CN118109478A - 靶向流感病毒的dna单克隆抗体 - Google Patents

Abstract

本文涉及靶向流感病毒的DNA单克隆抗体。具体地，本文公开了包含编码抗流感‑血凝素合成抗体的重组核酸序列的组合物。本公开还提供了使用所述组合物以及生成方法预防和/或治疗受试者的流感的方法。

Description

靶向流感病毒的DNA单克隆抗体

本申请是申请日为2017年05月05日的题为“靶向流感病毒的DNA单克隆抗体”的中国专利申请号201780042120.X的分案申请。

相关申请的引证

本申请要求2016年5月5日提交的美国临时申请号62/332,381和2016年8月17日提交的美国临时申请号62/376,162的优先权，每个临时申请均特此通过引证整体并入。

技术领域

本发明涉及一种组合物，其包含用于在体内产生一种或多种合成抗体，包括抗流感血凝素抗体及其功能片段的重组核酸序列，并且涉及一种通过施用所述组合物预防和/或治疗受试者的疾病的方法。

背景技术

尽管是有前景的创新，但流感疫苗和抗病毒药物不能对季节性感染提供全面保护，并且几乎不能立即防御新型和潜在的大流行性病毒株。已经开发了广泛的交叉保护性单克隆抗体，目的是提供针对高度相异的流感病毒的保护。

因此，本领域需要改进的用于治疗流感的组合物和方法。

发明内容

本发明涉及一种编码一种或多种合成抗体的核酸分子，其中所述核酸分子包含选自以下的至少一种：a)编码抗流感血凝素(HA)合成抗体的核苷酸序列；和b)编码抗HA合成抗体的片段的核苷酸序列。

在一个实施方案中，抗HA合成抗体选自结合流感HA的球状头部的抗体和结合流感HA的融合子结构域的抗体。

在一个实施方案中，核酸分子包含至少一个选自以下的核苷酸序列：编码第一抗HA抗体的第一核苷酸序列；和编码第二抗HA抗体的第二核苷酸序列。

在一个实施方案中，核酸分子包含编码裂解结构域的核苷酸序列。

在一个实施方案中，所述核酸分子包含编码抗HA的可变重链区和可变轻链区的核苷酸序列。

在一个实施方案中，所述核酸分子包含编码人IgG1κ的恒定重链区和恒定轻链区的核苷酸序列。

在一个实施方案中，所述核酸分子包含编码下述多肽的核苷酸序列，所述多肽包含：抗HA的可变重链区；人IgG1κ的恒定重链区；裂解结构域；抗HA的可变轻链区；和IgG1κ的恒定轻链区。

在一个实施方案中，所述核酸分子包含编码前导序列的核苷酸序列。

在一个实施方案中，所述核酸分子包含表达载体。

在一个实施方案中，本发明提供了包含核酸分子的组合物。在一个实施方案中，所述组合物还包含药学上可接受的赋形剂。

在一个实施方案中，本发明提供了一种预防或治疗受试者的流感感染的方法，其包括向受试者施用本文所述的核酸或组合物。在一个实施方案中，流感感染是甲型流感感染。在一个实施方案中，流感感染是乙型流感感染。

在一个实施方案中，本发明提供了用于在哺乳动物细胞或病毒载体中产生单克隆抗体的新型序列。

附图说明

图1显示抗流感抗体5J8结合的流感血凝素可变区。

图2显示抗流感抗体FI6结合的流感血凝素可变区。

图3，包括小图A和小图B，描绘了证明DMAb质粒DNA构建体在293T细胞中表达的实验结果。小图A描绘了ELISA结果，其中通过定量ELISA测定上清液和裂解物人IgG1κ表达(N＝3次转染重复，平均值±SEM)。小图B描绘了代表性western印迹，证明上清液和裂解物重链和轻链肽裂解。

图4，包括小图A和小图B，描绘了证明肌内DNA电穿孔后，DMAb在小鼠血清中表达的实验结果。对小鼠注射5J8或FI6质粒DNA，然后进行肌内电穿孔。通过定量ELISA测定小鼠血清中的人IgG1κ抗体水平。小图A描绘了证明抗流感DMAb在BALB/c小鼠中递送后7天表达，从53ng/mL至1.1μg/mL，高于第0天放血前基线水平的结果。定点递送和配制的优化策略增强了DMAb表达>3倍。小图B描绘了裸鼠中DNA剂量递增的结果。在向免疫受损的裸鼠递送300μg质粒DNA后，FI6表达峰值达到2.6μg/mL。DMAb的表达持续十周。(N＝5，平均值±SEM。)

图5描绘了证明来自小鼠血清的DMAb保持了结合血凝素抗原的能力的实验结果。裸鼠经肌内电穿孔接受FI6(300μg)质粒DNA。四周后，通过ELISA测定血清DMAb与重组甲型流感H1血凝素抗原的结合。(N＝5，平均值±SEM。)

图6描绘了甲型流感病毒株和乙型流感病毒株的系统发育树，证明了临床相关性流感病毒的多样性。

图7描绘了证明分离的针对甲型和乙型流感的人单克隆抗体(mAb)具有广泛交叉反应性的实验结果。甲型流感特异性FluA mAb广泛地中和1类和2类的季节性和大流行性病毒。FluB mAb有效中和来自乙型流感病毒谱系的病毒。

图8描绘了DMAb质粒构建和功能性mAb产生的示意图。

图9描绘了流感致死攻击研究设计的示意图。

图10描绘了证明FluA和FluB DMAb血清表达和功能的实验结果。在FluA DMAb(顶行)和FluB DMAb(底行)电穿孔(EP)后5天收集血清并评价人IgG表达、对各种HA蛋白的结合活性和中和活性。

图11描绘了证明FluA DMAb保护小鼠免于致死性甲型流感感染，达到与0.3mg/kg纯化FluA IgG相似的水平的实验结果。在感染时，DMAb的血清浓度与纯化IgG相关。用致死性甲型流感感染攻击后的体重减轻和存活率，FluA DMAb与对照DMAb相比有*显著存活益处，通过对数秩检验，p<0.0001。

图12描绘了证明FluB DMAb防止小鼠免于致死性乙型流感感染，达到与1mg/kg纯化FluB IgG相似的水平的实验结果。在感染时，DMAb的血清浓度与纯化IgG相关。用致死性乙型流感感染攻击后的体重减轻和存活率，FluB DMAb与对照DmAb相比有*显著存活益处，通过对数秩检验，p<0.0001。

图13描绘了证明FluA和FluB DMAb当组合施用时保护小鼠免于致死性甲型或乙型流感感染的实验结果。感染时Flu DMAb组合的血清浓度与纯化IgG组合相关。甲型或乙型流感特异性定量显示组合DMAb处理产生与单独给予时所看到的相似水平的表达。用致死性甲型或乙型流感感染攻击后的存活率，FluA+FluB DMAb与对照DmAb相比有*显著存活益处，通过对数秩检验，p<0.0001。

图14A-14F，描绘了证明DNA编码的单克隆抗体(DMAb)构建体在体外和体内表达的实验结果。小图A描绘通过ELISA量化细胞上清液(左)和裂解物(右)中的人IgG表达。用FluA或FluB DMAb质粒构建体或空质粒(pVax1)转染293T细胞。(n＝3，±SEM)。小图B描绘了还原的DMAb转染的293T细胞上清液(S)和裂解物(L)(左)和纯化的蛋白质单克隆抗体FluA和FluB(IgG，右)中的人IgG重链和轻链肽的western印迹。小图C描绘了在用100-300μgFluA质粒DNA进行肌内电穿孔(IM-EP)(第0天)后CAnN.Cg-Foxn1^nu/Crl裸鼠血清中的DMAb人IgG。(n＝5，±SEM)。小图D描绘了在用100-300μgFluB质粒DNA进行肌内电穿孔(IM-EP)(第0天)后CAnN.Cg-Foxn1^nu/Crl裸鼠血清中的DMAb人IgG。(n＝5，±SEM)。小图E描述了施用100-300μg的FluA DMAb质粒DNA后5天BALB/c小鼠血清中DMAb人IgG的水平。虚线表示检测限值(LOD)。(n＝5，±SEM)。小图F描述了施用100-300μg的FluB DMAb质粒DNA后5天BALB/c小鼠血清中DMAb人IgG的水平。虚线表示检测限值(LOD)。(n＝5，±SEM)。

图15A-15C，描绘了证明血清FluA DMAb和FluB DMAb具功能性的实验结果。用100-300μg的FluA或FluB DMAb质粒DNA处理后5天，从BALB/c小鼠收集的血清进行功能测定。小图A描绘了对于个别小鼠血清样品而言，与来自1类(H1 A/加利福尼亚/07/2009H1N1、H2 A/密苏里州/2006H2N3、H5 A/越南/1203/2004H5N1、H6A/水鸭/香港/W312/97H6N1、H9 A/鸡/香港/G9/1997H9N2)和2类(H3A/珀斯/16/2009H3N2、H7 A/荷兰/219/2003H7N7)的甲型流感HA蛋白的)ELISA结合EC₅₀值(稀释倍数的倒数)。小图B描绘了个别小鼠血清样品与来自山形(Yam B/佛罗里达/4/2006)和维多利亚(Vic B/布里斯班/60/2008)谱系的乙型流感HA蛋白的ELISA结合EC₅₀值(稀释倍数的倒数)。小图C描绘了针对Yam B/佛罗里达/4/2006和Vic B/马来西亚/2506/2004病毒的个体小鼠血清样品的中和IC₅₀值(倒数稀释)。(n＝5，±SD)。

图16A-16F，描绘了证明FluA DMAb保护小鼠免受多样化致死性甲型流感攻击的实验结果。鼻内感染A/加利福尼亚/7/2009H1N1(A-C)或重新分类的rA/香港/8/68xPR8 H3N1(D-F)前4-5天，用FluA DMAb质粒DNA(闭合符号)处理BALB/c小鼠。在感染前一天，单独的小鼠腹膜内接受0.03-1mg/kg FluA蛋白单克隆抗体(开口符号)。用300μg无关DMAb(DVSF-3)或1mg/kg非特异性蛋白单克隆抗体(R347)处理的小鼠用作对照。小图A描绘了流感感染时小鼠血清中的人IgG。小图B描绘了用甲型流感攻击的BALB/c小鼠的Kaplan-Meier存活曲线(n＝10)。小图C描绘了甲型流感攻击后BALB/c小鼠的重量。虚线表示25％最大失重。(n＝10，±SEM)。小图D描绘了流感感染时小鼠血清中的人IgG。小图E描绘了用甲型流感攻击的BALB/c小鼠的Kaplan-Meier存活曲线(n＝10)。小图F描绘了甲型流感攻击后BALB/c小鼠的重量。虚线表示25％最大失重。(n＝10，±SEM)。

图17A-17F，描绘了证明FluB DMAb保护小鼠免受多样化致死性乙型流感攻击的实验结果。在用B/马来西亚/2506/2004维多利亚(A-C)或B/佛罗里达/4/2006山形(D-F)谱系病毒感染前5天用FluB DMAb质粒DNA处理BALB/c小鼠。在感染前一天，单独组的小鼠腹膜内接受0.03-1mg/kg FluB蛋白单克隆抗体小图A描绘了感染时小鼠血清中的人IgG。虚线表示LOD。(n＝10，±SD)。小图B描绘了用乙型流感攻击的BALB/c小鼠的Kaplan-Meier存活曲线(n＝10)。小图C描绘了乙型流感攻击后BALB/C小鼠的重量。虚线表示25％最大失重。(n＝10，±SEM)。小图D描绘了感染时小鼠血清中的人IgG。虚线表示LOD。(n＝10，±SD)。小图E描绘了用乙型流感攻击的BALB/c小鼠的Kaplan-Meier存活曲线(n＝10)。小图F描绘了乙型流感攻击后BALB/C小鼠的重量。虚线表示25％最大失重。(n＝10，±SEM)。

图18A-18F，描绘了证明共同施用FluA和FluB DMAb保护小鼠免受致死性甲型/乙型流感攻击和同源再攻击的实验结果。BALB/c小鼠接受FluA和FluB DMAb两者。用FluA加上FluB蛋白单克隆抗体处理单独的小鼠。小鼠接受用甲型流感/加利福尼亚/7/2009或B/佛罗里达/4/2006的初始感染。小图A描绘了感染时小鼠血清中的总人IgG水平。(n＝8±SD)。小图B描绘了在通过HA结合ELISA定量的感染时小鼠血清中的甲型流感特异性和乙型流感特异性人IgG。(n＝8，±SD)。小图C描绘了在用A/加利福利亚/07/2009初始感染后的Kaplan-Meier存活曲线。小图D描绘了在用B/佛罗里达/4/2006初次感染后的Kaplan-Meier存活曲线。小图E描绘了在初始感染后28天，存活小鼠接受同源流感再感染的实验。与既未接受DMAb/IgG处理也未接受初始感染(未实验)的小鼠相比，再次感染后的Kaplan-Meier存活曲线。小图F描绘了在初始感染后28天，存活小鼠接受同源流感再感染的实验。与既未接受DMAb/IgG处理也未接受初始感染(未实验)的小鼠相比，再次感染后的Kaplan-Meier存活曲线。

图19描绘了证明体内DMAb表达增强的实验结果。在依次修改200μg FluB质粒DNA的施用后5天，小鼠中的血清DMAb人IgG表达。通过单独的肌内电穿孔(IM-EP)或通过用透明质酸酶制剂进行IM-EP(Hya+IM-EP)将质粒DNA递送至BALB/c小鼠。此外，质粒转基因插入序列经DNA密码子优化和RNA优化用于增强表达(Opt+Hya+IM-EP)。所有其他研究均以Opt+Hya+IM-EP进行。(每组n＝5只动物，平均值±SEM)。

图20描绘了证明小鼠血清中的FluA DMAb结合甲型流感血凝素H10的实验结果。用100-300μg FluA DMAB质粒DNA处理后5天收集的来自BALB/c小鼠的血清经连续稀释并添加到涂有甲型流感病毒2类重组H10抗原(A/江西-东湖/346/2013H10N8)(IBT Bioservices)的96孔板中。用HRP偶联的二抗驴抗人IgG(1:5,000)检测DMAb结合，并使用SigmaFast OPD底物(Sigma-Aldrich)进行显色。在450nm下测量吸光度。来自未处理(未实验)小鼠的血清用作对照。(每组n＝5只动物，平均值±SD)。

图21A-21B，描绘了证明体内表达的FluA和FluB DMAb产生与纯化IgG相似水平的功能性IgG的实验结果。小图A描绘了来自用FluA质粒DNA、纯化抗流感IgG蛋白或无关对照DMAb(DVSF-3)处理的动物的血清样品对来自A/加利福利亚/7/2009H1的纯化H1HA蛋白的反应性。在流感感染当天收获血清并通过结合ELISA测试HA反应性。小图B描绘了来自用FluB质粒DNA、纯化抗流感IgG蛋白或无关对照DMAb(DVSF-3)处理的动物的血清样品对来自B/布里斯班60/2008维多利亚的纯化维多利亚谱系HA蛋白的反应性。在流感感染当天收获血清并通过结合ELISA测试HA反应性

图22A-22B，描绘了证明FluB显著降低肺部乙型流感病毒载量的实验结果。在感染前5天，用200μg FluB DMAb质粒DNA或无关DMAb对照(DVSF-3)处理BALB/c小鼠。感染前一天，单独组腹膜内接受0.03-1mg/kg FluB纯化IgG蛋白或无关对照IgG R347。小图A描绘了用B/马来西亚/2508/2004感染后第5天的肺病毒滴度。小图B描绘了用B/佛罗里达/4/2006感染后第5天的肺病毒滴度。(n＝4，±SEM)。虚线表示LOD。*通过学生t检验，与对照DMAbDVSF-3组相比，病毒滴度显著降低。

