JP2022505687A - ウイルスカプシドタンパク質組成の分析方法 - Google Patents

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Abstract

ウイルスカプシドの化学量論を決定する方法及び／またはウイルスカプシドにおけるタンパク質成分の不均一性を決定する方法が開示される。
【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項に基づき、２０１８年１０月２５日に出願された米国特許仮出願第６２／７５０，５８３号の利益を主張するものであり、全ての目的のために、その全体が参照により本明細書に援用される。
発明の分野
本発明は、親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）及び質量分析法を使用して、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子などのウイルス粒子の不均一性を決定するための方法に関する。
遺伝子治療は、遺伝性疾患の代替治療として注目されている。遺伝子治療は、いくつかの遺伝子物質（ＤＮＡ、ＲＮＡまたはオリゴヌクレオチド）を標的細胞内に導入することを伴う。実際に、ＤＮＡまたはＲＮＡの分子を運ぶベクターによって、目的の遺伝子（導入遺伝子とも呼ばれる）を細胞に送達する必要がある。遺伝子治療は、欠陥遺伝子を置換または補充する機能性遺伝子を導入することを土台にしている。導入遺伝子は、ベクターによって細胞に送達することができる。送達の方法は、治療の種類及び標的となる器官／組織に応じて異なる。
ウイルス粒子は、遺伝子治療及び疾患の治療のためのベクターとして知られている。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ゲノムに基づくものなどのウイルスベクターは、遺伝子送達のプラットフォームとして期待されている。現在、ＡＡＶには１２種類のヒトセロタイプ（ＡＡＶ１～１２）が記載されており、その多くは、細胞向性及び組織向性が明確に異なることから、このウイルス属から多種多様なベクタークラスが生み出される可能性が潜在的にある。
しかしながら、ウイルスベクターを遺伝子治療に採用する際に直面する問題の１つとして、ウイルス粒子の均一性の特性評価がある。電子顕微鏡法及びサザンブロットなどの古典的な技術は、ＡＡＶの不均一性及び凝集などのウイルス粒子の不均一性を特徴付けることはできるが、臨床グレードのウイルスベクター調製物を製造する場合となると、均一性を定量するのに十分な解像度が得られない。製品の品質及び一貫性を確保するには、配列及び翻訳後修飾（ＰＴＭ）を含め、ＡＡＶベクターのカプシドタンパク質などの構造ウイルスカプシドタンパク質の完全な特性評価が強く推奨されている。したがって、ウイルス粒子の均一性を決定する方法が必要とされている。
一態様において、本発明は、ウイルス粒子のウイルスカプシドのタンパク質成分の化学量論を決定する方法を提供し、この方法は、（ａ）ウイルス粒子のサンプルを親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）に供して、ウイルス粒子のウイルスカプシドのタンパク質成分を分離することと、（ｂ）ウイルスカプシドのタンパク質成分の質量を決定して、ＨＩＬＩＣによって分離されたタンパク質成分を同定することと、（ｃ）ＨＩＬＩＣ分離からのウイルスカプシドのタンパク質成分の相対存在量を決定し、それにより、ウイルス粒子のウイルスカプシドのタンパク質成分の化学量論を決定することと、を含む。
別の態様において、本発明は、ウイルス粒子のカプシドにおけるタンパク質の不均一性を決定する方法を提供し、この方法は、（ａ）ウイルス粒子をＨＩＬＩＣに供して、ウイルス粒子カプシドのタンパク質成分を分離することと、（ｂ）タンパク質カプシドのタンパク質成分の質量を決定することと、（ｃ）決定されたウイルス粒子カプシドのタンパク質成分の質量を理論的質量と比較することであって、理論的質量からの、ウイルス粒子カプシドのタンパク質成分の質量のうちの１つ以上のずれは、カプシド不均一性を示している、ことと、を含む。
いくつかの実施形態において、ウイルス粒子は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を含む。
いくつかの実施形態において、ウイルスカプシドのタンパク質成分は、ＡＡＶ粒子のＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３を含む。
いくつかの実施形態において、不均一性は、セロタイプの混合、バリアントカプシド、カプシドアミノ酸の置換、切断カプシド、または改変カプシドのうちの１つ以上を含む。
いくつかの実施形態において、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１カプシド、ＡＡＶ２カプシド、ＡＡＶ３カプシド、ＡＡＶ４カプシド、ＡＡＶ５カプシド、ＡＡＶ６カプシド、ＡＡＶ７カプシド、ＡＡＶ８カプシド、ＡＡＶｒｈ８カプシド、ＡＡＶ９カプシド、ＡＡＶ１０カプシド、ＡＡＶ１１カプシド、ＡＡＶ１２カプシド、またはそのバリアントを含む。
いくつかの実施形態において、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３の質量は、ＡＡＶ１カプシド、ＡＡＶ２カプシド、ＡＡＶ３カプシド、ＡＡＶ４カプシド、ＡＡＶ５カプシド、ＡＡＶ６カプシド、ＡＡＶ７カプシド、ＡＡＶ８カプシド、ＡＡＶｒｈ８カプシド、ＡＡＶ９カプシド、ＡＡＶ１０カプシド、ＡＡＶ１１カプシド、ＡＡＶ１２カプシド、またはそのバリアントのうちの１つ以上の理論的質量と比較される。
いくつかの実施形態において、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１末端逆位反復配列（ＩＴＲ）、ＡＡＶ２ ＩＴＲ、ＡＡＶ３ ＩＴＲ、ＡＡＶ４ ＩＴＲ、ＡＡＶ５ ＩＴＲ、ＡＡＶ６ ＩＴＲ、ＡＡＶ７ ＩＴＲ、ＡＡＶ８ ＩＴＲ、ＡＡＶｒｈ８ ＩＴＲ、ＡＡＶ９ ＩＴＲ、ＡＡＶ１０ ＩＴＲ、ＡＡＶｒｈ１０ ＩＴＲ、ＡＡＶ１１ ＩＴＲ、またはＡＡＶ１２ ＩＴＲを含む。
いくつかの実施形態において、ＡＡＶ粒子は、対象の肝臓の細胞に形質導入するために選択されたカプシドセロタイプを有する。
いくつかの実施形態において、ＡＡＶ粒子は、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）粒子である。
いくつかの実施形態において、ＡＡＶ粒子は、異種導入遺伝子をコードするＡＡＶベクターを含む。
いくつかの実施形態において、ＡＡＶ粒子は、カプシドセロタイプＡＡＶ７、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９を有する。
いくつかの実施形態において、ＡＡＶ粒子は、カプシドセロタイプＡＡＶ９を有する。
いくつかの実施形態において、ＡＡＶ粒子は、カプシドセロタイプＡＡＶ９を有しており、抗ＣＤ６３抗体に連結したライソゾームアルファグルコシダーゼ（ＧＡＡ）をコードするウイルスベクターである。
いくつかの実施形態において、ウイルス粒子は、異種導入遺伝子をコードするウイルスベクターを含む。
いくつかの実施形態において、ウイルス粒子は、アデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ）、パルボウイルス（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）、レトロウイルス（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、バキュロウイルス（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、及びヘルペスウイルス（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）からなる群から選択されるウイルス科に属する。
いくつかの実施形態において、ウイルス粒子は、アタデノウイルス、アビアデノウイルス、イクタデノウイルス、マストアデノウイルス、シアデノウイルス、アンビデンソウイルス、ブレビデンソウイルス、ヘパンデンソウイルス、イテラデンソウイルス、ペンスチルデンソウイルス、アムドパルボウイルス、アベパルボウイルス、ボカパルボウイルス、コピパルボウイルス、ディペンドパルボウイルス、エリスロパルボウイルス、プロトパルボウイルス、テトラパルボウイルス、アルファレトロウイルス、ベータレトロウイルス、デルタレトロウイルス、イプシロンレトロウイルス、ガンマレトロウイルス、レンチウイルス、スプーマウイルス、アルファバキュロウイルス、ベータバキュロウイルス、デルタバキュロウイルス、ガンマバキュロウイルス、イルトウイルス、マルディウイルス、シンプレックスウイルス、バリセロウイルス、サイトメガロウイルス、ムロメガロウイルス、プロボスシウイルス、ロゼオロウイルス、リンホクリプトウイルス、マカウイルス、ペルカウイルス、及びラディノウイルスからなる群から選択されるウイルス属に属する。
いくつかの実施形態において、レトロウイルスは、モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭｏＭＳＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）、スプーマウイルス、フレンドウイルス、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウマ免疫不全ウイルス（ＥＩＶ）、ビスナ・マエディウイルス；ヤギ関節炎・脳炎ウイルス；ウマ伝染性貧血ウイルス；ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）；ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）；またはサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）である。
いくつかの実施形態において、ＨＩＬＩＣは、水中にトリフルオロ酢酸を含む移動相Ａを使用する。
いくつかの実施形態において、移動相Ａは、約０．１％トリフルオロ酢酸を含む。
いくつかの実施形態において、クロマトグラフィーは、アセトニトリル中にトリフルオロ酢酸を含む移動相Ｂを含む。
いくつかの実施形態において、移動相Ｂは、約０．１％トリフルオロ酢酸を含む。
いくつかの実施形態において、クロマトグラフィーにおける移動相Ａの割合は、時間の経過とともに増加する。
