JP2022185155A - 免疫レパートリーシーケンシングのための核酸サンプル調製の方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2016年11月2日に出願された米国仮特許出願第62/416,677号の米国特許法第119条(e)項に基づく優先権を主張し、この出願は、その全体が参照によって本願明細書に組み込まれる。
本明細書で記載される技術は、分析用の核酸分子の調製において有用な方法および組成物に関する。
適応免疫系は、非常に専門化された全身の細胞および病原体増殖を排除または防止することを目的としたプロセスから構成される。T細胞およびB細胞は、それらの抗原レセプター遺伝子座の遺伝的組換えおよび体細胞変異を通じて抗原結合分子の広い多様性を生成することによって適応免疫応答を駆動する適応免疫系の主な細胞構成成分と見做され得る。未成熟T細胞およびB細胞は、選択的プロセスを受けて、主として自己反応性を欠く集団を生じる。抗原結合分子(例えば、T細胞レセプターおよび免疫グロブリン)のこの最初のレパートリーを用意して、ナイーブT細胞およびB細胞は、身体全体を循環し、そこでそれら細胞は、抗原と接触した状態になり得る。
本明細書で開示される技術の局面は、核酸を調製および分析するための方法に関する。本明細書で提供される方法は、いくつかの実施形態において、免疫レセプターおよび免疫グロブリンをコードする核酸配列の多様な状況を含む免疫レパートリーを表す配列を含め、核酸調製物中で超低頻度核酸バリアント(例えば、スプライスバリアント、融合物、一ヌクレオチドバリアント、挿入および欠失、コピー数バリアント、体細胞組換えされた免疫レセプター遺伝子座に由来するmRNA、および発現レベルバリアント)を検出するために有用である。本明細書で提供される方法は、いくつかの実施形態において、以前に起こっている組換えおよび/またはスプライシング事象を反映する転写された核酸に相当するヌクレオチド配列を有する核酸分子を富化するライゲーションベースの捕捉を包含する。いくつかの実施形態において、特有の分子捕捉は、個体(例えば、腫瘍を有する個体または免疫が障害された個体)から抽出された核酸に関する従来の方法を超えて非常に改善している。いくつかの実施形態において、捕捉効率は、個体(例えば、腫瘍を有する個体または免疫が障害された個体)から抽出された核酸に関する従来の方法と比較して少なくとも倍加される。いくつかの実施形態において、改善された深度は、改善されたフロントエンド捕捉化学現象の結果として達成される。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される:
(項目1)
分析用の核酸を調製する方法であって、該方法は、
(a)標的ヌクレオチド配列を含む核酸分子と該標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする捕捉部分改変プライマーとを、ハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程;
(b)ハイブリダイズした捕捉部分改変プライマーによってプライムされかつ該核酸分子をテンプレートとして使用する第1鎖合成反応を行う工程;
(c)該第1鎖合成反応の生成物をテンプレートとして使用する第2鎖合成反応を行って、捕捉部分を含む2本鎖核酸を生成する工程;
(d)アダプター核酸を該2本鎖核酸にライゲーションして、該捕捉部分を含むライゲーション生成物を生成する工程;
(e)該ライゲーション生成物と該捕捉部分の結合パートナーとを接触させることによって、該ライゲーション生成物を捕捉する工程;および
(f)該標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする3’部分を含む標的特異的プライマーおよび該アダプター核酸の相補的配列に特異的にアニールする第1のアダプタープライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって、該捕捉したライゲーション生成物を増幅する工程であって、ここで該標的特異的プライマーは、該標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールしない5’テール部分を含む工程、
を包含する方法。
(項目2)
(g)前記標的特異的プライマーの5’テール部分の相補的配列に特異的にアニールする3’部分を含むテールプライマーおよび前記アダプター核酸の相補的配列に特異的にアニールする第2のアダプタープライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって、工程(f)の増幅生成物を増幅する工程であって、ここで該テールプライマーは、該標的特異的プライマーの相補的配列に特異的にアニールしない5’部分を含む工程、
をさらに包含する項目1に記載の方法。
(項目3)
前記テールプライマーの5’部分は、サンプルインデックス領域、分子バーコード領域、およびシーケンシングプライマー部位領域のうちの少なくとも1つを含む、項目2に記載の方法。
(項目4)
工程(d)は、前記アダプター核酸、前記2本鎖核酸、およびリガーゼを、該リガーゼが該アダプター核酸を該2本鎖核酸にライゲーションする条件下で合わせる工程を包含し、ここで該2本鎖核酸と合わされた該アダプター核酸は、二重鎖部分およびオーバーハング配列を含み、ここで該オーバーハング配列は、該2本鎖核酸の3’末端におけるオーバーハング配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む、前述の項目のうちのいずれか1項に記載の方法。
(項目5)
工程(d)は、前記アダプター核酸、前記2本鎖核酸、およびリガーゼを、該リガーゼが該アダプター核酸を該2本鎖核酸にライゲーションする条件下で合わせる工程を包含し、ここで該2本鎖核酸と合わされた該アダプター核酸は、1本鎖である、項目1~3のいずれか1項に記載の方法。
(項目6)
前記捕捉部分改変プライマーは、少なくとも1つの捕捉部分改変ヌクレオチドを含む、前述の項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目7)
前記捕捉部分改変プライマーは、捕捉部分に付着した第2の化学カップリング基に結合するように構成された第1の化学カップリング基を含む、項目1~5のいずれか1項に記載の方法。
(項目8)
前記捕捉部分はビオチン部分である、前述の項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目9)
前記ビオチン部分は、ビオチン-トリエチレングリコール、ビス-ビオチン、光切断性ビオチン、デスチオビオチン、デスチオビオチン-トリエチレングリコール、またはアジ化ビオチンを含む、項目8に記載の方法。
(項目10)