图23A-23D，描绘了证明共同施用FluA和FluB DMAb保护小鼠免受致死性流感攻击和同源再攻击的实验结果。BALB/c小鼠接受FluA和FluB DMAb两者。在感染前一天，用0.1-1mg/kg的FluA和FluB蛋白IgG的组合处理单独组。小图A描绘了用A/加利福尼亚/7/2009感染的动物的体重减轻(n＝10，±SEM)。小图B描绘了用B/佛罗里达/4/2006感染的动物的体重减轻(n＝10，±SEM)。小图C描绘了在初始感染后28天用A/加利福尼亚/7/2009对存活小鼠进行同源流感再攻击后的体重减轻。小图D描绘了在初始感染后28天用B/佛罗里达/4/2006对存活小鼠进行同源流感再攻击后的体重减轻。

图24A-24D，描绘了证明感染后21天经DMAb处理的小鼠的血清反应性的实验结果。用A/加利福尼亚/7/2009或B/佛罗里达/4/2006感染后21天收集的来自存活BALB/c小鼠的血清进行功能测定。小图A描绘了针对感染病毒A/加利福尼亚/07/2009的血凝集抑制活性(稀释倍数的倒数)。小图B描绘了针对流感A/加利福尼亚/07/2009HA蛋白的ELISA结合EC50值(稀释倍数的倒数)。小图C描绘了针对感染病毒B/弗罗里达/4/2006的血凝集抑制活性(稀释倍数的倒数)。小图D描绘了针对乙型流感HA蛋白的ELISA结合EC50值(稀释倍数的倒数)。

具体实施方式

本发明涉及包含编码抗体、其片段、其变体或它们的组合的重组核酸序列的组合物。所述组合物可以施用于有需要的受试者，以促进针对流感抗原的合成抗体的体内表达和形成。

具体来说，由重组核酸序列表达的重链多肽和轻链多肽可以组装成合成抗体。重链多肽和轻链多肽可以彼此相互作用以使得组装产生合成抗体，所述合成抗体能够结合抗原，与并非如本文所述组装的抗体相比具有更大的免疫原性，并且能够引发或诱导针对抗原的免疫应答。

此外，与响应于抗原免疫诱导的免疫应答而产生的抗体相比，这些合成抗体在受试者中更快速地产生。合成抗体能够有效地结合并且中和一系列抗原。合成抗体对靶标具有高度特异性。所述合成抗体还能够有效地防止疾病和/或促进疾病存活率。

1.定义

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有本领域普通技术人员通常所理解的相同含义。如有冲突，将以本文件(包括定义)为准。虽然可以在实施或测试本发明时使用与本文所述的方法和材料相似或等同的方法和材料，但是下文描述了优选的方法和材料。本文提到的所有出版物、专利申请、专利以及其他参考文献以引用的方式整体并入。本文公开的材料、方法、以及实例仅是说明性的并且不意图具有限制性。

如本文所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“可”、“含有”以及其变形意图是开放式过渡短语、术语、或词语，它们不排除另外的行为或结构的可能性。除非上下文另外明确规定，否则单数形式“一个/一种”和“该/所述”包括复数指代对象。本公开还考虑了“包含本文提供的实施方案或要素”、“由本文提供的实施方案或要素组成”以及“基本上由本文提供的实施方案或要素组成”的其他实施方案，无论是否明确阐述。

“抗体”可以意指类别IgG、IgM、IgA、IgD或IgE的抗体、或其片段、片段或衍生物，包括Fab、F(ab')2、Fd和单链抗体及其衍生物。抗体可以是从哺乳动物的血清样品中分离的抗体、多克隆抗体、亲和力纯化抗体或它们的混合物，它对所期望的表位或由其衍生的序列表现出足够的结合特异性。

如本文可互换使用的“抗体片段”或“抗体的片段”指的是完整抗体的包含抗原结合位点或可变区的部分。所述部分不包括完整抗体的Fc区的恒定重链结构域(即CH2、CH3或CH4，这取决于抗体同种型)。抗体片段的实例包括但不限于Fab片段、Fab’片段、Fab’-SH片段、F(ab’)2片段、Fd片段、Fv片段、双体抗体、单链Fv(scFv)分子、仅含一个轻链可变结构域的单链多肽、含有轻链可变结构域的三个CDR的单链多肽、仅含一个重链可变区的单链多肽、以及含有重链可变区的三个CDR的单链多肽。

“抗原”是指具有在宿主中产生免疫应答的能力的蛋白质。抗原可以由抗体识别和结合。抗原可以源自于体内或外部环境。在某些情况下，抗原是流感抗原。

如本文所用的“编码序列”可以意指包含编码本文所述抗体的核苷酸序列的核酸(RNA或DNA分子)。编码序列还可以包括与调控元件可操作地连接的起始信号和终止信号，所述调控元件包括能够指导在接受核酸施用的个体或哺乳动物的细胞中表达的启动子和多聚腺苷酸化信号。编码序列还可以包括编码信号肽的序列。

如本文所用，“互补序列”或“互补”可以意指核酸，可以意指核酸分子的核苷酸或核苷酸类似物之间的沃森-克里克(Watson-Crick)(例如，A-T/U和C-G)或Hoogsteen碱基配对。

如本文所用，“恒定电流”定义了在向组织递送电脉冲的持续时间内同一组织或限定所述组织的细胞接受或经历的电流。电脉冲是从本文所述的电穿孔装置递送的。因为本文提供的电穿孔装置具有反馈元件，优选地具有瞬时反馈，所以该电流在所述组织中在电脉冲的寿命内保持在恒定的安培数。反馈元件可以在整个脉冲的持续时间内测量组织(或细胞)的电阻，并且使电穿孔装置改变它的电能输出(例如，增加电压)，以使同一组织中的电流在整个电脉冲期间(约几微秒)和脉冲间保持恒定。在一些实施方案中，反馈元件包括控制器。

如本文所用，“电流反馈”或“反馈”可以互换使用并且可以意指所提供的电穿孔装置的主动响应，所述主动响应包括测量电极之间组织中的电流以及相应地改变由EP装置递送的能量输出，以将电流维持在恒定水平。在开始脉冲序列或电处理之前，由使用者预设该恒定水平。反馈可以通过电穿孔装置的电穿孔部件，例如控制器完成，这是因为其中的电路能够连续地监测电极之间组织中的电流，并且将该所监测的电流(或组织内的电流)与预设电流相比较，并且连续地进行能量输出调整以将所监测的电流维持在预设水平。反馈回路可以是瞬时的，因为它是模拟闭环反馈。

如本文所用，“分散电流”可以意指从本文所述的电穿孔装置的各种针电极阵列递送的电流模式，其中所述模式使正被电穿孔的组织的任何区域上电穿孔相关热应激的发生减到最低限度或优选地消除所述电穿孔相关热应激的发生。

如本文可互换使用，“电穿孔”、“电透化”或“电动增强”(“EP”)可以指使用跨膜电场脉冲在生物膜中诱导微观路径(孔)；它们的存在允许生物分子，诸如质粒、寡核苷酸、siRNA、药物、离子以及水从细胞膜的一侧传递到另一侧。

如本文所用，“内源性抗体”可以指在接受有效剂量的抗原的施用以诱导体液免疫应答的受试者体内产生的抗体。

如本文所用，“反馈机制”可以指由软件或硬件(或固件)执行的过程，所述过程接收所期望的组织的阻抗并且将其与预设值，优选地电流相比较(在递送能量脉冲之前、期间和/或之后)，并且调整所递送的能量脉冲以达到所述预设值。反馈机制可以由模拟闭环电路执行。

“片段”可以意指可以发挥功能，即可以结合所期望的靶标并且具有与全长抗体相同的预期作用的抗体的多肽片段。抗体的片段可以与全长具有100％同一性，除了缺少来自N末端和/或C末端的至少一个氨基酸之外，在每种情况下在位置1处具有或不具有信号肽和/或甲硫氨酸。片段可以包含特定全长抗体的长度的20％或更多、25％或更多、30％或更多、35％或更多、40％或更多、45％或更多、50％或更多、55％或更多、60％或更多、65％或更多、70％或更多、75％或更多、80％或更多、85％或更多、90％或更多、91％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、99％或更多百分比，不包括所添加的任何异源信号肽在内。片段可以包括与抗体具有95％或更大、96％或更大、97％或更大、98％或更大或99％或更大的同一性的多肽片段，并且另外包含在计算同一性百分比时不包括在内的N末端甲硫氨酸或异源信号肽。片段还可以包含N末端甲硫氨酸和/或信号肽，诸如免疫球蛋白信号肽，例如IgE信号肽或IgG信号肽。N末端甲硫氨酸和/或信号肽可以与抗体的片段连接。

编码抗体的核酸序列的片段可以与全长具有100％同一性，除了缺少来自5'末端和/或3'末端的至少一个核苷酸之外，在每种情况下在位置1处具有或不具有编码信号肽和/或甲硫氨酸的序列。片段可以包含特定全长编码序列的长度的20％或更多、25％或更多、30％或更多、35％或更多、40％或更多、45％或更多、50％或更多、55％或更多、60％或更多、65％或更多、70％或更多、75％或更多、80％或更多、85％或更多、90％或更多、91％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、99％或更多百分比，不包括所添加的任何异源信号肽在内。片段可以包括编码与抗体具有95％或更大、96％或更大、97％或更大、98％或更大或99％或更大的同一性的多肽的片段，并且另外任选地包含编码在计算同一性百分比时不包括在内的N末端甲硫氨酸或异源信号肽的序列。片段还可以包含N末端甲硫氨酸和/或信号肽，诸如免疫球蛋白信号肽，例如IgE信号肽或IgG信号肽的编码序列。编码N末端甲硫氨酸和/或信号肽的编码序列可以与编码序列的片段连接。

如本文所用，“遗传构建体”是指包含编码蛋白质，诸如抗体的核苷酸序列的DNA分子或RNA分子。编码序列包括与调控元件可操作地连接的起始信号和终止信号，所述调控元件包括能够指导在接受核酸分子施用的个体的细胞中的表达的启动子和多聚腺苷酸化信号。如本文所用的术语“可表达形式”指的是含有必要调控元件的基因构建体，所述调控元件与编码蛋白质的编码序列可操作地连接以使得当存在于个体的细胞中时，所述编码序列将被表达。

如本文所用，“同一”或“同一性”在两个或更多个核酸或多肽序列的背景下可以意指所述序列在指定区域中具有指定百分比的相同残基。所述百分比可以通过最佳地比对这两个序列，在指定区域中比较这两个序列，确定这两个序列中存在相同残基的位置数量以产生匹配位置数，将匹配位置数除以指定区域中位置的总数，并且将结果乘以100以得到序列同一性百分比来计算。在这两个序列具有不同的长度或比对产生一个或多个交错末端并且指定的比较区域仅包括单个序列的情况下，单个序列的残基被包括在计算的分母中，但是不包括在分子中。当比较DNA和RNA时，胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)可以被认为是等同的。同一性可以手动或通过使用计算机序列算法，诸如BLAST或BLAST 2.0来进行。

如本文所用，“阻抗”可以在论述反馈机制时使用并且可以根据欧姆定律(Ohm'slaw)转换成电流值，从而使得能够与预设电流相比较。

如本文所用，“免疫应答”可以意指响应于一种或多种核酸和/或肽的引入，宿主的免疫系统，例如哺乳动物的免疫系统的活化。所述免疫应答可以呈细胞应答或体液应答或这两者的形式。

如本文所用，“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”可以意指共价连接在一起的至少两个核苷酸。单链的描绘还限定了互补链的序列。因此，核酸还涵盖所描绘的单链的互补链。核酸的许多变体可以用于与给定核酸相同的目的。因此，核酸还涵盖基本上相同的核酸和其互补序列。单链提供了可以在严格杂交条件下与靶序列杂交的探针。因此，核酸还涵盖了在严格杂交条件下杂交的探针。

核酸可以是单链的或双链的，或可以含有双链序列和单链序列二者的部分。核酸可以是DNA(基因组和cDNA)、RNA、或杂合体，其中核酸可以含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合、以及包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤次黄嘌呤、异胞嘧啶以及异鸟嘌呤的碱基的组合。术语核酸还涵盖核酸类似物和非天然核酸。例如，核酸可以被修饰，例如，可以包含一个或多个经修饰的核碱基或经修饰的糖部分。核酸的骨架可以包含如同肽核酸(PNA)中的一个或多个肽键。核酸可包含碱基类似物，诸如非嘌呤或非嘧啶类似物或核苷酸类似物。核酸可以通过化学合成方法或通过重组方法获得。

如本文所用，“可操作地连接”可以意指基因的表达处在与它在空间上连接的启动子的控制之下。启动子可以位于处在它的控制之下的基因的5'(上游)或3'(下游)。启动子和基因之间的距离可以与作为该启动子来源的基因中该启动子与它控制的基因之间的距离大致相同。如本领域已知的那样，可以调节该距离的变化而不会丧失启动子功能。

如本文所用，“肽”、“蛋白质”或“多肽”可以意指氨基酸的连接序列并且可以是天然的、合成的、或天然和合成的修饰或组合。

如本文所用，“启动子”可以意指能够赋予、激活或增强核酸在细胞中的表达的合成或天然来源的分子。启动子可以包含一个或多个特定的转录调控序列，以进一步增强其表达和/或改变其空间表达和/或时间表达。启动子还可以包含远端增强子或阻遏子元件，它们可以位于与转录起始位点相距多达数千个碱基对的位置处。启动子可以来源于包括病毒、细菌、真菌、植物、昆虫和动物的来源。对于其中发生表达的细胞、组织或器官，或对于发生表达的发育阶段，或响应于外部刺激，诸如生理应激、病原体、金属离子或诱导剂，启动子可以组成型地或差异性地调控基因组分的表达。启动子的代表性实例包括噬菌体T7启动子、噬菌体T3启动子、SP6启动子、lac操纵子-启动子、tac启动子、SV40晚期启动子、SV40早期启动子、RSV-LTR启动子、CMV IE启动子、SV40早期启动子或SV 40晚期启动子以及CMV IE启动子。

“信号肽”和“前导序列”在本文中可互换使用，是指可以在本文所述的蛋白质的氨基末端处连接的氨基酸序列。信号肽/前导序列通常引导蛋白质的定位。本文所用的信号肽/前导序列优选地促进蛋白质从其产生的细胞中的分泌。在从细胞中分泌时，信号肽/前导序列常常从蛋白质的其余部分(常常被称为成熟蛋白)切割。信号肽/前导序列在蛋白质的N末端处连接。

如本文所用，“严格杂交条件”可以意指第一核酸序列(例如，探针)将与第二核酸序列(例如，靶标)，诸如核酸的复杂混合物中的第二核酸序列杂交的条件。严格条件具有序列依赖性并且在不同的情况下将是不同的。严格条件可选择为在限定离子强度pH下比特定序列的热解链温度(Tm)低约5-10℃。T_m可以是(在限定的离子强度、pH和核酸浓度下)平衡时50％与靶标互补的探针与靶序列杂交时的温度(因为靶序列过量存在，在T_m下，在平衡时50％的探针被占据)。严格条件可以是如下的那些条件，其中在pH 7.0至8.3下，盐浓度低于约1.0M钠离子，诸如约0.01M-1.0M钠离子浓度(或其他盐)，并且对于短探针(例如约10个-50个核苷酸)，温度为至少约30℃，对于长探针(例如大于约50个核苷酸)，为至少约60℃。严格条件还可以通过添加去稳定剂，诸如甲酰胺来实现。对于选择性或特异性杂交，阳性信号可以是背景杂交的至少2倍至10倍。示例性严格杂交条件包括以下：50％的甲酰胺、5×SSC和1％的SDS，在42℃孵育；或5×SSC、1％的SDS，在65℃孵育，以及在65℃下在0.2×SSC和0.1％ SDS中洗涤。

如本文可互换使用，“受试者”和“患者”是指任何脊椎动物，包括但不限于哺乳动物(例如牛、猪、骆驼、美洲驼、马、山羊、兔、绵羊、仓鼠、豚鼠、猫、狗、大鼠和小鼠、非人灵长类动物(例如猴，诸如食蟹猴或恒河猴、黑猩猩等)以及人)。在一些实施方案中，受试者可以是人或非人。受试者或患者可以正接受其他形式的治疗。

如本文所用，“基本上互补”可以意指第一序列在8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个或更多个核苷酸或氨基酸的区域内与第二序列的互补序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性，或这两个序列在严格杂交条件下杂交。

