CN113260657A - 用于转染细胞的组合物和方法 - Google Patents

用于转染细胞的组合物和方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113260657A
CN113260657A CN201980067037.7A CN201980067037A CN113260657A CN 113260657 A CN113260657 A CN 113260657A CN 201980067037 A CN201980067037 A CN 201980067037A CN 113260657 A CN113260657 A CN 113260657A
Authority
CN
China
Prior art keywords
polymer
alkyl
radical
200kda
group
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201980067037.7A
Other languages
English (en)
Inventor
L·卡特勒
W·王
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Enright Gene Co ltd
Original Assignee
Enright Gene Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Enright Gene Co ltd filed Critical Enright Gene Co ltd
Publication of CN113260657A publication Critical patent/CN113260657A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G73/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a linkage containing nitrogen with or without oxygen or carbon in the main chain of the macromolecule, not provided for in groups C08G12/00 - C08G71/00
    • C08G73/02—Polyamines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G73/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a linkage containing nitrogen with or without oxygen or carbon in the main chain of the macromolecule, not provided for in groups C08G12/00 - C08G71/00
    • C08G73/02—Polyamines
    • C08G73/024—Polyamines containing oxygen in the form of ether bonds in the main chain
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A61K48/0025—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid
    • A61K48/0041—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid the non-active part being polymeric
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/39—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin, cold insoluble globulin [CIG]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/465—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. lipases, ribonucleases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/641—Branched, dendritic or hypercomb peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G83/00—Macromolecular compounds not provided for in groups C08G2/00 - C08G81/00
    • C08G83/002—Dendritic macromolecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Compositions Of Macromolecular Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Macromolecular Compounds Obtained By Forming Nitrogen-Containing Linkages In General (AREA)

