JP2022512638A - 動物モデル及び治療用分子 - Google Patents
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Abstract
イヌ、ネコ若しくはウマそれぞれの疾患の予防又は治療における使用のため、或いはその使用のために適切な、ラムダ軽鎖、又はその機能的断片若しくは機能的誘導体を有する、イヌ科の動物、ネコ科の動物又はウマ科の動物の抗体、及び薬学的に許容される賦形剤又は担体を含む医薬組成物。
Description
本発明は、とりわけ、コンパニオンアニマルの外因性DNAを含むように遺伝子操作されたげっ歯動物及び細胞、医学及び疾患の研究におけるそれらの使用、げっ歯動物及び細胞の産生方法、並びにそのような動物から産生される抗体及び抗体鎖並びにその誘導体に関する。
ヒトDNAのげっ歯動物への挿入は、例えば、Murphy等、111巻、14号、5153～5158頁、doi:10.1073/pnas.1324022111;MacDonald等、111巻、14号、5147～5152頁、doi:10.1073/pnas.1323896111;及びLee等、Nature Biotechnology、32巻、356～363頁、発行年:2014DOI:, doi:10.1038/nbt.2825に開示されている。このアプローチは、ヒトの治療用途のための抗体製品を作製するために設計されている。しかしながら、コンパニオンアニマル等の他の種での使用に適した抗体を生成するためのげっ歯動物モデルは開発されていない。
本発明は、そのようなげっ歯動物、細胞、抗体、及びそれらから産生されるその部分、例えばコンパニオンアニマルで使用するためのその後に改変された抗体、並びにそのようなげっ歯動物、細胞、抗体、及び抗体鎖の作製方法に関する。
Murphy等、111巻、14号、5153～5158頁、doi:10.1073/pnas.1324022111
MacDonald等、111巻、14号、5147～5152頁、doi:10.1073/pnas.1323896111
Lee等、Nature Biotechnology、32巻、356～363頁、発行年:2014DOI:, doi:10.1038/nbt.2825
Harlow, E.及びLane, D.、1998、第5版、「Antibodies: A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Lab. Press、Plainview、NY
Pasqualini及びArap、Proceedings of the National Academy of Sciences(2004)101:257～259頁
Sambrook, J及びRussell, D.(2001、第3版)「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」(Cold Spring Harbor Lab. Press、Plainview、NY)
本発明は、以下に関する。
i)1つ以上のコンパニオンアニマルのIGH V領域遺伝子、1つ以上のコンパニオンアニマルのIGH D領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルのIGH J領域遺伝子と、
ii)必要に応じて、1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLカッパV領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLカッパJ領域遺伝子;並びに/又は1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLラムダV領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLラムダJ領域遺伝子と
を含むゲノムを有するげっ歯動物又はげっ歯動物細胞であって、
げっ歯動物又はげっ歯動物細胞が、コンパニオンアニマルの可変領域遺伝子を発現して抗体鎖を形成することができ、
コンパニオンアニマル種がげっ歯動物ではない、げっ歯動物又はげっ歯動物細胞。
i)1つ以上のコンパニオンアニマルのIGH V領域遺伝子、1つ以上のコンパニオンアニマルのIGH D領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルのIGH J領域遺伝子と、
ii)必要に応じて、1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLカッパV領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLカッパJ領域遺伝子;並びに/又は1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLラムダV領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLラムダJ領域遺伝子と
を含むゲノムを有するげっ歯動物又はげっ歯動物細胞であって、
げっ歯動物又はげっ歯動物細胞が、コンパニオンアニマルの可変領域遺伝子を発現して抗体鎖を形成することができ、
コンパニオンアニマル種がげっ歯動物ではない、げっ歯動物又はげっ歯動物細胞。
i)1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLカッパV領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLカッパJ領域遺伝子;並びに/又は1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLラムダV領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLラムダJ領域遺伝子と、
ii)必要に応じて、1つ以上のコンパニオンアニマルのIGH V領域遺伝子、1つ以上のコンパニオンアニマル又は宿主のIGH D領域遺伝子、及び1以上のコンパニオンアニマル又は宿主のIGH J領域遺伝子と
を含むゲノムを有するげっ歯動物又はげっ歯動物細胞であって、
げっ歯動物又はげっ歯動物細胞が、コンパニオンアニマルの可変領域遺伝子を発現して抗体鎖を形成することができ、
コンパニオンアニマル種がげっ歯動物ではない、げっ歯動物又はげっ歯動物細胞。
ii)必要に応じて、1つ以上のコンパニオンアニマルのIGH V領域遺伝子、1つ以上のコンパニオンアニマル又は宿主のIGH D領域遺伝子、及び1以上のコンパニオンアニマル又は宿主のIGH J領域遺伝子と
を含むゲノムを有するげっ歯動物又はげっ歯動物細胞であって、
げっ歯動物又はげっ歯動物細胞が、コンパニオンアニマルの可変領域遺伝子を発現して抗体鎖を形成することができ、
コンパニオンアニマル種がげっ歯動物ではない、げっ歯動物又はげっ歯動物細胞。
げっ歯動物又はげっ歯動物細胞を産生する方法であって、げっ歯動物細胞ゲノムに対し、
i)1つ以上のコンパニオンアニマルのIGH V領域遺伝子、1つ以上のコンパニオンアニマルのIGH D領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルのIGH J領域遺伝子、並びに/又は
ii)1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLカッパV領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLカッパJ領域遺伝子、並びに/又は
1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLラムダV領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLラムダJ領域遺伝子
のいずれかを挿入する工程を含み、
げっ歯動物又はげっ歯動物細胞が、コンパニオンアニマルの遺伝子を発現して、げっ歯動物又はコンパニオンアニマルの定常領域との組合せで抗体鎖を形成することができる、方法。
i)1つ以上のコンパニオンアニマルのIGH V領域遺伝子、1つ以上のコンパニオンアニマルのIGH D領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルのIGH J領域遺伝子、並びに/又は
ii)1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLカッパV領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLカッパJ領域遺伝子、並びに/又は
1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLラムダV領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLラムダJ領域遺伝子
のいずれかを挿入する工程を含み、
げっ歯動物又はげっ歯動物細胞が、コンパニオンアニマルの遺伝子を発現して、げっ歯動物又はコンパニオンアニマルの定常領域との組合せで抗体鎖を形成することができる、方法。
所望の抗原に特異的な抗体鎖又は抗体を産生する方法であって、本明細書に開示されるげっ歯動物を所望の抗原で免疫する工程と、抗体鎖を単独で若しくは完全抗体の一部として回収するか、又は抗体鎖を単独で若しくは完全抗体の一部として産生する細胞を回収する工程とを含む方法。
所望の抗原に特異的であり、単一種のコンパニオンアニマルに由来する抗体鎖又は抗体を産生する方法であって、本明細書に開示されるコンパニオンアニマルの遺伝子を含むげっ歯動物を免疫する工程と、次いで抗体鎖又は抗体をコードする核酸を適切に遺伝子操作することにより、げっ歯動物の抗体鎖の定常領域を同一のコンパニオン動物由来のコンパニオン動物の定常領域で置き換える工程とを含む方法。
抗体、又はその一部を作製する方法であって、
(i)本発明に従って得られた抗体若しくはその一部をコードする核酸、又は
(ii)本発明に従って得られた抗体若しくはその一部をコードする核酸を発現させて抗体を産生させることができる配列情報
を提供する工程を含む方法。
(i)本発明に従って得られた抗体若しくはその一部をコードする核酸、又は
(ii)本発明に従って得られた抗体若しくはその一部をコードする核酸を発現させて抗体を産生させることができる配列情報
を提供する工程を含む方法。
コンパニオンアニマルの可変領域を有する抗体鎖又はその一部を産生する方法であって、抗体鎖又はその一部をコードする核酸を細胞内で発現させる工程を含み、
抗体鎖の可変領域をコードするDNAの配列は、抗体鎖が産生されるように本発明のげっ歯動物を抗原で免疫することにより得られるか、又は得ることができ、
必要に応じて、方法が、次の:
抗原受容体鎖を精製及び/又は単離する工程と、
必要に応じて、次いで、可変領域として、コンパニオンアニマル、好ましくは同一のコンパニオンアニマルへの投与に適した薬学的に許容される製剤に抗原受容体鎖を製剤化する工程と
を含む、方法。
抗体鎖の可変領域をコードするDNAの配列は、抗体鎖が産生されるように本発明のげっ歯動物を抗原で免疫することにより得られるか、又は得ることができ、
必要に応じて、方法が、次の:
抗原受容体鎖を精製及び/又は単離する工程と、
必要に応じて、次いで、可変領域として、コンパニオンアニマル、好ましくは同一のコンパニオンアニマルへの投与に適した薬学的に許容される製剤に抗原受容体鎖を製剤化する工程と
を含む、方法。
本発明によるげっ歯動物又は細胞から得られるか又は得ることができる抗体若しくは抗体鎖、又はその一部。
コンパニオンアニマルの治療における使用のための、本発明により得られるか又は得ることができる抗体若しくは抗体鎖、又はその一部。
コンパニオンアニマルの治療の方法であって、抗体若しくは抗体鎖又はその一部を、それを必要とするコンパニオンアニマルに送達する工程を含み、抗体若しくは抗体鎖又はその一部が、完全にコンパニオンアニマル抗体となるように改変されている、方法。
イヌ、ネコ若しくはウマそれぞれの疾患の予防又は治療における使用のため、或いはその使用のために適切な、ラムダ軽鎖、又はその機能的断片若しくは機能的誘導体を有する、イヌ科の動物、ネコ科の動物又はウマ科の動物の抗体、及び薬学的に許容される賦形剤又は担体を含む医薬組成物。
イヌ、ネコ若しくはウマそれぞれの疾患の予防又は治療における使用のための、ラムダ軽鎖、又はその機能的断片若しくは機能的誘導体を有する、イヌ科の動物、ネコ科の動物又はウマ科の動物の抗体。
イヌ、ネコ若しくはウマそれぞれの疾患の予防又は治療における使用のための、イヌ科の動物、ネコ科の動物又はウマ科の動物のラムダ軽鎖、又はその機能的断片若しくは機能的誘導体。
イヌ科の動物、ネコ科の動物又はウマ科の動物のラムダ軽鎖を発現又はコードするげっ歯動物、又は細胞、例えば、げっ歯動物細胞。
コンパニオンアニマル、例えば、イヌ、ウマ又はネコの疾患を治療又は予防するための方法であって、コンパニオンアニマルに適した、本明細書に開示される有効量の抗体、又はその機能的断片若しくは機能的誘導体、或いは組成物を送達する工程を含む方法。
本発明は、
i)1つ以上のコンパニオンアニマルのIGH V領域遺伝子、1つ以上のコンパニオンアニマルのIGH D領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルのIGH J領域遺伝子と、
ii)必要に応じて、1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLカッパV領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLカッパJ領域遺伝子;並びに/又は1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLラムダV領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLラムダJ領域遺伝子と
を含むゲノムを有するげっ歯動物又はげっ歯動物細胞であって、
げっ歯動物又はげっ歯動物細胞が、コンパニオンアニマルの可変領域遺伝子を発現して、抗体の定常領域との組合せで抗体鎖を形成することができ、
コンパニオンアニマル種がげっ歯動物ではない、げっ歯動物又はげっ歯動物細胞における一態様に関する。
i)1つ以上のコンパニオンアニマルのIGH V領域遺伝子、1つ以上のコンパニオンアニマルのIGH D領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルのIGH J領域遺伝子と、
ii)必要に応じて、1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLカッパV領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLカッパJ領域遺伝子;並びに/又は1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLラムダV領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLラムダJ領域遺伝子と
を含むゲノムを有するげっ歯動物又はげっ歯動物細胞であって、
げっ歯動物又はげっ歯動物細胞が、コンパニオンアニマルの可変領域遺伝子を発現して、抗体の定常領域との組合せで抗体鎖を形成することができ、
コンパニオンアニマル種がげっ歯動物ではない、げっ歯動物又はげっ歯動物細胞における一態様に関する。
本発明は、以下にも関する。
i)1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLカッパV領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLカッパJ領域遺伝子;並びに/又は1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLラムダV領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLラムダJ領域遺伝子と、
ii)必要に応じて、1つ以上のコンパニオンアニマルのIGH V領域遺伝子、1つ以上のコンパニオンアニマルのIGH D領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルのIGH J領域遺伝子と
を含むゲノムを有するげっ歯動物又はげっ歯動物細胞であって、
げっ歯動物又はげっ歯動物細胞が、コンパニオンアニマルの可変領域遺伝子を発現して、抗体の定常領域との組合せで抗体鎖を形成することができ、
コンパニオンアニマル種がげっ歯動物ではない、げっ歯動物又はげっ歯動物細胞。
i)1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLカッパV領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLカッパJ領域遺伝子;並びに/又は1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLラムダV領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLラムダJ領域遺伝子と、
ii)必要に応じて、1つ以上のコンパニオンアニマルのIGH V領域遺伝子、1つ以上のコンパニオンアニマルのIGH D領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルのIGH J領域遺伝子と
を含むゲノムを有するげっ歯動物又はげっ歯動物細胞であって、
げっ歯動物又はげっ歯動物細胞が、コンパニオンアニマルの可変領域遺伝子を発現して、抗体の定常領域との組合せで抗体鎖を形成することができ、
コンパニオンアニマル種がげっ歯動物ではない、げっ歯動物又はげっ歯動物細胞。
例示的な例として、本発明に拘束されず、イヌ由来の免疫グロブリン重(IGH)鎖可変(V)領域遺伝子、IGH D領域遺伝子、及びIGH J領域遺伝子のマウスへの挿入は、定常領域との組合せで、マウスにおけるイヌ科の動物のDNAの発現に由来する可変抗体領域を含む抗体重鎖の産生を可能にする。定常領域は、げっ歯動物免疫グロブリン(IG)定常領域であってもよく、結果として、イヌ科の動物の可変領域とげっ歯動物の定常領域を有するキメラ重鎖が生成される。そのようなキメラ抗体鎖の可変領域に関する情報、又はそれを含む核酸は、例えばイヌでの治療的使用のために、完全なイヌ科の動物の抗体を生成するために使用され得る。イヌ科の動物のDNAを含むげっ歯動物は、疾患を理解し、医薬を試験するための動物モデルとしても役立ち得る。
マウスの全てのヌクレオチド座標は、別段の定めがない限り、マウスの2011年12月GRCm38/mm10アセンブリ(アセンブリ受託GCA_000001635.2)に対応するものである。
疑念を避けるため、マウスゲノムで参照される挿入点は、Lee等、Nature Biotechnology、Nature Biotechnology 32、356～363頁(2014)で詳述されている挿入点と同一である。
イヌのゲノムビルドはCanFam3.1(アセンブリ受託-GCA_000002285.2)であり、2011年9月に作成され、最後に2016年5月に更新された。
ネコのゲノムビルドは、2014年11月に作成されたFelisCatus8.0(アセンブリ受託-GCA_000181335.3)である。
本発明のげっ歯動物は、好ましくはマウス又はラットであり、好ましくはマウスである。
本発明のコンパニオンアニマルは、イヌ、ネコ、ウマ、トリ、ウサギ、ヤギ、爬虫類、魚類、及び両生類から適切に選択される。イヌは、本発明の好ましいコンパニオンアニマルである。ネコは、本発明の好ましいコンパニオンアニマルである。ウマは、本発明の好ましいコンパニオンアニマルである。疑念を避けるため、ヒトはコンパニオンアニマルではない。
一態様では、げっ歯動物はマウスであり、コンパニオンアニマルはイヌである。
一態様では、げっ歯動物はマウスであり、コンパニオンアニマルはネコである。
一態様では、げっ歯動物はマウスであり、コンパニオンアニマルはウマである。
コンパニオンアニマルのIG重鎖(IGH)遺伝子座は、複数のV、D、及びJ領域の遺伝子を含む。V、D、及びJ領域の遺伝子を一緒に発現させると、抗体の重鎖の可変領域が生成される。IGH V、D、及びJ遺伝子は、重鎖定常領域との組合せで自然に発現する。ラムダ又はカッパであり得るIG軽鎖遺伝子座(IGL)は、一緒に発現すると抗体の軽鎖の可変領域を形成する複数のV及びJ遺伝子セグメントを含む。IGL V及びJ領域遺伝子は、カッパ又はラムダの軽鎖の軽鎖定常領域との組合せで自然に発現する。本発明のげっ歯動物又はげっ歯動物細胞は、コンパニオンアニマルのVDJ又はVJ領域遺伝子を発現して抗体鎖を形成することができる。コンパニオンアニマルの遺伝子は、抗体鎖の発現を可能にするために、げっ歯動物のゲノムで定常領域と作動可能に連結される。コンパニオンアニマルIG遺伝子は、外因性定常領域遺伝子(げっ歯動物以外の種由来)とともにげっ歯動物のゲノムに位置し得るか、又はげっ歯動物のゲノムに天然に存在するげっ歯動物の定常領域とともに、例えば上流等の機能的な配置でげっ歯動物のゲノムに位置し得、定常領域を伴うV領域遺伝子の発現が起き得る。
げっ歯動物又はげっ歯動物細胞のゲノムは、1つ以上のコンパニオンアニマルのIGH V及びIGH D及びIGH J領域遺伝子を含み得るが軽鎖のコンパニオンアニマルのDNAは含まないか、1つ以上のコンパニオンアニマルIGL V及びIGL J領域遺伝子を含み得るが重鎖のコンパニオンアニマルのDNAを含まない。げっ歯動物又は細胞のゲノムは、重鎖及びカッパ鎖(ラムダではない)、若しくは重鎖及びラムダ鎖(カッパではない)由来のコンパニオンアニマルの遺伝子を含んでもよいか、又は3つの全ての遺伝子座、重鎖、カッパ、及びラムダ由来のコンパニオンアニマルの遺伝子を含んでもよい。
一態様では、挿入されたコンパニオンアニマルのDNAは、コンパニオンアニマルの重鎖可変(V)遺伝子の少なくとも50%、例えば少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%等を含み、一態様では、コンパニオンアニマルのV遺伝子の全てを含む。
一態様では、挿入されたコンパニオンアニマルのDNAは、コンパニオンアニマルの重鎖多様性(D)遺伝子の少なくとも50%、例えば少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%等を含み、一態様では、コンパニオンアニマルのD遺伝子の全てを含む。
一態様では、挿入されたコンパニオンアニマルのDNAは、コンパニオンアニマルの重鎖連結(J)遺伝子の少なくとも50%、例えば少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%等を含み、一態様では、コンパニオンアニマルのJ遺伝子の全てを含む。
一態様では、挿入されたコンパニオンアニマルのDNAは、コンパニオンアニマルの軽鎖可変(V)遺伝子の少なくとも50%、例えば少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%等を含み、一態様では、コンパニオンアニマルの軽鎖V遺伝子の全てを含む。
一態様では、挿入されたコンパニオンアニマルのDNAは、コンパニオンアニマルの軽鎖連結(J)遺伝子の少なくとも50%、例えば少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%等を含み、一態様では、コンパニオンアニマルの軽鎖J遺伝子の全てを含む。
一態様では、げっ歯動物のゲノムは、コンパニオンアニマル由来のIGH V、D、及びJ領域遺伝子、並びに介在配列の全てを含む。
一態様では、げっ歯動物のゲノムは、コンパニオンアニマル由来のIGLカッパV、及びJ領域遺伝子、並びに介在配列の全てを含む。
一態様では、げっ歯動物のゲノムは、コンパニオンアニマル由来のIGLラムダV、及びJ領域遺伝子、並びに介在配列の全てを含む。
げっ歯動物又はげっ歯動物細胞のゲノムは、少なくとも4、5、10、15、又は20個のコンパニオンアニマルのIGH V領域遺伝子、例えば少なくとも30、40、50、60、70、80個のV領域遺伝子を含んでもよい。好ましい一態様では、これらはイヌ科の動物のV領域遺伝子である。好ましい一態様では、げっ歯動物のゲノムは、少なくとも83個のイヌ科の動物のIG重鎖V領域遺伝子を含む。
げっ歯動物又はげっ歯動物細胞のゲノムは、コンパニオンアニマル由来の少なくとも1、2、3、4、5、又は6個のIGHD領域遺伝子、好ましくはイヌ科の動物の遺伝子を含んでもよい。
げっ歯動物又はげっ歯動物細胞のゲノムは、コンパニオンアニマル由来の少なくとも1、2、3、4、5、又は6個のIGHJ領域遺伝子、好ましくはイヌ科の動物の遺伝子を含んでもよい。
げっ歯動物又はげっ歯動物細胞のゲノムは、少なくとも10、15、16、17、18、又は19個のコンパニオンアニマルのIGLカッパV領域遺伝子を含んでもよい。好ましい態様では、これらはイヌ科の動物のカッパV領域遺伝子である。好ましい一態様では、げっ歯動物のゲノムは、少なくとも19個のイヌ科の動物の軽鎖カッパV領域遺伝子を含む。
げっ歯動物又はげっ歯動物細胞のゲノムは、コンパニオンアニマル由来の少なくとも1、2、3、4、又は5個のIGLカッパJ領域遺伝子、好ましくはイヌ科の動物の遺伝子を含んでもよい。
げっ歯動物又はげっ歯動物細胞のゲノムは、少なくとも5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、又は少なくとも160個のコンパニオンアニマルのIGLラムダV領域遺伝子を含んでもよい。好ましい態様では、これらはイヌ科の動物のラムダV領域遺伝子である。好ましい一態様では、げっ歯動物のゲノムは、少なくとも160個のイヌ科の動物の軽鎖ラムダV領域遺伝子を含む。
げっ歯動物又はげっ歯動物細胞のゲノムは、コンパニオンアニマル由来の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、又は9個のIGLラムダJ領域遺伝子、好ましくはイヌ科の動物の遺伝子を含んでもよい。
別の態様では、げっ歯動物又はげっ歯動物細胞のゲノムは、ネコ由来の少なくとも4、5、10、15、又は20個のIGH V領域遺伝子、例えば少なくとも23個のV領域遺伝子を含んでもよい。
別の態様では、げっ歯動物又はげっ歯動物細胞のゲノムは、ネコ由来の少なくとも4、5、10、又は11個のコンパニオンアニマルのIGH D領域遺伝子を含んでもよい。
別の態様では、げっ歯動物又はげっ歯動物細胞のゲノムは、ネコ由来の少なくとも1、2、3、4、又は5個のコンパニオンアニマルのIGH J領域遺伝子を含んでもよい。
別の態様では、げっ歯動物又はげっ歯動物細胞のゲノムは、ネコ由来の少なくとも4、5、10、15個のIGLカッパV領域遺伝子を含んでもよい。
