＨＰＤＦへの形質移入に、サイトメガロウイルスプロモーターと共に８．９ｋｂの全長ＣＯＬ７Ａ１ ｃＤＮＡをコードするＭＣＣ７を使用した。図１２に示すように、ＭＣＣ７は、８．９ｋｂのＣＯＬ７Ａ１ ｃＤＮＡ及び３ｋｂの骨格を含み、これは、ｐｃＤＮＡ３．１ＣＯＬ７Ａ１親プラスミドより２ｋｂ少ない。レトロウイルス及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの最大カーゴサイズは通常８ｋｂ未満であり、［３９］ｐｃＤＮＡ３．１ＣＯＬ７Ａ１及びＭＣＣ７のサイズは共に大多数のウイルスベクターの遺伝子パッケージング能力を上回るため、ＬＢＰＡＥによる効率的なＣＯＬ７Ａ１遺伝子形質移入は、ＲＤＥＢの遺伝子治療にとって非常に重要である。ＲＤＥＢの遺伝子治療での有用性の強化を期待して、ＬＢＰＡＥ及びＭＣ ＤＮＡを組み合わせることにより、ＭＣＣ７を送達してＨＰＤＦのＣ７発現を操作する。図７ａは、ＬＢＰＡＥ／ＭＣＣ７ポリプレックスによる形質移入から４日後のＨＰＤＦの細胞免疫蛍光染色画像の概要を示したものである。予想されたように、明らかなＣ７発現（赤色蛍光）は、未処置群及び抗Ｃ７二次抗体とインキュベートしたのみの群では観察されなかった。野生型ＨＰＤＦ及びＳｕｐｅｒＦｅｃｔ処置群は、中程度の蛍光を示した。これはＣ７の生成を示すものである。これに対し、ＬＢＰＡＥ／ＭＣＣ７ポリプレックスにより形質移入したＨＰＤＦは最も強力な蛍光を示し、ＬＢＰＡＥによって得られたより多くの組換え型Ｃ７発現を実証した。フローサイトメトリーをさらに使用して、Ｃ７発現効率を定量化した。これまでの報告と整合して、［４０］野生型ＨＰＤＦは約４１％のＣ７発現を示した。ＬＢＰＡＥ／ＭＣＣ７ポリプレックスによる形質移入後、Ｃ７発現効率は、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ／ＭＣＣ７ポリプレックスによって達成された４４．９％に対し、７４．４％まで顕著に増加した（図７ｂ）。さらに、ＬＢＰＡＥ／ＭＣＣ７ポリプレックスによってＭＦＩの４０％の強化も実現した。これに対し、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ／ＭＣＣ７カウンターパートによって達成されたのは１０％であった（図７ｃ）。これらの全ての結果は、ＬＢＰＡＥがＭＣＣ７を有効に送達して全体的なＣ７発現ＨＰＤＦの集団を増加させるだけでなく、個々のＨＰＤＦのＣ７レベルも強化し得ることを実証するものである。加えて、発明者らの予備試験では、Ｃ７ヌルＲＤＥＢ線維芽細胞（ＲＤＥＢＦ）において、ＬＢＰＡＥ／ＭＣＣ７による形質移入後、Ｃ７発現効率がおよそ４０％に回復したことが示されており、形質移入のさらなる最適化及びＲＤＥＢＦにおけるＣ７発現の定量化がなお進行中である。これらの知見からは、ＬＢＰＡＥが皮膚初代細胞に大きなｃＤＮＡを送達する強力なペイロード能力を有することが示される。初代皮膚線維芽細胞を、このポリマーベクターでさらに操作して、皮膚－表皮接合部を強化するのに重要である強力な細胞Ｃ７を分泌させることができる。非ウイルス遺伝子治療は反復適用を必要とするが、遺伝性Ｃ７機能不全皮膚疾患については、創傷部位が明らかで薬剤アクセス性が良好であることを考慮すれば、複数の局所投与が全身的遺伝子送達よりもはるかに安全であり、そのためＬＢＰＡＥは、線維芽細胞ベースの遺伝子治療がＣ７発現を回復または強化することでＲＤＥＢの疾患表現型を逆転させる上で、非常に有望である。
実施例８：実験
材料：トリメチロールプロパントリアクリレート（ＴＭＰＴＡ）、５－アミノ－１－ペンタノール（ＡＰ）、１，１１－ジアミノ－３，６，９－トリオキサウンデカン（ＤＡＴＯＵ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、分枝状ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、Ｍｗ＝２５ｋＤａ）、臭化リチウム（ＬｉＢｒ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジエチルエーテル、重水素化クロロホルム（ＣＤＣｌ３）、塩酸溶液（ＨＣｌ）、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）、酢酸トリス－ＥＤＴＡバッファー（ＴＡＥ）、トリプシンＥＤＴＡ溶液（０．２５％）、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）、アガロース、パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、マウス及びヤギ血清で生成されたモノクローナル抗コラーゲンＶＩＩ抗体を、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。酢酸ナトリウム（３．０Ｍ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用前に０．０２５Ｍに希釈した。１，４－ブタンジオールジアクリレート（ＢＤＡ）をＶＷＲから購入し、そのまま使用した。ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）はＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。Ｇｉｂｃｏから購入したウシ胎児血清（ＦＢＳ）を、使用前に０．２μｍフィルターで濾過した。ＨＰＤＦ及び３Ｔ３細胞をそれぞれＬｏｎｚａ及びＡＴＣＣから購入した。ＨＰＤＦの培養及び継代培養のために、線維芽細胞基本培地、ＦＧＭ－２ ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓ、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ試薬パック（ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水、トリプシンＥＤＴＡ溶液（０．２５％）、及びトリプシン中和溶液を含む）をＬｏｎｚａから購入した。細胞分泌Ｇａｕｓｓｉａ ｐｒｉｎｃｅｐｓルシフェラーゼプラスミド（ＧＬｕｃ ＤＮＡ）及びＢｉｏＬｕｘ（商標）ＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼアッセイキットをＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ＵＫから購入した。Ｇｌｕｃ－Ｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、プロトコルに従ってＧｌｕｃ ＤＮＡの伸長及び精製を実施した。緑色蛍光タンパク質プラスミド（ＧＦＰ ＤＮＡ）をＡｌｄｅｖｒｏｎから購入した。ｐｃＤＮＡ３．１ＣＯＬ７Ａ１プラスミドは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｄｕｎｄｅｅ（ＵＫ）のＤｒ．Ａｎｄｒｅｗ Ｓｏｕｔｈの厚意によって提供された。ＭＣＣ７は、ｐｃＤＮＡ３．１ＣＯＬ７Ａ１から生じたＣＯＬ７Ａ１配列を、Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから提供されるＭＮ５１１Ａ－１カセットに挿入することによって構築し、ミニサークルＤＮＡの生成は、Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅのユーザーマニュアルに従った。ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ遺伝子形質移入試薬をＱｉａｇｅｎから購入した。ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ生存率／細胞毒性キット、ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）高交差吸着二次抗体、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８、及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７をＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。アラマーブルーアッセイキット、ＳＹＢＲ ｓａｆｅ ＤＮＡゲル染色液、ＩＣ固定バッファー、及び１０×Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ透過バッファーをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。Ｃｙ３ ＤＮＡ標識キットをＭｉｒｕｓから購入し、プロトコルに従って使用した。４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）及びＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイキットをＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入し、製造業者のプロトコルに従って使用した。１×ダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）をＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。ＤＡＰＩを含むマウンティング培地をＡｂｃａｍから購入した。
ＬＢＰＡＥの合成及びキャラクタリゼーション：直鎖状オリゴマー組合せ戦略によりＬＢＰＡＥを合成した。最初に、化学量論比が１．２：１のＢＤＡ及びＡＰを１００ｍｇ ｍＬ－１のＤＭＳＯに溶解し、次いで９０℃で反応させた。三重の検出器（屈折率検出器（ＲＩ）、粘度検出器（ＶＳ ＤＰ）、ならびに二重光散乱検出器（ＬＳ １５°及びＬＳ ９０°））を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｅゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）を使用して、重量平均分子量（Ｍｗ）、数平均分子量（Ｍｎ）、及び多分散指数（ＰＤＩ）の成長をモニターした。ＧＰＣ測定のために、反応混合物２０μＬを採取し、１ｍＬ ＤＭＦで希釈し、次いで０．４５μｍフィルターで濾過した。０．１％ ＬｉＢｒを含むＤＭＦを利用して、６０℃、１ｍＬ 分－１の流量でＧＰＣカラム（Ｐｏｌａｒ Ｇｅｌ－Ｍ、７．５×３００ｍｍ、直列に２つ）を溶出した。ＧＰＣカラムの較正には、直鎖状ポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）標準物質を使用した。Ｍｗが３０００Ｄａに近づいたら、室温まで冷却することにより反応を停止し、ＤＭＳＯで希釈し、次いで過剰なエンドキャップ剤ＤＡＴＯＵを添加し、反応をさらに４８時間継続してＤＡＴＯＵエンドキャップ直鎖状Ａ２－Ｃ２オリゴマーを得、これをアセトンで３日間透析することにより精製し、次いで真空オーブン内で乾燥して溶媒を除去した。次に、直鎖状Ａ２－Ｃ２オリゴマーをＤＭＳＯに溶解し、分枝状モノマーＴＭＰＴＡと９０℃で反応させた。Ｍｗがおよそ１０ｋＤａのときに、反応混合物を室温まで冷却し、過剰なＤＡＴＯＵを添加して、さらに４８時間にわたり全ての未反応のビニル基を消費した。次いで、ポリマーをジエチルエーテルで３回沈殿させることによって精製し、２日間凍結乾燥し、さらなる試験のために－２０℃で保存した。最終生成物の分子量（Ｍｗ）、ＰＤＩ、及びマーク－フウィンク（ＭＨ）プロットアルファ値（α）を測定するため、１０ｍｇ ＬＢＰＡＥを２ｍＬ ＤＭＦに溶解し、上述のようにＧＰＣ測定を行った。ＬＢＰＡＥの化学組成及び純度を４００ＭＨｚ Ｖａｒｉａｎ Ｉｎｏｖａ分光計の１Ｈ ＮＭＲで定量した。試料は、溶媒ＣＤＣｌ３（７．２４ｐｐｍ）または内部対照（テトラメチルシラン０．００ｐｐｍ）に対する百万分率（ｐｐｍ）で報告した。
マーク－フウィンクアルファパラメーターの定量：屈折率検出器（ＲＩ）、粘度検出器（ＶＳ ＤＰ）、及び二重角光散乱検出器（ＬＳ １５°及びＬＳ ９０°）を備えた１２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ＧＰＣ ｓｙｓｔｅｍでポリマーのマーク－フウィンクアルファパラメーターの定量を行った。解析用のポリマーを調製するため、１０．０ｍｇの試料を２ｍＬ ＤＭＦに溶解し、次いで０．４５μｍのフィルターで濾過した。ＧＰＣカラム（３０ｃｍ ＰＬｇｅｌ Ｍｉｘｅｄ－Ｃ、直列に２つ）を、６０℃、１ｍＬ／分の流量のＤＭＦ及び０．１％ ＬｉＢｒで溶出し、カラムを直鎖状ポリ（メチルメタクリレート）標準物質（ＰＭＭＡ）で較正した。ユニバーサルキャリブレーションを用いてＧＰＣデータを解析した。
ＬＢＰＡＥ／ＤＮＡポリプレックス調製：ポリプレックス調製のために、最初にＬＢＰＡＥをＤＭＳＯに溶解して１００ｍｇ ｍＬ－１ストック溶液にした。ＬＢＰＡＥ／ＤＮＡ重量比（ｗ／ｗ）に従って、必要量のＬＢＰＡＥストック溶液及びＤＮＡ溶液を、酢酸ナトリウムバッファー（０．０２５Ｍ、ｐＨ＝５．２）で希釈してそれぞれ等体積にした。次いで、ＬＢＰＡＥ溶液を添加し、ボルテックスにより１０秒間混合し、室温で１０分間静置してポリプレックスを形成させた。
ＬＢＰＡＥによるＤＮＡ凝縮：アガロースゲル電気泳動を用いてＬＢＰＡＥのＤＮＡ凝縮能力を測定した。１μｇのＤＮＡを各試料調製に使用し、一連のｗ／ｗ比を有するポリプレックスを上記のように調製した。その後に、ウェル内の１０μＬのＳＹＢＲ ｓａｆｅ ＤＮＡゲル染色液を含むアガロースゲル（１×ＴＡＥバッファー中１％）に２０μＬのポリプレックス溶液を装填し、裸のＤＮＡを対照として使用した。ゲル電気泳動を１×ＴＡＥバッファー中で１２０Ｖで４０分間実施し、ＳｙｎｇｅｎｅのＧ：ＢＯＸを用いて画像をキャプチャーした。
ＬＢＰＡＥのＤＮＡ結合親和性：ＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイを使用してＬＢＰＡＥのＤＮＡ結合親和性を定量化した。０．２５μｇのＤＮＡを各試料調製に用いた。異なるｗ／ｗ比のポリプレックスを１５μＬの酢酸ナトリウムバッファー中で調製し、次いで１５μＬのＰｉｃｏＧｒｅｅｎ作業溶液と混合し、５分間インキュベートした。その後、２２０μＬの１×ＰＢＳバッファーを添加して、黒色９６ウェルプレート内のポリプレックスを希釈した。ポリプレックス溶液の蛍光強度（Ｆ）は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ３プレートリーダーにより、４９０ｎｍの励起及び５３５ｎｍの発光で４連で測定した。ＬＢＰＡＥのＤＮＡ結合親和性は、以下の式によって定義される。
Figure 2022514113000141
ＬＢＰＡＥのプロトン緩衝能：ＬＢＰＡＥのプロトン緩衝能を酸－塩基滴定によって定量した。０．１Ｍ ＮａＣｌ溶液をバックグラウンド対照として使用し、ＰＥＩ及びＳｕｐｅｒＦｅｃｔを陽性対照として使用した。Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ Ｓ２０ ｐＨメーターを使用してｐＨ値を測定した。１０ｍｇ ＬＢＰＡＥ、５ｍｇ ＰＥＩ、または０．８ｍｇ ＳｕｐｅｒＦｅｃｔを２０ｍＬ ０．１Ｍ ＮａＣｌ溶液に溶解した。溶液のｐＨ値を１．０Ｍ ＨＣｌ溶液で３．０に調整し、次いで０．１Ｍ ＮａＯＨ溶液を用いて１０．５まで滴定した。ＬＢＰＡＥのプロトン緩衝能（ｍｍｏｌ ｇ－１）は、以下の式を用いて計算した。
Figure 2022514113000142
