KR20210082183A - 바이러스 캡시드 단백질 조성물의 분석 방법 - Google Patents

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리제너론 파아마슈티컬스, 인크.
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Abstract

바이러스 캡시드의 화학양론을 결정하는 방법 및/또는 바이러스 캡시드 내의 단백질 구성성분들의 이질성을 결정하는 방법이 개시된다.

Description

바이러스 캡시드 단백질 조성물의 분석 방법
관련 출원의 상호참조
본 출원은 2018년 10월 25일에 출원된 미국 가출원 제62/750,583호의 35 USC §119(e)에 근거하여 혜택을 주장하며, 상기 내용은 모든 용도로 전체가 본원에 참조로 편입되었다.
본 발명은 바이러스 입자, 예컨대 아데노-관련 바이러스(AAV) 입자의 이질성을 결정하기 위한 방법에 관한 것으로, 이 방법에는 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피(HILIC) 및 질량 분석 결정이 사용된다.
유전자 요법이 유전 질환의 대안적 치료로 떠오르고 있다. 유전자 요법은 일부 유전 물질(DNA, RNA 또는 올리고뉴클레오타이드)를 표적 세포로 이전하는 단계를 수반한다. 실질적으로, 관심대상 유전자(일명 형질전환 유전자라 불림)가 DNA 또는 RNA 분자를 운반하는 벡터에 의해 상기 세포로 전달되어야 한다. 이것은 결함이 있는 유전자를 대체 또는 보충하기 위한 기능적 유전자의 이동을 기반으로 한다. 상기 형질전환 유전자는 상기 벡터에 의해 상기 세포로 전달될 수 있다. 전달 방법은 치료의 유형 및 표적이 되는 기관/조직에 따라 다르다.
바이러스 입자가 유전자 요법 및 질병의 치료를 위한 벡터로 떠오르고 있다. 바이러스 벡터, 예컨대 아데노-관련 바이러스(AAV)의 게놈을 기반으로 한 것들은 유전자 전달을 위한 흥미진진한 플랫폼을 제공한다. 현재, AAV의 12개의 인간 혈청형(AAV1-12)이 기술된 바 있고, 이 중 많은 수가 뚜렷이 구별되는 세포 및 조직 쏠림성(tropism)을 갖고 있어서, 잠재적으로 이와 같은 바이러스 속에서 다양한 종류의 상이한 벡터 부류를 생성하는 선택권을 제공한다.
하지만, 유전자 요법에서 바이러스 벡터를 채택할 때 직면하는 문제들 중 하나는 바이러스 입자 균질성의 특징 규명(characterization)이다. 전자 현미경 및 서던 블랏(Southern Blots)과 같은 고전적인 기법들이 바이러스 입자 이질성, 예컨대 AAV 이질성 및 응집의 특징을 규명할 수 있는 반면, 이들은 임상-등급의 바이러스 벡터 제제의 생산에 있어서, 균질성을 정량화하기 위한 충분한 해법을 제공하지 못하고 있다. 구성 성분인 바이러스 캡시드 단백질, 예컨대 AAV 벡터의 캡시드 단백질의 온전한 특징 규명, 예를 들면 그들의 염기서열 및 번역 후 변형(PTM)의 규명은 제품의 품질 및 일관성을 확보하기 위해 상당히 권장되고 있다. 따라서, 바이러스 입자의 균질성을 결정하기 위한 방법들이 요구된다.
일 양태에서, 본 발명은 바이러스 입자의 바이러스 캡시드의 단백질 구성성분의 화학양론을 결정하는 방법을 제공하되, 상기 방법은 (a) 바이러스 입자 시료에 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피(HILIC)를 실시하여 상기 바이러스 입자의 바이러스 캡시드의 단백질 구성성분들을 분리하는 단계; (b) 상기 바이러스 캡시드의 단백질 구성성분들의 질량을 결정하여 HILIC에 의해 분리된 상기 단백질 구성성분들을 식별하는 단계; 및 (c) 상기 HILIC 분리에서 상기 바이러스 캡시드의 단백질 구성성분의 상대적 존재비를 결정함으로써, 바이러스 입자의 바이러스 캡시드의 단백질 구성성분의 화학양론을 결정하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 바이러스 입자의 캡시드 내 단백질의 이질성을 결정하는 방법을 제공하되, 상기 방법은 (a) 상기 바이러스 입자에 HILIC를 실시하여 상기 바이러스 입자 캡시드의 단백질 구성성분들을 분리하는 단계; (b) 상기 단백질 캡시드의 단백질 구성성분들의 질량을 결정하는 단계; 및 (c) 상기 바이러스 입자 캡시드의 단백질 구성성분들의 결정된 질량을 이론적 질량과 비교하는 단계를 포함하되, 이론적 질량에서 바이러스 입자 캡시드의 단백질 구성성분의 질량 중 하나 이상의 편차는 캡시드 이질성을 나타낸다.
일부 구현예에서, 상기 바이러스 입자는 아데노-관련 바이러스(AAV) 입자를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 바이러스 캡시드의 단백질 구성성분은 상기 AAV　입자의 VP1, VP2 및 VP3를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 이질성은 혼합된 혈청형, 변종 캡시드, 캡시드 아미노산 치환체, 끝을 자른(truncated) 캡시드, 또는 변형된 캡시드 중 하나 이상을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 AAV　입자는 AAV1 캡시드, AAV2 캡시드, AAV3 캡시드, AAV4 캡시드, AAV5 캡시드, AAV6 캡시드, AAV7 캡시드, AAV8 캡시드, AAVrh8 캡시드, AAV9 캡시드, AAV10 캡시드, AAV11 캡시드, AAV　12 캡시드 또는 이들의 변종을 포함한다.
일부 구현예에서, VP1, VP2 및 VP3의 질량은 AAV1 캡시드, AAV2 캡시드, AAV3 캡시드, AAV4 캡시드, AAV5 캡시드, AAV6 캡시드, AAV7 캡시드, AAV8 캡시드, AAVrh8 캡시드, AAV9 캡시드, AAV10 캡시드, AAV11 캡시드, AAV　12 캡시드 또는 이들의 변종 중 하나 이상의 이론적 질량과 비교된다.
일부 구현예에서, 상기 AAV　입자는 AAV1 말단 역위 반복 서열(ITR), AAV2 ITR, AAV3 ITR, AAV4 ITR, AAV5 ITR, AAV6 ITR, AAV7 ITR, AAV8 ITR, AAVrh8 ITR, AAV9 ITR, AAV　10 ITR, AAVrh10 ITR, AAV11 ITR 또는 AAV　12 ITR을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 AAV 입자는 환자의 간에서 유래된 세포의 형질도입을 위해 선택된 캡시드 혈청형을 갖는다.
일부 구현예에서, 상기 AAV 입자는 재조합　AAV(rAAV) 입자이다.
일부 구현예에서, 상기 AAV　입자는 이종 형질전환 유전자를 인코딩하는 AAV　벡터를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 AAV　입자는 캡시드 혈청형 AAV7, AAV8 또는 AAV9를 갖는다.
일부 구현예에서, 상기 AAV　입자는 캡시드 혈청형 AAV9를 갖는다.
일부 구현예에서, 상기 AAV　입자는 캡시드 혈청형 AAV9를 갖고, 항-CD63 항체에 결합된 리소좀 알파 글루코시다아제(GAA)를 인코딩하는 바이러스 벡터이다.
일부 구현예에서, 상기 바이러스 입자는 이종 형질전환 유전자를 인코딩하는 바이러스 벡터를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 바이러스 입자는 아데노비리데, 파르보비리데, 레트로비리데, 바쿨로비리데 및 헤르페스비리데로 이루어진 군에서 선택된 바이러스 과(family)에 속한다.
일부 구현예에서, 상기 바이러스 입자는 아타데노바이러스, 아비아데노바이러스, 이치타데노바이러스, 마스타데노바이러스, 시아데노바이러스, 암비덴소바이러스, 브레비덴소바이러스, 헤판덴소바이러스, 이테라덴소바이러스, 펜스틸덴소바이러스, 암도파르보바이러스, 아베파르보바이러스, 보카파르보바이러스, 코피파르보바이러스, 데펜도파르보바이러스, 에리스로파르보바이러스, 프로토파르보바이러스, 테트라파르보바이러스, 알파레트로바이러스, 베타레트로바이러스, 델타레트로바이러스, 엡실론레트로바이러스, 감마레트로바이러스, 렌티바이러스, 스푸마바이러스, 알파바쿨로바이러스, 베타바쿨로바이러스, 델타바쿨로바이러스, 감마바쿨로바이러스, 일토바이러스, 마르디바이러스, 심플렉스바이러스, 바리첼로바이러스, 거대세포바이러스, 무로메갈로바이러스, 프로보시바이러스, 로세올로바이러스, 림포크립토바이러스, 마카바이러스, 페르카바이러스 및 라디노바이러스로 이루어진 군에서 선택된 바이러스 속에 속한다.
일부 구현예에서, 상기 레트로비리데는 몰로니 생쥐 육종바이러스(MoMSV), 하비 생쥐 육종 바이러스(HaMuSV), 생쥐 유선 종양바이러스(MuMTV), 긴팔원숭이(gibbon ape) 백혈병바이러스(GaLV), 고양이과 백혈병바이러스 (FLV), 스푸마바이러스, 프렌드 바이러스, 생쥐 줄기 세포바이러스(MSCV), 라우스 육종 바이러스(RSV), 인간 T 세포 백혈병 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 고양이과 면역결핍 바이러스(FIV), 말과 면역결핍 바이러스(EIV), 비스나-메디 바이러스; 염소과 관절염-뇌염 바이러스; 말과 전염성 빈혈 바이러스; 고양이과 면역결핍 바이러스(FIV); 소과 면연결핍 바이러스(BIV); 또는 원숭이과 면역결핍 바이러스(SIV)이다.
일부 구현예에서, 상기 HILIC는 물에 트리플루오로아세트산을 포함하는 이동상 A를 사용한다.
일부 구현예에서, 상기 이동상 A는 약 0.1% 트리플루오로아세트산을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 크로마토그래피는 아세토나이트릴에 트리플루오로아세트산을 포함하는 이동상 B를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 이동상 B는 약 0.1% 트리플루오로아세트산을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 크로마토그래피에서 이동상 A의 비율은 시간이 경과하면서 증가한다.
일부 구현예에서, 상기 이동상 A는 약 45분에 걸쳐 약 15%에서 약 100%로 증가한다.
도 1은 유전자 요법을 위한 벡터로서 아데노-관련 바이러스(AAV)의 사용을 포함하는, 폼페(Pompe)병의 가능한 치료 요법의 도식적 모형이다.
도 2a는 AAV 바이러스 캡시드의 모형이다.
도 2b는 AAV 혈청형의 바이러스 캡시드 단백질의 도식적 표현 및 그것의 질량 근사치이다.
