JP2022116034A - インフルエンザウイルスを標的とするdnaモノクローナル抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2016年5月5日に出願された米国仮出願第62/332,381号、及び、2016年8月17日に出願された米国仮出願第62/376,162号の優先権を主張し、各出願の全内容を、本明細書の一部を構成するものとして援用する。
特に定義していない限り、本明細書で使用する全ての技術的用語及び科学的用語は、当業者が一般的に理解するものと同じ意味を有する。矛盾が生じる場合には、定義を含めて本明細書が優先となる。本発明の実施または試験において、本明細書に記載したものと同様または同等の方法及び材料を用いることはできるが、好適な方法及び材料を以下に記載する。本明細書で言及する全ての刊行物、特許出願、特許、及び、他の引用文献は、本明細書の一部を構成するものとしてその全内容を援用する。なお、本明細書で開示した材料、方法、及び、実施例は、単なる例示であり、限定することを意図するものではない。
本発明は、抗体、その断片、その変異体、または、それらの組み合わせをコードする組換え核酸配列を含む組成物に関する。当該組成物は、それを必要とする対象に投与する場合、当該対象において合成抗体を生成することができる。当該合成抗体は、当該対象に存在する標的分子(すなわち、インフルエンザ抗原)に結合することができる。そのような結合は、抗原を、中和して、別の分子、例えば、タンパク質、または、核酸による当該抗原の認識をブロックし、そして、当該抗原に対する免疫応答を惹起または誘導することができる。
上記したように、当該組成物は、組換え核酸配列を含むことができる。当該組換え核酸配列は、当該抗体、その断片、その変異体、または、それらの組み合わせをコードすることができる。当該抗体の詳細については、後述する。
当該組換え核酸配列は、1つ以上の組換え核酸配列構築物を含むことができる。当該組換え核酸配列構築物は、1つ以上の構成要素を含むことができ、その詳細については、後述する。
当該組換え核酸配列構築物は、当該重鎖ポリペプチド、その断片、その変異体、または、それらの組み合わせをコードする異種核酸を含むことができる。当該重鎖ポリペプチドは、可変重鎖(VH)領域、及び/または、少なくとも1つの定常重鎖(CH)領域を含むことができる。少なくとも1つの当該定常重鎖領域は、定常重鎖領域1(CH1)、定常重鎖領域2(CH2)、定常重鎖領域3(CH3)、及び/または、ヒンジ領域を含むことができる。
当該組換え核酸配列構築物は、当該軽鎖ポリペプチド、その断片、その変異体、または、それらの組み合わせをコードする異種核酸配列を含むことができる。当該軽鎖ポリペプチドは、可変軽鎖(VL)領域、及び/または、定常軽鎖(CL)領域を含むことができる。
当該組換え核酸配列構築物は、当該プロテアーゼ開裂部位をコードする異種核酸配列を含むことができる。当該プロテアーゼ開裂部位は、プロテアーゼまたはペプチダーゼによって認識することができる。このプロテアーゼは、エンドペプチダーゼまたはエンドプロテアーゼとすることができ、例えば、フーリン、エラスターゼ、HtrA、カルパイン、トリプシン、キモトリプシン、トリプシン、及び、ペプシンなどがあるが、これらに限定されない。このプロテアーゼを、フーリンとすることができる。他の実施形態において、このプロテアーゼを、セリンプロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、または、内部ペプチド結合を開裂する(すなわち、N-末端またはC-末端ペプチド結合を開裂しない)あらゆるプロテアーゼとすることができる。
組換え核酸配列構築物は、1つ以上のリンカー配列を含むことができる。当該リンカー配列は、本明細書に記載の1つ以上の構成要素を、空間的に分離、または、連結することができる。他の実施形態において、当該リンカー配列は、2つ以上のポリペプチドを空間的に分離、または、連結するアミノ酸配列をコードすることができる。
当該組換え核酸配列構築物は、1つ以上のプロモーターを含むことができる。1つ以上の当該プロモーターは、遺伝子発現を駆動し、かつ、調節することが可能なあらゆるプロモーターとし得る。かようなプロモーターは、DNA依存RNAポリメラーゼを経由する転写に必要とされるシス作用配列要素である。遺伝子発現の指示に用いられるプロモーターは、特定の用途に依って選択される。当該プロモーターは、その自然環境における転写開始部位から由来しているため、当該組換え核酸配列構築物の当該転写開始からほぼ同じ距離で位置し得る。しかしながら、この距離の変動は、プロモーター機能を喪失せずに、適合し得る。
当該組換え核酸配列構築物は、1つ以上のイントロンを含むことができる。各イントロンは、機能的スプライスドナー部位、及び、機能的スプライスアクセプター部位を含むことができる。当該イントロンは、スプライシングのエンハンサーを含むことができる。当該イントロンは、効率のよいスプライシングに必要な1つ以上のシグナルを含むことができる。
当該組換え核酸配列構築物は、1つ以上の転写終止領域を含むことができる。当該転写終止領域は、効率的な終止を提供するためにコード配列の下流とすることができる。当該転写終止領域は、上記したプロモーターと同じ遺伝子から取得することができ、あるいは、1つ以上の異なる遺伝子から取得することもできる。
当該組換え核酸配列構築物は、1つ以上の開始コドンを含むことができる。当該開始コドンは、当該コード配列の上流に位置させることができる。当該開始コドンは、当該コード配列と共にインフレームにすることができる。当該開始コドンは、効率的な翻訳開始のために必要な1つ以上のシグナルと関連することができ、例えば、リボソーム結合部位と関連することができるが、これに限定されることはない。
当該組換え核酸配列構築物は、1つ以上の終止または停止コドンを含むことができる。当該終止コドンは、当該コード配列の下流とすることができる。当該終止コドンは、当該コード配列と共にインフレームにすることができる。当該終止コドンは、効率的な翻訳終止のために必要な1つ以上のシグナルと関連することができる。
当該組換え核酸配列構築物は、1つ以上のポリアデニル化シグナルを含むことができる。当該ポリアデニル化シグナルは、当該転写の効率的なポリアデニル化のために必要な1つ以上のシグナルを含むことができる。当該ポリアデニル化シグナルは、当該コード配列の下流に位置させることができる。当該ポリアデニル化シグナルは、SV40ポリアデニル化シグナル、LTRポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン(bGH)ポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン(hGH)ポリアデニル化シグナル、または、ヒトβ-グロビンポリアデニル化シグナルとし得る。当該SV40ポリアデニル化シグナルは、pCEP4プラスミド(Invitrogen,San Diego,CA)由来のポリアデニル化シグナルとし得る。
