KR20010032246A

KR20010032246A - 키메라형 전구활성화된 전사 인자

Info

Publication number: KR20010032246A
Application number: KR1020007005449A
Authority: KR
Inventors: 헥트피터; 매든케빈; 핑크제랄드알
Original assignee: 추후제출; 마이크로비아 인크.; 그라우어카우 패트리샤; 더 화이트헤드 인스티튜트 포 바이오메디칼 리서치
Priority date: 1997-11-19
Filing date: 1998-11-19
Publication date: 2001-04-16
Also published as: CZ20001841A3; JP2002505072A; WO1999025735A1; HUP0100126A3; AU762910B2; HUP0100126A2; EP1032590A1; CA2310624A1; EP1032590A4; US6500636B1; AU1797999A

Abstract

본 발명은 진균 유전자 발현을 조절하는 강력한 전사 활성화 도메인과 전구활성화된 전사 인자를 포함하는 키메라 단백질, 및 이러한 단백질을 작제하고 사용하기 위한 시약 및 방법에 관한 것이다.

Description

키메라형 전구활성화된 전사 인자{CHIMERIC PRE-ACTIVATED TRANSCRIPTION FACTORS}

진균 종은 많은 의약적으로 유용한 제품, 예컨대 항생제(예, 페니실린, 세팔로스포린 및 이것의 유도체와 같은 베타 락탐 항생제), 항콜레스테롤과잉혈증제(예, 로바스타틴 및 컴팩틴), 면역억제제(예, 시클로스포린) 및 항진균제(예, 뉴모칸딘 및 에키노칸딘)의 통용되는 출발 물질이다. 이러한 약물은 모두 진균의 미생물 환경에서 경쟁인자에 대항하여 진균이 이용하는 소량 분비되는 분자인 진균의 2차 대사산물이다. 또한, 진균은 상업적으로 중요한 효소(예, 셀룰라제, 프로테아제 및 리파제) 및 기타 다른 산물(예, 구연산, 지베렐산, 천연 안료 및 향미제)을 생산한다.

2차 대사산물, 효소 및 기타 산물의 생산은 통합된 유전자 발현에 의해 조절된다. 예를 들어, 페니실린의 생산은 ipnA 및 acvA 유전자에 의해 암호되는 2가지 효소의 활성에 의해 제한된다. 이들 두 유전자의 상류 서열에는 아연 핑거 전사 인자인 PacC가 결합한다. PacC의 증가된 활성은 효소 활성 및 페니실린 생산 양자의 증가를 유도한다.

상기 예시하였듯이, 2차 대사산물 생산의 전사 조절에 관한 지식은 지난 수십년 동안에 걸쳐 상당히 축적되어 있다. 하지만, 지금까지 상업적 중요도가 있는 진균 생산물의 생산 증가를 위하여 유전자 조작된 전사 인자가 사용된 적은 없었다. 이에 반해, 현재 이용되고 있는 페니실린의 생산 증가 방법은 돌연변이유발 및 2차 대사산물 생산의 증가를 나타내는 돌연변이체의 선발에 의존하고 있다.

도 1은 아스퍼질러스 니듈란스(Aspergillus nidulans)(서열 번호 1), 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger)(서열 번호 2), 페니실리움 크리소게넘(Penicillium chrysogenum)(서열 번호 3), 야로위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica)(서열 번호 4), 칸디다 알비칸스(Candida albicans)(서열 번호 5) 및 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)(서열 번호 6) 유래의 PacC계 성분의 아연 핑거 DNA 결합 도메인을 정렬한 것이다. 동일 서열은 검은 영역으로 표시하고 유사 서열은 박스 영역으로 표시하였다.

상세한 설명

본 발명은 진균 유전자 발현을 조절하는 강력한 전사 활성화 도메인과 전구활성화된 전사 인자를 포함하는 2부분 키메라 단백질을 특징으로 한다. 이 단백질은 진균 세포 중에서의 발현을 허용하는 벡터 중의 강력한 프로모터에 작동가능하게 결합된 핵산에 의해 암호된다. 전사 인자의 효과는 목적 산물 자체이거나 또는 숙주인 진균 세포에 의해 목적 산물이 제조될 때의 구성인자(예, 효소)로서 작용하는 단백질이 쉽게 발현될 수 있도록 하는 것이다. 이러한 성분에 대해서는 각각 하기에 설명하겠다. 본 명세서에 제시한 실험 예는 단지 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.

전구활성화된 전사 인자

본 발명의 벡터는 전구활성화된 형태로 제공될 수 있는 모든 단백성 전사 인자를 암호하는 DNA를 포함할 수 있는 것으로, 이 벡터는 이미 활성화된 형태의 단백질을 암호하여, 세포의 조절 DNA에 결합하여 쉽게 유전자 발현되도록 단백질을 진균 세포 중에서 활성화시키기 위한 해독후 프로세싱이 필요없다.

전사 인자는 각 유전자의 프로모터에 있는 핵심 전사 기구의 활성에 영향을 미쳐 유전자 발현의 정도를 조절한다. 이러한 전사 인자의 활성을 조절하는 기작에는 여러 가지가 있다.

전사 인자가 조절되는 기작 중 1가지는 해독후 변형이다. 이와 같이 전사 인자의 활성을 조절하기 위한 1가지 해독후 기작은 단백분해 절단이다[예, Pahl and Baeuerle, Curr.Opin.Cell Biol., 1996, 8:340-347; Goodbourn and King, Biochem.Soc.Trans. 1997, 25:498-502; Fan and Maniatis, Nature, 1991, 354:395-398]. 전사 인자 중 진균 PacC계는 단백분해에 의해 활성화될 수 있는 단백질의 일군이다. 이하에 PacC계 성분을 이용한 활성화 돌연변이에 대해 설명하였고, 이러한 돌연변이는 암호된 단백질을 절두하여 전사 인자의 전구활성화된 형태를 생산한다.

전사 인자를 전구활성화하는 다른 방법은 보통 활성을 조절하는 변형을 모방하는 것이다. 예를 들어, 인산화는 일부 전사 인자의 활성을 양성적으로 조절하고 다른 전사 인자의 활성은 음성적으로 조절하는 것으로 밝혀져 있다(Hunter and Karin, Cell, 1992, 70:375-387 참조). 전사 인자의 활성을 증가시킬 수 있는 해독후 변형의 기타 다른 형태로는 아세틸화(Gu and Roeder, Cell, 1997, 90:595-606) 및 알킬화(예, 메틸화)[Chinenov et al., J.Biol.Chem. 1998, 273;6203-6209; Sakashita et al., J.Biochem(Tokyo), 1995, 118: 1184-1191]가 있다.

특정 잔기의 탈인산화는 많은 전사 인자의 활성을 증가시킬 수 있다. 인산화는 세린(Ser), 트레오닌(Thr) 및 티로신(Tyr) 잔기에서 가장 일반적으로 일어나고, 몇몇 경우에는 아스파테이트(Asp)와 히스티딘(His)과 같은 잔기에서도 인산화가 일어날 수 있다. 따라서, 인산화된 잔기의 암호 서열을 돌연변이시키면 인산화될 수 없고 음하전을 띤 측쇄가 없는 아미노산[예, 알라닌(Ala)]을 암호할 수 있다. Ser → Ala, Thr → Ala, Tyr → Ala 및 Asp → Ala 치환은 전구활성화된 전사 인자를 생산하기 위한 방법으로 당해 기술분야에서 흔히 사용되고 있다[예컨대, Chen et al., Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A., 1998, 95:2349-2354; Song et al., Mol. Cell Biol., 1998, 18:4994-4999; O'Reilly et al., EMBO.J. 1997, 16:2420-2430; Hao et al., J.Biol.Chem., 1996, 271:29380-29385].