Abstract

本公开涉及可在基因疗法应用中用作安全且无毒的核酸转染剂的支化聚合物和聚合复合物。

Description

用于转染细胞的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年10月12日提交的美国临时申请第62/744,994号和于2019年3月29日提交的美国临时申请第62/826,461号的优先权权益，所述美国临时申请的内容在此通过引用整体并入。
技术领域
本公开的各种实施方案涉及可在例如基因疗法应用中用作安全且无毒的核酸转染剂的支化聚合物。
背景技术
将功能性遗传材料递送至细胞(例如，皮肤成纤维细胞)中以操纵转基因表达在纳米医学中具有重要意义。尽管已开发出许多聚合物基因递送系统，但尚未实现高度安全且高效的基因转染(例如，成纤维细胞基因转染)。
经过近三十年的发展，基因疗法已成为用于改善健康状况和纠正遗传病症的快速增长的一整套纳米医学的主要部分[1]。尽管已进行了使用病毒基因递送载体的多项临床试验，但触发免疫原性应答和转基因插入诱变的风险、与大规模生产相关的局限性和遗传材料的低“载货容量”以及载体移动性的不可预测性仍未得到解决[2,3]。从这个角度来看，非病毒基因递送载体因其免疫原性极小、非致瘤性、在制造上具有成本效益、核酸有效载荷高和基因表达局部化的潜力而更有前途。从2010年开始，使用非病毒基因载体进行基因疗法的临床试验数量已显著增加；质粒DNA和小干扰RNA(siRNA)已被配制用于针对基因纠正、治疗性蛋白质表达和抗原接种的至少40种基于纳米粒子的基因疗法中，其中在27项临床试验中研究了12种主要脂质体系统且在13项临床试验中研究了7种基于聚合物的系统[3]。在基于聚合物的基因疗法临床试验中，现成的阳离子聚合物聚乙烯亚胺(PEI)显示出一些前景。然而，PEI是不可降解的，并且因其安全性问题而严重受阻[4]。因此，已付出巨大的努力来改善聚合物基因载体的基因转染效率和安全性，从而使基于聚合物的基因疗法更接近临床应用。
在聚合物基因递送载体中，聚(β-氨基酯)(PAE)是一类最有前途的候选物。首先由Langer和其同事通过借助一步迈克尔加成工艺(Michael addition process)使胺与二丙烯酸酯共聚来设计并合成PAE[5]。骨架上的叔胺和末端处的伯胺用作阳离子单元，以使DNA通过静电相互作用凝聚成纳米粒子，并促进聚合复合物(polyplex)经由“质子海绵效应”从内体/溶酶体中逃逸，并且骨架上的酯键可在含水条件下水解降解从而使聚合复合物解离并释放DNA以及降低基因转染后的细胞毒性[6,7]。在密集的结构/性质优化[8–10]后，已鉴别出若干在体外和体内都具有有利的安全性谱和高转染效率的用于DNA转染的PAE[6,11,12]。然而，直至2015年，几乎所有关于PAE的研究都集中于具有线性结构的聚合物。支化聚合物可具有更大的用于基因转染的潜力，因为它们的三维(3D)结构和多末端官能团将赋予聚合物基因载体额外的优点。我们已经由简单的一锅“A2+B3+C2”迈克尔加成策略成功开发了高度支化的聚(β-氨基酯)(HPAE)[13–16]。在宽范围的的细胞类型中，HPAE与它们对应的线性对应物相比，展现出高得多的基因转染能力，这证实了它们在基因递送方面具有更大潜力。使用隐性营养不良性大疱性表皮松解症(RDEB)皮肤病模型在体内进一步证实了HPAE的高基因转染能力。RDEB是由编码VII型胶原(C7)的COL7A1基因突变引起的罕见、破坏性、遗传性机械性大疱性病症，所述VII型胶原(C7)是用于确保表皮-真皮粘附的锚定性原纤维(AF)的关键组分[17]。C7缺乏导致皮肤脆性、广泛的大泡和糜烂，其特征是愈合时出现大量疤痕形成和粟粒疹形成[18]。在RDEB敲除小鼠模型和移植小鼠模型两者中，HPAE均可介导高水平且长达10周的C7表达恢复[13,15,19]，这突显了它们用于临床皮肤基因递送的巨大潜力。HPAE进一步描述于美国专利公布第2017/0216455号中，所述美国专利公布出于所有目的据此通过引用整体并入。
成纤维细胞在维持皮肤组织的完整性和皮肤生物功能、调控细胞微环境方面发挥关键作用，并且与多种皮肤疾病(诸如肥大性瘢痕形成、老化/光老化、糖尿病性伤口愈合、癌症和厚皮性骨膜病)相关。操纵成纤维细胞内基因表达的能力是功能基因组学、途径分析和生物医学应用的基础。例如，原代人真皮成纤维细胞(HPDF)是表型和核型正常的人皮肤细胞的一个可获得来源，与永生化的细胞系相比，在生物学上与体内应用更相关[20]。先前，HPDF被直接注射到皮肤中用于RDEB中的C7修复。然而，HPDF的直接真皮内注射在RDEB患者中显示出AF的异常形态[21]和瞬时蛋白质置换[22]。相比之下，可以设想，在通过转染进行遗传工程改造后，可对成纤维细胞进行多样化地适应并且使其更适合于临床基因疗法。HPDF的C7增强将对改善重构AF的强度和稳定性、优化给药方案和减少在RDEB中的施用频率具有显著作用。然而，成纤维细胞的非病毒基因转染一直具有挑战性。最常见的方法包括昂贵的电穿孔、磁转染以及相对低效且有毒的化学制剂[20,23,24]。例如，通过不同的电穿孔系统仅检测到人真皮成纤维细胞[25]和人原代成纤维细胞[26]中增强的绿色荧光蛋白质(EGFP)递送效率的27％和44％。主要的阳离子脂质试剂TransFectin、Lipofectamine LTX以及电穿孔在小鼠胚胎成纤维细胞中的最大转染效率分别为15.7％、11.8％和48.1％[24]。
因此，开发一种可靠的非病毒基因递送系统来高效且安全地转染成纤维细胞势在必行且意义重大。
发明内容
在一些实施方案中，本公开提供了适合于形成可用于基因转染疗法的聚合复合物的支化聚合物，其通过下面的工艺制备：
(a)使式(A)化合物
Figure BDA0003014376920000041
与具有式R1-NH2或R1-N(H)-Z’-N(H)-R1的第一胺反应；
(b)使步骤(a)的产物与具有式R2-NH2或R2-N(H)-Z”-N(H)-R2的第二胺反应；以及
(c)使步骤(b)的产物与式(B)化合物反应：
Figure BDA0003014376920000042
其中
每个J独立地为–O–或–NH–；
Z、Z’和Z”为连接部分；
A为1至30个碳原子的线性或支化碳链、2至30个原子的线性或支化含杂原子碳链、含有3至30个碳原子的碳环，或含有3至30个原子的杂环；
其中A任选地被一个或多个以下基团取代：卤素、羟基、氨基、磺酰基、磺酰胺基、巯基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6醚、C1-C6硫醚、C1-C6砜、C1-C6亚砜、C1-C6伯酰胺、C1-C6仲酰胺、卤代C1-C6烷基、羧基、氰基、硝基、亚硝基、-OC(O)NR′R′、-N(R′)C(O)NR′R′、-N(R′)C(O)O-C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C3-C6杂环基、C2-C5杂芳基或C6-C10芳基；其中每个R′独立地选自由氢和C1-C6烷基组成的组；
G为–C–、–S–、–S(O)–、–P(OR1)–或–P(OH)–；
每个Q为C1-C10线性或支化烷基；
每个E1独立地选自由以下组成的组：共价键、–N–、–O–、–S–、亚烷基、杂亚烷基、烯基、杂亚烯基、炔基、杂亚炔基；
R1和R2各自独立地为C1-C40烷基、C1-C40杂烷基、C2-C40烯基、C2-C40杂亚烯基、C4-C8环烯基、C2-C40炔基、C2-C40杂亚炔基、C3-C8环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；其中所述杂环基和杂芳基含有1-5个选自由N、S、P和O组成的组的杂原子；其中所述C1-C40烷基、C2-C40烯基、C4-C8环烯基、C2-C40炔基、C3-C8环烷基、杂环基、芳基和杂芳基任选地被D、卤素、C1-C6烷基、-OH、-O-C1-C6烷基、-NH2、-NH(C1-C6烷基)或-N(C1-C6烷基)2取代；并且R1未被取代或被以下中的至少一者取代：卤素、羟基、氨基、磺酰基、磺酰胺基、巯基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6醚、C1-C6硫醚、C1-C6砜、C1-C6亚砜、C1-C6伯酰胺、C1-C6仲酰胺、卤代C1-C6烷基、羧基、氰基、硝基、亚硝基、-OC(O)NR′R′、-N(R′)C(O)NR′R′、-N(R′)C(O)O-C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C3-C6杂环基、C2-C5杂芳基和C6-C10)芳基；其中每个R′独立地选自由氢和C1-C6烷基组成的组；并且
每个n至少为1。
在一些实施方案中，本公开提供了一种制备聚合物的方法，所述方法包括：
(a)使式(A)化合物
Figure BDA0003014376920000061
与具有式R1-NH2或R1-N(H)-Z’-N(H)-R1的第一胺反应；
(b)使(a)的产物与具有式R2-NH2或R1-N(H)-Z”-N(H)-R2的第二胺反应；以及
(b)使(b)的产物与式(B)化合物反应：
Figure BDA0003014376920000062
其中
每个J独立地为–O–或–NH–；
Z、Z’和Z”为连接部分；
A为1至30个碳原子的线性或支化碳链、2至30个原子的线性或支化含杂原子碳链、含有3至30个碳原子的碳环，或含有3至30个原子的杂环；
其中A任选地被一个或多个以下基团取代：卤素、羟基、氨基、磺酰基、磺酰胺基、巯基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6醚、C1-C6硫醚、C1-C6砜、C1-C6亚砜、C1-C6伯酰胺、C1-C6仲酰胺、卤代C1-C6烷基、羧基、氰基、硝基、亚硝基、-OC(O)NR′R′、-N(R′)C(O)NR′R′、-N(R′)C(O)O-C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C3-C6杂环基、C2-C5杂芳基或C6-C10芳基；其中每个R′独立地选自由氢和C1-C6烷基组成的组；
G为–C–、–S–、–S(O)–、–P(OR1)–或–P(OH)–；
每个Q为H或C1-C10线性或支化烷基；
每个E1独立地选自由以下组成的组：共价键、–N–、–O–、–S–、亚烷基、杂亚烷基、烯基、杂亚烯基、炔基、杂亚炔基；
R1和R2各自独立地为C1-C40烷基、C1-C40杂烷基、C2-C40烯基、C2-C40杂亚烯基、C4-C8环烯基、C2-C40炔基、C2-C40杂亚炔基、C3-C8环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；其中所述杂环基和杂芳基含有1-5个选自由N、S、P和O组成的组的杂原子；其中所述C1-C40烷基、C2-C40烯基、C4-C8环烯基、C2-C40炔基、C3-C8环烷基、杂环基、芳基和杂芳基任选地被D、卤素、C1-C6烷基、-OH、-O-C1-C6烷基、-NH2、-NH(C1-C6烷基)或-N(C1-C6烷基)2取代；并且R1未被取代或被以下中的至少一者取代：卤素、羟基、氨基、磺酰基、磺酰胺基、巯基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6醚、C1-C6硫醚、C1-C6砜、C1-C6亚砜、C1-C6伯酰胺、C1-C6仲酰胺、卤代C1-C6烷基、羧基、氰基、硝基、亚硝基、-OC(O)NR′R′、-N(R′)C(O)NR′R′、-N(R′)C(O)O-C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C3-C6杂环基、C2-C5杂芳基和C6-C10)芳基；其中每个R′独立地选自由氢和C1-C6烷基组成的组；并且
每个n至少为1。
在一些实施方案中，本公开提供了一种聚合复合物，其包含核酸组分以及通过本文所述的工艺制备的聚合物或包含式(I)的聚合物
Figure BDA0003014376920000071
Figure BDA0003014376920000081
其中
每个A独立地为1至30个碳原子的线性或支化碳链、1至30个原子的线性或支化含杂原子碳链、含有3至30个碳原子的碳环，或含有3至30个原子的杂环；
其中A任选地被一个或多个以下基团取代：卤素、羟基、氨基、磺酰基、磺酰胺基、巯基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6醚、C1-C6硫醚、C1-C6砜、C1-C6亚砜、C1-C6伯酰胺、C1-C6仲酰胺、卤代C1-C6烷基、羧基、氰基、硝基、亚硝基、-OC(O)NR′R′、-N(R′)C(O)NR′R′、-N(R′)C(O)O-C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C3-C6杂环基、C2-C5杂芳基或C6-C10芳基；其中每个R′独立地选自由氢和C1-C6烷基组成的组；
每个B独立地为第一连接部分；
每个X独立地为
Figure BDA0003014376920000082
Figure BDA0003014376920000083
每个Y独立地为
Figure BDA0003014376920000084
每个L独立地为第二连接部分；
每个R1、R2和R3在每次出现时均独立地为H、C1-C40烷基、C1-C40杂烷基、C2-C40烯基、C2-C40杂亚烯基、C4-C8环烯基、C2-C40炔基、C2-C40杂亚炔基、C3-C8环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；其中所述杂环基和杂芳基含有1-5个选自由N、S、P和O组成的组的杂原子；其中所述C1-C6烷基、C2-C8烯基、C4-C8环烯基、C2-C6炔基、C3-C8环烷基、杂环基、芳基和杂芳基任选地被D、卤素、C1-C6烷基、-OH、-O-C1-C6烷基、-NH2、-NH(C1-C6烷基)或-N(C1-C6烷基)2取代；或
其中R2和R3与它们所连接的原子一起可形成含有1-3个选自由N、S、P和O组成的组的杂原子的杂环基或杂芳基；
a为1-1000；
b为1-4；
c为1-3；并且
z为1-100；
条件是R2和R3中至少一者不为H。
在一些实施方案中，本公开提供了一种药物组合物，其包含有效量的根据本公开某些实施方案的聚合复合物与药学上可接受的载剂的组合。
在一些实施方案中，本公开提供了一种细胞转染的方法，其包括使一个或多个靶细胞与根据本公开的某些实施方案的包含至少一种聚合复合物的药物组合物在适合于用一种或多种聚合复合物转染靶细胞的条件下接触。
在一些实施方案中，本公开提供了治疗有需要的患者的疾病的方法，其包括施用治疗有效量的包含至少一种根据本公开的某些实施方案的聚合复合物的药物组合物，使得所述患者的一个或多个细胞被聚合复合物核酸组分转染。
在一些实施方案中，本公开提供了治疗有此需要的患者的疾病的方法，其包括施用治疗有效量的包含至少一种根据本公开的某些实施方案的聚合复合物的药物组合物，其中所述组合物的所述施用纠正所述受试者中靶基因的有缺陷的翻译。
附图说明
图1示出转染效率和细胞存活力评估。图1a示出在被一系列w/w比的LBPAE/DNA、PEI/DNA和SuperFect/DNA聚合复合物转染后48h HPDF的Gluc活性和细胞存活力。图1b示出3T3的Gluc活性和细胞存活力。在Gluc活性方面与*PEI和#SuperFect组有显著差异(p<0.05，学生双尾t检验(Student’s two-tailed t test))。
图2示出对LBPAE/DNA聚合复合物和SuperFect/DNA聚合复合物在HPDF和3T3中的LC50的评估。图2a示出未处理细胞或用浓度为555μg mL-1的LBPAE/DNA聚合复合物或浓度为35μg mL-1的SuperFect/DNA聚合复合物转染的细胞的代表性活/死图像。比例尺为50μm。图2b示出通过Alamarblue测定测量的LBPAE/DNA聚合复合物浓度依赖性细胞存活力。图2c示出通过Alamarblue测定测量的SuperFect/DNA聚合复合物浓度依赖性细胞存活力。
图3示出对不同的基因递送系统介导的GFP表达和MFI的比较。图3a示出在用LBPAE/DNA、PEI/DNA和SuperFect/DNA聚合复合物处理后HPDF细胞的GFP图像。将未处理的(UT)细胞用作阴性对照。比例尺，200μm。图3b示出在用不同的聚合复合物转染后HPDF群体的直方图分布。图3c示出转染后GFP阳性HPDF的百分比和细胞的MFI。图3d示出3T3的GFP图像。比例尺，200μm。图3e示出在用不同的聚合复合物转染后3T3群体的直方图分布。图3f示出转染后GFP阳性3T3的百分比和细胞的MFI。在GFP阳性细胞百分比和#MFI方面与商业试剂组有显著差异(p<0.05，学生双尾t检验)。
图4示出LBPAE/DNA聚合复合物的物理化学特征。图4a示出用琼脂糖凝胶电泳进行的DNA凝聚能力确定。图4b示出用PicoGreen测定进行的DNA结合亲和力测量。图4c示出聚合复合物尺寸和ζ电位测量。图4d示出用TEM进行的聚合复合物形态观察。比例尺，200nm。
图5示出多种多样的聚合复合物的细胞摄取。图5a示出用不同聚合复合物转染后4小时细胞的荧光图像。用DAPI(蓝色)给细胞核染色，用Cy3(红色)标记DNA。比例尺，20μm。图5b示出用流式细胞术定量的HPDF中的聚合复合物摄取效率。图5c示出用流式细胞术定量的3T3中的聚合复合物摄取效率。图5d示出Cy3阳性HPDF的百分比和细胞的归一化MFI。图5e示出Cy3阳性3T3的百分比和细胞的归一化MFI。在*MFI定量方面与SuperFect有显著差异(p<0.05，学生双尾t检验)。
图6示出LBPAE的质子缓冲容量、降解和DNA释放评估。图6a示出通过酸-碱滴定确定的质子缓冲容量。图6b示出使用GPC确定的降解谱。图6c示出用PicoGreen测定评估的来自聚合复合物的DNA释放的评价。
图7示出HPDF中的C7表达的免疫荧光染色。图7a示出在用LBPAE/MCC7聚合复合物转染后四天HPDF的荧光图像。用DAPI(蓝色)对细胞核染色，并且将C7与单克隆抗胶原VII一级抗体一起孵育并用Alexa-568山羊抗小鼠二级抗体(红色)染色。比例尺，20μm。图7b示出HPDF的C7表达的流式细胞术定量。图7c示出在用LBPAE/MCC7和SuperFect/DNA聚合复合物转染后HPDF的C7表达上调程度和MFI。在*C7上调百分比和#MFI方面与SuperFect有显著差异(p<0.05，学生双尾t检验)。
图8是通过线性低聚物组合策略合成LBPAE的示意图。在步骤1中，A2型胺与C2型二丙烯酸酯反应从而形成线性A2-C2基础低聚物，将其进一步用第二胺封端从而产生线性A2-C2低聚物。在步骤2中，通过分支使线性A2-C2低聚物与B3型三丙烯酸酯结合以产生LBPAE。方框示出合成这项工作中的LBPAE所用的单体和封端剂。
图9示出线性低聚物和LBPAE的GPC结果。
图10示出LBPAE的MHα曲线和值。
图11示出通过1H NMR对LBPAE进行的化学组成分析。
图12示出MCC7和pcDNA3.1COL7A1的琼脂糖凝胶结果。
图13a示出经由“A2+B3+C2”迈克尔加成策略的HPAE合成。图13b示出本公开的HPAE的GPC曲线和计算的Mw。图13c示出本公开的HPAE的MHα曲线和计算值。(图13以及图16至图19使用“HC32-122”来定义本公开的HPAE聚合物。HC32-122等同于用于实施例中的HC32-DATOU。)
图14示出使用包含具有MW 11kDa、21kDa、34kDa和41kDa的HPAE的聚合复合物(其具有10:1(重量％/重量％)、30:1和50:1的HPAE/DNA比)对RDEB角质形成细胞进行的转染。
图15示出在使用包含具有MW 11kDa、21kDa、34kDa和41kDa的HPAE的聚合复合物(其具有10:1(重量％/重量％)、30:1和50:1的聚合物/DNA比)对RDEB角质形成细胞进行基因转染后的细胞存活力测试。
图16示出使用HPAE/DNA聚合复合物在RDEBK细胞中的报道基因转染研究。图16a示出在用HPAE/DNA和PEI/DNA聚合复合物转染后48h RDEBK细胞的相对Gluc活性。数据呈现为以被HPAE/DNA聚合复合物(30:1wt％/wt％)转染的RDEBK细胞的Gluc活性作归一化的百分比。*与HPAE(w/w＝30:1)组有显著差异(p<0.05，学生t检验)；图16b示出在用HPAE/DNA和PEI/DNA聚合复合物转染后RDEBK细胞的存活力；图16c示出未处理(UT)细胞、用HPAE/DNA(w/w＝30:1)或PEI/DNA(w/w＝1:1)聚合复合物处理的细胞的GFP图像。比例尺：200μm；图16d示出UT和经转染细胞群体的代表性直方图分布；图16e示出用流式细胞术定量的GFP阳性RDEBK细胞百分比和MFI。在*GFP阳性细胞百分比和#细胞MFI方面与PEI有显著差异(p<0.05，学生t检验)。
图17示出MCC7生物合成和HPAE/MCC7聚合复合物的细胞摄取。图17a示出用phiC31加1-scel消化系统进行的MCC7生物合成。图17b示出在EcoR1消化后三个编码COL7A1的质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳。pcDNA3.1COL7A1的常规质粒(RP)、MN511A-1-COL7A1的亲本质粒(PP)和MCC7分别具有5kb、8kb和3kb的骨架长度；图17c示出用不同的聚合复合物转染后RDEBK细胞的荧光图像。用DAPI(蓝色)给细胞核染色，用Cy3(红色)标记DNA。比例尺：20μm；图17d示出用流式细胞术定量的聚合复合物细胞摄取效率；图17e示出Cy3阳性细胞百分比和MFI。*在细胞MFI方面与PEI/MCC7组有显著差异(p<0.05，学生t检验)。
图18示出用HPAE/MCC7多聚合复合物转染后的COL7A1mRNA和重组C7表达。图18a示出通过RT-qPCR获得的内源对照GAPDH的扩增图；图18b示出通过RT-qPCR获得的在转染后RDEBK细胞的COL7A1 mRNA的扩增图；图18c示出COL7A1 mRNA定量，*与PEI组有显著差异(p<0.05，学生t检验)；图18d示出C7染色的细胞免疫荧光图像(红色荧光)，比例尺，20μm；图18e示出C7表达的蛋白质印迹法结果。将42-kDa的β-肌动蛋白用作上样对照。
图19示出在30:1的HPAE/DNA wt％/wt％比下的HPAE/MCC7聚合复合物的物理化学性质。图19a示出HPAE/MCC7聚合复合物形成；图19b示出在聚合复合物制备后2h DNA凝聚和肝素竞争测定的琼脂糖凝胶结果；图19c示出在聚合复合物制备后2h通过有或无肝素存在的PicoGreen测定进行的DNA结合能力测试；图19d示出通过NTA测量的HPAE/MCC7聚合复合物的尺寸；图19e示出HPAE/MCC7聚合复合物的ζ电位分布；图19f示出HPAE/MCC7聚合复合物的TEM图像。比例尺，500nm。
图20示出包含本公开的HPAE聚合复合物的制剂的基因转染性能。图20a示出聚合复合物冻干以及在RDEBK细胞中进行的进一步的转染研究；图20b示出在用来自不同储存方法和冻干条件的聚合复合物转染后细胞的GFP图像。FZ：冷冻干燥；Suc：蔗糖。比例尺：200μm；图20c示出UT和经转染的细胞群体的代表性直方图分布；图20d示出通过流式细胞术定量的转染后细胞的GFP表达效率。*与新制备的聚合复合物组有显著差异(p<0.05，学生t检验)；(e)通过流式细胞术定量的归一化MFI。*与新制备的聚合复合物组有显著差异(p<0.05，学生t检验)。
图21显示本公开的HPAE聚合复合物在长期储存后转染至RDEBK细胞中
具体实施方式
如上文和整个本公开中所用，除非另有说明，否则以下术语应理解为具有以下含义。如果缺少术语，则以本领域技术人员已知的常规术语为准。
如本文所用的术语“包括”、“含有”和“包含”以其开放的、非限制性的意义使用。
冠词“一(a)”和“一(an)”在本公开中用于指冠词的一个或超过一个(即，至少一个)语法对象。举例来说，“要素”意指一个要素或超过一个要素。
除非另有说明，否则用于本公开中的术语“和/或”意指“和”或“或”。
为了提供更简洁的描述，本文中给出的一些数量表述没有用术语“约”限定。应当理解，无论是否明确使用术语“约”，本文给出的每个量都意在指实际给定值，并且还意在指基于本领域普通技术合理推断的此类给定值的近似值，包括由此类给定值的实验和/或测量条件引起的等价值和近似值。每当产率以百分比形式给出时，此类产率是指产率被给出的实体的质量相对于可在特定化学计量条件下获得的相同实体的最大量的百分比。除非不同地指明，否则以百分比给出的浓度是指质量比。
“患者”是哺乳动物，例如，人、小鼠、大鼠、豚鼠、狗、猫、马、奶牛、猪或非人灵长类动物，诸如猴、黑猩猩、狒狒或恒河猴。“患者”包括人和动物两者。
当与化合物结合使用时，术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以提供期望的生物学结果的所述化合物的量。该结果可以是疾病的体征、症状或原因的减少和/或缓和，或生物系统的任何其他期望的改变。例如，用于治疗用途的“有效量”是提供疾病的临床上显著的减少所需的包含如本文所公开的化合物的组合物的量。本领域普通技术人员可使用常规实验来确定在任何个别情况下的适当“有效量”。因此，表述“有效量”一般是指活性物质具有治疗作用的量。
如本文所用的术语“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”与术语“预防”同义，并且意在指示延缓疾病发展、预防疾病发展，以及/或者降低此类将要发展或预期发展的症状的严重性。因此，这些术语包括改善现有疾病症状、预防额外症状、改善或预防症状的潜在原因、抑制病症或疾病，例如，遏制病症或疾病的发展、缓解病症或疾病、引起病症或疾病的消退、缓解由疾病或病症引起的病状，或者终止或缓和疾病或病症的症状。在某些实施方案中，“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”是指促进健康的皮肤表型。
除非另外指明，否则术语“病症”在本公开中用于意指术语疾病、病状或疾患，并且可与术语疾病、病状或疾患互换使用。
所使用的术语“药学上可接受的”或“药理学上可接受的”意在意指不是生物上或其他方面不期望的材料—所述材料可被施用于个体而不会引起任何实质上不期望的生物效果或者不会以有害的方式与其含有的组合物的任何组分相互作用。
如本公开中所用的术语“载剂”涵盖载剂、赋形剂和稀释剂，并且意指参与将药剂从受试者的一个器官或身体部分携载或运输至另一器官或身体部分的材料、组合物或媒介物，诸如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或囊封材料。应基于期望剂型的相容性和释放谱性质来选择赋形剂。示例性的载剂材料包括例如粘合剂、混悬剂、崩解剂、填充剂、表面活性剂、增溶剂、稳定剂、润滑剂、润湿剂、稀释剂、喷雾干燥分散体等。
术语“药学上相容的载剂材料”可包括例如阿拉伯胶(acacia)、明胶、胶体二氧化硅、甘油磷酸钙、乳酸钙、麦芽糖糊精、甘油、硅酸镁、酪蛋白酸钠、大豆卵磷脂、氯化钠、磷酸三钙、磷酸氢二钾、硬脂酰乳酸钠、角叉菜胶、甘油单酯、甘油二酯、预胶凝淀粉等。参见例如Hoover,John E.,Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.1975。
如本文所用的术语“受试者”涵盖哺乳动物和非哺乳动物。哺乳动物的实例包括但不限于哺乳动物纲的任何成员：人，非人灵长类动物，诸如黑猩猩，以及其他类人猿和猴物种；农场动物，诸如牛、马、绵羊、山羊、猪；家畜，诸如家兔、狗和猫；实验室动物，包括啮齿类动物，诸如大鼠、小鼠和豚鼠等。非哺乳动物的实例包括但不限于鸟类、鱼类等。在本公开的一个实施方案中，哺乳动物为人。
如本公开中所用的术语“施用(administered)”、“施用(administration)”或“施用(administering)”是指直接向受试者施用所公开的化合物或所公开的化合物的药学上可接受的盐或组合物，或者向所述受试者施用所述化合物或所述化合物的药学上可接受的盐或组合物的前药衍生物或类似物，所述前药衍生物或类似物可在需要治疗的包括动物在内的受试者身体内形成等同量的活性化合物，所述施用通过使此类个体与此类化合物接触或者使此类个体以其他方式暴露于此类化合物中来实施。
如本文所用的“烷基”意指具有1至40个碳原子的直链或支化饱和链。代表性的饱和烷基包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、2-甲基-1-丙基、2-甲基-2-丙基、2-甲基-1-丁基、3-甲基-1-丁基、2-甲基-3-丁基、2,2-二甲基-1-丙基、2-甲基-1-戊基、3-甲基-1-戊基、4-甲基-1-戊基、2-甲基-2-戊基、3-甲基-2-戊基、4-甲基-2-戊基、2,2-二甲基-1-丁基、3,3-二甲基-1-丁基、2-乙基-1-丁基、丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基等，以及更长的烷基，诸如庚基和辛基等。烷基可以未被取代或被取代。含有三个或更多个碳原子的烷基可以是直链或支化的。如本文所用的“低级烷基”意指具有1至10个碳原子的烷基。
如本文所用的“烯基”包括含有2-40个碳原子的未支化或支化的烃链。“烯基”含有至少一个双键。烯基的双键可不共轭或与另一不饱和基团共轭。烯基的实例包括但不限于乙烯基(ethylenyl)、乙烯基(vinyl)、烯丙基、丁烯基、戊烯基、己烯基、丁二烯基、戊二烯基、己二烯基、2-乙基己烯基、2-丙基-2-丁烯基、4-(2-甲基-3-丁烯)-戊烯基等。烯基可未被取代或被取代。如本文所定义的烯基还可以是支化或直链的。
如本文所用的“炔基”包括含有2-40个碳原子的未支化或支化的不饱和烃链。“炔基”含有至少一个三键。炔基的三键可不共轭或与另一不饱和基团共轭。炔基的实例包括但不限于乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基、甲基丙炔基、4-甲基-1-丁炔基、4-丙基-2-戊炔基、4-丁基-2-己炔基等。炔基可未被取代或被取代。
还应注意，本文的文本、方案、实施例和表格中具有不满足价态的任何碳原子以及杂原子被假定具有足够数量的氢原子以满足价态。
如本文所用，如果需要，则对氢的提及还可指氘取代。如本文所用的术语“氘”意指具有奇数个质子和中子的氢的稳定同位素。
术语“卤代基”或“卤素”是指氟、氯、溴或碘。
如本文所用的术语“卤代烷基”是指被一个或多个卤素取代的如本文所定义的烷基。卤代烷基的实例包括但不限于三氟甲基、二氟甲基、五氟乙基、三氯甲基等。
除非另有特别定义，否则术语“芳基”是指具有1至3个芳族环的环状芳族烃基，包括单环或二环基团，诸如苯基、联苯基或萘基。在含有两个芳族环(二环等)的情况下，芳基的芳族环可在单一点处接合(例如，联苯基)或稠合(例如，萘基)。芳基可在任一连接点处任选地被一个或多个取代基(例如，1至5个取代基)取代。取代基本身可以任选地被取代。此外，当含有两个稠环时，本文所定义的芳基可具有与完全饱和的环稠合的不饱和或部分饱和的环。这些芳基的示例性环系包括但不限于苯基、联苯基、萘基、蒽基、非那烯基(phenalenyl)、菲基、茚满基、茚基、四氢萘基、四氢苯并轮烯基(tetrahydrobenzoannulenyl)等。
除非另有特别定义，否则“杂芳基”意指5至18个环原子的单价单环或多环芳族基团或多环芳族基团，其含有一个或多个选自N、O或S的环杂原子，其余的环原子为C。如本文所定义的杂芳基还意指其中杂原子选自N、O或S的二环杂芳族基团。所述芳族基团任选地独立地被一个或多个本文所述的取代基取代。取代基本身可以任选地被取代。实例包括但不限于苯并噻吩、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡啶基、吡嗪基、吡唑基、哒嗪基、嘧啶基、咪唑基、异噁唑基、噁唑基、噁二唑基、吡嗪基、吲哚基、噻吩-2-基、喹啉基、苯并吡喃基、异噻唑基、噻唑基、噻二唑基、噻吩并[3,2-b]噻吩、三唑基、三嗪基、咪唑并[1,2-b]吡唑基、呋喃并[2,3-c]吡啶基、咪唑并[1,2-a]吡啶基、吲唑基、吡咯并[2,3-c]吡啶基、吡咯并[3,2-c]吡啶基、吡唑并[3,4-c]吡啶基、苯并咪唑基、噻吩并[3,2-c]吡啶基、噻吩并[2,3-c]吡啶基、噻吩并[2,3-b]吡啶基、苯并噻唑基、吲哚基、吲哚啉基、吲哚啉酮基、二氢苯并噻吩基、二氢苯并呋喃基、苯并呋喃、色满基、硫代色满基、四氢喹啉基、二氢苯并噻嗪、二氢苯并氧杂环己烷基(dihydrobenzoxanyl)、喹啉基、异喹啉基、1,6-萘啶基、苯并[de]异喹啉基、吡啶并[4,3-b][1,6]萘啶基、噻吩并[2,3-b]吡嗪基、喹唑啉基、四唑并[1,5-a]吡啶基、[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶基、异吲哚基、吡咯并[2,3-b]吡啶基、吡咯并[3,4-b]吡啶基、吡咯并[3,2-b]吡啶基、咪唑并[5,4-b]吡啶基、吡咯并[1,2-a]嘧啶基、四氢吡咯并[1,2-a]嘧啶基、3,4-二氢-2H-1λ2-吡咯并[2,1-b]嘧啶、二苯并[b,d]噻吩、吡啶-2-酮、呋喃并[3,2-c]吡啶基、呋喃并[2,3-c]吡啶基、1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噻嗪基、苯并噁唑基、苯并异噁唑基、呋喃并[2,3-b]吡啶基、苯并噻吩基、1,5-萘啶基、呋喃并[3,2-b]吡啶、[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶基、苯并[1,2,3]三唑基、咪唑并[1,2-a]嘧啶基、[1,2,4]三唑并[4,3-b]哒嗪基、苯并[c][1,2,5]噻二唑基、苯并[c][1,2,5]噁二唑、1,3-二氢-2H-苯并[d]咪唑-2-酮、3,4-二氢-2H-吡唑并[1,5-b][1,2]噁嗪基、4,5,6,7-四氢吡唑并[1,5-a]吡啶基、噻唑并[5,4-d]噻唑基、咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑基、噻吩并[2,3-b]吡咯基、3H-吲哚基和它们的衍生物。此外，当含有两个稠环时，本文所定义的杂芳基可具有与完全饱和的环稠合的不饱和或部分饱和的环。
如本文所用的术语“环烷基”是指每个环具有3至18个碳原子的饱和或部分饱和的单环、稠合或螺接多环碳环。环烷基环或碳环可在任一连接点处任选地被一个或多个取代基(例如，1至5个取代基)取代。取代基本身可以任选地被取代。环烷基的实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、降冰片烷基、降冰片烯基(norborenyl)、二环[2.2.2]辛基、二环[2.2.2]辛烯基、十氢萘基、八氢-1H-茚基、环戊烯基、环己烯基、环己-1,4-二烯基、环己-1,3-二烯基、1,2,3,4-四氢萘基、八氢并环戊二烯基、3a,4,5,6,7,7a-六氢-1H-茚基、1,2,3,3a-四氢并环戊二烯基、二环[3.1.0]己基、二环[2.1.0]戊基、螺[3.3]庚基、二环[2.2.1]庚基、二环[2.2.1]庚-2-烯基、二环[2.2.2]辛基、6-甲基二环[3.1.1]庚基、2,6,6-三甲基二环[3.1.1]庚基和它们的衍生物。
如本文所用的术语“环烯基”是指每个环具有3至18个碳原子，并且含有至少一个双键的部分饱和的单环、稠合或螺接多环碳环。环烯基环可在任一连接点处任选地被一个或多个取代基(例如，1至5个取代基)取代。取代基本身可以任选地被取代。
如本文所用的术语“杂环烷基”或“杂环基”是指4-至18-个原子的饱和的或部分不饱和且非芳族的单环环结构或者稠合或螺接多环环结构，其含有碳和取自氧、氮或硫的杂原子，并且其中在环碳或杂原子之间不存在共享的离域π-电子(芳香性)。杂环烷基或杂环基环结构可被一个或多个取代基取代。取代基本身可以任选地被取代。杂环烷基或杂环基环的实例包括但不限于氧杂环丁烷基、氮杂环丁烷基、四氢呋喃基、吡咯烷基、噁唑啉基、噁唑烷基、噻唑啉基、噻唑烷基、吡喃基、硫代吡喃基、四氢吡喃基、二氧戊环基(dioxalinyl)、哌啶基、吗啉基、硫代吗啉基、硫代吗啉基S-氧化物、硫代吗啉基S-二氧化物、哌嗪基、氮杂环庚三烯基(azepinyl)、氧杂环庚三烯基(oxepinyl)、二氮杂环庚三烯基(diazepinyl)、托烷基(tropanyl)、高托烷基(homotropanyl)、二氢噻吩-2(3H)-酮基、四氢噻吩1,1-二氧化物、2,5-二氢-1H-吡咯基、咪唑烷-2-酮、吡咯烷-2-酮、二氢呋喃-2(3H)-酮、1,3-二氧杂环戊烷-2-酮、异噻唑烷1,1-二氧化物、4,5-二氢-1H-咪唑基、4,5-二氢噁唑基、环氧乙烷基、吡唑烷基、4H-1,4-噻嗪基、硫代吗啉基、1,2,3,4-四氢吡啶基、1,2,3,4-四氢吡嗪基、1,3-噁嗪烷-2-酮、四氢-2H-硫代吡喃1,1-二氧化物、7-氧杂二环[2.2.1]庚基、1,2-硫杂氮杂环庚烷1,1-二氧化物、八氢-2H-喹嗪基、1,3-二氮杂二环[2.2.2]辛基、2,3-二氢苯并[b][1,4]二氧杂环己烯基、3-氮杂二环[3.2.1]辛基、8-氮杂螺[4.5]癸烷、8-氧杂-3-氮杂二环[3.2.1]辛基、2-氮杂二环[2.2.1]庚烷、2,8-二氮杂螺[5.5]十一烷基、2-氮杂螺[5.5]十一烷基、3-氮杂螺[5.5]十一烷基、十氢异喹啉基、1-氧杂-8-氮杂螺[4.5]癸基、8-氮杂二环[3.2.1]辛基、1,4'-联哌啶基、氮杂环庚烷基、8-氧杂-3-氮杂二环[3.2.1]辛基、3,4-二氢-2H-苯并[b][1,4]噁嗪基、5,6,7,8-四氢咪唑并[1,2-a]吡啶基、1,4-二氮杂环庚烷基、吩噁噻基、苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基、2,3-二氢苯并呋喃基、2,3-二氢苯并[b][1,4]二氧杂环己烯基、4-(哌啶-4-基)吗啉基、3-氮杂螺[5.5]十一烷基、十氢喹啉基、哌嗪-2-酮、1-(吡咯烷-2-基甲基)吡咯烷基、1,3'-联吡咯烷基和6,7,8,9-四氢-1H,5H-吡唑并[1,2-a][1,2]二氮杂环庚三烯基。
除非另有注释，否则如本文所用的数值范围旨在包括连续的整数。例如，表示为“0至5”的范围将包括0、1、2、3、4和5。
如本文所用的术语“取代的”意指指定的基团或部分带有一个或多个适合的取代基，其中所述取代基可在一个或多个位置连接至指定的基团或部分。例如，被环烷基取代的芳基可指示该环烷基利用键或通过与芳基稠合并共享两个或更多个共同原子而连接至芳基的一个原子。
如本文所用的术语“未被取代的”意指指定的基团不带有取代基。
术语“任选地被取代”应理解为意指给定的化学部分(例如，烷基)可(但不必需)键合其他取代基(例如，杂原子)。例如，任选地被取代的烷基可以是完全饱和的烷基链(即，纯烃)。替代地，相同的任选地被取代的烷基可具有不同于氢的取代基。例如，它可以在沿着链的任何点处结合至卤素原子、羟基或本文所述的任何其他取代基。因此，术语“任选地被取代的”意指给定的化学部分具有含有其他官能团的潜力，但不一定具有任何另外的官能团。如果没有另外说明，则在所描述的基团的任选取代中使用的适合的取代包括但不限于氧代、-卤素、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基、C1-C6卤代烷氧基、-OC1-C6烯基、-OC1-C6炔基、-C1-C6烯基、-C1-C6炔基、-OH、CN(氰基)、-CH2CN、-OP(O)(OH)2、-C(O)OH、-OC(O)C1-C6烷基、-C(O)C1-C6烷基、-C(O)-C0-C6亚烷基-环烷基、-C(O)-C0-C6亚烷基-杂环烷基、-C(O)-C0-C6亚烷基-芳基、-C(O)-C0-C6亚烷基-杂芳基、-OC(O)OC1-C6烷基、NH2、NH(C1-C6烷基)、N(C1-C6烷基)2、-C(O)NH2、-C(O)NH(C1-C6烷基)、-C(O)N(C1-C6烷基)2、-C(O)NH环烷基、-C(O)N(C1-C6烷基)环烷基、-C(O)NH杂环烷基、-C(O)N(C1-C6烷基)杂环烷基、-C(O)NH芳基、-C(O)N(C1-C6烷基)芳基、-C(O)NH杂芳基、-C(O)N(C1-C6烷基)杂芳基、-S(O)2-C1-C6烷基、-S(O)2-C1-C6卤代烷基、-S(O)2-环烷基、-S(O)2-杂环烷基、-S(O)2-芳基、-S(O)2-杂芳基-C0-C6亚烷基-S(O)2NH2、-S(O)2NHC1-C6烷基、-S(O)2N(C1-C6烷基)2、-S(O)2NH环烷基、-S(O)2NH杂环烷基、-S(O)2NH芳基、-S(O)2NH杂芳基、-NHS(O)2C1-C6烷基、-N(C1-C6烷基)S(O)2(C1-C6烷基)、-NHS(O)2芳基、-N(C1-C6烷基)S(O)2芳基、-NHS(O)2杂芳基、-N(C1-C6烷基)S(O)2杂芳基、-NHS(O)2环烷基、-N(C1-C6烷基)S(O)2环烷基、-NHS(O)2杂环烷基、-N(C1-C6烷基)S(O)2杂环烷基、-N(C1-C6烷基)S(O)2芳基、-C0-C6亚烷基-芳基、-C0-C6亚烷基-杂芳基、-C0-C6亚烷基-环烷基、-C0-C6亚烷基-杂环烷基、-O-芳基、-NH-芳基和N(C1-C6烷基)芳基。取代基本身可以任选地被取代。当显示多官能部分时，与核心的连接点由线指示，例如，(环烷氧基)烷基-是指烷基是与核心的连接点，而环烷基经由氧基连接至烷基。“任选地被取代”还指“被取代”或“未被取代”，其具有上面描述的含义。
如本文所用的术语“接头”或“连接部分”是指连接两个基团并且具有介于0与100个原子之间的骨架的基团。接头或键联可以是连接两个基团的共价键(即0个原子的骨架)或长度介于1与100个原子之间(例如长度为约1个、2个、3个、4个、5个、6个、8个、10个、12个、14个、16个、18个、20个、22个、24个、26个、28个、30个、32个、34个、36个、38个、40个、42个、44个、46个、48个、50个、52个、54个、56个、58个、60个、62个、64个、66个、68个、70个、72个、74个、76个、78个、80个、82个、84个、86个、88个、90个、92个、94个、96个、98个或100个碳原子)的链，其中所述接头可以是线性的、支化的、环状的或者是单个原子。在某些情况下，接头骨架的一个或多个碳原子可任选地被硫、氮或氧杂原子取代。骨架原子之间的键可以是饱和或不饱和的。接头可包括一个或多个取代基，例如烷基、芳基或烯基。接头可包括但不限于低聚(乙二醇)、醚、硫醚、叔胺、烷基，所述烷基可以是直链或支化的，例如甲基、乙基、正丙基、1-甲基乙基(异丙基)、正丁基、正戊基、1,1-二甲基乙基(叔丁基)等。接头骨架可包含环状基团，例如，芳基、杂环或环烷基，其中所述环状基团的2个或更多个原子，例如，2个、3个或4个原子包含在所述骨架中。接头可以是可切割的或不可切割的。
除非另有说明，否则术语分子量是指重均分子量(MW)。
术语“杂亚烷基”是指一个或多个碳原子被硫、氧或NRd(其中Rd为氢或烷基)替代的二价亚烷基。杂亚烷基可以是线性的、支化的、环状的或它们的组合。
术语“杂亚烯基”是指在其骨架中具有至少一个碳-碳双键和一个或多个杂原子(例如，N、S或O)的二价直链或支链烃基。
术语“杂亚炔基”是指在其骨架中具有至少一个碳-碳三键和一个或多个杂原子(例如，N、S或O)的二价直链或支链烃基。
如本文所用的术语“聚合复合物”是指核酸与聚合物之间的复合物。核酸经由非共价键、特别是静电键结合至聚合物。
术语“质粒”是指经常携载不为细胞中央代谢一部分的基因并且通常呈环状双链DNA分子的形式的染色体外元件。此类元件可以是来源于任何来源的单链或双链DNA或RNA的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列(线性、环状或超螺旋)，其中许多核苷酸序列已被接合或重组至能够将用于所选基因产物的启动子片段和DNA序列连同适当的3′非翻译序列引入到细胞中的独特构建体中。如本文所用的术语“质粒”是指由遗材料(即核酸)构成的构建体。通常，质粒含有在细菌宿主细胞(例如，大肠杆菌(Escherichiacoli))中起作用的复制起点，以及用于检测包含该质粒的细菌宿主细胞的选择标记物。
术语“纳米质粒(nanoplasmid)”是指具有减少的细菌序列的环状DNA序列，其提供具有期望的基因插入的较小质粒。例如，由无抗生素的RNA-OUT选择系统产生的纳米质粒以及制备该纳米质粒的方法描述于由Nature Technology获得专利的美国专利第9,109,012号中，所述专利在此通过引用整体并入。
术语“核酸”是指核苷酸碱基的生物聚合物，并且可包括但不限于脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、微小RNA(miRNA)和肽核酸(PNA)。
术语“微环”是指从亲本质粒中通过分子内重组除去细菌复制序列而得到的小的、最小尺寸的圆形DNA。
术语“基因编辑系统”是指能够通过许多DNA修复途径中的一种改变靶核酸的系统。
本公开涉及一类新的支化聚合物，包括通过线性低聚物组合策略合成的聚合物。在一些实施方案中，线性聚(β-氨基酯)低聚物通过支化单元连接从而形成多官能线性-支化的杂化聚(β-氨基酯)(LBPAE)。本公开的聚合物被设计和制备用于各种应用，包括但不限于高性能成纤维细胞基因转染。在人原代真皮成纤维细胞(HPDF)和小鼠胚胎成纤维细胞(3T3)中，通过LBPAE实现了超高的转基因表达：检测到最高达3292倍的荧光素酶(Gluc)表达增强和接近100％的绿色荧光蛋白质(GFP)表达。深入的机理研究揭示，LBPAE可以穿越成纤维细胞基因转染中涉及的多种细胞外和细胞内屏障。更重要的是，LBPAE可有效地递送多种基因(例如COL7A1)从而显著上调期望的表达(例如HPDF中的VII型胶原蛋白质(C7))，这证实其在治疗疾病(例如C7缺乏型遗传性皮肤病，诸如隐性营养不良性大疱性表皮松解症(RDEB))中具有巨大潜力。
聚合物
在一些实施方案中，本公开提供了通过下面的工艺制备的聚合物：
(a)使式(A)化合物
Figure BDA0003014376920000241
Figure BDA0003014376920000251
与具有式R1-NH2或R1-N(H)-Z’-N(H)-R1的第一胺反应；
(b)使步骤(a)的产物与具有式R2-NH2或R2-N(H)-Z”-N(H)-R2的第二胺反应；以及
(c)使步骤(b)的产物与式(B)化合物反应：
Figure BDA0003014376920000252
其中
每个J独立地为–O–或–NH–；
Z、Z’和Z”为连接部分；
A为1至30个碳原子的线性或支化碳链、2至30个原子的线性或支化含杂原子碳链、含有3至30个碳原子的碳环，或含有3至30个原子的杂环；
其中A任选地被一个或多个以下基团取代：卤素、羟基、氨基、磺酰基、磺酰胺基、巯基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6醚、C1-C6硫醚、C1-C6砜、C1-C6亚砜、C1-C6伯酰胺、C1-C6仲酰胺、卤代C1-C6烷基、羧基、氰基、硝基、亚硝基、-OC(O)NR′R′、-N(R′)C(O)NR′R′、-N(R′)C(O)O-C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C3-C6杂环基、C2-C5杂芳基或C6-C10芳基；其中每个R′独立地选自由氢和C1-C6烷基组成的组；
G为–C–、–S–、–S(O)–、–P(OR1)–或–P(OH)–；
每个Q为H或C1-C10线性或支化烷基；
每个E1独立地选自由以下组成的组：共价键、–N–、–O–、–S–、亚烷基、杂亚烷基、烯基、杂亚烯基、炔基、杂亚炔基；
R1和R2各自独立地为C1-C40烷基、C1-C40杂烷基、C2-C40烯基、C2-C40杂亚烯基、C4-C8环烯基、C2-C40炔基、C2-C40杂亚炔基、C3-C8环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；其中所述杂环基和杂芳基含有1-5个选自由N、S、P和O组成的组的杂原子；其中所述C1-C40烷基、C2-C40烯基、C4-C8环烯基、C2-C40炔基、C3-C8环烷基、杂环基、芳基和杂芳基任选地被D、卤素、C1-C6烷基、-OH、-O-C1-C6烷基、-NH2、-NH(C1-C6烷基)或-N(C1-C6烷基)2取代；并且R1未被取代或被以下中的至少一者取代：卤素、羟基、氨基、磺酰基、磺酰胺基、巯基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6醚、C1-C6硫醚、C1-C6砜、C1-C6亚砜、C1-C6伯酰胺、C1-C6仲酰胺、卤代C1-C6烷基、羧基、氰基、硝基、亚硝基、-OC(O)NR′R′、-N(R′)C(O)NR′R′、-N(R′)C(O)O-C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C3-C6杂环基、C2-C5杂芳基和C6-C10)芳基；其中每个R′独立地选自由氢和C1-C6烷基组成的组；并且
每个n至少为1。
在一些实施方案中，本公开提供了通过下面的工艺制备的聚合物：
(a)使式(A)化合物
Figure BDA0003014376920000261
和式(B)化合物：
Figure BDA0003014376920000271
与具有式R1-NH2或R1-N(H)-Z’-N(H)-R1的第一胺反应；
(b)使步骤(a)的产物与具有式R2-NH2或R2-N(H)-Z”-N(H)-R2的第二胺反应；
其中
每个J独立地为–O–或–NH–；
Z、Z’和Z”为连接部分；
A为1至30个碳原子的线性或支化碳链、2至30个原子的线性或支化含杂原子碳链、含有3至30个碳原子的碳环，或含有3至30个原子的杂环；
其中A任选地被一个或多个以下基团取代：卤素、羟基、氨基、磺酰基、磺酰胺基、巯基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6醚、C1-C6硫醚、C1-C6砜、C1-C6亚砜、C1-C6伯酰胺、C1-C6仲酰胺、卤代C1-C6烷基、羧基、氰基、硝基、亚硝基、-OC(O)NR′R′、-N(R′)C(O)NR′R′、-N(R′)C(O)O-C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C3-C6杂环基、C2-C5杂芳基或C6-C10芳基；其中每个R′独立地选自由氢和C1-C6烷基组成的组；
G为–C–、–S–、–S(O)–、–P(OR1)–或–P(OH)–；
每个Q为H或C1-C10线性或支化烷基；
每个E1独立地选自由以下组成的组：共价键、–N–、–O–、–S–、亚烷基、杂亚烷基、烯基、杂亚烯基、炔基、杂亚炔基；
R1和R2各自独立地为C1-C40烷基、C1-C40杂烷基、C2-C40烯基、C2-C40杂亚烯基、C4-C8环烯基、C2-C40炔基、C2-C40杂亚炔基、C3-C8环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；其中所述杂环基和杂芳基含有1-5个选自由N、S、P和O组成的组的杂原子；其中所述C1-C40烷基、C2-C40烯基、C4-C8环烯基、C2-C40炔基、C3-C8环烷基、杂环基、芳基和杂芳基任选地被D、卤素、C1-C6烷基、-OH、-O-C1-C6烷基、-NH2、-NH(C1-C6烷基)或-N(C1-C6烷基)2取代；并且R1未被取代或被以下中的至少一者取代：卤素、羟基、氨基、磺酰基、磺酰胺基、巯基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6醚、C1-C6硫醚、C1-C6砜、C1-C6亚砜、C1-C6伯酰胺、C1-C6仲酰胺、卤代C1-C6烷基、羧基、氰基、硝基、亚硝基、-OC(O)NR′R′、-N(R′)C(O)NR′R′、-N(R′)C(O)O-C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C3-C6杂环基、C2-C5杂芳基和C6-C10)芳基；其中每个R′独立地选自由氢和C1-C6烷基组成的组；并且
每个n至少为1。
在一些实施方案中，Z为1至30个碳原子的线性或支化碳链、1至30个原子的线性或支化含杂原子碳链、含有3至30个碳原子的碳环、含有3至30个碳原子的亚烷基-碳环、含有3至30个原子的杂环，或含有3至30个原子的亚烷基-杂环。Z可未被取代或被以下中的至少一者取代：卤素、羟基、氨基、磺酰基、磺酰胺基、巯基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6醚、C1-C6硫醚、C1-C6砜、C1-C6亚砜、C1-C6伯酰胺、C1-C6仲酰胺、卤代C1-C6烷基、羧基、氰基、硝基、亚硝基、-OC(O)NR′R′、-N(R′)C(O)NR′R′、-N(R′)C(O)O-C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C3-C6杂环基、C2-C5杂芳基和C6-C10芳基；其中每个R′独立地选自由氢和C1-C6烷基组成的组。在一些实施方案中，Z为1至30个碳原子的线性碳链。例如，Z可以是亚烷基，包括但不限于C1-C24亚烷基、C1-C20亚烷基、C1-C16亚烷基、C1-C12亚烷基、C1-C8亚烷基、C1-C6亚烷基、C1-C4亚烷基、C1-C3亚烷基、C1-C2亚烷基、C1亚烷基。代表性的亚烷基包括但不限于亚甲基、亚乙基、亚丙基、正亚丁基、亚乙烯基、亚丙烯基、正亚丁烯基、亚丙炔基、正亚丁炔基等。在一些实施方案中，Z为1至30个碳原子的线性或支化碳链，或1至30个原子的线性或支化含杂原子碳链。在一些实施方案中，Z为1至10个碳原子的线性或支化碳链。例如，在一些实施方案中，Z为
Figure BDA0003014376920000291
在一些实施方案中，Z为1至30个碳原子的支化碳链。在一些实施方案中，Z为1至30个原子的线性或支化含杂原子碳链。例如，Z可以是其中一个或多个碳原子被杂原子(包括但不限于O、N、S或P)取代的线性或支化碳链。在一些实施方案中，Z为含有3至30个碳原子的碳环。在一些实施方案中，Z为含有3至30个碳原子的亚烷基-碳环。例如，在一些实施方案中，Z为
Figure BDA0003014376920000292
其中x为1-1000。在一些实施方案中，Z为含有3至30个原子的杂环。在一些实施方案中，Z为含有3至30个原子的亚烷基-杂环。在一些实施方案中，Z未被取代。在一些实施方案中，Z被取代。在一些实施方案中，Z为以下中的至少一者：
Figure BDA0003014376920000293
Figure BDA0003014376920000294
在一些实施方案中，Z’为1至30个碳原子的线性或支化碳链、1至30个原子的线性或支化含杂原子碳链、含有3至30个碳原子的碳环、含有3至30个碳原子的亚烷基-碳环、含有3至30个原子的杂环，或含有3至30个原子的亚烷基-杂环。Z’可未被取代或被以下中的至少一者取代：卤素、羟基、氨基、磺酰基、磺酰胺基、巯基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6醚、C1-C6硫醚、C1-C6砜、C1-C6亚砜、C1-C6伯酰胺、C1-C6仲酰胺、卤代C1-C6烷基、羧基、氰基、硝基、亚硝基、-OC(O)NR′R′、-N(R′)C(O)NR′R′、-N(R′)C(O)O-C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C3-C6杂环基、C2-C5杂芳基和C6-C10芳基；其中每个R′独立地选自由氢和C1-C6烷基组成的组。在一些实施方案中，Z’为1至30个碳原子的线性碳链。例如，Z’可以是亚烷基，包括但不限于C1-C24亚烷基、C1-C20亚烷基、C1-C16亚烷基、C1-C12亚烷基、C1-C8亚烷基、C1-C6亚烷基、C1-C4亚烷基、C1-C3亚烷基、C1-C2亚烷基、C1亚烷基。代表性的亚烷基包括但不限于亚甲基、亚乙基、亚丙基、正亚丁基、亚乙烯基、亚丙烯基、正亚丁烯基、亚丙炔基、正亚丁炔基等。在一些实施方案中，Z’为1至30个碳原子的线性或支化碳链，或1至30个原子的线性或支化含杂原子碳链。
在一些实施方案中，Z”为1至30个碳原子的线性或支化碳链、1至30个原子的线性或支化含杂原子碳链、含有3至30个碳原子的碳环、含有3至30个碳原子的亚烷基-碳环、含有3至30个原子的杂环，或含有3至30个原子的亚烷基-杂环。Z”可未被取代或被以下中的至少一者取代：卤素、羟基、氨基、磺酰基、磺酰胺基、巯基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6醚、C1-C6硫醚、C1-C6砜、C1-C6亚砜、C1-C6伯酰胺、C1-C6仲酰胺、卤代C1-C6烷基、羧基、氰基、硝基、亚硝基、-OC(O)NR′R′、-N(R′)C(O)NR′R′、-N(R′)C(O)O-C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C3-C6杂环基、C2-C5杂芳基和C6-C10芳基；其中每个R′独立地选自由氢和C1-C6烷基组成的组。在一些实施方案中，Z”为1至30个碳原子的线性碳链。例如，Z”可以是亚烷基，包括但不限于C1-C24亚烷基、C1-C20亚烷基、C1-C16亚烷基、C1-C12亚烷基、C1-C8亚烷基、C1-C6亚烷基、C1-C4亚烷基、C1-C3亚烷基、C1-C2亚烷基、C1亚烷基。代表性的亚烷基包括但不限于亚甲基、亚乙基、亚丙基、正亚丁基、亚乙烯基、亚丙烯基、正亚丁烯基、亚丙炔基、正亚丁炔基等。在一些实施方案中，Z”为1至30个碳原子的线性或支化碳链或者1至30个原子的线性或支化含杂原子碳链。
根据本公开的某些实施方案，G为–C–、–S–、–S(O)–、–P(OR1)–或–P(OH)–，因此分别形成羰基、亚砜基、砜基和膦酰基。因此，在一些实施方案中，G为–C–。在一些实施方案中，G为–S–。在一些实施方案中，G为–S(O)–。
在一些实施方案中，式(B)化合物为
Figure BDA0003014376920000311
其中
R为1至10个碳原子的线性或支化碳链、1至10个原子的线性或支化含杂原子碳链、含有3至10个碳原子的碳环，或含有3至10个原子的杂环，并且R未被取代或被以下中的至少一者取代：卤素、羟基、氨基、磺酰基、磺酰胺基、巯基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6醚、C1-C6硫醚、C1-C6砜、C1-C6亚砜、C1-C6伯酰胺、C1-C6仲酰胺、卤代C1-C6烷基、羧基、氰基、硝基、亚硝基、-OC(O)NR′R′、-N(R′)C(O)NR′R′、-N(R′)C(O)O-C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C3-C6杂环基、C2-C5杂芳基和C6-C10芳基；其中每个R′独立地选自由氢和C1-C6烷基组成的组；并且R”为未被取代或被取代的1至10个碳原子的线性或支化碳链、1至10个原子的线性或支化含杂原子碳链、含有3至10个碳原子的碳环，或含有3至10个原子的杂环。在一些实施方案中，R为1个碳原子。在一些实施方案中，R”为线性或支化碳链，诸如甲基、乙基、正丙基、异丙基、2-甲基-1-丙基、2-甲基-2-丙基、2-甲基-1-丁基、3-甲基-1-丁基、2-甲基-3-丁基、2,2-二甲基-1-丙基、2-甲基-1-戊基、3-甲基-1-戊基、4-甲基-1-戊基、2-甲基-2-戊基、3-甲基-2-戊基、4-甲基-2-戊基、2,2-二甲基-1-丁基、3,3-二甲基-1-丁基、2-乙基-1-丁基、丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基。例如，在一些实施方案中，式(B)化合物为
Figure BDA0003014376920000321
在一些实施方案中，R为含有3至10个碳原子的碳环。例如，R可以是环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环壬基、环癸基、苯基或萘基。在一些实施方案中，R为含有3至10个原子的杂环。
在某些实施方案中，第一胺具有式R1-NH2或R1-N(H)-Z’-N(H)-R1。在一些实施方案中，第一胺具有式R1-NH2。在一些实施方案中，第一胺具有式R1-N(H)-Z’-N(H)-R1。在一些实施方案中，具有式R1-N(H)-Z’-N(H)-R1的第一胺为
Figure BDA0003014376920000322
Figure BDA0003014376920000323
在一些实施方案中，第一胺具有式R1-N(H)-Z’-N-(R1)2。在一些实施方案中，具有式R1-N(H)-Z’-N-(R1)2的第一胺为
Figure BDA0003014376920000324
在某些实施方案中，第二胺具有式R2-NH2或R2-N(H)-Z”-N(H)-R2。在一些实施方案中，第二胺具有式R2-NH2。在一些实施方案中，第二胺具有式R2-N(H)-Z”-N(H)-R2。在一些实施方案中，具有式R2-N(H)-Z”-N(H)-R2的第二胺为
Figure BDA0003014376920000325
Figure BDA0003014376920000326
在一些实施方案中，第一胺具有式R2-N(H)-Z”-N-(R2)2。在一些实施方案中，具有式R2-N(H)-Z”-N-(R2)2的第一胺为
Figure BDA0003014376920000327
