JP2022175987A - マイクロ流路チップにおいてエマルジョンを生成する方法及び装置 - Google Patents

Abstract

【課題】連続相液と分散相液とを別個にマイクロ流路チップに供給する方法において、改善されたエマルジョン生成方法、及び装置を提供する。【解決手段】マイクロ流路チップ１０において、分散相液保持部１０２，１０３が分散相液流路１１７を介してエマルジョン形成部１２０に接続しており、連続相液保持部１０１がエマルジョン形成部１２０に接続しており、エマルジョン形成部１２０がエマルジョン流路１３０を介して排出口１５０に接続しており、外部送液駆動力の適用によってエマルジョン形成部１２０において分散相液から構成される液滴及び連続相液から構成される連続相を含むエマルジョンを生成し、エマルジョン流路１３０に進入させること、を含み、連続相液がエマルジョン形成部１２０に達する前に、分散相液を、気体で充填された状態の分散相液流路１１７を通して、エマルジョン形成部１２０への流入部にまで移動させることを特徴とする方法。【選択図】図１

Description

本発明は、マイクロ流路チップにおいてエマルジョンを生成する方法及び装置に関する。特には、本発明は、液滴アレイ測定をより効率的かつ簡便・迅速に行うことができる装置及び方法に関する。

反応液を微小区画に分画し独立して反応を行なう技術として、微小液滴中に反応液を分画する微小液滴法が知られている。この手法は、例えばマイクロ・ナノ粒子の作製などに応用が期待されており、特に、マイクロ流体装置を用いて、標的分子を１分子単位で微小区画化し、微小液滴内で反応を行なうことで、標的分子の有無をシグナルの有無で計測し、標的分子の数の絶対定量を行なうデジタル計測に利用されている。

微小液滴法では、一般に、オイルなどの連続相と、この連続相に分散した水溶液の液滴とから構成されるエマルジョンが使用される。

非特許文献１は、遠心ステップ液滴生成法を開示している。当該文献は、装置の注入口にオイルを充填し、このオイルを遠心によって液滴回収室に送った後で、同じ注入口から、サンプル溶液を導入し、遠心によって液滴生成を行うことを記載している。

このような液滴生成法に対して、反応液などの分散相液とオイルなどの連続相液とを、別個の供給部を介してマイクロ流路チップに供給し、チップ内で合流させてエマルジョン生成を行う方法が知られている。

特許文献１は、液滴アッセイに適している液滴を生成するためのそのようなシステム及び方法を開示している。当該文献は、生成された液滴を、ピペットチップ又は液滴ウェルからなる出口領域に輸送することを記載している。また、当該文献は、気泡トラップ（エアトラップ）を記載しており、この気泡トラップによって、サンプルとオイルとが、（陰圧又は陽圧などの）流体駆動力の適用までの間、実質的に離されることを記載している。

また、微小液滴法に関して、近年、装置の簡便化・迅速化の観点から、検出領域に液滴を単層に整列させて簡便にシグナルを測定する液滴アレイ測定が注目されている。

特許文献２及び３は、液滴を形成するための流路及び液滴を保持するための液滴保持部を有するマイクロ流路チップを開示している。特許文献２は、２以上の反応液同士を合流させた後、反応液とは混和しない非混和性液体を接触させることで液滴を形成させることを記載している。特許文献３は、分散相流入部と連続相流入部とから流入した分散相及び連続相を、流路を介して液滴生成部で接触させることで液滴化することを記載している。

非特許文献２は、チップ上で液滴を生成する方法及びそのための装置について記載している。当該文献に記載の方法は、送液前に、液滴アレイ部をオイルで充填する操作（充填操作）を含む。

欧州特許第２５５０５２８号明細書 特開２０１９－１７０３６３号公報 特開２０２０－１６９９１１号公報

Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｓｔｅｐ ｅｍｕｌｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｐｐｌｉｅｄ ｆｏｒ ａｂｓｏｌｕｔｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｂｙ ｄｉｇｉｔａｌ ｄｒｏｐｌｅｔ ＲＰＡ， Ｌａｂ Ｃｈｉｐ， ２０１５， １５， ２７５９－２７６６ １－Ｍｉｌｌｉｏｎ ｄｒｏｐｌｅｔ ａｒｒａｙ ｗｉｔｈ ｗｉｄｅ－ｆｉｅｌｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ ｆｏｒ ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ、Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ、２０１１、１１、３８３８－３８４５

連続相液及び分散相液を、マイクロ流路チップ上に別個に用意されているそれぞれの供給部に供給し、供給部からそれぞれの流路を通してエマルジョン形成部で合流させる方法は、液滴生成速度を速くすることができるなどの利点を有する一方で、分散相液の流量又は混合に問題を生ずることがあった。

本発明は、連続相液と分散相液とを別個にマイクロ流路チップに供給する方法において、改善されたエマルジョン生成方法を提供すること、及びそのような方法で使用することができる装置を提供することを目的とする。

本発明に係る上記の課題は、本発明に係る下記の態様によって解決することができる。
＜態様１＞
マイクロ流路チップに分散相液及び連続相液を供給してエマルジョンの生成を行う方法であって、
前記マイクロ流路チップが、分散相液保持部、分散相液流路、連続相液保持部、連続相液流路、エマルジョン形成部、エマルジョン流路、及び排出口を有しており、
前記分散相液保持部が、前記分散相液流路を介して、前記エマルジョン形成部に接続しており、
前記連続相液保持部が、前記連続相液流路を介して、前記エマルジョン形成部に接続しており、
前記エマルジョン形成部が、前記エマルジョン流路を介して、前記排出口に接続しており、
前記分散相液保持部に、分散相液を供給すること、
前記連続相液保持部に、連続相液を供給すること、及び、
外部送液駆動力の適用によって、前記エマルジョン形成部において、前記分散相液から構成される液滴及び前記連続相液から構成される連続相を含むエマルジョンを生成し、このようにして生成された前記エマルジョンを、前記エマルジョン流路に進入させること、
を含み、
前記連続相液が前記エマルジョン形成部に達する前に、前記分散相液を、気体で充填された状態の前記分散相液流路を通して、前記エマルジョン形成部への流入部にまで移動させること
を特徴とする方法。
＜態様２＞
前記外部送液駆動力の適用の前に、前記連続相液を、前記エマルジョン形成部にまで移動させることを特徴とする、態様１に記載の方法。
＜態様３＞
前記分散相液及び／又は前記連続相液を、毛細管力及び／又は液面差圧によって移動させることを特徴とする、態様１又は２に記載の方法。
＜態様４＞
前記排出口に陰圧を印加し、それにより、前記分散相液を、気体で充填された状態の前記分散相液流路を通して前記エマルジョン形成部への流入部にまで移動させることを特徴とする、態様１～３のいずれか一項に記載の方法。
＜態様５＞
前記流入部が、進入抑制構造を有しており、
この進入抑制構造は、前記外部送液駆動力の適用の前に前記分散相液が前記エマルジョン形成部に進入することを抑制することができること、
を特徴とする、態様１～４のいずれか一項に記載の方法。
＜態様６＞
前記外部送液駆動力が、前記排出口に適用される陰圧であることを特徴とする、態様１～５いずれか一項に記載の方法。
＜態様７＞
前記分散相液保持部が、第一分散相液保持部及び第二分散相液保持部を含み、
前記分散相液流路が、前記第一分散相液保持部に接続されている第一分散相液流路、前記第二分散相液保持部に接続されている第二分散相液流路、及び分散相液合流部を含み、
前記第一分散相液流路及び前記第二分散相液流路が、それぞれ、分散相液合流部を介して、前記エマルジョン形成部に接続している、
態様１～６のいずれか一項に記載の方法。
＜態様８＞
前記マイクロ流路チップが、エマルジョン保持流路をさらに有しており、
前記エマルジョン形成部が、前記エマルジョン流路を介して、前記エマルジョン保持流路に接続しており、かつ
前記エマルジョン保持流路が、前記排出口に接続しており、
前記排出口に陰圧を適用することによって、前記エマルジョン形成部において、前記分散相液から構成される液滴及び前記連続相液から構成される連続相を含むエマルジョンを生成し、このようにして生成された前記エマルジョンを、前記エマルジョン流路を介して、気体で充填された状態の前記エマルジョン保持流路に輸送すること、を含む、
態様１～７のいずれか一項に記載の方法。
＜態様９＞
分散相液保持部、分散相液流路、連続相液保持部、連続相液流路、エマルジョン形成部、エマルジョン流路、及び排出口を有している、マイクロ流路チップであって、
前記分散相液保持部が、前記分散相液流路を介して、前記エマルジョン形成部に接続しており、
前記連続相液保持部が、前記連続相液流路を介して、前記エマルジョン形成部に接続しており、
前記エマルジョン形成部が、前記エマルジョン流路を介して、前記排出口に接続しており、かつ、
前記分散相液保持部に分散相液を供給し、前記連続相液保持部に連続相液を供給し、かつ前記マイクロ流路チップに外部送液駆動力を適用することによって、前記エマルジョン形成部において、前記分散相液から構成される液滴及び前記連続相液から構成される連続相を含むエマルジョンが生成され、このようにして生成された前記エマルジョンが、前記エマルジョン流路に進入するように構成されており、
ここで、前記分散相液流路の、前記エマルジョン形成部への流入部が、進入抑制構造を有しており、この進入抑制構造が、前記外部送液駆動力の前記適用の前に前記分散相液が前記エマルジョン形成部に進入することを抑制することができることを特徴とする、
マイクロ流路チップ。

本発明によれば、連続相液と分散相液とを別個にマイクロ流路チップに供給する方法において、改善されたエマルジョン生成方法を提供することができる。

図１は、本開示の方法に係るマイクロ流路チップの１つの実施態様の平面概略図である。 図２は、本開示に係る進入抑制構造の１つの実施態様を示す断面概略図である。 図３は、本開示に係る分散相液保持部の１つの実施態様を示す断面概略図である。 図４は、本開示の方法に係るマイクロ流路チップの別の実施態様の平面概略図である。

≪エマルジョンの生成を行う方法≫
本開示に係る方法は、マイクロ流路チップに分散相液及び連続相液を供給してエマルジョンの生成を行う方法であって、
マイクロ流路チップが、分散相液保持部、分散相液流路、連続相液保持部、連続相液流路、エマルジョン形成部、エマルジョン流路、及び排出口を有しており、
分散相液保持部が、分散相液流路を介して、エマルジョン形成部に接続しており、
連続相液保持部が、連続相液流路を介して、エマルジョン形成部に接続しており、
エマルジョン形成部が、エマルジョン流路を介して、排出口に接続しており、
分散相液保持部に、分散相液を供給すること、
連続相液保持部に、連続相液を供給すること、及び、
外部送液駆動力の適用によって、エマルジョン形成部において、分散相液から構成される液滴及び連続相液から構成される連続相を含むエマルジョンを生成し、このようにして生成された前記エマルジョンを、エマルジョン流路に進入させること、
を含み、
連続相液がエマルジョン形成部に達する前に、分散相液を、気体で充填された状態の分散相液流路を通してエマルジョン形成部への流入部にまで移動させることを特徴とする。

マイクロ流路チップでエマルジョンを生成する方法として、連続相液及び分散相液を、マイクロ流路チップ上に別個に用意されているそれぞれの供給部に供給し、供給部からそれぞれの流路を通してエマルジョン形成部で合流させてエマルジョンを生成する方法を用いることができる。この方法は、連続相液及び分散相液を１つの同一の保持部から供給する方法（例えば非特許文献１の方法）と比較して、エマルジョン形成部１つ当たりの液滴生成速度を速くすることができるなどの利点を有する。

一方で、別個の供給部を用いる方法では、連続相液が分散相液流路に進入した場合に、分散相液流路における分散相液の流れが不安定化しやすく、それによって分散相液の流量が不安定になる傾向があった。

また、特に、２種類の分散相液をマイクロ流路チップ内で混合する場合、このような分散相液の流量の不安定化は、２つの分散相液の不均一な混合比につながる。これは、検出反応の精度の低下をもたらしうる。

理論によって限定する意図はないが、分散相液流路の壁面に連続相液が残留することが、その要因の１つであると考えられる。特に、連続相液としてフッ素系分散媒のような表面張力及び粘性が比較的小さい液体を用いる場合には、連続相液が毛管現象等によって素早く流動して分散相液流路に進入しやすく、また、流路に連続相液が残留しやすいと考えられる。また、２つ以上の分散相液を流路内で混合することができる分散相液合流部を含むマイクロ流路チップを用いる場合、分散相液流路、分散相液合流部及び分散相液保持部に充填された連続相液が、液滴の生成の間も流路内に残留し、分散相液合流部における分散相液の層流化による液滴内の均一な混合を阻害すると考えられる。なお、残留した連続相液による均一な混合の阻害は、連続相液が流路壁面と分散相液との間に薄い層を形成することが原因と考えられるため、界面活性剤を添加せずに連続相液―分散相液界面の安定性を低下させることで連続相液の薄い層が除去されやすくなると考えられるが、これは、安定な液滴の生成及び保持に対して相反する効果を示すことがあるため、好ましくない。なお、エマルジョン形成前の分散相液の混合を抑制する目的のため、分散相液合流部の層流状態を維持したままエマルジョン形成を行う例を示したが、例えば攪拌を促す構造（マイクロミキサー構造）を有する分散相液合流部であっても、分散相液同士の界面の挙動が不安定化し、液滴内の均一な混合を阻害すると考えられる。

本発明では、連続相液がエマルジョン形成部に達する前に、分散相液を、気体で充填された状態の分散相液流路を通してエマルジョン形成部への流入部にまで移動させる。本発明の方法によれば、分散相液が分散相液流路内を進行して分散相液流路を塞ぐので、連続相液は、分散相液流路内に進入することができず、結果として、連続相液が分散相液流路に逆流して残留するという問題を抑制又は防止することができると考えられる。

