JP2022119883A

JP2022119883A - タンパク質界面

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Publication number: JP2022119883A
Application number: JP2022084997A
Authority: JP
Inventors: チャーワンチャーリー; Chahwan Charly; ソロヴェイチクマリア; Soloveychik Maria
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Priority date: 2016-05-27
Filing date: 2022-05-25
Publication date: 2022-08-17
Anticipated expiration: 2037-05-26
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Abstract

【課題】がんおよびＤＮＡ修復におけるタンパク質間相互作用を標的化する方法および組成物を提供する。【解決手段】本開示は、タンパク質間相互作用阻害剤の同定および産生のための方法、組成物および技術、ならびにタンパク質間相互作用阻害剤を使用するための方法、組成物および技術を提供する。本開示は、耐性がん細胞を標的化できる化合物を使用して、がんを含む状態を処置するための方法を提供する。これらの化合物は、耐性がん細胞を増感させるかまたは細胞の増殖を減少させるために使用され得る。これらの化合物は、ＤＮＡ損傷修復経路中のタンパク質を標的化して、標的細胞におけるＤＮＡ損傷修復の減少をもたらし得る。例えば、宿主細胞において第１の試験タンパク質と第２の試験タンパク質との間の相互作用を検出するための方法が提供される。【選択図】なし

Description

相互参照
本願は、２０１６年５月２７日に出願した仮出願第６２／３４２，８４０号および２０１６年９月７日に出願した仮出願第６２／３８４，２２６号の利益を主張する。これらの出願は、その全体が参考として援用される。

細胞の制御されない増殖であるがんは、腫瘍の形成、成長、および一部の場合には転移により特徴付けられる多因子性疾患である。現在のがん治療には、アポトーシス、壊死または増殖阻害を介してがん細胞を破壊することを試みる化学療法および標的化治療が含まれる。デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）修復経路は、がん細胞において頻繁に過剰発現され、化学療法耐性がんの増殖に重要であり得る。したがって、異常なＤＮＡ損傷修復経路シグナル伝達を減弱できる化合物は、がん患者にとって有益であり得る。しかし、ＤＮＡ修復およびがんにおけるかかるシグナル伝達経路には、決定的な調節ステップとしてタンパク質間相互作用が頻繁に関与し、伝統的な酵素活性部位阻害剤ベースの薬物開発スキームを困難なものにしている。したがって、がんおよびＤＮＡ修復におけるタンパク質間相互作用を標的化する方法および組成物の開発が必要である。

本開示は、タンパク質間相互作用阻害剤の同定および産生のための方法、組成物および技術、ならびにタンパク質間相互作用阻害剤を使用するための方法、組成物および技術に関する。

一態様では、本発明は、ヒトＲＡＤ５１上のＲＡＤ５１ＡＰ１の結合部位と相互作用する、天然に存在しない化合物に関する。一実施形態では、この化合物は、ヒトＲＡＤ５１の残基２０２、２０５および２０６のうちの少なくとも１つと相互作用する。一実施形態では、この化合物は、ヒトＲＡＤ５１の残基１８７とさらに相互作用する。別の実施形態では、この化合物は、１０^－４Ｍまたはそれ未満のＫｄ値の、ＲＡＤ５１への結合定数を有する。別の実施形態では、この化合物は、ポリペプチドを含む。一実施形態では、このポリペプチドは、天然に存在しないアミノ酸を含む。別の実施形態では、このポリペプチドは、（Ｌ）－アミノ酸および（Ｄ）－アミノ酸の両方を含む。別の実施形態では、このポリペプチドは、少なくとも１つの（Ｄ）－アミノ酸を含む。別の実施形態では、この化合物は、式Ｉまたはその反転体（invert）に従うアミノ酸配列を含み、アミノ酸のうち任意の１つまたは複数は、必要に応じて、非天然のアミノ酸または（Ｄ）－アミノ酸である。別の実施形態では、この化合物は、式ＩＩ～ＩＶのうちのいずれか１つまたはその反転体に従うアミノ酸配列を含み、アミノ酸のうち任意の１つまたは複数は、必要に応じて、非天然のアミノ酸または（Ｄ）－アミノ酸である。別の実施形態では、この化合物は、配列番号１、配列番号５、配列番号１０、配列番号６６または配列番号６７に従うアミノ酸配列を含み、アミノ酸のうち任意の１つまたは複数は、必要に応じて、非天然のアミノ酸または（Ｄ）－アミノ酸である。別の実施形態では、この化合物は、化合物１、化合物５、化合物１０、化合物１３または化合物１４である。別の実施形態では、このポリペプチドは、抗体ではない。別の実施形態では、このポリペプチドは、３０よりも少ないアミノ酸残基からなる。別の実施形態では、このポリペプチドは、６０またはそれ未満のアミノ酸残基からなる。別の実施形態では、このポリペプチドは、３０よりも少ないアミノ酸残基からなる。別の実施形態では、このポリペプチドは、２０よりも少ない、１５よりも少ないまたは１０よりも少ないアミノ酸残基からなる。別の実施形態では、このポリペプチドは、細胞透過性ペプチド配列をさらに含む。別の実施形態では、この化合物は、細胞中のＲＡＤ５１への結合の際に、以下の特徴のうちの少なくとも１つを示す：（ａ）ＤＮＡ上でのＲＡＤ５１モノマーのアセンブリの阻害；（ｂ）細胞内での相同組換えの阻害；（ｃ）ＲＡＤ５１ＡＴＰａｓｅ活性の阻害の欠如；または（ｄ）Ｃａ２＋に対するＲＡＤ５１親和性の低下。

別の態様では、本発明は、細胞死を誘導する方法であって、細胞を、細胞中の真核生物リコンビナーゼに結合するポリペプチドと接触させることを含み、真核生物リコンビナーゼへのポリペプチドの結合が、細胞中のタンパク質への真核生物リコンビナーゼの結合を阻害し、細胞が、真核生物リコンビナーゼへのポリペプチドの結合の際に、細胞内遊離カルシウム濃度の増加を示す、方法に関する。一実施形態では、このポリペプチドは、式Ｉまたはその反転体に従うアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、この真核生物リコンビナーゼはＲＡＤ５１である。別の実施形態では、このタンパク質はＢＲＣＡ２である。別の実施形態では、このタンパク質はＲＡＤ５１ＡＰ１である。別の実施形態では、この細胞死はアポトーシス細胞死である。別の実施形態では、細胞中の真核生物リコンビナーゼへのポリペプチドの結合は、細胞を化学療法薬に対して増感させる。別の実施形態では、この方法は、化学療法剤を投与することをさらに含む。別の実施形態では、この化学療法剤は、ＰＤ－Ｌ１、抗ＰＤ１剤またはＰＡＲＰ阻害剤である。別の実施形態では、この真核生物細胞はがん細胞である。別の実施形態では、この細胞はヒト細胞である。別の実施形態では、このポリペプチドは、このポリペプチドの非存在下よりも、少なくとも１０倍大きい速度で、細胞の死を誘導する。別の実施形態では、このポリペプチドは、非がん性細胞の死よりも大きい速度で、がん細胞の死を誘導する。別の実施形態では、このポリペプチドは、非がん性細胞よりも少なくとも１０倍大きい速度で、がん細胞の死を誘導する。別の実施形態では、このポリペプチドは、非がん性細胞の死よりも大きい速度で、上昇したＲＡＤ５１活性に依存するがん細胞の死を誘導する。

さらなる態様では、本発明は、異常なＲＡＤ５１活性と関連する状態を処置する方法であって、ヒトＲＡＤ５１上のＲＡＤ５１ＡＰ１の結合部位と相互作用するポリペプチドの治療有効量を、それを必要とする被験体に投与することを含む、方法に関する。一実施形態では、この化合物は、ヒトＲＡＤ５１の残基２０２、２０５および２０６のうちの少なくとも１つと相互作用する。一実施形態では、この化合物は、ヒトＲＡＤ５１の残基１８７とさらに相互作用する。別の実施形態では、この化合物は、１０^－４Ｍまたはそれ未満のＫｄ値の、ＲＡＤ５１への結合定数を有する。別の実施形態では、この化合物は、ポリペプチドを含む。別の実施形態では、このポリペプチドは、天然に存在しないアミノ酸を含む。別の実施形態では、このポリペプチドは、（Ｌ）－アミノ酸および（Ｄ）－アミノ酸の両方を含む。別の実施形態では、このポリペプチドは、少なくとも１つの（Ｄ）－アミノ酸を含む。別の実施形態では、この化合物は、式Ｉまたはその反転体に従うアミノ酸配列を含み、アミノ酸のうち任意の１つまたは複数は、必要に応じて、非天然のアミノ酸または（Ｄ）－アミノ酸である。別の実施形態では、この化合物は、式ＩＩ～ＩＶのうちのいずれか１つまたはその反転体に従うアミノ酸配列を含み、アミノ酸のうち任意の１つまたは複数は、必要に応じて、非天然のアミノ酸または（Ｄ）－アミノ酸である。別の実施形態では、この化合物は、配列番号１、配列番号５、配列番号１０、配列番号６６または配列番号６７に従うアミノ酸配列を含み、アミノ酸のうち任意の１つまたは複数は、必要に応じて、非天然のアミノ酸または（Ｄ）－アミノ酸である。別の実施形態では、この化合物は、化合物１、化合物５、化合物１０、化合物１３または化合物１４である。別の実施形態では、このポリペプチドは、抗体ではない。別の実施形態では、このポリペプチドは、３０よりも少ないアミノ酸残基からなる。別の実施形態では、このペプチドは、６０またはそれ未満のアミノ酸残基からなる。別の実施形態では、このポリペプチドは、２０よりも少ない、１５よりも少ないまたは１０よりも少ないアミノ酸残基からなる。別の実施形態では、このポリペプチドは、細胞透過性ペプチド配列をさらに含む。別の実施形態では、この化合物は、細胞中のＲＡＤ５１への結合の際に、以下の特徴のうちの少なくとも１つを示す：（ａ）ＤＮＡ上でのＲＡＤ５１モノマーのアセンブリの阻害；（ｂ）細胞内での相同組換えの阻害；（ｃ）ＲＡＤ５１ＡＴＰａｓｅ活性の阻害の欠如；または（ｄ）Ｃａ２＋に対するＲＡＤ５１親和性の低下。別の実施形態では、この状態はブルーム症候群である。別の実施形態では、この状態は、ブルーム症候群、ファンコニ貧血、ウェルナー症候群またはナイミーヘン染色体不安定症候群である。

なおさらなる態様では、本発明は、細胞における薬物耐性を低減させる方法であって、細胞を、ヒトＲＡＤ５１上のＲＡＤＡＰ１の結合部位を結合するポリペプチドと接触させることを含む、方法に関する。一実施形態では、この化合物は、ヒトＲＡＤ５１の残基２０２、２０５および２０６のうちの少なくとも１つと相互作用する。一実施形態では、この化合物は、ヒトＲＡＤ５１の残基１８７とさらに相互作用する。別の実施形態では、この化合物は、１０^－４Ｍまたはそれ未満のＫｄ値の、ＲＡＤ５１への結合定数を有する。別の実施形態では、この化合物は、ポリペプチドを含む。別の実施形態では、このポリペプチドは、天然に存在しないアミノ酸を含む。別の実施形態では、このポリペプチドは、（Ｌ）－アミノ酸および（Ｄ）－アミノ酸の両方を含む。別の実施形態では、このポリペプチドは、少なくとも１つの（Ｄ）－アミノ酸を含む。別の実施形態では、この化合物は、式Ｉまたはその反転体に従うアミノ酸配列を含み、アミノ酸のうち任意の１つまたは複数は、必要に応じて、非天然のアミノ酸または（Ｄ）－アミノ酸である。別の実施形態では、この化合物は、式ＩＩ～ＩＶのうちのいずれか１つまたはその反転体に従うアミノ酸配列を含み、アミノ酸のうち任意の１つまたは複数は、必要に応じて、非天然のアミノ酸または（Ｄ）－アミノ酸である。別の実施形態では、この化合物は、配列番号１、配列番号５、配列番号１０、配列番号６６または配列番号６７に従うアミノ酸配列を含み、アミノ酸のうち任意の１つまたは複数は、必要に応じて、非天然のアミノ酸または（Ｄ）－アミノ酸である。別の実施形態では、この化合物は、化合物１、化合物５、化合物１０、化合物１３または化合物１４である。別の実施形態では、このポリペプチドは、抗体ではない。別の実施形態では、このポリペプチドは、３０よりも少ないアミノ酸残基からなる。別の実施形態では、このポリペプチドは、６０またはそれ未満のアミノ酸残基からなる。別の実施形態では、このポリペプチドは、２０よりも少ない、１５よりも少ないまたは１０よりも少ないアミノ酸残基からなる。別の実施形態では、このポリペプチドは、細胞透過性ペプチド配列をさらに含む。別の実施形態では、この化合物は、細胞中のＲＡＤ５１への結合の際に、以下の特徴のうちの少なくとも１つを示す：（ａ）ＤＮＡ上でのＲＡＤ５１モノマーのアセンブリの阻害；（ｂ）細胞内での相同組換えの阻害；（ｃ）ＲＡＤ５１ＡＴＰａｓｅ活性の阻害の欠如；または（ｄ）Ｃａ２＋に対するＲＡＤ５１親和性の低下。別の実施形態では、この薬物は、ＰＤ－Ｌ１、抗ＰＤ１剤またはＰＡＲＰ阻害剤である。別の実施形態では、この薬物は、メルファラン、ドキソルビシン、アドリアマイシン（adrianmycin）、エトポシド、カンプトテシン、マイトマイシンＣ、シスプラチン、テモゾロミド、オキサリプラチン、カルボプラチンまたはゲムシタビンである。

なおさらなる態様では、本発明は、宿主細胞において第１の試験タンパク質と第２の試験タンパク質との間の相互作用を検出するための方法であって、ａ）第１の試験タンパク質およびＤＮＡ結合部分を含む第１の融合タンパク質を、宿主細胞において発現させること；ｂ）第２の試験タンパク質および遺伝子活性化部分を含む第２の融合タンパク質を、宿主細胞において発現させること；ならびにｃ）細胞死因子（deathagent）を宿主細胞において発現させることであって、細胞毒性レポーターが、ＤＮＡ結合部分に特異的なプロモーターＤＮＡ配列によって活性化される、ことを含み、第１のタンパク質と第２のタンパク質との間の相互作用が、遺伝子活性化部分に、細胞毒性レポーターの発現を活性化させる、方法に関する。一実施形態では、この宿主細胞は、ＤＮＡ結合部分に特異的なプロモーターＤＮＡ配列によって活性化される１つよりも多い細胞毒性レポーターを含む。別の実施形態では、この宿主細胞は、ａ）第１の融合タンパク質をコードするゲノムＤＮＡおよび第２の融合タンパク質をコードするゲノムＤＮＡ；ならびにｂ）細胞毒性レポーターをコードするプラスミドＤＮＡを含む。別の実施形態では、このＤＮＡ結合部分は、ＬｅｘＡ、ｃＩ、グルココルチコイド受容体、ＴｅｔＲまたはＵｍｅ６に由来する。別の実施形態では、この遺伝子活性化部分は、ＧＡＬ４、Ｂ４２、ＶＰ１６またはＤｏｆ１に由来する。別の実施形態では、この細胞毒性レポーターは、リボソーム性にコードされる（ribosomally-encoded）生体異物剤（xenobioticagent）、リボソーム性にコードされる毒物、軽度に過剰発現されると重度の成長欠損を生じる、リボソーム性にコードされる内因性もしくは外因性の遺伝子、生存能にとって必須の遺伝子を切除する、リボソーム性にコードされるリコンビナーゼ、毒性二次代謝物の合成に関与する制限因子、またはそれらの任意の組合せである。別の実施形態では、この細胞毒性レポーターは、コレラ毒素、ＳｐｖＢ毒素、ＣＡＲＤＳ毒素、ＳｐｙＡ毒素、ＨｏｐＵ１、Ｃｈｅｌｔ毒素、Ｃｅｒｔｈｒａｘ毒素、ＥＦＶ毒素、ＥｘｏＴ、ＣｄｔＢ、ジフテリア毒素、ＥｘｏＵ／ＶｉｐＢ、ＨｏｐＰｔｏＥ、ＨｏｐＰｔｏＦ、ＨｏｐＰｔｏＧ、ＶｏｐＦ、ＹｏｐＪ、ＡｖｒＰｔｏＢ、ＳｄｂＡ、ＳｉｄＧ、ＶｐｄＡ、Ｌｐｇ０９６９、Ｌｐｇ１９７８、ＹｏｐＥ、ＳｐｔＰ、ＳｏｐＥ２、ＳｏｐＢ／ＳｉｇＤ、ＳｉｐＡ、ＹｐｋＡ、ＹｏｐＭ、アマトキシン、ファラシジン、キラー毒素ＫＰ１、キラー毒素ＫＰ６、キラー毒素Ｋ１、キラー毒素Ｋ２８（ＫＨＲ）、キラー毒素Ｋ２８（ＫＨＳ）、炭疽致死因子（Anthraxlethal factor）エンドペプチダーゼ、志賀毒素、リシン毒素、またはそれらの任意の組合せである。別の実施形態では、この宿主細胞は、真菌または細菌である。別の実施形態では、この方法は、ランダム化ポリペプチドライブラリーをコードするＤＮＡ配列を含む試験遺伝子を、宿主細胞において発現させることをさらに含む。別の実施形態では、このランダム化ポリペプチドライブラリーは、６０またはそれ未満のアミノ酸長のポリペプチドを含む。別の実施形態では、このランダム化ポリペプチドライブラリーは、３０またはそれ未満のアミノ酸長のポリペプチドを含む。別の実施形態では、このランダム化ポリペプチドライブラリーは、２０またはそれ未満のアミノ酸長のポリペプチドを含む。別の実施形態では、この試験遺伝子は、短いタンパク質の３’ＵＴＲを含む。別の実施形態では、この３’ＵＴＲは、ｓＯＲＦ１の３’ＵＴＲである。別の実施形態では、ランダム化ポリペプチドライブラリーをコードするＤＮＡ配列は、メチオニン－バリン－アスパラギンの共通Ｎ末端配列をコードする。別の実施形態では、ランダム化ポリペプチドライブラリーをコードするＤＮＡ配列は、共通Ｎ末端安定化配列をコードする。別の実施形態では、ランダム化ペプチドライブラリーによってコードされるポリペプチドは、宿主細胞中で環状ペプチドへとプロセシングされる。別の実施形態では、ランダム化ペプチドライブラリーによってコードされるポリペプチドは、Ｇ．ｍａｒｇｉｎａｔａまたはＡ．ｂｉｓｐｏｒｉｇｅｒａ由来のＰＯＰＢによって、宿主細胞中で環状ペプチドへとプロセシングされる。

さらなる態様では、本発明は、配列番号６３のヌクレオチド配列を含むプラスミドベクターに関する。一実施形態では、このプラスミドベクターは、ＴｅｔＲ－ＤＢＤとインフレームで挿入された第１のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列およびＤｏｆ１－ＡＤとインフレームで挿入された第２のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を有する。

さらなる態様では、本発明は、配列番号６３のヌクレオチド配列を含む宿主細胞、または配列番号６３のヌクレオチド配列を含む宿主細胞であって、第１のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が、ＴｅｔＲ－ＤＢＤとインフレームで挿入され、第２のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が、Ｄｏｆ１－ＡＤとインフレームで挿入される、宿主細胞に関する。

さらなる態様では、本発明は、各プラスミドベクターが、ａ）第１の切り替え可能なプロモーターに作動可能に連結した異なるペプチド配列をコードするＤＮＡ配列；およびｂ）第２の切り替え可能なプロモーターの制御下の細胞毒性レポーターをコードするＤＮＡ配列を含む、プラスミドベクターのライブラリーに関する。一実施形態では、これらの異なるペプチド配列は、共通Ｎ末端安定化配列をコードする。別の実施形態では、異なるペプチド配列をコードするＤＮＡ配列は、３’ＵＴＲをさらにコードする。別の実施形態では、この異なるペプチド配列は、６０またはそれ未満のアミノ酸長である。別の実施形態では、この異なるペプチド配列は、３０またはそれ未満のアミノ酸長である。別の実施形態では、この異なるペプチド配列は、２０またはそれ未満のアミノ酸長である。別の実施形態では、このＮ末端安定化配列は、Ｍ－Ｖ－Ａである。別の実施形態では、この３’ＵＴＲは、ｓＯＲＦ１に由来する。別の実施形態では、これらの異なるペプチド配列はランダムである。別の実施形態では、これらの異なるペプチド配列は、標的への結合のために予め富化されている。