当該組換え核酸配列構築物は、1つ以上のリーダー配列を含むことができる。当該リーダー配列は、シグナルペプチドをコードすることができる。当該シグナルペプチドを、免疫グロブリン(Ig)シグナルペプチドとすることができ、例えば、IgGシグナルペプチド、及び、IgEシグナルペプチドなどがあるが、これらに限定されない。
上記したように、当該組換え核酸配列は、1つ以上の組換え核酸配列構築物を含むことができ、当該組換え核酸配列構築物の各々は、1つ以上の構成要素を含むことができる。1つ以上の当該構成要素とは、先に詳述した通りである。1つ以上の当該構成要素が当該組換え核酸配列構築物に含まれる場合、互いにあらゆる順序で配置し得る。幾つかの実施形態において、1つ以上の当該構成要素は、後述するようにして、当該組換え核酸配列構築物に配置することができる。
ある配置において、第1の組換え核酸配列構築物は、当該重鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列を含むことができ、かつ、第2の組換え核酸配列構築物は、当該軽鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列を含むことができる。
第2の配置において、当該組換え核酸配列構築物は、当該重鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列、及び、当該軽鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列を含むことができる。当該重鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列は、当該軽鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列の上流(または5’)に配置することができる。あるいは、当該軽鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列を、当該重鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列の上流(または5’)に配置することができる。
上記したように、当該組換え核酸配列構築物は、1つ以上の構成要素に、当該重鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列、及び/または、当該軽鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列を含むことができる。したがって、当該組換え核酸配列構築物は、当該重鎖ポリペプチド、及び/または、当該軽鎖ポリペプチドの発現を促す。
上記した当該組換え核酸配列構築物は、1つ以上のベクターに配置することができる。1つ以上の当該ベクターは、複製起点を含むことができる。1つ以上の当該ベクターを、プラスミド、バクテリオファージ、細菌人工染色体、または、酵母人工染色体とすることができる。1つ以上の当該ベクターを、自己複製染色体外ベクター、または、宿主ゲノムに組み込まれるベクターとすることができる。
1つ以上の当該ベクターは、環状プラスミド、または、線状核酸とすることができる。当該環状プラスミド、及び、線状核酸は、適切な対象細胞において特定のヌクレオチド配列の発現を指示することができる。当該組換え核酸配列構築物を含む1つ以上の当該ベクターは、キメラとすることができ、このことは、その構成要素の少なくとも1つが、その他の構成要素の少なくとも1つに関して異種であることを意味している。
1つ以上の当該ベクターを、プラスミドとすることができる。当該プラスミドは、当該組換え核酸配列構築物で細胞をトランスフェクトするために有用であり得る。当該プラスミドは、当該組換え核酸配列構築物を当該対象に導入するために有用であり得る。また、当該プラスミドは、当該プラスミドが投与される細胞における遺伝子発現に十分に適合し得る調節配列を含み得る。
ある実施形態において、当該核酸は、RNA分子である。ある実施形態において、当該RNA分子は、本明細書に記載したDNA配列から転写される。例えば、幾つかの実施形態において、当該RNA分子は、配列番号9~16のいずれか1つによってコードされる。別の実施形態において、当該ヌクレオチド配列は、配列番号9~16のポリペプチド配列、または、その変異体、または、その断片をコードするDNA配列によって転写されるRNA配列を含む。したがって、ある実施形態において、本発明は、1つ以上のDMAbをコードするRNA分子を提供する。当該RNAは、プラス鎖とし得る。したがって、幾つかの実施形態において、当該RNA分子は、逆転写などの介在性複製ステップを必要とせずに、細胞によって翻訳することができる。本発明に有用なRNA分子は、5’キャップ(例えば、7-メチルグアノシン)を有し得る。このキャップは、当該RNAのインビボでの翻訳を改善することができる。本発明に有用なRNA分子の当該5’ヌクレオチドは、5’三リン酸基を有し得る。キャップしたRNAにおいて、このものは、5’から5’への架橋を介して7-メチルグアノシンに連結し得る。RNA分子は、3’ポリ-Aテイルを有し得る。それは、ポリAポリメラーゼ認識配列(例えば、AAUAAA)も、3’末端の近傍に有する。本発明に有用なRNA分子は、一本鎖とし得る。本発明に有用なRNA分子は、合成RNAを含み得る。
1つ以上の当該ベクターを、細胞ゲノムへの組み込みによって標的細胞を形質転換し得るか、あるいは、染色体外に存在し得る環状プラスミド(例えば、複製起点を有する自律複製プラスミド)とし得る。当該ベクターは、pVAX、pcDNA3.0、または、provax、または、当該組換え核酸配列構築物によってコードされる当該重鎖ポリペプチド、及び/または、当該軽鎖ポリペプチドを発現することができるあらゆる他の発現ベクターとし得る。