いくつかの実施形態において、移動相Ａは、約４５分かけて、約１５％から約１００％まで増加する。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を遺伝子治療のベクターとして使用することを含む、ポンペ病の可能な治療レジメンの概略モデルである。 図２Ａは、ＡＡＶウイルスカプシドのモデルである。図２Ｂは、ＡＡＶセロタイプのウイルスカプシドタンパク質の略図及びそのおおよその質量である。 ＡＡＶ粒子からＡＡＶカプシドタンパク質を逆相ＴＩＣで分離した場合のＵＶトレースであり、個々のタンパク質の分解能が不十分であることが示されている。 いくつかの先行技術による分離方法の比較であり、不十分な分解能及び／または不十分な定量化の両方が示されている。 ＡＡＶ粒子からＡＡＶカプシドタンパク質を親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）で分離した場合のＵＶトレースであり、個々のタンパク質の高い分解能及び個々のタンパク質の相対存在量の決定が示されている。 ＡＡＶ粒子から得たＡＡＶカプシドタンパク質のマススペクトルである。 ＡＡＶ粒子から得たＡＡＶカプシドタンパク質のマススペクトルである。 ＡＡＶ粒子から得たＡＡＶカプシドタンパク質のマススペクトルである。 ＡＡＶ粒子から得たＡＡＶカプシドタンパク質のマススペクトルである。 ＡＡＶ９ウイルス粒子のＨＩＬＩＣ－ＵＶ分析及びその化学量論の決定の２つのトレースを示す。
発明の詳細な説明
本発明について記載する前に、本発明は、記載される特定の方法及び実験条件に限定されるものではなく、かかる方法及び条件は、多様であり得ることが理解される。また、本明細書で使用される用語は、本発明の範囲が添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることから、特定の実施形態を記載することのみを目的にしており、限定を意図するものではないことも理解されたい。いずれの実施形態または実施形態の特徴も互いに組み合わせることができ、そのような組み合わせは、本発明の範囲内に明示的に包含される。
別途の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書で使用されるとき、「約」という用語は、具体的に列挙される数値に関して使用される場合、その値が、列挙される値から１％を超えない程度で変動し得ることを意味する。例えば、本明細書で使用される場合、「約１００」という表現には、９９及び１０１、ならびにその間の全ての値（例えば、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、など）が含まれる。
本明細書に記載されるものと同様または同等の任意の方法及び材料を本発明の実施または検証に使用することができるが、好ましい方法及び材料が以下に記載される。本明細書で言及される全ての特許、出願、及び非特許文献は、その全体が参照により本明細書に援用される。
本明細書で使用される略語
ＭＳ／ＭＳ：タンデム質量分析
ＭＳ：質量分析
ＩＴＲ：末端逆位反復配列
ｒＡＡＶベクター：組換えＡＡＶベクター
ＨＩＬＩＣ：親水性相互作用液体クロマトグラフィー
ＧＡＡ：ライソゾームアルファグルコシダーゼ
ｍＡｂ：モノクローナル抗体
ＩｇＧ：免疫グロブリンＧ
ＬＣ：軽鎖
ＨＣ：重鎖
ＡＡＶ：アデノ随伴ウイルス
ＰＴＭ：翻訳後修飾
ＥＲＴ：酵素補充療法
定義
「アデノ随伴ウイルス」または「ＡＡＶ」：ＡＡＶは、非病原性パルボウイルスで、およそ４．７ｋｂのゲノムの一本鎖ＤＮＡを有し、エンベロープのない正二十面体の構造を有する。ＡＡＶは、当初、１９６５年にアデノウイルス調製物の混入物として発見された。ＡＡＶは、その複製にヘルペスウイルスまたはアデノウイルスのいずれかのヘルパー機能を必要とすることから、デペンドウイルス属及びパルボウイルス科に属する。ヘルパーウイルスが存在しない場合、ＡＡＶは、ヒト１９番染色体の位置１９ｑ１３．４に組み込まれることによって、潜伏状態に入ることができる。ＡＡＶゲノムは、Ｒｅｐ及びＣａｐの２つのＡＡＶ遺伝子のそれぞれに対する２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）から構成される。ＡＡＶのＤＮＡ末端は、１４５塩基の末端逆位反復（ＩＴＲ）を有し、末端の１２５塩基は、パリンドロームになっており、特徴的なＴ型ヘアピン構造をもたらす。
Ｒｅｐ遺伝子は、プロモーターｐ５及びｐ１９から４つのＲｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及びＲｅｐ４０）に転写され、これらのタンパク質は、ウイルスの生活環において重要な役割を果たしている。タンパク質Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８は、プロモーターｐ５から転写されるｍＲＮＡによってコードされる。これらのタンパク質は、ウイルスＤＮＡの複製、転写及び部位特異的組込みの制御に必要である。より小さな２つのタンパク質Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０は、プロモーターｐ１９から転写されるｍＲＮＡによって生成される。これらのタンパク質は、パッケージング及びウイルス組込みのための一本鎖ウイルスゲノムの形成に関与する。Ｃａｐ遺伝子は、３つのウイルスカプシドタンパク質：ＶＰ１（７３５アミノ酸、約９０ｋＤａ）、ＶＰ２（５９８アミノ酸、約７２ｋＤａ）及びＶＰ３（５３３アミノ酸、約６０ｋＤａ）をコードし、これらのタンパク質が１：１：１０の比率で６０サブユニットのウイルスカプシドを形成する（図２Ａ及び２Ｂ参照）。３つのカプシドタンパク質は、プロモーターｐ４０から転写されるｍＲＮＡから翻訳される。
「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、２本の重鎖（Ｈ）及び２本の軽鎖（Ｌ）がジスルフィド結合によって相互に接続された４本のポリペプチド鎖から構成される免疫グロブリン分子（すなわち、「完全抗体分子」）、ならびにその多量体（例えば、ＩｇＭ）またはその抗原結合断片を指すことが意図される。各重鎖は、重鎖可変領域（「ＨＣＶＲ」または「ＶＨ」）及び重鎖定常領域（ドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３から構成される）から構成される。種々の実施形態において、重鎖は、ＩｇＧアイソタイプであり得る。いくつかの場合において、重鎖は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４から選択される。いくつかの実施形態において、重鎖は、アイソタイプＩｇＧ１またはＩｇＧ４のものであり、アイソタイプＩｇＧ１／ＩｇＧ２またはＩｇＧ４／ＩｇＧ２のキメラヒンジ領域を任意選択で含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（「ＬＣＶＲまたは「ＶＬ」）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成される。ＶＨ領域及びＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域に更に分けることができ、その間にフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が点在する。各ＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成され、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、次の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置されている。「抗体」という用語は、任意のアイソタイプまたはサブクラスのグリコシル化及び非グリコシル化免疫グロブリンの両方への言及を含む。「抗体」という用語は、組換え手段によって、調製、発現、作製または単離された抗体分子、例えば、抗体を発現するようにトランスフェクトされた宿主細胞から単離された抗体を含む。抗体構造に関する総説については、Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，ＩＭＧＴ ｕｎｉｑｕｅ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ ａｎｄ Ｉｇ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ Ｖ－ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎｓ，２７（１）Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５５－７７（２００３）；及びＭ．Ｐｏｔｔｅｒ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ，２（１）Ｓｕｒｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．２７－４２（１９８３）を参照されたい。
抗体という用語はまた、１つを超える異なるエピトープに結合することができるヘテロ四量体免疫グロブリンを含む、「二重特異性抗体」も包含する。単一の重鎖及び単一の軽鎖ならびに６つのＣＤＲを含む、二重特異性抗体の半分は、１つの抗原またはエピトープに結合し、抗体のもう半分は、異なる抗原またはエピトープに結合する。いくつかの場合において、二重特異性抗体は、同じ抗原に結合するが、異なるエピトープまたは重複しないエピトープに結合することができる。いくつかの場合において、二重特異性抗体の半分は、両方とも、二重特異性を保持しながら、同一の軽鎖を有する。二重特異性抗体は、米国特許出願公開第２０１０／０３３１５２７号（２０１０年１２月３０日）に概説されている。
抗体の「抗原結合部分」及び「抗原結合断片」（または「抗体断片」）という用語は、抗原に特異的に結合する能力を保持している抗体の１つ以上の断片を指す。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合断片の例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価の断片である、Ｆａｂ断片、（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む二価の断片である、Ｆ（ａｂ’）２断片、（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ２４１：５４４－５４６）、（ｖｉ）単離されたＣＤＲ、ならびに（ｖｉｉ）合成リンカーによって接続されたＦｖ断片の２つのドメインであるＶＬ及びＶＨからなり、ＶＬ及びＶＨの領域ペアが一価の分子を形成して単一のタンパク質鎖を形成する、ｓｃＦｖが挙げられる。ダイアボディなどの単鎖抗体の他の形態もまた「抗体」という用語に包含される（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｔ．（１９９３）９０ ＰＮＡＳ Ｕ．Ｓ．Ａ．６４４４－６４４８；及びＰｏｌｊａｋ ｅｔ ａｔ．（１９９４）２ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １１２１－１１２３参照）。
更に、抗体及びその抗原結合断片は、当該技術分野において一般に知られている標準的な組換えＤＮＡ技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９参照）を使用して得ることができる。
