JP2022505307A - Ｃ１－ｉｎｈを精製する方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、Ｃ１エステラーゼ阻害剤（Ｃ１－ＩＮＨ）を、より特定するとＣ１－ＩＮＨ濃縮物を精製する方法に関する。
Description
本発明は、Ｃ１エステラーゼ阻害剤（Ｃ１－ＩＮＨ）を、より特定するとＣ１－ＩＮＨ濃縮物を精製する方法に関する。
補体活性化経路のタンパク質であるＣ１－ＩＮＨは、血漿中に存在するプロテアーゼ阻害剤であり、活性化されたＣ１ｒおよびＣ１ｓと共有結合複合体を形成することによってＣ１活性化を制御する。Ｃ１－ＩＮＨはまた、血漿プレカリクレイン、第ＸＩ因子および第ＸＩＩ因子のような重要な血液凝固酵素だけでなく、プラスミンも「制御」する。
Ｃ１－ＩＮＨ欠損症は、例えば、遺伝性血管性浮腫（ＨＡＥ）に関連しており、これはＣ１－ＩＮＨの欠如（Ｉ型ＨＡＥ）またはＣ１－ＩＮＨの活性の低下（ＩＩ型ＨＡＥ）によって引き起こされる。Ｃ１－ＩＮＨ欠損症はまた、血液が人工心肺装置などに入って表面に接触する場合に生成される酵素の中和に起因するＣ１－ＩＮＨの消費によっても引き起こされるが、慢性の、特にリウマチ性障害に関して現れる免疫複合体のような凝固カスケードを開始する疾患経過においても引き起こされる可能性がある。今のところ、Ｃ１－ＩＮＨタンパク質の補充は、急性ＨＡＥの予防または治療において絶対的基準とみなされる必要がある。このことは、市販のヒト血漿由来Ｃ１－ＩＮＨに特に当てはまり、ヒトＣ１－ＩＮＨタンパク質と同一ではないトランスジェニックウサギで産生される市販の組換えＣ１－ＩＮＨよりも自然な機能を持っていると報告されている（非特許文献１）。検討されているさらなる治療用途には、虚血再灌流障害の予防、軽減、および／または治療におけるＣ１－ＩＮＨの使用を含む（特許文献１を参照）。
ヒト血漿からのＣ１－ＩＮＨの単離および／または精製は公知であるが、多少の費用がかかり、特にほとんどの場合、非常に時間のかかる方法である。多くの従来技術の方法は、例えば、非特許文献２、非特許文献３に記載されているような方法は、複雑すぎて、十分な収率を伴わず、および／または技術的規模に受け入れられるには時間がかかりすぎる。他の従来技術の方法は、例えば、非特許文献４によって記載されているような方法は、他の欠点を有する。
血漿からＣ１－ＩＮＨを生産するために提案された異なる方法は、アフィニティークロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、沈殿、および疎水性相互作用クロマトグラフィーのような様々な分離方法を含む。これらの方法のいずれかを単独で使用することは、全般的に、Ｃ１－ＩＮＨを、特にＣ１－ＩＮＨ濃縮物を十分に精製するには不適当であり、したがって、それらの様々な組み合わせが従来技術において提案されている。
特許文献２は、陰イオン交換クロマトグラフィー、それに続く陽イオン交換クロマトグラフィーの使用を記載している。特許文献３は、約２０％の収率にて９０％純粋なＣ１－ＩＮＨの製造に到達する、沈殿工程と、ネガティブモードでの疎水性相互作用クロマトグラフィーとの組み合わせを記載している。特許文献４は、ＰＥＧ沈殿、およびジャカリン－アガロースでのクロマトグラフィー、およびネガティブモードでの疎水性相互作用クロマトグラフィーを記載している。特許文献５は、第１および第２の陰イオン交換を含む方法を記載している。
現在、血管性浮腫の治療用に４種の市販のＣ１－ＩＮＨ濃縮物が存在し、そのうち３種は血漿由来である。これらの血漿由来Ｃ１－ＩＮＨ濃縮物の１種は、Ｂｅｒｉｎｅｒｔ（登録商標）という商標で販売されている。これらのＣ１－ＩＮＨ濃縮物は、異なる独自の方法に従って製造され、Ｂｅｒｉｎｅｒｔ（登録商標）を製造する方法は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）の工程を含むが、ネガティブモードである（非特許文献１）。
より全般的に言えば、ＨＩＣは、分子を分子の疎水性に基づいて分離し、生物学的活性を維持しながらタンパク質を精製するために使用される。分子、より特定すると疎水性領域および親水性領域が配置しているタンパク質は、高塩濃度の緩衝液においてＨＩＣのカラムに適用される。緩衝液中の塩は、試料溶質の溶媒和を減少させる。溶媒和が減少すると、露出した疎水性領域は媒体によって吸着される、または固定相によって保持および／または結合される。分子の疎水性が高いほど、結合を促進するために、必要な塩は少なくなる。したがって、通常、疎水性の高い順にカラムから試料を溶出するために、塩の勾配の減少が用いられる。ある分子に関して、最初にその分子を固定相に結合し、次いでその分子を溶出することによってＨＩＣを使用するこのモードは、以下では「ポジティブモード」と呼ばれる。
Ｃ１－ＩＮＨの特定の場合では、しかしながら、ＨＩＣはこのようには使用されていない、つまり、「ポジティブ」または「結合」モードではない。これは、Ｃ１－ＩＮＨの場合、ＨＩＣがＣ１－ＩＮＨの顕著な親水性を利用することが記載されてきたためである。他のタンパク質は（疎水性）カラムに保持されるが、Ｃ１－ＩＮＨは移動相に残る。Ｃ１－ＩＮＨを精製するためにＨＩＣを使用するこの従来技術の技法は、以下では、「ネガティブ」または「フロースルー」モードと呼ばれる。フロースルーモードのＨＩＣとは、Ｃ１－ＩＮＨを精製するためにＨＩＣを使用する従来技術の手法である。本発明者らは、Ｃ１－ＩＮＨを精製する別の様式におけるＨＩＣの使用のいずれの記述についても未確認である。例えば、フロースルーは、特許文献６の発明の中核として記載されている。特許文献４もまた、Ｃ１－ＩＮＨがカラムによって保持されないこのような条件下（フロースルーモード）でのＨＩＣを記載し、これに関して、非特許文献５を参照し、これはまた、フロースルーモードのＨＩＣを記載している。より最近では、非特許文献６も、フロースルーモードまたはネガティブモードのＨＩＣを含むＣ１－ＩＮＨの中間精製工程を記載している：この著者は、０．８Ｍの硫酸アンモニウム濃度が、フロースルー画分において精製されたＣ１－ＩＮＨを得て、かつ他の血漿タンパク質から分離することに最適であると考えた。そのようにして得られたＣ１－ＩＮＨ濃縮物はさらなる精製を必要とした。
前述の従来技術によれば、Ｃ１－ＩＮＨを精製するためのＨＩＣの出発材料は、寒冷沈降（ｃｒｙｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）、イオン交換クロマトグラフィー、分別沈殿および／またはそれらの組み合わせのような工程を含む異なる方式で得ることができ、分別沈殿は、技術的または工業的規模で、すなわち、Ｂｅｒｉｎｅｒｔ（登録商標）の製造において使用されることが知られている（ＨＩＣの前に硫酸アンモニウム沈殿が先行する。非特許文献１を参照）。特許文献６によれば、液体の硫酸アンモニウムを沈殿剤として使用する分別沈殿は、溶液が６０％の硫酸アンモニウムを含むまで実行される。その後、沈殿したＣ１－ＩＮＨは、Ｃ１－ＩＮＨが沈殿しない濃度の沈殿剤を、この場合は硫酸アンモニウムを含有する水溶液に取り込まれる。この方法は技術的規模になっているが、例えば、時間、スペース、および材料という形の重要なリソースをさらに必要とする。
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Ｋｕｍａｒら、Ｊ．Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２０１４年；４（６）（ＤＯＩ：１０．４１７２／２１５５～９８２１．１０００１７４頁
ヒト血漿は、全般的に、既存のニーズを満たすのに十分な量で入手するのは困難である。それ故、保全的に最適なその使用を支援する、より効率的で、かつ特に時間のかからない方法を実現することが最も重要である。したがって、本発明は、疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用してＣ１－ＩＮＨを精製するためのより効率的かつ時間のかからない方法を提供することを目的としている。
前述の問題は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を使用してＣ１－ＩＮＨを精製する方法であって、以下の工程：
（ｉ）Ｃ１－ＩＮＨが固定相に結合する第１の条件下で、固定相を含む疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムに、溶解したＣ１－ＩＮＨを含有する溶液を充填する工程と、