さらなる態様では、本発明は、０または１コピーの、上記プラスミドベクターライブラリーのプラスミドベクターを各々が含む、宿主細胞のライブラリーに関する。

さらなる態様では、本発明は、ａ）ＤＮＡ結合部分を含む第１の融合タンパク質；ｂ）遺伝子活性化部分を含む第２の融合タンパク質；ｃ）その発現が、ＤＮＡ結合部分に特異的なＤＮＡ結合配列の制御下にある、細胞毒性レポーター；およびｄ）６０またはそれ未満のアミノ酸のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むｍＲＮＡであって、このｍＲＮＡが、ポリペプチドに対して３’側の３’ＵＴＲを含み、このポリペプチドが、ペプチド安定化のためのＮ末端配列をコードする、ｍＲＮＡを発現する宿主細胞に関する。一実施形態では、この宿主細胞は、真菌または細菌である。別の実施形態では、この宿主細胞は一倍体酵母細胞である。別の実施形態では、この宿主細胞は二倍体酵母細胞である。別の実施形態では、この二倍体酵母細胞は、第１のキメラ遺伝子および第２のキメラ遺伝子をコードするＤＮＡ配列を含む第１の宿主細胞を、細胞毒性レポーター、およびポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むｍＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む第２の宿主細胞と接合させることによって産生される。別の実施形態では、この宿主細胞は哺乳動物である。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
ヒトＲＡＤ５１上のＲＡＤ５１ＡＰ１の結合部位と相互作用する、天然に存在しない化合物。
（項目２）
ヒトＲＡＤ５１の残基２０２、２０５および２０６のうちの少なくとも１つと相互作用する、項目１に記載の天然に存在しない化合物。
（項目３）
ヒトＲＡＤ５１の残基１８７と相互作用することをさらに含む、項目１に記載の天然に存在しない化合物。
（項目４）
１０^－４Ｍまたはそれ未満のＫｄ値の、ＲＡＤ５１への結合定数を有する、項目１に記載の天然に存在しない化合物。
（項目５）
ポリペプチドを含む、項目１に記載の天然に存在しない化合物。
（項目６）
前記ポリペプチドが、天然に存在しないアミノ酸を含む、項目５に記載の天然に存在しない化合物。
（項目７）
前記ポリペプチドが、（Ｌ）－アミノ酸および（Ｄ）－アミノ酸の両方を含む、項目５に記載の天然に存在しない化合物。
（項目８）
前記ポリペプチドが、少なくとも１つの（Ｄ）－アミノ酸を含む、項目５に記載の天然に存在しない化合物。
（項目９）
式Ｉまたはその反転体：
［Ｔ／Ｋ／Ｒ／Ｑ］_１～３－［Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ／Ｍ／Ｗ／Ｙ］－［Ｒ／Ｇ／Ｓ］－［Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ／Ｍ／Ｗ／Ｙ］（式Ｉ、配列番号７０）
に従うアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸のうち任意の１つまたは複数が、必要に応じて、非天然のアミノ酸または（Ｄ）－アミノ酸である、項目５に記載の天然に存在しない化合物。
（項目１０）
式ＩＩ～ＩＶのうちのいずれか１つまたはその反転体：
［Ｒ／Ｋ］－［Ｌ］－［Ｇ］－［Ｍ／Ｖ］（式ＩＩ、配列番号７１）、
［Ｒ］－［Ｌ］－［Ｇ］－［Ｖ］－［Ｍ／Ｖ］－［Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ／Ｍ／Ａ／Ｗ／Ｙ］（式ＩＩＩ、配列番号７２）または
［Ｔ／Ｋ／Ｒ／Ｑ］_１～２－［Ｒ］－［Ｌ］－［Ｇ］－［Ｖ］－［Ｍ／Ｖ］－［Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ／Ｍ／Ａ／Ｗ／Ｙ］（式ＩＶ、配列番号７３）
に従うアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸のうち任意の１つまたは複数が、必要に応じて、非天然のアミノ酸または（Ｄ）－アミノ酸である、項目９に記載の天然に存在しない化合物。
（項目１１）
配列番号１、配列番号５、配列番号１０、配列番号６６または配列番号６７のアミノ酸配列を含む、項目９に記載の天然に存在しない化合物。
（項目１２）
前記ポリペプチドが抗体ではない、項目５に記載の天然に存在しない化合物。
（項目１３）
前記ポリペプチドが、３０個よりも少ないアミノ酸残基からなる、項目９に記載の天然に存在しない化合物。
（項目１４）
前記ポリペプチドが、細胞透過性ペプチド配列をさらに含む、項目９に記載の天然に存在しない化合物。
（項目１５）
細胞中のＲＡＤ５１へと結合すると、以下の特徴：
（ａ）ＤＮＡ上でのＲＡＤ５１モノマーのアセンブリの阻害；
（ｂ）細胞内での相同組換えの阻害；
（ｃ）ＲＡＤ５１ＡＴＰａｓｅ活性の阻害の欠如；または
（ｄ）Ｃａ２＋に対するＲＡＤ５１親和性の低下
のうちの少なくとも１つを示す、項目１に記載の天然に存在しない化合物。
（項目１６）
細胞死を誘導する方法であって、前記細胞を、細胞中の真核生物リコンビナーゼに結合するポリペプチドと接触させることを含み、前記真核生物リコンビナーゼへの前記ポリペプチドの前記結合が、前記細胞中のタンパク質への前記真核生物リコンビナーゼの結合を阻害し、前記細胞は、前記真核生物リコンビナーゼへと前記ポリペプチドが結合すると、細胞内遊離カルシウム濃度の増加を示す、方法。
（項目１７）
前記ポリペプチドが、式Ｉまたはその反転体：
［Ｔ／Ｋ／Ｒ／Ｑ］_１～３－［Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ／Ｍ／Ｗ／Ｙ］－［Ｒ／Ｇ／Ｓ］－［Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ／Ｍ／Ｗ／Ｙ］（式Ｉ；配列番号７０）
に従うアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸のうち任意の１つまたは複数が、必要に応じて、非天然のアミノ酸または（Ｄ）－アミノ酸である、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記真核生物リコンビナーゼがＲＡＤ５１である、項目１６に記載の方法。
（項目１９）
前記タンパク質がＢＲＣＡ２である、項目１６に記載の方法。
（項目２０）
前記タンパク質がＲＡＤ５１ＡＰ１である、項目１６に記載の方法。
（項目２１）
前記細胞死がアポトーシス細胞死である、項目１６に記載の方法。
（項目２２）
前記細胞中の真核生物リコンビナーゼへの前記ポリペプチドの前記結合が、前記細胞を化学療法剤に対して増感させる、項目１６に記載の方法。
（項目２３）
化学療法剤を投与することをさらに含む、項目１６に記載の方法。
（項目２４）
前記化学療法剤が、ＰＤ－Ｌ１、抗ＰＤ１剤またはＰＡＲＰ阻害剤である、項目１６に記載の方法。
（項目２５）
前記真核生物細胞ががん細胞である、項目１６に記載の方法。
（項目２６）
前記細胞がヒト細胞である、項目１６に記載の方法。
（項目２７）
前記ポリペプチドが、前記ポリペプチドの非存在下よりも、少なくとも１０倍大きい速度で、前記細胞の死を誘導する、項目１６に記載の方法。
（項目２８）
異常なＲＡＤ５１活性と関連する状態を処置する方法であって、ヒトＲＡＤ５１上のＲＡＤ５１ＡＰ１の結合部位と相互作用するポリペプチドの治療有効量を、それを必要とする被験体に投与することを含む、方法。
（項目２９）
前記ポリペプチドが、ヒトＲＡＤ５１の残基２０２、２０５および２０６のうちの少なくとも１つと相互作用する、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記ポリペプチドが、式Ｉ：
［Ｔ／Ｋ／Ｒ／Ｑ］_１～３－［Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ／Ｍ／Ｗ／Ｙ］－［Ｒ／Ｇ／Ｓ］－［Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ／Ｍ／Ｗ／Ｙ］（式Ｉ、配列番号７０）
に従うアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸のうち任意の１つまたは複数が、必要に応じて、非天然のアミノ酸または（Ｄ）－アミノ酸である、項目２８に記載の方法。
（項目３１）
前記状態がブルーム症候群である、項目２８に記載の方法。
（項目３２）
細胞における薬物耐性を低減させる方法であって、前記細胞を、ヒトＲＡＤ５１上のＲＡＤ５１ＡＰ１の結合部位と相互作用するポリペプチドと接触させることを含む、方法。
（項目３３）
前記ポリペプチドが、ヒトＲＡＤ５１の残基２０２、２０５および２０６のうちの少なくとも１つと相互作用する、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記ポリペプチドが、式Ｉまたはその反転体：
［Ｔ／Ｋ／Ｒ／Ｑ］_１～３－［Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ／Ｍ／Ｗ／Ｙ］－［Ｒ／Ｇ／Ｓ］－［Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ／Ｍ／Ｗ／Ｙ］（式Ｉ、配列番号７０）
に従うアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸のうち任意の１つまたは複数が、必要に応じて、非天然のアミノ酸または（Ｄ）－アミノ酸である、項目３２に記載の方法。
（項目３５）
前記薬物が、ＰＤ－Ｌ１、抗ＰＤ１剤またはＰＡＲＰ阻害剤である、項目３２に記載の方法。
（項目３６）
宿主細胞において第１の試験タンパク質と第２の試験タンパク質との間の相互作用を検出するための方法であって、
ａ）前記第１の試験タンパク質およびＤＮＡ結合部分を含む第１の融合タンパク質を、前記宿主細胞において発現させること；
ｂ）前記第２の試験タンパク質および遺伝子活性化部分を含む第２の融合タンパク質を、前記宿主細胞において発現させること；ならびに
ｃ）細胞死因子を前記宿主細胞において発現させることであって、細胞毒性レポーターが、前記ＤＮＡ結合部分に特異的なプロモーターＤＮＡ配列によって活性化される、ことを含み、
前記第１のタンパク質と前記第２のタンパク質との間の相互作用が、前記遺伝子活性化部分に、前記細胞毒性レポーターの発現を活性化させる、方法。
（項目３７）
前記宿主細胞が、前記ＤＮＡ結合部分に特異的な前記プロモーターＤＮＡ配列によって活性化される１つよりも多い細胞毒性レポーターを含む、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記宿主細胞が、ａ）前記第１の融合タンパク質をコードするゲノムＤＮＡおよび前記第２の融合タンパク質をコードするゲノムＤＮＡ；ならびにｂ）前記細胞毒性レポーターをコードするプラスミドＤＮＡを含む、項目３６に記載の方法。
（項目３９）
前記ＤＮＡ結合部分が、ＬｅｘＡ、ｃＩ、グルココルチコイド受容体、ＴｅｔＲまたはＵｍｅ６に由来する、項目３６に記載の方法。
（項目４０）
前記遺伝子活性化部分が、ＧＡＬ４、Ｂ４２またはＤｏｆ１に由来する、項目３６に記載の方法。
（項目４１）
前記細胞毒性レポーターが、リボソーム性にコードされる生体異物剤、リボソーム性にコードされる毒物、軽度に過剰発現されると重度の成長欠損を生じる、リボソーム性にコードされる内因性もしくは外因性の遺伝子、生存能にとって必須の遺伝子を切除する、リボソーム性にコードされるリコンビナーゼ、毒性二次代謝物の合成に関与する制限因子、またはそれらの任意の組合せである、項目３６に記載の方法。
（項目４２）
前記細胞毒性レポーターが、コレラ毒素、ＳｐｖＢ毒素、ＣＡＲＤＳ毒素、ＳｐｙＡ毒素、ＨｏｐＵ１、Ｃｈｅｌｔ毒素、Ｃｅｒｔｈｒａｘ毒素、ＥＦＶ毒素、ＥｘｏＴ、ＣｄｔＢ、ジフテリア毒素、ＥｘｏＵ／ＶｉｐＢ、ＨｏｐＰｔｏＥ、ＨｏｐＰｔｏＦ、ＨｏｐＰｔｏＧ、ＶｏｐＦ、ＹｏｐＪ、ＡｖｒＰｔｏＢ、ＳｄｂＡ、ＳｉｄＧ、ＶｐｄＡ、Ｌｐｇ０９６９、Ｌｐｇ１９７８、ＹｏｐＥ、ＳｐｔＰ、ＳｏｐＥ２、ＳｏｐＢ／ＳｉｇＤ、ＳｉｐＡ、ＹｐｋＡ、ＹｏｐＭ、アマトキシン、ファラシジン、キラー毒素ＫＰ１、キラー毒素ＫＰ６、キラー毒素Ｋ１、キラー毒素Ｋ２８（ＫＨＲ）、キラー毒素Ｋ２８（ＫＨＳ）、炭疽致死因子エンドペプチダーゼ、志賀毒素、リシン毒素、またはそれらの任意の組合せである、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記宿主細胞が、真菌または細菌である、項目３６に記載の方法。
（項目４４）
ランダム化ポリペプチドライブラリーをコードするＤＮＡ配列を含む試験遺伝子を、前記宿主細胞において発現させることをさらに含む、項目３６に記載の方法。
（項目４５）
前記ランダム化ポリペプチドライブラリーが、６０またはそれ未満のアミノ酸長のポリペプチドを含む、項目３６に記載の方法。
（項目４６）
試験遺伝子が、短いタンパク質の３’ＵＴＲを含む、項目４４に記載の方法。
（項目４７）
前記３’ＵＴＲが、ｓＯＲＦ１の３’ＵＴＲである、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
ランダム化ポリペプチドライブラリーをコードする前記ＤＮＡ配列が、メチオニン－バリン－アスパラギンの共通Ｎ末端配列をコードする、項目４４に記載の方法。
（項目４９）
前記ランダム化ペプチドライブラリーによってコードされるポリペプチドが、前記宿主細胞中で環状ペプチドへとプロセシングされる、項目４４に記載の方法。
（項目５０）
配列番号６３のヌクレオチド配列を含むプラスミドベクター。
（項目５１）
第１のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が、ＴｅｔＲ－ＤＢＤとインフレームで挿入され、第２のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が、Ｄｏｆ１－ＡＤとインフレームで挿入される、項目５０に記載のプラスミドベクター。
（項目５２）
項目５０または５１に記載のプラスミドベクターを含む宿主細胞。
（項目５３）
各プラスミドベクターが、
ａ）第１の切り替え可能なプロモーターに作動可能に連結した異なるペプチド配列をコードするＤＮＡ配列；および
ｂ）第２の切り替え可能なプロモーターの制御下の細胞毒性レポーターをコードするＤＮＡ配列
を含む、プラスミドベクターのライブラリー。
（項目５４）
前記異なるペプチド配列が、共通Ｎ末端安定化配列をコードする、項目５３に記載のプラスミドベクターのライブラリー。
（項目５５）
異なるペプチド配列をコードする前記ＤＮＡ配列が、３’ＵＴＲをさらにコードする、項目５３に記載のプラスミドベクターのライブラリー。
（項目５６）
前記異なるペプチド配列が、６０またはそれ未満のアミノ酸長である、項目５３に記載のプラスミドベクターのライブラリー。
（項目５７）
前記異なるペプチド配列がランダムである、項目５３に記載のプラスミドベクターのライブラリー。
（項目５８）
前記異なるペプチド配列が、標的への結合のために予め富化されている、項目５３に記載のプラスミドベクターのライブラリー。
（項目５９）
０または１コピーの項目５３に記載のプラスミドベクターを各々が含む、宿主細胞のライブラリー。
（項目６０）
宿主細胞であって、
ａ）ＤＮＡ結合部分を含む第１の融合タンパク質；
ｂ）遺伝子活性化部分を含む第２の融合タンパク質；
ｃ）その発現が、前記ＤＮＡ結合部分に特異的なＤＮＡ結合配列の制御下にある、細胞毒性レポーター；および
ｄ）６０またはそれ未満のアミノ酸のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むｍＲＮＡであって、前記ｍＲＮＡが、前記ポリペプチドに対して３’側の３’ＵＴＲを含み、前記ポリペプチドが、ペプチド安定化のためのＮ末端配列をコードする、ｍＲＮＡを発現する宿主細胞。
（項目６１）
前記宿主細胞が、真菌または細菌である、項目６０に記載の宿主細胞。
（項目６２）
前記宿主細胞が一倍体酵母細胞である、項目６１に記載の宿主細胞。
（項目６３）
前記宿主細胞が二倍体酵母細胞である、項目６１に記載の宿主細胞。
（項目６４）
前記二倍体酵母細胞が、第１のキメラ遺伝子および第２のキメラ遺伝子をコードするＤＮＡ配列を含む第１の宿主細胞を、前記細胞毒性レポーター、およびポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む前記ｍＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む第２の宿主細胞と接合させることによって産生される、項目６３に記載の宿主細胞。
（項目６５）
ａ）項目５０に記載のプラスミドベクター；および
ｂ）項目５３に記載のプラスミドベクターのライブラリー
を含むキット。

本開示のさらなる態様および利点は、本開示の例示的な実施形態のみが示され記載される以下の詳細な説明から、この分野の当業者に容易に明らかとなる。理解されるように、本開示は、他のおよび異なる実施形態が可能であり、そのいくつかの詳細は、全て本開示から逸脱することなく、種々の明らかな点において改変が可能である。したがって、図面および説明は、限定的ではなく、本来例示的と解釈すべきである。

参照による組込み
本出願で引用される各特許、刊行物および非特許文献は、各々が個々に参照によって組み込まれたかのように、その全体が本明細書で参照によって組み込まれる。

本開示の新規な特徴を、添付の特許請求の範囲で詳細に説明する。本開示の特徴および利点のより良い理解は、本開示の原理が利用される、例示的な態様を説明する以下の詳細な説明、および以下の添付の図面を参照することによって得られるであろう。

図１は、ＳＳＰ－２５細胞に対する化合物１、３、および５の効果を示す。

図２は、ＳＳＰ－２５細胞およびＨｅＬａ細胞に対する化合物１および５の効果を示す。

図３は、ＳＳＰ－２５細胞およびＨｅＬａ細胞に対する化合物１の効果を示す。

図４は、ＳＳＰ－２５細胞に対する化合物１の効果を示す。

図５は、ＳＳＰ－２５細胞に対する化合物１および２の効果を示す。

図６は、ＧＭ０８５０５細胞に対するエトポシドおよび化合物１の効果を示す。

図７は、タンパク質－タンパク質組込みプラスミドの実例である。

図８は、タンパク質－タンパク質組込みプラスミド（配列番号６０および６１）の配列である。

図９は、選択およびライブラリープラスミドの実例である。

図１０は、選択およびライブラリープラスミド（配列番号６２）の配列である。

図１１は、確認プラスミドの実例である。

図１２は、タンパク質間相互作用を妨害する化合物を同定するための、本開示のプラットフォームの実例である。

図１３は、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅアッセイを使用する、化合物５を使用するＳＳＰ－２５細胞の細胞殺傷を示す。垂直な矢印は化合物投与の時間を示し、細胞指数（Ｙ軸）は細胞生存能を表す。

図１４は、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅアッセイを使用する、化合物５および６を使用するＰＣ３細胞の細胞殺傷を比較する。

図１５は、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅアッセイを使用する、化合物１０によるＡ５４９細胞の細胞殺傷を示す。垂直な矢印は化合物投与の時間を示し、細胞指数（Ｙ軸）は細胞生存能を表す。

図１６は、図１５に示すデータに基づく、化合物１０のＩＣ５０を計算するための曲線当てはめの例を示す。

図１７は、本発明に従った典型的な化合物の完全な化学構造と、ＳＳＰ－２５細胞でのその細胞死ＩＣ５０の測定値とを示す。

図１８は、細胞透過性ペプチドを利用する細胞死ＩＣ５０の相対的無感受性を示す本発明に従った典型的な化合物を示す。

図１９は、ｉｎｖｉｖｏの無胸腺マウスＡ５４９異種移植モデルに腫瘍内投与および腹腔内投与した化合物１０の効果を示す。

図２０は、種々の腫瘍型に由来する不死化細胞株に対するｉｎｖｉｔｒｏでの化合物１０のＩＣ５０を示す。

図２１は、本明細書において記載されるＲＡＤ５１相互作用化合物を包含する典型的なマーカッシュ構造を示す。

図２２は、ＲＡＤ５１に結合した本発明に従った典型的なＲＡＤ５１ペプチドの結合モデルを示す（ｐｄｂ構造１Ｎ０Ｗによって表される）。ペプチドの結合が同定された重要な残基が強調されている。左側のパネルは、ＲＡＤ５１に結合したＢＲＣＡ２ペプチドを示し（ＢＲＣＡ２ペプチドの周囲の強調された残基と相互作用している化合物と共に）、右側のパネルは、ＢＲＣＡ２のこの配列を排除し、ＲＡＤ５１上の残基と相互作用している化合物のみを強調している。

図２３は、ＲＡＤ５１／配列番号５対を使用するＹ２Ｈアッセイによって評価される、本発明に従ったＲＡＤ５１相互作用ペプチドが配列番号５に結合するか否かに従ってグループ化した、様々な異なる種に由来するＲＡＤ５１の配列アラインメントを示す。結合の差の原因であると考えられる変異残基が強調されている。

図２４は、化合物１０を単独で、またはカルシウムキレート剤ＢＡＰＴＡ－ＡＭと組み合わせて添加した、ＳＳＰ－２５細胞に対するｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ細胞死アッセイを示し、ＢＡＰＴＡ－ＡＭの添加が化合物１０に起因する細胞死を抑えることを実証する。

図２５は、化合物１０を単独で、またはカルシウムキレート剤ルテニウムレッドと組み合わせて添加した、ＳＳＰ－２５細胞に対するｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ細胞死アッセイを示し、ルテニウムレッドの添加が化合物１０に起因する細胞死を抑えることを実証する。

図２６は、化合物１０またはオラパリブを単独で、または組み合わせて添加した、ＳＳＰ－２５細胞に対するｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ細胞死アッセイを示し、化合物１０およびオラパリブの組合せが化合物１０またはオラパリブ単独よりも細胞死を増強させることを実証する。

本発明の種々の実施形態が本明細書に示され記載されているが、かかる実施形態が例としてのみ提供されることは、当業者に明らかである。当業者は、本発明から逸脱することなしに、多数のバリエーション、変化および置換を想起し得る。本明細書に記載される本発明の実施形態に対する種々の代替法が使用され得ることを理解すべきである。

本開示は、相同組換えＤＮＡ修復経路に関与するタンパク質に結合できる化合物を使用する、がんの処置のための方法を提供する。本発明の化合物は、がん細胞における細胞増殖の速度を減少させ得、ＤＮＡ修復経路に特異的なタンパク質を過剰発現しない細胞に影響を与えることを回避し得る。本発明の化合物はさらに、細胞を化学療法に対して増感させ得、治療薬に対する耐性を発達させた細胞を増感させ得る。本明細書に開示される化合物は、特異的転写シグネチャーを有するがん細胞に対する特異性を示し得る。

がんは、身体中に転移する可能性を有する、細胞の制御されない増殖により特徴付けられる関連疾患の集合である。がんは、例えば、癌腫、肉腫、リンパ腫、白血病および腺腫を含む５つの広いカテゴリーに分類され得る。癌腫は、肺、乳房および結腸などの、身体の内部および外部部分を覆う細胞から生じ得る。肉腫は、骨、軟骨、脂肪、結合組織、筋肉および他の支持組織に位置する細胞から生じ得る。リンパ腫は、リンパ節および免疫系組織において生じ得る。白血病は、骨髄において生じ得、血流中で蓄積し得る。腺腫は、甲状腺、下垂体、副腎および他の腺性組織において生じ得る。

異なるがんが、身体の組織の事実上いずれにおいても発達し得るが、がんを引き起こす基礎的なプロセスは、この疾患の全ての形態において類似であり得る。がんは、細胞分裂に対する正常な拘束から細胞が逃れるときに始まり、異常に成長および分裂し始める。細胞における遺伝子変異は、その細胞が細胞分裂を制御しまたはアポトーシスを開始させる能力を妨げ得、細胞の制御されない成長および分裂を生じ得る。

癌遺伝子および腫瘍サプレッサー遺伝子は、細胞の増殖を調節できる。遺伝子変異は、潜在的に、活性を異常に活性化または抑制し、制御されない細胞分裂をさらに促進することによって、癌遺伝子および腫瘍サプレッサーに影響を与え得る。癌遺伝子は細胞成長を補助するが、腫瘍サプレッサー遺伝子は、損傷したＤＮＡを修復し、アポトーシスを活性化することによって、細胞分裂を緩慢にする。がんにおいて変異し得る細胞癌遺伝子には、例えば、Ｃｄｋ１、Ｃｄｋ２、Ｃｄｋ３、Ｃｄｋ４、Ｃｄｋ６、ｃ－ＭＹＣ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、Ｋ－Ｒａｓ、ＰＤＧＦＲ、ＲａｆキナーゼおよびＶＥＧＦが含まれる。がんにおいて変異し得る腫瘍サプレッサー遺伝子には、例えば、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤１Ｃ、ＰＴＥＮ、ｐ１６、ｐ２７、ｐ５３、ｐ７３および網膜芽細胞腫タンパク質（ｐＲｂ）が含まれる。

ＤＮＡ損傷およびがん。
ＤＮＡ損傷は、例えば、ＵＶ照射、ＩＲ照射、Ｘ線、反応性酸素種、脱プリン、脱ピリミジン、一本鎖切断、二本鎖切断、シトシン脱アミノ化、Ｏ６－メチルグアニン、塩基アルキル化、ＤＮＡの架橋、複製エラーまたはフリーラジカルの結果として生じ得る。化学化合物は、嵩高い付加体、鎖間架橋、鎖内架橋、ＤＮＡ鎖間のインターカレーション、またはＤＮＡアルキル化を引き起こすことによっても、ＤＮＡ損傷を引き起こし得る。ＤＮＡ損傷を引き起こし得る化合物には、例えば、アクチノマイシン－Ｄ、ベンゾ［ａ］ピレン、シスプラチン、ダウノルビシン、エチジウムブロマイド、ナイトロジェンマスタード、メチルメタンスルホン酸（ＭＭＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－ニトロソウレア（ＥＮＵ）、Ｎ－ニトロソ－Ｎ－メチルウレア（ＮＭＵ）またはソラレンが含まれる。

ＤＮＡ損傷修復経路の変異または早発性の発現が、がんにおいて見出され得る。ＤＮＡ損傷修復経路中の影響を受け得る遺伝子には、例えば、ＡＴＭ、ＡＴＲＸ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＥＲＣＣ１、ＦＡＮＣＢ、ＦＡＮＣＦ、ＦＥＮ１、ＨＭＧＡ１、ＨＭＧＡ１、ＭＤＣ１、ＭＧＭＴ、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ４、Ｍｒｅ１１Ａ、ＮＢＳ１、ＮＥＩＬ１、ＰＡＲＰ１、ＰＡＲＰ２、ＰＭＳ２、ＲＡＤ５１、ＲＡＤ５２、ＲＡＤ５４、ＲＡＤ５１ＡＰ１、ＷＲＮまたはＸＰＦが含まれる。

ＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２は、細胞ＤＮＡ損傷修復経路に関与する腫瘍サプレッサーである。ＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２は共に、ＤＮＡ修復に関与する真核生物リコンビナーゼＲＡＤ５１と相互作用できる。ＢＲＣＡ１またはＢＲＣＡ２における生殖系列変異は、個体を、例えば、乳房、卵巣、前立腺、肺および肝臓のがんが含まれる種々の癌にかかりやすくし得る。ＢＲＣＡ２変異を有する腫瘍は、野生型対立遺伝子のヘテロ接合性の喪失を示し得る。

ＢＲＣＡ１は、他の腫瘍サプレッサー、ＤＮＡ損傷センサーおよびシグナルトランスデューサーと組み合わさって、ＢＲＣＡ１関連ゲノムサーベイランス複合体（BRCA1-associatedgenome surveillance complex）（ＢＡＳＣ）として公知の大きいマルチサブユニットタンパク質複合体を形成し得る。ＢＲＣＡ１は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩおよびヒストンデアセチラーゼ複合体とも関連し得る。したがって、ＢＲＣＡ１は、転写、二本鎖切断のＤＮＡ修復、および組換えにおいて役割を果たし得る。ＢＲＣＡ１は、細胞周期依存的な局在化を有し、例えば、核、原形質または小胞体において見出され得る。

ＢＲＣＡ２は、ゲノム安定性を維持でき、ＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２は共に、二本鎖ＤＮＡ修復のための相同組換え経路を特異的に調節できる。ＢＲＣＡ２タンパク質は、ＲＡＤ５１リコンビナーゼへの結合を媒介できる、ＢＲＣモチーフとして公知の７０アミノ酸モチーフを約７コピー含む。ＲＡＤ５１は、相同組換えおよびＤＮＡ修復に必要なある特定の生化学的活性、例えば、接合分子形成の促進、および相同ＤＮＡ分子間のＤＮＡ鎖交換を遂行できる。これらの機能のための必要条件として、ＲＡＤ５１は、ＤＮＡに結合して、ＤＮＡがタンパク質鞘内に包まれる高秩序の核タンパク質フィラメントを形成できる。ＲＡＤ５１ＡＰ１は、構造特異的ＤＮＡ結合およびＲＡＤ５１との物理的接触の組合せを介して接合分子形成を刺激できるＲＡＤ５１アクセサリータンパク質である。ＲＡＤ５１ＡＰ１は、ＤＮＡ二本鎖切断誘導剤の有害効果から細胞を保護できる。

ＢＲＣＡ２中のＢＲＣ３またはＢＲＣ４リピートとＲＡＤ５１との間での直接的かつ特異的な相互作用は、ＤＮＡ損傷の部位に局在化する準備ができた、したがって、ＤＮＡ修復のために活性化される形態で、ＲＡＤ５１を隔離できる。機能的ＢＲＣＡ２の欠如、またはＢＲＣＡ２の過剰発現は、例えば、ＤＮＡ損傷の部位にＲＡＤ５１を局在化させないことによって、ＲＡＤ５１機能を攪乱し得る。停止したもしくは壊れた複製フォークにおいて形成される二本鎖切断、または外因性薬剤によって誘導される二本鎖切断を含み得る、これらの損傷した部位は、哺乳動物ＳＯＳ修復応答の活性化のためのシグナルを提供できる。活性化は、ＲＡＤ５１の翻訳後修飾を含み得、または他の修復タンパク質との相互作用を介して生じ得る。

ＢＲＣＡ２のＢＲＣモチーフは、細胞周期依存的様式で、ＤＮＡ損傷に応答して、モノマーまたはオリゴマー形態のＲＡＤ５１を結合できる。ＢＲＣＡ２タンパク質は、ＲＡＤ５１の核輸送に直接関与できる。例えば、膵臓腺癌細胞株ＣＡＰＡＮ－１は、ＢＲＣＡ２が欠損しており、これは、ＣＡＰＡＮ－１におけるＲＡＤ５１の損なわれた核輸送をもたらし得る。したがって、ＲＡＤ５１は、核移行および適切な相同組換えプロセスのためにＢＲＣＡ２を必要とし得る。

二本鎖ＤＮＡ切断は、例えば、天然のおよび医療的な放射線、ならびに他の環境曝露によって引き起こされ得る。二本鎖ＤＮＡ切断は、減数分裂の間およびＤＮＡ架橋の修復の間に染色体が遺伝子材料を交換する場合にも生じ得る。ＤＮＡを修復することによって、ＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ１は、ヒトゲノムの安定性を維持することおよび悪性疾患をもたらし得る危険な遺伝子再編成の可能性を低減させることにおいて役割を果たす。

化学療法または放射線療法を使用するがん処置は、付加体またはＤＮＡの二本鎖もしくは一本鎖切断を誘導することによって、腫瘍細胞のＤＮＡの機能を標的化し妨害できる。がん細胞は、誘導され得るかまたはがん細胞にとって固有であり得る耐性機構を発達させることによって、これらの治療に打ち勝つことができる。高レベルの相同組換えが、ＲＡＤ５１の過剰発現に起因して、がん細胞中に存在し得る。ＲＡＤ５１のこの過剰発現は、例えば、乳がん、膵がん、ＮＳＣＬＣ、ｍＣＲＰＣ、ＡＭＬ、ＩＣＣおよびＣＭＬにおいて見られ得る。これらのがん細胞では、ＲＡＤ５１の過剰発現は、化学療法によって誘導される二本鎖切断の修復を促進することによって、がん耐性を提供できる。したがって、本発明の化合物は、ＲＡＤ５１、またはＤＮＡ損傷修復経路に関与する他のタンパク質の活性に干渉して、化学療法に対してがん細胞を再増感させることができる、または化学療法の効果を強化できる。

ツーハイブリッドシステム。
ツーハイブリッドスクリーニングは、タンパク質間相互作用を同定し特徴付けるために使用され得る。ツーハイブリッドシステムは当初、宿主生物として酵母を使用して開発された。しかし、細菌ツーハイブリッドシステムもまた、タンパク質間相互作用を特徴付けるために使用され得る。本開示は、単一のベイト発現プラスミドが両方の生物の状況において使用される統合された酵母および細菌ツーハイブリッドシステムを使用できるシステムを提供する。さらに、既知の親和性の広範な一連のロイシンジッパー融合タンパク質が、両方のシステムを使用した相互作用検出の効率を比較するために生成され得る。酵母のシステムは、ダイナミックレンジにわたって定量的読み出しを生じ得る。ベイトによる「自己活性化」は、細菌のシステムではあまり一般的ではない場合がある。さらに、本明細書に開示される改変された発現ベクターは、酵母および細菌の両方における目的のタンパク質の発現のために使用され得る。

本明細書で使用する場合、「レポーター遺伝子」とは、その発現がアッセイされ得る遺伝子を指す。かかる遺伝子には、例えば、ＬａｃＺ、β－グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、アミノ酸生合成遺伝子、酵母ＬＥＵ２、ＨＩＳ３、ＬＹＳ２もしくはＵＲＡ３遺伝子、核酸生合成遺伝子、哺乳動物クロラムフェニコールトランスアセチラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、またはそれに対する特異的抗体が利用可能である任意の表面抗原遺伝子が含まれる。

「プロモーター」は、作動可能に連結した転写される配列の５’末端の、転写の開始に対して近位に位置するＤＮＡ配列である。プロモーターは、作動可能に連結した遺伝子の転写をモジュレートする際に相互作用する、１つまたは複数の調節エレメントまたはモジュールを含み得る。プロモーターは、切り替え可能または構成的になり得る。切り替え可能なプロモーターは、薬剤の投与の際に、作動可能に連結した標的遺伝子の可逆的な誘導または抑制を可能にする。切り替え可能なプロモーターの例には、ＴｅｔＯオペレーターおよびアルコールデヒドロゲナーゼＩ（ａｌｃＡ）遺伝子プロモーターが含まれるがこれらに限定されない。構成的プロモーターの例には、ヒトベータ－アクチン遺伝子プロモーターが含まれる。

「作動可能に連結した」は、第１のエレメントの活性をモジュレートすることが第２のエレメントに対する影響を誘導するように配置された、２つの高分子エレメントを記述する。この様式で、プロモーターエレメントの活性のモジュレーションは、作動可能に連結したコード配列の発現を変更または調節するために使用され得る。例えば、プロモーターエレメントに作動可能に連結したコード配列の転写は、プロモーターの活性を活性化する因子によって誘導される；プロモーターエレメントに作動可能に連結したコード配列の転写は、プロモーターの活性を抑制する因子によって阻害される。したがって、プロモーター領域は、かかるコード配列活性の転写がプロモーターの活性によって影響される場合、タンパク質のコード配列に作動可能に連結している。

「インフレームで」とは、本明細書を通じて使用する場合、最適な転写または翻訳を生じるように、プロモーター配列に作動可能に連結したＤＮＡ断片またはコード配列内のヌクレオチドの所望の配列を適切に位置させることを指す。

「融合構築物」とは、融合タンパク質をコードする組換え遺伝子を指す。

「融合タンパク質」は、ハイブリッドタンパク質、すなわち、少なくとも２つの異なるタンパク質由来のドメインを含むように構築されたタンパク質である。本明細書で使用する場合、融合タンパク質は、（ａ）転写調節タンパク質由来の転写調節ドメイン、または（ｂ）相互作用についてアッセイされる異種タンパク質に連結した、ＤＮＡ結合タンパク質由来のＤＮＡ結合ドメイン、を保有するハイブリッドタンパク質である。融合タンパク質の構造は、転写調節ドメインおよびＤＮＡ結合ドメインが、両方のドメインを生物学的に活性にするような様式で配置されるような構造である。転写調節ドメインの供給源であるタンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインの供給源であるタンパク質とは異なる。言い換えると、２つのドメインは、互いに異種である。

融合タンパク質の転写調節ドメインは、そのドメインの天然の生物学的活性に依存して、標的遺伝子の転写を活性化または抑制し得る。本発明のベイトタンパク質もまた、ＤＮＡ結合部分に作動可能に連結した目的のタンパク質を含み得る、融合遺伝子によってコードされる融合タンパク質である。

用語「融合タンパク質遺伝子」とは、融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を指す。融合タンパク質遺伝子は、その転写および翻訳制御のための転写および翻訳調節エレメントをさらに提供し得る。

「発現」は、遺伝子内にコードされる情報が明らかにされるプロセスである。遺伝子がタンパク質をコードする場合、発現には、両方の、ｍＲＮＡへのＤＮＡの転写、成熟ｍＲＮＡ産物へのｍＲＮＡのプロセシング（必要に応じて）、およびタンパク質への成熟ｍＲＮＡの翻訳が関与する。

核酸分子、例えば、ＤＮＡまたは遺伝子は、その分子が、ポリペプチドのコード配列、および適切な宿主環境において、ＤＮＡ中に含まれる遺伝情報をタンパク質産物へと転写、プロセシングおよび翻訳する能力を提供する発現制御配列を含む場合、ならびにかかる発現制御配列が、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結している場合、ポリペプチドを「発現することが可能」であると言われる。

本明細書で使用する場合、「クローニングビヒクル」は、クローニング目的のために、核酸配列を宿主細胞中に送達することが可能な任意の実体である。クローニングビヒクルの例には、プラスミドまたはファージゲノムが含まれる。宿主細胞中で自律的に複製できるプラスミドが、特に望ましい。あるいは、宿主細胞の染色体ＤＮＡ中に挿入（組み込み）できる核酸分子、特に、安定な様式で、すなわち、かかる分子が娘細胞によって受け継がれるような様式で、宿主細胞の染色体ＤＮＡ中に挿入する分子が有用である。

本明細書で記載される「宿主細胞」は、細菌、真菌または哺乳動物細胞であり得る。細菌宿主細胞の例は、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓである。真菌細胞の例は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＳ．ｐｏｍｂｅである。哺乳動物細胞の非限定的な例は、不死化哺乳動物細胞株、例えば、ＨＥＫ２９３、Ａ５４９、ＨｅＬａもしくはＣＨＯ細胞、または（例えば、ｈＴＥＲＴによるトランスフェクションによって）遺伝的に不死化された単離された患者初代組織細胞である。

クローニングビヒクルは、そのようなＤＮＡ配列がビヒクルの本質的生物学的機能の喪失を伴わずに決定可能な様式で切断され得、その複製およびクローニングをもたらすためにＤＮＡがその中にスプライスされ得る、１つまたは少数のエンドヌクレアーゼ認識部位により特徴付けられる場合が多い。

クローニングビヒクルは、そのクローニングビヒクルで形質転換された細胞の同定における使用に適切なマーカーをさらに含み得る。例えば、マーカー遺伝子は、特異的抗生物質に対する耐性を宿主細胞に付与する遺伝子であり得る。

単語「ベクター」は、「クローニングビヒクル」と相互交換可能に使用され得る。

本明細書で使用する場合、「発現ビヒクル」は、クローニングビヒクルと類似しているが、宿主中への形質転換後にクローニングされた遺伝子の発現を可能にする環境を提供するように特に設計された、ビヒクルまたはベクターである。かかる環境を提供する１つの様式は、かかる発現ビヒクル上に転写および翻訳調節配列を含むことであり、かかる転写および翻訳調節配列は、クローニングされた遺伝子に作動可能に連結されることが可能である。かかる環境を提供する別の様式は、かかるビヒクル上に、所望のクローニングされる遺伝子および所望の発現調節エレメントがクローニングされ得るクローニング部位（単数または複数）を提供することである。

発現ビヒクルでは、クローニングされる遺伝子は通常、プロモーター配列などのある特定の制御配列に作動可能に連結される。発現制御配列は、ベクターが、原核生物または真核生物宿主において作動可能に連結した遺伝子を発現するように設計されているかどうか、ならびに転写エレメント、例えば、エンハンサーエレメント、終結配列、組織特異性エレメント、または翻訳開始および終結部位をさらに含むことができるかどうかに依存して変動する。

「宿主」とは、クローニングまたは発現ビヒクルのレシピエントである任意の生物を指す。宿主は、酵母細胞または培養動物細胞、例えば、哺乳動物もしくは昆虫細胞であり得る。酵母宿主は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅであり得る。

「結合部分」または「ＤＮＡ結合部分」は、特定のＤＮＡ配列への特異的ポリペプチドの結合を指向させることが可能なアミノ酸のストレッチ（すなわち、「タンパク質結合部位」）である。本明細書でＤＮＡ結合ドメインとも呼ばれるが、これらのタンパク質は、配列特異的様式でＤＮＡを結合するホモダイマーまたはモノマーであり得る。本発明の例示的なＤＮＡ結合ドメインには、ＬｅｘＡ、ｃＩ、グルココルチコイド受容体結合ドメインおよびＵｍｅ６ドメインが含まれる。

「遺伝子活性化部分」は、その制御領域に遺伝子活性化部分が結合する遺伝子の発現を弱く誘導することが可能なアミノ酸のストレッチである（一例は、転写因子由来の活性化ドメインである）。本明細書で使用する場合、「弱く」とは、ＧＡＬ４活性化領域ＩＩによってもたらされる活性化のレベルより下を意味し、好ましくは、Ｂ４２活性化ドメインによってもたらされる活性化のレベルまたはそれよりも下である。活性化のレベルは、任意の下流のレポーター遺伝子系を使用し、並行アッセイにおいて、ＧＡＬ４領域ＩＩ－ポリペプチドによって刺激される発現のレベルを、試験されるポリペプチドによって刺激される発現のレベルと比較することで測定され得る。

タンパク質間相互作用阻害剤のスクリーニング。
２つのタンパク質間の接触界面を形成する大きく広い表面は、規範的小分子阻害剤の潜在的な標的であり得る。しかし、大きく広い表面は、サイズの制限を有し得、進化した耐性が容易に生じ得る。抗体の特異性は、短いペプチド、例えば、２５残基未満のペプチドの形態の、細胞透過性と組み合わされ得る。タンパク質間相互作用（ＰＰＩ）の短いペプチド遮断剤についてのスクリーニングは、ファージディスプレイまたはｍＲＮＡディスプレイなどのテクノロジーを使用して実施され得る；しかし、これらのスクリーニングは、ｉｎｖｉｔｒｏで実施され、目的の相互作用性タンパク質のうち１つの精製を必要とし得る。タンパク質のうち１つに対する親和性を有するペプチド配列の選択の際に、ペプチドが第２のタンパク質の結合界面に干渉することを検証するために、二次スクリーニングが実施され得る。この二次スクリーニングは、タンパク質の適切なフォールディング、およびアッセイにおける細胞内生物物理学的条件の複製に、さらに依存し得る。

本発明の方法には、ＰＰＩの強力なペプチド妨害剤の細胞内選択が関与し得る。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどのモデル生物が使用され得、目的のＰＰＩと、ランダム化ペプチドライブラリーをコードするＤＮＡ配列を含む試験遺伝子との共発現は、ストリンジェントな選択機構を使用した、ＰＰＩと干渉する偏りのないペプチドの選択を可能にし得る。この方法は、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）に融合した第１の試験タンパク質と転写活性化ドメイン（ＡＤ）または遺伝子活性化部分に融合した第２の試験タンパク質との間の相互作用を必要とする転写因子の再構成に依存し得る酵母ツーハイブリッドシステムの並べ替えで始まり得る。

目的の２つのタンパク質間の効率的相互作用は、ＲＮＡポリメラーゼを特異的ゲノム部位に指向させ得、遺伝エレメントの発現を可能にし得る。遺伝エレメントは、例えば、選択培地上で生物が成長するのを可能にするタンパク質をコードする遺伝子であり得る。選択培地は、例えば、ＡＤＥ２、ＵＲＡ３、ＴＲＰ１、ＫＡＮ^ＲまたはＮＡＴ^Ｒに特異的であり得る。相互作用がもはや存在しない、例えば、外部の物体によって妨害された場合に検出できるマーカーは、ＵＲＡ３遺伝子など、カウンター選択マーカーと呼ばれ得、これは、不十分または漏れやすい（選択を逃れる変異体の選択によって容易にマスクされる）場合がある。選択マーカーのこの漏れやすさは、高い偽陽性率をもたらし得る。

本発明の方法は、ＰＰＩの遮断剤についてスクリーニングするために、強力な陰性選択マーカーを、短いペプチドの産生の細胞内安定化と組み合わせ得る。いくつかの細胞毒性レポーター（細胞死因子）のいずれか１つまたはそれらの組合せの発現を駆動できる誘導性ツーハイブリッドアプローチが使用され得る。細胞毒性レポーターの全てが、誘導された細胞が生存できるように、同時に「漏れやすく」なければならないので、ツーハイブリッドシステムにおける細胞毒性レポーターの組合せの発現の誘導が関与する本発明の方法は、ツーハイブリッドアッセイの偽陽性率を低下させることにおいて乗算的効果を可能にし得る。細胞毒性レポーターは、例えば、以下であり得る：

本発明の細胞毒性レポーターは、例えば、リボソーム性にコードされる生体異物剤、リボソーム性にコードされる毒物、軽度に過剰発現されると重度の成長欠損を生じる、リボソーム性にコードされる内因性もしくは外因性の遺伝子、生存能にとって必須の遺伝子を切除する、リボソーム性にコードされるリコンビナーゼ、または毒性二次代謝物の合成に関与し得る１つの制限因子（または複数の因子）であり得る。

本発明の系は、Ｄｏｆ１などのＡＤに融合したタンパク質とＴｅｔＲなどのＤＢＤに融合した別のタンパク質との間の相互作用によって媒介される転写因子の再構成を使用できる。

ＰＰＩを妨害し得るペプチドを同定するために、ＰＰＩ組込みプラスミド（プラスミド１；図７）、選択およびライブラリープラスミド（プラスミド２；図９）、ならびに確認（プラスミド３；図１１）が使用され得る。

プラスミド１は、例えば、目的のＰＰＩを構成する２つのタンパク質の組込みを可能にする２つの制限部位を含み得る。目的のＰＰＩには、発癌にとっての公知の重要性を有するドメインの対、例えば、ｐ５３－ＭＤＭ２、ＲＡＳ－ＲＡＳＲＢＤおよびＭＹＣ－ＭＡＸが関与し得る。目的のＰＰＩには、癌遺伝子（例えば、Ｃｄｋ１、Ｃｄｋ２、Ｃｄｋ３、Ｃｄｋ４、Ｃｄｋ６、ｃ－ＭＹＣ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、Ｋ－Ｒａｓ、ＰＤＧＦＲ、ＲａｆキナーゼおよびＶＥＧＦ）または腫瘍サプレッサー（例えば、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤１Ｃ、ＰＴＥＮ、ｐ１６、ｐ２７、ｐ５３、ｐ７３および網膜芽細胞腫タンパク質（ｐＲｂ））と公知の細胞性相互作用パートナーとの相互作用もまた関与し得る。目的のＰＰＩには、ＤＮＡ修復経路に関与するタンパク質（例えば、ＡＴＭ、ＡＴＲＸ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＥＲＣＣ１、ＦＡＮＣＢ、ＦＡＮＣＦ、ＦＥＮ１、ＨＭＧＡ１、ＨＭＧＡ１、ＭＤＣ１、ＭＧＭＴ、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ４、Ｍｒｅ１１Ａ、ＮＢＳ１、ＮＥＩＬ１、ＰＡＲＰ１、ＰＡＲＰ２、ＰＭＳ２、ＲＡＤ５１、ＲＡＤ５２、ＲＡＤ５４、ＲＡＤ５１ＡＰ１、ＷＲＮおよびＸＰＦ）と別の細胞性因子との相互作用が関与し得る。

ＤＮＡ配列を指定する場合、Ｎは、任意の可能なデオキシヌクレオチドを意味する。

プラスミド１は、強力なプロモーターおよびターミネーター（例えば、ＡＤＨ１）によって、または誘導性プロモーター（例えば、ＧＡＬ１）によって駆動される、各タンパク質へのＡＤ（例えば、Ｄｏｆ１）または別の遺伝子活性化部分およびＤＢＤ（例えば、ＴｅｔＲ）の融合物をコードし得る。他の例示的な活性化ドメインには、ＶＰ１６およびＢ４２ＡＤのものが含まれる。他の例示的なＤＢＤには、ＧＡＬ４またはＬｅｘＡのものが含まれる。各タンパク質融合物は、引き続く生化学的実験のために、例えば、ＦＬＡＧ、ＨＡまたはＨｉｓタグでタグ化され得る。プラスミド１は、細菌の選択および繁殖マーカー（すなわち、ｏｒｉおよびＡｍｐＲ）、ならびに酵母の複製および選択マーカー（すなわち、ＴＲＰ１およびＣＥＮまたは２ｕｍ）もまた含み得る。このプラスミドはまた、特定された遺伝子座において、ゲノム中に組み込まれ得る。プラスミド１の配列は、