図１に示すマイクロ流路チップを用いて、本発明を具体的に説明する。なお、図１のマイクロ流路チップは例示的な実施態様の概略図であり、本発明に係る方法は、この実施態様に限られず、種々のマイクロ流路チップで実施することができる。図１は、理解を容易にするための概略図であり、縮尺どおりではない。

図１のマイクロ流路チップは、平面型の構成を有しており、すなわち、エマルジョンの生成及び輸送が、実質的に１つの平面内で行われるようになっている。図１の方向Ｗは、幅方向を示しており、方向Ｌは、長さ方向を示している。Ｗ及びＬに垂直な方向が、鉛直方向である。図１のマイクロ流路チップ１０は、第一分散相液保持部１０２、第二分散相液保持部１０３、分散相液流路１１７、連続相液保持部１０１、連続相液流路１１１、エマルジョン形成部１２０、エマルジョン流路１３０、及び排出口を１５０有している。分散相液保持部１０２、１０３が、分散相液流路１１７を介して、エマルジョン形成部１２０に接続しており、連続相液保持部１０１が、連続相液流路１１１を介して、エマルジョン形成部１２０に接続している。図１に係る態様では、分散相液流路１１７が、第一分散相液流路１１４、第二分散相液流路１１５、及び分散相液合流部１１６を有しており、連続相液流路１１１が、第一連続相液流路１１２及び第二連続相液流路１１３を有している。エマルジョン形成部１２０が、エマルジョン流路１３０を介して、排出口１５０に接続している。

本開示に係る方法では、検出対象となる物質を含有する水溶性反応液などの分散相液を、分散相液保持部１０２、１０３に供給し、オイルなどの連続相液を、連続相液保持部１０１に供給する。この時点で、マイクロ流路チップ１０の各流路には気体（特には空気）が充填されている（すなわち、「空」のマイクロ流路チップを用いる）。本発明に係る方法では、マイクロ流路チップの流路を連続相液であらかじめ充填せずに分散溶液及び連続相液をチップに供給するので、準備工程を省略することができる。

なお、空のマイクロ流路チップとは、流路内が気体（特には空気）で充填された状態のことを指し、流路全体に液体（例えば、分散相液、連続相液など）がない状態、すなわち流路全体が気体で充填されている状態が好ましい。なお、マイクロ流路チップの流路内に表面処理や空気中の水の凝結等によって液体が残留・発生していてもこの限りではないが、少なくとも流路の一部が液体によって閉塞していないことが好ましく、特に、分散相液流路、連続相液流路、エマルジョン形成部が閉塞していないことが好ましい。

図１のマイクロ流路チップ１０は、例えば毛細管力及び／又は液面差圧によって分散相液及び連続相液をそれぞれの保持部からそれぞれの流路を通してエマルジョン形成部１２０にまで移動させることができるように構成されている。したがって、各保持部１０１、１０２、１０３に供給された分散相液及び連続相液は、エマルジョン形成部１２０の方向（下流）に向かって移動する。なお、この移動（特には分散相液の移動）のために、外部から印加される圧力（特には排出口に印加される陰圧）を用いてもよい。

本発明によれば、連続相液がエマルジョン形成部１２０に達する前に、分散相液を、気体で充填された状態の分散相液流路１１７を通して、エマルジョン形成部１２０への流入部１１８にまで移動させる。流入部１１８は、分散相液流路(特には分散相液合流部）のうち、エマルジョン形成部１２０に隣接している部分である。本発明の方法によれば、分散相液が分散相液流路１１７内を進行して分散相液流路１１７を塞ぐので、連続相液は、分散相液流路１１７内に進入することができず、結果として、連続相液が分散相液流路１１７に逆流して残留するという問題を抑制することができる。

本発明では、外部送液駆動力によって、エマルジョン形成部１２０において、分散相液から構成される液滴及び連続相液から構成される連続相を含むエマルジョンを生成し、このようにして生成されたエマルジョンを、エマルジョン流路１３０に進入させる。外部送液駆動力としては、陰圧又は陽圧を用いることができる。陰圧の適用は、例えば、マイクロ流路チップ１０の排出口１５０に接続された吸引装置によって行うことができる。また、陽圧の適用は、例えば、分散相液保持部１０２及び１０３並びに連続相液保持部１０１に接続された圧力印加装置によって行うことができる。

＜移動＞
上述のとおり、本発明では、連続相液がエマルジョン形成部に達する前に、分散相液を、気体で充填された状態の分散相液流路を通して、エマルジョン形成部への流入部にまで移動させる。本開示に係る１つの実施態様では、外部送液駆動力なしでも分散相液が移動できる程度に、エマルジョン形成部及びその上流の流路抵抗が、十分に小さい。

好ましくは、分散相液がエマルジョン形成部への流入部に到達した後で直ぐに（特には、分散相液がエマルジョン形成部の中に進入する前に）、連続相液をエマルジョン形成部に進入させる。この場合には、エマルジョン形成部が分散相液によって閉塞されてしまうこと、及びそれに伴う気泡の発生を防止することができる。

なお、分散相液がエマルジョン形成部に進入した後であっても、分散相液がエマルジョン形成部を充填して閉塞する前に連続相液をエマルジョン形成部に進入させることで、流路閉塞を防止することができる。

また、特に好ましくは、外部送液駆動力の適用の前に、連続相液を、エマルジョン形成部にまで移動させる。外部送液駆動力を適用して送液を開始する前に連続相液をエマルジョン形成部まで移動させておくことによって、連続相液流路に存在する気体に起因する気泡の発生（流路閉塞）をさらに効果的に抑制することができる。

このような分散相液及び／又は連続相液の移動は、例えば、毛細管力及び／又は液面差によって行うことができる。この態様によれば、追加的な装置を必要とすることなく、容易に、分散相液及び連続相液の移動を制御することができる。例えばマイクロ流路チップの流路構造（流路表面の特性、流路の圧力損失など）を適宜設定することによって、所望の毛細管力を得ることができる。また、例えば各相液保持部に供給される液量（特には液面高さ）を調節することによって、所望の液面差圧を得ることができる。

毛細管力は、キャピラリー力とも呼ばれる力であり、大きく開けた保持部内の気液界面とより小さい断面を有する流路内の気液界面の表面張力差によって発生する流路に侵入する方向に働く力である。よって、毛細管力は各流路の特性だけでなく保持部の構造も影響し、特にエマルジョン充填法ではエマルジョンの気液界面の移動を制御するため、送液（液滴生成）中及び送液停止後の液滴保持中においても毛細管力が大きく影響する。

また、液面差圧は、静水圧とも呼ばれる力であり、一般に静止状態の液体中に重力によって発生する圧力、すなわち各保持部への各相液の供給量（重量）に依存した圧力を指す。

本開示に係る１つの実施態様では、外部送液駆動力なしでも分散相液と連続相液とが接触できる程度にエマルジョン形成部及びその上流の流路抵抗が十分に小さくなっており、それにより、例えば、（空の状態のマイクロ流路チップの）分散相液保持部に分散相液が供給された時点から、分散相液が連続相液と接触するまでの時間が、５分以内であるようになっている。この時間は、好ましくは３分以内であり、より好ましくは１分以内である。この場合には、エマルジョンの生成（及び随意に保持）に要する時間をさらに短縮することができる。

上記の移動のために、外部から印加される圧力を用いてもよい。特に、排出口に陰圧を印加し、そのようにして、分散相液を、気体で充填された状態の分散相液流路を通してエマルジョン形成部（特にはエマルジョン形成部への流入部）にまで移動させることができる。一般に、分散相液は流路表面に対して親和性が低いため、分散相液の移動速度を増大させるのが好ましい。その手段の１つとして陰圧を用いることで、装置を簡便化することができる。なお、外部から印加される圧力については、外部送液駆動力に関する下記の記載を参照することができる。

特に好ましくは、分散相液が分散相液流路を充填し、かつ、連続相液が連続相液流路及びエマルジョン形成部を充填している状態となった後で、外部送液駆動力を適用する。

各保持部に陽圧を印加することで上記の接触前の移動を制御する場合、流路内の微小量の各相液を制御するには、陽圧供給源を小さな圧力に制御し、かつ／又は陽圧の印加時間を極めて小さい時間に制御する必要があるため、装置として再現性が低下するおそれがある。

一方で、例えば連続相液を供給する前に分散相液が分散相液流路内を移動する際に排出口に陰圧を印加する場合、連続相液流路及び連続相液保持部は液体で閉塞していないため、排出口から連続相液保持部への流路は外気に開放されている状態となり、陰圧供給源が有する陰圧よりも小さい陰圧が分散相液に印加されることになるので、流路内の微小量の分散相液の移動を精度よく制御する上で、印加圧力を小さく制御しやすいため装置として再現性を確保しやすく好ましい。

（進入抑制構造）
本開示に係る好ましい実施態様では、流入部が、進入抑制構造を有しており、この進入抑制構造は、外部送液駆動力を適用する前に分散相液がエマルジョン形成部に進入することを、抑制することができる。なお、「流入部」は、分散相液流路（特には分散相液合流部）のうち、エマルジョン形成部に隣接する部分である。

進入抑制構造によって分散相液をエマルジョン形成部への流入部に留めておくことで、分散相液及び連続相液の到達のタイミングを制御することがより容易になり、流路閉塞及び気泡の発生をさらに効果的に抑制することができる。

進入抑制構造の具体的な設計は、所望の機能、すなわち、外部送液駆動力を適用する前に分散相液がエマルジョン形成部に進入することを抑制するという機能を発揮する限り、特に限定されない。進入抑制構造の具体的な設計は、使用する分散相液及び連続相液の種類、供給される分散相液及び連続相液の量、エマルジョン形成部以外のマイクロ流路チップの流路構造（流路表面の特性、流路の圧力損失など）などに応じて適宜決定することができる。

好ましくは、気体で充填されている分散相液流路を毛細管力及び／又は液面差圧（及び／又は陰圧）によってエマルジョン形成部に向かって移動してくる分散相液が、進入抑制構造によって流入部で停止し、かつ外部送液駆動力の適用がない限り流入部を超えてエマルジョン形成部の内部に進入しないように、進入抑制構造及びその他の流路が、構成されている。

進入抑制構造は、例えば、流入部からエマルジョン形成部へ向かう方向で、流路断面（流路断面面積）、特には流路高さ、が急激に増加するような構造であってよい。このような構造とすることによって、分散相液のさらなる移動を阻害する局所的な力を発生させることができる。この局所的な力は、分散相液に対する進入抑制構造の流路壁面の親和性が低いほど起こりやすく、例えば、分散相液が水溶液であり、前記分散相液流路の壁面への前記水溶液の接触角が３０度以上、より好ましくは４５度以上、特に好ましくは６０度以上であるとよい。なお、上部構造体と基材に別の素材を使用する場合、例えば、上部構造体としてＰＤＭＳ、基材としてガラスを使用する場合、進入抑制構造における流路断面内で壁面の分散相液への親和性が部分的に低くなる場合があるが、良好に侵入抑制構造が機能するように設計することも可能である。

マイクロ流路チップの製造の観点から、一般的に、流路構造は天地方向（鉛直方向）に対して水平に液体が流れるように配置されているため、流路上面及び流路底面において、エマルジョン形成部への流入角度は実質的にゼロ（又は１８０°）の場合が多い。特にそのような場合に、分散相液流路及びエマルジョン形成部の流路上面（及び／又は流路底面）が、同一平面上に存在せず、かつ流入部からエマルジョン形成部へ向かう方向で、流路断面（流路断面面積）が増加する態様、すなわち流路の高さが急激に増加する態様（いわゆる「段差」構造）が、好ましい。例えば、エマルジョン形成部の内部の底面（床部）が、それに接続する流入部の内部の底面よりも低い位置にあることによって、若しくはエマルジョン形成部の内部の上面（天井部）が、それに接続する流入部の内部の上面よりも高い位置にあることによって、又はこれらの両方によって、実施することができる。なお、ここでの「底面」及び「上面」は、マイクロ流路チップの通常の使用状態における上下方向（特には鉛直方向）に基づいて規定することができる。また、段差構造において、分散相液流路の流路上面とエマルジョン形成部の流路上面とは（かつ／又は、分散相液流路の流路底面とエマルジョン形成部の流路底面とは）、滑らかに接続されているよりも、角張って（不連続的かつ鋭角に）接続されている方が、分散相液がよりエマルジョン形成部へ侵入しにくくなるため好ましい。

図２は、本開示に係る進入抑制構造の１つの実施態様を示す断面概略図である。図２は、理解を容易にするための概略図であり、縮尺どおりではない。図２のＨは高さ方向を示し、Ｌは長さ方向を示す。図２の進入抑制構造２００は、いわゆる「段差」構造を有している。具体的には、エマルジョン形成部１２０の流路上面と、分散相液流路の流入部１１８の上面とが、同一平面上になく、流入部１１８からエマルジョン形成部１２０へ向かう方向で、流路の高さが急激に増加している。

図２の進入抑制構造２００では、分散相液流路の流入部１１８の流路上面と、エマルジョン形成部１２０の流路上面とが、不連続的に接続されており、かつ、分散相液流路の流路底面と、エマルジョン形成部の流路底面とが、不連続的に接続されている（特に、図２では、壁面が角を有するようになっている）。ただし、流路の上面又は底面のいずれか一方が不連続に接続されていてもよく、特には、上面のみが不連続に接続されている。

図２の進入抑制構造２００では、エマルジョン形成部１２０の流路上面と、分散相液流路の流入部１１８の上面とが、エマルジョン形成部１２０の壁面を構成する接続部２２０ａによって接続されている。底面についても、同様に、接続部２２０ｂによって接続されている。接続部２２０ａが、分散相液流路の流入部１１８の流路上面に対して９０°の角度α１で配置されており、かつ、接続部２２０ｂが、分散相液流路の流入部１１８の流路底面に対して９０°の角度α２で配置されている。接続部と、流入部の上面又は底面との間の角度は、４５～１３５°、６０～１２０°、７５～１０５°、８５°～９５°、又は実質的に９０°であってよい。