ＬＢＰＡＥの分解プロファイル：分解プロファイルを測定するため、ＬＢＰＡＥを１０ｍｇ ｍＬ－１の濃度でＰＢＳに溶解し、３７℃下で１８０ｒｐｍで振とうし続けた。０、２、４、６、及び８時間の時点で、１ｍＬの溶液を採取し、直ちに凍結した。フリーズドライ後、試料を１ｍＬ ＤＭＦに溶解した。試料のＭｗは、前述のようにＧＰＣにより３連で測定した。ＬＢＰＡＥ分解のパーセンテージを以下のように定義した。
Figure 2022514113000143
ポリプレックスサイズ及びゼータ電位の定量：Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ（Ｎａｎｏ－ＺＳ９０、散乱角１７３°、６３３ｎｍレーザー）を用いてポリプレックスサイズ及びゼータ電位を測定した。４μｇのＤＮＡを各試料調製に使用し、一連のｗ／ｗ比を有するポリプレックスを上記のように調製し、８００μＬの脱イオン水で希釈し、次いでＺｅｔａｓｉｚｅｒセルまたはキュベットに移した。サイズ及びゼータ電位の測定を２５℃で４連で行った。
透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）によるポリプレックス形態キャラクタリゼーション：ＬＢＰＡＥ／ＤＮＡ、ＰＥＩ／ＤＮＡ、及びＳｕｐｅｒＦｅｃｔ／ＤＮＡポリプレックスの形態をＴＥＭによってキャラクタリゼーションした。２μｇのＤＮＡを含む８０μＬのポリプレックス溶液を前述のように調製し、脱イオン水で２回洗浄して塩を除去し、次いで１０μＬの脱イオン水に再懸濁した。２．５μＬの再懸濁ポリプレックス溶液を、２００メッシュ銅グリッド上のＦｏｒｍｖａｒ支持フィルム上にキャストし、直ちに凍結乾燥した。ＴＥＭ画像は、ＵＣＤ Ｃｏｎｗａｙ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｅ Ｃｅｎｔｒｅで１２０ｋＶのＦＥＩ Ｔｅｃｎａｉ １２０ ＴＥＭでキャプチャーした。
ポリプレックスからのＤＮＡ放出：ポリプレックスからのＤＮＡ放出は、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイを用いてＬＢＰＡＥによる結合親和性の低下を測定することによって定量することができる。ｗ／ｗ比が１０：１、４０：１、及び７０：１であるＬＢＰＡＥ／ＤＮＡポリプレックスを上記のように調製し、１８０ｒｐｍ及び３７℃で振とうし続けた。ｏ、２、４、６、及び８時間の時点で、１００μＬのポリプレックス溶液を取り出し、４連で前と同様に直ちにＤＮＡ結合親和性を測定した。ポリプレックスからのＤＮＡ放出速度を以下のように定量した。
Figure 2022514113000144
細胞培養：ＨＰＤＦを線維芽細胞基本培地で培養し、２％ ＦＢＳを含むＦＧＭ－２ ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓを補充した。３Ｔ３を、１０％ ＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）を含むＤＭＥＭで培養した。両方のタイプの細胞を標準的な細胞培養条件下で３７℃、５％ ＣＯ２の加湿インキュベータで培養した。
Ｇｌｕｃ発現により定量化したＬＢＰＡＥの遺伝子形質移入能力：ＨＰＤＦ及び３Ｔ３におけるＬＢＰＡＥの遺伝子形質移入能力を、最初に、レポーター遺伝子としてＧｌｕｃ ＤＮＡを用いたＧｌｕｃ発現によって評価した。９６ウェルプレート内の１００μＬ培地に、３Ｔ３についてはウェル当たり１×１０４細胞の密度で、ＨＰＤＦについてはウェル当たり２×１０４細胞の密度で細胞を播種し、形質移入前の１日間インキュベートした。市販の遺伝子形質移入試薬ＰＥＩ及びＳｕｐｅｒＦｅｃｔを製造業者のプロトコルに従って最適化した。この目的のため、０．５μｇ Ｇｌｕｃ ＤＮＡを各ウェルに使用し、ＰＥＩ／ＤＮＡポリプレックスにおけるｗ／ｗ比を１：１、２：１から３：１まで変化させ、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ／ＤＮＡポリプレックスにおけるｗ／ｗ比を３：１、６：１から９：１まで変化させた。ＬＢＰＡＥ遺伝子形質移入については、同量の０．５μｇ Ｇｌｕｃ ＤＮＡを各ウェルに使用し、異なるｗ／ｗ比を有するＬＢＰＡＥ／ＤＮＡポリプレックスを上述のように２０μＬの酢酸ナトリウムバッファー中で調製し、次いで８０μＬの細胞培養基で希釈した。９６ウェルプレート内の細胞培養基を除去し、１００μＬのポリプレックス含有培地を添加した。４時間後、プレート内のポリプレックス含有培地を１００μＬの新鮮培地と交換し、細胞をさらに４４時間インキュベートした。形質移入後の細胞のＧｌｕｃ活性をＧｌｕｃアッセイを用いて標準プロトコルに従って４連で測定した。簡潔に述べると、９６ウェルプレート内の２０μＬの上清を取り出し、５０μＬのＧｌｕｃアッセイ溶液を添加した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ３プレートリーダーを用いて発光強度を測定し、Ｇｌｕｃ活性を相対光単位（ＲＬＵ）の観点から直接プロットした。
ＬＢＰＡＥの遺伝子形質移入能力のＧＦＰ発現による定量化：ＬＢＰＡＥの遺伝子形質移入能力をさらにＧＦＰ発現によって評価した。２４ウェルプレート内の５００μＬ培地に、ＨＰＤＦ及び３Ｔ３細胞をウェル当たり５×１０４細胞の密度で播種し、形質移入前の１日間インキュベートした。２μｇ ＧＦＰ ＤＮＡを各ウェルに使用し、異なるｗ／ｗ比を有するポリプレックスを１００μＬ酢酸ナトリウムバッファー中で調製し、次いで４００μＬ細胞培養基と混合した。細胞内の培地を除去し、ポリプレックス含有培地を添加した。４時間後、ポリプレックス含有培地を５００μＬの新鮮培地と交換し、細胞をさらに４４時間インキュベートした。その後、細胞をＨＢＳＳで洗浄し、蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ８１）でイメージングした。フローサイトメトリーでＧＦＰ発現を定量化するため、形質移入した細胞をトリプシンＥＤＴＡで消化し、ＨＢＳＳで２回洗浄し、次いで２％ ＦＢＳを含むＰＢＳ中に再懸濁した。フローサイトメトリー測定をＡｃｃｕｌｉ Ｃ６システムで３連で行い、各試料について少なくとも１０，０００細胞をカウントした。細胞の蛍光強度中央値（ＭＦＩ）をＦｌｏｗｊｏソフトウェアで定量化した。ＰＥＩ及びＳｕｐｅｒＦｅｃｔにより形質移入した細胞を陽性対照として使用し、未処置細胞を陰性対照として使用した。
アラマーブルーアッセイで測定した細胞生存率：形質移入後のＨＰＤＦ及び３Ｔ３細胞の生存率をアラマーブルーアッセイで測定した。この目的のため、形質移入から４８時間後に細胞上清を除去し、細胞をＨＢＳＳで２回洗浄した。次いで、ＨＢＳＳ中１０％のアラマーブルー溶液を添加し、細胞をさらに１～３時間インキュベートした。その後、ウェル内のアラマーブルー溶液を平底９６ウェルプレートに移し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ３プレートリーダーを用いて５９０ｎｍにおける蛍光強度を４連で測定した。ポリプレックス処置なしの細胞を陽性対照として使用し、蛍光強度を１００％細胞生存率として正規化した。
ＬＢＰＡＥの毒性学的プロファイル：ＬＢＰＡＥの毒性学的プロファイルを致死濃度５０（ＬＣ５０）評価によって定量した。ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ生存率／細胞毒性キットを使用して、生細胞及び死細胞を染色した。９６ウェルプレート内の１００μＬ培地に、ＨＰＤＦについてはウェル当たり２×１０４の密度で、３Ｔ３についてはウェル当たり１×１０４の密度で細胞を播種した。翌日、ＬＢＰＡＥ／ＤＮＡポリプレックス及びＳｕｐｅｒＦｅｃｔ／ＤＮＡポリプレックスを調製し、５つの異なる用量のポリプレックスを使用して、上述のように細胞に形質移入した。形質移入から２４時間後、細胞培養基を除去し、カルセイン－ＡＭ（Ｃ－ＡＭ）（１：５０００）及びエチジウムホモダイマー－１（ＥｔｈＤ－１）（１：５００）を含むＨＢＳＳで置き換え、細胞をさらに２０分間インキュベートした。次いで、細胞をＨＢＳＳで洗浄し、蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ８１）でイメージングした。４連のアラマーブルーアッセイで定量化した細胞生存率を使用してＬＣ５０を計算した。
ポリプレックス細胞取込み：ポリプレックス細胞取込み試験のために、Ｇｌｕｃ ＤＮＡを、推奨プロトコルに従ってＣｙ３（赤色蛍光色素）標識キットで標識した。２４ウェルプレートに、線維芽細胞をウェル当たり５×１０４細胞の密度で播種した。０．５μｇ標識ＤＮＡを各ウェルに使用し、遺伝子形質移入を翌日に行った。形質移入から４時間後、細胞をＨＢＳＳで洗浄し、４％ ＰＦＡで固定し、０．１％トリトン－１００で透過処理し、ＤＡＰＩで染色し、次いで蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ８１）でイメージングした。フローサイトメトリーで細胞取込み効率を定量化するため、形質移入後、細胞をトリプシンＥＤＴＡで消化し、ＨＢＳＳで２回洗浄し、次いで２％ ＦＢＳを含むＰＢＳに再懸濁し、Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６フローサイトメトリーシステムで３連でＣｙ３陽性細胞のパーセンテージ及びＭＦＩを定量化した。
細胞免疫蛍光染色によるＨＰＤＦにおけるＣ７発現の検出：細胞免疫蛍光染色でＣ７発現を検出するために、８ウェルチャンバー（Ｉｂｉｄｉ）にＨＰＤＦをウェル当たり１．５×１０４細胞の密度で播種した。翌日、１μｇ ＭＣＣ７を各ウェルに使用し、ｗ／ｗ比４０：１のＬＢＰＡＥ／ＤＮＡポリプレックス及びｗ／ｗ比３：１のＳｕｐｅｒＦｅｃｔ／ＤＮＡポリプレックスを用いて、上述のように遺伝子形質移入を行った。形質移入から４８時間後、細胞を４％ ＰＦＡで固定し、０．１％トリトン－１００で透過処理し、１×ＰＢＳ中５％ヤギ血清で室温で１時間ブロックし、次いで、マウスで生成されたモノクローナル抗コラーゲン及びＶＩＩ型抗体の一次抗体と共に、ブロッキングバッファー（抗体希釈度：１：２００）中で４℃で終夜インキュベートした。翌日、細胞をＡｌｅｘａ－５６８ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）高交差吸着二次抗体と共に、１：８００希釈で暗中及びＤＡＰＩ中室温で１時間インキュベートした。蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ８１）を用いて免疫蛍光画像を撮影した。抗体処置をせず二次抗体のみで処置した細胞を対照群として使用した。
フローサイトメトリーによって定量化したＨＰＤＦにおけるＣ７発現：フローサイトメトリーでＣ７発現を定量化するため、２４ウェルプレートにＨＰＤＦをウェル当たり５×１０４細胞の密度で播種し、２４時間後にトランスフェクトした。２μｇ ＭＣＣ７を各ウェルに使用し、ｗ／ｗ比４０：１のＬＢＰＡＥ／ＤＮＡポリプレックス及びｗ／ｗ比３：１のＳｕｐｅｒＦｅｃｔ／ＤＮＡポリプレックスを用いて形質移入を上述のように行った。形質移入から４日後、細胞をトリプシンＥＤＴＡで消化し、ＩＣ固定バッファー（２％ ＰＦＡ）で固定し、透過バッファー（１×ＰＢＳ／１％ ＢＳＡ／０．１％サポニン）で透過処理し、ヤギ血清（透過溶液中１０％）でブロックし、次いで、マウスで生成されたモノクローナル抗コラーゲン及びＶＩＩ型抗体の一次抗体と共に、１：５０希釈のブロッキングバッファー中室温で１時間インキュベートした。その後、細胞を、Ａｌｅｘａ－６４７ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）交差吸着二次抗体と共に、暗中透過バッファー中１：３０００の希釈でさらにインキュベートした。最後に、細胞をＰＢＳ中に再懸濁し、フローサイトメトリーによって３連で解析した。抗体処置をせず二次抗体のみで処置した細胞を対照群として使用した。
統計：ＳＰＳＳ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｆｏｒ ｗｉｎｄｏｗｓ ｖｅｒｓｉｏｎ ２４（ＩＢＭ Ｃｏｒｐ．，Ａｒｍｏｎｋ，Ｎ．Ｙ．，ＵＳＡ）を統計解析に使用した。スチューデントのｔ検定を使用して全ての遺伝子形質移入データを解析し、データを平均±標準偏差として示した。線形回帰分析によりＬＣ５０値を計算した。Ｐ値＜０．０５を統計的に有意とみなした。
実施例９：劣性栄養障害型表皮水疱症ケラチノサイトへの遺伝子送達のためのＣＯＬ７Ａ１を含むＨＰＡＥポリプレックス
以下の実施例は、約１０ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、及び４０ｋＤａの分子量（Ｍｗ）を有し、１０：１、３０：１、及び５０：１のＨＰＡＥ：ＣＯＬ７Ａ１ ＤＮＡ重量比を使用する、ミニサークルＣＯＬ７Ａ１及び本開示の４つの高度に分岐したポリ（β－アミノエステル）（ＨＰＡＥ）を含むポリプレックスについての形質移入結果を説明する。
ＨＰＡＥの合成及びキャラクタリゼーション：ＨＰＡＥを２段階で調製した。段階１では、モノマー５－アミノ－１－ペンタノール、トリメチロールプロパントリアクリレート、１，４－ブタンジオールジアクリレートを反応させて、高度に分岐したＣ３２（ポリ（５－アミノ－１－ペンタノール－ｃｏ－１，４－ブタンジオールジアクリレート））（「ＨＣ３２」）を得た。段階２では、ＨＣ３２を１，１１－ジアミノ－３，６，９－トリオキサウンデカン（ＤＡＴＯＵ）と反応させてＨＰＡＥ（「ＨＣ３２－ＤＡＴＯＵ」）を得た。
分子量（ＭＷ）の異なる４つのＨＣ３２－ＤＡＴＯＵポリマーを「Ａ２＋Ｂ３＋Ｃ２」マイケル付加戦略によって合成した。最初にＨＣ３２ベースポリマーを合成した。簡潔に述べると、Ａ２モノマーＡＰ（９．０ｍｍｏｌ、０．９２３ｇ）、Ｂ３モノマーＴＭＰＴＡ（０．５ｍｍｏｌ、０．１４８ｇ）、及びＣ２モノマーＣ（１０．０ｍｍｏｌ、１．９８ｇ）を３．１ｍＬ ＤＭＳＯに溶解し、次いで９０℃で反応させた。ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）を使用して、ＭＷ及び多分散指数（ＰＤＩ）の成長をモニターした。２０μＬの反応試料を異なる時点で採取し、次に１ｍＬ ＤＭＦ中で希釈し、０．２μｍフィルターで濾過した後、三重の検出器：屈折率検出器（ＲＩ）、粘度検出器（ＶＳ ＤＰ）、ならびに二重光散乱検出器（ＬＳ １５°及びＬＳ ９０°）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ＧＰＣでＧＰＣ測定を行った。ＤＭＦ及び０．１％ ＬｉＢｒを使用して、６０℃、１ｍＬ／分の流量でＧＰＣカラム（ＰｏｌａｒＧｅｌ－Ｍ、７．５×３００ｍｍ、直列に２つ）を溶出した。ＧＰＣカラムを直鎖状ポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）標準物質で較正した。
ベースポリマーの重量平均分子量（Ｍｗ）が目標値（それぞれおよそ１０、２０、３０、及び４０ｋＤａ）に近づいたら、ＤＭＳＯ中の反応溶液を１００ｍｇ／ｍＬに希釈することによって反応を停止させた。その後、ＤＭＳＯ（１００ｍｇ／ｍＬ）に溶解したエンドキャップ剤ＤＡＴＯＵ（１０．０ｍｍｏｌ、１．９２ｇ）を使用して、室温（ＲＴ）で４８時間、マイケル付加によってＨＣ３２ベースポリマーをエンドキャップしてＨＣ３２－ＤＡＴＯＵポリマーを得、これをジエチルによる２回の沈殿により精製して過剰なモノマー、オリゴマー、及びエンドキャップ剤を除去した。