であり得る。

プラスミド２は、例えば、強力なプロモーター（例えば、ＡＤＨ１プロモーター）または誘導性プロモーター（例えば、ＧＡＬ１プロモーター）によって駆動される、ランダム化ペプチドライブラリー（例えば、ランダム化されたＮＮＫ６０マー配列）の組込みのための制限部位を含み得る。ライブラリーはまた、ペプチドの半減期を最大化するために、例えば、メチオニンバリンアスパラギン（ＭＶＮ；配列番号６６）の固定された配列、または高半減期Ｎ末端残基の別の組合せ（例えば、Varshavsky.Proc. Natl. Acad. Sci. USA. ９３巻：１２１４２～１２１４９頁（１９９６年）を参照のこと）で始まり得、短いタンパク質（例えば、ｓＯＲＦ１）のＵＴＲで終結し得る。ペプチドはまた、Ｍｙｃなどのタンパク質タグでタグ化され得る。ペプチドはまた、リボソーム性に合成され（ribosomallysynthesized）翻訳後修飾されたペプチド（ＲｉＰＰ）の産物であり得、それによって、コアペプチドには、例えば、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓ由来のランチペプチド（lanthipeptide）成熟化酵素（ＬａｎＢ、ＬａｎＣ、ＬａｎＭ、ＬａｎＰ）、シアノバクテリア由来のパテラミド（patellamide）生合成因子（ＰａｔＤ、ＰａｔＧ）、Ｃｌｉｔｏｒｉａｔｅｒｎａｔｅａ由来のブテラーゼ（butelase）１、およびＧａｌｅｒｉｎａｍａｒｇｉｎａｔａまたはＡｍａｎｉｔａｂｉｓｐｏｒｉｇｅｒａ由来のＰＯＰＢを含む、成熟化、切断および／または改変酵素、例えば、切除または環化酵素の動員のためにシグナル伝達するリーダーペプチドおよび認識配列を含むプレプロペプチド配列が隣接する。

プラスミド２は、ＰＰＩ組込みプラスミド中に存在するＤＢＤに依存するプロモーター、例えば、ＴｅｔＲが結合した状態になり得るＴｅｔＯ配列によって駆動される「細胞死因子」（例えば、細胞毒性レポーター）として概略が示される作用因子のうち１つまたは複数をさらにコードし得る。「細胞死因子」の抑制を確実にするために、プラスミド２は、ＤＢＤを結合し、ドキシサイクリンの存在下で転写をサイレンシングするために、強力なプロモーター（例えば、ＡＤＨ１）によって駆動されるＴｅｔＲ’－Ｔｕｐ１１融合物などのサイレンシング構築物を含み得る。プラスミド２は、細菌の選択および繁殖マーカー（すなわち、ｏｒｉおよびＡｍｐＲ）、ならびに酵母の複製および選択マーカー（すなわち、ＬＥＵ２およびＣＥＮまたは２ｕｍ）を含み得る。プラスミド２の配列は、

であり得る。

プラスミド３を使用して、レポーターの発現および株の成功裏の構築を確認し得る。プラスミド３は、ＡＤとＤＢＤとの間の直接的融合物を含み得る。プラスミド３は、細菌の選択および繁殖マーカー（すなわち、ｏｒｉおよびＡｍｐＲ）、ならびに酵母の複製および選択マーカー（すなわち、ＴＲＰ１およびＣＥＮまたは２ｕｍ）をさらに含み得る。プラスミド３の配列は、

であり得る。

ＰＰＩを妨害するペプチドの同定のために使用される宿主細胞は、接合型または二倍体のいずれかのＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅであり得、プラスミド１において使用されるＤＢＤの認識配列（例えば、ＴｅｔＯ）によって駆動される遺伝子レポーター（例えば、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３および／またはＵＲＡ３）のゲノム組込みを含み得る。ＰＰＩを妨害するペプチドの同定のために使用される宿主細胞はまた、本明細書で以前に記載した別の宿主細胞、例えば、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）または哺乳動物細胞（例えば、不死化初代細胞または不死化細胞株）であり得る。この宿主細胞はまた、ペプチドの環化およびメチル化に必要な酵素（例えば、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓ由来のランチペプチド成熟化酵素（ＬａｎＢ、ＬａｎＣ、ＬａｎＭ、ＬａｎＰ）、シアノバクテリア由来のパテラミド生合成因子（ＰａｔＤ、ＰａｔＧ）、Ｃｌｉｔｏｒｉａｔｅｒｎａｔｅａ由来のブテラーゼ１、またはＧａｌｅｒｉｎａｍａｒｇｉｎａｔａもしくはＡｍａｎｉｔａｂｉｓｐｏｒｉｇｅｒａ由来のＰＯＰＢ）を発現し得る。ペプチドの環化に必要な例示的なＰＯＰは、以下の表２に概略が示される配列のいずれかもまた含み得る。

プラスミド１、プラスミド２、プラスミド３、プラスミド１～３と適合性のトランスフェクト可能な宿主細胞、またはそれらの任意の組合せを含むキットが、本開示の範囲内で想定される。一部の実施形態では、プラスミド１または２は、宿主細胞中に既にトランスフェクトされた形で提供される。一部の実施形態では、本開示に従うキットは、プラスミド１～３をトランスフェクトされた宿主細胞との使用のための選択可能な薬剤を含む。一部の実施形態では、単一よりも多くの対のＹ２Ｈ相互作用物質が提示される、プラスミド１のバリアントのライブラリーが提供される。かかるライブラリーは、例えば、規定された薬剤によって阻害されるタンパク質間相互作用についてスクリーニングするために使用され得る。一部の実施形態では、スクリーニングのための複数の異なる短い試験ポリペプチド配列が提示される、プラスミド１のバリアントのライブラリーが提供される。複数の異なる短いペプチド配列は、任意の方法（例えば、ＮＮＫまたはＮＮＮヌクレオチドランダム化）によってランダムに生成され得る。複数の異なる短いペプチド配列はまた、標的への結合について選択する以前の実験によって、または合理的に設計されたペプチドライブラリーを報告した科学文献中の既存のデータセットから、予め選択され得る。

プラスミド１、２および３は、種々の並べ替えで使用され得る。第１の例では、宿主細胞のゲノム中へのプラスミド１の組込み（プラスミド３を使用して確認される）には、例えば、ＮＮＫまたはＮＮＮコドンを使用してランダムにコードされたペプチドによるプラスミド２のライブラリーの形質転換が続き得る。

この第１の例では、ＰＰＩを妨害できるペプチドを同定するためのスクリーニングを実施するために、宿主細胞１が、プラスミド１の存在、および信頼できるＰＰＩが生じていることを確実にするために、選択培地中（例えば、酵母については、Ｔｒｐを欠く培地上、またはヒトもしくは細菌細胞については、抗生物質を含む培地中）で繁殖され得る。次いで、この宿主細胞は、プラスミド２で形質転換され得、全ての構成要素が存在し、任意の誘導性構成要素の発現を（例えば、Ｇａｌ、ドキシサイクリンなどを用いて）誘導していることを確実にするために選択培地（例えば、酵母については、ＴｒｐおよびＬｅｕを欠く培地上、または細菌もしくは哺乳動物細胞については、抗生物質を欠く培地上）に即座に移され得る。

第２の例では、これらのプラスミドは、酵母接合型システムを利用する「プラグ・アンド・プレイ・プラットフォーム（plug and play platform）」として使用され得（図１２）、このとき、２つまたはそれよりも多いプラスミド（またはその中の遺伝エレメント）は、細胞融合によって、または細胞融合とその後のトランスフェクションの代わりの減数分裂とによって、同じ細胞中に導入され得る。この細胞融合には、異なる遺伝エレメントを保有する２つの異なる酵母宿主細胞が関与する。この方法では、酵母宿主細胞１は、ＭＡＴａまたはＭＡＴアルファのうち１つであり得、プラスミド１の組込みを含み得る。この株は、信頼できるＰＰＩが存在することを確実にするために、陽性選択培地上で繁殖され得る。この方法ではまた、酵母宿主細胞２は、反対の接合型のものである。この株は、ランダム化ペプチドライブラリーおよび「細胞死因子」（例えば、細胞毒性レポーター）プラスミド（プラスミド２）を保有する（またはこれらを組み込んでいる）。酵母宿主細胞２は、細胞培養物内の高度に多様化されたライブラリーバリエーションを確実にする大バッチ高効率形質転換プロトコルを介して生成され得る。次いで、このライブラリーバッチのアリコートは、一貫性を維持するために、凍結され得る。

この第２の例では、これらの株は、マーカー、ＰＰＩ、「細胞死因子」およびペプチドを全て保有する二倍体株を生じるように、バッチ中で接合される。次いで、このバッチ培養物は、全ての系構成要素の選択を可能にし、任意の誘導性構成要素の発現を（例えば、Ｇａｌを用いて）誘導する固体培地（すなわち、ＬｅｕおよびＴｒｐを欠く培地）上で繁殖され得る。

Ｙ２Ｈおよびライブラリー／細胞毒性構築物（トランスフェクションまたは接合のいずれかによって細胞中に導入された）の両方を保有する宿主細胞に対して実施した限界希釈実験からの生存コロニーは、ペプチドによって妨害されており、コードされた「細胞死因子」（例えば、細胞毒性レポーター）によって誘発されるデスカスケード（deathcascade）をもはや誘発しないＰＰＩを有するコロニーを構成する。ペプチド配列は、各生存コロニー中のプラスミド２のペプチドコード領域をＤＮＡ配列決定することによって得られ得る。

生存が確率論的変化または不完全な遺伝子発現ではなくＰＰＩの阻害に起因することを確実にするために、誘導性マーカーを使用して、ＰＰＩまたはペプチドのいずれかの産生を不活性化し、特異性を確認し得る。例えば、全ての構成要素が発現している、ガラクトースを含む培地上のみで細胞生存が観察され、ペプチドの発現が失われている場合、ガラクトースを有さない培地上では生存は観察されない。

プラスミドはまた、特異性を確認するために、単離され、新たな宿主細胞中に再形質転換され得る。ＰＰＩ、ペプチドおよび「細胞死因子」を含む生存宿主細胞の生化学的分画とその後のプルダウン実験とによって、コードされたタグ（例えば、Ｍｙｃ－タグ、ＨＡ－タグ、Ｈｉｓ－タグ）を使用して、ペプチド配列といずれかのＰＰＩパートナーとの間の相互作用を確認できる。

十分な生存宿主細胞コロニーが配列決定されると、高度に保存された配列パターンが出現し得、マルチ配列アラインメントを使用して容易に同定され得る。任意のかかるパターンは、多様性を生成し、より密な結合を達成するために、ライブラリーペプチド挿入配列内の残基を「アンカー」し、可変残基を並べ替えるために使用され得る。これは、パターン認識およびライブラリー設計のために開発されたアルゴリズムを使用しても実施され得る。収束の際に、配列決定を介して同定される妨害性ペプチドパターンは、必要かつ十分なペプチド妨害剤配列を定義するために使用され得る。収束は、最後から２番目の反復と比較した、最後の反復における任意の新たな配列の回復の欠如によって定義される。

化合物。
ＲＡＤ５１のタンパク質界面に結合でき、ｉｎｖｉｔｒｏでまたは細胞中でＲＡＤ５１の機能を阻害できる天然に存在しない化合物が、本明細書に開示される。タンパク質界面は、ＲＡＤ５１のＡＴＰａｓｅドメインのサブ領域であり得る。タンパク質界面は、ＲＡＤ５１上のＲＡＤ５１ＡＰ１の結合部位であり得る。タンパク質界面は、ヒトＲＡＤ５１のアミノ酸残基１９０～２１８であり得る。本発明に従う天然に存在しない化合物がＲＡＤ５１上に結合し得るタンパク質界面の例示的なモデルは、図２２に提示され、図中、化合物は、黒で強調された残基と相互作用する。灰色は、ＲＡＤ５１へのＢＲＣＡ２の結合を示す。

ｉｎｖｉｔｒｏで、本明細書に開示される化合物は、ＲＡＤ５１マルチマー化、ＲＡＤ５１の別の公知の相互作用パートナー（例えば、ＢＲＣＡ２またはＲＡＤ５１ＡＰ１）とのＲＡＤ５１相互作用、またはＣａ２＋イオンのＲＡＤ５１キレート化／結合を阻害できる。ＲＡＤ５１の別の公知の相互作用パートナーとの相互作用の阻害は、競合的またはアロステリックであり得る。ＲＡＤ５１マルチマー化、ＲＡＤ５１の別の公知の相互作用パートナー（例えば、ＢＲＣＡ２またはＲＡＤ５１ＡＰ１）とのＲＡＤ５１相互作用、またはＣａ２＋イオンのＲＡＤ５１キレート化／結合の阻害には、ＲＡＤ５１ＡＴＰａｓｅ活性の阻害が伴い得る。ＲＡＤ５１マルチマー化、ＲＡＤ５１の別の公知の相互作用パートナー（例えば、ＢＲＣＡ２またはＲＡＤ５１ＡＰ１）とのＲＡＤ５１相互作用、またはＣａ２＋イオンのＲＡＤ５１キレート化／結合の阻害は、ＲＡＤ５１ＡＴＰａｓｅ活性の阻害を伴わない場合がある。

細胞中で、本明細書に開示される化合物は、ＤＮＡ上でのＲＡＤ５１フィラメントのアセンブリを阻害し得る。細胞中で、本明細書に開示される化合物は、ＤＮＡ損傷修復を阻害し得る。細胞中で、本明細書に開示される化合物は、細胞内での相同組換えを阻害し得る。細胞中で、本明細書に開示される化合物は、がん細胞の遺伝毒性化学療法薬に対する増感を生じ得る。細胞中で、本明細書に開示される化合物は、ＤＮＡ損傷修復の阻害を介して、または細胞内遊離カルシウム濃度の増加を通じた細胞ストレスの誘導を介して、化学療法剤に対する薬物耐性を低減させ得る。ＲＡＤ５１過剰発現に依存する細胞中では、本明細書に開示される化合物は、細胞死を生じ得る。細胞中で、本明細書に開示される化合物は、ＲＡＤ５１過剰発現に依存する細胞状態において死を引き起こし得る。一部の実施形態では、細胞は、がん細胞、または遺伝性良性増殖性障害（例えば、カウデン症候群）を有する患者の細胞であり得る。さらに、本明細書に開示される化合物のいずれかは、例えば、免疫腫瘍学剤（immuno-oncologyagent）もしくはＰＡＲＰ阻害剤、または細胞死を誘導することを目的とした他の化学療法薬と組み合わせて使用され得る。

本明細書に開示される化合物は、細胞成長阻害が相同組換えの下方調節によって生じる、またはＤＮＡ損傷修復経路に関与するタンパク質の過剰発現が存在する、障害または状態の処置の方法において使用され得る。本明細書に開示される化合物は、異常なＲＡＤ５１活性と関連する障害または状態の処置の方法において使用され得る。

本発明の化合物によって標的化され得るＲＡＤ５１の界面は、ＢＲＣＡ１／２相同組換えＤＮＡ修復経路の活性の制御のために重要であり得る。本明細書に開示される化合物による、ＢＲＣＡ１／２相同組換えＤＮＡ修復経路の活性の制御のために重要なこの界面の遮断は、いくつかの治療適応症について臨床的な関連性を有し得る。

本明細書に開示される化合物は、例えば、肝内胆管癌（ＩＣＣ）、転移性去勢耐性前立腺がん（ｍＣＲＰＣ）、およびＲＡＤ５１／ＢＲＣＡ２ＤＮＡ損傷修復経路のエフェクターの上方調節を示す他のがんの処置のための単剤治療として使用され得る。

ＩＣＣ細胞は、生存についてＢＲＣＡ２経路に依存し得、被験体を処置不能にし得る。ＲＡＤ５１妨害性化合物を介した相同組換え経路の不活性化は、細胞死をもたらし得る。この細胞死は、ＢＲＣＡ２経路に依存する細胞、例えばＩＣＣ細胞に選択的であり得る。この種の選択性の一例は、図２に示され、図中、ＨｅＬａ細胞（子宮頸がん細胞）およびＳＳＰ－２５細胞（ＩＣＣ由来細胞）が共に、化合物１および５で処理され、化合物処理の際に、ＳＳＰ－２５細胞と比較して、ＨｅＬａ細胞では細胞死はほとんど生じない。

ＢＲＣＡ２経路を過剰発現する去勢耐性前立腺がんでは、本明細書に開示されるＲＡＤ５１妨害性化合物の阻害を介したＢＲＣＡ２の不活性化は、細胞死をもたらし得る。いくつかのがんは、相同組換え経路、具体的にはＲＡＤ５１およびＢＲＣＡ２の上方調節を示し、これは、がん細胞を遺伝毒性化学療法に対して耐性にし得る。ＲＡＤ５１／ＢＲＣＡ２経路構成要素を自発的に過剰発現するがんには、例えば、肝細胞癌、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、アグレッシブマントル細胞リンパ腫、卵巣がんおよびイマチニブ耐性ＢＣＲ／ＡＢＬがんが含まれる。

本明細書に開示される化合物の作用機構には、例えば、ＲＡＤ５１ポリマーによって配位された一対のカルシウムイオンを急性様式で取り外して、急性の細胞内遊離カルシウム濃度の増加をもたらすことが関与し得る。細胞内遊離カルシウム濃度の増加は、細胞死をもたらし得る。細胞死のこの機構は、ＲＡＤ５１タンパク質を過剰発現する細胞において生じ得、細胞死は、ＲＡＤ５１過剰発現を有さない細胞よりも高いオーダーの程度であり得る。ＲＡＤ５１タンパク質を過剰発現する、本明細書に開示される化合物と接触した細胞における細胞死は、ＲＡＤ５１を過剰発現しない、本明細書に開示される化合物と接触した細胞におけるよりも、少なくとも３、少なくとも１０、少なくとも５０または少なくとも１００倍大きい場合がある。化合物の結合の際の、例えばマイクロモルレベルへの、ＲＡＤ５１フィラメントによるカルシウムイオンの隔離、および細胞質ゾル中へのカルシウムイオンのプールの引き続く急性放出は、ＲＡＤ５１／ＢＲＣＡ２経路に依存するがん、例えば、ＩＣＣおよびｍＣＲＰＣにおいて細胞死を生じ得る。この隔離／放出機構の証拠は、図２４および２５で見ることができ、図中、細胞内カルシウムキレーターＢＡＰＴＡ－ＡＭおよびルテニウムレッドは、化合物１０の細胞死誘導効果を相殺することができ、これは、化合物１０の細胞死機構にＣａ２＋イオンの放出が関与することを示唆している。この細胞死は、数分以内に急性に生じ得、ｐ５３非依存的および細胞周期非依存的であり得る。この細胞死の迅速性の一例は、図１３および１４で見ることができ、図中、化合物の投与（矢印）は、迅速な細胞死（細胞指数（cellindex）における減少）を引き起こす。

細胞死における本明細書に開示される化合物の作用機構には、細胞遊離カルシウム濃度の増加と共に、ＲＡＤ５１を介した組換え経路の不活性化が関与し得る。細胞死におけるこれらの化合物の作用機構には、ＲＡＤ５１を介した組換え経路の阻害なしの、細胞遊離カルシウム濃度の増加が関与し得る。細胞死におけるこれらの化合物の作用機構には、細胞遊離カルシウム濃度の増加と共に、ＲＡＤ５１ＡＴＰａｓｅ活性の阻害が関与し得る。細胞死におけるこれらの化合物の作用機構には、ＲＡＤ５１ＡＴＰａｓｅ活性の阻害なしの、細胞遊離カルシウム濃度の増加が関与し得る。

これらの化合物は、その患者の細胞における相同組換えの増加を示し得る、例えば、ブルーム症候群、ファンコニ貧血、ウェルナー症候群およびナイミーヘン染色体不安定症候群が含まれる稀な疾患および難病の処置においても使用され得る。個々の細胞への本明細書に開示されるＲＡＤ５１妨害性化合物の投与による組換えの下方調節は、細胞のＤＮＡ損傷過感受性を好転させ得る。細胞との本明細書に開示されるＲＡＤ５１妨害性化合物の接触による組換えの下方調節は、細胞のＤＮＡ損傷過感受性を好転させ得る。この現象の一例は、図６で見ることができ、図中、化合物５は、遺伝毒性ストレス（エトポシド）に対するブルーム細胞株（ＧＭ０８５０５）の過感受性を抑えることができる。

これらの化合物は、例えば、免疫腫瘍学剤、ＰＡＲＰ阻害剤および規範的化学療法薬が含まれる他の治療剤と組み合わせても使用され得る。例えば、抗ＰＤ１治療に対して応答性の転移性黒色腫患者は、患者腫瘍内のＢＲＣＡ２遺伝子における体細胞変異が高度に富化され得る。この相関は、ＢＲＣＡ２経路の不活性化が、抗ＰＤ１免疫療法に対して細胞を増感させることを示し得る。抗ＰＤ１剤は、例えば、ニボルマブ、ペンブロリズマブまたはピディリズマブであり得る。本明細書で記載される化合物とＢＲＣＡ経路を標的化する他の治療剤との相乗作用の一例は、図２６で見ることができ、図中、化合物１０およびオラパリブ（ＰＡＲＰ阻害剤）の共投与は、いずれか単独と比較して、細胞死の増強を引き起こす。

ＰＡＲＰ阻害剤は、ＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２が変異した乳房、卵巣および他のがんに対して、強力かつ選択的な活性を示し得る。ＲＡＤ５１妨害性化合物の使用は、ＢＲＣＡ２変異の影響を模倣し得、潜在的に、より幅広いがんを、ＰＡＲＰ阻害剤によって処置可能にし得る。ＰＡＲＰ阻害剤は、例えば、オラパリブ、ベリパリブ、ニラパリブ、タラゾパリブ、ルカパリブおよびＣＥＰ－９７２２であり得る。

本明細書に開示される化合物は、他の化学療法剤と組み合わせて使用され得る。これらの化学療法剤には、例えば、抗ＰＤ１剤、ペンブロリズマブ、メルファラン、ドキソルビシン、アドリアマイシン、エトポシド、カンプトテシン、マイトマイシンＣ、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチンまたはゲムシタビンが含まれ得る。

これらの化合物は、例えば、小分子、生物製剤、抗体、ペプチド模倣物またはペプチドであり得る。この化合物はペプチドであり得る。

本明細書に開示される化合物は、標的細胞中への進入を促進するために、細胞透過実体（ＣＰＰ）またはタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）を有し得る。タンパク質形質導入は、原形質膜を横切る、細胞中へのペプチド、タンパク質および他の分子の送達を指し得る。これらの化合物は、少なくとも１つの細胞透過ペプチド（ＣＰＰ）シグナル配列を含み得る。ＣＰＰの例には、ＨＩＶ－ＴＡＴ（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ；配列番号１３）、Ｒ８（ＲＲＲＲＲＲＲＲ；配列番号１４）、ＭＡＰ（ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡ；配列番号１５）、トランスポータン（ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ；配列番号１６）、ペゲリン（pegelin）（ＲＧＧＲＬＳＹＳＲＲＲＦＳＴＳＴＧＲ；配列番号１７）、ペネトリン（penetrin）（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ；配列番号１８）、ｃＦΦＲ４（環状ヘプタペプチドシクロ（ＦΦＲｒＲｒＫ）、ここで、Φは、ペプチド配列中のリジンのイプシロンアミノと末端グリシンのカルボキシル基との間のイソペプチド結合を介して連結されたｌ－２－ナフチルアラニンである、Qianら、Biochemistry.２０１４年６月２４日；５３巻（２４号）：４０３４～４６頁を参照のこと）およびそれらの誘導体または組合せが含まれる。種々の細胞透過性ペプチドを有する本発明に従う種々の化合物の比較は、図１８で見ることができ、図中、種々の異なる細胞透過性ペプチドを有する類似の配列が試験され、ＳＳＰ２５細胞に対する同様の細胞活性を示す。

本明細書で言及されるペプチド化合物のいずれかは、Ｎ末端（例えば、アルファ－アミン）アセチル化、Ｃ末端アミド化または骨格Ｎ－メチル化され得る。本明細書で言及される化合物のいずれかは、６炭素鎖を介してリジン残基のイプシロンアミノ基に連結された５ＦＡＭ（フルオレセインアミダイト（Fluoresceinamidite））標識を含むように改変され得る。種々のアミノ酸の化学的改変を包含し、ＳＳＰ２５細胞に対する活性を示す本発明に従う化合物の例は、図１７で見ることができる。