壁面における不連続的な部分（図２で符号２３０ａ又は２３０ｂで示されている部分）の丸みを円と仮定したときの半径、いわゆる角Ｒは、例えば０．３ｍｍ以下、０．１５ｍｍ以下、０．５ｍｍ以下、０．３ｍｍ以下、０．１ｍｍ以下、０．０５ｍｍ以下、０．０３ｍｍ以下、０．０１ｍｍ以下、０．００５ｍｍ以下、０．００３ｍｍ以下、又は０．００１ｍｍ以下であるのが好ましい。

なお、上記では、便宜上、流路底面及び流路上面の存在を定義したが、流路断面形状は、円状、半円状、楕円状、凸型、凹型、長方形、又は台形でもよい。

特には、流入部に隣接する部位において、エマルジョン形成部が、流入部に対して、１．１倍以上、１．２倍以上、１．３倍以上、１．５倍以上、２倍以上、３倍以上、５倍以上、又は１０倍以上の流路高さを有することができる。特に好ましくは、流入部に隣接する部位において、エマルジョン形成部が、流入部に対して、５倍以下、３倍以下、２倍以下、若しくは１．５倍以下である。この場合には、陰圧送液の際に分散相液に対する連続相液の流量比が過度に増加して液滴生成速度が低下することを、抑制することができる。なお、ここでの流路高さは、マイクロ流路チップの通常の使用状態において鉛直方向で計測することができ、流路内部の底面から上面までの距離として測定することができる。

分散相液が、エマルジョン流路への流入部と連続相液流路とが形成するエマルジョン形成部の流路側面に接触するまで進入すると、直ちにエマルジョン形成部が分散相液によって流路閉塞される。したがって、分散相液流路からの流入部付近の流路側面とエマルジョン流路への流入部付近の流路側面との距離は、離れていた方が好ましく、例えば、エマルジョン形成部の流路高さの１倍、１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、５倍、１０倍であると良い。ただし、この距離はエマルジョン生成の安定性に関わるため、実施形態に合わせて調整するのが特に好ましい。

（分散相液流路の壁面)
測定時間を短縮する観点からは、分散相液が分散相液流路を通ってエマルジョン形成部まで到達させる時間（到達時間）を早くすることが望ましい。しかし、液滴生成の安定性の観点からは分散相液に対して親和性が低い流路表面が望ましいため、分散相液として表面張力及び／又は粘性が高い液体を使用する場合は、この到達時間が極端に遅くなる場合がある。この場合、分散相液への界面活性剤等の添加や、流路表面の分散相液への親和性を調整することができる。

以下で、本開示に係る発明を構成する各構成要素及びその実施態様についてさらに詳細に説明する。

＜エマルジョン＞
本開示に係る方法によって生成されるエマルジョンは、分散性溶液であり、分散相液から構成される液滴、及び、連続相液から構成される連続相を含む。エマルジョン中で、分散相液から構成される液滴が、連続相液から構成される連続相に分散している。

（分散相液）
分散相液は、エマルジョンに含有される液滴を構成する液体である。

分散相液は、例えば、水溶液であってよい。分散相液は、随意に、界面活性剤、有機溶剤、増粘剤、血清、酵素などを含有することができる。分散相液は、反応液であってよく、例えば、後述する検出処理において検出対象となる試料を含有する液体、検出用の試薬を含有する液体、又はこれらの混合液であってよい。

（連続相液）
連続相液は、エマルジョンに含有される連続相を構成する液体である。

連続相液は、分散相液と混和しない非混和性液体であることが好ましい。例えば、分散相液が水溶液である場合、連続相液はオイルであってよく、この場合、ウォーターインオイル（Ｗ／Ｏ）型エマルジョンが形成される。

連続相液がオイルである場合、オイルとしては、シリコーンオイル、鉱油、フッ素系分散媒、植物油、又はこれらの組み合わせが挙げられる。

フッ素系分散媒としては、フルオロカーボン、特には、ペルフルオロヘキサン、ヘキサフルオロベンゼン、ペルフルオロメチルシクロヘキサン、ペルフルオロオクタン、及びペルフルオロトリペンチルアミンが挙げられる。

市販されているフルオロカーボンとしては、ＦＣ－３２８３（フロリナート（商品名）３Ｍ社製）、ＦＣ－４０（フロリナート（商品名）３Ｍ社製）、及びＨＦＥ－７５００（３Ｍ^ＴＭＮｏｖｅｃ^ＴＭ高機能性液体、３Ｍ社製）が挙げられる。

連続相液としてフッ素系分散媒、特に上記のフルオロカーボンを使用した場合には、特に安定かつ迅速な液滴生成が可能となる。また、極性溶媒や無極性溶媒に対して極めて相溶性が低い特徴を有するため、エマルジョン内の液滴の成分が連続相液を介して他の液滴に移動してしまう問題（クロストーク、コンタミ）を抑制することができる。また、炭化水素系分散媒やシリコーンオイルで表面張力や粘性の低い液体を選択する場合、一般的に可燃性等の危険物としてのリスクが増大するが、フッ素系分散媒は消火剤や冷却媒として利用されるほど安全性が高いのが特徴である。

なお、液滴の熱安定性の目的などのために、界面活性剤などの添加剤を連続相液に添加することもできる。これらの添加剤は、液滴における検出反応を阻害しないものであることが好ましい。界面活性剤としては、非イオン界面活性剤である、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのブロックコポリマーであるＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）およびＴＥＴＲＯＮＩＣ（登録商標）やＴｗｅｅｎ、Ｓｐａｎ、Ｚｏｎｙｌ（登録商標）など挙げられる。連続相液としてフッ素系分散媒を使用する場合、フッ素系界面活性剤を使用するのが好ましい、例えばパーフルオロポリエーテルとポリエチレングリコールのブロックコポリマー等が挙げられる。

（液滴）
エマルジョンに含有される液滴は、分散相液から構成される。液滴は、例えば、分散相液が連続相液との接触を介してカプセル封入されることによって形成される。

液滴は、例えば、検出対象となる試料を含有する。液滴中で、試料中に含有される標的物質と試薬とを反応させ、その反応の有無及び／又は反応の程度を示す検出可能なシグナル（例えば、蛍光シグナル）を介して、試料の分析を行うことができる。この反応は、例えば、化学反応、結合反応、表現型の変化、又はこれらの組み合わせであってよい。

液滴の体積は、標的物質をおおむね１つ（例えば１分子）保持できるだけの体積を有することが好ましい。具体的には、平均体積が、０．００００１ｎＬ以上、０．０００１ｎＬ以上、０．００１ｎＬ以上、０．０１ｎＬ以上、０．１ｎＬ以上、若しくは１ｎＬ以上、かつ／又は、１００ｎＬ以下、５０ｎＬ以下、若しくは１０ｎＬ以下であることが好ましい。なお、液滴内における標的分子の反応を均一に行なう観点から、形成する液滴の体積は単分散性が高いと好ましい。ここでいう単分散性とは、具体的には、液滴体積の変動係数（ＣＶ）が２０％以下、１０％以下、５％以下、２％以下、又は１％以下のことをいう。なお、下記では説明をわかりやすくするため、液滴を球状として取り扱うが、流路構造や周囲の流れによって液滴が非球状になっていても同様に考えてよい。

液滴は、少なくとも標的物質の反応温度条件下で液滴の形状を維持できるだけの熱安定性を有していることが好ましい。具体例として、検出処理において、ＴＲＣ法による核酸増幅を行う場合は、４０℃～４８℃の温度条件下で、ＰＣＲ法による核酸増幅を行う場合は、５０℃～１００℃の温度条件下で、それぞれ、形状を維持できるだけの熱安定性を液滴が有していることが好ましい。

＜マイクロ流路チップ＞
本開示のマイクロ流路チップは、分散相液保持部、分散相液流路、連続相液保持部、連続相液流路、エマルジョン形成部、エマルジョン流路、及び排出口を有している。分散相液保持部が、分散相液流路を介して、エマルジョン形成部に接続しており、連続相液保持部が、連続相液流路を介して、エマルジョン形成部に接続しており、エマルジョン形成部が、エマルジョン流路を介して、排出口に接続している。なお、マイクロ流路チップは、エマルジョン保持流路をさらに有することができる。

分散相液保持部、分散相液流路、連続相液保持部、連続相液流路、エマルジョン形成部、エマルジョン流路、（随意のエマルジョン保持流路）、及び排出口は、互いに流体的に接続され、全体として１つの流路構造を形成する。

特には、この流路構造は、分散相液保持部、連続相液保持部、及び排出口のみを介して、外部雰囲気（特には外部大気）に接続しうるようになっている。

本開示に係るマイクロ流路チップは、例えば、基材、及び基材の上に配置されている上部構造体を有している。好ましくは、上部構造体が、流路構造、すなわち、分散相液保持部、分散相液流路、連続相液保持部、連続相液流路、エマルジョン形成部、エマルジョン流路、（随意にエマルジョン保持流路）、及び排出口を有している。基材は、ガラスからできていてよい。上部構造体は、樹脂からできていてよい。マイクロ流路チップは、例えば、樹脂製の上部構造体と、マイクロ流路チップの底部を構成するガラス基材とを貼り合わせて作製することができる。

マイクロ流路チップを構成する流路の大きさ（幅及び深さなど）は、目的とする液滴の体積などを考慮して適宜決定することができ、特には、標的物質の反応形態を考慮して適宜決定することができる。例えば、標的物質がＤＮＡやＲＮＡなどの核酸であり、標的物質の反応が当該核酸のデジタル増幅反応（１分子単位での増幅反応）である場合は、ｐＬオーダー又はｎＬオーダーの液滴を作製することが必要なため、エマルジョン形成部の周辺の流路の幅及び深さが、それぞれ、０．１μｍ～１０００μｍ、特には１μｍ～３００μｍの範囲であることが好ましい。

マイクロ流路チップは、流路構造を正確かつ容易に作製可能なモールディング若しくはエンボッシングなどの鋳型を用いた技術、又は、フォトリソグラフィー、ソフトフォトリソグラフィー、ウェットエッチング、ドライエッチング、ナノインプリンティング、レーザー加工、電子線直接描画、積層造形法（ＡｄｄｉｔｉｖｅＭａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ、ＡＭ）、機械加工など、当業者が通常用いる技術を組み合わせて作製することができる。

マイクロ流路チップの作製に用いる材料として、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）及びアクリルなどのポリマー材料、ステンレスなどの金属材料、ガラス、シリコーン、セラミックスなどがあげられる。これらの中でも、ポリマー材料は、流路自体を安価に作製でき、ディスポーザブルな態様としやすい。したがって、ポリマー材料を少なくとも部分的に用いることが好ましい。

（分散相液保持部）
分散相液保持部は、エマルジョンを生成するための材料となる分散相液を保持する部分である。分散相液保持部は、例えば、マイクロ流路チップの使用状態において鉛直方向に延在する穴部及び／又はウェルであってよく、この穴部及び／又はウェル内に、分散相液を供給しかつ保持することができるようになっている。分散相液保持部は、例えば、直径０．１ｍｍ～２０ｍｍの穴部及び／又はウェルから構成されていてよい。分散相液保持部が穴部及びウェルから構成される場合、鉛直方向に延在するウェルが、鉛直方向に延在する穴部を介して、分散相液流路に接続することができる。

図３は、本開示に係る分散相液保持部の１つの実施態様を示す断面概略図である。図３は、理解を容易にするための概略図であり、縮尺どおりではない。図３のＨは高さ方向であり、Ｌは長さ方向である。図３に示されている分散相液保持部３００は、ウェル３１及び穴部３３を有している。ウェル３１が、穴部３３を介して、分散相液流路１１５に接続している。ウェル３１及び穴部３３は、高さ方向（ここでは鉛直方向）に延在している。図３の符号３５は、ウェルの底面と穴部とのつなぎ目である拡張部位を示す。図３の実施態様では、ウェル３１の底面が、穴部３３の延在方向（特には拡張部位３５近傍における穴部３３の側壁）に対して垂直に延在している。

分散相液保持部に関しては、下記に従ってさらなる最適化を行うことが好ましい。

送液中の駆動力としては、主に、送液圧力（陽圧、陰圧）及び／又は液面差圧（静水圧）及び／又は毛細管力（キャピラリー力）が働く。このうち、毛細管力は、送液中の流路下流（特にはエマルジョン保持流路）の気液界面（及び固液界面）の表面張力と各保持部内の気液界面（及び固液界面）の表面張力の差によって決定される。すなわち、各保持部における気液界面の形状（壁面への濡れ挙動）によって流路内送液速度などが変化するため、特に、流路内の気液界面を制御することによって送液（エマルジョン生成及び保持）を行うエマルジョン充填法において、各保持部の形状は、安定な送液を実現するための重要な因子である。特に、一般的なエマルジョン生成チップでは、少なくともエマルジョン形成部の流路壁面を分散相液に対して親和性の低い表面（分散相液が水性液体であれば疎水表面）にすることで安定なエマルジョン生成が実施可能となるため、チップ製造コストの観点から流路内表面処理や別基板を組み合わせていない場合、分散相液保持部の壁面も分散相液に対して親和性の低い表面になるのが一般的である。このとき、分散相液保持部において界面形状の変化に伴う気液界面の表面張力の変化量が大きくなるため、送液への影響がより大きくなる。

上述のような毛細管力の変化を低減する観点からは、実質的に壁面に不連続な形状が無く、垂直方向に延在する穴部及び／又はウェルが好ましい。また、分散相液保持部の分散相液の残量が少なくなると、気液界面が保持部のウェルの底面に実質的に接触し界面形状が変化しやすくなるため、その影響を低減するため流路と直接流体接続している穴部及び／又はウェルの口径は小さい方が好ましく、例えば５ｍｍ以下、より好ましくは２ｍｍ以下、特に好ましくは１ｍｍ以下であってよい。一方で、分散相液流路と直接流体接続している穴部又はウェルから径を拡張することで分散相液の保持量を増加させることもできるが、この場合は、気液界面が拡張部位付近に存在すると気液界面形状が変化しやすい。したがって、１つの好ましい態様として、拡張部位の形状を調整することができ、かつ／又は流路と直接流体接続している穴部若しくはウェルの拡張部位までの高さを小さくすることができ、例えば３ｍｍ以下、より好ましくは１ｍｍ以下、特に好ましくは０．５ｍｍ以下とすることができる。さらに、分散相液の供給量が少なくかつ／又は分散相液保持部周辺のチップ外部表面が分散相液に対して親和性が低く、かつ外部送液駆動力が排出口への陰圧印加である場合には、穴部のみの構成として、穴部に半球面状となるように分散相液を供給すると、チップ壁面への接触面積を最小限とし、分散相液の残量が少なくなっても気液界面の形状の変化を抑制できるため好ましい。