또한, 인산화가 전사 인자의 활성을 증가시킬 수도 있다. 인산화를 모방하고 전사 인자를 전구활성화시키기 위하여 당해 기술분야에서 종종 사용되는 돌연변이는 Ser, Thr 또는 Tyr 대신에 Glu나 Asp로 치환시키는 것이다[예컨대, Hoeffler et al., Nucleic Acids Res., 1994, 22:1305-12; Hao et al. 상기 문헌 설명 참조]. 또한, 인산화될 수 있는 Asp 잔기에 Asp 대신 Glu를 치환시킨 돌연변이도 활성화를 유발할 수 있다[Klose et al., J.Mol.Biol., 1993, 232:67-78; Krems et al., Curr.Genet., 1996, 29:327-34; Nohaile et al., J.Mol.Biol., 1997, 273:299-316].

또한, 해독후 변형의 활성화를 모방하는 기타 다른 돌연변이를 만들 수도 있다. 예를 들어, 이.콜리 Ada 전사 인자는 69번의 시스테인(Cys) 잔기의 메틸화에 의해 활성화된다. Cys → His 치환은 활성화를 유발하는 것으로 발견되었다(Taketomi et al., Mol.Gen.Genet., 1996, 250:523-532). 이 특정 치환은 Cys69를 19가지 다른 아미노산으로 각각 치환시켜 입증하였다. 별법으로, 변형(예, 아세틸화)을 모방하는 어떤 명백한 치환을 만들 수 없는 경우에는 무작위 돌연변이유발을 실시하여 전사 인자의 구성적 활성 형태를 동정하기도 한다[예컨대, Onishi et al., Mol.Cell Biol. 1998, 18:3871-3879]. 이러한 기법에는 활성화된 형태를 동정하기 위하여 본 명세서에 기재된 바와 같은 간단하고 신속한 표현형 또는 리포터 선발을 이용할 수 있다. 예를 들어, 활성화된 형태의 선발을 위해 리포터 작제물을 함유하는 사카로마이세스 세레비지에 균주를 이용할 수 있다. 구체적으로, PacC가 돌연변이에 의해 전구활성화되는 경우, HIS3과 같이 생육에 잇점을 부여하는 사카로마이세스 세레비지에의 유전자에 아스퍼질러스 니듈란스의 ipnA 프로모터(P_ipnA)를 융합시킬 수 있다. P_ipnA-HIS3 융합체는 발현 정도가 화합물 3-아미노트리아졸(3-AT)에 의해 적정될 수 있는 부가적인 장점이 있다. 3-AT는 His3의 경쟁 억제제로서, 충분한 양으로 존재시 P_ipnA로부터 발현된 His3을 억제하여, SC-HIS 상에서의 균주의 생육을 억제한다. 이 예에서, pacC 암호 서열은 무작위 돌연변이시킬 수 있고, 이 돌연변이된 대립유전자를 포함하는 벡터를 이용하여 리포터 균주를 형질전환시킨다. P_ipnA-HIS3 발현이 3-AT에 의한 His3의 경쟁적 억제를 극복할 정도로 증가된 경우에만 SC-HIS + 3-AT 평판상에서 P_ipnA-HIS3을 포함하는 균주의 성장이 일어난다. 이와 같은 방법은 전사 인자를 전구활성화시키는 돌연변이 선별의 신속한 기법을 제공한다.

PacC계 전사 인자

본 발명에 유용한 전사 인자 중 1군은 PacC계의 성분이다. PacC 전사 인자는 주위 pH의 변화에 대한 반응으로 유전자 발현을 조절한다. 이 계의 성분들은 다음과 같은 특징이 있다. 1) 아스퍼질러스 니듈란스 PacC 단백질(Tilburn et al., EMBO.J., 1995, 14:779-790)과 유의적인(35% 이상) 아미노산 서열 동일성을 나타낸다. 이러한 단백질들은 야로위아 리포리티카(Y1Rim101p; Lambert et al., Mol.Cell.Biol., 1997, 17:3966-3976), 페니실리움 크리소게놈(Suarez and Penalva, Mol.Microbiol., 1996, 20:529-540), 아스퍼질러스 나이거(MacCabe et al., Mol.Gen.Genet., 1996, 250:367-374), 사카로마이세스 세레비지에 (Inv8/Rim101/Rim1; Su and Mitchell, Nucleic Acids Res., 1993, 21:3789-3797) 및 칸디다 알비칸스(U.S.S.N._/_)(표 1)에서 동정된 바 있다. 2) Cys₂His₂클래스의 3개의 아연 핑거를 포함하는 추론된 DNA 결합 영역을 포함한다.

PacC 동족체의 기원 종	107aa에 있어서의 A.니듈란스 PacC와의 동일성 %	전체 길이 상에 있어서의 A.니듈란스 PacC와의 유사성 %
A. 나이거	94	75
P. 크리소게넘	84	67
C. 알비칸스	61	18
S. 세레비지에	56	22
Y. 리포리티카	58	30

또한, 여러 PacC계 성분은 상류 조절 서열 중의 5'-GCCAAG-3' 또는 5'-GCCAGG-3' 인자를 포함하는 유전자에 직접 결합하거나 그 유전자의 발현을 조절하는 것으로 밝혀져 있다[Tilburn et al., 상기 문헌 참조; Suarez and Penalva, 상기 문헌 참조]. 또한, P.크리소게넘 유래의 PacC를 제외하고, 단백질을 절두하는 돌연변이가 동정되거나 작제되었고, 이러한 돌연변이는 낮은 주위 pH에서도 PacC 계의 단백질에 의한 유전자 발현을 활성화시킨다[Tilburn et al., 상기 문헌 참조; van den Hombergh et al., Mol.Gen.Genet., 1996, 251:542-550; Lambert et al., 상기 문헌 참조; Li and Mitchell, Genetics, 1997, 145:63-73]. 마지막으로, A. 니듈란스 및 S. 세레비지에의 경우 특정 단백분해 절단은 생체내 시그널링의 활성화를 유발한다는 것이 입증되어 있다[Orejas et al., Genes.Dev., 1995, 9:1622-32; Li and Mitchell, 상기 문헌 참조].