（ｉｉ）第２の条件を適用して、移動相によってＣ１－ＩＮＨを溶出する工程と
を含む方法によって解決される。
（ｉ）Ｃ１－ＩＮＨが固定相に結合する第１の条件下で、固定相を含む疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムに、溶解したＣ１－ＩＮＨを含有する溶液を充填する工程と、
（ｉｉ）第２の条件を適用して、移動相によってＣ１－ＩＮＨを溶出する工程と
を含む方法によって解決される。
非常に驚くべきことに従来技術からみて、本発明者らは、Ｃ１－ＩＮＨをＨＩＣの固定相に結合することにより、時間および材料の比較的大きな経済性を可能にすることを見出した。第一に、Ｃ１－ＩＮＨを精製するフロースルーモードまたはネガティブモードで使用される本質的に同じ体積のＨＩＣのカラムよりも、ポジティブモードまたは結合モードで使用されるＨＩＣのカラムは、実質的により多くのＣ１－ＩＮＨ含有出発材料を充填することができる（発明者らは、最大約４倍多いことを発見した）。したがって、必要な固定相材料が少なくなり、カラム材料とスペースの経済性につながり、もちろん、カラムを通過するＣ１－ＩＮＨを含有する水溶液の体積が少なくなる。あるいは、より大きい体積のＣ１－ＩＮＨ含有出発材料を既存のサイズのカラムに充填することで時間を節約する方法となる。第二に、Ｃ１－ＩＮＨに結合すると、カラムからＣ１－ＩＮＨを溶出する前に、この結合したＣ１－ＩＮＨを洗浄することが可能となる。第三に、結合モードまたはポジティブモードのＨＩＣは、高流速を使用することを可能にし、したがって、Ｃ１－ＩＮＨがＨＩＣのカラムの固定相に相互作用するが、結合しないフロースルーモードまたはネガティブモードのＨＩＣ（つまり、遅い流速での比較的長いカラムに沿う分離のために時間が必要である）と比較して、はるかに速い時間でＣ１－ＩＮＨの精製を可能にする。
それに加えて、本発明者らは、硫酸アンモニウムを使用する分別沈殿によって得られる溶液を用いて作業する場合、本発明に従う結合モードまたはポジティブモードのＨＩＣを使用する精製に先行する６０％の硫酸アンモニウムを使用するＣ１－ＩＮＨの沈殿と、沈殿剤の硫酸アンモニウムを含む水溶液でのＣ１－ＩＮＨの取り込みとを含む分別沈殿による初期の材料濃縮は不要になることを見出した。この初期の材料濃縮の工程は、効率的なＣ１－ＩＮＨの精製のためのネガティブモードでの従来技術のＨＩＣの使用に必要である。しかしながら、本発明によれば、前の沈殿工程のわずか４０％の硫酸アンモニウムを含む濾液は、品質を損なうことなく直接使用することができ、このことはまた、さらに多くの時間、材料およびスペースを節約することによってより効率的な製造方法を導き、さらには確立され、十分に理解される方法を導く。
本発明は、「溶解したＣ１－ＩＮＨを含有する溶液」を使用し、Ｃ１－ＩＮＨが沈殿している溶液ではない。言い換えれば、このことは、タンパク質の沈殿の発生を回避するように、第１の条件を選択する必要があることを意味する。
本発明の文脈において、固定相への「結合」は、Ｃ１－ＩＮＨの構造的完全性に影響を与えることなく、好ましくは共有結合または化学吸着によってではなく、むしろ物理吸着によって、固定相により吸着または保持されることを意味すると理解されるべきである。
固定相は、例えば、アガロース、架橋アガロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）のような様々な商品名で販売）、親水性ポリマー、例えば、ポリメタクリレートのようなマトリックス材料であり、それぞれ、以下のような疎水性リガンドで置換されている：
－ 直鎖アルキル、例えば、エチル、ブチル、オクチル、
－ 分岐アルキル、例えば、ｔ－ブチル、
－ アリール、例えば、フェニル、または
－ シクロアルキル、例えば、ヘキシル。
－ 直鎖アルキル、例えば、エチル、ブチル、オクチル、
－ 分岐アルキル、例えば、ｔ－ブチル、
－ アリール、例えば、フェニル、または
－ シクロアルキル、例えば、ヘキシル。
好ましいマトリックス材料は、ブチルまたはフェニルで置換されたものであり、より好ましくは、ブチルまたはフェニルで、最も好ましくはフェニルで置換された架橋アガロースである。マトリックス材料は、ビーズのような様々な形態、またはスティック、膜、ペレットｎのような形態であることが可能である。ＨＩＣを含む様々な種類のクロマトグラフィーで使用するためのビーズ形態の架橋アガロースは、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）の商品名でも知られており、様々な等級および化学物質が利用可能である。特に好ましい種類のマトリックス材料は、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）である。市販のマトリックス材料の例は、Ｃａｐｔｏ（商標）Ｏｃｔｙｌ、Ｃａｐｔｏ（商標）Ｂｕｔｙｌ、Ｃａｐｔｏ（商標）Ｐｈｅｎｙｌ（高置換）、Ｏｃｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、Ｂｕｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、Ｂｕｔｙｌ－Ｓ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（登録商標）（低置換）、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（登録商標）（高置換）、Ｂｕｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、ＨｉＳｃｒｅｅｎ（商標）Ｃａｐｔｏ（商標）Ｂｕｔｙｌ ＨＰ、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（登録商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅによって全て販売）；Ｍａｃｒｏ－Ｐｒｅｐ Ｍｅｔｈｙｌ（登録商標）、Ｍａｃｒｏ－Ｐｒｅｐ ｔ－Ｂｕｔｙｌ（登録商標）（両方はＢＩＯ－ＲＡＤによって全て販売）；またはＴｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）Ｅｔｈｅｒ－６５０Ｓ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）Ｅｔｈｅｒ－６５０Ｍ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）ＰＰＧ－６００Ｍ（登録商標）、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）Ｐｈｅｎｙｌ－６５０Ｓ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）Ｐｈｅｎｙｌ－６５０Ｍ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）Ｐｈｅｎｙｌ－６５０Ｃ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）Ｐｈｅｎｙｌ－６００Ｍ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）Ｂｕｔｙｌ－６５０Ｓ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）Ｂｕｔｙｌ－６５０Ｍ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）Ｂｕｔｙｌ－６５０Ｃ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）Ｂｕｔｙｌ－６００Ｍ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）ＳｕｐｅｒＢｕｔｙｌ－５５０Ｃ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）Ｈｅｘｙｌ－６５０Ｃ、ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）Ｅｔｈｅｒ－５ＰＷ（２０）、ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）Ｅｔｈｅｒ－５ＰＷ（３０）、ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）Ｐｈｅｎｙｌ－５ＰＷ（２０）、ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）Ｐｈｅｎｙｌ－５ＰＷ（３０）（東ソー株式会社によって全て販売）の名前で販売されている疎水性相互作用クロマトグラフィーの媒体である。前述の市販のマトリックス材料の中で、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（低置換）およびＨｉＳｃｒｅｅｎ（商標）Ｃａｐｔｏ（商標）Ｂｕｔｙｌ ＨＰが特に好ましく、前者が後者よりも好ましい。