如本文所用，“基本上同一的”可以意指第一序列和第二序列在1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、1100个或更多个核苷酸或氨基酸的区域内具有至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，或对于核酸，如果第一序列与第二序列的互补序列基本上互补。

如本文所用，“合成抗体”是指由本文所述的重组核酸序列编码并且在受试者中产生的抗体。

如本文所用，“治疗”可以意指经由预防、抑制、阻遏、或完全消除疾病的手段来保护受试者免受疾病的影响。预防疾病涉及在疾病发作之前向受试者施用本发明的疫苗。抑制疾病涉及在诱发疾病之后，但是在它出现临床表现之前，向受试者施用本发明的疫苗。阻遏疾病涉及在疾病的临床表现之后向受试者施用本发明的疫苗。

本文关于核酸使用的“变体”可以指(i)参考核苷酸序列的一部分或片段；(ii)参考核苷酸序列或其部分的互补序列；(iii)与参考核酸或其互补序列基本相同的核酸；或(iv)在严格条件下与参考核酸、其互补序列或与其基本相同的序列杂交的核酸。

关于肽或多肽的“变体”在氨基酸序列上由于氨基酸的插入、缺失、或保守取代而不同，但是保留至少一种生物学活性。变体还可以意指具有这样的氨基酸序列的蛋白质：其与具有保留至少一种生物学活性的氨基酸序列的参考蛋白质基本上相同。氨基酸的保守取代，即将氨基酸用具有相似特性(例如带电荷的区域的亲水性、程度以及分布)的不同氨基酸置换，在本领域中通常被认为涉及微小变化。如本领域所理解的，通过考虑氨基酸的亲水指数可以部分地鉴定这些微小变化。Kyte等人，J.Mol.Biol.157:105-132(1982)。氨基酸的亲水指数是基于它的疏水性和电荷的考虑。在本领域中已知的是，具有相似亲水指数的氨基酸可以被取代并且仍保留蛋白质功能。在一个方面，具有相差±2的亲水指数的氨基酸被取代。氨基酸的亲水性还可以用于揭示将产生保留生物学功能的蛋白质的取代。在肽的背景下氨基酸的亲水性的考虑容许计算该肽的最大局部平均亲水性，这是已经被报道与抗原性和免疫原性良好相关的有用的量度。美国专利号4,554,101以引用的方式整体并入本文。如本领域所理解的，取代具有相似亲水性值的氨基酸可产生保留生物活性，例如免疫原性的肽。可以用亲水性值在彼此±2以内的氨基酸进行取代。氨基酸的疏水指数和亲水值这两者都受该氨基酸的特定侧链的影响。与该观测结果相一致，与生物学功能相容的氨基酸取代被理解为取决于氨基酸的相对相似性，并且特别是那些氨基酸的侧链，如疏水性、亲水性、电荷、大小和其他特性所揭示。

变体可以是在完整基因序列的全长或其片段上基本上相同的核酸序列。所述核酸序列在基因序列的全长或其片段上可以是80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的。变体可以是在氨基酸序列的全长或其片段上基本上相同的氨基酸序列。所述氨基酸序列在氨基酸序列的全长或其片段上可以是80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的。

如本文所用，“载体”可以意指含有复制起点的核酸序列。载体可以是质粒、噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。载体可以是DNA载体或RNA载体。载体可以是自我复制的染色体外载体或整合到宿主基因组中的载体。

对于本文中数值范围的叙述，其间具有相同精确度的每一个中间数被明确考虑。举例来说，对于6-9的范围，除了6和9之外，还考虑了数字7和8，并且对于范围6.0-7.0，数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、以及7.0被明确考虑。

2.组合物

本发明涉及一种组合物，所述组合物包含编码抗体、其片段、其变体或它们的组合的重组核酸序列。当向有需要的受试者施用时，组合物可以引起合成抗体在受试者中的产生。合成抗体可以结合受试者中存在的靶分子(即，流感抗原)。这样的结合可以中和抗原，阻断另一种分子(例如蛋白质或核酸)对抗原的识别，并且引发或诱导对抗原的免疫应答。

在一个实施方案中，组合物包含编码合成抗体的核苷酸序列。在一个实施方案中，组合物包含含有编码第一合成抗体的第一核苷酸序列和编码第二合成抗体的第二核苷酸序列的核酸分子。在一个实施方案中，核酸分子包含编码裂解结构域的核苷酸序列。

在一个实施方案中，核酸分子包含编码抗HA抗体的核苷酸序列。在一个实施方案中，编码抗HA抗体的核苷酸序列包括编码抗HA的可变VH区和VL区的密码子优化的核酸序列。在一个实施方案中，编码抗HA抗体的核苷酸序列包括编码人IgG1κ的CH区和CL区的密码子优化的核酸序列。

在一个实施方案中，核酸分子包含编码FluA重链抗HA的核苷酸序列。在一个实施方案中，核酸分子包含编码FluA轻链抗HA的核苷酸序列。在一个实施方案中，核酸分子包含编码FluA重链抗HA的核苷酸序列和编码FluA轻链抗HA的核苷酸序列。在一个实施方案中，核酸分子包含编码FluB重链抗HA的核苷酸序列和编码FluB轻链抗HA的核苷酸序列。

在一个实施方案中，抗HA抗体结合流感HA的球状头部。在一个实施方案中，抗HA抗体是FJ8。在一个实施方案中，抗HA抗体结合流感HA的融合子结构域。在一个实施方案中，抗HA抗体是FI6。在一个实施方案中，抗HA抗体与FluA H5和H7 HA蛋白交叉反应。在一个实施方案中，抗HA抗体对FluB HA蛋白具有反应性。

在一个实施方案中，核酸分子包含编码抗HA抗体的核苷酸序列，抗HA抗体包含选自SEQ ID NO:1-8的氨基酸序列，或其变体或其片段。在一个实施方案中，编码抗HA抗体的核酸包含SEQ ID NO:9-12中任一个的核苷酸序列，或其变体或其片段。在一个实施方案中，编码抗HA抗体的核酸包含由SEQ ID NO:9-12中任一个的DNA序列或其变体或其片段转录的RNA分子。

在一个实施方案中，核酸分子包含编码抗HA抗体的核苷酸序列，抗HA抗体包含在选自SEQ ID NO:1-8的氨基酸序列的整个长度上具有至少约80％，至少约85％，至少约90％或至少约95％同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，核酸分子包含编码抗HA抗体的片段的核苷酸序列，抗HA抗体包含在选自SEQ ID NO:1-8的氨基酸序列的整个长度上具有至少约80％，至少约85％，至少约90％或至少约95％同一性的氨基酸序列。

在一个实施方案中，核酸分子包含在核苷酸序列的整个长度上与选自SEQ ID NO:9-16的核苷酸序列具有至少约80％，至少约85％，至少约90％或至少约95％同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，核酸分子包含在核苷酸序列的整个长度上与选自SEQ ID NO:9-16的核苷酸序列具有至少约80％，至少约85％，至少约90％或至少约95％同一性的核苷酸序列的片段。

在一个实施方案中，核酸分子包含由在选自SEQ ID NO:9-16的DNA的整个长度上具有至少约80％，至少约85％，至少约90％或至少约95％同一性的DNA序列转录的RNA序列。在一个实施方案中，核酸分子包含由在选自SEQ ID NO:9-16的DNA的整个长度上具有至少约80％，至少约85％，至少约90％或至少约95％同一性的DNA序列转录的RNA序列的片段。

在一个实施方案中，编码抗HA抗体的核苷酸序列包括编码抗HA的可变VH区和VL区的密码子优化的核酸序列。在一个实施方案中，HA的VH区包含SEQ ID NO:5、7、9或10的氨基酸序列，或其变体或其片段。在一个实施方案中，HA的VH区包含与SEQ ID NO:5、7、9或10或其片段至少85％，至少90％或至少95％或更多同源的氨基酸。在一个实施方案中，HA的VL区包含SEQ ID NO:6-10之一的氨基酸序列，或其变体或其片段。在一个实施方案中，HA的核苷酸序列可变VH区包含SEQ ID NO:13或15的核苷酸序列，或其变体或其片段。在一个实施方案中，HA的核苷酸序列可变VH区包含与SEQ ID NO:13或15至少85％，至少90％或至少95％或更多同源的核苷酸序列，或其变体或其片段。在一个实施方案中，HA的核苷酸序列可变VL区包含SEQ ID NO:14、15或16的核苷酸序列，或其变体或其片段。在一个实施方案中，HA的核苷酸序列可变VL区包含与SEQ ID NO:14、15或16、其片段至少85％，至少90％或至少95％或更多同源的核苷酸序列。在一个实施方案中，HA的核苷酸序列可变VL区包含由SEQ IDNO:14、15或16中任一个的DNA序列或其变体或其片段转录的RNA分子。

在一个实施方案中，所述组合物包含至少两种核酸分子。在一个实施方案中，核酸分子选自编码FluA重链抗HA的核酸，编码FluA轻链抗HA的核酸，编码FluA抗HA的核酸和编码FluB抗HA的核酸。在一个实施方案中，核酸分子选自编码SEQ ID NO:1-8之一的核酸。在一个实施方案中，核酸分子选自编码与SEQ ID NO:1-8至少90％同源的肽的核酸。在一个实施方案中，组合物包含含有编码SEQ ID NO:1的核苷酸序列的核酸，并且包含含有编码SEQID NO:2的核苷酸序列的核酸。在一个实施方案中，组合物包含含有含SEQ ID NO:9的核苷酸序列的核酸，并且包含含有含SEQ ID NO:10的核苷酸序列的核酸。

本发明的组合物可以治疗、预防和/或防止任何流感感染。在某些实施方案中，所述组合物可以治疗、预防和/或防止甲型流感感染。在某些实施方案中，所述组合物可治疗、预防和/或防止来自H1类或H3类的甲型流感病毒。在另一个实施方案中，甲型流感病毒是pmH1流感病毒。在其它实施方案中，所述组合物可以治疗、预防和/或防止乙型流感感染。

所述合成抗体可以在接受所述组合物的施用的受试者中治疗、预防、和/或防止疾病。所述合成抗体通过结合抗原可以在接受所述组合物的施用的受试者中治疗、预防、和/或防止疾病。所述合成抗体可以在接受所述组合物的施用的受试者中促进疾病存活率。在一个实施方案中，与未接受合成抗体施用的患病受试者的预期存活率相比，合成抗体可以使受试者的疾病存活率提高。在多个实施方案中，与在不存在组合物的情况下的预期存活率相比，合成抗体可以使已接受组合物施用的受试者的疾病存活率提高至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。在一个实施方案中，与未接受合成抗体施用的受试者的预期保护相比，合成抗体可以增加使受试者的针对疾病的保护。在多个实施方案中，与在不存在组合物的情况下的预期保护相比，合成抗体可以防止接受组合物施用的受试者的疾病至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。

组合物可以在向所述受试者施用组合物的至少约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、20小时、25小时、30小时、35小时、40小时、45小时、50小时、或60小时内引起合成抗体在受试者中产生。组合物可以在向受试者施用组合物的至少约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、或10天内引起合成抗体在受试者中产生。组合物可以在向受试者施用组合物的约1小时至约6天、约1小时至约5天、约1小时至约4天、约1小时至约3天、约1小时至约2天、约1小时至约1天、约1小时至约72小时、约1小时至约60小时、约1小时至约48小时、约1小时至约36小时、约1小时至约24小时、约1小时至约12小时、或约1小时至约6小时内引起合成抗体在受试者中产生。

当向有需要的受试者施用时，与在接受抗原施用以诱导体液免疫应答的受试者中内源性抗体的产生相比，组合物可以更快地引起合成抗体在受试者中产生。组合物可以在接受抗原施用以诱导体液免疫应答的受试者中产生内源性抗体之前至少约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天引起合成抗体的产生。

本发明的组合物可具有有效组合物所需的特征，例如安全，以致所述组合物不会引起疾病或死亡；防止疾病；并且易于施用、副作用少、生物稳定性和每剂量成本低。

3.重组核酸序列

如上文所述，组合物可以包含重组核酸序列。重组核酸序列可以编码抗体、其片段、其变体或它们的组合。抗体在下文中更详细地描述。

重组核酸序列可以是异源核酸序列。重组核酸序列可以包括至少一种异源核酸序列或一种或多种异源核酸序列。

重组核酸序列可以是优化的核酸序列。这种优化可以增加或改变抗体的免疫原性。优化还可以改善转录和/或翻译。优化可以包括以下一种或多种：低GC含量的前导序列用于增加转录；mRNA稳定性和密码子优化；添加kozak序列(例如，GCC ACC)以增加翻译；添加编码信号肽的免疫球蛋白(Ig)前导序列；并尽可能消除顺式作用序列基序(即内部TATA盒)。

a.重组核酸序列构建体

重组核酸序列可以包括一种或多种重组核酸序列构建体。重组核酸序列构建体可以包括一种或多种组分，它们更详细地描述于下文中。

重组核酸序列构建体可以包括编码重链多肽、其片段、其变体或它们的组合的异源核酸序列。重组核酸序列构建体可以包括编码轻链多肽、其片段、其变体或它们的组合的异源核酸序列。重组核酸序列构建体还可以包括编码蛋白酶或肽酶切割位点的异源核酸序列。重组核酸序列构建体可以包括一个或多个前导序列，其中每个前导序列编码信号肽。重组核酸序列构建体可以包括一个或多个启动子、一个或多个内含子、一个或多个转录终止区、一个或多个起始密码子、一个或多个终止密码或终止密码子和/或一个或多个多聚腺苷酸化信号。重组核酸序列构建体还可以包括一个或多个接头或标签序列。标签序列可以编码血凝素(HA)标签。

(1)重链多肽

重组核酸序列构建体可以包括编码重链多肽、其片段、其变体或它们的组合的异源核酸。重链多肽可以包括可变重链(VH)区和/或至少一个恒定重链(CH)区。至少一个恒定重链区可以包括恒定重链区1(CH1)、恒定重链区2(CH2)以及恒定重链区3(CH3)和/或铰链区。

在一些实施方案中，重链多肽可以包括VH区和CH1区。在其他实施方案中，重链多肽可以包括VH区、CH1区、铰链区、CH2区和CH3区。

重链多肽可以包括互补决定区(“CDR”)组。CDR组可以含有VH区的三个高变区。从重链多肽的N末端开始，这些CDR分别被表示为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”。重链多肽的CDR1、CDR2和CDR3可以有助于抗原结合或识别。

(2)轻链多肽

重组核酸序列构建体可以包括编码轻链多肽、其片段、其变体或它们的组合的异源核酸序列。轻链多肽可以包括可变轻链(VL)区和/或恒定轻链(CL)区。

轻链多肽可以包括互补决定区(“CDR”)组。CDR组可以含有VL区的三个高变区。从轻链多肽的N末端开始，这些CDR分别被表示为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”。轻链多肽的CDR1、CDR2和CDR3可以有助于结合或识别抗原。

(3)蛋白酶切割位点

重组核酸序列构建体可以包括编码蛋白酶切割位点的异源核酸序列。蛋白酶切割位点可以由蛋白酶或肽酶识别。蛋白酶可以是内肽酶或内切蛋白酶，例如但不限于弗林蛋白酶、弹性蛋白酶、HtrA、钙蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶。蛋白酶可以是弗林蛋白酶。在其他实施方案中，蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、或切割内部肽键(即，不切割N末端肽键或C末端肽键)的任何蛋白酶。

蛋白酶切割位点可以包括促进或增加切割效率的一个或多个氨基酸序列。一个或多个氨基酸序列可以提高或增加形成或产生离散多肽的效率。一个或多个氨基酸序列可以包括2A肽序列。

(4)接头序列

重组核酸序列构建体可以包括一个或多个接头序列。接头序列可以在空间上分隔或连接本文所述的一种或多种组分。在其他实施方案中，接头序列可以编码在空间上分隔或连接两个或更多个多肽的氨基酸序列。