도 3a는 AAV 입자에서 AAV 캡시드 단백질의 역상 TIC 분리에 대한 UV 추적으로, 상기 개별 단백질의 양호하지 않은 해상도를 보여준다.
도 3b는 선행 기술의 여러 분리 방법들을 비교한 것으로, 양호하지 않은 해상도 및/또는 양호하지 않는 정량화를 나타낸다.
도 4는 AAV 입자에서 AAV 캡시드 단백질의 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피(HILIC) 분리에 대한 UV 추적으로, 상기 개별 단백질의 높은 해상도와 상기 개별 단백질의 상대적 존재비의 결정을 나타낸다.
도 5a~5d는 AAV 입자의 AAV 캡시드 단백질의 질량 스펙트럼이다.
도 6은 AAV9 바이러스 입자의 HILIC-UV 분석 및 이들의 화학양론 결정의 두 가지 흔적을 나타낸다.
본 발명을 기술하기에 앞서, 본 발명은 기술되는 특정 방법 및 실험 조건이 바뀔 수 있기 때문에 그들에 국한되지 않음이 이해되어야 한다. 또한 본원에 사용되는 용어는 단지 특정 구현예를 기술하기 위한 목적으로 사용된 것으로, 본 발명의 범위가 첨부된 청구항에 의해서만 제한될 것이기 때문에, 상기 용어는 제한하려는 의도가 없음이 이해되어야 한다. 모든 구현예 또는 구현예의 특징들이 서로 조합될 수 있고, 이와 같은 조합은 명확히 본 발명의 범위 내에 포함된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적/과학적 용어는 본 발명이 속한 당해기술의 숙련가에게 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 사용된 용어 "약"은 특별히 인용된 수치값에 대해 사용된 경우, 상기 값이 상기 인용된 값에서 1% 내외로 바뀔 수 있음을 의미한다. 예를 들어, 본원에 사용된 표현 "약 100"은 99와 101, 그리고 그들 사이의 모든 값들(예컨대, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4 등)을 포함한다.
본원에 기술된 것과 유사하거나 또는 동등한 모든 방법 및 물질들이 본 발명의 실제 또는 테스팅에 사용될 수 있으나, 선호되는 방법 및 물질들이 이제 기술된다. 본 명세서에 언급된 모든 특허, 출원 및 비-특허 문헌들은 그들 전체가 참조로 본원에 편입되었다.
본원에 사용되는 약어
MS/MS: 탠덤 질량 분석
MS: 질량 분석
ITR: 말단 역위 반복 서열
rAAV 벡터: 재조합　AAV　벡터
HILIC: 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피
GAA: 리소좀 알파 글루코시다아제
mAb: 단클론 항체
IgG: 면역글로불린 G
LC: 경쇄
HC: 중쇄
AAV: 아데노-관련 바이러스
PTM: 번역후 변형
ERT: 효소 대체 요법
정의
"아데노-관련 바이러스" 즉 "AAV": AAV는 단일가닥 DNA를 가진 비병원성 파르보바이러스로, 대략 4.7 kb의 게놈이며, 껍질로 싸여 있지 않고 이십면체 입체구조를 갖는다. AAV는 1965년 아데노바이러스 제제의 오염물질로 처음 발견되었다. AAV는 데펜도바이러스　속 및 파르보비리데 과에 속해, 복제를 위해서는 헤르페스 바이러스 또는 아데노바이러스 중 하나의 헬퍼 기능을 필요로 한다. 헬퍼 바이러스가 부재한 경우, AAV는 19q13.4 위치에서 인간 염색체 19로 통합되어, 잠복기를 생성할 수 있다. AAV 게놈은 2개의 열린 해독틀(ORF)로 구성되는데, 2개의 AAV 유전자인 Rep와 Cap 각각에 하나씩 존재한다. AAV DNA 말단에는 145-bp 역위 종단 반복(ITR)이 있고, 125개 종단 염기는 앞뒤역순상동서열(palindromic)로, 특징적인 T-형 헤어핀 구조를 만든다.
상기 Rep 유전자는 촉진자(promoter) p5 및 p19에서 시작해 4개 Rep 단백질(Rep78, Rep68, Rep52 및 Rep40)로 전사되는데, 이들은 바이러스의 생명주기에 중요한 역할을 한다. 단백질 Rep78과 Rep68은 촉진자 p5에서 전사된 mRNA에 의해 인코딩된다. 이들 단백질은 바이러스 DNA 복제, 전사 및 자리-특이적 통합(site-specific integration)의 제어에 반드시 필요한 것이다. 좀 더 작은 2개 단백질인 Rep52와 Rep40은 촉진자 p19에서 전사된 mRNA에 의해 생성된다. 이들 단백질은 패키징 및 바이러스 통합을 위한 단일 가닥 바이러스 게놈의 형성에 관여된다. Cap 유전자는 3가지 바이러스 캡시드 단백질: VP1(735개 아미노산, ~90 kDa), VP2(598개 아미노산, ~72 kDa) 및 VP3(533개 아미노산, ~60 kDa)을 인코딩하고, 이들은 1:1:10의 비율로 60 개 하부단위로 이루어진 바이러스 캡시드를 형성한다(도 2a 및 2b 참조). 상기 3가지 캡시드 단백질은 촉진자 p40에서 전사된 mRNA에서 번역된다.
본원에 사용된 용어 "항체"는 4개 폴리펩타이드 사슬(2개 중쇄(H)와 2개 경쇄(L)가 이황화 결합에 의해 서로 연결됨)로 구성된 면역글로불린 분자(즉, "온전한 항체 분자"), 또한 이것의 다합체(예컨대 IgM) 또는 이것의 항원-결합 절편을 가리키기 위한 것이다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역("HCVR" 또는 "VH") 및 중쇄 불변 영역(구역 CH1, CH2 및 CH3으로 구성됨)으로 구성된다. 다양한 구현예에서, 상기 중쇄는 IgG 아이소타입일 수 있다. 일부 사례에서, 상기 중쇄는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4에서 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 중쇄는 아이소타입 IgG1 또는 IgG4 중 하나로, 선택적으로 아이소타입 IgG1/IgG2 또는 IgG4/IgG2의 키메라 힌지 영역을 포함한다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역("LCVR" 또는 "VL") 및 경쇄 불변 영역(CL)으로 구성된다. 상기 VH 와 VL 영역은 추가적으로 기본틀 영역(FR)이라 불리는, 좀더 보존적인 영역들이 배치된, 상보성 결정 영역(CDR)이라 불리는 초가변성의 영역으로 세분화될 수 있다. 각 VH 와 VL 은 3개의 CDR과 4개의 FR로 구성되고, 이들은 다음과 같은 순서로 아미노 말단에서 카복시 말단으로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 용어 "항체"는 모든 아이소타입 또는 하위부류의 글리코실화된 및 비-글리코실화된 면역글로불린 모두에 대한 언급을 포함한다. 상기 용어 "항체"는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체 분자를 포함하는데, 예를 들어 상기 항체를 발현하기 위해 형질감염된 숙주 세포에서 단리된 항체를 포함한다. 항체 구조는 Lefranc et al.,　IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains,　27(1) Dev. Comp. Immunol. 55-77 (2003); and M. Potter,　Structural correlates of immunoglobulin diversity,　2(1) Surv. Immunol. Res. 27-42 (1983)을 참조하여 살펴볼 수 있다.
용어 항체는 또한 "이중특이성 항체"를 아우르는데, 여기에는 둘 이상의 상이한 에피토프에 결합될 수 있는 헤테로테트라머(heterotetrameric) 면역글로불린이 포함된다. 이중특이성 항체 중 절반(단일 중쇄 및 단일 경쇄, 그리고 6개 CDR를 포함함)은 하나의 항원 또는 에피토프에 결합되고, 상기 항체의 나머지 절반은 상이한 항원 또는 에피토프에 결합된다. 일부 경우에, 이중특이성 항체는 동일한 항원과 결합하지만, 상이한 에피토프에서 또는 겹치지 않는 에피토프에서 결합한다. 일부 경우에, 이중특이성 항체의 양쪽 절반은 이중 특이성을 유지하는 반면 동일한 경쇄를 갖는다. 이중특이성 항체는 일반적으로 미국출원 공보 제 2010/0331527호(2010년 12월 30일)에 기술되어 있다.
항체의 "항원-결합 부분"과 "항원-결합 절편"이란 용어(또는 "항체 절편")는 항원에 특이적으로 결합될 수 있는 능력을 보유한 항체의 하나 이상의 절편을 가리킨다. 항체의 "항원-결합 부위"란 용어 안에 아우러지는 결합 절편의 예에는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 구역으로 이루어진 1가 절편인 Fab 절편; (ii) 힌지 영역에서 이황화 다리에 의해 연결된 Fab 절편 2개를 포함하는 2가 절편인 F(ab′)2 절편; (iii) VH 및 CH1 구역으로 이루어진 Fd 절편; (iv) 항체의 단일 팔의 VL 및 VH 구역으로 이루어진 Fv 절편, (v) VH 구역으로 이루어진 dAb 절편(Ward et al. (1989) Nature 241:544-546), (vi) 단리된 CDR 및 (vii) Fv 절편의 두 구역인 VL과 VH로 이루어진 scFv(두 구역은 합성 링커에 의해 결합되어, VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자를 형성하는 단일 단백질을 형성한다)가 포함된다. 단일 사슬 항체의 그 밖의 형태, 예컨대 디아바디 역시 용어 "항체"의 범주에 속한다(예컨대, Holliger et at. (1993) 90 PNAS U.S.A. 6444-6448; and Poljak et at. (1994) 2 Structure 1121-1123 참조).
더 나아가, 항체 및 이것의 항원-결합 절편은 당해기술에 일반적으로 알려진 표준 재조합 DNA 기법을 사용하여 획득될 수 있다(Sambrook et al., 1989 참조).
용어 "인간 항체"는 인간 생식세포계열 면역글로불린 염기서열에서 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것이다. 본 발명의 인간 mAbs에는 예를 들면 CDRs에서, 특히 CDR3에서 인간 생식세포계열 면역글로불린 염기 서열에 의해 인코딩되지 않은 아미노산 잔기(예컨대, 체외에서 무작위로 또는 자리-특이적 돌연변이 생성에 의해, 또는 체내에서 체강내 돌연변이에 의해 유도된 돌연변이)가 포함될 수 있다. 하지만, 본원에 사용된 용어 "인간 항체"는 또 다른 포유류 종(예컨대, 생쥐)의 생식세포계열에서 유래된 CDR 염기 서열이 인간 FR 염기 서열 상에 접합된 바 있는 mAbs을 포함하는 것은 아니다. 상기 용어에는 비-인간 포유류에서 또는 비-인간 포유류의 세포에서 재조합으로 생성된 항체가 포함된다. 상기 용어에 인간 개체에서 단리되거나 인간 개체에서 생성된 항체가 포함되는 것은 아니다.