本明細書に開示されるペプチドはまた、ペプチド模倣物実体への変換によって安定化され得る。ペプチド模倣物は、アミド結合を介して一緒に接続されたアミノ酸残基を包含するポリマーであり得る。かかる安定化アプローチには、例えば、大環状分子への環化、ラクタムエステル化、骨格残基のＮ－メチル化、炭化水素ステープリング、およびそれらの組合せが含まれ得る。

本明細書に開示されるペプチドは、「逆反転体（retro-inverso）」実体への変換によって安定化または改変され得る。レトロ－インベルソペプチドは、そのアミノ酸配列が逆転され、アミノ酸サブユニットのアルファ炭素中心不斉も同様に反転される線状ペプチドである。かかる改変は、元のペプチドが（Ｌ）－ペプチドである場合、ペプチドの安定性を増加させることが公知である。

本発明の化合物は、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００のアミノ酸残基を有し得る。一部の実施形態では、本発明の化合物は、抗体ではない。一部の実施形態では、本発明の化合物は、抗体またはその機能的結合性断片／誘導体（例えば、Ｆａｂ断片またはＳｃＦｖ）である。本発明の化合物は、以下のコンセンサス配列を有するＲＡＤ５１相互作用モチーフを含み得る：Ｒ－Ｌ－Ｇ－Ｌ／Ｍ／Ｖ－Ｓ－Ｒ－Ｒ／Ｌ／Ｋ－Ｒ／Ｆ／Ｖ（配列番号１９）。

本発明の化合物は、以下の表３中の式のいずれか１つまたはその反転体に従う配列を含み得る：

式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶによって包含されるポリペプチドのいずれかは、１つまたは複数の、２つまたはそれよりも多い、３つまたはそれよりも多い、４つまたはそれよりも多い、５つまたはそれよりも多い、６つまたはそれよりも多い、天然に存在しないアミノ酸または（Ｄ）－アミノ酸を含み得る。一部の実施形態では、ペプチド全体が、Ｄ－アミノ酸または天然に存在しないアミノ酸から構成される。

したがって、一部の実施形態では、本開示は、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶを含み、アミノ酸のうち任意の１つまたは複数が、必要に応じて、非天然のアミノ酸または（Ｄ）－アミノ酸である、化合物を企図する。

本発明の化合物は、以下の表４中の配列番号のいずれかに従うアミノ酸配列を含み得る：

配列番号１～１１または６６～６９のいずれかは、１つまたは複数の、２つまたはそれよりも多い、３つまたはそれよりも多い、４つまたはそれよりも多い、５つまたはそれよりも多い、６つまたはそれよりも多い、天然に存在しないアミノ酸または（Ｄ）－アミノ酸を含み得る。一部の実施形態では、表４に記載されるペプチド全体が、（Ｄ）－アミノ酸または天然に存在しないアミノ酸から構成される。

本開示の例示的な化合物は、以下の表５に提供される：

本明細書に開示される化合物には、例えば、点変異を有する非結合性の陰性対照ペプチドもまた含まれ得る。この陰性対照ペプチドは、ＲＡＤ５１とＢＲＣＡ２との間の相互作用を妨害せず、実験対照として使用され得る。

本明細書に開示される化合物は、例えば、競合的またはアロステリック阻害によって、タンパク質間相互作用を阻害できる。本明細書の化合物は、例えば、ＤＮＡ損傷修復経路と関連する細胞標的を結合できる。この結合は、ＤＮＡ損傷修復経路中の変異遺伝子の有害な影響の減少を引き起こし得る。

本明細書に開示される化合物は、ＲＡＤ５１とＢＲＣＡ２またはＲＡＤ５１ＡＰ１との間の相互作用を標的化できる。この化合物は、ＲＡＤ５１とＲＡＤ５１ＡＰ１との間の相互作用を阻害できる。

この化合物は、耐性変異を有する細胞株に対して試験され得、薬物もしくはアポトーシスに対して耐性になるようにプログラムされ、またはＤＮＡ損傷修復経路に特異的な変異を有する。本明細書に開示される方法で試験され得る細胞株には、例えば、ＨＥＫ－２９３Ｔ、Ｈ１２９９、ＨＣＴ－１１６、ＭＣＦ－７、Ｕ２ＯＳ、Ｕ２５１、Ｕ８７、Ｔ９８Ｇ、ヒトＧＢＭ、Ａ５４９ＮＳＣＬＣ、Ｈ１９９３、Ｈ２０７３、ＭＥＳ－ＳＡ、ＭＥＳ－ＳＡ／Ｄｘ５、ＨＴ１０８０、ＨｅＬａ、Ｓａｏｓ－２、ＩＭＲ９０、ＳＳＰ－２５、ＰＣ３、ＬｎＣＡＰ、Ｃａｌｕ３、ＮｃｉＨ１９７５、ＭＤＡ＿ＭＢ＿２３１、Ａ３７５およびマウス胎仔線維芽細胞（ＭＥＦ）が含まれる。この試験の一例は、図２０中で見ることができ、図中、化合物１０は、細胞株のパネルに対して試験され、１０^－７～１０^－５の範囲のＩＣ５０を示すが、これは、広範な種々のがん細胞が、本明細書に開示される化合物によるＲＡＤ５１攪乱に対して感受性であり得ることを示唆している。

本明細書に開示される化合物は、ヒトＲＡＤ５１のサブ領域に結合できる。ヒトＲＡＤ５１は、配列：

を含み得る。本明細書に開示される化合物はまた、ヒトＲＡＤ５１（例えば、配列番号８２）に対して少なくとも８０または少なくとも９０パーセント同一の配列のサブ領域と相互作用できる。本明細書に開示される化合物は、ＲＡＤ５１上のＲＡＤ５１ＡＰ１の結合部位に結合できる。本明細書に開示される化合物は、ヒトＲＡＤ５１（例えば、配列番号８２）のサブ領域内に結合でき、このサブ領域は、ヒトＲＡＤ５１（例えば、配列番号８２）のアミノ酸１９０～３３９である。本明細書に開示される化合物は、ヒトＲＡＤ５１（例えば、配列番号８２）のサブ領域と相互作用でき、このサブ領域は、ヒトＲＡＤ５１（例えば、配列番号８２）のアミノ酸１９０～２１８である。本明細書に開示される化合物は、ヒトＲＡＤ５１（例えば、配列番号８２）の残基２０２、２０５および２０６のうちの少なくとも１つと相互作用できる。本明細書に開示される化合物は、ヒトＲＡＤ５１（例えば、配列番号８２）の残基２０２、２０５および２０６のうちの少なくとも２つと相互作用できる。本明細書に開示される化合物は、ヒトＲＡＤ５１（例えば、配列番号８２）の残基２０２、２０５および２０６のうち３つ全てと相互作用できる。本明細書に開示される化合物は、ヒトＲＡＤ５１（例えば、配列番号８２）の残基１８７と相互作用できる。本明細書に開示される化合物は、ヒトＲＡＤ５１（例えば、配列番号８２）の残基１８７、２０２、２０５および２０６のうちの少なくとも１つと相互作用できる。本明細書に開示される化合物は、ヒトＲＡＤ５１（例えば、配列番号８２）の残基１８７、２０２、２０５および２０６のうちの少なくとも２つと相互作用できる。本明細書に開示される化合物は、ヒトＲＡＤ５１（例えば、配列番号８２）の残基１８７、２０２、２０５および２０６のうちの少なくとも３つと相互作用できる。本明細書に開示される化合物は、ヒトＲＡＤ５１（例えば、配列番号８２）の残基１８７、２０２、２０５および２０６のうち４つ全てと相互作用できる。これらの残基の例示は、図２３中に見出すことができ、図中、配列アラインメントは、本発明に従う例示的なペプチド（配列番号５）を結合するまたは結合しないそれらの能力に基づいてクラスター化され、残基１８７、２０２、２０５および２０６の変異は、結合能と相関する。

アミノ酸。
本明細書で記載される化合物のいずれかは、親水性アミノ酸、疎水性アミノ酸、荷電アミノ酸、非荷電アミノ酸、酸性アミノ酸、塩基性アミノ酸、中性アミノ酸、芳香族アミノ酸、脂肪族アミノ酸、天然のアミノ酸、非天然のアミノ酸、合成アミノ酸、人工アミノ酸、キャップされたアミノ酸、遺伝子にコードされるアミノ酸、遺伝子にコードされないアミノ酸、ならびにアミノ酸のアナログ、ホモログおよび同類物を含み得る。

本明細書のペプチドおよびポリペプチドは、１つもしくは複数のＤ－アミノ酸もしくは天然に存在しないアミノ酸を含み得、または全てがＤ－アミノ酸もしくは天然に存在しないアミノ酸であり得る。本明細書のペプチドおよびポリペプチドは、反転され得、１つもしくは複数のＤ－アミノ酸もしくは天然に存在しないアミノ酸を含み得、または全てがＤ－アミノ酸もしくは天然に存在しないアミノ酸であり得る。

本明細書のアミノ酸は、その１文字または３文字の略称を使用して指定され得る。ＩＵＰＡＣ指定は、以下のように提供される：
略称アミノ酸名
－－－－－－－－－－－－
ＡｌａＡアラニン
ＡｒｇＲアルギニン
ＡｓｎＮアスパラギン
ＡｓｐＤアスパラギン酸（アスパルテート）
ＣｙｓＣシステイン
ＧｌｎＱグルタミン
ＧｌｕＥグルタミン酸（グルタメート）
ＧｌｙＧグリシン
ＨｉｓＨヒスチジン
ＩｌｅＩイソロイシン
ＬｅｕＬロイシン
ＬｙｓＫリジン
ＭｅｔＭメチオニン
ＰｈｅＦフェニルアラニン
ＰｒｏＰプロリン
ＳｅｒＳセリン
ＴｈｒＴスレオニン
ＴｒｐＷトリプトファン
ＴｙｒＹチロシン
ＶａｌＶバリン
ＡｓｘＢアスパラギン酸またはアスパラギン
ＧｌｘＺグルタミンまたはグルタミン酸。

本明細書で記載される化合物において使用される非天然のアミノ酸は、例えば、化学的に調製されるまたはｔＲＮＡシンテターゼテクノロジーによって発現されるアミノ酸であり得る。本明細書で記載される化合物において使用され得るアキラルなアミノ酸の非限定的な例は、グリシン（Ｇ、Ｇｌｙ）である。本明細書で記載される化合物において使用され得るＬ－エナンチオマーおよびＤ－エナンチオマーアミノ酸の非限定的な例は、アラニン（Ａ、Ａｌａ）；アルギニン（Ｒ、Ａｒｇ）；アスパラギン（Ｎ、Ａｓｎ）；アスパラギン酸（Ｄ、Ａｓｐ）；システイン（Ｃ、Ｃｙｓ）；グルタミン酸（Ｅ、Ｇｌｕ）；グルタミン（Ｑ、Ｇｌｎ）；ヒスチジン（Ｈ、Ｈｉｓ）；イソロイシン（Ｉ、Ｉｌｅ）；ロイシン（Ｌ、Ｌｅｕ）；リジン（Ｋ、Ｌｙｓ）；メチオニン（Ｍ、Ｍｅｔ）；フェニルアラニン（Ｆ、Ｐｈｅ）；プロリン（Ｐ、Ｐｒｏ）；セリン（Ｓ、Ｓｅｒ）；スレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ）；トリプトファン（Ｗ、Ｔｒｐ）；チロシン（Ｙ、Ｔｙｒ）；およびバリン（Ｖ、Ｖａｌ）である。一部の実施形態では、アミノ酸の保存的または非保存的置換は、本明細書で記載される任意の化合物で可能である。

本明細書で記載される化合物のいずれかは、保存的アミノ酸置換によって改変され得る。保存的アミノ酸置換には、化学的に類似のアミノ酸による、あるアミノ酸の置換が関与する。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換表は、種々の参考文献から入手可能である（例えば、Creighton、Proteins:Structures and MolecularProperties（W H Freeman & Co.；第２版（１９９３年１２月）を参照のこと）。以下の８つの群は各々、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；および
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）

非天然のアミノ酸は、特に、その非天然のアミノ酸が類似の化学的特性（例えば、疎水性、親水性）を有する場合、本明細書で記載される化合物のいずれかにおいて、天然の／規範的アミノ酸を置換し得る。非天然のアミノ酸は、２０種の一般的アミノ酸（アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリン）またはピロリシンもしくはセレノシステインのうちの１つではないアミノ酸である；用語「非天然のアミノ酸」と同義で使用され得る他の用語は、「天然にコードされないアミノ酸」、「天然でないアミノ酸」、「天然に存在しないアミノ酸」ならびにそれらの種々にハイフネーションされたまたはハイフネーションされないバージョンである。用語「非天然のアミノ酸」には、天然にコードされるアミノ酸（２０種の一般的アミノ酸またはピロリシンおよびセレノシステインが含まれるがこれらに限定されない）の改変によって天然に存在するアミノ酸であるが、翻訳複合体によって成長中のポリペプチド鎖中にそれ自体は取り込まれることがないアミノ酸が含まれるがこれらに限定されない。天然にコードされない天然に存在するアミノ酸の例には、Ｎ－アセチルグルコサミニル－Ｌ－セリン、Ｎ－アセチルグルコサミニル－Ｌ－スレオニンおよびＯ－ホスホチロシンが含まれるがこれらに限定されない。

非天然のアミノ酸には、アミノ酸アナログが含まれる。アミノ酸アナログは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基およびＲ基に結合した中心炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムである。かかるアナログは、改変されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または改変されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造を保持する。

ペプチド合成
本明細書で記載される化合物は、合成ペプチドであり得る。合成ペプチドは、標準的な固相ペプチド合成プロトコルに従って合成した。ペプチドが合成した通りのものであること、およびその純度を、ＲＰ－ＨＰＬＣ、ＭＳ／ＭＳおよび含有ペプチド分析によって確認および決定した。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）は、非毒性塩形態（例えば、酢酸塩またはＨＣｌ）と交換し、ペプチドの純度は、実験における使用前に少なくとも９５％であった。

薬学的に許容される塩。
本発明は、本明細書に開示される任意の治療化合物の薬学的に許容される塩の使用を提供する。薬学的に許容される塩には、例えば、酸付加塩および塩基付加塩が含まれる。酸付加塩を形成するために化合物に添加される酸は、有機酸または無機酸であり得る。塩基付加塩を形成するために化合物に添加される塩基は、有機塩基または無機塩基であり得る。一部の実施形態では、薬学的に許容される塩は、金属塩である。一部の実施形態では、薬学的に許容される塩は、アンモニウム塩である。

金属塩は、本発明の化合物への無機塩基の添加から生じ得る。無機塩基は、塩基性対イオン、例えば、水酸化物、カルボネート、ビカルボネートまたはホスフェートなどと対になった金属カチオンからなる。金属は、アルカリ金属、アルカリ土類金属、遷移金属または典型金属であり得る。一部の実施形態では、金属は、リチウム、ナトリウム、カリウム、セシウム、セリウム、マグネシウム、マンガン、鉄、カルシウム、ストロンチウム、コバルト、チタン、アルミニウム、銅、カドミウムまたは亜鉛である。

一部の実施形態では、金属塩は、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、セシウム塩、セリウム塩、マグネシウム塩、マンガン塩、鉄塩、カルシウム塩、ストロンチウム塩、コバルト塩、チタン塩、アルミニウム塩、銅塩、カドミウム塩または亜鉛塩である。

アンモニウム塩は、本発明の化合物へのアンモニアまたは有機アミンの添加から生じ得る。一部の実施形態では、有機アミンは、トリエチルアミン、ジイソプロピルアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、モルホリン、Ｎ－メチルモルホリン、ピペリジン、Ｎ－メチルピペリジン、Ｎ－エチルピペリジン、ジベンジルアミン、ピペラジン、ピリジン、ピラゾール（pyrrazole）、ピピラゾール（pipyrrazole）、イミダゾール、ピラジンまたはピピラジン（pipyrazine）である。

一部の実施形態では、アンモニウム塩は、トリエチルアミン塩、ジイソプロピルアミン塩、エタノールアミン塩、ジエタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、モルホリン塩、Ｎ－メチルモルホリン塩、ピペリジン塩、Ｎ－メチルピペリジン塩、Ｎ－エチルピペリジン塩、ジベンジルアミン塩、ピペラジン塩、ピリジン塩、ピラゾール塩、ピピラゾール塩、イミダゾール塩、ピラジン塩またはピピラジン塩である。

酸付加塩は、本発明の化合物への酸の添加から生じ得る。一部の実施形態では、酸は有機である。一部の実施形態では、酸は無機である。一部の実施形態では、酸は、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、亜硝酸、硫酸、亜硫酸、リン酸、イソニコチン酸、乳酸、サリチル酸、酒石酸、アスコルビン酸、ゲンチシン酸（gentisinicacid）、グルコン酸、グルクロン酸（glucaronicacid）、サッカリン酸（saccaric acid）、ギ酸、安息香酸、グルタミン酸、パントテン酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、フマル酸、コハク酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、クエン酸、シュウ酸またはマレイン酸である。

一部の実施形態では、塩は、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、亜硝酸塩、硫酸塩、亜硫酸塩、リン酸塩、イソニコチン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、酒石酸塩、アスコルビン酸塩、ゲンチシン酸（gentisinate）塩、グルコン酸塩、グルクロン酸（glucaronate）塩、サッカリン酸（saccarate）塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、パントテン酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、メタンスルホン酸（メシル酸）塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩またはマレイン酸塩である。

化合物の純度。
本明細書の任意の化合物は、精製され得る。本明細書の化合物は、少なくとも１％純粋、少なくとも２％純粋、少なくとも３％純粋、少なくとも４％純粋、少なくとも５％純粋、少なくとも６％純粋、少なくとも７％純粋、少なくとも８％純粋、少なくとも９％純粋、少なくとも１０％純粋、少なくとも１１％純粋、少なくとも１２％純粋、少なくとも１３％純粋、少なくとも１４％純粋、少なくとも１５％純粋、少なくとも１６％純粋、少なくとも１７％純粋、少なくとも１８％純粋、少なくとも１９％純粋、少なくとも２０％純粋、少なくとも２１％純粋、少なくとも２２％純粋、少なくとも２３％純粋、少なくとも２４％純粋、少なくとも２５％純粋、少なくとも２６％純粋、少なくとも２７％純粋、少なくとも２８％純粋、少なくとも２９％純粋、少なくとも３０％純粋、少なくとも３１％純粋、少なくとも３２％純粋、少なくとも３３％純粋、少なくとも３４％純粋、少なくとも３５％純粋、少なくとも３６％純粋、少なくとも３７％純粋、少なくとも３８％純粋、少なくとも３９％純粋、少なくとも４０％純粋、少なくとも４１％純粋、少なくとも４２％純粋、少なくとも４３％純粋、少なくとも４４％純粋、少なくとも４５％純粋、少なくとも４６％純粋、少なくとも４７％純粋、少なくとも４８％純粋、少なくとも４９％純粋、少なくとも５０％純粋、少なくとも５１％純粋、少なくとも５２％純粋、少なくとも５３％純粋、少なくとも５４％純粋、少なくとも５５％純粋、少なくとも５６％純粋、少なくとも５７％純粋、少なくとも５８％純粋、少なくとも５９％純粋、少なくとも６０％純粋、少なくとも６１％純粋、少なくとも６２％純粋、少なくとも６３％純粋、少なくとも６４％純粋、少なくとも６５％純粋、少なくとも６６％純粋、少なくとも６７％純粋、少なくとも６８％純粋、少なくとも６９％純粋、少なくとも７０％純粋、少なくとも７１％純粋、少なくとも７２％純粋、少なくとも７３％純粋、少なくとも７４％純粋、少なくとも７５％純粋、少なくとも７６％純粋、少なくとも７７％純粋、少なくとも７８％純粋、少なくとも７９％純粋、少なくとも８０％純粋、少なくとも８１％純粋、少なくとも８２％純粋、少なくとも８３％純粋、少なくとも８４％純粋、少なくとも８５％純粋、少なくとも８６％純粋、少なくとも８７％純粋、少なくとも８８％純粋、少なくとも８９％純粋、少なくとも９０％純粋、少なくとも９１％純粋、少なくとも９２％純粋、少なくとも９３％純粋、少なくとも９４％純粋、少なくとも９５％純粋、少なくとも９６％純粋、少なくとも９７％純粋、少なくとも９８％純粋、少なくとも９９％純粋、少なくとも９９．１％純粋、少なくとも９９．２％純粋、少なくとも９９．３％純粋、少なくとも９９．４％純粋、少なくとも９９．５％純粋、少なくとも９９．６％純粋、少なくとも９９．７％純粋、少なくとも９９．８％純粋、または少なくとも９９．９％純粋であり得る。

一部の実施形態では、本発明の化合物は、被験体の皮膚、または体腔、例えば、口腔、腟、膀胱、頭蓋、脊髄、胸部もしくは骨盤腔に、外用適用され得る。一部の実施形態では、本発明の化合物は、アクセス可能な体腔に適用され得る。

本明細書に開示される化合物は、細胞が化合物に曝露されない場合よりも、例えば、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１１倍、約１２倍、約１３倍、約１４倍、約１５倍、約１６倍、約１７倍、約１８倍、約１９倍、約２０倍、約２５倍、約３０倍、約３５倍、約４０倍、約４５倍、約５０倍、約５５倍、約６０倍、約６５倍、約７０倍、約７５倍、約８０倍、約８５倍、約９０倍、約９５倍、約１００倍、約１１０倍、約１２０倍、約１３０倍、約１４０倍、約１５０倍、約１６０倍、約１７０倍、約１８０倍、約１９０倍、約２００倍、約２５０倍、約３００倍、約３５０倍、約４００倍、約４５０倍、約５００倍、約５５０倍、約６００倍、約６５０倍、約７００倍、約７５０倍、約８００倍、約８５０倍、約９００倍、約９５０倍、約１０００倍、約１５００倍または約２０００倍大きく、細胞における細胞死を増加させるまたは細胞成長を阻害することができる。

本明細書に開示される化合物は、細胞中の遊離カルシウム濃度を、例えば、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１１倍、約１２倍、約１３倍、約１４倍、約１５倍、約１６倍、約１７倍、約１８倍、約１９倍または約２０倍増加させることができる。本明細書に開示される化合物は、細胞中の遊離カルシウム濃度を、例えば、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約１６倍、少なくとも約１７倍、少なくとも約１８倍、少なくとも約１９倍または少なくとも約２０倍増加させることができる。

本明細書に開示される化合物は、例えば、約０．１ｎＭ、約０．２ｎＭ、約０．３ｎＭ、約０．４ｎＭ、約０．５ｎＭ、約０．６ｎＭ、約０．７ｎＭ、約０．８ｎＭ、約０．９ｎＭ、約１ｎＭ、約１．５ｎＭ、約２ｎＭ、約２．５ｎＭ、約３ｎＭ、約３．５ｎＭ、約４ｎＭ、約４．５ｎＭ、約５ｎＭ、約５．５ｎＭ、約６ｎＭ、約６．５ｎＭ、約７ｎＭ、約７．５ｎＭ、約８ｎＭ、約８．５ｎＭ、約９ｎＭ、約９．５ｎＭ、約１０ｎＭ、約１５ｎＭ、約２０ｎＭ、約２５ｎＭ、約３０ｎＭ、約３５ｎＭ、約４０ｎＭ、約４５ｎＭ、約５０ｎＭ、約６０ｎＭ、約７０ｎＭ、約８０ｎＭ、約９０ｎＭ、約１００ｎＭ、約１１０ｎＭ、約１２０ｎＭ、約１３０ｎＭ、約１４０ｎＭ、約１５０ｎＭ、約２００ｎＭ、約２５０ｎＭ、約３００ｎＭ、約３５０ｎＭ、約４００ｎＭ、約４５０ｎＭ、約５００ｎｍ、約６００ｎＭ、約７００ｎＭ、約８００ｎＭ、約９００ｎＭ、約１μＭ、約１．５μＭ、約２μＭ、約２．５μＭ、約３μＭ、約３．５μＭ、約４μＭ、約４．５μＭ、約５μＭ、約６μＭ、約７μＭ、約８μＭ、約９μＭ、約１０μＭ、約１５μＭ、約２０μＭ、約２５μＭ、約３０μＭ、約３５μＭ、約４０μＭ、約４５μＭ、約５０μＭ、約６０μＭ、約７０μＭ、約８０μＭ、約９０μＭ、約１００μＭ、約１５０μＭ、約２００μＭ、約３００μＭ、約４００μＭ、約５００μＭ、約６００μＭ、約７００μＭ、約８００μＭ、約９００μＭ、または約１ｍＭであるＧＩ_５０値を示し得る。