第１の条件は、好ましくはＣ１－ＩＮＨ含有溶液への１つまたはそれ以上の特定の塩の存在または添加によって、Ｃ１－ＩＮＨの疎水性部分の固定相への結合を促進する条件である。
第２の条件は、固定相からのＣ１－ＩＮＨの溶出を可能にし、その結果として溶出液中に精製されたＣ１－ＩＮＨを回収できる条件である。いくつかの溶出の種類には、例えば、段階的に減少する塩濃度、連続的に減少する塩濃度、ｐＨ勾配を使用する溶出、温度勾配を使用する溶出、またはそれらの組み合わせを含む溶出緩衝液を用いる溶出が存在する。なおさらなる種類の溶出が存在し、水よりも極性の低い溶媒が溶出緩衝液として使用され、例えば、エタノール、ＰＥＧ、２－プロパノールなどを含む水溶液が使用される。また、カルシウムキレート化合物（ＥＤＴＡ、クエン酸塩、マロン酸塩など）の勾配が溶出緩衝液として使用することができる。
好ましくは、第１の条件は、移動相が、Ｃ１－ＩＮＨが固定相に結合する第１の濃度の抗カオトロピック塩を、好ましくは硫酸ナトリウムまたは硫酸アンモニウムを、最も好ましくは硫酸アンモニウムを含むことであること、および第２の条件は、移動相が、Ｃ１－ＩＮＨが溶出する第２の濃度の抗カオトロピック塩を、好ましくは硫酸ナトリウムまたは硫酸アンモニウムを、最も好ましくは硫酸アンモニウムを含むことである。硫酸ナトリウム、特に硫酸アンモニウムは、一般的に使用され、信頼性が高く、特にＨＩＣで十分に確立された抗カオトロピック塩であり、それ故に好ましい。
添加することができる硫酸アンモニウム濃度は、試料のタンパク質濃度に依存する。タンパク質濃度が高いほど、可能な試料の硫酸アンモニウム濃度は低く、つまり、タンパク質の沈殿が発生し始める硫酸アンモニウム濃度はより低くなる。試料の希釈は、より多くの硫酸アンモニウムを加えることを可能にする。抗カオトロピック塩として硫酸アンモニウムを使用する場合の最適なタンパク質濃度は、０．１～３ｍｇ／ｍＬタンパク質の範囲である。硫酸アンモニウム以外の抗カオトロピック塩を使用する場合は、他の濃度範囲を適用することができる。
第１の濃度から第２の濃度への移行は、濃度勾配によって、または段階溶出によって達成することができ、ここで、段階溶出は時間を節約する利点があり、かつ大規模な製造方法で実行することがより容易であるために、段階溶出が好ましい。本明細書で使用される段階溶出は、濃度が徐々に低下する濃度勾配のような連続的な移行の代わりに、第１の濃度から第２の濃度への突然の移行を意味することを意図している。
特定の第１の濃度および第２の濃度は、状況に、つまり、使用される固定相の種類、ｐＨ、塩などに依存する。以下の数値によって制限されることを望まないが（単なる例として与えられる）、第１の濃度は、例えば、１～２Ｍの間のどこかに位置することができ、かつ第１の濃度未満の第２の濃度は、例えば、０．０～１．４Ｍのどこかに位置することができる。
ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅによるＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（低置換）のようなフェニル置換Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ゲルを固定相として使用し、かつ硫酸アンモニウムを、カオトロピック塩として使用する場合、第１の濃度は、好ましくは、約１．１Ｍ～約１．４Ｍの範囲の濃度Ｘを超え（例えば、約１５５～約１８０ｍｇ／ｍｌの硫酸アンモニウムの範囲の濃度Ｘを超える）、好ましくは、約１．２Ｍ～約１．３Ｍの範囲の濃度Ｘを超え（例えば、約１６０～約１７４ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度Ｘを超える）、かつ第２の濃度は、濃度Ｘ未満である。
ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅによるＨｉＳｃｒｅｅｎ（商標）Ｃａｐｔｏ（商標）Ｂｕｔｙｌ ＨＰのようなブチル置換Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ゲルを固定相として使用し、かつ硫酸アンモニウムをカオトロピック塩として使用する場合、第１の濃度は、好ましくは、約０．９Ｍ～約１．０Ｍの範囲の濃度Ｘ（例えば、約１２４～約１３１ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度Ｘ）を超え、かつ好ましい硫酸アンモニウムの第２の濃度は、濃度Ｘ未満である。
ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅによって販売されるＰｈｅｎｙｌ－ＨＰ（登録商標）もしくはＣａｐｔｏ Ｐｈｅｎｙｌ ＩｍｐＲｅｓ（登録商標）、または東ソー株式会社によって販売されるＰｈｅｎｙｌ－６５０Ｍ（登録商標）もしくはＰｈｅｎｙｌ－６００Ｍ（登録商標）を固定相として使用し、かつ硫酸アンモニウムをカオトロピック塩として使用する場合、第１の濃度は、好ましくは、約０．９Ｍ～約１．０Ｍの範囲の濃度Ｘ（例えば、約１２４～約１３１ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度Ｘ）を超え、かつ好ましい硫酸アンモニウムの第２の濃度は、濃度Ｘ未満である。
異なる硫酸アンモニウム濃度を第１および第２の条件として使用する場合、好ましくは、第１の濃度は、約１８１ｍｇ／ｍｌ（１．３７Ｍ）であり、および／または第２の濃度は、固定相からＣ１－ＩＮＨを溶出するのに十分低い濃度である。
本発明は、Ｃ１－ＩＮＨを含有する異なる出発材料を用いて実行することができるが、出発材料として使用されるＣ１－ＩＮＨ濃縮物は、沈殿剤を用いた分別沈殿を含む方法によって得られることが好ましい。
出発材料として使用されるＣ１－ＩＮＨ濃縮物は、沈殿剤を用いた分別沈殿を含む方法によって得られる場合、該分別沈殿は、（ｉ）Ｃ１－ＩＮＨの沈殿と、Ｃ１－ＩＮＨの沈殿に必要な濃度よりも低い濃度の沈殿剤を含有する溶液に沈殿したＣ１－ＩＮＨを取り込むこととを含むか、または（ｉｉ）Ｃ１－ＩＮＨの沈殿に必要な濃度よりも低い濃度の分別沈殿で使用される沈殿剤を含有する上清にＣ１－ＩＮＨを含有する出発材料を提供することによって、Ｃ１－ＩＮＨの沈殿を含まないか、のいずれかが可能であり、ここでは、代替（ｉｉ）が好ましい。
本発明に従う方法は、好ましくは、ｐＨが６～９の範囲、好ましくは６．８～８．５の範囲、より好ましくは７～７．５の範囲、さらにより好ましくはｐＨが約７．２で実行される。
本発明に従う本発明の方法はまた、原則として、異なる方式で産生されるＣ１－ＩＮＨを精製するために使用することも可能であるが、該方法は、組換えＣ１－ＩＮＨ、トランスジェニックＣ１－ＩＮＨ、または血漿、好ましくはヒト血漿由来Ｃ１－ＩＮＨを用いて実行することが好ましい。
本発明に従う方法は、カラムまたはバッチ形式のいずれかで実行することができる。
以下において、本発明は、図および実施例によってより詳細に記載され、図は以下を示す：
本発明の文脈において、以下の定義が適用される：
本発明の特許請求の範囲および明細書において、「Ｃ１－ＩＮＨ」および「Ｃ１－ＩＮＨ濃縮物」とは、タンパク質Ｃ１エステラーゼ阻害剤を含有する濃縮物およびタンパク質Ｃ１エステラーゼ阻害剤を含有する液体の濃縮物を示すために共に使用される。背景技術および／または先行技術文献を参照する場合、「Ｃ１－ＩＮＨ」はまた、例えば、Ｃ１－ＩＮＨ欠損症を議論する文脈において、そのタンパク質自体も意味する。
本発明の特許請求の範囲および明細書において、「Ｃ１－ＩＮＨ」および「Ｃ１－ＩＮＨ濃縮物」とは、タンパク質Ｃ１エステラーゼ阻害剤を含有する濃縮物およびタンパク質Ｃ１エステラーゼ阻害剤を含有する液体の濃縮物を示すために共に使用される。背景技術および／または先行技術文献を参照する場合、「Ｃ１－ＩＮＨ」はまた、例えば、Ｃ１－ＩＮＨ欠損症を議論する文脈において、そのタンパク質自体も意味する。
本出願／特許を通して：