용어 "상응하는"은 위치, 목적 또는 구조에서의 유사성을 보여주는 상대적 용어이다. 특정 펩타이드 또는 단백질에 의해 유발된 질량 스펙트럼 신호는 또한 상기 펩타이드 또는 단백질에 상응하는 신호라 불린다. 특정 구현예에서, 특정 펩타이드 염기서열 또는, 예를 들어, 단백질과 같은, 아미노산들의 집합체가 상응하는 펩타이드 질량에 지정될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "단리된"은 생물학적 구성성분이 자연 발생되었거나 또는 유전형질 전환으로 발현된 생명체의 세포에 있는 구성성분에서 실질적으로 분리되거나, 이것과 별도로 생성되었거나 또는 이것에서 정제된 바 있는 생물학적 구성성분(예컨대 핵산, 펩타이드, 단백질, 지질, 바이러스 입자 또는 대사물질)을 가리킨다.
"질량 분석"은 시료에서 기체상 이온을 생성하고, 이어서 이들의 질량:전하 비율(m/z)에 따라 분석한 후 검출함으로써 시료를 분석하는 방법이다. 시료로 기체상을 생성하는 방법에는 전기분무 이온화(ESI), 매트릭스에 의한 레이저 탈착 이온화(MALDI), 표면증강 레이저 탈착 이온화(SELDI), 화학적 이온화 및 전자충격 이온화(EI)가 포함된다. m/z 비율에 따른 이온의 분리는 모든 유형의 질량 분석기, 예컨대 4중극자 질량 분석기(Q), 비행시간(time-of-flight)(TOF) 질량 분석기, 자기장 부채꼴 질량 분석기, 3D 및 선형 이온 트랩(IT), 오비트랩 질량 분석기, 푸리에 변환 이온 사이클로트론 공명(FT-ICR) 분석기 및 이들의 조합(예를 들어, 4중극자-비행시간 분석기, 또는 Q-TOF 분석기)로 달성될 수 있다. 분리 이전에, 상기 시료에 하나 이상의 차원의 크로마토그래피 분리, 예를 들어 HILIC를 실시할 수도 있다.
탠덤 질량 분석, 즉 MS/MS는 선택된 이온(전구체 이온)을 단편(생성 이온)으로 쪼개는 기법이다. 상기 단편은 이어서 전구체 이온의 화학적 구조의 양태를 드러낸다. 탠덤 질량 분석에서, 시료가 이온화되어(예를 들어, ESI, MALDI, EI 등에 의해) 이온의 혼합물을 생성하면, 특정 질량 전하 비율(m/z)의 전구체 이온, 예를 들면 소화물에서 유래된 펩타이드가 선택되고(MS1), 이어서 단편화(MS2)되어 검출을 위한 생성 이온이 형성된다. 전형적인 탠덤 MS 기구에는 QqQ, QTOF 및 하이브리드 이온 트랩/FTMS 등이 포함된다. 탠덤 질량 분석의 적용의 한 사례는 단백질 식별이다. 제1 질량 분석기가 이온 원재료에 유입된 후 떠오른 많은 것들 중 단일 종의 펩타이드를 나타내는 특정 m/z　값을 갖는 이온을 단리한다. 이들 이온은 이어서 아르곤과 같은 불활성 기체를 함유한 충돌 세포로 가속화되어 이온 단편화가 유도된다. 이와 같은 과정은 충돌로 유발된 해리(CID) 또는 충돌로 활성화된 해리(CAD)라고 명명된다. 이어서 단편 이온의 m/z　값이 제2 질량 분석기에서 측정되어 아미노산 염기서열 정보가 획득된다. 탠덤 질량 분석은 펩타이드의 염기서열을 식별하고, 따라서 본원에 개시된 방법에 따라 온전한 또는 부분적 길이의 단백질을 식별하는 데 사용될 수 있다. 전구체 이온은 여러 상이한 방법들로 활성화될 수 있다(내부 에너지의 증가로). 단편화 패턴은 에너지가 전구체 이온에 어떻게 전달되는지, 전달된 에너지의 양은 얼마인지, 그리고 전달된 에너지가 내부에서 어떻게 분산되는지에 따라 달라진다. 충돌-유발 해리와 적외선 다광자 해리는 이온의 볼츠만(Boltzmann) 온도를 올리고 그럼으로써 우선적으로 가장 약한 결합을 쪼개는 "느린 가열(slow-heating)" 기법이다.
용어 "펩타이드," "단백질" 및 "폴리펩타이드"는 상호교환적으로 펩타이드 결합 또는 펩타이드 결합 유사제(mimetics)에 의해 결합된 아미노산 및/또는 아미노산 유사체로 이루어진 중합체를 가리킨다. 20개의 자연발생적 아미노산과 이들의 한 글자 및 세 글자 명칭은 다음과 같다: 알라닌 A Ala; 시스테인 C Cys; 아스파르트산 D Asp; 글루탐산 E Glu; 페닐알라닌 F Phe; 글리신 G Gly; 히스티딘 H His; 이소류신 I He; 라이신 K Lys; 류신 L Leu; 메티오닌 M Met; 아스파라긴 N Asn; 프롤린 P Pro; 글루타민 Q Gln; 아르기닌 R Arg; 세린 S Ser; 트레오닌 T Thr; 발린 V Val; 트립토판 w Trp; 및 타이로신 Y Tyr.
아미노산의 질량에 대한 언급은 소정의 동위원소 존재비, 예컨대 자연적 존재비에서 아미노산의 단일동위원소 질량 또는 평균 질량을 의미한다. 일부 예에서, 아미노산의 질량은 예를 들어 아미노산을 하나의 동위 원소로 표지함으로써 왜곡될 수 있다. 아미노산의 정확한 동위원소 조성물을 근거로 개별 단일 아미노산에 대해, 아미노산의 평균 질량의 어느 정도의 가변성이 예상된다. 아미노산의 단일동위원소 질량 및 평균 질량을 비롯한 질량은 당해기술의 숙련가에 의해 쉽게 획득될 수 있다.
이와 유사하게, 펩타이드 또는 단백질의 질량의 언급은 소정의 동위원소 존재비, 예컨대 자연적 존재비에서 펩타이드 또는 단백질의 단일동위원소 질량 또는 평균 질량을 의미한다. 일부 예에서, 펩타이드의 질량은, 예를 들어 펩타이드 또는 단백질에 있는 하나 이상의 아미노산을 하나의 동위원소로 표지함으로써, 왜곡될 수 있다. 펩타이드의 정확한 동위원소 조성물을 근거로 개별 단일 펩타이드의 경우, 펩타이드의 평균질량의 어느 정도의 가변성은 예상된다. 특정 펩타이드의 질량은 당해기술의 숙련가에 의해 결정될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "벡터"는 핵산을 포함하여 체외 또는 체내에서 숙주 세포에 전달되는 재조합 플라스미드 또는 바이러스를 가리킨다.
본원에 사용된 용어 "폴리뉴클레오타이드" 또는 "핵산"은 임의의 길이의 뉴클레오타이드, 예컨대 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드 중 하나의 중합체 형태를 가리킨다. 따라서, 이 용어에는, 비제한적으로, 단일-, 이중- 또는 다중-가닥 DNA 또는 RNA, 게놈 DNA, cDNA, DNA-RNA 하이브리드, 또는 퓨린과 피리미딘 염기를 포함하는 중합체, 또는 기타 자연적인, 화학적으로 또는 생화학적으로 변형된, 비자연적인 또는 유도된 뉴클레오타이드 염기가 포함된다. 핵산의 근간은 당과 인산기(RNA 또는 DNA에 전형적으로 발견되는 것과 같이), 또는 변형되거나 치환된 당 또는 인산기를 포함할 수 있다.
선택적으로, 핵산의 근간은 합성 하위단위로 이루어진 중합체, 예컨대 포스포라미데이트를 포함할 수 있고, 따라서 올리고데옥시뉴클레오사이드 포스포라미데이트(P-NH2) 또는 혼합된 포스포라미데이트-포스포디에스테르 올리고머일 수 있다. 추가적으로, 상보성 가닥을 합성하고 적절한 조건 하에서 이들 가닥을 연결함으로써, 또는 처음부터 적절한 프라이머를 갖는 DNA 중합효소를 사용하여 상보적 가닥을 합성함으로써, 화학적 합성의 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드 생성물에서 이중-가닥 핵산이 획득될 수 있다.
"재조합 바이러스 벡터"는 하나 이상의 이종 염기 서열(즉, 바이러스에서 기원하지 않은 핵산 염기서열)을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오타이드 벡터를 가리킨다.
"재조합　AAV　벡터(rAAV 벡터)"는 적어도 하나, 예컨대 2개의 AAV　말단 역위 반복 서열(ITRs)이 옆에 있을 수 있는 하나 이상의 이종 염기 서열(즉 AAV에서 기원하지 않은 핵산 염기서열)을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 벡터를 가리킨다. 이와 같은 rAAV 벡터는, 적합한 헬퍼 바이러스에 감염되었고(또는 적합한 헬퍼 기능을 발현하고) AAV　rep과 cap 유전자 생성물(즉,　AAV　Rep 및 Cap 단백질)을 발현하는 숙주 세포에 존재할 경우, 복제되어 감염성 바이러스 입자에 패키징될 수 있다.
"바이러스 입자"는 적어도 하나의 바이러스 캡시드 단백질과 캡슐로 싸인 바이러스 게놈으로 구성된 바이러스 입자를 가리킨다.
"이종"은 그것이 비교되거나 또는 그것이 유입 또는 편입되는 개체들과 유전자형 측면에서 뚜렷이 구별되는 개체에서 유래된 것을 의미한다. 예를 들어, 유전공학 기법에 의해 다른 세포 유형에 유입된 핵산은 이종 핵산(그리고, 발현된 경우, 이종 폴리펩타이드를 인코딩할 수 있음)이다. 이와 유사하게, 바이러스 벡터에 편입된 세포 염기서열(예컨대, 하나의 유전자 또는 그것의 일부분)은 벡터와 관련하여 이종 뉴클레오타이드 염기서열이다.
"역위 말단 반복", 즉 "ITR" 염기서열은 반대 방향으로 배열된 바이러스 게놈의 말단에서 발견되는 상대적으로 짧은 염기 서열이다. "AAV　역위 말단 반복(ITR)" 서열은 단일가닥 AAV　게놈의 양 말단에 존재하는 대략 145-뉴클레오타이드 염기서열이다.
용어 "친수성 상호작용 크로마토그래피" 즉 HILIC는 친수성 고정상과, 친수성 화합물이 소수성 화합물보다 더 오래 머무르는 소수성 유기 이동상을 활용한 과정을 포함하는 것이다. 특정 구현예에서, 이와 같은 과정은 물-혼화성 용매 이동상을 활용한다.