ある実施形態において、本明細書において、本発明の核酸を細胞に送達することができるウイルスベクターを提供する。当該発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に提供され得る。ウイルスベクター技術は、当該技術分野で周知であり、例えば、Sambrook et al.(2001)、及び、Ausubel et al.(1997)、及び、その他のウイルス学、及び、分子生物学のマニュアルに記載がされている。ベクターとして有用なウイルスとして、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、及び、レンチウイルスなどがあるが、これらに限定されない。一般的に、適切なベクターは、少なくとも1つの生物において機能する複製起点、プロモーター配列、好都合な制限エンドヌクレアーゼ部位、及び、1つ以上の選択マーカーを含む。(例えば、WO01/96584、WO01/29058、及び、米国特許第6,326,193号を参照されたい。ウイルスベクター、特に、レトロウイルスベクターは、遺伝子を哺乳類、例えば、ヒト細胞に挿入するための最も広く使用されている方法となっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスI、アデノウイルス、及び、アデノ随伴ウイルスなどから誘導することができる。例えば、米国特許第5,350,674号、及び、第5,585,362号を参照されたい。
本明細書では、当該組換え核酸配列構築物が配置された1つ以上のベクターを調製する方法を提供する。最後のサブクローニング工程の後に、当該ベクターを用いて、当該技術分野で周知の方法を用いて、大規模発酵タンクに細胞培養物を接種することができる。
上記したように、当該組換え核酸配列は、抗体、その断片、その変異体、または、それらの組み合わせをコードすることができる。当該抗体は、抗原に結合できるか、あるいは、抗原と反応することができ、その詳細は、後述する。
当該組換え核酸配列は、二重特異性抗体、その断片、その変異体、または、それらの組み合わせをコードすることができる。当該二重特異性抗体は、2つの抗原、例えば、その詳細を後述する抗原の2つと結合または反応することができる。当該二重特異性抗体は、本明細書に記載の抗体の2つの断片から構成することができ、それにより、当該二重特異性抗体は、2つの所望の標的分子との結合または反応が可能となり、それら標的分子は、その詳細を後述する抗原、受容体に対するリガンドを含むリガンド、受容体上のリガンド結合部位を含む受容体、リガンド-受容体複合体、及び、がんマーカーを含むマーカーを含み得る。
当該組換え核酸配列は、二機能性抗体、その断片、その変異体、または、それらの組み合わせをコードすることができる。当該二機能性抗体は、後述する抗原と結合するか、または、反応することができる。当該二官能性抗体は、当該抗原の認識及び抗原への結合を超えて、当該抗体に対して付加的な機能性を付与するように改変することもできる。そのような改変として、因子H、または、その断片へのカップリングを含むことができるが、これらに限定されない。因子Hは、補体活性化の可溶性調節因子であり、また、補体媒介性溶解(CML)を介した免疫応答に寄与し得る。
上記したように、当該抗体を、当該対象における当該抗体の半減期を延長または短縮するように改変し得る。当該改変は、当該対象での当該血清に含まれる当該抗体の当該半減期を延長または短縮し得る。
当該組換え核酸配列は、フコシル化されていない抗体(すなわち、脱フコシル化抗体、または、非フコシル化抗体)、その断片、その変異体、または、それらの組み合わせをコードすることができる。フコシル化は、当該糖フコースの分子への付加、例えば、N-グリカン、O-グリカン、及び、糖脂質へのフコースの結合を含む。したがって、脱フコシル化抗体では、フコースは、当該定常領域の当該炭水化物鎖に結合していない。次に、このフコシル化が欠如すると、当該フコシル化抗体と比較して、当該抗体によるFcγRIIIa結合、及び、抗体依存性細胞毒性(ADCC)活性を改善し得る。したがって、幾つかの実施形態において、当該非フコシル化抗体は、フコシル化抗体と比較して、ADCC活性の増加を示し得る。
当該抗体を改変して、当該抗原に関連する疾患の抗体依存性感染増強(ADE)は抑制または防止するが、当該抗原は依然として中和し得る。
当該合成抗体は、その抗原、または、その断片または変異体に関する。当該抗原を、核酸配列、アミノ酸配列、または、それらの組み合わせとすることができる。当該核酸配列を、DNA、RNA、cDNA、その変異体、その断片、または、それらの組み合わせとすることができる。当該アミノ酸配列を、タンパク質、ペプチド、その変異体、その断片、または、それらの組み合わせとすることができる。
幾つかの実施形態において、当該抗原は、外来である。外来抗原は、体内に導入された場合、免疫応答を刺激することができるあらゆる非自己物質(すなわち、当該対象の外部由来のもの)である。
当該外来抗原を、ウイルス抗原、または、その断片、または、その変異体とすることができる。
幾つかの実施形態において、当該抗原は、自己抗原である。自己抗原は、免疫応答を刺激することが可能な当該対象自身の身体の構成要素としてもよい。幾つかの実施形態において、自己抗原は、当該対象が、疾患状態、例えば、自己免疫疾患でなければ、免疫応答を誘発しない。
当該組成物は、医薬として許容される賦形剤をさらに含み得る。医薬として許容される当該賦形剤を、ビヒクル、担体、または、希釈剤としての機能的分子とすることができる。医薬として許容される当該賦形剤を、界面活性剤を含むことができる、トランスフェクション促進剤、例えば、免疫刺激複合体(ISCOMS)、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリル脂質AなどのLPS類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、スクアレン及びスクアレンなどの小胞、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、または、ナノ粒子、または、その他の公知のトランスフェクション促進剤とすることができる。
また、本発明は、合成抗体の生成方法に関する。当該方法は、その詳細を後述する送達方法を用いて、それを必要とする当該対象に対して当該組成物を投与することを含むことができる。したがって、当該組成物を当該対象に投与した際に、当該合成抗体は、対象内またはインビボで生成される。
さらに、本発明は、上記した抗原に反応または結合する上記した抗体の同定またはスクリーニングの方法に関する。当該抗体を同定またはスクリーニングする当該方法を、当業者に周知の方法論における抗原に用いて、抗体を同定またはスクリーニングすることができる。そのような手法として、ライブラリ(例えば、ファージディスプレイ)由来の当該抗体の選択、及び、動物の免疫処置、続いて、当該抗体の単離、及び/または、精製があるが、これらに限定されない。
