JP2022122926A - 改善された凝乳特性を有するキモシンの変異体 - Google Patents
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Abstract
Description
-Suzuki et al : Site directed mutagenesis reveals functional contribution of Thr218, Lys220 and Asp304 in chymosin, Protein Engineering, vol. 4, January 1990, pages 69-71;
-Suzuki et al : Alteration of catalytic properties of chymosin by site-directed mutagenesis, Protein Engineering, vol. 2, May 1989, pages 563-569;
-van den Brink et al : Increased production of chymosin by glycosylation, Journal of biotechnology, vol. 125, September 2006, pages 304-310;
-Pitts et al : Expression and characterisation of chymosin pH optima mutants produced in Tricoderma reesei, Journal of biotechnology, vol. 28, March 1993, pages 69-83;
-M .G. Williams et al : Mutagenesis, biochemical characterization and X-ray structural analysis of point mutants of bovine chymosin, Protein engineering design and selection, vol. 10, September 1997, pages 991-997;
-Strop et al : Engineering enzyme subsite specificity: preparation, kinetic characterization, and x-ray analysis at 2.0 ANG resolution of Val l l lphe site mutated calf chymosin, Biochemistry, vol. 29, October 1990, pages 9863-9871 ;
-Supannee et al : Site-specific mutations of calf chymosin B which influence milk-clotting activity, Food Chemistry, vol. 62, June 1998, pages 133-139;
-Zhang et al : Functional implications of disulfide bond, Cys45-Cys50, in recombinant prochymosin, Biochimica et biophysica acta, vol. 1343, December 1997, pages 278-286。
(a)キモシン活性を有する親ポリペプチド中の1又は2以上の位置で変更を行う工程、ここで前記変更が、下記位置:70; 75; 77; 79; 90; 102; 103; 108; 114; 117; 120; 124; 134; 154; 156; 163; 212; 222; 223; 224; 238; 246; 256; 261; K279V; L280; F281 ; R300D,E,S,T,N,Q,C,U,G,P,A,V,I,L,M,F,Y,W; G309; R312D,E,S,T,N,Q,C,U,G,P,A,V,I,L,M,F,Y,W; 320; 324; D325Q; 326; 331; 336; 346; 361; 367及び 379の何れかに対応する少なくとも1つのアミノ酸位置での置換、欠失又は挿入を含んでおり;及び
(b)工程(a)の変更されたポリペプチドを生成し、そして単離し、そしてそれにより、単離されたキモシンポリペプチドを得る工程を含んで成り、ここで前記変異体はキモシン活性を有し;そして
(i)前記親ポリペプチドのアミノ酸位置が、配列番号1(ウシキモシン)のポリペプチドと、前記親ポリペプチドとの整列により決定され、すなわち、配列番号1のポリペプチドが、親ポリペプチドにおけるその対応するアミノ酸配列を決定するために使用され;そして
(ii)前記親ペプチドが、配列番号1のアミノ酸位置59~アミノ酸位置381である、配列番号1(ウシキモシン)の成熟ポリペプチドと少なくとも65%の配列同一性を有し;
そして但し、単離されたキモシンポリペプチド変異体は、下記:
Q246E + G309D + S329P + D337E;
R125Q + G128N + H204R + Q246E + S284T;
Y185F + R213Q + Q246E;
V261A + V263I + G309W + L311I + Y326F;
G128D + L188I + Y326F;
G128N + R312S +S313Y + Y326F;
G128N + R312S + S313Y +Y326F;
D117N + V261A + R312S;
D216S + L224V + V263I + F281V + G309D;
Y79S + L224V + L311I; 及び
R119S + L224V + T297Sから成る群から選択される特定の変異体ではない。
(a)キモシン活性を有する親ポリペプチド中の1又は2以上の位置での変更、ここで前記変更が、下記位置:70; 75; 77; 79; 90; 102; 103; 108; 114; 117; 120; 124; 134; 154; 156; 163; 212; 222; 223; 224; 238; 246; 256; 261; K279V; L280; F281; R300D,E,S,T,N,Q,C,U,G,P,A,V,I,L,M,F,Y,W; G309; R312D,E,S,T,N,Q,C,U,G,P,A,V,I,L,M,F,Y,W; 320; 324; D325Q; 326; 331; 336; 346; 361; 367及び 379の何れかに対応する少なくとも1つのアミノ酸位置での置換、欠失又は挿入を含んでいる、を含んで成り;そして
(b)前記変異体がキモシン活性を有し;
そして、
(i)前記親ポリペプチドのアミノ酸位置が、配列番号1(ウシキモシン)のポリペプチドと、前記親ポリペプチドとの整列により決定され、すなわち、配列番号1のポリペプチドが、親ポリペプチドにおけるその対応するアミノ酸配列を決定するために使用され;そして
(ii)前記親ペプチドが、配列番号1のアミノ酸位置59~アミノ酸位置381である、配列番号1(ウシキモシン)の成熟ポリペプチドと少なくとも90%の配列同一性を有し;そして
(iii)前記単離された変異体ポリペプチドが、配列番号1(ウシキモシン)の成熟ポリペプチドと100%未満の配列同一性を有し;そして
但し、単離されたキモシンポリペプチド変異体は、下記:
Q246E + G309D + S329P + D337E;
R125Q + G128N + H204R + Q246E + S284T;
Y185F + R213Q + Q246E;
V261A + V263I + G309W + L311I + Y326F;
G128D + L188I + Y326F;
G128N + R312S +S313Y + Y326F;
G128N + R312S + S313Y +Y326F;
D117N + V261A + R312S;
D216S + L224V + V263I + F281V + G309D;
Y79S + L224V + L311I; 及び
R119S + L224V + T297Sから成る群から選択された特定の変異体ではない。
(a)キモシン活性を有する親ポリペプチド中の1又は2以上の位置での変更、ここで前記変更が、下記位置:70; 75; 77; 79; 90; 102; 103; 108; 114; 117; 120; 124; 134; 154; 156; 163; 212; 222; 223; 224; 238; 246; 256; 261; K279V; L280; F281; R300D,E,S,T,N,Q,C,U,G,P,A,V,I,L,M,F,Y,W; G309; R312D,E,S,T,N,Q,C,U,G,P,A,V,I,L,M,F,Y,W; 320; 324; D325Q; 326; 331; 336; 346; 361; 367及び 379の何れかに対応する少なくとも1つのアミノ酸位置での置換、欠失又は挿入を含んでいる、を含んで成り;そして
(b)前記変異体がキモシン活性を有し;
そして、
(i)前記親ポリペプチドのアミノ酸位置が、配列番号1(ウシキモシン)のポリペプチドと、前記親ポリペプチドとの整列により決定され、すなわち配列番号1のポリペプチドが、親ポリペプチドにおけるその対応アルアミノ酸配列を決定するために使用され;そして
(ii)前記親ペプチドが、配列番号2のアミノ酸位置59~アミノ酸位置381である、配列番号2(ラクダキモシン)の成熟ポリペプチドと少なくとも90%の配列同一性を有し;そして
(iii)前記単離された変異体ポリペプチドが、配列番号2(ラクダキモシン)の成熟ポリペプチドと100%未満の配列同一性を有し;そして
但し、単離されたキモシンポリペプチド変異体は、下記:
Q246E + G309D + S329P + D337E;
R125Q + G128N + H204R + Q246E + S284T;
Y185F + R213Q + Q246E;
V261A + V263I + G309W + L311I + Y326F;
G128D + L188I + Y326F;
G128N + R312S +S313Y + Y326F;
G128N + R312S + S313Y +Y326F;
D117N + V261A + R312S;
D216S + L224V + V263I + F281V + G309D;
Y79S + L224V + L311I; 及び
R119S + L224V + T297Sから成る群から選択された特定の変異体ではない。
本明細書における関連する用語のすべての定義は、本明細書における関連する技術的内容に関連して、当業者により理解されるであろうことに従う。
(同一残基×100)/(アラインメントの長さ-アラインメントにおけるギャップの総数)
(同一デオキシリボヌクレオチド×100)/(アラインメントの長さ-アラインメントにおけるギャップの総数)。
上記で論じられたように-目的(例えば、ラクダ、ヒツジ、ウシ、等)の本明細書における関連するキモシンポリペプチドのアミノ酸位置を決定するための参照配列として、本明細書において配列番号1として開示される公知のウシキモシン配列が本明細書において使用される。
本発明の変異体の記載においては、下記命名法が、参照を容易にするために適合される。許容されるIUPAC一文字又は三文字アミノ酸略語が使用される。この下記「命名法」セクションにおいて論じられる特定の変異体は、本発明の関連する変異体ではなく、すなわち、この「命名法」セクションは、本明細書において関連する使用される命名法を説明しているに過ぎない。
アミノ酸置換のために、次の命名法が使用される:元のアミノ酸、位置、置換されるアミノ酸。従って、位置226でのアラニンによるスレオニンの理論的置換は、「Thr226 Ala」又は「T226A」として指定される。複数の突然変異は、追加の印「+」により分離され、例えば「Gly205Arg+Ser411Phe」又は「G205R+S441F」は、それぞれ、位置205及び411でのアルギニン(R)によるグリシン(G)の、及びフェニルアラニン(F)によるセリン(S)の置換を表す。置換、例えば、指定される「226A」は、位置226でのアラニンによる親アミノ酸(例えば、T、Q、S又は別の親アミノ酸)の置換を意味する。