在某些实施方案中，R1为C1-C40烷基、C1-C40杂烷基、C2-C40烯基、C2-C40杂亚烯基、C4-C8环烯基、C2-C40炔基、C2-C40杂亚炔基、C3-C8环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；其中所述杂环基和杂芳基含有1-5个选自由N、S、P和O组成的组的杂原子；其中所述C1-C40烷基、C2-C40烯基、C4-C8环烯基、C2-C40炔基、C3-C8环烷基、杂环基、芳基和杂芳基任选地被D、卤素、C1-C6烷基、-OH、-O-C1-C6烷基、-NH2、-NH(C1-C6烷基)或-N(C1-C6烷基)2取代。R1可未被取代或被以下中的至少一者取代：卤素、羟基、氨基、磺酰基、磺酰胺基、巯基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6醚、C1-C6硫醚、C1-C6砜、C1-C6亚砜、C1-C6伯酰胺、C1-C6仲酰胺、卤代C1-C6烷基、羧基、氰基、硝基、亚硝基、-OC(O)NR′R′、-N(R′)C(O)NR′R′、-N(R′)C(O)O-C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C3-C6杂环基、C2-C5杂芳基和C6-C10)芳基；其中每个R′独立地选自由氢和C1-C6烷基组成的组。在一些实施方案中，R1为C1-C20烷基。例如，R1可以是C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19或C20烷基，诸如甲基、乙基、正丙基、异丙基、2-甲基-1-丙基、2-甲基-2-丙基、2-甲基-1-丁基、3-甲基-1-丁基、2-甲基-3-丁基、2,2-二甲基-1-丙基、2-甲基-1-戊基、3-甲基-1-戊基、4-甲基-1-戊基、2-甲基-2-戊基、3-甲基-2-戊基、4-甲基-2-戊基、2,2-二甲基-1-丁基、3,3-二甲基-1-丁基、2-乙基-1-丁基、丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基、正十一烷基、正十二烷基、正十三烷基、正十四烷基、正十五烷基、正十六烷基、正十七烷基、正十八烷基、正十九烷基或正二十烷基。在一些实施方案中，R1未被取代。在一些实施方案中，R1被取代。在一些实施方案中，R1选自由以下组成的组：
Figure BDA0003014376920000331
Figure BDA0003014376920000332
Figure BDA0003014376920000341
Figure BDA0003014376920000342
在一些实施方案中，R1为
Figure BDA0003014376920000343
在一些实施方案中，R1为
Figure BDA0003014376920000344
Figure BDA0003014376920000345
Figure BDA0003014376920000351
在某些实施方案中，R2为C1-C40烷基、C1-C40杂烷基、C2-C40烯基、C2-C40杂亚烯基、C4-C8环烯基、C2-C40炔基、C2-C40杂亚炔基、C3-C8环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；其中所述杂环基和杂芳基含有1-5个选自由N、S、P和O组成的组的杂原子；其中所述C1-C40烷基、C2-C40烯基、C4-C8环烯基、C2-C40炔基、C3-C8环烷基、杂环基、芳基和杂芳基任选地被D、卤素、C1-C6烷基、-OH、-O-C1-C6烷基、-NH2、-NH(C1-C6烷基)或-N(C1-C6烷基)2取代。R2可未被取代或被以下中的至少一者取代：卤素、羟基、氨基、磺酰基、磺酰胺基、巯基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6醚、C1-C6硫醚、C1-C6砜、C1-C6亚砜、C1-C6伯酰胺、C1-C6仲酰胺、卤代C1-C6烷基、羧基、氰基、硝基、亚硝基、-OC(O)NR′R′、-N(R′)C(O)NR′R′、-N(R′)C(O)O-C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C3-C6杂环基、C2-C5杂芳基和C6-C10)芳基；其中每个R′独立地选自由氢和C1-C6烷基组成的组。在一些实施方案中，R2为C1-C20烷基。例如，R2可以是C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19或C20烷基，诸如甲基、乙基、正丙基、异丙基、2-甲基-1-丙基、2-甲基-2-丙基、2-甲基-1-丁基、3-甲基-1-丁基、2-甲基-3-丁基、2,2-二甲基-1-丙基、2-甲基-1-戊基、3-甲基-1-戊基、4-甲基-1-戊基、2-甲基-2-戊基、3-甲基-2-戊基、4-甲基-2-戊基、2,2-二甲基-1-丁基、3,3-二甲基-1-丁基、2-乙基-1-丁基、丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基、正十一烷基、正十二烷基、正十三烷基、正十四烷基、正十五烷基、正十六烷基、正十七烷基、正十八烷基、正十九烷基或正二十烷基。在一些实施方案中，R2未被取代。在一些实施方案中，R2被取代。在一些实施方案中，R2选自由以下组成的组：
Figure BDA0003014376920000352
Figure BDA0003014376920000353
Figure BDA0003014376920000361
Figure BDA0003014376920000362
在一些实施方案中，R2为
Figure BDA0003014376920000363
在一些实施方案中，R2为
Figure BDA0003014376920000364
Figure BDA0003014376920000365
Figure BDA0003014376920000371
在一些实施方案中，每个Q为H或C1-C10线性或支化烷基。因此，在一些实施方案中，每个Q为H。在其他实施方案中，每个Q为C1-C10线性或支化烷基。例如，每个Q可以是甲基、乙基、正丙基、异丙基、2-甲基-1-丙基、2-甲基-2-丙基、2-甲基-1-丁基、3-甲基-1-丁基、2-甲基-3-丁基、2,2-二甲基-1-丙基、2-甲基-1-戊基、3-甲基-1-戊基、4-甲基-1-戊基、2-甲基-2-戊基、3-甲基-2-戊基、4-甲基-2-戊基、2,2-二甲基-1-丁基、3,3-二甲基-1-丁基、2-乙基-1-丁基、丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、正庚基、正辛基、正壬基或正癸基。在一些实施方案中，每个Q为甲基。
在一些实施方案中，每个J为–O–。在一些实施方案中，每个J为–NH–。
在一些实施方案中，每个E1独立地选自由以下组成的组：共价键、–N–、–O–、–S–、亚烷基、杂亚烷基、烯基、杂亚烯基、炔基、杂亚炔基。在一些实施方案中，每个E1为杂亚烷基。在一些实施方案中，每个E1为-CH2-O-。在一些实施方案中，每个n至少为1。例如，n可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些实施方案中，n为1。
在一些实施方案中，A为1至30个碳原子的线性或支化碳链、2至30个原子的线性或支化含杂原子碳链、含有3至30个碳原子的碳环，或含有3至30个原子的杂环。例如，在一些实施方案中，A为
Figure BDA0003014376920000381
在一些实施方案中，本公开的聚合物具有
Figure BDA0003014376920000382
的一般结构，其中波浪键
Figure BDA0003014376920000383
表示与聚合物的其余部分的键，并且其中R1、R2和R4具有本文所提供的任何定义。由于高度受控的连续线性低聚物生长和分支，因此所得聚合物具有线性链段和分支单元的更均匀分布，如上述结构中所示。如随后的部分和实施例中所述，所述聚合物具有强的DNA结合亲和力，并且可使DNA凝聚从而配制出具有接近100％细胞摄取效率的纳米尺寸的聚合复合物。在一些实施方案中，本公开的聚合物为
Figure BDA0003014376920000384
其中基团R2具有本文所提供的任何定义。
在一些实施方案中，本公开提供一种聚合物，其包含：
(a)
Figure BDA0003014376920000385
(b)
Figure BDA0003014376920000391
(c)
Figure BDA0003014376920000392
Figure BDA0003014376920000393
其中R1、R2、A、E1、G、J、Q、Z、Z”和n具有本文所提供的任何定义。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约3kDa至约200kDa的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约5kDa至约50kDa的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有介于约10kDa与50kDa之间的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约5kDa至约15kDa的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约10kDa的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约20kDa的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约30kDa的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约40kDa的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物的由马克-豪温克(Mark-Houwink)定义的α参数小于约0.5。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物的由马克-豪温克方程定义的α参数在约0.3至约0.5范围内。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约1.0至约8.0的PDI。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约2.5的PDI。
在一些实施方案中，本公开提供一种聚合物，其包含：
(a)
Figure BDA0003014376920000394
(b)
Figure BDA0003014376920000401
(c)
Figure BDA0003014376920000402
其中R1、R2、A、E1、G、J、Q、Z和n具有本文所提供的任何定义。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约3kDa至约200kDa的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约5kDa至约50kDa的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有介于约10kDa与50kDa之间的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约5kDa至约15kDa的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约10kDa的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约20kDa的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约30kDa的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约40kDa的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物的由马克-豪温克定义的α参数小于约0.5。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物的由马克-豪温克方程定义的α参数在约0.3至约0.5范围内。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约1.0至约8.0的PDI。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约2.5的PDI。
在一些实施方案中，本公开提供一种聚合物，其包含：
(a)
Figure BDA0003014376920000403
(b)
Figure BDA0003014376920000404
(c)
Figure BDA0003014376920000411
其中R1、R2、A、E1、G、J、Q、Z、Z”和n具有本文所提供的任何定义。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约3kDa至约200kDa的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约5kDa至约50kDa的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有介于约10kDa与50kDa之间的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约5kDa至约15kDa的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约10kDa的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约20kDa的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约30kDa的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约40kDa的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物的由马克-豪温克定义的α参数小于约0.5。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物的由马克-豪温克方程定义的α参数在约0.3至约0.5范围内。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约1.0至约8.0的PDI。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约2.5的PDI。
在一些进一步的实施方案中，所述聚合物包含：
(a)
Figure BDA0003014376920000412
(c)
Figure BDA0003014376920000413
在一些进一步的实施方案中，所述聚合物包含：
(a)
Figure BDA0003014376920000421
(c)
Figure BDA0003014376920000422
其中
J为O并且Z为
Figure BDA0003014376920000423
其中x为1-1000。
在一些进一步的实施方案中，所述聚合物包含：
(b)
Figure BDA0003014376920000424
在一些另外的实施方案中，R1选自
Figure BDA0003014376920000425
Figure BDA0003014376920000426
在一些进一步的实施方案中，R1为
Figure BDA0003014376920000427
在一些进一步的实施方案中，R1为
Figure BDA0003014376920000428
在一些另外的实施方案中，R2选自
Figure BDA0003014376920000429
在一些进一步的实施方案中，R2为
Figure BDA00030143769200004210
在一些进一步的实施方案中，R2为
Figure BDA00030143769200004211
在一些进一步的实施方案中，R1为
Figure BDA0003014376920000431
并且R2为
Figure BDA0003014376920000432
在一些进一步的实施方案中，R1为
Figure BDA0003014376920000433
并且R2为
Figure BDA0003014376920000434
在一些的实施方案中，所述聚合物包含：
(a)
Figure BDA0003014376920000435
(b)
Figure BDA0003014376920000436
(c)
Figure BDA0003014376920000437
其中
R1为
Figure BDA0003014376920000438
并且
R2选自
Figure BDA0003014376920000439
在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约3kDa至约200kDa的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约5kDa至约50kDa的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有介于约10kDa与50kDa之间的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约5kDa至约15kDa的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约10kDa的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约20kDa的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约30kDa的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约40kDa的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物的由马克-豪温克定义的α参数小于约0.5。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物的由马克-豪温克方程定义的α参数在约0.3至约0.5范围内。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约1.0至约8.0的PDI。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约2.5的PDI。
在一些的实施方案中，所述聚合物包含：
(a)
Figure BDA0003014376920000441
(b)
Figure BDA0003014376920000442
和
(c)
Figure BDA0003014376920000443
其中
J为O并且Z为
Figure BDA0003014376920000444
其中x为1-1000；
R1为
Figure BDA0003014376920000445
并且
R2为
Figure BDA0003014376920000446
在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约3kDa至约200kDa的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约5kDa至约50kDa的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有介于约10kDa与50kDa之间的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约5kDa至约15kDa的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约10kDa的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约20kDa的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约30kDa的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约40kDa的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物的由马克-豪温克定义的α参数小于约0.5。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物的由马克-豪温克方程定义的α参数在约0.3至约0.5范围内。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约1.0至约8.0的PDI。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约2.5的PDI。
在一些实施方案中，本公开的某些聚合物可描述为式(A)化合物和具有式R1-NH2或R1-N(H)-Z’-N(H)-R1的第一胺(如本文所述)的线性聚合物(低聚物)，其与式(B)化合物(如本文所述)交联。当在其中式(A)化合物与具有式R1-NH2或R1-N(H)-Z’-N(H)-R1的第一胺相比以摩尔过量存在的条件下制备线性低聚物时，所得低聚物物质以迈克尔受体基团(例如，丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺或另一此类基团)为末端，并且随后可在适当条件下用具有式R2-NH2或R2-N(H)-Z”-N(H)-R2的第二胺(如本文所述)封端。随后可使所得的一种或多种封端的低聚物与式(B)的三官能迈克尔受体化合物(如本文所述)反应以提供支化结构。此类交联聚合物可替代地由低聚物链段的分子量分布(例如，如本文所公开的在约3至约200范围内的Mw值)和由掺入式(B)的迈克尔受体化合物获得的交联的摩尔或重量百分比来限定。
在一些实施方案中，使摩尔过量的式(A)化合物与第一胺反应。例如，式(A)化合物与第一胺的化学计量比可在以下范围内：约1.1:1至约10:1，包括约1.1:1、约1.2:1、约1.3:1、约1.4:1、约1.5:1、约1.6:1、约1.7:1、约1.8:1、约1.9:1、约2:1、约3:1、约4:1、约5:1、约6:1、约7:1、约8:1、约9:1或约10:1，包括它们之间的所有范围。
在一些实施方案中，式(A)化合物与第一胺的化学计量比为约1.1:1、约1.2:1、约1.3:1、约1.4:1、约1.5:1、约1.6:1、约1.7:1、约1.8:1、约1.9:1、约2:1、约3:1、约4:1、约5:1、约6:1、约7:1、约8:1、约9:1或约10:1。在一些实施方案中，式(A)化合物与第一胺的化学计量比可在约1.1:1至约2:1范围内。在一些实施方案中，式(A)化合物与第一胺的化学计量比为约1.2:1。在一些实施方案中，使式(A)化合物与第一胺以摩尔当量(即约1:1)反应。
在一些实施方案中，步骤(a)在有机溶剂中进行。可在本公开的上下文中使用的各种各样的有机溶剂包括但不限于二甲亚砜(DMSO)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)等；酮，诸如丙酮、甲基乙基酮、甲基异丁基酮等；醚，诸如四氢呋喃(THF)、乙醚、甲基叔丁基醚等；烃，诸如甲苯、二甲苯、环己烷等。在一些实施方案中，步骤(a)在DMSO中进行。
在一些实施方案中，步骤(a)在以下范围内的温度下进行：约40℃至约120℃，包括约40℃、约41℃、约42℃、约43℃、约44℃、约45℃、约46℃、约47℃、约48℃、约49℃、约50℃、约51℃、约52℃、约53℃、约54℃、约55℃、约56℃、约57℃、约58℃、约59℃、约60℃、约61℃、约62℃、约63℃、约64℃、约65℃、约66℃、约67℃、约68℃、约69℃、约70℃、约71℃、约72℃、约73℃、约74℃、约75℃、约76℃、约77℃、约78℃、约79℃、约80℃、约81℃、约82℃、约83℃、约84℃、约85℃、约86℃、约87℃、约88℃、约89℃、约90℃、约91℃、约92℃、约93℃、约94℃、约95℃、约96℃、约97℃、约98℃、约99℃、约100℃、约101℃、约102℃、约103℃、约104℃、约105℃、约106℃、约107℃、约108℃、约109℃、约110℃、约111℃、约112℃、约113℃、约114℃、约115℃、约116℃、约117℃、约118℃、约119℃或120℃，包括它们之间的所有范围。
在一些实施方案中，步骤(a)在约40℃、约41℃、约42℃、约43℃、约44℃、约45℃、约46℃、约47℃、约48℃、约49℃、约50℃、约51℃、约52℃、约53℃、约54℃、约55℃、约56℃、约57℃、约58℃、约59℃、约60℃、约61℃、约62℃、约63℃、约64℃、约65℃、约66℃、约67℃、约68℃、约69℃、约70℃、约71℃、约72℃、约73℃、约74℃、约75℃、约76℃、约77℃、约78℃、约79℃、约80℃、约81℃、约82℃、约83℃、约84℃、约85℃、约86℃、约87℃、约88℃、约89℃、约90℃、约91℃、约92℃、约93℃、约94℃、约95℃、约96℃、约97℃、约98℃、约99℃、约100℃、约101℃、约102℃、约103℃、约104℃、约105℃、约106℃、约107℃、约108℃、约109℃、约110℃、约111℃、约112℃、约113℃、约114℃、约115℃、约116℃、约117℃、约118℃、约119℃或120℃下进行。在一些实施方案中，步骤(a)在约90℃下进行。
在一些实施方案中，步骤(a)的产物在步骤(b)之前未被纯化。在其他实施方案中，步骤(a)的产物在步骤(b)之前被纯化。步骤(a)的产物可通过本领域普通技术人员显而易见的各种方法和技术来纯化。
在一些实施方案中，将摩尔过量的第二胺添加至步骤(a)的产物中。例如，第二胺与步骤(a)的产物的化学计量比可在以下范围内：约1.1:1至约10:1，包括约1.1:1、约1.2:1、约1.3:1、约1.4:1、约1.5:1、约1.6:1、约1.7:1、约1.8:1、约1.9:1、约2:1、约3:1、约4:1、约5:1、约6:1、约7:1、约8:1、约9:1或约10:1，包括它们之间的所有范围。
在一些实施方案中，第二胺与步骤(a)的产物的化学计量比为约1.1:1、约1.2:1、约1.3:1、约1.4:1、约1.5:1、约1.6:1、约1.7:1、约1.8:1、约1.9:1、约2:1、约3:1、约4:1、约5:1、约6:1、约7:1、约8:1、约9:1或约10:1。在一些实施方案中，第二胺与步骤(a)的产物的化学计量比为约5:1。在一些实施方案中，使第二胺与步骤(a)的产物以摩尔当量(即约1:1)反应。
在一些实施方案中，步骤(b)在约16℃至约40℃范围的温度下进行。例如，步骤(b)在以下范围内的温度下进行：约16℃至约40℃、约17℃至约40℃、约18℃至约40℃、约19℃至约40℃、约20℃至约40℃、约21℃至约40℃、约22℃至约40℃、约23℃至约40℃、约24℃至约40℃、约25℃至约40℃、约26℃至约40℃、约27℃至约40℃、约28℃至约40℃、约29℃至约40℃、约30℃至约40℃、约31℃至约40℃、约32℃至约40℃、约33℃至约40℃、约34℃至约40℃、约35℃至约40℃、约36℃至约40℃、约37℃至约40℃、约38℃至约40℃、约39℃至约40℃，包括它们之间的所有范围。
在一些实施方案中，步骤(b)在约16℃、约17℃、约18℃、约19℃、约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃、约30℃、约31℃、约32℃、约33℃、约34℃、约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃或约40℃的温度下进行。
在一些实施方案中，步骤(b)的产物在步骤(c)之前未被纯化。在其他实施方案中，步骤(b)的产物在步骤(c)之前被纯化。步骤(b)的产物可通过本领域普通技术人员显而易见的各种方法和技术来纯化。例如，可通过透析纯化步骤(b)的产物。
在一些实施方案中，步骤(c)在高于步骤(b)的温度下进行。例如，步骤(c)在约21℃至约200℃范围内的温度下进行。例如，步骤(c)在以下范围内的温度下进行：约21℃至约200℃、约22℃至约200℃、约23℃至约200℃、约24℃至约200℃、约25℃至约200℃、约26℃至约200℃、约27℃至约200℃、约28℃至约200℃、约29℃至约200℃、约30℃至约200℃、约31℃至约200℃、约32℃至约200℃、约33℃至约200℃、约34℃至约200℃、约35℃至约200℃、约36℃至约200℃、约37℃至约200℃、约38℃至约200℃、约39℃至约200℃、约40℃至约200℃、约41℃至约200℃、约42℃至约200℃、约43℃至约200℃、约44℃至约200℃、约45℃至约200℃、约46℃至约200℃、约47℃至约200℃、约48℃至约200℃、约49℃至约200℃、约50℃至约200℃、约51℃至约200℃、约52℃至约200℃、约53℃至约200℃、约54℃至约200℃、约55℃至约200℃、约56℃至约200℃、约57℃至约200℃、约58℃至约200℃、约59℃至约200℃、约60℃至约200℃、约61℃至约200℃、约62℃至约200℃、约63℃至约200℃、约64℃至约200℃、约65℃至约200℃、约66℃至约200℃、约67℃至约200℃、约68℃至约200℃、约69℃至约200℃、约70℃至约200℃、约71℃至约200℃、约72℃至约200℃、约73℃至约200℃、约74℃至约200℃、约75℃至约200℃、约76℃至约200℃、约77℃至约200℃、约78℃至约200℃、约79℃至约200℃、约80℃至约200℃、约81℃至约200℃、约82℃至约200℃、约83℃至约200℃、约84℃至约200℃、约85℃至约200℃、约86℃至约200℃、约87℃至约200℃、约88℃至约200℃、约89℃至约200℃、约90℃至约200℃、约91℃至约200℃、约92℃至约200℃、约93℃至约200℃、约94℃至约200℃、约95℃至约200℃、约96℃至约200℃、约97℃至约200℃、约98℃至约200℃、约99℃至约200℃、约100℃至约200℃、约101℃至约200℃、约102℃至约200℃、约103℃至约200℃、约104℃至约200℃、约105℃至约200℃、约106℃至约200℃、约107℃至约200℃、约108℃至约200℃、约109℃至约200℃、约110℃至约200℃、约111℃至约200℃、约112℃至约200℃、约113℃至约200℃、约114℃至约200℃、约115℃至约200℃、约116℃至约200℃、约117℃至约200℃、约118℃至约200℃、约119℃至约200℃、约120℃至约200℃、约121℃至约200℃、约122℃至约200℃、约123℃至约200℃、约124℃至约200℃、约125℃至约200℃、约126℃至约200℃、约127℃至约200℃、约128℃至约200℃、约129℃至约200℃、约130℃至约200℃、约131℃至约200℃、约132℃至约200℃、约133℃至约200℃、约134℃至约200℃、约135℃至约200℃、约136℃至约200℃、约137℃至约200℃、约138℃至约200℃、约139℃至约200℃、约140℃至约200℃、约141℃至约200℃、约142℃至约200℃、约143℃至约200℃、约144℃至约200℃、约145℃至约200℃、约146℃至约200℃、约147℃至约200℃、约148℃至约200℃、约149℃至约200℃、约150℃至约200℃、约151℃至约200℃、约152℃至约200℃、约153℃至约200℃、约154℃至约200℃、约155℃至约200℃、约156℃至约200℃、约157℃至约200℃、约158℃至约200℃、约159℃至约200℃、约160℃至约200℃、约161℃至约200℃、约162℃至约200℃、约163℃至约200℃、约164℃至约200℃、约165℃至约200℃、约166℃至约200℃、约167℃至约200℃、约168℃至约200℃、约169℃至约200℃、约170℃至约200℃、约171℃至约200℃、约172℃至约200℃、约173℃至约200℃、约174℃至约200℃、约175℃至约200℃、约176℃至约200℃、约177℃至约200℃、约178℃至约200℃、约179℃至约200℃、约180℃至约200℃、约181℃至约200℃、约182℃至约200℃、约183℃至约200℃、约184℃至约200℃、约185℃至约200℃、约186℃至约200℃、约187℃至约200℃、约188℃至约200℃、约189℃至约200℃、约190℃至约200℃、约191℃至约200℃、约192℃至约200℃、约193℃至约200℃、约194℃至约200℃、约195℃至约200℃、约196℃至约200℃、约197℃至约200℃、约198℃至约200℃、约199℃至约200℃，包括它们之间的所有范围。
在一些实施方案中，步骤(c)在约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃、约30℃、约31℃、约32℃、约33℃、约34℃、约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃、约40℃、约41℃、约42℃、约43℃、约44℃、约45℃、约46℃、约47℃、约48℃、约49℃、约50℃、约51℃、约52℃、约53℃、约54℃、约55℃、约56℃、约57℃、约58℃、约59℃、约60℃、约61℃、约62℃、约63℃、约64℃、约65℃、约66℃、约67℃、约68℃、约69℃、约70℃、约71℃、约72℃、约73℃、约74℃、约75℃、约76℃、约77℃、约78℃、约79℃、约80℃、约81℃、约82℃、约83℃、约84℃、约85℃、约86℃、约87℃、约88℃、约89℃、约90℃、约91℃、约92℃、约93℃、约94℃、约95℃、约96℃、约97℃、约98℃、约99℃、约100℃、约101℃、约102℃、约103℃、约104℃、约105℃、约106℃、约107℃、约108℃、约109℃、约110℃、约111℃、约112℃、约113℃、约114℃、约115℃、约116℃、约117℃、约118℃、约119℃、约120℃、约121℃、约122℃、约123℃、约124℃、约125℃、约126℃、约127℃、约128℃、约129℃、约130℃、约131℃、约132℃、约133℃、约134℃、约135℃、约136℃、约137℃、约138℃、约139℃、约140℃、约141℃、约142℃、约143℃、约144℃、约145℃、约146℃、约147℃、约148℃、约149℃、约150℃、约151℃、约152℃、约153℃、约154℃、约155℃、约156℃、约157℃、约158℃、约159℃、约160℃、约161℃、约162℃、约163℃、约164℃、约165℃、约166℃、约167℃、约168℃、约169℃、约170℃、约171℃、约172℃、约173℃、约174℃、约175℃、约176℃、约177℃、约178℃、约179℃、约180℃、约181℃、约182℃、约183℃、约184℃、约185℃、约186℃、约187℃、约188℃、约189℃、约190℃、约191℃、约192℃、约193℃、约194℃、约195℃、约196℃、约197℃、约198℃、约199℃或约200℃下进行。在一些实施方案中，步骤(c)在约90℃下进行。
在一些实施方案中，本公开提供了式(I)聚合物：
Figure BDA0003014376920000511
其中
每个A独立地为1至30个碳原子的线性或支化碳链、1至30个原子的线性或支化含杂原子碳链、含有3至30个碳原子的碳环，或含有3至30个原子的杂环；
其中A任选地被一个或多个以下基团取代：卤素、羟基、氨基、磺酰基、磺酰胺基、巯基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6醚、C1-C6硫醚、C1-C6砜、C1-C6亚砜、C1-C6伯酰胺、C1-C6仲酰胺、卤代C1-C6烷基、羧基、氰基、硝基、亚硝基、-OC(O)NR′R′、-N(R′)C(O)NR′R′、-N(R′)C(O)O-C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C3-C6杂环基、C2-C5杂芳基或C6-C10芳基；其中每个R′独立地选自由氢和C1-C6烷基组成的组；
每个B独立地为
Figure BDA0003014376920000521
G是–C–、–S–、–S(O)–、–P(OR1)–或–P(OH)–；n为至少1；
每个E1选自由以下组成的组：共价键、–N–、–O–、–S–、亚烷基、杂亚烷基、烯基、杂亚烯基、炔基、杂亚炔基；
每个E2选自由以下组成的组：共价键、–N–、–O–、–S–、亚烷基、杂亚烷基、烯基、杂亚烯基、炔基、杂亚炔基
每个X独立地为
Figure BDA0003014376920000522
Figure BDA0003014376920000523
每个Y独立地为
Figure BDA0003014376920000524
每个L独立地为第二连接部分；
每个R1、R2和R3在每次出现时均独立地为H、C1-C40烷基、C1-C40杂烷基、C2-C40烯基、C2-C40杂亚烯基、C4-C8环烯基、C2-C40炔基、C2-C40杂亚炔基、C3-C8环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；其中所述杂环基和杂芳基含有1-5个选自由N、S、P和O组成的组的杂原子；其中所述C1-C6烷基、C2-C8烯基、C4-C8环烯基、C2-C6炔基、C3-C8环烷基、杂环基、芳基和杂芳基任选地被D、卤素、C1-C6烷基、-OH、-O-C1-C6烷基、-NH2、-NH(C1-C6烷基)或-N(C1-C6烷基)2取代；或
其中R2和R3与它们所连接的原子一起可形成含有1-3个选自由N、S、P和O组成的组的杂原子的杂环基或杂芳基；
a为1-1000；
b为3或4；
c为1-3；并且
z为1-100；
条件是R2和R3中的至少一者不为H，并且当G为C时，E1不为-CH2-O-。
在某些实施方案中，本公开提供了式(II)聚合物：
Figure BDA0003014376920000531
其中，
每个E1选自由以下组成的组：共价键、–N–、–O–、–S–、亚烷基、杂亚烷基、烯基、杂亚烯基、炔基、杂亚炔基；
每个E2选自由以下组成的组：共价键、–N–、–O–、–S–、亚烷基、杂亚烷基、烯基、杂亚烯基、炔基、杂亚炔基；
G为–C–、–S–、–S(O)–、–P(OR1)–或–P(OH)–；并且
n至少为1，
条件是当G为C时，E1不为-CH2-O-。
在一些实施方案中，每个E1和E2独立地选自由以下组成的组：共价键、–N–、–S–、亚烷基、杂亚烷基、烯基、杂亚烯基、炔基、杂亚炔基。在一些实施方案中，每个E1为杂亚烷基。在一些实施方案中，每个E1为–CH2–N–。在一些实施方案中，每个E2为亚烷基。在一些实施方案中，每个E2为
Figure BDA0003014376920000541
Figure BDA0003014376920000542
在一些实施方案中，每个E2为
Figure BDA0003014376920000543
在一些实施方案中，每个n至少为1。例如，n可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些实施方案中，n为1。在一些实施方案中，G为–C–。在一些实施方案中，每个B为
Figure BDA0003014376920000544
Figure BDA0003014376920000545
在一些实施方案中，每个L为
Figure BDA0003014376920000546
其中x为1-1000。在一些实施方案中，a至少为2，b为3，并且每个X为
Figure BDA0003014376920000547
在一些实施方案中，每个A为
Figure BDA0003014376920000548
在一些实施方案中，每个L为
Figure BDA0003014376920000549
在一些实施方案中，每个R2和/或R3为
Figure BDA00030143769200005410
在一些实施方案中，每个R1为
Figure BDA00030143769200005411
在一些实施方案中，本公开提供了式(III)至(VIIe)的聚合物：
Figure BDA0003014376920000551
Figure BDA0003014376920000561
Figure BDA0003014376920000571
其中R5、R6和R7中的每一者在每次出现时独立地为H、C1-C40烷基、C1-C40杂烷基、C2-C40烯基、C2-C40杂亚烯基、C4-C8环烯基、C2-C40炔基、C2-C40杂亚炔基、C3-C8环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；其中所述杂环基和杂芳基含有1-5个选自由N、S、P和O组成的组的杂原子；其中所述C1-C6烷基、C2-C8烯基、C4-C8环烯基、C2-C6炔基、C3-C8环烷基、杂环基、芳基和杂芳基任选地被D、卤素、C1-C6烷基、-OH、-O-C1-C6烷基、-NH2、-NH(C1-C6烷基)或-N(C1-C6烷基)2取代；并且其余变量如上文所定义。
在一些实施方案中，z为1、2或3。在一些实施方案中，z为1。
由马克-豪温克方程定义的α参数参照马克-豪温克图。马克-豪温克图是用于研究溶液中的聚合物结构的强大工具，因为它以高灵敏度清楚地揭示了结构-分子量关系。它是通过将分子量(MW)相对于固有粘度(IV)标绘在重对数图上而产生。当然，分子量指示聚合物链的长度(或聚合度)，但其本身不能给出任何结构指示。固有粘度(以dL/g表示)是对溶液中聚合物链的分子密度的量度。链在溶液中折叠或卷曲得越紧，密度越高且固有粘度越低。这种测量不依赖于分子量，因此具有相同分子量的两种不同结构可具有不同的固有粘度，例如，相同分子量的线性(未支化)聚合物和支化聚合物将具有不同的固有粘度。此外，如果聚合物在其分子量分布上改变结构(例如变得被更多地取代)，则将容易检测到固有粘度变化。这就是马克-豪温克图如此有用且强大的原因。通过将来自光散射检测器的分子量与来自粘度计检测器的固有粘度组合而从高质量多检测GPC/SEC数据方便且简单地获得用于马克-豪温克图的原始数据。在样品的洗脱谱上的每个点处测量这两个数据集。所得到的图可以从简单地评估两种结构有多接近到对聚合物分支进行复杂的定量测量的许多方式使用。一般来说：α<0.5：致密/球形链；0.5<α<0.8：无规卷曲/柔性链；0.5<α<0.8：刚性棒状/硬性链。
在一些实施方案中，本公开的聚合物的由马克-豪温克方程定义的α参数小于约0.5。例如，本公开的聚合物的由马克-豪温克方程定义的α参数在约0.01至约0.49范围内。例如，本公开的聚合物的由马克-豪温克方程定义的α参数在以下范围内：约0.01至约0.49、约0.02至约0.49、约0.03至约0.49、约0.04至约0.49、约0.05至约0.49、约0.06至约0.49、约0.07至约0.49、约0.08至约0.49、约0.09至约0.49、约0.10至约0.49、约0.11至约0.49、约0.12至约0.49、约0.13至约0.49、约0.14至约0.49、约0.15至约0.49、约0.16至约0.49、约0.17至约0.49、约0.18至约0.49、约0.19至约0.49、约0.20至约0.49、约0.21至约0.49、约0.22至约0.49、约0.23至约0.49、约0.24至约0.49、约0.25至约0.49、约0.26至约0.49、约0.27至约0.49、约0.28至约0.49、约0.29至约0.49、约0.30至约0.49、约0.31至约0.49、约0.32至约0.49、约0.33至约0.49、约0.34至约0.49、约0.35至约0.49、约0.36至约0.49、约0.37至约0.49、约0.38至约0.49、约0.39至约0.49、约0.40至约0.49、约0.41至约0.49、约0.42至约0.49、约0.43至约0.49、约0.44至约0.49、约0.45至约0.49、约0.46至约0.49、约0.47至约0.49、约0.48至约0.49，包括它们之间的所有范围。在一些实施方案中，本公开的聚合物的由马克-豪温克方程定义的α参数为约0.2至约0.5。
在一些实施方案中，本公开的聚合物的由马克-豪温克方程定义的α参数为约0.01、约0.02、约0.03、约0.04、约0.05、约0.06、约0.07、约0.08、约0.09、约0.10、约0.11、约0.12、约0.13、约0.14、约0.15、约0.16、约0.17、约0.18、约0.19、约0.20、约0.21、约0.22、约0.23、约0.24、约0.25、约0.26、约0.27、约0.28、约0.29、约0.30、约0.31、约0.32、约0.33、约0.34、约0.35、约0.36、约0.37、约0.38、约0.39、约0.40、约0.41、约0.42、约0.43、约0.44、约0.45、约0.46、约0.47、约0.48或约0.49。
术语“多分散性指数”(PDI)是指给定聚合物样品中的分子质量分布的量度。通过将重均分子量(Mw)除以数均分子量(Mn)来计算多分散性指数。如本文所用的术语“重均分子量”一般是指取决于聚合物分子根据其尺寸的贡献的分子量测量值。如本文所用的术语“数均分子量”一般是指通过用样品中所有聚合物分子的总重量除以样品中聚合物分子的总数计算出的分子量测量值。这些术语是本领域普通技术人员众所周知的。
在一些实施方案中，本公开的聚合物具有约1.01至约8.0的PDI。例如，PDI可在以下范围内：约1.01至约8.0、约1.02至约8.0、约1.03至约8.0、约1.04至约8.0、约1.05至约8.0、约1.06至约8.0、约1.07至约8.0、约1.08至约8.0、约1.09至约8.0、约1.1至约8.0、约1.2至约8.0、约1.3至约8.0、约1.4至约8.0、约1.5至约8.0、约1.6至约8.0、约1.7至约8.0、约1.8至约8.0、约1.9至约8.0、约2.0至约8.0、约2.1至约8.0、约2.2至约8.0、约2.3至约8.0、约2.4至约8.0、约2.5至约8.0、约2.6至约8.0、约2.7至约8.0、约2.8至约8.0、约2.9至约8.0、约3.0至约8.0、约3.1至约8.0、约3.2至约8.0、约3.3至约8.0、约3.4至约8.0、约3.5至约8.0、约3.6至约8.0、约3.7至约8.0、约3.8至约8.0、约3.9至约8.0、约4.0至约8.0、约4.1至约8.0、约4.2至约8.0、约4.3至约8.0、约4.4至约8.0、约4.5至约8.0、约4.6至约8.0、约4.7至约8.0、约4.8至约8.0、约4.9至约8.0、约5.0至约8.0、约5.1至约8.0、约5.2至约8.0、约5.3至约8.0、约5.4至约8.0、约5.5至约8.0、约5.6至约8.0、约5.7至约8.0、约5.8至约8.0、约5.9至约8.0、约6.0至约8.0、约6.1至约8.0、约6.2至约8.0、约6.3至约8.0、约6.4至约8.0、约6.5至约8.0、约6.6至约8.0、约6.7至约8.0、约6.8至约8.0、约6.9至约8.0、约7.0至约8.0、约7.1至约8.0、约7.2至约8.0、约7.3至约8.0、约7.4至约8.0、约7.5至约8.0、约7.6至约8.0、约7.7至约8.0、约7.8至约8.0、约7.9至约8.0，包括它们之间的所有范围。
在一些实施方案中，本公开的聚合物具有约1.01、约1.02、约1.03、约1.04、约1.05、约1.06、约1.07、约1.08、约1.09、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9、约2.0、约2.1、约2.2、约2.3、约2.4、约2.5、约2.6、约2.7、约2.8、约2.9、约3.0、约3.1、约3.2、约3.3、约3.4、约3.5、约3.6、约3.7、约3.8、约3.9、约4.0、约4.1、约4.2、约4.3、约4.4、约4.5、约4.6、约4.7、约4.8、约4.9、约5.0、约5.1、约5.2、约5.3、约5.4、约5.5、约5.6、约5.7、约5.8、约5.9、约6.0、约6.1、约6.2、约6.3、约6.4、约6.5、约6.6、约6.7、约6.8、约6.9、约7.0、约7.1、约7.2、约7.3、约7.4、约7.5、约7.6、约7.7、约7.8、约7.9或约8.0的PDI。在一些实施方案中，本公开的聚合物具有约2.5的PDI。
在一些实施方案中，本公开的聚合物具有至少3kDa的MW。在一些实施方案中，本公开的聚合物具有约3kDa至约200kDa的MW。因此，本公开的聚合物具有在以下范围内的MW：约3kDa至约200kDa、约4kDa至约200kDa、约5kDa至约200kDa、约6kDa至约200kDa、约7kDa至约200kDa、约8kDa至约200kDa、约9kDa至约200kDa、约10kDa至约200kDa、约11kDa至约200kDa、约12kDa至约200kDa、约13kDa至约200kDa、约14kDa至约200kDa、约15kDa至约200kDa、约16kDa至约200kDa、约17kDa至约200kDa、约18kDa至约200kDa、约19kDa至约200kDa、约20kDa至约200kDa、约21kDa至约200kDa、约22kDa至约200kDa、约23kDa至约200kDa、约24kDa至约200kDa、约25kDa至约200kDa、约26kDa至约200kDa、约27kDa至约200kDa、约28kDa至约200kDa、约29kDa至约200kDa、约30kDa至约200kDa、约31kDa至约200kDa、约32kDa至约200kDa、约33kDa至约200kDa、约34kDa至约200kDa、约35kDa至约200kDa、约36kDa至约200kDa、约37kDa至约200kDa、约38kDa至约200kDa、约39kDa至约200kDa、约40kDa至约200kDa、约41kDa至约200kDa、约42kDa至约200kDa、约43kDa至约200kDa、约44kDa至约200kDa、约45kDa至约200kDa、约46kDa至约200kDa、约47kDa至约200kDa、约48kDa至约200kDa、约49kDa至约200kDa、约50kDa至约200kDa、约51kDa至约200kDa、约52kDa至约200kDa、约53kDa至约200kDa、约54kDa至约200kDa、约55kDa至约200kDa、约56kDa至约200kDa、约57kDa至约200kDa、约58kDa至约200kDa、约59kDa至约200kDa、约60kDa至约200kDa、约61kDa至约200kDa、约62kDa至约200kDa、约63kDa至约200kDa、约64kDa至约200kDa、约65kDa至约200kDa、约66kDa至约200kDa、约67kDa至约200kDa、约68kDa至约200kDa、约69kDa至约200kDa、约70kDa至约200kDa、约71kDa至约200kDa、约72kDa至约200kDa、约73kDa至约200kDa、约74kDa至约200kDa、约75kDa至约200kDa、约76kDa至约200kDa、约77kDa至约200kDa、约78kDa至约200kDa、约79kDa至约200kDa、约80kDa至约200kDa、约81kDa至约200kDa、约82kDa至约200kDa、约83kDa至约200kDa、约84kDa至约200kDa、约85kDa至约200kDa、约86kDa至约200kDa、约87kDa至约200kDa、约88kDa至约200kDa、约89kDa至约200kDa、约90kDa至约200kDa、约91kDa至约200kDa、约92kDa至约200kDa、约93kDa至约200kDa、约94kDa至约200kDa、约95kDa至约200kDa、约96kDa至约200kDa、约97kDa至约200kDa、约98kDa至约200kDa、约99kDa至约200kDa、约100kDa至约200kDa、约101kDa至约200kDa、约102kDa至约200kDa、约103kDa至约200kDa、约104kDa至约200kDa、约105kDa至约200kDa、约106kDa至约200kDa、约107kDa至约200kDa、约108kDa至约200kDa、约109kDa至约200kDa、约110kDa至约200kDa、约111kDa至约200kDa、约112kDa至约200kDa、约113kDa至约200kDa、约114kDa至约200kDa、约115kDa至约200kDa、约116kDa至约200kDa、约117kDa至约200kDa、约118kDa至约200kDa、约119kDa至约200kDa、约120kDa至约200kDa、约121kDa至约200kDa、约122kDa至约200kDa、约123kDa至约200kDa、约124kDa至约200kDa、约125kDa至约200kDa、约126kDa至约200kDa、约127kDa至约200kDa、约128kDa至约200kDa、约129kDa至约200kDa、约130kDa至约200kDa、约131kDa至约200kDa、约132kDa至约200kDa、约133kDa至约200kDa、约134kDa至约200kDa、约135kDa至约200kDa、约136kDa至约200kDa、约137kDa至约200kDa、约138kDa至约200kDa、约139kDa至约200kDa、约140kDa至约200kDa、约141kDa至约200kDa、约142kDa至约200kDa、约143kDa至约200kDa、约144kDa至约200kDa、约145kDa至约200kDa、约146kDa至约200kDa、约147kDa至约200kDa、约148kDa至约200kDa、约149kDa至约200kDa、约150kDa至约200kDa、约151kDa至约200kDa、约152kDa至约200kDa、约153kDa至约200kDa、约154kDa至约200kDa、约155kDa至约200kDa、约156kDa至约200kDa、约157kDa至约200kDa、约158kDa至约200kDa、约159kDa至约200kDa、约160kDa至约200kDa、约161kDa至约200kDa、约162kDa至约200kDa、约163kDa至约200kDa、约164kDa至约200kDa、约165kDa至约200kDa、约166kDa至约200kDa、约167约168kDa至约200kDa、约169kDa至约200kDa、约170kDa至约200kDa、约171kDa至约200kDa、约172kDa至约200kDa、约173kDa至约200kDa、约174kDa至约200kDa、约175kDa至约200kDa、约176kDa至约200kDa、约177kDa至约200kDa、约178kDa至约200kDa、约179kDa至约200kDa、约180kDa至约200kDa、约181kDa至约200kDa、约182kDa至约200kDa、约183kDa至约200kDa、约184kDa至约200kDa、约185kDa至约200kDa、约186kDa至约200kDa、约187kDa至约200kDa、约188kDa至约200kDa、约189kDa至约200kDa、约190kDa至约200kDa、约191kDa至约200kDa、约192kDa至约200kDa、约193kDa至约200kDa、约194kDa至约200kDa、约195kDa至约200kDa、约196kDa至约200kDa、约197kDa至约200kDa、约198kDa至约200kDa、约199kDa至约200kDa，包括它们之间的所有范围。在一些实施方案中，所述聚合物具有介于约5kDa与50kDa之间的MW。在一些实施方案中，所述聚合物具有介于约10kDa与50kDa之间的MW。
在一些实施方案中，本公开的聚合物具有约3kDa、约4kDa、约5kDa、约6kDa、约7kDa、约8kDa、约9kDa、约10kDa、约11kDa、约12kDa、约13kDa、约14kDa、约15kDa、约16kDa、约17kDa、约18kDa、约19kDa、约20kDa、约21kDa、约22kDa、约23kDa、约24kDa、约25kDa、约26kDa、约27kDa、约28kDa、约29kDa、约30kDa、约31kDa、约32kDa、约33kDa、约34kDa、约35kDa、约36kDa、约37kDa、约38kDa、约39kDa、约40kDa、约41kDa、约42kDa、约43kDa、约44kDa、约45kDa、约46kDa、约47kDa、约48kDa、约49kDa、约50kDa、约51kDa、约52kDa、约53kDa、约54kDa、约55kDa、约56kDa、约57kDa、约58kDa、约59kDa、约60kDa、约61kDa、约62kDa、约63kDa、约64kDa、约65kDa、约66kDa、约67kDa、约68kDa、约69kDa、约70kDa、约71kDa、约72kDa、约73kDa、约74kDa、约75kDa、约76kDa、约77kDa、约78kDa、约79kDa、约80kDa、约81kDa、约82kDa、约83kDa、约84kDa、约85kDa、约86kDa、约87kDa、约88kDa、约89kDa、约90kDa、约91kDa、约92kDa、约93kDa、约94kDa、约95kDa、约96kDa、约97kDa、约98kDa、约99kDa、约100kDa、约101kDa、约102kDa、约103kDa、约104kDa、约105kDa、约106kDa、约107kDa、约108kDa、约109kDa、约110kDa、约111kDa、约112kDa、约113kDa、约114kDa、约115kDa、约116kDa、约117kDa、约118kDa、约119kDa、约120kDa、约121kDa、约122kDa、约123kDa、约124kDa、约125kDa、约126kDa、约127kDa、约128kDa、约129kDa、约130kDa、约131kDa、约132kDa、约133kDa、约134kDa、约135kDa、约136kDa、约137kDa、约138kDa、约139kDa、约140kDa、约141kDa、约142kDa、约143kDa、约144kDa、约145kDa、约146kDa、约147kDa、约148kDa、约149kDa、约150kDa、约151kDa、约152kDa、约153kDa、约154kDa、约155kDa、约156kDa、约157kDa、约158kDa、约159kDa、约160kDa、约161kDa、约162kDa、约163kDa、约164kDa、约165kDa、约166kDa、约167约168kDa、约169kDa、约170kDa、约171kDa、约172kDa、约173kDa、约174kDa、约175kDa、约176kDa、约177kDa、约178kDa、约179kDa、约180kDa、约181kDa、约182kDa、约183kDa、约184kDa、约185kDa、约186kDa、约187kDa、约188kDa、约189kDa、约190kDa、约191kDa、约192kDa、约193kDa、约194kDa、约195kDa、约196kDa、约197kDa、约198kDa、约199kDa、至约200kDa的MW。在一些实施方案中，所述聚合物具有介于约5kDa与50kDa之间的MW。在一些实施方案中，所述聚合物具有介于约10kDa与50kDa之间的MW。在一些实施方案中，所述聚合物具有约10kDa的MW。在一些实施方案中，所述聚合物具有约20kDa的MW。在一些实施方案中，所述聚合物具有约30kDa的MW。在一些实施方案中，所述聚合物具有约40kDa的MW。
在一些实施方案中，步骤(b)之后的产物具有约3kDa的MW。在一些实施方案中，步骤(b)之后的产物有约10kDa的MW。在一些实施方案中，步骤(b)之后的产物有约20kDa的MW。在一些实施方案中，步骤(b)之后的产物有约30kDa的MW。在一些实施方案中，步骤(b)之后的产物有约40kDa的MW。
制备方法
在一些实施方案中，本公开提供了一种制备聚合物的方法，所述方法包括：
(a)使式(A)化合物
Figure BDA0003014376920000651
与具有式R1-NH2或R1-N(H)-Z’-N(H)-R1的第一胺反应；
(b)使步骤(a)的产物与具有式R2-NH2或R2-N(H)-Z”-N(H)-R2的第二胺反应；以及
(c)使步骤(b)的产物与式(B)化合物反应：
Figure BDA0003014376920000661
其中
每个J独立地为–O–或–NH–；
Z、Z’和Z”为连接部分；
A为1至30个碳原子的线性或支化碳链、2至30个原子的线性或支化含杂原子碳链、含有3至30个碳原子的碳环，或含有3至30个原子的杂环；
其中A任选地被一个或多个以下基团取代：卤素、羟基、氨基、磺酰基、磺酰胺基、巯基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6醚、C1-C6硫醚、C1-C6砜、C1-C6亚砜、C1-C6伯酰胺、C1-C6仲酰胺、卤代C1-C6烷基、羧基、氰基、硝基、亚硝基、-OC(O)NR′R′、-N(R′)C(O)NR′R′、-N(R′)C(O)O-C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C3-C6杂环基、C2-C5杂芳基或C6-C10芳基；其中每个R′独立地选自由氢和C1-C6烷基组成的组；
G为–C–、–S–、–S(O)–、–P(OR1)–或–P(OH)–；
每个Q为H或C1-C10线性或支化烷基；
每个E1独立地选自由以下组成的组：共价键、–N–、–O–、–S–、亚烷基、杂亚烷基、烯基、杂亚烯基、炔基、杂亚炔基；