また、本発明は、当該組成物を、それを必要とする当該対象に対して送達する方法に関する。当該送達方法は、当該組成物を、当該対象に対して投与することを含む、ことができる。投与としては、インビボ電気穿孔を利用する、及び、同電気穿孔を利用しないDNA注入、リポソーム介在送達、及び、ナノ粒子促進送達などがあるが、これらに限定されない。
電気穿孔による当該組成物の投与は、細胞膜に可逆的な孔を形成させるのに効果的なエネルギーパルスを哺乳動物の所望の組織に送達するように構成することができる電気穿孔装置を用いて達成され得るものであり、及び、好ましくは、当該エネルギーパルスは、使用者が入力したプリセット電流に近い定電流である。当該電気穿孔装置は、電気穿孔コンポーネント、及び、電極アセンブリ、または、ハンドルアセンブリを含み得る。電気穿孔コンポーネントは、制御器、電流波形発生器、インピーダンステスタ、波形ロガー、入力要素、ステータス報告要素、コミュニケーションポート、メモリーコンポーネント、電源、及び、電源スイッチなどの当該電気穿孔装置の1つ以上の様々な要素を含み、及び、組み込み得る。当該電気穿孔は、インビボ電気穿孔装置、例えば、CELLECTRA EPシステム(Inovio Pharmaceuticals,Plymouth Meeting,PA)、または、Elgenエレクトロポレーター(Inovio Pharmaceuticals,Plymouth Meeting、PA)を使用して、プラスミドによる細胞のトランスフェクションを容易にし得る。
本明細書でさらに提供されるものは、それを必要とする対象において、疾患の処置、疾患に対して保護、及び/または、予防をする方法であり、合成抗体を当該対象内で生成する。当該方法は、当該組成物を当該対象に投与することを含むことができる。当該対象への当該組成物の投与は、上記した送達の方法を用いて行うことができる。
以下の例において、本発明をさらに例示する。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すものであって、例示目的のみで記載しているものと理解すべきである。上記した説明、及び、これらの実施例から、当業者であれば、本発明に必須の特徴を確認することができ、また、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、本発明に対して様々な変更や改変を加えて、様々な用途や条件に適合させることができる。したがって、本明細書で説明した発明に加えて、本発明に対して様々な改変を加えることが当業者に自明であることは、上記した説明からも明らかである。そのような改変も、特許請求の範囲に属していることも意図をしている。
抗-インフルエンザ5J8及びFI6抗体クローン配列は、すでに公開されている(Krause et al., 2011, J virol 85(20):10905-8;Corti et al., 2011, Science 333(6044):850-6)。可変領域DNA配列をコドン最適化し、そして、定常ヒトIgG1κ主鎖へと合成した。構築体を、改変したpVax-1哺乳動物発現プラスミドにクローニングした。フーリン/2Aペプチド開裂部位を、重鎖及び軽鎖ペプチドの分離のために取り込んだ。(図1)。
1×106個の293T細胞を、GeneJammer(Agilent Technologies)を用いて、0.5μgのプラスミドDNAでトランスフェクトした。細胞上清、及び、全溶解物を、トランスフェクションの48時間後に回収した。
大腿四頭筋へ筋肉内送達して100~300μgのプラスミドDNAを与え、次いで、先述したようにして、CELLECTRA(登録商標)3Pデバイス(Inovio Pharmaceuticals, Plymouth Meeting, PA)で電気穿孔した(Flingai et al., 2015,Sci Rep 29(5):12616;Muthumani et al., 2013,Hum Vaccin Immunother,9(10):2253-62)。
ヒトIgG1κを、抗-ヒト-Fc断片を用いて捕捉し、そして、ヒトIgG1κ標準抗体に対する定量を使って、抗-κ-軽-鎖-HRP結合抗体(Bethyl)で検出した。組換えHA(Immune-Technologies)に対する結合を、HRP-結合抗-ヒト-IgG二次抗体(Sigma-Aldrich)で検出した。ウエスタンブロットを、結合抗-ヒトIgG 800nm抗体(Licor)を用いて行った。
モノクローナル抗体の可変VH及びVLアミノ酸配列を、DNAコドン最適化した。当該コドン最適化DNAを、ヒトIgG1κ抗体定常CH及びCL領域DNA配列を用いて合成した。改変した当該DNA配列を、改変したpVax-1発現ベクターにクローニングした。当該プラスミド構築物を筋肉内注射し、続いて、CELLECTRA(登録商標)デバイス(Inovio Pharmaceuticals)を用いて電気穿孔した。インビボで産生されたヒトIgG1 DMAbの発現及び機能を測定した。
当該DMAb構築物は、抗-インフルエンザモノクローナル抗体5J8(抗-HA 5J8)、及び、FI6(抗-HA FI6)由来の可変領域を含む。FJ8は、可変球状頭部の受容体結合ポケットに結合し、そして、複数のA型インフルエンザ型H1ウイルスと交差反応をする。FI6は、比較的に保存が良好な融合サブドメインに結合し、そして、グループ1及びグループ2のA型インフルエンザウイルスを広範に中和する(図2)。
実験を行って、DMAb構築物によってコードされた抗-インフルエンザ-HA抗体5J8及びFI6の発現及び分泌を評価した。HEK 293T細胞を、5J8またはFI6構築物を保有するプラスミドDNAでトランスフェクトした。空のプラスミドを、陰性コントロールとして用いた。ヒトIgG1κ発現を、定量的ELISAによって決定し、そして、ウエスタンブロットを実施して、上清及び溶解物の重鎖及び軽鎖ペプチドの開裂及び発現を検出した(図3A~図3B)。図3Bに示したように、抗-HA 5J8及び抗-HA FI6は、HEK 293T上清及びHEK 293T溶解物で認められており、このことは、抗-HA 5J8及び抗-HA FI6の発現及び分泌を誘導する当該DMAb構築物の能力を実証している。
実験を行って、DMAbが、インビボで、抗-HA 5J8、及び、抗-HA FI6の発現を誘導するか否かを評価した。BALB/cマウスに、5J8またはFI6プラスミドDNAを注射し、続いて、電気穿孔を行った。7日後に、血清ヒトIgG1κ抗体レベルを、ELISAで決定した。図3A及び図3Bに示したように、高レベルの抗-HA 5J8及び抗-HA FI6抗体が、筋肉のDNA電気穿孔をした後に、マウス血清で産生されている。