(5)启动子

重组核酸序列构建体可以包括一个或多个启动子。一个或多个启动子可以是能够驱动基因表达和调控基因表达的任何启动子。这种启动子是经由DNA依赖性RNA聚合酶进行转录所需的顺式作用序列元件。用于引导基因表达的启动子的选择取决于具体的应用。启动子可以位于与重组核酸序列构建体中的转录起始点相距与它在它的天然环境中与转录起始位点相距的距离大致相同的距离处。然而，可以容许该距离的变化而不会丧失启动子功能。

启动子可以与编码重链多肽和/或轻链多肽的异源核酸序列可操作地连接。启动子可以是被证实对于在真核细胞中表达来说有效的启动子。与编码序列可操作地连接的启动子可以是CMV启动子；来自猿猴病毒40(SV40)的启动子，诸如SV40早期启动子和SV40晚期启动子；小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)启动子；人免疫缺陷病毒(HIV)启动子，诸如牛免疫缺陷病毒(BIV)长末端重复序列(LTR)启动子；莫洛尼病毒启动子；禽白血病病毒(ALV)启动子；巨细胞病毒(CMV)启动子，诸如CMV立即早期启动子；爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)启动子或劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子。启动子也可以是来自人基因的启动子，诸如人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸、人多角体蛋白或人金属硫蛋白。

启动子可以是组成型启动子或诱导型启动子，所述诱导型启动子只有当宿主细胞暴露于一些特定的外部刺激时才会引发转录。在多细胞生物体的情况下，启动子也可以对特定组织或器官或发育阶段具有特异性。启动子也可以是天然或合成的组织特异性启动子，诸如肌肉或皮肤特异性启动子。这些启动子的实例描述于美国专利申请公开号US20040175727中，该美国专利申请公开的内容整体并入本文。

启动子可以与增强子结合。增强子可以位于编码序列的上游。增强子可以是人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸或病毒增强子，诸如来自CMV、FMDV、RSV或EBV的增强子。在美国专利第5,593,972、5,962,428和W094/016737号中描述了多核苷酸功能增强，每个专利的内容通过引用全部并入本文。

(6)内含子

重组核酸序列构建体可以包括一个或多个内含子。每个内含子可以包括功能性剪接供体和受体位点。内含子可以包括剪接的增强子。内含子可以包括有效剪接所需的一个或多个信号。

(7)转录终止区

重组核酸序列构建体可以包括一个或多个转录终止区。转录终止区可以在编码序列的下游以提供有效的终止。转录终止区可以从与上述启动子相同的基因中获得或可以从一个或多个不同的基因中获得。

(8)起始密码子

重组核酸序列构建体可以包括一个或多个起始密码子。起始密码子可以位于编码序列的上游。起始密码子可以与编码序列同框。起始密码子可以与有效翻译起始所需的一个或多个信号结合，例如但不限于核糖体结合位点。

(9)终止密码子

重组核酸序列构建体可以包括一个或多个终止子或终止密码子。终止密码子可以在编码序列的下游。终止密码子可以与编码序列同框。终止密码子可以与有效翻译终止所需的一个或多个信号结合。

(10)多聚腺苷酸化信号

重组核酸序列构建体可以包括一个或多个多聚腺苷酸化信号。多聚腺苷酸化信号可以包括转录物的有效多聚腺苷酸化所需的一个或多个信号。多聚腺苷酸化信号可以位于编码序列的下游。多聚腺苷酸化信号可以是SV40多聚腺苷酸化信号、LTR多聚腺苷酸化信号、牛生长激素(bGH)多聚腺苷酸化信号、人生长激素(hGH)多聚腺苷酸化信号、或人β-球蛋白多聚腺苷酸化信号。SV40多聚腺苷酸化信号可以是来自pCEP4质粒(Invitrogen,SanDiego,CA)的多聚腺苷酸化信号。

(11)前导序列

重组核酸序列构建体可以包括一个或多个前导序列。前导序列可以编码信号肽。信号肽可以是免疫球蛋白(Ig)信号肽，例如但不限于IgG信号肽和IgE信号肽。

b.重组核酸序列构建体的排列

如上文所述，重组核酸序列可以包括一种或多种重组核酸序列构建体，其中每种重组核酸序列构建体可以包括一种或多种组分。一种或多种组分详细描述于上文中。当被包括在重组核酸序列构建体中时，一种或多种组分可以相对于彼此以任何顺序排列。在一些实施方案中，一种或多种组分可以如下文所述在重组核酸序列构建体中排列。

(1)排列1

在一种排列中，第一重组核酸序列构建体可以包括编码重链多肽的异源核酸序列，并且第二重组核酸序列构建体可以包括编码轻链多肽的异源核酸序列。

第一重组核酸序列构建体可以被放置在载体中。第二重组核酸序列构建体可以被放置在第二或单独的载体中。将重组核酸序列构建体放置到载体中更详细地描述于下文中。

第一重组核酸序列构建体还可以包括启动子、内含子、转录终止区、起始密码子、终止密码子和/或多聚腺苷酸化信号。第一重组核酸序列构建体还可以包括前导序列，其中前导序列位于编码重链多肽的异源核酸序列的上游(或5')。因此，由前导序列编码的信号肽可以通过肽键与重链多肽连接。

第二重组核酸序列构建体还可以包括启动子、起始密码子、终止密码子和多聚腺苷酸化信号。第二重组核酸序列构建体还可以包括前导序列，其中前导序列位于编码轻链多肽的异源核酸序列的上游(或5')。因此，由前导序列编码的信号肽可以通过肽键与轻链多肽连接。

因此，排列1的一个实例可以包括编码包括VH和CH1的重链多肽的第一载体(并且因此包括第一重组核酸序列构建体)，以及编码包括VL和CL的轻链多肽的第二载体(并且因此包括第二重组核酸序列构建体)。排列1的第二实例可以包括编码包括VH、CH1、铰链区、CH2和CH3的重链多肽的第一载体(并且因此包括第一重组核酸序列构建体)，以及编码包括VL和CL的轻链多肽的第二载体(并且因此包括第二重组核酸序列构建体)。

(2)排列2

在第二排列中，重组核酸序列构建体可以包括编码重链多肽的异源核酸序列和编码轻链多肽的异源核酸序列。编码重链多肽的异源核酸序列可以位于编码轻链多肽的异源核酸序列的上游(或5')。或者，编码轻链多肽的异源核酸序列可以位于编码重链多肽的异源核酸序列的上游(或5')。

重组核酸序列构建体可以被放置在载体中，如下文更详细描述的那样。

重组核酸序列构建体可以包括编码蛋白酶切割位点的异源核酸序列和/或接头序列。如果被包括在重组核酸序列构建体中，那么编码蛋白酶切割位点的异源核酸序列可以位于编码重链多肽的异源核酸序列和编码轻链多肽的异源核酸序列之间。因此，蛋白酶切割位点允许在表达时将重链多肽和轻链多肽分离成不同的多肽。在其他实施方案中，如果接头序列被包括在重组核酸序列构建体中，则接头序列可以位于编码重链多肽的异源核酸序列和编码轻链多肽的异源核酸序列之间。

重组核酸序列构建体还可以包括启动子、内含子、转录终止区、起始密码子、终止密码子和/或多聚腺苷酸化信号。重组核酸序列构建体可以包括一个或多个启动子。重组核酸序列构建体可以包括两个启动子以使得一个启动子可以与编码重链多肽的异源核酸序列关联，并且第二启动子可以与编码轻链多肽的异源核酸序列关联。在另外的其他实施方案中，重组核酸序列构建体可以包括一个启动子，该启动子与编码重链多肽的异源核酸序列和编码轻链多肽的异源核酸序列关联。

重组核酸序列构建体还可以包括两个前导序列，其中第一前导序列位于编码重链多肽的异源核酸序列的上游(或5')，并且第二前导序列位于编码轻链多肽的异源核酸序列的上游(或5')。因此，由第一前导序列编码的第一信号肽可以通过肽键与重链多肽连接，并且由第二前导序列编码的第二信号肽可以通过肽键与轻链多肽连接。

因此，排列2的一个实例可以包括编码包括VH和CH1的重链多肽以及包括VL和CL的轻链多肽的载体(并且因此包括重组核酸序列构建体)，其中接头序列位于编码重链多肽的异源核酸序列和编码轻链多肽的异源核酸序列之间。

排列2的第二实例可以包括编码包括VH和CH1的重链多肽以及包括VL和CL的轻链多肽的载体(并且因此包括重组核酸序列构建体)，其中编码蛋白酶切割位点的异源核酸序列位于编码重链多肽的异源核酸序列和编码轻链多肽的异源核酸序列之间。

排列2的第三实例可以包括编码包括VH、CH1、铰链区、CH2和CH3的重链多肽以及包括VL和CL的轻链多肽的载体(并且因此包括重组核酸序列构建体)，其中接头序列位于编码重链多肽的异源核酸序列和编码轻链多肽的异源核酸序列之间。

排列2的第四实例可以包括编码包括VH、CH1、铰链区、CH2和CH3的重链多肽以及包括VL和CL的轻链多肽的载体(并且因此包括重组核酸序列构建体)，其中编码蛋白酶切割位点的异源核酸序列位于编码重链多肽的异源核酸序列和编码轻链多肽的异源核酸序列之间。

c.从重组核酸序列构建体表达

如上文所述，在一种或多种组分中，重组核酸序列构建体可以包括编码重链多肽的异源核酸序列和/或编码轻链多肽的异源核酸序列。因此，重组核酸序列构建体可以促进重链多肽和/或轻链多肽的表达。

当利用如上文所述的排列1时，第一重组核酸序列构建体可以促进重链多肽的表达，并且第二重组核酸序列构建体可以促进轻链多肽的表达。当利用如上文所述的排列2时，重组核酸序列构建体可以促进重链多肽和轻链多肽的表达。

在表达时，例如但不限于在细胞、生物体或哺乳动物中，重链多肽和轻链多肽可以组装成合成抗体。具体来说，重链多肽和轻链多肽可以彼此相互作用以使得组装产生能够结合抗原的合成抗体。在其他实施方案中，重链多肽和轻链多肽可以彼此相互作用以使得组装产生与并非如本文所述组装的抗体相比具有更大的免疫原性的合成抗体。在另外的其他实施方案中，重链多肽和轻链多肽可以彼此相互作用以使得组装产生能够引发或诱导对抗原的免疫应答的合成抗体。

d.载体

上述重组核酸序列构建体可以被放置在一种或多种载体中。一种或多种载体可以含有复制起点。一种或多种载体可以是质粒、噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。一种或多种载体可以是自我复制染色体外载体或整合到宿主基因组中的载体。

载体包括但不限于质粒、表达载体、重组病毒、任何形式的重组“裸DNA”载体等等。“载体”包含可以感染、转染、瞬时或永久转导细胞的核酸。应认识到，载体可以是裸核酸，或与蛋白质或脂质复合的核酸。载体任选地包含病毒或细菌核酸和/或蛋白质和/或膜(例如，细胞膜、病毒脂质包膜等)。载体包括但不限于DNA片段可以附接和复制的复制子(例如，RNA复制子、噬菌体)。因此，载体包括但不限于RNA、自主自我复制的环状或线性DNA或RNA(例如，质粒、病毒等，参见，例如美国专利第5,217,879号)，并且包括表达和非表达质粒。在一些实施方案中，载体包括线性DNA、酶DNA或合成DNA。当重组微生物或细胞培养物被描述为具有“表达载体”时，这包括染色体外环状和线性DNA以及已整合进一条或多条宿主染色体的DNA二者。当载体由宿主细胞维持时，载体可以在有丝分裂期间作为自主结构由细胞稳定复制，或整合在宿主的基因组内。

一种或多种载体可以是异源表达构建体，其通常是用于将特定基因引入到靶细胞中的质粒。一旦表达载体处于细胞内，由重组核酸序列构建体编码的重链多肽和/或轻链多肽就由细胞转录和翻译机制核糖体复合物产生。所述一种或多种载体可以表达大量稳定的信使RNA，因此也可以表达蛋白质。

(1)表达载体

一种或多种载体可以是环状质粒或线性核酸。环状质粒和线性核酸能够引导特定核苷酸序列在适当的受试者细胞中表达。包含重组核酸序列构建体的一种或多种载体可以是嵌合的，这意味着其组分中的至少一种相对于其他组分中的至少一种是异源的。

(2)质粒

一种或多种载体可以是质粒。质粒可用于用重组核酸序列构建体转染细胞。质粒可用于将重组核酸序列构建体引入受试者中。质粒还可以包含调控序列，所述调控序列可以非常适合于其中施用质粒的细胞中的基因表达。

质粒还可以包含哺乳动物复制起点，以在染色体外维持质粒并且在细胞中产生质粒的多个拷贝。质粒可以是来自Invitrogen(San Diego,CA)的pVAX、pCEP4或pREP4，它们可以包含爱泼斯坦-巴尔病毒复制起点和核抗原EBNA-1编码区，这可以在没有整合的情况下产生高拷贝游离型复制。质粒的骨架可以是pAV0242。质粒可以是复制缺陷型5型腺病毒(Ad5)质粒。

质粒可以是pSE420(Invitrogen,San Diego,Calif.)，可以用于在大肠杆菌(E.coli)中产生蛋白质。质粒也可以是p YES2(Invitrogen,San Diego,Calif.)，其可以用于在酵母的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)株中产生蛋白质。质粒也可以是MAXBAC^TM完整杆状病毒表达系统(Invitrogen,San Diego,Calif.)，其可以用于在昆虫细胞中产生蛋白质。质粒也可以是pcDNAI或pcDNA3(Invitrogen,San Diego,Calif.)，其可以用于在哺乳动物细胞，诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中产生蛋白质。

(3)RNA

在一个实施方案中，所述核酸为RNA分子。在一个实施方案中，所述RNA分子由本文所述的DNA序列转录而来。例如，在一些实施方案中，RNA分子由SEQ ID NO:9-16之一编码。在另一个实施方案中，所述核苷酸序列包含由编码SEQ ID NO:9-16的多肽序列，或其变体或其片段的DNA序列转录的RNA序列。因此，在一个实施方案中，本发明提供了编码一种或多种DMAb的RNA分子。RNA可以是正链。因此，在一些实施方案中，RNA分子可以由细胞翻译，而不需要任何中间重复步骤，诸如逆转录。本发明所用的RNA分子可以具有5′帽(例如7-甲基鸟苷)。该帽可以增加RNA的体内翻译。本发明所用的RNA分子的5′核苷酸可以具有5′三磷酸基团。在加帽RNA中，这可以通过5′至5′桥连接至7-甲基鸟苷。RNA分子可以具有3′多聚腺苷酸尾。它还可包括其3′末端附近的多聚腺苷酸聚合酶识别序列(例如AAUAAA)。可用于本发明的RNA分子可以是单链的。可用于本发明的RNA分子可包括合成RNA。

(4)环状和线性载体

一种或多种载体可以是环状质粒，其可以通过整合到细胞基因组中来转化靶细胞或在染色体外存在(例如，具有复制起点的自主复制质粒)。载体可以是pVAX、pcDNA3.0或provax，或能够表达由重组核酸序列构建体编码的重链多肽和/或轻链多肽的任何其他表达载体。

本文还提供了线性核酸或线性表达盒(“LEC”)，其能够经由电穿孔有效地向受试者递送并且表达由重组核酸序列构建体编码的重链多肽和/或轻链多肽。LEC可以是缺乏任何磷酸骨架的任何线性DNA。LEC可以不含任何抗生素抗性基因和/或磷酸骨架。LEC可以不含与所期望的基因表达无关的其他核酸序列。

LEC可以来源于能够线性化的任何质粒。质粒可能能够表达由重组核酸序列构建体编码的重链多肽和/或轻链多肽。质粒可以是pNP(Puerto Rico/34)或pM2(NewCaledonia/99)。质粒可以是WLV009、pVAX、pcDNA3.0或provax，或能够表达由重组核酸序列构建体编码的重链多肽和/或轻链多肽的任何其他表达载体。

LEC可以是pcrM2。LEC可以是pcrNP。pcrNP和pcrMR可以分别来源于pNP(PuertoRico/34)和pM2(New Caledonia/99)。