본원에 사용된 용어 "시료"는 본 발명의 방법에 따라 조작, 예컨대, 예를 들면 분리, 분석, 추출, 농축, 프로파일링 등이 실시되는 적어도 하나의 바이러스 입자, 예컨대 AAV 입자를 포함하는 분자들의 혼합물을 가리킨다.
본원에 사용된 용어 "크로마토그래피 표면"에는 시료 또는 피분석물질에 노출되는 표면이 포함된다. 크로마토그래피 표면은 화학적으로 변형되거나, 기능화되거나 또는 활성화되거나, 또는 미세구조, 공극을 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 크로마토그래피 표면은 소수성, 친수성(극성) 또는 이온성일 수 있다. 기타 구현예에서, 크로마토그래피 표면은 온전히 다공성이거나, 표면만 다공성이거나 또는 전혀 다공성이지 않다.
본원에 사용된 용어 "크로마토그래피 코어"에는, 비제한적으로, 입자 형태의 유기물질, 예컨대 실리카, 단일 암체(monolith) 또는 또 다른 적합한 구조체를 비롯한 크로마토그래프 물질이 포함되는데, 이것은 본 발명의 물질의 내부의 일부분을 형성한다. 특정 양태에서, 크로마토그래피 코어의 표면은, 본원에 정의된 바와 같이, 크로마토그래피 표면을 의미하거나 또는 크로마토그래피 표면에 의해 감싸진 물질을 나타낸다. 크로마토그래피 표면 물질은 별도의 또는 뚜렷이 구별되는 전이가 눈에 띄도록 크로마토그래피 코어 상에 배치되거나 결합되거나 또는 어닐링될 수도 있고, 또는 크로마토그래피 코어의 표면과 혼합되어 물질의 단계적 변화를 생성하거나 뚜렷이 구별되는 내부 코어 표면이 생성되지 않도록 크로마토그래피에 결합될 수 있다. 특정 양태에서, 크로마토그래피 표면 물질은 크로마토그래피 코어의 물질과 동일하거나 또는 상이할 수 있고, 크로마토그래피 코어와 상이한 물리적 또는 물리화학적 특성들, 예컨대 비제한적으로 공극 부피, 표면적, 평균 공극 직경, 탄소 함량 또는 가수분해 pH 안정성을 나타낼 수 있다.
본원에 사용된 용어 "친수성"은 물에 대해 친화도를 갖거나, 물을 끌어 당기거나, 흡착시키거나 또는 흡수시키는 것을 기술한다.
본원에 사용된 용어 "소수성"은 물에 대한 친화도가 부재하거나, 물을 밀어 내거나, 물을 흡착 또는 흡수하지 못하는 것을 기술한다.
본원에 사용된 용어 "크로마토그래피"는 혼합물, 예를 들면, 바이러스 캡시드 단백질을 함유한 혼합물을 분리하는 과정을 가리킨다. 이것은 혼합물을 고정상을 통과시키는 단계를 요구하는데, 이 단계는 상기 혼합물 중 다른 분자들에서 관심대상 분자를 분리하여 하나 이상의 관심 대상 분자가 단리되도록 한다. 크로마토그래피 분리의 방법의 한 예는 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피(HILIC)이다.
본원에 사용된 용어 "접촉시키는"은 용액 또는 고체상 중의 적어도 2개의 성분들을 붙여 놓는 것을 포함하는데, 예를 들어 크로마토그래피 물질의 고정상을 시료, 예컨대 바이러스 입자를 포함하는 시료와 접촉시키는 것이다.
일반 설명
폼페(Pompe)병은 글리코겐을 글루코오스로 가수분해하는 데 역할을 하는 리소좀 효소인 산 α-글루코시다아제(GAA)를 인코딩하는 GAA유전자에서의 돌연변이에 의해 유발되는 상염색체 열성 리소좀 축적 장애이다. GAA의 결핍은 리소좀에 글리코겐의 축적을 초래하고, 차후에 중추신경계 뿐만 아니라 심장, 골격계 및 평활근에 세포 역기능을 초래한다. 폼페병은 유아기 시작 폼페병(IOPD)으로 생애 초기에 또는 늦은 시작 폼페병(LOPD)으로 유년기 이후에서 성인에 이르는 시기에 나타날 수 있다. 호흡 부전은 두 가지 유형의 폼페 병 모두에서 죽음을 초래하는 두드러진 원인이다.
현재, 미 식품의약청에서 승인된 폼페병에 대한 유일한 치료는 효소 대체 요법(ERT)이다. 하지만, 전신에 투여되는 GAA는 혈액-뇌 장벽을 건너지 못하고, 따라서 중추신경계(CNS) 병리와 병이 생긴 호흡 운동 뉴런을 치료할 수 없다. 더 나아가, ERT는 근육섬유로의 흡수가 낮기 때문에 근골격 이상을 부분적으로만 고칠 수 있다. 결과적으로, IOPD 환자 중 2/3는 결국 산소호흡기 지원을 필요로 하고, LOPD 환자들 사이에서 호흡 부전이 지속된다.
아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터를 사용하는 유전자 요법이 폼페병에 이상적인데, 그것이 단일기원의(monogenetic) 장애이기 때문이다. 연구 중인 전략들 중 하나는 효소 대체와 연결된 항체와의 조합이다. 한 예에서, 내생 효소가 없는 환자에서 보여지는 대체 효소에 대한 면역 반응을 극복하기 위해, 유전자 요법을 통해 간에서의 항-CD63::GAA의 높은 발현이 개발되고 있는 중이다.(도 1 참조). 모든 바이러스 벡터 시스템에서 그렇듯이, 치료적 조성물이 올바른 형태의 바이러스 입자를 알맞은 양으로 함유하도록 하는 것이 중요하다. 따라서, 바이러스 입자의 화학양론 및 단백질 조성물을 결정하는 것이 매우 중요하다.
본 개시의 양태는 바이러스 입자의 바이러스 캡시드의 단백질 구성성분들의 화학양론를 결정하는 방법에 관한 것이다. 구현예에서, 상기 방법은 바이러스 입자의 시료에 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피(HILIC)를 실시하여 상기 바이러스 입자, 예컨대 캡시드에 대한 정보를 원하는 관심 대상의 바이러스 입자의 바이러스 캡시드의 단백질 구성성분들을 분리하는 단계를 포함한다. 구현예에서, HILIC 컬럼은 바이러스 입자를 함유한 시료와 접촉된다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 바이러스 캡시드의 단백질 구성성분들의 질량을 결정하여 HILIC, 예를 들면 질량 분석 기법, 예컨대 본원에 기술된 것에 의해, 분리된 단백질 구성성분들을 식별하는 단계를 포함한다. 구현예에서, 상기 방법은 HILIC 분리에서 바이러스 캡시드의 단백질 구성성분들의 상대적 존재비를 계산하여 바이러스 입자의 바이러스 캡시드의 단백질 구성성분들의 화학양론을 결정하는 단계를 포함하는데, 예를 들어, HILIC 컬럼에서 용출될 때 바이러스 캡시드의 단백질 구성성분들의 자외선(UV) 검출을 사용한다. 예를 들면, UV 피크의 면적이 캡시드 단백질의 상대적 존재비를 결정하는 데 사용될 수 있고, 필수 캡시드에서의 캡시드 단백질의 화학양론을 계산하는 데 사용될 수 있다(도 4 참조). 또 다른 예에서, 피크 높이 및/또는 피크 UV 강도가 상대적 존재비를 결정하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, HILIC 컬럼 상에서의 상이한 단백질의 머무름 시간이 사용된 이동상의 함수로 결정되고, 추후 분석에서 상기 머무름 시간이, 화학양론이 결정될 때마다 단백질의 질량 및/또는 정체성을 결정할 필요 없이, 바이러스 입자에서 단백질을 결정하고 상기 단백질의 상대적 존재비를 결정하는 데 사용될 수 있는데, 예컨대 표준 값 또는 값들이 개발될 수 있다. 본 개시에 앞서, 종래의 크로마토그래피 기법을 사용하여 상이한 캡시드 단백질을 분리하기가 매우 어려웠었다(도 3a 및 3b 참조). HILIC에 대한 본원에서 논의된 시료 조건을 사용하여, AAV 바이러스 입자에 대한 양호한 분리가 달성되었다. 추가적으로, HILIC 컬럼의 사용이 변성 단계에 대한 모든 요구를 제거하였다. 특정 구현예에서, 바이러스 입자의 혈청형을 결정하기 위해 상기 방법이 사용된다. 예를 들면, 각 AAV　혈청형의 VP 1, VP2 및 VP3의 질량은 고유하고, AAV　캡시드 혈청형을 식별하거나 또는 차별화하는 데 사용될 수 있다. 추가적으로, 분리된 캡시드 단백질에 하향류 분석(downstream analysis), 예컨대 예를 들면 손상되지 않은 단백질 수준에서의 정확한 질량 측정과 함께, 단백질 염기서열의 결정 및 캡시드 단백질의 번역 후 변형이 실시될 수 있다.
본 개시의 양태는 바이러스 입자의 캡시드 중 단백질 구성성분들의 이질성을 결정하는 방법에 관한 것이다. 구현예에서, 상기 방법은 바이러스 입자에 HILIC를 실시하여 바이러스 입자 캡시드의 단백질 구성성분들을 분리하는 단계를 포함한다. 구현예에서, 상기 방법은 단백질 캡시드의 단백질 구성성분들의 질량을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 바이러스 입자 캡시드의 단백질 구성성분들의 질량이 바이러스 입자 캡시드의 이론적 질량과 비교된다. 바이러스 입자 캡시드의 단백질 구성성분들의 질량들 중 하나 이상의 편차는 캡시드의 하나 이상의 단백질이 이질성(heterogeneous)임을 나타낸다(도 5a 참조). 반대로, 편차가 없음은 캡시드의 단백질이 균질성임을 나타낸다(도 5b~5d 참조). 구현예에서, 이질성은 혼합된 혈청형, 변종 캡시드, 캡시드 아미노산 치환체, 끝을 자른(truncated) 캡시드, 또는 변형된 캡시드 중 하나 이상 때문이다. 일부 구현예에서, 바이러스 입자의 바이러스 캡시드의 단백질 구성성분들의 화학양론의 결정과 바이러스 입자의 캡시드 중 단백질 구성성분들의 이질성의 결정은 동일한 시료 상에서, 예를 들면 단일 시험에서 이루어진다.