最終的なＨＣ３２－ＤＡＴＯＵ生成物を真空オーブン内で２４時間乾燥し、次いでさらに２４時間フリーズドライして残留溶媒を除去した。最終生成物のＭＷ及びＰＤＩを測定するため、１０ｍｇの試料を１ｍＬ ＤＭＦに溶解し、上述のようにＧＰＣ測定を行った。プロトン核磁気共鳴（１Ｈ ＮＭＲ）を利用して、ＣＤＣｌ３に溶解し、１Ｈ ＮＭＲスペクトルを４００ＭＨｚ Ｖａｒｉａｎ Ｉｎｏｖａ分光計で取得したＨＣ３２－ＤＡＴＯＵポリマーの化学組成及び純度を確認した。試料は、溶媒（７．２４ｐｐｍ）または内部対照（テトラメチルシラン０．００ｐｐｍ）に対する百万分率（ｐｐｍ）で報告した。
図１３は、ベースポリマーの重合時間を増加させることによって、異なるＭｗを有する４つのＨＣ３２－ＤＡＴＯＵポリマーが得られたことを示している。ＨＣ３２－ＤＡＴＯＵのＭｗは、ゲル化なしで１１ｋＤａから４１ｋＤａに増加し、ＨＡＰＥ ＭＷを制御する上で「Ａ２＋Ｂ３＋Ｃ２」マイケル付加戦略の柔軟性が高いことを実証した。全てのＨＣ３２－ＤＡＴＯＵポリマーのＭＨプロットアルファ値は０．５未満であり（図１３ｃ）、これらの高度に分岐した構造を示している。以下の表は、ＨＣ３２－ＤＡＴＯＵポリマーについてのＰＤＩ及びＭＨプロットα値を示している。
Figure 2022514113000145
ＭＣＣ７生合成。
通常のプラスミドｐｃＤＮＡ３．１ＣＯＬ７Ａ１を入手した。ｐｃＤＮＡ３．１ＣＯＬ７Ａ１起源のＣＯＬ７Ａ１配列をＳｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓが提供するサイトメガロウイルスプロモーターを伴ったＭＮ５１１Ａ－１カセットに挿入することによりＭＣＣ７を生合成し、Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅの使用説明書及び公開されているミニサークル技術のｐｈｉＣ３１ ｐｌｕｓ １－Ｓｃｅｌ消化システムに従ってミニサークルＤＮＡの誘導及び生成を行った（Ｇａｓｐａｒ，Ｖ．；ｄｅ Ｍｅｌｏ－Ｄｉｏｇｏ，Ｄ．；Ｃｏｓｔａ，Ｅ．；Ｍｏｒｅｉｒａ，Ａ．；Ｑｕｅｉｒｏｚ，Ｊ．；Ｐｉｃｈｏｎ，Ｃ．；Ｃｏｒｒｅｉａ，Ｉ．；Ｓｏｕｓａ，Ｆ．Ｍｉｎｉｃｉｒｃｌｅ ＤＮＡ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａｄｖａｎｃｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１５，１５（３），３５３－３７９．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１５１７／１４７１２５９８．２０１５．９９６５４４．）． ＭＣＣ７の生合成を確認するため、ＤＮＡ消化試験を行った。この目的のため、０．５μｇ ｐｃＤＮＡ３．１ＣＯＬ７Ａ１、親プラスミド（ＭＮ５１１Ａ－１－ＣＯＬ７Ａ１）、及びＭＣＣ７を１μＬ ＥｃｏＲＩで消化させ、次いで１００Ｖで４０分間アガロースゲル電気泳動に供した。次いで、ＳｙｎｇｅｎｅのＧ：ＢＯＸを用いて画像を可視化した。
ポリプレックスの調製及び製剤
ＨＣ３２－ＤＡＴＯＵをＤＭＳＯに溶解して１００μｇ／μＬストック溶液にし、これを今後の試験用に－２０℃で保存した。ＤＮＡをＴＥバッファーに溶解し、これも－２０℃で保存した。ＳＡバッファーを使用前に希釈して０．０２５Ｍとした。
標準的なポリプレックス調製のために、ポリマー／ＤＮＡ重量比（ｗ／ｗ）に従って、ＤＮＡ及びポリマーをそれぞれＳＡバッファーに等体積に溶解した。ポリマー溶液をＤＮＡ溶液に添加し、ボルテックスを用いて１０秒間混合し、室温でさらに１０分間インキュベートしてポリプレックス形成を可能にした。製剤試験については、典型的には、５μｇ ＧＦＰプラスミドＤＮＡ及び１５０μｇ ＨＣ３２－ＤＡＴＯＵをそれぞれ２００μＬ ＳＡに溶解して、ＨＣ３２－ＤＡＴＯＵ／ＤＮＡポリプレックス（ｗ／ｗ＝３０：１）を製剤化した。ポリプレックスは、新鮮なものとして直ちに使用するか、または形質移入の前に室温、４℃、－２０℃、及び－８０℃で保存するか、もしくは凍結乾燥した。
凍結乾燥のために、スクロースをポリプレックス溶液に添加して、それぞれ０％、１％、３％、及び５％の最終スクロース濃度とした。全ての試料を－８０℃で１時間凍結し、次いで直ちにＣｈｒｉｓｔ Ａｌｐｈａ １－２ ＬＤｐｌｕｓ Ｆｒｅｅｚｅ Ｄｒｙｅｒを用いて－５５℃で２４時間フリーズドライに供した。その後、ポリプレックスを元の体積のＳＡで再構成し、形質移入に使用した。
ポリプレックス調製手順の最適化後（以下の実施例１０を参照）、異なる条件で保存されたＧｌｕｃコードＤＮＡと複合体化したＨＣ３２－ＤＡＴＯＵを使用して、形質移入適用前のポリプレックスの長期保存の実現可能性を評価した。ここでは、３０：１ポリマー／ＤＮＡ ｗ／ｗ比における０．５μｇ ＤＮＡを、９６ウェルプレートの各ウェルに使用した。
ＤＮＡ凝縮及びヘパリン放出の試験
ＨＣ３２－ＤＡＴＯＵのＤＮＡ凝縮能力及びＨＣ３２－ＤＡＴＯＵ／ＤＮＡポリプレックスの物理的安定性を評価するため、アガロースゲル電気泳動を用いてＤＮＡ凝縮アッセイ及びヘパリン放出アッセイを実施した。０．５μｇ ＤＮＡ（ＭＣＣ７）を各試料に使用し、ｗ／ｗ比３０：１でポリプレックスを調製した。ヘパリン水溶液を０．１～６ＩＵ／μＬの濃度でポリプレックス溶液に添加した。ヘパリンなしの裸のＤＮＡ及びＨＣ３２－ＤＡＴＯＵ／ＭＣＣ７ポリプレックスを対照として使用した。全ての試料を室温で２時間インキュベートし、次いで１０μＬ ＳＹＢＲ ｓａｆｅ ＤＮＡ染色液で染色した１％アガロースゲル上に装填した。電気泳動は、１×ＴＡＥバッファー中で１００Ｖで１時間実施した。
ＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイ
ＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイを使用して、ヘパリン存在下でのＨＣ３２－ＤＡＴＯＵのＤＮＡ結合親和性及びＤＮＡ放出を定量化した。ＨＣ３２－ＤＡＴＯＵ／ＭＣＣ７ポリプレックスをｗ／ｗ比３０：１で０．２μｇのＤＮＡで調製し、次いでヘパリンをポリプレックス溶液にそれぞれ０．３ＩＵ／μＬ、３ＩＵ／μＬ、及び６ＩＵ／μＬの濃度で導入した。ヘパリン処置なしの裸のＤＮＡ及びＨＣ３２－ＤＡＴＯＵ／ＭＣＣ７ポリプレックスを対照として使用した。２時間のインキュベート後、全ての試料を１０μＬのＰｉｃｏＧｒｅｅｎ作業溶液と混合し、さらに５分間インキュベートした。その後、混合溶液を脱イオン水で希釈して、黒色９６ウェルプレート内で１μｇ／ｍＬの最終濃度とした。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ３プレートリーダーを用いて、４９０ｎｍの励起及び５３５ｎｍの発光で４連で蛍光測定を行った。試料の蛍光強度を裸のＤＮＡ対照を基準に正規化することにより、ＤＮＡ放出効率を定量化した。
ポリプレックスのサイズ及びゼータ電位の測定
Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ ＮＳ３００を用いたナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）により、ポリプレックスのサイズを測定した。ポリプレックスは、１０μＬのＳＡ中ｗ／ｗ比３０：１の０．５μｇ ＤＮＡを用いて調製した。次に、ポリプレックス溶液を１ｍＬの蒸留水に希釈し、次いでＮＴＡ解析に供した。ＮＴＡソフトウェア（バージョン３．２）を用いて粒子のブラウン運動追跡を含む６０秒の動画を記録した。各試料について１０トラックを評価した。Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ（Ｎａｎｏ－ＺＳ９０）を９０°散乱検出器角度で用いて、ポリプレックスのゼータ電位測定を行った。
透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）観察
ポリプレックスの形態をＴＥＭによってキャラクタリゼーションした。ｗ／ｗ比３０：１の２μｇ ＭＣＣ７を含む８０μＬのポリプレックス溶液を遠心分離し、上清を廃棄し、次いでポリプレックスをさらに８０μＬの蒸留水で２回洗浄して過剰な塩を除去した。その後、ポリプレックスを最終体積１０μＬの蒸留水に再懸濁した。次いで、２．５μＬポリプレックス溶液を２００メッシュ銅グリッド上のＦｏｒｍｖａｒ支持フィルム上にキャストし、直ちに凍結乾燥した。画像をＵＣＤ Ｃｏｎｗａｙ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｅ Ｃｅｎｔｅｒの１２０ｋＶのＦＥＩ Ｔｅｃｎａｉ １２０ ＴＥＭでキャプチャーした。
細胞培養
ＲＤＥＢＫ及びヒトケラチノサイト（ＮＨＫ）細胞を、標準的な細胞培養条件下、３７℃で５％ＣＯ２の加湿インキュベータ内で、補充パック（ＫＧＭ－Ｇｏｌｄ ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓ）及び１％ ＰＳを含むケラチノサイト基本培地（ＫＢＭ－Ｇｏｌｄ）中で培養した。
ＧＦＰ発現及び細胞生存率
最初にＧＦＰレポーター遺伝子形質移入を実施して、４つのＨＣ３２－ＤＡＴＯＵポリマーの遺伝子形質移入効率を評価し、最良の性能を示す候補をスクリーニングした。９６ウェルプレートに、ＲＤＥＢＫをウェル当たり２×１０４細胞の密度で播種した。翌日、ＧＦＰをコードするプラスミドＤＮＡ ０．５μｇを各ウェルに使用した。形質移入培地として８０μＬ新鮮培養培地と混合した２０μＬ ＳＡ中で、異なるＭｗを有するＨＣ３２－ＤＡＴＯＵポリプレックスを１０：１、３０：１、及び５０：１のポリマー／ＤＮＡ ｗ／ｗ比で調製した。形質移入から４時間後、形質移入培地を新鮮な培地で置き換えた。形質移入から４８時間後、蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ８１）下で細胞のＧＦＰ発現を可視化した。アラマーブルーアッセイで細胞生存率を測定した。細胞上清を除去し、次いで細胞をＨＢＳＳ中１０％アラマーブルー試薬と共に３７℃でさらに１時間インキュベートした。その後、アラマーブルー溶液を平底９６ウェルプレートに移した。蛍光強度は、５７０ｎｍの励起及び５９０ｎｍの発光でＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ３プレートリーダーによって読み取った。未処置細胞群の蛍光強度を１００％生存としてプロットした。細胞生存率を４連で測定し、試料の蛍光強度を未処置群の蛍光強度を基準に正規化することにより計算した。最も高いＧＦＰ発現及び細胞生存率を示すＨＣ３２－ＤＡＴＯＵを次の試験に使用した。
製剤試験（以下の実施例１０を参照）では、刊行物に従ってｗ／ｗ比３：１でＳｕｐｅｒＦｅｃｔ／ＤＮＡポリプレックスを調製した（Ｚｅｎｇ，Ｍ．；Ｚｈｏｕ，Ｄ．；Ａｌｓｈｅｈｒｉ，Ｆ．；Ｌａｒａ－Ｓａｅｚ，Ｉ．；Ｌｙｕ，Ｙ．；Ｃｒｅａｇｈ－Ｆｌｙｎｎ，Ｊ．；Ｘｕ，Ｑ．；Ａ，Ｓ．；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．；Ｗａｎｇ，Ｗ．Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｃｅｌｌｓ ｂｙ ａ Ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｌｉｎｅａｒ－Ｂｒａｎｃｈｅｄ Ｈｙｂｒｉｄ Ｐｏｌｙ（β－Ａｍｉｎｏ Ｅｓｔｅｒ） Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ａｎ Ｏｌｉｇｏｍｅｒ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ Ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．２０１９，１９（１），３８１－３９１．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ａｃｓ．ｎａｎｏｌｅｔｔ．８ｂ０４０９８． Ｔｈｅｏｈａｒｉｓ，Ｓ．；Ｋｒｕｅｇｅｒ，Ｕ．；Ｔａｎ，Ｐ．Ｈ．；Ｈａｓｋａｒｄ，Ｄ．Ｏ．；Ｗｅｂｅｒ，Ｍ．；Ｇｅｏｒｇｅ，Ａ．Ｊ．Ｔ．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｏ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉ Ｅ／Ｐ－Ｓｅｌｅｃｔｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌｉｎｋｅｄ ｔｏ ＰＡＭＡＭ Ｄｅｎｄｒｉｍｅｒｓ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００９，３４３（２），７９－９０．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｊｉｍ．２００８．１２．００５．）。リポフェクタミン２０００／ＤＮＡリポプレックスを製造業者のプロトコル（２：１体積／重量比）に従って調製した。蛍光強度中央値（ＭＦＩ）及びＧＦＰ陽性細胞を、３連でＡｃｃｕｌｉ Ｃ６システムでフローサイトメトリーによって定量化し、さらにＦｌｏｗｊｏ Ｖ１０ソフトウェアで解析した。１×１０４細胞を各実行ごとにカウントした。
Ｇｌｕｃレポーター遺伝子形質移入及び細胞生存率
Ｇｌｕｃレポーター遺伝子形質移入試験でさらにＨＣ３２－ＤＡＴＯＵを評価した。ＧｌｕｃをコードするプラスミドＤＮＡ０．５μｇを各ウェルに用いて、それぞれ２０：１、３０：１、及び４０：１のｗ／ｗ比でＨＣ３２－ＤＡＴＯＵ／ＤＮＡポリプレックスを調製した。過去の刊行物（Ｇｒｅｅｎ，Ｊ．Ｊ．；Ｚｕｇａｔｅｓ，Ｇ．Ｔ．；Ｔｅｄｆｏｒｄ，Ｎ．Ｃ．；Ｈｕａｎｇ，Ｙ．－Ｈ．；Ｇｒｉｆｆｉｔｈ，Ｌ．Ｇ．；Ｌａｕｆｆｅｎｂｕｒｇｅｒ，Ｄ．Ａ．；Ｓａｗｉｃｋｉ，Ｊ．Ａ．；Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．Ｇ．Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ Ｅｎａｂｌｅｓ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌｓ Ｃｏｍｐａｒａｂｌｅ ｔｏ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ．Ａｄｖ． Ｍａｔｅｒ．２００７，１９（１９），２８３６－２８４２．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／ａｄｍａ．２００７００３７１．Ｈｕａｎｇ，Ｊ．－Ｙ．；Ｇａｏ，Ｙ．；Ｃｕｔｌａｒ，Ｌ．；Ｏ’Ｋｅｅｆｆｅ－Ａｈｅｒｎ，Ｊ．；Ｚｈａｏ，Ｔ．；Ｌｉｎ，Ｆ．－Ｈ．；Ｚｈｏｕ，Ｄ．；ＭｃＭａｈｏｎ，Ｓ．；Ｇｒｅｉｓｅｒ，Ｕ．；Ｗａｎｇ，Ｗ．；ｅｔ ａｌ．Ｔａｉｌｏｒｉｎｇ Ｈｉｇｈｌｙ Ｂｒａｎｃｈｅｄ Ｐｏｌｙ（Ｂｅｔａ－Ａｍｉｎｏ Ｅｓｔｅｒ）ｓ： Ａ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ． （Ｃａｍｂ）．２０１５，５１（４０），８４７３－８４７６．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３９／ｃ５ｃｃ０２１９３ｆ． Ｚｅｎｇ，Ｍ．；Ｚｈｏｕ，Ｄ．；Ｎｇ，Ｓ．；Ａｈｅｒｎ，Ｊ．Ｏ．；Ａｌｓｈｅｈｒｉ，Ｆ．；Ｇａｏ，Ｙ．；Ｐｉｅｒｕｃｃｉ，Ｌ．；Ｇｒｅｉｓｅｒ，Ｕ．；Ｗａｎｇ，Ｗ．Ｈｉｇｈｌｙ Ｂｒａｎｃｈｅｄ Ｐｏｌｙ（５－Ａｍｉｎｏ－１－Ｐｅｎｔａｎｏｌ－Ｃｏ－１，４－Ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ Ｄｉａｃｒｙｌａｔｅ） ｆｏｒ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ．Ｐｏｌｙｍｅｒｓ （Ｂａｓｅｌ）．２０１７，９ （１２），１６１．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３９０／ｐｏｌｙｍ９０５０１６１．）に従って、ＰＥＩ／ＤＮＡポリプレックスをそれぞれ１：１、２：１、及び３：１のｗ／ｗ比で調製した。