R1和R2各自独立地为C1-C40烷基、C1-C40杂烷基、C2-C40烯基、C2-C40杂亚烯基、C4-C8环烯基、C2-C40炔基、C2-C40杂亚炔基、C3-C8环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；其中所述杂环基和杂芳基含有1-5个选自由N、S、P和O组成的组的杂原子；其中所述C1-C40烷基、C2-C40烯基、C4-C8环烯基、C2-C40炔基、C3-C8环烷基、杂环基、芳基和杂芳基任选地被D、卤素、C1-C6烷基、-OH、-O-C1-C6烷基、-NH2、-NH(C1-C6烷基)或-N(C1-C6烷基)2取代；并且R1未被取代或被以下中的至少一者取代：卤素、羟基、氨基、磺酰基、磺酰胺基、巯基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6醚、C1-C6硫醚、C1-C6砜、C1-C6亚砜、C1-C6伯酰胺、C1-C6仲酰胺、卤代C1-C6烷基、羧基、氰基、硝基、亚硝基、-OC(O)NR′R′、-N(R′)C(O)NR′R′、-N(R′)C(O)O-C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C3-C6杂环基、C2-C5杂芳基和C6-C10)芳基；其中每个R′独立地选自由氢和C1-C6烷基组成的组；并且
每个n至少为1。
在一些实施方案中，本公开提供了一种制备聚合物的方法，所述方法包括：
(a)使式(A)化合物
Figure BDA0003014376920000671
和式(B)化合物：
Figure BDA0003014376920000672
与具有式R1-NH2或R1-N(H)-Z’-N(H)-R1的第一胺反应；
(b)使步骤(a)的产物与具有式R2-NH2或R2-N(H)-Z”-N(H)-R2的第二胺反应；
其中
每个J独立地为–O–或–NH–；
Z、Z’和Z”为连接部分；
A为1至30个碳原子的线性或支化碳链、2至30个原子的线性或支化含杂原子碳链、含有3至30个碳原子的碳环，或含有3至30个原子的杂环；
其中A任选地被一个或多个以下基团取代：卤素、羟基、氨基、磺酰基、磺酰胺基、巯基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6醚、C1-C6硫醚、C1-C6砜、C1-C6亚砜、C1-C6伯酰胺、C1-C6仲酰胺、卤代C1-C6烷基、羧基、氰基、硝基、亚硝基、-OC(O)NR′R′、-N(R′)C(O)NR′R′、-N(R′)C(O)O-C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C3-C6杂环基、C2-C5杂芳基或C6-C10芳基；其中每个R′独立地选自由氢和C1-C6烷基组成的组；
G为–C–、–S–、–S(O)–、–P(OR1)–或–P(OH)–；
每个Q为H或C1-C10线性或支化烷基；
每个E1独立地选自由以下组成的组：共价键、–N–、–O–、–S–、亚烷基、杂亚烷基、烯基、杂亚烯基、炔基、杂亚炔基；
R1和R2各自独立地为C1-C40烷基、C1-C40杂烷基、C2-C40烯基、C2-C40杂亚烯基、C4-C8环烯基、C2-C40炔基、C2-C40杂亚炔基、C3-C8环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；其中所述杂环基和杂芳基含有1-5个选自由N、S、P和O组成的组的杂原子；其中所述C1-C40烷基、C2-C40烯基、C4-C8环烯基、C2-C40炔基、C3-C8环烷基、杂环基、芳基和杂芳基任选地被D、卤素、C1-C6烷基、-OH、-O-C1-C6烷基、-NH2、-NH(C1-C6烷基)或-N(C1-C6烷基)2取代；并且R1未被取代或被以下中的至少一者取代：卤素、羟基、氨基、磺酰基、磺酰胺基、巯基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6醚、C1-C6硫醚、C1-C6砜、C1-C6亚砜、C1-C6伯酰胺、C1-C6仲酰胺、卤代C1-C6烷基、羧基、氰基、硝基、亚硝基、-OC(O)NR′R′、-N(R′)C(O)NR′R′、-N(R′)C(O)O-C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C3-C6杂环基、C2-C5杂芳基和C6-C10)芳基；其中每个R′独立地选自由氢和C1-C6烷基组成的组；并且
每个n至少为1。
在一些实施方案中，Z为1至30个碳原子的线性或支化碳链、1至30个原子的线性或支化含杂原子碳链、含有3至30个碳原子的碳环、含有3至30个碳原子的亚烷基-碳环、含有3至30个原子的杂环，或含有3至30个原子的亚烷基-杂环。Z可未被取代或被以下中的至少一者取代：卤素、羟基、氨基、磺酰基、磺酰胺基、巯基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6醚、C1-C6硫醚、C1-C6砜、C1-C6亚砜、C1-C6伯酰胺、C1-C6仲酰胺、卤代C1-C6烷基、羧基、氰基、硝基、亚硝基、-OC(O)NR′R′、-N(R′)C(O)NR′R′、-N(R′)C(O)O-C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C3-C6杂环基、C2-C5杂芳基和C6-C10芳基；其中每个R′独立地选自由氢和C1-C6烷基组成的组。在一些实施方案中，Z为1至30个碳原子的线性碳链。例如，Z可以是亚烷基，包括但不限于C1-C24亚烷基、C1-C20亚烷基、C1-C16亚烷基、C1-C12亚烷基、C1-C8亚烷基、C1-C6亚烷基、C1-C4亚烷基、C1-C3亚烷基、C1-C2亚烷基、C1亚烷基。代表性的亚烷基包括但不限于亚甲基、亚乙基、亚丙基、正亚丁基、亚乙烯基、亚丙烯基、正亚丁烯基、亚丙炔基、正亚丁炔基等。在一些实施方案中，Z为1至30个碳原子的线性或支化碳链，或1至30个原子的线性或支化含杂原子碳链。在一些实施方案中，Z为1至10个碳原子的线性或支化碳链。例如，在一些实施方案中，Z为
Figure BDA0003014376920000691
在一些实施方案中，Z为1至30个碳原子的支化碳链。在一些实施方案中，Z为1至30个原子的线性或支化含杂原子碳链。例如，Z可以是其中一个或多个碳原子被杂原子(包括但不限于O、N、S或P)取代的线性或支化碳链。在一些实施方案中，Z为含有3至30个碳原子的碳环。在一些实施方案中，Z为含有3至30个碳原子的亚烷基-碳环。例如，在一些实施方案中，Z为
Figure BDA0003014376920000701
其中x为1-1000。在一些实施方案中，Z为含有3至30个原子的杂环。在一些实施方案中，Z为含有3至30个原子的亚烷基-杂环。在一些实施方案中，Z未被取代。在一些实施方案中，Z被取代。在一些实施方案中，Z为以下中的至少一者：
Figure BDA0003014376920000702
Figure BDA0003014376920000703
在一些实施方案中，Z’为1至30个碳原子的线性或支化碳链、1至30个原子的线性或支化含杂原子碳链、含有3至30个碳原子的碳环、含有3至30个碳原子的亚烷基-碳环、含有3至30个原子的杂环，或含有3至30个原子的亚烷基-杂环。Z’可未被取代或被以下中的至少一者取代：卤素、羟基、氨基、磺酰基、磺酰胺基、巯基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6醚、C1-C6硫醚、C1-C6砜、C1-C6亚砜、C1-C6伯酰胺、C1-C6仲酰胺、卤代C1-C6烷基、羧基、氰基、硝基、亚硝基、-OC(O)NR′R′、-N(R′)C(O)NR′R′、-N(R′)C(O)O-C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C3-C6杂环基、C2-C5杂芳基和C6-C10芳基；其中每个R′独立地选自由氢和C1-C6烷基组成的组。在一些实施方案中，Z’为1至30个碳原子的线性碳链。例如，Z’可以是亚烷基，包括但不限于C1-C24亚烷基、C1-C20亚烷基、C1-C16亚烷基、C1-C12亚烷基、C1-C8亚烷基、C1-C6亚烷基、C1-C4亚烷基、C1-C3亚烷基、C1-C2亚烷基、C1亚烷基。代表性的亚烷基包括但不限于亚甲基、亚乙基、亚丙基、正亚丁基、亚乙烯基、亚丙烯基、正亚丁烯基、亚丙炔基、正亚丁炔基等。在一些实施方案中，Z’为1至30个碳原子的线性或支化碳链，或1至30个原子的线性或支化含杂原子碳链。
在一些实施方案中，Z”为1至30个碳原子的线性或支化碳链、1至30个原子的线性或支化含杂原子碳链、含有3至30个碳原子的碳环、含有3至30个碳原子的亚烷基-碳环、含有3至30个原子的杂环，或含有3至30个原子的亚烷基-杂环。Z”可未被取代或被以下中的至少一者取代：卤素、羟基、氨基、磺酰基、磺酰胺基、巯基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6醚、C1-C6硫醚、C1-C6砜、C1-C6亚砜、C1-C6伯酰胺、C1-C6仲酰胺、卤代C1-C6烷基、羧基、氰基、硝基、亚硝基、-OC(O)NR′R′、-N(R′)C(O)NR′R′、-N(R′)C(O)O-C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C3-C6杂环基、C2-C5杂芳基和C6-C10芳基；其中每个R′独立地选自由氢和C1-C6烷基组成的组。在一些实施方案中，Z”为1至30个碳原子的线性碳链。例如，Z”可以是亚烷基，包括但不限于C1-C24亚烷基、C1-C20亚烷基、C1-C16亚烷基、C1-C12亚烷基、C1-C8亚烷基、C1-C6亚烷基、C1-C4亚烷基、C1-C3亚烷基、C1-C2亚烷基、C1亚烷基。代表性的亚烷基包括但不限于亚甲基、亚乙基、亚丙基、正亚丁基、亚乙烯基、亚丙烯基、正亚丁烯基、亚丙炔基、正亚丁炔基等。在一些实施方案中，Z”为1至30个碳原子的线性或支化碳链或者1至30个原子的线性或支化含杂原子碳链。
根据本公开的某些实施方案，G可以是–C–、–S–、–S(O)–、–P(OR1)–或–P(OH)–，因此分别形成羰基、亚砜基、砜基和膦酰基。因此，在一些实施方案中，G为–C–。在一些实施方案中，G为–S–。在一些实施方案中，G为–S(O)–。
在一些实施方案中，式(B)化合物为
Figure BDA0003014376920000721
其中
R为1至10个碳原子的线性或支化碳链、1至10个原子的线性或支化含杂原子碳链、含有3至10个碳原子的碳环，或含有3至10个原子的杂环，并且R未被取代或被以下中的至少一者取代：卤素、羟基、氨基、磺酰基、磺酰胺基、巯基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6醚、C1-C6硫醚、C1-C6砜、C1-C6亚砜、C1-C6伯酰胺、C1-C6仲酰胺、卤代C1-C6烷基、羧基、氰基、硝基、亚硝基、-OC(O)NR′R′、-N(R′)C(O)NR′R′、-N(R′)C(O)O-C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C3-C6杂环基、C2-C5杂芳基和C6-C10芳基；其中每个R′独立地选自由氢和C1-C6烷基组成的组；并且R”为未被取代或被取代的1至10个碳原子的线性或支化碳链、1至10个原子的线性或支化含杂原子碳链、含有3至10个碳原子的碳环，或含有3至10个原子的杂环。在一些实施方案中，R为1个碳原子。在一些实施方案中，R”为线性或支化碳链，诸如甲基、乙基、正丙基、异丙基、2-甲基-1-丙基、2-甲基-2-丙基、2-甲基-1-丁基、3-甲基-1-丁基、2-甲基-3-丁基、2,2-二甲基-1-丙基、2-甲基-1-戊基、3-甲基-1-戊基、4-甲基-1-戊基、2-甲基-2-戊基、3-甲基-2-戊基、4-甲基-2-戊基、2,2-二甲基-1-丁基、3,3-二甲基-1-丁基、2-乙基-1-丁基、丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基。例如，在一些实施方案中，式(B)化合物为
Figure BDA0003014376920000731
在一些实施方案中，R为含有3至10个碳原子的碳环。例如，R可以是环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环壬基、环癸基、苯基或萘基。在一些实施方案中，R为含有3至10个原子的杂环。
在某些实施方案中，第一胺具有式R1-NH2或R1-N(H)-Z’-N(H)-R1。在一些实施方案中，第一胺具有式R1-NH2。在一些实施方案中，第一胺具有式R1-N(H)-Z’-N(H)-R1。在一些实施方案中，具有式R1-N(H)-Z’-N(H)-R1的第一胺为
Figure BDA0003014376920000732
Figure BDA0003014376920000733
在一些实施方案中，第一胺具有式R1-N(H)-Z’-N-(R1)2。在一些实施方案中，具有式R1-N(H)-Z’-N-(R1)2的第一胺为
Figure BDA0003014376920000734
在某些实施方案中，第二胺具有式R2-NH2或R2-N(H)-Z”-N(H)-R2。在一些实施方案中，第二胺具有式R2-NH2。在一些实施方案中，第二胺具有式R2-N(H)-Z”-N(H)-R2。在一些实施方案中，具有式R2-N(H)-Z”-N(H)-R2的第二胺为
Figure BDA0003014376920000735
Figure BDA0003014376920000736
在一些实施方案中，第一胺具有式R2-N(H)-Z”-N-(R2)2。在一些实施方案中，具有式R2-N(H)-Z”-N-(R2)2的第一胺为
Figure BDA0003014376920000737
在某些实施方案中，R1为C1-C40烷基、C1-C40杂烷基、C2-C40烯基、C2-C40杂亚烯基、C4-C8环烯基、C2-C40炔基、C2-C40杂亚炔基、C3-C8环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；其中所述杂环基和杂芳基含有1-5个选自由N、S、P和O组成的组的杂原子；其中所述C1-C40烷基、C2-C40烯基、C4-C8环烯基、C2-C40炔基、C3-C8环烷基、杂环基、芳基和杂芳基任选地被D、卤素、C1-C6烷基、-OH、-O-C1-C6烷基、-NH2、-NH(C1-C6烷基)或-N(C1-C6烷基)2取代。R1可未被取代或被以下中的至少一者取代：卤素、羟基、氨基、磺酰基、磺酰胺基、巯基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6醚、C1-C6硫醚、C1-C6砜、C1-C6亚砜、C1-C6伯酰胺、C1-C6仲酰胺、卤代C1-C6烷基、羧基、氰基、硝基、亚硝基、-OC(O)NR′R′、-N(R′)C(O)NR′R′、-N(R′)C(O)O-C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C3-C6杂环基、C2-C5杂芳基和C6-C10)芳基；其中每个R′独立地选自由氢和C1-C6烷基组成的组。在一些实施方案中，R1为C1-C20烷基。例如，R1可以是C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19或C20烷基，诸如甲基、乙基、正丙基、异丙基、2-甲基-1-丙基、2-甲基-2-丙基、2-甲基-1-丁基、3-甲基-1-丁基、2-甲基-3-丁基、2,2-二甲基-1-丙基、2-甲基-1-戊基、3-甲基-1-戊基、4-甲基-1-戊基、2-甲基-2-戊基、3-甲基-2-戊基、4-甲基-2-戊基、2,2-二甲基-1-丁基、3,3-二甲基-1-丁基、2-乙基-1-丁基、丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基、正十一烷基、正十二烷基、正十三烷基、正十四烷基、正十五烷基、正十六烷基、正十七烷基、正十八烷基、正十九烷基或正二十烷基。在一些实施方案中，R1未被取代。在一些实施方案中，R1被取代。在一些实施方案中，R1选自由以下组成的组：
Figure BDA0003014376920000741
Figure BDA0003014376920000742
Figure BDA0003014376920000751
Figure BDA0003014376920000752
在一些实施方案中，R1为
Figure BDA0003014376920000753
在一些实施方案中，R1为
Figure BDA0003014376920000754
Figure BDA0003014376920000755
Figure BDA0003014376920000761
在某些实施方案中，R2为C1-C40烷基、C1-C40杂烷基、C2-C40烯基、C2-C40杂亚烯基、C4-C8环烯基、C2-C40炔基、C2-C40杂亚炔基、C3-C8环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；其中所述杂环基和杂芳基含有1-5个选自由N、S、P和O组成的组的杂原子；其中所述C1-C40烷基、C2-C40烯基、C4-C8环烯基、C2-C40炔基、C3-C8环烷基、杂环基、芳基和杂芳基任选地被D、卤素、C1-C6烷基、-OH、-O-C1-C6烷基、-NH2、-NH(C1-C6烷基)或-N(C1-C6烷基)2取代。R2可未被取代或被以下中的至少一者取代：卤素、羟基、氨基、磺酰基、磺酰胺基、巯基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6醚、C1-C6硫醚、C1-C6砜、C1-C6亚砜、C1-C6伯酰胺、C1-C6仲酰胺、卤代C1-C6烷基、羧基、氰基、硝基、亚硝基、-OC(O)NR′R′、-N(R′)C(O)NR′R′、-N(R′)C(O)O-C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C3-C6杂环基、C2-C5杂芳基和C6-C10)芳基；其中每个R′独立地选自由氢和C1-C6烷基组成的组。在一些实施方案中，R2为C1-C20烷基。例如，R2可以是C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19或C20烷基，诸如甲基、乙基、正丙基、异丙基、2-甲基-1-丙基、2-甲基-2-丙基、2-甲基-1-丁基、3-甲基-1-丁基、2-甲基-3-丁基、2,2-二甲基-1-丙基、2-甲基-1-戊基、3-甲基-1-戊基、4-甲基-1-戊基、2-甲基-2-戊基、3-甲基-2-戊基、4-甲基-2-戊基、2,2-二甲基-1-丁基、3,3-二甲基-1-丁基、2-乙基-1-丁基、丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基、正十一烷基、正十二烷基、正十三烷基、正十四烷基、正十五烷基、正十六烷基、正十七烷基、正十八烷基、正十九烷基或正二十烷基。在一些实施方案中，R2未被取代。在一些实施方案中，R2被取代。在一些实施方案中，R2选自由以下组成的组：
Figure BDA0003014376920000762
Figure BDA0003014376920000763
Figure BDA0003014376920000771
Figure BDA0003014376920000772
在一些实施方案中，R2为
Figure BDA0003014376920000773
在一些实施方案中，R2为
Figure BDA0003014376920000774
Figure BDA0003014376920000775
Figure BDA0003014376920000781
在一些实施方案中，每个Q为H或C1-C10线性或支化烷基。因此，在一些实施方案中，每个Q为H。在其他实施方案中，每个Q为C1-C10线性或支化烷基。例如，每个Q可以是甲基、乙基、正丙基、异丙基、2-甲基-1-丙基、2-甲基-2-丙基、2-甲基-1-丁基、3-甲基-1-丁基、2-甲基-3-丁基、2,2-二甲基-1-丙基、2-甲基-1-戊基、3-甲基-1-戊基、4-甲基-1-戊基、2-甲基-2-戊基、3-甲基-2-戊基、4-甲基-2-戊基、2,2-二甲基-1-丁基、3,3-二甲基-1-丁基、2-乙基-1-丁基、丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、正庚基、正辛基、正壬基或正癸基。在一些实施方案中，每个Q为甲基。
在一些实施方案中，每个J为–O–。在一些实施方案中，每个J为–NH–。
在一些实施方案中，每个E1独立地选自由以下组成的组：共价键、–N–、–O–、–S–、亚烷基、杂亚烷基、烯基、杂亚烯基、炔基、杂亚炔基。在一些实施方案中，每个E1为杂亚烷基。在一些实施方案中，每个E1为-CH2-O-。在一些实施方案中，每个n至少为1。例如，n可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些实施方案中，n为1。
在一些实施方案中，A为1至30个碳原子的线性或支化碳链、2至30个原子的线性或支化含杂原子碳链、含有3至30个碳原子的碳环，或含有3至30个原子的杂环。例如，在一些实施方案中，A为
Figure BDA0003014376920000791
在一些实施方案中，本公开的聚合物具有
Figure BDA0003014376920000792
的一般结构，其中波浪键表示与聚合物的其余部分的键。由于高度受控的连续线性低聚物生长和分支，因此所得聚合物具有线性链段和分支单元的更均匀分布，如上述结构中所示。如随后的部分和实施例中所述，所述聚合物具有强的DNA结合亲和力，并且可使DNA凝聚从而配制出具有接近100％细胞摄取效率的纳米尺寸的聚合复合物。在一些实施方案中，本公开的聚合物为
Figure BDA0003014376920000793
在一些实施方案中，使摩尔过量的式(A)化合物与第一胺反应。例如，式(A)化合物与第一胺的化学计量比可在以下范围内：约1.1:1至约10:1，包括约1.1:1、约1.2:1、约1.3:1、约1.4:1、约1.5:1、约1.6:1、约1.7:1、约1.8:1、约1.9:1、约2:1、约3:1、约4:1、约5:1、约6:1、约7:1、约8:1、约9:1或约10:1，包括它们之间的所有范围。
在一些实施方案中，式(A)化合物与第一胺的化学计量比为约1.1:1、约1.2:1、约1.3:1、约1.4:1、约1.5:1、约1.6:1、约1.7:1、约1.8:1、约1.9:1、约2:1、约3:1、约4:1、约5:1、约6:1、约7:1、约8:1、约9:1或约10:1。在一些实施方案中，式(A)化合物与第一胺的化学计量比可在约1.1:1至约2:1范围内。在一些实施方案中，式(A)化合物与第一胺的化学计量比为约1.2:1。在一些实施方案中，使式(A)化合物与第一胺以摩尔当量(即约1:1)反应。
在一些实施方案中，步骤(a)在有机溶剂中进行。可在本公开的上下文中使用的各种各样的有机溶剂包括但不限于二甲亚砜(DMSO)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)等；酮，诸如丙酮、甲基乙基酮、甲基异丁基酮等；醚，诸如四氢呋喃(THF)、乙醚、甲基叔丁基醚等；烃，诸如甲苯、二甲苯、环己烷等。在一些实施方案中，步骤(a)在DMSO中进行。
在一些实施方案中，步骤(a)在以下范围内的温度下进行：约40℃至约120℃，包括约40℃、约41℃、约42℃、约43℃、约44℃、约45℃、约46℃、约47℃、约48℃、约49℃、约50℃、约51℃、约52℃、约53℃、约54℃、约55℃、约56℃、约57℃、约58℃、约59℃、约60℃、约61℃、约62℃、约63℃、约64℃、约65℃、约66℃、约67℃、约68℃、约69℃、约70℃、约71℃、约72℃、约73℃、约74℃、约75℃、约76℃、约77℃、约78℃、约79℃、约80℃、约81℃、约82℃、约83℃、约84℃、约85℃、约86℃、约87℃、约88℃、约89℃、约90℃、约91℃、约92℃、约93℃、约94℃、约95℃、约96℃、约97℃、约98℃、约99℃、约100℃、约101℃、约102℃、约103℃、约104℃、约105℃、约106℃、约107℃、约108℃、约109℃、约110℃、约111℃、约112℃、约113℃、约114℃、约115℃、约116℃、约117℃、约118℃、约119℃或120℃，包括它们之间的所有范围。
在一些实施方案中，步骤(a)在约40℃、约41℃、约42℃、约43℃、约44℃、约45℃、约46℃、约47℃、约48℃、约49℃、约50℃、约51℃、约52℃、约53℃、约54℃、约55℃、约56℃、约57℃、约58℃、约59℃、约60℃、约61℃、约62℃、约63℃、约64℃、约65℃、约66℃、约67℃、约68℃、约69℃、约70℃、约71℃、约72℃、约73℃、约74℃、约75℃、约76℃、约77℃、约78℃、约79℃、约80℃、约81℃、约82℃、约83℃、约84℃、约85℃、约86℃、约87℃、约88℃、约89℃、约90℃、约91℃、约92℃、约93℃、约94℃、约95℃、约96℃、约97℃、约98℃、约99℃、约100℃、约101℃、约102℃、约103℃、约104℃、约105℃、约106℃、约107℃、约108℃、约109℃、约110℃、约111℃、约112℃、约113℃、约114℃、约115℃、约116℃、约117℃、约118℃、约119℃或120℃下进行。在一些实施方案中，步骤(a)在约90℃下进行。
在一些实施方案中，步骤(a)的产物在步骤(b)之前未被纯化。在其他实施方案中，步骤(a)的产物在步骤(b)之前被纯化。步骤(a)的产物可通过本领域普通技术人员显而易见的各种方法和技术来纯化。
在一些实施方案中，将摩尔过量的第二胺添加至步骤(a)的产物中。例如，第二胺与步骤(a)的产物的化学计量比可在以下范围内：约1.1:1至约10:1，包括约1.1:1、约1.2:1、约1.3:1、约1.4:1、约1.5:1、约1.6:1、约1.7:1、约1.8:1、约1.9:1、约2:1、约3:1、约4:1、约5:1、约6:1、约7:1、约8:1、约9:1或约10:1，包括它们之间的所有范围。
在一些实施方案中，第二胺与步骤(a)的产物的化学计量比为约1.1:1、约1.2:1、约1.3:1、约1.4:1、约1.5:1、约1.6:1、约1.7:1、约1.8:1、约1.9:1、约2:1、约3:1、约4:1、约5:1、约6:1、约7:1、约8:1、约9:1或约10:1。在一些实施方案中，第二胺与步骤(a)的产物的化学计量比为约5:1。在一些实施方案中，使第二胺与步骤(a)的产物以摩尔当量(即约1:1)反应。
在一些实施方案中，步骤(b)在约16℃至约40℃范围的温度下进行。例如，步骤(b)在以下范围内的温度下进行：约16℃至约40℃、约17℃至约40℃、约18℃至约40℃、约19℃至约40℃、约20℃至约40℃、约21℃至约40℃、约22℃至约40℃、约23℃至约40℃、约24℃至约40℃、约25℃至约40℃、约26℃至约40℃、约27℃至约40℃、约28℃至约40℃、约29℃至约40℃、约30℃至约40℃、约31℃至约40℃、约32℃至约40℃、约33℃至约40℃、约34℃至约40℃、约35℃至约40℃、约36℃至约40℃、约37℃至约40℃、约38℃至约40℃、约39℃至约40℃，包括它们之间的所有范围。
在一些实施方案中，步骤(b)在约16℃、约17℃、约18℃、约19℃、约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃、约30℃、约31℃、约32℃、约33℃、约34℃、约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃或约40℃的温度下进行。
在一些实施方案中，步骤(b)的产物在步骤(c)之前未被纯化。在其他实施方案中，步骤(b)的产物在步骤(c)之前被纯化。步骤(b)的产物可通过本领域普通技术人员显而易见的各种方法和技术来纯化。例如，可通过透析纯化步骤(b)的产物。
在一些实施方案中，步骤(c)在高于步骤(b)的温度下进行。例如，步骤(c)在约21℃至约200℃范围内的温度下进行。例如，步骤(c)在以下范围内的温度下进行：约21℃至约200℃、约22℃至约200℃、约23℃至约200℃、约24℃至约200℃、约25℃至约200℃、约26℃至约200℃、约27℃至约200℃、约28℃至约200℃、约29℃至约200℃、约30℃至约200℃、约31℃至约200℃、约32℃至约200℃、约33℃至约200℃、约34℃至约200℃、约35℃至约200℃、约36℃至约200℃、约37℃至约200℃、约38℃至约200℃、约39℃至约200℃、约40℃至约200℃、约41℃至约200℃、约42℃至约200℃、约43℃至约200℃、约44℃至约200℃、约45℃至约200℃、约46℃至约200℃、约47℃至约200℃、约48℃至约200℃、约49℃至约200℃、约50℃至约200℃、约51℃至约200℃、约52℃至约200℃、约53℃至约200℃、约54℃至约200℃、约55℃至约200℃、约56℃至约200℃、约57℃至约200℃、约58℃至约200℃、约59℃至约200℃、约60℃至约200℃、约61℃至约200℃、约62℃至约200℃、约63℃至约200℃、约64℃至约200℃、约65℃至约200℃、约66℃至约200℃、约67℃至约200℃、约68℃至约200℃、约69℃至约200℃、约70℃至约200℃、约71℃至约200℃、约72℃至约200℃、约73℃至约200℃、约74℃至约200℃、约75℃至约200℃、约76℃至约200℃、约77℃至约200℃、约78℃至约200℃、约79℃至约200℃、约80℃至约200℃、约81℃至约200℃、约82℃至约200℃、约83℃至约200℃、约84℃至约200℃、约85℃至约200℃、约86℃至约200℃、约87℃至约200℃、约88℃至约200℃、约89℃至约200℃、约90℃至约200℃、约91℃至约200℃、约92℃至约200℃、约93℃至约200℃、约94℃至约200℃、约95℃至约200℃、约96℃至约200℃、约97℃至约200℃、约98℃至约200℃、约99℃至约200℃、约100℃至约200℃、约101℃至约200℃、约102℃至约200℃、约103℃至约200℃、约104℃至约200℃、约105℃至约200℃、约106℃至约200℃、约107℃至约200℃、约108℃至约200℃、约109℃至约200℃、约110℃至约200℃、约111℃至约200℃、约112℃至约200℃、约113℃至约200℃、约114℃至约200℃、约115℃至约200℃、约116℃至约200℃、约117℃至约200℃、约118℃至约200℃、约119℃至约200℃、约120℃至约200℃、约121℃至约200℃、约122℃至约200℃、约123℃至约200℃、约124℃至约200℃、约125℃至约200℃、约126℃至约200℃、约127℃至约200℃、约128℃至约200℃、约129℃至约200℃、约130℃至约200℃、约131℃至约200℃、约132℃至约200℃、约133℃至约200℃、约134℃至约200℃、约135℃至约200℃、约136℃至约200℃、约137℃至约200℃、约138℃至约200℃、约139℃至约200℃、约140℃至约200℃、约141℃至约200℃、约142℃至约200℃、约143℃至约200℃、约144℃至约200℃、约145℃至约200℃、约146℃至约200℃、约147℃至约200℃、约148℃至约200℃、约149℃至约200℃、约150℃至约200℃、约151℃至约200℃、约152℃至约200℃、约153℃至约200℃、约154℃至约200℃、约155℃至约200℃、约156℃至约200℃、约157℃至约200℃、约158℃至约200℃、约159℃至约200℃、约160℃至约200℃、约161℃至约200℃、约162℃至约200℃、约163℃至约200℃、约164℃至约200℃、约165℃至约200℃、约166℃至约200℃、约167℃至约200℃、约168℃至约200℃、约169℃至约200℃、约170℃至约200℃、约171℃至约200℃、约172℃至约200℃、约173℃至约200℃、约174℃至约200℃、约175℃至约200℃、约176℃至约200℃、约177℃至约200℃、约178℃至约200℃、约179℃至约200℃、约180℃至约200℃、约181℃至约200℃、约182℃至约200℃、约183℃至约200℃、约184℃至约200℃、约185℃至约200℃、约186℃至约200℃、约187℃至约200℃、约188℃至约200℃、约189℃至约200℃、约190℃至约200℃、约191℃至约200℃、约192℃至约200℃、约193℃至约200℃、约194℃至约200℃、约195℃至约200℃、约196℃至约200℃、约197℃至约200℃、约198℃至约200℃、约199℃至约200℃，包括它们之间的所有范围。
在一些实施方案中，步骤(c)在约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃、约30℃、约31℃、约32℃、约33℃、约34℃、约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃、约40℃、约41℃、约42℃、约43℃、约44℃、约45℃、约46℃、约47℃、约48℃、约49℃、约50℃、约51℃、约52℃、约53℃、约54℃、约55℃、约56℃、约57℃、约58℃、约59℃、约60℃、约61℃、约62℃、约63℃、约64℃、约65℃、约66℃、约67℃、约68℃、约69℃、约70℃、约71℃、约72℃、约73℃、约74℃、约75℃、约76℃、约77℃、约78℃、约79℃、约80℃、约81℃、约82℃、约83℃、约84℃、约85℃、约86℃、约87℃、约88℃、约89℃、约90℃、约91℃、约92℃、约93℃、约94℃、约95℃、约96℃、约97℃、约98℃、约99℃、约100℃、约101℃、约102℃、约103℃、约104℃、约105℃、约106℃、约107℃、约108℃、约109℃、约110℃、约111℃、约112℃、约113℃、约114℃、约115℃、约116℃、约117℃、约118℃、约119℃、约120℃、约121℃、约122℃、约123℃、约124℃、约125℃、约126℃、约127℃、约128℃、约129℃、约130℃、约131℃、约132℃、约133℃、约134℃、约135℃、约136℃、约137℃、约138℃、约139℃、约140℃、约141℃、约142℃、约143℃、约144℃、约145℃、约146℃、约147℃、约148℃、约149℃、约150℃、约151℃、约152℃、约153℃、约154℃、约155℃、约156℃、约157℃、约158℃、约159℃、约160℃、约161℃、约162℃、约163℃、约164℃、约165℃、约166℃、约167℃、约168℃、约169℃、约170℃、约171℃、约172℃、约173℃、约174℃、约175℃、约176℃、约177℃、约178℃、约179℃、约180℃、约181℃、约182℃、约183℃、约184℃、约185℃、约186℃、约187℃、约188℃、约189℃、约190℃、约191℃、约192℃、约193℃、约194℃、约195℃、约196℃、约197℃、约198℃、约199℃或约200℃下进行。在一些实施方案中，步骤(c)在约90℃下进行。
在一些实施方案中，通过本公开的方法制备的聚合物的由马克-豪温克方程定义的α参数小于约0.5。例如，本公开的聚合物的由马克-豪温克方程定义的α参数在以下范围内：约0.01至约0.49、约0.02至约0.49、约0.03至约0.49、约0.04至约0.49、约0.05至约0.49、约0.06至约0.49、约0.07至约0.49、约0.08至约0.49、约0.09至约0.49、约0.10至约0.49、约0.11至约0.49、约0.12至约0.49、约0.13至约0.49、约0.14至约0.49、约0.15至约0.49、约0.16至约0.49、约0.17至约0.49、约0.18至约0.49、约0.19至约0.49、约0.20至约0.49、约0.21至约0.49、约0.22至约0.49、约0.23至约0.49、约0.24至约0.49、约0.25至约0.49、约0.26至约0.49、约0.27至约0.49、约0.28至约0.49、约0.29至约0.49、约0.30至约0.49、约0.31至约0.49、约0.32至约0.49、约0.33至约0.49、约0.34至约0.49、约0.35至约0.49、约0.36至约0.49、约0.37至约0.49、约0.38至约0.49、约0.39至约0.49、约0.40至约0.49、约0.41至约0.49、约0.42至约0.49、约0.43至约0.49、约0.44至约0.49、约0.45至约0.49、约0.46至约0.49、约0.47至约0.49、约0.48至约0.49，包括它们之间的所有范围。在一些实施方案中，通过本公开的方法制备的聚合物的由马克-豪温克方程定义的α参数为约0.2至约0.5。
在一些实施方案中，通过本公开的方法制备的聚合物的由马克-豪温克方程定义的α参数为约0.01、约0.02、约0.03、约0.04、约0.05、约0.06、约0.07、约0.08、约0.09、约0.10、约0.11、约0.12、约0.13、约0.14、约0.15、约0.16、约0.17、约0.18、约0.19、约0.20、约0.21、约0.22、约0.23、约0.24、约0.25、约0.26、约0.27、约0.28、约0.29、约0.30、约0.31、约0.32、约0.33、约0.34、约0.35、约0.36、约0.37、约0.38、约0.39、约0.40、约0.41、约0.42、约0.43、约0.44、约0.45、约0.46、约0.47、约0.48或约0.49。
在一些实施方案中，通过本公开的方法制备的聚合物具有约1.01至约8.0的PDI。例如，PDI可在以下范围内：约1.01至约8.0、约1.02至约8.0、约1.03至约8.0、约1.04至约8.0、约1.05至约8.0、约1.06至约8.0、约1.07至约8.0、约1.08至约8.0、约1.09至约8.0、约1.1至约8.0、约1.2至约8.0、约1.3至约8.0、约1.4至约8.0、约1.5至约8.0、约1.6至约8.0、约1.7至约8.0、约1.8至约8.0、约1.9至约8.0、约2.0至约8.0、约2.1至约8.0、约2.2至约8.0、约2.3至约8.0、约2.4至约8.0、约2.5至约8.0、约2.6至约8.0、约2.7至约8.0、约2.8至约8.0、约2.9至约8.0、约3.0至约8.0、约3.1至约8.0、约3.2至约8.0、约3.3至约8.0、约3.4至约8.0、约3.5至约8.0、约3.6至约8.0、约3.7至约8.0、约3.8至约8.0、约3.9至约8.0、约4.0至约8.0、约4.1至约8.0、约4.2至约8.0、约4.3至约8.0、约4.4至约8.0、约4.5至约8.0、约4.6至约8.0、约4.7至约8.0、约4.8至约8.0、约4.9至约8.0、约5.0至约8.0、约5.1至约8.0、约5.2至约8.0、约5.3至约8.0、约5.4至约8.0、约5.5至约8.0、约5.6至约8.0、约5.7至约8.0、约5.8至约8.0、约5.9至约8.0、约6.0至约8.0、约6.1至约8.0、约6.2至约8.0、约6.3至约8.0、约6.4至约8.0、约6.5至约8.0、约6.6至约8.0、约6.7至约8.0、约6.8至约8.0、约6.9至约8.0、约7.0至约8.0、约7.1至约8.0、约7.2至约8.0、约7.3至约8.0、约7.4至约8.0、约7.5至约8.0、约7.6至约8.0、约7.7至约8.0、约7.8至约8.0、约7.9至约8.0，包括它们之间的所有范围。
在一些实施方案中，通过本公开的方法制备的聚合物具有约1.01、约1.02、约1.03、约1.04、约1.05、约1.06、约1.07、约1.08、约1.09、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9、约2.0、约2.1、约2.2、约2.3、约2.4、约2.5、约2.6、约2.7、约2.8、约2.9、约3.0、约3.1、约3.2、约3.3、约3.4、约3.5、约3.6、约3.7、约3.8、约3.9、约4.0、约4.1、约4.2、约4.3、约4.4、约4.5、约4.6、约4.7、约4.8、约4.9、约5.0、约5.1、约5.2、约5.3、约5.4、约5.5、约5.6、约5.7、约5.8、约5.9、约6.0、约6.1、约6.2、约6.3、约6.4、约6.5、约6.6、约6.7、约6.8、约6.9、约7.0、约7.1、约7.2、约7.3、约7.4、约7.5、约7.6、约7.7、约7.8、约7.9或约8.0的PDI。在一些实施方案中，本公开的聚合物具有约2.5的PDI。在一些实施方案中，本公开的聚合物具有约3.5的PDI。在一些实施方案中，本公开的聚合物具有约6.5的PDI。在一些实施方案中，本公开的聚合物具有约8.5的PDI。
在一些实施方案中，通过本公开的方法制备的聚合物具有至少3kDa的MW。在一些实施方案中，通过本公开的方法制备的聚合物具有约3kDa至约200kDa的MW。因此，本公开的聚合物具有在以下范围内的MW：约3kDa至约200kDa、约4kDa至约200kDa、约5kDa至约200kDa、约6kDa至约200kDa、约7kDa至约200kDa、约8kDa至约200kDa、约9kDa至约200kDa、约10kDa至约200kDa、约11kDa至约200kDa、约12kDa至约200kDa、约13kDa至约200kDa、约14kDa至约200kDa、约15kDa至约200kDa、约16kDa至约200kDa、约17kDa至约200kDa、约18kDa至约200kDa、约19kDa至约200kDa、约20kDa至约200kDa、约21kDa至约200kDa、约22kDa至约200kDa、约23kDa至约200kDa、约24kDa至约200kDa、约25kDa至约200kDa、约26kDa至约200kDa、约27kDa至约200kDa、约28kDa至约200kDa、约29kDa至约200kDa、约30kDa至约200kDa、约31kDa至约200kDa、约32kDa至约200kDa、约33kDa至约200kDa、约34kDa至约200kDa、约35kDa至约200kDa、约36kDa至约200kDa、约37kDa至约200kDa、约38kDa至约200kDa、约39kDa至约200kDa、约40kDa至约200kDa、约41kDa至约200kDa、约42kDa至约200kDa、约43kDa至约200kDa、约44kDa至约200kDa、约45kDa至约200kDa、约46kDa至约200kDa、约47kDa至约200kDa、约48kDa至约200kDa、约49kDa至约200kDa、约50kDa至约200kDa、约51kDa至约200kDa、约52kDa至约200kDa、约53kDa至约200kDa、约54kDa至约200kDa、约55kDa至约200kDa、约56kDa至约200kDa、约57kDa至约200kDa、约58kDa至约200kDa、约59kDa至约200kDa、约60kDa至约200kDa、约61kDa至约200kDa、约62kDa至约200kDa、约63kDa至约200kDa、约64kDa至约200kDa、约65kDa至约200kDa、约66kDa至约200kDa、约67kDa至约200kDa、约68kDa至约200kDa、约69kDa至约200kDa、约70kDa至约200kDa、约71kDa至约200kDa、约72kDa至约200kDa、约73kDa至约200kDa、约74kDa至约200kDa、约75kDa至约200kDa、约76kDa至约200kDa、约77kDa至约200kDa、约78kDa至约200kDa、约79kDa至约200kDa、约80kDa至约200kDa、约81kDa至约200kDa、约82kDa至约200kDa、约83kDa至约200kDa、约84kDa至约200kDa、约85kDa至约200kDa、约86kDa至约200kDa、约87kDa至约200kDa、约88kDa至约200kDa、约89kDa至约200kDa、约90kDa至约200kDa、约91kDa至约200kDa、约92kDa至约200kDa、约93kDa至约200kDa、约94kDa至约200kDa、约95kDa至约200kDa、约96kDa至约200kDa、约97kDa至约200kDa、约98kDa至约200kDa、约99kDa至约200kDa、约100kDa至约200kDa、约101kDa至约200kDa、约102kDa至约200kDa、约103kDa至约200kDa、约104kDa至约200kDa、约105kDa至约200kDa、约106kDa至约200kDa、约107kDa至约200kDa、约108kDa至约200kDa、约109kDa至约200kDa、约110kDa至约200kDa、约111kDa至约200kDa、约112kDa至约200kDa、约113kDa至约200kDa、约114kDa至约200kDa、约115kDa至约200kDa、约116kDa至约200kDa、约117kDa至约200kDa、约118kDa至约200kDa、约119kDa至约200kDa、约120kDa至约200kDa、约121kDa至约200kDa、约122kDa至约200kDa、约123kDa至约200kDa、约124kDa至约200kDa、约125kDa至约200kDa、约126kDa至约200kDa、约127kDa至约200kDa、约128kDa至约200kDa、约129kDa至约200kDa、约130kDa至约200kDa、约131kDa至约200kDa、约132kDa至约200kDa、约133kDa至约200kDa、约134kDa至约200kDa、约135kDa至约200kDa、约136kDa至约200kDa、约137kDa至约200kDa、约138kDa至约200kDa、约139kDa至约200kDa、约140kDa至约200kDa、约141kDa至约200kDa、约142kDa至约200kDa、约143kDa至约200kDa、约144kDa至约200kDa、约145kDa至约200kDa、约146kDa至约200kDa、约147kDa至约200kDa、约148kDa至约200kDa、约149kDa至约200kDa、约150kDa至约200kDa、约151kDa至约200kDa、约152kDa至约200kDa、约153kDa至约200kDa、约154kDa至约200kDa、约155kDa至约200kDa、约156kDa至约200kDa、约157kDa至约200kDa、约158kDa至约200kDa、约159kDa至约200kDa、约160kDa至约200kDa、约161kDa至约200kDa、约162kDa至约200kDa、约163kDa至约200kDa、约164kDa至约200kDa、约165kDa至约200kDa、约166kDa至约200kDa、约167约168kDa至约200kDa、约169kDa至约200kDa、约170kDa至约200kDa、约171kDa至约200kDa、约172kDa至约200kDa、约173kDa至约200kDa、约174kDa至约200kDa、约175kDa至约200kDa、约176kDa至约200kDa、约177kDa至约200kDa、约178kDa至约200kDa、约179kDa至约200kDa、约180kDa至约200kDa、约181kDa至约200kDa、约182kDa至约200kDa、约183kDa至约200kDa、约184kDa至约200kDa、约185kDa至约200kDa、约186kDa至约200kDa、约187kDa至约200kDa、约188kDa至约200kDa、约189kDa至约200kDa、约190kDa至约200kDa、约191kDa至约200kDa、约192kDa至约200kDa、约193kDa至约200kDa、约194kDa至约200kDa、约195kDa至约200kDa、约196kDa至约200kDa、约197kDa至约200kDa、约198kDa至约200kDa、约199kDa至约200kDa。在一些实施方案中，所述聚合物具有介于约5kDa与50kDa之间的MW。在一些实施方案中，所述聚合物具有介于约10kDa与50kDa之间的MW。
在一些实施方案中，通过本公开的方法制备的聚合物具有约3kDa、约4kDa、约5kDa、约6kDa、约7kDa、约8kDa、约9kDa、约10kDa、约11kDa、约12kDa、约13kDa、约14kDa、约15kDa、约16kDa、约17kDa、约18kDa、约19kDa、约20kDa、约21kDa、约22kDa、约23kDa、约24kDa、约25kDa、约26kDa、约27kDa、约28kDa、约29kDa、约30kDa、约31kDa、约32kDa、约33kDa、约34kDa、约35kDa、约36kDa、约37kDa、约38kDa、约39kDa、约40kDa、约41kDa、约42kDa、约43kDa、约44kDa、约45kDa、约46kDa、约47kDa、约48kDa、约49kDa、约50kDa、约51kDa、约52kDa、约53kDa、约54kDa、约55kDa、约56kDa、约57kDa、约58kDa、约59kDa、约60kDa、约61kDa、约62kDa、约63kDa、约64kDa、约65kDa、约66kDa、约67kDa、约68kDa、约69kDa、约70kDa、约71kDa、约72kDa、约73kDa、约74kDa、约75kDa、约76kDa、约77kDa、约78kDa、约79kDa、约80kDa、约81kDa、约82kDa、约83kDa、约84kDa、约85kDa、约86kDa、约87kDa、约88kDa、约89kDa、约90kDa、约91kDa、约92kDa、约93kDa、约94kDa、约95kDa、约96kDa、约97kDa、约98kDa、约99kDa、约100kDa、约101kDa、约102kDa、约103kDa、约104kDa、约105kDa、约106kDa、约107kDa、约108kDa、约109kDa、约110kDa、约111kDa、约112kDa、约113kDa、约114kDa、约115kDa、约116kDa、约117kDa、约118kDa、约119kDa、约120kDa、约121kDa、约122kDa、约123kDa、约124kDa、约125kDa、约126kDa、约127kDa、约128kDa、约129kDa、约130kDa、约131kDa、约132kDa、约133kDa、约134kDa、约135kDa、约136kDa、约137kDa、约138kDa、约139kDa、约140kDa、约141kDa、约142kDa、约143kDa、约144kDa、约145kDa、约146kDa、约147kDa、约148kDa、约149kDa、约150kDa、约151kDa、约152kDa、约153kDa、约154kDa、约155kDa、约156kDa、约157kDa、约158kDa、约159kDa、约160kDa、约161kDa、约162kDa、约163kDa、约164kDa、约165kDa、约166kDa、约167约168kDa、约169kDa、约170kDa、约171kDa、约172kDa、约173kDa、约174kDa、约175kDa、约176kDa、约177kDa、约178kDa、约179kDa、约180kDa、约181kDa、约182kDa、约183kDa、约184kDa、约185kDa、约186kDa、约187kDa、约188kDa、约189kDa、约190kDa、约191kDa、约192kDa、约193kDa、约194kDa、约195kDa、约196kDa、约197kDa、约198kDa、约199kDa、至约200kDa的MW。在一些实施方案中，通过本公开的方法制备的聚合物具有介于约5kDa与50kDa之间的MW。在一些实施方案中，通过本公开的方法制备的聚合物具有约10kDa的MW。在一些实施方案中，通过本公开的方法制备的聚合物具有约20kDa的MW。在一些实施方案中，通过本公开的方法制备的聚合物具有约30kDa的MW。在一些实施方案中，通过本公开的方法制备的聚合物具有约40kDa的MW。
在一些实施方案中，步骤(b)之后的产物具有约3kDa的MW。
聚合复合物
在一些实施方案中，本公开提供了一种聚合复合物，其包含如本文所述的核酸组分和本文所公开的任何支化聚合物，例如通过本文所述的任何工艺制备的聚合物或式(I)聚合物：
Figure BDA0003014376920000921
其中
每个A独立地为1至30个碳原子的线性或支化碳链、1至30个原子的线性或支化含杂原子碳链、含有3至30个碳原子的碳环，或含有3至30个原子的杂环；
其中A任选地被一个或多个以下基团取代：卤素、羟基、氨基、磺酰基、磺酰胺基、巯基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6醚、C1-C6硫醚、C1-C6砜、C1-C6亚砜、C1-C6伯酰胺、C1-C6仲酰胺、卤代C1-C6烷基、羧基、氰基、硝基、亚硝基、-OC(O)NR′R′、-N(R′)C(O)NR′R′、-N(R′)C(O)O-C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C3-C6杂环基、C2-C5杂芳基或C6-C10芳基；其中每个R′独立地选自由氢和C1-C6烷基组成的组；
每个B独立地为第一连接部分；
每个X独立地为
Figure BDA0003014376920000922
Figure BDA0003014376920000923
每个Y独立地为
Figure BDA0003014376920000924
每个L独立地为第二连接部分；
每个R1、R2和R3在每次出现时均独立地为H、C1-C40烷基、C1-C40杂烷基、C2-C40烯基、C2-C40杂亚烯基、C4-C8环烯基、C2-C40炔基、C2-C40杂亚炔基、C3-C8环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；其中所述杂环基和杂芳基含有1-5个选自由N、S、P和O组成的组的杂原子；其中所述C1-C6烷基、C2-C8烯基、C4-C8环烯基、C2-C6炔基、C3-C8环烷基、杂环基、芳基和杂芳基任选地被D、卤素、C1-C6烷基、-OH、-O-C1-C6烷基、-NH2、-NH(C1-C6烷基)或-N(C1-C6烷基)2取代；或
其中R2和R3与它们所连接的原子一起可形成含有1-3个选自由N、S、P和O组成的组的杂原子的杂环基或杂芳基；
a为1-1000；
b为1-4；
c为1-3；并且
z为1-100；
条件是R2和R3中至少一者不为H。
在某些实施方案中，所述聚合复合物包含核酸组分和式(II)聚合物：
Figure BDA0003014376920000931
其中，
每个E1选自由以下组成的组：共价键、–N–、–O–、–S–、亚烷基、杂亚烷基、烯基、杂亚烯基、炔基、杂亚炔基；
每个E2选自由以下组成的组：共价键、–N–、–O–、–S–、亚烷基、杂亚烷基、烯基、杂亚烯基、炔基、杂亚炔基；
G为–C–、–S–、–S(O)–、–P(OR1)–或–P(OH)–；并且
n至少为1。
在一些实施方案中，每个B独立地为
Figure BDA0003014376920000941
Figure BDA0003014376920000942
在一些实施方案中，每个E1和E2独立地选自由以下组成的组：共价键、–N–、–O–、–S–、亚烷基、杂亚烷基、烯基、杂亚烯基、炔基、杂亚炔基。在一些实施方案中，每个E1为杂亚烷基。在一些实施方案中，每个E1为-CH2-O-。在一些实施方案中，每个E2为亚烷基。在一些实施方案中，每个E2为
Figure BDA0003014376920000943
Figure BDA0003014376920000944
在一些实施方案中，每个E2为
Figure BDA0003014376920000945
在一些实施方案中，每个n至少为1。例如，n可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些实施方案中，n为1。在一些实施方案中，G为–C–。在一些实施方案中，每个B为
Figure BDA0003014376920000946
在一些实施方案中，B和A组合以形成
Figure BDA0003014376920000951
在一些实施方案中，每个L为
Figure BDA0003014376920000952
其中x为1-1000。在一些实施方案中，a至少为2，b为3，并且每个X为
Figure BDA0003014376920000953
在一些实施方案中，每个A为
Figure BDA0003014376920000954
在一些实施方案中，每个L为
Figure BDA0003014376920000955
在一些实施方案中，Y为
Figure BDA0003014376920000961
在一些实施方案中，每个R2和/或R3为
Figure BDA0003014376920000962
在一些实施方案中，每个R1为
Figure BDA0003014376920000963
在一些实施方案中，所述聚合复合物包含核酸组分和式(III)至(VIIe)的聚合物：
Figure BDA0003014376920000964
Figure BDA0003014376920000971
Figure BDA0003014376920000981
Figure BDA0003014376920000991
其中R5、R6和R7中的每一者在每次出现时独立地为H、C1-C40烷基、C1-C40杂烷基、C2-C40烯基、C2-C40杂亚烯基、C4-C8环烯基、C2-C40炔基、C2-C40杂亚炔基、C3-C8环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；其中所述杂环基和杂芳基含有1-5个选自由N、S、P和O组成的组的杂原子；其中所述C1-C6烷基、C2-C8烯基、C4-C8环烯基、C2-C6炔基、C3-C8环烷基、杂环基、芳基和杂芳基任选地被D、卤素、C1-C6烷基、-OH、-O-C1-C6烷基、-NH2、-NH(C1-C6烷基)或-N(C1-C6烷基)2取代；并且其余变量如上文所定义。
在一些实施方案中，z为1、2或3。在一些实施方案中，z为1。
在一些实施方案中，所述聚合复合物包含核酸组分和聚合物，所述聚合物包含：
(a)
Figure BDA0003014376920001001
(b)
Figure BDA0003014376920001002
(c)
Figure BDA0003014376920001003
Figure BDA0003014376920001004
其中R1、R2、A、E1、G、J、Q、Z、Z”和n具有本文所提供的任何定义。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约3kDa至约200kDa的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约5kDa至约50kDa的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有介于约10kDa与50kDa之间的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约5kDa至约15kDa的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约10kDa的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约20kDa的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约30kDa的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约40kDa的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物的由马克-豪温克定义的α参数小于约0.5。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物的由马克-豪温克方程定义的α参数在约0.3至约0.5范围内。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约1.0至约8.0的PDI。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约2.5的PDI。
在一些实施方案中，所述聚合复合物包含核酸组分和聚合物，所述聚合物包含：
(a)
Figure BDA0003014376920001011
(b)
Figure BDA0003014376920001012
(c)
Figure BDA0003014376920001013
其中R1、R2、A、E1、G、J、Q、Z和n具有本文所提供的任何定义。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约3kDa至约200kDa的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约5kDa至约50kDa的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约介于约10kDa与50kDa之间的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约5kDa至约15kDa的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约10kDa的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约20kDa的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约30kDa的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约40kDa的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物的由马克-豪温克定义的α参数小于约0.5。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物的由马克-豪温克方程定义的α参数在约0.3至约0.5范围内。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约1.0至约8.0的PDI。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约2.5的PDI。