実験を行って、発現した抗-HA FI6の機能性を調べた。BALB/cマウスに300μgのプラスミドDNAを注射し、続いて、筋肉内の電気穿孔を行った。4週間後に、組換えA型インフルエンザH1 HA抗原に結合するDMAbを、ELISAで決定した。図5に示したように、発現した当該抗体は、標的A/Brisbane/59/2007及びA/California/07/2009標的に結合する。
マウス血清でのヒトIgGの量を、ELISAで決定した。HA結合ELISAは、種々のA型インフルエンザ亜型、及び、B型インフルエンザ系統に由来する精製された組換え三量体HAタンパク質で行った。
MDCK細胞を使用し、そして、Kallewaard et al., 2016に記載されたのと同様にしてノイラミニダーゼ活性を測定することで、インフルエンザウイルスのパネルに対してマイクロ中和活性をアッセイした。
Balb/cマウスにDMAbプラスミド(複数可)の筋肉内注射を行い、その直後に、CELLECTRA 3P適応定電流デバイス(Inovio Pharmaceuticals)を用いた、電気穿孔を行った。4日後に、致死量のA型インフルエンザ(A/California/7/2009 3×LD50,7:1 A/Puerto Rico/8/34:A/Hong Kong/8/68 7×LD50)を、あるいは、5日後に、致死量のB型インフルエンザ(B/Malaysia/2506/2004 10×LD50、B/Florida/4/2006 7×LD50)を、マウスに接種した。IgGと比較をするために、接種の1日前に、マウスの群に対して、精製モノクローナル抗体を腹腔内に注射して等級づけをした。感染当日に、血清試料を採取した。体重減少及び生存を、感染後の12日間、モニターをした。マウスの体重が当初よりも25%減量したところで、安楽死させた。
血清におけるDMAbの定量(図8)は、IgG発現を確認し、そして、当該タンパク質が、機能的であることを示している。FluA DMAb及びFluB DMAbの電気穿孔をして5日後に、血清を回収し(図9)、そして、ヒトIgG発現、様々なHAタンパク質への結合活性、及び、中和活性について評価をした。FluA-DMAb及びFluB-DMAbの双方で処置をした動物に由来する血清抗体は、同等のIgG濃度においてインビトロで産生をしたモノクローナル抗体と同様のHA結合活性とウイルス中和活性とを示しており、このことは、当該筋肉細胞が産生したDMAbは、インビボで発現されており、かつ、機能的であったことを示している(図10)。
A型インフルエンザ接種試験において、FluA-DMAbの投与は、無関係のコントロールDMAbと比較して、マウスを致命的ウイルス感染から有意に保護しており、そして、体重減少を抑制した。FluA-DMAbは、0.3mg/kgの精製FluA IgGと同様のレベルで、致命的なA型インフルエンザ感染からマウスを保護していた(図11)。同様に、マウスにFluB-DMAbを与えた後に致命的B型インフルエンザを感染させた場合、当該FluB-DMAbは、いずれかの系統に由来するB型インフルエンザウイルスによる致命的感染に対して、100%を生存させていた。同様に、FluB DMAbは、1mg/kgの精製FluB IgGと同様のレベルで、致命的B型インフルエンザ感染からマウスを保護している(図12)。
FluAとFluB DMAbとを組み合わせて投与すると、A型及びB型インフルエンザの双方の感染から保護をする。FluA DMAb及びFluB DMAbの併用投与は、A型インフルエンザIgG及びB型インフルエンザIgG血清発現をもたらした。A型またはB型インフルエンザのいずれかの致命的感染から動物は保護されている(図13)。
モノクローナル抗体は、先述したのと同様の方法論(Kallewaard et al., 2016,166:596-608;Pappas et al., 2014,Nature 516:418-22;Traggiai et al., 2004, Nat Med 10:871-5)を用いて単離をした。当該交差反応性A型インフルエンザモノクローナル抗体(FluA)は、H5及びH7 HAタンパク質(Kallewaard et al., 2016,166:596-608)に対する交差反応性結合に基づいて単離し、そして、B型インフルエンザモノクローナル抗体(FluB)は、異なる系統のB型インフルエンザに対する中和活性に基づいて単離をした。可変遺伝子配列を、RT-PCRによって、交差反応性クローンから単離し、クローニングを行い、そして、さらに改変を行って、非必須非生殖細胞系構成アミノ酸変化を戻した。全長ヒトIgG1κをCHO細胞で一過的に発現させ、そして、インビボでの研究に供するために精製した。プラスミドDNAがコードしたモノクローナル抗体(DMAb)構築物を、先述したようにして改変をした(Muthumani et al., 2016,J Infect Dis 214:369-78;Flingai et al., 2015,Sci Rep 5:12616)。DMAb構築物は、ヒトIgG1κモノクローナル抗体FluA DMAb及びFluB DMAbを完全にコードした。抗体のアミノ酸配列を、ヒト/マウスでの発現のために、DNAコドン最適化及びRNA最適化を行い、そして、得られたDNA導入遺伝子を、デノボで合成した(Genscript、Picastaway、NJ、USA)。合成導入遺伝子を、サイトメガロウイルス(CMV)前初期プロモーター下で、改変したpVax1哺乳動物発現ベクター(Invitrogen)に制限クローニングした。細胞のプロセッシング及び分泌のために、IgE重鎖及び軽鎖リーダー配列を添加した。最初の研究(図14~図17)において、導入遺伝子は、フーリン/ピコルナウイルス-2A(P2A)ペプチド開裂部位配列によって分離された抗体重鎖及び軽鎖配列から構成されており、そこでは、インシスで、単一プラスミドからの重鎖及び軽鎖ペプチドの発現が認められる。FluAとFluB DMAbの同時投与(図18)を行った後出の研究では、重鎖または軽鎖FluAペプチドを個別に発現する2つのFluA DMAb構築物を、イントランスで、別々のプラスミドに由来する重鎖及び軽鎖FluAペプチドの発現のために混合をした。