전사 활성화 도메인

전사 활성화 도메인(TAD)은 각종 기작에 의해 유전자 발현을 촉진하고 궁극적으로 RNA 폴리머라제를 활성화시키는 단백질의 분리된 영역이다. TAD는 일반적으로 DNA 결합 도메인(DBD)에 융합되었을 때 전사를 활성화시키는 최소 모티프로 정의된다[Webster et al., Cell, 1988, 52:169-178; Fischer et al., Nature, 1988, 332:853-856; Hope et al., Nature, 1988, 333:635-640]. 본 발명은 TAD가 적당한 DBD에 융합될 때 진균 유전자 프로모터로부터의 발현을 트란스활성화시킬 수 있는 모든 TAD를 이용할 수 있다. TAD는 단백질 서열 및/또는 조성물 성질의 유사성에 기초하여 분류한다. 그 종류로는 산성 고밀도 TAD(예, Gal4, Gcn4, VP16 및 Jun; Webster et al., 상기 문헌 참조; Fischer et al. 상기 문헌 참조; Hope et al., 상기 문헌 참조; Cress and Triezenberg, Science, 1991, 251:87-90; Struhl, Nature, 1988, 332:649-650), 글루타민 고밀도 TAD(Sp1, Oct1 및 Oct2; Courey and Tjian, Cell, 1988, 55:887-898; Tanaka et al., Mol.Cell Biol., 1994, 14:6046-6055; Tanaka and Herr, Mol.Cell Biol., 1994, 14:6056-6067) 및 프롤린 고밀도 TAD(CTF, NF-I 및 EKLF; Mermod et al., Cell, 1989, 58:741-753; Tanese et al., Genes Dev., 1991, 5:2212-2224; Chen and Bieker, EMBO J., 1996, 15:5888-5896]를 포함한다. 이러한 종류의 모든 TAD는 본 발명에 사용될 수 있다. 특정 프로모터로부터 트란스활성화시키는 임의의 특정 TAD의 성질은 공지된 간단한 선발 선별법을 사용하여 측정할 수 있다.

또한, TAD 또는 부위 특이적 DBD를 인공적으로 만드는 것도 가능하다. 그러한 일 예는 목적 프로모터로부터 리포터 유전자를 트란스활성화시키는 단백질 서열을 발현 라이브러리 중에서 선발하는 것이다. 다른 예는, 특정 DNA 서열에 특이적으로 결합하는 단백질 서열을 선발하는 것이다. 각 경우마다, 서열은 반복 공정으로 돌연변이시켜 특정 프로모터에 최적의 TAD 서열 또는 특정 DNA 서열에 최적의 DBD 서열을 얻을 수 있다. 이러한 방법이나 기타 다른 방법에 의해 제조된 인공 인자를 포함하는 전사 인자는 본 발명에 유용하게 사용된다.

본 발명의 키메라 전사 인자에 있어, TAD는 단독물 또는 조합물로 사용될 수 있다. 예를 들어, Sp1은 복수의 글루타민 고밀도 TAD를 포함하는데, 이 도메인은 상승적으로 작용하여 유전자 발현을 촉진한다(Courey and Tjian, 상기 문헌 참조; Courey et al., Cell, 1989, 59:827-836). Oct-2는 글루타민 고밀도 TAD와 프롤린 고밀도 TAD를 포함하는데, 이것 둘다 Oct-2 또는 이종 DBD에 융합되었을 때 최대 발현에 필요한 것이다(Tanaka et al., 상기 문헌 참조). 따라서, 한 작제물 중에 2 또는 그 이상의 TAD를 사용하면 발현의 유도를 증폭시킬 수 있다. 또한, 프롤린 또는 글루타민의 단독중합체 스트레치도 TAD로서 작용한다(Gerber et al., Science, 1994, 263:808-811). 일 예로서, 반복성 VP16 TAD에 결합된 단독중합체 글루타민 스트레치에 Gal4 DBD를 융합시켜 강력한 전사 인자를 만든 바 있다(Schwechheimer et al., Plant Mol. Biol., 1998, 36:195-204).

진균 프로모터

키메라 전구활성화된 전사 인자는 강력한 프로모터에 작동가능하게 결합되어 진균 세포내에서 그 전사 인자의 발현을 허용한다. 많은 진균 중에 있는 각종 프로모터를 이용하는 발현 시스템에 대해서는 공지되어 있고, 그 예로서 아스퍼질러스 니듈란스(gpd : Punt et al., Gene, 1987, 56:117-124; Hunter et al., Curr.Genet., 1992, 22: 377-383; Glumoff et al., Gene, 1989, 84:311-318. alcA : Fernandez-Abalos et al., Mol.Microbiol., 1998, 27:121-130. glaA : Carrez et al., Gene, 1990, 94:147-154. amdS: Turnbull et al., Appl.Environ.Microbiol., 1990, 56:2847-2852), 아스퍼질러스 나이거(gpd: Punt et al., 상기 문헌; Hunter et al., 상기 문헌; Glumoff et al., 상기 문헌. glaA : Tang et al., Chin.J.Biotechnol., 1996, 12:131-136. amdS 프로모터: Turnbull et al., 상기 문헌), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)(알코올 옥시다제 I 프로모터: Payne et al., Gene, 1988, 62:127-134), 플루로투스 오스트레아투스(Pleutotus ostreatus)(Lentinus edodes ras 프로모터: Yanai et al., Biosci.Biotechnol.Biochem., 1996, 60:472-475), 피토프토라 인페스탄스(Phytophthora infestans)(Bremia lactucae Hsp70: Judelson et al., Mol.Plant Microbe Interact., 1991, 4:602-607), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)(his3 프로모터: Avalos et al., Curr. Genet., 1989, 16:369-372), 야로위아 리포리티카(XPR2 프로모터: Nicaud et al., Curr. Genet., 1989, 16:253-260. TEF:Muller et al., Yeast, 1998, 14:1267-1283), 페니실리움 크리소게넘(phoA 프로모터: Graessle et al., Appl.Environ.Microbiol., 1997, 63:753-756), 리조푸스 델레마(Rhizopus delemar)(pyr4 프로모터: Horiuchi et al., Curr.Genet., 1995, 27:472-478), 글리오클라디움 비렌스(Gliocladium virens)(prom1: Dave et al., Appl.Microbiol.Biotechnol., 1994, 41:352-358) 및 코클리오볼러스 헤테로스트로푸스(Cochriobolus heterostrophus)(Monke and Shafer, Mol.Gen.Genet., 1993, 241:73-80)가 있으며, 이것에만 국한되는 것은 아니다.

또한, 유전학적으로 연구가 안된 유기체에서 프로모터를 분리하는 방법에는 간단한 기법이 있다. 이중 하나는 프로모터 활성이 있는 서열의 선발을 기초로 하는 시스템이다(예컨대, Turgeon et al., Mol.Cell Biol., 1987, 7:3297-3305; Weltring, Curr.Genet., 1995, 28:190-196). 이 방법은 각종 진균 유래의 프로모터 단편을 분리하기에 쉬운 방법을 제공한다.

또, 본 발명의 작제물은 키메라 전사 인자 암호 서열의 3' 쪽에 위치한 종결인자 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 각종 진균에서 작용하는 종결인자 서열에 대해서는 당해 기술분야에 공지되어 있다. 그 예로는 아스퍼질러스 니듈란스 trpC(Punt et al., 상기 문헌; Hunter et al., 상기 문헌; Glumoff et al., 상기 문헌), 렌티누스 에도데스 priA(Yanai et al., 상기 문헌), 브레미아 락투케(Bremia lactucae) Ham34(Judelson et al., 상기 문헌) 및 아스퍼질러스 니듈란스 argB(Carrez et al., 상기 문헌) 유래의 것을 포함한다.

키메라 전사 인자의 작제

본 발명의 전구활성화된 전사 인자는 1) 생체내에서 유전자 조절 영역에 위치한 특정 DNA 서열(예, 프로모터)에 대한 직접적이거나 또는 간접적인 증가된 결합성 및/또는 2) 전구체 분자에 비하여 증가된 전사 활성화 성질을 나타낸다. 이러한 목적 달성을 위하여 DNA 서열을 인식하여 여기에 결합하는 모 전사 인자의 도메인인 DBD 일부 또는 전체는 본래 상태로 유지되는 것이 좋다. 또한, 모 전사 인자 유래의 다른 서열은 키메라 작제물 중에 그대로 유지되거나 또는 제거될 수도 있다. 키메라 전사 인자가 본 명세서에 기재된 헤르페스바이러스 트란스활성인자 VP16과 같은 다른 단백질 유래의 TAD를 포함하는 경우 모 전사 인자의 TAD는 제거될 수 있다. 또한, 모 전사 인자의 TAD는 키메라 작제물 중에 유지될 수도 있다.