특정 구현예에서, 바이러스 입자는 아데노-관련 바이러스(AAV) 입자이고 개시된 방법은 AAV 입자로 이루어진 캡시드 중 단백질 구성성분의 화학양론 및/또는 AAV 입자로 이루어진 캡시드 중 단백질 구성성분들의 이질성을 결정하는 데 사용될 수 있다. 구현예에서, 단백질 캡시드의 단백질 구성성분들은 AAV　입자의 VP1, VP2 및 VP3을 포함한다. 구현예에서, AAV 입자는 재조합　AAV(rAAV) 입자이다. 구현예에서, AAV　입자는 이종 형질전환 유전자를 인코딩하는 AAV　벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 결정된 또는 계산된 질량(예컨대, AAV　입자의 VP1, VP2 및/또는 VP3의 결정된 또는 계산된 질량)이 참조질량 예를 들면, 하나 이상의 AAV　혈청형의 VP1, VP2 및/또는 VP3의 이론적 질량과 비교될 수 있다(예를 들면, 도 2a 및 2b 참조). 참조질량에는 임의의 AAV　혈청형 중 하나 이상의 VP1, VP2 및/또는 VP3의 이론적 질량이 포함될 수 있다. 예를 들면, 일부 구현예에서, VP1, VP2 및/또는 VP3의 질량이 AAV1 캡시드, AAV2 캡시드, AAV3 캡시드, AAV4 캡시드, AAV5 캡시드, AAV6 캡시드, AAV7 캡시드, AAV8 캡시드, AAVrh8 캡시드, AAV9 캡시드, AAV　10 캡시드, AAV　11 캡시드, AAV　12 캡시드 또는 이들의 변종의 하나 이상의 이론적 질량과 비교된다. 일부 구현예에서, 결정된 또는 계산된 질량(예컨대, AAV　입자의 VP1, VP2 및/또는 VP3의 결정된 또는 계산된 질량)이 이에 상응하는 AAV　혈청형의 VP1, VP2 및/또는 VP3의 이론적 질량과 비교될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시의 방법은 AAV 입자의 단백질의 이질성을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, VP1, VP2 및/또는 VP3의 질량 중 하나 이상의 편차(예컨대, 참조 질량, 예를 들어, 이론적, 예측된 또는 기대된 질량과의 편차)는 AAV　캡시드 단백질 이질성을 나타낸다. 일부 구현예에서, 이질성에는 비제한적으로 하기 중 하나 이상이 포함될 수 있다: 혼합된 혈청형, 변종 캡시드, 캡시드 아미노산 치환체, 끝을 자른(truncated) 캡시드, 또는 변형된 캡시드.
일부 구현예에서, AAV　입자의 이질성을 결정하는 방법은 변성된 AAV　입자에 LC/MS(예컨대, 본원에 기술된 바와 같이)를 실시하는 단계, AAV　입자의 VP1, VP2 및 VP3의 질량을 결정하는 단계 및 이들의 질량을 AAV　혈청형의 VP1, VP2 및 VP3의 이론적 질량과 비교하는 단계를 포함할 수 있고; 추가적으로 VP1, VP2 및/또는 VP3의 단편에 LC/MS/MS를 실시하는 단계, AAV　입자의 VP1, VP2 및 VP3의 단편의 질량을 결정하는 단계 및 이들의 질량을 AAV　혈청형의 VP1, VP2 및 VP3의 이론적 질량과 비교하는 단계를 포함할 수 있다(VP1, VP2 또는 VP3의 질량 중 하나 이상의 편차는 AAV　캡시드 이질성을 나타낸다).
구현예에서, AAV　입자에는 AAV1 캡시드, AAV2 캡시드, AAV3 캡시드, AAV4 캡시드, AAV5 캡시드, AAV6 캡시드, AAV7 캡시드, AAV8 캡시드, AAVrh8 캡시드, AAV9 캡시드, AAV10 캡시드, AAV11 캡시드, AAV　12 캡시드 또는 이들의 변종이 포함된다.
구현예에서, VP1, VP2 및 VP3의 질량이 AAV1 캡시드, AAV2 캡시드, AAV3 캡시드, AAV4 캡시드, AAV5 캡시드, AAV6 캡시드, AAV7 캡시드, AAV8 캡시드, AAVrh8 캡시드, AAV9 캡시드, AAV10 캡시드, AAV11 캡시드, AAV　12 캡시드 또는 이들의 변종 중 하나 이상의 이론적 질량과 비교된다.
구현예에서, AAV　입자는 AAV1 ITR, AAV2 ITR, AAV3 ITR, AAV4 ITR, AAV5 ITR, AAV6 ITR, AAV7 ITR, AAV8 ITR, AAVrh8 ITR, AAV9 ITR, AAV　10 ITR, AAV11 ITR 또는 AAV　12 ITR를 포함한다.
구현예에서, AAV 입자는 개체의 간 세포의 형질도입을 위해 선택된 캡시드 혈청형을 갖는다. 구현예에서, AAV　입자는 캡시드 혈청형 AAV7, AAV8 또는 AAV9를 갖는데, 이들은 개체의 간 세포의 형질 도입에 대해 선택적이다.
일부 구현예에서, AAV 입자는 재조합　AAV(rAAV) 입자이다. 일부 구현예에서, AAV　입자는 이종 형질전환 유전자를 인코딩하는 AAV　벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, AAV　입자는 캡시드 혈청형 AAV7, AAV8 또는 AAV9를 갖는다. 일부 구현예에서, AAV　입자는 캡시드 혈청형 AAV9를 갖는다. 일부 구현예에서, AAV　입자는 캡시드 혈청형 AAV9를 갖고, 근육 세포에서 발현된 항원에 대해 특이적인 항체(예컨대, 항-CD63 항체)에 연결된 리소좀 알파 글루코시다아제(GAA)를 인코딩하는 바이러스 벡터이다.
AAV가 본 개시를 위한 바이러스 입자 모형이었으나, 본원에 개시된 방법은 다양한 바이러스, 예컨대, 바이러스 과, 아과(subfamilies) 및 속(genera)의 개요를 작성하기 위해 적용될 수 있다. 본 개시의 방법은 예컨대, VP 발현, 번역후 변형 및 끝 잘림을 모니터링하기 위해, 그리고 VLP 생산 중에 생성물 일관성을 확보하기 위해, 캡시드 단백질 유전공학적 응용을 위한 자리-유발 돌연변이 생성 또는 구조적 특징 규명을 확인하기 위해, 및/또는 바이러스 입자 또는 제제의 이질성을 모니터링하거나 검출하기 위해 VP의 개요를 작성할 때 유용할 수 있다.
구현예에서, 바이러스 벡터는 이종 형질전환 유전자를 인코딩한다.
구현예에서, 바이러스 입자는 아데노비리데, 파르보비리데, 레트로비리데, 바쿨로비리데 및 헤르페스비리데로 이루어진 군에서 선택되는 바이러스 과에 속한다.
구현예에서, 바이러스 입자는 아타데노바이러스, 아비아데노바이러스, 이치타데노바이러스, 마스타데노바이러스, 시아데노바이러스, 암비덴소바이러스, 브레비덴소바이러스, 헤판덴소바이러스, 이테라덴소바이러스, 펜스틸덴소바이러스, 암도파르보바이러스, 아베파르보바이러스, 보카파르보바이러스, 코피파르보바이러스, 데펜도파르보바이러스, 에리스로파르보바이러스, 프로토파르보바이러스, 테트라파르보바이러스, 알파레트로바이러스, 베타레트로바이러스, 델타레트로바이러스, 엡실론레트로바이러스, 감마레트로바이러스, 렌티바이러스, 스푸마바이러스, 알파바쿨로바이러스, 베타바쿨로바이러스, 델타바쿨로바이러스, 감마바쿨로바이러스, 일토바이러스, 마르디바이러스, 심플렉스바이러스, 바리첼로바이러스, 거대세포바이러스, 무로메갈로바이러스, 프로보시바이러스, 로세올로바이러스, 림포크립토바이러스, 마카바이러스, 페르카바이러스 및 라디노바이러스로 이루어진 군에서 선택되는 바이러스 속에 속한다.
구현예에서, 레트로비리데는 몰로니 생쥐 육종바이러스(MoMSV), 하비 생쥐 육종 바이러스(HaMuSV), 생쥐 유선 종양바이러스(MuMTV), 긴팔원숭이(gibbon ape) 백혈병바이러스(GaLV), 고양이과 백혈병바이러스(FLV), 스푸마바이러스, 프렌드 바이러스, 생쥐 줄기 세포바이러스(MSCV) 라우스 육종 바이러스(RSV), 인간 T 세포 백혈병바이러스, 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 고양이과 면역결핍 바이러스(FIV), 말과 면역결핍 바이러스(EIV), 비스나-메디 바이러스; 염소과 관절염-뇌염 바이러스; 말과 전염성 빈혈바이러스; 고양이과 면역결핍 바이러스(FIV); 소과 면역 결핍 바이러스(BIV); 또는 원숭이과 면역결핍 바이러스(SIV)이다.
친수성 상호작용 크로마토그래피(HILIC)는 부분적으로 수성인 이동상으로 수행될 수 있는 NP-HPLC의 변형으로, 펩타이드, 탄수화물, 핵산 및 여러 단백질의 정상상 분리를 허용한다. HILIC에서 용출 순서는 최소 극성에서 최대 극성으로, 역상 HPLC에서의 순서와 반대이다.
HILIC는 피분석물과 고정상(예컨대, 기질) 사이의 극성 상호작용을 근거로 피분석물을 분리한다. 극성 피분석물은 극성 고정상과 연합하여, 극성 고정상에 의해 머무르게 된다. 피분석물 극성의 증가에 함께 흡착 강도가 증가하고, 극성 피분석물과 극성 고정상 사이의 상호작용(이동상과 대비됨)이 용출 시간을 증가시킨다. 이동상에서 극성을 좀 더 띠는 용매의 사용은 피분석물의 머무름 시간을 감소시키는 반면, 좀 더 소수성인 용매는 머무름 시간을 늘리는 경향이 있다.
다양한 유형의 기질이 HILIC에 사용될 수 있는데, 예컨대, 컬럼 크로마토그래피의 경우, 실리카, 아미노, 아마이드, 셀룰로오스, 사이클로덱스트린 및 폴리스타이렌 기질이 포함된다. 유용한 기질의 예, 예컨대, 컬럼 크로마토그래피에 사용될 수 있는 기질에는 하기가 포함된다: 폴리술포에틸 아스파르타마이드(예컨대, PolyLC에서 생산), 술포베타인 기질, 예컨대, ZIC®-HILIC (예컨대, SeQuant에서 생산), POROS®HS(예컨대, Applied Biosystems에서 생산), POROS®S(예컨대, Applied Biosystems에서 생산), 폴리하이드로에틸 아스파르타마이드(예컨대, PolyLC에서 생산), Zorbax 300 SCX(예컨대, Agilent에서 생산), PolyGLYCOPLEX®(예컨대, PolyLC에서 생산), 아마이드-80 (예컨대, Tosohaas에서 생산), TSK GEL®아마이드-80 (예컨대, Tosohaas에서 생산), 폴리하이드록시에틸 A(예컨대, PolyLC에서 생산), Glyco-Sep-N(예컨대, Oxford GlycoSciences에서 생산) 및 Atlantis　HILIC(예컨대, Waters에서 생산). 개시된 방법에 사용될 수 있는 컬럼에는 하기의 작용기 중 하나 이상을 활용하는 컬럼이 포함된다: 카바모일기, 술포프로필기, 술포에틸기(예컨대, 폴리(2-술포에틸 아스파르타마이드)), 하이드록시에틸기(예컨대, 폴리(2-하이드록시에틸 아스파르타마이드)) 및 방향족 술폰산 기.