アミノ酸欠失に関しては、次の命名法が使用される:元のアミノ酸、置換、*。従って、位置195でのグリシンの欠失は、「Gly195*」又は「G195*」として指定される。複数の欠失は、追加の印「+」により分離され、例えば「Gly195*+Ser441*」又は「G195*+S411*」が示される。
アミノ酸挿入に関しては、次の命名法が使用される:元のアミノ酸、位置、元のアミノ酸、挿入されるアミノ酸。従って、位置195でのグリシンの後へのリシンの挿入は、「Gly195GlyLys」又は「G195GK」として指定される。複数のアミノ酸の挿入は次のように指定される「元のアミノ酸、位置、元のアミノ酸、挿入されるアミノ酸#1、挿入されるアミノ酸#2、等」。例えば、位置195でのグリシンの後へのリシン及びアラニンの挿入は、「Gly195GlyLysAla」又は「G195GKA」として示される。そのような場合、挿入されるアミノ酸残基は、挿入されるアミノ酸残基の前のアミノ酸残基の位置番号に小文字の付加により番号付けされる。従って、上記においては、配列は次の通りである:
複数の変更を含む変異体は、追加の印「+」により分離され、例えば「Arg170Tyr+Gly195Glu」又は「R170Y+G195E」は、それぞれ、位置170及び195でのアルギニン及びグリシンによるチロシン及びグルタミン酸の置換を表す。
異なった置換が、1つの位置で挿入され得る場合、その異なった置換は、コンマにより分離され、例えば「Arg170Tyr,Glu」又は「R170Y,E」とは、位置170でのチロシン又はグルタミン酸によるアルギニンの置換を表す。従って、「Tyrl67Gly,Ala + Argl70Gly,Ala」又は「y167G,A + R170G,A」は、次の変異体を指定する:「Tyrl67Gly+Argl70Gly」、「Tyrl67Gly+Argl70Ala」、「Tyrl67Ala+Argl70Gly」及び「Tyrl67Ala+Argl70Ala」。
上記で論じられたように-当業界おいて知られているように、当業者は、彼らの共通する一般的知識に基づいて、キモシン及びキモシン変異体を、日常的に生成し、そして精製することができる。
-本明細書における配列番号1の成熟ポリペプチドを含むウシキモシンのC/P比に比較して、より高いC/P比を付与するキモシン活性;及び
-本明細書における配列番号2の成熟ポリペプチドを含むラクダキモシンのC/P比に比較して、より高いC/P比を付与するキモシン活性、を有する変異体である。
上記で論じられたように-例えば、前記第1の態様は、単離されたキモシンポリペプチド変異体に関し、ここで前記変更は、下記位置:70; 75; 77; 79; 90; 102; 103; 108; 114; 117; 120; 124; 134; 154; 156; 163; 212; 222; 223; 224; 238; 246; 256; 261; K279V; L280; F281; R300D,E,S,T,N,Q,C,U,G,P,A,V,I,L,M,F,Y,W; G309; R312D,E,S,T,N,Q,C,U,G,P,A,V,I,L,M,F,Y,W; 320; 324; D325Q; 326; 331; 336; 346; 361; 367及び 379の何れかに対応する、少なくとも1つのアミノ酸位置で、置換、欠失又は挿入を包含する。
H134Q + Q246E + Y326F;
D117N + L280I + G309D;
H134Q + D156V + G309D;
D156V + Q246E + L280I;
D117N + H 134Q + L280I;
D156V + G309D + Y326F;
D117N + D 156V + D325M;
L280I + D325M + Y326F;
D117N + Q246E + Y326F;
D117N + H 134Q + D325M;
N310Q + N349Q + K279V;
R300Q + N307D;
N307D + G309D;
N307D + R312S;
R300Q + K336Q;
N307D + K336Q;
G309D + R312S;
R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q;
N158Q + N349Q + R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q;
L280I + G309D + S331Y + T342S + D325Q;
L280I + G309D + L224V + E320T + T235S;
L280I + G309W + K77T + R324I;
L280I + G309D + H 134Q + V213F + F281A;
L280I + G309D + V213F + E320T + V90L;
L280I + G309D + Q220S + L224V + H134Q;
L280I + G309W + L238I + T342S;
L280I + G309W + F75Y + Y79S;
L280I + G309D + F75Y + S331Y + Q346E;
L280I + G309D + L224V + I103V + L238I;
L280I + G309D + F124Y + Q346E + I154L;
L280I + G309D + I154L + V261A + V367I;
L280I + G309D + Y79S + L224V + S212A;
L280I + G309D + L70M + T342S;
L280I + G309D + H 134Q + M223E + L70M;
L280I + G309D + Y79S + T342S + I154L;
L280I + G309D + Y79S + I103V + F281A;
L280I + G309D + V256I + V261A + K379P;
L280I + G309D + Q346E + K77T + T235S;
L280I + G309D + H239N + R324I + D325Q;
L280I + G309D + H 134Q + V213F + F281A;
L280I + G309D + Y326F + L70M + D325Q;
L280I + G309D + H 134Q + M223E + L70M;
L280I + G309W + S212A + V261A;
L280I + G309D + S331Y + L224V + Y326F;
L280I + G309D + K120Q + M223E + H239N;
L280I + G309D + H239N + R324I + D325Q;
L280I + G309W + L238I + T342S;
L280I + G309D + V213F + E320T + V90L;
L280I + G309D + L70M + T342S;
L280I + G309D + H 134Q + V213F + F281A;
L280I + G309D + Y79S + L224V + S212A;
L280I + G309D + S331Y + L224V + Y326F;
L280I + G309D + H134Q + M223E + L70M;
L280I + G309W + L238I + T342S;
L280I + G309D + V213F + E320T + V90L; 又は
L280I + G309W + S212A + V261A。
D117N + L280I + G309D;
L280I + D325M + Y326F;
D117N + Q246E + Y326F;
R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q; 又は
N158Q + N349Q + R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q。
好ましくは、親ポリペプチドは、配列番号1(ウシキモシン)の成熟ポリペプチドと少なくとも70%の配列同一性を有し、より好ましくは、親ポリペプチドは、配列番号1(ウシキモシン)の成熟ポリペプチドと少なくとも75%の配列同一性を有する。
上記で論じられたように-本明細書における実施例において、親ポリペプチドとして配列番号1(ウシ)のポリペプチドを用いて、変異体を製造し-そのような変異体は、本明細書において、ウシキモシン変異体と呼ばれ得る。
(a)キモシン活性を有する親ポリペプチド中の1又は2以上の位置での変更、ここで前記変更が、下記位置70; 75; 77; 79; 90; 102; 103; 108; 114; 117; 120; 124; 134; 154; 156; 163; 212; 222; 223; 224; 238; 246; 256; 261; K279V; L280; F281; R300D,E,S,T,N,Q,C,U,G,P,A,V,I,L,M,F,Y,W; G309; R312D,E,S,T,N,Q,C,U,G,P,A,V,I,L,M,F,Y,W; 320; 324; D325Q; 326; 331; 336; 346; 361; 367及び 379の何れかに対応する少なくとも1つのアミノ酸位置で置換、欠失又は挿入を含んでいる、を含んで成り;そして
(b)前記変異体がキモシン活性を有し;
そして、
(i)前記親ポリペプチドのアミノ酸位置が、配列番号1(ウシキモシン)のポリペプチドと、前記親ポリペプチドとの整列により決定され、すなわち配列番号1のポリペプチドが、親ポリペプチドにおけるその対応するアミノ酸配列を決定するために使用され;そして
(ii)前記親ペプチドが、配列番号1のアミノ酸位置59~アミノ酸位置381である、配列番号1(ウシキモシン)の成熟ポリペプチドと少なくとも90%の配列同一性を有し;そして
(iii)前記単離された変異体ポリペプチドが、配列番号1(ウシキモシン)の成熟ポリペプチドと100%未満の配列同一性を有し;そして
但し、単離されたキモシンポリペプチド変異体は、下記:
Q246E + G309D + S329P + D337E;
R125Q + G128N + H204R + Q246E + S284T;
Y185F + R213Q + Q246E;
V261A + V263I + G309W + L311I + Y326F;
G128D + L188I + Y326F;
G128N + R312S +S313Y + Y326F;
G128N + R312S + S313Y +Y326F;
D117N + V261A + R312S;
D216S + L224V + V263I + F281V + G309D;
Y79S + L224V + L311I; 及び
R119S + L224V + T297Sから成る群から選択された特定の変異体ではない。
H134Q + Q246E + Y326F;
D117N + L280I + G309D;
H134Q + D156V + G309D;
D156V + Q246E + L280I;
D117N + H 134Q + L280I;
D156V + G309D + Y326F;
D117N + D 156V + D325M;
L280I + D325M + Y326F;
D117N + Q246E + Y326F;
D117N + H 134Q + D325M;
N310Q + N349Q + K279V;
R300Q + N307D;
N307D + G309D;
N307D + R312S;
R300Q + K336Q;
N307D + K336Q;
G309D + R312S;
R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q;
N158Q + N349Q + R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q;
L280I + G309D + S331Y + T342S + D325Q;