전술하였듯이, TAD는 산성의 글루타민 고밀도 또는 프롤린 고밀도일 수 있다. 제시된 모든 진균 균주 중에서 작용하는 상기 각 TAD의 성질은 다양하다. 산성 TAD는 C.엘레강스(C. elegans)에서부터 진균을 비롯한 인간에 이르기까지 각종 유기체에서 작용하는 것으로 밝혀져 있다. 글루타민 고밀도 TAD 및 프롤린 고밀도 TAD는 진균을 비롯한 이종 유기체에서 작용하는 것으로 밝혀져 있다. 전술하였듯이, 트란스활성화의 증가된 활성은 한 부류에 속하는 복수의 TAD를 사용하여 얻을 수 있다(Tanaka and Herr, 상기 문헌). 또한, 1 이상의 부류에 속하는 TAD들도 역시 하나의 키메라 단백질에 사용할 수 있다(Schwechheimer et al., 상기 문헌; Tanaka et al., 상기 문헌). 하기 기술되는 예에서는 4개의 VP16 TAD와 프롤린 고밀도 TAD를 일렬로 배치하였다.

전사를 활성화시키는 키메라 전사 인자의 제조에 사용되는 모 전사 인자로서는 전사 활성인자 자체인 모 전사 인자에만 한정되는 것은 아니다. 이 방법을 사용하면, 전사 억제인자인 전사 인자를 TAD 첨가에 의해 전사 활성 인자로 변환시킬 수 있다. 한 예는 SUC2 발현의 억제인자인 사카로마이세스 세레비지에 Mig1이다. mig1의 결실은 SUC2 발현을 활성화시킨다. Mig1의 DBD가 VP16 TAD에 융합된 키메라 단백질은 Mig1 결합 부위를 포함하는 프로모터로부터 전사를 활성화시킬 수 있고, 결과적으로 SUC2 발현을 증가시킨다(Ostling et al., Mol Cell Biol., 1996, 16:753-61). 따라서, 키메라 전사 활성인자의 형성에는 활성인자이든지 억제인자이든지에 관계없이 모든 전사 인자를 이용하여 실시할 수 있다.

본 발명에 사용하기 위한 모 전사 인자의 선택은 얻고자 하는 목적 산물에 따라 달라진다. 전사 인자는 목적 유전자의 프로모터에 있는 서열을 인식해야만 한다. 이 유전자는 목적 산물 자체인 단백질 또는 숙주인 진균 세포에 의해 목적 산물이 만들어지는 경로 중의 구성인자(예, 효소)로 작용하는 단백질을 암호할 수 있다. 예를 들어, PacC를 포함하는 키메라 전사 인자는 베타 락탐 항생제의 생산을 증가시키고자 하는 경우에 사용할 수 있다. 이것은 페니실린 생산 공정 중의 효소들을 암호하는 최소 2개의 유전자인 ipnA 및 acvA의 발현을 증가시켜 달성된다.

당업자라면 어떤 전사 인자가 가장 강력한 전사 활성인자인지를 확인하기 위하여 키메라 전사 인자 작제물의 신속한 선발 및 선별을 허용하는 본 명세서에 기재된 것을 비롯한 표준 기법을 잘 알고 있을 것이다.

진균 발현 벡터의 작제

키메라 전사 인자를 고도 발현시키기 위한 발현 벡터에는 여러 종류가 있음이 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다(예, 본 명세서에 기재된 것 포함). 발현 벡터의 선택은 사용되어야 하는 진균의 종류에 따라 달라진다. 예를 들어, 아스퍼질러스 니듈란스에서의 키메라 전사 인자의 발현은 amdS 프로모터 시스템을 사용하여 달성될 수 있다(Turnbull et al. 상기 문헌). 이 프로모터 인자는 키메라 전사 인자가 인식하는 DNA 서열을 포함하도록 변형시킬 수 있다. 키메라 전사 인자의 발현은 자신의 프로모터로부터 증가된 활성화를 유도할 수 있고, 결과적으로 키메라 전사 인자 자체의 생산을 증폭시킨다. 또한, 발현 벡터는 전술한 바와 같은 종결인자 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 아스퍼질러스 니듈란스의 적합한 종결인자는 argB 종결인자이다.

벡터는 본 명세서에 기재된 바와 같은 진균 세포를 형질전환시킨 후, 에피좀으로 유지될 수 있는데, 이 경우 벡터는 복제 오리진을 포함하기도 한다. 또한, 벡터는 숙주 세포의 염색체 DNA로 통합되기도 한다. 통합된 발현 작제물의 발현은 위치에 따라 그 효과가 달라질 수 있고, 결과적으로 적당히 높은 발현을 나타내는 작제물을 분리하기 위하여 형질전환체를 통해 선별하거나 그런 형질전환체를 선발해야 할 필요가 있다. 이러한 선별 및 선발 방법에 대해서는 본 명세서에 상세히 설명된다. 또한, 통합된 발현 작제물은 진균 세포의 내인성 유전자의 발현을 변화시킬 수 있다. 이와 같이 변화된 발현은 그 세포의 생존 또는 그 진균 세포 제조의 목적에 유리한 영향을 미치거나 악영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 그 목적이 베타 락탐 항생제의 생산 증가라면, 발현 작제물의 통합에 이어 ipnA(이소페니실린 N-신타제를 암호하고 베타 락탐 생산에 요구됨)의 발현 상실은 키메라 전사 인자의 발현에 의한 어떠한 잇점에도 부정적 영향을 미칠 것이다. 따라서, 목적에 적합한 특성을 나타내는 형질전환체를 선발하기 위해 2차 선별을 수행할 수 있다. 대사산물 생산을 측정하는 방법에 대해서는 본 명세서에 상세히 설명된다.

몇몇 경우에는 키메라성이 아닌 전사 인자를 사용하는 것이 유리할 수 있다. 모 전사 인자의 과잉발현은 2차 대사산물의 증가를 유도할 수 있다. 이러한 과잉발현된 단백질은 과잉발현이나 유전자 돌연변이에 의해 구성적 활성형이거나 또는 내인성 전사 인자와 유사한 방식으로 조절될 수 있다. 진균 세포는 야생형 균주이거나 또는 1 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다(또한, 2차 대사산물의 생산을 증가시킬 수 있다). 돌연변이의 예로는 생합성 유전자(예, ipnA, acvA 및 aatA의 페니실린 유전자 클러스터)의 중복이나 재배열을 초래하는 돌연변이를 포함한다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 리포터 유전자 또는 기타 다른 외인성 유전자는 진균 세포 중에서 에피좀으로 존재하거나 또는 염색체에 통합하여 존재할 수 있다.