ＲＤＥＢＫを播種し、上述のように遺伝子形質移入を行った。形質移入から４８時間後、遺伝子形質移入効率を定量化するため、５０μＬの細胞上清を等体積のＧｌｕｃアッセイ作業溶液と混合した。混合物の蛍光強度は、４８５ｎｍの励起及び５２５ｎｍの発光でＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ３プレートリーダーを用いて測定した。Ｇｌｕｃ活性の結果を相対光単位（ＲＬＵ）に関してプロットした。細胞生存率を上述のように測定した。Ｇｌｕｃ活性及び細胞生存性実験の両方を４連で測定した。
ポリプレックスの細胞取込み
Ｃｙ３ ＤＮＡ標識キットを使用して、標準プロトコルに従ってＭＣＣ７を標識した。９６ウェルプレートに、ＲＤＥＢＫをウェル当たり１×１０４細胞の密度で播種した。翌日、０．２５μｇ ＭＣＣ７を各ウェルに用いて、細胞にＨＣ３２－ＤＡＴＯＵ／ＭＣＣ７ポリプレックス（ｗ／ｗ＝３０：１）及びＰＥＩ／ＭＣＣ７（ｗ／ｗ＝１：１）を４時間形質移入し、次いで４％ ＰＦＡで固定し、０．１％トリトン－１００で透過処理し、ＨＢＳＳ中１μｇ／ｍＬの作業濃度でＤＡＰＩと共にインキュベートした。蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ８１）で蛍光画像を撮影した。細胞のＭＦＩ及びＣｙ３陽性の割合を、Ａｃｃｕｌｉ Ｃ６システムにより３連で定量化した。各測定につき１×１０４細胞をカウントしたＦｌｏｗｊｏ Ｖ１０ソフトウェアでさらに結果を解析した。
定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ｑＰＣＲ）
ＲＴ－ｑＰＣＲを実施してＣＯＬ７Ａ１ ｍＲＮＡ発現を定量化した。形質移入の１日前に、６ウエルプレートに、ＲＤＥＢＫをウェル当たり２．５×１０５細胞の密度で播種した。細胞に、３０：１及び１：１のｗ／ｗ比で５μｇ ＤＮＡと複合体化したＨＣ３２－ＤＡＴＯＵ／ＭＣＣ７及びＰＥＩ／ＭＣＣ７ポリプレックスを形質移入した。処置から３日後、処置細胞及び未処置細胞を共に回収し、全ＲＮＡの精製に供した。ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔのプロトコルに従ってＲＮＡ抽出作業を行った。次に、各群から０．５μｇの全ＲＮＡを使用して第１鎖ｃＤＮＡを合成した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ＳｕｐｅｒＭｉｘのプロトコルに従って、５０μＭ Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０プライマーを用いて逆転写を実施した。その後、１μＬの最終相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）生成物を、３８４ウェルプレートの１つのウェルに装填した９μＬの反応混合物（０．５μＬ ＴａｑＭａｎプライマー、５μＬ ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ混合物、３．５μＬ ＲＮａｓｅフリー水）に添加した。各試料を３連で測定した。ＣＯＬ７Ａ１の定量的遺伝子発現については、ＧＡＰＤＨを内在性対照として使用した。比較ＣＴ値及びＴａｑＭａｎ試薬、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ７ Ｆｌｅｘ Ｓｙｓｔｅｍを実験用にセットアップした。結果をＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏリアルタイムＰＣＲソフトウェアで解析した。
Ｃ７の細胞免疫蛍光染色
細胞免疫蛍光染色を使用して、ＨＣ３２－ＤＡＴＯＵ／ＭＣＣ７及びＰＥＩ／ＭＣＣ７ポリプレックスで処置した後のＲＤＥＢＫのＣ７回復を定量した。１．５×１０４細胞を８－ウェルチャンバー（Ｉｂｉｄｉ）内の各カバーガラスに播種した。１μｇ ＭＣＣ７を各ウェルに使用し、ＨＣ３２－ＤＡＴＯＵ／ＭＣＣ７及びＰＥＩ／ＭＣＣ７ポリプレックスをそれぞれ３０：１及び１：１のｗ／ｗ比で調製した。形質移入から３日後、細胞を４％ ＰＦＡで固定し、０．１％トリトンＸ－１００で透過させ、１×ＤＰＢＳ中５％ヤギ血清中で室温で１時間ブロックし、次いで、一次抗体（マウスで生成されたモノクローナル抗コラーゲン、ＶＩＩ型抗体）と共に４℃で終夜、ブロッキング緩衝液中１：２００の抗体希釈度でインキュベートした。その後、細胞を二次抗体（Ａｌｅｘａ－５６８ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、ブロッキング緩衝液中１：８００の希釈度）と共にインキュベートした。最終洗浄後、ＤＡＰＩを含むＦｌｕｏｒｏｓｈｉｅｌｄマウンティング培地でカバーガラスをマウントした。最後に、蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ８１）で細胞画像をキャプチャーした。
ウェスタンブロッティング
形質移入の１日前に、Ｔ－７５フラスコに、ＲＤＥＢＫをフラスコ当たり１．５×１０６細胞の密度で播種した。ｗ／ｗ比がそれぞれ３０：１及び１：１のＨＣ３２－ＤＡＴＯＵ／ＭＣＣ７及びＰＥＩ／ＭＣＣ７ポリプレックスを、各フラスコにつき３９μｇ ＭＣＣ７を用いた形質移入に使用した。形質移入から４日後、細胞を回収し、効率的な細胞溶解及び細胞タンパク質の可溶化を可能にするＲＩＰＡバッファーで処置した。１μＬ ＰＩＣを細胞溶解物に添加して最終体積５０μＬとし、－８０℃で保存した。ブラッドフォードアッセイを使用して、既知のＢＳＡ濃度を基準に試料濃度を正規化することにより、タンパク質の濃度を定量化した。４０μｇの変性タンパク質試料をＳＤＳ－Ｐａｇｅゲル（４％～１０％）に装填し、次いで電気泳動を７５Ｖで２０分間、続いて１２０Ｖで１時間実行した。次いで、タンパク質試料を、室温で１時間、８０Ｖでニトロセルロース膜に移し、続いて４℃で３０分間、９０Ｖで移した。ブロッキングバッファー（ＴＢＳＴバッファー中５％ ＢＳＡ）中で膜ブロッキングを室温で１時間行った。β－アクチンを内在性対照として使用した。次いで、一次抗体（ブロッキングバッファー中２５００希釈のポリクローナル抗Ｃ７ウサギ抗体及び抗アクチンマウス抗体）を膜に添加し、４℃で終夜インキュベートした。洗浄ステップの後、二次抗体（ブロッキングバッファー中５０００希釈の抗ウサギＨＲＰ及び抗マウスＨＲＰ）を膜に添加し、室温で１時間インキュベートした。３回のＴＢＳＴ洗浄後、膜をＰｉｅｒｃｅ ＥＣＬ Ｐｌｕｓ基質で可視化した。
統計
ＳＰＳＳ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｆｏｒ ｗｉｎｄｏｗｓ ｖｅｒｓｉｏｎ ２４（ＩＢＭ Ｃｏｒｐ．，Ａｒｍｏｎｋ，Ｎ．Ｙ．，ＵＳＡ）を統計に使用した。スチューデントのｔ検定を使用して全ての遺伝子形質移入データを解析し、これを平均±標準偏差（ＳＤ）として表現した。全ての解析について、ｐ値＜０．０５を統計的に有意とみなした。
結果：
分子量の異なるＨＰＡＥを用いたＲＤＥＢＫにおけるレポーター遺伝子形質移入
遺伝子送達のための最も好ましいＭＷを同定するため、異なるＭｗを有する４つのＨＣ３２－ＤＡＴＯＵポリマーを使用して、レポーター遺伝子としてＧＦＰコードＤＮＡを用いてＲＤＥＢＫ細胞に形質移入した。図１４及び図１５に示すように、１０：１のポリマー／ＤＮＡ ｗ／ｗ比では明らかな細胞毒性は観察されないが、全てのＨＣ３２－ＤＡＴＯＵポリマーからの形質移入効率は比較的低い。ｗ／ｗ比を３０：１以上に増加させると、全てのポリマーの中で、３０：１の１１ｋＤａ ＨＣ３２－ＤＡＴＯＵが最も強力なＧＦＰ発現で最高の形質移入効率を達成し、同時に９８％という高いレベルの細胞生存率を保持した。概して、ＧＦＰ発現はＨＣ３２－ＤＡＴＯＵポリマーのＭｗが増加するに伴って減少した。
一方、細胞毒性は、ポリマーＭｗの増加と非常によく相関した。例えば、５０：１のｗ／ｗでは、Ｍｗが増加するにつれて、細胞生存率は、それぞれ９１％から５８％、４２％、及び１５％に減少する。形質移入効率は細胞毒性が増加するに伴って低下し、これはポリマーの主鎖の増加に起因すると考えられる。これらの結果は、ＭＷがＨＣ３２－ＤＡＴＯＵの形質移入性能に顕著に作用し、高い形質移入効率及び低い細胞毒性の両方を達成するには、約１０ｋＤａのＭｗがＲＤＥＢＫ遺伝子形質移入により好ましいことを実証するものである。
市販の遺伝子形質移入試薬ＰＥＩ（Ｍｗ＝２５ｋＤａ）と比較することにより、１１ｋＤａ ＨＣ３２－ＤＡＴＯＵの高い遺伝子形質移入能力を検証した。図１６ａに示すように、試験した３つのｗ／ｗ比全てにおいて、ＨＣ３２－ＤＡＴＯＵ／ＤＮＡポリプレックスによる形質移入後のＲＤＥＢＫ細胞の相対Ｇｌｕｃ活性は、ＰＥＩ／ＤＮＡカウンターパートによって媒介されるものよりもはるかに高かった。ｗ／ｗ比３０：１のＨＣ３２－ＤＡＴＯＵ／ＤＮＡポリプレックスによって達成された最も高いＧｌｕｃ活性は、ｗ／ｗ比２：１のＰＥＩ／ＤＮＡカウンターパートよりも１７倍高かった。
重要なことに、ＨＣ３２－ＤＡＴＯＵ／ＤＮＡポリプレックスは、明らかな細胞毒性を誘導せず、ほぼ１００％の細胞生存率を維持した。これに対し、ＰＥＩは明白な用量非依存性細胞毒性を示し、細胞生存率はｗ／ｗ比１：１における９０％からｗ／ｗ比３：１における３８％まで顕著に減少した（図１６ｂ）。細胞毒性が相当程度のため、以下の試験ではｗ／ｗ比１：１のＰＥＩを使用した。
ＨＣ３２－ＤＡＴＯＵ／ＤＮＡポリプレックスの高性能を確認するため、ＧＦＰコードＤＮＡを形質移入に使用した。ＨＣ３２－ＤＡＴＯＵ／ＤＮＡポリプレックスは、ＰＥＩよりもはるかに高いレベルのＧＦＰ発現を媒介し、これは実質的により強力な緑色蛍光が観察されたことにより立証される（図１６ｃ）。これに対応して、フローサイトメトリー定量分析は、より多くの細胞がＧＦＰ決定チャネルに対応してシフトすることを示している（図１６ｄ）。ＨＣ３２－ＤＡＴＯＵ／ＤＮＡポリプレックスによる形質移入後にＲＤＥＢＫ細胞の７５％がＧＦＰ陽性であったのに対し、ＰＥＩ／ＤＮＡポリプレックスによって達成されたのは３９％であった。さらに、ＨＣ３２－ＤＡＴＯＵ／ＤＮＡポリプレックスによって形質移入されたＲＤＥＢＫ細胞のＭＦＩは、ＰＥＩ／ＤＮＡカウンターパートによって媒介されるものより１３倍高く（図１６ｅ）、個々の細胞ではるかに高い遺伝子発現が達成されたことが示されている。これらの全ての結果は、ＨＣ３２－ＤＡＴＯＵがＲＤＥＢＫ細胞における遺伝子形質移入について、ＰＥＩよりもはるかに効率的で安全であることを実証するものである。
ＭＣＣ７の生合成及びＲＤＥＢＫ細胞によるＨＰＡＥ／ＭＣＣ７ポリプレックスの細胞取込み
ミニサークル技術のｐｈｉＣ３１及び１－Ｓｃｅｌ消化系（Ｇａｓｐａｒ，Ｖ．；ｄｅ Ｍｅｌｏ－Ｄｉｏｇｏ，Ｄ．；Ｃｏｓｔａ，Ｅ．；Ｍｏｒｅｉｒａ，Ａ．；Ｑｕｅｉｒｏｚ，Ｊ．；Ｐｉｃｈｏｎ，Ｃ．；Ｃｏｒｒｅｉａ，Ｉ．；Ｓｏｕｓａ，Ｆ．Ｍｉｎｉｃｉｒｃｌｅ ＤＮＡ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ： Ａｄｖａｎｃｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１５，１５ （３），３５３－３７９．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１５１７／１４７１２５９８．２０１５．９９６５４４．）を利用して、約９ｋｂの全長ＣＯＬ７Ａ１をコードするミニサークルＤＮＡを生合成した（図１７ａ）。ゲル電気泳動は、３つの全てのＣＯＬ７Ａ１タグ化ＤＮＡの中で、ＭＣＣ７のみが３ｋｂ長の骨格を有することを示しており、これは、通常のプラスミド（ＲＰ）ｐｃＤＮＡ３．１ＣＯＬ７Ａ１及び親プラスミド（ＰＰ）ＭＮ５１１Ａ－１－ＣＯＬ７Ａ１よりもそれぞれ２ｋｂ及び５ｋｂ短い（図１７ｂ）。これは、細菌配列を欠く従来のＰＰベクターからの小型化誘導体を有するＭＣＣ７を示している。
ＨＣ３２－ＤＡＴＯＵ／ＭＣＣ７ポリプレックスの細胞取込みをＲＤＥＢＫ細胞で行った。ＭＣＣ７を赤色蛍光色素Ｃｙ３で標識し、上述のようにＨＣ３２－ＤＡＴＯＵ／ＭＣＣ７ポリプレックスを調製した。４時間の形質移入後、細胞の核の周囲に非常に強力な赤色蛍光が観察された（図１７ｃ）。これに対し、ＰＥＩ／ＭＣＣ７ポリプレックスは、はるかに弱い赤色蛍光によって立証されるように、はるかに低い細胞取込み効率を示している。さらに、フローサイトメトリー測定値は、Ｃｙ３陽性細胞のパーセンテージは類似する（９６．４％対９３％、図１７ｄ）が、ＨＣ３２－ＤＡＴＯＵ／ＭＣＣ７ポリプレックスとインキュベートした細胞のＭＦＩは、ＰＥＩ／ＭＣＣ７カウンターパートによって処置されたものよりおよそ２倍高かった（図１７ｅ）ことを実証しており、これは、より多数のＤＮＡコピーがＲＤＥＢＫ細胞によって取り込まれたことを示している。ＲＶ及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが運搬できる最大ＤＮＡサイズは、それぞれ７～８ｋｂ及び５ｋｂである。ＨＣ３２－ＤＡＴＯＵが１２ｋｂ長のＭＣＣ７を効率的にＲＤＥＢＫ細胞に送達可能であるという事実は、ＲＤＥＢ治療のために高いＣ７発現を達成する可能性を強調するものである。
高レベルのＣＯＬ７Ａ１ ｍＲＮＡ及び組換えＣ７発現
内在化に続くベクター／ＤＮＡポリプレックスの課題は、エンド／リソソーム脱出、細胞質を介した輸送、ＤＮＡ放出、及び核進入を含めた細胞内バリアである。細胞周期は、細胞の核取込み効率に対するもう１つの障害である。有糸分裂を経ている細胞は、細胞周期の増殖期にある細胞よりも核取込み効率が１０倍以上高い。
ＨＣ３２－ＤＡＴＯＵ／ＭＣＣ７ポリプレックスによって媒介される転写物ＣＯＬ７Ａ１ ｍＲＮＡ及びＣ７タンパク質発現を評価するため、ＲＴ－ｑＰＣＲ、免疫蛍光染色、及びウェスタンブロッティング試験を実施した。
図１８ａ及び図１８ｂは、それぞれ内在性対照ＧＡＰＤＨ及びＣＯＬ７Ａ１ ｍＲＮＡ発現のＲＴ－ｑＰＣＲ増幅プロットの概要を示している。内因性対照を基準に正規化した後、ＨＣ３２－ＤＡＴＯＵ／ＭＣＣ７ポリプレックスが、ＵＴ細胞に比べてＣＯＬ７Ａ１ ｍＲＮＡ発現の４０１９倍の上方制御を媒介したことが示されており（図１８ｃ）、ＰＥＩ／ＭＣＣ７ポリプレックスによって媒介されたものよりも２．２倍高かった。免疫蛍光染色試験（図１８ｄ）はさらに、ヌルＣ７発現が未処置ＲＤＥＢＫ細胞で検出されたことを明らかにしている。これに対し、ＨＣ３２－ＤＡＴＯＵ／ＭＣＣ７ポリプレックスによる形質移入後、核周辺におけるはるかに高いレベルの細胞Ｃ７発現が細胞免疫蛍光画像で観察された。さらに、ＣＯＬ７Ａ１ ｍＲＮＡ発現の結果と一致して、ＨＣ３２－ＤＡＴＯＵ／ＤＮＡポリプレックスは、ＰＥＩ／ＭＣＣ７カウンターパートよりも効率的なＣ７発現を媒介した。
ウェスタンブロッティングの結果は、Ｃ７分泌が未処置ＲＤＥＢＫ細胞から検出されなかったことを示している（図１８ｅ）。これとは反対に、ＨＣ３２－ＤＡＴＯＵ／ポリプレックスによる形質移入後には、非常に明瞭なＣ７の２９０ｋＤａタンパク質バンドが認識でき、このＣ７バンドは、完全なＣ７生成機能を有する野生型ＮＨＫ細胞のバンドと同程度に強力である。ＰＥＩ／ＭＣＣ７ポリプレックスは顕著に高いレベルのＣＯＬ７Ａ１ ｍＲＮＡ発現を達成したが、Ｃ７生成が限定的であることに留意されたい。