別の態様では、げっ歯動物又はげっ歯動物細胞のゲノムは、ネコ由来の少なくとも1、2、3、4、5、又は6個のコンパニオンアニマルのIGカッパJ領域遺伝子を含んでもよい。
別の態様では、げっ歯動物又はげっ歯動物細胞のゲノムは、ネコ由来の、少なくとも5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、100、又はそれ以上、例えば113個のIGLラムダV領域遺伝子を含んでもよい。
別の態様では、げっ歯動物又はげっ歯動物細胞のゲノムは、ネコ由来の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、又は9個のコンパニオンアニマルのIGラムダJ領域遺伝子を含んでもよい。
上のいずれかの態様で言及したコンパニオンアニマルの遺伝子の数は、更に増加する可能性もあり、一態様では、両方の対立遺伝子に挿入を有するホモ接合体の場合、2倍になる。
一態様では、挿入されたコンパニオンアニマルのDNAは、コンパニオンアニマルの重鎖可変(V)領域遺伝子の100%未満、例えばコンパニオンアニマルのV領域遺伝子の90%未満、80%未満、70%未満、又は60%を含む。これは、重鎖、カッパ及びラムダ遺伝子座に対して適用される。挿入されたコンパニオンアニマルの総DNAのサイズを低下させると、必要な挿入の工程の数が低減される。いずれかの免疫グロブリン遺伝子座に対するコンパニオンアニマルの遺伝子の100%未満の挿入は、V領域の合理的な選択に基づき得る。
好ましいV領域遺伝子は、天然に存在するコンパニオンアニマルの抗体において最高の出現度(representation)を有するものであり、例えば、イヌでは、以下であろう:
IGHV:4～1、3～38、3～9、3～67、3-41
IGLV:1～136、1～55、1～138、8～93、1～149
IGKV:2S16、2～8、2～11
IGHV:4～1、3～38、3～9、3～67、3-41
IGLV:1～136、1～55、1～138、8～93、1～149
IGKV:2S16、2～8、2～11
特に、本発明者等は、上記Igカッパ及び/又はIgラムダセグメントが、げっ歯動物のゲノムに、好ましくはそれぞれイヌ科の動物のカッパ及び/又はラムダ遺伝子セグメントの完全なレパートリーが非存在で存在することを選ぶ。
別の態様では、2つの異なるV領域遺伝子が同じアミノ酸配列をコードする場合、V領域遺伝子の選択は、AID活性による等のV領域遺伝子によってコードされるアミノ酸配列のその後の変化の可能性に基づくことが好ましい。非同義変異を受ける可能性が高いその核酸配列等、そのようなアミノ酸変化の影響をより受けやすいこれらの配列が好ましく、例えば、遺伝暗号の単一の変異は、コードされたアミノ酸の変化をもたらす。
好ましくは、ゲノムに挿入されるV、D、及びJ領域の遺伝子は、同一のコンパニオンアニマル由来のものである。好ましくは、挿入されるIGH VDJ領域遺伝子、又はIGL VJ領域遺伝子は、全てイヌ科の動物であるか、全てネコ科の動物であるか、又は全てウマ科の動物である。好ましくは、遺伝子は全てイヌ科の動物である。
一態様では、挿入されるコンパニオンアニマルの遺伝子は全て、コンパニオンアニマルの同一の品種、例えば同一の犬品種由来のものである。
一態様では、コンパニオンアニマルの遺伝子は、げっ歯動物の定常領域のゲノム上流に位置し、挿入されるコンパニオンアニマル重鎖可変領域遺伝子については重鎖定常領域(複数可)の上流に適切に位置し、及び/又は挿入されるコンパニオンアニマル軽鎖可変領域遺伝子については軽鎖定常領域の上流に適切に位置し、これにより、げっ歯動物又はげっ歯動物細胞は、挿入される可変領域遺伝子とげっ歯動物の定常領域の発現に起因するキメラ抗体鎖を生成できる。
好ましくは、コンパニオンアニマル由来の重鎖V、D、及びJ領域遺伝子は、げっ歯動物の重鎖定常領域の上流でげっ歯動物のゲノムに位置する。
好ましくは、コンパニオンアニマル由来の軽鎖カッパV、J領域遺伝子は、げっ歯動物のカッパ軽鎖定常領域の上流でげっ歯動物のゲノムに位置する。
げっ歯動物の定常領域等の定常領域の上流の可変領域の位置へのいかなる言及も、げっ歯動物のin vivoでキメラ抗体鎖が発現することを可能にするために、抗体の可変領域と定常領域をコードする2つのゲノム部分の適切な相対位置が存在することを意味する。このようにして、挿入されたコンパニオンアニマルのDNAとげっ歯動物の定常領域は、抗体又は抗体鎖の産生のために互いに機能的に配置される。
一態様では、可変VDJ又はVJ領域遺伝子等の挿入されるコンパニオンアニマルのDNAは、げっ歯動物のゲノムの天然に存在する重鎖又は軽鎖定常領域の部位とは異なる部位、例えば、異なる染色体上に位置する。この場合、VDJ又はVJ領域遺伝子の挿入は、定常領域を伴い、好ましくはげっ歯動物又はコンパニオンアニマル由来の3'エンハンサーも伴う。1つの好ましい実施形態は、イヌ科の動物の定常領域及びイヌ科の動物の3'エンハンサー等のコンパニオンアニマルのVDJ又はVJ領域とのげっ歯動物の定常領域及びげっ歯動物の3'エンハンサーの使用である。一態様では、コンパニオンアニマルの遺伝子は、同一のコンパニオンアニマル由来の定常領域との機能的配置でゲノムに位置し、げっ歯動物は挿入されたコンパニオンアニマルのVDJ又はVJ領域遺伝子とコンパニオンアニマルの定常領域の発現から生じる抗体鎖を産生できる。代替的に、コンパニオンアニマルの遺伝子は、異なるコンパニオンアニマル等の他のコンパニオンアニマル由来の定常領域、又はげっ歯動物由来の定常領域等との機能的配置でゲノムに位置する。
コンパニオンアニマルの遺伝子が定常領域を伴ってげっ歯動物のゲノムに挿入される場合、内因性の定常領域遺伝子は抗体鎖の生産には必要ないため、挿入はげっ歯動物細胞のゲノム内の任意の適切な位置である可能性があり、げっ歯動物のIG遺伝子座を標的としない場合があることが理解されよう。挿入は、げっ歯動物のゲノムへのランダムな場所でなされ得る。
本発明はまた、完全なコンパニオンアニマル抗体をコードするゲノムDNAを含むげっ歯動物に関する。完全なコンパニオンアニマル抗体は、コンパニオンアニマルの定常領域を、挿入されたコンパニオンアニマルのV、(D)及びJ領域遺伝子とともに、機能的な配置でげっ歯動物ゲノムに挿入することにより、或いはコンパニオンアニマルの可変領域及びげっ歯動物の定常領域を有する適切なキメラ抗体が同定されたなら、げっ歯動物の定常領域をコンパニオンアニマルの定常領域で置き換えることにより、産生され得る。好ましくは、コンパニオンアニマルの定常領域は、IgG定常遺伝子及び/又は対立遺伝子のいずれかから、好ましくはヒトIgG1又はIgG4との機能的相同性等の最大の相同性を持つ同じコンパニオンアニマル種由来のIgGから選択される。イヌにおいて使用するための抗体のために、好ましくは、イヌ科の動物のIgGA又はIgGDが使用される。
したがって、本発明は、コンパニオンアニマルのラムダV及びJ及びC遺伝子を含むDNA等、又はコンパニオンアニマルのV、J及びCカッパ遺伝子を含むDNA、又はV、D、J及びC重鎖遺伝子セグメントを含むコンパニオンアニマルDNA等の内因性のげっ歯動物のIG遺伝子座において、コンパニオンアニマルの定常領域を伴う(「完全(fully)」なコンパニオンアニマルの抗体鎖をコードする)コンパニオンアニマルの遺伝子の挿入を有する細胞及びげっ歯動物を特に企図する。好ましくは、コンパニオンアニマル由来の軽鎖ラムダV及びJ領域遺伝子は、同一のコンパニオンアニマル由来のラムダ鎖定常領域とともに、例えば上流等の機能的な配置でゲノムに位置する。このようにして、コンパニオンアニマル由来のラムダ定常領域を有するラムダ抗体鎖が生成される。したがって、本発明は、ゲノムが1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLラムダV領域遺伝子、1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLラムダJ領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルのラムダ定常領域を含み、細胞又はげっ歯動物がコンパニオンアニマルの可変領域と定常領域との両方を有するラムダ抗体鎖を発現できる、げっ歯動物又はげっ歯動物細胞に関する。
一態様では、上述のコンパニオンアニマルのVJCラムダ抗体鎖は、げっ歯動物、例えば、マウスのラムダ遺伝子座、好ましくは最後のげっ歯動物のC遺伝子と3'エンハンサーとの間に挿入される。
一態様では、げっ歯動物又はげっ歯動物の細胞は、げっ歯動物細胞のカッパ遺伝子座内、例えば、げっ歯動物のカッパ定常領域のカッパ遺伝子座又は上流又は下流に位置する、1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLラムダV領域遺伝子、1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLラムダJ領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルラムダ定常領域を含む。挿入はIGLカッパ遺伝子座定常領域の上流にあることが好ましい。一態様では、げっ歯動物又はげっ歯動物細胞のゲノムは、げっ歯動物のカッパ定常領域の上流でコンパニオンアニマルの軽鎖ラムダV及びJ領域遺伝子の挿入を含み、これにより、コンパニオンアニマルのIGLラムダV及びJ領域遺伝子は、げっ歯動物IGLカッパ定常領域とともに発現される。適切には、挿入はコンパニオンアニマルの遺伝子を天然のげっ歯動物のカッパ遺伝子とほぼ同一の位置に配置し、潜在的にそれらを欠失又は置換し、例えば、最後に挿入された3'ラムダJ遺伝子からげっ歯動物カッパ定常領域遺伝子までは、最後のげっ歯動物のカッパ3'J遺伝子からカッパ定常領域までと同一又は実質的に同一の距離がある。一態様では、コンパニオンアニマルのラムダ軽鎖DNAの挿入は、げっ歯動物の免疫グロブリンカッパ遺伝子座の境界(上流又は下流)の1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10kb以内である。マウスのカッパ軽鎖は、天然で、マウスのラムダ軽鎖よりも高いレベルで発現し、このカッパ遺伝子座にコンパニオンアニマルのDNAを挿入すると、コンパニオンのラムダ鎖V領域遺伝子の高レベルの発現をもたらし得る。
一態様では、げっ歯動物のゲノムは、免疫グロブリン遺伝子座の1つ、又は両方、又は3つ全てでのコンパニオンアニマルの遺伝子の挿入についてホモ接合体であり得る。
別の態様では、げっ歯動物のゲノムは、免疫グロブリン遺伝子座の1つ、又は2つ、又は3つ全てでのコンパニオンアニマルの遺伝子の挿入についてヘテロ接合体であり得る。
特に、げっ歯動物のゲノムは、カッパ遺伝子座でのコンパニオンアニマルの遺伝子の挿入についてヘテロ接合体である。
一態様では、挿入されたDNAは、アイソタイプスイッチングにより異なるげっ歯動物の定常領域とともに発現することができる。
一態様では、挿入されたコンパニオンアニマルのDNAは、トランススイッチングにより異なるげっ歯動物の定常領域とともに発現することができる。
一態様では、コンパニオンアニマルはイヌであり、げっ歯動物のゲノムはイヌ科の動物のカッパ可変領域遺伝子を含み、げっ歯動物のゲノムのイヌ科の動物のカッパ可変領域遺伝子は全て、可変領域遺伝子がそれとともに発現する定常領域の上流、例えばげっ歯動物のカッパ定常領域の上流、又は例えばイヌ科の動物のカッパ定常領域の上流に位置する。
別の好ましい態様では、コンパニオンアニマルはウマであり、げっ歯動物のゲノムはウマ科の動物のカッパ可変領域遺伝子を含み、げっ歯動物のゲノムのウマ科の動物のカッパ可変領域遺伝子は全て、可変領域遺伝子がそれとともに発現する定常領域の上流、例えばげっ歯動物のカッパ定常領域の上流、又は例えばウマ科の動物のカッパ定常領域の上流に位置する。
一態様では、コンパニオンアニマルのDNAは、野生型遺伝子座に位置するげっ歯動物の野生型定常領域、適切にはげっ歯動物の定常領域と宿主VDJ又はVJ領域との間に挿入される。一態様では、IGH可変領域遺伝子は重鎖J領域の下流、及びEmuエンハンサーの上流に挿入される。
一態様では、げっ歯動物はマウスであり、IGH可変領域遺伝子はマウスの重鎖J領域の下流、及びEmuエンハンサーの上流に挿入される。一態様では、IGH V領域遺伝子の挿入は、マウス第12染色体上のマウスゲノムの位置114666435で行われる。一態様では、IGLラムダV領域遺伝子の挿入は、マウス第16染色体上のマウスゲノムの位置19047551で行われる。一態様では、IGLカッパV領域遺伝子(複数可)の挿入は、マウス第6染色体上のマウスゲノムの位置70674755で行われる。
一態様では、げっ歯動物はマウスであり、ゲノムは、少なくともイヌ科の動物のV4-1、V3-2、V3-3、及びV3-4のIGH可変領域遺伝子を含む。
一態様では、げっ歯動物はマウスであり、ゲノムは、少なくともイヌ科の動物のV4-1、V7-2、V3-3、V2-4、V2-5、V2-6、V2-7、V2-8、V2-9、V2-10、及びV2-11のIGLカッパ可変領域遺伝子を含む。
一態様では、げっ歯動物又はげっ歯動物の細胞は、マウス又はマウスの細胞であり、イヌ科の動物のカッパV遺伝子、4-S17、2-S16、3-S15、2-S14、2-S13、及び2-S12の1つ以上、又は全ては、げっ歯動物のカッパ定常領域の上流に位置する。
一態様では、げっ歯動物はマウスであり、ゲノムは、少なくともイヌ科の動物のV3-1、V3-2、V3-3、V3-4、V4-5、及びV4-6のIGLラムダ可変領域遺伝子を含む。
一態様では、げっ歯動物はマウスであり、ゲノムは、マウスIGH V領域遺伝子の1つ又はいくつか又は全て、好ましくはV1-85～V5-2の欠失を含む。
一態様では、げっ歯動物はマウスであり、ゲノムは、マウスIGLカッパV領域遺伝子の1つ又はいくつか又は全て、好ましくはV3-1～V2-137の欠失を含む。
一態様では、げっ歯動物はマウスであり、マウス重鎖D及びJ領域遺伝子は、挿入されるコンパニオンアニマルの重鎖可変領域遺伝子のゲノム上流に保持される。
一態様では、げっ歯動物のゲノムは、げっ歯動物由来の可変領域と定常領域の両方を有する完全げっ歯動物抗体の発現を低減又は防止するために改変される。これは、げっ歯動物のVDJ領域の全部若しくは一部の反転、又はゲノムの内因性げっ歯動物のVDJ若しくはVJ領域の欠失若しくはそこへの挿入によるものであり得る。一態様では、げっ歯動物のVDJ若しくはVJ領域又はその一部が欠失する。一態様では、げっ歯動物のV領域遺伝子の全て又はいくつかが、例えば、げっ歯動物のIGH遺伝子及び/又はげっ歯動物のIGLカッパVJ領域遺伝子及び/又はげっ歯動物のラムダVJ遺伝子の少なくとも50%、好ましくは少なくとも75%、若しくは少なくとも90%、又はその全てが欠失する。一態様では、げっ歯動物のIGLラムダ遺伝子は、げっ歯動物のゲノムから欠失しない。
一態様では、げっ歯動物のカッパ遺伝子座でのコンパニオンアニマルのDNAの挿入により、げっ歯動物のカッパ遺伝子座の一方又は両方の対立遺伝子が全体的又は部分的に欠失又は不活性化する。
一態様では、げっ歯動物のカッパ遺伝子座は、例えば挿入、又は欠失、又は反転により、全体的又は部分的に不活性化する。
一態様では、げっ歯動物のラムダ遺伝子座は、例えば挿入、又は欠失、又は反転により、全体的又は部分的に不活性化する。
一態様では、げっ歯動物の重鎖遺伝子座は、例えば挿入、又は欠失、又は反転により、全体的又は部分的に不活性化する。
コンパニオンアニマルの可変領域遺伝子は、げっ歯動物の定常領域の上流に適切に挿入され、げっ歯動物の定常領域は、完全な定常領域又は抗原を特異的に認識することのできる有効なキメラ抗体の形成を可能にするのに十分な定常領域の一部をコードするのに必要なDNAの全てを含む。したがって、本明細書におけるげっ歯動物の定常領域を有するキメラ抗体又は抗体鎖への言及は、完全な定常領域又は完全な定常領域遺伝子座を有する抗体鎖に限定されず、げっ歯動物で天然に存在する抗体で見られる1つ以上のエフェクター機能を提供するのに十分な定常領域又は定常領域遺伝子座の一部を有するキメラ抗体又はキメラ抗体鎖をも含む。エフェクター機能には、Fc受容体と相互作用する能力、及び/又は補体に結合する能力が含まれる。この教示は、げっ歯動物定常領域の全て又は一部とキメラ抗体鎖を形成して抗体鎖又はその一部を形成するように、可変領域DNAが宿主ゲノムに位置する本発明のげっ歯動物及び細胞並びに方法にも適用される。
好ましくは、げっ歯動物ゲノムは、コンパニオンアニマルのラムダ定常領域DNA及び介在領域の全てを含む。
コンパニオンアニマルの可変領域とともに発現するげっ歯動物の定常領域は、コンパニオンアニマルの重鎖又は軽鎖VDJ又はVJに適切な、野生型遺伝子座に位置するげっ歯動物の野生型定常領域であることが好ましい。
一態様では、少なくとも1つのげっ歯動物のエンハンサー又はスイッチ領域等の他の制御配列は、げっ歯動物の定常領域との機能的配置で維持される。このようにして、エンハンサー又は他の制御配列の効果は、細胞又はトランスジェニックげっ歯動物において全体的又は部分的に発揮され得る。
一態様では、Emuエンハンサー配列等の1つ以上のげっ歯動物の制御配列が、げっ歯動物のMu定常領域の上流、適切には定常領域からの距離に関してその天然の位置に維持される。
一態様では、エンハンサー配列等の1つ以上のげっ歯動物の制御配列が、げっ歯動物の定常領域の下流、適切には定常領域からの距離に関してその天然の位置に維持される。
一態様では、げっ歯動物のSmuスイッチ配列は、げっ歯動物のMu定常領域の上流、適切には定常領域からの距離に関してその天然の位置に維持される。
そのような位置では、げっ歯動物のエンハンサー又はスイッチ配列は、宿主（すなわち、自身の）定常領域配列でin vivoで適切に作動可能である。
更なる態様では、コンパニオンアニマルのV、D、又はJ領域遺伝子の1つ以上のプロモーターエレメント、又は他の制御エレメントは、げっ歯動物の転写機構と相互作用するようにゲノムで最適化される。
一態様では、げっ歯動物又はげっ歯動物細胞のゲノムは、1つ以上のコンパニオンアニマルのプロモーター、又はエンハンサー、及び/又はコンパニオンアニマルV、D、又はJ領域に伴う他の制御エレメントを含む。一態様では、プロモーター又はエンハンサー又はスイッチ領域等の1つ以上のコンパニオンアニマルの制御領域は、それぞれ1つ以上のげっ歯動物のプロモーター又はエンハンサー又はスイッチ領域を置き換える。コンパニオンアニマルの制御配列は、細胞又はトランスジェニックげっ歯動物において制御配列の効果が全体的又は部分的に発揮されるように、定常領域との機能的配置で適切に維持される。
一態様では、挿入されるコンパニオンアニマルのV、D、又はJ遺伝子セグメントの少なくとも1つ又はそれ以上は、同一のコンパニオンアニマル由来の組換えシグナル配列(RSS)等の制御配列を伴い、必要に応じて制御配列は、V、D、又はJ遺伝子セグメント(複数可)の組換えの成功を誘導する。
この文脈では、「同一の(same)」コンパニオンアニマルは、コンパニオンアニマルのV、D、又はJ遺伝子セグメントが取得される正確なコンパニオンアニマルに限定されない。一態様では、「同一の(same)」コンパニオンアニマルは、コンパニオンアニマルのV、D、又はJ遺伝子セグメントが取得されるコンパニオンアニマルと同一の品種又は種を指す。一態様では、それはまったく同一のコンパニオンアニマルである。
一態様では、挿入されるコンパニオンアニマルV、D、又はJ遺伝子セグメントの少なくとも1つ又はそれ以上は、制御配列をシス若しくはトランスで直接伴うか、又は制御配列が片側若しくは両側に隣接し、必要に応じて1つ以上の遺伝子セグメントには、制御配列が直接隣接する。
一態様では、制御配列は、個々のV遺伝子セグメントに先行するプロモーター、及び/又は個々のV遺伝子セグメント内のスプライス部位、及び/又はV遺伝子セグメントの下流、D遺伝子セグメントに隣接して、若しくはJ遺伝子セグメントの上流のV(D)J組換えのための組換えシグナル配列を含む。
一態様では、挿入されるコンパニオンアニマルのV、D、又はJ配列には、同一のコンパニオンアニマル由来のRSS配列が隣接する。例えば、イヌ科の動物のRSS配列は、イヌ科の動物のV、D、及び/又はJ配列とともに使用できる。これは、コンパニオンアニマル由来のゲノム断片のげっ歯動物のゲノムへの挿入によって提供できることが理解されよう。更なる態様では、本発明は、げっ歯動物細胞において内因性免疫グロブリン可変領域遺伝子座をコンパニオンアニマルの遺伝子座で全体又は一部を置き換える方法であって、少なくとも1つのV又はD(重鎖用)又はJ遺伝子セグメント、及びそれに伴う少なくとも1つの制御配列を含むコンパニオンの遺伝子座を全体的又は部分的に含むクローンニングされたゲノム断片又は合成配列を取得する工程と、コンパニオンアニマルのDNAを、内因性マウス免疫グロブリン遺伝子座で、好ましくは挿入されるコンパニオンアニマルのDNAの天然に対応する重鎖又は軽鎖の、げっ歯動物の遺伝子座で、げっ歯動物のゲノムに適切に挿入する工程とを含む方法を提供する。
一態様では、挿入されるコンパニオンアニマルのDNAは、コンパニオンアニマル由来の少なくとも5kb、少なくとも10kb、少なくとも15kb、20kb以上のゲノムDNAを含む。
別の態様では、げっ歯動物のゲノム中のコンパニオンアニマルの遺伝子座の再構築は、許容されるコンパニオン抗体プロファイルを得るのに適したコンパニオンアニマルのDNAのサブセットを挿入しつつ、げっ歯動物の遺伝子操作工程の数を最小限にするために設計され得る。個々のV領域遺伝子は、例えば、生殖系列構成ではなく、又は例えば、コンパニオンアニマルのゲノムの遺伝子のサブセットのみを表す、生殖系列配列の背景からげっ歯動物ゲノムに挿入され得る。げっ歯動物又はげっ歯動物細胞のゲノムに挿入されたコンパニオンアニマルのV、D又はJ領域遺伝子は、コンパニオンアニマルのゲノムに適切な上流及び/又は下流に位置する天然に存在する隣接コンパニオンアニマルのDNAの1～10kb、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10kbを伴い得る。これは、コンパニオンアニマルのゲノム中に生じる制御エレメントを含むことができ、可変領域V、D及びJ領域遺伝子の発現に有益であり得る。
一態様では、本発明のげっ歯動物細胞は、コンパニオンアニマルのDNAによってコードされる可変領域を含む抗体鎖、例えば、キメラ抗体重鎖、若しくはキメラ抗体軽鎖、又は可変領域及び定常領域を有するコンパニオンアニマルの可変領域によってコードされる完全なコンパニオンアニマルの抗体鎖若しくは抗体のレパートリーを産生できるげっ歯動物に発生することができるげっ歯動物ES細胞、げっ歯動物造血幹細胞、又は他の細胞である。
一態様では、本発明の細胞は、げっ歯動物のES細胞又は誘導多能性幹細胞(iPS細胞)である。
一態様では、細胞は単離されたげっ歯動物細胞である。
一態様では、細胞は単離されたげっ歯動物のB細胞である。
好ましくは、げっ歯動物細胞はげっ歯動物のES細胞又はiPS細胞である。そのような細胞は、コンパニオンアニマルのDNAの挿入に適しており、本明細書に記載の抗体鎖を発現するげっ歯動物を生成する。
ES細胞は、マウス細胞株129若しくはC57BL、例えばC57BL/6N、C57BL/6J、129S5若しくは129Sv株、又は129又はC57BLのゲノムDNAを含むハイブリッドゲノムを有する細胞であってもよい。
本発明はまた、不死化細胞株を含む、本明細書に記載の細胞から増殖するか、又はそうでなければ細胞に由来する細胞株に関する。
本発明の細胞又は細胞株又はゲノムは、生殖系列構成又はin vivo成熟後の再構成後のコンパニオンアニマルのV、(D)、又はJ遺伝子を含んでもよい。
本発明はまた、抗原で本発明のげっ歯動物を免疫することによって得られる、キメラ抗体重鎖等の抗体鎖を発現する細胞又は細胞株に関する。
本発明はまた、好ましくはコンパニオンアニマルの定常領域を伴うコンパニオンアニマル可変領域を有する抗体又は抗体鎖を発現する細胞又は細胞株に関し、その抗体又は抗体鎖の可変領域の核酸配列は、本発明のげっ歯動物を抗原で免疫し、げっ歯動物又はげっ歯動物細胞から抗体又は抗体鎖、又は抗体又は抗体鎖の配列を得ることにより、同定されてもよく、又は同定されている。
発現する抗体鎖は、好ましくは、コンパニオンアニマル由来の可変領域が、同一のコンパニオンアニマル由来の定常領域(げっ歯動物の定常領域ではなく)を伴って本発明の細胞又は細胞株又はげっ歯動物で発現する、完全なイヌ科の動物の抗体又は抗体鎖、又は完全なウマ科の動物の抗体又は抗体鎖、又は完全なネコ科の動物の抗体又は抗体鎖である。
抗体鎖又は抗体を発現する細胞又は細胞株は、CHO細胞、又は動物の使用のための治療薬の生産に適した他の哺乳動物細胞株であり得る。
細胞は、腫瘍細胞との融合により不死化されて、抗体産生細胞及び細胞株を提供するか、又は直接的な細胞不死化により作製され得る。
本発明はまた、本発明で使用するためのベクターに関する。一態様では、そのようなベクターは、コンパニオンアニマルのIG遺伝子座の全部又は一部を含む細菌人工染色体(BAC)である。本発明では他のクローニングベクターを使用することができ、したがって、本明細書のBACへの言及は、一般に任意の適切なベクターを指すと解釈され得ることが理解されよう。ベクターは、1つ以上の選択マーカー及び/又は1つ以上の部位特異的組換え部位を含んでもよい。一態様では、ベクターは、2つ以上、例えば3つのヘテロ特異的及び不適合部位特異的組換え部位を含む。一態様では、部位特異的組換え部位は、loxP部位若しくはそのバリアント、又はFRT部位若しくはそのバリアントであり得る。一態様では、ベクターは、1つ以上のトランスポゾンITR(末端逆位配列)配列を含む。
イヌ科の動物のDNAを含む適切なBACは、小児病院オークランド研究所のBACPACリソースセンターからCHORI-82 BACライブラリーとして入手できる。
ネコ科の動物のDNAを含む適切なBACは、Amplicon Express社からFCABライブラリーとして入手できる。
ウマ科の動物のDNAを含む適切なBACは、小児病院オークランド研究所のBACPACリソースセンターからCHORI-241 BACライブラリーとして入手できる。
本発明は、げっ歯動物又はげっ歯動物細胞を産生する方法であって、げっ歯動物細胞ゲノムに1つ以上のコンパニオンアニマルのIGH V領域遺伝子、1つ以上のコンパニオンアニマルのIGH D領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルのIGH J領域遺伝子を挿入する工程を含み、げっ歯動物又はげっ歯動物細胞が、定常領域との組合せでコンパニオンアニマルの可変領域遺伝子を発現し、抗体鎖を形成できる、方法に関する。
本発明はまた、げっ歯動物又はげっ歯動物細胞を産生する方法であって、げっ歯動物細胞ゲノムに1つ以上のコンパニオンアニマルのIGL V領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルのIGL領域J遺伝子を挿入する工程を含み、げっ歯動物又はげっ歯動物細胞が、定常領域との組合せでコンパニオンアニマルの可変領域遺伝子を発現し、抗体鎖を形成できる、方法に関する。