前記結合パートナーは、ストレプトアビジンである、前述の項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目11)
前記ストレプトアビジンは、基材に付着している、項目10に記載の方法。
(項目12)
前記基材は固体表面を含む、項目11に記載の方法。
(項目13)
前記固体表面は、常磁性ビーズを含む、項目12に記載の方法。
(項目14)
工程(d)の後でかつ工程(e)の前に洗浄工程をさらに包含する、前述の項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目15)
工程(e)の後でかつ工程(f)の前に:
i)前記捕捉部分を含む前記2本鎖核酸を、常磁性基材上に固定化する工程;および
ii)該固定化した2本鎖核酸を洗浄する工程、
をさらに包含する、前述の項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目16)
工程ii)の後に:
iii)前記洗浄した固定化2本鎖核酸を前記常磁性基材から放出する工程、
をさらに包含する、項目15に記載の方法。
(項目17)
工程(c)の後でかつ工程(d)の前に、前記2本鎖核酸を5’リン酸化する工程をさらに包含する、前述の項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目18)
工程(c)の後でかつ工程(d)の前に、前記2本鎖核酸を末端修復して、平滑末端化した2本鎖核酸を生成する工程をさらに包含する、前述の項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目19)
前記平滑末端化した2本鎖核酸の3’末端に1またはこれより多くのヌクレオチドを付加する工程をさらに包含する、項目18に記載の方法。
(項目20)
前記1またはこれより多くのヌクレオチドは、デオキシアデノシンヌクレオチドを含む、項目19に記載の方法。
(項目21)
前記アダプター核酸は、前記平滑末端化した2本鎖核酸の3’末端に付加した前記1またはこれより多くのヌクレオチドに相補的な1またはこれより多くのヌクレオチドを含む3’末端においてヌクレオチド配列を含む、項目19に記載の方法。
(項目22)
前記アダプター核酸の3’末端における前記ヌクレオチド配列は、1またはこれより多くのデオキシチミジンヌクレオチドを含む、項目21に記載の方法。
(項目23)
前記アダプター核酸は、前記3’末端において前記ヌクレオチド配列を含む増幅鎖にアニールしたブロッキング鎖をさらに含み、該3’末端における該ヌクレオチド配列は、該ヌクレオチド配列がオーバーハング配列を形成するように不対化される、項目21に記載の方法。
(項目24)
末端修復後に、
i)前記捕捉部分を含む前記2本鎖核酸を、常磁性基材上に固定化する工程;
ii)該固定化した2本鎖核酸を洗浄する工程;および
iii)該洗浄した固定化2本鎖核酸を該常磁性基材から放出する工程、
をさらに包含する、項目18に記載の方法。
(項目25)
末端修復後に、
i)前記捕捉部分を含む前記2本鎖核酸を、常磁性基材上に固定化する工程;および
ii)該固定化した2本鎖核酸を洗浄する工程、
をさらに包含する、項目18に記載の方法。
(項目26)
末端修復の後でかつ工程i)の前に、洗浄工程をさらに包含する、項目24または項目25に記載の方法。
(項目27)
(h)工程(g)の増幅生成物を常磁性基材上に固定化する工程;
(i)該固定化した増幅生成物を洗浄する工程;および
(j)該洗浄した固定化増幅生成物を該常磁性基材から放出する工程、
をさらに包含する、いずれか1項の項目2~26に記載の方法。
(項目28)
工程(g)の後でかつ工程(h)の前に、洗浄工程をさらに包含する、項目27に記載の方法。
(項目29)
工程(d)において、前記2本鎖核酸は、クラウディング剤の存在下で前記アダプター核酸にライゲーションされる、前述の項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目30)
工程(b)の後でかつ工程(c)の前に、前記核酸分子とリボヌクレアーゼ酵素とを接触させる工程をさらに包含する、前述の項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目31)
前記第2鎖合成反応は、前記第1鎖合成反応の生成物にハイブリダイズした前記核酸分子のフラグメントによってプライムされる、前述の項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目32)
前記第2鎖合成は、複数のランダムプライマーを使用してランダムにプライムされる、前述の項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目33)
前記複数のランダムプライマーは、6塩基長~15塩基長の間である、項目32に記載の方法。
(項目34)
前記核酸分子はmRNAを含む、前述の項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目35)
前記核酸分子は、T細胞、B細胞、またはこれらの混合物を含むサンプルから得られる、前述の項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目36)
前記サンプルは、T細胞悪性腫瘍またはB細胞悪性腫瘍を有するかまたは有すると疑われる被験体から得られる、項目35に記載の方法。
(項目37)
前記T細胞悪性腫瘍または前記B細胞悪性腫瘍は、リンパ腫、多発性骨髄腫、急性リンパ芽球性白血病、および慢性リンパ性白血病からなる群より選択される、項目36に記載の方法。
(項目38)
前記サンプルは、移植を受けた被験体または移植を受ける予定の被験体から得られる、項目35~37のいずれか1項に記載の方法。
(項目39)
前記サンプルは、処置に対する免疫応答が評価されている最中である被験体から得られる、項目35~37のいずれか1項に記載の方法。
(項目40)
前記サンプルは、白血球悪性腫瘍を有するか、または有すると疑われる被験体から得られる、項目35~37のいずれか1項に記載の方法。
(項目41)
前記被験体はヒトである、項目36~40のいずれか1項に記載の方法。
(項目42)
前記被験体は脊索動物である、項目36~40のいずれか1項に記載の方法。
(項目43)
前記核酸分子は、白血球を含むサンプルから得られる、前述の項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目44)
前記標的ヌクレオチド配列は、T細胞レセプター(TCR)遺伝子またはB細胞レセプター(BCR)遺伝子の一部に相当するヌクレオチド配列を含む、前述の項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目45)