本明細書に開示される化合物は、被験体においてがんを処置するために使用され得る。本明細書に開示される化合物は、例えば、がん細胞の増殖を緩慢にする、またはがん細胞を殺すことができる。本発明の化合物によって処置され得るがんの非限定的な例には、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連がん、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、肛門がん、虫垂がん、星状細胞腫、基底細胞癌、胆管がん、膀胱がん、骨がん、脳腫瘍、例えば、小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫／悪性神経膠腫、上衣腫、髄芽腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、視覚路および視床下部神経膠腫、乳がん、気管支腺腫、バーキットリンパ腫、原発不明癌腫、中枢神経系リンパ腫、小脳星状細胞腫、子宮頸がん、小児がん、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性障害、結腸がん、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、子宮内膜がん、上衣腫、食道がん、ユーイング肉腫、胚細胞腫瘍、胆嚢がん、胃（gastric）がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、神経膠腫、ヘアリー細胞白血病、頭頸部がん、心臓がん、肝細胞（肝臓）がん、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、眼球内黒色腫、膵島細胞癌、カポジ肉腫、腎臓がん、喉頭がん、口唇および口腔（oralcavity）がん、脂肪肉腫、肝臓がん、肺がん、例えば、非小細胞および小細胞肺がん、リンパ腫、白血病、マクログロブリン血症、骨の悪性線維性組織球腫／骨肉腫、髄芽腫、黒色腫、中皮腫、原発不明転移性扁平上皮性頸部がん、口腔（mouth）がん、多発性内分泌腫瘍症候群、骨髄異形成症候群、骨髄性白血病、鼻腔および副鼻腔がん、上咽頭癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん、口腔（oral）がん、中咽頭がん、骨肉腫／骨の悪性線維性組織球腫、卵巣がん、卵巣上皮がん、卵巣胚細胞腫瘍、膵がん、膵がん島細胞、副鼻腔および鼻腔がん、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、褐色細胞腫、松果体星状細胞腫、松果体胚細胞腫、下垂体腺腫、胸膜肺芽細胞腫、形質細胞新生物、原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺がん、直腸がん、腎細胞癌、腎盂および尿管移行上皮がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫、皮膚がん、皮膚癌メルケル細胞、小腸がん、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、胃（stomach）がん、Ｔ細胞リンパ腫、咽喉がん、胸腺腫、胸腺癌、甲状腺がん、絨毛性腫瘍（妊娠性）、原発部位不明がん、尿道がん、子宮肉腫、腟がん、外陰部がん、ワルデンストレームマクログロブリン血症およびウィルムス腫瘍が含まれる。

図１９および２０は、本発明に従う化合物についての示唆的ながん関連適応症および投与方法を示すデータを提供する。図１９は、Ａ５４９（非小細胞肺がん由来細胞株）を使用する異種移植モデルにおける化合物１０の活性を示し、図中、化合物１０は、数日間のみの処置の後に、腫瘍体積に対する有意な効果を示す。図２０は、上記がん適応症に由来する種々の不死化細胞株に対する化合物１０の活性を示し、種々のがん適応症についての１０に関する化合物の有効性を示唆している。

１００，０００人当たり約１～２症例の発生率である胆管細胞癌は、胆管に起源する変異した上皮細胞により特徴付けられる稀ながんである。胆管細胞癌は、肝内、肺門周囲または遠位胆管がんとして特徴付けられ得る。肝内胆管細胞癌は、肝臓の胆管内に生じる胆管細胞癌の一形態である。胆管中のがんは、胆管の遮断およびビリルビンの蓄積をもたらし得る。胆管細胞癌の主要症状には、例えば、異常な肝臓機能試験、腹部不快感、黄疸、体重減少、そう痒、発熱、食欲喪失、および便または尿の色の変化が含まれる。

胆管細胞癌のリスクファクターには、例えば、胆管の慢性炎症または機能不全が含まれる。胆管の機能不全は、例えば、原発性硬化性胆管炎、胆管結石、総胆管嚢胞、肝吸虫感染、多発性肝嚢胞症、カロリ症候群、硬変、Ｂ型肝炎感染またはＣ型肝炎感染として顕在化し得る。ＢＲＣＡ１／ＢＲＣＡ２における変異もまた、胆管細胞癌を引き起こし得る。肝吸虫は、アジア諸国において、生魚または加熱調理が不十分な魚中に一般的に見出される寄生生物である。胆管細胞癌の他のリスクファクターには、例えば、炎症性腸疾患、年齢、肥満、二酸化トリウムへの曝露、糖尿病、喫煙、膵炎、ＨＩＶ感染、アスベスト曝露またはラドン曝露が含まれる。

胆管細胞癌の処置には、例えば、根治的手術、姑息的手術、腹腔鏡下手順、外部ビーム放射線治療、三次元原体放射線治療、強度変調放射線治療、体幹部定位放射線療法、ブラキセラピー、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）、ゲムシタビン、シスプラチン、カペシタビンまたはオキサリプラチンが含まれ得る。

転移性去勢耐性前立腺がん（ＣＲＰＣ）では、去勢レベルのアンドロゲンにもかかわらず、アンドロゲン受容体（ＡＲ）は活性なままであり、がんの進行を駆動する。初期前立腺がんの主要症状には、例えば、排尿困難、排尿時痛、頻尿、血尿または骨盤痛が含まれる。前立腺がんは、骨およびリンパ節に転移する場合が多い。

ホルモン依存性前立腺がんは、１～３年間の治療後に、処置に対して耐性になり得る。ＣＲＰＣの処置には、例えば、抗有糸分裂化学療法薬、ドセタキセル、カバジタキセル、ベバシズマブ、サリドマイド、プレドニゾン、シプロイセルＴ、アビラテロン、エンザルタミド、またはそれらの任意の組合せが含まれる。

膵がんは、膵臓中の細胞が、制御から外れて増加し、塊を形成し始めるときに生じ、身体の他の部分に転移し得る。膵がんの主要症状には、例えば、上腹部痛、背部痛、黄疸、食欲喪失、体重減少および血餅が含まれる。外分泌がんは、例えば、膵臓腺癌、腺房細胞癌、嚢胞腺癌、膵芽腫、腺扁平上皮癌、印環細胞癌、肝様癌、膠様癌および膵粘液性嚢胞腫瘍であり得る。膵神経内分泌腫瘍（ＰａｎＮＥＴ）は、膵臓中の他の場所でも生じ得る。

膵がんの処置には、例えば、膵臓もしくは膵臓の罹患領域の外科的除去、化学療法、５－フルオロウラシル、ゲムシタビン、エルロチニブ、ｎａｂ－パクリタキセル、葉酸、イリノテカン、オキサリプラチン、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸレジメン、オクトレオチド、ランレオチド、エベロリムス、スニチニブ、放射線治療、またはそれらの任意の組合せが含まれ得る。

小細胞癌は、肺において生じ、高度に悪性であり得る。小細胞癌は、侵襲性の挙動、迅速な成長、遠位部位への早期の広がり、化学療法および放射線に対する感受性、ならびに例えば、高カルシウム血症、イートン・ランバート症候群または抗利尿ホルモン不適合分泌症候群（syndromeof inappropriate diuretic hormone）が含まれる明瞭な腫瘍随伴症候群との頻繁な関連を示し得る、神経内分泌癌である。小細胞癌の症状には、例えば、咳、呼吸困難、体重減少およびフレイルが含まれ得る。小細胞癌の処置には、例えば、シクロホスファミド、シスプラチン、ドキソルビシン、エトポシド、ビンクリスチン、パクリタキセル、放射線治療、またはそれらの任意の組合せが含まれ得る。

本明細書に開示される化合物は、被験体においてブルーム症候群を処置するために使用され得る。ブルーム症候群は、ＤＮＡヘリカーゼ酵素をコードするＢＬＭ遺伝子中の変異によって引き起こされる、稀な常染色体劣性遺伝性障害である。ブルーム症候群に罹患した被験体の細胞は、ＵＶ照射に対する感受性の増加およびがんのより高いリスクをもたらす顕著な染色体不安定性を示す。ブルーム症候群の特色には、例えば、異常な小柄、薄い脂肪組織、高音の声、長く狭い顔、目立つ鼻、目立つ耳、日光過敏、日光への曝露の際の皮膚発疹、色素沈着低下、色素沈着過剰、女性では妊孕能の低減、男性では不妊、糖尿病のリスクの増加、および慢性閉塞性肺疾患、軽度の免疫系異常、ならびに短い平均余命が含まれる。

被験体は、例えば、高齢者、成人、青年、青年前、小児、幼児、乳児および非ヒト動物であり得る。一部の実施形態では、被験体は患者である。

医薬組成物。
本明細書に開示される医薬組成物は、例えば、別の医薬品剤による被験体の処置の前、その間またはその後に使用され得る。

本明細書に開示される医薬組成物は、本明細書に開示される任意の医薬品化合物と他の化学的構成要素、例えば、担体、安定剤、希釈剤、分散剤、懸濁剤、増粘剤および／または賦形剤との組合せであり得る。医薬組成物は、生物への化合物の投与を容易にする。医薬組成物は、例えば、静脈内、皮下、筋肉内、経口、非経口、眼、皮下、経皮、経鼻、腟および外用投与が含まれる、種々の形態および経路によって、医薬組成物として治療有効量で投与され得る。

医薬組成物は、局所的様式で、例えば、臓器中への化合物の直接的注射を介して、必要に応じてデポーまたは徐放性製剤またはインプラントで、投与され得る。医薬組成物は、急速放出製剤の形態で、持続放出製剤の形態で、または中間放出製剤の形態で、提供され得る。急速放出形態は、即時放出を提供できる。持続放出製剤は、制御放出または徐放遅延放出を提供できる。

経口投与のために、医薬組成物は、活性化合物を薬学的に許容される担体または賦形剤と組み合わせることによって製剤化され得る。かかる担体は、被験体による経口摂取のための液体、ゲル、シロップ、エリキシル、スラリーまたは懸濁物を製剤化するために使用され得る。経口溶解可能な製剤において使用される溶媒の非限定的な例には、水、エタノール、イソプロパノール、食塩水、生理食塩水、ＤＭＳＯ、ジメチルホルムアミド、リン酸カリウム緩衝液、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、リン酸ナトリウム緩衝液、４－２－ヒドロキシエチル－１－ピペラジンエタンスルホン酸緩衝液（ＨＥＰＥＳ）、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸緩衝液（ＭＯＰＳ）、ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸）緩衝液（ＰＩＰＥＳ）および食塩水クエン酸ナトリウム緩衝液（ＳＳＣ）が含まれ得る。経口溶解可能な製剤において使用される共溶媒の非限定的な例には、スクロース、尿素、クレモフォール（cremaphor）、ＤＭＳＯおよびリン酸カリウム緩衝液が含まれ得る。

医薬調製物は、静脈内投与のために製剤化され得る。医薬組成物は、油性または水性ビヒクル中の無菌懸濁物、溶液または乳濁物として非経口注射に適切な形態であり得、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤などの調合剤（formulatoryagent）を含み得る。非経口投与のための医薬製剤には、水溶性形態での活性化合物の水溶液が含まれる。活性化合物の懸濁物は、油性注射懸濁物として調製され得る。適切な親油性溶媒またはビヒクルには、脂肪油、例えば、ゴマ油、または合成脂肪酸エステル、例えば、オレイン酸エチルもしくはトリグリセリド、またはリポソームが含まれる。懸濁物は、高度に濃縮された溶液の調製を可能にするために、適切な安定剤または化合物の溶解度を増加させる薬剤もまた含み得る。あるいは、活性成分は、使用前に、適切なビヒクル、例えば、無菌の発熱物質を含まない水による構成のための粉末形態であり得る。

活性化合物は、外用投与され得、種々の外用投与可能な組成物、例えば、溶液、懸濁物、ローション、ゲル、ペースト、薬用スティック、バーム、クリームおよび軟膏へと製剤化され得る。かかる医薬組成物は、可溶化剤、安定剤、張度増強剤（tonicityenhancing agent）、緩衝液および防腐剤を含み得る。

化合物は、従来の坐剤基剤、例えば、カカオバターまたは他のグリセリド、ならびに合成ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドンおよびＰＥＧを含む直腸組成物、例えば、浣腸、直腸ゲル、直腸フォーム、直腸エアロゾル、坐剤、ゼリー坐剤または停留浣腸でも製剤化され得る。坐剤形態の組成物では、低融点ワックス、例えば、必要に応じてカカオバターと組み合わせた、脂肪酸グリセリドの混合物が融解され得る。

本明細書に提供される処置または使用の方法を実施する際に、治療有効量の本明細書に開示される化合物が、処置される疾患または状態を有する被験体に、医薬組成物中で投与される。一部の実施形態では、被験体は、哺乳動物、例えばヒトである。治療有効量は、疾患の重症度、被験体の年齢および相対的健康状態、使用される化合物の効力ならびに他の因子に依存して、広く変動し得る。化合物は、単一で、または混合物の構成要素として１種もしくは複数の治療剤と組み合わせて、使用され得る。

医薬組成物は、薬学的に使用され得る調製物への活性化合物の加工を促進する賦形剤および補助剤を含む１種または複数の生理学的に許容される担体を使用して製剤化され得る。製剤は、選択される投与経路に依存して改変され得る。本明細書に開示される化合物を含む医薬組成物は、例えば、混合、溶解、乳化、カプセル化、捕捉または圧縮プロセスによって製造され得る。

医薬組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と、遊離塩基形態または薬学的に許容される塩形態としての本明細書で記載される化合物とを含み得る。医薬組成物は、可溶化剤、安定剤、張度増強剤、緩衝液および防腐剤を含み得る。

本明細書に開示される化合物を含む組成物の調製のための方法は、化合物を、１種または複数の不活性な薬学的に許容される賦形剤または担体を用いて製剤化して、固体、半固体または液体組成物を形成することを含む。固体組成物には、例えば、粉末、錠剤、分散性顆粒、カプセルおよびカシェが含まれる。液体組成物には、例えば、化合物が溶解された溶液、化合物を含む乳濁物、または本明細書に開示される化合物を含むリポソーム、ミセルもしくはナノ粒子を含む溶液が含まれる。半固体組成物には、例えば、ゲル、懸濁物およびクリームが含まれる。組成物は、液体溶液もしくは懸濁物、使用前に液体中で溶液もしくは懸濁物にするのに適切な固体形態で、または乳濁物としてであり得る。これらの組成物は、微量の非毒性補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、および他の薬学的に許容される添加物もまた含み得る。

本発明における使用に適切な投薬形態の非限定的な例には、液体、粉末、ゲル、ナノ懸濁物、ナノ粒子、ミクロゲル、水性または油性懸濁物、乳濁物、およびそれらの任意の組合せが含まれる。

本発明における使用に適切な薬学的に許容される賦形剤の非限定的な例には、結合剤、崩壊剤、粘着防止剤、帯電防止剤、界面活性剤、抗酸化剤、コーティング剤、着色剤、可塑剤、防腐剤、懸濁剤、乳化剤、抗菌剤、球形化剤、およびそれらの任意の組合せが含まれる。

組成物は、例えば、即時放出形態または制御放出製剤であり得る。即時放出製剤は、化合物が迅速に作用するのを可能にするように製剤化され得る。即時放出製剤の非限定的な例には、容易に溶解可能な製剤が含まれる。制御放出製剤は、活性薬剤の放出速度および放出プロファイルが生理的および時間治療学的要件に一致し得るように適応された、またはあるいは、プログラムされた速度での活性薬剤の放出をもたらすように製剤化された、医薬製剤であり得る。制御放出製剤の非限定的な例には、顆粒、遅延放出顆粒、ヒドロゲル（例えば、合成または天然起源のもの）、他のゲル化剤（例えば、ゲル形成性食物繊維）、マトリックスベースの製剤（例えば、至る所に分散された少なくとも１種の活性成分を有するポリマー材料を含む製剤）、マトリックス内の顆粒、ポリマー混合物および顆粒状塊が含まれる。

一部では、制御放出製剤は、遅延放出形態である。遅延放出形態は、延長された期間、化合物の作用を遅延させるように製剤化され得る。遅延放出形態は、有効用量の１種または複数の化合物の放出を、例えば、約４、約８、約１２、約１６または約２４時間遅延させるように製剤化され得る。

制御放出製剤は、徐放性形態であり得る。徐放性形態は、例えば、延長された期間にわたって化合物の作用を持続させるように製剤化され得る。徐放性形態は、約４、約８、約１２、約１６または約２４時間にわたって、有効用量の本明細書に開示される任意の化合物を提供する（例えば、生理学的に有効な血中プロファイルを提供する）ように製剤化され得る。

薬学的に許容される賦形剤の非限定的な例は、例えば、その各々の全体が参照によって組み込まれる、Remington: The Science andPractice of Pharmacy、第１９版（Easton、Pa.: Mack Publishing Company、１９９５年）；Hoover,John E.、Remington's PharmaceuticalSciences、Mack Publishing Co.、Easton、Pennsylvania１９７５年；Liberman, H.A.およびLachman, L.編、Pharmaceutical Dosage Forms、Marcel Decker、NewYork、N.Y.、１９８０年；ならびにPharmaceutical Dosage Formsand Drug Delivery Systems、第７版（LippincottWilliams &Wilkins １９９９年）中に見出すことができる。

複数の治療剤が、任意の順序でまたは同時に投与され得る。一部の実施形態では、本発明の化合物は、抗生物質と組み合わせて、抗生物質の前に、またはその後に、投与される。同時の場合、複数の治療剤は、単一の統合された形態で、または例えば、複数の別々の丸剤として複数の形態で、提供され得る。これらの薬剤は、単一の包装または複数の包装中に、一緒にまたは別々に包装され得る。治療剤のうち１つまたは全ては、複数の用量で与えられ得る。同時でない場合、複数の用量間のタイミングは、約１ヶ月程度まで変動し得る。

本明細書に開示される治療剤は、疾患または状態の出現の前、その間またはその後に投与され得、治療剤を含む組成物を投与するタイミングは、変動し得る。例えば、組成物は、予防薬として使用され得、疾患または状態の出現の可能性を低下させるために、状態または疾患の傾向を有する被験体に、持続的に投与され得る。組成物は、症状の発生の間に、または症状の発生後可能な限り直ぐに、被験体に投与され得る。治療剤の投与は、症状の発生の最初の４８時間以内、症状の発生の最初の２４時間以内、症状の発生の最初の６時間以内、または症状の発生の３時間以内に開始され得る。初回投与は、例えば、本明細書で記載される任意の製剤を使用して、本明細書で記載される任意の経路によって、実際的な任意の経路を介してであり得る。治療剤は、疾患または状態の発生が検出または疑われた後、実施可能になったらできるだけ直ぐに、疾患の処置に必要な長さの時間、例えば、約１ヶ月間～約３ヶ月間などにわたって投与され得る。処置の長さは、各被験体について変動し得る。

本明細書に開示される医薬組成物は、正確な投薬量の単一の投与に適切な単位投薬形態であり得る。単位投薬形態では、製剤は、適切な量の１種または複数の化合物を含む単位用量へと分割される。この単位投薬量は、分離された量の製剤を含む包装の形態であり得る。非限定的な例は、包装された注射剤、バイアルまたはアンプルである。水性懸濁組成物は、単一用量の再閉鎖不能な容器中に包装され得る。複数用量の再閉鎖可能な容器が、例えば、防腐剤と組み合わせてまたは組み合わせずに、使用され得る。注射のための製剤は、単位投薬形態で、例えば、アンプル中に、または防腐剤と共に多用量容器中に提示され得る。

本明細書に提供される医薬組成物は、他の治療、例えば、化学療法、放射線、手術、抗炎症剤および選択されたビタミンと併せて投与され得る。他の薬剤は、医薬組成物の前、その後、またはそれと併用して、投与され得る。

意図した投与様式に依存して、医薬組成物は、固体、半固体または液体投薬形態、例えば、錠剤、坐剤、丸剤、カプセル、粉末、液体、懸濁物、ローション、クリームまたはゲルなどの形態で、例えば、正確な投薬量の単一の投与に適切な単位投薬形態であり得る。

固体組成物について、非毒性固体担体には、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロースおよび炭酸マグネシウムが含まれる。

本開示の組成物との組合せのために適切な薬学的に活性な薬剤の非限定的な例には、抗感染症薬、すなわち、アミノグリコシド、抗ウイルス剤、抗菌薬、抗コリン薬／抗けいれん薬（antispasmotics）、抗糖尿病剤、降圧剤、抗悪性腫瘍薬、心血管系薬剤、中枢神経系薬剤、凝固改変剤、ホルモン、免疫学的薬剤、免疫抑制剤および眼調製物が含まれる。

化合物は、リポソームテクノロジーを介して送達され得る。薬物担体としてのリポソームの使用は、化合物の治療指数を増加させ得る。リポソームは、天然のリン脂質から構成され、界面活性特性を有する混合脂質鎖（例えば、卵ホスファチジルエタノールアミン）を含み得る。リポソーム設計は、不健康な組織に付着するために表面リガンドを使用し得る。リポソームの非限定的な例には、多重層小胞（ＭＬＶ）、小型単層小胞（ＳＵＶ）および大型単層小胞（ＬＵＶ）が含まれる。リポソームの物理化学的特性は、生物学的障壁を介した透過および投与の部位における保持を最適化するため、ならびに成熟前分解および非標的組織に対する毒性を発達させる可能性を低減させるために、モジュレートされ得る。最適なリポソーム特性は、投与経路に依存する：大きいサイズのリポソームは、局所的注射の際に良好な保持を示し、小さいサイズのリポソームは、受動的標的化を達成するのにより適している。ＰＥＧ化は、肝臓および脾臓によるリポソームの取り込みを低減させ、循環時間を増加させて、透過性および保持増強（enhancedpermeability and retention）（ＥＰＲ）効果に起因して、炎症部位における局在化の増加を生じる。さらに、リポソーム表面は、カプセル化された薬物の、特異的標的細胞への選択的送達を達成するために改変され得る。標的化リガンドの非限定的な例には、疾患と関連する細胞の表面上に濃縮した受容体に対して特異的な、モノクローナル抗体、ビタミン、ペプチドおよび多糖が含まれる。

本開示での使用に適切な投薬形態の非限定的な例には、液体、エリキシル、ナノ懸濁物、水性または油性懸濁物、ドロップ、シロップ、およびそれらの任意の組合せが含まれる。本開示での使用に適切な薬学的に許容される賦形剤の非限定的な例には、造粒剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、甘味剤、流動促進剤、粘着防止剤、帯電防止剤、界面活性剤、抗酸化剤、ガム、コーティング剤、着色剤、香味剤、コーティング剤、可塑剤、防腐剤、懸濁剤、乳化剤、植物セルロース材料および球形化剤、ならびにそれらの任意の組合せが含まれる。