機序試験は、コンパクトなＤＮＡ構造が細胞取込み、細胞内ベクターコピー数、核配置、及びｍＲＮＡ転写レベルを増大させることを実証している（Ｋｏｂｅｌｔ，Ｄ．；Ｓｃｈｌｅｅｆ，Ｍ．；Ｓｃｈｍｅｅｒ，Ｍ．；Ａｕｍａｎｎ，Ｊ．；Ｓｃｈｌａｇ，Ｐ．Ｍ．；Ｗａｌｔｈｅｒ，Ｗ．Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｏｆ Ｈｉｇｈ Ｑｕａｌｉｔｙ Ｍｉｎｉｃｉｒｃｌｅ ＤＮＡ ｆｏｒ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３，５３（１），８０－８９．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／ｓ１２０３３－０１２－９５３５－６．）。本明細書においては、ＨＣ３２－ＤＡＴＯＵは、最適化されたポリマー及び小型化された遺伝子構築物を利用して、ＣＯＬ７Ａ１遺伝子をＲＤＥＢＫ細胞に有効に送達し、その後のｍＲＮＡ転写及び最終的な組換えＣ７発現を促進し、それによって皮膚の統合性を強化することができる。
ＨＰＡＥ／ＭＣＣ７ポリプレックスの高い遺伝子形質移入効率の機構的試験
ＤＮＡ凝縮、結合、ポリプレックスサイズ、ゼータ電位、形態、及びＤＮＡ放出は、形質移入性能に関連する。ＨＣ３２－ＤＡＴＯＵ／ＭＣＣ７ポリプレックスによって媒介される高い遺伝子形質移入効率の機構をより十分に理解するため、これらの物理化学的パラメーターを検討した。
カチオン性のＨＣ３２－ＤＡＴＯＵは、負に帯電したＭＣＣ７を凝縮し、静電的自己集合を介してポリプレックスを形成すると考えられる（図１９ａ）。これを確認するため、アガロースゲル電気泳動を行ってポリプレックス調製から２時間後のＨＣ３２－ＤＡＴＯＵのＤＮＡ凝縮能力を評価した。図１９ｂに示すように、裸のＭＣＣ７ ＤＮＡはゲル上でシフトしたが、ＨＣ３２－ＤＡＴＯＵは明らかなＤＮＡシフトなしにウェル上でＤＮＡを凝縮することができた。さらに、ヘパリン競合アッセイは、低いヘパリン濃度（０．１～０．３ＩＵ／μＬ）を有するＨＣ３２－ＤＡＴＯＵポリプレックスが依然として大部分のＤＮＡを凝縮することを示した。このことは、ＨＣ３２－ＤＡＴＯＵポリプレックスの強力なＤＮＡ凝縮能力及び高度に安定な特性を示唆するものである。
同様に、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイ（図１９ｃ）によって定量化されたように、ＨＣ３２－ＤＡＴＯＵは、９６．３％という安定的かつ高いＤＮＡ結合親和性を示した。このことは、ＤＮＡアンパッキングがわずか３．７％であることを示している。３及び６ＩＵ／μＬ濃度のヘパリンを適用した場合、それぞれ６８．２％及び９９．６％のＤＮＡアンパッキングが検出された。これらの結果は、ＨＣ３２－ＤＡＴＯＵが、調整可能な負に荷電したヘパリンの存在下で、制御された方式で効率的にＤＮＡを縮合、結合、及び放出することを実証している。
効率的なＣ７発現のために最適化されたｗ／ｗ比（３０：１）において、ナノ粒子は、それぞれ平均サイズ１１０ｎｍ及び最頻サイズ８１ｎｍ（図１９ｄ）、ゼータ電位は＋３７．４ｍＶ（図１９ｅ）を示した。これは、正の表面電荷を有するコンパクトなナノ粒子構造を示すものである。ポリプレックスは、最も一般的には球形またはトロイダル形状で形成されていることが知られている。これに関し、ＨＣ３２－ＤＡＴＯＵ／ＭＣＣ７ポリプレックスは、均一で球状の形態を示した（図１９ｆ）。
形質移入効率の強化は、ジアミン末端基修飾から利益を得ることが報告されている。この修飾は、ポリマーのカチオン電荷を増加させ、それによってポリマー／ＤＮＡ結合動力学及びＤＮＡのナノ粒子への縮合を改善し、ＤＮＡを分解から保護する。ジアミンＤＡＴＯＵによる末端修飾とは別に、１級、２級、３級アミンを含む複数のＤＮＡ結合／縮合部分がＨＣ３２骨格及び末端基に存在する。概して、ＬＰＡＥ／ＤＮＡ粒子は２５０ｎｍ未満であり、より小さいサイズの粒子は、細胞によってより効率的に内在化されることが分かっている。
いかなる理論にも拘束されることなく、ＨＣ３２／ＭＣＣ７ポリプレックスの小さくコンパクトで均一でカチオン性の特性が高い細胞取込み効率を可能にすることが考えられる。さらに、複数のイオン化可能な２級及び３級アミンは、広範囲のプロトンを緩衝することができ、これは、「プロトンスポンジ効果」を介してエンド／リソソーム脱出を容易にし得る。その後、ＨＣ３２－ＤＡＴＯＵの安定的な遺伝子パッケージング安定性は、ポリプレックスの細胞質を介した核への細胞内輸送を支援し得ることを示唆する。
効率的なベクターは、ＤＮＡを保護するのに十分な結合強度とＤＮＡを放出する能力とのバランスをとらなければならない。いかなる理論にも拘束されることなく、ＨＣ３２－ＤＡＴＯＵとＭＣＣ７との間の適度な静電相互作用及びＨＣ３２－ＤＡＴＯＵの生分解性特性は、核内のポリプレックスからの遺伝子放出を容易にして転写ステップを開始させ得る。
実施例１０：本開示のＨＰＡＥポリプレックスを含む凍結乾燥組成物
以下の実施例は、例示的なＨＰＡＥ／ＤＮＡポリプレックス製剤のための凍結乾燥プロセスにおける貯蔵条件及び凍結保護物質濃度を変化させた結果について説明する。
凍結乾燥プロセスにおける貯蔵条件及び凍結保護物質濃度を変化させることによってＨＣ３２－ＤＡＴＯＵ／ＤＮＡポリプレックス製剤を最適化した。図２０ａは、ＧＦＰコードＤＮＡを用いたＲＤＥＢＫ細胞におけるポリプレックス凍結乾燥加工及び遺伝子形質移入の試験のスキームを図示している。新鮮に調製したポリプレックス以外に、全てのポリプレックスを調製から１日後の遺伝子形質移入に用いた。図２０ｂに示すように、保存温度を変化させることによって、室温で保存されたものを除いて、新鮮なポリプレックスならびに４℃、－２０℃、及び－８０℃で保存したポリプレックスは、フローサイトメトリーヒストグラム分布において、細胞集団の顕著なシフトを伴った同等かつ高いＧＦＰ発現を示している（図２０ｃ）。図２０ｄ及び２０ｅに示すように、フローサイトメトリーで定量化された効率は７０％より高く、正規化ＭＦＩは、ＵＴ群よりおよそ１０倍高かった。これらの結果は、ＨＣ３２－ＤＡＴＯＵ／ＤＮＡポリプレックスの高い遺伝子形質移入能力を維持するには低い貯蔵温度が好ましいことを実証している。
次に、フリーズドライプロセス中の凍結保護物質としてスクロースを用いて、凍結保護物質濃度がＨＣ３２－ＤＡＴＯＵ／ＤＮＡポリプレックスの遺伝子形質移入能力に及ぼす作用を調べた。凍結保護物質なし（０％スクロース）のフリーズドライポリプレックスは、形質移入能力の大部分が喪失し、ＵＴ細胞に比べて２０％の効率及び１．４倍高いＭＦＩを示すにとどまった。
凍結乾燥前に１％、３％、及び５％スクロースをポリプレックス溶液に添加すると、形質移入効率は、それぞれ５４％、６１％、５２％まで増加した。これらの結果は、ＨＣ３２－ＤＡＴＯＵ／ＤＮＡポリプレックスの高い遺伝子形質移入能力を維持するには３％スクロースがより効率的であることを実証している。遺伝子形質移入は、新鮮に調製したカウンターパートよりもいくらか低かったものの、低温で保存またはスクロースを伴ってフリーズドライしたポリプレックスの遺伝子形質移入能力は、市販の試薬ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ及びリポフェクタミンよりも依然としてはるかに高く、これらの試薬の効率はそれぞれ１０％及び３２％である。
さらに、ポリプレックス凍結乾燥は固有の利点を有する。第一に、より高い濃度でポリプレックスを再構成するのを可能にする。これは、限定的な投与体積が求められるインビボ注射に特に有益である。第二に、容易に調整可能な溶質（スクロース）は、製剤中に再構成されたポリプレックス溶液を等張にすることができる。また、スクロースを伴った凍結乾燥ポリプレックスは、新鮮に調製されたポリプレックスに比べて、血清の存在下でより安定していることが予想される。最後に、凍結乾燥したポリプレックスは、有効性を喪失することなく何年も保存することができる。
保存時間の異なる高性能のＨＣ３２－ＤＡＴＯＵ／ＤＮＡポリプレックス（４℃、－２０℃、－８０℃）について遺伝子形質移入試験を行った。図２１に示すように、４℃で０．５または１ヵ月間保存した後、ポリプレックスのＧｌｕｃ活性は、新鮮に調製されたものによって媒介されるものより２～３桁低かった。２か月後、ポリプレックスの効率は無視できる程度になった。
これに対し、１年後であっても、－２０℃及び－８０℃で保存したポリプレックスは、新鮮に製剤化したポリプレックスと同じレベルのＧｌｕｃ活性を媒介した。これらの結果は、ＨＣ３２－ＤＡＴＯＵ／ＤＮＡポリプレックスが非常に安定しており、－２０℃または－８０℃で保存するだけで遺伝子形質移入の完全な機能を保持し、そのため臨床応用に非常に適していることを実証している。
実施例９及び１０のための材料：モノマー：５－アミノ－１－ペンタノール（ＡＰ、９９％）、トリメチロールプロパントリアクリレート（ＴＭＰＴＡ、９９％）、１，１１－ジアミノ－３，６，９－トリオキサウンデカン（ＤＡＴＯＵ、９８％）をＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、１，４－ブタンジオールジアクリレート（ＢＤＡ、９８％）をＶＷＲから購入した。化学物質：臭化リチウム（ＬｉＢｒ、９９％）、トリス緩衝食塩水、及びＴｗｅｅｎ ２０（ＴＢＳＴ）、パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）、及びトリトンＸ－１００をＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。溶媒：ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、９９％）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、９９％）、ジエチルエーテル（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、９９％）、及び重水素化クロロホルム（ＣＤＣｌ３、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、９９．９％）をそのまま使用した。分枝状ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、Ｍｗ＝２５ｋＤａ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ（ＱＩＡＧＥＮ）、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、市販の試薬対照として使用した。ケラチノサイト細胞基本培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ ＫＢＭ－Ｇｏｌｄ）及び補充パック（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ ＫＧＭ－Ｇｏｌｄ ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓ）をＬｏｎｚａから購入した。細胞分泌Ｇａｕｓｓｉａ ｐｒｉｎｃｅｐｓルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）プラスミド及びＢｉｏＬｕｘ ＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼアッセイキットをＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ＵＫから入手した。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）プラスミドをＡｌｄｅｖｒｏｎから購入した。ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）、酢酸ナトリウム（ＳＡ、ｐＨ５．２±０．１、３Ｍ）バッファー、酢酸トリス－ＥＤＴＡ（ＴＡＥ）バッファー及び放射免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）バッファー、アガロース、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヤギ血清、マウスで生成されたモノクローナル抗Ｃ７抗体、プロテアーゼ阻害薬カクテル（ＰＩＣ）、及びブラッドフォード試薬をＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。１×ダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、Ｇｉｂｃｏ ＯＰＴＩ－ＭＥＭ Ｉ還元血清培地、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、及びＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイキットをＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。ペニシリン－ストレプトマイシン（ＰＳ）、ＥｃｏＲＩ、Ａｌｅｘａ－５６８ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）高交差吸着二次抗体、及びＰｉｅｒｃｅ ＥＣＬ ｐｌｕｓ ウェスタンブロッティング基質をＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。アラマーブルーアッセイキット、ＳＹＢＲ ｓａｆｅ ＤＮＡゲル染色液、及びＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ＳｕｐｅｒＭｉｘをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。コラーゲンＶＩＩ型アルファ１（Ｆａｍ－ＭＧＢ、プライマー及びプローブ）、ヒトグリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）内在性対照（ＶＩＣ／ＭＧＢプローブ、プライマー制限）、ならびにＴａｑＭａｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘをＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入した。ＴＥバッファー（ＱＩＡＧＥＮ）、Ｃｙ３ ＤＮＡ標識キット（Ｍｉｒｕｓ）、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）、ＤＡＰＩを含むＦｌｕｏｒｏｓｈｉｅｌｄマウンティング培地（Ａｂｃａｍ）を製造業者のプロトコルに従って使用した。ポリクローナル抗Ｃ７ウサギ一次抗体（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、抗ベータアクチンマウス一次抗体（Ａｂｃａｍ）、抗ウサギＩｇＧ ＨＲＰ結合抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、及び抗マウスＩｇＧ ＨＲＰ結合抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）はそのまま使用した。
本明細書で引用または他の形で参照もしくは開示される全ての参考文献は、参照によりその全体があらゆる目的で援用される。
[参考文献]
Figure 2022514113000146
Figure 2022514113000147
Figure 2022514113000148