－ 「ＨＩＣ」とは、疎水性相互作用クロマトグラフィーを指す；
－ 「ネガティブモード」もしくは「フロースルーモード」、または「フロースルー」ＨＩＣとは、Ｃ１－ＩＮＨがＨＩＣのカラムの固定相に結合しない条件下でＨＩＣを実行する方式を指す；
－ 「結合モード」、「結合および溶出」または「ポジティブモード」とは、最初に、Ｃ１－ＩＮＨがＨＩＣのカラムの固定相に結合する条件下で実行され、次いでＣ１－ＩＮＨがＨＩＣのカラムから溶出される条件下で実行されるＨＩＣを指す；
－ 「固定相への結合」とは、Ｃ１－ＩＮＨの構造的完全性に影響を与えることなく、好ましくは共有結合または化学吸着によってではなく、むしろ物理吸着によって、固定相により吸着または保持されることを意味することを意図している；
－ 「ＷＦＩ」とは、「注射用水」を意味する；
－ 「一倍充填」とは、通常充填を指し、本文脈では、より特定すると、フロースルーモードで実行された場合にＨＩＣによるＣ１－ＩＮＨの十分な精製が起こる本質的な最大充填を指し、このような通常の「一倍充填」は、状況に、例えば、使用される出発材料、使用されるクロマトグラフィーマトリックスなどに非常に依存する可能性があり、ここでは、クロマトグラフィーマトリックスとしてフェニル置換Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）を使用する場合、かつＣ１－ＩＮＨ濃縮物を出発材料として使用する場合（従来技術である欧州特許第０１０１９３５号に記載されているようにＣ１－ＩＮＨの分別沈殿および再溶解によって生成される）、そのような通常の「一倍充填」は、約６～９、好ましくは、約７～８、最も好ましくは、約７．５ｍｇタンパク質／ｍｌクロマトグラフィーゲルの数値を有する；
－ 「二倍充填」とは、一倍充填の二倍の量を指し、本文脈では、より特定すると、フロースルーモードで実行した場合にＨＩＣによるＣ１－ＩＮＨの精製がもはや十分でない充填を指す；
－ 「濃度勾配」とは、溶液中の溶解物質濃度が高濃度から低濃度に徐々に変化することを指す、
－ 「段階溶出」とは、濃度が徐々に低下する濃度勾配のような連続的な移行の代わりに、第１の濃度から第２の濃度への突然の移行を意味する；
－ 「％」とは、特に明記されない限り、「重量％」を意味する；
－ 「沈殿剤」とは、タンパク質の沈殿を引き起こす薬剤であり、沈殿剤は、抗カオトロピック剤または塩としても機能することができる；
－ 本明細書で使用される「抗カオトロピック剤」または「抗カオトロピック塩」は、Ｃ１－ＩＮＨが固定相に結合することができるように水溶液中でＣ１－ＩＮＨを疎水性にすることができる１つまたはそれ以上の塩を指すことを意図している；
－ 「溶出画分」とは、溶出画分に含まれる特定の分析対象物が、以前に固定相に結合または保持されていたか（本明細書に記載のポジティブモードのように）、またはそうでないか（本明細書に記載のネガティブモードのように）に関係なく、クロマトグラフィーカラムから出現する移動相の流れの画分を指す。
－ 「ＨＩＣ」とは、疎水性相互作用クロマトグラフィーを指す；
－ 「ネガティブモード」もしくは「フロースルーモード」、または「フロースルー」ＨＩＣとは、Ｃ１－ＩＮＨがＨＩＣのカラムの固定相に結合しない条件下でＨＩＣを実行する方式を指す；
－ 「結合モード」、「結合および溶出」または「ポジティブモード」とは、最初に、Ｃ１－ＩＮＨがＨＩＣのカラムの固定相に結合する条件下で実行され、次いでＣ１－ＩＮＨがＨＩＣのカラムから溶出される条件下で実行されるＨＩＣを指す；
－ 「固定相への結合」とは、Ｃ１－ＩＮＨの構造的完全性に影響を与えることなく、好ましくは共有結合または化学吸着によってではなく、むしろ物理吸着によって、固定相により吸着または保持されることを意味することを意図している；
－ 「ＷＦＩ」とは、「注射用水」を意味する；
－ 「一倍充填」とは、通常充填を指し、本文脈では、より特定すると、フロースルーモードで実行された場合にＨＩＣによるＣ１－ＩＮＨの十分な精製が起こる本質的な最大充填を指し、このような通常の「一倍充填」は、状況に、例えば、使用される出発材料、使用されるクロマトグラフィーマトリックスなどに非常に依存する可能性があり、ここでは、クロマトグラフィーマトリックスとしてフェニル置換Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）を使用する場合、かつＣ１－ＩＮＨ濃縮物を出発材料として使用する場合（従来技術である欧州特許第０１０１９３５号に記載されているようにＣ１－ＩＮＨの分別沈殿および再溶解によって生成される）、そのような通常の「一倍充填」は、約６～９、好ましくは、約７～８、最も好ましくは、約７．５ｍｇタンパク質／ｍｌクロマトグラフィーゲルの数値を有する；
－ 「二倍充填」とは、一倍充填の二倍の量を指し、本文脈では、より特定すると、フロースルーモードで実行した場合にＨＩＣによるＣ１－ＩＮＨの精製がもはや十分でない充填を指す；
－ 「濃度勾配」とは、溶液中の溶解物質濃度が高濃度から低濃度に徐々に変化することを指す、
－ 「段階溶出」とは、濃度が徐々に低下する濃度勾配のような連続的な移行の代わりに、第１の濃度から第２の濃度への突然の移行を意味する；
－ 「％」とは、特に明記されない限り、「重量％」を意味する；
－ 「沈殿剤」とは、タンパク質の沈殿を引き起こす薬剤であり、沈殿剤は、抗カオトロピック剤または塩としても機能することができる；
－ 本明細書で使用される「抗カオトロピック剤」または「抗カオトロピック塩」は、Ｃ１－ＩＮＨが固定相に結合することができるように水溶液中でＣ１－ＩＮＨを疎水性にすることができる１つまたはそれ以上の塩を指すことを意図している；
－ 「溶出画分」とは、溶出画分に含まれる特定の分析対象物が、以前に固定相に結合または保持されていたか（本明細書に記載のポジティブモードのように）、またはそうでないか（本明細書に記載のネガティブモードのように）に関係なく、クロマトグラフィーカラムから出現する移動相の流れの画分を指す。
以下では、図を参照して本発明についてより詳細に説明する。
図１および２は、それぞれ、従来技術に従う分別沈殿によって得られたＣ１－ＩＮＨ濃縮物を使用する、つまり、沈殿され、次いで出発材料として再溶解したＣ１－ＩＮＨを使用するネガティブモードのＨＩＣのクロマトグラムである。図１は、従来技術で使用されている「一倍充填」のクロマトグラムを、図２は、比較のための「二倍充填」のクロマトグラムを示す。クロマトグラムの第１のピーク（それぞれ２００ｍｌの溶出液にて開始）は、それぞれＣ１－ＩＮＨを含有するフロースルー画分を表す。図１では、第１のピークは本質的に他のピークと重なっていないかなり鋭い単一ピークであることがわかるが、図２では、第１のピークは実際にはいくつかの重なったピークからなることがわかる。また、次のピークと端にて重なっている第１の重なりのピークは、図１に示されている一倍充填の実験の単一の鋭いピークよりも広範囲へ続くはるかに大きいピークである。これは、フロースルーモードまたはネガティブモードでＨＩＣを使用してＣ１－ＩＮＨを精製するために使用される「一倍充填」は、純度に関する欠点なしに二倍にできないことを示している。したがって、図１および２は、本発明の文脈において「一倍充填」および「二倍充填」により理解されるべきことを表している：一倍充填は、Ｃ１－ＩＮＨ含有出発材料の充填であり、これはクロマトグラムにおいて他のピークと本質的に重なっていないＣ１－ＩＮＨに起因する単一ピークを本質的にもたらし、よって従来技術に従って、つまり、フロースルーモードまたはネガティブモードで実行されるＨＩＣにおいて、本質的に純粋なＣ１－ＩＮＨ溶出液を得ることを可能にし、ここで、他の点では本質的に同じ条件下での同じ出発材料の二倍充填は、クロマトグラムにおける他のピークと本質的に重なっていないＣ１－ＩＮＨに起因する単一ピークを本質的にもたらさず、つまり、一倍充填と比較して、所望のＣ１－ＩＮＨ溶出液の純度に関して、二倍充填は本質的な品質を損なうことなしにスケールアップを可能にしない。
図３は、ＨＩＣ実験からのＨＩＣ溶出画分を含有する様々なＣ１－ＩＮＨの試料のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（トリス－グリシンゲル、１．５ｍｍ厚、勾配８～１６％、最大電圧１５０Ｖ、実行時間：９０分）であり、従来技術である欧州特許第０１０１９３５号に記載されているようなＣ１－ＩＮＨの分別沈殿および再溶解によって生成されるＣ１－ＩＮＨ濃縮物を出発材料として全て使用している。より良好な比較を可能にするために、ゲルに充填された試料はほぼ同じ量のタンパク質を含む。