「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する抗体を含むことが意図される。本発明のヒトｍＡｂは、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのランダム変異導入もしくは部位特異的変異導入、またはｉｎ ｖｉｖｏでの体細胞変異によって導入された変異）を、例えば、ＣＤＲ及び特定のＣＤＲ３中に含み得る。一方、「ヒト抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、別の哺乳動物種（例えば、マウス）の生殖細胞系列由来のＣＤＲ配列がヒトＦＲ配列にグラフト化されたｍＡｂを含むことは意図されない。この用語は、非ヒト哺乳動物、または非ヒト哺乳動物の細胞において組換え的に産生された抗体を含む。この用語は、ヒト対象から単離された抗体またはヒト対象において生成された抗体を含むことは意図されない。
「対応する」という用語は、位置、目的または構造における類似性を示す相対的な用語である。特定のペプチドまたはタンパク質に起因するマススペクトルシグナルは、そのペプチドまたはタンパク質に対応するシグナルとも呼ばれる。特定の実施形態において、タンパク質などの特定のペプチド配列またはアミノ酸セットは、対応するペプチド質量に割り当てることができる。
「単離された」という用語は、本明細書で使用される場合、生物学的成分（核酸、ペプチド、タンパク質、脂質、ウイルス粒子または代謝産物など）であって、その成分が天然に生じるか、またはトランスジェニックに発現される生物の細胞内の他の生物学的成分から実質的に分離されたもの、それらから離れて産生されたもの、またはそれらから精製されたものを指す。
「質量分析」は、サンプルから気相イオンを生成させ、次いで、それらを質量電荷比（ｍ／ｚ）に応じて分離及び検出することによって、サンプルを分析する方法である。サンプルから気相イオンを生成させる方法には、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）、表面エンハンス型レーザー脱離イオン化（ＳＥＬＤＩ）、化学イオン化、及び電子衝撃イオン化（ＥＩ）が含まれる。ｍ／ｚ比に応じたイオンの分離は、四重極型質量分析計（Ｑ）、飛行時間型（ＴＯＦ）質量分析計、磁場セクター型質量分析計、３Ｄ及びリニアイオントラップ型（ＩＴ）、オービトラップ型質量分析計、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型（ＦＴ－ＩＣＲ）分析計、及びこれらの組み合わせ（例えば、四重極飛行時間型分析計、またはＱ－ＴＯＦ分析計）を含む、任意の種類の質量分析計で実施することができる。サンプルは、分離前に、一次元以上のクロマトグラフィー分離、例えば、ＨＩＬＩＣに供されてもよい。
タンデム質量分析またはＭＳ／ＭＳは、選択したイオン（プリカーサーイオン）を断片（プロダクトイオン）に分解する技術である。それにより、その断片からプリカーサーイオンの化学構造の様子が明らかになる。タンデム質量分析において、サンプルがイオン化されて（例えば、ＥＳＩ、ＭＡＬＤＩ、ＥＩなどによる）、イオンの混合物が生成されると、特定の質量電荷比（ｍ／ｚ）のプリカーサーイオン、例えば、消化物のペプチドが選択され（ＭＳ１）、次いで、それが断片化されて（ＭＳ２）、検出のためのプロダクトイオンが生成される。典型的なタンデムＭＳ機器としては、ＱｑＱ、ＱＴＯＦ、及びハイブリッドイオントラップ／ＦＴＭＳなどが挙げられる。タンデム質量分析のアプリケーションの一例は、タンパク質の同定である。１台目の質量分析計は、イオン源に導入されイオン源から出てくる多くのイオンのうち、単一のペプチド種を表す特定のｍ／ｚ値のイオンを単離する。次いで、これらのイオンをアルゴンなどの不活性ガスが入ったコリジョンセルへ加速させて、イオンフラグメンテーションを誘起する。このプロセスは、衝突誘起解離（ＣＩＤ）または衝突活性化解離（ＣＡＤ）と呼ばれる。次いで、フラグメントイオンのｍ／ｚ値を２台目の質量分析計で測定してアミノ酸配列情報を得る。本明細書で開示される方法に従って、タンデム質量分析を使用して、ペプチドの配列、したがって、全長または部分長タンパク質の配列を同定することができる。プリカーサーイオンは、多数の異なる方法で活性化することができる（内部エネルギーの増加を伴う）。フラグメンテーションパターンは、エネルギーがどのようにプリカーサーイオンに移動するか、移動したエネルギーの量、及び移動したエネルギーがどのように内部分布されるかに依存する。衝突誘起解離及び赤外多光子解離は、イオンのボルツマン温度を増加させることより、最も弱い結合を優先的に切断する「低速加熱」技術である。
「ペプチド」、「タンパク質」及び「ポリペプチド」という用語は、区別なく、ペプチド結合またはペプチド結合模倣物によって接続されたアミノ酸及び／またはアミノ酸類似体の重合体を指す。２０の天然アミノ酸ならびにその一文字及び三文字表記は、次のとおりである：アラニン Ａ Ａｌａ；システイン Ｃ Ｃｙｓ；アスパラギン酸 Ｄ Ａｓｐ；グルタミン酸 Ｅ Ｇｌｕ；フェニルアラニン Ｆ Ｐｈｅ；グリシン Ｇ Ｇｌｙ；ヒスチジン Ｈ Ｈｉｓ；イソロイシン Ｉ Ｈｅ；リシン Ｋ Ｌｙｓ；ロイシン Ｌ Ｌｅｕ；メチオニン Ｍ Ｍｅｔ；アスパラギン Ｎ Ａｓｎ；プロリン Ｐ Ｐｒｏ；グルタミン Ｑ Ｇｌｎ；アルギニン Ｒ Ａｒｇ；セリン Ｓ Ｓｅｒ；トレオニン Ｔ Ｔｈｒ；バリン Ｖ Ｖａｌ；トリプトファン ｗ Ｔｒｐ；及びチロシン Ｙ Ｔｙｒ。
アミノ酸の質量への言及は、天然存在比などの所与の同位体存在比における、アミノ酸のモノアイソトピック質量または平均質量を意味する。いくつかの例において、アミノ酸の質量は、例えば、アミノ酸を同位体で標識することによって、偏らせることができる。個々の単一のアミノ酸については、アミノ酸の正確な同位体組成に基づいて、アミノ酸の平均質量を中心にある程度のばらつきが予想される。モノアイソトピック質量及び平均質量を含むアミノ酸の質量は、当業者であれば、容易に得ることができる。
同様に、ペプチドまたはタンパク質の質量への言及は、天然存在比などの所与の同位体存在比における、ペプチドまたはタンパク質のモノアイソトピック質量または平均質量を意味する。いくつかの例において、ペプチドの質量は、例えば、ペプチドまたはタンパク質中の１つ以上のアミノ酸を同位体で標識することによって、偏らせることができる。個々の単一のペプチドについては、ペプチドの正確な同位体組成に基づいて、ペプチドの平均質量を中心にある程度のばらつきが予想される。特定のペプチドの質量は、当業者であれば、決定することができる。
「ベクター」は、本明細書で使用される場合、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで宿主細胞に送達される核酸を含む、組換えプラスミドまたはウイルスを指す。
本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの任意の長さのヌクレオチドの重合形態を指す。したがって、この用語は、限定するものではないが、一本鎖、二本鎖または多鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、あるいはプリン及びピリミジン塩基または他の天然、化学的もしくは生化学的修飾、非天然もしくは誘導体化ヌクレオチド塩基を含む重合体を含む。核酸の骨格は、糖及びリン酸基（典型的にＲＮＡまたはＤＮＡに認められ得るもの）、または修飾もしくは置換された糖もしくはリン酸基を含み得る。
あるいは、核酸の骨格は、ホスホロアミデートなどの合成サブユニットの重合体を含み得、したがって、オリゴデオキシヌクレオシドホスホロアミデート（Ｐ－ＮＨ２）またはホスホロアミデート－ホスホジエステルオリゴマーの混合物であり得る。加えて、化学合成の一本鎖ポリヌクレオチド産物から、相補鎖を合成して適切な条件下で鎖をアニーリングすることによって、またはＤＮＡポリメラーゼを適切なプライマーとともに使用して新規で相補鎖を合成することによって、二本鎖核酸を得ることができる。
「組換えウイルスベクター」は、１つ以上の異種配列（すなわち、ウイルス起源ではない核酸配列）を含む組換えポリヌクレオチドベクターを指す。
「組換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶベクター）」は、少なくとも１つ、例えば、２つのＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）が隣接し得る、１つ以上の異種配列（すなわち、ＡＡＶ起源ではない核酸配列）を含むポリヌクレオチドベクターを指す。そのようなｒＡＡＶベクターは、好適なヘルパーウイルスに感染しており（または好適なヘルパー機能を発現し）、ＡＡＶのｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子産物（すなわち、ＡＡＶのＲｅｐ及びＣａｐタンパク質）を発現する宿主細胞中に存在する場合、複製され、感染性ウイルス粒子中にパッケージングされる。
「ウイルス粒子」は、少なくとも１つのウイルスカプシドタンパク質及びカプセル化されたウイルスゲノムで構成されるウイルス粒子を指す。
「異種」とは、比較される、または導入もしくは組み込まれる実体の残りとは遺伝子型が異なる実体に由来することを意味する。例えば、遺伝子工学技術によって異なる細胞種に導入された核酸は、異種核酸である（そして、発現された場合、異種ポリペプチドをコードし得る）。同様に、ウイルスベクターに組み込まれる細胞配列（例えば、遺伝子またはその部分）は、そのベクターに対して異種ヌクレオチド配列である。
「末端逆位反復」または「ＩＴＲ」配列は、ウイルスゲノムの末端に認められる比較的短い配列であり、逆向きに配置されている。「ＡＡＶ末端逆位反復（ＩＴＲ）」配列は、一本鎖ＡＡＶゲノムの両末端に存在するおよそ１４５のヌクレオチド配列である。
「親水性相互作用クロマトグラフィー」またはＨＩＬＩＣという用語は、親水性化合物が疎水性化合物よりも長く保持される、親水性固定相及び疎水性有機移動相を採用するプロセスを含むことが意図される。ある特定の実施形態において、プロセスは、水混和性溶媒の移動相を利用する。
「サンプル」という用語は、本明細書で使用される場合、本発明の方法に従った操作、例えば、分離すること、分析すること、抽出すること、濃縮すること、プロファイリングすることなどを含む操作に供される、ＡＡＶ粒子などの少なくともウイルス粒子を含む分子の混合物を指す。
「クロマトグラフィー表面」という用語は、本明細書で使用される場合、サンプルまたは分析種にさらされる表面を含む。クロマトグラフィー表面は、化学修飾、官能化もしくは活性化されてもよいし、またはミクロ構造、例えば、細孔を有し得る。特定の実施形態において、クロマトグラフィー表面は、疎水性、親水性（極性）またはイオン性であり得る。他の実施形態において、クロマトグラフィー表面は、全多孔性、表面多孔性または非多孔性である。
「クロマトグラフィーコア」という用語は、本明細書で使用される場合、限定するものではないが、シリカなどの有機材料を粒子、モノリスまたは別の好適な構造の形態で含むクロマトグラフィー材料を含み、本発明の材料の内部部分を形成する。ある特定の態様において、クロマトグラフィーコアの表面は、本明細書で定義されるように、クロマトグラフィー表面を表すか、またはクロマトグラフィー表面によって包まれた材料を表す。クロマトグラフィー表面材料は、個別的もしくは明確な変化が認識できるようにクロマトグラフィーコア上に配置されてもよいし、接着されてもよいし、アニーリングされてもよく、またはクロマトグラフィーコアの表面と混ざり合うことで、材料のグラデーションがもたらされ、内部コア表面が不連続にならないようにクロマトグラフィーコアに結合されてもよい。ある特定の態様において、クロマトグラフィー表面材料は、クロマトグラフィーコアの材料と同じであっても、異なっていてもよく、クロマトグラフィーコアとは異なる物理学的または生理化学的性質、例えば、限定するものではないが、細孔容積、表面積、平均細孔径、炭素含有率または加水分解ｐＨ安定性を示し得る。