在一些实施方案中，所述聚合复合物包含核酸组分和聚合物，所述聚合物包含：
(a)
Figure BDA0003014376920001021
(b)
Figure BDA0003014376920001022
(c)
Figure BDA0003014376920001023
其中R1、R2、A、E1、G、J、Q、Z、Z”和n具有本文所提供的任何定义。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约3kDa至约200kDa的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约5kDa至约50kDa的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有介于约10kDa与50kDa之间的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约5kDa至约15kDa的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约10kDa的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约20kDa的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约30kDa的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约40kDa的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物的由马克-豪温克定义的α参数小于约0.5。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物的由马克-豪温克方程定义的α参数在约0.3至约0.5范围内。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约1.0至约8.0的PDI。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约2.5的PDI。
在一些进一步的实施方案中，所述聚合复合物包含核酸组分和聚合物，所述聚合物包含：
(a)
Figure BDA0003014376920001031
(c)
Figure BDA0003014376920001032
在一些进一步的实施方案中，所述聚合复合物包含核酸组分和聚合物，所述聚合物包含：
(a)
Figure BDA0003014376920001033
(c)
Figure BDA0003014376920001034
其中
J为O并且Z为
Figure BDA0003014376920001035
其中x为1-1000。
在一些进一步的实施方案中，所述聚合复合物包含核酸组分和聚合物，所述聚合物包含：
(b)
Figure BDA0003014376920001036
在一些进一步的实施方案中，所述聚合复合物包含核酸组分和聚合物，其中R1选自
Figure BDA0003014376920001037
在一些进一步的实施方案中，所述聚合复合物包含核酸组分和聚合物，其中R1为
Figure BDA0003014376920001041
在一些进一步的实施方案中，所述聚合复合物包含核酸组分和聚合物，其中R1为
Figure BDA0003014376920001042
在一些进一步的实施方案中，所述聚合复合物包含核酸组分和聚合物，其中R2选自
Figure BDA0003014376920001043
在一些进一步的实施方案中，所述聚合复合物包含核酸组分和聚合物，其中R2为
Figure BDA0003014376920001044
在一些进一步的实施方案中，所述聚合复合物包含核酸组分和聚合物，其中R2为
Figure BDA0003014376920001045
在一些进一步的实施方案中，所述聚合复合物包含核酸组分和聚合物，其中R1为
Figure BDA0003014376920001046
并且R2为
Figure BDA0003014376920001047
在一些进一步的实施方案中，所述聚合复合物包含核酸组分和聚合物，其中R1为
Figure BDA0003014376920001048
并且R2为
Figure BDA0003014376920001049
在一些实施方案中，所述聚合复合物包含核酸组分和聚合物，所述聚合物包含：
(a)
Figure BDA00030143769200010410
(b)
Figure BDA0003014376920001051
(c)
Figure BDA0003014376920001052
其中
R1为
Figure BDA0003014376920001053
并且
R2选自
Figure BDA0003014376920001054
在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约3kDa至约200kDa的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约5kDa至约50kDa的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有介于约10kDa与50kDa之间的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约5kDa至约15kDa的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约10kDa的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约20kDa的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约30kDa的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约40kDa的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物的由马克-豪温克定义的α参数小于约0.5。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物的由马克-豪温克方程定义的α参数在约0.3至约0.5范围内。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约1.0至约8.0的PDI。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约2.5的PDI。
在一些实施方案中，所述聚合复合物包含核酸组分和聚合物，所述聚合物包含：
(a)
Figure BDA0003014376920001055
(b)
Figure BDA0003014376920001056
(c)
Figure BDA0003014376920001061
其中
J为O并且Z为
Figure BDA0003014376920001062
其中x为1-1000；
R1为
Figure BDA0003014376920001063
并且
R2为
Figure BDA0003014376920001064
在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约3kDa至约200kDa的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约5kDa至约50kDa的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有介于约10kDa与50kDa之间的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约5kDa至约15kDa的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约10kDa的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约20kDa的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约30kDa的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约40kDa的MW。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物的由马克-豪温克定义的α参数小于约0.5。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物的由马克-豪温克方程定义的α参数在约0.3至约0.5范围内。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约1.0至约8.0的PDI。在一些进一步的实施方案中，所述聚合物具有约2.5的PDI。
在一些实施方案中，所述聚合物和核酸组分以约0.1:1至约200:1(w/w)的比率存在。例如，所述聚合物和核酸组分以在以下范围内的比率存在：约0.1:1至约200:1、约0.2:1至约200:1、约0.3:1至约200:1、约0.4:1至约200:1、约0.5:1至约200:1、约0.6:1至约200:1、约0.7:1至约200:1、约0.8:1至约200:1、约0.9:1至约200:1、约1:1至约200:1、约2:1至约200:1、约3:1至约200:1、约4:1至约200:1、约5:1至约200:1、约6:1至约200:1、约7:1至约200:1、约8:1至约200:1、约9:1至约200:1、约10:1约11:1至约200:1、约12:1至约200:1、约13:1至约200:1、约14:1至约200:1、约15:1至约200:1、约16:1至约200:1、约17:1至约200:1、约18:1至约200:1、约19:1至约200:1、约20:1至约200:1、约21:1至约200:1、约22:1至约200:1、约23:1至约200:1、约24:1至约200:1、约25:1至约200:1、约26:1至约200:1、约27:1至约200:1、约28:1至约200:1、约29:1至约200:1、约30:1至约200:1、约31:1至约200:1、约32:1至约200:1、约33:1至约200:1、约34:1至约200:1、约35:1至约200:1、约36:1至约200:1、约37:1至约200:1、约38:1至约200:1、约39:1至约200:1、约40:1至约200:1、约41:1至约200:1、约42:1至约200:1、约43:1至约200:1、约44:1至约200:1、约45:1至约200:1、约46:1至约200:1、约47:1至约200:1、约48:1至约200:1、约49:1至约200:1、约50:1至约200:1、约51:1至约200:1、约52:1至约200:1、约53:1至约200:1、约54:1至约200:1、约55:1至约200:1、约56:1至约200:1、约57:1至约200:1、约58:1至约200:1、约59:1至约200:1、约60:1至约200:1、约61:1至约200:1、约62:1至约200:1、约63:1至约200:1、约64:1至约200:1、约65:1至约200:1、约66:1至约200:1、约67:1至约200:1、约68:1至约200:1、约69:1至约200:1、约70:1至约200:1、约71:1至约200:1、约72:1至约200:1、约73:1至约200:1、约74:1至约200:1、约75:1至约200:1、约76:1至约200:1、约77:1至约200:1、约78:1至约200:1、约79:1至约200:1、约80:1至约200:1、约81:1至约200:1、约82:1至约200:1、约83:1至约200:1、约84:1至约200:1、约85:1至约200:1、约86:1至约200:1、约87:1至约200:1、约88:1至约200:1、约89:1至约200:1、约90:1至约200:1、约91:1至约200:1、约92:1至约200:1、约93:1至约200:1、约94:1至约200:1、约95:1至约200:1、约96:1至约200:1、约97:1至约200:1、约98:1至约200:1、约99:1至约200:1、约100:1至约200:1、约101:1至约200:1、约102:1至约200:1、约103:1至约200:1、约104:1至约200:1、约105:1至约200:1、约106:1至约200:1、约107:1至约200:1、约108:1至约200:1、约109:1至约200:1、约110:1至约200:1、约111:1至约200:1、约112:1至约200:1、约113:1至约200:1、约114:1至约200:1、约115:1至约200:1、约116:1至约200:1、约117:1至约200:1、约118:1至约200:1、约119:1至约200:1、约120:1至约200:1、约121:1至约200:1、约122:1至约200:1、约123:1至约200:1、约124:1至约200:1、约125:1至约200:1、约126:1至约200:1、约127:1至约200:1、约128:1至约200:1、约129:1至约200:1、约130:1至约200:1、约131:1至约200:1、约132:1至约200:1、约133:1至约200:1、约134:1至约200:1、约135:1至约200:1、约136:1至约200:1、约137:1至约200:1、约138:1至约200:1、约139:1至约200:1、约140:1至约200:1、约141:1至约200:1、约142:1至约200:1、约143:1至约200:1、约144:1至约200:1、约145:1至约200:1、约146:1至约200:1、约147:1至约200:1、约148:1至约200:1、约149:1至约200:1、约150:1至约200:1、约151:1至约200:1、约152:1至约200:1、约153:1至约200:1、约154:1至约200:1、约155:1至约200:1、约156:1至约200:1、约157:1至约200:1、约158:1至约200:1、约159:1至约200:1、约160:1至约200:1、约161:1至约200:1、约162:1至约200:1、约163:1至约200:1、约164:1至约200:1、约165:1至约200:1、约166:1至约200:1、约167:1至约200:1、约168:1至约200:1、约169:1至约200:1、约170:1至约200:1、约171:1至约200:1、约172:1至约200:1、约173:1至约200:1、约174:1至约200:1、约175:1至约200:1、约176:1至约200:1、约177:1至约200:1、约178:1至约200:1、约179:1至约200:1、约180:1至约200:1、约181:1至约200:1、约182:1至约200:1、约183:1至约200:1、约184:1至约200:1、约185:1至约200:1、约186:1至约200:1、约187:1至约200:1、约188:1至约200:1、约189:1至约200:1、约190:1至约200:1、约191:1至约200:1、约192:1至约200:1、约193:1至约200:1、约194:1至约200:1、约195:1至约200:1、约196:1至约200:1、约197:1至约200:1、约198:1至约200:1、约199:1至约200:1，包括它们之间的所有范围。在一些实施方案中，所述聚合物和核酸组分以约20:1至约80:1(w/w)的比率存在。
在一些实施方案中，所述聚合物和核酸组分以约0.1:1、约0.2:1、约0.3:1、约0.4:1、约0.5:1、约0.6:1、约0.7:1、约0.8:1、约0.9:1、约1:1、约2:1、约3:1、约4:1、约5:1、约6:1、约7:1、约8:1、约9:1、约10:1约11:1、约12:1、约13:1、约14:1、约15:1、约16:1、约17:1、约18:1、约19:1、约20:1、约21:1、约22:1、约23:1、约24:1、约25:1、约26:1、约27:1、约28:1、约29:1、约30:1、约31:1、约32:1、约33:1、约34:1、约35:1、约36:1、约37:1、约38:1、约39:1、约40:1、约41:1、约42:1、约43:1、约44:1、约45:1、约46:1、约47:1、约48:1、约49:1、约50:1、约51:1、约52:1、约53:1、约54:1、约55:1、约56:1、约57:1、约58:1、约59:1、约60:1、约61:1、约62:1、约63:1、约64:1、约65:1、约66:1、约67:1、约68:1、约69:1、约70:1、约71:1、约72:1、约73:1、约74:1、约75:1、约76:1、约77:1、约78:1、约79:1、约80:1、约81:1、约82:1、约83:1、约84:1、约85:1、约86:1、约87:1、约88:1、约89:1、约90:1、约91:1、约92:1、约93:1、约94:1、约95:1、约96:1、约97:1、约98:1、约99:1、约100:1、约101:1、约102:1、约103:1、约104:1、约105:1、约106:1、约107:1、约108:1、约109:1、约110:1、约111:1、约112:1、约113:1、约114:1、约115:1、约116:1、约117:1、约118:1、约119:1、约120:1、约121:1、约122:1、约123:1、约124:1、约125:1、约126:1、约127:1、约128:1、约129:1、约130:1、约131:1、约132:1、约133:1、约134:1、约135:1、约136:1、约137:1、约138:1、约139:1、约140:1、约141:1、约142:1、约143:1、约144:1、约145:1、约146:1、约147:1、约148:1、约149:1、约150:1、约151:1、约152:1、约153:1、约154:1、约155:1、约156:1、约157:1、约158:1、约159:1、约160:1、约161:1、约162:1、约163:1、约164:1、约165:1、约166:1、约167:1、约168:1、约169:1、约170:1、约171:1、约172:1、约173:1、约174:1、约175:1、约176:1、约177:1、约178:1、约179:1、约180:1、约181:1、约182:1、约183:1、约184:1、约185:1、约186:1、约187:1、约188:1、约189:1、约190:1、约191:1、约192:1、约193:1、约194:1、约195:1、约196:1、约197:1、约198:1、约199:1或约200:1的比率存在。在一些实施方案中，所述聚合物和核酸组分以约30:1(w/w)的比率存在。
在一些实施方案中，粒度小于2μm。在一些实施方案中，所述聚合复合物的粒度小于约300nm。例如，所述聚合复合物的粒度可以是约50nm、51nm、约52nm、约53nm、约54nm、约55nm、约56nm、约57nm、约58nm、约59nm、约60nm、约61nm、约62nm、约63nm、约64nm、约65nm、约66nm、约67nm、约68nm、约69nm、约70nm、约71nm、约72nm、约73nm、约74nm、约75nm、约76nm、约77nm、约78nm、约79nm、约80nm、约81nm、约82nm、约83nm、约84nm、约85nm、约86nm、约87nm、约88nm、约89nm、约90nm、约91nm、约92nm、约93nm、约94nm、约95nm、约96nm、约97nm、约98nm、约99nm、约100nm、约101nm、约102nm、约103nm、约104nm、约105nm、约106nm、约107nm、约108nm、约109nm、约110nm、约111nm、约112nm、约113nm、约114nm、约115nm、约116nm、约117nm、约118nm、约119nm、约120nm、约121nm、约122nm、约123nm、约124nm、约125nm、约126nm、约127nm、约128nm、约129nm、约130nm、约131nm、约132nm、约133nm、约134nm、约135nm、约136nm、约137nm、约138nm、约139nm、约140nm、约141nm、约142nm、约143nm、约144nm、约145nm、约146nm、约147nm、约148nm、约149nm、约150nm、约151nm、约152nm、约153nm、约154nm、约155nm、约156nm、约157nm、约158nm、约159nm、约160nm、约161nm、约162nm、约163nm、约164nm、约165nm、约166nm、约167nm、约168nm、约169nm、约170nm、约171nm、约172nm、约173nm、约174nm、约175nm、约176nm、约177nm、约178nm、约179nm、约180nm、约181nm、约182nm、约183nm、约184nm、约185nm、约186nm、约187nm、约188nm、约189nm、约190nm、约191nm、约192nm、约193nm、约194nm、约195nm、约196nm、约197nm、约198nm、约199nm、约200nm、约201nm、约202nm、约203nm、约204nm、约205nm、约206nm、约207nm、约208nm、约209nm、约210nm、约211nm、约212nm、约213nm、约214nm、约215nm、约216nm、约217nm、约218nm、约219nm、约220nm、约221nm、约222nm、约223nm、约224nm、约225nm、约226nm、约227nm、约228nm、约229nm、约230nm、约231nm、约232nm、约233nm、约234nm、约235nm、约236nm、约237nm、约238nm、约239nm、约240nm、约241nm、约242nm、约243nm、约244nm、约245nm、约246nm、约247nm、约248nm、约249nm、约250nm、约251nm、约252nm、约253nm、约254nm、约255nm、约256nm、约257nm、约258nm、约259nm、约260nm、约261nm、约262nm、约263nm、约264nm、约265nm、约266nm、约267nm、约268nm、约269nm、约270nm、约271nm、约272nm、约273nm、约274nm、约275nm、约276nm、约277nm、约278nm、约279nm、约280nm、约281nm、约282nm、约283nm、约284nm、约285nm、约286nm、约287nm、约288nm、约289nm、约290nm、约291nm、约292nm、约293nm、约294nm、约295nm、约296nm、约297nm、约298nm、约299nm或约300nm。在一些实施方案中，本公开的聚合复合物具有约60nm至约250nm的粒度。在一些实施方案中，本公开的聚合复合物具有约175nm至约250nm的粒度。
在一些实施方案中，本公开的聚合复合物具有约0mV至约100mV的ζ电位。例如，本公开的聚合复合物可具有在以下范围内的ζ电位：约0mV至约100mV、约1mV至约100mV、约2mV至约100mV、约3mV至约100mV、约4mV至约100mV、约5mV至约100mV、约6mV至约100mV、约7mV至约100mV、约8mV至约100mV、约9mV至约100mV、约10mV至约100mV、约11mV至约100mV、约12mV至约100mV、约13mV至约100mV、约14mV至约100mV、约15mV至约100mV、约16mV至约100mV、约17mV至约100mV、约18mV至约100mV、约19mV至约100mV、约20mV至约100mV、约21mV至约100mV、约22mV至约100mV、约23mV至约100mV、约24mV至约100mV、约25mV至约100mV、约26mV至约100mV、约27mV至约100mV、约28mV至约100mV、约29mV至约100mV、约30mV至约100mV、约31mV至约100mV、约32mV至约100mV、约33mV至约100mV、约34mV至约100mV、约35mV至约100mV、约36mV至约100mV、约37mV至约100mV、约38mV至约100mV、约39mV至约100mV、约40mV至约100mV、约41mV至约100mV、约42mV至约100mV、约43mV至约100mV、约44mV至约100mV、约45mV至约100mV、约46mV至约100mV、约47mV至约100mV、约48mV至约100mV、约49mV至约100mV、约50mV至约100mV、约51mV至约100mV、约52mV至约100mV、约53mV至约100mV、约54mV至约100mV、约55mV至约100mV、约56mV至约100mV、约57mV至约100mV、约58mV至约100mV、约59mV至约100mV、约60mV至约100mV、约61mV至约100mV、约62mV至约100mV、约63mV至约100mV、约64mV至约100mV、约65mV至约100mV、约66mV至约100mV、约67mV至约100mV、约68mV至约100mV、约69mV至约100mV、约70mV至约100mV、约71mV至约100mV、约72mV至约100mV、约73mV至约100mV、约74mV至约100mV、约75mV至约100mV、约76mV至约100mV、约77mV至约100mV、约78mV至约100mV、约78mV至约100mV、约79mV至约100mV、约80mV至约100mV、约81mV至约100mV、约82mV至约100mV、约83mV至约100mV、约84mV至约100mV、约85mV至约100mV、约86mV至约100mV、约87mV至约100mV、约88mV至约100mV、约89mV至约100mV、约90mV至约100mV、约91mV至约100mV、约92mV至约100mV、约93mV至约100mV、约94mV至约100mV、约95mV至约100mV、约96mV至约100mV、约97mV至约100mV、约98mV至约100mV、约99mV至约100mV。在一些实施方案中，ζ电位为约30mV至约34mV。
在一些实施方案中，本公开的聚合复合物具有0mV、约1mV、约2mV、约3mV、约4mV、约5mV、约6mV、约7mV、约8mV、约9mV、约10mV、约11mV、约12mV、约13mV、约14mV、约15mV、约16mV、约17mV、约18mV、约19mV、约20mV、约21mV、约22mV、约23mV、约24mV、约25mV、约26mV、约27mV、约28mV、约29mV、约30mV、约31mV、约32mV、约33mV、约34mV、约35mV、约36mV、约37mV、约38mV、约39mV、约40mV、约41mV、约42mV、约43mV、约44mV、约45mV、约46mV、约47mV、约48mV、约49mV、约50mV、约51mV、约52mV、约53mV、约54mV、约55mV、约56mV、约57mV、约58mV、约59mV、约60mV、约61mV、约62mV、约63mV、约64mV、约65mV、约66mV、约67mV、约68mV、约69mV、约70mV、约71mV、约72mV、约73mV、约74mV、约75mV、约76mV、约77mV、约78mV、约78mV、约79mV、约80mV、约81mV、约82mV、约83mV、约84mV、约85mV、约86mV、约87mV、约88mV、约89mV、约90mV、约91mV、约92mV、约93mV、约94mV、约95mV、约96mV、约97mV、约98mV、约99mV或约100mV的ζ电位。
在一些实施方案中，所述聚合复合物的核酸组分是质粒、纳米质粒、核酸、微环或基因编辑系统。在一些实施方案中，所述聚合复合物的核酸组分是质粒。在一些实施方案中，所述聚合复合物的核酸组分是纳米质粒。在一些实施方案中，纳米质粒包含真核转基因和尺寸小于0.5kb的细菌骨架。在一些实施方案中，质粒或纳米质粒是不含抗生素抗性标记物的质粒或不含抗生素抗性标记物的纳米质粒。在一些实施方案中，质粒或纳米质粒包含蔗糖选择标记物或无义抑制因子标记物。
在一些实施方案中，聚合复合物的核酸组分是基因编辑系统。在一些实施方案中，基因编辑系统是(i)成簇的规律间隔的回文重复序列(CRISPR)相关(Cas)系统；(ii)转录激活子样效应物核酸酶(TALEN)系统；或(iii)锌指核酸酶(ZFN)系统。
在一些实施方案中，核酸是RNAi诱导分子。RNAi诱导分子可选自由siRNA、dsRNA、shRNA和微小RNA组成的组。
在一些实施方案中，核酸组分包含组织特异性启动子。
在一些实施方案中，核酸组分包含与遗传疾病或病症相关的基因。遗传疾病或病症可由一个或多个基因的突变引起，所述突变导致低的、缺失的或功能失调的蛋白质表达。所述基因可选自由以下组成的组：COL7A1、LAMB3、ADA、SERPINA1、CFTR、HTT、NF1、PHA、HBS、FERMT1、KRT14、DSP、SPINK5和FLG。在一些实施方案中，所述基因是COL7A1，并且所述遗传疾病或病症是大疱性表皮松解症的形式。大疱性表皮松解症包括营养不良性大疱性表皮松解症(常染色体隐性)、营养不良性大疱性表皮松解症(局灶性变异型)、痒疹性大疱性表皮松解症、大疱性表皮松解症(胫前型)、单纯性大疱性表皮松解症(道林-米拉(Dowling-Meara)型)、单纯性大疱性表皮松解症(科布内(Koebner)型)、单纯性表皮松解症(隐性1)、单纯性大疱性表皮松解症(韦伯-科凯恩(Weber-Cockayne)型)、大疱性表皮松解症(致死性棘层松解症)。在一些实施方案中，遗传病症或遗传疾病是腺苷脱氨酶(ADA)缺乏症、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、囊性纤维化、亨廷顿氏病(Huntington’s Disease)、1型神经纤维瘤病、苯丙酮尿症、镰状细胞病、散发性包涵体肌炎、迪谢内肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy)、金德勒综合征(Kindler syndrome)、交界型大疱性表皮松解症、网状色素性皮病、纳格里-弗朗西斯凯-贾达森综合征(Naegeli-Franceschetti-Jadassohn syndrome)、内瑟顿综合征(Netherton Syndrome)、寻常性鱼鳞病、特应性皮炎、尤希尔氏综合征(Usher’ssyndrome)、埃勒斯-当洛斯综合征(Ehlers-Danlos syndrome)、纯合性家族性高胆固醇血症(HoFH)或克罗恩氏病(Crohn’s disease)。
在一些实施方案中，所述基因的序列被优化成在所述聚合复合物被递送至细胞中后获得最大的蛋白质表达。
药物组合物
在一些实施方案中，本公开提供了一种药物组合物，其包含有效量的一种或多种根据本公开某些实施方案的聚合复合物与药学上可接受的载剂的组合。
在一些实施方案中，本公开提供了一种药物组合物，其包含有效量的一种或多种本文所述的聚合复合物与药学上可接受的赋形剂的组合。在一些实施方案中，药学上可接受的赋形剂选自由一种或多种增量剂、缓冲剂、张度剂和冷冻保护剂组成的组。在一些实施方案中，增量剂选自由羟乙基淀粉、海藻糖、甘露醇、乳糖和甘氨酸组成的组。在一些实施方案中，缓冲剂选自由磷酸盐缓冲液、tris HCl缓冲液、柠檬酸盐缓冲液和组氨酸组成的组。在一些实施方案中，张度剂选自由甘露醇、蔗糖、甘氨酸、甘油和氯化钠组成的组。
在一些实施方案中，本公开提供了一种药物组合物，其包含有效量的一种或多种本文所述的聚合复合物与冷冻保护剂的组合。在一些实施方案中，冷冻保护剂选自由以下组成的组：葡萄糖、蔗糖、海藻糖、乳糖、甘露醇、山梨糖醇、高度分散的硅胶(aerosil)(胶体二氧化硅)、麦芽糖、聚(乙烯基吡咯烷酮)、果糖、右旋糖酐、甘油、聚(乙烯醇)、甘氨酸、羟丙基-β-环糊精和明胶。在某些实施方案中，冷冻保护剂选自由海藻糖、蔗糖、葡萄糖和甘露醇组成的组。在一些实施方案中，冷冻保护剂是蔗糖。
在一些实施方案中，药学上可接受的载剂适合于口服、胃肠外、吸入、局部、皮下、肌内、静脉内、眼内或真皮内施用。在一些实施方案中，药物组合物被配制为选自由非水性洗剂、油包水洗剂和水包油洗剂组成的组的洗剂。在一些实施方案中，药物组合物被冻干用于将来使用。在一些实施方案中，药物组合物以水溶液形式被冷冻。
在一些实施方案中，药物组合物是亲液物(lyophil)。在一些实施方案中，亲液物包含有效量的一种或多种本文所述的聚合复合物与药学上可接受的赋形剂的组合。在某些实施方案中，药学上可接受的赋形剂包含冷冻保护剂。在某些实施方案中，冷冻保护剂选自由海藻糖、蔗糖、葡萄糖和甘露醇组成的组。在一些实施方案中，冷冻保护剂是蔗糖。
在一些实施方案中，本公开提供了制备药物组合物的方法，所述药物组合物包含有效量的一种或多种本文所述的聚合复合物与药学上可接受的载剂的组合。在一些实施方案中，所述方法包括将一种或多种本文所述的聚合复合物与适合的溶剂组合。在一些实施方案中，适合的溶剂选自由水、二甲亚砜和其混合物组成的组。在某些实施方案中，适合的溶剂包含水。
在一些实施方案中，所述方法包括：
(a)将一种或多种本文所述的聚合复合物与适合的溶剂组合；
(b)将一种或多种药学上可接受的赋形剂添加至步骤(a)的混合物中，以及
(c)冻干步骤(b)的混合物以提供亲液物。
在一些实施方案中，步骤(b)的一种或多种药学上可接受的赋形剂包含冷冻保护剂。在某些实施方案中，冷冻保护剂的浓度以步骤(b)混合物的重量计为约1％至约20％，包括约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％和约19％，包括它们之间的所有范围。在某些实施方案中，冷冻保护剂的浓度以步骤(b)混合物的重量计为约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％或约20％。在特定实施方案中，冷冻保护剂的浓度以步骤(b)混合物的重量计为约1％。在特定实施方案中，冷冻保护剂的浓度以步骤(b)混合物的重量计为约3％。在特定实施方案中，冷冻保护剂的浓度以步骤(b)混合物的重量计为约5％。
在一些实施方案中，本公开提供了根据本文所述的方法制备的药物组合物。
在一些实施方案中，本公开提供了通过包括以下的方法制备的药物组合物：
(a)将一种或多种本文所述的聚合复合物与适合的溶剂组合；
(b)将一种或多种药学上可接受的赋形剂添加至步骤(a)的混合物中，以及
(c)冻干步骤(b)的混合物以提供亲液物。
在一些实施方案中，步骤(b)的一种或多种药学上可接受的赋形剂包含冷冻保护剂。在某些实施方案中，冷冻保护剂的浓度以步骤(b)混合物的重量计为约1％至约20％，包括约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％和约19％，包括它们之间的所有范围。在某些实施方案中，冷冻保护剂的浓度以步骤(b)混合物的重量计为约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％或约20％。在特定实施方案中，冷冻保护剂的浓度以步骤(b)混合物的重量计为约1％。在特定实施方案中，冷冻保护剂的浓度以步骤(b)混合物的重量计为约3％。在特定实施方案中，冷冻保护剂的浓度以步骤(b)混合物的重量计为约5％。
细胞转染方法
在一些实施方案中，本公开提供了一种细胞转染的方法，其包括使一个或多个靶细胞与根据本公开的某些实施方案的药物组合物在适合于用聚合复合物转染靶细胞的条件下接触。在一些实施方案中，所述一个或多个靶细胞是真核细胞。在一些实施方案中，所述一个或多个靶细胞是以下中的一者或多者：T细胞、B细胞、血细胞、肺泡细胞、肺细胞、脑神经元、皮肤神经元、上皮细胞、角质形成细胞、iPS细胞、成纤维细胞和汗腺细胞。
治疗方法
在一些实施方案中，本公开提供了治疗有需要的患者的疾病的方法，其包括施用治疗有效量的根据本公开的某些实施方案的药物组合物，使得所述患者的一个或多个细胞被聚合复合物核酸组分转染。
在一些实施方案中，本公开提供了治疗有此需要的患者的疾病的方法，其包括施用治疗有效量的根据本公开的某些实施方案的药物组合物，其中所述组合物的所述施用纠正所述受试者中靶基因的有缺陷的翻译。
在一些实施方案中，靶基因选自由以下组成的组：COL7A1、LAMB3、ADA、SERPINA1、CFTR、HTT、NF1、PHA、HBS、FERMT1、KRT14、DSP、SPINK5和FLG。在一些实施方案中，所述基因是COL7A1，并且所述遗传疾病或病症是大疱性表皮松解症的形式。大疱性表皮松解症包括营养不良性大疱性表皮松解症(常染色体隐性)、营养不良性大疱性表皮松解症(局灶性变异型)、痒疹性大疱性表皮松解症、大疱性表皮松解症(胫前型)、单纯性大疱性表皮松解症(道林-米拉型)、单纯性大疱性表皮松解症(科布内型)、单纯性表皮松解症(隐性1)、单纯性大疱性表皮松解症(韦伯-科凯恩型)、大疱性表皮松解症(致死性棘层松解症)。在一些实施方案中，遗传病症或遗传疾病是腺苷脱氨酶(ADA)缺乏症、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、囊性纤维化、亨廷顿氏病、1型神经纤维瘤病、苯丙酮尿症、镰状细胞病、散发性包涵体肌炎、迪谢内肌营养不良、金德勒综合征、交界型大疱性表皮松解症、网状色素性皮病、纳格里-弗朗西斯凯-贾达森综合征、内瑟顿综合征、寻常性鱼鳞病、特应性皮炎、尤希尔氏综合征、埃勒斯-当洛斯综合征、纯合性家族性高胆固醇血症(HoFH)或克罗恩氏病。
实施例
提供以下实施例以举例说明本公开，并且不应将其解释为对本公开的限制。在这些实施例中，除非另有注释，否则所有份数和百分比均以重量计。实施例中的缩写在下文中有注释。
实施例1：通过线性低聚物组合制备的LBPAE
成纤维细胞基因递送尚未表现出治疗应用所需的效率。如本文所述，为了克服这种限制，经由新的线性低聚物组合策略来制备根据本公开的某些实施方案的新型多功能LBPAE基因递送材料。根据本公开的某些实施方案的LBPAE在难以转染的成纤维细胞HPDF和常用的3T3中实现了优异的转染效率和降低的细胞毒性，显著优于市售试剂(支化PEI和SuperFect)。LBPAE聚合复合物的高LC50值证实它们在成纤维细胞转染中具有有利的生物相容性。机理研究表明，装配有足够量的伯胺、仲胺和叔胺的LBPAE能够使DNA凝聚成具有均匀球形形态的纳米尺寸的粒子，从而促进细胞摄取并介导强缓冲容量以实现高效的内体逃逸。LBPAE上酯键的水解促进DNA释放并显著增加生物相容性，从而允许对聚合物/DNA w/w比进行灵活的设计和调整。除了LBPAE在报道基因递送方面的高性能之外，LBPAE还可高效地将微环COL7A1基因递送至HPDF，并显著改善C7的表达，这对于维持皮肤完整性至关重要。这些结果证实LBPAE是基于成纤维细胞的基因递送中的高性能非病毒载体，突显了其在遗传性皮肤病治疗和再生医学中的巨大潜力。
连续的线性低聚物生长和分支赋予所得LBPAE更均匀的线性链段和分支单元分布。令人惊讶的是，在难以转染的HPDF和常用的小鼠胚胎成纤维细胞(3T3)中，新开发的LBPAE展现出稳健的基因转染能力，荧光素酶(Gluc)的表达比商业基因转染试剂PEI和SuperFect高出多达三个数量级，并且实现了几乎100％的绿色荧光蛋白质(GFP)表达，而没有诱导明显的细胞毒性。为了探明LBPAE在成纤维细胞中超强的基因转染能力背后的可能机理，研究了与基因转染过程相关的多种细胞外和细胞内屏障。结果表明，LBPAE表现出强的DNA结合亲和力并且可使DNA凝聚从而配制出具有接近100％细胞摄取效率的纳米尺寸的聚合复合物。LBPAE的强的质子缓冲容量连同生物可降解性也将有助于LBPAE/DNA聚合复合物从内体/溶酶体中逃逸以及DNA在细胞质中释放。此外，使用LBPAE将编码COL7A1基因(MCC7)的微环质粒递送至HPDF并且检测到C7表达的显著上调，这证明LBPAE具有治疗C7缺乏型遗传性皮肤病(诸如破坏性和衰弱性遗传性皮肤病症RDEB)的巨大前景。
本实施例描述了合成LBPAE的线性低聚物组合策略。如图8中所示，该策略涉及两个连续步骤：线性低聚物形成和分支。在第一步骤中，A2型胺与C2型二丙烯酸酯反应从而产生以丙烯酸酯为末端的基础低聚物，将其进一步用第二胺封端。在纯化以去除未反应的单体和过量封端剂之后，形成线性A2-C2低聚物。在第二步骤中，引入B3型三丙烯酸酯以组合线性A2-C2低聚物并产生LBPAE。LBPAE的益处是双重的：1)所获得的LBPAE中的线性链段的长度将是预先确定的，因此可容易地定制；2)LBPAE中的分支单元将更均匀地分布在线性链段之间。
为了验证这一假设，将已被证实为合成用于基因转染的PAE的有效单体的5-氨基-1-戊醇(AP)、三羟甲基丙烷三丙烯酸酯(TMPTA)、1,4-丁二醇二丙烯酸酯(BDA)和1,11-二氨基-3,6,9-三氧杂十一烷(DATOU)分别用作用于LBPAE合成的A2、B3、C2类型的单体和封端剂。使化学计量比为1.2:1的AP和BDA在二甲亚砜(DMSO)中在90℃下反应，并用凝胶渗透色谱(GPC)监测重均分子量(Mw)。在24小时后，当反应混合物的Mw接近3000Da时，通过冷却至室温来中止反应并用DMSO稀释，然后添加过量的DATOU以在25℃下将以丙烯酸酯为末端的基础低聚物封端48小时。在通过在丙酮中透析去除未反应的单体、封端剂连同Mw<3000Da的低聚物之后，获得Mw为约3500Da且多分散性指数(PDI)为1.69的线性A2-C2低聚物(图10)。为了产生LBPAE，将线性A2-C2低聚物和TMPTA溶解于DMSO(将A2-C2:TMPTA的摩尔比设定为3:1)中并且在90℃下反应。当Mw为约10kDa时，中止反应并掺入过量的DATOU以消耗所有未反应的乙烯基。然后，使聚合物在二乙醚中沉淀并在真空烘箱中干燥，得到最终的LBPAE产物。GPC测量显示，LBPAE具有9.4kDa的Mw，PDI为2.5(图19)。马克-豪温克(MH)图的α值0.36验证了其高度支化的结构(图10)。通过1H NMR确认LBPAE的化学组成(图11)。
实施例2：LBPAE在成纤维细胞中实现了稳健的基因转染效率和优异的细胞存活力
可行的基因递送载体不仅可实现高的基因转染效率，而且可诱导最小的细胞毒性。然而，实际上，基因载体的转染效率的改善通常以其生物相容性为代价，或反之亦然。为评价合成的LBPAE的基因转染能力并鉴别出用于成纤维细胞转染的最佳参数，首先针对HPDF和3T3的转染评估了一系列具有不同w/w比的LBPAE/DNA聚合复合物。使用Gluc DNA作为报道基因，并且通过转染后的Gluc活性测量对基因转染效率进行定量。使用Alamarblue测定和致死浓度50(LC50)评估来测量转染后在成纤维细胞中的细胞毒性和毒理谱。然后使用GFP DNA作为报道基因，通过流式细胞术进一步验证了LBPAE的转染效力。
用LBPAE转染后的成纤维细胞的Gluc表达和细胞存活力
对于基于阳离子聚合物的基因递送载体，聚合物/DNA的重量比(w/w)是用于确定转染效率和细胞毒性两者的有用参数[5,11]，因此我们首先系统地优化了w/w比。考虑到原代细胞(例如，HPDF)通常对于阳离子聚合物来说是脆弱的，将用于HPDF转染的LBPAE/DNA w/w比逐渐从10:1增加至50:1。为了建立用于比较的强基准，还根据制造商的方案和先前的出版物对用于两种枝状商业基因转染试剂(PEI和SuperFect)的w/w比进行了优化[6,13]。图1a概述了转染后HPDF的Gluc活性和细胞存活力。可以清楚地看出，用于PEI和SuperFect基因转染的最佳w/w比分别为1:1和3:1。w/w比的进一步增加不仅明显降低Gluc活性，而且显著增加细胞毒性。例如，与3:1的w/w比下的情况相比，在用9:1的w/w比的SuperFect/DNA聚合复合物转染后HPDF的Gluc活性要低3.4倍，并且细胞存活率从>89％降低至<44％。与此形成鲜明对比的是，在所测试的w/w比的范围内，即使在10:1的最低w/w比下，在用LBPAE/DNA聚合复合物转染后HPDF的Gluc表达仍然强于PEI/DNA聚合复合物和SuperFect/DNA聚合复合物在它们的最佳w/w比下所介导的Gluc表达。尤其是，被w/w比为40:1的LBPAE/DNA聚合复合物转染的HPDF的Gluc活性比PEI/DNA聚合复合物介导的Gluc活性高出多达103倍。重要的是，LBPAE不会诱导明显的细胞毒性。即使在50:1的最高w/w比下，>95％的细胞存活力仍得以保留。在3T3中，PEI/DNA聚合复合物展现出与HPDF中类似的基因转染效率和细胞毒性趋势。尽管在6:1和9:1的w/w比下，但SuperFect/DNA聚合复合物显示出较高的基因转染效率，但仅保留62％和49％的细胞存活力(图1b)。同样，在所有测试的w/w比下，LBPAE/DNA聚合复合物都展现出强的基因转染能力和高的细胞存活力。用LBPAE/DNA聚合复合物转染后3T3的Gluc活性比PEI/DNA和SuperFect/DNA聚合复合物在它们的最佳w/w比下介导的Gluc活性高多个数量级。令人惊讶地，在70:1的w/w比下，LBPAE/DNA聚合复合物介导了与PEI/DNA聚合复合物相比高出多达3292倍的Gluc活性，同时仍然维持>90％的细胞存活力。应当注意，在各组之间使用相同量的DNA。用于LBPAE/DNA聚合复合物的w/w比高得多意味着要比PEI或SuperFect情况使用显著更多的LBPAE。这进一步证实了LBPAE的优异生物相容性。
LBPAE的毒理谱
尽管已经开发并筛选了>2500个候选物用于基因转染[28]，但到目前为止，还没有用任何PAE聚合物在成纤维细胞中进行毒理学研究。为进一步验证LBPAE在基因转染中的生物相容性，确定LBPAE的毒理谱并计算LC50值。为此，使用具有40:1的相同w/w比的LBPAE/DNA聚合复合物，用从355μg mL-1增加至755μg mL-1的聚合复合物浓度来转染HPDF和3T3。为了进行比较，使用SuperFect/DNA聚合复合物，并将浓度从15μg mL-1增加至55μg mL-1。在转染后24小时，将细胞同时用绿色荧光的钙黄绿素-AM(C-AM，用于活细胞)和红色荧光的乙锭同型二聚体-1(EthD-1，用于死细胞)染色。未处理细胞以及用浓度为555μg mL-1的LBPAE/DNA聚合复合物和浓度为35μg mL-1的SuperFect/DNA聚合复合物处理的细胞的代表性荧光图像示于图2a中。可以看出，尽管用高一个数量级浓度的LBPAE/DNA聚合复合物进行了处理，但HPDF和3T3显示出与用SuperFect/DNA聚合复合物处理的HPDF和3T3类似的细胞存活力。用Alamarblue测定确定聚合复合物浓度依赖性细胞存活力，结果示于图2b和图2c中，由这些图计算出SuperFect/DNA聚合复合物在HPDF和3T3的LC50值分别为35.2μg mL-1和39.5μg mL-1。相比之下，LBPAE/DNA聚合复合物的LC50值为538.4μg mL-1和552.3μgmL-1，对应于与SuperFect/DNA对应物相比的14倍和13倍增加。SuperFect因其突出的生物相容性而已被广泛用于基因转染[29,30]，显示出低得多的细胞杀灭效应的LBPAE表现出极高的生物相容性，这在基因转染中，尤其是对于难以转染的细胞类型来说具有重要意义，因为可使用相当高的聚合复合物剂量或多次重复转染来增强转染效率。
用流式细胞术定量的GFP表达
使用Gluc DNA对由LBPAE介导的总转基因表达水平进行定量，进一步使用GFP DNA对所转染细胞的百分比进行定量。将HPDF和3T3用LBPAE/DNA聚合复合物以与上文相同的w/w比转染。如通过图3a中所示的荧光图像所证明的，在所有w/w比下，与PEI/DNA和SuperFect/DNA对应物在它们的最佳w/w比下的情况相比，多得多的HPDF被LBPAE/DNA聚合复合物转染。流式细胞术测量显示由PEI/DNA和SuperFect/DNA聚合复合物所实现的GFP阳性HPDF的百分比分别仅为50％和44％。相比之下，由LBPAE/DNA聚合复合物实现的GFP阳性群体水平要高得多，如通过对应于直方图分布中GFP光谱通道的细胞群体的远移所反映(图3b)。在10:1的w/w比下，由LBPAE/DNA聚合复合物介导的最低GFP阳性群体为68％。当w/w比高于40:1时，>93％的HPDF为GFP阳性。此外，被LBPAE/DNA聚合复合物转染的HPDF的中值荧光强度(MFI)比被PEI/DNA和SuperFect/DNA对应物转染的HPDF的MFI高出多达140倍(图3c)。在3T3中，由LBPAE/DNA聚合复合物实现的GFP阳性细胞的百分比从30:1的w/w比下的35％增加至70:1的w/w比下的>91％，与由PEI/DNA和SuperFect/DNA聚合复合物分别实现的5％和11％形成对比(图3d和图3e)。另外，在70:1的w/w比下，由LBPAE/DNA聚合复合物介导的3T3的MFI与PEI/DNA和SuperFect/DNA对应物的MFI相比高出了272倍和230倍(图3f)。这些结果表明，LBPAE不仅转染更多的细胞数，而且还显著促进单独转染的细胞中的蛋白质表达水平。原代成纤维细胞是难以转染的细胞类型，LBPAE在原代HPDF中可介导>90％的基因转染效率的事实证实了其超强的基因转染能力。鉴于LBPAE已被证明在宽范围的w/w比内具有高度的生物相容性与优异的基因转染能力，可设想LBPAE将在成纤维细胞基因转染中具有广泛的适用性。
实施例3：LBPAE实现超强基因转染效率和优异生物相容性的可能机理
为了探明LBPAE在成纤维细胞转染中高性能背后的可能机理，进行了一系列与众多细胞外和细胞内基因递送屏障有关的研究，包括来自聚合复合物的DNA凝聚和结合亲和力、聚合复合物尺寸、ζ电位、形态、质子缓冲容量、降解速率和DNA释放。
LBPAE的DNA凝聚和结合亲和力
有效的DNA凝聚，不仅可保护DNA免受内切核酸酶降解，而且有利于聚合复合物的细胞摄取，是基因成功转染的先决条件[30]。对于阳离子聚合物，DNA凝聚主要由静电相互作用驱动。有多种胺可部分或完全质子化以产生正电。例如，可部分或完全质子化的胺是衍生自封端剂DATOU的多个末端伯胺，或衍生自AP的众多主链叔胺。用琼脂糖凝胶电泳确定LBPAE的DNA凝聚能力。如图4a中所示，在所有w/w比下，都没有观察到DNA移位带，表明带负电荷的DNA被带正电荷的LBPAE有效地屏蔽，并因此保留在琼脂糖孔中而没有移位。两种商业基因转染试剂(PEI和SuperFect)都显示出高的DNA凝聚能力，尤其是SuperFect，其使DNA凝聚得非常紧密，以致于DNA染色染料难以接近DNA，因此DNA条带较浅。用PicoGreen测定进一步对DNA与LBPAE之间的结合亲和力进行定量。如图4b中所示，LBPAE在所有w/w比率下均展现出强的DNA结合亲和力。一般来说，DNA结合亲和力随w/w比而增加，例如从10:1的w/w比下的86％增加至70:1的w/w比下的96％，表明更多的LBPAE导致LBPAE与DNA之间的静电相互作用更强。相比之下，PEI和SuperFect两者都显示出甚至更强的接近100％的DNA结合亲和力，LBPAE、PEI和SuperFect的DNA结合亲和力与它们的DNA凝聚能力非常好地相关。然而，应当注意的是，中等的DNA结合亲和力更有利于基因转染，因为过强的相互作用将损害DNA从聚合复合物中的释放[31,32]。
LBPAE/DNA聚合复合物的尺寸、ζ电位和形态
纳米尺寸和正表面电荷可促进通过胞吞途径的粒子细胞摄取[33,34]。如图4c中所示，在生理溶液中，在所有测试的w/w比内，用动态光散射(DLS)测量的LBPAE/DNA聚合复合物的平均尺寸都小于250nm。在10:1至60:1的w/w比范围内，聚合复合物具有介于228nm与188nm之间的粒度。然而，当w/w比进一步增加至70:1时，聚合复合物尺寸减小至97nm。相应地，所有的聚合复合物都展现出正ζ电位。在10:1的最低w/w比下，LBPAE/DNA聚合复合物具有6mV的极低ζ电位。当w/w比高于10:1时，ζ电位显著增加至>30mV，其中在40:1的w/w比下达到最高的34mV。在相同的测试条件下，SuperFect/DNA聚合复合物具有极小的尺寸(约92nm)和高ζ电位(约37mV)。这些观察结果与聚合物的DNA凝聚能力和结合亲和力是一致的。相比之下，尽管PEI/DNA聚合复合物具有高的DNA凝聚和结合容量，但它具有相当大的尺寸(>500nm)。进一步使用透射电子显微术(TEM)来观察聚合复合物的尺寸和形态。如图4d中所示，所有LBPAE/DNA和SuperFect/DNA聚合复合物都表现出尺寸介于60nm与250nm之间的均匀的球形形态，该尺寸类似于通过DLS所测量的尺寸。重要的是，没有明显的聚合复合物聚集，这证实了聚合复合物的高稳定性。相反，PEI/DNA聚合复合物展现椭圆体形态，并且其尺寸远大于其他聚合复合物的尺寸。人们普遍认为，具有<250nm的尺寸和中等正表面电荷的聚合复合物更有利于细胞摄取，同时避免了由过量的正电荷引起的潜在细胞毒性[7,9]。上述基因转染研究已显示，用于HPDF和3T3转染的最佳w/w比分别为40:1和70:1。这表明对于有效的成纤维细胞基因转染来说，最有利的聚合复合物尺寸和表面电荷可根据细胞类型而显著变化。这里，在宽的w/w比范围内，LBPAE/DNA聚合复合物始终具有<250nm的平均尺寸和中等ζ电位，证实了它们对于转染多种多样的细胞类型以实现高性能的广泛适用性。
实施例4：LBPAE/DNA聚合复合物的细胞摄取
进一步研究了聚合复合物的细胞摄取。如图5a中所示，在相同的细胞密度下，在转染4小时后，所有的聚合复合物都显示出高的细胞摄取效率。相比之下，与PEI/DNA和SuperFect/DNA聚合复合物相比，多得多的LBPAE/DNA聚合复合物被HPDF和3T3摄取，如从Cy3标记的DNA观察到的强得多的红色荧光所证明。流式细胞术定量揭示PEI/DNA和SuperFect/DNA聚合复合物在HPDF中实现96.5％和98.4％的细胞摄取效率(图5b)。即便如此，LBPAE/DNA聚合复合物的摄取效率仍然稍高并且几乎是100％(99.3％)。在3T3中，也观察到类似的趋势(图5c)。此外，在HPDF中，LBPAE/DNA聚合复合物的归一化MFI比由PEI/DNA和SuperFect/DNA对应物实现的归一化MFI高出3.05倍和1.39倍(图5d)。在3T3中，性能分别高出了1.98倍和1.68倍(图5e)。所有这些结果表明PEI/DNA聚合复合物具有最低的细胞摄取效率，而LBPAE/DNA聚合复合物的性能显著地优于PEI/DNA和SuperFect/DNA对应物两者。总的来说，这些摄取结果与不同聚合复合物的上述聚合复合物尺寸、ζ电位和基因转染性能非常好地相关。
实施例5：质子缓冲容量的测量
基于阳离子聚合物的聚合复合物通常通过胞吞途径被细胞摄入，一旦被内化，它们主要被捕获在内体/溶酶体中。如果聚合复合物不能及时从内体/溶酶体区室逃逸，则凝聚在聚合复合物中的DNA将被酸性区室中的消化酶降解。因此，内体/溶酶体逃逸是高效非病毒基因递送要克服的另一主要瓶颈。“质子海绵效应”被广泛地认为是阳离子聚合物促进聚合复合物从内体/溶酶体中逃逸的主要机理。考虑到“质子海绵效应”的机理，pKa接近内体/溶酶体pH的具有高含量的可质子化仲胺和叔胺的阳离子聚合物更有利于聚合复合物从内体/溶酶体中逃逸，PEI和SuperFect是最典型的代表[29]。为了验证LBPAE的质子缓冲容量，进行酸-碱滴定。如图6a中所示，对于给定量的溶解于NaCl溶液中的聚合物，毫无人意外地，PEI显示出最强的质子缓冲容量，酸-碱滴定曲线在pH 7.4与5.1之间的斜率相对更平坦。这归因于以下事实：PEI具有非常高的伯胺、仲胺和叔胺含量，骨架中每3个原子就有一个氮。在归一化后，发现PEI、SuperFect和LBPAE的质子缓冲容量分别为5.1mmol H+g-1、4.6mmol H+g-1和1.6mmol H+g-1(表1)。实际上，LBPAE展现出的质子缓冲容量低于PEI和SuperFect。然而，由于细胞毒性小得多，为了有效促进LBPAE/DNA聚合复合物的内体/溶酶体逃逸，在实际应用中可显著增大w/w比。例如，对于HPDF和3T3基因的转染，LBPAE/DNA聚合复合物分别以40:1和70:1的w/w比使用。在这种条件下，所使用的总体LBPAE的质子缓冲容量比在1:1的w/w比下的PEI的质子缓冲容量高出12倍和21倍，并且比在3:1的w/w比下的SuperFect的质子缓冲容量高出5倍和8倍。基于“质子海绵效应”假设，LBPAE的高质子缓冲容量将引起渗透压力的增加，导致内体/溶酶体的溶胀和破裂，由此及时且高效地使LBPAE/DNA聚合复合物释放到细胞质中。
表1.LBPAE和商业试剂的缓冲容量。
Figure BDA0003014376920001281
实施例6：LBPAE的降解和DNA释放评估
通用的基因递送载体不仅可有效地使DNA凝聚并保护其免受酶降解，而且还可以能够在细胞核输入后使凝聚的DNA从聚合复合物中释放出来。对于阳离子聚合物，已提出一系列策略来促进聚合物在细胞质中的降解，从而促进DNA释放并降低基因转染后的累积细胞毒性。然而，对于高效的基因转染，基因载体需要适度长的半衰期，因为太短的半衰期将导致DNA保护不足和未成熟的DNA释放，而太长的半衰期将导致聚合复合物解离和DNA释放的困难。PAE的骨架上有多个酯键。在生理条件下，酯键可被水解降解从而产生生物相容的小分子β-氨基酸和二醇。据报道，根据化学组成，LPAE在含水环境中具有跨越1.5小时至超过6小时的半衰期[7]。对于根据本公开的某些实施方案和实施例的LBPAE，在37℃下孵育2小时后观察到43％的降解。在孵育6小时和8小时后，降解分别连续增加至81％和85％(图6b)。通过PicoGreen测定确定来自聚合复合物的相应DNA释放。如图6c中所示，在10:1的最低w/w比下，LBPAE/DNA聚合复合物具有最快的DNA释放速率，在孵育2小时后，>60％的DNA已被释放出来。相比之下，在40:1和70:1的中等和高w/w比下，凝聚的DNA以较慢但类似的速率从聚合复合物中释放。然而，在6小时后，>60％的DNA被释放出来。DNA释放谱与LBPAE降解谱匹配，证实LBPAE可在生理条件下自发地经由水解释放凝聚的DNA，而不需要任何额外的外部触发。所有来自DNA凝聚、结合亲和力、聚合复合物尺寸、ζ电位、细胞摄取、降解和DNA释放的结果都与LBPAE/DNA聚合复合物的基因转染效率和生物相容性非常相关，这突显了为实现有利于成纤维细胞中的高性能基因转染的聚合复合物性质而对LBPAE组成、结构和功能的操纵。
实施例7：LBPAE递送功能性COL7A1以操纵HPDF中的C7表达
根据本公开的某些实施方案和实施例的多功能LBPAE已被证实能够以超高效率和优异的生物相容性递送Gluc DNA和GFP DNA以转染HPDF和3T3。然而，许多基因递送载体显示出高水平的报道基因表达，翻译此类成功以产生功能蛋白质的表达有挑战性得多。因此，通过递送功能性COL7A1基因以促进HPDF中C7的表达，进一步评估LBPAE的有效性。当前，对于RDEB，除了姑息护理之外，尚无可用的有效治愈。尽管角质形成细胞和真皮成纤维细胞两者都能够产生和分泌C7[35]，但作为遗传性皮肤病的基因疗法中的靶细胞类型，后者比前者更稳健[21,36]。微环(MC)DNA盒显示出与正常质粒相比高出10-1000倍且更稳定的非整合转基因表达，而没有来自标准质粒中细菌骨架的免疫原性应答的风险[37,38]。考虑到COL7A1基因相当大，具有约9kb的cDNA/mRNA转录物，因此使用编码具有巨细胞病毒启动子的8.9kb全长COL7A1 cDNA的MCC7来转染HPDF。如图12中所示，MCC7含有8.9kb COL7A1 cDNA和比pcDNA3.1COL7A1亲本质粒小2kb的3kb骨架。应当注意的是，逆转录病毒和腺相关病毒(AAV)载体的最大载货尺寸通常小于8kb[39]，pcDNA3.1COL7A1和MCC7两者的尺寸均超过大多数病毒载体的基因包装容量，因此LBPAE的高效COL7A1基因转染将对RDEB的基因疗法具有重要意义。在本文中，通过组合LBPAE和MC DNA，递送MCC7以操纵HPDF中的C7表达，以期增强其在RDEB的基因疗法中的效用。图7a概述用LBPAE/MCC7聚合复合物转染后四天的HPDF的细胞免疫荧光图像。如所预期的，在未处理组和仅与抗C7二级抗体一起孵育的组中没有观察到明显的C7表达(红色荧光)。野生型HPDF和用SuperFect处理的组展现出中等的荧光，表明产生了C7。相比之下，用LBPAE/MCC7聚合复合物转染的HPDF显示出最强的荧光，证实通过LBPAE获得了更多的重组C7表达。将流式细胞术进一步用于对C7表达效率进行定量。与先前的报道[40]一致，HPDF的野生型显示出约41％的C7表达。在用LBPAE/MCC7聚合复合物转染后，与通过SuperFect/MCC7聚合复合物实现的44.9％相比，C7表达效率显著增加至74.4％(图7b)。此外，还通过LBPAE/MCC7聚合复合物实现了MFI的40％增强，与通过SuperFect/MCC7对应物实现的10％形成对比(图7c)。所有这些结果都证实，LBPAE不仅可有效地递送MCC7以增加表达C7的HPDF的总体群体，而且还可增强单个HPDF中的C7水平。另外，我们的初步研究显示，在C7缺失的RDEB成纤维细胞(RDEBF)中，在用LBPAE/MCC7转染后，C7表达效率恢复至约40％，对RDEBF中转染的进一步优化和C7表达的定量仍在进行中。这些发现表明，LBPAE具有用于在皮肤原代细胞中递送大cDNA的强的有效载荷容量。可通过这种聚合物载体进一步对原代真皮成纤维细胞进行工程改造，以使其分泌对于增强真皮-表皮接合至关重要的强效细胞C7。尽管非病毒基因疗法需要重复应用，但对于遗传性C7功能障碍性皮肤病来说，鉴于明显的伤口部位和良好的药物可及性，多次局部施用比全身基因递送安全得多，因此，LBPAE有很大希望用于基于成纤维细胞的基因疗法中以恢复或增强C7表达并因此逆转RDEB的疾病表型。