前記捕捉部分改変プライマーは、免疫レセプター遺伝子または免疫グロブリン遺伝子に相補的であるヌクレオチド配列を含む、前述の項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目46)
前記捕捉部分改変プライマーは、相補性決定領域3(CDR3)の下流にある定常領域に特異的にアニールする、項目45に記載の方法。
(項目47)
前記標的特異的プライマーは、CDR3の下流にある定常領域またはJセグメントに特異的にアニールする、項目45または46に記載の方法。
(項目48)
前記標的特異的プライマーは、定常領域とJセグメントとの間に形成されるエキソン-エキソン接合部に特異的にアニールし、ここで該エキソン-エキソン接合部は、CDR3の下流にある、項目45または46に記載の方法。
(項目49)
前記第1のアダプタープライマーおよび前記第2のアダプタープライマーは同じである、項目2~48のいずれか1項に記載の方法。
(項目50)
前記第1のアダプタープライマーおよび前記第2のアダプタープライマーは異なる、項目2~48のいずれか1項に記載の方法。
(項目51)
前記第2のアダプタープライマーは、前記第1のアダプタープライマーに対してネスト化される、項目2~48のいずれか1項に記載の方法。
(項目52)
分析用の核酸を調製する方法であって、該方法は、
(a)既知の標的ヌクレオチド配列および未知の標的ヌクレオチド配列を含む核酸分子と、該既知の標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする捕捉部分改変プライマーとをハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程;
(b)ハイブリダイズした捕捉部分改変プライマーによってプライムされかつ該核酸分子をテンプレートとして使用する第1鎖合成反応を行う工程;
(c)該核酸分子のフラグメントによってプライムされかつ該第1鎖合成反応の生成物をテンプレートとして使用する第2鎖合成反応を行って、捕捉部分を含む2本鎖核酸を生成する工程;
(d)該2本鎖核酸を末端修復して、該捕捉部分を含む平滑末端化した2本鎖核酸を生成する工程;
(e)アダプター核酸を該平滑末端化した2本鎖核酸にライゲーションして、ライゲーション生成物を生成する工程であって、ここで該ライゲーション生成物は、該アダプター核酸および該捕捉部分に隣接した該未知の標的ヌクレオチド配列を含む工程;
(f)該ライゲーション生成物と該捕捉部分の固定化した結合パートナーとを接触させることによって、該ライゲーション生成物を捕捉する工程;
(g)該既知の標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする3’部分を含む標的特異的プライマーおよび該アダプター核酸の相補的配列に特異的にアニールする第1のアダプタープライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって、該ライゲーション生成物を増幅する工程であって、ここで該標的特異的プライマーは、該既知の標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールしない5’テール部分を含む工程;
(h)該標的特異的プライマーの5’テール部分の相補的配列に特異的にアニールするテールプライマーおよび該アダプター核酸の相補的配列に特異的にアニールする第2のアダプタープライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって、工程(g)の増幅生成物を増幅する工程;ならびに
(i)工程(h)の増幅生成物を洗浄する工程、
を包含する方法。
(項目53)
分析用の核酸を調製する方法であって、該方法は、
(a)標的ヌクレオチド配列を含む核酸分子と該標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする第1の標的特異的プライマーとをハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程;
(b)ハイブリダイズした第1の標的特異的プライマーによってプライムされかつ該核酸分子をテンプレートとして使用する第1鎖合成反応を行う工程;
(c)該核酸分子のハイブリダイズしたフラグメントによってプライムされかつ該第1鎖合成反応の生成物をテンプレートとして使用する第2鎖合成反応を行って、2本鎖核酸を生成する工程;
(d)アダプター核酸を該2本鎖核酸にライゲーションして、ライゲーション生成物を生成する工程;
(e)該標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする3’部分を含む第2の標的特異的プライマーおよび該アダプター核酸の相補的配列に特異的にアニールする第1のアダプタープライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって、該ライゲーション生成物を増幅する工程であって、ここで該第2の標的特異的プライマーは、該標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールしない5’テール部分を含む工程;ならびに
(f)該第2の標的特異的プライマーの5’テール部分の相補的配列に特異的にアニールする3’部分を含むテールプライマーおよび該アダプター核酸の相補的配列に特異的にアニールする第2のアダプタープライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって、工程(e)の増幅生成物を増幅する工程であって、ここで該テールプライマーは、該第2の標的特異的プライマーの相補的配列に特異的にアニールしない5’部分を含む工程、
を包含する方法。
(項目54)
前記第1の標的特異的プライマーは、捕捉部分を含む、項目53に記載の方法。
(項目55)
工程(d)の後でかつ工程(e)の前に、前記ライゲーション生成物と該捕捉部分の結合パートナーとを接触させることによって、該ライゲーション生成物を捕捉する工程をさらに包含する、項目54に記載の方法。
(項目56)
前記第1鎖合成反応は、捕捉部分改変ヌクレオチドの少なくとも1つのタイプを使用して行われ、該第1鎖合成反応の生成物は、少なくとも1つの捕捉部分を含む、項目53に記載の方法。
(項目57)
工程(d)の後でかつ工程(e)の前に、前記ライゲーション生成物と前記少なくとも1つの捕捉部分の固定化された結合パートナーとを接触させることによって、該ライゲーション生成物を捕捉する工程をさらに包含する、項目56に記載の方法。
(項目58)
工程(c)の後でかつ工程(d)の前に、前記2本鎖核酸と前記少なくとも1つの捕捉部分の固定化された結合パートナーとを接触させることによって、該2本鎖核酸を捕捉する工程をさらに包含する、項目56に記載の方法。
(項目59)
サンプル中の免疫レパートリーを決定する方法であって、該方法は、