특정 구현예에서, 캡시드 단백질은 HILIC 컬럼 상에서 분리되고, 차후에 HILIC 컬럼에서 용출되는데, 예를 들면 이동상 구배를 사용하여 개별 캡시드 단백질을 용해시킴으로써(resolve), 시료 중의 캡시드 단백질을 정제 및 분리한다. 특정 예에서, HILIC 컬럼에서 용출된 캡시드 단백질은 하나 이상의 분획으로 분리된다. 이와 같은 분획은 추후 분석, 예컨대 MS 분석을 위해 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 하나 이상의 분획에 존재하는 캡시드 단백질을 식별하는 단계를 포함한다.
이용되는 이동상은 이온 쌍 시약(ion pairing agents), 예컨대, 아세토나이트릴과 물이 존재하는 또는 부재한 완충액을 포함할 수 있다. 이온 쌍 시약에는 포름산 염, 아세테이트산 염, TFA 및 소금이 포함된다. 예컨대, 완충액 2개가 사용되어, 상기 크로마토그래피 시행 과정에서 제2 완충액의 농도 또는 비율이 증가하는 한편, 제1 완충액의 농도 또는 비율이 감소할 수 있는 경우, 완충액의 구배(Gradients)가 사용될 수 있다. 예를 들면, 제1 완충액의 비율이 크로마토그래피 구동(run)의 과정에서 약 100%, 약 99%, 약 95%, 약 90%, 약 85%, 약 80%, 약 75%, 약 70%, 약 65%, 약 60%, 약 50%, 약 45%, 또는 약 40%에서 약 0%, 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35% 또는 약 40%로 감소할 수 있다. 또 다른 예로서, 제2 완충액의 비율이 동일한 구동의 과정에서 약 0%, 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 또는 약 40%에서 약 100%, 약 99%, 약 95%, 약 90%, 약 85%, 약 80%, 약 75%, 약 70%, 약 65%, 약 60%, 약 50%, 약 45% 또는 약 40%로 증가할 수 있다. 구현예에서, 상기 크로마토그래피 중 이동상 A의 비율은 시간이 경과하면서 증가한다. 선택적으로, 제1 및 제2 완충액의 농도 또는 비율이 상기 크로마토그래피 구동의 끝에서 시작 값으로 돌아갈 수 있다. 한 예로서, 제1 완충액의 비율이 85%에서 63%로, 59%로, 10%로, 85%로 5단계에 걸쳐 변화할 수 있는 반면; 동일한 단계에서 제2 완충액의 비율은 15%에서 37%로, 41%로, 90%로, 15%로 변화할 수 있다. 비율은 선형 구배로 또는 비선형 형태(예컨대, 계단식)로 점진적으로 변할 수 있다. 예를 들면, 상기 구배는 다상(multiphasic), 예컨대, 이중상, 삼중상 등일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본원에 기술된 방법은 이온 쌍 시약의 사용 없이 이동상의 극성의 증가에 상응하여 감소하는 아세토나이트릴 완충액 구배를 사용한다. 구현예에서, HILIC는 물에 트리플루오로아세트산을 포함하는 이동상 A를 사용한다. 구현예에서, 상기 이동상 A는 약 0.1% 트리플루오로아세트산을 포함한다. 구현예에서, 상기 크로마토그래피는 아세토나이트릴에 트리플루오로아세트산을 포함하는 이동상 B를 포함한다. 구현예에서, 상기 이동상 B는 약 0.1% 트리플루오로아세트산을 포함한다.
상기 크로마토그래피 구동 내내 컬럼 온도가 일정 온도로 유지될 수 있는데, 예컨대, 상용화된 컬럼 가열기가 사용된다. 일부 구현예에서, 컬럼은 약 50℃ 내지 약 70℃, 예컨대, 약 50℃ 내지 약 60℃, 약 55℃ 내지 약 60℃, 예컨대, 약 50℃, 약 55℃, 약 60℃, 약 65℃ 또는 약 70℃의 온도로 유지된다. 한 구현예에서, 온도는 약 60℃이다.
이동상의 유속은 약 0 내지 약 100ml/분일 수 있다. 분석을 목적으로 할 때, 유속의 범위는 전형적으로 0 내지 10ml/분이고, 예비 HPLC의 경우, 100ml/분을 초과하는 유속이 사용될 수 있다. 예를 들면, 유속은 약 0.5, 약 1, 약 1.5, 약 2, 약 2.5, 약 3, 약 3.5, 약 4, 약 4.5 또는 약 5ml/분일 수 있다. 채우기(packing)가 같고, 길이가 같고, 단 직경이 더 작은 컬럼으로 대체할 경우, 직경이 더 넓은 컬럼에서 관찰되듯이, 동일한 머무름 시간과 피크에 대한 해상도를 유지하기 위해서 유속의 감소가 요구된다. 바람직하게는, 4.6×100mm, 5μm 컬럼에서 약 1ml/분과 동등한 유속이 사용된다.
구동 시간은 약 15분 내지 약 240분, 예컨대, 약 20분 내지 약 70분, 약 30분 내지 약 60분, 약 40분 내지 약 90분, 약 50분 내지 약 100분, 약 60 분 내지 약 120분, 약 50분 내지 약 80분 사이일 수 있다. 구현예에서, 이동상 A는 약 45분에 걸쳐 약 15%에서 약 100%로 증가한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 바이러스 입자에 액체 크로마토그래피/질량 분석(LC/MS)을 실시하는 단계를 포함한다. 당해기술에 공지된 바와 같이, LC/MS는 이온의 물리적 분리를 위해 액체 크로마토그래피를, 이온에서 질량 스펙트럼 데이터의 생성을 위해 질량 분석을 활용한다. 이와 같은 질량 스펙트럼 데이터는 예컨대 질량, 정량, 순도 등에 의해 입자의 분자량 또는 구조, 식별을 결정하는 데 사용될 수 있다. 이들 데이터는 검출된 이온의 특성들, 예컨대 시간 경과에 따른(예컨대, 머무름 시간) 신호 강도(예컨대, 존재비), 또는 질량:전하 비율 대비 상대적 존재비를 나타낼 수도 있다.
일부 구현예에서, 질량 분석(예컨대, 본원에 기술된 바와 같이 LC/MS에 사용되는)은 전기분무 이온화 질량 분석(ESI-MS)을 가리킬 수 있다. ESI-MS는 질량 분석을 사용해 용액에서 유래된 이온을 분석하기 위해 전기 에너지를 사용하는 기법으로 당해기술에 공지되어 있다(예컨대, Yamashita, M. and Fenn, J.B. (1984) . Phys. Chem. 88:4451-4459 참조). 이온 종(또는 용액이나 기체상에서 이온화되는 중성 종(neutral species))은 전하를 띤 비말의 에어로졸로 분산됨으로써 용액에서 기체상으로 전이되고, 이어서 전하를 띤 비말의 크기를 축소시키는 용매 증발이 일어나고, 용액이 바닥(예컨대, 둘러싼 챔버ESI의 벽)에 비례한 전압을 갖는 작은 모세관을 통과할 때, 시료를 휘발성 산 및 유기용매와 혼합하고 그것을 높은 전압이 걸린 전도성 바늘을 통해 주입함으로써, 전하를 띤 비말에서의 시료 이온 방출이 수행된다. 바늘 끝에서 분무(또는 방출)되는 전하를 띤 비말은 질량 분석기로 향하고, 날아 들어가면서 열과 진공에 의해 건조된다. 비말이 건조된 후, 남아 있는 전하를 띤 분자는 전자기 렌즈에 의해 질량 검출기로 향하여 질량이 분석된다. 한 구현예에서, 용출된 시료는 모세관에서 바로 전기분무 노즐로 증착되는데, 예컨대 모세관이 시료 적재기로서 기능한다. 또 다른 구현예에서, 모세관은 추출 장치 및 전기분무 노즐로서 기능한다.
MALDI의 경우, 피분석물 분자(예컨대, 단백질)가 금속 표적 상에 증착되고 유기 기질과 함께 결정화된다. 시료는 건조되어 질량 분석기에 삽입되고, 전형적으로 비행시간(TOF) 검출을 통해 분석된다. 일 구현예에서, 용출된 시료는 모세관에서 금속 표적으로 바로 증착되는데, 예컨대, 모세관은 시료 적재기로 기능한다. 일 구현예에서, 추출된 피분석물은 MALDI 표적 상에 증착되고, MALDI 이온화 기질이 첨가된 후, 시료가 이온화되고, 예컨대, TOF 검출에 의해 분석된다.
일부 구현예에서, 기타 이온화 모드, 예컨대 ESI-MS, 터보분무 이온화 질량 분석, 나노분무 이온화 질량 분석, 열분무 이온화 질량 분석, 음파 분무 이온화 질량 분석, SELDI-MS　및 MALDI-MS가 사용된다. 일반적으로, 이들 방법의 장점은 시료의 "적기" 정제 및 이온화 환경으로의 직접적인 유입이 가능하다는 점이다. 다양한 이온화 및 검출 모드가 사용하는 탈착 용액의 속성에 그것들 나름의 제약을 가한다는 점을 유의하는 것이 중요하고, 탈착 용액이 두 가지 모두에 쓰일 수 있다는 점이 중요하다. 예를 들면, 여러 응용에서 시료 기질은 이온 강도가 낮아야 하거나, 특정 pH 범위에 머물러야 한다. ESI에서, 시료 중 염이 이온화를 낮추고 노즐의 입구를 막음으로써 검출을 방해할 수 있다. 이와 같은 문제는 피분석물을 적은 염으로 제공하거나 및/또는 휘발성 염의 사용에 의해 해소될 수 있다. MALDI의 경우, 피분석물은 표적 상의 스폿팅(spotting) 및 활용된 이온화 기질과 양립할 수 있는 용매 중에 있어야 한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 본 개시의 바이러스 입자 또는 본 개시의 변성된 바이러스 입자의 소화된 단편에 액체 크로마토그래피/질량 분석-질량 분석(LC/MS/MS)을 실시하는 단계를 포함한다. 당해기술에 공지된 바와 같이, LC/MS/MS(용어 "액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석"이 본원에서 상호교환되어 사용될 수 있다)는 이온의 물리적 분리를 위해 액체 크로마토그래피를, 이온에서 질량 스펙트럼 데이터의 생성을 위해 질량 분석을 활용하되, 질량 분석은 여러 단계의 질량(예컨대, m/z) 분리를 사용하는데, 전형적으로 단편화 단계에 의한 분리를 사용한다. 예를 들면, m/z의 일정 범위 내에 있는 관심 대상 이온은 MS의 제1 구동에서 분리되어 단편화된 후, MS의 제2 구동에서 개별 m/z를 근거로 추가적으로 분리된다. 이온 단편화에는 비제한적으로 충돌-유도 해리(CID), 높은 에너지 충돌 해리(HCD), 전자-포획 해리(ECD) 또는 전자-전이 해리(ETD)와 같은 기법이 포함된다.