なお、外部送液駆動力として陽圧を用いる場合、分散相液保持部が、陽圧源と接続することに適していることが好ましい。この場合、分散相液保持部が、印加される圧力に対する耐性を有することが好ましい。

（分散相液の供給）
本開示に係る方法は、分散相液保持部に分散相液を供給することを含む。

分散相液の供給は、分注手段によって行うことができる。

分散相液保持部に分散相液を供給するために、分散相液を保持するために別個に用意される別容器（相液保持容器）を用いることもできる。このような容器は、保管中及び操作中における液の流出を防止する観点から、分散相液を保持した状態で完全に又は可変的に密閉されていることが好ましい。

また、分散相液の供給（及び／又は連続相液の供給）は、分注手段によって行うことができる。分注手段の使用は、分散相液の残量を抑制し、かつ測定時間及び／又は試薬（分散相液）間のコンタミを抑制できる点で、好ましい。

例えば、分注手段を用いて各保持部に各相液を滴下し、又は、各保持部の壁面に沿って各相液を導入することができる。これは、送液を陰圧で行う場合に、特に有利である。従来の供給方法、特に、各保持部にチューブ又はマニフォールドを流体接続（密閉接続）させて各保持部への液導入及び送液圧力を同時に行う方法では、接続時の不意の圧力変動及び圧力の安定化までに要する時間に起因して、分散相液及び連続相液の進行を正確に制御することが容易でなく、流路閉塞なく分散相液と連続相液とを接触させることが困難であった。これに対して、分注手段を用い、かつ送液を陰圧で行う場合には、各保持部に相液供給用装置及び圧力源を接続する際の圧力の変動がなくなるので、陰圧適用前の各相液の移動及び分散相液と連続相液との接触をより正確に制御することが可能となり、結果として、気泡の発生をさらに効果的に抑制することができる。

分注手段は、保持部における圧力変動を生じないものであることが好ましい。分注手段は、例えばピペットであってよい。好ましくは、分注手段（特に、分注手段を構成する液吐出口）が、各保持部に対して流体接続（密閉接続）されておらず、空間的に離されている。

例えば、分注手段は、ポンプ、アクチュエーター、ピペットを含む機構であってよく、別容器に保持された各相液をポンプによって吸い上げ、アクチュエーターによって各保持部までピペット先端を移動した後、ポンプによって各保持部に各相液を押し出す動作を行うことが好ましい。加えて、各相液が接触したピペット等の一部は取り外し可能で使用毎に取り換えることができると、コンタミが抑制できるので好ましい。さらに、分注手段のポンプを送液手段として併用すると、装置構成が簡便化できるため好ましい。また、繰り返し使用が意図される場合、使い捨てのピペットを含む分注手段によって相液を添加しても良いし、共通のラインを使用して相液保持容器からマイクロ流路チップへ添加を行っても良い。後者の場合、連続相液への分散相液のコンタミ抑制のため、マイクロ流路チップへの接続部までの共用のラインを洗浄する工程を含んでいることが好ましい。また、ピペットを含まない分注手段として、外力によって、相液を保持した容器から直接保持部に各液体を添加（滴下）する方法も好ましい（例えば、容器の熱圧着した部位を圧力によって破断させ容器内の液体を押し出す手段など）。また、例えばＴＲＣ反応やＰＣＲ反応を行う場合、水溶液サンプルの精製手段や調製手段として分注手段を併用してもよい。

（分散相液流路）
分散相液流路は、分散相液保持部とエマルジョン形成部とを接続している。分散相液流路は、分散相液がその中を通るように構成されている。なお、分散相液に加えて連続相液が分散相液流路を通ることを想定することもできる。

分散相液流路の寸法は、使用する分散相液の種類及び特性などに応じて適宜設定することができる。分散相液流路は、例えば、１０～５００μｍ、又は５０～２００μｍの幅を有することができ、１ｍｍ～５００ｍｍ、又は１０～２００ｍｍの長さを有することができる。また、分散相液流路は、１～２００μｍ、又は１０～１００μｍの流路高さを有することができる。分散相液流路は、１つ以上の場所で屈曲してもよく、蛇行形状を有してもよい。

分散相液をエマルジョン形成部まで迅速に到達させるため、分散相液流路の長さは短い方が好ましい。上記の到達時間は流路断面積及び／または流路体積、流路圧損抵抗なども重要な因子であるため、実施形態に合わせて適宜調整するのが好ましい。

本発明において、エマルジョン形成部に到達した分散相液が連続相液と接触した後に、送液開始までの間に連続相液が分散相液流路を逆流しないことが好ましい。ただし、上記の逆流が生じるような場合でも、すでに充填されていた分散相液の存在によって連続相液の残留は抑制され得る。加えて、上記接触から送液開始までの時間を短縮することで逆流の影響を低減することも可能であり、例えば、前記接触前に排出口に陰圧駆動力を印加できる手段を有しているのが好ましい。よって、下記に示す逆流を抑制するための方策は好ましい対応であって、その方策によって本発明は限定されない。

上記の逆流現象は、１．連続相液が、分散相液よりも表面張力及び／または粘性が低いことに起因して、分散相液流路壁面と分散相液の間に連続相液の薄い層を形成しながら逆流する力、２．エマルジョン形成部における分散相液保持部への分散相液の供給量に依存した液面差圧（エマルジョン形成部における分散相液流路の流入部へのベクトル成分）、３．連続相液保持部への連続相液の供給量に依存した液面差圧（３と同じベクトル成分）、４．エマルジョン形成部からエマルジョン流路への連続相液の流動に起因した分散相液へのずり応力、に主に依存し、上記１及び３よりも上記２及び４が大きい状態であれば上記の逆流現象は発生しにくいため好ましい。上記１は各相液と流路壁面の物性に依存する値のため、上記の薄い層の形成を防止するのは困難であるが、流路断面積を大きくすることで、薄い層と分散相液の接触面積に対する分散相液の体積を増大させ、結果的薄い層の逆流によるずり応力によって流路断面中央の付近の分散相液も一緒に逆流することを抑制できる。また、分散相液流路の流路断面積大きくし、流路長さを短くすることで、流路圧損抵抗を低減させると、上記２の力がエマルジョン形成部まで伝わりやすくなるため好ましい。ただし、各保持部への陽圧送液の場合、送液開始時に分散相液流路の流路圧損抵抗がエマルジョン形成部下流方向への流路圧損抵抗の合計よりも小さいと、エマルジョン形成部においてエマルジョン流路方向だけでなく分散相液流路方向に連続相液が送液され（逆流）、エマルジョン生成が困難となるため、実施形態に合わせて分散相液流路の流路圧損抵抗を適宜設定するとよい。加えて、連続相液流路の流路断面積小さくし、流路長さを長くすることで、流路圧損抵抗を増大させ、上記３の力がエマルジョン形成部まで伝わりにくくなるため好ましいが、エマルジョン生成における連続相液と分散相液の流量比を調整するために、分散相液流路と連続相液流路の流路圧損抵抗比が重要であるため、実施形態に合わせて適宜設定すればよい。また、上記３の力はエマルジョン形成部におけるエマルジョン流路側の流出断面積と分散相液流路側の流入断面積にも依存する（断面積が大きい側に流れやすい）が、エマルジョン生成の安定性に重要なため、実施形態に合わせて適宜設定すればよい。上記４は連続相液がエマルジョン形成部、エマルジョン流路（及び随意にエマルジョン保持流路）を滑らかに移動することができれば、その間連続相液の移動速度に依存して継続して発生し続ける力であり、外力を加えない限り（液面差圧と毛細管力に依存して液移動している限り）、逆流を抑制しつづける。まとめると、上記の逆流を抑制するためには、分散相液流路の流路断面積を大きく、流路長さを小さくすることで流路圧損抵抗を小さくするのが好ましい。

本開示に係るマイクロ流路チップは、２つ以上の分散相液保持部、及びそれらにそれぞれ対応する２つ以上の分散相液流路を有することができる。

特には、本開示に係るマイクロ流路チップが、第一分散相液保持部及び第二分散相液保持部を有し、分散相液流路が、第一分散相液保持部に接続されている第一分散相液流路、第二分散相液保持部に接続されている第二分散相液流路、及び分散相液合流部を含む。第一分散相液流路及び第二分散相液流路は、それぞれ、分散相液合流部を介して、エマルジョン形成部に接続する。

２つ以上の分散相液保持部を用いることによって、例えば、分析用試料を含有する反応液と、検出用試薬を含有する反応液とを、別個にマイクロ流路チップに供給し、液滴を生成する直前まで両者が混合しないようにすることができる。これは、反応開始のタイミングをより良好に制御することができるので、好ましい。

一方で、２種類の分散相液を２つの分散相液流路を用いてそれぞれエマルジョン形成部に供給する場合、分散相液流路（特に分散相液合流部）における連続相液の残留は、２つの分散相液の不均一な混合比につながる。これは、検出反応の精度の低下をもたらしうる。本発明の方法によれば、分散相液流路における連続相液の残留を回避又は抑制することができるので、複数の反応液をチップ内で混合する場合に、混合比の均一性を確保することができる。

分散相液合流部を有するマイクロ流路チップにおいて、分散相液を、気体で充填された状態の分散相液流路を通してエマルジョン形成部（又はエマルジョン形成部への流入部）にまで移動させる場合には、第一分散相液保持部及び第二分散相液保持部にそれぞれ供給された第一分散相液及び第二分散相液を、分散相液合流部で合流させることが好ましい。

分散相液合流部で気泡による流路閉塞が起こると、エマルジョンの生成を行うことができなくなくおそれがある。特に陰圧で送液を行う場合には、一般的に水溶性である分散相液の性質に起因して、気泡による流路閉塞を解消することが容易ではない。第一分散相液保持部及び第二分散相液保持部にそれぞれ供給された第一分散相液及び第二分散相液を、分散相液合流部で合流させることによって、このような問題を回避することが可能となる。

（連続相液保持部）
連続相液保持部は、エマルジョンを生成するための材料となる連続相液を保持する部分である。連続相液保持部の構造は、連続相液を保持することができれば特に限定されない。連続相液保持部は、穴部又はウェルであってよく、例えば垂直方向に延在する穴部又はウェルであってよく、この穴部又はウェル内に連続相液を供給し、かつ保持することができるようになっている。連続相液保持部は、例えば、直径１ｍｍ～２０ｍｍの穴部又はウェルであってよい。

なお、連続相液は、一般に表面張力及び粘性が小さい液体を使用するため、連続相液保持部における界面形状の変化に伴う表面張力の変化量は小さい。したがって、連続相液保持部の形状は、送液に大きな影響を与えない。加えて、本発明において例えばエマルジョンを保持し検出反応などを行う場合、連続相液保持部の連続相液が枯渇しないように十分な量の連続相液を供給するため、送液中に保持部の連続相液の残量が少なくなり界面形状が変化しやすい状況になることもない。したがって、やはり、連続相液保持部の形状は、送液に大きな影響は与えにくい。

外部送液駆動力として陽圧を用いる場合、連続相液保持部が、陽圧源と接続することに適していることが好ましい。この場合、連続相液保持部が、印加される圧力に対する耐性を有することが好ましい。

（連続相液の供給）
本開示に係る方法は、連続相液保持部に連続相液を供給することを含む。

連続相液の供給は、分散相液の供給に関して上述したのと同様に、別容器を用いて、かつ／又は分注手段によって、行うことができる。例えば、分注手段を用いて保持部に相液を滴下し、又は、保持部の壁面に沿って相液を導入することができる。別容器、及び分注手段の詳細については、分散相液の供給に関する上記の記載を参照することができる。

（連続相液流路）
連続相液流路は、連続相液保持部とエマルジョン形成部とを接続している。連続相液流路は、連続相液がその中を通るように構成されている。

連続相液流路の寸法は、使用する連続相液の種類及び特性などに応じて適宜設定することができる。連続相液流路は、例えば、１０～５００μｍ、又は５０～２００μｍの幅を有することができ、１ｍｍ～５００ｍｍ、又は１０～２００ｍｍの長さを有することができる。また、連続相液流路は、１～２００μｍ、又は１０～１００μｍの流路高さを有することができる。連続相液流路は、１つ以上の場所で屈曲してもよく、少なくとも部分的に蛇行形状を有してもよい。

マイクロ流路チップは、２つ以上の連続相液流路を有することができる。特には、本開示に係るマイクロ流路チップが、第一連続相液流路及び第二連続相液流路を有しており、これらの流路が、それぞれ、連続相液保持部とエマルジョン形成部とを接続している。

図１の例示的な実施態様を参照すると、連続相液流路１１１が２つの流路（第一連続相液流路１１２及び第二連続相液流路１１３）から構成されている。これら２つの流路１１２、１１３は、エマルジョン形成部１２０において互いに対向するようになっており、かつ、エマルジョン形成部１２０に接続している分散相液流路１１７（より正確には、分散相液合流部１１６）に対して実質的に直交するようになっている。図１の実施態様では、第一連続相液流路１１２と第二連続相液流路１１３とが、実質的に同一の構造及び流路長を有しており、それにより、それぞれの流路を移動する連続相液の速度が、実質的に同一となるようになっている。また、上述のようにエマルジョン生成前における分散相液同士の混合を抑制したい場合、分散相液合流部１１６の下流部とエマルジョン形成部１２０とを連結する流路の長さは比較的短い方が好ましく（例えば、３ｍｍ以下、より好ましくは０．５ｍｍ以下）、流路内で分散相液が別々に層流状態を保っていることが好ましい。