(a)免疫レセプターおよび免疫グロブリンのうちの少なくとも一方をコードする核酸分子を含むサンプルを得る工程;
(b)該サンプルからの該核酸分子と該核酸分子の標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする第1の標的特異的プライマーとをハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程;
(c)ハイブリダイズした第1の標的特異的プライマーによってプライムされかつ該核酸分子をテンプレートとして使用する第1鎖合成反応を行う工程;
(d)該第1鎖合成反応の生成物をテンプレートとして使用する第2鎖合成反応を行って、2本鎖核酸を生成する工程;
(e)アダプター核酸を該2本鎖核酸にライゲーションして、ライゲーション生成物を生成する工程;
(f)該標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする3’部分を含む第2の標的特異的プライマーおよび該アダプター核酸の相補的配列に特異的にアニールする第1のアダプタープライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって、該ライゲーション生成物を増幅する工程であって、ここで該第2の標的特異的プライマーは、該標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールしない5’テール部分を含む工程;
(g)該第2の標的特異的プライマーの5’テール部分の相補的配列に特異的にアニールする3’部分を含むテールプライマーおよび該アダプター核酸の相補的配列に特異的にアニールする第2のアダプタープライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって、工程(f)の増幅生成物を増幅する工程であって、ここで該テールプライマーは、該第2の標的特異的プライマーの相補的配列に特異的にアニールしない5’部分を含む工程;ならびに
(h)第1のおよび第2のシーケンシングプライマーを使用して、工程(g)の増幅生成物をシーケンシングする工程、
を包含する方法。
(項目60)
前記免疫レセプターはTCRを含み、前記免疫グロブリンはBCRを含む、項目59に記載の方法。
(項目61)
前記標的ヌクレオチド配列は、遺伝的に組み換えた配列に相当する、項目59に記載の方法。
(項目62)
前記サンプルは、T細胞、B細胞、またはこれらの混合物を含む、項目59に記載の方法。
(項目63)
前記サンプルは被験体から得られる、項目62に記載の方法。
(項目64)
前記被験体はヒトである、項目63に記載の方法。
(項目65)
分析用の核酸を調製する方法であって、該方法は、
(a)標的ヌクレオチド配列を含む核酸分子と該標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする第1の標的特異的プライマーとを、プライマーがハイブリダイズした核酸分子を生成する条件下で接触させる工程;
(b)該プライマーがハイブリダイズした核酸分子と、該核酸分子に相補的である第1鎖へと組み込むための複数のタイプのヌクレオチドとを接触させる工程であって、ここで該複数のタイプのヌクレオチドのうちの少なくとも1つは、捕捉部分を含む工程;
(c)該プライマーがハイブリダイズした核酸分子の該第1の標的特異的プライマーによってプライムされかつ該プライマーがハイブリダイズした核酸分子の該核酸分子をテンプレートとして使用する第1鎖合成反応を行う工程であって、ここで該第1鎖合成反応の生成物は、少なくとも1つの捕捉部分を含む工程;
(d)該核酸分子のフラグメントによってプライムされかつ該第1鎖合成反応の生成物をテンプレートとして使用する第2鎖合成反応を行って、該少なくとも1つの捕捉部分を含む2本鎖核酸を生成する工程;
(e)アダプター核酸を該2本鎖核酸にライゲーションして、該少なくとも1つの捕捉部分を含むライゲーション生成物を生成する工程;ならびに
(f)該標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする3’部分を含む第2の標的特異的プライマーおよび該アダプター核酸の相補的配列に特異的にアニールする第1のアダプタープライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって、該ライゲーション生成物を増幅する工程であって、ここで該第2の標的特異的プライマーは、該標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールしない5’テール部分を含む工程、
を包含する方法。
(項目66)
工程(e)の後でかつ工程(f)の前に、前記ライゲーション生成物と前記捕捉部分の固定化された結合パートナーとを接触させることによって、該ライゲーション生成物を捕捉する工程をさらに包含する、項目65に記載の方法。
(項目67)
工程(d)の後でかつ工程(e)の前に、前記2本鎖核酸と前記捕捉部分の固定化された結合パートナーとを接触させることによって、該2本鎖核酸を捕捉する工程をさらに包含する、項目65に記載の方法。
(項目68)
分析用の核酸を調製する方法であって、該方法は、
(a)標的ヌクレオチド配列を含む核酸分子と、ハイブリダイゼーション条件下で該標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする3’部分および該標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールしない5’テール部分を含む捕捉部分改変プライマーとを、接触させる工程;
(b)ハイブリダイズした捕捉部分改変プライマーによってプライムされかつ該核酸分子をテンプレートとして使用する第1鎖合成反応を行う工程;
(c)該第1鎖合成反応の生成物と複数のランダムプライマーとを、ハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程であって、ここで該複数のランダムプライマーの各々は、共通配列を含む非ランダム5’テール部分を含む工程;
(d)該複数のランダムプライマーのうちの少なくとも1つによってプライムされかつ該第1鎖合成反応の生成物をテンプレートとして使用する第2鎖合成反応を行って、該捕捉部分を含む2本鎖核酸を生成する工程;
(e)該2本鎖核酸と該捕捉部分の結合パートナーとを接触させることによって、該捕捉部分を含む2本鎖核酸を捕捉する工程;
(f)第1のテールプライマーおよび該標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする第1の標的特異的プライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって、該2本鎖核酸を増幅する工程であって、ここで該第1のテールプライマーは、該共通配列の相補体に特異的にアニールする3’部分および該共通配列の相補体に特異的にアニールしない5’テール部分を含む工程;ならびに