实施例8：实验
材料：三羟甲基丙烷三丙烯酸酯(TMPTA)、5-氨基-1-戊醇(AP)、1,11-二氨基-3,6,9-三氧杂十一烷(DATOU)、氯化钠(NaCl)、氢氧化钠(NaOH)、支化聚乙烯亚胺(PEI,Mw＝25kDa)、溴化锂(LiBr)、二甲亚砜(DMSO)、二乙醚、氘化氯仿(CDCl3)、盐酸溶液(HCl)、汉克斯平衡盐溶液(Hank’s balanced salt solution)(HBSS)、tris乙酸盐-EDTA缓冲液(TAE)、胰蛋白酶-EDTA溶液(0.25％)、达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco’s Modified EagleMedium)(DMEM)、青霉素-链霉素(P/S)、琼脂糖、多聚甲醛(PFA)、0.1％Triton X-100、在小鼠中产生的单克隆抗胶原VII抗体，以及山羊血清购自Sigma-Aldrich。在使用前将乙酸钠(3.0M,Sigma-Aldrich)稀释至0.025M。1,4-丁二醇二丙烯酸酯(BDA)购自VWR且按收到的原样使用。二甲基甲酰胺(DMF)购自Fisher Scientific。将购自Gibco的胎牛血清(FBS)在使用前通过0.2μm过滤器过滤。HPDF和3T3细胞分别购自Lonza和ATCC。对于HPDF的培养和传代培养，成纤维细胞基础培养基、FGM-2SingleQuots、Clonetics Reagent Pack(包含HEPES缓冲盐水溶液、胰蛋白酶EDTA溶液(0.25％)和胰蛋白酶中和溶液)购自Lonza。细胞分泌型Gaussia princeps荧光素酶质粒(GLuc DNA)和BioLuxTM Gaussia荧光素酶测定试剂盒购自New England Biolabs UK。依照方案使用Giga-Prep试剂盒(Qiagen)进行Gluc DNA的扩增和纯化。绿色荧光蛋白质质粒(GFP DNA)购自Aldevron。pcDNA3.1COL7A1质粒由Universityof Dundee(UK)的Andrew South博士友好提供。通过将来源于pcDNA3.1COL7A1的COL7A1序列插入到由System Biosciences提供的MN511A-1盒中来构建MCC7，根据SystemBiosciences的用户手册产生微环DNA。SuperFect基因转染试剂购自Qiagen。LIVE/DEAD存活力/细胞毒性试剂盒、山羊抗小鼠IgG(H+L)高度交叉吸附的二级抗体、Alexa Fluor 568和Alexa Fluor 647购自Thermo Fisher Scientific。Alamarblue检测试剂盒、SYBR安全DNA凝胶染料、IC固定缓冲液和10×Bioscience透化缓冲液购自Invitrogen。Cy3DNA标记试剂盒购自Mirus并且依照方案使用。4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)和PicoGreen测定试剂盒购自Life Technologies并且依照制造商的方案使用。1×达尔伯克磷酸盐缓冲盐水(Dulbecco’sphosphate buffered saline)(PBS)购自Life Technologies公司。含有DAPI的封固剂(mounting medium)购自Abcam。
LBPAE的合成与表征：通过线性低聚物组合策略合成LBPAE。首先，将化学计量比为1.2:1的BDA和AP以100mg mL-1溶解于DMSO中，然后在90℃下反应。使用装配有三重检测器((折射率检测器(RI)、粘度计检测器(VS DP)和双光散射检测器(LS 15°和LS 90°))的Agilent 1260Infinite凝胶渗透色谱(GPC)来监测重均分子量(Mw)、数均分子量(Mn)和多分散性指数(PDI)的增长。对于GPC测量，取20μL反应混合物，在1mL DMF中稀释，然后通过0.45μm过滤器过滤。在60℃下利用含有0.1％LiBr的DMF以1mL min-1的流动速率洗脱GPC柱(Polar Gel-M，7.5×300mm，串联的两个)。将线性聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)标准品用于GPC柱的校准。当Mw接近3000Da时，通过冷却至室温来中止反应并用DMSO稀释，然后添加过量封端剂DATOU，使反应再继续48小时，得到DATOU封端的线性A2-C2低聚物，将其通过用丙酮透析3天加以纯化，并然后在真空烘箱中干燥以去除溶剂。接着，将线性A2-C2低聚物溶解于DMSO中，并在90℃下与分支单体TMPTA反应。当Mw为约10kDa时，将反应混合物冷却至室温，并添加过量的DATOU以消耗所有未反应的乙烯基，再持续48小时。然后通过用二乙醚沉淀三次将聚合物纯化，冷冻干燥两天，并且在-20℃下储存以供进一步研究。为了测量最终产物的分子量(Mw)、PDI和马克-豪温克(MH)图的α值(α)，将10mg LBPAE溶解于2mL DMF中，并如上所提到的那样进行GPC测量。在400MHz Varian Inova波谱仪上用1H NMR核磁共振确定LBPAE的化学组成和纯度。相对于溶剂CDCl3(7.24ppm)或内部对照(四甲基硅烷0.00ppm)以百万分率(ppm)报告样品。
马克-豪温克α参数的确定：在具有折射率检测器(RI)、粘度计检测器(VS DP)和双角度光散射检测器(LS 15°和LS 90°)的1260Infinite GPC系统上进行聚合物的马克-豪温克α参数的确定。为了制备用于分析的聚合物，将10.0mg样品溶解于2mL DMF中，然后通过0.45μm过滤器过滤。在60℃下用DMF和0.1％LiBr以1mL/min的流动速率洗脱GPC柱(30cmPLgel Mixed-C，串联的两个)。将柱用线性聚(甲基丙烯酸甲酯)标准品(PMMA)校准。使用通用校准分析GPC数据。
LBPAE/DNA聚合复合物的制备：对于聚合复合物的制备，首先将LBPAE于DMSO中溶解成100mg·mL-1母液。根据LBPAE/DNA重量比(w/w)，将所需量的LBPAE母液和DNA溶液分别用乙酸钠缓冲液(0.025M,pH＝5.2)稀释至等体积。然后，将LBPAE溶液添加至DNA溶液中，通过涡旋混合10秒钟，并在室温下保持不受干扰10分钟，以允许形成聚合复合物。
LBPAE所致的DNA凝聚：使用琼脂糖凝胶电泳来确定LBPAE的DNA凝聚能力。每次样品制备均使用1μg DNA，如上文那样制备具有一系列w/w比的聚合复合物。此后，将20μL聚合复合物溶液加载至孔中的含有10μL SYBR安全DNA凝胶染料的琼脂糖凝胶(1％于1×TAE缓冲液中)中，使用裸DNA作为对照。在1×TAE缓冲液中于120V下进行40分钟的凝胶电泳，并使用Syngene的G:BOX捕获图像。
LBPAE的DNA结合亲和力：使用PicoGreen测定对LBPAE的DNA结合亲和力进行定量。每次样品制备均使用0.25μg DNA。在15μL乙酸钠缓冲液中制备具有不同w/w比的聚合复合物，然后将其与15μL PicoGreen工作溶液混合并孵育5分钟。之后，添加220μL 1×PBS缓冲液以在黑色96孔板中稀释聚合复合物。通过SpectraMax M3板读数器，以490nm处的激发和535nm处的发射一式四份地测量聚合复合物溶液的荧光强度(F)。LBPAE的DNA结合亲和力由下式定义：
Figure BDA0003014376920001341
LBPAE的质子缓冲容量：通过酸-碱滴定确定LBPAE的质子缓冲容量。使用0.1MNaCl溶液为背景对照，使用PEI和SuperFect为阳性对照。使用Mettler Toledo S20 pH计测量pH值。将10mg LBPAE、5mg PEI或0.8mg SuperFect溶解于20mL 0.1M NaCl溶液中。将该溶液的pH值用1.0M HCl溶液调整至3.0，然后使用0.1M NaOH溶液滴定至10.5。使用下面的等式计算LBPAE的质子缓冲容量(mmol g-1)：
Figure BDA0003014376920001342
LBPAE的降解谱：为了测量降解谱，将LBPAE以10mg·mL-1的浓度溶解于PBS中并在37℃下以180rpm保持振荡。在0、2、4、6和8小时的时间点，取出1mL溶液并立即冷冻。在冷冻干燥后，将样品溶解于1mL DMF中。以一式三份如前面所提到的那样通过GPC测量样品的Mw。LBPAE降解的百分比定义如下：
Figure BDA0003014376920001343
聚合复合物尺寸和ζ电位确定：使用Malvern Instruments Zetasizer(Nano-ZS90，散射角173°，633nm激光)测量聚合复合物尺寸和ζ电位。每一样品制备均使用4μgDNA，如上文所提到的那样制备具有一系列w/w比的聚合复合物，并将其用800μL去离子水稀释，然后转移至Zetasizer小池或比色皿中。在25℃下以一式四份进行尺寸和ζ电位测量。
通过透射电子显微术(TEM)进行聚合复合物的形态表征：通过TEM对LBPAE/DNA、PEI/DNA和SuperFect/DNA聚合复合物的形态进行表征。如前面那样制备80μL含有2μg DNA的聚合复合物溶液，用去离子水洗涤两次以去除盐，然后将其再悬浮于10μL去离子水中。将2.5μL再悬浮的聚合复合物溶液浇注至200目铜网格上的Formvar支撑膜上并立即冷冻干燥。在UCD Conway Imaging Core中心在FEI Tecnai 120TEM上在120kV下捕获TEM图像。
DNA从聚合复合物中的释放：可通过使用PicoGreen测定测量LBPAE的结合亲和力的降低来确定DNA从聚合复合物中的释放。如上文那样制备具有10:1、40:1和70:1的w/w比的LBPAE/DNA聚合复合物，并将其在180rpm和37℃下保持振荡。在0、2、4、6和8小时的时间点，取出100μL的聚合复合物溶液，并以一式四份如前面那样立即测量DNA结合亲和力。聚合复合物的DNA释放速率确定如下：
Figure BDA0003014376920001351
细胞培养：在成纤维细胞基础培养基中培养HPDF，并补充含有2％FBS的FGM-2SingleQuots。在含有10％FBS和1％青霉素/链霉素(P/S)的DMEM中培养3T3。在潮湿孵育器中在标准细胞培养条件下在37℃、5％CO2下培养这两种类型的细胞。
通过Gluc表达定量的LBPAE的基因转染能力：首先使用Gluc DNA作为报道基因，利用Gluc表达来评价LBPAE在HPDF和3T3中的基因转染能力。在转染前将细胞在96孔板中以每孔1×104个细胞(对于3T3)和每孔2×104个细胞(对于HPDF)的密度接种于100μL培养基中并且孵育1天。依照制造商的方案对商业基因转染试剂PEI和SuperFect进行优化。为此，对于每个孔使用0.5μg Gluc DNA，PEI/DNA聚合复合物的w/w比从1:1、2:1至3:1变化，SuperFect/DNA聚合复合物的w/w比从3:1、6:1至9:1变化。对于LBPAE基因转染，对于每个孔使用相同量的0.5μg Gluc DNA，如上文所提到的那样在20μL的乙酸钠缓冲液中制备具有不同w/w比的LBPAE/DNA聚合复合物，然后将其用80μL细胞培养基稀释。去除96孔板中的细胞培养基并添加100μL含有聚合复合物的培养基。在4小时后，用100μL新鲜培养基替换板中的含有聚合复合物的培养基，将细胞再孵育44小时。以一式四份依照标准方案用Gluc测定测量转染后细胞的Gluc活性。简单地说，取出96孔板中的20μL上清液并添加50μLGluc测定溶液。使用SpectraMax M3板读数器测量发光强度，并且以相对光单位(RLU)直接标绘Gluc活性。
通过GFP表达定量的LBPAE的基因转染能力：用GFP表达进一步评价LBPAE的基因转染能力。在转染前将HPDF和3T3细胞在24孔板中以每孔5×104个细胞的密度接种于500μL培养基中并孵育1天。对于每个孔使用2μg GFP DNA，在100μL乙酸钠缓冲液中制备具有不同w/w比的聚合复合物，然后将其与400μL细胞培养基混合。去除细胞中的培养基并添加含有聚合复合物的培养基。在4小时后，用500μL新鲜培养基替换含有聚合复合物的培养基，并且将细胞再孵育44小时。此后，将细胞用HBSS洗涤并用荧光显微镜(Olympus IX81)成像。为了用流式细胞术定量GFP的表达，将所转染的细胞用胰蛋白酶EDTA消化并且用HBSS洗涤两次，然后再悬浮于含有2％FBS的PBS中。在Accuri C6系统上以一式三份进行流式细胞术测量，为每个样品计数至少10,000个细胞。用Flowjo软件对细胞的中值荧光强度(MFI)进行定量。将用PEI和SuperFect转染的细胞用作阳性对照，将未处理的细胞用作阴性对照。
用Alamarblue测定测量的细胞存活力：用Alamarblue测定测量转染后的HPDF和3T3细胞的存活力。为此，在转染后48小时，移出细胞上清液并用HBSS将细胞洗涤两次。然后添加10％于HBSS中的Almarblue溶液，并且将细胞再孵育1至3小时。之后，将孔中的Alamarblue溶液转移至平底96孔板中，并使用SpectraMax M3板读数器以一式四份在590nm处测量荧光强度。将没有任何聚合复合物处理的细胞用作阳性对照，将荧光强度归一化为100％细胞存活力。
LBPAE的毒理谱：通过致死浓度50(LC50)评估来确定LBPAE的毒理谱。使用LIVE/DEAD存活力/细胞毒性试剂盒(LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity kit)对活细胞和死细胞进行染色。将细胞在96孔板中以每孔2×104个(对于HPDF)和每孔1×104个(对于3T3)的密度接种于100μL培养基中。第二天，制备LBPAE/DNA聚合复合物和SuperFect/DNA聚合复合物，使用五种不同剂量的所述聚合复合物来如上文所提到的那样转染细胞。在转染后24小时，去除细胞培养基并用含有钙黄绿素-AM(C-AM)(1:5000)和乙锭同型二聚体-1(EthD-1)(1:500)的HBSS替换，将细胞再孵育20分钟。然后，将细胞用HBSS洗涤并用荧光显微术(Olympus IX81)成像。将以一式四份通过Alamarblue测定定量的细胞存活力用于LC50计算。
聚合复合物细胞摄取：对于聚合复合物细胞摄取研究，依照推荐方案，用Cy3(红色荧光染料)标记试剂盒标记Gluc DNA。将成纤维细胞以每孔5×104个细胞的密度接种于24孔板中。对于每个孔使用0.5μg经标记的DNA，如前面所提到的那样在第二天进行基因转染。在转染后4小时，用HBSS洗涤细胞，用4％PFA固定，用0.1％triton-100透化，用DAPI染色，然后用荧光显微镜(Olympus IX81)成像。为了用流式细胞术定量细胞摄取效率，在转染后，将细胞用胰蛋白酶EDTA消化并且用HBSS洗涤两次，然后然后再悬浮于含有2％FBS的PBS中，在Accuri C6流式细胞术系统上以一式三份定量Cy3阳性细胞的百分比和MFI。
通过细胞免疫荧光染色检测HPDF中的C7表达：为了用细胞免疫荧光染色检测C7表达，将HPDF以每孔1.5×104个细胞的密度接种于8孔室(Ibidi)中。第二天，对于每个孔使用1μg MCC7，使用w/w比为40:1的LBPAE/DNA聚合复合物和w/w比为3:1的SuperFect/DNA聚合复合物如上文所提到的那样进行基因转染。在转染后48小时，将细胞用4％PFA固定，用0.1％triton-100透化，在室温下用5％的在1×PBS中的山羊血清封闭1小时，然后在4℃下与小鼠中产生的单克隆抗胶原的VII型抗体的一级抗体一起在封闭缓冲液(抗体稀释度：1:200)中孵育过夜。第二天，将细胞与以1:800稀释的Alexa-568山羊抗小鼠IgG(H+L)高度交叉吸附的二级抗体在黑暗中和DAPI在室温下孵育1小时。使用荧光显微镜(Olympus IX81)拍摄免疫荧光图像。将未经抗体处理和仅用二级抗体处理的细胞用作对照组。
通过流式细胞术定量的HPDF中的C7表达：为了用流式细胞术定量C7表达，将HPDF以每孔5×104个细胞的密度接种于24孔板中，并在24小时后进行转染。每孔使用2μg MCC7，并且使用w/w比为40:1的LBPAE/DNA聚合复合物和w/w比为3:1的SuperFect/DNA聚合复合物如上文那样进行转染。在转染后4天，将细胞用胰蛋白酶EDTA消化，用IC固定缓冲液(2％PFA)固定，用透化缓冲液(1×PBS/1％BSA/0.1％皂苷)透化并在山羊血清(10％在渗透溶液中)中封闭，然后与在封闭缓冲液中以1:50稀释的小鼠中产生的单克隆抗胶原的VII型抗体的一级抗体一起在室温下孵育1h。之后，将细胞与在渗透缓冲液中以1:3000稀释的Alexa-647山羊抗小鼠IgG(H+L)交叉吸附的二级抗体一起在黑暗中进一步孵育。最后，将细胞再悬浮于PBS中，并通过流式细胞术以一式三份进行分析。将未经抗体处理和仅用二级抗体处理的细胞用作对照组。
统计：将用于windows的SPSS统计分析软件(24版)(IBM公司，Armonk,N.Y.,USA)用于统计分析。使用学生t检验来分析所有的基因转染数据，数据示出为平均值±标准偏差。通过线性回归分析计算LC50值。P值<0.05被认为统计学显著。
实施例9：用于向隐性营养不良性大疱性表皮松解症角质形成细胞递送基因的包含COL7A1的HPAE聚合复合物
以下实施例描述了包含微环COL7A1和本公开的四种高度支化的聚(β-氨基酯)(HPAE)的聚合复合物的转染结果，所述的四种高度支化的聚(β-氨基酯)(HPAE)具有约10kDa、20kDa、30kDa和40kDa的分子量(Mw)，并且所述聚合复合物使用了10:1、30:1和50:1的HPAE:COL7A1 DNA重量比。
HPAE的合成和表征：以两个阶段制备HPAE。在第一阶段，使单体5-氨基-1-戊醇、三羟甲基丙烷三丙烯酸酯、1,4-丁二醇二丙烯酸酯反应以提供高度支化的C32(聚(5-氨基-1-戊醇-共-1,4-丁二醇二丙烯酸酯))(“HC32”)。在第二阶段，使HC32与1,11-二氨基-3,6,9-三氧杂十一烷(DATOU)反应以提供HPAE(“HC32-DATOU”)。
经由“A2+B3+C2”迈克尔加成策略合成4种具有不同分子量(MW)的HC32-DATOU聚合物。首先合成HC32基础聚合物。简单地说，将A2单体AP(9.0mmol,0.923g)、B3单体TMPTA(0.5mmol,0.148g)和C2单体C(10.0mmol,1.98g)溶解于3.1mL DMSO中，然后在90℃下反应。使用凝胶渗透色谱(GPC)来监测MW和多分散性指数(PDI)的增长。在不同时间点取20μL反应样品，之后在1mL DMF中稀释并通过0.2μm过滤器过滤，随后在装配有三重检测器(折射率检测器(RI)、粘度计检测器(VS DP)和双光散射检测器(LS 15°和LS 90°))的Agilent1260infinite GPC上进行GPC测量。在60℃下使用DMF和0.1％LiBr以1mL/min的流动速率洗脱GPC柱(PolarGel-M，7.5×300mm，串联的两个)。用线性聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)标准品校准GPC柱。
当基础聚合物的重均分子量(Mw)接近目标值(分别为约10kDa、20kDa、30kDa和40kDa)时，通过将反应溶液在DMSO中稀释至100mg/mL来中止反应。之后，使用溶解于DMSO(100mg/mL)中的封端剂DATOU(10.0mmol,1.92g)在室温(RT)下通过迈克尔加成将HC32基础聚合物封端48h，以获得HC32-DATOU聚合物，将其通过用二乙醚沉淀两次以去除过量的单体、低聚物和封端剂来纯化。
将最终的HC32-DATOU产物在真空烘箱中干燥24h，然后再冷冻干燥24h以去除残余溶剂。为了测量最终产物的MW和PDI，将10mg样品溶解于1mL DMF中，并如上文所提到的那样进行GPC测量。利用质子核磁共振(1H NMR)来确认HC32-DATOU聚合物的化学组成和纯度，将该聚合物溶解于CDCl3中，并在400MHz Varian Inova波谱仪上获取1H NMR谱。相对于溶剂(7.24ppm)或内部对照(四甲基硅烷0.00ppm)以百万分率(ppm)报告样品。
图13显示通过增加基础聚合物的聚合时间，获得了四种具有不同Mw的HC32-DATOU聚合物。HC32-DATOU的Mw在没有胶凝的情况下从11kDa增加至41kDa，证实“A2+B3+C2”迈克尔加成策略在控制HAPE MW方面的高度灵活性。所有HC32-DATOU聚合物的MH图α值均低于0.5(图13c)，表明它们具有高度支化的结构。下表给出HC32-DATOU聚合物的PDI和MH图α值
M<sub>W</sub>(kDa) PDI α值
11 3.4 0.44
21 6.3 0.38
34 8.5 0.29
41 12.9 0.33
MCC7生物合成.
获得了常规质粒pcDNA3.1COL7A1。通过将来源于pcDNA3.1COL7A1的COL7A1序列插入到由System Biosciences提供的具有巨细胞病毒启动子的MN511A-1盒中来生物合成MCC7，根据System Bioscience的用户手册和已公开的微环技术的phiC31+1-Scel消化系统进行微环DNA的诱导和生产(Gaspar,V.；de Melo-Diogo,D.；Costa,E.；Moreira,A.；Queiroz,J.；Pichon,C.；Correia,I.；Sousa,F.Minicircle DNA Vectors for GeneTherapy:Advances and Applications.Expert Opin.Biol.Ther.2015,15(3),353-379.https://doi.org/10.1517/14712598.2015.996544.)。为了确认MCC7的生物合成，进行DNA消化研究。为此，用1μL EcoRI消化0.5μgpcDNA3.1COL7A1、亲本质粒(MN511A-1-COL7A1)和MCC7，然后在100V下进行40分钟的琼脂糖凝胶电泳。然后用Syngene的G:BOX使图像显现。
聚合复合物的制备和配制
将HC32-DATOU于DMSO中溶解成100μg/μL母液，将其在-20℃下储存以供以下研究。将DNA溶解于TE缓冲液中并且也在-20℃下储存。将SA缓冲液在使用前稀释至0.025M。
对于标准聚合复合物制备，根据聚合物/DNA重量比(w/w)，将DNA和聚合物分别溶解于SA缓冲液中至等体积。将聚合物溶液添加至DNA溶液中，使用涡旋混合10秒，并在RT下再孵育10分钟以允许聚合复合物形成。对于配制研究来说，通常将5μg GFP质粒DNA和150μgHC32-DATOU分别溶解于200μL SA中，从而配制出HC32-DATOU/DNA聚合复合物(w/w＝30:1)。将所述聚合复合物立即作为新鲜聚合复合物使用，或者在转染前储存在室温、4℃、-20℃和-80℃下，或冻干。
对于冻干来说，将蔗糖添加至聚合复合物溶液中至最终蔗糖浓度分别为0％、1％、3％和5％。将所有样品在-80℃下冷冻1h，然后立即用Christ Alpha 1-2LDplus冷冻干燥器在-55℃下冷冻干燥24h。随后，用原始体积的SA重构聚合复合物并将其用于转染。
在优化聚合复合物配制程序(参见下面的实施例10)之后，将在不同条件下储存的与编码Gluc的DNA复合的HC32-DATOU用于评价聚合复合物在转染应用前长期储存的可行性。这里，对于96孔板中的每个孔使用聚合物/DNA w/w比为30:1的0.5μg DNA。
DNA凝聚和肝素释放研究
为了评估HC32-DATOU的DNA凝聚能力以及HC32-DATOU/DNA聚合复合物的物理稳定性，采用琼脂糖凝胶电泳进行DNA凝聚测定和肝素释放测定。每个样品使用0.5μg DNA(MCC7)，并以30:1的w/w比制备聚合复合物。将肝素水溶液以从0.1-6IU/μL增加的浓度添加于聚合复合物溶液中。将无肝素的裸DNA和HC32-DATOU/MCC7聚合复合物用作对照。将所有样品在RT下孵育2h，然后加载于用10μL SYBR安全DNA染料染色的1％琼脂糖凝胶上。在1×TAE缓冲液中在100V下电泳1h。
PicoGreen测定
使用PicoGreen测定来定量在肝素存在下HC32-DATOU的DNA结合亲和力和DNA释放。用0.2μg DNA，以30:1的w/w比制备HC32-DATOU/MCC7聚合复合物，然后分别以0.3IU/μL、3IU/μL和6IU/μL的浓度向聚合复合物溶液中添加肝素。将无肝素处理的裸DNA和HC32-DATOU/MCC7聚合复合物用作对照。在2h孵育后，将所有样品与10μL PicoGreen工作溶液混合并且再孵育5分钟。之后，在黑色96孔板中，用去离子水将混合物溶液稀释至最终浓度为1μg/mL。使用SpectraMax M3板读数器，以490nm处的激发和535nm处的发射一式四份地进行荧光测量。通过将样品的荧光强度以裸DNA对照作归一化来定量DNA释放效率。
聚合复合物的尺寸和ζ电位测量
使用Nanosight NS300通过纳米粒子跟踪分析(NTA)来测量聚合复合物的尺寸。在10μL SA中以30:1的w/w比使用0.5μg DNA制备聚合复合物。接着，将聚合复合物溶液稀释至1mL蒸馏水中，然后进行NTA分析。使用NTA软件(3.2版)记录含有粒子的布朗运动跟踪的60秒影片。对每个样本评估10个迹线(track)。使用Malvern Instruments Zetasizer(Nano-ZS90)以90°散射检测器角度进行聚合复合物的ζ电位测量。
透射电子显微术(TEM)观察
通过TEM对聚合复合物的形态进行表征。将80μL具有2μgMCC7的聚合复合物溶液(w/w比为30:1)离心并弃去上清液，然后将聚合复合物进一步用80μL蒸馏水洗涤两次以去除过量的盐。之后，将聚合复合物再悬浮至最终体积为10μL的蒸馏水中。然后，将2.5μL聚合复合物溶液浇注至200目铜网格上的Formvar支撑膜上并立即冻干。在UCD Conway ImagingCore中心在FEI Tecnai 120TEM上在120kV下捕获图像。
细胞培养
将RDEBK和人角质形成细胞(NHK)在具有补充剂包(KGM-Gold SingleQuots)和1％PS的角质形成细胞基础培养基(KBM-Gold)中在含有5％CO2的潮湿孵育器中于37℃下在标准细胞培养条件下培养。
GFP表达和细胞存活力
首先进行GFP报道基因转染以评价四种HC32-DATOU聚合物的基因转染效率并筛选出表现最佳的候选物。将RDEBK以每孔2×104个细胞的密度接种于96孔板中。第二天，将0.5μg编码GFP的质粒DNA用于每个孔中。在20μL SA中以10:1、30:1和50:1的聚合物/DNA w/w比制备具有不同Mw的HC32-DATOU聚合复合物，将所述SA与80μL新鲜培养基混合作为转染培养基。在转染后4h，用新鲜培养基替换转染培养基。在转染后48h，使细胞的GFP表达在荧光显微镜(Olympus IX81)下显现。用Alamarblue测定来测量细胞存活力。移出细胞上清液，然后将细胞与10％Alamarblue试剂在HBSS中于37℃下再孵育1h。之后，将Alamarblue溶液转移至平底96孔板中。通过SpectraMax M3板读数器，以570nm处的激发和590nm的发射读取荧光强度。将未处理的细胞组的荧光强度标绘为100％存活。以一式四份测量细胞存活力，并通过将样品的荧光强度以未处理组的荧光强度作归一化来计算细胞存活力。将显示出最高GFP表达和细胞存活力的HC32-DATOU用于以下研究。
在配制研究中(参见下面的实施例10)，根据出版物(Zeng,M.；Zhou,D.；Alshehri,F.；Lara-Sáez,I.；Lyu,Y.；Creagh-Flynn,J.；Xu,Q.；A,S.；Zhang,J.；Wang,W.Manipulation of Transgene Express ion in Fibroblast Cells by aMultifunctional Linear-Branched HybridPoly(β-Amino Ester)Synthesized throughan Oligomer Combinatio n Approach.Nano Lett.2019,19(1),381-391.https://doi.org/10.1021/acs.nanolett.8b04098.Theoharis,S.；Krueger,U.；Tan,P.H.；Haskard,D.O.；Weber,M.；George,A.J.T.Targeting Gene Delivery to Activated VascularEndothelium Using Anti E/P-Selectin AntibodyLinked to PAMAMDendrimers.J.Immunol.Methods 2009,343(2),79-90.https://doi.org/10.1016/j.jim.2008.12.005.)，以3:1的w/w比制备SuperFect/DNA聚合复合物。根据制造商的方案(2:1体积/重量比)制备Lipofectamine 2000/DNA脂质复合物。在Accuri C6系统上通过流式细胞术以一式三份定量中值荧光强度(MFI)和GFP阳性细胞，并用Flowjo V10软件进一步分析。对于每次运行计数1×104个细胞。
Gluc报道基因转染和细胞存活力
在Gluc报道基因转染研究中进一步评价HC32-DATOU。对于每个孔使用0.5μg编码Gluc的质粒DNA，分别以20:1、30:1和40:1的w/w比制备HC32-DATOU/DNA聚合复合物。根据先前的出版物(Green,J.J.；Zugates,G.T.；Tedford,N.C.；Huang,Y.-H.；Griffith,L.G.；Lauffenburger,D.A.；Sawicki,J.A.；Langer,R.；Anderson,D.G.CombinatorialModification of Degradable Polymers Enables Transfection of Human CellsComparable to Adenovirus.Adv.Mater.2007,19(19),2836–2842.https://doi.org/10.1002/adma.200700371.Huang,J.-Y.；Gao,Y.；Cutlar,L.；O’Keeffe-Ahern,J.；Zhao,T.；Lin,F.-H.；Zhou,D.；McMahon,S.；Greiser,U.；Wang,W.；等人Tailoring HighlyBranched Poly(Beta-Amino Ester)s:A Synthetic Platform for Epidermal GeneTherapy.Chem.Commun.(Camb).2015,51(40),8473-8476.https://doi.org/10.1039/c5cc02193f.Zeng,M.；Zhou,D.；Ng,S.；Ahern,J.O.；Alshehri,F.；Gao,Y.；Pierucci,L.；Greiser,U.；Wang,W.Highly Branched Poly(5-Amino-1-Pentanol-Co-1,4-ButanediolDiacrylate)for High Performance Gene Transfection.Polymers(Basel).2017,9(12),161.https://doi.org/10.3390/polym9050161.)，分别以1:1、2:1和3:1的w/w比制备PEI/DNA聚合复合物。
如上文所提到的那样接种RDEBK并进行基因转染。在转染后48h，为了定量基因转染效率，将50μL的细胞上清液与等体积的Gluc测定工作溶液混合。使用SpectraMax M3板读数器，以485nm处的激发和525nm处的发射测量该混合物的荧光强度。以相对光单位(RLU)标绘Gluc活性结果。如上文所提到的那样测量细胞存活力。以一式四份确定Gluc活性和细胞存活力实验两者。
聚合复合物的细胞摄取
使用Cy3 DNA标记试剂盒来根据标准方案标记MCC7。将RDEBK以每孔1×104个细胞的密度接种于96孔板中。第二天，对于每个孔使用0.25μg MCC7，将细胞用HC32-DATOU/MCC7聚合复合物(w/w＝30:1)和PEI/MCC7(w/w＝1:1)转染4h，然后用4％PFA固定，用0.1％triton-100透化，并且在HBSS中以1μg/mL的工作浓度与DAPI一起孵育。用显微镜(OlympusIX81)拍摄荧光图像。通过Accuri C6系统以一式三份定量MFI和Cy3阳性细胞比例。用Flowjo V10软件进一步分析结果，对于每次测量计数1×104个细胞。
定量逆转录聚合酶链式反应(RT-qPCR)
进行RT-qPCR以对COL7A1 mRNA表达进行定量。在转染前一天将RDEBK以每孔2.5×105个细胞的密度接种于6孔板上。将细胞用30:1和1:1的w/w比的与5μg DNA复合的HC32-DATOU/MCC7和PEI/MCC7聚合复合物转染。在处理后3天，收获处理的细胞和未处理的细胞两者，并进行总RNA的纯化。根据RNeasy微型试剂盒的方案进行RNA提取工作。接着，使用0.5μg来自各组的总RNA合成第一链cDNA。根据SuperScript III First-Strand SynthesisSuperMix的方案，用引物50μM低聚(dT)20进行反转录。之后，将1μL最终互补DNA(cDNA)产物添加至9μL反应混合物(0.5μL TaqMan引物、5μL TaqMan PCR混合物、3.5μL RNase游离水)中，将所述反应混合物加载至384孔板的一个孔中。以一式三份测量每个样品。对于COL7A1定量基因表达，将GAPDH被用作内源对照。为实验设置比较CT值和TaqMan试剂、QuantStudio7Flex系统。用QuantStudio实时PCR软件分析结果。
C7的细胞免疫荧光染色
使用细胞免疫荧光染色来确定在用HC32-DATOU/MCC7和PEI/MCC7聚合复合物处理后RDEBK的C7恢复。将1.5×104个细胞接种在8孔室(Ibidi)中的每个盖玻片上。对于每个孔使用1μg MCC7，分别以30:1和1:1的w/w比制备HC32-DATOU/MCC7和PEI/MCC7聚合复合物。在转染后3天，将细胞用4％PFA固定，用0.1％Triton X-100渗透并在5％的在1×DPBS中的山羊血清中在RT下封闭1h，然后在封闭缓冲液中与一级抗体(在小鼠中产生的单克隆抗胶原的VII型抗体)一起以1:200的抗体稀释度在4℃下孵育过夜。之后，将细胞与二级抗体(在封闭缓冲液中以1:800稀释的Alexa-568山羊抗小鼠IgG(H+L))一起孵育。在最终洗涤后，将盖玻片用含DAPI的Fluoroshield封固剂封固。最后，用荧光显微镜(Olympus IX81)捕获细胞图像。
蛋白质印迹法
在转染前一天将RDEBK以每烧瓶1.5×106个细胞的密度接种于T-75烧瓶中。将w/w比分别为30:1和1:1的HC32-DATOU/MCC7和PEI/MCC7聚合复合物用于转染，其中对于每个烧瓶使用39μg MCC7。在转染后4天，收获细胞并用RIPA裂解缓冲液处理，所述RIPA裂解缓冲液使得能够进行高效的细胞裂解和细胞蛋白质的增溶。将1μLPIC添加至细胞裂解液中至最终体积为50μL，并储存在-80℃下。使用Bradford测定来通过将样品浓度以已知的BSA浓度作归一化来定量蛋白质的浓度。将40μg变性蛋白质样品加载至SDS-Page凝胶(4％-10％)中，然后在75V下进行20分钟的电泳，之后在120V下进行1h的电泳。然后将蛋白质样品转移至硝酸纤维素膜上，在RT下在80V下保持1h，之后在4℃下在90V下保持30分钟。在封闭缓冲液(5％的在TBST缓冲液中的BSA)中在RT下进行1h膜封闭。将β-肌动蛋白用作内源对照。然后将一级抗体(在封闭缓冲液中以2500倍稀释的多克隆抗C7家兔抗体和抗肌动蛋白小鼠抗体)添加至膜上并且在4℃下孵育过夜。在洗涤步骤之后，将二级抗体(在封闭缓冲液中以5000倍稀释的抗家兔HRP和抗小鼠HRP)添加至膜上并且在RT下孵育1h。在3次TBST洗涤后，用Pierce ECL Plus底物显现膜。
统计学
将用于windows的SPSS统计分析软件(24版)(IBM公司，Armonk,N.Y.,USA)用于统计。使用学生t检验来分析所有基因转染数据，将所述数据表示为平均值±标准偏差(SD)。对于所有分析，p值<0.05被认为统计学显著。
结果：
使用不同分子量的HPAE在RDEBK中进行的报道基因转染
为了鉴别最有利于基因递送的MW，使用4种具有不同Mw的HC32-DATOU聚合物，使用编码GFP的DNA作为报道基因，来转染RDEBK细胞。如图14和图15中所示，尽管在10:1的聚合物/DNA w/w比下没有观察到明显的细胞毒性，但来自所有HC32-DATOU聚合物的转染效率相对较低。当使所有聚合物中的w/w比增加至30:1或更大时，30:1的11kDa HC32-DATOU实现最高的转染效率与最强的GFP表达，同时保持98％的高水平细胞存活力。一般来说，GFP表达随着HC32-DATOU聚合物的Mw增加而降低。
另一方面，细胞毒性与增加的聚合物Mw非常好地相关。例如，在50:1的w/w下，随着Mw增加，细胞存活力分别从91％下降至58％、42％和15％。随着可能归因于聚合物的递增主链的细胞毒性增加，转染效率受到损害。这些结果证实，MW对HC32-DATOU的转染性能有显著影响，并且约10kDa Mw更有利于RDEBK基因转染，以实现高转染效率和低细胞毒性两者。
通过与商业基因转染试剂PEI(Mw＝25kDa)比较，验证了11kDa HC32-DATOU的高基因转染能力。如图16a中所示，在所有三个测试的w/w比下，在被HC32-DATOU/DNA聚合复合物转染后RDEBK细胞的相对Gluc活性远高于由PEI/DNA对应物所介导的相对Gluc活性。由30:1w/w比的HC32-DATOU/DNA聚合复合物实现的最高Gluc活性比w/w比为2:1的PEI/DNA对应物高出17倍。
重要的是，HC32-DATOU/DNA聚合复合物未诱导明显的细胞毒性并且保留了几乎100％的细胞存活力。相比之下，PEI显示出明显的剂量依赖性细胞毒性，细胞存活力从1:1w/w比下的90％显著降低至3:1w/w比下的38％(图16b)。由于相当大的细胞毒性，因此将具有1:1w/w比的PEI用于以下研究。
为了验证HC32-DATOU/DNA聚合复合物的高性能，将编码GFP的DNA用于转染。HC32-DATOU/DNA聚合复合物介导远高于PEI的GFP表达水平，如由所观察到的显著更强的绿色荧光所证明(图16c)。相应地，流式细胞术定量分析表明更多的细胞对应于GFP-决定通道移位(图16d)。在被HC32-DATOU/DNA聚合复合物转染后，75％的RDEBK细胞为GFP阳性，与通过PEI/DNA聚合复合物实现的39％形成对比。此外，被HC32-DATOU/DNA聚合复合物转染的RDEBK细胞的MFI比由PEI/DNA对应物介导的MFI高出13倍(图16e)，表明在单个细胞中实现了高得多的基因表达。所有这些结果证实，HC32-DATOU在RDEBK细胞中的基因转染效率和安全性远高于PEI。
MCC7的生物合成以及RDEBK细胞对HPAE/MCC7聚合复合物的细胞摄取
利用微环技术的phiC31+1-Scel消化系统(Gaspar,V.；de Melo-Diogo,D.；Costa,E.；Moreira,A.；Queiroz,J.；Pichon,C.；Correia,I.；Sousa,F.Minicircle DNA Vectorsfor Gene Therapy:Advances and Applications.Expert Opin.Biol.Ther.2015,15(3),353-379.https://doi.org/10.1517/14712598.2015.996544.)，生物合成编码约9kb全长COL7A1的微环DNA(图17a)。凝胶电泳显示在所有三种经COL7A1标记的DNA中，MCC7仅具有3kb的骨架长度，其分别比常规质粒(RP)pcDNA3.1COL7A1和亲本质粒(PP)MN511A-1-COL7A1短2kb和5kb(图17b)，表明具有来自传统PP载体的小型化衍生物的MCC7缺乏细菌序列。
在RDEBK细胞中进行HC32-DATOU/MCC7聚合复合物的细胞摄取。用红色荧光染料Cy3标记MCC7，如上所提到的那样制备HC32-DATOU/MCC7聚合复合物。在转染4h后，在细胞中的细胞核周围观察到非常强的红色荧光(图17c)。相比之下，PEI/MCC7聚合复合物显示出低得多的细胞摄取效率，如由弱得多的红色荧光所证明的。流式细胞术测量进一步证实，尽管Cy3阳性细胞的百分比类似(96.4％相对于93％，图17d)，但与HC32-DATOU/MCC7聚合复合物一起孵育的细胞的MFI比用PEI/MCC7对应物处理的细胞的MFI高出约2倍(图17e)，表明更高数量的DNA拷贝被RDEBK细胞摄取。RV和腺相关病毒(AAV)载体可携带的最大DNA尺寸分别为7-8kb和5kb。HC32-DATOU能够以高效的方式将12kb长度的MCC7递送至RDEBK细胞中的事实突出了它实现高C7表达用于RDEB治疗的潜力。
高水平的COL7A1 mRNA和重组C7表达
在内化后，载体/DNA聚合复合物受到包括内体/溶酶体逃逸、通过细胞质的运输、DNA释放和细胞核进入在内的细胞内屏障的挑战。细胞周期是经历有丝分裂的细胞的细胞核摄取效率的另一个障碍，所述经历有丝分裂的细胞的细胞核摄取效率是处于细胞周期生长阶段的细胞的大于10倍。
为评价由HC32-DATOU/MCC7聚合复合物介导的转录物COL7A1 mRNA和C7蛋白质表达，进行RT-qPCR、免疫荧光染色和蛋白质印迹法研究。
图18a和图18b分别概述了内源对照GAPDH和COL7A1 mRNA表达的RT-qPCR扩增图。在以内源对照作归一化后，结果表明，HC32-DATOU/MCC7多聚合复合物介导的COL7A1 mRNA表达与UT细胞相比上调了4019倍(图18c)，比由PEI/MCC7多聚合复合物介导的表达高2.2倍。免疫荧光染色研究(图18d)进一步揭示，对未处理的RDEBK细胞检测到C7表达缺失。相比之下，在用HC32-DATOU/MCC7聚合复合物转染后，在细胞免疫荧光图像中观察到细胞核周围的细胞C7表达水平高得多。此外，与COL7A1 mRNA表达结果一致，HC32-DATOU/DNA聚合复合物比PEI/MCC7的对应物介导了更高效的C7表达。
蛋白质印迹法结果显示，从未处理的RDEBK细胞中未检测到C7分泌(图18e)。相反，在用HC32-DATOU/聚合复合物转染后，可见C7的非常清晰的290-kDa蛋白质带，所述C7带甚至与具有C7产生的全部功能的野生型NHK细胞的C7带一样强。值得注意的是，尽管PEI/MCC7多聚合复合物实现了显著高水平的COL7A1 mRNA表达，但C7产生有限。
机理研究证实，紧凑的DNA结构增加细胞摄取、细胞内载体拷贝数、核定位和mRNA转录水平(Kobelt,D.；Schleef,M.；Schmeer,M.；Aumann,J.；Schlag,P.M.；Walther,W.Performance of High Quality Minicircle DNA for in Vitro and in Vivo GeneTransfer.Mol.Biotechnol.2013,53(1),80-89.https://doi.org/10.1007/s12033-012-9535-6.)。在本文中，利用优化的聚合物和小型化的基因构建体，HC32-DATOU可有效地将COL7A1基因递送至RDEBK细胞中，促进随后的mRNA转录和最终的重组C7表达，由此增强皮肤完整性。
HPAE/MCC7聚合复合物的高基因转染效率的机理研究
DNA凝聚、结合、聚合复合物的尺寸、ζ电位、形态和DNA释放与转染性能有关。为了更好地理解由HC32-DATOU/MCC7聚合复合物介导的高基因转染效率的机理，对这些物理化学参数进行了研究。
阳离子HC32-DATOU被认为经由静电自组装使带负电荷的MCC7凝聚从而形成聚合复合物(图19a)。为了确认这一点，进行琼脂糖凝胶电泳以评价HC32-DATOU在聚合复合物制备后2h的DNA凝聚能力。如图19b中所示，裸MCC7 DNA在凝胶上移位，而HC32-DATOU能够使DNA在孔上凝聚而没有明显的DNA移位。肝素竞争测定进一步表明，具有低肝素浓度(0.1-0.3IU/μL)的HC32-DATOU聚合复合物仍然使大部分DNA凝聚，表明HC32-DATOU聚合复合物具有强DNA凝聚能力和高度稳定的性质。
类似地，如通过PicoGreen测定(图19c)所定量的，HC32-DATOU显示出96.3％的稳定的高DNA结合亲和力，表明仅3.7％的DNA解包。当施加3和6IU/μL浓度的肝素时，分别检测到68.2％和99.6％的DNA解包。这些结果证实HC32-DATOU在可调整的带负电荷的肝素存在下以受控方式高效地使DNA凝聚、结合和释放。
在用于高效C7表达的优化w/w比(30:1)下，纳米粒子分别展现出110nm的平均尺寸和81nm的模式尺寸(图19d)，ζ电位为+37.4mV(图19e)，表明纳米粒子结构紧凑，表面带正电荷。已知聚合复合物最常由球形或环形形状形成。在此，HC32-DATOU/MCC7聚合复合物表现出均匀的球形形态(图19f)。
据报道，转染效率的增强得益于二胺端基修饰，所述二胺端基修饰增加了聚合物的阳离子电荷，从而改善聚合物/DNA结合动力学和DNA向纳米粒子的凝聚并且保护DNA免于降解。除了用二胺DATOU进行末端修饰之外，多个DNA结合/凝聚部分(包括伯胺、仲胺、叔胺)还存在于HC32骨架和端基中。一般来说，LPAE/DNA粒子小于250nm，并且发现较小尺寸的粒子被细胞更高效地内化。
不受任何理论的约束，HC32/MCC7聚合复合物的小的、致密的、均匀的和阳离子的性质可实现高细胞摄取效率。另外，多种可电离的仲胺和叔胺可缓冲宽范围的质子，这可以经由“质子海绵效应”促进内体/溶酶体逃逸。之后，HC32-DATOU的稳定基因包装稳定性表明，它可以辅助聚合复合物通过细胞质向细胞核的细胞内运输。
高效的载体必须在用于保护DNA的足够的结合强度与释放DNA的能力之间取得平衡。不受任何理论的约束，HC32-DATOU与MCC7之间的适度静电相互作用以及HC32-DATOU的可生物降解性质可促进基因从细胞核内的聚合复合物种释放以开始转录步骤。
实施例10：包含本公开的HPAE聚合复合物的冻干组合物
以下实施例描述了在示例性HPAE/DNA多聚合复合物制剂的冻干过程中改变储存条件和防冻剂浓度的结果。
通过改变冻干过程中的储存条件和冷冻保护剂浓度来优化HC32-DATOU/DNA聚合复合物制剂。图20a示出使用编码GFP的DNA在RDEBK细胞中进行聚合复合物冻干制作和基因转染研究的方案。除了新鲜制备的聚合复合物外，所有聚合复合物均在制备后1天用于基因转染。如图20b中所示，在改变储存温度时，除了在RT下储存的聚合复合物，新鲜聚合复合物以及在4℃、-20℃和-80℃下储存的聚合复合物都显示出有可比性的高的GFP表达，细胞群体在流式细胞术柱状图分布中有显著的移位(图20c)。如图20d和图20e中所示，用流式细胞术定量的效率高于70％，并且归一化MFI比UT组高出约10倍。这些结果证实低储存温度有利于维持HC32-DATOU/DNA聚合复合物的高基因转染能力。
接着，使用蔗糖作为冷冻干燥过程期间的冷冻保护剂，研究冷冻保护剂浓度对HC32-DATOU/DNA聚合复合物的基因转染能力的影响。无任何冷冻保护剂(0％蔗糖)的冷冻干燥聚合复合物导致大部分转染能力的损失，展现出20％效率以及与UT细胞相比仅高出1.4倍的MFI。
当在冻干前将1％、3％和5％的蔗糖添加至聚合复合物溶液中时，转染效率分别增加至54％、61％和52％。这些结果证实3％的蔗糖对于维持HC32-DATOU/DNA聚合复合物的基因转染能力更高效。尽管基因转染略低于新制备的对应物，但是具有蔗糖的在低温下储存或冷冻干燥的聚合复合物的基因转染能力仍远高于商业试剂(SuperFect和Lipofectamine)的基因转染能力，所述商业试剂的效率分别为10％和32％。
此外，聚合复合物冻干具有独特的优点。首先，它使得能够后续以较高的浓度重构聚合复合物，这特别有益于需要有限的施用体积的体内注射。其次，易于调整的溶质(蔗糖)可使重构的聚合复合物溶液在配制期间等渗。此外，预期具有蔗糖的冻干聚合复合物与新制备的聚合复合物相比，在血清存在下更稳定。最后，冻干的聚合复合物可储存数年而不失去功效。
对具有不同储存时间的表现最好的HC32-DATOU/DNA多聚合复合物(4℃、-20℃和-80℃组)进行基因转染研究，以评价货架期。如图21中所示，在4℃下储存0.5个月或1个月后，聚合复合物的Gluc活性比新制备的聚合复合物介导的Gluc活性低2至3个数量级。在2个月后，聚合复合物的效率变得可忽略不计。
相比之下，即使在一年后，在-20℃和-80℃下储存的聚合复合物也介导了与新配制的聚合复合物相同水平的Gluc活性。这些结果证实HC32-DATOU/DNA聚合复合物非常稳定，仅仅通过储存在-20℃或-80℃下就能保留它们的完整基因转染功能，使得它们对于临床应用高度可行。
用于实施例9和10的材料：单体5-氨基-1-戊醇(AP,99％)、三羟甲基丙烷三丙烯酸酯(TMPTA,99％)、1,11-二氨基-3,6,9-三氧杂十一烷(DATOU,98％)购自Sigma-Aldrich，并且1,4-丁二醇二丙烯酸酯(BDA,98％)购自VWR。化学品溴化锂(LiBr,99％)、tris缓冲盐水和Tween 20(TBST)、多聚甲醛(PFA)和triton X-100购自Sigma-Aldrich。溶剂二甲亚砜(DMSO,Sigma-Aldrich,99％)、二甲基甲酰胺(DMF,Fisher Scientific,99％)、二乙醚(Sigma-Aldrich,99％)和氘化氯仿(CDCl3,Sigma-Aldrich,99.9％)按收到的原样使用。将支化聚乙烯亚胺(PEI,Mw＝25kDa,Sigma-Aldrich)、SuperFect(QIAGEN)、Lipofectamine2000(Invitrogen)用作商业试剂对照。具有补充剂包(Clonetics KGM-Gold SingleQuots)的角质形成细胞基础培养基(Clonetics KBM-Gold)购自Lonza。从New England BiolabsUK获得细胞分泌型Gaussia princeps荧光素酶(Gluc)质粒和BioLux Gaussia荧光素酶测定试剂盒。绿色荧光蛋白质(GFP)质粒购自Aldevron。汉克斯平衡盐溶液(HBSS)、乙酸钠(SA,pH 5.2±0.1,3M)缓冲液、tris乙酸盐-EDTA(TAE)缓冲液和放射免疫沉淀测定(RIPA)缓冲液、琼脂糖、牛血清白蛋白(BSA)、山羊血清、小鼠中产生的单克隆抗C7抗体、蛋白酶抑制剂混合液(PIC)和Bradford试剂购自Sigma-Aldrich。1×达尔伯克磷酸盐缓冲盐水(PBS)、Gibco OPTI-MEM I减血清培养基、4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)和PicoGreen测定试剂盒购自Life Technologies。青霉素-链霉素(PS)、EcoRI、Alexa-568山羊抗小鼠IgG(H+L)高度交叉吸附的二级抗体和Pierce ECL+蛋白质印迹底物购自Thermo FisherScientific。Alamarblue测定试剂盒、SYBR安全DNA凝胶染料和SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix购自Invitrogen。胶原VII型α1(Fam-MGB、引物和探针)、人甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)内源对照(VIC/MGB探针，引物受限)和TaqMan基因表达主混合物购自Applied Biosystems。依照制造商的方案使用TE缓冲液(QIAGEN)、Cy3 DNA标记试剂盒(Mirus)、RNeasy微型试剂盒(QIAGEN)、含DAPI的Fluoroshield封固剂(Abcam)。多克隆抗C7家兔一级抗体(Merck Millipore)、抗β-肌动蛋白小鼠一级抗体(Abcam)、抗家兔IgG HRP连接的抗体(Cell Signaling)和抗小鼠IgG HRP连接的抗体(Cell Signaling)按收到的原样使用。
本文中引用或以其他方式提及或公开的所有文献出于所有目的通过引用整体并入本文。
参考文献
[1]L.Naldini，Gene therapy returns to centre stage.Nature 2015.
[2]H.Yin，R.L.Kanasty，A.A.Eltoukhy，A.J.Vegas，J.R.Dorkin，D.G.Anderson，Non-viral vectors for gene-based therapy.Nat.Rev.Genet.2014.
[3]M.Foldvari，D.W.Chen，N.Nafissi，D.Calderon，L.Narsineni，A.Rafiee，J.Control.Release 2016.
[4]H.Lv，S.Zhang，B.Wang，S.Cui，J.Yan，Toxicity of cationic lipids andcationic polymers in gene delivery.J.Control.Release 2006.
[5]D.M.Lynn，R.Langer，J Am Chem Soc 2000.
[6]J.J.Green，G.T.Zugates，N.C.Tedford，Y.H.Huang，L.G.Griffith，D.A.Lauffenburger，J.A.Sawicki，R.Langer，D.G.Anderson，Adv.Mater.2007.
[7]J.C.Sunshine，D.Y.Peng，J.J.Green，Mol.Pharm.2012.
[8]D.G.Anderson，A.Akinc，N.Hossain，R.Langer，Mol.Ther.2005.
[9]A.Akinc，D.M.Lynn，D.G.Anderson，R.Langer，J.Am.Chem.Soc.2003.
[10]D.G.Anderson，D.M.Lynn，R.Langer，Angew.Chemie-Int.Ed.2003.
[11]J.C.Sunshine，S.B.Sunshine，I.Bhutto，J.T.Handa，J.J.Green，PLoS One2012.
[12]A.Mangraviti，S.Y.Tzeng，K.L.Kozielski，Y.Wang，Y.Jin，D.Gullotti.M.Pedone，N.Buaron，A.Liu，D.R.Wilson，S.K.Hansen，F.J.Rodriguez，G.D.Gao，F.Dimeco，H.Brem，A.Olivi，B.Tyler，J.J.Green，ACS Nano 2015.
[13]D.Zhou，L.Cutlar，Y.Gao，W.Wang，J.O.Keeffe-ahern，S.Mcmahon，B.Duarte，F.Larcher，B.J.Rodriguez，U.Greiser，W.Wang，Sci.Adv.2016，1.
[14]D.Zhou，Y.Gao，J.O’Keeffe Ahem，A.Sigen，Q.Xu，X.Huang，U.Greiser，W.Wang，ACS Appl.Mater.Interfaces 2016.
[15]D.Zhou，Y.Gao，A.Aied，L.Cutlar，O.Igoucheva，B.Newland，V.Alexeeve，U.Greiser，J.Uitto，W.Wang，J.Control.Release 2016.
[16]M.Zeng，D.Zhou，S.Ng，J.O.Ahem，F.Alshehri，Y.Gao，L.Pierucci，U.Greiser，W.Wang，Polymers(Basel).2017，9，161.
[17]D.T.Woodley，M.Chen，Journal of Investigative Dermatology.2015，.
[18]J.-D.Fine，L.Bruckner-Tuderman，R.A.J.Eady，E.A.Bauer，J.W.Bauer，C.Has，A.Heageny，H.Hintner，A.Hovnanian，M.F.Jonkman，I.Leigh，M.P.Marinkovich，A.E.Martinez，J.A.McGrath，J.E.Mellerio，C.Moss.D.F.Murrell.H.Shimizu，J.Uitto，D.Woodley，G.Zambruno，J.Am.Acad.Dermatol.2014.
[19]L.Cutlar，D.Zhou，X.Hu，B.Duarte，U.Greiser，F.Larcher，W.Wang，A non-viral gene therapy for treatment of recessive dystrophic epidermolysisbullosa.Exp.Dermatol.2016.
[20]J.W.Fountain，W.K.Lockwood，F.S.Collins，Gene 1988.
[21]T.Wong，L.Gammon，L.Liu，J.E.Mellerio，P.J.C.Dopping-Hepenstal，J.Pacy，G.Elia，R.Jeffery，i.M.Leigh，H.Navsaria，J.a McGrath，J.Invest.Dermatol.2008.
[22]G.Petrof，M.Martinez-Queipo，J.E.Mellerio，P.Kemp，J.A.McGrath，Br.J.Dermatol.2013.
[23]A.Nakayama，M.Sato，M.Shinohara，S.Matsubara，T.Yokomine，E.Akasaka，M.Yoshida，S.Takao，Cloning Stem Cells 2007.
[24]M.Lee，K.Chea，R.Pyda，M.Chua，I.Dominguez，J.Biomol.Tech.2017.
[25]M.S.Tabar，M.Hesaraki，F.Esfandiari，F.S.Samani，H.Vakilian，H.Baharvand，Cell J.2015.
[26]E.T.Jordan，M.Collins，J.Terefe，L.Ugozzoli，T.Rubio，J.Biomol.Tech.2008.
[27]Y.Liu，D.Wu，Y.Ma，G.Tang，S.Wang，C.He，T.Chung，S.Goh，Chem.Commun.(Camb).2003.
[28]J.J.Green，R.Langer，D.G.Anderson，A combinatorial polymer libraryapproach yields insight into nonviral gene delivery.Acc.Chem.Res.2008.
[29]D.W.Pack，A.S.Hoffman，S.Pun，P.S.Stayton，Design and development ofpolymers for gene delivery.Nat.Rev.Drug Discov.2005.
[30]M.A.Mintzer，E.E.Simanek，Nonviral vectors for genedelivery.Chem.Rev.2009.
[31]D.V.Schaffer，N.A.Fidelman，N.Dan，D.A.Lauffenburger，Biotechnol.Bioeng.2000.
[32]O.Zelphati，F.C.Szoka，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1996.
[33]J.REJMAN，V.OBERLE，I.S.ZUHORN，D.HOEKSTRA，Biochem.J.2004.
[34]A.Verma，O.Uzun，Y.Hu，Y.Hu，H.S.Han，N.Watson，S.Chen，D.J.Irvine，F.Stellacci，Nat.Mater.2008.
[35]J.A.McGrath，A.Ishida-Yamamoto，A.O’Grady，I.M.Leigh，R.A.J.Eady，J.Invest.Dermatol.1993，100，366.
[36]M.Goto，D.Sawamura，K.Ito，M.Abe，W.Nishie，K.Sakai，A.Shibaki，M.Akiyama，H.Shimizu，J.Invest.Dermatol.2006.
[37]Z.Y.Chen，C.Y.He，A.Ehrhardt，M.A.Kay，Mol.Ther.2003.
[38]F.Jia，K.D.Wilson，N.Sun，D.M.Gupta，M.Huang，Z.Li，N.J.Panetta，Z.Y.Chen，R.C.Robbins，M.A.Kay，M.T.Longaker，J.C.Wu，Nat.Methods 2010.
[39]C.Perdoni，M.J.Osborn，J.Tolar，Transl.Res.2016.
[40]C.Georgiadis，F.Syed，A.Petrova，A.Abdul-Wahab，S.M.Lwin，F.Farzaneh，L.Chan，S.Ghani，R.A.Fleck，L.Glover，J.R.McMillan，M.Chen，A.J.Thrasher，J.A.McGrath，W.L.Di，W.Qasim，J.Invest.Dermatol.2016.