好ましくは、本方法は、軽鎖と重鎖との両方がコンパニオンアニマルのDNAの発現に由来する可変領域を有する抗体が産生されるように、軽鎖と重鎖との両方のコンパニオンアニマルのVDJ及びVJ領域遺伝子をそれぞれ挿入することに関する。
本発明はまた、げっ歯動物又はげっ歯動物細胞を産生する方法であって、複数のコンパニオンアニマルのDNA断片を逐次的にげっ歯動物細胞ゲノムに挿入する工程を含み、挿入される断片が、げっ歯動物細胞に連続挿入を形成する、すなわち、それらが介在配列を含まずに直接結合される、方法を含む。
一態様では、挿入プロセスは、ES細胞等の細胞のゲノムに開始カセットが挿入される部位で開始する。一態様では、開始カセットは、コンパニオンアニマルの重鎖DNAの挿入に使用するために、げっ歯動物の重鎖遺伝子座に挿入される。同様に、開始カセットは、コンパニオンアニマルの軽鎖VJ DNAの挿入に使用するために、げっ歯動物の軽鎖遺伝子座に挿入されてもよい。開始カセットは、げっ歯動物の重鎖とカッパ鎖の最後のJ領域とC領域との間に配置してもよい。開始カセットは、IGLラムダコンパニオンアニマルの遺伝子の挿入に使用するために、同一の染色体上の、げっ歯動物カッパIGL遺伝子座の下流に配置してもよい。
開始カセットは、コンパニオンアニマルDNAの挿入を行うことができる、げっ歯動物のゲノムに固有の連続した遺伝子座を適切に含む。
一態様では、第1のDNA断片の開始カセットへの挿入の後に、第2のDNA断片の第1のDNA断片の一部への挿入が続いてもよい。事前に挿入されるDNAフラグメントの少なくとも一部に後続の挿入を行ってもよい。
一態様では、方法は、相同組換えによる開始カセットのげっ歯動物ゲノムへの標的化挿入、部位特異的組換えによる開始カセットの少なくとも一部への第1のDNA配列の挿入、第1のDNA配列の少なくとも一部への第2のDNA配列の部位への挿入、必要に応じて、先行するdNA配列の少なくとも一部への更なる1つ以上のDNA配列の挿入を含み、コンパニオンアニマルのDNAを含む標的内の連続したDNA断片を構築する。初期の断片の少なくとも一部へのDNA断片の挿入は、例えばリコンビナーゼ媒介カセット交換(RMCE)による部位特異的組換えによるものであり得る。この方法は、相同組換え(例えば、開始カセットの挿入の最初の工程)と部位特異的組換え、例えばRMCE(例えば、1つ以上のその後の挿入事象)との両方を含んでもよい。部位特異的リコンビナーゼシステムは当該技術分野で周知であり、Cre-lox、及びFLP/FRT、又はそれらの組み合わせを含んでもよい。
一態様では、挿入されるコンパニオンアニマルのDNAは、ES細胞等の細胞のゲノムに、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、又はそれ以上の重鎖又は軽鎖領域ごとの別個の挿入を使用して段階的に構築される。コンパニオンアニマルのDNA断片は、同一又は実質的に同一の細胞の遺伝子座、例えば、ES細胞の遺伝子座に、次々と適切に挿入され、完全なVDJ若しくはVJ領域、又はその一部を形成する。
本発明はまた、プロセス中に中間体を含む細胞及びげっ歯動物に関し、そのゲノムは、コンパニオンアニマルの可変領域遺伝子DNAのみ等の部分的なコンパニオンアニマルのVDJ又はVJ領域のみを含み得る。
挿入されるV、D、及びJ遺伝子が宿主の定常領域で発現できるようにされる内因性マウス遺伝子座での外因性DNAの標的化挿入のための方法は、当該技術分野で周知である。Murphy等、111巻、14号、5153～5158頁、doi:10.1073/pnas.1324022111;MacDonald等、111巻、14号、5147～5152頁、doi:10.1073/pnas.1323896111;及びLee等、Nature Biotechnology、32巻、356～363頁 2014DOI:, doi:10.1038/nbt.2825を参照されたい。
特に、トランスジェニックげっ歯動物を生産する方法は、順次リコンビナーゼ媒介カセット交換(SRMCE)による複数のDNA断片の段階的な挿入による、対応するげっ歯動物哺乳類の定常領域の上流又は下流への、本明細書に開示されるコンパニオンアニマルのVDJ又はVJ領域遺伝子の挿入を含む。
一態様では、マルチステップクローニングプロセスの次の工程に進む前に、正しい挿入事象が確認される。
一態様では、コンパニオンアニマルはイヌであり、げっ歯動物はマウスであり、イヌにおけるイヌ科の動物のカッパ定常領域の下流に天然で位置するイヌ科の動物のIGLカッパV領域遺伝子は、げっ歯動物におけるげっ歯動物カッパ定常領域の上流、好ましくはイヌ科の動物のIGLカッパ定常領域の上流に天然で見られるイヌ科の動物のIGLカッパV遺伝子と同一の向きで上流に挿入される。
一態様では、げっ歯動物は、少なくとも1×106個の異なる機能的キメラ免疫グロブリン配列の組み合わせの多様性を生成することができる。
一態様のげっ歯動物及び細胞、例えば、1つ以上のキメラ遺伝子座を有するES細胞を使用してキメラを作製し、ここで、RAG-1欠損バックグラウンド又は成熟した宿主B及びTリンパ球の産生を妨げる他の適切な遺伝的バックグラウンドから宿主胚が生成される。これにより、全てのB及びT細胞を、注入されたES細胞由来のものとすることができる。
一態様では、好ましいげっ歯動物はマウスであり、本発明の細胞はマウス細胞又はES細胞である。別の態様では、好ましいげっ歯動物はラットであり、本発明の細胞はラット細胞又はES細胞である。
本発明のES細胞は、ES細胞を胚盤胞に注入し、続いてキメラ胚盤胞を雌に移植して子孫を生成し、これをヘテロ接合子孫を生成するために交配させ、その後、必要な挿入を有するホモ接合組換え体を生成するために交配させることを含む、当該技術分野で周知の技術を使用して動物を生成するために使用することができる。一態様では、宿主胚盤胞はRag欠損である。
本発明は、本発明のES細胞を胚盤胞に注入した後、キメラ胚盤胞(blastocystys)をげっ歯動物の雌に移植して子孫を生産することにより生成されるキメラのげっ歯動物に関する。
一態様では、げっ歯動物又はげっ歯動物細胞はマウス又はマウス細胞であり、マウスADAM6a及びADAM6b遺伝子はマウスゲノムに存在し、以前にIGH遺伝子座から削除され、その後再挿入されているわけではなく、例えばここで、マウスADAM6遺伝子は、以前にマウスIgH遺伝子座から削除され、その後繁殖性を改善するためにIGH遺伝子座に導入により戻されているわけではない。
一態様では、げっ歯動物のADAM6a及びADAM6b遺伝子は、挿入された1つ以上のコンパニオンアニマルのV、D、及びJ遺伝子の5'の位置に位置する。
一態様では、げっ歯動物のIGH D及びJ遺伝子は、げっ歯動物のゲノムに存在する。一態様では、げっ歯動物のIGH D及びJ遺伝子は、げっ歯動物のゲノムから欠失していない。一態様では、げっ歯動物のIGH D及びJ遺伝子は、挿入された1つ以上のコンパニオンアニマルのV、D、及びJ遺伝子の5'の位置に位置する。
一態様では、本発明で使用されるイヌ科の動物の対立遺伝子は、各イヌ科の動物の遺伝子の参照対立遺伝子である。これらは、CanFam3.1のものである。2011年9月に作成され、最後に2016年5月に更新されたアセンブリ受託-GCA_000002285.2を参照されたい。
驚くべきことに、19品種にわたる107匹のイヌのゲノムデータから、品種のばらつきが最小限であり、参照対立遺伝子(ボクサー犬由来)が試料全体にわたって76%の割合で見出され、非参照対立遺伝子は、典型的には参照対立遺伝子とのヘテロ接合体として見出されることが本発明者等により判明した。これは、イヌ科の動物の参照対立遺伝子を含むげっ歯動物から生成された抗体集団が、異なる犬品種にわたる使用に広く適用可能であることを意味する。
したがって、本発明は、挿入された少なくとも90%、少なくとも95%、及び好ましくは全てのコンパニオンの遺伝子セグメントがCanFam 3.1からのイヌ科の動物の参照対立遺伝子である、本明細書に開示されるげっ歯動物細胞又はげっ歯動物に関する。
好ましくは、げっ歯動物又はげっ歯動物細胞は、以下の遺伝子セグメントの1つ以上の参照対立遺伝子ではない(「*01対立遺伝子」ではない)対立遺伝子を含む:IGKV2-S13、IGLV1-57、IGLV1-68、IGLV1-72、IGLV1-88、IGLV1-96、IGLV8-60、IGLV8-90、IGLV8-120。好ましくは、げっ歯動物又はげっ歯動物細胞のゲノムは、これらの非参照対立遺伝子の2、3、4、5、6、7、8、又は9つ全てを含む。
本発明はまた、本明細書に開示されるように得られるか、又は得ることができ、特に、参照ゲノムの品種以外の犬品種における、疾患の治療における、イヌ科の動物の参照対立遺伝子の発現に由来する可変領域を有する抗体鎖又はその一部に関する。一態様では、挿入されるV遺伝子セグメントの少なくとも50、60、70、80、90、又は100%はイヌ科の動物のV遺伝子参照対立遺伝子であり、及び/又は挿入されるD遺伝子セグメントの少なくとも50、60、70、80、90、又は100%はイヌ科の動物のD遺伝子参照対立遺伝子であり、及び/又は挿入されるJ遺伝子セグメントの少なくとも50、60、70、80、90、又は100%はイヌ科の動物のJ遺伝子参照対立遺伝子であり、並びにこれらの組み合わせである。好ましくは、挿入されるイヌ科の動物の遺伝子セグメント対立遺伝子の少なくとも90%、例えば100%が、その遺伝子セグメントの参照対立遺伝子である。
本発明はまた、異なる犬品種における疾患の予防又は治療に使用するための、抗体若しくは抗体鎖、又はその一部の生成における、本明細書に開示されるイヌ科の動物のV、D、及びJセグメントを挿入したげっ歯動物、並びに異なる犬品種の疾患の予防又は治療に使用するための、抗体鎖又はその一部の生成における、本明細書に記載のイヌV、D、及びJセグメントを挿入したげっ歯動物の使用に関する。
本発明はまた、本明細書に記載されるように、ボクサー犬品種由来の1つ以上又は全てのイヌ科の動物のV、D、及びJセグメントを有するげっ歯動物に関する。本発明は更に、本明細書に記載のゲノムのイヌ科の動物の遺伝子セグメントを有するあらゆるげっ歯動物から得られる又は得ることのできる抗体又はその断片の使用を提供し、抗体は、イヌ科の動物の遺伝子セグメントで使用されている品種とは異なる犬品種での疾患の予防又は治療におけるイヌ科の動物のDNAから少なくとも部分的に発現する。
例えば、挿入されるイヌ科の動物のDNAがボクサー由来である場合、ボクサー以外の犬種で使用される。
本発明は、以下にも関する。
(i)ボクサー犬品種由来のイヌ科の動物のV、D、Jセグメント、好ましくは、参照対立遺伝子である1つ以上のボクサー遺伝子セグメントを有するげっ歯動物;
(ii)ボクサー以外の犬品種に由来する、本明細書に記載のイヌ科の動物のV、D、及びJセグメント、好ましくはボクサー犬と同一である1つ以上のV、D及び/又はJ遺伝子セグメント(すなわち、イヌは参照対立遺伝子を有する)を有するげっ歯動物;
(iii)(i)又は(ii)のげっ歯動物由来の抗体又は抗体鎖を発現するB細胞、ハイブリドーマ、CHO、又は他の適切な細胞等の細胞、ここで抗体は、イヌ科の動物のV、D、J DNA(又はイヌ科の動物の軽鎖のV、及びJ DNA)から発現する、好ましくは参照対立遺伝子から発現する少なくともいくつかのアミノ酸を含む;
(iv)例えば、イヌ科の動物の定常領域をコードするDNAとともにイヌ科の動物の可変領域をコードするDNAを発現することにより生成され得る、上記(iii)の抗体の抗体可変領域を含む完全なイヌ科の動物の抗体又は抗体鎖;
(v)そのような完全なイヌ科の動物の抗体の全部又は一部をコードするDNAを含むCHO細胞等の発現細胞。
(i)ボクサー犬品種由来のイヌ科の動物のV、D、Jセグメント、好ましくは、参照対立遺伝子である1つ以上のボクサー遺伝子セグメントを有するげっ歯動物;
(ii)ボクサー以外の犬品種に由来する、本明細書に記載のイヌ科の動物のV、D、及びJセグメント、好ましくはボクサー犬と同一である1つ以上のV、D及び/又はJ遺伝子セグメント(すなわち、イヌは参照対立遺伝子を有する)を有するげっ歯動物;
(iii)(i)又は(ii)のげっ歯動物由来の抗体又は抗体鎖を発現するB細胞、ハイブリドーマ、CHO、又は他の適切な細胞等の細胞、ここで抗体は、イヌ科の動物のV、D、J DNA(又はイヌ科の動物の軽鎖のV、及びJ DNA)から発現する、好ましくは参照対立遺伝子から発現する少なくともいくつかのアミノ酸を含む;
(iv)例えば、イヌ科の動物の定常領域をコードするDNAとともにイヌ科の動物の可変領域をコードするDNAを発現することにより生成され得る、上記(iii)の抗体の抗体可変領域を含む完全なイヌ科の動物の抗体又は抗体鎖;
(v)そのような完全なイヌ科の動物の抗体の全部又は一部をコードするDNAを含むCHO細胞等の発現細胞。
好ましくは、ボクサーのV、D、及びJ遺伝子セグメントは、CHORI-82 BACライブラリー由来である。
別の態様では、本発明は、異なる犬品種における疾患の予防又は治療における、イヌ科の動物の可変領域を有する抗体又は抗体鎖、及び抗体又は抗体鎖の使用を提供し、抗体又は鎖は、本明細書に開示されているげっ歯動物から得られるか、又は得ることができ、イヌ科の動物の可変領域を生成するために使用されるV遺伝子セグメントは、イヌ科の動物の参照対立遺伝子であり、好ましくは、抗体又は抗体鎖は、有効であり、例えば、異なる犬品種の少なくとも50%、例えば60%又は少なくとも70%で疾患の処置又は予防において生物学的に有効である。好ましくは、重鎖及び/又は軽鎖由来のイヌ科の動物のV遺伝子セグメントは、ボクサー由来である。好ましくは、D及びJ遺伝子セグメントもボクサーの遺伝子セグメントである。
本発明は、以下に関する。
所望の抗原に特異的な抗体鎖を産生する方法であって、本明細書に開示されるげっ歯動物を所望の抗原で免疫する工程と、抗体鎖を単独で若しくは完全抗体の一部として回収するか、又は抗体鎖を単独で若しくは完全抗体の一部として産生する細胞を回収する工程とを含む方法(例えば、Harlow, E.及びLane, D.、1998、第5版、「Antibodies: A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Lab. Press、Plainview、NY;並びにPasqualini及びArap、Proceedings of the National Academy of Sciences(2004)101:257～259頁を参照されたい)。適切には、免疫原性量の抗原が送達される。本発明はまた、標的抗原を検出する方法であって、上述のように産生された抗体を、その抗体の一部を認識する二次検出剤で検出する工程を含む方法に関する。
所望の抗原に特異的な抗体鎖を産生する方法であって、本明細書に開示されるげっ歯動物を所望の抗原で免疫する工程と、抗体鎖を単独で若しくは完全抗体の一部として回収するか、又は抗体鎖を単独で若しくは完全抗体の一部として産生する細胞を回収する工程とを含む方法(例えば、Harlow, E.及びLane, D.、1998、第5版、「Antibodies: A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Lab. Press、Plainview、NY;並びにPasqualini及びArap、Proceedings of the National Academy of Sciences(2004)101:257～259頁を参照されたい)。適切には、免疫原性量の抗原が送達される。本発明はまた、標的抗原を検出する方法であって、上述のように産生された抗体を、その抗体の一部を認識する二次検出剤で検出する工程を含む方法に関する。
所望の抗原に特異的であり、単一種のコンパニオンアニマルに由来する抗体鎖又は抗体を産生する方法であって、本明細書に開示されるコンパニオンアニマルの遺伝子を含むげっ歯動物を免疫する工程と、次いで抗体をコードする核酸を適切に遺伝子操作することにより、げっ歯動物の抗体鎖の定常領域を同一のコンパニオン動物由来のコンパニオン動物の定常領域で置き換える工程とを含む方法。これは、DNAレベルでの標準的なクローニング技術により、非ヒト哺乳動物の定常領域を適切なコンパニオンアニマル定常領域DNA配列に置き換えることができる。例えば、Sambrook, J及びRussell, D.(2001、第3版)「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」(Cold Spring Harbor Lab. Press、Plainview、NY)を参照されたい。又は、直接的な核酸合成によって達成できる。
コンパニオンアニマルの可変領域を有する抗体鎖又はその一部を産生する方法であって、抗体鎖又はその一部をコードするDNAを細胞内で発現させる工程を含み、
抗体鎖の可変領域をコードするDNAの配列は、抗体鎖が産生されるように本発明のげっ歯動物を抗原で免疫することによりそこから得られるか、又は得ることができ、
必要に応じて、方法が、次の:
抗原受容体鎖を精製及び/又は単離する工程と、
必要に応じて、次いで、抗原受容体鎖をコンパニオンアニマルへの投与に適した薬学的に許容される製剤に製剤化する工程と
を含む、方法。
抗体鎖の可変領域をコードするDNAの配列は、抗体鎖が産生されるように本発明のげっ歯動物を抗原で免疫することによりそこから得られるか、又は得ることができ、
必要に応じて、方法が、次の:
抗原受容体鎖を精製及び/又は単離する工程と、
必要に応じて、次いで、抗原受容体鎖をコンパニオンアニマルへの投与に適した薬学的に許容される製剤に製剤化する工程と
を含む、方法。
本発明によるげっ歯動物又は細胞から得られるか、又は得ることができる抗体若しくは抗体鎖、又はその一部、又は抗体鎖若しくはその一部をコードする核酸。
本発明はまた、本明細書に開示されるイヌ科の動物の可変ドメイン及びげっ歯動物由来のB細胞に由来するげっ歯動物の定常ドメインを含む免疫グロブリン分子の一部、又は全体に関し、同様に、そのB細胞から得られる又は得ることのできるハイブリドーマ細胞、及びそのハイブリドーマ細胞から得られる又は得ることのできるイヌ科の動物の可変ドメインとげっ歯動物の定常ドメインを含む免疫グロブリン分子の一部又は全体に関する。本発明はまた、単一細胞のシークエンシングによるイヌ科の動物の可変領域の同定、及び対応するイヌ科の動物の定常領域を有する完全な抗体鎖を発現する合成ベクターの作製に関する。本発明はまた、PCRによりこれらの配列を得て、ブリッジPCR及びギブソンクローニング等であるがこれらに限定されない適切な分子生物学技術により適切な定常領域に結合することに関する。
本発明の別の態様は、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第2015/040401号に開示されるようなハイスループット細胞スクリーニングを使用する本発明のげっ歯動物で生成される目的の抗体の同定、及びそこに開示される方法を使用して同定された抗体に関する。例えば、適切な抗体は、抗体及び/又は抗体鎖(目的のタンパク質又はPOIとも呼ばれる)のレパートリーを発現する細胞の集団から得てもよく、又は得ることができ、抗体及び鎖は、コンパニオンアニマルの可変領域及びげっ歯動物の定常領域を含み、細胞を生成するための方法は、以下の通り:
a)POIのレパートリーを発現する細胞の集団を提供する工程、
b)細胞の集団を選別して、単一細胞の選別された集団を生成する工程であって、各細胞がそれぞれのPOIをコードする核酸を含む、工程、
c)選別された単一細胞集団に含まれる核酸を増幅して、POIをコードする増幅された核酸の選別されたレパートリーを生成する工程、
d)工程(c)からの核酸をコードする選別された増幅されたPOIを改変して、発現カセットの選別されたレパートリーを生成する工程であって、各カセットが、POIをコードする核酸配列及びPOIを発現するための1つ以上の制御エレメントを含む、工程、並びに
e)POI発現カセットの選別を維持し、POIの選別されたレパートリーを発現する宿主細胞の選別されたレパートリーを生成しながら、POI発現カセットを、前記カセットのレパートリーから宿主細胞の選別された集団に移す工程であって、選別された宿主細胞のレパートリーがPOIのレパートリーを安定的に発現することができる工程
であり、
POIが免疫グロブリン鎖又はその一部であり、工程(a)において、細胞が、B細胞、胚中心細胞、メモリーB細胞、抗体分泌細胞、形質細胞又は形質芽細胞を含む1つ以上の動物から単離された細胞であり、工程(c)がPCRを使用して行われる。
a)POIのレパートリーを発現する細胞の集団を提供する工程、
b)細胞の集団を選別して、単一細胞の選別された集団を生成する工程であって、各細胞がそれぞれのPOIをコードする核酸を含む、工程、
c)選別された単一細胞集団に含まれる核酸を増幅して、POIをコードする増幅された核酸の選別されたレパートリーを生成する工程、
d)工程(c)からの核酸をコードする選別された増幅されたPOIを改変して、発現カセットの選別されたレパートリーを生成する工程であって、各カセットが、POIをコードする核酸配列及びPOIを発現するための1つ以上の制御エレメントを含む、工程、並びに
e)POI発現カセットの選別を維持し、POIの選別されたレパートリーを発現する宿主細胞の選別されたレパートリーを生成しながら、POI発現カセットを、前記カセットのレパートリーから宿主細胞の選別された集団に移す工程であって、選別された宿主細胞のレパートリーがPOIのレパートリーを安定的に発現することができる工程
であり、
POIが免疫グロブリン鎖又はその一部であり、工程(a)において、細胞が、B細胞、胚中心細胞、メモリーB細胞、抗体分泌細胞、形質細胞又は形質芽細胞を含む1つ以上の動物から単離された細胞であり、工程(c)がPCRを使用して行われる。
本発明はまた、コンパニオンアニマルの治療における使用のための、本発明により得られるか又は得ることができる抗体若しくは鎖、又はその一部に関する。
本発明はまた、コンパニオンアニマルの治療の方法であって、本発明に従って得られるか又は得ることのできる適切な抗体若しくは抗体鎖又はその一部を、それを必要とするコンパニオンアニマルに送達する工程を含む方法。特に、本発明は、それを必要とするコンパニオンアニマルに抗体鎖若しくは抗体、又はその一部を送達する工程を含み、少なくとも抗体の可変領域は、コンパニオンのDNA V(D)J領域遺伝子を含む本発明のげっ歯動物を抗原で免疫することによって得られるか、又はそうでなければ同定される、医学的治療の方法に関する。
一態様では、本発明は、げっ歯動物の定常領域とコンパニオンアニマルの可変領域を有するキメラコンパニオンアニマル抗体及び抗体鎖、並びに前記抗体及び鎖の機能的断片及び機能的誘導体、並びに前記抗体、鎖及び断片の、診断を含む医学並びにin vitro又はex vivo研究における使用に関する。機能的抗体断片及び誘導体には、抗原への特異的結合が可能な断片が含まれ得る。機能的抗体断片は、例えば、Fab、Fab'、F(ab)2、Fv、scFv断片、ダイアボディ、線状抗体又は単鎖抗体分子であり得る。一態様では、断片は、少なくともCDR3、例えばラムダCDR3を含む。機能的誘導体は、例えば、イムノアドヘシン(immunoadhension)分子、イメージング剤、治療剤及び細胞傷害剤等の別の薬剤との付着によって、改変された抗体又はその断片であり得る。適切な例は、当該技術分野において周知である。例えば参照により本明細書に組み込まれる国際公開第2012024650A2号を参照されたい。更なる態様では、本発明は、「完全な(fully)」コンパニオンアニマル抗体及び抗体鎖(「完全な(fully)」は、抗体の可変領域と定常領域との両方が同一の種のコンパニオンアニマルの遺伝子から発現するという事実を反映する)、並びに前記抗体及び鎖の断片及び機能的誘導体、並びに前記抗体、鎖及び断片の、診断を含む医学並びにin vitro又はex vivo研究における使用に関する。
モノクローナル抗体とポリクローナル抗体との両方を生成する方法は当該技術分野で周知であり、本発明は、本発明のげっ歯動物における抗原負荷に応答して産生されるキメラ又は完全なコンパニオンアニマル抗体のポリクローナル抗体とモノクローナル抗体との両方に関する。
更なる態様では、本発明は、薬物及びワクチンの試験のためのモデルとしての、本明細書に記載されるようなげっ歯動物の使用に関する。したがって、本発明は、薬物又はワクチンの同定又は検証のための方法であって、本発明の哺乳動物にワクチン又は薬物を送達する工程と、及び免疫応答、安全性プロファイル、疾患に対する影響の1つ以上をモニタリングする工程とを含む方法に関する。
更に別の態様では、本発明で生成されたキメラ抗体又は抗体鎖を適切にDNAレベルで操作して、抗体様の特性又は構造を有する分子、例えばドメイン抗体等の定常領域が存在しない重鎖若しくは軽鎖からコンパニオンアニマルの可変領域、又は、同種若しくは異種由来の重鎖若しくは軽鎖のいずれかからの任意の定常領域を有するコンパニオンアニマルの可変領域、又は天然に存在しない定常領域を有するコンパニオンアニマルの可変領域、又は他の任意の融合パートナーを有するコンパニオンアニマルの可変領域を生成することができる。本発明は、本発明に従って同定されたキメラ抗体に由来する全てのそのようなキメラ抗体誘導体に関する。
本発明はまた、本明細書に開示される抗体又は抗体誘導体、及びそのような抗体又は緩衝液、抗体検出試薬等の適切な実験用試薬の使用説明書のいずれかを含むキットに関する。
本発明はまた、抗体、又はその一部を作製する方法であって、
(i)本発明に従って得られた抗体若しくはその一部をコードする核酸、又は
(ii)本発明に従って得られた抗体若しくはその一部をコードする核酸を発現させて抗体を産生させることができる配列情報
を提供する工程を含む方法に関する。
(i)本発明に従って得られた抗体若しくはその一部をコードする核酸、又は
(ii)本発明に従って得られた抗体若しくはその一部をコードする核酸を発現させて抗体を産生させることができる配列情報
を提供する工程を含む方法に関する。
本発明はまた、コンパニオンアニマルの可変領域とげっ歯動物の定常領域(必要に応じて、Cガンマ又はCミュー)を含むキメラ抗体に関し、抗体は、細胞(必要に応じて、B細胞、ES細胞又はハイブリドーマ)のキメラ重鎖の遺伝子座のヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列によりコードされ、遺伝子座は、げっ歯動物の定常領域のヌクレオチド配列、並びに、コンパニオンアニマルのV領域、コンパニオンアニマルのD領域、及びコンパニオンアニマルのJ領域のin vivo再構成によって生成された再構成VDJヌクレオチド配列を含み、コンパニオンアニマルのV領域は、イヌ科の動物のIGH V4-1、V3-2、V3-3、V3-4、V3-5のIGH可変領域遺伝子から選択される。