형질전환

이러한 작제물을 진균 세포에 도입시키기 위하여, 다양한 형질전환 프로토콜을 이용할 수 있다[예컨대, Punt and van den Hondel, Methods Enzymol., 1992, 216:447-457; Timberlake and Marshall, Science, 1989, 244:1313-1317; Fincham, Microbiol. Rev., 1989, 53:148-170). 적합한 DNA 형질전환 기법으로는 전기침투, 폴리에틸렌 글리콜 매개 형질전환, 리튬 아세테이트 매개 형질전환 및 바이오리스틱 형질전환을 포함한다(Brown et al., Mol.Gen.Genet., 1998, 259:327-335; Zapanta et al., Appl.Environ.Microbiol., 1998; 64:2624-2629; Thompson et al., Yeast, 1998, 14:565-571; Barreto et al., FEMS Microbiol.Lett., 1997, 156:95-99; Nicolaisen and Geisen, Microbiol.Res., 1996, 151:281-284; Wada et al., Appl.Microbiol.Biotechnol., 1996, 45:652-657; Ozeki et al., Biosci.Biotechnol.Biochem., 1994, 58:2224-2227; Lorito et al., Curr.Genet., 1993, 24:349-356; Oda and Tonomura, Curr.Genet., 1995, 27:131-134). 필요한 경우, DNA 작제물을 특정 유전자좌에 표적화되게 만들 수 있다. 표적화 상동성 재조합 기법은 현재 많은 진균 중에서 실시되는 것으로, 예컨대 칸디다 알비칸스(Fonzi and Irwin, Genetics, 1993, 134:717-728), 유스틸라고 메이디스(Fotheringham and Hollman, Mol.Cell Biol., 1989, 9:4052-4055; Bolker et al., Mol.Gen.Genet., 1995, 248:547-552), 야로위아 리포리티카(Neuveglise et al., Gene 1998, 213:37-46; Chen et al., Appl.Microbiol.Biotechnol., 1997, 48:232-235; Cordero et al., Appl.Microbiol.Biotechnol., 1996, 46:143-148), 아크레모늄 크리소게넘(Acremonium chrysogenum)(Skatrud et al., Curr.Genet., 1987, 12:337-348; Walz and Kuck, Curr.Genet., 1993, 24:421-427), 마그나포르테 그리세아(Magnaporthe grisea)(Sweigard et al., Mol.Gen.Genet., 1992, 232:183-190); Kershaw et al., EMBO J., 1998, 17:3838-3849), 히스토플라즈마 캡슐라텀(Histoplasma capsulatum)(Woods et al., J.Bacteriol., 1998, 180:5135-5143) 및 아스퍼질러스 종(Miller et al., Mol.Cell Biol., 1985, 5:1714-1721; de Ruiter-Jacobs et al., Curr.Genet., 1989, 16:159-163; Gouka et al., Curr.Genet., 1995, 27:536-540; vad den Hombergh et al., Mol.Gen.Genet., 1996, 251:542-550; D'Enfert, Curr.Genet., 1996, 30:76-82; Weidner et al., Curr.Genet., 1998, 33:378-385)를 포함하지만, 이것에만 국한되는 것은 아니다.

형질전환체를 선발 및 선별하는 방법

리포터 유전자는 작용성 키메라 전사 인자를 발현하는 형질전환체를 분리하는데 유용하다. 이 리포터 유전자는 키메라 전사 인자가 조절하는 프로모터 서열에 작동가능하게 결합될 수 있다. 리포터 유전자로는 다음과 같은 것을 포함하지만, 이것에 국한되는 것은 아니다. β-갈락토시다제(lacZ), β-글루코로니다제(GUS), β-글루코시다제 및 인버타제를 암호하는 유전자, 아미노산 생합성 유전자(예, 효모 LEU2, HIS3, LYS2, TRP1 유전자(또는 유사한 작용성 활성을 나타내는 단백질을 암호하는 사상 진균과 같은 기타 다른 진균 유래의 상동성 유전자), 핵산 생합성 유전자, 예 효모 URA3 및 ADE2 유전자(또는 유사한 작용성 활성을 나타내는 단백질을 암호하는 사상 진균과 같은 기타 다른 진균 유래의 상동성 유전자), 포유동물의 클로람페니콜 트란스아세틸라제(CAT) 유전자 또는 특정 항체가 이용가능한 모든 표면 항원 유전자. 리포터 유전자는 발광성 또는 형광성으로 검출할 수 있는 단백질, 예컨대 녹색 형광 단백질(GFP)을 암호할 수 있다. 또한, 리포터 유전자는 표현형적 마커를 제공하는 모든 단백질, 예컨대 세포 생육 또는 생존성에 필요한 단백질 또는 세포 사멸을 유도하는 독성 단백질을 암호하거나 또는 색의 존재 유무를 유도하는 비색법으로 검출가능한 단백질을 암호할 수 있다.

리포터 유전자의 선택은 형질전환시킬 진균 세포의 종류에 따라 달라진다. 바람직하게는, 진균 세포 중에 2개의 리포터 유전자를 보유하는 것이 좋다. 하나의 리포터 유전자는 발현되는 경우 키메라 전사 인자를 발현하는 형질전환된 세포의 생육에 유리한 영향을 제공할 수 있다. 그 결과 선발적 압력을 통해 그런 형질전환체를 분리할 수 있게 된다. 다른 리포터 유전자는 비색 마커, 예컨대 lacZ 유전자와 이것의 암호된 단백질, β-갈락토시다제를 제공할 수 있다. 별법으로, 제2 리포터는 GFP와 같은 형광이나 발광 마커를 제공할 수 있다. 이러한 리포터들은 키메라 전사 인자를 포함하는 발현 작제물 유래의 발현 양을 정량하는 방법을 제공한다. 전술한 것과 유사한 선별 및 선발 방법을 사용하여 키메라 전사 인자 또는 발현 작제물의 작제를 최적화할 수 있다.

발명의 개요

본 발명은 진균 자체의 유전자 조작에 의해 진균내 2차 대사산물의 생산을 증가시키는 수단을 제공한다. 진균의 2차 대사산물 생산에 대한 증가능은 적어도 다음과 같은 2가지 측면에서 매우 중요하다. 첫째, 임상용 세트와 실험용 세트에 유용한 기존의 2차 대사산물의 증가 생산을 허용한다. 둘째, 2차 대사산물의 증가 생산은 실험실에서 검출할 수 없는 정도의 양으로 만들어지는 진균 중의 신규 화합물을 쉽게 동정할 수 있도록 한다.

따라서, 제1 양태로 본 발명은 (i) 진균 균주 중에서 작용성인 전구활성화된 전사 인자 및 (ii) 이 전사 인자와 천연적으로 관련이 있는 전사 활성화 도메인과는 상이한 전사 활성화 도메인을 포함하는 2부분 키메라 전사 인자를 특징으로 한다. 바람직한 구체예로서, 키메라 전사 인자의 전사 활성은 전구활성화된 전사 인자와 천연적으로 관련이 있는 전사 활성보다 더 큰 것이 좋다. 또 다른 바람직한 구체예로서, 전구활성화된 전사 인자는 절두에 의해 전구활성화되는 것이 좋다. 관련된 바람직한 구체예로서, 전구활성화된 전사 인자는 이 전사 인자를 전구활성화(예컨대, 인산화의 모방 또는 변화)시키는 세린 잔기 또는 트레오닌 잔기의 알라닌, 아스파르트산 또는 글루탐산 잔기로의 치환을 포함한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 전사 인자는 PacC계의 성분(하기 기재됨)으로 전구활성화될 수 있는 것이다. 이와 관련된 바람직한 구체예에서, 전구활성화된 전사 인자는 도 1에 도시된 아미노산 서열의 부분을 포함한다(서열 번호 1 내지 6).