L280I + G309D + L224V + E320T + T235S;
L280I + G309W + K77T + R324I;
L280I + G309D + H 134Q + V213F + F281A;
L280I + G309D + V213F + E320T + V90L;
L280I + G309D + Q220S + L224V + H134Q;
L280I + G309W + L238I + T342S;
L280I + G309W + F75Y + Y79S;
L280I + G309D + F75Y + S331Y + Q346E;
L280I + G309D + L224V + I103V + L238I;
L280I + G309D + F124Y + Q346E + I154L;
L280I + G309D + I154L + V261A + V367I;
L280I + G309D + Y79S + L224V + S212A;
L280I + G309D + L70M + T342S;
L280I + G309D + H 134Q + M223E + L70M;
L280I + G309D + Y79S + T342S + I154L;
L280I + G309D + Y79S + I103V + F281A;
L280I + G309D + V256I + V261A + K379P;
L280I + G309D + Q346E + K77T + T235S;
L280I + G309D + H239N + R324I + D325Q;
L280I + G309D + H 134Q + V213F + F281A;
L280I + G309D + Y326F + L70M + D325Q;
L280I + G309D + H134Q + M223E + L70M;
L280I + G309W + S212A + V261A;
L280I + G309D + S331Y + L224V + Y326F;
L280I + G309D + K120Q + M223E + H239N;
L280I + G309D + H239N + R324I + D325Q;
L280I + G309W + L238I + T342S;
L280I + G309D + V213F + E320T + V90L;
L280I + G309D + L70M + T342S;
L280I + G309D + H134Q + V213F + F281A;
L280I + G309D + Y79S + L224V + S212A;
L280I + G309D + S331Y + L224V + Y326F;
L280I + G309D + H 134Q + M223E + L70M;
L280I + G309W + L238I + T342S;
L280I + G309D + V213F + E320T + V90L; 又は
L280I + G309W + S212A + V261Aである。
D117N + L280I + G309D;
L280I + D325M + Y326F;
D117N + Q246E + Y326F;
R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q; 又は
N158Q + N349Q + R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Qである。
上記で論じられたように-本明細書における実施例において、親ポリペプチドとして配列番号2(ラクダ)のポリペプチドを用いて、変異体を製造し-そのような変異体は、本明細書において、ラクダキモシン変異体と呼ばれ得る。
(a)キモシン活性を有する親ポリペプチド中の1又は2以上の位置での変更、ここで前記変更が、下記位置70; 75; 77; 79; 90; 102; 103; 108; 114; 117; 120; 124; 134; 154; 156; 163; 212; 222; 223; 224; 238; 246; 256; 261; K279V; L280; F281; R300D,E,S,T,N,Q,C,U,G,P,A,V,I,L,M,F,Y,W; G309; R312D,E,S,T,N,Q,C,U,G,P,A,V,I,L,M,F,Y,W; 320; 324; D325Q; 326; 331; 336; 346; 361; 367及び 379の何れかに対応する少なくとも1つのアミノ酸位置で置換、欠失又は挿入を含んでいる、を含んで成り;そして
(b)前記変異体がキモシン活性を有し;
そして、
(i)前記親ポリペプチドのアミノ酸位置が、配列番号1(ウシキモシン)のポリペプチドと、前記親ポリペプチドとの整列により決定され、すなわち、配列番号1のポリペプチドが、親ポリペプチドにおけるその対応するアミノ酸配列を決定するために使用され;そして
(ii)前記親ペプチドが、配列番号2のアミノ酸位置59~アミノ酸位置381である、配列番号2(ラクダキモシン)の成熟ポリペプチドと少なくとも90%の配列同一性を有し;そして
(iii)前記単離された変異体ポリペプチドが、配列番号2(ラクダキモシン)の成熟ポリペプチドと100%未満の配列同一性を有し;そして
但し、単離されたキモシンポリペプチド変異体は、下記:
Q246E + G309D + S329P + D337E;
R125Q + G128N + H204R + Q246E + S284T;
Y185F + R213Q + Q246E;
V261A + V263I + G309W + L311I + Y326F;
G128D + L188I + Y326F;
G128N + R312S +S313Y + Y326F;
G128N + R312S + S313Y +Y326F;
D117N + V261A + R312S;
D216S + L224V + V263I + F281V + G309D;
Y79S + L224V + L311I; 及び
R119S + L224V + T297Sから成る群から選択された特定の変異体ではない。
H134Q + Q246E + Y326F;
D117N + L280I + G309D;
H134Q + D156V + G309D;
D156V + Q246E + L280I;
D117N + H134Q + L280I;
D156V + G309D + Y326F;
D117N + D156V + D325M;
L280I + D325M + Y326F;
D117N + Q246E + Y326F;
D117N + H134Q + D325M;
N310Q + N349Q + K279V;
R300Q + N307D;
N307D + G309D;
N307D + R312S;
R300Q + K336Q;
N307D + K336Q;
G309D + R312S;
R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q;
N158Q + N349Q + R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q;
L280I + G309D + S331Y + T342S + D325Q;
L280I + G309D + L224V + E320T + T235S;
L280I + G309W + K77T + R324I;
L280I + G309D + H134Q + V213F + F281A;
L280I + G309D + V213F + E320T + V90L;
L280I + G309D + Q220S + L224V + H134Q;
L280I + G309W + L238I + T342S;
L280I + G309W + F75Y + Y79S;
L280I + G309D + F75Y + S331Y + Q346E;
L280I + G309D + L224V + I103V + L238I;
L280I + G309D + F124Y + Q346E + I154L;
L280I + G309D + I154L + V261A + V367I;
L280I + G309D + Y79S + L224V + S212A;
L280I + G309D + L70M + T342S;
L280I + G309D + H 134Q + M223E + L70M;
L280I + G309D + Y79S + T342S + I154L;
L280I + G309D + Y79S + I103V + F281A;
L280I + G309D + V256I + V261A + K379P;
L280I + G309D + Q346E + K77T + T235S;
L280I + G309D + H239N + R324I + D325Q;
L280I + G309D + H134Q + V213F + F281A;
L280I + G309D + Y326F + L70M + D325Q;
L280I + G309D + H 134Q + M223E + L70M;
L280I + G309W + S212A + V261A;
L280I + G309D + S331Y + L224V + Y326F;
L280I + G309D + K120Q + M223E + H239N;
L280I + G309D + H239N + R324I + D325Q;
L280I + G309W + L238I + T342S;
L280I + G309D + V213F + E320T + V90L;
L280I + G309D + L70M + T342S;
L280I + G309D + H134Q + V213F + F281A;
L280I + G309D + Y79S + L224V + S212A;
L280I + G309D + S331Y + L224V + Y326F;
L280I + G309D + H 134Q + M223E + L70M;
L280I + G309W + L238I + T342S;
L280I + G309D + V213F + E320T + V90L; 又は
L280I + G309W + S212A + V261Aである。
D117N + L280I + G309D;
L280I + D325M + Y326F;
D117N + Q246E + Y326F;
R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q;又は
N158Q + N349Q + R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Qである。
上記で論じられたように-本明細書に記載されるような、単離されたキモシンポリペプチド変異体は、例えば、目的の乳ベースの製品(例えば、チーズ製品)を製造するために、技術に従って使用され得る。
本明細書に記載される本発明の態様及び好ましい実施態様は、いわゆるクレーム形式で提供され/記載され得-これは以下に行われる。
(a)キモシン活性を有する親ポリペプチド中の1又は2以上の位置で変更を行う工程、ここで前記変更が、下記位置70; 75; 77; 79; 90; 102; 103; 108; 114; 117; 120; 124; 134; 154; 156; 163; 212; 222; 223; 224; 238; 246; 256; 261; K279V; L280; F281 ; R300D,E,S,T,N,Q,C,U,G,P,A,V,I,L,M,F,Y,W; G309; R312D,E,S,T,N,Q,C,U,G,P,A,V,I,L,M,F,Y,W; 320; 324; D325Q; 326; 331; 336; 346; 361; 367及び 379の何れかに対応する少なくとも1つのアミノ酸位置で置換、欠失又は挿入を含んでおり;及び
(b)工程(a)の変更されたポリペプチドを生成し、そして単離し、そしてそれにより、単離されたキモシンポリペプチドを得る工程を含んで成り、ここで前記変異体はキモシン活性を有し;そして