Claims (142)

  1. 以下のプロセス：
    （ａ）式（Ａ）の化合物
    Figure 2022514113000149
     を、式Ｒ１－ＮＨ２またはＲ１－Ｎ（Ｈ）－Ｚ’－Ｎ（Ｈ）－Ｒ１を有する第１のアミンと反応させることと、
    （ｂ）ステップ（ａ）の生成物を、式Ｒ２－ＮＨ２またはＲ２－Ｎ（Ｈ）－Ｚ’’－Ｎ（Ｈ）－Ｒ２を有する第２のアミンと反応させることと、
    （ｃ）ステップ（ｂ）の生成物を式（Ｂ）の化合物と反応させることと
    Figure 2022514113000150
     と反応させることとによって作製される、ポリマーであって、式中、
    各Ｊが、独立的に－Ｏ－または－ＮＨ－であり、
    Ｚ、Ｚ’、及びＺ’’が結合部分であり、
    Ａが、１～３０個の炭素原子の直鎖状もしくは分枝状炭素鎖、２～３０個の原子の直鎖状もしくは分枝状ヘテロ原子含有炭素鎖、３～３０個の炭素原子を含む炭素環、または３～３０個の原子を含む複素環であり、
    Ａが、任意選択で、１つ以上のハロゲン、ヒドロキシル、アミノ基、スルホニル基、スルホンアミド基、チオール、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ、Ｃ１－Ｃ６エーテル、Ｃ１－Ｃ６チオエーテル、Ｃ１－Ｃ６スルホン、Ｃ１－Ｃ６スルホキシド、Ｃ１－Ｃ６１級アミド、Ｃ１－Ｃ６２級アミド、ハロＣ１－Ｃ６アルキル、カルボキシル基、シアノ基、ニトロ基、ニトロソ基、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ３－Ｃ６シクロアルキル、Ｃ３－Ｃ６ヘテロシクリル、Ｃ２－Ｃ５ヘテロアリール、またはＣ６－Ｃ１０アリールで置換され（式中、各Ｒ’は、独立的に、水素及びＣ１－Ｃ６アルキルからなる群より選択される）、
    Ｇが、－Ｃ－、－Ｓ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｐ（ＯＲ１）－、または－Ｐ（ＯＨ）－であり、
    各Ｑが、ＨまたはＣ１－Ｃ１０直鎖状もしくは分枝状アルキル基であり、
    各Ｅ１が、独立的に、共有結合、－Ｎ－、－Ｏ－、－Ｓ－、アルキレン、ヘテロアルキレン、アルケニル、ヘテロアルケニレン、アルキニル、ヘテロアルキニレンからなる群より選択され；
    Ｒ１及びＲ２が、各々独立的に、Ｃ１－Ｃ４０アルキル、Ｃ１－Ｃ４０ヘテロアルキル、Ｃ２－Ｃ４０アルケニル、Ｃ２－Ｃ４０ヘテロアルケニレン、Ｃ４－Ｃ８シクロアルケニル、Ｃ２－Ｃ４０アルキニル、Ｃ２－Ｃ４０ヘテロアルキニレン、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリールであり、このとき、前記ヘテロシクリル及び前記ヘテロアリールが、Ｎ、Ｓ、Ｐ、及びＯからなる群より選択される１～５個のヘテロ原子を含み、前記Ｃ１－Ｃ４０アルキル、Ｃ２－Ｃ４０アルケニル、Ｃ４－Ｃ８シクロアルケニル、Ｃ２－Ｃ４０アルキニル、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、及びヘテロアリールが、任意選択で、Ｄ、ハロゲン、Ｃ１－Ｃ６アルキル、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、または－Ｎ（Ｃ１－Ｃ６アルキル）２で置換され、Ｒ１は、非置換であるか、またはハロゲン、ヒドロキシル、アミノ基、スルホニル基、スルホンアミド基、チオール、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ、Ｃ１－Ｃ６エーテル、Ｃ１－Ｃ６チオエーテル、Ｃ１－Ｃ６スルホン、Ｃ１－Ｃ６スルホキシド、Ｃ１－Ｃ６１級アミド、Ｃ１－Ｃ６２級アミド、ハロＣ１－Ｃ６アルキル、カルボキシル基、シアノ基、ニトロ基、ニトロソ基、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ３－Ｃ６シクロアルキル、Ｃ３－Ｃ６ヘテロシクリル、Ｃ２－Ｃ５ヘテロアリール、及びＣ６－Ｃ１０）アリールのうちの１つ以上で置換され（式中、各Ｒ’は、独立的に、水素及びＣ１－Ｃ６アルキルからなる群より選択される）、
    各ｎが少なくとも１である、前記ポリマー。
  2. Ｚが、１～３０個の炭素原子の直鎖状もしくは分枝状炭素鎖、１～３０個の原子の直鎖状もしくは分枝状ヘテロ原子含有炭素鎖、３～３０個の炭素原子を含む炭素環、３～３０個の炭素原子を含むアルキレン－炭素環、３～３０個の原子を含む複素環、または３～３０個の原子を含むアルキレン－複素環であり、
    Ｚが、非置換であるか、またはハロゲン、ヒドロキシル、アミノ基、スルホニル基、スルホンアミド基、チオール、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ、Ｃ１－Ｃ６エーテル、Ｃ１－Ｃ６チオエーテル、Ｃ１－Ｃ６スルホン、Ｃ１－Ｃ６スルホキシド、Ｃ１－Ｃ６１級アミド、Ｃ１－Ｃ６２級アミド、ハロＣ１－Ｃ６アルキル、カルボキシル基、シアノ基、ニトロ基、ニトロソ基、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ３－Ｃ６シクロアルキル、Ｃ３－Ｃ６ヘテロシクリル、Ｃ２－Ｃ５ヘテロアリール、及びＣ６－Ｃ１０アリールのうちの少なくとも１つで置換されている（式中、各Ｒ’は、独立的に、水素及びＣ１－Ｃ６アルキルからなる群より選択される）、請求項１に記載のポリマー。
  3. Ｇが－Ｃ－である、請求項１または２に記載のポリマー。
  4. 前記式（Ｂ）の化合物が
    Figure 2022514113000151
     であり、式中、
    Ｒが、１～１０個の炭素原子の直鎖状もしくは分枝状炭素鎖、１～１０個の原子の直鎖状もしくは分枝状ヘテロ原子含有炭素鎖、３～１０個の炭素原子を含む炭素環、または３～１０個の原子を含む複素環であり、Ｒが、非置換であるか、またはハロゲン、ヒドロキシル、アミノ基、スルホニル基、スルホンアミド基、チオール、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ、Ｃ１－Ｃ６エーテル、Ｃ１－Ｃ６チオエーテル、Ｃ１－Ｃ６スルホン、Ｃ１－Ｃ６スルホキシド、Ｃ１－Ｃ６１級アミド、Ｃ１－Ｃ６２級アミド、ハロＣ１－Ｃ６アルキル、カルボキシル基、シアノ基、ニトロ基、ニトロソ基、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ３－Ｃ６シクロアルキル、Ｃ３－Ｃ６ヘテロシクリル、Ｃ２－Ｃ５ヘテロアリール、及びＣ６－Ｃ１０アリールのうちの少なくとも１つで置換されており（式中、各Ｒ’は、独立的に、水素及びＣ１－Ｃ６アルキルからなる群より選択される）、
    Ｒ’’が、非置換または置換された、１～１０個の炭素原子の直鎖状もしくは分枝状炭素鎖、１～１０個の原子の直鎖状もしくは分枝状ヘテロ原子含有炭素鎖、３～１０個の炭素原子を含む炭素環、または３～１０個の原子を含む複素環である、請求項１～３のいずれか１項に記載のポリマー。
  5. 前記式（Ｂ）の化合物が
    Figure 2022514113000152
     である、請求項４に記載のポリマー。
  6. Ｚが、１～３０個の炭素原子の直鎖状もしくは分枝状炭素鎖、または１～３０個の原子の直鎖状もしくは分枝状ヘテロ原子含有炭素鎖である、請求項１～５のいずれか１項に記載のポリマー。
  7. Ｚが、１～１０個の炭素原子の直鎖状または分枝状炭素鎖である、請求項６に記載のポリマー。
  8. Ｚが
    Figure 2022514113000153
     であって、
    式中、ｘが１～１０００である、請求項１～６のいずれか１項に記載のポリマー。
  9. 各Ｚが
    Figure 2022514113000154
     である、請求項１～６のいずれか１項に記載のポリマー。
  10. Ｒ１及びＲ２が、独立的に、
    Figure 2022514113000155
     からなる群より選択される、請求項１～９のいずれか１項に記載のポリマー。
  11. Ｒ１が
    Figure 2022514113000156
     であり、Ｒ２が
    Figure 2022514113000157
     である、請求項１０に記載のポリマー。
  12. モル過剰の前記式（Ａ）の化合物が前記第１のアミンと反応させられる、請求項１～１１のいずれか１項に記載のポリマー。
  13. 前記式（Ａ）の化合物：前記第１のアミンの化学量論比が約１．２：１である、請求項１２に記載のポリマー。
  14. ステップ（ａ）が有機溶媒中で実施される、請求項１～１３のいずれか１項に記載のポリマー。
  15. 前記有機溶媒がＤＭＳＯである、請求項１４に記載のポリマー。
  16. ステップ（ａ）が約４０℃～約１２０℃の温度で実施される、請求項１～１５のいずれか１項に記載のポリマー。
  17. ステップ（ａ）が約９０℃で実施される、請求項１６に記載のポリマー。
  18. 前記ステップ（ａ）の生成物がステップ（ｂ）の前に精製されない、請求項１～１７のいずれか１項に記載のポリマー。
  19. モル過剰の前記第２のアミンが前記ステップ（ａ）の生成物と反応させられる、請求項１～１８のいずれか１項に記載のポリマー。
  20. ステップ（ｂ）が約２０℃～約２５℃の温度で実施される、請求項１～１９のいずれか１項に記載のポリマー。
  21. 前記ステップ（ｂ）の生成物がステップ（ｃ）の前に精製される、請求項１～２０のいずれか１項に記載のポリマー。
  22. ステップ（ｃ）がステップ（ｂ）の温度よりも高い温度で実施される、請求項１～２１のいずれか１項に記載のポリマー。
  23. ステップ（ｃ）が約９０℃で実施される、請求項２２に記載のポリマー。
  24. 前記ポリマーのマーク－フウィンクの式から定義されるアルファパラメーターが約０．５未満である、請求項１～２３のいずれか１項に記載のポリマー。
  25. 前記ポリマーのマーク－フウィンクの式から定義されるアルファパラメーターが約０．２～約０．５である、請求項１～２４のいずれか１項に記載のポリマー。
  26. 前記ポリマーのＰＤＩが約１．０１～約８．０である、請求項１～２５のいずれか１項に記載のポリマー。
  27. 前記ポリマーのＰＤＩが約２．５である、請求項１～２６のいずれか１項に記載のポリマー。
  28. 前記ポリマーのＭＷが少なくとも３ｋＤａである、請求項１～２７のいずれか１項に記載のポリマー。
  29. 前記ポリマーのＭＷが約５ｋＤａから５０ｋＤａの間である、請求項１～２８のいずれか１項に記載のポリマー。
  30. 前記ポリマーのＭＷが約１０ｋＤａである、請求項１～２９のいずれか１項に記載のポリマー。
  31. ステップ（ｂ）の後の前記生成物のＭＷが約３ｋＤａである、請求項１～３０のいずれか１項に記載のポリマー。
  32. ポリマーを作製する方法であって、
    （ａ）式（Ａ）の化合物
    Figure 2022514113000158
     を、式Ｒ１－ＮＨ２またはＲ１－Ｎ（Ｈ）－Ｚ’－Ｎ（Ｈ）－Ｒ１を有する第１のアミンと反応させることと、
    （ｂ）（ａ）の生成物を、式Ｒ２－ＮＨ２またはＲ２－Ｎ（Ｈ）－Ｚ’’－Ｎ（Ｈ）－Ｒ２を有する第２のアミンと反応させることと、
    （ｃ）（ｂ）の生成物を式（Ｂ）の化合物と反応させることとを含み、
    Figure 2022514113000159
     式中、
    各Ｊが、独立的に－Ｏ－または－ＮＨ－であり、
    Ｚ、Ｚ’、及びＺ’’が結合部分であり、
    Ａが、１～３０個の炭素原子の直鎖状もしくは分枝状炭素鎖、２～３０個の原子の直鎖状もしくは分枝状ヘテロ原子含有炭素鎖、３～３０個の炭素原子を含む炭素環、または３～３０個の原子を含む複素環であり、
    Ａが、任意選択で、１つ以上のハロゲン、ヒドロキシル、アミノ基、スルホニル基、スルホンアミド基、チオール、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ、Ｃ１－Ｃ６エーテル、Ｃ１－Ｃ６チオエーテル、Ｃ１－Ｃ６スルホン、Ｃ１－Ｃ６スルホキシド、Ｃ１－Ｃ６１級アミド、Ｃ１－Ｃ６２級アミド、ハロＣ１－Ｃ６アルキル、カルボキシル基、シアノ基、ニトロ基、ニトロソ基、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ３－Ｃ６シクロアルキル、Ｃ３－Ｃ６ヘテロシクリル、Ｃ２－Ｃ５ヘテロアリール、またはＣ６－Ｃ１０アリールで置換され（式中、各Ｒ’は、独立的に、水素及びＣ１－Ｃ６アルキルからなる群より選択される）、
    Ｇが、－Ｃ－、－Ｓ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｐ（ＯＲ１）－、または－Ｐ（ＯＨ）－であり、
    各Ｑが、ＨまたはＣ１－Ｃ１０直鎖状もしくは分枝状アルキル基であり、
    各Ｅ１が、独立的に、共有結合、－Ｎ－、－Ｏ－、－Ｓ－、アルキレン、ヘテロアルキレン、アルケニル、ヘテロアルケニレン、アルキニル、ヘテロアルキニレンからなる群より選択され；
    Ｒ１及びＲ２が、各々独立的に、Ｃ１－Ｃ４０アルキル、Ｃ１－Ｃ４０ヘテロアルキル、Ｃ２－Ｃ４０アルケニル、Ｃ２－Ｃ４０ヘテロアルケニレン、Ｃ４－Ｃ８シクロアルケニル、Ｃ２－Ｃ４０アルキニル、Ｃ２－Ｃ４０ヘテロアルキニレン、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリールであり、このとき、前記ヘテロシクリル及び前記ヘテロアリールが、Ｎ、Ｓ、Ｐ、及びＯからなる群より選択される１～５個のヘテロ原子を含み、前記Ｃ１－Ｃ４０アルキル、Ｃ２－Ｃ４０アルケニル、Ｃ４－Ｃ８シクロアルケニル、Ｃ２－Ｃ４０アルキニル、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、及びヘテロアリールが、任意選択で、Ｄ、ハロゲン、Ｃ１－Ｃ６アルキル、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、または－Ｎ（Ｃ１－Ｃ６アルキル）２で置換され、Ｒ１は、非置換であるか、またはハロゲン、ヒドロキシル、アミノ基、スルホニル基、スルホンアミド基、チオール、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ、Ｃ１－Ｃ６エーテル、Ｃ１－Ｃ６チオエーテル、Ｃ１－Ｃ６スルホン、Ｃ１－Ｃ６スルホキシド、Ｃ１－Ｃ６１級アミド、Ｃ１－Ｃ６２級アミド、ハロＣ１－Ｃ６アルキル、カルボキシル基、シアノ基、ニトロ基、ニトロソ基、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ３－Ｃ６シクロアルキル、Ｃ３－Ｃ６ヘテロシクリル、Ｃ２－Ｃ５ヘテロアリール、及びＣ６－Ｃ１０）アリールのうちの１つ以上で置換され（式中、各Ｒ’は、独立的に、水素及びＣ１－Ｃ６アルキルからなる群より選択される）、
    各ｎが少なくとも１である、前記方法。
  33. Ｚが、１～３０個の炭素原子の直鎖状もしくは分枝状炭素鎖、１～３０個の原子の直鎖状もしくは分枝状ヘテロ原子含有炭素鎖、３～３０個の炭素原子を含む炭素環、または３～３０個の原子を含む複素環であり、
    Ｚが、非置換であるか、またはハロゲン、ヒドロキシル、アミノ基、スルホニル基、スルホンアミド基、チオール、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ、Ｃ１－Ｃ６エーテル、Ｃ１－Ｃ６チオエーテル、Ｃ１－Ｃ６スルホン、Ｃ１－Ｃ６スルホキシド、Ｃ１－Ｃ６１級アミド、Ｃ１－Ｃ６２級アミド、ハロＣ１－Ｃ６アルキル、カルボキシル基、シアノ基、ニトロ基、ニトロソ基、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ３－Ｃ６シクロアルキル、Ｃ３－Ｃ６ヘテロシクリル、Ｃ２－Ｃ５ヘテロアリール、及びＣ６－Ｃ１０アリールのうちの少なくとも１つで置換されている（式中、各Ｒ’は、独立的に、水素及びＣ１－Ｃ６アルキルからなる群より選択される）、請求項３２に記載のポリマー。