本発明の組成物は、キットとして包装され得る。一部の実施形態では、キットは、組成物の投与／使用に関する書面による指示を含む。書面による資料は、例えば、ラベルであり得る。書面による資料は、投与の条件方法を示唆し得る。指示は、被験体および監督医師に、治療の投与からの最適な臨床転帰を達成するための最良の指導を提供する。書面による資料は、ラベルであり得る。一部の実施形態では、このラベルは、規制機関、例えば、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）、欧州医薬品庁（ＥＭＡ）または他の規制機関によって承認され得る。

投薬。
本明細書で記載される医薬組成物は、正確な投薬量の単一の投与に適切な単位投薬形態であり得る。単位投薬形態では、製剤は、適切な量の１種または複数の化合物を含む単位用量へと分割される。この単位投薬量は、分離された量の製剤を含む包装の形態であり得る。非限定的な例は、バイアルまたはアンプル中の液体である。水性懸濁組成物は、単一用量の再閉鎖不能な容器中に包装され得る。複数用量の再閉鎖可能な容器が、例えば、防腐剤と組み合わせて使用され得る。非経口注射のための製剤は、単位投薬形態で、例えば、アンプル中に、または防腐剤と共に多用量容器中に提示され得る。

本明細書で開示される化合物は、組成物中に、約１ｍｇ～約２０００ｍｇ；約１００ｍｇ～約２０００ｍｇ；約１０ｍｇ～約２０００ｍｇ；約５ｍｇ～約１０００ｍｇ、約１０ｍｇ～約５００ｍｇ、約５０ｍｇ～約２５０ｍｇ、約１００ｍｇ～約２００ｍｇ、約１ｍｇ～約５０ｍｇ、約５０ｍｇ～約１００ｍｇ、約１００ｍｇ～約１５０ｍｇ、約１５０ｍｇ～約２００ｍｇ、約２００ｍｇ～約２５０ｍｇ、約２５０ｍｇ～約３００ｍｇ、約３００ｍｇ～約３５０ｍｇ、約３５０ｍｇ～約４００ｍｇ、約４００ｍｇ～約４５０ｍｇ、約４５０ｍｇ～約５００ｍｇ、約５００ｍｇ～約５５０ｍｇ、約５５０ｍｇ～約６００ｍｇ、約６００ｍｇ～約６５０ｍｇ、約６５０ｍｇ～約７００ｍｇ、約７００ｍｇ～約７５０ｍｇ、約７５０ｍｇ～約８００ｍｇ、約８００ｍｇ～約８５０ｍｇ、約８５０ｍｇ～約９００ｍｇ、約９００ｍｇ～約９５０ｍｇ、または約９５０ｍｇ～約１０００ｍｇの範囲で存在し得る。

本明細書で開示される化合物は、組成物中に、約１μｇ、約１０μｇ、約１００μｇ、約１ｍｇ、約２ｍｇ、約３ｍｇ、約４ｍｇ、約５ｍｇ、約１０ｍｇ、約１５ｍｇ、約２０ｍｇ、約２５ｍｇ、約３０ｍｇ、約３５ｍｇ、約４０ｍｇ、約４５ｍｇ、約５０ｍｇ、約５５ｍｇ、約６０ｍｇ、約６５ｍｇ、約７０ｍｇ、約７５ｍｇ、約８０ｍｇ、約８５ｍｇ、約９０ｍｇ、約９５ｍｇ、約１００ｍｇ、約１２５ｍｇ、約１５０ｍｇ、約１７５ｍｇ、約２００ｍｇ、約２５０ｍｇ、約３００ｍｇ、約３５０ｍｇ、約４００ｍｇ、約４５０ｍｇ、約５００ｍｇ、約５５０ｍｇ、約６００ｍｇ、約６５０ｍｇ、約７００ｍｇ、約７５０ｍｇ、約８００ｍｇ、約８５０ｍｇ、約９００ｍｇ、約９５０ｍｇ、約１０００ｍｇ、約１０５０ｍｇ、約１１００ｍｇ、約１１５０ｍｇ、約１２００ｍｇ、約１２５０ｍｇ、約１３００ｍｇ、約１３５０ｍｇ、約１４００ｍｇ、約１４５０ｍｇ、約１５００ｍｇ、約１５５０ｍｇ、約１６００ｍｇ、約１６５０ｍｇ、約１７００ｍｇ、約１７５０ｍｇ、約１８００ｍｇ、約１８５０ｍｇ、約１９００ｍｇ、約１９５０ｍｇ、または約２０００ｍｇの量で存在し得る。

治療有効量の化合物は、例えば、約０．１ｎＭ、約０．２ｎＭ、約０．３ｎＭ、約０．４ｎＭ、約０．５ｎＭ、約０．６ｎＭ、約０．７ｎＭ、約０．８ｎＭ、約０．９ｎＭ、約１ｎＭ、約１．５ｎＭ、約２ｎＭ、約２．５ｎＭ、約３ｎＭ、約３．５ｎＭ、約４ｎＭ、約４．５ｎＭ、約５ｎＭ、約５．５ｎＭ、約６ｎＭ、約６．５ｎＭ、約７ｎＭ、約７．５ｎＭ、約８ｎＭ、約８．５ｎＭ、約９ｎＭ、約９．５ｎＭ、約１０ｎＭ、約１５ｎＭ、約２０ｎＭ、約２５ｎＭ、約３０ｎＭ、約３５ｎＭ、約４０ｎＭ、約４５ｎＭ、約５０ｎＭ、約６０ｎＭ、約７０ｎＭ、約８０ｎＭ、約９０ｎＭ、約１００ｎＭ、約１１０ｎＭ、約１２０ｎＭ、約１３０ｎＭ、約１４０ｎＭ、約１５０ｎＭ、約２００ｎＭ、約２５０ｎＭ、約３００ｎＭ、約３５０ｎＭ、約４００ｎＭ、約４５０ｎＭ、約５００ｎｍ、約６００ｎＭ、約７００ｎＭ、約８００ｎＭ、約９００ｎＭ、約１μＭ、約１．５μＭ、約２μＭ、約２．５μＭ、約３μＭ、約３．５μＭ、約４μＭ、約４．５μＭ、約５μＭ、約６μＭ、約７μＭ、約８μＭ、約９μＭ、約１０μＭ、約１５μＭ、約２０μＭ、約２５μＭ、約３０μＭ、約３５μＭ、約４０μＭ、約４５μＭ、約５０μＭ、約６０μＭ、約７０μＭ、約８０μＭ、約９０μＭ、約１００μＭ、約１５０μＭ、約２００μＭ、約３００μＭ、約４００μＭ、約５００μＭ、約６００μＭ、約７００μＭ、約８００μＭ、約９００μＭ、または約１ｍＭであり得る。

一部の実施形態では、用量は、薬物の量を被験体の体重で除算したものを単位として、例えば、被験体の体重１キログラム当たりの薬物のミリグラム数で表され得る。一部の実施形態では、化合物は、約５ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ、２５０ｍｇ／ｋｇ～約２０００ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ～約８００ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ～約４００ｍｇ／ｋｇ、約１００ｍｇ／ｋｇ～約３００ｍｇ／ｋｇまたは約１５０ｍｇ／ｋｇ～約２００ｍｇ／ｋｇの範囲の量で投与される。

（実施例１）
タンパク質間相互作用妨害物質を同定するための方法。
短いペプチドの安定化を行うために、ターミネーター配列および非翻訳領域（ＵＴＲ）または短いタンパク質（ｓＯＲＦ１など）を使用した。タンパク質分解を模倣する残基（Ｍｅｔ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、またはＰｒｏなど）でペプチド配列を開始させるために、タンパク質安定性のＮ末端則を使用した。

ＰＰＩ組込みプラスミド（プラスミド１、図７）は、目的のＰＰＩを構成していた２つのタンパク質の組込みを可能にするための２つの制限部位を含有していた。このプラスミドは、強力なプロモーターおよびターミネーター（ＡＤＨ１など）によって、または誘導性プロモーター（ＧＡＬ１など）によって駆動される、各タンパク質へのＡＤ（Ｄｏｆ１など、図８（下部））およびＤＢＤ（ＴｅｔＲなど、図８（上部））の融合体をコードしていた。各タンパク質融合体配列を、ＦＬＡＧまたはＨＡでタグ付けした。このプラスミドはさらに、細菌由来の選択マーカーおよび増殖マーカー（すなわち、ｏｒｉおよびＡｍｐＲ）、ならびに酵母由来の複製マーカーおよび選択マーカー（すなわち、ＴＲＰ１およびＣＥＮまたは２ｕｍ）を含んでいた。このプラスミドはた、特定の遺伝子座でゲノム内に組み込むための部位を有していた。

選択およびライブラリープラスミド（図９）は、強力なプロモーター（ＡＤＨ１プロモーターなど）または誘導性プロモーター（ＧＡＬ１プロモーターなど）によって駆動される、ランダム化ペプチドライブラリー（すなわち、ランダム化ＮＮＫ６０－ｍｅｒ配列）の組込みのための制限部位を含んでいた。選択およびライブラリープラスミドの開始配列は、ペプチドの半減期を最大にするためのメチオニン・バリン・アスパラギン（ＭＶＮ）の固定された配列であり、短いタンパク質（ｓＯＲＦ１）のＵＴＲで終結していた（図１０、配列番号６２）。このペプチドはまた、Ｍｙｃタグをタグ付けされていた。

選択およびライブラリープラスミドはさらに、ＰＰＩ組込みプラスミド内に存在するＤＢＤに依存する、プロモーターによって駆動される「細胞死因子」（例えば、細胞毒性レポーター）として概説される作用因子の１つまたは複数をコードしていた（図７）。選択およびライブラリープラスミド内のＴｅｔＯ配列は、ＰＰＩ組込みプラスミド内のＴｅｔＲが結合した状態になり得る。ランダムライブラリーを、ＧＡＬ１プロモーターとｓＯＲＦ－１ターミネーターとの間の中央にあるＰａｃＩ部位で挿入した。

「細胞死因子」を確実に抑止するために、選択およびライブラリープラスミドは、強力なプロモーター（ＡＤＨ１）によって駆動されてＤＢＤを結合し、ドキシサイクリンの存在下で転写を抑制する、抑制構築物ＴｅｔＲ’－Ｔｕｐ１１融合体を含んでいた。

選択およびライブラリープラスミドはさらに、細菌由来の選択マーカーおよび増殖マーカー（ｏｒｉおよびＡｍｐＲ）、ならびに酵母由来の複製マーカーおよび選択マーカー（ＬＥＵ２およびＣＥＮまたは２ｕｍ）を含んでいた（図９）。

確認プラスミド（図１１）を使用して、レポーターの発現および株の成功裏の構築を確認した。このプラスミドは、ＡＤとＤＢＤとの間の直接融合体を含んでいる。確認プラスミドは、細菌由来の選択マーカーおよび増殖マーカー（すなわち、ｏｒｉおよびＡｍｐＲ）、ならびに酵母由来の複製マーカーおよび選択マーカー（すなわち、ＴＲＰ１およびＣＥＮまたは２ｕｍ）を含んでいた。確認プラスミドを使用して、バックグラウンド株内への適正なプロモーター組込み、例えば、ＡＤＥ２遺伝子の前へのＴｅｔＯ７プロモーターの組込みを確認した。確認プラスミドでの形質転換によって、プロモーターが適正に組み込まれている場合にのみＡＤＥ２の活性化が可能になる。

実験に使用した酵母バックグラウンド株は、交配型または二倍体のいずれかのＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅであり、ＴｅｔＯなどの、ＰＰＩ組込みプラスミドにおいて使用されるＤＢＤの認識配列によって駆動される遺伝子レポーター（ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、および／またはＵＲＡ３など）（図７）の遺伝子組込みを含んでいた。

バックグラウンド株はまた、ペプチドの環化およびメチル化に必要な酵素を発現した（例えば、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓ由来のランチペプチド成熟化酵素（ＬａｎＢ、ＬａｎＣ、ＬａｎＭ、ＬａｎＰ）、シアノバクテリア由来のパテラミド生合成因子（ＰａｔＤ、ＰａｔＧ）、Ｃｌｉｔｏｒｉａｔｅｒｎａｔｅａ由来のブテラーゼ１、およびＧａｌｅｒｉｎａｍａｒｇｉｎａｔａ由来のＧｍＰＯＰＢ）。

スクリーニングを、２つの方法を使用して行った。第１の方法では、親株を選択培地上で増殖させて、ＰＰＩ組込みプラスミドの存在、および忠実なタンパク質間相互作用の発生を確実にし、これを、確認プラスミドの使用を介して確認した。株を、Ｔｒｐを欠く培地上で培養して、所望の相互作用が生じたコロニーの選択を確実にした。株を次いで、選択およびライブラリープラスミドで形質転換し、即座に選択培地上に播種して、全ての構成要素が存在すること（すなわち、ＴｒｐおよびＬｅｕを欠く培地上）、およびいずれかの誘導性構成要素の発現の誘導（すなわち、Ｇａｌを伴う）が確実となるようにした。

第２の方法では、株をバッチ内で交配して、全てのマーカー、ＰＰＩ、「細胞死因子」、およびペプチドを有する二倍体株を得た。このバッチ培養物を次いで、固体培地上で増殖させ、これによって、全ての系構成要素の選択（すなわち、ＬｅｕおよびＴｒｐを欠く培地）、およびいずれかの誘導性構成要素の発現の誘導（すなわち、Ｇａｌを伴う）が可能になった。

上記のいずれかの選択肢から得られた生存コロニーは、ペプチドによって妨害されているＰＰＩであって、コードされた「細胞死因子」によって引き起こされるデスカスケードをもはや引き起こさないＰＰＩを有するコロニーを構成した。

ＰＰＩを妨害し得たペプチド配列を、各生存コロニーにおける選択およびライブラリープラスミドのペプチドコード領域のＤＮＡ配列決定を行うことによって得た。

特異性を確認するために、誘導性マーカーを使用して、ＰＰＩまたはペプチドの産生を不活化し、特異性を確認する。例えば、全ての構成要素が発現している、ガラクトースを有する培地上のみで細胞生存が観察され、ペプチドの発現が失われている場合、ガラクトースを有さない培地上では生存は観察されない。プラスミドを次いで単離し、新鮮な親株内に再形質転換して、特異性を確認した。

ＰＰＩ、ペプチド、および「細胞死因子」を含有していた生存可能株の生化学的分画と、その後のプルダウン実験とによって、コードされたタグを使用して、ペプチド配列といずれかのＰＰＩパートナーとの間の相互作用を確認した。

（実施例２）
本明細書において開示される化合物でのＳＳＰ－２５細胞（胆管癌）の処置。
本明細書において開示される化合物の成長阻害特性を評価するために、５μＭまたは１０μＭの化合物１、３、および５を、４８時間の細胞成長の後にＭＴＴアッセイを使用して、ＳＳＰ－２５細胞の成長阻害について、水モック処置と比較して試験した。図１は、化合物１および３がＳＳＰ－２５の成長に対して用量依存性の効果を有していた一方で、化合物５が濃度に関係なく強力な阻害効果を有していたことを示す。

図１３は、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（商標）機器によって測定される、ＳＳＰ－２５細胞における急な細胞死動態を示す、化合物５での処置の結果を示す。まず、５，０００のＳＳＰ－２５細胞を播種し、付着性および成長を２０時間、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（商標）機器を使用する、プレートを介する電流インピーダンスのライブ測定を使用して測定した。２０時間のマークのところで、３０μＭの化合物５またはＰＢＳ対照をＳＳＰ－２５細胞に添加し、これを、１０％ＦＢＳを添加した１００μＭのＲＰＭＩ培地内で培養した。急な死亡動態がリアルタイムで観察され、細胞の成長は続けられた。７２時間目に、３０μＭを超える化合物５を、前処置したウェルおよびＰＢＳのみで事前に処置したウェルの両方に添加した。図１３は、最初の処置後に得られた細胞成長は耐性に起因するものではなく、化合物の不十分な投与量に起因するものであったことを示す。さらに、単回投与された細胞は回復し続け、このことは、培地または溶解細胞内での化合物の通常の細胞毒性が低減したことを示した。この結果は、ある特定の閾値を超える用量での急性処置が、カルシウム濃度の増加に起因する迅速な殺傷メカニズムを活性化するために必要であり得るという考えをサポートするものであった。さらに、７２時間後にＰＢＳ中で成長させた、事前に処置されていない細胞の化合物５での処置は、酸性化した培地における化合物５の有効性を実証した。

（実施例３）
本明細書において開示される化合物でのＰＣ３細胞（ｍＣＲＰＣ細胞）の処置。
図１４は、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（商標）機器によって測定される、ｍＣＲＰＣ細胞における急な細胞死動態を示す、化合物５での処置の結果を示す。まず、５，０００のＰＣ３細胞を播種し、付着性および成長を２４時間、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（商標）機器を使用する、プレートを介する電流インピーダンスのライブ測定を使用して測定した。２４時間のマークのところで、６０μＭの化合物５、６０μＭの化合物６、またはＰＢＳ対照を、１０％ＦＢＳを添加した１００μＭのＤＭＥＭ内で成長させたＰＣ３細胞に添加した。急な死亡動態がリアルタイムで観察され、細胞の成長は続けられた。８４時間目に、１００μＭを超える化合物５を、前処置した細胞に添加した。これを、１２４時間のマークのところで再び反復した。このレジメンは、化合物６およびＰＢＳ対照と対照的に、ＰＣ３細胞の７５％超を成功裏に排除した。

図１４は、化合物５がＰＣ３細胞に対して非常に強力であったが、化合物６はそうではなかったことを示した。さらに、投与量が多い方が、ＰＣ３細胞の迅速な殺傷においてより効果的であったが、それはＳＳＰ－２５細胞の殺傷に必要な濃度よりも高い濃度であり、このことは、化合物の取り込みの動態の改変、または閾値の改変が、細胞内カルシウム濃度の増加に起因する急性の細胞死を引き起こすために必要であることを示す。

（実施例４）
細胞の選択的な殺傷。
ＢＲＣＡ２経路に突然変異を有するがんの標的化における、本明細書において開示される化合物の特異性を評価するために、化合物１および５を、ＨｅＬａ（ヒト子宮頸がん）細胞およびＳＳＰ－２５細胞（胆管癌細胞株）に対して試験した（図２）。化合物１および５による細胞の殺傷を測定するために、分光光度的に測定することが可能であり、細胞生存能の指標である、細胞株（ＣｙｔｏＴｏｘＲｅｄ（商標））を使用した。まず、５，０００の細胞を、９６ウェル培養プレート内で一晩インキュベートした。培地（１０％ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ）を除去し、１２５ｎＭのＣｙｔｏＴｏｘＲｅｄ（商標）を含有する無血清培地（ＲＰＭＩ）で置き換えた。ＦＩＴＣ標識した化合物５および１をそれぞれ５μＭおよび１０μＭの濃度まで添加し、画像化を、１５分の時点を使用して、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（商標）機器を使用して開始した。２×血清含有培地を、１時間のインキュベーションの後に添加し、細胞を２時間ごとに画像化した。ＣｙｔｏＴｏｘＲｅｄ（商標）を検出するために、以下のパラメータを使用した：励起波長：５８５ｎｍ、通過帯域：［５６５，６０５］ｎｍ、および発光波長：６３５ｎｍ、通過帯域：［６２５，７０５］ｎｍ。ＦＩＴＣ標識を使用して化合物５および１を検出するために、以下のパラメータを使用した：励起波長：４６０ｎｍ、通過帯域：［４４０，４８０］ｎｍ、および発光波長：５２４ｎｍ、通過帯域：［５０４，５４４］ｎｍを使用した。

図２は、染色された細胞の画像を示し、これは、処置前に、ＨｅＬａ（２０１）細胞集団およびＳＳＰ－２５（２０３）細胞集団の両方でわずかな染色を示す。化合物１または５で処置した後、ＨｅＬａ細胞（２０２）ではわずかな細胞死があり、一方、これらの化合物は、細胞（２０４）の明るい灰色への染色によって示されるように、ＰＢＳ（２０４）でのプラセボ処置と比較して、ＳＳＰ－２５細胞において最大の有効性を示した。ＨｅＬａ細胞およびＳＳＰ－２５細胞の両方は、細胞の明るい灰色への染色によって示されるように、化合物の効率的な取り込みを示した。

上記と同一の生存能アッセイを、１０μＭの化合物１を使用して反復した。図３は実験の結果を示し、化合物１がＰＢＳのプラセボ処置と比較してＳＳＰ－２５細胞に特異的であったことを示す。

図３は、染色された細胞の画像を示し、これは、処置前に、ＨｅＬａ（３０１）細胞集団およびＳＳＰ－２５（３０２）細胞集団の両方でわずかな染色を示す。化合物１で処置した後、ＨｅＬａ細胞（３０３）ではわずかな細胞死があり、一方、肝臓がん細胞は、暗い灰色への染色によって示されるように（３０４）、最大の染色（３０４）を示す。

（実施例５）
ＲＡＤ５１に対する化合物の特異性。
ＳＳＰ－２５細胞と、５μＭまたは１０μＭの化合物１とを使用して、成長アッセイを行った。図４は、化合物での処置によって、ＰＢＳでの処置と比較して、試験期間全体にわたり細胞のコンフルエンスのパーセントが低下したことを示す。実施例３で記載した実験プロトコルを成長アッセイに使用した。

同一の成長アッセイを、１０μＭの化合物１および化合物２を使用して反復した。化合物２は、核コンセンサス配列内に、ＲＡＤ５１への化合物２の結合を遮る単一の置換を含む。したがって、図５において示されるように、化合物２は、化合物１と同程度までＳＳＰ－２５細胞の成長を低下させることはできず、このことは、ＲＡＤ５１に対する化合物１の特異性を示す。

（実施例６）
ブルーム細胞における、ストレスへの増加した感受性の相殺
本明細書において開示される化合物の、ブルーム症候群患者の細胞であるＧＭ０８５０５の薬剤感受性を抑える能力を評価するために、Ｂｌｍ細胞を、ＰＢＳ、５μＭのエトポシド、または５μＭのエトポシドおよび１０μＭの化合物５で処置した。図６は、Ｂｌｍ細胞の成長が、５ｕＭのエトポシドでの処置に影響されたことを示す。しかし、ＰＢＳ、またはエトポシドおよび化合物５の組合せでの処置は同程度であり、このことは、試験期間中の細胞のコンフルエンスのパーセントによって測定される、エトポシドによって誘導される細胞成長欠損の、化合物５を使用することによる抑制を示している。

（実施例７）
細胞活性のための一般のペプチド調製および最適化

合成ペプチド化合物（化合物１、３、４、５、７、９、１０、１１、１３、１４、１９、および２５、表５および図１７を参照されたい）を、実施例１の方法によって同定されたコンセンサスＲＡＤ５１結合配列に従って、様々な修飾、アミノ酸立体異性体、非天然のアミノ酸、および細胞透過性ペプチドで調製した。ペプチドを、標準的な固相ペプチド合成プロトコルに従って合成した。ペプチドが合成した通りのものであること、およびその純度を、ＲＰ－ＨＰＬＣ、ＭＳ／ＭＳ、および含有ペプチド分析によって確認および決定した。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を無毒の塩形態（例えば、酢酸塩またはＨＣｌ）に交換し、ペプチドの純度は、実験で使用する前に少なくとも９５％であった。