「親水性」という用語は、本明細書で使用される場合、水に対する親和性を持ち、水を引き寄せ、吸着し、または吸収することを記述する。
「疎水性」という用語は、本明細書で使用される場合、水に対する親和性がなく、水をはじき、または水を吸着もしくは吸収しないことを記述する。
「クロマトグラフィー」は、本明細書で使用される場合、混合物、例えば、ウイルスカプシドタンパク質を含有する混合物を分離するプロセスを指す。これには、混合物を固定相に通すことが含まれ、これにより、混合物中の目的の分子が他の分子から分離され、１つ以上の目的の分子を単離することができる。クロマトグラフィー分離の方法の一例は、親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）である。
「接触させること」には、本明細書で使用される場合、溶液中または固相中で少なくとも２つの物質を一緒にすること、例えば、クロマトグラフィー材料の固定相を、ウイルス粒子を含むサンプルなどのサンプルと接触させることを含む。
概要
ポンペ病は、グリコーゲンのグルコースへの加水分解に関与するライソゾーム酵素の酸α－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）をコードするＧＡＡ遺伝子の変異によって引き起こされる常染色体劣性ライソゾーム蓄積障害である。ＧＡＡの欠損は、ライソゾームにおけるグリコーゲンの蓄積をもたらし、それに続き、心筋、骨格筋、及び平滑筋、ならびに中枢神経系における細胞障害を引き起こす。ポンペ病は、人生の早期に乳児期発症型ポンペ病（ＩＯＰＤ）として、またはそれより遅い小児期から成人期に遅発型ポンペ病（ＬＯＰＤ）として発症し得る。どちらのタイプのポンペ病においても、呼吸不全が主な死因である。
現在、米国食品医薬品局が承認しているポンペ病の治療は、酵素補充療法（ＥＲＴ）だけである。しかしながら、全身投与されるＧＡＡは、血液脳関門を通過しないため、ＣＮＳの病状及び冒された呼吸運動ニューロンを治療することはできない。更に、ＥＲＴは、筋繊維への取り込みが少ないため、骨格筋異常を部分的にしか改善しない。その結果、ＩＯＰＤ患者の３分の２が最終的に人工呼吸器のサポートを必要とし、ＬＯＰＤ患者では呼吸機能不全が持続する。
ポンペ病は単一遺伝子障害であるので、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを使用する遺伝子治療は理想的である。研究されている戦略の１つは、酵素補充と結合抗体の組み合わせである。一例において、内因性酵素を持たない患者において認められる、補充酵素に対する免疫応答を克服するために、遺伝子治療を介して肝臓から抗ＣＤ６３：：ＧＡＡを高発現させることが開発されている（図１参照）。全てのウイルスベクター系と同様に、治療用組成物には、正しく形成されたウイルス粒子が適切な量で含まれることを確実にすることが重要である。したがって、ウイルス粒子の化学量論及びタンパク質組成を決定することは、非常に重要である。
本開示の態様は、ウイルス粒子のウイルスカプシドのタンパク質成分の化学量論を決定する方法に関する。実施形態において、方法は、ウイルス粒子のサンプルを親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）に供して、カプシドに関する情報が所望される目的のウイルス粒子などのウイルス粒子のウイルスカプシドのタンパク質成分を分離することを含む。実施形態において、ＨＩＬＩＣカラムを、ウイルス粒子を含有するサンプルと接触させる。ある特定の実施形態において、方法は、ウイルスカプシドのタンパク質成分の質量を決定して、例えば、本明細書に記載されるものなどの質量分析技術を使用するＨＩＬＩＣによって分離されたタンパク質成分を同定することを含む。実施形態において、方法は、例えば、ＨＩＬＩＣカラムから溶出したウイルスカプシドのタンパク質成分の紫外線（ＵＶ）検出を使用することで、ＨＩＬＩＣ分離からのウイルスカプシドのタンパク質成分の相対存在量を算出して、ウイルス粒子のウイルスカプシドのタンパク質成分の化学量論を決定することを含む。例えば、ＵＶピーク面積を使用して、カプシドタンパク質の相対存在量を決定し、生体カプシドのカプシドタンパク質の化学量論を算出することができる（図４参照）。別の例において、相対存在量の決定には、ピーク高さ及び／またはピークＵＶ強度が使用される。いくつかの実施形態において、ＨＩＬＩＣカラムにおける異なるタンパク質の保持時間は、使用される移動相の関数として決定され、その後の分析では、化学量論の決定が行われるたびにタンパク質の質量及び／または同一性の決定をする必要なく、この保持時間を使用してウイルス粒子からのタンパク質及びタンパク質の相対存在量を決定することができ、例えば、標準値（複数可）を出すことができる。本開示の前は、従来のクロマトグラフィー技術を使用して異なるカプシドタンパク質を分解することは極めて困難であった（図３Ａ及び３Ｂ参照）。ＨＩＬＩＣについて本明細書で説明されるサンプル条件を使用すると、ＡＡＶウイルス粒子の良好な分離が達成された。加えて、ＨＩＬＩＣカラムの使用により、変性ステップのいかなる要件もなくなった。特定の実施形態において、方法は、ウイルス粒子のセロタイプを決定するために使用される。例えば、各ＡＡＶセロタイプのＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３の質量は、ユニークであるので、ＡＡＶカプシドセロタイプの同定または識別に使用することができる。加えて、分離されたカプシドタンパク質は、例えば、インタクトなタンパク質レベルでの正確な質量測定とともに、カプシドタンパク質のタンパク質配列及び翻訳後修飾の決定などの下流の分析に供することができる。
本開示の態様は、ウイルス粒子のカプシドにおけるタンパク質成分の不均一性を決定する方法に関する。実施形態において、方法は、ウイルス粒子をＨＩＬＩＣに供して、ウイルス粒子カプシドのタンパク質成分を分離することを含む。実施形態において、方法は、タンパク質カプシドのタンパク質成分の質量を決定することを含む。いくつかの場合において、ウイルス粒子カプシドのタンパク質成分の質量は、ウイルス粒子カプシドの理論的質量と比較される。ウイルス粒子カプシドのタンパク質成分の質量のうちの１つ以上のずれは、カプシドの１つ以上のタンパク質が不均一であることを示す（図５Ａ参照）。逆に、ずれがないことは、カプシドのタンパク質が均一であることを示す（図５Ｂ～５Ｄ参照）。実施形態において、不均一性は、セロタイプの混合、バリアントカプシド、カプシドアミノ酸の置換、切断カプシド、または改変カプシドのうちの１つ以上に起因する。いくつかの実施形態において、ウイルス粒子のウイルスカプシドのタンパク質成分の化学量論の決定及びウイルス粒子のカプシドにおけるタンパク質成分の不均一性の決定は、同じサンプルで行われ、例えば、単一の試験である。
特定の実施形態において、ウイルス粒子は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子であり、開示される方法は、ＡＡＶ粒子のカプシドにおけるタンパク質成分の化学量論及び／またはＡＡＶ粒子のカプシドにおけるタンパク質成分の不均一性を決定するために使用することができる。実施形態において、タンパク質カプシドのタンパク質成分は、ＡＡＶ粒子のＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３を含む。実施形態において、ＡＡＶ粒子は、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）粒子である。実施形態において、ＡＡＶ粒子は、異種導入遺伝子をコードするＡＡＶベクターを含む。いくつかの実施形態において、本開示の決定または算出された質量（例えば、ＡＡＶ粒子のＶＰ１、ＶＰ２及び／またはＶＰ３について決定または算出された質量）は、参照、例えば、１つ以上のＡＡＶセロタイプのＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３の理論的質量と比較され得る（例えば、図２Ａ及び２Ｂ参照）。参照は、ＡＡＶセロタイプのいずれかの１つ以上のＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３の理論的質量を含み得る。例えば、いくつかの実施形態において、ＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３の質量は、ＡＡＶ１カプシド、ＡＡＶ２カプシド、ＡＡＶ３カプシド、ＡＡＶ４カプシド、ＡＡＶ５カプシド、ＡＡＶ６カプシド、ＡＡＶ７カプシド、ＡＡＶ８カプシド、ＡＡＶｒｈ８カプシド、ＡＡＶ９カプシド、ＡＡＶ１０カプシド、ＡＡＶ１１カプシド、ＡＡＶ１２カプシド、またはそのバリアントのうちの１つ以上の理論的質量と比較される。いくつかの実施形態において、決定または算出された質量（例えば、ＡＡＶ粒子のＶＰ１、ＶＰ２及び／またはＶＰ３について決定または算出された質量）は、対応するＡＡＶセロタイプのＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３の理論的質量と比較され得る。
いくつかの実施形態において、本開示の方法は、ＡＡＶ粒子のタンパク質の不均一性を決定することを含み得る。いくつかの実施形態において、ＶＰ１、ＶＰ２及び／またはＶＰ３の質量のうちの１つ以上のずれ（例えば、理論的質量、予測質量、または予想質量などの参照質量からのずれ）は、ＡＡＶカプシドタンパク質の不均一性を示す。いくつかの実施形態において、不均一性には、限定するものではないが、次のもの：セロタイプの混合、バリアントカプシド、カプシドアミノ酸の置換、切断カプシド、または改変カプシドのうちの１つ以上が含まれ得る。
いくつかの実施形態において、ＡＡＶ粒子の不均一性を決定する方法は、変性させたＡＡＶ粒子をＬＣ／ＭＳ（例えば、本明細書に記載されるもの）に供することと、ＡＡＶ粒子のＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３の質量を決定することと、これらの質量をＡＡＶセロタイプのＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３の理論的質量と比較することと、更に、ＶＰ１、ＶＰ２及び／またはＶＰ３の断片をＬＣ／ＭＳ／ＭＳに供することと、ＡＡＶ粒子のＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３の断片の質量を決定することと、これらの質量をＡＡＶセロタイプのＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３の理論的質量と比較すること（ＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３の質量のうちの１つ以上のずれは、ＡＡＶカプシド不均一性を示す）と、を含み得る。