(5)病毒载体

在一个实施方案中，本文提供病毒载体，它们能够将本发明的核酸递送至细胞。表达载体可以以病毒载体的形式提供给细胞。病毒载体技术是本领域中公知的，并且例如在Sambrook等人(2001年)和在在Ausubel等人(1997)，以及其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。一般来讲，合适的载体含有在至少一种生物体中发挥功能的复制起点、启动子序列、简便限制性核酸内切酶位点以及一个或多个选择性标记。(参见，例如WO 01/96584；WO01/29058；和美国专利第6,326,193号。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物(例如人)细胞的方法。其他病毒载体可以来源于慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺相关病毒等等。参见例如，美国专利第5,350,674和5,585,362号。

(6)制备载体的方法

本文提供了一种用于制备一种或多种载体的方法，在一种或多种载体中已经放置了重组核酸序列构建体。在最终亚克隆步骤之后，可以使用本领域已知的方法，使用载体来接种大规模发酵罐中的细胞培养物。

在其他实施方案中，在最终亚克隆步骤之后，可以将载体与一种或多种电穿孔(EP)装置一起使用。EP装置更详细地描述于下文中。

一种或多种载体可以使用已知装置和技术组合配制或制造，但优选地，它们使用2007年5月23日提交的、许可的、共同未决的美国临时专利申请美国序列号60/939,792描述的质粒制造技术来制造。在一些实例中，本文所述的DNA质粒可以以大于或等于10mg/mL的浓度配制。除了美国序列号60/939792中所述的那些装置和方案之外，制造技术还包括或结合了本领域的普通技术人员通常已知的多种装置和方案，包括2007年7月3日公布的许可专利美国专利号7,238,522中所述的那些。上文引用的申请和专利美国序列号60/939,792和美国专利号7,238,522分别据此整体并入本文。

4.抗体

如上文所述，重组核酸序列可以编码抗体、其片段、其变体或它们的组合。抗体可以与抗原结合或反应，所述抗原更详细地描述于下文中。

抗体可以包含重链互补决定区(“CDR”)组和轻链互补决定区组，其分别插入于重链框架(“FR”)组和轻链框架组之间，这为CDR提供支撑并且限定CDR相对于彼此的空间关系。CDR组可以含有重链V区或轻链V区的三个高变区。从重链或轻链的N末端开始，这些区域分别表示为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”。抗原结合位点因此可以包括六个CDR，包括来自重链V区和轻链V区中的每一个的CDR组。

蛋白水解酶木瓜蛋白酶优先切割IgG分子以产生几个片段，其中两个(F(ab)片段)各自包含包括完整抗原结合位点的共价异二聚体。胃蛋白酶能够切割IgG分子以提供几个片段，包括F(ab')₂片段，其包含两个抗原结合位点。因此，抗体可以是Fab或F(ab')₂。Fab可以包括重链多肽和轻链多肽。Fab的重链多肽可以包括VH区和CH1区。Fab的轻链可以包括VL区和CL区。

抗体可以是免疫球蛋白(Ig)。Ig可以是例如IgA、IgM、IgD、IgE和IgG。免疫球蛋白可以包括重链多肽和轻链多肽。免疫球蛋白的重链多肽可以包括VH区、CH1区、铰链区、CH2区和CH3区。免疫球蛋白的轻链多肽可以包括VL区和CL区。

抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。抗体可以是嵌合抗体、单链抗体、亲和力成熟抗体、人抗体、人源化抗体或完全人抗体。人源化抗体可以是来自非人物种的结合所期望的抗原的抗体，所述抗原具有来自非人物种的一个或多个互补决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的框架区。

抗体可以是如下文更详细描述的双特异性抗体。抗体可以是也如下文更详细描述的双功能抗体。

如上文所述，在向受试者施用组合物后，在受试者体内可以产生抗体。抗体在受试者体内可能具有半衰期。在一些实施方案中，抗体可以被修饰以延长或缩短其在受试者体内的半衰期。这样的修饰更详细地描述于下文中。

抗体可以是脱岩藻糖基化的，如下文更详细描述的那样。

抗体可以被修饰以减少或防止抗原相关的疾病的抗体依赖性增强(ADE)，如下文更详细描述的那样。

a.双特异性抗体

重组核酸序列可以编码双特异性抗体、其片段、其变体或它们的组合。双特异性抗体可以与两种抗原结合或反应，例如下文更详细描述的抗原中的两种。双特异性抗体可以由本文所述的两种抗体的片段组成，从而允许双特异性抗体与两种预期靶分子结合或反应，所述靶分子可以包括抗原(其在下文中有更详细地描述)、配体(包括受体的配体)、受体(包括受体上的配体结合位点)、配体-受体复合物和标志物(包括癌症标志物)。

b.双功能抗体

重组核酸序列可以编码双功能抗体、其片段、其变体或它们的组合。双功能抗体可以与下文所述的抗原结合或反应。双功能抗体还可以被修饰以赋予抗体除识别和结合抗原之外的另外的功能。这样的修饰可以包括但不限于与因子H或其片段偶联。因子H是补体激活的可溶性调节因子并且因此可以经由补体介导的裂解(CML)来促进免疫应答。

c.延长抗体半衰期

如上文所述，抗体可以被修饰以延长或缩短抗体在受试者体内的半衰期。修饰可以延长或缩短抗体在受试者的血清中的半衰期。

修饰可以存在于抗体的恒定区中。修饰可以是抗体的恒定区中的一个或多个氨基酸取代，与不包含一个或多个氨基酸取代的抗体的半衰期相比，一个或多个氨基酸置换延长了抗体的半衰期。修饰可以是抗体的CH2域中的一个或多个氨基酸取代，与不包含一个或多个氨基酸取代的抗体的半衰期相比，一个或多个氨基酸取代延长了抗体的半衰期。

在一些实施方案中，恒定区中的一个或多个氨基酸取代可以包括用酪氨酸残基置换恒定区中的甲硫氨酸残基、用苏氨酸残基置换恒定区中的丝氨酸残基、用谷氨酸残基置换恒定区中的苏氨酸残基或它们的任何组合，从而延长抗体的半衰期。

在其他实施方案中，恒定区中的一个或多个氨基酸置换可以包括用酪氨酸残基置换CH2结构域中的甲硫氨酸残基、用苏氨酸残基置换CH2结构域中的丝氨酸残基、用谷氨酸残基置换CH2结构域中的苏氨酸残基或它们的任何组合，从而延长抗体的半衰期。

d.脱岩藻糖基化

重组核酸序列可以编码未经岩藻糖基化的抗体(即，脱岩藻糖基化抗体或非岩藻糖基化抗体)、其片段、其变体或它们的组合。岩藻糖基化包括将糖岩藻糖添加到分子中，例如，将岩藻糖与N-聚糖、O-聚糖以及糖脂连接。因此，在脱岩藻糖基化抗体中，岩藻糖不与恒定区的碳水化合物链连接。进而，与岩藻糖基化抗体相比，这种岩藻糖基化的缺乏可以提高抗体的FcγRIIIa结合和抗体指导的细胞毒性(ADCC)活性。因此，在一些实施方案中，与岩藻糖基化抗体相比，非岩藻糖基化抗体可以表现出增加的ADCC活性。

抗体可以被修饰以防止或抑制抗体的岩藻糖基化。在一些实施方案中，与未修饰的抗体相比，这样的修饰的抗体可以表现出增加的ADCC活性。修饰可以在重链、轻链或它们的组合中。修饰可以是重链中的一个或多个氨基酸取代、轻链中的一个或多个氨基酸取代或它们的组合。

e.减少的ADE反应

抗体可以被修饰以减少或防止抗原相关的疾病的抗体依赖性增强(ADE)，但是仍中和抗原。

在一些实施方案中，抗体可以被修饰以包括减少或防止抗体与FcyR1a结合的一个或多个氨基酸取代。一个或多个氨基酸取代可以在抗体的恒定区中。一个或多个氨基酸取代可以包括在抗体的恒定区中用丙氨酸残基置换亮氨酸残基，即在本文也被称为LA、LA突变或LA取代。一个或多个氨基酸取代可以包括在抗体的恒定区中分别用丙氨酸残基取代两个亮氨酸残基，并且在本文也被称为LALA、LALA突变或LALA取代。LALA取代的存在可以防止或阻断抗体与FcyR1a结合，因此修饰的抗体不会增强或引起抗原相关的疾病的ADE，但是仍中和抗原。

5.抗原

合成抗体涉及抗原或其片段或变体。抗原可以是核酸序列、氨基酸序列或其组合。核酸序列可以是DNA、RNA、cDNA、其变体、其片段或它们的组合。氨基酸序列可以是蛋白质、肽、其变体、其片段或它们的组合。

在一些实施方案中，抗原是自身抗原。在一个实施方案中，抗原是流感HA。在一个实施方案中，抗原是流感HA的球状头部。在一个实施方案中，抗原是流感HA的融合子结构域

a.外来抗原

在一些实施方案中，抗原是外来的。外来抗原是任何非自身物质(即，源于受试者外部)，当其被引入体内时，能够刺激免疫应答。

(1)病毒抗原

外来抗原可以是病毒抗原或其片段，或其变体。

病毒抗原可包括来自流感病毒的抗原。流感抗原是那些能够在哺乳动物中引发针对一种或多种流感血清型的免疫应答的抗原。抗原可包含全长翻译产物HA0、亚基HA1、亚基HA2、其变体、其片段或其组合。流感血凝素抗原可以源自甲型流感血清型H1、血清型H2的多种病毒株，源自甲型流感血清型H1的多种病毒株的不同组的杂合序列，或源自多种乙型流感病毒株。流感血凝素抗原可以是来自乙型流感。

流感抗原还可以含有至少一个抗原表位，其可以有效对抗针对其可以诱导免疫应答的特定流感免疫原。抗原可以提供完整流感病毒中存在的全部免疫原位点和表位。抗原可以源自来自一种血清型的多种甲型流感病毒株，诸如血清型H1或血清型H2的多种甲型流感病毒株的血凝素抗原序列。抗原可以是源自组合两种不同血凝素抗原序列或其部分的杂合血凝素抗原序列。两种不同的血凝素抗原序列中的每一种可以源自一种血清型的多种甲型流感病毒株，例如血清型H1的多种甲型流感病毒株的不同组。抗原可以是源自来自多种乙型流感病毒株的血凝素抗原序列的血凝素抗原序列。

在一些实施方案中，流感抗原可以是H1 HA、H2 HA、H3 HA、H5 HA或BHA抗原。

b.自身抗原

在一些实施方案中，抗原是自身抗原。自身抗原可以是受试者自身的能够刺激免疫应答的组成部分。在一些实施方案中，除非受试者处于疾病状态，例如自身免疫性疾病，否则自身抗原不会引发免疫应答。

自身抗原可包括但不限于细胞因子，针对病毒诸如上文列出的包括HIV和登革热在内的那些的抗体，影响癌症进展或发展的抗原，以及细胞表面受体或跨膜蛋白。

6.组合物的赋形剂和其他组分

组合物还可以包含药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂可以是功能性分子，诸如媒介物、载剂或稀释剂。药学上可接受的赋形剂可以是转染促进剂，其可以包括表面活性剂，诸如免疫刺激复合物(ISCOMS)；弗氏不完全佐剂(Freunds incompleteadjuvant)；LPS类似物，包括单磷酰脂质A；胞壁酰肽；醌类似物；囊泡，诸如鲨烯和角鲨烯；透明质酸；脂质；脂质体；钙离子；病毒蛋白；聚阴离子；聚阳离子或纳米颗粒或者其他已知的转染促进剂。

转染促进剂是聚阴离子；聚阳离子，包括聚L-谷氨酸(LGS)；或脂质。转染促进剂是聚L-谷氨酸，聚L-谷氨酸可以以小于6mg/ml的浓度存在于组合物中。转染促进剂还可以包括表面活性剂，诸如免疫刺激复合物(ISCOMS)；弗氏不完全佐剂；LPS类似物，包括单磷酰脂质A；胞壁酰肽；醌类似物以及囊泡，诸如鲨烯和角鲨烯，并且还可以使用与组合物结合施用的透明质酸。组合物还可以包括转染促进剂，诸如脂质；脂质体，包括卵磷脂脂质体或本领域已知的其他脂质体，作为DNA-脂质体混合物(参见例如W09324640)；钙离子、病毒蛋白、聚阴离子、聚阳离子或纳米颗粒或者其他已知的转染促进剂。转染促进剂是聚阴离子；聚阳离子，包括聚L-谷氨酸(LGS)；或脂质。疫苗中转染剂的浓度小于4mg/ml、小于2mg/ml、小于1mg/ml、小于0.750mg/ml、小于0.500mg/ml、小于0.250mg/ml、小于0.100mg/ml、小于0.050mg/ml或小于0.010mg/ml。

组合物还可以包含1994年4月1日提交的美国序列号021,579中所述的遗传促进剂，该专利以引用的方式整体并入。

该组合物可包含DNA，其量为约1纳克至100毫克；约1微克至约10毫克；或优选约0.1微克至约10毫克；或更优选约1毫克至约2毫克。在一些优选的实施方案中，根据本发明的组合物包含约5纳克至约1000微克的DNA。在一些优选的实施方案中，组合物可以含有约10纳克至约800微克的DNA。在一些优选的实施方案中，组合物可以含有约0.1微克至约500微克的DNA。在一些优选的实施方案中，组合物可以含有约1微克至约350微克的DNA。在一些优选的实施方案中，组合物可含有约25至约250微克，约100至约200微克，约1纳克至100毫克；约1微克到约10毫克；约0.1微克到约10毫克；约1毫克至约2毫克，约5纳克至约1000微克，约10纳克至约800微克，约0.1至约500微克，约1至约350微克，约25至约250微克，约100至约200微克的DNA。

组合物可以根据要使用的施用方式来配制。可注射的药物组合物可以是无菌的、无热原的和无颗粒的。可以使用等渗制剂或溶液。用于等渗性的添加剂可以包括氯化钠、右旋糖、甘露糖醇、山梨糖醇和乳糖。组合物可以包含血管收缩剂。等渗溶液可以包括磷酸盐缓冲盐水。组合物还可以包含稳定剂，包括明胶和白蛋白。稳定剂可以允许制剂在室温或环境温度下在一段较长的时间内稳定，包括LGS或聚阳离子或聚阴离子。

7.产生合成抗体的方法

本发明还涉及一种产生合成抗体的方法。该方法可以包括通过使用下文更详细描述的递送方法向有需要的受试者施用组合物。因此，在向受试者施用组合物后，在受试者中或体内产生合成抗体。

该方法还可以包括将组合物引入一种或多种细胞中，并且因此，在一种或多种细胞中可以形成或产生合成抗体。该方法还可以包括将组合物引入一种或多种组织中，例如但不限于皮肤和肌肉，并且因此，在一种或多种组织中可以形成或产生合成抗体。

8.鉴定或筛选抗体的方法

本发明还涉及一种鉴定或筛选上述抗体的方法，所述抗体对上述抗原具有反应性或结合上述抗原。鉴定或筛选抗体的方法可以在本领域技术人员已知的方法中使用抗原来鉴定或筛选抗体。这些方法可以包括但不限于从文库(例如，噬菌体展示)中选择抗体以及对动物进行免疫接种，然后分离和/或纯化抗体。

9.组合物的递送方法

本发明还涉及一种向有需要的受试者递送组合物的方法。递送方法可以包括向受试者施用组合物。施用可以包括但不限于在进行和不进行体内电穿孔的情况下进行DNA注射、脂质体介导的递送以及纳米颗粒促进的递送。

接受组合物的递送的哺乳动物可以是人、灵长类动物、非人灵长类动物、奶牛、牛、绵羊、山羊、羚羊、野牛、水牛、野牛、牛科动物、鹿、刺猬、象、美洲驼、羊驼、小鼠、大鼠和鸡。