（エマルジョン形成部）
エマルジョン形成部は、エマルジョンを生成するように構成されている。エマルジョン形成部は、分散相液流路及び連続相液流路を介して、それぞれ分散相液及び連続相液の供給を受ける。また、エマルジョン形成部は、エマルジョン流路に接続されており、エマルジョン形成部で生成されたエマルジョンが、エマルジョン流路に送られる。

エマルジョン形成部は、分散相液流路へと開く１又は複数の開口部、及び、連続相液流路へと開く１又は複数の開口部を有することができる。また、エマルジョン形成部は、エマルジョン流路へと開く１又は複数の開口部を有することができる。

図１の例示的な実施態様を参照して、エマルジョン形成部について説明する。図１のエマルジョン形成部１２０では、２つの流路１１２、１１３から構成される連続相液流路１１１と、分散相液流路１１７（より正確には、分散相液合流部１１６）とが、実質的に直交している。外部送液駆動力の適用の間に、連続相液が、２つの互いに実質的に対向する方向からエマルジョン形成部１２０へと流入し、かつ、分散相液が、連続相液の流入方向に対して実質的に直交する方向でエマルジョン形成部１２０に流入する。その結果、エマルジョン形成部１２０において、連続相に分散した液滴（すなわちエマルジョン）が生成される。このようにして生成されたエマルジョンが、エマルジョン流路１３０に進入する。

エマルジョン形成部は、Ｔ－ｊａｎｃｔｉｏｎ、Ｆｌｏｗ－Ｆｏｃｕｓ、ｃｏ－ｆｌｏｗ、ｓｔｅｐ－ｅｍｕｌｓｉｆｉｃａｔｉｏｎなどの一般的な液滴生成法を利用した流路を適宜用いることができる。迅速にエマルジョンを生成するために、複数のエマルジョン形成部を並列して配置してもよい。また、エマルジョン中の液滴を攪拌させるための蛇行流路などを備えていてもよい。

（エマルジョン流路）
エマルジョン流路は、エマルジョン形成部に接続し、かつ随意に、エマルジョン形成部とエマルジョン保持流路とを接続することができる。エマルジョン流路は、エマルジョン形成部と排出口（又はエマルジョン保持流路）とを接続する。エマルジョン流路のうちエマルジョン形成部に隣接する部位は、好ましくは、分散相液流路（特には分散相液合流部）に対向するように配置される。図１は、そのような態様のエマルジョン流路を示している。また、図１では、エマルジョン流路のうちエマルジョン形成部に隣接する部位が、連続相液流路のエマルジョン形成部への流入部に対して、実質的に直交している。図１の場合、エマルジョンが生成される際に、分散相液流路からエマルジョン形成部に流入してくる分散相液が液滴となり、そのまま流れの角度を変えずに、エマルジョン流路に進入する。

エマルジョン流路は、エマルジョン形成部に隣接する部位の下流側（排出口の方向）で、拡張した幅及び／又は高さを有する流路を有することができ、かつ／又は蛇行していることができる。このような態様によれば、液滴中での攪拌を促進することができるので、好ましい。

（エマルジョン保持流路）
本開示に係る方法のさらに別の実施態様では、マイクロ流路チップが、エマルジョン保持流路をさらに有しており、エマルジョン形成部が、エマルジョン流路を介して、エマルジョン保持流路に接続しており、エマルジョン保持流路が、排出口に接続している。外部送液駆動力を適用することによって、エマルジョン形成部において、分散相液から構成される液滴及び連続相液から構成される連続相を含むエマルジョンを生成し、このようにして生成されたエマルジョンを、エマルジョン流路を介して、エマルジョン保持流路に輸送する。

図４に示すマイクロ流路チップを参照して、この実施態様を具体的に説明する。図４は、理解を容易にするための概略図であり、縮尺どおりではない。図４のマイクロ流路チップは、エマルジョン保持流路を有している点、及び排出口の配置が異なっている点を除いて、図１と類似の構造を有する。下記では、相違点のみを説明する。

図４のマイクロ流路チップ２０は、エマルジョン保持流路１４０をさらに有している。エマルジョン形成部１２０が、エマルジョン流路１３０を介して、エマルジョン保持流路１４０に接続しており、エマルジョン保持流路１４０が、排出口１５０に接続している。

エマルジョン形成部１２０で生成されたエマルジョンを、エマルジョン流路１３０を介して、エマルジョン保持流路１４０に輸送する。

エマルジョン保持流路を有しているマイクロ流路チップを用いてエマルジョン生成及び保持を行う場合に、分散相液流路（特には分散相液流路の壁面）に連続相液が残留していると、エマルジョン保持流路における気泡の発生が増加することがある。これは、分散相液保持部が空になった場合に、残留した連続相液がいわば潤滑剤として働き、空になった分散相液保持部を介して、周囲雰囲気（特には周囲大気）から液滴保持流路へと気体（特には空気）が進入することによると考えられる。空になった分散相液保持部を介した気体の進入は、分散相液保持部が空になる前に送液を停止することで防止することができるが、この場合、未使用の分散相液が分散相液保持部に残るため、無駄が発生することになる。特に、分散相液として比較的高価な遺伝子検査用の反応液を用いる場合には、コストの増加を招くおそれがある。特に、分散相液として低濃度な核酸を標的物質として検出する遺伝子検査用の反応液を用いる場合には、上記の無駄によって検出感度や測定再現性の低下を招くおそれがある。

本発明によれば、分散相液流路への連続相液の進入、及び／又は分散相液流路における連続相液の残留を、抑制又は回避することができる。したがって、本発明を、エマルジョン保持流路を有しているマイクロ流路チップを用いて実施することによって、簡便かつ良好な安定性を有するエマルジョンの生成及び保持を実現することが可能となる。

本開示の方法では、エマルジョン形成部で生成されるエマルジョン（液滴＋連続相）を、気体で充填されているエマルジョン保持流路に輸送することができる。例えば、図４を参照すると、エマルジョン形成部１２０で生成されたエマルジョンを、エマルジョン流路１３０を介して、気体で充填された状態のエマルジョン保持流路１４０に輸送することができる（「エマルジョン充填法」）。なお、エマルジョン保持流路１４０は、エマルジョンが輸送される際に、完全に気体で充填されている必要はなく、例えば部分的に連続相液で充填されていてもよい。

このようなエマルジョン充填法では、エマルジョン形成部で生成されたエマルジョンが、気体で充填されているエマルジョン保持流路の中を（特には排出口の方向に向かって）移動し、エマルジョン保持流路を充填する。すなわち、エマルジョン保持流路を充填している気体とエマルジョンとによって形成される「気液界面」が、エマルジョン保持流路の下流（特には排出口）に向かって移動する。エマルジョン充填法は、マイクロ流路チップの流路をあらかじめ連続相液で充填する準備工程及びそのための装置を省くことができるため、好ましい。

エマルジョン保持流路の幅及び長さは、保持する液滴の体積・数等に合わせて適宜設定することができ、例えば、幅と長さとがほぼ同等の幅広い単純な流路にしてもよく、連続した単一の長い流路を蛇行状又は渦巻き状に配列させてもよく、分岐させた直線流路を並行させてもよい。

本発明において、エマルジョン保持流路の流路断面は、液滴の中心が流路の中心に沿って流れやすいため、円状、半円状、楕円状、凸型、凹型、長方形、台形が好ましい。

エマルジョン充填法では、一般に、エマルジョン保持流路内の気液界面の移動を制御することでエマルジョン生成と保持を同時に行うため、送液中の気液界面の形状が維持される（移動しながらもその形状に変化が小さい）ように、流路断面形状が一定で屈曲の無い直線流路であることが望ましい。しかし、検出液滴数を増加させるために流路高さに対して流路幅を極端に大きくすると、意図した流路構造を有するチップを安定して製造するのが難しく、かつ／又は、流路の底面及び／若しくは上面が変形して流路側面から遠い流路領域の高さが送液圧やチップへの固定圧などによって変化して測定に悪影響を及ぼす可能性がある（ルーフコラップス）。対策として、例えば、流路高さに対する流路幅の比は、１００以下、より好ましくは５０以下、２５以下、特に好ましくは１０以下であるのが好ましい（下記のピラーが無い場合）。あるいは、流路中央に柱（ピラー）を設けることで、流路高さに対する、柱同士の間隔及び／又は柱と流路側面の間隔の比が、例えば、１００以下、より好ましくは５０以下、２５以下、特に好ましくは１０以下であるのが好ましい。一方で、イメージセンサなどによる一括検出処理を行う場合、エマルジョン保持流路が水平面で(例えば正方形や円形に近い形で）密にパッケージされていると、検出液滴数を増加させられるため好ましい。よって、同じ流路断面形状の連続した単一の長い流路を蛇行状又は渦巻き状に配列させてもよく、分岐させた直線流路を並行させてもよい。この場合、屈曲部が存在するため送液中に界面形状が変化しやすいが、屈曲部における断面形状を調整することでその影響を低減することが可能である。

１つの実施態様では、保持されているエマルジョンに対して検出処理を行うことが意図されている。すなわち、エマルジョン保持流路に保持されたエマルジョンに対して、随意に、後述する検出処理を行うことができる。

好ましくは、エマルジョン保持流路は、保持されているエマルジョンの大部分又は全部がマイクロ流路チップの外部雰囲気（特には外部大気）に触れないように、構成されている。好ましくは、エマルジョン保持流路に保持されている液滴のうち、検出処理の対象となっている液滴が、外部雰囲気（特には外部大気）に触れないようになっている。特に好ましくは、エマルジョン保持流路に保持されるエマルジョンが、外部雰囲気（特には外部大気）に対して密封されるようになっている。これは、例えば、エマルジョン保持流路の流路長を比較的長く設定し、エマルジョン保持流路の下流側末端部のみでエマルジョンが外部雰囲気（特には外部大気）と接触しうるようにすることによって、実現することができる。

好ましくは、エマルジョン保持流路は、エマルジョン保持流路に保持されているエマルジョンに対して検出処理を行うことに適している。

好ましくは、エマルジョン保持流路は、外部大気に開放されていないエマルジョンに対して検出処理を行うことができるように、構成されている。例えば、保持されているエマルジョンと検出手段との間に、エマルジョンを外部大気から隔離する構造が存在する。この構造は、例えば、光を透過する材料でできている。なお、この場合、エマルジョン保持流路に保持されているエマルジョンのうち、検出処理の対象とならないエマルジョン、例えばエマルジョン保持流路の排出側末端部に位置するエマルジョンが、外部大気に開放されていてもよい。

好ましくは、エマルジョン保持流路の流路体積が、エマルジョン形成部で生成される液滴（特には、検出処理において検出の対象となる液滴）の合計体積以上であり、かつ／又は、エマルジョン保持流路の流路体積が、１μＬ以上、５μＬ以上、若しくは１０μＬ以上である。このようなエマルジョン保持流路によれば、検出処理を効率的に行うことができる。なお、エマルジョン保持流路の流路体積の上限は、例えば、１０００μＬ以下であってよい。

好ましくは、エマルジョン保持流路が、平均体積０．１ｎＬ～１０ｎＬ、特には０．３ｎＬ～３ｎＬの液滴の液滴を、５００個以上、１０００個以上、２５００個以上、５０００個以上、若しくは１００００個以上、かつ／又は１０００００個以下、８００００個以下、６００００個以下、若しくは４００００個以下、保持することができる流路体積を有する。エマルジョン保持流路に保持されたこれらの液滴に対して、検出処理を行うことができる。

なお、液滴の平均体積は、デジタルカメラなどの画像取得装置を用いて明視野画像を取得し、取得された画像においてＮ＝１０以上の液滴に関して下記に基づいて算出することができる。

球状、又はディスク状の液滴の体積（Ｖ_ｄｒｏｐそれぞれＶ_ｄｉｓｋ［ｎＬ］）は、それぞれ、下記の式（１）と式（２）で表わされる。なお、下記式（１）及び式（２）におけるＤ_ｄｒｏｐ、Ｄ_ｄｉｓｋは、それぞれ、マイクロ流路チップの通常の使用状態において、エマルジョン保持流路に保持されている液滴を上方から観察した場合の、球状の液滴の直径、及びディスク状の液滴の直径である。また、式（２）中、ｈは、エマルジョン保持流路の流路高さである。

また、好ましくは、検出処理で使用される（カメラなどの）検出手段に対して、検出対象となるエマルジョン中の液滴が互いに重ならないようになっており、特には、検出方向に直交する平面に広がる単層を形成している。この場合には、検出処理の対象となる液滴の大部分を、１つの検出方向から容易に観察することができるので、検出精度をさらに向上させることができる。

特に好ましくは、エマルジョン保持流路の「流路高さ」が調節されており、それにより、マイクロ流路チップの使用状態において、エマルジョン保持流路に保持される液滴が垂直方向で互いに重ならない（すなわち、単一の液滴層が形成される）ようになっている。このようなエマルジョン保持流路で検出処理を行う場合には、検出精度がさらに向上する。なお、「流路高さ」は、通常、マイクロ流路チップの使用状態において、垂直方向（鉛直方向）での流路の長さである。

好ましくは、エマルジョン保持流路の流路高さが、検出処理において検出の対象となる液滴の直径に応じた寸法を有することが好ましく、例えば、液滴の直径の１／１０倍～１０倍、１／４倍～４倍、又は１／２倍～２倍の流路高さを有することが好ましい。また、エマルジョン保持流路の流路高さは、流路幅の１／４倍以下であってよい。なお、流路の幅は、通常、マイクロ流路チップの使用状態において流路の長さ方向に直交する水平方向における長さである。液滴の直径は、流路の幅方向で計測することができる。

また、エマルジョン充填法では、エマルジョン形成部における連続相液と分散相液の流量比に依存してエマルジョン保持流路にエマルジョンが充填されるため、例えば、エマルジョン生成を安定させるため、分散相液に対する連続相液の流量比を大きくした場合、液滴を水平方向に密にパッケージするため流路高さを通常よりも大きく設計した方が好ましい。例えば、分散相液に対する連続相液の流量比が８～１２である場合、エマルジョン保持流路の高さを、液滴の直径の２～４倍にすることができる。