図３に示されるゲルでは、レーン３は出発材料として使用されるＣ１－ＩＮＨ濃縮物である。出発材料が他の高分子量および低分子量のタンパク質を含有することがわかる。レーン４は、Ｂｅｒｉｎｅｒｔ（登録商標）の製造方法からの、つまり、従来技術に従う工業的規模の方法からのＨＩＣの溶出画分を含有するＣ１－ＩＮＨである。レーン４で最も強度が高いバンドはＣ１－ＩＮＨであり、重量はおよそ１０５ｋＤである。明らかに、この画分では高分子量の成分を検出することができない。
レーン５および７は、フロースルーのＨＩＣ実験の溶出画分を含有するＣ１－ＩＮＨである。レーン５の試料は、一倍充填の実験から取得され、レーン７の試料は、二倍充填の実験から取得される。高分子量の不純物は、出発材料（レーン３）、Ｂｅｒｉｎｅｒｔ（登録商標）製品試料（レーン４）、およびそれぞれ一倍充填および二倍充填のフロースルーの試料（レーン５、レーン７）で検出可能である。レーン３、４、５、７の高分子量の不純物に起因するバンドは、図３の四角により強調表示されている。高分子量の不純物に起因するバンドは、レーン４および５で比較的弱く、レーン３および７でより顕著である。レーン７から明らかなように、二倍充填の溶出画分は、一倍充填の溶出画分（レーン５を参照）およびＢｅｒｉｎｅｒｔ（登録商標）の製造方法からの溶出画分（レーン４を参照）で検出可能なものよりも多くの高分子量の不純物を含有する。この発見は、異なる血漿製造物からの出発材料でのなおさらなる実験を実行することによって検証され、その結果は、以下でさらに議論される図４に示される。これは、従来技術に従うフロースルーモードまたはネガティブモードでのＨＩＣの実行が、品質を損なうことなくＣ１－ＩＮＨ濃縮物の精製を可能にするカラムの最大充填に関して制限されていることを明確に示している。これらの実験で使用された一倍充填は、７．５ｍｇタンパク質／ｍｌクロマトグラフィーゲルの充填に相当する。
図３のレーン６および８は、本発明に従うＨＩＣ実験の溶出画分を含有するＣ１－ＩＮＨであり、つまり、ＨＩＣを結合および溶出モード、またはポジティブモードで実行した。図３のレーン６の溶出画分は、一倍充填の実験からのものであり、図３のレーン８の溶出画分は、二倍充填の実験からのものである（１５ｍｇタンパク質／ｍｌクロマトグラフィーゲルを使用）。該ゲルは、二倍充填がカラムに適用された場合にも、Ｃ１－ＩＮＨの重量を超える、つまり、１０５ｋＤを超える不純物が、それぞれの溶出画分で検出できなかったことを示している（図３のレーン８を参照）。
したがって、図３のレーン６は、本発明に従うＨＩＣが、Ｃ１－ＩＮＨ濃縮物中の高分子量の不純物を除去するための実行可能な代替的な解決法を提供し、従来技術よりも高分子量の不純物が少ない生成物を生じることを実証している。それとは関係なしに、レーン８は、本発明に従うＨＩＣが、本質的に従来技術よりも品質を損なうことなく、Ｃ１－ＩＮＨ濃縮物の精製に到達することを可能にするカラムの最大充填に関して制限が少ないことを実証している。言い換えると：本発明者らは、Ｃ１－ＩＮＨ濃縮物の精製に到達することを可能にするカラムの最大充填が、従来技術に従うネガティブモードまたはフロースルーモードのＨＩＣを使用する場合に他に避けられないような精製に関する欠点なしに、本発明に従うポジティブモードまたは結合モードを使用することによって少なくとも２倍にすることが可能であることを示すことができた。
図４は、従来技術に従う、つまり、フロースルーモードまたはネガティブモードでのＨＩＣ実験からのＨＩＣ溶出画分を含有する様々なＣ１－ＩＮＨの試料でのＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（トリス－グリシンゲル、１．５ｍｍ厚、勾配８～１６％、最大電圧１５０Ｖ、実行時間：９０分）であり、従来技術である欧州特許第０１０１９３５号に記載されているように、Ｃ１－ＩＮＨの分別沈殿および再溶解によって生成されるＣ１－ＩＮＨ濃縮物を出発材料として使用している。より良好な比較を可能にするために、ゲルに充填された試料はほぼ同じ量のタンパク質を含む。図４のゲルでは、レーン１は、マーカーであり、レーン６および９は、それぞれ異なる装入量のＢｅｒｉｎｅｒｔ（登録商標）の最終製品試料であり、レーン１０は、典型的な出発材料の試料である。レーン２、４、および７は、一倍充填で実行されたＨＩＣの溶出画分を示し、レーン３、５、および８は、二倍充填、つまりＣ１－ＩＮＨ含有出発材料の２倍の量で実行されたＨＩＣの溶出画分を示す。高分子量の不純物は、最終製品試料（図４のレーン６、９を参照）を含む全ての試料で検出可能であり、ここで、後者では不純物の検出が困難である。一倍充填試料および二倍充填試料のバンドの強度を比較すると、二倍充填試料には一倍充填試料よりも高分子量の不純物が多く含有されていることが明らかである。図４のゲルは、言い換えれば、Ｃ１－ＩＮＨ濃縮物の精製を可能にする最大充填に関して、従来技術に従う方法の制限に関するさらなる証拠を提供している。
本発明者らは、本発明を使用することにより本質的に品質を損なうことなく、Ｃ１－ＩＮＨ濃縮物の精製を可能にするカラムの最大充填は、クロマトグラフィーマトリックスがＣ１－ＩＮＨを解放し始めるまで、該マトリックスのＣ１－ＩＮＨ含有出発材料の充填容量によって、最終的に制限されると考える。Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）の場合、４０％の硫酸アンモニウムを含有する沈殿画分の上清または濾液からなるＣ１－ＩＮＨ含有出発材料を使用する場合のカラムの充填容量は、Ｃ１－ＩＮＨ濃縮物の精製に到達することができるようにフロースルー（従来技術に従う）で適用された再溶解した６０％の硫酸アンモニウムの沈殿物からなるＣ１－ＩＮＨ含有出発材料の一倍充填の約４倍またはさらに４．４倍であることがわかった。したがって、生産規模では、原則として、該充填が、従来技術と比較して２倍になるだけでなく、現在使用されている充填の２倍を超えることさえ可能である。これは、カラム体積および／または固定相材料に関する重要な経済性が、本発明のおかげで実際に実現され、かつこれは品質を損なうことがないことを意味する。
本発明者らはまた、本発明に従う方法は、フロースルーモードまたはネガティブモードでＨＩＣを使用する場合と比較して、はるかに高い流速で実行することができ、品質を損なうことなく所望の濃縮物の精製に到達することができることを見出した。この経済性はかなり重要である：Ｂｅｒｉｎｅｒｔ（登録商標）の方法で現在使用されている規模での従来のＨＩＣ実行は通常４２．６時間かかるが、本発明を使用する最適化された実行は、一倍充填を使用する場合わずか６時間で実行することができ、ＨＩＣの方法の工程を削減して、したがって、全体のプロセス時間は３６．６時間である。二倍充填を使用する場合、実行は６．６時間で実行することができ、二倍充填の使用が可能であると、全体のプロセス時間が７８．６時間程度に削減することが可能である。
図５は、ＨＩＣ実験からの溶出画分を含有するＣ１－ＩＮＨのＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（トリス－グリシンゲル、１．５ｍｍ厚、勾配８～１６％、最大電圧１５０Ｖ、最大電流３５ｍＡ、実行時間：９０分）であり、出発材料を、Ｃ１－ＩＮＨを沈殿させるのに必要な濃度よりも低い沈殿剤濃度での分別沈殿（つまり、従来技術のようなＣ１－ＩＮＨの沈殿なし）、すなわち、４０％の硫酸アンモニウムを含有する沈殿画分の上清または濾液によって生成した。最も強いバンドは、再びＣ１－ＩＮＨであり、ここでまた、高分子量の成分は検出することはできなかった。４０％の硫酸アンモニウムの沈殿物の上清または濾液は、従来技術のように６０％の硫酸アンモニウムの沈殿物から生成される溶液よりも多くの不純物を含むためこれは注目に値する。これはまた、本発明に従う方法が、分別沈殿においてＣ１－ＩＮＨを沈殿させて、ＨＩＣ精製を実行する前にそれを再溶解することなしに、従来技術の方法を実行することを可能にする追加の利点を有することを意味する。
したがって、発明者らは、本請求の方法が、ＨＩＣに先行する分別沈殿でのＣ１－ＩＮＨの沈殿およびＣ１－ＩＮＨの再溶解を省くことにより、プロセス時間をさらに削減することを可能にすることも見出した。これにより、それ故、他では必要とされる付加的な９．２時間を節約することができる。したがって、本発明に従う方法は、さらに多くのプロセス時間を節約することができ、すなわち、一倍充填を実行する場合４５．８時間、二倍充填で方法を実行する場合、なお最大９７時間である。