组合物可以通过不同的途径施用，包括口服、肠胃外、舌下、透皮、经直肠、经粘膜、局部、经由吸入、经由颊面施用、胸膜内、静脉内、动脉内、腹膜内、皮下、肌内、鼻内、鞘内以及关节内或它们的组合。对于兽医用途，组合物可以根据正常的兽医实践作为可适当接受的制剂施用。兽医可以容易地确定最适合于具体动物的给药方案和施用途径。组合物可以通过传统注射器、无针注射装置、“微粒轰击基因枪”或其他物理方法，诸如电穿孔(“EP”)、“流体动力学方法”或超声来施用。

a.电穿孔

经由电穿孔施用组合物可以使用电穿孔装置来完成，所述电穿孔装置可以被配置成向哺乳动物的所期望的组织递送能够有效引起在细胞膜中形成可逆性孔隙能量脉冲，并且优选的是，能量脉冲是与使用者输入的预设电流相似的恒定电流。电穿孔装置可以包括电穿孔部件和电极组件或柄部组件。电穿孔部件可以包括和结合电穿孔装置的各种元件中的一种或多种，包括：控制器、电流波形发生器、阻抗测试器、波形记录器、输入元件、状态报告元件、通信端口、存储部件、电源和电源开关。电穿孔可以使用体内电穿孔装置完成，例如CELLECTRA EP系统(Inovio Pharmaceuticals,Plymouth Meeting,PA)或Elgen电穿孔仪(Inovio Pharmaceuticals,Plymouth Meeting,PA)，以促进质粒对细胞的转染。

电穿孔部件可以充当电穿孔装置的一个元件，并且其他元件是与电穿孔部件通信的单独元件(或部件)。电穿孔部件可以充当电穿孔装置的多于一个元件，其可以与和电穿孔部件分开的电穿孔装置的另外其他元件通信。作为一个机电装置或机械装置的零件存在的电穿孔装置的元件可以不受限制，因为元件可以充当一个装置或彼此通信的单独元件。电穿孔部件可能能够在所期望的组织中递送产生恒定电流的能量脉冲，并且包括反馈机制。电极组件可以包括具有空间排列的多个电极的电极阵列，其中电极组件从电穿孔部件接收能量脉冲并且将其经由电极递送至所期望的组织。多个电极中的至少一个在递送能量脉冲期间是中性的，并且测量所期望组织中的阻抗，并且将阻抗传送给电穿孔部件。反馈机制可以接收所测量的阻抗并且可以调整由电穿孔部件递送的能量脉冲以维持恒定电流。

多个电极可以以分散模式递送能量脉冲。多个电极可以经由按照编程序列控制电极以分散模式来递送能量脉冲，并且编程序列是由使用者输入到电穿孔部件。编程序列可以包括按顺序递送的多个脉冲，其中多个脉冲中的每一个脉冲是由至少两个有源电极递送的，其中一个中性电极测量阻抗，并且其中多个脉冲的后续脉冲由至少两个有源电极中不同的电极递送，其中一个中性电极测量阻抗。

反馈机制可以通过硬件或软件执行。反馈机制可以通过模拟闭环电路执行。反馈每50μs、20μs、10μs或1μs发生一次，但优选地是实时反馈或瞬时的(即基本上瞬时的，如通过用于确定响应时间的可用技术确定)。中性电极可以测量所期望的组织中的阻抗并且将阻抗传送给反馈机制，并且反馈机制对阻抗作出响应并且调整能量脉冲以将恒定电流维持在与预设电流相似的值。反馈机制可以在递送能量脉冲期间连续地并且瞬时地维持恒定电流。

可以促进本发明的组合物的递送的电穿孔装置和电穿孔方法的实例包括Draghia-Akli等人的美国专利号7,245,963、Smith等人递交的美国专利公开2005/0052630中所述的那些，这些文献的内容据此以引用的方式整体并入本文。可以用于促进组合物的递送的其他电穿孔装置和电穿孔方法包括2007年10月17日提交的共同未决的和共同拥有的美国专利申请序列号11/874072中提供的那些，该美国专利申请依照美国法典第35篇第119条(e)款要求保护2006年10月17日提交的美国临时申请序列号60/852,149和2007年10月10日提交的美国临时申请序列号60/978,982的权益，所有申请均据此整体并入。

Draghia-Akli等人的美国专利号7,245,963描述了模块化电极系统和它们用于促进将生物分子引入到身体或植物中所选择的组织的细胞中的用途。模块化电极系统可包括多个针电极；皮下注射针；电连接器，其提供从可编程恒流脉冲控制器到多个针电极的导电连接；和电源。操作人员可以抓住安装在支撑结构上的多个针电极并且将它们牢固地插入到身体或植物中所选择的组织中。然后经由皮下注射针将生物分子递送到所选择的组织中。启动可编程的恒定电流脉冲控制器并且将恒定电流电脉冲施加到多个针电极。所施加的恒定电流电脉冲促进将生物分子引入到多个电极之间的细胞中。美国专利号7,245,963的全部内容据此以引用的方式并入。

Smith等人递交的美国专利公开2005/0052630描述了一种电穿孔装置，其可以用于有效地促进生物分子引入到身体或植物中所选择的组织的细胞中。电穿孔装置包括电动装置(“EKD装置”)，其操作由软件或固件指定。EKD装置基于使用者对脉冲参数的控制和输入在阵列中的电极之间产生一系列可编程的恒定电流脉冲图形，并且允许存储和获取电流波形数据。电穿孔装置还包括可更换的电极盘，所述电极盘具有针电极的阵列、用于注射针的中心注射通道以及可移除的引导盘。美国专利公开2005/0052630的全部内容在此以引用的方式并入。

美国专利号7,245,963和美国专利公开2005/0052630中所述的电极阵列和方法可以适用于不仅深度穿透到诸如肌肉的组织中，而且还深度穿透到其他组织或器官中。由于电极阵列的配置，因此注射针(递送所选择的生物分子)也完全插入到靶器官中，并且在由电极预先界定的区域中垂直于靶组织施用注射。美国专利号7,245,963和美国专利公开2005/005263中所述的电极优选地为20mm长和21号。

此外，在包括电穿孔装置和其用途的一些实施方案中考虑，电穿孔装置是以下专利中所述的那些：1993年12月28日公布的美国专利5,273,525、2000年8月29日公布的美国专利6,110,161、2001年7月17日公布的美国专利6,261,281、和2005年10月25日公布的美国专利6,958,060、以及2005年9月6日公布的美国专利6,939,862。此外，本文考虑了涵盖2004年2月24日公布的美国专利6,697,669(涉及使用多种装置中的任一种递送DNA)和2008年2月5日公布的美国专利7,328,064(涉及注射DNA的方法)中提供的主题的专利。上述专利以引用的方式整体并入。

10.治疗方法

本文还提供了一种在有需要的受试者中通过在受试者中产生合成抗体来治疗、防止和/或预防疾病的方法。该方法可以包括向受试者施用组合物。向受试者施用组合物可以使用上述递送方法进行。

在某些实施方案中，本发明提供治疗、防止和/或预防流感感染或与流感感染相关的疾病或病症的方法。例如，在一个实施方案中，该方法治疗、防止和/或预防甲型流感。在一个实施方案中，该方法治疗、防止和/或预防呼吸道感染。通过施用本发明的组合物治疗或预防的示例性疾病或病症包括但不限于病毒或细菌性肺炎、脱水和耳部感染和鼻窦感染。

在受试者中产生合成抗体后，合成抗体可以与抗原结合或反应。这种结合可以中和抗原，阻断另一种分子(例如蛋白质或核酸)对抗原的识别，并且引发或诱导对抗原的免疫应答，从而治疗、防止和/或预防受试者的抗原相关的疾病。

组合物剂量可以是1μg至10mg活性组分/kg体重/次，并且可以是20μg至10mg组分/kg体重/次。组合物可以每1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天或31天施用。用于有效治疗的组合物剂量数可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。

本发明具有通过以下非限制性实施例说明的多个方面。

11.实施例

在以下实施例中进一步说明本发明。应当了解的是，这些实施例虽然表明了本发明的优选的实施方案，但是仅通过说明方式给出。从上述论述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不脱离其精神和范围的情况下，可以对本发明进行各种变化和修改以使它适应各种用途和条件。因此，根据上述说明，除本文所示和所述的那些之外，本发明的多种修改对本领域技术人员来说将是显而易见的。这些修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。

实施例1

本文提供的研究证明通过质粒DNA的肌内电穿孔产生功能性抗IL-6和抗CD126“DNA单克隆抗体”(DMAb)。将来自抗IL-6和抗CD126单克隆抗体的密码子优化的可变区DNA序列合成到人IgG1恒定结构域上。将编码抗体的质粒DNA递送至BALB/c小鼠体内(图1)。该研究支持DMAb作为现有生物疗法的替代方案，并提供了一种新方法用于进一步明确体内IL-6信号传导在免疫病理学中的作用。

现在描述方法和材料

抗体DNA序列和克隆：

抗流感5J8和FI6抗体克隆序列先前已公布(Krause等人，2011,J virol 85(20):10905-8；Corti等人，2011,Science 333(6044):850-6)。可变区DNA序列经密码子优化并合成为恒定人IgG1κ主链。将构建体克隆到经修饰的pVax-1哺乳动物表达质粒中。包括弗林蛋白酶(furin)/2A肽切割位点用于分离重链肽和轻链肽。(图1)。

转染：

使用GeneJammer(Agilent Technologies)，用0.5μg质粒DNA转染大约1x10⁶个293T细胞。48小时后收集细胞上清液和裂解物。

DMAb电穿孔：

100-300μg质粒DNA经肌肉内递送至股四头肌，然后如前所述用3P装置(Inovio Pharmaceuticals,Plymouth Meeting,PA)进行电穿孔(Flingai等人，2015,Sci Rep 29(5):12616；Muthumani等人，2013,Hum Vaccin Immunother,9(10):2253-62。

ELISA和Western印迹：

人IgG1κ与抗人-F_c片段结合，并用抗κ轻链HRP偶联抗体(Bethyl)检测，并针对人IgG1κ标准抗体进行定量。用HRP偶联的抗人IgG二抗(Sigma-Aldrich)检测与重组HA(Immune-Technologies)的结合。用偶联的抗人IgG 800nm抗体(Licor)显示出Western印迹。

现在描述实验结果

编码抗流感抗体的质粒DNA的肌内电穿孔在体内产生单克隆抗体

单克隆抗体可变VH和VL氨基酸序列经DNA密码子优化。用人IgG1κ抗体恒定CH区和CL区DNA序列合成密码子优化的DNA。将工程改造的DNA序列克隆到经修饰的pVax-1表达载体中。肌肉内注射质粒构建体，然后用装置(Inovio Pharmaceuticals)进行电穿孔。测量体内产生的人IgG1 DMAb的表达和功能。

DMAb构建体含有来自公开的抗流感单克隆抗体的可变区

DMAb构建体含有来自抗流感单克隆抗体5J8(抗HA 5J8)和FI6(抗HA FI6)的可变区。FJ8与可变球状头部上的受体结合口袋结合，并与多种甲型流感H1病毒交叉反应。FI6与相对保守的融合子结构域结合，并给予1类和2类甲型流感病毒的广泛中和(图2)。

DMAb构建体由转染的293T细胞表达和分泌

进行实验以评价由DMAb构建体编码的抗流感-HA抗体5J8和FI6的表达和分泌。用携带5J8或FI6构建体的质粒DNA转染HEK 293T细胞。空质粒用作阴性对照。通过定量ELISA测定人IgG1κ表达，并进行Western印迹以检测上清液和裂解物重链和轻链肽的切割和表达(图3的A-B)。如图3的小图B所示，在HEK 293T上清液和HEK 293T裂解物中观察到抗HA 5J8和抗HA FI6，证明DMAb构建体能够诱导抗HA 5J8和抗HA FI6的表达和分泌。

在肌内DNA电穿孔后达到稳健的DNA单克隆抗体血清水平

进行实验以评价DMAb是否在体内诱导抗HA 5J8和抗HA FI6表达。对BALB/c小鼠注射5J8或FI6质粒DNA，然后进行肌内电穿孔。七天后，通过ELISA测定血清人IgG1κ抗体水平。如图3的小图A和图3的小图B所示，在肌肉DNA电穿孔后，在小鼠血清中产生高水平的抗HA5J8抗体和抗HA FI6抗体。

在肌内DNA电穿孔后产生的DNA单克隆抗体保持了结合不同靶HA抗原的能力

进行实验以研究表达的抗HA FI6的功能。对BALB/c小鼠注射300μg质粒DNA，然后进行肌内电穿孔。四周后，通过ELISA测定DMAb与重组甲型流感H1 HA抗原的结合。如图5所示，表达的抗体与靶标A/布里斯班/59/2007和A/加利福尼亚/07/2009靶标结合。

本文提供的实验证明，在表达密码子优化的抗体可变序列的质粒DNA构建体的肌肉内电穿孔后，抗HA 5J8和抗HA FI6 DNA单克隆抗体(DMAb)在小鼠血清中以高水平体内表达。体内肌肉细胞产生的抗体在体外是功能性的和结合的。DMAb为靶向流感HA的纯化蛋白单克隆抗体疗法提供安全、经济、实用的替代方案。

与纯化的蛋白质mAb和病毒载体相比，DMAb具有几个优点。相对于蛋白质mAb，DMAb的生产相对便宜；具热稳定性；易于分配；可修饰；并且诱导持久表达而不需要频繁的重新施用。相对于病毒载体，DMAb安全并且是非整合性的；非免疫原性；可以反复递送；没有预先存在的血清学特征；并且诱导急性表达以快速施用。DMAb的有效持久表达在治疗可能需要重新给药的慢性病状诸如癌症和自身免疫性疾病方面提供了实质性益处。廉价的DNA载体生产和分配提供了增强的负担能力，特别是在发展中国家和长期需要的地方。应当了解的是，上述详细说明和所附实施例仅仅是说明性的而不应当被认为对本发明的范围构成限制，本发明的范围仅由所附权利要求和它们的等同方案限定。

实施例2

本文提供的研究证明了目前开发的替代被动疫苗方法，其通过合成质粒DNA(DMAb)的体内电穿孔递送针对甲型和乙型流感病毒的全长人广泛中和抗体。

现在描述方法和材料。

对抗甲型或乙型流感特异性人抗体序列进行遗传优化并克隆到质粒pGX001中。肌内注射每种候选物，然后在BALB/c小鼠中进行电穿孔(IM-EP)。监测体内抗体表达并通过HA结合和病毒中和确认功能活性。在IM-EP后的不同时间，分别用致死剂量的H1或H3甲型流感亚型或源自两个谱系的乙型流感病毒攻击小鼠。监测受感染动物的存活率和体重减轻

IgG定量和HA蛋白结合

通过ELISA测定小鼠血清中人IgG的量。对来自各种甲型流感亚型和乙型流感谱系的纯化重组三聚体HA蛋白进行HA结合ELISA。

微量中和测定

使用MDCK细胞针对一组流感病毒测量中和活性，并类似于Kallewaard等人，2016所述测量神经氨酸酶活性。

体内功效

给予Balb/c小鼠肌内注射DMAb质粒，然后立即使用CELLECTRA 3P自适应恒流装置(Inovio Pharmaceuticals)进行电穿孔。四天后用致死剂量的甲型流感(A/加利福利亚/7/2009 3xLD₅₀，7:1A/波多黎各/8/34:A/香港/8/68 7xLD₅₀)或五天后用致死剂量的乙型流感(B/马来西亚/2506/2004 10xLD₅₀，B/佛罗里达/4/2006 7xLD₅₀)攻击小鼠。为了与IgG比较，在攻击前一天通过腹膜注射给予各组小鼠梯度浓度的纯化mAb。在感染当天收集血清样品。在感染后12天监测体重减轻和存活率。小鼠在减少原体重的25％时施安乐死。

根据美国陆军医疗部动物保护和使用审查办公室(Animal Care and Use ReviewOffice of the U.S.Army Medical Department)以及MedImmune和宾夕法尼亚大学机构动物保护和使用委员会(MedImmune and University of Pennsylvania’s InstitutionalAnimal Care and Use Committees)制定的指导方针批准和进行动物研究。

现在描述实验结果

体内产生的DNA编码的抗体(DMAb)表达功能性FluA和FluB mAb

对血清中DMAb的定量(图8)确认IgG表达并指示蛋白质是功能性的。在FluA DMAb和FluB DMAb电穿孔后5天(图9)收集血清并评价人IgG表达、与各种HA蛋白的结合活性和中和活性。来自经FluA-DMAb和FluB-DMAb处理的动物的血清抗体显示HA结合和病毒中和活性，类似于在同等IgG浓度下体外产生的mAb，表明肌细胞产生的DMAb在体内表达并具有功能性(图10)。