(i)前記親ポリペプチドのアミノ酸位置が、配列番号1(ウシキモシン)のポリペプチドと、前記親ポリペプチドとの整列により決定され、すなわち配列番号1のポリペプチドが、親ポリペプチドにおけるその対応するアミノ酸配列を決定するために使用され;そして
(ii)前記親ペプチドが、配列番号1のアミノ酸位置59~アミノ酸位置381である、配列番号1(ウシキモシン)の成熟ポリペプチドと少なくとも65%の配列同一性を有し;
そして但し、単離されたキモシンポリペプチド変異体は、下記:
Q246E + G309D + S329P + D337E;
R125Q + G128N + H204R + Q246E + S284T;
Y185F + R213Q + Q246E;
V261A + V263I + G309W + L311I + Y326F;
G128D + L188I + Y326F;
G128N + R312S +S313Y + Y326F;
G128N + R312S + S313Y +Y326F;
D117N + V261A + R312S;
D216S + L224V + V263I + F281V + G309D;
Y79S + L224V + L311I; 及び
R119S + L224V + T297Sから成る群から選択された特定の変異体ではない。
-配列番号1の成熟ポリペプチドを含むウシキモシンのC/P比に比較して、より高いC/P比を付与するキモシン活性;及び
-配列番号2の成熟ポリペプチドを含むラクダキモシンのC/P比に比較して、より高いC/P比を付与するキモシン活性を有する、請求項1に記載の方法。
H134Q + Q246E + Y326F;
D117N + L280I + G309D;
H134Q + D156V + G309D;
D156V + Q246E + L280I;
D117N + H134Q + L280I;
D 156V + G309D + Y326F;
D117N + D156V + D325M;
L280I + D325M + Y326F;
D117N + Q246E + Y326F;
D117N + H134Q + D325M;
N310Q + N349Q + K279V;
R300Q + N307D;
N307D + G309D;
N307D + R312S;
R300Q + K336Q;
N307D + K336Q;
G309D + R312S;
R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q;
N158Q + N349Q + R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q;
L280I + G309D + S331Y + T342S + D325Q;
L280I + G309D + L224V + E320T + T235S;
L280I + G309W + K77T + R324I;
L280I + G309D + H134Q + V213F + F281A;
L280I + G309D + V213F + E320T + V90L;
L280I + G309D + Q220S + L224V + H 134Q;
L280I + G309W + L238I + T342S;
L280I + G309W + F75Y + Y79S;
L280I + G309D + F75Y + S331Y + Q346E;
L280I + G309D + L224V + I103V + L238I;
L280I + G309D + F124Y + Q346E + I154L;
L280I + G309D + I154L + V261A + V367I;
L280I + G309D + Y79S + L224V + S212A;
L280I + G309D + L70M + T342S;
L280I + G309D + H134Q + M223E + L70M;
L280I + G309D + Y79S + T342S + I154L;
L280I + G309D + Y79S + I103V + F281A;
L280I + G309D + V256I + V261A + K379P;
L280I + G309D + Q346E + K77T + T235S;
L280I + G309D + H239N + R324I + D325Q;
L280I + G309D + H134Q + V213F + F281A;
L280I + G309D + Y326F + L70M + D325Q;
L280I + G309D + H134Q + M223E + L70M;
L280I + G309W + S212A + V261A;
L280I + G309D + S331Y + L224V + Y326F;
L280I + G309D + K120Q + M223E + H239N;
L280I + G309D + H239N + R324I + D325Q;
L280I + G309W + L238I + T342S;
L280I + G309D + V213F + E320T + V90L;
L280I + G309D + L70M + T342S;
L280I + G309D + H134Q + V213F + F281A;
L280I + G309D + Y79S + L224V + S212A;
L280I + G309D + S331Y + L224V + Y326F;
L280I + G309D + H 134Q + M223E + L70M;
L280I + G309W + L238I + T342S;
L280I + G309D + V213F + E320T + V90L; 又は
L280I + G309W + S212A + V261Aである、請求項4に載の方法。
D117N + L280I + G309D;
L280I + D325M + Y326F;
D117N + Q246E + Y326F;
R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q; 又は
N 158Q + N349Q + R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Qである、請求項4に載の方法。
(a)キモシン活性を有する親ポリペプチド中の1又は2以上の位置での変更、ここで前記変更が、下記位置70; 75; 77; 79; 90; 102; 103; 108; 114; 117; 120; 124; 134; 154; 156; 163; 212; 222; 223; 224; 238; 246; 256; 261; K279V; L280; F281 ; R300D,E,S,T,N,Q,C,U,G,P,A,V,I,L,M,F,Y,W;G309; R312D,E,S,T,N,Q,C,U,G,P,A,V,I,L,M,F,Y,W; 320; 324; D325Q; 326; 331; 336; 346; 361; 367及び 379の何れかに対応する少なくとも1つのアミノ酸位置で置換、欠失又は挿入を含んでいる、を含んで成り;そして
(b)前記変異体がキモシン活性を有し;
そして、
(i)前記親ポリペプチドのアミノ酸位置が、配列番号1(ウシキモシン)のポリペプチドと、前記親ポリペプチドとの整列により決定され、すなわち、配列番号1のポリペプチドが、親ポリペプチドにおけるその対応するアミノ酸配列を決定するために使用され;そして
(ii)前記親ペプチドが、配列番号1のアミノ酸位置59~アミノ酸位置381である、配列番号1(ウシキモシン)の成熟ポリペプチドと少なくとも90%の配列同一性を有し;そして
(iii)前記単離された変異体ポリペプチドが、配列番号1(ウシキモシン)の成熟ポリペプチドと100%未満の配列同一性を有し;そして
但し、単離されたキモシンポリペプチド変異体は、下記:
Q246E + G309D + S329P + D337E;
R125Q + G128N + H204R + Q246E + S284T;
Y185F + R213Q + Q246E;
V261A + V263I + G309W + L311I + Y326F;
G128D + L188I + Y326F;
G128N + R312S +S313Y + Y326F;
G128N + R312S + S313Y +Y326F;
D117N + V261A + R312S;
D216S + L224V + V263I + F281V + G309D;
Y79S + L224V + L311I; 及び
R119S + L224V + T297Sから成る群から選択された特定の変異体ではない。
H134Q + Q246E + Y326F;
D117N + L280I + G309D;
H134Q + D156V + G309D;
D156V + Q246E + L280I;
D117N + H134Q + L280I;
D156V + G309D + Y326F;
D117N + D156V + D325M;
L280I + D325M + Y326F;
D117N + Q246E + Y326F;
D117N + H134Q + D325M;
N310Q + N349Q + K279V;
R300Q + N307D;
N307D + G309D;
N307D + R312S;
R300Q + K336Q;
N307D + K336Q;
G309D + R312S;
R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q;
N158Q + N349Q + R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q;
L280I + G309D + S331Y + T342S + D325Q;
L280I + G309D + L224V + E320T + T235S;
L280I + G309W + K77T + R324I;
L280I + G309D + H134Q + V213F + F281A;
L280I + G309D + V213F + E320T + V90L;
L280I + G309D + Q220S + L224V + H 134Q;
L280I + G309W + L238I + T342S;
L280I + G309W + F75Y + Y79S;
L280I + G309D + F75Y + S331Y + Q346E;
L280I + G309D + L224V + I103V + L238I;
L280I + G309D + F124Y + Q346E + I154L;
L280I + G309D + I154L + V261A + V367I;
L280I + G309D + Y79S + L224V + S212A;
L280I + G309D + L70M + T342S;
L280I + G309D + H134Q + M223E + L70M;
L280I + G309D + Y79S + T342S + I154L;
L280I + G309D + Y79S + I103V + F281A;
L280I + G309D + V256I + V261A + K379P;
L280I + G309D + Q346E + K77T + T235S;
L280I + G309D + H239N + R324I + D325Q;
L280I + G309D + H134Q + V213F + F281A;
L280I + G309D + Y326F + L70M + D325Q;
L280I + G309D + H134Q + M223E + L70M;
L280I + G309W + S212A + V261A;
L280I + G309D + S331Y + L224V + Y326F;
L280I + G309D + K120Q + M223E + H239N;
L280I + G309D + H239N + R324I + D325Q;
L280I + G309W + L238I + T342S;
L280I + G309D + V213F + E320T + V90L;
L280I + G309D + L70M + T342S;
L280I + G309D + H134Q + V213F + F281A;