上記のように、本発明者らは、本発明を使用することによって本質的に品質を損なうことなくＣ１－ＩＮＨ濃縮物の精製を可能にするカラムの最大充填は、カラムのＣ１－ＩＮＨ含有出発材料の結合能力によってのみ制限されると考え、したがって、該充填は、従来技術と比較して二倍になるだけでなく、現在使用されている充填の二倍を超える可能性さえある。これは、上記で論じたものよりも、カラム体積および／または固定相材料および／または時間に関するなおさらに重要な経済性が、本発明のおかげで、原則として品質を損なうことなく実現することができ、一方で生産規模でさえ同時に純度の改善を達成することが可能であることを意味する。
図６は、試料の導電率を沈殿剤濃度と相関させる標準曲線を示す。抗カオトロピック塩が沈殿剤として使用され、ほとんどが硫酸ナトリウムまたは硫酸アンモニウムであり、ここで、後者が好ましい。緩衝液中の塩濃度は、図６に示すように、その導電率と相関させることができ、以下の実験のセクションでより詳細に説明される。これは、沈殿剤濃度、またはむしろ抗カオトロピック塩濃度についての対応する試料の適切な分析を可能にする。
図７～１１は、従来技術および本発明に従うＨＩＣから得られたクロマトグラムであり、それぞれ横軸はカラムを出る溶離液の体積をｍｌで示し、左の縦軸は導電率をｍＳ／ｃｍで示し、右の縦軸は吸光度をｍＡＵで示す。導電率は、上記で説明したように決定される相関係数によって、溶離液の硫酸アンモニウム濃度に直接関連付けることができる。
図７は、従来技術に従うＨＩＣから得られたクロマトグラムである。出発材料は、欧州特許第０１０１９３５号に記載されているように、分別沈殿および沈殿物の溶解によって生成される血漿由来Ｃ１－ＩＮＨ含有濃縮物である。硫酸アンモニウム濃度はしばらくの間約１０６ｍｇ／ｍｌで一定のままである。この濃度は、固定相がＣ１－ＩＮＨを保持するには低すぎる。Ｃ１－ＩＮＨ含有のピークは、約５０ｍｌの溶離液の体積にてみられる。初期の硫酸アンモニウム濃度でカラムに結合したＣ１－ＩＮＨ以外のタンパク質の段階溶出は、約５００ｍｌの溶離液の体積でみることができる。これは、硫酸アンモニウム濃度が突然低下した場合に起こる。
図８は、濃度勾配による溶出を伴う本発明に従うＨＩＣから得られたクロマトグラムである。出発材料は、欧州特許第０１０１９３５号に記載されているように、分別沈殿および沈殿物の溶解によって生成される血漿由来Ｃ１－ＩＮＨ含有濃縮物である。溶離液の硫酸アンモニウム濃度が約１６０ｍｇ／ｍｌをわずかに下回る濃度に下げられるまでは、初期の硫酸アンモニウム濃度は固定相にＣ１－ＩＮＨを保持するのに十分に高い濃度である。Ｃ１－ＩＮＨに起因する対応するピークは、約２７０ｍｌの溶離液の体積でみられる。
図９は、濃度勾配による溶出を用いた本発明に従うＨＩＣから得られたクロマトグラムである。出発材料は、４０％の硫酸アンモニウムを用いた分別沈殿の上清または濾液から得られた血漿由来Ｃ１－ＩＮＨ含有濃縮物である。溶離液の硫酸アンモニウム濃度が約１６０ｍｇ／ｍｌをわずかに下回る濃度に下げられるまでは、溶液の初期の硫酸アンモニウム濃度は、固定相にＣ１－ＩＮＨを保持するのに十分に高い濃度である。Ｃ１－ＩＮＨに起因する対応するピークは、約２７０ｍｌの溶離液の体積でみられる。
図１０は、濃度勾配の代わりに段階溶出を使用して、本発明に従うＨＩＣから得られたクロマトグラムである。出発材料は、４０％の硫酸アンモニウムを用いた分別沈殿の濾液から得られた血漿由来Ｃ１－ＩＮＨ含有濃縮物である。溶離液の硫酸アンモニウム濃度が突然下げられるまでは、溶液の初期の硫酸アンモニウム濃度は、固定相にＣ１－ＩＮＨを保持するのに十分に高い濃度である。
図１１は、濃度勾配による溶出を用いた本発明に従うＨＩＣから得られたクロマトグラムである。出発材料は、従来技術に従うＢｅｒｉｎｅｒｔ（登録商標）濃縮物である。溶離液の硫酸アンモニウム濃度が約１６２ｍｇ／ｍｌをわずかに下回る濃度に下げられるまでは、溶液の初期の硫酸アンモニウム濃度は、固定相にＣ１－ＩＮＨを保持するのに十分に高い濃度である。Ｃ１－ＩＮＨに起因する対応するピークは、約６７０ｍｌの溶離液の体積でみられる。
本発明者らは、前述の従来技術に記載されたＢｅｒｉｎｅｒｔ（登録商標）の製造方法の改善に関心を持っていたが、ポジティブモードのＨＩＣが他のＣ１－ＩＮＨの精製方法にも有益であることは明らかである。言い換えれば、本発明は、欧州特許第０１０１９３５号に記載された方法、もしくはＢｅｒｉｎｅｒｔ（登録商標）の製造方法に使用されることだけでなく、あらゆる起源のＣ１－ＩＮＨ濃縮物（例えば、血漿から得られた濃縮物、またはトランスジェニック動物から得られた組換えＣ１－ＩＮＨを含有するＣ１－ＩＮＨ濃縮物、またはさらに異なる手段で得られたＣ１－ＩＮＨ濃縮物）を精製するためのフロースルーモードもしくはさらには未だ設計されていない将来の方法においてＨＩＣの工程を前に含む、異なる出発材料を使用するＣ１－ＩＮＨ濃縮物を精製することを目的とする他の方法に使用されることに明らかに制限されない。
材料および方法
Ｉ．カラムＡ
使用される材料：
－ それぞれ半精製された画分の形態における血漿由来Ｃ１－ＩＮＨ試料；
－ ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅによるＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（低置換）（２０％のエタノールに保存された市販の芳香族疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）樹脂）
－ 硫酸アンモニウム緩衝液：
・ １８１ｍｇ／ｍＬ（１７５～２９２ｍｇ／ｍＬ）の硫酸アンモニウム、
・ ２５ｍＭのトリス、
・ ｐＨ７．２±０．２
－ トリス緩衝液：
・ ２５ｍＭのトリス
・ ｐＨ７．２±０．２
－ クロマトグラフィーカラム、直径：１．６ｃｍ（Ａｋｔａ Ａｖａｎｔ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）
－ ＵＶ分光光度計（ｕｎｉｃｏｒｎ）；
－ 導電率計
Ｉ．カラムＡ
使用される材料：
－ それぞれ半精製された画分の形態における血漿由来Ｃ１－ＩＮＨ試料；
－ ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅによるＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（低置換）（２０％のエタノールに保存された市販の芳香族疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）樹脂）
－ 硫酸アンモニウム緩衝液：
・ １８１ｍｇ／ｍＬ（１７５～２９２ｍｇ／ｍＬ）の硫酸アンモニウム、
・ ２５ｍＭのトリス、
・ ｐＨ７．２±０．２
－ トリス緩衝液：
・ ２５ｍＭのトリス
・ ｐＨ７．２±０．２
－ クロマトグラフィーカラム、直径：１．６ｃｍ（Ａｋｔａ Ａｖａｎｔ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）
－ ＵＶ分光光度計（ｕｎｉｃｏｒｎ）；
－ 導電率計
１．ＨＩＣのカラムＡの充填：２０％のエタノールに保存されたＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ゲルを、注射用水（ＷＦＩ）で３回洗浄した。ＷＦＩで洗浄した７０％のＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ゲルのスラリーを製造し、クロマトグラフィーカラムに配置した。ＷＦＩおよび１５０ｃｍ／ｈの線流速を使用して、該ゲルをゲルベッドの高さが約１８ｃｍ（２０±５ｃｍ）に詰めた。次いで、２．５％のカラム体積の５％のアセトン（ｖ／ｖ）を注入してカラムを試験した。カラム試験は、非対称性が０．８～１．８であり、かつ理論段数が２８００以上であるという条件で合格する。
２．試料製造：精製される血漿Ｃ１－ＩＮＨ試料を、硫酸アンモニウム濃度１８１ｍｇ／ｍＬ（１７５～２９２ｍｇ／ｍＬ）、およびトリス含有量２５ｍＭに入れた。添加することができる硫酸アンモニウム濃度は、試料のタンパク質濃度に依存する。タンパク質濃度が高いほど、試料の可能な硫酸アンモニウム濃度は低くなり、つまり、タンパク質の沈殿が発生し始める硫酸アンモニウム濃度は低くなる。試料の希釈は、より多くの硫酸アンモニウムを添加することを可能にする。最適なタンパク質濃度は、０．１～３ｍｇ／ｍＬタンパク質の範囲である。試料は、ｐＨ調整のために２５ｍＭのトリスを含む。硫酸アンモニウムおよびトリスの添加後に、試料を、１ＭのＮａＯＨまたは１ＭのＨＣｌを添加することによって、ｐＨ７．２±０．２に調整し、０．４５μｍのフィルターで濾過した。タンパク質濃度の測定後に、カラムの充填（カラムＡの場合）を、最大３０ｍｇタンパク質／ｍＬゲルの充填に達するように計算した。タンパク質濃度を、２８０ｎｍでのそれぞれの試料の光学濃度（ＯＤ）の測定に基づく公知の方法で決定した。