由抗甲型和乙型流感mAb工程改造的DMAb防止致死性流感感染达到与纯化IgGmAb相似的程度

在甲型流感攻击研究中，与无关对照DMAb相比，施用FluA-DMAb显著保护小鼠免受致死性病毒感染，并减少体重减轻。FluA DMAb保护小鼠免受致死性甲型流感病毒感染，达到与0.3mg/kg纯化FluA IgG相似的水平(图11)。类似地，当给予小鼠FluB-DMAb，接着给予致死性乙型流感感染时，FluB-DMAb产生针对来自任一谱系的乙型流感病毒的致死性感染的100％存活率。类似地，FluB DMAb保护小鼠免于致死性乙型流感感染，达到与1mg/kg纯化FluB IgG相似的水平(图12)。

FluA和FluB DMAb组合疗法引起对甲型或乙型流感攻击的防护

当FluA和FluB DMAb组合施用时，它们提供对甲型和乙型流感感染的防护。FluADMAb和FluB DMAb的组合施用引起甲型流感IgG和乙型流感IgG血清表达。保护动物免受甲型或乙型流感致死性感染(图13)。

总之，这些研究证明，由广泛中和抗流感mAb工程改造的DMAb在体内以足够水平表达完全功能性抗体，以防止甲型和乙型流感病毒对鼠类的致死性感染。这些结果表明，全长IgG mAb的合成DNA递送可能是通用流感免疫预防的可行平台策略，并且可以适应其中已经表征了交叉反应性mAb的其它感染性病原体。

实施例3

本文提供的研究展示了编码两种新型的广泛交叉保护性单克隆抗体的合成质粒DNA的产生。质粒DNA编码的单克隆抗体(DMAb)构建体的体内电穿孔在小鼠血清中产生稳健水平的针对甲型和乙型流感的功能性抗体。用甲型流感DMAb处理的动物在致死性1类和2类甲型流感攻击中存活，并且用乙型流感DMAb处理的动物受到保护免于致死性维多利亚和山形谱系乙型流感发病和死亡。为了增进这种技术的通用交叉保护潜力，当两种DMAb联合施用时，成功地保护动物免受严重的甲型和乙型流感感染。另外，递送抗流感DMAb产生了针对流感攻击的即时保护，但不抑制针对流感的保护性宿主免疫。体内产生的DMAb和腹膜内递送的蛋白质单克隆抗体赋予针对致死性流感攻击的类似保护，提出DMAb作为对抗严重流感感染的免疫预防的实用替代品。

现在描述方法和材料。

DNA编码的单克隆抗体构建体

使用如前所述的类似方法分离单克隆抗体(Kallewaard等人，2016,166:596-608；Pappas等人，2014,Nature 516:418-22；Traggiai等人，2004,Nat Med 10:871-5)。基于与H5和H7 HA蛋白的交叉反应性结合分离交叉反应性甲型流感单克隆抗体(FluA)(Kallewaard等人，2016,166:596-608)，并基于针对乙型流感不同谱系的中和活性分离乙型流感单克隆抗体(FluB)。通过RT-PCR从交叉反应性克隆物中分离可变基因序列，克隆并进一步修饰以恢复非必需的非种系框架氨基酸变化。全长人IgG1κ在CHO细胞中瞬时表达并纯化用于体内研究。如前所述工程改造质粒DNA编码的单克隆抗体(DMAb)构建体(Muthumani等人，2016,J Infect Dis 214:369-78；Flingai等人，2015,Sci Rep 5:12616)。DMAb构建体编码全人IgG1κ单克隆抗体FluA DMAb和FluB DMAb。抗体氨基酸序列经过DNA密码子优化和RNA优化以在人/小鼠中表达，并且从头合成得到的DNA转基因(Genscript,Picastaway,NJ,USA)。在巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子下将合成转基因限制性克隆到经修饰的pVax1哺乳动物表达载体(Invitrogen)中。添加IgE重链和轻链前导序列用于细胞加工和分泌。在初始研究中(图14A-14F至图17A-17F)，转基因由弗林蛋白/小核糖核酸病毒-2A(P2A)肽切割位点序列隔开的抗体重链序列和轻链序列组成，引起由单个质粒顺式表达重链和轻链肽。在联合施用FluA和FluB DMAb的后续研究中(图18A-18F)，将两种单独表达重链或轻链FluA肽的FluA DMAb构建体混合，用于由单独质粒反式表达重链和轻链FluA肽。

转染和Western印迹

将人293T细胞(ATCC)保持在补充有10％胎牛血清的杜尔贝科改良伊格尔培养基(Invitrogen)中。转染前一天，将细胞以每孔0.25x10⁶个细胞接种于12孔板中，并使用GeneJammer(Agilent Technologies)用0.5μg质粒DNA转染。48小时后，收集上清液并用含有蛋白酶抑制剂混合物(Roche Boehringer Mannheim)的1x细胞裂解缓冲液(CellSignaling)裂解粘附细胞。大约50μg总上清液/裂解物蛋白和10μg蛋白IgG使用SeeBluePlus2预染蛋白标准品(Thermo Fisher Scientific)在预制的4-12％ Bis-tris凝胶(Invitrogen)上电泳，并使用iBlot 2干式印迹系统(Thermo Fisher Scientific)转移至Immobilon-FL PVDF膜(EMD Millipore)上。使用IRDye 800CW山羊抗人IgG(H+L)(LI-CORBiosciences)(1:10,000)鉴定重链和轻链肽。用Odyssey CLx(LI-COR Biosciences)扫描荧光印迹。

定量ELISA

为了定量图14A-14F和图19中细胞裂解物、细胞上清液和小鼠血清中的总人IgG1κ，在4℃下将96孔MaxiSorp板(Nunc)用10μg/mL山羊抗人IgG F_c片段包被过夜(BethylLaboratories)。板用10％于PBS中的FBS封闭。将样品在1x PBS+0.1％ Tween₂₀(PBST)中稀释，并加入板中1小时。使用纯化人IgG1κ(Bethyl Laboratories)生成标准曲线。将板用HRP偶联的二抗山羊抗人κ轻链(Bethyl Laboratories)(1:20,000)染色1小时，使用SigmaFastOPD(Sigma-Aldrich)显色，并用2N硫酸终止。在Synergy2酶标仪(Biotek)上测量吸光度450nm。

鼠攻击研究中人IgG的定量使用384孔黑色MaxiSorp板(Nalgene Nunc)进行，该板在4℃下用10μg/mL山羊抗人IgG(H+L)(Pierce)包被过夜。将板用酪蛋白阻滞剂(Thermo)封闭，并将血清样品和标准曲线(10μg/mL的ChromPure人IgG，全分子)(Jackson Labs)连续稀释。将板洗涤并用驴抗人IgG-HRP二抗(Jackson)(1:4,000)染色，并使用SuperSignalELISA Pico Reagent(Thermo)使其可见。使用Perkin Elmer Envision测量发光。

如上所述进行小鼠血清中特定甲型或乙型流感人IgG的定量，来自A/越南/1203/2004(H5N1)的3μg/mL的HA蛋白或来自B/佛罗里达/4/2006(山形)的3μg/mL的HA作为包被试剂。FluA或FluB纯化蛋白IgG分别用作甲型和乙型流感测定的标准品。

结合ELISA

如前所述表达并纯化重组血凝素(HA)蛋白(Benjamin等人，2014,J Virol 88:6743-50)。使用384孔MaxiSorp板(Nunc)进行ELISA结合测定，该板包被5μg/ml来自A/珀斯/16/2009(H3N2)、A/香港/G9/1997(H9N2)和B/布里斯班/60/2008(维多利亚)的纯化HA蛋白质；或3μg/ml来自A/加利福利亚/07/2009(H1N1)、A/越南/1203/2004(H5N1)、A/荷兰/2003(H7N7)、A/密苏里州/2006(H2N3)和B/佛罗里达/4/2006(山形)的纯化HA蛋白。用酪蛋白(Thermo Scientific)封闭ELISA板，并将连续稀释的抗体在室温下孵育1小时。使用过氧化物酶偶联的小鼠抗人IgG抗体(KPL)(1:10,000)检测结合的抗体，然后用TMB溶液(KPL)显色，并在OD 450nm下进行吸光度测量。除了用过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠IgG抗体(DAKO)(1:5,000)的二抗之外，如上所述进行小鼠血清对HA的反应性测量。

病毒原液、体外中和及血凝抑制

野生型流感病毒株从疾病预防控制中心获得，或从美国模式培养物保藏所购买。通过反向遗传学产生的重配株H3病毒(rA/HK/68)含有来自A/香港/8/68(H3N2)的H3 HA和其余7个来自A/波多黎各/8/34(H1N1)的基因区段；该病毒的HA还含有增强鼠发病机理的N165S突变(Jin等人，2003,Virology 306:18-24)。所有病毒都在含胚鸡蛋中繁殖，并通过每毫升平均50％组织培养感染剂量(TCID₅₀)来测定病毒滴度。如前所述进行微量中和测定(Benjamin等人，2014,J Virol88:6743-50)。简言之，将60TCID₅₀病毒/孔添加到384孔板两个相同孔中含有0.75μg/ml N-甲苯磺酰基L-苯丙氨酰甲基氯酮(TPCK)胰蛋白酶(Worthington)的完全MEM培养基中的稀释于天然血清中的血清或纯化FluB抗体的三倍连续稀释液中。在33℃和5％CO₂孵育1小时后，向板中添加2x10⁴个Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞/孔。将板在33℃和5％CO₂孵育大约40小时，并通过向每孔添加荧光标记的底物甲基伞形酮-N-乙酰神经氨酸(MU-NANA)(Sigma),在37℃下保持1小时，测量神经氨酸酶(NA)活性。通过使用以下设置读取荧光来定量由NA活性表示的病毒复制：激发波长355nm，发射波长460nm，每孔闪烁10次。如前所述，用感染后第21天收集的血清进行血凝抑制测定。

肌内DNA电穿孔

DNA电穿孔前30分钟，雌性BALB/C和CAnN.Cg-Foxn1^nu/Crl小鼠(Charles River)在每个递送部位进行预处理，肌内(im)注射12单位(30μL)透明质酸酶(Sigma-Aldrich)。在初始研究中(图14A-14F至图17A-17F)，向胫骨前肌(TA)和/或股四头肌(Q)注射100μg(30μL)的FluA或FluB DMAb质粒；小鼠在一个部位(TA)接受100μg DNA，在两个部位(右TA+左TA)接受200μg DNA，或在三个部位(右TA+左TA+Q)接受300μg DNA。在后续联合施用研究中(图18A-18F)，小鼠接受FluA和FluB DMAb构建体两种。修改FluA构建体设计以在单独的质粒上表达重链和轻链肽，从比单质粒设计更少的注射部位产生相等的FluA IgG血清水平。在这种情况下，在两个部位(右TA+右Q)上递送100μg的FluA重链和轻链质粒的1:1(重量:重量)混合物，并且像之前那样在两个部位(左TA+左Q)上递送200μg质粒FluB。在每次DNA注射后立即用CELLECTRA 3P自适应恒流装置(Inovio Pharmaceuticals)进行肌内电穿孔(IM-EP)。

致死性流感攻击

六至八周龄的BALB/c小鼠(Harlan Laboratories)在感染前4-5天通过IM-EP接受FluA DMAb、FluB DMAb或无关对照DMAb(先前所述的DVSF-3(Flingai等人，2015,Sci Rep5:12616))。感染前一天，将具有与质粒DMAb编码的氨基酸序列相同的氨基酸序列的蛋白质IgG单克隆抗体以0.03mg/kg至1.0mg/kg范围的剂量经腹膜内(i.p.)施用给单独组的小鼠。对照小鼠经腹膜内接受非特异性蛋白质IgG R347。小鼠接受鼻内感染3xLD₅₀的A/加利福利亚/07/2009(H1N1)(9.5x10⁴ TCID₅₀/只小鼠)、7xLD₅₀的rA/HK/68(H3)(1.2x10⁵ TCID₅₀/只小鼠)、10xLD₅₀ B/马来西亚/2506/2004(维多利亚)(3.6x10⁴ TCID₅₀/只小鼠)或7xLD₅₀ B/弗罗里达/4/2006(山形)(7.0x 10⁴TCID₅₀/只小鼠)。每天监测一次所有小鼠的失重和存活情况，持续12天(对体重减轻≥25％的小鼠施安乐死)。在感染当天收集血液以评估血清中人IgG的量。为了评估肺部的病毒载量，在感染后五天对另外的小鼠施安乐死。将全肺在10％(重量/体积)无菌L15培养基(Invitrogen)中匀化，并在MDCK细胞上滴定以测定TCID₅₀/克组织。在同源再感染研究中，在初始感染后21天从所有存活小鼠中取血样以确认人IgG清除且不存在。在初始感染后28天，用与初始感染相同的病毒株和致死剂量再次攻击小鼠。

所有动物圈养和实验都根据NIH、美国陆军医疗部动物保护和使用审查办公室、宾夕法尼亚佩雷尔曼医学院机构动物保护和使用委员会以及MedImmune机构动物保护和使用委员会制定的指导方针得到批准和执行。所有鼠类攻击研究均根据国际实验动物评估和认可委员会(AAALAC)认证设施进行并随后在所述认证设施进行。

分析与统计

使用GraphPad Prism 6制备标准曲线和图表。使用log(血清稀释倍数的倒数)与反应的非线性回归计算EC₅₀和IC₅₀值。使用Kaplan-Meier存活曲线表示存活数据，其中p值通过对数秩(Mantel-Cox)检验计算。

现在描述实验的结果。

DNA编码的针对流感病毒的单克隆抗体(DMAb)在体外和体内表达

如前所述从人记忆B细胞分离针对甲型流感(FluA)和乙型流感(FluB)的广泛中和性单克隆抗体(Pappas等人，2014,Nature,516:418-22；Traggiai等人，2004,Nat Med,10:871-875)。FluA单克隆抗体与最近公布的广泛中和性单克隆抗体密切相关，该抗体由于与HA茎结合而显示出广泛的HA交叉反应性，并且能够中和来自1类和2类的甲型流感病毒。(平均IC₅₀为2.56μg/ml，数据未示出)(Kallewaard等人，2016,Cell,6743-50)。FluB单克隆抗体基于其有效中和属于维多利亚和山形谱系的乙型流感病毒的能力进行鉴定和选择(平均IC₅₀为0.64μg/ml，数据未示出)。该抗体与乙型流感HA球状头部中的保守性区域结合，并且可以抑制红细胞的病毒血凝作用。为了测试DMAb递送用于预防重度流感感染的实用性，从头合成编码人IgG FluA或FluB的合成DNA转基因，并克隆到哺乳动物表达质粒中。进行多次修饰以增强DMAb表达，所述修饰包括DNA密码子优化，RNA优化和质粒DNA的配制(图19)(Muthumani等人，2016,J Infect Dis 214:369-78；Flingai等人，2015,Sci Rep 5:12616)。经DMAb构建体转染的人胚肾293T细胞的裂解物和上清液中的人IgG的定量ELISA证实了组装的FluA和FluB抗体在细胞内表达和细胞外分泌(图14的小图A)。人IgG Western印迹还证明抗体重链和轻链存在于转染的293T细胞上清液和裂解物中(图14的小图B)。

按100μg至300μg的剂量通过肌内注射向无胸腺的CAnN.Cg-Foxn1^nu/Crl裸鼠施用FluA或FluB DMAb质粒DNA，利用透明质酸酶配制的肌内电穿孔(IM-EP)来增强DMAb递送和表达(图19)。对于FluA DMAb和FluB DMAb而言，裸鼠血清中的峰值表达水平分别达到平均10.0μg/mL(±2.6SEM)和31.8μg/mL(±8.1SEM)，在DMAb递送后10周及其以后观察到显著的人IgG表达(图14的小图C和小图D)。