（送液の停止）
エマルジョン保持流路内にエマルジョンを保持するためには、例えば、エマルジョン保持流路内に所望の量のエマルジョンが充填された時点で、送液を停止し、かつ随意に排出口を閉じる。送液のために陰圧を用いる場合には、排出口を外部大気に（少なくとも部分的に）開放することによって、陰圧の適用を停止することもできる。エマルジョン充填法を行う場合、送液の停止は、エマルジョン保持流路を充填していた気体がエマルジョンで完全に置換されてから行うこともできるが、好ましくは、エマルジョン保持流路を充填していた気体がエマルジョンで完全に置換されない間に送液の停止を行う。換言すると、流路内又は排出口内に気体―エマルジョン界面が存在する状態で、送液を停止させる。

送液を停止する際に、排出口を外部大気に段階的に開放することによって、気液界面（気体―エマルジョン界面）の逆流を抑制することができる場合がある。例えば、２つの弁（特には電磁弁）の中間に比較的低圧力のタンクを別個に設け、外部大気への開放の前にこのタンクに対して排出口を開放することによって、段階的な開放を行うことができる。また、電磁弁の開放速度を調節し、開放の程度が段階的に大きくなるようにすることによって、送液停止を行うこともできる。

また、送液の停止に関して、連続相液の流量比を大きくしたり、エマルジョン保持流路の流路体積を小さくしたりすることで、気体―エマルジョン界面と全液滴との最小距離が大きくなるように調整すると、エマルジョン中の液滴が排出口に流出しにくく、かつ気体―エマルジョン界面による近傍の液滴への悪影響（液滴同士の凝集・合一、液滴内反応やシグナル検出の阻害）を抑制できるため好ましい。

また、送液の停止及びその後のエマルジョンの保持に関して、流動性の高い連続相液を使用する場合、外部送液駆動力が印加されていなくても毛細管力及び／又は液面差圧によって気体―エマルジョン界面が下流に流動することがある。加えて、揮発性の高い連続相液を使用する場合、かつ／又は液滴内反応等のためにエマルジョンを加熱している場合には、連続相液が蒸発し流路内の連続相液が減少し、かつ／又は蒸発した分の連続相液を補充するように連続相液保持部に残存する連続相液が流路内に流入することによって、エマルジョン保持流路の液滴が送液停止後も流動することもある。このような送液停止後の液滴の流動は、エマルジョン保持流路内の液滴が排出口方向又はエマルジョン流路方向に流出する要因となるため、対策を行うのが望ましい。このために、各保持部及び排出口を密閉し圧力制御を行い、かつ／又は、流路基板としてガス透過性の低い材料を使用することによって、毛細管力及び／又は液面差圧、並びに連続相液の蒸発に起因する液滴の流動を抑制することができる。なお、分注手段を有する場合には、このような密閉操作は分注操作後又は送液停止後に行う必要があるため、装置の自動化の観点からは好ましくない。

（排出口）
マイクロ流路チップは、排出口を有する。この排出口は、エマルジョン流路、又は随意にエマルジョン保持流路に接続している。排出口は、マイクロ流路チップに陰圧を適用するための陰圧源接続部としても機能しうる。

送液のために陰圧を用いる場合、排出口が、陰圧源と接続することに適しているように構成されていることが好ましい。この場合、排出口が、印加される圧力に対する耐性を有することが好ましい。

マイクロ流路チップがエマルジョン保持流路を有しており、かつ送液のために陰圧を用いる場合、通常、排出口は、エマルジョン保持流路の下流側に位置する。この排出口に陰圧を適用することによって、エマルジョン保持流路の全長又は大部分を、生成されたエマルジョンで充填することができる。

（送液）
外部送液駆動力は、エマルジョン形成部において分散相液及び連続相液からエマルジョンを生成するための駆動力を提供する。また、外部送液駆動力は、マイクロ流路チップがエマルジョン保持流路を有する場合に、生成されたエマルジョンをエマルジョン保持流路に輸送するための駆動力を提供する。外部送液駆動力は、排出口への陰圧の適用、又は分散相液保持部及び連続相液保持部への陽圧の適用であってよい。なお、排出口への陰圧を適用している間は、各保持部を常圧に、分散相液保持部及び連続相液保持部への陽圧を適用している間は、排出口を常圧にしている方が、装置の簡便性の観点からは好ましいが、陰圧及び／若しくは陽圧の送液を安定化させるため、かつ／又はエマルジョンの保持のための密閉操作を兼ねるために、非常圧状態に圧力制御してもよい。

排出口に陰圧を適用する場合、分散相液保持部及び連続相液保持部は、外部雰囲気（特には外部大気）に開放されていることができる。同様に、分散相液保持部及び連続相液保持部に陽圧を適用する場合、排出口は、外部雰囲気（特には外部大気）に開放されていることができる。

陰圧を適用する場合、例えば、圧力タンク又はシリンジポンプを用いて、排出口を介して、マイクロ流路チップの流路内の流体（例えば気体又は連続相液）を吸引することができる。

陰圧源として圧力タンクを用いる場合、圧力タンクの体積は、排出口から圧力タンクまでの流路の体積及びマイクロ流路チップの流路の体積の合計よりも大きいことが好ましい。圧力タンクは、外部雰囲気（特には外部大気）に開放しうるような設計とすることもできる。また、圧力タンクは例えば、ポンプで圧力タンク内の圧力を制御すると好ましい。また、圧力タンク内の圧力値をモニタリングできるように圧力センサを設けても良い。

陽圧を適用する場合、例えば、圧力印加手段を用いて、分散相液保持部及び連続相液保持部を介して、マイクロ流路チップの流路内の流体（気体、分散相液、及び／又は連続相液）に対して圧力を印加することができる。

なお、適用された陰圧又は陽圧の圧力値をモニタリングするための監視手段を用いて、送液状態の確認、例えばエマルジョンが問題なく生成しているかどうかを確認することができる。

（陰圧による送液）
本開示に係る１つの実施態様では、外部送液駆動力として陰圧を用いる。すなわち、本開示に係る１つの実施態様では、排出口に陰圧を適用することによって、エマルジョン形成部においてエマルジョンを生成し、このようにして生成されたエマルジョンを、エマルジョン流路、及び随意にエマルジョン保持流路に輸送する。

陰圧送液は、陽圧送液と比較して、必要な装置を簡略化することができるので好ましい。

また、陽圧送液、特に、各保持部へ気体を介して陽圧を印加する場合、各保持部に分散相液及び連続相液を添加してから送液手段と各保持部とを密封接続する必要があるが、接続時に不要な外部圧力がかかりやすい。特に、シリコンゴム等の柔軟性が高い基板を使用する場合、接続時にマイクロ流路チップが変形し、流路断面が変形するおそれがある。また、連続相液に粘性及び表面張力が低い液体を使用することで、エマルジョン形成部におけるせん断力を利用した安定かつ迅速な液滴生成が可能となるが、上記の物性を持つ液体は密閉状態が不完全な場合に液漏れしやすく適切な圧力印加が困難になりやすい。また、密閉接続後に連続相液及び／又は分散相液を導入することで、上述の接続時の不要な外部圧力による送液や液漏れの問題を抑制することが可能だが、これは前述の液導入と圧力送液を同時に行う手段の一例であり、分散相液と連続相液とを接触させる操作の再現性が低下しやすい。

これに対して、陰圧送液の場合、分散相液及び連続相液を添加する前に送液手段を接続できるため、接続時の圧力が分散相液及び連続相液に加わることがないという利点を有する。また、粘性及び表面張力が低い連続相液を保持する連続相液保持部を密閉する必要を回避できるという利点も有する。

さらに、本発明では、分散相液流路を通してエマルジョン形成部まで分散相液を到達させる時間を短くするため、分散相液流路の長さを短くすることが好ましい場合が多い。したがって、それに合わせて、流路全体の圧損抵抗の小さいマイクロ流路チップを用いた方が好ましい。しかし、各保持部に陽圧を印加する方法では、送液手段と接続する際の不要な圧力によって意図せず分散相液または連続相液が流路内に侵入してしまうおそれがある。

これに対して、排出口に陰圧を印加する方法は、分散相液及び連続相液を添加する前に排出口と送液手段とを接続できるため、不要な圧力がかからないという利点を有する。

このように、陰圧送液は多くの利点を有する。しかしながら、その一方で、陰圧を適用する場合には、送液する分散相液に直接に圧力が適用されないので、分散相液流路の壁面に残留した連続相液を除去することは容易ではない。上述したとおり、分散相液流路に残留した連続相液は、液滴生成の不安定化などをもたらす。

これに対して、本発明によれば、分散相液流路における連続相液の残留を実質的に回避することができるので、外部送液駆動力として陰圧を用いた場合であっても、安定したエマルジョンの生成を行うことが可能となる。

本開示に係る方法の１つの実施態様では、排出口に陰圧制御手段が流体接続されており、陰圧制御手段が、陰圧源、接続部及び弁から構成されており、陰圧源が、一定の陰圧に制御されており、かつ、この弁が、陰圧源と接続部との間に配置されている。接続部を介して、陰圧制御手段を、排出口に接続することができる。この態様によれば、弁を開放することによって瞬時に陰圧を適用することができる。

弁の具体的態様については特に制限はない。送液停止時の逆流を防止するという観点からは、弁の開閉時の流路における圧力変動を抑制できるもの、例えば開閉動作が比較的遅いものが好ましい。弁は、例えば三方弁であってよく、マイクロ流路チップを陰圧源（例えば圧力タンク）及び外部雰囲気（特には外部大気）のいずれかに接続することができるようになっていてよい。

特には、分散相液と連続相液とが接触する前に、排出口に陰圧制御手段が流体接続されている。この場合には、分散相液と連続相液との接触の後に迅速に陰圧を適用することができるため、早期の液滴の発生を抑制し、液滴の均一性をさらに向上させることができる場合がある。

（エマルジョン充填法における送液）
エマルジョン充填法では、一般に、エマルジョンが排出口に到達する前に（すなわち、気液界面が排出口に到達する前に）送液を停止した方が検出液滴のロスを低減し、検出液滴数を増加させられるため好ましい。また、排出口にエマルジョン中の連続相液のみが充填されるように、送液中の分散相液に対する連続相液の流量比を大きくしても良いが、排出口を連続相液で十分に満たすのは困難である。

このような理由から、エマルジョン充填法では、送液を停止する際に気液界面が流路内又は排出口の流路開口部近傍に存在する場合が多く、送液停止の際の急激な圧力変動（陰圧送液の際は排出口への空気の流入）によって気液界面が流路内を逆流し、エマルジョン保持に悪影響が生じやすい（エマルジョン保持流路外へ液滴が流出する、又は気液界面近傍で液滴同士が凝集・合一する）。

加えて、陰圧送液の場合には、送液停止によって排出口に空気が流入してくるため、気液界面により圧力がかかりやすく、基板の材料にシリコンゴム（ＰＤＭＳ）のような柔軟性の高い材料を使用したり、基板の厚みを極端に薄くしたり（ＣＯＣだと１ｍｍ以下ぐらい）すると、陰圧送液時に流路が変形しやすく、送液停止時にその変形を復元する力によってより逆流が起きやすくなる。（すなわち、流路側面の壁面から遠い流路の中央部において流路の上面、底面が流路断面積を小さくする方向にたわむ（ルーフコラップス）。エマルジョン保持流路は前述のとおり流路高さに対して流路幅を大きくするのが好ましいため、特に影響が大きいと考えられる。

このような送液停止時の逆流を抑制するため、送液圧力を小さくするのが好ましい。例えば、外部送液駆動力によってマイクロ流路チップに適用される圧力を、３０ｋＰａ以下、１０ｋＰａ以下、特に好ましくは５ｋＰａ以下とすることができる。なお、外部送液駆動力によってマイクロ流路チップに適用される圧力は、特には、排出口に適用される陰圧の圧力、又は分散相液保持部及び連続相液保持部に適用される陽圧の圧力である。

一方で、例えば本発明を迅速なデジタル測定に用いる場合、送液速度と分散相液に対する連続相液の流速の比から計算される液滴生成速度は速い方が好ましい。例えば、エマルジョン形成部における液滴の生成速度が、５個／秒以上、２０個／秒以上、５０個／秒以上、１００個／秒以上、特に好ましくは２００個／秒以上であることが好ましい

送液圧力を小さくし、かつ液滴生成速度を大きくしたい場合には、流路圧損抵抗値（＝送液圧力／送液速度）が小さくなるように調整するのが望ましい。流路圧損抵抗値は、流路構造、流路壁面の表面物性、各相液の物性、送液手段の圧力制御方法等に依存するため、送液中の送液速度及び／又は液滴生成速度と送液圧力が適切な値になるように、上述のパラメータを適宜調整すればよい。

（マイクロ流路チップの設置）
マイクロ流路チップは、鉛直方向（天地方向）に水平に設置するのが一般的であるが、エマルジョンの保持等の観点から、一定方向に意図的に傾斜を設けて設置しても良い。例えば、連続相液が分散相液よりも比重が大きい場合（例：フッ素系分散剤を連続相液、水溶液を分散相液として使用）、液滴は比重差によって浮力を有するため、エマルジョン保持流路から液滴が流出しにくいように、意図的に傾斜を設けてマイクロ流路チップを設置しても良い。

＜検出処理＞
本開示に係る方法に従って生成されたエマルジョン中の液滴に対して、検出処理を行うことができる。検出処理は、例えば、液滴中での標的物質の反応、及び当該反応の検出（例えば反応生成物の検出）を含む。検出処理は、エマルジョン保持流路に保持されたエマルジョン中の液滴に対して行うことができる。

標的物質（特には標的分子）としては、核酸、タンパク質、ペプチド、酵素、細胞、細菌、胞子、ウイルス、オルガネラ、高分子アセンブリ、薬物候補、脂質、炭水化物、代謝物、又はこれらの任意の組合せが挙げられる。