LC/MS 및/또는 LC/MS/MS에 적합한 다양한 질량 분석기가 당해기술에 공지되어 있는데, 예컨대 비제한적으로 비행시간(TOF) 분석기, 4중극자 질량 여과기, 4중극자 TOF(QTOF), 및 이온트랩(예컨대, 푸리에 변환 방식 질량 분석기 또는 오비트랩)이 포함된다. 오비트랩에서, 접지형 계기 전위(ground potential)의 배럴형 외부전극과 축형 중심 전극이 사용되어, 원심력과 정전기력의 균형에 의해 제한되고, 중심 축을 따라 진동하면서 중심전극 주변을 타원형으로 회전하는 궤도에 있는 이온을 가둔다. 이와 같은 기구의 사용에 이미지 흐름의 검출에서 나온 시간영역 신호(예컨대, 주파수)를 고해상도 질량 측정(예컨대, 나노 LC/MS/MS)으로 전환하는 푸리에 변환 작용이 활용된다. 추가적인 설명과 상세한 내용은 예컨대, Scheltema, R.A. et al. (2014) Mol. Cell Proteomics 13:3698-3708; Perry, R.H. et al. (2008) Mass. Spectrom. Rev. 27:661-699; and Scigelova, M. et al. (2011) Mo/. Cell Proteomics 10:M11 1.009431에서 찾아볼 수 있다.
일부 구현예에서, 바이러스 캡시드 단백질의 질량이 예컨대, LC/MS 및/또는 LC/MS/MS 데이터를 근거로 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, AAV　입자의 VP1, VP2 및 VP3의 질량 또는 AAV 입자의 VP1, VP2 및 VP3의 단편의 질량이 예컨대, LC/MS 및/또는 LC/MS/MS 데이터를 근거로 결정될 수 있다. MS 데이터에서 단백질 질량 및/또는 정체성을 결정하는 다양한 방법이 당해기술에 공지되어 있다. 예를 들면, 펩타이드 질량 핑거프린팅(fingerprinting)이 사용되어 MS 데이터를 근거로 단백질 염기서열을 결정할 수도 있고, 또는 하나 이상의 구성 펩타이드와 관련된 MS/MS 데이터를 근거로 단백질이 식별될 수도 있다. 탠덤 MS를 이용할 때, 관심대상의 단백질의 하나 이상의 펩타이드와 관련된 m/z 데이터를 분석하는 데 생성물 이온 스캐닝이 사용될 수 있다. 그러고 나서, 예컨대, 식별된 피크를 참조 피크 또는 공지된 피크와 일치시키고, 피크를 동위원소 이성질체 엔벨로프(envelope)에 분류하는 것 등에 당해 기술에 공지된 소프트웨어가 사용될 수 있다. 펩타이드 질량값이 공지되 펩타이드 염기 서열의 데이터베이스와 비교될 수도 있다. 예를 들면, 관측된 펩타이드와 이론적 데이터베이스 펩타이드를 일치시키는 데 마스코트(Mascot)가 사용될 수 있는데, 예컨대, 인실리코(in silico) 단백질 데이터베이스에 특정 소화 패턴을 적용함으로써 나타난 결과이다. 기타 적합한 소프트웨어에는 비제한적으로 Proteome Discoverer, Protein-Prospector, X! Tandem, Pepfinder, Bonics 또는 MassLynx™(Waters)가 포함된다.
일부 구현예에서, 이종 핵산이 촉진자에 작용가능하게 연결된다. 촉진자의 예에는, 비제한적으로, 거대세포바이러스(CMV) 급초기 촉진자, RSV LTR, MoMLV LTR, 포스포글리세레이트 키나아제-1(PGK) 촉진자, 원숭이과 바이러스 40(SV40) 촉진자 및 CK6 촉진자, 트랜스타이레틴 촉진자(TTR), TK 촉진자, 테트라사이클린 반응성 촉진자(TRE), HBV 촉진자, hAAT 촉진자, LSP 촉진자, 키메라 간-특이성 촉진자(LSP), E2F 촉진자, 텔로메라아제(hTERT) 촉진자; 거대세포바이러스 증폭자/닭 베타-액틴/토끼 β-글로빈 촉진자(CAG 촉진자; Niwa et al., Gene, 1991, 108(2): 193-9) 및 연장 인자 1-알파 촉진자(EFI-alpha) 촉진자(Kim et al., Gene, 1990, 91(2):217-23 and Guo et al., Gene Ther., 1996, 3(9): 802- 10)가 포함된다. 일부 구현예에서, 촉진자에는 인간 β-글루쿠로니다아제 촉진자 또는, 닭 β-액틴(CBA) 촉진자에 연결된 거대세포바이러스 증폭자가 포함된다. 촉진자는 구성요소, 유도성 또는 억제성 촉진자일 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명은 CBA 촉진자에 작동 가능하게 연결된, 본 개시의 이종 형질전환 유전자를 인코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
구성요소 촉진자의 예에는, 비제한적으로, 레트로바이러스 라우스 육종 바이러스(RSV) LTR 촉진자(선택적으로 RSV 증폭자 존재), 거대세포바이러스(CMV) 촉진자(선택적으로 CMV 증폭자 존재), SV40 촉진자, 디히드로엽산 환원효소 촉진자, 13-액틴 촉진자, 포스포글리세롤 키나아제(PGK) 촉진자 및 EFla 촉진자가 포함된다.
유도성 촉진자는 유전자 발현의 조절을 허용하고, 외인성으로 공급된 화합물, 온도와 같은 환경 요인들, 또는 특정 생리학적 상태, 예컨대, 급성기, 세포의 특정 분화 상태의 존재에 의해, 또는 세포를 복제할 때에만 조절될 수 있다. 유도성 촉진자와 유도성 시스템은, 예컨대 비제한적으로 Invitrogen, Clontech 및 Ariad와 같은 다양한 업체에서 구입할 수 있다. 그 밖의 여러 시스템이 당해기술에 기술된 바 있고, 당해기술의 숙련가에 의해 손쉽게 선택될 수 있다. 외인성으로 공급된 촉진자에 의해 조절되는 유도성 촉진자의 예에는 아연-유도성 양 메탈로티오닌(MT) 촉진자, 덱사메타손(Dex)-유도성 생쥐 유선 종양바이러스(MMTV) 촉진자, T7 중합효소 촉진자 시스템(WO 98/10088); 엑다이손 곤충 촉진자(No et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:3346-3351 (1996)), 테트라사이클린-억제성 시스템(Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)), 테트라사이클린-유도성 시스템(Gossen et al., Science, 268: 1766-1769 (1995), 또한 Harvey et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 2:512-518 (1998) 참조), RU486-유도성 시스템(Wang et al., Nat. Biotech., 15:239-243 (1997) and Wang et al, Gene Ther., 4:432-441 (1997)) 및 라파마이신-유도성 시스템(Magari et al., J. Clin. Invest., 100:2865-2872 (1997))이 포함된다. 본 맥락에서 유용하게 쓰일 수 있는 그 밖의 기타 유형의 유도성 촉진자는 특정한 생리적 상태, 예컨대, 온도, 급성기, 세포의 특정 분화 상태에 의해, 또는 세포를 복제할 때에만 조절되는 것이다.
또 다른 구현예에서, 형질전환 유전자를 위한 천연(native) 촉진자 또는 그것의 단편이 사용될 것이다. 천연 촉진자는 형질전환 유전자의 발현이 본래의 발현을 모방하는 것이 바람직할 경우에 사용될 수 있다. 천연 촉진자는 형질전환 유전자의 발현이 일시적으로 또는 발달 과정에서, 또는 조직 특이적 방식으로, 또는 특정 전사 자극에 대한 반응으로 조절되어야 하는 경우에도 사용될 수 있다. 추가적인 구현예에서, 본래의 발현을 모방하기 위해, 또한 다른 본래의 발현 제어 요소들, 예컨대 증폭자 요소, 폴리아데닐화 자리 또는 코작(Kozak) 공통 염기 서열이 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 조절 염기 서열은 조직-특이적 유전자 발현 능력을 부여한다. 일부 경우에, 조직-특이적 조절 염기 서열은 조직 특이적 방식으로 전사를 유도하는 조직-특이적 전사 인자와 결합한다. 이와 같은 조직-특이적 조절 염기 서열(예컨대, 촉진자, 증폭자 등)은 당해기술에 잘 알려져 있다.
일부 구현예에서, 벡터는 인트론을 포함한다. 예를 들면, 일부 구현예에서, 인트론은 닭 베타-액틴과 토끼 베타-글로빈에서 유래된 키메라 인트로이다. 일부 구현예에서, 인트론은 생쥐(MVM) 인트로의 극히 작은 바이러스이다.
일부 구현예에서, 벡터는 폴리아데닐화(polyA) 염기서열을 포함한다. 폴리아데닐화 염기 서열의 수많은 예들이 당해 기술에 공지되어 있는데, 예를 들면 소과 성장 호르몬(BGH) 폴리(A) 염기서열(예컨대, 승인 번호 EF592533), SV40 폴리아데닐화 염기서열, 및 HSV TK pA 폴리아데닐화 염기 서열이 있다.
앞서 제시된 구현예에 기술된 예시 시스템, 방법 및 행위들은 설명을 위한 것으로, 대안적 구현예에서, 특정 행위가 다른 순서로 수행되거나, 또 다른 것과 병행되거나, 완전히 누락되거나, 상이한 예시적 구현예들 사이에 조합될 수 있고, 및/또는 다양한 구현예의 범위 및 원칙에서 벗어나지 않으면서, 특정한 추가적 행위가 수행될 수 있다. 따라서, 이와 같은 대안적 구현예는 본원에 기술된 실시예에 포함된다.