Claims (142)

1.一种聚合物，其通过下面的工艺制备：
(a)使式(A)化合物
Figure FDA0003014376910000011
与具有式R1-NH2或R1-N(H)-Z’-N(H)-R1的第一胺反应；
(b)使步骤(a)的产物与具有式R2-NH2或R2-N(H)-Z”-N(H)-R2的第二胺反应；以及
(c)使步骤(b)的产物与式(B)化合物反应：
Figure FDA0003014376910000012
其中
每个J独立地为–O–或–NH–；
Z、Z’和Z”’为连接部分；
A为1至30个碳原子的线性或支化碳链、2至30个原子的线性或支化含杂原子碳链、含有3至30个碳原子的碳环，或含有3至30个原子的杂环；
其中A任选地被一个或多个以下基团取代：卤素、羟基、氨基、磺酰基、磺酰胺基、巯基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6醚、C1-C6硫醚、C1-C6砜、C1-C6亚砜、C1-C6伯酰胺、C1-C6仲酰胺、卤代C1-C6烷基、羧基、氰基、硝基、亚硝基、-OC(O)NR′R′、-N(R′)C(O)NR′R′、-N(R′)C(O)O-C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C3-C6杂环基、C2-C5杂芳基或C6-C10芳基；其中每个R′独立地选自由氢和C1-C6烷基组成的组；
G为–C–、–S–、–S(O)–、–P(OR1)–或–P(OH)–；
每个Q为H或C1-C10线性或支化烷基；
每个E1独立地选自由以下组成的组：共价键、–N–、–O–、–S–、亚烷基、杂亚烷基、烯基、杂亚烯基、炔基、杂亚炔基；
R1和R2各自独立地为C1-C40烷基、C1-C40杂烷基、C2-C40烯基、C2-C40杂亚烯基、C4-C8环烯基、C2-C40炔基、C2-C40杂亚炔基、C3-C8环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；其中所述杂环基和杂芳基含有1-5个选自由N、S、P和O组成的组的杂原子；其中所述C1-C40烷基、C2-C40烯基、C4-C8环烯基、C2-C40炔基、C3-C8环烷基、杂环基、芳基和杂芳基任选地被D、卤素、C1-C6烷基、-OH、-O-C1-C6烷基、-NH2、-NH(C1-C6烷基)或-N(C1-C6烷基)2取代；并且R1未被取代或被以下中的至少一者取代：卤素、羟基、氨基、磺酰基、磺酰胺基、巯基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6醚、C1-C6硫醚、C1-C6砜、C1-C6亚砜、C1-C6伯酰胺、C1-C6仲酰胺、卤代C1-C6烷基、羧基、氰基、硝基、亚硝基、-OC(O)NR′R′、-N(R′)C(O)NR′R′、-N(R′)C(O)O-C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C3-C6杂环基、C2-C5杂芳基和C6-C10)芳基；其中每个R′独立地选自由氢和C1-C6烷基组成的组；并且
每个n至少为1。
2.如权利要求1所述的聚合物，其中Z为1至30个碳原子的线性或支化碳链、1至30个原子的线性或支化含杂原子碳链、含有3至30个碳原子的碳环、含有3至30个碳原子的亚烷基-碳环、含有3至30个原子的杂环，或含有3至30个原子的亚烷基-杂环；
其中Z未被取代或被以下中的至少一者取代：卤素、羟基、氨基、磺酰基、磺酰胺基、巯基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6醚、C1-C6硫醚、C1-C6砜、C1-C6亚砜、C1-C6伯酰胺、C1-C6仲酰胺、卤代C1-C6烷基、羧基、氰基、硝基、亚硝基、-OC(O)NR′R′、-N(R′)C(O)NR′R′、-N(R′)C(O)O-C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C3-C6杂环基、C2-C5杂芳基和C6-C10芳基；其中每个R′独立地选自由氢和C1-C6烷基组成的组。
3.如权利要求1或2所述的聚合物，其中G为-C-。
4.如权利要求1至3中任一项所述的聚合物，其中所述式(B)化合物为
Figure FDA0003014376910000031
其中
R为1至10个碳原子的线性或支化碳链、1至10个原子的线性或支化含杂原子碳链、含有3至10个碳原子的碳环，或含有3至10个原子的杂环，并且R未被取代或被以下中的至少一者取代：卤素、羟基、氨基、磺酰基、磺酰胺基、巯基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6醚、C1-C6硫醚、C1-C6砜、C1-C6亚砜、C1-C6伯酰胺、C1-C6仲酰胺、卤代C1-C6烷基、羧基、氰基、硝基、亚硝基、-OC(O)NR′R′、-N(R′)C(O)NR′R′、-N(R′)C(O)O-C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C3-C6杂环基、C2-C5杂芳基和C6-C10芳基；其中每个R′独立地选自由氢和C1-C6烷基组成的组；并且
R”为未被取代或被取代的1至10个碳原子的线性或支化碳链、1至10个原子的线性或支化含杂原子碳链、含有3至10个碳原子的碳环，或含有3至10个原子的杂环。
5.如权利要求4所述的聚合物，其中所述式(B)化合物为
Figure FDA0003014376910000041
6.如权利要求1至5中任一项所述的聚合物，其中Z为1至30个碳原子的线性或支化碳链或1至30个原子的线性或支化含杂原子碳链。
7.如权利要求6所述的聚合物，其中Z为1至10个碳原子的线性或支化碳链。
8.如权利要求1至6中任一项所述的聚合物，其中Z为
Figure FDA0003014376910000042
其中x为1-1000。
9.如权利要求1至6中任一项所述的聚合物，其中每个Z为
Figure FDA0003014376910000051
10.如权利要求1至9中任一项所述的聚合物，其中R1和R2独立地选自由以下组成的组：
Figure FDA0003014376910000052
Figure FDA0003014376910000053
Figure FDA0003014376910000061
11.如权利要求10所述的聚合物，其中R1为
Figure FDA0003014376910000062
并且R2为
Figure FDA0003014376910000063
12.如权利要求1至11中任一项所述的聚合物，其中使摩尔过量的所述式(A)化合物与所述第一胺反应。
13.如权利要求12所述的聚合物，其中所述式(A)化合物与所述第一胺的化学计量比为约1.2:1。
14.如权利要求1至13中任一项所述的聚合物，其中步骤(a)在有机溶剂中进行。
15.如权利要求14所述的聚合物，其中所述有机溶剂是DMSO。
16.如权利要求1至15中任一项所述的聚合物，其中步骤(a)在约40℃至约120℃的温度下进行。
17.如权利要求16所述的聚合物，其中步骤(a)在约90℃下进行。
18.如权利要求1至17中任一项所述的聚合物，其中步骤(a)的产物在步骤(b)之前未被纯化。
19.如权利要求1至18中任一项所述的聚合物，其中将摩尔过量的所述第二胺添加至步骤(a)的产物中。
20.如权利要求1至19中任一项所述的聚合物，其中步骤(b)在约20℃至约25℃的温度下进行。
21.如权利要求1至20中任一项所述的聚合物，其中步骤(b)的产物在步骤(c)之前被纯化。
22.如权利要求1至21中任一项所述的聚合物，其中步骤(c)在高于步骤(b)的温度下进行。
23.如权利要求22所述的聚合物，其中步骤(c)在约90℃下进行。
24.如权利要求1至23中任一项所述的聚合物，其中所述聚合物的由马克-豪温克方程定义的α参数小于约0.5。
25.如权利要求1至24中任一项所述的聚合物，其中所述聚合物的由马克-豪温克方程定义的α参数为约0.2至约0.5。
26.如权利要求1至25中任一项所述的聚合物，其中所述聚合物具有约1.01至约8.0的PDI。
27.如权利要求1至26中任一项所述的聚合物，其中所述聚合物具有约2.5的PDI。
28.如权利要求1至27中任一项所述的聚合物，其中所述聚合物具有至少3kDa的MW。
29.如权利要求1至28中任一项所述的聚合物，其中所述聚合物具有介于约5kDa与50kDa之间的MW。
30.如权利要求1至29中任一项所述的聚合物，其中所述聚合物具有约10kDa的MW。
31.如权利要求1至30中任一项所述的聚合物，其中步骤(b)之后的产物具有约3kDa的MW。
32.一种制备聚合物的方法，其包括：
(a)使式(A)化合物
Figure FDA0003014376910000081
与具有式R1-NH2或R1-N(H)-Z’-N(H)-R1的第一胺反应；
(b)使(a)的产物与具有式R2-NH2或R2-N(H)-Z”-N(H)-R2的第二胺反应；以及
(b)使(b)的产物与式(B)化合物反应：
Figure FDA0003014376910000082
其中
每个J独立地为–O–或–NH–；
Z、Z’和Z”为连接部分；
A为1至30个碳原子的线性或支化碳链、2至30个原子的线性或支化含杂原子碳链、含有3至30个碳原子的碳环，或含有3至30个原子的杂环；
其中A任选地被一个或多个以下基团取代：卤素、羟基、氨基、磺酰基、磺酰胺基、巯基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6醚、C1-C6硫醚、C1-C6砜、C1-C6亚砜、C1-C6伯酰胺、C1-C6仲酰胺、卤代C1-C6烷基、羧基、氰基、硝基、亚硝基、-OC(O)NR′R′、-N(R′)C(O)NR′R′、-N(R′)C(O)O-C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C3-C6杂环基、C2-C5杂芳基或C6-C10芳基；其中每个R′独立地选自由氢和C1-C6烷基组成的组；
G为–C–、–S–、–S(O)–、–P(OR1)–或–P(OH)–；
每个Q为H或C1-C10线性或支化烷基；
每个E1独立地选自由以下组成的组：共价键、–N–、–O–、–S–、亚烷基、杂亚烷基、烯基、杂亚烯基、炔基、杂亚炔基；
R1和R2各自独立地为C1-C40烷基、C1-C40杂烷基、C2-C40烯基、C2-C40杂亚烯基、C4-C8环烯基、C2-C40炔基、C2-C40杂亚炔基、C3-C8环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；其中所述杂环基和杂芳基含有1-5个选自由N、S、P和O组成的组的杂原子；其中所述C1-C40烷基、C2-C40烯基、C4-C8环烯基、C2-C40炔基、C3-C8环烷基、杂环基、芳基和杂芳基任选地被D、卤素、C1-C6烷基、-OH、-O-C1-C6烷基、-NH2、-NH(C1-C6烷基)或-N(C1-C6烷基)2取代；并且R1未被取代或被以下中的至少一者取代：卤素、羟基、氨基、磺酰基、磺酰胺基、巯基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6醚、C1-C6硫醚、C1-C6砜、C1-C6亚砜、C1-C6伯酰胺、C1-C6仲酰胺、卤代C1-C6烷基、羧基、氰基、硝基、亚硝基、-OC(O)NR′R′、-N(R′)C(O)NR′R′、-N(R′)C(O)O-C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C3-C6杂环基、C2-C5杂芳基和C6-C10)芳基；其中每个R′独立地选自由氢和C1-C6烷基组成的组；并且
每个n至少为1。
33.如权利要求32所述的方法，其中Z为1至30个碳原子的线性或支化碳链、1至30个原子的线性或支化含杂原子碳链、含有3至30个碳原子的碳环，或含有3至30个原子的杂环；
其中Z未被取代或被以下中的至少一者取代：卤素、羟基、氨基、磺酰基、磺酰胺基、巯基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6醚、C1-C6硫醚、C1-C6砜、C1-C6亚砜、C1-C6伯酰胺、C1-C6仲酰胺、卤代C1-C6烷基、羧基、氰基、硝基、亚硝基、-OC(O)NR′R′、-N(R′)C(O)NR′R′、-N(R′)C(O)O-C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C3-C6杂环基、C2-C5杂芳基和C6-C10芳基；其中每个R′独立地选自由氢和C1-C6烷基组成的组。
34.如权利要求32或33所述的方法，其中G为–C–。
35.如权利要求32至34中任一项所述的方法，其中所述式(B)化合物为
Figure FDA0003014376910000101
其中
R未被取代或被以下中的至少一者取代：卤素、羟基、氨基、磺酰基、磺酰胺基、巯基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6醚、C1-C6硫醚、C1-C6砜、C1-C6亚砜、C1-C6伯酰胺、C1-C6仲酰胺、卤代C1-C6烷基、羧基、氰基、硝基、亚硝基、-OC(O)NR′R′、-N(R′)C(O)NR′R′、-N(R′)C(O)O-C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C3-C6杂环基、C2-C5杂芳基和C6-C10芳基；其中每个R′独立地选自由氢和C1-C6烷基组成的组；并且
R”为未被取代或被取代的1至10个碳原子的线性或支化碳链、1至10个原子的线性或支化含杂原子碳链、含有3至10个碳原子的碳环，或含有3至10个原子的杂环。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述式(B)化合物为
Figure FDA0003014376910000111
37.如权利要求32至36中任一项所述的方法，其中Z为1至30个碳原子的线性或支化碳链或1至30个原子的线性或支化含杂原子碳链。
38.如权利要求37所述的方法，其中Z为1至10个碳原子的线性或支化碳链。
39.如权利要求32至37中任一项所述的方法，其中Z为
Figure FDA0003014376910000112
其中x为1-1000。
40.如权利要求32至38中任一项所述的方法，其中Z为
Figure FDA0003014376910000113
41.如权利要求32至40中任一项所述的方法，其中R1和R2独立地选自由以下组成的组：
Figure FDA0003014376910000114
Figure FDA0003014376910000121
42.如权利要求41所述的方法，其中R1为
Figure FDA0003014376910000122
并且R2为
Figure FDA0003014376910000131
43.如权利要求32至42中任一项所述的方法，其中使摩尔过量的所述式(A)化合物与所述第一胺反应。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述式(A)化合物与所述第一胺的化学计量比为约1.2:1。
45.如权利要求32至44中任一项所述的方法，其中步骤(a)在有机溶剂中进行。
46.如权利要求45所述的方法，其中所述有机溶剂是DMSO。
47.如权利要求32至46中任一项所述的方法，其中步骤(a)在约20℃至约200℃的温度下进行。
48.如权利要求47所述的方法，其中步骤(a)在约90℃下进行。
49.如权利要求32至48中任一项所述的方法，其中步骤(a)的产物在(b)之前未被纯化。
50.如权利要求32至49中任一项所述的方法，其中将摩尔过量的所述第二胺添加至(a)的产物中。
51.如权利要求32至50中任一项所述的方法，步骤(b)在约20℃至约25℃的温度下进行。
52.如权利要求32至51中任一项所述的方法，其中步骤(b)的产物在步骤(c)之前被纯化。
53.如权利要求32至52中任一项所述的方法，其中步骤(c)在高于步骤(b)的温度下进行。
54.如权利要求53所述的方法，其中步骤(c)在约90℃下进行。
55.如权利要求32至54中任一项所述的方法，其中所述聚合物的由马克-豪温克方程定义的α参数小于约0.5。
56.如权利要求32至55中任一项所述的方法，其中所述聚合物的由马克-豪温克方程定义的α参数为约0.3至约0.5。
57.如权利要求32至56中任一项所述的方法，其中所述聚合物具有约2.0至约3.0的PDI。
58.如权利要求32至57中任一项所述的方法，其中所述聚合物具有约2.5的PDI。
59.如权利要求32至58中任一项所述的方法，其中所述聚合物具有至少3kDa的MW。
60.如权利要求32至59中任一项所述的方法，其中所述聚合物具有介于约5kDa与50kDa之间的MW。
61.如权利要求32至60中任一项所述的方法，其中所述聚合物具有约10kDa的MW。
62.如权利要求32至61中任一项所述的方法，其中步骤(b)之后的产物具有约3kDa的MW。
63.一种聚合复合物，其包含核酸组分以及权利要求1-31所述的聚合物或式(I)的聚合物
Figure FDA0003014376910000141
其中
每个A独立地为1至30个碳原子的线性或支化碳链、1至30个原子的线性或支化含杂原子碳链、含有3至30个碳原子的碳环，或含有3至30个原子的杂环；
其中A任选地被一个或多个以下基团取代：卤素、羟基、氨基、磺酰基、磺酰胺基、巯基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6醚、C1-C6硫醚、C1-C6砜、C1-C6亚砜、C1-C6伯酰胺、C1-C6仲酰胺、卤代C1-C6烷基、羧基、氰基、硝基、亚硝基、-OC(O)NR′R′、-N(R′)C(O)NR′R′、-N(R′)C(O)O-C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C3-C6杂环基、C2-C5杂芳基或C6-C10芳基；其中每个R′独立地选自由氢和C1-C6烷基组成的组；
每个B独立地为第一连接部分；
每个X独立地为
Figure FDA0003014376910000151
Figure FDA0003014376910000152
每个Y独立地为
Figure FDA0003014376910000153
每个L独立地为第二连接部分；
每个R1、R2和R3在每次出现时均独立地为H、C1-C40烷基、C1-C40杂烷基、C2-C40烯基、C2-C40杂亚烯基、C4-C8环烯基、C2-C40炔基、C2-C40杂亚炔基、C3-C8环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；其中所述杂环基和杂芳基含有1-5个选自由N、S、P和O组成的组的杂原子；其中所述C1-C6烷基、C2-C8烯基、C4-C8环烯基、C2-C6炔基、C3-C8环烷基、杂环基、芳基和杂芳基任选地被D、卤素、C1-C6烷基、-OH、-O-C1-C6烷基、-NH2、-NH(C1-C6烷基)或-N(C1-C6烷基)2取代；或
其中R2和R3与它们所连接的原子一起可形成含有1-3个选自由N、S、P和O组成的组的杂原子的杂环基或杂芳基；
a为1-1000；
b为1-4；
c为1-3；并且
z为1-100；
条件是R2和R3中至少一者不为H。
64.如权利要求63所述的聚合复合物，其中所述式(I)聚合物具有式(II)的结构：
Figure FDA0003014376910000161
其中，
每个E1选自由以下组成的组：共价键、–N–、–O–、–S–、亚烷基、杂亚烷基、烯基、杂亚烯基、炔基、杂亚炔基；
每个E2选自由以下组成的组：共价键、–N–、–O–、–S–、亚烷基、杂亚烷基、烯基、杂亚烯基、炔基、杂亚炔基；
G为–C–、–S–、–S(O)–、–P(OR1)–或–P(OH)–；并且
n至少为1。
65.如权利要求63或64所述的聚合复合物，其中每个B独立地为
Figure FDA0003014376910000171
66.如权利要求63至65中任一项所述的聚合复合物，其中每个B为
Figure FDA0003014376910000172
67.如权利要求63至66中任一项所述的聚合复合物，其中每个L为
Figure FDA0003014376910000173
其中x为1-1000。
68.如权利要求63至67中任一项所述的聚合复合物，其中
a至少为2；
b为3；并且
每个X为
Figure FDA0003014376910000174
69.如权利要求68所述的聚合复合物，其中每个A为
Figure FDA0003014376910000175
70.如权利要求68或69所述的聚合复合物，其中每个L为
Figure FDA0003014376910000176
71.如权利要求68至70中任一项所述的聚合复合物，其中Y为
Figure FDA0003014376910000181
并且每个B为
Figure FDA0003014376910000182
Figure FDA0003014376910000183
72.如权利要求68至71中任一项所述的聚合复合物，其中每个R2和/或R3为
Figure FDA0003014376910000184
73.如权利要求68至72中任一项所述的聚合复合物，其中每个R1为
Figure FDA0003014376910000185
74.如权利要求68所述的聚合复合物，其中所述式(I)聚合物具有式(III)至(VIIe)中的一种的结构：
Figure FDA0003014376910000186
Figure FDA0003014376910000191
Figure FDA0003014376910000201
Figure FDA0003014376910000211
R5、R6和R7中的每一者在每次出现时独立地为H、C1-C40烷基、C1-C40杂烷基、C2-C40烯基、C2-C40杂亚烯基、C4-C8环烯基、C2-C40炔基、C2-C40杂亚炔基、C3-C8环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；其中所述杂环基和杂芳基含有1-5个选自由N、S、P和O组成的组的杂原子；其中所述C1-C6烷基、C2-C8烯基、C4-C8环烯基、C2-C6炔基、C3-C8环烷基、杂环基、芳基和杂芳基任选地被D、卤素、C1-C6烷基、-OH、-O-C1-C6烷基、-NH2、-NH(C1-C6烷基)或-N(C1-C6烷基)2取代；并且其余变量如权利要求1、63或64中所定义。
75.如权利要求63-74中任一项所述的聚合复合物，其中z为1-3。
76.如权利要求75所述的聚合复合物，其中z为1。
77.如权利要求63-74中任一项所述的聚合复合物，其中E2为
Figure FDA0003014376910000221
并且n为1。
78.如权利要求77所述的聚合复合物，其中E2为
Figure FDA0003014376910000222
79.一种聚合复合物，其包含核酸组分和聚合物：
(a)
Figure FDA0003014376910000223
(b)
Figure FDA0003014376910000224
和
(c)
Figure FDA0003014376910000225
或
Figure FDA0003014376910000226
每个J独立地为–O–或–NH–；
Z和Z”为连接部分；
A为1至30个碳原子的线性或支化碳链、2至30个原子的线性或支化含杂原子碳链、含有3至30个碳原子的碳环，或含有3至30个原子的杂环；
其中A任选地被一个或多个以下基团取代：卤素、羟基、氨基、磺酰基、磺酰胺基、巯基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6醚、C1-C6硫醚、C1-C6砜、C1-C6亚砜、C1-C6伯酰胺、C1-C6仲酰胺、卤代C1-C6烷基、羧基、氰基、硝基、亚硝基、-OC(O)NR′R′、-N(R′)C(O)NR′R′、-N(R′)C(O)O-C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C3-C6杂环基、C2-C5杂芳基或C6-C10芳基；其中每个R′独立地选自由氢和C1-C6烷基组成的组；
G为–C–、–S–、–S(O)–、–P(OR1)–或–P(OH)–；
每个Q为H或C1-C10线性或支化烷基；
每个E1独立地选自由以下组成的组：共价键、–N–、–O–、–S–、亚烷基、杂亚烷基、烯基、杂亚烯基、炔基、杂亚炔基；
R1和R2各自独立地为C1-C40烷基、C1-C40杂烷基、C2-C40烯基、C2-C40杂亚烯基、C4-C8环烯基、C2-C40炔基、C2-C40杂亚炔基、C3-C8环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；其中所述杂环基和杂芳基含有1-5个选自由N、S、P和O组成的组的杂原子；其中所述C1-C40烷基、C2-C40烯基、C4-C8环烯基、C2-C40炔基、C3-C8环烷基、杂环基、芳基和杂芳基任选地被D、卤素、C1-C6烷基、-OH、-O-C1-C6烷基、-NH2、-NH(C1-C6烷基)或-N(C1-C6烷基)2取代；并且R1未被取代或被以下中的至少一者取代：卤素、羟基、氨基、磺酰基、磺酰胺基、巯基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6醚、C1-C6硫醚、C1-C6砜、C1-C6亚砜、C1-C6伯酰胺、C1-C6仲酰胺、卤代C1-C6烷基、羧基、氰基、硝基、亚硝基、-OC(O)NR′R′、-N(R′)C(O)NR′R′、-N(R′)C(O)O-C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C3-C6杂环基、C2-C5杂芳基和C6-C10)芳基；其中每个R′独立地选自由氢和C1-C6烷基组成的组；并且每个n至少为1。
80.如权利要求79所述的聚合复合物，其中Z为1至30个碳原子的线性或支化碳链、1至30个原子的线性或支化含杂原子碳链、含有3至30个碳原子的碳环，或含有3至30个原子的杂环；
其中Z未被取代或被以下中的至少一者取代：卤素、羟基、氨基、磺酰基、磺酰胺基、巯基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6醚、C1-C6硫醚、C1-C6砜、C1-C6亚砜、C1-C6伯酰胺、C1-C6仲酰胺、卤代C1-C6烷基、羧基、氰基、硝基、亚硝基、-OC(O)NR′R′、-N(R′)C(O)NR′R′、-N(R′)C(O)O-C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C3-C6杂环基、C2-C5杂芳基和C6-C10芳基；其中每个R′独立地选自由氢和C1-C6烷基组成的组。
81.如权利要求79-80中任一项所述的聚合复合物，其中G为–C–。
82.如权利要求79-81中任一项所述的聚合复合物，其中J为O。
83.如权利要求79-82中任一项所述的聚合复合物，其中Z为1至30个碳原子的线性或支化碳链或1至30个原子的线性或支化含杂原子碳链。
84.如权利要求79-83中任一项所述的聚合复合物，其中Z为1至10个碳原子的线性或支化碳链。
85.如权利要求79-83中任一项所述的聚合复合物，其中Z为
Figure FDA0003014376910000241
其中x为1-1000。
86.如权利要求79-84中任一项所述的聚合复合物，其中Z为
Figure FDA0003014376910000242
87.如权利要求79-86中任一项所述的聚合复合物，其中R1和R2独立地选自由以下组成的组：
Figure FDA0003014376910000251
Figure FDA0003014376910000252
88.如权利要求87所述的聚合复合物，其中R1为
Figure FDA0003014376910000261
并且R2为
Figure FDA0003014376910000262
89.如权利要求87所述的聚合复合物，其中R1为
Figure FDA0003014376910000263
并且R2为
Figure FDA0003014376910000264
90.如权利要求79-89中任一项所述的聚合复合物，其中所述聚合物包含：
(a)
Figure FDA0003014376910000265
(b)
Figure FDA0003014376910000266
和
(c)
Figure FDA0003014376910000267
91.如权利要求79-89中任一项所述的聚合复合物，其中所述聚合物包含：
(a)
Figure FDA0003014376910000268
(b)
Figure FDA0003014376910000269
和
(c)
Figure FDA0003014376910000271
92.如权利要求79-84或86-91中任一项所述的聚合复合物，其中所述聚合物包含：
(a)
Figure FDA0003014376910000272
和
(c)
Figure FDA0003014376910000273
93.如权利要求79-83、85或87-91中任一项所述的聚合复合物，其中所述聚合物包含：
(a)
Figure FDA0003014376910000274
和
(c)
Figure FDA0003014376910000275
其中
J为O并且Z为
Figure FDA0003014376910000276
其中x为1-1000。
94.如权利要求79-93中任一项所述的聚合复合物，其中所述聚合物包含：
(b)
Figure FDA0003014376910000277
95.如权利要求79-89中任一项所述的聚合复合物，其中所述聚合物包含：
(a)
Figure FDA0003014376910000281
(b)
Figure FDA0003014376910000282
和
(c)
Figure FDA0003014376910000283
其中
R1为
Figure FDA0003014376910000284
并且
R2选自
Figure FDA0003014376910000285
96.如权利要求79-89中任一项所述的聚合复合物，其中所述聚合物包含：
(a)
Figure FDA0003014376910000286
(b)
Figure FDA0003014376910000287
和
(c)
Figure FDA0003014376910000288
其中
J为O并且Z为
Figure FDA0003014376910000289
其中x为1-1000；
R1为
Figure FDA0003014376910000291
并且
R2为
Figure FDA0003014376910000292
97.如权利要求79-96中任一项所述的聚合复合物，其中所述聚合物具有约3kDa至约200kDa的MW。
98.如权利要求79-96中任一项所述的聚合复合物，其中所述聚合物具有约5kDa至约50kDa的MW。
99.如权利要求79-96中任一项所述的聚合复合物，其中所述聚合物具有介于约10kDa与50kDa之间的MW。
100.如权利要求79-96中任一项所述的聚合复合物，其中所述聚合物具有约5kDa至约15kDa的MW。
101.如权利要求79-96中任一项所述的聚合复合物，其中所述聚合物具有约10kDa的MW。
102.如权利要求79-96中任一项所述的聚合复合物，其中所述聚合物具有约20kDa的MW。
103.如权利要求79-96中任一项所述的聚合复合物，其中所述聚合物具有约30kDa的MW。
104.如权利要求79-96中任一项所述的聚合复合物，其中所述聚合物具有约40kDa的MW。
105.如权利要求79-103中任一项所述的聚合复合物，其中所述聚合物的由马克-豪温克定义的α参数小于约0.5。
106.如权利要求79-104中任一项所述的聚合复合物，其中所述聚合物的由马克-豪温克方程定义的α参数在约0.3至约0.5范围内。
107.如权利要求79-105中任一项所述的聚合复合物，其中所述聚合物具有约1.0至约8.0的PDI。
108.如权利要求79-106中任一项所述的聚合复合物，其中所述聚合物具有约2.5的PDI。
109.如权利要求107所述的聚合复合物，其中聚合物和核酸组分以约20:1至约80:1(w/w)的比率存在。
110.如权利要求108所述的聚合复合物，其中聚合物和核酸组分以约30:1(w/w)的比率存在。
111.如权利要求63-109中任一项所述的聚合复合物，其具有小于约2μm的粒度。
112.如权利要求110所述的聚合复合物，其具有约60nm至约250nm的粒度。
113.如权利要求110所述的聚合复合物，其具有约175nm至约250nm的粒度。
114.如权利要求63至112中任一项所述的聚合复合物，其具有约0mV至约100mV的ζ电位。
115.如权利要求113所述的聚合复合物，其中所述ζ电位为约30mV至约34mV。
116.如权利要求63至114中任一项所述的聚合复合物，其中所述复合体具有球形形状。
117.如权利要求63至87中任一项所述的聚合复合物，其中所述聚合物具有约10kDa的MW。
118.如权利要求63至116中任一项所述的聚合复合物，其中所述核酸组分是质粒、纳米质粒、核酸、微环或基因编辑系统。
119.如权利要求117所述的聚合复合物，其中所述纳米质粒包含真核转基因和尺寸小于0.5kb的细菌骨架。
120.如权利要求117所述的聚合复合物，其中所述质粒或纳米质粒是不含抗生素抗性标记物的质粒或不含抗生素抗性标记物的纳米质粒。
121.如权利要求117所述的聚合复合物，其中所述质粒或纳米质粒包含蔗糖选择标记物或无义抑制因子标记物。
122.如权利要求117所述的聚合复合物，其中所述基因编辑系统是(i)成簇的、规则间隔的回文重复(CRISPR)相关(Cas)系统；(ii)转录激活子样效应物核酸酶(TALEN)系统；或(iii)锌指核酸酶(ZFN)系统。
123.如权利要求117所述的聚合复合物，其中所述核酸是RNAi诱导分子。
124.如权利要求122所述的聚合复合物，其中所述RNAi诱导分子选自由siRNA、dsRNA、shRNA和微小RNA组成的组。
125.如权利要求63至116中任一项所述的聚合复合物，其中所述核酸组分包含组织特异性启动子。
126.如权利要求63至116中任一项所述的聚合复合物，其中所述核酸组分包含与遗传疾病或病症相关的基因。
127.如权利要求125所述的聚合复合物，其中所述遗传疾病或病症由一个或多个基因的突变引起，所述突变导致低的、缺失的或功能失调的蛋白质表达。
128.如权利要求126所述的聚合复合物，其中所述基因选自由以下组成的组：COL7A1、LAMB3、ADA、SERPINA1、CFTR、HTT、NF1、PHA、HBS、FERMT1、KRT14、DSP、SPINK5和FLG。
129.如权利要求127所述的聚合复合物，其中所述基因是COL7A1，并且所述遗传疾病或病症是大疱性表皮松解症的形式。
130.如权利要求125所述的聚合复合物，其中所述基因的序列被优化成在所述聚合复合物被递送至细胞中后获得最大的蛋白质表达。
131.一种药物组合物，其包含有效量的权利要求63-129中任一项所述的聚合复合物与药学上可接受的载剂的组合。
132.如权利要求130所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的载剂适合于口服、胃肠外、吸入、局部、皮下、肌内、静脉内、眼内或真皮内施用。
133.如权利要求131所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制为选自由非水性洗剂、油包水洗剂和水包油洗剂组成的组的洗剂。
134.如权利要求130所述的药物组合物，其中所述药物组合物被冻干用于将来使用。
135.如权利要求130所述的药物组合物，其中所述药物组合物以水溶液形式被冷冻。
136.一种细胞转染的方法，其包括使一个或多个靶细胞与权利要求130至134中任一项所述的药物组合物在适于用聚合复合物转染所述靶细胞的条件下接触。
137.如权利要求135所述的方法，其中所述一个或多个靶细胞是真核细胞。
138.如权利要求136所述的方法，其中所述一个或多个靶细胞是以下中的一者或多者：T细胞、B细胞、血细胞、肺泡细胞、肺细胞、脑神经元、皮肤神经元、上皮细胞、角质形成细胞、iPS细胞、成纤维细胞和汗腺细胞。
139.一种治疗有需要的患者的疾病的方法，其包括施用治疗有效量的权利要求130至134中任一项所述的药物组合物，使得所述患者的一个或多个细胞被聚合复合物核酸组分转染。
140.一种治疗有需要的患者的疾病的方法，其包括施用治疗有效的权利要求130至134中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物的所述施用纠正所述受试者中靶基因的有缺陷的翻译。
141.如权利要求139所述的方法，其中所述靶基因选自由以下组成的组：COL7A1、LAMB3、ADA、SERPINA1、CFTR、HTT、NF1、PHA、HBS、FERMT1、KRT14、DSP、SPINK5和FLG。
142.如权利要求139所述的方法，其中所述疾病是腺苷脱氨酶(ADA)缺乏症、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、囊性纤维化、亨廷顿氏病、1型神经纤维瘤病、苯丙酮尿症、镰状细胞病、散发性包涵体肌炎、迪谢内肌营养不良、金德勒综合征、交界型大疱性表皮松解症、营养不良性大疱性表皮松解症(常染色体隐性)、营养不良性大疱性表皮松解症(局灶性变异型)、痒疹性大疱性表皮松解症、大疱性表皮松解症(胫前)、网状色素性皮病、单纯性大疱性表皮松解症(道林-米拉型)、单纯性大疱性表皮松解症(科布内型)、单纯性大疱性表皮松解症(隐性1)、单纯性大疱性表皮松解症(韦伯-科凯恩型)、纳格里-弗朗西斯凯-贾达森综合征、大疱性表皮松解症(致死性棘层松解症)、内瑟顿综合征、寻常性鱼鳞病、特应性皮炎、尤希尔氏综合征、埃勒斯-当洛斯综合征、纯合性家族性高胆固醇血症(HoFH)或克罗恩氏病。
CN201980067037.7A 2018-10-12 2019-10-14 用于转染细胞的组合物和方法 Pending CN113260657A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862744994P 2018-10-12 2018-10-12
US62/744,994 2018-10-12
US201962826461P 2019-03-29 2019-03-29
US62/826,461 2019-03-29
PCT/US2019/056151 WO2020077347A2 (en) 2018-10-12 2019-10-14 Compositions and methods for transfecting cells