ヒト293T細胞(ATCC)を、10%ウシ胎仔血清を補充したダルベッコ改変イーグル培地(Invitrogen)で維持した。トランスフェクションの1日前に、0.25×106細胞/ウェルで、12ウェルプレートに細胞を接種し、そして、GeneJammer(Agilent Technologies)を用いて、0.5μgのプラスミドDNAでトランスフェクトした。48時間後に上清を回収し、そして、接着細胞を、プロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche Boehringer Mannheim)を含む1×細胞溶解緩衝液(Cell Signaling)で溶解した。約50μgの総上清/溶解物タンパク質、及び、10μgのタンパク質IgGを、SeeBlue Plus2プレ染色タンパク質標準(Thermo Fisher Scientific)を用いて、プレキャスト4~12%Bis-trisゲル(Invitrogen)に対して流し込み、そして、iBlot 2 Dry Blotting System(Thermo Fisher Scientific)を用いて、Immobilon-FL PVDF膜(EMD Miliipore)へと移した。重鎖、及び、軽鎖のペプチドは、IRDye 800CWヤギ抗ヒトIgG(H+L)(LI-COR Biosciences)(1:10,000)を用いて同定をした。蛍光ブロットを、Odyssey CLx(LI-COR Biosciences)でスキャンをした。
図14及び図19における細胞溶解物、細胞上清、及び、マウス血清での全ヒトIgG1κの定量のために、96ウェルMaxiSorpプレート(Nunc)を、10μg/mlのヤギ抗ヒトIgG Fc断片(Bethyl Laboratories)で、一晩、4℃で、コーティングした。プレートを、10%FBSを含むPBSでブロックした。試料を、1×PBS+0.1%Tween20(PBST)で希釈し、次いで、プレートに1時間にわたって添加した。精製ヒトIgG1κ(Bethyl Laboratories)を用いて、標準曲線を作成した。プレートを、HRP結合二次抗体ヤギ抗-ヒトκ軽鎖(Bethyl Laboratories)(1:20,000)で1時間かけて染色し、SigmaFast OPD(Sigma-Aldrich)を用いて発色させ、そして、2N硫酸で停止した。吸光度450nmを、Synergy2プレートリーダー(Biotek)で測定した。
組換えヘマグルチニン(HA)タンパク質を、上記したようにして、発現及び精製をした(Benjamin et al., 2014,J Virol 88:6743-50)。A/Perth/16/2009(H3N2)、A/Hong Kong/G9/1997(H9N2)、及び、B/Brisbane/60/2008(Victoria)に由来する5μg/mlの精製HAタンパク質、または、A/California/07/2009(H1N1)、A/Vietnam/1203/2004(H5N1)、A/Netherlands/2003(H7N7)、A/Missouri/2006(H2N3)、及び、B/Florida/4/2006(Yamagata)に由来する3μg/mlの精製HAタンパク質でコーティングをした384ウェルMaxiSorpプレート(Nunc)を用いて、ELISA結合アッセイを行った。ELISAプレートを、カゼイン(Thermo Scientific)でブロックし、そして、連続希釈した抗体を、室温で、1時間、インキュベートした。結合した抗体を、ペルオキシダーゼ結合マウス抗-ヒトIgG抗体(KPL)(1:10,000)を用いて検出し、続いて、TMB溶液(KPL)で発色させ、450nmのODで、吸光度測定を行った。ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗-マウスIgG抗体(DAKO)(1:5,000)の二次抗体の他は、HAに対するマウス血清反応性を上記したようにして行った。
野生型インフルエンザ株は、the Centers for Disease Control and Preventionから入手し、あるいは、American Tissue Culture Collectionから購入した。逆遺伝学によって産生した再分類したH3ウイルス(rA/HK/68)は、A/Hong Kong/8/68(H3N2)に由来するH3 HA、及び、A/Puerto Rico/8/34(H1N1)に由来する残りの7つの遺伝子セグメントを含んでおり、そして、このウイルスのHAは、ネズミの病原性を増強するN165S変異も含んでいた(Jin et al., 2003, Virology 306:18-24)。すべてのウイルスは、孵化鶏卵において増殖しており、そして、ウイルス力価を、ミリリットル当たり平均50%の組織培養感染用量(TCID50)で決定した。微量中和アッセイを、先述したようにして行った(Benjamin et al., 2014,J Virol 88:6743-50)。簡潔に説明すると、0.75μg/mlのN-トシル-L-フェニルアラニルクロロメチルケトン(TPCK)トリプシン(Worthington)を含有する完全MEM培地が入った384ウェルプレートに、2連のウェルに入れられた、血清の3倍連続希釈物、または、ナイーブ血清で希釈した精製FluB抗体に対して、60TCID50のウイルス/ウェルを加えた。33℃で、かつ、5%CO2で、1時間インキュベートした後に、2×104個のMadin-Darby Canine Kidney(MDCK)細胞/ウェルを、プレートに対して加えた。プレートを、33℃で、かつ、5%CO2で、約40時間インキュベートし、そして、37℃で、1時間かけて、蛍光標識基質メチルウンベリフェリル-N-アセチルノイラミン酸(MU-NANA)(Sigma)を、各ウェルに加えて、ノイラミニダーゼ(NA)活性を測定した。NA活性が示すウイルス複製を、以下の設定を用いて蛍光を読み取ることで定量した。励起355nm、発光460nm、ウェル当たり10回の点滅。赤血球凝集阻害アッセイを、先述したようにして、感染の21日後に回収した血清について行った。
DNA電気穿孔の30分前に、メスのBALB/C、及び、CAnN.Cg-Foxnlnu/Crlマウス(Charles River)に対して、12単位(30μl)のヒアルロニダーゼ酵素(Sigma-Aldrich)を筋肉内(im)注射して、各送達部位での前処置をした。最初の研究(図14~図17)では、100μg(30μl)のFluAまたはFluB DMAbプラスミドのいずれかを、前脛骨(TA)、及び/または、大腿四頭(Q)筋に対して筋肉注射を行い、マウスに対して、1箇所(TA)で100μgのDNA、2箇所(右のTA+左のTA)で200μgのDNA、あるいは、3箇所(右のTA+左のTA+Q)で300μgのDNAを与えた。後出の同時投与研究(図18)では、マウスに対して、FluA及びFluBの双方のDMAb構築物を与えた。当該FluA構築物のデザインを改変して、重鎖及び軽鎖ペプチドを別々のプラスミドに発現させて、1つのプラスミドデザインよりも少ない注入部位から同等の血清レベルのFluA IgGを生成した。この場合、FluA重鎖及び軽鎖プラスミドの100μgの1:1(重量:重量)混合物を、2箇所(右のTA+右のQ)に送達し、そして、前述したようにして、2箇所(左のTA+左のQ)に向けて、200μgのプラスミドFluBを送達した。CELLECTRA 3P適応定電流デバイス(Inovio Pharmaceuticals)を用いた各DNAを注入した直後に、筋肉内電気穿孔(IM-EP)を行った。