제2 양태로서, 본 발명은 (i) 진균 균주 중에서 작용성인 전구활성화된 전사 인자 및 (ii) 이 전사 인자와 천연적으로 관련이 있는 전사 활성화 도메인과는 상이한 전사 활성화 도메인을 포함하는 키메라 전사 인자를 암호하는 DNA 함유의 벡터를 특징으로 한다. 이 DNA는 진균 균주 중에서 키메라 전사 인자의 발현을 유도하고 조절할 수 있는 프로모터에 작동적으로 연결되어 있다.

전술한 벡터 중에서 암호되는 전사 인자는 목적의 2차 대사산물을 생산하는 사상 진균 세포와 같은 진균 세포 중에서 발현되고, 이때 전사 인자의 발현은 진균 세포에 의한 2차 대사산물의 생산을 증가시킨다. 2차 대사산물은 비단백성이거나 단백질 또는 펩티드일 수도 있다.

제3 양태로서, 본 발명은 (i) 진균 세포 중에서 유전자 발현을 조절할 수 있는 프로모터와, DNA 결합 도메인과 전사 활성화 도메인을 포함하는 2부분 전사 인자를 암호하는 핵산을 포함하는 벡터를 사상 진균 세포와 같은 진균 세포에 도입시키는 단계, 및 (ii) 이 진균 세포를 2차 대사산물 생산 조건하에 배양하는 단계를 포함하여, 목적의 2차 대사산물을 생산하는 방법을 특징으로 한다. 이것의 바람직한 구체예로서, 전사 활성화 도메인은 DNA 결합 도메인과 천연적으로 결합된 전사 활성화 도메인과는 상이한 것이다. 다른 바람직한 구체예로서, 전사 인자는 전구활성화된 전사 인자이다(세린 또는 트레오닌 잔기의 알라닌, 아스파르트산 또는 글루탐산 잔기로의 치환에 의한 전구활성화 또는 절두에 의한 전구활성화). 다른 바람직한 구체예로서, 전사 인자의 DNA 결합 도메인은 진균 전사 활성인자 또는 진균 전사 억제인자 유래인 것이다.

″전구활성화된 전사 인자″라는 용어는 전구체 분자에 비하여, 1) 유전자 조절 영역에 위치한 특정 DNA 서열(예, 프로모터)에 대한 직접적 또는 간접적 결합능이 증가되거나, 2) 전사 활성화 성질이 증가된 전사 인자 또는 이것의 단편을 의미한다. 전구활성화된 전사 인자는 프로모터로부터의 전사를 활성화시킬 수 있지만, 절대적인 것은 아니다. 예를 들어, 결합 성질은 있으나 트란스활성화 성질은 없는 전사 인자 DNA 결합 도메인은 전구활성화된 전사 인자로 간주된다. ″절두에 의한 전구활성화″란 용어는 단백질의 일부를 제거하여 전구활성화를 유도하는 것을 의미한다. 이러한 현상은 단백분해 절단을 통해 생체내에서 일어나는 것이다. 본 발명에서는, 절두에 의한 전구활성화를, 생체내에서 단백분해적으로 절단될 것으로 보이는 단백질의 부분을 제거한 전구활성화된 형태의 단백질을 암호하는 DNA를 사용하여 달성한다.

″실질적으로 동일한″이란 대조 아미노산 서열 또는 핵산 서열과 최소 50%, 바람직하게는 85%, 보다 바람직하게는 90%, 가장 바람직하게는 95%의 동일성을 나타내는 폴리펩티드 또는 핵산을 의미한다. 폴리펩티드의 경우, 비교 서열의 길이는 일반적으로 아미노산 16개 이상, 바람직하게는 아미노산 20개 이상, 보다 바람직하게는 아미노산 25개 이상, 가장 바람직하게는 35개 아미노산인 것이 좋다. 핵산의 경우, 비교 서열의 길이는 일반적으로 뉴클레오티드 50개 이상, 바람직하게는 뉴클레오티드 60개 이상, 보다 바람직하게는 뉴클레오티드 75개 이상, 가장 바람직하게는 110개 뉴클레오티드인 것이 좋다.

″프로모터″라는 용어는 전사를 유도 및/또는 조절하기에 충분한 서열을 의미한다. 또한, 본 발명은 외부 시그널이나 제제에 의한 유도성, 세포 종류 특이성, 조직 특이성, 또는 시간 특이성이도록 프로모터 의존성 유전자 발현을 조절할 수 있기에 충분한 인자를 포함한다. 이러한 인자는 천연 유전자의 5' 또는 3' 또는 인트론 서열 영역에 위치할 수 있다.

″작동가능하게 결합된″이란 용어는 적당한 분자(즉, 전사 활성인자 단백질)가 조절 서열에 결합할 때 유전자 발현이 일어날 수 있도록 유전자와 1 이상의 조절 서열이 연결되어 있는 것을 의미한다.

본 발명의 기타 다른 특징과 장점에 대해서는 이하에 기재되는 바람직한 구체예의 상세한 설명과 청구의 범위를 통해 명백하게 이해할 수 있을 것이다.

다음 실시예는 단백분해작용 또는 특정 절두에 의해 유도되는 정도 이상으로 PacC 활성의 정도를 증가시키는 방법을 설명한 것이다. 본 발명은 비제한적으로 페니실린 및 세팔로스포린을 비롯한 진균의 2차 대사산물의 생산을 증가시키는데 용이하게 사용될 수 있다. 이와 유사한 유전자 조작을 실시하여 기타 다른 전사 인자의 기능을 변화시킬 수도 있다.

이하, 키메라 전사 인자를 암호하는 작제물에 대하여 설명하겠다. 이 실시예에서는, 프롤린 고밀도 TAD에 이어 헤르페스 단순 바이러스 VP16 유래의 산성 고밀도 TAD의 복수 복사체를 아스퍼질러스 니듈란스 유래의 절두형 전구활성화된 PacC에 융합시켰다(서열 번호 7). 이 작제물은 하기 기재되듯이 아스퍼질러스 니듈란스 중의 pyrG 유전자좌에 통합시킬 수 있다. 이러한 키메라 폴리펩티드의 발현은 아스퍼질러스 니듈란스 유래의 강력한 PGK 프로모터 및 아스퍼질러스 니듈란스의 crnA 유전자 유래의 종결인자 서열에 의해 조절된다.

이러한 키메라 작제물의 작제에는 여러 DNA 클로닝 단계를 필요로 한다. 클로닝 벡터로서 Bluescript KS(미국 캘리포니아주 라졸라에 소재하는 Stratagene 제품)를 사용한다. 게놈 DNA 주형 유래의 crnA 종결인자 서열의 347 bp를 증폭시키기 위하여 프라이머 5'-aactgcagTAGTTGACCGTGTGATTGGGTTCT-3'(서열 번호 8)(소문자는 클로닝시 도입되는 서열을 의미하고, 밑줄친 부위는 제한 부위를 의미한다) 및 5'-ccggaattcTTTGTAAACTGGCTTGAAGAT-3'(서열 번호 9)를 사용하였다. PCR 생성물을 PstI/EcoRI 절단하고 그 다음 KS 폴리링커에 클로닝하여 p1을 생성하였다. 이어서, 상보성 올리고뉴클레오티드 5'-gatccCCCCCCCCTCCTCCACCCCCACCCCCTCCC-3'(서열 번호 10) 및 5'-GGGAGGGGGTGGGGGTGGAGGAGGGGGGGGg-3'(서열 번호 11)을 어닐링하고(이러한 2본쇄 올리고뉴클레오티드는 프롤린 고밀도 모티프를 암호함), 이 2본쇄 생성물을 SmaI/BamHI 분해된 p1에 결찰시켜 p2를 생성하였다.