３．カラムの平衡化：カラムを、３カラム体積以上の硫酸アンモニウム緩衝液を使用して、１００ｃｍ／ｈの線流速で平衡化した。
４．カラムへの試料の充填：試料を、１００ｃｍ／ｈの線流速でカラムに充填した。次いで、カラムを３カラム体積以上の硫酸アンモニウム緩衝液で、同じ流速にて洗浄した。
５．Ｃ１阻害剤の溶出：Ｃ１－ＩＮＨを、トリス緩衝液への硫酸アンモニウム緩衝液の勾配により、２０カラム体積にわたって１００ｃｍ／ｈの線流速で溶出した。完全な溶出液を分画し、次いで、非還元の単一画分をトリス－グリシンゲルへ充填して分析した。バンドパターンを使用することで、第１のピークがＣ１－ＩＮＨであることを示すことが可能であった。
６．カラムの再生：カラムの再生を、３カラム体積のＷＦＩ、４カラム体積の０．１ＭのＮａＯＨ、３カラム体積のＷＦＩを順次使用して１００ｃｍ／ｈの線流速にて実行した。
ＩＩ．カラムＢ
使用される材料：
－ それぞれ半精製された画分の形態における血漿由来Ｃ１－ＩＮＨ試料；
－ ＨｉＳｃｒｅｅｎ（商標）Ｃａｐｔｏ（商標）Ｂｕｔｙｌ ＨＰ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、コード２８－９７８２－４２；直径：０．７７ｃｍ；ゲルベッドの高さ：１０ｃｍ；ゲル体積：４．７ｍｌ
－ 硫酸アンモニウム緩衝液：
・ １８１ｍｇ／ｍＬ（１３１～２９２ｍｇ／ｍＬ）の硫酸アンモニウム、
・ ２５ｍＭのトリス、
・ ｐＨ７．２±０．２
－ トリス緩衝液：
・ ２５ｍＭのトリス
・ ｐＨ７．２±０．２
－ Ａｋｔａ Ａｖａｎｔ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｕｎｉｃｏｒｎ、ＵＶ分光光度計、導電率計
使用される材料：
－ それぞれ半精製された画分の形態における血漿由来Ｃ１－ＩＮＨ試料；
－ ＨｉＳｃｒｅｅｎ（商標）Ｃａｐｔｏ（商標）Ｂｕｔｙｌ ＨＰ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、コード２８－９７８２－４２；直径：０．７７ｃｍ；ゲルベッドの高さ：１０ｃｍ；ゲル体積：４．７ｍｌ
－ 硫酸アンモニウム緩衝液：
・ １８１ｍｇ／ｍＬ（１３１～２９２ｍｇ／ｍＬ）の硫酸アンモニウム、
・ ２５ｍＭのトリス、
・ ｐＨ７．２±０．２
－ トリス緩衝液：
・ ２５ｍＭのトリス
・ ｐＨ７．２±０．２
－ Ａｋｔａ Ａｖａｎｔ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｕｎｉｃｏｒｎ、ＵＶ分光光度計、導電率計
１．試料製造：精製される血漿Ｃ１－ＩＮＨ試料を、硫酸アンモニウム濃度１８１ｍｇ／ｍＬ（１３１～２９２ｍｇ／ｍＬ）、およびトリス含有量２５ｍＭに入れた。添加することができる硫酸アンモニウム濃度は、試料のタンパク質濃度に依存する。タンパク質濃度が高いほど、試料の可能な硫酸アンモニウム濃度は低くなり、つまり、タンパク質の沈殿が発生し始める硫酸アンモニウム濃度は低くなる。試料の希釈は、より多くの硫酸アンモニウムを添加することを可能にする。最適なタンパク質濃度は、０．１～３ｍｇ／ｍＬタンパク質の範囲である。試料は、ｐＨ調整のために２５ｍＭのトリスを含む。硫酸アンモニウムおよびトリスの添加後に、試料を、１ＭのＮａＯＨまたは１ＭのＨＣｌを添加することによって、ｐＨ７．２±０．２に調整し、０．４５μｍのフィルターで濾過した。タンパク質濃度の測定後に、カラムの充填（カラムＢの場合）を、７．５ｍｇタンパク質／ｍＬゲルの充填に達するように計算した、つまり、カラムＢを、７．５ｍｇタンパク質／ｍｌクロマトグラフィーゲルの充填でのみ試験した。タンパク質濃度を、２８０ｎｍでのそれぞれの試料の光学濃度（ＯＤ）の測定に基づく公知の方法で決定した。
２．カラムＢの平衡化、カラムＢへの試料の充填、Ｃ１－ＩＮＨの溶出、およびカラムの再生を、カラムＡについて上述したように同じ方式でそれぞれ実行した。
計算方法：
１．Ｃ１－ＩＮＨの溶出のための硫酸アンモニウム濃度の決定：導電率、２８０ｎｍおよび６１０ｎｍでのＵＶシグナルを、クロマトグラフィーの実行を通して記録した。これにより、発明者らは、クロマトグラムのＣ１－ＩＮＨのピークに導電率を割り当てることが可能であった。緩衝液希釈系列を製造し、対応する導電率を測定することにより、検量線を作成した。測定値を以下の表１に示し、ＡＳは硫酸アンモニウムを表す。
１．Ｃ１－ＩＮＨの溶出のための硫酸アンモニウム濃度の決定：導電率、２８０ｎｍおよび６１０ｎｍでのＵＶシグナルを、クロマトグラフィーの実行を通して記録した。これにより、発明者らは、クロマトグラムのＣ１－ＩＮＨのピークに導電率を割り当てることが可能であった。緩衝液希釈系列を製造し、対応する導電率を測定することにより、検量線を作成した。測定値を以下の表１に示し、ＡＳは硫酸アンモニウムを表す。
全てのＣ１－ＩＮＨ溶出が、カラムＡのＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）マトリックスを使用する場合に１６０ｍｇ／ｍｌ～１７４ｍｇ／ｍｌの間のＡＳ濃度で発生したこと、カラムＢのＨｉＳｃｒｅｅｎ（商標）Ｃａｐｔｏ（商標）Ｂｕｔｙｌ ＨＰマトリックスを使用する場合に１２４～１３１ｍｇ／ｍｌの間のＡＳ濃度で発生したことが、硫酸アンモニウム濃度への導電率の変換により示すことができた。導電率測定に基づくＡＳ濃度の決定を可能にする対応する検量線を図６に示す。
２．沈殿なしの可能な硫酸アンモニウムの最高濃度の決定：タンパク質の沈殿なしに、固定相へのＣ１－ＩＮＨの保持または結合を可能にする可能な硫酸アンモニウムの最高濃度を決定するために、滴定を実行した。この実験では、沈殿が起こるまで飽和硫酸アンモニウムをＣ１－ＩＮＨ試料に添加した。そのように決定された試料中の可能な硫酸アンモニウムの最高濃度は、２９２ｍｇ／ｍＬであった。これを、同じ濃度で実行を行うことによって検証し、これにより、Ｃ１－ＩＮＨが固定相に結合し、かつ続いて固定相から溶出することができることを示すことができた（以下の表２、実験１８０６１９ＨＷおよび図１１を参照）。
３．従来技術に従うフロースルーの方法との比較における最大のタンパク質充填容量の決定：従来技術に従うフロースルーの方法との比較における最大のタンパク質充填容量を決定するために、フロースルー画分においてＵＶシグナルが２８０ｎｍで検出することができるまで、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ゲル（カラムＡ）を結合条件下にて出発材料１で充填した。そのように決定されたタンパク質の量は、出発材料１を使用する従来技術に従うフロースルーの方法で使用される７．５ｍｇ／ｍｌの一倍充填と比較した場合、２倍を超えるタンパク質の量であった。出発材料２（４０％の硫酸アンモニウムの沈殿物の濾液）を使用して、そのように決定された量を、出発材料１（再溶解した６０％の硫酸アンモニウムの沈殿物）を使用する従来技術に従うフロースルーの方法で使用された７．５ｍｇ／ｍｌの一倍充填と比較した場合、４倍を超えるタンパク質の量であった。
その後、それぞれ一倍および二倍充填でのクロマトグラフィーの実行を、フロースルーモード（つまり、従来技術のように）および本発明に従う結合および溶出モードでそれぞれ実行した。全ての４つの実行の試料で作製されたトリス－グリシンゲルの比較では、本発明に従う２つの実行から得られた試料のＣ１－ＩＮＨのピークが、従来技術に従う実行から得られた試料のＣ１－ＩＮＨのピークよりも高い純度を有し、試料の充填に関係なく、最も純度の低いＣ１－ＩＮＨのピークが、従来技術に従うフロースルーモードの二倍充填の実行においてみられたことを示す。この結果を上述の図３に示す。
特定の実験のデータを以下の表２に示す。これらの実験のいくつかに対応するクロマトグラムを上述の図７～１１に示す。
表２は、従来技術（「フロースルー」）のように実行した実験、前述のカラムＡ（カラム体積（ＣＶ）が３６ｍｌ）またはカラムＢ（カラム体積が４．７ｍｌ）を使用して本発明（「ポジティブモード」）に従って実行した実験、およびそれぞれ以下の出発材料１～４のうちの１つを列挙する：