実施形態において、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１カプシド、ＡＡＶ２カプシド、ＡＡＶ３カプシド、ＡＡＶ４カプシド、ＡＡＶ５カプシド、ＡＡＶ６カプシド、ＡＡＶ７カプシド、ＡＡＶ８カプシド、ＡＡＶｒｈ８カプシド、ＡＡＶ９カプシド、ＡＡＶ１０カプシド、ＡＡＶ１１カプシド、ＡＡＶ１２カプシド、またはそのバリアントを含む。
実施形態において、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３の質量は、ＡＡＶ１カプシド、ＡＡＶ２カプシド、ＡＡＶ３カプシド、ＡＡＶ４カプシド、ＡＡＶ５カプシド、ＡＡＶ６カプシド、ＡＡＶ７カプシド、ＡＡＶ８カプシド、ＡＡＶｒｈ８カプシド、ＡＡＶ９カプシド、ＡＡＶ１０カプシド、ＡＡＶ１１カプシド、ＡＡＶ１２カプシド、またはそのバリアントのうちの１つ以上の理論的質量と比較される。
実施形態において、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１ ＩＴＲ、ＡＡＶ２ ＩＴＲ、ＡＡＶ３ ＩＴＲ、ＡＡＶ４ ＩＴＲ、ＡＡＶ５ ＩＴＲ、ＡＡＶ６ ＩＴＲ、ＡＡＶ７ ＩＴＲ、ＡＡＶ８ ＩＴＲ、ＡＡＶｒｈ８ ＩＴＲ、ＡＡＶ９ ＩＴＲ、ＡＡＶ１０ ＩＴＲ、ＡＡＶ１１ ＩＴＲ、またはＡＡＶ１２ ＩＴＲを含む。
実施形態において、ＡＡＶ粒子は、対象の肝臓の細胞に形質導入するために選択されたカプシドセロタイプを有する。実施形態において、ＡＡＶ粒子は、対象の肝臓の細胞に形質導入することに選択的であるカプシドセロタイプＡＡＶ７、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９を有する。
いくつかの実施形態において、ＡＡＶ粒子は、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）粒子である。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ粒子は、異種導入遺伝子をコードするＡＡＶベクターを含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ粒子は、カプシドセロタイプＡＡＶ７、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９を有する。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ粒子は、カプシドセロタイプＡＡＶ９を有する。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ粒子は、カプシドセロタイプＡＡＶ９を有しており、筋細胞から発現される抗原に特異的な抗体（例えば、抗ＣＤ６３抗体）に連結されたライソゾームアルファグルコシダーゼ（ＧＡＡ）をコードするウイルスベクターである。
ＡＡＶが本開示のモデルウイルス粒子であるが、本開示の方法は、様々なウイルスのプロファイル、例えば、ウイルス科、亜科、及び属に適用できることが意図される。本開示の方法は、例えば、ＶＰの発現、翻訳後修飾、及び切断をモニタリングするためのＶＰのプロファイリングにおける用途、ならびにＶＬＰ製造中の製品の一貫性の確保、カプシドタンパク質の工学的応用のための部位特異的変異導入もしくは構造の特徴付けの確認、及び／またはウイルス粒子もしくは調製物の不均一性のモニタリングもしくは検出に用途を見出すことができる。
実施形態において、ウイルスベクターは、異種導入遺伝子をコードする。
実施形態において、ウイルス粒子は、アデノウイルス、パルボウイルス、レトロウイルス、バキュロウイルス、及びヘルペスウイルスからなる群から選択されるウイルス科に属する。
実施形態において、ウイルス粒子は、アタデノウイルス、アビアデノウイルス、イクタデノウイルス、マストアデノウイルス、シアデノウイルス、アンビデンソウイルス、ブレビデンソウイルス、ヘパンデンソウイルス、イテラデンソウイルス、ペンスチルデンソウイルス、アムドパルボウイルス、アベパルボウイルス、ボカパルボウイルス、コピパルボウイルス、ディペンドパルボウイルス、エリスロパルボウイルス、プロトパルボウイルス、テトラパルボウイルス、アルファレトロウイルス、ベータレトロウイルス、デルタレトロウイルス、イプシロンレトロウイルス、ガンマレトロウイルス、レンチウイルス、スプーマウイルス、アルファバキュロウイルス、ベータバキュロウイルス、デルタバキュロウイルス、ガンマバキュロウイルス、イルトウイルス、マルディウイルス、シンプレックスウイルス、バリセロウイルス、サイトメガロウイルス、ムロメガロウイルス、プロボスシウイルス、ロゼオロウイルス、リンホクリプトウイルス、マカウイルス、ペルカウイルス、及びラディノウイルスからなる群から選択されるウイルス属に属する。
実施形態において、レトロウイルスは、モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭｏＭＳＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）、スプーマウイルス、フレンドウイルス、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウマ免疫不全ウイルス（ＥＩＶ）、ビスナ・マエディウイルス；ヤギ関節炎・脳炎ウイルス；ウマ伝染性貧血ウイルス；ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）；ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）；またはサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）である。
親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）は、ＮＰ－ＨＰＬＣの一種であり、部分的に水性の移動相を用いて実施することができるので、ペプチド、炭水化物、核酸、及び多くのタンパク質の順相分離が可能である。ＨＩＬＩＣの溶出順序は、逆相ＨＰＬＣとは逆に、極性の最も低いものから極性の最も高いものになる。
ＨＩＬＩＣは、分析種と固定相（例えば、基質）との間の極性相互作用に基づいて分析種を分離する。極性分析種は、極性固定相と会合し、極性固定相によって保持される。吸着強度は、分析種の極性が高くなるほど大きくなり、極性分析種と極性固定相（移動相と比較して）との間の相互作用により、溶出時間が長くなる。移動相に極性の高い溶媒を使用すると、分析種の保持時間が短くなり、一方、疎水性の高い溶媒を使用すると、保持時間が長くなる傾向がある。
ＨＩＬＩＣでは、様々な種類の基質、例えば、シリカ、アミノ、アミド、セルロース、シクロデキストリン及びポリスチレンの各基質を含む、カラムクロマトグラフィー用の基質を使用することができる。例えば、カラムクロマトグラフィーに使用することができる有用な基質の例としては、ポリスルホエチルアスパルタミド（例えば、ＰｏｌｙＬＣ製）、スルホベタイン基質、例えば、ＺＩＣ（登録商標）－ＨＩＬＩＣ（例えば、ＳｅＱｕａｎｔ製）、ＰＯＲＯＳ（登録商標）ＨＳ（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）、ＰＯＲＯＳ（登録商標）Ｓ（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）、ポリヒドロエチルアスパルタミド（例えば、ＰｏｌｙＬＣ製）、Ｚｏｒｂａｘ ３００ ＳＣＸ（例えば、Ａｇｉｌｅｎｔ製）、ＰｏｌｙＧＬＹＣＯＰＬＥＸ（登録商標）（例えば、ＰｏｌｙＬＣ製）、Ａｍｉｄｅ－８０（例えば、Ｔｏｓｏｈａａｓ製）、ＴＳＫ ＧＥＬ（登録商標）Ａｍｉｄｅ－８０（例えば、Ｔｏｓｏｈａａｓ製）、ポリヒドロキシエチルＡ（例えば、ＰｏｌｙＬＣ製）、Ｇｌｙｃｏ－Ｓｅｐ－Ｎ（例えば、Ｏｘｆｏｒｄ ＧｌｙｃｏＳｃｉｅｎｃｅｓ製）、及びＡｔｌａｎｔｉｓ ＨＩＬＩＣ（例えば、Ｗａｔｅｒｓ製）が挙げられる。開示される方法で使用することができるカラムとしては、次の官能基：カルバモイル基、スルホプロピル基、スルホエチル基（例えば、ポリ（２－スルホエチルアスパルタミド））、ヒドロキシエチル基（例えば、ポリ（２－ヒドロキシエチルアスパルタミド））及び芳香族スルホン酸基のうちの１つ以上を利用するカラムが挙げられる。
特定の実施形態において、カプシドタンパク質は、ＨＩＬＩＣカラムで分離され、その後、例えば、移動相グラジエントを使用して、ＨＩＬＩＣカラムから溶出して個々のカプシドタンパク質を分解することにより、サンプル中のカプシドタンパク質を精製及びまたは分離する。ある特定の例において、ＨＩＬＩＣカラムから溶出したカプシドタンパク質は、１つ以上のフラクションに分離される。そのようなフラクションは、ＭＳ分析などの後続の分析に使用することができる。特定の実施形態において、方法は、フラクションのうちの１つ以上に存在するカプシドタンパク質を同定することを含む。
使用される移動相は、イオン対試薬を含んでも含まなくてもよい緩衝液、例えば、アセトニトリル及び水を含み得る。イオン対試薬には、ギ酸塩、酢酸塩、ＴＦＡ及び塩が含まれる。緩衝液のグラジエントが使用され得、例えば、２つの緩衝液が使用される場合、クロマトグラフィーの実行中に、第１の緩衝液の濃度または割合を減少させ、一方、第２の緩衝液の濃度または割合を増やすことができる。例えば、第１の緩衝液の割合は、クロマトグラフィーの実行中、約１００％から、約９９％、約９５％、約９０％、約８５％、約８０％、約７５％、約７０％、約６５％、約６０％、約５０％、約４５％、または約４０％～約０％、約１％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、または約４０％に減少し得る。別の例として、第２の緩衝液の割合は、同実行中、約０％から、約１％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、または約４０％～約１００％、約９９％、約９５％、約９０％、約８５％、約８０％、約７５％、約７０％、約６５％、約６０％、約５０％、約４５％、または約４０％に増加し得る。実施形態において、クロマトグラフィーにおける移動相Ａの割合は、時間の経過とともに増加する。任意選択により、第１及び第２の緩衝液の濃度または割合は、クロマトグラフィーの実行終了時に、開始値に戻すことができる。一例として、第１の緩衝液の割合は、８５％から６３％、５９％、１０％、８５％へ５段階で変化し、同ステップにおける第２の緩衝液の割合は、１５％から３７％、４１％、９０％、１５％へ変化し得る。割合は、リニアグラジエントで段階的に変化し得、または非リニア（例えば、ステップワイズ）的に変化し得る。例えば、グラジエントは、多相性、例えば、二相性、三相性などであり得る。好ましい実施形態において、本明細書に記載される方法は、イオン対試薬を使用することなく、移動相の極性の増加に対応して減少するアセトニトリル緩衝液のグラジエントを使用する。実施形態において、ＨＩＬＩＣは、水中にトリフルオロ酢酸を含む移動相Ａを使用する。実施形態において、移動相Ａは、約０．１％トリフルオロ酢酸を含む。実施形態において、クロマトグラフィーは、アセトニトリル中にトリフルオロ酢酸を含む移動相Ｂを含む。実施形態において、移動相Ｂは、約０．１％トリフルオロ酢酸を含む。