(g)第2の標的特異的プライマーおよび該第1のテールプライマーの5’テール部分の相補体に特異的にアニールする第2のテールプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって、工程(f)の増幅生成物を増幅する工程であって、ここで該第2の標的特異的プライマーは、該標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする3’部分および該標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールしない5’テール部分を含む工程、
を包含する方法。
とりわけ、本開示は、免疫レパートリー分析用の核酸ライブラリーの調製に関する改善された技術を提供する。本明細書で記載されるように、既知の標的ヌクレオチド配列を含む標的核酸分子(例えば、mRNA)は、標的特異的プライマーと接触され、その核酸分子をテンプレートとして使用する第1鎖合成反応において伸長される。いくつかの実施形態において、その第1鎖合成反応は、その第1鎖合成反応の生成物が捕捉部分を含むように行われ得、その捕捉部分の結合パートナーは、その生成物を捕捉する(例えば、単離する)ために使用され得る。よって、本開示の局面は、その標的核酸分子(例えば、mRNA)を含む初期投入物に相補的である第1鎖合成の生成物を富化するために有用な技術を提供する。
適応免疫系は特有の抗原結合分子を発現する細胞のクローン性拡大によって一部機能するので、各T細胞またはB細胞クローンの合計存在量の変化を正確に測定することは、適応免疫応答のダイナミクスの理解にとって重要である。ハイスループットシーケンシングにおける進歩を利用して、広大なTCRおよびBCRレパートリーをプロファイルする分子免疫学の新たな分野が近年出現してきた。いくつかの実施形態において、本明細書で記載される技術は、免疫細胞クローン型を分析するために有用である。
適応免疫系は、潜在的病原体の母集団を認識するために十分な多様性を有するT細胞およびB細胞抗原レセプター(例えば、適応免疫レセプター)のレパートリーを生成するためにいくつかのストラテジーを使用する。T細胞が、種々のがんまたは感染性生物と関連する抗原の母集団を認識する能力は、そのTCRによって与えられ、このTCRは、TCRA遺伝子座に由来するα(アルファ)鎖およびTCRB遺伝子座に由来するβ(ベータ)鎖のヘテロダイマー、またはTCRG遺伝子座に由来するγ(ガンマ)鎖およびTCRD遺伝子座に由来するδ(デルタ)鎖のヘテロダイマーである。これらの鎖を構成するタンパク質は、DNAによってコードされ、これはリンパ様細胞において、そのTCRのおびただしい多様性を生成するために、特有の再配列機構を使用する。このマルチサブユニット免疫認識レセプターは、CD3複合体と関連し、抗原提示細胞(APC)の表面上の主要組織適合遺伝子複合体(MHC)クラスIまたはMHCクラスIIタンパク質のいずれかによって提示されるペプチドに結合する。そのAPC上の抗原性ペプチドへのTCRの結合は、T細胞活性化における中心的な事象であり、これは、T細胞とAPCとの間の接触点の免疫学的シナプスにおいて起こる。
免疫グロブリン(Ig)(本明細書ではB細胞レセプター(BCR)ともいわれる)は、H2L2構造を形成する4種のポリペプチド鎖(IGH遺伝子座に由来する2つの重鎖(H鎖)およびIGK遺伝子座もしくはIGL遺伝子座のいずれかに由来する2つの軽鎖(L鎖)からなるB細胞によって発現されるタンパク質である。H鎖およびL鎖は各々、抗原認識に関与する3つのCDR、ならびにフレームワーク領域およびTCRに類似の定常ドメインを含む。IgのH鎖は最初に、IGMまたはIGD定常領域エキソンのいずれかを使用する膜結合アイソフォームとして発現され、抗原認識後に、その定常領域がいくつかのさらなるアイソタイプ(IGG、IGEおよびIGAを含む)へとクラススイッチされ得る。TCRと同様に、個体内のナイーブIgの多様性は主に、超可変CDRによって決定される。TCRBと同様に、H鎖のCDR3ドメインは、VH、DH、およびJH遺伝子セグメントのコンビナトリアル接合によって作られる。超可変ドメイン配列多様性は、Ig遺伝子再配列のプロセスの間に、VH-DH、DH-JH、およびVH-JH接合部におけるヌクレオチドの独立した付加および欠失によってさらに増大される。TCRとは別個に、Ig配列多様性は、ナイーブB細胞が最初に抗原を認識した後に、その再配列されたIG遺伝子全体を通じた体細胞超変異(SHM)によってさらに増大される。SHMのプロセスは、CDR3に制限されず、従って、フレームワーク領域、CDR1およびCDR2において、ならびに体細胞再配列された(somatically rearranged)CDR3において、生殖細胞系統配列に変化を導入し得る。
いくつかの局面において、本明細書で記載される技術は、目的の状態の存在を決定するために使用され得る。いくつかの実施形態において、目的の状態の存在の決定は、診断適用に関連し得、ここで被験体は、その状態を有するかまたは有すると疑われる。いくつかの実施形態において、目的の状態の存在の決定は、防止的処置の目的で推測的測定に有用であり得る。いくつかの実施形態において、免疫レパートリーの分析は、目的の状態の存在を示し得る。例えば、いくつかの実施形態において、がんの病歴は、1またはこれより多くのがん抗原に結合する免疫レセプター配列の存在下で反映され得る。いくつかの実施形態において、自己免疫疾患の存在は、自己抗原に結合する免疫レセプター配列の存在下で反映され得る。いくつかの実施形態において、自己免疫に関する状態は、本明細書で記載される技術を使用して、特定の時点で評価され得るかまたはある期間にわたって追跡され得る。いくつかの実施形態において、自己免疫に関する状態としては、多発性硬化症(MS)、セリアック病、1型糖尿病、サルコイドーシス、全身性エリテマトーデス(SLE)、シェーグレン症候群、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症、橋本甲状腺炎、グレーブス病、特発性血小板減少性紫斑病、アジソン病、関節リウマチ(RA)、強直性脊椎炎、多発性筋炎(PM)、および皮膚筋炎(DM)が挙げられる。よって、いくつかの実施形態において、本明細書で記載される方法は、状態の処置が適切であるか否かを決定するために使用され得る。例えば、いくつかの実施形態において、悪性T細胞およびB細胞の存在量は、特定のCDR3配列を介して経時的に追跡され得る。
本明細書で記載される技術の局面は、目的の分子(例えば、核酸、ライゲーション生成物など)を単離するための捕捉部分の使用に関する。本明細書で使用される場合、「捕捉部分(capture moiety)」とは、その目的の分子を捕捉する(例えば、単離する/精製する)目的で、結合パートナーと選択的に相互作用するように構成される部分をいう。