必要に応じて、J領域は、イヌ科の動物のJH1、JH2、JH3、JH4、JH5、又はJH6のいずれかである。
必要に応じて、D領域は、イヌ科の動物のDH1、DH2、DH3、DH4、DH5、及びDH6のいずれかである。
一態様では、抗体は、本明細書の実施例及び図面に例示される任意の組み合わせを含む。必要に応じて、in vivo再構成は、定常領域配列と同一のげっ歯動物種(例えば、マウスB細胞又はES細胞)の細胞(例えば、B細胞又はES細胞)内で起きる。本発明はまた、そのゲノムがこの段落で上述したキメラ重鎖遺伝子座を含む非ヒト脊椎動物又は哺乳動物細胞(例えば、B細胞又はES細胞又はハイブリドーマ)に関する。
本発明はまた、そのゲノムがこの段落で上述したキメラ重鎖遺伝子座を含む非ヒト脊椎動物又は哺乳動物(例えば、マウス又はラット)に関する。
本発明の抗体は単離されてもよく、一態様では、それらが発現する細胞又は生物から単離される。
本発明はまた、抗体鎖の一部に関する。特に、この一部は少なくとも抗体の可変領域を含む。これは、特に抗体産生のために、細胞から発現し得る。この一部は、抗体のFab領域を含んでもよく、又は少なくともCDR領域を含んでもよい。
本発明は、抗体又は抗体鎖の生成方法であって、本明細書に記載のげっ歯動物を、げっ歯動物のゲノムに存在するコンパニオンアニマルのDNAの供給源と同一のコンパニオンアニマルから得ることのできる抗原で免疫する工程を含む方法に関する。例えば、イヌ科の動物の抗原は、本明細書に開示されるイヌ科の動物のV、D、及びJ遺伝子を含むげっ歯動物を免疫するために使用することができる。
したがって、本発明はまた、げっ歯動物のゲノムに存在するコンパニオンアニマルのDNAの供給源に対応するコンパニオンアニマル由来の抗原で免疫されたげっ歯動物に関する。
正確に同一のコンパニオンアニマルを使用する必要はない。例えば、ある品種から採取したイヌ科の動物の抗原を使用して、異なる品種由来のイヌ科の動物のDNAを含むげっ歯動物を免疫することができる。同一の犬品種由来の抗原も使用できる。
代替的に、抗原は、コンパニオンアニマルに感染することが知られている細菌又はウイルス等の病原体由来のものであり得る。例えば、イヌに感染して疾患を引き起こす病原体由来の抗原は、本明細書に開示されるイヌ科の動物のV、D、及びJ遺伝子を含むげっ歯動物を免疫するために使用することができる。
したがって、本発明は、げっ歯動物のゲノムに存在するコンパニオンアニマルのDNAの供給源に対応するコンパニオンアニマルに疾患を引き起こす抗原で免疫されたげっ歯動物に関する。
更なる態様では、抗原は、ヒトの疾患に関連する、好ましくはヒトの疾患の予防又は治療の標的として検証されているヒト抗原のコンパニオンアニマルでの均等物であってもよい。
一態様では、本発明は、本明細書に記載の抗原によるげっ歯動物の免疫により得られるか、又は得ることのできる抗体鎖又はその断片を提供する。
本発明はまた、前記抗体、抗体鎖、又はそれらの一部をコードするDNA又はRNA等の核酸に関する。特に、その一部は抗体鎖の可変部分である可能性があり、これはげっ歯動物内のコンパニオンアニマルのDNAによってコードされる部分である。
本発明はまた、部分的に若しくは完全にイヌ科の動物の抗体鎖、又は部分的に若しくは完全にイヌ科の動物の抗体鎖の一部、例えば、可変領域を発現するB細胞若しくはハイブリドーマ等の細胞、又は発現細胞株(例えばCHO細胞)に関し、そのDNA又はタンパク質の配列は、本明細書に記載のげっ歯動物から得ることができるか、又は得られている。
目的の抗体が免疫されたげっ歯動物から同定されると、B細胞からその抗体をコードするDNA配列を同定し、その配列から、又は、遺伝暗号の冗長性の結果として同一のタンパク質を発現できる実際には別のDNA配列から、抗体又はその部分を発現することができることは、当該技術分野で標準的であることが理解されよう。特に、イヌ科の動物の可変領域をイヌ科の動物の定常領域とともに発現して、完全なイヌ科の動物の抗体鎖又は抗体を生成することができる。
したがって、本発明はまた、完全なイヌ科の動物の抗体を得る方法であって、
少なくとも1つの重鎖イヌ科の動物の免疫グロブリンV遺伝子セグメント、少なくとも1つのイヌ科の動物の重鎖D遺伝子セグメント、及び少なくとも1つのイヌ科の動物の重鎖J遺伝子セグメントを有する、並びに/又は少なくとも1つの軽鎖イヌ科の動物の免疫グロブリンV遺伝子セグメント及び少なくとも1つのイヌ科の動物の重鎖J遺伝子セグメントを有するげっ歯動物を本明細書に記載される抗原で免疫する工程と、
イヌ科の動物のDNAによってコードされる可変抗体領域を有する、げっ歯動物によって産生された抗体鎖(複数可)を選択する工程と、
好ましくは完全なイヌ科の動物のものであり、例えば、イヌ科の動物の可変領域とイヌ科の動物の定常領域を含む抗体若しくは抗体鎖又はその一部を発現するために、発現細胞株のDNAからその可変抗体領域を発現させる工程と、
必要に応じて、抗体、抗体鎖又はその一部を精製する工程と、
必要に応じて、それを必要とするコンパニオンアニマルへの投与を可能にするのに適した薬学的に許容される賦形剤とともに抗体若しくは鎖又はその一部を更に製剤化する工程と
を含む方法を提供する。
少なくとも1つの重鎖イヌ科の動物の免疫グロブリンV遺伝子セグメント、少なくとも1つのイヌ科の動物の重鎖D遺伝子セグメント、及び少なくとも1つのイヌ科の動物の重鎖J遺伝子セグメントを有する、並びに/又は少なくとも1つの軽鎖イヌ科の動物の免疫グロブリンV遺伝子セグメント及び少なくとも1つのイヌ科の動物の重鎖J遺伝子セグメントを有するげっ歯動物を本明細書に記載される抗原で免疫する工程と、
イヌ科の動物のDNAによってコードされる可変抗体領域を有する、げっ歯動物によって産生された抗体鎖(複数可)を選択する工程と、
好ましくは完全なイヌ科の動物のものであり、例えば、イヌ科の動物の可変領域とイヌ科の動物の定常領域を含む抗体若しくは抗体鎖又はその一部を発現するために、発現細胞株のDNAからその可変抗体領域を発現させる工程と、
必要に応じて、抗体、抗体鎖又はその一部を精製する工程と、
必要に応じて、それを必要とするコンパニオンアニマルへの投与を可能にするのに適した薬学的に許容される賦形剤とともに抗体若しくは鎖又はその一部を更に製剤化する工程と
を含む方法を提供する。
本発明はまた、コンパニオンアニマルの治療におけるそのような抗体若しくは抗体鎖又はその断片の使用に関する。
上述のアプローチは、ネコやウマ等の他の好ましいコンパニオンアニマルにも同様に適用される。ネコ科の動物の抗原は同等のネコ科の動物/げっ歯動物モデルで使用でき、ウマ科の動物の抗原は同等のウマ科の動物/げっ歯動物モデルで使用でき、本発明の他の全ての態様はネコ及びウマに同様に適用できる。
本発明は、交差反応性抗体又は抗体鎖の生成方法であって、本明細書に開示されるコンパニオンアニマルのDNAを含むげっ歯動物を、前記げっ歯動物由来の目的の抗原及びコンパニオンアニマル由来の対応する抗原で免疫する工程を含み、げっ歯動物が前記抗原をコードする遺伝子の遺伝子ノックアウトを含む、方法に関する。前記免疫されたげっ歯動物から生じる抗体集団は、げっ歯動物とコンパニオンアニマルの抗原の両方に結合することができる、すなわち、交差反応する抗体を含むことができる。
したがって、更なる態様では、本発明は、目的のげっ歯動物の抗原及びコンパニオンアニマル由来の対応する抗原で免疫された、本明細書に記載のコンパニオンアニマルのDNAを含むげっ歯動物に由来する交差反応性抗体又は抗体断片に関し、げっ歯動物が前記抗原をコードする遺伝子の遺伝子ノックアウトを有する。
一態様では、げっ歯動物は、タンパク質又はそのペプチド断片で直接的に、又は関連する抗原若しくはその断片をコードするベクター、又は所望の抗原を発現する同系細胞株のいずれかによって、げっ歯動物の抗原によって、及びコンパニオンアニマル由来の対応する抗原によって、逐次的に又は同時に免疫される。
一態様では、げっ歯動物はマウスであり、コンパニオンアニマルは、イヌ、ネコ、又はウマである。
創薬の分野では交差反応性抗体が非常に重要である。交差反応性抗体は、抗体修飾の必要なしに、抗体が反応性である他の種をモデルとして使用することにより、抗体が反応性である種のための薬物候補として迅速に検証できる。
本発明はまた、本明細書で請求されるげっ歯動物の免疫のためのイヌ科の動物の抗原の使用に関し、本明細書で請求されるげっ歯動物の免疫のためのイヌ科の動物の抗原に関し、イヌ科の動物の抗原は、ヒトにおいてファミリー遺伝子又はタンパク質均等物を有し、好ましくは治療的に検証されており、ヒト均等抗原に対する抗体が疾患の治療に有効であることが示されていることを意味する。
本発明は、イヌ科の動物とヒトとのIg可変領域の間の強い相同性を初めて開示する。図16を参照されたい。[生殖系列イヌ科の動物-ヒトIG Vの強い相同性、TCR V相同性はあまり保存されていない]。この情報は、イヌ科の動物の可変領域のDNAを含むげっ歯動物モデルは、例えば、マウスの制御配列を必要とするのではなく、イヌ科の動物の制御配列を利用できる可能性があることを示唆し、これは、ヒト化マウスがマウス内のヒト制御配列を使用できるためである。実際、本発明者等は、挿入されたイヌ科の動物のゲノムDNAの制御配列とRSS配列は、げっ歯動物によって認識され、げっ歯動物でキメラ抗体を発現するために使用できることを実験的に検証した。
本発明者等によるこれらの発見は驚くべきものであり、イヌ科の動物とヒトの進化的相違に基づいて予想されるものではない。
割り当てられた系統発生内で、マウスとヒトは、(例えば)ネコ及びイヌを含む肉食動物、並びにウマのいずれよりも密接に関連していることはよく知られている。これが、ヒトDNAのV、D、及びJ遺伝子セグメント挿入を有するキメラマウスモデルでのヒト制御配列の使用が前記モデルで成功する理由である可能性が高い。これに基づいて、ヒト及びイヌ等の進化的により多様な動物についても同じことは予測できなかった。実際、マウスでイヌ科の動物の遺伝子セグメントを使用しようとする以前の試みでは、ネズミの制御性制御配列を利用していた(例えば、Trianni、US2017306352)。
一態様では、本発明は、挿入された(コンパニオンアニマル)IGHJ4及びIGHJ6が成熟B細胞抗体集団に見られる主要なJH遺伝子セグメントであるげっ歯動物に関する。好ましくは、げっ歯動物はイヌ科の動物のV、D、及びJ遺伝子セグメントを含み、J4及びJ6はイヌ科の動物のJ4及びJ6遺伝子セグメントである。本発明の一態様では、げっ歯動物は、げっ歯動物抗体レパートリー内の抗体鎖の生成において、異なる挿入IGH Dセグメントの1、2、3、4、5、6、若しくはそれ以上、又はその全て、並びに/又は挿入されたIGH J遺伝子セグメントの1、2、3、4、5、6、若しくはそれ以上、又はその全てを使用することができる。
イヌ科の動物の挿入された重鎖D1-6及びJ1-6遺伝子セグメントを有する現在試験されているげっ歯動物マウスは、抗体形成においてイヌ科の動物のIGH J1-6及びD1-6の全てを利用することができる。
本発明の一態様では、げっ歯動物は、他の軽鎖J遺伝子セグメントよりも多くのIGLJ1を利用する。
本発明の一態様では、げっ歯動物はイヌ由来のコンパニオンアニマルのDNAを含み、げっ歯動物は以下の特徴のうちの1つ以上を有する:
げっ歯動物は、IGHJ4から発現するキメラ抗体重鎖を、個々に、IGHJ1、2、3、5、又は6のいずれよりも多く発現し、げっ歯動物は、IGHJ6から発現するキメラ抗体重鎖を、個々に、IGHJ1、2、3、又は5のいずれよりも多く発現する;
げっ歯動物は、IGHD5から発現するキメラ抗体重鎖を、個々に、IGHD1、2、3、4、又は6のいずれよりも多く発現する;
げっ歯動物は、IGHD2から発現するキメラ抗体重鎖を、個々に、IGHD1、3、4、又は6のいずれよりも多く発現する;
げっ歯動物は、IGHJ4とともにIGHD2から抗体鎖を発現する;
げっ歯動物は、IGHJ4とともにIGHD5から抗体鎖を発現する;
げっ歯動物は、IGHJ4とともにIGHD5から、イヌ科の動物のIGHDとIGHJセグメントの他の組み合わせのいずれかから発現するよりも多くの抗体鎖を発現する;
げっ歯動物は、IGLJ1から発現するキメラ抗体軽鎖を、任意の他のIGL J遺伝子セグメントよりも多く発現する。
げっ歯動物は、IGHJ4から発現するキメラ抗体重鎖を、個々に、IGHJ1、2、3、5、又は6のいずれよりも多く発現し、げっ歯動物は、IGHJ6から発現するキメラ抗体重鎖を、個々に、IGHJ1、2、3、又は5のいずれよりも多く発現する;
げっ歯動物は、IGHD5から発現するキメラ抗体重鎖を、個々に、IGHD1、2、3、4、又は6のいずれよりも多く発現する;
げっ歯動物は、IGHD2から発現するキメラ抗体重鎖を、個々に、IGHD1、3、4、又は6のいずれよりも多く発現する;
げっ歯動物は、IGHJ4とともにIGHD2から抗体鎖を発現する;
げっ歯動物は、IGHJ4とともにIGHD5から抗体鎖を発現する;
げっ歯動物は、IGHJ4とともにIGHD5から、イヌ科の動物のIGHDとIGHJセグメントの他の組み合わせのいずれかから発現するよりも多くの抗体鎖を発現する;
げっ歯動物は、IGLJ1から発現するキメラ抗体軽鎖を、任意の他のIGL J遺伝子セグメントよりも多く発現する。
一態様では、げっ歯動物は、以下のような挿入されたイヌ科の動物の重鎖遺伝子セグメントを含む。J1-6、D1-6、V4-1、V3-2、V3-3、及びV3-5、必要に応じてV3-4(偽遺伝子である)とともに。
一態様では、げっ歯動物は、以下のような挿入されたイヌ科の動物のラムダ軽鎖遺伝子セグメントを含む。C1-9を伴うJ1-9(つまり、完全なイヌ科の動物のラムダJCクラスター)、並びにV3-2、V3-3、V3-4、V4-5、V4-6、並びに必要に応じてV3-1及びV3-7(どちらも偽遺伝子)。
本発明のげっ歯動物は、挿入されたコンパニオンアニマルのV、D、及びJ遺伝子セグメントをN及び/若しくはP付加により適切に修飾することができ、並びに/又は挿入されたコンパニオンアニマルのV、D、及びJ遺伝子セグメントの体細胞超変異を受けることができる。
本発明はまた、HCDR3、VHドメイン、抗体重鎖、又は抗体を提供し、ここで、重鎖又は抗体のVHドメインは、げっ歯動物のAIDパターン体細胞超変異及び/又はマウスdTdパターン変異を含む。このパターンは、例えば、VHドメインが、げっ歯動物AID及び/又はげっ歯動物TdT(例えば、内因性AID又はTdT)を含むげっ歯動物で産生される場合に提供され得る。マウスは好ましいげっ歯動物である。
本発明の一態様では、キメラ抗体鎖の可変領域は、抗体を生成するために使用されるV、D、及びJ遺伝子セグメントの生殖系列配列から予測されるアミノ酸配列とは異なる。そのため、ある程度の体細胞超変異、及び/又はN/Pの付加が存在していた。
驚くべきことに、実施例4のRNAシークエンシングアプローチを使用して両方の試料を同一の深度で調査すると、イヌ科の動物のV、D、及びJ遺伝子セグメントを含むげっ歯動物を使用して生成されたキメラ抗体集団の多様性、又は本明細書に記載のV及びJセグメントは、遺伝子セグメントが由来する野生型イヌの観察された抗体多様性よりも大きいことが本発明者等により見出された。図21は、イヌ科の動物の重鎖V、D、及びJ遺伝子セグメント、又は軽鎖V及びJセグメントを含むげっ歯動物のシークエンシングされたライブラリー内で一度だけ見つかった抗体ヌクレオチド配列が、イヌ自体で見出されるものよりも、はるかに多いことを示している。
そのため、本発明は、各抗体が少なくとも1つのコンパニオンアニマルの遺伝子セグメントの発現に起因するキメラ抗体鎖の集団を発現する本明細書に記載の任意のげっ歯動物に関し、その集団は、対応するコンパニオンアニマルに見られる抗体の集団と比べて、より多様であるか又は少なくとも同じくらい多様である。換言すると、げっ歯動物で生成される抗体集団の多様性は、コンパニオンアニマルの抗体レパートリーで見られるものよりも大きいか、又は少なくとも同じくらい大きい。
好ましくは、イヌ科の動物のDNAのV、D、及びJ遺伝子セグメント、又は軽鎖V及びJセグメントを有するマウスで生成される抗体集団の多様性は、イヌの抗体レパートリーで見られるものよりも大きいか、又は少なくとも同じくらい大きい。
適切には、集団の多様性は、重鎖集団又は軽鎖集団、或いはその両方に存在する一意的な抗体配列の数によって評価される。
本発明はまた、例えば実施例4における、5'RACEによって決定されるような配列に関して、少なくとも65%、又は少なくとも70%が一意的であるキメラ抗体鎖の集団を含むげっ歯動物、例えば、65～80%のキメラ抗体配列が一意的であるげっ歯動物、例えば、65～75%が一意的であるげっ歯動物に関する。
げっ歯動物は本明細書に開示されるいずれのげっ歯動物であってよく、例えば、一態様では、げっ歯動物は、以下のような挿入されたイヌ科の動物の重鎖遺伝子セグメントを含む。J1-6、D1-6、V4-1、V3-2、V3-3、及びV3-5、必要に応じてV3-4(偽遺伝子である)とともに。一態様では、げっ歯動物は、以下のような挿入されたイヌ科の動物のラムダ軽鎖遺伝子セグメントを含む。C1-9とともにJ1-9(完全なイヌ科の動物のラムダJCクラスター)、並びにV3-2、V3-3、V3-4、V4-5、V4-6、並びに必要に応じてV3-1及びV3-7(どちらも偽遺伝子)。一態様では、げっ歯動物は、イヌ科の動物の重鎖挿入と軽鎖挿入の両方を含む。
本発明はまた、コンパニオンアニマル自体で見られるよりも多いか、又は少なくとも同程度多様なキメラ抗体鎖又は抗体のレパートリーの生成における、本明細書に開示されるコンパニオンアニマルのDNAを含む任意のげっ歯動物(例えばマウス)の使用に関し、コンパニオンアニマル自体に見られるよりも多いか、又は少なくとも同程度多様なキメラ抗体鎖又は抗体のレパートリーを生成するための本明細書に開示されるコンパニオンアニマルのDNAを含むマウス等のげっ歯動物に関する。
したがって、本発明の好ましい態様は次の通りである。
抗体又は抗体鎖の生成方法であって、本明細書に開示されるげっ歯動物を、げっ歯動物のゲノムに存在するコンパニオンアニマルのDNAの供給源と同一であるコンパニオンアニマルから得られるか、又は得ることのできる抗原で免疫する工程を含み、抗原が、タンパク質抗原、抗原を発現する細胞、又は抗原をコードする核酸であり得る方法。
抗体又は抗体鎖の生成方法であって、本明細書に開示されるげっ歯動物を、げっ歯動物のゲノムに存在するコンパニオンアニマルのDNAの供給源であるコンパニオンアニマルの種に感染する細菌又はウイルス等の病原体由来の抗原で免疫する工程を含む方法。
げっ歯動物のゲノムに存在するコンパニオンアニマルのDNAの供給源に対応するコンパニオンアニマル由来の抗原で免疫された本明細書に開示されるげっ歯動物。
げっ歯動物のゲノムに存在するコンパニオンアニマルのDNAの供給源に対応するコンパニオンアニマルに疾患を引き起こす抗原で免疫された本明細書に開示されるげっ歯動物。
ヒトの疾患に関連するヒト抗原のコンパニオンアニマル抗原均等物で免疫された、本明細書に開示されるげっ歯動物。
げっ歯動物がイヌ由来のコンパニオンアニマルのDNAを含み、げっ歯動物は以下の特徴のうちの1つ以上又は全てを有する、本明細書に開示されるげっ歯動物:
げっ歯動物は、IGHJ4から発現するキメラ抗体重鎖を、個々に、IGHJ1、2、3、5、又は6のいずれよりも多く発現する;
げっ歯動物は、IGHJ6から発現するキメラ抗体重鎖を、個々に、IGHJ1、2、3、又は5のいずれよりも多く発現する;
げっ歯動物は、IGHD5から発現するキメラ抗体重鎖を、個々に、IGHD1、2、3、4、又は6のいずれよりも多く発現する;
げっ歯動物は、IGHD2から発現するキメラ抗体重鎖を、個々に、IGHD1、3、4、又は6のいずれよりも多く発現する;
げっ歯動物は、IGHJ4とともにIGHD2から抗体鎖を発現する;
げっ歯動物は、IGHJ4とともにIGHD5から抗体鎖を発現する;
げっ歯動物は、IGHJ4とともにIGHD5から、イヌ科の動物のIGHDとIghJセグメントの他の組み合わせのいずれかから発現するよりも多くの抗体鎖を発現する;
げっ歯動物は、IGLJ1から発現するキメラ抗体軽鎖を、任意の他のIGL J遺伝子セグメントよりも多く発現する。
げっ歯動物は、IGHJ4から発現するキメラ抗体重鎖を、個々に、IGHJ1、2、3、5、又は6のいずれよりも多く発現する;
げっ歯動物は、IGHJ6から発現するキメラ抗体重鎖を、個々に、IGHJ1、2、3、又は5のいずれよりも多く発現する;
げっ歯動物は、IGHD5から発現するキメラ抗体重鎖を、個々に、IGHD1、2、3、4、又は6のいずれよりも多く発現する;
げっ歯動物は、IGHD2から発現するキメラ抗体重鎖を、個々に、IGHD1、3、4、又は6のいずれよりも多く発現する;
げっ歯動物は、IGHJ4とともにIGHD2から抗体鎖を発現する;
げっ歯動物は、IGHJ4とともにIGHD5から抗体鎖を発現する;
げっ歯動物は、IGHJ4とともにIGHD5から、イヌ科の動物のIGHDとIghJセグメントの他の組み合わせのいずれかから発現するよりも多くの抗体鎖を発現する;
げっ歯動物は、IGLJ1から発現するキメラ抗体軽鎖を、任意の他のIGL J遺伝子セグメントよりも多く発現する。
以下のような挿入されたイヌ科の動物の重鎖遺伝子セグメントを含む、本明細書に開示されるげっ歯動物。J1-6、D1-6、V4-1、V3-2、V3-3、及びV3-5、必要に応じてV3-4とともに。
以下のような挿入されたイヌ科の動物のラムダ軽鎖遺伝子セグメントを含む、本明細書に開示されるげっ歯動物。J1-9、C1-9、V3-2、V3-3、V3-4、V4-5、V4-6、並びに必要に応じて、V3-1及びV3-7。
挿入されたコンパニオンアニマルのV、D、及びJ遺伝子セグメントをN及び/若しくはP付加によって改変できる、並びに/又は体細胞超変異を示す本明細書に開示されるげっ歯動物。
各抗体鎖が少なくとも1つのコンパニオンアニマルの遺伝子セグメントの発現に起因するキメラ抗体鎖の集団を発現し、そのキメラ抗体集団が、対応する野生型コンパニオンアニマルに見られる抗体集団よりも多様である、本明細書に開示されるげっ歯動物。
少なくとも65%、又は少なくとも70%が一意的であるキメラ抗体鎖の集団を含み、必要に応じて、げっ歯動物がイヌである、本明細書に開示されるげっ歯動物。
65～75%が一意的であるげっ歯動物等、キメラ抗体配列の65～80%が一意的である、本明細書に開示されるげっ歯動物。
コンパニオンアニマル自体に見られるよりも多様なキメラ抗体鎖又は抗体のレパートリーの生成における、本明細書に開示されるコンパニオンアニマルのDNAを含む任意のげっ歯動物(例えば、マウス)の使用。
コンパニオンアニマル自体に見られるよりも多様なキメラ抗体鎖又は抗体のレパートリーを生成するための、マウス等の、本明細書に開示されるげっ歯動物。
挿入されたコンパニオンアニマルV、D、又はJ遺伝子セグメントの1つ以上が、同一のコンパニオンアニマル由来の制御配列を伴い、必要に応じて制御配列が個々のV遺伝子セグメントに先行するプロモーター、及び/又はスプライス部位、及び/又はV(D)J組換えのための組換えシグナル配列を含む、本明細書に開示されるげっ歯動物。
挿入されたコンパニオンアニマルのV、D、又はJ配列に同一のコンパニオンアニマル由来のRSS配列が隣接し、宿主のげっ歯動物のRSS配列が使用されない、本明細書に開示されるげっ歯動物。
ある品種のイヌ科の動物のDNAを含み、異なる犬品種の疾患の治療又は予防に使用するための、抗体若しくは抗体鎖、又はその一部の生成に使用する、本明細書に開示されるげっ歯動物。
ある品種のイヌ科の動物のDNAを含み、異なる犬品種の処理に使用するための、抗体鎖又はその一部の生成における、本明細書に開示されるげっ歯動物の使用。
1つ以上又は全てのイヌ科の動物のV、D、及びJセグメントがボクサー犬由来である、本明細書に開示されるげっ歯動物。
別の態様では、げっ歯動物ゲノムに挿入されるコンパニオンアニマルのDNAは、非免疫グロブリン遺伝子を含まないか、又は機能的非免疫グロブリン遺伝子を含まない(後者は非機能的非免疫グロブリン遺伝子の包含を可能にする)。非免疫グロブリン遺伝子がコンパニオンアニマルのゲノム内に位置する場合、これらは挿入の前に切除され得る。したがって、本発明は、本明細書に記載の挿入されたコンパニオンアニマルのDNAを有するが、コンパニオンアニマルの非免疫グロブリン遺伝子を含まないか、又は機能的なコンパニオンアニマルの非免疫グロブリン遺伝子を含まない、げっ歯動物のゲノムに関する。
例えば、本発明者等は、免疫グロブリン遺伝子をコードしないイヌ科の動物のラムダ遺伝子セグメント内に位置する、したがって好ましくは挿入前に切除され、げっ歯動物のゲノムに挿入されない、3つの遺伝子があるイヌ科の動物のIg遺伝子座を同定した。したがって、一態様では、本明細書に開示されるイヌ科動物化げっ歯動物は、以下のイヌ科の動物の遺伝子:ZNF280B、PRAME、RPIA及びPCBP2のいずれか1つ、又は2つ又は3つ又は全てを含まない。挿入前の非免疫グロブリン遺伝子の切除は、所望のIGLラムダV遺伝子の挿入を達成するために必要な挿入のサイズを低減する。当業者に理解されるように、これは、挿入を容易にし、非IG遺伝子がげっ歯動物又はげっ歯動物細胞に望まれない任意の干渉を引き起こす可能性を低減する。したがって、一態様では、挿入されたコンパニオンアニマルのDNAは、ゲノムクローンではないが、1つ以上の遺伝子が欠失した「編集された」ゲノムクローンを含んでいてもよい。別の態様では、本発明は、トランスジェニックげっ歯動物の生成のための本明細書に開示されるいずれかの方法であって、げっ歯動物に挿入されたDNAが、非免疫グロブリン遺伝子を含まず、例えばZNF280B、PRAME、RPIA及びPCBP2のうちのいずれか1つ以上を含まない、方法に関する。
別の態様では、本発明は、コンパニオンアニマルのDNAを含む本明細書に開示されるげっ歯動物又は細胞であって、ゲノムが1つ以上のげっ歯動物遺伝子のノックアウトを更に含む、げっ歯動物又は細胞に関する。本発明はまた、本明細書に記載の挿入されたコンパニオンアニマルのDNAを有するげっ歯動物であって、ゲノムが遺伝子ノックアウトを更に含み、げっ歯動物が、ノックアウトされた遺伝子によってコードされるか、又はその遺伝子のコンパニオンアニマルのホモログによってコードされる抗原で免疫されている、げっ歯動物に関する。適切なホモログは、核酸レベル又はタンパク質レベルで60%以上の相同性、例えば核酸レベル又はタンパク質レベルで65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%又はそれ以上の相同性を有する。
したがって、本発明はまた、目的の特異抗原に対する抗体を産生するための方法であって、本明細書に開示される挿入されたコンパニオンアニマルの遺伝子を有するゲノムを含み、及び目的の抗原又はそのコンパニオンアニマルのホモログをコードする遺伝子に対するノックアウトを含むげっ歯動物を免疫する工程を含む方法を含む。