L280I + G309D + Y79S + L224V + S212A;
L280I + G309D + S331Y + L224V + Y326F;
L280I + G309D + H134Q + M223E + L70M;
L280I + G309W + L238I + T342S;
L280I + G309D + V213F + E320T + V90L; 又は
L280I + G309W + S212A + V261Aである、請求項19に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体。
D117N + L280I + G309D;
L280I + D325M + Y326F;
D117N + Q246E + Y326F;
R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q; 又は
N 158Q + N349Q + R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q、である、請求項19に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体。
(a)キモシン活性を有する親ポリペプチド中の1又は2以上の位置での変更、ここで前記変更が、下記位置の何れかに対応する少なくとも1つのアミノ酸位置で置換、欠失又は挿入を含んでおり:70; 75; 77; 79; 90; 102; 103; 108; 114; 117; 120; 124; 134; 154; 156; 163; 212; 222; 223; 224; 238; 246; 256; 261; K279V; L280; F281 ; R300D,E,S,T,N,Q,C,U,G,P,A,V,I,L,M,F,Y,W;G309; R312D,E,S,T,N,Q,C,U,G,P,A,V,I,L,M,F,Y,W; 320; 324; D325Q; 326; 331; 336; 346; 361 ; 367及び 379、を含んで成り;そして
(b)前記変異体がキモシン活性を有し;
そして、
(i)前記ポリペプチドのアミノ酸位置が、配列番号1(ウシキモシン)のポリペプチドと、前記親ポリペプチドとの整列により決定され、すなわち配列番号1のポリペプチドが、親ポリペプチドにおけるその対応アルアミノ酸配列を決定するために使用され;そして
(ii)前記親ペプチドが、配列番号2のアミノ酸位置59~アミノ酸位置381である、配列番号2(ラクダキモシン)の成熟ポリペプチドと少なくとも90%の配列同一性を有し;そして
(iii)前記単離された変異体ポリペプチドが、配列番号2(ラクダキモシン)の成熟ポリペプチドと100%未満の配列同一性を有し;そして
但し、単離されたキモシンポリペプチド変異体は、下記:
Q246E + G309D + S329P + D337E;
R125Q + G128N + H204R + Q246E + S284T;
Y185F + R213Q + Q246E;
V261A + V263I + G309W + L311I + Y326F;
G128D + L188I + Y326F;
G128N + R312S +S313Y + Y326F;
G128N + R312S + S313Y +Y326F;
D117N + V261A + R312S;
D216S + L224V + V263I + F281V + G309D;
Y79S + L224V + L311I; 及び
R119S + L224V + T297Sから成る群から選択された特定の変異体ではない。
H134Q + Q246E + Y326F;
D117N + L280I + G309D;
H134Q + D156V + G309D;
D156V + Q246E + L280I;
D117N + H134Q + L280I;
D 156V + G309D + Y326F;
D117N + D156V + D325M;
L280I + D325M + Y326F;
D117N + Q246E + Y326F;
D117N + H134Q + D325M;
N310Q + N349Q + K279V;
R300Q + N307D;
N307D + G309D;
N307D + R312S;
R300Q + K336Q;
N307D + K336Q;
G309D + R312S;
R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q;
N 158Q + N349Q + R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q;
L280I + G309D + S331Y + T342S + D325Q;
L280I + G309D + L224V + E320T + T235S;
L280I + G309W + K77T + R324I;
L280I + G309D + H134Q + V213F + F281A;
L280I + G309D + V213F + E320T + V90L;
L280I + G309D + Q220S + L224V + H134Q;
L280I + G309W + L238I + T342S;
L280I + G309W + F75Y + Y79S;
L280I + G309D + F75Y + S331Y + Q346E;
L280I + G309D + L224V + I103V + L238I;
L280I + G309D + F124Y + Q346E + I154L;
L280I + G309D + I154L + V261A + V367I;
L280I + G309D + Y79S + L224V + S212A;
L280I + G309D + L70M + T342S;
L280I + G309D + H134Q + M223E + L70M;
L280I + G309D + Y79S + T342S + I154L;
L280I + G309D + Y79S + I103V + F281A;
L280I + G309D + V256I + V261A + K379P;
L280I + G309D + Q346E + K77T + T235S;
L280I + G309D + H239N + R324I + D325Q;
L280I + G309D + H134Q + V213F + F281A;
L280I + G309D + Y326F + L70M + D325Q;
L280I + G309D + H134Q + M223E + L70M;
L280I + G309W + S212A + V261A;
L280I + G309D + S331Y + L224V + Y326F;
L280I + G309D + K120Q + M223E + H239N;
L280I + G309D + H239N + R324I + D325Q;
L280I + G309W + L238I + T342S;
L280I + G309D + V213F + E320T + V90L;
L280I + G309D + L70M + T342S;
L280I + G309D + H134Q + V213F + F281A;
L280I + G309D + Y79S + L224V + S212A;
L280I + G309D + S331Y + L224V + Y326F;
L280I + G309D + H134Q + M223E + L70M;
L280I + G309W + L238I + T342S;
L280I + G309D + V213F + E320T + V90L; 又は
L280I + G309W + S212A + V261Aである、請求項30に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体。
D117N + L280I + G309D;
L280I + D325M + Y326F;
D117N + Q246E + Y326F;
R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q;又は
N158Q + N349Q + R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q、である、請求項30に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体。
キモシンタンパク質配列を、EBI(EBI, ツール, 多重配列アラインメント, CLUSTALW", http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)により提供されるような、及びLarkin MA, Blackshields G, Brown NP, Chenna R, McGettigan PA, McWilliam H, Valentin F, Wallace IM, Wilm A, Lopez R, Thompson JD, Gibson TJ, Higgins DG (2007). Bio-informatics 23(21), 2947-2948に記載されるようなClustalWアルゴリズムを用いて、整列した。
キモシン変異体を、異なった方法を用いて設計した。
すべてのキモシン変異体を、合成遺伝子として合成し、そしてpGAMpR-Cに実質的に対応する菌類発現ベクター中にクローン化した(国際公開第02/36752A2号に記載される)。
4.1 凝固活性の決定
凝乳活性を、国際酪農連盟により開発された標準方法(IDF方法)であるREMCAT方法を用いて決定した。凝乳活性を、0.5g/Lの塩化カルシウム溶液(pH約6.5)と共に、低発熱性、低脂肪粉乳から調製された標準乳基質の可視凝集のために必要とされる時間から決定した。レンネットサンプルの凝集時間を、サンプルとしてのIDF標準110Bにより、既知の凝乳活性を有し、そして同じ酵素組成物を有する参照標準のその凝集時間と比較する。サンプル及び参照標準を同一の化学的及び物理的条件下で測定した。変異体サンプルを、84mMの酢酸緩衝液(pH5.5)を用いて、約3IMCU/mlに調節した。この後、200μlの酵素を、一定の攪拌下で32℃±1℃の一定温度を維持できる、水浴に配置されるガラス試験管中の10mlの予備加熱された乳(32℃)に添加した。
IMCU/mlでの強度=(Sstandard×Tstandard×Dsample)/(Dstandard×Tsample)
Sstandard:レネットについての国際参照標準の凝乳活性。
Tstandard:標準希釈について得られる秒での凝集時間。
Dsample:サンプルについての希釈率。
Dstandard:標準についての希釈率。
Tsample:酵素の添加から凝集の時間までの希釈されたレンネットサンプルについて得られた秒での凝集時間。
総タンパク質含有量を、Thermo ScientificからのPierce BCA Protein Assay Kitを用いて、そのキットの説明書に従って決定した。
特定の凝固活性(IMCU/mg総タンパク質)を、総タンパク質含有量(ml当たりのmgの総タンパク質)により凝固活性(IMCU/lm)を割ることにより決定した。
一般的なタンパク質分解活性を、基質として、蛍光標識されたBodipy-FLカゼイン(EnzChek; Molecular Bioprobes, E6638)を用いて測定した。pH-非感受性緑色蛍光Bodipy-FLにより重度に標識されたカゼイン誘導体は、接合体の蛍光のほとんど完全な消光をもたらす。プロテアーゼ触媒された加水分解は、蛍光Bidipy-FLを放出する。CHYMAX Mは今日まで知られているすべての凝固剤の最低な一般的タンパク質分解活性を有するので、この実験のために必須であったこの方法は、非常に敏感である。
すべての変異体について、特定の凝固活性(IMCU/全タンパク質のmg)を、実施例4に従って、pH6.5で決定し、そしてタンパク質分解活性を、pH6.5で、実施例5に従って決定した。C/P比を、タンパク質分解活性により、特定の凝固活性(IMCU/mg)を割ることにより、pH6.5で全変異体について決定した。参照として、ラクダ野生型遺伝子が含まれた。