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113260657A true CN113260657A (zh) 2021-08-13

Family

ID=68387441

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201980067037.7A Pending CN113260657A (zh) 2018-10-12 2019-10-14 用于转染细胞的组合物和方法

Country Status (13)

Country Link
US (1) US20220040331A1 (zh)
EP (1) EP3864070A2 (zh)
JP (1) JP2022514113A (zh)
KR (1) KR20210072773A (zh)
CN (1) CN113260657A (zh)
AU (1) AU2019356596A1 (zh)
BR (1) BR112021006861A2 (zh)
CA (1) CA3114205A1 (zh)
CO (1) CO2021004463A2 (zh)
IL (1) IL282160A (zh)
MX (1) MX2021004169A (zh)
SG (1) SG11202102538RA (zh)
WO (1) WO2020077347A2 (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3700965A1 (en) 2017-10-27 2020-09-02 Massachusetts Institute of Technology Poly (beta-amino esters) and uses thereof
CN108753813B (zh) * 2018-06-08 2021-08-24 中国水稻研究所 获得无标记转基因植物的方法
US20220287983A1 (en) * 2021-03-09 2022-09-15 Massachusetts Institute Of Technology Branched poly(-amino esters) for the delivery of nucleic acids

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20170216455A1 (en) * 2014-08-06 2017-08-03 National University Of Ireland, Galway HYPERBRANCHED POLY (ß-AMINO ESTER) FOR GENE THERAPY

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2152889B1 (en) 2007-05-29 2017-03-15 Nature Technology Corporation Vectors and methods for genetic immunization

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20170216455A1 (en) * 2014-08-06 2017-08-03 National University Of Ireland, Galway HYPERBRANCHED POLY (ß-AMINO ESTER) FOR GENE THERAPY

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ZHOU DEZHONG等: "Development of Branched Poly(5-Amino-1-pentanol-co-1,4-butanediol Diacrylate) with High Gene Transfection Potency Across Diverse Cell Types", 《ACS APPL. MATER. INTERFACES》 *

Also Published As

Publication number Publication date
CA3114205A1 (en) 2020-04-16
WO2020077347A2 (en) 2020-04-16
BR112021006861A2 (pt) 2021-07-13
IL282160A (en) 2021-05-31
MX2021004169A (es) 2021-08-05
JP2022514113A (ja) 2022-02-09
WO2020077347A3 (en) 2020-05-22
SG11202102538RA (en) 2021-04-29
US20220040331A1 (en) 2022-02-10
EP3864070A2 (en) 2021-08-18
CO2021004463A2 (es) 2021-04-30
AU2019356596A1 (en) 2021-04-08
KR20210072773A (ko) 2021-06-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Shen et al. A glutathione-responsive sulfur dioxide polymer prodrug as a nanocarrier for combating drug-resistance in cancer chemotherapy
Klausner et al. Ultrapure chitosan oligomers as carriers for corneal gene transfer
Yoo et al. Protease-activatable cell-penetrating peptide possessing ROS-triggered phase transition for enhanced cancer therapy
Wang et al. Covalently adaptable elastin‐like protein–hyaluronic acid (ELP–HA) hybrid hydrogels with secondary thermoresponsive crosslinking for injectable stem cell delivery
CN113260657A (zh) 用于转染细胞的组合物和方法
Kievit et al. PEI–PEG–chitosan‐copolymer‐coated iron oxide nanoparticles for safe gene delivery: synthesis, complexation, and transfection
Oupický et al. Bioreducible polycations in nucleic acid delivery: past, present, and future trends
Kim et al. Highly efficient gene silencing and bioimaging based on fluorescent carbon dots in vitro and in vivo
Ping et al. Chitosan-graft-(PEI-β-cyclodextrin) copolymers and their supramolecular PEGylation for DNA and siRNA delivery
Ping et al. Supramolecular β-sheets stabilized protein nanocarriers for drug delivery and gene transfection
Yang et al. The biocompatibility of fatty acid modified dextran-agmatine bioconjugate gene delivery vector
US20080112916A1 (en) CHEMICALLY MODIFIED POLYCATION POLYMER FOR siRNA DELIVERY
CN115252807A (zh) 用于核酸递送的解体型细胞穿透性复合物
Yue et al. Influence of reduction-sensitive diselenide bonds and disulfide bonds on oligoethylenimine conjugates for gene delivery
Hong et al. Fine‐Tunable and Injectable 3D Hydrogel for On‐Demand Stem Cell Niche
Zhang et al. PEGylated poly (amine-co-ester) micelles as biodegradable non-viral gene vectors with enhanced stability, reduced toxicity and higher in vivo transfection efficacy
Li et al. A pH-responsive sequential-disassembly nanohybrid for mitochondrial targeting
JP2007145761A (ja) 細胞膜透過性ペプチド修飾多糖−コレステロールまたは多糖−脂質非ウイルス性ベクターおよびその製造方法
Xia et al. Polyglutamic acid based polyanionic shielding system for polycationic gene carriers
Huang et al. Genetic recombination of poly (l-lysine) functionalized apoferritin nanocages that resemble viral capsid nanometer-sized platforms for gene therapy
Sonotaki et al. Successful PEGylation of hollow encapsulin nanoparticles from Rhodococcus erythropolis N771 without affecting their disassembly and reassembly properties
Oliveira et al. Combining hyaluronic acid with chitosan enhances gene delivery
Cai et al. Reversible PEGylation and Schiff-base linked imidazole modification of polylysine for high-performance gene delivery
Xia et al. Synthesis and characterization of a pH-sensitive shielding system for polycation gene carriers
Kim et al. Fibroin particle-supported cationic lipid layers for highly efficient intracellular protein delivery

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 40048155

Country of ref document: HK