本発明はまた、多特異性抗体又は抗体鎖、例えば二特異性抗体又は抗体鎖を発現する本明細書に開示されるげっ歯動物又はげっ歯動物細胞に関する。二特異性抗体を作製するための方法及び様々な様式は、二特異性抗体及びその機能的部分を生成するための異なる方法に関して参照により本明細書に組み込まれる「The making of bispecific antibodies」,Brinkmann等,MAbs.2017年2月-3月;9巻(2号):182～212頁に記載されている。多特異性抗体は、それらに記載のいずれかの様式、例えば、Fc-二特性が低い形態、タンデム単鎖可変断片(scFv2、taFv)及びトリプルボディの形態、ダイアボディ及びダイアボディ誘導体の形態、Fab融合タンパク質の形態であってもよい。多特異性抗体は、scFvにグラフトされた更なる抗原結合部位を含んでいてもよく、2つの異なる抗体由来の重鎖及び軽鎖を有する非対称IgGであってもよく、非対称Fc領域を有する二特異性IgGであってもよく、付加されたIgG又は改変されたIgGであってもよく、又はBrinkmann等にも記載の対称Fc及びCH3に基づく二特異性抗体であってもよい。
本発明のげっ歯動物又はげっ歯動物細胞は、単一の軽鎖を発現する(又は2つの軽鎖のいずれか又は両方を発現する)再構成されたコンパニオンアニマルの軽鎖可変領域遺伝子(又は再構成された軽鎖可変領域遺伝子)を形成するために再構成される、単一の再構成されていないコンパニオンアニマルの軽鎖可変領域遺伝子セグメント(又は2つのコンパニオンアニマルの軽鎖可変領域遺伝性セグメント)を含み得る。再構成されたコンパニオンアニマルの軽鎖可変ドメインは、コンパニオンアニマルによって選択された複数の親和性成熟コンパニオンアニマル重鎖と対形成することができ、重鎖可変領域は異なるエピトープに特異的に結合する。軽鎖は、カッパ鎖又はラムダ鎖であってもよい。
例えば、本発明は、以下に関する。
げっ歯動物又はげっ歯動物細胞であって、
(a)全て又は実質的に全ての内因性のげっ歯動物のκ免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントの内因性のげっ歯動物のκ免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子座での、単一のコンパニオンアニマルの軽鎖VJ遺伝子セグメント、又は2つのコンパニオンアニマルの軽鎖VJ遺伝子セグメントによる置き換えであって、各コンパニオンアニマルの遺伝子セグメントが、内因性のげっ歯動物の軽鎖定常遺伝子に作動可能に連結される、置き換え;並びに
(b)一部又は全て又は実質的に全ての内因性のげっ歯動物の重鎖可変領域遺伝子の遺伝子座の、複数のコンパニオンアニマルの重鎖可変領域遺伝子セグメントによる置き換えであって、コンパニオンアニマルの重鎖可変領域遺伝子セグメントが、内因性のげっ歯動物の重鎖定常領域に作動可能に連結され、コンパニオンアニマルの重鎖可変領域遺伝子セグメントが、再構成されたコンパニオンアニマル/げっ歯動物のキメラ重鎖遺伝子を再構成及び形成することができる、置き換え
を含むげっ歯動物又はげっ歯動物細胞。
げっ歯動物又はげっ歯動物細胞であって、
(a)全て又は実質的に全ての内因性のげっ歯動物のκ免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントの内因性のげっ歯動物のκ免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子座での、単一のコンパニオンアニマルの軽鎖VJ遺伝子セグメント、又は2つのコンパニオンアニマルの軽鎖VJ遺伝子セグメントによる置き換えであって、各コンパニオンアニマルの遺伝子セグメントが、内因性のげっ歯動物の軽鎖定常遺伝子に作動可能に連結される、置き換え;並びに
(b)一部又は全て又は実質的に全ての内因性のげっ歯動物の重鎖可変領域遺伝子の遺伝子座の、複数のコンパニオンアニマルの重鎖可変領域遺伝子セグメントによる置き換えであって、コンパニオンアニマルの重鎖可変領域遺伝子セグメントが、内因性のげっ歯動物の重鎖定常領域に作動可能に連結され、コンパニオンアニマルの重鎖可変領域遺伝子セグメントが、再構成されたコンパニオンアニマル/げっ歯動物のキメラ重鎖遺伝子を再構成及び形成することができる、置き換え
を含むげっ歯動物又はげっ歯動物細胞。
実質的に全ての置き換えが、好ましくは90%以上を意味し、例えば、95%以上のそれぞれのげっ歯動物の遺伝子座が置き換えられる。置き換えは、関連するげっ歯動物の遺伝子座が、げっ歯動物の抗体鎖がないか、又はげっ歯動物の鎖の10%未満が遺伝子座から発現するように、好ましくはその不活化遺伝子座から1%未満の発現があるように、不活化され得るという点において、機能的置き換えであり得る。
一態様では、げっ歯動物は、それぞれげっ歯動物のκ及び/若しくはラムダ可変領域をコードする遺伝子を再構成並びに形成することができる内因性のげっ歯動物のκ及び/又はラムダ免疫グロブリン軽鎖可変領域の遺伝子座を欠くか、或いはそれぞれげっ歯動物のκ及び/若しくはラムダ可変領域の形成を防止するのに適切な、そのための部分を欠くか、或いはそれぞれげっ歯動物のκ及び/若しくはラムダ可変領域の形成を防止するのに適切な変異(例えば、欠失又は挿入又は置き換え)を含む。
本発明は、コンパニオンアニマルだけでなく家畜にも関する。コンパニオンアニマルのDNAに関する本明細書に開示される本発明のいずれかの開示又は態様は、家畜のDNAを指すために同様に解釈され得る。家畜としては、例えば、食肉、卵、乳、毛皮、皮革及び羊毛等の労働力並びに商品を生産するために農業環境で飼育される家畜動物が挙げられる。そのような動物の例としては、ウシ、ヤギ、ブタ、シカ及びヒツジが挙げられるが、これらに限定されない。
加えて、本発明は、ニワトリ、シチメンチョウ及び他の飼育鳥類を含む家禽由来のDNAの使用にも同様に関する。コンパニオンアニマルのDNAについての本明細書に記載の全ての態様は、そのような家禽にも同様に適用される。
イヌ科の動物のカッパCDR3
本発明の更なる態様では、本発明者等は、特定イヌ科の動物のIgK CDR3配列が他のものよりも強く発現されることを同定した。3つの最も好ましい配列は、全ての配列の27.55%を一緒に構成し、それぞれ9アミノ酸長である(CDR3に隣接する保存アミノ酸を含まない)。明確性及び疑念の回避のために、IMGTの固有の番号付け体系(Lefranc,M.-P.,Immunology Today,18巻,509頁(1997年)PMID:9386342)を参照して、最初のアミノ酸は位置105に対応し、最後、この場合では9番目のアミノ酸は位置117に対応する。
本発明の更なる態様では、本発明者等は、特定イヌ科の動物のIgK CDR3配列が他のものよりも強く発現されることを同定した。3つの最も好ましい配列は、全ての配列の27.55%を一緒に構成し、それぞれ9アミノ酸長である(CDR3に隣接する保存アミノ酸を含まない)。明確性及び疑念の回避のために、IMGTの固有の番号付け体系(Lefranc,M.-P.,Immunology Today,18巻,509頁(1997年)PMID:9386342)を参照して、最初のアミノ酸は位置105に対応し、最後、この場合では9番目のアミノ酸は位置117に対応する。
イヌにおけるイヌ科の動物のカッパ軽鎖CDR3の発現についてのデータは以下の通りである。
したがって、げっ歯動物又はげっ歯動物細胞(例えば、げっ歯動物のB細胞、又は本明細書に開示される抗体若しくは抗体鎖を発現する細胞)、好ましくはイヌ科の動物のカッパCDR3領域の9アミノ酸(CDR3に隣接する保存アミノ酸を含まない)をコード又は発現する。明確性及び疑念の回避のために、IMGTの固有の番号付け体系(Lefranc,M.-P.,Immunology Today,18巻,509頁(1997年) PMID:9386342)を参照して、最初のアミノ酸は位置105に対応し、最後、この場合では9番目のアミノ酸は位置117に対応する。
イヌ科の動物のIgK DNAを含む本発明のげっ歯動物又はげっ歯動物細胞(例えば、げっ歯動物のB細胞、又は抗体若しくは抗体鎖を発現する発現細胞)が、以下の1のうちから選択される配列を含むか、若しくはその配列からなるイヌ科の動物のカッパCDR3領域をコード及び/又は発現することが好ましい。
一態様では、コード又は発現されるCDR3配列は、QQSLHFPPTを含むか、又はQQSLHFPPTからなる。
一態様では、コード又は発現されるCDR3配列は、QQSLHLPPTを含むか、又はQQSLHLPPTからなる。
一態様では、コード又は発現されるCDR3配列は、GQGTHSPTTを含むか、又はGQGTHSPTTからなる。
CDR3のQQSLHFPPT及びQQSLHLPPTが好ましい。
一態様では、コード又は発現されるCDR3配列は、QQSLHFPPTを含まないか、又はQQSLHFPPTからならず、特に、天然レパートリー内の完全なイヌ科の動物の抗体の形態である場合、又はそのレパートリーから精製される場合、QQSLHFPPTではない。一態様では、コード又は発現されるCDR3配列は、国際公開第2012024650号に開示される形態ではない。疑念の回避のために、コード又は発現されるCDR3のQQSLHFPPTは、医薬組成物の一部であるカッパ鎖中にあってもよく、又は全長カッパ鎖の断片であってもよく、又は二特異性抗体様式等の組合せであってもよい。
別の態様では、イヌ科の動物のIgK DNAを含むげっ歯動物又はげっ歯動物細胞は、位置7にプロリン(P)残基を含むイヌ科の動物のカッパCDR3領域をコード及び/又は発現する。イヌ科の動物のカッパ軽鎖抗体鎖のCDR3領域の96.68%は、そのようなプロリンを含む。
別の態様では、イヌ科の動物のIgK DNAを含むげっ歯動物又はげっ歯動物細胞は、位置2にグルタミン(Q)残基を含むイヌ科の動物のカッパCDR3領域をコード及び/又は発現する。イヌ科の動物のカッパ軽鎖抗体鎖のCDR3領域の97.75%は、そのようなグルタミンを含む。
別の態様では、イヌ科の動物のIgK DNAを含むげっ歯動物又はげっ歯動物細胞は、位置9にトレオニン(T)残基を含むイヌ科の動物のカッパCDR3領域をコード及び/又は発現する。イヌ科の動物のカッパ軽鎖抗体鎖のCDR3領域の97.10%は、そのようなトレオニンを含む。
一態様では、げっ歯動物ゲノムは、単一の再構成されたコンパニオンアニマルの軽鎖可変領域遺伝子、若しくは2つのそのような軽鎖のいずれかをそれぞれ発現するように再構成され得る単一又は2つのイヌ科の動物のカッパ軽鎖可変領域遺伝子セグメントのみを含み、ゲノムに挿入されるイヌ科の動物のカッパDNAは、好ましい3つのイヌ科の動物のカッパCDR3配列の1つを含むか、若しくはそれらからなるか、又は特定の位置で上記で言及された好ましいアミノ酸のP、Q又はTの1つ、2つ若しくは全てを有するCDR3を含む抗体鎖をコード及び/又は発現する。
一態様では、CDR3は、以下のいずれか1つ以上ではない。
ラムダCDR3
本発明の更なる態様では、本発明者等は、特定のイヌ科の動物のIgラムダCDR3配列が天然のイヌ科の動物レパートリー中の他のものよりも強く発現されることを同定した。これらの配列は、典型的には、11アミノ酸長である(CDR3に隣接する保存アミノ酸を含まない)。明確性及び疑念の回避のために、IMGTの固有の番号付け体系(Lefranc,M.-P.,Immunology Today,18巻,509頁(1997年) PMID:9386342)を参照して、最初のアミノ酸は位置105に対応し、最後、この場合では11番目のアミノ酸は位置117に対応する。
本発明の更なる態様では、本発明者等は、特定のイヌ科の動物のIgラムダCDR3配列が天然のイヌ科の動物レパートリー中の他のものよりも強く発現されることを同定した。これらの配列は、典型的には、11アミノ酸長である(CDR3に隣接する保存アミノ酸を含まない)。明確性及び疑念の回避のために、IMGTの固有の番号付け体系(Lefranc,M.-P.,Immunology Today,18巻,509頁(1997年) PMID:9386342)を参照して、最初のアミノ酸は位置105に対応し、最後、この場合では11番目のアミノ酸は位置117に対応する。
イヌにおけるイヌ科の動物のラムダCDR3発現についてのデータを下記に示す。
好ましい残基に関して、それらは、Pommie,C.等,J. Mol. Recognit.,17巻,17～32頁(2004年). PMID:14872534に定義されるクラスに関係する。一態様では、それらはハイドロパシーに基づいて分類され、残基は、疎水性(A、C、I、L、M、F、W、V)、又は中性のハイドロパシー(G、H、P、S、T、Y)、又は親水性(R、N、D、Q、E、K)である。別の態様では、それらは、体積に基づいて分類され、残基は、非常に小さい(A、G、S)、小さい(N、D、C、P、T)、中間(Q、E、H、V)、大きい(R、I、L、K、M)、又は非常に大きい(F、W、Y)。別の態様では、それらは、それらの化学的性質に基づいて分類され、残基は、脂肪族(A、G、I、L、P、V)、芳香族(F、W、Y)、硫黄含有(C、M)、ヒドロキシル(S、T)、塩基性(R、H、K)、酸性(D、E)、又はアミド(N、Q)である。別の態様では、それらは、それらの電荷に基づいて分類され、残基は、正に荷電(R、H、K)、負に荷電(D、E)、又は非荷電(A、N、C、Q、G、I、L、M、F、P、S、T、W、Y、V)である。別の態様では、それらは、それらが水素結合を供与すること及び/又は受容することができるか否かに基づいて分類され、残基は、供与体(R、K、W)、受容体(D、E)、供与体及び受容体の両方(N、Q、H、S、T、Y)であるか、又は供与体でも受容体でもない(A、C、G、I、L、M、F、P,V)。別の態様では、それらは、それらの極性に基づいて分類され、それらは、極性(R、N、D、Q、E、H、K、S、T、Y)、又は非極性(A、C、G、I、L、M、F、P、W、V)である。
位置1
別の態様では、イヌ科の動物のラムダDNAを含むげっ歯動物又はげっ歯動物細胞は、位置1に極性残基を含むイヌ科の動物のラムダCDR3領域をコード及び/又は発現する。
別の態様では、イヌ科の動物のラムダDNAを含むげっ歯動物又はげっ歯動物細胞は、位置1に極性残基を含むイヌ科の動物のラムダCDR3領域をコード及び/又は発現する。
別の態様では、イヌ科の動物のラムダDNAを含むげっ歯動物又はげっ歯動物細胞は、位置1に無電荷残基を含むイヌ科の動物のラムダCDR3領域をコード及び/又は発現する。
別の態様では、イヌ科の動物のラムダDNAを含むげっ歯動物又はげっ歯動物細胞は、位置1に中性のハイドロパシー状態の残基を含むイヌ科の動物のラムダCDR3領域をコード及び/又は発現する。
別の態様では、イヌ科の動物のラムダDNAを含むげっ歯動物又はげっ歯動物細胞は、位置1に水素結合を供与すること及び受容することの両方ができる残基を含むイヌ科の動物のラムダCDR3領域をコード及び/又は発現する。
別の態様では、イヌ科の動物のラムダDNAを含むげっ歯動物又はげっ歯動物細胞は、位置1に非常に小さな残基を含むイヌ科の動物のラムダCDR3領域をコード及び/又は発現する。
別の態様では、イヌ科の動物のラムダDNAを含むげっ歯動物又はげっ歯動物細胞は、位置1にヒドロキシル残基を含むイヌ科の動物のラムダCDR3領域をコード及び/又は発現する。
一態様では、位置1の残基は、上記に列挙された好ましいクラスの1つである。別の態様では、位置1の残基は、上記に列挙された好ましいクラスの2つ以上、例えば、好ましいクラスの2、3、4、5又は6つである。
別の態様では、イヌ科の動物のラムダDNAを含むげっ歯動物又はげっ歯動物細胞は、位置1にセリン(S)残基を含むイヌ科の動物のラムダCDR3領域をコード及び/又は発現する。
位置4
別の態様では、イヌ科の動物のラムダDNAを含むげっ歯動物又はげっ歯動物細胞は、位置4に極性残基を含むイヌ科の動物のラムダCDR3領域をコード及び/又は発現する。
別の態様では、イヌ科の動物のラムダDNAを含むげっ歯動物又はげっ歯動物細胞は、位置4に極性残基を含むイヌ科の動物のラムダCDR3領域をコード及び/又は発現する。
別の態様では、イヌ科の動物のラムダDNAを含むげっ歯動物又はげっ歯動物細胞は、位置4に負に荷電した残基を含むイヌ科の動物のラムダCDR3領域をコード及び/又は発現する。
別の態様では、イヌ科の動物のラムダDNAを含むげっ歯動物又はげっ歯動物細胞は、位置4に親水性残基を含むイヌ科の動物のラムダCDR3領域をコード及び/又は発現する。
別の態様では、イヌ科の動物のラムダDNAを含むげっ歯動物又はげっ歯動物細胞は、位置4に水素結合を受容することができる残基を含むイヌ科の動物のラムダCDR3領域をコード及び/又は発現する。
別の態様では、イヌ科の動物のラムダDNAを含むげっ歯動物又はげっ歯動物細胞は、位置4に小さな残基を含むイヌ科の動物のラムダCDR3領域をコード及び/又は発現する。
別の態様では、イヌ科の動物のラムダDNAを含むげっ歯動物又はげっ歯動物細胞は、位置4に酸性残基を含むイヌ科の動物のラムダCDR3領域をコード及び/又は発現する。
一態様では、位置4の残基は、上記に列挙された好ましいクラスの1つである。別の態様では、位置4の残基は、上記に列挙された好ましいクラスの2つ以上、例えば、好ましいクラスの2、3、4、5又は6つである。
別の態様では、イヌ科の動物のラムダDNAを含むげっ歯動物又はげっ歯動物細胞は、位置4にアスパラギン酸(D)残基を含むイヌ科の動物のラムダCDR3領域をコード及び/又は発現する。
位置6
別の態様では、イヌ科の動物のラムダDNAを含むげっ歯動物又はげっ歯動物細胞は、位置6に極性残基を含むイヌ科の動物のラムダCDR3領域をコード及び/又は発現する。
別の態様では、イヌ科の動物のラムダDNAを含むげっ歯動物又はげっ歯動物細胞は、位置6に極性残基を含むイヌ科の動物のラムダCDR3領域をコード及び/又は発現する。
別の態様では、イヌ科の動物のラムダDNAを含むげっ歯動物又はげっ歯動物細胞は、位置6に無電荷残基を含むイヌ科の動物のラムダCDR3領域をコード及び/又は発現する。
別の態様では、イヌ科の動物のラムダDNAを含むげっ歯動物又はげっ歯動物細胞は、位置6に中性のハイドロパシー状態の残基を含むイヌ科の動物のラムダCDR3領域をコード及び/又は発現する。
別の態様では、イヌ科の動物のラムダDNAを含むげっ歯動物又はげっ歯動物細胞は、位置6に水素結合を供与すること及び受容することの両方ができる残基を含むイヌ科の動物のラムダCDR3領域をコード及び/又は発現する。
別の態様では、イヌ科の動物のラムダDNAを含むげっ歯動物又はげっ歯動物細胞は、位置6に非常に小さな残基を含むイヌ科の動物のラムダCDR3領域をコード及び/又は発現する。
別の態様では、イヌ科の動物のラムダDNAを含むげっ歯動物又はげっ歯動物細胞は、位置6にヒドロキシル残基を含むイヌ科の動物のラムダCDR3領域をコード及び/又は発現する。
一態様では、位置6の残基は、上記に列挙された好ましいクラスの1つである。別の態様では、位置6の残基は、上記に列挙された好ましいクラスの2つ以上、例えば、好ましいクラスの2、3、4、5又は6つである。
別の態様では、イヌ科の動物のラムダDNAを含むげっ歯動物又はげっ歯動物細胞は、位置6にセリン(S)残基を含むイヌ科の動物のラムダCDR3領域をコード及び/又は発現する。
位置7
別の態様では、イヌ科の動物のラムダDNAを含むげっ歯動物又はげっ歯動物細胞は、位置7に非極性残基を含むイヌ科の動物のラムダCDR3領域をコード及び/又は発現する。
別の態様では、イヌ科の動物のラムダDNAを含むげっ歯動物又はげっ歯動物細胞は、位置7に非極性残基を含むイヌ科の動物のラムダCDR3領域をコード及び/又は発現する。
別の態様では、イヌ科の動物のラムダDNAを含むげっ歯動物又はげっ歯動物細胞は、位置7に無電荷残基を含むイヌ科の動物のラムダCDR3領域をコード及び/又は発現する。
別の態様では、イヌ科の動物のラムダDNAを含むげっ歯動物又はげっ歯動物細胞は、位置7に疎水性残基を含むイヌ科の動物のラムダCDR3領域をコード及び/又は発現する。
別の態様では、イヌ科の動物のラムダDNAを含むげっ歯動物又はげっ歯動物細胞は、位置7に水素結合を供与することも受容もすることもできない残基を含むイヌ科の動物のラムダCDR3領域をコード及び/又は発現する。
別の態様では、イヌ科の動物のラムダDNAを含むげっ歯動物又はげっ歯動物細胞は、位置7に大きな残基を含むイヌ科の動物のラムダCDR3領域をコード及び/又は発現する。
別の態様では、イヌ科の動物のラムダDNAを含むげっ歯動物又はげっ歯動物細胞は、位置7に脂肪族残基を含むイヌ科の動物のラムダCDR3領域をコード及び/又は発現する。
一態様では、位置7の残基は、上記に列挙された好ましいクラスの1つである。別の態様では、位置7の残基は、上記に列挙された好ましいクラスの2つ以上、例えば、好ましいクラスの2、3、4、5又は6つである。
別の態様では、イヌ科の動物のラムダDNAを含むげっ歯動物又はげっ歯動物細胞は、位置7にロイシン(L)残基を含むイヌ科の動物のラムダCDR3領域をコード及び/又は発現する。
位置11
別の態様では、イヌ科の動物のラムダDNAを含むげっ歯動物又はげっ歯動物細胞は、位置11に非極性残基を含むイヌ科の動物のラムダCDR3領域をコード及び/又は発現する。
別の態様では、イヌ科の動物のラムダDNAを含むげっ歯動物又はげっ歯動物細胞は、位置11に非極性残基を含むイヌ科の動物のラムダCDR3領域をコード及び/又は発現する。
別の態様では、イヌ科の動物のラムダDNAを含むげっ歯動物又はげっ歯動物細胞は、位置11に無電荷残基を含むイヌ科の動物のラムダCDR3領域をコード及び/又は発現する。
別の態様では、イヌ科の動物のラムダDNAを含むげっ歯動物又はげっ歯動物細胞は、位置11に疎水性残基を含むイヌ科の動物のラムダCDR3領域をコード及び/又は発現する。
別の態様では、イヌ科の動物のラムダDNAを含むげっ歯動物又はげっ歯動物細胞は、位置11に水素結合を供与も受容することもできない残基を含むイヌ科の動物のラムダCDR3領域をコード及び/又は発現する。
別の態様では、イヌ科の動物のラムダDNAを含むげっ歯動物又はげっ歯動物細胞は、位置11に中間サイズの残基を含むイヌ科の動物のラムダCDR3領域をコード及び/又は発現する。
別の態様では、イヌ科の動物のラムダDNAを含むげっ歯動物又はげっ歯動物細胞は、位置11に脂肪族残基を含むイヌ科の動物のラムダCDR3領域をコード及び/又は発現する。
一態様では、位置11の残基は、上記に列挙された好ましいクラスの1つである。別の態様では、位置11の残基は、上記に列挙された好ましいクラスの2つ以上、例えば、好ましいクラスの2、3、4、5又は6つである。
好ましい態様は、以下である。
イヌ科の動物のラムダDNAを含むげっ歯動物又はげっ歯動物細胞は、位置4にアスパラギン酸(D)残基を含むイヌ科の動物のラムダCDR3領域をコード及び/又は発現する。
イヌ科の動物のラムダDNAを含むげっ歯動物又はげっ歯動物細胞は、位置4にアスパラギン酸(D)残基を含むイヌ科の動物のラムダCDR3領域をコード及び/又は発現する。
イヌ科の動物のラムダDNAを含むげっ歯動物又はげっ歯動物細胞は、位置7にロイシン(L)残基を含むイヌ科の動物のラムダCDR3領域をコード及び/又は発現する。
イヌ科の動物のラムダDNAを含むげっ歯動物又はげっ歯動物細胞は、位置1にセリン(S)を含むイヌ科の動物のラムダCDR3領域をコード及び/又は発現する。
イヌ科の動物のラムダDNAを含むげっ歯動物又はげっ歯動物細胞は、位置6にセリン(S)を含むイヌ科の動物のラムダCDR3領域をコード及び/又は発現する。
イヌ科の動物のラムダDNAを含むげっ歯動物又はげっ歯動物細胞は、位置11にバリン(V)を含むイヌ科の動物のラムダCDR3領域をコード及び/又は発現する。
一態様では、本発明のげっ歯動物ゲノムは、単一の再構成されたコンパニオンアニマルの軽鎖可変領域遺伝子、若しくは2つのそのような軽鎖のいずれかをそれぞれ発現するように再構成される単一又は2つのイヌ科の動物のラムダ軽鎖可変領域遺伝子セグメントのみを含み、ゲノムに挿入されるイヌ科の動物のラムダDNAは、ラムダCDR3領域中の上記で言及された好ましいアミノ酸の1個又はそれ以上、例えば、好ましいアミノ酸の2、3、4個又は5個全てを有するCDR3を含む抗体鎖をコード及び/又は発現する。
一態様では、CDR3は、以下のいずれかではない。
マウスにおいて発現するイヌ科の動物のラムダレパートリー
別の態様では、本発明者等は、マウスゲノムから発現される場合に、特定のアミノ酸が、イヌ科の動物のラムダ抗体鎖のCDR3で発現されることを同定した。
別の態様では、本発明者等は、マウスゲノムから発現される場合に、特定のアミノ酸が、イヌ科の動物のラムダ抗体鎖のCDR3で発現されることを同定した。
別の態様では、イヌ科の動物のラムダDNAを含むげっ歯動物又はげっ歯動物細胞は、以下の
位置7又は9のA;
位置4のD;
位置1のQ;
位置8のK;
位置5及び/又は6のS;
位置2及び/又は11のV;並びに
位置3のW
の1つ以上又は全てを含むイヌ科の動物のラムダCDR3領域をコード及び/又は発現する。
位置7又は9のA;
位置4のD;
位置1のQ;
位置8のK;
位置5及び/又は6のS;
位置2及び/又は11のV;並びに
位置3のW
の1つ以上又は全てを含むイヌ科の動物のラムダCDR3領域をコード及び/又は発現する。
マウスにおけるイヌ科の動物のラムダCDR3発現についてのデータは以下の通りである。
一態様では、本発明のげっ歯動物ゲノムは、単一の再構成されたコンパニオンアニマルの軽鎖可変領域遺伝子、若しくは2つのそのような軽鎖のいずれかをそれぞれ発現するように再構成される単一又は2つのイヌ科の動物のラムダ軽鎖可変領域遺伝子セグメントのみを含み、ゲノムに挿入されるイヌ科の動物のラムダDNAは、ラムダCDR3領域中の上記で言及された好ましいアミノ酸の1個又はそれ以上、例えば、上記で言及された好ましいアミノ酸の2、3、4、5、6、7、8、9、10又は11個を有するCDR3を含む抗体鎖をコード及び/又は発現する。
また、好ましい定義された位置で90%より大きい出現度を有するアミノ酸を含むゲノムを有するげっ歯動物及びげっ歯動物細胞が好ましく、並びに95%より大きい出現度を有するもの、例えばV11がより好ましい。
また、イヌにおいて見られるイヌ科の動物の抗体集団、及びマウスにおけるイヌ科の動物の抗体集団において、上記のように好ましいアミノ酸、例えば位置6のセリンを含むゲノムを有するげっ歯動物及びげっ歯動物細胞が好ましい。
イヌ科の動物のラムダ軽鎖について、本発明は、
そのような鎖を含むイヌ科の動物のラムダ軽鎖又は抗体;
そのような鎖又は抗体を含む医薬組成物;
本明細書に記載のいずれかの断片又は誘導体のタイプを含む、Fab又はドメイン抗体又は二特異性抗体等の活性な抗体断片又は誘導体;