異なった置換が、それぞれの効果に対して影響を及ぼす場合、明確な組合せ効果が存在することが結論づけられ得る。
すべての変異体は多重突然変異を含んでいたので、ランクされた変異体のデータを、統計学的方法及び3D構造分析を用いて、より詳細に調べ、正又は負の効果を有する個々のアミノ酸変化を決定した。
上記結果は、ラクダキモシンにおける次の個々の突然変異が好ましいことを実証する(すなわち、ラクダ野生型キモシンに比較して、改善されたC/P比を有する):D117N、Q246E、G309D、Y326F、L280I。
D117N + L280I + G309D;
L280I + D325M + Y326F;
D117N + Q246E + Y326F。
すべての変異体について、特異的凝固活性(IMCU/mgの総タンパク質)を、実施例4に従ってpH6.5で決定し、そして一般的な又は特異的タンパク質分解活性を、実施例5に記載のようにして決定した。C/P比を、タンパク質分解活性により特異的凝固活性(IMCU/mg)を割ることにより、pH6.5で、全変異体について決定した。参照として、ラクダ野生型遺伝子が含まれた。
変異体J2においては、K279がウシ非グリコシル化キモシンにおけるVにより置換された。変異体J32においては、ウシ非グリコシル化キモシンからのフラップ領域が、ペプシンからのフラップ領域により置換された。
ウシケモシンの位置279でのリシンの突然変異が、ウシケモシン(変異体J2)に比較して、同程度のタンパク質分解活性及び高められた特異的凝固活性を示した変異体をもたらした。従って、位置279でのバリンが好ましいアミノ酸であることが結論づけられ得る。
RxxxxxxNxGxxRxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxK ラクダ
QxxxxxxDxDxxSxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxQ ウシ
R300
N307
G309
R312
K336。
野生型ラクダキモシンに比較して、それぞれ多重置換を有する多くの異なった変異体を分析した。全変異体について、特異的凝固活性(IMCU/mgの全タンパク質)を、実施例4に従って、pH6.5で決定し、そして特異的タンパク質分解活性を、100IMCU当たりのタンパク質分解活性を測定することにより、実施例5に記載のようにして決定した。参照として、ラクダ野生型遺伝子が含まれた。
表に示される変異体は、ラクダキモシン遺伝子(ラクダwtにより示される)と同一のアミノ酸配列を有するが、但し、各変異体について言及される変更を除く。
PCAに基づく、統計学的分析を使用し、タンパク質分解活性、凝乳活性の何れか又は両者に対して陽性効果を有する単一の突然変異を同定した。下記表においては、高められた凝固活性をもたらす突然変異、低められたタンパク質分解活性、又は両高められた凝固及び低められたタンパク質分解性が要約されている。PCAプロットが図4に示されている。
凝固活性又は一般的タンパク質分解活性(すなわち、特異性)に対する効果を有するほとんどの突然変異は、触媒クレフトに位置するか又は近接するであろうことが予測された。基質は、触媒クレフトに入り、そしてここで、切断が生じる。
改善された凝固活性をもたらす置換のほとんどは、酵素の本体に位置し、そして分子の立体構造変化を引起した可能性がある。置換F75Yは、クレフトの入り口に位置し、そしてかなり微妙であり、高められた極性をもたらす。
置換のほとんどは、分子本体に位置する。得られる構造変化は、基質に対する高められた接近性をもたらす。2つの突然変異が、触媒クレフトの入口をマーキングするローブで見出された。L163E置換は、負の電荷を高める。これは、それらの位置での電荷の重要性を示す、実施例7からの結果を強化する。
凝乳能力の全体的な改善性をもたらす置換のいくつかは、基質認識に関与する可能性がある電荷変更をもたらす。それらは、より高い陽性をもたらすH134Q、及びより陰性の電荷をもたらすQ346E置換を包含する。凝固及び特異性の両者に対して陽性効果を有する他の置換は、キモシン分子のより一般的な構造変化をもたらす可能性が最も高い。
変異体の特性評価
凝乳(C)及び一般的タンパク質分解(P)活性に関する。実施例7において評価されたラクダキモシン変異体を、再び生成し、そしてそれらのカゼイン分解特異性C/Pに関して評価した(下記表1)。C/P比は、チーズ製造における凝固剤の効果、すなわち一定体積の乳から得られるチーズカードの収量についてのR度である。凝乳及び一般的タンパク質分解活性を、それぞれ、実施例4及び5に記載のようにして決定した。しかしながら、この実施例においては、タンパク質分解活性を、凝固活性について標準化しないで測定した。
PCAに基づく統計学的分析を、ラクダキモシンの一般的カゼインタンパク質分解(C/P)に対する凝乳の特異性に対する陽性効果を有する単一の突然変異を同定するために使用した。次の突然変異は、高いC/P比のために有益であることが見出された:
H134Q, F281A, I103V, V256I, I154L, S222G, L224V, Q346E, S331Y, K77T, V367I, G309D, V261A, D325Q, L280I, D117N, L163E, S212A。
変異体の特性評価
実施例7において決定された位置及び突然変異効果に基づいて、別の組のラクダケモシン変異体を、野生型ラクダケモシンに比較して、多重置換により生成し、そして実施例9に記載のようにして、それらのカゼイン基質特異性(C/P)に関して評価した(下記表1)。
S331Y, Y79S, K77T, D117N, H 134Q, N108D, G309W, L224V, D156V, L280I, M223E, V367I, F114Y。
PCAに基づく統計学的分析を、実施例9及び10からの組合わされた組の変異体に対して実施し、そしてラクダキモシンの一般的カゼインタンパク質分解(C/P)に対する凝乳の特異性に対して陽性効果を有する単一の突然変異を同定した。次の突然変異が、高いC/P比について有益であることが見出された:
F281A, H 134Q, I103V, S331Y, S222G, I154L, L280I, G309D, D117N, L224V, N 108D, L163E, G309W, K77T, Y79S。
実施例8に見られるように、有益な突然変異の大部分は、再び、基質結合クレフトから離れて位置している。L280I及びF281Aのみがクレフト内に直接位置している(Gilliland et al. 1990)。I280はC末端ローブの疎水性コアに向かう。従って、この突然変異は、結合クレフトの微妙な構造変化を導き、そして従って、基質特異性に影響を及ぼす。位置281は、S2結合部位の位置であり、そしてカゼイン基質におけるP2位置と相互反応する。この位置での突然変異は、カゼイン結合、及び従って、タンパク質分解対する影響の可能性が非常に高い。突然変異G309W及びS331Yは、触媒性クレフトにおける基質結合を助けるためにκ-カゼインと相互作用することが記載されている領域におけるC末端ローブの表面上に位置する(Gilliland et al. 1990)。従って、それらの突然変異は、基質結合に対して陽性の影響を与える。I154L及びD156V、及びL163Eは、N末端ローブのコアへの変化を表し、たぶん、触媒活性に対して影響を与える酵素の微妙な構造的再配列を導く。突然変異S222G及びL224Vは、その活性化された形でタンパク質N末端と相互作用するβシートへの変化を導入する(Langholm Jensen et al.)。酵素の活性化状態に対する可能性ある効果は、シフトされたカゼイン基質特異性をもたらすことができた。残りのヒット突然変異K77T、Y79S、I103V、N108D、D117N及びH134Qは、N末端ローブの表面上に位置し、そしてI103Vを除いて、極性アミノ酸の交換を表す。酵素の表面上のそれらの変化は、κ-カゼインの利益となるように、改善された特異性を導くカゼイン分子との相互作用に多分影響を及ぼす。
1 : 国際公開第02/36752A2号 (Chr. Hansen)
2 : Suzuki et al : Site directed mutagenesis reveals functional contribution of Thr218, Lys220 and Asp304 in chymosin, Protein Engineering, vol. 4, January 1990, pages 69-71
3 : Suzuki et al : Alteration of catalytic properties of chymosin by site-directed mutagenesis, Protein Engineering, vol. 2, May 1989, pages 563-569
4: van den Brink et al : Increased production of chymosin by glycosylation, Jour-nal of biotechnology, vol. 125, September 2006, pages 304-310.
5 : Pitts et al : Expression and characterisation of chymosin pH optima mutants produced in Tricoderma reesei, Journal of biotechnology, vol. 28, March 1993, pages 69-83
6 : M.G. Williams et al : Mutagenesis, biochemical characterization and X-ray structural analysis of point mutants of bovine chymosin, Protein engineering design and selection, vol. 10, September 1997, pages 991-997
7 : Strop et al : Engineering enzyme subsite specificity: preparation, kinetic characterization, and x-ray analysis at 2.0 ANG resolution of Val l l lphe site mutated calf chymosin, Biochemistry, vol. 29, October 1990, pages 9863-9871
8 : Supannee et al : Site-specific mutations of calf chymosin B which influence milk-clotting activity, Food Chemistry, vol. 62, June 1998, pages 133-139
9 : Zhang et al : Functional implications of disulfide bond, Cys45-Cys50, in recombinant prochymosin, Biochimica et biophysica acta, vol. 1343, December 1997, pages 278-286.
10 : 国際公開第2013/174840A1号 (Chr. Hansen).
11 : 国際公開第2013/164479A2号 (DSM).
12 : Langholm Jensen et al : Camel and bovine chymosin : the relationship between their structures and cheese-making properties, Acta Crystallographica Section D : Biological Crystallography, vol. 69, 2013, pages 901-913.