を含む。
本開示の局面は、既知の標的ヌクレオチド配列(例えば、免疫レセプターの既知の標的ヌクレオチド配列)に連続したヌクレオチド配列を決定する改善された方法を提供する。旧来のシーケンシング法は、配列情報を無作為に(例えば、「ショットガン(shotgun)」シーケンシング)、またはプライマーをデザインするために使用される2つの既知の配列の間で生成する。対照的に、本明細書で開示される方法のうちのある種のものは、いくつかの実施形態において、高レベルの特異性および感度で既知の配列のうちの1つの領域の上流または下流にあるヌクレオチド配列を決定する(例えば、シーケンシングする)ことを可能にする。
いくつかの実施形態において、標的核酸および/またはその増幅生成物は、1つの方法のうちの任意の適切な工程の前および/または後で、酵素、プライマー、または緩衝液構成要素から単離され得る。核酸を単離するための任意の適切な方法が、使用され得る。いくつかの実施形態において、その単離は、固相可逆的固定法(Solid Phase Reversible Immobilization(SPRI))クリーンアップを含み得る。SPRIクリーンアップのための方法は、当該分野で周知である(例えば、Agencourt AMPure XP - PCR Purification(カタログ番号A63880、Beckman Coulter; Brea, CA))。いくつかの実施形態において、酵素は、加熱処理によって不活性化され得る。いくつかの実施形態において、非標識dNTPは、酵素処理によって除去される。いくつかの実施形態において、クリーンアップ工程(例えば、SPRIクリーンアップ)は、伸長しなかったプライマーまたは過剰なプライマー(例えば、捕捉部分改変プライマー、標的特異的プライマー、アダプタープライマーなど)を除去するために行われる。
本明細書で使用される場合、用語「アダプター核酸(adapter nucleic acid)」、「核酸アダプター(nucleic acid adapter)」または「アダプター(adapter)」とは、標的ヌクレオチド配列の増幅および/またはシーケンシングの間に有用な1またはこれより多くの要素を提供する、その標的ヌクレオチド配列を含む核酸にライゲーションされ得る核酸分子をいう。いくつかの実施形態において、アダプターは、1本鎖である。いくつかの実施形態において、アダプターは、2本鎖である。いくつかの実施形態において、2本鎖アダプターは、第1のライゲーション可能な二重鎖末端および第2の不対末端を含む。いくつかの実施形態において、アダプターは、増幅鎖およびブロッキング鎖を含む。いくつかの実施形態において、その増幅鎖は、5’不対部分および3’二重鎖部分を含む。いくつかの実施形態において、その増幅鎖は、3’オーバーハングをさらに含む。いくつかの実施形態において、その3’オーバーハングは、3’Tオーバーハングである。いくつかの実施形態において、その増幅鎖は、第1のおよび第2のアダプタープライマーと同一のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、そのアダプターのブロッキング鎖は、5’二重鎖部分および伸長不能な3’部分を含む。いくつかの実施形態において、そのブロッキング鎖は、3’不対部分をさらに含む。いくつかの実施形態において、その増幅鎖およびそのブロッキング鎖の二重鎖部分は、実質的に相補的であり、そしてその二重鎖部分は、ライゲーション温度においてにおいて二重鎖形態を保持するために十分な長さである。
本開示の局面は、1またはこれより多くの伸長反応(例えば、第1鎖合成、第2鎖合成)および/または1またはこれより多くの増幅ラウンドを含み得る技術に関する。本明細書で記載されるように、伸長反応および増幅は、1またはこれより多くの標的特異的プライマーを使用して行われ得る。
一般に、目的の配列(例えば、標的配列またはアダプター配列)に相補的である配列を含むプライマーは、相補的配列のみからなり得るか、またはその目的の配列に相補的でないさらなる配列(例えば、テール配列、アダプター配列、インデックス配列など)をも含み得るかのいずれかである。いくつかの実施形態において、プライマーは、非ヌクレオチド部分(例えば、捕捉部分など)をも含み得る。
いくつかの実施形態において、本明細書で記載される方法は、伸長レジメンまたは工程を含む。このような実施形態において、伸長は、1つまたはこれより多くのハイブリダイズしたランダムプライマーから、プライマーがテンプレートに関してハイブリダイズされる核酸分子を使用して、進み得る。伸長工程は、本明細書で記載される。いくつかの実施形態において、1つまたはこれより多くのランダムプライマーは、サンプル中の核酸の実質的に全てにハイブリダイズし得、そのうちの多くは、標的ヌクレオチド配列を含まなくてもよい。よって、いくつかの実施形態において、ランダムプライマーの伸長は、標的ヌクレオチド配列を含まないテンプレートとのハイブリダイゼーションに起因して起こり得る。
ここで:ΔHは,ヘリックス形成のエンタルピーであり;ΔSは、ヘリックス形成のエントロピーであり;Rは、モル気体定数(1.987cal/℃×mol)であり;Cは、核酸濃度であり;そして[K+]は、塩濃度である。大部分の増幅レジメンに関して、アニーリング温度は、推定Tmより約5℃低いように選択されるが、例えば、推定Tmより5℃より大きく低い温度(例えば、6℃低い、8℃低い、10℃低い、またはより低い)であり得るように、Tmにより近く、Tmを上回る温度(例えば、推定Tmより1℃~5℃の間または低い、推定Tmより1℃~5℃の間高い)が使用され得る。いくつかの実施形態において、アニーリング温度がTmに近いほど、アニーリングはより特異的になる。いくつかの実施形態において、伸長反応の間(例えば、PCR増幅レジメンの状況内で)プライマーアニーリングに使用される時間は、少なくとも部分的に、反応の容積に基づいて決定される(例えば、容積が大きいほど、より長い時間を要する)。いくつかの実施形態において、伸長反応の間に(例えば、PCR増幅レジメンの状況内で)プライマーアニーリングに使用される時間は、少なくとも部分的に、プライマーおよびテンプレート濃度に基づいて決定される(例えば、テンプレートに対するプライマーの相対的濃度が高いほど、より低い相対的濃度より、より短い時間を要する)。いくつかの実施形態において、容積および相対的プライマー/テンプレート濃度に依存して、伸長反応における(例えば、増幅レジメンの状況内での)プライマーアニーリング工程は、1秒~5分、10秒~2分、または30秒~2分の範囲内であり得る。本明細書で使用される場合、「実質的にアニールする(substantially anneal)」とは、相補的塩基対が、PCR増幅レジメンの状況において使用される場合に、特異的に増幅された生成物の検出可能なレベルを生じるために十分である2つの核酸の間で形成する程度を指す。