カラム温度は、例えば、市販のカラムヒーターを使用して、クロマトグラフィーの実行中、一定温度に維持することができる。いくつかの実施形態において、カラムは、約５０℃～約７０℃、例えば、約５０℃～約６０℃、約５５℃～約６０℃、例えば、約５０℃、約５５℃、約６０℃、約６５℃、または約７０℃の温度に維持される。一実施形態において、温度は、約６０℃である。
移動相の流量は、約０～約１００ｍｌ／分の間であり得る。分析目的では、流量は、典型的に、０～１０ｍｌ／分の範囲であり、分取ＨＰＬＣの場合、１００ｍｌ／分を超える流量が使用され得る。例えば、流量は、約０．５、約１、約１．５、約２、約２．５、約３、約３．５、約４、約４．５、または約５ｍｌ／分であり得る。同じパッキングで同じ長さを有するが、直径のより小さいカラムに置き換える場合、直径の大きいカラムで認められるのと同じピーク保持時間及びピーク分解能を維持するために、流量を下げる必要がある。好ましくは、４．６×１００ｍｍ、５μｍカラムにおいて約１ｍｌ／分に相当する流量が使用される。
実行時間は、約１５～約２４０分の間、例えば、約２０～約７０分、約３０～約６０分、約４０～約９０分、約５０分～約１００分、約６０～約１２０分、約５０～約８０分であり得る。実施形態において、移動相Ａは、約４５分かけて、約１５％から約１００％まで増加する。
いくつかの実施形態において、方法は、ウイルス粒子を液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）に供することを含む。当該技術分野で知られているように、ＬＣ／ＭＳは、イオンを物理的に分離するための液体クロマトグラフィー、及びイオンからマススペクトルデータを生成するための質量分析を利用する。そのようなマススペクトルデータを使用して、例えば、分子量または分子構造、質量、量、純度などによる粒子の識別を決定することができる。これらのデータは、検出されたイオンの特性、例えば、時間の経過（例えば、保持時間）に伴うシグナル強度（例えば、存在量）、または質量電荷比に対する相対存在量を表し得る。
いくつかの実施形態において、質量分析（例えば、本明細書に記載されるようなＬＣ／ＭＳで使用されるもの）は、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）を指し得る。ＥＳＩ－ＭＳは、電気エネルギーを使用して溶液から得られたイオンを質量分析の使用により分析する技術として当該技術分野において知られている（例えば、Ｙａｍａｓｈｉｔａ，Ｍ．ａｎｄ Ｆｅｎｎ，Ｊ．Ｂ．（１９８４）．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．８８：４４５１－４４５９参照）。イオン種（または溶液中もしくは気相中でイオン化される中性種）は、接地（例えば、周囲のチャンバーの壁）に対して電圧を持つ小さなキャピラリーを溶液が通過するときに、帯電液滴のエアロゾルに分散され、続いて、溶媒が蒸発して帯電液滴の大きさが小さくなり、帯電液滴からサンプルイオンが放出されることによって、溶液から気相に移動する。ＥＳＩは、サンプルを揮発性酸及び有機溶媒と混合し、それを高電圧をかけた導電性の針を介して注入することによって実施される。針の先から噴霧（または放出）した帯電液滴は、質量分析計に直接導入され、飛行する際に熱及び真空で乾燥される。液滴が乾燥したら、残りの帯電分子は、電磁レンズによって質量検出器に導入され、質量分析がなされる。一実施形態において、溶出したサンプルは、キャピラリーからエレクトロスプレーノズルに直接入れられ、例えば、キャピラリーは、サンプルローダーとして機能する。別の実施形態において、キャピラリー自体が抽出装置とエレクトロスプレーノズルの両方として機能する。
ＭＡＬＤＩの場合、分析種の分子（例えば、タンパク質）を金属ターゲット上に堆積させ、有機マトリックスと共結晶させる。サンプルを乾燥させ、質量分析計に挿入して、典型的に、飛行時間型（ＴＯＦ）検出により分析する。一実施形態において、溶出したサンプルは、キャピラリーから金属ターゲット上に直接堆積させ、例えば、キャピラリー自体がサンプルローダーとして機能する。一実施形態において、抽出した分析種をＭＡＬＤＩターゲット上に堆積させ、ＭＡＬＤＩイオン化マトリックスを加え、サンプルをイオン化して、例えば、ＴＯＦ検出によって分析する。
いくつかの実施形態において、他のイオン化モード、例えば、ＥＳＩ－ＭＳ、ターボスプレーイオン化質量分析、ナノスプレーイオン化質量分析、サーモスプレーイオン化質量分析、ソニックスプレーイオン化質量分析、ＳＥＬＤＩ－ＭＳ及びＭＡＬＤＩ－ＭＳが使用される。一般に、これらの方法の利点は、サンプルの「ジャストインタイム」精製及びイオン化環境への直接導入が可能になることである。様々なイオン化及び検出モードにより、使用される脱離液の性質に独自の制約が生じることに注意することが重要であり、脱離液が両方に適合することが重要である。例えば、多くのアプリケーションにおいて、サンプルマトリックスは、低イオン強度を有するか、特定のｐＨ範囲内にある必要などがある。ＥＳＩにおいて、サンプル中の塩は、イオン化を低下させたり、ノズルを詰まらせることによって、検出を妨げる場合がある。この問題は、分析種を低い塩で提示すること及び／または揮発性塩を使用することによって対処される。ＭＡＬＤＩの場合、分析種は、ターゲットへのスポッティング及び採用するイオン化マトリックスに適合する溶媒中に含まれている必要がある。
いくつかの実施形態において、方法は、本開示のウイルス粒子を液体クロマトグラフィー／質量分析－質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）に供すること、または本開示の変性ウイルス粒子の消化された断片をＬＣ／ＭＳ／ＭＳに供することを含む。当該技術分野で知られているように、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（「液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析」という用語は、本明細書中で区別なく用いられ得る）は、イオンを物理的に分離するための液体クロマトグラフィー、及びイオンからマススペクトルデータを生成するための質量分析を利用し、ここで、質量分析は、複数の段階の質量（例えば、ｍ／ｚ）分離を使用し、典型的には、フラグメンテーションステップによって分離される。例えば、ｍ／ｚの範囲内の目的のイオンは、１回目のＭＳで分離され、断片化され、次いで、２回目のＭＳで個々のｍ／ｚに基づいて更に分離され得る。イオンフラグメンテーションは、限定するものではないが、衝突誘起解離（ＣＩＤ）、高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）、電子捕獲解離（ＥＣＤ）、または電子移動解離（ＥＴＤ）などの技術を含み得る。
ＬＣ／ＭＳ及び／またはＬＣ／ＭＳ／ＭＳに好適な質量分析計は、様々なものが当該技術分野において知られており、限定するものではないが、飛行時間型（ＴＯＦ）分析計、四重極質量フィルター、四重極ＴＯＦ（ＱＴＯＦ）、及びイオントラップ（例えば、フーリエ変換型質量分析計またはＯｒｂｉｔｒａｐ）が挙げられる。Ｏｒｂｉｔｒａｐにおいて、接地電位のバレル状の外部電極及び紡錘形状の中央電極を使用して、遠心力と静電力のバランスによって閉じ込められ、中心軸に沿って振動しながら、中央電極の周りを楕円形に回転する軌道にイオンを捕捉する。そのような機器の使用は、イメージ電流の検出による時間領域信号（例えば、周波数）を高分解能の質量測定（例えば、ナノＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）に変換するために、フーリエ変換操作を採用する。更なる記載及び詳細については、例えば、Ｓｃｈｅｌｔｅｍａ，Ｒ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ １３：３６９８－３７０８；Ｐｅｒｒｙ，Ｒ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｍａｓｓ．Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．Ｒｅｖ．２７：６６１－６９９；及びＳｃｉｇｅｌｏｖａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｍｏ／．Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ １０：Ｍ１１ １．００９４３１に見出すことができる。
いくつかの実施形態において、ウイルスカプシドタンパク質の質量は、例えば、ＬＣ／ＭＳデータ及び／またはＬＣ／ＭＳ／ＭＳデータに基づいて、決定され得る。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ粒子のＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３の質量、またはＡＡＶ粒子のＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３の断片の質量は、例えば、ＬＣ／ＭＳデータ及び／またはＬＣ／ＭＳ／ＭＳデータに基づいて、決定され得る。ＭＳデータからタンパク質の質量及び／または同一性を決定するための方法は、様々なものが当該技術分野において知られている。例えば、ペプチドマスフィンガープリンティングを使用して、ＭＳデータに基づいてタンパク質配列を決定することもできるし、または１つ以上の構成ペプチドに関するＭＳ／ＭＳデータに基づいてタンパク質を同定することもできる。タンデムＭＳを使用する場合、プロダクトイオンスキャニングを使用して、目的のタンパク質のうちの１つ以上のペプチドに関するｍ／ｚデータを分析することができる。次いで、当該技術分野において知られているソフトウェアを使用して、例えば、同定されたピークを参照または既知のピークと照合したり、ピークをアイソトポマーエンベロープにグループ化したりすることができる。ペプチド質量の値は、既知のペプチド配列のデータベースと比較することができる。例えば、Ｍａｓｃｏｔを使用して、観察されたペプチドを、例えば、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏタンパク質データベースに特定の消化パターンを適用することから生じる理論上のデータベースペプチドと照合することができる。他の好適なソフトウェアとしては、限定するものではないが、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ、ＰｒｏｔｅｉｎＰｒｏｓｐｅｃｔｏｒ、Ｘ！ Ｔａｎｄｅｍ、Ｐｅｐｆｉｎｄｅｒ、Ｂｏｎｉｃｓ、またはＭａｓｓＬｙｎｘ（商標）（Ｗａｔｅｒｓ）を挙げることができる。