6~8週齢のBALB/cマウス(Harlan Laboratories)に対して、感染の4~5日前に、IM-EPを介して、FluA DMAb、FluB DMAb、または、無関係なコントロールDMAb(DVSF-3、すでに説明した(Flingai et al., 2015, Sci Rep 5:12616))を与えた。感染の1日前に、プラスミドDMAbによってコードされるものと同一のアミノ酸配列を有するタンパク質IgGモノクローナル抗体を、0.03mg/kg~1.0mg/kgの範囲の用量で、マウスの別々の群に対して腹腔内(i.p.)投与した。コントロールのマウスに対して、非特異的タンパク質IgG R347を腹腔内投与した。3×LD50のA/California/07/2009(H1N1)(9.5×104 TCID50/マウス)、7×LD50のrA/HK/68(H3)(1.2×105 TCID50/マウス)、10×LD50のB/Malaysia/2506/2004(Victoria)(3.6×104 TCID50/マウス)、または、7×LD50のB/Florida/4/2006(Yamagata)(7.0×104 TCID50/マウス)でマウスを鼻腔内感染させた。すべてのマウスについて、毎日、体重減少と生存について、12日間、モニターをした(25%以上の体重減少を示すマウスは、安楽死させた)。感染の当日に血液を採取して、血清でのヒトIgGの量を評価した。肺のウイルス量を評価するために、別のマウスを、感染の5日後に安楽死させた。全肺を、10%(重量/体積)滅菌L15培地(Invitrogen)でホモジナイズし、そして、MDCK細胞で滴定して、組織のTCID50/gを決定した。同種再感染試験では、最初の感染の21日後にすべての生存マウスから血液試料を採取して、ヒトIgGのクリアランス及び非存在を確認した。最初の感染の28日後に、マウスに対して、最初の感染と同一のウイルス株を、致死量でもってして再接種した。
標準曲線とグラフは、GraphPad Prism 6を用いて調製した。EC50値及びIC50値は、log(レシプロカル血清希釈)と応答との非線形回帰を用いて、計算した。生存データは、log-rank(Mantel-Cox)検定によって計算されたp値を用いたKaplan-Meier生存曲線を用いて表した。
A型インフルエンザ(FluA)、及び、B型インフルエンザ(FluB)を広範に中和するモノクローナル抗体を、先述したようにして、ヒト記憶B細胞から単離した(Pappas et al., 2014,Nature,516:418-22;Traggiai et al., 2004、Nat Med,10:871-875)。FluAモノクローナル抗体は、最近公開された広範に中和するモノクローナル抗体と密接に関連しており、同抗体は、HA幹への結合に起因する広範囲のHA交差反応性を示し、そして、グループ1及びグループ2の双方に由来するA型インフルエンザウイルスを中和することができる(平均IC50は、2.56μg/ml、データは示さず)(Kallewaard et al., 2016,Cell,6743-50)。FluBモノクローナル抗体は、Victoria及びYamagataの双方の系統に属するB型インフルエンザウイルスを強力に中和する能力に基づいて、同定及び選択をした(平均IC50は、0.64μg/ml、データは示さず)。この抗体は、B型インフルエンザHAの球状頭部に保存された領域に結合し、そして、赤血球のウイルス赤血球凝集を阻害することができる。重症のインフルエンザ感染を防ぐためのDMAb送達の有用性を試験するために、ヒトIgG FluAまたはFluBのいずれかをコードする合成DNA導入遺伝子をデノボで合成し、そして、哺乳動物発現プラスミドにクローニングした。DNAコドン最適化、RNA最適化、及び、プラスミドDNAの製剤などのDMAb発現を増強するために、複数の改変を行った(図19)(Muthumani et al., 2016, J Infect Dis 214:369-78;Flingai et al., 2015, Sci Rep 5:12616)。DMAb構築物でトランスフェクトされたヒト胚腎臓293T細胞の溶解物及び上清でのヒトIgGの定量的ELISAは、組み立てられたFluA及びFluB抗体の細胞内発現及び細胞外分泌を確認した(図14A)。また、ヒトIgGウエスタンブロットは、トランスフェクトした293T細胞の上清及び溶解物に抗体重鎖及び軽鎖が存在することを示した(図14B)。
インビボで生成されたDMAbの機能性を試験するために、DMAbで処置したBALB/cマウスから得た血清を、インビトロ結合活性について試験をした。季節性(H1、H3)及び潜在的流行性(H2、H5、H6、H7、H9)インフルエンザ分離株に由来する組換え三量体HA(図15A)、ならびに、組換え単量体HA H10(図20)など、ヒトに感染することが公知のウイルスに由来する広範囲のA型インフルエンザグループ1及びグループ2 HA抗原に、血清由来のFluA DMAbは結合した。マウス血清でのFluB DMAbは、Victoria及びYamagataの双方の系統のウイルスに由来するB型インフルエンザHAに結合した(図15B)。レシプロカル血清希釈の半数効果濃度(EC50)は、300μg対100μgのプラスミドDNAで処置したマウスの血清において、より高い結合活性を反映しており、このことは、より多くのプラスミドDNAを与えた動物でのDMAb発現が大きいことを反映している。