本明細書で使用される場合、用語「標的核酸(target nucleic acid)」、「標的ヌクレオチド配列を含む核酸分子(nucleic acid molecule comprising a target nucleotide sequence)」および「標的ヌクレオチド配列を含む核酸(nucleic acid comprising a target nucleotide sequence)」とは、目的の核酸分子(例えば、分析されるべき核酸)をいう。いくつかの実施形態において、標的核酸は、標的ヌクレオチド配列(例えば、既知のまたは所定のヌクレオチド配列)および決定されるべき隣接するヌクレオチド配列(これは、未知の配列といわれ得る)の両方を含む。標的核酸は、任意の適切な長さのものであり得る。いくつかの実施形態において、標的核酸は、2本鎖である。いくつかの実施形態において、標的核酸は、DNAである。いくつかの実施形態において、標的核酸は、ゲノムDNAまたは染色体DNA(gDNA)を含む。いくつかの実施形態において、その標的核酸は、相補的DNA(cDNA)を含む。いくつかの実施形態において、その標的核酸は、1本鎖である。いくつかの実施形態において、標的核酸は、RNA(例えば、mRNA、rRNA、tRNA、cfDNA、cfRNA、長い非コードRNA、マイクロRNA)を含む。
いくつかの実施形態において、プライマーおよび/またはアダプターは、識別子配列(例えば、バーコード、インデックス)、シーケンシングプライマーハイブリダイゼーション配列(例えば、Rd1)、およびアダプター配列のようなさらなる配列を含み得る。いくつかの実施形態において、そのアダプター配列は、次世代シーケンシングシステムとともに使用される配列である。いくつかの実施形態において、そのアダプター配列は、Illuminaベースのシーケンシング技術のためのP5およびP7配列である。いくつかの実施形態において、そのアダプター配列は、Ion Torrentシーケンシング技術と適合性のP1およびAである。
本明細書で記載される核酸分子は、任意の所望のサイズのフラグメントを生成するために、剪断され得る(例えば、機械的にまたは酵素により剪断され得るか、ネブライザーにより剪断され得る)。機械的剪断プロセスの非限定的な例としては、超音波処理、ネブライゼーション、およびCovaris(Woburn, MA)から市販されるAFATM剪断技術が挙げられる。いくつかの実施形態において、核酸は、超音波処理によって機械的に剪断され得る。いくつかの実施形態において、標的核酸は、剪断も消化もされない。いくつかの実施形態において、調製工程の核酸生成物(例えば、伸長生成物、増幅生成物)は、剪断も酵素消化もされない。
いくつかの局面において、本明細書で記載される技術は、オリゴヌクレオチドシーケンシングのために核酸サンプルを富化するための方法に関する。いくつかの実施形態において、そのシーケンシングは、次世代シーケンシング法によって行われ得る。本明細書で使用される場合、「次世代シーケンシング(next-generation sequencing)」とは、数千から数百万のシーケンシング反応を並行して行いかつ読み取ることに起因して、従来のシーケンシング法(例えば、サンガーシーケンシング法)で可能な速度を上回る速度でオリゴヌクレオチドをシーケンシングする能力を有するオリゴヌクレオチドシーケンシング技術をいう。次世代シーケンシング法/プラットフォームの非限定的な例としては、以下が挙げられる:大規模並行シグネチャーシーケンシング(Massively Parallel Signature Sequencing)(Lynx Therapeutics);454パイロシーケンシング(454 Life Sciences/ Roche Diagnostics);固相可逆的ダイターミネーターシーケンシング(solid-phase, reversible dye-terminator sequencing)(Solexa/Illumina);SOLiD技術(Applied Biosystems);イオン半導体シーケンシング(Ion semiconductor sequencing)(ION Torrent);DNAナノボールシーケンシング(Complete Genomics);ならびにPacific Biosciences、Intelligen Bio-systems、およびOxford Nanopore Technologiesから入手可能な技術。いくつかの実施形態において、そのシーケンシングプライマーは、選択された次世代シーケンシング法と適合性の部分を含み得る。次世代シーケンシング技術およびその制約、ならびに関連したシーケンシングプライマーのデザインパラメーターは、当該分野で周知である(例えば、Shendureら,「Next-generation DNA sequencing」, Nature, 2008, vol. 26, No. 10, 1135-1145;Mardis, 「The impact of next-generation sequencing technology on genetics」, Trends in Genetics, 2007, vol. 24, No. 3, pp. 133-141; Suら, 「Next-generation sequencing and its applications in molecular diagnostics」 Expert Rev Mol Diagn, 2011, 11(3):333-43;Zhangら, 「The impact of next-generation sequencing on genomics」, J Genet Genomics, 2011, 38(3):95-109;(Nyren, P.ら Anal Biochem 208: 17175(1993); Bentley, D. R. Curr Opin Genet Dev 16:545-52(2006); Strausberg, R. L.ら, Drug Disc Today 13:569-77(2008);米国特許第7,282,337号;米国特許第7,279,563号;米国特許第7,226,720号;米国特許第7,220,549号;米国特許第7,169,560号;米国特許第6,818,395号;米国特許第6,911,345号;米国公開番号2006/0252077;同2007/0070349;および同20070070349を参照のこと;これらは、それらの全体において本明細書に参考として援用される)。