細胞活性を最適化するために、化合物を、様々な細胞株に対するｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ細胞死アッセイにおいて試験した。Ａ５４９細胞および化合物１０を使用する、使用したワークフローの例を、図１５および１６に示す。図１５は、典型的なｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ処置実験を示し、垂直な線は化合物投与の時点を示し、細胞指数（Ｙ軸）は細胞生存能を表す。図１５の異なる化合物濃度でのｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ軌跡のデータを次いで使用して用量応答曲線を作成し、これを次いで、Ｓ字状用量応答モデルを使用して非線形回帰分析して、各化合物／細胞株の組合せでの細胞死のＩＣ５０値およびＲ２値を得た（図１６）。

化合物１、３、４、５、７、９、１０、１１、１３、１４、１９、および２５をＳＳＰ－２５細胞に対して試験した最適化実験の例を、図１７に示す。化合物の細胞死ＩＣ５０は、１０^－４Ｍから１０^－６Ｍの範囲で変化した。異なる細胞透過性ペプチド配列が組み込まれた類似のペプチドの分析（図１８）は、細胞活性が、選択される細胞透過性ペプチドに大きくは依存しないことを実証した（化合物５、１３、１４、１０、および２５は全て、類似のＩＣ５０値を有するため）。

（実施例８）
Ｙ２Ｈアッセイにおける突然変異分析を使用するＲＡＤ５１結合ペプチドの結合部位のマッピング

ＲＡＤ５１結合ペプチドを、２ハイブリッド対間の相互作用がＡＤＥ２遺伝子およびＨＩＳ遺伝子の発現を駆動した「従来の」Ｙ２Ｈアッセイを使用して、いくつかの異なる種のＲＡＤ５１を結合する能力について試験した。このＹ２Ｈアッセイでは、２ハイブリッド対はＲＡＤ５１および化合物５のペプチド配列（配列番号５）であり、そのため、相互作用を有する細胞は、選択培地（－ＡＤＥ、－ＨＩＳ）上で生存（＋）し、相互作用を有さない細胞は死ぬ（－）。ペプチドは、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、およびＳ．ｐｏｍｂｅのＲＡＤ５１に成功裏に結合したが、これらはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＲＡＤ５１には結合せず、このことは、ペプチドの結合を不可能にするｃｅｒｅｖｉｓｉａｅとヒトとの間の配列の相違を示す。このデータのサブセットを表６にまとめる。

Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＨ．ｓａｐｉｅｎｓのＲＡＤ５１の配列比較に基づいて、ＲＡＤ５１の複数のｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ－ｓａｐｉｅｎｓハイブリッド構築物を構築し、上記の同一のＲＡＤ５１／配列番号５ハイブリッド系におけるＲＡＤ５１結合ペプチドを結合するその能力について試験した。ＲＡＤ５１ペプチドは、ヒトＲＡＤ５１の少なくとも残基１９０～３３９を含有する構築物を成功裏に結合したにすぎず、ヒトＲＡＤ５１の残基２１８～３３９を含んでいた構築物は結合せず、このことは、結合部位が１９０～２１８の領域のどこかにあることを示す。データを表７にまとめる。

様々な突然変異を有するヒトＲＡＤ５１を結合するペプチドの能力を、次いで、Ｙ２Ｈアッセイによって試験した。突然変異は、ＢＲＣＡ２およびＲＡＤ５１－ＡＰ１などのＲＡＤ５１相互作用パートナーの結合に影響することが公知である、文献に記載されている突然変異と、配列番号５を結合する／結合しないＲＡＤ５１種オルソログのより広い配列アラインメント分析によって同定された残基との両方を包含していた（図２３、四角で囲まれた残基「Ｒ」、「Ｄ」、および「Ａ」を参照されたい）。ＢＲＣＡ２の結合に影響する突然変異は、ペプチドの結合に対する効果を有さなかったが、ＲＡＤ５１－ＡＰ１の結合に影響した突然変異は、ペプチドの結合を妨害した。これらの突然変異は残基２０２、２０５、および２０６にあったため、これらは、１９０～２１８領域のどこかでの結合を示す先の融合データと一致し、配列番号５のペプチドが、ＲＡＤ５１の少なくとも残基２０２、２０５、および２０６と接触することを示した。

図２３の配列アラインメントもまた、ヒトＲＡＤ５１の残基１８７が、化合物を結合する／結合しないオルソログ間で相違していることを示していることに留意されたく、このことは、ヒトＲＡＤ５１の残基１８７がさらに、化合物の結合において役割を有することを示唆している。

（実施例９）
ＲＡＤ５１結合ペプチドと、ＲＡＤ５１へのカルシウムの結合との相互作用

ＲＡＤ５１へのカルシウムの結合とペプチドの結合との間の相互作用を試験するために、ＲＡＤ５１に対する活性な（化合物５、１０）ペプチドのＫｄをマイクロスケール熱泳動アッセイによって試験し、化合物５のＫｄをさらに、１ｍＭのカルシウムの存在下で調べた。

マイクロスケール熱泳動を、以前に記載されている通りに行った（例えば、Jerabek-Willemsen, M.、Wienken, C. J.、Braun,D.、Baaske, P.およびDuhr, S. Molecular interaction studies usingmicroscalethermophoresis. Assay Drug Dev. Technol. ９巻、３４２～３５３頁(２０１１年)を参照されたい）。化合物の親和性を、ＮａｎｏｔｅｍｐｅｒＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＭｏｎｏｌｉｔｈＮＴ．１１５を使用して測定した。Ｒａｄ５１を、製造者のプロトコルに従って蛍光標識し、各アッセイに使用した標識されたタンパク質は、約５００ｎＭであった。未標識のペプチドの溶液を、適切な連続濃度勾配に希釈した。試料をシリカキャピラリー（ＰｏｌｙｍｉｃｒｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）内にロードした。測定を、ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．５ｍＭのＡＴＰ、２．５ｕＭのｓｓＤＮＡと、１ｍＭのＣａＣｌ２（言及した場合）を含有する緩衝液中で室温で行った。測定は、１２％ＬＥＤパワーおよび６０％ＭＳＴパワーを使用して行った。アッセイを、各親和性測定で３回反復した。データ分析を、製造者によって提供されるＮａｎｏｔｅｍｐｅｒ分析ソフトウェアおよびＯｒｉｇｉｎＰｒｏ８．０ソフトウェアを使用して行った。

マイクロスケール熱泳動のデータを表９にまとめる。両活性ペプチド（５および１０）は、およそ８ナノモル濃度のＫｄで結合した。しかし、ＲＡＤ５１結合アッセイにおいてｉｎｖｉｔｒｏでのカルシウム（Ｃａ２＋）濃度が０から１ｍＭに増加すると、Ｋｄは３．４倍増加し、このことは、ＲＡＤ５１上のカルシウム結合部位とペプチド結合界面との間にアロステリックなコミュニケーションがあることを示す。

（実施例１０）
がんの無胸腺異種移植片マウスモデルにおける化合物の有効性

メスの無胸腺ｎｕ／ｎｕマウス（６～８週齢）をＳｉｍｏｎｓｅｎｌａｂｓから購入し（ｎ＝１２）、ヴァレーホにあるＭｕｒｉｇｅｎｉｃｓの動物飼育施設で飼育した。マウスを動物飼育施設の設定に５日間馴化させ、標準的な固形飼料、１２：１２時間の暗期／明期サイクルで維持し、ｈｅｐａフィルターを付けたケージ内で群飼した（ケージ当たり３頭のマウス）。馴化した後、各マウスに、マトリゲル溶液と１：１（ｖ／ｖ）で混合した５×１０^６のＡ５４９（ＡＴＣＣ：ＣＣＬ－１８５）細胞を皮下注射した（左下脇腹）。腫瘍が約１００ｍｍ３の容積に達したら、マウスを、所望の処置のために、別個の処置群に分けた。腫瘍内（ＩＴ）投与および腹腔内（ＩＰ）投与の両方を使用する実験を行い、データを図１９で報告する。

実験１：腫瘍内（ＩＴ）投与

上記のように準備したマウスを４群に分けた。

群１は、いずれでも処置しなかった（ｎ＝３）

群２には、５０マイクロリットルのリン酸緩衝生理食塩水（モック）を腫瘍内注射した（ｎ＝３）

群３には、リン酸緩衝生理食塩水中の１０ｍｇ／ｍｌの化合物１０を５０マイクロリットル、腫瘍内注射した（ｎ＝３）

群４には、リン酸緩衝生理食塩水中の２０ｍｇ／ｍｌの化合物１０を５０マイクロリットル、腫瘍内注射した（ｎ＝３）

５０マイクロリットルの注射を（３０ｇ針）で行った。注射を０日目に行い、次いで、３日目に再び行った。腫瘍量の長さ（Ｌ）および幅（Ｗ）をバーニヤキャリパーで測定し、腫瘍容積（Ｖ）をＶ＝（Ｌ×Ｗ^２）／２として計算した。各測定日での各腫瘍量の相対腫瘍容積を、注射開始直前の０日目の同一質量の開始容積に対して正規化した。測定を０日目、３日目、および６日目に行い、データを図１９にまとめ、これは、早くも３日目に腫瘍サイズがかなり減少することを示す。

実験２：腹膜内（ＩＰ）投与

上記のように準備したマウスを２群に分けた。

群１には、１２５マイクロリットルのリン酸緩衝生理食塩水（モック）を腹膜内注射した（ｎ＝２）

群２には、リン酸緩衝生理食塩水中の３ｍｇ／ｍｌの化合物１０を１２５マイクロリットル、腹膜内注射した（ｎ＝３）

注射を３０ｇ針で行った。注射を７日目に行った。腫瘍量の長さ（Ｌ）および幅（Ｗ）をバーニヤキャリパーで測定し、腫瘍容積（Ｖ）をＶ＝（Ｌ×Ｗ^２）／２として計算した。各測定日での各腫瘍量の相対腫瘍容積を、注射開始直前の０日目の同一質量の開始容積に対して正規化した。測定を０～１０日目を通して行い、ＩＰ投与は７日目に行い、データを図１９にまとめ、これは、早くも注射の３日後（１０日目）に腫瘍サイズがかなり減少することを示す。

（実施例１１）
細胞内Ｃａ２＋キレート化は、ＳＳＰ－２５細胞における化合物１０の細胞毒性を抑制する

細胞中のＲＡＤ５１へのペプチドの結合が、細胞内遊離カルシウムレベルの増加を介して細胞死を生じさせるという仮説をさらに調べるために、単独の、ならびに２つの異なる細胞内カルシウムキレート剤（１，２－ビス（２－アミノフェノキシ）エタン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸テトラキス（アセトキシメチルエステル）、別名「ＢＡＰＴＡ－ＡＭ」、およびアンモニア処理ルテニウムオキシクロリド、別名「ルテニウムレッド」と組み合わせた、化合物１０を、実施例３のｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（商標）細胞死アッセイで試験した。細胞内カルシウムキレート剤単独もまた、細胞に対して評価した。両ケースで、カルシウムキレート剤の投与は細胞死を抑え、このことは、本明細書におけるＲＡＤ５１結合化合物が、細胞内遊離Ｃａ２＋イオンの上昇の結果として細胞を殺すこと、および細胞内遊離Ｃａ２＋イオンの上昇の相殺が、ＲＡＤ５１結合化合物に起因する細胞死を予防することを示唆する。

図２３は、１０μＭの化合物１０で処置した細胞への１０μＭのＢＡＰＴＡ－ＡＭの添加が、化合物単独と比較して細胞死を抑えることを実証する（ＢＡＰＴＡ－ＡＭ＋化合物の組合せに相当する曲線はＰＢＳ単独とほぼ等しいが、化合物１０単独に相当する曲線は有意な細胞死を示す、図２３の曲線を参照されたい）。

図２４は、１０μＭの化合物１０で処置した細胞への４０μＭのルテニウムレッドの添加が、化合物単独と比較して細胞死を抑えることを実証する（ルテニウムレッド＋化合物の組合せに相当する曲線はＰＢＳ単独とほぼ等しいが、化合物単独に相当する曲線は有意な細胞死を示す、図２４を参照されたい）。

（実施例１２）
ＳＳＰ－２５細胞に対するオラパリブと化合物１０との相乗効果

ＲＡＤ５１へのペプチドの結合によって欠陥のあるＤＮＡ修復が生じるという仮説をさらに調べるために、単独の、または組み合わせた、ＤＮＡ修復を標的化する他の薬剤、化合物１０、またはポリＡＤＰリボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤であるオラパリブ（ＡＺＤ－２２８１、Ｌｙｎｐａｒｚａ、４－［４－フルオロ－３－［（４－メトキシピペリジン－１－イル）カルボニル］ベンジル］フタラジン－１（２Ｈ）－オン、４－［［４－フルオロ－３－［（４－メトキシ－１－ピペリジニル）カルボニル］フェニル］メチル］－１（２Ｈ）－フタラジノン）との相乗効果を、実施例３のｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（商標）細胞死アッセイにおいて試験した。

図２５は、１０μＭの化合物１０で処置した細胞への１μＭのオラパリブの添加が、化合物単独またはオラパリブ単独よりも細胞死を増強させることを実証する（オラパリブ＋化合物の組合せに相当する曲線が、他の曲線と比較して増強した細胞死を示す、図２５の曲線を参照されたい）。

実施形態
以下の非限定的な実施形態は本発明の実例を提供するが、本発明の範囲を限定するものではない。

実施形態１．状態を処置する方法であって、それを必要とする被験体に、細胞中の真核生物リコンビナーゼに結合する治療有効量のポリペプチドを投与することを含み、真核生物リコンビナーゼへのポリペプチドの結合が、細胞中のタンパク質への真核生物リコンビナーゼの結合を阻害し、タンパク質への真核生物リコンビナーゼの結合の阻害が、ポリペプチドに曝露されていない細胞と比較して細胞内のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）損傷修復を減少させるまたは阻害する、方法。

実施形態２．真核生物リコンビナーゼがＲＡＤ５１である、実施形態１に記載の方法。

実施形態３．ポリペプチドが抗体ではない、実施形態１～２のいずれか１つに記載の方法。

実施形態４．タンパク質がＢＲＣＡ２である、実施形態１～３のいずれか１つに記載の方法。

実施形態５．タンパク質がＲＡＤ５１ＡＰ１である、実施形態１～３のいずれか１つに記載の方法。

実施形態６．タンパク質への真核生物リコンビナーゼの結合の阻害が、ポリペプチドとタンパク質との間の競合的阻害を介して生じる、実施形態１～５のいずれか１つに記載の方法。

実施形態７．タンパク質への真核生物リコンビナーゼの結合の阻害が、タンパク質への真核生物リコンビナーゼの結合のアロステリックな阻害を介して生じる、実施形態１～５のいずれか１つに記載の方法。

実施形態８．細胞中の真核生物リコンビナーゼへのポリペプチドの結合が、細胞の増殖を減少させる、実施形態１～７のいずれか１つに記載の方法。

実施形態９．細胞中の真核生物リコンビナーゼへのポリペプチドの結合が、細胞の死を誘導する、実施形態１～７のいずれか１つに記載の方法。

実施形態１０．細胞死がアポトーシス細胞死である、実施形態９に記載の方法。

実施形態１１．細胞における相同組換えの減少をさらに含む、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の方法。

実施形態１２．細胞におけるＤＮＡ損傷修復の減少または阻害が、細胞を化学療法剤に対して増感させる、実施形態１～１１のいずれか１つに記載の方法。

実施形態１３．ポリペプチドが４から７０のアミノ酸長である、実施形態１～１２のいずれか１つに記載の方法。

実施形態１４．ポリペプチドが１５から３０のアミノ酸長である、実施形態１～１３のいずれか１つに記載の方法。

実施形態１５．ポリペプチドが細胞透過性ペプチドのシグナル配列を含む、実施形態１～１４のいずれか１つに記載の方法。

実施形態１６．ポリペプチドがＲＡＤ５１相互作用モチーフを含み、ＲＡＤ５１相互作用モチーフが配列番号１９である、実施形態１～１５のいずれか１つに記載の方法。

実施形態１７．ポリペプチドがタンパク質形質導入ドメインを含む、実施形態１～１６のいずれか１つに記載の方法。

実施形態１８．ポリペプチドが配列番号１である、実施形態１～１７のいずれか１つに記載の方法。

実施形態１９．ポリペプチドが配列番号３である、実施形態１～１７のいずれか１つに記載の方法。

実施形態２０．ポリペプチドが配列番号５である、実施形態１～１７のいずれか１つに記載の方法。

実施形態２１．化学療法剤の投与をさらに含む、実施形態１～２０のいずれか１つに記載の方法。

実施形態２２．化学療法剤が抗ＰＤ１剤である、実施形態２１に記載の方法。

実施形態２３．化学療法剤がＰＡＲＰ阻害剤である、実施形態２１に記載の方法。

実施形態２４．状態ががんである、実施形態１～２３のいずれか１つに記載の方法。

実施形態２５．状態が肝内胆管癌である、実施形態１～２４のいずれか１つに記載の方法。

実施形態２６．状態が去勢耐性前立腺がんである、実施形態１～２４のいずれか１つに記載の方法。

実施形態２７．状態がブルーム症候群である、実施形態１～２３のいずれか１つに記載の方法。

実施形態２８．投与が経口投与である、実施形態１～２７のいずれか１つに記載の方法。

実施形態２９．投与が皮下投与である、実施形態１～２７のいずれか１つに記載の方法。

実施形態３０．投与が静脈内投与である、実施形態１～２７のいずれか１つに記載の方法。

実施形態３１．治療有効量が約５μＭから約１ｍＭである、実施形態１～３０のいずれか１つに記載の方法。

実施形態３２．被験体がヒトである、実施形態１～３１のいずれか１つに記載の方法。

実施形態３３．細胞は、真核生物リコンビナーゼへとポリペプチドが結合すると、カルシウム濃度の増加を示す、実施形態１～３２のいずれか１つに記載の方法。

実施形態３４．カルシウム濃度の増加が細胞の死を誘導する、実施形態３３に記載の方法。

実施形態３５．細胞死を誘導する方法であって、細胞を、細胞中の真核生物リコンビナーゼに結合するポリペプチドと接触させることを含み、真核生物リコンビナーゼへのポリペプチドの結合が、細胞中のタンパク質への真核生物リコンビナーゼの結合を阻害し、タンパク質への真核生物リコンビナーゼの結合の阻害が細胞内のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）損傷修復を減少させるかまたは阻害し、タンパク質への真核生物リコンビナーゼの結合の阻害が、ポリペプチドと接触していない細胞と比較して細胞の死を誘導する、方法。

実施形態３６．細胞における薬剤耐性を低減させる方法であって、細胞を、細胞中の真核生物リコンビナーゼに結合するポリペプチドと接触させることを含み、真核生物リコンビナーゼへのポリペプチドの結合が、細胞中のタンパク質への真核生物リコンビナーゼの結合を阻害し、タンパク質への真核生物リコンビナーゼの結合の阻害が細胞内のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）損傷修復を減少させるかまたは阻害し、真核生物リコンビナーゼの結合の阻害が、ポリペプチドと接触していない細胞と比較して細胞における薬剤耐性を低減させる、方法。

Claims

第１の試験タンパク質と第２の試験タンパク質の間のタンパク質間相互作用の阻害剤をスクリーニングする方法であって、前記方法は、
第１の試験タンパク質およびＤＮＡ結合部分を含む第１の融合タンパク質を宿主細胞において発現させることと；
前記第２の試験タンパク質および遺伝子活性化部分を含む第２の融合タンパク質を前記宿主細胞において発現させることと；
前記宿主細胞に化合物を提供することと
を含み、
前記宿主細胞は、複数の細胞毒性物質をコードするポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドの各々が、前記ＤＮＡ結合部分に対して選択的な親和性を有するプロモーターの制御下にあり；
前記第１の試験タンパク質と前記第２の試験タンパク質の間の相互作用が、前記遺伝子活性化部分に、前記細胞毒性物質の発現を活性化させ；そして
前記第２の融合タンパク質への前記第１の融合タンパク質の結合の破壊が、細胞生存能に基づき、前記第１の試験タンパク質と前記第２の試験タンパク質の間の前記相互作用の化合物阻害剤の同定を可能にする、
方法。
前記宿主細胞に前記化合物を提供することが、前記宿主細胞内でランダム化ポリペプチドを発現させることを含む、請求項１に記載の方法。
前記ランダム化ポリペプチドが６０またはそれ未満のアミノ酸長である、請求項２に記載の方法。
前記ランダム化ポリペプチドにＮ末端安定化配列が結合される、請求項２～３のいずれか一項に記載の方法。
前記細胞毒性物質が、リボソーム性にコードされる生体異物剤、リボソーム性にコードされる毒物、軽度に過剰発現されると重度の成長欠損を生じる、リボソーム性にコードされる内因性もしくは外因性の遺伝子、生存能にとって必須の遺伝子を切除する、リボソーム性にコードされるリコンビナーゼ、毒性二次代謝物の合成に関与する制限因子、またはそれらの任意の組合せである、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
前記宿主細胞が真核生物細胞であり、前記細胞毒性物質が原核生物細胞毒性物質である、請求項１～５のいずれかに記載の方法。
前記細胞毒性物質が、コレラ毒素、ＳｐｖＢ毒素、ＣＡＲＤＳ毒素、ＳｐｙＡ毒素、ＨｏｐＵ１、Ｃｈｅｌｔ毒素、Ｃｅｒｔｈｒａｘ毒素、ＥＦＶ毒素、ＥｘｏＴ、ＣｄｔＢ、ジフテリア毒素、ＥｘｏＵ／ＶｉｐＢ、ＨｏｐＰｔｏＥ、ＨｏｐＰｔｏＦ、ＨｏｐＰｔｏＧ、ＶｏｐＦ、ＹｏｐＪ、ＡｖｒＰｔｏＢ、ＳｄｂＡ、ＳｉｄＧ、ＶｐｄＡ、Ｌｐｇ０９６９、Ｌｐｇ１９７８、ＹｏｐＥ、ＳｐｔＰ、ＳｏｐＥ２、ＳｏｐＢ／ＳｉｇＤ、ＳｉｐＡ、ＹｐｋＡ、ＹｏｐＭ、アマトキシン、ファラシジン、キラー毒素ＫＰ１、キラー毒素ＫＰ６、キラー毒素Ｋ１、キラー毒素Ｋ２８（ＫＨＲ）、キラー毒素Ｋ２８（ＫＨＳ）、炭疽致死因子エンドペプチダーゼ、志賀毒素、リシン毒素、またはそれらの任意の組合せである、請求項１～６のいずれかに記載の方法。
前記宿主細胞が真菌細胞である、請求項１～７のいずれかに記載の方法。
前記ＤＮＡ結合部分が、ＬｅｘＡ、ｃＩ、グルココルチコイド受容体、ＴｅｔＲまたはＵｍｅ６に由来する、請求項１～８のいずれかに記載の方法。
前記遺伝子活性化部分がＧＡＬ４、Ｂ４２またはＤｏｆ１に由来する、請求項１～９のいずれかに記載の方法。
以下：
（ａ）ＤＮＡ結合部分を含む第１の融合タンパク質；
（ｂ）遺伝子活性化部分を含む第２の融合タンパク質；
（ｃ）複数の細胞毒性レポーターであって、前記細胞毒性レポーターの発現が、前記ＤＮＡ結合部分に特異的なＤＮＡ結合配列の制御下にある、細胞毒性レポーター；および
（ｄ）天然に存在しないポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むｍＲＮＡ
を発現するように構成された、真菌宿主細胞。
前記天然に存在しないポリペプチドが６０またはそれ未満のアミノ酸長である、請求項１１に記載の宿主細胞。
前記天然に存在しないポリペプチドが、ペプチド安定化のためのＮ末端配列に結合される、請求項１１または１２に記載の宿主細胞。
前記宿主細胞が一倍体酵母細胞である、請求項１１に記載の宿主細胞。
前記宿主細胞が二倍体酵母細胞である、請求項１１に記載の宿主細胞。