13 : Gilliland et al : The three-dimentional structure of bovine chymosin at 2.3A resolution, Proteins, vol. 8, 1990, pages 82-101。
Claims (15)
- 単離されたキモシンポリペプチド変異体の製造方法であって、以下の工程:
(a)キモシン活性を有する親ポリペプチド中の1つ以上の位置で変更を行い、ここで前記変更が、下記位置70; 75; 77; 79; 90; 102; 103 ; 108; 114; 117; 120; 124; 134; 154; 156; 163; 212; 222; 223; 224; 238; 246; 256; 261 ; K279V; L280; F281; R300D,E,S,T,N,Q,C,U,G,P,A,V,I,L,M,F,Y,W; G309; R312D,E,S,T,N,Q,C,U,G,P,A,V,I,L,M,F,Y,W; 320; 324; D325Q; 326; 331; 336; 346; 361; 367及び379の何れかに対応する少なくとも1つのアミノ酸位置での置換、欠失又は挿入を含んでおり;及び
(b)工程(a)の変更されたポリペプチドを生成し、そして単離し、そしてそれにより、単離されたキモシンポリペプチドを得る
ことを含み、ここで前記変異体は、キモシン活性を有し;そしてここで、
(i)前記親ポリペプチドのアミノ酸位置が、配列番号1(ウシキモシン)のポリペプチドと、前記親ポリペプチドとのアライメントにより決定され、すなわち、配列番号1のポリペプチドが、親ポリペプチドにおける対応するアミノ酸配列を決定するために使用され;そして
(ii)前記親ペプチドが、配列番号1(ウシキモシン)のアミノ酸位置59~アミノ酸位置381である、配列番号1の成熟ポリペプチドと少なくとも65%の配列同一性を有し;
そして但し、前記単離されたキモシンポリペプチド変異体は、下記:
Q246E + G309D + S329P + D337E;
R125Q + G128N + H204R + Q246E + S284T;
Y185F + R213Q + Q246E;
V261A + V263I + G309W + L311I + Y326F;
G128D + L188I + Y326F;
G128N + R312S +S313Y + Y326F;
G128N + R312S + S313Y +Y326F;
D117N + V261A + R312S;
D216S + L224V + V263I + F281V + G309D;
Y79S + L224V + L311I; 及び
R119S + L224V + T297Sから成る群から選択される特定の変異体ではない、方法。 - 前記単離されたキモシンポリペプチド変異体が、以下:
-配列番号1の成熟ポリペプチドを含むウシキモシンのC/P比と比較して、より高いC/P比を付与するキモシン活性;及び
-配列番号2の成熟ポリペプチドを含むラクダキモシンのC/P比と比較して、より高いC/P比を付与するキモシン活性
を有する、請求項1に記載の方法。 - 前記変更が、少なくとも1つのアミノ酸位置での置換を包含し、そして前記置換が、L70M; F75Y; K77T; Y79S; V90L; D102N; I103V; K120Q; F124Y; H134Q; I154L; L163E; S212A; M223E; L224V; L238I; Q246E; V256I; V261A; K279V; F281A; R300D,E,S,T,N,Q; R312D,E,S,T,N,Q; E320T; R324V; Y326F; K336D,E,S,T,N,Q,C,U,G,P,A,V,I,L,M,F,Y,W; S331Y; Q346E; I361L; V367I;又はK379Pである、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記置換が、Q246E; K279V; R300Q; R312S; Y326F; K336D,E,S,T,N,Q又はK336Qである、請求項3に記載の方法。
- 前記変更が、少なくとも1つのアミノ酸位置での置換を含み、そして前記置換が、
H134Q + Q246E + Y326F;
D117N + L280I + G309D;
H134Q + D156V + G309D;
D156V + Q246E + L280I;
D117N + H134Q + L280I;
D156V + G309D + Y326F;
D117N + D156V + D325M;
L280I + D325M + Y326F;
D117N + Q246E + Y326F;
D117N + H134Q + D325M;
N310Q + N349Q + K279V;
R300Q + N307D;
N307D + G309D;
N307D + R312S;
R300Q + K336Q;
N307D + K336Q;
G309D + R312S;
R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q;
N158Q + N349Q + R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q;
L280I + G309D + S331Y + T342S + D325Q;
L280I + G309D + L224V + E320T + T235S;
L280I + G309W + K77T + R324I;
L280I + G309D + H134Q + V213F + F281A;
L280I + G309D + V213F + E320T + V90L;
L280I + G309D + Q220S + L224V + H134Q;
L280I + G309W + L238I + T342S;
L280I + G309W + F75Y + Y79S;
L280I + G309D + F75Y + S331Y + Q346E;
L280I + G309D + L224V + I103V + L238I;
L280I + G309D + F124Y + Q346E + I 154L;
L280I + G309D + I154L + V261A + V367I;
L280I + G309D + Y79S + L224V + S212A;
L280I + G309D + L70M + T342S;
L280I + G309D + H134Q + M223E + L70M;
L280I + G309D + Y79S + T342S + I154L;
L280I + G309D + Y79S + I103V + F281A;
L280I + G309D + V256I + V261A + K379P;
L280I + G309D + Q346E + K77T + T235S;
L280I + G309D + H239N + R324I + D325Q;
L280I + G309D + H134Q + V213F + F281A;
L280I + G309D + Y326F + L70M + D325Q;
L280I + G309D + H134Q + M223E + L70M;
L280I + G309W + S212A + V261A;
L280I + G309D + S331Y + L224V + Y326F;
L280I + G309D + K120Q + M223E + H239N;
L280I + G309D + H239N + R324I + D325Q;
L280I + G309W + L238I + T342S;
L280I + G309D + V213F + E320T + V90L;
L280I + G309D + L70M + T342S;
L280I + G309D + H134Q + V213F + F281A;
L280I + G309D + Y79S + L224V + S212A;
L280I + G309D + S331Y + L224V + Y326F;
L280I + G309D + H134Q + M223E + L70M;
L280I + G309W + L238I + T342S;
L280I + G309D + V213F + E320T + V90L; 又は
L280I + G309W + S212A + V261Aである、請求項1~4のいずれか1項記に載の方法。 - 前記親ポリペプチドが、配列番号1(ウシキモシン)の成熟ポリペプチドと、少なくとも95%の配列同一性を有する、請求項1~5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記親ポリペプチドが、配列番号2(ラクダキモシン)のアミノ酸位置59~381である、配列番号2の成熟ポリペプチドと、少なくとも95%の配列同一を有する、請求項1~5のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1~7の何れか1項に記載の方法により得られる、単離されたキモシンポリペプチド変異体。
- 単離されたキモシンポリペプチド変異体であって、以下:
(a)キモシン活性を有する親ポリペプチド中の1つ以上の位置での変更、ここで前記変更が、下記位置70; 75; 77; 79; 90; 102; 103; 108; 114; 117; 120; 124; 134; 154; 156; 163; 212; 223; 224; 238; 246; 256; 261; K279V; L280; F281; R300D,E,S,T,N,Q,C,U,G,P,A,V,I,L,M,F,Y,W; G309; R312D,E,S,T,N,Q,C,U,G,P,A,V,I,L,M,F,Y,W; 320; 324; D325Q; 326; 331; 336; 346; 361; 367及び379の何れかに対応する少なくとも1つのアミノ酸位置での置換、欠失又は挿入を含む
を含み;そして
(b)前記変異体が、キモシン活性を有し;そして、
(i)前記親ポリペプチドのアミノ酸位置が、配列番号1(ウシキモシン)のポリペプチドと、前記親ポリペプチドとのアライメントにより決定され、すなわち、配列番号1のポリペプチドが、親ポリペプチドにおける対応するアミノ酸配列を決定するために使用され;そして
(ii)前記親ペプチドが、配列番号1(ウシキモシン)のアミノ酸位置59~アミノ酸位置381である、配列番号1の成熟ポリペプチドと少なくとも90%の配列同一性を有し;そして
(iii)前記単離された変異体ポリペプチドが、配列番号1(ウシキモシン)の成熟ポリペプチドと100%未満の配列同一性を有し;そして
但し、前記単離されたキモシンポリペプチド変異体は、下記:
Q246E + G309D + S329P + D337E;
R125Q + G128N + H204R + Q246E + S284T;
Y185F + R213Q + Q246E;
V261A + V263I + G309W + L311I + Y326F;
G128D + L188I + Y326F;
G128N + R312S +S313Y + Y326F;
G128N + R312S + S313Y +Y326F;
D117N + V261A + R312S;
D216S + L224V + V263I + F281V + G309D;
Y79S + L224V + L311I; 及び
R119S + L224V + T297Sから成る群から選択された特定の変異体ではなく;そして
前記単離された変異体が、配列番号1の成熟ポリペプチドを含むウシキモシンのC/P比と比較して、より高いC/P比を付与するキモシン活性を有する、
単離されたキモシンポリペプチド変異体。 - 前記親ポリペプチドが、配列番号1(ウシキモシン)の成熟ポリペプチドと少なくとも97%の配列同一性を有し;そして
前記単離されたウシキモシン変異体が、配列番号1(ウシキモシン)の成熟ポリペプチドと比較して、10個未満のアミノ酸の変更(例えば、置換)を含む、請求項9に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体。 - 前記変更が、少なくとも1つのアミノ酸位置に置換を含み、そして前記置換が、L70M; F75Y; K77T; Y79S; V90L; D102N; I103V; N108D; D117N; F114Y; K120Q; F124Y; H134Q; I154L; D156V; L163E; S212A; S222G; M223E; L224V; D325Q; L238I; Q246E; V256I; V261A; K279V; L280I; F281A; R300D,E,S,T,N,Q; G309D,W; R312D,E,S,T,N,Q; E320T; R324V; Y326F; K336D,E,S,T,N,Q,C,U,G,P,A,V,I,L,M,F,Y,W; S331Y; Q346E; I361 L; V367I;又はK379Pである、請求項9又は10に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体。