のいずれか1つであって、イヌ科の動物のラムダ軽鎖(又は抗体若しくは医薬組成物若しくは抗体断片若しくは誘導体)のCDR3が、げっ歯動物又はげっ歯動物細胞について列挙された上記の好ましいアミノ酸又はクラスのいずれかを含む、に関する。本発明はまた、医薬において使用するため、例えばイヌの疾患の治療又は予防のためのこれらのいずれか、及びイヌの疾患の予防又は治療のための薬剤の調製における上記のいずれかの使用に関する。別の態様では、CDR3は、好ましい位置の2、3、4又は5つ(天然のイヌ科の動物のレパートリーの好ましさを考慮して)、又は好ましいアミノ酸位置の2、3、4、5、6、7、8、9又は10(マウスで発現された通りイヌ科の動物のCDR3の好ましさを考慮する場合)に、好ましいアミノ酸クラス又は好ましいアミノ酸を含む。
そのような鎖を含むイヌ科の動物のラムダ軽鎖又は抗体;
そのような鎖又は抗体を含む医薬組成物;
本明細書に記載のいずれかの断片又は誘導体のタイプを含む、Fab又はドメイン抗体又は二特異性抗体等の活性な抗体断片又は誘導体;
のいずれか1つであって、イヌ科の動物のラムダ軽鎖(又は抗体若しくは医薬組成物若しくは抗体断片若しくは誘導体)のCDR3が、げっ歯動物又はげっ歯動物細胞について列挙された上記の好ましいアミノ酸又はクラスのいずれかを含む、に関する。本発明はまた、医薬において使用するため、例えばイヌの疾患の治療又は予防のためのこれらのいずれか、及びイヌの疾患の予防又は治療のための薬剤の調製における上記のいずれかの使用に関する。別の態様では、CDR3は、好ましい位置の2、3、4又は5つ(天然のイヌ科の動物のレパートリーの好ましさを考慮して)、又は好ましいアミノ酸位置の2、3、4、5、6、7、8、9又は10(マウスで発現された通りイヌ科の動物のCDR3の好ましさを考慮する場合)に、好ましいアミノ酸クラス又は好ましいアミノ酸を含む。
一態様では、CDR3は、好ましい位置の2つに好ましいアミノ酸又はアミノ酸クラスを含む。一態様では、CDR3は、好ましい位置の3つ以上に好ましいアミノ酸又はアミノ酸クラスを含む。
一態様では、各CDR3のアミノ酸位置は、そのアミノ酸位置について少なくとも2つ又は少なくとも3つ以上の好ましいクラスにあるアミノ酸を含む。
これらのイヌ科の動物のラムダCDR3の位置でのアミノ酸のクラス及び/又は特定のアミノ酸の両方の観察された非常に高度の保存は、これらの配列を有する抗体についての生物学的な好ましさが、このようにして、イヌの薬剤としての使用のために適切なイヌ科の動物のラムダ軽鎖の生成及び使用に非常に関連することを示すことが理解されよう。これは、これまでに理解されていなかった。
特に、これまでの全てのイヌ科の動物の薬剤は、カッパ軽鎖を有する。本発明は、イヌ科の動物のラムダ軽鎖、そのような軽鎖を有する抗体を薬剤として提供するのを可能にする。
別の態様では、本発明は、げっ歯動物若しくはげっ歯動物細胞、例えばB細胞、又は抗体を発現するいずれかの発現細胞若しくは細胞株に関し、抗体は、上記の好ましいCDR3配列のいずれか、若しくは上記で言及された好ましいCDR3アミノ酸を有するカッパ軽鎖又はラムダ軽鎖或いはその両方を含む。軽鎖(カッパ若しくはラムダ又はその両方のいずれか)は、完全なイヌ科の動物抗体のカッパ若しくはラムダ軽鎖の形態、又は再構成されたイヌ科の動物の可変領域及び宿主のげっ歯動物細胞由来のげっ歯動物の定常領域を有するキメラカッパ若しくはラムダ軽鎖の形態のいずれかであり得る。完全なイヌ科の動物のカッパ又はラムダ軽鎖は、キメラ(イヌ科の動物の可変領域、げっ歯動物の定常領域)重鎖を伴ってもよい。キメラのカッパ又はラムダ軽鎖は、キメラのイヌ科の動物の重鎖、又はイヌ科の動物の可変領域及びイヌ科の動物の定常領域の両方を有する完全なイヌ科の動物重鎖を伴ってもよい。
別の態様では、本明細書に記載のいずれかの方法によって得ることができるか、又は得られる抗体は、上記に記載の好ましいアミノ酸、又はアミノ酸配列のいずれかを有する軽鎖CDR3を含む。
本明細書におけるCDR3領域の番号付けは、
http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/IMGTIGVLsuperfamily.htmlに開示されるIMGT体系を参照することによって定義される。
http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/IMGTIGVLsuperfamily.htmlに開示されるIMGT体系を参照することによって定義される。
本発明の追加の態様としては、以下が挙げられる。
完全なイヌ科の動物の重鎖及び完全なイヌ科の動物の軽鎖を有するイヌ科の動物の抗体であって、
(i)軽鎖が、
位置4にアスパラギン酸(D)を含むラムダCDR3領域、
位置7にロイシン(L)残基を含むラムダCDR3領域、
位置1にセリン(S)を含むラムダCDR3領域、
位置6にセリン(S)を含むラムダCDR3領域、
位置11にバリン(V)を含むラムダCDR3領域
の1つを有するラムダ軽鎖であるか、
又は、ラムダ軽鎖が、好ましい位置に上記の好ましいアミノ酸の2、3、4若しくは5個を含むか、
又は、ラムダ軽鎖が、2つ以上のクラスの特性を有する好ましい上記の位置にアミノ酸を含み、
或いは、
(ii)軽鎖が、
位置7若しくは9にAn Aを含むラムダCDR3領域、
位置4にDを含むラムダCDR3領域、
位置8にA Kを含むラムダCDR3領域、
位置5及び/又は6にAn Sを含むラムダCDR3領域、
位置2及び/又は11にA Vを含むラムダCDR3領域、並びに
位置3にWを含むラムダCDR3領域、
の1つを有するラムダ軽鎖であるか、
又は、ラムダ軽鎖が、好ましい位置に上記の好ましいアミノ酸の2、3、4、5、6、7、8、9、10又は11個を含み、
特に、アミノ酸が、イヌ科の動物のラムダの位置6のSであり、
或いは、
(iii)軽鎖が、
位置7にプロリン(P)を含むイヌ科の動物のカッパCDR3領域、
位置2にグルタミン(Q)を含むイヌ科の動物のカッパCDR3領域、
位置9にトレオニン(T)を含むイヌ科の動物のカッパCDR3領域、
の1つを有するカッパ軽鎖であるか、
又は、カッパ軽鎖が、例えば、好ましい位置に上記の好ましいアミノ酸の2若しくは3個を含むか、
又は、軽鎖が、QQSLHFPPT、QQSLHLPPT又はGQGTHSPTTから選択されるCDR3を有するカッパ軽鎖であり、
必要に応じて、抗体が、カッパCDR3配列
完全なイヌ科の動物の重鎖及び完全なイヌ科の動物の軽鎖を有するイヌ科の動物の抗体であって、
(i)軽鎖が、
位置4にアスパラギン酸(D)を含むラムダCDR3領域、
位置7にロイシン(L)残基を含むラムダCDR3領域、
位置1にセリン(S)を含むラムダCDR3領域、
位置6にセリン(S)を含むラムダCDR3領域、
位置11にバリン(V)を含むラムダCDR3領域
の1つを有するラムダ軽鎖であるか、
又は、ラムダ軽鎖が、好ましい位置に上記の好ましいアミノ酸の2、3、4若しくは5個を含むか、
又は、ラムダ軽鎖が、2つ以上のクラスの特性を有する好ましい上記の位置にアミノ酸を含み、
或いは、
(ii)軽鎖が、
位置7若しくは9にAn Aを含むラムダCDR3領域、
位置4にDを含むラムダCDR3領域、
位置8にA Kを含むラムダCDR3領域、
位置5及び/又は6にAn Sを含むラムダCDR3領域、
位置2及び/又は11にA Vを含むラムダCDR3領域、並びに
位置3にWを含むラムダCDR3領域、
の1つを有するラムダ軽鎖であるか、
又は、ラムダ軽鎖が、好ましい位置に上記の好ましいアミノ酸の2、3、4、5、6、7、8、9、10又は11個を含み、
特に、アミノ酸が、イヌ科の動物のラムダの位置6のSであり、
或いは、
(iii)軽鎖が、
位置7にプロリン(P)を含むイヌ科の動物のカッパCDR3領域、
位置2にグルタミン(Q)を含むイヌ科の動物のカッパCDR3領域、
位置9にトレオニン(T)を含むイヌ科の動物のカッパCDR3領域、
の1つを有するカッパ軽鎖であるか、
又は、カッパ軽鎖が、例えば、好ましい位置に上記の好ましいアミノ酸の2若しくは3個を含むか、
又は、軽鎖が、QQSLHFPPT、QQSLHLPPT又はGQGTHSPTTから選択されるCDR3を有するカッパ軽鎖であり、
必要に応じて、抗体が、カッパCDR3配列
のいずれかを含まない
イヌ科の動物の抗体。
イヌ科の動物の抗体。
加えて、本発明は、以下に関する。
前記イヌ科の動物の抗体のいずれかを、薬学的な希釈剤、担体又は賦形剤との適切な組合せで含む医薬組成物。
医薬において、特に、イヌにおける疾患の治療又は予防において使用するための本明細書に開示されるイヌ科の動物の抗体又は医薬組成物であって、一態様では、イヌはボクサーではない、イヌ科の動物の抗体又は医薬組成物。
イヌにおける疾患の治療又は予防のための医薬の調製における本明細書に開示されるイヌ科の動物の抗体又は医薬組成物の使用。
イヌにおける疾患の治療又は予防の方法であって、ラムダ軽鎖、好ましくは、本発明に記載のラムダCDR3領域を含む抗体を、それを必要とするイヌに送達する工程を含む方法。
本発明者らは、驚くべきことに、上記の好ましいCDR3アミノ酸及びCDR3配列が、イヌ科の動物の抗体の集団において非常に高度に出現することを決定した。特定のアミノ酸残基についてのこの非常に強い好ましさは、予測可能ではなかった。
一態様では、抗体は、以下のラムダCDR3配列
のいずれかを含まない。
好ましい方法は、完全なコンパニオンアニマルの抗体、例えば、完全なイヌ科の動物の抗体を得る方法であって、本明細書に記載のいずれかの方法を使用して少なくともコンパニオンアニマルの可変領域を含む抗体を発現させる工程、及び最終工程として、許容される薬学的な賦形剤とともに完全なコンパニオンアニマルの抗体を製剤化して、医薬組成物を形成する工程、次いで、必要に応じて抗体を包装する工程を含む方法を含む。本発明はまた、適切な哺乳動物、例えば、同族のコンパニオンアニマルにおける抗体又は組成物の使用に関する。
本明細書における抗体への言及はまた、本明細書に開示される抗体鎖又は任意の生物学的に活性な抗体断片への言及でもあり得る。
本明細書における「イヌ科の動物の抗体」への言及は、例えば、イヌにおいて天然に発現し得るか、又はマウス等のげっ歯動物のゲノムへの挿入後にイヌ科の動物のVDJ又はVJ領域遺伝子の組換えによって発現し得る抗体の可変領域のアミノ酸配列と連結された、天然に存在するイヌ科の動物の定常領域のアミノ酸配列、又は1つ以上のエフェクター機能を有するその機能的部分を含む。したがって、本発明のイヌ科の動物の抗体が、イヌ科の動物のV、(D)及びJ領域遺伝子の組換えから得ることができる抗体であるが、抗体の起源は限定されないことが理解されよう。
特定の本発明の好ましい実施形態は、以下の記載に反映される。
1.i)1つ以上のコンパニオンアニマルのIGH V領域遺伝子、1つ以上のコンパニオンアニマルのD領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルのJ領域遺伝子と、
ii)必要に応じて、1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLカッパV領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLカッパJ領域遺伝子;並びに/又は1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLラムダV領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLラムダJ領域遺伝子と
を含むゲノムを有するげっ歯動物又はげっ歯動物細胞であって、
げっ歯動物又はげっ歯動物細胞が、コンパニオンアニマルの可変領域遺伝子を発現して抗体鎖を形成することができ、
コンパニオンアニマル種がげっ歯動物ではない、
げっ歯動物又はげっ歯動物細胞。
2.i)1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLカッパV領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLカッパJ領域遺伝子;並びに/又は1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLラムダV領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLラムダJ領域遺伝子と、
ii)必要に応じて、1つ以上のコンパニオンアニマルのIGH V領域遺伝子、1つ以上のコンパニオンアニマル又は宿主のD領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマル又は宿主のJ領域遺伝子と
を含むゲノムを有するげっ歯動物又はげっ歯動物細胞であって、
げっ歯動物又はげっ歯動物細胞が、コンパニオンアニマルの可変領域遺伝子を発現して抗体鎖を形成することができ、
コンパニオンアニマル種がげっ歯動物ではない、
げっ歯動物又はげっ歯動物細胞。
3.挿入されたコンパニオンアニマルのV、D、又はJ領域遺伝子の1つ以上が、同一のコンパニオンアニマル由来の制御配列を伴う、記載1又は2に記載のげっ歯動物又はげっ歯動物細胞。
4.げっ歯動物のゲノムが、重鎖と少なくとも1つの軽鎖の両方に由来するコンパニオンアニマルの遺伝子を含む、記載1から3に記載のげっ歯動物又はげっ歯動物細胞。
5.少なくとも4、5、10、15、20、30、40、50、60、70、又は少なくとも80個のコンパニオンアニマルのIGH V領域遺伝子を含み、必要に応じてV領域遺伝子がイヌ科の動物のものである、記載1～4のいずれか一項に記載のげっ歯動物又はげっ歯動物細胞。
6.少なくとも4、5、10、15、16、17、18、又は19個のコンパニオンアニマルのIGLカッパV領域遺伝子を含み、必要に応じてV領域遺伝子がイヌ科の動物のものである、記載1～5のいずれか一項に記載のげっ歯動物又はげっ歯動物細胞。
7.少なくとも5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、又は少なくとも160個のコンパニオンアニマルのIGLラムダV領域遺伝子を含み、必要に応じてV領域遺伝子がイヌ科の動物のものである、記載1～6のいずれか一項に記載のげっ歯動物又はげっ歯動物細胞。
8.コンパニオンアニマルの遺伝子が、げっ歯動物の定常領域のゲノム上流に、挿入されるコンパニオンアニマル重鎖可変領域遺伝子については重鎖定常領域の上流に適切に、及び挿入されるコンパニオンアニマル軽鎖可変領域遺伝子については軽鎖定常領域の上流に適切に位置し、これにより、げっ歯動物又はげっ歯動物細胞は、挿入される可変領域遺伝子と宿主の定常領域の発現に起因するキメラ抗体鎖を生成できる、記載1～7のいずれか一項に記載のげっ歯動物又はげっ歯動物細胞。
9.コンパニオンアニマルの遺伝子が、同一のコンパニオンアニマル由来の定常領域とともに機能的配置でゲノム中に位置し、これによりげっ歯動物が、挿入されるコンパニオンアニマルのVDJ又はVJ領域遺伝子と、コンパニオンアニマルの定常領域との発現に起因する抗体鎖を産生することができ、必要に応じて、コンパニオンアニマル遺伝子が、同一のコンパニオンアニマルに由来するラムダ定常領域とともに機能的配置にあるラムダ軽鎖V及びJ遺伝子である、ゲノムを有する、記載1～7のいずれか一項に記載のげっ歯動物又はげっ歯動物細胞。
10.げっ歯動物のカッパ定常領域の下流等のげっ歯動物細胞のカッパ遺伝子座に位置する、1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLラムダV領域遺伝子、1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLラムダJ領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルラムダ定常領域遺伝子を含む、記載1～9のいずれか一項に記載のげっ歯動物又はげっ歯動物細胞。
11.イヌ科の動物のカッパ可変領域遺伝子を含み、げっ歯動物のゲノムのイヌ科の動物のカッパ可変領域遺伝子は全て、可変領域遺伝子がそれとともに発現する定常領域の上流に位置し、必要に応じて、宿主のカッパ定常領域の上流に位置する、記載1～10のいずれか一項に記載のげっ歯動物又はげっ歯動物細胞。
12.コンパニオンの遺伝子セグメントの全てがCanFam 3.1のイヌ科の動物の参照対立遺伝子に対応するか、又はコンパニオンの遺伝子セグメントが以下の遺伝子セグメントIGKV2-S13、IGLV 1-57、IGLV 1-68、IGLV 1-72、IGLV 1-88、IGLV 1-96、IGLV 8-60、IGLV 8-90、及びIGLV 8-120のうちの1つ以上からの非参照対立遺伝子を含む、記載1～11のいずれか一項に記載のげっ歯動物又はげっ歯動物細胞。
13.げっ歯動物がマウスであり、コンパニオンアニマルがイヌ、又はネコ、又はウマであり、好ましくはイヌである、記載1～12のいずれか一項に記載のげっ歯動物又はげっ歯動物細胞。
14.記載1～13のいずれか一項に記載のげっ歯動物又はげっ歯動物細胞を産生する方法であって、げっ歯動物細胞ゲノムに1つ以上のコンパニオンアニマルのIGH V領域遺伝子、1つ以上のコンパニオンアニマルのIGH D領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルのIGH J領域遺伝子を挿入する工程を含み、げっ歯動物又はげっ歯動物細胞が、定常領域との組合せでコンパニオンアニマルの可変領域遺伝子を発現し、抗体鎖を形成できる、方法。
15.げっ歯動物細胞ゲノムに1つ以上のコンパニオンアニマルのIGL V領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルのIGL領域J遺伝子を挿入する工程を含み、げっ歯動物又はげっ歯動物細胞が、定常領域との組合せでコンパニオンアニマルの可変領域遺伝子を発現し、抗体鎖を形成できる、記載14に規定のげっ歯動物又はげっ歯動物細胞を産生する方法。
16.所望の抗原に特異的な抗体鎖を産生する方法であって、記載1から13のいずれか一項に記載のげっ歯動物を所望の抗原で免疫する工程と、抗体鎖を単独で若しくは完全抗体の一部として回収するか、又は抗体鎖を単独で若しくは完全抗体の一部として産生する細胞を回収する工程とを含む方法。
17.所望の抗原に特異的であり、単一種のコンパニオンアニマルに由来する抗体鎖又は抗体を産生する方法であって、記載1から13のいずれか一項に規定のコンパニオンの遺伝子を含むげっ歯動物を免疫する工程と、次いで抗体をコードする核酸を適切に操作することにより、げっ歯動物の抗体鎖の定常領域を同一のコンパニオンアニマル由来のコンパニオンアニマルの定常領域で置き換える工程とを含む方法。
18.コンパニオンアニマルの可変領域を有する抗体鎖又はその一部を産生する方法であって、抗体鎖又はその一部をコードするDNAを細胞内で発現させる工程を含み、
抗体鎖の可変領域をコードするDNAの配列は、抗体鎖が産生されるように記載1から13のいずれか一項に記載のげっ歯動物を抗原で免疫することによりそこから得られるか、又は得ることができ、
必要に応じて、方法が、次の:
(i)抗原受容体鎖を精製及び/又は単離する工程と、
(ii)必要に応じて、次いで、抗原受容体鎖をコンパニオンアニマルへの投与に適した薬学的に許容される製剤に製剤化する工程と
を含む方法。
19.記載1から13のいずれか一項に記載のげっ歯動物若しくはげっ歯動物細胞から、又は記載16から18のいずれか一項に記載の方法から得られるか、又は得ることができる抗体若しくは抗体鎖、又はその一部、又は抗体鎖若しくはその一部をコードするDNA。
20.それを必要とするコンパニオンアニマルの疾患の治療又は予防における使用のための、記載1から13のいずれか一項に記載のげっ歯動物又は細胞から得られるか、又は得ることができる抗体若しくは抗体鎖、又はその一部。
21.コンパニオンアニマルの治療の方法であって、記載1から13のいずれか一項に記載のげっ歯動物若しくは細胞から、又は記載16から18のいずれか一項に記載の方法から得られるか、又は得ることができる抗体若しくは抗体鎖、又はその一部を、それを必要とするコンパニオンアニマルに送達する工程を含む方法。
22.げっ歯動物又はげっ歯動物細胞において、全体又は一部の、内因性免疫グロブリン可変領域遺伝子座を相同又はオルソロガスなコンパニオンアニマルの遺伝子座及び制御配列に置き換える方法であって、
i)相同又はオルソロガスなコンパニオンアニマルの遺伝子座及び制御配列の全部又は一部を含むクローンニングされたゲノム断片又は合成配列を取得する工程と、
ii)相同組換えを使用して、(i)のクローンニングされたゲノム断片を遺伝的に改変して、げっ歯動物又はげっ歯動物細胞で使用するための大きなターゲティングベクターを作製する工程と、
iii)(ii)のベクターをげっ歯動物又はげっ歯動物細胞に導入して、内因性免疫グロブリン可変遺伝子座を全体又は一部を置き換える工程と
を含む方法。
1.i)1つ以上のコンパニオンアニマルのIGH V領域遺伝子、1つ以上のコンパニオンアニマルのD領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルのJ領域遺伝子と、
ii)必要に応じて、1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLカッパV領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLカッパJ領域遺伝子;並びに/又は1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLラムダV領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLラムダJ領域遺伝子と
を含むゲノムを有するげっ歯動物又はげっ歯動物細胞であって、
げっ歯動物又はげっ歯動物細胞が、コンパニオンアニマルの可変領域遺伝子を発現して抗体鎖を形成することができ、
コンパニオンアニマル種がげっ歯動物ではない、
げっ歯動物又はげっ歯動物細胞。
2.i)1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLカッパV領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLカッパJ領域遺伝子;並びに/又は1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLラムダV領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLラムダJ領域遺伝子と、
ii)必要に応じて、1つ以上のコンパニオンアニマルのIGH V領域遺伝子、1つ以上のコンパニオンアニマル又は宿主のD領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマル又は宿主のJ領域遺伝子と
を含むゲノムを有するげっ歯動物又はげっ歯動物細胞であって、
げっ歯動物又はげっ歯動物細胞が、コンパニオンアニマルの可変領域遺伝子を発現して抗体鎖を形成することができ、
コンパニオンアニマル種がげっ歯動物ではない、
げっ歯動物又はげっ歯動物細胞。
3.挿入されたコンパニオンアニマルのV、D、又はJ領域遺伝子の1つ以上が、同一のコンパニオンアニマル由来の制御配列を伴う、記載1又は2に記載のげっ歯動物又はげっ歯動物細胞。
4.げっ歯動物のゲノムが、重鎖と少なくとも1つの軽鎖の両方に由来するコンパニオンアニマルの遺伝子を含む、記載1から3に記載のげっ歯動物又はげっ歯動物細胞。
5.少なくとも4、5、10、15、20、30、40、50、60、70、又は少なくとも80個のコンパニオンアニマルのIGH V領域遺伝子を含み、必要に応じてV領域遺伝子がイヌ科の動物のものである、記載1～4のいずれか一項に記載のげっ歯動物又はげっ歯動物細胞。
6.少なくとも4、5、10、15、16、17、18、又は19個のコンパニオンアニマルのIGLカッパV領域遺伝子を含み、必要に応じてV領域遺伝子がイヌ科の動物のものである、記載1～5のいずれか一項に記載のげっ歯動物又はげっ歯動物細胞。
7.少なくとも5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、又は少なくとも160個のコンパニオンアニマルのIGLラムダV領域遺伝子を含み、必要に応じてV領域遺伝子がイヌ科の動物のものである、記載1～6のいずれか一項に記載のげっ歯動物又はげっ歯動物細胞。
8.コンパニオンアニマルの遺伝子が、げっ歯動物の定常領域のゲノム上流に、挿入されるコンパニオンアニマル重鎖可変領域遺伝子については重鎖定常領域の上流に適切に、及び挿入されるコンパニオンアニマル軽鎖可変領域遺伝子については軽鎖定常領域の上流に適切に位置し、これにより、げっ歯動物又はげっ歯動物細胞は、挿入される可変領域遺伝子と宿主の定常領域の発現に起因するキメラ抗体鎖を生成できる、記載1～7のいずれか一項に記載のげっ歯動物又はげっ歯動物細胞。
9.コンパニオンアニマルの遺伝子が、同一のコンパニオンアニマル由来の定常領域とともに機能的配置でゲノム中に位置し、これによりげっ歯動物が、挿入されるコンパニオンアニマルのVDJ又はVJ領域遺伝子と、コンパニオンアニマルの定常領域との発現に起因する抗体鎖を産生することができ、必要に応じて、コンパニオンアニマル遺伝子が、同一のコンパニオンアニマルに由来するラムダ定常領域とともに機能的配置にあるラムダ軽鎖V及びJ遺伝子である、ゲノムを有する、記載1～7のいずれか一項に記載のげっ歯動物又はげっ歯動物細胞。
10.げっ歯動物のカッパ定常領域の下流等のげっ歯動物細胞のカッパ遺伝子座に位置する、1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLラムダV領域遺伝子、1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLラムダJ領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルラムダ定常領域遺伝子を含む、記載1～9のいずれか一項に記載のげっ歯動物又はげっ歯動物細胞。
11.イヌ科の動物のカッパ可変領域遺伝子を含み、げっ歯動物のゲノムのイヌ科の動物のカッパ可変領域遺伝子は全て、可変領域遺伝子がそれとともに発現する定常領域の上流に位置し、必要に応じて、宿主のカッパ定常領域の上流に位置する、記載1～10のいずれか一項に記載のげっ歯動物又はげっ歯動物細胞。
12.コンパニオンの遺伝子セグメントの全てがCanFam 3.1のイヌ科の動物の参照対立遺伝子に対応するか、又はコンパニオンの遺伝子セグメントが以下の遺伝子セグメントIGKV2-S13、IGLV 1-57、IGLV 1-68、IGLV 1-72、IGLV 1-88、IGLV 1-96、IGLV 8-60、IGLV 8-90、及びIGLV 8-120のうちの1つ以上からの非参照対立遺伝子を含む、記載1～11のいずれか一項に記載のげっ歯動物又はげっ歯動物細胞。
13.げっ歯動物がマウスであり、コンパニオンアニマルがイヌ、又はネコ、又はウマであり、好ましくはイヌである、記載1～12のいずれか一項に記載のげっ歯動物又はげっ歯動物細胞。