いくつかの実施形態において、核酸(例えば、標的核酸、標的ヌクレオチド配列を含む核酸)は、適切なサンプル(例えば、食品サンプル、環境サンプル、生物学的サンプル、例えば、血液サンプルなど)中に存在するかまたはこれらサンプルから得られる。いくつかの実施形態において、その標的核酸は、被験体から得られる生物学的サンプルである。いくつかの実施形態において、サンプルは、被験体から得られる診断サンプルであり得る。いくつかの実施形態において、サンプルは、タンパク質、細胞、流体、生物学的流体、保存剤、および/または他の物質をさらに含み得る。非限定的な例によれば、サンプルは、口内スワブ、血液、血清、血漿、喀痰、脳脊髄液、尿、涙液、肺胞単離物、胸膜液、心膜液、嚢胞液、腫瘍組織、組織、生検物、唾液、吸引物、またはこれらの組み合わせであり得る。いくつかの実施形態において、サンプルは、切除物または生検物によって得られ得る。
本開示の局面は、免疫系の遺伝的分析において有用であり得る。しかし、本明細書で記載される技術が任意の標的遺伝子または目的の核酸に適用され得ることは、認識されるべきである。 本明細書で記載される技術のいくつかの実施形態において、既知のオリゴヌクレオチド標的配列に連続する配列の決定は、疾患の処置と直接関連する情報を提供し得る。従って、いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、疾患を処置することを補助するために使用され得る。いくつかの実施形態において、サンプルは、遺伝的変化と関連する疾患の処置の必要性のある被験体に由来し得る。いくつかの実施形態において、既知の標的配列は、疾患関連遺伝子、例えば、発がん遺伝子の配列である。いくつかの実施形態において、既知のオリゴヌクレオチド標的配列に連続する配列および/またはその既知のオリゴヌクレオチド標的配列は、疾患に関連する変異または遺伝的異常(例えば、SNP、挿入、欠失、および/または遺伝子再編成)を含み得る。いくつかの実施形態において、サンプル中に存在する既知の標的配列に連続する配列および/または既知の標的配列は、遺伝子再編成生成物の配列を含んだ。いくつかの実施形態において、遺伝子再編成は、発がん遺伝子、例えば、融合発がん遺伝子であり得る。
本明細書で記載される方法は、多重形式で使用され得る。本明細書で記載される方法の実施形態において、多重適用は、1つまたはこれより多くの既知の標的ヌクレオチド配列に連続するヌクレオチド配列を決定することを含み得る。本明細書で使用される場合、「多重増幅(multiplex amplification)」とは、1つまたはこれより多くの反応容器において1より多くの標的核酸の同時増幅を包含するプロセスをいう。いくつかの実施形態において、方法は、プライマーの1つまたはこれより多くのセットを使用して、多重増幅生成物の配列のその後の決定を包含する。多重とは、約2~1,000個の間の異なる標的配列を1つの反応において検出することを指し得る。しかし、いくつかの実施形態において、多重とは、1つの反応での約1,000~10,000の間の異なる標的配列の検出に指し得る。いくつかの実施形態において、多重とは、1つの反応での約10,000~100,000の間の異なる標的配列の検出を指し得る。本明細書で使用される場合、多重とは、2~1,000の間の任意の範囲、例えば、5~500個、25~1,000個、または10~100個などの間の異なる標的配列を1つの反応において検出することを言う。PCRに当てはまる場合の用語「多重(multiplex)」とは、同じPCR反応において少なくとも2個の異なる標的配列に特異的なプライマーが存在することを示唆する。
分析用の核酸サンプルを調製するための方法を図示するプロトコルの一例は、図1に示される。
シーケンシング情報を、上記で記載される方法を使用する反復実験にわたって、種々の投入量(25ng、100ng、200ng、400ng、800ng、および1600ng)のサンプルから得た。図4に示されるように、反復実験間のクローン型重複は、投入量とともに増大する。複製サンプルのペアワイズ分析を、256,000リードからのデータを使用してさらに行った。その結果(これは、そのアッセイの非常に再現性のある性質を示した)は、図5において800ngおよび1600ngの投入サンプルに関して示される。図6Aおよび6Bは、全クローン(図6A) 対 重複するクローン(図6B)の完全なサイドバイサイド分析(side-by-side analysis)を示す。図7は、多様性 対 サンプルサイズのプロット(上)および投入サイズによるShannon多様度指数のチャート(下)を示し、これらは、投入量が、観察の複雑性および多様性を決めることを示す。
図12は、TCR(β/γ)レパートリーの分析に関するFFPE最適化ストラテジーを示す。示されるように、逆転写酵素(RT)プライマー結合部位は、定常ドメインエキソンの5’領域に相当する。その第1のPCR遺伝子特異的プライマー(GSP)を、Jセグメントの3’領域またはJセグメント:Cエキソンの共通部分にわたる領域のいずれかに相当する領域に結合させるためにデザインする。そのRTプライマーの5’末端からCDR3の5’末端までの平均距離は、100塩基対未満である。プライマーのパネルを、TCR(β/γ)およびTCR(α/δ)の免疫レパートリーシーケンシングのためにデザインし、それぞれ、表6および表7に列挙した。
いくつかの発明の実施形態は、本明細書で記載および例証されてきたが、当業者は、その機能を行うならびに/または結果および/もしくは本明細書で記載される利点のうちの1つもしくはこれより多くを得るための、種々の他の手段および/または指示を容易に想定し得、このようなバリエーションおよび/または改変の各々は、本明細書に記載される本発明の実施形態の範囲内にあると見做される。より一般には、当業者は、本明細書で記載される全てのパラメーター、寸法、物質、および構成が、例示的であることが意味され、その実際のパラメーター、寸法、物質、および/または構成が、本発明の教示が使用される特定の適用に依存することを容易に認識する。当業者は、慣用的に過ぎない実験を使用して、本明細書で記載される発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識するかまたは確認し得る。従って、前述の実施形態が例示によって提示されるに過ぎず、そして添付の請求項およびその均等物の範囲内で、本発明の実施形態が具体的に記載されかつ請求項に記載されるとおりのもの以外の方法で実施され得ることは、理解されるべきである。本開示の発明の実施形態は、本明細書で記載される各個々の特徴、システム、物品、物質、キット、および/または方法に関する。さらに、2つまたはこれより多くのこのような特徴、システム、物品、物質、キット、および/または方法の任意の組み合わせは、このような特徴、システム、物品、物質、キット、および/または方法が相互に矛盾しなければ、本開示の発明の範囲内に含まれる。
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- 明細書に記載の発明。
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