－ 従来技術である欧州特許第０１０１９３５号と同じ、つまり、再溶解した６０％の硫酸アンモニウム（ＡＳ）の沈殿物（＝出発材料１）；
－ 前の４０％のＡＳ沈殿物の濾液（＝出発材料２）、
－ 凍結乾燥されたＢｅｒｉｎｅｒｔ（登録商標）製品（＝出発材料３）、
－ 出発材料１を使用する２つのＨＩＣ実験の組み合わせ溶出液（＝出発材料４）
－ 従来技術である欧州特許第０１０１９３５号と同じ、つまり、再溶解した６０％の硫酸アンモニウム（ＡＳ）の沈殿物（＝出発材料１）；
－ 前の４０％のＡＳ沈殿物の濾液（＝出発材料２）、
－ 凍結乾燥されたＢｅｒｉｎｅｒｔ（登録商標）製品（＝出発材料３）、
－ 出発材料１を使用する２つのＨＩＣ実験の組み合わせ溶出液（＝出発材料４）
それぞれの出発材料を平衡緩衝液に溶解した。溶出は、特に記載がない限り、特定量のカラム体積（ＣＶ）での濃度および／またはｐＨ勾配によって、または段階溶出によって行った。Ｃ１－ＩＮＨのピークの検出は、上記のように実行した。
表２からわかるように、Ｃ１－ＩＮＨ溶出のピークが観察される硫酸アンモニウム（ＡＳ）濃度は、カラムＡを使用する場合は約１６０～約１７４ｍｇ／ｍｌの間、カラムＢを使用する場合は約１２４～約１３１ｍｇ／ｍｌの間である。さらにわかるように、出発材料１を使用する場合のカラムＡの充填容量は、一倍充填の少なくとも２倍、つまり、少なくとも２×７．５ｍｇまたは１５ｍｇタンパク質／ｍｌクロマトグラフィーゲルであり、出発材料２を使用する場合、一倍充填の少なくとも４倍、つまり、少なくとも３０ｍｇタンパク質／ｍｌクロマトグラフィーゲルである。
表３は、多数の異なるゲルの種類を比較したさらなる実験を示す。表３に記載される条件下で、Ｃ１－ＩＮＨはマトリックスに結合し、異なる勾配で溶出した。
ＳＤＳゲル（データは示さず）では、溶出したＣ１－ＩＮＨの純度を分析し、表４に示す４つのゲルの種類が夾雑タンパク質からのＣ１－ＩＮＨの最も高い分解をもたらすことがわかった。表３に示す結合条件および溶出条件を使用する後続の実験では、Ｃ１－ＩＮＨの収率をこれら４つのゲルの種類の間で比較し、ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅからのＰｈｅｎｙｌ－Ｈａｎｓ－Ｐｅｔｅｒ（登録商標）、続いて東ソー株式会社からのＰｈｅｎｙｌ－６５０Ｍ（登録商標）が最も高い収率をもたらすことがわかった。
Claims (16)
- 疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用してＣ１－ＩＮＨを精製する方法であって、以下の工程：
（ｉ）Ｃ１－ＩＮＨが固定相に結合する第１の条件下で、固定相を含む疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムに、溶解したＣ１－ＩＮＨを含有する溶液を充填する工程と、
（ｉｉ）第２の条件を適用して、移動相によってＣ１－ＩＮＨを溶出する工程と
を含む前記方法。 - 第１の条件は、移動相が、Ｃ１－ＩＮＨが固定相に結合する第１の濃度の抗カオトロピック塩を、好ましくは硫酸ナトリウムまたは硫酸アンモニウムを、最も好ましくは硫酸アンモニウムを含むことであること、および
第２の条件は、移動相が、Ｃ１－ＩＮＨが溶出されるようになる第２の濃度の抗カオトロピック塩を、好ましくは硫酸ナトリウムまたは硫酸アンモニウムを、最も好ましくは硫酸アンモニウムを含むことであること
を特徴とする、請求項１に記載の方法。 - 第１の濃度から第２の濃度への移行は、濃度勾配によって、または段階溶出によって達成される、請求項２に記載の方法。
- 固定相は、
直鎖アルキル、例えば、エチル、ブチル、オクチル、
分岐アルキル、例えば、ｔ－ブチル、
アリール、例えば、フェニル、または
シクロアルキル、例えば、ヘキシル
のような疎水性リガンドで置換されている、以下のマトリックス材料：アガロース、架橋アガロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）のような様々な商品名で販売）、親水性ポリマー、例えば、ポリメタクリレートのうちの１つまたはそれ以上から選択され、
固定相は、好ましくは、アルキルまたはアリールで、好ましくは、ブチルまたはフェニルで置換されたマトリックス材料であり、より好ましくは、ブチルまたはフェニルで、最も好ましくはフェニルで置換された架橋アガロースである、
請求項２または３に記載の方法。 - 固定相は、ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅによるＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（低置換）のようなフェニル置換Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ゲルである、請求項４に記載の方法。
- 硫酸アンモニウムは、カオトロピック塩として使用され、第１の濃度は、約１．１Ｍ～約１．４Ｍの範囲の濃度Ｘを超え（例えば、約１５５～約１８０ｍｇ／ｍｌの硫酸アンモニウムの範囲の濃度Ｘを超える）、好ましくは、約１．２Ｍ～約１．３Ｍの範囲の濃度Ｘを超え（例えば、約１６０～約１７４ｍｇ／ｍｌの硫酸アンモニウムの範囲の濃度Ｘを超える）、かつ、第２の濃度は、濃度Ｘ未満である、請求項５に記載の方法。
- 固定相は、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅによって販売されるＨｉＳｃｒｅｅｎ（商標）Ｃａｐｔｏ（商標）Ｂｕｔｙｌ ＨＰのようなブチル置換Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ゲルである、請求項４に記載の方法。
- 硫酸アンモニウムは、カオトロピック塩として使用され、第１の濃度は、約０．９Ｍ～約１．０Ｍの範囲の濃度Ｘ（例えば、約１２４～約１３１ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度Ｘ）を超え、かつ、第２の濃度は、濃度Ｘ未満である、請求項７に記載の方法。
- 固定相は、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅによって販売されるＰｈｅｎｙｌ－ＨＰ（登録商標）もしくはＣａｐｔｏ－Ｐｈｅｎｙｌ ＩｍｐＲｅｓ（登録商標）、または東ソー株式会社によって販売されるＰｈｅｎｙｌ－６５０Ｍ（登録商標）もしくはＰｈｅｎｙｌ－６００Ｍ（登録商標）である、請求項４に記載の方法。
- 硫酸アンモニウムは、カオトロピック塩として使用され、第１の濃度は、約１．１Ｍ～約１．４Ｍの範囲の濃度Ｘを超え（例えば、約１５５～約１８０ｍｇ／ｍｌの硫酸アンモニウムの範囲の濃度Ｘを超える）、好ましくは、約１．２Ｍ～約１．３Ｍの範囲の濃度Ｘを超え（例えば、約１６０～約１７４ｍｇ／ｍｌの硫酸アンモニウムの範囲の濃度Ｘを超える）、かつ、第２の濃度は、濃度Ｘ未満である、請求項９に記載の方法。
- 硫酸アンモニウムは、カオトロピック塩として使用され、第１の濃度は、約１．３Ｍ～約１．６Ｍの間であり、好ましくは、約１．３Ｍ～約１．４Ｍの間であり、最も好ましくは、約１．３２Ｍ（つまり、約１８１ｍｇ／ｍｌ）である、請求項２～１０のいずれか１項に記載の方法。
- Ｃ１－ＩＮＨは、組換えＣ１－ＩＮＨ、トランスジェニックＣ１－ＩＮＨ、または血漿、好ましくはヒト血漿由来Ｃ１－ＩＮＨである、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
- 出発材料として使用されるＣ１－ＩＮＨ濃縮物は、沈殿剤を用いた分別沈殿を含む方法によって得られる、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
- 分別沈殿は、Ｃ１－ＩＮＨの沈殿を含み、かつ、Ｃ１－ＩＮＨは、Ｃ１－ＩＮＨの沈殿に必要な濃度よりも低い濃度の沈殿剤を含有する溶液に取り込まれる、請求項１３に記載の方法。
- 分別沈殿は、Ｃ１－ＩＮＨの沈殿を含まず、かつ、Ｃ１－ＩＮＨは、Ｃ１－ＩＮＨの沈殿に必要な濃度よりも低い濃度の沈殿剤を含有する上清中に含有される、請求項１４に記載の方法。
- ｐＨが６～９の範囲、好ましくは６．８～８．５の範囲、より好ましくは７～７．５の範囲、さらにより好ましくはｐＨが約７．２で実行される、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
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