標的物質の反応は、特に限定されない。標的物質の反応としては、酵素反応が挙げられ、より具体的には、キナーゼ、ヌクレアーゼ、ヌクレオチドシクラーゼ、ヌクレオチドリガーゼ、ヌクレオチドホスホジエステラーゼ、ポリメラーゼ（ＤＮＡ又はＲＮＡ）、プレニルトランスフェラーゼ、ピロホスパターゼ、レポーター酵素、逆転写酵素、トポイソメラーゼ等を用いた酵素反応が例示できる。標的分子がＤＮＡやＲＮＡなどの核酸であり、標的分子の反応が当該核酸の増幅反応である場合、ＬＡＭＰ法、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、ＴＲＣ法といった核酸を等温増幅可能な反応が挙げられる。また、ワンステップＲＴ－ＰＣＲの場合、逆転写反応に適した温度で液滴を作製することは、逆転写反応の反応効率、反応時間において好ましい。また、逆転写反応による生成物であるｃＤＮＡをサイクリングプローブ法により検出することも可能である。

反応を行う場合、２種以上の反応液をエマルジョン形成部の上流（例えば分散相液合流部）で混合し、この混合物を用いて液滴を生成することが好ましい。なお、本発明において、反応液とは、標的物質及び標的物質を反応させるのに必要な成分のうち、少なくとも一部を含んだ溶液のことをいう。全ての反応液が混合することで標的物質の反応に必要な成分全てが揃えばよく、標的物質はいずれかの反応液に含まれていればよい。反応液は３種以上であっても問題はない。

例えば、標的物質が特定配列を含む核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）であり、標的物質の反応が前記特定配列を増幅させる反応である場合、反応液に含まれる成分としては、特定配列の一部と相同的な配列を含むプライマー、特定配列の一部と相補的な配列を含むプライマー、特定配列の一部と相同的又は相補的な配列を含む検出用プローブ、ポリメラーゼ、ヌクレオチド、塩類、及び緩衝液成分があげられる。なお、反応液内で、標的分子、反応基質、酵素などが分解、変質、非特異反応が生じないように組成が工夫されていることが好ましく、装置内での挙動を考慮して、グリセロール、界面活性剤などをさらに添加してもよい。

＜その他の手段＞
（検出手段）
反応の検出のために、例えば、反応による生成物を検出可能な検出手段を用いることができる。

検出方法は、反応生成物に応じて適宜適切な方法を選択することができ、例えば、光学的、Ｘ線、ＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化法）、ＦＣＳ（蛍光相関分光法）、ＦＰ（蛍光偏光）／ＦＣＳ、蛍光法、比色分析、化学ルミネセンス、生物発光、散乱、表面プラズモン共鳴、電気化学法、電気泳動、レーザー、質量分光測定、ラマン分光法、ＦＬＩＰＲ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ社）など公知の方法を用いて検出することができる。なお、透過光を用いて検出する場合は、光を透過する材料でマイクロ流路チップを作製すると、マイクロ流路チップを光学検出器に載置するのみで、チップ内の液滴を移動させることなく反応生成物を検出できる点で好ましい。

反応生成物の検出に用いる検出手段（検出器）として、標的物質の反応を記録・測定するためのイメージングセンサ及び随意にその構成部品を用いることができる。検出の一例として、検出対象となる個々のシグナルを空間的に分解するのに適切な照明及び解像度を有するカメラ又はイメージング装置があげられる。カメラ又はイメージング装置としては、公知のものを利用することができ、例えばカメラは、電荷結合素子（ＣＣＤ）、電荷注入装置（ＣＩＤ）、フォトダイオードアレイ（ＰＤＡ）又は相補型金属酸化物半導体（ＣＭＯＳ）を含む任意の普通の半導体イメージセンサを使用することができる。また、検出の際、励起／放射された光の偏光を使用することによって改善することができる。例えば、蛍光シグナルを発する液滴を検出する場合、その検出領域を大きな視野を持つ光学ユニットによって一括で撮影することで、迅速かつハイスループットなシグナル検出を行なうことが可能になる。

（温調手段）
温調手段は、マイクロ流路チップ内の液体を標的物質の反応に適した温度に保つ役割を有する。温調手段はマイクロ流路チップと近接（好ましくは密着）可能な形状であればよく、必ずしも平板状である必要はない。

温調手段のうち、少なくともマイクロ流路チップと近接（好ましくは密着）する部分は、熱伝導性の高い金属材料で作製することが好ましい。なお、基材と上部構造体とを貼り合わせてマイクロ流路チップが作製されている場合、温調手段に接する基材及び／又は上部構造体の厚さを薄くすると、マイクロ流路チップに設けた流路への熱伝導をより効率的に行なえるので、好ましい。温調手段は、少なくとも、標的物質の反応場であるエマルジョン保持流路を温調できればよいが、相液保持部及び流路も温調できると、標的分子の非特異的反応を抑制できる点で好ましい。具体例として、標的物質の反応が核酸増幅反応の場合、各保持部や流路における温度を、エマルジョン保持流路における標的物質の反応温度よりも高くなるよう、温調手段で温調することで、プライマー／プローブ同士の非特異的なアニールを低減することができる。また、マイクロ流路チップの底面を温調手段によって反応温度に加熱し、かつ光を透過する材料でマイクロ流路チップ上面基板を作製し上面から透過光検出を行う場合、各相液供給前の空のマイクロ流路チップの位置並びに／又は流路構造及び／若しくはチップ内外のゴミの評価、各相液を供給する際の流路内の挙動並びに／又は送液中のエマルジョン生成の挙動の評価、並びに反応中のエマルジョンのシグナル検出結果を利用したデジタル検出の定量上限の向上を装置上簡便に行えるため好ましい。

以下で、実施例を用いて、本発明をさらに詳細に説明する。本発明は、これらの記載に限定されない。

本発明で使用したマイクロ流路チップについて下記に記載する。

≪マイクロ流路チップの作製≫
フォトリソグラフィー及びソフトリソグラフィー技術を用いて、マイクロ流路チップを作製した。具体的な手順を以下に示す。

（１）４インチベアシリコンウェハ（フィルテック社）上へ、フォトレジストＳＵ－８ ３０５０（Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍ社）を滴下後、スピンコーター（ＭＩＫＡＳＡ社）を用いてフォトレジスト薄膜を形成した。

（２）マスクアライナー（ウシオ電機社）と、マイクロ流路チップの流路パターンを形成したクロムマスクとを用いて、流路パターンをフォトレジスト膜へ形成させた後、ＳＵ－８ Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ（Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍ社）を用いて流路パターンを現像することで、マイクロ流路チップを構成する流路の鋳型を作製した。

（３）ＳＵ－８への吸着を抑えるために、Ｔｒｉｃｈｌｏｒｏ（１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ－ｐｅｒｆｌｕｏｒｏ－ｏｃｔｙｌ）ｓｉｌａｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）による蒸着表面処理を行なった。

（４）上記（３）の処理を行なった鋳型へ、ＳＹＬＧＡＲＤ ＳＩＬＩＣＯＮＥ ＥＬＡＳＴＯＭＥＲ ＫＩＴ（東レ・ダウコーニング社）を用いて調製した未硬化のシロキサンモノマーと重合開始剤との混合物（重量比１０：１）を流し込み、８０℃で２時間加熱することで、流路の形状が転写されたポリマー（ＰＤＭＳ）基板を作製した。

（５）得られたポリマー基板を鋳型から慎重に剥がし、カッターで成形後、パンチャーを用いて分散相液保持部及び連続相液保持部、並びに排出口を形成した。

（６）保持部及び排出口を形成したポリマー基板並びにカバーガラス（松浪硝子社）を酸素プラズマ発生装置（メイワフォーシス社）で表面処理後、ＰＤＭＳ基板のパターン面とカバーガラスとを貼り合わせた。作製したチップはデシケーター内に保存した。

作製したマイクロ流路チップは、縦３４ｃｍ×横７５ｃｍの大きさであり、分散相液保持部としてはφ４ｍｍの穴を、連続相液保持部としてはφ８ｍｍの穴を、排出口としてはφ１．５ｍｍの穴を、それぞれ設けている。

（流路構造）
マイクロ流路チップは、２つの分散相液保持部、（第一分散相液流路、第二分散相液流路、及び分散相液合流部を有する）分散相液流路、連続相液保持部、２つの連続相液流路、エマルジョン形成部、エマルジョン流路、エマルジョン保持流路、及び排出口を有していた。２つの分散相液保持部が、第一又は第二分散相液流路を介して、エマルジョン形成部に接続しており、連続相液保持部が、２つの連続相液流路を介して、エマルジョン形成部に接続しており、エマルジョン形成部が、エマルジョン流路を介して、エマルジョン保持流路に接続しており、エマルジョン保持流路が、排出口に接続していた。

実施例で使用したマイクロ流路チップは、下記のいずれか（Ｎｏ．１又はＮｏ．２）の構造を有していた。

（Ｎｏ．１）
マイクロ流路チップＮｏ．１に関して、第一分散相液流路及び第二分散相液流路は、高さ８０μｍ、幅１００μｍ、長さ３０ｍｍの蛇行を含む流路であり、分散相液合流部で合流し、１００μｍの流路幅に狭窄され、エマルジョン形成部に合流する。２つの連続相液流路はそれぞれ屈曲部を二箇所有した高さ８０μｍ、幅１００μｍ、長さ３０ｍｍの直線流路である。エマルジョン形成部において、分散相液合流部と２つの連続相液流路とが角度９０度で十字に交差しており、反応液と非混和性液体（オイル）とが合流し、液滴を形成するようになっている。エマルジョン流路は、エマルジョン形成部に近接する部分で幅８０μｍ×長さ１００μｍ、その下流部分で幅２００μｍ×長さ６８０μｍの直線流路であり、さらにその下流部分ではＲ２７５μｍの円弧曲線で構成された蛇行を含めた幅２００μｍ×長さ１１．５ｍｍの撹拌用流路であり、エマルジョン保持流路に連結する。エマルジョン保持流路は、流路高さ１３０μｍ、幅２ｍｍ、長さ３５０ｍｍの蛇行流路であり、幅２ｍｍ、長さ１０ｍｍの排出口連通流路を介して、排出口に直接つながっている。エマルジョン保持流路の体積は、９１μＬであった。

（Ｎｏ．２）
マイクロ流路チップＮｏ．２に関して、第一分散相液流路及び第二分散相液流路は高さ８０μｍ、幅２００μｍ、長さ５０００μｍの流路であり、分散相液合流部で合流し、１００μｍの流路幅に狭窄され、エマルジョン形成部に合流する。２つの連続相液流路はそれぞれ屈曲部を二箇所有した高さ８０μｍ、幅２８０μｍ、２６ｍｍの直線流路である。エマルジョン形成部において、分散相液合流部と２つの連続相液流路とが角度９０度で十字に交差している。エマルジョン形成部において、反応液と非混和性液体（オイル）とが合流し、液滴を形成するようになっている。エマルジョン流路は、エマルジョン形成部に近接する部分で幅８０μｍ×長さ１００μｍ、その下流部分で幅２００μｍ×長さ６８０μｍの直線流路であり、さらにその下流部分ではＲ２７５μｍの円弧曲線で構成された蛇行を含めた幅２００μｍ×長さ１１．５ｍｍの撹拌用流路であり、エマルジョン保持流路に連結する。エマルジョン保持流路は、流路高さ１３０μｍ、幅２ｍｍ、長さ３５０ｍｍの蛇行流路であり、幅２ｍｍ、長さ１０ｍｍの排出口連通流路を介して、排出口に直接つながっている。エマルジョン保持流路の体積は、９１μＬであった。

（Ｎｏ．３）
マイクロ流路チップＮｏ．３に関して、分散相液流路はＮｏ．２と同様である。２つの連続相液流路はそれぞれ屈曲部を二箇所有した、高さ１３０μｍ、幅２８０μｍ、長さ３３ｍｍの直線流路である。エマルジョン形成部において、分散相液合流部と２つの連続相液流路とが角度９０度で十字に交差している。エマルジョン形成部において、反応液と非混和性液体（オイル）とが合流し、液滴を形成するようになっている。分散相液流路の高さはエマルジョン形成部への流入部まで８０μｍであり、エマルジョン形成部の流路高さは連続相液流路及びエマルジョン形成部の下流の流路と同じ１３０μｍであるため、流入部は、高さ５０μｍの段差を有する段差構造（進入抑制構造）を有することになる（エマルジョン形成部が、流入部の約１．６倍の流路高さを有する）。なお、段差形状はほぼ直角となるように上述の鋳型を作製した。エマルジョン流路は、エマルジョン形成部に近接する部分で幅８０μｍ×長さ１００μｍ、その下流部分で幅２００μｍ×長さ６８０μｍの直線流路であり、さらにその下流部分ではＲ２７５μｍの円弧曲線で構成された蛇行を含めた幅２００μｍ×長さ１１．５ｍｍの撹拌用流路であり、エマルジョン保持流路に連結する。エマルジョン保持流路は、流路高さ１３０μｍ、幅２ｍｍ、長さ３５０ｍｍの蛇行流路であり、幅２ｍｍ、長さ１０ｍｍの排出口連通流路を介して、排出口に直接つながっている。エマルジョン保持流路の体積は、９１μＬであった。

≪実施例１≫
（エマルジョンの生成及び保持）
上記のマイクロ流路チップ（Ｎｏ．２）を用いて、本発明に従って、エマルジョンの生成及び保持を行った。詳細を下記の（１）～（６）に示す。

（分散相液）
（１）分散相液保持部に導入する分散相液として、下記の２種類の組成の水溶液（「開始液」及び「反応液」）を調製した。なお、下記組成の水溶液は、核酸増幅反応の１つであるＴＲＣ反応を使用する際の反応開始液の組成を模している。

（開始液）
３６．８ｍＭ 塩化マグネシウム
１８０．０ｍＭ 塩化カリウム
０．２％（ｗ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ ２０
１８．０％（ｖ／ｖ） ＤＭＳＯ
５．０％（ｖ／ｖ） グリセロール