  34. Ｇが－Ｃ－である、請求項３２または３３に記載の方法。
  35. 前記式（Ｂ）の化合物が
    Figure 2022514113000160
     であり、式中、
    Ｒが、非置換であるか、またはハロゲン、ヒドロキシル、アミノ基、スルホニル基、スルホンアミド基、チオール、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ、Ｃ１－Ｃ６エーテル、Ｃ１－Ｃ６チオエーテル、Ｃ１－Ｃ６スルホン、Ｃ１－Ｃ６スルホキシド、Ｃ１－Ｃ６１級アミド、Ｃ１－Ｃ６２級アミド、ハロＣ１－Ｃ６アルキル、カルボキシル基、シアノ基、ニトロ基、ニトロソ基、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ３－Ｃ６シクロアルキル、Ｃ３－Ｃ６ヘテロシクリル、Ｃ２－Ｃ５ヘテロアリール、及びＣ６－Ｃ１０アリールのうちの少なくとも１つで置換され（式中、各Ｒ’は、独立的に、水素及びＣ１－Ｃ６アルキルからなる群より選択される）、
    Ｒ’’が、非置換または置換された、１～１０個の炭素原子の直鎖状もしくは分枝状炭素鎖、１～１０個の原子の直鎖状もしくは分枝状ヘテロ原子含有炭素鎖、３～１０個の炭素原子を含む炭素環、または３～１０個の原子を含む複素環である、請求項３２～３４のいずれか１項に記載の方法。
  36. 前記式（Ｂ）の化合物が
    Figure 2022514113000161
     である、請求項３５に記載の方法。
  37. Ｚが、１～３０個の炭素原子の直鎖状もしくは分枝状炭素鎖、または１～３０個の原子の直鎖状もしくは分枝状ヘテロ原子含有炭素鎖である、請求項３２～３６のいずれか１項に記載の方法。
  38. Ｚが、１～１０個の炭素原子の直鎖状または分枝状炭素鎖である、請求項３７に記載の方法。
  39. Ｚが
    Figure 2022514113000162
     であり、
    式中、ｘが１～１０００である、請求項３２～３７のいずれか１項に記載の方法。
  40. Ｚが
    Figure 2022514113000163
     である、請求項３２～３８のいずれか１項に記載の方法。
  41. Ｒ１及びＲ２が、独立的に、
    Figure 2022514113000164
     からなる群より選択される、請求項３２～４０のいずれか１項に記載の方法。
  42. Ｒ１が
    Figure 2022514113000165
     であり、Ｒ２が
    Figure 2022514113000166
     である、請求項４１に記載の方法。
  43. モル過剰の前記式（Ａ）の化合物が前記第１のアミンと反応させられる、請求項３２～４２のいずれか１項に記載の方法。
  44. 前記式（Ａ）の化合物：前記第１のアミンの化学量論比が約１．２：１である、請求項４３に記載の方法。
  45. ステップ（ａ）が有機溶媒中で実施される、請求項３２～４４のいずれか１項に記載の方法。
  46. 前記有機溶媒がＤＭＳＯである、請求項４５に記載の方法。
  47. ステップ（ａ）が約２０℃～約２００℃の温度で実施される、請求項３２～４６のいずれか１項に記載の方法。
  48. ステップ（ａ）が約９０℃で実施される、請求項４７に記載の方法。
  49. 前記ステップ（ａ）の生成物が（ｂ）の前に精製されない、請求項３２～４８のいずれか１項に記載の方法。
  50. モル過剰の前記第２のアミンが前記ステップ（ａ）の生成物と反応させられる、請求項３２～４９のいずれか１項に記載の方法。
  51. ステップ（ｂ）が約２０℃～約２５℃の温度で実施される、請求項３２～５０のいずれか１項に記載の方法。
  52. 前記ステップ（ｂ）の生成物がステップ（ｃ）の前に精製される、請求項３２～５１のいずれか１項に記載の方法。
  53. ステップ（ｃ）がステップ（ｂ）の温度よりも高い温度で実施される、請求項３２～５２のいずれか１項に記載の方法。
  54. ステップ（ｃ）が約９０℃で実施される、請求項５３に記載の方法。
  55. 前記ポリマーのマーク－フウィンクの式から定義されるアルファパラメーターが約０．５未満である、請求項３２～５４のいずれか１項に記載の方法。
  56. 前記ポリマーのマーク－フウィンクの式から定義されるアルファパラメーターが約０．３～約０．５である、請求項３２～５５のいずれか１項に記載の方法。
  57. 前記ポリマーのＰＤＩが約２．０～約３．０である、請求項３２～５６のいずれか１項に記載の方法。
  58. 前記ポリマーのＰＤＩが約２．５である、請求項３２～５７のいずれか１項に記載の方法。
  59. 前記ポリマーのＭＷが少なくとも３ｋＤａである、請求項３２～５８のいずれか１項に記載の方法。
  60. 前記ポリマーのＭＷが約５ｋＤａから５０ｋＤａの間である、請求項３２～５９のいずれか１項に記載の方法。
  61. 前記ポリマーのＭＷが約１０ｋＤａである、請求項３２～６０のいずれか１項に記載の方法。
  62. ステップ（ｂ）の後の前記生成物のＭＷが約３ｋＤａである、請求項３２～６１のいずれか１項に記載の方法。
  63. 核酸成分と、請求項１～３１のポリマーまたは式（Ｉ）のポリマーのいずれかとを含む、ポリプレックスであって、
    Figure 2022514113000167
     式中、
    各Ａが、独立的に、１～３０個の炭素原子の直鎖状もしくは分枝状炭素鎖、１～３０個の原子の直鎖状もしくは分枝状ヘテロ原子含有炭素鎖、３～３０個の炭素原子を含む炭素環、または３～３０個の原子を含む複素環であり、
    Ａが、任意選択で、１つ以上のハロゲン、ヒドロキシル、アミノ基、スルホニル基、スルホンアミド基、チオール、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ、Ｃ１－Ｃ６エーテル、Ｃ１－Ｃ６チオエーテル、Ｃ１－Ｃ６スルホン、Ｃ１－Ｃ６スルホキシド、Ｃ１－Ｃ６１級アミド、Ｃ１－Ｃ６２級アミド、ハロＣ１－Ｃ６アルキル、カルボキシル基、シアノ基、ニトロ基、ニトロソ基、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ３－Ｃ６シクロアルキル、Ｃ３－Ｃ６ヘテロシクリル、Ｃ２－Ｃ５ヘテロアリール、またはＣ６－Ｃ１０アリールで置換され（式中、各Ｒ’は、独立的に、水素及びＣ１－Ｃ６アルキルからなる群より選択される）、
    各Ｂが、独立的に、第１の結合部分であり、
    各Ｘが、独立的に、
    Figure 2022514113000168
     であり、
    各Ｙが、独立的に、
    Figure 2022514113000169
     であり、
    各Ｌが、独立的に、第２の結合部分であり、
    各Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３が、各出現において独立的に、Ｈ、Ｃ１－Ｃ４０アルキル、Ｃ１－Ｃ４０ヘテロアルキル、Ｃ２－Ｃ４０アルケニル、Ｃ２－Ｃ４０ヘテロアルケニレン、Ｃ４－Ｃ８シクロアルケニル、Ｃ２－Ｃ４０アルキニル、Ｃ２－Ｃ４０ヘテロアルキニレン、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、もしくはヘテロアリールであり、前記ヘテロシクリル及び前記ヘテロアリールが、Ｎ、Ｓ、Ｐ、及びＯからなる群より選択される１～５個のヘテロ原子を含み、前記Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ８アルケニル、Ｃ４－Ｃ８シクロアルケニル、Ｃ２－Ｃ６アルキニル、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、及びヘテロアリールが、任意選択で、Ｄ、ハロゲン、Ｃ１－Ｃ６アルキル、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、もしくは－Ｎ（Ｃ１－Ｃ６アルキル）２で置換され、または
    Ｒ２及びＲ３が、それらが結合する原子と一緒になって、Ｎ、Ｓ、Ｐ、及びＯからなる群より選択される１～３個のヘテロ原子を含むヘテロシクリルまたはヘテロアリールを形成してもよく、
    ａが１～１０００であり、
    ｂが１～４であり、
    ｃが１～３であり、
    ｚが１～１００であり、
    ただし、Ｒ２及びＲ３の少なくとも一方がＨではないことを前提とする、前記ポリプレックス。
  64. 前記式（Ｉ）のポリマーが、式（ＩＩ）の構造：
    Figure 2022514113000170
     であって、式中、
    各Ｅ１が、共有結合、－Ｎ－、－Ｏ－、－Ｓ－、アルキレン、ヘテロアルキレン、アルケニル、ヘテロアルケニレン、アルキニル、ヘテロアルキニレンからなる群より選択され；
    各Ｅ２が、共有結合、－Ｎ－、－Ｏ－、－Ｓ－、アルキレン、ヘテロアルキレン、アルケニル、ヘテロアルケニレン、アルキニル、ヘテロアルキニレンからなる群より選択され；
    Ｇが、－Ｃ－、－Ｓ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｐ（ＯＲ１）－、または－Ｐ（ＯＨ）－であり、
    ｎが少なくとも１である、前記式（ＩＩ）の構造を有する、請求項６３に記載のポリプレックス。
  65. 各Ｂが
    Figure 2022514113000171
     である、請求項６３または６４に記載のポリプレックス。
  66. Ｂが
    Figure 2022514113000172
     である、請求項６３～６５のいずれか１項に記載のポリプレックス。
  67. 各Ｌが
    Figure 2022514113000173
     であり、
    式中、ｘが１～１０００である、請求項６３～６６のいずれか１項に記載のポリプレックス。
  68. ａが少なくとも２であり、
    ｂが３であり、
    各Ｘが
    Figure 2022514113000174
     である、請求項６３～６７のいずれか１項に記載のポリプレックス。
  69. 各Ａが
    Figure 2022514113000175
     である、請求項６８に記載のポリプレックス。
  70. 各Ｌが
    Figure 2022514113000176
     である、請求項６８または６９に記載のポリプレックス。
  71. Ｙが
    Figure 2022514113000177
     であり、各Ｂが
    Figure 2022514113000178
     または
    Figure 2022514113000179
     である、請求項６８～７０のいずれか１項に記載のポリプレックス。
  72. 各Ｒ２及び／またはＲ３が
    Figure 2022514113000180
     である、請求項６８～７１のいずれか１項に記載のポリプレックス。
  73. 各Ｒ１が
    Figure 2022514113000181
     である、請求項６８～７２のいずれか１項に記載のポリプレックス。
  74. 前記式（Ｉ）のポリマーが、式（ＩＩＩ）～（ＶＩＩｅ）の構造：
    Figure 2022514113000182
    Figure 2022514113000183
    Figure 2022514113000184
     であって、
    各Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７が、各出現において独立的に、Ｈ、Ｃ１－Ｃ４０アルキル、Ｃ１－Ｃ４０ヘテロアルキル、Ｃ２－Ｃ４０アルケニル、Ｃ２－Ｃ４０ヘテロアルケニレン、Ｃ４－Ｃ８シクロアルケニル、Ｃ２－Ｃ４０アルキニル、Ｃ２－Ｃ４０ヘテロアルキニレン、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、もしくはヘテロアリールであり、前記ヘテロシクリル及び前記ヘテロアリールが、Ｎ、Ｓ、Ｐ、及びＯからなる群より選択される１～５個のヘテロ原子を含み、前記Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ８アルケニル、Ｃ４－Ｃ８シクロアルケニル、Ｃ２－Ｃ６アルキニル、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、及びヘテロアリールが、任意選択で、Ｄ、ハロゲン、Ｃ１－Ｃ６アルキル、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、もしくは－Ｎ（Ｃ１－Ｃ６アルキル）２で置換され、残りの変数が請求項１、６３、または６４で定義されている通りである、前記構造を有する、請求項６８に記載のポリプレックス。
  75. ｚが１～３である、請求項６３～７４のいずれかに記載のポリプレックス。
  76. ｚが１である、請求項７５に記載のポリプレックス。
  77. Ｅ２が
    Figure 2022514113000185
     であり、ｎが１である、請求項６３～７４のいずれかに記載のポリプレックス。
  78. Ｅ２が
    Figure 2022514113000186
     である、請求項７７に記載のポリプレックス。
  79. 核酸成分と、以下のポリマー：
    Figure 2022514113000187
     とを含むポリプレックスであって、
    各Ｊが、独立的に－Ｏ－または－ＮＨ－であり、
    Ｚ及びＺ’’が結合部分であり、
    Ａが、１～３０個の炭素原子の直鎖状もしくは分枝状炭素鎖、２～３０個の原子の直鎖状もしくは分枝状ヘテロ原子含有炭素鎖、３～３０個の炭素原子を含む炭素環、または３～３０個の原子を含む複素環であり、
    Ａが、任意選択で、１つ以上のハロゲン、ヒドロキシル、アミノ基、スルホニル基、スルホンアミド基、チオール、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ、Ｃ１－Ｃ６エーテル、Ｃ１－Ｃ６チオエーテル、Ｃ１－Ｃ６スルホン、Ｃ１－Ｃ６スルホキシド、Ｃ１－Ｃ６１級アミド、Ｃ１－Ｃ６２級アミド、ハロＣ１－Ｃ６アルキル、カルボキシル基、シアノ基、ニトロ基、ニトロソ基、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ３－Ｃ６シクロアルキル、Ｃ３－Ｃ６ヘテロシクリル、Ｃ２－Ｃ５ヘテロアリール、またはＣ６－Ｃ１０アリールで置換され（式中、各Ｒ’は、独立的に、水素及びＣ１－Ｃ６アルキルからなる群より選択される）、
    Ｇが、－Ｃ－、－Ｓ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｐ（ＯＲ１）－、または－Ｐ（ＯＨ）－であり、
    各Ｑが、ＨまたはＣ１－Ｃ１０直鎖状もしくは分枝状アルキル基であり、
    各Ｅ１が、独立的に、共有結合、－Ｎ－、－Ｏ－、－Ｓ－、アルキレン、ヘテロアルキレン、アルケニル、ヘテロアルケニレン、アルキニル、ヘテロアルキニレンからなる群より選択され；