그 다음, 올리고뉴클레오티드 프라이머 5'-cgcgatatcAAAGTCGCCCCCCCGACCGAT-3'(서열 번호 12) 및 5'-cgcgatatcCCCACCGTACTCGTCAATTCC-3'(서열 번호 13)을, 주형으로 pVP16(Clontech, 미국 캘리포니아주 팔로알토 소재)을 사용하여 258 bp 단편을 증폭하기 위한 PCR 반응에 사용하였다. 생성물은 VP16의 산성 고밀도 도메인을 암호한다. 이 생성물을 EcoRV로 분해하고, SmaI 분해된 소 알칼리 포스파타제 처리된 p2에 비해 〉20배 이상의 과량인 EcoRV 삽입체를 사용하여 결찰 반응을 실시하였다. VP16 서열의 복수 직렬 삽입체를 포함하는 플라스미드를 갖고 있는 박테리아 형질전환체를 선별하였다. VP16 암호 서열내의 SmaI 부위는 삽입 배향이 결정될 수 있게 허용한다. VP16 산성 고밀도 도메인의 4개의 삽입체를 포함하는 플라스미드를 선택한다(p3). 그 결과, p3은 VP16 도메인의 4개의 반복체에 프레임에 맞게 배치된 프롤린 고밀도 도메인을 암호하고, 이 TAD들에는 crnA 종결인자를 결합시킨다.

다음 클로닝 단계에서는 상기 TAD들의 암호 서열에 pacC의 절두 형태를 융합시켰다. 아스퍼질러스 니듈란스 cDNA 라이브러리 유래의 1419 생성물(서열 번호 16)을 증폭시키기 위하여 프라이머 5'-tgctctagaGGCGCCATGGCCGAAGAAGCG-3'(서열 번호 14) 및 5'-cgcggatccGTAACCAGAAGTCATACCGTC-3'(서열 번호 15)를 사용한다. 이 생성물을 XbaI/BamHI 절단하고, 절단된 p3에 결찰시켜 p4를 만든다. 이 클로닝 반응은 전술한 TAD들에 프레임에 맞게, 카르복시 말단 209 아미노산이 결실된 pacC 형태를 도입시킨다.

상기 키메라에 대한 암호 서열을 강력한 프로모터의 제어하에 배치하는데에는 부가 클로닝 단계가 필요로 된다. 아스퍼질러스 니듈란드 게놈 DNA 유래의 PGK 프로모터 서열(서열 번호 19)의 689 bp를 증폭시키기 위하여 프라이머 5'-ataagaatgcggccgcCCTCTGCATTATTGTCTTATC-3'(서열 번호 17) 및 5'-tgctctagaAGACATTGTTGCTATAGCTGT-3'(서열 번호 18)을 사용한다. 이 단편을 NotI/XbaI 절단하고, 절단된 p4에 클로닝하여 p5를 생산한다. 즉, p5는 PGK 프로모터로부터 발현되는 815 아미노산 키메라 전사 인자의 암호 서열을 포함한다.

위치 효과의 정도를 줄이기 위하여, p5 작제물이 pyrG 유전자좌를 표적으로 하도록 유도하였다. 즉, 아스퍼질러스 니듈란스 게놈 DNA 유래의 2240 bp 생성물(서열 번호 22)을 증폭시키기 위하여 올리고뉴클레오티드 5'-tccccgcggATGGAAGCTTCGTTAAGGATAATT-3'(서열 번호 20) 및 5'-ataagaatgcggccgcCTACCAGATTAGGGAGCATAT-3'(서열 번호 21)을 사용하였다. 이 생성물은 오로티딘-5'-포스페이트 탈카르복실라제를 암호하는 pyrG 유전자의 암호 서열 및 조절 서열을 포함한다. 2240 bp 단편을 SacII/NotI 절단하고, 그 다음 p5에 클로닝하여 p6을 생산하였다. 이 단편을 다시 KS에 클로닝하여 p7(대조 작제물, pyrG 유전자의 조절 서열은 포함하지만, PGK 프로모터 또는 전사 인자는 포함하지 않음)을 만들었다. p6과 p7은 선발에 이용할 수 있는 우리딘 영양요구주를 보충할 수 있는 벡터로서, 키메라 전사 인자를 pyrG 유전자좌에 대하여 표적화한다. 또한, 아스퍼질러스 니듈란스 cDNA 라이브러리로부터 PacC의 절두 형태를 증폭시키기 위하여 프라이머 5'-tgctctagaGGCGCCATGGCCGAAGAAGCG-3'(서열 번호 23) 및 5' tcccccgggGTAACCAGAAGTCATACCGTC-3'(서열 번호 24)를 사용하였다. 이 단편을 XbaI/SmaI 절단된 p6에 클로닝하여 p8을 생산하였다. p8은 대조 작제물로서, 이종 TAD의 존재와는 무관하게 PGK 프로모터로부터 발현되는 전구활성화된 PacC의 활성을 모니터하는데 사용된다.

PEG-CaCl₂(또는 본 명세서에 기재된 기타 다른 방법)를 사용하여 pyrG 돌연변이를 보유하는 우리딘 영양요구주의 원형질을 형질전환시켰다(Ballance and Turner, Gene, 1985, 36:321-331). p6, p7 및 p8 플라스미드 DNA를 사용하여 우리딘 원영양주로 형질전환시켰다. PCR 및 서던 분석을 실시하여 pyrG에서의 단일복사체 통합을 확인하였다.

여러 방법을 이용하여 야생형, 전구활성화형 및 키메라 PacC-TAD 인자의 활성을 측정하였다. 균사 샘플은 p6, p7 및 p8을 포함하는 균주를 대등하게 발효시켜 얻었다. 이 균사의 추출물로부터 제조한 RNA에 대하여 노던 블롯 분석을 실시하였다. 프로브는 아스퍼질러스 니듈란스의 ipnA 유전자 및 acvA 유전자에 대한 암호 서열로부터 제조하였다. 리포터 작제물은 PacC 활성화의 정도를 조사할 수 있는 중요한 기구이다. 예를 들어, ipnA 및 acvA는 공통 조절 서열로부터 각각 전사된다. 동일 플라스미드내에 ipnA-lacZ 및 acvA-uidA 리포터를 포함하는 작제물(예, pAXB4A; Brakhage et al., 상기 문헌)을 사용할 수 있다. 이러한 특정 플라스미드는 특정 게놈 유전자좌에 통합되도록 argB 유전자좌를 표적으로 하여 유도될 수 있다. argB 및 pyrG 돌연변이를 모두 보유하는 균주를 pyrG 및 리포터 벡터로 연속적으로 형질전환시킬 수 있고, 균사로부터 얻은 추출물을 사용하여 효소 분석을 실시할 수 있다(van Gorcom et al., Gene, 1985, 40:99-106; Pobjecky et al., Mol.Gen.Genet., 1990, 220:314-316). 또한, 생체분석법을 실시하여 키메라 전사 인자가 페니실린과 같은 진균의 2차 대사산물의 생산을 증가시키는지 결정할 수 있다. 발효 배양시 얻은 상징액을 원심분리하여 바실러스 칼리도락티스와 같은 지시 유기체를 포함하는 웰에 첨가할 수 있다(Smith et al., Mol.Gen.Genet., 1989, 216:492-497). 이러한 모든 방법을 사용하면 키메라 전사 인자의 효능을 신속하고 정량적으로 분석할 수 있다.