특정 구현예들이 앞서 상세히 기술된 바 있으나, 이와 같은 기술은 단지 설명을 목적으로 한 것이다. 따라서, 앞서 기술된 여러 양태는, 명시적으로 달리 언급되지 않는 한, 필요 또는 필수 요소로 의도된 것이 아님이 이해되어야 한다. 앞서 기술된 것들 뿐만 아니라, 예시적 구현예의 개시된 양태의 변형, 그것과 동등한 구성성분 또는 그에 상응하는 행위가 당해기술의 숙련가에 의해 수행될 수 있고, 추후 청구항에서 정의되는 구현예의 원칙과 범위에서 벗어나지 않으면서, 본 발명의 개시의 혜택을 받되, 상기 범위에는 그와 같은 변형과 동등한 구조가 모두 포함되도록 가장 넓은 범위의 해석이 부여되어야 한다.
하기의 실시예는 특정 구현예의 특징들을 설명하기 위해 제공된다. 하지만, 하기에 기술된 특징들은 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안 되며, 오히려 당해기술의 숙련가에 의해 동등한 것으로 인정되는 것의 예로 간주되어야 한다.
실시예
하기 실시예는 당해기술의 숙련가에게 본 발명의 방법을 제작하고 사용하는 방법에 대해 완전한 개시 및 설명을 제공하고자 제시되며, 발명자가 그들의 발명이라고 간주하는 것의 범위를 제한하기 위한 것이 아니다. 본원에 사용된 숫자(예컨대, 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 확보하기 위해 노력하였으나, 일부 실험 오차 및 편차가 감안되어야 한다. 달리 나타내지 않는 한, 부(parts)는 중량부이고, 분자량은 달리 나타내지 않는 한 평균 분자량이며, 온도는 섭씨이고 실온은 약 25oC이며, 압력은 대기압 또는 대기압 근처이다.
손상되지 않은(Intact) AAV 입자에서 캡시드 단백질의 분리
손상되지 않은 AAV9 바이러스 입자의 분리를 위해, 아래 표에 기술된 바와 같이, AAV 시료 1μL를 HILIC 컬럼 상에 주입하였다. 분리의 결과는 도 4에 나타냈다. 보다시피, 3개의 AAV 캡시드 단백질이 서로 완전히 구별되는 해상도를 나타냈다.
표 1은 손상되지 않은 AAV9 캡시드에서 AAV9 캡시드 단백질의 분리를 위해 사용된 크로마토그래피 조건의 요약을 보여준다.
Figure pct00001
RP-기반 분리와 비교할 때, VP 분리의 경우 HILIC 컬럼의 고유한 머무름 기전이 놀라우리 만치 더욱 효과가 있었다(도 4, 3a 및 3b 참조).
분리된 AAV 캡시드 단백질의 질량 스펙트럼 분석
본원에 기술된 방법의 장점 중 하나는 어떤 시료 제제가 필요하지 않다는 점이다. 시료 1uL을 LC-MS에 직접 주입한 후, 생성된 데이터를 분석하였다. 손상되지 않은 질량 분석을 위해, 하기의 조정 매개변수를 Q-Exactive Plus 질량 분석계에 적용하였다:
Figure pct00002
도 5a~5d는 개별 캡시드 단백질의 질량 스펙트럼을 나타낸다. 도 5a에 나타낸 바와 같이, VP3에 단백질 이질성이 있었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 피크 높이는 손상되지 않은 AAV 입자의 화학양론을 결정하는 데 사용될 수 있다.
본 발명은 본원에 기술된 특정 구현예에 의해 범위가 제한되어서는 안 된다. 사실상, 본원에 기술된 것 뿐만 아니라 본 발명의 다양한 변형들은 앞서의 설명 그리고 이에 수반되는 도면들로 당해기술의 숙련가에게 명백할 것이다. 이와 같은 변형은 첨부된 청구항의 범위 내에 속하도록 의도된 것이다.

Claims (20)

  1. 바이러스 입자의 바이러스 캡시드의 단백질 구성성분들의 화학양론을 결정하는 방법으로서,
    바이러스 입자 시료에 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피(HILIC)를 실시하여 상기 바이러스 입자의 바이러스 캡시드의 단백질 구성성분들을 분리하는 단계;
    상기 바이러스 캡시드의 단백질 구성성분들의 질량을 결정하여 HILIC에 의해 분리된 상기 단백질 구성성분들을 식별하는 단계;
    상기 HILIC 분리에서 상기 바이러스 캡시드의 단백질 구성성분의 상대적 존재비를 결정함으로써, 바이러스 입자의 바이러스 캡시드의 단백질 구성성분의 화학양론을 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 바이러스 입자가 아데노-관련 바이러스(AAV) 입자를 포함하는 것인 방법.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 단백질 캡시드의 단백질 구성성분이 상기 AAV　입자의 VP1, VP2 및 VP3을 포함하는 것인 방법.
  4. 청구항 2에 있어서, 상기 VP1, VP2 및 VP3의 질량이 AAV1 캡시드, AAV2 캡시드, AAV3 캡시드, AAV4 캡시드, AAV5 캡시드, AAV6 캡시드, AAV7 캡시드, AAV8 캡시드, AAVrh8 캡시드, AAV9 캡시드, AAV10 캡시드, AAV11 캡시드, AAV　12 캡시드 또는 이들의 변종 중 하나 이상의 이론적 질량과 비교되는 것인 방법.
  5. 청구항 3에 있어서, 상기 AAV 입자가 AAV1 캡시드, AAV2 캡시드, AAV3 캡시드, AAV4 캡시드, AAV5 캡시드, AAV6 캡시드, AAV7 캡시드, AAV8 캡시드, AAVrh8 캡시드, AAV9 캡시드, AAV10 캡시드, AAV11 캡시드, AAV 12 캡시드 또는 이들의 변종을 포함하는 것인 방법.
  6. 청구항 2에 있어서, 상기 AAV　입자가 AAV1 ITR, AAV2 ITR, AAV3 ITR, AAV4 ITR, AAV5 ITR, AAV6 ITR, AAV7 ITR, AAV8 ITR, AAV9 ITR, AAV　10 ITR, AAV11 ITR 또는 AAV　12 ITR를 포함하는 것인 방법.
  7. 청구항 2에 있어서, 상기 AAV 입자가 재조합　AAV(rAAV) 입자 또는 이종 형질전환 유전자를 인코딩하는 AAV 벡터인 것인 방법.
  8. 청구항 2에 있어서, 상기 AAV 입자가 개체의 간 세포의 형질 도입을 위해 선택된 캡시드 혈청형을 갖는 것인 방법.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 AAV　입자가 캡시드 혈청형 AAV7, AAV8 또는 AAV9를 갖는 것인 방법.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 AAV　입자가 캡시드 혈청형 AAV9를 갖는 것인 방법.
  11. 청구항 2에 있어서, 상기 AAV　입자가 캡시드 혈청형 AAV9를 갖고, 항-CD63 항체에 연결된 리소좀 알파 글루코시다아제(GAA)를 인코딩하는 바이러스 벡터인 것인 방법.
  12. 청구항 1에 있어서, 상기 바이러스 입자가 이종 형질전환 유전자를 인코딩하는 바이러스 벡터를 포함하거나, 또는 아데노비리데, 파르보비리데, 레트로비리데, 바쿨로비리데 및 헤르페스비리데로 이루어진 군에서 선택되는 바이러스 과에 속하는 것인 방법.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 바이러스 입자가 아타데노바이러스, 아비아데노바이러스, 이치타데노바이러스, 마스타데노바이러스, 시아데노바이러스, 암비덴소바이러스, 브레비덴소바이러스, 헤판덴소바이러스, 이테라덴소바이러스, 펜스틸덴소바이러스, 암도파르보바이러스, 아베파르보바이러스, 보카파르보바이러스, 코피파르보바이러스, 데펜도파르보바이러스, 에리스로파르보바이러스, 프로토파르보바이러스, 테트라파르보바이러스, 알파레트로바이러스, 베타레트로바이러스, 델타레트로바이러스, 엡실론레트로바이러스, 감마레트로바이러스, 렌티바이러스, 스푸마바이러스, 알파바쿨로바이러스, 베타바쿨로바이러스, 델타바쿨로바이러스, 감마바쿨로바이러스, 일토바이러스, 마르디바이러스, 심플렉스바이러스, 바리첼로바이러스, 거대세포바이러스, 무로메갈로바이러스, 프로보시바이러스, 로세올로바이러스, 림포크립토바이러스, 마카바이러스, 페르카바이러스 및 라디노바이러스로 이루어진 군에서 선택되는 바이러스 속에 속하는 것인 방법.
  14. 청구항 12에 있어서, 상기 레트로비리데가 몰로니 생쥐 육종바이러스(MoMSV), 하비 생쥐 육종 바이러스(HaMuSV), 생쥐 유선 종양바이러스(MuMTV), 긴팔원숭이(gibbon ape) 백혈병바이러스(GaLV), 고양이과 백혈병바이러스(FLV), 스푸마바이러스, 프렌드 바이러스, 생쥐 줄기 세포바이러스(MSCV) 라우스 육종 바이러스(RSV), 인간 T 세포 백혈병바이러스, 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 고양이과 면역결핍 바이러스(FIV), 말과 면역결핍 바이러스(EIV), 비스나-메디 바이러스; 염소과 관절염-뇌염 바이러스; 말과 전염성 빈혈바이러스; 고양이과 면역결핍 바이러스 (FIV); 소과 면역 결핍 바이러스 (BIV); 또는 원숭이과 면역결핍 바이러스(SIV)인 것인 방법.
  15. 청구항 1에 있어서, 상기 HILIC가 물에 트리플루오로아세트산을 포함하는 이동상 A를 사용하거나, 또는 아세토나이트릴에 트리플루오로아세트산을 포함하는 이동상 B을 사용하는 것인 방법.
  16. 청구항 13에 있어서, 상기 이동상 A 또는 상기 이동상 B가 약 0.1% 트리플루오로아세트산을 포함하는 것인 방법.
  17. 청구항 15에 있어서, 상기 크로마토그래피에서 이동상 A의 비율이 시간이 경과하면서 증가하는 것인 방법.
  18. 청구항 17에 있어서, 이동상 A가 약 45분에 걸쳐 약 15%에서 약 100%로 증가하는 것인 방법.
  19. 바이러스 입자의 캡시드 중 단백질 구성성분들의 이질성을 결정하는 방법으로서,
    상기 바이러스 입자에 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피(HILIC)를 실시하여 상기 바이러스 입자 캡시드의 단백질 구성성분들을 분리하는 단계;
    상기 단백질 캡시드의 단백질 구성성분들의 질량을 결정하는 단계;
    상기 바이러스 입자 캡시드의 단백질 구성성분들의 결정된 질량을 이론적 질량과 비교하는 단계를 포함하되, 상기 이론적 질량에서 바이러스 입자 캡시드의 단백질 구성성분들 중 하나 이상의 편차가 캡시드 이질성을 나타내는 것인 방법.
  20. 청구항 19에 있어서, 상기 이질성이 혼합된 혈청형, 변종 캡시드, 캡시드 아미노산 치환체, 끝을 자른(truncated) 캡시드 또는 변형된 캡시드 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
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