（反応液）
０．２％（ｗ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ ２０
３００ｎM トレハロース
５．０％（ｖ／ｖ） グリセロール

（２）ＴＲＣ反応温度である４６℃で加熱したガラスヒーター（ブラスト社）を倒立型顕微鏡ＩＸ７１（オリンパス社）に設置して、その上にマイクロ流路チップを設置してテープで固定した。

（３）送液手段として、ペリスタポンプ（高砂工業）、電磁弁（高砂工業）、圧力センサ（キーエンス社）で構成された、２００ｍＬ容量のタンク内の圧力を－１～－１０ｋＰａに制御できる装置を使用した。このタンクとマイクロ流路チップの排出口とをＰＴＦＥチューブ（ニチアス社）で接続し、タンク内の圧力を開放することによって、チップに圧力差（陰圧）を適用した。

（４）２つの分散相液保持部に、反応液及び開始液を、ピペットマンを使用して、それぞれ２０μＬずつ滴下した。反応液及び開始液の滴下から４０秒、連続相液としてのオイル（Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｇｅｎｅｒａｔｏｒオイル ｆｏｒ ＥｖａＧｒｅｅｎ（Ｂｉｏｒａｄ社））を２００μＬ滴下した。なお、上記のピペットマンは最大許容誤差が±０．０６μＬに校正されたものを使用した。連続相液がエマルジョン形成部に達する前に、分散相液（反応液及び開始液の混合液）が、気体で充填された状態の分散相液流路を通って、エマルジョン形成部への流入部に到達した。

（５）オイル滴下から２０秒後に、あらかじめ排出口に接続された上記の送液装置のタンク内圧力を－５ｋＰａに調整した状態で、圧力差（陰圧）を印加して液滴生成と液滴捕捉を開始させた。なお、送液中の各保持部は大気圧開放された状態とした。陰圧の適用の前に、連続相液が、エマルジョン形成部に移動した。

（６）オイルと空気との界面（エマルジョンと空気の界面）がエマルジョン保持流路の下流末端部に到達した後（陰圧の適用から約１５０秒後）で、排出口に印加されていた陰圧を常圧開放し、送液を停止した。

（混合比の評価）
実施例１における２つの分散相液（開始液及び反応液）の混合比を、下記のとおりにして評価した。

送液停止後、分散相液保持部に残った反応液及び開始液の量を、それぞれ、０．２～１０．０μＬのピペットマンで測定した。この残量は０．２μＬ刻みで測り取り、分散相液保持部の液が枯渇しピペットに空気が侵入したときのピペットマンの設定液量を残量の最大値とし、最大値から０．２μＬ差し引いた値を最小値として、残量はその中央値（最大値から０．１μＬ差し引いた値）とし、その標準偏差は±０．１μＬと仮定した。上記のピペットマンは最大許容誤差が±０．０３μＬに校正されたものを使用したのを考慮すると、本測定による残量測定の標準偏差は±０．１１μＬとなる。加えて、２０μＬの反応液と開始液を添加する際の標準偏差は±０．０６μＬであるため、反応液と開始液の送液量の合計（＝各液の添加液量と残量の差）の測定の標準偏差δａは、±（０．１１^２×２＋０．０６^２×２）^０．５＝±０．１８μＬとなる。また、反応液と開始液の送液量の差（＝各残量の差、絶対値）の測定の相対誤差δｂは、±（０．１１^２×２）^０．５×２＝±０．３２μＬとなる。

本実験における理想的な混合比ｃは反応液：開始液＝１：１であると仮定し、実験毎の混合比の誤差を（反応液と開始液の送液量の差ｂ）／（反応液と開始液の合計の送液量ａ）と定義して、混合比の誤差を測定した。なお、上記の混合比の誤差の測定における相対誤差δｃは、δｃ＝（δａ／ａ＋δｂ／ｂ）×ｃから計算した。

実施例１に係る混合比の平均誤差（試行回数＝１０回）は、１．０％であり、混合比の誤差の最大値は、２．４％であった。結果を下記の表１に示す。

（エマルジョン保持流路への空気侵入までの時間の評価）
分散相液（開始液及び反応液それぞれ）の供給量を１０μＬとしたこと以外は、上記と同様にして、エマルジョンの生成及び保持を行い、その後、分散相液保持部を介したエマルジョン保持流路内への空気の流入を評価した。

反応液又は開始液が枯渇し、チップ流路内に空気が侵入し始めてから、空気がエマルジョン保持流路に気泡として侵入するまでの時間を測定した。３回の試行（Ｎ＝３）に関して、分散相液の枯渇から気泡侵入までの時間は、それぞれ１６秒、１９秒、及び１７秒であり、平均値は１７．３秒であった。結果を下記の表１に示す。

≪比較例１≫
（エマルジョンの生成及び保持）
上記のマイクロ流路チップ（Ｎｏ．１）を用いて分散相液及び連続相液の供給並びに送液を下記のとおりに行ったこと以外は、実施例１と同様にして、エマルジョンの生成及び保持を行った。

連続相液保持部に、ピペットマン（ギルソン社）を使用して、オイルを２００μＬ滴下した。オイル滴下から４０秒後に、分散相液保持部に、反応液及び開始液を、２．０～２０．０μＬのピペットマンを使用して、２０μＬずつ滴下した。なお、分散相液を滴下する前に、連続相液は分散相液流路を通って分散相液保持部に到達していた。

反応液の滴下から２０秒後に、あらかじめ排出口に接続された上記の送液装置のタンク内圧力を－５ｋＰａに調整した状態で、陰圧を適用して、液滴生成及び保持を開始させた。なお、送液中の各保持部は、大気圧開放された状態とした。

（混合比の評価）
実施例１と同様にして混合比を評価した。

比較例１に係る混合比の平均誤差（試行回数＝１０回）は、６．７％であり、混合比の誤差の最大値は、１５．０％であった。結果を下記の表１に示す。

（エマルジョン保持流路への空気侵入までの時間の評価）
分散相液（開始液及び反応液それぞれ）の供給量を１０μＬとしたこと以外は、上記と同様にして、エマルジョンの生成及び保持を行い、その後、分散相液保持部を介したエマルジョン保持流路内への空気の流入を評価した。

反応液又は開始液が枯渇し、チップ流路内に空気が侵入し始めてから、空気がエマルジョン保持流路に気泡として侵入するまでの時間を測定した。３回の試行（Ｎ＝３）に関して、分散相液音枯渇から気泡侵入までの時間は、それぞれ３秒、２秒、及び３秒であり、平均値は２．３秒であった。結果を下記の表１に示す。

表１で見られるとおり、連続相液がエマルジョン形成部に達する前に分散相液が気体で充填された状態の分散相液流路を通ってエマルジョン形成部への流入部に到達した場合（実施例１）には、分散相液がエマルジョン形成部の流入部に到達する前に連続相液がエマルジョン形成部に到達した場合（比較例１）と比較して、２つの分散相液の混合比が安定しており、かつ、分散相液保持部で分散相液が枯渇した後の気泡の侵入が抑制されていた。

特に、実施例１の場合には、比較例１の場合と比較して、１０倍程度、空気の侵入速度が遅くなることを確認した。上記の侵入速度は、送液圧力、流路構造、各液の物性、流路壁面の物性などによって大きく変化する。一方で、水溶液のような表面張力の大きい分散相液を使用し、かつ一般的な液滴生成に使用される表面張力及び粘性が低い連続相液を使用した場合、分散相液が枯渇して分散相液を押しのけて空気が侵入する速度は、連続相液を押しのけて空気が侵入する速度よりも遅くなる。したがって、一般に、分散相液を先に導入してエマルジョン形成部への流入部まで到達させることによって、空気の侵入を抑制することができ、結果として、サンプルロスを最小限に抑制することが可能となると考えられる。

≪参考例１≫
（進入抑制構造による流路閉塞の抑制の評価）
上記「（エマルジョンの生成及び保持）」に記載の（１）～（４）までは実施例１と同様の操作を行い、ただしオイルの滴下を行わず、エマルジョン形成部に分散相液が到達してからエマルジョン形成部が分散相液によって流路閉塞するまでの時間を測定した（Ｎ＝３）。その結果、測定された時間は、２１秒、２８秒、２９秒（平均２６秒）であった。結果を下記の表２に示す。

≪参考例２≫
上記のチップＮｏ．３を用いたこと以外は、参考例１と同様にして、エマルジョン形成部に分散相液が到達してからエマルジョン形成部が分散相液によって流路閉塞されるまでの時間を測定した（Ｎ＝３）。その結果、測定された時間は、７７秒、８６秒、１０２秒（平均８８秒）であった。結果を下記の表２に示す。

表２で見られるとおり、進入抑制構造（段差構造）を設けることによって、流路閉塞が特に効果的に抑制されることがわかる。進入抑制構造によって分散相液をエマルジョン形成部への流入部に留めておくことで、流路閉塞及び気泡の発生をさらに効果的に抑制することができる。

１０、２０ マイクロ流路チップ
１０１ 連続相液保持部
１０２ 第一分散相液保持部
１０３ 第二分散相液保持部
１１１ 連続相液流路
１１２ 第一連続相液流路
１１３ 第二連続相液流路
１１４ 第一分散相液流路
１１５ 第二分散相液流路
１１６ 分散相液合流部
１１７ 分散相液流路
１１８ エマルジョン形成部への流入部
１２０ エマルジョン形成部
１３０ エマルジョン流路
１４０ エマルジョン保持流路
１５０ 排出口
２００ 進入抑制構造
２２０ａ、２２０ｂ 接続部
２３０ａ、２３０ｂ 壁面における不連続的な部分、角部
α１、α２ 角度
３００ 分散相液保持部
３１ ウェル
３３ 穴部
３５ 拡張部位
Ｗ 幅方向
Ｌ 長さ方向
Ｈ 高さ方向

Claims (9)

1. マイクロ流路チップに分散相液及び連続相液を供給してエマルジョンの生成を行う方法であって、
   前記マイクロ流路チップが、分散相液保持部、分散相液流路、連続相液保持部、連続相液流路、エマルジョン形成部、エマルジョン流路、及び排出口を有しており、
   前記分散相液保持部が、前記分散相液流路を介して、前記エマルジョン形成部に接続しており、
   前記連続相液保持部が、前記連続相液流路を介して、前記エマルジョン形成部に接続しており、
   前記エマルジョン形成部が、前記エマルジョン流路を介して、前記排出口に接続しており、
   前記分散相液保持部に、分散相液を供給すること、
   前記連続相液保持部に、連続相液を供給すること、及び、
   外部送液駆動力の適用によって、前記エマルジョン形成部において、前記分散相液から構成される液滴及び前記連続相液から構成される連続相を含むエマルジョンを生成し、このようにして生成された前記エマルジョンを、前記エマルジョン流路に進入させること、
   を含み、
   前記連続相液が前記エマルジョン形成部に達する前に、前記分散相液を、気体で充填された状態の前記分散相液流路を通して、前記エマルジョン形成部への流入部にまで移動させること
   を特徴とする方法。
2. 前記外部送液駆動力の適用の前に、前記連続相液を、前記エマルジョン形成部にまで移動させることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. 前記分散相液及び／又は前記連続相液を、毛細管力及び／又は液面差圧によって移動させることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記排出口に陰圧を印加し、それにより、前記分散相液を、気体で充填された状態の前記分散相液流路を通して前記エマルジョン形成部への流入部にまで移動させることを特徴とする、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記流入部が、進入抑制構造を有しており、
   この進入抑制構造は、前記外部送液駆動力の適用の前に前記分散相液が前記エマルジョン形成部に進入することを抑制することができること、
   を特徴とする、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記外部送液駆動力が、前記排出口に適用される陰圧であることを特徴とする、請求項１～５いずれか一項に記載の方法。
7. 前記分散相液保持部が、第一分散相液保持部及び第二分散相液保持部を含み、
   前記分散相液流路が、前記第一分散相液保持部に接続されている第一分散相液流路、前記第二分散相液保持部に接続されている第二分散相液流路、及び分散相液合流部を含み、
   前記第一分散相液流路及び前記第二分散相液流路が、それぞれ、分散相液合流部を介して、前記エマルジョン形成部に接続している、
   請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記マイクロ流路チップが、エマルジョン保持流路をさらに有しており、
   前記エマルジョン形成部が、前記エマルジョン流路を介して、前記エマルジョン保持流路に接続しており、かつ
   前記エマルジョン保持流路が、前記排出口に接続しており、
   前記排出口に陰圧を適用することによって、前記エマルジョン形成部において、前記分散相液から構成される液滴及び前記連続相液から構成される連続相を含むエマルジョンを生成し、このようにして生成された前記エマルジョンを、前記エマルジョン流路を介して、気体で充填された状態の前記エマルジョン保持流路に輸送すること、を含む、
   請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
9. 分散相液保持部、分散相液流路、連続相液保持部、連続相液流路、エマルジョン形成部、エマルジョン流路、及び排出口を有している、マイクロ流路チップであって、
   前記分散相液保持部が、前記分散相液流路を介して、前記エマルジョン形成部に接続しており、
   前記連続相液保持部が、前記連続相液流路を介して、前記エマルジョン形成部に接続しており、
   前記エマルジョン形成部が、前記エマルジョン流路を介して、前記排出口に接続しており、かつ、
   前記分散相液保持部に分散相液を供給し、前記連続相液保持部に連続相液を供給し、かつ前記マイクロ流路チップに外部送液駆動力を適用することによって、前記エマルジョン形成部において、前記分散相液から構成される液滴及び前記連続相液から構成される連続相を含むエマルジョンが生成され、このようにして生成された前記エマルジョンが、前記エマルジョン流路に進入するように構成されており、
   ここで、前記分散相液流路の、前記エマルジョン形成部への流入部が、進入抑制構造を有しており、この進入抑制構造が、前記外部送液駆動力の前記適用の前に前記分散相液が前記エマルジョン形成部に進入することを抑制することができることを特徴とする、
   マイクロ流路チップ。

Images