いくつかの実施形態において、異種核酸は、プロモーターに作動可能に連結される。例示的なプロモーターとしては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、ＲＳＶ ＬＴＲ、ＭｏＭＬＶ ＬＴＲ、ホスホグリセリン酸キナーゼ－１（ＰＧＫ）プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター及びＣＫ６プロモーター、トランスサイレチンプロモーター（ＴＴＲ）、ＴＫプロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター（ＴＲＥ）、ＨＢＶプロモーター、ｈＡＡＴプロモーター、ＬＳＰプロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、Ｅ２Ｆプロモーター、テロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）プロモーター；サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリベータ－アクチン／ウサギβ－グロビンプロモーター（ＣＡＧプロモーター；Ｎｉｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１９９１，１０８（２）：１９３－９）ならびに伸長因子１－アルファプロモーター（ＥＦｌ－アルファ）プロモーター（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１９９０，９１（２）：２１７－２３及びＧｕｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１９９６，３（９）：８０２－ １０）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ヒトβ－グルクロニダーゼプロモーターまたはニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーターに連結されたサイトメガロウイルスエンハンサーを含む。プロモーターは、構成性、誘導性または抑制性プロモーターであり得る。いくつかの実施形態において、本発明は、ＣＢＡプロモーターに作動可能に連結された本開示の異種導入遺伝子をコードする核酸を含む、組換えベクターを提供する。
構成性プロモーターの例としては、限定するものではないが、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意選択でＲＳＶエンハンサーを伴う）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（任意選択でＣＭＶエンハンサーを伴う）、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、１３－アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、及びＥＦｌａプロモーターが挙げられる。
誘導性プロモーターは、遺伝子発現の調節を可能にするものであり、外因的に供給される化合物、温度などの環境因子、もしくは特定の生理学的状態、例えば、急性期、細胞の特定の分化状態の存在によって、または複製中の細胞のみにおいて、調節され得る。誘導性プロモーター及び誘導系は、様々な商業的供給源から入手可能であり、限定するものではないが、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ及びＡｒｉａｄが挙げられる。他にも多くの系が記載されており、当業者によって容易に選択することができる。外因的に供給されるプロモーターによって調節される誘導性プロモーターの例としては、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオニン（ＭＴ）プロモーター、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）誘導性マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系（ＷＯ９８／１００８８）；エクジソン昆虫プロモーター（Ｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：３３４６－３３５１（１９９６））、テトラサイクリン抑制系（Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５５４７－５５５１（１９９２））、テトラサイクリン誘導系（Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８：１７６６－１７６９（１９９５）、Ｈａｒｖｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２：５１２－５１８（１９９８）も参照）、ＲＵ４８６－誘導系（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１５：２３９－２４３（１９９７）及びＷａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，４：４３２－４４１（１９９７））及びラパマイシン誘導系（Ｍａｇａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１００：２８６５－２８７２（１９９７））が挙げられる。また、本文脈で有用であり得る誘導性プロモーターの他の種類には、特定の生理学的状態、例えば、温度、急性期、細胞の特定の分化状態によって、または複製中の細胞のみにおいて、調節されるものがある。
別の実施形態において、導入遺伝子に天然プロモーターまたはその断片が使用される。天然プロモーターは、導入遺伝子の発現が自然な発現を再現すべきことが望ましい場合に使用することができる。天然プロモーターは、導入遺伝子の発現を、時間的もしくは発生的に、または組織特異的に、または特定の転写刺激に応じて、調節しなければならない場合に使用され得る。更なる実施形態において、エンハンサーエレメント、ポリアデニル化部位またはＫｏｚａｋコンセンサス配列などの他の天然発現制御エレメントも自然な発現を再現するために使用され得る。
いくつかの実施形態において、調節配列は、組織特異的な遺伝子発現能力を付与する。いくつかの場合において、組織特異的な調節配列は、組織特異的に転写を誘導する組織特異的な転写因子に結合する。そのような組織特異的な調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）は、当該技術分野においてよく知られている。
いくつかの実施形態において、ベクターは、イントロンを含む。例えば、いくつかの実施形態において、イントロンは、ニワトリベータ－アクチン及びウサギベータ－グロビンに由来するキメライントロンである。いくつかの実施形態において、イントロンは、マウス微小ウイルス（ＭＶＭ）イントロンである。
いくつかの実施形態において、ベクターは、ポリアデニル化（ｐｏｌｙＡ）配列を含む。ポリアデニル化配列の例としては、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）Ｐｏｌｙ（Ａ）配列（例えば、アクセッション番号ＥＦ５９２５３３参照）、ＳＶ４０ポリアデニル化配列、及びＨＳＶ ＴＫ ｐＡポリアデニル化配列など、多くのものが当該技術分野において知られている。
前述の実施形態に記載されているシステム、方法、及び行為の例は、例示的なものであり、代替的な実施形態において、種々の実施形態の範囲及び趣旨から逸脱することなく、ある特定の行為を、異なる順序で、互いに並行して、完全に省略して、及び／または異なる例示的な実施形態間で組み合わせて実施することができ、及び／またはある特定の追加的な行為を実施することができる。したがって、そのような代替的な実施形態は、本明細書に記載される例に含まれる。
以上、具体的な実施形態について詳細に記載してきたが、当該記載は、単なる例示を目的にしている。したがって、上記の多数の態様は、特に明記されない限り、必要な要素または必須の要素であることを意図していないことが理解される。例示的な実施形態について開示された態様の変更及びそれに対応する同等の構成要素または行為は、上記のものに加えて、以下の特許請求の範囲に定義される実施形態の趣旨及び範囲から逸脱することなく、本開示の恩恵を受ける当業者によって行うことができ、その範囲は、そのような変更及び同等の構造を包含するように、最も広い解釈が与えられるものとする。
以下の実施例は、ある特定の実施形態の特定の特徴を例示するために提供される。しかしながら、以下に記載される特定の特徴は、本発明の範囲を限定するものではなく、その例から当業者が等価物を認識するものとみなされるべきである。
以下の実施例は、本発明の方法を実施及び使用する方法についての完全な開示及び説明を当業者に提供するために提示されるものであり、発明者らが発明とみなすものの範囲を限定する意図はない。使用される数（例えば、量、温度など）に関しては、正確さを確保するよう努めたが、ある程度の実験誤差及びずれを考慮されたい。特に指示されない限り、部は、重量部であり、分子量は、指示のない限り、平均分子量であり、温度は、セ氏温度であり、室温は、約２５℃であり、圧力は、大気圧またはほぼ大気圧である。
インタクトなＡＡＶ粒子からのカプシドタンパク質の分離
インタクトなＡＡＶ９ウイルス粒子を分離するために、以下の表に記載されるＨＩＬＩＣカラムに１μＬのＡＡＶサンプルを注入した。分離の結果を図４に示す。示されるように、３つのＡＡＶカプシドタンパク質は、互いに完全な分解を示した。
表１は、インタクトなＡＡＶ９カプシドからＡＡＶ９カプシドタンパク質を分離するために使用したクロマトグラフィー条件の概要を示す。
（表１）クロマトグラフィー条件の要約
Figure 2022505687000001
ＲＰベースの分離と比較して、ＨＩＬＩＣカラムの独自の保持機構は、ＶＰ分離に驚くほど良好に作用した（図４、３Ａ及び３Ｂ参照）。
分離したＡＡＶカプシドタンパク質のマススペクトル分析
本明細書に記載される方法の利点の１つは、サンプル調製を必要としないことである。１ｕＬのサンプルをＬＣ－ＭＳに直接注入し、得られたデータを分析した。インタクト質量分析のために、Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｐｌｕｓ質量分析計に以下のチューンパラメーターを適用した。
Figure 2022505687000002
図５Ａ～５Ｄは、個々のカプシドタンパク質のマススペクトルを示す。図５Ａに示されるように、ＶＰ３にはタンパク質の不均一性があった。
図６に示されるように、ピーク高さを使用して、インタクトなＡＡＶ粒子の化学量論を決定することができる。
本発明は、本明細書に記載される具体的な実施形態によって範囲が限定されるものではない。事実、本明細書に記載されるものに加えて、本発明の様々な変更は、前述の説明及び添付の図面から当業者に明らかになるであろう。そのような変更は、添付する特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。

Claims (20)

  1. ウイルス粒子のウイルスカプシドのタンパク質成分の化学量論を決定する方法であって、
    ウイルス粒子のサンプルを親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）に供して、前記ウイルス粒子のウイルスカプシドのタンパク質成分を分離することと、
    前記ウイルスカプシドのタンパク質成分の質量を決定して、ＨＩＬＩＣによって分離された前記タンパク質成分を同定することと、