接下来，在具有免疫能力的BALB/c小鼠(已建立的流感攻击模型)中确定抗流感DMAb的表达(图14的小图E和小图F)。BALB/c小鼠通过IM-EP接受100μg至300μg的质粒DNA。在递送后5天测量，FluA DMAb构建体在BALB/c小鼠血清中产生适度水平的人IgG(300μg质粒平均值1.8μg/mL±0.3SEM)。与在裸鼠中观察到的相似，递送后5天FluB DMAb表达比FluADMAb表达更稳健(200μg平均值5.4μg/mL±0.6SEM，300μg平均值10μg/mL±1.9SEM)。与在裸鼠中观察到的稳定表达不同，在递送后10天无法检测到BALB/c小鼠中的血清DMAb水平，这可能是由于针对表达的DMAb的小鼠适应性抗人IgG反应。总的来说，这些数据清楚地证明，在施用质粒构建体后，体内产生了相当水平的DMAb人IgG。

体内表达的流感DMAb具有功能活性并表现出广泛的交叉反应性

为了测试体内产生的DMAb的功能性，测试从经过DMAb处理的BALB/c小鼠收集的血清的体外结合活性。来自血清的FluA DMAb与甲型流感1类和2类HA抗原综合阵列结合，所述抗原来自于已知会感染人的病毒，包括来自季节性(H1、H3)和潜在大流行性(H2、H5、H6、H7、H9)流感分离株的重组三聚体HA(图15的小图A)，以及重组单体HA H10(图20)。鼠血清中的FluB DMAb与来自维多利亚和山形谱系病毒的乙型流感病毒HA结合(图15的小图B)。为血清稀释倍数倒数的半数最大有效浓度(EC₅₀)反映用300μg与100μg质粒DNA处理的小鼠血清中的结合活性较高，从而反映了在接受更多质粒DNA的动物中DMAb表达增加。

亲本FluB单克隆抗体的有效体外中和能力允许进行中和活性测试，而FluA单克隆抗体的效力不允许在微量中和测定中与小鼠血清的非特异性干扰进行区分。来自接受FluBDMAb质粒构建体的小鼠的血清在体外基于细胞的测定中有效地中和山形和维多利亚谱系乙型流感病毒(图15的小图C)，具有与结合测定中所见的相似反应模式。在对每个样品中的人IgG浓度进行标准化后，计算的经FluB DMAb质粒(对于B/弗罗里达/4/2006为0.015μg/mL且对于B/马来西亚/2506/2004为0.030μg/mL)处理的小鼠的半数最大抑制浓度(IC₅₀)与纯化蛋白FluB单克隆抗体(对于B/弗罗里达/4/2006为0.011μg/mL且对于B/马来西亚/2506/2004为0.047μg/mL)相似，在这项基于细胞的测定的整体误差范围内。接受FluA和FluBDMAb质粒构建体的小鼠中结合HA的人IgG的存在，以及在经FluB DMAb质粒构建体处理的小鼠中的中和滴度，证实了体内功能性DMAb的表达并证明了这些新型抗流感FluA和FluB抗体显著的广泛交叉反应性。

流感DMAb保护小鼠免受各种甲型流感和乙型流感致死性攻击

为了评价该技术在体内的实用性，在致死性流感攻击模型中评价经DMAb处理的动物。通过IM-EP为动物施用300μg FluA DMAb或无关DMAb对照(DVSF-3(Flingai等人，2015,Sci Rep 5:12616))，然后在电穿孔后4天用致死剂量的A/加利福利亚/7/2009H1N1(A/CA/09H1)进行攻击(图16A-16F)。为了DMAb和蛋白质IgG的直接体内比较，在感染前一天经腹膜内向单独组的小鼠递送一系列稀释的FluA蛋白单克隆抗体。在感染时从所有动物获得的血清样品显示FluA DMAb处理导致与在用0.3mg/kgFluA蛋白IgG处理的小鼠中观察到的相似平均人IgG浓度和HA结合活性(图16的小图A和图21A-21B)。当用致死剂量的A/加利福利亚/7/2009H1N1(A/CA/09H1)病毒进行攻击时，FluA DMAb处理提供90％的存活益处，而用针对登革热病毒(DVSF-3)的对照DMAb处理的所有动物均死于感染(图16的小图B)。对应于人IgG表达水平，FluA DMAb处理和0.3mg/kg FluA纯化蛋白对致死性和流感诱导的体重减轻显示出相似的保护作用(图16的小图C)。

用另一种临床相关的甲型流感病毒扩大这些结果，这是使用在施用DMAb后五天给予的rA/香港/8/68H3N1(rA/HK/68H3)的致死性攻击进行的类似研究。同样，在感染时，人抗体水平显示出在相似浓度下的FluA DMAb和0.3mg/kg FluA蛋白IgG(图16的小图D)。在致死性rA/HK/68H3攻击后，与DMAb对照相比，经FluA DMAb处理的动物具有显著的存活益处(用FluA DMAb的存活率为80％，而用对照DMAb的存活率为0％)(图16的小图E)。这些结果表明，FluA DMAb预防由已知会导致人疾病的临床相关H1和H3亚型的致死性甲型引起的流感感染，并且至关重要地表明通过DMAb平台产生的FluA抗体与腹膜内递送的纯化FluA抗体的体内功能相似。

为了进一步研究DMAb技术的预防潜力，进行了类似的致死性攻击研究以评价FluBDMAb的活性。在这些研究中，通过IM-EP为小鼠施用200μg FluB DMAb质粒构建体或对照DMAb，然后在五天后用致死剂量的来自维多利亚谱系(B/马来西亚/2506/2004(B/Mal/04))或山形谱系(B/佛罗里达/4/2006(B/Fla/06))的病毒进行攻击(图17A-17F)。同样，为了直接比较DMAb与纯化蛋白质，在感染前一天经腹膜内向单独小组施用纯化FluB单克隆抗体。在B/Mal/04攻击时小鼠血清中存在的人IgG的定量显示，FluB DMAb产生与在用1mg/kg的FluB蛋白质经腹膜处理的动物中观察到的相似的平均人IgG浓度和HA结合活性(图17的小图A和图21A-21B)。值得注意的是，100％经FluB DMAb处理的小鼠在维多利亚和山形致死性乙型流感攻击中存活，而非特异性DMAb对照到第8天完全死于两种感染(图17的小图B和小图E)。此外，FluB保护小鼠免于乙型流感相关的发病率，其中经处理的动物几乎没有表现出重量减轻(图17的小图C和小图F)。另外，经FluB处理的小鼠表现出比对照小鼠显著更低的肺病毒载量(图22A-22B)。经FluB DMAb处理的小鼠的存活率、重量减轻、肺病毒载量及血清中的体外结合活性与接受1mg/kg纯化FluB蛋白IgG的小鼠中的相同参数非常相似，再次证实DMAb和纯化的蛋白质单克隆抗体的体内功能等效。

联合施用FluA和FluB DMAb保护小鼠免受甲型和乙型流感攻击以及同源再攻击

甲型和乙型流感病毒共同传播，针对季节性感染的全面免疫预防策略应针对两种流感类型。为了测试DMAb平台用于该作用的能力，向BALB/c小鼠联合施用FluA DMAb和FluBDMAb。感染前5天，给小鼠施用FluB DMAb，然后在第二天施用FluA DMAb。感染前一天，比较组的动物经腹膜内接受FluA和FluB纯化蛋白质单克隆抗体的混合物。用致死剂量的A/CA/09H1或B/Fla/06攻击小鼠。感染时的血清样品显示经DMAb处理的动物具有平均3μg/ml的总人IgG(图18的小图A)。甲型和乙型流感特异性ELISA显示两种DMAb都表现出与先前观察到的那些相似的表达水平(图18的小图B)，其中FluA DMAb的血清水平近似于腹膜内递送的0.3mg/kg FluA蛋白IgG的血清水平，并且FluB DMAb近似于腹膜内递送的1mg/kg FluB蛋白IgG的血清水平。在攻击研究中，所有接受FluA加FluB DMAb的小鼠都受到保护免于致死性感染，而用对照DMAb处理的小鼠的90％和100％分别死于甲型和乙型流感感染(图18的小图C和小图D)。同样，施用DMAb和递送蛋白质IgG产生相似的保护水平，在存活率和体重减轻两个方面均显而易见(图23A-23D)。

在初始感染后21天，存活的BALB/c小鼠的血清的人IgG水平不可检测(数据未示出)，表明不再存在DMAb和重组蛋白。血清血凝抑制(HAI)和针对感染性流感菌株的小鼠抗HA结合抗体证实小鼠对感染产生宿主免疫应答(图24A-24D)。经DMAb处理的小鼠能够对病毒产生宿主免疫应答，达到与经纯化IgG处理的动物相同的程度。

至关重要的是，体内FluA和FluB的存在并未阻止针对攻击病毒的保护性宿主免疫应答。在初始感染后28天，对所有存活的小鼠(包括在初始A/CA/09H1感染中存活的一只DMAb对照小鼠)用致死剂量的同源流感病毒再次攻击以证实小鼠宿主免疫应答的水平具保护性。先前受到攻击的所有小鼠在致死性同源再攻击中存活而没有实质性重量减轻，而80-90％未经感染、未经处理的年龄匹配的小鼠未能存活(图18的小图E、图18的小图F和图23A-23D)。这些结果证明保护性宿主抗流感应答在保护性水平的FluA和FluB抗体的存在下发展，所述抗体无论是在体内以DMAb形式表达还是作为蛋白质单克隆抗体递送，证明DMAb不相互拮抗或拮抗宿主对流感的免疫应答。

讨论

仅在美国季节性流感感染就产生每年平均100亿美元的直接医疗费用和800亿美元的经济负担(Molinari等人，2007,Vaccine25:5086-96)。尽管有流感疫苗和抗病毒药物可用，但大型亚群易受季节性流感感染引起的并发症影响。在美国几乎90％归因于季节性流感的死亡发生在65岁及以上的成年人中(Frieden等人，2010,MMWR 59)，这是在显著抗原漂移的年代估计的疫苗功效低至36％的群体。除了季节性感染的持续性危害之外，大流行性流感爆发有可能超过疫苗设计的速度。因此，针对流感感染的创新通用性干预至关重要。

目前制造通用流感疫苗的大部分工作都集中在重组抗原的设计上，这些抗原可以用作免疫原来刺激交叉保护性抗流感抗体的成熟(Yassine等人，2015,Nat Med 21:1065-70；Impagliazzo等人，2015,Science 349:1301-6；Bommakanti等人，2010,PNAS107:13701-6)。这里，寻求绕过免疫接种而直接在体内产生交叉保护性免疫。在编码两种HA靶向抗体的质粒DNA构建体的肌内电穿孔后，在小鼠血清中产生功能交叉保护性抗流感抗体，导致针对致死性甲型流感和乙型流感攻击的显著保护。

大量蛋白质单克隆抗体可商购获得，用于治疗自身免疫性疾病、癌症和其它慢性病状；但考虑到施用生物制剂的费用及其有限的半衰期，只有一种蛋白质单克隆抗体广泛用于针对感染性疾病靶标的预防(Group,1998,Pediatrics 102:531-7)。DMAb技术是一种值得注意的递送替代方案，因为由体内肌肉细胞产生的DMAb和体外生产的纯化蛋白质单克隆抗体在小鼠中针对致死性流感感染赋予相同水平的保护作用。质粒DNA没有先前存在的抗载体血清学所带来的限制，并且DMAb平台可以反复使用以提供对抗病毒逃逸的附加抗流感抗体，或针对完全不同的病原体的抗体(Muthumani等人，2016,J Infect Dis214:369-78；Flingai等人，2015,Sci Rep 5:12616)。质粒DNA也几乎没有基因组整合的风险，类似的质粒设计已经在DNA疫苗人临床研究中证明安全性。

基于DNA质粒的单克隆抗体的递送是在供应链每个步骤蛋白质疗法的可行替代方案。在生产中，DMAb相对于蛋白质单克隆抗体(和病毒载体)廉价，因为DNA复制不需要哺乳动物细胞培养。在分销中，冷链是不必要的，这是发展中国家中的一个巨大的实际优势。DNA易于扩展并且可以稳定储存，这是资源有限的环境中尤为重要的考虑因素。DMAb长期表达的潜力可以避免频繁注射重组抗体的需要，这与新出现的抗体半衰期延长技术互补。在递送过程中，DMAb持续表达可以避免频繁注射抗体的需要，而蛋白质单克隆抗体通常表现出较短的体内半衰期；在DMAb递送至裸鼠后数月观察到DMAb有效表达。至关重要的是，经DMAb处理的小鼠在同源再感染后存活，表明在用FluA DMAb和FluB DMAb处理后宿主对流感感染的免疫应答保持完整。可以想象，这些流感特异性DMAb可用于增强疫苗活动，立即产生针对严重流感感染的预防，同时允许充分的疫苗诱导的免疫应答成熟化。DMAb还可以为不能产生抗体应答的免疫严重受损个体提供重要选择。由于能够使用质粒DNA递送有效的功能性抗体，DMAb技术提供了格外广泛的治疗潜力平台。

实施例4

本文提供了肽核酸序列标识符。

SEQ ID	标识	SEQ ID	标识符
				SEQ ID NO:1	pGX9211氨基酸	SEQ ID NO:9	pGX9211核苷酸
SEQ ID NO:2	pGX9212氨基酸	SEQ ID NO:10	pGX9212核苷酸
				SEQ ID NO:3	pGX222hc氨基酸	SEQ ID NO:11	pGX222hc核苷酸
SEQ ID NO:4	pGX222lc氨基酸	SEQ ID NO:12	pGX222lc核苷酸
				SEQ ID NO:5	pGX9223氨基酸	SEQ ID NO:13	pGX9223核苷酸
SEQ ID NO:6	pGX9231氨基酸	SEQ ID NO:14	pGX9231核苷酸
				SEQ ID NO:7	pGX9310氨基酸	SEQ ID NO:15	pGX9310核苷酸
SEQ ID NO:8	pGX9311氨基酸	SEQ ID NO:16	pGX9311核苷酸

对于本领域技术人员来说，对所公开的实施方案的各种改变和修改将是显而易见的。在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以进行此类改变和修改，包括但不限于与本发明的化学结构、取代基、衍生物、中间体、合成、组合物、制剂或使用方法有关的那些改变和修改。

Claims (15)

1.一种编码一种或多种合成抗体的核酸分子，其中所述核酸分子包含选自以下的至少一种：

a)编码抗流感血凝素(HA)合成抗体的核苷酸序列；和

b)编码抗流感HA合成抗体的片段的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述抗流感HA合成抗体选自结合流感HA的球状头部的抗体和结合流感HA的融合子结构域的抗体。

3.根据权利要求1所述的核酸分子，其中核酸分子编码抗流感HA合成抗体，所述抗流感HA合成抗体包含选自与SEQ ID NO:1-8至少90％同源的序列及其片段的氨基酸序列。

4.根据权利要求3所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含选自与SEQ ID NO:9-16至少90％同源的序列及其片段的核苷酸序列。

5.根据权利要求1所述的核酸分子，包含至少一个选自以下的核苷酸序列：编码第一抗流感HA抗体的第一核苷酸序列；和编码第二抗流感HA抗体的第二核苷酸序列。

6.根据权利要求1所述的核酸分子，还包含编码裂解结构域的核苷酸序列。

7.根据权利要求1所述的核酸分子，包含编码抗流感HA抗体的可变重链区和可变轻链区的核苷酸序列。

8.根据权利要求1所述的核酸分子，包含编码人IgG1κ的恒定重链区和恒定轻链区的核苷酸序列。

9.根据权利要求1所述的核酸分子，包含编码下述多肽的核苷酸序列，所述多肽包含：抗流感HA的可变重链区、人IgG1κ的恒定重链区、裂解结构域、抗流感HA的可变轻链区、和IgG1κ的恒定轻链区。

10.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述核苷酸序列编码前导序列。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含表达载体。

12.一种组合物，包含根据权利要求1-11中任一项所述的核酸分子。

13.根据权利要求12所述的组合物，还包含药学上可接受的赋形剂。

14.一种治疗受试者的流感感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1-11中任一项所述的核酸分子或根据权利要求12-13中任一项所述的组合物。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述流感感染选自甲型流感感染和乙型流感感染。