    Ｒ１及びＲ２が、各々独立的に、Ｃ１－Ｃ４０アルキル、Ｃ１－Ｃ４０ヘテロアルキル、Ｃ２－Ｃ４０アルケニル、Ｃ２－Ｃ４０ヘテロアルケニレン、Ｃ４－Ｃ８シクロアルケニル、Ｃ２－Ｃ４０アルキニル、Ｃ２－Ｃ４０ヘテロアルキニレン、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリールであり、このとき、前記ヘテロシクリル及び前記ヘテロアリールが、Ｎ、Ｓ、Ｐ、及びＯからなる群より選択される１～５個のヘテロ原子を含み、前記Ｃ１－Ｃ４０アルキル、Ｃ２－Ｃ４０アルケニル、Ｃ４－Ｃ８シクロアルケニル、Ｃ２－Ｃ４０アルキニル、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、及びヘテロアリールが、任意選択で、Ｄ、ハロゲン、Ｃ１－Ｃ６アルキル、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、または－Ｎ（Ｃ１－Ｃ６アルキル）２で置換され、Ｒ１は、非置換であるか、またはハロゲン、ヒドロキシル、アミノ基、スルホニル基、スルホンアミド基、チオール、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ、Ｃ１－Ｃ６エーテル、Ｃ１－Ｃ６チオエーテル、Ｃ１－Ｃ６スルホン、Ｃ１－Ｃ６スルホキシド、Ｃ１－Ｃ６１級アミド、Ｃ１－Ｃ６２級アミド、ハロＣ１－Ｃ６アルキル、カルボキシル基、シアノ基、ニトロ基、ニトロソ基、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ３－Ｃ６シクロアルキル、Ｃ３－Ｃ６ヘテロシクリル、Ｃ２－Ｃ５ヘテロアリール、及びＣ６－Ｃ１０）アリールのうちの１つ以上で置換され（式中、各Ｒ’は、独立的に、水素及びＣ１－Ｃ６アルキルからなる群より選択される）、ｎが少なくとも１である、前記ポリプレックス。
  80. Ｚが、１～３０個の炭素原子の直鎖状もしくは分枝状炭素鎖、１～３０個の原子の直鎖状もしくは分枝状ヘテロ原子含有炭素鎖、３～３０個の炭素原子を含む炭素環、または３～３０個の原子を含む複素環であり、
    Ｚが、非置換であるか、またはハロゲン、ヒドロキシル、アミノ基、スルホニル基、スルホンアミド基、チオール、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ、Ｃ１－Ｃ６エーテル、Ｃ１－Ｃ６チオエーテル、Ｃ１－Ｃ６スルホン、Ｃ１－Ｃ６スルホキシド、Ｃ１－Ｃ６１級アミド、Ｃ１－Ｃ６２級アミド、ハロＣ１－Ｃ６アルキル、カルボキシル基、シアノ基、ニトロ基、ニトロソ基、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ３－Ｃ６シクロアルキル、Ｃ３－Ｃ６ヘテロシクリル、Ｃ２－Ｃ５ヘテロアリール、及びＣ６－Ｃ１０アリールのうちの少なくとも１つで置換されている（式中、各Ｒ’は、独立的に、水素及びＣ１－Ｃ６アルキルからなる群より選択される）、請求項７９に記載のポリプレックス。
  81. Ｇが－Ｃ－である、請求項７９～８０のいずれかに記載のポリプレックス。
  82. ＪがＯである、請求項７９～８１のいずれかに記載のポリプレックス。
  83. Ｚが、１～３０個の炭素原子の直鎖状もしくは分枝状炭素鎖、または１～３０個の原子の直鎖状もしくは分枝状ヘテロ原子含有炭素鎖である、請求項７９～８２のいずれかに記載のポリプレックス。
  84. Ｚが、１～１０個の炭素原子の直鎖状または分枝状炭素鎖である、請求項７９～８３のいずれかに記載のポリプレックス。
  85. Ｚが
    Figure 2022514113000188
     であり、
    式中、ｘが１～１０００である、請求項７９～８３のいずれかに記載のポリプレックス。
  86. Ｚが
    Figure 2022514113000189
     である、請求項７９～８４のいずれかに記載のポリプレックス。
  87. Ｒ１及びＲ２が、独立的に、
    Figure 2022514113000190
     からなる群より選択される、請求項７９～８６のいずれかに記載のポリプレックス。
  88. Ｒ１が
    Figure 2022514113000191
     であり、Ｒ２が
    Figure 2022514113000192
     である、請求項８７に記載のポリプレックス。
  89. Ｒ１が
    Figure 2022514113000193
     であり、Ｒ２が
    Figure 2022514113000194
     である、請求項８７に記載のポリプレックス。
  90. 前記ポリマーが、
    Figure 2022514113000195
     を含む、請求項７９～８９のいずれかに記載のポリプレックス。
  91. 前記ポリマーが、
    Figure 2022514113000196
     を含む、請求項７９～８９のいずれかに記載のポリプレックス。
  92. 前記ポリマーが、
    Figure 2022514113000197
     を含む、請求項７９～８４または８６～９１のいずれかに記載のポリプレックス。
  93. 前記ポリマーが、
    Figure 2022514113000198
     を含み、式中、
    ＪがＯであり、Ｚが
    Figure 2022514113000199
     であり、式中、ｘが１～１０００である、請求項７９～８３、８５，または８７～９１のいずれかに記載のポリプレックス。
  94. 前記ポリマーが、
    Figure 2022514113000200
     を含む、請求項７９～９３のいずれかに記載のポリプレックス。
  95. 前記ポリマーが、
    Figure 2022514113000201
     を含み、式中、
    Ｒ１が
    Figure 2022514113000202
     であり、
    Ｒ２が
    Figure 2022514113000203
     から選択される、請求項７９～８９のいずれかに記載のポリプレックス。
  96. 前記ポリマーが、
    Figure 2022514113000204
     を含み、式中、
    ＪがＯであり、Ｚが
    Figure 2022514113000205
     であり、式中、ｘが１～１０００であり、
    Ｒ１が
    Figure 2022514113000206
     であり、
    Ｒ２が
    Figure 2022514113000207
     である、請求項７９～８９のいずれかに記載のポリプレックス。
  97. 前記ポリマーのＭＷが約３ｋＤａ～約２００ｋＤａである、請求項７９～９６のいずれかに記載のポリプレックス。
  98. 前記ポリマーのＭＷが約５ｋＤａ～約５０ｋＤａである、請求項７９～９６のいずれかに記載のポリプレックス。
  99. 前記ポリマーのＭＷが約１０ｋＤａ～５０ｋＤａである、請求項７９～９６のいずれかに記載のポリプレックス。
  100. 前記ポリマーのＭＷが約５ｋＤａ～約１５ｋＤａである、請求項７９～９６のいずれかに記載のポリプレックス。
  101. 前記ポリマーのＭＷが約１０ｋＤａである、請求項７９～９６のいずれかに記載のポリプレックス。
  102. 前記ポリマーのＭＷが約２０ｋＤａである、請求項７９～９６のいずれかに記載のポリプレックス。
  103. 前記ポリマーのＭＷが約３０ｋＤａである、請求項７９～９６のいずれかに記載のポリプレックス。
  104. 前記ポリマーのＭＷが約４０ｋＤａである、請求項７９～９６のいずれかに記載のポリプレックス。
  105. 前記ポリマーのマーク－フウィンクから定義されるアルファパラメーターが約０．５未満である、請求項７９～１０３のいずれかに記載のポリプレックス。
  106. 前記ポリマーのマーク－フウィンクの式から定義されるアルファパラメーターが約０．３～約０．５を範囲とする、請求項７９～１０４のいずれかに記載のポリプレックス。
  107. 前記ポリマーのＰＤＩが約１．０～約８．０である、請求項７９～１０５のいずれかに記載のポリプレックス。
  108. 前記ポリマーのＰＤＩが約２．５である、請求項７９～１０６のいずれかに記載のポリプレックス。
  109. ポリマー及び核酸成分が約２０：１～約８０：１（ｗ／ｗ）の比で存在する、請求項１０７に記載のポリプレックス。
  110. ポリマー及び核酸成分が約３０：１（ｗ／ｗ）の比で存在する、請求項１０８に記載のポリプレックス。
  111. 約２μｍ未満の粒子サイズを有する、請求項６３～１０９のいずれかに記載のポリプレックス。
  112. 約６０ｎｍ～約２５０ｎｍの粒子サイズを有する、請求項１１０に記載のポリプレックス。
  113. 約１７５ｎｍ～約２５０ｎｍの粒子サイズを有する、請求項１１０に記載のポリプレックス。
  114. 約０ｍＶ～約１００ｍＶのゼータ電位を有する、請求項６３～１１２のいずれか１項に記載のポリプレックス。
  115. 前記ゼータ電位が約３０ｍＶ～約３４ｍＶである、請求項１１３に記載のポリプレックス。
  116. 前記ポリプレックスが球形である、請求項６３～１１４のいずれか１項に記載のポリプレックス。
  117. 前記ポリマーのＭＷが約１０ｋＤａである、請求項６３～８７のいずれか１項に記載のポリプレックス。
  118. 前記核酸成分が、プラスミド、ナノプラスミド、核酸、ミニサークル、または遺伝子編集システムである、請求項６３～１１６のいずれか１項に記載のポリプレックス。
  119. 前記ナノプラスミドが、真核導入遺伝子及び０．５ｋｂ未満のサイズの細菌骨格を含む、請求項１１７に記載のポリプレックス。
  120. 前記プラスミドまたはナノプラスミドが、抗生物質耐性マーカーなしのプラスミドまたは抗生物質耐性マーカーなしのナノプラスミドである、請求項１１７に記載のポリプレックス。
  121. 前記プラスミドまたはナノプラスミドが、スクロース選択マーカーまたはナンセンスサプレッサーマーカーを含む、請求項１１７に記載のポリプレックス。
  122. 前記遺伝子編集システムが、（ｉ）クラスター化等間隔短回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）システム、（ｉｉ）転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）システム、または（ｉｉｉ）ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）システムである、請求項１１７に記載のポリプレックス。
  123. 前記核酸がＲＮＡｉ誘導分子である、請求項１１７に記載のポリプレックス。
  124. 前記ＲＮＡｉ誘導分子が、ｓｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びマイクロＲＮＡからなる群より選択される、請求項１２２に記載のポリプレックス。
  125. 前記核酸成分が組織特異的プロモーターを含む、請求項６３～１１６のいずれか１項に記載のポリプレックス。
  126. 前記核酸成分が、遺伝子疾患または障害に関連する遺伝子を含む、請求項６３～１１６のいずれか１項に記載のポリプレックス。
  127. 前記遺伝子疾患または障害が、タンパク質発現の低下、不在、または機能不全をもたらす１つ以上の遺伝子の変異によって引き起こされる、請求項１２５に記載のポリプレックス。
  128. 前記遺伝子が、ＣＯＬ７Ａ１、ＬＡＭＢ３、ＡＤＡ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＣＦＴＲ、ＨＴＴ、ＮＦ１、ＰＨＡ、ＨＢＳ、ＦＥＲＭＴ１、ＫＲＴ１４、ＤＳＰ、ＳＰＩＮＫ５、及びＦＬＧからなる群より選択される、請求項１２６に記載のポリプレックス。
  129. 前記遺伝子がＣＯＬ７Ａ１であり、前記遺伝子疾患または障害が表皮水疱症の形態である、請求項１２７に記載のポリプレックス。
  130. 前記遺伝子の配列が、前記ポリプレックスを細胞に送達した際にタンパク質発現が最大限になるように最適化されている、請求項１２５に記載のポリプレックス。
  131. 請求項６３～１２９のいずれかに記載のポリプレックスの有効量と医薬的に許容される担体との組合せを含む、医薬組成物。
  132. 前記医薬的に許容される担体が、経口、非経口、吸入、局所、皮下、筋肉内、静脈内、眼内、または皮内の投与に適している、請求項１３０に記載の医薬組成物。
  133. 前記医薬組成物が、非水性ローション、油中水型ローション、及び水中油型ローションからなる群より選択されるローションとして製剤化される、請求項１３１に記載の医薬組成物。
  134. 前記医薬組成物が将来使用するために凍結乾燥される、請求項１３０に記載の医薬組成物。
  135. 前記医薬組成物が水性溶液中で凍結される、請求項１３０に記載の医薬組成物。
  136. 細胞形質移入の方法であって、標的細胞にポリプレックスを形質移入するのに適した条件下で、１つ以上の前記標的細胞を、請求項１３０～１３４のいずれか１項に記載の医薬組成物に接触させることを含む、前記方法。
  137. 前記１つ以上の標的細胞が真核細胞である、請求項１３５に記載の方法。
  138. 前記１つ以上の標的細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、血球、肺胞細胞、肺細胞、脳ニューロン、皮膚ニューロン、上皮細胞、ケラチノサイト、ｉＰＳ細胞、線維芽細胞、及び汗腺細胞のうちの１つ以上である、請求項１３６に記載の方法。
  139. 疾患の治療を必要とする患者における前記疾患を治療する方法であって、前記患者の細胞のうちの１つ以上に前記ポリプレックス核酸成分が形質移入されるように、請求項１３０～１３４のいずれか１項に記載の医薬組成物の治療有効量を投与することを含む、前記方法。
  140. 疾患の治療を必要とする患者における前記疾患を治療する方法であって、請求項１３０～１３４のいずれか１項に記載の治療的に有効な医薬組成物を投与することを含み、前記組成物の前記投与が、対象における標的遺伝子の不完全な翻訳を補正する、前記方法。
  141. 前記遺伝子が、ＣＯＬ７Ａ１、ＬＡＭＢ３、ＡＤＡ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＣＦＴＲ、ＨＴＴ、ＮＦ１、ＰＨＡ、ＨＢＳ、ＦＥＲＭＴ１、ＫＲＴ１４、ＤＳＰ、ＳＰＩＮＫ５、及びＦＬＧからなる群より選択される、請求項１３９に記載の方法。
  142. 前記疾患が、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損症、アルファ－１アンチトリプシン欠損症、嚢胞性線維症、ハンチントン病、１型神経線維腫症、フェニルケトン尿症、鎌状赤血球症、孤発性封入体筋炎、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、キンドラー症候群、接合部型表皮水疱症、栄養障害型表皮水疱症（常染色体劣性）、栄養障害型表皮水疱症（限局型バリアント）、痒疹型表皮水疱症、表皮水疱症（前脛骨型）、網状色素性皮膚症、単純型表皮水疱症（Ｄｏｗｌｉｎｇ－Ｍｅａｒａ型）、単純型表皮水疱症（Ｋｏｅｂｎｅｒ型）、単純型表皮水疱症（劣性１）、単純型表皮水疱症（Ｗｅｂｅｒ－Ｃｏｃｋａｙｎｅ型）、Ｎａｅｇｅｌｉ－Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｅｔｔｉ－Ｊａｄａｓｓｏｈｎ症候群、表皮水疱症（致死性棘融解型症）、ネザートン症候群、尋常性魚鱗癬、アトピー性皮膚炎、アッシャー症候群、Ｅｈｌｅｒｓ－Ｄａｎｌｏｓ症候群、ホモ接合性家族性高コレステロール血症（ＨｏＦＨ）、またはクローン病である、請求項１３９に記載の方法。
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