14.記載1～13のいずれか一項に記載のげっ歯動物又はげっ歯動物細胞を産生する方法であって、げっ歯動物細胞ゲノムに1つ以上のコンパニオンアニマルのIGH V領域遺伝子、1つ以上のコンパニオンアニマルのIGH D領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルのIGH J領域遺伝子を挿入する工程を含み、げっ歯動物又はげっ歯動物細胞が、定常領域との組合せでコンパニオンアニマルの可変領域遺伝子を発現し、抗体鎖を形成できる、方法。
15.げっ歯動物細胞ゲノムに1つ以上のコンパニオンアニマルのIGL V領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルのIGL領域J遺伝子を挿入する工程を含み、げっ歯動物又はげっ歯動物細胞が、定常領域との組合せでコンパニオンアニマルの可変領域遺伝子を発現し、抗体鎖を形成できる、記載14に規定のげっ歯動物又はげっ歯動物細胞を産生する方法。
16.所望の抗原に特異的な抗体鎖を産生する方法であって、記載1から13のいずれか一項に記載のげっ歯動物を所望の抗原で免疫する工程と、抗体鎖を単独で若しくは完全抗体の一部として回収するか、又は抗体鎖を単独で若しくは完全抗体の一部として産生する細胞を回収する工程とを含む方法。
17.所望の抗原に特異的であり、単一種のコンパニオンアニマルに由来する抗体鎖又は抗体を産生する方法であって、記載1から13のいずれか一項に規定のコンパニオンの遺伝子を含むげっ歯動物を免疫する工程と、次いで抗体をコードする核酸を適切に操作することにより、げっ歯動物の抗体鎖の定常領域を同一のコンパニオンアニマル由来のコンパニオンアニマルの定常領域で置き換える工程とを含む方法。
18.コンパニオンアニマルの可変領域を有する抗体鎖又はその一部を産生する方法であって、抗体鎖又はその一部をコードするDNAを細胞内で発現させる工程を含み、
抗体鎖の可変領域をコードするDNAの配列は、抗体鎖が産生されるように記載1から13のいずれか一項に記載のげっ歯動物を抗原で免疫することによりそこから得られるか、又は得ることができ、
必要に応じて、方法が、次の:
(i)抗原受容体鎖を精製及び/又は単離する工程と、
(ii)必要に応じて、次いで、抗原受容体鎖をコンパニオンアニマルへの投与に適した薬学的に許容される製剤に製剤化する工程と
を含む方法。
19.記載1から13のいずれか一項に記載のげっ歯動物若しくはげっ歯動物細胞から、又は記載16から18のいずれか一項に記載の方法から得られるか、又は得ることができる抗体若しくは抗体鎖、又はその一部、又は抗体鎖若しくはその一部をコードするDNA。
20.それを必要とするコンパニオンアニマルの疾患の治療又は予防における使用のための、記載1から13のいずれか一項に記載のげっ歯動物又は細胞から得られるか、又は得ることができる抗体若しくは抗体鎖、又はその一部。
21.コンパニオンアニマルの治療の方法であって、記載1から13のいずれか一項に記載のげっ歯動物若しくは細胞から、又は記載16から18のいずれか一項に記載の方法から得られるか、又は得ることができる抗体若しくは抗体鎖、又はその一部を、それを必要とするコンパニオンアニマルに送達する工程を含む方法。
22.げっ歯動物又はげっ歯動物細胞において、全体又は一部の、内因性免疫グロブリン可変領域遺伝子座を相同又はオルソロガスなコンパニオンアニマルの遺伝子座及び制御配列に置き換える方法であって、
i)相同又はオルソロガスなコンパニオンアニマルの遺伝子座及び制御配列の全部又は一部を含むクローンニングされたゲノム断片又は合成配列を取得する工程と、
ii)相同組換えを使用して、(i)のクローンニングされたゲノム断片を遺伝的に改変して、げっ歯動物又はげっ歯動物細胞で使用するための大きなターゲティングベクターを作製する工程と、
iii)(ii)のベクターをげっ歯動物又はげっ歯動物細胞に導入して、内因性免疫グロブリン可変遺伝子座を全体又は一部を置き換える工程と
を含む方法。
本明細書に記載される特定の実施形態は、本発明の限定としてではなく、例示として示されることが理解されるであろう。本発明の主な特徴は、本発明の範囲から逸脱することなく、様々な実施形態で使用することができる。当業者は、日常的な研究にすぎないものを用いて、本明細書において記載される具体的な手順の多くの均等物を認識するか、又はそれを確かめることができるであろう。そのような均等物は、本発明の範囲内にあるとみなされ、特許請求の範囲に含まれる。本明細書中で言及されている全ての刊行物及び特許出願は、本発明が関係する当業者の技術水準を示している。全ての刊行物及び特許出願は、個々の刊行物又は特許出願が、参照により組み込まれているように具体的かつ個別に示されているかのように、それと同程度まで、参照により本明細書に組み込まれている。特許請求の範囲及び/又は本明細書において用語「含む(comprising)」と合わせて使用される場合の「1つの(a)」又は「1つの(an)」という用語の使用は、「1つ(one)」を意味する場合もあるが、それはまた「1つ以上(one or more)」、「少なくとも1つ(at least one)」、及び「1つ又は1つ以上(one or more than one)」の意味とも一致する。特許請求の範囲における用語「又は(or)」の使用は、本開示が選択肢のみ、及び「及び/又は(and/or)」を指す定義を裏付けるとしても、選択肢のみを指すと明示的に示されない限り、又は選択肢が互いに排他的である場合を除いて、「及び/又は(and/or)」を意味するのに使用される。この出願全体を通して、「約(about)」という用語は、値が装置、すなわち値を決定するために採用されている方法の誤差の固有の変動、又は研究対象間に存在する変動を含むことを示すために使用される。
本明細書及び特許請求の範囲において使用されるとき、用語「含むこと(comprising)」(並びに、「含む(comprise)」及び「含む(comprises)」等の含むことの任意の形態)、「有する(having)」こと(並びに、「有する(have)」及び「有する(has)」等の有することの任意の形態)、「含む(including)」こと(並びに、「含む(includes)」及び「含む(include)」等の含むことの任意の形態)、又は「含む(containing)」こと(並びに、「含む(contains)」及び「含む(contain)」等の含むことの任意の形態)は、両立的又はオープンエンドであり、追加の、言及されていない要素又は方法の工程を排除しない。
本明細書において使用されるとき、「又はそれらの組み合わせ(or combinations thereof)」という用語は、用語に先行して列挙された項目の全ての順列及び組み合わせを指す。例えば、「A、B、C、又はそれらの組み合わせ(A, B, C, or combinations thereof)」は、A、B、C、AB、AC、BC、又はABCの少なくとも1つを含むことを意図しており、特定の文脈において順序が重要である場合、BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC、又はCABをもまた含む。この例を続けると、例えばBB、AAA、ABAB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等の1つ以上の項目又は用語の繰り返しを含む組み合わせが明示的に含まれる。当業者であれば、文脈から他が明らかでない限り、典型的には、任意の組み合わせにおける項目又は用語の数に制限はないことを理解するであろう。
本開示の任意の部分は、文脈からそうでないことが明らかでない限り、本開示の任意の他の部分と組み合わせて読むことができる。
本明細書に開示され請求される全ての組成物及び/又は方法は、本開示に照らして過度の実験をすることなく作製及び実行することができる。本発明の組成物及び方法を好ましい実施形態に関して説明してきたが、本発明の概念、趣旨及び範囲から逸脱することなく、本明細書に記載される、組成物及び/又は方法、並びに方法の工程又は工程の順序に変更を加えてもよいことが当業者には明らかであろう。当業者に明らかなそのような類似の置換及び改変は全て、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨、範囲及び概念内にあるとみなされる。
本発明は、以下の非限定的な実施例においてより詳細に説明される。
(実施例1)
イヌ科の動物のIG遺伝子座の注釈
イヌは、ヒトの疾患の優れたモデルであり、例えば、イヌ科の動物のリンパ腫の治療は、多くの場合、その治療に対するヒトの反応を予測する。しかしながら、それらの抗原受容体(AR)遺伝子座が不完全にしか分っていないため、その使用は制限される。この研究は、イヌ科の動物のAR遺伝子座の注釈を進め、その進化ストレスを調査する方法を開発し、遺伝子座の品種固有の特徴を調べる。偏りのないRNAシークエンシングとともにバイオインフォマティクスのアプローチを使用して、イヌ科の動物のAR遺伝子の注釈を完成させ、これらの配列を使用して19の品種から107個の全ゲノム配列を照会した。既存の方法と新規の方法の組み合わせを使用して、これらの遺伝子にわたる多様性と変異率を分析した。AR遺伝子座の約550個の遺伝子セグメント(そのうち326に新たに注釈が付けられている)にわたって5,500を超える新規対立遺伝子が同定され、AR進化の洞察が得られ、並びにイヌとヒトとの間において、そのいずれかとマウスとの間よりも保存性が高いことが確認された。この研究により、イヌのARの遺伝学と発現に関する理解がマウス及びヒトと同一の高水準になり、注釈を付けた全てのAR遺伝子座を有する、たった3番目の種になった。多数のゲノム配列は、将来の研究の参考になり、これらの遺伝子座を形作ったストレスについて統計的に強力な結論を引き出すことができた。
イヌ科の動物のIG遺伝子座の注釈
イヌは、ヒトの疾患の優れたモデルであり、例えば、イヌ科の動物のリンパ腫の治療は、多くの場合、その治療に対するヒトの反応を予測する。しかしながら、それらの抗原受容体(AR)遺伝子座が不完全にしか分っていないため、その使用は制限される。この研究は、イヌ科の動物のAR遺伝子座の注釈を進め、その進化ストレスを調査する方法を開発し、遺伝子座の品種固有の特徴を調べる。偏りのないRNAシークエンシングとともにバイオインフォマティクスのアプローチを使用して、イヌ科の動物のAR遺伝子の注釈を完成させ、これらの配列を使用して19の品種から107個の全ゲノム配列を照会した。既存の方法と新規の方法の組み合わせを使用して、これらの遺伝子にわたる多様性と変異率を分析した。AR遺伝子座の約550個の遺伝子セグメント(そのうち326に新たに注釈が付けられている)にわたって5,500を超える新規対立遺伝子が同定され、AR進化の洞察が得られ、並びにイヌとヒトとの間において、そのいずれかとマウスとの間よりも保存性が高いことが確認された。この研究により、イヌのARの遺伝学と発現に関する理解がマウス及びヒトと同一の高水準になり、注釈を付けた全てのAR遺伝子座を有する、たった3番目の種になった。多数のゲノム配列は、将来の研究の参考になり、これらの遺伝子座を形作ったストレスについて統計的に強力な結論を引き出すことができた。
1.導入
この研究では、イヌ科の動物のIGK及びIGLに注釈が付けられ、IGH遺伝子座が更新された(図1～図3)。100匹を超えるイヌの全ゲノム配列データを使用して、5,000の非参照対立遺伝子を同定し、これらは、これらの遺伝子座を形作った進化ストレスに光を当てた。種間比較により、更なる洞察が得られ、イヌがより忠実な免疫モデルであることを確認した。
この研究では、イヌ科の動物のIGK及びIGLに注釈が付けられ、IGH遺伝子座が更新された(図1～図3)。100匹を超えるイヌの全ゲノム配列データを使用して、5,000の非参照対立遺伝子を同定し、これらは、これらの遺伝子座を形作った進化ストレスに光を当てた。種間比較により、更なる洞察が得られ、イヌがより忠実な免疫モデルであることを確認した。
2.物質及び方法
2.1.1 バイオインフォマティクスによる注釈
遺伝子座には、最初はDas等に類似する方法に従って、Olivieri等のアルゴリズムと同等の原理を使用して注釈が付けられた1、2。簡潔に述べると、ヒト及びマウスの配列を使用して、イヌ科の動物の参照ゲノム(CanFam3.1)を調査した。領域が同定されると、AR遺伝子を局所的に検索した。当初はマウスとヒトのAR遺伝子とRSSコンセンサスが使用されていたが、より多くのイヌ科の動物の遺伝子が同定されると、代わりにこれらが使用された。次に、RNAシークエンシングデータのアライメントに基づいて注釈を検証し、追加した。
2.1.1 バイオインフォマティクスによる注釈
遺伝子座には、最初はDas等に類似する方法に従って、Olivieri等のアルゴリズムと同等の原理を使用して注釈が付けられた1、2。簡潔に述べると、ヒト及びマウスの配列を使用して、イヌ科の動物の参照ゲノム(CanFam3.1)を調査した。領域が同定されると、AR遺伝子を局所的に検索した。当初はマウスとヒトのAR遺伝子とRSSコンセンサスが使用されていたが、より多くのイヌ科の動物の遺伝子が同定されると、代わりにこれらが使用された。次に、RNAシークエンシングデータのアライメントに基づいて注釈を検証し、追加した。
2.1.2 イヌ
26匹のイヌから末梢血試料を確保した。試料は、ケンブリッジ大学の獣医病院で見られる患畜からの獣医が義務付けられた採血の未使用の臨床的過剰のものであった。この研究は、ケンブリッジ大学の獣医学部の倫理委員会から事前に承認を受けていた。
26匹のイヌから末梢血試料を確保した。試料は、ケンブリッジ大学の獣医病院で見られる患畜からの獣医が義務付けられた採血の未使用の臨床的過剰のものであった。この研究は、ケンブリッジ大学の獣医学部の倫理委員会から事前に承認を受けていた。
2.1.3 シークエンシング
製造者の取扱説明書に従って、Ficoll-Paque(GE Healthcare社)を使用して、末梢血から単核細胞を単離した。細胞は、Wellcome Trust Sanger Instituteのコアシークエンシングチームにより、polyAプルダウンを使用してmRNAに処理され、切断され、250bpのペアエンドリードを使用して、HiSeq 2500マシン(Illumina社)でシークエンシングされた。
製造者の取扱説明書に従って、Ficoll-Paque(GE Healthcare社)を使用して、末梢血から単核細胞を単離した。細胞は、Wellcome Trust Sanger Instituteのコアシークエンシングチームにより、polyAプルダウンを使用してmRNAに処理され、切断され、250bpのペアエンドリードを使用して、HiSeq 2500マシン(Illumina社)でシークエンシングされた。
2.1.4 遺伝子命名
AR遺伝子はファミリーに分割され、Bao等3と同一の基準を使用して、機能的、偽遺伝子、又はORFとして割り当てられた。ファミリー番号は、ヒトのファミリーとの相同性に基づいて割り当てられ、明らかな一致が見つからない場合に新規の番号が与えられた。全ての遺伝子名は、IMGT4の命名体系に合わせて割り当てられた。
AR遺伝子はファミリーに分割され、Bao等3と同一の基準を使用して、機能的、偽遺伝子、又はORFとして割り当てられた。ファミリー番号は、ヒトのファミリーとの相同性に基づいて割り当てられ、明らかな一致が見つからない場合に新規の番号が与えられた。全ての遺伝子名は、IMGT4の命名体系に合わせて割り当てられた。
2.1.5 非参照対立遺伝子
107個のイヌ科の動物の全ゲノム配列からのAR遺伝子座へのバリアントコールファイルのマッピングは、ミネソタ大学のSteven Friedenbergから親切に提供された。
107個のイヌ科の動物の全ゲノム配列からのAR遺伝子座へのバリアントコールファイルのマッピングは、ミネソタ大学のSteven Friedenbergから親切に提供された。
2.1.6 種間及び種内の遺伝子座アライメント
RepeatMaskerを使用して配列をマスクし、PipMakerを使用してアライメントプロットを生成した5、6。
RepeatMaskerを使用して配列をマスクし、PipMakerを使用してアライメントプロットを生成した5、6。
2.1.7 系統樹解析
Clustal Omegaを使用して配列をアライメントし、Interactive Tree of Lifeを使用して出力ツリーを視覚化した7、8。
Clustal Omegaを使用して配列をアライメントし、Interactive Tree of Lifeを使用して出力ツリーを視覚化した7、8。
3.結果
3.1.1 遺伝子数
以前に注釈された遺伝子座内で、3つの新規のIGHJ遺伝子が同定された。7つの遺伝子ファミリーにわたる162のIGLV遺伝子が同定され、IGLV1は86のメンバーを有する最大のものであった。他のIGL遺伝子座と一致して、J及びC遺伝子は合計9個の対として発見された。19個のIGKV遺伝子が同定され、そのうち14個はIGKV2で、同時に5個のIGKJ遺伝子と1個のIGKC遺伝子が同定された。
3.1.1 遺伝子数
以前に注釈された遺伝子座内で、3つの新規のIGHJ遺伝子が同定された。7つの遺伝子ファミリーにわたる162のIGLV遺伝子が同定され、IGLV1は86のメンバーを有する最大のものであった。他のIGL遺伝子座と一致して、J及びC遺伝子は合計9個の対として発見された。19個のIGKV遺伝子が同定され、そのうち14個はIGKV2で、同時に5個のIGKJ遺伝子と1個のIGKC遺伝子が同定された。
3.1.2 非参照対立遺伝子
全て現在のリファレンスビルド(CanFam3.1)とアライメントしされた19品種のイヌ107匹からの全ゲノム配列が新規AR対立遺伝子について調査され、3つの遺伝子座にわたって4,074個が同定された。対立遺伝子の分布に関して、参照対立遺伝子は、コールされた68,908個の対立遺伝子のうち53,311回発見された(77%)。対立遺伝子の分布における有意な品種特異性は同定されなかった。
全て現在のリファレンスビルド(CanFam3.1)とアライメントしされた19品種のイヌ107匹からの全ゲノム配列が新規AR対立遺伝子について調査され、3つの遺伝子座にわたって4,074個が同定された。対立遺伝子の分布に関して、参照対立遺伝子は、コールされた68,908個の対立遺伝子のうち53,311回発見された(77%)。対立遺伝子の分布における有意な品種特異性は同定されなかった。
機能的、偽遺伝子、又はORFの割り当ては、全ての新規対立遺伝子で行われ、参照対立遺伝子に戻して比較された。新規の対立遺伝子の大部分(72.8%)は、参照対立遺伝子と同一の機能を有する。新規の対立遺伝子の機能を選択中の対立遺伝子の機能とみなすと、「喪失(loss)」(23.8%)である対立遺伝子が多くなり、すなわち、新規の対立遺伝子が機能的である、「獲得(gain)」(3.4%)よりも、新規の対立遺伝子は偽遺伝子であった。機能を得るよりも機能を失うためのはるかに多くの方法があるため、これは驚くことではなく、したがって、変異がその変化の方向をもたらす可能性が高い。機能からのORFへの変更は喪失として分類され、偽からのORFへの変更は獲得として分類された。
非参照V対立遺伝子は、全ての試料及び遺伝子座で13,129回コールされた。興味深いことに、IGKV2-S13、及び8つのIGLV遺伝子は、ボクサーの試料を含む非参照対立遺伝子としてのみ検出された。これはおそらく参照ゲノムのエラーであるが、参照イヌがたまたまこのデータセットに表れない9つのまれな対立遺伝子を有している可能性もある。非参照対立遺伝子を考慮すると、選択ストレスがなかったとき、データセット内の変更タイプの分布は、対立遺伝子自体内の分布と同一になる。例えば、対立遺伝子の3.4%は「獲得」であるため、データセット内で446回の獲得対立遺伝子の検出が期待される。
しかしながら、喪失の変化は予想よりも少ない頻度で検出され、変化や獲得は予想よりも頻繁には検出されない(図7)。更に、品種間の差異は非常に低く、品種依存性が限られているAR遺伝子座の選択ストレスに更に重きが置かれた。z検定が実行され、母集団と予想平均の差は非常に有意で、p=2.34×10-25からp=0の範囲であった(値の計算に使用されるソフトウェアは1×10-250未満のp値を表示できない)。
3.1.3 遺伝子座の構造
イヌ科の動物のIGH遺伝子座は、アンチセンス鎖上の第8染色体のサブテロメアに位置する。このテロメアの位置は、単孔類及び有袋類を除く全ての哺乳類で観察される1。しかしながら、軽鎖遺伝子座は、ヒト、マウス、及びイヌ間の染色体位置の強力な保存を示さない。
イヌ科の動物のIGH遺伝子座は、アンチセンス鎖上の第8染色体のサブテロメアに位置する。このテロメアの位置は、単孔類及び有袋類を除く全ての哺乳類で観察される1。しかしながら、軽鎖遺伝子座は、ヒト、マウス、及びイヌ間の染色体位置の強力な保存を示さない。
ヒト及びマウスのIGH遺伝子座と同様に、イヌ科の動物のIGH遺伝子座は、定常領域と同一の意味で転写される全ての機能的遺伝子セグメントがあり、1つの偽遺伝子で転写が逆方向である(図1)。IGH遺伝子座の構造は、バオ等によって発表されたものと類似する3。しかしながら、3つの新規のIGHJ遺伝子が同定されており、V遺伝子の位置と予想される機能にはわずかな違いがあるが、絶対的な比率と数は一致している。この不一致は、参照ゲノムの異なるビルドの使用が原因である可能性があり、この注釈は、最新の公開されているビルド(CanFam3.1)を使用している。
イヌ科の動物のIGK遺伝子座は小さく(約400kbp)、また通常ではない構造を有する(図2)。J及びC遺伝子の上流に11個のV遺伝子があり、IGKV2ファミリーの8つのC遠位遺伝子が全て機能し、3つのC近位遺伝子とは異なり、J及びC遺伝子と同一の転写方向にある。しかしながら、また、他の遺伝子の下流に8つのV遺伝子があり、他の遺伝子に対して大部分が反転している。これはウマ科の動物のIGL遺伝子座を連想させるもので、向きはV遺伝子の使用に影響を与えないことがわかった。
逆位及びブロック重複は、軽鎖遺伝子座、特にIGK遺伝子座の特徴であるようである。ヒト、ブタ、マウス、ウマ、及びイヌのIGK遺伝子座には、全てC遺伝子とは逆の転写方向を有するV遺伝子が含まれているだけでなく、イヌ、ヒト、及びブタの遺伝子座がブロック全体の反転重複を受けている10、11。ブタとヒトの遺伝子座では、2つのブロックの遺伝子が十分に発散していないため、一部又は全てが他のブロックの対と同一の名前で知られている10、12。
ヒト、ブタ、及びマウスのIGLV遺伝子は遺伝子座に沿って転写方向を維持するが、イヌ科の動物のIGLVはそうではない13。大きな(2.6Mbp)イヌ科の動物のIGL遺伝子座には、J-C-クラスターに対して反転した多くのV遺伝子が含まれる(図3)。逆位は、ある程度の場所固有の選択ストレス下にあるようで、J-C遺伝子とは逆の転写方向にある116個の最もC近位のIGLV遺伝子のうち3つだけであり、最後の46個のうち26個の逆位V遺伝子がある。この増加は、非常に高いレベルの配列同一性を示すIGLV1及びIGLV8の区間が、メンバーが繰り返しブロック内で位置的に保存されているパターンとなるかたちで発生したブロックの重複に一部起因する。
より広範な傾向の観点から、イヌ科の動物のIG遺伝子座は、他の公開された遺伝子座と一貫性を保持する。以前に注釈が付けられたIGHVでは、遺伝子対偽遺伝子の比率はおよそ1:1であり、イヌ科の動物のIgH遺伝子座1と一致していることが判明した1。しかしながら、2つの軽鎖遺伝子座は5:1に近いように見え、重鎖と軽鎖の間の偽遺伝子に対する異なる許容差を反映する可能性がある。更に、遺伝子数は、これまでに研究されたほとんどの種の軽鎖における偏った鎖の使用と相関することが判明している14、15。例えば、9つの機能遺伝子のみを含むマウスIGL遺伝子座は、発現した抗体のわずか5%でのその使用を反映している14。イヌ科の動物のレパートリーも同様の偏りを示しているが、反対に、各種の2つの軽鎖レパートリーの相対的なサイズに応じて、91%でのIGK鎖の使用を報告している15。
3.1.4 種間及び種内の遺伝子座アライメント
ゲノムの領域をそれ自体に対して及び他の種の同等の領域に対してアライメントすることは、進化の洞察を引き出す確立された方法であり、PipMakerはこの目的に使用される一般的なツールである16、17、6、18。イヌ科の動物のIGK、IGL、及びTRA/D遺伝子座を使用して、それら自体に対して、並びにそれぞれマウス及びヒト遺伝子座に対してアライメントを実行した。
ゲノムの領域をそれ自体に対して及び他の種の同等の領域に対してアライメントすることは、進化の洞察を引き出す確立された方法であり、PipMakerはこの目的に使用される一般的なツールである16、17、6、18。イヌ科の動物のIGK、IGL、及びTRA/D遺伝子座を使用して、それら自体に対して、並びにそれぞれマウス及びヒト遺伝子座に対してアライメントを実行した。
IGK自己アライメントでは、3つの比較、上流と下流のブロックのセルフアライメント(図8)、並びにそれらの相互のアライメント(図8)が注目すべきである。同一性パーセンテージプロット(PIP)内では、線は同一性の領域を示し、したがって、それ自体に対してアライメントされた配列は、常に対角線に沿って走る実線を有する。メインの対角線から外れた実線は、重複事象の可能性が高いことを示しており、ギャップは重複以降に蓄積されたインデル及び他の変異を表す。
上流の自己アライメントにおける複数の破線の対角線は、イヌ科の動物のTCRB遺伝子座内の3つの遺伝子カセットのブロック重複と同様に、ブロックの特徴であり、この場合、単一のVとその隣接配列が局所的に複数回複製される16。下流ブロックの自己アライメントでは、線はより短く、時には垂直であり、局所的な反転した相同性を意味する。最後に、上流ブロックと下流ブロックの相同性比較により、C遺伝子の上流のIgKV2遺伝子との良好な相同性の程度、特にIGKV2-S18とIGKV-S19が明らかになった。このパターンは、単一の遺伝子がC遺伝子の上流で複数回複製され、その後、ヒトIGK及びウマ科の動物のIGLを連想させる様式でブロック反転複製が発生した場合に見られはずである。したがってこの下流のブロックは、選択ストレスが低下した可能性が高く、発散がより少ないIGKV2-S18及びIGKV-S19遺伝子を除いて、変異と局所的逆位をより高い割合で蓄積している。これが唯一の可能な説明ではないが、他の種及びAR遺伝子座にわたる類似の特徴についての提案された説明と一致している。