この技術のインビボでの有用性を評価するために、DMAbで処置した動物を、致命的インフルエンザ接種モデルで評価した。IM-EPを介して、300μgのFluA DMAb、または、無関係なDMAbコントロール(DVSF-3(Flingai et al., 2015, Sci Rep 5:12616))を動物に投与し、次いで、電気穿孔の4日後に、A/California/7/2009 H1N1(A/CA/09 H1)の致死量を接種した(図16)。DMAbとタンパク質IgGとを直接にインビボで比較するために、感染の1日前に、FluAタンパク質モノクローナル抗体の一連の希釈物を腹腔内に投与して、マウスのグループ分けを行った。感染時に全ての動物から得た血清試料は、0.3mg/kgのFluAタンパク質IgGで処置したマウスに認められるのと同様の平均ヒトIgG濃度及びHA結合活性を、FluA DMAb処置がもたらす、ことを示した(図16A及び図21)。致死量のA/California/7/2009 H1N1(A/CA/09 H1)を接種した場合に、FluA DMAb処置が、90%の生存利益をもたらしたのに対して、デング熱ウイルス(DVSF-3)に対するコントロールDMAbで処置をした全ての動物は、感染により死亡した(図16B)。ヒトIgG発現レベルに対応して、FluA DMAb処置、及び、0.3mg/kgのFluA精製タンパク質は、致命的で、かつ、インフルエンザ誘発性である体重減少に対して、同様の保護をもたらした(図16C)。
A型及びB型インフルエンザウイルスは、共循環し、そして、季節性感染症に対する包括的な免疫予防戦略は、双方のインフルエンザを標的とすべきである。DMAbプラットフォームが、この役割を果たす能力を試験するために、FluA DMAb及びFluB DMAbを、BALB/cマウスに対して同時投与した。感染の5日前に、マウスに対してFluB DMAbを投与し、次いで、翌日に、FluA DMAbを投与した。比較群の動物には、感染の1日前に、FluA及びFluB精製タンパク質モノクローナル抗体の混合物を腹腔内に投与した。A/CA/09 H1またはB/Fla/06のいずれかの致死量を、マウスに接種した。感染時の血清試料は、DMAbで処置した動物が、全ヒトIgGが平均で3μg/mlであることを示した(図18A)。A型及びB型インフルエンザに特異的なELISAは、双方のDMAbが、以前に観察されたものと同様の発現レベルを示しており(図18B)、FluA DMAbの血清レベルは、腹腔内に送達した0.3mg/kg FluAタンパク質IgGの血清レベルに近似しており、かつ、FluB DMAbの血清レベルは、腹腔内に送達した1mg/kgのFluBタンパク質IgGに近似している。接種研究において、FluA+FluB DMAbを与えた全てのマウスは、致命的感染から保護されたが、コントロールのDMAbで処置したマウスの90%と100%は、それぞれ、A型インフルエンザとB型インフルエンザ感染で死亡した(図18C及び18D)。DMAb投与及びタンパク質IgGの送達は、改めて、生存率及び体重減少の双方において明確に同様の保護レベルを示した(図23)。
季節性インフルエンザ感染は、米国だけで、年平均で100億ドルの直接医療費と、800億ドルの経済的負担を招いている(Molinari et al., 2007, Vaccine 25:5086-96)。インフルエンザワクチン及び抗ウイルス薬が入手可能であるにもかかわらず、大きな亜集団は、季節性インフルエンザ感染に起因する合併症の影響を受けやすい。米国での季節性インフルエンザに起因する死亡者の90%近くは、65歳以上の成人であり(Frieden et al,2010, MMWR 59)、この集団では、抗原連続変異が顕著な年のワクチン有効性が推定で36%にまで低下する。季節性感染症の持続的な危険性に加えて、流行性インフルエンザの発生は、ワクチンデザインを撹乱する可能性がある。したがって、インフルエンザ感染に対する革新的普遍的介入が不可欠である。
Claims (15)
- 1つ以上の合成抗体をコードする核酸分子であって、前記核酸分子が、
a)抗-インフルエンザヘマグルチニン(HA)合成抗体をコードするヌクレオチド配列、及び
b)抗-インフルエンザHA合成抗体の断片をコードするヌクレオチド配列、からなる群から選択される少なくとも1つを含む、前記核酸分子。 - 前記抗-インフルエンザHA合成抗体が、インフルエンザHAの球状頭部に結合する抗体、及び、インフルエンザHAの融合サブドメインに結合する抗体、からなる群より選択される請求項1に記載の核酸分子。
- 前記核酸分子が、配列番号1~8に対して少なくとも90%の相同性を示す配列、及び、その断片から選択されるアミノ酸配列を含む抗-インフルエンザHA合成抗体をコードする、請求項1に記載の核酸分子。
- 前記核酸分子が、配列番号9~16に対して少なくとも90%の相同性を示す配列、及び、その断片から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項3に記載の核酸分子。
- 第1の抗-インフルエンザHA抗体をコードする第1のヌクレオチド配列、及び、第2の抗-インフルエンザHA抗体をコードする第2のヌクレオチド配列からなる群から選択された、少なくとも1つのヌクレオチド配列をさらに含む、請求項1に記載の核酸分子。
- 開裂ドメインをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項1に記載の核酸分子。
- 抗-インフルエンザ-HA抗体の可変重鎖領域、及び、可変軽鎖領域をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項1に記載の核酸分子。
- ヒトIgG1κの定常重鎖領域、及び、定常軽鎖領域をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項1に記載の核酸分子。
- 抗-インフルエンザ-HAの可変重鎖領域、ヒトIgG1κの定常重鎖領域、開裂ドメイン、抗-インフルエンザ-HAの可変軽鎖領域、及び、IgG1κの定常軽鎖領域を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項1に記載の核酸分子。
- 前記ヌクレオチド配列が、リーダー配列をコードする、請求項1に記載の核酸分子。
- 前記核酸分子が、発現ベクターを含む、請求項1~10のいずれか1項に記載の核酸分子。
- 請求項1~11のいずれか1項に記載の核酸分子を含む組成物。
- 医薬として許容される賦形剤をさらに含む、請求項12に記載の組成物。
- 対象におけるインフルエンザ感染を処置する方法であって、前記対象に対して、請求項1~11のいずれか1項に記載の核酸分子、または、請求項12~13のいずれか1項に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
- 前記インフルエンザ感染が、A型インフルエンザ感染、及び、B型インフルエンザ感染から選択される、請求項14に記載の方法。
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