- 前記変更が、少なくとも1つのアミノ酸位置での置換を含み、そして前記置換が、
H134Q + Q246E + Y326F;
D117N + L280I + G309D;
H134Q + D156V + G309D;
D156V + Q246E + L280I;
D117N + H134Q + L280I;
D156V + G309D + Y326F;
D117N + D156V + D325M;
L280I + D325M + Y326F;
D117N + Q246E + Y326F;
D117N + H134Q + D325M;
N310Q + N349Q + K279V;
R300Q + N307D;
N307D + G309D;
N307D + R312S;
R300Q + K336Q;
N307D + K336Q;
G309D + R312S;
R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q;
N158Q + N349Q + R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q;
L280I + G309D + S331Y + T342S + D325Q;
L280I + G309D + L224V + E320T + T235S;
L280I + G309W + K77T + R324I;
L280I + G309D + H134Q + V213F + F281A;
L280I + G309D + V213F + E320T + V90L;
L280I + G309D + Q220S + L224V + H134Q;
L280I + G309W + L238I + T342S;
L280I + G309W + F75Y + Y79S;
L280I + G309D + F75Y + S331Y + Q346E;
L280I + G309D + L224V + I103V + L238I;
L280I + G309D + F124Y + Q346E + I154L;
L280I + G309D + I154L + V261A + V367I;
L280I + G309D + Y79S + L224V + S212A;
L280I + G309D + L70M + T342S;
L280I + G309D + H134Q + M223E + L70M;
L280I + G309D + Y79S + T342S + I154L;
L280I + G309D + Y79S + I103V + F281A;
L280I + G309D + V256I + V261A + K379P;
L280I + G309D + Q346E + K77T + T235S;
L280I + G309D + H239N + R324I + D325Q;
L280I + G309D + H134Q + V213F + F281A;
L280I + G309D + Y326F + L70M + D325Q;
L280I + G309D + H134Q + M223E + L70M;
L280I + G309W + S212A + V261A;
L280I + G309D + S331Y + L224V + Y326F;
L280I + G309D + K120Q + M223E + H239N;
L280I + G309D + H239N + R324I + D325Q;
L280I + G309W + L238I + T342S;
L280I + G309D + V213F + E320T + V90L;
L280I + G309D + L70M + T342S;
L280I + G309D + H134Q + V213F + F281A;
L280I + G309D + Y79S + L224V + S212A;
L280I + G309D + S331Y + L224V + Y326F;
L280I + G309D + H134Q + M223E + L70M;
L280I + G309W + L238I + T342S;
L280I + G309D + V213F + E320T + V90L; 又は
L280I + G309W + S212A + V261Aである、請求項9~10のいずれか1項に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体。 - 単離されたキモシンポリペプチド変異体であって、以下:
(a)キモシン活性を有する親ポリペプチド中の1つ以上の位置での変更、ここで前記変更が、下記位置70; 75; 77; 79; 90; 102; 103; 108; 114; 117; 120; 124; 134; 154; 156; 163; 212; 222; 223; 224; 238; 246; 256; 261; K279V; L280; F281; R300D,E,S,T,N,Q,C,U,G,P,A,V,I,L,M,F,Y,W; G309; R312D,E,S,T,N,Q,C,U,G,P,A,V,I,L,M,F,Y,W; 320; 324; D325Q; 326; 331; 336; 346; 361; 367及び379の何れかに対応する少なくとも1つのアミノ酸位置での置換、欠失又は挿入を含む
を含み;そして
(b)前記変異体が、キモシン活性を有し;そして、
(i)前記親ポリペプチドのアミノ酸位置が、配列番号1(ウシキモシン)のポリペプチドと、前記親ポリペプチドとのアライメントにより決定され、すなわち、配列番号1のポリペプチドが、親ポリペプチドにおける対応するアミノ酸配列を決定するために使用され;そして
(ii)前記親ペプチドが、配列番号2(ラクダキモシン)のアミノ酸位置59~アミノ酸位置381である、配列番号2の成熟ポリペプチドと少なくとも90%の配列同一性を有し;そして
(iii)前記単離された変異体ポリペプチドが、配列番号2(ラクダキモシン)の成熟ポリペプチドと100%未満の配列同一性を有し;そして
但し、前記単離されたキモシンポリペプチド変異体は、下記:
Q246E + G309D + S329P + D337E;
R125Q + G128N + H204R + Q246E + S284T;
Y185F + R213Q + Q246E;
V261A + V263I + G309W + L311I + Y326F;
G128D + L188I + Y326F;
G128N + R312S +S313Y + Y326F;
G128N + R312S + S313Y +Y326F;
D117N + V261A + R312S;
D216S + L224V + V263I + F281V + G309D;
Y79S + L224V + L311I; 及び
R119S + L224V + T297Sから成る群から選択される特定の変異体ではなく;そして
前記単離された変異体が、配列番号2の成熟ポリペプチドを含むラクダキモシンのC/P比と比較して、より高いC/P比を付与するキモシン活性を有する
単離されたキモシンポリペプチド変異体。 - 前記変更が、少なくとも1つのアミノ酸位置での置換を含み、そして前記置換が、
H134Q + Q246E + Y326F;
D117N + L280I + G309D;
H134Q + D156V + G309D;
D156V + Q246E + L280I;
D117N + H134Q + L280I;
D156V + G309D + Y326F;
D117N + D156V + D325M;
L280I + D325M + Y326F;
D117N + Q246E + Y326F;
D117N + H134Q + D325M;
N310Q + N349Q + K279V;
R300Q + N307D;
N307D + G309D;
N307D + R312S;
R300Q + K336Q;
N307D + K336Q;
G309D + R312S;
R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q;
N158Q + N349Q + R300Q + N307D + G309D + R312S + K336Q;
L280I + G309D + S331Y + T342S + D325Q;
L280I + G309D + L224V + E320T + T235S;
L280I + G309W + K77T + R324I;
L280I + G309D + H134Q + V213F + F281A;
L280I + G309D + V213F + E320T + V90L;
L280I + G309D + Q220S + L224V + H 134Q;
L280I + G309W + L238I + T342S;
L280I + G309W + F75Y + Y79S;
L280I + G309D + F75Y + S331Y + Q346E;
L280I + G309D + L224V + I103V + L238I;
L280I + G309D + F124Y + Q346E + I154L;
L280I + G309D + I154L + V261A + V367I;
L280I + G309D + Y79S + L224V + S212A;
L280I + G309D + L70M + T342S;
L280I + G309D + H134Q + M223E + L70M;
L280I + G309D + Y79S + T342S + I154L;
L280I + G309D + Y79S + I103V + F281A;
L280I + G309D + V256I + V261A + K379P;
L280I + G309D + Q346E + K77T + T235S;
L280I + G309D + H239N + R324I + D325Q;
L280I + G309D + H134Q + V213F + F281A;
L280I + G309D + Y326F + L70M + D325Q;
L280I + G309D + H134Q + M223E + L70M;
L280I + G309W + S212A + V261A;
L280I + G309D + S331Y + L224V + Y326F;
L280I + G309D + K120Q + M223E + H239N;
L280I + G309D + H239N + R324I + D325Q;
L280I + G309W + L238I + T342S;
L280I + G309D + V213F + E320T + V90L;
L280I + G309D + L70M + T342S;
L280I + G309D + H134Q + V213F + F281A;
L280I + G309D + Y79S + L224V + S212A;
L280I + G309D + S331Y + L224V + Y326F;
L280I + G309D + H134Q + M223E + L70M;
L280I + G309W + L238I + T342S;
L280I + G309D + V213F + E320T + V90L; 又は
L280I + G309W + S212A + V261Aである、請求項13に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体。 - 食品又は飼料製品の製造方法であって、請求項8~14の何れか1項に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体の有効量を、食品又は飼料成分に添加し、さらなる製造工程を実施して、前記食品又は飼料製品を得ることを含み、そして
ここで前記製品が、乳ベースの製品であり、そして前記方法が、請求項8~14の何れか1項に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体の有効量を、乳に添加し、そしてさらなる製造工程を実施して、乳ベースの製品を得ることを含み、そして
前記乳が、豆乳、ヒツジ乳、ヤギ乳、水牛乳、ヤク乳、ラマ乳、ラクダ乳、又は牛乳であり;そして
前記乳ベースの製品が、発酵乳製品、クオーク、又はチーズである、方法。
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