イヌとヒトのIGL遺伝子座の比較では、以下の2つのことが印象的ある。ヒトの配列の中点付近でほぼ切れ目のない対角線と、コード配列又はその近くの多数の線によって特徴付けられる非常に高い相同性の程度である(図9a)。ヒト/イヌPIPにおける対角線の更なる分析は、それが非AR遺伝子ZNF280A、ZNF280B、及びPRAMEを含むヒト遺伝子座の領域に及ぶことが明らかになった(図9b)。これらの遺伝子の配列、及びそれらを取り巻く領域のほとんどは、イヌとヒトとの間で高度に保存されており、イヌにとってヒトと同様の機能的重要性がある可能性が高いことをほのめかす。特定の比較は、ZNF280B及びPRAME遺伝子がイヌで機能する可能性が高いことを示すが、ZNF280Aはこの遺伝子座で確実に同定することができない(データ示さず)。更なる調査により、ZNF280Bの近くにある別の非IGL遺伝子PCBP2が同定される。
問題の場所と遺伝子が常に保存されているわけではないが、AR遺伝子座に散在する非AR遺伝子は種間で共通の特徴である。例えば、ADAM6遺伝子は、ヒトとマウスのIGHV遺伝子とIGHD遺伝子との間のIGH遺伝子座に見出されるが、ヒトオルソログは非機能的である。イヌではオルソログが特徴付けられていないが、2つの候補がある。そのうちの1つはIGHV3-4とIGHV3-5との間にあり、そのうちの他方はIGH遺伝子座全体の上流にある。イヌのADAM遺伝子ファミリーの研究が限られているため、この潜在的なオルソログはIGH注釈に追加されていないが、今後の研究の候補として維持される。イヌ科の動物のIGK又はIGL遺伝子座では、現時点では他の非AR遺伝子は同定されていない。
3.1.5 対立遺伝子の分布
イヌのモデル生物としての使用の、際立った特徴の1つは、品種間の不均一性が高い一方で、品種の均一性が非常に高く、品種形成がヌクレオチドの多様性における35%の損失の原因であると推定されている点である19。選択は非常に厳しいため、最近の研究では、特定の品種で1メガベースより長い22個のホモ接合性のブロックが同定されており、著者は、これ育種家が課した選択ストレスに起因するとしている20。これは、ヒトに見られる多様性とは対照的である。地理的に孤立した集団であっても、この分離に起因する変動は5～10%であるのに対し、4分の1を超えるイヌのゲノム変動は、個体の変動ではなく、品種の変動に起因する21。
イヌのモデル生物としての使用の、際立った特徴の1つは、品種間の不均一性が高い一方で、品種の均一性が非常に高く、品種形成がヌクレオチドの多様性における35%の損失の原因であると推定されている点である19。選択は非常に厳しいため、最近の研究では、特定の品種で1メガベースより長い22個のホモ接合性のブロックが同定されており、著者は、これ育種家が課した選択ストレスに起因するとしている20。これは、ヒトに見られる多様性とは対照的である。地理的に孤立した集団であっても、この分離に起因する変動は5～10%であるのに対し、4分の1を超えるイヌのゲノム変動は、個体の変動ではなく、品種の変動に起因する21。
イヌ科の動物のゲノミクスの品種特異性のレベルを考慮すると、非参照AR対立遺伝子が強力な品種特異的ハプロタイプに従うように見えなかったことはおそらく驚くべきことである。この試料で最も割合が高い2つの品種は、ボクサーとスタンダードプードル(それぞれ22匹と20匹の犬)であり、これらは類似のパターン、つまり、少数の非参照対立遺伝子が両方の品種で比較的頻繁に見つかり、よりまれな対立遺伝子が1つの品種の1匹のイヌの単一の染色体上に見出されるパターンに従った。あまり割合が高くない品種は同様の分布に従っており、一回しか出現しない対立遺伝子の数を考慮すると、非参照対立遺伝子は典型的にはヘテロ接合体に見られるようであった。
より大きな品種固有のコホートサイズは、このデータセットでは明らかではない傾向を明らかにする可能性があるが、現状では、AR遺伝子座を形成する選択ストレスは品種に依存せず、品種自体よりも勝っているようである。例外の可能性は、あまり一般的でない対立遺伝子の存在量を増やす進化のボトルネックの場合である。例えば、IGLC1*01(参照対立遺伝子)は、シークエンシングされた44個のボクサー染色体のうち19個、及び6個のトイプードル染色体のうちの1個で見つかるが、他のいずれの品種でも見つからない。全ての品種にわたってコールされた217個の対立遺伝子のうちの194個は、その他の対立遺伝子IGLC1*02によって表される。トイプードルがボクサーと以前に交配されているか、又はシークエンシングのエラーがあり、これが実際にボクサー固有の対立遺伝子である可能性があるが、これらの問題に何らかの方法で最終的に答えるには、より大きなデータセットが必要な場合が残されている。
非参照対立遺伝子の分布を考慮すると、これらは全て予想されるものと一致する。予想より頻繁に変化が見られないのは、問題の遺伝子が現在の状態を保つように選択ストレスを受けており、したがってこれからの逸脱は好ましくないためである可能性が高い。これは、有効な機能遺伝子の喪失、又は自己反応性遺伝子の再活性化のいずれかである可能性があり、どちらの場合も、生物の適応度が低下するため、これが除かれるように選択される。同様に、AR遺伝子は生物の適応度にとって非常に重要であり、その損失には選択コストが伴う。
機能の獲得が、予想よりも一般的であるという事実は、AR遺伝子座の偽遺伝子の量が多いことに関して提唱された理論に重みを与える。偽遺伝子の量は、一般にAR遺伝子座、特にイヌで多く、しばしば発現する16、1、12、9。例えば、SHM又は組換え自体により停止コドンが失われた場合、それらは組換えにおいて機能性を獲得し、遺伝子変換の基質として作用し得る22。参照対立遺伝子がその大多数の使用に沿ったオリジナルであると仮定すると、機能非参照対立遺伝子の獲得は、新規の有益な対立遺伝子の変異可能な開始プールである偽遺伝子の例であり、そのような選択ストレスの下にある。
(参照文献)
(参照文献)
(実施例2)
マウス細胞におけるキメラIG遺伝子座の構築
マウスES細胞のIG遺伝子座は、以下のように、マウスのIGH遺伝子座にイヌ科の動物の重鎖DNAを導入し、マウスのIGLカッパ及びラムダ遺伝子座にイヌ科の動物の軽鎖免疫グロブリンDNAを導入するために、BAC挿入によって改変された:
マウス細胞におけるキメラIG遺伝子座の構築
マウスES細胞のIG遺伝子座は、以下のように、マウスのIGH遺伝子座にイヌ科の動物の重鎖DNAを導入し、マウスのIGLカッパ及びラムダ遺伝子座にイヌ科の動物の軽鎖免疫グロブリンDNAを導入するために、BAC挿入によって改変された:
イヌ科の動物のIGH挿入
第8染色体からのイヌ科の動物のDNAの挿入は、BAC挿入によりマウスのIGH遺伝子座に対して行われた。挿入されたDNAはヌクレオチド72,988,807-73,128,041を含み、IGHV4-1からIGHV3-4、並びにIGHD1-6及びIGHJ1-6を含む。図1及び10を参照されたい。
第8染色体からのイヌ科の動物のDNAの挿入は、BAC挿入によりマウスのIGH遺伝子座に対して行われた。挿入されたDNAはヌクレオチド72,988,807-73,128,041を含み、IGHV4-1からIGHV3-4、並びにIGHD1-6及びIGHJ1-6を含む。図1及び10を参照されたい。
イヌ科の動物のIGLラムダDNA挿入
第26染色体からのイヌ科の動物のDNAの挿入は、マウスの第16染色体上のIGLラムダ遺伝子座に対して行われた。挿入されたDNAはヌクレオチド27,509,860-27,646,373を含み、IGLV3-1からIGLV4-6、並びにIGLJ1-9及びIGLC1-9を含む。図2及び13を参照されたい。
第26染色体からのイヌ科の動物のDNAの挿入は、マウスの第16染色体上のIGLラムダ遺伝子座に対して行われた。挿入されたDNAはヌクレオチド27,509,860-27,646,373を含み、IGLV3-1からIGLV4-6、並びにIGLJ1-9及びIGLC1-9を含む。図2及び13を参照されたい。
座標は、マウスでは2011年12月のGRCm38/mm10アセンブリから、イヌではCanfam3.1からのものである。
イヌ科の動物のDNAの挿入は、マウスゲノムの以下の位置にあるランディングパッドに挿入された。
イヌ科の動物の重鎖DNA:マウス第12染色体、位置114,666435のすぐ上流に挿入
イヌ科の動物のカッパDNA:マウス第6染色体、位置70,674,7.55のすぐ上流に挿入
イヌ科の動物のラムダDNA:マウス第16染色体、位置19,047,551のすぐ上流に挿入
イヌ科の動物の重鎖DNA:マウス第12染色体、位置114,666435のすぐ上流に挿入
イヌ科の動物のカッパDNA:マウス第6染色体、位置70,674,7.55のすぐ上流に挿入
イヌ科の動物のラムダDNA:マウス第16染色体、位置19,047,551のすぐ上流に挿入
キメラ転写物の発現は、キメラ重遺伝子座からのPCR分析により確認されている-図15を参照されたい。
方法は以下の通りであった。
BAC改変
CHORI-82ライブラリーに由来するイヌ科の動物のBACは、小児病院オークランド研究所のBACライブラリーから直接入手した。
CHORI-82ライブラリーに由来するイヌ科の動物のBACは、小児病院オークランド研究所のBACライブラリーから直接入手した。
BACを含む全ての細菌は、12.5μg/mlクロラムフェニコールを補充したルリアベルタニ(LB)培地又はLB寒天上で32℃で培養した。BAC含有細胞は、標準的なCaCl2熱ショックプロトコールによる細胞へのpSIM18プラスミドの添加により組換え能を発揮し、培地に75μg/mlハイグロマイシンを補充することにより、pSIM18の維持を選択した。
pRMCE38等の組換えプラスミドを線状化し、ギブソンアセンブリを使用して1kbpのBAC特異的相同性アームを導入した。プラスミドには、cre-lox及びPiggbyBac配列等の下流の組換えに必要な配列、並びにBAC又はESCエンジニアリング工程の選択マーカーが含まれている。完成したプラスミドを制限消化し、ゲル精製して、BAC特異的相同性アーム、導入される組換え配列、及びBACのベクターバックボーンに対する相同性アームにまたがる断片を得た。これらの断片は、エレクトロポレーションによりBACに挿入され、BACへの断片の組込みが成功したものが選択された。
挿入されたDNAと内因性DNAとの接合部を横切るPCRにより、耐性クローンの成功した改変が検証された。BACの両端が改変されると、BAC DNAが精製され、Electromax(商標)DH10B細胞(Life Technologies社)にエレクトロポレーションされた。ハイグロマイシン耐性を失い、したがってpSIM18陰性であったクローンを、更なる分析のために選択した。これらのクローンのDNAに対してPCR反応を行い、適切なBACを使用して挿入されるエクソンの存在と同様に、両方の末端での正しい改変を確実にした。この品質管理チェックに合格したクローンは、胚性幹細胞(ESC)の遺伝子操作に使用された。
ESC遺伝子操作
ESC培養、エレクトロポレーション、及び薬物選択のプロセスは、Lee等、2014年に記載されるようになされた。各免疫グロブリン遺伝子座にSRMCEのランディングパッドをすでに含むマウスオスAB2.1細胞を使用し、M15培地(15%FBS、2mMグルタミン、及び100μMのβ-メルカプトエタノールを補充したノックアウトDMEM)で培養し、照射されたSNL76/7フィーダー上で維持した。使用した全ての細胞を試験して、マイコプラズマ等の汚染物質がないことを確認した。
ESC培養、エレクトロポレーション、及び薬物選択のプロセスは、Lee等、2014年に記載されるようになされた。各免疫グロブリン遺伝子座にSRMCEのランディングパッドをすでに含むマウスオスAB2.1細胞を使用し、M15培地(15%FBS、2mMグルタミン、及び100μMのβ-メルカプトエタノールを補充したノックアウトDMEM)で培養し、照射されたSNL76/7フィーダー上で維持した。使用した全ての細胞を試験して、マイコプラズマ等の汚染物質がないことを確認した。
各トランスフェクションには1×107個の細胞を使用し、全てのトランスフェクションはBio-Rad社のエレクトロポレーター(GenePulser Xcell)を使用して500μF及び230Vで実施した。BACの導入のために、10μgのBAC DNA及び25μgのpCAGGS-iCREを、トランスフェクションごとに使用した。24時間後に細胞を3μg/mlピューロマイシンで1週間選択し、増殖と試験のためにコロニーを選択した。マウスとBAC DNAとの接合部にまたがるプライマーを使用したPCRで、BACのランディングパッドへの組み込みが成功したことを確認した。
次いで、陽性クローンをPBaseを使用する3'のランディングパッドの切除に供した。クローンを増殖し、10μgのPiggyBacトランスポザーゼプラスミドのエレクトロポレーションあたり1×105個の細胞を使用した。M15での3日間の回復後、細胞を分割し、低密度で播種した後、翌日にFIAUで選択し、10日間維持した。ランディングパッドの3'末端の正常な切除は、ジャンクションPCRによって確認された。次いで、陽性クローンを元のBACと同一のエクソン試験にかけ、欠失が発生していないことを確認した。
マウスの生成と分析
陽性ES細胞クローンを、標準手順によりC57BL/6 Tyrc-Brdマウス系統の胚盤胞に注入した。注入された胚盤胞は、偽妊娠した雌のB6/CBA F1レシピエントの子宮に移された。各クローンについて、約40個の胚盤胞を注入した。コート色素に基づいて注入されたESCに由来する仔犬を識別できるようにするために、高いパーセンテージのキメラ雄をアルビノC57BL/6 Tyrc-Brd雌と交配させた。ESCクローンに由来するマウスは、マウスと挿入されたDNAとの接合部にまたがるプライマーをによるPCR試験にかけられた。
陽性ES細胞クローンを、標準手順によりC57BL/6 Tyrc-Brdマウス系統の胚盤胞に注入した。注入された胚盤胞は、偽妊娠した雌のB6/CBA F1レシピエントの子宮に移された。各クローンについて、約40個の胚盤胞を注入した。コート色素に基づいて注入されたESCに由来する仔犬を識別できるようにするために、高いパーセンテージのキメラ雄をアルビノC57BL/6 Tyrc-Brd雌と交配させた。ESCクローンに由来するマウスは、マウスと挿入されたDNAとの接合部にまたがるプライマーをによるPCR試験にかけられた。
挿入された遺伝子の発現を検証するために、逆転写に基づくアプローチが実施された。BACを有することが確認されたマウス並びに関連する野生型対照の血液、脾臓、及び大腿骨を採取した。大腿骨をPBSで吸引して、骨髄試料を得た。NucleoSpin RNA-kit(Macherey-Nagel社)を使用して、これら3つの組織タイプをRNAに変換した。逆転写は、挿入されたBACに関連するマウスの定常領域の5'末端(例えば、IGL BACを含むマウスのIGLC)又はmRNAのpolyAテールに対するプライマーを使用して、superscript II(Thermo Fisher社)を使用して実施された。次いで、これらの転写産物は、ネズミC領域にネストされたバーコードプライマーと、イヌ科の動物のV遺伝子由来の挿入されたリーダー領域からのプライミングを使用して増幅された。これにより、全てのマウス免疫グロブリン転写物ではなく、キメラ転写物のみが増幅されることを確証した。これらのPCR産物をゲル上で視覚化し、野生型マウスではなく、BACを有するマウスにキメラ転写物が存在することを確認した。図15-IGHキメラ転写産物の確認を参照されたい。最初の8レーンは血液試料からのRNA、2番目の8レーンは骨髄試料、及び最後の8レーンは脾臓試料に対応する。所与の8個のうち最初の4個はC領域でプライミングされ、2番目の4個はpolyAテールでプライミングされる。4つのうち、最初の2つは対照であり、後の2つはキメラ転写産物の産生が予想されるマウスである。
全ての動物実験及び飼育は、ウェルカムトラストサンガーインスティテュートAWERB(動物福祉及び倫理審査機関)の承認の下で実施された。英国内務省の承認は、プロジェクトライセンス80/2432の下で提供される。
(実施例3)
図4、5、及び6は、ネコのIg遺伝子座の注釈を示す。注釈の方法は、実施例1の2.1.1で概説した方法と同一であるが、ネコのゲノムがイヌ科の動物のゲノムの代わりに調査され、RNAシークエンシングのデータが使用されなかった点が異なる。
図4、5、及び6は、ネコのIg遺伝子座の注釈を示す。注釈の方法は、実施例1の2.1.1で概説した方法と同一であるが、ネコのゲノムがイヌ科の動物のゲノムの代わりに調査され、RNAシークエンシングのデータが使用されなかった点が異なる。
注釈は、上述の方法を使用して、げっ歯動物のゲノムでネコのDNAを使用できるツールと情報を提供する。
(実施例4)
cDNA末端の5'迅速増幅(5'RACE)
物質及び方法
血液試料
ベースライン試料:末梢血は、ミネソタ大学の獣医学部で13匹の犬から採取された。RNAは現場で抽出され、ドライアイス上で運搬された。この研究は、ミネソタ大学獣医学部の倫理委員会から事前に承認を受けていた。
cDNA末端の5'迅速増幅(5'RACE)
物質及び方法
血液試料
ベースライン試料:末梢血は、ミネソタ大学の獣医学部で13匹の犬から採取された。RNAは現場で抽出され、ドライアイス上で運搬された。この研究は、ミネソタ大学獣医学部の倫理委員会から事前に承認を受けていた。
ライブラリー調製
C特異的プライマーとテンプレートスイッチオリゴ(TSO)との混合プールを使用して、第1鎖cDNAを合成した。反応に含まれるもの:30μlの容量中、666.7μMのdNTP(Sigma Aldrich社)、666.7nMのTSO、333.3nMのそれぞれの重鎖及び軽鎖RTプライマー混合物、1～5μgのRNA、2mMのDTT(Invitrogen社)、3mMのMgCl2、40単位のRNaseOUT(Invitrogen社)、並びに100単位のSuperScript II逆転写酵素(Invitrogen社)。伸長は42℃で60分間であり、その後1μlのRNase A/T1混合物(Thermo Scientific社)を添加し、反応液を37℃で15分間インキュベートした。次いで、製造元の推奨に従ってAMPure XPシステム(Agencourt社)を使用して、反応をクリーンアップした(初期反応:AMPure XP溶液比5:4を使用)。cDNAを21μlのPCRグレードの水に再懸濁し、1つの重鎖反応と1つの軽鎖反応に均等に分割した。PCRは、Q5高忠実度ポリメラーゼ(New England Biolabs社)、10.5μlの再懸濁されたcDNA、及び5'RFWAと重鎖又は軽鎖のPCR1混合物のそれぞれ400nMを使用して、25μlの容量で実施された。サイクリング条件は以下の通りである。98℃30秒間、次いで20サイクルの(98℃10秒間、63℃30秒間、72℃20秒間)、続いて、72℃2分間の最後の伸長。PCR反応は、以前と同一のAMPure XPクリーンアップに供し、10.5μlのPCRグレードの水に再懸濁した。これは、Q5ポリメラーゼ、並びに5'RRVA及び試料特異的インデックスヘキサマーを含むフォワードプライマーのそれぞれ400nMを使用した25μLのPCR反応で行われた。PCR条件は以前と同一で、産物は同一のAMPure XPシステムを使用してクリーンアップされ、20μlのPCRグレードの水に再懸濁した。次いで、これらのライブラリーを定量化し、等モル混合液にプールし、シークエンシングのために最終濃度10nMに希釈した。
C特異的プライマーとテンプレートスイッチオリゴ(TSO)との混合プールを使用して、第1鎖cDNAを合成した。反応に含まれるもの:30μlの容量中、666.7μMのdNTP(Sigma Aldrich社)、666.7nMのTSO、333.3nMのそれぞれの重鎖及び軽鎖RTプライマー混合物、1～5μgのRNA、2mMのDTT(Invitrogen社)、3mMのMgCl2、40単位のRNaseOUT(Invitrogen社)、並びに100単位のSuperScript II逆転写酵素(Invitrogen社)。伸長は42℃で60分間であり、その後1μlのRNase A/T1混合物(Thermo Scientific社)を添加し、反応液を37℃で15分間インキュベートした。次いで、製造元の推奨に従ってAMPure XPシステム(Agencourt社)を使用して、反応をクリーンアップした(初期反応:AMPure XP溶液比5:4を使用)。cDNAを21μlのPCRグレードの水に再懸濁し、1つの重鎖反応と1つの軽鎖反応に均等に分割した。PCRは、Q5高忠実度ポリメラーゼ(New England Biolabs社)、10.5μlの再懸濁されたcDNA、及び5'RFWAと重鎖又は軽鎖のPCR1混合物のそれぞれ400nMを使用して、25μlの容量で実施された。サイクリング条件は以下の通りである。98℃30秒間、次いで20サイクルの(98℃10秒間、63℃30秒間、72℃20秒間)、続いて、72℃2分間の最後の伸長。PCR反応は、以前と同一のAMPure XPクリーンアップに供し、10.5μlのPCRグレードの水に再懸濁した。これは、Q5ポリメラーゼ、並びに5'RRVA及び試料特異的インデックスヘキサマーを含むフォワードプライマーのそれぞれ400nMを使用した25μLのPCR反応で行われた。PCR条件は以前と同一で、産物は同一のAMPure XPシステムを使用してクリーンアップされ、20μlのPCRグレードの水に再懸濁した。次いで、これらのライブラリーを定量化し、等モル混合液にプールし、シークエンシングのために最終濃度10nMに希釈した。
シークエンシング及びデータ分析
ライブラリーは、ウェルカムトラストサンガーインスティテュートのコアシークエンシングチームにより、300bpのペアエンドリード(10%PhiXスパイクインを含む)を使用して、MiSeqマシン(Illumina社)でシークエンシングされた。次いで、IMGT V-Questソフトウェアに送信する前に、逆多重化されたデータの品質をフィルタリングした(「HighV-Quest」ソフトウェアを使用し、「種」=「Canis lupus familiaris(イヌ)」及び「受容体タイプ又は遺伝子座=「IG」」を選択する)14。
ライブラリーは、ウェルカムトラストサンガーインスティテュートのコアシークエンシングチームにより、300bpのペアエンドリード(10%PhiXスパイクインを含む)を使用して、MiSeqマシン(Illumina社)でシークエンシングされた。次いで、IMGT V-Questソフトウェアに送信する前に、逆多重化されたデータの品質をフィルタリングした(「HighV-Quest」ソフトウェアを使用し、「種」=「Canis lupus familiaris(イヌ)」及び「受容体タイプ又は遺伝子座=「IG」」を選択する)14。
Claims (13)
- イヌ、ネコ若しくはウマそれぞれの疾患の予防又は治療における使用のため、或いはその使用のために適切な、ラムダ軽鎖、又はその機能的断片若しくは機能的誘導体を有する、イヌ科の動物、ネコ科の動物又はウマ科の動物の抗体、及び薬学的に許容される賦形剤又は担体を含む医薬組成物。
- イヌ、ネコ若しくはウマそれぞれの疾患の予防又は治療における使用のための、ラムダ軽鎖、又はその機能的断片若しくは機能的誘導体を有する、イヌ科の動物、ネコ科の動物又はウマ科の動物の抗体。
- イヌ、ネコ若しくはウマそれぞれの疾患の予防又は治療における使用のための、イヌ科の動物、ネコ科の動物又はウマ科の動物のラムダ軽鎖、又はその機能的断片若しくは機能的誘導体。
- イヌ科の動物、ネコ科の動物又はウマ科の動物のラムダ軽鎖、又はその機能的断片若しくは機能的誘導体を発現又はコードするげっ歯動物、又は細胞、例えば、げっ歯動物細胞。
- ラムダCDR3が、
極性残基、
非荷電残基、
中性のハイドロパシー状態の残基、
水素結合を供与すること及び受容することの両方ができる残基、
非常に小さな残基、
ヒドロキシル残基、
位置1のセリン(S)残基
から選択される位置1のアミノ酸を含むイヌ科の動物のCDR3領域を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の組成物、抗体、抗体鎖、げっ歯動物、げっ歯動物細胞又は細胞。 - ラムダCDR3が、
位置4の極性残基、
位置4の負に荷電した残基、
位置4の親水性残基、
位置4の水素結合を受容することができる残基、
位置4の小さな残基、
位置4の酸性残基、
位置4のアスパラギン酸(D)残基
から選択される位置4のアミノ酸を含むイヌ科の動物のCDR3領域を含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の組成物、抗体、抗体鎖、げっ歯動物、げっ歯動物細胞又は細胞。 - ラムダCDR3が、
位置6の極性残基、
位置6の非荷電残基、
位置6の中性のハイドロパシー状態の残基、
位置6の水素結合を供与すること及び受容することの両方ができる残基、
位置6の非常に小さな残基、
位置6のヒドロキシル残基、
位置6のセリン(S)残基
から選択される位置6のアミノ酸を含むイヌ科の動物のCDR3領域を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の組成物、抗体、抗体鎖、げっ歯動物、げっ歯動物細胞又は細胞。 - ラムダCDR3が、
位置7の非極性残基、
位置7の非荷電残基、
位置7の疎水性残基、
位置7の水素結合を供与することも受容することもできない残基、
位置7の大きな残基、
位置7の脂肪族残基、
位置7のロイシン(L)残基
から選択される位置7のアミノ酸を含むイヌ科の動物のCDR3領域を含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の組成物、抗体、抗体鎖、げっ歯動物、げっ歯動物細胞又は細胞。 - ラムダCDR3が、
位置11の非極性残基、
位置11の非荷電残基、
位置11の疎水性残基、
位置11の水素結合を供与することも受容することもできない残基、
位置11の中サイズの残基、
位置11の脂肪族残基
から選択される位置11のアミノ酸を含むイヌ科の動物のCDR3領域を含む、請求項1から8のいずれか一項に記載の組成物、抗体、抗体鎖、げっ歯動物、げっ歯動物細胞又は細胞。 - CDR3がイヌ科の動物のものであり、CDR3の位置1、位置4、位置6、位置7又は位置11のそれぞれのアミノ酸が、請求項5、6、7、8及び9にそれぞれ列挙された2つ以上の特性、好ましくは列挙された3つ以上の特性を有する、請求項1から9のいずれか一項に記載の組成物、抗体、抗体鎖、げっ歯動物、げっ歯動物細胞又は細胞。
- CDR3がイヌ科の動物のものであり、それぞれ請求項5、6、7、8若しくは9のいずれか一項に規定のアミノ酸であるか、又は請求項10に規定のものである、位置1、位置4、位置6、位置7又は位置11の2つ以上のアミノ酸を含む、請求項1から10のいずれか一項に記載の組成物、抗体、抗体鎖、げっ歯動物、げっ歯動物細胞又は細胞。
- イヌの疾患を治療又は予防するための方法であって、有効量の請求項1及び5～11に記載の組成物を送達する工程を含む方法。
- 抗体がイヌ科の動物の抗体である、請求項1から12のいずれか一項に記載の組成物、抗体、抗体鎖、げっ歯動物、げっ歯動物細胞若しくは細胞、又は使用。
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