2차 대사산물 생산 향상

본 명세서에 기재된 작제물 및 방법을 사용하여 진균 발효 배양에 완전히 또는 부분적으로 의존적인 생산을 특징으로 하는 시판 약제의 수율을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 아스퍼질러스 니듈란스의 경우, 페니실린 생합성은 ipnA, acvA 및 aatA가 암호하는 3개의 효소에 의해 촉매된다. 이 유전자 중 2개인 ipnA와 acvA는 PacC에 의해 직접 조절된다. 예를 들어, P_ipnA는 3개 이상의 PacC 결합 부위를 포함한다(ipnA2, ipnA3 및 ipnA4AB)(Espeso and Penalva, J.Biol.Chem., 1996, 271:28825-28830). PacC 절두 형의 발현은 페니실린의 생산 뿐만 아니라 ipnA 및 acvA의 발현을 모두 증가시키는 것으로 밝혀졌다. PacC의 활성화(즉, 단백분해 절단)는 palA, palB, palC, palF, palH 및 palI 유전자에 의해 암호되는 단백질을 필요로 한다. 이들 유전자 중 적어도 일부의 발현을 증가시켜, 페니실린의 생산을 증가시킬 수 있다. 본 명세서에 기재된 예에서, ipnA 및 acvA 발현은 PacC의 DNA 결합 도메인과 4개의 VP16 산성 TAD 및 프롤린 고밀도 TAD를 포함하는 키메라 전사 인자의 형성에 의한 증가에 대해 표적화되었다. 본 발명의 방법을 사용하면, 다른 2차 대사산물의 생산도 증가시킬 수 있다.

발효 배양 동안의 수율이 본 발명의 방법에 의해 증가될 수 있는 시판되는 2차 대사산물의 예로는 사이클로스포린, 페니실린, 세팔로스포린, 맥각 알칼로이드, 로바스타틴, 메바스타틴 및 이것의 생합성 중간체를 포함하지만, 이것에 국한되는 것은 아니다. 또한, 이러한 방법은 발효액 중에서 이러한 대사산물의 농도를 증가시켜 의학적 또는 농업적으로 가치가 있는 새로운 2차 대사산물을 동정할 수 있는 가능성(이에 따라, 화합물에 의한 검출이나 생체분석의 가능성)을 증가시키는데 사용할 수 있다.

진균 2차 대사산물의 생산 및 검출 방법

베타 락탐 항생제, 스타틴, 맥각 알칼로이드, 사이클로스포린 및 기타 다른 진균 대사산물의 발효 및 생산 방법은 문헌[Masurekar, Biotechnology, 1992, 21:241-301] 및 본원의 참고 문헌에 설명되어 있다. 2차 대사산물의 검출은 각 대

서열 목록

Claims

(a) 진균 균주에서 작용성인 전구활성화된 전사 인자 및

(b) 상기 전사 인자와 천연적으로 관련이 있는 전사 활성화 도메인과는 상이한 전사 활성화 도메인을 포함하는 키메라 전사 인자.
제1항에 있어서, 상기 키메라 전사 인자가 상기 전구활성화된 전사 인자에 비해 상당히 증가된 효율로 전사를 활성화시키는 것이 특징인 키메라 전사 인자.
제1항에 있어서, 전구활성화된 전사 인자가 절두(切頭)에 의해 전구활성화되는 것이 특징인 키메라 전사 인자.
제1항에 있어서, 전구활성화된 전사 인자가 세린 또는 트레오닌 잔기 대신 알라닌, 아스파르트산 또는 글루탐산 잔기로의 치환을 포함하고, 이러한 치환이 전사 인자를 전구활성화시키는 것이 특징인 키메라 전사 인자.
제3항에 있어서, 전구활성화된 전사 인자가 아스퍼질러스 니듈란스(Aspergillus nidulans) PacC와 실질상 동일한 것이 특징인 키메라 전사 인자.
(a) 아스퍼질러스 니듈란스 PacC와 실질상 동일한 전사 인자 및

(b) 상기 전사 인자와 천연적으로 관련이 있는 전사 활성화 도메인과는 상이한 전사 활성화 도메인을 포함하는 키메라 전사 인자.
제1항에 있어서, 상기 전구활성화된 전사 인자가 도 1에 도시된 아미노산 서열(서열 번호 1 내지 6)을 포함하는 것이 특징인 키메라 전사 인자.
제1항에 있어서, 전구활성화된 전사 인자가 5'-GCCAAG-3' 또는 5'-GCCAGG-3'를 포함하는 DNA 서열에 결합하는 것이 특징인 키메라 전사 인자.
진균 균주내에서 키메라 전사 인자의 발현을 조절할 수 있는 프로모터에 작동가능하게 결합된 제1항에 기재된 키메라 전사 인자를 암호하는 DNA를 포함하는 벡터.
제9항에 기재된 DNA를 포함하고 발현하는 진균 세포.
제10항에 있어서, 상기 진균 세포가 사상 진균 세포인 것이 특징인 진균 세포.
제10항에 있어서, 상기 세포가 2차 대사산물을 생산하고 상기 DNA의 발현이 상기 세포에 의한 2차 대사산물의 생산을 증가시키는 것이 특징인 진균 세포.
제12항에 있어서, 상기 2차 대사산물이 비단백성인 것이 특징인 진균 세포.
제12항에 있어서, 상기 2차 대사산물이 단백질 또는 펩티드인 것이 특징인 진균 세포.
2차 대사산물 생산 조건하에서 제10항에 기재된 진균 세포를 배양하는 단계를 포함하여 2차 대사산물을 생산하는 방법.
(a) (i) 진균 세포 중에서 유전자 발현을 조절할 수 있는 프로모터와, (ii) (1) DNA 결합 도메인 및 (2) 전사 활성화 도메인을 포함하는 전사 인자를 암호하는 핵산을 포함하는 벡터를 진균 세포 중으로 도입시키는 단계, 및

(b) 상기 진균 세포를 2차 대사산물 생산 조건하에서 배양하는 단계를 포함하여 2차 대사산물을 생산하는 방법.
제16항에 있어서, 상기 진균 세포가 사상 진균 세포인 것이 특징인 방법.
제16항에 있어서, 전사 인자가 키메라 전사 인자인 것이 특징인 방법.
제16항에 있어서, 전사 인자가 전구활성화된 전사 인자인 것이 특징인 방법.
제16항에 있어서, 전사 인자가 세린 또는 트레오닌 잔기 대신 알라닌, 아스파르트산 또는 글루탐산 잔기로의 치환을 포함하고, 이러한 치환이 전사 인자를 전구활성화시키는 것이 특징인 방법.
제16항에 있어서, 전사 인자가 절두에 의해 전구활성화되는 것이 특징인 방법.
제16항에 있어서, DNA 결합 도메인이 진균 전사 활성인자 유래인 것이 특징인 방법.
제16항에 있어서, DNA 결합 도메인이 진균 전사 억제인자 유래인 것이 특징인 방법.
제16항에 있어서, 전사 활성화 도메인이 상기 전사 인자와 천연적으로 관련이 있는 전사 활성화 도메인과는 상이한 것이 특징인 방법.