    前記ＨＩＬＩＣ分離からの前記ウイルスカプシドのタンパク質成分の相対存在量を決定し、それにより、ウイルス粒子のウイルスカプシドのタンパク質成分の化学量論を決定することと
    を含む、前記方法。
  2. 前記ウイルス粒子が、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記タンパク質カプシドのタンパク質成分が、前記ＡＡＶ粒子のＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３を含む、請求項２に記載の方法。
  4. 前記ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３の質量が、ＡＡＶ１カプシド、ＡＡＶ２カプシド、ＡＡＶ３カプシド、ＡＡＶ４カプシド、ＡＡＶ５カプシド、ＡＡＶ６カプシド、ＡＡＶ７カプシド、ＡＡＶ８カプシド、ＡＡＶｒｈ８カプシド、ＡＡＶ９カプシド、ＡＡＶ１０カプシド、ＡＡＶ１１カプシド、ＡＡＶ１２カプシド、またはそのバリアントのうちの１つ以上の理論的質量と比較される、請求項２に記載の方法。
  5. 前記ＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ１カプシド、ＡＡＶ２カプシド、ＡＡＶ３カプシド、ＡＡＶ４カプシド、ＡＡＶ５カプシド、ＡＡＶ６カプシド、ＡＡＶ７カプシド、ＡＡＶ８カプシド、ＡＡＶｒｈ８カプシド、ＡＡＶ９カプシド、ＡＡＶ１０カプシド、ＡＡＶ１１カプシド、ＡＡＶ１２カプシド、またはそのバリアントを含む、請求項３に記載の方法。
  6. 前記ＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ１ ＩＴＲ、ＡＡＶ２ ＩＴＲ、ＡＡＶ３ ＩＴＲ、ＡＡＶ４ ＩＴＲ、ＡＡＶ５ ＩＴＲ、ＡＡＶ６ ＩＴＲ、ＡＡＶ７ ＩＴＲ、ＡＡＶ８ ＩＴＲ、ＡＡＶ９ ＩＴＲ、ＡＡＶ１０ ＩＴＲ、ＡＡＶ１１ ＩＴＲ、またはＡＡＶ１２ ＩＴＲを含む、請求項２に記載の方法。
  7. 前記ＡＡＶ粒子が、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）粒子または異種導入遺伝子をコードするＡＡＶベクターである、請求項２に記載の方法。
  8. 前記ＡＡＶ粒子が、対象の肝臓の細胞に形質導入するために選択されたカプシドセロタイプを有する、請求項２に記載の方法。
  9. 前記ＡＡＶ粒子が、カプシドセロタイプＡＡＶ７、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９を有する、請求項８に記載の方法。
  10. 前記ＡＡＶ粒子が、カプシドセロタイプＡＡＶ９を有する、請求項９に記載の方法。
  11. 前記ＡＡＶ粒子が、カプシドセロタイプＡＡＶ９を有しており、抗ＣＤ６３抗体に連結したライソゾームアルファグルコシダーゼ（ＧＡＡ）をコードするウイルスベクターである、請求項２に記載の方法。
  12. 前記ウイルス粒子が、異種導入遺伝子をコードするウイルスベクターを含むか、またはアデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ）、パルボウイルス（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）、レトロウイルス（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、バキュロウイルス（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、及びヘルペスウイルス（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）からなる群から選択されるウイルス科に属する、請求項１に記載の方法。
  13. 前記ウイルス粒子が、アタデノウイルス、アビアデノウイルス、イクタデノウイルス、マストアデノウイルス、シアデノウイルス、アンビデンソウイルス、ブレビデンソウイルス、ヘパンデンソウイルス、イテラデンソウイルス、ペンスチルデンソウイルス、アムドパルボウイルス、アベパルボウイルス、ボカパルボウイルス、コピパルボウイルス、ディペンドパルボウイルス、エリスロパルボウイルス、プロトパルボウイルス、テトラパルボウイルス、アルファレトロウイルス、ベータレトロウイルス、デルタレトロウイルス、イプシロンレトロウイルス、ガンマレトロウイルス、レンチウイルス、スプーマウイルス、アルファバキュロウイルス、ベータバキュロウイルス、デルタバキュロウイルス、ガンマバキュロウイルス、イルトウイルス、マルディウイルス、シンプレックスウイルス、バリセロウイルス、サイトメガロウイルス、ムロメガロウイルス、プロボスシウイルス、ロゼオロウイルス、リンホクリプトウイルス、マカウイルス、ペルカウイルス、及びラディノウイルスからなる群から選択されるウイルス属に属する、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記レトロウイルスが、モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭｏＭＳＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）、スプーマウイルス、フレンドウイルス、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウマ免疫不全ウイルス（ＥＩＶ）、ビスナ・マエディウイルス；ヤギ関節炎・脳炎ウイルス；ウマ伝染性貧血ウイルス；ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）；ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）；またはサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）である、請求項１２に記載の方法。
  15. 前記ＨＩＬＩＣが、水中にトリフルオロ酢酸を含む移動相Ａまたはアセトニトリル中にトリフルオロ酢酸を含む移動相Ｂを使用する、請求項１に記載の方法。
  16. 前記移動相Ａまたは前記移動相Ｂが、約０．１％トリフルオロ酢酸を含む、請求項１３に記載の方法。
  17. 前記クロマトグラフィーにおける移動相Ａの割合が、時間の経過とともに増加する、請求項１５に記載の方法。
  18. 移動相Ａが、約４５分かけて、約１５％から約１００％まで増加する、請求項１７に記載の方法。
  19. ウイルス粒子のカプシドにおけるタンパク質成分の不均一性を決定する方法であって、
    前記ウイルス粒子を親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）に供して、前記ウイルス粒子カプシドのタンパク質成分を分離することと、
    前記タンパク質カプシドのタンパク質成分の質量を決定することと、
    前記決定されたウイルス粒子カプシドのタンパク質成分の質量を理論的質量と比較することであって、前記理論的質量からの、前記ウイルス粒子カプシドのタンパク質成分の質量のうちの１つ以上のずれは、カプシド不均一性を示している、ことと
    を含む、前記方法。
  20. 前記不均一性が、セロタイプの混合、バリアントカプシド、カプシドアミノ酸の置換、切断カプシド、または改変カプシドのうちの１つ以上を含む、請求項１９に記載の方法。
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021127309A1 (en) * 2019-12-20 2021-06-24 University Of Maryland, Baltimore Noninvasive quantitation of full versus empty capsids using water proton nmr
US20240052322A1 (en) * 2020-12-15 2024-02-15 Pfizer Inc. HILIC UPLC-MS Method For Separating and Analyzing Intact Adeno-Associated Virus Capsid Proteins
TWI829131B (zh) * 2021-09-28 2024-01-11 美商索特拉科技公司 用於淘選材料之方法和系統以及儲存在電腦可讀儲存媒體上的電腦程式產品
WO2023207918A1 (en) * 2022-04-25 2023-11-02 Beijing Hanmoluojie Technology Co., Ltd. Aav capsid 3d molecular surface feature mapping

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998010088A1 (en) 1996-09-06 1998-03-12 Trustees Of The University Of Pennsylvania An inducible method for production of recombinant adeno-associated viruses utilizing t7 polymerase
US9329169B2 (en) * 2007-10-29 2016-05-03 University Of Georgia Research Foundation, Inc Vivo isotopic labeling method for quantitative glycomics
PL2975051T3 (pl) 2009-06-26 2021-09-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Wyizolowane z łatwością dwuswoiste przeciwciała o formacie natywnej immunoglobuliny
JP6062860B2 (ja) 2010-10-29 2017-01-18 コヒーシブ・テクノロジーズ・インコーポレイテッド 広範囲の疎水性を有する被検成分の精製及び検出のためのｌｃ−ｍｓ構成
US8946395B1 (en) * 2013-10-18 2015-02-03 Abbvie Inc. Purification of proteins using hydrophobic interaction chromatography
EP2975401B1 (en) 2014-07-18 2019-12-25 Hexal AG Improved method of mapping glycans of glycoproteins in serum samples
JPWO2018003559A1 (ja) 2016-07-01 2019-02-07 日立オートモティブシステムズ株式会社 燃料噴射弁
TN2019000047A1 (en) * 2016-08-15 2020-07-15 Genzyme Corp Methods for detecting aav
CN107228912A (zh) * 2017-05-26 2017-10-03 河南省兽药饲料监察所 一种动物性食品中79种抗菌药物的筛查方法

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